MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká Fakulta REVÍZIA

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta

Natália MURÁRIKOVÁ

REVÍZIA TAXONOMICKÉHO POSTAVENIA MODELOVÝCH SKUPÍN DRUHOV ČEĽADE TACHINIDAE (DIPTERA), rekonštrukcia ich fylogenézy pomocou analýzy morfologických znakov a molekulárno-genetických metód

Dizertačná práca

Školiteľ: Prof. RNDr. Jaromír Vaňhara, CSc. Brno 2010

Bibliografická identifikácia

Meno, priezvisko autora: Natália Muráriková

Názov dizertačnej práce: Revízia taxonomického postavenia modelových

skupín druhov čeľade Tachinidae (Diptera),

rekonštrukcia ich fylogenézy pomocou analýzy

morfologických znakov a molekulárno-genetických

metód

Názov dizertačnej práce anglicky: Revision of taxonomic position of the model species

groups in the family Tachinidae (Diptera),

reconstruction of their phylogeny on the basis of the

morfological characters and molecular-genetic methods

Študijný program: Biologie

Študijný odbor (smer), kombinácia odborov: 1501V – Zoologie

Školiteľ: Prof. RNDr. Jaromír Vaňhara, CSc.

Rok obhajoby: 2010

Kľúčové slová v slovenčine: Diptera, Tachinidae, Tachina, taxonómia, umelé

neurónové siete (ANN), molekulárno-genetické

metódy, 12S rDNA, 16S rDNA, CO I a CYT B

Kľúčové slová v angličtine: Diptera, Tachinidae, Tachina, taxonomy, Artificial

Neural Networks (ANN), molecular-biology 12S

rDNA, 16S rDNA, CO I a CYT B

„Všetko, čo je podľa prírody, je hodné našej úcty.“

CICERO

Poďakovanie

Na tomto mieste si dovoľujem poďakovať môjmu školiteľovi, Prof. RNDr. Jaromírovi Vaňharovi, CSc., predovšetkým za to, že som mohla byť účastníčkou realizácie jeho novej myšlienky a riešiteľkou novej výskumnej úlohy a následne za jeho usmernenia, pripomienky a rady počas celého obdobia práce na výskume až po písomné zdokumentovanie celého projektu. Zároveň ďakujem aj za možnosť prezentácie výsledkov doma i v zahraničí.

Moje poďakovanie patrí Prof. RNDr. Josefovi Havlovi, DrSc. za odbornú pomoc pri riešení čiastkových úloh.

Dovoľujem si tiež poďakovať Prof. RNDr. Rudolfovi Rozkošnému, DrSc. a Mgr. Igorovi Malenovskému, Ph.D. za ich cenné rady a ochotu pomôcť.

Chcela by som sa poďakovať RNDr. Andrei Tóthovej, Ph.D. a Mgr. et Mgr. Josefovi Bryjovi, Ph.D. za ich ochotu, mnohé rady a pomoc v laboratóriu.

Moja vďaka patrí Mgr. Hane Novotnej a Mgr. Petrovi Bejdákovi za spoluprácu pri riešení projektu a pri príprave publikácie. Vďaka patrí aj Mgr. Veronike Michalkovej, Ph.D. za jej morálnu podporu.

Rada by som tiež poďakovala RNDr. Jiřímu Rozehnalovi za zabezpečenie bezchybného technického zázemia a ďalej každému tomu, kto mi poskytol vzácny materiál pre výskum.

Ďakujem všetkým priateľom a známym, ktorí ma podporovali počas tvorby tejto práce.

Naposledy, ale nie najmenej, sa chcem poďakovať mojej mamičke a môjmu priateľovi Milanovi za to, že so mnou znášali všetky radosti aj úskalia môjho štúdia a za ich morálnu podporu po celú dobu.

Dizertačná práca bola vypracovaná v rámci interného a neskôr externého doktorandského štúdia v Ústavě botaniky a zoologie Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity v Brně. Práca bola finančne podporená doktorským grantom Evolučně ekologická analýza biologických systémů: výzkumné centrum DSP (GA ČR GD524/05/H536, hlavný riešiteľ Prof. RNDr. Milan Chytrý, DrSc.) a výskumným zámerom Diverzita biotických společenstev a populací: kauzální analýza variability v prostoru a čase (Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy ČR, MSM 0021622416, hlavný riešiteľ Prof. RNDr. Milan Chytrý, DrSc.).

Prehlásenie o autorskom podiele

Všetky merania a analýzy v rámci metódy umelých neurónových sietí som spracovala samostatne a všetci spoluautori molekulárnych analýz a štúdia samčieho postabdomenu sú uvedení v prílohách a v zozname literatúry. Zároveň uvádzam, že som v značnej miere pracovala s vypožičaným materiálom.

V Brne dňa ......

Natália Muráriková

Abstrakt

REVÍZIA TAXONOMICKÉHO POSTAVENIA MODELOVÝCH SKUPÍN DRUHOV ČEĽADE TACHINIDAE (DIPTERA), rekonštrukcia ich fylogenézy pomocou analýzy morfologických znakov a molekulárno-genetických metód

Natália Muráriková

Determinácia druhov čeľade Tachinidae (Diptera) je v súčasnej dobe trvale riešeným problémom. V západopalaearktickej oblasti je doteraz známych 12 druhov rodu Tachina a ďalšie taxonomické úrovne sú neustále spochybňované. Tento problém je v práci paralelne analyzovaný tromi rozdielnymi metódami – umelými neurónovými sieťami (ANN), analýzou molekulárnych DNA markerov – 12S, 16S rDNA, CO I a CYT B uvedených druhov a metódami porovnávacej morfológie (štúdium samčieho postabdomenu). Všetky tri prístupy riešia taxonomické problémy s rovnakými výsledkami v nasledujúcich piatich prípadoch: Kauza 1) štyri v súčasnosti uznávané podrody rodu Tachina boli potvrdené a opis nového podrodu bol odporučený; Kauza 2) platnosť nových boreo-alpínnych druhov (sp.n.) sa potvrdila; Kauza 3) skôr predpokladaný výskyt druhu

T. casta (Rondani, 1859) v strednej Európe nebol potvrdený; Kauza 4) západopalaearktické jedince T. nupta (Rondani, 1859) boli kontrastované s východopalaearktickými vzorkami z Japonska, predpokladajúcimi platný druh, ktorý nie je identický so stredoeurópskymi exemplármi; v prípade T. nupta je potrebné ďalšie podrobné štúdium; Kauza 5) T. nigrohirta (Stein, 1924), v doterajšej kategorizácii považovaná za synonymum T. ursiny (Meigen, 1824), bola potvrdená ako platný druh. Toto súbežné použitie troch alternatívnych metód umožnil princíp „polyfázovej taxonómie“, ktorý bol testovaný a overený pomocou samostatných výsledkov. Prvýkrát boli využitím metódy ANN v taxonómii odôvodnené hodnoty dvoch nematematických metód (molekulárnej a morfologickej).

Kľúčové slová: Diptera, Tachinidae, Tachina, taxonómia, umelé neurónové siete (ANN), molekulárno-genetické metódy, 12S rDNA, 16S rDNA, CO I a CYT B

Abstract

REVISION OF TAXONOMIC POSITION OF THE MODEL SPECIES GROUPS IN THE FAMILY TACHINIDAE (DIPTERA), reconstruction of their phylogeny on the basis of the morfological characters and molecular-genetic methods

Natália Muráriková

Determination of the species of the family Tachinidae (Diptera) is currently persisting problem solved. In West Palaearktic area is known 12 species of the genus Tachina and other taxonomic levels are constantly questioned. This problem is analyzed by three different paralell methods in these study – artificial neural networks (ANN), molecular analysis of DNA markers – 12S, 16S rDNA, CO I and CYT B of that species and by methods of comparative morphology (study of male postabdomen). All three approaches solve the taxonomic problems with the same results in the following five cases: Case 1) four currently recognized subgenera of the genus Tachina were confirmed and the description of a new subgenus was recommended; Case 2) the validity of the new boreo-alpine species (sp.n.) was confirmed; Case 3) before expected occurrence of T. casta (Rondani, 1859) in Central Europe was not confirmed; The Case 4) the individuals of West Palaearctic T. nupta (RONDANI 1859) were confronted with East Palaearctic samples from Japan, expecting a valid species, which is not identical with the Central European specimens, in the case of T. nupta needs further detailed study; Case 5) T. nigrohirta (Stein, 1924), the categorization of hitherto considered as synonymous with T. ursina (Meigen, 1824), was confirmed as a valid species. This simultaneous use of three alternative methods would enable the principle of „polyphase taxonomy”, which has been tested and certified by independent results. The valuables of two non-mathematical methods (molecular and morphological) were well-founded through using of ANN methodology for the first time.

Key words: Diptera, Tachinidae, Tachina, taxonomy, Artificial Neural Networks (ANN), molecular-biology, 12S rDNA, 16S rDNA, CO I a CYT B

Obsah

1 Úvod ...... 10 1.1 Umelé neurónové siete ...... 11 1.2 Molekulárno-genetické analýzy v rade Diptera ...... 14 1.3 Kladistika ...... 18 1.4 Polyfázová taxonómia...... 20 1.5 Výber problematických taxónov pre naše štúdium ...... 20 1.5.1 Taxonomické problémy v rode Tachina ...... 22 1.5.2 História taxonomického zaradenia analyzovaných zástupcov rodu Tachina ...... 22 2 Ciele práce ...... 24 3 Materiál a metódy ...... 25 3.1 Materiál ...... 25 3.1.1 Výber taxónov ...... 25 3.1.2 Početnosť materiálu ...... 25 3.1.3 Výber morfologických znakov ...... 26 3.1.4 Výber DNA-markerov ...... 31 3.2 Metódy ...... 31 3.2.1 Umelé neurónové siete ...... 31 3.2.2 Molekulárno-genetická analýza ...... 35 3.2.3 Kladistika ...... 40 4 Výsledky ...... 41 4.1 Kauza 1 ...... 41 4.1.1 Umelé neurónové siete ...... 41 4.1.2 Molekulárno-genetická analýza ...... 42 4.1.3 Analýza samčieho postabdomenu ...... 43 4.1.4 Diskusia ku kauze 1 ...... 43 4.2 Kauza 2 ...... 43 4.2.1 Umelé neurónové siete ...... 43 4.2.2 Molekulárno-genetická analýza ...... 44 4.2.3 Analýza samčieho postabdomenu ...... 44 4.2.4 Diskusia ku kauze 2 ...... 44 4.3 Kauza 3 ...... 45 4.3.1 Umelé neurónové siete ...... 46 4.3.2 Molekulárno-genetická analýza ...... 46 4.3.3 Analýza samčieho postabdomenu ...... 47 4.3.4 Diskusia ku kauze 3 ...... 47 4.4 Kauza 4 ...... 47 4.4.1 Umelé neurónové siete ...... 47 4.4.2 Molekulárno-genetická analýza ...... 48 4.4.3 Analýza samčieho postabdomenu ...... 49 4.4.4 Diskusia ku kauze 4 ...... 49 4.5 Kauza 5 ...... 50 4.5.1 Umelé neurónové siete ...... 50 4.5.2 Molekulárno-genetická analýza ...... 51 4.5.3 Analýza samčieho postabdomenu ...... 51 4.5.4 Diskusia ku kauze 5 ...... 51 5 Záverečná diskusia ...... 55 6 Záver ...... 60 7 Zoznam použitej literatúry ...... 61 8 Zoznam tabuliek ...... 73 9 Zoznam obrázkov ...... 74 Prílohy ...... 76

Úvod

1 Úvod

Determinácia živočíšnych druhov a ich systematická klasifikácia predstavovali vo vede a výskume vždy veľký problém. Neustále sú hľadané nové metódy a formy, ako tento proces zjednodušiť a zrýchliť. Správna identifikácia druhov nie je vždy jednoduchá a preto využitie klasických dichotomických kľúčov s morfologickými znakmi, určenými len autorom kľúča, na identifikáciu živočíšnych druhov nepostačujú (CLARK 2003). Pre transformáciu taxonomických procesov je nevyhnutné zvýšiť produktivitu identifikácie biologickej diverzity, vrátane opisu nových druhov, s využitím nových nástrojov (napr. MILLER 2007,

LA SALLE et al. 2009). Výsledkom následného využitia nových prístupov s použitím paralelných alternatívnych metód by mohol byť polo- alebo plne automatizovaný proces identifikácie. Medzi doteraz známe nástroje patria napríklad rôzne digitálne kľúče

(CRANSTON 2005). Taxonomické problémy umožňuje riešiť molekulárna biológia, založená na štúdiu bunkových biologických procesov na úrovni molekúl, napríklad prostredníctvom sekvencovania DNA, použitím polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) a ďalších metód a techník. Využitie molekulárnych dát v komplexe s klasickou taxonómiou a morfológiou, ktorá ani v dnešnej dobe nestráca svoj význam, umožňuje riešiť celý rad zložitých fylogenetických, taxonomických a populačno-genetických otázok. Medzi súčasné moderné metódy determinácie patria umelé neurónové siete (ANN), metodicky postavené na využívaní princípu umelej inteligencie (WEEKS & GASTON 1997,

VAŇHARA et al. 2007, MACLEOD 2008, FEDOR et al. 2008, 2009, VAŇHARA et al. 2010). Táto vysokorýchlostná metóda je schopná riešiť problémy z jednej sady vzoriek (BISHOP 1994) a je veľmi významná v tom, že pomocou nej je možné po natrénovaní vykonávať veľmi rýchlu determináciu a spoľahlivo indikovať tak napr. hospodársky významné škodce, alebo dokonca i nové druhy pre vedu (CHESMORE 2001). Hľadanie nových determinačných nástrojov sťažuje aj nedostatok odbornej literatúry a porovnávacích zbierok najmä pri málo preskúmaných a vzácnych druhoch

(WEEKS & GASTON 1997) a problémom zostáva aj nedostatok špecialistov na tieto druhy

živočíchov (WEEKS et al. 1997). V mojej práci sa venujem analýze problematických taxónov z radu Diptera. Ťažiskovou metódou, použitou vo výskume, je metóda umelých neurónových sietí. Výsledky

Úvod

porovnávam s ďalšími zisteniami, získanými metódami molekulárnej biológie a morfologickou metódou – kladistikou.

1.1 Umelé neurónové siete

Umelé neurónové siete (ANN, artificial neural network) predstavujú v súčasnosti revolučnú metódu pri spracovávaní rozsiahlych a komplexných množín dát, ktoré by boli štandardnými výpočtovými alebo inými štatistickými metódami neriešiteľné. Prvú neurónovú sieť popísal v roku 1957 psychológ Frank Rosenblatt. Bola nazvaná Perceptron a jej podstatou bolo modelovanie postupu činnosti ľudského mozgu. Objav však bol nedokonalý a v tej dobe sa ešte neuvažovalo o jeho využití ako samostatného nástroja, a preto upadol do zabudnutia. Záujem vzrástol až o niekoľko desaťročí pri búrlivom nástupe výpočtovej techniky vypracovaním nových modelov ANN. Umelé neurónové siete majú obrovský potenciál a využívajú sa v mnohých oblastiach na riešenie komplexných a zložitých úloh, napr. v biológii, chémii, biochémii, mikrobiológii, ekológii, hydrobiológii, entomológii a dokonca aj pri policajných vyšetrovacích metódach. Využitie ANN predstavuje obrovskú úsporu času a to umožňuje riešiť dané problémy rýchlejšie a jednoduchšie. V taxonómii je využitie ANN pomerne nové, ale metóda zaznamenáva veľké úspechy práve preto, že je veľmi presná a rýchla. Umelé neurónové siete sú schopné analyzovať a triediť aj obrazce, preto sú využiteľné pri riešení taxonomických a fylogenetických problémov organizmov. ANN predstavujú aj výpočtové základy automatického rozpoznávania druhov v systéme (WEEKS & GASTON 1997,

MACLEOD et al. 2007, MACLEOD 2008). Jednou z ich výhod ako výpočtovej metódy je, že môžu vyhodnotiť rôzne druhy informácií pomocou vstupných dát, napr. kvalitatívne a kvantitatívne (napr. morfometrické) morfologické znaky, transformovať digitálne obrázky a pod. Technológia ANN je schopná vyhodnotiť obrovské množstvá dát, ktoré by mohli tvoriť stabilný základ pre dobrý a spoľahlivý systém identifikácie biodiverzity

(VANDAMME et al. 1996). Vo svete sú už známe výsledky úspešného využitia ANN pri determinácii rôznych živočíšnych skupín.

Úvod

CULVERHOUSE et al. (1994) analyzovali mikrosnímky 5 druhov z rodu Cymatocylis (Protozoa, Tintinnida) prostredníctvom ANN s úspešnosťou 82 %, resp. chyba mala hodnotu len 18 %, ak sa použili aj predtým skryté dáta.

GARRAFFONI et al. (2007) rozlišovali pomocou ANN 31 druhov zo 4 podčeľadí Polychaeta. Dáta predstavovalo 24 metrických znakov na 6 háčikoch, z ktorých tri boli vypreparované zo 7. a ďalšie tri zo 16. telového segmentu. Autori rozlíšili skúmané 4 podčeľade na základe tejto metódy.

ANN boli použité aj v chemotaxonómii (HERNÁNDEZ-BORGES et al. 2004). Analyzovalo sa chemické zloženie tela troch druhov prílipiek (Patella) z Kanárskych ostrovov s cieľom rozlíšiť tieto druhy. Pri štúdiu mohla byť využitá spätná väzba (redeterminácia) podľa zachovanej schránky. Optimálny model ANN bol 19:6:3 (1 skrytá vrstva so šiestimi neurónmi). Úspešnosť chemicko-taxonomickej analýzy bola viac ako 98 %. Na báze ANN bolo vyvinutých niekoľko špecifických systémov na spracovanie dát v biológii – ABIS bol vyvinutý pre identifikáciu včiel (FRANCOY et al. 2008) a systém

DAISY (O'NEILL 2007) pre niekoľko skupín hmyzu (napr. mory, čmeliaky, pakomáriky, pavúky, motýle, húsenice atď.). DO et al. (1999), PLATNICK et al. (2005) a RUSSELL et al. (2008) využili automatizovaný identifikačný systém na pavúky – SPIDA – SPecies IDentified Automatically. Systém je založený na analýze digitálnych fotografií samčích pedipalov a samičieho epigya. Do analýzy postačuje mať obrázky veľké len 256 x 256 pixlov, v rôznych stupňoch šedi a zrezané do obdĺžnika. Analýza spracováva informácie, ktoré sú extrahované z obrázkov samčích pedipalov a samičieho epigya a sú zakódované do ANN prostredníctvom vlnovej transformácie. Tím úspešne testoval 121 druhov z 15 rodov austrálskych pavúkov z čeľade Trochanteriidae.

Pomocou ANN ALDRICH et al. (2007) identifikovali 3 druhy a 2 poddruhy z rodu Zootermopsis (Isoptera). Ako vstupné dáta boli použité údaje vlnových dĺžok blízkych infračervenému odrazovému spektru chemického zloženia termitov. Optimálny model ANN bol 125:46:4. Úspešnosť bola vyhodnotená na viac ako 99 %.

CHESMORE (2001) analyzoval zvuky 13 a 25 druhov britských Orthoptera pomocou ANN (2 testy – 1. s vysokosignálnymi druhmi a 2. s druhmi, ktoré mali varírujúci signál). Úspešnosť v teste 13 druhov bola veľmi vysoká, prakticky bez chybnej identifikácie.

CHESMORE (2004) analyzoval zvuky vybraných skupín v troch podobách: jednoduché zvuky, celé spevy a zvuky po dvojsekundových intervaloch. Dospel k výsledku, že pomocou zvukov

Úvod

je možné presne rozpoznať 4 druhy britských Orthoptera v prirodzených podmienkach pod vysokými hranicami interferencie s 99% úspešnosťou. Zvuky 4 druhov britských kobyliek boli analyzované v práci

CHESMORE & OHYA (2004). Výsledky ukázali, že ANN sú schopné nielen na 70–100 % správne identifikovať druhy na základe zvukov, ale sú navyše schopné identifikovať aj iné zvuky v pozadí, ako je vtáčí spev alebo ľudské zvuky.

FEDOR et al. (2008) rozlišovali 18 druhov zo 4 rodov Thysanoptera (Thripidae) na základe 20 znakov, zahrňujúcich 17 morfometrických, 2 kvalitatívne znaky a pohlavie. Optimálna štruktúra ANN bola 20:7:18. Úspešnosť bola 97 %.

WEEKS et al. (1997) analyzovali digitálne fotografie pravých predných krídiel 5 druhov Hymenoptera (Ichneumonidae) z Kostariky. Fotografie boli zmenšené na 100x100 pixelov a spracované tak, že boli zachované skutočné pomery na krídle a tiež žilnatina. Testovaných bolo 175 obrázkov krídiel. Na znázorneniach bola zdôraznená žilnatina a pigmentové vzory. Úspešnosť testu bola vyhodnotená na 94 %.

GEVREY & WORNER (2006) stanovili pomocou ANN celosvetové rozšírenie dvoch škodcov Ceratitis capitata (Diptera, Tephritidae) a Lymantria dispar (Lepidoptera, Lymantriidae) na základe 16 klimatických faktorov. Skúmaných bolo 433 geografických miest s použitím troch dátových súborov pre každého škodcu. Vstupná vrstva obsahovala 16 klimatických charakteristik, skrytá vrstva mala 5 neurónov a výstup bol charakterizovaný buď prítomnosťou, alebo absenciou škodcu. Úspešnosť bola pre C. capitata 95,8 %, 81,5 % a 80,6 % a pre L. dispar 96,8 %, 84,3 % a 81,5 %.

