UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
RAYANNE FARIAS DA SILVA
ANÁLISE HISTOLÓGICA DE TECIDOS CULTIVADOS IN VITRO DE PLANTAS LATICÍFERAS, PERFIL DE PROTEÍNAS SOLÚVEIS E AÇÃO CONTRA FITOPATÓGENOS
FORTALEZA-CE 2015
RAYANNE FARIAS DA SILVA
ANÁLISE HISTOLÓGICA DE TECIDOS CULTIVADOS IN VITRO DE PLANTAS LATICÍFERAS, PERFIL DE PROTEÍNAS SOLÚVEIS E AÇÃO CONTRA FITOPATÓGENOS
Dissertação submetida à Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Bioquímica, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Bioquímica. Área de concentração: Bioquímica vegetal.
Orientador: Prof. Dr. Márcio Viana
Ramos
Coorientadora: Profa. Dra. Cristina Paiva da Silveira Carvalho.
FORTALEZA-CE 2015
RAYANNE FARIAS DA SILVA
ANÁLISE HISTOLÓGICA DE TECIDOS CULTIVADOS IN VITRO DE PLANTAS LATICÍFERAS, PERFIL DE PROTEÍNAS SOLÚVEIS E AÇÃO CONTRA FITOPATÓGENOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Ceará, como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Bioquímica.
Área de concentração: Bioquímica vegetal. Aprovada em: 02 / 04 / 2015.
BANCA EXAMINADORA
Aos meus avós, Armando e Maria, e à minha mãe Almaiza por todo amor e apoio incondicional.
AGRADECIMENTOS INSTITUCIONAIS
Este trabalho foi realizado com o suporte das seguintes instituições:
Universidade Federal do Ceará, através do Laboratório de Plantas Laticíferas, coordenado pelo Professor Dr. Márcio Viana Ramos e o Laboratório de Biotecnologia vegetal, coordenado pela Professora Dra. Cristina Paiva da Silveira Carvalho, do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular;
Universidade de Fortaleza (UNIFOR), através do Núcleo de Biologia Experimental;
Embrapa Agroindústria Tropical, através do Laboratório de Bioprocessos;
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES);
Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq);
Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (FUNCAP);
Rede Nordeste de Biotecnologia (RENORBIO).
AGRADECIMENTOS
A Deus, meu porto seguro, pela coragem ao longo desta caminhada, pela proteção em todas as horas e pela força nos momentos de fraqueza e limitação.
Ao professor Dr. Márcio Viana Ramos, exemplo de pesquisador dedicado e competente. Agradeço pela criteriosa orientação deste trabalho, pelo incentivo e por contribuir diretamente para o meu crescimento profissional e pessoal. À Professora Dra. Cristina Paiva da Silveira Carvalho, por quem tenho grande admiração como pessoa e como profissional. Obrigada por todo apoio, paciência, ensinamentos e por sua amizade. À Professora Dra. Arlete Aparecida Soares por ter aceitado o convite para participar da banca examinadora, pelas contribuições dadas a esse trabalho e por disponibilizar gentilmente seu espaço de laboratório para realização de parte desta dissertação. A Dra. Christiana de Fátima Bruce da Silva por ter aceitado o convite para participar da banca examinadora. Ao Núcleo de Biologia Experimental, da Universidade de Fortaleza, coordenado pelo Prof. Dr. Renato de Azevedo Moreira e Profa. Dra. Ana Cristina de Oliveira Monteiro Moreira, pelas análises de espectrometria de massas. Em especial ao Dr. Frederico Moreno pelo apoio durante os experimentos. Aos integrantes do Laboratório de Morfologia e Anatomia vegetal, Clemir, Lauana, Karine, Ana, Alexandre, Gisele, James e Alessandra, sobretudo a Robson por toda a ajuda durante os experimentos de histologia. Ao Laboratório de Proteínas Vegetais de Defesa, coordenado pelo Prof. Dr. José Tadeu, pelo apoio. Aos seus integrantes, Rodolpho, Fred, Emanuel, Ana Luíza, Anna Lídia, Handerson, Pedro, e especialmente ao Thiago pela contribuição nos experimentos e por estar sempre disposto a ajudar nos momentos que precisei. Aos amigos do laboratório de Plantas Laticíferas, Cleverson Diniz, Danielle, Diego, Daniel, Jackson, Juliane, João Pedro, Guilherme, Letícia, Aline, Beatriz, Hugo, Wallace, Zelândia, Raissa, Camila, Rafaela e Carol pela ótima convivência no laboratório, companheirismo, apoio e pelos grandes momentos de aprendizado e alegria.
Aos amigos do laboratório de Biotecnologia Vegetal, Brenda, Italo, Misrael, Rachel, Cinthya, Fernanda, Marinete, Pedro, Mathias e Cristiano por toda a amizade, carinho e companheirismo. A Isabel por ser uma amiga de todas as horas. Obrigada por todo apoio, conselhos e incentivos, sem a sua ajuda eu não teria realizado metade de tudo que fiz, sempre terei admiração e carinho por você. Aos amigos do curso de pós-graduação George, Willer, Camila, Igor, Cibele, Aline, Mariana, Paulo e Antônio Neto pelo constante incentivo e as conversas sempre animadas, em especial a Felipe pela disponibilidade e prontidão em ajudar, pelas sugestões, incentivo e pela amizade. Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, pelos valiosos conhecimentos transmitidos, e também aos funcionários e técnicos, pela agradável convivência e pela pronta ajuda. Agradeço em especial à Aldelisa Viana e a Edinilda Nascimento pela amizade e ajuda nos diversos momentos. À minha família, pelo amor e por estar sempre comigo nos momentos difíceis, me confortando e incentivando. Em especial aos meus pais, por todo amor, apoio incondicional e educação que me deram. Ao meu amor e amigo, Hélio pelo carinho, amor e incentivos constantes, sempre demonstrados mesmo à distância. Obrigada pelo companheirismo e por estar sempre presente nos momentos que mais precisei.
“Nada é impossível para Deus” (Lucas 1:37)
RESUMO
Plantas laticíferas têm sido estudadas por apresentarem uma grande diversidade de proteínas relacionadas à defesa vegetal em seu látex. O objetivo deste trabalho foi pesquisar em tecidos cultivados in vitro, proteínas e atividades descritas para o látex de duas espécies laticíferas. Tecidos de calos e raízes de Cryptostegia grandiflora foram obtidos através de protocolos de cultura in vitro de tecidos e submetidos à análise histológica para caracterização de laticíferos. Tecidos cultivados de Calotropis procera foram utilizados como referencial comparativo nas análises. Não foi detectada qualquer estrutura laticífera em calos ou raízes de C. grandiflora enquanto que em C. procera laticíferos se formam nas raízes. Proteínas solúveis foram extraídas dos tecidos cultivados e caracterizadas por meio de ensaios enzimáticos, técnicas bioquímicas, imunológicas e espectrometria de massas. A presença de atividade contra fungos fitopatogênicos foi investigada e todos os dados obtidos foram comparados com dados previamente determinados para os látex das espécies estudadas. Proteínas dos calos e raízes de C. procera, apresentaram atividade antifúngica sobre fungos fitopatogênicos. Os percentuais de inibição do crescimento vegetativo de hifas na presença de proteínas de calos e raízes de C. procera, respectivamente, foram: 75,5% e 82,6% para Fusarium solani, 76,7% e 57,1% para Rhizoctonia solani, 88,8% e 79,8% para Fusarium oxysporum, 93,7% e 90,2% para Colletotrichum lindemuthianum e 80,2% e 79,7% para Colletotrichum gloesporioides, no entanto, não demonstraram nenhum efeito sobre Mucor sp. As proteínas de calos e raízes de C. grandiflora não apresentaram qualquer efeito inibitório sobre o crescimento de hifas ou germinação de esporos dos fungos avaliados. Por meio de ensaios com marcadores de fluorescência, foi possível demonstrar que as proteínas extraídas da cultura in vitro de C. procera interagem com a membrana de C. gloesporioides causando extravasamento do conteúdo citoplasmático, sugerindo que possivelmente seu mecanismo de ação contra fungos esteja relacionado à alteração na permeabilidade da membrana plasmática. Também foi observado estresse oxidativo em esporos de C. gloesporioides tratados com proteínas de calos e raízes de C. procera através da produção de peróxido de hidrogênio. Inibidores de proteases, quitinases, osmotinas e proteases foram detectados nas amostras de calos e raízes de C. procera, porém, osmotinas e proteases não foram observadas em calos e raízes de C. grandiflora. A atividade das enzimas antioxidantes APX, G-POD e catalase foram observadas nos tecidos cultivados in vitro de C. grandiflora. Considerando que proteases laticíferas de C.
grandiflora foram demonstradas exercer ação contra fungos, os resultados observados nesta pesquisa sugerem que a ausência de atividade antifúngica em tecidos cultivados de C. grandiflora deve-se a ausência de proteases nestes tecidos e ainda excluem quitinases e inibidores de proteases presentes como proteínas antifúngicas. Em calos e raízes de C. procera, além de proteases, outras proteínas tais como, quitinases, inibidores de proteases e osmotinas detectadas podem estar envolvidas na atividade antifúngica observada, e/ou agir sinergicamente na defesa contra fungos. O estudo conclui que o uso de tecidos cultivados que não diferenciam laticíferos é um interessante modelo para estudar atividades associadas às proteínas encontradas no látex. Proteases antifúngicas presentes no látex de C. grandiflora não foram encontradas nos tecidos sem formação laticífera.
Palavras-Chave: Calotropis procera. Cryptostegia grandiflora. Cultura de tecidos. Látex. Proteínas de defesa.
ABSTRACT
Laticifers plants have been studied by presenting a wide range of proteins related to plant defense in its latex. The aim of this study was to investigate, in tissue cultured in vitro, proteins and activities described for latex laticíferas two species. Tissue callus and roots of Cryptostegia grandiflora were obtained by in vitro tissues culture protocols and subjected to histological analysis for laticifers characterization. Cultured tissue of Calotropis procera were used as comparative reference in the analysis. There wasn’t any laticifer structure in callus or roots of C. grandiflora while in C. procera laticifers are formed in the roots. Soluble proteins were extracted from the cultured tissue and characterized using enzymatic assays, biochemical, immunological techniques and mass spectrometry. The presence of activity against phytopathogenic fungi was investigated and all data obtained were compared with the previously one determined for the plants studied latex. Callus and roots proteins of C. procera showed antifungal activity against pathogenic fungi. The percentage inhibition of the vegetative hyphae growth in the presence of callus and roots C. procera protein respectively were 75.5% and 82.6% for Fusarium solani, 76.7% and 57.1% for Rhizoctonia solani, 88.8% and 79.8% for Fusarium oxysporum, 93.7% and 90.2% for Colletotrichum lindemuthianum and 80.2% and 79.7% for Colletotrichum gloesporioides, however, showed no effect on Mucor sp. Callus and roots proteins of C. grandiflora showed no inhibitory effect on the hyphae growth or spores germination of assayed fungi. Through assays using fluorescent markers, it was demonstrated that proteins extracted from in vitro culture of C. procera interact with the membrane of C. gloesporioides causing leakage of cytoplasmic contents, possibly suggesting that its mechanism of action against fungi is related to the change in plasma membrane permeability. Also oxidative stress was observed in C. gloesporioides spores treated with callus and roots protein C. procera by hydrogen peroxide production. Protease inhibitors, chitinases, osmotins and proteases were detected in the C. procera callus and roots samples, however, osmotins and proteases were not observed in C. grandiflora callus and roots. The activity of antioxidant enzymes APX, G-POD and catalase were observed in tissue cultured in vitro of C. grandiflora. Considering that C. grandiflora laticifers proteases were demonstrated exert action against fungi, the results observed in this study suggest that the absence of antifungal activity in C. grandiflora cultured tissue is due to the absence of proteases in these tissues as well exclude chitinases and proteases inhibitors as
antifungal proteins. The study concludes that the use of cultured tissues that do not differentiate laticifers is an interesting model to study activities associated to proteins founded in latex. Antifungal proteases present in C. grandiflora latex were not found in the tissues without laticifer formation.
Keywords: Calotropis procera. Cryptostegia grandiflora. Tissue culture. Latex. Defense proteins.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Aspectos gerais da espécie Cryptostegia grandiflora R. Br...... 28
Figura 2 - Aspectos gerais da espécie Calotropis procera (Ait.) R. Br...... 30
Figura 3 - Desenvolvimento de calos e raízes adventícias de Cryptostegia grandiflora.....60
Figura 4 – Secção transversal do cotilédone de Cryptostegia grandiflora ...... 62
Figura 5 – Secção transversal do hipocótilo de Cryptostegia grandiflora ...... 63
Figura 6 – Corte histológico de calos de Cryptostegia grandiflora...... 64
Figura 7 – Secção longitudinal de ápice radicular de Cryptostegia grandiflora ...... 65
Figura 8– Secção longitudinal de explante de cotilédone mostrando a origem de raízes adventícias e calos de Cryptostegia grandiflora...... 66
Figura 9 - Atividade antifúngica de calos e raízes de Cryptostegia grandiflora e Calotropis procera...... 68
Figura 10 - Atividade inibitória das proteínas de calos e raízes de Cryptostegia grandiflora e Calotropis procera sobre a germinação de esporos de fungos fitopatogênicos...... 69
Figura 11 - Efeito de proteínas de calos e raízes de Cryptostegia grandiflora e Calotropis procera sobre a permeabilidade da membrana plasmática de esporos de C. gloeosporioides...... 70
Figura 12 - Detecção de H2O2 em esporos de C. gloeosporioides...... 71
Figura 13 - Efeito de inibidores de proteases endógenos sobre a atividade proteolítica da papaína e tripsina ...... 73
Figura 14 - Imunodetecção de osmotinas em calos, raízes e látex de Cryptostegia grandiflora e Calotropis procera por meio de ELISA...... 75
Figura 15 - Atividade proteolítica dos extratos proteicos obtidos a partir de látex, calos e raízes de Cryptostegia grandiflora e Calotropis procera...... 77
Figura 16 – Efeito do pH na atividade proteolítica de proteínas de calos e raízes de Cryptostegia grandiflora ...... 78
Figura 17 - Imunodetecção de proteases em calos, raízes e látex de Cryptostegia grandiflora e Calotropis procera por meio de ELISA ...... 79
Figura 18 – Atividade antifúngica e proteolítica de calos e raízes de Calotropis procera e Cryptostegia grandiflora tratadas com IAA ...... 81
Figura 19 - Eletroforese em gel de poliacrilamida das frações proteicas de calos e raízes de Cryptostegia grandiflora na presença ou ausência de agente redutor...... 89
Figura 20 – Perfil cromatográfico, eletroforese, atividade proteolítica e zimograma das sub-frações dos calos de Cryptostegia grandiflora...... 90
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Concentração de proteína presente em látex e extratos de calos e raízes de C. procera e C. grandiflora estimado pelo método de Bradford ...... 67
Tabela 2 - Atividade quitinolítica de proteínas do látex e de calos e raízes de C. grandiflora e C. procera...... 74
Tabela 3 - Atividade das enzimas antioxidantes APX, G-POD e CAT de calos e raízes de C. grandiflora ...... 82
Tabela 4 - Lista de proteínas identificadas de calos e raízes adventícias de C. grandiflora e C. procera por ESI-QUAD-TOF.
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Alguns hospedeiros e as doenças causadas por fungos utilizados neste estudo. .. 31
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ACN Acetonitrila
ANA Ácido 1-naftaleno acético
ANOVA Análise de Variância APX Peroxidase do Ascorbato
AST Açúcares solúveis totais
BANA Nα-benzoil-DL-arginina-2-naftilamida
BAPNA Nα-benzoil-DL-arginina-p-nitroanilida
BCIP 5-bromo-4-cloro-3-indoil fosfato
B.O.D. Biochemical oxygen demand BSA Albumina sérica bovina
CAT Catalase
CIN Cinetina
CPCg Proteínas dos calos de Cryptostegia grandiflora
CPCg-PI Proteínas dos calos de Cryptostegia grandiflora- Pico I
CPCg-PII Proteínas dos calos de Cryptostegia grandiflora- Pico II CPCp Proteínas dos calos de Calotropis procera
DAB 3,3'-diaminobenzidina
DMAB ρ-Dimetilaminobenzaldeido
DMACA 4-Dimetil-amino-cinamaldeído
DMSO Dimetilsulfóxido
DTT Ditiotreitol EDTA Ácido etileno-diamino-tetracético
E-64 Trans-epoxisuccinil-L-leucilamida-(4- guanidino)-butano
ELISA Ensaio imunoenzimático (Enzyme linked immunosorbent assay)
ESI Ionização por Eletrospray
G-POD Peroxidase do guaiacol
H2O2 Peróxido de Hidrogênio
H2SO4 Ácido sulfúrico HCl Ácido clorídrico
IAA Iodoacetamida
IgG Imunoglobulina G
KDa Quilodalton
LPCg Proteínas do látex de Crypstostegia grandiflora LPCp Proteínas do látex de Calotropis procera
MF Massa Fresca
Mg Miligrama
NaCl Cloreto de sódio
NAG N-acetil-D-glucosamina
NaOH Hidróxido de Sódio NBT Nitro blue tetrazolium
Nkat Nanokatal
PBS Tampão Fosfato de Sódio
PMSF Fenilmetilsulfonilflúor
RPCg Proteínas das raízes de Cryptostegia grandiflora
RPCp Proteínas das raízes de Calotropis procera SDA Sabouraud Dextrose Agar
SDS Dodecil sulfato de sódio
TCA Ácido Tricloro Acético
TEMED N,N,N’,N’ – tetrametiletilenodiamina
TOF Time of Fly
Tris Tris-hidroxiaminometano UA Unidade de Atividade
UA/µgP Unidade de Atividade por micrograma de proteína
YPD Yeast Peptone Dextrose
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...... 23
1.1 Látex e Laticíferos ...... 23
1.2 Plantas Laticíferas...... 24
1.2.1 Cryptostegia grandiflora R. Br...... 27
1.2.2 Calotropis procera (Ait.) R. Br...... 29
1.3 Fungos e Proteínas Antifúngicas ...... 30
1.4 Cultura in vitro de tecidos vegetais ...... 36
2 JUSTIFICATIVA ...... 40
3 OBJETIVOS ...... 41
3.1 Objetivo geral ...... 41
3.2 Objetivos específicos ...... 41
4 MATERIAL E MÉTODOS ...... 42
4.1 Materiais ...... 42
4.1.1 Reagentes químicos ...... 42
4.1.2 Material vegetal ...... 42
4.1.3 Animais ...... 42
4.1.4 Fungos ...... 43
4.2 Métodos ...... 43
4.2.1 Germinação de sementes e indução in vitro de calos e raízes adventícias ...... 43
4.2.2 Análise Histológica ...... 44
4.2.3 Extração de proteínas de calos, raízes adventícias e látex ...... 45
4.2.4 Determinação da concentração de proteínas solúveis ...... 45
4.2.5 Atividade antifúngica ...... 46
4.2.5.1 Cultivo dos fungos e obtenção das suspensões de esporos ...... 46
4.2.5.2 Inibição do crescimento micelial ...... 46
4.2.5.3 Inibição da germinação de esporos ...... 47
4.2.5.4 Avaliação do mecanismo de ação ...... 47
4.2.5.4.1 Efeito dos extratos proteicos de calos e raízes sobre a permeabilidade da membrana plasmática de C. gloesporioides ...... 47
4.2.5.4.2 Efeito dos extratos proteicos de calos e raízes na indução de estresse oxidativo em esporos de C. gloesporioides ...... 48
4.2.6 Avaliação da presença de PR-proteínas ...... 48
4.2.6.1 Inibidores de proteases cisteínicas e serínicas...... 48
4.2.6.2 Quitinases ...... 49
4.2.6.3 Osmotinas ...... 50
4.2.6.3.1 Imunodetecção de osmotinas por ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay)51
4.2.6.3.2 Identificação de Osmotina por Dot Blotting ...... 52
4.2.6.4 Proteases ...... 53
4.2.6.4.1 Atividade proteolítica com substrato Azocaseína ...... 53
4.2.6.4.2 Atividade proteolítica com substrato BANA ...... 53
4.2.6.4.3 Atividade proteolítica com substrato BAPNA ...... 54
4.2.6.4.4 Efeito do pH sobre a atividade proteolítica ...... 54
4.2.6.4.5 Zimograma ...... 55
4.2.6.4.6 Produção de anticorpos anti-proteases ...... 55
4.2.6.4.7 Imunodetecção de proteases por ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) 55
4.2.6.4.8 Avaliação do efeito de proteases cisteínicas na atividade antifúngica ...... 56
4.2.6.5 Atividades das enzimas antioxidantes ...... 56
4.2.6.5.1 Extrato Proteico ...... 56
4.2.6.5.2 Ascorbato peroxidase (APX; EC: 1.11.1.1) ...... 57
4.2.6.5.3 Catalase (CAT; EC: 1.11.1.6) ...... 57
4.2.6.5.4 Peroxidase do guaiacol (G-POD; EC: 1.11.1.7) ...... 57
4.2.7 Espectrometria de massas ...... 58
4.2.8 Caracterização Bioquímica de calos e raízes de C. grandiflora ...... 59
4.2.8.1 Eletroforeses em gel de poliacrilamida em primeira dimensão ...... 59
4.2.8.2 Fracionamento das proteínas dos calos de C. grandiflora em coluna de DEAE- Sepharose ...... 59
5 RESULTADOS ...... 60
5.1 Cultura in vitro de tecidos de C. procera e C. grandiflora ...... 60
5.2 Análise Histológica ...... 61
5.3 Atividade antifúngica ...... 67
5.4 Avaliação do mecanismo de ação de proteínas dos calos e raízes de C. procera e C. grandiflora ...... 70
5.5 Avaliação da presença de PR-proteínas...... 72
5.6 Atividades das enzimas antioxidantes ...... 82
5.7 Espectrometria de massas ...... 82
5.8 Caracterização Bioquímica de calos e raízes de C. grandiflora ...... 89
6 DISCUSSÃO ...... 117
6.1 Cultura in vitro de tecidos de C. procera e C. grandiflora ...... 117
6.2 Análise Histológica ...... 118
6.3 Atividade antifúngica ...... 120
6.4 Avaliação do mecanismo de ação de proteínas dos calos e raízes de C. procera e C. grandiflora ...... 120
6.5 Avaliação da presença de PR-proteínas...... 122
6.6 Atividades das enzimas antioxidantes ...... 127
6.7 Espectrometria de massas ...... 129
6.8 Caracterização Bioquímica de calos e raízes de C. grandiflora ...... 129
7 CONCLUSÃO ...... 130
REFERÊNCIAS ...... 131
23
1 INTRODUÇÃO
1.1 Látex e Laticíferos
O látex é uma secreção produzida pelos laticíferos, que é liberado pelas plantas quando estas sofrem algum tipo de injúria (FAHN, 1979). Este caracteriza-se por ser uma mistura complexa que inclui vários metabólitos especializados, tais como: proteínas, carboidratos, terpenos, alcalóides, vitaminas, lipídios, aminoácidos livres, taninos, cardenólideos e isoprenóides de grande peso molecular, variando sua composição consideravelmente conforme a espécie (MORCELLE; CAFFINI; PRIOLO, 2004; DOMSALLA; MELZIG, 2008). Embora geralmente apresente um aspecto leitoso, o látex também pode apresentar coloração amarelada, vermelha, marrom ou até mesmo transparente (PICKARD, 2008).
