Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity Ústav experimentální biologie Oddělení fyziologie a anatomie rostlin
DIPLOMOVÁ PRÁCE
Efektivní koncentrace polyolů v mechanismech odolnosti lišejníků vůči nízkým teplotám
Lubomír Smejkal
Vedoucí diplomové práce: Mgr. Josef Hájek, Ph.D. Konzultant: Prof. Ing. Miloš Barták, CSc. Brno 2010
1 Motto: Podle jedné legendy vznikly lišejníky takto: Kojot se pokoušel ulovit labuť. Ta však vzlétla a kojota vzala s sebou do vzduchu. Upustila ho až ve velké výšce a kojot cestou k zemi padal skrz hustý les. A jak se jeho tělo brzdilo o jednotlivé větve, tak se do nich jeho srst stále víc zamotávala. Potom proměnil kojot své chlupy v lišejník slovy: „Má srst nesmí být zmařena. Lidé tě budou sbírat a připravovat z tebe jídlo“.
[Turner N. J., Bouchard R., Kennedy D. I. D. (1980): Ethnobotany of the Okanagan-Colville Indians of British Columbia and Washington. Occasional Papers of the British Provincial Museum, Nb. 21: 1–179]
2
Poděkování:
Moje poděkování patří především: Mgr. Josefu Hájkovi, Ph.D. (vedoucí) za odborné vedení a cenné rady v průběhu mého magisterského studia a připomínek při zpracování diplomové práce Prof. Ing. Miloši Bartákovi, CSc. (konzultant) za pomoc a jeho odborné rady při experimentální práci v průběhu magisterského studia a při zpracování diplomové práce Mgr. Peterovi Váczimu, Ph.D. za jeho neocenitelné rady při experimentální práci v průběhu magisterského studia RNDr. Stanislavu Manovi, Ph.D. za jeho pomoc při ověřování správnosti chemických vzorců polyolů Doc. RNDr. Marii Kummerové, CSc. za její neocenitelné rady a odborné vedení při nacvičování prezentační činnosti své diplomové a experimentální práce Všem ostatním zaměstnancům Katedry fyziologie a anatomie rostlin PřF MU.
V neposlední řadě bych rád poděkoval svojí rodině a přítelkyni za jejich svatou trpělivost a neocenitelnou podporu v průběhu celého studia.
3
Prohlášení
Prohlašuji, že jsem zadanou diplomovou práci na téma: „Efektivní koncentrace polyolů v mechanismech odolnosti lišejníků vůči nízkým teplotám” zpracoval samostatně za použití citované literatury.
Brno 2010 ______
Lubomír Smejkal
4 Abstrakt
V mé bakalářské práci jsem se zabýval otázkami souvisejícími s polyoly (cukerné alkoholy), respektive jejich rolí v ochraně lišejníků za nízkých a mrazových teplot. Součástí této práce byl experiment zaměřený na vliv různé koncentrace ribitolu na lišejníky. Základním cílem diplomové práce bylo odpovědět na otázku, jaká je efektivní koncentrace polyolů v lišejníkových stélkách v přirozeném prostředí při působení nízkých teplot. A to je hlavním bodem, kterým bych se měl v mé diplomové práci zabývat. Koncem listopadu 2006 jsme u hráze na Brněnské přehradě sesbírali vzorky lišejníku Xanthoparmelia somloensis (Gyelnik) Hale. Stélky jsme očistili a následně nechali vysychat při pokojové teplotě. Po vyschnutí jsme u poloviny stélek provedli extrakci sekundárních metabolitů, včetně polyolů, pomocí 100% acetonu (varianta aceton rinsing = AR). Druhou polovinu stélek jsme nepromývali (varianta non–AR). Poté jsme stélky zvážili a následně je exponovali po dobu 10 minut v příslušných koncentracích ribitolu, tj. 32mM (5 g/l), resp. 50mM (7,8 g/l). Kontrolní stélky byly po stejnou dobu vlhčeny pouze v destilované vodě. Všechny exponované stélky jsme následně opět zvážili. Tento postup se po 24 hodinách opakoval. Následně jsme stélky umístili do Petriho misek, uzavřeli a oblepili parafilmem (pro zabránění vysychání). Poté jsme Petriho misky umístili do kultivátoru s řízenou teplotou LABIO (CZ) a exponovali za mírné ozářenosti (300 mmol.m-2.s-1) za teplot –5, 0, +5 °C po dobu 8 dní. V průběhu experimentu byly misky několikrát krátkodobě otevřeny a stélky roseny destilovanou vodou. Během expozice jsme každých 24 hodin pomocí přenosné fluorescenční kamery Handy Fluor Cam 010 (PSI,
ČR) měřili parametry indukované fluorescence chlorofylu (FV/FM, II a NPQ). Výsledky měření ukázaly, že experimentální přídavek 32mM ribitolu vedl ke zvýšení hodnot FV/FM. Toto zvýšení však bylo patrné pouze při teplotě –5 °C, u ostatních experimentálních teplot (0 °C a +5 °C) nebyly zjištěny žádné výrazné rozdíly ve srovnání s kontrolou (tj. stélky v destilované vodě, bez přídavku ribitolu). To ukazuje, že pozitivní efekt externě dodaného ribitolu na primární procesy fotosyntézy v lišejnících se objevuje pouze za mrazových teplot. Tento účinek tak může souviset s kryoprotektivní rolí polyolů v rostlinách a symbiotických organismech (lišejnících). Přídavek 32mM ribitolu se také pozitivně projevil ve zvýšení hodnot kvantového výtěžku fotochemických procesů v PS II ( II) za všech experimentálních teplot.
5 Naproti tomu přídavek 50mM ribitolu měl v porovnání s kontrolou negativní
účinek na FV/FM, II za všech sledovaných experimentálních teplot. Výraznější vlivy ve variantě AR nebyly pozorovány.
Klíčová slova: lišejníky, polyoly, ribitol, manitol, arabitol, nízké a mrazové teploty, Xanthoparmelia somloensis (Gyelnik) Hale, Trebouxia
6 Abstract
My bachelor thesis was composed of two basic parts. The first one was focused on a literature review on polyols (sugar alcohols), their role in lichen protection against low and freeze temperatures. The second part of my bachelor thesis was an experimental work. The main aim of the diploma thesis was to find effective concentrations of polyols, ribitol in particular, in mechanisms of lichen resistance to low and freezing temperatures. Thalli of foliose lichen species Xanthoparmelia somloensis (Gyelnik) Hale, with Trebouxia as a photobiont, were collected close to the Brno Lake dam, Czech Republic, in November 2006. The thalli were cleaned with deionized water. Then, a half of the selected segments were subjected to acetone rinsing. In acetone rinsed (AR) lichen segments, majority of secondary metabolites were extracted. Untreated (non-AR) and acetone-rinsed (AR) thalli were exposed to 32mM (5 g/l) or 50mM (7.8 g/l) ribitol for 10 min, left in closed Petri dishes under dim light for 24 h, and then exposed to the respective ribitol concentration for 10 min again. Thalli segments of control (C), non- AR and AR treatments were then closed into Petri dishes using Parafilm and cultivated at -5, 0, and +5 °C (LABIO, Prague, Czech Republic) under 300 μmol.m-2.s-1 of photosynthetically active radiation for 168 h. Every 24 h, parameters of chlorophyll fluorescence (potential yield of photochemical reactions in PS II – FV/FM, effective quantum yield of photochemical reactions in PS II – II and non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence – NPQ) were measured using a HFC-010 portable fluorometer (Photon Systems Instruments, Brno, Czech Republic). During cultivation, the Petri dishes were opened very shortly and lichen thalli were sprayed several times by demineralised water. In all the examined thalli segments, an apparent drop in potential yield of photochemical reactions in PS II (FV/FM) values was found after 24-h exposure to respective temperature. Maximum decrease in FV/FM was found at -5 °C, while the decrease was much less pronounced at 0 and +5 °C. Lower FV/FM values were usually found in control thalli than in acetone rinsed thalli segments (AR) and in non-AR.
Application of ribitol affected FV/FM values only at -5 °C. While positive effect on
FV/FM was apparent in thalli treated with 32mM ribitol, negative effect occurred when treated with 50mM ribitol.
7 Effective quantum yield of photochemical reactions in PS II ( II) showed similar response to temperature treatments as FV/FM. Absolute II values decreased with treatment temperature. Positive effect of 32 mM ribitol on II was found at -5 °C in AR thalli while no such response was apparent in non-AR thalli.
Key-words: lichens, polyols, sugar alcohols, ribitol, mannitol, arabitol, low and freezing temperatures, Xanthoparmelia somloensis (Gyelnik) Hale, Trebouxia
8 OBSAH: 1. ÚVOD 1 2. PŘEHLED LITERATURY 5 2.1. Lišejníky 5 2.1.1. Anatomická a morfologická stavba lišejníků 5 2.2. Mechanismy kryoprotekce 9 2.2.1. Vliv nízkých teplot na rozšíření rostlin na Zemi 9 2.2.2. Teplotní stres 10 2.2.2.1. Chladový stres 10 2.2.2.2. Mrazový stres 11 2.2.3. Proces mrznutí 11 2.2.3.1. Nukleace ledu 12 2.2.3.2. Antifreeze proteins AFP´s 12 2.2.4. Mechanismy mrazové odolnosti 14 2.2.4.1. Mrazová avoidance 14 2.2.4.2. Mrazová tolerance 14 2.2.5. Signální dráhy v buňkách ovlivněných nízkou teplotou 15 2.2.5.1. Reakce vyvolané pomalým poklesem teploty 15 2.2.5.2. Reakce vyvolané rychlým poklesem teploty 16 2.3. Kryoprotekce a kryoprotektanty 19 2.4. Polyoly 21 2.4.1. Obecná charakteristika polyolů 21 2.4.2. Biologické vlastnosti polyolů 24 2.4.2.1. Výskyt, funkce a použití 24 2.4.3. Přirozená množství polyolů v lišejnících 26 2.4.4. Metabolismus polyolů 28 3. MATERIÁL A METODY 31 3.1. Charakteristika experimentálních druhů 31 3.2. Cíle experimentu 36 3.3. Průběh přípravy experimentu a expozice stélek 37 3.4. Měření parametrů indukované fluorescence chlorofylu 39 3.5. Stanovení obsahu chlorofylů a karotenoidů 40 3.6. Stanovení obsahu polyolů 41
9 4. VÝSLEDKY 42 4.1. Xanthoparmelia somloensis 42
4.1.1. FV/FM 42 4.1.2. 42 4.1.3. NPQ 43 4.2. Cetraria islandica 43
4.2.1. FV/FM 43 4.2.2. 43 4.2.3. NPQ 44 4.3. Flavocetraria nivalis 44
4.3.1. FV/FM 44 4.3.2. 44 4.3.3. NPQ 45 4.4. Obsah chlorofylů a karotenoidů 45 4.5. Obsah polyolů 45 5. DISKUZE 50 6. ZÁVĚR 53 7. SEZNAM CITOVANÉ LITERATURY 55 8. PŘÍLOHY 65
10 Přehled používaných symbolů a zkratek:
DW - suchá hmotnost (Syn: hmotnost sušiny) stélky
F0 - minimální výtěžek fluorescence chlorofylu změřený na zatemněných vzorcích (Syn: základní fluorescence chlorofylu vyvolaná měřícím zářením po zatemnění vzorku)
FM - maximální výtěžek fluorescence chlorofylu změřený na zatemněných vzorcích (Syn: maximální fluorescence chlorofylu vyvolaná saturačním pulsem po zatemnění vzorku)
FM’= FMS - maximální výtěžek fluorescence chlorofylu změřený na záření- aklimovaných vzorcích (Syn: maximální fluorescence chlorofylu vyvolaná saturačním pulsem při zapnutém aktinickém záření)
FS - rovnovážná hodnota výtěžku fluorescence chlorofylu měřená na světlo aklimovaném vzorku
FV/FM - poměr variabilní/maximální fluorescence chlorofylu
(Syn: poměr FV/FM, maximální výtěžek primárních fotochemických procesů PS II, potenciální výtěžek fotochemických reakcí ve PS II)
II - kvantový výtěžek fotochemických reakcí ve PS II (Syn: efektivní kvantový výtěžek fotochemické přeměny energie ve PS II, kvantový výtěžek elektronového transportu PS II)
Chla - obsah chlorofylu a
Chlb - obsah chlorofylu b
Cx+c - obsah celkových karotenoidů NPQ - koeficient nefotochemického zhášení fluorescence chlorofylu (Syn: nefotochemické zhášení variabilního výtěžku fluorescence chlorofylu) PS II - fotosystém II
(Přehled používaných symbolů a zkratek převzat a upraven podle Smejkal 2008).
11 1. Úvod
Lišejník je symbiotické spojení milionů fotosyntetických mikroorganismů, řas nebo sinic, zachycených ve spleti houbových hyf. Jednou součástí lišejníků je tedy houbová složka. Tuto část přibližně z 90% tvoří zástupci Ascomycota – vřeckovýtrusných hub, jsou však známy i lišejníky tvořené houbami Basidiomycota – houbami stopkovýtrusnými. Mezi fotosyntetické mikroorganismy, které tvoří lišejníkové asociace, můžeme zařadit zástupce jednobuněčných či vláknitých zelených řas nebo sinic. Mezi nejznámější zástupce patří rody Trebouxia a Nostoc. Spojení houby a řasy je natolik specifické, že lišejníky byly dokonce pojmenovány rodovými i druhovými jmény. Doposud bylo popsáno přes 25 000 druhů lišejníků.
