Downstream Signaling Pathway in Bone Stromal Cells Induced with Basic Fibroblast Growth Factor (FGF2)
Total Page：16
File Type：pdf, Size：1020Kb
i Downstream Signaling Pathway in Bone Stromal Cells Induced with Basic Fibroblast Growth Factor (FGF2) Paweena Wongwitwichot A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Doctor of Philosophy in Pharmaceutical Sciences Prince of Songkla University 2015 Copyright of Prince of Songkla University ii Thesis Title Downstream Signaling Pathway in Bone Stromal Cells Induced with Basic Fibroblast Growth Factor (FGF2) Author Miss Paweena Wongwitwichot Major Program Pharmaceutical Sciences Major Advisor Examining Committee: ……………………………….……….............. ……………………………………Chairperson (Assoc. Prof. Dr. Jasadee Kaewsrichan) (Asst. Prof. Dr. Bhutorn Canyuk) ……………………………….………............... Co-advisor (Dr. Danai Tiwawech) ……………………………….……….............. ……………………………….………............... (Asst. Prof. Dr. Potchanapond Graidist) (Assoc. Prof. Dr. Chua Kien Hui) ……………………………….………............... (Assoc. Prof. Dr. Jasadee Kaewsrichan) ……………………………….………............... (Asst. Prof. Dr. Potchanapond Graidist) The Graduate School, Prince of Songkla University, has approved this thesis as partial fulfillment of the requirements for the Degree of Doctor of Philosophy in Pharmaceutical Sciences. ……………………………….………............... (Assoc. Prof. Dr. Teerapol Srichana) Dean of Graduate School iii This is to certify that the work here submitted is the result of the candidate’s own investigations. Due acknowledgement has been made of any assistance received. …………………………………..……Signature (Assoc. Prof. Dr. Jasadee Kaewsrichan) Major Advisor …………………………………..……Signature (Miss Paweena Wongwitwichot) Candidate iv I hereby certify that this work has not been accepted in substance for any degree, and is not being currently submitted in candidature for any degree. …………………………………..……Signature (Miss Paweena Wongwitwichot) Candidate v ชื่อวิทยานิพนธ ์ การสงต่ ่อสญญาณในเซลลั ต์ นก้ าเนํ ิดกระดกเมู อถ่ื กเหนู ่ียวนําดวย้ Basic Fibroblast Growth Factor (FGF2) ผ้เขู ียน นางสาวปวณาี วงศว์ ทยิ ว์ โชติ ิ สาขาวิชา เภสชศาสตรั ์ ปี การศึกษา 2557 บทคดยั ่อ วศวกรรมเนิ ้ือเยอกระด่ื กจากเซลลู ต์ นก้ าเนํ ิด เป็นเทคโนโลยที ถ่ี กพู ฒนาขั นเพ้ึ อการ่ื รกษาและทดแทนกระดั กทู ส่ี ญเสู ยไปในปรี มาณมากิ เกนความสามารถของริ างกายท่ จะซ่ี ่อมแซมได้ เอง เซลลต์ นก้ าเนํ ิดจากไขกระดกเปู ็นแหลงท่ มาของเซลล่ี ท์ เข่ี าถ้ งไดึ ง้ าย่ และหากเป็นของผปู้ วยเองก่ ็ จะไมม่ ปี ญหาเรั ่องการเขื าก้ นไมั ได่ ของเน้ ้ือเยอ่ื แต่มขี อจ้ ากํ ดทั ส่ี าคํ ญคั อปรื มาณเซลลิ ต์ นก้ าเนํ ิดในไข กระดกมู นี ้อยมาก กลาวค่ อนื ้อยกวา่ 0.01 เปอรเซ์ นต็ ์ สาหรํ บการรั กษาดั วยเทคน้ ิคน้ีซงต่ึ องใช้ เซลล้ ์ ปรมาณมากจิ งเปึ ็นขอเส้ ยเปรี ยบที ส่ี าคํ ญั การเพมจิ่ านวนเซลลํ ในห์ องทดลองถ้ อไดื ว้ าเป่ ็นทางเลอกทื ่ี เหมาะสม แต่เกดปิ ญหาทั ช่ี ดเจนจากปฏั บิ ตั การดิ งกลั าว่ นนคั่ อเซลลื แบ์ ่งตวไดั น้ ้อยลงและไมสามารถ่ คงความเป็นเซลลต์ นก้ าเนํ ิดไวได้ เม้ อผ่ื านการเพาะเล่ ยงหลายๆคร้ี งั้ จงเปึ ็นทมาของงานว่ี จิ ยชั นน้ิ ้ี ทม่ี ุง่ พฒนาสภาวะสั าหรํ บแยกเซลลั ต์ นก้ าเนํ ิดจากไขกระดกู เพาะเลยงเซลล้ี ในหลอดทดลอง์ กระตุนเซลล้ ์ ดวยสารกระต้ ุนการเจร้ ญิ (growth factor) ทเหน่ี ่ียวนําใหเก้ ดการแบิ งเซลล่ และเปล์ ยนแปลงเป่ี ็นเซลล์ กระดกู (osteoblasts) ใหมากข้ น้ึ ศกษาการสรึ างกระด้ กใหมู ส่ วนนอก่ (ectopic bone) ในสตวั ทดลองท์ ่ี ไดร้ บการปลั กเซลลู ด์ งกลั ่าวลงไป และศกษากลไกการเหนึ ่ยวนี ําการสรางกระด้ กใหมู ระด่ บโมเลกั ุลของ สารกระตุนการเจร้ ญเหลิ าน่ นั้ โดยมเปี ้าหมายทจะลดค่ี าใช่ จ้ ายในการเตร่ ยมเซลลี ต์ นก้ าเนํ ิด และเพมิ่ ประสทธิ ภาพของเทคนิ ิควศวกรรมเนิ ้อเยื อกระด่ื กทางคลู นิ ิกใหส้ งขู น้ึ งานวจิ ยชั ให้ี เห้ นว็ า่ เทคนิคทใช่ี แยกเซลล้ ต์ นก้ าเนํ ิดจากไขกระดกมู ประสี ทธิ ภาพดิ ี และงายหากจะน่ ําไปใชในห้ องปฏ้ บิ ตั การทางคลิ นิ ิก การกระตุนเซลล้ ตามล์ าดํ บดั วย้ basic fibroblast growth factor (หรอื fibroblast growth factor 2; FGF2) ความเขมข้ น้ 2.5 ng/ml เสรมดิ วยอ้ นซิ ูลนิ ความเขมข้ น้ 60 ng/ml เป็นเวลา 1 วนั พกเซลลั เป์ ็นเวลา 2 วนั กระตุนเซลล้ ต์ ่อดวย้ Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2) ความเขมข้ น้ 10 ng/ml หรอื bone morphogenetic protein 7 (BMP7) ความเขมข้ น้ 10 ng/ml อกี 1 วนั สงผลเหน่ ่ียวนําใหเก้ ดการสริ างกระด้ กใหมู ่ทงในหลอดั้ ทดลองและในสตวั ทดลอง์ การกระตุนเซลล้ ช์ วงแรกนอกจากจะส่ งผลให่ เซลล้ แบ์ ่งตวเพั มขิ่ นแล้ึ ว้ ยงั สามารถชกนั ําเซลลต์ นก้ าเนํ ิดใหโน้ ้มเอยงที จะเปล่ี ยนไปเป่ี ็นเซลลต์ วอั ่อนกระดกู (pre-osteoblast) เพมขิ่ นด้ึ วย้ สวนการกระต่ ุนเซลล้ ช์ วงหล่ งสั งผลให่ เซลล้ ต์ นก้ าเนํ ิดทงหมดเปลั้ ยนไปเป่ี ็นเซลลต์ วอั ่อน กระดกทู พร่ี อมจะสะสมแคลเซ้ ยมและฟอสฟอรี สั (mineralization) และเปลยนเป่ี ็นกระดกในทู ส่ี ดุ พบว่าการเพมจิ่ านวนเซลลํ เก์ ดจากการกระติ ุนผ้ านว่ ถิ ของี Wingless and Int1 (WNT pathway) สวนการเพ่ มแนวโนิ่ ้มใหเซลล้ เปล์ ยนเป่ี ็นเซลลต์ วอั ่อนกระดกู เกดจากการทิ เซลล่ี ์ สราง้ Runt-related transcription factor 2 (Runx2) เพมขิ่ นเม้ึ อถ่ื กกระตู ุนด้ วย้ FGF2 vi Runx2 เป็นโปรตนหลี กทั ท่ี าหนํ ้าทในการการควบค่ี มการถอดรหุ สของยั นที เซลล่ี ์ สรางเพ้ มขิ่ น้ึ และจะส่งผลต่อใหเซลล้ สร์ างโปรต้ นที เก่ี ยวข่ี องก้ บการสรั างกระด้ กเพู มขิ่ นด้ึ วย้ ไดแก้ ่ BMP2 และ alkaline phosphatase (ALP) ปรมาณการสะสมแคลเซิ ยมและฟอสฟอรี สสามารถั ตรวจสอบดวยเทคน้ ิคสยี อมจ้ าเพาะํ Alizarin Red S กลไกกระตุนระด้ บเซลลั เก์ ดจากิ Runx2 จบกั บั สวนของด่ เอี นเอ็ ap1 ทอย่ี เหนู่ ือยนี runx2 แลวส้ งผลเช่ งบวกใหิ เซลล้ สร์ าง้ Runx2 เพมขิ่ น้ึ ตามดวย้ การสราง้ BMP2 และ ALP ทเพ่ี มขิ่ น้ึ เทคนิคการเพาะเลยงเซลล้ี ต์ นก้ าเนํ ิดเพอใช่ื ในว้ ศวกรรมเนิ ้ือเยอกระด่ื กทู พ่ี ฒนาขั น้ึ ใหมน่ ้ีเป็นวธิ ที ง่ี าย่ ปลอดภยั มคี าใช่ จ้ ายท่ เหมาะสม่ี และสามารถนําไปใชได้ จร้ งทางคลิ นิ ิก vii Thesis Title Downstream Signaling Pathway in Bone Stromal Cells Induced with Basic Fibroblast Growth Factor (FGF2) Author Miss Paweena Wongwitwichot Major Program Pharmaceutical Sciences Academic Year 2014 ABSTRACT Bone tissue engineering using mesenchymal stromal cells (MSCs) becomes a promising technique for treatment of severe bone defect. Bone marrow is an easily accessible source of MSCs, which are autologous if own to the patient. Because of the rare population of MSCs (< 0.01%), this has been the major drawback of the repair technique as it requires large cell numbers. In vitro propagation is generally applied to increase the numbers of cells. However, the cells grow with reduced rate and have lowered differentiation potential during the expansion. Accordingly, this research is aimed to (1) improve techniques of MSC separation and cultivation with enhanced growth rate and preserved differentiation potential, by