Os laticíferos são caracterizados por um conjunto de células altamente especializadas capazes de produzir látex, sendo definidas pelas suas características anatômicas e conteúdo citoplasmático distinto (HAGEL; YEUNG; FACCHINI, 2008). Estas células originam-se a partir do meristema fundamental, procâmbio ou células parenquimáticas (MILANEZ, 1959; LOPES et al., 2009). Tais células são limitadas por paredes primárias exclusivamente pectocelulósicas e suas características químicas provavelmente se alteram durante o seu desenvolvimento, podendo ser depositadas substâncias como suberina ou calose, que selam o sistema e impedem a comunicação com células subjacentes (APPEZZATO-DA-GLÓRIA; CARMELLO-GUERREIRO, 2006).
O laticífero é um dos primeiros tipos celulares a se diferenciar. Sua fase meristemática é muito breve e, enquanto a maioria dos tecidos ainda é meristemática, os laticíferos já estão diferenciados e em fase secretora nos diferentes órgãos (DEMARCO; SUMIKO; MORAES, 2006). Durante o desenvolvimento dos laticíferos, as células possuem diversas organelas; citoplasma denso com ribossomos abundantes; diversos grãos de amido e metabolismo celular muito ativo com síntese intensa de biomoléculas, principalmente poliisoprenos, que são armazenados em grandes vacúolos. Nos laticíferos maduros, o citoplasma tornar-se periférico com menor número de organelas, os vacúolos são degradados e as partículas que constituem o látex são misturadas ao conteúdo citoplasmático. As células 24
aparentemente permanecem ativas com o látex em seu interior, que somente será liberado para o meio extracelular se a planta sofrer algum tipo de injúria (ZHAO et al., 2014).
Os canais laticíferos ocorrem em todos os orgãos da planta, tais como, caule (Hevea brasiliensis), flores (Aspidosperma australe e Blepharodon bicuspidatum), frutos (Carica papaya e Achras sapota) tubérculos (Manihot glaziovii), folhas (Calotropis procera) e ramos (Plumeria rubra e Cryptostegia grandiflora) (ALBUQUERQUE et al., 2009).
Estudos descrevem a presença de laticíferos em Apocynaceae como sendo universal, no entanto, há controvérsias quanto à origem e o tipo estrutural dessas células nos representantes desta família (DEMARCO; SUMIKO; MORAES, 2006; CANAVEZE, 2012). Os laticíferos variam amplamente quanto a sua estrutura e origem. Em termos estruturais, os laticíferos agrupam-se em duas categorias: não-articulados e articulados, podendo também formar ramificações laterais, sendo chamados não-ramificados e ramificados (HAGEL; YEUNG; FACCHINI, 2008). Essa característica estrutural permite determinar a intensidade e a velocidade com que o látex é exsudado após a planta ser lesionada (FREITAS et al., 2010).
Os laticíferos não-articulados desenvolvem-se a partir de uma única célula que cresce dentro dos espaços intercelulares por crescimento intrusivo. Estes possuem células longas, multinucleadas, sem comunicações intercelulares, que se estendem desde a raiz até as folhas, geralmente em tecidos do parênquima (PICKARD, 2008).
Os laticíferos articulados consistem de uma série de células alongadas, em que as paredes terminais tornam-se porosas e desaparecem completamente, formando uma estrutura longa e multinucleada. Durante o processo de formação desses tipos de laticíferos, ocorre à diferenciação de células do parênquima em células laticíferas, a lamela média é dissolvida e ocorre a formação de um orifício interligando as duas células adjacentes (HAGEL; YEUNG; FACCHINI, 2008).
1.2 Plantas Laticíferas
As plantas laticíferas são aquelas que, ao serem submetidas a injúrias mecânicas, exsudam látex (CHO et al., 2014). Por ser um fluido comum em plantas, estima-se que cerca de 6% de todas as espécies de plantas vasculares apresentem laticíferos (FREITAS et al., 25
2010). Essas plantas crescem em ambientes diversos e possuem porte herbáceo, arbustivo ou arbóreo. Cerca de 12.500 espécies representantes de 22 famílias possuem a capacidade de produzir este fluido (EVERT, 2006). Dentre estas famílias botânicas as mais representativas quanto à produção de látex são: Asclepiadaceae, Apocynaceae, Moraceae, Papaveraceae e Euphorbiaceae (ALBUQUERQUE et al., 2009).
Várias funções biológicas têm sido atribuídas aos laticíferos. Uma das primeiras justificativas apontadas para a existência de laticíferos em plantas seria a função de reservatório de água, devido ao fato do látex ser frequentemente encontrado em plantas de regiões áridas. No entanto, sabe-se que as plantas que contêm látex não estão restritas a essas regiões. Outras funções atribuídas ao látex seria a atuação como reserva nutritiva e o auxílio na cicatrização de lesões mecânicas. Entretanto, a justificativa mais aceita para a presença de laticíferos nas plantas é o envolvimento destas células na defesa vegetal, considerando a alta demanda energética exigida pela síntese de látex e ao fato deste fluido somente ser exsudado após danos mecânicos ou durante o ataque de patógenos (KEKWICK, 2001; RAMOS et al., 2007a).
Neste contexto, o papel defensivo do látex tem sido indicado por muitos autores (HAGEL; YEUNG; FACCHINI, 2008; PICKARD, 2008; KONNO, 2011) devido à função relevante na defesa contra microrganismos, redução de herbivoria, como selante de ferimentos e no armazenamento de defesas químicas, com vários metabólitos e proteínas especializadas em concentrações que são frequentemente muito maiores que nas outras partes da planta (AGRAWAL; KONNO, 2009; DEMARCO; SUMIKO; MORAES, 2006).
Uma grande variedade de proteínas e enzimas relacionadas à defesa vegetal tem sido encontrada em fluidos laticíferos de diferentes famílias, tais como: proteases cisteínicas (Caricaceae, Moraceae, Apocynaceae e Anacardiaceae) (KONNO et al., 2004; RAMOS et al., 2010; RASMANN; JOHNSON; AGRAWAL, 2009; SABY JOHN; BHAT; PRASADA RAO, 2003), proteases serínicas (Moraceae, Euphorbiaceae, Apocynaceae, Convolvulaceae, e Anacardiaceae) (ARIMA et al., 2000; LYNN; CLEVETTE-RADFORD, 1986a; PATEL; SINGH; JAGANNADHAM, 2007; SABY JOHN; BHAT; PRASADA RAO, 2003; TOMAR; KUMAR; JAGANNADHAM, 2008), quitinases (Moraceae e Apocynaceae) (KITAJIMA et al., 2010; RAMOS et al., 2010), lectinas (Euphorbiaceae) (LYNN; CLEVETTE-RADFORD, 1986b), oxidases (Euphorbiacea, Asteraceae, Anacardiaceae e Convolvulaceae) (PATEL et 26
al., 2008; SETHI et al., 2009; WAHLER et al., 2009; WITITSUWANNAKUL et al., 2002), glucanases (Euphorbiaceae, Caricaceae) (GIORDANI; LAFON, 1993; SUBROTO et al., 1996) e inibidores de proteases (Caricaceae, Euphorbiaceae, Cucurbitaceae e Apocynaceae) (AZARKAN et al., 2003, 2004; KEHR, 2006; KIM et al., 2003; WALZ et al., 2004).
Muitos dos compostos presentes no látex desempenham um papel vital na defesa contra vários patógenos, e também contra insetos herbívoros, por serem tóxicos, antinutricionais, ou aderentes. Este último efeito é a função principal da borracha no látex, uma vez que possibilita o aprisionamento do inseto e a imobilização de suas peças bucais (MITHÖFER; BOLAND, 2012). Proteínas inibidoras de proteases exercem papéis defensivos contra insetos herbívoros, por causar a inibição de suas enzimas digestivas, interferindo na utilização dos nutrientes (KONNO, 2011). Estudos apontam que frações proteicas do látex de Calotropis procera (Apocynaceae), contidas em uma dieta artificial na concentração de 0,1% mostraram alta toxicidade contra larvas de Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera: Noctuidae) e do besouro bruquídeo, Callosobruchus maculatus (Coleoptera: Bruchidae) (RAMOS et al., 2010; RAMOS et al., 2007a).
Outros trabalhos mostram o aumento da expressão de algumas proteínas em plantas laticíferas desafiadas por insetos. Sethi et al. (2009) relatam que Lactuca sativa (Asteraceae) tem as atividades de três enzimas (fenilalanina amônia-liase - PAL, polifenoloxidase - PPO, e peroxidase - POX) aumentadas duas vezes quando desafiadas por Diabrotica balteata (Coleoptera). Azarkan et al. (2004) e Kim et al. (2003) observaram o aumento da expressão de quitinases no látex de F. carica (Moraceae) e C. papaia (Caricaceae) em resposta a ferimentos ou tratamento com ácido jasmônico. Há também relatos do aumento de cinco vezes na concentração de alcalóides em Lobelia cardinalis (Campanulaceae) após ferimentos pela lagarta Enigmogramma basigera (Noctuidae), próximo ao local da lesão (OPPEL; DUSSOURD; GARIMELLA, 2009). Compostos fenólicos, incluindo taninos, ligninas e difenóis, são encontrados em grandes quantidades nas plantas laticíferas, sugerindo que estes também fazem parte do sistema de defesa destas plantas (SNOOK; DATA; KAYS, 1994).
Além de potente atividade inseticida, frações proteicas do látex de Calotropis procera e Cryptostegia grandiflora (Apocynaceae) apresentam forte atividade contra os 27
fungos fitopatogênicos: Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Neurospora sp., Rhizoctonia solani, Aspergillus niger e Colletotrichum gloeosporioides. Confirmada após o tratamento com ditiotreitol (DTT), este reagente intensificou a atividade proteolítica endógena das proteínas e concomitantemente suas propriedades antifúngicas. Por outro lado, o pré- tratamento com iodoacetamida (IAA), proteólise, ou tratamento térmico reduziu drasticamente as atividades proteolíticas endógenas e parcialmente anularam a atividade antifúngica, fornecendo indícios do envolvimento de proteínas, especialmente proteases cisteínicas, na inibição do crescimento dos fungos fitopatogênicos testados (SOUZA et al., 2011; RAMOS et al., 2014).
1.2.1 Cryptostegia grandiflora R. Br.
A família botânica Apocynaceae está entre as dez maiores famílias de angiospermas, englobando de 250 a mais de 550 gêneros e entre 3.700 e 5.100 espécies, dentre elas, Cryptostegia grandiflora R. Br. (ENDRESS; BRUYNS, 2000). Esta espécie é originária do sudoeste de Madagascar (África), com distribuição em várias partes do mundo, adaptando-se principalmente às regiões tropicais e subtropicais. Essa ampla distribuição deve- se principalmente a sua utilização como planta ornamental ou no uso do seu látex na produção de borracha (KRITICOS et al., 2003). No Brasil, a espécie é encontrada na região Nordeste, onde é popularmente conhecida por unha de onça devido à morfologia tradicional do seu fruto. Entretanto, possui outros nomes populares, como alamanda-roxa, boca-de-leão, leite- de-bom-jesus, margarida, e viúva alegre.
Cryptostegia grandiflora R. Br. é uma planta de porte arbustivo, muito ramificada, com folhas simples e opostas, nervura central bem marcada e esbranquiçada. As inflorescências são terminais com flores roxas. Caules, folhas e frutos exsudam látex quando injuriados. Os frutos são deiscentes, geralmente triangulares, medindo de 10 a 12 cm de comprimento, produzidos em pares e opostos, contendo por volta de 350 sementes de 0,8 centímetros de comprimento, envoltas por fibras de seda que facilitam a dispersão pelo vento e pela água (SEN, 1968) (Figura 1). 28
Figura 1 - Aspectos gerais da espécie Cryptostegia grandiflora R. Br. (A) Arbusto (B) Flores (C) Fruto maduro.
Fonte: MERCADANTE, (2011); SUNRISE, (2011).
Esta espécie apresenta características de fitoinvasor, podendo causar danos nas áreas em que for introduzida devido ao seu hábito de crescimento arbustivo. Esta pode chegar a medir cerca de 2,5 metros como arbusto e como trepadeira pode atingir 30 metros de comprimento em suportes. Deste modo, desenvolve-se sobre a copa das árvores impedindo a passagem de luz e matando-as por sombreamento excessivo. No Brasil, C. grandiflora integra a lista de plantas consideradas potencialmente invasoras no bioma caatinga (CAVALCANTE; MAJOR, 2006).
Estudos têm atribuído um efeito tóxico a esta espécie, particularmente, folhas e caules são extremamente venenosos devido à presença de glicosídeos cardioativos. O trabalho de Kamel et al. (2001) discute o isolamento e a elucidação da estrutura de quatro novos glicosídeos cardioativos em conjunto com dois glicosídeos conhecidos a partir das folhas de C. grandiflora.
Na medicina popular, esta planta é utilizada para interromper sangramentos, promover a cicatrização de feridas e tratar distúrbios do sistema nervoso (BRITTO; MAHESH, 2007). Muitos investigadores relataram as ações de metabólitos secundários, como os flavonóides e alcalóides, desempenhando um papel importante na atividade analgésica (HANUMANTHAPPA et al., 2012). Extratos de diversas partes da planta apresentaram atividades biológicas como, anti-inflamatória (CASTRO; OCAMPO; 29
FRANCO, 2014), antibacteriana (MUKHERJEE et al., 1999), antitumoral (DOSKOTCH et al., 1972), e atividade esquistossomicida (YOUSIF et al., 2012).
Inúmeras atividades relacionadas à propriedades farmacológicas presentes em frações proteicas de látex de C. grandiflora, têm sido demonstradas em estudos, como atividade pró-inflamatória através da migração de neutrófilos e aumento da permeabilidade vascular (ALBUQUERQUE et al., 2009). Além disso, há relatos de atividade larvicida de frações proteicas do látex, sendo um agente eficaz no controle do desenvolvimento do mosquito transmissor da dengue (RAMOS et al., 2009). Atividades antifúngica (RAMOS et al., 2014), antioxidativa, proteolítica (FREITAS et al., 2010), pró-coagulante e fibrinogenolítica (VIANA et al., 2013) das frações proteicas do látex desta espécie também foram relatadas.
1.2.2 Calotropis procera (Ait.) R. Br.
Calotropis procera pertencente à família Apocynaceae é originária da Índia, no entanto é encontrada em quase todas as regiões tropicais e subtropicais do planeta, sobretudo em regiões semi-áridas da América. Esta planta possui vários nomes populares, como exemplo, algodão-de-seda, flor-de-seda, ciúme, hortência, paininha-de-seda e leiteiro (SILVA et al., 2013). Apresenta como característica peculiar uma intensa produção de látex, devido principalmente a constituição dos seus laticíferos, identificados como não articulados, o que permite que o látex seja exsudado mais rapidamente após danos nos tecidos. O látex de C. procera é altamente abundante em todas as partes verdes da planta, contudo, não há relatos de sua presença em sementes ou raízes (RAMOS et al., 2007a).
C. procera é uma planta perene que apresenta porte arbustivo ou subarbóreo e que pode alcançar entre 1-5 metros de altura, com ramificações que ocorrem a partir da base da planta. Suas hastes são de textura lisa e coberta de pelos de cor esbranquiçada. As folhas deste arbusto são grandes (5-30 cm de comprimento e 4-15 cm de largura) de coloração verde- acinzentada e geralmente opostas. São subcoriáceas cobertas por uma camada de cera e com nervuras bem desenvolvidas. Suas flores são dispostas em inflorescências axilares com 20-30 mm de diâmetro cada e de cor púrpura. Os frutos são cápsulas infladas ou globosas, de parede externa carnosa e fina, superfície lisa e de coloração verde, com numerosas sementes em seu interior. As sementes são ovoides, com base arredondada e ápice agudo, achatadas, com 30
superfície pouco rugosa, e coloração castanha; envoltas por filamentos sedosos que facilitam sua dispersão a longas distâncias pelo vento e pela água (SEN, 1968) (Figura 2).
Figura 2 - Aspectos gerais da espécie Calotropis procera (Ait.) R. Br. (A) Arbusto (B) Flores (C) Sementes (D) Frutos.
Fonte: HASSAN et al. (2015).
O látex de C. procera é uma rica fonte de proteínas com diversas propriedades farmacológicas, como anti-inflamatória (ALENCAR et al., 2004), antinociceptiva (SOARES et al., 2005), antitumoral (OLIVEIRA et al., 2007), antibacteriana (LARHSINI et al., 1999), pró-inflamatória (RAMOS et al., 2012), hemolítica (SINGH et al., 2000) e antiplasmodial (SHARMA; SHARMA, 2001). Além de apresentar atividade inseticida contra o mosquito da dengue e contra diferentes pragas agrícolas e atividade antifúngica contra variados fungos fitopatogênicos (RAMOS et al., 2006a, 2007a; SOUZA et al., 2011).
1.3 Fungos e Proteínas Antifúngicas
Os fungos possuem uma ampla distribuição na natureza, desenvolvendo-se em uma grande variedade de habitats, incluindo ambientes extremos como desertos e mares profundos. A classificação desses organismos demonstra que cerca de 250.000 espécies de fungos habitam a superfície terrestre, distribuídos em todos os ecossistemas (SELITRENNIKOFF, 2001). Ao longo da evolução, as plantas adquiriram mecanismos complexos de defesa contra agentes patogênicos, ao mesmo tempo em que alguns destes 31
patógenos desenvolveram meios para superar essas defesas. Lee et. al. (2010) apontam que para estabelecer uma infecção na planta hospedeira, o patógeno depende em parte da sua capacidade em evitar a toxicidade de proteínas de defesa da planta. Estudos de interação planta-patógeno sugerem que esses dois organismos estão em constante evolução para a sobrevivência, na medida em que evoluem continuamente seus mecanismos de defesa (LI et al., 2013).
Quadro 1 - Alguns hospedeiros e as doenças causadas por fungos utilizados neste estudo.
Principais Doenças Tecido/órgão Fungos Referências hospedeiros causadas injuriado Hemibiotrófico Colletotrichum Phaseolus Folhas, caule e Antracnose COSTA, 2002 lindemuthianum vulgaris pecíolos CIA et al., 2007; Carica papaya, Colletotrichum Frutas, caules e BARRETO, Vigna Antracnose gloeosporioides folhas 2007; unguiculata ANDRADE et. al., 2007 Murcha LEE et al., Mais de 100 Fusarium vascular e 2010; espécies de Raízes Oxysporum Podridão AGRIOS, plantas radicular 2005 FU; CHANG, Deterioração, Glycine max, 1999; IQBAL, Murcha e Fusarium solani Phaseolus Raízes et al., 2005; Podridão de vulgaris ABEYSINGH raízes E, 2007 Necrotrófico Oryza sativa, Queima da Hipocótilos e DATTA et Rhizoctonia solani Phaseolus bainha raízes al., 1999 vulgaris ALVES; 159 espécies de Podridões pós- Grãos, flores e TRUFEM; Mucor sp. plantas colheita frutos MILANEZ, 2002 Fonte: Adaptado de Souza et al. (2011).
As plantas estão constantemente expostas a uma grande quantidade de agentes patogênicos. Deste modo, desenvolveram estratégias de defesa que permitem o retardamento ou até mesmo impedem a penetração de fitopatógenos em seus tecidos. A ativação dos 32
mecanismos de defesa da planta ocorre por meio de sucessivos eventos e sinais que começam no reconhecimento do agente invasor e terminam com a ativação das barreiras físicas e bioquímicas envolvidas no processo de defesa (FERNANDES et al., 2009). Algumas dessas barreiras bioquímicas incluem a síntese e acúmulo de um grupo de proteínas conhecidas coletivamente como proteínas relacionadas à patogênese (PR-proteínas) que são induzidas somente durante o ataque de patógenos ou em situações relacionadas a infecções (CARUSO et al., 1999). Essas proteínas foram descritas pela primeira vez em plantas de tabaco infectadas pelo vírus do mosaico do tabaco e desde então têm sido encontradas e agrupadas em 17 famílias de acordo com sua similaridade de sequência e suas atividades biológicas (VAN LOON; REP; PIETERSE, 2006).
Os fluidos laticíferos de diversas espécies apresentam vários tipos de proteínas envolvidas na defesa vegetal. Proteínas relacionadas à patogênese são comumente encontradas em látex, sendo os laticíferos reportados como locais importantes de síntese de PR-proteínas, suportando a hipótese do seu papel de defesa contra predadores e fungos fitopatogênicos (FREITAS et al., 2011a).
Dentre as proteínas antifúngicas mais estudadas na defesa de plantas, estão incluídas algumas famílias de PR-proteínas como as β-1,3-glucanases (PR-2), quitinases (PR- 3), osmotinas (PR-5), inibidores de proteases (PR-6), proteases (PR-7), peroxidases (PR-9) e defensinas (PR-12) (FERREIRA et al., 2007).
O mecanismo de ação dessas proteínas antifúngicas esta relacionado tanto à indução de resistência, estimulando respostas de defesa, quanto a efeitos diretos, utilizando como alvos principais a parede celular, a membrana plasmática e alvos intracelulares. Essas PR-proteínas podem interferir na síntese da parede celular, por meio da inibição da biossíntese dos componentes celulares essenciais da parede, como quitina ou glucanos, ou podem atuar em alvos intracelulares como os ribossomos, encerrando a síntese proteica nas células fúngicas (FERREIRA et al., 2007). No entanto, a membrana plasmática é o alvo principal da maioria das proteínas antifúngicas. Alguns autores sugerem que essas proteínas uma vez inseridas na membrana das células fúngicas formam poros transmembranares, permitindo assim, que o efluxo de íons intracelulares resulte na morte da célula (TOSSI; SANDRI; GIANGASPERO, 2000). Algumas proteínas podem ainda exercer sua atividade antifúngica por meio de alterações no potencial de membrana (THEIS; STAHL, 2004), e na 33
geração de peróxido de hidrogênio (FERREIRA et al., 2007) que pode ser diretamente tóxico para os fungos e/ou estimular respostas de defesa na planta (PUNJA, 2001; PARK et al., 2004).