Obr. 1: Lichenes" from Ernst Haeckel's Artforms of Nature, 1904 (http://en.wikipedia.org/wiki/Lichen)
Pseudopletivo, jež představuje velké procento celkové hmoty lišejníku, je tvořena houbovými hyfami. Zelená část, složená z řas či sinic, je většinou umístěna pod svrchní korovou vrstvou lišejníku. U většiny lišejníku bylo také prokázáno, že si partneři navzájem poskytují výhodné výměnné služby. Houba určuje tvar a vnitřní strukturu lišejníku. Má samozřejmě i ochranou funkci. Chrání svého fotosyntetického partnera před vnějšími vlivy, například před intenzivním slunečním zářením a
1 podporuje ho také v jeho vlastním růstu, poskytuje tak podmínky vhodné pro růst lišejníkové asociace. Houbová složka lišejníkové asociace je heterotrofní a zajišťuje zejména příjem vody a minerálních látek. Tvoří morfologii stélky a vytváří struktury podílející se na pohlavním i nepohlavním rozmnožování. Není však schopná vytvářet některé organické látky potřebné pro svůj vlastní růst, proto je musí získávat jiným způsobem. Tvorba těchto látek probíhá v symbiotickém partnerovi lišejníkové asociace. Symbiotické řasy a sinice mají schopnost fotosyntézy, přeměňují sluneční energii na energii chemickou, kterou si ukládají většinou ve formě sacharidů. Některé sinice jsou schopné dokonce přímo fixovat vzdušný dusík. Dusík začleněný fotosyntetickým symbiotickým partnerem v organických látkách je už houba schopna využít. Navíc houbový partner vytváří a extracelulárně vylučuje některé jedovaté sloučeniny, které chrání lišejník před některými konzumenty. Naproti tomu vylučuje i některé specifické kyseliny, které napomáhají získávání minerálních látek z okolního prostředí, ve kterém lišejník žije. Celý organismus je tedy autotrofní a houba odebírá od svého partnera, ať už je to řasa či sinice, až 50% produktů jejich fotosyntézy (Smejkal 2008). Symbióza v lišejnících je poměrně složitým procesem, bývá často popisována spíše jako vzájemné prospívání a získávání důležitých látek od partnera, než využívání jednoho organismu druhým. Díky tomuto funkčnímu spojení mohou lišejníky osidlovat i prostředí, kde by jako samostatné jednotky nikdy nemohly existovat. Zatímco se však houbové části lišejníků nevyskytují nikde jinde než ve stélkách lišejníků, lišejníkové symbiotické řasy jsou schopné volně přežívat mimo lišejníkovou asociaci. Houby a řasy některých lišejníků byly experimentálně izolovány a pěstovány. Jakmile však byly od sebe trvale odděleny, ani jeden z partnerů nebyl schopen produkce specifických látek, které normálně vylučují, jsou-li v symbiotickém kontaktu se svým partnerem. A díky tomuto vzácnému spojení a pevnosti vazby mezi houbou a fotosyntetickým partnerem jsou lišejníky schopny nejen osidlovat extrémní stanoviště, ale následně i odolávat a růst v podmínkách prostředí, ve kterých vyšší rostliny nepřežívají. Spektrum extrémních stanovišť, které jsou osidlovány lišejníky, je velmi široké. Takovým extrémním stanovištěm může být například půda zničená lesním požárem nebo třeba oblasti kudy tekla láva. Lišejníky můžeme také nalézt v Antarktidě, vysokohorských masívech nebo na pouštích (Lange et al. 2001). Pro lišejníky je typická schopnost tzv. bioindikace čistoty ovzduší, vzhledem k jejich citlivosti znečištění ovzduší (Roser et al. 1992b). Nejcitlivější jsou obecně druhy s keříčkovitou formou stélky. Zástupcem je například druh provazovka (Usnea
2 sp.). Naopak je tomu u lišejníků s korovitou formou stélky, která je plochá a nezaujímá tak velký prostor. Lišejníky s tímto typem stélky jsou nejméně citlivé na čistotu ovzduší díky tomu, že expoziční plocha stélky, přes kterou mohou škodliviny pronikat, je relativně malá. Třetím typem stélky je stélka lupenitá. V citlivosti vůči škodlivým látkám je pak někde mezi oběma výše uvedenými a tvoří jejich přechodný typ. Místa, kde se lišejníky nevyskytují, z důvodu velmi silně znečištěného prostředí, se nazývají lišejníková poušť (Grünert et al. 1995). Některé druhy lišejníků se používají ve vědě v různých oblastech běžných sociokulturních činností i specifických odvětvích průmyslu a obchodu, například jako součást parfému (Evernia prunastri, Pseudevernia furfuracea) a dokonce jako dekorace. Lišejníky rodu Umbilicaria mají na celém světě využití jako potrava. Nejoblíbenější je nejspíš v Japonsku jako součást každodenního stravování. Někteří lidé dokonce věří, že lišejník rodu Lecanora esculenta byl legendární biblickou mannou – jídlem bohů. Některé druhy lišejníků měly a dodnes mají uplatnění v medicíně (Usnea florida, Xanthoria parietina, Pettigera canina, Cetraria islandica). Asi nejstarší využitím, již od dob starého Egypta, byla výroba barviv (červená – Rocella, purpurová – Pertusaria corallina, Ochrolechia tartarea, hnědá – Parmelia omphalodes). V několika posledních desetiletích vzrostl zájem o lišejníky u vědeckých pracovníků téměř ze všech koutů světa. Nejdůležitějším předmětem jejich zájmu a zkoumání je schopnost lišejníků odolávat stresovým podmínkám na extrémních stanovištích, na kterých se často vyskytují. Vědeckou veřejnost zejména zajímá, jakými mechanismy se chrání proti extrémům fyzikálního prostředí, jakým způsobem probíhá za těchto podmínek jejich fotosyntetická aktivita a samozřejmě produkce sekundárních metabolitů. Nízké a mrazové teploty patří k často studovaným faktorům prostředí a jejich účinky na fyziologické procesy lišejníků jsou ve středu zájmu vědců zejména v posledních dvou desetiletích. Jedním z obranných mechanismů, umožňujících lišejníkům přežít za extrémně nízkých teplot, je produkce polyolů (cukerných alkoholů) a s nimi spojená ochrana jednotlivých částí lišejníků. Tato diplomová práce navazuje na moji bakalářskou práci, která byla zaměřena na roli těchto polyolů v rezistenci lišejníků vůči mrazu. Jednou částí byla literární rešerše o polyolech, jejich chemické podstatě, biologických vlastnostech a funkcích. Druhou částí bakalářské práce pak byl experiment, jehož výsledky byly publikovány ve vědeckých časopisech a informovali jsme o nich i na několika konferencích (Smejkal et al. 2009, Hájek et al. 2007, Hájek et
3 al. 2009a, c). Cílem experimentu bylo testovat pozitivní účinek externě dodaného ribitolu na primární procesy fotosyntézy za nízkých a mrazových teplot u foliózního lišejníku Xanthoparmelia somloensis (Gyelnik) Hale, který jako fotobionta obsahuje zelenou řasu rodu Trebouxia. V experimentu jsme dodávali ribitol do lišejníku ve dvou příslušných koncentracích, a to 32mM a 50mM. Z výsledků bylo patrné, že pozitivní vliv na primární procesy fotosyntézy měla jen koncetrace 32mM. V diplomové práci se podrobněji zabývám rolí polyolů v mechanismech odolnosti lišejníků vůči nízkým a mrazovým teplotám. Součástí mé diplomové práce je navazující experiment zaměřený na nalezení efektivní koncentrace polyolů v mechanismech odolnosti lišejníků vůči nízkým teplotám, tedy koncentrace, při které můžeme dokázat pozitivní vliv na primární procesy fotosyntézy. Úvodní kapitola je zpracována podle Smejkal 2008 a Campbell a Reece 2008.
4 2. Přehled literatury 2.1. Lišejníky
2.1.1. Anatomická a morfologická stavba lišejníků
Vnitřní stavba lišejníkové stélky je velmi složitá a rozmanitá. U většiny lišejníků není fotosyntetický partner (fotobiont) rovnoměrně rozptýlen po celé stélce, ale bývá soustředěn jen do určité vrstvy. Rozlišujeme dva základní typy.
1) Stélka homeomerická (stejnorodá), která má jednoduchou stavbu a v níž jsou buňky (případně vlákna) fotobionta volně rozptýlené mezi hyfami mykobionta, a nevytvářejí tak zřetelnou vrstvu dobře odlišitelnou od ostatních částí stélky. Homeomerická stélka bývá rosolovitá (vlivem slizu cyanobionta), vláknitá, leprariová (práškovitá, rozpadavá).
2) Stélka heteromerická (vrstevnatá), v níž buňky (případně vlákna) fotobionta tvoří samostatnou vrstvu. Tvar homeomerické stélky určuje zpravidla fotobiont, zatímco tvar heteromerické stélky mykobiont.
Heteromerická stélka bývá diferencována na tyto vrstvy:
– svrchní korová vrstva (svrchní kortex) – je tvořena hyfami mykobionta a má především ochrannou funkci.
– vrstva fotobionta – hyfy mykobionta jsou mezi buňkami fotobionta, a tyto hyfy mohou, ale také nemusí zasahovat pomocí haustorií do buněk fotobionta
– vrstva dřeňová (medula) – je tvořena řídce uspořádanými hyfami mykobionta, s velkým množstvím mezibuněčných prostor. Hlavní funkce této vrstvy je zásobárna vody.
– spodní korová vrstva (spodní kortex) – má podobnou stavbu jako svrchní korová vrstva. Bývá vyvinuta u většiny lupenitých a keříčkovitých lišejníků, u korovitých lišejníků chybí (přirůstají k substrátu přímo dření).
5
Obr. 2: Průřez heteromerickou stélkou (1) svrchní kůra tvořená obvykle pseudoparenchymem mykobionta (mechanická ochrana, omezení výparu) (2) řasová (gonidiová) vrstva - buňky fotobionta, mezi nimi řídce hyfy (3) dřeňová vrstva obsahuje pouze rozvolněná vlákna mykobionta (4) spodní kůra stejné stavby jako svrchní kůra, může být opatřena rhizinami (5) (upraveno z http://www.sci.muni.cz/botany/mycology/repetit/vi_basidiomycota-ii+lichenes.pdf)
Ad 2) Heteromerické stélky – podle morfologie lze rozlišit několik základních typů:
Korovitá (krustózní) stélka - stélka je celou svou plochou přirostlá k povrchu substrátu nebo je vrostlá do substrátu (horniny, kůry), nelze ji proto bez poškození od substrátu oddělit - vytváří buď souvislé povlaky, nebo častěji zrnité, bradavčité nebo políčkovité útvary - zpravidla nemá spodní kůru, k substrátu přirůstá přímo dření a nemá rhiziny (svazky houbových vláken) - příklady druhů - Rhizocarpon geographicum (mapovník zeměpisný) nebo Verrucaria muralis (bradavnice zední)
6
Obr. 3: Příčný řez korovitou stélkou lišejníku (zdroj: http://home.manhattan.edu/~frances.cardillo/plants/fungi/licrusto.html)
Lupenitá (foliózní) stélka - stélka je převážně plochá, k substrátu je přirostlá buď v jednom místě nebo volně celou svou plochou (rhizinami – svazky hyf vrůstající do substrátu), lze ji bez poškození od substrátu oddělit (k substrátu buď přiléhá, nebo na okrajích odstává) - skládá se z lupenitých laloků, které mají zřetelně rozlišenu lícovou a rubovou stranu - příklady druhů - Parmelia physodes (terčovka bublinatá) nebo Xanthoria parietina (terčovník zední), Xanthoparmelia somloensis (Gyelnik) Hale (terčovka úzkolistá), Peltigera sp. (hávnatka)
Obr. 4: Příčný řez lupenitou stélkou lišejníku (zdroj: http://home.manhattan.edu/~frances.cardillo/plants/fungi/lifolios.html)
7 Keříčkovitá (frutikózní) stélka - stélka je k substrátu přichycena svou bází, zpravidla pouze v jednom místě a zřetelně od něho odstává - bývá složena z oblých, stužkovitých, pentlicovitých nebo rourkovitých, většinou bohatě rozvětvených částí - je charakteristická radiální stavbou (na průřezu tvoří vrstvy korová, řasová a dřeňová soustředné kruhy) - příklady druhů - Usnea (provazovka), Alectoria (vousatec), Cetraria islandica (pukléřka islandská), Flavocetraria nivalis (pukléřka sněžná), Cetraria delisei (pukléřka Deliseova)
Obr. 5: Příčný řez keříčkovitou stélkou lišejníku (zdroj: http://home.manhattan.edu/~frances.cardillo/plants/fungi/lifrutic.html)
Dimorfická (dvoutvará) stélka - je přechodným typem mezi lupenitou a keříčkovitou stélkou - lze u ní rozlišit: a) spodní horizontální část (šupinovitá až lupenitá - přízemní stélkové šupiny), přisedlou k substrátu b) vzpřímenou vertikální část (keříčkovitá), na které se vytvářejí plodnice [plodnice (apotecium), nosiče plodnic (podecium, kmínky) - například u rodu Cladonia - dutohlávka]
(Kapitola 2.1. Lišejníky převzata a upravena podle Smejkal 2008)
8 2.2. Mechanismy kryoprotekce
Rostliny zpravidla nemohou výrazně změnit prostředí, ve kterém se vyskytují. Jestliže se zhoršují podmínky pro jejich přežití, vede to rostliny k rozvíjení mechanismů, které by je před těmito nepříznivými vlivy ochránily. Jedním z nepříznivých vlivů prostředí, který vyvolává aklimační a adaptační reakce rostlin je chlad a mráz. Velké množství vegetace bylo objeveno například na východní Sibiři nebo v polárních regionech, tedy na místech, kde je téměř po celý rok teplota hluboko pod bodem mrazu. Teplota zde dosahuje někdy teplot i kolem -40 °C. Některé druhy rostlin rostoucí v alpských regionech jsou schopné přežít i za teplot -50 °C (Hoshino et al. 1999). Lišejníky jsou tolerantní organismy, které jsou schopny přežívat za nízkých i mrazových teplot. Existují i některé druhy, které byly po ovlhčení schopny pokračovat ve fotosyntéze i po několikaletém zmražení suchých stélek na teplotu -196 °C (Kappen 1973, Fontaniella et al. 2000).
Obr. 6: Vztah teploty a vodního stresu (Upraveno dle Guy 1999. Převzato z Janská et Zelenková 2005)
2.2.1. Vliv nízkých teplot na rozšíření rostlin na Zemi
Rozšíření rostlin je limitováno především dvěma abiotickými faktory: přístupností vody a teplotou. Tyto dva faktory většinou působí společně a charakterizují klima i rozšíření rostlin na naší planetě (viz obr. 6). Biochemické a růstové procesy
9 rostlin mají určité teplotní optimum, které však po většinu vegetační sezóny není u rostlin, např. mírného pásma, dosaženo. Některé studie (např. Pokorná 2002) ukazují, že jen 6,6% celkové kontinentální plochy zaujímají místa, kde teploty neklesají pod 15 °C. To se týká zejména povodí Amazonky, Konga a části jihovýchodní Asie (Pokorná 2002). Rostliny se tak spíše setkávají s podmínkami více či méně suboptimálními a nízké teploty jsou jedním z nejdůležitějších faktorů, které růst rostlin omezují.
2.2.2. Teplotní stres
2.2.2.1. Chladový stres: Chladový stres postihuje zejména rostliny ze subtropů a tropů, kde se teploty pohybují v rozmezí 0 °C a 20 °C. Nezáleží však jen na teplotě, ale také na době, po kterou je rostlina této teplotě vystavena. Rostliny mají různé strategie a mechanismy, které používají k růstu a rozmnožování se na svých běžných stanovištích. Pokud se však, ať už svou přirozenou cestou, či působením člověka, dostanou na stanoviště s méně vhodnými až extrémními (chladovými) podmínkami, nastává u těchto rostlin stav, na který musí rostlina okamžitě reagovat. Pokud toho jsou rostliny schopné a dokáží se s těmito nepříznivými vlivy okolního prostředí vyrovnat, nazýváme tyto rostliny chladuvzdorné. Tyto rostliny lze pak dále rozdělit na chladově tolerantní (neboli chladově rezistentní) a chladově necitlivé (terminologie viz Janská et Zelenková 2005). U chladově tolerantních rostlin sice vyvolají nízké teploty primární poškození, nicméně jsou schopné odolávat sekundárnímu poškození. U chladově necitlivých, primární poškození vůbec nenastane při teplotě nad 0 °C. Naopak u rostlin citlivých na chlad (neboli chladově sensitivních rostlin) mohou být nízkými teplotami orgány či celé rostliny poškozeny nebo mohou dokonce odumírat (McKersie et Leshem 1994, Nilsen et Orcutt 1996). Primárním poškozením se rozumí počáteční rychlá reakce, která se v rostlině projeví inhibicí nebo inaktivací různých fyziologických procesů, ale je snadno reversibilní. Jako příklad se uvádí změny metabolismu a plasmatické membrány, dalším příkladem je inhibice fotosyntézy. Pokud vystavení nepříznivé teplotě pokračuje, následují sekundární změny. Ty mohou být nevratné a jejich výsledkem jsou charakteristické symptomy, které je už možné okulárně na rostlině pozorovat. Příkladem sekundárního poškození je nadprodukce aktivních forem kyslíku (ROS – reactive oxygen species). Jejich vlivem dochází k peroxidaci mastných kyselin a mění
10 se tak fyzikální vlastnosti membránových lipidů. To znemožní správnou funkci integrálních proteinů membrány a dochází tak k nevratnému poškození celé buňky.
2.2.2.2. Mrazový stres Za mrazuvzdorné považujeme rostliny, které jsou schopny tolerovat teploty pod 0 °C. Jednotlivé druhy mrazuvzdorných rostlin se liší ve svém genetickém potenciálu odolnosti vůči mrznutí. Celková odolnost rostlin vůči zmrznutí je však dána i jinými faktory. Nejvýznamnějšími z nich je teplota mrznutí a tání, rychlost aklimace a fyziologické rozdíly mezi jednotlivými pletivy a orgány rostliny, vodní poměry v rostlině, sněhová pokrývka a morfologické charakteristiky (Nilsen et Orcutt 1996). Podobně jako u chladového stresu jsou citlivější časná stádia vývoje semenáčků než dospělé rostliny a důležitá je také proměnlivost v mrazové rezistenci mezi jednotlivými pletivy a sezónní změny v citlivosti jednotlivých tkání.
2.2.3. Proces mrznutí
Mrznutí lze obecně rozdělit na dva základní typy: radiační a advekční. Radiační typ můžeme pozorovat za chladných jasných nocí, kdy je teplo z povrchu rostliny emitováno zpět do atmosféry. Za těchto okolností je teplota povrchu rostliny nižší než okolní teplota. K advekčnímu mrznutí dochází v případech, kdy se do určité oblasti dostane velmi studený vzduch z polárních oblastí. Ten způsobí nástup extrémně nízkých teplot vzduchu a vyvolá velmi rychlé mrznutí rostlin (Nilsen et Orcutt 1996). Led se v těle rostlin objevuje nejprve v místech s vyšším (nejméně negativním) osmotickým potenciálem. To zahrnuje zejména velké cévy xylému v listech a stoncích, buněčnou stěnu a mezibuněčné prostory. Velký průměr cév napomáhá tvorbě ledu. Jejich zředěná míza má obvykle nejvyšší bod mrznutí. Poté, co se led v cévách vytvoří, se začne rozšiřovat do extracelulárních prostor. Mrzne však pouze „čistá voda“, ostatní látky jsou vylučovány do okolní tekutiny (McKersie et Leshem 1994). Extracelulární roztok se tak stává mnohem koncentrovanějším, až mezi ním a roztokem uvnitř buňky vznikne gradient vodního potenciálu. Buňka ztrácí vodu, dokud se vodní potenciály nevyrovnají a následkem toho se cytoplasma dehydratuje. To má tři důležité fyziologické následky: během mrznutí a tání musí projít přes plazmatickou membránu velké množství vody, krystaly ledu se rozšiřují v apoplastu, a pokud jim tento prostor
11 nestačí, pletivo se začne roztahovat a vnitrobuněčné spoje začnou praskat. Nakonec dojde k ztrátě vody v cytoplasmě a buňky tak mohou zkolabovat. Z výše uvedeného tak vyplývá, že plasmatická membrána hraje důležitou roli v procesu mrznutí. Slouží nejen jako fyzická bariéra průniku ledu do cytoplasmy, ale udržuje také integritu buňky.
