Analys Av Växtsteroler Med Gaskromatografi Och Ft-Nir-Spektroskopi

ANALYS AV VÄXTSTEROLER MED GASKROMATOGRAFI OCH FT-NIR-SPEKTROSKOPI

Aino Visuri

Pro gradu-avhandling utförd under handledning av docent Tiina Saloranta-Simell och professor Reko Leino och TkD, utvecklingschef Ville Nieminen

Laboratoriet för molekylärvetenskap och -teknik

Fakulteten för naturvetenskaper och teknik

Åbo Akademi

April 2021

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______REFERAT

Målet med denna pro gradu-avhandling var att jämföra och evaluera fyra olika gaskromatografiska metoder för analys av växtsteroler. Det har presenterats flera metoder i litteraturen, men de flesta tillämpas på analys av varierande matriser av livsmedel samt oljor, och mer sällan koncentrerade växtsteroler. I det här arbetet undersöktes metodernas duglighet att analysera prover av koncentrerade växtsteroler, samt förmåga att separera de växtsteroler som är reglerade av Europeiska unionen. Utöver evalueringen utvecklades nya gaskromatografiska metoder baserade på de fyra behandlade. Resultaten av de befintliga metoderna var i regel i samma storleksklass, och de antogs således fungerande för analys av koncentrerade växtsteroler. Tre av fyra metoder hade en tillräcklig separation av de viktigaste växtsterolerna. De utvecklade metoderna möjliggjorde en snabbare analys av växtsterolblandningen med tillräcklig separation mellan föreningarna.

Förutom gaskromatografiska metoder evaluerades också möjligheten av att använda FT-NIR- spektroskopi som en snabb analysmetod för koncentrerade växtsteroler. Resultaten erhållna i det här arbetet var riktgivande, men bristen i provmängden gör att inga generella slutsatser kan dras.

Sökord: växtsterol, växtstanol, fytosterol, gaskromatografi

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______FÖRKORTNINGAR OCH BETECKNINGAR

α alfa: används också som beteckning för att beskriva konfiguration av steroler AOCS American Oil Chemists’ Society ASG Acylsterolglykosid β beta: används som beteckning för att beskriva konfiguration av steroler BSTFA N,O-Bis(trimetylsilyl)trifluoroacetamid CAS Chemical Abstracts Service Δ delta: används för att beteckna position av dubbelbindning i sterolstrukturer ECN Effective carbon number, effektiv kolnummer EU Europeiska unionen FDA United States Food and Drug Administration FID Flame ionization detector, flamjoniserings detector FIR Far infrared, fjärrinfraröd FT Fouriertransform FT-NIR Fouriertransform-närinfraröd GC Gas chromatography, gaskromatografi GRAS Generally Recognized as Safe HSE Hydroxicinnamatsterolester IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry ISTD Intern standard LDL Low-density lipoprotein MIR Mid infrared, mellaninfraröd MS Mass spectrometry, masspektrometri MSC Multiplicative scatter correction NIR Near infrared, närinfraröd NMKL Nordisk metodikkommitté för livsmedel OCI On-column injection PLS Partial least squares PTV Programmable temperature vaporization SE Sterolester SG Sterolglykosid THF Tetrahydrofuran TMCS Trimetylklorosilan

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______INNEHÅLLSFÖRTECKNING

REFERAT ...... I

FÖRKORTNINGAR OCH BETECKNINGAR ...... II

INNEHÅLLSFÖRTECKNING ...... III

1 INLEDNING ...... 1

2 TEORI OCH BAKGRUND ...... 2

2.1 Växtsteroler ...... 2

2.1.1 Nomenklatur ...... 5

2.1.2 Växtsterolers funktion i växter och människor ...... 7

2.1.3 Reglering ...... 10

2.1.4 Analys av växtsteroler ...... 11

2.2 Gaskromatografi ...... 12

2.2.1 Instrumentet ...... 12

2.2.2 Gaskromatografisk teori...... 17

2.2.3 Gaskromatografisk analys av växtsteroler ...... 21

2.2.4 Utveckling av gaskromatografiska metoder ...... 25

2.3 FT-NIR-spektroskopi ...... 26

2.3.1 FT-NIR-instrumentet ...... 27

2.3.2 FT-NIR-spektroskopi i analys av växtsteroler ...... 28

3 MÅLSÄTTNING...... 29

4 EXPERIMENTELL DEL ...... 30

4.1 Analys av växtsteroler med gaskromatografi...... 30

4.1.1 Metod A7 ...... 30

4.1.2 Metod B9 ...... 31

4.1.3 Metod C3 ...... 32

III

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

4.1.4 Metod D8 ...... 33

4.2 Utveckling av gaskromatografiska metoder ...... 34

4.3 Analys av växtsteroler med FT-NIR-spektroskopi ...... 36

5 RESULTAT OCH DISKUSSION ...... 37

5.1 Evaluering av befintliga gaskromatografiska metoder ...... 37

5.1.1 Analysresultat ...... 37

5.1.2 Jämförelse av metoderna ...... 39

5.2 Metodutvecklingen ...... 44

5.2.1 Analysresultat ...... 44

5.2.2 Jämförelse av de utvecklade metoderna ...... 50

5.3 FT-NIR-spektroskopi i växtsterolanalys ...... 54

6 SAMMANFATTNING ...... 57

7 REFERENSER ...... 58

8 BILAGOR ...... 65

8.1 Bilaga 1 ...... 65

8.2 Bilaga 2 ...... 84

8.3 Bilaga 3 ...... 95

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______1 INLEDNING

Växtsteroler är naturligt förekommande steroidföreningar i växter. Växtsteroler och främst deras estrar används som tillsatsämnen i livsmedel tack vare deras kolesterolsänkande effekt.1 Eftersom växtsteroler används i livsmedel, är mängderna av totala och enskilda växtsterolföreningar reglerad.2 Regleringarna diskuteras i kapitel 2.1.3. För att kunna följa regleringarna behövs noggranna analysmetoder för både livsmedel och råmaterialen så som koncentrerade växtsterolblandningar. I litteraturen presenteras flera metoder för analys av växtsterolhalten i livsmedel samt oljor,3–7 men endast få som inkluderar procedurer för analys av koncentrerade fria växtsteroler.8,9 Majoriteten av analysmetoderna använder gaskromatografi för att separera och kvantifiera de enskilda föreningarna.

Gaskromatografi (GC) är en av de mer använda analysmetoderna för flyktiga organiska föreningar. Analysmetoden har många fördelar för rutinanalys; det finns flera väletablerade metoder i varierande områden av analys, metodutveckling för nya analyser är hanterbar, och metoden är flexibel med tanke på olika storlekars föreningar. Dessutom är instrumentets pris relativt lågt, och injiceringen av prover kan automatiseras, vilket ökar på effektiviteten. Olika detektorer kan kopplas till gaskromatografer, av vilka till exempel flamjoniseringsdetektorn (FID) är väldigt sensitiv och har hög reproducerbarhet. Masspektrometri (MS) används som detektor då pikarnas identitet ska bestämmas. Både kvalitativa och kvantitativa analyser kan utföras med gaskromatografi.10 Analystiderna är beroende av provprepareringen och själva körprogrammen och kan variera stort. I analyser av växtsteroler rör sig GC-programmens analystider mellan 15 minuter till lite över en timme.7,8 Tiden på provprepareringen varierar mer, och beror speciellt på matrisen som ska analyseras.

För snabba analyser kan Fouriertransform-närinfrarödspektroskopi (FT-NIR-spektroskopi) vara ett lockande alternativ, speciellt inom kvalitetskontroll. Det är en sekundär analysmetod som har många möjligheter; den kan bland annat analysera råvaror på sekunder och också användas för uppföljning av kemiska processer i realtid. I många FT-NIR-mätningar behövs dessutom ingen provpreparering, vilket försnabbar analyserna betydligt.11 Växtsterolhalter har i tidigare studier kunna bestämmas i olivolja med FT-NIR-spektroskopi.12

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______2 TEORI OCH BAKGRUND

2.1 Växtsteroler

Växtsteroler och -stanoler är steroidföreningar som är naturligt förekommande i växter. Steroler definieras av International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) som steroider som har en hydroxylgrupp i position 3 (se Figur 1), och som har en kolesterol- liknande struktur med varierande längd på sidokedjan.13 Deras uppgift i växter är liknande till kolesterolets uppgift i djur – de har en viktig roll i cellmembranens funktion.14 Det finns över 250 växtsterolföreningar, och de förekommer främst i växtoljor, men också i andra delar av växterna.15 Naturligt kan steroler förekomma som sådana, alltså som fria steroler, men också som esterifierade fettsyror (växtsterolestrar/sterylfettsyraestrar) eller som glykosider (sterylglykosider). För växtsteroler och -stanoler kan även begreppet fytosteroler användas.14

Figur 1. Steroidskelettet med numrering enligt IUPAC.13

Några av de mest förekommande växtsterolerna presenteras i Figur 2.16 De här sterolerna hör till en grupp av föreningar som kallas ibland för 4-desmetylsteroler, som syftar på att det inte finns metylgrupper i position fyra i strukturen.14 Sitostanol och kampestanol klassas som stanoler, som skiljer sig från deras motsvarande steroler i och med att de är mättade, och har därmed inga kol-kol dubbelbindningar i strukturen. Sitostanol är den mättade motsvarigheten till sitosterol, och kampestanol till kampesterol. Sitosterol har en dubbelbindning i position 5 och en etylgrupp i position 24. Stigmasterol har en liknande struktur som sitosterol, med skillnaden av en ytterligare dubbelbindning i position 22. Kampesterol däremot har en metylgrupp i position 24, och en dubbelbindning i position 5. Brassikasterol i sin tur har två dubbelbindningar i positionerna 5 och 22, och en metylgrupp i position 24 med motsatt konfiguration än de andra fem exemplen.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Figur 2. Strukturer för några vanliga växtsteroler och -stanoler.