As proteases constituem a família de PR-proteínas mais descritas e estudadas em fluidos laticíferos, com sua atividade antifúngica amplamente relatada na literatura. As proteases desempenham papéis importantes na regulação de processos biológicos em plantas, e estão envolvidas na percepção, sinalização e resposta a estresses bióticos e abióticos, atuando no reconhecimento de patógenos e na indução de respostas eficazes de defesa. Além disso, as proteases estão envolvidas em todos os aspectos do crescimento e desenvolvimento vegetal, incluindo a degradação de proteínas de reserva e defeituosas, a ativação de zimogênios, germinação, senescência e morte celular programada (SCHALLER, 2004; VAN DER HOORN; JONES, 2004; GRUDKOWSKA; ZAGDANSKA, 2004; GAVIRA et al., 2007; DOMSALLA; MELZIG, 2008). O látex é uma importante fonte de proteases vegetais. Mais de 110 fluidos laticíferos, oriundos de espécies pertencentes a diferentes famílias, são conhecidos por conter enzimas proteolíticas em sua composição. No látex, estas proteínas além de atuarem na defesa vegetal, agindo diretamente contra os patógenos, promovem a degradação de proteínas durante o desenvolvimento de laticíferos e atuam no processo de coagulação de fluidos laticíferos (DOMSALLA; MELZIG, 2008).
A maioria das proteases encontradas em fluidos laticíferos pertencem à família das proteases cisteínicas e serínicas. Somente alguns membros da família das proteases aspárticas e metaloproteases são conhecidos (DOMSALLA; MELZIG, 2008; KUMAR et al., 2011). Cerca de 40 proteases cisteínicas foram relatadas em estudos com fluidos laticíferos de diferentes espécies. O látex de Carica papaya é um exemplo de látex rico em proteases cisteínicas, no qual foram isoladas quatro destas proteases: a papaína, a quimopapaína, a caricaína e a papaia protease IV (MOUSSAOUI et al., 2001). Outros exemplos de proteases cisteínicas isoladas de fluidos laticíferos são a proceraína, proceraína b e três isoformas nomeadas de CPCP-1, CPCP-2 e CPCP-3 extraídas do látex de Calotropis procera e calotropina FI, FII, DI e DII extraídas do látex de Calotropis gigantea. Recentemente, uma protease cisteínica de 24,118 kDa foi purificada do látex de Cryptostegia grandiflora (DUBEY; JAGANNADHAM, 2003; NANDANA et al., 2014; SINGH et al., 2010; RAMOS et al., 2013; RAMOS et al., 2014). Proteases serínicas também foram isoladas de fluidos 34
laticíferos, havendo cerca de 30 proteases desta família já descritas. Dentre estas proteases destacam-se as euphorbaínas obtidas a partir de plantas do gênero Euphorbia (LENNOX; ELLIS, 1945; ARIMA et. al., 2000), as hevaínas A, B e G de H. brasiliensis (LYNN; CLEVETTE-RADFORT, 1986c), a carneina do látex de Ipomoea carnea ssp. fistulosa (PATEL; SINGH; JAGANNADHAM, 2007) e a ficina de Ficus elastica (LYNN; CLEVETTE-RADFORT, 1986a)
Outra classe de PR-proteínas frequentemente descrita em fluidos laticíferos é a das quitinases. Essas foram isoladas no látex de Hevea brasiliensis, Carica papaya, Morus sp. e Ficus microcarpa e na maioria das vezes estão associados a processos de defesa vegetal (SUBROTO et al., 1996; AZARKAN et al., 1997; AZARKAN et al., 2003, 2004; TAIRA et al., 2005; KITAJIMA et al., 2010).
As quitinases são endoglicosil-hidrolases que clivam especificamente as ligações glicosídicas de β-1,4-N –acetil-D-glucosamina, polímero de quitina. A quitina é o segundo biopolímero mais abundante na natureza, podendo ser encontrado, principalmente, nas carapaças de crustáceos, cutículas de insetos e na parede celular de fungos (THARANATHAN; KITTER, 2003). Quitinases e β-1,3-glucanases participam dos mecanismos de defesa da planta contra infecção por patógenos. Essas enzimas atuam diretamente sobre as paredes celulares, uma vez que são capazes de promover a lise das extremidades das hifas de fungos fitopatogênicos, em que quitina e β-1,3-glucano são componentes importantes. Dessa forma, inibindo o crescimento de várias classes de fungos patogênicos. Somando a essa ação direta sobre os fungos, os oligômeros de N- acetilglucosamina liberados podem ainda ser reconhecidos pela planta e funcionarem como indutores para amplificar outras respostas de defesa, tais como produção de fitoalexinas e lignificação, nas células circundantes ao local de infecção (CAWOOD et al., 2010; DATTA et al., 2001).
Wang et al. (2005) mostraram que quitinases, glucanases e peroxidases foram diferencialmente reguladas em folhas de batata (Solanum tuberosum) inoculadas com Phytophthora infestans. Quitinases e glucanases foram induzidas logo após 6 horas de inoculação com o fungo. Essa rápida indução pode estar relacionada com a atividade inicial da proteína na liberação de elicitores, os quais são capazes de aumentar ainda mais a indução de genes relacionados com a defesa. Enquanto a indução de quitinases e glucanases foi local e 35
sistêmica, a indução de peroxidases foi essencialmente local. Sugerindo que essa resposta local está relacionada à função peroxidásica da proteína, uma vez que essas são frequentemente envolvidas na resistência à doença por meio da lignificação da parede celular ou remoção de radicais tóxicos na planta, tais como o peróxido de hidrogênio. Acredita-se que esse é um mecanismo de defesa geral contra um largo espectro de agentes patogênicos (YOSHIDA et al., 2003; KIM et al., 2000).
As osmotinas são outro grupo de PR-proteínas e entre as várias proteínas relacionadas com estresses, as osmotinas têm chamado atenção por serem capazes de agir em resposta a estresses bióticos e abióticos, sendo a primeira osmotina descrita em culturas celulares de plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) adaptadas às condições de salinidade (SINGH et al., 1987). No entanto, propriedades antifúngicas tanto in vitro, como em condições in vivo são relatadas na literatura (LIU et al., 1996; SUBRAMANYAM et al., 2012). Rajam et al., (2007) observaram que a superexpressão da osmotina em plantas transgênicas de tabaco conferiu resistência contra infecções fúngicas e estresses abióticos, como o salino e o hídrico.
As osmotinas são formadas por multidomínios, onde um domínio pode exercer sua função independentemente, ou em cooperação com domínios vizinhos. Por esse motivo, a osmotina tem sido apontada como uma proteína multifuncional de plantas, uma vez que sua atividade antifúngica, e sua função protetora contra o frio, a salinidade e a deficiência hídrica são bem documentadas (OSTERMEIER, BENKOVIC, 2000).
Abad et al. (1996) em uma pesquisa realizada com 31 isolados representando 18 gêneros de fungos patogênicos, demonstraram a ação antifúngica da osmotina contra 27 destes isolados. Os gêneros Bipolaris, Fusarium, Phytophthora e Trichoderma foram considerados como os mais sensíveis ao tratamento com osmotina, enquanto que algumas espécies foram altamente resistentes à osmotina, como Aspergillus flavus, Aspergillus parasitica, Rhizoctonia solani e Macrophomina phaseolina.
Outros trabalhos demonstraram atividade similar da osmotina contra diversos fungos patogênicos, apresentando possíveis mecanismos de ação dessa proteína. Esse fato tem fortalecido a hipótese de que osmotinas desempenham papel defensivo contra fungos patogênicos (CHU; NG, 2003; VITALI et al., 2006; HO et al., 2007; TZOU et al., 2011). 36
Interações específicas da osmotina com a membrana plasmática resulta na formação de poros, alterando a permeabilidade da membrana fúngica e finalmente, provocando a apoptose celular. O mecanismo causador do aumento da permeabilidade da membrana plasmática não foi completamente elucidado. No entanto, tem sido sugerido que as cargas negativas polarizadas que ocorrem numa fenda presente na estrutura da osmotina permitem a interação desta com proteínas de membrana de carga positiva, como os canais de íons ou de água. Desta forma, essa interação acarreta o aumento do fluxo de água através da membrana plasmática (BATALIA et al., 1996).
Existem relatos de que as osmotinas também possuem atividade β-1,3-glucanase, liberando oligômeros de β-1,3-D-glucano que agem como elicitores e induzem várias respostas de defesa nas plantas (LAURENCE et al., 2003), como o aumento da atividade de quitinase e da L-fenilalanina amônia-liase (PAL) em cultura de suspensão de células de arroz (Oryza sativa) (INUI; YAMAGUCHI; HIRANO, 1997). No entanto, a função da atividade β- 1,3-glucanase não é limitada para a geração de elicitores, mas pode ser estendida a degradação da parede celular. As osmotinas podem também levar a morte celular programada por induzir o acúmulo de espécies reativas de oxigênio, e impedirem as células de manterem o gradiente de pH (NARASIMHAN et al., 2001; VIKTOROVA et al., 2012).
Algumas osmotinas de fluidos laticíferos foram purificadas e caracterizadas, como as dos látex de Hevea brasiliensis (SUBROTO et al., 2001), Calotropis procera (FREITAS et al., 2011a; 2011b) e Cryptostegia grandiflora (SOUZA, 2014). Em particular, a osmotina do látex de Calotropis procera apresentou forte atividade antifúngica sobre Fusarium solani, Neurospora sp. e Colletotrichum gloeosporioides inibindo a germinação de esporos e o crescimento micelial.
1.4 Cultura in vitro de tecidos vegetais
A cultura in vitro de tecidos vegetais representa uma estratégia biotecnológica aplicável a diversos problemas da pesquisa científica e industrial. Esta estratégia popularizou- se por ser uma ferramenta com alto potencial de aplicação no melhoramento vegetal, dispondo de alternativas para garantir a perpetuação de espécies de interesse econômico, por meio da propagação clonal e do desenvolvimento de genótipos resistentes a condições de estresses bióticos e abióticos. A aplicação das técnicas de cultura de tecidos em plantas 37
permite também a obtenção de fontes de compostos biologicamente ativos através do isolamento de clones que produzem maiores quantidades de produtos vegetais de interesse, como fitofármacos, metabólitos secundários, proteases e antioxidantes. Esses produtos são utilizados para fins medicinais ou industriais, e representam formas alternativas para a exploração sustentável de algumas espécies, principalmente em ecossistemas ameaçados (MATKOWSKI, 2008; GONZÁLEZ-RÁBADE et al., 2011; NEELAKANDAN; WANG, 2012).
Pesquisas têm demonstrado sucesso na produção de metabólitos secundários em diferentes órgãos e culturas não organizadas como calos e suspensão de células (KARAM et al., 2003; FURDEN; HUMBURG; FUSS, 2005; GYÖRGY; TOLONEN; NEUBAUER, 2005). Zypman, Ziv e Applebaum (1997) relatam a produção de um bioinseticida potencialmente eficaz no controle de Schistocerca gregaria, a partir de calos e suspensões celulares in vitro de nim indiano (Azadirachata indica).
Nos últimos anos, várias estratégias têm sido desenvolvidas para avaliar o acúmulo de biomassa e síntese de compostos biologicamente ativos em culturas de células. Uma dessas estratégias é o controle dos parâmetros que regulam o crescimento e a multiplicação das células, como, a seleção de linhagens de alta produção de compostos de interesse e a padronização das condições de cultura, no que se refere ao meio de cultivo adequado, fonte de carbono, os níveis de regulador de crescimento; e fatores físicos, como temperatura, iluminação, e o pH do meio. Os meios nutritivos utilizados para a cultura de células fornecem as substâncias essenciais para o crescimento e desenvolvimento dos tecidos, e supreem as necessidades metabólicas, energéticas e estruturais das células, uma vez que a capacidade fotossintética no sistema de cultivo in vitro é, em geral, reduzida (MURTHY; LEE; PAEK, 2014).
A Cultura in vitro de tecidos vegetais basea-se, sobretudo, na teoria da totipotência celular, que diz respeito à capacidade das células vegetais organizarem-se em tecidos e, eventualmente, em plantas completas, ou formarem estruturas desorganizadas como calos, sob estímulo apropriado (VASIL, 2008). A cultura in vitro tecidos vegetais tem permitido ainda uma compreensão mais aprofundada da fisiologia e bioquímica de plantas cultivadas sob condições ambientais adversas, possibilitando estudar os aspectos do crescimento e desenvolvimento das plantas (BENDERRADJI et al., 2012). Isto tem sido 38
realizado por meio do controle do ambiente físico e dos parâmetros nutricionais, aspectos difíceis de regular no sistema experimental tradicional (PÉREZ-CLEMENTE; GÓMEZ- CADENAS, 2012). A cultura de tecidos tem sido amplamente integrada à biotecnologia vegetal como uma ferramenta de pesquisa para a formação de calos, proliferação e regeneração de plantas (JAYARAMAN et al., 2014).
Calos são uma massa de células, com crescimento desordenado, originadas a partir de segmentos da planta, chamados de explantes. Os calos se desenvolvem basicamente em três estágios: indução da divisão celular; seguido por um período de rápida divisão celular, durante o qual as células diferenciadas do explante perdem quaisquer recursos especializados; logo após, a divisão das células diminui e há uma crescente diferenciação celular nos calos, em células meristemáticas e não especializadas (GEORGE, 2008). Durante o processo de desdiferenciação, os novos meristemas formados no tecido dão origem a células parenquimatosas indiferenciadas e sem ordem estrutural definida, regiões de divisão de células meristemáticas e ocasionais células do xilema. No entanto, alterações na composição do meio ou ainda a origem do explante podem afetar a formação dos calos e alguns tipos de células especializadas podem ser formadas, como raízes, brotos ou embriões (GARCIA et al., 2011; GEORGE, 2008). Os calos podem ser classificados em dois tipos: friáveis e compactos. Calos friáveis são formados a partir de divisão celular rápida, e são compostos por células indiferenciadas, altamente vacuoladas e frouxamente ligadas. Enquanto que calos compactos são formados por células com pequeno espaço intercelular e densamente compactadas, não favorecendo a divisão celular rápida (NA et al., 2007). Os calos desenvolvem-se em resposta a lesões físicas ou químicas, contudo a oferta exógena de reguladores de crescimento é frequentemente necessária para a calogênese (LIMA et al., 2008).
Deste modo, sob estímulo de reguladores de crescimento, o metabolismo das células que estavam em estado de repouso, é alterado para uma condição de intensa divisão celular. As classes de reguladores de crescimento mais reportadas na literatura para cultura de células vegetais são auxinas e citocininas. O balanço hormonal obtido entre níveis de citocinina e auxina, exógenas e endógenas à planta, pode estimular a proliferação celular. As auxinas são geralmente utilizadas com o propósito de alongamento celular, expansão dos tecidos, divisão celular (formação de calo), e formação de raízes. Enquanto que as citocininas são frequentemente utilizadas para estimular o crescimento, a divisão celular e o 39
desenvolvimento de brotações múltiplas (NURAZAH et al., 2009). Combinações de auxinas e citocininas em cultura in vitro são bem documentadas por promoverem diferenciação celular e também a organogênese. Evidências experimentais sugerem que tanto auxinas como citocininas participam na regulação do ciclo celular controlando a atividade de quinases que são dependentes de ciclinas (LIMA et al., 2008). Entre os reguladores de crescimento utilizados na indução de calos, destacam-se o ácido diclorofenóxiacético (2,4-D), ácido 1- naftalenoacético (ANA), ácido indolbutírico (AIB), 6-benzilaminopurina (BAP), cinetina (CIN) e Thidiazuron (TDZ).
Dessa forma, a cultura in vitro de tecidos tem sido umas das principais ferramentas utilizadas na Biotecnologia Vegetal para solucionar os desafios atuais e emergentes enfrentados pelo comércio e pela agricultura mundial, como: produção de alimentos limitada, baixa qualidade nutritiva, suscetibilidade a condições de estresse biótico e abiótico e restrita disponibilidade de combustíveis. Através da produção de plantas que apresentem características desejáveis, tais como: resistência/tolerância a fatores bióticos e abióticos, melhoria do estado nutricional e/ou produção de compostos com alto potencial comercial, como vacinas e biocombustíveis. Além disso as técnicas de cultura in vitro de tecidos vegetais permite através da produção de calos, a obtenção de maiores quantidades de compostos biologicamente ativos, como metabólitos secundários, proteases e antioxidantes (VASIL, 2008; DAWSON et al., 2009; NEELAKANDAN; WANG, 2012).
40
2 JUSTIFICATIVA
A proteção de plantas de interesse agrícola contra o ataque por patógenos, em especial fungos fitopatogênicos, tem sido um dos maiores desafios dos últimos anos. Culturas em todo o mundo sofrem de uma vasta gama de doenças fúngicas que causam severas perdas agrícolas, tendo em vista que estas afetam diretamente a produção, comercialização e qualidade dos produtos. Entre as metodologias mais utilizadas para o controle de infecções fúngicas estão a aplicação de fungicidas à lavoura, as técnicas de melhoramento genético e o controle biológico. Embora o uso de defensivos contribua para o aumento da produtividade agrícola, eles têm sido responsáveis por efeitos adversos sobre o meio ambiente e a saúde humana. Podendo apresentar diversas características negativas, que vão desde os problemas de contaminação ambiental, mortalidade de espécies não-alvo, resistência e surgimento de novas pragas, até o alto custo econômico para sua aquisição e aplicação.
Assim, muitas alternativas ao uso de defensivos químicos têm sido propostas. Dentre elas, a utilização de proteínas antifúngicas tem chamado atenção de um grande número de pesquisadores em virtude do potencial na proteção de culturas economicamente importantes contra o ataque de patógenos. Nesse cenário, as plantas laticíferas têm um grande destaque, por serem, reconhecidamente, fontes de proteínas relacionadas com a defesa vegetal. As plantas laticíferas podem constituir fontes vegetais de proteínas antifúngicas, uma vez que a atividade inibitória contra diversos fungos é bem documentada na literatura, especialmente para as espécies C. grandiflora e C. procera.
Tendo em vista que as culturas de células vegetais têm sido estudadas para produção de compostos biologicamente ativos e de interesse biotecnológico, e que através da cultura in vitro de tecidos pode-se otimizar a obtenção destas proteínas em uma escala de tempo menor e em maior quantidade. Este trabalho, buscou estabelecer protocolos de cultura de tecidos in vitro das espécies C. grandiflora e C. procera como uma fonte alternativa para produção de moléculas de interesse biotecnológico. Uma vez que a presença de proteínas antifúngicas nestes fluidos laticíferos tem sido amplamente documentada, é pertinente investigar se essas proteínas estariam presentes em tecidos de C. procera e C. grandiflora cultivados in vitro, podendo assim, constituir uma ferramenta biotecnológica para o biocontrole de fungos fitopatogênicos. 41
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Estabelecer culturas in vitro de calos e raízes adventícias de duas espécies laticíferas, Cryptostegia grandiflora e Calotropis procera, como fonte de proteínas com potencial antifúngico.
3.2 Objetivos específicos
Obter calos e raízes adventícias de C. grandiflora e C. procera utilizando hipocótilos e cotilédones como fonte de explantes e investigar a ocorrência de laticíferos, em calos e raízes de C. grandiflora; Avaliar a atividade antifúngica de extratos proteicos dos calos e raízes adventícias de C. grandiflora e C. procera sobre os fungos fitopatogênicos: Fusarium solani, F. oxysporum, Colletotrichum lindemuthianum, C. gloesporioides e Mucor sp.; Avaliar possíveis mecanismos de ação de proteínas antifúngicas presentes na cultura in vitro de C. grandiflora e C. procera; Investigar a presença de PR-proteínas em calos e raízes de C. grandiflora e C. procera; Examinar o envolvimento de proteases cisteínicas na atividade antifúngica de calos e raízes adventícias de C. grandiflora e C. procera; Avaliar a atividade das enzimas antioxidantes catalase, ascorbato peroxidase e peroxidase do guaiacol em calos e raízes de C. grandiflora; Identificar por espectrometria de massas, proteínas envolvidas na defesa contra fungos em calos e raízes de C. grandiflora e C. procera; Determinar o perfil proteico de calos e raízes de C. grandiflora por eletroforese em primeira dimensão; Fracionar as proteínas dos calos de C. grandiflora por cromatografia, no intuito de concentrar as proteínas dos calos em sub-frações. 42
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Materiais
4.1.1 Reagentes químicos
Acrilamida, ágar, azocaseína, ácido 1-naftaleno acético (ANA), cinetina (CIN), Nα-benzoil-DL-arginina-p-nitroanilida (BAPNA), Nα-benzoil-DL-arginina-2-naftilamida (BANA), 4-Dimetil-aminocinamaldeído (DMACA), trans-epoxisuccinil-L-leucilamida-(4- guanidino)-butano (E-64), fenilmetilsulfonilflúor (PMSF), glucuronidase (EC 3.2.1.31), marcadores de massa molecular, membrana de diálise “cut off” 12.000 Da, papaína (EC 3.4.22.2), persulfato de amônio, piridina, quitina coloidal, tripsina (EC 3.4.21.4), 3,3'- diaminobenzidina (DAB), anti-IgG de coelho produzido em cabra e marcado com fosfatase alcalina, 5- bromo-4-cloro-3-indolilfosfato (BCIP), nitroazul de tetrazólio (NBT), e adjuvante completo e incompleto de Freund, foram obtidos da Sigma-Aldrich, Brasil. Os meios de cultura Sabouraud Dextrose Agar (SDA) e Yeast Peptone Dextrose (YPD) foram obtidos da DIFCO e Himedia, respectivamente. Ditiotreitol (DTT), Dodecil sulfato de sódio (SDS), ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), iodoacetamida (IAA), sacarose e matriz DEAE- Sepharose fast flow foram obtidas da G&E healthcare, Brasil. Triton X-100 foi obtido da USB Corporation, Cleveland, OH USA. Os demais reagentes utilizados foram de grau analítico.
4.1.2 Material vegetal
Exemplares de Calotropis procera (Ait) R. Br. e Cryptostegia grandiflora R. Br. foram identificados por um taxonomista do Herbário Prisco Bezerra da Universidade Federal do Ceará e depositadas sob exsicatas de número 32663 e 040409, respectivamente. Plantas saudáveis, localizadas na cidade de Fortaleza-Brasil, foram utilizadas como fonte de látex fresco e seus frutos maduros e secos foram coletados. As sementes foram removidas e mantidas no laboratório de Biotecnologia Vegetal da Universidade Federal do Ceará na temperatura de 25 ± 2 ºC.