2.2.3.1. Nukleace ledu Aby se mohl vytvořit uvnitř nebo na povrchu rostliny led, musí nastat tzv. nukleace ledu. Obecně je známo, že bod mrznutí vody je 0 °C. Čistá voda má ale ve skutečnosti jen malou šanci zamrznout při teplotě vyšší než –40 °C. Ta představuje teplotu homogenní nukleace ledu. Voda se však v přírodě nevyskytuje v čistém stavu, ale jako iontový nebo koloidní roztok, jejichž bod mrznutí je 0 °C (Janská et Zelenková 2005). Nejprve se musí vytvořit malý zárodek krystalu. Tomu napomáhají tzv. heterogenní nukleátory ledu. Mezi ně patří například specifické druhy baktérií, houby, hmyz, prach, ale také samotný led. Tyto nukleační agens mohou být rozděleny do dvou skupin, a to na vnější a vnitřní. Mezi vnější patří zejména vlhkost a dva druhy bakterií (Pseudomonas syringae a Erwinia herbicola). Tyto bakterie, se aktivně podílejí na nukleaci ledu tím, že produkují specifické proteiny, které orientují molekuly vody do ledové mřížky. Čím více je těchto bakterií na povrchu, tím je stupeň nukleace ledu vyšší. Vnitřní nukleační agens si rostlina syntetizuje sama. Heterogenní nukleátory ledu jsou velmi efektivní a četné, mrznutí tedy u rostlin nastává při mnohem vyšších teplotách než je homogenní nukleace ledu (Janská et Zelenková 2005). Na nukleaci ledu má vliv i struktura rostliny. Zřejmý rozdíl je mezi adaxiálním a abaxiálním povrchem listu. Kapky vody s bakteriemi aktivními v procesu nukleace ledu mrznou na obou površích stejně rychle. Ale list nejprve mrzne na povrchu abaxiálním, protože se led šíří skrze průduchové štěrbiny. Je tedy patrné, že led musí proniknout povrchem listu a to buď skrze průduchy, praskliny v kutikule nebo zlomené epidermální vlásky (Wisniewski et Fuller 1999).
2.2.3.2. Antifreeze proteins AFP´s Utváření krystalků ledu v intracelulárním prostoru je pro organismy smrtící, protože růst ledového krystalku způsobí roztrhnutí buněčných membrán. Strategie, kterými se rostliny chrání při působení stresu způsobeného mrazovými teplotami, jsou založeny na zpomalování vzniku těchto ledových krystalků (Janská et Zelenková 2005).
12 Přes zimu některé rostliny akumulují ve svých orgánech látky, jako jsou cukerné alkoholy (polyoly), jednoduché cukry a aminokyseliny. Tyto sloučeniny způsobují tzv. přechlazení vody, a tím snižují bod tuhnutí. Dochází ke změně fyzikálních vlastností vody a současné ke zvýšení odolnosti rostlin k velmi nízkým a mrazovým teplotám. Cukry a aminokyseliny nejsou však jedinými látkami aktivními v obraně rostlin proti mrazu, které rostliny produkují. Dalšími sloučeninami jsou tzv. antifreeze AFP´s (proti mrazové) proteiny. AFPs byly poprvé objeveny v arktických a antarktických rybách. Později také v mušlích, hmyzu a některých členovcích (Duman et al. 1993). Na druhé straně i v mnoha mikroorganismech a rostlinách, také u některých mechů (Duman et Olsen 1993, Duman et al. 1993). Mechanismus působení těchto proteinů není u rostlin ještě dokonale objasněn. Bylo však v nedávné době objeveno, že přezimující rostliny produkují nejméně dva z těchto proteinů, které souvisí s odolností rostlin vůči mrazu. Jedním proteinem je AFP a druhým je kryoprotektivní protein. Biochemickou podstatou funkce AFP proteinů je zpomalování růstu ledových krystalů v intracelulárním prostoru a regulace jejich tvaru. Hincha (1997) informoval o tom, že tyto kryoprotektivní proteiny ochraňují tylakoidy proti poškození, způsobeného mrazem (Hoshino et al. 1999).
Obr. 7: Mechanismus inhibice růstu ledových krystalů pomocí AFP´s (A) a morfologie ledu (B+C). (Převzato dle Hoshino et al. 1999)
13 2.2.4. Mechanismy mrazové odolnosti Mrazuvzdorné rostliny si vyvinuly několik unikátních mechanismů, které jim umožňují vypořádat se s nízkými teplotami a možnou přítomností ledu v jejich tkáních. Všechny tyto strategie se dají rozdělit do dvou skupin: mrazové tolerance a strategie se mrznutí vyhnout (mrazová avoidance).
2.2.4.1. Mrazová avoidance Rostliny málokdy zmrznou při teplotě mrznutí buněčného roztoku, ale často se přechlazují. To je způsobeno přítomností některých specifických látek jako např. cukerné alkoholy (polyoly), jednoduché cukry a aminokyseliny (Hoshino et al. 1999). Produkce těchto látek jsou do určité míry schopny všechny rostliny, některé se však mohou přechlazovat až k teplotě homogenní nukleace ledu. Například mnoho dřevin se pomocí této strategií vyhýbá vysušení cytoplasmy. Důležitou úlohu při tomto procesu pak hraje u některých rostlin porozita buněčné stěny a plazmatické membrány a zvláště pak struktura a složení ztenčenin parenchymatických buněk xylému (Janská et Zelenková 2005). Ztenčenina je tenká nelignifikovaná (nezdřevnatělá) část buněčné stěny, složená hlavně z celulosy a pektinů. Hluboké přechlazení je charakteristické pro mírně otužilé dřeviny, protože je limitováno teplotou homogenní nukleace ledu. Extrémně otužilé druhy si vyvinuly rafinovanější strategii k vyhnutí se mrznutí svých tkání, tzv. „sklovatění“. Podobně jako strategie přechlazení, tak i strategie sklovatění reprezentuje situaci, kde je voda přítomna v metastabilním stavu. Zatímco rostliny, které dávají přednost přechlazení, se snaží zabránit přechodu vody z tekuté fáze na fázi pevnou, sklovatění představuje mechanismus, s jehož pomocí se stanou buňky osmoticky, teplotně i mechanicky netečné k přítomnosti externího ledu dokonce při teplotách blízkých teplotě tekutého dusíku, tedy –196 °C (Janská et Zelenková 2005).
2.2.4.2. Mrazová tolerance Ačkoli některé rostliny jsou schopné bránit se mrazovým podmínkám výše uvedeným způsobem, zůstává většina rostlin, které přezimují ve vegetativním stavu a jsou nuceny tolerovat růst ledových krystalů ve svých tkáních. Mechanismy tolerance zahrnují tvorbu krystalů ledu v rostlinných tkáních bez letálních (smrtících) následků (Janská et Zelenková 2005). Led musí být ovšem vytvořen v extracelulárních prostorech, tedy buněčné stěně, v mezibuněčném prostoru či v xylému. Mrazové
14 poškození je ovlivněno rychlostí a hloubkou mrznutí, složením roztoku, rychlostí tání a stupněm dehydratace (Reaney et Gusta 1999). Buňky a tkáně zmírňují dopad mrznutí změnou extracelulárního prostředí. Přítomnost velkého množství intersticiální vody zřeďuje ochranné látky, které buňky během mrznutí transportují do apoplastu (cukry, specifické proteiny a enzymy) a jejich tolerance je tak oslabena.
2.2.5. Signální dráhy v buňkách ovlivněných nízkou teplotou Rozpoznání vnějšího podnětu je umožněno díky receptorům, následný přenos signálu díky specifickým molekulám. Hlavními vlastnostmi přenosu signálu jsou rychlost, citlivost a specifita. Vnímání a přenosu signálu se účastní tři hlavní elementy – povrchové receptory, druzí poslové (second messengers) a proteinkinasy (Janská et Zelenková 2005). Rozpoznávání signálu z prostředí se děje během poplachové fáze stresové reakce. V závislosti na síle stresoru a genetických vlastnostech rostliny mohou vést následné reakce buď ke kolapsu buněčné integrity nebo zahájení aklimace. Reakce rostlin na pokles teploty lze rozdělit do dvou kategorií:
2.2.5.1. Reakce vyvolané pomalým poklesem teploty Díky změně stavu vody a nerovnováze mezi absorpcí vody kořeny a ztrátou vody transpirací klesá turgor a zastavuje se růst. Jednou z prvních změn po působení chladu na rostlinu je rigidifikace membrán následovaná přestavbou cytoskeletu (Janská et Zelenková 2005). Přeskupení cytoskeletárních struktur je potřebné pro rozvinutí mrazové tolerance. Ve fotosynteticky aktivních buňkách je ovlivněna rovnováha mezi absorpcí a utilizací energie a to změnou redox stavu PSII. Obrat reakčních center PSII je limitující v přeměně světelné energie do ATP a NADPH (Janská et Zelenková 2005). Dochází k syntéze neenzymatických antioxidantů jako je tripeptidthiol, glutathion, vitamin C (askorbát) a vitamin E (α-tokofero1) i antioxidačních enzymů - superoxiddismuthasa, glutathionperoxidasa, glutathionreduktasa, askorbát-peroxidasa a katalasa. Také jsou podpořeny dráhy přeměny a disipace nadbytečné zářivé energie. Mění se metabolismus rostliny. Navíc, určité cukry, zejména glukosa, fruktosa i sacharosa, mohou ovlivňovat expresi genů (Winter et Huber 2000). Přechodně se zvyšuje hladina ABA a závisí na míře působícího stresu. Výstupy odpovědí rostlin na pomalý pokles teploty (modifikace růstu orgánů, metabolická a osmotická přizpůsobení,
15 změny genové exprese atd.) umožňují aklimaci rostlin vůči nízkým teplotám. Výše popsané procesy jsou schematicky znázorněny na obr. 8.
2.2.5.2. Reakce vyvolané rychlým poklesem teploty Citlivost každé rostliny k náhlému poklesu teploty je dána jejími genetickými vlastnostmi, vývojovým stádiem a fyziologickým stavem. V tomto případě nejprve dojde k inhibici exkrece protonů do apoplastu a tím k depolarizaci membrány. Dochází tedy k alkalizaci apoplastu, který slouží jako aniontová past, ve které se hromadí ABA a ke změnám toku iontů. Také dochází ke ztrátě vody. Rozvíjí se oxidativní stres a zvyšuje se syntéza ethylenu (Janská et Zelenková 2005). Tento hormon se účastní regulace exprese obranných genů. Hraje důležitou roli v kontrole systémových odpovědí rostlin na stresor (Kacperska 1999). Vše nakonec vede k modifikaci genové exprese, a tím i ke změně skladby proteinů v buňce ovlivněné náhlým teplotním poklesem. Najdeme v ní například dehydriny. V buněčné stěně jsou přítomny extensiny, které se snaží zabránit deformacím buněčné stěny, ke které dochází vlivem dehydratace při extracelulárním mrznutí. Výsledkem náhlého poklesu teploty je i syntéza osmotinů a PR proteinů (pathogen-related proteins), mezi které řadíme i β-glukanasu. Ta snižuje osmotický stres a možnost prasknutí cév během tání. Výše popsané procesy jsou schematicky znázorněny na obr. 9. Celá tato kapitola byla podrobně zpracována podle: Hoshino et al. 1999, Janská et Zelenková 2005 a Kosová et Tichá 2005.
16
Obr. 8: Schéma možné sekvence dějů, které probíhají při reakci rostliny na pomalý pokles teplot (převzato a upraveno dle Janská et Zelenková 2005, Kacperska 1999).
17
Obr. 9: Schéma možné sekvence dějů, které probíhají při reakci rostliny na rychlý pokles teplot (převzato a upraveno dle Janská et Zelenková 2005, Kacperska 1999).
18 2.3. Kryoprotekce a kryoprotektanty
Schopnost přežít ukládání ledu v rostlinných pletivech většinou směřuje k minimálnímu obsahu vody, a to 65% celkového obsahu vody ve všech zkoumaných látkách. V takovém případě je nutné mít účinný obranný mechanismus, kterým se může organismus bránit. Jedním z nich je právě kryoprotekce, což je schopnost organismů chránit vlastní tkáně před teplotami pod bodem mrazu. Hlavní úlohu zde hrají látky zajišťující ochranu - kryoprotektanty. Důležitou vlastností je jejich nízká molekulová hmotnost. Hlavní funkcí je pak jejich schopnost zpomalit ztráty vody z cytoplazmy, která se v extracelulárních prostorech mění v ledové krystaly za současného zvyšování osmotického tlaku uvnitř buněk. Jako kryoprotektanty jsou známy různé cukry, například sacharosa a samozřejmě polyoly z nichž se nejvíce uplatňuje sorbitol a manitol. Tato kapitola zpracována dle Storey et Storey 2005 a http://www.answers.com/topic/cryoprotectant.
Dimethyl sulfoxid DMSO – molekulová hmotnost: 78,13 g.mol-1 (C2H6OS) – bod tání: 18,5 °C – bod varu: 189 °C
propan-1,2,3-triol Glycerol – molekulová hmotnost: 92,0938 g.mol-1 (C3H8O3) – bod tání: 18 °C – bod varu: 290 °C
ethan-1,2-diol
Ethylenglykol – molekulová hmotnost: 62,068 g.mol-1 (C2H6O2) – bod tání: –12,9 °C – bod varu: 197,3 °C
Manitol (2R,3R,4R,5R)-hexan- 1,2,3,4,5,6-hexol (C6H14O6) – molekulová hmotnost: 182,172 g.mol-1
19 propan-1,2-diol Propylenglykol – molekulová hmotnost: -1 (C3H8O2) 76,09 g.mol – bod tání: –59 °C – bod varu: 188,2 °C (2R,3R,4R,5S)-hexan- D-Sorbitol 1,2,3,4,5,6-hexol – molekulová hmotnost: (C6H14O6) 182,17 g.mol-1 – bod tání: 95 °C – bod varu: 296 °C
Sacharosa α-D-glukopyranosyl-β-D- fruktofuranosid (C12H22O11) – molekulová hmotnost: 342,296 g.mol-1 – bod tání: 186 °C
Trehalosa α-D-glukopyranosyl- α - D-glukopyranosid (C12H22O11) – molekulová hmotnost: 342,296 g.mol-1
Tab. 1: Obecný přehled kryoprotektantů
20 2.4. Polyoly
2.4.1. Obecná charakteristika polyolů (2R,3S)-butan-1,2,3,4- tetrol
Erytritol – molekulová hmotnost: -1 (C4H10O4) 122,1 g.mol – bod tání: 121 °C – bod varu: 329-331 °C propan-1,2,3-triol
Glycerol – molekulová hmotnost: 92,0938 g.mol-1 (C3H8O3) – bod tání: 18 °C – bod varu: 290 °C cyklohexan-r-1,c-2,c-3,t- 4,c-5,t-6-hexol Inositol (C H O ) – molekulová hmotnost: 6 12 6 180,16 g.mol-1 – bod tání: 225-227 °C
(2R,3R,4R,5R)-hexan- Manitol 1,2,3,4,5,6-hexol
(C6H14O6) – molekulová hmotnost: 182,172 g.mol-1
(2R,3s,4S)-pentan- Ribitol 1,2,3,4,5-pentol
(C5H12O5) – molekulová hmotnost: 152,15 g.mol-1 – bod tání: 102 °C (2R,3R,4R,5S)-hexan- 1,2,3,4,5,6-hexol D-Sorbitol (C H O ) – molekulová hmotnost: 6 14 6 182,17 g.mol-1
– bod tání: 95 °C – bod varu: 296 °C
(2R,3r,4S)-pentan- 1,2,3,4,5-pentol Xylitol (C H O ) – molekulová hmotnost: 5 12 5 152,15 g.mol-1
– bod tání: 92-96 °C – bod varu: 216 °C
Tab. 2: Obecná charakteristika polyolů
21 Při reakci na abiotický stres se u rostlin uplatňuje mnoho různorodých látek. Jedná se o molekuly signální povahy, osmoticky aktivní látky a látky podílející se na utlumení negativních účinků volných radikálů (tzv. zhášeče). Řada z těchto látek ovšem plní hned několik odlišných rolí. Jednou z možností, jak rostlina může negativním dopadům působení stresových faktorů předcházet, je akumulace kompatibilních látek nenarušujících rostlinný metabolizmus ani při vysokých koncentracích, jejichž významnou složkou jsou sacharidy. Sacharidy fungují při abiotickém stresu u rostlin jako osmoticky aktivní látky za podmínek, kdy je voda pro rostlinu špatně dostupná (sucho, nízká teplota, zasolení), svou vazbou na makromolekuly a fosfolipidy v membránách nahrazují hydratační obaly a zabraňují tuhnutí membrán (Krsek 2006). Jejich velkou podskupinou, na které se tato práce nejvíce zaměřuje, jsou cukerné alkoholy. Jejich četné hydroxylové skupiny se uplatňují při zhášení volných radikálů, vazbou na membrány předcházejí jejich poškození a chrání proteiny. Polyoly, jiným názvem cukerné alkoholy, se vyznačují tím, že obsahují hydroxylové skupiny –OH. Z předchozí tabulky je patrné, že počet těchto skupin se pohybuje v rozmezí 3 až 6, proto můžeme polyoly označit jako vysoce hydroxylované. Po chemické stránce můžeme polyoly rozdělit do dvou základních skupin. První skupinou jsou polyoly s lineárním řetězcem jako například glycerol nebo ribitol a druhou skupinou jsou polyoly s cyklickým řetězcem jako například inositol. Vedle sacharózy jsou polyoly rostlinami vytvářeny jako primární fotosyntetické produkty (Stoop et al. 1996). Ty pak mohou být transportovány v rostlinném těle na delší vzdálenosti a mají mnoho rozmanitých funkcí: od přizpůsobení se buněk osmotickému stresu až po zhášeče volných radikálů (Smirnoff et Cumbes 1989). Zajímavou vlastností některých polyolů, je schopnost tvořit komplexy s bórem a podílet se na jeho transportu. U většiny rostlin je bór ukládán v listech, odkud není přemísťován. To však neplatí u druhů produkujících cukerné alkoholy, zejména sorbitol a manitol. U některých růžovitých (Rosaceae) a celeru byly zjištěny komplexy sorbitol- bór-sorbitol nebo analogicky manitol-bór-manitol volně transportovatelné floémem (Bellaloui et al. 1999). Jak je patrné z výše uvedených skutečností, polyoly hrají významnou úlohu v toleranci rostlin a lišejníků k abiotickému stresu, v našem případě k nízkým a mrazovým teplotám.
