OBTENCIÓN DE ENZIMAS LIGNOCELULOLÍTICAS Y POLISACÁRIDOS A PARTIR DE RESIDUOS LIGNOCELULÓSICOS DEL DEPARTAMENTO DE CALDAS EMPLEANDO MACROMICETOS DE PUDRICIÓN BLANCA POR FERMENTACIÓN SUMERGIDA Y FERMENTACIÓN EN ESTADO SÓLIDO
SANDRA MONTOYA BARRETO
Facultad de Ciencias Agropecuarias Doctorado en ciencias Agrarias Universidad de Caldas Manizales, Colombia, 2012
1
OBTENCIÓN DE ENZIMAS LIGNOCELULOLÍTICAS Y POLISACÁRIDOS A PARTIR DE RESIDUOS LIGNOCELULÓSICOS DEL DEPARTAMENTO DE CALDAS EMPLEANDO MACROMICETOS DE PUDRICIÓN BLANCA POR FERMENTACIÓN SUMERGIDA Y FERMENTACIÓN EN ESTADO SÓLIDO
Tesis para optar el título de Doctora en Ciencias Agrarias de:
SANDRA MONTOYA BARRETO
Bajo la dirección del Doctor:
ÓSCAR JULIÁN SÁNCHEZ TORO
Facultad de Ciencias Agropecuarias Doctroado en Ciencias Agrarias
Manizales, 2012
Agradecimientos
Institutciones y oficinas
Universidad de Caldas: Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados, por la financiación de la Tesis Doctoral Departamento de Ingeniería, por el aval para la comisión de estudios. Instituto de Biotecnología Agropecuaria, por el uso de los laboratorios y sus instalaciones para el desarrollo de la Tesis. Grupo de alimentos y Agroindustria, por el apoyo permanente durante el desarrollo de la investigación.
Universidad de Buenos Aires, por el apoyo con la pasantía realizada en el Departamento de Biodiversidad y biología Experimental.
Universidade Federal Do Paraná, por el apoyo con la pasantía realizada en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular.
Doctores e investigadores
Doctor Óscar Julián Sánchez Toro, Director de la tesis Doctoral, por su apoyo y orientación permanentes en cada uno de los procesos académicos durante el desarrollo de todo el trabajo. Doctora Laura Levín, Codirectora de la Tesis Doctoral, por su apoyo permanente y orientaciones pertinentes durante todo el proceso de formación doctoral. Doctoras Lucía Atehortúa, profesora de la Universidad de Antioquia y Aida Rodriguez de Stouvenel, porfesora de la Universidad del Valle, quienes conforman el Comité tutorial de mi Tesis Doctoral, por su evaluación oportuna y participación en los eventos académicos relacionados con la Tesis Doctoral. Prof. Arkady P. Sinitsyn, Institute of Biochemistry, Russian Academy of Sciences, Department of Chemical Enzymology, Moscow State University, Russia, por su apoyo y orientación durante visita académica a la Universidad de Caldas en el año 2011.
Estudiantes de Postgrados, Ingenieros y Compañeros
Profesor Óscar Darío Hernández, por su apoyo y colaboración en la construcción y desarrollo de los modelos matemáticos desarrollados en este trabajo. Profesional Diego Fernado Arias Monsalve, por su colaboración con el trabajo de campo realizado para la Tesis. Profesionales Patricia Salazar Villegas y Silvio Alexandro Gómez saldarriaga, por la colaboración y apoyo con el trámite de la solcitud de Patente de Biorreactor de lecho fijo. Agradecimientos personales Especialmente a mi hijo por su compañía permanente, su amor y apoyo complice; a mi esposo por su paciencia y solaridad.
TABLA DE CONTENIDO 1. Introducción 4 1.1. Contexto general 4 1.2. Objetivos de la tesis 8 2. Estado del Arte y Marco Teórico 10 2.1. Los hongos 10 2.1.1 Generalidades de los hongos 10 2.1.2. Biología d elos hongos 12 2.1.3 Crecimeinto y desarrollo de los hongos 13 2.1.4. Investigaciones con hongos en Colombia 15 2.2. materiales lignocelulósicos 20 2.2.1. Celulosa 22 2.2.2. Hemicelulosa 24 2.2.3. Lignina 25 2.2.4. Otros polímeros presentes en los materiales lignocelulósicos 27 2.2.5. Pretratamiento de los materiales lignocelulóscios 28 2.3. Enzimas lignocelulolíticas 30 2.3.1. Enzimas celulolíticas 31 2.3.2. Enzimas xilanolíticas 37 2.3.3. Enzimas ligninolíticas 38 2.3.4. Otras enzimas producidas por hongos de pudrición blanca 43 2.3.5. Aplicaciones de las enzimas 44 2.4. Polisacáridos fúngicos 45 2.5. fermentación sumergida 48 2.6. Fermentación en estado sólido 50 2.7. Modelamiento de las cinéticas de fermentación de hongos de pudrición blanca 54 2.8. Evaluación de biomasa fúngica, enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos 57 2.8.1. Detarminación de biomasa celular 57 2.8.2. Rastreo de cepas para la producción de biosustancias 58 2.8.3. determinación de actividades enzimáticas lignocelulolíticas 59 2.8.4. Determinación de polisacáridos 59 Referencias 60 3. Evaluación de Actividades Endoglucanasa, Exoglucanasa, Lacasa y Lignina Peroxidasa en Diez hongos de pudrición blanca 72 4. Producción de Polisacáridos por Cultivos Sumergidos y en Estado sólido a partir de diferentes basidiomicetos 86 5. Selección de la mejor Combinación Hongo – Formulación para la degradación de Sustratos Lignocelulósicos mediante Fermentación en Estado Sólido con Pleurotus ostreatus, Coriolus versicolor y Lentinus edodes 98 6. Selección de la mejor Combinación Hongo – Formulación para la degradación de Sustratos Lignocelulósicosproducción de polisacáridos mediante Fermentación en Estado Sólido con Pleurotus ostreatus, Coriolus versicolor y Lentinus edodes 120 7. Selección de la mejor Combinación Hongo – Formulación para la degradación de Sustratos Lignocelulósicos mediante Fermentación Sumergida con Pleurotus ostreatus, Coriolus versicolor y Lentinus edodes 139 8. Selección de la mejor Combinación Hongo – Formulación para la producción de exo- polisacáridos mediante Fermentación Sumergida con Pleurotus ostreatus, Coriolus versicolor y Lentinus edodes 163 9. Biorreactor para la Obtención de Ssutancias Bioactivas por Fermentación en Estado Sólido Empleando Hongos Macromcietos (Solicitud de Patente) 181 10. Conclusiones Generales 184 10.1. Contribuciones de la Tesis 184 10.2. Impactos Potenciales de la Tesis 186 10.3. Trabajos Futuros 187 Anexos 1. Documento Solictud de Patente
Anexo 2. Obtención de polisacáridos del cuerpo fructífero Grifola frondosa
Anexo 3. Aprobación de proyecto Colciencias
1. Introducción
1.1. Contexto general
1.1.1. Campo de aplicación y motivación
La producción de enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos a partir de hongos de pudrición blanca empleando residuos lignocelulósicos como sustratos ha sido estudiada en diversos centros de investigación y universidades en el mundo con múltiples resultados a escala de laboratorio. Sin embargo, no hay disponible información suficiente sobre los procesos industriales para la obtención de estos productos, ni sobre su escalamiento. Tampoco existe información suficiente y disponible en torno a la producción de polisacáridos fúngicos empleando residuos lignocelulósicos como sustratos, diferenciando la fuente de los polisacáridos fúngicos como son el cuerpo fructífero de los hongos, el micelio vegetativo o los medios de cultivo procedentes de las fermentaciones sumergidas. De igual forma, se ha detectado que muchos de los problemas que se presentan en el escalamiento y montaje de los procesos industriales para la producción de biosustancias empleando hongos macromicetos sobre matrices sólidas heterogéneas, como son las diversas mezclas de materiales lignocelulósicos, se deben a la ausencia de modelos matemáticos adercuados que describan y permitan la articulación entre el crecimiento y desarrollo de los macromicetos de pudrición blanca, el consumo de los sustratos y la producción de las sustancias con valor comercial. Varios fueron los motivos que nos llevaron a encarar este trabajo en el marco del Doctroado en Ciencias Agrarias de la Universidad de Caldas, entre los que se destacaron:
En Colombia son escasos los trabajos de investigación en torno a la producción de enzimas lignocelulolíticas obtenidas a partir de hongos de pudrición blanca empleando residuos lignocelulósicos como sustratos en procesos de fermentación sumergida y en estado sólido. En la producción de polisacáridos de hongos de pudrición blanca se requiere información en torno a la descripción de las clases de polisacáridos que pueden obtenerse dependiendo si éstos se encuentran en el cuerpo fructífero, en el micelio o son excretados al medio de cultivo. Asimismo, es reducida la información en torno a los esquemas de extracción de polisacáridos y a su identificación y cuantificación. No sehan establecido pleanemente los medios de cultivo basados en materiales lignocelulósicos pretratados utilizados en fermentación sumergida para la producción de polisacáridos a partir de hongos de pudrición blanca. Existen escasas propuestas en referencia a modelos matemáticos que permitan la descripción del crecimiento y desarrollo de los hongos de pudrición blanca y la producción de biosustancias como metabolitos primarios y secundarios a fin de buscar el escalamiento de los procesos (nivel piloto) para su producción industrial.
La producción de enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos de hongos de pudrición blanca empleando mezclas de residuos lignocelulósicos es bastante compleja por todas las interacciones que se presentan entre la biomasa, el sustrato y las nuevas sustancias producto del metabolismo del hongo; estas sustancias son a su vez necesarias para realizar la conversión de la matriz polimérica del sustrato, constituida principalmente por celulosa, hemicelulosa y lignina, en sustancias pequeñas que le sirvan de fuente de energía para su crecimiento y desarrollo. Esta tesis doctoral intenta describir los procesos de obtención de enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos, como productos del metabolismo de estos hongos. Este trabajo fue realizado entre agosto de 2009 y diciembre de 2012, con el soporte económico de la Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados, el Instituto de Biotecnología Agropecuaria y el Departamento de Ingeniería de la Universidad de Caldas; adicionalmente, se contó con el apoyo parcial de la Gobernación de Caldas con cargo a los recursos de la estampilla para proyectos de investigación de las 6 universidades públicas del Departamento de Caldas. La autora de esta tesis realizó una pasantía internacional en dos instituciones de reconocida trayectoria en el campo de aplicación que aborda el presente trabajo: Departamento de Biología y Bioquímica de la Universidade Federal do Paraná (Curitiba, Brasil) y el Departamento de Biodiversidad y Biología Experimental de la Universidad de Buenos Aires (Argentina). Durante el desarrollo de esta investigación se realizaron dos trabajos paralelos que complementan esta tesis y hacen parte de los productos obtenidos como aplicaciones de los conocimientos adquiridos, los cuales son: i) Diseño y puesta en marcha de la Planta de Bioprocesos de la Universidad de Caldas, la cual consta de seis unidades de proceso, compostaje, cultivo de hongos macromicetos, planta de tratamiento de aguas residuales, lombricultivo, unidad de fermentaciones sumergidas con biorreactores bajo condiciones controladas y unidad de fermentaciones en estado sólido con biorreactores bajo condiciones controladas; la cual se encuentra operando desde diciembre de 2011; y ii) planteamiento y desarrollo del proyecto Desarrollo y evaluación de los parámetros de cultivo a escala semi industrial del hongo Grifola frondosa en climas tropicales y su transformación con fines comerciales como productos nutraceúticos. Este proyecto se encuentra en la ejecución de su primera etapa que corresponde al estudio de mercado del producto y a pruebas piloto de producción. El espectro de aplicación de este trabajo se resume en la importancia de ampliar el conocimiento en torno a la producción de enzimas lignocelulolíticas de los hongos de pudrición blanca Coriolus versicolor, Lentinus edodes y Pleurotus ostreatus (seleccionados de entre 10 especies de hongos) sobre 12 formulaciones diferentes en fermentaciones sumergida y en estado sólido bajo condiciones controladas. Esta importancia radica no solamente en la relevancia comercial que puede llegar a tener la producción de enzimas de este tipo, sino porque el conocimiento acerca de cómo estos hongos producen estas enzimas, permiten profundizar en el conocimiento del funcionamiento de los hongos de pudrición blanca, lo cual posibilita incrementar la eficiencia en los cultivos de hongos para la obtención de sus cuerpos fructíferos, y de otras sustancias como polisacáridos de micelio y exopolisacáridos de los medios de cultivo en procesos de fermentación sumergida. De igual forma, se amplía el conocimiento en referencia al potencial que presentan los polisacáridos de los hongos macromicetos y su importancia como potenciadores del sistema inmunológico, para lo cual es relevante dilucidar los esquemas de extracción y la importancia de la obtención de las diferentes fracciones y su acción sinérgica.
1.1.2. Estructura de la tesis
El documento de la tesis se desarrolló en 10 capítulos. En el capítulo dos se presenta el estado del arte de la tesis, el cual contiene una descripción acerca de los hongos, los materiales lignocelulósicos, las enzimas lignocelulolíticas, los procesos de fermentación sumergida y en estado sólido, la producción de polisacáridos fúngicos, los modelos matemáticos, los métodos analíticos para determinar las actividades enzimáticas y polisacáridos, y la realización de rastreos para la producción de enzimas y polisacáridos de cepas fúngicas. En la revisión realizada sobre los hongos se contemplaron sus generalidades, su biología, crecimiento y desarrollo y un compendio de trabajos realizados en Colombia empleando hongos. En la sección de materiales lignocelulósicos, se encontrará información relacionada con la composición química de estos materiales y su distribución dentro de la matriz lignocelulósica, que permita dilucidar cómo pueden ser atacadas estas estructuras por las enzimas lignocelulolíticas producidas por los hongos de pudrición blanca. De igual forma, en esta sección se encontrará un compendio sobre tipos de pretratamientos que se les puede realizar a los materiales lignocelulósicos a fin de desordenar la matriz lignocelulósica y permitir más fácilmente el acceso de los hongos de pudrición blanca a estos materiales en procesos de fermentación sumergida. En la sección 2.3 se encontrará información general sobre las enzimas lignocelulolíticas, los tipos de estas enzimas producidas por los macromicetos de pudrición blanca, su modo de acción sobre los materiales lignocelulósicos y las aplicaciones de ellas en diferentes sectores industriales. En la sección 2.4 se encontrará un compendio sobre polisacáridos fúngicos, las clases de polisacáridos contenidos en la pared celular fúngica, cómo se producen, las funciones fisiológicas y su utilidad en la industria farmacéutica. En las secciones 2.5 y 2.6 se tratan los procesos de fermentaciones sumergidas y en estado sólido respectivamente con hongos de pudrición blanca, en las cuales se describe la importancia de conocer el comportamiento de estos hongos en cada uno de los procesos con sus ventajas y desventajas para producción a escala industrial. En la sección 2.7 se hace un compendio sobre el modelamiento de las cinéticas de fermentación de hongos de pudrición blanca, en el que se exponen las expresiones matemáticas más utilizadas para el ajuste de datos experimentales de procesos de fermentación sumergida y en estado sólido, así como los problemas que representa la ausencia de modelos para el escalamiento de estos procesos productivos a tamaño industrial. La última sección de este capítulo trata sobre cómo se realiza la evaluación de biomasa fúngica, enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos; en ella se discute cómo se determina la biomasa en procesos de fermentación en fase sólida por estimación indirecta, utilizando la medida de N-acetil-D-glucosamina (NAGA), el cual es precursor de quitina, componente mayoritario de la pared celular de los hongos. En esta sección también se hace referencia a los métodos para realizar el rastreo de cepas para la producción de biosustancias, en particular de enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos. En la última parte de esta sección se describen los métodos para determinar actividades enzimáticas lignocelulolíticas y polisacáridos. En el capítulo tres se encontrará el primer artículo producto de esta tesis doctoral: “Polysaccharide production by submerged and solid state cultures from several basidiomicetes”, aceptado para su publicación en la revista International Journal of Medicinal Mushrooms. Este artículo es el resultado del rastreo de polisacáridos realizado a diez especies de hongos de pudrición blanca con el fin de seleccionar la mejor cepa para la producción de exopolisacáridos y el cuerpo fructífero de mayor contenido de intrapolisacáridos. A su vez, el capítulo cuatro contiene el artículo: “Evaluación de las actividades endoglucanasa, exoglucanasa, lacasa y lignina peroxidasa en diez hongos de pudrición blanca”, como resultado del rastreo de enzimas lignocelulolíticas realizado a las diez cepas de hongos de pudrición blanca con el fin de seleccionar las mejores cepas productoras de celulasas y ligninasas. En los capítulos cinco, seis, siete y ocho se encontrarán los artículos realizados como compendio de los resultados obtenidos en el diseño experimental como elemento central de esta tesis. Los capítulos cinco y seis corresponden a la producción de enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos por fermentación en estado sólido, respectivamente, y los capítulos siete y ocho están relacionados con la producción de enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos por fermentación sumergida. En el capítulo nueve se encontrará el documento petitorio de la patente: “Biorreactor para la obtención de sustancias bioactivas por fermentación en estado sólido empleando hongos macromicetos”, en el cual se describe el diseño, construcción y puesta en marcha de un biorreactor de lecho fijo para fermentación en fase sólida con hongos de pudrición blanca para la producción de biosustancias como enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos. Por último en el capítulo diez se encontrará la discusión general de la tesis, en la que se condensarán los resultados generales obtenidos, los impactos y las perspectivas futuras del trabajo.
1.2. Objetivos de la Tesis
1.2.1. Objetivo general
Obtener enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos a partir de residuos lignocelulósicos disponibles en el Departamento de Caldas empleando macromicetos de pudrición blanca tanto por fermentación sumergida como por fermentación en estado sólido.
1.2.2. Objetivos específicos
Determinar la influencia de los medios de cultivo formulados con base en los residuos lignocelulolíticos seleccionados disponibles en el Departamento de Caldas sobre la producción de enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos empleando macromicetos de pudrición blanca por fermentación en medio líquido. Determinar la influencia de los medios de cultivo formulados con base en los residuos lignocelulolíticos seleccionados disponibles en el Departamento de Caldas sobre la producción de enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos empleando macromicetos de pudrición blanca por fermentación en estado sólido. Realizar y caracterizar cinéticamente los procesos de fermentación sumergida y en estado sólido a nivel piloto para la producción de enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos empleando macromicetos de pudrición blanca.
2. Estado del Arte y Marco Teórico
2.1. Los hongos
2.1.1. Generalidades de los hongos
Los hongos tienen una importancia fundamental como organismos descomponedores en el ambiente terrestre, ellos juegan un rol importante en los ciclos bio-geoquímicos de carbono, nitrógeno, fósforo y otros (Wainwright, 1988; Gadd, 1999). Los hongos hacen parte de una comunidad natural con plantas, otros microorganismos e invertebrados, esta combinación demuestra la condición mutualista de los hongos en el planeta y los pone como integrantes importantes en los procesos que involucran los ciclos ambientales de la tierra (Bosell et al., 2003). Adicionalmente, la importancia de los hongos se incrementa por su uso en la producción industrial de alcoholes, antibióticos, ácidos orgánicos, prebióticos, diversas sustancias de uso farmacológico, enzimas, además del gran potencial de uso en procesos de biorremediación, control biológico, entre otros (Burgstaller y Schinner, 1993; Tobin et al., 1994; Gadd, 2001). Los hongos son organismos celulares sin cloroplastos y por lo tanto heterótrofos que poseen paredes celulares compuestas de quitina y células con especialización funcional. Actualmente se consideran como un grupo heterogéneo, formado por organismos pertenecientes por lo menos a tres líneas evolutivas independientes (Whittaker, 1969; Naeem, 2002). Los hongos son organismos eucarióticos uni o pluricelulares que se desarrollan en sitios húmedos y con poca luz. Las células de los hongos pluricelulares se agrupan en filamentos llamados hifas que en conjunto reciben el nombre de micelio (Hudson, 1986; Chang y Miles, 2004). Los hongos descomponen la materia orgánica por medio de enzimas, absorbiendo las sustancias nutritivas. La reproducción puede ser asexual o sexual, principalmente por esporas. La mayor parte de los hongos son saprofitos; algunos se consideran parásitos; otros mutualistas o simbiontes basados en asociaciones con algas, líquenes o con otro grupo en forma de micorrizas, en los que los hongos acompañan a la mayor parte de las plantas, residiendo en sus raíces y ayudándolas a absorber nutrientes del suelo. Se piensa que esa simbiosis fue esencial para la conquista del medio terrestre por las plantas y para la existencia de los ecosistemas continentales (Hudson, 1986; Naeem, 2002). Otras características de los hongos pueden resumirse diciendo que carecen de tejido vascular y que no tienen movimiento. Mientras el componente principal de la pared celular de las plantas está formado por celulosa, la de los hongos contiene mayoritariamente quitina (Carlile et al., 2001). Los hongos son heterotróficos, igual que los animales, pero los animales primero ingieren y después digieren y los hongos primero digieren y después ingieren por medio de la producción de moléculas más simples. La mayoría de los hongos, como los animales, almacenan alimentos como glucógeno; mientras las plantas almacenan almidones, celulosas y azúcares simples. Los saprófitos se alimentan de materia orgánica en descomposición. La falta de clorofila afecta profundamente su forma de vida: no necesitan de la luz. Crecen en cualquier dirección; invaden el sustrato con filamentos absorbentes. Junto con las bacterias, su función principal es reciclar el carbono, el nitrógeno y los minerales esenciales para la nutrición. Como parásitos, usan la materia orgánica de organismos vivos, causando daño a plantas, animales y humanos (por las toxinas que producen). En simbiosis, pueden beneficiar a otros organismos, como las micorrizas en las raíces de las plantas y los líquenes (asociación de un hongo y un alga). Son organismos muy útiles por su versatilidad genética y fisiológica, producen enormes cantidades de esporas que permanecen viables hasta que las condiciones climatológicas favorecen su multiplicación. Descomponen toda clase de productos manufacturados, exceptuando los plásticos y algunos plaguicidas. Los hongos son muy útiles al ser humano, los hay que producen antibióticos, hormonas y esteroides y muchas más sustancias. Son muy importantes en la investigación, debido a que se reproducen rápida y fácilmente, ocupan poco espacio y su ciclo de vida puede ser controlado a conveniencia de los procesos (Whittaker, 1969; Moore, 1998a; Carlile et al., 2001). Las características moleculares (recién descubiertas) indican que los hongos están más relacionados con los animales que con las plantas (Hudson, 1986; Naeem, 2002). Existen diferencias entre los micromicetos y macromicetos. En las hifas de los micromicetos u hongos 10 inferiores, el citoplasma es generalmente continuo, no está separado por septos, posee numerosos núcleos minúsculos, que se desplazan libremente por una corriente citoplasmática que permite el transporte de nutrientes al interior del micelio. Los hongos superiores o macromicetos tiene septos con perforaciones centrales que permiten el paso del citoplasma (Carle - Urioste et al., 1997). Las setas o champiñones son macrohongos que tienen cuerpos fructíferos definidos, que pueden ser epigeos (encima de la tierra o aéreos) o hipogeos (bajo la tierra), son observados por el ojo humano y recolectados. Conforme con esta definición, champiñón no es un basidiomiceto, aéreo, suave y comestible exclusivamente; champiñón, también puede ser un ascomiceto no aéreo (Carlile et al., 2001; Chang y Miles, 2004). El tipo más común de champiñones es el que posee píleo (sombrero o cabeza) en forma de sombrilla y estípite (pie) como el Lentinus edodes; sin embargo existen macrohongos que tiene anillos, como Agaricus bisporus, o volva, como el Volvariella volvacea, o ambos como el Amanita phalloides. Adicionalmente, existen los que tienen forma de taza plegable, palo de golf, en forma de coral, de globo, además de diversos colores, lo que muestra que los cuerpos fructíferos de los hongos llamados champiñones son ricos en diversidad de formas y colores y que son un cúmulo de micelios en su estado de madurez reproductiva (Hudson, 1986; Chang y Miles, 2004). Principalmente en hongos superiores (Ascomycota y Basidiomycota) la parte recolectada del hongo no es más que el órgano de reproducción del hongo, llamado carpóforo (Gow, 1995a). El verdadero cuerpo del hongo, o cuerpo vegetativo, está escondido formado por una red de filamentos microscópicos inmersa en el substrato, llamada micelio (Carlile et al., 2001). Los hongos tanto por su capacidad hidrolítica como por su distribución, son los organismos lignocelulolíticos por excelencia. Entre ellos existen algunos con mayor capacidad degradativa de lignina: los que producen la llamada “pudrición blanca” que podrían utilizarse en el proceso de bioconversión de materiales lignocelulósicos. Esta categoría definida por el tipo de pudrición que causan en la madera contiene cientos de especies de Basidiomycetes. Todos son capaces de degradar la lignina, la celulosa y la hemicelulosa de la madera, pero la velocidad y extensión de la degradación de cada componente de la pared celular varía considerablemente (Joselau y Ruel, 1994; Carlile et al., 2001). Los hongos de pudrición castaña o café, clasificados dentro de los basidiomycetes, degradan preferentemente celulosa, la alta concentración de lignina que queda en la madera deteriorada evidencia la limitada capacidad de estos hongos para degradar la lignina. La lignina residual sin embargo, está químicamente alterada y diversas investigaciones revelan que ocurre cierto grado de degradación de lignina, principalmente a través de reacciones de demetoxilación. Atacan las capas de la pared a distancia, desde el lumen celular (no son capaces de degradar extensivamente a la lignina; lo que les facilitaría el acceso a los carbohidratos), por lo tanto los agentes del deterioro deben ser moléculas muy pequeñas para pasar por los poros de las paredes. No tienen exoglucanasa y en cambio llevarían a cabo la solubilización de la celulosa nativa por un mecanismo que involucra a la endoglucanasa y a factores no proteicos, entre ellos H2O2 y Fe(II) (reactivo de Fenton: que produce radicales libres -OH muy reactivos que oxidan las cadenas de celulosa). Producen extracelularmente H2O2 y la madera contiene suficiente Fe(III). Recientemente se describió en Gloeophyllum trabeum un ciclo hidroquinona-quinona redox extracelular que reduce Fe(III) y produce H2O2. Junto con la producción de enzimas, Trichoderma también excreta sustancias que generan hinchamiento e hidratación sobre las moléculas que va a degradar, presumiblemente como coadyuvantes de la degradación (Carlile et al., 2001). En estadíos tempranos del decaimiento hay reducción de la fuerza mecánica de la madera pero no pérdida de peso seco, mientras que en la pudrición blanca son dos procesos que progresan en paralelo. Esto se debe a que los hongos de pudrición castaña clivan completamente a través de las regiones amorfas de las microfibrillas antes de utilizar la celulosa; mientras que los hongos de pudrición blanca erosionan progresivamente la superficie de las microfibrillas y consumen la celulosa a medida que esta es degradada. El desperdicio de enzimas secretadas al medio es probablemente minimizado por la existencia de una cubierta o vaina de exopolisacáridos que se desarrolla alrededor de la hifa durante la colonización del hongo sobre la madera. Las moléculas de enzimas son retenidas en estas vainas y no se dispersan muy lejos de la zona del sustrato a ser degradado. Es sorprendente como esta acción permite que el hongo pueda digerir enzimáticamente el micelio viejo como fuente de nitrógeno orgánico y reutilizar su misma biomasa para desarrollar nuevas hifas (Hudson, 1986; Gow, 1995a; Carlile et al., 2001). Los hongos de pudrición blanca son los principales causantes de la degradación de la madera. Son más numerosos que los hongos de pudrición café, están representados por basidiomicetos y ascomicetos. Son capaces de degradar completamente la lignina hasta su mineralización, dejando la madera de color blanco en las zonas atacadas, por la celulosa remanente. Estos hongos producen grandes cantidades de oxido- reductasas, las cuales son las responsables de la mineralización de la lignina, además de tener la capacidad de producir y transformar sustancias no fenólicas en fenólicas para su fácil degradación y la obtención de sustancias aromáticas de menor tamaño que la lignina y de menor toxicidad. Este concepto lo describe Wong (2009), cuando expone el mecanismo de acción de la enzima lignina peroxidada (LiP) sobre la estructura de la lignina. La estructura de la lignina no es única, es decir depende de cómo se unen sus precursores, los alcoholes sinapílico, coniferílico y p-cumarílico, basados en substituciones metoxi sobre el anillo aromático. Estos precursores se unen por medio de diversos tipos de enlaces, los cuales conforman una matriz de unidades estructurales por enlaces C-C y éter. Estos enlaces incluyen el acoplamiento de β-O-4, β-5, β-β, 5- 5, 4-O-5, y 1-β. Este tipo de agrupamientos a través de tan diversos enlaces demuestran que la lignina se sintetiza como una estructura fenólica y no-fenólica. Teniendo en cuenta que en la estructura de la lignina están presentes sólo alrededor del 10-20% de subunidades fenólicas. Sin embargo, reacciones de demetilación y ruptura de los enlaces éter catalizados por la enzima LiP durante la degradación pueden generar productos fenólicos, que a su vez pueden servir de sustrato para la subdivisión de la lignina. En general, la ruptura de los restos no-fenólicos, componen el 80-90% de la estructura de lignina y se convierten en el indicador principal de la degradación enzimática. Asimismo, dentro del grupo de hongos de pudrición blanca existen los hongos que degradan selectivamente la lignina, los cuales degradan primero la mayor parte de la lignina presente en la vecindad del material que se encuentra rodeando la hifa antes de iniciar la degradación de la celulosa y los que atacan simultáneamente celulosa y lignina en la madera. De todos modos los hongos de pudrición blanca y café comparten varias características y ambos pueden ser utilizados con diversos fines en la industria agrícola (Hudson, 1986; Carlile et al., 2001).
2.1.2. Biología de los hongos
Los principales responsables del reciclaje de las plantas muertas son los hongos saprófitos. Esta actividad de reciclaje es esencial para la continuación de la vida en el planeta. El ciclo del carbono involucra la fijación de dióxido de carbono atmosférico dentro de moléculas orgánicas por fotosíntesis; los hongos juegan un papel importante en la degradación de estas moléculas reponiendo nuevamente el dióxido de carbono a la atmósfera. Además de madera aprovechable, una explotación forestal produce anualmente dos toneladas por hectárea de residuos forestales húmedos, los cuales pueden ser degradados exclusivamente por hongos especializados (Moore, 1998a; Chang y Miles, 2004). Además de la importancia que tiene la degradación de estos residuos forestales en el ciclo de otros elementos como el nitrógeno, fósforo y potasio, los cuales deben ser incorporados como componentes insolubles de las células vegetales (Moore, 1998a). Los hongos por ser organismos eucariotas típicos, poseen un núcleo que contiene varios cromosomas (siete en Candida albicans, ocho en Aspergillus nidulans y 16 en Saccharomyces cerevisiae) delimitado por una membrana nuclear, con nucléolo rico en ARN y orgánulos citoplásmicos como mitocondrias, vacuolas, retículo endoplásmico, aparato de Golgi y ribosomas 80S. El citoplasma se encuentra limitado por la membrana citoplásmica, que es una doble capa de lípidos que contiene proteínas y esteroles y que controla la permeabilidad celular y participa en la síntesis de la pared celular. La estructura de las células de los hongos es muy diferente de la de las bacterias que son organismos procariotas (Whittaker, 1969). Aunque comparten muchas estructuras, las células de los hongos se diferencian de las de las plantas en la composición de la pared celular y en que carecen de cloroplastos y clorofila, y de las humanas en que tienen pared celular y en la presencia de ergosterol en la membrana citoplásmica. Por el exterior de la membrana citoplásmica, presentan una pared celular que está compuesta fundamentalmente por polisacáridos y por diversas proteínas. Los polisacáridos más importantes son la quitina (polímero de N-acetil glucosamina), el manano (polímero de manosa) y el glucano (polímero de glucosa) (Carlile et al., 2001), siendo la quitina el componente mayoritario de la pared celular de los hongos, el cual es un polímero de la N-acetil-D- glucosamina; esta sustancia puede ser vista como un derivado de la celulosa, en la cual los grupos hidroxilos del segundo carbono de cada unidad de glucosa son reemplazados con grupos acetamido (NH(C=O)CH3). El desarrollo fúngico se concentra en el ápice de la hifa, con numerosas vesículas liberando enzimas líticas y biosintéticas de la membrana plasmática a una alta velocidad. Se han desarrollado amplios estudios sobre la biosíntesis de la quitina y de otros componentes de la pared celular (Carlile et al., 2001; Campbell y Farrell, 2004). Pero aún resta por estudiar en profundidad las rutas metabólicas de la biosíntesis de las enzimas que involucran la conversión de glucosa-6-fosfato en el precursor de quitina.
2.1.3. Crecimiento y desarrollo de los hongos
El crecimiento de los hongos es un fenómeno complejo que no tiene una definición sencilla. Este crecimiento es un incremento ordenado de los componentes celulares que involucran un aumento de biomasa. Las velocidades de crecimiento celular pueden variar por diferentes factores, tales como las características genéticas y el número de generaciones (multiplicaciones) de la cepa. Intervienen factores externos como las condiciones ambientales, las características físico-químicas y el estado (sólido o líquido) de los sustratos en los que crecen, las condiciones de asepsia de las plantas de producción donde se desarrollan los cultivos, entre otros. Estos factores también afectan de forma directa o indirecta la producción de metabolitos de los hongos durante las fases de crecimiento y desarrollo (Chang y Miles, 2004). El desarrollo de los hongos en cultivos líquidos induce el micelio a la formación de pellets, generalmente de forma esférica. La hifa en el interior del pellet está expuesta a condiciones limitadas de oxígeno, lo que no sucede con las hifas que se encuentran en la superficie de éste. Los micelios que se desarrollan en cultivos líquidos no están limitados espacialmente, como sí es el caso de los que crecen en medios sólidos (Stames, 1993; Chang y Miles, 2004). La fase vegetativa de los hongos filamentosos es especializada y está dividida en dos estructuras micelianas: rizomorfas, que corresponde a los ramales de hifas bien formados, y esclerotia, que son los ramales de hifas entrecruzadas o trenzadas. Estas estructuras probablemente cumplen con la función primaria de sobrevivencia de los hongos en condiciones ambientales adversas (Chang y Miles, 2004). En la fase reproductiva de los hongos intervienen múltiples estructuras especializadas. En referencia a la reproducción sexual de los ascomicetos, ésta involucra la producción de meiosporas dentro de una estructura en forma de bolsas llamadas ascas. Las meiosporas haploides son denominadas ascosporas. Para estudios genéticos los ascomicetos más trabajados han sido los géneros Saccharomyces, Neurospora y Sordaria (Carlile et al., 2001; Chang y Miles, 2004). Los basidiomicetos producen sus meiosporas (basidiosporas) sobre una estructura llamada basidio. Para estudios genéticos los géneros de basidiomicetos más empleados son Ustilago, Schizophyllum y Coprinus, y de los géneros comestibles se reconocen Agaricus, Lentinus, Volvariella, Flamulina y Pleurotus (Hudson, 1986; Chang y Miles, 2004). En referencia a los requerimientos nutricionales de los hongos, es necesario considerar tanto los requerimientos de oxígeno, como las concentraciones del ión hidrógeno. Si bien existen hongos, como las levaduras que pueden vivir en condiciones anaeróbicas, la mayoría de los hongos son considerados aeróbicos y las bajas concentraciones de oxígeno en los medios donde los hongos se desarrollan pueden generar un efecto negativo por tensión (déficit) de oxígeno. Del mismo modo, el ión hidrógeno (pH) puede provocar efectos positivos y negativos en el desarrollo morfológico del hongo, ya que este factor es determinante para la absorción y asimilación de nutrientes. En general, la mayoría de los hongos se desarrollan adecuadamente en intervalos de pH de 4 a 8, aunque hay excepciones y, por lo tanto, estas especies deben ser manejadas por separado. Los factores tensión de oxígeno y pH influyen de forma directa en los procesos metabólicos y consecuentemente en la habilidad de las especies fúngicas para utilizar las sustancias del medio como nutrientes en poco tiempo (Hudson, 1986; Carlile et al., 2001; Chang y Miles, 2004). De igual forma, en la utilización de las fuentes de carbono; éste provee los requerimientos energéticos y estructurales a las células fúngicas. El carbono es tomado por los hongos de diversas fuentes, como de polisacáridos, monosacáridos, ácidos orgánicos, aminoácidos, alcoholes, compuestos policíclicos, celulosas y hemicelulosas, además de tener la habilidad de degradar sustancias como la lignina. El nitrógeno es esencial en la síntesis de proteínas, purinas y pirimidinas. La quitina, un polisacárido de ocurrencia común en las paredes celulares de muchos hongos, también contiene nitrógeno. Los hongos utilizan una variedad de fuentes para obtener el nitrógeno necesario para la síntesis de estos compuestos esenciales. Se ha reportado por Burnett (1976) que existen organismos eucarióticos que tienen la habilidad de usar el nitrógeno atmosférico para la síntesis de estas sustancias; otras fuentes de nitrógeno utilizadas son los nitratos, el ión amonio y las fuentes de nitrógeno orgánico. Los minerales y las vitaminas también son muy importantes para el crecimiento y desarrollo de los hongos, además de intervenir directamente en la producción de sus metabolitos primarios y secundarios. En la Tabla 1 se muestran las proporciones de los minerales y vitaminas denominados esenciales para el adecuado crecimiento y desarrollo de los hongos. Cuando se pretende producir alguna sustancia en particular o se busca la fructificación de una especie específica, debe indagarse respecto a las necesidades puntuales del hongo en cuanto a inductores o inhibidores de las sustancias deseadas a fin de obtener el medio con las mejores características para un fin específico. En conjunto con los requerimientos nutricionales que demandan los hongos para su crecimiento y desarrollo, éstos también, necesitan unas condiciones físicas mínimas en los sustratos para su adecuado desarrollo. Los factores físicos más importantes son la temperatura, la luz, la humedad, la aireación y la gravedad. Otros factores que pueden incidir en el crecimiento de algunos hongos son la presión hidrostática, viscosidad, y radiación mutagénica. Comúnmente, se hace referencia a condiciones mínimas necesarias para el adecuado desarrollo de los hongos. Sin embargo, cada especie tiene unos requerimientos propios que deben ser suplidos cuando se desea optimizar los procesos de producción de alguna especie en particular (Chang y Miles, 2004).
Tabla 1. Requerimientos de minerales y vitaminas esenciales para el desarrollo fúngico Cantidad Compuesto Tipo/forma Función media Azufre (S): como sulfato de magnesio Para la síntesis de diversos metabolitos secundarios 10-4 M o suministrado por aminoácidos que como las penicilinas y mercaptanos y para la síntesis contienen S. de aminoácidos que contienen S. Fósforo (P): como fosfatos de El P se requiere para la síntesis de adenosin trifosfato 10-3 M potasio o por el mismo material, (ATP), ácidos nucleicos y los fosfolípidos de la cuando éste contiene P. membrana celular. Potasio (K): como fosfatos de potasio El K cumple el rol como cofactor en algunos sistemas 10-3 M enzimáticos, está involucrado en el metabolismo de los carbohidratos y es importante en el mantenimiento del balance iónico de los hongos. Magnesio (Mg): como sulfato de Es esencial para todos los hongos, muchas enzimas 10-3 M magnesio. son activadas por Mg y es importante en el metabolismo del ATP Elementos menores o microelementos Activador de enzimas oxido-reductasas. 10-6 M Minerales (traza): Hierro (Fe) Elementos menores o microelementos Activador de enzimas, alcohol deshidrogenasa, 10-8 M (traza): Zinc (Zn) contiene cuatro átomos de Zn/molécula. Elementos menores o microelementos Activador de muchas enzimas (oxido-reductasas), se 10-6 - 10-7 (traza): Manganeso (Mn) requiere en el ciclo ATC y en la síntesis de ácidos M nucleicos. Elementos menores o microelementos Requerido para el desarrollo normal de los hongos, 10-7 M (traza): Cobre (Cu) intervine como activador de varias enzimas, en cantidades muy altas resulta tóxico, ya que tiene actividad fungicida. Elementos menores o microelementos Requerido esencialmente si la fuente de nitrógeno 10-6 M (traza): Molibdeno (Mo) tiene nitratos, ya que es un elemento constituyente de (muy la flavoproteína nitrato reductasa, la cual reduce los variado) nitratos hasta el ión amonio. Elementos menores o microelementos Requerido para la formación de carpóforos de varias 10-6 M (traza): Calcio (Ca) especies de macromicetos. Tiamina (vitamina B1): adicionando Actúa como coenzima de la carboxilasa en la 100 µg/L pirimidinas, tiazoles o algunas regulación del metabolismo de carbohidratos por especies requieren la molécula de conversión del ácido pirúvico en acetaldehído y tiamina completa. dióxido de carbono. En especies de macromicetos, puede requerirse en la fase vegetativa, para fructificar o en la maduración de los carpóforos. Biotina (vitamina B7 o H): por Como coenzima para la carboxilación, es coenzima 5 µg/L materiales que la contengan o de la piruvato carboxilasa, actúa como donador o Vitaminas adicionándola directamente. aceptor de dióxido de carbono, en reacciones de carboxilación de ácidos grasos, tales como el ácido aspártico. Ácido nicotínico (B3), Ácido Como coenzimas de diversos grupos de enzimas. Muy pantoténico (B5) y ácido para-amino- pequeñas benzoico: suplidas por materiales cantidades naturales, que son heterogéneos, si (<1µg/L) los medios son sintéticos, deben adicionarse. Fuente: Chang y Miles (2004)
2.1.4. Investigaciones con hongos en Colombia
En la Tabla 2 se hace una recopilación de trabajos de investigación y revisiones publicados sobre hongos en general, hechos en Colombia con énfasis en hongos de pudrición blanca. Los trabajos representan el interés de las instituciones y de los académicos en la profundización, investigación y desarrollo en procesos y productos utilizando hongos y el conocimiento de estos organismos enfocados a las necesidades que demanda un país con vocación agrícola como Colombia. En la búsqueda realizada se encontró una mayor cantidad de trabajos referidos al conocimiento de hongos entomopatógenos, causantes de infecciones agrícolas y micromicetos de uso industrial. En la Tabla 2 se ubicaron algunas publicaciones seleccionadas que se refieren a temas como modificaciones genéticas, modo de acción y control biológico de hongos en general. De acuerdo al contexto de este trabajo en particular, se realizó con detalle la búsqueda de trabajos con hongos macromicetos, en especial con hongos de pudrición blanca; obteniéndose como resultado una cantidad de publicaciones muy importantes sobre diferentes tópicos como son el reconocimiento de las especies nativas de los bosques colombianos, su taxonomía, caracterización morfológica, y diversas aplicaciones, entre las que se destacan procesos de biorremediación a nivel de laboratorio, evaluación de técnicas de cultivo de varios hongos con atributos comestibles y medicinales a escala artesanal o de laboratorio, y caracterizaciones químicas de diversos grupos funcionales de interés de los cuerpos fructíferos de estos hongos; así como, trabajos donde se desarrollaron procesos de fermentación en fase líquida y sólida con estos organismos. Sin embargo, no se encontraron trabajos que planteen el escalamiento de procesos de fermentación en estado sólido y líquido para la producción de enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos con hongos de pudrición blanca silvestres o cepas adaptadas. Asimismo, no se encontraron referencias sobre investigación y desarrollo de exo e intrapolisacáridos a una escala de producción diferente a la de laboratorio.
Tabla 2. Trabajos de investigación y revisiones sobre hongos en general hechos en Colombia Título del trabajo Descripción Referencia Utilización de residuos de plátano Residuos del cultivo de plátano empleados como sustrato en un proceso de para la producción de metabolitos fermentación en estado sólido con el hongo de la podredumbre de la madera secundarios por fermentación en Lentinus crinitus. La producción de metabolitos fue determinada durante un Granada et al. estado sólido con el hongo Lentinus periodo de 21 días de fermentación conformado por 7 combinaciones de (2005) crinitus sustrato. Evaluaron la presencia de los compuestos aromáticos ácido ferúlico, vainilla, ácido vainillínico y eugenol en los días 11, 16 y 21. Estudio del efecto de dos Evaluación del uso de Tween 80 como protector enzimático y variación de inductores y un protector concentraciones de sales de cobre y manganeso como activadoras de las Gómez- enzimático sobre la actividad de las enzimas MnP y lacasa evaluadas sobre los materiales coloreados. Dorado et al. enzimas MnP y lacasa producidas (2005) por Trametes versicolor y su acción en la decoloración Establecimiento de un medio de Producción de fenoles totales, actividad antioxidante, crecimiento micelial y Peña-Serna et cultivo para una cepa nativa de un consumo de sustrato de una cepa nativa de un hongo poliporal en cultivo al. (2006) hongo poliporal sumergido. Inmovilización de hongos Evaluaron el efecto de los hongos Trametes versicolor, Pleurotus ostreatus y ligninolíticos para la remoción del Phanerochaete chrysosporium sobre la decoloración de un agua que contiene Fernández et colorante negro reactivo 5 colorante negro reactivo 5 (NR5), usado en la industria textil. El hongo con al. (2009) mayor capacidad para la decoloración fue el Trametes versicolor. Macromicetes (Ascomycota, Listado taxonómico de macromicetos encontrados en los departamentos de Vasco- basidiomycota) de la región del Caquetá y Amazonas (Colombia). Palacios et al. medio Caquetá, departamentos de (2005) Caquetá y Amazonas (Colombia) Nuevos registros de Los hongos Aphyllophorales (Basidiomycota) contribuyen de gran manera al Aphyllophorales (Basidiomycota) mantenimiento de la estructura y la función de los ecosistemas forestales a Ruíz y Varela en bosque montano húmedo través de su actividad saprofítica como descomponedores de madera. Los (2006) y de niebla de Colombia estudios sobre estos organismos han sido escasos y esporádicos en Colombia; de acuerdo con la literatura se han inventariado 262 especies para el país. Actividad enzimática, degradación Se determinaron las actividades enzimáticas de las enzimas celulolíticas: de residuos sólidos orgánicos y endoglucanasa, exoglucanasa y β-glucosidasa; ligninolíticas: lacasa, lignin Montoya generación de biomasa útil por el peroxidasa (LiP) y manganeso-peroxidasa (MnP) y xilanolíticas: endoxilanasa (2008) macromiceto Grifola frondosa del hongo en dos formulaciones diferentes basadas en aserrín de roble y borra de café Effect of culture parameters on the Desarrollo de las condiciones de cultivo del hongo Grifola frondosa en climas production of the edible tropicales. En Manizales Colombia se adaptó y desarrolló una cepa del hongo Montoya et al. mushroom Grifola frondosa en cultivos a nivel de laboratorio, con una eficiencia biológica de 34% (2008) (maitake) in tropical weathers comparable con las eficiencias obtenidas por Shen y Royse (2002) Producción de biomasa y Evaluaron la incidencia de diferentes fuentes de carbono (FC) en la producción exopolisacáridos de Grifola de biomasa y exopolisacáridos (EPS), bajo condiciones de cultivo sumergido. Zapata et al. frondosa bajo cultivo sumergido La máxima producción de biomasa micelial (21,10 ± 0,82) g/l y la máxima (2007) utilizando fuentes de carbono no producción de EPS (6,53 ± 0,14) g/l se logró utilizando el medio MB convencionales suplementado con FC Producción de enzimas Evaluación del crecimiento de los hongos de pudrición blanca: Trametes ligninolíticas por Basidiomycetes versicolor, Phanerochaete chrysosporium y Pleurotus florida sobre residuos García y mediante la técnica de sólidos agroindustriales para la producción de las enzimas ligninolíticas: LiP, Torres (2003) fermentación en fase sólida MnP y lacasa, utilizando matraces Dehidroergosterol: un artefacto Estudiaron la fracción esterólica del hongo Pleurotus sajor-caju. Establecieron generado durante el proceso de que el dehidroergosterol (ergosta-5, 7, 9 (11), 22-tetraen-3-ol) presente en el extracción de esteroles en el hongo extracto obtenido del hongo no es un producto natural sino un artefacto Rivera et al. Pleurotus sajor-caju producido durante el proceso de extracción de los esteroles con cloroformo. El (2005b) valor nutricional de los hongos cultivados en desechos agroindustriales del café puede verse afectado por la presencia de polifenoles. Determinación de ácidos grasos y Del cuerpo fructífero de Suillus luteus extrajeron e identificaron, con base en el compuestos triterpenoides del análisis de sus espectros de masas, dieciséis compuestos, los cuales Nieto y Ávila cuerpo fructífero de Suillus luteus corresponden al ácido palmítico, oléico, linolénico y linoléico, octadecanoato (2008) de etilo y otros a fin de buscar nuevas fuentes de sustancias con diversos usos industriales. Degradación de colorantes Evaluaron siete cepas de hongos ligninolíticos en función de su capacidad para industriales con hongos degradar el colorante Orange II y los colorantes industriales Rojo Cibacrón®, ligninolíticos Rojo Erionyl®, Azul Terasil® y Turquesa Erionyl® en medio semisólido y líquido. Phanerochaete chrysosporium y Phanerochaete sordida mostraron Cardona et al. alta capacidad de decoloración, alcanzando 98% en medio líquido para Orange (2009) II y entre 82 y 86% para los colorantes industriales después de ocho días de tratamiento. En medio semisólido todos los colorantes se eliminaron completamente. Estudio químico de la fracción Obtuvieron la fracción insaponificable del Lentinula edodes alcanzando 5 Benavidez- insaponificable del hongo fracciones denominadas: LE1, LE2, LE3, LE4 y LE5. Del estudio de los Calvache macromiceto Lentinula edodes espectros de masas de las diferentes fracciones por comparación con patrones y (2004) (Shiitake) análisis de fragmentación, identificaron 8 esteroles tipo ergostano. Aislamiento y evaluación de la Evaluaron hongos seleccionados recolectados de la reserva natural La montaña actividad enzimática de hongos del ocaso, Quimbaya-Quindío, les determinaron actividad ligninolítica Chaparro y descomponedores de madera en la semicuantitativa inoculando los hongos sobre agar y realizando inducción de Rosas (2006) reserva natural La montaña del las ligninasas con ABTS. ocaso, Quimbaya-Quindío Evaluación de la síntesis de Estudio sobre la capacidad de síntesis de proteína de los hongos Pleurotus Montoya y proteína a partir del crecimiento ostreatus, P. sajor-caju y P. pulmonarius sobre uno de los residuos de la Restrepo vegetativo de Pleurotus spp. sobre Industria Licorera de Caldas, uva pasa y algarrobo, en su fase vegetativa. (2006) residuos de algarrobo y uva pasa Validación de deshidratación Deshidratación convencional del hongo, le realizaron evaluación convencional para la conservación microbiológica al producto obtenido y el análisis estadístico. La deshidratación Castro-Ríos del hongo comestible Pleurotus de esta seta la realizaron a cuatro temperaturas (45, 50, 55 y 60°C). (2006) sajor-caju Incorporación de cafeína en el Estudiaron la composición química de los metabolitos secundarios de Nieto- hongo Pleurotus sajor-caju Pleurotus sajor-caju cultivado en pulpa de café, encontraron que el hongo Ramírez et al. cultivado sobre tiene la capacidad de incorporar en su fructificación la cafeína, componente del (2007) pulpa de café sustrato (cerca del 1,3% en base seca), sin modificar la estructura del alcaloide. Macrocybe titans (Bigelow y Descripción macro y microscópica a partir de colecciones realizadas durante Kimbr.) Pegler, Lodge y Nakasone, los años 2001-2004 del Macrocybe titans (Bigelow y Kimbr.) Pegler Lodge, y Corrales y un registro nuevo para Colombia Nakasone en los departamentos Colombianos de Antioquia y Santander. Este López (2005) género y especie se registran por primera vez para Colombia. Nuevos aspectos sobre la Revisión sobre la importancia de los hongos para el hombre y los aspectos Montes et al. clasificación de los hongos y su indeterminados sobre la clasificación y ubicación como reino, evolución: (2003) posible aplicación médica conceptos filogenéticos, biológicos y morfológicos Producción de enzimas Evaluación de la propagación de los hongos Bjerkandera adusta y ligninolíticas con hongos Phanerochaete chrysosporium sobre suelos contaminados mezclados con Quintero et al. basidiomicetos cultivados sobre materiales lignocelulósicos que les suministran la fuente de carbono necesaria (2006) materiales lignocelulósicos para sostener su crecimiento e inducir la producción del complejo enzimático ligninolítico y la biodegradación de contaminantes. Screening of white rot fungal Evaluación de la capacidad de degradación de las especies Bjerkandera adusta, species for their capacity to Irpex lacteus, Lentinus tigrinus, Phanerochaete chrysosporium, Phanerochaete Quintero et al. degrade lindane and other isomers sordida, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Polyporus cialatus, y Stereum (2008) of hexachlorocyclohexane (HCH) hirsutum actuando sobre varias concentraciones de sustancias tóxicas como α-, β-, γ- y δ isómeros de hexaclorociclohexano (HCH) Aislamiento e identificación de Aislaron e identificaron hongos filamentosos en los Páramos de guasca y cruz Arias y hongos filamentosos de muestras verde específicamente en frailejones. Los principales géneros encontrados Piñeros de suelo de los páramos Guasca y fueron Aspergillus, Penicillium, Cladosporium, Curvilaria, Mucor, (2008) Cruz verde Paicelomyces, Trichoderma, entre otros. Cultivo de hongos comestibles del Desarrollo de cultivos de hongos comestibles del género Pleurotus sobre Rodríguez y género Pleurotus sobre residuos mezclas de residuos de café a nivel de planta piloto con el método de Jaramillo agrícolas de la zona cafetera anaerobiosis. (2005) Producción comercial del Producción de champiñón Pleurotus ostreatus sobre pulpa de café como una Lozano Champiñón/Pleurotus ostreatus/ en alternativa ambiental y nutricional de la zona cafetera (1989) pulpa de café Producción de hongos comestibles Evaluación de la producción artesanal de los hongos comestibles Pleurotus en residuos de caña de azúcar. VI ostreatus; Pleurotus djamur; Pleurotus sajor-caju; Volvariella esculenta; Guzmán et al. congreso Colombiano de la Volvariella volvacea; Lentinus edodes sobre residuos de caña de azúcar (2003) Asociación de Técnicos de la Caña de Azúcar Hongos comestibles: otro producto Evaluación de las posibilidades de producción de hongos comestibles de los de las plantaciones de coníferas no órdenes Agaricales; Aphyllophorales; Lycoperdales; Pezizales sobre residuos Uribe-López explotado en Colombia de coníferas en Colombia. (1983) (Agaricales, Aphyllophorales, Lycoperdales, Pezizales) El cultivo de hongos comestibles Eficiencias biológicas (kg de hongos frescos/kg sustrato, base seca) X 100 de Rodríguez sobre desechos agroindustriales hongos del género Pleurotus medidas sobre sustratos a base de pulpa de café (1993) proveniente de despulpado sin agua. Aprovechamiento de los residuos Se determinó la factibilidad técnica y económica de cultivar el hongo sólidos generados en el cultivo e comestible Pleurotus sajor caju, el hongo comestible y medicinal Lentinula Rodríguez industrialización del café para la edodes y el hongo medicinal Ganoderma lucidum, sobre sustratos preparados (2003) producción de hongos comestibles con los subproductos generados durante el proceso de cultivo e y medicinales industrialización del café. Con intervalo de relación C/N de 40 a 60. Utilización de los desechos del Evaluación de los residuos del cultivo de banano para el cultivo artesanal de Arteaga- banano para el cultivo del hongo hongos comestibles Pleurotus ostreatus. Hoyos (2002) comestible Pleurotus ostreatus Evaluación de algunos residuos Evaluación de residuos de jardín, como sustrato para la producción de dos Garcés- orgánicos como sustrato para el especies de hongos, Pleurotus ostreatus y Pleurotus pulmonarius y Molina et al. cultivo de hongos comestibles estandarización de la producción de semilla. (2006) Fortificación de hongos Fortificación del hongo comestible Pleurotus ostreatus con calcio y vitamina C Cortés et al. comestibles (Pleurotus ostreatus) como tratamiento posterior a la cosecha y determinaron vida de anaquel del (2007) con calcio, selenio y vitamina C hongo. Registro de Gimnopilus rugulosus Se registra por primera vez en Colombia Gimnopilus rugulosus (Agaricales, Cardona et al. (Agaricales, Cortinariaceae) de Cortinariaceae), prospera en zonas húmedas subtropicales der Colombia, entre (2005) Colombia los 2.500 y 3.200 m s.n.m. Se ha reportado en Colombia, Costa rica y México. Ácidos grasos, ésteres y esteroles Del extracto en acetato de etilo del hongo comestible Laccaria laccata se del cuerpo fructífero del hongo aislaron 3 ácidos grasos, 6 esteres etílicos, 5 esteroles y un triterpeno Laccaria laccata ergostánico. Los compuestos se identificaron como ácido palmítico, ácido Nieto y linoléico y ácido oléico, hexadecanoato de etilo, 8-octadecenoato de etilo, 9- Cucaita octadecenoato de etilo, 9,12-octadecadienoato de etilo, estearato de etilo, (2007) eicosanoato de etilo, ergosta- 2,5,7,9(11), 22-pentaeno, ergosta-5,7,22-trien-3_- ol (ergosterol), ergosta-7,22-dien-3_-ol, ergosta-7-en-3_-ol, ergosta- 5,7,9(11),22-tetraen-3_-ol y estigmast-5-en-3-ol. Actividad enzimática de hongos y Evaluaron seis aislamientos de Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae Delgado et al. su patogenicidad para cuantificar la actividad catalítica de cinco enzimas y su relación con la (2001) sobre Hypothenemus hampei patogenicidad sobre la broca del café (Hypothenemus hampei). Aislamiento y evaluación de la De hongos colectados de troncos caídos con diferentes estados de Chaparro et actividad enzimática de hongos descomposición en la reserva natural La Montaña del Ocaso, se evaluó su al. (2009) descomponedores de madera actividad ligninolítica y la celobiosa deshidrogenasa (CDH). Seleccionaron los (Quindío, Colombia) hongos con mayor actividad enzimática de troncos con diferente grado de descomposición: Cookeina sulcipes, Corticiaceae, Xylaria polymorpha y Earliella sp. Micorrizas Arbusculares del Sur de Evaluaron la presencia natural de hongos micorrícicos de tipo arbuscular la Amazonia Colombiana y su (HMA) en suelos ácidos de textura franco-arcillosa a arcillosa del sur de la Peña-Venegas Relación con Algunos Factores Amazonia colombiana bajo bosque, rastrojo joven, y praderas establecidas, a et al. (2007) Fisicoquímicos y Biológicos del dos profundidades diferentes. Suelo Avances en conocimiento y En Cenicafé se están usando dos aproximaciones para producir un hongo Góngora mejoramiento del hongo mejorado para el control de la broca: 1). Estudio de la genómica de Beauveria (2009) entomopatógenos Beauveria bassiana. conocimiento de genes y modificación genética y 2) Exploración y bassiana para el control de la uso de la diversidad genética de Beauveria bassiana broca del café, Hypothenemus hampei Caracterización de una cepa nativa Evaluación de la cepa nativa de Aspergillus niger en la producción de ácido Sáez et al. de Aspergillus niger y evaluación cítrico sobre un sustrato con sacarosa y otro con almidón. Los rendimientos (2002) de la producción de ácido cítrico fueron bajos comparados con los que se reportan en la literatura. Contribución al estudio de Realizaron el aislamiento e identificación de hongos filamentosos originarios Chitiva - microhongos filamentosos en los de los páramos de Guasca y El Tablazo, presentes en muestras del suelo y en Jaramillo et ecosistemas páramo de guasca y el las hojas de las plantas Espeletia barclayana y Espeletia killipii. al. (2009) tablazo Diversidad taxonómica y ecológica Determinaron la estructura y composición de la comunidad de insectos Amat-García de la entomofauna micófaga en un micófagos encontrados en robledales (Quercus spp.) de la región de Iguaque et al. (2001) bosque alto-andino de la cordillera (Villa de Leyva-Boyacá). Colectaron 1778 insectos en estado adulto; en oriental de Colombia laboratorio criaron 3409 para un total de 5187 individuos distribuidos en 48 morfoespecies, éstas fueron infectadas por los hongos entomopatógenos. Evaluación de la patogenicidad de Evaluación del efecto de los hongos Bauveria basiana y Metarhizium Valbuena y los hongos Bauveria basiana y anisopliae sobre los estados parásitos de la garrapata del ganado Rhipicephalus Alzate (2007) Metarhizium anisopliae en el micraplus con diferentes concentraciones de esporas de cada una de las control de la garrapata del ganado especies de los hongos. Rhipicephalus micraplus en su fase parasítica en su estado larval y ninfal Problemas fitopatológicos en Se expone la recopilación de los estudios ubicados realizados en Colombia, Carreño et al. especies de la familia Solanáceas referentes a las enfermedades causadas por tres de los patógenos más (2007) causados por los géneros importantes que afectan la familia Solanáceas: Phytophthora, Alternaria y Phytophthora, Alternaria y Ralstonia. Ralstonia en Colombia. Una revisión Evaluación de la susceptibilidad de Evaluación de la capacidad de hongos endófitos aislados de rosa como Corredor et al. hongos endófitos aislados de rosa controladores biológicos de las plagas preferentes en rosa y su resistencia a los (2007) (Rosa hybrida) a insecticidas insecticidas. comerciales El género Pseudocyphellaria Descripciones morfoanatómicas, complementadas con datos de pruebas Moncada y VAIN. (Lobariaceae - ascomycetes químicas con K, P, C, KCl y cromatografía en capa fina de las especies Forero (2006) liquenizados) en encontradas, comentarios de datos ecológicos y de distribución geográfica. Colombia Aislamiento de hongos Encontraron que los principales solubilizadores del fosfato de calcio fueron Vera et al. solubilizadores de fosfatos de la Trichoderma aureoviride, Aspergillus aculeatus, Trichoderma cepa 1 y (2002) rizosfera de arazá (Eugenia Trichoderma cepa 2 y para el fosfato de hierro: Aspergillus oryzae, stipitata, Myrtaceae) Paecilomyce cepa 3, Gongronella butleri y Fusarium oxysporum. Macromicetos observados en Se analizaron algunos patrones de diversidad y distribución de macrohongos en Montoya et al. bosques del Departamento de relación con el paisaje antropogénico en varios tramos de bosques del (2010) Caldas: su influencia en el departamento de Caldas. Se hace la relación de los géneros encontrados, como equilibrio y la conservación de la indicadores para el monitoreo biológico de la Eco-región. Los géneros biodiversidad encontrados corresponden al orden Agaricales con 12 familias y 35 géneros; seguido del orden Polyporales con cinco familias y 11 géneros. Influencia del sustrato utilizado El objetivo del presente estudio fue el de evaluar el efecto del sustrato sobre las Nieto y para el crecimiento de hongos propiedades nutricionales o nutriceúticas de hongos del género Pleurotus. Chegwin, comestibles sobre sus Como resultado se determinó que efectivamente la composición de los hongos (2010) características nutraceúticas en cuanto al contenido de proteínas netas, fibra, humedad, cenizas, carbohidratos y grasas totales varía con el sustrato empleado. Dehidroergosterol: un artefacto Durante el estudio químico de la fracción esterólica del hongo Pleurotus sajor- Rivera et al. generado durante el proceso de caju se estableció que el dehidroergosterol (ergosta-5,7,9 (11),22-tetraen-3-ol) (2005a) extracción de esteroles en el hongo presente en el extracto. Pleurotus sajor-caju Growth, fruiting and Efecto de las actividades enzimáticas sobre los diferentes estados de Montoya et al. lignocellulolytic enzyme producción del hongo G. frondosa en diversas mezclas de materiales (2011a) production by the edible mushroom lignocelulósicos. Grifola frondosa (maitake) Evaluación in vitro de celulasas La celulosa es el polisacárido más abundante en la naturaleza, los organismos Gutiérrez producidas por cepas nativas de capaces de degradarlo son principalmente hongos y bacterias, ellos son Ramírez et al. Trichoderma reesei, Cladosporium reconocidos por la habilidad de producir enzimas no sólo celulasas sino (2012) herbarum y Aspergillus niger también amilasas, proteasas y peptidasas entre otras; que les permite el reciclado de material orgánico de nuevo al suelo. La hidrólisis de ésta se realiza mediante un complejo enzimático llamado celulasas, constituido básicamente por tres enzimas: Endoglucanasa, exoglucanasa y β-glucosidasas. Macromicetos en Zona Rural de Mediante colecciones puntuales se recolectaron 30 especímenes en la zona Ortiz-Moreno Villavicencio rural de la ciudad de Villavicencio, que posee un paisaje de Piedemonte. En el (2010) muestreo predominaron los basidiomicetos. El orden Polyporales y la familia Polyporaceae fueron los mejor representados y los géneros más frecuentes Trametes y Auricularia. Se espera que este estudio contribuya al conocimiento de la diversidad micológica en los Llanos Orientales de Colombia. Modeling Grifola frondosa fungal Aplicación de modelos matemáticos a fin de describir el crecimiento y Montoya et al. growth during solid-state desarrollo de la fase vegetativa del hongo G. frondosa sobre un sustrato sólido (2011b) fermentation con materiales lignocelulósicos. Production of Biomass, Production of Biomass, Polysaccharides, and Ganoderic Acid using Non- Zapata et al. Polysaccharides, and Ganoderic conventional Carbon Sources under Submerged Culture of the Lingzhi or (2012) Acid using Non-conventional Reishi Medicinal Mushroom, Ganoderma lucidum (W.Curt.:Fr.)P. Karst. Carbon (Higher Basidiomycetes)
2. 2. Materiales lignocelulósicos
El desarrollo de los hongos de pudrición blanca requiere de sustratos compuestos de materiales que le proporcionen las características físicas y la composición química adecuada para su crecimiento y desarrollo en condiciones controladas. Los materiales lignocelulósicos cumplen con las condiciones generales requeridas por estos hongos. Estos materiales son los principales constituyentes de los vegetales, representados por lignina, celulosa, hemicelulosa y pectina en sus paredes celulares y el almidón utilizado como reserva energética de la célula. Estos materiales son los que descomponen los hongos de pudrición blanca. La celulosa, componente mayoritario de la pared celular de todas las plantas, es el material natural más abundante en el planeta. Aunque su estructura química es simple, por estar compuesta de unidades de glucosa y ser una cadena lineal tiene diversas propiedades químicas que han sido de interés científico y técnico. Asimismo, la lignina que es otro componente importante de los materiales lignocelulósicos se localiza entre los carbohidratos que componen las maderas formando una red a través de enlaces covalentes cross-liking (ver Figura 2). Por ejemplo, la lignina en las maderas blandas los enlaces covalentes se dan entre la lignina y ambas hemicelulosas (glucomanano y Xilano) y en maderas duras el contenido de glucomanano es bajo, por lo que el enlace dominante se da entre la lignina y el Xilano (Ek et al., 2009). Además de considerar que, estos materiales lignocelulósicos se constituyen como uno de los materiales más acumulables del planeta, debido a que en este grupo se encuentran los residuos agroindustriales, forestales y residuos sólidos urbanos, entre otros (Papinutti et al., 2003; Sánchez y Cardona, 2007). Los carbohidratos como componentes importantes de los materiales lignocelulósicos, son muy versátiles, ya que hacen parte de una gran variedad de productos en la industria, como la alimentaria, farmacéutica, textil, papelera y en la producción de empaques biodegradables, entre otros. De la misma manera, los carbohidratos juegan un rol muy importante en el establecimiento y evolución de la vida en la tierra por la creación directa de una fuente de energía química a partir de la energía solar. Los carbohidratos son producidos durante el proceso de fotosíntesis. Los carbohidratos están distribuidos en plantas y animales y cumplen diversas funciones: i) reserva de energía como el almidón, fructanos y glucógeno, ii) materiales estructurales como la celulosa, quitina, xilanos y mananos, iii) sustancias protectoras, algunas plantas producen carbohidratos repelentes de insectos o inhibidores de formación de hielo como el arabinoxilano en la supervivencia de los cereales en climas templados, iv) fracciones de polisacáridos, los cuales pueden ser oligosacáridos conjugados con proteínas (glicoproteínas) o con lípidos (glicolípidos) como componentes importantes de la membrana celular que pueden servir como sondas con las cuales la célula interactúa con su entorno, v) como agentes de transferencia de información, como los ácidos nucleicos (Cui, 2005). Los materiales lignocelulósicos se clasifican de acuerdo a su origen. En la Tabla 3 se muestra una clasificación general de los principales materiales con alto contenido de biomasa lignocelulósica, componentes básicos para el desarrollo fúngico. Los residuos agrícolas compuestos por pajas, rastrojos, capachos y otros residuos como las pulpas de café, desechos de cultivos de hortalizas (de corta duración), leguminosas y oleaginosas, etc. y en general, los más representativos de la región cafetera y el país se mencionan en la Tabla 5. Los materiales provenientes de maderas, se componen de dos subgrupos, los que pertenecen a las maderas duras, provenientes principalmente de angiospermas, como el álamo, el eucalipto, el aspen, el roble, el arce, entre otros. Las maderas blandas, en cambio corresponden a maderas de coníferas, ubicándose los árboles de gimnospermas como el pino, el abeto, la pícea, el alerce, entre otros, haciendo la consideración que las maderas blandas contienen más lignina que las maderas duras. La biomasa herbácea proviene de las plantas que no generan madera, sus tallos son verdes, en general se consideran los follajes, pastos, etc. Los residuos sólidos urbanos son muy heterogéneos y en general contienen un alto contenido de material lignocelulósico, como residuos de papel, cartón, cáscaras de frutas y vegetales en general, residuos de jardinería, entre otros (Sánchez y Cardona, 2007).
Tabla 3. Clasificación de los principales materiales con alto contenido de biomasa lignocelulósica. Tipo de Biomasa Ejemplos Residuos Agrícolas Pajas: Trigo, arroz, cebada, algodón, sorgo, millo, cogollos de caña, etc. Otros residuos: rastrojo de maíz, capacho de coco, algodón de desecho, zoca de café, pulpa de café, vainas de leguminosas. Residuos Bagazos: caña, sorgo dulce. Agroindustriales Otros residuos: cascarilla de arroz, huesos de aceituna, borra, cascarilla y película plateada de café, cascarilla de cacao y de cereales como arroz, sorgo, maíz; tortas de oleaginosas (algodón, soya y palma) Madera y Residuos Madera dura: álamo, eucalipto, aspen. Forestales Madera blanda: pino, picea. Aserrín, ramas: de roble, mezclas de industrialización de madera en construcción de muebles. Residuos Lignocelulósicos Papel: periódico, de oficina utilizado, lodo de papel reciclado Biomasa Herbácea Pastos: pasto de pradera, alpiste rosado, pasto Bermuda de la variedad costera, fleo de los prados, Heno de alfalfa. Residuos Sólidos Urbanos Fracción celulósica: papel, cartón, madera, residuos de jardinería, cáscaras de frutas y verduras. Modificado de Sánchez y Cardona (2007)
En la Tabla 4 se relaciona la composición en base seca de diferentes materiales lignocelulósicos, incluyendo algunos residuos de la industria pecuaria. Se observa que son muy representativos los contenidos de los polímeros celulosa y hemicelulosa en las maderas duras y blandas, bagazo de caña, residuos de papel, pajas de cereales (en este caso de trigo), tusa de maíz y pastos (Sánchez y Cardona, 2007). Estos altos contenidos de celulosa en todos estos materiales, los convierten en relevantes para la obtención de productos de valor agregado por fermentación de los azúcares derivados de la hidrólisis de este polisacárido. De igual forma, todos estos materiales contienen lignina, la cual puede ser removida o tratada con hongos de pudrición blanca a través de sus enzimas oxido-reductasas (Kirk y Farrel, 1987).
Tabla 4. Composición porcentual (en base seca) de varios materiales lignocelulósicos Materiales Celulosa Hemicelulosa (%) Lignina (%) (%) Bagazo de caña 50 25 25 Madera dura 40-55 24-40 18-25 Madera blanda 45-50 25-35 25-35 Cubierta de la nuez 25-30 25-30 30-40 Tusa de maíz 45 35 15 Pastos 25-40 35-50 10-30 Papel 85-99 0 0-15 Paja de trigo 30 50 15 Basura surtida 60 20 20 Hojas 15-20 80-85 0 Hebras de semilla de algodón 80-95 5-20 0 Papel periódico 40-55 25-40 18-30 Papeles de desecho de pulpas químicas 60-70 10-20 5-10 Sólidos primarios de aguas residuales 8-15 - 24-29 Desechos de cerdo 6 28 - Estiércol bovino sólido 1,6-4,7 1,4-3,3 2,7-5,7 Pasto bermuda de la variedad costera 25 35,7 6,4 Pasto de pradera 45 31,4 12 Fuente: Sánchez y Cardona (2007)
En la Figura 1 se muestra un esquema simple del complejo lignocelulósico de los tejidos vegetales donde se puede observar el arreglo de las fibras de celulosa, hemicelulosa y la matriz lignina-hemicelulosa haciendo parte de la pared celular primaria y secundaria. Asimismo, en la Figura 2 se muestra un esquema de la distribución molecular de la lignina y los polisacáridos en los materiales lignocelulósicos, donde se evidencia la distribución de las diferentes concentraciones de lignina en la estructura. La lignina se deposita en las zonas precedidas de una deposición de carbohidratos. El primer depósito de lignina inicia en las esquinas de la pared celular y continua en la laminilla media. El segundo estado de lignificación ocurre después de la deposición de celulosa y hemicelulosa en la capa S2. La principal lignificación se da en la etapa S3, aunque la mayor concentración de lignina se presenta en la capa S2 (media) tanto para maderas duras como blandas y su asociación en red parece más claramente con el xilano que con mananos y celulosa (Ek et al., 2009).
Figura 1. a) Estructura simplificada de la pared celular que muestra la laminilla media (ML), pared primaria (P), capas secundarias de la pared celular (S1, S2, S3) y lignina en forma de capas verrugosas sobre la pared celular (W). Las flechas indican la orientación de las microfibrillas de celulosa en las capas individuales de la pared celular secundaria. La microfotografía de la derecha, muestra la localización de la lignina en la laminilla media intercelular (ML) y la laminilla de la esquina entre las traqueidas de pino, b) y las fibras de abedul, c). Las capas S1 y S3 no aparecen en las microfotografías. Fuente: Ek et al. (2009)
Las materias primas de mayor utilización en los procesos de fermentación son los subproductos agropecuarios y agroindustriales, por su gran disponibilidad y por su bajo precio. En Colombia, por tener una alta vocación agrícola y por ser un país tropical, existe una gran cantidad de residuos que pueden ser utilizados como materias primas para los medios de cultivo, en la Tabla 5 se muestra la distribución por grupos de materiales orgánicos naturales disponibles en Colombia. En el Departamento de Caldas, los materiales lignocelulósicos más representativos son: i) residuos del cultivo e industrialización del café, como la pulpa, soca, cascarilla, borra de café; ii) residuos agroindustriales, como el capacho de coco y otros residuos de frutas, iii) residuos de la agroindustria de la caña de azúcar y iv) residuos de la agroindustria de la madera, especialmente del beneficio del roble. Algunos de estos residuos están siendo utilizados como combustible en los mismos procesos productivos, como materias primas de procesos de compostaje o en otros usos secundarios en avícolas, caballerizas, entre otros.
2.2.1. Celulosa
La celulosa, que es un biopolímero de D-glucosa, es el material orgánico más abundante sobre la corteza terrestre. Las plantas sintetizan la celulosa como material estructural para soportar su peso. Las estructuras longitudinales de celulosa, llamadas micro fibrillas, forman haces por los puentes de hidrógeno que se crean entre los numerosos grupos OH de los anillos de glucosa. En la celulosa las unidades de D-glucosa están unidas por enlaces glucosídicos β(1,4), que le confieren una disposición bastante rígida y muy estable. En la Figura 3 se muestra la estructura parcial de la celulosa.
Figura 2. Distribución de la lignina y polisacáridos a nivel molecular en los materiales lignocelulósicos. Fuente: Ek et al. (2009)
Tabla 5. Principales materiales orgánicos naturales disponibles en Colombia Materiales (según cultivo) Ubicación Lignocelulósico proteico Caña de azúcar (bagazos de Valle del Cauca, Caldas, ingenio y de trapiche, melaza, X Santander, Antioquia desechos de cultivo) Caldas, Risaralda, Quindío, Café (borra, cascarilla, pulpa, Antioquia, Tolima, Nariño, X mucílago, zoca) Huila Cereales (cascarilla, jarabes, Tolima, Antioquia, Valle, X residuos de cultivo) Llanos Orientales Tolima, Valle, Eje cafetero, Leguminosas (residuos de Santander, Cundinamarca, X X cultivo y de cosecha) Antioquia Oleaginosas (residuos de Tolima, Antioquia, Costa X X cosecha y tortas) Atlántica, Valle del Cauca Maderas (aserrín, cascarilla, Caldas, Antioquia, Chocó, X viruta) Cundinamarca Frutales (cáscaras, semillas y Todo el país X residuos de cosecha) Hortalizas (residuos de cosecha, Caldas, Cundinamarca, X hojas, tallos) Antioquia Centrales de sacrificio de animales (sangre, plumas, Todo el país X cascos, cuernos) Cacao (cascarilla y residuos de Caldas, Antioquia, X X cultivo) Cundinamarca
Figura 3. Estructura de la celulosa mostrando los enlaces glucosídicos β(1,4). Fuente: Sánchez y Cardona (2007)
La longitud del polímero es altamente variable y depende del organismo del cual la celulosa provenga, así como de la edad y estado metabólico al momento de su extracción. Un grado de polimerización promedio de alrededor de 10.000 se determinó para la celulosa de la madera (Zabel y Morrel, 1992b). Cada monómero de glucosa presenta una rotación de 180º respecto de los residuos contiguos, estabilizada por la formación de puentes de hidrógeno intramoleculares. Las microfibrillas están conformadas por zonas cristalinas donde las moléculas de celulosa se hallan ordenadas y regiones para cristalinas donde se hallan desorganizadas. La estructura cristalina de la celulosa hace que la pared de la célula sea anisótropa (que presentan más de un índice de refracción de la luz en función de la dirección de vibración o polarización de las ondas luminosas) y por consiguiente con doble refracción (birrefringente) cuando se mira con luz polarizada (Meier, 1955). Se consideran dos tipos de celulosa: la nativa o cristalina, caracterizada por un alto grado de cristalinidad u ordenamiento y de polimerización, resultando así insoluble (ej.: Avicel, fibras de algodón, papel de filtro, etc.); y la celulosa modificada, la cual resulta soluble como la celulosa amorfa, carboximetilcelulosa, y los celooligosacáridos, en los cuales el grado de cristalinidad y el grado de polimerización es menor (Levin, 1998; Sánchez y Cardona, 2007). En resumen las fibras de celulosa están ordenadas en cristales de tres dimensiones. La primera dimensión está dada por enlaces covalentes, impuestos por puentes de hidrógenos a lo largo de la cadena de celulosa, que le da la longitud final de la fibrilla, la cual depende de su grado de polimerización. La segunda dimensión está constituida por los puentes de hidrógeno, la estructura se pliega en hojas. La formación de puentes entre las hojas de celulosa y las fibrillas provocadas por las interacciones-X y las fuerzas de Van der Waals generan la tercera dimensión de la celulosa (Ek et al., 2009). Hecho que hace que la celulosa sea una sustancia altamente estable frente a procesos químicos como la hidrólisis, donde se requieren altas concentraciones de ácidos o bases para obtener éxito en la ruptura de la estructura. Los microorganismos juegan un rol importante en el reciclado del carbono celulósico, ya que hay un gran número de microorganismos, que incluyen bacterias y hongos, los cuales son capaces de romper las unidades de celulosa hasta monosacáridos bajo condiciones aeróbicas o anaeróbicas. Las bacterias anaeróbicas incluyen Bacteroids cellulosolvens, Bacillus sp., Clostridium (C. celluloliticum, C. cellulovorans, C. papyrosolvens, C. Thermocellum), Fibrobacter succinogenes, Cellvibrio gilvus, Ruminococcus flavefaciens, etc., levaduras como Candida (C. wickerhamii, C. lucitance), hongos del rumen como Neocallimastix frontalis (Leschine, 1995; Joshi y Pandey, 1999b), y todos los hongos aeróbicos filamentosos micro y macromicetos (Carlile et al., 2001). Todos estos organismos emplean exoenzimas para la degradación del polímero de celulosa, entre las que se destacan la endoglucansa, exocelobiohidrolasas y β-glucosidasa de las cuales se hace referencia más adelante, y la celobiosa quinasa y fosfo- β-glucosidasa que también pueden estar presentes en muchos de estos organismos mencionados.
2.2.2. Hemicelulosa
La hemicelulosa junto con la celulosa son tanto carbohidratos estructurales de las plantas como los componentes mayoritarios de la pared celular. Las hemicelulosas son encontradas en la matriz entre las fibras de celulosa y la pared celular, ubicándose entre la celulosa y la lignina. Los tipos y cantidades de hemicelulosas son diversas en la naturaleza, dependiendo de los materiales, el tipo de tejido, estado de desarrollo, condiciones de desarrollo, almacenamiento y métodos de extracción. Las hemicelulosas aparecen como heteropolisacáridos de diversas hexosas y pentosas, principalmente D-xilosa, L-arabinosa, D-manosa, D-glucosa, D-galactosa, y ácido D-glucururónico, que aparecen en las paredes celulares en forma amorfa y poseen una especie de columna vertebral formada por una cadena plana de azúcares unidos casi siempre por enlaces β (1,4) de menor longitud que la de celulosa con grado de polimerización 100-200 (ver Figura 4) de la que pueden salir ramificaciones muy cortas, generalmente de un solo azúcar de longitud. Las hemicelulosas se clasifican usualmente de acuerdo a los azúcares residuales presentes (Ek et al., 2009). Los tipos y cantidades de las hemicelulosas contenidas en las paredes celulares de las maderas de angiospermas y coníferas son diferentes. Estas últimas contienen menos hemicelulosas constituidas principalmente por glucomananos y galactoglucomananos (Moore, 1998b). En los glucomananos la cadena principal está formada por residuos alternos de β-D-glucopiranósido y β-D-manopiranósido; en los galactoglucomananos sustituyentes de D-galactopiranosil terminales están asociados al O-6 de manosa o glucosa (Zabel y Morrel, 1992a; Joselau y Ruel, 1994; Goodenough, 1996; Sánchez y Cardona, 2007; 2008). Los xilanos son las principales hemicelulosas en la madera de angiospermas (constituyen del 10 al 35% del peso seco) (Zabel y Morrel, 1992a; Joselau y Ruel, 1994). Consisten de una cadena principal de unidades β-D-xilopiranósido con uniones β(1,4) y, dependiendo de su origen, esta cadena puede tener diferentes sustituyentes y cadenas laterales. Se consideran tres familias principales de xilanos (Coughlan y Hazlewood, 1993; Goodenough, 1996): Xilano de la madera de angiospermas, de la madera de coníferas y el xilano de los pastos. Las hemicelulosas cubren y unen a las microfibrillas de celulosa en una matriz común. La corta extensión de las cadenas, que incrementa la solubilidad de las hemicelulosas y la posición expuesta de las mismas en la superficie de las microfibrillas, explicaría por qué este polímero está entre los primeros componentes de la pared celular atacados por los hongos causantes de pudrición (Zabel y Morrel, 1992b; Goodenough, 1996).
(A)
(B)
Figura 4. (A) Estructura de xilano en maderas blandas, con una cadena adicional de L-arabinofuranosa; (B) Estructura de xilano en maderas duras, con 4-O-metil-D-glucuronxilano. Fuente: Ek et al. (2009)
2.2.3. Lignina
La lignina es el material aromático renovable más abundante del planeta, es un biopolímero aromático, no polisacárido (Kirk y Farrel, 1987). Es un compuesto amorfo e insoluble en agua, de alto peso molecular y tridimensional. La lignina se encuentra principalmente en la pared celular de las plantas formando parte de una matriz ordenada con las microfibrillas de la celulosa. Los precursores de la lignina son denominados monolignoles: alcoholes sinapílico (3,5-dimetoxi-4-hidroxicinamil), p-cumarílico (p-hidroxicinamilico) y coniferílico (4-hidroxi-3-metoxicinamil alcohol), cada uno aportando unidades de siringil, p-hidroxifenil y guaiacil respectivamente en el biopolímero (Adler, 1977; Buswell y Odier, 1987; Reid, 1995) (ver Figura 5). La copolimerización de los radicales libres de estos alcoholes produce polímeros heterogéneos ópticamente inactivos, entrelazados y altamente polidispersos. Las unidades de guaiacil se encuentran en mayor proporción conformando las ligninas de las gimnospermas, mientras que las ligninas de las angiospermas están conformadas por cantidades aproximadamente iguales de guaiacil y siringil. Ambos tipos de ligninas contienen pequeñas cantidades de unidades de p-hidroxifenil (Adler, 1977; Kirk y Farrel, 1987). El proceso de polimerización de los monómeros se inicia con una oxidación que da semiquinonas, luego estos radicales libres reaccionan unos con otros y forman enlaces covalentes entre C-O o C-C, siendo el predominante el enlace β-O-4, el cual usualmente con adición de agua da una forma más estable de enlace éter β-O-4. Alrededor del 40-60% de todas las uniones que conforman la lignina corresponden a enlaces tipo éter. En la Figura 6 se observa un acercamiento de la estructura de la lignina de maderas blandas y el segmento que se repite en las diferentes estructuras de lignina presentes en los otros productos. Tres tipos de lignina pueden ser reconocidos según el contenido de monolignoles: i) lignina de maderas blandas (gimnospermas, eudicotiledonas, etc.) o guayacil lignina que está compuesta mayoritariamente de alcohol coniferílico y pequeñas cantidades de alcohol p-cumaríclico y sólo trazas de alcohol sinapílico. ii) lignina de maderas duras o lignina siringil-guayacil contienen los alcoholes coniferílicos y sinapílicos en proporciones iguales con pequeñas cantidades de alcohol p-cumarílico. Este tipo de lignina está presente en angiospermas eudicotiledoneas y genotipos del grupo de gimnospermas que estén evolucionando a angiospermas y iii) ligninas de hierbas y pastos o lignina hidroxi-fenol, guayacil y siringil, contienen todos los monolignoles y contienen un alto contenido de p-cumarílico. Este tipo de lignina está presente en árboles de palma, musáceas, helechos, etc.
Notación de la estructura
Alcohol p-cumarílico Alcohol coniferílico Alcohol sinapílico general simplificada
Figura 5. Monómeros precursores de la molécula de lignina. Fuente: Bommarius y Riebel (2004a).
La lignina imparte resistencia a la degradación microbiana de la madera. La íntima asociación espacial existente entre los polisacáridos y la lignina dentro de las paredes celulares de la madera provee una barrera protectora que impide la degradación de la celulosa. Una vez que la lignina que rodea a las fibrillas de celulosa es removida o modificada, la celulosa resulta más accesible a las enzimas microbianas y puede ser degradada eficientemente. Así, la lignificación en muchas plantas puede ser un mecanismo de resistencia a la enfermedad y se produce como un mecanismo de defensa hacia los hongos patógenos o en respuesta a heridas (Blanchette, 1995). Hasta el momento, los únicos organismos capaces de mineralizar eficientemente la lignina hasta CO2 y agua como productos finales son los hongos causantes de pudrición blanca (Leonowicz et al., 1999). Estos hongos en su mayoría pertenecen a los ordenes Aphyllophorales y Agaricales (Pelaez et al., 1995) y poseen un complejo de enzimas oxidasas y peroxidasas que catalizan las primeras reacciones que rompen uniones dentro de la compleja molécula de lignina, generando moléculas más pequeñas. Los productos de degradación se incorporan luego a los ciclos metabólicos del organismo originando como producto final CO2 (Kirk y Farrel, 1987). Se ha demostrado que la lignina como sustrato único no es una fuente aprovechable para el crecimiento de los hongos, sino que es necesaria la presencia de un co-sustrato (Kirk et al., 1976).
(A)
(B)
Figura 6. (A) Estructura sugerida de lignina de madera blanda. Las ligninas de maderas duras y monocotiledoneas difieren mucho en el contenido de grupos metoxilo (-OCH3). (B) Estructura que se repite en las diferentes ligninas encontradas en los materiales lignocelulósicos. Fuente: (Ek et al.(2009)
2.2.4. Otros polímeros presentes en los materiales lignocelulósicos
El almidón y las pectinas pueden estar presentes en el complejo lignocelulósico, dependiendo de la procedencia. El almidón es un homopolisacárido de unidades de D-glucosa unidos con enlaces glicosídicos α(1,4). El almidón tiene dos componentes, amilosa y amilopectina. La amilosa es una molécula de peso molecular cercano a 5000 y naturalmente está conformada por un grupo terminal hemiacetal reducido y otro no reducido en cada cadena. La amilopectina es un polisacárido con enlaces α(1-4) y α(1-6) cada 25-30 unidades de glucosa. Su peso molecular es diferente para distintas fuentes de almidón. El almidón se encuentra ampliamente distribuido en microalgas, algas y plantas superiores, se constituye en el mejor material de almacenamiento. Para los organismos heterótrofos es la fuente más común de energía. Una gran cantidad de microorganismos tienen la capacidad de utilizar este polisacárido (Joshi y Pandey, 1999b). La hidrólisis del almidón en glucosa en los sistemas biológicos es llevada a cabo por múltiples enzimas, como α-amilasa, β-amilasa, glucoamilasa, maltosa hidrolasa (β-amilasa), y otras enzimas como la 1-6, glucosidasa, la dextrinasa límite y las pulanasas (Takasaki, 1976; Hyun y Zeikus, 1985). Las pectinas son otro componente importante de la pared celular de las plantas, lo que lo constituye en un polisacárido que hace parte del complejo lignocelulósico y es de los principales constituyentes de la fibra soluble. Las sustancias pécticas se localizan principalmente en la laminilla media y la pared primaria de las células vegetales. En los árboles la laminilla media de los elementos xilemáticos jóvenes está constituida mayoritariamente por pectina, pero al envejecer éstos, se torna altamente lignificada. La pectina está constituida principalmente por ácido D-galacturónico, un derivado de la galactosa donde el grupo hidroxilo del carbono 6 ha sido oxidado para formar un grupo carboxílico y, en menor medida está compuesto de ramnosa, arabinosa y galactosa. La importancia comercial de las pectinas se centra en su uso como gelificante en el procesamiento de diversos alimentos, entre los que se encuentran los yogurts, conservas, jaleas y mermeladas (Rodríguez-Palenzuela et al., 2000; Campbell y Farrell, 2004). Las pectinas tienen un papel esencial en la estabilidad de la pared celular al actuar como material aglutinador de las fibras de celulosa (Pasquel, 2001).
2.2.5. Pretratamientos de los materiales lignocelulósicos
Los residuos lignocelulósicos son potencialmente utilizables como materias primas para la obtención de diversos productos. Actualmente, para la producción de etanol de biomasa lignocelulósica es necesario realizar una hidrólisis previa de la celulosa y hemicelulosa para la obtención de azúcares fermentables y separación de la lignina residual. El fin del pretratamiento es romper la estructura de la lignina y desestabilizar la celulosa cristalina con el propósito de incrementar la accesibilidad de las enzimas a la estructura de la celulosa durante la hidrólisis (Mosier et al., 2005a; Shi et al., 2009). Los materiales lignocelulósicos tienen diferentes características físico-químicas, lo que hace necesario adoptar diferentes tecnologías de pretratamiento según las características de cada material crudo. Los aspectos generales a tener en cuenta para un efectivo pretratamiento del material lignocelulósico a fin de conseguir material rico en monosacáridos fermentables son: la composición química del material lignocelulósico, la edad del cultivo, el tiempo de cosecha, los requerimientos de digestibilidad final de los materiales, la degradación de los azúcares obtenidos, la cantidad de compuestos tóxicos, el tamaño de partícula, residuos sólidos generados del pretratamiento, contenido de humedad, compatibilidad del material pretratado con el proceso de fermentación posterior, recuperación de la lignina y mínimos requerimientos de calor y energía. Para lo cual se puede someter el material, por ejemplo a pretratamientos alcalinos con cal, explosión de la fibra con amonio (AFEX) y percolación con reciclado del amonio (ARP), reducen el contenido de lignina de residuos agrícolas, aunque no son tan apropiados para el pretratamiento de maderas blandas. Pretratamientos con ácido-base han presentado mejores rendimientos para materiales lignocelulósicos, aunque más costosos (Mosier et al., 2005b; Chandra R.P. et al., 2007). Las tecnologías de pretratamiento de la biomasa lignocelulósica se presentan en la Tabla 6.