4.1.3 Animais
Coelhos machos da raça Nova Zelândia de quatro meses de idade, foram obtidos no Departamento de Zootecnia da Universidade Federal do Ceará e mantidos no Biotério 43
Experimental do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, sob condições controladas de temperatura de 25 ± 2 °C, fotoperíodo de 12 horas e livre acesso à água e ração (Purina, Paulinia, SP, Brasil).
4.1.4 Fungos
Os fungos fitopatogênicos F. solani, F. oxysporum, C. lindemuthianum, C. gloesporioides e Mucor sp., utilizados nos experimentos, pertencem à micoteca do laboratório de Proteínas Vegetais de Defesa do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular - UFC.
4.2 Métodos
4.2.1 Germinação de sementes e indução in vitro de calos e raízes adventícias
Sementes de C. procera e C. grandiflora foram esterilizadas através de lavagem em detergente comercial diluído, seguido de imersão em etanol 70% (v/v) por 5 minutos, e em hipoclorito de sódio (1% de cloro ativo), durante 20 minutos. Em seguida foram submetidas a cinco lavagens em água destilada estéril. Para germinação das sementes de C. procera foi utilizada a formulação nutritiva de Murashige e Skoog (MS) (MURASHIGE; SKOOG, 1962), com metade das concentrações de macronutrientes, 2% (p/v) de sacarose, pH 5,8 e solidificado com 0,7% (p/v) de ágar. Posteriormente as sementes foram inoculadas em tubos de ensaio contendo 15 mL de meio MS e mantidas em casa de cultura, sob condições controladas de temperatura (25 ± 2 °C) e luz (fotoperíodo de 16 horas). Sementes de C. grandiflora foram germinadas em areia autoclavada e mantidas em câmara de germinação tipo B.O.D. (Biochemical oxygen demand), temperatura de 25 ± 2 °C e fotoperíodo de 16 horas. Após quatro semanas, as plântulas obtidas foram utilizadas como fonte de explantes.
O protocolo utilizado neste estudo para obtenção de calos e raízes adventícias de C. grandiflora baseia-se em experiências descritas por Suri e Ramawat (1995) e por Teixeira et al. (2011) em que cultura de tecidos de C. procera foram desenvolvidas utilizando-se de concentrações apropriadas de auxinas e citocininas para formação de calos e diferenciação de raízes adventícias. Assim, as plântulas obtidas do cultivo das sementes de C. procera e C. grandiflora foram utilizadas como fonte de explantes para indução de calos e raízes adventícias. Para tanto, segmentos de 1 cm2 de hipocótilo e cotilédones foram cultivados em 44
placas de Petri contendo meio MS, com metade das concentrações de macronutrientes, 2% (p/v) de sacarose, pH 5,8 e solidificado com 0,7% (p/v) de ágar, acrescido de 3µM de ácido 1- naftalenoacético (ANA) e 4,6 µM de cinetina (CIN). O cultivo dos calos e raízes foi realizado em câmara de germinação tipo B.O.D. na ausência de luz e na temperatura de 25 ± 2 ºC. Após quatro semanas de cultivo, as raízes adventícias obtidas foram coletadas e submetidas à extração de proteínas. Os calos foram subcultivados a cada quatro semanas em câmara de fluxo laminar, para garantir a esterilidade dos mesmos e em cada fase de subcultivo foram coletadas amostras dos calos obtidos para extração e análises proteicas.
4.2.2 Análise Histológica
As análises anatômicas foram feitas em explantes de cotilédone e hipocótilo de C. grandiflora; um estágio intermediário de formação de calos e raízes a partir de explantes cotiledonares; raízes; e calos em sexto ciclo de subcultivo, tendo como modelo, o sistema de cultivo in vitro de C. procera, anteriormente caracterizado quanto a ocorrência de formação de laticíferos em calos e raízes (TEIXEIRA et al. 2001). As amostras de cada grupo foram fixadas em solução de Karnovsky (Paraformaldeído a 1%, Glutaraldeído a 3% em tampão Cacodilato 0,07 M e pH 7,2) por 48 horas (KARNOVSKY, 1965). Após este período, os tecidos foram desidratados em soluções de etanol crescente: 10% a 100%, por 1 hora cada, e posteriormente colocados em contato com solução de pré-infiltração composta por 50% de álcool e 50% de resina básica (LEICA HISTORESIN EMBEDDING KIT) durante 24 horas. Em seguida, as amostras foram infiltradas com resina básica permanecendo nesta solução até que todo o material estivesse infiltrado com resina.
Secções transversais e longitudinais dos explantes, calos e raízes foram emblocadas e secções de 5 μm de espessura foram obtidas em micrótomo LEICA 2065. Os cortes obtidos foram montados em lâminas histológicas e corados com safrablau (Safranina 1% e Azul de Astra 1%) por 24 horas adaptado de Bukatsch (1972) ou azul de toluidina 0,12% em bórax 5%, durante 10 minutos, seguido por tratamento com fucsina básica 0,05% durante 5 segundos. Após esse procedimento as lâminas foram seladas com Entellan® e examinadas por microscopia com auxílio do microscópio Leica DM4000 B LED. 45
4.2.3 Extração de proteínas de calos, raízes adventícias e látex
Para obtenção das proteínas de interesse, os calos e raízes foram pesados, macerados e homogeneizados em solução de cloreto de sódio (NaCl) 500 mM, acrescido de ácido ascórbico 10 mM, na proporção de 1:2,5 (m/v). As misturas foram agitadas durante 90 minutos, e centrifugados a 9.000 x g durante 10 minutos a 4 °C. Os sobrenadantes foram fracionados com sulfato de amônio na faixa de saturação de 0-90% e submetidos à agitação por 4 horas. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 9.000 x g durante 20 minutos a 4 °C. Os precipitados foram ressuspensos e dialisados contra água destilada por dois dias sob agitação contínua. Posteriormente as amostras foram liofilizadas e armazenadas em frascos de plásticos a temperatura ambiente até posterior utilização. As proteínas obtidas a partir de calos e raízes de C. grandiflora e C. procera, foram denominadas, respectivamente por CPCg, RPCg, CPCp e RPCp.
Proteínas solúveis dos fluidos laticíferos de Calotropis procera e Cryptostergia grandiflora foram utilizadas como referencial comparativo nas análises de atividade antifúngica. Para tal, estes látex foram coletados em água destilada (proporção 1:1, v/v) através da quebra dos ápices caulinares de cada espécie. Após a coleta, os látex foram centrifugados a 10.000 x g, por 10 minutos a 4 ºC e os precipitados obtidos, constituídos principalmente de borracha, foram descartados. Os sobrenadantes foram submetidos à diálise contra água destilada por três dias a 4 ºC, utilizando uma membrana de diálise com capacidade de retenção de moléculas com massa molecular superior a 12 kDa, em seguida, estes foram novamente centrifugados. Os sobrenadantes límpidos e livres de borracha foram liofilizados, e denominados de proteínas do látex de Calotropis procera (LPCp) e proteínas do látex de Cryptostegia grandiflora (LPCg).
4.2.4 Determinação da concentração de proteínas solúveis
A concentração de proteínas solúveis das amostras estudadas foi determinada pelo método colorimétrico descrito por Bradford (1976), em que 2,5 mL do reagente de Bradford foram adicionados a alíquotas de 100 µL das amostras testadas. Após 10 minutos, as leituras das absorbâncias foram feitas a 595 nm em espectrofotômetro (Ultrospec 1000 Amersham Pharmacia). Albumina sérica bovina (BSA) foi utilizada para obtenção de uma curva padrão e 46
definição do fator de correção, necessário para determinar a concentração de proteínas solúveis.
4.2.5 Atividade antifúngica
A atividade antifúngica foi investigada com base em dois ensaios: inibição do crescimento micelial e inibição da germinação de esporos dos fungos fitopatogênicos: F. solani, F. oxysporum, C. lindemuthianum, C. gloesporioides e Mucor sp., como descrito por Souza et al. (2011). Para tanto, foram utilizados nos ensaios, os extratos proteicos dos calos e raízes de C. grandiflora e C. procera (5 mg/mL), as proteínas dos seus respectivos látex (2,5 mg/mL) e a fração LPCp P1 das proteínas do látex de C. procera (2 mg/mL). A fração LPCp P1 é constituída por quitinases e foi utilizada como um controle para quitinases de C. procera.
4.2.5.1 Cultivo dos fungos e obtenção das suspensões de esporos
Os fungos fitopatogênicos foram armazenados em estufa a 27 ± 2 ºC na ausência de luz e renovados mensalmente através da transferência de fragmentos de micélio para placas de Petri contendo meio Sabouraud Dextrose Agar (SDA) estéril.
As suspensões de esporos dos fungos foram preparadas pela adição de 5 mL de água destilada estéril em placa de Petri, quinze dias após o repique. Com auxilio de uma alça de Drigalsky foram feitos movimentos suaves na superfície do micélio para liberação dos esporos. As suspensões obtidas foram filtradas em malhas finas de nylon estéreis para a retirada das hifas remanescentes. Os esporos foram contados com o auxílio de uma câmara de Neubauer, em microscópio óptico (Olimpus System Microscope BX 60) e a concentração de esporos foi ajustada para 2 x 105 esporos/mL.
4.2.5.2 Inibição do crescimento micelial
Misturas contendo 10 µL de uma suspensão aquosa de esporos (2 x 105 esporos/mL) e 90 µL de meio liquido Yeast Peptone Dextrose (YPD) foram incubados em placas de microtitulação de poliestireno de fundo plano de 96 poços. Após 16 horas a 27 °C e no escuro, 100 µL das amostras foram adicionadas. As amostras foram dissolvidas em tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,0, acrescido de ditiotreitol (DTT) 3 mM, centrifugadas a 10.000 x g por 10 minutos a 4 °C e filtrada através de membrana com poro de 0,20 µm de 47
diâmetro. Foram utilizados como controles negativo e positivo, respectivamente, tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,0 com DTT 3 mM e peróxido de hidrogênio (H2O2) 200 mM. A turbidimetria foi monitorada a 620 nm, por 48 horas em intervalos de 12 horas num leitor de microplacas (Biotrak II Plate Reader, Amersham Biosciences). Os experimentos foram realizados em triplicatas e conduzidos com quatro repetições para cada uma das amostras. Foi considerada como unidade experimental uma placa de ELISA. Os dados foram examinados utilizando o programa GraphPadPrism 6 e análise de variância (ANOVA). O teste de múltiplas comparações de Tukey foi utilizado para identificar as médias que diferiram no teste de ANOVA. Valores de p <0,05 foram considerados estatisticamente diferentes.
4.2.5.3 Inibição da germinação de esporos
Misturas contendo 10 µL de suspensão de esporos (2 x 105 esporos/mL) e 10 µL das amostras foram adicionadas em placas de polietileno reticuladas estéreis por 24 horas a 27 °C. As amostras foram dissolvidas em tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,0, acrescido de DTT 3 mM, centrifugadas a 10.000 x g por 10 minutos a 4 °C e filtrada através de membrana com poro de 0,20 µm de diâmetro. Foram utilizados como controles negativo e positivo, respectivamente, tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,0 com DTT 3 mM e peróxido de hidrogênio 200 mM. As placas foram avaliadas quanto à inibição da germinação de esporos sob microscópio de luz (Olimpus System Microscope BX). A microfotografia de cada preparação foi obtida, e a taxa de germinação de esporos foi avaliada visualmente. Os experimentos foram realizados em triplicatas e conduzidos com quatro repetições para cada uma das amostras.
4.2.5.4 Avaliação do mecanismo de ação
4.2.5.4.1 Efeito dos extratos proteicos de calos e raízes sobre a permeabilidade da membrana plasmática de C. gloesporioides
Para avaliar o efeito das proteínas de calos e raízes de C. procera e C. grandiflora sobre a integridade da membrana plasmática de esporos de C. gloesporioides, utilizou-se o corante iodeto de propídio (RAMOS et al., 2014). Neste ensaio, misturas contendo 25 µL da suspensão de esporos (20 x 105 esporos/mL) e 25 µL das amostras foram adicionadas a microtubos e incubadas por 30 minutos. Após este período, uma alíquota de 10 µL de uma solução de iodeto de propídio 1 mM foi adicionada a mistura. As suspensões foram 48
transferidas para lâminas e visualizadas em microscópio óptico utilizando filtro de fluorescência (Olimpus System Microscope BX). Foram considerados esporos permeabilizados aqueles em que os núcleos se apresentaram fluorescentes (vermelhos). Foram utilizados como controles negativo e positivo, respectivamente, tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,0 com DTT 3 mM e cetrimida 100 µM, um surfactante catiônico com atividade biocida. Os experimentos foram realizados em triplicatas e conduzidos com quatro repetições para cada uma das amostras.
4.2.5.4.2 Efeito dos extratos proteicos de calos e raízes na indução de estresse oxidativo em esporos de C. gloesporioides
A produção de espécies reativas de oxigênio (EROS), tais como H2O2 por esporos do fungo C. gloesporioides tratados com amostras de calos e raízes de C. procera e C. grandiflora foi estimada pela adição de 3,3'-diaminobenzidina (DAB), como descrito por Souza et al. (2011). O DAB é oxidado por peroxidases na presença de peróxido de hidrogênio, gerando um precipitado castanho avermelhado. Este precipitado é utilizado para indicar indução de estresse oxidativo em esporos fúngicos. Para tanto, 25 µL de suspensão de esporos (20 x 105 esporos/mL) e 25 µL das amostras foram incubados durante 30 minutos. Em seguida, 10 µL de DAB 0,1 mg/mL foram adicionados e incubados por 2 horas a 27 °C. As suspensões foram transferidas para lâminas e visualizadas em microscópio óptico (Olimpus System Microscope BX). Os experimentos foram realizados em triplicatas e conduzidos com quatro repetições para cada uma das amostras.
4.2.6 Avaliação da presença de PR-proteínas
4.2.6.1 Inibidores de proteases cisteínicas e serínicas
A presença de inibidores de proteases cisteínicas foi investigada em calos e raízes de C. grandiflora e C. procera, através do ensaio de atividade inibitória da papaína descrito por Xavier-Filho et al. (1989). Neste ensaio, alíquotas de 20 e 100 µL dos extratos proteicos de calos e raízes (5 mg/mL) foram incubados durante 30 minutos a 37 °C, com 15 µL de solução de papaína (0,1 mg/mL em tampão fosfato de sódio 50 mM pH 6,0) previamente ativada com 40 µL de solução de DTT 3 mM. O volume foi ajustado para 500 µL com tampão fosfato de sódio 50 mM pH 6,0 e em seguida 200 µL de Nα-benzoil-DL-arginina-2- naftilamida (BANA) 1 mM foram adicionados a mistura e novamente incubados durante 30 49
minutos, a 37 °C. Posteriormente, a reação foi finalizada pela adição de 500 µL de ácido clorídrico (HCl) 2% em etanol e em seguida 500 µL de 4-Dimetil-aminocinamaldeído (DMACA) 0,06% em etanol foram adicionados. Após 40 minutos, a atividade proteolítica foi mensurada através de leitura em espectrofotômetro a 540 nm, para avaliar se a ação proteolítica da papaína foi inibida. Os experimentos foram realizados em triplicatas e conduzidos com três repetições para cada uma das amostras. Concomitantemente, foram realizados três ensaios controle, atividade proteolítica dos calos e raízes, atividade proteolítica da papaína na presença do inibidor comercial E-64 e atividade proteolítica da papaína na ausência de inibidor cujo resultado foi usado para obter o percentual de inibição.
A presença de inibidores de proteases serínicas foi estimada através do ensaio de atividade inibitória da tripsina descrito por Xavier-Filho et al. (1989). No ensaio foram adicionados 385 - 485 µL de tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, 15 µL de solução de tripsina (0,1 mg/ml em tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,5) e alíquotas de 20 e 100 µL das amostras de calos e raízes de C. grandiflora e C. procera (5 mg/mL). Estes foram incubados durante 30 minutos a 37 °C e em seguida 200 µL de Nα-benzoil-DL-arginina-p-nitroanilida (BAPNA) 1,25 mM foram adicionados à mistura e novamente incubados durante 30 minutos a 37 °C. Posteriormente a reação foi finalizada pela adição de 150 µL de ácido acético 30%. Após 10 minutos a absorbância foi lida a 405 nm e a atividade proteolítica foi mensurada para avaliar se a ação proteolítica da tripsina foi inibida. Os experimentos foram realizados em triplicatas e conduzidos com três repetições para cada uma das amostras. Concomitantemente, foram realizados três ensaios controle, atividade proteolítica dos calos e raízes, atividade proteolítica da tripsina na presença do inibidor comercial fenilmetilsulfonilflúor (PMSF) e atividade proteolítica da tripsina na ausência de inibidor cujo resultado foi usado para obter o percentual de inibição.
4.2.6.2 Quitinases
A atividade quitinolítica foi determinada seguindo o método colorimétrico descrito por Oliveira, Gondim e Vasconcelos (2010). O princípio do ensaio consiste na liberação de N-acetil-D-glucosamina (NAG) a partir da ação hidrolítica das enzimas sobre a quitina coloidal. Para tal, 250 µL de quitina coloidal foram adicionados a 250 µL do extrato proteico dos calos e raízes de C. grandiflora e C. procera (5 mg/mL) e incubados a 37 °C por 1 hora. Em seguida, a reação foi interrompida por fervura em banho-maria a 98 ºC, por 5 50
minutos. Após resfriamento, as amostras foram centrifugadas a 17.949 x g por 20 minutos a 10 °C. A seguir, 10 µL da enzima glucoronidase foram adicionados a 300 µL de cada sobrenadante e incubados novamente, a 37 ºC, por 1 hora. Esta segunda etapa enzimática também foi interrompida por meio de fervura em banho-maria a 98 ºC, por 5 minutos. Para determinação da quantidade de NAG liberada, 310 µL dos hidrolizados foram acrescidos de 190 µL de tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,2 e 100 µL de tetraborato de potássio 0,6 M. A mistura reacional foi aquecida em banho-maria a 98 ºC, por 5 minutos. Após resfriamento, foram adicionados 1 mL da solução de ρ-dimetilaminobenzaldeido (DMAB) e incubado a 37 ºC por 20 minutos. Após resfriamento, as leituras das absorbâncias foram feitas no comprimento de onda de 585 nm. A atividade quitinolítica foi expressa em nanokatal (nkat) por micrograma (µg) de proteína. Foram utilizados como controle os extratos proteicos dos látex de C. grandiflora e C. procera (1 mg/mL). Os experimentos foram realizados em triplicatas e conduzidos com três repetições para cada uma das amostras.
4.2.6.3 Osmotinas
Para detecção de osmotinas presentes nos calos e raízes de C. grandiflora e C. procera foram produzidos anticorpos policlonais anti-osmotina em coelho macho, da raça Nova Zelândia, de quatro meses de idade, segundo Ramos et al. (2006b). Para tanto, o animal foi inicialmente imunizado com uma emulsão contendo 1 mg/mL da osmotina purificada do látex de C. procera, dissolvida em 0,5 mL de salina estéril e 0,5 mL de adjuvante completo de Freund, administrada por via intramuscular, na pata traseira do animal. Doses reforço de 1 mg da proteína foram preparadas como descrito anteriormente, diferindo apenas pelo uso do adjuvante incompleto de Freund, e aplicadas por via subcutânea no dorso do animal em intervalos de 21, 15 e 7 dias. Os procedimentos de manutenção, manuseio e uso do animal nos experimentos seguiram o que preconiza as diretrizes da comissão institucional de ética animal, sob aprovação.
Amostras de sangue foram coletadas através de cortes nas extremidades das orelhas e aproximadamente 20 mL de sangue foram coletados antes da primeira sensibilização (dia 0) e posteriores coletas similares foram realizadas nas datas das doses de reforço (dias 21, 35 e 42). O sangue foi deixado em repouso em estufa a 37 ºC por 5 horas, para retração do coágulo. Posteriormente, o soro foi obtido após centrifugação a 2.000 x g por 5 minutos a 25 ºC. Os antissoros obtidos nas coletas (dias 21, 35, 42 e 49) foram reunidos, dialisado contra 51
água destilada, liofilizados e armazenados como única amostra para posterior uso nos experimentos de reações de imune detecção.
4.2.6.3.1 Imunodetecção de osmotinas por ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay)
O reconhecimento de osmotinas presentes nas frações proteicas de calos e raízes de C. grandiflora e C. procera foi avaliado pelo ensaio imunoenzimático ELISA através da técnica de imunoadsorção indireta (RAMOS et al., 2007b). As amostras utilizadas no ensaio e suas respectivas concentrações foram: Látex de C. procera (0,625 a 0,039 µg/mL); Calos de C. procera (0,312 a 0,019 mg/mL); Raízes de C. procera (0,312 a 0,019 mg/mL); Látex de C. grandiflora (0,250 a 0,015 mg/mL); Calos de C. grandiflora (5 a 0,312 mg/mL) e Raízes de C. grandiflora (5 a 0,312 mg/mL).
Em microplacas com 96 poços foram adicionados 150 µL/poço das frações proteicas a serem analisadas, dissolvidas em tampão do antígeno (Na2CO3 0,1 M e NaHCO3 0,1 M, pH 9,6). As placas foram incubadas durante 16 horas a 4 °C. Em seguida, as placas foram lavadas três vezes, com intervalos de 5 minutos, com tampão PBS (NaCl 0,15 M,
KH2PO4 0,003 M e K2HPO4 0,007 M, Tween 20 0,05 %, pH 7,4), deixadas secar e bloqueadas por 1 hora, a 37 °C, com 200 µL/poço da solução de BSA (10 mg/mL em tampão PBS, pH 7,4). Após esta etapa, uma segunda lavagem foi realizada conforme já descrito e aplicados 150 µL/poço do anticorpo primário anti-osmotina na diluição 1:5.000 dissolvidos em tampão de anticorpo (KH2PO4 0,001 M, Na2HPO4 0,01 M, KCl 0,002 M, NaCl 0,15 M, Tween 20 0,025 %, pH 7,6) e deixados em repouso por 2 horas, a 37 °C. Em seguida, uma terceira sessão de lavagem foi realizada e 150 µL/poço do anticorpo secundário foram adicionados na diluição fixa de 1:2.000 (anti-IgG de coelho conjugado à enzima fosfatase alcalina), dissolvido em tampão do anticorpo (KH2PO4 0,001 M, Na2HPO4 0,01 M, KCl 0,002 M, NaCl 0,15 M, Tween 20 0,025 %, pH 7,6), e incubados por 2 horas, a 37 °C. Após este período, uma quarta sessão de lavagem foi realizada e 150 µL/poço do substrato p-nitrofenil fosfato dissódico na concentração de 1 mg/mL em tampão do substrato (Na2CO3 0,05 M,
NaHCO3 0,05 M e MgCl2 0,01 M, pH 9,8) foram adicionados e as placas deixadas em repouso protegidas da luz por 30 minutos, a 37 °C. A reação foi então paralisada com a adição de 50 µL/poço da solução de hidróxido de sódio (NaOH) 4 N e a leitura foi feita a 405 nm em leitor de microplacas (ELx800 Absorbance Microplate Reader, BioTek Customer Care). Os resultados foram expressos como médias e desvios padrões de três repetições das 52
absorbâncias obtidas para os antissoros em diferentes diluições. Os experimentos foram realizados em triplicatas e conduzidos com três repetições para cada uma das amostras. Foi considerada como unidade experimental uma placa de ELISA.