SPARKS et al. (2000) aplikovali ANN aj pri stanovení novej triedy fermentovaných zlúčenín určených na boj proti motýlím škodcom, najmä škodcu na tabaku – Heliothis virescens (Lepidoptera, Noctuidae). Optimálne modely ANN boli 8:8:1, úspešnosť dosiahla hodnotu približne 95 %.

DALE & COLLETT (2001) využili metódu ANN v analýze navigácie hmyzu pri lete.

V dipterológii boli ANN aplikované v čeľadi Culicidae (Diptera). MOORE (1991) hodnotil frekvenciu mávania krídiel u 2 druhov komárov. Metódou ANN identifikovali druhy a pohlavie komárov s 92 % úspešnosťou, optimálna štruktúra ANN bola trojvrstvová (256:127:4).

MARCONDES & BORGES (2000) rozlišovali samce 2 druhov z komplexu druhov Lutzomyia intermedia (Psychodidae). Samice týchto druhov sú zreteľne rozpoznateľné, avšak samce sú morfologicky takmer rovnaké. Ako vstupné dáta boli použité pomery rôznych častí

Úvod

tela samcov, optimálny model ANN mal tri skryté vrstvy s počtom neurónov v skrytých vrstvách deväť (2, 5, 2). Signifikantne rozlíšených bolo 96,6 % jedincov.

PARK & CHUNG (2006) pomocou ANN odhadovali škodcu Thecodiplosis japonensis (Diptera, Cecidomyiidae) v boroviciach na základe ôsmich charakteristík stromov. Boli využité dva typy sietí – supervised neural network (MLP) a unsupervised neural network (SOM). Úspešnosť MLP bola 96 %.

V čeľadi Tachinidae sme v práci VAŇHARA et al. (2007) rozlišovali 3 modelové druhy z rodu Tachina podrod Eudoromyia a 2 druhy z rodu Ectophasia na na základe 17 morfometrických znakov na pravom krídle a tykadle a na základe pohlavia jedincov. Optimálna ANN architektúra bola 17:4:2. Súčasťou práce bolo porovnanie pravého a ľavého krídla pri dvoch druhoch rodu Ectophasia. Optimálna štruktúra ANN bola 38:4:2. Zistilo sa, že pravé a ľavé krídla sú zameniteľné. Úspešnosť varírovala medzi 88–100 %. Uvedenými zisteniami sa preukázalo, že pri využití ANN v taxonómii boli doposiaľ použité rôzne typy znakov, ako sú kvalitatívne znaky, farba štruktúry, prezencia alebo absencia napr. rôznych telových štruktúr (viď Thysanoptera), označenie pohlavia (viď Thysanoptera, Diptera – Culicidae, Tachinidae), rovnako i kvantitatívne znaky, napr. morfometria (viď Polychaeta, Thysanoptera, Diptera – Psychodidae, Tachinidae), chemometria (viď Patella), digitálne záznamy (viď Protozoa, Lycosidae, pavúky – SPIDA- web, Culicidae, Hymenoptera, akustické (viď Orthoptera) a spektrofotometrické snímky (viď Isoptera), ekologické (viď Cecidomyiidae) a klimatické faktory (viď Diptera – Tephritidae).

1.2 Molekulárno-genetické analýzy v rade Diptera

Druhou skupinou metód použitých na rekonštrukciu taxonomického delenia druhov rodu Tachina sú metódy založené na štúdiu buniek na molekulárnej úrovni. V biologickom výskume sa využíva analýza molekulárnych súčastí buniek, najmä DNA a RNA, ktoré sú zdrojmi genetických informácií. Detekciou konkrétnych sekvencií nukleotidov sa vyvíjajú vhodné metódy na využie v praxi, ktorých výslednými nástrojmi sú rôzne molekulárne markery. Táto metóda patrí v súčasnosti k moderným determinačným postupom a je veľmi rožšírená. DNA-markery rozoznávame podľa lokalizácii v bunke jadrové (nukleárne, nDNA) a mitochondriálne (mtDNA). Obidva sú využívané na fylogenetické analýzy.

Úvod

Ako príklad uvediem niektoré z početných štúdií autorov, v ktorých sú použité analýzy rôznych sekvencií a rozličných častí mitochondriálneho génu. Z jadrových sekvencií sú to najmä gény pre rRNA. Okrem nich sa používa viac druhov jadrových génov kódujúcich proteíny. Novšie práce uvádzajú analýzy na základe použitia dlhších sekvencií alebo aj celého mitochondriálneho génu (CAMERON et al. 2007, CASTRO & DOWTON 2007). Tento prístup zvyšuje vzájomnú porovnateľnosť výsledkov a možnosť použitia na širšom rozmedzí taxonomických úrovní.

KRZYWINSKI et al. (2001) sa pokúsili o rekonštrukciu podčeľade Anophelinae (Diptera: Culicidae). Analyzovali dva mitochondriálne gény, cytochróm B (CYT B) a podjednotku ND5 a podjednotku D2 jadrového génu 28S rDNA. Výsledné analýzy sekvencií génu CYT B boli väčšinou v rozpore s platnými taxonomickými vzťahmi a tiež aj s výsledkami ďalších dvoch študovaných génov.

STÅHLS et al. (2003) používali mitochondriálny gén CO I a jadrový 28S rRNA pre fylogenetickú rekonštrukciu Syrphidae a porovnali ich s informáciami na základe morfologických znakov lariev a dospelých. Tie ukázali, že monofýlia podčeľadí Syrphinae a Eristalinae bola podporená. Ďalšie skúmanie vzťahov vo vnútri čeľadí však vyžaduje potrebu výrazného zvýšenia počtu analyzovaných taxónov.

BYBEE et al. (2004) použili v štúdii dva mitochondriálne gény (16S rDNA a CO II) a dva jadrové gény (18S rDNA a 28S rDNA) s cieľom zrekonštruovať fylogenézu čeľade Asilidae a vzťahy medzi čeľaďami Asiloidea. Monofýlia Asilidae bola overená a monofýlia štyroch podčeľadí bola tiež podporená. Ostatné podčeľade sa zdajú byť polyfyletické. Výber uvedených molekulárnych markerov poskytol uspokojivé výsledky.

SAVAGE et al. (2004) analyzovali fylogenetické vzťahy v rode Thricops (Diptera, Muscidae) na základe morfologických znakov v kombinácii s analýzou jadrových a mitochondriálnych génových markerov (white, CO I, tRNA-leucín, CO II). Získané výsledky podporili monofýliu rodu Thricops.

KUTTY et al. (2008) dokázali na základe štyroch mitochondriálnych (12S a 16S rDNA, CO I a CYT B) a štyroch jadrových markerov (18S, 28S rDNA, Ef1a a CAD), že nadčeľaď Muscoidea je parafyletická. Použili k tomu 127 druhov.

ROHÁČEK et al. (2009) urobili kombinovanú analýzu na základe dvoch mitochondriálnych génov – 12S a 16S rDNA a morfologických znakov. Skúmali čeľaď Anthomyzidae a potvrdili monofýliu čeľade.

Úvod

RINDAL et al. (2009) sa zamerali vo svojej štúdii na čeľaď Mycetophilidae. Ako molekulárne markery si vybrali jeden mitochondriálny marker (16S rDNA) a dva jadrové markery (18S, 28S rDNA). Potvrdili monofýliu a ujasnili fylogenetické vzťahy v rámci tejto čeľade.

KEHLMAIER & ASSMANN (2010) študovali podčeľaď Chalarinae z čeľade Pipunculidae. Využili k tomu jeden mitochondriálny gén (CO I) a dva jadrové gény (28S rDNA a ITS2). Dokázali, že vo vnútri podčeľade existuje v rôznych rodoch monofýlia aj polyfýlia.

TÓTHOVÁ et al. (2006) konštatovali v súhrnnej práci, zhrnutej z analýz od rôznych autorov do roku 2004, že neexistuje univerzálny marker použiteľný pre fylogenetické analýzy na rôznych taxonomických úrovniach. Na úrovni druhov boli skoro výlučne použité sekvencie mitochondriálnej DNA (prevažne gény CO I, CO II a 16S rDNA).

Jadrové (nukleárne) DNA-markery (nDNA) Jadrová DNA má na chromozómoch usporiadaný vysoký počet nukleotidov. Diploidný jedinec nesie od každého génu dve kópie, ktoré sa môžu líšiť. Tieto a ďalšie odlišnosti majú vplyv aj na fylogenetickú analýzu. Jadrové markery sú používané na všetkých taxonomických úrovniach. Najčastejšie používanými sú gény 28S rDNA, gény rRNA a tRNA sa vyvíjajú pomerne pomaly, preto sa používajú na vyšších taxonomických úrovniach. Kvalita výstupných hodnôt závisí od viacerých faktorov – napr. keď je DNA extrahovaná zo starších vzoriek hmyzu, pri jadrových génoch môžu vyskytnúť problémy s PCR. Niektorí autori tiež uvádzajú, že markery vyvinuté na báze nDNA často poskytujú sporné vysledky (STIREMAN 2002).

PAWLOWSKI et al. (1996) používa sekvencie jadrového génu 28S DNA na rekonštrukciu fylogenézy Culicomorpha.

Tachinidae: V rámci čeľade Tachinidae vôbec prvú molekulárnu fylogenézu publikovali

VOSSBRINCK & FRIEDMAN (1989). Analyzovali jadrový gén 28S rRNA. Hodnotili vzťahy skupiny Cyclorrhapha a na základe troch jedincov spochybnili monofýliu čeľade Tachinidae. Výsledné analýzy však nevyriešili dôležité fylogenetické otázky.

Úvod

Najrozsiahlejšiu prácu na základe sekvencií DNA v rámci Tachinidae publikoval STIREMAN (2002). Študoval 55 zástupcov, najviac z podčeľade Exoristinae. Ako DNA-markery použil dva jadrové gény: 28S rDNA a EF-1α. Analýzy preukázali monofýliu čeľade, rovnako aj podčeľade Exoristinae, niekteré rody predtým priradené do tejto podčeľade sa však nepotvrdili (Drino, Masiphya, Ceracia). Podobne bola spochybnená monofýlia podčeľadí Tachininae a Phasinae. Na spoľahlivé riešenie sporných skupín a vzťahov v rámci podčeľadí výsledky jeho výskumu nepostačovali.

NIRMALA et al. (2001) zrekonštruovali fylogenetické vzťahy medzi 12 kalyptrátnymi čeľaďami (analyzovaných 16 druhov) s použitím 16S rDNA(mtDNA) a 18S rDNA (nDNA) genetických markerov v štúdii a potvrdili tak monofýliu skupiny Calyptrata a nadčeľade Hippoboscoidea.

STIREMAN (2005) urobil kombinované analýzy s využitím jadrového génu 28S rDNA a EF-1α. pri podčeľadi Exoristinae (Tachinidae). V tejto práci sa však vyskytlo niekoľko nejasností.

TACHI & SHIMA (2010) analyzovali opäť podčeľaď Exoristinae na základe jadrových génov 18S a 28S rDNA a na základe jedného mitochondriálneho 16S rDNA. Podporili monofýliu čeľade Tachinidae a tiež tvrdenie, že táto čeľaď je sesterská k čeľadi

Sarcophagidae. Ďalej zistili, rovnako ako iní autori (STIREMAN 2002), že vzťahy medzi tribusmi sú veľmi podobné.

Mitochondriálne DNA-markery (mtDNA) Mitochondriálny gén je haploidný, tvorí ho kruhová molekula dvojreťazcovej DNA. Táto vlastnosť uľahčuje amplifikáciu pri PCR a zvýhodňuje využitie mtDNA ako fylogenetického markeru vzhľadom k možnosti použitia aj starších vzoriek obsahujúcich často degradovanú DNA. Mitochondriálne markery sa používajú skôr na nižších taxonomických úrovniach. Mitochondriálne markery sú spoľahlivejšie ako jadrové a často sú získané výsledky transparentné s klasickými morfologickými metódami (BECKENBACH & BORKENT 2003).

LUNT et al. (1996) skúmali gén pre cytochróm-c-oxidázu I (CO I). Porovnávali sekvencie niekoľkých zástupcov hmyzu. Tento gén je univerzálne používaný marker pre druhovú determináciu (barcoding).

BERNASCONI et al. (2000) sa pokúsil riešiť fylogenetické vzťahy vnútri Muscoidea na základe mtDNA génov (CO I a II a tRNA-leucín). Na vysokej taxonomickej úrovni

Úvod

Calyptratae-Acalyptratae neboli analýzy vždy úspešné, na strednej úrovni rovnako nebolo možné vyriešenie vzťahov vnútri Muscoidea. Na nižšej taxonomickej úrovni všetkých skúmaných druhov boli potvrdení zástupcovia skupín. Tieto výsledky naznačujú, že použité mtDNA markery sú vhodné pre riešenie fylogenetických vzťahov na nižšej taxonomickej

úrovni (podľa TÓTHOVEJ et al. 2006).

GURYEV et al. (2001) študovali taxonomické problémy rodu Chironomus (Chironomidae). Použili dva mitochondriálne gény, CYT B a CO I. Zistili, že sekvencie oboch génov majú podobné zloženie nukleotidov. Autori potvrdili monofýliu podrodu Chironomus a na základe toho rozdelili druh do 6 skupín. Podrod Camptochironomus bol vyčlenený ako samostatný rod.

BECKENBACH & BORKENT (2003) zrekonštruovali základnú fylogenézu čeľade Ceratopogonidae s využitím sekvencií génu CO II (mtDNA). Výsledky potvrdili vzťahy založené na morfologických znakoch v rámci čeľade.

CAMERON et al. (2007) vo svojej štúdii skúmajú, či je použiteľná celá mitochondriálna DNA na rôznych úrovniach v rámci radu Diptera. Zistili, že použitie celej mtDNA umožňuje rozlíšenie vzťahov v rámci radu v rozmedzí 1–200 mil. rokov. Najväčšie rozdiely zaznamenali na úrovni medzi radmi.

SIMMONS & WELLER (2001) analyzovali sekvencie cytochrómu B (CYT B) rôznych radov hmyzu. Z dvojkrídlych použili zástupcov čeľadí Chironomidae, Culicidae, Psychodidae, Drosophilidae a Tephritidae.

Za účelom druhovej identifikácie sa CO I používa aj v súdnom lekárstve (WELLS et al. 2001) a často ako DNA-marker pre populačné štúdie (WELLS & SPERLING 1999).

Tachinidae: SMITH et al. (2006) objavili pri využití sekvencií CO I niekoľko druhov rodu

Belvosia. Tieto druhy boli potvrdené aj jadrovými sekvenciami ITS 1. V ďalšej štúdii (SMITH et al. 2007) bolo sekvenciami CO I identifikovaných 73 odlišných skupín pri 16 morfologických druhoch čeľade Tachinidae. Autori použili viac ako 2000 jedincov a identifikovali výrazne odlíšené mitochondriálne línie, ktoré oprávnene považujú za samostatné druhy, morfospecies.

1.3 Kladistika

Tretím nástrojom použitým pri riešení postavenia vybraných taxónov čeľade Tachinidae bola jedna z metód porovnávacej morfológie – kladistika. 18

Úvod

Kladistika používa presne definované postupy a je založená na podobnosti vyplývajúcej z genealogických vzťahov medzi taxónmi. Jej cieľom je na základe rozloženia homologických znakov formulovať hypotézy o hierarchických príbuzenských vzťahoch, identifikovať sesterské taxóny a vytvoriť rozvetvujúce sa schémy, kladogramy. Kladistický prístup sa v analýze morfologických znakov začal intenzívnejšie využívať skôr ako analýzy založené na metodicky zložitejšom získavaní molekulárno-genetických dát. Pri rekonštrukcii fylogenézy dvojkrídleho hmyzu so zreteľom na čeľaď Tachinidae boli metódy kladistiky rozpracované niekoľkými autormi. Kladistický prístup v systematike je založený na použití opakovateľných a presne definovaných postupov a metód. Prvý raz ho použil nemecký entomológ W. Hennig, ktorý ho nazýval aj fylogenetická systematika. Výraz kladistika je odvodený od gréckeho slova klados – vetva. Systém využíva podobnosť vyplývajúcu z príbuznosti vzťahov medzi taxónmi. Klasifikuje teda organizmy podľa ich zaradenia v evolučnom strome, nie podľa morfologickej podobnosti. Výsledkom analýzy je strom nazývaný kladogram a jednotlivé vetvy – klady. Pri prenose informácie z kladogramov do klasifikačnej schémy kladistika stavia na tvorbe monofyletických skupín a na zachovaní „sesterských vzťahov“ medzi skupinami. Kladistika predstavuje jeden z často využívaných systémov pre klasifikáciu organizmov. Jedným z hlavných nástrojov tejto metódy v súčasnosti je analýza príbuznosti sekvencií DNA a RNA. Metódu kladistiky použili vo svojich štúdiách viacerí autori. Čeľaďou Tachinidae vo vzťahu k iným – Oestridae, Rhinophoridae, Calliphoridae a Sarcophagidae sa zaoberal PAPE (1992). Analyzoval 50 znakov na dospelcoch, vrátane niekoľkých na samčom a samičom a na postabdomene a tiež znaky v štádiu vajíčka a larvy. Výsledkom sú 4 odlišné hypotézy. V rade Diptera sa štúdiu znakov na tele a na samčom postabdomene venovali

VERBEKE (1962) GRIFFITHS (1972, 1982), MCALPINE (1981), TSCHORSNIG (1985a, 1985b),

TSCHORSNIG & RICHTER (1998) SINCLAIR (2000) a O´HARA (1989, 2002). Táto metóda nie je predmetom mojej bezprostrednej výskumnej úlohy, výsledky zo spoločnej práce (viď NOVOTNÁ et al. 2009) na vybraných skúmaných druhoch sú však relevantné pre riešenie cieľa dizertácie, a preto boli analýzy využité ako východiskový vstup.

Úvod

1.4 Polyfázová taxonómia

Na riešenie taxonomických otázok čeľade Tachinidae som v konečnej fáze hodnotenia výsledkov použila integráciu všetkých troch vybraných metód.

Termín polyfázová taxonómia predstavil pre mikrobiológiu COLWELL (1970), ktorý ako prvý začal používať integráciu rôznych zdrojov dát pre identifikáciu organizmov. Polyfázový prístup berie do úvahy všetky známe fenotypové a genotypové informácie a integruje ich nielen pre účely taxonómie a identifikácie, ale aj pre úplnú vzájomnú validáciu metód a získaných výsledkov. Porovnávala som tri základné analýzy: identifikáciu založenú na ANN, na molekulárnej analýze odvodenej až zo štyroch mitochondriálnych markerov a štruktúry samčieho postabdomenu na rôznych taxonomických úrovniach (viď NOVOTNÁ et al. 2009). Pretože súčasný výskum vyžaduje aj pri iných skupinách živočíchov integrovaný prístup k spoľahlivému riešeniu taxonomických problémov, nachádza polyfázový prístup stále

širšie prijatie. Súbežne s našou publikáciou MURÁRIKOVÁ et al. (2010) bola publikovaná všeobecne poňatá práca SCHLICK-STEINER et al. (2010) zaoberajúca sa tzv. „Integračnou taxonómiou“. Práca zhrňuje 11 možných prístupov pri štúdiu taxonómie a teda aj biodiverzity. Podľa prístupu autorov pokrýva moja dizertácia morfológiu, mitochondriálnu DNA a jadrovú DNA, teda 3 prístupy, úplne však autorom vypadla oblasť matematického vymedzovania možnych taxónov, vrátane využitia ANN.

1.5 Výber problematických taxónov pre naše štúdium

V rade Diptera existuje mnoho taxónov s problémovým rozlišovaním alebo validitou. Takéto taxóny sa vyskytujú vo veľkej miere aj v čeľadi Tachinidae. Z čeľadí dvojkrídlych je Tachinidae počtom druhov jednou z najväčších, ale aj pomerne mladých. Vo svete bolo doteraz opísaných asi 10 000 druhov (O´HARA 2007). Spolu s príbuznými čeľaďami tvorí monofyletickú skupinu Calyptratae. Aktuálny počet druhov je však oveľa väčší, pretože v neotropickom, afrotropickom, orientálnom a austrálskom regióne sa vyskytuje veľké množstvo zatiaľ neopísaných druhov.

V Palaearkte sa vyskytuje asi 1600 druhov a v Európe takmer 880 druhov (TSCHORSNIG &

RICHTER 1998). Tachinologická literatúra, použitelná v dnešnej dobe a týkajúca sa Európy, bola spracovaná v monografiách HERTING (1984) a MESNIL (1966). Kľúč maďarských druhov bystrúš s informáciami o ich biológii spracoval MIHÁLYI (1986). ZIMIN et al. (1970)

Úvod

spracovali kľúč pre európsku časť bývalého ZSSR. Kľúč kuklíc strednej Európy so základnými informáciami o ich biológii a ich hostiteľoch zverejnili TSCHORSNIG &

HERTING (1994), kľúč pre anglické druhy bystrúš s názornými ukážkami znakov spracoval

BELSHAW (1993). Problematika taxonómie čeľade Tachinidae je zložitá. Problémom je veľká habituálna podobnosť na úrovni niektorých rodov a druhov, ktorá sťažuje určovanie jednotlivých druhov. Obmedzujúcim faktorom stále zostáva využívanie klasických morfologických „kľúčových“ znakov. Mnohé znaky nie sú jednoznačné, alebo sa dokonca prekrývajú a čo hlavne, v čeľadi Tachinidae obvykle platí takmer vždy viac znakov súčasne. Uspokojivo nie je doriešená ani samotná validita niektorých rodov, prípadne i vyšších taxonomických úrovní. Larvy všetkých zástupcov čeľade Tachinidae sú parazitoidy. Ich hostiteľom je rôzny hmyz a iné článkonožce (napr. motýle, chrobáky, pavúky, stonožky). Hostitelia väčšiny druhov ešte nie sú zmapovaní, VAŇHARA et al. (2009) uvádzajú hostiteľov u 149 druhov čeľade z doteraz známych 476 v ČR. Pre naše štúdium boli vybrané západopalearktické druhy rodu Tachina, v ktorých sa vyskytuje množstvo taxonomických problémov. Rod Tachina patrí do čeľade Tachinidae, podčeľade Tachininae a tribusu Tachinini

(HERTING & DELY-DRASKOVITS 1993). Zástupcovia rodu Tachina sa nachádzajú z palearktickej, ale aj nearktickej, neotropickej a orientálnej oblasti (O´HARA 2007). Môj výskum sa týka jediného rodu čeľade Tachinidae, ktorý reprezentuje jednu z najväčších a veľmi špecializovaných čeľadí dvojkrídlych entomofágnych parazitov – rodu Tachina.