Fördelningen mellan olika växtsterolföreningar, eller växtsterolsammansättningen, varierar beroende på växtsorten. Sitosterol är den vanligaste växtsterolen, och utgör den störta andelen av enskild sterol i de flesta växterna. Kampesterol och stigmasterol kan i de flesta fallen detekteras som en del av sterolsammansättningen. Brassikasterol, å andra sidan, förekommer i relativt höga andelar i rybs- och rapsväxter (Brassica-släktet), medan det inte har detekterats alls eller bara i väldigt låga koncentrationer i sterolsammansättningen från trä- och sojakällor.17,18 Växtsterolfördelningen i från trämaterial utvunna steroler har höga halter av sitostanol och ibland också kampestanol, medan halten av dessa mättade stanoler är låg i rybs- och sojasteroler.18 Växtsterolers fördelningar är reglerade då de ska användas i livsmedel. Specifika regleringar finns för de sex vanligaste växtsterolerna och -stanolerna, alltså brassikasterol, sitosterol, kampesterol, stigmasterol, sitostanol och kampestanol.2

Exempel på fördelningen av totala växtsteroler, alltså summan av fria och konjugerade steroler, i rybs- och rapsoljor, sojaoljor, samt i koncentrerade steroler från tallolja presenteras i Tabell 1.17,18 Rybs och raps samt soja presenteras i tabellen som oljor, medan steroler av tallolja presenteras som koncentrerade steroler. Med koncentrerade växtsteroler

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______avses det i den här avhandlingen fria växtsteroler i fast form med hög renhet, där andelen växtsteroler är över 90 %. Förutom de i Tabell 1 presenterade råmaterialen har växtsterolhalten och fördelningen för flera oljor av olika ursprung analyserats, som till exempel sesam, kokosnöt, solros och majs.19 Vidare har flera livsmedel,6 nötter,20,21 grönsaker och frukter22 analyserats för växtsterolinnehållet. Också svamp har analyserats, och intressant nog innehöll det endast kampesterol, men i relativt hög koncentration.22

Tabell 1. Fördelning av totala växtsteroler i växtoljor samt i koncentrerad sterol från tallolja. Sterol Rybs- och rapsolja17 Sojabönsolja17 Sterol av tallolja18

% % % Kampesterol 28,3 - 35,0 16,7 - 20,1 4 - 25 Kampestanol id - 0,1 0,8 - 1,2 0 - 14 Stigmasterol 0,3 - 0,5 18,0 - 21,0 <1 Sitosterol 50,5 - 55,2 55,1 - 60,4 36 - 80 Sitostanol 0,3 - 0,9 1,4 - 2,0 6 - 34 Brassikasterol 8,8 - 12,8 id - 0,2 <1 Andra steroler 2,4* - 5,0* 1,7* - 3,8* id - 2 id = inte detekterad; *endast Δ5-avenasterol

Medan steroler i naturen förekommer både i fri och konjugerad form, kan koncentrerade fria växtsteroler erhållas industriellt bland annat i raffineringsprocessen av vegetabiliska oljor. Åtskiljandet av steroler sker i deodoriseringen (eng. deodorization), som separerar flyktiga föreningar under högt vacuum och ångdestillation (eng. steam distillation) i hög temperatur. Ett så kallat deodoriseringsdestillat (eng. deodorizer distillate) erhålls, som är en blandning av olika föreningar, där fria steroler utgör 2-15 % av blandningen, och esterifierade steroler 0-5 %.23 Sterolmängden i råoljan är alltså högre än vad den är i den raffinerade oljan, men sterolfördelningen kan variera i olika skeden av processen. Speciellt de olika växtsterolestrarnas fördelningar kan ändras; i en undersökning av processeringen av sojaolja ändrade andelen kampesterolester från 9,3 % i råolja till 15,3 % efter deodoriseringen. Förändringen i fördelningen av totala växtsteroler är ändå betydligt mindre, och således anses de givna värdena i Tabell 1 jämförbara.24

Växtsteroler kan också erhållas från tallolja, som är en sidoprodukt från skogsindustrin. Talloljan innehåller ungefär 10–40 % fria steroler.1 Processen är olika än för andra oljor, vilket möjligen kunde påverka sterolfördelningen. Växtsteroler kan isoleras från talloljesåpa (eng. tall oil soap), råtallolja (eng. crude tall oil) och från talloljebeck (eng. tall oil pitch). Talloljesåpa

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______erhålls då svartluten koncentreras och såpan flyter på ytan. Då till exempel svavelsyra tillsätts i talloljesåpan bildas två faser av vilka oljefasen kallas för råtallolja. Talloljebeck erhålls genom fraktionerad destillation av råtallolja, där sterolerna är i den tyngre fasen. På grund av den höga temperaturen sönderfaller många av de fria sterolerna i processen. Ifall olika steroler sönderfaller i olika förhållanden, kan det vara skillnad i sterolfördelningen i tallolja jämfört med koncentrerade steroler erhållna från tallolja.23 På en industriell skala utvinns växtsteroler främst från talloljebeck.25

2.1.1 Nomenklatur

Sterolföreningar har varit kända länge, och flera växtsteroler har trivialnamn. Ibland används fler än ett namn för samma molekyl, och många växtsteroler har dessutom liknande namn. Detta medför en del oklarheter, i och med att det finns över 250 växtsteroler med liknande strukturer. Termen fytosterol används ofta som synonym till växtsteroler och –stanoler. Begreppet fytostanol används som synonym till växtstanol, och tyder på endast de mättade sterolföreningarna, medan dessa oftast är inkluderade i begreppet fytosterol.16,26 I detta arbete definieras fytosteroler som alla kolesterol-liknande strukturer med en hydroxylgrupp i position 3, alltså som synonym till växtsteroler.

Växtsteroler kan kategoriseras bland annat genom mängden metylsubstituenter i position 4. De mest förekommande växtsterolerna är de så kallade 4-desmetylsterolerna, vilket tyder på att strukturen inte har metylsubstituenter i position 4. Utöver dessa förekommer också 4- metyl- och 4,4-dimetylsteroler, vilka har en respektive två metylsubstituenter. Dessa två grupper av steroler förekommer i lägre halter i växter. Vidare kan 4-desmetylsterolerna grupperas enligt antalet och positionen av dubbelbindningar, som oftast befinner sig i positionerna 5 och/eller 7 i ringstrukturen, samt position 22 i alkylkedjan. Beteckningen Δ (delta) används för att beskriva dubbelbindningars position, som till exempel i Δ5-avenasterol. Mättade växtsteroler, alltså de utan dubbelbindningar, kallas för stanoler, växtstanoler, eller fytostanoler. Beteckningarna α (alfa) och β (beta) används ibland för att beskriva konfiguration i positionerna 3, 5 och 24.15,16

IUPAC uppdaterade nomenklaturen för steroider år 1989, och numreringen motsvarar det som presenteras i Figur 1. Möjliga metylgrupper i position 4 numreras som 28 (α- konfiguration) och 29 (β-konfiguration), medan en metylgrupp i position 14 numreras som 30. Det här gäller främst triterpenoider som ses som trimetylsteroler (till exempel

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______cykloartanol). Ifall kolkedjan grenar sig ytterligare numreras därpå kommande kolatomer med prim, så som i position 24.13

Trivialnamn är användarvänliga, och används också i den här avhandlingen. De steroler som behandlas i det här arbetet samt den valda nomenklaturen presenteras i Tabell 2. I litteraturen har även andra namn för samma föreningar använts, och synonymer har samlats i Bilaga 2, tillsammans med molekylstrukturerna och CAS-numrorna (Chemical Abstracts Service). Strukturerna som ges i Bilaga 2 är de som presenterades i SciFinder27 genom att utföra sökningen med föreningarnas CAS-numror.

Tabell 2. Växtsterolerna som behandlas i det här arbetet. Föreningarnas strukturer är samlade i Bilaga 2. Nr. i Bilaga 2 Namn Engelskt namn CAS-nummer Molekylformel

1 Brassikasterol Brassicasterol 474-67-9 C28H46O

2 Kampesterol Campesterol 474-62-4 C28H48O

3 Kampestanol Campestanol 474-60-2 C28H50O

4 Stigmasterol Stigmasterol 83-48-7 C29H48O

5 Sitosterol Sitosterol 83-46-5 C29H50O

6 Sitostanol Sitostanol 83-45-4 C29H52O

7 Kolesterol Cholesterol 57-88-5 C27H46O

8 Kolestanol Cholestanol 80-97-7 C27H48O

9 Ergosterol Ergosterol 57-87-4 C28H44O

10 24-Metylenkolesterol 24-Methylene cholesterol 474-63-5 C28H46O

11 Klerosterol Clerosterol 2364-23-0 C29H48O

12 Stigmast-22-en-3-ol Stigmast-22-en-3-ol 65494-30-6 C29H50O

13 Ergost-7-en-3-ol Ergost-7-en-3-ol 70095-94-2 C28H48O

14 Stigmasta-5,7,22-trien-3-ol Stigmasta-5,7,22-trien-3-ol 481-19-6 C29H46O

15 Δ5-Avenasterol Δ5-Avenasterol 18472-36-1 C29H48O

16 Stigmasta-5,24-dienol Stigmasta-5,24-dienol 17605-67-3 C29H48O

17 Stigmast-7-enol Stigmast-7-enol 521-03-9 C29H50O

18 Δ7-Avenasterol Δ7-Avenasterol 23290-26-8 C29H48O

19 Cykloartanol Cycloartanol 4657-58-3 C30H52O

20 24-Metylencykloartanol 24-Methylene cycloartanol 1449-09-8 C31H52O

21 Citrostadienol Citrostadienol 474-40-8 C30H50O

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______2.1.2 Växtsterolers funktion i växter och människor

Växtsterolernas funktion i växter påminner om kolesterolets funktion i däggdjur, alltså har de en viktig roll i cellmembranernas funktion. Som i djurceller finns det också lipidflottar i växtceller, där fria växtsteroler, sterolglykosider och acylsterolglykosider påverkar strukturen och reglerar fluiditeten. De möjliggör interaktionen med proteiner och andra lipider. Konjugerade steroler kan spela en roll i transmissionen av signaler genom membranen. Växtsteroler och deras konjugat påverkar även växters uthållighet mot ändringar i omgivningen, så som kyla, hetta och torka. Sterolestrarna är intracellulärt belägna och spelar en viktig roll i lagring och transport. Växtsteroler utgör också prekursorer till sekundära metaboliter. De olika konjugatens funktioner i växter är fortfarande till viss grad okända, och för att öka förståelsen måste analysmetoder fortfarande förbättras, och vidare undersökningar göras.1,15

Växtsteroler kan förekomma som fria obundna molekyler, eller konjugerade till en annan molekylenhet via syreatomen i position 3 av sterolen. Konjugat som växtsteroler förekommer som kan delas in i fyra grupper; sterolestrar (SE), hydroxicinnamatsterolestrar (HSE), sterolglykosider (SG) och acylsterolglykosider (ASG). Sterolestrarna är bundna till olika fettsyror, medan hydroxicinnamatsterolestrar är bundna till syror som ferulinsyra (eng. ferulic acid), kumarsyra (eng. coumaric acid), koffeinsyra (eng. caffeic acid) och sinapinsyra (eng. sinapic acid). Sterolglykosider är bundna till en monosackarid (oftast glukos), och acylsterolglykosider till en acylerad monosackarid.1,15 Exempel på olika konjugat och var de förekommer är presenterade i Tabell 3. Sterolprofilerna, alltså fördelningen av olika steroler, varierar mellan olika växter. Ytterligare kan de fria sterolerna binda sig i olika förhållandet till andra molekyler i olika växtarter – ibland kan de esterifierade konjugaten vara dominanta, ibland sterolglykosiderna. I till exempel potatis finns det mycket sterolglykosider,26 medan växtsterolestrar är berikade i oljor. I växter är sterolmängden oftast högst i nötter och frön, och vidare förhöjda då oljorna pressas ur dem. Mängderna kan ändå variera stort, till och med inom samma art. Hydroxicinnamatsterolestrar förekommer främst i spannmål.1