Tabla 6. Tecnologías de pretratamiento a biomasa lignocelulolósica Materiales Pretratamiento Descripción pretratados Referencia (ejemplos) Empleando hongos de pudrición blanca, parda y blanda selectivos por la lignina a menor costo de degradación para la obtención de azúcares fermentables, menor impacto ambiental y menor producción de sustancias tóxicas. Sin embargo, aún es Maderas, pajas, Kumar y Biológico necesario mejorar la capacidad de los pretratamientos biológicos con hongos bagazos, semillas Wyman (2009) basidiomicetos a fin de mejorar su habilidad para delignificar los materiales lignocelulósicos en menor tiempo y más eficientemente. Los materiales son sometidos a: Conminución mecánica: reducción del tamaño de partícula y cristalización del material a fin de incrementar la superficie específica y reducir el grado de Karunanithy et polimerización. Se utilizan molinos de diferentes tipos según los requerimientos al. (2008); Maderas duras, finales, son costosos por el alto consumo de energía e infraestructura. Alvira et al. Físicos bagazo de caña, (2009); Sánchez Extrusión: los materiales son sometidos a calentamiento, mezclado y agitación, pajas obteniéndose una modificación física y química del material cuando es pasado y Cardona por el extrusor, por desfibrilación, fibrilación y corte de las fibras del material, (2007) incrementando al final la accesibilidad de los carbohidratos al ataque enzimático. Esta es una tecnología promisoria, nueva y costosa. Pretratamiento con álcali: su eficiencia depende del contenido de lignina en el material. Este pretratamiento incrementa la digestibilidad de la celulosa y es más efectivo para solubilizar la lignina, aunque genera menor solubilidad de la celulosa y hemicelulosa. Este pretratamiento puede ser más efectivo para residuos agrícolas, que para residuos de maderas. Se emplean hidróxidos de sodio, potasio, calcio y amonio. La selección de la base depende de la composición del material. El hidróxido de sodio incrementa la digestibilidad de las maderas duras y reduce los contenidos de lignina, disminuyendo el grado de polimerización y cristalinidad. Con hidróxido de calcio se remueven sustancias amorfas como la lignina, la cual incrementa el índice de cristalinidad. También, remueve grupos acetilo de la hemicelulosa e incrementa la digestibilidad de la celulosa. Los pretratamientos con cal son menos costosos comparados con los realizados con NaOH y KOH. Pertratamiento con ácido: El objetivo de este pretratamiento es la solubilización de la fracción de la hemicelulosa y hacer la celulosa más accequible al ataque enzimático. El tratamiento con ácido diluido aparece como el método más favorable a escala industrial. Las ventajas de este pretratamiento se centran en la disponibilidad de reactores para hacerlo, a altas temperaturas y cortos períodos de tiempo; presenta ventajas en cuanto a la alta solubilización de la hemicelulosa, principalmente el xilano, convirtiendo la hemicelulosa solubilizada en azúcares fermentables. Debe tenerse en cuenta la temperatura a fin de disminuir la degradación de algunos azúcares hasta furfural y la degradación de los compúestos aromáticos de la lignina, los cuales pueden Mosier et al. afectar el proceso de fermentación. El ácido más utilizado es el sulfúrico, aunque (2005b); Kim y se utilizan el ácido clorhídrico, nítrico, fosfórico y ácidos orgánicos como Maderas duras, Holtzapple fumárico y maleico. La ventaja comparativa del uso de los ácidos orgánicos residuos agrícolas, (2006); Kootstra Químicos frente al sulfúrico es la menor formación de furfural durante la hidrólisis. rastrojo de maíz, et al. (2009); Ozonólisis: el ozono es un potente oxidante y presenta una alta eficiencia en la pajas, Sun y Cheng deslignificación. La deslignificación ocurre generalmente a temperatura de salón (2002); Li et al. y presión normal y no se dirige hacia la formación de compuestos inhibitorios (2009) que afecten la subsecuente hidrólisis y fermentación. Ha sido utilizado en el pretratamiento de pajas de cereales y otros residuos agrícolas. Sin embargo, se requieren grandes cantidades de ozono, lo que hasta al momento lo hace inviable económicamente. Organosolvatación: Es una estrategia promisoria. Mezclas de solventes orgánicos acuosas o no, pueden ser utilizadas, entre las cuales se incluyen metanol, etanol, acetona, etilen glicol y tetrathidrofurfuril alcohol, solubilizan la lignina y viabilizan la celulosa para la posterior hidrólisis enzimática. Un aspectos importante de este pretratamiento es la recuperación de la lignina pura como un subproducto. Este pretratameinto ha sido combinado con tratamiento catalítico con ácidos clorhídrico, sulfúrico, oxálico y salicílico a fin de solubilizar la hemicelulosa. Los altos costos de este proceso son la principal restricción de este pretratamiento, es necesario recuperar los solventes para bajar costos de operación y evitar riesgos de inhibición en los procesos de fermentación posteriores. Pretratameinto con líquidos iónicos: es un pretratamiento que se encuentra aún en fase de laboratorio. Se ha realizado con 1-etil-3-metil imidazolim dietil fosfato, presenta excelentes propiedades de estabilidad química y térmica, trabaja a bajas temperaturas. Los carbohidratos y la lignina pueden ser disueltos simultáneamente, generando un desorden efectivo sin formación de sustancias tóxicas. No ha sido aplicado industrialmente y hasta el momento presenta altos costos de operación, ya que se presentan dificultades en la recuperación de la hemicelulosa y la lignina de la solución, después del pretratamiento. Explosión con vapor: SO2-explosión con vapor. La explosión con vapor es uno de los pretratamientos más eficientes para la biomasa lignocelulósica. Este proceso combina fuerzas mecánicas con efectos químicos por el incremento y la caída de presión. Ocurre una autohidrólisis de los grupos acetil presentes en la hemicelulosa formando ácido a altas temperaturas; mientras que, los efectos mecánicos reducen las fibras generando una separación de la misma durante la descompresión. En combinación con la hidrólisis parcial y solubilización de la hemicelulosa, la lignina es redistribuida y removida del material, quedando la celulosa expuesta a fin de incrementar la accesibilidad de las fibras. Los factores más importantes a tener en cuenta para el pretratamiento con explosión a vapor son el tamaño de partícula, temperatura, tiempo de residencia y el efecto (τ-100/14.75) combinado temperatura-tiempo (Ro) [Ro = t*e ], el cual describe la condición óptima para la producción máxima de azúcares fermentables: el factor debe estar entre 3 y 4,5. Altas temperaturas incrementan la remoción de la hemicelulosa del sólido y la digestibilidad de la celulosa. Las ventajas, incluyen menor impacto ambiental, mayor eficiencia energética, menores costos de operación, recuperación completa de los azúcares, entre otros. Pretratamiento con agua caliente: Se aplica agua al material a temperaturas de 160-240°C para provocar alteración en la estructura de la lignocelulosa. El objetivo del líquido es solubilizar la hemicelulosa y hacer más accequible la celulosa, asimismo evitar la formación de inhibidores. Hay menor formación de inhibidores y mayor recuperación de pentosas. Sin embargo, consumen grandes Zhu et al. cantidades de energía y no se utiliza a escala industrial. (2006); Yachmenev et Explosión de fibra con amonio (AFEX): Los materiales son tratados con al. (2009); líquidos amoniacales a temperaturas entre 60 y 100°C en tiempos variables. Solo Residuos Palonen et al. produce pretratamiento al material sólido, es decir que se solubiliza poca agrícolas, maderas (2004); Kim et cantidad de material sólido; disminuye la cristalinidad de la celulosa y rompe los Fisico-químicos blandas, duras, al. (2008); enlaces carbohidratos-lignina; pequeñas cantidades de hemicelulosa y lignina bagazo de caña, Wyman et al. son removidas, baja formación de sustancias tóxicas e inhibidoras de los rastrojo de maíz. (2005); Mosier postratamientos enzimáticos. La recuperación del amonio es costoso. Hay un et al. (2005b); pretratamiento de explosión con amonio acuoso, denominado percolación de Hamelinck et al. amonio reciclado (ARP), en el cual se utiliza solución de amonio acuoso (5- (2005) 15% p/p) y temperatura entre 140 y 210°C, con tiempos de reacción de 90 min y
velocidades de percolación de 5mL/min. Este procedimiento solubiliza hemicelulosa, pero mantiene intacta la celulosa. Una ventaja de este método es la disminución en el consumo de energía. Oxidación húmeda: Se emplea aire u oxígeno como catalizador a temperaturas de 170 a 200°C y presiones de 10 a 12 bar O2. Ese proceso produce reacciones de formación de ácidos del proceso hidrolítico y reacciones oxidativas. Se solubiliza la hemicelulosa y la lignina y se incrementa la digestibilidad de la celulosa. Adicionando Na2CO3 se disminuye la formación de compuestos inhibitorios y se mantiene el pH neutro-alcalino. Asimismo, se logra la recuperación del 96% de la celulosa (65% convertida a glucosa). La principal desventaja es el costo del oxígeno. Pretratamiento con microondas: El material es sometido entre 5 y 20 min, se hace comparable con los tratamientos con álcali. Se realizan a escala de laboratorio. Pretratamiento ultrasonido: se utiliza en diferentes tiempos, obteniendo los mejores resultados a 50°C. Abre los poros del material por impacto mecánico, haciendo que las macromoléculas se desordenen y se incremente el rendimiento de la hidrólisis enzimática. No hay formación de sustancias tóxicas. Explosión con CO2: El CO2 es utilizado como fluido supercrítico a temperaturas por encima del punto crítico, removiendo efectivamente la lignina e incrementando la digestibilidad de la celulosa.
2.3. Enzimas lignocelulolíticas
De todas las funciones de las proteínas, la catálisis es tal vez la más importante, la cual es realizada por las enzimas. Las enzimas son producidas en el interior de la célula, de las cuales se conocen enzimas extracelulares que actúan fuera de la célula y se hará referencia más abajo, y las enzimas intracelulares que son responsables de todas las reacciones metabólicas que mantienen en equilibrio los diferentes sistemas biológicos y que actualmente son aisladas y utilizadas con diversos fines industriales. Estas enzimas intracelulares pueden ser obtenidas por métodos de extracción químicos o físicos de las diferentes partes de los organismos que las contienen, según se requiera. Asimismo, ya hay desarrollos de técnicas para la separación y purificación de las fracciones enzimáticas obtenidas de los procesos de extracción, como procesos combinados de centrifugación, ultrafiltración y cromatografía (Blanch y Clark, 1997; Bommarius y Riebel, 2004b). Las enzimas extracelulares actúan fuera de la célula. Su función principal es disminuir el tamaño de las moléculas complejas que se encuentran en el medio cultivo, las cuales posteriormente son absorbidas como fuentes de nutrientes y energía por los organismos que las excretan (Bommarius y Riebel, 2004b). El sistema de secreción enzimática en los hongos filamentosos tiene como propósito principal el crecimiento y transporte de nutrientes hacia el ápice hifal, siendo ésta el área activa de secreción enzimática. No se descarta que exista una cierta actividad secretora a lo largo del resto del micelio con el fin de mantener la actividad metabólica (Papinutti et al., 2003). Las enzimas para la degradación de polímeros (no necesariamente polisacáridos) pueden emplear dos estrategias de ataque. Pueden actuar sobre el polímero aleatoriamente fragmentando efectivamente la molécula polimérica en oligómeros, siendo responsables de esta forma de ataque las endoenzimas. Alternativamente en el caso de los polisacáridos, pueden actuar a partir de un extremo (exoenzimas), generalmente el extremo no reductor de la molécula, liberando monómeros o dímeros de modo secuencial. Los sistemas se completan con enzimas capaces de actuar sobre oligómeros o dímeros, llevando a la degradación completa del polímero. Estos complejos de enzimas actúan de modo sinérgico (Moore, 1998b). En general las enzimas degradadoras de polisacáridos están sujetas a mecanismos de regulación de su síntesis. Es decir no se producen de modo constante, sino que su síntesis es inducida por el sustrato adecuado y es reprimida por azúcares fácilmente utilizables, en particular glucosa. El inductor más eficiente es el polímero-sustrato de las enzimas que serán sintetizadas. Sin embargo, debido a su alto peso molecular, no son compuestos que puedan penetrar en las células y ejercer su efecto (Béguin y Aubert, 1994). Algunas de las enzimas extracelulares que producen los hongos se encuentran dispersos en la película de líquido que rodea la hifa, pero otras están fijas en el espacio sujetas a la pared de la hifa, a la matriz extracelular o al propio sustrato (Hudson, 1986). Cabe destacar que en medios de cultivo ligeramente diferentes se sintetizan diversas formas de una misma enzima, que a pesar de poseer características catalíticas similares, difieren notablemente en sus características fisicoquímicas, por lo que se deduce que hay formas múltiples que coexisten en determinado momento pero también puede variar la composición de isoenzimas a lo largo del desarrollo del hongo (Carlile et al., 2001). Las enzimas extracelulares del complejo celulolítico y ligninolítico existen en múltiples formas. La síntesis de isoenzimas puede deberse a productos de genes diferentes, aunque también pueden deberse a cambios postraduccionales como proteólisis, glicosilación, o agregados cuaternarios. Se pueden sintetizar como consecuencia de estados fisiológicos diferentes (composición del medio de cultivo, pH, temperatura, etc.) a partir de genes regulados diferencialmente. En la naturaleza, el hongo se encuentra con distintos sustratos, distintas condiciones ambientales, y pueden entonces producirse distintas formas enzimáticas, con propiedades más adecuadas a las nuevas circunstancias que les permitan degradar al polímero de la manera más eficiente. Sin embargo, también el producto de un gen puede ser modificado diferencialmente mediante glicosilaciones o digestiones proteolíticas luego de la secreción (Joselau y Ruel, 1994; Blanchette, 1995; Barr et al., 1996; Carlile et al., 2001).
2.3.1. Enzimas celulolíticas
El complejo de enzimas celulolíticas de los hongos de pudrición blanca consiste de tres enzimas hidrolíticas: endoglucanasa, exoglucanasa y glucosidasas, las cuales trabajan sinérgicamente (Lemaire, 1996) y se detallan a continuación.
i. Endoglucanasas
La engolucanasa como 1,4-β-D-glucan 4-glucanohidrolasas (EC 3.2.1.4) produce una disminución en el grado de polimerización de la celulosa, por cortes al azar de la cadena glucosídica, produciendo glucosa, celobiosa (disacáridos) y celotriosa (trisacáridos). Los sustratos sobre los que actúan las endoglucanasas son carboximetilcelulosa, celulosa amorfa, celooligosacáridos; sin atacar en forma significativa a la celulosa cristalina, como las fibras de algodón.
ii. Exoglucanasas
Causan principalmente rupturas secuenciales en la molécula de celulosa a partir de un extremo no reductor liberado y están representadas por dos grupos de enzimas: exocelobiohidrolasas o celobiohidrolasas (CBH) (1,4-β-D-glucan celobiohidrolasas) (EC 3.2.1.91) que liberan unidades de celobiosa a partir del extremo no reductor y exoglucohidrolasas (1,4-β-D-glucan glucohidrolasas) (EC 3.2.1.74) que liberan unidades de glucosa a partir del extremo no reductor liberado e incluyen también actividad de las celobiohidrolasas produciendo celobiosa por ataque en el extremo no reductor del polímero. Las celobiohidrolasas son las que se encuentran con mayor frecuencia (Ângelo, 2004).
iii. β-glucosidasas
La β-glucosidasa o β-D-glucósido glucohidrolasas (EC 3.2.1.21) hidrolizan celobiosa y otros β-1,4- oligoglucósidos de cadena corta, para formar glucosa, siendo este monosacárido el resultado final de la acción degradativa del complejo celulolítico sobre el polímero de celulosa (Moore, 1998b). La celulosa es atacada inicialmente por la endoglucanasa (ver Figura 7), la cual se liga al azar sobre las microfibrillas de celulosa en regiones amorfas, produciendo hidrólisis de los enlaces β-1,4 glucosídicos, generando así múltiples sitios de ataque para las exo-1,4-β-D-glucanasas, las cuales actúan sobre los extremos no reductores de la cadena, liberando una unidad de celobiosa. Existe una cooperación continua entre la acción de ambas enzimas y la de la β-glucosidasa, la cual actúa sobre la celobiosa o también sobre pequeños oligómeros produciendo moléculas de glucosa. El resultado de la acción de estas tres actividades enzimáticas es la degradación sinérgica de la celulosa como se muestra en la Figura 7. Existen actividades complementarias entre los tres tipos de enzimas y se consideran los responsables del sinergismo, dado que la acción de dos o más enzimas combinadas es mayor que la suma de las actividades individuales en la degradación (Papinutti et al., 2003). Puede ocurrir sinergismo tanto entre, como dentro de las diferentes clases de enzimas celulolíticas (Barr et al., 1996; Boisset et al., 2000). Aunque el sinergismo entre los distintos componentes del complejo celulasa aún no ha sido completamente elucidado, está claro que depende de diferentes factores como la naturaleza del sustrato, la afinidad del componente celulasa por el sustrato, la estereo-especificidad de dicho componente, la concentración de la enzima y la proporción entre los componentes enzimáticos (Barr et al., 1996; Mansfield et al., 1999). En adición a los tres grupos principales de enzimas, se han encontrado en distintas especies fúngicas, especialmente en hongos de pudrición blanca, un número de actividades enzimáticas oxidativas auxiliares, las cuales no son esenciales para la hidrólisis de la celulosa pero pueden asistir a la descomposición del polímero llevando a cabo conversiones muy útiles, por ejemplo oxidaciones o la remoción de productos finales que pueden provocar represión catabólica o inhibición de la actividad de los grupos principales de enzimas celulolíticas (Coughlan y Ljungdahl, 1988; Markham, 1998). Cuando un hongo de pudrición blanca se desarrolla sobre la celulosa se producen dos celobiosas-oxido- reductasas: celobiosa-quinona oxido-reductasa (CBQ) y celobiosa-oxidasa (CBO). Esta serie convierte la celobiosa en δ-lactona que puede a su vez convertirse en ácido celobiónico y entonces obtenerse glucosa y ácido glucónico. Las enzimas celobiosa-oxido-reductasas son capaces de utilizar una gran variedad de aceptores de electrones y son de gran significancia en la regulación de los niveles de celobiosa y glucosa, cuya acumulación puede inhibir la acción de la endoglucanasa. La CBQ degrada las uniones entre celulosa y lignina (Moore, 1998b). La celobiosa-oxidasa reduce el Fe+3 conjuntamente con el peróxido de hidrógeno, generando radicales hidroxilo. Estos radicales pueden degradar tanto la celulosa como la lignina, posiblemente indicando que la celobiosa oxidasa tiene un rol central en degradación de maderas por hongos degradadores de madera (Ander, 1994). Actualmente aún se desconocen muchas de las formas de ataque bioquímico que utilizan los hongos filamentosos para la degradación de los materiales celulósicos heterogéneos, como los residuos lignocelulósicos. La síntesis de celulasas está sujeta a inducción por el sustrato adecuado (celulosa cristalina) y represión por una fuente hidrocarbonada fácilmente utilizable, como la glucosa. El inductor más efectivo es el sustrato natural: la celulosa cristalina. Sin embargo este material, es un polímero de gran tamaño, que no puede penetrar en la célula e inducir la síntesis de celulasas a nivel transcripcional. No obstante, existen niveles basales de celulasas constitutivas que a partir de un bajo nivel de hidrólisis de la celulosa, producirían algún producto soluble capaz de penetrar en la célula induciendo la síntesis enzimática (Carle - Urioste et al., 1997; Forchiassin y Levin, en imprenta). Los hongos de pudrición castaña utilizan un sistema celulolítico bien diferenciado del sistema hidrolítico de los hongos de pudrición blanca. Éstos pueden despolimerizar celulosa rápidamente a través de +2 un mecanismo que involucra a la endoglucanasa y a factores no proteicos, entre ellos H2O2 y Fe (Coughlan y Ljungdahl, 1988; Wood y García, 1994), ya que producen endoglucanasas y β-glucosidasas, pero aparentemente no producen exoglucanasas (Gow, 1995b).
(a)
Región cristalina Región amorfa
(b)
β-glucosidasa Exoglucanasa Endoglucanasa Figura 7. Representación del modo de acción de las ce lulasas: Glucosa extremo reductor ; Glucosa extremo no reductor (a) Estructura cristalina y amorfa de la celulosa, (b) Acción del complejo celulolítico sobre la estructura de la celulosa, endoglucanasas sobre la región interna amorfa, exoglucanasas sobre los extremos no reductores de la región cristalina y β-glucosidasa sobre los dímeros formados.
Las celulasas fúngicas son producidas por diversos hongos de importancia económica, incluyendo especies de Trichoderma spp., Aspergillus spp. y Phanerochaete chrysosporium y un gran número de especies más (Lockington et al., 2002). La secreción de celulasas por los hongos, así como las demás enzimas que producen estos organismos, está regulada por factores relacionados con la composición química del sustrato y el metabolismo celular. Los hongos pueden disminuir la producción de celulasas por represión catabólica de carbono (mediada por ruta metabólica vía CreA ) (Ilmen et al., 1996). Los hongos filamentosos, en general, son potentes productores de celulasas. Sin embargo, no es posible asegurar un mayor productor de estas enzimas bajo una sola premisa, ya que la experiencia ha demostrado que se deben priorizar los factores asociados a la maximización de la producción de este grupo de enzimas, y aún en el caso en que se requiera la selección de una de las celulasas en particular (Dekker, 1985; Coughlan y Ljungdahl, 1988; Jennings, 1995; Ilmen et al., 1996; Lia et al., 2000; Lockington et al., 2002; Sohail et al., 2009). Los sistemas de celulasas están compuestos de múltiples proteínas que poseen funciones complementarias que interactúan con la hidrólisis de la celulosa en la formación de complejos multiproteínicos. Sin embargo, estas interacciones exhiben diferentes comportamientos cuando los componentes del sistema de celulasas se presentan combinados, o cuando ellas están presentes de forma aislada. Los sustratos celulósicos se presentan en diversas estructuras macroscópicas insolubles con una distribución de partícula, una forma y en algunos casos composición variada, lo que genera una heterogeneidad en el modo de ataque de los sistemas celulolíticos al material celulósico. Asimismo, influyen también, la procedencia del sistema celulolítico, la dotación y la presencia de activadores de éstos en los sustratos. Por ejemplo, Trichoderma reesei ha sido investigado desde hace 50 años. T. reesei, el cual produce como mínimo dos exoglucanasas (CBHI y CBHII), cinco endoglucanasas (EGI, EGII, EGIII, EGIV y EGV) y dos β-glucosidasas (βGI y βGII), con muchos esfuerzos realizados por años, se han modificado genéticamente las cepas de este hongo y se ha logrado obtener hasta 0.33 g de proteína/g de carbohidrato utilizado y un reconocimiento de su modo de acción sobre diversos materiales (Lynd et al., 2002). En la Tabla 7 se enumeran actividades enzimáticas celulolíticas de varios hongos de pudrición blanca, como Phanerochaete chrysosporium, Pleurotus ostreatus, Lentinus edodes, en contraste con diferentes especies de Trichoderma spp. sobre diferentes tipos de sustratos compuestos en su mayoría, por materiales lignocelulósicos heterogéneos como los residuos agrícolas. Los sustratos se presentan tanto en estado sólido, como en medio líquido. Uno de los principales aspectos relevantes que se observan en la Tabla 7 es la variación directa en la expresión de las celulasas, cualquiera que sea la que haya sido determinada, con el sustrato sobre el cual se desarrolla el organismo. Es visible la influencia del estado de la fermentación en las actividades de las enzimas celulolíticas; Elisashvili et al. (2001a) por ejemplo, muestra que las actividades de endoglucanasa como CMasa determinadas en fermentaciones sumergidas corresponden a por lo menos tres veces más que las actividades de la CMasa sobre medio sólido para Lentinus edodes IBB363 y L. edodes IBB1233. En la determinación de la actividad de la enzima endoglucanasa (EG), se observa que ésta fue determinada por varios investigadores sobre carboximetilcelulosa (CMC) y por otros como CMCasa. La actividad FPasa es equivalente a la determinación de la exoglucanasa, debido a que se mide la actividad de la enzima (o el organismo) sobre papel de filtro, el cual se compone de aproximadamente 99% de celulosa cristalina; sin embargo, es considerada comúnmente como la actividad celulolítica total o global de un organismo productor de estas enzimas (Dobozi et al., 1992; Rodríguez y Piñeros, 2007). Todo lo anteriormente expuesto acerca del comportamiento de los organismos que producen celulasas hace pensar que aún falta mayor exploración sobre la producción de enzimas celulolíticas tanto en medios sólidos, como líquidos utilizando como sustratos diferentes mezclas de residuos lignocelulósicos y rastrear un mayor número de especies fúngicas que pueden expresar enzimas celulolíticas si las condiciones medioambientales y las características de los sustratos promueven su producción.
Tabla 7. Comparación de las actividades enzimáticas celulolíticas de hongos sobre diversos sustratos Material sobre el Actividad enzimática Hongo que se cultivó el Tipo de enzima Sustrato empleado Actividad Referencia hongo CBHI y CBHII Avicel+AR, 50°C, 0,014-0,027 U/mg Tomme et al. - purificadas 3h* (1988) Trichoderma CBHI y CBHII Avicel+AR, 40°C, 0,26-0,48 U/mg El Gogary et al. - reesei purificadas 3h* (1989) Proteína cruda Avicel, 37°C, 21 h* 0,000241 U/mg Johnson et al. - (1982) Residuos de Papel filtro 0,004±0,008 U/mL Trichoderma EXG Rodríguez y palma (RP) sin CMC 0,086±0,022 U/mL viride T12 EG Piñeros (2007) pretratamiento RP tratamiento EXG Papel filtro 0,012±0,004 U/mL ácido 0,5% EG CMC 0,000±0,000 U/mL RP tratamiento EXG Papel filtro 0,052±0,012 U/mL ácido 1% EG CMC 0,048±0,022 U/mL RP tratamiento Papel filtro 0,146±0,088 U/mL EXG biológico (P. CMC 0,614±0,078 U/mL EG ostreatus) 10 días RP tratamiento Papel filtro 0,150±0,038 U/mL EXG biológico (P. CMC 0,558±0,091 U/mL EG ostreatus) 20 días Plantas EXG Papel filtro 13,01 U/g aromáticas EG CMC 94,13 U/g Trichoderma medicinales: βG p-nitrofenil-β-D- 16,85 U/g reesei citronela, artemisa glucopiranósido y desechos de jardín Plantas EXG Papel filtro - aromáticas EG CMC - Trichoderma medicinales: βG p-nitrofenil-β-D- 45 U/g viride citronela, artemisa glucopiranósido y desechos de jardín Plantas EXG Papel filtro 10,0 U/g aromáticas EG CMC 97,60 U/g Trichoderma medicinales: βG p-nitrofenil-β-D- 94,77 IU/g citrinoviride citronela, artemisa glucopiranósido y desechos de jardín Chandra et al. Plantas EXG Papel filtro 10,0 U/g (2009) aromáticas EG CMC 28,66 U/g Trichoderma medicinales: βG p-nitrofenil-β-D- 90,0 U/g harzianum citronela, artemisa glucopiranósido y desechos de jardín Plantas EXG Papel filtro 5,0 U/g aromáticas EG CMC 72,80 U/g Trichoderma medicinales: βG p-nitrofenil-β-D- 16,34 U/g fasciculatum citronela, artemisa glucopiranósido y desechos de jardín Plantas EXG Papel filtro 3,0 U/g aromáticas EG CMC 60,0 U/g Trichoderma medicinales: βG p-nitrofenil-β-D- 63,09 U/g koningii citronela, artemisa glucopiranósido y desechos de jardín Residuo de EG CMC 30 U/mL algodón molido. Rastrojo de 21 U/mL EG CMC algodón. Residuo de 8 U/mL algodón EG CMC parcialmente Trichoderma Mandels y degradado. viride Reese (1956) Lodos de madera EG CMC 29 U/mL Celulosa 4 U/mL Chromista EG CMC (Saprolegnia) Celulosa bacterial 5 U/mL EG CMC (Acetobacter) Celulosa animal EG CMC 7 U/mL α-lactosa EG CMC 22 U/mL β-lactosa EG CMC 21 U/mL Glucosa EG CMC 4 U/mL Celobiosa EG CMC 10 U/mL Ácido péctico EG CMC 0,3 U/mL Xilano+hojuelas EXG Papel filtro 0,02 IU/mL de avena Phanerochaete
chrysosporium Dobozi et al. Salvado de maíz EXG Papel filtro 0,30 IU/mL (todos en medio (1992)
líquido 144 h) Avicel EXG Papel filtro 0,25 IU/mL
Hojas de árboles EXG Papel filtro 45±3,9 U/mL en FES EG CMC en medio 65±5,8 U/mL sólido Paja de trigo en EXG Papel filtro 45±5,1 U/mL FES EG CMC en medio 135±10 U/mL Lentinus edodes sólido IBB363 Cáscaras de EXG Papel filtro 75±6,0 U/mL mandarina FS EG CMC en medio 565±45 U/mL sólido Hojas de árboles EXG Papel filtro 150±11 U/mL en FS EG CMC en medio 100±8 U/mL sólido Hojas de árboles EXG Papel filtro 45±3,2 U/mL en FES EG CMC en medio 40±3,1 U/mL sólido Paja de trigo en EXG Papel filtro 60±5,8 U/mL FES EG CMC en medio 345±22 U/mL Lentinus edodes sólido IBB123 Cáscaras de EXG Papel filtro 65±6,0 U/mL mandarina FS EG CMC en medio 650±48 U/mL sólido Hojas de árboles EXG Papel filtro 30±3,0 U/mL en FS EG CMC en medio 1790±152 U/mL sólido Elisashvili et al. Paja de trigo en EXG Papel filtro 20±2,0 U/mL (2008) FES EG CMC en medio 185±18 U/mL sólido Hojas de árboles EXG Papel filtro 40±3,8 U/mL en FES EG CMC en medio 25±2,6 U/mL Pleurotus sólido ostreatus IBB8 Hojas de árboles EXG Papel filtro 180±14 U/mL en FS EG CMC en medio 1800±169U/mL sólido Cáscaras de EXG Papel filtro 235±16 U/mL mandarina FS EG CMC en medio 1160±87 U/mL sólido Paja de trigo en EXG Papel filtro 80±5,3 U/mL FES EG CMC en medio 660±50 U/mL sólido Hojas de árboles EXG Papel filtro 105±10 U/mL en FES EG CMC en medio 1300±126 U/mL Pleurotus sólido ostreatus 2191 Hojas de árboles EXG Papel filtro 150±15 U/mL en FS EG CMC en medio 270±24 U/mL sólido Cáscaras EXG Papel filtro 80±5,3 U/mL mandarina FS EG CMC en medio 665±59 U/mL sólido U/mg : actividad enzimática por mg de proteína aislada; U/g, U/mL: actividad enzimática correspondiente a µmol/min formados del producto esperado ( azúcares reductores) por g o por mL de sustrato seco o volumen de extracto crudo del cual proviene; AR: azúcares reductores, *tiempo de reacción enzimática, el número en paréntesis indica el día de máxima actividad, FES: fermentación en estado sólido, FS: fermentación sumergida, EG: endoglucanasa, CMC: carboximetilcelulosa, EXG: exoglucanasa, Cel: celulosa cristalina, βG: β-glucosidasa, MD: extracto de malta, SM: salvado de maíz, BC: borra de café.
En la Tabla 8 se muestran las actividades enzimáticas máximas de los hongos Grifola frondosa y Trametes trogii en procesos de fermentación en estado sólido para G. frondosa y en estado líquido para T. trogii. Hay que resaltar que se muestran los tiempos de fermentación en los que se logran las máximas actividades enzimáticas, hecho importante, ya que esto refleja que cada una de las enzimas manifiesta su actividad a diferentes tiempos de fermentación. Asimismo, como se ve afectada esta actividad por la composición de los medios de cultivo.
Tabla 8. Máximas actividades enzimáticas celulolíticas de los hongos T. trogii y G. frondosa sobre sustratos sintéticos para dos procesos de fermentación en estado sólido. Material sobre el Actividad enzimática Hongo que se cultivó el Tipo de Sustrato empleado Actividad Referencia hongo enzima EG CMC(29) 167,25 U/g Madera βG p-nitrofenil-β-D- 0,35 U/g glucopiranósido (43) EG CMC(36) 253,49 U/g Madera+MD βG p-nitrofenil-β-D- 0,66 U/g glucopiranósido (43) Levin et al. Trametes trogii EG CMC(7) 503,81 U/g (2008) Madera+MD+pep βG p-nitrofenil-β-D- 0,89 U/g tona glucopiranósido (14) EG CMC(17) 512,21 U/g Madera+MD+pep βG p-nitrofenil-β-D- 0,87 U/g tona+Cu glucopiranósido (14) Aserrín+SM en EG CMC(45) 11,45±0,81U/g FES EXG Cel(30) 15,63±0,55 U/g βG p-nitrofenil-β-D- 2,20±0,013 U/g Grifola glucopiranósido(60) frondosa Montoya (2008) Aserrín+SM+BC EG CMC(30) 8,84±0,804 U/g PSUMCC 922 en FES EXG Cel(30) 10,8±0,61 U/g βG p-nitrofenil-β-D- 1,90±0,075 U/g glucopiranósido(75) U/g, U/mL: actividad enzimática correspondiente a µmol/min formados del producto esperado ( azúcares reductores) por g o por mL de sustrato seco o volumen de extracto crudo del cual proviene; el número en paréntesis indica el día de máxima actividad, FES: fermentación en estado sólido, EG: endoglucanasa, CMC: carboximetilcelulosa, EXG: exoglucanasas, Cel: celulosa cristalina, βG: β-glucosidasa, MD: extracto de malta, SM: salvado de maíz, BC: borra de café.
2.3.2. Enzimas xilanolíticas
Las enzimas que degradan hemicelulosa se nombran según el sustrato sobre el que actúan; por ejemplo, mananasas degradan mananos, xilanasas degradan xilanos, etc. (Moore, 1998b). Dentro de las hemicelulosas, el más abundante es el xilano, por ello las xilanasas constituyen el grupo enzimático más estudiado entre las hemicelulasas. Las D-xilanasas, similares a las celulasas, se componen básicamente de dos grupos de enzimas: endo-1,4--D-xilanasas (EC 3.2.1.8), y 1,4--D-xilosidasas (EC 3.2.1.37), las cuales en muchos casos están presentes en forma de distintas isoenzimas (Goodenough, 1996; Lia et al., 2000). La hidrólisis de estas moléculas complejas requiere de la interacción de numerosas enzimas que corten la cadena principal y también las laterales. La endo-1,4--D-xilanasa actúa sobre la cadena de xilano al azar, disminuyendo el grado de polimerización con liberación de xilooligosacáridos, xilobiosa y xilosa. La 1,4-- D-xilosidasa interviene luego de la endoxilanasa, actuando sobre los xilooligosacáridos (a partir de los extremos no reductores) o sobre la xilobiosa, dando como producto xilosa (Bajpai, 1997). Sin embargo, un sistema xilanolítico completo requiere de las enzimas que actúan sobre sus ramificaciones tales como las α- arabinofuranosidasas que remueven cadenas laterales de L-arabinosa, las α-glucuronosidasas que liberan ácidos glucurónicos de las cadenas laterales y las acetilxilano-esterasas que remueven los grupos sustituyentes acetílicos de la xilosa (Forchiassin y Levin, en imprenta), como se ilustra en la Figura 8. Las estructuras de varios xilanos y xilanasas han sido estudiadas por diversos autores (Beily et al., 1981; Visser et al., 1991; Tolan et al., 1996; Lia et al., 2000) utilizando técnicas electrónicas como difracción de rayos X, espectroscopía de barrido electrónico y otras. El modo de acción de varias endoxilanasas sobre sustratos conocidos ha sido estudiado (Dekker y Richards, 1975; Comtat y Joseleau, 1981; Meagher et al., 1988). Sin embargo, aún falta por estudiar y comparar los modos de acción de varias xilanasas sobre sustratos heterogéneos, como mezclas de residuos lignocelulósicos. Las investigaciones que se realicen en torno a este tema adquieren importancia por las diversas aplicaciones industriales que poseen estas enzimas.
2.3.3. Enzimas ligninolíticas
En la Tabla 9 se presenta una descripción sobre el complejo ligninolítico, y en la Figura 9 se muestra un esquema de acción del mismo sistema producido por hongos de pudrición blanca. El sistema ligninolítico funciona en sinergismo con los demás complejos enzimáticos. En especial en la Figura 9 se ilustra como la hifa de los hongos de pudrición blanca a través de su complejo de celulasas degradan la celulosa hasta glucosa. La glucosa en el medio, activa la formación de la enzima glucosa oxidasa (GOX), que en presencia de oxígeno produce gluconolactona (producto intermedio) y peróxido de hidrógeno. Posteriormente por reacciones químicas diferentes a las enzimáticas la gluconolactona se convierte en ácido glucónico. Asimismo, la hifa produce otro metabolito llamado glioxal sobre el cual actúa la glioxal oxidasa (Gliox), activada por el mismo metabolito a través de la cual también se obtiene peróxido de hidrógeno. Estas enzimas productoras de peróxido de hidrógeno son necesarias para el funcionamiento de las peroxidasas, ya que sin ellas no habría presencia de H2O2 en el medio. Este mecanismo corresponde a parte de la interpretación que probablemente puede dársele al funcionamiento de los hongos de pudrición blanca para lograr descomponer sustancias tan complejas como la lignina, ya que la presencia de peróxido de hidrógeno en el medio, el manganeso y el alcohol veratrílico (metabolito secundario producido por la hifa) son necesarios para la activación y acción de las enzimas oxido-redutasas lacasa, manganeso peroxidasa (MnP) y lignin peroxidasa (LiP), degradadoras de los compuestos fenólicos y no fenólicos en todas las direcciones, para su conversión en radicales y productos de bajo peso molecular. La acción de las enzimas oxido- reductasas resulta en una despolimerización parcial y las roturas ocurren sin estereoespecificidad. Estos mecanismos oxidativos que producen radicales libres, pueden reaccionar entre sí volviendo a polimerizarse. Sin embargo, existe un equilibrio entre polimerización-despolimerización y pueden iniciarse reacciones no específicas que después pueden seguir cualquier camino sin subsiguiente control por parte de las enzimas, lo que se ha llamado “combustión enzimática” (Kirk y Farrel, 1987). 3 3
1 5 2
3 2 5 1 2
4
4
Figura 8. Estructura de xilano y enzimas involucradas en su degradación. Xilosa , ácido acético arabinofuranosa , ácido glucurónico o 4-O-metilglucurónico , 1-acetilxilanoestearasa, 2-arabinofuranosidasa, 3- endoxilanasa, 4-β-xilosidasa, 5-α-glucuronosidasa. Fuente: Forchiasin y Levin, (en imprenta)
La LiP, MnP y peroxidasa versatil (PV) son peroxidasas con un grupo hemo como cofactor, que emplean peróxido de hidrógeno como primer aceptor de electrones. La LiP puede oxidar directamente sustratos aromáticos fenólicos y no fenólicos siendo el más estudiado el alcohol veratrílico (3,4 dimetoxi- fenol). La MnP oxida Mn+2 a Mn+3 y este último es quelado por ácidos orgánicos sintetizados por el hongo (Pérez y Jeffries, 1992). Es decir que la MnP puede oxidar sustratos del tipo fenólico a través del Mn+2 (Tuor et al., 1992), pero también puede hacerlo con sustratos no fenólicos a través de los productos de peroxidación de ácidos grasos insaturados (Bao et al., 1994). La PV oxida Mn+2 a Mn+3, como lo realiza la MnP y también oxida compuestos no fenólicos, como la LiP lo que significa que comparte propiedades catalíticas con ambas peroxidasas fúngicas (Martinez et al., 1996; Martinez, 2002). La lacasa es una oxidasa con cuatro átomos de cobre como cofactor y cuyo aceptor de electrones es el oxígeno dando agua como producto (Thurston, 1994). Las lacasas oxidan sustratos fenólicos y no fenólicos formando radicales catiónicos, quinonas o radicales fenoxi. Esta enzima en presencia de cooxidantes como el 1- hidroxibenzotriazol (HBT), el 2,2’-azinobis (ácido 3-etilbenzotiazoline-6-sulfónico) (ABTS) o el ácido violúrico; capacita a la enzima para atacar sustratos más difícilmente oxidables como los de tipo no fenólico (Soares et al., 2001). La lacasa es la enzima ligninolítica presente más frecuentemente en los hongos de pudrición blanca.
Hifa
O2
Glioxal [GOX] [Celulasas] Glc Cel. O2
[Glox] Gluconolactona ácido glucónico
+2 +2 Cu VA H2O2 H2O2 Mn
Radicales: productos [Lc] [LiP] [MnP] Lig. de despolimerización de la lignina
Figura 9. Esquema de acción del sistema ligninolítico. Cel: celulosa; Lig.: lignina; [Glox]: glioxal oxidasa; [GOX]: glucosal oxidasa; [MnP]: manganeso peroxidasa; [LiP]: lignin peroxidasa; [Lc]: lacasa VA: alcohol veratrílico.
Generalmente las materias primas que componen los sustratos que se utilizan para el desarrollo y crecimiento de hongos de pudrición blanca son materiales heterogéneos, los cuales poseen además de las fuentes de carbono una cantidad de minerales asociados que pueden servir como inductores dependiendo de las concentraciones en las que se encuentren presentes, de otro modo puede complementarse adicionando sales minerales que mejoren las reacciones de las oxido-reductasas producidas por los hongos de pudrición blanca. Los títulos de las enzimas óxido-reductasas, como lacasa, MnP, glioxal-oxidasa, se ven afectadas por la concentración de metales como el cobre en el medio de cultivo; así no sea un hecho común que la MnP se induzca con otro metal que no sea Mn+2 ya se ha mostrado por Mouso et al.(2003) y Niku-Paavola et al. (1990) que en Stereum hirsutum el Cu+2 y el Cd+2 inducen la síntesis de esta enzima y por Levin et al. (2002) en Trametes trogii la producción de lacasa y MnP son incrementadas con el agregado de CuSO4 al medio. La concentración de los metales que son utilizados como inductores debe ser regulada de modo que no superen la concentración de inhibición del crecimiento del hongo. Por ejemplo, Levin et al. (2002) realizaron pruebas de crecimiento del hongo Trametes trogii variando la concentración de sulfato de cobre en el medio como inductor de lacasa y MnP, obteniendo como resultado los mayores títulos de lacasa, MnP y glioxal- oxidasa con 1mM de sulfato de cobre en el medio, mientras que con 1,5 mM de la misma sal se presentó inhibición del crecimiento. Este hecho resulta ser muy importante para utilizar un metal como el cobre para inducir la formación de enzimas ligninolíticas, aunque aún no se conozca la razón por la cual la mayor parte de las ligninasas se ven favorablemente afectadas en su producción cuando al medio de cultivo se le adiciona una sal de cobre. Asimismo, estos trabajos pueden convertirse en puntos de partida interesantes en aplicaciones de estas enzimas, como en procesos de biorremediación, dado que en un mismo medio se produce la máxima cantidad de enzima aprovechándose la acción sinérgica de todo el sistema enzimático de los hongos de pudrición blanca en los diferentes procesos de degradación. La degradación de sustancias polifenólicas se puede llevar a cabo mediante la reacción Fenton, la cual se define como una reacción de oxido-reducción en presencia de iones metálicos, especialmente el Fe+2 o Fe+3 y peróxido de hidrógeno (Gold y Alic, 1993; Rodríguez et al., 2003; Hammel et al., 2002). Varios trabajos dan indicios de que los hongos de pudrición blanca además de la producción de H2O2, sintetizan ciertos metabolitos aromáticos como productos intermedios, inclusive que tienen la capacidad de convertir los compuestos no fenólicos de la lignina en compuestos fenólicos cuando en el medio ocurre una reacción +3 +2 de oxidación de Fe a Fe en presencia de H2O2, reacción que generalmente es llevada a cabo por medio de la acción de la LiP. La macromolécula de lignina está compuesta de 10 a 20% de estructura fenólica y entre el 80-90% de estructura no fenólica, lo que hace que estos hongos deban contener mínimo un mecanismo con alto potencial redox por el cual las unidades de lignina son degradadas o convertidas a unidades fenólicas a fin de fomentar la oxidación por acción de la MnP y lacasa (Arantes y Milagres, 2007b). Asimismo, a los hongos de pudrición blanca no se les conoce un único mecanismo por el cual degraden la lignina, sino que esta biodegradación es atribuida probablemente a la contribución que hace cada enzima en dependencia de las condiciones ambientales y la composición y estructura del sustrato. Sin embargo, la evaluación completa del sistema oxidativo de los hongos de pudrición blanca no se ha totalizado aún. Ha sido reportada la secreción de muchas sustancias de bajo peso molecular por los hongos de pudrición blanca, como ácidos orgánicos, ácidos grasos y compuestos de Fe+3 con capacidad reductora y quelante, tales como catecol-quelante y glucopéptidos. Los compuestos reducidos de Fe+3 juegan un rol importante en la +2 degradación de la madera por reducción a Fe que en presencia de H2O2 generan radicales •OH, el cual es uno de los más potentes oxidantes conocidos, de amplio espectro sobre compuestos orgánicos naturales diversos, estos radicales •OH reaccionan de diferentes formas con la lignina y algunas de estas reacciones convierten sustancias no fenólicas en fenólicas, como por ejemplo cuando ocurre la adición de un radical OH en una posición insustituible de un anillo y el radical favorece la oxidación y libera un protón para ser introducido a un nuevo grupo fenólico hidroxílico. En este punto MnP o lacasa pueden fomentar una nueva forma fenólica de lignina; lo que genera en el proceso global de degradación de lignina una explicación mínima de la degradación completa de esta estructura en ausencia de LiP (Buswell y Odier, 1987; Kirk y Farrel, 1987; Blanchette, 1995; Blanchette et al., 1997; Arantes y Milagres, 2007b). En diferentes estudios previos se reporta la degradación de la lignina fenólica y no fenólica utilizando el +3 reactivo de Fenton (Fe /H2O2) sintético reductor. Un sistema referido a una reacción mediadora de Fenton como quelante. Según estos resultados, probablemente en mayor o menor magnitud la reacción de Fenton puede ser involucrada en el proceso global de la biodegradación de la lignina por hongos de pudrición blanca, también reportada para hongos de pudrición café, ya que ellos poseen una forma de generar la +2 solubilización del Fe , el cual en presencia de H2O2 una especie de oxígeno reactivo (ROS) es formado vía reacción de Fenton (Gold y Alic, 1993; Blanchette et al., 1997; Rodríguez et al., 2003; Hammel et al., 2002). Existen evidencias de la degradación del compuesto no fenólico azure B (indicador de LiP) han sido +3 llevados a cabo utilizando el posible sinergismo dado entre el reactivo de Fenton (Fe /H2O2) con hongos de pudrición blanca que producen solamente MnP y lacasa, evidenciando que la degradación del azure B está +3 sujeta a la modificación de su estructura, promovida por Fe /H2O2 a fin de que el sustrato sea oxidado por el sistema lacasa/MnP de los hongos de pudrición blanca (Arantes y Milagres, 2007a; Arantes y Milagres, 2007b). Estas investigaciones se constituyen en un excelente avance para el desarrollo de procesos, como el de +3 biorremediación, ya que hay evidencias de sustratos previamente tratados con Fenton (Fe /H2O2) y posteriormente inoculados con el hongo de pudrición blanca no productor de LiP o adicionando un extracto rico en MnP/lacasa fueron ampliamente degradados, demostrándose la importancia de la LiP para la degradación de compuestos recalcitrantes, asimismo la asociación positiva que puede generarse entre la reacción Fenton y los hongos de pudrición blanca, teniendo en cuenta que Fenton no sólamente corresponde a reacciones en presencia de hierro férrico o ferroso, sino que también puede generarse en presencia de otros metales como el cobre (Arantes y Milagres, 2007b; Arantes y Milagres, 2007a; Henry, 2003).
Tabla 9. Principales enzimas ligninolíticas de hongos de pudrición blanca Enzima Sustratos Propiedades Ocurrencia natural Referencias ligninolítica Grupos fenólicos y Hemoproteína glicosilada, Hongos de pudrición blanca: Glenn y Gold no fenólicos Azure extracelular, dependiente de H2O2. Phanerochaete crysosporium, (1985); Koduri y B, alcohol Es capaz de oxidar alcohol veratrílico, Grifola frondosa, Oxyporus Tien, (1994); Lignin- veratrílico, Poly R- metabolito producido durante el latemarginatus CTM 10133 y Leonowicz et al., peroxidasa 478 y oxida el crecimiento secundario junto con la CTM 10136, Trametes trogii (1999); Levin et (E.C.1.11.1.14) ABTS. enzima. Es importante porque por su CTM 10154 y CTM 10156, al. (2004); Dhouib (LiP) pequeño tamaño puede difundir y Polyporus sp., Coriolus et al. (2005); actuar a cierta distancia de la enzima. antarcticus, Pycnoporus Kersten y Cullen, Cumple un rol protector de la enzima sanguineus, Trametes extenuata, (2007). ya que previene su oxidación. Pleurotus lindquistii entre otros. Actúa sobre sustratos Hemoproteina glicosilada con fuerte Phlebia sp., Oxyporus Glenn y Gold fenólicos, rojo fenol preferencia por el Mn+2 como latemarginatus, CTM 10133 y (1985); y sales de Mn. sustrato. Lo oxida a Mn+3, el cual 10136 Trametes trogii, Leonowicz et al. forma complejos con ácidos Polyporus sp. Grifola frondosa, (1999); Levin et dicarboxílicos o con α-hidroxiácidos, Ganoderma applanatum, al. (2004); estos complejos pueden difundir a Ganoderma lucidum, Lentinus Buswell et al. Manganeso cierta distancia de la enzima y oxidar edodes, Pleurotus sp., Fomes (1995); Peroxidasa a su vez a la lignina. La regulación de sclerodermeus, Daedaleopsis Maganhotto de (E.C.1.11.1.13) su producción está dada por la confragosa, Marasmius allaceus, Souza-Silva et al. (MnP) limitación de nitrógeno y por la entre otros. (2005); presencia de Mn. Rodriguez-Couto y Sanromán, (2005); Kersten y Cullen, (2007); Levin et al. (2008). Modelos de lignina Es una polifenoloxidasa que contiene Hongos de pudrición blanca, Levin et al. que contiene grupos cobre en su molécula. Son algunas bacterias, insectos y (2004); Dhouib et fenólicos libres extraordinariamente no-específicas plantas superiores: Phlebia sp., al. (2005); Levin formando radicales respecto al sustrato. Presentan una Oxyporus latemarginatus, CTM et al. (2008) fenoxi y mediante la amplia gama de aplicaciones: 10133 y 10136 Trametes trogii, Thurston, (1994); Lacasa acción de blanqueo de pulpas, decoloración de Polyporus sp. Grifola frondosa, Eggert et al. (E.C.1.10.3.2) mediadores del textiles, tratamiento de aguas Ganoderma applanatum, (1996); Mayer y proceso actúa sobre residuales, biorremediación, etc. Ganoderma lucidum, Lentinus Staples, (2002); grupos no fenólicos., edodes, Pleurotus sp., Fomes Rodriguez-Couto ABTS. sclerodermeus, Daedaleopsis y Toca-Herrera, confragosa, Marasmius allaceus, (2007). entre otros. Celobiosa, quinonas Oxida celobiosa a celobionolactona y Por ser enzimas que intervienen Evans et al. y metabolitos reduce quinonas y otros radicales siempre en las reacciones de (1994); Zhao y producidos por la producidos por LiP, MnP, lacasa y transición en las reacciones de Janse, (1996); Celobiosa- acción de enzimas protege así de la repolimerización. las enzimas MnP, LiP, lacasa y Carlile et al. quinona-oxido- ligninolíticas. celulasas. Aún no se determinan (2001). reductasa especies particulares de (CBQ) producción de éstas. En general todos los hongos que producen enzimas ligninolíticas, también producen CBQ El requerimiento Su síntesis acompaña la síntesis de En general, por todos los hongos Evans et al. necesario es la peroxidasas. Actúa específicamente que utilizan la glucosa como (1994); Zhao y presencia de glucosa sobre la glucosa mediante la fuente de energía. Janse, (1996); Glucosa-oxidasa y oxígeno. Polímeros incorporación de O , para producir Vroemen (2002) (GOX: glucosa 2 de celulosas, gluconolactona y H O , 1-oxidasa) 2 2 almidones, etc. posteriormente, a partir de la glucolactona se obtiene ácido glucónico. Oxida varios Es extracelular. El glioxal es un Por ser enzimas que intervienen Evans et al. sustratos: glioxal, metabolito excretado por los hongos siempre en las reacciones de (1994); Zhao y metilglioxal. de pudrición blanca. Los azúcares transición en las reacciones de Janse, (1996); necesarios para la glioxal-oxidasa las enzimas MnP, LiP, lacasa y Carlile et al. Glioxal-oxidasa pueden ser producidos por la acción celulasas. En general todos los (2001). (Glox) de celulasas o hemicelulasas sobre los hongos de pudrición blanca que polisacáridos de la madera. producen enzimas ligninolíticas, también producen glioxal- oxidasa
2.3.4. Otras enzimas producidas por hongos de pudrición blanca
i. Proteasas
Hidrolizan los enlaces peptídicos de las proteínas y los péptidos; rompen las moléculas de sustrato en fragmentos más pequeños (Moore, 1998a). Las enzimas proteolíticas son producidas intra y extra celularmente, juegan un rol importante en los procesos de regulación de la célula y la pared celular, contribuyendo con la nutrición de los hongos a través de la degradación de las proteínas presentes en los nutrientes. Las proteasas extracelulares son producidas por muchas especies de hongos, aunque las más conocidas son las producidas por Aspergillus sp. y Neurospora crassa. Los basidiomicetos Agaricus, Coprinus y Volvariella son organismos que se pueden destacar porque además de utilizar la glucosa como fuente de energía, pueden también usar proteínas como fuente de nitrógeno y azufre (Kalisz et al., 1987; Kalisz, 1988; Kalisz et al., 1989).
ii. Pectinasas
Las enzimas pectinolíticas constituyen un grupo heterogéneo de enzimas que catalizan la degradación de las pectinas. Las plantas y los microorganismos son los principales productores de estas enzimas. Las pectinasas se clasifican en tres tipos principales: pectinas esterificantes o pectinesterasas, enzimas despolimerizantes, las hidrolasas y liasas y protopectinasas. Las pectinestearasas catalizan la desesterificación de los grupos metilo de la pectina dando lugar a ácido poligalacturónico o pectato (Burns, 1991; Alkorta et al., 1998). Su actividad se puede determinar midiendo la liberación de metanol. Las despolimerasas se clasifican atendiendo a tres aspectos, que se refieren al modo de ataque al esqueleto de ácido poligalacturónico. Estos aspectos siguen los siguientes criterios: a) el mecanismo químico de ruptura de los enlaces: hidrólisis o transeliminación; b) la naturaleza del sustrato preferido: pectina o ácido poligalacturónico; c) el modo de corte del polímero: endo o exo (Chang et al., 1994). Las enzimas despolimerizantes pueden romper los enlaces α(1-4) glucosídicos entre los monómeros de ácido galacturónico de las pectinas por hidrólisis (hidrolasas) o por transeliminación (liasas). Las hidrolasas rompen los enlaces entre los monómeros del ácido galacturónico por adición de agua. Son activas a pH ácido y pueden ser inhibidas por el ión calcio (Alkorta et al., 1998). Generalmente las exopoligalacturonasas de hongos y plantas liberan ácido galacturónico, mientras que las bacterianas liberan ácido digalacturónico. Las polimetilgalacturonasas degradan el polímero metilado, la pectina. Todas las pectinasas descritas hasta el momento, actúan de forma endo (Baker y Wicker, 1996; Alkorta et al., 1998). Son sintetizadas mayoritariamente por hongos, aunque también se han identificado en algunas bacterias (Chang et al., 1994). Las pectinasas se usan ampliamente en la industria alimentaria en la clarificación de jugos y vinos, en la extracción de aceites, en la remoción de cáscaras de frutas cítricas y para incrementar la firmeza de varias frutas (Rodríguez-Couto y Sanromán, 2005).
iii. Lipasas y esterasas
Catalizan la hidrólisis de ésteres formando alcoholes y ácidos orgánicos, generalmente presentan baja especificidad y podría decirse que casi cualquier lipasa puede hidrolizar cualquier éster orgánico variando solamente la velocidad de reacción. Los principales factores que influyen en la especificidad son las longitudes y formas de las cadenas hidrocarbonadas que se encuentran a lado y lado del grupo éster. El término esterasa es generalmente aplicado a enzimas que prefieren cadenas de carbono cortas en el grupo acilo. Las lipasas apropiadas tienden a favorecer las cadenas largas de carbono en el grupo acilo, como las grasas. Los componentes lipídicos de las lipoproteínas y el enlace éster son fosfolípidos. La producción de lipasas extracelulares han sido detectadas en Agaricus bisporus durante la degradación bacteriana (Fermor y Wood, 1981); en cultivos de fermentación han sido producidas en fase estacionaria como metabolitos secundarios por Rhizopus sp., teniéndose que controlar las concentraciones de carbono, nitrógeno y oxígeno para obtener buenos rendimientos de lipasas (Mukhamedzhanova y Bezborodov, 1982; Guiseppin, 1984). Las fosfatasas son también estearasas que actúan sobre ésteres de alcoholes con ácido fosfórico. Éstas son enzimas de baja especificidad y se dividen en grupos dependiendo de su actividad, como fosfomonoestearasas, fosfodiestearasas y polifosfatasas. Se distinguen por su acción bajo condiciones alcalinas o ácidas. Por ejemplo las fosfatasas producidas por Agaricus bisporus durante su crecimiento sobre compost, se convierten en un factor de nutrición importante para el hongo; ya que éstas pueden hacer una recuperación importante de sulfatos o de polisacáridos sulfatados, tales como los que se encuentran en el suelo (Moore, 1998a).
2.3.5. Aplicaciones de las enzimas lignocelulolíticas
En el contexto general, es notable el incremento de la integración de la catálisis biológica en una gran variedad de procesos industriales de artículos básicos de consumo y en la industria química, tales como acril- amida, fructosa, ácido málico y aspártico, como intermediarios de complejos farmacéuticos intermedios, insumos para la producción de drogas, entre otros (Schulze y Wubbolts, 1999; Zaks, 2001). Las hidrolasas se consideran un grupo importante de enzimas para ser utilizadas en la producción de químicos finos como enantiómeros de moléculas quirales, productos químicos con diferentes grados de pureza, ya que por la selectividad de este grupo de enzimas, se pueden obtener mayores combinaciones de estos productos a menores costos de producción (Stead et al., 1996; Ladner y Ditrich, 1999). Las enzimas oxido-reductasas son utilizadas para la conversión de compuestos proquirales en moléculas quirales con alta selectividad. En la industria se encuentran aplicaciones de reacciones de bio-oxidación, que hacen uso de la regioselectividad de la biocatálisis. Por ejemplo, se han utilizado procesos de fermentación para la producción de ácido 6-hidroxinicotínico, para la fabricación de agroquímicos, a partir de ácido nicotínico a gran escala con Achromobacter xilososidans y para la conversión de ácido (R)-2- fenoxipropanoico a (R)-2-4-hidroxifenoxi-ácido propanoico (utilizado para síntesis de muchos agroquímicos) con Bauveria bassiana (utilzada por la BASF) (Meyer et al., 1997; Schulze y Wubbolts, 1999). Las enzimas ligninolíticas de hongos de pudrición blanca tienen una amplia aplicación en procesos de transformación y mineralización de órgano-contaminantes con estructuras similares a las de la lignina. Estas enzimas en la actualidad están siendo involucradas en los procesos de depuración de aguas residuales, pesticidas bifenil policlorados, hidrocarburos policíclicos aromáticos, efluentes de plantas de blanqueo, residuos sintéticos, polímeros sintéticos, entre otros (Pointing, 2001). Las enzimas ligninolíticas por su baja especificidad son activas sobre una amplia gama de sustratos; su modo de acción se basa en la generación de radicales libres. Estas enzimas son capaces de realizar transformación o mineralización in vitro de productos altamente recalcitrantes como fenantrenos, benzopirenos, pentaclorofenol, 2,2’,4,4’-tetraclorofenil y muchos otros compuestos aromáticos policíclicos (Reddy, 1995; Pointing, 2001; Ali, 2010). Esto es de particular importancia para el tratamiento de residuos con xenobióticos que están generando un problema de polución ambiental. Referente al tema de biorremediación, en particular, se requiere mayor investigación sobre el modo de acción de las enzimas ligninolíticas sobre diversos compuestos aromáticos. Falta información disponible acerca de la determinación de condiciones ambientales para realizar las transformaciones y mineralizaciones de estas sustancias denominadas recalcitrantes in situ. Asimismo, es importante realizar las comparaciones de las eficiencias de procesos de fermentación con procesos enzimáticos, utilizando los extractos crudos de enzimas o las enzimas purificadas. Las ligninasas son utilizadas para la deslignificación de los materiales lignocelulósicos dispuestos para alimentación de rumiantes. Por ejemplo, la industria de producción de carne bovina en el mundo presenta dificultades para mantener estable el suministro de alimentos para los animales. Uno de los principales inconvenientes es la variación del clima, lo que ha generado que este segmento de la industria alimentaria busque nuevas alternativas para el mantenimiento de la alimentación animal (Koutinas et al., 2004). En el planeta se desechan grandes cantidades de materiales lignocelulósicos que generan contaminación y que pueden ser utilizados para este fin utilizando complejos de enzimas ligninolíticas para la degradación de la lignina y posteriormente realizar los ensilajes o las transformaciones y suplementaciones requeridas por los animales (Weinberg, 2000; Koutinas et al., 2004). Las enzimas celulolíticas son consideradas de gran importancia industrial. Por ejemplo, ellas han sido ampliamente utilizadas para reemplazar la hidrólisis ácida como método de conversión de celulosa en azúcares fermentables, especialmente glucosa para la producción de etanol y otros alcoholes de importancia industrial, asimismo, la glucosa obtenida es utilizada como materia prima para la manufactura de diferentes alimentos para animales, humanos y productos químicos. Las celulasas también son utilizadas en diversos procesos de fermentación para la producción de sustancias de uso industrial como el ácido láctico, en procesos de fermentación aceto-butílica; en el mejoramiento de la textura del papel (liso), biodesentintado para reciclado del papel utilizando una mezcla de celulasas, pectinasas, xilanasas y lipasas; en el biopulido de telas para el tratamiento superficial de las pelusas, en la elaboración de paños super absorbentes, en la extracción de jugos, aromas, aceites y pigmentos con agregados enzimáticos de celulasas, pectinasas y xilanasas, éstas rompen paredes celulares y hace más eficiente la extracción; en la elaboración de aditivos no calóricos; ampliamente utilizada en la formulación de detergentes para mejoramiento del liso de las telas y de la evacuación de la formación de fibras indeseables en telas de algodón (Joshi y Pandey, 1999a; Carlile et al., 2001; Bommarius y Riebel, 2004b; Sánchez y Cardona, 2007). Las enzimas lignocelulolíticas juegan un rol importante en la conversión del complejo lignocelulósico en azúcares fermentables para la producción de alcohol carburante (Sánchez y Cardona, 2008). Los materiales lignocelulósicos generalmente son sometidos a pretratamientos físicos y químicos como adecuación de los materiales a fin de mejorar las condiciones de procesos y de trabajo en los procesos de fermentación para la producción de etanol. A pesar de que existen alternativas de desarrollo para realizar los pretratamientos de estos materiales lignocelulósicos utilizando enzimas comerciales. Falta más investigación para el desarrollo de estas tecnologías de transformación de los materiales lignocelulósicos, en azúcares fermentables con extractos crudos de enzimas lignocelulolíticas para el proceso de producción de etanol a escala industrial. 2.4. Polisacáridos fúngicos
Los polisacáridos de los hongos macromicetos han sido reconocidos como excelentes inmunoestimuladores debido al potencial de sus propiedades terapéuticas, a que no son tóxicos y son escasos sus efectos secundarios en comparación con otros inmunoestimulantes. Estos polisacáridos bioactivos son producidos en cantidades relevantes a partir de los cuerpos fructíferos de los hongos, su micelio y además, de los filtrados obtenidos de sus cultivos en fermentación sumergida. En mayor medida las estructuras de los polisacáridos procedentes de los macromicetos corresponden a homoglicanos, heteroglicanos o complejos de gluco-proteínas. En general, la actividad inmunomoduladora de los polisacáridos de los macromicetos está relacionada con las estructuras β-(1→3), β-(1→6) glucanos, α-(1→3) glucanos y complejos de polisacáridos de galactomananos y glucuromananos unidos a proteínas presentes en la pared celular de los macromicetos (Enshasy, 2010). El β-D-glucano es un polisacárido que produce exclusivamente D-glucosa luego de la hidrólisis ácida (Mizuno, 1999). A los biopolímeros fúngicos quitina y quitosano no se les ha reportado actividad antitumoral. Los polisacáridos pueden ser obtenidos por medio de fermentación sumergida con una selección apropiada del medio de cultivo, procedimiento que en ocasiones puede ser más útil que esperar que las diferentes especies de macromicetos fructifiquen para utilizar estos carpóforos como materia prima de los polisacáridos (Komura et al., 2010). Los β-glucanos forman moléculas largas y cilíndricas que pueden contener hasta 250.000 unidades de glucosa. Los β-glucanos también se encuentran en las paredes de las células del endosperma de granos como la cebada y la avena, y ayudan a reducir las enfermedades del corazón bajando el nivel de colesterol y reduciendo la reacción glicémica de los carbohidratos. Se usan comercialmente para sustituir grasas y para modificar la textura de los productos alimenticios (Mohammad-Fata et al., 2007). En efecto, de los 700 hongos comestibles, solo unos 50 tienen valor medicinal y entre ellos Grifola frondosa es uno de los más notables e investigado, especialmente como estimulador del sistema inmune y por sus propiedades en la lucha contra el cáncer. Sin embargo, según Chang y Miles (2004) se ha considerado que existen unas 1800 especies de macrohongos con potencial medicinal en el planeta. Se han aislado muchas sustancias bioactivas con efecto inmunoestimulador a partir de los macromicetos entre los que se incluyen polisacáridos de alto y bajo peso molecular, glicoproteínas, triterpenoides y proteínas fúngicas que estimulan el sistema inmunológico. Estas sustancias bioactivas pueden ser obtenidas de diferentes estructuras del macromiceto como de extractos del cuerpo fructífero en diferentes solventes, desde agua caliente hasta distintas mezclas de solventes orgánicos; también se pueden extraer del micelio obtenido de los cultivos líquidos y de los caldos de cultivo de las fermentaciones sumergidas. En mayor proporción estas sustancias se obtienen del cuerpo fructífero sometido a proceso de extracción con un promedio del 77, 3%, seguida del micelio conseguido del procesos en medio líquido con un 20,8% y finalmente un 2% derivadas de los caldos de cultivo de las fermentaciones sumergidas. Sin embargo, cada especie de hongo produce distintos tipos de polisacáridos con diferentes propiedades y actividad biológica, lo cual, a pesar de sus aplicaciones, no se ha discutido sistemáticamente en la literatura más que a nivel de laboratorio. De igual forma, la estructura de la cual se obtiene el polisacáridos bioactivo, del carpóforo, del micelio o de los caldos de cultivo afectan las estructuras moleculares, la unidad estructural que se repite (el monómero), los pesos moleculares, entre otros factores, lo cual influye directamente en su modo de acción y su actividad biológica (Tsukagoshi et al., 1984; Ishikawa et al., 1992; Hamlyn y Schmidt, 1994; Kobayashi et al., 1995; Zhuang y Mizuno, 1999; Chang y Miles, 2004; Mohammad-Fata et al., 2007). Los exopolisacáridos de basidiomicetos de pudrición blanca juegan un rol importante en los procesos de crecimiento y desarrollo de estos organismos. Estos exopolisacáridos pueden inmovilizar las exoenzimas que ellos mismo excretan (Tang y Zhong, 2002). Según Catley (1992) el gel formado por estos biopolímeros previene la deshidratación de la hifa, permitiendo la adherencia de otras células a las superficies de los sustratos, posibilitando la selección de las moléculas del ambiente que los rodea (Maziero et al., 1999). Adicionalmente, estos biopolímeros tienen una amplia expectativa de aplicaciones industriales. Un ejemplo es el exopolisacárido conocido como schizophyllan producido por el basidiomiceto Schizophyllum commune. Este polímero es el β-(1-3), (1-6)-glucano soluble en agua, que forma una solución viscosa con alta estabilidad térmica y ha sido utilizado con buenos resultados en pacientes con cáncer cervical (ver Tabla 10) (Jong y Birgmingham, 1992; Hamlyn y Schmidt, 1994). En la Tabla 10 se hace referencia a algunos polisacáridos obtenidos de hongos de pudrición blanca con su actividad antitumoral e inmunomoduladora y sus estructuras generales. Asimismo, a estos compuestos se les ha encontrado otras funciones biológicas, en las que se incluye actividad antiviral, propiedades inmunoreguladoras (Kumari y Sahoo, 2006; Tao et al., 2006), en la industria cosmética (Mansel, 1994; Zanchetta et al., 2003). Además, de haberse reportado usos de estos biopolímeros en la industria alimentaria (Moon et al., 2006), y en la remoción de iones metálicos de aguas residuales (Chu y Kim, 2006). Otros investigadores han reportado actividad antitumoral de los complejos de polisacáridos extraídos del micelio o del cuerpo fructífero de hongos macromicetos, como el complejo proteína-polisacárido PSK del hongo Coriolus versicolor (Ooi y Liu, 2000), el complejo polisacárido-proteína del cultivo de Tricholoma lobayense (Liu et al., 1996), exobiopolímeros de varias especies de Cordyceps a las cuales se les ha demostrado actividad antitumoral (Chen et al., 1997), inmunopotenciador (Nakamura et al., 1999), actividad hipoglicémica (Kiho et al., 1999) y efecto hipocolesterolémico (Koh et al., 2003). Los polisacáridos de los macromicetos y sus complejos polisacárido-proteina estimulan el sistema inmune no específico y por lo tanto ejercen actividades antitumorales a través de la estimulación de los propios mecanismos de defensa del cuerpo (Wasser y Weis, 1999). Los polisacáridos de las setas pueden actuar como efectores y antiproliferativos en la inducción de la apoptosis (muerte celular programada) en las células antitumorales, activando los efectores de las células como macrófagos y los linfocitos para secretar citoquinas, las cuales son capaces de promover la citoxicidad de los macrófagos; de modo que la producción de las citocinas (citoquinas) por las células inmunes es considerada como un acontecimiento de la iniciación y regulación de la respuesta inmune del cuerpo que consume estos polisacáridos bioactivos (Lull et al., 2005). Los polisacáridos bioactivos de los hongos han demostrado reducir el tamaño de los tumores hasta en un 50% en ratones prolongando la supervivencia del portador del tumor (Wasser, 2002). A través de los años se ha comprobado que los extractos de los hongos macromicetos tienen actividad inmunomoduladora, aunque el enfoque estándar haya sido aislar y caracterizar los compuestos bioactivos puros a fin de facilitar el suministro vía intravenosa a las personas que lo requieran. De forma que surgen interrogantes de cómo los polisacáridos de los macromicetos pueden introducirse en la célula, si éstos por su tamaño no pueden penetrar la pared celular. Sin embargo, estos polisacáridos pueden actuar de forma sinérgica con otros componentes, ya que las respuestas a diferentes polisacáridos son mediadas por el reconocimiento de diferentes receptores que se encuentran en la superficie celular y su adecuada combinación ofrece una mejor respuesta, dando mayores efectos terapéuticos al polisacárido o su combinación (Borchers et al., 2004; Lull et al., 2005; Leung et al., 2006). Los pesos moleculares de los polisacáridos o los compuestos asociados de los hongos juegan un rol importante al momento de medir su actividad biológica o bioactividad, ya que todas las fracciones de estas estructuras no exhiben una actividad biológica detectable. Por ejemplo, en extractos obtenidos de G. frondosa se obtuvieron fracciones de diferentes tamaños, detectando la mayor actividad inmunomoduladora en la fracción de masa molecular de 800 kDa (Adachi et al., 1990). De igual forma, cuando se realizaron las separaciones de las fracciones del PSK (Krestin) de C. versicolor por ultrafiltraciones sucesivas, en cuatro fracciones: F1, <50 kDa; F2, 50-100 kDa; F3, 100-200 kDa; F4, >200 kDa la fracción que mayor actividad inmunomoduladora arrojó fue la de mayor masa molecular (Kim et al., 1990). Estos ejemplos son una muestra de la potencialidad que tienen los hongos como fuente de sustancias bioactivas para la obtención de potenciadores del sistema inmunológico, teniendo en cuenta que de las 140.000 especies de macromicetos que se estima existen en el planeta, solamente se conocen cerca del 10%, de las cuales sólo han sido examinadas desde su potencial inmunomodulador el 5% (Lindequist et al., 2005). En la formación de exo e intra-polisacáridos están involucradas varias enzimas que conducen a su formación y pueden estar divididas en cuatro grupos: enzimas responsables del metabolismo inicial de los carbohidratos; enzimas que involucran síntesis de nucleótidos y azúcares y su interconversión; glicosiltransferasas que frecuentemente sintetizan unidades glucosídicos de lípidos y; translocasas y polimerasas que sintetizan los polímeros. La fosfoglucosaisomerasa (PGI) conduce a la formación de lactato y la α-fosfoglucomutamasa (α-PGM) conduce a la formación de los polisacáridos, que son los puntos ramificados entre la vía Embden–Meyerhof–Parnas (EMP) y la biosíntesis de polisacáridos. La suplementación de los sustratos es una estrategia para incrementar la producción de biomasa celular y una forma de mantener constante la producción de polisacáridos (Tang y Zhong, 2002).
Tabla 10. Polisacáridos bioactivos obtenidos de hongos de pudrición blanca con actividad antitumoral e inmunomoduladora. Tumor/cáncer Origen del Especie tratado/Actividad Estructura del polisacárido Referencia polisacárido inmunomoduladora Ishikawa et al. Sistema digestivo / Glucoproteínas, (1-4), (1-3)-β- (1992); Tsukagoshi et Coriolus versicolor Cultivo micelial inmunomodulador D-glucan, Polisacaropéctido al. (1984); Cui y Chisti (2003) (1-3)-β-D-glucan, Cáncer de Chihara et al. (1969); Cuerpo fructífero, manoglucanos, glucanos, Lentinus edodes estómago/actividad Kosaka y Yamashita medio de cultivo lentinan, complejo poliscáridos- inmunomoduladora (1993); Hobbs (2000) proteina Cuerpo fructífero, Glucano, heteroglucanos, Russell y Paterson Cordyceps sinensis Inmunomodulador micelio, caldo de cordiglucanos (2008); Yalin et al. cultivo (2005)
Flamulina velutipes Inmunomodulador Carpóforo, micelio Complejo proteo-glucano, Leung et al. (1997)
Schizophyllum Cervical Micelio y carpóforo (1-3), (1-6)-β-D-glucan Komatsu et al. (1969) commune Ácido ganodérico, Mizuno et al. (1995); Ganoderma Actividad antitumoral Micelio y carpóforo manoglucano, glicopeptidos, Ooi y Liu (1999); Gao lucidum genérica/inmunomoduladora heteroglucano, y Zhou (2003) Actividad antitumoral Agaricus blazei Micelio y carpóforo (1-6)-β-D-glucan Mizuno et al. (1995) genérica (1-3), (1-6)-β-D-glucan, Zhuang y Mizuno Actividad antitumoral Cuerpo fructífero , Grifola frondosa Glicoproteínas , heteroglucanos, (1999); Yang et al. genérica/inmunomoduladora medios de cultivo galactomananos, grifolan (2007) Actividad Cuerpo fructífero, Heteroglucanos, complejo Hericum erinaceus Mizuno (1992) inmunomoduladora micelio péptido-heteroglucano Cuerpo fructífero, Actividad Pleurotus ostreatus micelio, medio de Heterogalactan, proteoglucano Sarangi et al. (2006) inmunomoduladora cultivo
2.5. Fermentación sumergida
La fermentación sumergida involucra el desarrollo de microorganismos en medio líquido rico en nutrientes y con altas concentraciones de oxígeno (condiciones aeróbicas). La producción industrial de enzimas se ha hecho principalmente por fermentación sumergida. Sin embargo, el desarrollo de las hifas (especialmente de basidiomicetos) en cultivos sumergidos resulta usualmente en el desarrollo incontrolado del micelio (conjunto de hifas). La extensión de la biomasa fúngica tiene profundos efectos en la transferencia de masa, velocidad metabólica y secreción de productos. El micelio fúngico puede enrollarse alrededor de las esferas (pellets) de la misma biomasa, causando bloqueos y extendiéndose en todo el medio de cultivo, incrementando la viscosidad, la cual resulta ser una limitante de la transferencia de masa y de oxígeno en el reactor. Todos estos inconvenientes limitan el tiempo de operación en los biorreactores (Rodriguez-Couto y Toca-Herrera, 2007). Diferentes estrategias han sido utilizadas para el control del desarrollo fúngico en los biorreactores de tanque agitado, como el control del desarrollo de los pellets de micelio, lo cual incrementa los períodos de tiempo de operación en los biorreactores. Varios investigadores, entre los que se destacan Blánquez et al. (2004; 2006; 2007) han inmovilizado diferentes cepas de hongos de pudrición blanca para el control de la velocidad de crecimiento y el aumento de la viscosidad, lo que resulta ser benéfico para la transferencia de oxígeno en las fermentaciones sumergidas. Debido a la variabilidad existente no sólo entre cepas fúngicas sino también en las características físico-químicas de los productos que originan, el desarrollo de fermentaciones sumergidas con hongos de pudrición blanca para la producción industrial de metabolitos como enzimas lignocelulolíticas y exopolisacáridos, es aún una línea promisoria de investigación. Los residuos agrícolas en países del tercer mundo equivalen hasta el 70% del total de los residuos generados, y en la mayoría de los casos no son utilizados o se utilizan de forma marginal, con el consecuente impacto ambiental. Aprovecharlos como materias primas de nuevos procesos de transformación, se constituye en una alternativa importante para el desarrollo de la región y del país. Investigadores como Elisashvili et al. (2001a; 2008) y Fujian et al. (2001) han demostrado que la producción de enzimas hidrolasas es más eficiente en los procesos de fermentación sumergida, utilizando materiales lignocelulósicos pretratados en forma de lodos o con un grado de solubilidad en los medios de cultivo. Probablemente, porque con los pretratamientos necesarios para las fermentaciones sumergidas de estos materiales lignocelulósicos se degrada parte de la estructura de la lignina, quedando expuesta la celulosa, la cual se comporta como un activador de celulasas en el medio de cultivo, mejorando la actividad enzimática de endoglucanasas, exocelobiohidrolasas y β-glucosidasas en medios líquidos, en comparación con las actividades hidrolíticas en sustratos sólidos para basidiomicetos. Cuando se trabaja en procesos de fermentación en estado sólido generalmente no se realizan pretratamientos a los materiales lignocelulósicos y los organismos que trabajan sobre ellos, probablemente excretan solo las hidrolasas que se requieren para la obtención de la energía necesaria para su desarrollo. La producción de polisacáridos extracelulares con hongos macromicetos por fermentación sumergida resulta influida por las condiciones de fermentación, tales como el tiempo de proceso, temperatura, composición del medio de cultivo, velocidad de agitación, pH inicial, tamaño del inóculo, etc. Realizar este seguimiento y control de todas estas variables demanda tiempo, esfuerzo y dinero para obtener los datos experimentales requeridos a fin de obtener la evaluación exhaustiva de la interacción de estas variables con la producción directa de los polisacáridos. Actualmente se encuentran reportes de investigaciones realizadas en la obtención de intra y exopolisacáridos a partir de macromicetos como Coprinus comatus, Agaricus nevoi, Auricularia auricula-judae, y Flammulina velutipes extraídos con etanol y mostrando una actividad antioxidante de más del 80% medida con 1,1 difenil-2-picril hidrazil (DPPH) y una producción de exopolisacáridos de 0,6 a 4,2 g/L en cultivos sumergidos (Asatiani et al., 2008). En referencia al medio de cultivo para la producción de polisacáridos a partir de hongos, diferentes trabajos publicados en la última década evidencian la importancia de la presencia de aceites vegetales ricos en ácido oleico como promotores de crecimiento de la biomasa fúngica y por ende de sus polisacáridos constituyentes (Yang et al., 2000; Hsieh et al., 2008). Al momento de seleccionar el tipo de aceite vegetal o ácido grasos a utilizar como inductor de polisacáridos es necesario considerar la composición de ácidos grasos del aceite; ya que ha sido reportado por varios investigadores que cantidades importantes de ácido linoleico suprimen la producción de biomasa y polisacáridos, mientras que la presencia de ácido oleico promueve su producción (Park et al., 2002; Hsieh et al., 2006; Hsieh et al., 2008). Los aceites de soya y de oliva han sido utilizados como promotores de crecimiento celular y de polisacáridos en cultivos de macromicetos, tanto líquidos como sólidos. Al respecto, el aceite de oliva contiene 84% de ácido oleico y entre 30 y 60% en aceite de soya con bajos contenidos de ácido linoleico (Wade, 1993; Hsieh et al., 2008). Aún se requiere mayor investigación en torno al control de los procesos de fermentación sumergida con hongos macromicetos. Por ejemplo, Wu et al. (2006) encontraron que para incrementar y mantener constante la producción de biomasa celular y exopolisacáridos producidos por el macromiceto Auricularia auricula en fermentación sumergida fue necesario controlar variables tales como composición de sustrato, pH del medio, temperatura y condiciones ambientales, entre otras. Sin embargo, estudios previos a éste han demostrado que el control del pH cumple un rol muy importante en el desarrollo de la biomasa miceliana y la producción de polisacáridos (Fang y Zhong, 2002). Los estudios cinéticos de crecimiento fúngico y producción de exopolisacáridos por macromicetos en fermentaciones sumergidas son de carácter prioritario para la optimización de estos procesos. Las materias primas que se requieren como fuente del complejo lignocelulósico para obtener extractos crudos de enzimas lignocelulolíticas, celulasas y polisacáridos (exo y endopolisacáridos) utilizando hongos de pudrición blanca, deben ser tomados de los residuos de la región donde se realicen los procesos. En este caso en particular, se deben tener en cuenta los residuos de las industrias cafetera (pulpa, borra, cascarilla, zoca), maderera (aserrín de roble y de pino y los residuos forestales de cosecha), de transformación de cacao (cascarilla que contiene un alto contenido de proteína y puede ser utilizada como suplemento nutricional de los sustratos). De la misma forma, la producción agrícola de frutas y hortalizas son el suministro de cáscaras (plátano, cítricos, aguacate, etc.), los residuos provenientes de la industria de transformación frutícola, como cáscaras y semillas de mango, mora, lulo, naranja, maracuyá, coco, entre otros. El Departamento de Caldas y sus alrededores también, produce caña de azúcar y la transforma, obteniéndose subproductos como el bagazo, la melaza y la cachaza, con valor industrial importante. Por ejemplo, el bagazo de caña posee unas cantidades importantes de celulosa y hemicelulosa, representan el 75% en base seca de todo el material (Sánchez y Cardona, 2008). De igual forma, se registra una creciente producción de maíz y arroz en Caldas, de los cuales pueden utilizarse la tusa, las cáscaras, cascarillas, el tamo (hojas) y la planta después de la cosecha. Los hongos, como los demás organismos, utilizados en fermentación sumergida obedecen a una selección cuando van a ser utilizados en procesos industriales, teniendo en cuenta aspectos básicos de selección como son la estabilidad genética, la velocidad de crecimiento, la facilidad de adaptación a los medios de cultivo, entre otros. La selección de los organismos en la mayoría de los casos, se realiza probando medios de cultivo preferenciales, en la sección 2.7 se amplía la información sobre los métodos de selección y rastreo de cepas fúngicas según los productos que se esperan obtener. Las desventajas que limitan los tiempos de operación de los biorreactores de trabajo en fase líquida con organismos filamentosos como hongos y actinomicetos, hacen que se prefieran los procesos de fermentación discontinua; sin embargo, estos procesos han sufrido limitaciones tales como altos costos de proceso, control de tiempos de frecuencias de inicio y terminado de la fermentación, el requisito del inóculo fresco para cada fermentación y la recuperación de los productos en cantidades menores que cuando el proceso es continuo. Actualmente se están desarrollando nuevos diseños de biorreactores para dar solución operacional a estos problemas relacionados con los hongos filamentosos (Moreira et al., 2003). La dispersión del micelio, comúnmente en fermentaciones líquidas industriales implica homogenización y agitación de las hifas ramificadas. La dispersión del micelio produce un caldo con comportamiento no- newtoniano y su viscosidad aparente se incrementa con la velocidad de agitación, reduciendo el transporte de nutrientes, oxígeno y calor y por ende incrementando los costos de operación (Prosser y Tough, 1991). Este crecimiento del micelio, normalmente forma pellets. Cuando estas esferas exceden al denominado radio crítico, puede llevar a una disminución en el crecimiento de la masa celular. Esta situación aumenta las dificultades, prácticas y técnicas del cultivo de hongos filamentosos en medio líquido y consecuentemente el control y regulación de la extensión hifal y el tamaño del pellets se convierten en un factor de control crítico en los procesos continuos (Allen y Robinson, 1989; Moreira et al., 2003). De hecho, los hongos de pudrición blanca cada vez son más utilizados en procesos industriales para producir diferentes sustancias como enzimas y polisacáridos y en procesos de biorremediación; por lo que las investigaciones ligadas a dichos temas contribuirán a incrementar y optimizar sus aplicaciones industriales.
2.6. Fermentación en estado sólido
La fermentación en estado sólido involucra el desarrollo de organismos sobre sustratos sólidos en ausencia de agua libre. En la última década se han incrementado sus aplicaciones en torno a la producción de enzimas, antibióticos, surfactantes, biofertilizantes, bioinsecticidas, etc. así como también, en la adición de valor a muchos residuos sólidos, ya que estos subproductos son utilizados como materias primas de estos procesos. Las ventajas de los usos biotecnológicos que presenta la fermentación en estado sólido sobre la fermentación sumergida o fermentación clásica incluyen aspectos históricos, biológicos, ecológicos e ingenieriles. Como aspectos históricos relevantes se puede mencionar que los procesos de fermentación en estado sólido han sido convencionalmente utilizados por los asiáticos en la producción de koji ricos en enzimas a partir de cepas de Aspergillus sp., bebidas alcohólicas como el sake, utilizando materiales sacarificados de arroz, producción de colorantes, como el angkak (Monascus purpurea) y otros metabolitos y sustancias de utilidad con la tecnología de fermentación en estado sólido a gran escala, realizando la transferencia de tecnología entre las familias como secretos industriales. En occidente la tecnología de fermentación en fase sólida debe competir con la fermentación sumergida, ya que a partir de la segunda guerra mundial todos los desarrollos tecnológicos fueron orientados en torno a la fermentación sumergida. Sin embargo, en la actualidad por la globalización, las tendencias han cambiado y ya se encuentran avances en los procesos tecnológicos de las fermentaciones en estado sólido para la obtención de diversas sustancias, así como para la transformación de una gran cantidad de materiales lignocelulósicos (Hölker y Lenz, 2005). En referencia a los aspectos biológicos, la situación de mayor importancia probablemente es la condición de vida natural de los hongos filamentosos, ascomicetos, basidiomicetos y deuteromicetos, los cuales tienen sus hábitats silvestres sobre sustratos húmedos. Por esta condición la producción de enzimas, esporas o metabolitos de los hongos se encuentran bien ajustados al desarrollo sobre sustratos sólidos. Como ejemplo, la producción de esporas fúngicas por fermentación en estado sólido muestran una alta estabilidad, son más resistentes a las épocas de sequía y exhiben mayores velocidades de de germinación por largos períodos de tiempo, este hecho, probablemente se le atribuye a que las conidiosporas producidas en fermentación en estado sólido tienen una alta hidrofobicidad o causado también por la formación de un enlace hidrofóbico en las proteínas, una pared celular fuerte y un volumen pequeño (Munoz et al., 1995; Hölker y Lenz, 2005). Utilizando fermentación en estado sólido con hongos filamentosos se ha logrado obtener mejores rendimientos en la producción de enzimas, menores problemas de inhibición de crecimiento por sustratos y mayor estabilidad de los organismos a cambios de temperatura y pH que cuando estos mismos organismos se cultivan en medios líquidos, menor ocurrencia de degradación de enzimas por la presencia de proteasas indeseables (Hölker et al., 2004). Interesantes estudios en este campo exploran las características fisiológicas que se presentan durante el desarrollo de las células fúngicas en los procesos de FES. Ocurre una aparente acumulación de glicerol, eritritol y arabinitol que generan una inducción de genes de glucoamilasas, hecho que aparentemente está sujeto a la temperatura y actividad agua bajo estas condiciones de proceso. La formación de metabolitos secundarios de numerosos hongos filamentosos (especialmente micromicetos) en FES está asociada con la formación de las hifas aéreas y de esporas al inicio de la fase del metabolismo secundario y únicamente descritas en este tipo de procesos y no en FS (Hölker y Lenz, 2005). Esta es otra razón por la cual es necesario el desarrollo tecnológico en torno a FES, ya que existe mucho por explorar en cuanto a la obtención de nuevas sustancias utilizando hongos filamentos en FES. Una de las razones más serias que detienen los adelantos de los procesos FES son los problemas de ingeniería. Los problemas de estandarización y escalamiento de los procesos limitan la reproducibilidad de los resultados. El escalamiento en particular, genera un cuello de botella importante, debido al manejo de los gradientes de temperatura, humedad, concentración de sustrato, los cuales pueden variar, incrementándose durante el proceso, generando condiciones adversas en los procesos de cama sólida estática y en los reactores de tambor giratorio u otros equipos de agitación intermitente. La interrelación entre las condiciones ambientales, tales como concentración de oxígeno, niveles de humedad y temperatura contribuyen a la dificultad de regular estos mismos parámetros. El desarrollo fúngico bajo condiciones aeróbicas en el biorreactor resulta en un considerable incremento en la producción de calor causado por un aumento rápido de la temperatura. Este efecto es deseable en procesos de compostaje, pero es totalmente adverso en procesos biotecnológicos en biorreactores, ya que una gran parte de las enzimas producidas durante la FES pueden desnaturalizarse al final del proceso. En ausencia de la fase acuosa libre el calor producido es muy difícil de remover. Generalmente se utiliza para la remoción del calor metabólico, aireaciones inducidas que deben ser cuidadosamente planeadas a fin de evitar la pérdida excesiva de agua del material sólido o el incremento de la actividad agua del mismo, provocando un desequilibrio indeseable en el balance metabólico del proceso estático, el cual puede contaminarse con otros organismos oportunistas. Toda esta situación descrita provoca un desafío para nuevos desarrollos en cuanto al diseño y control de los procesos de FES, entendiendo mejor los procesos biológicos, físicos y químicos que ocurren durante el desarrollo de la hifa en medios sólidos (ver Figura 10) para así despejar las rutas de proceso más adecuadas para la industrialización de los procesos FES (Muller dos Santos et al., 2004; Hölker y Lenz, 2005; Lenz et al., 2004). Aspectos tales como la transferencia de masa y de calor, el diseño, control y escalamiento de los biorreactores en estado sólido constituyen líneas de estudio de relevancia. Los basidiomicetos de pudrición blanca se destacan por la producción de enzimas celulasas, xilanasas, lacasas y manganeso peroxidasas en fermentaciones en estado sólido utilizando sustratos lignocelulósicos. Perfiles de comparación sobre la producción de enzimas lignocelulolíticas hechos para los ciclos de vida de cepas comerciales de Grifola frondosa, Pleurotus ostreatus y Lentinus edodes en fermentaciones sólidas mostraron que las actividades de las lacasas y MnP fueron altas al final de la fase de colonización y declinaron rápidamente en las fases reproductivas. En contraste con las actividades enzimáticas de celulasas y xilanasas, las cuales expresaron actividades enzimáticas medianamente estables durante la colonización y se incrementaron durante la fase reproductiva (Asatiani et al., 2008; Montoya et al., 2011a). La selección de las materias primas para los sustratos de las fermentaciones en estado sólido depende de los productos a obtener. En la Tabla 4 se muestran los materiales que mayoritariamente son utilizados como materias primas para los procesos de fermentación en estado sólido, siempre obedeciendo a formulaciones preestablecidas de acuerdo con las necesidades de cada proceso en particular. En la Tabla 5 se muestran algunos materiales sólidos orgánicos naturales colombianos, los cuales hacen parte de los materiales lignocelulósicos y que probablemente, son aptos para la producción de enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos por fermentación en estado sólido, con las relaciones carbono/nitrógeno indicadas, según los resultados esperados. Uno de los aspectos importantes a tener en cuenta durante el diseño y operación en los procesos de FES es la transferencia de masa. La difusión del oxígeno y de los nutrientes generan restricciones importantes en el desarrollo fúngico de estas fermentaciones. La transferencia de masa intrapartícula depende de factores como el tamaño de la partícula y el contenido de humedad de los sustratos. Esta transferencia está ligada directamente a la transferencia de los nutrientes y de las enzimas con el sólido. Existen muchas limitaciones acerca de la relación entre los hongos y los sustratos sólidos sobre los que se desarrolla la fermentación. El desarrollo de la biomasa celular en las fermentaciones sumergidas se da generalmente en forma de esferas (pellets) y en torno a ellas giran los procesos de difusión de oxígeno y nutrientes que han sido ampliamente estudiados. En las FES los fenómenos de transferencia de masa son diferentes, ya que la biomasa (hifa de los hongos filamentosos) se desarrolla sobre y entre el material sólido que sirve como sustrato (Chen et al., 2002; Lonsane et al., 2005).