Tachina MEIGEN (1803) Synonymá: Echinodes Meigen, 1800, Echinomyia Latreille, 1804, Periechusa Gistel, 1848, Pelus Gistel, 1848, Pareudora Wachtl, 1894, Eupeleteria Townsend, 1908, Larvaevora Hendel, 1908, Laufferia Strobl, 1909, Smirnoviola Zimin, 1931, Parasmirnoviola Chao, 1962, Servillia Robineau-Desvoidy, 1830, Echinogaster Lioy, 1864, Eudoromyia Bezzi, 1906

Západopalearktické druhy rodu Tachina: Tachina (Tachina) grossa (Linnaeus, 1758) Tachina (Tachina) magna (Giglio-Tos, 1890) Tachina (Eudoromyia) casta (Rondani, 1859) 21

Úvod

Tachina (Eudoromyia) canariensis (Macquart, 1839) Tachina (Eudoromyia) corsicana Villeneuve, 1931 Tachina (Eudoromyia) fera (Linnaeus, 1761) Tachina (Eudoromyia) magnicornis (Zetterstedt, 1844) Tachina (Eudoromyia) nupta (Rondani, 1859) Tachina (Servillia) lurida (Fabricius, 1781) Tachina (Servillia) ursina Meigen, 1824 Tachina (Servillia) nigrohirta (Stein, 1924) Tachina (Echinogaster) praeceps Meigen, 1824

(HERTING 1984, HERTING & DELY-DRASKOVITS 1993, TSCHORSNIG et al. 2004).

1.5.1 Taxonomické problémy v rode Tachina Znalosť taxonómie a druhových vzťahov v rámci rodu Tachina nebola doteraz dostatočne hlboko preskúmaná. Existencia 45 synoným pre 12 druhov, v súčasnosti považovaných za platnú v západopalearktickej faune, sú výsledkom trvalého stavu neistoty v taxonómii tohto rodu (HERTING 1984, HERTING & DRASKOVITS 1993, TSCHORSNIG et al. 2004). Známe taxonomické problémy rodu Tachina sa týkajú druhov Tachina (Eudoromyia) fera, ďalej len T. fera, Tachina (Eudoromyia) magnicornis, ďalej len T. magnicornis, Tachina (Eudoromyia) nupta, ďalej len T. nupta a Tachina (Servillia) nigrohirta, ďalej len T. nigrohirta. Snaha o doriešenie postavenia sporných druhov bola motivovaná poznámkami v kľúči TSCHORSNIG & HERTING (1994). Tieto taxonomické problémy v literatúre trvale pretrvávajú.

1.5.2 História taxonomického zaradenia analyzovaných zástupcov rodu Tachina Prví opísaní európski zástupcovia dnešného rodu Tachina byli jednotne zaradení do rovnakého rodu Echinomyia Latreille, 1804. Postupom času boli nachádzané nové druhy a rovnako vznikali aj nové názory na ich taxonomickú kategorizáciu, ale aj na zaradenie do existujúceho systému.

Všetky doteraz známe západopalearktické druhy uvádza MESNIL (1966) pod rovnakým rodovým názvom Tachina okrem druhu Tachina nigrohirta, ktorý považuje za synonymum druhu T. ursina. V ďalších publikáciách najmä ruskí autori vyčleňujú druh

T. praeceps do ďalšieho samostatného rodu Pareudora Wachtl, 1894 (ZIMIN et al. 1970 22

Úvod

a ZIMIN & KOLOMIETZ 1984) alebo iní autori do rodu Echinogaster Lioy, 1864 (napr.

ČEPELÁK 1987).

Úplne novú klasifikáciu zavádza nakoniec HERTING (1984), ktorá je doteraz akceptovaná najmä európskymi autormi. Herting zlúčil všetky druhy pod jeden rodový názov Tachina a súčasne zaviedol aj štyri podrody: Tachina, Eudoromyia, Servillia a Echinogaster.

ČEPELÁK (1987) však vo svojej štúdii ešte toto nové zaradenie nerešpektoval. Rozdielne názory publikovali aj ďalší autori – O'HARA et al. (2009), ktorí zrušili podrody. Novú taxonomickú kategóriu na úrovni podrodov však stanovili len u Nowickie.

Ciele práce

2 Ciele práce

1. Pôvod a taxonomická príbuznosť modelového rodu Tachina a jeho systematické poňatie. 2. Štruktúra podrodov, validita druhov a druhová identifikácia pri využití polyfázového prístupu na základe klasickej a progresívnej analýzy morfologických znakov a analýzy molekulárno-genetickými metódami.

Materiál a metódy

3 Materiál a metódy

3.1 Materiál

3.1.1 Výber taxónov Témou práce bolo preštudovať taxonomicky problémové taxóny rodu Tachina. Vymedzená skupina západopalaearktických druhov bola vybraná z dôvodu radu taxonomických problémov vo vnútri zvoleného rodu, ktoré neboli uspokojivo riešené a doriešené viac ako 100 rokov.

3.1.2 Početnosť materiálu V predloženej práci bol využitý materiál imág z územia Českej republiky (CZ), Francúzska (FR), Grécka (EL), Japonska (JP), Nemecka (DE), Talianska (IT), Slovenska (SK), Španielska (ES) a Švédska (SE), Tuniska (TU) a Iránu (IRN). Celkovo bolo molekulárno-genetickými metódami a metódou umelých neurónových sietí (ďalej už len ANN – z angl. Artificial Neural Networks) spracovaných 258 jedincov. Zoznam lokalít a ďalšie informácie (pôvodná determinácia jedincov, pôvod materiálu, pohlavie, dátum, zberateľ, ktoré konkrétne jedince boli spracované v jednotlivých analýzach a výsledok analýz), sú zaznamenané v tab. 10 (na disku CD). Nie všetky jedince, ktoré boli analyzované molekulárno-genetickými metódami, boli analyzované zároveň aj metódou umelých neurónových sietí z dôvodu chýbajúcich znakov (poškodené časti tela jedinca a naopak, pre molekulárne analýzy je nepoužiteľný materiál uložený vo formaldehyde). Jedince boli identifikované pomocou kľúča TSCHORSNIG & HERTING (1994). Pôvod materiálu je podrobne zaznamenaný aj v tab. 1.

Materiál a metódy

Tab.1. Pôvod materiálu.

Zberateľ Miesto uloženia zbierky

Česká zemědělská univerzita, Fakulta Agrobiologie, potravinových a přírodních Miroslav Barták (BAR) zdrojů, Katedra zoologie a rybářství, 165 21 Praha 6 ‐ Suchdol, Česká republika; [email protected]

Christer Bergström (BERG) Säves väg 10, Uppsala, SE‐75263, Sweden; [email protected]

zbierka uložená v Prírodovednom múzeu, Bratislava, Slovensko, čiastočne i u prof. J. Juraj Čepelák (†) (ČEP) Vaňharu

Università degli Studi La Sapienza, Dipartimento di Biologia Animale e del Úomo, Pierfilippo Cerretti (CER) Viale dell´Università 32 00185 Roma, Italy; [email protected]

Japan International Research Center for Agricultural Sciences, Ohwashi, Tsukuba, Ryoko T. Ichiki (ICH) Ibaraki 305‐8686, Japan; [email protected]

Ferenc Mihályi (†) (MIH) National Museum, Budapest, Hungary (spravované prof. László Pappom)

Vladimír Straka (STR) Slovenské národné múzeum, Martin

Staatliches Museum für Naturkunde, Rosenstein 1, 70191 Stuttgart, Germany; Hans‐Peter Tschorsnig (TSCH) tschorsnig.smns@naturkundemuseum‐bw.de

Jaromír Vaňhara (VAŇ) Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Brno

VULH Výzkumný ústav lesního hospodářství a myslivosti, Strnady

Museum für Naturkunde, Leibniz‐Institute for Research on Evolution and Biodiversity Joachim Ziegler (ZIE) at the Humboldt University Berlin, Invalidenstrasse 43, 10115 Berlin, Germany; joachim.ziegler@mfn‐berlin.de

vlastné zbery (N. Muráriková) Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Brno

3.1.3 Výber morfologických znakov Bolo vybraných 14 morfometrických znakov na krídle (dĺžka rôznych krídelných

žiliek alebo časti z nich) a 2 znaky na tykadle (tab. 2, VAŇHARA et al. 2007). Metrické znaky boli merané pomocou okulárového mikrometra v stereomikroskope zn. OLYMPUS SZX 12 a s použitím počítača pomocou programu M.I.S. QuickPhoto Micro Olympus. Krídla a tykadlá, na ktorých som merala znaky v počítači, boli naskôr nasnímané digitálnou kamerou Camedia C-5050 zo stereomikroskopu a uložené ako súbory v počítači. Po otvorení súboru v programe M.I.S. QuickPhoto Micro Olympus boli všetky vzdialenosti ručne merané na monitore počítačovou myšou pomocou nakreslenej priamky vedené od začiatku žilky alebo časti žilky až po koniec rozmeru, ktoré nám udávali ich dĺžku v μm. Rovnako som merala dva rozmery na tykadle (obr. 1).

Materiál a metódy

Vzdialenosti jednotlivých bodov na žilnatine krídla môžu byť v rámci druhu rôzne, ale ich pomer u všetkých jedincov zostáva zachovaný. Namerané hodnoty rôznych znakov pre každý druh tvorili databázu, prostredníctvom ktorej boli identifikované jednotlivé druhy. Fotografované a merané boli pravé krídla a tykadlá. V prípade poškodenia alebo absencie krídiel alebo tykadiel na pravej strane boli vyfotografované a využité ľavé krídla a tykadlá, táto zámena je možná, viď VAŇHARA et al. (2007). Pohlavie bolo použité ako ďalší, 17. znak. Databáza (tab. 9, na disku CD), ktorá obsahovala 227 vzoriek, bola rozdelená do menších sub-databáz (tab. 4, 5, 6, 7, 8) k riešeniu jednotlivých taxonomických problémov. Ďalších 13 špeciálnych slovných znakov bolo pridaných k jednotlivým sub-databázam (okrem základných 17 zdieľaných znakov). S cieľom dosiahnutia vyššej spoľahlivosti sub-databázy, boli všetky poškodené, neúplné alebo atypické exempláre odstránené.

Tab. 2. Zoznam vybraných metrických a slovných znakov pre sub-databázy.

Merané a slovné znaky Číslo znaku Použité skratky (znaky 25‐30 – podľa NOVOTNÁ et al. (2009)

1 cs1 dĺžka kostálnej sekcie cs1 žilky C

2 cs2 dĺžka kostálnej sekcie cs2

3 cs3 dĺžka kostálnej sekcie cs3

4 cs4 dĺžka kostálnej sekcie cs4

5 cs5 dĺžka kostálnej sekcie cs5

6 R1 dĺžka radiálnej žilky R1

7 R2+3 dĺžka radiálnej žilky R2+3

8 R4+5 dĺžka radiálnej žilky R4+5 Mpart1=časť 1 dĺžka bazálnej časti mediálnej žilky – medzi krížovou žilkou bm‐cu a 9 mediálnej žilky M záhybom mediálnej žilky M Mpart2=časť 2 10 dĺžka postangulárnej žilky – mediálna žilka M od jej záhybu až po koniec mediálnej žilky M CuA part= časť žilky 11 1 dĺžka anteriórnej vetvy CuA kubitálnej žilky – časť medzi bm‐cu a dm‐cu CuA1 1 12 dm‐cu dĺžka diskálnej mediálno‐kubitálnej krížovej žilky dm‐cu 13 r‐m dĺžka radiálno‐mediálnej krížovej žilky r‐m 14 bm‐cu dĺžka bazálnej mediálno‐kubitálnej krížovej žilky bm‐cu 15 2nd = 2. šírka 2. tykadlového článku v jeho najširšej časti 16 3rd = 3. šírka 3. tykadlového článku v jeho najširšej časti 17 M, F samec, samica 18 farba predného tarzu: tmavá/žltá/červená Eudoromyia 19 farba postpronota: tmavá/červená Eudoromyia 20 dĺžka samčieho pazúrika porovnaná s dĺžkou 5. prednej tarzoméry, pazúrik

Eudoromyia dlhší: áno/nie 27

Materiál a metódy

Merané a slovné znaky Číslo znaku Použité skratky (znaky 25‐30 – podľa NOVOTNÁ et al. (2009) 21 šírka 4. predposlednej prednej tarzoméry k jej dĺžke pre samice, tarzoméra

Eudoromyia širšia ako dlhšia: áno/nie 22 A1 dĺžka análnej žilky A1 Servillia 23 farba odlesku hrudných chĺpkov: tmavá/bledá Servillia 24 hrúbka apikálních štetín: silné/slabé Servillia 25 syncerkus laterálne: hrubšia proximálna časť dlhšia/kratšia ako úzka distálna

Euroromyia časť, alebo sú nerozlíšiteľné 26 predĺženie syncerku: chýba/prítomné Eudoromyia 27 surstylus: rovný/zreteľne zahnutý k syncerku všetky podrody 28 surstylus: bez/s vonkajším výrezom Eudoromyia 29 apex surstylu: jednoduchý/s dvomi výbežkami všetky podrody 30 bacilliformný sklerit: vrchnejší apikálny výbežok širší/štíhlejší,

všetky podrody zaguľatený/štíhlejší špicatý (obr. 4‐17 e, viď NOVOTNÁ et al. (2009)

ANN výpočet bol vykonaný v programe Trajan Neural Network Simulator, verzia 3.0 D. (TRAJAN Software Ltd 1996-1998, UK). Všetky výpočty boli vykonávané na štandardnom počítači PC s operačným systémom Microsoft Windows XP Professional.

Obr. 1. Krídlo a časť tykadla jedinca z čeľade Tachinidae a vyznačené merané znaky 1–16 a 22. (upravené podľa TSCHORSNIG & HERTING 1994).

Materiál a metódy

Obr. 2. Použité štruktúry na tele zástupcu Tachinidae, pre ANN analýzu – 19. a 24. znak vyznačené červenou farbou (podľa TSCHORSNIG & HERTING 1994); humeral callus=postpronotum; apical bristles=apikálne štetiny.

Obr. 3. Časť nohy (posledné dva články tarzu) s vyznačenými meranými dĺžkami pre ANN – 18. znak – na obr. časť tarzu, 20. znak (vyznačený modrými šípkami), 21. znak (vyznačený červenými šípkami); claw=pazúrik, 5th tarsal segment= 5. tarzálny segment (podľa TSCHORSNIG & HERTING 1994).

Materiál a metódy

Obr. 4. Idealizovaná schéma samčieho postabdomenu dorzálne, T. (Eudoromyia) sp. Znaky č. 27-29. (podľa NOVOTNEJ et. al 2009).

Obr. 5. Idealizovaná schéma samčieho postabdomenu laterálne, T. (Servillia) sp. (Orig.). Znaky č. 25 a 26. (podľa NOVOTNEJ et al. 2009). Skratky: AeA – aedeagálna apodéma, BF – bazifalus, BS – baciliformné sklerity, DF – distifalus, E (T9) – epandrium (tergit 9), EjA – ejakulatórna apodéma, Ha – hypandriálna apodéma, Hod – stredná hypandriálna doštička, Hr – ramená hypandria, Hy – hypandrium, I – intermediálny výbežok aedeagálnej apodémy, ML – mediálna lišta distifalu, PostG – postgonit/y, PreG – pregonit/y, S(7+8) – syntergosternit/segment 7+8, S5 – sternit 5, S6 – sternit 6, Sti 6 – stigma 6, Sti 7 – stigma 7, Sur – surstyly, Syn – syncerkus, viď syncerkus – cerky

Materiál a metódy

3.1.4 Výber DNA-markerov Boli vybrané 4 molekulárno-genetické markery (mitochondrionálne gény) 12S rDNA, 16S rDNA, CO I a CYT B, ktoré sú vhodné na riešenie rôznych medzidruhových taxonomických problémov (TÓTHOVÁ et al. 2006).

3.2 Metódy

Na vyriešenie taxonomických problémov boli použité metódy umelých neurónových sietí (ANN) a molekulárno-genetické metódy. Pri celkovom hodnotení výsledkov polyfázovou úrovňou riešenia problému boli využité aj výsledky získané metódou porovnávacej morfológie – kladistiky (NOVOTNÁ et al. 2009).

3.2.1 Umelé neurónové siete Umelé neurónové siete (ANN) sú výnimočnou metódou uplynulej dekády, ktorá využíva metódy umelej inteligencie. ANN môžu aplikovať vedomosti o fungovaní ľudského mozgu na zhodnocovaní získaných dát. Predstavujú vysoko špecializovaný výpočtový nástroj, ktorý využíva svoj potenciál k vyriešeniu rozsiahlych a zložitých problémov. Ich atraktivita spočíva v ich schopnosti učiť sa na predchádzajúcich skúsenostiach a tieto poznatky modelovať. Sú tak schopné z nameraných dát riešiť problémy, pri ktorých je k dispozícii potrebná klasifikácia. ANN dokážu riešiť problémy rýchlo a komplexne. ANN sú tvorené umelými neurónmi, fungujúcimi na princípoch biologických neurónov. Architektúra ANN závisí vo všeobecnosti od zložitosti úlohy. Model ANN je, okrem uzlov, tvorený určitými číselnými hodnotami a koeficientmi (váhami=weights; wij), ktoré spájajú neuróny. Existujú rôzne neurónové architektúry. Jedna z najpoužívanejších je „feedforwad supervised neural network of multi-layer perceptrons“ (MLP). MLP je skonštruovaná sieť s najmenej tromi alebo viacerými vrstvami, tzn. – vstupná vrstva (Input), výstupná informácia (Output) a skrytá vrstva (Hidden Layer) (obr. 6). Každá z týchto vrstiev má rozdielny počet uzlov. Vstupná vrstva prijíma vkladané informácie, pričom každý neurón v tejto vrstve predstavuje jednu vstupnú informáciu – nameraný znak. Skrytá vrstva spracováva informácie zo vstupnej vrstvy, zatiaľ čo výstupná vrstva je odpoveď systému na vzájomnom porovnaní všetkých premenných. Vkladané znaky (dáta) môžu byť rôzne (viď kap. 1.1).

Materiál a metódy

Vstupy (inputs), násobené váhovými spojmi wi (wij), sú spočítané a následne transformované cez prenosovú funkciu xi (xj) a tak je získaný výstup (output). Minimalizáciou

štvorca rozdielu odchýlok tij a oij (RMS) sa v tréningovom procese hľadajú také hodnoty váh wi, (wij), aby vypočítané a experimentálne hodnoty výstupov boli čo najviac rovnaké. Určenie vhodného počtu skrytých vrstiev a počtu uzlov v každej tejto vrstve je základom v tvorení umelej neurónovej siete. Kritickým miestom je potom tiež tzv. pretrénovanie (overtraining ), pretože potom môžeme získať nepresné výsledky (viď ďalej).

Stratégia ANN Proces ANN se skladá z troch základných krokov: „trénovanie“ alebo učenie, „overovanie“ alebo verifikácia a „predpovedanie“ alebo predikcia, v našom prípade je to determinácia taxónu. V rámci trénovania sa musia najprv definovať vstupné a výstupné hodnoty. Obvykle je potrebné vkladané dáta (namerané hodnoty vybraných znakov, characters) najskôr vhodne upraviť a normalizovať tak, aby ich vybudovaná sieť bola schopná prijať. Táto databáza tvorí tzv. „tréningový set“. Vo fáze trénovania sa hľadá optimálna štruktúra neurónovej siete a váhové koeficienty pre dané informácie. Hneď ako neurónové siete dosiahnu požadovanú štatistickú presnosť a produkujú vhodné výstupy voči vstupným dátam, je tréning kompletný. Aby sme našli správnu štruktúru siete ANN, je potrebné minimalizovať kvadratický priemer 32

Materiál a metódy

chyby (root mean square error – RMS, vzorec 1). V tomto momente je dôležité usledovať RMS tak, aby nedošlo k už zmienenému pretrénovaniu. Týmto krokom sa skončí aj proces trénovania.

N M 2 Σ i=1Σ j−1 ( y ij − out ij ) RMS = N × M

Vzorec 1. yij je elementom matice (N x M) pre tréningový set a outij je elementom pre výstupovú maticu (N x M), v ktorej N je počet premenných v matici a M je počet vzoriek.