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Tabell 3. Strukturer av konjugerade steroler och exempel på förekomst.15 Sitosterol används som exempel. Exempelstruktur Förekomst

Fria steroler Speciellt i (FS) cellmembranen

Intracellulärt, som en Sterolestrar lagringsform av (SE) steroler. Berikade i växtoljor

Hydroxicinnamat- Bland annat i sterolestrar spannmål, främst (HSE) som ferulinsyra

Små mängder i cellmembranen Sterolglykosider av flera växtarter. (SG) Högre halter i till exempel

potatis.26

Acylsterol- Små mängder i glykosider cellmembranen (ASG)

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Växtsteroler förekommer i små mängder i växtbaserade livsmedel, och intaget via kosten kan vara upp till 500 mg per dag.1 Växtsteroler har en LDL-kolesterolsänkande effekt i människokroppen, och därför har funktionella livsmedel som är berikade med växtsteroler utvecklats. Via dem kan en högre mängd intas i dagen för att förstärka effekten. De första produkterna som kom till marknaden var margariner innehållande växtstanolestrar, men numera finns ett stort sortiment produkter, som bland annat yoghurt, mjölkbaserade drycker och myslistänger.28 Växtsteroler kan tillsättas i form av fria växtsteroler, som växtsterolestrar och hydrerade växtstanolestrar. Esterifieringen underlättar tillsatsen i livsmedel i och med fettlösligheten, men det finns också metoder för tillsats av växtsteroler i andra former.1

Den mest studerade fysiologiska egenskapen som växtsteroler har i människokroppen är just den LDL-kolesterolsänkande effekten. Speciell fokus har lagts på dosen och tajmningen av intaget, formen av växtsterolen, och livsmedelsmatrisen.1 Sänkningen av LDL-kolesterolet är beroende på dosen, men studier tyder på att mängden doser per dag inte är lika viktig som det att växtsterolerna intas i samband med en måltid.1,29 En skillnad på livsmedel som är berikade kunde också ses, och de med högre fettinnehåll gav en större sänkning. 29 Det har observerats att växtsteroler absorberas i högre grad i kroppen jämfört med de mättade motsvarigheterna växtstanolerna. Effektiviteten på sänkningen av LDL-kolesterol har ändå visats vara samma för både de omättade och mättade växtsterolerna.1 Det finns individuella skillnader i hur kroppen reagerar till växtsteroler, och vissa människors LDL-kolesterolvärden påverkas inte signifikant av växtsteroler.1 Ett samband mellan förhöjda LDL-kolesterolvärden och en större sänkning med hjälp av växtsteroler har ändå upptäckts.29 Sitosterolemia är en ovanlig sjukdom som orsakar lagring av sitosterol i kroppen, och människor som lider av denna ska inte konsumera växtsteroler.1

Ett högt intag av växtsteroler kan påverka absorptionen av vissa karotenoider, av vilka β- karoten kan ha en reduktion av upp till 10 % i plasman. I forskningen var nivåerna ändå inom gränsvärdena, och effekten kunde inhiberas med att ha en hälsosam kost med flera portioner frukt och grönsaker.1 En skillnad mellan absorptionen av steroler jämfört med stanoler i kroppen, samt skillnader mellan olika växtsterolföreningar kan märkas. Sitosterol absorberas i lägre grad jämfört med kampesterol, och deras stanolderivat i ännu lägre grad.15 Den här inverkan kan vara en orsak att det dagliga intaget av växtsteroler är reglerat, och varför regleringarna också berör halten av vissa enskilda växtsteroler.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______2.1.3 Reglering

I och med att växtsteroler tillsätts i livsmedel är kompositionen och mängden av sterolerna reglerade i många länder i världen.30 Förutom den totala mängden växtsteroler som får tillsättas, är också vissa enskilda steroler reglerade. Detta ställer krav på analysmetodernas noggrannhet.

Benecol-margarinet producerat av Raisio Oyj var det första funktionella livsmedlet som introducerades till den europeiska marknaden år 1995.30 Som en följd av detta antogs regleringen Novel Food Regulation, EC 258/97, av det Europeiska parlamentet och rådet år 1997 för att reglera funktionella livsmedel i Europeiska unionen (EU). Regleringarna berör nya livsmedel och ingredienser som inte tidigare har använts i livsmedel inom EU, samt användningen av nya sorters processer i tillverkningen.30,31 År 2015 förbereddes en uppdaterad rapport som trädde i kraft år 2017, och upphävde således den förra.2

År 2000 godkände Europeiska kommissionen sterolestrar som en livsmedelsingrediens, och godkände dess användning i margariner. År 2004 godkändes användningen av sterolestrar samt växtsteroler och -stanoler i ett antal övriga livsmedel. Mängden växtsteroler reglerades enligt produkt, och produkterna måste också tillverkas så att det är lätt för konsumenten att portionera livsmedlet så att en portion innehåller tre eller ett gram tillsatta växtsteroler. Också hälsopåståenden som livsmedlen får ha är reglerade.30

Utöver mängden steroler per produkt, specificerades också kompositionen av de använda växtsterolerna. Renheten av koncentrerade växtsteroler ska vara minst 99 %, ifall de är extraherade från andra källor än ätbara växtoljor. År 2017 gavs en rapport ut med följande gränsvärden för sterolkompositionen: sitosterol < 81 %, sitostanol < 35 %, kampesterol < 40 %, kampestanol < 15 %, stigmasterol < 30 %, brassikasterol < 3,0 %, samt övriga steroler och stanoler < 3,0 %.32

I Förenta staterna har United States Food and Drug Administration (FDA)33 hand om regleringarna. De använder sig av ett tillvägagångssätt som kallas för GRAS (Generally Recognized as Safe) där aktörer själv ska skicka in en utredning om att en ingrediens som skall användas för livsmedel är säker för ändamålet.30

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______2.1.4 Analys av växtsteroler

Steroler finns naturligt i växter, och många analysmetoder är gjorda för analys av svårare matriser än koncentrerade fria växtsteroler. I och med att livsmedel kan berikas med växtsteroler finns det också standardiserade officiella metoder för analysen.34–37 Steroler är fettlösliga och kan extraheras som lipider från olika matriser. Ifall den totala sterolmängden i form av fria steroler vill bestämmas, kan basisk och/eller sur hydrolys användas för att frigöra sterolerna från sterolestrar och sterolglykosider.3,7–9,34,38 Om koncentrationerna för de specifika konjugaten vill bestämmas, kan fastfasextraktion användas för separationen.39,40

De flesta metoderna för att analysera växtsteroler baserar sig på gaskromatografiska metoder. Utöver dessa har vätskekromatografiska metoder med varierande detektorer använts,41,42 också för analys av konjugerade växtsteroler. I dessa metoder behövs konjugaten inte spjälkas, vilket är den främsta fördelen.43 Sekundärt har växtsteroler också mätts ibland annat olivolja med FT-NIR-spektroskopi.12

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______2.2 Gaskromatografi

Gaskromatografi (GC) är en analysmetod som används brett inom kemiska industrin och forskning av organiska föreningar. Gaskromatografi möjliggör en snabb separation av flyktiga föreningar i en blandning. Gaskromatografi kan användas både för kvalitativa och kvantitativa analyser. Tekniken utvecklas fortfarande; instrumenten blir mindre och analyserna snabbare.

2.2.1 Instrumentet

Instrumentet som används för separeringen är en gaskromatograf. Den består förenklat av ett inlopp där provet introduceras, en temperaturkontrollerad ugn med separationskolonnen, och en detektor. Det finns flera olika kolonner för olika föreningar och tillämpningar, och likaså flera alternativ till detektorer, av vilka en mycket vanlig är flamjoniseringsdetektorn (FID). En schematisk bild över ett GC-FID-instrument presenteras i Figur 3.44

Bärgasen utgör den rörliga fasen av det kromatografiska systemet. Bärgasen förflyttar provet från injektorn genom kolonnen till detektorn. För att få reproducerbara kromatogram måste flödeshastigheten vara konstant, alltså krävs en flödesstabiliserare i instrumentet. Ugnen där kolonnen befinner sig håller temperaturen konstant, och möjliggör också utnyttjandet av temperaturprogram i separationen av komponenterna. För reproducerbara analyser krävs en noggrann kontroll över temperaturen.

INLOPP DETEKTOR

GAS

KOLONN

Figur 3. En schematisk figur över ett GC-FID-instrument. Reglerad mängd gas går in i injektorn där också provet injiceras. Separationen sker i kolonnen och föreningarna detekteras an efter i flamjoniseringsdetektorn.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Injektionen är ett av de viktigaste skedena i gaskromatografisk analys, och påverkar resultatet och kvaliteten av analysen. För att resultaten ska vara reproducerbara måste introduceringen av provet ske på samma sätt i varje analys. I nya instrument sker introduceringen av provet automatiserat, vilket ger bättre precision än manuell injektion. Automatiseringen möjliggör också kontinuerliga analyser dygnet runt. Injektionerna görs med en mikrospruta i volymer i µl skala.10 Numera finns det tre vanliga inlopp; OCI (eng. on- column injection), PTV (eng. programmable temperature vaporization) och split/splitless inloppet. Split/splitless-inloppet kan användas som två olika injektionssätt, och PTV inloppet har ännu fler injektionsmöjligheter. Alla injektionssätt och inlopp har för- och nackdelar, och valet mellan dem beror på analysmetoden och det önskade resultatet. Tabell 4 presenterar kort i hurdana applikationer de olika injektionsmetoderna är fördelaktiga, samt för- och nackdelar.45

I det här arbetet användes ett split/splitless-inlopp med splitinställningen för injektionen av prov. En schematisk figur över ett splitinlopp är presenterat i Figur 4. Till skillnad från splitlessinställningen där hela provvolymen injiceras, styrs en del av provet bort i splitinställningen. Hur mycket det är, alltså splitförhållandet, kan modifieras enligt koncentrationen av provet. Injektionstemperaturen i split/splitless inloppet måste vara så högt att alla komponenter förgasas, och temperaturen är ofta lite högre jämfört med kolonnen. I split/splitless-inloppet sker injektionen i en injektionskammare med en liner av glas. Här förgasas provet och blandas med bärgasen.10,46 Linern är ett glasrör med en inre diameter av 2–4 mm och en längd på några centimeter. Det finns ett stort sortiment med olika liners, de kan vara strypta på ett eller fler ställen, innehålla glasull för effektivare förgasning samt för att fånga orenheter, och dimensionerna kan variera beroende på instrumentet.47,48 Med linern förhindras kontakt mellan provet och instrumentets metalldelar, som kunde katalysera provets sönderfall. Ifall det finns icke-flyktiga orenheter i provet kan de fastna i linern, vilket förlänger kolonnens livslängd. Kolonnen börjar i botten av linern dit gasflödet i inloppet styr provet, enligt det bestämda splitförhållandet. Resten av provet ventileras bort som avfall.46

