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Obtención De Enzimas Lignocelulolíticas Y

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Obtención De Enzimas Lignocelulolíticas Y OBTENCIÓN DE ENZIMAS LIGNOCELULOLÍTICAS Y POLISACÁRIDOS A PARTIR DE RESIDUOS LIGNOCELULÓSICOS DEL DEPARTAMENTO DE CALDAS EMPLEANDO MACROMICETOS DE PUDRICIÓN BLANCA POR FERMENTACIÓN SUMERGIDA Y FERMENTACIÓN EN ESTADO SÓLIDO SANDRA MONTOYA BARRETO Facultad de Ciencias Agropecuarias Doctorado en ciencias Agrarias Universidad de Caldas Manizales, Colombia, 2012 1 OBTENCIÓN DE ENZIMAS LIGNOCELULOLÍTICAS Y POLISACÁRIDOS A PARTIR DE RESIDUOS LIGNOCELULÓSICOS DEL DEPARTAMENTO DE CALDAS EMPLEANDO MACROMICETOS DE PUDRICIÓN BLANCA POR FERMENTACIÓN SUMERGIDA Y FERMENTACIÓN EN ESTADO SÓLIDO Tesis para optar el título de Doctora en Ciencias Agrarias de: SANDRA MONTOYA BARRETO Bajo la dirección del Doctor: ÓSCAR JULIÁN SÁNCHEZ TORO Facultad de Ciencias Agropecuarias Doctroado en Ciencias Agrarias Manizales, 2012 Agradecimientos Institutciones y oficinas Universidad de Caldas: Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados, por la financiación de la Tesis Doctoral Departamento de Ingeniería, por el aval para la comisión de estudios. Instituto de Biotecnología Agropecuaria, por el uso de los laboratorios y sus instalaciones para el desarrollo de la Tesis. Grupo de alimentos y Agroindustria, por el apoyo permanente durante el desarrollo de la investigación. Universidad de Buenos Aires, por el apoyo con la pasantía realizada en el Departamento de Biodiversidad y biología Experimental. Universidade Federal Do Paraná, por el apoyo con la pasantía realizada en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Doctores e investigadores Doctor Óscar Julián Sánchez Toro, Director de la tesis Doctoral, por su apoyo y orientación permanentes en cada uno de los procesos académicos durante el desarrollo de todo el trabajo. Doctora Laura Levín, Codirectora de la Tesis Doctoral, por su apoyo permanente y orientaciones pertinentes durante todo el proceso de formación doctoral. Doctoras Lucía Atehortúa, profesora de la Universidad de Antioquia y Aida Rodriguez de Stouvenel, porfesora de la Universidad del Valle, quienes conforman el Comité tutorial de mi Tesis Doctoral, por su evaluación oportuna y participación en los eventos académicos relacionados con la Tesis Doctoral. Prof. Arkady P. Sinitsyn, Institute of Biochemistry, Russian Academy of Sciences, Department of Chemical Enzymology, Moscow State University, Russia, por su apoyo y orientación durante visita académica a la Universidad de Caldas en el año 2011. Estudiantes de Postgrados, Ingenieros y Compañeros Profesor Óscar Darío Hernández, por su apoyo y colaboración en la construcción y desarrollo de los modelos matemáticos desarrollados en este trabajo. Profesional Diego Fernado Arias Monsalve, por su colaboración con el trabajo de campo realizado para la Tesis. Profesionales Patricia Salazar Villegas y Silvio Alexandro Gómez saldarriaga, por la colaboración y apoyo con el trámite de la solcitud de Patente de Biorreactor de lecho fijo. Agradecimientos personales Especialmente a mi hijo por su compañía permanente, su amor y apoyo complice; a mi esposo por su paciencia y solaridad. TABLA DE CONTENIDO 1. Introducción 4 1.1. Contexto general 4 1.2. Objetivos de la tesis 8 2. Estado del Arte y Marco Teórico 10 2.1. Los hongos 10 2.1.1 Generalidades de los hongos 10 2.1.2. Biología d elos hongos 12 2.1.3 Crecimeinto y desarrollo de los hongos 13 2.1.4. Investigaciones con hongos en Colombia 15 2.2. materiales lignocelulósicos 20 2.2.1. Celulosa 22 2.2.2. Hemicelulosa 24 2.2.3. Lignina 25 2.2.4. Otros polímeros presentes en los materiales lignocelulósicos 27 2.2.5. Pretratamiento de los materiales lignocelulóscios 28 2.3. Enzimas lignocelulolíticas 30 2.3.1. Enzimas celulolíticas 31 2.3.2. Enzimas xilanolíticas 37 2.3.3. Enzimas ligninolíticas 38 2.3.4. Otras enzimas producidas por hongos de pudrición blanca 43 2.3.5. Aplicaciones de las enzimas 44 2.4. Polisacáridos fúngicos 45 2.5. fermentación sumergida 48 2.6. Fermentación en estado sólido 50 2.7. Modelamiento de las cinéticas de fermentación de hongos de pudrición blanca 54 2.8. Evaluación de biomasa fúngica, enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos 57 2.8.1. Detarminación de biomasa celular 57 2.8.2. Rastreo de cepas para la producción de biosustancias 58 2.8.3. determinación de actividades enzimáticas lignocelulolíticas 59 2.8.4. Determinación de polisacáridos 59 Referencias 60 3. Evaluación de Actividades Endoglucanasa, Exoglucanasa, Lacasa y Lignina Peroxidasa en Diez hongos de pudrición blanca 72 4. Producción de Polisacáridos por Cultivos Sumergidos y en Estado sólido a partir de diferentes basidiomicetos 86 5. Selección de la mejor Combinación Hongo – Formulación para la degradación de Sustratos Lignocelulósicos mediante Fermentación en Estado Sólido con Pleurotus