Po trénovaní, keď sieť dosiahne požadovaný výkon, je potrebné urobiť verifikáciu, čiže „overovanie“ metódou tzv. krížového, náhodného overovania (cross-validation). Vyberie sa vtedy niekoľko náhodných jedincov a sleduje sa, či ich sieť správne determinuje. V tomto prípade verifikácie sú taxóny už síce známe, ale nie sú predložené sieti k trénovániu. Toto testovanie je nutné k uisteniu sa, že sa sieť naučila zahrnúť všeobecné vzory v priebehu aplikácie a že tréningový set využíva správne. Predpovedané výstupné hodnoty (determinované taxóny) sú potom porovnané s taxónmi, ktoré sme získali iným spôsobom klasifikácie (napr. podľa kľúča), aby sme videli, ako dobre sieť pracuje. Pokiaľ systém neposkytuje správny výstup (chybná determinácia), tréningová perióda ešte nie je na konci, lebo sieť síce dokáže dáta modelovať, ale nedokáže ich správne interpretovať. Keď však tréningová perióda prekročí istú hranicu, nastáva vyššie zmieňované pretrénovanie. Prejavuje sa to tak, že sieť síce vykazuje vynikajúce parametre, ale neposkytuje racionálny výstup (chybná determinácia). Akonáhle prebehne overenie dát úspešne, sú vo finálnej fáze neznáme jedince (ich dáta) vyhodnotené – determinované správne. Táto klasifikácia neznámych jedincov je na konci, získali sme dobre natrénovanú databázu, ktorá bude dobrým predpokladom pre získanie spoľahlivej identifikácie.

Postup pri hľadaní vhodnej architektúry ANN Databáza bola rozdelená do niekoľkých sub-databáz, pre ktoré potom bola hľadaná vhodná architektúra. Sub-databázy boly volené podľa logiky veci, teda, podľa vnútornej štruktúry rodu. Dôležitým momentom pri hľadaní vhodnej architektúry ANN je nájdenie optimálneho počtu uzlov v skrytej vrstve. Pri riešení jednoduchších prípadov nám postačí jedna skrytá vrstva, pri riešení zložitejších úloh je potrebné použiť viac vrstiev. V našom prípade postačilo použiť jednu skrytú vrstvu. 33

Materiál a metódy

Optimálny počet uzlov v skrytej vrstve sa stanoví jednoduchým testom (obr. 7). Je potrebné sledovať hodnotu RMS pri počte uzlov od 1 po, napr., 10 (až kým sa hodnota už ďalej nemení). Hodnoty sú zaznamenané do grafu a bod, v ktorom bola hodnota RMS najnižšia, nám udáva optimálny počet uzlov, ktorý je najvhodnejší pre skrytú vrstvu našej siete. Je odporučované počet uzlov mierne navýšiť, počet môže byť vyšší o jeden, nanajvýš o dva uzly.

Obr. 7. Závislosť kvadratického priemeru chyby na počte uzlov v skrytej vrstve ANN pre trojvrstvovú sieť, trénovaných 5 podrodov rodu Tachina.

Materiál a metódy

a) b)

Obr. 8. Použitá trojvrstvová architektúra ANN na rozlíšenie podrodov, trénované s novým podrodom (a) a trénované bez nového podrodu (b). (MLP 24, 5, 4/or 5) (MURÁRIKOVÁ et al. 2010).

Po určení vhodnej štruktúry neurónovej siete je možné začať s trénovaním. Pri využití 10000 epoch v priebehu jednej periódy sa tréningový proces se opakuje, až kým sa hodnota RMS (error T) nepriblíží k osi x a nestagnuje. V tomto okamihu získame kvalitnú štruktúru ANN a môžeme urobiť verifikáciu (viď vyššie). Po verifikácii je možné začať s identifikáciou neznámych jedincov (VAŇHARA et. al. 2010).

3.2.2 Molekulárno-genetická analýza

Extrakcia DNA, PCR a sekvencovanie DNA bola extrahovaná z 53 jedincov (48 jedincov skúmaných druhov rodu Tachina a 5 jedincov vonkajších skupín – outgroups, tab. 3, obr. 9). Vo fylogenetických stromoch na obr. 10 a 11 boli použité rovnaké jedince, ktoré boli použité aj v strome na obr. 9. Jeden jedinec, ktorý je tiež zaznamenaný v tab. 3 (na obr. 10 je pomenovaný ako T. ursina 1) bol použitý len v strome na obr. 10. Jedince použité v analýzach na obr. 10 a 11 sú zaznamenané aj v NOVOTNÁ et al., 2009, tab. 2. Jedince z vonkajších skupín boli vybrané z najbližšej taxonomickej úrovne. Na extrakciu DNA bol použitý suchý materiál (jedinci uchovávaní na entomologických špendlíkoch) a materiál uložený v 70% ethanole. Extrahovalo sa z nohy, alebo abdomenu. Ostatné časti tela boli zachované na ďalšie štúdium (najmä samčí postabdomen). Pri niektorých jedincoch chýba údaj, aké bolo pohlavie, ale mitochondriálne gény, ktoré sme použili ako DNA markery, nie sú viazané na pohlavie, takže, tento chýbajúci údaj neovplyvnil

Materiál a metódy

naše výsledky. Z vlastných skúseností vieme, že materiál nemohol byť starší ako 20 rokov a nemohol byť uchovávaný vo formaldehyde – DNA bola zničená a analýzy z takýchto jedincov nie sú možné (TÓTHOVÁ et al. 2006). Na extrakciu DNA bol použitý kit DNeasy tissue Kit (Qiagen). Postupovalo sa podľa priloženého návodu výrobcu. Tkanivo bolo opláchnuté v roztoku PBS (Phosphate Buffered Saline), následne bolo premiestnené do sterilnej Eppendorf skúmavky a ponorené do pufru ATL. Potom sa tkanivo homogenizovalo v tekutom dusíku – bolo krátko viackrát striedavo zmrazené a rozmrazené, až kým sa nehomogenizovalo (spravidla to bolo dvakrát). Extrakcia bola dokončená pridaním proteinázy K a následne boli vzorky 3 hod. inkubované v termostate pri teplote 56 °C. Fragmenty mitochondriálnych génov boli amplifikované (namnožené) metódou PCR. Použili sme nasledovné primery: • 12S rDNA (cca 375 bp.) – 12Sma (5'-CTGGGATTAGATACCCTGTTAT) a 12Smb (5'-

CAGAGAGTGACGGGCGATTTGT) (COOK et al. 2004), • 16S rDNA (cca 350 bp.) modifikované primery mt32 (5'-CAACATCGAGGTCGC) a mt34 (5'-

TTGACCGTGCAAAGGTAG) (NIRMALA et al. 2001), • CO I (cca 650 bp.) primery 911 5´-TTTCTACAAATCATAAAGATATTGG-3´ a 912 5´-

TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3´. (GURYEV et al. 2001), • CYTB (cca 450 bp) boli použité primery cytbF 5´GGACAAATATCATTTTGAGGAGCAACAG-3´

a cytbR 5´ATTACTCCTCCTAGCTTATTAGGAATTG-3´ (KRZYWINSKI et al. 2001). PCR boli urobené v objeme 20 μl podľa protokolu: 1x PCR-pufor (Fermentas),

2 mM MgCl2, 200 μM dNTPs (mix), 1,2 U Taq-polymeráza (Fermentas) a 4 μM z každého primeru. Teploty reakcie boli nastavené podľa štandardných podmienok: 2 min úvodná denaturácia pri 94 oC, nasledovaná 38 cyklami, skladajúcich sa z 94 oC na 30 s, 53 oC na 45 s (pre 16S rDNA) a 72 oC na 1 min 30 s. Cyklus bol zakončený záverečnou extenziou pri 72 oC na 7 min. Annaelingová teplota bola pre fragment 12S rDNA 55 oC, pre CYT B 50 oC a pre CO I 47 oC. PCR reakce boli uskutočnené v EpGradientS (Eppendorf) thermal cykléri. Pri vzorkách, pri ktorých nebolo možné uvedeným postupom získať PCR produkt v dostatočnej kvalite, prebehli optimalizácie (urobený teplotný gradient pre zistenie najvhodnejšej annaelingovej teploty pre nasadnutie (pripojenie) primerov, alebo zvýšená koncentrácia Mg2+, či množstvo vstupného templátu DNA). Získané PCR produkty (odobrané 4 μl zo vzorky) boli vizualizované prostredníctvom elektroforézy v 1% agarózovom geli pomocou fluorescenčných farbív ethidiumbromid (Top Bio), neskôr GoldView (SBS Genetech). Následne boli prečistené (purifikované) pomocou QIAquick PCR Purification Kit 36

Materiál a metódy

(QIAGEN) a ponechané priamo na sekvencovanie. Sekvenačné PCR boli urobené v objeme 10 ul, prostredníctvom sekvenačného kitu BigDye Terminator v 1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). Osekvencované boli v automatizovanom fluorescenčnom sekvenátore ABI Prism 3130 Genetic Analyser (Applied Biosystems). Produkt bol purifikovaný pomocou BigDye XTerminator Purification Kit (Applied Biosystems). DNA-marker bol sekvencovaný z oboch strán. (upravené podľa odporučenej metodiky).

Analýza sekvencií Získané sekvencie boli manuálne upravené v programe Sequencher v. 4.8 (GeneCodes). Mnohonásobné zoradenie sekvencií (multiple alignment) v kombinácii s matricou morfologických dát do finálneho datasetu bolo urobené v programoch

MEGA v. 3.1 (KUMAR et al. 2004) a PAUP* v.4.0b10 (SWOFFORD 2003).

Konštrukcia fylogenetických stromov Boli skonštruované tri fylogenetické stromy (kombinovaná analýza 12S a 16S rDNA – obr. 9, kombinovaná analýza 12S, 16S rDNA a morfologických znakov – obr. 10 a kombinovaná analýza 12S, 16S rDNA, CYT B a CO I – obr. 11). Všetky tri fylogenetické stromy boli skonštruované metódou Bayesian Analyses (BA) v programe MrBayes v. 3.1.1.

(RONQUIST & HUELSENBECK 2003).

V programe MrModeltest 2.3 (NYLANDER 2004) bol vybraný najvhodnejší evolučný model pre analýzy (GTR+I+G). Parametre Bayesovskej analýzy BA boli vo všetkých analýzach nastavené nasledovne: mcmc printfreq=1000 samplefreq=1000 nchains=8 nruns=2 temp=0.05 swapfreq=1 nswap=2 printmax=16 mcmcdiagn=yes diagnfreq=1000 relburnin=yes burninfrac=0.3 sumt displaygeq=0.5 burnin=300 sump burnin=300. Vierohodnosť topológie výsledného stromu bola overená 1 500 000 generáciami. Vo fylogenetických stromoch sú posteriórne pravdepodobnosti, ktoré udávajú spoľahlivosť vetiev. Zobrazené sú len hodnoty vyššie ako 0,5.

Výsledný strom bol upravený v programe TreeView (PAGE 1996) a Adobe Photoshop 8.0 CS. Maximum parsimony analýzy (MP) boli urobené v programe PAUP* version 4.0b10 (SWOFFORD 2003).

Materiál a metódy

Tab. 3. Použité jedince na molekulárno-genetickú analýzu.

Jedinec (druh) Pohlavie Det. Lokalita, dátum zberu a lgt.

Eudromyia ES: Canary Isls: La Palma, Fuencaliente, Las Caletas 400 m, canariensis 1 F H.‐P. Tschorsnig 12. 12. 2005, lgt. D. Bartsch, J. Berg

canariensis 2 F J. Čepelák ES: Canary Isls: Tenerife, N, Cruz de Luis, 23. 4. 2001, lgt. J Bosák

ES: Spain, Cataluna, Prov. Gerona, Berge, N Cadaques, É Figueres, casta 1 M J. Ziegler 2. 7. 1992, 500m, leg. J. Ziegler ES: Prov. Gerona, Sierra de Rodes, W Cadaqués, Puig Alt, casta 2 M H.‐P. Tschorsnig 16. 6. 1995, leg. H.‐P. Tschorsnig IT: Sicilia (PA), Bosco della Ficuzza, 865m, Pulpito del Re, casta 3 M P. Cerretti N37.53174 E13.23768, (su Ferula communis), 15. 5. 2004 (retino), leg. P. Cerretti, B. Birtele, G. Nardi, D. Whitmore EL: Epyro, Pindos Mts., Joannina prov., Baltouma, Driskos passage, corsicana 1 F P. Cerretti 26.5.2002, lgt. P. Cerretti, M. Mei, M. Tisato, S. Vanin EL: Epyro, Thesprotia prov., Igoumenitsa near Polydrosso, corsicana 2 M P. Cerretti 1. 6. 2002, lgt. P. Cerretti, M. Mei, M. Tisato, S. Vanin

corsicana 3 M J. Ziegler TU: Bou Hedma, 15.‐17. 3. 1993, lgt. M. Hauser

fera 1 ‐ ‐ CZ: Južná Morava, Pálava, Kotel. Ind. 19. 9. 1995, lgt. J. Vaňhara

IT: Lazio‐RM, Monti della Tolfa, Sasso 300m, 29. 4. 2001, lgt. P. fera 2 M P. Cerretti Cerretti

fera 3 F H.‐P. Tschorsnig SK: Hrdovická ŠPR, Nitrianska Streda, 3. 10. 1986, lgt. J. Čepelák

IT: Sardegna (Carbonia, Iglesias), Domusnovas, Bega d'Aleni, 621m, fera 4 F ‐ UTM 32 S 0467915 4361475, 24. 5. 2006, lgt. D. Whitmore, M. Bardiani, D. Birtele, P. Cornacchia IT: Sardinie, Iglesias M ti Marganai, Tintillonis, 480 m s. l.m. N 39 fera 5 F P. Cerretti 20452 E8 337 46, 9. 6. 2004, lgt. P. Cerretti, D. Birtele, C. Nardi, M. Tisato, D. Whitmore

fera 6 M Straka SK: N. Tatry, Čierny Váh, nádrž, 24. 6. 2005, lgt. V. Straka

fera 7 M ‐ FR: Buorgogne, Loire, Apremont, 27. 7. 1992, lgt. J. Vaňhara

magnicornis 1 F J. Čepelák SK: B. Karpaty, Španie, 18. 7. 1993, lgt. J. Čepelák

magnicornis 2 M Ch. Bergström SE, Öl Algutsrum, Kta V 100m 628375/154420 25. 5. 2005, ?

magnicornis 3 F ‐ FR: Bourgogne, Foret ‐ St. Prix. Mts., 31. 7. 1992, lgt. J. Vaňhara

JP: Kyushu, Oita‐ken Yufu‐shi, Shonai, Oita, 860m, nupta 1 M P. Cerretti N33º07’28.3”, E131 º 17’41.0”, lgt. P. Cerretti, D. Whitmore, (Japonsko) 29.9.2006 nupta 2 M R. T. Ichiki, T. Tachi JP: Minami Park, Fukuoka, Japan, 20. 4. 2007, lgt. dr. T. Tachi (Japonsko) FR: Hautes Alpes, Col de la Pousterie, 9. 8. 1998, lgt. H.‐P. sp. n. 1 M H.‐P. Tschorsnig Tschorsnig FR: Hautes Alpes, Col de la Pousterie, 9. 8. 1998, lgt. H.‐P. sp. n. 2 M H.‐P. Tschorsnig Tschorsnig

Materiál a metódy

Jedinec (druh) Pohlavie Det. Lokalita, dátum zberu a lgt.

SE: Suecia Vs Fellingsbro f d, Sörbysjön RN 6597 1483, 8.9. 1991, sp. n. 3 F Ch. Bergström lgt. N. Ryrholm sp. n. 4 M J. Čepelák SK: Vtáčnik v. 23. 7. 1988, J. Čepelák sp. n. 5 M J. Čepelák SK: Vtáčnik, Glergov J. 23. 7. 1988, J. Čepelák sp. n. 6 M ‐ IT: Apennines Mts., Sestola, 23. 8. 1992, lgt. J. Vaňhara

IRN: Gilan Province, Sebostaneh (Kuhha‐ye Alborz) SE of Tutkabon, sp. n. 7 M J. Ziegler south of Rasht, 36º46’53, 1 N 049º48’16.6 E, 1430m, Zool. Mus. Berlin, 29.125, 31.7.2005, lgt. J. Ziegler FR: Hautes Alpes, E Lautaret, 1950m, 29. 7. 1992, sp. n. 8 M Ch. Bergström lgt. H.‐P. Tschorsnig FR: Hautes Alpes, Les Têtes NW I’Argentière, 44“47’85N, sp. n. 9 M J. Ziegler 006“31‘75E ,2044m, 5. 8. 1998, lgt. C. Lange, J. Ziegler FR: Dauphine Provinz Hautes Alpes, Vallee de la Guisane, E Col du sp. n. 10 M J. Ziegler Lautaret 1950m; 29. 7. 1992, lgt. C. Lange, J. Ziegler IT: Sicilia (PA) Bosco della Ficuzza, 600‐1000m, (Elaeoselinum sp. n. 11 M P. Cerretti asclepium), 28. 7.2003 (retino), lgt. P. Cerretti, M. Tisato Tachina IT: Sicilia‐Madonia, Collesano env., 1‐600m, 3.‐5. 6. 2002, magna 1 M H. Novotná lgt. J. Halada EL: Thessalia, Trikala prov., Vlahava, N39.74353‐E21. 65747‐650m, magna 2 M P. Cerretti 29. 4. 2003, lgt. P. Cerretti, L. Facchinelli, M. Tisato, L. Valerio, S. Vanin Servilia lurida 1 ‐ P. Mückstein CZ: Žďárské vrchy, 31. 3. 2005, lgt. P. Mückstein lurida 2 F J. Vaňhara SVK: N. B. Španie, B. Karpaty, 25. 4. 1993, lgt. S. Čepelák lurida 3 F H. Novotná CZ: Brno, Hády, 23. 4. 2007, lgt. H. Novotná, N. Muráriková lurida 4 M J. Vaňhara CZ: S. Moravia, 7367, Lanžhot, 10. 5. 1994, lgt. J. Vaňhara ursina 1 F ‐ CZ: Soběslav‐okolí, Vlkov, 3. 5. 2000, lgt. Máca ursina 2 F P. Cerretti IT: Lazio. Percile (RM), 4. 4. 1999, lgt. M. Mei

CZ: Drahanská vrchovina, Morava, 6566, Boskovice – Valchov, ursina 3 F ‐ 6. 5. 1992, lgt. Chrudina DE: Südschwarzwald, 5 km NO Bad Säckingen Rippoldingen, nigrohirta 1 M H.‐P. Tschorsnig 20. 4. 1992, lgt. Ch. Schmid‐Egger DE: BW‐Horb MU76, Ihlinger Berg, 91 Ih, 15. 4. 1991, MU76 Ih, lgt. nigrohirta 2 M H.‐P. Tschorsnig Ch. Schmid‐Egger nigrohirta 3 M ‐ SK, N. B. Mravcové, B. Karpaty, 24. 4. 1993, lgt. S. Čepelák

Tachina grossa 1 F J. Čepelák SK: Kľačno (Zlatno), 19. 7. 1992, lgt. J. Čepelák

Materiál a metódy

Jedinec (druh) Pohlavie Det. Lokalita, dátum zberu a lgt.

SK: Višňové blízko Nového Mesta (7272), (distr. Trenčín), grossa 2 M ‐ 20. 7. 1996, lgt. Martinovský Echinogaster IT: Sicilia (PA), Parco delle Madonie, Piano Zucchi, 1075m, UTM, praeceps 1 F P. Cerrerri 33S 411992 4195243 29. 6. 2005, lgt. P. Cerretti ES: Prov. Gerona, 3‐5 km, SE, L’Escala, 27. 5. 1998, praeceps 2 F H.‐P. Tschorsnig lgt. H.‐P. Tschorsnig Servilia ursina (ursina 1, F P. Mückstein CZ: Žďárské vrchy, 31. 3. 2005, lgt. P. Mückstein obr. 10) Vonkajšia

skupina Germaria CZ: S. Moravia, 7367, Lanžhot, Soutok, lužná louka, 25. 8. 1992, ‐ J. Vaňhara ruficeps lgt. J. Vaňhara Gymnocheta ‐ J. Vaňhara CZ: S. Moravia, Pavlovské vrchy, kotel, 4. 5. 1995, lgt. J. Vaňhara viridis

Linnaemya picta ‐ R. Rozkošný CZ: S. Moravia, Pavlovské vrchy, 13. 8. 1998, lgt. R. Rozkošný

Nowickia ferox ‐ R. Rozkošný CZ, Brno Hády Hill, 1987, lgt. R. Rozkošný

Peleteria varia ‐ ‐ SK: Vihorlat, 1986, lgt. J. Čepelák

3.2.3 Kladistika Postup preparácie samčieho postabdomenu na jednotlivých druhoch, zostavovanie databázy pre kladistickú analýzu a samotná analýza sú podrobne opísané v NOVOTNÁ et al. (2009).

Výsledky

4 Výsledky

4.1 Kauza 1

Validita doterajších štyroch podrodov verzus návrh nového, piateho podrodu

Súčasný stav: Rod Tachina sa delí na štyri podrody (HERTING 1984). Na základe našich najnovších poznatkov a na základe analýzy znakov na samčom postabdomene, bolo navrhnuté stanoviť nový, piaty podrod (NOVOTNÁ et al. 2009). Tento podrod by mal zahrňovať druh T. magna, ktorý sa v kladistickej analýze oddelil od druhu T. grossa. Druh T. magna stojí bližšie k podrodu Servillia, než k druhu T. grossa. Oba tieto druhy však zatiaľ patria do podrodu Tachina s. str. Typovým druhom tohoto podrodu je T. grossa. Hypotéza pre ANN: Sme schopní pomocou ANN rozpoznať nový podrod?