Figura 10. Esquema de un proceso a micro escala durante una FES, la hifa produce un trenzado micelial el cual se observa sobre las partículas que componen el sustrato sólido. Del trenzado micelial sobresalen unas hifas aéreas por entre las cuales muy probablemente ocurre el intercambio gaseoso (g) (O2, CO2 y otros). En los espacios del entramado micelial horizontal hay líquido (l). Las actividades metabólicas muestran que se producen principalmente dentro de la superficie del sustrato y dentro de los poros; sin embargo, las regiones expuestas del micelio (por ejemplo las hifas aéreas) también muestran un metabolismo y el transporte de sustancias de la penetración de las mismas hifas aéreas. Enzimas hidrolíticas (azul claro), que son producidos por el micelio se difunden por la matriz sólida y catalizan la degradación de las macromoléculas en unidades más pequeñas (verde), los que más tarde son tomados por el hongo como nutrientes. El O2 se consume y el CO2, H20, el calor y los productos bioquímicos de interés se producen durante la fermentación. Por lo tanto, los gradientes desarrollados dentro de la biopelícula como las fuerzas de difusión de O2 para difundirse desde la fase gaseosa hasta las zonas más profundas de la biopelícula (lila) y la difusión del CO2 desde estas regiones hasta la zona de difusión de los gases (rojo). La producción de calor (Q; naranja) conduce a un rápido aumento de la temperatura (T), que es un problema grave durante el FES. El calor es por lo tanto eliminado del sustrato no sólo a través de la conducción, sino también por la evaporación, que es parte del balance de agua complejo del sistema (azul oscuro). Junto a la evaporación, el balance de agua incluye la absorción de agua por el micelio durante el crecimiento, el consumo de agua durante las reacciones de hidrólisis y la producción de agua a través de la respiración. Otro factor importante, es el pH local, que podría ser cambiado debido a la liberación de los ácidos carboxílicos y el intercambio de amoníaco (gris). Los productos bioquímicos de interés (magenta) que se liberan en la matriz sólida y el líquido fijado entre los espacios durante la fermentación podrían ser absorbidos por la matriz sólida y tener que ser extraídos para su uso posterior al final del proceso. Todos estos y muchos otros fenómenos pueden influir fuertemente en el rendimiento del proceso durante la FES. Fuente: Hölker y Lenz (2005).
Tabla 11. Enzimas ligninolíticas producidas en procesos de FES. Material Organismo Enzima ligninolítica Referencia Polyporus BH1, Polyporus BW1 Ligninasas Nigam et al. (1987) Trametes versicolor MnP, Lacasa Pal et al. (1995) Bagazo de caña Pleurotus ostreatus, Phanerochaete MnP, LiP, Lacasa Pradeep y Datta (2002) chrysosporium Borra de café y Grifola frondosa MnP, LiP, Lacasa Montoya (2008) aserrín de roble Desechos de Pleurotus ostreatus, P. sajor-caju Lacasa, LiP Reddy et al. (2003) banano Lentinus edodes, cepa CS-495 Lacasa D’Annibale et al. (1996) Maíz y sus Sporotrichum sp. Lignocelulasas Li et al. (2000) residuos Pleurotus pulmonaris Lacasa Tychanowicz et al. (2004) Pleurotus ostreatus, Pleurotus Lacasas, MnP cystidiosus, Pleurotus pulmonarius, Jaszek et al. (1998) Pholiota nameko. Algodón
Phanerochaete chrysosporium, Lacasas, peroxidasas, celulasas Ünyayar y Sik (1998) Funalia trogii Coriolus versicolor, Panus tigrinus, Ligninasas Golovleva et al. (1987) Phanerochaete chrysosporium Residuos de Uva Daedaleopsis confragosa, Marasmius Lacasa, MnP allaceus, Phanerochaete Elisashvili et al. (2001b) chrysosporium Rigidoporus lignosus MnP Galliano et al. (1991) Aserrín Coriolus hirsutus Lacasa, MnP Elisashvili et al. (2001b) Pleurotus eryngii, Pleurotus MnP Paja de trigo Martínez et al. (1996) pulmonarius Pleurotus pulmonarius Lacasa Marques de Souza et al. (2002) Salvado de trigo Pleurotus ostreatus, Phanerochaete Lacasa, MnP, LiP Shinners-Carnelley et al. chrysosporium (2002) Fomes sclerodermeus Lacasa, MnP Papinutti et al. (2003) Coriolus versicolor, Panus tigrinus, Ligninasas Golovleva et al. (1987) Phanerochaete chrysosporium Phlebia radiata Lacasa, MnP, LiP Vares et al. (1995) Pleurotus spp. Lacasa, MnP Lang et al. (1996) Phanerochaete chrysosporium LiP, MnP Castillo et al. (1997) Granos de trigo Pleurotus sp.2, Trametes gallica MnP, Lacasa Xie et al. (2001) Phanerochaete chrysosporium LiP, MnP, Lacasa Fujian et al. (2001) Pleurotus ostreatus Lacasa Baldrian y Gabriel (2002) Pleurotus pulmonarius Lacasa Marques de Souza et al. (2002) Bjerkandera sp. cepa BOS55 LiP, MnP Mester et al. (1998) Maderas Ceriporiopsis subvermispora MnP, laccase, hemicellulase, Ferraz et al. (2003) cellulase
La transferencia de calor es uno de los mayores problemas a solucionar cuando se trabaja con FES. El factor más determinante en este aspecto, es el calor metabólico producido, el cual depende de una serie de características físico-químicas y ambientales del proceso. Al inicio de la fermentación, generalmente la temperatura de los sustratos es homogénea, así como la concentración de oxígeno; pero con el progreso de la fermentación, la difusión de oxígeno se limita; hay liberación de calor con dificultad para disiparlo por la pequeña conductividad térmica de los sustratos, la porosidad del sustrato disminuye y toda la transferencia de calor y masa se dificulta (Raghavarao et al., 2003). En este campo hace falta mucha investigación y desarrollo acerca del control de la transferencia de calor y masa en los procesos de FES, debido a la heterogeneidad de los materiales utilizados para la elaboración de los sustratos, y a las dificultades ligadas a la manipulación de los hongos filamentosos y al control de las velocidades de desarrollo de las reacciones bioquímicas intra y extra celulares. Las áreas de aplicación de la FES son: aplicaciones para el control ambiental, las cuales incluyen la producción de compost, la producción de alimento para animales utilizando residuos sólidos, los procesos de biorremediación y biodegradación de compuestos difíciles de degradar, detoxificaciones biológicas de residuos industriales. Como segunda gran aplicación, está la adición de valor a diferentes productos, como enriquecimiento nutricional a residuos de cereales por biotransformación, biopulpado, producción de alimentos fermentados, enzimas, pigmentos. En la Tabla11 se enumeran una serie de hongos de pudrición blanca actuando sobre diversos materiales sólidos orgánicos (soporte), en su mayoría residuos lignocelulósicos, con la respectiva enzima ligninolítica producida. En particular, la producción de enzimas ligninolíticas es reportada con mejores actividades enzimáticas en los procesos de fermentación en estado sólido. Por ejemplo, la MnP de Lentinus edodes y Pleurotus ostreatus sobre sustratos a base de hojas de árboles y paja de trigo fue tres veces mayor que la actividad de la misma enzima, en fermentación sumergida con los mismos materiales lignocelulósicos pretratados (Elisashvili et al., 2008).
2.7. Modelamiento de las cinéticas de fermentación de hongos de pudrición blanca
La cinética del crecimiento microbiano se relaciona con el cálculo de las velocidades de reacción de formación de biomasa celular, velocidad de formación de producto y de CO2. En la Tabla 12 se enumeran algunas de las ecuaciones más utilizadas para perfiles cinéticos cuando se espera describir procesos de fermentación sumergida y en fase sólida. De igual forma, estas ecuaciones han sido utilizadas para la descripción de la producción de diversas biosustancias utilizando bacterias y hongos en dichos procesos de fermentación. Los modelos más reportados son el modelo lineal, logístico y de dos fases (de fase de aceleración y desaceleración) (Sangsurasak et al., 1996). Estos modelos no incluyen el efecto de la concentración de nutrientes sobre el desarrollo. Las ecuaciones lineal, exponencial y logística han utilizado ampliamente, mientras que la ecuación de dos fases es mas reciente (Ikasari y Mitchell, 2000). En el modelo de dos fases, la fase exponencial es seguida por la fase de desaceleración, cuya expresión está representada por la ecuación (4b) (ver Tabla 12), la cual está afectada por un decrecimiento, que se debe probablemente a dos factores. Primero a que el instante en el que se inicia la fase de desaceleración es el tiempo ta, con el parámetro L representado como la relación entre las velocidades específicas de desarrollo de las fases de desaceleración y de aceleración, respectivamente. Segundo, la desaceleración se describe por un decrecimiento exponencial reflejado en la velocidad específica de desarrollo, con una constante de velocidad de primer orden k (ecuación (4b)). Una dificultad para aplicar este modelo es que el período exponencial es típicamente corto, pero se ha indicado cuando se requieren ajustes de procesos con pocos datos experimentales (Mitchell et al., 2004; Van de Lagemaat y Pyle, 2005). Asimismo, para la descripción de la producción de biomasa en diversos tipos de procesos de fermentación se utilizan las expresiones tipo Monod y Logística modificada, las cuales en la Tabla 12 corresponden a las ecuaciones (5) y (6) respectivamente (Mitchell et al., 2004; Tavares et al., 2005). Las expresiones tipo Monod para describir la producción de biomasa presentan múltiples variaciones de la representación del modo del desarrollo cinético con la obtención de la velocidad específica de desarrollo de los hongos filamentosos macroscópicamente; ya que lo que se busca es relacionar la velocidad de un segmento de biomasa, una hifa, antes de su ramificación, buscando entender como después de pocas ramificaciones simétricas de la biomasa entre el sustrato sólido, ésta se extiende activamente en segmentos de micelio equivalentes a la mitad de la biomasa anterior. Una aproximación para describir este desarrollo del micelio debe estar relacionado con la concentración de sustrato limitante, como los azúcares solubles o el oxígeno, pudiéndose incorporar este efecto de la concentración de sustrato limitante en el modelo cinético, sólo si estas expresiones son acopladas con las ecuaciones de transporte local de nutrientes (Mitchell et al., 2004; Tavares et al., 2005). La ecuación logística modificada (ecuación (6)) ha sido propuesta para procesos de FES en los cuales el incremento en la producción de biomasa se debe a la equivalencia entre el incremento total de biomasa y la disminución total de masa seca; lo que infiere, como los diferentes tipos de microorganismos con los que se trabaja en procesos de FES pueden presentar una aceleración temprana en su crecimiento, seguido de un período extendido en el cual la desaceleración es lenta. Este perfil puede ser aproximado por el incremento de la relación (X/Xm) elevado a un exponente n. El valor del coeficiente n de la ecuación (6) determina la sensibilidad relativa de la auto-inhibición del cultivo por la alta densidad de biomasa (Mitchell et al., 2004). La ecuación (7) de la Tabla 12 fue propuesta por Luedeking y Piret (1959) inicialmente para la producción de lactato por bacterias. Sin embargo, esta ecuación ha sido utilizada con éxito para describir la producción de enzimas y otras biosustancias de hongos filamentosos en procesos de FS y FES tomando la misma expresión o haciéndole modificaciones que permitan la descripción del proceso de producción de una biosustancia en particular (Aguilar et al., 2001; Tavares et al., 2005; Shi et al., 2012).
Tabla 12. Formas de ecuaciones diferenciales que son aplicadas en sistemas de fermentación Forma ecuación Ecuación dX kX (1) Lineal dt
dX Exponencial X (2) dt dX X Logística X 1 (3) dt X m dX X, t ta (4a) dt Dos fases dX Lek t ta X ,tt (4b) a dt Producción de biomasa en dX S fase exponencial tipo max X (5) Monod dt ks S n dX X X 1 (6) dt X m
Logística modificada n<1 el organismos es relativamente sensible a ala auto-inhibición y ésta ocurre para valores bastante bajos de X. Para n=1 ecuación logística. n>1 el organismo es relatovamente resistente a la auto-inhibición y ésta ocurre solo cuando X≈Xm
dP dX Modelo Luedeking–Piret X (7) dt dt
*X es biomasa microbial, t es tiempo, k es la constante de velocidad de desarrollo lineal, µ es la velocidad específica de desarrollo constante, Xo es la biomasa inicial, Xm es la máxima cantidad de biomasa posible, ta, L y k son parámetros para la expresión de dos fase que son explicadas en el texto (Mitchell et al., 1999; Mitchell et al., 2004; Tavares et al., 2005; Shi et al., 2012)
Las sustancias que se producen en un proceso de fermentación pueden pertenecer a diversos grupos de metabolitos, los cuales pueden ser productos finales de metabolismo energético, productos intermedios de metabolismo primario o productos de metabolismo secundario. Las expresiones matemáticas utilizadas para la descripción de la formación de productos dependen de qué clase de metabolito se esté produciendo; generalmente las expresiones más simples son para el primer grupo, ya que su formación se considera directamente proporcional a la formación de la biomasa celular y se tienen en cuenta los parámetros de mantenimiento celular y crecimiento microbiano, respecto de la formación de la misma sustancia; en el caso de los tipos de sustancias que corresponden a las clases productos intermedios de metabolismo primario y productos de metabolismo secundario, la cinética de formación de estos productos es más compleja que los del primer grupo, y no existen hasta el momento expresiones simples bien definidas que abarquen a todas las sustancias pertenecientes a estos grupos. Existen aún, varios interrogantes con relación a los mecanismos que controlan la síntesis de los metabolitos secundarios y su interrelación con los metabolitos primarios. Actualmente, no hay modelos matemáticos disponibles que permitan describir la producción de biosustancias de hongos macromicetos, ni su crecimiento; probablemente porque cada uno de estos hongos se ve afectado directamente por diversos factores intrínsecos y extrínsecos, como son las características físicas y la composición química de los medios de cultivo, la procedencia de las cepas, la influencia de las condiciones ambientales y el crecimiento lento asociado a la gran mayoría de las especies de macromicetos en comparación con el tiempo de crecimiento de los hongos micromicetos. La formación de los productos en procesos de fermentación tiene relación directa con la formación de biomasa celular. En general la velocidad de formación de los productos es directamente proporcional a la formación de biomasa celular y a su velocidad específica de formación. Esta relación, radica en que dichas sustancias son metabolitos producidos durante el proceso de fermentación, metabolitos primarios y secundarios. Sin embargo, lo relevante, no corresponde únicamente al conocimiento sobre si la sustancia de interés es un metabolito primario o secundario por la necesidad de determinar las fases de producción de la misma sustancia; sino porque, es muy importante conocer la relación o interrelación que existe entre el término de la producción de metabolitos primarios, la cual está asociada directamente con el crecimiento y desarrollo del organismo y el inicio de la fase estacionaria, que es la etapa en la que normalmente se forman los metabolitos secundarios. Asimismo, para el conocimiento de formación de productos en procesos de fermentación es necesario conocer varias de las sustancias que se forman durante el crecimiento y desarrollo del organismo a fin de comprender el mecanismo de producción de la sustancias de interés y lograr plantear expresiones matemáticas que permitan la descripción y escalamiento de su proceso productivo. El método Plackett–Burman (PB) (Plackett y Burman, 1946), ha sido propuesto para la optimización de las variables del procesos de fermentación sumergida, así como el uso de superficies de respuesta (SR) para realizar optimizaciones de estos procesos (Liu et al., 2003). Utilizando estas técnicas no es posible cuantificar cada una de las variables a medir en el proceso, pero si son una herramienta válida que indica la tendencia de cada factor y su relativa influencia en el mismo (Xu et al., 2008). Por ejemplo, la producción de polisacáridos extracelulares de Morchella esculenta As51620 se ve afectada por el tiempo de fermentación y composición del medio; mientras que el desarrollo de la biomasa celular se ve influenciada por la temperatura y la composición del medio. Pudiéndose tratar estos tres factores (temperatura, tiempo de fermentación y composición del medio) como una sola variable utilizando herramientas de superficie de respuesta (SR). Con esta técnica se puede dar explicación al efecto de la combinación de todos los factores en los procesos de fermentación sumergida, utilizando los datos experimentales, los métodos matemáticos y la inferencia estadística (Elibol, 2004; Xu et al., 2008). La descripción de procesos de fermentación, bien sea FS o FES, con herramientas matemáticas que permitan avanzar en el conocimiento de la formación de biomasa celular, de los productos y el consumo de los sustratos no han sido completamente esclarecidos. Diferentes investigadores han propuesto diversos modelos matemáticos a fin de aproximar la descripción del crecimiento y formación de biomasa, el consumo de sustrato y la formación de productos. Sin embargo, los procesos de fermentación presentan gran complejidad y diversidad en referencia a la composición de los sustratos, la selección de los microorganismos y la formación de productos. Los sustratos utilizados en los procesos de fermentación en general son multicomponentes, hecho que no ha posibilitado encontrar expresiones matemáticas que permitan una descripción general del consumo de los sustratos; así como tampoco encontrar expresiones para la formación de los productos. En referencia a la formulación de expresiones matemáticas para describir la formación de productos en procesos de fermentación se dificulta por la gran cantidad de sustancias que se forman durante el crecimiento y desarrollo del organismo como parte de su mecanismo para lograr que se den las reacciones metabólicas que finalmente posibilitarán la obtención de las sustancias de interés. No hay suficiente literatura disponible referente al planteamiento de modelos matemáticos que describan la formación de biomasa celular, consumo de sustratos o formación de productos con hongos macromicetos de pudrición blanca tanto en procesos de FS, como en procesos de FES. Los hongos macromicetos son organismos que presentan dos fases de crecimiento bien definidas, una fase vegetativa y una fase reproductiva, son filamentosos y hacen que las hifas se envuelvan entre sí formando pellets cuando están en medio líquido y agitación y cuando están en medio sólido colonizan alrededor y entre los sustratos sólidos. Investigadores como Tišma et al.(2010), Tavares et al.(2005), Shi et al. (2012) y otros han propuesto modelos matemáticos para la descripción del crecimiento de hongos de pudrición blanca y la formación de enzimas, polisacáridos y otras biosustancias en procesos de FS y FES. Estos modelos matemáticos han sido propuestos a partir de modelos y ecuaciones tipo, como son la ecuación de Mitchaelis-Menten y varias de las que se describen en la Tabla 12. Estas expresiones matemáticas han sido modificadas o aplicadas directamente por los investigadores para el ajuste de datos experimentales, empleando como variables diversos componentes de los sustratos, diferentes tipos de productos como enzimas, polisacáridos (intra y exo), además de parámetros asociados a los procesos de fermentación como son el pH, la actividad de agua, temperatura del proceso, humedad relativa, concentración de oxígeno, entre otros (Hormiga et al., 2008; Rocha et al., 2009; Sriyudthsak y Shiraishi, 2010; Shi et al., 2012). Otra de las dificultades que se presentan cuando se busca proponer modelos matemáticos con el fin de ajustar datos experimentales en estos procesos de fermentación, es la ausencia de expresiones que permitan determinar la mejor aproximación del ajuste de los datos experimentales con el modelo propuesto. Sin embargo, algunos investigadores han buscado aplicar expresiones utilizadas en matemáticas financieras y estadística con fines de encontrar parámetros que permitan comparar la aproximación de un modelo matemático propuesto para el ajuste de un grupo de datos experimentales dado como lo proponen Rocha et al. (2009).
2.8. Evaluación de biomasa fúngica, enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos
2.8.1. Determinación de biomasa celular
En los procesos de FES la estimación directa de la biomasa es usualmente imposible, por la dificultad de la separación eficiente de la biomasa de la matriz sólida (sustrato). La biomasa de los hongos filamentosos puede ser estimada indirectamente por la determinación de componentes celulares de las colonias fúngicas, tales como la N-acetil-D-glucosamina (NAGA), presente en la quitina como componente de la pared celular fúngica; el ergosterol presente en la membrana celular; por la determinación de proteínas o ácidos nucleicos; o se puede estimar la biomasa por medio del balance estequiométrico cuando se conoce el valor del dióxido de carbono formado (De Carvalho et al., 2005). El ergosterol es un componente celular que favorablemente puede ser usado para la determinación de la biomasa fúngica por su fácil extracción y análisis. Este compuesto es utilizado para la determinación de la biomasa fúngica en sustratos sólidos, porque es el esterol más importante de la membrana celular de los hongos y algunas microalgas, estando prácticamente ausente en plantas y animales (Gong et al., 2001; Mattila et al., 2002). El análisis de ergosterol fue inicialmente propuesto para estimar contaminaciones de cereales por hongos, lo que llevó este análisis a ser adoptado para la estimación de la biomasa fúngica en materiales sólidos (Montgomery et al., 2000 ). Actualmente, el ergosterol puede ser tomado como una representación adecuada de la cuantificación de biomasa total (células vivas) en procesos de FES, ya que permanece durante todo el proceso (Mattila et al., 2002; Lindblom et al., 2004; Zhao et al., 2005). La determinación del ergosterol se puede realizar utilizando cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con detector arreglo de diodos (PDA) y columna C18, iniciándose la detección del ergosterol a 282 nm, con una fase móvil de metanol puro y acetonitrilo. La extracción de las muestras en procesos de fermentación se realiza con etanol grado analítico, hidróxido de sodio y n-hexano para obtener una fase liviana y una fase pesada, evaporándose posteriormente la fase orgánica al vacío (Mattila et al., 2002; Lindblom et al., 2004; De Carvalho et al., 2005; Zhao et al., 2005). Los principales componentes de la pared celular fúngica son los polisacáridos, los cuales corresponden entre el 80 y 90% de la masa seca. Entre los que se encuentra la quitina, polisacárido que se encuentra formando parte del esqueleto fungal, responsable de la rigidez y la forma de la pared celular. La quitina es el componente característico de los grupos taxonómicos Zygo-, Asco-, Basidio-, y Deuteromycetes, estando ausentes en otros grupos como Oomycetes. Por lo tanto, el contenido de quitina es característico de las especies de hongos verdaderos e independientes de la variedad. Asimismo, los niveles de quitina de los hongos pueden estar regulados por el tipo de nutrición de cada especie (Vetter, 2007). El contenido de quitina puede determinarse por el método de valoración de Glucosamina (N-acetil-D-glucosamina: NAGA) (Plassard et al., 1982) en las muestras de sustratos colonizadas por los hongos filamentosos. Las muestras de sustrato fermentadas se someten a hidrólisis ácida con HCl 6N, con posterior alcalinización y reacción del hidrolizado alcalinizado con reactivos preparados a partir de acetilacetona y p-dimetilamino benzaldehído por espectrofotometría a 530 nm. Se realiza una curva patrón con una solución de D-(+)-clorhidrato de glucosamina. Es así como varios investigadores han publicado resultados del contenido de quitina de diversas especies de hongos basidiomicetos entre el 1 y 25% presentes en la pared celular y cuantificada por varios métodos (Ivshin et al., 2007; Nitschke et al., 2011). La biomasa celular en procesos de FS se determina por peso seco cuando los medios de cultivo permiten la separación completa entre la biomasa y el sustrato por filtración. Sin embargo, hay procesos de FS en los que los medios de cultivo tienen material sólido en suspensión que hace parte del sustrato, por ejemplo materiales lignocelulósicos pretratados, en estos casos es necesario determinar también el contenido de quitina o ergosterol a fin de disminuir el error en el que se pueda incurrir cuando se determina el incremento de la biomasa por peso seco.
2.8.2. Rastreo de cepas para producción de biosustancias
Cuando se está buscando que un organismo produzca una sustancia en particular, se debe seguir algunos lineamientos para seleccionar el organismo: esta selección puede realizarse a través de búsquedas bibliográficas especializadas según la sustancia que se requiera. Puede hacerse un rastreo a los organismos con el mejor potencial para la producción de la sustancia de referencia. Existen métodos para rastrear organismos, entre los que se encuentran los métodos para seleccionar hongos basidiomicetos de pudrición blanca a fin de visualizar su capacidad de producción diversas sustancias. En el caso de ligninasas, se conocen los métodos de Kirk y Farrel, (1987) modificado y Zhao et al., (1996), asímismo, se encuentran métodos de rastreo para celulasas (Mandels y Weber, 1969; Montenecourt y Eveleigh, 1977; Zhang et al., 2006a; Sohail et al., 2009) producidas especialmente por hongos. Estos métodos usualmente son cualitativos o semicuantitativos, ya que una de las principales características que deben cumplir estos procedimientos es que sean de fácil ejecución. La forma como se detectan las diferentes sustancias puede ser por decoloraciones en las zonas de crecimiento, por formación de halos de diversos colores como reacción a algún reactivo en particular, entre otros. Sin embargo, cuando se va a rastrear el contenido de intra o exo- polisacáridos es necesario recurrir a métodos cuantitativos a tiempos fijos de crecimiento y producción del polisacárido, bien sea por FS o por FES empleando métodos espectrofotómetricos como la determinación del contenido de polisacáridos como carbohidratos totales por el método fenol-sulfúrico. Los métodos cualitativos constituyen una buena herramienta para la búsqueda rápida (rastreo) de enzimas que degraden el complejo lignocelulósico (Pointing, 1999; Nazareno et al., 2000). Estas pruebas proporcionan una indicación certera de la presencia de estas enzimas con el fin de realizar una adecuada selección de cepas de hongos respecto al grupo de enzimas que producen, disminuyendo la cantidad de pruebas cuantitativas, que son mucho más costosas y demandan mayor tiempo. Sin embargo, estos métodos tienen limitaciones especialmente de precisión, aunque juegan un rol importante en procesos de selección de cepas (Montenecourt y Eveleigh, 1977; Takano, 2001). Actualmente se emplean varios métodos cualitativos para la detección de celulasas, entre los que se encuentran los medios sintéticos con el reactivo específico sobre el cual actúa la enzima. Por ejemplo, para la detección de la endoglucanasa se emplea carboximetil celulosa (CMC), para exoglucanasas se usa celulosa cristalina o agar azure celulosa. Estas dos enzimas o grupo de enzimas generalmente se detectan por la formación de un halo blanco alrededor de la colonia. Para la β-glucosidasa se emplea agar esculina (6,7dihidroxicumarino 6-glucósido) como fuente única de carbono. La enzima β-glucosidasa forma glucosa, la cual es excretada al medio y forma un halo negro en torno a la colonia; este halo negro también puede formarse cuando se realizan las pruebas para las enzimas celulolíticas, endoglucanasas y exoglucanasas (Pointing, 1999; Zhang et al., 2006b). Para detectar ligninasas, se emplean reactivos que las óxido-reductasas puedan degradar. Por ejemplo, para la detección de ligninasas como la enzima lignina peroxidasa (LiP) se utiliza azure B, el cual se decolora por la acción de esta enzima (Archibald, 1992) y la detección de lacasa se hace a través de la preparación de un medio con el reactivo ABTS (2,2'azino- bis (3-etilbenzo-tiazolin-6- ácido sulfónico)), el cual se oxida en presencia de la enzima lacasa (Thurston, 1994; Eggert et al., 1996).
2.8.3. Determinación de actividades enzimáticas lignocelulolíticas
Las actividades enzimáticas lignocelulolíticas se determinan utilizando sustratos específicos para cada una, en los tiempos y temperaturas de reacción necesarios para que la enzima ejerza su acción sobre el sustrato. En la Tabla 13 se enumeran las enzimas con los sustratos específicos de reacción y las longitudes de onda a las que deben ser leídas.
Tabla 13. Métodos para determinación de actividad de enzimas lignocelulolíticas Actividad enzimática Sustrato Longitud de onda (nm) Referencia Carboximetilcelulosa Somogyi (1945); Nelson Endoglucanasa (determinación final de azúcares 540 (1944) reductores producidos) Celulosa cristalina Somogyi (1945); Nelson Exoglucanasa (determinación final de azúcares 540 (1944) reductores producidos) β-glucosidasa p-nitrofenil ß-D-glucopiranósido 430 Nidetzky et al. (1994) Xilano (determinación final de Somogyi (1945); Nelson Endoxilanasa 540 azúcares reductores producidos) (1944) LiP Azure B 650 Archibald (1992) 2,2´-azinobis (3-etilbenztiazoline- Lacasa 420 Paszczczynski et al. (1988) 6-sulfonato) (ABTS) Sulfato de manganeso y rojo MnP 610 Paszczczynski et al. (1988) fenol
2.8.4. Determinación de polisacáridos
Para determinar el contenido y la clase de polisacáridos presentes en los hongos hay una gran variedad de métodos de extracción y técnicas para su determinación. Los métodos de extracción son seleccionados dependiendo de la estructura que se espera identificar o cuantificar; estos métodos van desde una sola extracción con un solvente como etanol cuando se requiere cuantificar la cantidad total de polisacáridos como carbohidratos totales realizando algunas modificaciones al método fenol-sulfúrico de Dubois et al. (1956), hasta completos esquemas de extracción que generalmente inician con un desengrasado de la muestra empleando solventes orgánicos no polares o mezclas entre solvente polares y no polares como metanol, hexano, éter de petróleo, tetracloruro de carbono, acetona, etc. La muestra sin grasa puede ser sometida una serie de extracciones con agua y agua con bases (KOH, NaOH) y sometidos a ebullición por períodos de tiempo que pueden estar entre las dos y cinco horas a ebullición con el fin de lograr extraer la mayor cantidad de fracciones de polisacáridos tanto solubles como insolubles (Chihara et al., 1970; Amaral et al., 2008; Nie y Xie, 2011). Los polisacáridos de los hongos hacen parte de su pared celular, varios de ellos son solubles en agua, otros no, por lo que el uso de soluciones básicas como solventes busca solubilizar parte de los polisacáridos insolubles en agua. Estas fracciones obtenidas en cada extracción deben ser sometidas a procesos de lavado con exceso de agua destilada o bidestilada en diálisis abiertas o cerradas; además, de someter las muestras a congelación, descongelación y posterior centrifugación a fin de retirar los excesos de álcali y otras sustancias que pudieron ser extraídas durante los procesos de extracción y que no hacen parte del grupo de sustancias bioactivas buscadas. Asimismo, cada una de las fracciones obtenidas debe ser sometida a ultrafiltración a fin de obtener las sustancias puras que deben ser identificadas por algún método cromatográfico, como HPLC con detector de índice de refracción, método con el cual se puede identificar la sustancia y cuantificarla. Respecto a la determinación de los β-glucanos, existen métodos de detección por su especificidad, como los que emiten fluorescencia, FIA-calcofluor. Los β-glucanos se unen al colorante calcofluor, cuando esto ocurre, la intensidad de los tintes aumenta en una medida proporcional a la cantidad de β-glucano en la muestra. La fluorescencia se mide a una longitud de onda de exitación y emisión de 360 y 425 nm respectivamente. Debido a que el calcofluor es específico para β-glucanos, la muestra no tiene que estar pura, aunque el calcofluor si puede unirse a sustancias como xiloglucanos o algunos derivados de celulosa, por lo que la muestra deberá estar libre de estos componentes (Izawa et al., 1995; Brummer y Cui, 2006).
REFERENCIAS
Adachi Y., Ohno N., Ohsawa M., Oikawa S., Yadomae T. (1990). Change of biological activities of (1-3)-B-D glucan from Grifola frondosa upon molecular-weight reduction by heat-treatment. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 38: 477-481. Adler E. (1977). Lignin chemistry. Past, present and future. Wood Science Technology, 11: 169-218. Aguilar C., Augur C., Favela-Torres E., Viniegra-Gonzalez G. (2001). Production of tannase by Aspergillus niger Aa-20 in submerged and solid-state fermentation: influence of glucose and tannic acid. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology Advances, 26: 296-302. Ali H. (2010). Biodegradation of Synthetic Dyes-A Review. Water Air Soil Pollut, 213: 251-273. Alkorta I., Garbisu G., Llama M.J., Serra J.L. (1998). Industrial applications of pectic enzymes: a review. Process Biochemistry, 33: 21-28. Allen D.G., Robinson C.W. (1989). Hydrodynamics and mass transfer in Aspergillus niger fermentations in buble column and loop bioreactors. Biotechnology and Bioengineering 34: 731-740. Alvira P., Tomás-Pejó E., Ballesteros M., Negro M.J. (2009). Pretreatment technologies for an efficient bioethanol production process based on enzymatic hydrolysis: A review. Bioresource Technology, doi: 10.1016/j.biortech.2009.11.093. Amaral A., Carbonero E., Simao R., Kadowaki M., Sassaki G., Osaku C., Gorin P., Lacomini M. (2008). An unusual water-soluble B-glucan from the basidiocarp of the fungus Ganoderma resinaceum. Carbohydrate Polymers, 72: 473-478. Amat-García E.C., Amat-García G.D., Henao L.G. (2001). Diversidad taxonómica y ecológica de la entomofauna micófaga en un bosque alto-andino de la cordillera oriental de Colombia. Revista Academia Colombiana de Ciencia 1-21. Ander P. (1994). The celloiose-oxidizing enzymes CBQ and CBO as related to lignin and cellulose degradation - a review. FEMS Microbiology Reviews, 13: 297-312. Ângelo A.S. (2004). Enzimas hidrolíticas. En: Fungos: Uma Introducâo à biologia, bioquimica e biotecnologia. Universidade. de Caxias do Sul. pp. 263-285. Arantes V., Milagres A.M.F. (2007a). The effect of a catecholate chelator as a redox agent in Fenton-based reactions on degradation of lignin-model substrates and on COD removal from effluent of an ECF kraft pulp mill. Journal of Hazardous Materials, 141: 273-279. Arantes V., Milagres A.M.F. (2007b). The synergistic action of ligninolytic enzymes (MnP and Laccase) and Fe3+-reducing activity from white-rot fungi for degradation of Azure B. Enzyme and Microbial Technology, 42: 17-22. Archibald F. (1992). A new assay for lignin-type peroxidases employing the dye Azure B. Applied Environmental Microbiology, 58: 3110-3116 Arias E.L., Piñeros P.A. (2008). Enzimas ligninolíticas fúngicas para fines ambientales.Trabajo de grado. Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana: Bogotá. 202 p. p. Arteaga-Hoyos A.B. (2002). Utilización de los desechos del banano para el cultivo del hongo comestible Pleurotus ostreatus. Augura Carta Informativa, (212): 4-6. Asatiani M.D., Kachlishvili E.T., Khardziani T.S., Metreveli E.M., Mikiashvili N.A., Songulashvili G.G., Tsiklauri N.D., Wasser S.P., Elisashvili V.I. (2008). Basidiomycetes as a source of antioxidants, lectins, polysaccharides, and enzymes. Journal of Biotechnology 136S: S717-S742. Bajpai P. (1997). Microbial xylanolytic enzyme system: properties and applications. Advances in Applied Microbiology, 43: 141-194. Baker R.A., Wicker L. (1996). Current and potential applications of enzyme infusion in the food industry. Trends Food Science Technology, 7: 279-284. Baldrian P., Gabriel J. (2002). Variability of laccase activity in the whiterot basidiomycete Pleurotus ostreatus. Folia Microbiology, 47: 385-390. Bao W., Fukushima Y., Jensen K., Moen M., Hammel K. (1994). Oxidative degradation of non-phenolic lignin during lipid peroxidation by fungal manganese peroxidase. FEBS Letters, 354: 297-300. Barr B.K., HsieH Y.L., Ganem B., Wilson D.B. (1996). Identification of two functionally different classes of exocellulases. Biochemistry, 35: 586-592. Béguin P., Aubert J.P. (1994). The biological degradation of cellulose. FEMS Microbiology Reviews, 13: 25-58. Beily P., Kratky Z., Vrsanska M. (1981). Substrate binding site of endo-1,4- β-xylanase of the yeast Cryptococcus albidus. Europe Journal Biochemestry, 119: 559 -571. Benavidez-Calvache O.L. (2004). Estudio Químico de la fracción insaponificable del hongo macromiceto Lentinula edodes (Shiitake).Maestría en Ciencias-Química. Programa de Postgrados en Química, Universidad Nacional de Colombia: Bogotá. 98 p. Blanch H.W., Clark D.S. (1997). Biochemical Engineering. Marcel Dekker: New York. 702 pp. p. Blanchette R.A. (1995). Degradation of the lignocellulose complex in wood. Canadian Journal of Botany, 73: S999-S1010. Blanchette R.A., Krueger E.W., Haight J.E., Akhtar M., Akin D.E. (1997). Cell wall alterations in loblolly pine wood decayed by the white-rot fungus, Ceriporiopsis subvermispora. Journal of Biotechnology, 53 203-213. Blánquez P., Casas N., Font X., Gabarrell M., Sarrá M., Caminal G. (2004). Mechanism of textile metal dye biotransformation by Trametes versicolor. Water Resource, 38: 2166-2172. Blánquez P., Sarrà M., Vicent M. (2006). Study of the cellular retention time and the partial biomass renovation in a fungal decolourisation continuous process. Water Resource, 40: 1650-1656. Blánquez P., Caminal G., Sarrà M., Vicent M. (2007). The effect of HRT on the decolourisation of the Grey Lanaset G textile dye by Trametes versicolor. Chemistry Engineering Journal, 126: 163-169. Boisset C., Fraschini C., Schülein M., Henriss B. (2000). Imaging the enzymatic digestion of bacterial cellulose ribbons reveals the endo character of the cellobioydrolase Cel6A from Humicola insolens and its mode of synergy with cellobiohydrolse Cel 7A. Environmental Microbiology, 66: 1444-1452. Bommarius A.S., Riebel B.R. (2004a). Biocatalysis. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA: Atlanta, USA. Bommarius A.S., Riebel B.R. (2004b). Biocatalysis. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA: Atlanta, USA. 611 p. p. Borchers A., Keen C., Gerhwin M. (2004). Mushrooms, tumors, and immunity: an update
. Experiment in Biological Medical, 229: 393-406. Bosell G.P., Jacobs H., Davidson F.A., G.M. G., Ritz K. (2003). Growth and Function of Fungal Mycelia in Heterogeneous Environments. Bulletin of Mathematical Biology, 65: 447-477. Brummer Y., Cui S.W. (2006). Detection and Determination of Polysaccharides in Foods. En: Food Polysaccharides and Their Applications. Stephen A.M., Phillips G.O., Williams P.A. (Eds.). CRC Press Taylor & Francis Group: Boca Raton, FL. 676-706 p. pp. 676-706. Burgstaller W., Schinner F. (1993). Leaching of metals with fungi. Journal of Biotechnology, 27: 91-116. Burnett J.H. (1976). Fundamental of Micology. 2a ed Edward Arnold: London. 221 p. p. Burns J.K. (1991). The polygalacturonases and lyases. En: The Chemistry and Technology of Pectin. Walter R.H. (Ed.). Academic Press,: San Diego. pp. 165- 188. Buswell J.A., Odier E. (1987). Lignin biodegradation. Review Biotechnology, 6: 1-59. Buswell J.A., Cai Y., Chang S.T. (1995). Effect of nutrient nitrogen and manganese on manganese peroxidase and laccase production by Lentinula (Lentinus) edodes. FEMS Microbiology Letters, 128: 32- 45. Campbell M.K., Farrell S.O. (2004). Bioquímica. Cuarta ed International Thomson Editores: México. 725 p. p. Cardona B.E., Saldarriaga Y., Guzmán L. (2005). Registro de Gimnopilus rugulosus (Agaricales, Cortinariaceae) de Colombia. Revista Mexicana de Micología, 021: 55-58. Cardona M., Osorio J., Quintero J. (2009). Degradación de colorantes industriales con hongos ligninolíticos. Revista Facultad de Ingeniería de la Universidad de Antioquia, (48): 27-37. Carle - Urioste J.C., Escobar - Vera J., El-Gogary S. (1997). Cellulase induction in Trichoderma reesei by cellulose requires its own basal expression. Journal of Biological Chemistry, 272: 10169-10174. Carlile M., Watkinson S., Gooday G. (2001). The fungi. Second ed Academic Press: London. 588 p. p. Carreño N., Vargas A., Bernal A.J., Restrepo S. (2007). Problemas fitopatológicos en especies de la familia Solanaceae causados por los géneros Phytophthora, Alternaria y Ralstonia en Colombia. Una revisión. Agronomía Colombiana, 25(2): 320-329. Castillo M.d.P., Ander P., Stenstrom J. (1997). Lignin and manganese peroxidase activity in extracts from straw solid substrate fermentation. Biotechnol. Technol. , 11 701-706. Castro-Ríos K. (2006). Validación de deshidratación convencional para la conservación del hongo comestible Pleurotus sajor-caju Revista Universidad de Caldas: 123-133. Catley B.J. (1992). The biochemistry of some fungal polysaccharides with industrial potencial. En: Handbook of applied mycology: fungal biotechnology. Mukerji K.G. (Ed.). Marcel Dekker,: New York. pp. 1091-1114. Chandra M., Kalra A., Sharma P.K., Sangwan R.S. (2009). Cellulase production by six Trichoderma spp. fermented on medicinal plant processings. Journal Industrial Microbiology Biotechnology, 36: 605-609. Chandra R.P., Bura R., Mabee W.E., Berlin A., Pan X., Saddler J.N. (2007). Substrate pretreatment: the key to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics? Advance Biochemistry Engineering and Biotechnology, 108: 67-93. Chang S.T., Miles P.G. (2004). Mushrooms Cultivation, Nutritional Value, Medicinal effect, and Enviromental Impact. Segunda ed CRC Press: New York. 451 p. Chang T.S., Siddiq M., Sinha N.K., Cash J.N. (1994). Plum juice quality affected by enzyme treatment and fining. Journal of Food Science, 59: 1065-1069. Chaparro D.F., Rosas D.C. (2006). Aislamiento y evaluación de la actividad enzimática de hongos descomponedores de madera en la reserva natural La montaña del ocaso, Quimbaya-Quindío. Microbiología Industrial, Javeriana: Bogotá. 109 p. p. Chaparro D.F., Rosas D.C., Varela A. (2009). Aislamiento y evaluación de la actividad enzimática de hongos descomponedores de madera (Quindío, Colombia) Revista Iberoamericana de Micologia, 26(4): 238-243. Chen H., Xu F., Li Z. (2002). Recent developments in biodegradation of industrial pollutants by white rot fungi and their enzyme system. Bioresource Technology 81: 261. Chen Y.J., Shiao M.S., Lee S.S., Wang S.Y. (1997). Effects of Cordyceps sinensis on the proliferation and differentiation of human leukemic U937 cells. Life Science, 60(23): 49-59. Chihara G., Maeda Y., Humuro J., Sasaki T., Fukuoka F. (1969). Inhibition of mouse sarcoma 180 by polysaccharides from Lentinus edodes Nature, 222: 687-688. Chihara G., Hamuro J., Maeda Y., Arai Y., Fukuoka F. (1970). Fractionation and Purification of the Polysaccharides with Marked Antitumor Activity, Especially Lentinan, from Lentinus edodes (Berk.) Sing, (an Edible Mushroom). Cáncer Research, 30: 2776-2781. Chitiva - Jaramillo A., Torrenegra – Guerrero R., Cabrera - Parada C., Díaz - Puentes N., Pineda - Parra V. (2009). Contribución al estudio de microhongos filamentosos en los ecosistemas páramo de guasca y el tablazo.[1-10]. Disponible en: http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/gifuj/hongos_ ecosistemas_ paramo.pdf. [Visitada en marzo de 2010]. Chu K.H., Kim E.Y. (2006). Predictive modeling of competitive biosorption equilibrium data. Biotehchnology Bioprocess Engineerong, 11: 67-71. Comtat J., Joseleau J. (1981). Mode of action of a xylanase and its significance for the structural investigation of the branched L- arabino-Dglucurono-D-xylan from redwood (Sequoia sempervirens). Carbohydrates Resources, 95: 101-112. Corrales A., López C.A. (2005). Macrocybe titans (Bigelow y Kimbr.) Pegler, Lodge y Nakasone, un registro nuevo para Colombia. Actual Biología, 27(82): 93-97 Corredor I.C., Caridad M., Restrepo S. (2007). Evaluación de la suceptibilidad de hongos endófitos aislados de rosa (rosa hybrida) a insecticidas comerciales. Revista Colombiana de Biotecnología, 9(1): 59-74. Cortés M.R., García A.S., Suarez H.M. (2007). Fortificación de hongos comestibles (Pleurotus ostreatus) con calcio, selenio y vitamina C. VITAE, Revista de la Facultad de Química Farmacéutica, 14(1): 16-24. Coughlan M.P., Ljungdahl L.G. (1988). Comparative biochemistry of fungal and bacterial cellulolytic enzyme systems. En: Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation Millet J.P.A.P.B.J. (Ed.). Academic Press: London. pp. 34 p. Coughlan M.P., Hazlewood G.P. (1993). β-1,4-D-xylan-degrading enzyme systems: biochemistry, molecular biology and applications. Biotechnology and Applied Biochemistry, 17: 259-289. Cui F., Chisti Y. (2003). Polysaccharopeptides of Coriolus versicolor: physiological activity, uses and production. Biotechnology and Advances, 21: 109-122. Cui S. (2005). Food Carbohydrates, Chemistry, Physical propierties and Applications. CRC Press, ed. Group T.F. Taylor & Francis Group: Boca Raton Florida. 404 p. D’Annibale A., Celleti D., Felici M., Di Mattia E., Giovannozzi-Sermani G. (1996). Substrate specificity of laccase from Lentinus edodes. Acta
Biotechnol. Bioengineering, 16: 257-270. De Carvalho J.C., Pandey A., Oishi B.O., Brand D., Rodriguez-León J.A., Soccol C.R. (2005). Relation between growth, respirometric anaysis and biopigments production from Monascus by solid-state fermentation. Biochemical Engineering Journal, 29: 262-269. Dekker R.F.H., Richards G.N. (1975). Purification, properties and mode of action of hemicellulase I produced by Ceratocystis paradoxa. Carbohydrates Resources 39: 97-114. Dekker R.F.H. (1985). Biodegradation of the hemicelluloses. En: Biosynthesis and Biodegradation of wood components. Higuchi T. (Ed.). Academic press,: Orlando. pp. 113-132. Delgado F., López Y., Giraldo E.M. (2001). Actividad enzimática de hongos y su patogenicidad sobre Hypothenemus hampei. Manejo Integrado de Plagas (Costa Rica), 60: 43-49. Dhouib A., Hamza M., Zouari H., Mechichi T., H’midi R., Labat M., Martínez M.J., Sayadi S. (2005). Autochthonous fungal strains with high ligninolytic activities from Tunisian biotopes. African Journal of Biotechnology, 4(5): 431-436. Dobozi M.S., Szakacs G., Bruschi C.V. (1992). xylanase activity of Phanerochaete Chrysosporium. Applied and environmental microbiology, 58(11): 3466-3471. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. (1956). Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry Engineering Journal, 28(3): 350-356. Eggert C., Temp U., Dean J.F., Eriksson K.L. (1996). A fungal metabolite mediates degradation of non-phenolic lignin structures and synthetic lignin by laccase. FEBS Letters, 391: 144-148. Ek M., Gellerstedt G., Henriksson G. (2009). Pulp and Paper Chemistry and Technology: Wood Chemistry and Wood Biotechnology. ed. KG W.d.G.G.C. Vol. 1. THE GRUITER: Berlin. 320 p. El Gogary S., Leite O., Criverallo D.E., Eveleigh D.E., El-Dorry H. (1989). Mechanism by which cellulose triggers cellobiohydrolase I gene expression in Trichoderma reesei. Proceedings of the National academy of Sciences of the United States of America, 86: 6138-6141. Elibol M. (2004). Optimization of medium composition for actinorhodin production by Streptomyces coelicolor A3 (2) with response surface methodology. Process Biochemistry, 39: 1057-1062. Elisashvili V., Parlar H., Kachlishvili E., Chichua D., Kvesitadze G. (2001a). Ligninolytic activity of basidiomycetes grown under submerged and solid-state fermentation on plant raw material (sawdust of grapevine cuttings). Advances Food Science, 23: 117- 123. Elisashvili V., Parlar H., Kachlishvili E., Chihua D., Bakrazde M., Kokhreidze N., Kvesitadze G. (2001b). Potential of solid-state fermentation for laccase production. Advance Food Science, 23: 117-123. Elisashvili V., Penninckx M., Kachlishvili E., Tsiklauri N., Metreveli E., Kharziani T., Kvesitadze G. (2008). Lentinus edodes and Pleurotus species lignocellulolytic enzymes activity in submerged and solid-state fermentation of lignocellulosic wastes of different composition. Bioresource Technology, 99: 457-462. Enshasy H.E. (2010). Immunomodulators. En: The Mycota. Hofrichter M. (Ed.). Springer-Verlag: Berlin, 477 p. pp. 477. Evans C., Dutton. M., Guillen. F., Veness R. (1994). Enzymes and small molecular mass agents involved with lignocellulose degradation. FEMS Microbiology Letters, 13: 235-240. Fang Q.H., Zhong J.J. (2002). Effect of initial pH on production of ganoderic acid and polysaccharide by submerged fermentation of Ganoderma lucidum. Process Biochemistry, 37(7): 69-74. Fermor T.R., Wood D.A. (1981). Degardation of bacteria by Agaricus bisporus and other fungi. Journal of General Microbiology, 126: 377-387. Fernández J.A., Henao L.M., Pedroza-Rodríguez A.M., Quevedo-Hidalgo B. (2009). Inmovilización de hongos ligninolíticos para la remoción del colorante negro reactivo 5. Revista Colombiana de Biotecnología, 11(1): 59-72. Ferraz A., Cordova A.M., Machuca A. (2003). Wood biodegradation and enzyme production by Ceriporiopsis subvermispora during solidstate fermentation of Eucalyptus grandis. Enzyme and Microbiology Technology, 32: 59-65. Forchiassin F., Levin L. (en imprenta). Enzimas Extracelulares Degradación de Polímeros Vegetales. En: Introducción al reino de los hongos y los grupos afines. Albertó E., Vadell E. (Eds.). Literature for Latin America: Buenos Aires. Fujian X., Hongzhang C., Zuohu L. (2001). Solid-state production of lignin peroxidase (LiP) and manganese peroxidase (MnP) by Phanerochaete chrysosporium using steam-exploded straw as substrate. Bioresource Technology, 80: 149-151. Gadd G.M. (1999). Fungal production of citric and oxalic acid: importance in metal speciation, physiology and biogeochemical processes. Advance in Microbiology and Physiology, 41: 47-92. Gadd G.M. (2001). Fungi in Bioremediation. Cambridge University Press: Cambridge. 481 p. Galliano H., Gas G., Seris J.L., Boudet A.M. (1991). Lignin degradation by Rigidoporus lignosus involves synergistic action of two oxidizing enzymes: manganese peroxidase and laccase. Enzyme and Microbial Technology, 13: 478-482. Gao Y., Zhou S. (2003). Cancer prevention and treatment by Ganoderma, a mushroom with medicinal properties. Food Research International, 19: 275-325. Garcés-Molina A.M., Velez-Cardona N., Ruiz-Alzate S., Serna-D´León J.G., Suarez-Holguín E. (2006). Revista Lasallista de Investigación, 2(2): 15-20. García A.M., Torres R.G. (2003). Producción de enzimas ligninolíticas por Basidiomycetes mediante la técnica de fermentación en fase sólida. Revista Colombiana de Biotecnología, 5(001): 56-64. Glen J.K., Gold M.H. (1985). Purification and characterization of an extracellular Mn(II)-dependent peroxidase from the lignin- degrading basidiomycetes Phanerochaete chrysosporium. Archives of Biochemistry and Biophysics, 242: 329-341. Gold M.H., Alic M. (1993). Molecular Biology of the lignin-degrading Basidiomycete Phanerochaete Chrysosporium. Microbiological Reviews, 57(3): 605-622. Golovleva L.A., Malt’seva O.V., Leont’evskii A.A., Myasoedova N.M., Skryabin G.K. (1987). Ligninase biosynthesis by the fungus Panus tigrinus during solid-state fermentation of straw. Doklady Akademii Nauk, 294: 992-995. Gómez-Dorado C., Martinez-Salgado M., Nieto-Mosquera D., Pedrosa-Rodriguez A., Rodriguez-Vásquez R., Rosas-Acosta J. (2005). Estudio del efecto de dos inductores y un protector enzimático sobre la actividad de las enzimas MnP y lacasa producidas por Trametes versicolor y su acción en la decoloración. Revista de la Facultad de Ciencias Universidad Javeriana, 10(2): 37-45. Gong P., Guan X., Witter E. (2001). A rapid method to extract ergosterol from soil by physical disruption. Applied Soil Ecology, 17: 285-289. Góngora C.E. (2009). Avances en conocimiento y mejoramiento del hongo entomopatógenos Beauveria bassiana para el control de la broca del café, Hypothenemus hampei. Cenicafé. Disponible en: http://almacafe.com.co/modules/News/images/simposio2.pdf. [Visitada en marzo de 2010]. Goodenough P.W. (1996). Structural studies on cellulases, pectinases an xylanases. En: Enzymes for Carbohydrate Engineering. Elsevier Science B.V,. pp. 83-107. Gow N.A.R. (1995a). The Growing Fungus. ed. Hall C. N.A.R Gow & G. M. Gadd: London. 402 p. p. Gow N.A.R. (1995b). The growing Fungus. ed. Hall C. N.A.R Gow & G. M. Gadd: London. Granada R.D.M., Mejía G.A.I., Jimenez T.G.A. (2005). Utilización de residuos de plátano para la producción de metabolitos secundarios por fermentación en estado sólido con el hongo Lentinus crinitus. Revista de la Facultad de Química Farmacéutica, 12(2): 13-20. Guiseppin M.L.F. (1984). Effects of disolved oxygen concentration on lipase production by Rhizopus delemar. Applied Microbiology and Biotechnology, 20: 161-173. Gutiérrez Ramírez L., Pérez Bran J., Uribe M. (2012). Evaluación in vitro de celulasas producidas por cepas nativas de Trichoderma reesei, Cladosporium herbarum y Aspergillus niger. Journal Agricultural and Animal Science, 1(1): 7-15. Guzmán M.L., Angel J.C., Rivas A., Suarez L. (2003). Producción de hongos comestibles en residuos de caña de azúcar, Memorias VI congreso Colombiano de la Asociación de Técnicos de la Caña de Azúcar: Colombia. 323-331. Hamelinck C.N., van Hooijdonk G., Faaij A.P.C. (2005). Ethanol from lignocellulosic biomass: techno-economic performance in short-, middle- and long-term. Biomass Bioenergy, 28: 384-410. Hamlyn P.F., Schmidt R.J. (1994). Potential therapeutic application of fungal filaments in wound management. Mycologist, 8: 147- 152. Hammel K.E., Kapich A.N., Jensen Jr. K.A., Ryan Z.C. ( 2002). Reactive oxygen species as agents of wood decay by fungi. Enzyme Microbiology and Technology, 30: 445-453. Henry W.P. ( 2003). Non-enzymatic iron, manganese and copper chemistry of potencial importance in wood decay. En: Wood Deterioration and Preservation - Advances in our Changing World. Society A.C. (Ed.). Goodell, B., Nicholas, D.D., Schultz, T.P. (Eds.): Washington. pp. 175-195. Hobbs C. (2000). Medicinal values of Lentinus edodes (Berk.) Sing. (Agaricomyvetideae). A literature review. Interantional Journal of Medicinal Mushrooms, 2: 287-297. Hölker U., Höfer M., Lenz J. (2004). Biotechnological advantages of laboratory-scale solid-state fermentation with fungi. Applied Microbiology Biotechnology, 64: 175-186. Hölker U., Lenz J. (2005). Solid-state fermentation - are there any biotechnological advantages? Current Option in Microbiology, 8: 301-306. Hormiga J.A., Verab J., Frías I., Torres Dariasa N.V. (2008). Growth and ligninolytic system production dynamics of the Phanerochaete chrysosporium fungus A modelling and optimization approach. Journal of Biotechnology, 137: 50-58. Hsieh C., Liu C.-J., Tseng M.-H., Lo C.-T., Yang Y.-C. (2006). Effect of olive oil on the production of mycelial biomass and polysaccharides of Grifola frondosa under high oxygen concentration aeration. Enzyme and Microbial Technology, 39: 434-439. Hsieh C., Wang H.-L., Chena C.-C., Hsub T.-H., Tseng M.-H. (2008). Effect of plant oil and surfactant on the production of mycelial biomass and polysaccharides in submerged culture of Grifola frondosa. Biochemical Engineering Journal, 38: 198-205. Hudson H. (1986). Fungal Biology. CPC press Edward Arnolds Eds: Maryland. 298 p. p. Hyun H.H., Zeikus J.G. (1985). General Biochemical characterization of thermostable extracellular B-amylasa from Clostridium thermosulfurogenes. Applied Environmental Microbiology, 49: 1162-1170. Ikasari L., Mitchell D.A. (2000). Two-phase model of yhe kinetics of growth of Rhizopus oligosporus in membrana culture. Biotechnology Bioengineering, 68: 619-627. Ilmen M., Saloheimo A., Onnela M.L., Pentilla M. (1996). Rgulation of cellulase gen expression in the filamentous fungus Trichoderma reesei. Applied Environmental Microbiology, 63: 1298-1306. Ishikawa K., Majima T., Ebina T. (1992). Anti-tumour effect of a Coriolus preparation, PSK: Induction of macrophage chemotactic factor (MCF) in spleens of tumour bearing mice. Biotherapy, 5: 251-258. Ivshin V., Artamonova S., Ivshina T., Sharnina F. (2007). Methods for Isolation of Chitin–Glucan Complexes from Higher Fungi Native Biomass. Polymer Science, Serie B., 49(11-12): 305-310. Izawa M., Takashio M., Koshino S. (1995). Several new factors influencing the measurement of β-glucan content using calcofluor flow-injection analysis method. Journal of the Institute of Brewing, 101: 371. Jaszek M., Malarczyk E., Leonowicz A. (1998). Investigation of ligninolytic enzymes during solid state fermentation of cotton wastes by selected strains of basidiomycetes. En: Proceedings of the 7th International Conference on Biotechnology in the Pulp and Paper Industry. Vancouver. pp. 16-18. Jennings D.H. (1995). The Physiology of Fungal Nutrition, Cambridge, UK: Cambridge University press. Johnson E.A., Sakajoh M., Halliwell G., Madia A., Demain A.L. (1982). Saccharification of complex cellulosic substrates by the cellulase system from C. thermocellum. Applied and environmental microbiology, 43: 1125-1132. Jong S.C., Birgmingham J.M. (1992). Medicinal benefits of the mushroom Ganoderma. Adv. Appl. Microbiol., 37: 101-134. Joselau J.P., Ruel K. (1994). Wood polysaccharides and their degradation by fungi. En: Host Wall Alterations by Parasitic Fungi. Ouellette P. (Ed.). APS Press: Minnesota. pp. 334-387. Joshi V.K., Pandey A. (1999a). Biotechnology. Food fermentation Vol II. Educational Publishers & distributors: New Delhi. 998 p p. Joshi V.K., Pandey A. (1999b). Biotechnology: Food Fermentation (Microbiology, Biochemistry and Technology) Vol I. Educational Publishers & distributiors: New Delhi. 521 P. p. Kalisz H.M., Wood D.A., Moore D. (1987). Production, regulation and release of extracellular proteinasa activity in basidiomycetes fungi. Transactions of the British Mycological Society, 88: 221-227. Kalisz H.M. (1988). Microbial Proteinases. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 36: 1-65. Kalisz H.M., Wood D.A., Moore D. (1989). Some Characteristics of extracellular proteinases from Coprinus cinereus. Mycological Research, 92: 278-285. Karunanithy C., Muthukumarappan K., Julson J.L. (2008). Influence of high shear bioreactor parameters on carbohydrate release from different biomasses American Society of Agricultural and Biological Engineers Annual International Meeting ASABE 084114. ASABE. Kersten P., Cullen D. (2007). Extracellular oxidative systems of the lignin-degrading Basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. Fungal Genetics and Biology, 44: 77-87. Kiho T., Ookubo K., Usui S., Ukai S., Hirano K. (1999). Structural features and hypoglycemic activity of a polysaccharides (CS- F10) from the cultured mycelium of Cordyceps sinensis. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 22(9): 66-70. Kim F., Sakagami H., Tanuma S., Konno K. (1990). Stimulation of interferon-g-induced human myelogenous leukemic cell differentiation by high molecular weight PSK subfraction. Anticancer Research, 10: 55-58. Kim S., Holtzapple M.T. (2006). Delignification kinetics of corn stover in lime pretreatment. Bioresource Technology, 97: 778-785. Kim T.H., Taylor F., Hicks K.B. (2008). Bioethanol production from barley hull using SAA (soaking in aqueous ammonia) pretreatment. . Bioresouce Technology, 99: 5694-5702. Kirk T.K., Connors W., Zeikus J. (1976). Requeriment for a growth substrate during lignin decomposition by two wood-roting fungi. Applied Environmental Microbiology, 32: 192-194. Kirk T.K., Farrel R.L. (1987). Enzymatic combustion: the microbial degradation of lignin. Annual Reviews of Microbiology 41: 465- 505. Kobayashi H., Matsunaga K., Oguchi Y. (1995). Antimetastatic Effects of P5K (Krestin), a Protein-bound Polysaccharide Obtained from Basidiomycetes: An Overview. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention, 4: 275-281. Koduri R.S., Tien M. (1994). Kinetic analysis of lignin peroxidase-explanation for the mediation phenomen by veratryl alcohol. Biochemistry, 33: 4225-4230. Koh J.H., Kim J.M., Chang U.J., Suh H.J. (2003). Hypocholesterolemic effect of hotwater extract from mycelia of Cordyceps sinensis. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 26: 84-87. Komatsu M., Okubo S., Kikumoto S., Kimura K., Saito G., Sakai S. (1969). Host-mediated antitumor action of Schizophyllan a glucan produced by Schizophyllum commune. Gann, 60: 137-144. Komura D.L., Ruthers A.C., Carbonero E.R., Alquini G., Rosa M.C., Sassaki G.L., Lacomini M. (2010). The origin of mannans found in submerged culture of basidiomycetes. Carbohydrate polymers, 79: 1052-1056. Kootstra A.M.J., Beeftink H.H., Scott E.L., Sanders J.P.M. (2009). Comparison of dilute mineral and organic acid pretreatment for enzymatic hydrolysis of wheat straw. Biochemical Engineering Journal, 46: 126-131. Kosaka A., Yamashita A. (1993). Lentinan as an effective inmmunomodulator against breast cancer, with special reference to clinical applications. International Journal Immunotherapy, 9: 111-116. Koutinas A.A., Wang R., Webb C. (2004). Restructuring Upstream Bioprocessing: Technological and Economical Aspects for Production of a Generic Microbial Feedstock From Wheat. Published online in Wiley InterScience: 1-15. Kumar R., Wyman C.E. (2009). Effects of cellulase and xylanase enzymes on the deconstruction of solids from pretreatment of poplar by leading technologies. Biotechnology Progress, 25: 302-314. Kumari J., Sahoo P.K. (2006). Non-specific immune response of healthy and immunocompromised Asia catfish (Clarias batrachus) to several immunostimulants. Aquaculture, 255: 133-141. Ladner W., Ditrich K. (1999). Biocatalytic production of chiral intermediates. Chimica Oggi 7/8: 51-54. Lang E., Nerud F., Novotna E., Martens R. (1996). Production of ligninolytic exoenzymes and 14C-pyrene mineralization by Pleurotus sp. in lignocellulose substrate. Folia Microbiology, 41: 489-493. Lemaire M. (1996). The Cellulosome - an exocellular multiprotein complex specialised in cellulose degradation. Critical Reviews and Biochemistry & Molecular Biology, 31: 201-236. Lenz J., Höfer M., Krasenbrink J.B., Hölker U. ( 2004). Computational and physical methods in solid-state fermentation. Applied Microbiology Biotechnology, 65: 9-17. Leonowicz A., Matuszewska A., Luterek J., Ziegenhagen D., Wojtas-wasilewska M., Cho N.S., otros. (1999). Biodegradation of lignin by white-rot fungi. Fungal Genetics and Biology 27: 175-185. Leschine S.B. (1995). Cellulose degradation in anerobic environments. Annual Review Microbiology, 49: 399-410. Leung M., Fung K., Choy Y. (1997). The isolation and characterization of an immunomodulatory and antitumor polysaccharide preparation from Flammulina velutipes. Immunopharmacol 35: 255-263. Leung M., Liu C., Koon J., Fung K. (2006). Polysaccharide biological response modifiers. Immunologycal Letters, 105: 101-114. Levin L. (1998). Biodegradación de materiales lignocelulósicos por Trametes trogii (Aphyllophorales, Basidiomycetes).Tesis Doctoral. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires: Buenos Aires. Levin L., Forchiassin F., Ramos A.M. (2002). Copper induction of lignin-modifying enzymes in the white-rot fungus Trametes trogii. Mycologia, 94(3): 377-383. Levin L., Papinutti L., Forchiassin F. (2004). Evaluation of Argentinean white rot fungi for their ability to produce lignin-modifying enzymes and decolorize industrial dyes. Bioresource Technology, 94: 169-176. Levin L., Herrmann C., Papinutti V.L. (2008). Optimization of lignocellulolytic enzyme production by the white-rot fungus Trametes trogii in solid-state fermentation using response surface methodology. Biochemical Engineering Journal 39: 207-214. Li Q., He Y.C., Xian M., Jun G., Xu X., Yang J.M., Li L.Z. (2009). Improving enzymatic hydrolysis of wheat straw using ionic liquid 1-ethyl-3-methyl imidazolium diethyl phosphate pretreatment. Bioresource Technology, 100: 3570-3575. Li X., Liun Y., Ji L. (2000). Production of lignocellulolytic enzymes in solid state fermentation using corn stalks as substrate. Henong Xuebao, 14: 99-103. Lia K., Azadic P., Collinsb R., Toland J., Kimc J.S., E. K.E.L. (2000). Relationships between activities of xylanases and xylan structures. Enzyme and Microbial Technology, 27: 89-94. Lindblom C.M., Wachenfeldt E.V., Tranvik L.J. (2004). Ergosterol as a measure of living fungal biomass: persistence in environmental samples after fungal death. Journal of Microbiological Methods, 59 253- 262. Lindequist U., Niedermeyer T., Ju¨lich W.-D. (2005). The pharmaceutical potential of mushrooms. Electronic centralised aircraf monitor (eCAM), 2: 285-299. Liu C., Liu Y., Liao W. (2003). Application of statistically based experimental designs for the optimization of nisin production from whey. Biotechnology Letters, 25: 877-882. Liu F., Fung M.C., Ooi V.E.C., Chang S.T. (1996). Induction in the mouse of gene expression of immunomodulating cytokines by mushroom polysaccharide-protein complexes. Life Science, 58(1): 795-803. Lockington R.A., Rodbourn L., Barnett S., Carter C.J., Kelly J.M. (2002). Regulation by carbon and nitrogen sources of family of cellulases in Aspergillus nidulans. Fungal Genetics and Biology, 37: 190-196. Lonsane B.K., Ghildyal N.P., Budiatman S., Ramakrishna S.V. (2005). Solid state fermentation for production of α-amylase by Bacillus megaterium 16M Enzyme Microbiology Technology, 7: 258-265. Lozano J.C. (1989). Producción comercial del Champiñon /Pleurotus ostreatus/ en pulpa de café, CONGRESO ASCOLFI, X. Cali (Colombia): Manizales. 60 p. Luedeking R., Piret E. (1959). Transient and steady states in continuous fermentation. Theory and experiment. Journal of Biochemical and Microbiological Technology and Engineering, 1: 431-459. Lull C., Wichers H., Savelkoul H. (2005). Antiinflammatory and immunomodulating properties of fungal metabolites. Mediator Inflammation, 2: 63-80. Lynd L.R., Weimer P.J., Zyl W.H.v., Pretorius I.S. (2002). Microbial cellulose utilization: Fundamentals and Biotechnology. Microbiological and Molecular Biology Reviews, 66(3): 506-577. Maganhotto de Souza-Silva C.M., Soares de Melo I., de Oliveira P.R. (2005). Ligninolytic enzyme production by Ganoderma spp. Enzyme and Microbial Technology 37: 324-329. Mandels M., Reese E. (1956). Induction of cellulase in Trichoderma viride as influenced by carbon sources and metals. Biology Branch: 269-277. Mandels M., Weber J. (1969). The production of cellulases and their applications. Advances Chemistry, 95: 391-414. Mansel P.W.A. (1994). Polysaccharides in skin care. Cosmetics Toilet, 109: 7-72. Mansfield S.D., Mooney C., Sanddler J.N. (1999). Substrate and enzyme characteristics that limit cellulose hydrolysis. Biotechnological progress, 15: 804-816. Markham P. (1998). Occlusions of septal pores in filamentous fungi. Mycological Research, 98: 1089-1106. Marques de Souza C.G., Zilly A., Peralta R.M. (2002). Production of laccase as the sole phenoloxidase by a Brazilian strain of Plerotus pulmonarius in solid state fermentation. Journal Basic Microbiology, 42: 83-90. Martinez A. (2002). Molecular Biology and structure-function of lignin-degradin heme peroxidases. Enzyme Microbiology Technology, 30: 425-444. Martinez M., Ruiz-Dueñas F., Guillen F., Martinez A. (1996). Purifacation and catalytic properties of two manganese peroxidase isoenzymes from Pleurotus eryngii. European Journal Biochemistry, 237: 424-432. Martínez M.J., Ruíz-Dueñas F.J., Guillén F., Martínez A.T. (1996). Purification and catalytic properties of two manganese- peroxidase isoenzymes from Pleurotus eryngii. European Journal of Biochemistry, 237: 424-432. Mattila P., Lampi A.M., Ronkainen R., Toivo J., Piironen V. (2002). Sterol and Vitamin D2 contents in some wild and cultivated mushroomn. Food Chemistry, 76: 293-298. Mayer A.M., Staples R.C. (2002). Laccase: new functions for an old enzyme. Phytochemistry, 60: 551-565. Maziero R., Cavazzoni V., Ramos-Bononi V.L. (1999). Screening of Basidiomycetes for the production of exopolisaccharides and biomass in submerged culture. Revista de Microbiologia, 30: 77-84. Meagher M.M., Tao B.Y., Chow J.M., Reilly P.J. (1988). Kinetics and subsite mapping of β -D-xylobiose and D-xylose producing Aspergillus niger endo-β-1,4-D-xylanase. Carbohydrates Resources, 173: 273-283. Meier H. (1955). Decomposition of the cell wall by wood-destroying fungi and the submicroscopic structure of tracheids of spruce and wood fibers of birch (translation Nº 92: Department of the Secretary of State of Canada, February 1956) Holz. Roh-Werkst., 13: 323-338. Mester T., Sierra-Alvarez R., Holzforschung. (1998). Peroxidase and aryl metabolite production by the white rot fungus Bjerkandera sp. strain BOS55 during solid state fermentation of lignocellulosic substrates. J. Field, 52: 351-358. Meyer H.P., Kiener A., Imwinkelried R., Shaww N. (1997). Biotransformations for fine chemicals production. Chimia, 51: 287-289. Mitchell D., Stuart D., Tanner R. (1999). Solid-State fermentation - Microbial growth kinetics, in The Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis and bioseparation, Flickinger M., Drew S., EditorsWiley: New York. 2407-2429 Mitchell D.A., Von meien O.F., Krieger N., Dalsenter F.D. (2004). A review of recent developments in modeling of microbial growth kinetics and intraparticle phenomena in solid-state fermentation. Biochemical Engineering Journal 17: 15-26. Mizuno T. (1992). Antitumor active polysaccharides isolated from the fruiting body of Hericium erinaceum, and edible, and medicinal mushroom called Yamabushitake or Houtou. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 56: 349-357. Mizuno T., Saito H., Nishitoba T., Kawagishi H. (1995). Antitumor-active substances from mushrooms. Food review international, 11: 23-61. Mizuno T. (1999). The extraction and development of antitumouractive polysaccharides from medicinal mushrooms in Japan. International Journal Medicine Mushrooms, 1: 9-29. Mohammad-Fata M., Hossein M., Shirin G., Ghorban-Ali H. (2007). Immunomodulating and anticancer agents in the realm of macromycetes fungi (macrofungi). International Immunopharmacology 7: 701-724. Moncada B., Forero E. (2006). El género Pseudocyphellaria VAIN. (Lobariaceae - ascomycetes liquenizados) en Colombia. Caldasia, 28(2): 197-215. Montenecourt B.S., Eveleigh D.E. (1977). Semiquantitative plate assay for determination of cellulase production by Trichoderma viride. Applied and Environmental Microbiology, 33(1): 178-183. Montes B., Restrepo A., McEwen J.G. (2003). Nuevos aspectos sobre la clasificación de los hongos y su posible aplicación médica. Biomédica, 23: 213-237. Montgomery H.J., Monrealb C.M., Young J.C., Seifert K.A. (2000 ). Determinination of soil fungal biomass from soil ergosterol analyses. Soil Biology & Biochemistry, 32: 1207±1217. Montoya B.S., Varon L.M., Levin L. (2008). Effect of culture parameter on the production of the edible mushroom Grifola frondosa (maitake) in tropical weathers. World J. Microbiol. Biotechnol., 24: 1361-1366. Montoya B.S., Orrego C.A., Levin L. (2011a). Growth, fruiting and lignocellulolytic enzyme production by the edible mushroom Grifola frondosa (maitake). World Journal of Microbiology and Biotechnology, ISSN 0959-3993: DOI 10.1007/s11274-11011- 10957-11272. Montoya S., Restrepo G.M. (2006). Evaluación de la síntesis de proteína a partir del crecimiento vegetativo de Pleurotus sp. sobre residuos de algarrobo y uva pasa. Revista Universidad de Caldas, 26(1-2): 23-32. Montoya S. (2008). Actividad enzimática, degradación de residuos sólidos orgánicos y generación de biomasa útil por el macromiceto Grifola frondosa.Investigación. Ingeniería Química, Universidad Nacional de Colombia Sede Manizales: Manizales. 95 p. p. Montoya S., Gallego J., Sucerquia A., Pelaez B., Betancourt O., Arias D. (2010). Macromicetos observados en bosques del Departamento de Caldas: su influencia en el equilibrio y la conservación de la biodiversidad. Boletín Científico Centro de Museos de Historia Naural, 14(2): 57-76. Montoya S.B., Orrego C.A., Levin L. (2011b). Modeling Grifola frondosa fungal growth during solid-state fermentation. Engineering in Life Science, 11(316-321). Moon S.H., Park J.M., Chun H.Y., Kim S.J. (2006). Comparisons of physical properties of bacterial cellulose produced in different culture conditions using saccharified food wastes. Biotechnology Bioprocess Engineering, 11: 26-31. Moore D. (1998a). Fungal Morphogenesis. Primera ed Cambrige University Press.: New York. 469 p. p. Moore D. (1998b). Fungal Morphogenesis. Cambrige University Press: New York, United States of America. Moreira M.T., Feijoo G., Lema J.M. (2003). Fungal bioreactors: Applications to white-rot fungi. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology 2: 247-259. Mosier N., Hendrickson R., Ho N., Sedlak M., Ladisch M.R. (2005a). Optimization of pH controlled liquid hot water pretreatment of corn stover. Bioresource Technology, 96: 1986-1993. Mosier N., Wyman C.E., Dale B.D., Elander R.T., Lee Y.Y., Holtzapple M., Ladisch C.M. (2005b). Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass. Bioresource Technology, 96: 673-686. Mouso N., Papinutti L., Forchiassin F. (2003). Efecto combinado del cobre y pH inicial del medio de cultivo sobre la producción de lacasa y manganeso peroxidasa por Stereum hirsutum (Willd) Pers. Revista Iberoamericana de Micología, 20: 176-178. Mukhamedzhanova T.G., Bezborodov A.M. (1982). Effect of nitrogen and carbon sources on lipase accumulation by the fungus Rhizopus oryzae 1414. Mikrobiologia, 18: 16-22. Muller dos Santos M., Souza das Rosa A., Dal’Boit, Mitchell D., Krieger N. (2004). Thermal denaturation: is solid-state fermentation really a good technology for the production of enzymes? Bioresource Technology 93: 261-268. Munoz G.A., Agosin E., Cotoras M., San Martin R., Volpe D. (1995). Comparison of aerial and submerged spore properties for Trichoderma harzianum. FEMS Microbiology Letter, 125: 63-70. Naeem S. (2002). Autotrophic-Hecterotrophic Interactions and their Impacts on Biodiversity and Ecosystem Functioning. En: Functional Consequences of Biodiversity. Princeton University Press,: New Jersy. pp. 96-119. Nakamura K., Yamaguchi Y., Kagota S., Shinozuka K., Kunitomo M. (1999). Activation of in vivo Kupffer cell function by oral administration of Cordyceps sinensis in rats. . Japan Journal Pharmacology, 79: 508-508. Nazareno M.C., Bucsinszky A.M.M., Tournier H.A., Cabello M.N., Arambarri A.M. (2000). Extracellular ABTS-oxidizing activity of autochthonous fungal strains from Argentina in solid medium. Revista Iberoamericana de Micología, 17: 64-68. Nelson N.J. (1944). A photometric adaptation of the Somogyi method for the detrmination of glucose. Journal Biochemistry, 153: 375-380. Nidetzky B., Steiner W., Hayn M., Claeyssens M. (1994). Cellulose hydrolysis by the cellulases from Trichoderma reesei: a new model for synergistic interaction. Bichemistry Journal, 298: 705-710. Nie S.-P., Xie M.-Y. (2011). A review on the isolation and structure of tea polysaccharides and their bioactivities. Food Hydrocolloids, 25: 144-149. Nieto I., Chegwin C. (2010). Influencia del sustrato utilizado para el crecimiento de hongos comestibles sobre sus características nutraceúticas. Revista Colombiana de Biotecnología, 12(1): 169-178. Nieto I.J., Cucaita R.E. (2007). Ácidos grasos, ésteres y esteroles del cuerpo fructífero del hongo Laccaria laccata. Revista Comobiana de Química, 36(3): 277-284. Nieto I.J., Ávila I.M. (2008). Determinación de ácidos grasos y compuestos triterpenoides del cuerpo fructífero de Suillus luteus. Revista Colombiana de Química, 37(3): 45-52. Nieto-Ramirez I.J., Chegwin-Angarita C., Osorio-Zuluaga H.J. (2007). Incorporación de cafeína en el hongo Pleurotus sajor-caju cultivado sobre pulpa de café. Revista Iberoamericana de Micología 24: 72-74. Nigam P., Pandey A., Prabhu K.A. (1987). Cellulase and ligninase production by basidiomycete culture in solid-state fermentation. Biology Wastes, 20: 1-9. Niku-Paavola M., Raaska M., Itavaara M. (1990). Detection of white-rot fungi by non-toxic stain. Mycology and Resource, 94: 27- 31. Nitschke J., Altenbach H.-J., Malolepszy T., Mölleken H. (2011). A new method for the quantification of chitin and chitosan in edible mushrooms. Carbohydrate Research, 346: 1307-1310. Ooi V., Liu F. (2000). Immunomodulation and anti-cancer activity of polysaccharide-protein complexes. Current Medicine Chemistry, 7: 715-728. Ooi V.E.C., Liu F. (1999). A review of a farmacological activities of mushroom polysaccharides. International Journal Medicinal Mushrooms, 1: 195-206. Ortiz-Moreno M. (2010). Macromicetos en Zona Rural de Villavicencio. Orinoquía, 14(2): 125-132. Pal M., Calvo A., Terron M.C., Gonzalez A.E. (1995). Solid-state fermentation of sugarcane bagasse with Flammulina velutipes and Trametes versicolor. World Journal Microbiology Biotechnology, 11: 541-545. Palonen H., Thomsen A.B., Tenkanen M., Schmidt A.S., Viikari L. (2004). Evaluation of wet oxidation pretreatment for enzymatic hydrolysis of softwood. Applied Biochemistry and Biotechnology, 117: 1-17. Papinutti V.L., Dorio L.A., Forchiassin F. (2003). Degradación de madera de álamo por Fomes sclerodermeus: Producción de enzimas ligninolíticas en aserrín de álamo y cedro. Revista Iberoamericana de Micología, 20: 16-20. Park J.-P., Kim S.-W., Hwang H.-J., Cho Y.-J., Yun J.-W. (2002). Stimulatory effect of plant oils and fatty acids on the exo- biopolymer production in Cordyceps militaris. Enzyme and Microbial Technology, 31: 250-255. Pasquel A. (2001). Gomas: una aproximación a la Industria de alimentos. Revista Amazónica de Investigación Alimentaria, 1(1): 1-8. Paszczczynski A., Crawford R., Huyn V. (1988). Manganese peroxidase of Phanerochaete chrysosporium purification. Methods enzymology, 161: 264-270. Pelaez F., Martinez M.J., Martinez A.T. (1995). Screening of 68 species of basidiomycetes for enzymes involved in lignin degradation. Mycology Resources, 99: 37-42. Peña-Serna C., Sierra-Cadavid A., Sáez A., Rojano B.A. (2006). Establecimiento de un medio de cultivo para una cepa nativa de un hongo Poliporal. Revista Colombiana de Biotecnología, 8(001): 5-13. Peña-Venegas C.P., Cardona G.I., Arguelles J.H., Arcos A.L. (2007). Micorrizas Arbusculares del Sur de la Amazonia Colombiana y su Relación con Algunos Factores Fisicoquímicos y Biológicos del Suelo. Acta Amazónica, 37(3): 327-336. Pérez J., Jeffries T.W. (1992). Roles of Manganese and organic acid chelators in regulating lignin degradation and biosynthesis of peroxidases by Phanerochaete chrysosporium. App Environl Microbiol, 58: 2402-2409. Plackett R.L., Burman J.P. (1946). The design of optimum multifactorial experiments. Biometrika, 33: 305-325. Plassard C., Mousain D., Salsac L. (1982). Estimation of mycelial growth of basidiomycetes by means of chitin determination. Phytochemistry, 21: 345-348. Pointing S.B. (1999). Qualitative methods for the determination of lignocellulolytic enzyme production by tropical fungi. Fungal Diversity, 2: 17-33. Pointing S.B. (2001). Feasibility of bioremediation by white-rot fungi. Applied Microbiology Biotechnology, 57: 20-33. Pradeep V., Datta M. (2002). Production of ligninolytic enzymes for decolorization by cocultivation of white-rot fungi Pleurotus ostreatus and Phanerochaete chrysosporium under solid-state fermentation. Applied Biochemistry Biotechnology, 102-103: 109- 118. Prosser J.I., Tough A.J. (1991). Growth mechanism and growth kinetics of filamentous microorganisms. Critical Reviews in Biotechnology, 10: 253-274. Quintero J.C., Moreira M.T., Feijoo G., Lema J.M. (2008). Screening of white rot fungal species for their capacity to degrade lindane and other isomers of hexachlorocyclohexane (HCH). Ciencia e Investigación Agraria, 35(2): 159-167. Quintero J.D., Feijoo G.C., Lema J.M. (2006). Producción de enzimas ligninolíticas con hongos basidiomicetos cultivados sobre materiales lignocelulósicos. Revista de la Facultad de química Farmacéutica, 13(2): 61-67. Raghavarao K.S., Ranganathan T.V., Karanth N.G. (2003). Some engineering aspects of solid-state fermentation. Biochemical Engineering Journal, 13: 127-135. Reddy C.A. (1995). The potential for white-rot fungi in the treatment of pollutants. Current Opinion in Biotechnology, 6: 320-328. Reddy G.V., Ravindra B.P., Komaraiah P., Roy R.M., Kothari I.L. (2003). Utilization of banana waste for the production of lignolytic and cellulolytic enzymes by solid substrate fermentation using two Pleurotus species (P. ostreatus and P. sajor-caju). Process Biochemistry, 38: 1457-1462. Reid I.D. (1995). Biodegradation of lignin. Canadian Journal of Botany, 73: S1011-S1018. Rivera A., Laverde C.M., Ríos-Motta J., Nieto I.J., Osorio H.J. (2005a). Dehidroergosterol: un artefacto generado durante el proceso de extracción de esteroles en el hongo Pleurotus sajor-caju. Revista Colombiana de Química, 34(2): 117-125. Rivera A., Osorio H.J., Ríos-Motta J., Nieto I.J., Laverde C.M. (2005b). Dehidroergosterol: un artefacto generado durante el proceso de extracción de esteroles en el hongo Pleurotus sajor-caju. Revista Colombiana de Química, 34(2): 117-125. Rocha O., Nobre C., Dominguez A., Torres A., Faria N., Rodrigues L., Teixeira J.A., Ferreira E.C., Rocha I. (2009). A Dynamical Model for the rmentative production of fructooligosaccharides, in 10th International Symposium on Process Systems Engineering - PSE2009
, Rita Maria de Brito Alves C.A.O.d.N.a.E.C.B.J.E., Editor© 2009 Elsevier B.V. All rights reserved: Braga, Portugal. 1827-1833. Rodríguez I., Piñeros Y. (2007). Producción de complejos enzimáticos celulolíticos mediante el cultivo en fase sólida de Trichoderma sp. sobre los racimos vacíos de palma de aceite como sustrato. Revista de la Facultad de química farmacéutica, 14(2): 35-42. Rodríguez J., Ferraz A., Mello M.P. (2003). Role of metals in wood biodegradation. En: Wood Deterioration and Preservation - Advances in our Changing World. Series A.S. (Ed.). Goodell, B., Nicholas, D.D., Schultz, T.P. (Eds.): Washington. pp. 154- 174. Rodríguez N. (2003). Aprovechamiento de los residuos sólidos generados en el cultivo e industrialización del café para la producción de hongos comestibles y medicinales.Postgrado. Universidad Politécnica de Valencia: Valencia. 140 p. Rodríguez N., Jaramillo C. (2005). Cultivo de hongos comestibles del género Pleurotus sobre residuos agrícolas de la zona cafetera. Centro Nacional de Investigaciones de Café, 23: 34-40. Rodríguez V.N. (1993). El cultivo de hongos comestibles sobre desechos agroindustriales, Cenicafé: Chinchiná. 1-2 p. Rodriguez-Couto S., Toca-Herrera J.L. (2007). Laccase production at reactor scale by filamentous fungi. Biotechnology advances, 25: 558.569. Rodríguez-Couto S., Sanromán M.A. (2005). Application of solid-state fermentation to ligninolytic enzyme production. Biochemical Engineering Journal 22 211-219. Rodríguez-Couto S., Toca-Herrera J.L. (2007). Laccase production at reactor scale by filamentous fungi. Biotechnology Advances, 25: 558-569. Rodríguez-Palenzuela P., García J., de Blas C., Madrid. D.B.U.P.d., Madrid. D.d.P.A.U.P.d. (2000). XIV Curso de Especialización: Avances en nutrición y alimentación animal. En: Fibra soluble y su implicación en nutrición animal: Enzimas y probióticos. Madrid. pp. 17p. Ruíz A., Varela A. (2006). Nuevos registros de Aphyllophorales (basidiomicota) en bosque montano húmedo y de niebla de Colombia. Caldasia 28(2): 259-266. Russell R., Paterson M. (2008). Cordyceps – A traditional Chinese medicine and another fungal therapeutic biofactory. Phytochemistry, 69: 1469-1495. Sáez A., Florez L., Cadavid A. (2002). Caracterización de una cepa nativa de Aspergillus niger y evaluación de la producción de ácido cítrico. Revista Universidad EAFIT, (128): 33-42. Sánchez O.J., Cardona C.A. (2007). Producción de Alcohol Carburante: Una Alternativa para el Desarrollo Agroindustrial. Universidad Nacional de Colombia: Manizales. 386 p. Sánchez O.J., Cardona C.A. (2008). Trends in biotechnological production of fuel ethanol from different feedstocks. Bioresource Technology, 99: 5270-5295. Sangsurasak P., Nopharatana M., Mitchell D. (1996). Mathematical modeling of the growth of filamentous fungi in solid-state fermentation. Journal Science Industrial Resources 55: 333-342. Sarangi I., Ghosh D., Bhutia S., Mallick S., Maiti T. (2006). Anti-tumor and immunomodulating effects of Pleurotus ostreatus mycelia-derived proteoglycans. International Immunopharmacology, 6: 1287-1297. Schulze B., Wubbolts M.G. (1999). Biocatalysis for industrial production of fine chemicals. Chemical Biotechnology, 10: 609-615. Shen Q., Royse D. (2002). Effects of genotipes of maitake (Grifola frondosa) on biological efficiency, quality and crop cycle time. Applied Microbiology Biotechnology, 58: 178-182. Shi J., Sharm-Shivappa R.R., Chinn M., Howell N. (2009). Effect of microbial pretreatment one nzymatic hydrolysis and fermentation of cotton stalks for ethanol production. Biomass and Bioenergy, 33: 88-96. Shi J., Sharma-Shivappa R.R., Chinn M.S. (2012). Interactions between fungal growth, substrate utilization and enzyme production during shallow stationary cultivation of Phanerochaete chrysosporium on cotton stalks. Enzyme and Microbial Technology, 51: 1- 8. Shinners-Carnelley T.C., Szpacenko A., Tewari J.P., Palcic M.M., Cho N.S. (2002). Enzymatic activity of Cyathus olla during solid state fermentation of canola roots. Phytoprotection 83: 31-40. Soares G., De Amorin M., Costa-Ferreira M. (2001). Use of laccase together with redox mediators to decolourize Remazol Brilliant Blue R. Journal Biotechnology, 89: 123-129. Sohail M., Siddiqi R., Ahmad A., Khan S.A. (2009). Cellulase production from Aspergillus niger MS82: effect of temperature and pH. New Biotecchnology, 25(6): 437-441. Somogyi M. (1945). A new reagent for the determination of sugars. Journal Biology Chemistry, 160: 61-73. Sriyudthsak K., Shiraishi F. (2010). Investigation of the performance of fermentation processes using a mathematical model including effects of metabolic bottleneck and toxic product on cells. Mathematical Biosciences, 228: 1-9. Stames P. (1993). Growing gourmet and medicinal fungi Ten Speed Press and Mycomedia: Hong Kong. 456 p. p. Stead P., Marley H., Mahmoudian M., Webb G., Noble D., Ip Y., Piga E., Rossi T., Roberts S. (1996). Efficient procedures for the largescale preparation of (1S,2S)-trans-2-methoxycyclohexanol, a key chiral intermediate in the synthesis of tricyclic b-lactam antibiotics. Dawson MJ: Tetrahedron - Asymmetry, 7: 2247-2250. Sun Y., Cheng J. (2002). Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a review. Bioresource Technology, 83: 1-11. Takano M., Nishida, A., Nakamura, M. (2001). Screening of wood-rotting fungi for kraft pulp bleaching by the Poly R decolorization test and biobleaching of hardwood kraft pulp by Phanerochaete crassa WD 1694. Journal of Wood Science, 47: 63-68. Takasaki Y. (1976). Production and utilization of B-amylase and pullulanase from B. cereus var. mycoides. Agriculture Biology Chemistry, 40: 1515-1525. Tang Y.J., Zhong J.J. (2002). Exopolysaccharide biosynthesis and related enzyme activities of the medicinal fungus, Ganoderma lucidum, grown on lactose in a bioreactor. Biotechnology Letters, 24: 1023-1026. Tao Y., Zhang L., Cheung P. (2006). Physicochemical properties and antitumor activities of watersoluble native and sulfated hyperbranched mushroom polysaccharides. Carbohydrates Resources, 341: 2261-2269. Tavares A., Coelho M., Coutinho J., Xavier A. (2005). Laccase improvement in submerged cultivation: induced production and kinetic modelling. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 80: 669-676. Thurston C. (1994). The structure and function of fungal laccases. Microbiology-UK, 140: 19-26. Tišma M., Sudar M., Raĉki S., Zelic B. (2010). Mathematical model for Trametes versicolor growth in submerged cultivation. Bioprocess and Biosystems Engineering, 33: 749-758. Tobin J.M., White C., Gadd C.M. (1994). Metal accumulation by fungi—applications in environmental biotechnology. Journal of Industrial and Microbiology 13: 126-130. Tolan J., Olson D., Dines R. (1996). Survey of mill usage of xylanase. En: Enzymes for pulp and paper processing (Jeffries, TW. Viikari L). Society A.C. (Ed.). Washington DC. pp. 25-35. Tomme P.H., Van Tilbeurgh G., Petterson J., Van Damme J., Vanderker-Ckhove J., Knowles T., Teeri, Claeyssens M. (1988). Studies of cellulolityc system of Trichoderma reesei QM 9414. Analysis of domain function in two cellobiohydrolases by limited proteolysis. Europe Journal Biochemestry, 170: 575-581. Tsukagoshi S., Hashimoto Y., Fujii G., Kobayashi H., Nomoto K., Orita K. (1984). Krestin (PSK). Cancer Treatment review, 11: 131-155. Tuor U., Wariishi H., Schoemaker H., Gold M.H. (1992). Oxidation of phenolic arylglycerol beta-aryl ether lignin model compounds by manganese peroxidase from Phanerochete chrysosporium: oxidative cleavage of an alpha-carbonyl mode compoundl. Biochemistry, 31: 4986-4995. Tychanowicz G.K., Zilly A., Marques de Souza C.G., Peralta R.M. (2004). Decolourisation of industrial dyes by solid-state cultures of Pleurotus pulmonarius. Process Biochemistry, 39: 855-859. Ünyayar A., Sik S. (1998). Phanerochaete chrysosporium and Funalia trogii for the degradation of cotton stalk and their laccase, peroxidase, ligninase and cellulase enzyme activities under semi-solid state conditions. Turkish Jornal Biology, 22: 287-298. Uribe-López A.M. (1983). Hongos comestibles: otro producto de las plantaciones de coníferas no explotado en Colombia [Agaricales, Aphyllophorales, Lycoperdales, Pezizales]. ed. Agronomía F.d. Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín: Medellín (Colombia). 73 p. Valbuena D.C., Alzate C.J. (2007). Evaluación de la patogenicidad de los hongos Bauveria basiana y Metarhizium anisopliae en el control de la garrapata del ganado Rhipicephalus micraplus en su fase parasítica en su estado larval y ninfal.Trabajo de grado. Microbiología Agrícola y Veterinaria, Javeriana: Bogotá. 144 p. p. Van de Lagemaat J., Pyle D.L. (2005). Modelling the uptake and growth kinetics of Penicillium glabrum in a tannic acid-containing solid-state fermentation for tannase production. Process Biochemistry, 40: 1773-1782. Vares T., Kalsi M., Hatakka A. (1995). Lignin peroxidases, manganese peroxidases and other ligninolytic enzymes produced by Phlebia radiata during solid state fermentation of wheat straw. Applied and Environment Microbiology 61: 3515-3520. Vasco-Palacios A.M., Franco-Molano A.E., López-Quintero C.A., Bohechout T. (2005). Macromicetes (ascomicota, basidiomicota) de la región del medio Caquetá, departamentos de Caquetá y Amazonas (Colombia). Biota Colombiana, 6(1): 127-140. Vera D.F., Pérez H., Valencia H. (2002). Aislamiento de hongos solubilizadores de fosfatos de la rizosfera de arazá (Eugenia stipitata, Myrtaceae). Acta Biológica Colombiana 7(1): 33-39. Vetter J. (2007). Chitin content of cultivated mushrooms Agaricus bisporus, Pleurotus ostreatus and Lentinula edodes. Food Chemistry, 102: 6-9. Visser J., Beldman G., Kusters–van Someran M.A., Voragen A.G.J. (1991). International Conference of Xylans and Xylanases Netherlands: Elsevier. pp. 89-94. Vroemen A.J. (2002). Glucose oxidase. En: Handbook of food enzymology. Witaker J.R., Voragen A.G., Wong D.W.S. (Eds.). Marcel Dekker, INC: New York. pp. 425-432. Wade L.G. (1993). Química Orgánica. 2 ed, ed. Educación P. Debra Wechsler: México. 1312 p. Wainwright M. (1988). Metabolic diversity of fungi in relation to growth and mineral cycling in soil—a review. Transactions of the British Society of Mycology, 90: 159-170. Wasser S. (2002). Medicinal mushrooms as a source of antitumor and immunomodulating polysaccharides. Applied Microbiology and Biotechnology, 60: 258-274. Wasser S.P., Weis A.L. (1999). Medicinal properties of substances occurring in higher Basidiomycete mushrooms: current perspective (review). International Journal Medicine Mushrooms, 1: 31-62. Weinberg Z.G. (2000). Biotechnology in developing countries: opportunities in solid state fermentation applied in the agricultural industry. Internation Journal of Biotechnology, 2(4): 364-373. Whittaker R.H. (1969). New Concepts of Kingdoms of Organisms. Science, 163: 150-160. Wong D.W.S. (2009). Structure and Action Mechanism of Ligninolytic Enzymes. Applied Biochemestry and Biotechnology, 157: 174-209. Wood T.M., García C.V. (1994). Enzymes and mechanisms involved in microbial cellulolysis. Kluwer Academic publishers: Netherlands. Wu J., Ding Z.-Y., Zhang K.-C. (2006). Improvement of exopolysaccharide production by macro-fungus Auricularia auricula in submerged culture. Enzyme and Microbial Technology, 39: 743-749. Wyman C.E., Dale B.E., Elander R.T., Holtzapple M., Ladisch M.R., Lee Y.Y. (2005). Coordinated development of leading biomass pretreatment technologies. Bioresource Technology, 96: 1959-1966. Xie J., Sun X., Ren L., Zhang Y.Z., Wu Kung S. (2001). Studies in lignocellulolytic enzymes production and biomass degradation of Pleurotus sp.2 and Trametes gallica in wheat straw cultures. Chemical Engineering Journal and the Biochemical Engineering Journal, 17: 575-578. Xu H., Sun L.-P., Shi Y.Z., Wu Y.W., Zhang B., Zhao D.Q. (2008). Optimization of cultivation conditions for extracellular polysaccharide and mycelium biomass by Morchella esculenta As51620 Biochemical Engineering Journal, 39: 66-73. Yachmenev V., Condon B., Klasson T., Lambert A.J. (2009). Acceleration of the enzymatic hydrolysis of corn stover and sugar cane bagasse celluloses by low intensity uniform ultrasound. Biobased Material Bioenergy, 3: 25-31. Yalin W., Ishurd O., Cuirong S., Yuanjiang P. (2005). Structure analysis and anti-tumor activity of (1→3)-β-D-glucans (cordyglucans) from the mycelia of Cordyceps sinensis. Planta Medica, 71: 381-384. Yang B.-K., Gu Y.-A., Jeong Y.-T., Jeong H., C-H. S. (2007). Chemical characteristics and immune-modulating activities of exo- biopolymers produced by Grifola frondosa during submerged fermentation process. International Journal of Biological Macromolecules, 41: 327-333. Yang F.-C., Ke Y.-F., Kuo S.-S. (2000). Effect of fatty acids on the mycelial growth and polysaccharide formation by Ganoderma lucidum in shake flask cultures. Enzyme and Microbial Technology, 27: 295-301. Zabel R.A., Morrel J.J. (1992a). Decay and its Prevention. Academic Press: San Diego. 534 p. p. Zabel R.A., Morrel J.J. (1992b). Decay and its Prevention. Academic Press: San Diego, California. Zaks A. (2001). Industrial biocatalysis. Chemical Biology, 5: 130-136. Zanchetta P., Lagarde P.N., Guezennec J. (2003). A new bone-healing material: A hyaluronic acid-like bacterial exopolysaccharide. Calcified Tissue International, 72: 74-79. Zapata P., Rojas D., Carlos Fernández C., Ramírez D., Restrepo G., Orjuela V., Arroyave M., Gómez T., Atehortúa L. (2007). Producción de biomasa y exopolisacáridos de Grifola frondosa bajo cultivo sumergido utilizando fuentes de carbono no convencionales. Revista EIA, ISSN 1794-1237, (7): 137-144. Zapata P., Rojas D., Atehortúa L. (2012). Production of Biomass, Polysaccharides, and Ganoderic Acid using Non-conventional Carbon. International Journal of Medicinal Mushrooms, 14(2): 197-203. Zhang P., Himmel M.E., Mielenz J.R. (2006a). Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies. Biotechnology Advances 24: 452-481. Zhang Y.-H.P., Himmel M.E., Mielenz J.R. (2006b). Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies. Biotechnology Advances, 24: 452-481. Zhao J., Janse B.J. (1996). Comparison of H2O2-producing enzymes in selected white rot fungi. FEMS Microbiology Letters, 139: 215-221. Zhao J., Koker T., Janse B.J. (1996). Comparative studies of lignin peroxidases and manganese-dependent peroxidases produced by selected white rot fungi in solid media. FEMS Microbiology Letters, 143: 393-399. Zhao X.R., Lin Q., Brookes P.C. (2005). Does soil ergosterol concentration provide a reliable estimate of soil fungal biomass? Soil Biology and Biochemistry, 37: 311-317. Zhu S., Wu Y., Yu Z., Wang C., Yu F., Jin S., Ding Y., Chi R., Liao J., Zhang Y. (2006). Comparison of three microvawe/chemical pretreatment processes for enzymaric hydrolyisis of rice straw. Biosystem Engineering, 93: 279-283. Zhuang O., Mizuno T. (1999). Biological responses from Grifola frondosa (Dick.:Fr.) S.F. Gray-Maitake (Aphyllophoromycetideae). Internation Journal medicinal mushrooms, 1: 317-324.