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Tabell 4. Gaskromatografiska injektionsmetoders användning samt för- och nackdelar.45 Injektions- Användning Fördelar Nackdelar metod Lämpar sig för prover Väldigt reproducerbar Kolonnen måste bytas OCI som har hög kokpunkt, oftare, i och med att också som är termiskt labila Provet injiceras rakt i alla orenheter injiceras och som är reaktiva i kolonnen: hela inloppet provvolymen introduceras, Kolonner med mindre inre alltså sker ingen diameter än 0,25 mm Proven kan inte vara diskrimination av måste injiceras manuellt, alltför koncentrerade, då komponenter och mindre än 0,53 mm hela injektionsvolymen kräver en spruta med går in i kolonnen Provet kan injiceras i låga tunnare ända som inte är temperaturer lika robust Lämplig för utspädda Temperaturen i inloppet Inloppet är komplext, PTV prover och spåranalys kan modifieras, och vilket medför större krav injektionen sker i låg på metodutveckling, och Stora volymer kan temperatur, varefter optimeringen kan vara injiceras i och med det provet snabbt förgasas krävande kalla inloppet, vilket förbättrar detektionen. Stora provvolymer kan Instrumenteringen kan Också mindre stabila injiceras, över 100 µl vara dyr prov kan analyseras Mångsidig, många möjligheter Lämplig för Prover med höga Detektionsgränsen är låg, Split koncentrerade prover, koncentrationer kan alltså måste provet vara då bara en del av analyseras, och relativt koncentrerat provvolymen når splitförhållandet kan kolonnen. Går bra ihop modifieras enligt behov Provpreparering är viktig med kolonner med liten för att koncentrera provet inre diameter Snabb injektion möjliggör snabba separationer Passar främst för stabila Stabila prover prover, då injektionen sker Relativt lättanvänd, och i het Injektionen är snabb, och med split/splitless- och används i snabba inloppet kan båda Diskriminering GC-separeringar injektionssätten utnyttjas Lämplig för prov med Låga koncentrationer kan Injektionen är Splitless lägre koncentrationer detekteras då långsammare än i split, och spåranalys, då injektionsvolymen är vilket kan leda till en nästan hela ganska hög, omkring 1 µl större grad termisk injektionsvolymen riktas degradering i den heta till kolonnen Relativt lättanvänd, och i linern. Lämpar sig alltså och med split/splitless- främst för stabila prover Stabila prover inloppet kan båda injektionssätten utnyttjas

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

De främsta nackdelarna med splitinjektionen är möjlig diskriminering av vissa provkomponenter gentemot andra, samt utmaningar med linjäriteten. Diskriminering kan uppstå i alla heta injektioner, i och med att provet hettas upp på en stor yta i linern, och ändan av sprutan hettas upp i injektionen. Det kan orsaka att vissa föreningar förgasas i olika proportion jämfört med andra. Ickelinjär-splitting orsakas av att vissa provkomponenter adsorberas i linern eller i kontaminationer där, vilket leder till att ett prov med felaktig komponentfördelning når kolonnen. För att minska på diskrimination och ickelinjäriteten är temperaturen i inloppet viktigt att tänka på i metodutvecklingen. Geometrin och renheten av linern påverkar också funktionen.45,49

Ventilering av septumet Bärgas leds in

Överlopps prov ventileras bort enligt det bestämda splitförhållandet

Det förgasade provet leds till kolonnen

Figur 4. En schematisk figur över ett splitinlopp. Provet injiceras genom ett septum in i en liner av glas.

Gaskromatografins grundidé baserar sig på föreningarnas interaktion med den stationära fasen, som optimalt orsakar en avvikande retention av alla enskilda föreningar i blandningen. Valet av stationär fas och kolonn är således avgörande för en lyckad separation och analys.50 Kolonnen befinner sig i en ugn, vars temperatur kan noga kontrolleras mellan ungefär 35 °C till 400 °C. Vissa GC-metoder utnyttjar temperaturprogram där ugnen hettas upp, med upp till 20 °C per minut.46 Kolonnen utgör den stationära fasen av det gaskromatografiska systemet, och där sker separationen av komponenterna. Tidiga instrument hade packade kolonner, som bestod av rör fyllda med packningsmaterial. Kapillärkolonner med smält silika utvecklades i slutet av 70-talet, och är nuförtiden de mest använda kolonnerna i gaskromatografiska tillämpningar. De har flera fördelar jämfört med packade kolonner, bland annat bättre separation, högre upplösning (resolution) och kortare analystider.51 Dessa i mitten öppna kolonner är gjorda av smält silika som kolonnmaterial med ett yttre skikt av en

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______polyamidpolymer för att ge struktur. Den stationära fasen är belägen som ett ytskikt på insidan av kolonnen, ofta i tjocklekar mellan 0,1–1 µm. Den inre diametern varierar mellan 0,10 mm och 0,53 mm i de flesta kolonnerna. Kolonner med större inre diameter har ofta en tjockare stationär fas. Längden på kapillärkolonnerna brukar variera mellan 5 och 60 meter, men kan också vara längre än så i krävande separeringar. Kolonnerna måste vara termiskt stabila, i och med att vissa metoder kräver att temperaturen höjs till över 300 °C för att alla föreningar i provet ska förgasas.10,46

Det finns ett antal alternativ till detektorer i gaskromatografi. Flamjoniseringsdetektorn (FID) är en av de vanligaste, och användes i det här arbetet. Andra exempel på detektorer inkluderar en masspektrometer (MS), som är användbar i identifikationen av föreningar, kväve-fosfor-detektorn (eng. nitrogen-phosphorus detector, NPD), flamfotometriska detektorn (eng. flame photometric detector, FPD), och atomemissionsdetektorn (eng. atomic-emission detector, AED). Dessa detektorer, liksom FID, är destruktiva, alltså kan de separerade komponenterna inte tas till vara efter analys. Icke-destruktiva detektorer som kan användas i GC inkluderar termiska konduktivitetsdetektorn (eng. thermal conductivity detector, TCD), elektroninfångnings detektorn (eng. electron capture detector, ECD) och fotojoniseringsdetektorn (eng. photo ionization detector, PID).10,46

Flamjoniseringsdetektorn Flamjoniseringsdetektorn (FID) är en brett använd detektor för gaskromatografiska tillämpningar och en av de populäraste metoderna för att detektera organiska föreningar. FID har en hög sensitivitet och linjäritet, den är robust, och passar till alla storlekars kolonner.10,46

Eluaten, alltså de i kolonnen separerade fraktionerna av provet, blandas i detektorn med vätgas och leds till en låga som bildas av förbränning av väte och luft. Förbränningen av eluaterna leder till att joner bildas och samlas på elektroderna i detektorn, och bildar en ström som utgör signalen. Ju mer det finns av en förening, desto fler joner bildas och signalen blir starkare. Av signalerna bildas ett kromatogram som beskriver mängden ström mot tid. Mellan pikarna i kromatogrammet passerar endast bärgasen genom lågan, och detta bildar baslinjen av kromatogrammet.10,46 FID är en massasensitiv detektor. Pikens area beror på antalet joner som bildas i förbränningen. Hastigheten med vilken föreningarna är matade i lågan påverkar pikens form; om flödeshastigheten är snabb bildas smala och höga pikar, medan långsam flödeshastighet ger breda och lägre pikar. Den totala arean av pikarna hålls

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

ändå densamma. Således kan kromatogram som är erhållna med olika flödeshastigheter jämföras med varandra.46

Ett högt flöde av luft behövs i detektorn för att hålla lågan brinnande. Temperaturen i detektorn måste vara tillräckligt hög så att vatten och andra föreningar med hög kokpunkt inte kondenserar i detektorn. Kondensation i FID kan minska sensitiviteten. Vatten detekteras inte i detektorn, vilket möjliggör analyser av prov som innehåller vatten (ifall kolonnen klarar det) utan att breda pikar påverkar kvaliteten av kromatogrammet. Det att FID inte detekterar vatten är en bra egenskap också för att det är svårt att hålla gaser och lösningsmedel helt vattenfria.10,46 Ett luftflöde, make-up-flödet, i detektorn hjälper att snabbt förflytta föreningarna från kolonnen till lågan. Det här minskar på breddningen av signalerna (eng. band broadening), vilket förbättrar upplösningen och ökar pikarnas höjd, som i sin tur förbättrar signal/brusförhållandet (eng. signal to noise ratio).46

2.2.2 Gaskromatografisk teori

Separation och temperatur Separationen av föreningarna börjar då blandningen når kolonnen. Föreningarna reagerar inte med bärgasen, och efter injektionen har de två alternativ; antingen rör de sig framåt i kolonnen med bärgasens hastighet, eller adsorberar till den stationära fasen och bromsas. Summan av tiden i den mobila fasen och tiden i den stationära fasen utgör föreningarnas retentionstid (tR). Retentionstiden är den tid som det tar för en förening att eluera från början till slutet av kolonnen. Retentionsvolymen (VR) däremot beskriver den volym av bärgas som krävs för att eluera en specifik förening. Retentionen påverkas av temperaturen i systemet, den rörliga fasens hastighet och den stationära fasens typ.10

Retentionen kan också beskrivas med retentionsfaktorn k, enligt

푡푅 − 푡푀 푘 = (1) 푡푀 där tR är retentionstiden och tM är hold up-tiden, alltså tiden det tar för bärgasen att flöda från början av kolonnen till slutet, utan att retenteras alls.

Upplösningen (Rs) beskriver graden av separering mellan två pikar i kromatogrammet. Upplösningen kan beskrivas med ekvationen

2훥푡 푅 (2) 푅푆 = 푤퐴 + 푤퐵

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______där ΔtR är skillnaden mellan pikarnas retentionstid, och wA och wB är de respektive pikarnas breddar på baslinjen. Desto högre värdet blir, desto bättre är upplösningen. Upplösningen kan förbättras antingen genom att öka mellanrummet mellan pikarnas toppar, eller genom att erhålla smalare pikar. En bra upplösning möjliggör en noggrannare kvantifiering av de enskilda föreningarna.10 Figur 5 presenterar upplösningen mellan två pikar i tre olika gaskromatografiska metoder. I metod a) uppnås ingen upplösning mellan pikarna, alltså överlappar de helt. I metod b) kan en separation ses, men pikarna överlappar fortfarande delvis. Metod c) har den bästa upplösningen med ingen överlappning av pikarna.