22 Nejrozšířenějším a patrně i nejvíce prostudovaným polyolem v rostlinách i v lišejnících je manitol. Jeho syntéza byla zjištěna u prokaryot, mnoha druhů řas, hub a více než 100 druhů vyšších rostlin, zejména z čeledí Rubiaceae (kávovník), Oleaceae (oliva, jasan) a Apiaceae, včetně některých zemědělských plodin – např. celer, mrkev. Zajímavá je jeho přítomnost u parazitických rostlin, například Orobanche, Striga (Stoop et al. 1996, Fer et al. 1993). Jedná se o redukovanou formu manózy se šesti uhlíky v řetězci. Prekurzory pro jeho syntézu jsou, podobně jako u sacharózy, triózafosfáty dávající vznik fruktóza-6-fosfátu, v dalším kroku izomerovaném na manóza-6-fosfát. Ten je následně NADPH-manóza-6-fosfátreduktázou redukován na manitol-1-fosfát, v posledním kroku defosforylovaném na manitol (Gao et Loescher 2000). Manitol se může akumulovat v pletivech, kde se pro své osmoprotektivní vlastnosti uplatňuje v toleranci k abiotickému stresu (Pharr et al. 1995). Další významnou funkcí manitolu při abiotickém stresu je zhášení volných radikálů (Shen et al. 1997). Poslední výzkumy naznačují, že se manitol uplatňuje také v odpovědi na napadení rostliny patogeny (Joosten et al. 1990). Sorbitol je syntetizován ve fotosyntetizujících pletivech a je transportován floémem. O tomto cukerném alkoholu je známo mnohem méně údajů než o manitolu. Sorbitol je rozšířeným metabolitem především u růžovitých (Rosaceae), zde byl zjištěn u jabloně, hrušně a meruňky, dále také u jitrocele (Moing et al. 1992, Ahdam et al. 1979). Jeho biosyntéza připomíná syntézu manitolu (Krsek 2006). Sorbitol-6-fosfát vznikající z glukóza-6-fosfátu činností NAD-dependentní aldóza-6-fosfátreduktázy (A6PR) je v posledním kroku defosforylován fosfatázou na sorbitol (Williamson et al. 2002). Sorbitol, který se používá pro diabetiky, vzniká redukcí glukosy. Lze z něj také syntetizovat kyselinu L-askorbovou (vitamin C). Glycerol je trojsytný alkohol, není jedovatý a jeho ester s kyselinou dusičnou vytváří glyceroltrinitrát (nazývaný nesprávně nitroglycerin), který se používá jako výbušnina. Vytváří se z tuků (esterů vyšších mastných kyselin a glycerolu) alkalickou hydrolýzou (vedlejší produkt při výrobě mýdel). Lze ho také vyrobit z propylenu nebo akroleinu. Glycerol vystupuje také jako prekurzor syntézy triacylglycerolů a fosfolipidů v játrech a v tukových tkáních. Pokud začne tělo využívat uložený tuk v těle jako zdroj energie, glycerol a další kyseliny se vypouští do krevního oběhu. V játrech se pak přeměňuje na glukózu a poskytuje energii potřebnou pro buněčný metabolismus. Inositol, jako nejjednodušší cyklický hexitol, je široce rozšířen jak v rostlinné, tak živočišné říši. Biosyntetická dráha inositolu začíná glukóza-6-fosfátem
23 konvertovaným inositol-1-fosfátsyntázou na inositol-1-fosfát. Ten je za pomocí inositol- 1-fosfátfosfatázy defosforylován na samotný inositol (Ishitani et al. 1996). Inositol se v buňce účastní celé řady procesů, mezi které patří například buněčná signalizace, úloha při osmotickém přizpůsobení a zhášení volných radikálů. Při vystavení rostlin abiotickému stresu jsou produkty metylace inositolu využívány k osmotickému přizpůsobení buněk (Krsek 2006).
2.4.2. Biologické vlastnosti polyolů
2.4.2.1. Výskyt, funkce a použití Polyoly jsou v rostlinné i živočišné říši velmi rozšířenými sloučeninami. Prakticky je můžeme nalézt téměř všude od rostlin, přes houby, lišejníky, mechy až po živočichy (Williamson et al. 1995). Funkce a použití polyolů v těchto organismech jsou velice rozmanité. U člověka jsou polyoly hojně využívány jako umělá sladidla. Jejich chuť je srovnatelná s domácím cukrem běžně používaným v našich kuchyních. První nespornou výhodou polyolů je, že je nejsou ústní bakterie schopny metabolizovat, a proto nemají žádný vliv na zubní sklovinu. Druhou výhodou je pak možnost používat polyoly jako přípravek pro diabetiky, protože žádným zásadním způsobem neovlivňují hladinu krevního cukru. Poslední použití, které bych zde chtěl uvést, je uplatnění polyolů při gastrointestinálních problémech. Někdy slouží jako účinné laxativum. Naproti tomu u rostlin, řas nebo lišejníků je funkce polyolů značně odlišná. Například Williamson et al. (1995) se zabýval tím, jakou roli hraje manitol při fotosyntetických procesech u celeru. Stoop et al. (1996) zase zjistil, že manitol hraje důležitou roli v mechanismech odolnosti rostlin proti různým stresovým situacím, jako jsou například nízké či naopak vysoké teploty nebo osmotický stres. V lišejnících je funkce polyolů podobná. Polyoly se jako osmoticky aktivní látky podílí na udržování fyziologické aktivity za nízkých a mrazových teplot (Hájek et al. 2009b). Rozpustné polyoly zaujímají v některých lišejnících až 10% DW a přispívají k uchování polymerů a zajišťují metabolickou ochranu membrán a proteinů vůči okolnímu stresu (Armstrong et Smith 1994). Erytritol byl objeven v řasách (Hajny et al. 1964), houbách a v lišejnících, kde fotobiontem byla zelená řasa (Jacobs et Ahmadjian 1971). V lišejnících se však vyskytuje jen ve formě esterů (Hajny et al. 1964).
24 Inositol se vyskytuje, podobně jako erytritol, jen ve formě inositol fosfátu. Jeho struktura je cyklická (viz. Tabulka 2: Obecná charakteristika polyolů). Inositol ve formě myo-inositolu byl objeven v lišejníku Hypogymnia physodes (Farrar 1976a). Ve stejné formě byl objeven také u některých druhů hub Agaricus blazei, Agrocybe cylindracea a Boletus edulis (Tsai et al. 2008, Chang et al. 2001). Některé lišejníky obsahují jako fotobionta zelenou řasu Stichococcus. Ta produkuje sorbitol, který je přenášen v podobě jednoduchého polyolu do buněk mykobionta (Hill et Ahmadjian 1972). Richardson et al. (1968) ukázal, že druh polyolu, který je přenášený mezi symbionty, je specificky závislý na druhu řasy ve stélce lišejníku. U řas Trebouxia, Myrmecia nebo Coccomyxa je tímto transportním polyolem ribitol, u řas Hyalococcus nebo Trentepohlia je to pak erythritol nebo sorbitol (Hill et Ahmadjian 1972). Sorbitol byl nalezen ve velkém množství v řasách Prasiola crispa, Desmococcus vulgaris a Schizogonium murale (Roser et al. 1992a). Dokázán byl také u lišejníku druhu Dermatocarpon miniatum (Green et Smith 1974) a u některých lišejníků rodu Haematomma sp. (Stocker-Wörgötter et al. 2008). Ribitol, manitol a arabitol byly objeveny v řasách i v lišejnících (Roser et al. 1992a). Manitol se objevuje ve více jak 100 druhů vyšších rostlin (Williamson et al. 1995). Ribitol byl objeven u rostliny Adonis vernalis (Negm et Marlow 1985). Tyto tři polyoly byly objeveny například u lišejníků druhu Evernia esorediosa, Ramalina subbreviuscula a Ramalina sublitoralis (Hamada et al. 1994), dále pak třeba u druhu Hypogymnia physodes (Farrar 1976a, b) nebo Xanthoparmelia somloensis (Hájek et al. 2009a). Galun (1988) shrnula, že manitol a arabitol byly nalezeny ve více než 50 druzích lišejníků (Hamada et al. 1994). Například u Parmelia conspersa (Armstrong et Smith 1994), Evernia prunastris (Fontaniella et al. 2000), Usnea sphacelata (Roser et al. 1992b) a dalších. Konkrétně manitol byl objeven u lišejníků druhu Collema furfuraceum, Peltigera polydactyla a Peltigera rufescens (MacFarlane et Kershaw 1981), Xanthoparmelia mexicana (Kong et al. 1999) a několika zástupců druhu Haematomma (Stocker-Wörgötter et al. 2008).
25 2.4.3. Přirozená množství polyolů v lišejnících
Z kapitoly obecná charakteristika polyolů plyne, že v přírodě existuje celá řada polyolů. Co se týká lišejníků a mojí experimentální práce, jsou z těchto polyolů nejdůležitější tyto tři základní: ribitol, manitol a arabitol. Armstrong a Smith (1994) ve své studii dokázali, že přirozené množství ribitolu v lišejníkové stélce se pohybuje mezi 2-7 g.g-1 hmotnosti sušiny (DW). Jiní autoři pak uvádějí množství polyolů, zejména manitolu a arabitolu v lišejníkových stélkách v rozmezí 3-5 % DW (Lewis et Smith 1967, Holligan et Drew 1971, Hale 1983, Roser et al. 1992b). Jednou z prací zabývajících se studiem antarktických lišejníků adaptovaných na chladové a mrazové podmínky je Roser et al. (1992b). Zjistil, že ribitol a manitol zaujímají 10%, respektive 19% celkového množství rozpustných polyolů v lišejníkových stélkách antarktických druhů lišejníků. Celkové množství polyolů a cukrů u lišejníku druhu Umbilicaria decussata se pohybuje mezi 30 – 36 mg.g-1 DW, z toho arabitol, ribitol a manitol zaujímají 63%, 10%, respektive 18% této hmotnosti (Roser et al. 1992b). Přirozené množství polyolů v lišejníkových stélkách závisí také na druhu lišejníku a samozřejmě na místě, kde lišejník roste (Roser et al. 1992b). Tearle (1987) ve své studii objevil vysoké hodnoty polyolů a cukrů u druhů Usnea sp. a Himanthormia lugubris (Hue). Tyto hodnoty se pohybovaly na jaře a v létě mezi 160 a 240 mg.g-1 DW (Roser et al. 1992b). Hamada et al. (1994) se zabývali studiem polyolů u tří druhů lišejníků: Evernia esorediosa, Ramalina subbreviuscula a Ramalina sublitoralis. Všechny tyto lišejníky obsahovaly ribitol, manitol i arabitol. V lišejníku Evernia esorediosa zaujímaly polyoly 0,2%, 0,2% a 0,7% DW. Druhý lišejník Ramalina subbreviuscula pak 0,9% ribitolu, 0,1% manitolu a 3,4% arabitolu. Třetí lišejník Ramalina sublitoralis 0,9% ribitolu, 0,1% manitolu a 1,7% arabitolu. Farrar (1976c) ve své studii dokázal, že přirozené množství polyolů u lišejníku druhu Hypogymnia physodes je 10 mg.g-1 ribitolu, 10 mg.g-1 manitolu a 50 mg.g-1 arabitolu. Pueyo (1960) uvádí, že celkové množství polyolů v 11 druzích lišejníků se pohybuje v rozmezí od 1.7% do 4.9% DW. Aubert et al. (2007) se zabýval metabolickými procesy v lišejníku Xanthoria elegans, včetně studia polyolů v závislosti na charakteru světelné části dne. Vzorky lišejníku sesbíral na stejném místě, ale v různou denní dobu. První odběr byl za
26 slunečného dne, za nejvyšší denní teploty vzduchu pohybující se kolem 35 °C, druhý odběr byl pak opět ve dne, ale tentokrát po dešti a třetí poslední odběr byl proveden v noci před svítáním. Přirozené množství ribitolu bylo v prvním odběru 110 µmol.g-1 DW, ve druhém 105 µmol.g-1 DW a ve třetím odběru 90 µmol.g-1 DW. Množství arabitolu byla 360 µmol.g-1 DW, 340 µmol.g-1 DW, respektive 240 µmol.g-1 DW. A přirozené množství manitolu bylo 240 µmol.g-1 DW, 250 µmol.g-1 DW a 290 µmol.g-1 DW.
Ribitol Manitol Arabitol Druh lišejníku (mg.g-1 DW) (mg.g-1 DW) (mg.g-1 DW) Usnea sphacelata2 2,2 3,1 26,0 Umbilicaria decussata2 2,8 9,0 15,0 Usnea antarctica2 5,3 5,0 55,0 Xanthoria candelaria2 5,5 29,0 22,0 Candelariella hallettensis2 1,4 6,0 10,0 Pseudephebe minuscula2 2,0 11,0 22,0 Buellia frigida1 8,8 2,2 31,24 Rinodina olivaceobrunnea1 – 3,5 < 7,98 Evernia esorediosa3 – 1,4 3,4 Ramalina subbreviuscula3 – 1,0 2,4 Ramalina sublitoralis3 – 0,4 2,0 Evernia prunastri4 3,9 1,4 15,0 Xanthoria parietina4 1,4 8,4 5,0 Hypogymnia physodes5 3,7 10,8 31,6 Xanthoparmelia somloensis6 2,6 4,1 35,2 Cetraria islandica7 2,6 6,2 18,6 Cladina stellaris7 0,8 0,6 6,4 Hypogymnia physodes7 2,8 2,4 22,4 Bryória capilláris7 8,6 2,6 32,0 Bryória fuscéscens7 7,1 3,5 35,5 Alectória sarmentósa7 4,6 1,6 18,2 Platismatia glauca7 2,3 1,9 12,5 Nephroma arcticum7 0,7 25,0 37,6 Peltigera aphthosa7 0,1 13,8 14,0 Lobaria pulmonaria7 4,4 4,4 32,4 Peltigera malacea7 – 29,0 – Peltigera membranacea7 0,1 37,5 – Leptogium saternium7 – 16,8 – Nephroma bellum7 2,1 18,5 47,2
Tab. 3: Přehled přirozeného obsahu polyolů u jednotlivých druhů lišejníků. Hmotnost je uvedena v mg.g-1 DW, dry weight – hmotnost sušiny) Zpracováno dle Roser et al. 1992a (1), Chapman et al. 1994 (2), Hamada et al. 1994 (3), Oliveira et al. 2005 (4), Farrar 1976b (5), Hájek et al. 2009 (6), Dahlman et al. 2004 (7).