4.1.1 Umelé neurónové siete V subdatabáze (tab. 4) bolo použitých všetkých 13 druhov, zo všetkých rodov (vrátane potencionálneho nového druhu, viď Kauza 2). Počet jedincov je uvedený v tab. 4. Boli analyzované len samce, s použitím 16 základných znakov na krídle a tykadle a 6 znakov na postabdomene. MLP: Bola zostavená trojvrstvová sieť (24, n, 4/alebo 5), v ktorej 24 je počet znakov vo vstupnej vrstve, n je počet neurónov v skrytej vrstve a 4/alebo 5 je počet podrodov vo výstupnej vrstve (s novým podrodom alebo bez neho v procese trénovania, obr. 8). Počet neurónov: 4/5 neurónov bolo vybraných podľa testu (obr. 7). Počet uzlov sa obyčajne odporúča navýšiť o jeden alebo dva uzly, než je stanovené optimum v grafe. Trénovanie: 100 % úspěšnosť. Verifikácia: V overovacom procese boli náhodne vybrané vždy 2 jedince a boli testované procesom krížového overovania. Všetky, okrem jedného jedinca, boli overené správne. Úspešnosť procesu verifikácie bola teda 90 %. Identifikácia: Všetkých 10 jedincov druhu T. magna bolo daných ako neznáme vzorky a všetkých 10 bolo určených ako nesprávnych, čiže ani jeden jedinec nebol zaradený do štyroch doposiaľ známych podrodov (architektúra siete 24/4/4, natrénovaných 71 jedincov, neznámych bolo 10 jedincov; identifikácia bola teda správna – úspešnosť 100 %). Tým sme podporili náš predchádzajúci výskum (NOVOTNÁ et al. 2009), že druh T. magna by mal patriť do nového podrodu.

Výsledky

V druhej identifikácii sme umiestnili týchto 10 jedincov do piateho podrodu (piaty výstup), čiže natrénovaných bolo všetkých 81 jedincov (architektúra siete 24/5/5). Žiadny z analyzovaných jedincov nebol identifikovaný pomocou ANN ako niektorý podrod z natrénovaných štyroch podrodov, čím sme dostali výsledok ako v predchádzajúcom prípade, aj keď nepriamo.

Tab. 4. ANN analýza podporuje nový podrod. Použili sme dve metódy trénovania, “bez” a “s” jedincami z nového podrodu. Nesprávna identifikácia 10 exemplárov bol dobrý výsledok pre Kauzu 1; žiadny z týchto 10 jedincov nebol zaradený do už známych štyroch podrodov. Výsledok bol podporený tiež DNA analýzou a štúdiom morfologických znakov na samčom postabdomene, viď Kauza 1; “-“ žiadny materiál pre identifikáciu (podľa MURÁRIKOVEJ et al. 2010).

Trénovanie Identifikácia Podrod Celkove Správne Nesprávne Celkove Správne Nesprávne

T. (Eudoromyia) 39 39 0 ‐ ‐ ‐

T. (navrhovaný nový podrod) 0/10 0/10 0 10/0 0/0 10/0 (pre T. magna) (bez/s trénovaním)

T. (Servillia) 12 12 0 ‐ ‐ ‐

T. (Tachina) s.str. (pre T. grossa) 13 13 0 ‐ ‐ ‐

T. (Echinogaster) 7 7 0 ‐ ‐ ‐

Celkový počet jedincov (bez/s 71/81 71/81 0 10/0 0/0 10/0 trénovaním) % 100/100 100/100 0 100/0 0 100/0

4.1.2 Molekulárno-genetická analýza Boli urobené tri paralelné analýzy (obr. 9, 10, 11). Prvý fylogenetický strom je výsledkom analýzy 12S a 16S rDNA génov (obr. 9). Druhá analýza bola založená na kombinácii 12S a 16S rDNA génov a morfologických znakov (znaky na samčom postabdomene) (obr. 10). V tretej boli analyzované až štyri mitochondriálne DNA markery (12S a 16S rDNA, CO I a CYT B, obr. 11), celková dĺžka DNA reťazca bola približne 1500 bp. Oba fylogenetické stromy sú aj v publikácii NOVOTNÁ et al. 2009 (viď obr. 18, 19). Všetky tri analýzy boli použité na preukázanie validity nového, piateho podrodu. Spoľahlivosť vetiev v jednotlivých stromoch je vysoká. Výsledky molekulárno-genetických analýz sú obdobné, ako ANN a kladistická analýza. Druh T. magna sa oddelil od druhu T. grossa a stojí blízko druhov z podrodu Servillia. Výsledky molekulárno-genetickej analýzy a podrobné informácie, ako boli pôvodne určené konkrétne jedince, sú v tab. 10. 42

Výsledky

4.1.3 Analýza samčieho postabdomenu Na základe analýzy znakov na samčom postabdomene bolo odporučené, aby bol druh T. magna zaradený do nového podrodu (NOVOTNÁ et al. 2009). T. magna totiž nestojí pri druhu T. grossa, ale je bližšie k druhom podrodu Servillia. Výsledky analýzy sú zreteľné vo fylogenetickom strome – viď Novotná et al. 2009, obr. 20. Je však ešte nutná širšia revízia druhov podrodu Tachina, do ktorého zatiaľ patrí T. grossa, aj T. magna, preto ešte stanovenie nového podrodu nie je formálne.

4.1.4 Diskusia ku kauze 1 Všetkými tromi analýzami sme nezávisle od seba prišli k rovnakému záveru – potvrdenie návrhu nového podrodu. V procese ANN sme náš výsledok potvrdili dvomi rôznymi výpočtovými metódami, ktoré priniesli rovnaký výsledok. Spätná kontrola bola urobená metódou krížovej validácie.

4.2 Kauza 2

Nový druh verzus známe západopalaearktické druhy podrodu Eudoromyia

Súčasný stav: Výskumom druhov z podrodu Eudoromyia bol indikovaný nový druh

(viď NOVOTNÁ et al. 2009). Hypotéza pre ANN: Sme schopní pomocou ANN rozpoznať nový druh?

4.2.1 Umelé neurónové siete V subdatabáze boli použité jedince z piatich druhov rodu Eudoromyia. Počet jedincov je uvedený v tab. 5. MLP: Bola zostavená trojvrstvová sieť (21, n, 5). Počet neurónov: 6 neurónov v skrytej vrstve (21, 6, 5). Trénovanie: Natrénovaných bolo 12 jedincov z nového druhu – T. sp. n., 100 % úspěšnosť. Verifikácia: 12 jedincov nového druhu – T. sp.n. (BER) bolo dvanásťkrát náhodne vybraných po jednom kuse a otestovaných procesom krížového overovania so 100 % úspešnosťou. Identifikácia: 40 neznámych jedincov, ktoré pochádzali z francúzskych Álp, boli všetky určené ako T. sp. n. Takto bol reidentifikovaný prostredníctvom ANN aj kladistikou aj jeden jedinec, ktorý bol pôvodne určený ako T. fera.

Výsledky

Tab. 5. ANN analýza podporuje navrhovaný nový druh T. sp.n. (Kauza 2). Tento druh bol identifikovaný medzi netrénovaným materiálom z francúzskych Álp. Tiež dva netrénované jedince z druhu T. fera (det. Čepelák a Herting) boli klasifikované prostredníctvom ANN ako nesprávne a identifikované paralelne ako T. sp.n. Tento druh bol podporený tiež DNA analýzou a štúdiom morfologických znakov na samčom postabdomene, viď Kauza 2; “-“ žiadny materiál pre identifikáciu (podľa MURÁRIKOVEJ et al. 2010).

Trénovanie Identifikácia Druhy Celkove Správne Nesprávne Celkove Správne Nesprávne

T. casta 8 8 0 ‐ ‐ ‐ T. fera 16 16 0 1 0 1 T. fera (hory – Slovensko, ČEP) 0 0 0 1 0 1 T. magnicornis 9 9 0 ‐ ‐ ‐ T. nupta (Japonsko) 6 6 0 ‐ ‐ ‐ T. sp.n. (Škandinávia, BER) 12 12 0 ‐ ‐ ‐ (francúzske Alpy, TSCH) 0 0 0 40 40 0 Celkový počet jedincov 51 51 0 42 40 2 % 100 100 100 95 5

4.2.2 Molekulárno-genetická analýza Nový druh (T. sp. n.) bol zreteľne indikovaný v analýze dvoch mitochondriálnych markerov 12S a 16S rDNA (obr. 9, jedince T. sp. n. 1–11) a v kombinovanej analýze 12S a 16S rDNA spolu s morfologickými znakmi (znaky na samčom postabdomene, obr. 10, jedince T. sp. 1 a 2, viď NOVOTNÁ et al. 2009, obr. 19). Podrobné informácie, ako boli pôvodne určené konkrétne jedince, sú v tab. 10.

4.2.3 Analýza samčieho postabdomenu V publikácii NOVOTNÁ et al.(2009) je opísaný jeden znak na samčom postabdomene – zreteľný kalus na syncerku, ktorý charakterizuje skupinu druhov okolo druhu T. fera – T. fera, T. canariensis (Macquart, 1839), T. casta (Rondani, 1859) a navrhovaný druh T. sp. n.). Slovenský jedinec, ktorý bol pôvodne určený ako druh T. fera, bol pomocou ANN, aj analýzou samčieho postabdomenu určený ako T. sp. n. Informácie o tom, ktorým samcom boli preskúmané postabdomeny, sú v tab. 10.

4.2.4 Diskusia ku kauze 2 Niektoré jedince T. sp. n., ktoré boli určené molekulárno-genetickými analýzami a analýzou samčieho postabdomenu, neboli pôvodne určené ako sp. n. (T. sp. n. 4, 5 – pôvodne zaradené medzi jedincami „T. lefebvrei“ – viď Kauza 3, T. sp. n. 6 – pôvodne určené

Výsledky

ako T. magnicornis a T. sp. n. 7 a 11 – pôvodne určené ako T. nupta – viď Kauza 3). ANN analýza a analýza znakov na samčom postabdomene priniesli zhodné výsledky s molekulárno- genetickými analýzami (T. sp. n. 1, 2, 5 – jedince analyzované všetkými tromi metódami, ostatné jedince stoja v strome pri týchto troch, možno ich teda tiež považovať za sp. n., aj keď neboli analyzované všetkými tromi metódami – T. sp. n. 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11). Pri dvoch jedincoch (T. sp. n. 4 a 7, zistené neskôr, tab. 10), neboli výsledky všetkých troch analýz rovnaké. Jedinec označený ako T. sp. n. 4 bol pôvodne zaradený medzi jedince „T. lefebvrei“ – viď Kauza 3. V procese ANN bol určený ako T. nupta a podľa postabdomenu ako sp. n. Jedinec označený ako T. sp. n. 7 bol pôvodne určený ako T. nupta – viď Kauza 4. V procese ANN bol určený ako sp. n. a analýzou samčieho postabdomenu ako T. nupta. Súhrnné informácie, ako boli pôvodne určené jednotlivé jedince v molekulárnej analýze a ako boli určené pomocou ANN a analýzou samčieho postabdomenu, sú v tab. 10. V procese ANN bolo 40 neznámych jedincov z francúzskych Álp priradených k 12 natrénovaným škandinávskym jedincom ako sp. n. Neboli pridelené k žiadnym iným západopalaearktickým druhom (hlavne v skupine T. fera a T. magnicornis). Na základe publikovaných faunistických záznamov niektorých autorov

ZIEGLER & LANGE (2001, 2006) a TSCHORSNIG et al. (2003), ktorí publikovali tento boreoalpínny druh ako sp. n., sme očakávali naše výsledky. Tento druh ešte nie je formálne opísaný a bol zaznamenaný vo Švédsku, Fínsku, Dánsku, v alpskej časti Francúzska a z horskej časti Slovenska.

4.3 Kauza 3

Mediteránna T. casta verzus stredoeurópska „T. casta“ (= syn. T. lefebvrei sensu Čepelák)

Súčasný stav: T. lefebvrei (Robineau-Desvoidy, 1830) bola opísaná na základe materiálu z typovej lokality na Sicílii (HERTING & DELY-DRASKOVITS 1993). BEZZI & STEIN (1907) ju prijali ako platný druh. J. Čepelák tento fakt akceptoval na dlhú dobu a zistil, že T. lefebvrei sa nachádza aj na Slovensku (prevažne faunistické práce), T. lefebvrei bola tiež akceptovaná v publikácii ZIMIN et al. (1970). HERTING (1984) ju však synonymizoval s T. casta (Rondani), ktorá je v súčasnosti považovaná za stredomorský druh. Preurčením niekoľkých exemplárov

T. lefebvrei J. Čepeláka bola T. casta vylúčená zo zoznamu slovenských druhov(VAŇHARA et al. 2004, VAŇHARA & TSCHORSNIG 2009). Hypotéza pre ANN: Vyskytuje sa T. casta v strednej Európe (= ako T. lefebvrei)? 45

Výsledky

4.3.1 Umelé neurónové siete V subdatabáze boli použité jedince z piatich druhov rodu Eudoromyia. Počet jedincov je uvedený v tab. 6. MLP: Bola zostavená trojvrstvová sieť (21, n, 5). Počet neurónov: 6 neurónov v skrytej vrstve (21, 6, 5). Trénovanie: Natrénovaných bolo 8 jedincov druhu T. casta. 100 % úspešnosť. Verifikácia: 8 jedincov druhu – T. casta bolo osemkrát náhodne vybraných po jednom kuse a otestovaných procesom krížového overovania so 100 % úspešnosťou. Identifikácia: 22 neznámych slovenských a srbských jedincov, bolo z veľkej časti určených ako T. sp. n. a T. magnicornis. Jeden jedinec z lokality Golubac bol určený ako druh T. casta a tiež jeden problematický jedinec z Talianska (CER) bol reientifikovaný ako T. casta. Žiadny jedinec zo Slovenska nebol určený ako T. casta.

Tab. 6. ANN analýza druhu T. casta sensu Čepelák (ako syn. T. lefebvrei). J. Čepelák identifikoval svoju T. lefebvrei správne medzi juhoeurópskymi jedincami. Všetky tieto jedince jeho T. lefebvrei z centrálnej Európy boli však správne identifikované ako ostatné druhy z rodu Eudoromyia. Tento výsledok bol podporený tiež DNA analýzou a štúdiom morfologických znakov na samčom postabdomene, viď Kauza 3; “-“ žiadny materiál pre identifikáciu (podľa MURÁRIKOVEJ et al. 2010).

Trénovanie Identifikácia Druhy Celkove Správne Nesprávne Celkove Správne Nesprávne

T. casta 8 8 0 ‐ ‐ ‐ T. casta sensu Čepelák (= syn. T. 0 0 0 22 1 (Srbsko) 21 lefebvrei) T. fera 16 16 0 ‐ ‐ ‐ T. magnicornis 9 9 0 ‐ ‐ ‐ T. nupta (Japonsko, ICH) 6 6 0 ‐ ‐ ‐ T. sp.n. (Škandinávia, BER) 12 12 0 ‐ ‐ ‐ Celkový počet jedincov 51 51 0 22 1 21 % 100 100 100 5 95

4.3.2 Molekulárno-genetická analýza Bola urobená analýza 12S a 16S rDNA mitochondriálnych markerov. Ani jeden z troch vzoriek T. lefebvrei nebol priradený k druhu T. casta (viď Kauza 2). Postavenie jedného jedinca bolo dokonca natoľko otázne, že sme ho nakoniec zo záverečnej analýzy vylúčili (pripustená možnosť kontaminácie DNA vzorky). Ostatné dva jedince boli nakoniec priradené k T. sp. n. (vo fylogenetickom strome sú označené ako T. sp. n. 4, 5). Analýzou samčieho postabdomenu boli tiež oba jedince určené ako sp.n. V pocese ANN bol jeden 46

Výsledky

jedinec určený ako T. nupta a druhý ako sp. n. Ostatné zo vzoriek T. lefebvrei nebolo možné analyzovať molekulárno-genetickými metódami, vzhľadom na to, že boli staršie ako 20 rokov.

4.3.3 Analýza samčieho postabdomenu Samčí postabdomen bol analyzovaný pri 14 jedincoch T. lefebvrei. Ako druh T. casta bol určený len jeden jedinec zo Srbska. Naopak, žiadny jedinec zo Slovenska nebol určený ako T. casta (tento druh sa líši od ostatných niekoľkými znakmi, viď NOVOTNÁ et al. 2009.) Väčšina z nich bola určená ako T. sp.n. a T. magnicornis.

4.3.4 Diskusia ku kauze 3 Žiadne jedince T. casta sensu Čepelák (det. ako T. lefebvrei) zo Slovenska neboli potvrdené všetkymi tromi analýzami. Predchádzajúce vylúčenie tohoto druhu zo zoznamu dvojkrídleho hmyzu na Slovensku bolo teda správne. Len jeden jedinec zo Srbska bol na základe postabdomenu určený ako T. casta. J. Čepelák teda správne predpokladal, že tento jedinec je niečo iné ako doposiaľ známe druhy.

4.4 Kauza 4

Problematická T. nupta verzus. T. magnicornis

Súčasný stav: T. nupta bola opísaná v roku 1859 z Talianska (porovn. HERTING & DELY-

DRASKOVITS 1993). Tento druh možno považovať za problematický, pretože existuje veľká variabilita morfologických znakov v skupine druhov okolo T. magnicornis. BEZZI & STEIN (1907) ho neakceptovali a vo svojej práci ho označili ako synonymum T. magnicornis.

Niektorí ďalší autori ho stanovili ako validný druh (MESNIL 1966, MIHÁLYI 1986, HERTING &

DELY-DRASKOVITS 1993, ZIMIN & KOLOMIETZ 1984,. CHAO et al. 1998, ČEPELÁK &

VAŇHARA 1997). Podľa HERTINGA & DELY-DRASKOVITS (1993) má tento druh 6 synoným.

MESNIL (1966) klasifikoval východopalaearktický druh T. micado (Kirby, 1884) ako poddruh druhu T. nupta. Tento taxón bol synonymizovaný HERTINGOM (1984). Podľa autorov

TSCHORSNIG & HERTING (1994) má tento druh nejasné postavenie. Hypotéza pre ANN: Je západopalaearktická T. nupta validný druh?

4.4.1 Umelé neurónové siete V subdatabáze boli použité jedince z piatich druhov rodu Eudoromyia. Počet jedincov je uvedený v tab. 7. 47

Výsledky

V tejto analýze sme pracovali so 6 jedincami z Japonska a s 11 jedincami zo západného Palaearktu. Týchto 11 jedincov bolo umiestnených do identifikácie a natrénované boli len jedince z Japonska. Bolo to z dôvodu, že nebolo predtým možné jednoznačne určiť, ktoré západopalaearktické jedince sú skutočne T. nupta, pretože identifikácia jedincov bola dlho neistá. MLP: Bola zostavená trojvrstvová sieť (21, n, 5). Počet neurónov: 6 neurónov v skrytej vrstve (21, 6, 5). Trénovanie: Natrénovaných bolo 6 jedincov druhu T. nupta z Japonska. 100 % úspěšnosť. Verifikácia: 6 jedincov druhu T. nupta z Japonska bolo šesťkrát náhodne vybraných po jednom exemplári a otestovaných procesom krížového overovania so 100 % úspešnosťou. Identifikácia: Jeden jedinec z analyzovaných jedenástich, bol podľa znakov na samčom postabdomene určený ako západopalaearktická T. nupta, ale jeho identifikácia podľa ANN zo začiatku nebola možná, pretože hlavný kľúčový znak u samcov je na predných nohách a tie chýbali. Neskoršími ANN analýzami bol tento jedinec určený ako T. nupta. Ostatných 10 jedincov bolo prostredníctvom ANN určených ako T. sp.n. alebo neurčený druh, lebo tieto jedince boli poškodené, čiže nebolo možné preskúmať potrebné znaky k analýze.

Tab. 7. ANN analýza identifikácie druhu T. nupta. Zo vzácneho európskeho materiálu len 1 jedinec koreloval s trénovanými japonskými exemplármi. Tento výsledok bol podporený tiež štúdiom morfologických znakov na samčom postabdomene, viď Kauza 4; “-“ žiadny materiál pre identifikáciu (podľa MURÁRIKOVEJ et al. 2010).

Trénovanie Identifikácia Druhy Celkove Správne Nesprávne Celkove Správne Nesprávne

T. casta 8 8 0 ‐ ‐ ‐ T. fera 16 16 0 ‐ ‐ ‐ T. magnicornis 9 9 0 ‐ ‐ ‐ T. nupta 6 (Japonsko) 6 0 11 (Európa) 1 10

T. sp.n. Škandinávia (BER) 12 12 0 ‐ ‐ ‐ Celkový počet jedincov 51 51 0 11 1 10 % 100 100 0 100 9 91

4.4.2 Molekulárno-genetická analýza Boli urobené tri paralelné analýzy (obr. 9, 10, 11, viď Kauza 1). Skúmané boli dve skupiny vzoriek druhu T. nupta. Dva exempláre z Japonska stoja vo fylogenetických stromoch pri sebe, ale mimo druhu T. magnicornis. Zo štyroch vzoriek zo západného Palaearktu, nebola ani jedna určená ako T. nupta. Dva exempláre boli určené ako sp. n., (viď

Výsledky

Kauza 2), tretí exemplár bol nakoniec spätne preurčený ako T. magnicornis podľa kľúča

TSCHORSNIG & HERTING (1994) (v strome, obr. 9, je označený ako T. magnicornis 1) a štvrtého jedinca sme nakoniec vylúčili z analýzy, lebo DNA vzorka pochádzajúca z daného jedinca bola pravdepodobne kontaminovaná. Východopalaearktickú T. nuptu sme teda odlíšili od T. magnicornis. Jediný západopalearktický zástupca T. nupta (BAR), ktorý bol určený aj podľa postabdomenu, aj podľa ANN ako T. nupta, čiže sa blíži k japonským jedincom, nemohol byť analyzovaný molekulárno-genetickými metódami kvôli jeho uchovaniu vo formaldehyde. Nevieme teda, ako by sa postavil vo fylogenetickom strome.