Separationen mellan pikar kan också beskrivas med separationsfaktorn (α), som beskriver den relativa retentionen mellan två pikar, A och B, enlig ekvationen

푘퐵 훼 = (3) 푘퐴 där kA är retentionsfaktorn för den första eluaten och kB för den senare eluaten. Desto högre separationsfaktorn är, desto längre är avståndet mellan pikarna och desto bättre upplösning har det erhållna kromatogrammet.46

+ Deltaa)-5-Avenasterol b) c)

Figur 5. Tre exempel som beskriver olika grad av upplösning. I a) överlappar två pikar, alltså finns det ingen upplösning, i b) kan en separation ses, men pikarna överlappar fortfarande och i c) uppnås en bra upplösning.

Temperaturen utgör en viktig roll i gaskromatografi. Genom att öka temperaturen i systemet ökar föreningars energi vilket minskar de intermolekylära interaktionerna med den stationära fasen. Det här leder till att föreningarna flyttas aktivare till den rörliga fasen, och eluerar snabbare från kolonnen. Ökad temperatur ger alltså snabbare retentionstid, och kortare analystid, men utan retention finns ingen upplösning. Ifall temperaturen genast i början är så hög att alla föreningar är konstant i den rörliga fasen eluerar alla samtidigt. Å

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______andra sidan, ifall temperaturen är alltför låg eluerar inga föreningar. Det gäller att hitta en lämplig temperatur för att balansera tiden för separationen med tillräcklig upplösning.46

Stationära fasen Separation erhålls genom den varierande retentionen av komponenterna i kolonnen, vilket påverkas av den stationära fasens typ och dess varierande interaktion med de olika komponenterna. Det finns ett stort sortiment av olika stationära faser, beroende på sorten av förening som skall separeras. Vanligtvis består stationära fasen av en polysiloxan polymer kovalent bunden till silikaväggarna i kolonnen. Vissa kolonner utnyttjar intermolekylära interaktioner som ger separation på basen av flyktighet, medan andra kolonner utnyttjar dipol-dipol-interaktioner och vätebindningar, alltså ger en högre retention till polära föreningar.46 Ett exempel på en stationär fas, 5 % difenyl – 95 % dimetylpolysiloxan, presenteras i Figur 6.

Förutom valet av stationär fas, påverkar också kolonnens dimensioner separeringen. Dimensionerna är den inre diametern, längden på kapillärkolonnen, samt den stationära fasens tjocklek. Längden påverkar analystiden och upplösningen. Kortare kolonner möjliggör snabba analyser, medan långa kolonner har en hög upplösning. Den stationära fasens tjocklek påverkar kolonnens kapacitet; tjockare faser har högre kapacitet och klarar av högre provmängder, medan de mindre möjliggör en snabbare analys med bättre upplösning.10

Figur 6. Exempelstruktur för en stationär fas, 5 % difenyl - 95 % dimetylpolysiloxan.

Kolonnens stationära fas påverkar separationen både genom val av själva fasen, tjockleken på fasen, och den inre diametern av kolonnen. Fasförhållandet (β) används för att jämföra kolonner sinsemellan, och definieras enligt ekvationen

푟 훽 = 2푑푓

där r är kolonnens radie och df är den stationära fasens tjocklek. Vanligtvis används kolonner vars β-värde ligger mellan 100 och 400. För att hållas inom ramen av dessa (4)

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______värden används sällan kolonner med liten inre diameter och tjock stationär fas. Tjockleken på den stationära fasen påverkar också kolonnens kapacitet. Då kapaciteten är högre kan en större mängd prov injiceras utan överlastning, och med tillräcklig upplösning. Tjockleken leder också till större retention.46

Rörliga fasen Bärgasen är den rörliga fasen i systemet, och förflyttar komponenter vidare genom kolonnen. Bärgasen ska vara en gas som inte reagerar med provet. De vanligaste bärgaserna är kvävgas, helium och vätgas. Bärgasen rör sig genom systemet med en noga kontrollerad hastighet, som också påverkar upplösningen. Ifall bärgasens hastighet försnabbas för mycket ökar höjden av teoretiska botten (eng. plate height, HEPT), vilket leder till försämrad upplösning. I gaskromatografi är effekten ändå relativt låg, i och med det höga antalet teoretiska bottnar och att separationsfaktorer ofta är stora.46

Skillnaderna i bärgasernas egenskaper förklaras med deras viskositet. Viskositeten påverkar lösningars diffusionsförmåga i gaserna. Kvävgas har den högsta viskositeten som gör att diffusionen av ämnen sker långsammare än i de två andra gaserna. En snabb diffusion av de analyserade ämnena i den rörliga fasen är viktig för att minska bandbreddning (eng. band broadening).46

Bärgasens hastighet uttrycks ofta som flödeshastigheten (ml/min). Ett alternativt sätt att utrycka hastigheten för flödet är linjär hastighet (eng. linear velocity) (enhet cm/s). Att uttrycka hastigheten på flödet med linjär hastighet är fördelaktigt i och med att olika metoder kan jämföras även om dimensionerna på kolonnen är olika, medan flödeshastigheten är beroende på kolonnens dimensioner.46 Ekvationerna för beräkning av linjär hastighet och flödeshastighet ges nedan.

퐿 (5) 푢(푐푚/푠) = 푡푀 (6) 퐹(푚푙⁄푚푖푛) = 60휋푟2푢

där u är linjär hastighet, L är kolonnens längd i cm, tM är hold up-tiden, F är flödeshastigheten, och r är kolonnens inre radie.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______2.2.3 Gaskromatografisk analys av växtsteroler

Efter varierande provprepareringar beroende på matrisen har många gaskromatografiska metoder för analys av växtsteroler liknande drag. Många beskriver en kvantitativ metod med 5β-kolestan-3α-ol som intern standard, och derivatisering före analys.3–9,34

Derivatisering Det krävs att de analyserade föreningarna är flyktiga för att kunna analyseras med GC, och därför måste vissa föreningar derivatiseras före analys. Derivatiseringen gör föreningen mer flyktig, ökar termiska stabiliteten, och förbättrar dessutom pikformen och responsfaktorn, vilket underlättar kvantifieringen. Alternativ på derivatiseringsreaktioner är bland annat silylering, alkylering och acylering. Val av typ beror på föreningarna man jobbar med.1,10

I analys av växtsteroler används oftast silylering, där sterolernas hydroxylgrupp reageras till en trimetylsilyleter. Som exempel presenteras silylering av sitostanol i Schema 1. Silylering är vanlig speciellt bland alkoholer. Förutom själva silyleringsreagenset (till exempel BSTFA) används ofta en syra (till exempel TMCS) som katalysator. Ett lösningsmedel, som till exempel pyridin, brukar också användas för att reagera med de sura sidoprodukterna. Ibland krävs uppvärmning för att försnabba derivatiseringsreaktionen. Ifall reaktionen inte hinner bli färdig finns det både derivatiserade och icke-derivatiserade föreningar i blandningen, vilket försvårar tolkningen av kromatogrammet. Därför brukar ett överskott av derivatiseringsreagens användas för att köra reaktionen framåt. Det betyder att den kromatografiska metoden måste klara av att separera derivatiseringsreagensen från de egentliga föreningarna.1,10

Schema 1. Silylering av sitosterol.

Interna standarder För att utföra en kvantitativ analys med GC är användning av en eller flera interna standarder ett bra alternativ. Interna standarder ska vara föreningar med liknande struktur som de man vill analysera. Retentionstider ska vara nära de analyserade föreningarna, och upplösningen

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______ska vara bra och piken får inte överlappas. Renheten för standarder ska vara hög, och de får inte reagera med provkomponenter. Interna standarden ska tillsättas i provet i tidigt skede, före möjliga derivatiserings- eller andra reaktioner. Möjliga variationer i injektionen sker både till provet och den interna standarden, och förhållandena hålls samma.10,46

I växtsterolanalyser har 5β-kolestan-3α-ol använts som intern standard i nyare metoder.3,7–9 Den lämpar sig i och med att strukturen liknar den för växtsteroler, men den eluerar tidigare. 5β-Kolestan-3α-ol förekommer heller inte naturligt. Även andra föreningar har använts, men de har brister. Bland dessa interna standarder finns föreningar som kan vara förekomma naturligt i proverna, som till exempel kolesterol och 5α-kolestan-3β-ol.38,53 Dessa har dessutom retentionstider som är nära de övriga växtsterolerna, vilket riskerar överlappning av pikar. Strukturellt sett passar dessa två dock som interna standarder. Också 5α-kolestan och betulin har använts som interna standarder i sterolanalyser.54,55 Dessa har en mer avvikande struktur från växtsterolerna jämfört med de ovannämnda. Betulin har två hydroxylgrupper och en lite avvikande kolstruktur, medan 5α-kolestan inte har alls någon hydroxylgrupp. Heteroatomer ger ingen signal i FID, men om analysblandningen silyleras skiljer sig massan av analyterna från den interna standarden ytterligare. Ifall 5α-kolestan används kunde prov ändå analyseras utan silylering, vilket ger mer liknande strukturer.56

Figur 7. Exempel på interna standarder som har använts i växtsterolanalys.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Teoretiska korrektionsfaktorer FID ger en respons till alla organiska föreningar som brinner i lågan, och signalen är proportionell till antalet kolatomer i föreningen. Men fastän två olika pikar i ett kromatogram har samma areor, kan man inte direkt dra slutsatsen att de har samma koncentration. När föreningen innehåller heteroatomer (ofta syre eller kväve) är signalen inte mera proportionell i och med att heteroatomerna inte ger någon FID-respons. Då minskar alltså den analyserade föreningens respons relativt till en möjlig intern standard. Relativa responsfaktorer anges ofta som effektiva kolnummer (eng. effective carbon number, ECN). Responsfaktorer kan vara nödvändiga att bestämma i vissa fall.10,46

I och med att FID-responsen beror på kolnummern ska olikheter mellan föreningarnas massa tas i beaktande i kvantitativ analys. Ett sätt är att göra kalibreringskurvor av alla föreningar i jämförelse med den använda interna standarden. Det kräver dock en hel del arbete och tid, och det finns ofta inte rena föreningar att köpa. Vissa matriser har ett så stort antal olika komponenter, att det tids- och arbetsmässigt inte gäller att experimentellt bestämma responsen till var och en av dem. Genom att använda teoretiska korrektionsfaktorer kan föreningarnas massor tas i beaktande utan att behöva göra experimentellt arbete. För bestämningen av dessa krävs det att föreningarnas strukturer är kända. Ett flertal växtsterolers teoretiska korrektionsfaktorer har tidigare blivit beräknade relativt till interna standarden 5β-kolestan-3α-ol, av vilka några presenteras i Tabell 5. Vissa metoder använder inte korrektionsfaktorer, troligen för att skillnaderna mellan växtsterolerna är så små att de inte skulle påverka resultaten betydligt.52

Tabell 5. Teoretiska korrektionsfaktorer för några steroler relativa till interna standarden 5β-cholestan-3α-ol.52 Namn Molekylformel Teoretisk korrektionsfaktor