27 2.4.4. Metabolismus polyolů
U lišejníků, podobně jako u vyšších rostlin, probíhá u řasového nebo sinicového fotobionta fotosyntéza. Je dokázáno, že fotobiontů existuje celá řada, z nichž nejznámější a nejrozšířenější v lišejnících je řasa rodu Trebouxia. Jak je vidět z přiložené tabulky, existují také další lišejníkové symbiotické řasy jako rod Myrmecia, Coccomyxa či Trentepohlia. Ale ať jde o kteréhokoliv fotobionta, všichni při fotosyntéze využívají oxid uhličitý, vodu a slunečního záření, s jejichž pomocí si vytváří energeticky bohaté sloučeniny – cukry. V případě metabolismu polyolů je to stejné. Příslušné řasy nebo sinice v lišejnících asimilují při fotosyntéze oxid uhličitý. Ten jako základní zdroj uhlíku je fotobiontem rychle metabolizován na první produkt metabolické dráhy polyolů, a tím je ribitol (Lines et al. 1989, Dahlman et al. 2003). Ribitol je pak následně transportován směrem k mykobiontovi, kde se opět velkou rychlostí přeměňuje na arabitol. Dalšími metabolickými dráhami je arabitol postupně metabolizován na arabinosu, ribinosu, fruktosu a posledním členem metabolické přeměny je manitol (Lines et al., 1989, Jensen et al., 1991, Dahlman et al. 2003).
Obr. 10: Schéma přenosu uhlíku (upraveno dle: http://avalon.unomaha.edu/lichens/Bio%204350%20PDF/Lichen%20Physiology.pdf)
28 Richardson et al. 1968, Dahlman et al. 2003 dokázali, že to který polyol bude transportován od fotobionta směrem k mykobiontovi, závisí na tom, jaký druh fotobionta je v příslušném lišejníku obsažen. Tento poznatek ilustrují přiložená tabulka a obrázek.
Druh Trasnsportovaný polyol Druhy lišejníků fotobionta (od fotobionta k mykobiontovi) Lecanora conizaeoides Pseudevernia furfuracea Parmelia saxatilis Trebouxia Ribitol Umbilicaria pustulata Xanthoria aureola Dermatocarpon hepatieum Myrmecia Ribitol Lobaria laetevirens Lobaria pulmonaria Gyalecta cupularis Lecanactis stenhammarii Trentepohlia Erytritol Roccella puciformis Roccella phycopsis Dermatocarpon fluviatile Dermatocarpon Hyalococcus Sorbitol miniatum Myrmecia a Lobaria amplissima Ribitol Nostoc Peltigera aphthosa Coccomyxa a Ribitol Solorina saccata Nostoc
Tab. 4: Přehled vybraných druhů lišejníků, jejich fotobiontů a druhů polyolů, které jsou transportovány směrem k houbovému partnerovi (Richardson et al. 1968).
Přeměněný uhlík ve formě manitolu už není dále fotobiont schopen zpracovat, ale pořád je velice důležitý pro jeho životní mechanismy (Feige et Jensen 1992). Obranným mechanismem, kterým se fotobiont může chránit před zvýšenou ztrátou
29 uhlíku je snížení toku ribitolu směrem k mykobiontovi. Sníží-li se množství ribitolu transportovaného do mykobionta, nedojde tak k vlastnímu poškození fotobionta nebo k totální destrukci vlastních buněk (Honegger 1991, Dahlman et al. 2003). Rychlost s jakou je uhlík přeměněn na ribitol, nebo na jeho další metabolické produkty, je různá. Existuje několik studií na toto téma a je z nich patrné, že to velmi pravděpodobně závisí na druhu lišejníku a zejména na vlivu okolního prostředí, ve kterém lišejník žije. Různé okolní vlivy prostředí, jako je nedostatek světla, nebo naopak jeho nadprůměrné množství, nebo i vliv teplot, klesajících hluboko pod bod mrazu, mohou způsobit snížení či zvýšenou produkci polyolů řasou, vyčerpání zásob polyolů v lišejníku nebo snížení rychlosti růstu. Při těchto uvedených stresových situacích se pak arabitol vyčerpává rychleji než manitol. Proč tomu tak je, vysvětlili Armstrong et Smith (1994). Tito vědci objevili, že zatímco arabitol funguje v lišejnících jako krátkodobá energetická hotovost, manitol naproti tomu má spíše ochrannou a zásobní funkci. Proto tedy ve stresových situacích dochází k tomu, že se arabitol, jako okamžitý zdroj energie, vyčerpá mnohem dříve. Rychlost přeměny uhlíku na pozdější produkty (polyoly) je u lišejníků značná. Bednar et Smith (1965) dokázali, že u lišejníku druhu Xanthoria aureola bylo více jak 75% fixovaného uhlíku přeměněno na polyoly v prvních 15 minutách probíhající fotosyntézy a po 6 hodinách se toto číslo zvýšilo nad 90%. Drew et Smith (1967) referovali o tom, že v lišejníkové stélce druhu Peltigera polydactyla se fixovaný uhlík rychle přesunul od fotobionta, řasy rodu Nostoc směrem k mykobiontovi. Zde se přeměnilo po 4 hodinách přibližně 40% fixovaného uhlíku na polyoly a usadilo se v dřeňové vrstvě (medule) mykobionta. Největší množství zaujímal manitol, do nějž se metabolizovala největší část fixovaného uhlíku.
30 3. Materiál a Metody
Pro experiment zaměřený na zjištění efektivní koncentrace polyolů v mechanismech odolnosti lišejníků vůči nízkým teplotám byly vybrány následující druhy lišejníků:
3.1. Charakteristika experimentálních druhů
Cetraria islandica (L.) Ach.
Český název: - Pukléřka islandská („islandský mech“) Typ stélky : - frutikózní (keříčkovitá) Fotobiont : - zelená řasa rodu Trebouxia (Brodo et al. 2001) Znaky : - volně přilehlá stélka, nepravidelně růžicovitá, úkrojky 0,5-3 cm dlouhé, 0,1-0,6 cm široké, svrchu zelenavě žluté, trsnatě křovitá až polštářovitá, polymorfní, laloky jsou žlábkovitě svinuté až skoro rourkovité, lesklé, olivově zelené, šedozelené až tmavě hnědé, s krátce brvitými okraji. Stanoviště : - řídké trávníky, na kyselé půdě, vzácně epifyticky, na písčité půdě v mechu a v trávě, v řídkých trávnících na kyselé půdě, v suchých trávnících na vápenci, na rašeliništích, na kmenech kleče. Rozšíření : - od nížin nad horní hranici lesa v Evropě, Asii a Severní Americe; do Arktidy. Lokalita sběru : - Norsko – JV od městečka Aas - 59° 39′ 37″ N, 10° 47′ 1″ E
Obr. 11: Cetraria islandica (Foto Hájek)
31 Charakteristika druhu
Flavocetraria nivalis (L.) Kärnefelt & Theko
Český název: - Pukléřka sněžná Typ stélky : - frutikózní (keříčkovitá) Fotobiont : - zelená řasa rodu Trebouxia (Brodo et al. 2001) Znaky : - vzpřímená stélka, zelenavě bílá, na líci se zřetelně žilnatou síťkou, jamkovitě nerovná, odumírající báze se barví žlutohnědě. Stanoviště : - na návětrných hranách v holích nad horní hranicí lesa. Rozšíření : - vzácně v nížinách (u Verden v Dolním Sasku), na ostrově Öland (Švédsko), Norsko (Aas). Lokalita sběru : - Norsko – JV od městečka Aas. - 59° 39′ 37″ N, 10° 47′ 1″ E
Obr. 12: Flavocetraria nivalis (Foto Hájek)
32 Charakteristika druhu
Cetraria delisei (Bory ex Schaer.) Nyl. / Cetrariella delisei
Český název: - Pukléřka Deliseova Typ stélky : - frutikózní (keříčkovitá) Fotobiont : - zelená řasa rodu Trebouxia (Brodo et al. 2001) Znaky : - sdružují se do velkých trsů, stélka je hnědé barvy s pravidelně rozmístěnými bělavými pseudocyphelami, stélka je vzpřímená (4-8 cm výška, šířka 3-5 mm), základna je mírně rozšířená a plochá, koncové větévky se rozdělují nepravidelně, špička je chocholatá. Stanoviště : - mírně vlhká stanoviště ve vysokých nadmořských výškách. Rozšíření : - velmi rozšířený ve vyšších nadmořských výškách na severní polokouli, v Japonsku nalezena lokalita na Mt. Daisetsu na ostrově Hokkaidó. Lokalita sběru : - Norsko – JV od městečka Aas. - 59° 39′ 37″ N, 10° 47′ 1″ E
Obr. 13: Cetraria delisei / Cetrariella delisei (Foto Hájek)
33 Charakteristika druhu
Peltigera sp.
Český název: - Hávnatka Typ stélky : - foliózní (lupenitá) Fotobiont : - sinice Znaky : - stélka často značných rozměrů, hluboce laločnatá, se zaoblenými okraji, nebo je tvořena jedním lupenem, barva hnědá až šedá za sucha, za vlhka je pak živě zelená, nebo modrošedá až černavá, apothecia sedlovitá až plochá, barvy červenohnědé až černé. Stanoviště : - na zemi, skalách ale i někdy na kůře, často ji najdeme na meších. Rozšíření : - kosmopolitní rozšíření na obou polokoulích. Lokalita sběru : - Svalbard – Špicberky, východní břeh zátoky Petunia bukta. - 78° 40′ 60″ N, 16° 33′ 00″ E
Obr. 14: Peltigera sp. (Foto Hájek)
34 Charakteristika druhu
Xanthoparmelia somloensis (Gyelnik) Hale
Český název: - Terčovka úzkolistá Typ stélky : - foliózní (lupenitá) Fotobiont : - zelená řasa rodu Trebouxia (Brodo et al. 2001) Znaky : - volně přilehlá stélka, nepravidelně růžicovitá, úkrojky 0,5-3 cm dlouhé, 0,1–0,6 cm široké, svrchu zelenavě žluté, bez izidií Stanoviště : - na výslunných skalách Rozšíření : - roztroušeně v teplejších oblastech střední Evropy, hojněji v kontinentální jižní a východní Evropě, po celém světě, - Baleáry, Kanárské ostrovy, Madeira, ČR, Austrálie Lokalita sběru : - Brněnská přehrada, u hráze na skále - 49° 13' 57" N, 16° 31' 7" E
Obr. 15: Xanthoparmelia somloensis (Gyelnik) Hale (zdroj: http://www.biolib.cz/cz/taxonimage/id6381/, Foto: František Bouda )
35 3.2. Cíle experimentu
– studovat vliv externě dodaného ribitolu na fotosyntetické procesy za nízkých a mrazových teplot u lišejníků s keříčkovitým typem stélky – potvrdit nebo vyvrátit hypotézu pozitivního účinku externě dodaného ribitolu na fotosyntézu lišejníků s keříčkovitým typem stélky, pomocí měření parametrů indukované fluorescence chlorofylu – zjistit efektivní koncentraci polyolů v mechanismech odolnosti lišejníků vůči nízkým teplotám – porovnat pozitivní/negativní účinek externě dodaného ribitolu za nízkých a mrazových teplot na parametry fluorescence chlorofylu u lišejníků s keříčkovitým typem stélky (Cetraria islandica a Flavocetraria nivalis) a lišejníku s lupenitým typem stélky (Xanthoparmelia somloensis (Gyelnik) Hale) – detailně analyzovat teplotní účinek nízkých a mrazových teplot na parametry indukované fluorescence chlorofylu, tj. maximální výtěžek primárních fotochemických procesů ve PS II (FV/FM), kvantový výtěžek fotochemických reakcí ve PS II ( II) a koeficient nefotochemického zhášení fluorescence chlorofylu (NPQ) – studovat vliv heterogenity fotosyntetických procesů v různých částech stélky na hodnoty parametrů indukované fluorescence chlorofylu
36 3.3. Průběh přípravy experimentu a expozice stélek
Pro náš experiment nasbíral prof. Barták stélky lišejníků druhu Cetraria islandica, Flavocetraria nivalis, Cetraria delisei a Peltigera sp.. První tři druhy byly sesbírány ve vyšších nadmořských výškách v Norsku u města Aas a čtvrtý byl nasbírán na Špicberkách, všechny v roce 2009. Stélky následně vysychaly za laboratorní teploty a poté byly dovezeny do České republiky. Zde byly všechny čtyři druhy lišejníků před experimentem namočeny a řádně očištěny a omyty. Poté vysychaly za laboratorní teploty a následně byly umístěny do exikátoru, kde za dobu 4 dní úplně vyschly. Po těchto 4 dnech byly lišejníkové stélky rozděleny na menší stélky o hmotnosti průměrně kolem 0,3 g. Všechny rozdělené stélky všech čtyř druhů lišejníků byly nejprve zváženy v suchém stavu na analytických vahách (Váhy AE 100, Mettler Instrumente Zurich). Poté byly exponovány po dobu 10 min v příslušné koncentraci ribitolu, tj. 16mM (2,5 g/l), 32mM (5 g/l), 40mM (6,3 g/l), resp. 50mM (7,8 g/l). Zvolené koncentrace vycházely z předchozích experimentů a z článku publikovaného Solhaug et al. 2003 a Hájek et al. 2009. Kontrolní stélky byly po stejnou dobu máčeny pouze v destilované vodě. Takto ovlivněné stélky všech 4 koncentrací a kontroly byly následně opětovně zváženy na analytických vahách. Stélky jsme poté nechali vysychat na filtračním papíře za laboratorní teploty a po 24 hodinách byl celý postup vážení vysušených stélek, máčení a opětovného vážení zopakován. Následně byly stélky umístěny do dělených, skleněných Petriho misek. Poté byly umístěny do kultivátoru teploty LABIO (CZ) a exponovány za mírné ozářenosti (150 mol m-2s-1), s teplotami (0 °C, –10 °C a –15 °C) po dobu 7 dní. Každých 24 hodin byly pomocí přenosné fluorescenční kamery Handy Fluor Cam 010 (PSI, ČR) měřeny parametry indukované fluorescence chlorofylu (FV/FM, II, NPQ – blíže viz. kapitola Měření parametrů indukované fluorescence chlorofylu).
Po ukončení experimentu bylo provedeno stanovení obsahu pigmentů (ChlA,
ChlB, ChlTotal a karotenoidů) a stanovení obsahu polyolů ve stélkách (HPLC).
37
Obr. 16: Handy Fluor Cam 010 (PSI, ČR)
1 2
3 4
Obr 17: Umístění stélek na dělenou, skleněnou Petriho misku (1 – Cetraria islandica, 2 – Flavocetraria nivalis, 3 – Cetraria delisei, 4 – Peltigera sp.)
Obr. 18: Umístění Petriho misek do kultivátoru teploty LABIO (CZ) a exponovány za mírné ozářenosti (150 mol m-2s-1), s teplotami (0 °C, –10 °C a –15 °C).
38 3.4. Měření parametrů indukované fluorescence chlorofylu
V experimentu používané parametry fluorescence chlorofylu (přehled udávající jejich výpočet a reference je uveden v tab. 5):
FV/FM Maximální kvantový výtěžek PSII vyjadřuje hodnotu vnitřní (nebo maximální) účinnosti přenosu energie PSII (tedy účinnost pokud jsou všechna PSII centra otevřená). Parametr FV/FM je měřen na předem zatemněném vzorku a odráží možnou kvantovou účinnost PSII. Parametr FV/FM je využíván jako citlivý indikátor ovlivnění fotochemických procesů v PS II a dosahuje maximální hodnoty 0,83. Pokud je rostlina vystavena stresu, hodnoty jsou pak nižší, což například v případě radiačního stresu ukazuje na fenomén fotoinhibice.
II Kvantový výtěžek informuje o efektivitě přenosu absorbované excitační energie do lineárního elektronového transportu a poskytuje údaje o celkové fotosyntéze. Tento parametr je měřen na ozářeném vzorku a odráží aktuální efektivitu přenosu energie PSII a dalšími elektronovými přenašeči při určité ozářenosti. Jeho hodnota je vždy menší než FV/FM téhož vzorku.
NPQ Nefotochemické zhášení NPQ je indikátor ne-fotochemických procesů, zejména je přímo spjat s tepelnou disipací. Jakákoli změna v NPQ poukazuje na změnu v účinnosti tepelné disipace. NPQ pro výpočet nevyžaduje měření F0 nebo F0’. Obecně lze říci, že existuje korelace mezi energetickou disipací měřenou jako NPQ a množstvím zeaxanthinu, což bylo potvrzeno mnoha autory na vyšších rostlinách (Demmig-Adams et Adams 1996, Gilmore 1997), zelených řasách (Masojídek et al. 2004) a lišejnících (MacKenzie et al. 2002).
Zkratka Definice Reference
FV/FM (FM-F0)/FM Genty et al. 1989
II (FM’-FS)/FM’ Genty et al. 1989
NPQ (FM-FM’)/ FM’ Bilger et Björkman 1990
39 Tab. 5: Měřené fluorescenční parametry a koeficienty, jejich definice a reference
F0 = minimální fluorescence chlorofylu předzatemnělého vzorku; FM = maximální fluorescence chlorofylu předzatemnělého vzorku indukovaná saturačním pulsem; FS = ustálený stav fluorescence chlorofylu na světlo adaptovaného vzorku; FM’ = maximální fluorescence chlorofylu na světlo adaptovaného vzorku indukovaná saturačním pulsem.