4.4.3 Analýza samčieho postabdomenu Samčí postabdomen bol analyzovaný u štyroch jedincov z východného Palaearktu (CER, ICH, ZIE zb.) a jedna vzorka (neskôr ďalšie dve) zo západného Palaearktu (BAR, ČEP zb.) (tab. 10). V publikácii NOVOTNÁ et al. (2009) odporúčame revíziu západopalearktickej T. nupta, ktorá se líši od východopalaearktických vzoriek na základe znakov na postabdomene. Obe formy „nupta“ sú bez mediálneho alebo submediálneho kalusu na syncerku. Rozdiely medzi západopalaearktickým jedincom T. nupta (kresby viď NOVOTNÁ et al. 2009) a japonskými jedincami sú podrobne opísané v NOVOTNÁ et al. (2009). Japonská T. nupta je vo výsledku bližšie k druhu T. magnicornis než k západopalaearktickému jedincovi (BAR). Rozlíšili sme síce východopalaearktickú T. nuptu od západopalaearktickej, ale nepodarilo sa nám nájsť žiaden znak na postabdomene, ktorý by jednoznačne rozlíšil T. nuptu (či už západopalaearktickú alebo východopalaearktickú) od T. magnicornis.

4.4.4 Diskusia ku kauze 4 Všetky tri analýzy preukázali rovnaké výsledky (viď NOVOTNÁ et al. 2009). Analýzou znakov na samčom postabdomene bol potvrdený len jediný exemplár ako západopalaearktická T. nupta. Ostatných 10 vzoriek – „nupta“, bolo buď nesprávne determinovaných, alebo to bolo z dôvodu poškodenia. V dôsledku toho nemáme jednoznačné závery pre túto problematiku. Uvedené závery sa zhodujú s najnovšou publikáciou

CERRETTIHO (2010) (v distribúcii koncom septembra 2010), ktorý na základe štúdia typového materiálu T. nupta určil jej taxonomickú pozíciu ako mladšie synonymum T. magnicornis.

Náš jediný kus, sa najviac podobá japonským jedincom (viď NOVOTNÁ et al. 2009), môže teda byť taxonomickou novinkou, pretože skutočná „nupta“ bola synonymizovaná.

Výsledky

4.5 Kauza 5

Znovuustanovenie druhu T. nigrohirta ako validného druhu v európskej faune verzus synonymum s druhom T. ursina

Súčasný stav: Druh T. nigrohirta opísal v roku 1924 Stein. Typová lokalita je v Rakúsku

(HERTING & DELY-DRASKOVITS 1993). Väčšina autorov ho prijala ako synonymum druhu

T. ursina Meigen, 1824 (MESNIL 1966; HERTING & DELY-DRASKOVITS 1993). TSCHORSNIG &

HERTING (1994) považujú tento druh za: „nejasný a možnú formu druhu T. ursina“. Druh bol prijatý a opakovane určený Čepelákom (ČEPELÁK 1971, 1987, ČEPELÁK & VAŇHARA 1997) a opätovne zaradený do európskej fauny TSCHORSNIG et al. (2004) na základe piatich jedincov, ktoré sme analyzovali aj my. Hypotéza pre ANN: Bolo opätovné stanovenie druhu T. nigrohirta ako validného druhu správne?

4.5.1 Umelé neurónové siete V subdatabáze boli použité jedince, z troch druhov z rodu Servillia. Počet jedincov je uvedený v tab. 8. MLP: Bola zostavená trojvrstvová sieť (20, n, 3). Number of nodes: 6 neurónov v skrytej vrstve (20, 4, 3). Training: Natrénovaných bolo 5 jedincov druhu T. nigrohirta. 100 % úspešnosť. Verification: 5 jedincov druhu T. nigrohirta bolo päťkrát náhodne vybraných po jednom kuse a otestovaných procesom krížového overovania so 100 % úspešnosťou. Identifikácia: Analyzovaných bolo 12 neznámych jedincov, ktoré boli pôvodne určené ako T. nigrohirta. Päť exemplárov bolo určených ako T. nigrohirta (2 z nich boli určené kladistikou tiež ako T. nigrohirta), 4 boli určené ANN ako T. ursina, 2 ako T. lurida a jeden jedinec bol identifikovaný ako neznámy, z dôvodu chýbajúcich dát.

Výsledky

Tab. 8. ANN analýza identifikácie druhu T. nigrohirta. Päť jedincov použitých pre „vzkriesenie“ druhu T. nigrohirta zo synonyma, bolo použitých na trénovanie. Medzi ďalšími jedincami bolo 5 exemplárov re- identifikovaných správne. Tento výsledok bol podporený tiež DNA analýzou a štúdiom morfologických znakov na samčom postabdomene, viď Kauza 5; “-“ žiadny materiál pre identifikáciu (podľa MURÁRIKOVEJ et al. 2010).

Trénovanie Identifikácia Druhy Celkove Správne Nesprávne Celkove Správne Nesprávne

T. lurida 40 40 0 ‐ ‐ ‐ T. ursina 17 17 0 ‐ ‐ ‐ T. nigrohirta 5 5 0 12 5 7 Celkový počet jedincov 62 62 0 12 5 7 % 100 100 0 100 42 58

4.5.2 Molekulárno-genetická analýza Boli urobené tri paralelné analýzy (obr. 9, 10, 11, viď Kauza 1). Z natrénovaných exemplárov (TSCH) boli analyzované dva jedince v ANN analýze. Ďalší jedinec, ktorý bol pôvodne určený ako T. nigrohirta, bol takto potvrdený aj na základe postabdomenu a správne identifikovaný pomocou ANN (z neznámych jedincov ČEP) a tiež molekulárnou analýzou.

4.5.3 Analýza samčieho postabdomenu Boli nájdené dôležité znaky na postabdomene (viď NOVOTNÁ et al. 2009) ktorými sa T. nigrohirta dá odlíšiť od druhu T. ursina. Štyri vzorky T. nigrohirta (ČEP, TSCH) boli analyzované a dva z nich boli tiež analyzované molekulárno-genetickými metódami (tab. 10).

4.5.4 Diskusia ku kauze 5 Opätovné zaradenie T. nigrohirty ako platného druhu do databázy Fauna Europaea podľa TSCHORSNIGA et al. (2004) bol správny. Druh T. nigrohirta je samostatným, platným druhom, tento záver sme získali rovnakými výsledkami všetkých troch polyfázových analýz (potvrdený i jeden jedinec, TSCH).

Výsledky

Obr. 9. Fylogenetický strom, skonštruovaný pomocou Bayesovskej analýzy na základe kombinovanej sekvencie génov 12S a 16S rDNA, s použitím modelu GTR+I+G, 677 bp, 47 jedincov+5 „outgroups“; počet generácií ngen=1 500 000; číselné hodnoty pri jednotlivých vetvách predstavujú posteriórne pravdepodobnosti, uvedené sú len hodnoty väčšie ako 50%.

Výsledky

Obr. 10. Fylogenetický strom, skonštruovaný pomocou Bayesovskej analýzy na základe kombinovanej sekvencie génov 12S a 16S rDNA (334 bp 12S a 343 bp 16S rDNA)+12 morfologických znakov na postabdomene, s použitím modelu GTR+I+G, 689 bp, 26 jedincov + 5 „outgroups“; počet generácií ngen=1 500 000; číselné hodnoty pri jednotlivých vetvách predstavujú posteriórne pravdepodobnosti, uvedené sú len hodnoty väčšie ako 50%. Z druhu T. nupta sú v analýze obsiahnuté len jedince z Japonska (podľa Novotná et. al. 2009).

Výsledky

Obr. 11. Fylogenetický strom, skonštruovaný pomocou Bayesovskej analýzy na základe kombinovanej sekvencie génov 12S, 16S rDNA, CO I a CYT B, s použitím modelu GTR+I+G, 1495 bp, 11 jedincov + 3 „outgroups“; počet generácií ngen=1 500 000; číselné hodnoty pri jednotlivých vetvách predstavujú posteriórne pravdepodobnosti, uvedené sú len hodnoty väčšie ako 50%. Navrhovaný nový podrod pre druh T. magna je pravdepodobne sesterská skupina podrodu Servillia a druh T. praeceps z podrodu Echinogaster je bazálna línia rodu Tachina, blízko k pôvodnému podrodu Tachina s.str. (podľa Novotná et. al. 2009).

Všetky informácie o tom, ako boli ďalšie jedince určené prostredníctvom jednotlivých metód, sú dostupné v prílohe na disku CD (tab. 10).

Záverečná diskusia

5 Záverečná diskusia

Táto práca mala za úlohu podať odpovede na vybrané taxonomické problémy u západopalaearktických druhov rodu Tachina a preveriť možnosti využitia umelých neurónových sietí (ANN) pre determináciu taxónov. Na štúdium boli použité tri na sebe nezávislé a metodicky odlišné metódy (viď ANN – MURÁRIKOVÁ et al. 2010 a molekulárno- genetická analýza a štúdium samčieho postabdomenu – NOVOTNÁ et al. 2009). Najprv sme zistili v Kauze 1 všetkými tromi metódami (viď obr. 9, 10, 11 a obr. 18,

19, 20 – NOVOTNÁ et al. 2009), že podrod Tachina vyžaduje vnútornú úpravu taxonomického pojatia. V analýzach stojí totiž druh T. magna bližšie k druhom z podrodu Servillia ako k druhu T. grossa, s ktorým sa pôvodne nachádzal v podrode Tachina. Táto príbuznosť nás najviac prekvapila a z analýzy morfologických dát sa zdá byť omnoho výraznejšia ako z analýzy molekulárno-genetických znakov. Bolo by teda vhodné oddeliť od seba druhy T. grossa a T. magna do rozdielnych podrodov. Podrody Eudoromyia, Servillia a Echinogaster sú dobre formulované na základe výsledkov molekulárno-genetickej analýzy, ale niektorí autori ich neuznávajú. Z tohto hľadiska je možné hovoriť o dvoch prístupoch – o európskom – B. Herting (†2004) – skorší a H.-P. Tschorsnig – súčasný a o prístupe americkom – O´Hara. Herting a Tschorsnig rozdeľujú druhy do viacerých podrodov, ktoré vybudovali na predtým samostatných rodoch, ich názvy tak použili pre úroveň podrodov. HERTING (1984) a TSCHORSNIG & HERTING (1994) tak uznávajú v rode Tachina spomínané štyri podrody, kým kanadský tachinológ O´Hara uznáva z týchto štyroch podrodov len podrod Tachina a do rodu Tachina dokonca ešte pridal nový podrod Nowickiu (O´HARA et al. 2009, O´HARA 2010). Nowickia bola doposiaľ uznávaná ako samostatný rod (HERTING 1984, TSCHORSNIG & HERTING 1994). O´Harove rozdelenie rodu Tachina nie je však zdôvodnené ani v uvedenej, ani v nasledujúcich publikáciách. Autor túto novú štruktúru nepodložil žiadnymi molekulárno-genetickými, ani inými analýzami, jedná se teda vlastne len o intuitívne rozdelenie. V našom výskume sme teda vychádzali z dnes už klasického členenia, ktoré sa nám v našom výskume podarilo aj potvrdiť. Rod Tachina sa javí takto ako dobre vymedzený. Sme si vedomí toho, že toto sú závery, postavené len na západopalearktickom materiále, aj keď, naopak, O’Hara postavil svoje poňatie zaradenia len na čínskom materiále. Je však pripravená cesta pre budúcich autorov, aby takýto výskum rozšířili i o východopalearktické druhy, prípadne sa tiež zaoberali štúdiom ďalších, veľmi blízkych rodov, ako, napr., Schineria tergestina Rondani, 1857, ktorý

Záverečná diskusia

sa stavia na základe štúdia samčieho genitálu do veľmi príbuzného vzťahu s rodom Tachina (bohužiaľ sa nepodarilo získať použiteľný materiál pre molekulárne alebo ANN analýzy). Zaujímalo nás tiež, či je možné indikovať ďalšími metódami aj nový druh pre vedu (viď Kauza 2). Vytipovaní jedinci boli, na základe štúdia samčieho genitálu, analyzovaní molekulárne aj a pomocou ANN. Opäť všetkými tromi metódami bol nový druh potvrdený. Skutočne i ekologicky sa odlišuje výskytom vo vyšších nadmorských výškach, ako už pred časom publikovali ZIEGLER & LANGE ( 2001, 2006) a TSCHORSNIG et al. 2003). Tiež jedince, ktoré sme našli my, pochádzajú z lokalít, ktoré majú nadmorskú výšku približne od 1000 m n. m. a viac – pohorie Vtáčnik (SR). Ďalej boli analyzované dva neznáme jedince z francúzskych Álp (vo fylogenetickom strome – obr. 9 označené ako T. sp. n. 1 a 2). Pri týchto jedincoch bol predpoklad, že budú určené ako sp. n., podľa lokality, ktorú teóriu sme tiež potvrdili. Vo všeobecnosti zaraďujeme druhy T. fera, T. casta, T. canariensis a nový druh T. sp. n. do skupiny druhov okolo druhu T. fera. Podľa všetkých analýz sú to skutočne rozdielne druhy. Ďalej nás zaujímalo, či sa druh T. casta z tejto skupiny vyskytuje v strednej Európe. Získali sme J. Čepelákom determinovanú skupinu 22 jedincov (ako syn. T. lefebvrei), ktoré sme podrobili i nášmu výskumu všetkými tromi metódami. Zistili sme, že žiaden jedinec „T. lefebrei“ det. Čepelák zo Slovenska nebol T. casta. Znamená to, že na Slovensku sa tento druh nevyskytuje. Ako T. casta bol určený len 1 jedinec, determinovaný Čepelákom, pochádzajúci zo srbskej lokality, čo zodpovedá Čepelákovej spolupráci

(napr. SISOJEVIC & ČEPELÁK 1987). To znamená, že dokázal určiť tento druh, v prípade slovenských nálezov však došlo v niektorých prípadoch k jeho zámene napr. aj s vyššie uvedeným novým druhom. Táto zámena však bola ľahko možná, pretože oba druhy patria do rovnakej skupiny druhu okolo T. fera. Podľa našich záverov bolo vylúčenie T. casta zo zoznamu druhov Slovenska urobené na základe morfológie a rozšírenia už skôr, správne

(VAŇHARA et al., 2004). Taxonomickým problémom bola tiež validita druhu T. nupta, t. j., či je alebo nie je len synonymom druhu T. magnicornis. Skúmali sa dve skupiny vzoriek – jedince zo západného a jedince z východného Palaearktu. Podarilo sa nám odlíšiť dve skupiny len analýzou postabdomenu, pretože pre ďalšie štúdium chýbal materiál. HERTING (1984) síce urobil z japonského poddruhu synonymum „nupty“, ale my sme ho bezproblémovo odlíšili a máme ho aj v kľúči NOVOTNÁ et al. (2009), vytvorenom podľa znakov na samčom

Záverečná diskusia

postabdomene. Odlíšili sme ho tiež od ostatných druhov, vrátane T. magnicornis, čo dokumentuje jeho druhový štatút. Chýba nám však skutočná európska „nupta“. Súbežne s nami CERRETTI (2010) po preštudovaní typového materiálu T. nupta ju zosynonymizoval s T. magnicornis. Náš exemplár (BAR), ktorý bol použitý do kľúča podľa postabdomenu, ako predstaviteľ „nupty“, sa po synomizácii „nupty“ líši od typového materiálu, takže je veľmi pravdepodobné, že sa jedná o taxonomickú novinku. Tento jedinec však, bohužiaľ, nebol použiteľný na molekulárno-genetické analýzy, pretože bol uložený vo formaldehyde a pre ANN analýzu je potrebných viac takých jedincov. Z východnej T. nupta (T. nupta hokkaido sensu Herting) bolo k dispozícii len 6 samcov z japonských lokalít. O japonskej „nupte“ sa už dlho hovorí medzi tachinológmi, ako o samostatnom druhu, avšak, bez toho, aby to niekto doriešil. Celkovo sme teda analyzovali tri skupiny jedincov pôvodne určených ako T. nupta: 1. skup.: západopalaearktická T. nupta –zmienený 1 jedinec odlíšený od japonských jedincov T. nupta na základe analýzy znakov na postabdomene (BAR, viď vyššie, ale odlišný od súčasného synonymného typového materiálu T. nupta), 2. skup.: východopalaearktické jedince (z Japonska) a 3. skup.: všetky ostatné jedince z európskeho priestoru, ktoré boli rôznymi autormi pôvodne určené ako T. nupta, ale po našich analýzach sa začlenili do iných druhov. Za povšimnutie stojí ešte jedinec, patriaci do rovnakej skupiny druhov okolo T. magnicornis, označený vo fylogenetickom strome ako T. corsicana 3 (obr. 9). Hoci tento druh nebol predmetom riešenia nejakého taxonomického problému, objavila sa tu istá nezrovnalosť. Tento jedinec pochádza z Tuniska a nepričlenil sa priamo k ďalším dvom jedincom tohoto druhu (v strome označené ako T. corsicana 1 a 2). Tieto dva jedince pochádzajú z Grécka, tak je možné, že sú to dve rôzne populácie (postupne sa odlišujúce) alebo dokonca aj iný druh. Nestabilný podrod Eudoromyia je fylogeneticky mladý, zástupcovia tohto podrodu sa vyskytujú na území celého Palaearktu a výrazný pokrok by prinieslo štúdium zástupcov rôznych populácií z celého regiónu. Dôležité informácie by nám poskytol molekulárny výskum ďalších DNA markerov a štúdium fylogeografie modelových druhov, taký výskum je však limitovaný súčasnou ťažkou nedostupnosťou väčšiny východopalearktického materiálu a keď sa ho aj podarí získať, je obvykle nepoužiteľný pre molekulárne analýzy vzhľadom k vysokému veku materiálu a tým aj degradovanej DNA.

Záverečná diskusia

Posledným taxonomickým problémom bolo potvrdenie validity druhu T. nigrohirta, pred časom navrátenej do systému. Analyzovali sme päť jedincov, na základe ktorých H. P. Tschorsnig opätovne zaradil druh T. nigrohirta do európskej fauny. Všetkými tromi metódami sa nám podarilo tento druh tiež potvrdiť, takže bezpochyby je T. nigrohirta validným, samostatným druhom. Diskutabilná a tiež prekvapivá je však väčšia príbuznosť druhov T. lurida a T. nigrohirta, než druhov T. ursina a T. nigrohirta. Druh T. nigrohirta bol na základe viacerých morfologických podobností uznávaný nanajvýš ako poddruh druhu T. ursina

(HERTING 1984, HERTING & DELY-DRASKOVITS 1993). Autori, ktorí druh považujú za validný, tak väčšinou robia s poznámkou, že sa môže jednať o variantu druhu T. ursina

(TSCHORSNIG & HERTING 1994). Štúdium modelových skupín druhov čeľadi Tachinidae, postavenej na polyfázovom prístupe, prinieslo okrem nových taxonomických poznatkov tiež veľmi zásadné molekulárne a morfologické potvrdenie, že neurónové siete pracujú správne a že sa ich dá použiť k determinácii taxónov, čo je základný stupeň pre všetky nadväzujúce štúdiá. Metódu ANN sme vôbec prvý raz aplikovali na bystruše v rode Tachina a Eudoromyia v roku 2007 – VAŇHARA et al. 2007 a vôbec prvý raz sme tiež túto metódu podporili ďalšími analýzami, na princípe polyfázie – MURÁRIKOVÁ et. al. (2010). Znaky na analýzu boli vybrané jednak na krídle, so zámerom, primárne použiť odlišné znaky, ako doposiaľ využívané v kľúčoch (TSCHORSNIG & HERTING 1994). Tieto znaky boli vcelku dostačujúce, avšak, pri detailnom štúdiu jedincov boli na ich posilnenie použité aj niektoré ďalšie znaky, vrátane nami publikovaných zo samčieho postabdomenu. Aj keď kľúčové znaky sú v niektorých prípadoch diskutabilné, pretože sa častokrát jedná o kvalitatívne znaky (farba nejakej časti tela), do ANN analýzy boli postačujúce, pretože na trénovanie sme vyberali len také jedince, u ktorých boli tieto znaky určené jednoznačne. Istý problém teda spôsobuje vysoká variabilita jedincov niektorých druhov. Osvedčilo sa nám tiež využitie principu sub-databází pre možnú analýzu len časti druhov. Pre každú kauzu bola tak vybraná z celkovej databázy len tá časť materiálu, ktorá odpovedala potrebnému druhovému výberu pre každú kauzu.

Záverečná diskusia

Metóda ANN poskytuje pre účely taxonomického výskumu celý rad výhod (VAŇHARA et al. 2010): 1. predstavuje významný nástroj pre polo- alebo plnoautomatickú identifikáciu nielen Tachinidae ale aj iného druhu hmyzu, 2. umožňuje identifikáciu jedincov na rôznych taxonomických úrovniach, 3. je schopná riešiť taxonomické problémy, 4. je schopná určiť aj ťažko rozlíšiteľné druhy alebo označiť (nepriamo) nový druh, 5. kvalita identifikácie je úmerná počtu výskumného materiálu, použitého pre trénovanie, 6. má schopnosť porovnávať všetky dostupné znaky súčasne, 7. po natrénovaní je jej výkonnosť oveľa vyššia v porovnaní s inými metódami, 8. je použiteľná pre spracovanie informácií aj s neúplnými vstupnými dátami.

Perspektívy využitia ANN v budúcnosti: Pre špecifické vlastnosti a schopnosti spracovania údajov na inej ako štatistickej úrovni predstavujú ANN výrazné možnosti pri správnej identifikácii druhov a ich systematickej klasifikácii. Táto metóda má veľký význam aj pri označovaní nových druhov. Použitím špecializovaných počítačových programov sa proces determinácie výrazne urýchľuje a zároveň sa dáta uchovávajú, čím je možné konštruovať databázy pre širšie využitie (vedeckou verejnosťou). Prenos informácií následne umožňuje intenzívnu spoluprácu odborníkov z rôznych častí sveta a tým aj spoľahlivé štúdium taxonomických problémov. Ideálom by bola automatická determinácia hmyzu pri vhodnom výbere znakov.