using suitable bone growth- related factors; (2) to determine the ability of the induced cells to form new bone in vitro and in vivo; and (3) to clarify the induction mechanisms by the used growth factors at molecular levels. Results showed that the cell isolation method developed was efficient and could be applied in clinics. Improved in vitro and in vivo bone formation was apparent when the cells were sequentially induced by using 2.5 ng/ml basic fibroblast growth factor (or fibroblast growth factor 2; FGF2) plus 60 ng/ml insulin for 1 day (the 1st induction), followed by cell starvation for 2 days, and finally challenged by 10 ng/ml bone morphogenetic protein 2 (BMP2) or 10 ng/ml bone morphogenetic protein 7 (BMP7) for 1 day (the 2nd induction). The increase of cell growth and pre-osteoblastic commitment was achieved by the 1st induction phase, while the improvement of osteoblastic differentiation and mineralization processes was accomplished by the 2nd induction phase. The effect on cell proliferation was found to involve in the Wingless and Int1 (WNT) pathway. Instead, the cells trended to produce Runt-related transcription viii factor 2 (Runx2) after induced by FGF2, resulting in increased pre-osteoblastic commitment. Since Runx2 was the principal transcription factor produced, it then positively regulated the synthesis of osteogenic proteins including BMP2 and alkaline phosphatase (ALP). The degree of mineralization was determined by Alizarin red s (ARS) staining. The proposed mechanism of Runx2 on accelerating new bone formation would be via the activation of ap1 consensus sequence located up-stream of runx2 gene by Runx2, resulting in increased production of BMP2 and ALP. The newly developed method for cultivating MSCs isolated from bone marrow was simple, safe, cost-effective, and possible to be applied for bone tissue engineering in clinics. x CONTENTS Page ABSTRACT (in Thai) v ABSTRACT (in English) vii ACKNOWLEDGEMENT ix CONTENTS x LIST OF TABLES xv LIST OF FIGURES xvii LIST OF ABBREVIATIONS AND SYMBOLS xx CHAPTER 1 INTRODUCTION 1 1.1 Background 1 1.1.1 Bone 1 1.1.2 Bone cells 2 1.1.3 Osteogenesis 4 1.1.3.1 Bone tissue formation process 4 1.1.3.2 Transcriptional regulation of osteogenesis 6 1.1.3.3 Major signaling pathways controlling bone formation 10 1.1.3.4 Signaling crosstalk in bone development 16 1.1.4 Bone defects and treatment 17 1.1.4.1 Defects of bone tissue 17 1.1.4.2 Bone fracture healing process 18 1.1.4.3 Treatments of lost bone tissue 19 1.1.5 Tissue engineering 20 1.1.5.1 The concept 20 1.1.5.2 Osteogenic cells 21 1.1.5.3 Scaffolds 22 1.1.5.4 Growth factors 23 1.2 Research rationale 23 1.3 Objectives 25 xi CONTENTS (continued) Page CHAPTER 2 RESEARCH METHODOLOGY 26 2.1 Materials 26 2.1.1 General reagents 26 2.1.2 Reagents for cell isolation, culture, and characterization 26 2.1.3 Reagents for in vitro evaluation of induction conditions 27 2.1.4 Reagents for in vivo experiment 27 2.1.5 Reagents for plasmid construction 28 2.1.5.1 Plasmids 28 2.1.6 Reagents for transfection experiment 32 2.1.7 Laboratory animal 32 2.1.8 Primers and oligonucleotides 32 2.2 Experimental scheme 39 2.3 Methods 40 2.3.1 MSCs isolation and culture 40 2.3.1.1 Human bone marrow-derived