3.5. Stanovení obsahu chlorofylů a karotenoidů Stélky byly po ukončení experimentu odebrány z kultivátoru a uloženy do papírových sáčků a zamraženy v tekutém dusíku. Následně byly stélky příslušných variant rozemlety na kuličkovém mlýnku na jemnou frakci (MM 2000, Retsch, Haan Německo). Poté bylo z příslušné varianty do mikrozkumavky naváženo 0,5 g vzorku.
Poté jsme přidali na špičku nože MgCO3 a 1 ml DMSO. Následně byly mikrozkumavky uloženy do sušárny při 70 °C na dobu jedné hodiny. Po hodině v sušárně byly vzorky ponechány zchladnout na vzduchu při laboratorní teplotě a centrifugovány při 3500 otáček/min. Po centrifugaci byl supernatant přenesen do nové mikrozkumavky a centrifugován při 10 000 otáček/min. Pro spektrofotometrické stanovení obsahu chlorofylu (ChlA, ChlB, ChlTotal a karotenoidy) byly vzorky 4násobně zředěny DMSO, pro dosažení nižší optické hustoty. Poté byly vzorky pipetovány do kyvet a měřeny na spektrofotometru (Specord 205, AnalyticJena, Jena Německo). Jako kontrolní vzorek byla použita kyveta s roztokem DMSO. Vzorky byly měřeny při 4 vlnových délkách 480, 649, 665 a 750 nm (Wellburn et al. 1994)
Vzorce převzaty Wellburn et al 1994
Chl A (12,19 A665 ) (3,45 A649 )
Chl B (21,99 A649 ) (5,32 A665 )
Chl Total (1000 A480 2,14 Chl A 70,16 Chl b ) / 220 (všechno v g/g, pro rozpouštědlo DMSO, dimethylsulfoxid)
40 3.6. Stanovení obsahu polyolů Stanovení obsahu ribitolu, manitolu a arabitolu byl vyhodnocen jako část NSSs (Nonstructual saccharides). Po ukončení experimentu byly vzorky hluboce zamraženy v kapalném dusíku a následně lyofylizovány (vysoušeny mrazem). Analýza byla provedena v laboratoři dr. H. Lipavské v Praze podle metodiky publikované Vojtíšková et al. 2006a, b, modifikované pro lišejníky (Lipavská, dosud nepublikováno). Polyoly byly extrahovány v 80% ethanolu (po dobu 15 minut, při 75 °C). Rozpouštědlo se odpařilo (SpeedVac) a zbytek byl rozpuštěn v MILI-Q ve velmi čisté vodě (Millipore, Bedford, MA;10 min, ultrazvuková vodní vana). Vzorky byly centrifugovány (14 000 G po dobu 10 min) a supernatant filtrován přes membránový filtr (Millipore, 0,45 m/13 mm). Až do analýzy byly vzorky umístěny do mrazicí lednice (–20 °C), aby se předešlo změnám. Analýza byla provedena pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie (HPLC) s refraktometrickou detekcí (Spectra Physics; refractometer Shodex RI-71; integrátor ChromJet; předkolona Hema-Bio 1000 Q + SB, kolona IEX Pb forma (Watrex, Česká republika), eluent ultrapure Mili-Q voda (Millipore; isokratické čerpadlo (Spectra Phycisc); rychlost toku 0,5 ml.min-1; teplota 80 °C; objem vzorku 10 l. Takto stanovené obsahy polyolů u jednotlivých vzorků byly následně vztaženy na jejich suchou hmotnost.
41 4. Výsledky Do kapitoly Výsledky byly z námi měřených keříčkovitých druhů lišejníků vybrány dva druhy: C. islandica a F. nivalis. Důvodem byla jednoznačnost výsledků u těchto dvou druhů. U dalších dvou námi měřených keříčkovitých druhů lišejníků C. delisei a Peltigera sp. bude potřeba detailnější analýzy, případně provedení dalších doplňkových měření. Abychom mohli porovnat výsledky měření fluorescenčních parametrů u keříčkovitých druhů lišejníků (C. islandica a F. nivalis) s dříve měřeným lupenitým lišejníkem (X. somloensis), zařadili jsme do kapitoly Výsledky pouze hodnoty pro kontrolu, 32mM a 50mM koncentraci ribitolu. U keříčkovitých druhů lišejníků jsou naměřené hodnoty fluorescenčních parametrů prezentovány integrálně za celou stélku. Všechny námi zjištěné výsledky budou po ukončení doplňkových experimentů součástí připravované publikace, na níž se budu spoluautorsky podílet.
4.1. Xanthoparmelia somloensis
4.1.1. FV/FM
Při měření kapacity fotochemických procesů v PS II - FV/FM (Graf č. 1), byly během expozice (0. – 6. den) zjištěny výrazně nižší hodnoty za nejnižší teploty expozice (–5 °C; 0,141) než za teploty (0 °C; 0,180). Při teplotě 0 °C nebyly zjištěny rozdíly v hodnotách FV/FM. Především za teploty (0 °C) byl zaznamenán postupný pokles kapacity fotochemických procesů v PS II v průběhu expozice (0. – 6. den). Po aplikaci ribitolu bylo zaznamenáno pozitivní ovlivnění hodnoty parametru FV/FM pouze při teplotě –5 °C. Za této teploty byly po aplikaci 32mM koncentrace ribitolu zjištěny významně vyšší hodnoty FV/FM (0,242) než u kontroly (0,141). Naproti tomu, při dávce 50mM koncentrace ribitolu, byly hodnoty parametru významně nižší (0,070). Za nemrazových teplot (0 °C a 5 °C) nebyl zjištěn výraznější vliv aplikace ribitolu v použitých koncentracích na hodnoty kapacity fotochemických procesů v PS II.
4.1.2. II Hodnoty kvantového výtěžku fotochemických procesů v PS II – II se s klesající expoziční teplotou snižují (Graf č. 1). Nejvyšší hodnoty II byly naměřeny za teploty 0 °C a nejnižší při teplotě –5 °C. Za teploty (0 °C) byl v průběhu expozice (0. – 5. den) zaznamenán postupný dvoutřetinový pokles parametru II. Zatímco při teplotě –5 °C se hodnoty II po počátečním poklesu v průběhu další expozice neměnily.
42 Při teplotě expozice –5 °C byl zjištěn po přidání ribitolu v koncentraci 32mM významný nárůst hodnot kvantového výtěžku (dvojnásobný oproti kontrole). Zatímco v koncentraci 50mM ribitolu se hodnoty II o jednu třetinu snížily. Za teploty 0 °C však aplikace ribitolu v obou použitých koncentracích znamenal mírný nárůst hodnot II.
4.1.3. NPQ Významné změny NPQ po aplikaci ribitolu byly zaznamenány jen při teplotě –5°C (Graf č. 1). Při expozici 32mM koncentrace ribitolu (v teplotě –5 °C) nebyly zjištěny výrazné změny NPQ oproti kontrole. Naproti tomu, při ovlivnění 50mM koncentrace ribitolu, bylo zaznamenáno výrazné zvýšení hodnot NPQ (3,5krát, 1. den), navíc, v průběhu expozice došlo k dalšímu zvýšení hodnot NPQ (2,5krát, 1. – 6. den expozice).
4.2. Cetraria islandica
4.2.1. FV/FM Po aplikaci ribitolu bylo zaznamenáno pozitivní ovlivnění hodnoty parametru
FV/FM oproti kontrole u všech tří experimentálních teplot (0 °C, –10 °C, –15 °C). Ve všech těchto teplotách došlo při aplikaci 50mM koncentrace ribitolu k mírnému nárůstu hodnot FV/FM oproti kontrole. Nejvýrazněji při teplotě 0 °C (o 30%), při teplotě –10 °C (o 19%) a při –15 °C (o 4%). Při aplikaci 32mM koncentrace ribitolu došlo k nárůstu hodnot FV/FM vůči kontrole pouze za teploty –10 °C (o 13%). Naproti tomu, v teplotách
–15 °C a 0 °C při dávce 32mM koncentrace ribitolu, byly hodnoty parametru FV/FM oproti kontrolnímu vzorku nižší (o 9%, respektive o 20%).
4.2.2. II
U parametru II byl po aplikaci ribitolu zaznamenán podobný trend jako u parametru FV/FM. Po aplikaci 50mM koncentrace ribitolu došlo u všech tří experimentálních teplot (0 °C, –10 °C, –15 °C) k mírnému nárůstu hodnot II oproti kontrole. Nejvýrazněji při teplotách 0 °C a –10 °C (shodně o 20%). Při teplotě –15 °C došlo jen k nepatrnému nárůstu (o 3%). Při aplikaci 32mM koncentrace ribitolu došlo k nárůstu hodnot II vůči kontrole pouze za teploty –10 °C (o 15%). Naproti tomu, v teplotách –15 °C a 0 °C při 32mM koncentraci ribitolu, byly hodnoty parametru II oproti kontrolnímu vzorku nižší (o 10%, respektive o 19%).
43 4.2.3. NPQ
Po aplikaci 50mM koncentrace ribitolu došlo u dvou experimentálních teplot (– 10 °C, –15 °C) k mírnému nárůstu hodnot NPQ oproti kontrole (o 41%, respektive o 6%). Naproti tomu, při teplotě 0 °C došlo ke snížení hodnoty NPQ oproti kontrole (o 46%). Při aplikaci 32mM koncentrace ribitolu došlo k nárůstu hodnot NPQ vůči kontrole pouze za teploty –10 °C (o 25%). Naproti tomu, v teplotách –15 °C a 0 °C při
32mM koncentraci ribitolu, byly hodnoty parametru II oproti kontrole nižší (o 16%, respektive o 28%).
4.3. Flavocetraria nivalis
4.3.1. FV/FM
Prokazatelný pozitivní vliv externě dodaného ribitolu na zvýšení hodnot FV/FM oproti kontrole byl zjištěn pouze za teploty 0 °C. Účinek na hodnoty FV/FM byl patrný jak u 32mM tak i u 50mM koncentrace ribitolu, výraznější však byl při 50mM koncentraci ribitolu (zvýšení o 31% oproti kontrole). Za mrazových teplot (–10 °C a –15 °C) nebyly zjištěny významné rozdíly v hodnotách FV/FM.
4.3.2. II
Za teploty –15 °C nebyly zjištěny rozdíly v hodnotách II . Při teplotě –10 °C došlo k mírnému poklesu u 50mM koncentrace ribitolu oproti kontrole (o 10%). Naopak došlo k mírnému nárůstu u 32mM koncetrace ribitolu oproti kontrole (o 2%). Za teploty
0 °C došlo k mírnému nárůstu hodnot II u 50mM koncentrace ribitolu oproti kontrole (o 11%). U 32mM koncentrace ribitolu nebyl zjištěn významný rozdíl oproti kontrole.
44 4.3.3. NPQ
Za všech tří experimentálních teplot nebyly zjištěny rozdíly v hodnotách NPQ u obou experimentálních koncentrací ribitolu (32mM, 50mM) ve srovnání s kontrolou.
4.4. Obsah chlorofylů a karotenoidů
V obsahu chlorofylu a (Chla), chlorofylu b (Chlb) a celkových karotenoidů (Cx+c) ve stélkách studovaného lišejníku Xanthoparmelia somloensis nebyly zjištěny výrazné rozdíly mezi jednotlivými variantami. Na výsledcích lišejníků Cetraria islandica a Flavocetraria nivalis se intenzivně pracuje a budou součástí připravované publikace.
4.5. Obsah polyolů Analýza obsahu ribitolu, manitolu a arabitolu a ostatních NSS (Nonstructual saccharides) byla provedena v laboratoři dr. Lipavské (PřF UK, Praha). Data lišejníku Xanthoparmelia somloensis jsou k dispozici v kapitole Přirozené množství polyolů a data ostatních čtyř experimentálních druhů jsou v současné době zpracovávána a budou součástí připravované publikace, na které se budu podílet jako spoluautor.
45
Graf č. 1: Dynamika kapacity fotochemických procesů ve PS II (FV/FM), dynamika kvantového výtěžku fotochemických procesů ve PS II ( II) a dynamika nefotochemického zhášení fluorescence chlorofylu (NPQ) za 2 experimentálních teplot (–5 °C, 0 °C), u stélek lišejníků Xanthoparmelia somloensis, v kontrole ( ), 32mM koncentraci ribitolu ( ), 50mM koncentraci ribitolu ( ). Body grafu jsou průměrem z 6 opakování směrodatná odchylka.
46
47
48
Graf č. 4: Vliv heterogenity fotosyntetických procesů v různých částech stélky na hodnoty fluorescenčních parametrů FV/FM a II u lišejníků druhu Cetraria islandica a Flavocetraria nivalis.
49 5. Diskuze
Přímý vliv ribitolu na zvýšení hodnot parametrů indukované fluorescence chlorofylu FV/FM, II a NPQ byl prokazatelný u lišejníku Xanthoparmelia somloensis (Gyelnik) Hale při koncentraci 32mM pouze za teploty – 5 °C. U lišejníku Cetraria islandica byl přímý vliv prokazatelný za všech tří experimentálních teplot, tedy: 0 °C, –10 °C a –15 °C. U lišejníku Flavocetraria nivalis byl prokazatelný vliv pouze na zvýšení hodnot parametrů FV/FM a II, a to pouze za teploty 0 °C. Přestože je lišejník Xanthoparmelia somloensis (Gyelnik) Hale lupenitým typem lišejníkové stélky a Cetraria islandica je typem keříčkovitým, jejich přímý vliv na zvýšení hodnot parametrů indukované fluorescence chlorofylu je podobný. Je tedy pravděpodobné, že typ stélky (lupenitý versus keříčkovitý) nemá vliv na přímý účinek externě dodaného ribitolu na fotosyntetické procesy. Naproti tomu u druhu lišejníku Flavocetraria nivalis, i když jde o keříčkovitý lišejník, je přímý vliv externě dodaného ribitolu pouze u FV/FM a výrazný vliv je zřejmý jen při teplotě 0 °C. Ve srovnání s X. somloensis a C. islandica, nebyl tedy zaznamenán žádný efekt ribitolu u F. nivalis v teplotě -5 oC. Příčina tohoto jevu je neznámá. Lze se však domnívat, že při vyšším počtu opakování by se snížila variabilita hodnot u FV/FM a II zjištěná u F. nivalis za nízkých teplot a vliv ribitolu by pak byl u tohoto druhu lišejníku prokazatelný i za mrazových teplot –10 °C a –15 °C. Všeobecně lze říci, že tento experiment potvrdil předpoklad o pozitivním účinku externě dodaného ribitolu na fotosyntetické procesy lišejníků s řasovým fotobiontem, který byl testován v dřívějším experimentu zahrnutého do bakalářské práce (Smejkal 2008). Tento výsledek je obdobný jako v odborných studiích zaměřených na vliv externě dodaného ribitolu (Hájek et al. 2009a, b). Jako podpůrný argument pozitivního účinku ribitolu na fyziologické procesy lišejníků lze uvést práci Fontaniella et al. (2000). Ve své studii referuje o vlivu externě dodaného ribitolu do stélky druhu Evernia prunastri na snížení aktivity mRNázy za mrazových teplot. Podobně také Hájek et al. (2009c) uvádí, že přídavek ribitolu ovlivňuje potenciální kapacitu fotochemických procesů v PSII (FV/FM) za mrazových teplot. Lze tedy konstatovat, že údaje zjištěné v rámci diplomové práce pro C. islandica a F. nivalis, korespondují s poznatky obdobných studií na jiných druzích lišejníků. Teplotní účinek expoziční teploty na zvýšení hodnot NPQ je zřejmý u všech zkoumaných druhů lišejníků – potvrdil se vliv zejména extrémní mrazové teploty (-15
50 oC). Znamená to, že lišejníky sesbírané ve Skandinávii (konkrétně Norsko – Aas) jsou teplotně aklimovány na nižší teploty, neboť při 0 °C vykazují nárůst NPQ, což naznačuje působení stresu ve fotosystému II vyvolaného neoptimální teplotou. Podobný trend, tj. nárůst NPQ zaznamenaný pro lišejník Xanthoparmelia somloensis (Gyelnik) Hale za teploty 5 °C (data zde neuvedena) indikuje, že pro tento lišejník byla teplota 5 oC rovněž mimo optimum. Nárůst NPQ je jak u vyšších rostlin (Demmig-Adams et al. 2006, Brugnoli et al. 1994), tak i u lišejníků (Hájek et al. 2009a), považován za indikátor působení stresu ve fotosyntetickém aparátu chloroplastu, respektive součástí elektronového lineárního transportního řetězce. Částečná inhibice fotosyntetických procesů v PSII způsobená stresem je doprovázena zvýšením hodnot NPQ. Na základě porovnání zjištěných hodnot NPQ lze vysledovat rozdílný trend u polárních lišejníků oproti těm sbíraným v oblastech temperátní zóny Evropy. U C. islandica a F. nivalis tedy zvýšení expozičních teplot nad 0 oC zvyšuje NPQ, zatímco u temperátních lišejníků, které nejsou adaptovány na nízké teploty (Lasallia postulata) se NPQ v nadnulových fyziologických teplotách snižuje (Hájek et al. 2009b).