3. Evaluación de Actividades Endoglucanasa, Exoglucanasa, Lacasa y Lignina Peroxidasa en Diez Hongos de Pudrición Blanca
72
EVALUACIÓN DE ACTIVIDADES ENDOGLUCANASA, EXOGLUCANASA, LACASA Y LIGNINA PEROXIDASA EN DIEZ HONGOS DE PUDRICIÓN BLANCA
EVALUATION OF ENDOGLUCANASE, EXOGLUCANASE, LACCASE, AND LIGNIN PEROXIDASE ACTIVITIES ON TEN WHITE-ROT FUNGI
AVALIAÇÃO DE ATIVIDADES ENDOGLUCANASE, EXOGLUCANASE, LACASE E LIGNINA PEROXIDASE EM DEZ FUNGOS DA PODRIDÃO BRANCA
SANDRA MONTOYA B. 1, ÓSCAR JULIÁN SÁNCHEZ T. 2, LAURA LEVIN 3
RESUMEN
Este trabajo presenta una vía de rastreo de producción de enzimas lignocelulolíticas en diez especies de hongos de pudrición blanca: Lentinula edodes, Schizophyllum commune, Trametes trogii, Coriolus versicolor, Pycnoporus sanguineus, Ganoderma applanatum, Ganoderma lucidum, Grifola frondosa, Pleurotus ostreatus y Auricularia delicata. Estas especies primero fueron rastreadas sobre medios de cultivo sólido que contienen carboximetil celulosa, celulosa cristalina, ABTS (2,2´-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato)) y azure B, los cuales evidenciaron la producción de las enzimas endoglucanasa, exoglucanasa, lacasa y lignina peroxidasa (LiP). Las actividades celulolíticas fueron detectadas a los cinco días de incubación con el indicador rojo congo, formándose un halo claro-blanco en las zonas donde se degrada la celulosa. Para las ligninasas, este rastreo consistió en el seguimiento a la formación de halos verdes por oxidación del ABTS para lacasa y halos de decoloración sobre el azure B para la LiP durante 14 días de incubación. De este rastreo cualitativo, se seleccionaron cuatro cepas (G. lucidum, L. edodes, C. versicolor y T. Trogii), como las mejores productoras de enzimas celulolíticas y ligninolíticas. Estas cuatro especies fueron inoculadas sobre un sustrato de aserrín de roble, obteniéndose 51,8% de lignina degradada por L. edodes y 22% de celulosa degrada por C. versicolor.
PALABRAS CLAVE: Celulasas, Ligninasas, Lentinula edodes, Coriolus versicolor, Celulosa.
ABSTRACT
This paper presents a way of tracking the production of lignocellulolytic enzymes in ten species of white rot fungi: Lentinula edodes, Schizophyllum commune, Trametes trogii, Coriolus versicolor, Pycnoporus sanguineus, Ganoderma applanatum, Ganoderma lucidum, Grifola frondosa, Pleurotus ostreatus and Auricularia delicata. These species were first screened on solid culture media containing carboxymethyl cellulose, crystalline cellulose, ABTS (2,2´-azino- bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonate)) and azure B, which showed the production of endoglucanase, exoglucanase, laccase and lignin peroxidase (LiP) enzymes. Cellulolytic activities were detected after five days of incubation with congo red indicator, forming a clear- white halo in areas where cellulose was degraded. For ligninases, the tracking consisted of the monitoring in the formation of green halos due to ABTS oxidation for laccase, and decolorization halos on azure B for LiP during 14 days of incubation. From this qualitative screening, four strains were selected (G. lucidum, L. edodes, C. versicolor and T. trogii) as the best producers of cellulolytic and ligninolytic enzymes. These four species were inoculated on a substrate of sawdust oak, yielding 51.8% of lignin degraded by L. edodes and 22% of cellulose degraded by C. versicolor.
1 Magíster en Ingeniería-Ingeniería Química, Instituto de Biotecnología Agropecuaria, Universidad de Caldas, Manizales, Colombia. 2 Doctor en Ingeniería, Instituto de Biotecnología Agropecuaria, Universidad de Caldas, Manizales, Colombia. 3 Doctora en Ciencias, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Argentina. Correspondencia: [email protected]
KEYWORDS: Cellulases, Ligninases, Lentinula edodes, Coriolus versicolor, Cellulose.
RESUMO
Este trabalho apresenta uma maneira de seguir produção da enzimas lignocelulolíticas em 10 espécies de fungos da podridão branca: Lentinula edodes, Schizophyllum commune, Trametes trogii, Coriolus versicolor, Pycnoporus sanguineus, Ganoderma applanatum, Ganoderma lucidum, Grifola frondosa, Pleurotus ostreatus e Auricularia delicata. Estas espécies foram primeiramente rastreados em meio de cultura sólido contendo os reagentes de carboximetil celulose, celulose cristalina, ABTS (2,2 '-azinobis (3-etilbenztiazoline-6-sulfonato)) e azure B que mostrou a produção de enzimas de endoglucanase, exoglucanase lacase, peroxidase de lignina e (LiP). Actividades celulolíticas foram detectados após cinco dias de incubação com o indicador vermelho congo, formando um claro halo-branco em áreas degrada a celulose. Para ligninases, esta consistia de rastreamento faixa formação de halo verde por oxidação de ABTS a lacase e descoloração halos no lábio azure B, durante 14 dias de incubação. Esta triagem qualitativa, foram selecionados quatro cepas: G. lucidum, L. edodes, C. versicolor e T. trogii, cepas como os melhores produtores de enzimas celulolíticas e ligninolíticas. Estas quatro espécies foram inoculados sobre um substrato de madeira de carvalho serradura, obtendo-se 51,8% de lignina por L. edodes degradad e 22% de celulose degradada por C. versicolor.
PALAVRAS-CHAVE: Celulases, Ligninases, Lentinula edodes, Coriolus versicolor, Celulose.
INTRODUCCIÓN butílica; en el mejoramiento de la textura del papel (liso), biodesentintado para reciclado Las enzimas lignocelulolíticas juegan del papel utilizando una mezcla de un rol importante en la conversión del celulasas, pectinasas, xilanasas y lipasas; complejo lignocelulósico en azúcares en el biopulido de telas para el tratamiento fermentables para la producción de alcohol superficial de las pelusas, en la elaboración carburante en la actualidad [1]. Las enzimas de paños super absorbentes, en la celulolíticas son consideradas de gran extracción de jugos, aromas, aceites y importancia industrial. Por ejemplo, ellas pigmentos con agregados enzimáticos de han sido ampliamente utilizadas para celulasas, pectinasas y xilanasas, éstas reemplazar la hidrólisis ácida como método rompen paredes celulares y hace más de conversión de celulosa en azúcares eficiente la extracción; en la elaboración de fermentables, especialmente glucosa para aditivos no calóricos [2-5]. De igual forma, la producción de etanol y otros alcoholes de las ligninasas son utilizadas para la importancia industrial, asimismo, para la deslignificación de los materiales glucosa obtenida es utilizada como materia lignocelulósicos dispuestos para prima para la manufactura de diferentes alimentación de rumiantes. Por ejemplo, la alimentos para animales, humanos y industria de producción de carne bovina en productos químicos. Las celulasas también el mundo presenta dificultades para son utilizadas en diversos procesos de mantener estable el suministro de alimentos fermentación para la producción de para los animales. Uno de los principales sustancias de uso industrial como el ácido inconvenientes es la variación del clima, lo láctico, en procesos de fermentación aceto- que ha generado que este segmento de la 74
industria alimentaria busque nuevas a CO2 y agua gracias a las grandes alternativas para el mantenimiento de la cantidades de óxido-reductasas que alimentación animal [6]. En el planeta se excretan. Además tienen la capacidad de desechan grandes cantidades de materiales producir y transformar sustancias no lignocelulósicos que generan contaminación fenólicas en fenólicas para su fácil y que pueden ser utilizados para este fin degradación y la obtención de sustancias utilizando complejos de enzimas aromáticas de menor tamaño que la lignina ligninolíticas para la degradación de la y de menor toxicidad. Aunque estos hongos lignina y posteriormente realizar los no pueden usar el carbono obtenido como ensilajes o las transformaciones y fuente de energía, ellos son considerados suplementaciones requeridas por los como los mejores organismos degradadores animales [7, 6]. de sustancias aromáticas que han sido encontrados hasta el momento [12]. Estos La producción de enzimas degradadoras del hongos también degradan celulosa y complejo lignocelulósico, se realiza a partir hemicelulosa, cuya hidrólisis provee una de microorganismos que las producen, fuente verdadera de energía [13, 3]. entre los que se encuentran los hongos de pudrición blanca [8]. Los materiales Entre los hongos de pudrición blanca como lignocelulósicos en promedio se componen potentes agentes productores de enzimas de 40-50% de celulosa, 25-40% de lignocelulolíticas, se encuentran especies hemicelulosa y 25-35% de lignina y otros de los géneros Auricularia, Schizophyllum, monómeros en menor proporción [9]. Estos Lentinus, Polyporus, Pycnoporus y materiales pueden ser degradados en Trametes, entre otros [14]. Especies de medios naturales por los hongos de estos géneros como Coriolus versicolor, pudrición blanca a través de las enzimas Ganoderma lucidum, Ganoderma que excretan, como el complejo de applanatum, Schizophyllum commune, celulasas celulasas: endoglucanasas, Pycnoporus sanguineus, Pleurotus exoglucanasas, otras que degradan ostreatus, Grifola frondosa, Auricularia oligosacáridos como la β-glucosidasa, las delicata, Trametes trogii y Lentinula edodes, óxidorreductasas, como lacasas, en la actualidad son reconocidas por su manganeso peroxidasa y lignina gran capacidad de degradación de celulosa peroxidasa, las cuales son las enzimas y lignina. Asimismo, estos hongos han sido responsables de la degradación del utilizados en diferentes procesos con fines complejo lignocelulósico [10, 11]. de biodegradación de diferentes polímeros: carbohidratos, aromáticos, hidrocarburos, Los materiales lignocelulósicos son los colorantes sintéticos, etc. [15-17]. sustratos indicados para el desarrollo de muchos hongos. Estos materiales Los métodos cualitativos constituyen una lignocelulósicos constituyen el principal buena herramienta para la búsqueda rápida componente de los vegetales y sus (rastreo) de enzimas que degraden el residuos, así como de residuos complejo lignocelulósico [9, 18]. Estas agroindustriales, forestales y residuos pruebas proporcionan una indicación sólidos urbanos, entre otros [5]. Los hongos certera de la presencia de estas enzimas de pudrición blanca presentan como con el fin de realizar una adecuada característica especial la capacidad de selección de cepas de hongos respecto al degradar la lignina hasta su mineralización grupo de enzimas que producen, 75
disminuyendo la cantidad de pruebas diez especies de hongos macromicetos: L. cuantitativas, que son mucho más costosas edodes, S. commune, T. trogii, C. versicolor, y demandan mayor tiempo. Sin embargo, P. sanguineus, G. applanatum, G. lucidum, estos métodos tienen limitaciones G. frondosa, P. ostreatus y A. delicata. especialmente de precisión, aunque juegan un rol importante en procesos de selección MÉTODO de cepas [19, 20]. Hongos Actualmente se emplean varios métodos cualitativos para la detección de celulasas, Los siguientes hongos de pudrición blanca entre los que se encuentran los medios empleados para el rastreo fueron obtenidos sintéticos con el reactivo específico sobre el de la colección del Laboratorio de cual actúa la enzima. Por ejemplo, para la Macromicetos de la Universidad de Caldas: detección de la endoglucanasa se emplea L. edodes (CICL54), S. commune carboximetil celulosa (CMC), para (UCS004), T. trogii (BAFC463), C. versicolor exoglucanasas se usa celulosa cristalina o (PSUWC430), P. sanguineus (UCS003), G. agar azure celulosa. Estas dos enzimas o applanatum (UCS001), G. lucidum grupo de enzimas generalmente se (UCC002), G. frondosa (PSUMCC 922), P. detectan por la formación de un halo blanco ostreatus (UCC001) y A. delicata (UCS002). alrededor de la colonia. Para la β- Las cepas fueron mantenidas en caja de glucosidasa se emplea agar esculina Petri con agar papa dextrosa (PDA) a 4°C. (6,7dihidroxicumarino 6-glucósido) como fuente única de carbono. La enzima β- Rastreo de celulasas glucosidasa forma glucosa, la cual es excretada al medio y forma un halo negro Los medios de cultivo para el rastreo de las en torno a la colonia; este halo negro actividades endoglucanasa y exoglucanasa, también puede formarse cuando se realizan se formularon con 1,7% de agar-agar, y las pruebas para las enzimas celulolíticas, 0,1% de CMC para las endoglucanasas y endoglucanasas y exoglucanasas [9, 21]. 0,1% de celulosa cristalina para las Para detectar ligninasas, se emplean exoglucanasas como única fuente de reactivos que las óxido-reductasas puedan carbono. El medio fue autoclavado durante degradar. Por ejemplo, para la detección de 15 minutos a 121°C. Las diez cepas de ligninasas como la enzima lignina hongos fueron inoculadas en cuatro cajas peroxidasa (LiP) se utiliza azure B, el cual de Petri por especie y por triplicado y se se decolora por la acción de esta enzima incubaron por 5 días a 25°C. Las colonias [22] y la detección de lacasa se hace a fueron reveladas con el colorante azoico través de la preparación de un medio con el rojo congo al 0,3% por 15 minutos con reactivo ABTS (2,2'azino- bis (3-etilbenzo- posterior lavado del colorante empleando tiazolin-6-ácido sulfónico)), el cual se oxida una solución 1 N de NaCl [9]. En todos los en presencia de la enzima lacasa [23, 24]. casos se realizó observación y medición de la formación de halos de decoloración y del El objetivo de este trabajo fue determinar el crecimiento micelial de cada una de las microorganismo con mayor potencial para especies. degradar celulosa y lignina sobre residuos lignocelulósicos mediante el rastreo de las enzimas lignocelulolíticas producidas por 76
Rastreo de ligninasas soluble, hemicelulosa, celulosa y lignina [25]. Para estimar la presencia de LiP se empleó el colorante heterocíclico azure B en una Determinación cuantitativa de concentración de 50 µM en medio agar actividades enzimáticas PDA. Para la enzima lacasa se empleó ABTS al 0,035% (p/v) en un medio Los extractos para la determinación de las heterogéneo con la siguiente composición actividades enzimáticas (celulolíticas y en g/L: 10 glucosa, 2 K2HPO4, 0,5 ligninolíticas) fueron obtenidos por la adición MgSO4.7H2O, 0,2 extracto de levadura, 0,5 de 12 mL de agua destilada estéril neutra a (NH4)2SO4, 0,1 Cl2Ca, 0,0064 CuSO4, 22 1 g de medio sólido fresco, sometido a agar-agar y 0,35 de ABTS. Se inocularon ultrasonido por 5 minutos y agitación por 10 las diez cepas preseleccionadas en cuatro minutos con posterior filtración y cajas de Petri por triplicado. Se incubaron centrifugación. por 14 días a 25°C. Posteriormente se determinó el halo de decoloración para los Hidrolasas. Para la determinación de la medios con azure B y la formación de halo actividad endo-1,4-ß-D-glucanasa verde para los medios con ABTS, así como (E.C.3.2.1.4) se usó CMC como sustrato al el tamaño de la colonia en todos los casos 0,5% en buffer acetato de sodio pH 4,8 en [9]. reacción con 100 µL de extracto enzimático por 30 minutos a 50°C. La reacción Determinación del contenido de fibra de enzimática se detuvo con la adición del los sustratos reactivo DNS (ácido dinitrosalicílico) [26]. Se continuó con la reacción de DNS para la Para determinar el contenido de fibra fue determinación de azúcares reductores, se necesario elaborar sustratos empleando leyó la absorbancia a una longitud de onda 98% de aserrín de roble y 2% carbonato de de 540 nm. Una unidad de actividad calcio (porcentajes en base seca) al 60% de enzimática fue definida como la cantidad de humedad y pH 5,5. El sustrato fue enzima que produce 1 µmol de azúcares empacado en frascos de 125 mL con 30 g y reductores en un minuto. Para cuantificar la llevados a esterilización a 121°C por 30 actividad se elaboró una curva patrón de minutos. Posteriormente los sustratos azúcares reductores con distintas fueron inoculados al 4% con cada una de concentraciones de glucosa. Para la las cepas (cuatro frascos por cada especie) actividad exo-1,4-ß-D-glucanasa y se llevaron a incubación por 30 días en (E.C.3.2.1.91) se usó celulosa cristalina al penumbra y 25°C. Luego del proceso de 1% en buffer acetato de sodio con pH de inoculación, los frascos fueron tapados con 4,8 como sustrato, en reacción con 100 µL interlón y película parafinada con el fin de de extracto enzimático a 50°C por 60 filtrar el aire enurante el tiempo de minutos. La reacción se detuvo adicionando incubación. Este experimento se realizó por el reactivo DNS. Se continuó con la triplicado. La determinación de la fibra se determinación de azúcares reductores por realizó a partir de la medida de fibra el método DNS y se centrifugó antes de leer detergente neutra, fibra detergente ácida y la absorbancia a una longitud de onda de fibra lignino-ácida, a partir de las cuales 540 nm. Una unidad de actividad enzimática fueron calculados los contenidos de fibra de exoglucanasa fue definida como la cantidad de enzima que produce 1 µmol de 77
azúcares reductores en un minuto. La sustrato una solución 32 µM de azure B, actividad β-glucosidasa (E.C.3.2.1.21) se 100 µM de H2O2 y 150 µL de extracto determinó por la reacción que se produce enzimático. La mezcla de reacción se entre el sustrato, p-nitrofenil β-D- realizó en buffer tartrato de sodio 50 mM a glucopiranosido al 0,02%, en buffer acetato un pH de 4,5 y se inició la reacción con una de sodio con pH de 4,8 y 100 µL de extracto solución de peróxido de hidrógeno 100 μM. enzimático a 50°C por 30 minutos. La La lectura de la disminución de absorbancia reacción se detuvo adicionando solución se hizo a 650 nm. Una unidad actividad buffer Clark y Lubs (pH 9,8) y se leyó la enzimática es equivalente al decrecimiento absorbancia a una longitud de onda de 430 de 0,1 unidades de absorbancia por minuto nm (ε430=18,5/mM cm) (Wood y Bhat, 1988). y por mL (U/min/mL). Una unidad de actividad enzimática β- glucosidasa se define como la cantidad de Análisis estadístico enzima que produce 1 µmol de producto (p- nitrofenol) en un minuto. Para cuantificar la Para la selección de las cepas con mejor actividad se elaboró una curva patrón con p- comportamiento en la producción de nitrofenol. La actividad endo-1,4-ß-D- enzimas celulolíticas y ligninolíticas se xilanasa (E.C.3.2.1.8) se determinó realizaron dos experimentos sucesivos. El mediante la reacción producida entre el primero, consistió en el seguimiento de las sustrato xilano al 0,2% en buffer acetato de 10 cepas aplicando técnicas sodio con un pH de 4,8 y 100 µL de extracto semicuantitativas registrando el diámetro de enzimático a 50°C por 30 minutos. La los halos de decoloración /oxidación de los reacción se detuvo adicionando DNS y se diferentes sustratos. El segundo leyó la absorbancia a una longitud de onda experimento se deriva de los resultados del de 540 nm. Una unidad de actividad primero; a las cuatro cepas con mejor enzimática de endo-1,4-ß-D-xilana se define respuesta, se les realizó una prueba como la cantidad de enzima que produce 1 cuantitativa de degradación de fibra µmol de azúcares reductores en un minuto. discriminada. En el primer caso, se realizó La curva patrón de azúcares reductores se un diseño completamente aleatorizado a elaboró con xilosa. una vía donde la variable de respuesta fue la formación de los halos y el número de Actividades ligninolíticas. Para la repeticiones fue de 12. Para el caso de las determinación de la actividad lacasa enzimas celulolíticas se tuvo en cuenta la (E.C.1.10.3.2) se utilizaron 0,5 mM de ABTS formación del halo de degradación del en una solución 0,1M de buffer acetato de colorante rojo congo (endoglucanasa y sodio a un pH de 3,6 como sustrato, según exoglucanasa). En el caso de las enzimas el método de Paszczynski y Crawford [27], ligninolíticas se realizaron pruebas para la leyendo el aumento de absorbancia a 420 lacasa siendo su variable de respuesta la nm (ε420=36/mM cm) luego de tres minutos formación de halo de oxidación verdoso; de reacción a 30°C. Una unidad de también se hicieron pruebas para la LiP actividad de lacasa fue definida como la donde la variable de respuesta fue la cantidad de enzima requerida para oxidar 1 formación de un halo de decoloración sobre μmol de ABTS en 1 minuto. Para la el medio de cultivo con azure B. En el cuantificación de la actividad lignina segundo experimento consistente en la peroxidasa (E.C.1.11.1.14) se aplicó el determinación cuantitativa de la fibra, se método del azure B [22], que usa como realizó un análisis estadístico para 78
determinar la capacidad de degradación de normalidad siempre y cuando la varianza lignina, celulosa y hemicelulosa sobre fuera homogénea. En ningún caso los aserrín de madera, incubado a 25°C residuales pasaron ambas pruebas durante 30 días. (homocedasticidad y normalidad) por lo que se debió realizar la prueba no paramétrica Para la evaluación del rastreo de celulasas de Kruskal Wallis. Esta prueba mostró se realizó un análisis de varianza ANOVA a diferencia significativa con valor p < 0,5 una vía, tomando como factor la cepa a 10 (0,000) e indicó que las mejores cepas para niveles y como variable de respuesta la la producción de enzimas celulolíticas formación de los halos. Se empleó el fueron G. lucidum, L. edodes y C. versicolor. programa Statgraphics® Versión 5.1. No todas las cepas evaluadas resultaron También se evaluó la capacidad de capaces de crecer en medios con celulosa degradación y las actividades enzimáticas como única fuente de carbono. Algunas lignocelulolíticas sobre sustrato cepas crecieron muy poco o no presentaron lignocelulósico, de las cuatro especies de crecimiento sobre ninguno de los dos hongos preseleccionadas en las pruebas medios (G. frondosa, A. delicata, G. cualitativas. Para ello se realizó un ANOVA applanatum y S. commune); sin embargo, a una vía utilizando el mismo programa en todos los casos se observó secreción de estadístico. enzimas celulolíticas ya que se apreció un halo decolorado alrededor del inóculo, no RESULTADOS superior en promedio a los 12 mm (Cuadro 14). Las cepas de P. sanguineus, T. trogii y Rastreo en placa de enzimas celulolíticas P. ostreatus crecieron y decoloraron el rojo congo, pero en menor medida que las A las diez cepas pre-seleccionadas (L. cepas de L. edodes, G. lucidum y C. edodes, S. commune, T. trogii, C. versicolor, versicolor, Entre ellas se destacó la cepa C. P. sanguineus, G. applanatum, G. lucidum, versicolor. G. frondosa, P. ostreatus y A. delicata) se les realizó un rastreo a fin de seleccionar las Cuadro 14. Diámetros del halo de crecimiento cepas con mejor comportamiento en la micelial al quinto día de incubación. Diámetro producción de las enzimas celulolíticas Especie halo/crecimiento endoglucanasa y exoglucanasa. Se evaluó, micelial (mm) luego de cinco días de incubación, el A. delicata 8 tamaño de los halos de degradación S. commune 6,5 T. trogii 26 formados y el tamaño de la colonia en mm. * Como resultado del ANOVA se obtuvo un C. versicolor 65 G. frondosa 10 valor p < 0,5 (0,000), lo que mostró una G. lucidum* 59 diferencia estadísticamente significativa G. applanatum 12 entre las cepas a un nivel de confianza del P. sanguineus 27 95% para definir cuáles cepas fueron L. edodes* 62 significativamente diferentes unas de otras. P. ostreatus 31 *Estadísticamente diferentes a las demás especies en Se realizó una prueba de Tukey a fin de producción de celulasas determinar que tratamientos fueron estadísticamente diferentes. Posteriormente, se realizó el análisis de los residuales de homocedasticidad y de 79
Rastreo en placa de enzimas enzimas ligninolíticas. En las cajas de ABTS ligninolíticas con L. edodes, G. lucidum, C. versicolor y T. trogii se observó un halo de oxidación verde La evaluación del rastreo de ligninasas intenso mayor a 3 cm de diámetro (++) y en (lacasa y LiP) se realizó con un ANOVA a las cajas con azure B, T. trogii y C. una vía, tomando como factor la cepa a 10 versicolor produjeron halos de decoloración niveles y como variable de respuesta la mayores a 3 cm (++). Luego de realizar la formación de los halos. Como resultado del prueba no paramétrica de Kruskal Wallis a ANOVA se obtuvo una valor p < 0,05 todos los datos obtenidos de estas pruebas (0,000), lo que mostró una diferencia cualitativas de rastreo de enzimas estadísticamente significativa entre las ligninolíticas se obtuvo diferencia cepas con un nivel de confianza del 95%. significativa (valor p < 0,05) entre las Para definir cuáles cepas fueron especies de hongos, resultando C. significativamente diferentes unas de otras versicolor y T. trogii como las mejores cepas se realizó una prueba de Tukey a fin de productoras de ligninasas. determinar que tratamientos fueron estadísticamente diferentes. Cuadro 15. Capacidad de oxidación del ABTS o Posteriormente, se realizó el análisis de los decoloración del azure B. Cepa Oxidación Decoloración residuales de homocedasticidad y de del ABTS del azure B normalidad, siempre y cuando la varianza L. edodes ++ - fuera homogénea. En ningún caso los A. delicata + - residuales pasaron ambas pruebas G. frondosa + + (homocedasticidad y normalidad) por lo que S. commune - - se debió realizar la prueba no paramétrica G. applanatum + + G. lucidum ++ + de Kruskal Wallis. Esta prueba arrojó C. versicolor* ++ ++ diferencia significativa con valor p < 0,05 T. trogii* ++ ++ (0,000) e indicó que los mayores P. sanguineus + - productores de enzimas ligninolíticas fueron P. ostreatus + - * T. trogii y C. versicolor. En el Cuadro 2 se Estadísticamente diferentes a las demás especies en producción de ligninasas muestran los resultados obtenidos de los ensayos con ABTS (para detectar lacasa) y Capacidad de degradación de celulosa y azure B (para detectar LiP), donde (-) lignina corresponde a un halo verdoso de oxidación del ABTS o blanquecino de decoloración del De acuerdo con los resultados obtenidos del azure B menor a 1 cm de diámetro, (+) rastreo cualitativo realizado, en las cuatro corresponde a un halo entre 1 y 2,9 cm de cepas con mejor respuesta (L. edodes, C. diámetro, y (++) corresponde a un halo versicolor, G. lucidum y T. trogii) se evaluó mayor a 3 cm de diámetro a los 14 días de la capacidad de degradación de lignina y incubación. De las 10 cepas de hongos, celulosa sobre un sustrato sólido a base de solamente el S. commune dio negativa (-) aserrín de roble durante 30 días de en las tres repeticiones que se realizaron a incubación (Figura 1). A los resultados cada cepa para las dos enzimas rastreadas obtenidos de la degradación de los (lacasa y LiP), lo que implica que para esta componentes de la fibra en forma cepa debe realizarse una serie de pruebas discriminada por cada una de las cuatro adicionales a fin de corroborar su especies de hongos preseleccionadas en comportamiento frente a la producción de 80
las pruebas cualitativas, se les realizó un trabajos realizados por otros investigadores ANOVA a una vía arrojando como en referencia a los hongos basidiomicetos y resultados que hubo diferencia significativa en especial los de pudrición blanca, como en la degradación de lignina con un valor-p potentes degradadores de lignina y celulosa < 0,05 (valor p = 0,0219). El hongo L. [28, 29]. edodes degradó el mayor porcentaje de lignina (51,8%) correspondiente a una Figura 1. Componentes de la fibra en los sustratos disminución de la cantidad de lignina del inoculados a los 30 días de incubación. 29,86% en el sustrato crudo a 14,4% después de 30 días de incubación, seguido de T. trogii el cual a los 30 días de incubación dejó el sustrato con 14,94% de lignina. Asimismo, se realizó una prueba de comparación múltiple entre las cuatro especies de hongos y los datos finales de lignina obtenidos, ratificando que L. edodes fue la especie que degradó la mayor cantidad de lignina en 30 días de incubación con un nivel de significancia del 95%. En el Cuadro 3 se detallan las actividades En referencia a la degradación de celulosa, enzimáticas cuantitativas promedio se encontró que hubo diferencia significativa (endoglucanasa, exoglucanasa, β- (valor–p = 0,0362) entre las cuatro especies glucosidasa, endoxilanasa, lacasa y lignina de hongos preseleccionadas peroxidasa) de los sustratos inoculados con corroborándose con una prueba de las cuatro cepas preseleccionadas a los 30 comparación múltiple a un nivel de días de incubación. C. versicolor y T. trogii significancia del 95%. C. versicolor degradó exhibieron resultados significativamente el mayor porcentaje de celulosa (22%) diferentes de G. lucidum y L. edodes en correspondiente a la disminución en la cuanto a las actividades enzimáticas cantidad de celulosa de 59,56% en el endoglucanasa (valor-p = 2,71×10-5) y sustrato crudo hasta 46,45% en el sustrato exoglucanasa (valor-p = 9,16×10-5) se con 30 días de incubación, seguido de G. refiere, por lo que degradaron el mayor lucidum que redujo el porcentaje de porcentaje de celulosa del sustrato (ver celulosa en el sustrato hasta 46,95%. Sin Figura 1). Sin embargo, respecto a la embargo, dado que todas las cepas actividad de la β-glucosidasa las especies resultaron capaces de degradar porcentajes significativamente diferentes fueron L. importantes de ambos polímeros, cualquiera edodes y C. versicolor con un valor-p = de ellas podría utilizarse en la degradación 0,0144. L. edodes mostró ser el hongo de de materiales lignocelulósicos; máxime mejor desempeño en cuanto a la teniendo en cuenta que los hongos de degradación de lignina del sustrato utilizado pudrición blanca pueden potenciar la acción (ver Figura 1) a pesar de no haberse de degradación de los componentes de la encontrado diferencias significativas en la fibra variando las formulaciones de producción de enzimas ligninolíticas entre sustratos y las condiciones medio las cuatro cepas. No obstante, al analizar ambientales. Los resultados obtenidos en los resultados obtenidos debemos tener en este trabajo tienen concordancia con cuenta que el método de extracción 81
utilizado puede no haber garantizado la AGRADECIMIENTOS extracción de todas las enzimas adsorbidas al sustrato. Los autores agradecen a la Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados de la Cuadro 16. Actividades enzimáticas por gramo de Universidad de Caldas (Colombia) por la sólido seco (sustrato) inoculados con cuatro hongos financiación del presente trabajo y al durante 30 días de incubación. Cepa G. L. C. T. trogii Instituto de Biotecnología Agropecuaria de lucidum edodes versicolor la misma institución por el apoyo material y de infraestructura. Asimismo, los autores Endoglu canasa 3,872 3,371 9,798 10,514 expresan sus agradecimientos a la Facultad Exogluc 5,132 4,469 9,401 8,148 de Ciencias Exactas y Naturales de la anasa Universidad de Buenos Aires (Argentina) β- 1,896 4,436 3,496 4,024 glucosid por su apoyo y asesoría durante la asa realización de este trabajo. Endoxila 29,643 25,924 18,869 26,234 nasa Lacasa 7,050 9,489 8,916 9,478 REFERENCIAS Lignina 0,065 0,011 0,097 0,088 peroxida [1] SÁNCHEZ, O.J. and CARDONA, C.A. sa (LiP) Las actividades enzimáticas están expresadas en Trends in biotechnological production of [UE(µmol/g s.s min)], y la LIP en (U/mL/min) fuel ethanol from different feedstocks. Bioresource Technology, 99, 2008, p. CONCLUSIONES 5270-5295. [2] JOSHI, V.K. and PANDEY, A. A partir del rastreo cualitativo en placa de la Biotechnology. Food fermentation Vol. producción de celulasas y ligninasas en 10 II. New Delhi: Educational Publishers & cepas fúngicas causantes de pudrición Distributors, 1999, 998 p p. blanca, se seleccionaron cuatro hongos: G. [3] CARLILE, M., WATKINSON, S. and lucidum, L. edodes, C. versicolor y T. trogii y GOODAY, G. The fungi. Second ed. se evaluó su capacidad para degradar la London: Academic Press, 2001, 588 p. lignina y la celulosa durante la fermentación p. en estado sólido de aserrín de roble. De los [4] BOMMARIUS, A.S. and RIEBEL, B.R. resultados obtenidos surge que cualquiera Biocatalysis. Atlanta, USA: Wiley-VCH de estas cepas que se utilice con fines de Verlag GmbH & Co. KGaA, 2004, 611 degradación de materiales lignocelulósicos p. p. probablemente será efectiva. Entre ellas, sin [5] SÁNCHEZ, O.J. y CARDONA, C.A. embargo, L. edodes degradó el mayor Producción de Alcohol Carburante: Una porcentaje de lignina (51,8%) al cabo de 30 Alternativa para el Desarrollo días, y C. versicolor el mayor porcentaje de Agroindustrial. Manizales: Universidad celulosa (22%). Lo cual demuestra su Nacional de Colombia, 2007, 386 p. potencialidad en procesos industriales de [6] KOUTINAS, A.A., WANG, R. and producción de enzimas a partir de WEBB, C. Restructuring Upstream materiales lignocelulósicos residuales. Bioprocessing: Technological and Economical Aspects for Production of a Generic Microbial Feedstock From Wheat. Published online in Wiley InterScience, 2004, p. 1-15. 82
[7] WEINBERG, Z.G. Biotechnology in [16] LITTHAUER, D., VAN VUUREN, M.J.,, developing countries: opportunities in VAN TONDER, A. and WOLFAARDT, solid state fermentation applied in the F.W. Purification and kinetics of a agricultural industry. Internation Journal thermostable laccase from Pycnoporus of Biotechnology, 2 (4), 2000, p. 364- sanguineus (SCC 108). Enzyme and 373. Microbial Technology, 40, 2007, p. 563- [8] REDDY, C.A. The potential for white-rot 568. fungi in the treatment of pollutants. [17] ELISASHVILI, V., KACHLISHVILI, E., Current Opinion in Biotechnology, 6, KHARDZIANI, T. and AGATHOS, S.N. 1995, p. 320-328. Effect of aromatic compounds on the [9] POINTING, S.B. Qualitative methods for production of laccase and manganese the determination of lignocellulolytic peroxidase by white-rot basidiomycetes. enzyme production by tropical fungi. Journal of Industrial Microbiology and Fungal Diversity, 2, 1999, p. 17-33. Biotechnology, 37, 2010, p. 1091-1096. [10] KIRK, T.K. and FARREL, R.L. [18] NAZARENO, M.C., BUCSINSZKY, Enzymatic combustion: the microbial A.M.M., TOURNIER, H.A., CABELLO, degradation of lignin. Annual Reviews of M.N. and ARAMBARRI, A.M. Microbiology, 41, 1987, p. 465-505. Extracellular ABTS-oxidizing activity of [11] ÂNGELO, A.S. Enzimas hidrolíticas. En: autochthonous fungal strains from Fungos: Uma Introducâo à biologia, Argentina in solid medium. Revista bioquimica e biotecnologia. Iberoamericana de Micología, 17, 2000, Universidade de Caxias do Sul, 2004, p. p. 64-68. 263-285. [19] MONTENECOURT, B.S. and [12] ARORA, D.S. and SHARMA, R.K. EVELEIGH, D.E. Semiquantitative plate Ligninolytic fungal laccases and their assay for determination of cellulase biotechnological applications. Applied production by Trichoderma viride. Biochemistry and Biotechnology, 160, Applied and environmental 2010, p. 1760-1788. microbiology, 33 (1), 1977, p. 178-183. [13] HUDSON, H. Fungal Biology. Maryland: [20] TAKANO, M., NISHIDA, A., Edward Arnolds Eds, 1986, 298 p. p. NAKAMURA, M. Screening of wood- [14] MONTOYA, S., GALLEGO, J., rotting fungi for kraft pulp bleaching by SUCERQUIA, A., PELAEZ, B., the Poly R decolorization test and BETANCOURT, O. y ARIAS, D. biobleaching of hardwood kraft pulp by Macromicetos observados en bosques Phanerochaete crassa WD 1694. del Departamento de Caldas: su Journal of Wood Science, 47, 2001, p. influencia en el equilibrio y la 63-68. conservación de la biodiversidad. [21] ZHANG, Y.-H.P., HIMMEL, M.E. and Boletín Científico Centro de Museos de MIELENZ, J.R. Outlook for cellulase Historia Naural, 14 (2), 2010, p. 57-76. improvement: Screening and selection [15] ARORA, D.S., CHANDER, M. and strategies. Biotechnology Advances, 24, GILL, P.K. Involvement of lignin 2006, p. 452-481. peroxidase, manganese peroxidase and [22] ARCHIBALD, F. A new assay for lignin- laccase in degradation and selective type peroxidases employing the dye ligninolysis of wheat straw. International Azure B. Applied Environmental Biodeterioration & Biodegradation, 50, Microbiology, 58, 1992, p. 3110-3116. 2002, p. 115-120. 83
[23] THURSTON, C. The structure and ligninases from Phanerochaete function of fungal laccases. chrysosporium Involment of veratryl Microbiology-UK, 140, 1994, p. 19-26. alcohol. Biochemistry Biophysics [24] EGGERT, C., TEMP, U., DEAN, J.F. resources communications, 178, 1991, and ERIKSSON, K.L. A fungal p. 1056-1063. metabolite mediates degradation of [28] BALDRIAN, P. and VALASKOVÁ, V. non-phenolic lignin structures and Degradation of cellulose by synthetic lignin by laccase. FEBS basidiomycetous fungi. FEMS Letters, 391, 1996, p. 144-148. Microbiology Review, 32, 2008, p. 501- [25] LETERME, P. Análisis de alimentos y 521. forrajes. (Protocolos de Laboratorio). [29] MARTÍNEZ-ANAYA, C., BALCÁZAR- Palmira: Universidad Nacional de LÓPEZ, E., DANTÁN-GONZÁLEZ, E. y Colombia, 2010, 66 pp. p. FOLCH-MALLOL, J., L. Celulasas [26] MILLER, G.L. Use of DinitrosaIicyIic fúngicas: Aspectos biológicos y acid reagent for determination of aplicaciones en la industria energética. reducing sugar. Analytical Chemistry, Revista Latinoamericana de 31 (3), 1959, p. 426-428. Microbiología, 50 (3 y 4), 2008, p. 119- [27] PASZCZYNSKI, A. and CRAWFORD, 131. R.L. Degradation of azo compounds by
84
4. Producción de Polisacáridos por Cultivos Sumergido y en Estado Sólido a partir de Diferentes Basidiomicetos
85
Polysaccharide production by submerged and solid state cultures from several basidiomycetes S. Montoya(a), Ó.J. Sánchez(a), L. Levin(b), e-mail: [email protected], Tel/fax: 8781500x15661 (a) Institute of Agricultural Biotechnology, Universidad de Caldas, Calle 65 No. 26-10, Manizales, Colombia (b) Biodiversity and Experimental Biology Department, PRHIDEB-CONICET, FCEN, Ciudad Universitaria, Pabellón II, Piso 4, Laboratorio 8 C1428 GBA, Universidad de Buenos Aires, Argentina
Abstract
Polysaccharides produced by microorganisms represent an industrially unexploited market. An important number of polysaccharides have been isolated from fungi, especially mushrooms, with many interesting biological functions, such as antitumor, hypoglycemic and immuno-stimulating activities. In the search of new sources of fungal polysaccharides, the main goal of this research was to test the ability of several species of basidiomycetes, among them various edible mushrooms, for production of both extracellular (EPS) and intracellular (IPS) polysaccharides. Among 10 species screened for production of EPS in submerged cultures with glucose, soy oil and yeast extract, the best results were obtained with Ganoderma lucidum (0.79 g/L EPS) and Pleurotus ostreatus (0.75 g/L). Agitation strongly improved EPS production in most of the studied strains. Eight out of ten species assayed could successfully developed basidiomes on synthetic “bag-log” cultivation on a substrate consisting of oak sawdust and corn bran. This work describes for the first time the environmental factors required for fruiting under such conditions for four species: Schizophyllum commune, Coriolus versicolor, Ganoderma applanatum and Trametes trogii. IPS were extracted from the carpophores. The content of IPS in the carpophores varied from 1.4% (G. applanatum) up to 5.5% and 6% in G. lucidum and Grifola frondosa, respectively.
Keywords: basidiomycetes, submerged cultivation, solid state fermentation, exopolysaccharides, fructification, endopolysaccharides
1. Introduction
Polysaccharides are industrially used as thickeners, stabilizers and gelling agents in food products. They are also employed as depolluting agents and there is also a growing interest in their biological functions like antitumor, antioxidant or prebiotic activities (Liu et al., 1996b). They are derived from a wide variety of sources: bacterial, fungi, algae and plants. Despite the many sources of polysaccharides, the world market is dominated by polysaccharides from algae and higher plants. Exopolysaccharides (EPS) production from microorganisms, including bacteria, yeasts and moulds, demands shorter periods of time. EPS produced by microorganisms represent an industrially untapped market (Donot et al., 2012). Production of EPS is widely distributed among fungi (Papinutti, 2010). They fulfill different tasks during the growth on natural substrates, such as adhesion to surfaces, immobilization of secreted enzymes, prevention of hyphae from dehydration, and increased residence time of nutrients inside the mucilage (Bolla et al., 2010). Interest has concentrated on polysaccharides produced by mushrooms, because of their various biological and pharmacological activities. These include immunostimulating, antitumor, antibacterial, antiviral, hypocholesterolemic, antioxidant and hypoglycemic activities, vitality and performance enhancement effects and beneficial cosmetic effects on skin (Ooi y Liu, 2000b; Lee et al., 2007a). Mushroom polysaccharides, as lentinan and schizophyllan, among others, are mainly glucans with diferent structures. β-D-glucans are the most common polysaccharides of basidiomycetes having a 86
branched structure, varied degree of substitution, containing β(1→3) linkages in the main chain and additional β(1→6) branch points (Amaral et al., 2008). To obtain bioactive polysaccharides from mushrooms, different authors have cultivated edible or medicinal mushrooms on solid media (for fruiting body production) or in submerged cultures. In addition to EPS excreted into the fermentation broth, mycelial cultures also produce internal polysaccharides localized within the mycelia (endo or intracellular polysaccharides, IPS). Submerged cultures of basidiomycetes can be used to produce polysaccharides in a shorter time, when compared to the production and extraction process of mushroom fruiting bodies. This encouraged many authors to develop a variety of culture media to optimize the production of these polymers (Komura et al., 2010). Most reports have focused on EPS, but not on IPS (Lee et al., 2007a). The IPS can be extracted from fruiting bodies and their mycelia by solid-liquid extraction using heated water or mixtures of organic solvents (Komura et al., 2010). As the demand for fruiting bodies and/or mycelium biomass is constantly increasing, artificial cultivation has become essential. Solid-state cultivation is one way of meeting the rising demand for fungal mycelium and its bioactive metabolites (Švagelj et al., 2008). In the search of new sources of fungal polysaccharides, the main goal of this research was to screen the ability of several species of basidiomycetes for the production of EPS under submerged cultivation and to evaluate the IPS content in the fruiting bodies produced by these fungi under solid-state cultivation.
2. Materials and methods
2.1 Microorganisms
The fungi studied in this work were selected according to their commercial potential and their attributes. Thus, fungi like Grifola frondosa, Lentinula edodes, Ganoderma lucidum and others are becoming better known and their markets are growing because of their active components and usefulness. On the other hand, fungi like Schyzophyllum commune, Ganoderma applanatum and Trametes trogii have been studied by different researchers, which have found that their components are also important for several segments of the industry, although their cultures have not been disseminated. In this way, they represent both scientific and industrial interest. Ten species of basidiomycetes, were screened: Lentinula edodes (CICL54), Schizophyllum commune (UCS004), Trametes trogii (BAFC463), Coriolus versicolor (PSUWC430), Pycnoporus sanguineus (UCS003), Ganoderma applanatum (UCF001), Ganoderma lucidum (UCC002), Grifola frondosa (PSUMCC 922), Pleurotus ostreatus (UCC001) and Auricularia delicata (UCS002). Pure cultures are deposited at Culture Collection of Macrofungi at University of Caldas (Manizales, Colombia). The species were maintained on potato dextrose agar (PDA) at 4°C with periodic transfer.
2.2. Culture medium for production of EPS under submerged fermentation
Inocula consisted of a 50-mm2 surface agar plug from a 10-day-old culture grown on PDA. Cultures were performed in 100 mL Erlenmeyer flasks containing 25 mL of liquid medium. The medium consisted of: 1 g (NH4)2SO4, 1 g KH2PO4, 0,5 g MgSO4.7H2O, 0,1 g CaCl2, 30 g glucose, 14.15 g soy oil, 2 g yeast extract and distilled water up to 1 L. Initial pH of the medium was 5.5. The medium was autoclaved at 121°C for 15 min. Incubation was carried out at 25°C. Static as well as stirring conditions (100 rpm) were assayed. Cultures were harvested after 14 and 21 days. Six replicas of all the experiments were performed.
87
2.3. EPS measurement
Cultures were harvested over time and mycelium was separated from the culture broth by vacuum filtration using a pre-weighed glass microfiber filter (Whatman GF/F, Maidstone, England). To estimate growth, mycelial weight was determined after drying overnight at 80ºC the mycelial mats obtained from filtration. For both water- and alkali-soluble EPS determination, EPS were precipitated from the resulting culture filtrate (0.5 mL mixed with 4 times the volume of ethanol 96%, during 45 min) and then separated by centrifugation at 14000 rpm for 15 min. The insoluble components were re-suspended in 0.5 mL NaOH 1 M at 60 ºC for 1 h. After EPS solubilization, samples of 5-50 µL were taken (proper dilutions in distilled water were done when necessary), the volume was completed to 0.5 mL with distilled water, then 0.5 mL of 5% (w/v) phenol were added and the mixture was shaken thoroughly. Three mL of 98% sulphuric acid were also added and stirred vigorously. The tubes were allowed to stand 30 min at room temperature. A blank test was prepared by substituting the solubilised EPS with distilled water. Total carbohydrates were determined measuring the absorbance at 490 nm (Dubois et al., 1956). The EPS content of supernatants was calculated subtracting the amount of alcohol-insoluble carbohydrates from un-inoculated media. EPS yields were expressed as grams of EPS per litre of culture medium (g/L) and specific yields as milligrams of EPS per gram dry mycelium (mg/g mycelium).
2.4. Fruit body production
Spawn of all the species evaluated with the exception of G. frondosa was prepared on wheat grains (40% moisture content) according to Chang and Miles (Chang y Miles, 2004). G. frondosa was inoculated on corn grains according to Montoya et al. (Montoya et al., 2008b). The substrate consisted of (dry weight basis) 73% oak sawdust (25% moisture content), 23% corn bran (13% moisture content), 2% sucrose and 2% calcium carbonate. The substrates were packed in polypropylene bags and tyndallized. The moisture content was adjusted according to the development requirements of each species L. edodes (55%), S. commune (60%), T. trogii (65%), C. versicolor (60%), G. applanatum (65%), G. lucidum (60%), G. frondosa (58%) and P. ostreatus (70%) (Chang y Quimio, 1982; Jaramillo et al., 1999; Rodríguez, 2003a; Chang y Miles, 2004; Rodríguez y Jaramillo, 2005c; Montoya et al., 2008b; Montoya et al., 2009a). Each bag of 20 cm diameter and 30 cm height contained 1 kg of substrate. One square hole of 2.54 cm2 was made at the top of each bag and covered with a microporous breather strip to allow for gas exchange. The bags containing the substrate were aseptically inoculated with 4% (wet basis) of spawn.
2.5. IPS measurement
Carpophores were dehydrated in a Deni® dehydrator tray, with forced convection of hot air, at a temperature between 55 and 60°C up to 5% moisture content. Subsequently, the dried fruit bodies were milled with a knife mill Tecator® (model Cyclotec 1093) to achieve particles size mesh 180-200. For IPS determination, 1 g of dry powder (5% moisture content) was mixed with 50 mL of 80% (v/v) ethanol, and extracted with an ultrasound-assisted extractor (Elmasonic E Elma®) for 30 min with an ulterior 20 h rest contact between the fungus and the solvent. The extract was filtrated at reduced pressure by using a pre- weighed glass microfiber filter (Whatman GF/F, Maidstone, England) and then centrifuged for 15 min at 14000 rpm. The precipitate was suspended in 1M NaOH solution at 60°C for 1h. Total carbohydrates were determined in this suspension by the phenol-sulfuric method (Dubois et al., 1956).
88
2.6. Statistical analysis of data
To select the best EPS producing species among the evaluated ones, a multifactorial design with 3 factors was performed. The factors were: ten species, incubation day (14 or 21) and stirring conditions (100 rpm or none). The response variable was the total carbohydrate concentration in g EPS/L. The data presented are the average of the results of at least 3 replicates with a standard error of less than 5%. Analysis of variance (ANOVA) and repeated measures analysis were tested by the software Statistica v. 7. The significant differences between treatments were compared by Tukey’s test at 5% level of probability.
3. Results and discussion
3.1. Production of EPS in submerged cultivation
EPS production in submerged cultivation under stirred and static conditions was evaluated after 14 and 21 days of incubation in 10 species of basidiomycetes. Results are summarized in Table 1. The ANOVA showed that the species and incubation conditions influenced EPS production while the incubation time was not a significant factor in their EPS production. Among the species assayed, best results were obtained with G. lucidum at 21 days of incubation under agitation (0.79 g/L of EPS) and P. ostreatus (0.75 g/L) under the same conditions. Tukey’s test indicated that G. lucidum, produced higher EPS concentrations on average than A. delicata, P. sanguineus, L. edodes, S. commune, G. frondosa, T. trogii and G. applanatum, but no significant differences were obtained with P. ostreatus and C. versicolor EPS production. Agitation strongly improved EPS production in most of the studied species. For example, L. edodes and P. ostreatus EPS production at 21 days under static conditions was around 30% of that produced under agitation. Nevertheless, for some of the species tested (T. trogii, G. applanatum, G. frondosa and A. delicata) agitation and incubation time were not significant factors in EPS production. Differences between EPS concentrations obtained under static and agitated conditions in both incubation periods did not exceed 15%. Although the statistical analysis of experimental data showed no significant differences in the incubation period, differences were observed in EPS production in some of the species tracked, as was the case of L. edodes without stirring, which decreased from 0.21 g/L EPS at 14 days of incubation down to 0.08 g/L after 21 days, T. trogii which rendered 0.28 g/L under agitated conditions after 14 days but only 0.16 g/L at 21 days or P. sanguineus whose EPS production increased under static conditions from 0.07 g/L at 14 days up to 0.20 g/L at 21 days. Stirring conditions may affect fungal biomass production, and in turn, EPS production. Maintenance of high dissolved oxygen levels was important for both cell growth and EPS formation in Tremella fuciformis (Cho et al., 2006). However, Park et al. (Park et al., 2002a) reported an inhibitory effect of high aeration rates on EPS production by Cordyceps militaris. Submerged cultures showed different concentrations of EPS varying from 0.22 g/L to 0.79 g/L for A. delicata and G. lucidum, respectively. Nevertheless culture medium and incubation conditions need to be optimized for each strain. Komura et al. (Komura et al., 2010) recently compared EPS production under submerged fermentation in various basidiomycetes and showed that EPS concentrations varied between 0.24 and 0.91 g/L. Kim et al. (Kim et al., 2008b) examined the effect of different synthetic liquid media on EPS production by shake flask cultures of 19 mushrooms. Best EPS production was attained by G. lucidum and Phellinus linteus in potato malt peptone medium, with EPS concentrations of 1.17 and 1.52 g/L, respectively. Remarkably, high values were obtained recently by G. lucidum (15 g/L EPS) in an optimized medium for EPS production under submerged fermentation (Papinutti, 2010). Undoubtedly, the screening results shown in this work can be useful to address research efforts on optimization of culture media for EPS production using different basidiomycetes. 89
Antrodia cinnamomea and G. frondosa exhibited EPS increase that paralleled growth response (Bae et al., 2005; Lin y Sung, 2006). However, C. versicolor and Gloeophyllum trabeum showed an inverse relationship between biomass and EPS production. Thus, low biomass production was associated with high EPS production and vice versa. For this reason, specific EPS yield (mg EPS/g dry mycelium) provides more information on how different culture conditions could influence the EPS enhancement production (Papinutti, 2010). Table 1 also depicts specific EPS yields. The highest specific EPS yield was attained by G. applanatum under static conditions after 21 days (204 mg/g). Specific EPS production compares favorably to previous reports. A maximum of 139 mg EPS/g was obtained by G. lucidum in an optimized medium for EPS production (Papinutti, 2010).
3.2. Basidiome development
For basidiome production of each 8 out of 10 species assayed (L. edodes, S. commune, T. trogii, C. versicolor, G. applanatum, G. lucidum, G. frondosa and P. ostreatus) on synthetic “bag-log” cultivation, several methods were modified and applied in this work (see Table 2). The morphological properties of the carpophores obtained, are depicted in Figure 1 and Table 2. Figure 1 shows the fruit bodies obtained from eight of ten isolates of study and Table 2 describes the details of how the carpophores were obtained. Under the conditions tested neither A. delicata nor P. sanguineus developed basidiomes. Although the environmental factors required for fruiting in synthetic “bag-log” cultivation of some of the species screened in this work have already been described, such as for L. edodes and G. lucidum (Chang y Miles, 2004), G. frondosa (Montoya et al., 2008b) and P. ostreatus (Rodríguez y Jaramillo, 2005c), this work portrays for the first time the conditions required for synthetic “bag-log” basididiome development for four species: S. commune, T. trogii, C. versicolor and G. applanatum (Table 2). As far as we know, only Badcock (Badcock, 1943) described a method for obtaining G. applanatum, Polystictus versicolor (syn. of C. versicolor) and S. commune fructifications (after 11, 7 and 5.5 weeks, respectively) in large tubes filled with a medium consisting of sawdust and various nutrients, and Williams et al. (Williams et al., 1981) obtained morphologically typical fruit bodies of C. versicolor within 8-12 weeks on cut logs of birch or hazel wood, placed with their bases submerged in water in closed horticultural propagators.
3.3. Quantification of IPS in the basidiomes
The fruiting bodies obtained were subsequently subjected to drying and grinding for IPS quantification. Figure 2 shows IPS content (percentage of the basidiome in dry basis). The content of IPS in the carpophores varied from 1.4% (G. applanatum) to 5.5% and 6% of IPS in G. lucidum and G. frondosa, respectively. Up to 4.5% of IPS were extracted by Lee et al. (Lee et al., 2007a) from the mycelium of G. applanatum cultivated under submerged fermentation, 1.3% were obtained from mycelium of G. frondosa grown in liquid cultures (Berovič et al., 2007), and 1.4% from its mycelium grown under solid-state fermentation (Švagelj et al., 2008). Thus the results obtained, show the potential of using some of the basidiomycetes evaluated in this work, in order to obtain significant amounts of IPS from fruiting bodies.
4. Conclusions
This study contributes to expand the knowledge on exopolysaccharides production by basidiomycetes, including scantily studied species. It also demonstrates that solid state basidiome
90
development under synthetic bag-log cultivation could be an alternative biotechnological process for production and isolation of fungal intracellular polysaccharides.
5. Acknowledgements
The authors thank the Vice-Rectorate for Research and Graduate Studies of the Universidad de Caldas (Colombia) for financial and material support. The authors also acknowledge the Universidad de Buenos Aires and CONICET (Argentina) for scientific and material assistance.
91
Table 1. Exopolysaccharides (EPS) production under submerged cultivation in stirred and static conditions aSpecific exopolysaccaharides yield Shake flasks Static conditions Shake flasks Static conditions Species 14 days 14 days 21 days 21 days
EPS Biomass sp EPSa EPS Biomass sp EPS EPS Biomass sp EPS EPS Biomass sp EPS
(g/L) (g/L) (mg/g) (g/L) (g/L) (mg/g) (g/L) (g/L) (mg/g) (g/L) (g/L) (mg/g)
L. edodes 0.19b 1.92 96.35 0.21 1.73 118.50 0.28 3.41 82.35 0.08 2.03 41.38
S. commune 0.16 2.88 56.25 0.13 1.93 68.91 0.33 4.01 79.30 0.16 2.54 64.31
T. trogii 0.28 2.34 120.51 0.25 1.88 134.57 0.16 3.93 41.73 0.18 2.10 84.29
C. versicolor 0.35 2.98 116.11 0.25 2.32 109.05 0.59 4.67 126.12 0.24 2.12 112.74
P. sanguineus 0.24 1.87 128.34 0.07 1.23 56.91 0.19 3.05 61.31 0.20 1.98 100.51
G. lucidum 0.38 2.99 126.76 0.25 1.77 138.42 0.79 4.97 158.72 0.34 2.68 125.37 G. applanatum 0.19 1.76 107.39 0.19 1.02 185.29 0.23 3.56 60.04 0.28 1.35 204.44
G. frondosa 0.17 2.54 65.75 0.17 1.45 120 0.24 4.38 55.71 0.28 3.01 93.36
P. ostreatus 0.48 2.97 160.61 0.19 2.00 96.5 0.75 4.87 154.62 0.24 3.77 64.72
A. delicata 0.15 1.54 98.70 0.13 0.98 131.63 0.22 2.85 78.60 0.19 1.79 107.26 bResults are the mean of six replicas of each experiment
92
Table 2. Development of basidiome on synthetic “bag-log” cultivation by several white rot fungi and environmental conditions applied Species Spawn run (mycelial Primordial formation Fruiting Carpophores’ morphological properties Cultivation growth) development obtained in this work methodology adapted from: Thermal shock at 8°C for 24 hs, 25-28°C, darkness, 18% O , 2.5% CO , Pileus 8-10 cm diameter, scaly, brown, with 14.5% O , 5.5% CO , darkness; 7 2 2 Chang & Miles L. edodes 14.5% O , 5.5% CO , 2 2 18-20°C, 800 luxes, well formed lamellae beige, stipe 5cm long, 1 2 2 days at 18-22°C, 800 luxes, 80% (2004) 60% RH, 50 days 80-85% RH, 7 days cm in diameter RH 18-20°C, 18% O , 18-20°C, 18% O , 2.5% CO , 2 25-30°C, darkness, 60% 2 2 2.5% CO , 700-1000 Fan-shaped pileus grayish-white, with white Method developed S. commune 700-1000 luxes, 80-85% RH, 5 2 RH, 20 days luxes, 80-85% RH, 7 lamellae, without stem, in clusters in this work days days 18-20°C, 18% O , Shelf-type pileus whitish yellow to honey, 25-30°C, darkness, 11% 18-20°C, 18% O , 2.5% CO , 2 2 2 2.5% CO , 400-500 corrugated and continues as vertical blinds, all Method developed T. trogii CO , 9.5% O , 60% RH, 400-500 luxes, 70-80% RH, 25 2 2 2 luxes, 70-80% RH, 7 around the substrate block. in this work 30 days days days 18-20°C, 18% O , Shelf-type pileus 4-6 cm wide showing typical 25-30°C, 17.2% O , 7.3% 18-20°C, 18% O , 2.5% CO , 2 2 2 2 2.5% CO , 500-800 concentric zones of different colors light tan, Method developed C. versicolor CO darkness, 60% RH, 500-800 luxes, 70-80% RH, 20 2 2 luxes, 70-80% RH, 14 yellow to brown, individuals around the side of in this work 30 days days days the substrate block 18-20°C, 18% O , 27-30°C, darkness, 11% 18-20°C, 18% O , 2.5% CO , 2 Pileus 8-12 cm of diameter, shelf-type, light 2 2 2.5% CO , 500-700 Chang & Miles G. lucidum CO , 9.5% O , 60% RH, 500-700 luxes, 70-75% RH, 40- 2 yellow to red, with stipe 1-3 cm long, clustered 2 2 luxes, 70-80% RH, 15 (2004) 35 days 50 days especially at the top of the substrate block days 18-20°C, 18% O , 27-30°C, darkness, 8% 18-20°C, 18% O , 2.5% CO , 2 Pileus 4-7 cm de diámeter, shelf-type, beige to 2 2 2.5% CO ,300-500 Method developed G. applanatum CO , 12.5% O , 60% RH, 300-500 luxes, 70% RH, 45-60 2 dark brown, significant stipe, formed at the top 2 2 luxes, 70-80% RH, in this work 25 days days and around the substrate block 15 days Thermal shock at 10°C for 24 hs 16-18°C, 19,5% O , Pileus elongated, brown-dark gray to light 25°C, shadow, 14.5% O , 2 2 16-18°C, 19.5% O , 0.7% CO , 0,7% CO , 100-500 beige, mature fruiting clusters with overlapping Montoya et al. G. frondosa 5,5% CO , 60% RH, 75 2 2 2 2 100-500 luxes, 70-80% RH, 7 luxes, 70-80% RH, 7 petals (caps and lateral stems) extending (2008a) days days days outward resembling a cluster flower. 18-20°C, 18% O , Rodríguez & 27-30°C, darkness, 9% 2 18-20°C, 18% O , 2.5% CO , 2.5% CO , 700-1000 Pileus 7-10 cm of diameter, oyster-shaped, Jaramillo (2005b); P. ostreatus CO , 11.5% O , 60% RH, 2 2 2 2 2 700-1000 luxes, 90% RH, 5 days luxes, 90-95% RH, 7 purplish to light beige, stipe 1-3 cm, gregarious. Montoya et al. 15 days days (2009b) RH: relative humidity
93
References
1. Liu F, Fung MC, V.E.C. O, Chang ST. Induction in the mouse of gene expression of immunomodulating cytokines by mushroom polysaccharide-protein complexes. Life Sci 1996;58(1):795-803. 2. Donot F, Fontana A, Baccou J, Schorr-Galindo S. Microbial exopolysaccharides: Main examples of synthesis, excretion, genetics and extraction. Carbohydr Polym 2012;87:951- 62. 3. Papinutti L. Effects of nutrients, pH and water potential on exopolysaccharides production by a fungal strain belonging to Ganoderma lucidum complex. Bioresour Technol 2010;101:1941-6. 4. Bolla K, Gopinath B, Shaheen S, Charya M. Optimization of carbon and nitrogen sources of submerged culture process for the production of mycelial biomass and exopolysaccharides by Trametes versicolor. Int J Biotechnol Mol Biol Res 2010;1:15-21. 5. Lee WY, Park Y, Ahn JK, Ka KH, Park SY. Factors influencing the production of endopolysaccharide and exopolysaccharide from Ganoderma applanatum. Enzyme Microb Technol 2007;40 249-54. 6. Ooi V, Liu F. Immunomodulation and anti-cancer activity of polysaccharide-protein complexes. Curr Med Chem 2000;7:715-28. 7. Amaral A, Carbonero E, Simao R, Kadowaki M, Sassaki G, Osaku C, Gorin, PAJ Lacomini, M. An unusual water-soluble B-glucan from the basidiocarp of the fungus Ganoderma resinaceum. Carbohydr Polym 2008;72:473-8. 8. Komura DL, Ruthers AC, Carbonero ER, Alquini G, Rosa MC, Sassaki GL, et al. The origin of mannans found in submerged culture of basidiomycetes. Carbohydr Polym 2010;79:1052-6. 9. Švagelj M, Berovič M, Boh B, Menard A, Simčič S, Wraber B. Solid-state cultivation of Grifola frondosa (Dicks: Fr) S.F. Gray biomass and immunostimulatory effects of fungal intra- and extracellular β-polysaccharides. New Biotechnol 2008;25:150-6. 10. Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal Chem Eng J 1956;28(3):350-6. 11. Chang ST, Miles PG. Mushrooms Cultivation, Nutritional Value, Medicinal effect, and Enviromental Impact. Second ed. New York: CRC Press; 2004. 12. Montoya BS, Varon LM, Levin L. Effect of culture parameter on the production of the edible mushroom Grifola frondosa (maitake) in tropical weathers. World J Microbiol Biotechnol 2008;24:1361-6. 13. Chang ST, Quimio TH. Tropical Mushrooms: Biological Nature and Cultivation Methods. T.H. QE, editor. Hong Kong: Chinese University Press; 1982. 14. Jaramillo C, Rodriguez N, Gómez FA. Cultivo de hongos tropicales sobre residuos agroindustriales presentes en la zona cafetera. Informe final experimento QIN-09-23 (Cultivation of tropical mushrooms on agri-industrial wastes present in coffee-growing region. Final report of experiment QIN-09-23, in Spanish). Chinchiná, Colombia: Cenicafé; 1999. p. 44. 15. Rodríguez N. Aprovechamiento de los residuos sólidos generados en el cultivo e industrialización del café para la producción de hongos comestibles y medicinales (Utilization of solid wastes generated during the cultivation and industrialization of coffee for production of edible and medicinal mushrooms, in Spanish) [Ph.D. Thesis]. Valencia: Universidad Politécnica de Valencia; 2003. 16. Rodríguez N, Jaramillo C. Cultivo de hongos comestibles del género Pleurotus sobre residuos agrícolas de la zona cafetera. Bol Téc Cenicafé 2005;23:34-40. 17. Montoya SB, Restrepo GM, Tabarez LA. Rendimientos en el cultivo de los hongos Pleurotus ostreatus. Rev Inv UCM 2009;14:16-26. 18. Cho EJ, Oh JY, Chang HY, Yun JW. Production of exopolysaccharides by submerged mycelial culture of a mushroom Tremella fuciformis. J Biotechnol 2006;127:129-40. 19. Park J-P, Kim S-W, Hwang H-J, Cho Y-J, Yun J-W. Stimulatory effect of plant oils and fatty acids on the exo-biopolymer production in Cordyceps militaris. Enzyme Microb Technol 2002;31:250-5.
94
20. Kim TH, Taylor F, Hicks KB. Bioethanol production from barley hull using SAA (soaking in aqueous ammonia) pretreatment. Bioresour Technol 2008;99:5694-702. 21. Bae J, Sim J, Lee B, Pyo H, Choe T, Yun J. Production of exopolysaccharide from mycelial culture of Grifola frondosa and its inhibitory effect on matrix metalloproteinase-1 expression in UV- irradiated human dermal fibroblasts. FEMS Microbiol Lett 2005;251:347-54. 22. Lin E, Sung S. Cultivating conditions influence exopolysaccharide production by the edible Basidiomycete Antrodia cinnamomea in submerged culture. Int J Food Microbiol 2006;108:182-7. 23. Badcock E. Methods for obtaining fructifications of wood-rotting fungi in culture. Trans Br Mycol Soc 1943;26:127-32. 24. Williams E, Todd N, Rayner A. Propagation and development of fruit bodies of Coriolus versicolor. Trans Br Mycol Soc 1981;77:409-14. 25. Berovič M, Boh B, Wraber B, Pohleven F. Production of intra- and extracellular polysaccharides of Grifola frondosa by solid state and submerged fermentation. Int J Med Mushrooms 2007;9:193-4. 26. Montoya BS, Varon LM, Levin L. Effect of culture parameter on the production of the edible mushroom Grifola frondosa (maitake) in tropical weathers. World J Microbiol Biotechnol 2008;24:1361-6. 27. Rodríguez N, Jaramillo C. Cultivo de hongos comestibles del género Pleurotus spp. sobre residuos agrícolas de la zona cafetera. Boletín Técnico Cenicafé 2005;27:54 pp. 28. Montoya SB, Restrepo GMF, Tabarez LAL. Rendimientos en el cultivo de los hongos Pleurotus ostreatus. Revista de Investigaciones Universidad Católica de Manizales 2009;14:16-26.
Fig. 1. Fruiting body development under the conditions assayed in this work. (a) Grifola frondosa, (b) Lentinus edodes, (c) Coriolus versicolor, (d) Ganoderma lucidum, (e) Schizophyllum commune, (f) Pleurotus ostreatus, (g) Ganoderma applanatum, (h) Trametes trogii.
95
Fig. 2. Content of intracellular polysaccharides (IPS) in the carpophores (percentage in dry basis).
96
5. Selección de la Mejor Combinación Hongo – Formulación para la Degradación de Sustratos Lignocelulósicos mediante Fermentación en Estado Sólido con Pleurotus ostreatus, Coriolus versicolor y Lentinus edodes
97
Selección de la Mejor Combinación Hongo – Formulación para la Degradación de Sustratos Lignocelulósicos mediante Fermentación en Estado Sólido con Pleurotus ostreatus, Coriolus versicolor y Lentinus edodes
Sandra Montoya1, Óscar Julián Sánchez2*, Laura Levin3
RESUMEN
En esta investigación se realizó el cultivaron de tres especies de hongos de pudrición blanca: Coriolus versicolor, Pleurotus ostreatus y Lentinus edodes sobre doce formulaciones de sustrato en estado sólido empleando mezclas de diversos los materiales y sales carbonato de calcio y dos niveles de sulfato de cobre (II). Los objetivos de este trabajo fueron i) evaluar los efectos de la relación C/N y del sulfato de cobre (II) sobre las actividades enzimáticas endoglucanasa, exoglucanasa, endoxilanasa, β-glucosidasa, lacasa y manganeso peroxidasa (MnP) durante 49 días de fermentación en estado sólido; así como el consumo de celulosa y hemicelulosa y la degradación de lignina y ii) proponer un modelo matemático para la descripción de la producción de biomasa, de las enzimas lignocelulolíticas, producción y consumo de azúcares reductores, consumo de celulosa y hemicelulosa y degradación de lignina. Las tres especies de hongos crecieron bien sobre todas las formulaciones de sustrato y se obtuvo respuesta en la medida de los títulos de todas las actividades enzimáticas por combinación especie – fórmula. C. versicolor presentó la mayor capacidad de degradación de lignina, celulosa y hemicelulosa para todas las combinaciones, con 65% como la máxima degradación de lignina para F1 y 43% de degradación de celulosa sobre F9. Se propuso un modelo matemático compuesto de 11 ecuaciones diferenciales a fin de buscar la descripción de los datos experimentales de todas las combinaciones resultantes para el C. versicolor, por haber sido el hongo que mayor capacidad de degradación de los sustratos lignocelulósdicos mostró. En este trabajo se presentan los resultados del modelamiento para la combinación especie de hongo fórmula (F9) de mejor comportamiento respecto a la degradación de los sustratos basados en materiales lignocelulósicos.
Palabras clave: hongos de pudrición blanca, relación C/N, actividades lignocelulolíticas, degradación de materiales lignocelulósicos.
1. INTRODUCCIÓN
Los hongos de pudrición blanca son hasta ahora los únicos organismos capaces de degradar completamente todos los componentes de los materiales lignocelulósicos gracias a las enzimas lignocelulolíticas que producen (Kirk y Farrel, 1987b). En general las enzimas degradadoras de polisacáridos están sujetas a mecanismos de regulación de su síntesis. Es decir no se producen de modo constante, sino que su síntesis es inducida por el sustrato adecuado y es reprimida por azúcares fácilmente utilizables, en particular glucosa. El inductor más eficiente es el polímero-sustrato de las enzimas que serán sintetizadas. Sin embargo, debido a su alto peso molecular, no son compuestos que puedan penetrar en las células y ejercer su efecto (Béguin y Aubert, 1994). Algunas de las enzimas extracelulares que se producen por los hongos son solubles y se encuentran libremente dispersas en la película de líquido que rodea la hifa, pero otras están fijas en el espacio sujetas a la pared de la hifa, a la matriz extracelular o al propio sustrato (Hudson, 1986a). La producción de enzimas por hongos como Pleurotus ostreatus, Coriolus versicolor y Lentinus edodes puede depender de diversos factores como las condiciones microambientales y nutricionales en el sustrato que afecta la velocidad de crecimiento de cada una de las especies (Gutierrez-Correa y Tengerdy, 1997; Carabajal et al., 2012). La biodegradación de la celulosa es un proceso sinérgico que implica en primera instancia las endoglucanasas y exocelobiohidrolasas, las cuales atacan las estructuras amorfa y cristalina de la celulosa produciendo celotriosas y celobiosas que posteriormente son degradadas hasta
98 glucosa por la β-glucosidasa. La hidrólisis del xilano requiere principalmente de la acción de la endoxilanasa y la β-xilosidasa, aunque para degradar completamente el xilano se requiere la acción de otras enzimas para hidrolizar los xilanos sustituidos (Levin et al., 2008; Montoya et al., 2011a). La lignina es degradada por la interacción de diversas enzimas extracelulares, principalmente fenoloxidasas (lacasas) y peroxidasas (manganeso-peroxidasa (MnP) y lignina peroxidasa) (Martínez et al., 2005). Los basidiomicetos de pudrición blanca se destacan por la producción de enzimas celulasas, xilanasas, lacasas y MnP en procesos de fermentaciones en estado sólido utilizando sustratos lignocelulósicos. Se han reportado perfiles de producción de enzimas lignocelulolíticas durante los ciclos de vida de cepas comerciales de Grifola frondosa, P. ostreatus y L. edodes en fermentaciones en estado sólido mostrándose que las actividades de las lacasas y MnP fueron altas al final de la fase de colonización y declinaron rápidamente en las fases reproductivas. En contraste, las actividades enzimáticas de celulasas y xilanasas se evidenciaron de manera medianamente estables durante la colonización para incrementarse durante la fase reproductiva (Asatiani et al., 2008; Montoya et al., 2011a). En el caso de los hongos de pudrición blanca cuando se cultivan en medios de composición ligeramente diferente, se sintetizan diversas formas de una misma enzima (isoenzimas) que a pesar de poseer propiedades catalíticas similares, difieren notablemente en sus características físico-químicas, por lo que se deduce que hay formas múltiples que coexisten en determinado momento; también puede variar la proporción de estas isoenzimas a lo largo del desarrollo del hongo (Carlile et al., 2001). La síntesis de isoenzimas puede deberse a productos de genes diferentes, aunque también pueden deberse a cambios postraduccionales como proteólisis, glicosilación o agregados cuaternarios. Se pueden sintetizar como consecuencia de estados fisiológicos diferentes (composición del medio de cultivo, pH, temperatura, etc.) a partir de genes regulados diferencialmente (Joselau y Ruel, 1994; Blanchette, 1995; Barr et al., 1996; Carlile et al., 2001). Reviste especial interés el modelamiento de la cinética de cultivo de los hongos de pudrición blanca. Se han empleado varias expresiones matemáticas para la descripción de la producción de diversas biosustancias utilizando hongos en procesos de fermentación. Los modelos más reportados son el modelo lineal, logístico y, más recientemente, de dos fases (aceleración y desaceleración) (Sangsurasak et al., 1996), aunque estos modelos no incluyen el efecto de la concentración de nutrientes sobre el desarrollo (Ikasari y Mitchell, 2000; Mitchell et al., 2004; Van de Lagemaat y Pyle, 2005). Asimismo, para la descripción de la producción de biomasa en diversos tipos de procesos de fermentación se utilizan las expresiones tipo Monod y Logística modificada (Mitchell et al., 2004; Tavares et al., 2005). Las expresiones matemáticas utilizadas para la descripción de la formación de productos dependen de qué clase de metabolito se esté produciendo; generalmente, las expresiones más simples son para los metabolitos primarios, ya que su formación se considera diractamente proporcional a la formación de la biomasa celular teniéndose en cuenta los parámetros de matenimiento celular y crecimiento microbiano. En el caso de los productos intermedios del metabolismo primario y productos del metabolismo secundario, la descripción de su cinética de formación es más compleja que para los metabolitos secundarios; no existen hasta el momento expresiones simples bien definidas que abarquen a todas las sustancias pertenecientes a estos grupos. Actualmente no hay modelos matemáticos disponibles que permitan describir la producción de biosustancias de hongos macromicetos, ni su crecimiento. Esta dificultad se debe, probablemente, a que cada uno de estos hongos se ve afectado directamente por factores intrínsecos y extrínsecos particulares como las características físicas y la composición química de los medios de cultivo, la procedencia de las cepas, la influencia de las condiciones ambientales y el crecimiento lento asociado a la gran mayoría de las especies de macromicetos en comparación con el tiempo de crecimiento de los micromicetos. Asimismo, para el análisis de la formación de productos en procesos de fermentación en estado sólido es necesario conocer varias de las sustancias que se forman durante el crecimiento y desarrollo del organismo a fin de comprender el mecanismo de producción de las sustancias de interés y lograr plantear expresiones matemáticas que permitan la descripción y escalamiento de su proceso productivo. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la relación carbono nitrógeno y del sulfato de cobre (II) sobre la producción de enzimas lignocelulolíticas por tres especies de hongos de pudrición
99 blanca (L. edodes, C. versicolor y P. ostreatus) empleando doce formulaciones diferentes de sustratos lignocelulósicos. Estos hongos fueron seleccionados de entre diez hongos de pudrición blanca mediante un rastreo basado en sus actividades enzimáticas celulolíticas, xilanolíticas y ligninolíticas, así como en su capacidad de degradación de celulosa y lignina; los resultados de este rastreo se relacionan en el artículo anterior. Igualmente este trabajo tuvo como objetivo adicional proponer y validar un modelo matemático para la mejor combinación hallada especie de hongo - formulación a fin de realizar la descripción de la cinética de crecimiento del organismo, la degradación de los materiales lignocelulósicos y la producción de las enzimas lignocelulolíticas en condiciones de fermentación en estado sólido.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Microorganismos
Tres especies de basidiomicetos fueron empleados para la producción de enzimas lignocelulolíticas en fermentación en estado sólido, tomadas de la colección de hongos de la Universidad de Caldas (Manizales, Colombia): Lentinula edodes del Centro de Investigaciones del Café, Chinchiná, Caldas, Colombia (CICL54), Coriolus versicolor de Pennsylvania State University, Estados Unidos de Norte América (PSUWC430), y Pleurotus ostreatus de la Colección interna de la Universidad de Caldas (UCC001). Las cepas fueron extendidas sobre agar papa dextrosa (PDA) y mantenidas en refrigeración a 4°C y transferencias periódicas.
2.2. Producción de semilla
La semilla para la inoculación de los medios de cultivo sólidos se realizó sobre trigo lavado, hidratado con agua caliente hasta 40% de humedad. El trigo hidratado fue empacado en unidades de 1 kg en bolsas de polipropileno biorientado, provistas con un filtro de interlón en el primer tercio de la parte superior de la bolsa de una pulgada de lado. Posteriormente, el grano fue esterilizado a 121°C por 30 minutos aplicando el método Thindal. Finalmente el grano hidratado y esterilizado fue inoculado a una tasa del 4% en base húmeda con cada especie de hongo en cabina de flujo laminar y llevadas a incubación por 12 a 15 días a 25°C y penumbra hasta colonización completa.
2.3. Medios de cultivo
Se realizaron doce formulaciones de sustrato por triplicado. Los sustratos fueron formulados en base seca, con 40% de aserrín de roble, 20% de capacho de coco y 2% de aceite de soya como materias primas fijas en todas las formulaciones y variando los porcentajes de cascarilla de café y salvado de maíz a fin de modificar la relación carbono nitrógeno (R C/N) (ver Tabla 1) y dos niveles de sulfato de cobre: 0,1596% para las fórmulas impares y 0,0798% para las fórmulas pares. Todos los sustratos fueron formulados a 60% de humedad. Los sustratos fueron empacados en bolsas de polipropileno biorientado en unidades de 200 g cada una y esterilizados a 121°C por 30 min aplicando el método Thindal. Posteriormente fueron inoculados en cabina de flujo laminar con 4% de inóculo en base húmeda respecto al sustrato. Éstos fueron llevados a incubación a 25°C en penumbra por 49 días. Se tomaron 15 muestras, dos por semana, tomándose la primera muestra el día de la inoculación.
Tabla 1. Relaciones carbono nitrógeno (R C/N) en doce niveles (formulaciones) F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12
142,640 91,77 114,61 93,64 100,92 91,79 85,34 84,87 55,11 51,55 114,55 111,05
100
2.4. Determinación de la relación carbono nitrógeno
La relación carbono nitrógeno (C/N) fue determinada a partir de la medida de la materia orgánica de las doce formulaciones de sustratos empleando el método de Walkley y Black (1934), el cual utiliza ácido sulfúrico concentrado y solución de dicromato de potasio. La muestra se lee a 585 nm. La cantidad de carbono total corresponde al 58% de la materia orgánica. El nitrógeno orgánico total fue determinado por el método de Kjeldahl (Kjeldahl, 1883).
2.5. Determinación cuantitativa de actividades enzimáticas
Los extractos para la determinación de las actividades enzimáticas (celulolíticas y ligninolíticas) fueron obtenidos de 1 g de sustrato fresco en 12 mL de agua destilada estéril neutra sometido a ultrasonido por 5 minutos y agitación por 10 minutos con posterior filtración y centrifugación.