5β-Kolestan-3α-ol (ISTD) C27H48O 1,0000

Kolesterol C27H46O 0,9956

Brassikasterol C28H46O 0,9887

Kampesterol C28H48O 0,9930

Kampestanol C28H50O 0,9972

Stigmasterol C29H48O 0,9864

Sitosterol C29H50O 0,9905

Sitostanol C29H52O 0,9925

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Beräkningar I kvantitativa analyser beräknas olika föreningars halter från kromatogrammet med hjälp av en intern standard. Teoretiska korrektionsfaktorer kan tas i beaktande i beräkningsskedet i vissa metoder. Torrheten av växtsterolproverna kan mätas och beaktas. Som exempel presenteras beräkningsproceduren för växtsterolanalys som använder interna standarder, där individuella sterolhalter i g/100 g beräknas enligt7 (7)

퐴푆 × 푚푆푇퐷 × 100 푆푡푒푟표푙푖 = 퐴푆푇퐷 × 푚푆 där

퐴푆 = arean för sterolsignalen i kromatogrammet

퐴푆푇퐷 = arean för interna standardpiken i kromatogrammet

푚푠 = mängd prov i vialen (mg)

푚푆푇퐷 = mängd intern standard i vialen (mg)

I gaskromatografisk analys av växtsteroler används en intern standard. Mängden av provet och den interna standarden kan räknas enligt

푚푆푉 × 푉푆,푝푖푝푒푡푡푒푟푎푑 (8) 푚푆 = 푉푆,푡표푡푎푙 där

푚푆푉 = mängden uppvägd prov

푉푆,푝푖푝푝푒푡푒푟푎푑 = volymen pipetterad provlösning

푉푆,푡표푡푎푙 = totala volymen provlösning

Då mängden intern standard beräknas ska dess renhet tas i beaktande. Detta görs genom att multiplicera dess renhet med den uppvägda mängden intern standard. Renheten kan analyseras med GC.7 För att hålla den interna standarden torr rekommenderas den förvaras i en exsickator.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______2.2.4 Utveckling av gaskromatografiska metoder

Utveckling av gaskromatografiska metoder underlättas ifall det finns befintliga metoder som man kan basera den nya metoden på. Ifall separationen i de befintliga metoderna redan är acceptabel, kan analysen ofta göras snabbare, då snabba analyser har flera fördelar.57 En självklar fördel är att spara tid, men snabbare analyser kan också möjliggöra nya användningsområden. Snabbare GC-analyser ökar på effektiviteten, och möjliggör att fler analyser kan utföras på kortare tid. Prover kan analyseras i duplikat, vilket kan ge mindre fel, och möjliga problem med instrumentet kan upptäckas snabbare. Också metodutvecklingen blir snabbare. För riktigt snabba GC-analyser krävs det ändå mycket av instrumentet.10

Sätt att försnabba analyserna inkluderar bland annat användning av kortare kolonner, försnabba bärgasens flödeshastighet, snabbare temperaturökning i temperaturprogram, användning av vätgas som bärgas, och använda en kolonn med mindre inre diameter och/eller tunnare stationär fas. För snabba flödeshastigheter är användning av vätgas bäst, och temperaturprogram kan lätt modifieras. De snabbaste temperaturprogrammen är de isotermiska, i och med att instrumentet då inte behöver ändra temperatur mellan körningar.10,57 Försnabbandet av en metod är en kompromiss mellan andra delar av analysen, så som resolution och kapacitet, och det gäller att hitta en balans mellan dessa.57

Det är ändå inte bara GC-programmets analystid som påverkar den totala tiden det tar för att erhålla resultatet. Till exempel provprepareringen kan utgöra en stor del av den totala tiden, men också faktorer som nedkylning av instrumentet (i temperaturprogram) och rapportering kan beaktas i den totala tiden. Om någon annan del i processen är väldigt långsam, påverkar den snabbare analystiden bara marginellt på den totala tiden.57

Ett sätt att optimera befintliga metoder är via metodtranslation (eng. method translation). Det innebär att befintliga metoder och vissa av deras parametrar kan ”översättas” så att metoden blir snabbare och effektivare, men att föreningarnas elueringsordning hålls densamma. Agilent Technologies erbjuder ett program58 som kan användas för ändamålet. Parametrar som lämpar sig för metodtranslation är kolonndimensioner, bärgasens sort, hastighet och tryck, samt proportionella ändringar i temperaturprogrammen och tider för temperaturplatåer. Parametrar som inte kan ”översättas” är ändringar i den stationära fasens typ och fasförhållandet, samt utgångstemperaturer och platåtemperaturer.57

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______2.3 FT-NIR-spektroskopi

Fouriertransform-närinfrarödspektroskopi (FT-NIR-spektroskopi) mäter absorbans i det närinfraröda området, ca 13000–4000 cm-1.59 Analytiska fördelar med NIR-spektroskopi inkluderar dess snabbhet, att ingen provpreparering behövs, att den är icke-destruktiv, och att både kvalitativa och kvantitativa analyser kan utföras.60 NIR-spektroskopiska applikationer började först användas inom jordbrukssektorn för att bestämma fuktighet i frön. Numera används NIR-spektroskopi inom flera branscher, bland annat för analys och autentisering av livsmedel och inom läkemedelsbranschen.61

Det infraröda området kan delas in i tre delar: fjärrinfraröd (FIR), mellaninfraröd (MIR) och närinfraröd (NIR). NIR-området befinner sig närmast det visuella området, och har den högsta energin.61 FIR-området (400–100 cm-1)59 har lägst energi, och absorberas av tyngre atomer, så som vissa oorganiska och organometalliska föreningar.61 MIR-spektroskopi (4000– 400 cm-1)59 är en populär analysmetod inom organiska kemin, där de från mätningarna erhållna spektra innehåller skarpa band för fundamentala absorptioner.61 Dessa band kan kopplas till specifika funktionaliteter av den analyserade molekylen. Även NIR-spektroskopi används för analys av organiska föreningar, men till skillnad från MIR-spektra, består NIR- spektra av övertoner (eng. overtone) och kombinationsband (eng. combination band), som förekommer i spektra som breda band med låg intensitet och hög grad av överlappning. Dessa band kan oftast inte direkt kopplas till specifika föreningar eller funktionaliteter, och informationen som visuellt fås från ett NIR-spektra är låg, och tolkningen kräver matematiska modeller.61

Övertoner är elektronexcitationer till högre energinivåer, och förekommer som multiplar av de fundamentala frekvenserna som förekommer i MIR-området. Dessa övertoner upprepar den kemiska informationen, men med lägre intensitet för varje högre överton. Kombinationsband förekommer som följd av några varierande fenomen, bland annat som en kombination av vibrationer av övertoner av samma kemiska grupp, eller när två fundamentala band absorberar energi samtidigt. Också dessa upprepar den kemiska informationen, med låg intensitet för signalerna och överlappning.59,61

För att analysera data som fås i NIR-mätningar krävs kemometri, alltså användningen av matematik, statistik och beräkningsverktyg i kemisk analys. Kemometri möjliggör tolkningen av de överlappande banden i de erhållna spektra. NIR-spektra tolkas med hjälp av kalibreringsmodeller, till vilka det krävs någon referensmetod, som till exempel

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______gaskromatografi, för att analysera föreningarna av intresse. En tillräcklig mängd av prover över ett tillräckligt brett intervall av koncentrationer måste mätas för kalibreringen, som sedan ska valideras.61

2.3.1 FT-NIR-instrumentet

Ett FT-NIR-instrument är lätt att använda, då det sällan behövs provpreparering, och själva analysen är snabb – ett spektrum kan erhållas på ett tiotal sekunder. Instrumenten har hög precision och reproduktion av våglängder och högt signal/brusförhållande. FT-NIR-spektra påverkas av temperaturförändringar, alltså ska temperaturen hållas konstant.60 Schematiska figurer över ett FT-NIR-instrument samt en interferometer är presenterade i Figur 8.59,60,62

FT-tekniken inom NIR-analys möjliggör snabbare analyser jämfört med annan NIR- instrumentering, och samtidig detektion av flera frekvenser. Ljuskällan utstrålar i NIR- området, och strålen riktas till interferometern.60,62 I FT-NIR-spektroskopi används en interferometer med en stråldelare, som delar den inkommande strålen i hälften, av vilka den ena reflekteras tillbaka från en stationär spegel och den andra från en rörlig spegel. Strålarna kombineras igen vid stråldelaren, och interfererar enligt positionen av den rörliga spegeln. Den transmitterade strålen riktas till provet, som absorberar de till provet specifika frekvenserna av energin.59 Interferometern möjliggör att strålning på en bred skala av våglängder kan göras nästan samtidigt, och således försnabbas tiden det tar för att erhålla

INTERFEROMETER: SPEGEL LJUSKÄLLA SPEGEL RÖRLIG SPEGEL

SPEGEL LJUSKÄLLA INTERFEROMETER

STRÅLDELARE

SPEGEL PROV SPEGEL PROV

DETEKTOR Fourier- FT-NIR- DETEKTOR transform spektrum

Figur 8. Schematisk figur över ett FT-NIR-instrument samt en interferometer.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______ett spektrum. Ingen strålning filtreras heller bort, och all strålning når detektorn samtidigt.60 Vidare når strålen detektorn och ett interferogram erhålls. Informationen i interferogrammet är i tiddomänen, och det kan konverteras med hjälp av Fouriertransformation till ett NIR- spektrum i frekvensdomänen.60

2.3.2 FT-NIR-spektroskopi i analys av växtsteroler

FT-NIR-spektroskopi har använts för bestämning av totala växtsterolhalten i extra jungfruolivolja. Även modeller för bestämningen av enskilda växtsteroler (kolesterol, kampesterol, sitosterol, stigmasterol och Δ5-avenasterol) har presenterats, men till skillnad från modellen för de totala växtsterolerna var dessa inte fungerande.12 Olivoljor delas upp i kategorier enligt deras produktionssätt och kemiska sammansättning, och extra jungfruolivolja har de striktaste kriterierna. Extra jungfruolivolja innehåller flera hälsofrämjande föreningar, bland annat växtsteroler, som anses vara viktiga indikatorer av kvalitet, och kan användas för autentisering av oljorna. FT-NIR-spektroskopi kunde möjliggöra en snabb analysmetod för att försäkra autenticiteten.12 Totala sterolerna samt enskilda halter för sitosterol och Δ5-avenasterol har även bestämts i sesamolja med måttlig kvalitet på modellerna.63

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______3 MÅLSÄTTNING

Målsättningen med det här arbetet var att evaluera fyra gaskromatografiska analysmetoders lämplighet för bestämning av växtsterolhalter i koncentrerade blandningar. Många metoder presenterade i litteraturen är riktade för analys av växtsteroler i livsmedel samt oljor, men i och med att Europeiska unionen även reglerar sammansättningen för koncentrerade växtsteroler som används för att berika livsmedel, behövs noggranna analysmetoder också för dem. Sex växtsteroler är enskilt reglerade, och speciellt fokus lades på analysmetodernas förmåga att separera dessa. På basis av resultaten övervägdes ifall utveckling av nya metoder var nödvändig, speciellt med tanke på besparing av tid. Även möjligheten att använda FT- NIR-spektroskopi som en snabb analysmetod för koncentrerade växtsteroler undersöktes.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______4 EXPERIMENTELL DEL

De gaskromatografiska analyserna utfördes med två Shimadzu GC-2010 Plus instrument, av vilka en hade vätgas och den andra helium som bärgas. Kolonnerna som användes var ZB-5 kolonner av Phenomenex med stationära fasen 5 % difenyl – 95 % dimetylpolysiloxan, längderna var 30 meter, inre diametrarna 0,32 mm och fastjocklekarna 0,25 µm. NIR- analyserna utfördes med FT-NIR-instrumentet Antaris™ II FT-NIR Analyzer av Thermo Scientific. Sonden var Antaris™ II Sample Cup Spinner, som fungerar med diffusreflektans.