4.2.6.3.2 Identificação de Osmotina por Dot Blotting
Uma segunda metodologia foi realizada com o objetivo de confirmar o reconhecimento das osmotinas presentes nas amostras testadas no ensaio de ELISA. Para isso, as amostras foram submetidas à análise de Dot Blotting de acordo com o método descrito por Towbin et al. (1979). Para tanto, foram adicionados 10 µL de cada amostra (Proteínas dos látex – 1 mg/mL; Proteínas dos calos e raízes - 5 mg/mL de C. procera e C. grandiflora) em membrana de nitrocelulose (Hybond-C, Amersham Life Science) e deixadas secar por 10 minutos a 25 °C.
Após esse procedimento, as membranas foram incubadas com solução bloqueadora composta de tampão PBS (NaCl 0,13 M, KCl 2,6 mM, NaHPO4 5,3 mM,
KH2PO4 1,7 mM, pH 7,4) contendo 5% de leite em pó desnatado, e submetidas a agitação por 2 horas a 25 °C. Em seguida, a solução bloqueadora foi descartada e as membranas foram lavadas por três vezes consecutivas com tampão PBS; e novamente incubadas em solução bloqueadora, desta vez na presença dos anticorpos primários na diluição de 1:5.000 (v/v) e agitadas por 2 horas a temperatura ambiente. Após três lavagens, com tampão PBS, as membranas foram incubadas com o segundo anticorpo na diluição de 1:20.000 (v/v, anti-IgG de coelho desenvolvido em cabra, conjugado com fosfatase alcalina), por 2 horas, à temperatura de 25 °C. Finalmente, após um ciclo de três lavagens sucessivas idênticas às anteriores, a reação de revelação foi desenvolvida utilizando o substrato 5-bromo-4-cloro-3- indolilfosfato/nitroazul de tetrazólio (BCIP/NBT), que consistiu de uma solução de Tris-HCl
0,2 M, NaCl 0,1 M, MgCl2 2,5 mM, NBT 10 mg/mL, BCIP 25 mg/mL, pH 9,0. As membranas foram deixadas sob agitação com a solução do substrato, até o aparecimento das bandas arroxeadas. A reação foi parada com água destilada. Os experimentos foram realizados em triplicatas. 53
4.2.6.4 Proteases
4.2.6.4.1 Atividade proteolítica com substrato Azocaseína
Atividade proteolítica foi testada através da reação colorimétrica, em que azocaseína foi utilizada como um substrato não específico para investigação da atividade proteolítica total. Essa proteína ao sofrer degradação por proteases, em geral, libera um composto denominado azo que funciona como um cromóforo, sendo detectado no comprimento de onda de 420-440 nm, como descrito em Freitas et al. (2007). No ensaio, foram adicionados 100 µL das frações proteicas dos calos e raízes de C. grandiflora e C. procera (5 mg/mL), pré-incubadas por 10 minutos com 40 µL de solução DTT 3 mM e etilenodiaminotetraacetico (EDTA) 2 mM. O volume foi ajustado para 500 µL com tampão acetato de sódio 50 mM pH 5,0, para amostras de C. grandiflora e tampão fosfato de sódio 50 mM pH 6,0 para amostras de C. procera. Em seguida, 200 µL de azocaseína 1% foram adicionados às misturas e novamente foram incubados durante 1 hora a 37 °C. Após este período, a reação foi finalizada pela adição de 300 µL de ácido tricloroacético (TCA) 20%, e centrifugados a 10.000 x g durante 10 minutos a 4 °C. Posteriormente, 500 µL dos sobrenadantes foram misturados a 500 µL de NaOH 2 M e a absorbância lida a 420 nm. Uma unidade de atividade foi definida como a quantidade de enzima necessária para aumentar a absorbância em 0,01 nm. Neste ensaio, o grupo controle foi conduzido com os mesmos reagentes, contudo o substrato somente foi adicionado à reação após o termino da reação com TCA. Os ensaios foram realizados em triplicata e os resultados expressos em Unidade de Atividade (UA) por micrograma de proteína (UA/µgP).
4.2.6.4.2 Atividade proteolítica com substrato BANA
Para identificação dos tipos de proteases presentes nas amostras de calos e raízes de C. grandiflora e C. procera, a atividade proteolítica foi testada utilizando-se BANA, um substrato específico para proteases do tipo cisteínica (ABE et al., 1992). No ensaio foram adicionados 360 µL de tampão acetato de sódio 50 mM pH 5,0, para amostras de C. grandiflora e tampão fosfato de sódio 50 mM pH 6,0 para amostras de C. procera, 40 µL de solução de DTT 3 mM e EDTA 2 mM, e 100 µL das amostras na concentração de 5 mg/mL. Estes foram incubados durante 10 minutos a 37 °C, e em seguida 200 µL de BANA 1 mM foram adicionados a mistura e novamente incubados durante 30 minutos a 37 °C. Após este 54
período, a reação foi finalizada pela adição de 500 µL de HCl 2% em etanol, e 500 µL de DMACA 0,06% em etanol foram adicionados. Após 40 minutos a absorbância foi lida a 540 nm. Uma unidade de atividade foi definida como a quantidade de enzima necessária para aumentar a absorbância em 0,01 nm. O grupo controle foi conduzido com os mesmos reagentes, contudo o substrato somente foi adicionado a reação após a adição do HCl 2% em etanol. Os ensaios foram realizados em triplicata e expressos em Unidade de Atividade (UA) por microgramas de proteínas (UA/µgP).
4.2.6.4.3 Atividade proteolítica com substrato BAPNA
A atividade proteolítica foi testada utilizando-se BAPNA como substrato específico para proteases serínicas (GOMES et al., 2005). No ensaio foram adicionados 400 µL de tampão acetato de sódio 50 mM pH 5,0, para amostras de C. grandiflora e tampão fosfato de sódio 50 mM pH 6,0 para amostras de C. procera, 100 µL alíquotas das amostras na concentração de 5 mg/mL, e 200 µL de BAPNA 1,25 mM foram adicionados a mistura e incubados durante 30 minutos a 37 °C. Posteriormente, a reação foi finalizada pela adição de 150 µL de ácido acético 30%, após 10 minutos a absorbância foi lida a 405 nm. Uma unidade de atividade foi definida como a quantidade de enzima necessária para aumentar a absorbância em 0,01 nm em 30 minutos. O controle foi conduzido com os mesmos reagentes, contudo o substrato somente foi adicionado à reação após a adição do ácido acético. Os ensaios foram realizados em triplicata e expressos em unidade de atividade (UA) por micrograma de proteína (UA/µgP).
4.2.6.4.4 Efeito do pH sobre a atividade proteolítica
A determinação do efeito do pH sobre a atividade proteolítica das amostras foi realizada de acordo com a metodologia descrita por Freitas et al. (2007), utilizando azocaseína. Proteínas dos calos e raízes de C. grandiflora (5 mg/ml) foram solubilizadas em diferentes tampões (glicina 50 mM pH 2,6 e 10,0, acetato de sódio 50 mM pH 4,0 e 5,0, fosfato de sódio 50 mM pH 6,0 e 7,0 e Tris-HCl 50 mM pH 8,0 e 9,0) e mensurada a atividade residual, como descrito no item 4.2.6.4.1. 55
4.2.6.4.5 Zimograma
Para investigação da atividade proteolítica in situ, as amostras foram submetidas à técnica de zimograma. Para isso as mesmas não foram aquecidas e não se adicionou agentes redutores, a fim de manter sua estrutura tridimensional e consequentemente sua função catalítica. Para tal, as amostras foram inicialmente submetidas à eletroforese em primeira dimensão em gel de poliacrilamida segundo a metodologia descrita por Laemmli (1970). Gel de concentração contendo 5% de acrilamida/bisacrilamida e 10% de dodecil sulfato de sódio (SDS), preparados em tampão Tris-HCl 0,5 mM, pH 6,8; e o gel de separação, 12,5% de acrilamida/bisacrilamida, 10% de SDS, e 0,5% de gelatina em tampão Tris-HCl 3 M, pH 8,8. As amostras foram tratadas com tampão de amostra, composto por Tris-HCl 0,0625 M, 2% de SDS, 20% de glicerol e 0,02% de azul de bromofenol, estes últimos conferem densidade e cor à amostra, respectivamente.
As amostras foram centrifugadas e os sobrenadantes aplicados nos poços do gel de concentração. A corrida eletroforética foi realizada com os seguintes parâmetros: voltagem de 120 V e amperagem 30 mA. Após o termino da eletroforese, os géis foram incubados sob agitação constante por 40 minutos em solução de Triton X-100 2,5% para remoção do SDS. Em seguida, os géis foram lavados duas vezes com água destilada para retirada do Triton X- 100, e incubados por 12 horas em solução ativadora de tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,0 contendo DTT 3 mM em banho-maria a 37 ºC. Em seguida, os géis foram revelados através de coloração com Coomassie Brilliant Blue R-350 a 0,1%. A presença de bandas não coradas indica a atividade proteolítica.
4.2.6.4.6 Produção de anticorpos anti-proteases
Anticorpos policlonais contra três isoformas de proteases do látex de C. procera foram produzidos em coelho macho, da raça Nova Zelândia, de quatro meses de idade, como descrito no item 4.2.6.3.
4.2.6.4.7 Imunodetecção de proteases por ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay)
A identificação de proteases presentes nas frações proteicas de calos e raízes de C. grandiflora e C. procera foi realizada pelo ensaio imunoenzimático ELISA como descrito no item 4.2.6.3.1. As amostras utilizadas no ensaio e suas respectivas concentrações foram: 56
Antígeno (0,625 a 0,019 µg/mL); Látex de C. procera (0,625 a 0,039 µg/mL); PII do látex de C. procera (0,625 a 0,039 µg/mL); Calos de C. procera (5 a 0,312 mg/mL); Raízes de C. procera (5 a 0,312 mg/mL); Látex de C. grandiflora (2 a 0,125 mg/mL); Calos de C. grandiflora (5 a 0,312 mg/mL) e Raízes de C. grandiflora (5 a 0,312 mg/mL). Anticorpo anti- protease foi utilizado na diluição 1:20.000.
4.2.6.4.8 Avaliação do efeito de proteases cisteínicas na atividade antifúngica
Para avaliar o efeito de proteases cisteínicas sobre a atividade antifúngica, as proteínas dos látex, calos e raízes de C. procera e C. grandiflora foram dissolvidas em tampão acetato de sódio 50 mM pH 5,0 contendo iodoacetamida (IAA) 20 mM e incubadas por 30 minutos. Posteriormente, as amostras foram centrifugadas a 10.000 x g por 10 minutos a 4 ºC e os sobrenadantes obtidos foram exaustivamente dialisados contra água destilada durante três dias. Em seguida, as amostras desprovidas de atividade proteolítica do tipo cisteínica foram liofilizadas e utilizadas nos experimentos de inibição do crescimento micelial e inibição da germinação de esporos, como descritos anteriormente. Azocaseína foi utilizada como substrato não específico para investigar a atividade proteolítica total presente nas frações inibidas com IAA. O ensaio foi realizado como descrito no item 4.2.6.4.1. Os experimentos foram realizados em triplicatas e conduzidos com quatro repetições para cada uma das amostras. Foi considerada como unidade experimental uma placa de ELISA. Os dados foram examinados utilizando o programa GraphPadPrism 6 e análise de variância (ANOVA). O teste de múltiplas comparações de Tukey foi utilizado para identificar as médias que diferiram no teste de ANOVA. Valores de p <0,05 foram considerados estatisticamente diferentes.
4.2.6.5 Atividades das enzimas antioxidantes
4.2.6.5.1 Extrato Proteico
Os calos e as raízes de C. grandiflora foram investigados quanto à presença de atividade das enzimas antioxidantes. Para tanto, primeiramente foram obtidos os extratos proteicos da cultura de calos e raízes. As amostras (500 mg) foram maceradas com nitrogênio liquido em gral de porcelana e o pó resultante foi homogeneizado em 5 mL de tampão fosfato de potássio 0,1 M acrescido de EDTA 0,1 mM (pH 7,0). Em seguida, os homogeneizados 57
foram centrifugados a 12.000 x g por 30 minutos a 4 ºC. Os sobrenadantes foram armazenados em freezer, a -20 ºC, para utilização nos testes de atividade enzimática.
4.2.6.5.2 Ascorbato peroxidase (APX; EC: 1.11.1.1)
Para determinação da atividade da ascorbato peroxidase foi usado o método descrito por Nakano e Asada (1981). Alíquotas de 100 µL do extrato proteico de calos e raízes de C. grandiflora foram adicionados ao meio de reação composto de 2,7 mL de tampão fosfato de potássio 50 mM pH 6,0, contendo ácido ascórbico 0,5 mM. Logo após, foi adicionado peróxido de hidrogênio 30 mM ao meio de reação e observado o decaimento da absorbância a 290 nm em espectrofotômetro no intervalo de 0 a 300 segundos, sendo feita as leituras em intervalos sucessivos de 15 segundos. A atividade enzimática foi medida utilizando o coeficiente de extinção molar do ascorbato e os resultados expressos em consumo -1 -1 em μmol de H2O2/min /g MF. Os experimentos foram realizados em triplicatas.
4.2.6.5.3 Catalase (CAT; EC: 1.11.1.6)
A atividade da catalase foi determinada pelo método de Beers e Sizer (1952), no qual o extrato proteico obtido dos calos e das raízes (50 µL) foram adicionados a 2,95 mL de tampão fosfato de potássio 50 mM, pH 7,0 contendo H2O2 20 mM. Através da leitura em espectrofotômetro a 240 nm, foi monitorado o consumo de H2O2. O cálculo da atividade foi quantificado pelo coeficiente de extinção molar do H2O2 e os resultados expressos em -1 -1 consumo em μmol de H2O2/min /g MF. Os experimentos foram realizados em triplicatas.
4.2.6.5.4 Peroxidase do guaiacol (G-POD; EC: 1.11.1.7)
A atividade da G-POD foi determinada segundo Urbanek et al. (1991). A reação foi iniciada pela adição de 10 μL dos extratos proteicos de calos e raízes de C. grandiflora ao meio de reação composto por tampão fosfato de potássio 100 mM pH 7,0, EDTA 0,1 μM, e
H2O2 15 mM. O aumento da absorbância foi medido em espectrofotômetro a 470 nm durante um minuto. A atividade da G-POD foi quantificada pela quantidade de tetraguaicol formado, usando seu coeficiente de extinção molar como base para cálculos (26,6 M-1 cm-1) levando em consideração que quatro moles de guaicol são necessários para reduzir um mol de H2O2. Os experimentos foram realizados em triplicatas. 58
4.2.7 Espectrometria de massas
Para identificação e caracterização das proteínas presentes nos extratos proteicos dos calos e raízes de C. grandiflora e C. procera, estas foram submetidas à análise por espectrometria de massas em um espectrômetro de massas do tipo SYNAPT HDMS (Waters Co., Milford, MA, EUA). Para tal, as amostras foram submetidas ao processo de digestão com tripsina, para liberação de peptídeos e posterior identificação dos mesmos. Neste ensaio, 50 µL das amostras numa solução de 1 µg/µL foram transferidos para tubos de microcentrífuga e adicionados 10 µL de Bicarbonato de Amônio 50 mM. As misturas foram agitadas em vórtex, e aquecidas a 80 ºC durante 15 minutos. Em seguida, foram reduzidas pela adição de 2,5 μL de DTT 100 mM, e novamente agitadas em vórtex. Após este procedimento as amostras foram aquecidas a 60 ºC durante 30 minutos, e alquiladas por 2,5 μL de IAA 300 mM, e agitadas em vórtex. As amostras foram mantidas por 30 minutos na ausência de luz a 25 °C. Em seguida, foram digeridas pela adição de 1 μg de tripsina (Promega) e agitada em vórtex. A digestão das proteínas pela tripsina foi realizada por 18 horas a 37 °C. Após este período, as amostras foram centrifugadas a 10.000 x g, 4 °C durante 30 minutos. Os sobrenadantes obtidos foram transferidos para frascos apropriados (Total Recovery vials, Waters).
Os peptídeos obtidos foram analisados em espectrômetro de massas por ESI-Q- TOF acoplado a um sistema de cromatografia nano ACQUITY UPLC, utilizando separação por fase reversa em uma coluna do tipo BEH C18 com dimensões de 100 mm x 75 μm e tamanho da partícula de 1,7 μm, com um gradiente de 0 a 85% (v/v) de acetonitrila, contendo ácido fórmico 0,1% (v/v), a um fluxo de 400 nL/min. A coluna foi alimentada com 50 ng de amostra, contendo os peptídeos. Para todas as medições, o espectrômetro de massas foi operado no modo 'V', com uma potência de resolução de, pelo menos, 10.000 m/z. Todas as análises foram realizadas utilizando ionização por eletropulverização (electrospray) no modo ESI (+) através da fonte NanoLockSpray. O canal de coleta do analito foi fechado a cada 30 segundos para passagem do íon de referência contendo o peptídeo GFP (Glu-fibrinopeptide). Os espectros de massas obtidos foram processados usando o usando o software ProteinLynx Global Server v. 2.4 (Waters) e os arquivos gerados foram consultados no bando de dados NCBI (National Center for Biotechnology Information) usando a pesquisa do software MASCOT v.2.2 (Matrix Science – www.matrixscience.com). 59
4.2.8 Caracterização Bioquímica de calos e raízes de C. grandiflora
4.2.8.1 Eletroforeses em gel de poliacrilamida em primeira dimensão
As proteínas obtidas da cultura de calos e raízes de C. grandiflora foram analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida para determinação e análise do perfil proteico obtido, como descrito no item 4.2.6.4.5, diferindo apenas pela substituição de gelatina no gel de concentração por água. Com o intuito de determinar o perfil proteico em condições desnaturantes e redutoras, as amostras foram tratadas com tampão de amostra, composto por Tris-HCL 0,0625 M, 2% de SDS, 20% de glicerol, 0,02% de azul de bromofenol, com ou sem 5% de 2-mercaptoetanol. As bandas correspondentes às proteínas foram visualizadas através da coloração por Coomassie Brilliant Blue R-350 a 0,1% em água: ácido acético: metanol (6:1:3 v/v/v) durante 4 horas seguido da remoção do corante com a mesma solução na ausência do corante.
4.2.8.2 Fracionamento das proteínas dos calos de C. grandiflora em coluna de DEAE- Sepharose
As proteínas dos calos de C. grandiflora foram submetidas à cromatografia de troca iônica em coluna DEAE-Sepharose Fast Flow previamente equilibrada com tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,0 (25 x 2 cm). As proteínas dos calos 100 mg/10 mL foram dissolvidas em tampão de equilíbrio e posteriormente centrifugada a 10.000 x g durante 10 minutos a 10 ºC, cujo sobrenadante foi aplicado à coluna. Em seguida, as proteínas foram inicialmente eluídas com a mesma solução de equilíbrio. As proteínas que ficaram retidas a coluna foram eluídas com o tampão de equilíbrio acrescido de NaCl 1 M. Frações de 1 mL/tubo foram coletadas a um fluxo de 0,5 mL/minuto e o teor proteico mensurado a 280 nm.
As frações proteicas obtidas foram submetidas à caracterização bioquímica por eletroforese em primeira dimensão, atividade proteolítica utilizando azocaseína como substrato e zimograma, como descritos anteriormente.
60
5 RESULTADOS
5.1 Cultura in vitro de tecidos de C. procera e C. grandiflora
A formulação nutritiva MS suplementado com 3,0 µM ácido naftalenoacético (ANA) e 4,6 µM cinetina (CIN) utilizada neste trabalho, mostrou-se muito eficiente, uma vez que calos parcialmente friáveis, e de coloração amarelada, foram desenvolvidos a partir de hipocótilos; enquanto que a partir de explantes cotiledonares houve predominantemente a formação de raízes adventícias, com formação de biomassa de calos apenas na superfície dos explantes. O início da formação de calos e raízes foi observado dentro de duas semanas após a inoculação dos explantes no meio nutritivo. Após quatro semanas sob influência dos reguladores de crescimento, as duas estruturas estavam completamente formadas (Figura 3). Subcultivos dos calos foram realizados em intervalos de quatro semanas, pela transferência de pequenos segmentos para placas contendo meio nutritivo novo. O aumento da biomassa dos calos em cada ciclo foi observado, além de baixos níveis de oxidação associados, provavelmente, às condições de cultivo na ausência de luz.
Figura 3 - Desenvolvimento de calos e raízes adventícias de Cryptostegia grandiflora. (A, B e C) - Calos foram obtidos a partir de hipocótilos e (D, E e F) raízes adventícias obtidos a partir de explantes cotiledonares cultivadas em meio MS suplementado com 3 µM de ácido naftalenoacético (ANA) e 4,6 μM de cinetina (CIN). Barras 1 mm.
Fonte: elaborada pela autora 61
5.2 Análise Histológica
Laticíferos foram identificados nos tecidos dos dois explantes analisados, cotilédones e hipocótilos. Nos cotilédones eles puderam ser observados tanto na nervura central quanto na lâmina foliar. A lâmina foliar apresenta a epiderme unisseriada, abaixo da qual se encontra o parênquima clorofiliano paliçádico, constituído por duas camadas de células alongadas e justapostas, seguido do parênquima clorofiliano esponjoso, constituído por cerca de seis camadas de células, onde os laticíferos foram observados dispostos longitudinalmente (Figura 4 - C). Na nervura central, os laticíferos ocorrem próximos ao feixe vascular. Suas células caracterizam-se por serem, em secção transversal, esféricas com paredes primárias, exclusivamente pectocelulósicas, e mais espessas que as do parênquima, com a secreção no seu interior apresentando-se de aspecto denso (Figura 4 – A, B). No hipocótilo, eles são observados no córtex (Figura 5).