2.5.2. Actividades celulolíticas y xilanolíticas
Endo-1,4-ß-D-glucanasa (E.C.3.2.1.4). Se usó carboximetil celulosa (CMC) como sustrato al 0,5% en buffer acetato de sodio pH 4,8 en reacción con 100 µL de extracto enzimático por 30 minutos a 50°C. La reacción se detuvo adicionando el reactivo DNS (ácido dinitrosalicílico) (Miller, 1959). Se continuó con la reacción de DNS para la determinación de azúcares reductores, se leyó la absorbancia a longitud de onda 540 nm. Una unidad de actividad enzimática (UE) fue definida como la cantidad de enzima que produce 1 µmol de azúcares reductores en un minuto. Para cuantificar la actividad se elaboró una curva patrón de azúcares reductores, con distintas cantidades de glucosa. Exo-1,4-ß-D-glucanasa (E.C.3.2.1.91). Se usó celulosa cristalina 1% en buffer acetato de sodio pH 4,8 como sustrato, en reacción con 100 µL de extracto enzimático a 50°C por 60 minutos y agitación. La reacción se detuvo adicionando el reactivo DNS. Se continuó la reacción de azúcares reductores por el método DNS y se centrifugó antes de leer la absorbancia a longitud de onda 540 nm. Una unidad de actividad enzimática (UE) fue definida como la cantidad de enzima que produce 1 µmol de azúcares reductores en un minuto. β-glucosidasa (E.C.3.2.1.21). La reacción se produce entre el sustrato de p-nitrofenil β-D- glucopiranosido 0,02% en buffer acetato de sodio pH 4,8 con 100 µL de extracto enzimático a 50°C por 30 minutos. La reacción se detuvo adicionando solución buffer Clark y Lubs (pH 9,8) y se leyó la absorbancia a longitud de onda 430 nm (ε430=18,5/mM cm) (Wood and Bhat, 1988). Una unidad de actividad enzimática (UE) fue definida como la cantidad de enzima que produce 1 µmol de producto (p- nitrofenol) en un minuto. Para cuantificar la actividad se confeccionó una curva patrón con p-nitrofenol. Endo-1,4-ß-D-xilanasa (E.C.3.2.1.8). La reacción se produce entre el sustrato xilano al 0,2% en buffer acetato de sodio pH 4,8 con 100 µL de extracto enzimático a 50°C por 30 minutos. La reacción se detuvo adicionando DNS y se leyó la absorbancia a longitud de onda 540 nm. Una unidad de actividad enzimática (UE) fue definida como la producción de 1 µmol de azúcares reductores en un minuto. La curva patrón de azúcares reductores se confeccionó en este caso con xilosa.
2.5.3. Actividades ligninolíticas
Lacasa (E.C.1.10.3.2): Se utilizaron 0,5 mM de ABTS en solución 0,1M de buffer acetato de sodio pH 3,6 como sustrato, según método de Paszczynski and Crawford (1991), leyendo el aumento de absorbancia a 420 nm (ε420=36/mM cm) luego de tres minutos de reacción a 30°C. Una unidad de actividad lacasa (UE) fue definida como la cantidad de enzima requerida para oxidar 1 μmol de ABTS en 1 minuto. Manganeso peroxidasa (E.C.1.11.1.13) (MnP): Se utilizó como sustrato una solución 0,01% de rojo fenol en buffer succinato de sodio 0,1 M y pH 4,5 y sulfato de manganeso (0,22 g/L), con peróxido de hidrógeno 0,2 mM como iniciador de la reacción. La reacción fue detenida adicionando NaOH 5N
101 después de 10 minutos de reacción para leer el incremento de absorbancia a 610 nm (ε610=22/mM cm). Una unidad de actividad enzimática (UE) fue definida como la cantidad de enzima necesaria para oxidar 1 μmol de rojo fenol en 1 minuto (Paszczczynski et al., 1988).
2.6. Cuantificación del contenido de N-acetil-D-glucosamina (NAGA) y biomasa
Las muestras de sustrato fueron colectadas en 15 tiempos de incubación, dos por semana, hasta el día 49 de incubación para las tres especies de trabajo. El sustrato sólido incubado a diferentes tiempos fue secado en estufa a 101°C hasta peso constante, molido y almacenado en lugar fresco y seco para la determinación del contenido de quitina. El contenido de biomasa fúngica en los sustratos sólidos fue indirectamente estimado por la determinación del contenido de N-acetil-D-glucosamina (NAGA) después de la hidrólisis con HCl 6N grado analítico según el método de Plassard et al. (1982). Para ello se cuantificó paralelamente el contenido de NAGA por gr de micelio en cada una de las tres especies, cultivándolas en medio líquido. El contenido de NAGA del micelio de cada una de las especies de hongos de trabajo: C. versicolor, P. ostreatus y L. edodes fue determinado del desarrollo del micelio en medio líquido en matraces de 250 mL con 100 mL de medio de cultivo con la siguiente composición: glucosa (30 g/L), extracto de levadura (6 g/L), SO4Mg.5H2O (0,5 g/L), K2HPO4 (0,5 g/L) y CaCl2 (0,1 g/L). El tiempo de fermentación para el crecimiento del hongo fue de 25 días y sometidos a 100 rpm de agitación. Los compuestos solubles en agua fueron extraídos durante la hidrólisis con HCl 6N por tres horas.
2.7. Cuantificación de los componentes de la fibra y azúcares reductores
Se determinaron los componentes de la fibra (celulosa, hemicelulosa y lignina) de los sustratos de cada unad e las formulaciones en 15 tiempos durante los 49 días de incubación, así como la fracción soluble, empleando los resultados de la determinación de fibras detergente neutra, ácida y lignino-ácida. La medición se realizó a una muestra seca y molida de sustrato; dicha muestra se sometió a tres hidrólisis en serie (cada una de 75 min): i) hidrólisis con lauril sulfato de sodio y otros, ii) hidrólisis en solución de bromuro de amonio en ácido sulfúrico 1N, y iii) hidrólisis con ácido sulfúrico al 72% (p/v). Al finalizar cada hidrólisis, las muestras fueron lavadas y secadas a 105°C hasta peso constante (Leterme, 2010a). El contenido de azúcares reductores como glucosa fue determinado por el método del ácido dinitrosalicílico (DNS) (Miller, 1959).
2.7. Diseño experimental
Se planteó un diseño experimental bifactorial con la especie a tres niveles y doce formulaciones de sustrato. Las formulaciones varían en su relación C/N y la concentración de sulfato de cobre (II). Las variables independientes en este diseño experimental fueron la especie de hongo, la formulación del sustrato y el tiempo de fermentación. Las variables de respuesta medidas fueron las actividades enzimáticas: endoglucanasa, Exoglucanasa, β-glucosidasa, lacasa, manganeso peroxidasa y endoxilanasa a fin de buscar la mejor combinación especie de hongo fórmula para la producción de celulasas y de ligninasas en términos de la capacidad de degradación de los componentes de la fibra, celulosa, hemicelulosa y lignina en 15 tiempos durante 49 días de fermentación.
2.6. Modelamiento matemático del crecimiento del hongo y la producción de enzimas
Para la solución de los modelos matemáticos del proceso de fermentación en estado sólido se utilizó el software Matlab® 2010b (MathWorks, EUA) en un PC de 3 GB de memoria RAM y un procesador Intel CORE-i3 de 2,13 GHz. Para los modelos matemáticos planteados en ecuaciones diferenciales ordinarias se utilizó el comando ode45 que está basado en una fórmula explícita de Runge- Kutta (4,5) usando un par de Dormand-Prince (Dormand y Prince, 1980) y el comando ode15s basado en una fórmula de orden variable que funciona mediante fórmulas de diferenciación numérica.
102
2.8. Análisis estadístico
Para todos los análisis estadísticos del presente trabajo se utilizó el software Matlab ® 2010b. Este análisis se realizó en tres etapas. Primero se realizó un ANOVA a todos los datos del diseño experimental y sus posibles combinaciones: especie, fórmula y tiempo de fermentación mediante el comando anovan. Luego se realizó un análisis comparativo (Kruskal Wallis) de la capacidad de degradación de celulosa, hemicelulosa y lignina para cada especie de hongo estudiado y las doce formulaciones de sustratos mediante los comandos kruskalwallis y multcompare. A los máximos obtenidos de cada especie se les realizó un nuevo análisis comparativo a fin de encontrar la combinación de mejor desempeño con los porcentajes de degradación de la fibra al final del período de fermentación (49 días) mediante los comandos kruskalwallis y multcompare. Para evaluar si el modelo matemático propuesto describe adecuadamente los datos experimentales, se realizó una prueba F de una cola que parte de las siguientes hipótesis:
S 2 residuales, Fi H0 :12 Sdatosexp, F i S 2 H :1residuales, Fi 1 S 2 datosexp, Fi
2 Donde: Fi está dado para i = 1,2,…,12, s residuales es la varianza de los residuales (desviaciones de los datos experimentales con respecto a los valores calculados por el modelo matemático) y se calcula para cada 2 variable de respuesta medida y s datos exp es la varianza de la serie experimental de cada variable de respuesta medida. Para estos análisis se utilizaron los comandos vartest y vartest2 de Matlab. Con las varianzas de los residuales obtenidos para cada serie experimental se calcularon los porcentajes de cada una respecto a la serie que dio la mayor varianza de residuales a fin de mostrar el ajuste de los datos experimentales al modelo matemático propuesto de forma más simple.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. Efecto de la relación C/N sobre la degradación de los residuos lignocelulósicos y la producción de enzimas lignocelulolíticas
Las tres especies de hongos (C. versicolor, P. ostreatus y L. edodes) probadas en el diseño experimental, fueron inoculadas e incubadas bajo las mismas condiciones ambientales en las doce formulaciones de sustrato. El intervalo de la relación C/N en las doce formulaciones de sustrato evaluadas fue de 50 a 140 con una variación en los contenidos de nitrógeno de 0,29 a 0,8% en base seca. Las tres especies de hongos se desarrollaron bien en todas las formulaciones evaluadas y produjeron actividades enzimáticas significativas en todas las relaciones C/N durante los 49 días de incubación, como se observa en la Tabla 2. Todos los contenidos de nitrógeno de las formulaciones estimularon el crecimiento de los macromicetos de trabajo durante la fase vegetativa, incrementando el contenido de biomasa (ver Figuras 1 y 2) en todos los casos desde el inicio de la fase de incubación. Empero se debe tener en cuenta que la variación del contenido de nitrógeno y de la fuente de carbono se garantizó empleando los mismos materiales y no modificando las fuentes de nitrógeno y de carbono. Sin embargo, sí hubo variabilidad sobre las actividades enzimáticas medidas (endoglucanasa, exoglucanasa, β-glucosidasa, endoxilanasa, lacasa y MnP), dependiendo de la especie y a diferentes tiempos de incubación como se observa en la Tabla 2. Las actividades enzimáticas máximas fueron seleccionadas realizando análisis estadístico por etapas. Primero se realizó un ANOVA a fin de determinar si hubo diferencias significativas entre los resultados obtenidos respecto a las variables independientes especie, fórmula y tiempo; posteriormente, se realizó una selección de los máximos de las actividades enzimáticas gráficamente. La mayor actividad de
103
β-glucosidasa fue detectada para L. edodes – F2 con 84,01 U/g ss (sustrato sólido) a los 14 de incubación. En comparación con las actividades obtenidas de esta misma enzima para las otras dos especies de hongos existe una gran diferencia con los datos obtenidos para P. ostreatus, siendo mucho menor la diferencia con las registradas para C. versicolor - F5, cuyo valor máximo fue de 71,05 U/g ss. Para la enzima endoglucanasa la mayor actividad fue detectada con P. ostreatus – F1 al día 11 de la fermentación con 128,75 U/g ss, seguida de 78,75 U/g ss para C. versicolor – F10 en el día 11 de la fermentación. Los niveles más altos de la enzima exoglucanasa se obtuvieron para L. edodes – F6 y F5 con 106,44 U/g ss (día 21) y 99,29 U/g ss (día 32) respectivamente; mientras que, la menor actividad de exoglucanasa obtenida fue para P. ostreatus – F12 con 44,05 U/g ss (día 35). Respecto a la enzima endoxilanasa, la mayor actividad obtenida se reporta para C. versicolor – F9 con 124,18 U/g ss en el día 21 de fermentación, con el menor valor obtenido para P. ostreatus – F12 al día 28 de fermentación. Las actividades enzimáticas máximas de lacasa y MnP fueron para C. versicolor – F7 y P. ostreatus – F5 con 106,76 U/g ss y 9,77 U/g ss respectivamente y ambas en el día 28 de la fermentación. Según los datos obtenidos de las actividades enzimáticas lignocelulolíticas para las 12 formulaciones evaluadas, no hay un aparente efecto directo de la relación C/N sobre la variación de dichas actividades enzimáticas, probablemente porque los componentes del sustrato que provocan la variación de la relación C/N no se modifican durante la formulación de los medios y los niveles evaluados no son suficientemente diferentes para provocar un cambio significativo en estas actividades enzimáticas. En este estudio se presentó la producción de cuatro actividades enzimáticas de hidrolasas y dos actividades de ligninasas de tres especies de hongos de pudrición blanca, en fermentación en estado sólido variando las mezclas de diversos materiales lignocelulósicos; entendiendo que para la bioconversión de los materiales lignocelulósicos con hongos, las hidrolasas juegan un rol muy importante ya que son las que proveen la fuente de energía a los microorganismos; por lo que la baja producción de estas enzimas pueden limitar la velocidad de degradación de los polisacáridos en azúcares solubles. En este trabajo los datos de las actividades de endoglucanasa y endoxilanasa obtenidos fueron mucho menores que las obtenidas por otros investigadores como Kachlishvili et al. (2006) con diferentes relaciones C/N. Aunque los títulos de exoglucanasa, β-glucosidasa, lacasa y MnP obtenidos fueron mayores en comparación con los obtenidos para diferentes relaciones C/N y otras especies de basidiomicetos de pudrición blanca por otros autores (Tsiklauri et al., 1999; Baldrian y Gabriel, 2002; Reddy et al., 2003). De todos modos los títulos enzimáticos obtenidos pueden variar de acuerdo a la eficiencia del método utilizado para extraer las enzimas a partir del sustrato sólido, ya que la metodología empleada no necesariamente garantiza la extracción de todas las enzimas adsorbidas al sustrato.
3.2. Efecto del sulfato de cobre sobre la degradación de residuos lignocelulósicos y la producción de enzimas lignocelulolíticas
Los dos niveles de CuSO4 utilizados en las doce formulaciones del presente estudio no generaron inhibición aparente en el crecimiento de los tres organismos de trabajo. Como se observa en las Figuras 1 y 2 la biomasa de los tres hongos aumentó en todas las formulaciones durante los 49 días de fermentación. Las enzimas lignocelulolíticas fueron determinadas dos veces por semana con muestras destructivas a partir de la elaboración de un extracto líquido al cual se le determinó siete actividades enzimáticas, cuatro hidrolasas y dos óxido-reductasas. Se observa una gran variación en los máximos de las actividades enzimáticas medidas entre especies y formulaciones como se observa en la Tabla 2. Son muchos los factores que pueden afectar la producción de enzimas lignocelulolíticas en hongos de pudrición blanca. Además, las diferentes cepas responden de un modo particular a cada uno de los factores intrínsecos y extrínsecos que deben enfrentar cuando son inoculados. Debido a esto, el estudio combinado de dos o más factores puede generar mayor dificultad al momento de la interpretación de las posibles interacciones entre los compuestos que afectan directamente la producción de enzimas lignocelulolíticas. La variabilidad de las actividades enzimáticas de las hidrolasas es tan amplia entre las especies de trabajo y las doce formulaciones probadas que no hay una evidencia clara de que las cantidades de CuSO4 (0,1596% y 0,0796%) adicionadas a los sustratos hayan generado alguna inhibición
104 o activación directa a estas actividades. Adicionalmente, no hay reportes de que la adición de cobre al medio de cultivo sólido en las cantidades adicionadas genere algún efecto importante sobre las actividades enzimáticas de las hidrolasas.
Tabla 2. Máximas actividades enzimáticas lignocelulolíticas (U/gss) de tres especies de hongos de pudrición blanca para doce niveles de relación carbono nitrógeno (R C/N) y dos niveles de CuSO4 Fórmula F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12
CuSO4 (% p/p) 0,1596 0,0798 0,1596 0,0798 0,1596 0,0798 0,1596 0,0798 0,1596 0,0798 0,1596 0,0798 R C/N 142,6 91,8 114,6 93,6 100,9 91,8 85,3 84,9 55,1 51,6 114,6 111 29,92 22,30 47,32 26,20 25,63 37,02 17,68 35,21 33,92 32,64 19,58 36,31 P. ostreatus (35) (7) (46) (32) (21) (21) (28) (39) (25) (28) (35) (32) 45,93 51,7 61,71 69,71 71,05 57,99 55,71 28,30 21,96 63,99 43,41 26,21 βG (U/g ss) C. versicolor (11) (11) (39) (35) (32) (28) (25) (14) (25) (28) (21) (32) 64,28 84,01 67,28 56,75 63,66 69,24 69,71 69,19 61,90 76,00 63,42 61,42 L. edodes (14) (14) (42) (28) (39) (35) (25) (28) (35) (25) (28) (32) 128,75 37,46 76,71 23,71 18,78 34,81 17,31 39,19 43,25 42,73 7,37 16,10 P. ostreatus (11) (11) (42) (4) (4) (4) (4) (4) (4) (4) (4) (35) 52,15 22,85 73,11 41,17 54,75 59,82 20,89 33,48 78,75 48,26 18,61 16,31 ENG (U/g ss) C. versicolor (11) (4) (7) (4) (4) (4) (4) (4) (11) (4) (4) (39) 44,29 38,15 66,85 18,44 25,61 42,91 10,18 11,68 12,73 13,43 12,21 14,22 L. edodes (11) (21) (11) (4) (4) (4) (28) (32) (4) (7) (32) (42) 58,55 73,96 91,34 86,30 90,89 74,49 69,37 62,35 62,48 61,70 50,41 44,05 P. ostreatus (18) (11) (39) (42) (46) (7) (28) (25) (21) (32) (21) (35) 47,72 56,77 55,86 59,6 74,50 57,82 60,45 61,3 64,45 70,10 53,03 50,10 EXG (U/g ss) C. versicolor (46) (49) (49) (32) (7) (7) (28) (28) (32) (32) (28) (25) 57,43 89,12 77,64 89,12 99,29 106,44 61, 5 74,75 76,52 77,37 57,76 53,03 L. edodes (11) (18) (21) (21) (32) (21) (25) (25) (28) (32) (35) (7) 39,89 37,14 40,77 37,67 60,52 80,88 33,43 35,91 62,29 61,23 27,58 19,70 P. ostreatus (18) (18) (28) (18) (21) (21) (11) (25) (14) (21) (35) (28) 66,10 62,82 50,43 96,20 90,00 59,46 45,47 41,13 124,18 67,87 38,56 64,33 ENX (U/g ss) C. versicolor (28) (32) (21) (25) (7) (11) (28) (7) (21) (14) (28) (35) 56,62 70,70 68,31 95,58 70,79 109,11 66,54 94,52 83,45 107,53 71,85 70,7 L. edodes (18) (28) (28) (35) (32) (21) (32) (18) (28) (21) (32) (28) 80,81 40,23 90,42 28,80 43,33 40,15 78,53 40,40 78,83 44,65 62,31 66,56 P. ostreatus (18) (32) (28) (25) (25) (21) (21) (18) (18) (11) (21) (25) 80,29 40,15 83,03 106,10 45,52 63,26 106,76 57,57 104 70,90 101,97 67,22 Lac (U/g ss) C. versicolor (28) (25) (28) (39) (21) (14) (28) (11) (25) (32) (25) (25) 40,05 30,66 38,05 26,61 39,28 52,57 38,50 32,43 26,86 45,19 47,25 32,89 L. edodes (35) (28) (21) (35) (21) (18) (21) (18) (18) (25) (18) (21) 4,66 6,64 7,69 9,57 6,42 4,98 5,02 6,14 4,49 4,50 4,48 P. ostreatus 5,51 (25) (49) (21) (42) (28) (42) (21) (35) (32) (14) (25) (32) 4,56 7,36 6,63 6,09 6,29 5,44 3,78 5,44 5,22 5,21 4,73 MnP (U/g ss) C. versicolor 4,87 (46) (32) (28) (32) (35) (21) (18) (11) (25) (25) (14) (18) 4,48 5,64 6,92 4,95 6,01 4,58 4,76 5,14 4,86 4,73 4,73 L. edodes 4,16 (39) (35) (28) (25) (42) (28) (25) (28) (21) (32) (39) (49) Nota: Los números entre paréntesis corresponden al día de incubación en el que se determinó la máxima actividad enzimática (valor-p<0.05)
En referencia a las enzimas ligninolíticas, el efecto del CuSO4 como inductor de lacasa y peroxidasas si ha sido estudiado por varios investigadores (Levin et al., 2002; Niladevi y Prema, 2008). La actividad de lacasa para las tres especies de hongos evaluadas y las doce formulaciones de sustrato diferentes si pudo haberse afectado por la presencia del CuSO4, ya que las actividades enzimáticas máximas obtenidas de lacasa son mayores que las obtenidas en otros trabajos donde se trabajó con hongos de pudrición blanca y sustratos a bases de mezclas de residuos lignocelulósicos, como en el trabajo de Montoya et al. (2011a) en el que las actividades de lacasa obtenida para el hongo de pudrición blanca Grifola frondosa no fueron superiores a 15 U/g ss. Asimismo, en el presente estudio se obtuvieron actividades de lacasa del orden de 90,42 U/g ss (valor-p<0,05) para P. ostreatus y de 106,76 U/g ss (valor- p < 0,05) para C. versicolor a los 28 días de incubación, comparables con las obtenidas por Gassara et al.
105
(2010) para el hongo Phanerochaete chrysosporium en presencia de CuSO4 sobre diferentes sustratos a base de diversos residuos (manzana, pulpa de papel, residuos de cerveceras y de pescaderías) y quienes no obtuvieron actividad de lacasa cuando no utilizaron activadores. Adicionalmente, las actividades de lacasa obtenidas en este estudio fueron también comparadas con las obtenidas por Rosale et al. (2007) donde se presentó un incremento en la actividad de lacasa de Trametes hirsuta desarrollada sobre cáscara de naranja con 1 mM de sulfato de cobre en cultivo sólido. Las lacasas pertenecen al grupo de oxidasas de cobre azul y contienen cuatro átomos de cobre por molécula, distribuidos en tres diferentes sitios de unión de cobre (Solomon et al., 1997); por lo tanto la presencia de cobre en los medios de cultivo siempre es importante para la inducción y producción de las mismas. Además, es resaltable que con los hongos de pudrición blanca se tiene una herramienta ambiental importante, ya que incrementando la actividad de lacasas utilizando sulfato de cobre es posible utilizarlas en procesos de biorremediación de aguas residuales y otros recalcitrantes, de modo que la concentración total de cobre en el medio es consumido o disminuido por estos organismos durante el mismo proceso de biorremediación (Gassara et al., 2010).
Figura 1. Producción de biomasa de tres especies de hongos C. versicolor, P. ostreatus, L. edodes sobre seis formulaciones de sustratos diferentes. A: F1, B: F2, C: F3, D: F4, E: F5, F: F6
Figura 2. Producción de biomasa de tres especies de hongos C. versicolor, P. ostreatus, L. edodes sobre seis formulaciones de sustratos diferentes. A: F7, B: F8, C: F9, D: F10, E: F11, F: F12
En este trabajo las actividades de las enzimas MnP (ver Tabla 2) no mostraron una gran variabilidad entre las especies y las formulaciones, las actividades obtenidas son comparables con las reportadas en un trabajo previo (Montoya et al., 2011a) para G. frondosa sobre residuos lignocelulósicos sin utilizar inductores o activadores y con los datos reportados por Gassara et al. (2010) cuando no utilizaron activadores de peroxidasas. Varios investigadores han reportado efectos adversos sobre la
106
actividad de peroxidasas por los métodos de extracción utilizados cuando éstas se producen por fermentación en fase sólida, ya que los sustratos deben ser sometidos a diversos métodos de extracción a fin de obtener el extracto líquido al que se le determinan las actividades enzimáticas (Li et al., 2008; Silva et al., 2008; Gassara et al., 2010). Aunque en este trabajo no se determinó el efecto del método de extracción para la determinación de las actividades enzimáticas, si se deja el precedente de que los resultados obtenidos para las actividades de la enzima MnP pudieron haberse afectado por el método de extracción de las mismas seleccionado para el presente estudio.
Tabla 3. Porcentaje de degradación de celulosa, hemicelulosa y lignina en las doce fórmulas y las tres especies de hongos: C. versicolor, P. ostreatus y L. edodes durante 49 días de incubación Celulosa Hemicelulosa Lignina Fórmula C. versicolor P. ostreatus L. edodes C. versicolor P. ostreatus L. edodes C. versicolor P. ostreatus L. edodes
F1 37,833341 29,495518 27,8331 37,86446 35,6546 34,4557 65,2256 46,0133 50,389 F2 38,172471 25,558856 30,9033 29,94283 29,2839 27,9128 53,3108 41,97 41,185 F3 39,179947 29,843347 29,792 35,92689 32,6892 33,969 58,9696 41,6 45,556 F4 39,152249 32,277082 26,0413 28,77414 25,7434 27,8841 60,4469 42,6422 46,698 F5 42,887186 30,281074 28,4923 29,41067 25,4267 26,5507 57,6707 40,6837 44,553 F6 40,671656 32,92567 23,2732 32,47132 29,11223 30,5613 58,1862 41,0474 44,951 F7 37,350715 31,130603 27,0458 33,02014 32,9014 31,3301 55,9312 44,9481 43,209 F8 43,64179 29,554255 30,7922 32,88098 28,80198 30,1188 54,4718 42,884 42,082 F9 43,212706 29,683321 28,2663 36,54323 26,50323 29,5432 63,699 44,9364 49,21 F10 38,504861 26,870928 26,5966 28,12701 25,1557 27,1223 53,2825 37,5881 41,163 F11 34,713944 26,89905 24,8235 32,3288 26,8812 30,2883 53,9464 38,0564 41,676 F12 37,327093 28,762513 27,932 37,53958 27,3958 29,3966 47,4033 33,4406 36,621
3.3. Producción de enzimas lignocelulolíticas y consumo de sustratos de la mejor combinación hongo – formulación
Los datos experimentales obtenidos en el presente estudio fueron sometidos a un proceso de selección a fin de lograr la mejor combinación especie de hongo fórmula del diseño experimental bifactorial respecto a la producción de enzimas lignocelulolíticas, el cual se realizó por etapas. Primero se hizo un análisis de varianza, ANOVA a tres vías (especie, fórmula, tiempo) para cada una de las actividades enzimáticas: endoglucanasa, exoglucanasa, β-glucosidasa, endoxilanasa, lacasa y MnP durante 15 tiempos en los 49 días de fermentación; se obtuvieron diferencias significativas para todas las combinaciones con un valor-p < 0,05. Posteriormente, se realizó un análisis por especie y una selección de los máximos de cada una de las actividades enzimáticas y un análisis comparativo de los máximos (empleando la función multcompare) aplicando una prueba de Kruskal-Wallis para cada actividad enzimática, obteniendo diferencias significativas con valor-p < 0,05 para cada actividad enzimática comparada (ver Tabla 2). Para concluir la selección de la mejor combinación especie-fórmula se realizó un nuevo análisis comparativo a las cantidades de celulosa, hemicelulosa y lignina degradadas en 49 días de fermentación en fase sólida aplicando la prueba de Kruskal-Wallis y una prueba de comparación con la función multcompare a las combinaciones seleccionadas de la Tabla 2. De este análisis comparativo se obtuvo que C. versicolor fue el hongo que presentó mayor capacidad de degradación de los tres componentes mayoritarios de los materiales lignocelulósicos, celulosa, hemicelulosa y lignina en todas las formulaciones como se resume en la Tabla 3 con valor-p < 0,05. Del mismo modo, en la Tabla 3 se observa que C. versicolor en combinación con las fórmulas F1, F5 y F9 fueron las que mostraron mayor
107 capacidad de degradación de los materiales lignocelulósicos, en los que la mejor combinación para degradar celulosa y lignina fueron F1 y F9 y la que mejor degradó hemicelulosa fue la F9. A estas tres combinaciones se les realizó un análisis comparativo a fin de seleccionar de entre las tres combinaciones la de mejor comportamiento para aplicar un modelo matemático que describa los datos experimentales de producción de enzimas lignocelulolíticas y biomasa y de consumo de los sustratos medidos. Sin embargo, el análisis comparativo no presentó diferencia significativa (valor-p = 0.988), por lo que se seleccionó la combinación C. versicolor – F9 ya que fue la que arrojó el mayor promedio de las medias.
3.4. Variación de las actividades enzimáticas durante la fermentación en fase sólida
La variación de las actividades enzimáticas durante los 49 días de fermentación en estado sólido no presentó una tendencia definida para ninguna de las enzimas medidas para las tres especies de hongos estudiados en las doce formulaciones de sustrato. Sin embargo, sí se conservó una tendencia general en los datos experimentales obtenidos en este trabajo consistente en que todas las actividades de las enzimas determinadas disminuyen luego de un tiempo específico; cada combinación arrojó un máximo de actividad enzimática los cuales se consignan en la Tabla 2. Se hace la consideración que en adelante se muestran solamente las figuras de la variación de las actividades enzimáticas medias. La actividad de las enzimas celulolíticas medidas en este trabajo, endoglucanasa y exoglucanasa, fue variable sin tendencia definida como se observa en las Figuras 3 y 4, pero en las que se perciben caídas de las actividades enzimáticas luego del día 20 de incubación coincidiendo con el tiempo donde las tres especies han terminado la colonización del sustrato. Sin embargo, algunas de las combinaciones (hongo-fórmula) presentaron comportamiento diferentes, como es el caso de P. ostreatus – F3 donde la endoglucanasa presenta una tendencia relativamente estable hasta el día 35 donde se observa que se inicia una alteración de la actividad con ascenso y descenso hasta el término de 49 días de incubación. Asimismo, el comportamiento de la exoglucanasa en F1 para las tres especies de hongos no presentó gran variación en comparación con las demás combinaciones. De igual forma, el comportamiento de la actividad de la endoglucanasa para las formulaciones F7 a F12 tampoco presentó una tendencia definida y si presentaron descensos a partir del día 20 de incubación para las tres especies de trabajo. Mientras que la actividad de la exoglucanasa para las formulaciones F7 a F12 presentó ascenso hasta el día 30 de incubación y una tendencia al descenso a partir de allí hasta el final de las determinaciones, el día 49 de incubación. En contraste, la actividad de la endoxilanasa se presenta un poco más dispersa que las dos hidrolasas anteriores como se observa en la Figura 5, donde por ejemplo para la F5 es notable una gran dispersión de los datos con actividades de hasta 90 U/gss. En referencia a la actividad de la β-glucosidasa, el comportamiento de las combinaciones de cada uno de las especies de hongos entre las F7 y F12 se observan en la Figura 6 en las que es notable la variación de los datos por combinación, pero si es marcada la tendencia hacia un descenso de la actividad en todas las combinaciones. Las dos actividades de ligninasas medidas en este trabajo mostraron comportamientos diferentes. La actividad de la lacasa varía apreciablemente entre combinaciones como se puede observar en la Figura 7, dejando ver que el hongo C. versicolor fue el que mayores títulos de esta actividad arrojó con actividades del orden de 80 a 100 U/gss en varias de las combinaciones evaluadas como se consigna en la Tabla 2. Como se observa en la Figura 8 la variación de la actividad MnP fue escasa, y los títulos obtenidos de esta enzima fueron bajos durante los 49 días de incubación en la que fue determinada, como se consigna en la tabla 2.
108
Figura 3. Actividad enzimática de endoglucanasa de tres especies de hongos: C. versicolor, P. ostreatus, L. edodes sobre seis formulaciones de sustratos. A: F1, B: F2, C: F3, D: F4, E: F5, F: F6 en 49 días de fermentación en estado sólido
Muchos basidiomicetos tienen la capacidad de producir simultáneamente enzimas hidrolíticas y oxidativas las cuales son necesarias para degradar los sustratos del complejo lignocelulósico (Kirk, 1983; Wood y García, 1994). Estas enzimas son extracelulares e inducibles y según Buswell et al. (1996) especialmente los hongos de pudrición blanca en general exhiben mayores títulos de ligninasas que de celulasas; lo cual se convierte en una fortaleza de estos hongos ya que para lograr acceder a la celulosa deben iniciar la degradación de la lignina. De hecho, según los datos experimentales obtenidos y consignados en las Tablas 2 y 3 los datos de las actividades enzimáticas máximas de todas las combinaciones y la capacidad de degradación de celulosa y lignina fueron obtenidos con las combinaciones del hongo C. versicolor como el que más degradó lignina, por lo que probablemente debió tener acceso más rápidamente a la celulosa, teniendo como resultado también una mayor degradación de la celulosa. De forma que los títulos de las actividades enzimáticas obtenidas en este estudio indican que los hongos de pudrición blanca como P. ostreatus, C. versicolor y L. edodes en investigaciones similares obtuvieron resultados comparables, a pesar de la gran cantidad de factores que afectan los resultados de las actividades enzimáticas, tanto de las hidrolasas como de las ligninasas (Mata y Savoie, 1998; Mata et al., 2005; Gassara et al., 2010).
Figura 4. Actividad enzimática de exoglucanasa de tres especies de hongos: C. versicolor, P. ostreatus, L. edodes sobre seis formulaciones de sustratos. A: F1, B: F2, C: F3, D: F4, E: F5, F: F6 en 49 días de fermentación en estado sólido
109
Figura 5. Actividad enzimática de endoxilanasa de tres especies de hongos: C. versicolor, P. ostreatus, L. edodes sobre seis formulaciones de sustratos. A: F1, B: F2, C: F3, D: F4, E: F5, F: F6 en 49 días de fermentación en estado sólido
Figura 611. Actividad enzimática de β-glucosidasa de tres especies de hongos: C. versicolor, P. ostreatus, L. edodes sobre seis formulaciones de sustratos. A: F7, B: F8, C: F9, D: F10, E: F11, F: F12 en 49 días de fermentación en estado sólido
Figura 7. Actividad enzimática de lacasa de tres especies de hongos: C. versicolor, P. ostreatus, L. edodes sobre seis formulaciones de sustratos. A: F7, B: F8, C: F9, D: F10, E: F11, F: F12 en 49 días de fermentación en estado sólido
110
Figura 8. Actividad enzimática de MnP de tres especies de hongos: C. versicolor, P. ostreatus, L. edodes sobre seis formulaciones de sustratos. A: F7, B: F8, C: F9, D: F10, E: F11, F: F12 en 49 días de fermentación en estado sólido
Las actividades enzimáticas obtenidas presentaron descensos a diferentes tiempos del proceso de fermentación en estado sólido, hecho que pudo atribuirse a aspectos como la eficiencia del método de extracción empleado; a los cambios en la composición del sustrato durante el tiempo de fermentación, ya que pueden producirse nuevas sustancias que inhiban las actividades enzimáticas; represión catabólica por productos de las reacciones que se generan en la fermentación; producción de variantes isoenzimáticas de las mismas enzimas a diferentes tiempos y diferentes condiciones del sustrato arrojan actividades diferentes. Sin embargo, estos descensos en las actividades enzimáticas lignocelulolíticas también han sido detectados por varios investigadores, quienes reportan algunas de estas hipótesis como posibles causantes de los descensos de dichas actividades enzimáticas (Panagiotou et al., 2003; Mata et al., 2005; Levin et al., 2008; Montoya et al., 2011a).
3.5. Modelamiento matemático
Basado en los datos experimentales obtenidos de actividades enzimáticas lignocelulolíticas durante los 49 días de fermentación en estado sólido para las tres especies de hongos basidiomicetos de pudrición blanca: C. versicolor, P. ostreatus y L. edodes, se propuso un modelo matemático compuesto de 11 ecuaciones diferenciales (ver Tabla 3) a fin de ajustar los datos experimentales de todas las combinaciones resultantes para C. versicolor, ya que este fue el hongo que mayor capacidad de degradación mostró de los materiales lignocelulósicos medidos en este trabajo (celulosa, hemicelulosa y lignina). Sin embargo, aquí se presentan los resultados del modelamiento arrojados para la combinación especie de hongo fórmula, F9, ya que ésta fue la que mostró el mejor comportamiento respecto de la degradación de los sustratos basados en materiales lignocelulósicos. De igual forma, para comparar el ajuste de los datos experimentales al modelo matemático propuesto se planteó una prueba F de una cola, con la cual se obtuvieron las varianzas de los residuales entre los datos experimentales y el modelo, individualmente para cada variable medida, pero haciendo la comparación de cada ecuación aplicada para todas las formulaciones de F1 a F12 en la misma especies, en este caso C. versicolor, lo que permitió probar la bondad del ajuste del modelo en términos de la mejor representación de los datos experimentales obtenidos. Con el modelo matemático propuesto se plantea la descripción de producción de biomasa, seis enzimas lignocelulolíticas, azúcares reductores como producto intermedio consumido durante la misma fermentación, el consumo de celulosa, hemicelulosa y la degradación de lignina. Asimismo, los datos experimentales obtenidos en esta investigación serán ajustados al modelo planteado a fin de contribuir con nuevas propuestas en el camino al planteamiento de modelos matemáticos más complejos que permitan la
111 descripción de los procesos de fermentación en fase sólida con fines industriales. Varias ecuaciones cinéticas de complejidad variable, tales como la ecuación lineal, logística, de dos fases o la ecuación de Monod han sido utilizadas por diferentes investigadores a fin de buscar la descripción de la producción de biomasa en procesos de fermentación en estado sólido (Sangsurasak et al., 1996; Viccini et al., 2001). De las expresiones matemáticas utilizadas, la más frecuente es la ecuación logística, debido probablemente a la forma simple de la expresión. El modelo propuesto consignado en la Tabla 3 para la descripción de la biomasa es la ecuación (1), la cual corresponde a la ecuación logística modificada por Mitchell et al. (1999). Para describir la variación de los azúcares reductores en el tiempo se propuso la ecuación (2) que correspondió a un factor de producción constante que afecta la derivada de la velocidad de producción de biomasa, debido a que los azúcares reductores son considerados un producto de la fermentación que es consumido por el mismo hongo como fuente de energía y su variación se ajustó más a la velocidad de variación de la biomasa que a la variación de la biomasa misma. Para la degradación de lignina y los consumos de hemicelulosa y celulosa en el tiempo de fermentación se plantearon las ecuaciones (3), (6) y (8) cuyo planteamiento se realizó en función de las concentraciones de las enzimas específicas responsables de la degradación de cada uno de los sustratos. La variación de las actividades enzimáticas celulolíticas (endoglucanasa y exoglucanasa), xilanolítica (endoxilanasa) y las ligninasas (lacasa y MnP) fueron propuestas como una producción que dependió de la concentración del sustrato específico y de la velocidad de producción de la biomasa con un factor de inhibición provocado por la concentración de azúcares reductores en el medio en el caso de las dos celulasas y la endoxilanasa, mientras que para las dos ligninasas el factor de inhibición fue afectado por la misma concentración de lignina en el medio (ver ecuaciones (4), (5), (7), (9) y (10)). La inhibición de las enzimas ligninolíticas puede deberse a sustancias intermedias producidas durante la fermentación o probablemente por concentraciones muy altas de lignina (Tengerdy y Szakacs, 2003). Aunque aún no hay certeza de ello, los datos experimentales obtenidos en este trabajo mostraron una posible inhibición de las ligninasas y como no se determinaron productos intermedios durante el desarrollo de la fermentación, se asumió una inhibición por sustrato, en este caso por lignina. Finalmente para la variación de la enzima β-glucosidasa se propuso una ecuación cuya producción dependió únicamente de la variación de la producción de biomasa con un factor de inhibición causado por la concentración de los azúcares reductores. Los parámetros de cada una de las ecuaciones consignadas en la Tabla 3 se describen en la Tabla 4. La fermentación en estado sólido es un proceso heterogéneo que se ve afectado además por las condiciones ambientales. La dificultad que representa la determinación del crecimiento de la biomasa, el consumo de los sustratos y la imposibilidad de determinar todas las sustancias intermedias que pueden generarse como producto de las reacciones bioquímicas durante las fases de incubación ha dificultado la descripción de los procesos de fermentación en estado sólido y su escalamiento cuando se pretende aplicar estos procesos en producción industriales de alguna sustancia de interés (Pal et al., 1995a; Sarikaya y Ladisch, 1997; Pandey et al., 2000; Moreira et al., 2003). Las materias primas utilizadas para el crecimiento y desarrollo de los hongos de pudrición blanca son bastante heterogéneas, compuestas principalmente del complejo lignocelulósico (Viccini et al., 2001; Pradeep y Datta, 2002). Los hongos basidiomicetos como los utilizados en el presente estudio contienen quitina en su pared celular. Debido a que en los procesos de fermentación en estado sólido no es posible determinar directamente la cantidad de biomasa, se determinó el contenido de quitina a través de la cuantificación de N-acetil-D-glucosamina (NAGA) en todos los tiempos de la fermentación. Además, se le determinó el contenido de NAGA al micelio seco obtenido de cultivo líquido a cada una de las tres especies de trabajo, obteniendo como resultado 15,83% (p/p) en P. ostreatus, 14,15% (p/p) en C. versicolor y 10,08% (p/p) en L. edodes. Estos porcentajes de NAGA fueron utilizados para calcular la cantidad de biomasa de los sustratos sólidos en cada uno de los tiempos de fermentación; por lo que estos datos de biomasa fueron los que se sometieron al modelamiento con la ecuación (1). El ajuste de los datos experimentales al modelo de la biomasa y los azúcares reductores se muestran en la Figura 9, en la Tabla 5 se encuentran los valores de los parámetros ajustados de la biomasa y los azúcares reductores y la bondad del ajuste obtenido para los datos de la biomasa fue del 90% aproximadamente y para los azúcares reductores del 55% referidos a la combinación que presentó el ajuste más pobre que corresponde a la varianza de los residuales más alta.
112
Tabla 3. Modelo matemático para la descripción de producción de biomasa, enzimas lignocelulolíticas y consumo de la matriz lignocelulósica Ecuación Descripción n dCbb C mb.1C (1) Biomasa dt C bm n dCAR dCbb C qnpm. . . 1 1 . Azúcares dt dt Cbm (2) reductores
dC L k.. C C (3) Lignina dt L lac MnP dC dC lack... b C C (4) Lacasa dtlac dt L lac L Manganeso (5) peroxidasa dCMnP dC b k... C C (MnP) dtMnP dt L MnP L dC HM kC. (6) Hemicelulosa dt HM ENX dC dC ENXk... C b C (7) Endoxilanasa dtENX HM dt ENX AR dC C k.. C C dt C ENG EXG (8) Celulosa
dC dC ENG kC. b . .C dtENG dt C ENG AR (9) Endoglucanasa
dC dC EXG kC. b . .C (10) Exoglucanasa dtEXG dt C EXG AR dC dC BG k . b .C (11) β-glucosidasa dt BG dt BG AR
En la Figura 10 se presenta el comportamiento de los datos experimentales respecto al modelo propuesto en las ecuaciones (3), (4) y (5); los parámetros de las ecuaciones se encuentran consignados en la tabla 5. De igual forma, el ajuste para los datos experimentales de la lignina, lacasa y MnP al modelo propuesto son del 90%, 43% y 87% respectivamente para la F9. En la Figura 11 se muestra el ajuste de los datos experimentales de la hemicelulosa y la enzima endoxilanasa al modelo (ecuaciones (6) y (7)) y los parámetros del modelamiento se encuentran en la Tabla 5. Los porcentajes de ajuste al modelo para la hemicelulosa fueron del 86% y para la endoxilanasa fue del 82% aproximadamente para F9. El modelamiento de los datos experimentales de celulosa, endoglucanasa, exoglucanasa y β-glucosidasa se muestran en la Figura 12. Del mismo modo los parámetros del modelo están consignados en la Tabla 5 y el ajuste de los datos experimentales al modelo fue de 40% para celulosa, 88% endoglucanasa, 78% exoglucanasa y 96% β-glucosidasa para la F9.
113
Tabla 4. Parámetros de las ecuaciones del modelo matemático. Parámetro Significado Parámetro Significado Velocidad específica de crecimiento de la biomasa Coeficiente de producción de Endoxilanasa µ k m (día-1) ENX (gss/mg) -1 Cbm Concentración de biomasa máxima (mg/gss) µENX Coeficiente de inhibición de Endoxilanasa (día ) n < 1 el organismo es relativamente sensible a la auto-inhibición y ésta ocurre para valores muy bajos
de Cb
N n = 1 ecuación logística CHM0 Concentración inicial de hemicelulosa (mg/gss)
n > 1 el organismo es relativamente resistente a la
auto-inhibición y ésta ocurre solo cuando Cb ≈ Cbm
Concentración de biomasa máxima (mg/gss) Cb0 CENX0 Actividad inicial de Endoxilanasa (U/gss) Coeficiente de producción constante de azúcares Coeficiente de consumo de celulosa q k p reductores (día) C (mg.gss/día.U2) Concentración inicial de azúcares reductores Coeficiente de producción de Endoglucanasa C k AR0 (mg/gss) ENG (gss/mg) Coeficiente de degradación de lignina Coeficiente de inhibición de Endoglucanasa (día- k µ L (mg.gss/día.U) ENG 1) Coeficiente de producción de lacasa (gss/mg) Coeficiente de producción de Exoglucanasa k k lac EXG (unidades gss/mg) -1 -1 µlac Coeficiente de inhibición de lacasa (día ) µEXG Coeficiente de inhibición de Exoglucanasa (día ) kMnP Coeficiente de producción de MnP (gss/mg) CC0 Concentración inicial de celulosa (mg/g ss) -1 µMnP Coeficiente de inhibición de MnP (día ) CENG0 Actividad inicial de Endoglucanasa (U/g ss) CL0 Concentración inicial de lignina (mg/g ss) CEXG0 Actividad inicial de Exoglucanasa (U/g ss) Actividad inicial de lacasa (U/gss) Coeficiente de producción de β-glucosidasa C k lac0 BG (mg/mg) -1 CMnP0 Actividad inicial de MnP (U/gss) µBG Coeficiente de inhibición de β-glucosidasa (día ) kHM Coeficiente de consumo de hemicelulosa (mg/día.U) CBG0 Actividad inicial de β-glucosidasa (U/gss)
Figura 9. Perfil en el tiempo de la biomasa celular y los azúcares reductores para la combinación C. versicolor - F9. Los puntos discretos corresponden a los datos experimentales; las líneas continuas son calculadas por el modelo propuesto.
114
Figura 10. Ajuste de datos experimentales de lignina, lacasa, MnP para la combinación C. versicolor - F9
Figura 11. Ajuste de datos experimentales de hemicelulosa y endoxilanasa para la combinación C. versicolor - F9
Figura 12. Ajuste de datos experimentales de celulosa, endoglucanasa, exoglucanasa y β-glucosidasa para la combinación C. versicolor - F9
115
Tabla 5. Valores de los parámetros del ajuste de los datos experimentales al modelo para C. versicolor – F9 Parámetro Valor Parámetro Valor -1 µm 6,7416 día kENX 0,002353 gss/mg -1 Cbm 358,0071 mg/gss µENX 0,2563 día 0,02786 225,36 mg/gss n CHM0 25,2333 mg/gss 1 U/gss Cb0 CENX0 2 qp 0,2636 día kC 0,01010 mg.gss/día.U CAR0 12,8 mg/gss kENG 0,002511 gss/mg -1 kL 0,008238 mg.gss/día.U µENG 0,07996 día klac 0,001341 gss/mg kEXG 0,0005064 gss/mg -1 -1 µlac 0 día µEXG 0,08104 día kMnP 0,0001035 gss/mg CC0 490 mg/gss -1 µMnP 0,0005659 día CENG0 1,888 U/gss CL0 205,45 mg/gss CEXG0 0,4793 U/gss Clac0 1,7374 U/gss kBG 0,07420 mg/mg -1 CMnP0 0,5335 U/gss µBG 0,02556 día kHM 0,02451 mg/día.U CBG0 3,9999 U/gss
Aunque existen numerosas investigaciones previas acerca de la producción de actividades enzimáticas lignocelulolíticas por diversos hongos de pudrición blanca, y la degradación de materiales lignocelulósicos; y aproximaciones sobre la formación de productos intermedios en procesos de fermentación en fase sólida (Meagher et al., 1988; Levin, 1998; Mitchell et al., 2002; Levin et al., 2008). Se requiere aun mayor información sobre las cinéticas de formación de biomasa, de producción de enzimas, del consumo de nutrientes y degradación de la lignina que permitan la descripción del proceso global y posterior escalado para la obtención de alguno de los productos de interés como los que se plantean en este estudio. El planteamiento de las ecuaciones para la descripción de la cinética de cada una de las variables medidas se realizó bajo la premisa de darle a cada expresión matemática algún sentido biológico respecto al compuesto a describir. Las expresiones propuestas describieron aceptablemente cada una de las variables medidas, ya que durante los procesos de fermentación en fase sólida cuando se utilizan como sustratos mezclas de materiales lignocelulósicos pueden producirse una gran cantidad de sustancias intermedias producto de las reacciones bioquímicas, además de la gran cantidad de enzimas que producen los hongos de pudrición blanca, muchas de las cuales no han sido valoradas. Contemplar productos intermedios originados por la acción de las enzimas medidas, u otras enzimas no evaluadas y sus productos, contribuiría a una interpretación más acabada de los complejos fenómenos que ocurren durante el crecimiento de los macromicetos en los sustratos lignocelulósicos.
4. Conclusiones
En el presente estudio, las tres especies de hongos de pudrición blanca probadas sobre las doce formulaciones de sustrato propuestas crecieron bien durante los 49 días de fermentación en fase sólida, por lo que se concluye que tanto la relación C/N como las concentraciones de CuSO4 no afectaron drásticamente el crecimiento y desarrollo de ninguno de los tres hongos. Sin embargo, de la evaluación detallada de los datos experimentales si se observaron diferencias en la producción de las enzimas lignocelulolíticas durante los 49 días de fermentación, en la que a pesar de la gran variabilidad de las actividades enzimáticas en el tiempo, unas combinaciones hongo formulación mostraron mejor comportamiento respecto a la producción de las enzimas que fueron determinadas. Del mismo modo, el hongo C. versicolor mostró mayor capacidad de degradación de lignina en todos los sustratos, hecho que probablemente le facilitó el acceso a la celulosa, por lo cual demostró mayor capacidad de degradación de la misma. El modelo matemático planteado en este estudio para la representación de los procesos de fermentación en estado sólido se realizó buscando describir el desarrollo de estos hongos en el sustrato
116 lignocelulósico, a fin de buscar puntos generales de interpretación de estos procesos que por ser tan heterogéneos se hacen complejos y carecen de expresiones matemáticas que permitan el escalamiento de estos procesos con fines industriales, evitando hacer experimentación individual de cada proceso.
Agradecimientos
Los autores agradecen a la Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados de la Universidad de Caldas (Colombia) por la financiación del presente trabajo y al Instituto de Biotecnología Agropecuaria de la misma institución por el apoyo material y de infraestructura. Asimismo, los autores expresan sus agradecimientos a la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad de Buenos Aires (Argentina) por su apoyo y asesoría durante la realización de este trabajo.
Referencias
Asatiani MD, Kachlishvili ET, Khardziani TS, Metreveli EM, Mikiashvili NA, Songulashvili GG, Tsiklauri ND, Wasser SP, Elisashvili VI (2008) Basidiomycetes as a source of antioxidants, lectins, polysaccharides, and enzymes. Journal of Biotechnology 136S: S717-S742. Baldrian P, Gabriel J (2002) Variability of laccase activity in the whiterot basidiomycete Pleurotus ostreatus. Folia Microbiology 47: 385-390. Barr BK, HsieH YL, Ganem B, Wilson DB (1996) Identification of two functionally different classes of exocellulases. Biochemistry 35: 586-592. Béguin P, Aubert JP (1994) The biological degradation of cellulose. FEMS Microbiology Reviews 13: 25-58. Blanchette RA (1995) Degradation of the lignocellulose complex in wood. Canadian Journal of Botany 73: S999-S1010. Buswell JA, Cai YJ, Chang ST (1996) Ligninolytic enzyme production and secretion in edible mushroom fungi. En Royse DJ (Ed.) Mushroom Biology and Mushroom Products. The Pennsylvania State University pp. 113±122. Pennsylvania. Carabajal M, Levin L, Abertó E, Lechner B (2012) Effect of co-cultivation of two Pleurotus species on lignocellulolytic enzyme production and mushroom fructification. International Biodeterioration & Biodegradation 66: 71-76. Carlile M, Watkinson S, Gooday G (2001) The fungi. Academic Press. London. 588 p. p. Dormand JR, Prince PJ (1980) A family of embedded Runge-Kutta formulae. Journal of computational and applied mathematics 6: 19-26. Gassara F, Brar S, Tyagi RD, Verma M, Surampalli RY (2010) Screening of agro-industrial wastes to produce ligninolytic enzymes by Phanerochaete chrysosporium. Biochemical Engineering Journal 49: 388-394. Gutierrez-Correa M, Tengerdy RP (1997) Production of cellulase on sugar cane bagasse by fungal mixed culture solid substrate fermentation. Biotechnology Letters in Applied Microbiology 19: 665 - 667. Hudson H (1986) Fungal Biology. Edward Arnolds Eds. Maryland. 298 p. p. Ikasari L, Mitchell DA (2000) Two-phase model of yhe kinetics of growth of Rhizopus oligosporus in membrana culture. Biotechnology Bioengineering 68: 619-627. Joselau JP, Ruel K (1994) Wood polysaccharides and their degradation by fungi. En Ouellette P (Ed.) Host Wall Alterations by Parasitic Fungi. APS Press. Minnesota. Kachlishvili E, Penninckx M, Tsiklauri N, Elisashvili V (2006) Effect of nitrogen source on lignocellulolytic enzyme production by white-rot basidiomycetes under solid-state cultivation. World Journal of Microbiology & Biotechnology 22(4): 391-397. Kirk TK (1983) Degardation and convertion of lignocelluloses. En Smith JE, Berry DR, Kristiansen P (Eds.) The filamentous fungi. London. Kirk TK, Farrel RL (1987) Enzymatic combustion: the microbial degradation of lignin. Annual Reviews of Microbiology 41: 465- 505. Kjeldahl J (1883) Neue Methode Zùr Bestimmung der Stickstoffs in Organichen Kòrpen. Zeitschrift fur Analytische Chemie 22: 366-382. Leterme P. (2010). Análisis de alimentos y forrajes, in Protocolos de LaboratorioUniversidad Nacional de Colombia Sede Palmira: Palmira. 66 pp. Levin L (1998) Biodegradación de materiales lignocelulósicos por Trametes trogii (Aphyllophorales, Basidiomycetes).Tesis. Universidad de Buenos Aires. Buenos Aires. Levin L, Forchiassin F, Ramos AM (2002) Copper induction of lignin-modifying enzymes in the white-rot fungus Trametes trogii. Mycologia 94(3): 377-383. Levin L, Herrmann C, Papinutti VL (2008) Optimization of lignocellulolytic enzyme production by the white-rot fungus Trametes trogii in solid-state fermentation using response surface methodology. Biochemical Engineering Journal 39: 207-214. Li L, Li XZ, Tang WZ, Zhao J, Qu Y-B (2008) Screening of a fungus capable of powerful and selective delignification on wheat straw. Letters in Applied Microbiology 47: 415-420. Mata G, Savoie JM (1998) Extracellular enzyme activities in six Lentinula edodes strains during cultivation in wheat straw. World J. Microbiol. Biotechnol. 14: 513-519.
117
Mata G, Murrieta Hernández DM, Iglesias Andreu LG (2005) Changes in lignocellulolytic enzyme activites in six Pleurotus spp. strains cultivated on coffee pulp in confrontation with Trichoderma spp. World Journal of Microbiology & Biotechnology 21: 143-150. Meagher MM, Tao BY, Chow JM, Reilly PJ (1988) Kinetics and subsite mapping of β -D-xylobiose and D-xylose producing Aspergillus niger endo-β-1,4-D-xylanase. Carbohydrates Resources 173: 273-283. Miller GL (1959) Use of DinitrosaIicyIic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar. Analytical Chemistry 31(3): 426- 428. Mitchell D, Stuart D, Tanner R. (1999). Solid-State fermentation - Microbial growth kinetics, in The Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis and bioseparation, Flickinger M, Drew S, EditorsWiley: New York. 2407-2429 Mitchell D, Von Meien O, Krieger N (2002) Recent developments in modeling of solid-state feremntation: heat and mass transfer in bioreactors. BiochemicalEngineering Journal 13: 137-147. Mitchell DA, Von meien OF, Krieger N, Dalsenter FD (2004) A review of recent developments in modeling of microbial growth kinetics and intraparticle phenomena in solid-state fermentation. Biochemical Engineering Journal 17: 15-26. Montoya BS, Orrego CA, Levin L (2011) Growth, fruiting and lignocellulolytic enzyme production by the edible mushroom Grifola frondosa (maitake). World J. Microbiol. Biotechnol. ISSN 0959-3993: DOI 10.1007/s11274-11011-10957-11272. Moreira MT, Feijoo G, Lema JM (2003) Fungal bioreactors: Applications to white-rot fungi. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology 2: 247-259. Niladevi KN, Prema P (2008) Effect of inducers and process parameters on laccase production by Streptomyces psammoticus and its application in dye decolourization. Bioresource Technology 99 4583-4589. Pal M, Calvo A, Terron MC, Gonzalez AE (1995) Solid-state fermentation of sugarcane bagasse with Flammulina velutipes and Trametes versicolor. World Journal Microbiology Biotechnology 11: 541-545. Panagiotou G, Kekos D, Macris B, Christakopoulos P (2003) Production of cellulolytic and xylanolytic enzymes by Fusarium oxysporum grown on corn stover in solid state fermentation. Industrial Crops and Products 18: 37-45. Pandey A, Soccol CR, Mitchell D (2000) New developments in solid state fermentation: I-bioprocesses and products. Process Biochemistry 35: 1153–1169. Paszczczynski A, Crawford R, Huyn V (1988) Manganese peroxidase of Phanerochaete chrysosporium purification. Methods enzymology 161: 264-270. Paszczynski A, Crawford RL (1991) Degradation of azo compounds by ligninases from Phanerochaete chrysosporium Involment of veratryl alcohol. Biochemistry Biophysics resources communications 178: 1056-1063. Plassard C, Mousain D, Salsac L (1982) Estimation of mycelial growth of basidiomycetes by means of chitin determination. Phytochemistry 21: 345-348. Pradeep V, Datta M (2002) Production of ligninolytic enzymes for decolorization by cocultivation of white-rot fungi Pleurotus ostreatus and Phanerochaete chrysosporium under solid-state fermentation. Applied Biochemistry Biotechnology 102-103: 109-118. Reddy GV, Ravindra BP, Komaraiah P, Roy RM, Kothari IL (2003) Utilization of banana waste for the production of lignolytic and cellulolytic enzymes by solid substrate fermentation using two Pleurotus species (P. ostreatus and P. sajor-caju). Process Biochemistry 38: 1457-1462. Rosale E, Couto SR, Sanromán A (2007) Increased laccase production by Trametes hirsuta grown on ground orange peelings. Enzyme and Microbial Technology 40 1286-1290. Sangsurasak P, Nopharatana M, Mitchell D (1996) Mathematical modeling of the growth of filamentous fungi in solid-state fermentation. Journal Science Industrial Resources 55: 333-342. Sarikaya A, Ladisch M (1997) An Unstructured Mathematical Model for Growth of Pleurotus ostreatus on Lignocellulosic Material in Solid-State Fermentation Systems. Applied Biochemistry and Biotechnology 62: 72-85. Silva EM, Martins SF, Milagres AMF (2008) Extraction of manganese peroxidase produced by Lentinula edodes. Bioresource Technology 99: 2471-2475. Solomon EI, Sundaram UM, Machonkin TE (1997) Multicopper oxidases and oxygenases. Chemical Reviews 96: 2563-2605. Tavares A, Coelho M, Coutinho J, Xavier A (2005) Laccase improvement in submerged cultivation: induced production and kinetic modelling. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 80: 669-676. Tengerdy RP, Szakacs G (2003) Bioconversion of lignocellulose in solid substrate fermentation. Biochemical Engineering Journal 13: 169-179. Tsiklauri ND, Khardziani TS, Kachlishvili ET, Elisashvili VI (1999) Cellulase and xylanase activities of higher basidiomycetes during bioconversion of plant raw materials depending on the carbon source in the nutrient medium. Applied Biochemistry and Microbiology 35: 291-295. Van de Lagemaat J, Pyle DL (2005) Modelling the uptake and growth kinetics of Penicillium glabrum in a tannic acid-containing solid-state fermentation for tannase production. Process Biochemistry 40: 1773-1782. Viccini G, Mitchell D, Boit S, Gern J, da Rosa A, Costa R (2001) Analysis of growth kinetic profiles in solid-state fermentation. Food Technology and Biotechnology Advances 39: 271-294. Walkley A, Black I (1934) An estimation of the Degtjareft method for determining of soil organic matter and a proposed modification of chromic acid titration method. Soil Science 37: 29-38. Wood TM, García CV (1994) Enzymes and mechanisms involved in microbial cellulolysis. Kluwer Academic publishers. Netherlands.
118
6. Selección de la Mejor Combinación Hongo – Formulación para la producción de polisacáridos mediante Fermentación en Estado Sólido con Pleurotus ostreatus, Coriolus versicolor y Lentinus edodes
119
Selección de la Mejor Combinación Hongo – Formulación para la producción de polisacáridos mediante Fermentación en Estado Sólido con Pleurotus ostreatus, Coriolus versicolor y Lentinus edodes
Sandra Montoya1, Óscar Julián Sánchez2*, Laura Levin3
RESUMEN
En esta investigación se realizó el cultivo de tres especies de hongos de pudrición blanca: Coriolus versicolor, Pleurotus ostreatus y Lentinus edodes sobre doce formulaciones de sustrato en estado sólido empleando mezclas de diversos materiales y sales de carbonato de calcio y dos niveles de sulfato de cobre (II). Los objetivos de este trabajo fueron i) evaluar los efectos de la relación C/N y del sulfato de cobre (II) sobre la producción de polisacáridos durante 49 días de fermentación en estado sólido; así como el consumo de celulosa y hemicelulosa y la degradación de lignina y ii) proponer un modelo matemático para la descripción de la producción de biomasa, de los polisacáridos, producción y consumo de azúcares reductores, consumo de celulosa y hemicelulosa y degradación de lignina. Las tres especies de hongos crecieron bien sobre todas las formulaciones de sustrato. Empero, hubo combinaciones para los cuales la producción de polisacáridos fue muy baja, como 23,282 mg/gss (g sustrato sólido) para la combinación P. ostreatus – F12, mientras que la mayor producción la exhibió C. versicolor – F2 con 96,085 mg/gss. Se propuso un modelo matemático compuesto de 6 ecuaciones diferenciales a fin de buscar la descripción de los datos experimentales de todas las combinaciones resultantes para C. versicolor, por haber sido el hongo que más cantidad de polisacáridos produjo; asimismo, se plantearon ecuaciones para describir la degradación de los sustratos lignocelulósicos. En este trabajo se presentan los resultados del modelamiento para las cuatro combinaciones especie de hongo-fórmula, F2, F4, F7 y F11 que arrojaron la mayor producción de polisacáridos en los 49 días de fermentación en fase sólida.
Palabras clave: hongos de pudrición blanca, relación C/N, producción de polisacáridos, degradación de materiales lignocelulósicos.
1. INTRODUCCIÓN
Los polisacáridos de los hongos macromicetos han sido reconocidos como excelentes inmunoestimuladores debido al potencial de sus propiedades terapéuticas, a que no son tóxicos y son escasos sus efectos secundarios en comparación con otros inmunoestimulantes. Estos polisacáridos bioactivos son producidos en cantidades relevantes a partir de los cuerpos fructíferos de los hongos, su micelio y además, de los filtrados obtenidos de sus cultivos en fermentación sumergida. En mayor medida las estructuras de los polisacáridos procedentes de los macromicetos corresponden a homoglicanos, heteroglicanos o complejos de gluco-proteínas. La fuente principal de polisacáridos antitumorales parecen ser sus paredes celulares, las cuales están compuestas de polisacáridos. En general, la actividad inmunomoduladora de los polisacáridos de los macromicetos está relacionada con las estructuras β-(1→3), β-(1→6) glucanos, α-(1→3) glucanos y complejos de polisacáridos de galactomananos y glucuromananos unidos a proteínas presentes en la pared celular de los macromicetos (Enshasy, 2010). El β-D-glucano es un polisacárido que produce exclusivamente D-glucosa luego de la hidrólisis ácida (Mizuno, 1999). Los polisacáridos obtenidos por fermentación sumergida con una adecuada selección del medio de cultivo, se denominan exopolisacáridos (EPS), ya que se excretan en el medio de cultivo durante el curso de la fermentación. Los intrapolisacáridos (IPS) pueden ser producidos a partir de los cuerpos fructíferos y su micelio después de haber sido sometido a diferentes procesos de extracción sólido-líquido utilizando
120 diferentes disolventes, desde agua caliente hasta diferentes mezclas de disolventes orgánicos (Amaral et al., 2008; Komura et al., 2010). Los exopolisacáridos de basidiomicetos de pudrición blanca juegan un rol importante en los procesos de crecimiento y desarrollo de estos organismos. Estos exopolisacáridos pueden inmovilizar las exoenzimas que ellos mismo excretan (Tang y Zhong, 2002). Según Catley (1992) el gel formado por estos biopolímeros previene la deshidratación de la hifa, permitiendo la adherencia de otras células a las superficies de los sustratos, posibilitando la selección de las moléculas del ambiente que los rodea (Maziero et al., 1999). Adicionalmente, estos biopolímeros tienen un amplio rango de aplicaciones industriales. Las diferentes especies de hongos producen diferentes tipos de polisacáridos con diversas propiedades y la estructura del polisacárido influye sobre la actividad biológica que se obtiene. Del mismo modo las estructuras químicas de los polisacáridos dependen de la fuente de donde provienen, el carpóforo, el micelio o el medio de cultivo, estos compuestos varían en sus estructuras moleculares, la unidad estructural que se repite (el monómero) y los pesos moleculares, entre otros factores (Tsukagoshi et al., 1984; Ishikawa et al., 1992; Hamlyn y Schmidt, 1994; Kobayashi et al., 1995; Zhuang y Mizuno, 1999; Chang y Miles, 2004; Mohammad-Fata et al., 2007). Por ejemplo, el lentinan un β-(1→3)-D- glucano extraído de L. edodes es una potente droga inmunoestimuladora licenciada en Japón para terapias antitumorales (Kupfahl et al., 2006). De igual forma se ha reportado actividad antitumoral de los complejos de polisacáridos extraídos del micelio o del cuerpo fructífero de hongos macromicetos, como el complejo proteína-polisacárido PSK del hongo C. versicolor (Ooi y Liu, 2000a), el complejo polisacárido- proteína del cultivo de Tricholoma lobayense (Liu et al., 1996a), exobiopolímeros de varias especies de Cordyceps a las cuales se les ha demostrado actividad antitumoral (Chen et al., 1997), inmunopotenciadora (Nakamura et al., 1999), actividad hipoglicémica (Kiho et al., 1999) y efecto hipocolesterolémico (Koh et al., 2003). Estos ejemplos son una muestra de la potencialidad que tienen los hongos como fuente de sustancias bioactivas para la obtención de potenciadores del sistema inmunológico, teniendo en cuenta que de las 140.000 especies de macromicetos que se estima existen en el planeta, solamente se conocen cerca del 10%, de las cuales sólo han sido examinadas desde su potencial inmunomodulador el 5% (Lindequist et al., 2005b). La suplementación de los sustratos es una estrategia para incrementar la producción de biomasa celular y una forma de mantener constante la producción de polisacáridos (Tang y Zhong, 2002). Asimismo, diferentes trabajos publicados en la última década evidencian la importancia de la presencia de aceites vegetales ricos en ácido oleico como promotores de crecimiento de la biomasa fúngica y por ende de sus polisacáridos constituyentes (Yang et al., 2000; Hsieh et al., 2008). Al momento de seleccionar el tipo de aceite vegetal o ácido graso a utilizar como inductor de polisacáridos es necesario considerar la composición de ácidos grasos del aceite; ya que ha sido reportado por varios investigadores que cantidades importantes de ácido linoleico suprimen la producción de biomasa y polisacáridos, mientras que la presencia de ácido oleico promueve su producción (Park et al., 2002a; Hsieh et al., 2006; Hsieh et al., 2008). Los aceites de soya y de oliva han sido utilizados como promotores de crecimiento celular y de polisacáridos en cultivos de macromicetos, tanto líquidos como sólidos. Al respecto, el aceite de oliva contiene 84% de ácido oleico y entre 30 y 60% en aceite de soya con bajos contenidos de ácido linoleico (Wade, 1993; Hsieh et al., 2008). En general, el proceso de determinación de intra y exo-polisacáridos se inicia mediante la medición de la cantidad de polisacáridos como carbohidratos totales presentes en una muestra seleccionada. Estos polisacáridos corresponden a los contenidos en los cuerpos fructíferos de los hongos, al micelio o a los presentes en los caldos de cultivo de fermentaciones sumergidas. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la relación carbono nitrógeno y del sulfato de cobre (II) sobre la producción de polisacáridos por tres especies de hongos de pudrición blanca (L. edodes, C. versicolor y P. ostreatus) empleando doce formulaciones diferentes de medios de cultivo por fermentación en estado sólido en fase vegetativa. Estos hongos fueron seleccionados de entre diez hongos de pudrición blanca mediante un rastreo basado en la medida de los polisacáridos como carbohidratos totales; los resultados de este rastreo se relacionan en el artículo anterior. Igualmente este trabajo tuvo
121 como objetivo adicional proponer y validar un modelo matemático para la mejor combinación hallada especie de hongo - formulación a fin de realizar la descripción de la cinética de crecimiento del organismo, y la producción de polisacáridos en condiciones de fermentación en estado sólido.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Microorganismos
Tres especies de basidiomicetos fueron empleados para la producción de polisacáridos en fermentación en estado sólido, tomadas de la colección de hongos de la Universidad de Caldas (Manizales, Colombia): Lentinula edodes del Centro de Investigaciones del Café, Chinchiná, Caldas, Colombia (CICL54), Coriolus versicolor de Pennsylvania State University, Estados Unidos de Norte América (PSUWC430), y Pleurotus ostreatus de la Colección interna de la Universidad de Caldas (UCC001). Las cepas fueron extendidas sobre agar papa dextrosa (PDA) y mantenidas en refrigeración a 4°C y transferencias periódicas.
2.2. Producción de semilla
La semilla para la inoculación de los medios de cultivo sólidos se realizó sobre trigo lavado, hidratado con agua caliente hasta 40% de humedad. El trigo hidratado fue empacado en unidades de 1 kg en bolsas de polipropileno biorientado, provistas con un filtro de interlón en el primer tercio de la parte superior de la bolsa de una pulgada de lado. Posteriormente, el grano fue esterilizado a 121°C por 30 minutos aplicando el método Thindal. Finalmente el grano hidratado y esterilizado fue inoculado a una tasa del 4% en base húmeda con cada especie de hongo en cabina de flujo laminar y llevadas a incubación por 12 a 15 días a 25°C y penumbra hasta colonización completa.
2.3. Medios de cultivo
Se realizaron doce formulaciones de sustrato por triplicado. Los sustratos fueron formulados en base seca, con 40% de aserrín de roble, 20% de capacho de coco y 2% de aceite de soya como materias primas fijas en todas las formulaciones y variando los porcentajes de cascarilla de café y salvado de maíz a fin de modificar la relación carbono nitrógeno (R C/N) (ver Tabla 1) y dos niveles de sulfato de cobre: 0,1596% para las fórmulas impares y 0,0798% para las fórmulas pares. Todos los sustratos fueron formulados a 60% de humedad. Los sustratos fueron empacados en bolsas de polipropileno biorientado en unidades de 200 g cada una y esterilizados a 121°C por 30 min aplicando el método Thindal. Posteriormente fueron inoculados en cabina de flujo laminar con 4% de inóculo en base húmeda respecto al sustrato. Éstos fueron llevados a incubación a 25°C en penumbra por 49 días. Se tomaron 15 muestras, dos por semana, tomándose la primera muestra el día de la inoculación.
Tabla 1. Relaciones carbono nitrógeno (R C/N) en doce niveles (formulaciones) F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12
142,640 91,77 114,61 93,64 100,92 91,79 85,34 84,87 55,11 51,55 114,55 111,05
2.4. Determinación de la relación carbono nitrógeno
La relación carbono nitrógeno (C/N) fue determinada a partir de la medida de la materia orgánica de las doce formulaciones de sustratos empleando el método de Walkley y Black (1934), el cual utiliza ácido sulfúrico concentrado y solución de dicromato de potasio. La muestra se lee a 585 nm. La cantidad
122 de carbono total corresponde al 58% de la materia orgánica. El nitrógeno orgánico total fue determinado por el método de Kjeldahl (Kjeldahl, 1883).
2.5. Determinación de polisacáridos como carbohidratos totales
Los polisacáridos fueron extraídos de 0,1g de sólido seco en 5mL de etanol concentrado grado reactivo, sometido a ultrasonido por 20 min, con posterior reposo por 24 horas. Luego se realizó una filtración al vacío, el filtrado fue centrifugado por 20 min a 14.000 rpm descartando el sobrenadante. El precipitado (la muestra) fue resuspendida en NaOH 1N a 60°C por 1 hora, posteriormente, la suspensión fue sometida al método fenol-sulfúrico para determinar la cantidad de carbohidratos totales a 490 nm (Dubois et al., 1956).
2.6. Cuantificación del contenido de N-acetil-D-glucosamina (NAGA) y biomasa
Las muestras de sustrato fueron colectadas en 15 tiempos de incubación, dos por semana, hasta el día 49 de incubación para las tres especies de trabajo. El sustrato sólido incubado a diferentes tiempos fue secado en estufa a 101°C hasta peso constante, molido y almacenado en lugar fresco y seco para la determinación del contenido de quitina. El contenido de biomasa fúngica en los sustratos sólidos fue indirectamente estimado por la determinación del contenido de N-acetil-D-glucosamina (NAGA) después de la hidrólisis con HCl 6N grado analítico según el método de Plassard et al. (1982). Para ello se cuantificó paralelamente el contenido de NAGA por g de micelio en cada una de las tres especies, cultivándolas en medio líquido. El contenido de NAGA del micelio de cada una de las especies de hongos de trabajo: C. versicolor, P. ostreatus y L. edodes fue determinado del desarrollo del micelio en medio líquido en matraces de 250 mL con 100 mL de medio de cultivo con la siguiente composición: glucosa (30 g/L), extracto de levadura (6 g/L), SO4Mg.5H2O (0,5 g/L), K2HPO4 (0,5 g/L) y CaCl2 (0,1 g/L). El tiempo de fermentación para el crecimiento del hongo fue de 25 días, en agitación a 100 rpm de agitación. Los compuestos solubles en agua fueron extraídos durante la hidrólisis con HCl 6N por tres horas.
2.7. Cuantificación de de los componentes de la fibra y azúcares reductores
Se determinaron los componentes de la fibra (celulosa, hemicelulosa y lignina) de los sustratos de cada una de las formulaciones en 15 tiempos durante los 49 días de incubación, así como de la fracción soluble, empleando los resultados de la determinación de fibras detergente neutra, ácida y lignino-ácida. La medición se realizó a una muestra seca y molida de sustrato; dicha muestra se sometió a tres hidrólisis en serie (cada una de 75 min): i) hidrólisis con lauril sulfato de sodio y otros, ii) hidrólisis en solución de bromuro de amonio en ácido sulfúrico 1N, y iii) hidrólisis con ácido sulfúrico al 72% (p/v). Al finalizar cada hidrólisis, las muestras fueron lavadas y secadas a 105°C hasta peso constante (Leterme, 2010a). El contenido de azúcares reductores como glucosa fue determinado por el método del ácido dinitrosalicílico (DNS) (Miller, 1959).
2.8. Diseño experimental
Se planteó un diseño experimental bifactorial con la especie a tres niveles y doce formulaciones de sustrato. Las formulaciones varían en su relación C/N y la concentración de sulfato de cobre (II). Las variables independientes en este diseño experimental fueron la especie de hongo, la formulación del sustrato y el tiempo de fermentación. Las variables de respuesta medidas fueron la producción de biomasa, de polisacáridos, producción y consumo de azúcares reductores y la degradación de la celulosa en 15 tiempos durante 49 días de fermentación en estado sólido.
123
2.9. Modelamiento matemático del crecimiento del hongo y la producción de enzimas
Para la solución de los modelos matemáticos del proceso de fermentación en estado sólido se utilizó el software Matlab® 2010b (MathWorks, EUA) en un PC de 3 GB de memoria RAM y un procesador Intel CORE-i3 de 2,13 GHz. Para los modelos matemáticos planteados en ecuaciones diferenciales ordinarias se utilizó el comando ode45 que está basado en una fórmula explícita de Runge- Kutta (4,5) usando un par de Dormand-Prince (Dormand y Prince, 1980) y el comando ode15s basado en una fórmula de orden variable que funciona mediante fórmulas de diferenciación numérica.
2.10. Análisis estadístico
Para todos los análisis estadísticos del presente trabajo se utilizó el software Matlab ® 2010b. Este análisis se realizó en tres etapas. Primero se realizó un ANOVA a todos los datos del diseño experimental y sus posibles combinaciones: especie, fórmula y tiempo de fermentación mediante el comando anovan. Luego se realizó un análisis comparativo (Kruskal Wallis) de la producción de polisacáridos para cada especie de hongo estudiado y las doce formulaciones de sustratos mediante los comandos kruskalwallis y multcompare. Para evaluar si el modelo matemático propuesto describe adecuadamente los datos experimentales, se realizó una prueba F de una cola que parte de las siguientes hipótesis:
S 2 residuales, Fi H0 :12 Sdatosexp, F i S 2 H :1residuales, Fi 1 S 2 datosexp, Fi
2 Donde: Fi está dado para i = 1,2,…,12, s residuales es la varianza de los residuales (desviaciones de los datos experimentales con respecto a los valores calculados por el modelo matemático) y se calcula para cada 2 variable de respuesta medida y s datos exp es la varianza de la serie experimental de cada variable de respuesta medida. Para estos análisis se utilizaron los comandos vartest y vartest2 de Matlab. Con las varianzas de los residuales obtenidos para cada serie experimental se calcularon los porcentajes de cada una respecto a la serie que dio la mayor varianza de residuales a fin de mostrar el ajuste de los datos experimentales al modelo matemático propuesto de forma más simple.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. Efecto de la relación C/N y sulfato de cobre sobre la producción de biomasa y polisacáridos
Las tres especies de hongos (C. versicolor, P. ostreatus y L. edodes) probadas en el diseño experimental, fueron inoculadas e incubadas bajo las mismas condiciones ambientales en las doce formulaciones de sustrato. El intervalo de la relación C/N en las doce formulaciones de sustrato evaluadas fue de 50 a 140 con una variación en los contenidos de nitrógeno de 0,29 a 0,8% en base seca y dos niveles de CuSO4. Las tres especies de hongos se desarrollaron bien en todas las formulaciones evaluadas, sin aparente inhibición en el crecimiento de los tres organismos de trabajo en las cuales, probablemente los contenidos de nitrógeno de las formulaciones estimularon el crecimiento de los macromicetos durante la fase vegetativa y los dos niveles de sulfato de cobre no afectaron el crecimiento de los hongos, de hecho es evidente el incremento en el contenido de biomasa como se observa en las Figuras 1 y 2 en todos los casos desde el inicio de la fase de incubación. Empero se debe tener en cuenta que la variación del
124 contenido de nitrógeno y de la fuente de carbono se realizó empleando los mismos materiales y no modificando las fuentes de nitrógeno y de carbono. Las tres especies de hongos mostraron crecimiento homogéneo durante los 49 días de fermentación sobre la mayoría de las formulaciones, con incremento sostenido para nueve de las 12 formulaciones, exceptuando las formulaciones F3, F4 y F5, las cuales presentaron un ascenso más lento. Sin embargo, todas las combinaciones mostraron bajos períodos de adaptación y tendencia a la fase estacionaria después del día 30 de incubación, tiempo en el que se había alcanzado la colonización completa. Las combinaciones de las tres especies de hongos con la F3 fueron las que presentaron un crecimiento diferente al de las demás, ya que como se observa en la Figura 1C la biomasa parece estar en la fase logarítmica hasta el día 49 de incubación, especialmente en la combinación con L. edodes. Del mismo modo, es importante tener en cuenta que las diferentes especies de hongos pueden tener dependencia de las diferentes fuentes de carbono y esto provocar en ellos la variación en su crecimiento y en la formación de los tipos de polisacáridos presentes en su pared celular y los exopolisacáridos que excretan al medio. Según Xiao et al. (2010) la producción de polisacáridos y el crecimiento de la biomasa de las diferentes especies de hongos dependen directamente de la fuente de carbono suministrada, lo que sugiere que la composición del medio puede influir en la composición y el mecanismo de producción tanto de los intra como de los exopolisacáridos para una determinada especie de hongo. Asimismo, la cantidad y fuente de nitrógeno en la producción de los polisacáridos de los hongos y su influencia en su crecimiento y desarrollo es definitivo, ya que el nitrógeno es un componente esencial de las proteínas y ácidos nucleicos y su deficiencia afecta el crecimiento de los hongos y los metabolitos que producen durante su crecimiento y desarrollo (Xiao et al., 2006). La fuente de nitrógeno utilizada en este trabajo fue únicamente la proveniente de materiales orgánicos naturales, ya que variando los contenidos de cascarilla de café y salvado de maíz en las formulaciones de sustrato se obtuvo la variación de las relaciones C/N, con un intervalo en los contenidos de nitrógeno entre 0,29 y 0,8% en base seca, razón por la cual probablemente las tres especies de hongos crecieron sobre todas las formulaciones evaluadas. Sin embargo, el crecimiento de las tres especies de hongos no fue igual para las 12 formulaciones, ni la producción de polisacáridos como se observa en las Figuras 1, 2, 3 y 4. De hecho, las combinaciones que mostraron mejor producción de polisacáridos fueron para C. versicolor con F2, F4, F7 y F11, pero no fue el C. versicolor el que mayor cantidad de biomasa produjo para estas mismas formulaciones; ya que fue el L. edodes el hongo que mayor cantidad de biomasa produjo para esas mismas formulaciones. Empero, es necesario tener en cuenta que en este trabajo se está determinando la cantidad total de polisacáridos de sustratos sólidos colonizados con tres especies de hongos y no se está diferenciando entre los intra y los exopolisacáridos, ni en la estructura de los mismos, siendo este aspecto relevante al momento de definir la especie de hongo para la producción de polisacáridos. En las combinaciones de P. ostreatus con F7, F9, F10 y F12 se observó una muy baja producción de polisacáridos durante todo el tiempo de la fermentación como se observa en la Figura 3, del orden de 20 mg/gss o menos; también para estas cuatro combinaciones se detectó una menor producción de biomasa en comparación con las demás combinaciones, del orden de 300 mg/gss (g sustrato sólido), lo que permite inferir que sí hay una relación directa entre la producción de biomasa y la producción de polisacáridos. Sin embargo, no hay un factor común bien definido al que se le pueda atribuir la baja producción de biomasa y de polisacáridos para P. ostreatus en estas cuatro combinaciones, ya que las relaciones C/N de cada una de estas formulaciones fueron F7:85, F9:55, F10:51 y F12:111, para las cuales habría cierta relación entre los contenidos de F9 y F10, pero no podría hacerse la misma relación para F7 y F12. De igual modo no fue claro el efecto de la sal de cobre, ya que para las formulaciones impares se adicionó 0,1596% y para las formulaciones pares 0,0798% en base seca y en este caso las bajas producciones se reflejaron en formulaciones con ambas participaciones de sulfato de cobre. No obstante, debe considerarse la composición de los sustratos utilizados en este estudio, su procedencia y la alta variabilidad en la calidad de las materias primas, ya que éstas fueron residuos lignocelulósicos, pudiendo haber generado cambios en la composición química y características físicas de los sustratos; además de tener en cuenta que durante la fermentación pudieron haberse producido sustancias intermedias que hayan
125 generado una disminución en la velocidad de crecimiento de este hongo sobre estas formulaciones de sustrato y por ende la disminución en la velocidad de formación de los polisacáridos. A pesar de todo el esfuerzo que se ha dado para explorar el efecto de las condiciones de cultivo en la producción de polisacáridos de hongos, la mayoría de las investigaciones giran en torno a la producción de exopolisacáridos por fermentación sumergida y muy pocas en torno a la producción de intrapolisacáridos y son aún menos las referidas a la producción de polisacáridos contenidos en el micelio de los sustratos sólidos colonizados por macromicetos (Lee et al., 1999; Shu y Lung, 2003; Lee et al., 2004; Wu et al., 2004; Wu et al., 2006; Lee et al., 2007b). Sin embargo, es razonable esperar que la producción de ambos tipos de polisacáridos, IPS y EPS podrían estar vinculados uno con otro, por la misma dependencia con el crecimiento de la biomasa (Lama et al., 1996). Por lo tanto, las características físico-químicas de los medios de cultivo y condiciones medioambientales siempre deberán ser tenidas en cuenta a fin de satisfacer la producción de intra y exo-polisacáridos acorde con las necesidades particulares de la especie de hongo a utilizar.
Figura 1. Producción de biomasa de tres especies de hongos C. versicolor, P. ostreatus, L. edodes sobre seis formulaciones de sustratos diferentes. A: F1, B: F2, C: F3, D: F4, E: F5, F: F6
Figura 2. Producción de biomasa de tres especies de hongos C. versicolor, P. ostreatus, L. edodes sobre seis formulaciones de sustratos diferentes. A: F7, B: F8, C: F9, D: F10, E: F11, F: F12
126
3.2. Producción de polisacáridos en la mejor combinación resultante del diseño experimental
Los datos experimentales obtenidos en el presente estudio fueron sometidos a un proceso de selección a fin de lograr la mejor combinación especie de hongo fórmula del diseño experimental bifactorial respecto a la producción de polisacáridos, el cual se realizó por etapas. Primero se hizo un análisis de varianza, ANOVA a tres vías (especie, fórmula, tiempo) para los polisacáridos obtenidos durante 15 tiempos en los 49 días de fermentación; se obtuvieron diferencias significativas para todas las combinaciones con un valor-p < 0,05. Posteriormente, se realizó un análisis por especie y una selección de los máximos de cada una de las cantidades de polisacáridos obtenidos y un análisis comparativo de los máximos (empleando la función multcompare) y aplicando una prueba de Kruskal-Wallis, obteniéndose diferencias significativas con valor-p < 0,05. De este análisis comparativo se obtuvo que la mejor combinación para la producción de polisacáridos fue C. versicolor – F11 seguida de las combinaciones con F2, F4 y F7. A estas cuatro combinaciones se les realizó un análisis comparativo a fin de seleccionar de entre las cuatro combinaciones la de mejor comportamiento respecto a la producción de polisacáridos y aplicar un modelo matemático que describa los datos experimentales de producción de biomasa, de polisacáridos, de producción y consumo de azúcares reductores, de consumo de celulosa y de degradación de lignina. Sin embargo, el análisis comparativo no presentó diferencia significativa (valor-p = 0.212), por lo que se aplicó el modelo matemático a las cuatro combinaciones de C. versicolor.
Figura 3. Polisacáridos de tres especies de hongos: C. versicolor, P. ostreatus, L. edodes sobre seis formulaciones de sustratos. A: F1, B: F2, C: F3, D: F4, E: F5, F: F6 en 49 días de fermentación en estado sólido
En la Tabla 2 se presentan los datos de las producciones de biomasa, polisacáridos y la relación de la producción de polisacáridos con la producción de biomasa (producción específica de polisacáridos) a los 49 días de fermentación (final del período), en la que se observó que la mayor producción de biomasa por combinación fue de 377.133, 353.795 y 366.653 mg/gss para C. versicolor – F11, P. ostreatus – F10 y L. edodes – F6 respectivamente; la máxima producción de polisacáridos fue de 96.85 mg/gss, 90.78 mg/gss y 87.454 mg/gss para las combinaciones C. versicolor –F2, P. ostreatus – F6 y L. edodes – F3 respectivamente. Sin embargo, la producción específica de polisacáridos no correspondió estrictamente a las combinaciones que arrojaron las máximas producciones de polisacáridos, por ejemplo para la combinaciones de C. versicolor, la máxima producción de polisacáridos específica fue para F3 con 0.385, mientras que para F2 se obtuvo 0.297, seguido de F11 con 0.247; de igual forma, para P. ostreatus la mayor producción específica de polisacáridos fue para la F5 con 0.399, seguido de F6 con 0.259; para L. edodes la mayor producción específica fue para F3 con 0.407 y F5 con 0.394. De lo anterior, se puede inferir que además de la importancia que tiene la cantidad de polisacáridos producidos, otro importante parámetro es la relación de producción de polisacáridos respecto a la cantidad de biomasa producida, al
127 momento de tomar decisiones en torno a la producción de polisacáridos por fermentación en fase sólida buscando mejorar las condiciones de proceso y los rendimientos. Como ya se mencionó, la producción de polisacáridos a partir del micelio obtenido de fermentación en fase sólida no ha sido ampliamente estudiada, probablemente porque cuando se produce un sustrato sólido para sembrar alguna especie de macromiceto se busca la producción de los cuerpos fructíferos, en los que los contenidos de polisacáridos son bastante altos. Sin embargo, en este trabajo se determinó el contenido de polisacáridos de los sustratos sólidos colonizados con tres especies de hongos en 15 tiempos durante 49 días de fermentación a fin de mostrar la importancia que tienen los basidiomicetos en la obtención de nuevos productos como son los alimentos para animales, en este caso en particular, para rumiantes. Varios investigadores coinciden en que es necesario el desarrollo de nuevos productos que mejoren la calidad de la alimentación de animales de cría, como los bovinos, y que además estos alimentos deben ser coadyuvantes a fin de incrementar la salud del animal (Koutinas et al., 2004; Graminha et al., 2008). Lo anterior demuestra la importancia de este estudio, ya que las materias primas utilizadas para las formulaciones de los sustratos fueron residuos lignocelulósicos, los cuales son potencialmente utilizados como alimento para rumiantes. Los sustratos fueron colonizados por las tres especies de hongos de pudrición blanca obteniendo como resultado una conversión de los materiales lignocelulósicos que componen los sustratos como se observa en las Figuras 5, 6 y 7. Asimismo, los componentes de la fibra del material lignocelulósico presente en los sustratos fueron degradados. Los polímeros de celulosa y hemicelulosa fueron degradados por acción de las enzimas hidrolíticas de los hongos a azúcares reductores a fin de conseguir la fuente de energía necesaria para su crecimiento y desarrollo (Ângelo, 2004). La lignina, fue degradada por óxidorreductasas excretadas por estos hongos que, como agentes causantes de pudrición blanca, son los únicos hongos capaces de degradarla completamente, facilitando en el proceso el acceso a la celulosa (Kirk y Farrel, 1987b). Sin embargo, estos polímeros no fueron consumidos por el hongo en su totalidad luego de 49 días de fermentación (ver Figuras 5, 6 y 7), hecho que se hace favorable para que los sustratos colonizados por estos hongos sean potencialmente utilizados en alimentación de rumiantes, ya que en estos sustratos permanece una apreciable cantidad de celulosa y hemicelulosa y un contenido bajo de lignina. El aumento de la digestibilidad mediada por la acción enzimática del hongo, el incremento del contenido de proteína con la colonización fúngica al cabo de 49 días de fermentación y la presencia de polisacáridos fúngicos que pueden favorecer la salud de los animales, contribuyen a mejorar las características de estos residuos lignocelulósicos para satisfacer las necesidades de alimentación bovina. Según Weinberg (2000) el uso de sustratos agotados de la producción de hongos macromicetos, como Pleurotus sp., L. edodes, Ganoderma sp., Agaricus bisporus y otros o el empleo de hongos de pudrición blanca para deslignificar los materiales lignocelulósicos son una alternativa para la producción de alimento para rumiantes, debido a que durante la fermentación en fase sólida con estos basidiomicetos, los materiales lignocelulósicos exhiben una bioconversión favorable en términos de disminución de lignina y producción de azúcares reductores que luego son utilizados por el animal en su digestión.