Från litteraturen valdes fyra metoder för analys av växtsteroler med gaskromatografi, som namngavs som metod A,7 metod B,9 metod C,3 och metod D.8 Ett och samma koncentrerade växtsterolprov analyserades med dessa fyra metoder. Tre parallella analysprov bereddes till varje analys och vägdes till 0,1 mg noggrannhet. Ett referensprov analyserades alltid i samma serie för att försäkra instrumentets korrekta funktion.

Utöver analyserna med de befintliga metoderna utvecklades nya gaskromatografiska metoder. Det gjordes genom metodtranslation med hjälp av ett program av Agilent Technologies, genom att justera temperaturprogram och flödeshastigheter i de befintliga metoderna, och genom att prova på isotermiska körningar.

De använda kemikalierna (lösningsmedel, silyleringsreagens och interna standarden) användes som sådana utan vidare behandling.

4.1 Analys av växtsteroler med gaskromatografi

4.1.1 Metod A7

Beredning av intern standardlösning Den interna standardlösningen bereddes genom att noggrant väga upp ungefär 70 mg 5β- kolestan-3α-ol i en 100 ml mätflaska. Cirka 50 ml 1-propanol tillsattes, och provet löstes upp i 30 minuter i ultrabad på 40 °C. Efter att lösningen kylts ned till rumstemperatur tillsättes 1- propanol så att den totala volymen blev 100 ml. Renheten av den interna standardlösningen bestämdes genom att överföra 500 µl av lösningen i en vial och evaporera till torrhet i ett värmeblock under kväveflöde. Provet silylerades genom tillsättning av 100 µl pyridin och 200 µl BSTFA (1 % TMCS) i 70 °C i 15 minuter. Provet analyserades med GC, där renheten var pikens area-%.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Provberedning Mellan 40 och 80 mg koncentrerat sterolprov vägdes noggrant i en 25 ml mätflaska. Provet löstes upp i cirka 15 ml tetrahydrofuran (THF) i ett ultrabad på 40 °C i 15 minuter. Lösningen läts kylas ner till rumstemperatur, varefter flaskan fylldes till rätt volym och blandades noga. 500 µl av den interna standardlösningen överfördes till ett provrör tillsammans med 500 µl av provlösningen. Proven evaporerades till torrhet i ett värmeblock på 70 °C under kväveflöde. Proven silylerades genom tillsättning av 100 µl pyridin och 200 µl BSTFA (1 % TMCS), och fick stå 15 minuter i ett värmeblock i 70 °C. De silylerade proverna överfördes till vialer och analyserades med GC. Med denna provberedning injekteras ungefär 2,6–5,3 µg steroler och 1 µg intern standard i kolonnen.

GC-parametrar Injektions- och detektionstemperaturen ställdes in på 310 °C. Splitförhållandet var 50:1 och injektionsvolymen 1 µl. Temperaturprogrammet var isotermiskt, 300 °C i 15 minuter. Bärgasen helium hade en flödeshastighet på 1,2 ml/min. Flödeshastigheterna i detektorn ställdes in på 400 ml/min för luft, 40 ml/min för väte och 30 ml/min för kväve.

4.1.2 Metod B9

Beredning av intern standardlösning Den interna standardlösningen bereddes till en koncentration på 5 mg/ml 5β-kolestan-3α-ol i toluen, genom att väga upp cirka 125 mg i en 25 ml mätflaska och blanda noggrant. Renheten av den interna standardlösningen bestämdes genom att överföra 300 µl intern standardlösning i en GC-vial tillsamman med lite natriumsulfat. Provet silylerades genom tillsats av 0,5 ml pyridin och 0,8 ml BSTFA (1 % TMCS). Provet analyserades med GC enligt parametrarna nedan, och renheten bestämdes enligt pikens area-%.

Provberedning Ungefär 100 mg växtsterolprov vägdes noggrant i ett provrör med skruvkork och löstes upp i 5 ml intern standardlösning, varefter provet blandades noga. 500 µl pyridin och 1 ml BSTFA (1 % TMCS) tillsattes i provröret som blandades ytterligare. Av det silylerade provet överfördes 300 µl i en GC-vial tillsammans med några natriumsulfat korn och 1 ml toluen, och analyserades med GC. Med denna provberedning var den i kolonnen injekterade mängden växtsteroler ungefär 3,6 µg och intern standard 0,9 µg.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

GC-parametrar Injektions- och detektionstemperaturen ställdes in på 325 °C. Splitförhållandet var 100:1 och injektionsvolymen 1 µl. Temperaturprogrammet började på 200 °C och temperaturen höjdes med 3 °C per minut till 300 °C, och hölls i 11,67 minuter. Bärgasen H2 hade en flödeshastighet på 1,5 ml/min. Flödeshastigheterna i detektorn ställdes in på 450 ml/min för luft, 40 ml/min för väte och 45 ml/min för kväve.

4.1.3 Metod C3

Beredning av intern standardlösning Den interna standardlösningen bereddes till en koncentration på 5 mg/ml 5β-kolestan-3α-ol i kloroform genom att väga upp cirka 125 mg i en 25 ml mätflaska, varefter lösningen blandades noggrant. Renheten av den interna standardlösningen bestämdes genom att överföra 500 µl till en GC-vial, evaporera till torrhet och silylera, varefter provet analyserades med GC. Renheten var den interna standardens pikarea i procent.

Provberedning 500 µl av den interna standardlösningen överfördes i ett provrör och evaporerades till torrhet i ett värmeblock på 70 °C under kväveflöde. 25 mg av växtsterolprovet vägdes noggrant och tillsattes i provröret med den interna standarden, varefter den löstes upp i 2,5 ml kloroform. Lösningen blandades noggrant och 200 µl överfördes i en GC-vial tillsammans med 250 µl pyridin och 250 µl BSTFA (1 % TMCS). Proverna silylerades i 15 minuter i ett värmeblock på 70 °C före analysering med GC. Med denna provberedning injekterades ungefär 2,9 µg växtsteroler och 0,3 µg intern standard i kolonnen.

GC-parametrar Injektions- och detektionstemperaturen ställdes in på 290 °C. Splitförhållandet var 25:1 och injektionsvolymen 1 µl. Temperaturprogrammet började på 250 °C i 60 minuter, varefter temperaturen höjdes med 15 °C per minut till 265 °C och hölls i 5 minuter. Sedan sänktes temperaturen till 250 °C och hölls i 3 minuter. Bärgasen H2 hade en flödeshastighet på 1,0 ml/min. Flödeshastigheterna i detektorn ställdes in på 400 ml/min för luft, 30 ml/min för väte och 30 ml/min för kväve.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______4.1.4 Metod D8

Beredning av intern standard Den interna standardlösningen bereddes till en koncentration på 5 mg/ml 5β-kolestan-3α-ol i toluen, genom att väga upp ungefär 250 mg i en 50 ml mätflaska och blanda noggrant. Renheten av den interna standardlösningen bestämdes genom att överföra 300 µl intern standardlösning i en GC-vial tillsamman med några natriumsulfat korn. Provet silylerades genom tillsats av 0,5 ml pyridin och 0,8 ml BSTFA (1 % TMCS). Provet analyserades med GC enligt parametrarna nedan, och renheten bestämdes enligt pikens area-%.

Provberedning Cirka 50 mg växtsterolprov vägdes noggrant i ett provrör med skruvkork och löstes upp i 5 ml intern standardlösning, varefter provet blandades noga. 0,5 ml pyridin och 1 ml BSTFA (1 % TMCS) tillsattes i provröret som blandades ytterligare. Av det silylerade provet överfördes 300 µl i en GC-vial tillsammans med lite natriumsulfat och 1 ml toluen, och analyserades med GC. Med den här provberedningen var den ungefärliga injektionsmängden i kolonnen 1,8 µg växtsteroler och 0,9 µg intern standardlösning.

GC-parametrar Injektions- och detektionstemperaturen ställdes in på 290 °C. Splitförhållandet var 25:1 och injektionsvolymen 1 µl. Temperaturprogrammet började på 250 °C i 60 minuter, varefter temperaturen höjdes med 15 °C per minut till 265 °C, och hölls i 7 minuter. Sedan sänktes temperaturen till 250 °C och hölls i 3 minuter. Bärgasen H2 hade en flödeshastighet på 1,0 ml/min. Flödeshastigheterna i detektorn ställdes in på 400 ml/min för luft, 30 ml/min för väte och 30 ml/min för kväve.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______4.2 Utveckling av gaskromatografiska metoder

Utvecklingen av nya metoder gjordes med de befintliga metoderna som grund, och genom att modifiera parametrar för flödeshastigheter, tryck och temperaturprogram. Samma GC- apparatur och kolonn som för de alla andra metoderna användes. Bärgasen i alla de utvecklade metoderna var vätgas.

Provprepareringen som användes var liknande till den som användes i metod A. Utvecklingen av GC-programmet gjordes i två delar. Först användes en programvara av Agilent Technologies för metodtranslation. Tre inställningar kunde väljas emellan; hastighetsökning (eng. speed gain), translation (eng. translate) och bästa effektivitet (eng. best efficiency). Vidare provades några isotermiska program som var baserade på metod D.

Beredning av intern standardlösning Beredningen av den interna standardlösningen var densamma som i metod A. Standardlösningen bereddes till en koncentration på ungefär 0,75 mg/ml 5β-kolestan-3α-ol i 1-propanol. Renheten bestämdes genom att analysera ett silylerat prov av lösningen med GC, där pikarean motsvarade renheten, som anges i procent.