Entretanto, laticíferos não foram observados em cultura de calos e raízes de C. grandiflora. A análise detalhada da estrutura dos calos demonstrou a presença de dois tipos celulares. As células no interior dos calos apresentaram-se com pequenos espaços intercelulares, densamente compactadas, com menor tamanho, núcleos evidentes e citoplasma mais denso, sugerindo intensa divisão celular, características essas de calos compactos. As células presentes próximas à superfície dos calos eram constituídas por parede celular primária, e apresentavam-se altamente vacuoladas e com amplos espaços intercelulares, composição característica de calos friáveis (Figura 6).
Nas raízes foi evidenciada a presença de epiderme unisseriada com numerosos pelos radiculares, que aumentam a superfície de absorção (Figura 7-A). A análise do processo de formação de calos e raízes a partir de explantes cotiledonares demonstrou que durante o processo de desdiferenciação dos tecidos do cotilédone em tecidos de raízes e calos, ocorre a perda de estruturas especializadas como os laticíferos. Foi observado que as novas raízes têm origem nos tecidos situados na proximidade do feixe vascular, e mantém, ao menos inicialmente, essa conexão com o tecido de origem (Figura 8-C).
62
Figura 4 – Secção transversal do cotilédone de Cryptostegia grandiflora (A) na região da nervura central. (B) Laticíferos próximos ao feixe vascular (C) e na lâmina foliar próximo a epiderme adaxial. (D) Detalhe mostrado laticífero disposto longitudinalmente em corte paradérmico de cotilédone. (Azul de astra e safranina). EP = epiderme; PP = parênquima clorofiliano paliçádico; PE = parênquima clorofiliano esponjoso; XI = xilema; FL = floema; Seta = laticífero.
Fonte: elaborada pela autora. 63
Figura 5 – Secção transversal do hipocótilo de Cryptostegia grandiflora. (A, B) Secção transversal e (C, D e E) secção longitudinal de hipocótilo. (B, D e E) Detalhes evidenciando a presença de laticíferos. (Azul de astra e safranina). Seta = laticífero.
Fonte: Elaborada pela autora. 64
Figura 6 – (A) Corte histológico de calos de Cryptostegia grandiflora. Detalhe evidenciando (B) áreas de calos compactos e (C) áreas de calos friáveis. (Azul de astra e safranina).
Fonte: Elaborada pela autora.
65
Figura 7 – (A) Secção longitudinal de ápice radicular de Cryptostegia grandiflora. (B) Detalhe mostrando a epiderme, córtex e o cilindro vascular na raiz. (Azul de toluidina e fucsina básica). (C) Secção transversal de raízes adventícias de Cryptostegia grandiflora. (Azul de astra e safranina). PER = pelos radiculares; EP = epiderme; CT = córtex; CV = cilindro vascular; END = endoderme; PR = periciclo.
Fonte: Elaborada pela autora.
66
Figura 8– (A) Secção longitudinal de explante de cotilédone mostrando a origem de raízes adventícias e calos de Cryptostegia grandiflora. (B) Detalhe da origem de raízes. (C) Corte longitudinal mostrando a conexão vascular entre cotilédone e a raiz primária de Cryptostegia grandiflora. (Azul de astra e safranina). CL = calos; RZ = raízes.
Fonte: Elaborada pela autora. 67
Os extratos proteicos, obtidos a partir de calos e raízes, foram analisados quanto a concentração de proteínas solúveis. Foram observadas baixas concentrações de proteínas solúveis em relação à quantidade em massa de extrato proteico utilizado (Tabela 1).
Tabela 1 - Concentração de proteína presente em látex e extratos de calos e raízes de C. procera e C. grandiflora estimado pelo método de Bradford
EXTRATO AMOSTRA BRADFORD* PROTEICO
Proteínas do látex de C. grandiflora (LPCg) 1 mg/mL 0,159 mg/mL ± 0,0027
Proteínas dos calos de C. grandiflora (CPCg) 5 mg/mL 0,245 mg/mL ± 0,0014 Proteínas das raízes de C. grandiflora (RPCg) 5 mg/mL 0,312 mg/mL ± 0,0044 Proteínas do látex de C. procera (LPCp) 1 mg/mL 0,489 mg/mL ± 0,0019 Proteínas dos calos de C. procera (CPCp) 5 mg/mL 0,416 mg/mL ± 0,0053 Proteínas das raízes de C. procera (RPCp) 5 mg/mL 0,242 mg/mL ± 0,0043 Fonte: Elaborada pela autora *Valores expressos como médias ± desvio padrão de ensaios em triplicatas.
5.3 Atividade antifúngica
Proteínas dos calos e raízes de C. procera apresentaram forte inibição do crescimento micelial dos fungos analisados. Os percentuais de inibição do crescimento micelial na presença de proteínas de calos e raízes de C. procera, respectivamente, foram: 75,5% e 82,6% para F. solani, 88,8% e 79,8% para F. oxysporum, 93,7% e 90,2% para C. lindemuthianum e 80,2% e 79,7% para C. gloesporioides, no entanto, não demonstraram nenhum efeito sobre Mucor sp. Enquanto, calos e raízes de C. grandiflora e a fração LPCp P1 não apresentaram atividade sobre qualquer dos fungos avaliados. As proteínas dos látex de C. procera (LPCp) e de C. grandiflora (LPCg) exibiram atividade antifúngica sobre todos os fungos utilizados neste estudo (Figura 9).
Assim como no ensaio de inibição do crescimento micelial, as frações CPCp e RPCp inibiram a germinação de esporos dos fungos C. lindemuthianum e C. gloesporioides, entretanto não foram eficazes em inibir a germinação de F. oxysporum. Entre essas duas frações, somente RPCp inibiu a germinação de F. solani. As amostras CPCg e RPCg não demonstraram efeito sobre os fungos analisados, semelhante ao observado para a inibição do 68
crescimento micelial (Figura 10). Ensaios de inibição da germinação de esporos de Mucor sp. não se mostraram conclusivos para nenhuma das amostras testadas.
Figura 9 - Atividade antifúngica de calos e raízes de Cryptostegia grandiflora e Calotropis procera. Controle (C): Tampão acetato de sódio 50 mM (pH 5,0) acrescido de DTT 3 mM. Os resultados são expressos como média ± desvio padrão de três determinações independentes. Significância estatística foi avaliada por ANOVA seguido pelo teste de Tukey. * P <0,05 indica diferença estatística (controle vs. experimental). Legenda: LPCg, Proteínas do látex de C. grandiflora; CPCg, Proteínas dos calos de C. grandiflora; RPCg, Proteínas das raízes de C. grandiflora; LPCp, Proteínas do látex de C. procera; LPCp P1, Subfração de proteínas do látex de C. procera; CPCp, Proteínas dos calos de C. procera; RPCp, Proteínas das raízes de C. procera.
Fonte: Elaborada pela autora
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Figura 10 - Atividade inibitória das proteínas de calos e raízes de C. grandiflora e C. procera sobre a germinação de esporos de fungos fitopatogênicos. Controle: A1 - Tampão acetato de sódio 50 mM (pH 5,0) acrescido de DTT 3 mM; A2 - H2O2; A3 – LPCg; A4 – LPCp. Os resultados foram avaliados por meio de microscópio de luz. Barras de 50 µm. Legenda: LPCg, Proteínas do látex de C. grandiflora; CPCg, Proteínas dos calos de C. grandiflora; RPCg, Proteínas das raízes de C. grandiflora; LPCp, Proteínas do látex de C. procera; CPCp, Proteínas dos calos de C. procera; RPCp, Proteínas das raízes de C. procera.
Fonte: Elaborada pela autora 70
5.4 Avaliação do mecanismo de ação de proteínas dos calos e raízes de C. procera e C. grandiflora
Foi observado que proteínas de calos e raízes de C. procera apresentaram ação deletéria a esporos de C. gloeosporioides, por causarem danos à membrana plasmática dos esporos tratados, tendo em vista que estes se apresentaram fluorescentes quando analisados por microscopia óptica (Figura 11). Contrariamente, proteínas dos calos e raízes de C. grandiflora não causaram danos à membrana plasmática fúngica.
Figura 11 - Efeito de proteínas de calos e raízes de Cr. grandiflora e C. procera sobre a permeabilidade da membrana plasmática de esporos de C. gloeosporioides. Controle: tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,0 acrescido de DTT 3 mM. Barras de 10 µm. Legenda: CPCg, Proteínas dos calos de C. grandiflora; RPCg, Proteínas das raízes de C. grandiflora; CPCp, Proteínas dos calos de C. procera; RPCp, Proteínas das raízes de C. procera.
Fonte: Elaborada pela autora
Outro mecanismo de ação amplamente relatado na literatura para as proteínas antifúngicas é a indução de estresse oxidativo em fungos fitopatogênicos, através da produção de peróxido de hidrogênio (H2O2). Também tem sido demonstrado que a atividade antifúngica de proteínas laticíferas induz estresse oxidativo em esporos de fungos fitopatogênicos. Deste modo, foi investigada a hipótese de que proteínas presentes nas frações proteicas de calos e 71
raízes de C. grandiflora e C. procera podem causar dano oxidativo em esporos de C. gloeosporioides. Observou-se que os esporos expostos às proteínas de calos e raízes de C. grandiflora não apresentaram indícios de precipitado marrom-avermelhado, indicando baixos níveis de H2O2 nos esporos tratados, sendo equivalente ao controle (tampão acetato de sódio 50 mM pH 5,0 com DTT 3mM). No entanto, os esporos tratados com proteínas de calos e raízes de C. procera exibiram forte coloração avermelhada, indicando possível estresse oxidativo por meio da produção de espécies reativas de oxigênio (EROS) (figura 12). Este método de marcação de H2O2 se baseia na atividade de peroxidases presentes nos esporos fúngicos, que durante a redução do H2O2 em água (H2O) e oxigênio molecular (O2) utilizam o
DAB como um substrato para degradação do H2O2, resultando em um composto marrom- avermelhado que pode ser detectado por microscopia.
Figura 12 - Detecção de H2O2 em esporos de C. gloeosporioides. Controle: tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,0 acrescido de DTT 3 mM. Barras de 10 µm. Legenda: CPCg, Proteínas dos calos de C. grandiflora; RPCg, Proteínas das raízes de C. grandiflora; CPCp, Proteínas dos calos de C. procera; RPCp, Proteínas das raízes de C. procera.
Fonte: Elaborada pela autora
72
5.5 Avaliação da presença de PR-proteínas
5.5.1 Inibidores de proteases cisteínicas e serínicas
Frações proteicas de calos e raízes de C. grandiflora foram capazes de inibir a ação proteolítica da papaína nas duas concentrações testadas. O percentual de inibição da atividade da papaína na presença de calos de C. grandiflora foi de 85,3% e para as raízes foi de 91,4% na concentração de 500 µg. Atividade da tripsina também foi inibida na presença dessas amostras. Quando a fração proteica dos calos foi incubada com a tripsina a atividade desta foi reduzida 82,1% enquanto que para raízes o percentual de inibição foi de 68,9% na mesma concentração utilizada para papaína. Estes resultados sugerem que ambas as classes de inibidores de proteases são encontradas no sistema de cultivo in vitro de C. grandiflora.
Evidenciou-se que a fração proteica de calos e raízes de C. procera também é constituída por inibidores de proteases cisteínicas. O percentual de inibição da atividade proteolítica da papaína na presença de 500 µg da fração proteica das raízes foi 95,8%, enquanto que para calos a redução da atividade foi de 61,6%, utilizando a mesma concentração. No entanto, não foi observada a presença de inibidores de proteases serínicas, tanto em calos quanto em raízes de C. procera. Em contrapartida, foi observado efeito sinérgico entre as proteases presentes nas amostras estudadas e a tripsina, com aumento de 21,8% na atividade da tripsina quando incubadas com a fração proteica das raízes e 116% quando incubadas com os calos. Com isso a presença de inibidores de proteases serínicas em calos e raízes de C. procera é improvável (Figura 13). 73
Figura 13 - Efeito de inibidores de proteases endógenos sobre a atividade proteolítica da papaína e tripsina. Calos e raízes de C. grandiflora e C. procera foram incubados com 0,2 mL de Nα-benzoil-DL-arginina-2- naftilamida (BANA) 1mM ou Nα-benzoil-DL-arginina-p-nitroanilida (BAPNA) 1,25mM, em diferentes concentrações de proteína, 100 e 500 µg. Foram realizados três ensaios controles, um de atividade proteolítica das amostras, outro de atividade proteolítica da protease na ausência de inibidor e outro com a protease na presença de inibidor comercial. (A, B) Calos de C. grandiflora e C. procera. (C, D) Raízes de C. grandiflora e C. procera. Legenda: Pap, papaína; CPCg, Proteínas dos calos de C. grandiflora; RPCg, Proteínas das raízes de C. grandiflora; CPCp, Proteínas dos calos de C. procera; RPCp, Proteínas das raízes de C. procera.
Fonte: Elaborada pela autora
74
5.5.2 Quitinases
Outra classe de proteína detectada nos dois sistemas de cultivo in vitro, que poderia estar relacionada com a atividade antifúngica, seria a das quitinases. A atividade quitinolítica em amostras de calos e raízes de C. procera foi considerada muito alta se comparada às outras amostras analisadas, incluído o látex de C. procera.
Tabela 2 - Atividade quitinolítica de proteínas do látex e de calos e raízes de C. grandiflora e C. procera.
AMOSTRA nkat/µGp Proteínas do látex de C. grandiflora (LPCg) 166 ± 0,0070 Proteínas dos calos de C. grandiflora (CPCg) 146 ± 0,012 Proteínas das raízes de C. grandiflora (RPCg) 179 ± 0,021 Proteínas do látex de C. procera (LPCp) 81 ± 0,0063 Proteínas dos calos de C. procera (CPCp) 358 ± 0,035 Proteínas das raízes de C. procera (RPCp) 390 ± 0,038 Fonte: Elaborada pela autora * Valores expressos médias ± desvio padrão de ensaios em triplicatas.
5.5.3 Osmotinas
Foi observado que para calos e raízes de C. grandiflora não houve a formação de uma curva dose resposta com o aumento da concentração de proteína, sugerindo baixa reatividade destas proteínas com o soro anti-osmotina (Figura 14-A). Por análise de Dot Blotting, os anticorpos anti-osmotina não reconheceram os calos e raízes de C. grandiflora, no entanto, mostraram alta reatividade com as amostras de C. procera. Esses resultados podem explicar, pelo menos em parte, porque não foi observada uma curva dose resposta no ensaio de ELISA, pois não houve reconhecimento entre os anticorpos policlonais produzidos contra a osmotina e as proteínas dos calos de raízes de C. grandiflora. No entanto, foi confirmada a presença de osmotinas no sistema in vitro de calos e raízes de C. procera (Figura 14-B).
75
Figura 14 - (A) Imunodetecção de osmotinas em calos, raízes e látex de Cryptostegia grandiflora e Calotropis procera por meio de ELISA. (B) Identificação da proteína osmotina por Dot Blotting. Legenda: LPCg, Proteínas do látex de C. grandiflora; CPCg, Proteínas dos calos de C. grandiflora; RPCg, Proteínas das raízes de C. grandiflora; LPCp, Proteínas do látex de C. procera; CPCp, Proteínas dos calos de C. procera; RPCp, Proteínas das raízes de C. prócer; BSA, Albumina do Soro Bovino.
Fonte: Elaborada pela autora
5.5.4 Proteases
Tendo em vista, que entre todas as atividades enzimáticas descritas em fluidos laticíferos, a atividade de enzimas proteolíticas são as de maior destaque, buscamos investigar a presença de proteases em calos e raízes de C. grandiflora e C. procera. Assim, analisamos 76
comparativamente os dois sistemas de cultivo in vitro quanto à presença de atividade proteolítica, utilizando-se de diferentes substratos para quantificação de atividade proteolítica total e especifica. A análise comparativa dos extratos proteicos de calos e raízes das duas espécies demonstrou que para todos os substratos testados, a atividade proteolítica das amostras de C. procera foi superior a observada para as frações proteicas de C. grandiflora. Especialmente quando utilizado o substrato BANA, sugerindo predominância de proteases cisteínicas. Zimograma foi realizado para a detecção qualitativa de atividade proteolítica in situ, usando como controle as proteínas dos látex de C. grandiflora e C. procera. A presença de atividade proteolítica em calos de C. procera foi confirmada também por zimograma. Entretanto, não foi observada a presença de atividade proteolítica in situ em calos de C. grandiflora (Figura 15).
Com o intuito de avaliar se a baixa atividade proteolítica observada para as proteínas dos calos e raízes de C. grandiflora poderia estar relacionada ao efeito do pH sobre as enzimas proteolíticas, foi avaliado o efeito do pH sobre a atividade proteolítica das amostras utilizando azocaseína. Contudo, o aumento da atividade proteolítica não foi observado pelas alterações nos pHs testados. Zimograma foi realizado para investigação da atividade proteolítica in situ, no melhor pH de atividade observada em ensaio colorimétrico. Neste ensaio, foram utilizados como controles positivos, papaína e a fração proteica do látex de C. grandiflora. Nota-se uma baixa atividade proteolítica in situ nas amostras tanto de calos quanto de raízes, considerada apenas residual quando comparada ao látex de C. grandiflora (Figura 16).
Anticorpos policlonais anti-proteases produziram uma fraca reação contra as proteínas dos calos de C. procera, enquanto que as raízes de C. procera e calos e raízes de C. grandiflora não foram reconhecidas, quando comparados com a reação observada para a mistura de proteases do látex de C. procera utilizada como antígeno. Anticorpos anti- proteases também não foram capazes de reconhecer as proteases do látex de C. grandiflora, mesmo com evidências experimentais comprovadas da existência de proteases neste látex. Estas observações sugerem que as proteases das duas espécies são imunologicamente distintas e possuem poucos determinantes antigênicos em comum (Figura 17).
Portanto, a detecção de proteases através da técnica de ELISA não se mostrou eficiente, tendo em vista que as proteases presentes na fração proteica do látex de C. 77
grandiflora não foram reconhecidas pelos anticorpos policlonais produzidos contra as proteases de C. procera.
Figura 15 - Atividade proteolítica dos extratos proteicos obtidos a partir de látex (LP), calos (CP) e raízes (RP) de Cryptostegia grandiflora e Calotropis procera. (A) Atividade proteolítica de LPCg e LPCp usando azocaseína como substrato. (B) Atividade proteolítica de calos e (D) raízes usando azocaseína 1%, Nα-benzoil- DL-arginina-2-naftilamida (BANA) 1 mM ou Nα-benzoil-DL-arginina-p-nitroanilida (BAPNA) 1,25 mM como substratos. (C) Zimograma em gel de poliacrilamida (gel principal: 7,5% acrilamida, 0,5% de gelatina). Legenda: LPCg, Proteínas do látex de C. grandiflora; CPCg, Proteínas dos calos de C. grandiflora; RPCg, Proteínas das raízes de C. grandiflora; LPCp, Proteínas do látex de C. procera; CPCp, Proteínas dos calos de C. procera; RPCp, Proteínas das raízes de C. procera.
Fonte: Elaborada pela autora 78
Figura 16 – (A) Efeito do pH na atividade proteolítica de proteínas de calos e (B) raízes de Cryptostegia grandiflora. A amostra (500 µg) foi incubada com 0,2 mL de Azocaseína 1%, em diferentes tampões por 1 h a 37 ⁰C. (C) Zimograma em gel de poliacrilamida das amostras de látex, calos e raízes de Cr. grandiflora dissolvidas em tampão acetato de sódio 50 mM pH 5,0. Referências: Pap, papaína; LPCg, proteínas do látex de C. grandiflora; CPCg, proteínas dos calos de C. grandiflora; RPCg, proteínas das raízes de C. grandiflora.
Fonte: Elaborada pela autora
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Figura 17 - Imunodetecção de proteases em calos, raízes e látex de Cryptostegia grandiflora e Calotropis procera por meio de ELISA. Legenda: LPCg, Proteínas do látex de C. grandiflora; CPCg, Proteínas dos calos de C. grandiflora; RPCg, Proteínas das raízes de C. grandiflora; LPCp, Proteínas do látex de C. procera; LPCp pII, Subfração das proteínas do látex de C. procera; CPCp, Proteínas dos calos de C. procera; RPCp, Proteínas das raízes de C. procera.
Fonte: Elaborada pela autora 80
5.5.4.1 Avaliação do efeito de proteases cisteínicas na atividade antifúngica
À medida que a atividade antifúngica do látex de C. grandiflora tem sido relacionada com a presença de protease cisteínica (RAMOS et al., 2014), buscou-se associar a presença de atividade proteolítica com a atividade antifúngica observada nas amostras de calos e raízes de C. procera. Uma vez que as amostras que exibiram atividade proteolítica também mostraram alta toxicidade contra os fungos fitopatogênicos testados.
Quando as frações proteicas foram incubadas com IAA a atividade proteolítica foi perdida nas amostras testadas (Figura 18 - A), exceto para calos e raízes de C. procera, que apesar da atividade proteolítica ter sido caracterizada como do tipo cisteínica, não foi eficientemente inibida por IAA (Figura 18 - B). Assim, as proteínas dos calos e raízes de C. procera continuaram a apresentar atividade inibitória sobre o crescimento micelial de C. gloeosporioides (Figura 18 - C). Enquanto que a atividade antifúngica das proteínas dos látex de C. procera e C. gandiflora foi drasticamente reduzida quando pré-tratadas com IAA, confirmando o envolvimento de proteases na ação antifúngica observada para esses fluidos laticíferos. Amostras de calos e raízes de C. grandiflora continuaram não apresentando atividade antifúngica, demonstrando que possivelmente a ausência de atividade proteolítica seja a responsável por este efeito.
Contudo, a atividade antifúngica observada para calos e raízes de C. procera não foi claramente associada à presença de atividade proteolítica. Uma vez que os dados obtidos nos ensaios de inibição da geminação de esporos mostram que outras classes de proteínas podem também estar envolvidas na defesa contra fungos, tendo em vista que os esporos germinaram mesmo na presença de proteases cisteínicas (Figura 18 - D).