Tabla 2. Producción máxima de polisacáridos en doce fórmulas y las tres especies de hongos: C. versicolor, P. ostreatus y L. edodes durante 49 días de incubación C. versicolor P. ostreatus L. edodes Fórmula Bio Pol Rel. Bio Pol Rel. Bio Pol Rel. (mg/gss) (mg/gss) (Pol/Bio) (mg/gss) (mg/gss) (Pol/Bio) (mg/gss) (mg/gss) (Pol/Bio) F1 328,388 63,029 0,192 333,648 65,681 0,197 345,485 40,740 0,118 F2 323,785 96,085 0,297 332,333 70,669 0,213 346,142 63,147 0,182 F3 208,711 80,408 0,385 225,150 49,489 0,220 214,629 87,454 0,407 F4 351,902 91,057 0,259 334,604 88,207 0,264 309,318 57,763 0,187 F5 240,932 59,426 0,247 222,520 88,721 0,399 220,547 86,979 0,394 F6 360,808 76,726 0,213 350,711 90,780 0,259 366,653 75,063 0,205
128
F7 336,936 61,663 0,183 289,592 26,409 0,091 348,115 87,454 0,251 F8 346,910 61,083 0,176 345,485 47,589 0,138 329,703 37,534 0,114 F9 351,403 64,458 0,183 349,430 6,694 0,019 344,169 50,796 0,148 F10 341,424 40,911 0,120 353,795 24,430 0,069 323,127 73,599 0,228 F11 377,133 92,997 0,247 352,060 52,617 0,149 348,115 51,390 0,148 F12 362,138 61,801 0,171 331,671 23,282 0,070 350,986 78,705 0,224
Figura 4. Producción de polisacáridos de tres especies de hongos: C. versicolor, P. ostreatus, L. edodes en seis formulaciones de sustratos: A: F7, B: F8, C: F9, D: F10, E: F11, F: F12 en 49 días de fermentación en estado sólido
Figura 5. Degradación de celulosa por tres especies de hongos: C. versicolor, P. ostreatus, L. edodes sobre seis formulaciones de sustratos diferentes. A: F1, B: F2, C: F3, D: F4, E: F5, F: F6 en 49 días de fermentación en estado sólido
129
Figura 6. Degradación de hemicelulosa por tres especies de hongos: C. versicolor, P. ostreatus, L. edodes sobre seis formulaciones de sustratos. A: F1, B: F2, C: F3, D: F4, E: F5, F: F6 en 49 días de fermentación en estado sólido
Figura 7. Degradación delignina por tres especies de hongos: C. versicolor, P. ostreatus, L. edodes sobre seis formulaciones de sustratos. A: F7, B: F8, C: F9, D: F10, E: F11, F: F12 en 49 días de fermentación en estado sólido
3.5. Modelamiento matemático
Basado en los datos experimentales obtenidos de polisacáridos durante los 49 días de fermentación en estado sólido para las tres especies de hongos basidiomicetos de pudrición blanca: C. versicolor, P. ostreatus y L. edodes, se propuso un modelo matemático compuesto de 6 ecuaciones diferenciales (ver Tabla 3) a fin de ajustar los datos experimentales de todas las combinaciones resultantes para C. versicolor, ya que éste fue el hongo que mayor producción de polisacáridos mostró en todas las combinaciones medidas. De hecho, en este trabajo se presentan los resultados del modelamiento arrojados para las combinaciones C. versicolor con las formulaciones F2, F4, F7 y F11, ya que estas combinaciones fueron las que presentaron la mayor producción de polisacáridos. De igual forma, para comparar el ajuste de los datos experimentales al modelo matemático propuesto se planteó una prueba F de una cola, con la cual se obtuvieron las varianzas de los residuales entre los datos experimentales y el modelo, individualmente para cada variable medida, pero haciendo la comparación de cada ecuación aplicada para todas las formulaciones de F1 a F12 en la misma especie, en este caso C. versicolor, lo que permitió probar la bondad del ajuste del modelo en términos de la mejor representación de los datos experimentales obtenidos.
130
Con el modelo matemático propuesto se plantea la descripción de producción de biomasa, los azúcares reductores como producto intermedio consumido durante la misma fermentación, el consumo de celulosa, hemicelulosa y la degradación de lignina. Asimismo, los datos experimentales obtenidos en esta investigación serán ajustados al modelo planteado a fin de contribuir con nuevas propuestas en el camino al planteamiento de modelos matemáticos más complejos que permitan la descripción de los procesos de fermentación en fase sólida con fines industriales. Varias ecuaciones cinéticas de complejidad variable, tales como la ecuación lineal, logística, de dos fases o la ecuación de Monod han sido utilizadas por diferentes investigadores a fin de buscar la descripción de la producción de biomasa en procesos de fermentación en estado sólido (Sangsurasak et al., 1996; Viccini et al., 2001). De las expresiones matemáticas utilizadas, la más frecuente es la ecuación logística, debido probablemente a la forma simple de la expresión. El modelo propuesto consignado en la Tabla 3 para la descripción de la biomasa es la ecuación (1), la cual corresponde a la ecuación logística modificada por Mitchell et al. (1999). Para describir la variación de los azúcares reductores en el tiempo se propuso la ecuación (2) que correspondió a un factor de producción constante que afecta la derivada de la velocidad de producción de biomasa, debido a que los azúcares reductores son considerados un producto de la fermentación que es consumido por el mismo hongo como fuente de energía y su variación se ajustó más a la velocidad de variación de la biomasa que a la variación de la biomasa misma. Para la degradación de lignina y los consumos de hemicelulosa y celulosa en el tiempo de fermentación se plantearon las ecuaciones (3), (4) y (5) cuyo planteamiento se realizó en función de las concentraciones de las enzimas específicas responsables de la degradación de cada uno de los sustratos. La producción de los polisacáridos fue expresada por la ecuación de Luedeking y Piret (1959) dada por la ecuación (6) que representa la producción de metabolitos en procesos de fermentación. Los parámetros de cada una de las ecuaciones consignadas en la Tabla 3 se describen en la Tabla 4. La fermentación en estado sólido es un proceso heterogéneo que se ve afectado además por las condiciones ambientales. La dificultad que representa la determinación del crecimiento de la biomasa, el consumo de los sustratos y la imposibilidad de determinar todas las sustancias intermedias que pueden generarse como producto de las reacciones bioquímicas durante las fases de incubación ha dificultado la descripción de los procesos de fermentación en estado sólido y su escalamiento cuando se pretende aplicar estos procesos en producción industriales de alguna sustancia de interés (Pal et al., 1995b; Sarikaya y Ladisch, 1997; Pandey et al., 2000; Moreira et al., 2003). Asimismo, afecta también, la heterogeneidad de las materias primas utilizadas para el crecimiento y desarrollo de los hongos de pudrición blanca, compuestas principalmente del complejo lignocelulósico (Viccini et al., 2001; Pradeep y Datta, 2002). Los hongos basidiomicetos como los utilizados en el presente estudio contienen quitina en su pared celular. Debido a que en los procesos de fermentación en estado sólido no es posible determinar directamente la cantidad de biomasa, se determinó el contenido de quitina a través de la cuantificación de N-acetil-D-glucosamina (NAGA) en todos los tiempos de la fermentación. Además, se le determinó el contenido de NAGA al micelio seco obtenido de cultivo líquido a cada una de las tres especies de trabajo, obteniendo como resultado 15,83% (p/p) en P. ostreatus, 14,15% (p/p) en C. versicolor y 10,08% (p/p) en L. edodes. Estos porcentajes de NAGA fueron utilizados para calcular la cantidad de biomasa de los sustratos sólidos en cada uno de los tiempos de fermentación; por lo que estos datos de biomasa fueron los que se sometieron al modelamiento con la ecuación (1). Se aplicó el modelo matemático propuesto de seis ecuaciones a todos las combinaciones de C. versicolor a fin de determinar la capacidad del modelo para describir diferentes datos experimentales obtenidos para una misma especie. En las Figuras 8, 9, 10 y 11 se muestran el ajuste de los datos experimentales en contraste con el modelo matemático para las combinaciones de C. versicolor con F2, F4, F7 y F9, las cuales fueron seleccionadas como las de mayor producción de polisacáridos durante los 49 días de fermentación en estado sólido. Los porcentajes de ajuste para la descripción del modelo matemático propuesto sobre los datos experimentales de las cuatro combinaciones de C. versicolor con F2, F4, F7 y F11 se resumen en la Tabla 6; en la que se observa que el mejor ajuste de los datos experimentales obtenidos para cada variable medida fue: biomasa, F7 (98%); azúcares reductores, F7 (90%); polisacáridos, F7 (92%); hemicelulosa, F2 y F7 (60%); celulosa, F2 (95,7%) y lignina, F2 (88%). Por lo anterior, el modelo matemático propuesto no hace una descripción
131 apropiada para todas las variables medidas, ni para todas las series de datos experimentales, pero sí es una aproximación a la búsqueda de modelos matemáticos que permitan la descripción de procesos de fermentación en fase sólida para producir diferentes tipos de biosustancias o la trasformación de diversos materiales con fines de escalamiento industrial.
Tabla 3. Modelo matemático para la descripción de producción de biomasa, consumo de la matriz lignocelulósica y producción de polisacáridos Ecuación Descripción n dCbb C mb.1C (1) Biomasa dt C bm n dC dC C AR qn. .bb . 1 1 . Azúcares pm reductores dt dt Cbm (2) dC L k.. C C (3) Lignina dt L lac MnP dC HM kC. (4) Hemicelulosa dt HM ENX dC C k.. C C dt C ENG EXG (5) Celulosa
dC dC POLkb. b .C (6) Polisacáridos dtPOL dt b
Tabla 4. Parámetros de las ecuaciones del modelo matemático. Parámetro Significado -1 µm Velocidad específica de crecimiento de la biomasa (día ) Cbm Concentración de biomasa máxima (mg/gss) n < 1 el organismo es relativamente sensible a la auto-inhibición y ésta ocurre para valores muy bajos de Cb N n = 1 ecuación logística n > 1 el organismo es relativamente resistente a la auto-inhibición y ésta ocurre solo cuando Cb ≈ Cbm Cb0 Concentración de biomasa máxima (mg/gss) qp Coeficiente de producción constante de azúcares reductores (día) CAR0 Concentración inicial de azúcares reductores (mg/gss) kL Coeficiente de degradación de lignina (mg.gss/día.U) CL0 Concentración inicial de lignina (mg/g ss) kHM Coeficiente de consumo de hemicelulosa (mg/día.U) CHM0 Concentración inicial de hemicelulosa (mg/gss) 2 kC Coeficiente de consumo de celulosa (mg.gss/día.U ) CC0 Concentración inicial de celulosa (mg/g ss) kPOL Coeficiente de producción de polisacáridos (mg/mg) -1 B Velocidad específica de producción de polisacáridos (día )
132
Figura 8. Ajuste de datos experimentales de la producción de biomasa y de polisacáridos y la degradación de celulosa, hemicelulosa y lignina para la combinación C. versicolor – F2 durante 49 días de fermentación en fase sólida
Figura 9. Ajuste de datos experimentales de la producción de biomasa y de polisacáridos y la degradación de celulosa, hemicelulosa y lignina para la combinación C. versicolor – F4 durante 49 días de fermentación en fase sólida
133
Figura 10. Ajuste de datos experimentales de la producción de biomasa y de polisacáridos y la degradación de celulosa, hemicelulosa y lignina para la combinación C. versicolor – F7 durante 49 días de fermentación en fase sólida
Figura 11. Ajuste de datos experimentales de la producción de biomasa y polisacáridos y la degradación de celulosa, hemicelulosa y lignina para la combinación C. versicolor – F11 durante 49 días de fermentación en fase sólida
Aunque existen numerosas investigaciones previas acerca de la producción de polisacáridos fúngicos, éstas giran en torno a los procesos de fermentación sumergida y no a la producción de polisacáridos de la fase vegetativa en procesos de fermentación en fase sólida, en la que además de producir polisacáridos también ocurre la degradación de materiales lignocelulósicos. Se requiere aun mayor información sobre las cinéticas de formación de biomasa, de producción de polisacáridos, del consumo de nutrientes y degradación de la lignina que permitan la descripción del proceso global y posterior escalado para la obtención de alguno de los productos de interés como los que se plantean en este estudio. El planteamiento de las ecuaciones para la descripción de la cinética de cada una de las variables medidas se realizó bajo la premisa de darle a cada expresión matemática algún sentido biológico respecto al compuesto a describir. Las expresiones propuestas representaron aceptablemente cada una de las variables medidas, ya que durante los procesos de fermentación en fase sólida cuando se utilizan como sustratos mezclas de materiales lignocelulósicos pueden producirse una gran cantidad de sustancias intermedias producto de las reacciones bioquímicas. Contemplar productos intermedios originados por la acción del metabolismo de estos hongos, contribuiría a una interpretación más acabada de los complejos fenómenos que ocurren durante el crecimiento de los macromicetos en los sustratos lignocelulósicos.
Tabla 5. Parámetros de ajuste de los datos experimentales al modelo para cuatro combinaciones de C. versicolor para la producción de polisacáridos Parámetro F2 F4 F7 F11
µm 41.664 43.2515 4.9462 28.6281
Cbm 314.1649 423.6859 348.12 357.8715 n 0.005335 0.002518 0.002282 0.004069 Cb0 47.8261 12.3485 34.7 27.9885 qp 0.1 0.7696 0.2686 0.7 CAR0 6.5 7.5 8 5.2
kL 0.02072 0.006017 0.007841 0.009598 CL0 211.62 194,14 200 207.25
kHM 0,04294 0.03174 0.05629 0.06197 CHM0 210.98 200.87 199.96 205.55
kC 0.005306 0.06209 0.01002 0.01059 CC0 493.29 475.65 499.35 490.041 kPOL 0.1413 0.06512 0.05862 0.1093
b 0.005059 0.0063 0.004031 0.0051
134
Tabla 6. Ajuste (%) de la descripción del modelo matemático a los datos experimentales de cuatro combinaciones de C. versicolor con cuatro formulaciones para la producción de polisacáridos en fermentación en estado sólido Azúcares Fórmula Biomasa Polisacáridos Celulosa Hemicelulosa Lignina reductores F2 91 55 25 95,7 60 88 F4 1 72,5 60 70 20 40,5 F7 98 90 92 85,7 60 64 F11 80 61 1 1 6,6 71,4
4. Conclusiones
En el presente estudio, las tres especies de hongos de pudrición blanca probadas sobre las doce formulaciones de sustrato propuestas crecieron bien durante los 49 días de fermentación en fase sólida, por lo que se concluye que tanto la relación C/N como las concentraciones de CuSO4 no afectaron drásticamente el crecimiento y desarrollo de ninguno de los tres hongos. Sin embargo, de la evaluación detallada de los datos experimentales sí se observaron diferencias en la producción de los polisacáridos y en la producción específica de los mismos durante los 49 días de fermentación, en la que se observó que la mayor producción de biomasa fue para la combinación C. versicolor – F11 (377.133 mg/gss), aunque esta combinación no haya sido la de mayor producción de polisacáridos, pues la combinación C. versicolor – F2 fue la que arrojó la mayor cantidad de polisacáridos con 96,085 mg/gss. Asimismo, la combinación que mayor conversión mostró de polisacáridos referida a la cantidad de biomasa seca fue L. edodes – F2, aspecto que puede ser de utilidad al momento de escalar los procesos. El modelo matemático planteado en este estudio para la representación de los procesos de fermentación en estado sólido se realizó buscando describir el desarrollo de tres hongos de pudrición blanca sobre sustratos lignocelulósicos a fin de buscar puntos generales de interpretación de estos procesos que por ser tan heterogéneos se hacen complejos y carecen de expresiones matemáticas que permitan el escalamiento de los mismos con fines industriales, evitando hacer experimentación individual de cada proceso.
Agradecimientos
Los autores agradecen a la Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados de la Universidad de Caldas (Colombia) por la financiación del presente trabajo y al Instituto de Biotecnología Agropecuaria de la misma institución por el apoyo material y de infraestructura. Asimismo, los autores expresan sus agradecimientos a la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad de Buenos Aires (Argentina) por su apoyo y asesoría durante la realización de este trabajo.
Referencias
Amaral A, Carbonero E, Simao R, Kadowaki M, Sassaki G, Osaku C, Gorin P, Lacomini M (2008) An unusual water-soluble B- glucan from the basidiocarp of the fungus Ganoderma resinaceum. Carbohydrate Polymers 72: 473-478. Ângelo AS (2004) Enzimas hidrolíticas. En Esposito, Azevedo JI (Eds.) Fungos: Uma Introducâo à biologia, bioquimica e biotecnologia. Universidade de Caxias do Sul,. Catley BJ (1992) The biochemistry of some fungal polysaccharides with industrial potencial. En Mukerji KG (Ed.) Handbook of applied mycology: fungal biotechnology. Marcel Dekker,. New York. Chang ST, Miles PG (2004) Mushrooms Cultivation, Nutritional Value, Medicinal effect, and Enviromental Impact. CRC Press. New York. 451 p. Chen YJ, Shiao MS, Lee SS, Wang SY (1997) Effects of Cordyceps sinensis on the proliferation and differentiation of human leukemic U937 cells. Life Science 60(23): 49-59. Dormand JR, Prince PJ (1980) A family of embedded Runge-Kutta formulae. Journal of Computational and Applied Mathematics 6: 19-26. Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F (1956) Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry Engineering Journal 28(3): 350-356. Enshasy HE (2010) Immunomodulators. En Hofrichter M (Ed.) The Mycota. Springer-Verlag. Berlin, 477 p.
135
Graminha EBN, Gonc¸alves AZL, Pirota RDPBB, M.A.A., Da Silva R, Gomes E (2008) Enzyme production by solid-state fermentation: Application to animal nutrition. Animal Feed Science and Technology 144: 1-22. Hamlyn PF, Schmidt RJ (1994) Potential therapeutic application of fungal filaments in wound management. Mycologist 8: 147- 152. Hsieh C, Liu C-J, Tseng M-H, Lo C-T, Yang Y-C (2006) Effect of olive oil on the production of mycelial biomass and polysaccharides of Grifola frondosa under high oxygen concentration aeration. Enzyme and Microbial Technology 39: 434-439. Hsieh C, Wang H-L, Chena C-C, Hsub T-H, Tseng M-H (2008) Effect of plant oil and surfactant on the production of mycelial biomass and polysaccharides in submerged culture of Grifola frondosa. Biochemical Engineering Journal 38: 198-205. Ishikawa K, Majima T, Ebina T (1992) Anti-tumour effect of a Coriolus preparation, PSK: Induction of macrophage chemotactic factor (MCF) in spleens of tumour bearing mice. Biotherapy 5: 251-258. Kiho T, Ookubo K, Usui S, Ukai S, Hirano K (1999) Structural features and hypoglycemic activity of a polysaccharides (CS-F10) from the cultured mycelium of Cordyceps sinensis. Biological and Pharmaceutical Bulletin 22(9): 66-70. Kirk TK, Farrel RL (1987) Enzymatic combustion: the microbial degradation of lignin. Annual Reviews of Microbiology 41: 465- 505. Kjeldahl J (1883) Neue Methode Zùr Bestimmung der Stickstoffs in Organichen Kòrpen. Zeitschrift fur Analytische Chemie 22: 366-382. Kobayashi H, Matsunaga K, Oguchi Y (1995) Antimetastatic Effects of P5K (Krestin), a Protein-bound Polysaccharide Obtained from Basidiomycetes: An Overview. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention 4: 275-281. Koh JH, Kim JM, Chang UJ, Suh HJ (2003) Hypocholesterolemic effect of hotwater extract from mycelia of Cordyceps sinensis. Biological and Pharmaceutical Bulletin 26: 84-87. Komura DL, Ruthers AC, Carbonero ER, Alquini G, Rosa MC, Sassaki GL, Lacomini M (2010) The origin of mannans found in submerged culture of basidiomycetes. Carbohydrate polymers 79: 1052-1056. Koutinas AA, Wang R, Webb C (2004) Restructuring Upstream Bioprocessing: Technological and Economical Aspects for Production of a Generic Microbial Feedstock From Wheat. Published online in Wiley InterScience: 1-15. Kupfahl C, Geginat G, Hof H (2006) Lentinan has a stimulatory effect on innate and adaptive immunity against murine Listeria monocytogenes infection. International Immunopharmacology 6: 686- 696. Lama L, Nicolaus B, Calandrell V, Manca M, Romano I, Gambacorta AM, Arambarri (1996) Effect of growth conditions on endo- and exopolymer biosynthesis in Anabaena cylindrica 10C. Phytochemistry 42: 655-664. Lee B, Bae J, Pyo H, Choe T, Kim S, Hwang H, Yun J (2004) Submerged culture conditions for the production of mycelial biomass and exopolysaccharides by the edible basidiomycete Grifola frondosa. Enzyme and Microbial Technology 35: 369-376. Lee K, Lee S, Lee H (1999) Bistage control of pH for improving exopolysaccharide production from mycelia of Ganoderma lucidum in an air-lift fermentor. Journal of Bioscience and Bioengineering 88: 646-650. Lee WY, Park Y, Ahn JK, Ka KH, Park SY (2007) Factors influencing the production of endopolysaccharide and exopolysaccharide from Ganoderma applanatum. Enzyme and Microbial Technology 40 249-254. Leterme P. (2010). Análisis de alimentos y forrajes, in Protocolos de LaboratorioUniversidad Nacional de Colombia Sede Palmira: Palmira. 66 pp. Lindequist U, Niedermeyer T, Julich W-D (2005) The pharmaceutical potential of mushrooms. Electronic Centralised Aircraf Monitor (eCAM) 2: 285-299. Liu F, Fung MC, Ooi VEC, Chang ST (1996) Induction in the mouse of gene expression of immunomodulating cytokines by mushroom polysaccharide-protein complexes. Life Science 58(1): 795-803. Luedeking R, Piret E (1959) Transient and steady states in continuous fermentation. Theory and experiment. Journal of Biochemical and Microbiological Technology and Engineering 1: 431-459. Maziero R, Cavazzoni V, Ramos-Bononi VL (1999) Screening of Basidiomycetes for the production of exopolisaccharides and biomass in submerged culture. Revista de Microbiologia 30: 77-84. Miller GL (1959) Use of DinitrosaIicyIic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar. Analytical Chemistry 31(3): 426- 428. Mitchell D, Stuart D, Tanner R. (1999). Solid-State fermentation - Microbial growth kinetics, in The Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis and bioseparation, Flickinger M, Drew S, EditorsWiley: New York. 2407- 2429 Mizuno T (1999) The extraction and development of antitumouractive polysaccharides from medicinal mushrooms in Japan. International Journal Medicine Mushrooms 1: 9-29. Mohammad-Fata M, Hossein M, Shirin G, Ghorban-Ali H (2007) Immunomodulating and anticancer agents in the realm of macromycetes fungi (macrofungi). International Immunopharmacology 7: 701-724. Moreira MT, Feijoo G, Lema JM (2003) Fungal bioreactors: Applications to white-rot fungi. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology 2: 247-259. Nakamura K, Yamaguchi Y, Kagota S, Shinozuka K, Kunitomo M (1999) Activation of in vivo Kupffer cell function by oral administration of Cordyceps sinensis in rats. . Japan Journal Pharmacology 79: 508-508. Ooi V, Liu F (2000) Immunomodulation and anti-cancer activity of polysaccharide-protein complexes. Current Medicine Chemistry 7: 715-728.
136
Pal M, Calvo A, Terron MC, Gonzalez AE (1995) Solid-state fermentation of sugarcane bagasse with Flammulina velutipes and Trametes versicolor. World Journal Microbiology and Biotechnology 11: 541-545. Pandey A, Soccol CR, Mitchell D (2000) New developments in solid state fermentation: I-bioprocesses and products. Process Biochemistry 35: 1153–1169. Park J-P, Kim S-W, Hwang H-J, Cho Y-J, Yun J-W (2002) Stimulatory effect of plant oils and fatty acids on the exo-biopolymer production in Cordyceps militaris. Enzyme and Microbial Technology 31: 250-255. Plassard C, Mousain D, Salsac L (1982) Estimation of mycelial growth of basidiomycetes by means of chitin determination. Phytochemistry 21: 345-348. Pradeep V, Datta M (2002) Production of ligninolytic enzymes for decolorization by cocultivation of white-rot fungi Pleurotus ostreatus and Phanerochaete chrysosporium under solid-state fermentation. Applied Biochemistry Biotechnology 102- 103: 109-118. Sangsurasak P, Nopharatana M, Mitchell D (1996) Mathematical modeling of the growth of filamentous fungi in solid-state fermentation. Journal Science Industrial Resources 55: 333-342. Sarikaya A, Ladisch M (1997) An Unstructured Mathematical Model for Growth of Pleurotus ostreatus on Lignocellulosic Material in Solid-State Fermentation Systems. Applied Biochemistry and Biotechnology 62: 72-85. Shu C, Lung M (2003) Effect of pH on the production and molecular weight distribution of exopolysaccharide by Antrodia camphorata in batch cultures Process Biochemestry 39: 931-937. Tang YJ, Zhong JJ (2002) Exopolysaccharide biosynthesis and related enzyme activities of the medicinal fungus, Ganoderma lucidum, grown on lactose in a bioreactor. Biotechnology Letters 24: 1023-1026. Tsukagoshi S, Hashimoto Y, Fujii G, Kobayashi H, Nomoto K, Orita K (1984) Krestin (PSK). Cancer Treatment Review 11: 131- 155. Viccini G, Mitchell D, Boit S, Gern J, da Rosa A, Costa R (2001) Analysis of growth kinetic profiles in solid-state fermentation. Food Technology and Biotechnology Advances 39: 271-294. Wade LG (1993) Química Orgánica. Debra Wechsler. México. 1312 p. Walkley A, Black I (1934) An estimation of the Degtjareft method for determining of soil organic matter and a proposed modification of chromic acid titration method. Soil Science 37: 29-38. Weinberg ZG (2000) Biotechnology in developing countries: opportunities in solid state fermentation applied in the agricultural industry. Internation Journal of Biotechnology 2(4): 364-373. Wu J, Cheung P, Wong K, Huang N (2004) Studies on submerged fermentation of (Fr.) Singer. Part 2. Effect of carbonto-nitrogen ration of the culture medium on the content and composition of the mycelial dietary fibre. Food Chemistry 85: 101-105. Wu J, Ding Z-Y, Zhang K-C (2006) Improvement of exopolysaccharide production by macro-fungus Auricularia auricula in submerged culture. Enzyme and Microbial Technology 39: 743-749. Xiao J-H, Xiao D-M, Xiong Q, Liang Z-Q, Zhong JJ (2010) Nutritional requirements for the hyperproduction of bioactive exopolysaccharides by submerged fermentation of the edible medicinal fungus Cordyceps taii. Biochemical Engineering Journal 49(2): 241-249. Xiao JH, Chen DX, Wan WH, Hu XJ, Qi Y, Liang ZQ (2006) Enhanced simultaneous the production of mycelia and intracellular polysaccharide in submerged cultivation of Cordyceps jiangxiensis using desirability functions. Process Biochemestry 41: 1887-1893. Yang F-C, Ke Y-F, Kuo S-S (2000) Effect of fatty acids on the mycelial growth and polysaccharide formation by Ganoderma lucidum in shake flask cultures. Enzyme and Microbial Technology 27: 295-301. Zhuang O, Mizuno T (1999) Biological responses from Grifola frondosa (Dick.:Fr.) S.F. Gray-Maitake (Aphyllophoromycetideae). Internation Journal Medicinal Mushrooms 1: 317-324.
137
7. Selección de la Mejor Combinación Hongo – Formulación para la Degradación de Sustratos Lignocelulósicos mediante Fermentación Sumergida con Pleurotus ostreatus, Coriolus versicolor y Lentinus edodes
138
Selección de la Mejor Combinación Hongo – Formulación para la Degradación de Sustratos Lignocelulósicos mediante Fermentación Sumergida con Pleurotus ostreatus, Coriolus versicolor y Lentinus edodes
Sandra Montoya1, Óscar Julián Sánchez2*, Laura Levin3
RESUMEN
En esta investigación se probaron tres especies de hongos de pudrición blanca: Coriolus versicolor, Pleurotus ostreatus y Lentinus edodes sobre 12 formulaciones de medios de cultivo líquidos con cascarilla de café pretratada como fuente de materiales lignocelulósicos y dos niveles de sulfato de cobre (II). Los objetivos de este trabajo fueron i) evaluar los efectos de la relación C/N y del sulfato de cobre (II) sobre las actividades enzimáticas endoglucanasa, exoglucanasa, endoxilanasa, β-glucosidasa, lacasa y manganeso peroxidasa (MnP) durante 32 días de fermentación sumergida; así como el consumo de celulosa y hemicelulosa y la degradación de lignina y ii) proponer un modelo matemático para la descripción de la producción de las enzimas lignocelulolíticas, la producción de biomasa, producción y consumo de azúcares reductores, consumo de celulosa y hemicelulosa y degradación de lignina. Las tres especies de hongos crecieron bien sobre todas las formulaciones de los medios de cultivo y se obtuvieron títulos de actividades enzimáticas de todas las enzimas. Del mismo modo, no hubo una gran variación entre las combinaciones de las tres especies de hongos con las diversas formulaciones sobre la degradación de los componentes de la fibra de los medios de cultivo, probablemente porque el material lignocelulósico adicionado fue pretratado y esto debió generar un desorden en la matriz lignocelulósica de modo que las hifas de los hongos pudieron acceder más fácilmente a la celulosa. P. ostreatus mostró una mejor capacidad de degradación de los componentes de la fibra en las diferentes combinaciones, por lo que este hongo fue seleccionado con las diferentes combinaciones para la aplicación del modelo matemático compuesto por 11 ecuaciones diferenciales propuesto para describir los datos experimentales.
Palabras clave: hongos de pudrición blanca, relación C/N, actividades lignocelulolíticas, degradación de materiales lignocelulósicos.
1. INTRODUCCIÓN
Los hongos de pudrición blanca son hasta ahora los únicos organismos capaces de degradar completamente todos los componentes de los materiales lignocelulósicos gracias a las enzimas lignocelulolíticas que producen (Kirk y Farrel, 1987b). En general las enzimas degradadoras de polisacáridos están sujetas a mecanismos de regulación de su síntesis. Es decir no se producen de modo constante, sino que su síntesis es inducida por el sustrato adecuado y es reprimida por azúcares fácilmente utilizables, en particular glucosa. El inductor más eficiente es el polímero-sustrato de las enzimas que serán sintetizadas. Sin embargo, debido a su alto peso molecular, no son compuestos que puedan penetrar en las células y ejercer su efecto (Béguin y Aubert, 1994). Algunas de las enzimas extracelulares que se producen por los hongos son solubles y se encuentran libremente dispersas en la película de líquido que rodea la hifa, pero otras están fijas en el espacio sujetas a la pared de la hifa, a la matriz extracelular o al propio sustrato (Hudson, 1986a). Hay un mercado creciente en la producción de enzimas lignocelulolíticas y otras biosustancias por fermentación sumergida empleando hongos macromicetos. En la actualidad, el cultivo sumergido de hongos macromicetos es una alternativa promisoria a nivel mundial para la producción eficiente de micelio y metabolitos. Sin embargo, a través de décadas la producción de metabolitos por fermentación sumergida utilizando macromicetos continúa enfrentando limitaciones de carácter biológico, fisiológico y de ingeniería. De igual forma el desarrollo de las hifas (especialmente de basidiomicetos) en cultivos
139 sumergidos resulta usualmente en el desarrollo incontrolado del micelio (conjunto de hifas). La extensión de la biomasa fúngica tiene profundos efectos en la transferencia de masa, velocidad metabólica y secreción de productos. El micelio fúngico puede enrollarse alrededor de las esferas (pellets) de la misma biomasa, causando bloqueos y extendiéndose en todo el medio de cultivo, incrementando la viscosidad, la cual resulta ser una limitante de la transferencia de masa y de oxígeno en el reactor. Todos estos inconvenientes limitan el tiempo de operación para la producción de biosustancias de basidiomicetos por fermentación sumergida. Asimismo, la falta de información sobre el cultivo sumergido de setas es significativa en comparación con la gran cantidad de información acerca de la fermentación sumergida empleando bacterias (estreptomicetos) y microhongos (Rodriguez-Couto y Toca-Herrera, 2007; Tang et al., 2007). Para producir enzimas lignocelulolíticas con hongos de pudrición blanca como Pleurotus ostreatus, Coriolus versicolor y Lentinus edodes han sido empleados métodos de fermentación en estado sólido, debido a que el medio sólido es la forma natural de crecimiento de los hongos. Sin embargo, investigadores como Hölker et al. (2004) han alcanzado métodos sencillos y económicos de obtención de enzimas lignocelulolíticas por fermentación sumergida con hongos de pudrición blanca. Empero dificultades como la determinación de la biomasa y la descripción de la cinética de estos procesos, han reducido la cantidad de información publicada que sirva como herramienta indispensable en la descripción fisiológica y biotecnológica del proceso productivo de enzimas lignocelulolítcas por fermentación sumergida (Kovarova-Kovar y Egli, 1998). El modelado de procesos de fermentación sumergida para la producción de enzimas lignocelulolíticas con hongos de pudrición blanca tiene un gran potencial en la búsqueda de las condiciones óptimas del proceso, diseño y desarrollo de procesos, control, ampliación e identificación de la estructura de costos (Vasic-Racki et al., 2003; Vrsalovic Presecki et al., 2006). Para ese propósito, se han utilizado modelos matemáticos no-estructurados con el fin de describir el crecimiento celular y la producción de las diferentes biosustancias en los diferentes procesos de producción discontinuos, continuos o alimentados (Zelic et al., 2004). Los modelos más reportados para procesos de fermentación por lotes son el modelo lineal, logístico y de dos fases (aceleración y desaceleración) (Sangsurasak et al., 1996), aunque estos modelos no incluyen el efecto de la concentración de nutrientes sobre el desarrollo (Ikasari y Mitchell, 2000; Mitchell et al., 2004; Van de Lagemaat y Pyle, 2005). Asimismo, para la descripción de la producción de biomasa en diversos tipos de procesos de fermentación se utilizan las expresiones tipo Monod y Logística modificada (Mitchell et al., 2004; Tavares et al., 2005). Las expresiones matemáticas utilizadas para la descripción de la formación de productos dependen de qué clase de metabolito se esté produciendo; generalmente, las expresiones más simples son para los metabolitos primarios, ya que su formación se considera directamente proporcional a la formación de la biomasa celular teniéndose en cuenta los parámetros de matenimiento celular y crecimiento microbiano. Actualmente existen dificultades para describir la producción de biosustancias de hongos macromicetos y su crecimiento con el uso de los modelos matemáticos disponibles (Tišma et al., 2010). Esta dificultad se debe, probablemente, a que cada uno de estos hongos se ve afectado directamente por factores intrínsecos y extrínsecos particulares como las características físicas y la composición química de los medios de cultivo, la procedencia de las cepas, la influencia de las condiciones ambientales y una velocidad de crecimiento menor asociada a la gran mayoría de las especies de macromicetos en comparación con el tiempo de crecimiento de los micromicetos. Asimismo, para el análisis de la formación de productos en procesos de fermentación sumergida es necesario conocer todas las interrelaciones que suceden entorno a la formación de las diversas sustancias intermedias que se pueden formar durante el crecimiento y desarrollo del organismo, que a su vez cambian las características fisico-químicas del medio de cultivo a fin de comprender el mecanismo de producción de la biomasa y de las sustancias de interés y lograr plantear expresiones matemáticas que permitan la descripción y escalamiento de estos procesos productivos. En el caso de los hongos de pudrición blanca cuando se cultivan en medios de composición ligeramente diferente, se sintetizan diversas formas de una misma enzima (isoenzimas) que a pesar de poseer propiedades catalíticas similares, difieren notablemente en sus características físico-químicas, por
140 lo que se deduce que hay formas múltiples que coexisten en determinado momento; también puede variar la proporción de estas isoenzimas a lo largo del desarrollo del hongo (Carlile et al., 2001). La síntesis de isoenzimas puede deberse a productos de genes diferentes, aunque también pueden deberse a cambios postraduccionales como proteólisis, glicosilación o agregados cuaternarios. Se pueden sintetizar como consecuencia de estados fisiológicos diferentes (composición del medio de cultivo, pH, temperatura, etc.) a partir de genes regulados diferencialmente (Joselau y Ruel, 1994; Blanchette, 1995; Barr et al., 1996; Carlile et al., 2001). El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la relación carbono nitrógeno y del sulfato de cobre (II) sobre la producción de enzimas lignocelulolíticas por tres especies de hongos de pudrición blanca (L. edodes, C. versicolor y P. ostreatus) empleando doce formulaciones diferentes de medios de cultivo por fermentación sumergida. Estos hongos fueron seleccionados de entre diez hongos de pudrición blanca mediante un rastreo basado en sus actividades enzimáticas celulolíticas, xilanolíticas y ligninolíticas, así como en su capacidad de degradación de celulosa y lignina; los resultados de este rastreo se relacionan en el artículo anterior. Igualmente este trabajo tuvo como objetivo adicional proponer y validar un modelo matemático para la mejor combinación hallada especie de hongo - formulación a fin de realizar la descripción de la cinética de crecimiento del organismo, la degradación de los materiales lignocelulósicos y la producción de las enzimas lignocelulolíticas en condiciones de fermentación sumergida.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Microorganismos
Tres especies de basidiomicetos fueron empleados para la producción de enzimas lignocelulolíticas en fermentación sumergida, tomadas de la colección de hongos de la Universidad de Caldas (Manizales, Colombia): Lentinula edodes del Centro de Investigaciones del Café, Chinchiná, Caldas, Colombia (CICL54), Coriolus versicolor de Pennsylvania State University, Estados Unidos de Norte América (PSUWC430), y Pleurotus ostreatus de la Colección interna de la Universidad de Caldas (UCC001). Las cepas fueron extendidas sobre agar papa dextrosa (PDA) y mantenidas en refrigeración a 4°C y transferencias periódicas.
2.2. Pretratamiento de cascarilla de café
La cascarilla de café seca y molida fue sumergida en H2SO4 al 3% en relación 1:4 sólido: líquido y sometida a ultrasonido por una hora a 80°C con posterior tratamiento térmico a 121°C y 15 psig por una hora con fines de modificar la matriz lignocelulósica. En seguida, la cascarilla fue lavada con exceso de agua hasta obtener un pH = 6.8 en el agua de lavado del material para retirar el exceso de ácido. La cascarilla lavada fue utilizada como fuente de carbono proveniente de material lignocelulósico en los medios de cultivo para la fermentación sumergida del presente trabajo.
2.3. Medios de cultivo
Se realizaron doce formulaciones de medios de cultivo por triplicado con base en un litro de medio de cultivo. La composición por cada litro de medio de cultivo fue: 100g de cascarilla de café pretratada y seca, 2g KH2PO4, 0,5g MgSO4.7H2O, 0,1g CaCl2, 2g de extracto de levadura y tres concentraciones de SO4(NH4)2 0,5g, 1g y 1,5g, dos concentraciones de aceite de soya 13,5g y 22,42g y dos concentraciones de sulfato de cobre (II) 0,1592g (fórmulas pares) y 0,0798g (fórmulas impares), con la variación de los niveles de SO4(NH4)2 y aceite de soya se modificó la relación carbono nitrógeno (R C/N) (ver Tabla 1). Los medios de cultivo fueron servidos en matraces de 250 mL de capacidad con 100 mL de medio, esterilizados a 121°C por 20 minutos, los pH de los medios de cultivo variaron entre 5.6 y 5.8 para todas las formulaciones medido antes de la inoculación; seguidamente, los medios de cultivo
141 fueron inoculados en cabina de flujo laminar con un fragmento de micelio extendido en agar PDA de ½ cm de lado de cada especie de trabajo. Los matraces fueron llevados a incubación con agitación de 100 rpm, 25°C y penumbra por 32 días. Se tomaron 10 muestras, dos por semana y la primera muestra fue tomada el día de la inoculación.
Tabla 1. Relaciones carbono nitrógeno (R C/N) en doce niveles (formulaciones) F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12
24,68 24,13 28,40 26,84 23,98 22,06 23,41 23,79 20,81 20,61 20,70 21,04
2.4. Determinación de la relación carbono nitrógeno
La relación carbono nitrógeno (C/N) fue determinada a partir de la medida de la materia orgánica de las doce formulaciones de sustratos empleando el método de Walkley y Black (1934), el cual utiliza ácido sulfúrico concentrado y solución de dicromato de potasio. La muestra se lee a 585 nm. La cantidad de carbono total corresponde al 58% de la materia orgánica. El nitrógeno orgánico total fue determinado por el método de Kjeldahl (Kjeldahl, 1883).
2.5. Determinación cuantitativa de actividades enzimáticas
2.5.2. Actividades celulolíticas y xilanolíticas
Endo-1,4-ß-D-glucanasa (E.C.3.2.1.4). Se usó carboximetil celulosa (CMC) como sustrato al 0,5% en buffer acetato de sodio pH 4,8 en reacción con 100 µL de extracto enzimático (medio filtrado) por 30 minutos a 50°C. La reacción se detuvo adicionando el reactivo DNS (ácido dinitrosalicílico) (Miller, 1959). Se continuó con la reacción de DNS para la determinación de azúcares reductores, se leyó la absorbancia a longitud de onda 540 nm. Una unidad de actividad enzimática (UE) fue definida como la cantidad de enzima que produce 1 µmol de azúcares reductores en un minuto. Para cuantificar la actividad se elaboró una curva patrón de azúcares reductores, con distintas cantidades de glucosa. Exo-1,4-ß-D-glucanasa (E.C.3.2.1.91). Se usó celulosa cristalina 1% en buffer acetato de sodio pH 4,8 como sustrato, en reacción con 100 µL de extracto enzimático a 50°C por 60 minutos y agitación. La reacción se detuvo adicionando el reactivo DNS. Se continuó la reacción de azúcares reductores por el método DNS y se centrifugó antes de leer la absorbancia a longitud de onda 540 nm. Una unidad de actividad enzimática (UE) fue definida como la cantidad de enzima que produce 1 µmol de azúcares reductores en un minuto. β-glucosidasa (E.C.3.2.1.21). La reacción se produce entre el sustrato de p-nitrofenil β-D- glucopiranosido 0,02% en buffer acetato de sodio pH 4,8 con 100 µL de extracto enzimático a 50°C por 30 minutos. La reacción se detuvo adicionando solución buffer Clark y Lubs (pH 9,8) y se leyó la absorbancia a longitud de onda 430 nm (ε430=18,5/mM cm) (Wood y Bhat, 1988). Una unidad de actividad enzimática (UE) fue definida como la cantidad de enzima que produce 1 µmol de producto (p-nitrofenol) en un minuto. Para cuantificar la actividad se confeccionó una curva patrón con p-nitrofenol. Endo-1,4-ß-D-xilanasa (E.C.3.2.1.8). La reacción se produce entre el sustrato xilano al 0,2% en buffer acetato de sodio pH 4,8 con 100 µL de extracto enzimático a 50°C por 30 minutos. La reacción se detuvo adicionando DNS y se leyó la absorbancia a longitud de onda 540 nm. Una unidad de actividad enzimática (UE) fue definida como la producción de 1 µmol de azúcares reductores en un minuto. La curva patrón de azúcares reductores se confeccionó en este caso con xilosa.
142
2.5.3. Actividades ligninolíticas
Lacasa (E.C.1.10.3.2): Se utilizaron 0,5 mM de ABTS en solución 0,1M de buffer acetato de sodio pH 3,6 como sustrato, según método de Paszczynski y Crawford (1991), leyendo el aumento de absorbancia a 420 nm (ε420=36/mM cm) luego de tres minutos de reacción a 30°C. Una unidad de actividad lacasa (UE) fue definida como la cantidad de enzima requerida para oxidar 1 μmol de ABTS en 1 minuto. Manganeso peroxidasa (E.C.1.11.1.13) (MnP): Se utilizó como sustrato una solución 0,01% de rojo fenol en buffer succinato de sodio 0,1 M y pH 4,5 y sulfato de manganeso (0,22 g/L), con peróxido de hidrógeno 0,2 mM como iniciador de la reacción. La reacción fue detenida adicionando NaOH 5N después de 10 minutos de reacción para leer el incremento de absorbancia a 610 nm (ε610=22/mM cm). Una unidad de actividad enzimática (UE) fue definida como la cantidad de enzima necesaria para oxidar 1 μmol de rojo fenol en 1 minuto (Paszczczynski et al., 1988).
2.6. Cuantificación del contenido de N-acetil-D-glucosamina (NAGA) y biomasa
Las muestras de sustrato fueron colectadas en 10 tiempos de incubación hasta el final de la fermentación (día 32) para las tres especies de trabajo. El medio de fermentación fue filtrado al vacío, con posterior secado en estufa a 101°C hasta peso constante. A la muestra seca y molida se le determinó el contenido de quitina. El contenido de biomasa fúngica en este medio fue estimado por la determinación del contenido de N-acetil-D-glucosamina (NAGA) después de la hidrólisis con HCl 6N grado analítico según el método de Plassard et al. (1982). Para ello se cuantificó paralelamente el contenido de NAGA por gramo de micelio en cada una de las tres especies, cultivándolas en medio líquido. El contenido de NAGA del micelio de cada una de las especies de hongos de trabajo: C. versicolor, P. ostreatus y L. edodes fue determinado del desarrollo del micelio en medio líquido en matraces de 250 mL con 100 mL de medio de cultivo con la siguiente composición: glucosa (30 g/L), extracto de levadura (6 g/L), SO4Mg.5H2O (0,5 g/L), K2HPO4 (0,5 g/L) y CaCl2 (0,1 g/L). El tiempo de fermentación para el crecimiento del hongo fue de 25 días y sometidos a 100 rpm de agitación. Los compuestos solubles en agua fueron extraídos durante la hidrólisis con HCl 6N por tres horas.
2.7. Cuantificación de los componentes de la fibra y azúcares reductores
Se determinaron los componentes de la fibra (celulosa, hemicelulosa y lignina) de los medios de cultivo de cada una de las formulaciones en 10 tiempos durante los 32 días de incubación, así como la fracción soluble, empleando los resultados de la determinación de fibras detergente neutra, ácida y lignino-ácida. La medición se realizó a una muestra seca y molida de sustrato; dicha muestra se sometió a tres hidrólisis en serie (cada una de 75 min): i) hidrólisis con lauril sulfato de sodio y otros, ii) hidrólisis en solución de bromuro de amonio en ácido sulfúrico 1N, y iii) hidrólisis con ácido sulfúrico al 72% (p/v). Al finalizar cada hidrólisis, las muestras fueron lavadas y secadas a 105°C hasta peso constante (Leterme, 2010a). El contenido de azúcares reductores como glucosa fue determinado por el método del ácido dinitrosalicílico (DNS) (Miller, 1959).
2.7. Diseño experimental
Se planteó un diseño experimental bifactorial con la especie a tres niveles y doce formulaciones de sustrato. Las formulaciones varían en su relación C/N y la concentración de sulfato de cobre (II). Las variables independientes en este diseño experimental fueron la especie de hongo, la formulación del sustrato y el tiempo de fermentación. Las variables de respuesta medidas fueron las actividades enzimáticas: endoglucanasa, exoglucanasa, β-glucosidasa, lacasa, MnP y endoxilanasa a fin de buscar la mejor combinación especie de hongo fórmula para la producción de celulasas y de ligninasas en términos
143 de la capacidad de degradación de los componentes de la fibra, celulosa, hemicelulosa y lignina durante 32 días de fermentación sumergida en 10 tiempos.
2.6. Modelamiento matemático del crecimiento del hongo y la producción de enzimas
Para la solución de los modelos matemáticos del proceso de fermentación en estado líquido se utilizó el software Matlab® 2010b (MathWorks, EUA) en un PC de 3 GB de memoria RAM y un procesador Intel CORE-i3 de 2,13 GHz. Para los modelos matemáticos planteados en ecuaciones diferenciales ordinarias se utilizó el comando ode45 que está basado en una fórmula explícita de Runge- Kutta (4,5) usando un par de Dormand-Prince (Dormand y Prince, 1980) y el comando ode15s basado en una fórmula de orden variable que funciona mediante fórmulas de diferenciación numérica.
2.8. Análisis estadístico
Para todos los análisis estadísticos del presente trabajo se utilizó el software Matlab ® 2010b. Este análisis se realizó en tres etapas. Primero se realizó un ANOVA a todos los datos del diseño experimental y sus posibles combinaciones: especie, fórmula y tiempo de fermentación mediante el comando anovan. Luego se realizó un análisis comparativo (Kruskal Wallis) de la capacidad de degradación de celulosa, hemicelulosa y lignina para cada especie de hongo estudiado y las doce formulaciones de sustratos mediante los comandos kruskalwallis y multcompare. A los máximos obtenidos de cada especie se les realizó un nuevo análisis comparativo a fin de encontrar la combinación de mejor desempeño con los porcentajes de degradación de la fibra al final del período de fermentación (32 días) mediante los comandos kruskalwallis y multcompare. Para evaluar si el modelo matemático propuesto describe adecuadamente los datos experimentales, se realizó una prueba F de una cola que parte de las siguientes hipótesis:
S 2 residuales, Fi H0 :12 Sdatosexp, F i S 2 H :1residuales, Fi 1 S 2 datosexp, Fi
2 donde: Fi está dado para i = 1,2,…,12, s residuales es la varianza de los residuales (desviaciones de los datos experimentales con respecto a los valores calculados por el modelo matemático) y se calcula para cada 2 variable de respuesta medida y s datos exp es la varianza de la serie experimental de cada variable de respuesta medida. Para estos análisis se utilizaron los comandos vartest y vartest2 de Matlab. Con las varianzas de los residuales obtenidos para cada serie experimental se calcularon los porcentajes de cada una respecto a la serie que dio la mayor varianza de residuales a fin de mostrar el ajuste de los datos experimentales al modelo matemático propuesto de forma más simple.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. Efecto de la relación C/N sobre la degradación de los residuos lignocelulósicos y la producción de enzimas lignocelulolíticas
Las tres especies de hongos (C. versicolor, P. ostreatus y L. edodes) probadas en el diseño experimental, fueron inoculadas e incubadas bajo las mismas condiciones ambientales en las doce formulaciones de los medios de cultivo. El intervalo de la relación C/N en las doce formulaciones de sustrato evaluadas fue de 20 a 28,4 con una variación en los contenidos de nitrógeno de 1.4 a 1,93% en base seca. Las tres especies de hongos se desarrollaron bien en todas las formulaciones evaluadas y se
144 obtuvieron títulos de todas las actividades enzimáticas en todas las formulaciones durante los 32 días de incubación, como se observa en la Tabla 2. Todos los contenidos de nitrógeno de las formulaciones estimularon el crecimiento micelial de los macromicetos durante la fermentación, incrementando el contenido de biomasa (ver Figuras 1 y 2) en todos los casos y con una marcada fase lag para las tres especies en todos los medios de cultivo. Empero se debe tener en cuenta que la variación de la relación C/N se provocó modificando los contenidos de (NH4)2SO4 y aceite de soya y no modificando las fuentes de nitrógeno y de carbono en cada formulación. Sin embargo, sí hubo variabilidad sobre las actividades enzimáticas medidas (endoglucanasa, exoglucanasa, β-glucosidasa, endoxilanasa, lacasa y MnP), dependiendo de la especie y a diferentes tiempos de incubación como se observa en la Tabla 2. Las actividades enzimáticas máximas fueron seleccionadas realizando análisis estadístico por etapas. Primero se realizó un ANOVA a fin de determinar si hubo diferencias significativas entre los resultados obtenidos respecto a las variables independientes especie, fórmula y tiempo; posteriormente, se realizó una selección de los máximos de las actividades enzimáticas gráficamente. La mayor actividad de β-glucosidasa fue detectada para L. edodes – F10 con 32.640 U/L.min a los 32 días de incubación, seguida por la combinación C. versicolor – F5 con 30.560 U/L.min. Mientras que la máxima actividad de β-glucosidasa para las combinaciones con P. ostreatus fue para la F3 con 15.721,6 U/L.min. Para la enzima endoglucanasa la mayor actividad fue detectada para C. versicolor – F9 con 11.727,7 U/L.min en el día 32 de la fermentación, seguida de 11.403 U/L.min para P. ostreatus – F5 en el día 25 de la fermentación. Los niveles más altos de la enzima exoglucanasa se obtuvieron para L. edodes – F6 y F5 con un títulos de 10.980 U/L.min (días 21) y 10.240 U/L.min (día 32) respectivamente. Para la enzima endoxilanasa, la mayor actividad obtenida se reporta para L. edodes – F10 con 21880 U/L.min en el día 21 de fermentación. Las máximas actividades enzimáticas de lacasa fueron obtenidas para C. versicolor – F11 día 25 de incubación y 260 U/L.min para P. ostreatus – F1 y F3 en los días 18 y 28 de la fermentación respectivamente. En referencia a los títulos obtenidos de la MnP, los máximos detectados fueron para P. ostretaus – F5 y F6 con 135,89 U/L.min y 106,2 U/L.min respectivamente. Detallando las actividades enzimáticas máximas obtenidas para todas las formulaciones y visualizando especialmente los títulos obtenidos para las formulaciones F3 cuya relación C/N fue la máxima y las formulaciones F10 y F11 que tenían las menores relaciones C/N no se aprecia una diferencia notable entre ninguna de las actividades enzimáticas medias como para ser atribuido a este factor, probablemente porque los componentes del sustrato que provocan la variación de la relación C/N no se modifican durante la formulación de los medios de cultivo y los niveles evaluados no son suficientemente diferentes para provocar un cambio significativo en estas actividades enzimáticas. En este estudio se presentó la producción de cuatro actividades enzimáticas celulolíticas y xilanolíticas y dos actividades ligninolíticas de tres especies de hongos de pudrición blanca, en fermentación sumergida con una fuente fija de material lignocelulósico, la cascarilla de café pretratada, variando las cantidades de sulfato de amonio y aceite de soya adicionados por litro de medio de cultivo para conseguir las diferentes relaciones C/N. La cascarilla de café pretratada se adicionó con el fin de activar la producción de enzimas lignocelulolíticas por las especies de hongos utilizadas. Entendiendo que para la bioconversión de los materiales lignocelulósicos con hongos, las enzimas que degradan polisacáridos juegan un rol muy importante ya que son las que proveen la fuente de energía a los microorganismos; por lo que la baja producción de estas enzimas pueden limitar la velocidad de producción de azúcares solubles. Sin embargo, en este trabajo los organismos probablemente pudieron aprovechar como fuentes de carbono, los contenidos en el aceite de soya y extracto de levadura para su mantenimiento durante las fase lag prolongadas que se visualizan para todas las combinaciones hongo formulaciones en las Figuras 1 y 2, mientras los mismos hongos inician la degradación del material lignocelulósico a fin de tener la cantidad de nutrientes necesarios para su crecimiento y desarrollo. Los títulos de las actividades de las enzimas lignocelulolíticas endoglucanasa, endoxilanasa, exoglucanasa, lacasa y MnP obtenidas en este trabajo fueron similares a las obtenidas por Elisashvili et al. (2008) cuando utilizaron hojas de árboles de eucalipto en los medios de cultivo para fermentación sumergida con varias especies de L. edodes y P. ostreatus, ya que cuando ellos utilizaron como fuentes de carbono en los medios de cultivo cáscaras de mandarinas, de manzana y de banano, los títulos de las
145 actividades enzimáticas fueron inferiores a las obtenidas en este trabajo, especialmente los títulos de la MnP y lacasa. Asimismo, trabajos recientes han demostrado que diversos materiales lignocelulósicos pueden estimular la producción de enzimas lignocelulolíticas por los basidiomicetos (Kapich et al., 2004; Elisashvili et al., 2006). Acorde con lo anterior, los resultados obtenidos con las tres especies de hongos de pudrición blanca L. edodes, C. versicolor y P. ostreatus utilizadas en este estudio para producir enzimas lignocelulolíticas son concordantes con los obtenidos por otros autores respecto a las variaciones cuantitativas de las actividades enzimáticas como las celulasas. Por ejemplo, en este estudio se obtuvieron actividades de endoglucanasa máximas de 11.403 U/L.min, 11.727 U/L.min y 9.226 U/L.min en P. ostreatus, C. versicolor y L. edodes respectivamente mayores a las actividades de endoglucanasa obtenidas por Tsiklauri et al. (1999) utilizando aserrín de uva y cáscaras de mandarina con Funalia trogii y Polyporus ciliatus. Esto significa que varios de estos hongos basidiomicetos son capaces de degradar diversos materiales lignocelulósicos bajo diferentes relaciones C/N y en condiciones medioambientales diversas.
3.2. Efecto del sulfato de cobre sobre la degradación de residuos lignocelulósicos y la producción de enzimas lignocelulolíticas
Los dos niveles de CuSO4 utilizados en las doce formulaciones del presente estudio no generaron inhibición aparente en el crecimiento de los tres organismos de trabajo. Como se observa en las Figuras 1 y 2 la biomasa de los tres hongos aumentó en todas las formulaciones durante los 32 días de fermentación. Las enzimas lignocelulolíticas fueron medidas dos veces por semana tomando las muestras del medio líquido en cabina de flujo laminar a las cuales se le determinó las actividades enzimáticas de cuatro hidrolasas y dos óxido-reductasas. Se observa una gran variación en los máximos de las actividades enzimáticas medidas entre especies y formulaciones como se observa en la Tabla 2. Son muchos los factores que pueden afectar la producción de enzimas lignocelulolíticas de hongos de pudrición blanca. Además, las diferentes cepas responden de un modo particular a cada uno de los factores intrínsecos y extrínsecos que deben enfrentar cuando son inoculados. Debido a esto, el estudio combinado de dos o más factores puede generar mayor dificultad al momento de la interpretación de las posibles interacciones entre los compuestos que afectan directamente la producción de enzimas lignocelulolíticas. La variabilidad de las actividades enzimáticas de las hidrolasas es tan amplia entre las especies de trabajo y las doce formulaciones probadas que no hay una evidencia clara de que las cantidades de CuSO4 (0,1596 g/L y 0,0796 g/L) adicionadas a los sustratos hayan generado alguna inhibición o activación directa a estas actividades. Adicionalmente, no hay reportes de que la presencia de cobre en el medio de cultivo líquido en las cantidades adicionadas genere algún efecto importante sobre las actividades enzimáticas de las hidrolasas, de hecho en las Figuras 3, 4, 5 y 6 se muestran las actividades enzimáticas hidrolíticas medidas para las tres cepas sobre las formulaciones F1 a F6 en las que se observó una gran variación entre los diferentes tiempos.
Tabla 2. Máximas actividades enzimáticas lignocelulolíticas (U/L.min) de tres especies de hongos de pudrición blanca para doce niveles de relación carbono nitrógeno (R C/N) y dos niveles de CuSO4 Fórmula F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12
CuSO4 (g/L) 0,1596 0,0798 0,1596 0,0798 0,1596 0,0798 0,1596 0,0798 0,1596 0,0798 0,1596 0,0798 R C/N 24,68 24,13 28,40 26,84 23,98 22,06 23,41 23,79 20,81 20,61 20,70 21,04 11950 15721,6 12210 11250 15930 7600 6720 14590 14040 7520 15620 P. ostreatus 9590 (7) (28) (28) 828) (28) (21) (28) (28) (25) (28) (28) (32) 19760 22240 23770 28610 30560 24950 23960 12170 9450 27520 18670 11270 βG (U/g ss) C. versicolor (11) (11) (32) (32) (32) (28) (25) (14) (25) (28) (21) (32) 26710 24460 22690 24410 25600 26320 29990 29760 25840 30640 27280 26420 L. edodes (21) (18) (32) (28) (28) (32) (25) (28) (32) (32) (28) (32) 5860 5196,5 6089 8022 11403 10213,2 8480 8428,3 6575,2 2451,5 9631,7 P. ostreatus 4850 (14) (11) (21) (14) (21) (25) (25) (32) (32) (32) (32) (32) 3736,1 5237,1 7833,3 5845,6 5007 8184,9 8150 11727,7 10389 8360,7 9023,2 ENG (U/g ss) C. versicolor 4310 (14) (14) (18) (25) (28) (28) (32) (32) (32) (28) (32) (32) 5967,3 9307,2 10267,3 8658,2 8630 7995,6 8830 7752,2 6372,9 9226,1 8428,3 L. edodes 7250 (18) (21) (21) (21) (21) (28) (32) (32) (32) (28) (32) (32)
146
7630 6690 6270 7150 6430 6440 6360 5200 4320 P. ostreatus 6024 (28) 6660 (7) 5546 (7) (11) (14) (11) (28) (25) (21) (32) (21) (32) 5190 6140 5260 6230 6320 6640 7230 5470 5170 EXG (U/g ss) C. versicolor 4560 (32) 5720 (7) 7680 (7) (32) (32) (32) (28) (28) (32) (32) (28) (25) 9190 8000 9190 10240 10980 6340 7540 6270 7980 5940 4630 L. edodes 5930 (11) (18) (21) (21) (32) (21) (25) (28) (32) (32) (32) (32) 7560 8290 7670 12310 16460 6800 7300 10260 12406 11633,1 4001 P. ostreatus 7990 (14) (18) (28) (18) (21) (21) (11) (25) (21) (21) (32) (28) 12980 12780 13040 19580 18320 12100 9250 12670 9920 7804 7320 ENX (U/g ss) C. versicolor 8370 (7) (32) (32) (21) (25) (7) (11) (28) (14) (18) (28) (32) 10170 12960 13110 12780 13320 12220 13540 15920 11740 21880 14602 11940 L. edodes (32) (21) (28) (25) (32) (21) (32) (32) (32) (21) (32) (25) 155,4 117,1 117,8 189,4 130,2 181,7 176,33 P. ostreatus 260 (18) 150 (28) 260 (28) 84 (25) 229(21) (32) (21) (18) (21) (11) (21) (32) 135,5 311,3 167,9 272,6 206,7 297,4 Lac (U/g ss) C. versicolor 240 (28) 130 (32) 240 (28) 260 (28) 311 (28) 196 (25) (21) (28) (11) (32) (32) (25) 120,1 161,2 112,3 131,8 137,8 L. edodes 120 (32) 110 (28) 110 (21) 76 (11) 95 (18) 78 (18) 95 (21) (18) (14) (21) (25) (18) 66,8 66,19 135,89 106,2 83,12 78,38 102,4 70,61 75,11 74,7 P. ostreatus 59 (32) 70 (14) (25) (18) (32) (25) (21) (28) (32) (28) (25) (32) 75,2 65,5 93,76 100,6 77,4 90,9 87,05 72,24 MnP (U/g ss) C. versicolor 70,7 (25) 76 (32) 60 (14) 106 (18) (18) (25) (28) (32) (21) (21) (25) (18) 69,6 78,21 100,3 76,5 81,81 85,74 81,08 72,444 77,8 L. edodes 68 (28) 69 (32) 99 (25) (28) (25) (28) (25) (18) (18) (32) (28) (32) Nota: Los números entre paréntesis corresponden al día de incubación en el que se determinó la máxima actividad enzimática (valor-p<0.05)
El efecto del CuSO4 como inductor de lacasa y peroxidasas ha sido estudiado por varios investigadores (Levin et al., 2002; Niladevi y Prema, 2008). Las actividades enzimáticas de MnP obtenidas en las diferentes combinaciones evaluadas en este trabajo fueron mucho menores que las obtenidas por Bonugli-Santos et al. (2012) de los hongos marinos Tictoperellus sp., Marasmiellus sp. y Peniphora sp. sobre diferentes medios de cultivo con inductores 1mM de CuSO4, 1mM de guaiacol y salvado de trigo, cuyos títulos enzimáticos encontrados fueron de 1.600 a 2.600U/L cuando emplearon CuSO4 como activador para las tres especies y cuando utilizaron salvado de trigo la actividad de MnP fue de 2.556 y 8.206 U/L para Marasmiellus sp. y Peniphora sp., pero la actividad de MnP reportada para Tictoperellus sp. sobre medio de cultivo con salvado de trigo fue de 627x103 U/L. De igual forma, los títulos de MnP obtenidos por Levin et al. (2002) para Trametes trogii utilizando 1mM de CuSO4 como activador también fueron mayores que los obtenidos en todas las combinaciones del presente estudio. Lo anterior probablemente se debió a que en el presente estudio se utilizaron concentraciones de CuSO4 menores a las utilizadas por estos investigadores, acción que pudo no haber generado el efecto de activador de la enzima MnP de los hongos de pudrición blanca evaluados.
147
Figura 1. Producción de biomasa de tres especies de hongos C. versicolor, P. ostreatus, L. edodes sobre seis formulaciones de medios de cultivo. A: F1, B: F2, C: F3, D: F4, E: F5, F: F6 durante 32 días de fermentación sumergida
Figura 2. Producción de biomasa de tres especies de hongos C. versicolor, P. ostreatus, L. edodes sobre seis formulaciones de medios de cultivo. A: F7, B: F8, C: F9, D: F10, E: F11, F: F12 durante 32 días de fermentación sumergida
La actividad de lacasa obtenida en las diferentes combinaciones de las tres especies de hongos evaluadas mostró relación con el comportamiento de la biomasa, ya que durante los primeros 10 días de fermentación, en la cual todas las combinaciones valoradas se mantuvieron en una aparente fase lag, la actividad de la enzima lacasa también se apreció con bajos títulos. Pasada esa fase, cuando los hongos inician la fase logarítmica de crecimiento, la actividad de lacasa también se incrementó notablemente. Diferentes especies de P. ostreatus, C. versicolor y L. edodes han sido reportados como buenos productores de enzimas ligninolíticas empleando inductores o simplemente cuando son cultivados sobre medios que tienen algún material lignocelulósico (Buswell et al., 1995; Baldrian y Gabriel, 2002). Los resultados de este estudio indican que seleccionando las formulaciones y las condiciones de los medios de cultivo para el crecimiento y desarrollo de hongos de pudrición blanca es posible aumentar la secreción de las actividades enzimáticas como la de lacasa, como se observa en la Tabla 2, P. ostreatus con F1, F3 y F7 y C. versicolor con F1, F3, F6 y F7 arrojaron títulos de 260 y 229 U/L.min y de 240 a 311 U/L.min (valor- p < 0.05) respectivamente, resultando promisorios para la producción de esta enzima. Además, se ha demostrado que la presencia de la cascarilla de café pretratada en medios de cultivo líquidos para fermentaciones sumergidas contribuyen al incremento de actividades enzimáticas ligninolíticas tales como la de lacasa, hecho que también ha sido demostrado por otros investigadores (Elisashvili et al., 2006). Finalmente, las lacasas pertenecen al grupo de oxidasas de cobre azul y contienen cuatro átomos de cobre
148
por molécula, distribuidos en tres diferentes sitios de unión de cobre (Solomon et al., 1997); por lo tanto la presencia de cobre en los medios de cultivo siempre es importante para la inducción y producción de las mismas. Además, cabe resaltar que con los hongos de pudrición blanca se tiene una herramienta ambiental importante, ya que incrementando la actividad de lacasas utilizando sulfato de cobre es posible utilizarlas en procesos de biorremediación de aguas residuales y otros recalcitrantes, de modo que la concentración total de cobre en el medio es consumido o disminuido por estos organismos durante el mismo proceso de biorremediación (Gassara et al., 2010).
Tabla 3. Porcentaje de degradación de celulosa, hemicelulosa y lignina en las doce fórmulas y las tres especies de hongos: C. versicolor, P. ostreatus y L. edodes durante 32 días de fermentación sumergida (valor-p = 0,0656) Celulosa Hemicelulosa Lignina Fórmula C. versicolor P. ostreatus L. edodes C. versicolor P. ostreatus L. edodes C. versicolor P. ostreatus L. edodes
F1 58,12 57,78 58,12 76,24 69,83 72,69 46,59 47,29 49,64 F2 57,74 58,12 58,09 58,12 73,86 67,53 45,83 47,57 48,06 F3 58,12 57,78 58,12 67,81 61,13 74,31 48,36 44,97 44,81 F4 56,50 57,10 58,34 76,79 69,83 72,69 43,96 43,24 47,29 F5 57,78 59,12 58,50 58,82 73,86 67,83 50,57 44,99 44,21 F6 56,79 57,71 58,21 67,81 61,63 74,01 43,58 45,34 43,19 F7 57,55 49,50 57,78 76,79 69,12 73,32 46,68 46,74 45,77 F8 58,12 57,78 57,18 57,85 74,46 67,83 44,86 46,95 52,99 F9 58,12 57,73 58,83 67,81 61,03 74,31 45,56 47,40 50,74 F10 57,06 58,12 57,15 76,79 69,12 73,32 45,42 47,38 46,73 F11 58,84 58,34 57,89 57,05 74,46 67,83 46,98 46,08 43,86 F12 57,11 58,84 58,34 67,81 61,32 74,31 44,44 45,62 44,81
3.3. Producción de enzimas lignocelulolíticas y consumo de sustratos de la mejor combinación hongo – formulación
Los datos experimentales obtenidos en el presente estudio fueron sometidos a un proceso de selección a fin de lograr la mejor combinación especie de hongo fórmula del diseño experimental bifactorial respecto a la producción de enzimas lignocelulolíticas, el cual se realizó por etapas. Primero se hizo un análisis de varianza, ANOVA a tres vías (especie, fórmula, tiempo) para cada una de las actividades enzimáticas: endoglucanasa, exoglucanasa, β-glucosidasa, endoxilanasa, lacasa y MnP durante 10 tiempos en los 32 días de fermentación; se obtuvieron diferencias significativas para todas las combinaciones con un valor-p < 0,05. Posteriormente, se realizó un análisis por especie y una selección de los máximos de cada una de las actividades enzimáticas y un análisis comparativo de los máximos (empleando la función multcompare) aplicando una prueba de Kruskal-Wallis para cada actividad enzimática, obteniendo diferencias significativas con valor-p < 0,05 para cada actividad enzimática comparada (ver Tabla 2). Para concluir la selección de la mejor combinación especie-fórmula se realizó un nuevo análisis comparativo a las cantidades de celulosa, hemicelulosa y lignina degradadas en 32 días de fermentación en fase sólida aplicando la prueba de Kruskal-Wallis y una prueba de comparación con la función multcompare a las combinaciones seleccionadas de la Tabla 2. De este análisis comparativo se detectó que las tres especies de hongos en todas las combinaciones degradaron de forma similar los tres componentes mayoritarios de los materiales lignocelulósicos, celulosa, hemicelulosa y lignina como se resume en la Tabla3.
149
Del mismo modo, en la Tabla 3 se observa que todas las combinaciones presentaron porcentajes cercanos de degradación de cada uno de los componentes de la fibra adicionada; C. versicolor – F5 fue el que mejor comportamiento presentó respecto a la capacidad de degradación de lignina con 50,57%, P. ostreatus en combinación con las fórmulas F5 y F11 fueron las que mostraron mayor capacidad de degradación de hemicelulosa con 73,86% y 74,46% respectivamente y P. ostreatus – F5 degradó 59,12% de celulosa. A estas combinaciones se les realizó un análisis comparativo a fin de seleccionar de entre las tres combinaciones la de mejor comportamiento para aplicar un modelo matemático que describa los datos experimentales de producción de enzimas lignocelulolíticas y biomasa y de consumo de los sustratos medidos. Sin embargo, el análisis comparativo no presentó diferencia significativa (valor-p = 0.677), por lo que se seleccionó la combinación P. ostreatus – F5 ya que fue la que arrojó el mayor promedio de las medias.
3.4. Variación de las actividades enzimáticas durante la fermentación en fase sólida
La variación de las actividades enzimáticas durante los 32 días de fermentación sumergida no presentó una tendencia definida para ninguna de las enzimas medidas para las tres especies de hongos estudiados en las doce formulaciones de medios de cultivo. La actividad de las enzimas celulolíticas medidas en este trabajo, endoglucanasa y exoglucanasa, fue variable con tendencia ascendente hasta el día 20 de incubación sin descenso definido a partir de allí como se observa en las Figuras 3 y 4; exceptuando las combinaciones de las tres especies con la F1 para endoglucanasa (ver Figura 3A) que sí presentan un ascenso hasta el día 20 de incubación y posterior descenso sostenido hasta el final de la incubación (día 32). Del mismo modo las combinaciones de las tres especies con F2 para exoglucanasa mostraron tendencia al ascenso hasta el día 20 de incubación con descenso a partir de allí. Asimismo, en contraste con el comportamiento de las combinaciones de las tres especies de hongos de F1 a F6, las actividades de la endoglucanasa y exoglucanasa de las tres especies de hongos con las formulaciones F7 a F12 presentaron tendencia hacia el ascenso hasta el día 32 de incubación. En contraste, la actividad de la endoxilanasa presentó un ascenso leve y tendencia a estabilizarse como se observa en la Figura 5, salvo para las combinaciones de las tres especies con F6 las cuales tendieron a tener un marcado ascenso hasta el día 20 de incubación y un posterior descenso hasta el día 32 de incubación. De igual forma para las combinaciones de las tres especies con las formulaciones F7 a F12 se presentó tendencia a la estabilidad posterior al ascenso entre los días 10 y 20 de la incubación. En referencia a la actividad de la β- glucosidasa, el comportamiento de las combinaciones de cada uno de las especies de hongos entre las F1 y F3 mostraron una alta variabilidad como se observan en la Figura 6 las combinaciones de P. ostreatus con F4 a F6 se mostraron estables, así como todas las combinaciones de las tres especies con las formulaciones F7 a F12. Las dos actividades de ligninasas medidas en este trabajo mostraron comportamientos similares tendientes al ascenso con posterior estabilización al final del período de incubación (32 días). La actividad de lacasa mostró mayor variabilidad en las combinaciones de las tres especies con F1, especialmente para el P. ostreatus alcanzando una actividad cercana a 300 U/L.min después de los 20 días de incubación. Las actividades de MnP variaron hacia el ascenso con alguna diferencia para las combinaciones con la F9 cuyas actividades parecen tender hacia el descenso luego de los 25 días de incubación como se observa en la Figura 8. Muchos basidiomicetos tienen la capacidad de producir simultáneamente enzimas hidrolíticas y oxidativas las cuales son necesarias para degradar los sustratos del complejo lignocelulósico (Kirk, 1983; Wood y García, 1994). Estas enzimas son extracelulares e inducibles y según Buswell et al. (1996) especialmente los hongos de pudrición blanca en general exhiben mayores títulos de ligninasas que de celulasas; lo cual se convierte en una fortaleza de estos hongos ya que para lograr acceder a la celulosa deben iniciar la degradación de la lignina. Sin embargo, en este estudio el material lignocelulósico empleado, cascarilla de café, como la principal fuente de carbono, fue sometido a un pretratamiento en el que se desordenó la matriz lignocelulósica permitiendo el acceso más rápidamente a la celulosa por las tres especies de hongos. De hecho, según los datos experimentales obtenidos y consignados en las Tablas 2 y 3 las actividades enzimáticas máximas de todas las combinaciones y la capacidad de degradación de
150 celulosa y lignina estuvieron muy próximos unos de otros para las diferentes combinaciones de las tres especies de hongos de trabajo con las 12 formulaciones, lo que indica que los hongos de pudrición blanca como P. ostreatus, C. versicolor y L. edodes degradan material lignocelulósico bajo condiciones de fermentación sumergida sin grandes diferencias cuando se adiciona material lignocelulósico de mayor acceso a la celulosa (pretratado). Empero, la cantidad de hemicelulosa presente en los medios de cultivo fue bastante baja en comparación con la hemicelulosa que se encuentra presente en la cascarilla de café sin pretatamiento, ya que durante el pretratamiento con ácido sulfúrico debió haberse alterado este componente y sus productos arrastrados durante el lavado del material antes de ser utilizado como componente de los medios de cultivo. Este hecho se corroboró comparando los títulos de las actividades enzimáticas obtenidas en este estudio con las obtenidas en investigaciones similares en las que obtuvieron resultados comparables, a pesar de la gran cantidad de factores que afectan los resultados de las actividades enzimáticas, tanto de las hidrolasas como de las ligninasas (Tlecutil-Beristain et al., 112; Mata y Savoie, 1998; Mata et al., 2005; Elisashvili et al., 2008; Gassara et al., 2010).
Figura 3. Actividad enzimática de endoglucanasa de tres especies de hongos: C. versicolor, P. ostreatus, L. edodes sobre seis formulaciones de sustratos diferentes. A: F1, B: F2, C: F3, D: F4, E: F5, F: F6 en 32 días de fermentación sumergida
Figura 4. Actividad enzimática de exoglucanasa de tres especies de hongos: C. versicolor, P. ostreatus, L. edodes sobre seis formulaciones de sustratos diferentes. A: F1, B: F2, C: F3, D: F4, E: F5, F: F6 en 32 días de fermentación sumergida
151
Figura 5. Actividad enzimática de endoxilanasa de tres especies de hongos: C. versicolor, P. ostreatus, L. edodes sobre seis formulaciones de sustratos diferentes. A: F1, B: F2, C: F3, D: F4, E: F5, F: F6 en 32 días de fermentación sumergida
Figura 6. Actividad enzimática de β-glucosidasa de tres especies de hongos: C. versicolor, P. ostreatus, L. edodes sobre seis formulaciones de sustratos diferentes. A: F1, B: F2, C: F3, D: F4, E: F5, F: F6 en 32 días de fermentación sumergida
Figura 7. Actividad enzimática de lacasa de tres especies de hongos: C. versicolor, P. ostreatus, L. edodes sobre seis formulaciones de sustratos diferentes. A: F7, B: F8, C: F9, D: F10, E: F11, F: F12 en 32 días de fermentación sumergida
152
Figura 8. Actividad enzimática de MnP de tres especies de hongos: C. versicolor, P. ostreatus, L. edodes sobre seis formulaciones de sustratos diferentes. A: F7, B: F8, C: F9, D: F10, E: F11, F: F12 en 32 días de fermentación sumergida
En el tiempo de fermentación en el que se realizaron todas las determinaciones enzimáticas, de la biomasa y los componentes de la fibra se evidenció la formación de pellets de la biomasa enrollándose en las mismas hifas y en este caso en particular, también en las partículas del material lignocelulósico utilizado como parte de la fuente de carbono, la cascarilla de café pretratada. Asimismo, hubo un incremento considerable de la viscosidad, hasta que los medios de cultivo adquirieron apariencia de gelatinización (tiempo superior a 32 días de incubación), probablemente por la secreción de otras sustancias como biopolímeros que cumplen funciones fisiológicas para el crecimiento y desarrollo de estos basidiomicetos. Aunque los títulos de las actividades enzimáticas obtenidas presentaron en su mayoría tendencia a la estabilización en los diferentes tiempos del proceso de fermentación sumergida, los apreciables cambios en de los medios de cultivo durante el tiempo de fermentación, debieron producir nuevas sustancias que pudieron haber generado algunas perturbaciones en las actividades enzimáticas, provocando las disminuciones de las actividades enzimáticas en algunas de las combinaciones o por otras causas como represión catabólica por productos de las reacciones que se generan en la fermentación; producción de variantes isoenzimáticas de las mismas enzimas a diferentes tiempos y diferentes condiciones del sustrato arrojan actividades diferentes. Sin embargo, estos descensos en las actividades enzimáticas lignocelulolíticas también han sido detectados por varios investigadores, quienes reportan algunas de estas hipótesis como posibles causantes de los descensos de dichas actividades enzimáticas (Panagiotou et al., 2003; Mata et al., 2005; Levin et al., 2008; Montoya et al., 2011a).
3.5. Modelamiento matemático
Basado en los datos experimentales obtenidos de actividades enzimáticas lignocelulolíticas durante los 32 días de fermentación sumergida para las tres especies de hongos basidiomicetos de pudrición blanca: C. versicolor, P. ostreatus y L. edodes, se propuso un modelo matemático compuesto de 11 ecuaciones diferenciales (ver Tabla 4) a fin de buscar la descripción de los datos experimentales de todas las combinaciones resultantes para P. ostreatus. Empero, aquí se presentan los resultados del modelamiento arrojados para la combinación especie de hongo fórmula, F5, ya que ésta fue la que mostró el mejor comportamiento respecto de la degradación de los sustratos basados en materiales lignocelulósicos. De igual forma, para comparar el ajuste de los datos experimentales al modelo matemático propuesto se planteó una prueba F de una cola, con la cual se obtuvieron las varianzas de los residuales entre los datos experimentales y el modelo, individualmente para cada variable medida, pero haciendo la comparación de cada ecuación aplicada para todas las formulaciones de F1 a F12 en la misma especies, en este caso P. ostreatus, lo que permitió probar cual combinación fue mejor descrita por el modelo en términos de la mejor representación de los datos experimentales obtenidos.
153
Con el modelo matemático propuesto se plantea la descripción de producción de biomasa, seis enzimas lignocelulolíticas, azúcares reductores como producto intermedio consumido durante la misma fermentación, el consumo de celulosa, hemicelulosa y la degradación de lignina. Asimismo, los datos experimentales obtenidos en esta investigación serán ajustados al modelo planteado a fin de contribuir con nuevas propuestas en el camino al planteamiento de modelos matemáticos más complejos que permitan la descripción de los procesos de fermentación sumergida con fines industriales empleando hongos de pudrición blanca. Varias ecuaciones cinéticas de complejidad variable, tales como la ecuación lineal, logística, de dos fases o la ecuación de Monod han sido utilizadas por diferentes investigadores a fin de buscar la descripción de la producción de biomasa en procesos de fermentación sumergida y en estado sólido (Sangsurasak et al., 1996; Viccini et al., 2001). De las expresiones matemáticas utilizadas, la más frecuente es la ecuación logística, debido probablemente a la forma simple de la expresión. El modelo propuesto consignado en la tabla 4 para la descripción de la biomasa es la ecuación (1), la cual corresponde a la ecuación logística modificada por Mitchell et al. (1999). Para describir la variación de los azúcares reductores en el tiempo se propuso la ecuación (2) que correspondió a un factor de producción constante de azúcares reductores y un consumo de los mismos por el hongo como fuente de energía durante la fermentación sumergida. Para la degradación de lignina y el consumo de celulosa en el tiempo de fermentación se plantearon las ecuaciones (3) y (8) cuyo planteamiento se realizó en función de las concentraciones de las concentraciones de los mismos sustratos, es decir de las concentraciones de lignina y celulosa respectivamente; mientras que el consumo de hemicelulosa se planteó en términos de la concentración de la endoxilanasa como se muestra en la ecuación (6). La variación de las actividades enzimáticas celulolíticas fueron propuestas para la exoglucanasa un coeficiente de producción de la actividad enzimática por la concentración de la celulosa y para la endoglucanasa se planteó la producción de la actividad enzimática igual que para exoglucanasa afectado por un factor de inhibición regido por la concentración de azúcares reductores, estas dos expresiones están dadas por las ecuaciones (10) y (9) respectivamente. Para la descripción de la ligninasas se plantearon dos expresiones simples de producción de las enzimas de un coeficiente de producción de cada una por la concentración del sustrato sobre el cual actúan, la lignina como se muestra en las ecuaciones (4) y (5) para la lacasa y MnP respectivamente. Finalmente para la variación de la enzima β-glucosidasa se propuso una ecuación cuya producción dependió únicamente de la variación de la degradación de celulosa con un factor de inhibición causado por la concentración de los azúcares reductores y está representada en la ecuación (11). Los parámetros de cada una de las ecuaciones consignadas en la Tabla 4 se describen en la tabla 5. La fermentación sumergida es considerada en general como un proceso homogéneo por la agitación que se da en todo el tiempo de la fermentación. Sin embargo, en el proceso que se llevó a cabo en este estudio, la fermentación sumergida no puede considerarse como un proceso completamente homogéneo, así durante todo el tiempo de la fermentación se hubiera mantenido en agitación; debido a que hubo varios factores que no permiten tal consideración, en especial las características del medio de cultivo, el cual a pesar de ser inicialmente un medio líquido, contenía el 10% de la masa como cascarilla de café pretratada, la cual hizo parte de la fase sólida del medio de cultivo, diferentes de la biomasa. Por lo anterior, no se pudo determinar en forma directa el crecimiento de la biomasa como peso seco del micelio, fue necesario determinar la biomasa indirectamente a través de la medición del contenido de NAGA y realizar cálculos para la obtención de los datos de biomasa en el tiempo de fermentación. Asimismo, la medida del consumo del sustrato fue realizada únicamente por la determinación de los componentes de la fibra. En estos procesos de fermentación se producen una gran cantidad de sustancias intermedias que pueden generarse como producto de las reacciones bioquímicas durante las fases de crecimiento y desarrollo de estos basidiomicetos, lo cual hace aún más compleja la descripción de los procesos de fermentación sumergida y su escalamiento cuando se pretende aplicar estos procesos en producción industriales para la obtención de alguna sustancia de interés (Pal et al., 1995a; Sarikaya y Ladisch, 1997; Pandey et al., 2000; Moreira et al., 2003; Patil y Dayanand, 2006; Rodríguez-Couto y Toca-Herrera, 2007; Elisashvili et al., 2008). Los hongos basidiomicetos como los utilizados en el presente estudio contienen quitina en su pared celular. Debido a que en los procesos de fermentación sumergida del presente estudio no fue posible
154 determinar directamente la cantidad de biomasa, se determinó el contenido de quitina a través de la cuantificación de N-acetil-D-glucosamina (NAGA) en todos los tiempos de la fermentación y se le determinó el contenido de NAGA al micelio seco obtenido de cultivo líquido a cada una de las tres especies de trabajo, obteniendo como resultado 15,83% (p/p) en P. ostreatus, 14,15% (p/p) en C. versicolor y 10,08% (p/p) en L. edodes. Estos porcentajes de NAGA fueron utilizados para calcular la cantidad de biomasa de los medios de cultivo en cada uno de los tiempos de fermentación; asimismo, estos datos de biomasa fueron los que se sometieron al modelamiento con la ecuación (1). Para la descripción de la producción de biomasa de la combinación P. ostreatus – F5 el coeficiente n que afecta la relación entre la concentración de biomasa y la concentración de biomasa máxima fue mayor a 1 (7,23) lo que sugiere que P. ostreatus en estos medios de cultivo se comporta como un organismo relativamente resistente a la autoinhibición. El ajuste de los datos experimentales al modelo de la biomasa y los azúcares reductores se muestran en la Figura 9, en la cual se observa una marcada fase lag y una rápida producción de azúcares reductores, probablemente debido a que la concentración inicial de los azúcares reductores en este medio de cultivo es bastante baja y el hongo debe iniciar su proceso de generación de fuente de energía a fin de iniciar su crecimiento y desarrollo. En la Tabla 6 se encuentran los valores de los parámetros ajustados de la biomasa y los azúcares reductores y la bondad del ajuste en términos de la varianza de los residuales, obteniendo para los datos de la biomasa un ajuste aproximado del 77% y para los azúcares reductores del 76% referidos a la combinación que presentó la descripción del menor ajuste (o el ajuste más pobre) que corresponde a la varianza de los residuales más alta.
Tabla 4. Modelo matemático para la descripción de producción de biomasa, enzimas lignocelulolíticas y consumo de la matriz lignocelulósica Ecuación Descripción n dCbb C mb.1C (1) Biomasa dt C bm dC AR qm. Cb (2) Azúcares reductores dt p dC L kC. (3) Lignina dt LL dC lac kC. (4) Lacasa dt lac L dC MnP kC. (5) Manganeso peroxidasa (MnP) dt MnP L dC HM kC. (6) Hemicelulosa dt HM ENX dC ENX kC. (7) Endoxilanasa dt ENX HM dC C k. Cc (8) Celulosa dt C dC ENG k.. C C (9) Endoglucanasa dt ENG C ENG AR dC EXG kC. (10) Exoglucanasa dt EXG C
dCBG dC C kBG . BG.C AR (11) β-glucosidasa dt dt
155
En la Figura 10 se presenta el comportamiento de los datos experimentales respecto al modelo propuesto para la descripción de la degradación de la lignina y de dos ligninasas, lacasa y MnP descrita por las ecuaciones (3), (4) y (5); los parámetros de las ecuaciones se encuentran consignados en la Tabla 6. De igual forma, el ajuste para los datos experimentales de la lignina, lacasa y MnP al modelo propuesto fueron aproximadamente del 97%, 99% y 54% respectivamente para la lignina, lacasa y MnP de la combinación P. ostreatus - F5. En la Figura 11 se muestra el ajuste de los datos experimentales de la hemicelulosa y la enzima endoxilanasa al modelo (ecuaciones (6) y (7)) y los parámetros del modelamiento se encuentran en la Tabla 6. Los porcentajes de ajuste al modelo para la hemicelulosa y endoxilanasa fueron aproximadamente del 94% y 96% respectivamente para F5. El modelamiento de los datos experimentales de celulosa, endoglucanasa, exoglucanasa y β-glucosidasa se muestran en la Figura 12. Del mismo modo los parámetros del modelo están consignados en la ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia. y el ajuste aproximado de los datos experimentales al modelo fue de 50% para celulosa, 75% endoglucanasa, 83% exoglucanasa y 93% β-glucosidasa para la combinación P. ostreatus – F5.
Tabla 5. Parámetros de las ecuaciones del modelo matemático. Parámetro Significado Parámetro Significado Velocidad específica de crecimiento de la biomasa µ k Coeficiente de consumo de hemicelulosa (día-1) m (día-1) HM Concentración de biomasa máxima (g/L) Coeficiente de producción de Endoxilanasa C k bm ENX (U/min.g/día) n < 1 el organismo es relativamente sensible a la auto-inhibición y ésta ocurre para valores muy bajos de C N b C Concentración inicial de hemicelulosa (g/L) n = 1 ecuación logística HM0 n > 1 el organismo es relativamente resistente a la auto-inhibición y ésta ocurre solo cuando Cb ≈ Cbm Cb0 Concentración de biomasa máxima (g/L) CENX0 Actividad inicial de Endoxilanasa (U/L.min) Coeficiente de producción constante de azúcares q k Coeficiente de consumo de celulosa (día-1) p reductores (g/L/día) C Coeficiente de mantenimiento celular (día-1) Coeficiente de producción de Endoglucanasa M k ENG (U/min.g/día) Concentración inicial de azúcares reductores (g/L) Coeficiente de inhibición de Endoglucanasa C µ AR0 ENG (U/min.g/día) Coeficiente de degradación de lignina (día-1) Coeficiente de producción de Exoglucanasa k k L EXG (U/min.g/día) klac Coeficiente de producción de lacasa (U/min.g/día) CC0 Concentración inicial de celulosa (g/L) kMnP Coeficiente de producción de MnP (U/min.g/día) CENG0 Actividad inicial de Endoglucanasa (U/L.min) CL0 Concentración inicial de lignina (g/L) CEXG0 Actividad inicial de Exoglucanasa (U/L.min) Actividad inicial de lacasa (U/L.min) Coeficiente de producción de β-glucosidasa C k lac0 BG (U/g.min) Actividad inicial de MnP (U/L.min) Coeficiente de inhibición de β-glucosidasa C µ MnP0 BG (U/g.min/día) CBG0 Actividad inicial de β-glucosidasa (U/L.min)
156
Figura 9. Perfil en el tiempo de la biomasa celular y los azúcares reductores para la combinación P. ostreatus – F5. Los puntos discretos corresponden a los datos experimentales; las líneas continuas son calculadas por el modelo propuesto.
Figura 10. Ajuste de datos experimentales de lignina, lacasa, MnP para la combinación P. ostreatus – F5. Los puntos discretos corresponden a los datos experimentales; las líneas continuas son calculadas por el modelo propuesto.
Figura 11. Ajuste de datos experimentales de hemicelulosa y endoxilanasa para la combinación P. ostreatus – F5. Los puntos discretos corresponden a los datos experimentales; las líneas continuas son calculadas por el modelo propuesto.
157
Figura 12. Ajuste de datos experimentales de celulosa, endoglucanasa, exoglucanasa y β-glucosidasa para la combinación P. ostreatus – F5. Los puntos discretos corresponden a los datos experimentales; las líneas continuas son calculadas por el modelo propuesto
Tabla 6. Valores de los parámetros del ajuste de los datos experimentales al modelo para P. ostreatus – F5 Parámetro Valor Parámetro Valor -1 µm 0.1523 día kENX 347,7099 U/min.g/día Cbm 76,1285 g/L CHM0 1,5859 g/L n 7,2339 CENX0 1,578 U/L.min -1 Cb0 1,5001 g/L kC 0,035 día qp 0,2608 g/L/día kENG 20,2676 U/min.g/día -1 m 0,0092 día µENG 121,3156 U/min.g/día CAR0 1,3916 g/L kEXG 4,4188 U/min.g/día) -1 kL 0,025 día CC0 47,7708 g/L klac 0,1433 U/min.g/día CENG0 1,1202 U/L.min kMnP 0,1322 U/min.g/día) CEXG0 1750 U/L.min CL0 38,66 g/L kBG 893,3498 U/g.min
Clac0 32 U/L.min µBG 167,3245 U/g.min/día) CMnP0 7,3 U/L.min CBG0 817,99 U/L.min -6 -1 kHM 6,39x10 día
Aunque existen numerosas investigaciones previas acerca de la producción de actividades enzimáticas lignocelulolíticas por diversos hongos de pudrición blanca, y la degradación de materiales lignocelulósicos; y aproximaciones sobre la formación de productos intermedios en procesos de fermentación sumergida (Bizukojc y Ledakowicz, 2006; Rodríguez-Couto y Toca-Herrera, 2007). Se requiere aun mayor información sobre las cinéticas de formación de biomasa, de producción de enzimas, del consumo de nutrientes y degradación de la lignina que permitan la descripción del proceso global y posterior escalado para la obtención de alguno de los productos de interés como los que se plantean en este estudio empleando como materias primas residuos lignocelulósicos pretratados a fin de buscar bajar los costos de producción de estas biosustancias. El planteamiento de las ecuaciones para la descripción de la cinética de cada una de las variables medidas se realizó bajo la premisa de darle a cada expresión matemática algún sentido biológico respecto al compuesto a describir. Las expresiones propuestas describieron aceptablemente cada una de los compuestos determinados en el presente estudio. Sin embargo, algunas de las ecuaciones describieron mejor los datos experimentales obtenidos que otras, como en el caso de la descripción de la degradación de lignina y hemicelulosa, y producción de lacasa, endoxilanasa y β-glucosidasa, las cuales dieron un porcentaje de ajuste en la descripción mayor al 90%, mientras que para la degradación de celulosa y producción de MnP las ecuaciones propuestas arrojaron un ajuste cercano al 50% lo que indica que deberá buscarse nuevas expresiones que mejoren los porcentajes de ajuste a los datos experimentales. Por último, debe considerarse la posibilidad de medir algunos de los productos intermedios originados por la acción de las enzimas medidas, u otras enzimas no evaluadas y
158 sus productos a fin de contribuir a una interpretación más acabada de los complejos fenómenos que ocurren durante el crecimiento de los macromicetos en los procesos de fermentación sumergida.