Na výskum sme použili štyri mitochondriálne gény (12S, 16S rDNA, CO I a CYT B). Mitochondriálne gény sú všeobecne považované za variabilnejšie, a preto sú oveľa vhodnejšie pre nižšie taxonomické úrovne, než jadrové gény. Analýza štyroch uvedených génov nám stačila na podporu riešenia našich taxonomických problémov. Analyzovali sme aj jadrové, ale vhľadom k tomu, že materiál bol vo viacerých prípadoch starší (vek sa blížil k 20. roku), analýza jadrových génov nebola úspešná.

Záver

6 Záver

Tri nezávislé, principiálne odlišné a paralelné metódy jednoznačne podporili princípy polyfázovej (=integračnej) taxonómie, aplikovanej na dvojkrídlovce. Sme si vedomí toho, že existujú ešte aj ďalšie nástroje (napr. matematické), ktoré by bylo možné využiť. Avšak, už na základe tohoto modelového projektu sme dospeli k záveru, že princíp polyfázovej taxonómie by sa mal používať omnoho častejšie a rovnako aj pre iné skupiny hmyzu, s cieľom dosiahnuť konsenzus hodnotenia, na základe paralelne použitých numerických, genotypových a fenotypových vstupov.

Zoznam použitej literatúry

7 Zoznam použitej literatúry

ALDRICH, B. T., MAGHIRANG, E. B., DOWELL, F. E. & KAMBHAMPATI, S. 2007. Identification of termite species and subspecies of the genus Zootermopsis using near-infrared reflectance spectroscopy. J. Insect Sci. Vol. 7, Article 18., 7 pp. ISSN: 1536-2442 (Electronic). Online http://www.insectscience.org/7.18/ (XI, 2010).

BECKENBACH, A. T. & BORKENT, A. 2003. Molecular analysis of the biting midges (Diptera, Ceratopogonidae) based on mitochondrial cytochrome oxidase subunit 2. Mol. Phylogenet. Evol. 27: 21–35.

BELSHAW R. 1993. Tachinid flies (Diptera: Tachinidae). Handbook for identification of British insect. Vol.10, part 4a(i), 169 pp. Royal Ent. Soc., London.

BERNASCONI, M. V., PAWLOWSKI, J., VALSANGIACOMO, C., PIFFARETTI, J.-C., & WARD, P. I. 2000. Phylogeny of the Scathophagidae (Diptera, Calyptratae) based on mitochondrial DNA sequences. Mol. Phylogenet. Evol. 16: 308–315.

BEZZI, M. & STEIN, P. 1907. Tachinidae (Cyclorrhapha Schizophora: Schizometopa). pp. 189– 584 in Becker, T., Bezzi, M., Kertész, K. & Stein, P. (Eds) Katalog der paläarktischen Dipteren, bd. 3. Budapest, Hungary.

BISHOP, C. M. 1994. Neural networks and their applications. Rev. Sci. Instruments 65 (6): 1803–1832.

BYBEE, S. M., TAYLOR, S. D., NELSON, C. R. & WHITING, M. F. 2004. A phylogeny of robber flies (Diptera: Asilidae) at the subfmilial level: molecular evidence. Mol. Phylogenet. Evol. 30: 789–797.

CAMERON, S. L., LAMBKIN, C. L., BARKER, S. C. & WHITING, M. F. 2007. A mitochondrial genome phylogeny of Diptera: whole genome sequence data accurately resolve relationships over broad timescales with high precision. Syst. Entomol. 32: 40–59.

Zoznam použitej literatúry

CASTRO, L. R. & DOWTON, M. 2007. Mitochondrial genomes in the Hymenoptera and their utility as phylogenetic markers. Syst. Entomol. 32: 60–69.

CERRETTI P. 2010. I tachinidi della fauna Italiana (Diptera, Tachinidae). 1° vol. 573 pp., 2° vol. 339 pp. / 1 CD-R. Cierre Edizioni, Verona, Italy. ISBN 978-88-8314-569–8.

CLARK, J. Y. 2003. Artificial neural network for species identification by taxonomists. BioSystems 72: 131–147.

COLWELL, R. R. 1970. Polyphasic taxonomy of the genus Vibrio: numerical taxonomy of Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, and related Vibrio species. J. Bacter. 104: 410– 433.

COOK, C. E., AUSTIN, J. J. & DISNEY, H. L. 2004. A mitochondrial 12S and 16S rRNA phylogeny of critical genera of Phoridae (Diptera) and related families of Aschiza. Zootaxa 593: 1–11.

CRANSTON, P. 2005. Ancient and modern – toolboxes for e-bugs. Systematic Entomology 30: 183–185.

CULVERHOUSE, P. F., SIMPSON, R. G., ELLIS, R., LINDLEY, J. A., WILLIAMS, R., PARISINI, T.,

REGUERA, B., BRAVO, I., ZOPPOLI, R., EARNSHAW, G., MCCALL, H., SMITH, G. 1994. Automatic classification of field-collected dinoflagellates by artificial neural network. Mar. Ecol. Prog. Ser. 139: 281–287.

ČEPELÁK, J. 1971.Tachinidae, 1–19. In: JEŽEK, J.: Systematický přehled druhů řádu Diptera zjištěných na území Československa. [A preliminary list of Czechoslovak Diptera]. Národní muzeum, Praha.(Cyklostilovaný manuskript).

ČEPELÁK, J. 1987. Tachinidae, pp. 305–320. In: Ježek, J., Check list of Czechoslovak Insects II (Diptera). Acta Faun. Ent. Mus. Nat. Praha Vol. 18, 342 pp.

ČEPELÁK, J. & VAŇHARA, J. 1997. Tachinidae, pp. 100–106. In: Chvála, M. (ed.), Check List of Diptera (Insecta) of the Czech and Slovak Republics. Karolinum, Praha.

Zoznam použitej literatúry

DALE, K., & COLLETT, T. S. 2001. Using artificial evolution and selection to model insect navigation. Current Biology 11: 1305–1316.

DO, M. T., HARP, J. M. & NORRIS, K.C. 1999. A test of a pattern recognition system for identification of spiders. Bull. Ent. Res. 89: 217–224.

FEDOR, P., MALENOVSKÝ, I., VAŇHARA, J., SIERKA, W. & HAVEL, J. 2008. Thrips (Thysanoptera) identification using artificial neural networks. Bull. Ent. Res. 98: 437–447.

FEDOR, P., VAŇHARA, J., HAVEL, J.,MALENOVSKÝ, I. & SPELLERBERG, I. 2009. Artificial intelligence in pest insect monitoring. Syst. Entomol. 34: 398–400.

FRANCOY, T. M., WITTMANN, D., DRAUSCHKE, M., MÜLLER, S., STEINHAGE, V., BEZERRA-

LAURE, M. A. F., DE JONG, D. & GONÇALVES, L. S. 2008. Identification of Africanized honey bees through wing morphometrics: two fast and efficient procedures. Apidologie 39: 488– 494.

GARRAFFONI, A. R. S., CAMAGO, M. D. 2007. A new application of morphometrics in a study of the variation in uncinal shape present within the Terebellidae (Polychaeta): a reevaluation from digital images. Cahiers de Biologie Marine 48: 229–240.

GEVREY, M. & WORNER, S. P. 2006. Prediction of global distribution of insect pest species in relation to climate by using an ecological informatics method. J. Econ. Entomol. 99(3): 979– 986.

GRIFFITHS, G. C. D. 1972. The phylogenetic classification of Diptera Cyclorrhapha with special reference to the structure of the male postabdomen. Dr. W. Junk N. V., Publishers, The Hague, 340 pp.

GRIFFITHS, G. C. D. 1982. Anthomyiidae. In: Griffiths, G. C. D., . (ed.), Flies of the Nearctic Region. Vol. 8, Part 2 (No 1), pp.1–160. Schweizerbart. Verl., Stuttgart.

GURYEV, V., MAKAREVITCH, I., BLINOV, A. & MARTIN, J. 2001. Phylogeny of the enus

Chironomus (Diptera) Inferred from DNA Sequences of Mitochondrial Cytochrome b and Cytochrome oxidase I. Mol. Phylogenet. Evol. 19: 9–21. 63

Zoznam použitej literatúry

HERNÁNDEZ-BORGES, J., CORBELLA-TENA, R., RODRIGUEZ- DELGADO, M. A., GARCIA-

MONTELONGO, F. J. & HAVEL, J. 2004. Content of aliphatic hydrocarbons in limpets (Patella) as a new way for classification of species using Artificial Neural Networks. Chemosphere. 54: 1059–1069.

HERTING, B. 1984. Catalogue of Palearctic Tachinidae (Diptera). Stutt. Beitr. Naturk., Serie A (Biologie) 383: 1–137.

HERTING, B. & DELY-DRASKOVITS, Á. 1993. Tachinidae. pp. 118–458. In: Soós, Á. & Papp, L. (Eds) Catalogue of Palaearctic Diptera, vol. 13. Budapest, Hungary, Hungarian Natural History Museum.

CHESMORE, E. D. 2001. Application of time domain signal coding and artificial neural networks to passive acoustical identification of animals. Applied Acoustics 62: 1359–1374.

CHESMORE, E. D. 2004. Automated bioacoustic identification of species. Anais da Academia Brasileira de Ciencias 76: 435–440.

CHESMORE, E. D. & OHYA, E. 2004. Automated identification of field-recorded songs of four British grasshoppers using bioacoustic signal recognition. Bull. Ent. Res. 94 (4): 319–330.

CHAO, C., SHI, Y., ZHOU, S., CHEN, R., LIANG, E. & SUN, X. 1998. Tachinidae. pp. 1661–2206. In: Xue, W. & Chao, C. (Eds) Flies of China, vol. 2. Shenyang, China, Liaoning Science & Technology Press (v čínštine).

KEHLMAIER, CH., ASSMANN, T. 2010. Molecular analysis meets morphology-based systematics – a synthetic approach for Chalarinae (Insecta: Diptera: Pipunculidae). Syst. Entomol. 35: 181–195.

KRZYWINSKI, J., WILKERSON, R. C. & BESANSKY, N. J. 2001. Evolution of mitochondrial and ribosomal gene sequences in Anophelinae (Diptera: Culicidae): Implications for phylogeny reconstruction. Mol. Phylogenet. Evol. 18: 479–487.

Zoznam použitej literatúry

KUMAR, S., TAMURA, K. & NEI, M. 2004. MEGA3: Integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment. Brief. Bioinform. 5: 150–163.

KUTTY, S. N., PAPE, T., PONT, A., WIEGMANN, B. M. & MEIER, R. 2008. The Muscoidea (Diptera: Calyptratae) are paraphyletic: Evidence from four mitochondrial and four nuclear genes. Mol. Phylogenet. Evol. 49: 639–652.

LUNT, D. H., ZHANG, D.-X., SZYMURA, J. M. & HEWITT, G. M. 1996. The insect cytochrome oxidase I gene: evolutionary patterns and conserved primers for phylogenetic studies. Insect Mol. Biol. 5: 153–165.

LA SALLE, J.,WHEELER,Q., JACKWAY, P.,WINTERTON, S.,HOBERN, D.& LOVELL, D. 2009. Accelerating taxonomic discovery through automated character extraction. Zootaxa. 2217: 43–55.

MACLEOD, N., O’NEILL, M. & WALSH, S. A. 2007. A comparison between morphometric and Artificial Neural Network approaches to the automated species recognition problem in systematic. pp. 37–62.In: Curry, G. B. & Humphries, C. J. (Eds) Biodiversity Databases: Techniques, Politics, and Applications. The Systematics Association, special vol. 73. Boca Raton, FL, USA, CRC Press.

MACLEOD, N. (Ed.) (2008) Automated taxon identification in systematics. Theory, approaches and applications. The systematics association, special vol. 74, Boca Raton, FL, USA, CRC Press 339 pp.

MARCONDES, C. B. & BORGES, P. S. 2000. Distinction of males of the Lutzomyia intermedia (Lutz & Neiva, 1912) species complex by ratios between dimensions and by an Artificial Neural Network (Diptera: Psychodidae, Phlebotominae). Memorias del Instituto de Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro 95: 685–688.

Zoznam použitej literatúry

MCALPINE, J. F. 1981. Morphology and terminology – adults, pp. 9–63. In: McAlpine, J. F., (eds.), Manual of Nearctic Diptera. Vol 1., 674 pp. Research Branch, Agriculture Canada, Ottawa. Agric. Can. Monograph No. 27.

MESNIL, L. P. 1966. Larvaevorinae (Tachininae). pp. 881–928. In: Lindner, E. (Ed.) Die Fliegen der Palaearktischen Region 64 g. Stuttgart, Germany, Schweizerbart.

MIHÁLYI F. 1986. Fürkészlegyek – Aszkalegyek, Tachinidae – Rhinophoridae. Fauna Hungariae, 161, 15 (14–15), 425 pp. Akad. Kiadó, Budapest. (v maďarčine.).

MILLER, S. E. 2007. DNA barcoding and the renaissance of taxonomy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 104, 4775–4776. Online: http://www.pnas.org/content/104/12/4775.full (III, 2010).

MOORE, A. 1991. Artificial Neural Network trained to identify mosquitoes in flight. J. Ins. Behav. 4: 391–396.

MURÁRIKOVÁ, N., VAŇHARA, J., TÓTHOVÁ, A. & HAVEL J. 2010: Polyphasic approach applying Artificial Neural Networks, molecular analysis and postabdomen morphology to West Palaearctic Tachina spp. (Diptera, Tachinidae). Bull. Ent. Res. 100: 1–11, doi:10.1017/S0007485310000295.NIHEI, S. S. & DE CARVALHO, C. J. B., 2006. Phylogeny and classification of Muscini (Diptera, Muscidae). Zool. J. Linn. Soc.London 149: 493–532.

NIRMALA, X., HYPŠA, V. & ŽUROVEC, M. 2001. Molecular phylogeny of Calyptratae (Diptera, Brachycera): the evolution of 18S and 16S ribosomal rDNAs in higher dipterans and their use in phylogenetic inference. Mol. Biol. 10: 475–485.

NOVOTNÁ, H., VAŇHARA, J., TÓTHOVÁ, A., MURÁRIKOVÁ, N., BEJDÁK, P. & ROZKOŠNÝ, R. 2009. Identification and taxonomy of the West Palaearctic species of Tachina Meigen (Tachinidae, Diptera) based on male terminalia and molecular analyses. Entomol. Fenn. 20: 139–169.

NYLANDER, J. A. A. 2004. MrModeltest v 2.3 [online]. Program distributed by the author, Evolutionary Biology Centre, Uppsala University [cit. 5. mája 2008]. Online: http://www.abc.se/~nylander. 66

Zoznam použitej literatúry

O´HARA, J. E. 1989. Systematics of the genus group taxa of the Siphonini (Diptera: Tachinidae). Quaest. Ent. 25: 1–229.

O´HARA, J. E. 2002. Revision of the Polideini (Tachinidae) of America North of Mexico.

Studia dipterologica. Supl. 10, 170 pp.

O´HARA, J. E. 2007. World genera of the Tachinidae (Diptera) and their regional occurence. Version 3.0., 71 pp. Online: www.nadsdiptera.org/ (IV, 2008).

O’HARA, J. E., SHIMA, H. & ZHANG, C. 2009. Annotated Catalogue of the Tachinidae (Insecta Diptera) of China. Zootaxa 2190: 1–236.

O’HARA, J. E., 2010: World genera of the Tachinidae (Diptera) and their regional occurrence. Version 5.0, 71 pp. Online: http://www.nadsdiptera.org/Tach/Genera/Gentach_ver5.pdf

O’NEILL, M. A. 2007. DAISY: A practical computer-based tool for semi-automated species identification. pp. 101–114. In: MacLeod, N. (Ed.) Automated taxon identification in systematics: Theory, approaches and applications. The Systematics Association, special vol. 74, Boca Raton, FL, USA, CRC Press. Online: http://www.tumblingdice.co.uk/daisy/ (III, 2010).

PAGE, R. D. 1996: TreeView: an application to display phylogenetic trees on personal computers. Computer Applied Bioscience 12: 357–358.

PAPE, T. 1992. Phylogeny of the Tachinidae family-group. Tijdschr. v. Entomol. 135: 43–86.

PARK, Y.-S. & CHUNG, Y.-J. 2006. Hazard rating of pine trees from a forest insect pest using artificial neural networks. For. Ecol. Manage., 222: 222–233.

PAWLOWSKI, J., SZADZIEWSKI, R., KMIECIAK, D., FAHRNI, J. & BITTAR, G. 1996. Phylogeny of infraorder Culicomorpha (Diptera: Nematocera) based on 28S RNA gene sequences. Syst. Entomol. 21: 167–178.

Zoznam použitej literatúry

PLATNICK, N.I., RUSSELL, K.N. & DO, M.T. 2005. SPIDA. Species IDentified Automatically: A neural network based automated identification system for biological species. Online: http://research.amnh.org/iz/spida/common/index.htm (III, 2010).

RINDAL, E., SOLI, G. E. E., BACHMANN, L. 2009. Molecular phylogeny of the fungus gnat family Mycetophilidae (Diptera, Mycetophiliformia). Syst. Entomol. 34: 524–532.

ROHÁČEK, J, TÓTHOVÁ, A., VAŇHARA, J. 2009. Phylogeny and affiliation of European Anthomyzidae (Diptera) based on mitochondrial 12S and 16S rRNA. Zootaxa 2054: 49–58.

RONQUIST, F. & HUELSENBECK, J. P. 2003. MRBAYES 3: Bayesian phylogenetic inference under mixed models. Bioinformatics 19: 1572–1574.

RUSSELL, K. N., DO, M. T., HUFF, J. C. & PLATNICK, N. I. 2008. Introducing SPIDA-Web: wavelets, neural networks and internet accessibility in an image-based automated identification system. pp. 131–152. In: MacLeod, N. (Ed.) Automated taxon identification in systematics: Theory, approaches and applications. The Systematics Association, special vol. 74, Boca Raton, FL, USA, CRC Press.

SAVAGE, J., WHEELER, T. A. & WIEGMANN, B. M. 2004. Phylogeentic analysis of the genus Thricops Rondani (Diptera, Muscidae) based on molecular and morphological characters. Syst. Entomol. 29: 395–414.

SIEGEL-CAUSEY, D., BROOKS, D. R., FUNK, V. A. 1991. The compleat cladist. a primer of phylogenetic procedures. University of Kansas Museum of Natural History Special Publication 19: 1–158.

SCHLICK-STEINER, B. C., STEINER, F. M.,SEIFERT, B. STAUFFER, C., CHRISTIAN, E. AND

CROZIER R.H. 2010: Integrative taxonomy: A multisource approach to exploring biodiversity. Annu. Rev. Entomol. 55: 421–38.

SIMMONS, R. B. & WELLER, S. J. 2001. Evolution and Utility of Cytochrome b in Insects. Mol. Phylogenet. Evol. 20: 196–210.

Zoznam použitej literatúry

SINCLAIR B. J. 2000. Morphology and terminology of Diptera male terminalia, pp. 53–74. In: Papp L. & Darvas B., Manual of palaearctic Diptera. Vol. 1., 978 pp., Science Herald, Budapest.

SISOJEVIČ, P. & ČEPELÁK, J. 1987. Prilog poznavanju faune parazitskich muva tachina (Diptera, Tachinidae) Jakovačkog Ključa (Donji Srem). /Contribution to the fauna of parastic flies (Diptera; Tachinidae) of Jakovački Ključ (Srem, Northern Serbia)/. Proc. Fauna of SR Serbia, 4: 117–158, 36 refs. (In Serb.; Engl. summ.).

SMITH, M. A., WOOD, D., JANZEN, D. H., HALLWACHS, W. & HEBERT, P. D. N. 2007. DNA barcodes affirm that 16 species of apparently generalist tropical parasitoid flies (Diptera, Tachinidae) are not all generalist. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104: 4967–4972.

SMITH, M. A., WOODLEY, N. E., JANZEN, D. H., HALLWACHS, W. & HEBERT, P. D. N. 2006. DNA barcodes reveal cryptic host-specificity within the presumed polyphagous members of a genus of parasitoid flies (Diptera: Tachinidae). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103: 3657–3662.

SPARKS, T. C., ANZEVENO, P. B., MARTYNOW, J. G., GIFFORD, J. M., HERTLEIN, M. B.,

WORDEN, T. V., KIRST, H. A. 2000. The application of artificial neural networks to the identification of new spinosoids with improved biological activity toward larvae of Heliothis virescens. Pestic. Biochem. Physiol. 67: 187–197.

STÅHLS, G., HIPPA, H., ROTHERAY, G., MUONA, J. & GILBERT, F. 2003. Phylogeny of Syrphidae (Diptera) inferred from combined analysis of molecular and morphological characters. Syst. Entomol. 28: 433–450.

STEIN, P. 1924. Die verbreitetsten Tachiniden Mitteleuropas nach ihren Gattungen und Arten. – Archiv für Naturgeschichte. Abteilung A, 6. Heft, pp. 1–271, Berlin.

STIREMAN, J. O., III. 2002. Phylogenetic relationships of tachinid flies in subfamily Exoristinae (Tachinidae: Diptera) based on 28S rDNA and elongation factor-1α. Syst. Entomol. 27: 409–435.

Zoznam použitej literatúry

STIREMAN, J. O. 2005. Phylogenetic reconstruction of Exoristinae using molecular data: a Bayesian re-analysis. In: O`Hara J. (ed.), The Tachinid Times 18. Newsletter. Agric. Canada, Ottawa, p. 4.

SWOFFORD, D. L. 2003. PAUP*. Phylogenetic Analysis Using Parsimony (*and Other Methods). Version 4.0 beta 10 win [CD-ROM]. Sinauer Associates, Sunderland.