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Figura 18 – Atividade antifúngica e proteolítica de calos e raízes de Calotropis procera e Cryptostegia grandiflora tratadas com IAA. (A, B) Atividade proteolítica de extratos proteicos. Significância estatística foi avaliada por ANOVA seguido pelo teste de Tukey. * P <0,05 indica diferença estatística (amostras tratadas com IAA vs amostras não tratadas). (C) Atividade antifúngica das amostras tratadas com IAA sobre o crescimento de hifas. Controle: Tampão de acetato de sódio 50 mM (pH 5,0) acrescido de DTT 3 mM. Os resultados são expressos como média ± desvio padrão de três determinações independentes. Significância estatística foi avaliada por ANOVA seguido pelo teste de Tukey. * P <0,05 indica diferença estatística (controlo vs. experimental). (D) Inibição da germinação de esporos de C. gloeosporioides das amostras tratadas com IAA. Barras de 50 µm. Controle: A1 - Tampão A2 – H2O2 A3 - LPCg A4 - LPCp Legenda: LPCg, Proteínas do látex de C. grandiflora; CPCg, Proteínas dos calos de C. grandiflora; RPCg, Proteínas das raízes de C. grandiflora; LPCp, Proteínas do látex de C. procera; CPCp, Proteínas dos calos de C. procera; RPCp, Proteínas das raízes de C. procera.
Fonte: Elaborada pela autora 82
5.6 Atividades das enzimas antioxidantes
Além de PR-proteínas, as frações proteicas de calos e raízes de C. grandiflora também são constituídas por enzimas antioxidantes (Tabela 3). A atividade da enzima calatase não foi observada em calos; e nas raízes a atividade foi considerada baixa. Entretanto, a atividade da G-POD foi a mais expressiva, entre as três enzimas.
Tabela 3 - Atividade das enzimas antioxidantes APX, G-POD e CAT de calos e raízes de Cryptostegia grandiflora
APX G-POD CAT
AMOSTRA (µMol de H2O2 (µMol de H2O2 (µMol de H2O2 min-1g-1MF) min-1g-1MF) min-1g-1MF)
CALOS 0,0645±0,0074 0,5097±0,0312 ND
RAÍZES 0,0142±0,0008 0,1734±0,0149 0,0153±0,0015
Valores expressos como médias de três repetições com os respectivos desvios padrões. APX, Ascorbato peroxidase; G-POD, Peroxidase do guaiacol; CAT, Catalase. ND= Não detectada atividade.
5.7 Espectrometria de massas
Na Tabela 4 estão listadas as proteínas identificadas por espectrometria de massas, com seus respectivos dados de massa molecular, pI teóricos, seqüências dos peptídeos, número de entrada no NCBI, e origem das proteínas. 83
Tabela 4: Lista de proteínas identificadas de calos e raízes adventícias de C. grandiflora e C. procera por ESI-QUAD-TOF. Legenda: CPCg, Proteínas dos calos de C. grandiflora; RPCg, Proteínas das raízes de C. grandiflora; CPCp, Proteínas dos calos de C. procera; RPCp, Proteínas das raízes de C. procera.
Teórico Descrição e Origem das Proteínas Amostra ID Massa Sequência de todos os Identificadas pI Score Molecular Peptídeos Identificados (NCBI)
VVSCSDIVAIAAR
LYPSQDPTMDK Peroxidase 12 precursor, putativo (Ricinus 39,30 8,24 140 gi|255566672 YYVDLMNR communis)
QGLFTSDQDLYTDKR
IFDDDIGQAAGLLR CPCg YYVDLMNR 39,64 8,52 136 gi|502118925 Peroxidase 12-like (Cicer arietinum) QGLFTSDQDLYTDKR MGQLNVLTGTQGEIR VFKDDIGQAAGLLR 39,39 8,55 98 gi|565386499 Peroxidase 12-like (Solanum tuberosum) YYVDLMNR
VGADQSVINR
IDAFQDTLYTHSLR 34,12 9,19 95 gi|1279598 Pectinesterase (Nicotiana plumbaginifolia) NMVTAQGR
TLYYGEYMNK 84
Teórico Descrição e Origem das Proteínas Amostra ID Massa Sequência de todos os Identificadas pI Score Molecular Peptídeos Identificados (NCBI)
LVLPVPAFNVINGGSHAGNK LTAEIGEK 47,79 5,41 96 gi|3023685 Enolase (Alnus glutinosa) VQIVGDDLLVTNPK VNQIGSVTESIEAVK
AVNNVNSIIAPALIGK 48,31 5,56 83 gi|357145900 Enolase-like (Brachypodium distachyon) VNQIGSVTESIEAVK
34,98 5,93 93 SFGGFGTTGDTDTR gi|260505591 Quitinase (Camellia sinensis) CPCg
34,53 8,55 76 WQPSAADSAAGR gi|7435357 Quitinase (EC 3.2.1.14) – (Cucurbitaceae)
23,14 9,20 51 LALSDVPYQVK gi|357499791 Inibidor de tripsina (Medicago truncatula)
Inibidor de proteina - Endoglucanase 47,06 7,42 59 DASTLQYLTQISQR gi|222822566 (Xiloglucanase – específico) (Petunia x hybrid) beta-1, 3-glucananse (Musa acuminata - AAA 36,35 8,84 60 TYNQNLIR gi|6073860 Group) 85
Teórico Descrição e Origem das Proteínas Amostra ID Massa Sequência de todos os Identificadas pI Score Molecular Peptídeos Identificados (NCBI)
NVVDGSTTFK 63,92 9,03 75 DITFQNTAGPSK gi|6174912 Pectinesterase (Citrus sinensis) NMVTAQGR CPCg 33,09 6,37 72 MGNLSPLTGTDGQIR gi|568827620 Peroxidase-like (Citrus sinensis)
GLLNSDQVLVTK 36,90 9,25 88 gi|206812328 Peroxidase - Pericarpo (Litchi chinensis) MGNISPLTGSKGEIR
VVSCSDIVAIAAR
LYPSQDPTMDK Peroxidase 12 precursor, putativo (Ricinus 39,30 8,24 129 gi|255566672 YYVDLMNR communis)
QGLFTSDQDLYTDKR
VVSCSDIVALAAR DSVFLSGGPDYEVPLGR gi|6470277 RPCg 39,74 5,53 105 YYVDLMNR Peroxidase (Litchi chinensis)
QGLFTSDQDLYTDKR MGQLSVLTGNQGEIR
39,49 5,99 94 DSVFLSGGPDYDLPLGRR gi|14031049 Peroxidase (Nicotiana tabacum) 86
Teórico Descrição e Origem das Proteínas Amostra ID Massa Sequência de todos os Identificadas pI Score Molecular Peptídeos Identificados (NCBI) YYVDLMNR MGQLNVLTGTQGEIR
YYVDLMNR 39,15 8,42 80 gi|55057256 Peroxidase (Picea abies) MGQLNVLTGSKGEIR
YYVDLMNR gi|1402914 39,94 8,58 80 Peroxidase (Arabidopsis thaliana)
MGQMSVLTGTQGEIR
SFGGFGTTGDTDTR 35,18 5,60 92 gi|359494718 Endoquitinase - Isoforma 1 (Vitis vinifera) GPIQISYNYNYGPAGR
RPCg 33,09 6,37 72 MGNLSPLTGTDGQIR gi|568827620 Peroxidase-like (Citrus sinensis)
Inibidor de proteina - Endoglucanase 47,06 7,42 67 DASTLQYLTQISQR gi|222822566 (Xiloglucanase – específico) (Petunia x hybrid)
Glucano endo-1,3-beta-glicosidase-like 39,11 4,55 57 YIAVGNEVDPVK gi|565404247 (Solanum tuberosum)
Inibidor de protease cisteínica (Musa acuminata 23,83 5,54 55 GETQVVAGINYK gi|695018835 subsp. Malaccensis)
VPGYGVVTNIINGGIECGK CPCp 29,09 8,83 157 EIAAFLAQTSHETTGGWATA gi|302180065 Quitinase putativa (Catharanthus roseus)
PDGPYAWGYCFK 87
Teórico Descrição e Origem das Proteínas Amostra ID Massa Sequência de todos os Identificadas pI Score Molecular Peptídeos Identificados (NCBI)
39,15 8,42 80 MGQLNVLTGSKGEIR gi|55057256 Peroxidase (Picea abies) CPCp Peroxidase catiônica (Brachypodium 43,38 9,05 79 MGQINVLTGSQGQIR gi|721660843 distachyon)
40,12 5,82 60 MGQLDVLTGSQGEIR gi|9931567 Peroxidase classe III (Pinus sylvestris)
37,40 8,04 60 MGKIDVLTGSKGEIR gi|449436373 Peroxidase 5-like (Cucumis sativus)
NDIGQAAGLLR 40,51 6,17 116 gi|187453118 Peroxidase (Catharanthus roseus) QGLFTSDQDLYTDR
DDIGQAAGLLR 39,39 8,55 108 gi|565386499 Peroxidase 12-like (Solanum tuberosum) LEKVFKDDIGQAAGLLR
DGLNFATR RPCp 39,49 5,99 105 gi|697099545 Peroxidase 12-like (Nicotiana tomentosiformis) QGLFTSDQDLYTDR
DIGQAAGLLR 38,54 8,46 95 gi|703103599 Peroxidase 12 (Morus notabilis) DSVFLSNGPDYAVPLGR
KDVGQAAGLLR Peroxidase 12 precursor, putativo (Ricinus 39,30 8,24 94 gi|255566672 LYPSQDPTMDK communis)
38,63 8,07 93 NDIGQAAGLLR gi|747046767 Peroxidase 12 (Sesamum indicum) 88
Teórico Descrição e Origem das Proteínas Amostra ID Massa Sequência de todos os Identificadas pI Score Molecular Peptídeos Identificados (NCBI) LYPSQDPTMDK
VPGYGVVTNIINGGIECGK
29,09 8,83 92 EIAAFLAQTSHETTGGWATA gi|302180065 Quitinase putativa (Catharanthus roseus) RPCp PDGPYAWGYCFK
ELAAFLAQTSHETTGGWAT Quitinase (Zea mays subsp. Parviglumis) 34,53 4,88 60 gi|48093268 APDGPYAWGYCFK Fonte: Elaborada pela autora 89
5.8 Caracterização Bioquímica de calos e raízes de C. grandiflora
Uma vez que calos e raízes de C. procera já foram anteriormente caracterizados, buscamos realizar uma caracterização dos calos e raízes de C. grandiflora. As proteínas extraídas da cultura de tecidos in vitro foram separadas por eletroforese em primeira dimensão e mostrou a presença de proteínas de variadas massas moleculares, sendo as mais abundantes aquelas com massas próximas de 66,0 a 30,0 kDa. Na fração CPCg foram visualizadas duas bandas proteicas com massas moleculares aparentes entre 45,0 e 30,0 kDa, enquanto que na fração RPCg foram observadas além de bandas proteicas entre 45,0 e 30,0 kDa, como observado em calos, uma banda na altura de 97,0 kDa. O tratamento das amostras com o agente redutor 2-mercaptoetanol promoveu um perfil levemente distinto, o qual evidenciou a presença de bandas proteicas em CPCg na altura de 20,1 kDa e em RPCg a presença de várias bandas proteicas com massas moleculares aparentes variando entre 97,0 a 14,4 kDa (Figura 19).
Figura 19 - Eletroforese em gel de poliacrilamida (12,5%) das frações proteicas de calos e raízes de Cryptostegia grandiflora na presença ou ausência de agente redutor. (B e D) com 2-mercaptoetanol. Foram aplicadas concentrações crescentes em alíquotas de 30 – 15 µL no interior de cada poço, a partir da solução de 5 mgP/mL. Gel corado com Comassie Brilliant Blue R-250.
Fonte: Elaborada pela autora
O perfil cromatográfico obtido apresentou dois picos bem definidos, sendo um não retido e outro retido. A fração de proteínas de CPCg que não interagiu com a coluna foi 90
denominada CPCg-PI, enquanto que a fração proteica retida a coluna, eluída após adição de tampão de equilíbrio acrescido de NaCl 1 M foi denominada CPCg-PII (Figura 20-A).
De acordo com a análise do perfil protéico das sub-frações de CPCg por eletroforese unidimensional, observou-se que a sub-fração CPCg-PI apresentou perfil distinto, com bandas protéicas evidentes, predominantemente, na faixa de 66,0, 30,0 e 20,1 kDa. A sub-fração CPCg-PII apresentou bandas proteicas menos evidentes com massas moleculares aparentes, entre 97,0 66,0, e 20,1 kDa (Figura 20-B). As sub-frações de CPCg foram avaliadas quanto à presença de atividade proteolítica, através de ensaio colorimétrico, utilizando azocaseína, e por zimograma. Observou-se que a atividade proteolítica está ausente nestas sub-frações, assim como no extrato total obtido dos calos (Figura 20-C, D).
Figura 20 – (A) Perfil cromatográfico da fração proteica dos calos de Cryptostegia grandiflora. (B) Eletroforese em gel de poliacrilamida (12,5%) da fração proteica de calos de C. grandiflora e suas subfrações. Foram aplicados 25 µL em cada poço a partir da solução de 5 mgP/mL. (C) Atividade proteolítica das sub-frações dos calos de C. grandiflora usando Azocaseína 1% como substrato. (D) Zimograma em gel de poliacrilamida (gel principal 7,5% acrescido de gelatina 0,5%) das sub-frações dos calos de C. grandiflora. Incubado por 12 horas em tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,0 acrescido de 3 mM de DTT. Referências: Pap, papaína; LPCg, LP de C. grandiflora; P1 CPCg, CP de C. grandiflora; P2 CPCg, CP de C. grandiflora.
Fonte: Elaborada pela autora 117
5 DISCUSSÃO
6.1 Cultura in vitro de tecidos de C. procera e C. grandiflora
Os explantes utilizados reagiram diferentemente à mesma formulação nutritiva. Sugerindo com isso, que a capacidade de indução de diferentes respostas morfogenéticas, como calogênese e rizogênese, está diretamente relacionada à concentração hormonal e ao tipo de explante utilizado. Suri e Ramawat (1995) relataram a obtenção de calos, mas não de raízes, a partir de explantes cotiledonares de C. procera cultivados na mesma formulação nutritiva utilizada neste estudo. Teixeira et al. (2011) descreveram a produção de calos e raízes adventícias de C. procera a partir de hipocótilos e cotilédones cultivados em formulação nutritiva MS suplementado com 3,0 µM ANA e 4,6 µM CIN. Singh et al. (2011) observaram a formação de calos a partir de segmentos nodais de C. grandiflora em meio MS suplementado com 1,0 mg/L de ácido indolacético (IAA), 5,0 mg/L de 6-benzilaminopurina (BAP), e 1,0 mg/L de cinetina.
O sucesso no estabelecimento de protocolos de cultura in vitro de tecidos depende de fatores como, a composição do meio nutritivo, e a concentração e combinação dos reguladores de crescimento. Jayaraman et al. (2014) investigaram os efeitos de reguladores de crescimento, de fontes de carbono e de valores de pH na indução de calos de Aquilaria malaccensis, assim como as características dos calos resultantes. Para tanto, explantes foliares foram inoculados em meio MS contendo 1,5% de sacarose e pH 5,7, com diferentes tipos e concentrações de auxinas (2,4-D, ANA e AIB) e citocininas (BAP e CIN). Dentre os reguladores de crescimento utilizados, calos induzidos somente com ANA 1,1 µM induziu a formação de maior quantidade de biomassa de calos em peso seco e do tipo compacto. Ao combinar as diferentes citocininas a esta concentração de auxina, BAP 2,2 µM produziu uma quantidade abundante de calo friável. Ao testar as diferentes fontes de carbono, sacarose a 1,5% produziu maiores quantidades de biomassa em comparação à frutose e à glicose; que são açúcares importantes não apenas para o fornecimento de energia, mas também para a manutenção do potencial osmótico do meio (NOWAK et al., 2004). Com relação ao outro parâmetro observado, o pH do meio, constatou-se que o pH 5,7 rendeu as maiores biomassas. Este influencia diretamente a absorção e a solubilidade dos nutrientes e reguladores de crescimento no meio de cultura (BHATIA; ASHWATH, 2005). 118
A obtenção de tecidos desdiferenciados se dá pela ação combinada dos reguladores de crescimento, auxinas e citocininas, uma vez que, a indução da divisão celular ocorre por meio do balanço entre auxinas e citocininas exógenas e endógenas presentes no segmento da planta. Os reguladores de crescimento mais comumente relatados para formação de calos são ANA em combinação com CIN, BAP ou TDZ. Isto foi observado em Salvia canariensis L., Nicotiana tabacum L., Linum usitatissimum L e Ziziphora tenuior L. (MEDEROS-MOLINA, 2004; ALI et al., 2007; ROSU et al., 2010; DAKAH et al., 2014). A aplicação exógena de reguladores de crescimento também pode exercer influência sobre a formação e acúmulo de metabólitos específicos em culturas de células. Auxinas e citocininas têm sido apontadas por aumentar o acúmulo de biomassa e a produção de antocianinas em culturas de células em suspensão de várias espécies (MURTHY; LEE; PAEK, 2014).
A cultura in vitro de calos e raízes de C. procera já foram anteriormente estabelecidas e caracterizadas quanto a presença de algumas atividades biológicas encontradas no látex desta espécie, como atividade anti-inflamatória, antinociceptiva, e larvicida contra Aedes aegypti (TEIXEIRA et al., 2011; KUMAR et al., 2014). Calos produzidos a partir de segmentos nodais de C. grandiflora apresentaram atividade antimicrobiana contra Escherichia coli e Candida albicans. Concentrações elevadas de metabólitos secundários, especialmente fitoesteróis e triterpenos, são apontados como os responsáveis por estas atividades em calos de C. grandiflora (SINGH et al., 2011).
6.2 Análise Histológica
Calos e raízes de C. grandiflora não apresentaram laticíferos, semelhante ao observado para calos de C. procera produzidos a partir de hipocótilos. Diferentemente de C. grandiflora raízes adventícias originadas a partir de explantes cotiledonares de C. procera sob mesma formulação nutritiva e hormonal, produz laticíferos nas raízes oriundas a partir de explantes cotiledonares (TEIXEIRA et al., 2011). O processo de diferenciação de laticíferos é dependente de citocinina, e cinetina é considerada a mais eficaz para a diferenciação dessas estruturas. No entanto, o tipo e a concentração de auxina, a idade das culturas e o explante utilizado, afetam diretamente a formação de estruturas diferenciadas (SURI; RAMAWAT, 119
1995; TEIXEIRA et al., 2011). O que poderia explicar, ao menos em parte a não diferenciação de laticíferos observados em calos e raízes de C. grandiflora.
Em Apocynaceae, a ocorrência de laticíferos é uma característica comum. Estes são definidos por suas características anatômicas e conteúdo citoplasmático distinto, sendo, portanto, facilmente distinguíveis dos outros tecidos, devido ao conteúdo, espessura das paredes, número variável de núcleos e ramificações das suas células. Os laticíferos crescem por adição de novas células e, posteriormente, por alongamento celular, podendo ser encontrados permeando todos os tecidos do caule e da folha, sendo observados principalmente nas regiões nodais, lâmina foliar e frutos (DEMARCO; SUMIKO; MORAES, 2006), semelhante ao observado para as amostras de hipocótilos e cotilédones de C. grandiflora analisados.
Suri e Ramawat (1995) observaram a diferenciação de laticíferos em calos originados de cotilédones de C. procera, e evidenciaram que o processo de diferenciação é proporcional ao número de ciclos de subcultivos, com maior diferenciação observada após 12 ciclos. No entanto, laticíferos iniciais já foram formados com duas semanas de cultivo em meio MS suplementado com 3 µM de ANA e 4,6 µM de CIN. Após quatro semanas nestas condições, laticíferos maduros, caracterizados como articulados e não ramificados foram observados em calos de C. procera. Teixeira et al. (2011) investigaram a presença de laticíferos tanto em cultura de calos quanto de raízes de C. procera, sob mesma formulação utilizada por Suri e Ramawat (1995), no entanto a partir de explantes diferentes. Laticíferos foram observados nas raízes provenientes de explantes cotiledonares e identificados como multinucleados, longos e não articulados, porém calos originados de hipocótilos não diferenciaram estruturas laticíferas. O uso de tecidos cultivados in vitro que não diferenciam laticíferos é um interessante modelo para estudar atividades associadas às proteínas encontradas no látex. Especificamente, a ausência de laticíferos em calos de C. procera sugere que as proteínas detentoras de ação antifúngica estariam também sendo expressas em células diferentes dos laticíferos.
Suri e Ramawat (1996) destacam que a diferenciação celular é um pré-requisito para produção de metabólitos especializados, e que em alguns casos a adição de precursores ao meio de cultura é necessária. Esses autores relatam o efeito do látex e seus constituintes na diferenciação de laticíferos em calos de C. procera, sendo observado um aumento 120
significativo na diferenciação de laticíferos (10,1% - 28,4%) em meio suplementado com concentrações crescentes de látex de 0,1% a 2,5% (v/v).
6.3 Atividade antifúngica
Os fluidos laticíferos apresentam vários tipos de proteínas envolvidas na defesa vegetal, sendo a presença de proteínas antifúngicas no látex amplamente relatada na literatura. Proteínas dos látex de C. procera e C. grandiflora exibiram atividade antifúngica contra os fungos Rhizoctonia solani, C. gloeosporioides, F. solani e F. oxysporum (SOUZA et al., 2011; RAMOS et al., 2014), corroborando com os resultados apresentados neste trabalho. Proteínas dos calos e raízes de C. procera, apresentaram forte inibição do crescimento micelial de F. solani, F. oxysporum, C. lindemuthianum e C. gloesporioides, sugerindo que as proteínas antifúngicas expressas no látex de C. procera, provavelmente, podem também ser encontradas em calos e raízes desta espécie.
Diferenças quanto a inibição da germinação de esporos foram observadas nas frações CPCp e RPCp. Estas diferenças podem estar relacionadas às variações na composição da parede celular dos fungos fitopatogênicos testados. A composição química da parede celular dos fungos é bastante complexa, constituída principalmente por glicoproteínas; proteínas e polissacarídeos como, quitina, glucanas, galactomananas e manoses. Contudo, sua composição, estrutura e dimensões variam consideravelmente entre as diferentes espécies de fungos (ADAMS, 2004). Evidências do reconhecimento entre proteínas antifúngicas e moléculas específicas de agentes patogênicos têm sido demonstradas. Esses componentes específicos da parede celular desempenham papéis importantes na modulação da toxicidade observadas entre as proteínas antifúngicas e suas moléculas alvo (LEE et al., 2010). Contudo, as amostras CPCg e RPCg não apresentaram atividade sobre qualquer dos fungos avaliados. Indicando que possivelmente as proteínas antifúngicas presentes no látex de C. grandiflora não estejam sendo expressas em calos e raízes.