4. Conclusiones
En el presente estudio, las tres especies de hongos de pudrición blanca probadas sobre las doce formulaciones de sustrato propuestas crecieron bien durante los 32 días de fermentación sumergida, por lo que se concluye que tanto la relación C/N como las concentraciones de CuSO4 no afectaron drásticamente el crecimiento y desarrollo de ninguno de los tres hongos. Sin embargo, de la evaluación detallada de los datos experimentales si se observaron diferencias en la producción de las enzimas lignocelulolíticas durante los 32 días de fermentación, en la que a pesar de la gran variabilidad de las actividades enzimáticas en el tiempo, unas combinaciones hongo formulación mostraron mejor comportamiento respecto a la producción de las enzimas que fueron determinadas. Del mismo modo, el hongo P. ostreatus mostró mejor comportamiento en cuanto a la capacidad de degradación de lignina y celulosa en la mayoría de los medios de cultivo, hecho que probablemente ocurrió por el desorden generado a la matriz lignocelulósica por el pretratamiento realizado a la cascarilla de café utilizada como fuente principal de carbono en este proceso. El modelo matemático planteado en este estudio para la representación de los procesos de fermentación sumergida se realizó buscando describir el desarrollo de estos hongos de pudrición blanca sobre medios de cultivo no convencionales, a fin de buscar puntos generales de interpretación de estos procesos que por ser heterogéneos se hacen complejos y carecen de expresiones matemáticas directas que permitan el escalamiento de los mismos con fines industriales, evitando hacer experimentación individual de cada proceso.
Agradecimientos
Los autores agradecen a la Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados de la Universidad de Caldas (Colombia) por la financiación del presente trabajo y al Instituto de Biotecnología Agropecuaria de la misma institución por el apoyo material y de infraestructura. Asimismo, los autores expresan sus agradecimientos a la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad de Buenos Aires (Argentina) por su apoyo y asesoría durante la realización de este trabajo.
Referencias
Baldrian P, Gabriel J (2002) Variability of laccase activity in the whiterot basidiomycete Pleurotus ostreatus. Folia Microbiologica 47: 385-390. Barr BK, HsieH YL, Ganem B, Wilson DB (1996) Identification of two functionally different classes of exocellulases. Biochemistry 35: 586-592. Béguin P, Aubert JP (1994) The biological degradation of cellulose. FEMS Microbiology Reviews 13: 25-58. Bizukojc M, Ledakowicz S (2006) A kinetic model to predict biomass content for Aspergillus niger germinating spores in the submerged culture. Process Biochemistry 41: 1063-1071. Blanchette RA (1995) Degradation of the lignocellulose complex in wood. Canadian Journal of Botany 73: S999-S1010. Bonugli-Santos R, Durrant L, Durães Sette L (2012) The production of ligninolytic enzymes by marine-derived basidiomycetes and their biotechnological potential in the biodegradation of recalcitrant pollutants and the treatment of textile effluents. Water Air Soil Pollution 223: 2333-2345. Buswell JA, Cai Y, Chang ST (1995) Effect of nutrient nitrogen and manganese on manganese peroxidase and laccase production by Lentinula (Lentinus) edodes. FEMS Microbiology Letters 128: 32- 45. Buswell JA, Cai YJ, Chang ST (1996) Ligninolytic enzyme production and secretion in edible mushroom fungi. En Royse DJ (Ed.) Mushroom Biology and Mushroom Products. The Pennsylvania State University pp. 113±122. Pennsylvania. Carlile M, Watkinson S, Gooday G (2001) The fungi. Academic Press. London. 588 p. p. Dormand JR, Prince PJ (1980) A family of embedded Runge-Kutta formulae. Journal of Computational and Applied Mathematics 6: 19-26.
159
Elisashvili V, Penninckx M, Kachlishvili E, Asatiani M, Kvesitadze G, Gadd G (2006) Use of Pleurotus dryinus for lignocellulolytic enzymes production in submerged fermentation of mandarin peels and tree leaves. Enzyme and Microbial Technology 38: 998-1004. Elisashvili V, Penninckx M, Kachlishvili E, Tsiklauri N, Metreveli E, Kharziani T, Kvesitadze G (2008) Lentinus edodes and Pleurotus species lignocellulolytic enzymes activity in submerged and solid-state fermentation of lignocellulosic wastes of different composition. Bioresource Technology 99: 457-462. Gassara F, Brar S, Tyagi RD, Verma M, Surampalli RY (2010) Screening of agro-industrial wastes to produce ligninolytic enzymes by Phanerochaete chrysosporium. Biochemical Engineering Journal 49: 388-394. Hölker U, Höfer M, Lenz J (2004) Biotechnological advantages of laboratory-scale solid-state fermentation with fungi. Applied Microbiology and Biotechnology 64: 175-186. Hudson H (1986) Fungal Biology. Edward Arnolds Eds. Maryland. 298 p. p. Ikasari L, Mitchell DA (2000) Two-phase model of yhe kinetics of growth of Rhizopus oligosporus in membrana culture. Biotechnology Bioengineering 68: 619-627. Joselau JP, Ruel K (1994) Wood polysaccharides and their degradation by fungi. En Ouellette P (Ed.) Host Wall Alterations by Parasitic Fungi. APS Press. Minnesota. Kapich AN, Prior BA, Botha A, Galkin S, Lundell T, Hatakka A (2004) Effect of lignocellulose-containing substrate on production of ligninolytic peroxidases in submerged cultures of Phanerochaete chrysosporium ME-446. Enzyme and Microbial Technology 34: 187-195. Kirk TK (1983) Degardation and convertion of lignocelluloses. En Smith JE, Berry DR, Kristiansen P (Eds.) The filamentous fungi. London. Kirk TK, Farrel RL (1987) Enzymatic combustion: the microbial degradation of lignin. Annual Reviews of Microbiology 41: 465- 505. Kjeldahl J (1883) Neue Methode Zùr Bestimmung der Stickstoffs in Organichen Kòrpen. Zeitschrift fur Analytische Chemie 22: 366-382. Kovarova-Kovar K, Egli T (1998) Growth kinetics of suspended microbial cells: from single substrate-controlled growth to mixed-substrate kinetics. Microbiology and Molecular Biology Reviews 62: 646-666. Leterme P. (2010). Análisis de alimentos y forrajes, in Protocolos de Laboratorio Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira: Palmira. 66 pp. Levin L, Forchiassin F, Ramos AM (2002) Copper induction of lignin-modifying enzymes in the white-rot fungus Trametes trogii. Mycologia 94(3): 377-383. Levin L, Herrmann C, Papinutti VL (2008) Optimization of lignocellulolytic enzyme production by the white-rot fungus Trametes trogii in solid-state fermentation using response surface methodology. Biochemical Engineering Journal 39: 207-214. Mata G, Savoie JM (1998) Extracellular enzyme activities in six Lentinula edodes strains during cultivation in wheat straw. World Journal of Microbiology & Biotechnology 14: 513-519. Mata G, Murrieta Hernández DM, Iglesias Andreu LG (2005) Changes in lignocellulolytic enzyme activites in six Pleurotus spp. strains cultivated on coffee pulp in confrontation with Trichoderma spp. World Journal of Microbiology & Biotechnology 21: 143-150. Miller GL (1959) Use of DinitrosaIicyIic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar. Analytical Chemistry 31(3): 426- 428. Mitchell D, Stuart D, Tanner R. (1999). Solid-State fermentation - Microbial growth kinetics, in The Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis and bioseparation, Flickinger M, Drew S, EditorsWiley: New York. 2407- 2429 Mitchell DA, Von meien OF, Krieger N, Dalsenter FD (2004) A review of recent developments in modeling of microbial growth kinetics and intraparticle phenomena in solid-state fermentation. Biochemical Engineering Journal 17: 15-26. Montoya BS, Orrego CA, Levin L (2011) Growth, fruiting and lignocellulolytic enzyme production by the edible mushroom Grifola frondosa (maitake). World Journal of Microbiology & Biotechnology ISSN 0959-3993: DOI 10.1007/s11274- 11011-10957-11272. Moreira MT, Feijoo G, Lema JM (2003) Fungal bioreactors: Applications to white-rot fungi. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology 2: 247-259. Niladevi KN, Prema P (2008) Effect of inducers and process parameters on laccase production by Streptomyces psammoticus and its application in dye decolourization. Bioresource Technology 99 4583-4589. Pal M, Calvo A, Terron MC, Gonzalez AE (1995) Solid-state fermentation of sugarcane bagasse with Flammulina velutipes and Trametes versicolor. World Journal of Microbiology & Biotechnology 11: 541-545. Panagiotou G, Kekos D, Macris B, Christakopoulos P (2003) Production of cellulolytic and xylanolytic enzymes by Fusarium oxysporum grown on corn stover in solid state fermentation. Industrial Crops and Products 18: 37-45. Pandey A, Soccol CR, Mitchell D (2000) New developments in solid state fermentation: I-bioprocesses and products. Process Biochemistry 35: 1153–1169. Paszczczynski A, Crawford R, Huyn V (1988) Manganese peroxidase of Phanerochaete chrysosporium purification. Methods enzymology 161: 264-270. Paszczynski A, Crawford RL (1991) Degradation of azo compounds by ligninases from Phanerochaete chrysosporium Involment of veratryl alcohol. Biochemistry Biophysics Research Communications 178: 1056-1063.
160
Patil S, Dayanand A (2006) Optimization of process for the production of fungal pectinases from deseeded sunflower head in submerged and solid-state conditions. Bioresource Technology 97: 2340-2344. Plassard C, Mousain D, Salsac L (1982) Estimation of mycelial growth of basidiomycetes by means of chitin determination. Phytochemistry 21: 345-348. Rodriguez-Couto S, Toca-Herrera JL (2007) Laccase production at reactor scale by filamentous fungi. Biotechnology advances 25: 558.569. Sangsurasak P, Nopharatana M, Mitchell D (1996) Mathematical modeling of the growth of filamentous fungi in solid-state fermentation. Journal Science Industrial Resources 55: 333-342. Sarikaya A, Ladisch M (1997) An unstructured mathematical model for growth of Pleurotus ostreatus on lignocellulosic material in solid-state fermentation systems. Applied Biochemistry and Biotechnology 62: 72-85. Solomon EI, Sundaram UM, Machonkin TE (1997) Multicopper oxidases and oxygenases. Chemical Reviews 96: 2563-2605. Tang Y-J, Zhu L-W, Li H-M, Li D-S (2007) Submerged Culture of Mushrooms in Bioreactors – Challenges, Current State-of-the- Art, and Future Prospects. Food Technology and Biotechnology 45(3): 221-229. Tavares A, Coelho M, Coutinho J, Xavier A (2005) Laccase improvement in submerged cultivation: induced production and kinetic modelling. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 80: 669-676. Tišma M, Sudar M, Raĉki S, Zelic B (2010) Mathematical model for Trametes versicolor growth in submerged cultivation. Bioprocess and Biosystems Engineering 33: 749-758. Tlecutil-Beristain S, Sánchez C, Loera O, Robson G, Díaz-Godínez G (112) Laccases of Pleurotus ostreatus observed at different phases of its growth in submerged fermentation: production of a novel laccase isoform. Micologycal Research 1080 - 1084. Tsiklauri ND, Khardziani TS, Kachlishvili ET, Elisashvili VI (1999) Cellulase and xylanase activities of higher basidiomycetes during bioconversion of plant raw materials depending on the carbon source in the nutrient medium. Applied Biochemistry and Microbiology 35: 291-295. Van de Lagemaat J, Pyle DL (2005) Modelling the uptake and growth kinetics of Penicillium glabrum in a tannic acid-containing solid-state fermentation for tannase production. Process Biochemistry 40: 1773-1782. Vasic-Racki D, Kragl U, Liese A (2003) Benefits of enzyme kinetics modelling. Chemical and Biochemical Engineering Quarterly 17: 7-18. Viccini G, Mitchell D, Boit S, Gern J, da Rosa A, Costa R (2001) Analysis of growth kinetic profiles in solid-state fermentation. Food Technology and Biotechnology Advances 39: 271-294. Vrsalovic Presecki A, Findrik Z, Zelic B (2006) Modeling of the biotransformation processes. Chemical and Biochemical Engineering Quarterly 20: 227-241. Walkley A, Black I (1934) An estimation of the Degtjareft method for determining of soil organic matter and a proposed modification of chromic acid titration method. Soil Science 37: 29-38. Wood TM, García CV (1994) Enzymes and mechanisms involved in microbial cellulolysis. Kluwer Academic publishers. Netherlands. Zelic B, Vasic Racki D, Wandrey C, Takors R (2004) Modeling of the pyruvate production with Escherichia coli in a fed-batch bioreactor. Bioprocess and Biosystems Engineering 26: 249-258.
161
8. Selección de la Mejor Combinación Hongo – Formulación para la producción de exo-polisacáridos mediante Fermentación sumergida con Pleurotus ostreatus, Coriolus versicolor y Lentinus edodes
162
Selección de la Mejor Combinación Hongo – Formulación para la producción de exo-polisacáridos mediante Fermentación sumergida con Pleurotus ostreatus, Coriolus versicolor y Lentinus edodes
Sandra Montoya1, Óscar Julián Sánchez2*, Laura Levin3
RESUMEN
En esta investigación se probaron tres especies de hongos de pudrición blanca: Coriolus versicolor, Pleurotus ostreatus y Lentinus edodes sobre 12 formulaciones de medios de cultivo líquidos con cascarilla de café pretratada como fuente de materiales lignocelulósicos y dos niveles de sulfato de cobre (II). Los objetivos de este trabajo fueron i) evaluar los efectos de la relación C/N y del sulfato de cobre (II) sobre la producción de EPS durante 32 días de fermentación sumergida; así como el consumo de celulosa y ii) proponer un modelo matemático para la descripción de la producción de EPS, la producción de biomasa, producción y consumo de azúcares reductores y consumo de celulosa. Las tres especies de hongos crecieron sobre todas las formulaciones de los medios de cultivo y se obtuvieron EPS, pero no en las cantidades esperadas probablemente por la adición de sulfato de amonio a los medios de cultivo como fuente de nitrógeno. Del mismo modo, no hubo una gran variación entre las combinaciones de las tres especies de hongos con las diversas formulaciones sobre la degradación de la celulosa presente en los medios de cultivo, posiblemente porque el material lignocelulósico adicionado fue pretratado y esto debió generar un desorden en la matriz lignocelulósica de modo que las hifas de los hongos pudieron acceder más fácilmente a la celulosa. Las combinaciones con C. versicolor arrojaron las mayores producciones de EPS, por lo que este hongo fue seleccionado en las diferentes combinaciones para la aplicación del modelo matemático compuesto por cuatro ecuaciones diferenciales propuesto para describir los datos experimentales.
Palabras clave: hongos de pudrición blanca, relación C/N, producción de EPS, degradación de celulosa.
1. INTRODUCCIÓN
Los polisacáridos de los hongos macromicetos han sido reconocidos como excelentes inmunoestimuladores debido al potencial de sus propiedades terapéuticas, a que no son tóxicos y son escasos sus efectos secundarios en comparación con otros inmunoestimulantes. Estos polisacáridos bioactivos son producidos en cantidades relevantes a partir de los cuerpos fructíferos de los hongos, su micelio y además, de los filtrados obtenidos de sus cultivos en fermentación sumergida. En mayor medida las estructuras de los polisacáridos procedentes de los macromicetos corresponden a homoglicanos, heteroglicanos o complejos de gluco-proteínas. La fuente principal de polisacáridos antitumorales parecen ser sus paredes celulares, las cuales están compuestas de polisacáridos. En general, la actividad inmunomoduladora de los polisacáridos de los macromicetos está relacionada con las estructuras β-(1→3), β-(1→6) glucanos, α-(1→3) glucanos y complejos de polisacáridos de galactomananos y glucuromananos unidos a proteínas presentes en la pared celular de los macromicetos (Enshasy, 2010). El β-D-glucano es un polisacárido que produce exclusivamente D-glucosa luego de la hidrólisis ácida (Mizuno, 1999). Los polisacáridos obtenidos por fermentación sumergida con una adecuada selección del medio de cultivo, se denominan exopolisacáridos (EPS), ya que se excretan en el medio de cultivo durante el curso de la fermentación. Los intrapolisacáridos (IPS) pueden ser producidos a partir de los cuerpos fructíferos y su micelio después de haber sido sometido a diferentes procesos de extracción sólido-líquido utilizando diferentes disolventes, desde agua caliente hasta diferentes mezclas de disolventes orgánicos (Amaral et al., 2008; Komura et al., 2010).
163
Los exopolisacáridos de basidiomicetos de pudrición blanca juegan un rol importante en los procesos de crecimiento y desarrollo de estos organismos. Estos exopolisacáridos pueden inmovilizar las exoenzimas que ellos mismo excretan (Tang y Zhong, 2002). Según Catley (1992) el gel formado por estos biopolímeros previene la deshidratación de la hifa, permitiendo la adherencia de otras células a las superficies de los sustratos, posibilitando la selección de las moléculas del ambiente que los rodea (Maziero et al., 1999). Adicionalmente, estos biopolímeros tienen un amplio rango de aplicaciones industriales. Las diferentes especies de hongos producen diferentes tipos de polisacáridos con diversas propiedades y la estructura del polisacárido influye sobre la actividad biológica que se obtiene. Del mismo modo las estructuras químicas de los polisacáridos dependen de la fuente de donde provienen, el carpóforo, el micelio o el medio de cultivo, estos compuestos varían en sus estructuras moleculares, la unidad estructural que se repite (el monómero) y los pesos moleculares, entre otros factores (Tsukagoshi et al., 1984; Ishikawa et al., 1992; Hamlyn y Schmidt, 1994; Kobayashi et al., 1995; Zhuang y Mizuno, 1999; Chang y Miles, 2004; Mohammad-Fata et al., 2007). Por ejemplo, el lentinan un β-(1→3)-D- glucano extraído de L. edodes es una potente droga inmunoestimuladora licenciada en Japón para terapias antitumorales (Kupfahl et al., 2006). De igual forma se ha reportado actividad antitumoral de los complejos de polisacáridos extraídos del micelio o del cuerpo fructífero de hongos macromicetos, como el complejo proteína-polisacárido PSK del hongo C. versicolor (Ooi y Liu, 2000a), el complejo polisacárido- proteína del cultivo de Tricholoma lobayense (Liu et al., 1996a), exobiopolímeros de varias especies de Cordyceps a las cuales se les ha demostrado actividad antitumoral (Chen et al., 1997), inmunopotenciadora (Nakamura et al., 1999), actividad hipoglicémica (Kiho et al., 1999) y efecto hipocolesterolémico (Koh et al., 2003). Estos ejemplos son una muestra de la potencialidad que tienen los hongos como fuente de sustancias bioactivas para la obtención de potenciadores del sistema inmunológico, teniendo en cuenta que de las 140.000 especies de macromicetos que se estima existen en el planeta, solamente se conocen cerca del 10%, de las cuales sólo han sido examinadas desde su potencial inmunomodulador el 5% (Lindequist et al., 2005b). La suplementación de los sustratos es una estrategia para incrementar la producción de biomasa celular y una forma de mantener constante la producción de polisacáridos (Tang y Zhong, 2002). Asimismo, diferentes trabajos publicados en la última década evidencian la importancia de la presencia de aceites vegetales ricos en ácido oleico como promotores de crecimiento de la biomasa fúngica y por ende de sus polisacáridos constituyentes (Yang et al., 2000; Hsieh et al., 2008). Al momento de seleccionar el tipo de aceite vegetal o ácido graso a utilizar como inductor de polisacáridos es necesario considerar la composición de ácidos grasos del aceite; ya que ha sido reportado por varios investigadores que cantidades importantes de ácido linoleico suprimen la producción de biomasa y polisacáridos, mientras que la presencia de ácido oleico promueve su producción (Park et al., 2002a; Hsieh et al., 2006; Hsieh et al., 2008). Los aceites de soya y de oliva han sido utilizados como promotores de crecimiento celular y de polisacáridos en cultivos de macromicetos, tanto líquidos como sólidos. Al respecto, el aceite de oliva contiene 84% de ácido oleico y entre 30 y 60% en aceite de soya con bajos contenidos de ácido linoleico (Wade, 1993; Hsieh et al., 2008). En general, el proceso de determinación de intra y exo-polisacáridos se inicia mediante la medición de la cantidad de polisacáridos como carbohidratos totales presentes en una muestra seleccionada. Estos polisacáridos corresponden a los contenidos en los cuerpos fructíferos de los hongos, al micelio o a los presentes en los caldos de cultivo de fermentaciones sumergidas. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la relación carbono nitrógeno, del sulfato de cobre (II) y de aceite de soya sobre la producción de exo-polisacáridos (EPS) por tres especies de hongos de pudrición blanca (L. edodes, C. versicolor y P. ostreatus) empleando doce formulaciones diferentes de medios de cultivo por fermentación sumergida. Estos hongos fueron seleccionados de entre diez hongos de pudrición blanca mediante un rastreo basado en la medida de los polisacáridos como carbohidratos totales; los resultados de este rastreo se relacionan en el artículo anterior. Igualmente este trabajo tuvo como objetivo adicional proponer y validar un modelo matemático para la mejor combinación hallada especie de hongo -
164 formulación a fin de realizar la descripción de la cinética de crecimiento del organismo, y la producción de EPS en condiciones de fermentación sumergida.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Microorganismos
Tres especies de basidiomicetos fueron empleados para la producción de polisacáridos en fermentación en estado sólido, tomadas de la colección de hongos de la Universidad de Caldas (Manizales, Colombia): Lentinula edodes del Centro de Investigaciones del Café, Chinchiná, Caldas, Colombia (CICL54), Coriolus versicolor de Pennsylvania State University, Estados Unidos de Norte América (PSUWC430), y Pleurotus ostreatus de la Colección interna de la Universidad de Caldas (UCC001). Las cepas fueron extendidas sobre agar papa dextrosa (PDA) y mantenidas en refrigeración a 4°C y transferencias periódicas.
2.2. Pretratamiento de cascarilla de café
La cascarilla de café seca y molida fue sumergida en H2SO4 al 3% en relación 1:4 sólido: líquido y sometida a ultrasonido por una hora a 80°C con posterior tratamiento térmico a 121°C y 15 psig por una hora con fines de modificar la matriz lignocelulósica. En seguida, la cascarilla fue lavada con exceso de agua hasta obtener un pH de 6.8 en el agua de lavado del material para retirar el exceso de ácido. La cascarilla lavada fue utilizada como fuente de carbono proveniente de material lignocelulósico en los medios de cultivo para la fermentación sumergida del presente trabajo.
2.3. Medios de cultivo
Se realizaron doce formulaciones de medios de cultivo por triplicado con base en un litro de medio de cultivo. La composición por cada litro de medio de cultivo fue: 100g de cascarilla de café pretratada y seca, 2g KH2PO4, 0,5g MgSO4.7H2O, 0,1g CaCl2, 2g de extracto de levadura y tres concentraciones de SO4(NH4)2 0,5g, 1g y 1,5g, dos concentraciones de aceite de soya 13,5g y 22,42g y dos concentraciones de sulfato de cobre (II) 0,1592g (fórmulas pares) y 0,0798g (fórmulas impares), con la variación de los niveles de SO4(NH4)2 y aceite de soya se modificó la relación carbono nitrógeno (R C/N) (ver Tabla 1). Los medios de cultivo fueron servidos en matraces de 250 mL de capacidad con 100 mL de medio, esterilizados a 121°C por 20 minutos, los pH de los medios de cultivo variaron entre 5.6 y 5.8 para todas las formulaciones medido antes de la inoculación; seguidamente, los medios de cultivo fueron inoculados en cabina de flujo laminar con un fragmento de micelio extendido en agar PDA de ½ cm de lado de cada especie de trabajo. Los matraces fueron llevados a incubación con agitación de 100 rpm, 25°C y penumbra por 32 días. Se tomaron 10 muestras, dos por semana y la primera muestra fue tomada el día de la inoculación.
Tabla 1. Relaciones carbono nitrógeno (R C/N) en doce niveles (formulaciones) F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12
24,68 24,13 28,40 26,84 23,98 22,06 23,41 23,79 20,81 20,61 20,70 21,04
2.4. Determinación de la relación carbono nitrógeno
La relación carbono nitrógeno (C/N) fue determinada a partir de la medida de la materia orgánica de las doce formulaciones de sustratos empleando el método de Walkley y Black (1934), el cual utiliza ácido sulfúrico concentrado y solución de dicromato de potasio. La muestra se lee a 585 nm. La cantidad
165 de carbono total corresponde al 58% de la materia orgánica. El nitrógeno orgánico total fue determinado por el método de Kjeldahl (Kjeldahl, 1883).
2.5. Determinación de polisacáridos como carbohidratos totales
La precipitación de los EPS se provocó a partir de una fracción de 150 µL en 2mL de etanol concentrado grado reactivo con agitación por 1 horas. Luego se realizó una centrifugación por 20 min a 14.000 rpm descartando el sobrenadante. El precipitado (la muestra) fue resuspendida en NaOH 1N a 60°C por 1 hora, posteriormente, la suspensión fue sometida al método fenol-sulfúrico para determinar la cantidad de carbohidratos totales a 490 nm (Dubois et al., 1956).
2.6. Cuantificación del contenido de N-acetil-D-glucosamina (NAGA) y biomasa
Las muestras de sustrato fueron colectadas en 10 tiempos de incubación hasta el final de la fermentación (día 32) para las tres especies de trabajo. El medio de fermentación fue filtrado al vacío, con posterior secado en estufa a 101°C hasta peso constante. A la muestra seca y molida se le determinó el contenido de quitina. El contenido de biomasa fúngica en este medio fue estimado por la determinación del contenido de N-acetil-D-glucosamina (NAGA) después de la hidrólisis con HCl 6N grado analítico según el método de Plassard et al. (1982). Para ello se cuantificó paralelamente el contenido de NAGA por gramo de micelio en cada una de las tres especies, cultivándolas en medio líquido. El contenido de NAGA del micelio de cada una de las especies de hongos de trabajo: C. versicolor, P. ostreatus y L. edodes fue determinado del desarrollo del micelio en medio líquido en matraces de 250 mL con 100 mL de medio de cultivo con la siguiente composición: glucosa (30 g/L), extracto de levadura (6 g/L), SO4Mg.5H2O (0,5 g/L), K2HPO4 (0,5 g/L) y CaCl2 (0,1 g/L). El tiempo de fermentación para el crecimiento del hongo fue de 25 días y sometidos a 100 rpm de agitación. Los compuestos solubles en agua fueron extraídos durante la hidrólisis con HCl 6N por tres horas.
2.7. Cuantificación de de los componentes de la fibra y azúcares reductores
Se determinaron los componentes de la fibra (celulosa, hemicelulosa y lignina) de los medios de cultivo de cada una de las formulaciones en 10 tiempos durante los 32 días de incubación, así como la fracción soluble, empleando los resultados de la determinación de fibras detergente neutra, ácida y lignino-ácida. La medición se realizó a una muestra seca y molida de sustrato; dicha muestra se sometió a tres hidrólisis en serie (cada una de 75 min): i) hidrólisis con lauril sulfato de sodio y otros, ii) hidrólisis en solución de bromuro de amonio en ácido sulfúrico 1N, y iii) hidrólisis con ácido sulfúrico al 72% (p/v). Al finalizar cada hidrólisis, las muestras fueron lavadas y secadas a 105°C hasta peso constante (Leterme, 2010a). El contenido de azúcares reductores como glucosa fue determinado por el método del ácido dinitrosalicílico (DNS) (Miller, 1959).
2.8. Diseño experimental
Se planteó un diseño experimental bifactorial con la especie a tres niveles y doce formulaciones de sustrato. Las formulaciones varían en su relación C/N y la concentración de sulfato de cobre (II). Las variables independientes en este diseño experimental fueron la especie de hongo, la formulación del sustrato y el tiempo de fermentación. Las variables de respuesta medidas fueron la producción de biomasa, de polisacáridos, producción y consumo de azúcares reductores y la degradación de la celulosa en 10 tiempos durante 32 días de fermentación en estado sólido.
2.9. Modelamiento matemático del crecimiento del hongo y la producción de enzimas
166
Para la solución de los modelos matemáticos del proceso de fermentación sumergida se utilizó el software Matlab® 2010b (MathWorks, EUA) en un PC de 3 GB de memoria RAM y un procesador Intel CORE-i3 de 2,13 GHz. Para los modelos matemáticos planteados en ecuaciones diferenciales ordinarias se utilizó el comando ode45 que está basado en una fórmula explícita de Runge-Kutta (4,5) usando un par de Dormand-Prince (Dormand y Prince, 1980) y el comando ode15s basado en una fórmula de orden variable que funciona mediante fórmulas de diferenciación numérica.
2.10. Análisis estadístico
Para todos los análisis estadísticos del presente trabajo se utilizó el software Matlab ® 2010b. Este análisis se realizó en tres etapas. Primero se realizó un ANOVA a todos los datos del diseño experimental y sus posibles combinaciones: especie, fórmula y tiempo de fermentación mediante el comando anovan. Luego se realizó un análisis comparativo (Kruskal Wallis) de la producción de polisacáridos para cada especie de hongo estudiado y las doce formulaciones de sustratos mediante los comandos kruskalwallis y multcompare. Para evaluar si el modelo matemático propuesto describe adecuadamente los datos experimentales, se realizó una prueba F de una cola que parte de las siguientes hipótesis:
S 2 residuales, Fi H0 :12 Sdatosexp, F i S 2 H :1residuales, Fi 1 S 2 datosexp, Fi
2 donde: Fi está dado para i = 1,2,…,12, s residuales es la varianza de los residuales (desviaciones de los datos experimentales con respecto a los valores calculados por el modelo matemático) y se calcula para cada 2 variable de respuesta medida y s datos exp es la varianza de la serie experimental de cada variable de respuesta medida. Para estos análisis se utilizaron los comandos vartest y vartest2 de Matlab. Con las varianzas de los residuales obtenidos para cada serie experimental se calcularon los porcentajes de cada una respecto a la serie que dio la mayor varianza de residuales a fin de mostrar el ajuste de los datos experimentales al modelo matemático propuesto de forma más simple.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. Efecto de la relación C/N y sulfato de cobre sobre la producción de biomasa y polisacáridos
Las tres especies de hongos (C. versicolor, P. ostreatus y L. edodes) probadas en el diseño experimental, fueron inoculadas e incubadas bajo las mismas condiciones ambientales en las doce formulaciones de los medios de cultivo. El intervalo de la relación C/N en las doce formulaciones de sustrato evaluadas fue de 20 a 28,4 con una variación en los contenidos de nitrógeno de 1.4 a 1,93% en base seca. Las tres especies de hongos se desarrollaron bien en todas las formulaciones evaluadas durante los 32 días de incubación, como se observa en las Figuras 1 y 2. Todos los contenidos de nitrógeno de las formulaciones estimularon el crecimiento micelial de los macromicetos durante la fermentación, incrementando el contenido de biomasa (ver Figuras 1 y 2) en todos los casos y con una marcada fase lag para las tres especies en todos los medios de cultivo. Empero se debe tener en cuenta que la variación de la relación C/N se provocó modificando los contenidos de (NH4)2SO4 y aceite de soya y no modificando las fuentes de nitrógeno y de carbono en cada formulación. Sin embargo, sí hubo variabilidad sobre la producción de EPS, ya que no para la especie que produjo mayor cantidad de biomasa, fue la que mas
167 excretó EPS. Por ejemplo, C. versicolor – F2 produjo 241,93 mg/L, la mayor cantidad de EPS no fue el que formó la mayor cantidad de biomasa como se observa en la Tabla 2. Con el fin de seleccionar la combinación de mejor comportamiento en cuanto a la producción de EPS se realizó un análisis estadístico por etapas. Primero se realizó un ANOVA a fin de determinar si hubo diferencias significativas entre los resultados obtenidos respecto a las variables independientes especie, fórmula y tiempo, obteniendo diferencia significativa para las tres combinaciones evaluadas (especie, formulación y tiempo de fermentación) con valor–p < 0.05; posteriormente, se realizó una selección de los máximos de las producciones de EPS, obteniendo que C. versicolor en varias de las combinaciones evaluadas fue la especie que mayor cantidad de EPS produjo, en especial las combinaciones F2, F5 y F11 (ver Tabla 2). En este estudio se presentó la producción de EPS de tres especies de hongos de pudrición blanca, en fermentación sumergida con una fuente fija de material lignocelulósico, la cascarilla de café pretratada, variando las cantidades de sulfato de amonio y aceite de soya adicionados por litro de medio de cultivo para conseguir las diferentes relaciones C/N. La cascarilla de café pretratada se adicionó con el fin de activar la producción de enzimas lignocelulolíticas por las especies de hongos utilizadas. Entendiendo que para la bioconversión de los materiales lignocelulósicos con hongos, las enzimas que degradan polisacáridos juegan un rol muy importante ya que son las que proveen la fuente de energía a los microorganismos; por lo que la baja producción de estas enzimas pueden limitar la velocidad de producción de azúcares solubles. Sin embargo, en este trabajo los organismos probablemente pudieron aprovechar como fuentes de carbono, los contenidos en el aceite de soya y extracto de levadura para su mantenimiento durante las prolongadas fases lag que se visualizan para todas las combinaciones hongo formulaciones en las Figuras 1 y 2, mientras los mismos hongos inician la degradación del material lignocelulósico a fin de tener la cantidad de nutrientes necesarios para su crecimiento y desarrollo. Del mismo modo, es importante tener en cuenta que las diferentes especies de hongos pueden tener dependencia de las diferentes fuentes de carbono y esto provocar en ellos la variación en su crecimiento y en la formación de los tipos de polisacáridos presentes en su pared celular y los exopolisacáridos que excretan al medio. Según Xiao et al. (2010) la producción de polisacáridos y el crecimiento de la biomasa de las diferentes especies de hongos dependen directamente de la fuente de carbono suministrada, lo que sugiere que la composición del medio puede influir en la composición y el mecanismo de producción tanto de los intra como de los exopolisacáridos para una determinada especie de hongo. Asimismo, la cantidad y fuente de nitrógeno en la producción de los polisacáridos de los hongos y su influencia en su crecimiento y desarrollo es definitivo, ya que el nitrógeno es un componente esencial de las proteínas y ácidos nucleicos y su deficiencia afecta el crecimiento de los hongos y los metabolitos que producen durante su crecimiento y desarrollo (Xiao et al., 2006). La fuente de nitrógeno utilizada en este trabajo fue suministrada por extracto de levadura y el SO4(NH4)2 básicamente, se variaron tres niveles de sulfato de amonio y dos niveles de aceite en las formulaciones de sustrato a fin de obtener la variación de las relaciones C/N, con un intervalo en los contenidos de nitrógeno entre 1.4 a 1,93% en base seca como ya se mencionó arriba. Sin embargo, el crecimiento de las tres especies de hongos no fue igual para las 12 formulaciones, ni la producción de EPS como se observa en las Figuras 1, 2, 3 y 4. Se presentaron grandes variaciones, como en el caso de la combinación C. versicolor – F9 que para el final del período de fermentación se obtuvo 26,9428 mgEPS/L; en este caso en particular, el hongo pudo haber entrado en una fase diferente de su crecimiento, que le haya generado una caída en la secreción de los EPS. Según se observa en los datos experimentales obtenidos para producción de EPS, si parece haberse generado una influencia de la relación C/N sobre la producción de los mismos, ya que las formulaciones F1, F2, F3, F4 y F5 fueron las de mayor relación C/N y para esas combinaciones se obtuvieron los mayores contenidos de EPS, mientras que para las formulaciones de menor relación C/N (F9, F10, F11 y F12) se obtuvieron menores cantidades de EPS, con excepción de la combinación C. versicolor – F11 con 183,2586 mgEPS/L. Hay disponible gran cantidad de investigaciones en referencia a los efectos de las fuentes de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS; en las que se han probado diversas fuentes de carbono, como monosacáridos y disacáridos, y varias fuentes de nitrógeno de origen orgánico e inorgánico. Se reportó por Park et al. (2002b) un incremento de producción de EPS de 2,3 a 7,5 g/L cuando se adicionó el
168
4% de aceite de oliva al medio de cultivo; Wu et al. (2006) reportaron las concentraciones de EPS obtenidas utilizando diferentes monosacáridos y disacáridos como fuentes de carbono, de los que reportaron como la mejor fuente productora de EPS, la glucosa. Asimismo, varios investigadores coinciden en expresar que la adición de fuentes de nitrógeno inorgánico a los medios de cultivo produce inhibición en la producción de EPS, hecho que pudo haber ocurrido en este estudio, ya que se utilizó como parte de la fuente de nitrógeno, sulfato de amonio. De la misma manera, los doce medios de cultivo utilizados en este trabajo contenían 100 g/L de cascarilla de café pretratada, la cual pudo haber generado alguna interrupción en el crecimiento y desarrollo de los hongos y por ende afecta la producción de EPS. Respecto a la producción específica de EPS (mg EPS/g biomasa seca) es un factor de importancia a tener en cuenta debido a que la evaluación de este tipo de procesos en términos de eficiencia sobre una variable de referencia es lo indicado, para lo cual la biomasa es una buena elección, ya que ella es la que produce los EPS y en general siempre es determinada. Lo que se observa en la Tabla 2 es que no necesariamente la combinación que produjo la mayor cantidad de biomasa no fue la que produjo la mayor cantidad de EPS, como fue el caso de la combinación L. edodes – F12 para la cuales e obtuvo 3.099 mgEPS/g biomasa seca. El efecto de la sal de cobre no fue claro, ya que para las formulaciones impares se adicionó 0,1596 g/L y para las formulaciones pares 0,0798 g/L y en este caso las bajas producciones no presnetarón tendencia por las formulaciones pares o impares. No obstante, debe considerarse la composición de la cascarilla de café utilizada en este estudio, su procedencia y el pretratameinto al que fue sometida antes de iniciar la fermentación. Con los pretratamientos a los materiales lignocelulósicos se busca generar cambios en la composición química y características físicas de los sustratos a fin de que sean más exequibles para los hongos; además, se debe tener en cuenta que durante la fermentación pudieron haberse producido sustancias intermedias que hayan generado una disminución en la velocidad de crecimiento de este hongo sobre las diversas combinaciones que no dieron una respuesta satisfactoria respecto a la producción de EPS. Por lo anterior, las condiciones de cultivo y su composición química si parecen un factor determinante en la producción de EPS. La cantidad de EPS obtenidos en este trabajo en todas las combinaciones especie de hongo fórmula fueron comparables con los resultados más bajos obtenidos por Xiao et al. (2010) cuando probaron medios de cultivo con fuentes de carbono como galactosa y maltosa. A pesar de todo el esfuerzo que se ha dado para explorar el efecto de las condiciones de cultivo en la producción de polisacáridos de hongos, aún hace falta explorar el uso de una gran variedad de materias primas procedentes de residuos industriales y agroindustriales a fin de disminuir los costos de producción con miras hacia la industrialización (Lee et al., 1999; Shu y Lung, 2003; Lee et al., 2004; Wu et al., 2004; Wu et al., 2006; Lee et al., 2007b). Finalmente, es razonable esperar que la producción de ambos tipos de polisacáridos, IPS y EPS podrían estar vinculados uno con otro, por la misma dependencia con el crecimiento de la biomasa (Lama et al., 1996). Por lo tanto, las características físico-químicas de los medios de cultivo y condiciones medioambientales siempre deberán ser tenidas en cuenta a fin de satisfacer la producción de intra y exo-polisacáridos acorde con las necesidades particulares de la especie de hongo a utilizar.
169
Figura 1. Producción de biomasa de tres especies de hongos C. versicolor, P. ostreatus, L. edodes sobre seis formulaciones de sustratos diferentes. A: F1, B: F2, C: F3, D: F4, E: F5, F: F6
Figura 2. Producción de biomasa de tres especies de hongos C. versicolor, P. ostreatus, L. edodes sobre seis formulaciones de sustratos diferentes. A: F7, B: F8, C: F9, D: F10, E: F11, F: F12 en 32 días de fermentación sumergida
3.2. Producción de polisacáridos en la mejor combinación resultante del diseño experimental
Los datos experimentales obtenidos en el presente estudio fueron sometidos a un proceso de selección a fin de lograr la mejor combinación especie de hongo fórmula del diseño experimental bifactorial respecto a la producción de polisacáridos, el cual se realizó por etapas. Primero se hizo un análisis de varianza, ANOVA a tres vías (especie, fórmula, tiempo) para los polisacáridos obtenidos durante 10 tiempos en los 32 días de fermentación; se obtuvieron diferencias significativas para todas las combinaciones con un valor-p < 0,05. Posteriormente, se realizó un análisis por especie y una selección de los máximos de cada una de las cantidades de polisacáridos obtenidos y un análisis comparativo de los máximos (empleando la función multcompare) y aplicando una prueba de Kruskal-Wallis, obteniéndose diferencias significativas con valor-p < 0,05. De este análisis comparativo se obtuvo que la mejor combinación para la producción de polisacáridos fue C. versicolor – F2 seguida de las combinaciones con F5 y F11. A estas tres combinaciones se les realizó un análisis comparativo a fin de seleccionar de entre las cuatro combinaciones la de mejor comportamiento respecto a la producción de polisacáridos y aplicar un modelo matemático que describa los datos experimentales de producción de biomasa, de polisacáridos,
170 de producción y consumo de azúcares reductores, y de consumo de celulosa. Sin embargo, el análisis comparativo no presentó diferencia significativa (valor-p = 0.131), por lo que se aplicó el modelo matemático a las tres combinaciones de C. versicolor. En la Tabla 2 se presentan los datos de las producciones de biomasa, polisacáridos y la relación de la producción de polisacáridos con la producción de biomasa (producción específica de polisacáridos) a los 32 días de fermentación (final del período), en la que se observó que la mayor producción de biomasa por combinación fue de 81.514, 100.04 y 83.052 g/L para P. osteratus – F7, C. versicolor – F10 y L. edodes – F10 respectivamente; mientras que la máxima producción de polisacáridos fue de 241.9377 mg/L, 183.282 mg/gss y 194.922 mg/L para las combinaciones C. versicolor –F2, P. ostreatus – F4 y L. edodes – F10 respectivamente, de lo que se concluye que las combinaciones que más crecieron no fueron las que más EPS produjeron. En concordancia con lo anterior, la producción específica de polisacáridos para la combinación C. versicolor – F2 también fue la que arrojó la mayor relación 2,5937 mgEPS/g biomasa seca; aunque no fue así para todas las combinaciones. De lo anterior, se puede inferir que además de la importancia que tiene la cantidad de polisacáridos producidos, otro importante parámetro es la relación de producción de polisacáridos respecto a la cantidad de biomasa producida, al momento de tomar decisiones en torno a la producción de EPS por fermentación sumergida buscando mejorar las condiciones de proceso y los rendimientos.
Figura 3. Producción de EPS de tres especies de hongos: C. versicolor, P. ostreatus, L. edodes sobre seis formulaciones de sustratos diferentes. A: F1, B: F2, C: F3, D: F4, E: F5, F: F6 en 32 días de fermentación sumergida
En las formulaciones probadas en este estudio, la principal fuente de carbono empleada fue la cascarilla de café pretratada, por lo que en este trabajo se describe el consumo de celulosa. Los polímeros de celulosa y hemicelulosa fueron degradados por acción de las enzimas hidrolíticas de los hongos a azúcares reductores a fin de conseguir la fuente de energía necesaria para su crecimiento y desarrollo (Ângelo, 2004). La lignina, fue degradada por óxidorreductasas excretadas por estos hongos que, como agentes causantes de pudrición blanca, son los únicos hongos capaces de degradarla completamente, facilitando en el proceso el acceso a la celulosa (Kirk y Farrel, 1987b). En esta fermentación los tres hongos degradaron el material, pero no hasta el consumo total de la celulosa en los 32 días de fermentación sumergida, la cantidad de hemicelulosa presente en los medios de cultivo fue muy baja debido al pretratamiento del material antes de la fermentación, por lo que aquí solo se mostrará el consumo de celulosa en la próxima sección.
171
Tabla 2. Producción máxima de polisacáridos de tres especies de hongos: C. versicolor, P. ostreatus y L. edodes sobre doce formulaciones y durante 32 días de incubación Biomasa (g/L) EPS (mg/L) Fracción (mg EPS/g biomasa seca) Fórmula P. ostreatus C. versicolor L. edodes P. ostreatus C. versicolor L. edodes P. ostreatus C. versicolor L. edodes
F1 79,488076 96,1549 68,3441 137,521 122,0016 84,5715 1,73009 1,268803 1,23744 F2 78,96429 93,27701 76,2122 139,918 241,9377 115,269 1,77191 2,593755 1,51247 F3 74,319357 94,87854 74,7643 143,912 176,8915 183,396 1,9364 1,864399 2,45299 F4 77,16561 93,75387 74,8809 183,282 140,1461 110,818 2,37518 1,49483 1,47993 F5 76,641824 93,33484 74,3362 179,402 187,6184 183,054 2,34079 2,010165 2,46251 F6 74,319357 92,3518 75,4801 146,537 146,6507 168,903 1,97171 1,587957 2,23772 F7 81,51408 92,08865 79,4033 74,4152 118,2358 146,308 0,91291 1,283934 1,8426 F8 67,737463 86,21135 65,0756 108,992 96,21134 74,4152 1,60904 1,115994 1,14352 F9 65,422958 83,68695 61,7939 26,9428 116,524 110,134 0,41183 1,39238 1,78227 F10 77,719356 100,0393 83,052 81,8327 157,0353 145,966 1,05293 1,569736 1,75753 F11 67,965624 80,73473 57,956 86,1691 183,8526 110,704 1,26783 2,277243 1,91014 F12 65,642319 84,53524 62,8967 72,2469 74,30104 194,922 1,10062 0,878936 3,09908
Figura 4. Producción de EPS de tres especies de hongos: C. versicolor, P. ostreatus, L. edodes sobre seis formulaciones de sustratos diferentes. A: F7, B: F8, C: F9, D: F10, E: F11, F: F12 en 32 días de fermentación sumergida
3.5. Modelamiento matemático
Basado en los datos experimentales obtenidos de EPS durante los 32 días de fermentación sumergida para las tres especies de hongos basidiomicetos de pudrición blanca: C. versicolor, P. ostreatus y L. edodes, se propuso un modelo matemático compuesto de 4 ecuaciones diferenciales (ver Tabla 3) a fin de ajustar los datos experimentales de todas las combinaciones resultantes para C. versicolor, ya que éste fue el hongo que mayor producción de EPS mostró en todas las combinaciones medidas. De hecho, en este trabajo se presentan los resultados del modelamiento arrojados para las combinaciones C. versicolor con las formulaciones F2, F5 y F11, ya que estas combinaciones fueron las que presentaron la mayor producción de EPS durante los 32 días de fermentación. De igual forma, para comparar el ajuste de los datos experimentales al modelo matemático propuesto se planteó una prueba F de una cola, con la cual se
172 obtuvieron las varianzas de los residuales entre los datos experimentales y el modelo, individualmente para cada variable medida, pero haciendo la comparación de cada ecuación aplicada para todas las formulaciones de F1 a F12 en la misma especie, en este caso C. versicolor, lo que permitió probar la bondad del ajuste del modelo en términos de la mejor representación de los datos experimentales obtenidos. Con el modelo matemático propuesto se plantea la descripción de producción de biomasa, los azúcares reductores como producto intermedio consumido durante la misma fermentación, el consumo de celulosa y la producción de EPS. Asimismo, los datos experimentales obtenidos en esta investigación serán ajustados al modelo propuesto a fin de contribuir con nuevas propuestas en el camino al planteamiento de modelos matemáticos más complejos que permitan la descripción de los procesos de fermentación sumergida con fines industriales. Varias ecuaciones cinéticas de complejidad variable, tales como la ecuación lineal, logística, de dos fases o la ecuación de Monod han sido utilizadas por diferentes investigadores a fin de buscar la descripción de la producción de biomasa en procesos de fermentación en estado sólido (Sangsurasak et al., 1996; Viccini et al., 2001). De las expresiones matemáticas utilizadas, la más frecuente es la ecuación logística, debido probablemente a la forma simple de la expresión. El modelo propuesto consignado en la Tabla 3 para la descripción de la biomasa es la ecuación (1), la cual corresponde a la ecuación logística modificada por Mitchell et al. (1999). Para describir la variación de los azúcares reductores en el tiempo se propuso la ecuación (2) que correspondió a un primer factor de producción constante de azúcares y un segundo factor de consumo de azúcares para el crecimiento y desarrollo de los hongos. Para el consumo de celulosa en el tiempo de fermentación se planteó la ecuación (4), cuyo planteamiento se realizó en función de la concentración de la celulosa y un parámetro que afecta el consumo de la misma. La producción de los EPS fue expresada por la ecuación (3) que representa la producción de metabolitos primarios en procesos de fermentación. Los parámetros de cada una de las ecuaciones consignadas en la Tabla 3 se describen en la Tabla 4. La fermentación sumergida para la producción de EPS con basidiomicetos es un proceso que potencialmente puede ser utilizado con fines industriales, pero el éxito a escala comercial depende de los costos que arrojen las nuevas tecnologías en comparación con las tecnologías existentes y si la industria encuentra alguna ventaja. La expansión de las nuevas tecnologías para la producción de metabolitos como los EPS se verá facilitada por el incremento en los rendimientos de los bioproductos y el desarrollo de procesos con tecnologías exequibles. El cultivo sumergido con macromicetos se caracteriza por un marcado incremento en la viscosidad en el caldo de cultivo con el curso de la fermentación, el cual es debido al incremento de la biomasa, los cambios de morfología del crecimiento y la producción de productos extracelulares que alteran el carácter reológico del cultivo; el aumento de la viscosidad es generalmente considerada como un fenómeno indeseable pero inevitable, ya que causan dificultades en el suministro de oxígeno, en la eliminación del dióxido de carbono y en la provisión de la agitación (Wagner et al., 2003; Zhong y Tang, 2004; Tang et al., 2007). Todos estos aspectos han disminuido las posibilidades de industrialización de muchos procesos de obtención EPS por fermentación sumergida empleando setas, debido a que el planteamiento de modelos matemáticos que contribuyan con la descripción de los procesos se dificulta y no hay una gran disponibilidad de propuestas que posibiliten la descripción de procesos de producción de múltiples sustancias útiles. La fermentación sumergida desde un esquema muy general es considerada un proceso homogéneo, pero realmente cuando se trabaja con hongos macromcietos bajo condiciones de fermentación sumergida y se adicionan materiales lignocelulóscios como parte de los componentes del medio de cultivo, se convierte en un proceso heterogéneo que se ve afectado además por las condiciones ambientales. Por lo anterior, la determinación del crecimiento de la biomasa y el consumo de los sustratos se dificulta y es necesario recurrir a métodos indirectos de medida en varias ocasiones (Pal et al., 1995b; Sarikaya y Ladisch, 1997; Pandey et al., 2000; Moreira et al., 2003). En los procesos de fermentación sumergida del presente estudio no fue posible determinar directamente la cantidad de biomasa de las tres especies de hongo, por lo que fue necesario determinarles el contenido de quitina a través de la cuantificación de N-acetil-D-glucosamina (NAGA) en todos los tiempos de la fermentación. Asimismo, se le determinó el contenido de NAGA al micelio seco obtenido
173 de cultivo líquido a cada una de las tres especies de trabajo, obteniendo como resultado 15,83% (p/p) en P. ostreatus, 14,15% (p/p) en C. versicolor y 10,08% (p/p) en L. edodes. Estos porcentajes de NAGA fueron utilizados para calcular la cantidad de biomasa de los medios de cultivo en cada uno de los tiempos de fermentación; de igual forma, estos datos de biomasa fueron los que se sometieron al modelamiento con la ecuación (1). Para la descripción de la producción de biomasa de las tres combinaciones de C. versicolor que se presentan en esta trabajo, el coeficiente n que afecta la relación entre la concentración de biomasa y la concentración de biomasa máxima fue mayor a 1 en los tres casos (ver Tabla 5) lo que sugiere que C. versicolor en estos medios de cultivo se comportó como un organismo relativamente resistente a la autoinhibición. En las Figuras 5, 6 y 7 se muestra el ajuste de los datos experimentales al modelo para las tres combinaciones seleccionadas, en las cuales se observa una marcada fase lag y una rápida producción de azúcares reductores, probablemente debido a que la concentración inicial de los azúcares reductores en estos medio de cultivo es bastante baja y el hongo debe iniciar su proceso de generación de fuente de energía a fin de iniciar su crecimiento y desarrollo. De igual forma, el consumo de celulosa y la producción de EPS conservan la misma tendencia para las tres combinaciones, aunque la combinación de F11 demuestra un menor ajuste de los datos experimentales con el modelo. En la Tabla 5 están consignados los valores de los parámetros ajustados de cada una de las ecuaciones diferenciales propuestas luego de solucionar el sistema de ecuaciones y los porcentajes que representaron la bondad del ajuste en términos de la varianza de los residuales se encuentran consignados en la Tabla 6, obteniendo para las variables de la combinación C. versicolor – F11 un ajuste aproximado para la biomasa del 60%, azúcares reductores del 72%, celulosa 92,5% y los EPS 50%.
Tabla 3. Modelo matemático para descripción de producción de biomasa, consumo de celulosa y producción de EPS Ecuación Descripción n dCbb C mb.1C (1) Biomasa dt C bm dC AR qCm. (2) Azúcares reductores dt pb dC C kC. (3) dt CC Celulosa
dC dC EPS k . b (4) Polisacáridos dtEPS dt
Tabla 4. Parámetros de las ecuaciones del modelo matemático. Parámetro Significado -1 µm Velocidad específica de crecimiento de la biomasa (día ) Cbm Concentración de biomasa máxima (g/L) n < 1 el organismo es relativamente sensible a la auto-inhibición y ésta ocurre para valores muy bajos de Cb n n = 1 ecuación logística n > 1 el organismo es relativamente resistente a la auto-inhibición y ésta ocurre solo cuando Cb ≈ Cbm Cb0 Concentración de biomasa máxima (g/L) Coeficiente de producción constante de azúcares reductores q p (g/L/día) m Coeficiente de consumo de azúcares reductores (día-1) CAR0 Concentración inicial de azúcares reductores (g/L) -1 kC Coeficiente de consumo de celulosa (día ) CC0 Concentración inicial de celulosa (g/L) kEPS Coeficiente de producción de polisacáridos (mg/mg)
174
Figura 5. Ajuste de datos experimentales de la producción de biomasa y de EPS y la degradación de celulosa para la combinación C. versicolor – F2 durante 32 días de fermentación sumergida
Figura 6. Ajuste de datos experimentales de la producción de biomasa y de EPS y la degradación de celulosa, hemicelulosa y lignina para la combinación C. versicolor – F5 durante 32 días de fermentación sumergida
Aunque existen numerosas investigaciones previas acerca de la producción de polisacáridos fúngicos por fermentación sumergida, aún se requiere mayor información sobre las cinéticas de formación de biomasa, de producción de polisacáridos, tanto los EPS, como los intrapolisacáridos, del consumo de nutrientes y la degradación de la lignina, cuando se utilizan residuos lignocelulósicos como parte de los medios de cultivo, que permitan la descripción del proceso global y posterior escalado para la obtención de alguno de los productos de interés como los que se presentan en este estudio. El planteamiento de las ecuaciones para la descripción de la cinética de cada una de las variables medidas se realizó bajo la premisa de darle a cada expresión matemática algún sentido biológico respecto al compuesto a describir. Las expresiones propuestas representaron aceptablemente cada una de las variables medidas, ya que durante los procesos de fermentación sumergida cuando se utilizan en los medios de cultivo materiales lignocelulósicos, así sean pretratados, pueden producirse una gran cantidad de sustancias intermedias producto de las reacciones bioquímicas. Contemplar productos intermedios originados por la acción del metabolismo de estos hongos, contribuiría a una interpretación más acabada de los complejos fenómenos que ocurren durante el crecimiento de los macromicetos en medios de cultivo complejos.
175
Figura 7. Ajuste de datos experimentales de la producción de biomasa y de EPS y la degradación de celulosa, hemicelulosa y lignina para la combinación C. versicolor – F11 durante 32 días de fermentación sumergida
Tabla 5. Parámetros de ajuste de los datos experimentales al modelo matemático para la producción de EPS de tres combinaciones de C. versicolor Parámetro F2 F5 F11 -1 -1 -1 µm 0.1626 día 0,1726 día 0,1799 día Cbm 928713 g/L 93,2247 g/L 80,8324 g/L N 5,9475 4,7975 4,1732 Cb0 1,4660 g/L 1,2 g/L 0,90 g/L qp 0.25045 g/L/día 0,2545 g/L 0,2789 g/L CAR0 1,3925 g/L 1,3925 g/L 0,9799 g/L -1 -1 -1 M 0.007214 día 0,007699 día 0.0088 día -1 -1 -1 kC 0.035 día 0.035 día 0,045 día CC0 48,4907 g/L 48,1267 g/L 48,12 g/L kEPS 0.002982 mg/mg 0,001991 mg/mg 0,00235 mg/mg
Tabla 6. Ajuste (%) de la descripción del modelo matemático a los datos experimentales de tres combinaciones de C. versicolor con tres formulaciones para la producción de EPS por fermentación sumergida Azúcares Fórmula Biomasa Polisacáridos Celulosa reductores F2 52 67 1 95 F5 40 64 66,6 95 F11 60 72 50 92,5
4. Conclusiones
En el presente estudio, el crecimiento de las tres especies de hongos de trabajo y la producción de EPS pudieron haber estado afectadas más que por la relación C/N, por la adición de sulfato de amonio, ya que en otras investigaciones se ha probado que la presencia de fuentes inorgánicas de nitrógeno en los medios de cultivo disminuyen la producción de EPS. Por el contrario, las concentraciones de CuSO4 no parecen haber afectado drásticamente el crecimiento y desarrollo de ninguno de los tres hongos, ya que no se observó tendencia en la disminución o incremento de la biomasa o de los EPS para los dos niveles utilizados. El modelo matemático planteado en este estudio para la representación de los procesos de fermentación sumergida se realizó buscando describir el desarrollo de tres hongos de pudrición blanca sobre sustratos lignocelulósicos a fin de buscar puntos generales de interpretación de estos procesos que por ser tan heterogéneos se hacen complejos y no hay disponibilidad de muchas expresiones matemáticas
176 que permitan el escalamiento de los mismos con fines industriales, evitando hacer experimentación individual de cada proceso.
Agradecimientos
Los autores agradecen a la Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados de la Universidad de Caldas (Colombia) por la financiación del presente trabajo y al Instituto de Biotecnología Agropecuaria de la misma institución por el apoyo material y de infraestructura. Asimismo, los autores expresan sus agradecimientos a la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad de Buenos Aires (Argentina) por su apoyo y asesoría durante la realización de este trabajo.
Referencias
Amaral A, Carbonero E, Simao R, Kadowaki M, Sassaki G, Osaku C, Gorin P, Lacomini M (2008) An unusual water-soluble B- glucan from the basidiocarp of the fungus Ganoderma resinaceum. Carbohydrate Polymers 72: 473-478. Ângelo AS (2004) Enzimas hidrolíticas. En Esposito, Azevedo JI (Eds.) Fungos: Uma Introducâo à biologia, bioquimica e biotecnologia. Universidade de Caxias do Sul,. Catley BJ (1992) The biochemistry of some fungal polysaccharides with industrial potencial. En Mukerji KG (Ed.) Handbook of applied mycology: fungal biotechnology. Marcel Dekker,. New York. Chang ST, Miles PG (2004) Mushrooms Cultivation, Nutritional Value, Medicinal effect, and Enviromental Impact. CRC Press. New York. 451 p. Chen YJ, Shiao MS, Lee SS, Wang SY (1997) Effects of Cordyceps sinensis on the proliferation and differentiation of human leukemic U937 cells. Life Science 60(23): 49-59. Dormand JR, Prince PJ (1980) A family of embedded Runge-Kutta formulae. Journal of Computational and Applied Mathematics 6: 19-26. Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F (1956) Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry Engineering Journal 28(3): 350-356. Enshasy HE (2010) Immunomodulators. En Hofrichter M (Ed.) The Mycota. Springer-Verlag. Berlin, 477 p. Hamlyn PF, Schmidt RJ (1994) Potential therapeutic application of fungal filaments in wound management. Mycologist 8: 147- 152. Hsieh C, Liu C-J, Tseng M-H, Lo C-T, Yang Y-C (2006) Effect of olive oil on the production of mycelial biomass and polysaccharides of Grifola frondosa under high oxygen concentration aeration. Enzyme and Microbial Technology 39: 434-439. Hsieh C, Wang H-L, Chena C-C, Hsub T-H, Tseng M-H (2008) Effect of plant oil and surfactant on the production of mycelial biomass and polysaccharides in submerged culture of Grifola frondosa. Biochemical Engineering Journal 38: 198-205. Ishikawa K, Majima T, Ebina T (1992) Anti-tumour effect of a Coriolus preparation, PSK: Induction of macrophage chemotactic factor (MCF) in spleens of tumour bearing mice. Biotherapy 5: 251-258. Kiho T, Ookubo K, Usui S, Ukai S, Hirano K (1999) Structural features and hypoglycemic activity of a polysaccharides (CS-F10) from the cultured mycelium of Cordyceps sinensis. Biological and Pharmaceutical Bulletin 22(9): 66-70. Kirk TK, Farrel RL (1987) Enzymatic combustion: the microbial degradation of lignin. Annual Reviews of Microbiology 41: 465- 505. Kjeldahl J (1883) Neue Methode Zùr Bestimmung der Stickstoffs in Organichen Kòrpen. Zeitschrift fur Analytische Chemie 22: 366-382. Kobayashi H, Matsunaga K, Oguchi Y (1995) Antimetastatic Effects of P5K (Krestin), a Protein-bound Polysaccharide Obtained from Basidiomycetes: An Overview. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention 4: 275-281. Koh JH, Kim JM, Chang UJ, Suh HJ (2003) Hypocholesterolemic effect of hotwater extract from mycelia of Cordyceps sinensis. Biological and Pharmaceutical Bulletin 26: 84-87. Komura DL, Ruthers AC, Carbonero ER, Alquini G, Rosa MC, Sassaki GL, Lacomini M (2010) The origin of mannans found in submerged culture of basidiomycetes. Carbohydrate polymers 79: 1052-1056. Kupfahl C, Geginat G, Hof H (2006) Lentinan has a stimulatory effect on innate and adaptive immunity against murine Listeria monocytogenes infection. International Immunopharmacology 6: 686- 696. Lama L, Nicolaus B, Calandrell V, Manca M, Romano I, Gambacorta AM, Arambarri (1996) Effect of growth conditions on endo- and exopolymer biosynthesis in Anabaena cylindrica 10C. Phytochemistry 42: 655-664. Lee B, Bae J, Pyo H, Choe T, Kim S, Hwang H, Yun J (2004) Submerged culture conditions for the production of mycelial biomass and exopolysaccharides by the edible basidiomycete Grifola frondosa. Enzyme and Microbial Technology 35: 369-376. Lee K, Lee S, Lee H (1999) Bistage control of pH for improving exopolysaccharide production from mycelia of Ganoderma lucidum in an air-lift fermentor. Journal of Bioscience and Bioengineering 88: 646-650.
177
Lee WY, Park Y, Ahn JK, Ka KH, Park SY (2007) Factors influencing the production of endopolysaccharide and exopolysaccharide from Ganoderma applanatum. Enzyme and Microbial Technology 40 249-254. Leterme P. (2010). Análisis de alimentos y forrajes, in Protocolos de LaboratorioUniversidad Nacional de Colombia Sede Palmira: Palmira. 66 pp. Lindequist U, Niedermeyer T, Julich W-D (2005) The pharmaceutical potential of mushrooms. Electronic Centralised Aircraf Monitor (eCAM) 2: 285-299. Liu F, Fung MC, Ooi VEC, Chang ST (1996) Induction in the mouse of gene expression of immunomodulating cytokines by mushroom polysaccharide-protein complexes. Life Science 58(1): 795-803. Maziero R, Cavazzoni V, Ramos-Bononi VL (1999) Screening of Basidiomycetes for the production of exopolisaccharides and biomass in submerged culture. Revista de Microbiologia 30: 77-84. Miller GL (1959) Use of DinitrosaIicyIic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar. Analytical Chemistry 31(3): 426- 428. Mitchell D, Stuart D, Tanner R. (1999). Solid-State fermentation - Microbial growth kinetics, in The Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis and bioseparation, Flickinger M, Drew S, EditorsWiley: New York. 2407- 2429 Mizuno T (1999) The extraction and development of antitumouractive polysaccharides from medicinal mushrooms in Japan. International Journal Medicine Mushrooms 1: 9-29. Mohammad-Fata M, Hossein M, Shirin G, Ghorban-Ali H (2007) Immunomodulating and anticancer agents in the realm of macromycetes fungi (macrofungi). International Immunopharmacology 7: 701-724. Moreira MT, Feijoo G, Lema JM (2003) Fungal bioreactors: Applications to white-rot fungi. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology 2: 247-259. Nakamura K, Yamaguchi Y, Kagota S, Shinozuka K, Kunitomo M (1999) Activation of in vivo Kupffer cell function by oral administration of Cordyceps sinensis in rats. . Japan Journal Pharmacology 79: 508-508. Ooi V, Liu F (2000) Immunomodulation and anti-cancer activity of polysaccharide-protein complexes. Current Medicine Chemistry 7: 715-728. Pal M, Calvo A, Terron MC, Gonzalez AE (1995) Solid-state fermentation of sugarcane bagasse with Flammulina velutipes and Trametes versicolor. World Journal Microbiology and Biotechnology 11: 541-545. Pandey A, Soccol CR, Mitchell D (2000) New developments in solid state fermentation: I-bioprocesses and products. Process Biochemistry 35: 1153–1169. Park J-P, Kim S-W, Hwang H-J, Cho Y-J, Yun J-W (2002a) Stimulatory effect of plant oils and fatty acids on the exo-biopolymer production in Cordyceps militaris. Enzyme and Microbial Technology 31: 250-255. Park JP, Kim SW, Hwang HJ, Cho YJ, Yun JW (2002b) Stimulatory effect of plant oils and fatty acids on the exo-biopolymer production in Cordyceps militaris. Enzyme and Microbial Technology 31: 250-255. Plassard C, Mousain D, Salsac L (1982) Estimation of mycelial growth of basidiomycetes by means of chitin determination. Phytochemistry 21: 345-348. Pradeep V, Datta M (2002) Production of ligninolytic enzymes for decolorization by cocultivation of white-rot fungi Pleurotus ostreatus and Phanerochaete chrysosporium under solid-state fermentation. Applied Biochemistry Biotechnology 102- 103: 109-118. Sangsurasak P, Nopharatana M, Mitchell D (1996) Mathematical modeling of the growth of filamentous fungi in solid-state fermentation. Journal Science Industrial Resources 55: 333-342. Sarikaya A, Ladisch M (1997) An Unstructured Mathematical Model for Growth of Pleurotus ostreatus on Lignocellulosic Material in Solid-State Fermentation Systems. Applied Biochemistry and Biotechnology 62: 72-85. Shu C, Lung M (2003) Effect of pH on the production and molecular weight distribution of exopolysaccharide by Antrodia camphorata in batch cultures Process Biochemestry 39: 931-937. Tang Y-J, Zhu L-W, Li H-M, Li D-S (2007) Submerged Culture of Mushrooms in Bioreactors – Challenges, Current State-of-the- Art, and Future Prospects. Food Technology and Biotechnology 45(3): 221-229. Tang YJ, Zhong JJ (2002) Exopolysaccharide biosynthesis and related enzyme activities of the medicinal fungus, Ganoderma lucidum, grown on lactose in a bioreactor. Biotechnology Letters 24: 1023-1026. Tsukagoshi S, Hashimoto Y, Fujii G, Kobayashi H, Nomoto K, Orita K (1984) Krestin (PSK). Cancer Treatment Review 11: 131- 155. Viccini G, Mitchell D, Boit S, Gern J, da Rosa A, Costa R (2001) Analysis of growth kinetic profiles in solid-state fermentation. Food Technology and Biotechnology Advances 39: 271-294. Wade LG (1993) Química Orgánica. Debra Wechsler. México. 1312 p. Wagner R, Mitchell DA, Sassaki GL, Lopes de Almeida A, Berovic M (2003) Current techniques for the cultivation of Ganoderma lucidum for the production of biomass, ganoderic acid and polysaccharides. Food Technology and Biotechnology 41: 371-382. Walkley A, Black I (1934) An estimation of the Degtjareft method for determining of soil organic matter and a proposed modification of chromic acid titration method. Soil Science 37: 29-38. Wu J, Cheung P, Wong K, Huang N (2004) Studies on submerged fermentation of (Fr.) Singer. Part 2. Effect of carbonto-nitrogen ration of the culture medium on the content and composition of the mycelial dietary fibre. Food Chemistry 85: 101-105.
178
Wu J, Ding Z-Y, Zhang K-C (2006) Improvement of exopolysaccharide production by macro-fungus Auricularia auricula in submerged culture. Enzyme and Microbial Technology 39: 743-749. Xiao J-H, Xiao D-M, Xiong Q, Liang Z-Q, Zhong JJ (2010) Nutritional requirements for the hyperproduction of bioactive exopolysaccharides by submerged fermentation of the edible medicinal fungus Cordyceps taii. Biochemical Engineering Journal 49(2): 241-249. Xiao JH, Chen DX, Wan WH, Hu XJ, Qi Y, Liang ZQ (2006) Enhanced simultaneous the production of mycelia and intracellular polysaccharide in submerged cultivation of Cordyceps jiangxiensis using desirability functions. Process Biochemestry 41: 1887-1893. Yang F-C, Ke Y-F, Kuo S-S (2000) Effect of fatty acids on the mycelial growth and polysaccharide formation by Ganoderma lucidum in shake flask cultures. Enzyme and Microbial Technology 27: 295-301. Zhong JJ, Tang YJ (2004) Submerged cultivation of medicinal mushrooms for production of valuable bioactive metabolites. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology 87: 25-59. Zhuang O, Mizuno T (1999) Biological responses from Grifola frondosa (Dick.:Fr.) S.F. Gray-Maitake (Aphyllophoromycetideae). Internation Journal Medicinal Mushrooms 1: 317-324.
179
9. Biorreactor para la Obtención de Sustancias Bioactivas por Fermentación en Estado Sólido Empleando Hongos Macromicetos (Solicitud de Patente)
Durante el desarrollo de la presente investigación se realizó el diseño, construcción y puesta en marcha de un biorreactor de lecho fijo con convección natural y tiro forzado con el fin de realizar las pruebas piloto con las mejores combinaciones “especie de hongo – formulación” que arrojara el dieño experimental. Sin embargo, una vez el biorreactor fue , se consideró que éste podía ser sometido a proceso de solicitud de patente en Colombia y otros países. Este proceso de solicitud de patente en Colombia se inició con las pruebas preliminares realizadas al biorreactor, las cuales se discuten en el siguiente párrafo. La patente solicitada ante la Superintendencia de Industria y Comercio tiene la siguienjte denominación: “BIORREACTOR PARA LA OBTENCIÓN DE SUSTANCIAS BIOACTIVAS POR FERMENTACIÓN EN ESTADO SÓLIDO EMPLEANDO HONGOS MACROMICETOS” (ver Anexos 1, 2 y 3). Es importante aclarar que toda la información consignada en esta sección es confidencial debido a que, además de haber realizado la solicitud de patente ante la superintendencia mencionada, se está realizando la exploración y análisis de ampliación de esta solicitud en otros países. Adicionalmente, se está evaluando la solicitud de nuevas patentes en otros terriotrios donde se tenga conocimiento del potencial de uso y comercialización del desarrollo adquirido con los nuevos datos obtenidos de la presente investigación para la obtención de sustancias empleando hongos macromicetos en procesos de fermentación en fase sólida. Por lo anterior, los datos experimentales obtenidos sobre el biorreactor de lecho fijo con convección natural y tiro forzado de las mejores combinaciones especie-formulación arrojadas por el diseño experimental realizado en este trabajo no son consignados aquí; estos datos experimentales hacen parte de la confidencialidad que se requiere cuando se está en la búsqueda de patentes de equipos, proceso de producción de sustancias y productos. Como fase experimental inicial y con fines de prueba y puesta en marcha del biorreactor de lecho fijo, se realizaron pruebas con varias especies de hongos de pudrición blanca. De estas pruebas, se obtuvieron varias características particulares del procesos de fermentación en fase sólida en el biorreactor objeto del patentamiento como el incremento de la velocidad de colonización y producción de exudados de los hongos basidiomicetos de pudrición blanca. A continuación se relacionan dos de los procesos probados en el biorreactor con sendos hongos de pudrición blanca: i) Ganoderma lucidum aumentó en un 68% su velocidad de crecimiento sobre sustrato a base de mezclas de materiales lignocelulósicos, como aserrín de madera, cascarillas de café, cacao y arroz, suplementados con salvado de maíz, arroz o trigo, carbonato de calcio y sulfato de calcio. La velocidad de colonización se incrementó de 0,67 kg de sustrato colonizado/dia a 2,14 kg de sustrato colonizado/dia. La producción de exudado como extracto crudo de enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos fúngicos se incrementó de 10% (p/p) a 15% (p/p), expresada como masa de exudado producido por masa de sustrato húmedo al momento de la inoculación. La determinación de los incrementos en velocidad de crecimiento del hongo y producción de exudado fue referida a la inoculación del hongo en bolsas de tres kg de capacidad, siguiendo el mismo tratamiento al sustrato que cuando se trabajó en el biorreactor. ii) Coriolus versicolor aumentó en un 72% su velocidad de crecimeiento sobre un sustrato formulado con base en los mismos materiales lignocelulósicos enunciados para el hongo G. lucidum. La velocidad de colonización se incrementó de 0,75 kg de sustrato colonizado/dia a 2,0 kg de sustrato colonizado/dia.
180
La producción de exudado como extracto crudo de enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos fúngicos se incrementó de 7% (p/p) a 16,7% (p/p), como masa de exudado producido por masa de sustrato húmedo al momento de la inoculación. La determinación de los incrementos en velocidad de crecimiento del hongo y la producción de exudado fue referida a la inoculación del hongo en bolsas de tres kg de capacidad, siguiendo el mismo tratamiento al sustrato que cuando se trabajó en el biorreactor. Se desarrolló el proceso de producción de las biosustancias (enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos fúngicos) por fermentación en fase sólida con hongos macromicetos de pudrición blanca y utilizando residuos lignocelulósicos como materias primas. Este proceso se resume en la Figura 1 en la que se especifican los puntos donde es necesario controlar cada una de las variables físico-químicas de los sustratos, las condiciones medioambientales y la condiciones del biorreactor, las cuales dependen directamente de la especie del hongo macromiceto seleccionado. Las biosustancias obtenidas en el biorreactor de lecho fijo con convección natural y tiro forzado fueron evaluadas de los exudados y del material sólido colonizado tanto para los sustratos inoculados con Ganoderma lucidum, como para Coriolus versicolor. Los resultados promedio obtenidos para ambas especies de hongos se muestran en la Tabla 1. Con la información anterior fue solicitada la patente de invención para el biorreactor, el proceso y los productos obtenidos.
Tabla 1. Actividades enzimáticas y cantidad de polisacáridos y NAGA obtenidos en los sustratos sólidos colonizados con G. lucidum y C. versicolor y sus exudados producidos en Biorreactor de lecho fijo Bioproducto Sustrato colonizado Exudado Endoglucanasa 8 - 86 U/gss 6 - 18 U/mL Exoglucanasa 8 – 74 U/gss 4,5 – 36 Endoxilanasa 12 – 25 U/gss 12 – 27 U/mL β-glucosidasa 2 – 9 u/gss 2.1 – 60 U/mL Lacasa 12 – 97 U/gss 15 – 36 U/mL Manganeso peroxidasa 25 – 65 U/gss 4,5 – 20 U/mL Lignina peroxidasa* 9-18 U/gss 1 – 2 U/mL Polisacáridos como 0,03 - 0,13 g/gss 0,2 - 0,8 g/L carbohidratos totales N-acetil-D- 0,04 - 0,13 mg/gss Nd glucosamina (NAGA) *Positiva unicamente para el hongo C. versicolor
181
Figura 1. Diagrama de proceso para la obtención de sustancias bioactivas por fermentación en fase sólida en biorreactor bajo condiciones controladas, empleando hongos macromicetos
182
10. Conclusiones Generales
10.1. Contribuciones de la Tesis
En esta sección se relacionan las conclusiones del trabajo de tesis doctoral en cumplimento con el planteamiento hecho en los objetivos específicos. El planteamiento general de la tesis correspondió a un rastreo de cepas de entre diez especies preseleccionadas a fin de buscar las de mejor rendimiento en la producción de celulasas, ligninasas y polisacáridos. Posteriormente se desarrolló un diseño experimental bifactorial para fermentación sumergida y otro para fermentación en estado sólido con el fin de obtener la mejor combinación especie-formulación en la producción de enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos, para lo cual se variaron 12 niveles de la relación C/N y tres niveles del bioagente correspondientes a las tres especies de hongos con mejor comporatmiento en la etapa de rastreo. Finalmente, se llevó a cabo el diseño, montaje y puesta en marcha de un biorreactor de lecho fijo a nivel piloto para la fermentación en estado sólido con los macromicetos estudiados. En este trabajo se realizaron pruebas de rastreo cualitativas para las enzimas celulolíticas endoglucanasa y exoglucanasa, y para las enzimas ligninolíticas lacasa y lignina peroxidasa, a fin de seleccionar de entre diez especies de hongos de pudrición blanca (Lentinula edodes, Schizophyllum commune, Trametes trogii, Coriolus versicolor, Pycnoporus sanguineus, Ganoderma applanatum, Ganoderma lucidum, Grifola frondosa, Pleurotus ostreatus y Auricularia delicata) las cepas de mejor desempeño en cuanto a las actividades enzimáticas mencionadas (ver Capítulo 3). Se concluyó que las especies de hongos con mejor producción de celulasas y ligninasas fueron las cepas de Lentinula edodes y Coriolus versicolor. Asimismo, se realizó un rastreo cuantitativo a las mismas diez especies de hongos de pudrición blanca determinando su contenido de exopolisacáridos e intrapolisacáridos, expresados como carbohidratos totales (ver Capítulo 4). De ambos rastreos se obtuvo que las especies Lentinula edodes, Coriolus versicolor y Pleurotus ostreatus fueron las cepas de mejor comportamiento respecto a la producción de celulasas, ligninasas y exopolisacáridos, mientras que para la producción de intrapolisacáridos de los cuerpos fructíferos de los hongos, se seleccionó el hongo Grifola frondosa. Se realizaron procesos de fermentación en estado sólido para la obtención de enzimas lignocelulolíticas de hongos de pudrición blanca empleando como materias primas para la elaboración de los sustratos mezclas de residuos lignocelulósicos. Se determinaron las actividades de las enzimas celulolíticas (endoglucanasa, exoglucanasa, endoxilanasa y β-glucosidasa) y de las enzimas ligninolíticas (lacasa y manganeso peroxidasa). Asimismo, fueron determinadas la producción de biomasa, la producción y consumo de azúcares reductores, consumo de celulosa y hemicelulosa y la degradación de la lignina en 15 tiempos durante 49 días de fermentación. Este proceso fue evaluado en el marco de un diseño experimental las siguientes tres especies de hongos: Lentinula edodes, Coriolus versicolor y Pleurotus ostreatus (Capítulo 5). De esta evaluación se concluye que las actividades enzimáticas obtenidas presentaron descensos a diferentes tiempos del proceso de fermentación en estado sólido, hecho que pudo atribuirse a aspectos como la eficiencia del método de extracción empleado; a los cambios en la composición del sustrato durante el tiempo de fermentación, ya que pueden producirse nuevas sustancias que inhiban las actividades enzimáticas; a la represión catabólica por productos de las reacciones que se generan en la fermentación; a la producción de variantes isoenzimáticas de las mismas enzimas a diferentes tiempos; y a las diferentes condiciones de utilización del sustrato que arrojan actividades diferentes. Con este trabajo se hace un aporte al estudio de las cinéticas de formación de biomasa, producción de enzimas, consumo de nutrientes y degradación de la lignina que permiten dar un paso adelante en la descripción del proceso global y posterior escalado para la obtención mediante fermentación en estado sólido de los productos de interés estudiados (Capítulo 5). Uno de los inconvenientes más frecuentes en el planteamiento de las ecuaciones para la descripción de la cinética de cada una de las variables mencionadas en procesos de fermentación en estado sólido consiste en conferirle a cada expresión matemática algún sentido biológico respecto al metabolito a describir. Las expresiones
183 propuestas describieron aceptablemente cada una de las variables medidas según se desprende del análisis estadístico realizado; cabe destacar a este respecto que durante los procesos de fermentación en fase sólida, cuando se utilizan como sustratos mezclas de materiales lignocelulósicos, puede producirse una gran cantidad de sustancias intermedias producto de las reacciones bioquímicas, que en la mayoría de los casos no se pueden valorar, lo cual dificulta el modelamiento matemático. La producción de polisacáridos fúngicos de la fase vegetativa de los macromicetos en procesos de fermentación en fase sólida, en la que además de producir polisacáridos también ocurre la degradación de materiales lignocelulósicos, es uno de los aportes que respresentan novedad en este trabajo. Lo anterior, considerando que en el contexto general de los estudios sobre producción de polisacáridos por fermentación en estado sólido, se enfatiza la producción de los cuerpos fructíferos de los hongos como fuente de polisacáridos y no el uso del micelio desarrollado dentro del sustrato como fuente de los mismos (Capítulo 6). Aunque se requiere una mayor información sobre las cinéticas de formación de biomasa, de producción de polisacáridos, de consumo de nutrientes y de degradación de lignina, este trabajo hace un aporte a esta temática con el planteamiento y validación de las expresiones matemáticas que describen la cinética de cada una de las variables medidas. De esta manera, los resultados obtenidos tienen el potencial de contribuir al mejor entendimiento del proceso global de cultivo de los hongos con miras al posterior escalado a nivel comercial de la obtención de alguno de los productos de interés que se plantean en este estudio. Se presenta un avance en referencia a la obtención de enzimas lignocelulíticas por fermentación sumergida empleando hongos macromicetos, especialmente en cuanto a las cinéticas de formación de biomasa, de producción de enzimas, del consumo de nutrientes y de degradación de la lignina se refiere (Capítulo 7). Los modelos matemáticos planteados para la descripción del proceso global de obtención de enzimas lignocelulolíticas empleando como materias primas residuos lignocelulósicos pretratados, representan una valiosa herramienta que contribuirá a cualificar nuestro entendimiento del cultivo sumergido de los hongos de pudrición blanca y de su actividad enzimática, lo cual a su vez permitirá establecer estrategias que disminuyan los costos de producción de estas biosustancias. Es evidente que se requiere mayor información sobre la dinámica de la biosíntesis y consumo de estos metabolitos, pero el planteamiento y validación de las ecuaciones cinéticas de cada una de las variables medidas permitieron la descripción de cada una de los compuestos determinados en el presente estudio. A pesar de que algunas de las ecuaciones describieron de una manera más adecuada los datos experimentales que otras, el hecho de disponer de nuevos modelos cinéticos validados, se convierte en una oportunidad para continuar desarrollando trabajos que profundicen en este tópico. En particular, la descripción matemática de algunos de los productos intermedios originados por la acción de las enzimas estudiadas, o de otras enzimas no evaluadas, así como de sus productos, contribuirá a una interpretación más acabada de los complejos fenómenos que ocurren durante el crecimiento de los macromicetos en los procesos de fermentación sumergida. La producción de polisacáridos fúngicos por fermentación sumergida empleando residuos lignocelulósicos como parte de los medios de cultivo es un proceso no muy estudiado (Capítulo 8), a pesar de las valiosas actividades biológicas que exhiben estos metabolitos cuando son obtenidos a partir de hongos de pudrición blanca (ver Capítulo 2). En este trabajo se plantearon ecuaciones para la descripción de la cinética de formación de biomasa, de producción de exopolisacáridos y de consumo de nutrientes bajo la premisa de conferirle a cada expresión matemática algún sentido biológico respecto al compuesto cuya dinámica se desea describir. Las expresiones propuestas representaron aceptablemente cada una de las variables medidas; la dificultad del modelamiento matemático de este proceso radica en la complejidad de la determinación experimental de la gran cantidad de sustancias intermedias que participan en las vías metabólicas de síntesis de los exopolisacáridos cuando se utilizan en los medios de cultivo en fase líquida materiales lignocelulósicos, así éstos sean pretratados. Es de anotar que la descripción del proceso global de obtención de los productos de interés estudiados, requiere de planteamientos matemáticos complejos que permitan describir eficientemente estos procesos metabólicos de tal manera que los resultados obtenidos sean funcionales y útiles para el escalamiento de la producción de polisacáridos fúngicos bioactivos a nivel industrial con bajos costos de producción.
184
El presente trabajo doctoral contempló el cultivo a nivel piloto de hongos macromicetos productores de enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos empleando biomasa lignocelulósica (residuos agroindustriales) como materia prima. Se desarrolló el cultivo de hongos macromicetos en un biorreactor de lecho fijo con convección natural y tiro forzado bajo condiciones controladas. El biorreactor fue diseñado, construido y puesto en marcha como resultado de esta tesis (Capítulo 9). Este biorreactor fue puesto en operación con las especies de hongos Ganoderma lucidum (especie incluida en las diez cepas preseleccionadas para los rastreos iniciales) y Coriolus versicolor sobre diferentes mezclas de residuos lignocelulósicos. Posteriormente, se consideró que este equipo podía ser sometido a proceso de solicitud de patente en Colombia y otros países. La solicitud de patente en Colombia se inició con las pruebas preliminares realizadas en el biorreactor empleando las dos especies de hongos mencionadas. La solicitud de patente denominada “Bioreactor para la obtención de sustancias bioactivas por fermentación en estado sólido empleando hongos macromicetos” se realizó ante la Superintendencia de Industria y Comercio de Colombia (ver Anexos XXX). Actualmente se está realizando la exploración y análisis de ampliación de solicitud de esta patente en otros países, así como la solicitud de nuevas patentes en otros terriotrios donde se tenga conocimiento del potencial de uso y comercialización tanto del equipo diseñado como del proceso desarrollado en la presente investigación.
10.2. Impactos Potenciales de la Tesis
El aprovechamiento y tratamiento de los diferentes tipos de residuos generados durante las actividades agrícolas y agropindustriales en Colombia y el mundo son un reto para la humanidad, ya que éstos se han constituido en uno de los problemas más álgidos (y a la vez, en una de las oportunidades más claras) para las sociedades presentes y futuras. En este trabajo se desarrollaron procesos de obtención de enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos empleando como materias primas residuos lignocelulósicos con hongos de pudrición blanca. En los procesos desarrollados se realizó la descripción de las cinéticas de crecimiento de la biomasa, la producción y consumo de los azúcares reductores, el consumo de celulosa y hemicelulosa y la degradación de lignina en procesos de fermentación sumergida y en estado sólido. Con este trabajo se generan múltiples posibilidades para el uso adecuado de residuos agrícolas y agroindustriales con miras a la producción de productos de uso industrial en el segmento agrícola, agroindustrial y farmacológico. El sector agrícola colombiano requiere del desarrollo de nuevos productos que mejoren la calidad de la alimentación de animales de cría, como los bovinos, y que además estos alimentos sirvan como coadyuvantes en el incremento de la salud del animal. Los residuos lignocelulósicos se pueden utilizar potencialmente como alimento para rumiantes, pero con problemas de digestibilidad además de su bajo contenido proteico. Los sustratos basados en materiales lignocelulósicos colonizados por estos hongos de pudrición blanca, resultan ser una alternativa promisoria para este sector ya que el sustrato experimenta un aumento de la digestibilidad mediada por la acción enzimática del hongo y un incremento del contenido de proteína con la colonización fúngica al final de la fermentación. Adicionalmente, la ocurrencia de los polisacáridos fúngicos contribuye a mejorar las características de estos residuos lignocelulósicos para satisfacer las necesidades de alimentación bovina y el incremento de la salud animal. De hecho el uso de sustratos agotados de la producción de hongos macromicetos como Pleurotus sp., L. edodes, Ganoderma sp., Agaricus bisporus y otros, así como el empleo de hongos de pudrición blanca para deslignificar los materiales lignocelulósicos, son una alternativa para la producción de alimento de rumiantes. Lo anterior, debido a que durante la fermentación en fase sólida con estos basidiomicetos, los materiales lignocelulósicos exhiben una bioconversión favorable en términos de disminución de lignina y producción de azúcares reductores que luego son utilizados por las bacterias ruminales que, finalmente, suministran los nutrientes requeridos por el animal para su desarrollo. Con los resultados que se iban obteniendo durante la ejecución de esta tesis doctoral, se complementó el conocimiento y la experiencia necesarios para la participación de la autora de esta tesis (en conjunto con el director de la misma y otro colega) en la Convocatoria Colciencias 523-2011 para la conformación de un banco de proyectos de creación de empresas o unidades de negocio de base
185 tecnológica. El grupo proponente participó con el proyecto Desarrollo y evaluación de los parámetros de cultivo a escala semi industrial del hongo Grifola frondosa en climas tropicales y su transformación con fines comerciales como productos nutracéutico. Este proyecto fue aprobado para ser desarrollado en dos etapas, de la cual actualmente se está desarrollando la primera que corresponde especialmente al estudio de mercado de los productos nutracéuticos obtenidos a partir del hongo Grifola frondosa (maitake). La formulación de este proyecto partió de una investigación terminada en la Universidad de Caldas sobre el desarrollo del cultivo del hongo Grifola frondosa en climas tropicales a escala de laboratorio cuyops resultados fueron complementados con los hallazgos encontrados en esta tesis. Entre estos hallazgos se cuenta la exploración y refinación de los métodos de extracción de las diferentes fracciones de polisacáridos y otros carbohidratos de interés farmacológico a partir de los cuerpos fructíferos del hongo G. frondosa. En el Anexo 4 se muestra el esquema de extracción y la composición química global de las fracciones obtenidas hasta el momento, así como un perfil general del balance de masa del cuerpo fructífero del hongo. La purificación de las fracciones no se alcanzó a realizar, pero se definieron los métodos para su desarrollo, los cuales consisten en una serie de diálisis abiertas y cerradas con diferentes tamaños de membranas para eliminar el exceso de hidróxido de potasio y separar cada una las fracciones obtenidas de oligosacáridos y monosacáridos. Asimismo, se definieron los métodos de determinación de glucanos por HPLC con detector de fluorescencia y el perfil de carbohidratos por HPLC con detector de índice de refracción.