Teplotní účinek týdenní expozice na hodnoty FV/FM a II se u studovaných druhů sbíraných v Norsku neprojevil. Lze to vysvětlit tím, že zvolený teplotní interval (0 °C až –15 °C) zahrnoval optimální teploty pro Flavocetraria nivalis a Cetraria islandica, zatímco u Xanthoparmelia somloensis (Gyelnik) Hale byly mrazové teploty již suboptimální, což se projevilo poklesem hodnot FV/FM a II při teplotě –5 °C. Tento jev je obvyklý u lišejníků, které nejsou přivyklé (neaklimované) mrazovým teplotám. Obdobně jako ukazují výsledky této diplomového práce, u lišejníků aklimovaných na mrazové teploty se hodnoty FV/FM v mrazových teplotách nemění, nebo jen nepatrně klesají. Tento efekt byl popsán ve studii Hájek et al. (2001). Vliv heterogenity fotosyntetických procesů uvnitř stélek studovaných druhů lišejníků může mít dopady na zjištěné hodnoty fotosyntetických parametrů indukované fluorescence chlorofylu. Keříčkovitá stélka je složitý třírozměrný objekt, u něhož nelze vyloučit takzvaný geometrický efekt. Jde o skutečnost, že jak běžné záření (v technice fluorescence chlorofylu nazývané aktinické), tak saturační světelný puls, pronikají díky složité struktuře do jednotlivých částí stélky nerovnoměrně, a tím dochází i k nerovnoměrné excitaci molekul chlorofylu v buňkách fotobionta. Příčina tohoto jevu je jak v komplexnosti prostorového uspořádání stélky, které způsobuje samostínění (anglicky self shading), tak v nerovnoměrném umístění absorpčních látek v rámci stélky. Zatímco horní části stélek bývají zpravidla velmi tmavě pigmentované
51 specifickými látkami, zejména sekundárními metabolity houbového partnera, střední a dolní část stélky je naopak světlejší. Celkově lze tedy z výše uvedených důvodů předpokládat nerovnoměrnou ozářenost jednotlivých partií keříčkovitého typu stélky a z toho vyplývající nerovnoměrnou absorpci fotosynteticky aktivního záření a vnitrostélkovou heterogenitu fotosyntetických procesů. Vliv heterogenity fotosyntetických procesů na hodnoty fluorescenčních parametrů lze u lišejníků studovaných v této diplomové práci doložit, jestliže vyhodnocujeme jednotlivé partie keříčkovitých stélek měřené metodou zobrazení fluorescence chlorofylu (anglicky chlorophyll fluorescence imaging) odděleně. Je zřejmé, že horní části stélek mají hodnoty FV/FM a II nižší, než střední části (viz. Graf č. 4). Heterogenita fotosyntetických procesů u lišejníků je popsána u foliózních druhů lišejníků a může mít nejrůznější příčiny: Nekonstantní obsah vody ve stélce (Barták et al. 2000), anatomické charakteristiky stélky (Jensen et Siebke 1997), ochranu před ozářením, způsobenou hydratačními pohyby stélek (Barták et al. 2006). Z těchto důvodů bylo vyhodnocení fluorescenčních parametrů Xanthoparmelia somloensis (Gyelnik) Hale, Flavocetraria nivalis a Cetraria islandica uskutečněno na celých stélkách tak, aby výsledné hodnoty fluorescenčních parametrů indukované fluorescence chlorofylu byly integrální, jak je typické pro celé stélky lišejníků.
52 6. Závěr První částí mé diplomové práce je zpracování literární rešerše. Jejími hlavními body jsou mechanismy odolnosti lišejníků vůči nízkým a mrazovým teplotám a rozšíření poznatků o polyolech, kterými jsem se zabýval v mé bakalářské práci. Důležitou součástí je vypracování přehledné tabulky přirozených obsahů polyolů u různých druhů lišejníků. Druhou částí pak je experimentální práce, kde se zabývám vlivem externě dodaného ribitolu na primární procesy fotosyntézy pomocí měření parametrů indukované fluorescence chlorofylu in vivo a snažím se potvrdit či vyvrátit předpokládanou účinnou koncentraci ribitolu, která pomáhá lišejníkům udržet fotosyntetické procesy aktivní i v mrazových teplotách. Prvním zjištěním je, že externě dodaný ribitol má pozitivní vliv na primární procesy fotosyntézy u lišejníků druhu Cetraria islandica a Flavocetraria nivalis. U lišejníku Cetraria islandica je přímý vliv prokazatelný za všech tří experimentálních teplot, tedy: 0 °C, –10 °C a –15 °C. Naproti tomu u lišejníku Flavocetraria nivalis byl prokazatelný vliv pouze na zvýšení hodnot parametrů FV/FM a II, a to pouze za teploty 0 °C. Po srovnání všech tří lišejníků pak z toho vyplývá, že přímý vliv externě dodávaného ribitolu je podobný u lišejníků Xanthoparmelia somloensis (Gyelnik) Hale a Cetraria islandica, ale u druhu Flavocetraria nivalis je přímý vliv prokázán pouze u
FV/FM a jediné teploty, a to 0 °C. Jedním z cílů bylo najít efektivní koncentraci ribitolu v mechanismech odolnosti experimentálních druhů lišejníků vůči nízkým teplotám. Z výsledků experimentální práce publikované v mé bakalářské práci u druhu lišejníku Xanthoparmelia somloensis (Gyelnik) Hale se 32mM koncentrace jevila jako efektivní. Z výsledků dvou experimentálních druhů Cetraria islandica a Flavocetraria nivalis však nelze tuto hypotézu potvrdit. Z grafů je patrné, že tato koncentrace nevykazuje pozitivní vliv na primární procesy fotosyntézy a její úlohu spíše přebírá 50mM koncentrace. Hledání a potvrzení efektivní koncentrace externě dodaného ribitolu v mechanismech odolnosti lišejníků si však vyžádá ještě hlubší zkoumání a řadu dalších experimentů. Bude to však nesmírně těžké, protože v těchto procesech hrají důležitou roli různé chemické a fyzikální faktory (pH, transport vody, sluneční energie, transport živin). Nedílnou součástí je také fyziologický stav studovaných lišejníků.
53 Teplotní účinek na zvýšení hodnot NPQ se projevil u všech zkoumaných druhů lišejníků. Lišejníky Cetraria islandica a Flavocetraria nivalis vykazují nárůst při 0 °C, lišejník Xanthoparmelia somloensis (Gyelnik) Hale při 5 °C. Teplotní účinek týdenní expozice na hodnoty FV/FM a II se u studovaných druhů sbíraných v Norsku neprojevil. Může to být způsobeno tím, že oba lišejníky sesbírané v Norsku jsou teplotně aklimovány na nižší teploty. Naproti tomu lišejník Xanthoparmelia somloensis (Gyelnik) Hale byl sesbírán v okolí Brna, a tak není teplotně aklimován na nižší teploty. Tento fakt se projevil poklesem hodnot parametrů indukované fluorescence chlorofylu
FV/FM a II při teplotě –5 °C. Podobný efekt popsal ve své studii Hájek et al. 2001. Vliv heterogenity fotosyntetických procesů uvnitř stélek studovaných druhů lišejníků může mít dopady na zjištěné hodnoty fotosyntetických parametrů indukované fluorescence chlorofylu. Keříčkovitá stélka je velmi složitý objekt. U takového typu stélky dochází k nerovnoměrnému rozložení dopadajícího slunečního záření. Je to způsobeno tím, že horní část stélek je tmavěji pigmentována než spodní nebo střední
část. Hodnoty parametrů indukované fluorescence chlorofylu FV/FM a II jsou tak v horní části stélky nižší, než ve střední části.
54 7. Seznam citované literatury
Adamson E., Seppelt R. D. (1990): A comparison of airborne alkaline pollution damage in selected lichen and mosses at Casey Station, Wilkes Land, Antarctica. In Guy K. R., Hempel G. (eds.) Antarctic ecosystems: ecological change and conservation. Proceedings of 4th SCAR Biology Symposium. Berlin: Springer Verlag: 347-353.
Ahdam I., Larher F., Stewart G. R. (1979): Sorbitol, a compatible osmotic solute in Plantago maritima. New Phytologist, 82: 671-678.
Armstrong R. A., Smith S. N. (1994): The levels of ribitol, arabitol and mannitol in individual lobes of the lichen Parmelia conspersa (Ehrh ex Ach) Ach. Environmental and Experimental Botany, 34: 253-260.
Aubert S., Juge Ch., Boisson A-M., Gout E., Bligny R. (2007): Metabolic processes sustaining the reviviscence of lichen Xanthoria elegans (Link) in high mountain environments. Planta, 226: 1287-1297.
Barták M., Hájek J., Gloser J. (2000): Heterogeneity of chlorophyll fluorescence over thalli of several foliose macrolichens exposed to adverse environmental factors: Interspecific differences as related to thallus hydration and high irradiance. Photosynthetica, 38 (4): 531-537.
Barták M., Solhaug K. A., Vráblíková H., Gauslaa Y. (2006): Curling during desiccation protects the foliose lichen Lobaria pulmonaria against photoinhibition. Oecologia, 149: 553-560.
Bednar T. W., Smith D. C. (1965): Studies in the physiology of lichens. VI. – Preliminary studies of photosynthesis and carbohydrate metabolism of the lichen Xanthoria aureola. New Phytologist, 65: 211-220.
Bellaloui N., Brown P. H., Dandekar A. M. (1999): Manipulation of in vivo sorbitol production alters boron uptake and transport in tobacco. Plant Physiology, 119: 735- 741.
Benson E. E., Harding K., Day J. G. (2007): Algae at extreme low temperatures: The Cryobank. In: J. Seckbach (ed.): Algae and cyanobacteria in extreme environments. Springer, 365-383 pp.
Bilger W., Björkman O. (1990): Role of the xanthophyll cycle in photoprotection elucidated by measurements of light-induced absorbance changes, fluorescence and photosynthesis in leaves of Hedera canariensis. Photosynthesis Research, 25: 173-185.
Bohnert H. J., Jensen R. G. (1996): Strategies for engineering water stress tolerance in plants. Trends in Biotechnology, 14: 89-97.
Brodo I. M., Sharnoff S. D., Sharnoff S. (2001): Lichens of North America. Yale University Press, USA.
55 Brugnoli E., Cona A., Lauteri M. (1994): Xanthophyll cycle components and capacity for nonradiative energy-dissipation in sun and shade leaves of Ligustrum ovalifolium exposed to conditions limiting photosynthesis. Photosynthesis research, 41 (3): 451- 463.
Campbell N. A., Reece J. B. (2008): Biologie, Computer Press, a. s., Brno, 1332 stran.
Černohorský Z. (2000): Lišejníky rostou všude - jejich odolnost vůči nečistotám v prostředí je značně rozmanitá. Vesmír, 79: 629.
Dahlman L. (2003): Resource acquisition and allocation in Lichens. Disertační práce: 60 p.
Dahlman L., Persson J., Nasholm T., Palmqvist K. (2003): Carbon and nitrogen distribution in the green algal lichens Hypogymnia physodes and Platismatia glauca in relation to nutrient supply. Planta, 217: 41-48.
Dahlman L., Persson J., Palmqvist K., Näsholm T. (2004): Organic and inorganic nitrogen uptake in lichens. Planta, 219: 459–467.
Demmig-Adams B., Adams W. W. (1996): Xanthophyll cycle and light stress in nature: Uniform response to excess direct sunlight among higher plant species. Planta, 198: 460-470.
Demmig-Adams B., Ebbert V., Mellman D. L., Mueh K. E., Schaffer L., Funk Ch., Zarter C. R., Adamska I., Jansson S., Adams W. W. (2006): Modulation of PsbS and flexible vs sustained energy dissipation by light environment in different species. Physiologia Plantarum, 127: 670-680.
Drew E. A., Smith D. C. (1967): Studies in the physiology of lichens. VII. – The physiology of the Nostoc symbiont of Peltigera polydactyla compared with cultured and free-living forms. New Phytologist, 66: 379-388.
Dudley S. A., Lechowicz M. J. (1987): Losses of polyol through leaching in Subarctic lichens. Plant Physiology, 83: 813-815.
Duman J. G., Olsen T. M. (1993): Thermal hysteresis protein activity in bacteria, fungi and phylogenetically diverse plants. Cryobiology, 30: 322-328.
Duman J. G., Wu D. W., Olsen T. M., Urrutia M., Tursman D. (1993): Thermal hysteresis proteins. Adv. Low Temp. Biol., 2: 131-182.
Elster J., Benson E. E. (2004): Life in the polar terrestrial environment: a focus on algae and cyanobactria, in B. Fuller, N. Lane and E. E. Benson (eds.). Life in the Frozen State. CRC Press, London, UK: 111-150.
Farrar J. F. (1976a): Ecological physiology of the lichen Hypogymnia physodes. New Phytologist, 77: 93-103.
56 Farrar J. F. (1976b): Ecological physiology of the lichen Hypogymnia physodes. II – Effects of wetting and drying cycles and the concept of „Physiological buffering“. New Phytologist, 77: 105-113.
Farrar J. F. (1976c): Ecological physiology of the lichen Hypogymnia physodes. III – The importance of the rewetting phase. New Phytologist, 77: 115-125.
Feige G. B., Jensen M. (1992): Basic carbon and nitrogen metabolism of lichens. In: W. Reisser (ed.) Algae and symbioses: plants, animals, fungi, viruses, interactions explored. Biopress Ltd., Bristol, England, 277-299 pp.
Fer A., Simier P., Arnaud M. C., Rey L., Renaudin S. (1993): Carbon acquisition and metabolism in a root hemiparasitic angiosperm, Thesium humile (Santalaceae) growing on wheat (Triticum vulgare). Aust. J. Plant Physiology, 20: 15-24.
Fernández E., Quilhot W., González I., Hidalgo M. E., Molina X., Meneses I. (1996): Lichen metabolites as UVB filters. Cosmetics Toiletries, 111: 69–74.
Fontaniella B., Vicente C., Legaz M. E. (2000): The cryoprotective role of polyols in lichens: Effects on the redistribution of RNAse in Evernia prunastri thallus during freezing. Plant Physiology and Biochemistry, 38: 621-627.
Galun M. (1988): Handbook of Lichenology, Vol. 3. Boca Raton, USA.
Gao Z., Loescher W. H. (2000): NADPH supply and mannitol biosynthesis. Characterization, cloning, and regulation of the non-reversible glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase in celery leaves. Plant Physiology, 124: 321-330.
Gauslaa Y., Solhaug K. A. (2001): Fungal melanins as a sunscreen for symbiotic green algae in the lichen Lobaria pulmonaria. Oecologia, 126: 462-471.
Genty B., Briantais J. M., Baker N. R. (1989): The relationship between quantum yield of photosynthetic electron transport and quenching of chlorophyll fluorescence. Biochimica et Biophysica Acta, 990: 87-92.
Gilmore A. M. (1997): Mechanistic aspects of xanthophyll cycle-dependent photoprotection in higher plant chloroplasts and leaves. Physiologia Plantarum, 99: 197-209.
Green G. A., Smith D. C. (1974): Lichen physiology. XIV. – Differences between lichen algae in symbiosis and in isolation. New Phytologist, 73: 753-766.
Grünert H., Grünertová R. (1995): Houby. Ikar, Praha.
Hájek J., Barták M., Gloser J. (2001): Effects of thallus temperature and hydration on photosynthetic parameters of Cetraria islandica from contrasting habitats. Photosynthetica, 39: 427-435.
Hájek J. (2002): Fotosyntetická odezva stélek lišejníků k dehydrataci a nízké teplotě detekovaná pomocí fluorescence chlorofylu. Disertační práce: 115 p.
57 Hájek J., Váczi P., Smejkal L., Barták M. (2007): Vliv externě aplikovaného ribitolu na primární procesy fotosyntézy lišejníku Xanthoparmelia somloensis (Gyelnik) Hale za nízkých teplot. In: Bulletin České společnosti experimentální biologie rostlin a Fyziologické sekce Slovenské botanické společnosti. Konference experimentální biologie rostlin: 11. dny fyziologie rostlin Olomouc 9-12.7.2007: 109-109 p.
Hájek J., Váczi P., Barták M., Smejkal L., Lipavská H. (2009a): Cryoprotective role of ribitol in Xanthoparmelia somloensis. Biologia Plantarum, 53: 677-684.
Hájek J., Váczi P., Barták M. (2009b): Photosynthetic electron transport at low temperatures in the green algal foliose lichens Lasallia pustulata and Umbilicaria hirsuta affected by manipulated levels of ribitol. Photosynthetica, 47: 199-205.