6.4 Avaliação do mecanismo de ação de proteínas dos calos e raízes de C. procera e C. grandiflora
Muitas proteínas com ação antifúngica podem afetar a permeabilidade da membrana plasmática de fungos fitopatogênicos. Assim, com o intuito de buscar possíveis mecanismos de ação para a atividade antifúngica observada para proteínas dos calos e raízes 121
de C. procera, foi avaliada a capacidade destas proteínas causarem danos à membrana plasmática e estresse oxidativo em esporos de C. gloeosporioides. Acredita-se que as espécies reativas de oxigênio desempenhem um importante papel nas interações planta-patógeno. Nas plantas, podem apresentar ação direta contra os agentes invasores, além de estarem envolvidas em cascatas de sinalização intracelulares que resultam no reforço da parede celular, respostas de hipersensibilidade (HR), produção de fitoalexinas e na indução da expressão de genes de defesa (O’BRIEN et al., 2012). Nos fungos, concentrações elevadas de EROS provocam danos em macromoléculas, tais como ácidos nucléicos, proteínas e lipídios de membrana, perda de função celular e por fim morte celular por apoptose ou necrose (NORDBERG; ARNÉR, 2001; SUBRAMANYAM et al., 2012). Alguns trabalhos demonstram que proteínas de defesa podem interagir com proteínas específicas da membrana plasmática e, por meio de transdução de sinais, levam à morte celular programada por induzir acúmulo de espécies reativas de oxigênio (NARASIMHAN et al., 2001).
Resultados semelhantes aos observados neste trabalho foram obtidos para proteínas dos látex de Carica papaya, Carica candamarcensis e C. procera. Estas foram capazes de inibir a germinação de esporos e o crescimento micelial de diferentes fitopatógenos e induzir estresse oxidativo em esporos de F. solani. Possivelmente, a presença de proteases cisteínicas nestes fluidos laticíferos possa estar associada ao efeito deletério observado, uma vez que o tratamento das amostras com iodoacetamida eliminou a ocorrência de dano oxidativo e o uso de tripsina não teve efeito sobre os esporos (SOUZA et al., 2011). As enzimas proteolíticas desempenham papéis estratégicos na defesa da planta contra o ataque por patógenos. Estas podem ser parte das barreiras de defesa pré-formadas ou podem ser induzidas mediante a percepção de microrganismos. Evidências mostram que proteases aspárticas com atividade antimicrobiana são induzidas após estresse abióticos e bióticos em Solanum tuberosum (GUEVARA et al., 2004). Mendieta et al. (2006) demonstraram que proteases aspárticas são capazes de destruir esporos de F. solani e Phytophthora infestans de um modo dependente da dose, por interagir diretamente com a superfície de esporos e hifas, induzindo estresse oxidativo através da produção de peróxido de hidrogênio e afetando a permeabilidade da membrana plasmática. O látex de C. grandiflora exibe uma mistura complexa de proteases. Recentemente, uma protease cisteínica denominada de Cg24-I de 24,118 kDa foi purificada do látex de C. grandiflora. Esta foi capaz de inibir totalmente a 122
germinação de esporos de F. solani e seu mecanismo de ação contra fungos foi relacionado à alteração na permeabilidade da membrana (RAMOS et al., 2014).
A membrana plasmática é composta predominantemente por uma bicamada fosfolipídica, porém, contêm proteínas que são responsáveis pela realização de várias funções, incluindo transporte seletivo de moléculas e o reconhecimento celular. A manutenção da integridade da membrana plasmática é um fator crucial na manutenção das condições celulares (ABAD et al., 1996). Portanto, as proteases podem atuar degradando as proteínas que compõem a membrana plasmática, permitindo assim, que o efluxo de íons intracelulares conduza à morte da célula (TOSSI; SANDRI; GIANGASPERO, 2000; RAMOS et al., 2014).
6.5 Avaliação da presença de PR-proteínas
O fato de somente calos e raízes de C. procera apresentarem atividade antifúngica levanta questionamentos sobre quais as proteínas responsáveis por essas atividades nos látex das duas espécies, C. procera e C. grandiflora, e por qual motivo elas não são encontradas em calos e raízes de C. grandiflora. Essas observações fomentaram a investigação de quais as propriedades que divergem nos dois sistemas de cultivo in vitro, que poderiam conferir a atividade antifúngica a calos e raízes de C. procera. PR-proteínas são uma classe de proteínas comumente encontradas em fluidos laticíferos e a sua presença está ligada ao papel defensivo deste fluido em plantas. Proteases (FREITAS et al., 2007), inibidores de proteases (RAMOS et al. 2015), quitinases (RAMOS et al., 2007a), osmotinas (FREITAS et al. 2011b) e peroxidases (FREITAS et al. 2010) são PR-proteínas já descritas em látex de C. grandiflora e C. procera.
Para tanto, foi avaliada a atividade de algumas destas PR-proteínas, uma vez que essas possuem atividade antifúngica estabelecida e podem ser encontradas expressas, embora em baixos níveis, de forma constitutiva em plantas.
6.5.1 Inibidores de proteases cisteínicas e serínicas
Inibidores de proteases são proteínas que formam complexos menos ativos ou completamente inativos com proteases, assim impedem o acesso do substrato ao sítio ativo das enzimas. Estes podem estar presentes constitutivamente, participando dos processos de regulação de proteases endógenas, ou serem induzidos e atuarem na defesa da planta contra 123
patógenos (HABIB; FAZILI, 2007). Seu papel na defesa pode estar relacionado à eliminação da atividade enzimática de microrganismos fitopatogênicos. Durante o processo de invasão, proteases fúngicas atuam facilitando a penetração do patógeno no tecido vegetal. Inibidores de proteases exibem atividade antifúngica por inibirem as proteases dos fungos, retardando assim, a taxa de germinação de esporos e a extensão de hifas (VERNEKAR et al., 1999). Valueva et al. (2003) destacam o acúmulo de inibidores de proteases em Solanum tuberosum após danos mecânicos ou infecção com Phytophthora infestans. Tratamentos com elicitores abióticos e bióticos, como o ácido jasmônico e o ácido araquidônico, respectivamente intensificaram o acúmulo destes inibidores em tubérculos de batata. Portanto, a presença de inibidores de proteases cisteínicas em calos e raízes de C. procera poderia ser uma das moléculas envolvidas na defesa contra fungos encontradas neste sistema de cultivo in vitro.
Inibidores de proteases de várias classes são frequentemente reportados no látex de diversas plantas. Inibidores de proteases serínicas foram encontrados nas espécies Ficus carica (KIM et al., 2003), C. papaia (AZARKAN et al., 2003, 2004) e C. procera (RAMOS et al., 2015). Enquanto que no látex de C. grandiflora foram detectados inibidores de proteases serínicas e cisteínicas (RAMOS et al., 2015). Além de ação antifúngica, inibidores de proteases também apresentam efeito inseticida. Ramos et al. (2010) observaram que as proteínas do látex de C. procera apresentaram atividade inseticida em doses tão baixas quanto 0,1% (w/w) em dietas artificiais contra Callosobruchus maculatus (Coleoptera: Chrysomelidae). Análise por zimograma reverso evidenciou a presença de bandas de proteínas resistentes à digestão com papaína. Estes inibidores de proteases não perderam a sua atividade inseticida, mesmo depois de tratamento térmico ou digestão proteolítica.
6.5.2 Quitinases
As quitinases estão presentes em todos os organismos. Nas plantas, possuem papel, principalmente, na defesa contra patógenos, especialmente fungos fitopatogênicos (KASPRZEWSKA, 2003). Quitinases foram detectadas nos látex de P. rubra, E. tirucalli, C. procera e C. grandiflora (FREITAS et al., 2010) sendo a atividade quitinolítica de C. grandiflora duas vezes maior do que a encontrada no látex de C. procera. Quitinase e proteínas de ligação à quitina foram encontradas nos látex de F. microcarpa e H. brasiliensis exibindo forte atividade antifúngica (TAIRA et al., 2005; FREITAS et al., 2007). 124
No entanto, uma fração rica em atividade quitinolitica do látex de C. procera isolada em nosso grupo de pesquisa (LPCp P1), e utilizada neste trabalho, não apresentou qualquer atividade sobre os fungos avaliados. Contudo, o potencial destas proteínas contra insetos foi testado e concluiu-se que esta fração (LPCp P1), apresentou potente ação inseticida contra Callosobruchus maculatus (Coleoptera: Chrysomelidae). Quando a fração foi incluída em dieta artificial na concentração 0,1% demonstrou ser tóxica para os insetos adultos e larvas de Callosobruchus maculatus (dados não publicados).
Estes resultados corroboram com o observado por Ramos et al. (2007a), que avaliaram o envolvimento de quitinases sobre efeitos adversos contra insetos. Neste, proteínas do látex de C. procera apresentaram ação inseticida contra diferentes pragas agrícolas. Dietas contendo concentrações variando de 0,1% a 4% de LPCp afetaram a sobrevivência, o desenvolvimento e o ganho de peso de Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae), Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera: Noctuidae) e Peruvianus dysdercus (Hemiptera: Pyrrhocoridae). O baixo desempenho destas pragas em dietas contendo as proteínas do látex de C. procera pode estar relacionado à ligação das proteínas laticíferas em estruturas de quitina presentes na membrana peritrófica dos insetos, interferindo desta forma no processo digestivo.
Contudo, os resultados apresentados indicam que provavelmente as quitinases do látex de C. procera estejam envolvidas especificamente na proteção da planta contra o ataque de insetos, não possuindo efeito sobre fungos fitopatogênicos. No entanto, não podemos afirmar que estas observações se estendem para calos e raízes de C. procera, tendo em vista que a atividade quitinolítica de calos e raízes de C. procera foi em média quatro vezes maior do que a observada para as proteínas desse látex e que quitinases são reconhecidamente proteínas antifúngicas. Assim, as quitinases de calos e raízes de C. procera poderiam estar envolvidas na defesa contra fungos fitopatogênicos observada neste trabalho.
6.5.3 Osmotinas
Outra classe de PR-proteínas envolvida na defesa vegetal são as osmotinas. Estas têm chamado atenção por serem capazes de agir em resposta a ambos os estresses bióticos e abióticos, podendo se apresentar constitutiva ou induzida (VIKTOROVA et al., 2012). Osmotinas foram relatadas em fluidos laticíferos de H. brasiliensis, C. procera, C. grandiflora e C. papaya (SUBROTO et al., 2001; LOOZE et al., 2009; FREITAS et al., 125
2011b; SOUZA, 2014). Evidências mostram que particularmente, a osmotina do látex de C. papaya é encontrada somente em plantas submetidas à injúria mecânica. Essa é uma osmotina de 22,13 kDa isolada somente em plantas danificadas antes da coleta do látex, mostrando-se ausente no látex de plantas que nunca tinham sido submetidas a injúrias anteriormente. Contudo, osmotina do látex de C. papaya não demonstrou possuir atividade antifúngica (LOOZE et al., 2009). Por outro lado, uma osmotina denominada de CpOsm purificada do látex de C. procera mostrou ser exibida constitutivamente e apresentou forte atividade antifúngica sobre F. solani, Neurospora sp. e C. gloeosporioides, inibindo a germinação de esporos e o crescimento micelial (FREITAS et al. 2011a). Diferenças na sensibilidade de osmotinas contra diversos fungos fitopatogênicos foram observadas (ABAD et al. 1996). Osmotinas foram eficazes em inibir a germinação de esporos e o crescimento micelial dos gêneros Bipolaris, Fusarium, Phytophthora e Trichoderma. Enquanto que algumas espécies foram altamente resistentes à osmotina, como Aspergillus flavus, A. parasitica, R. solani e M. phaseolina.
Essas diferenças na atividade contra fungos se devem provavelmente à existência de modificações na estrutura tridimensional das proteínas, conferindo-as distintos papéis. A osmotina apresenta estrutura tridimensional composta por três domínios semelhantes e uma estrutura de fenda entre os domínios I e II. Diferenças na topologia da superfície e no potencial eletrostático ao redor da fenda são consideradas para determinar a especificidade destas proteínas com suas células alvo. Portanto, essa estrutura de fenda nas osmotinas pode estar envolvida na interação com o seu receptor na membrana plasmática de fungos e assim conferir as diferentes respostas observadas (MIN et al., 2004; REISS; SCHLESIER; BRANDT, 2006). Reiss, Schlesier e Brandt (2006) observaram a existência de uma região conservada na fenda. Osmotinas apresentando atividade antifúngica tinham a região da fenda altamente ácida, enquanto que regiões da fenda básica foram observadas em osmotinas destituídas de atividade antifúngica. Portanto, estas observações sugerem que as cargas negativas na região da fenda podem ser cruciais em conferir atividade antifúngica.
Uma proteína purificada do látex de C. grandiflora identificada como uma osmotina de 21 kDa denominada de CgOsm, não apresentou qualquer atividade antifúngica sobre os fungos fitopatogênicos C. gloeosporioides e R. solani, nem mesmo na maior concentração testada (1 mg/mL) (SOUZA, 2014). No entanto, as osmotinas podem 126
desempenhar outros papéis fisiológicos na planta, que não sejam de defesa, como reguladores osmóticos. Calos de C. grandiflora cultivados in vitro e submetidos à condição de estresse salino apresentaram níveis aumentados de transcritos desta proteína quando comparadas ao controle sem NaCl, em que não foram observados transcritos, indicando que para calos de C. grandiflora essa proteína somente é expressa em condições de estresse (SOUZA, 2015). Sugere-se, que pelo menos para C. grandiflora, as osmotinas podem estar relacionadas à condições de estresse osmótico e não à ação antifúngica. Portanto, com base nesses resultados, a ausência de atividade antifúngica observada para calos e raízes de C. grandiflora, possivelmente não se relaciona com a ausência de osmotinas nestes tecidos.
6.5.4 Proteases
Uma protease cisteínica de 33 kDa encontrada em calos de milho (Zea mays) tem sido associada com a inibição do crescimento de larvas da lagarta do cartucho, Spodoptera frugiperda (JIANG et al, 1995; PECHAN et al., 2000). Calos provenientes de genótipos resistentes de milho apresentam resistência para larvas por expressar uma protease de 33 kDa ausente em calos de linhagens suscetíveis. Quando as larvas foram criadas em calos expressando a protease, o seu crescimento foi inibido de 60 a 80%. Alterações na expressão do gene para essa protease foram observadas durante a alteração morfológica de calos friáveis para calos compactos. Culminando com a perda da proteína durante o processo de transição de calos friáveis para calos não friáveis (JIANG et al., 1995).
Yamamoto e Tabata (1989) sugeriram que a produção de proteases semelhantes a papaína está intimamente associada com a diferenciação celular de laticíferos. Protease semelhante à papaína foi produzida em embriões somáticos de Carica papaya, no entanto, não foi detectada em culturas de calos friáveis ou compactos que não desenvolveram laticíferos. Como observado no presente trabalho, calos e raízes de C. grandiflora não diferenciaram estruturas laticíferas, o que poderia justificar, pelo menos em parte, a baixa atividade proteolítica observada nestas amostras.
Fluidos laticíferos de diversas espécies exibem misturas complexas de proteases de vários tipos. Sobretudo, o látex de C. grandiflora exibe uma atividade proteolítica mais forte do que a observada no látex de C. procera. Por este motivo, a baixa atividade proteolítica observada para calos e raízes de C. grandiflora, é um fato curioso, uma vez que as 127
proteases desempenham diversos papéis na fisiologia vegetal, e é encontrada em abundância no látex desta espécie. A atividade proteolítica observada para calos e raízes de C. grandiflora sugere que nestes tecidos as proteases possam estar presentes em baixas quantidades, somente para realização de funções consideradas basais na célula vegetal, tais como, desenvolvimento e renovação de proteínas.
Considerando que proteases laticíferas de C. grandiflora apresentaram ação antifúngica, os resultados observados nesta pesquisa sugerem que a ausência de atividade antifúngica em tecidos cultivados in vitro de C. grandiflora deve-se a ausência de proteases nestes tecidos e ainda excluem quitinases e inibidores de proteases presentes como proteínas antifúngicas. Em calos e raízes de C. procera, além de proteases, outras proteínas tais como, quitinases, inibidores de proteases e osmotinas detectadas podem estar envolvidas na atividade antifúngica observada, e/ou agir sinergicamente na defesa contra fungos.
6.6 Atividades das enzimas antioxidantes
Cal os e raízes de C. grandiflora também foram investigados quanto a presença de proteínas que participam do metabolismo oxidativo e que estão relacionadas com a defesa vegetal. Dentre as enzimas analisadas estão a catalase (EC 1.11.1.6) que catalisa a conversão do peróxido de hidrogênio a água e oxigênio molecular e as peroxidases, APX (EC 1.11.1.11) e G-POD (EC: 1.11.1.7) ambas catalisam a conversão de peróxido de hidrogênio a água, através da oxidação de diferentes substratos. Enzimas antioxidativas são um grupo de enzimas especializadas na regulação dos níveis celulares de espécies reativas de oxigênio, especialmente o H2O2, que em concentrações elevadas podem ser tóxicos para as plantas (MHAMDI et al., 2010). A presença de enzimas do metabolismo oxidativo já foram relatadas em fluidos laticíferos e reforça a hipótese do látex como mecanismo de defesa vegetal. As enzimas, superóxido dismutase e ascorbato peroxidase foram encontradas nos látex de C. grandiflora, C. procera e P. rubra. A atividade da ascorbato peroxidase em C. grandiflora foi mais elevada do que as encontradas para esses fluidos laticíferos. Por outro lado, o látex de C. procera apresentou uma atividade da superóxido dismutase mais alta. No entanto, dentre esses fluidos laticíferos, a catalase somente foi detectada no látex de C. grandiflora (FREITAS et al., 2010). 128
Comparativamente, ao observado no látex de C. grandiflora; calos e raízes de C. grandiflora obtiveram uma atividade da ascorbato peroxidase de 0,064 ± 0,0074 e 0,014 ± -1 -1 0,0008 µMol H2O2/min g MF, respectivamente; porém, a atividade observada no látex foi -1 -1 em média seis vezes maior, com atividade de 0,389 ± 0,03 µMol H2O2/min g . A atividade da enzima calatase não foi observada em calos; e nas raízes a atividade foi considerada baixa -1 - 1 0,015 ± 0,0015 µMol H2O2/min g MF, enquanto que no látex foi 0,254 ± 0,03 µMol -1 -1 H2O2/min g . Em compensação, a atividade da G-POD foi mais expressiva em calos 0,509 ± -1 -1 0,0312 µMol H2O2/min g , se comparada a atividade da APX no látex, que também é uma peroxidase.
Entre as enzimas antioxidantivas avaliados, sugere-se que a peroxidase do guaiacol seja a principal responsável pela eliminação de EROS, uma vez que outras enzimas eliminadoras, como a CAT e APX tiveram níveis baixos ou não foram detectadas. Os baixos níveis de oxidação observados no cultivo in vitro de calos e raízes podem ser resultantes da alta atividade da G-POD demostradas por estas amostras.
Ao longo da evolução, as plantas desenvolveram um complexo sistema antioxidante, composto por mecanismos enzimáticos e não-enzimáticos, os quais são responsáveis por atenuar os níveis das espécies reativas de oxigênio (EROS), evitando com isso, o dano oxidativo. Altos níveis de EROS podem levar a um quadro de estresse oxidativo, caracterizado pela peroxidação dos lipídios celulares, oxidação proteica, danos ao DNA e RNA, e indução de vias de morte celular programada (MITTLER, 2002). Contudo, as células contam com diversas proteínas que auxiliam na manutenção do equilíbrio redox da célula. Enzimas antioxidativas, como peroxidases, catalase e superóxido dismutase, além de atuarem eliminando as espécies reativas de oxigênio (TEIXEIRA et al., 2004), podem apresentar funções específicas. As peroxidases, por exemplo, auxiliam na formação da parede celular e em particular, na biossíntese da lignina, além de promoverem o alongamento celular durante o processo de desenvolvimento de laticíferos (ZHAO et al., 2014) e também são reconhecidas como proteínas relacionadas à patogênese, uma vez que suas atividades são reguladas no momento da infecção (VAN LOON; REP; PIETERSE, 2006). 129
6.7 Espectrometria de massas
A análise preliminar do proteoma de calos e raízes de C. grandiflora e C. procera permitiu identificar a existência de várias proteínas relacionadas à patogênese, como quitinases, oxidases e inibidores de proteases, corroborando com os resultados obtidos da caracterização enzimática. Dentre as proteínas encontradas em calos e raízes de C. grandiflora e C. procera, destacam-se as quitinases e peroxidases, ambas relacionadas a processos de defesa vegetal contra insetos e fitopatógenos (VAN LOON et al. 2006; ZHAO et al. 2014). No entanto, proteases e osmotinas não foram detectadas em nenhuma das amostras testadas. A ausência de proteases em calos e raízes de C. grandiflora, sugerem que para a cultura in vitro desta espécie, as proteases somente são utilizadas para processos celulares considerados basais, este fato corrobora com a atividade proteolítica residual encontrada nessas amostras.
6.8 Caracterização Bioquímica de calos e raízes de C. grandiflora
Na análise do perfil proteico de calos e raízes de C. grandiflora, observou-se que estas amostras apresentam perfis de proteínas semelhantes. Quando estes perfis de proteínas de calos e raízes são comparados aos das proteínas do látex de C. grandiflora, nota-se grandes diferenças entre eles, uma vez que o látex de C. grandiflora apresenta proteínas de variadas massas moleculares, sendo as mais abundantes àquelas com massas próximas de 14,4, 45,0 e acima de 97 kDa (FREITAS et al., 2010). Diferenças nos perfis proteicos de látex e de amostras de cultura in vitro são esperadas, uma vez que as proteínas foram obtidas a partir de fontes de células distintas sob diferentes estímulos.
130
7 CONCLUSÃO
Proteínas dos calos e raízes de C. grandiflora não apresentaram atividade sobre os fungos fitopatogênicos avaliados. Enquanto que as proteínas extraídas de calos e raízes de C. procera exibiram uma potente atividade antifúngica sobre fungos fitopatogênicos: F. solani, F. oxysporum, C. lindemuthianum e C. gloesporioides, quando comparadas com a atividade observada para proteínas do látex de C. procera. Possivelmente seu mecanismo de ação contra fungos está relacionado à alteração na permeabilidade da membrana plasmática e a indução de estresse oxidativo, através da produção de peróxido de hidrogênio. Proteases, osmotinas, quitinases e inibidores de proteases foram detectados nas amostras de calos e raízes de C. procera, porém, osmotinas e proteases não foram observadas em calos e raízes de C. grandiflora.
Compostos derivados de plantas têm sido investigados para uso como potenciais novas fontes de proteínas antifúngicas, uma vez que estes se mostram seguros para os seres humanos e para o meio ambiente. Deste modo, o sistema de cultivo in vitro de calos e raízes de C. procera representa uma ferramenta a ser explorada em estudos de bioprospecção de compostos bioativos com direta potencialidade de benefícios em culturas de interesse econômico.
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