ostreatus, Coriolus versicolor y Lentinus edodes 98 6. Selección de la mejor Combinación Hongo – Formulación para la degradación de Sustratos Lignocelulósicosproducción de polisacáridos mediante Fermentación en Estado Sólido con Pleurotus ostreatus, Coriolus versicolor y Lentinus edodes 120 7. Selección de la mejor Combinación Hongo – Formulación para la degradación de Sustratos Lignocelulósicos mediante Fermentación Sumergida con Pleurotus ostreatus, Coriolus versicolor y Lentinus edodes 139 8. Selección de la mejor Combinación Hongo – Formulación para la producción de exo- polisacáridos mediante Fermentación Sumergida con Pleurotus ostreatus, Coriolus versicolor y Lentinus edodes 163 9. Biorreactor para la Obtención de Ssutancias Bioactivas por Fermentación en Estado Sólido Empleando Hongos Macromcietos (Solicitud de Patente) 181 10. Conclusiones Generales 184 10.1. Contribuciones de la Tesis 184 10.2. Impactos Potenciales de la Tesis 186 10.3. Trabajos Futuros 187 Anexos 1. Documento Solictud de Patente Anexo 2. Obtención de polisacáridos del cuerpo fructífero Grifola frondosa Anexo 3. Aprobación de proyecto Colciencias 1. Introducción 1.1. Contexto general 1.1.1. Campo de aplicación y motivación La producción de enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos a partir de hongos de pudrición blanca empleando residuos lignocelulósicos como sustratos ha sido estudiada en diversos centros de investigación y universidades en el mundo con múltiples resultados a escala de laboratorio. Sin embargo, no hay disponible información suficiente sobre los procesos industriales para la obtención de estos productos, ni sobre su escalamiento. Tampoco existe información suficiente y disponible en torno a la producción de polisacáridos fúngicos empleando residuos lignocelulósicos como sustratos, diferenciando la fuente de los polisacáridos fúngicos como son el cuerpo fructífero de los hongos, el micelio vegetativo o los medios de cultivo procedentes de las fermentaciones sumergidas. De igual forma, se ha detectado que muchos de los problemas que se presentan en el escalamiento y montaje de los procesos industriales para la producción de biosustancias empleando hongos macromicetos sobre matrices sólidas heterogéneas, como son las diversas mezclas de materiales lignocelulósicos, se deben a la ausencia de modelos matemáticos adercuados que describan y permitan la articulación entre el crecimiento y desarrollo de los macromicetos de pudrición blanca, el consumo de los sustratos y la producción de las sustancias con valor comercial. Varios fueron los motivos que nos llevaron a encarar este trabajo en el marco del Doctroado en Ciencias Agrarias de la Universidad de Caldas, entre los que se destacaron: En Colombia son escasos los trabajos de investigación en torno a la producción de enzimas lignocelulolíticas obtenidas a partir de hongos de pudrición blanca empleando residuos lignocelulósicos como sustratos en procesos de fermentación sumergida y en estado sólido. En la producción de polisacáridos de hongos de pudrición blanca se requiere información en torno a la descripción de las clases de polisacáridos que pueden obtenerse dependiendo si éstos se encuentran en el cuerpo fructífero, en el micelio o son excretados al medio de cultivo. Asimismo, es reducida la información en torno a los esquemas de extracción de polisacáridos y a su identificación y cuantificación. No sehan establecido pleanemente los medios de cultivo basados en materiales lignocelulósicos pretratados utilizados en fermentación sumergida para la producción de polisacáridos a partir de hongos de pudrición blanca. Existen escasas propuestas en referencia a modelos matemáticos que permitan la descripción del crecimiento y desarrollo de los hongos de pudrición blanca y la producción de biosustancias como metabolitos primarios y secundarios a fin de buscar el escalamiento de los procesos (nivel piloto) para su producción industrial. La producción de enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos de hongos de pudrición blanca empleando mezclas de residuos lignocelulósicos es bastante compleja por todas las interacciones que se presentan entre la biomasa, el sustrato y las nuevas sustancias producto del metabolismo del hongo; estas sustancias son a su vez necesarias para realizar la conversión de la matriz polimérica del sustrato, constituida principalmente por celulosa, hemicelulosa y lignina, en sustancias pequeñas que le sirvan de fuente de energía para su crecimiento y desarrollo. Esta tesis doctoral intenta describir los procesos de obtención de enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos, como productos del metabolismo de estos hongos. Este trabajo fue realizado entre agosto de 2009 y diciembre de 2012, con el soporte económico de la Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados, el Instituto de Biotecnología Agropecuaria y
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