10.3. Trabajos Futuros
Actualmente están en desarrollo tres trabajos de grado a nivel de maestría derivados de esta tesis doctoral, los cuales se relacionan a continuación:
Trabajo de grado de Maestría en Ingeniería de alimentos (Universidad de Caldas): Estudio cinético para la producción de polisacáridos de Ganoderma applanatum. Trabajo de grado de Maestría en Sistemas de Producción Agropecuaria (Universidad de Caldas): Aplicación de cocteles enzimáticos producidos con el macromiceto Coriolus versicolor como coadyuvantes en los procesos de compostaje y ensilaje. Trabajo de grado de Maestría en Microbiología Agroindustrial (Universidad Católica de Manizales): Evaluación del efecto de las ligninasas (lacasa y manganeso peroxidasa) en la fructificación y eficiencia biológica del hongo Ganoderma lucidum.
Adicionalmente y como aplicación directa de los resultados de la presente tesis, se está participando en la Convocatoria del Fondo de Ciencia, Tecnología e Innovación del Sistema Nacional de Regalías Vigencia 2012 con el proyecto Diseño e implementación de una estrategia integral para el tratamiento y aprovechamiento de residuos en el sector agrícola y agroindustrial de Caldas mediante innovación en procesos biotecnológicos y la formación del capital humano pertinente para la generación de valor en el sector agrícola y agroindustrial de Caldas. En este proyecto se propone el desarrollo de dos paquetes tecnológicos derivados de la tesis doctoral para la producción de cocteles enzimáticos con actividad lignocelulolítica y de polisacáridos por fermentación sumergida y en estado sólido, así como el inicio de la implementación de la cadena productiva de hongos macromicetos en el Departamento de Caldas. A la fecha, este proyecto ha pasado todos los filtros respectivos a nivel departamental (Comisión de Ciencia y Tecnología –CODECTI– de Caldas, Gobernación de Caldas) y la revisión nacional por parte de la Secretaría Técnica de Colciencias en donde fue declarado viable; el proyecto espera su posible aprobación por parte del Órgano Colegiado de Decisión –OCAD– en las próximas semanas. Todos estos desarrollos se realizarían en la Planta de Bioprocesos de la Universidad de Caldas.
186
Se contempla el inicio de las siguientes propuestas de investigaciones derivadas de la tesis doctoral a corto y mediano plazo en las siguientes temáticas:
Síntesis de enzimas lignocelulolíticas por fermentación en estado sólido empleando mezclas de residuos lignocelulósicos en donde se determine una mayor cantidad de sustancias intermedias producto del metabolismo de hongos de pudrición blanca a fin de lograr dilucidar las técnicas de ataque que utilizan estos hongos para degradar la matriz lignocelulósica. Producción de polisacáridos por fermentación en estado sólido en fase vegetativa en biorreactores bajo condiciones controladas en la que se diferencien y caractericen las fracciones de intrapolisacáridos y los exopolisacáridos en los exudados del cultivo fúngico. Evaluación del efecto de la viscosidad en los procesos de fermentación sumergida para la producción de enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos empleando hongos macromicetos en biorreactor de tanque agitado. Caracterización química y evaluación de la actividad biológica de las fracciones obtenidas del proceso de extracción de polisacáridos de los cuerpos fructíferos de los macromicetos. Evaluación de los hongos de pudrición blanca utilizados en este estudio como agentes biológicos degradadores de residuos recalcitrantes, por ejemplo, en las aguas provenientes de los lixiviados de rellenos sanitarios, y en aguas contaminadas con compuestos organoclorados y organofosforados. Se plantea la utilización como inóculo de los sustratos colonizados por los hongos en los biorreactores en estado sólido luego de haber producido enzimas o polisacáridos. Proponer nuevas pruebas de los modelos matemáticos planteados en esta tesis para la descripción de los procesos de fermentación sumergida y en estado sólido utilizando formulaciones de sustratos diferentes, así como otras especies de hongos a fin de examinar la universalidad de los modelos matemáticos propuestos.
187
Adachi Y., Ohno N., Ohsawa M., Oikawa S., Yadomae T. (1990). Change of biological activities of (1-3)-B-D glucan from Grifola frondosa upon molecular-weight reduction by heat-treatment. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 38: 477-481. Adler E. (1977). Lignin chemistry. Past, present and future. Wood Science Technology, 11: 169-218. Aguilar C., Augur C., Favela-Torres E., Viniegra-Gonzalez G. (2001). Production of tannase by Aspergillus niger Aa-20 in submerged and solid-state fermentation: influence of glucose and tannic acid. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology Advances, 26: 296-302. Ali H. (2010). Biodegradation of Synthetic Dyes-A Review. Water Air Soil Pollut, 213: 251-273. Alkorta I., Garbisu G., Llama M.J., Serra J.L. (1998). Industrial applications of pectic enzymes: a review. Process Biochemistry, 33: 21-28. Allen D.G., Robinson C.W. (1989). Hydrodynamics and mass transfer in Aspergillus niger fermentations in buble column and loop bioreactors. Biotechnology and Bioengineering 34: 731-740. Alvira P., Tomás-Pejó E., Ballesteros M., Negro M.J. (2009). Pretreatment technologies for an efficient bioethanol production process based on enzymatic hydrolysis: A review. Bioresource Technology, doi: 10.1016/j.biortech.2009.11.093. Amaral A., Carbonero E., Simao R., Kadowaki M., Sassaki G., Osaku C., Gorin P., Lacomini M. (2008). An unusual water- soluble B-glucan from the basidiocarp of the fungus Ganoderma resinaceum. Carbohydrate Polymers, 72: 473-478. Amat-García E.C., Amat-García G.D., Henao L.G. (2001). Diversidad taxonómica y ecológica de la entomofauna micófaga en un bosque alto-andino de la cordillera oriental de Colombia. Revista Academia Colombiana de Ciencia 1-21. Ander P. (1994). The celloiose-oxidizing enzymes CBQ and CBO as related to lignin and cellulose degradation - a review. FEMS Microbiology Reviews, 13: 297-312. Ângelo A.S. (2004). Enzimas hidrolíticas. En: Fungos: Uma Introducâo à biologia, bioquimica e biotecnologia. Esposito, Azevedo J.I. (Eds.). Universidade de Caxias do Sul,. pp. 263-285. Arantes V., Milagres A.M.F. (2007a). The effect of a catecholate chelator as a redox agent in Fenton-based reactions on degradation of lignin-model substrates and on COD removal from effluent of an ECF kraft pulp mill. Journal of Hazardous Materials, 141: 273-279. Arantes V., Milagres A.M.F. (2007b). The synergistic action of ligninolytic enzymes (MnP and Laccase) and Fe3+-reducing activity from white-rot fungi for degradation of Azure B. Enzyme and Microbial Technology, 42: 17-22. Archibald F. (1992a). A new assay for lignin-type peroxidases employing the dye Azure B. Applied Environmental Microbiology, 58: 3110-3116 Archibald F. (1992b). A new assay for lignin-type peroxidases employing the dye Azure B. Applied Environmental Microbiology, 58: 3110-3116. Arias E.L., Piñeros P.A. (2008). Enzimas ligninolíticas fúngicas para fines ambientales.Trabajo de grado. Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana: Bogotá. 202 p. p. Arora D.S., Chander M., Gill P.K. (2002). Involvement of lignin peroxidase, manganese peroxidase and laccase in degradation and selective ligninolysis of wheat straw. International Biodeterioration & Biodegradation, 50: 115-120. Arora D.S., Sharma R.K. (2010). Ligninolytic fungal laccases and their biotechnological applications. Applied Biochemistry and Biotechnology, 160: 1760-1788. Arteaga-Hoyos A.B. (2002). Utilización de los desechos del banano para el cultivo del hongo comestible Pleurotus ostreatus. Augura Carta Informativa, (212): 4-6. Asatiani M.D., Kachlishvili E.T., Khardziani T.S., Metreveli E.M., Mikiashvili N.A., Songulashvili G.G., Tsiklauri N.D., Wasser S.P., Elisashvili V.I. (2008). Basidiomycetes as a source of antioxidants, lectins, polysaccharides, and enzymes. Journal of Biotechnology 136S: S717-S742. Badcock E. (1943). Methods for obtaining fructifications of wood-rotting fungi in culture. Transactions of the British Mycological Society, 26: 127-132. Bae J., Sim J., Lee B., Pyo H., Choe T., Yun J. (2005). Production of exopolysaccharide from mycelial culture of Grifola frondosa and its inhibitory effect on matrix metalloproteinase-1 expression in UV-irradiated human dermal fibroblasts. FEMS Microbiology Letters, 251: 347-354. Bajpai P. (1997). Microbial xylanolytic enzyme system: properties and applications. Advances in Applied Microbiology, 43: 141- 194. Baker R.A., Wicker L. (1996). Current and potential applications of enzyme infusion in the food industry. Trends Food Science Technology, 7: 279-284. Baldrian P., Gabriel J. (2002). Variability of laccase activity in the whiterot basidiomycete Pleurotus ostreatus. Folia Microbiology, 47: 385-390. Baldrian P., Valasková V. (2008). Degradation of cellulose by basidiomycetous fungi. FEMS Microbiology Review, 32: 501-521. Bao W., Fukushima Y., Jensen K., Moen M., Hammel K. (1994). Oxidative degradation of non-phenolic lignin during lipid peroxidation by fungal manganese peroxidase. FEBS Letters, 354: 297-300. Barr B.K., HsieH Y.L., Ganem B., Wilson D.B. (1996). Identification of two functionally different classes of exocellulases. Biochemistry, 35: 586-592. Béguin P., Aubert J.P. (1994). The biological degradation of cellulose. FEMS Microbiology Reviews, 13: 25-58. Beily P., Kratky Z., Vrsanska M. (1981). Substrate binding site of endo-1,4- β-xylanase of the yeast Cryptococcus albidus. Europe Journal Biochemestry, 119: 559 -571.
188
Benavidez-Calvache O.L. (2004). Estudio Químico de la fracción insaponificable del hongo macromiceto Lentinula edodes (Shiitake).Maestría en Ciencias-Química. Programa de Postgrados en Química, Universidad Nacional de Colombia: Bogotá. 98 p. Berovič M., Boh B., Wraber B., Pohleven F. (2007). Production of intra- and extracellular polysaccharides of Grifola frondosa by solid state and submerged fermentation. International Journal for Medicinal Mushrooms, 9: 193-194. Bizukojc M., Ledakowicz S. (2006). A kinetic model to predict biomass content for Aspergillus niger germinating spores in the submerged culture. Process Biochemistry, 41: 1063-1071. Blanch H.W., Clark D.S. (1997). Biochemical Engineering. Marcel Dekker: New York. 702 pp. p. Blanchette R.A. (1995). Degradation of the lignocellulose complex in wood. Canadian Journal of Botany, 73: S999-S1010. Blanchette R.A., Krueger E.W., Haight J.E., Akhtar M., Akin D.E. (1997). Cell wall alterations in loblolly pine wood decayed by the white-rot fungus, Ceriporiopsis subvermispora. Journal of Biotechnology, 53 203-213. Blánquez P., Casas N., Font X., Gabarrell M., Sarrá M., Caminal G. (2004). Mechanism of textile metal dye biotransformation by Trametes versicolor. Water Resource, 38: 2166-2172. Blánquez P., Sarrà M., Vicent M. (2006). Study of the cellular retention time and the partial biomass renovation in a fungal decolourisation continuous process. Water Resource, 40: 1650-1656. Blánquez P., Caminal G., Sarrà M., Vicent M. (2007). The effect of HRT on the decolourisation of the Grey Lanaset G textile dye by Trametes versicolor. Chemistry Engineering Journal, 126: 163-169. Boisset C., Fraschini C., Schülein M., Henriss B. (2000). Imaging the enzymatic digestion of bacterial cellulose ribbons reveals the endo character of the cellobioydrolase Cel6A from Humicola insolens and its mode of synergy with cellobiohydrolse Cel 7A. Environmental Microbiology, 66: 1444-1452. Bolla K., Gopinath B., Shaheen S., Charya M. (2010). Optimization of carbon and nitrogen sources of submerged culture process for the production of mycelial biomass and exopolysaccharides by Trametes versicolor. International Journal for Biotechnology and Molecular Biology Research, 1: 15-21. Bommarius A.S., Riebel B.R. (2004a). Biocatalysis. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA: Atlanta, USA. Bommarius A.S., Riebel B.R. (2004b). Biocatalysis. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA: Atlanta, USA. 611 p. p. Bonugli-Santos R., Durrant L., Durães Sette L. (2012). The Production of Ligninolytic Enzymes by Marine-Derived Basidiomycetes and Their Biotechnological Potential in the Biodegradation of Recalcitrant Pollutants and the Treatment of Textile Effluents. Water Air Soil Pollut, 223: 2333-2345. Borchers A., Keen C., Gerhwin M. (2004). Mushrooms, tumors, and immunity: an update
. Experiment in Biological Medical, 229: 393-406. Bosell G.P., Jacobs H., Davidson F.A., G.M. G., Ritz K. (2003). Growth and Function of Fungal Mycelia in Heterogeneous Environments. Bulletin of Mathematical Biology, 65: 447-477. Brummer Y., Cui S.W. (2006). Detection and Determination of Polysaccharides in Foods. En: Food Polysaccharides and Their Applications. Stephen A.M., Phillips G.O., Williams P.A. (Eds.). CRC Press Taylor & Francis Group: Boca Raton, FL. 676- 706 p. pp. 676-706. Burgstaller W., Schinner F. (1993). Leaching of metals with fungi. Journal of Biotechnology, 27: 91-116. Burnett J.H. (1976). Fundamental of Micology. 2a ed Edward Arnold: London. 221 p. p. Burns J.K. (1991). The polygalacturonases and lyases. En: The Chemistry and Technology of Pectin. Walter R.H. (Ed.). Academic Press,: San Diego. pp. 165- 188. Buswell J.A., Odier E. (1987). Lignin biodegradation. Review Biotechnology, 6: 1-59. Buswell J.A., Cai Y., Chang S.T. (1995). Effect of nutrient nitrogen and manganese on manganese peroxidase and laccase production by Lentinula (Lentinus) edodes. FEMS Microbiology Letters, 128: 32- 45. Buswell J.A., Cai Y.J., Chang S.T. (1996). Ligninolytic enzyme production and secretion in edible mushroom fungi. En: Mushroom Biology and Mushroom Products. Royse D.J. (Ed.). The Pennsylvania State University pp. 113±122: Pennsylvania. Campbell M.K., Farrell S.O. (2004). Bioquímica. Cuarta ed International Thomson Editores: México. 725 p. p. Carabajal M., Levin L., Abertó E., Lechner B. (2012). Effect of co-cultivation of two Pleurotus species on lignocellulolytic enzyme production and mushroom fructification. International Biodeterioration & Biodegradation, 66: 71-76. Cardona B.E., Saldarriaga Y., Guzmán L. (2005). Registro de Gimnopilus rugulosus (Agaricales, Cortinariaceae) de Colombia. Revista Mexicana de Micología, 021: 55-58. Cardona M., Osorio J., Quintero J. (2009). Degradación de colorantes industriales con hongos ligninolíticos. Revista Facultad de Ingeniería de la Universidad de Antioquia, (48): 27-37. Carle - Urioste J.C., Escobar - Vera J., El-Gogary S. (1997). Cellulase induction in Trichoderma reesei by cellulose requires its own basal expression. Journal of Biological Chemistry, 272: 10169-10174. Carlile M., Watkinson S., Gooday G. (2001). The fungi. Second ed Academic Press: London. 588 p. p. Carreño N., Vargas A., Bernal A.J., Restrepo S. (2007). Problemas fitopatológicos en especies de la familia Solanaceae causados por los géneros Phytophthora, Alternaria y Ralstonia en Colombia. Una revisión. Agronomía Colombiana, 25(2): 320-329. Castillo M.d.P., Ander P., Stenstrom J. (1997). Lignin and manganese peroxidase activity in extracts from straw solid substrate fermentation. Biotechnol. Technol. , 11 701-706. Castro-Ríos K. (2006). Validación de deshidratación convencional para la conservación del hongo comestible Pleurotus sajor- caju Revista Universidad de Caldas: 123-133.
189
Catley B.J. (1992). The biochemistry of some fungal polysaccharides with industrial potencial. En: Handbook of applied mycology: fungal biotechnology. Mukerji K.G. (Ed.). Marcel Dekker,: New York. pp. 1091-1114. Chandra M., Kalra A., Sharma P.K., Sangwan R.S. (2009). Cellulase production by six Trichoderma spp. fermented on medicinal plant processings. Journal Industrial Microbiology Biotechnology, 36: 605-609. Chandra R.P., Bura R., Mabee W.E., Berlin A., Pan X., Saddler J.N. (2007). Substrate pretreatment: the key to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics? Advance Biochemistry Engineering and Biotechnology, 108: 67-93. Chang S.T., Quimio T.H. (1982). Tropical Mushrooms: Biological Nature and Cultivation Methods. ed. T.H. Q.E. Chinese University Press: Hong Kong. 493 p. Chang S.T., Miles P.G. (2004). Mushrooms Cultivation, Nutritional Value, Medicinal effect, and Enviromental Impact. Segunda ed CRC Press: New York. 451 p. Chang T.S., Siddiq M., Sinha N.K., Cash J.N. (1994). Plum juice quality affected by enzyme treatment and fining. Journal of Food Science, 59: 1065-1069. Chaparro D.F., Rosas D.C. (2006). Aislamiento y evaluación de la actividad enzimática de hongos descomponedores de madera en la reserva natural La montaña del ocaso, Quimbaya-Quindío. Microbiología Industrial, Javeriana: Bogotá. 109 p. p. Chaparro D.F., Rosas D.C., Varela A. (2009). Aislamiento y evaluación de la actividad enzimática de hongos descomponedores de madera (Quindío, Colombia) Revista Iberoamericana de Micologia, 26(4): 238-243. Chen H., Xu F., Li Z. (2002). Recent developments in biodegradation of industrial pollutants by white rot fungi and their enzyme system. Bioresource Technology 81: 261. Chen Y.J., Shiao M.S., Lee S.S., Wang S.Y. (1997). Effects of Cordyceps sinensis on the proliferation and differentiation of human leukemic U937 cells. Life Science, 60(23): 49-59. Chihara G., Maeda Y., Humuro J., Sasaki T., Fukuoka F. (1969). Inhibition of mouse sarcoma 180 by polysaccharides from Lentinus edodes Nature, 222: 687-688. Chihara G., Hamuro J., Maeda Y., Arai Y., Fukuoka F. (1970). Fractionation and Purification of the Polysaccharides with Marked Antitumor Activity, Especially Lentinan, from Lentinus edodes (Berk.) Sing, (an Edible Mushroom). Cáncer Research, 30: 2776-2781. Chitiva - Jaramillo A., Torrenegra – Guerrero R., Cabrera - Parada C., Díaz - Puentes N., Pineda - Parra V. (2009). Contribución al estudio de microhongos filamentosos en los ecosistemas páramo de guasca y el tablazo.[1-10]. Disponible en: http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/gifuj/hongos_ ecosistemas_ paramo.pdf. [Visitada en marzo de 2010]. Cho E.J., Oh J.Y., Chang H.Y., Yun J.W. (2006). Production of exopolysaccharides by submerged mycelial culture of a mushroom Tremella fuciformis. Journal of Biotechnology, 127: 129-140. Chu K.H., Kim E.Y. (2006). Predictive modeling of competitive biosorption equilibrium data. Biotehchnology Bioprocess Engineerong, 11: 67-71. Comtat J., Joseleau J. (1981). Mode of action of a xylanase and its significance for the structural investigation of the branched L- arabino-Dglucurono-D-xylan from redwood (Sequoia sempervirens). Carbohydrates Resources, 95: 101-112. Corrales A., López C.A. (2005). Macrocybe titans (Bigelow y Kimbr.) Pegler, Lodge y Nakasone, un registro nuevo para Colombia. Actual Biología, 27(82): 93-97 Corredor I.C., Caridad M., Restrepo S. (2007). Evaluación de la suceptibilidad de hongos endófitos aislados de rosa (rosa hybrida) a insecticidas comerciales. Revista Colombiana de Biotecnología, 9(1): 59-74. Cortés M.R., García A.S., Suarez H.M. (2007). Fortificación de hongos comestibles (Pleurotus ostreatus) con calcio, selenio y vitamina C. VITAE, Revista de la Facultad de Química Farmacéutica, 14(1): 16-24. Coughlan M.P., Ljungdahl L.G. (1988). Comparative biochemistry of fungal and bacterial cellulolytic enzyme systems. En: Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation Millet J.P.A.P.B.J. (Ed.). Academic Press: London. pp. 34 p. Coughlan M.P., Hazlewood G.P. (1993). β-1,4-D-xylan-degrading enzyme systems: biochemistry, molecular biology and applications. Biotechnology and Applied Biochemistry, 17: 259-289. Cui F., Chisti Y. (2003). Polysaccharopeptides of Coriolus versicolor: physiological activity, uses and production. Biotechnology and Advances, 21: 109-122. Cui S. (2005). Food Carbohydrates, Chemistry, Physical propierties and Applications. CRC Press, ed. Group T.F. Taylor & Francis Group: Boca Raton Florida. 404 p. D’Annibale A., Celleti D., Felici M., Di Mattia E., Giovannozzi-Sermani G. (1996). Substrate specificity of laccase from Lentinus edodes. Acta
Biotechnol. Bioengineering, 16: 257-270. De Carvalho J.C., Pandey A., Oishi B.O., Brand D., Rodriguez-León J.A., Soccol C.R. (2005). Relation between growth, respirometric anaysis and biopigments production from Monascus by solid-state fermentation. Biochemical Engineering Journal, 29: 262-269. Dekker R.F.H., Richards G.N. (1975). Purification, properties and mode of action of hemicellulase I produced by Ceratocystis paradoxa. Carbohydrates Resources 39: 97-114. Dekker R.F.H. (1985). Biodegradation of the hemicelluloses. En: Biosynthesis and Biodegradation of wood components. Higuchi T. (Ed.). Academic press,: Orlando. pp. 113-132. Delgado F., López Y., Giraldo E.M. (2001). Actividad enzimática de hongos y su patogenicidad sobre Hypothenemus hampei. Manejo Integrado de Plagas (Costa Rica), 60: 43-49.
190
Dhouib A., Hamza M., Zouari H., Mechichi T., H’midi R., Labat M., Martínez M.J., Sayadi S. (2005). Autochthonous fungal strains with high ligninolytic activities from Tunisian biotopes. African Journal of Biotechnology, 4(5): 431-436. Dobozi M.S., Szakacs G., Bruschi C.V. (1992). xylanase activity of Phanerochaete Chrysosporium. Applied and environmental microbiology, 58(11): 3466-3471. Donot F., Fontana A., Baccou J., Schorr-Galindo S. (2012). Microbial exopolysaccharides: Main examples of synthesis, excretion, genetics and extraction. Carbohydrate Polymers, 87: 951- 962. Dormand J.R., Prince P.J. (1980). A family of embedded Runge-Kutta formulae. Journal of Computational and Applied Mathematics, 6: 19-26. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. (1956). Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry Engineering Journal, 28(3): 350-356. Eggert C., Temp U., Dean J.F., Eriksson K.L. (1996). A fungal metabolite mediates degradation of non-phenolic lignin structures and synthetic lignin by laccase. FEBS Letters, 391: 144-148. Ek M., Gellerstedt G., Henriksson G. (2009). Pulp and Paper Chemistry and Technology: Wood Chemistry and Wood Biotechnology. ed. KG W.d.G.G.C. Vol. 1. THE GRUITER: Berlin. 320 p. El Gogary S., Leite O., Criverallo D.E., Eveleigh D.E., El-Dorry H. (1989). Mechanism by which cellulose triggers cellobiohydrolase I gene expression in Trichoderma reesei. Proceedings of the National academy of Sciences of the United States of America, 86: 6138-6141. Elibol M. (2004). Optimization of medium composition for actinorhodin production by Streptomyces coelicolor A3 (2) with response surface methodology. Process Biochemistry, 39: 1057-1062. Elisashvili V., Parlar H., Kachlishvili E., Chichua D., Kvesitadze G. (2001a). Ligninolytic activity of basidiomycetes grown under submerged and solid-state fermentation on plant raw material (sawdust of grapevine cuttings). Advances Food Science, 23: 117-123. Elisashvili V., Parlar H., Kachlishvili E., Chihua D., Bakrazde M., Kokhreidze N., Kvesitadze G. (2001b). Potential of solid-state fermentation for laccase production. Advance Food Science, 23: 117-123. Elisashvili V., Penninckx M., Kachlishvili E., Asatiani M., Kvesitadze G., Gadd G. (2006). Use of Pleurotus dryinus for lignocellulolytic enzymes production in submerged fermentation of mandarin peels and tree leaves. Enzyme and Microbial Technology, 38: 998-1004. Elisashvili V., Penninckx M., Kachlishvili E., Tsiklauri N., Metreveli E., Kharziani T., Kvesitadze G. (2008). Lentinus edodes and Pleurotus species lignocellulolytic enzymes activity in submerged and solid-state fermentation of lignocellulosic wastes of different composition. Bioresource Technology, 99: 457-462. Elisashvili V., Kachlishvili E., Khardziani T., Agathos S.N. (2010). Effect of aromatic compounds on the production of laccase and manganese peroxidase by white-rot basidiomycetes. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 37: 1091- 1096. Enshasy H.E. (2010). Immunomodulators. En: The Mycota. Hofrichter M. (Ed.). Springer-Verlag: Berlin, 477 p. pp. 477. Evans C., Dutton. M., Guillen. F., Veness R. (1994). Enzymes and small molecular mass agents involved with lignocellulose degradation. FEMS Microbiology Letters, 13: 235-240. Fang Q.H., Zhong J.J. (2002). Effect of initial pH on production of ganoderic acid and polysaccharide by submerged fermentation of Ganoderma lucidum. Process Biochemistry, 37(7): 69-74. Fermor T.R., Wood D.A. (1981). Degardation of bacteria by Agaricus bisporus and other fungi. Journal of General Microbiology, 126: 377-387. Fernández J.A., Henao L.M., Pedroza-Rodríguez A.M., Quevedo-Hidalgo B. (2009). Inmovilización de hongos ligninolíticos para la remoción del colorante negro reactivo 5. Revista Colombiana de Biotecnología, 11(1): 59-72. Ferraz A., Cordova A.M., Machuca A. (2003). Wood biodegradation and enzyme production by Ceriporiopsis subvermispora during solidstate fermentation of Eucalyptus grandis. Enzyme and Microbiology Technology, 32: 59-65. Forchiassin F., Levin L. (en imprenta). Enzimas Extracelulares Degradación de Polímeros Vegetales. En: Introducción al reino de los hongos y los grupos afines. Albertó E., Vadell E. (Eds.). Literature for Latin America: Buenos Aires. Fujian X., Hongzhang C., Zuohu L. (2001). Solid-state production of lignin peroxidase (LiP) and manganese peroxidase (MnP) by Phanerochaete chrysosporium using steam-exploded straw as substrate. Bioresource Technology, 80: 149-151. Gadd G.M. (1999). Fungal production of citric and oxalic acid: importance in metal speciation, physiology and biogeochemical processes. Advance in Microbiology and Physiology, 41: 47-92. Gadd G.M. (2001). Fungi in Bioremediation. Cambridge University Press: Cambridge. 481 p. Galliano H., Gas G., Seris J.L., Boudet A.M. (1991). Lignin degradation by Rigidoporus lignosus involves synergistic action of two oxidizing enzymes: manganese peroxidase and laccase. Enzyme and Microbial Technology, 13: 478-482. Gao Y., Zhou S. (2003). Cancer prevention and treatment by Ganoderma, a mushroom with medicinal properties. Food Research International, 19: 275-325. Garcés-Molina A.M., Velez-Cardona N., Ruiz-Alzate S., Serna-D´León J.G., Suarez-Holguín E. (2006). Revista Lasallista de Investigación, 2(2): 15-20. García A.M., Torres R.G. (2003). Producción de enzimas ligninolíticas por Basidiomycetes mediante la técnica de fermentación en fase sólida. Revista Colombiana de Biotecnología, 5(001): 56-64. Gassara F., Brar S., Tyagi R.D., Verma M., Surampalli R.Y. (2010). Screening of agro-industrial wastes to produce ligninolytic enzymes by Phanerochaete chrysosporium. Biochemical Engineering Journal 49: 388-394.
191
Glen J.K., Gold M.H. (1985). Purification and characterization of an extracellular Mn(II)-dependent peroxidase from the lignin- degrading basidiomycetes Phanerochaete chrysosporium. Archives of Biochemistry and Biophysics, 242: 329-341. Gold M.H., Alic M. (1993). Molecular Biology of the lignin-degrading Basidiomycete Phanerochaete Chrysosporium. Microbiological Reviews, 57(3): 605-622. Golovleva L.A., Malt’seva O.V., Leont’evskii A.A., Myasoedova N.M., Skryabin G.K. (1987). Ligninase biosynthesis by the fungus Panus tigrinus during solid-state fermentation of straw. Doklady Akademii Nauk, 294: 992-995. Gómez-Dorado C., Martinez-Salgado M., Nieto-Mosquera D., Pedrosa-Rodriguez A., Rodriguez-Vásquez R., Rosas-Acosta J. (2005). Estudio del efecto de dos inductores y un protector enzimático sobre la actividad de las enzimas MnP y lacasa producidas por Trametes versicolor y su acción en la decoloración. Revista de la Facultad de Ciencias Universidad Javeriana, 10(2): 37-45. Gong P., Guan X., Witter E. (2001). A rapid method to extract ergosterol from soil by physical disruption. Applied Soil Ecology, 17: 285-289. Góngora C.E. (2009). Avances en conocimiento y mejoramiento del hongo entomopatógenos Beauveria bassiana para el control de la broca del café, Hypothenemus hampei. Cenicafé. Disponible en: http://almacafe.com.co/modules/News/images/simposio2.pdf. [Visitada en marzo de 2010]. Goodenough P.W. (1996). Structural studies on cellulases, pectinases an xylanases. En: Enzymes for Carbohydrate Engineering. Elsevier Science B.V,. pp. 83-107. Gow N.A.R. (1995a). The Growing Fungus. ed. Hall C. N.A.R Gow & G. M. Gadd: London. 402 p. p. Gow N.A.R. (1995b). The growing Fungus. ed. Hall C. N.A.R Gow & G. M. Gadd: London. Graminha E.B.N., Gonc¸alves A.Z.L., Pirota R.D.P.B., Balsalobre M.A.A., Da Silva R., Gomes E. (2008). Enzyme production by solid-state fermentation: Application to animal nutrition. Animal Feed Science and Technology, 144: 1-22. Granada R.D.M., Mejía G.A.I., Jimenez T.G.A. (2005). Utilización de residuos de plátano para la producción de metabolitos secundarios por fermentación en estado sólido con el hongo Lentinus crinitus. Revista de la Facultad de Química Farmacéutica, 12(2): 13-20. Guiseppin M.L.F. (1984). Effects of disolved oxygen concentration on lipase production by Rhizopus delemar. Applied Microbiology and Biotechnology, 20: 161-173. Gutiérrez Ramírez L., Pérez Bran J., Uribe M. (2012). Evaluación in vitro de celulasas producidas por cepas nativas de Trichoderma reesei, Cladosporium herbarum y Aspergillus niger. Journal Agricultural and Animal Science, 1(1): 7-15. Gutierrez-Correa M., Tengerdy R.P. (1997). Production of cellulase on sugar cane bagasse by fungal mixed culture solid substrate fermentation. Biotechnology Letters in Applied Microbiology, 19: 665 - 667. Guzmán M.L., Angel J.C., Rivas A., Suarez L. (2003). Producción de hongos comestibles en residuos de caña de azúcar, Memorias VI congreso Colombiano de la Asociación de Técnicos de la Caña de Azúcar: Colombia. 323-331. Hamelinck C.N., van Hooijdonk G., Faaij A.P.C. (2005). Ethanol from lignocellulosic biomass: techno-economic performance in short-, middle- and long-term. Biomass Bioenergy, 28: 384-410. Hamlyn P.F., Schmidt R.J. (1994). Potential therapeutic application of fungal filaments in wound management. Mycologist, 8: 147-152. Hammel K.E., Kapich A.N., Jensen Jr. K.A., Ryan Z.C. ( 2002). Reactive oxygen species as agents of wood decay by fungi. Enzyme Microbiology and Technology, 30: 445-453. Henry W.P. ( 2003). Non-enzymatic iron, manganese and copper chemistry of potencial importance in wood decay. En: Wood Deterioration and Preservation - Advances in our Changing World. Society A.C. (Ed.). Goodell, B., Nicholas, D.D., Schultz, T.P. (Eds.): Washington. pp. 175-195. Hobbs C. (2000). Medicinal values of Lentinus edodes (Berk.) Sing. (Agaricomyvetideae). A literature review. Interantional Journal of Medicinal Mushrooms, 2: 287-297. Hölker U., Höfer M., Lenz J. (2004). Biotechnological advantages of laboratory-scale solid-state fermentation with fungi. Applied Microbiology Biotechnology, 64: 175-186. Hölker U., Lenz J. (2005). Solid-state fermentation - are there any biotechnological advantages? Current Option in Microbiology, 8: 301-306. Hormiga J.A., Verab J., Frías I., Torres Dariasa N.V. (2008). Growth and ligninolytic system production dynamics of the Phanerochaete chrysosporium fungus A modelling and optimization approach. Journal of Biotechnology, 137: 50-58. Hsieh C., Liu C.-J., Tseng M.-H., Lo C.-T., Yang Y.-C. (2006). Effect of olive oil on the production of mycelial biomass and polysaccharides of Grifola frondosa under high oxygen concentration aeration. Enzyme and Microbial Technology, 39: 434- 439. Hsieh C., Wang H.-L., Chena C.-C., Hsub T.-H., Tseng M.-H. (2008). Effect of plant oil and surfactant on the production of mycelial biomass and polysaccharides in submerged culture of Grifola frondosa. Biochemical Engineering Journal, 38: 198- 205. Hudson H. (1986a). Fungal Biology. CPC press Edward Arnolds Eds: Maryland. 298 p. p. Hudson H. (1986b). Fungal Biology. Edward Arnolds Eds: Maryland. 298 p. p. Hyun H.H., Zeikus J.G. (1985). General Biochemical characterization of thermostable extracellular B-amylasa from Clostridium thermosulfurogenes. Applied Environmental Microbiology, 49: 1162-1170. Ikasari L., Mitchell D.A. (2000). Two-phase model of yhe kinetics of growth of Rhizopus oligosporus in membrana culture. Biotechnology Bioengineering, 68: 619-627.
192
Ilmen M., Saloheimo A., Onnela M.L., Pentilla M. (1996). Rgulation of cellulase gen expression in the filamentous fungus Trichoderma reesei. Applied Environmental Microbiology, 63: 1298-1306. Ishikawa K., Majima T., Ebina T. (1992). Anti-tumour effect of a Coriolus preparation, PSK: Induction of macrophage chemotactic factor (MCF) in spleens of tumour bearing mice. Biotherapy, 5: 251-258. Ivshin V., Artamonova S., Ivshina T., Sharnina F. (2007). Methods for Isolation of Chitin–Glucan Complexes from Higher Fungi Native Biomass. Polymer Science, Serie B., 49(11-12): 305-310. Izawa M., Takashio M., Koshino S. (1995). Several new factors influencing the measurement of β-glucan content using calcofluor flow-injection analysis method. Journal of the Institute of Brewing, 101: 371. Jaramillo C., Rodriguez N., Gómez F.A. (1999). Cultivo de hongos tropicales sobre residuos agroindustriales presentes en la zona cafetera. Informe final experimento QIN-09-23 (Cultivation of tropical mushrooms on agri-industrial wastes present in coffee-growing region. Final report of experiment QIN-09-23, in Spanish), Cenicafé: Chinchiná, Colombia. 44. Jaszek M., Malarczyk E., Leonowicz A. (1998). Investigation of ligninolytic enzymes during solid state fermentation of cotton wastes by selected strains of basidiomycetes. En: Proceedings of the 7th International Conference on Biotechnology in the Pulp and Paper Industry. Vancouver. pp. 16-18. Jennings D.H. (1995). The Physiology of Fungal Nutrition, Cambridge, UK: Cambridge University press. Johnson E.A., Sakajoh M., Halliwell G., Madia A., Demain A.L. (1982). Saccharification of complex cellulosic substrates by the cellulase system from C. thermocellum. Applied and environmental microbiology, 43: 1125-1132. Jong S.C., Birgmingham J.M. (1992). Medicinal benefits of the mushroom Ganoderma. Adv. Appl. Microbiol., 37: 101-134. Joselau J.P., Ruel K. (1994). Wood polysaccharides and their degradation by fungi. En: Host Wall Alterations by Parasitic Fungi. Ouellette P. (Ed.). APS Press: Minnesota. pp. 334-387. Joshi V.K., Pandey A. (1999a). Biotechnology. Food fermentation Vol II. Educational Publishers & distributors: New Delhi. 998 p p. Joshi V.K., Pandey A. (1999b). Biotechnology: Food Fermentation (Microbiology, Biochemistry and Technology) Vol I. Educational Publishers & distributiors: New Delhi. 521 P. p. Joshi V.K., Pandey A. (1999c). Biotechnology. Food fermentation Vol. II. Educational Publishers & Distributors: New Delhi. 998 p p. Kachlishvili E., Penninckx M., Tsiklauri N., Elisashvili V. (2006). Effect of nitrogen source on lignocellulolytic enzyme production by white-rot basidiomycetes under solid-state cultivation. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 22(4): 391-397. Kalisz H.M., Wood D.A., Moore D. (1987). Production, regulation and release of extracellular proteinasa activity in basidiomycetes fungi. Transactions of the British Mycological Society, 88: 221-227. Kalisz H.M. (1988). Microbial Proteinases. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 36: 1-65. Kalisz H.M., Wood D.A., Moore D. (1989). Some Characteristics of extracellular proteinases from Coprinus cinereus. Mycological Research, 92: 278-285. Kapich A.N., Prior B.A., Botha A., Galkin S., Lundell T., Hatakka A. (2004). Effect of lignocellulose-containing substrate on production of ligninolytic peroxidases in submerged cultures of Phanerochaete chrysosporium ME-446. Enzyme and Microbial Technology, 34: 187-195. Karunanithy C., Muthukumarappan K., Julson J.L. (2008). Influence of high shear bioreactor parameters on carbohydrate release from different biomasses American Society of Agricultural and Biological Engineers Annual International Meeting ASABE 084114. ASABE. Kersten P., Cullen D. (2007). Extracellular oxidative systems of the lignin-degrading Basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. Fungal Genetics and Biology, 44: 77-87. Kiho T., Ookubo K., Usui S., Ukai S., Hirano K. (1999). Structural features and hypoglycemic activity of a polysaccharides (CS- F10) from the cultured mycelium of Cordyceps sinensis. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 22(9): 66-70. Kim F., Sakagami H., Tanuma S., Konno K. (1990). Stimulation of interferon-g-induced human myelogenous leukemic cell differentiation by high molecular weight PSK subfraction. Anticancer Research, 10: 55-58. Kim S., Holtzapple M.T. (2006). Delignification kinetics of corn stover in lime pretreatment. Bioresource Technology, 97: 778- 785. Kim T.H., Taylor F., Hicks K.B. (2008a). Bioethanol production from barley hull using SAA (soaking in aqueous ammonia) pretreatment. . Bioresouce Technology, 99: 5694-5702. Kim T.H., Taylor F., Hicks K.B. (2008b). Bioethanol production from barley hull using SAA (soaking in aqueous ammonia) pretreatment. Bioresource Technology, 99: 5694-5702. Kirk T.K., Connors W., Zeikus J. (1976). Requeriment for a growth substrate during lignin decomposition by two wood-roting fungi. Applied Environmental Microbiology, 32: 192-194. Kirk T.K. (1983). Degardation and convertion of lignocelluloses. En: The filamentous fungi. Smith J.E., Berry D.R., Kristiansen P. (Eds.). London. pp. 266-295. Kirk T.K., Farrel R.L. (1987a). Enzymatic combustion: the microbial degradation of lignin. Annual Reviews of Microbiology, 41: 465-505. Kirk T.K., Farrel R.L. (1987b). Enzymatic combustion: the microbial degradation of lignin. Annual Reviews of Microbiology 41: 465-505. Kjeldahl J. (1883). Neue Methode Zùr Bestimmung der Stickstoffs in Organichen Kòrpen. Zeitschrift fur Analytische Chemie 22: 366-382.
193
Kobayashi H., Matsunaga K., Oguchi Y. (1995). Antimetastatic Effects of P5K (Krestin), a Protein-bound Polysaccharide Obtained from Basidiomycetes: An Overview. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention, 4: 275-281. Koduri R.S., Tien M. (1994). Kinetic analysis of lignin peroxidase-explanation for the mediation phenomen by veratryl alcohol. Biochemistry, 33: 4225-4230. Koh J.H., Kim J.M., Chang U.J., Suh H.J. (2003). Hypocholesterolemic effect of hotwater extract from mycelia of Cordyceps sinensis. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 26: 84-87. Komatsu M., Okubo S., Kikumoto S., Kimura K., Saito G., Sakai S. (1969). Host-mediated antitumor action of Schizophyllan a glucan produced by Schizophyllum commune. Gann, 60: 137-144. Komura D.L., Ruthers A.C., Carbonero E.R., Alquini G., Rosa M.C., Sassaki G.L., Lacomini M. (2010). The origin of mannans found in submerged culture of basidiomycetes. Carbohydrate polymers, 79: 1052-1056. Kootstra A.M.J., Beeftink H.H., Scott E.L., Sanders J.P.M. (2009). Comparison of dilute mineral and organic acid pretreatment for enzymatic hydrolysis of wheat straw. Biochemical Engineering Journal, 46: 126-131. Kosaka A., Yamashita A. (1993). Lentinan as an effective inmmunomodulator against breast cancer, with special reference to clinical applications. International Journal Immunotherapy, 9: 111-116. Koutinas A.A., Wang R., Webb C. (2004). Restructuring Upstream Bioprocessing: Technological and Economical Aspects for Production of a Generic Microbial Feedstock From Wheat. Published online in Wiley InterScience: 1-15. Kovarova-Kovar K., Egli T. (1998). Growth kinetics of suspended microbial cells: from single substrate-controlled growth to mixed-substrate kinetics. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62: 646-666. Kumar R., Wyman C.E. (2009). Effects of cellulase and xylanase enzymes on the deconstruction of solids from pretreatment of poplar by leading technologies. Biotechnology Progress, 25: 302-314. Kumari J., Sahoo P.K. (2006). Non-specific immune response of healthy and immunocompromised Asia catfish (Clarias batrachus) to several immunostimulants. Aquaculture, 255: 133-141. Kupfahl C., Geginat G., Hof H. (2006). Lentinan has a stimulatory effect on innate and adaptive immunity against murine Listeria monocytogenes infection. International Immunopharmacology, 6: 686- 696. Ladner W., Ditrich K. (1999). Biocatalytic production of chiral intermediates. Chimica Oggi 7/8: 51-54. Lama L., Nicolaus B., Calandrell V., Manca M., Romano I., Gambacorta A.M., Arambarri. (1996). Effect of growth conditions on endo- and exopolymer biosynthesis in Anabaena cylindrica 10C. Phytochemistry, 42: 655-664. Lang E., Nerud F., Novotna E., Martens R. (1996). Production of ligninolytic exoenzymes and 14C-pyrene mineralization by Pleurotus sp. in lignocellulose substrate. Folia Microbiology, 41: 489-493. Lee B., Bae J., Pyo H., Choe T., Kim S., Hwang H., Yun J. (2004). Submerged culture conditions for the production of mycelial biomass and exopolysaccharides by the edible basidiomycete Grifola frondosa. Enzyme and Microbial Technology, 35: 369- 376. Lee K., Lee S., Lee H. (1999). Bistage control of pH for improving exopolysaccharide production from mycelia of Ganoderma lucidum in an air-lift fermentor. Journal of Bioscience and Bioengineering, 88: 646-650. Lee W.Y., Park Y., Ahn J.K., Ka K.H., Park S.Y. (2007a). Factors influencing the production of endopolysaccharide and exopolysaccharide from Ganoderma applanatum. Enzyme and Microbial Technology, 40 249-254. Lee W.Y., Park Y., Ahn J.K., Ka K.H., Park S.Y. (2007b). Factors influencing the production of endopolysaccharide and exopolysaccharide from Ganoderma applanatum. Enzyme and Microbial Technology 40 249-254. Lemaire M. (1996). The Cellulosome - an exocellular multiprotein complex specialised in cellulose degradation. Critical Reviews and Biochemistry & Molecular Biology, 31: 201-236. Lenz J., Höfer M., Krasenbrink J.B., Hölker U. ( 2004). Computational and physical methods in solid-state fermentation. Applied Microbiology Biotechnology, 65: 9-17. Leonowicz A., Matuszewska A., Luterek J., Ziegenhagen D., Wojtas-wasilewska M., Cho N.S., otros. (1999). Biodegradation of lignin by white-rot fungi. Fungal Genetics and Biology 27: 175-185. Leschine S.B. (1995). Cellulose degradation in anerobic environments. Annual Review Microbiology, 49: 399-410. Leterme P. (2010a). Análisis de alimentos y forrajes, in Protocolos de LaboratorioUniversidad Nacional de Colombia Sede Palmira: Palmira. 66 pp. Leterme P. (2010b). Análisis de alimentos y forrajes. Protocolos de Laboratorio Universidad Nacional de Colombia: Palmira. 66 pp. p. Leung M., Fung K., Choy Y. (1997). The isolation and characterization of an immunomodulatory and antitumor polysaccharide preparation from Flammulina velutipes. Immunopharmacol 35: 255-263. Leung M., Liu C., Koon J., Fung K. (2006). Polysaccharide biological response modifiers. Immunologycal Letters, 105: 101-114. Levin L. (1998). Biodegradación de materiales lignocelulósicos por Trametes trogii (Aphyllophorales, Basidiomycetes).Tesis Doctoral. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires: Buenos Aires. Levin L., Forchiassin F., Ramos A.M. (2002). Copper induction of lignin-modifying enzymes in the white-rot fungus Trametes trogii. Mycologia, 94(3): 377-383. Levin L., Papinutti L., Forchiassin F. (2004). Evaluation of Argentinean white rot fungi for their ability to produce lignin- modifying enzymes and decolorize industrial dyes. Bioresource Technology, 94: 169-176. Levin L., Herrmann C., Papinutti V.L. (2008). Optimization of lignocellulolytic enzyme production by the white-rot fungus Trametes trogii in solid-state fermentation using response surface methodology. Biochemical Engineering Journal 39: 207- 214.
194
Li L., Li X.Z., Tang W.Z., Zhao J., Qu Y.-B. (2008). Screening of a fungus capable of powerful and selective delignification on wheat straw. Letters in Applied Microbiology, 47: 415-420. Li Q., He Y.C., Xian M., Jun G., Xu X., Yang J.M., Li L.Z. (2009). Improving enzymatic hydrolysis of wheat straw using ionic liquid 1-ethyl-3-methyl imidazolium diethyl phosphate pretreatment. Bioresource Technology, 100: 3570-3575. Li X., Liun Y., Ji L. (2000). Production of lignocellulolytic enzymes in solid state fermentation using corn stalks as substrate. Henong Xuebao, 14: 99-103. Lia K., Azadic P., Collinsb R., Toland J., Kimc J.S., E. K.E.L. (2000). Relationships between activities of xylanases and xylan structures. Enzyme and Microbial Technology, 27: 89-94. Lin E., Sung S. (2006). Cultivating conditions influence exopolysaccharide production by the edible Basidiomycete Antrodia cinnamomea in submerged culture. International Journal of Food Microbiology, 108: 182-187. Lindblom C.M., Wachenfeldt E.V., Tranvik L.J. (2004). Ergosterol as a measure of living fungal biomass: persistence in environmental samples after fungal death. Journal of Microbiological Methods, 59 253- 262. Lindequist U., Niedermeyer T., Ju¨lich W.-D. (2005a). The pharmaceutical potential of mushrooms. Electronic centralised aircraf monitor (eCAM), 2: 285-299. Lindequist U., Niedermeyer T., Julich W.-D. (2005b). The pharmaceutical potential of mushrooms. Electronic Centralised Aircraf Monitor (eCAM), 2: 285-299. Litthauer D., van Vuuren, M.J.,, van Tonder A., Wolfaardt F.W. (2007). Purification and kinetics of a thermostable laccase from Pycnoporus sanguineus (SCC 108). Enzyme and Microbial Technology, 40: 563-568. Liu C., Liu Y., Liao W. (2003). Application of statistically based experimental designs for the optimization of nisin production from whey. Biotechnology Letters, 25: 877-882. Liu F., Fung M.C., Ooi V.E.C., Chang S.T. (1996a). Induction in the mouse of gene expression of immunomodulating cytokines by mushroom polysaccharide-protein complexes. Life Science, 58(1): 795-803. Liu F., Fung M.C., V.E.C. O., Chang S.T. (1996b). Induction in the mouse of gene expression of immunomodulating cytokines by mushroom polysaccharide-protein complexes. Life Sciences, 58(1): 795-803. Lockington R.A., Rodbourn L., Barnett S., Carter C.J., Kelly J.M. (2002). Regulation by carbon and nitrogen sources of family of cellulases in Aspergillus nidulans. Fungal Genetics and Biology, 37: 190-196. Lonsane B.K., Ghildyal N.P., Budiatman S., Ramakrishna S.V. (2005). Solid state fermentation for production of α-amylase by Bacillus megaterium 16M Enzyme Microbiology Technology, 7: 258-265. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. (1951). Protein measuremnet with the folin phenol reagent. Department of Pharmacology, Washington University School oj Medicine, St. Louis, Missouri: 265 - 275. Lozano J.C. (1989). Producción comercial del Champiñon /Pleurotus ostreatus/ en pulpa de café, CONGRESO ASCOLFI, X. Cali (Colombia): Manizales. 60 p. Luedeking R., Piret E. (1959). Transient and steady states in continuous fermentation. Theory and experiment. Journal of Biochemical and Microbiological Technology and Engineering, 1: 431-459. Lull C., Wichers H., Savelkoul H. (2005). Antiinflammatory and immunomodulating properties of fungal metabolites. Mediator Inflammation, 2: 63-80. Lynd L.R., Weimer P.J., Zyl W.H.v., Pretorius I.S. (2002). Microbial cellulose utilization: Fundamentals and Biotechnology. Microbiological and Molecular Biology Reviews, 66(3): 506-577. Maganhotto de Souza-Silva C.M., Soares de Melo I., de Oliveira P.R. (2005). Ligninolytic enzyme production by Ganoderma spp. Enzyme and Microbial Technology 37: 324-329. Mandels M., Reese E. (1956). Induction of cellulase in Trichoderma viride as influenced by carbon sources and metals. Biology Branch: 269-277. Mandels M., Weber J. (1969). The production of cellulases and their applications. Advances Chemistry, 95: 391-414. Mansel P.W.A. (1994). Polysaccharides in skin care. Cosmetics Toilet, 109: 7-72. Mansfield S.D., Mooney C., Sanddler J.N. (1999). Substrate and enzyme characteristics that limit cellulose hydrolysis. Biotechnological progress, 15: 804-816. Markham P. (1998). Occlusions of septal pores in filamentous fungi. Mycological Research, 98: 1089-1106. Marques de Souza C.G., Zilly A., Peralta R.M. (2002). Production of laccase as the sole phenoloxidase by a Brazilian strain of Plerotus pulmonarius in solid state fermentation. Journal Basic Microbiology, 42: 83-90. Martinez A. (2002). Molecular Biology and structure-function of lignin-degradin heme peroxidases. Enzyme Microbiology Technology, 30: 425-444. Martinez M., Ruiz-Dueñas F., Guillen F., Martinez A. (1996). Purifacation and catalytic properties of two manganese peroxidase isoenzymes from Pleurotus eryngii. European Journal Biochemistry, 237: 424-432. Martínez M.J., Ruíz-Dueñas F.J., Guillén F., Martínez A.T. (1996). Purification and catalytic properties of two manganese- peroxidase isoenzymes from Pleurotus eryngii. European Journal of Biochemistry, 237: 424-432. Martínez-Anaya C., Balcázar-López E., Dantán-González E., Folch-Mallol J., L. (2008). Celulasas fúngicas: Aspectos biológicos y aplicaciones en la industria energética. Revista Latinoamericana de Microbiología, 50(3 y 4): 119-131. Mata G., Savoie J.M. (1998). Extracellular enzyme activities in six Lentinula edodes strains during cultivation in wheat straw. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 14: 513-519. Mata G., Murrieta Hernández D.M., Iglesias Andreu L.G. (2005). Changes in lignocellulolytic enzyme activites in six Pleurotus spp. strains cultivated on coffee pulp in confrontation with Trichoderma spp. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 21: 143-150.
195
Mattila P., Lampi A.M., Ronkainen R., Toivo J., Piironen V. (2002). Sterol and Vitamin D2 contents in some wild and cultivated mushroomn. Food Chemistry, 76: 293-298. Mayer A.M., Staples R.C. (2002). Laccase: new functions for an old enzyme. Phytochemistry, 60: 551-565. Maziero R., Cavazzoni V., Ramos-Bononi V.L. (1999). Screening of Basidiomycetes for the production of exopolisaccharides and biomass in submerged culture. Revista de Microbiologia, 30: 77-84. Meagher M.M., Tao B.Y., Chow J.M., Reilly P.J. (1988). Kinetics and subsite mapping of β -D-xylobiose and D-xylose producing Aspergillus niger endo-β-1,4-D-xylanase. Carbohydrates Resources, 173: 273-283. Meier H. (1955). Decomposition of the cell wall by wood-destroying fungi and the submicroscopic structure of tracheids of spruce and wood fibers of birch (translation Nº 92: Department of the Secretary of State of Canada, February 1956) Holz. Roh-Werkst., 13: 323-338. Mester T., Sierra-Alvarez R., Holzforschung. (1998). Peroxidase and aryl metabolite production by the white rot fungus Bjerkandera sp. strain BOS55 during solid state fermentation of lignocellulosic substrates. J. Field, 52: 351-358. Meyer H.P., Kiener A., Imwinkelried R., Shaww N. (1997). Biotransformations for fine chemicals production. Chimia, 51: 287- 289. Miller G.L. (1959). Use of DinitrosaIicyIic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar. Analytical Chemistry, 31(3): 426- 428. Mitchell D., Stuart D., Tanner R. (1999). Solid-State fermentation - Microbial growth kinetics, in The Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis and bioseparation, Flickinger M., Drew S., EditorsWiley: New York. 2407-2429 Mitchell D., Von Meien O., Krieger N. (2002). Recent developments in modeling of solid-state feremntation: heat and mass transfer in bioreactors. BiochemicalEngineering Journal, 13: 137-147. Mitchell D.A., Von meien O.F., Krieger N., Dalsenter F.D. (2004). A review of recent developments in modeling of microbial growth kinetics and intraparticle phenomena in solid-state fermentation. Biochemical Engineering Journal 17: 15-26. Mizuno T. (1992). Antitumor active polysaccharides isolated from the fruiting body of Hericium erinaceum, and edible, and medicinal mushroom called Yamabushitake or Houtou. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 56: 349-357. Mizuno T., Saito H., Nishitoba T., Kawagishi H. (1995). Antitumor-active substances from mushrooms. Food review international, 11: 23-61. Mizuno T. (1999). The extraction and development of antitumouractive polysaccharides from medicinal mushrooms in Japan. International Journal Medicine Mushrooms, 1: 9-29. Mohammad-Fata M., Hossein M., Shirin G., Ghorban-Ali H. (2007). Immunomodulating and anticancer agents in the realm of macromycetes fungi (macrofungi). International Immunopharmacology 7: 701-724. Moncada B., Forero E. (2006). El género Pseudocyphellaria VAIN. (Lobariaceae - ascomycetes liquenizados) en Colombia. Caldasia, 28(2): 197-215. Montenecourt B.S., Eveleigh D.E. (1977). Semiquantitative plate assay for determination of cellulase production by Trichoderma viride. Applied and Environmental Microbiology, 33(1): 178-183. Montes B., Restrepo A., McEwen J.G. (2003). Nuevos aspectos sobre la clasificación de los hongos y su posible aplicación médica. Biomédica, 23: 213-237. Montgomery H.J., Monrealb C.M., Young J.C., Seifert K.A. (2000 ). Determinination of soil fungal biomass from soil ergosterol analyses. Soil Biology & Biochemistry, 32: 1207±1217. Montoya B.S., Varon L.M., Levin L. (2008a). Effect of culture parameter on the production of the edible mushroom Grifola frondosa (maitake) in tropical weathers. World J. Microbiol. Biotechnol., 24: 1361-1366. Montoya B.S., Varon L.M., Levin L. (2008b). Effect of culture parameter on the production of the edible mushroom Grifola frondosa (maitake) in tropical weathers. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 24: 1361-1366. Montoya B.S., Orrego C.A., Levin L. (2011a). Growth, fruiting and lignocellulolytic enzyme production by the edible mushroom Grifola frondosa (maitake). World Journal of Microbiology and Biotechnology, ISSN 0959-3993: DOI 10.1007/s11274- 11011-10957-11272. Montoya S., Restrepo G.M. (2006). Evaluación de la síntesis de proteína a partir del crecimiento vegetativo de Pleurotus sp. sobre residuos de algarrobo y uva pasa. Revista Universidad de Caldas, 26(1-2): 23-32. Montoya S. (2008). Actividad enzimática, degradación de residuos sólidos orgánicos y generación de biomasa útil por el macromiceto Grifola frondosa.Investigación. Ingeniería Química, Universidad Nacional de Colombia Sede Manizales: Manizales. 95 p. p. Montoya S., Gallego J., Sucerquia A., Pelaez B., Betancourt O., Arias D. (2010). Macromicetos observados en bosques del Departamento de Caldas: su influencia en el equilibrio y la conservación de la biodiversidad. Boletín Científico Centro de Museos de Historia Naural, 14(2): 57-76. Montoya S.B., Restrepo G.M., Tabarez L.A. (2009a). Rendimientos en el cultivo de los hongos Pleurotus ostreatus. Revista de Investigaciones Universidad Católica de Manizales, 14: 16-26. Montoya S.B., Restrepo G.M.F., Tabarez L.A.L. (2009b). Rendimientos en el cultivo de los hongos Pleurotus ostreatus. Revista de Investigaciones Universidad Católica de Manizales, 14: 16-26. Montoya S.B., Orrego C.A., Levin L. (2011b). Modeling Grifola frondosa fungal growth during solid-state fermentation. Engineering in Life Science, 11(316-321). Moon S.H., Park J.M., Chun H.Y., Kim S.J. (2006). Comparisons of physical properties of bacterial cellulose produced in different culture conditions using saccharified food wastes. Biotechnology Bioprocess Engineering, 11: 26-31. Moore D. (1998a). Fungal Morphogenesis. Cambrige University Press: New York, United States of America.
196
Moore D. (1998b). Fungal Morphogenesis. Primera ed Cambrige University Press.: New York. 469 p. p. Moreira M.T., Feijoo G., Lema J.M. (2003). Fungal bioreactors: Applications to white-rot fungi. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology 2: 247-259. Mosier N., Hendrickson R., Ho N., Sedlak M., Ladisch M.R. (2005a). Optimization of pH controlled liquid hot water pretreatment of corn stover. Bioresource Technology, 96: 1986-1993. Mosier N., Wyman C.E., Dale B.D., Elander R.T., Lee Y.Y., Holtzapple M., Ladisch C.M. (2005b). Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass. Bioresource Technology, 96: 673-686. Mouso N., Papinutti L., Forchiassin F. (2003). Efecto combinado del cobre y pH inicial del medio de cultivo sobre la producción de lacasa y manganeso peroxidasa por Stereum hirsutum (Willd) Pers. Revista Iberoamericana de Micología, 20: 176-178. Mukhamedzhanova T.G., Bezborodov A.M. (1982). Effect of nitrogen and carbon sources on lipase accumulation by the fungus Rhizopus oryzae 1414. Mikrobiologia, 18: 16-22. Muller dos Santos M., Souza das Rosa A., Dal’Boit, Mitchell D., Krieger N. (2004). Thermal denaturation: is solid-state fermentation really a good technology for the production of enzymes? Bioresource Technology 93: 261-268. Munoz G.A., Agosin E., Cotoras M., San Martin R., Volpe D. (1995). Comparison of aerial and submerged spore properties for Trichoderma harzianum. FEMS Microbiology Letter, 125: 63-70. Naeem S. (2002). Autotrophic-Hecterotrophic Interactions and their Impacts on Biodiversity and Ecosystem Functioning. En: Functional Consequences of Biodiversity. Princeton University Press,: New Jersy. pp. 96-119. Nakamura K., Yamaguchi Y., Kagota S., Shinozuka K., Kunitomo M. (1999). Activation of in vivo Kupffer cell function by oral administration of Cordyceps sinensis in rats. . Japan Journal Pharmacology, 79: 508-508. Nazareno M.C., Bucsinszky A.M.M., Tournier H.A., Cabello M.N., Arambarri A.M. (2000). Extracellular ABTS-oxidizing activity of autochthonous fungal strains from Argentina in solid medium. Revista Iberoamericana de Micología, 17: 64-68. Nelson N.J. (1944). A photometric adaptation of the Somogyi method for the detrmination of glucose. Journal Biochemistry, 153: 375-380. Nidetzky B., Steiner W., Hayn M., Claeyssens M. (1994). Cellulose hydrolysis by the cellulases from Trichoderma reesei: a new model for synergistic interaction. Bichemistry Journal, 298: 705-710. Nie S.-P., Xie M.-Y. (2011). A review on the isolation and structure of tea polysaccharides and their bioactivities. Food Hydrocolloids, 25: 144-149. Nieto I., Chegwin C. (2010). Influencia del sustrato utilizado para el crecimiento de hongos comestibles sobre sus características nutraceúticas. Revista Colombiana de Biotecnología, 12(1): 169-178. Nieto I.J., Cucaita R.E. (2007). Ácidos grasos, ésteres y esteroles del cuerpo fructífero del hongo Laccaria laccata. Revista Comobiana de Química, 36(3): 277-284. Nieto I.J., Ávila I.M. (2008). Determinación de ácidos grasos y compuestos triterpenoides del cuerpo fructífero de Suillus luteus. Revista Colombiana de Química, 37(3): 45-52. Nieto-Ramirez I.J., Chegwin-Angarita C., Osorio-Zuluaga H.J. (2007). Incorporación de cafeína en el hongo Pleurotus sajor-caju cultivado sobre pulpa de café. Revista Iberoamericana de Micología 24: 72-74. Nigam P., Pandey A., Prabhu K.A. (1987). Cellulase and ligninase production by basidiomycete culture in solid-state fermentation. Biology Wastes, 20: 1-9. Niku-Paavola M., Raaska M., Itavaara M. (1990). Detection of white-rot fungi by non-toxic stain. Mycology and Resource, 94: 27-31. Niladevi K.N., Prema P. (2008). Effect of inducers and process parameters on laccase production by Streptomyces psammoticus and its application in dye decolourization. Bioresource Technology, 99 4583-4589. Nitschke J., Altenbach H.-J., Malolepszy T., Mölleken H. (2011). A new method for the quantification of chitin and chitosan in edible mushrooms. Carbohydrate Research, 346: 1307-1310. Ooi V., Liu F. (2000a). Immunomodulation and anti-cancer activity of polysaccharide-protein complexes. Current Medicine Chemistry, 7: 715-728. Ooi V., Liu F. (2000b). Immunomodulation and anti-cancer activity of polysaccharide-protein complexes. Current Medicinal Chemistry, 7: 715-728. Ooi V.E.C., Liu F. (1999). A review of a farmacological activities of mushroom polysaccharides. International Journal Medicinal Mushrooms, 1: 195-206. Ortiz-Moreno M. (2010). Macromicetos en Zona Rural de Villavicencio. Orinoquía, 14(2): 125-132. Pal M., Calvo A., Terron M.C., Gonzalez A.E. (1995a). Solid-state fermentation of sugarcane bagasse with Flammulina velutipes and Trametes versicolor. World Journal Microbiology Biotechnology, 11: 541-545. Pal M., Calvo A., Terron M.C., Gonzalez A.E. (1995b). Solid-state fermentation of sugarcane bagasse with Flammulina velutipes and Trametes versicolor. World Journal Microbiology and Biotechnology, 11: 541-545. Palonen H., Thomsen A.B., Tenkanen M., Schmidt A.S., Viikari L. (2004). Evaluation of wet oxidation pretreatment for enzymatic hydrolysis of softwood. Applied Biochemistry and Biotechnology, 117: 1-17. Panagiotou G., Kekos D., Macris B., Christakopoulos P. (2003). Production of cellulolytic and xylanolytic enzymes by Fusarium oxysporum grown on corn stover in solid state fermentation. Industrial Crops and Products, 18: 37-45. Pandey A., Soccol C.R., Mitchell D. (2000). New developments in solid state fermentation: I-bioprocesses and products. Process Biochemistry, 35: 1153–1169. Papinutti L. (2010). Effects of nutrients, pH and water potential on exopolysaccharides production by a fungal strain belonging to Ganoderma lucidum complex. Bioresource Technology, 101: 1941-1946.
197
Papinutti V.L., Dorio L.A., Forchiassin F. (2003). Degradación de madera de álamo por Fomes sclerodermeus: Producción de enzimas ligninolíticas en aserrín de álamo y cedro. Revista Iberoamericana de Micología, 20: 16-20. Park J.-P., Kim S.-W., Hwang H.-J., Cho Y.-J., Yun J.-W. (2002a). Stimulatory effect of plant oils and fatty acids on the exo- biopolymer production in Cordyceps militaris. Enzyme and Microbial Technology, 31: 250-255. Park J.P., Kim S.W., Hwang H.J., Cho Y.J., Yun J.W. (2002b). Stimulatory effect of plant oils and fatty acids on the exo- biopolymer production in Cordyceps militaris. Enzyme and Microbial Technology, 31: 250-255. Pasquel A. (2001). Gomas: una aproximación a la Industria de alimentos. Revista Amazónica de Investigación Alimentaria, 1(1): 1-8. Paszczczynski A., Crawford R., Huyn V. (1988). Manganese peroxidase of Phanerochaete chrysosporium purification. Methods enzymology, 161: 264-270. Paszczynski A., Crawford R.L. (1991). Degradation of azo compounds by ligninases from Phanerochaete chrysosporium Involment of veratryl alcohol. Biochemistry Biophysics resources communications, 178: 1056-1063. Patil S., Dayanand A. (2006). Optimization of process for the production of fungal pectinases from deseeded sunXower head in submerged and solid-state conditions. Bioresource Technology, 97: 2340-2344. Pelaez F., Martinez M.J., Martinez A.T. (1995). Screening of 68 species of basidiomycetes for enzymes involved in lignin degradation. Mycology Resources, 99: 37-42. Peña-Serna C., Sierra-Cadavid A., Sáez A., Rojano B.A. (2006). Establecimiento de un medio de cultivo para una cepa nativa de un hongo Poliporal. Revista Colombiana de Biotecnología, 8(001): 5-13. Peña-Venegas C.P., Cardona G.I., Arguelles J.H., Arcos A.L. (2007). Micorrizas Arbusculares del Sur de la Amazonia Colombiana y su Relación con Algunos Factores Fisicoquímicos y Biológicos del Suelo. Acta Amazónica, 37(3): 327-336. Pérez J., Jeffries T.W. (1992). Roles of Manganese and organic acid chelators in regulating lignin degradation and biosynthesis of peroxidases by Phanerochaete chrysosporium. App Environl Microbiol, 58: 2402-2409. Plackett R.L., Burman J.P. (1946). The design of optimum multifactorial experiments. Biometrika, 33: 305-325. Plassard C., Mousain D., Salsac L. (1982). Estimation of mycelial growth of basidiomycetes by means of chitin determination. Phytochemistry, 21: 345-348. Pointing S.B. (1999). Qualitative methods for the determination of lignocellulolytic enzyme production by tropical fungi. Fungal Diversity, 2: 17-33. Pointing S.B. (2001). Feasibility of bioremediation by white-rot fungi. Applied Microbiology Biotechnology, 57: 20-33. Pradeep V., Datta M. (2002). Production of ligninolytic enzymes for decolorization by cocultivation of white-rot fungi Pleurotus ostreatus and Phanerochaete chrysosporium under solid-state fermentation. Applied Biochemistry Biotechnology, 102-103: 109-118. Prosser J.I., Tough A.J. (1991). Growth mechanism and growth kinetics of filamentous microorganisms. Critical Reviews in Biotechnology, 10: 253-274. Quintero J.C., Moreira M.T., Feijoo G., Lema J.M. (2008). Screening of white rot fungal species for their capacity to degrade lindane and other isomers of hexachlorocyclohexane (HCH). Ciencia e Investigación Agraria, 35(2): 159-167. Quintero J.D., Feijoo G.C., Lema J.M. (2006). Producción de enzimas ligninolíticas con hongos basidiomicetos cultivados sobre materiales lignocelulósicos. Revista de la Facultad de química Farmacéutica, 13(2): 61-67. Raghavarao K.S., Ranganathan T.V., Karanth N.G. (2003). Some engineering aspects of solid-state fermentation. Biochemical Engineering Journal, 13: 127-135. Reddy C.A. (1995). The potential for white-rot fungi in the treatment of pollutants. Current Opinion in Biotechnology, 6: 320- 328. Reddy G.V., Ravindra B.P., Komaraiah P., Roy R.M., Kothari I.L. (2003). Utilization of banana waste for the production of lignolytic and cellulolytic enzymes by solid substrate fermentation using two Pleurotus species (P. ostreatus and P. sajor- caju). Process Biochemistry, 38: 1457-1462. Reid I.D. (1995). Biodegradation of lignin. Canadian Journal of Botany, 73: S1011-S1018. Rivera A., Laverde C.M., Ríos-Motta J., Nieto I.J., Osorio H.J. (2005a). Dehidroergosterol: un artefacto generado durante el proceso de extracción de esteroles en el hongo Pleurotus sajor-caju. Revista Colombiana de Química, 34(2): 117-125. Rivera A., Osorio H.J., Ríos-Motta J., Nieto I.J., Laverde C.M. (2005b). Dehidroergosterol: un artefacto generado durante el proceso de extracción de esteroles en el hongo Pleurotus sajor-caju. Revista Colombiana de Química, 34(2): 117-125. Rocha O., Nobre C., Dominguez A., Torres A., Faria N., Rodrigues L., Teixeira J.A., Ferreira E.C., Rocha I. (2009). A Dynamical Model for the rmentative production of fructooligosaccharides, in 10th International Symposium on Process Systems Engineering - PSE2009
, Rita Maria de Brito Alves C.A.O.d.N.a.E.C.B.J.E., Editor© 2009 Elsevier B.V. All rights reserved: Braga, Portugal. 1827-1833. Rodríguez I., Piñeros Y. (2007). Producción de complejos enzimáticos celulolíticos mediante el cultivo en fase sólida de Trichoderma sp. sobre los racimos vacíos de palma de aceite como sustrato. Revista de la Facultad de química farmacéutica, 14(2): 35-42. Rodríguez J., Ferraz A., Mello M.P. (2003). Role of metals in wood biodegradation. En: Wood Deterioration and Preservation - Advances in our Changing World. Series A.S. (Ed.). Goodell, B., Nicholas, D.D., Schultz, T.P. (Eds.): Washington. pp. 154- 174. Rodríguez N. (2003a). Aprovechamiento de los residuos sólidos generados en el cultivo e industrialización del café para la producción de hongos comestibles y medicinales (Utilization of solid wastes generated during the cultivation and
198
industrialization of coffee for production of edible and medicinal mushrooms, in Spanish).Ph.D. Thesis. Universidad Politécnica de Valencia: Valencia. 140 p. Rodríguez N. (2003b). Aprovechamiento de los residuos sólidos generados en el cultivo e industrialización del café para la producción de hongos comestibles y medicinales.Postgrado. Universidad Politécnica de Valencia: Valencia. 140 p. Rodríguez N., Jaramillo C. (2005a). Cultivo de hongos comestibles del género Pleurotus sobre residuos agrícolas de la zona cafetera. Centro Nacional de Investigaciones de Café, 23: 34-40. Rodríguez N., Jaramillo C. (2005b). Cultivo de hongos comestibles del género Pleurotus spp. sobre residuos agrícolas de la zona cafetera. Boletín Técnico Cenicafé, 27: 54 pp. Rodríguez N., Jaramillo C. (2005c). Cultivo de hongos comestibles del género Pleurotus sobre residuos agrícolas de la zona cafetera. Boletín Técnico Cenicafé, 23: 34-40. Rodríguez V.N. (1993). El cultivo de hongos comestibles sobre desechos agroindustriales, Cenicafé: Chinchiná. 1-2 p. Rodriguez-Couto S., Toca-Herrera J.L. (2007). Laccase production at reactor scale by filamentous fungi. Biotechnology advances, 25: 558.569. Rodríguez-Couto S., Sanromán M.A. (2005). Application of solid-state fermentation to ligninolytic enzyme production. Biochemical Engineering Journal 22 211-219. Rodríguez-Couto S., Toca-Herrera J.L. (2007). Laccase production at reactor scale by filamentous fungi. Biotechnology Advances, 25: 558-569. Rodríguez-Palenzuela P., García J., de Blas C., Madrid. D.B.U.P.d., Madrid. D.d.P.A.U.P.d. (2000). XIV Curso de Especialización: Avances en nutrición y alimentación animal. En: Fibra soluble y su implicación en nutrición animal: Enzimas y probióticos. Madrid. pp. 17p. Rosale E., Couto S.R., Sanromán A. (2007). Increased laccase production by Trametes hirsuta grown on ground orange peelings. Enzyme and Microbial Technology, 40 1286-1290. Ruíz A., Varela A. (2006). Nuevos registros de Aphyllophorales (basidiomicota) en bosque montano húmedo y de niebla de Colombia. Caldasia 28(2): 259-266. Russell R., Paterson M. (2008). Cordyceps – A traditional Chinese medicine and another fungal therapeutic biofactory. Phytochemistry, 69: 1469-1495. Sáez A., Florez L., Cadavid A. (2002). Caracterización de una cepa nativa de Aspergillus niger y evaluación de la producción de ácido cítrico. Revista Universidad EAFIT, (128): 33-42. Sánchez O.J., Cardona C.A. (2007). Producción de Alcohol Carburante: Una Alternativa para el Desarrollo Agroindustrial. Universidad Nacional de Colombia: Manizales. 386 p. Sánchez O.J., Cardona C.A. (2008). Trends in biotechnological production of fuel ethanol from different feedstocks. Bioresource Technology, 99: 5270-5295. Sangsurasak P., Nopharatana M., Mitchell D. (1996). Mathematical modeling of the growth of filamentous fungi in solid-state fermentation. Journal Science Industrial Resources 55: 333-342. Sarangi I., Ghosh D., Bhutia S., Mallick S., Maiti T. (2006). Anti-tumor and immunomodulating effects of Pleurotus ostreatus mycelia-derived proteoglycans. International Immunopharmacology, 6: 1287-1297. Sarikaya A., Ladisch M. (1997). An Unstructured Mathematical Model for Growth of Pleurotus ostreatus on Lignocellulosic Material in Solid-State Fermentation Systems. Applied Biochemistry and Biotechnology, 62: 72-85. Schulze B., Wubbolts M.G. (1999). Biocatalysis for industrial production of fine chemicals. Chemical Biotechnology, 10: 609- 615. Shen Q., Royse D. (2002). Effects of genotipes of maitake (Grifola frondosa) on biological efficiency, quality and crop cycle time. Applied Microbiology Biotechnology, 58: 178-182. Shi J., Sharm-Shivappa R.R., Chinn M., Howell N. (2009). Effect of microbial pretreatment one nzymatic hydrolysis and fermentation of cotton stalks for ethanol production. Biomass and Bioenergy, 33: 88-96. Shi J., Sharma-Shivappa R.R., Chinn M.S. (2012). Interactions between fungal growth, substrate utilization and enzyme production during shallow stationary cultivation of Phanerochaete chrysosporium on cotton stalks. Enzyme and Microbial Technology, 51: 1- 8. Shinners-Carnelley T.C., Szpacenko A., Tewari J.P., Palcic M.M., Cho N.S. (2002). Enzymatic activity of Cyathus olla during solid state fermentation of canola roots. Phytoprotection 83: 31-40. Shu C., Lung M. (2003). Effect of pH on the production and molecular weight distribution of exopolysaccharide by Antrodia camphorata in batch cultures
. Process Biochemestry, 39: 931-937. Silva E.M., Martins S.F., Milagres A.M.F. (2008). Extraction of manganese peroxidase produced by Lentinula edodes. Bioresource Technology, 99: 2471-2475. Soares G., De Amorin M., Costa-Ferreira M. (2001). Use of laccase together with redox mediators to decolourize Remazol Brilliant Blue R. Journal Biotechnology, 89: 123-129. Sohail M., Siddiqi R., Ahmad A., Khan S.A. (2009). Cellulase production from Aspergillus niger MS82: effect of temperature and pH. New Biotecchnology, 25(6): 437-441. Solomon E.I., Sundaram U.M., Machonkin T.E. (1997). Multicopper oxidases and oxygenases. Chemical Reviews, 96: 2563- 2605. Somogyi M. (1945). A new reagent for the determination of sugars. Journal Biology Chemistry, 160: 61-73.
199
Sriyudthsak K., Shiraishi F. (2010). Investigation of the performance of fermentation processes using a mathematical model including effects of metabolic bottleneck and toxic product on cells. Mathematical Biosciences, 228: 1-9. Stames P. (1993). Growing gourmet and medicinal fungi Ten Speed Press and Mycomedia: Hong Kong. 456 p. p. Stead P., Marley H., Mahmoudian M., Webb G., Noble D., Ip Y., Piga E., Rossi T., Roberts S. (1996). Efficient procedures for the largescale preparation of (1S,2S)-trans-2-methoxycyclohexanol, a key chiral intermediate in the synthesis of tricyclic b- lactam antibiotics. Dawson MJ: Tetrahedron - Asymmetry, 7: 2247-2250. Sun Y., Cheng J. (2002). Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a review. Bioresource Technology, 83: 1- 11. Švagelj M., Berovič M., Boh B., Menard A., Simčič S., Wraber B. (2008). Solid-state cultivation of Grifola frondosa (Dicks: Fr) S.F. Gray biomass and immunostimulatory effects of fungal intra- and extracellular β-polysaccharides. New Biotechnology, 25: 150-156. Takano M., Nishida, A., Nakamura, M. (2001). Screening of wood-rotting fungi for kraft pulp bleaching by the Poly R decolorization test and biobleaching of hardwood kraft pulp by Phanerochaete crassa WD 1694. Journal of Wood Science, 47: 63-68. Takasaki Y. (1976). Production and utilization of B-amylase and pullulanase from B. cereus var. mycoides. Agriculture Biology Chemistry, 40: 1515-1525. Tang Y.-J., Zhu L.-W., Li H.-M., Li D.-S. (2007). Submerged Culture of Mushrooms in Bioreactors – Challenges, Current State- of-the-Art, and Future Prospects. Food Technology and Biotechnology, 45(3): 221-229. Tang Y.J., Zhong J.J. (2002). Exopolysaccharide biosynthesis and related enzyme activities of the medicinal fungus, Ganoderma lucidum, grown on lactose in a bioreactor. Biotechnology Letters, 24: 1023-1026. Tao Y., Zhang L., Cheung P. (2006). Physicochemical properties and antitumor activities of watersoluble native and sulfated hyperbranched mushroom polysaccharides. Carbohydrates Resources, 341: 2261-2269. Tavares A., Coelho M., Coutinho J., Xavier A. (2005). Laccase improvement in submerged cultivation: induced production and kinetic modelling. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 80: 669-676. Tengerdy R.P., Szakacs G. (2003). Bioconversion of lignocellulose in solid substrate fermentation. Biochemical Engineering Journal, 13: 169-179. Thurston C. (1994). The structure and function of fungal laccases. Microbiology-UK, 140: 19-26. Tišma M., Sudar M., Raĉki S., Zelic B. (2010). Mathematical model for Trametes versicolor growth in submerged cultivation. Bioprocess and Biosystems Engineering, 33: 749-758. Tlecutil-Beristain S., Sánchez C., Loera O., Robson G., Díaz-Godínez G. (112). Laccases of Pleurotus ostreatus observed at different phases of its growth in submerged fermentation: production of a novel laccase isoform. Micologycal Research 1080 - 1084. Tobin J.M., White C., Gadd C.M. (1994). Metal accumulation by fungi—applications in environmental biotechnology. Journal of Industrial and Microbiology 13: 126-130. Tolan J., Olson D., Dines R. (1996). Survey of mill usage of xylanase. En: Enzymes for pulp and paper processing (Jeffries, TW. Viikari L). Society A.C. (Ed.). Washington DC. pp. 25-35. Tomme P.H., Van Tilbeurgh G., Petterson J., Van Damme J., Vanderker-Ckhove J., Knowles T., Teeri, Claeyssens M. (1988). Studies of cellulolityc system of Trichoderma reesei QM 9414. Analysis of domain function in two cellobiohydrolases by limited proteolysis. Europe Journal Biochemestry, 170: 575-581. Tsiklauri N.D., Khardziani T.S., Kachlishvili E.T., Elisashvili V.I. (1999). Cellulase and xylanase activities of higher basidiomycetes during bioconversion of plant raw materials depending on the carbon source in the nutrient medium. Applied Biochemistry and Microbiology, 35: 291-295. Tsukagoshi S., Hashimoto Y., Fujii G., Kobayashi H., Nomoto K., Orita K. (1984). Krestin (PSK). Cancer Treatment review, 11: 131-155. Tuor U., Wariishi H., Schoemaker H., Gold M.H. (1992). Oxidation of phenolic arylglycerol beta-aryl ether lignin model compounds by manganese peroxidase from Phanerochete chrysosporium: oxidative cleavage of an alpha-carbonyl mode compoundl. Biochemistry, 31: 4986-4995. Tychanowicz G.K., Zilly A., Marques de Souza C.G., Peralta R.M. (2004). Decolourisation of industrial dyes by solid-state cultures of Pleurotus pulmonarius. Process Biochemistry, 39: 855-859. Ünyayar A., Sik S. (1998). Phanerochaete chrysosporium and Funalia trogii for the degradation of cotton stalk and their laccase, peroxidase, ligninase and cellulase enzyme activities under semi-solid state conditions. Turkish Jornal Biology, 22: 287-298. Uribe-López A.M. (1983). Hongos comestibles: otro producto de las plantaciones de coníferas no explotado en Colombia [Agaricales, Aphyllophorales, Lycoperdales, Pezizales]. ed. Agronomía F.d. Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín: Medellín (Colombia). 73 p. Valbuena D.C., Alzate C.J. (2007). Evaluación de la patogenicidad de los hongos Bauveria basiana y Metarhizium anisopliae en el control de la garrapata del ganado Rhipicephalus micraplus en su fase parasítica en su estado larval y ninfal.Trabajo de grado. Microbiología Agrícola y Veterinaria, Javeriana: Bogotá. 144 p. p. Van de Lagemaat J., Pyle D.L. (2005). Modelling the uptake and growth kinetics of Penicillium glabrum in a tannic acid- containing solid-state fermentation for tannase production. Process Biochemistry, 40: 1773-1782. Vares T., Kalsi M., Hatakka A. (1995). Lignin peroxidases, manganese peroxidases and other ligninolytic enzymes produced by Phlebia radiata during solid state fermentation of wheat straw. Applied and Environment Microbiology 61: 3515-3520.
200
Vasco-Palacios A.M., Franco-Molano A.E., López-Quintero C.A., Bohechout T. (2005). Macromicetes (ascomicota, basidiomicota) de la región del medio Caquetá, departamentos de Caquetá y Amazonas (Colombia). Biota Colombiana, 6(1): 127-140. Vasic-Racki D., Kragl U., Liese A. (2003). Benefits of enzyme kinetics modelling. Chemical and Biochemical Engineering Quarterly 17: 7-18. Vera D.F., Pérez H., Valencia H. (2002). Aislamiento de hongos solubilizadores de fosfatos de la rizosfera de arazá (Eugenia stipitata, Myrtaceae). Acta Biológica Colombiana 7(1): 33-39. Vetter J. (2007). Chitin content of cultivated mushrooms Agaricus bisporus, Pleurotus ostreatus and Lentinula edodes. Food Chemistry, 102: 6-9. Viccini G., Mitchell D., Boit S., Gern J., da Rosa A., Costa R. (2001). Analysis of growth kinetic profiles in solid-state fermentation. Food Technology and Biotechnology Advances, 39: 271-294. Visser J., Beldman G., Kusters–van Someran M.A., Voragen A.G.J. (1991). International Conference of Xylans and Xylanases Netherlands: Elsevier. pp. 89-94. Vroemen A.J. (2002). Glucose oxidase. En: Handbook of food enzymology. Witaker J.R., Voragen A.G., Wong D.W.S. (Eds.). Marcel Dekker, INC: New York. pp. 425-432. Vrsalovic Presecki A., Findrik Z., Zelic B. (2006). Modeling of the biotransformation processes. Chemical and Biochemical Engineering Quarterly 20: 227-241. Wade L.G. (1993). Química Orgánica. 2 ed, ed. Educación P. Debra Wechsler: México. 1312 p. Wagner R., Mitchell D.A., Sassaki G.L., Lopes de Almeida A., Berovic M. (2003). Current techniques for the cultivation of Ganoderma lucidum for the production of biomass, ganoderic acid and polysaccharides. Food Technology and Biotechnology, 41: 371-382. Wainwright M. (1988). Metabolic diversity of fungi in relation to growth and mineral cycling in soil—a review. Transactions of the British Society of Mycology, 90: 159-170. Walkley A., Black I. (1934). An estimation of the Degtjareft method for determining of soil organic matter and a proposed modification of chromic acid titration method. Soil Science, 37: 29-38. Wasser S. (2002). Medicinal mushrooms as a source of antitumor and immunomodulating polysaccharides. Applied Microbiology and Biotechnology, 60: 258-274. Wasser S.P., Weis A.L. (1999). Medicinal properties of substances occurring in higher Basidiomycete mushrooms: current perspective (review). International Journal Medicine Mushrooms, 1: 31-62. Weinberg Z.G. (2000). Biotechnology in developing countries: opportunities in solid state fermentation applied in the agricultural industry. Internation Journal of Biotechnology, 2(4): 364-373. Whittaker R.H. (1969). New Concepts of Kingdoms of Organisms. Science, 163: 150-160. Williams E., Todd N., Rayner A. (1981). Propagation and development of fruit bodies of Coriolus versicolor. Transactions of the British Mycological Society, 77: 409-414. Wong D.W.S. (2009). Structure and Action Mechanism of Ligninolytic Enzymes. Applied Biochemestry and Biotechnology, 157: 174-209. Wood T.M., García C.V. (1994). Enzymes and mechanisms involved in microbial cellulolysis. Kluwer Academic publishers: Netherlands. Wu J., Cheung P., Wong K., Huang N. (2004). Studies on submerged fermentation of (Fr.) Singer. Part 2. Effect of carbonto- nitrogen ration of the culture medium on the content and composition of the mycelial dietary fibre. Food Chemistry, 85: 101- 105. Wu J., Ding Z.-Y., Zhang K.-C. (2006). Improvement of exopolysaccharide production by macro-fungus Auricularia auricula in submerged culture. Enzyme and Microbial Technology, 39: 743-749. Wyman C.E., Dale B.E., Elander R.T., Holtzapple M., Ladisch M.R., Lee Y.Y. (2005). Coordinated development of leading biomass pretreatment technologies. Bioresource Technology, 96: 1959-1966. Xiao J.-H., Xiao D.-M., Xiong Q., Liang Z.-Q., Zhong J.J. (2010). Nutritional requirements for the hyperproduction of bioactive exopolysaccharides by submerged fermentation of the edible medicinal fungus Cordyceps taii. Biochemical Engineering Journal, 49(2): 241-249. Xiao J.H., Chen D.X., Wan W.H., Hu X.J., Qi Y., Liang Z.Q. (2006). Enhanced simultaneous the production of mycelia and intracellular polysaccharide in submerged cultivation of Cordyceps jiangxiensis using desirability functions. Process Biochemestry, 41: 1887-1893. Xie J., Sun X., Ren L., Zhang Y.Z., Wu Kung S. (2001). Studies in lignocellulolytic enzymes production and biomass degradation of Pleurotus sp.2 and Trametes gallica in wheat straw cultures. Chemical Engineering Journal and the Biochemical Engineering Journal, 17: 575-578. Xu H., Sun L.-P., Shi Y.Z., Wu Y.W., Zhang B., Zhao D.Q. (2008). Optimization of cultivation conditions for extracellular polysaccharide and mycelium biomass by Morchella esculenta As51620 Biochemical Engineering Journal, 39: 66-73. Yachmenev V., Condon B., Klasson T., Lambert A.J. (2009). Acceleration of the enzymatic hydrolysis of corn stover and sugar cane bagasse celluloses by low intensity uniform ultrasound. Biobased Material Bioenergy, 3: 25-31. Yalin W., Ishurd O., Cuirong S., Yuanjiang P. (2005). Structure analysis and anti-tumor activity of (1→3)-β-D-glucans (cordyglucans) from the mycelia of Cordyceps sinensis. Planta Medica, 71: 381-384.
201
Yang B.-K., Gu Y.-A., Jeong Y.-T., Jeong H., C-H. S. (2007). Chemical characteristics and immune-modulating activities of exo- biopolymers produced by Grifola frondosa during submerged fermentation process. International Journal of Biological Macromolecules, 41: 327-333. Yang F.-C., Ke Y.-F., Kuo S.-S. (2000). Effect of fatty acids on the mycelial growth and polysaccharide formation by Ganoderma lucidum in shake flask cultures. Enzyme and Microbial Technology, 27: 295-301. Zabel R.A., Morrel J.J. (1992a). Decay and its Prevention. Academic Press: San Diego. 534 p. p. Zabel R.A., Morrel J.J. (1992b). Decay and its Prevention. Academic Press: San Diego, California. Zaks A. (2001). Industrial biocatalysis. Chemical Biology, 5: 130-136. Zanchetta P., Lagarde P.N., Guezennec J. (2003). A new bone-healing material: A hyaluronic acid-like bacterial exopolysaccharide. Calcified Tissue International, 72: 74-79. Zapata P., Rojas D., Carlos Fernández C., Ramírez D., Restrepo G., Orjuela V., Arroyave M., Gómez T., Atehortúa L. (2007). Producción de biomasa y exopolisacáridos de Grifola frondosa bajo cultivo sumergido utilizando fuentes de carbono no convencionales. Revista EIA, ISSN 1794-1237, (7): 137-144. Zapata P., Rojas D., Atehortúa L. (2012). Production of Biomass, Polysaccharides, and Ganoderic Acid using Non-conventional Carbon. International Journal of Medicinal Mushrooms, 14(2): 197-203. Zelic B., Vasic Racki D., Wandrey C., Takors R. (2004). Modeling of the pyruvate production with Escherichia coli in a fed- batch bioreactor. Bioprocess and Biosystems Engineering, 26: 249-258. Zhang P., Himmel M.E., Mielenz J.R. (2006a). Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies. Biotechnology Advances 24: 452-481. Zhang Y.-H.P., Himmel M.E., Mielenz J.R. (2006b). Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies. Biotechnology Advances, 24: 452-481. Zhao J., Janse B.J. (1996). Comparison of H2O2-producing enzymes in selected white rot fungi. FEMS Microbiology Letters, 139: 215-221. Zhao J., Koker T., Janse B.J. (1996). Comparative studies of lignin peroxidases and manganese-dependent peroxidases produced by selected white rot fungi in solid media. FEMS Microbiology Letters, 143: 393-399. Zhao X.R., Lin Q., Brookes P.C. (2005). Does soil ergosterol concentration provide a reliable estimate of soil fungal biomass? Soil Biology and Biochemistry, 37: 311-317. Zhong J.J., Tang Y.J. (2004). Submerged cultivation of medicinal mushrooms for production of valuable bioactive metabolites. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 87: 25-59. Zhu S., Wu Y., Yu Z., Wang C., Yu F., Jin S., Ding Y., Chi R., Liao J., Zhang Y. (2006). Comparison of three microvawe/chemical pretreatment processes for enzymaric hydrolyisis of rice straw. Biosystem Engineering, 93: 279-283. Zhuang O., Mizuno T. (1999). Biological responses from Grifola frondosa (Dick.:Fr.) S.F. Gray-Maitake (Aphyllophoromycetideae). Internation Journal medicinal mushrooms, 1: 317-324.
202