Hájek J., Barták M., Smejkal L., Váczi P. (2009c): Cryoproective effects of ribitol on lichen photosynthetic processes. In: M. Barták, J. Hájek, P. Váczi (eds.): Structure and Function of Antarctic Terrestrial Ecosystems. Book of Abstracts and Contributed Papers. Conference, Brno, October 22th-23th : 67-68.
Hajny G. J., Smith J. H., Garver J. C. (1964): Erythritol production by a yeastlike fungus. Applied Microbiology, 12: 240-246.
Hale M. E. (1973): Growth. In: V. Ahmadjian, M. E. Hale (eds.): The Lichens. London: Academic Press: 473-492.
Hale M. E. (1983): The bioiogy of lichens. 3rd edition. Baltimore: Edward Arnold: 190.
Hamada N., Okazaki K., Shinozaki M. (1994): Accumulation of monosaccharides in lichen mycobionts cultured under osmotic conditions. The Bryologist, 97: 176-179.
Hill D. J., Ahmadjian V. (1972): Relationship between carbohydrate movement and the symbiosis in lichens with green algae. Planta, 103: 267-277.
Hincha D. K., Meins Jr. F., Schmitt J. M. (1997): β-1,3-Glukanase is cryoprotective in vitro and is accumulated in leaves during cold aclimation. Plant Physiology, 114: 1077-1083.
Holligan P. M., Drew E. A. (1971): Routine analysis by gas-liquid chromatography of soluble carbohydrates in extracts of plant tissues. New Phytologist, 70: 271-297.
Honegger R. (1991): Functional aspects of the lichen symbiosis. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 42: 553-578.
Hoshino T., Odaira M., Yoshida M., Tsuda S. (1999): Physiological and biochemical Significance of Antifreeze Substances in Plants. Journal of Plant Research, 112: 255- 261.
Hovenden M. J., Jackson A. E., Seppelt R. D. (1994): Field photosynthetic activity of lichens in the Windmill Islands oasis, Wilkes Land, continental Antarctica. Physiologia Plantarum, 90: 567-576.
58 Chang H-L., Chao G-R., Chen Ch-Ch., Mau J-L. (2001): Non-volatile taste components of Agaricus blazei, Antrodia camphorata and Cordyceps militaris. Food Chemistry, 74: 203-207.
Chapman B. E., Roser D. J., Seppelt R. D. (1994): 13C NMR analysis of Antarctic cryptogram extracts. Antarctic Science, 6: 295-305.
Ishitani M., Majumder A. L., Bornhouser A., Michalowski C. B., Jensen R. G., Bohnert H. J. (1996): Coordinate transcriptional induction of myo-inositol metabolism during environmental stress. Plant Journal, 9: 537-548.
Jacobs J. B., Ahmadjian V. (1971): The ultrastructure of lichens. New Phytologist, 70: 47-50.
Janská A., Zelenková S. (2005): Vliv chladu a mrazu na rostliny. Biologické listy, 70: 53-76.
Jensen M. J., Feige G. B., Waterkotte A. (1991): Mannitol-1-phosphate dehydrogenase in Psedovernia furfuracea. Lichenologist, 23: 187- 196.
Jensen M., Siebke K. (1997): Fluorescence imaging of lichens in the macroscale. Symbiosis, 23: 183-195.
Joosten M. H. A. J., Hendricks L. J. M., de Wit P. J. G. M. (1990): Carbohydrate composition of apoplastic fluids isolated from tomato leaves inoculated with virulent or avirulent races of Cladosporium fulvum. Neth. Journal of Plant Pathology, 96: 103-112.
Kacperska A. (1999): Plant responses to low temperature: signaling pathways involved in plant aclimation. In: R. Margesin, F. Schinner (eds.): Cold-adapted organisms – ecology, physiology, enzymology and molecular biology. S. 79. Springer-Verlag. Berlin, Heidelberg.
Kappen L. (1973): Responses to extreme environments. In: V. Ahmadjian, M. E. Hale (eds.): The Lichens. Academic Press, London, 311-380.
Kappen L. (1988): Ecophysiological relationships in different climatic regions. In: Galun M. (ed.): CRC Handbook of lichenology. Boca Raton: CRC Press: 37-100.
Kappen L., Breuer M. (1991): Ecological and physiological investigations in continental Antarctic cryptogams. II. Moisture relations and photosynthesis of lichens near Casey Station, Wilkes Land. - Antarctic Science, 3: 273-278.
Kappen L. (1993a): Lichens in the Antarctic region. In: E. I. Friedmann (ed.): Antarctic Microbiology. New York: Wiley-Liss: 433-490.
Kappen L. (1993b): Plant activity under snow and ice, with particular reference to lichens. Arctic, 46: 297-302.
Kappen L., Schroeter B., Hestmark G., Winkler J. B. (1996a): Field measurements of photosynthetis of umbilicarious lichens in winter. Botanica Acta, 109: 292-298.
59 Kappen L., Schroeter B., Scheidegger C., Sommerkorn M., Hestmark G. (1996b): Cold resistance and metabolic activity of lichens below 0 °C. Advances in Space Research, 18: 119-128.
Kieft T. L. (1988): Ice nucleation activity in lichens. Applied and Environmental Microbiology, 54: 1678-1681.
Kieft T. L., Ahmadjian V. (1989): Biological ice nucleation activity in lichen mycobionts and photobionts. Lichenologist, 21: 355-362.
Kieft T., Ruscetti T. (1990): Characterization of biological ice nuclei from a lichen. Journal of Bacteriology, 172: 3519-3523.
Kieft T. L., Ruscetti T. (1992): Molecular sizes of lichen ice nucleation sites determined by gamma radiation inactivation analysis. Cryobiology, 29: 407-413.
Kosová K., Tichá I. (2005): Vliv chladu na fotosyntetické procesy a ochranné mechanismy u rostlin. Biologické listy, 70: 107-128.
Kremer B. P., Muhle M. (1997): Lišejníky, mechorosty, kapraďorosty. Knižní klub, Ikar, Praha, 286 p.
Krsek D. (2006): Úloha sacharidů při abiotickém stresu. Bakalářská práce: 28 p.
Lange O. L., Bertsch A. (1965): Photosynthese der Wűstenflechte Ramalina maciformis nach Wasserdampfaufnahme aus dem Luftraum. Naturwissenschaften, 52: 215-216.
Lange O. L., Kappen L. (1972): Photosynthesis of lichens from Antarctica. In: Llano G. A. (ed.).: Antarctic Terrestrial Biology. Antarctic Research Series, American Geophysical Union, Washington D.C., 20: 83-96.
Lange O. L., Green T. G. A., Heber U. (2001): Hydration-dependent photosynthetic production of lichens : what do laboratory studies tell us about field performance? Journal of Experimental Botany, 52, 363: 2033-2042.
Larson D. W. (1983): Environmental stress and Umbilicaria lichens: the effect of subzero temperature pretreatment. Oecologia, 55: 268-278.
Lewis D. H., Smith D. C. (1967): Sugar alcohols (polyols) in fungi and green plants. New Phytologist, 66: 143-184.
Lines C. E. M., Ratcliffe R. G., Rees T. A. V., Southon T. E. (1989): A 13C NMR study of photosynthate transport and metabolism in the lichen Xantoria calicicola Oxner. Oxner. New Phytologist, 111: 447-456.
60 MacFarlane J. D., Kershaw K. A. (1982): Physiological-environmental interactions in lichens. XIV. – The environmental control of glucose movement from alga to fungus in Peltigera polydactyla, Peltigera rufescens and Collema furfuraceum. New Phytologist, 91: 93-101.
Mackenzie T. D. B., Krol M., Huner N. P. A., Campbell D. A. (2002): Seasonal changes in chlorophyll fluorescence quenching and the induction and capacity of the photoprotective xanthophyll cycle in Lobaria pulmonaria. Canadian Journal of Botany- Revue Canadienne De Botanique, 80: 255-261.
Masojídek J., Kopecký J., Koblížek M., Torzillo G. (2004): The xanthophyll cycle in green algae (Chlorophyta): Its role in the photosynthetic apparatus. Plant Biology, 6: 342-349.
Matsuda T. (1968): Ecological study of the moss community and microorganisms in the vicinity of Syowa Station, Antarctica. Japanese Antarctic Research Expedition Scientific Reports, 29: 1-58.
McKersie B. D., Leshem Y. Y. (1994): Stress and stress coping in cultivated plants. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 256 pp.
Moing A., Carbonne F., Rashad M. H., Gaudillére J. P. (1992): Carbon fluxes in mature peach leaves. Plant Physiology, 100: 1878-1884.
Nash T. H. (1996): Photosynthesis, respiration, productivity and growth. In: Lichen Biology, 88-120 pp.
Negm F. B., Marlow G. C. (1985): Partial purification and characterization of D- Ribose-5-phosphate reductase from Adonis vernalis (L.) leaves. Plant Physiology, 78: 758-761.
Němcová L. (2006): Fylogeneze a systém nižších rostlin. Univerzita Jana Evangelisty Purkyně, Přírodovědecká fakulta, katedra biologie, Ústí nad Labem. PowerPointová prezentace
Neven L. G., Haskell D. W., Hofig A., Li Q. B., Guy G. L. (1993): Characterization of spinach gene responsive to low temperature and water stress. Plant and Molecular Biology, 21: 291-305.
Nilsen E. T., Orcutt D. M. (1996): Physiology of plants under stress – Abiotic factors. John Wiley & Sons. New York, 704 pp.
Oliveira G. G., Dahlman L., Palmqvist K., Martins-Loucao M. A., Máguas M. (2005): Nitrogen uptake in relation to excess supply and its effects on the lichens Evernia prunastri (L.) Ach and Xanthoria parietina (L.) Th. Fr.. Planta, 220: 794–803.
Palmqvist K. (2000): Carbon economy in lichens. New Phytologist, 148: 11-36.
61 Pharr D. M., Stoop J. M. H., Williamson J. D., Feusi M. E. S., Nassel M. O., Conkling M. A. (1995): The dual role of mannitol as osmoprotectant and photoassimilate in celery. HortScience, 30: 1182-1188.
Pokorná J. (2002): Vliv chladu na aktinový cytoskelet buněčné linie tabáku BY-2 (Nicotiana tabacum L.). Diplomová práce. Přírodovědecká fakulty Univerzity Karlovy, Katedra fyziologie rostlin, Praha.
Pueyo G. (1960): Recherches sur la nature et l´évolution des glucides solubles chez quelques lichens du bassin Parisien. Année biol., 36: 117.
Reaney M. J. T., Gusta L. V. (1999): Modeling sequential responses of plant cells to freezing and thawing. In: R. Margesin, F. Schinner (eds.): Cold-adapted organisms – ecology, physiology, enzymology and molecular biology. S. 119. Springer-Verlag. Berlin, Heidelberg.
Richardson D. H. S., Hill D. J., Smith D. C. (1968): Lichen physiology. XI. - The role of the alga in determining the pattern of carbohydrate movement between lichen symbionts. New Phytologist, 67: 469-486.
Roser D. J., Melick D. R., Ling H. U., Seppelt R. D. (1992a): Polyol and sugar content of terrestrial plants from continental Antarctica. Antarctic Science, 4: 413-420.
Roser D. J., Melick D. R., Seppelt R. D. (1992b): Reductions in the polyhydric alcohol content of lichens as an indicator of environmental pollution. Antarctic Science, 4: 185-188.
Shen B., Jensen R. G., Bohnert H. J. (1997): Increased resistance to oxidative stress in transgenic plants by targeting mannitol biosynthesis to chloroplast. Plant Physiology, 113: 1177-1183.
Schroeter B., Green T. G. A., Kappen L., Seppelt R. D. (1994): Carbon dioxide exchange at subzero temperatures. Field measurements on Umbilicaria aprina in Antarctica. Cryptogamic Botany, 4: 233-241.
Schroeter B., Kappen L., Green T. G. A., Seppelt R. D. (1997): Lichens and the Antarctic environment: Effects of temperature and water availability on photosynthesis. In: W. B. Lyons, C. Howard-Williams, I. Hawes (eds.): Ecosystem processes in Arctic icefree landscapes. Rotterdam, Balkema, 103-117 pp.
Schulz M. (1995): Protein and ubiquitin conjugate patterns of Peltigera horizontalis during desiccation and rehydration. In: F. J. A. Daniels, M. Schulz and J. Peine, Editors, Flechten Follmann, Koeltz Scientific Books, Koeningstein, 87–96 pp.
Smejkal L. (2008): Role polyolů v rezistenci lišejníků vůči mrazu. Bakalářská práce: 43 p.
62 Smejkal L., Hájek J., Barták M. (2009): Vliv nízkých teplot na základní fyziologické funkce lišejníků: role ribitolu v odolnosti lišejníků vůči mrazu. In: K. Láska (ed.): Současné trendy v bioklimatologii a ekologické fyziologii rostlin. Sborník příspěvků. Seminář věnovaný výzkumu prostředí přírodních i člověkem pozměněných ekosystémů, aplikací v zemědělské a lesnické praxi, 11. prosince 2009, PřF MU.: 8-11 pp.
Smirnoff N., Cumbes Q. J. (1989): Hydroxyl radical scavenging activity of compatible solutes. Phytochemistry, 28: 1057-1060
Solhaug K. A., Gauslaa Y., Nybakken L., Bilger W. (2003):UV-induction of sun- screening pigments in lichens. New Phytologist, 158: 91-100.
Solhaug K. A., Gauslaa Y. (2004): Photosynthates stimulate the UV-B induced fungal anthraquinone synthesis in the foliose lichen Xanthoria parietina. Plant Cell and Environment, 27: 167-176.
Stocker-Wörgötter E., Hager A., Elix J. A. (2008): Intraspecific chemical variation within the crustose lichen genus Haematomma: anthraquinone production in selected cultured mycobionts as a response to stress and nutrient supply. Phytochemistry Review, 8: 561–569.
Stoop J. M. H., Williamson J. D., Pharr D. M. (1996): Manitol metabolism in plants: a model for coping with stress. Trends in Plant Science, 1: 139-144.
Storey K. B., Storey J. M. (2005): Freeze tolerance. In: Extremophiles (Gerday, C. and Glansdorff, N. (eds.): Encyclopedia of Life Support Systems (EOLSS), Developed under the Auspices of the UNESCO, Eolss Publishers, Oxford, UK.
Sturgeon R. J. (1985): Biosynthesis and utilization of storage sugars in algae, fungie, and lichens. Physiologia Vegetale, 23: 95-106.
Tearle P. V. (1987): Cryptogamic carbohydrate release and microbialresponse during spring freeze-thaw cycles in Antarctic fellfield fines. Soil Biology and Biochemistry, 19: 381-390.
Tsai S-Y., Tsai H-L., Mau J-L. (2008): Non-volatile taste components of Agaricus blazei, Agrocybe cylindracea and Boletus edulis. Food Chemistry, 107: 977-983.
Turner N. J., Bouchard R., Kennedy D. I. D. (1980): Ethnobotany of the Okanagan- Colville Indians of British Columbia and Washington. Occasional Papers of the British Provincial Museum, 21: 1–179.
Vojtíšková L., Munzarová E., Votrubová O., Čížková H., Lipavská, H. (2006a): The influence of nitrogen nutrition on the carbohydrate and nitrogen status of emergent macrophyte Acorus calamus L. Hydrobiologia, 563: 73–85.
Steinbachová-Vojtíšková L., Tylová E., Soukup A., Novická H., Votrubová O., Lipavská H., Čížková, H. (2006b): Influence of nutrient supply on growth, carbohydrate and nitrogen metabolic relations in Typha angustifoli. Environmental Experimental Botany, 57: 246-257.
63 Wellburn A. R. (1994): The spectral determination of chlorophylls a and b, as well as total carotenoids, using various solvents with spectrophotometers of different resolution. Journal of Plant Physiology, 144: 307-313.
Williamson J. D., Stoop J. M. H., Massel M. O., Conkling M. A., Mason Pharr D. (1995): Sequence analysis of a mannitol dehydrogenase cDNA from plants reveals a function for the pathogenesis-related protein ELI3. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Plant Biology, 92: 7148-7152.
Williamson J. D., Jennings D. B., Guo Wein-Wen, Pharr D. M. (2002): Sugar alcohols, salt stress, and fungal resistance: Polyols - multifunctional plant protection? Journal of the American Society for Horticultural Science, 127: 467-473.
Winter H., Huber S. C. (2000): Sucrose metabolism and the actin cytoskeleton: SuSy as actin-binding protein. In: Staiger, C. J., Baluška, F., Volkmann, L. V., Barlow, M. W. (eds.). Actin: Dynamic framework for multiple plant cell functions. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 661 p.
Wisniewski M., Fuller M. (1999): Ice nucleation and deep supercooling in plants: new insights using infrared thermography. In: Margesin, R., Schinner, F. (eds.): Cold- adapted organisms – ecology, physiology, enzymology and molecular biology. Springer-Verlag. Berlin, Heidelberg.
64
8. Přílohy
65