TACHI, T., SHIMA, H. 2010. Molecular phylogeny of the subfamily Exoristinae (Diptera, Tachinidae), with discussions on the evolutionary history of female oviposition strategy. Syst. Entomol. 35: 148–163.

TÓTHOVÁ, A., BRYJA, J., BEJDÁK, P. & VAŇHARA, J. 2006. Molecular markers used in phylogenetic studies of Diptera with a methodological overview. In.: Dipterologica Bohemoslovaca. Vol. 13. Acta Univ. Carol., Biol. 50: 125–133.

TSCHORSNIG, H.-P. 1985a. Die Struktur des männlichen Postabdomens der Rhinophoridae (Diptera). Stutt. Beitr. Naturk. (A) 375, 18 pp.

TSCHORSNIG, H.-P. 1985b. Taxonomie forstlich wichtiger Parasiten: Untersuchungen zur Struktur des männlichen Postabdomens der Raupenfliegen (Diptera, Tachinidae). Stutt. Beitr. Naturk. (A) 383, 137 pp.

TSCHORSNIG, H.-P., BERGSTRÖM, C., BYSTROWSKI, C., CERRETTI, P., HUBENOV, Z., RAPER, C.,

RICHTER, V. A., VAN DE WEYER, G., VAŇHARA, J., ZEEGERS, T. & ZIEGLER, J. 2004. In: Pape T. (ed.), Fauna Europea: Diptera, Tachinidae. Fauna Europea, Version 1.1. Online: http://www.faunaeur.org.

TSCHORSNIG H.-P. & HERTING B. 1994. Die Raupenfliegen (Diptera: Tachinidae) Mitteleuropas: Bestimmungstabellen und Angaben zur Verbreitung und Ökologie der einzelnen Arten. Stutt. Beitr. Naturk. (A), 506, 170 pp.

TSCHORSNIG, H. P. & RICHTER, V. A. 1998. Family Tachinidae, pp. 691–827. In: Papp, L. & Darvas, B. (ed.). Contributions to a Manual of Palaearctic Diptera (with Special reference to flies of economic importance), Vol. 3: Higher Brachycera. Sci. Herald, Budapest.

Zoznam použitej literatúry

TSCHORSNIG, H.-P., ZIEGLER, J. & HERTING, B. 2003. Tachinid flies (Diptera: Tachinidae) from the Hautes-Alpes, France. Stuttgarter Beiträge zur Naturkunde, Serie A, No. 656: 1–62.

VANDAMME, P., POT, B., GILLS, M., DE VOS, P., KERSTERS, K. & SWINGS, J. 1996. Polyphasic taxonomy a consensus approach to bacterial systematics. Microbiol. Rev. 60: 407–438.

VAŇHARA, J., HAVEL, J. & FEDOR, P. 2010. Artificial Neural Networks (ANN) in Entomology. pp. 9–12. In: O’Hara, J. (Ed.) The Tachinid Times, vol. 23. Online: http:// www.uoguelph.ca/nadsfly/Tach/TTimes/TT23.pdf (III, 2010).

VAŇHARA, J., MURÁRIKOVÁ, N., MALENOVSKÝ, I. & HAVEL, J. 2007. Artificial Neural Networks for fly identification: a case study from the genera Tachina and Ectophasia (Diptera, Tachinidae). Biologia 62: 462–469.

VAŇHARA, J. & TSCHORSNIG, H.-P. 2009: Tachinidae Robineau-Desvoidy 1830. In: Jedlička L., Kúdela, M. & Stloukalová, V. (eds): Checklist of Diptera of the Czech Republic and Slovakia. Electronic version 2. http://zoology.fns.uniba.sk/diptera2009/Tachinidae.htm + CD- ROM: ISBN 978-80-969629-4-5. Online: http://zoology.fns.uniba.sk/diptera/

VAŇHARA, J., TSCHORSNIG, H.-P. & BARTÁK, M. 2004. New records of Tachinidae (Diptera) from the Czech Republic and Slovakia, with revised check-list. Studia dipterologica. 10 (2003): 679–701.

VAŇHARA J., TSCHORSNIG H.-P., HERTING B., MÜCKSTEIN P. & MICHALKOVÁ V. 2009. Annotated host catalogue for the Tachinidae (Diptera) of the Czech Republic. Entomol. Fenn. 20: 22–48.

VERBEKE, J. 1962. Contribution à l’étude des Tachinidae Africains (Diptera); Description et valeur taxonomique des Genitalia mâles; 2. Imitomyiini, Palpostomatini et Ethillini nouveaux ou peu connus. – Expl. Hydr. lacs Kivu, Edouard et Albert. Vol. 3, fasc. 4, pp. 79–187 + 25 plts.

VOSSBRINCK C.R. & FRIEDMAN S. 1989. A 28S ribosomal RNA phylogeny of certain cyclorrhaphous Diptera based upon a hypervariable region. Syst. Entomol. 14: 417–431.

Zoznam použitej literatúry

WEEKS, P.J.D. & GASTON, K.J. 1997. Image analysis, neural networks, and the taxonomic impediment to biodiversity studies. Biodivers. Conserv. 6: 263–274.

WEEKS, P. J. D., GAULD, I. D., GASTON, K. J. & O’NEILL, M. A. 1997. Automating the identification of insects: a newsolution to an old problem. Bull. Ent. Res. 87: 203–211.

WELLS, J. D. & SPERLING F. A. H. 1999. Molecular phylogeny of Chrysomya albiceps and C. rufifacies (Diptera:Calliphoridae). J. Med. Entomol. 36 (3): 222–226.

WELLS, J. D., PAPE, T. & SPERLING F. A. H. 2001. DNA-based identification and molecular systematics of forensicaly important Sarcophagidae (Diptera). J. Forensic. Sci. 46 (5): 1098- 1102.

ZIEGLER, J. & LANGE, C. H. 2001. Asselfliegen, Fleischfliegen und Raupenfliegen (Diptera: Rhinophoridae, Sarcophagidae, Tachinidae) aus Südtirol (Italien). Gredleriana 1: 133–170.

ZIEGLER, J. & LANGE, C. H. 2006. Raupenfliegen (Diptera: Tachinidae) aus dem Nationalpark Stilfserjoch (Norditalien): Teil 2. Forest Observer 2/3: 169–204.

ZIMIN, L. S. & KOLOMIETZ, N. G. 1984. [Parasitic Diptera of the USSR fauna (Diptera, Tachinidae)]. The Key. 233 pp., Nauka, Novosibirsk.

ZIMIN, L. S., ZINOVĚVA, K. B., SHTAKELBERG, A. A. 1970. Tachinidae (Larvaevoridae), pp. 678-798. In: Shtakelberg, A. A, Nartshuk, E. P. (Eds), [Diptera, Siphonaptera. Klíč hmyzu evropské části SSSR]. Vol. 5 (1–2), Nauka Leningrad.

Zoznam tabuliek

8 Zoznam tabuliek

Tab.1. Pôvod materiálu ...... 26

Tab. 2. Zoznam vybraných metrických a slovných znakov pre sub-databázy...... 27

Tab. 3. Použité jedince na molekulárno-genetickú analýzu...... 38

Tab. 7. ANN analýza identifikácie druhu T. nupta. Zo vzácneho európkskeho materiálu len 1 jedinec koreloval s trénovanými japonskými exemplármi. Tento výsledok bol podporený tiež štúdiom morfologických znakov na samčom postabdomene, viď Kauza 4; “-“ žiadny materiál pre identifikáciu (podľa MURÁRIKOVEJ et al. 2010)...... 48

Tab. 8. ANN analýza identifikácie druhu T. nigrohirta. Päť jedincov použitých pre „vzkriesenie“ druhu T. nigrohirta zo synonyma, bolo použitých na trénovanie. Medzi ďalšími jedincami bolo 5 exemplárov re-identifikovaných správne. Tento výsledok bol podporený tiež DNA analýzou a štúdiom morfologických znakov na samčom postabdomene, viď Kauza 5; “-“ žiadny materiál pre identifikáciu (podľa MURÁRIKOVEJ et al. 2010)...... 51

Zoznam obrázkov

9 Zoznam obrázkov

Obr. 1. Krídlo a časť tykadla jedinca z čeľade Tachinidae a vyznačené merané znaky 1–16 a 22. (upravené podľa TSCHORSNIG & HERTING 1994)...... 28 Obr. 2. Použité štruktúry na tele zástupcu Tachinidae, pre ANN analýzu – 19. a 24. znak vyznačené

červenou farbou (podľa TSCHORSNIG & HERTING 1994); humeral callus=postpronotum; apical bristles=apikálne štetiny...... 29 Obr. 3. Časť nohy (posledné dva články tarzu) s vyznačenými meranými dĺžkami pre ANN – 18. znak – na obr. časť tarzu, 20. znak (vyznačený modrými šípkami), 21. znak (vyznačený červenými šípkami); claw=pazúrik, 5th tarsal segment= 5. tarzálny segment (podľa TSCHORSNIG & HERTING 1994)...... 29 Obr. 4. Idealizovaná schéma samčieho postabdomenu dorzálne, T. (Eudoromyia) sp. Znaky č. 27-29. (podľa NOVOTNEJ et. al 2009)...... 30 Obr. 5. Idealizovaná schéma samčieho postabdomenu laterálne, T. (Servillia) sp. (Orig.). Znaky č. 25 a 26. (podľa NOVOTNEJ et al. 2009)...... 30

Obr. 6. Schéma jednoduchej 3-vrstvovej štruktúry ANN; matematické vyjadrenie ANN, v ktorom xi (xj) sú vstupy neurónu, wi (wij) sú synaptické váhy, tss je RMS, tij sú nami namerané (experimentálne) hodnoty, oij je výstup (output) neurónu – vypočítané hodnoty prostredníctvom ANN...... 32 Obr. 7. Závislosť kvadratického priemeru chyby na počte uzlov v skrytej vrstve ANN pre trojvrstvovú sieť, trénovaných 5 podrodov rodu Tachina...... 34 Obr. 8. Použitá trojvrstvová architektúra ANN na rozlíšenie podrodov, trénované s novým podrodom (a) a trénované bez nového podrodu (b). (MLP 24, 5, 4/or 5) (MURÁRIKOVÁ et al. 2010)...... 35 Obr. 9. Fylogenetický strom, skonštruovaný pomocou Bayesovskej analýzy na základe kombinovanej sekvencie génov 12S a 16S rDNA, s použitím modelu GTR+I+G, 677 bp, 47 jedincov+5 „outgroups“; počet generácií ngen=1 500 000; číselné hodnoty pri jednotlivých vetvách predstavujú posteriórne pravdepodobnosti, uvedené sú len hodnoty väčšie ako 50%...... 52 Obr. 10. Fylogenetický strom, skonštruovaný pomocou Bayesovskej analýzy na základe kombinovanej sekvencie génov 12S a 16S rDNA (334 bp 12S a 343 bp 16S rDNA)+12 morfologických znakov na postabdomene, s použitím modelu GTR+I+G, 689 bp, 26 jedincov + 5 „outgroups“; počet generácií ngen=1 500 000; číselné hodnoty pri jednotlivých vetvách predstavujú posteriórne pravdepodobnosti, uvedené sú len hodnoty väčšie ako 50%. Z druhu T. nupta sú v analýze obsiahnuté len jedince z Japonska (podľa Novotná et. al. 2009)...... 53 Obr. 11. Fylogenetický strom, skonštruovaný pomocou Bayesovskej analýzy na základe kombinovanej sekvencie génov 12S, 16S rDNA, CO I a CYT B, s použitím modelu GTR+I+G, 1495 bp, 11 jedincov + 3 „outgroups“; počet generácií ngen=1 500 000; číselné hodnoty pri jednotlivých vetvách predstavujú posteriórne pravdepodobnosti, uvedené sú len hodnoty väčšie ako 50%. Navrhovaný nový podrod pre druh T. magna je pravdepodobne sesterská skupina podrodu Servillia a druh T. praeceps z podrodu 74

Zoznam obrázkov

Echinogaster je bazálna línia rodu Tachina, blízko k pôvodnému podrodu Tachina s.str. (podľa Novotná et. al. 2009)...... 54 Obr. 12: Tachina (Eudoromyia) casta: Pravé krídlo, vrchný pohľad...... 78 Obr. 13: Tachina (Eudoromyia) casta: Pravé tykadlo, laterálny pohľad...... 78 Obr. 14: Tachina (Servillia) lurida: Pravé krídlo, vrchný pohľad...... 78 Obr. 15: Tachina (Servillia) lurida: Pravé tykadlo, laterálny pohľad...... 78 Obr. 16: Tachina (Eudoromyia) canariensis: Pravé krídlo, vrchný pohľad...... 78 Obr. 17: Tachina (Eudoromyia) canariensis: Pravé tykadlo, laterálny pohľad...... 78

Prílohy

Príloha 1 (publikácie, v ktorých sú prezentované výsledky, uložené na disku CD)

Článok A

Článok B

Článok C

Prílohy

Príloha 2 (tabuľky)

Tab. 9. Databáza meraných znakov k metóde ANN – uložené na disku CD Tab. 10. Materiál, použitý v jednotlivých analýzach – uložené na disku CD

Prílohy

Príloha 3 – príklady archivovanej podoby analyzovaných znakov na krídle a tykadle všetkých západopalaearktických druhov (fotografie krídiel a tykadiel jednotlivých druhov – pravá strana tela)

Obr. 12: Tachina (Eudoromyia) casta: Pravé Obr. 13: Tachina (Eudoromyia) casta: Pravé krídlo, vrchný pohľad. tykadlo, laterálny pohľad.

Obr. 14: Tachina (Servillia) lurida: Pravé krídlo, Obr. 15: Tachina (Servillia) lurida: Pravé tykadlo, vrchný pohľad. laterálny pohľad.

Obr. 16: Tachina (Eudoromyia) canariensis: Pravé Obr. 17: Tachina (Eudoromyia) canariensis: Pravé krídlo, vrchný pohľad. tykadlo, laterálny pohľad.

Prílohy

Príloha 4 (Curriculum vitae)

Osobné údaje Meno, priezvisko, titul: Natália Muráriková, Mgr. Dátum, miesto narodenia: 25. 06. 1981, Šaľa, Slovenská republika

Vzdelanie 2004–2010 Doktorandské štúdium – Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, odbor biológia, špecializácia zoológia

2004 Mgr., odbor biológia, špecializácia zoológia, diplomová práca: Druhy skupiny Simulium reptans na Slovensku (Diptera: Smuliidae)

1999–2004 Magisterské štúdium – Univerzita Komenského v Bratislave, Prírodovedecká fakulta, odbor biológia, špecializácia zoológia

Zamestnanie 2005–2008 Čiastočný pracovný úväzok – odborný pracovník, Ústav botaniky a zoologie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita v Brně

Pedagogické skúsenosti (pomoc pri výuke) 2004–2005 Zoológia bezstavovcov– cvičenia, Masarykova univerzita, Brno,

2004–2006 Zoológia bezstavovcov – Bransouze – terénne cvičenia, Masarykova univerzita, Brno

2006–2007 Entomológia – cvičenia, Masarykova univerzita, Brno

Prílohy

Výskum 1999–2004 Diptera, čeľaď Simuliidae, Prírodovedecká fakulta, UK Bratislava

2004–2010 Diptera, čeľaď Tachinidae, Přírodovědecká fakulta, MU Brno

Účasť v grantových projektoch

2005–2008 Doktorský grant GA ČR GD524/05/H536: Evolučně ekologická analýza biologických systémů: výzkumné centrum DSP

2005–2008 ÚBZ PřF MU Brno: Výskumný zámer MSM0021622416: Diverzita biotických společenstev a populací: kauzální analýza variability v prostoru a čase

Účasť na medzinárodných konferenciách (vybrané) 7. International Congress of Dipterology, San José, Kostarika, 2010, poster 23. International Congress of Entomology, Durban, Juhoafrická republika, 2008, poster 6. International Congress of Dipterology, Fukuoka, Japonsko, 2006, aktívna prednáška

Členstvo v odborných spoločnostiach Česká entomologická spoločnosť SOVS – Spoločnosť pre ochranu vtáctva na Slovensku

Prílohy

Príloha 5 (Zoznam vlastných publikácií) a) Časopisy s IF

MURÁRIKOVÁ, N., VAŇHARA, J., TÓTHOVÁ, A. & HAVEL, J. 2010. Polyphasic approach applying Artificial Neural Networks, molecular analysis and postabdomen morphology to West Palaearctic Tachina spp. (Diptera, Tachinidae). Bull. Ent. Res. 100: 1–11, doi:10.1017/S0007485310000295. IF=1,580

NOVOTNÁ, H., VAŇHARA, J., TÓTHOVÁ, A., MURÁRIKOVÁ, N., BEJDÁK, P., TKOČ, M. &

ROZKOŠNÝ, R. 2009. Identification and taxonomy of the West Palaearctic species of Tachina Meigen (Tachinidae, Diptera) based on male terminalia and molecular analyses. Entomol. Fenn. 20: 139–169. IF=0,410

VAŇHARA, J., MURÁRIKOVÁ, N., MALENOVSKÝ, I. & HAVEL, J. 2007. Artificial neural networks for fly identification: A case study from the genera Tachina and Ectophasia (Diptera, Tachinidae). Biologia 62: 462–469. IF=0,213

b) Recenzované časopisy

VAŇHARA, J., MURÁRIKOVÁ, N., MALENOVSKÝ, I. & HAVEL, J. 2007. Artificial neural networks for insect identification. pp. 8–9. In: O’Hara, J. (Ed.) The Tachinid Times, vol. 20. c) Účasť na konferenciách

VAŇHARA, J., TÓTHOVÁ, A., MURÁRIKOVÁ, N., ONDROUCHOVÁ, H. & HAVEL, J. 2010. New views on the taxonomy of Tachina spp. (Tachinidae): West Palaearctic species. In: 7th International Congress of Dipterology, San José, Kostarika.

VAŇHARA, J., FEDOR, P., MALENOVSKÝ, I., MURÁRIKOVÁ, N. & HAVEL, J. 2008. Insect identification using Artificial Neural Networks (ANN). In: Proceedings CD incl. Abstracts and Author´s List ICE 2008. CD s abstraktmi, Durban, Juhoafrická republika.

Prílohy

MURÁRIKOVÁ, N., NOVOTNÁ, H. TÓTHOVÁ, A., BRYJA, J., BEJDÁK, P. & VAŇHARA, J. 2007. Fylogenéza západopalaearktických druhov rodu Tachina (Diptera, Tachinidae) na základe morfologických a molekulárnych dát. In: 19. Dipterologický seminár, Dubová pri Modre, Slovenská republika.

VAŇHARA, J., MURÁRIKOVÁ, N., MALENOVSKÝ, I., FEDOR, P. & HAVEL, J. 2007. Využitie umelých neurónových sietí (ANN) pre determináciu hmyzu. In: 19. Dipterologický seminár, Dubová pri Modre, Slovenská republika.

VAŇHARA, J. MURÁRIKOVÁ, N., FEDOR, P., MALENOVSKÝ, I. & HAVEL, J. 2006. Artificial neural networks for insect identification. In: Proceedings of the 6th International Congress of Dipterology. Fukuoka, Japonsko, pp. 289–290.

MURÁRIKOVÁ, N., TÓTHOVÁ, A., BRYJA, J., MICHALKOVÁ, V. & VAŇHARA, J. 2006. Molekulárno-genetická analýza tribu Winthemiini (Diptera, Tachinidae): predbežné výsledky. In: Sborník abstraktů z konference Zoologické dny 2006, Brno, Česká republika, p. 108.

VAŇHARA, J., MURÁRIKOVÁ, N. & HAVEL, J. 2006. Umělé neuronové sítě a taxonomická klasifikace v entomologii. In: Sborník abstraktů z konference Zoologické dny 2006, Brno, Česká republika, pp. 123–124.

MURÁRIKOVÁ, N., TÓTHOVÁ, A., ONDROUCHOVÁ, H., BRYJA, J. & VAŇHARA, J. 2006. Phylogenetic relationships within the genus Tachina (Diptera, Tachinidae): preliminary results on the basis of 16S rDNA sequences. In: Dipteron 22, Bulletin of the Dipterological section of the Polish Entomological Society, Wroclav, Poľsko, pp. 34–35. Online: http://pte.au.poznan.pl/dipteron/wskazowki.html

MURÁRIKOVÁ, N. 2005. The species of the group Simulium reptans (Diptera, Simuliidae). In Dipteron 21, Bulletin of the Dipterological section of the Polish Entomological Society, Wroclav, Poľsko, pp. 25–27.

Prílohy

MURÁRIKOVÁ, N. 2004. Rozlišovanie druhov Simulium reptans a Simulium galeratum (Diptera, Simuliidae) v štádiu kukiel. Študentská vedecká konferencia, Bratislava, Slovenská republika.

MURÁRIKOVÁ, N. 2002. Rozlišovanie druhov skupiny Simulium reptans (Diptera, Simuliidae) na na základe morfologických znakov. 17. seminár českých a slovenských dipterológov, Banská Štiavnica, Slovenská republika.

MURÁRIKOVÁ, N. 2002. The extension of the species Simulium reptans (Diptera, Simuliidae) from the group Simulium reptans. In: Kurzfassungen aus 12. Deutschsprachigen/4. Europäischen Simuliidensymposium, Bratislava, p. 13.

MURÁRIKOVÁ, N. 2002. Rozšírenie druhov skupiny Simulium reptans (Diptera, Simuliidae) na Slovensku. 16. seminár českých a slovenských dipterológov, Kostelec nad Černými lesy, Česká republika. d) Verejné prednášky 2 prednášky na Zoologickom seminári v r. 2004 a 2008 2 prednášky na Evertebratologickom seminári v r. 2004 a 2006