Provberedning Provberedningen gjordes liknande som i metod A, men utan uppvärmning av provet. Av växtsterolprovet vägdes 40–80 mg noggrant upp i en 25 ml mätflaska, och löstes upp i THF till volymen. Lösningen blandades noggrant, varefter 500 µl av den interna standardlösningen överfördes till provrör tillsammans med 500 µl av provlösningen. Proven evaporerades till torrhet i ett värmeblock på 70 °C under kväveflöde, varefter de silylerades genom tillsättning av 100 µl pyridin och 200 µl BSTFA (1 % TMCS). Efter att ha reagerat i 15 minuter i ett värmeblock i 70 °C överfördes de silylerade proverna till vialer och analyserades med GC. Med denna provberedning injekteras ungefär 2,6–5,3 µg steroler och 1 µg intern standard i kolonnen.

Vissa analyser gjordes genom att parallellt med provberedningen ovan också analysera prover som hade värmts upp (alltså samma som provberedningen för metod A). Genom att jämföra dessa tillvägagångssätt försäkrades att allt hade lösts upp också utan uppvärmning.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

GC-parametrar Alla metoder hade vätgas som bärgas. Injektions- och detektionstemperaturerna var 310 °C, och splitförhållandet 1:50. Injektionsvolymen var 1 µl. Modifikationerna i GC-parametrarna gjordes i två delar; genom utnyttjandet av en programvara för metodtranslation, och genom provning av isotermiska program med metod D som bas.

Agilent Technologies programvara för translation av metoder användes. Utöver bara translation kunde parametrarna också optimeras enligt hastighet och effektivitet. Translationsinställningen tillämpades på metoderna A och B, och effektivitetsinställnigen tillämpades på metoderna A, B, och D. Hastighetsinställningen användes på metoderna B och D. I dessa fall ställdes den linjära hastigheten på 60 cm/s. Till metod A gjordes ingen hastighetsoptimering i och med att programmet är kort till att börja med. De erhållna parametrarna presenteras i Tabell 6. Metoderna A-1 och A-2 motsvarar translations- respektive effektivitetsinställningarna för metod A. Metoderna B-1, B-2 och B-3 motsvarar translations-, hastighets-, och effektivitetsinsällningarna för metod B. Metoderna D-1 och D- 2 motsvarar hastighets- och effektivitetsinställningarna för metod D.

Tabell 6. GC-parametrar till optimeringar av befintliga metoderna A, B och D, som också är presenterade. Linjär hastighet Temperatur Platåtid början Temperaturökning Platåtid slut Total tid Metod (cm/s) (°C) (min) (°C/min) (min) (min)

A 31,8 300 - - - 15

A-1 45,5 300 - - - 10,5 A-2 47,9 300 - - - 10,0 B 31,1 200–300 - 3 11,67 45 B-1 29,0 200–300 - 3,4 10,3 39,6 B-2 60,0 200–300 - 7,1 5,0 19,1 B-3 42,1 200–300 - 5,0 7,1 27,3 D 30,5 250-265-250 60 15 7/3 71 D-1 60,1 250-265-250 30,5 29,5 3,6/1,5 36,6 D-2 45,2 250-265-250 40,7 22,1 4,7/2,0 48,8

Till näst provades isotermiska program utgående från metod D. Tre olika linjära hastigheter användes, 40, 50 och 60 cm/s, med temperaturerna 260 °C, 265 °C och 270 °C. Parametrarna är presenterade i Tabell 7. Flödeshastigheterna i detektorn ställdes in på 400 ml/min för luft, 30 ml/min för väte och 30 ml/min för kväve.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Tabell 7. De utvecklade isotermiska körprogrammen. Linjär hastighet Temperatur Total tid Metod (cm/s) (°C) (min) IT-1 60 260 22 IT-2 50 265 25 IT-3 50 260 29 IT-4 60 265 25 IT-5 40 265 30 IT-6 40 270 25 IT-7 50 270 25 IT-8 60 270 25

4.3 Analys av växtsteroler med FT-NIR-spektroskopi

Med sonden för diffusreflektans mättes NIR-spektrum av 16 olika växtsterolpulver, av vilka en var samma växtsterol som analyserats med GC. Antalet scans var 32. De erhållna spektrumen användes till att göra kalibreringar, som utfördes med Thermo Scientifics egna programvara tillhörande instrumentet. Som kalibreringsmodell användes PLS (eng. partial least squares). Då ljuslängden inte var konstant, användes MSC (eng. multiplicative scatter correction) för processering av spektra. Fem kalibreringsmodeller gjordes; en till summan av alla växtsteroler, och fyra till de enskilda huvudväxtsterolerna sitosterol, kampesterol, stigmasterol och brassikasterol. I och med det låga antalet prover kunde inte en valideringsmodell göras, utan i stället lämnades ett prov (växtsterolen som använts i GC- analyserna) utanför kalibreringen, och kvantifierades mot kalibreringen.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______5 RESULTAT OCH DISKUSSION

5.1 Evaluering av befintliga gaskromatografiska metoder

Fyra befintliga gaskromatografiska metoder för analys av växtsteroler användes för att analysera ett och samma koncentrerade växtsterolprov. Identifieringen av föreningarna baserar sig på litteraturen. Metoderna som använts skiljer sig i både provpreparering och GC- parametrar. Metod A, den så kallade NMKL-metoden, publicerades år 20147 och baserar sig på en metod utvecklad av Laakso år 2005.6 Metoden har tillämpats av Nordisk metodikkommitté för livsmedel (NMKL). Metod B av Clement et al. publicerades år 2010,9 och väldigt liknande provpreparering utnyttjades senare i AOCS-metoden. Metod C av Srigley och Haile publicerades år 2015,3 och deras GC-program har stått som grund för den senare utvecklade AOCS-metoden. Metod D, den så kallade AOCS-metoden, är en officiell metod av American Oil Chemist Society, publicerad år 2018.8 Bilaga 3 presenterar sammanfattande tabeller av GC-parametrar (Tabell B3.1) samt provprepareringar (Tabell B3.2).

5.1.1 Analysresultat

Analysresultaten för analysmetoderna A, B, C, och D presenteras i Tabell 8. Värdena i analysresultatstabellerna är presenterade så att en decimal använts för sterolhalten, två decimaler för standardavvikelsen (SD), och en decimal för relativa standardavvikelsen (RSD). Värdena är avrundade. Resultaten av de olika metoderna är i regel i samma storleksklass då de jämförs sinsemellan. Repeterbarheten är bra för de flesta växtsterolerna, men för föreningar med väldigt låga koncentrationer varierar resultaten mera. Speciellt metoderna A och B har i regel repeterbara resultat med låg RSD. Ett RSD-värde på under 5 % anses vara en indikator på god repeterbarhet,8 och ifall RSD är över 5 % är det markerat med rött i tabellen. Förutom de enskilda växtsterolerna presenteras även summan av alla växtsteroler som totala steroler. Också totala eluerade föreningar är inkluderade i tabellen, och med dessa menas den beräknade summan av alla i kromatogrammet detekterade pikarna jämfört med den interna standarden. Metod A identifierar färre enskilda steroler jämfört med de tre andra metoderna, och anger i stället ett intervall där pikarna ska markeras som övriga steroler, och dessa är angivna enligt det i tabellen. Växtsterolblandningen som analyserades i det här arbetet innehöll inte detekterbara mängder av de senare eluerande växtsterolerna cyckloartanol, 24-metylencycloartanol och citrostadienol, och de har därför uteslutits från resultattabellerna. Kromatogrammen är presenterade i Bilaga 1.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Tabell 8. Analysresultat av de fyra metoder som användes för att analysera samma koncentrerade växtsterolprov.

Metod A Metod B Metod C Metod D g/100 g SD RSD (%) g/100 g SD RSD (%) g/100 g SD RSD (%) g/100 g SD RSD (%) Brassikasterol 2,6 0,02 0,7 2,7 0,02 0,9 2,6 0,04 1,6 2,6 0,04 1,6 Kampesterol 25,0 0,04 0,2 25,1 0,11 0,4 24,5 0,13 0,5 24,6 0,17 0,7 Kampestanol 0,5 0,01 1,2 0,5 0,02 4,5 0,4 0,08 21,2 0,3 0,04 11,0 Stigmasterol 24,8 0,06 0,2 25,1 0,10 0,4 24,6 0,03 0,1 24,8 0,08 0,3 Sitosterol 41,5 0,05 0,1 42,1 0,17 0,4 41,1 0,15 0,4 41,2 0,26 0,6 Sitostanol 1,7 0,01 0,5 0,8 0,00 0,3 0,7 0,02 2,3 0,6 0,00 0,7 Kolesterol 0,3 0,00 0,6 0,3 0,01 3,4 0,2 0,02 6,9 0,2 0,01 4,1 Kolestanolb,d 0,0 0,01 86,7 - - - id id Id - - - Ergosterola,b,c ------0,0 0,01 12,6 24-Metylenkolesterola - - - 0,4 0,03 6,7 0,4 0,02 5,4 0,4 0,03 7,9 Klerosterola,b (+Δ5,23-Stigmastadienol) ------0,3 0,02 4,8 0,3 0,01 3,7 Stigmast-22-en-3-ola - - - 0,5 0,00 0,9 0,4 0,01 2,1 0,4 0,03 7,8 Ergost-7-en-3-ola - - - 0,4 0,02 3,8 0,3 0,08 25,5 0,3 0,06 22,0 Stigmasta-5,7,22-trien-3-ola,c,d - - - 0,4 0,01 1,6 ------Δ5-Avenasterola - - - 0,8 0,01 0,6 0,6 0,02 3,2 0,6 0,00 0,7 Stigmasta-5,24-dienol 0,5 0,00 0,5 0,5 0,01 1,6 0,4 0,02 4,7 0,4 0,02 5,7 Stigmast-7-enol 0,4 0,00 0,7 0,4 0,00 0,7 0,3 0,02 4,8 0,3 0,12 3,4 Δ7-Avenasterol 0,1 0,00 3,0 0,1 0,00 3,4 0,1 0,01 9,8 0,1 0,03 27,7 Övriga steroler 1,7 0,01 0,9 ------Totala steroler 99,0 0,12 0,1 100,1 0,46 0,5 97,0 0,52 0,5 97,1 0,58 0,6 Totala eluerade 100,1 0,14 0,1 101,3 0,52 0,5 97,6 0,58 0,6 97,7 0,57 0,6 Växtsterolerna kvantifieras i gram per 100 gram koncentrerat växtsterolprov. SD: standardavvikelsen av tre parallella körningar i g/100 g. RSD: relativa standardavvikelsen. id: inte detekterat. a Växtsterolerna identifieras inte med metod A. b Växtsterolerna identifieras inte med metod B. c Växtsterolerna identifieras inte med metod C. d Växtsterolerna identifieras inte med metod D. Kromatogrammen är presenterade i Bilaga 1.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

5.1.2 Jämförelse av metoderna

Den främsta skillnaden i analysresultaten är mängden detekterad sitostanol. Sitostanol hör till de sex växtsterolerna som regleras skilt i EU-regleringarna, och borde därför kunna analyseras skilt, och inte bara inkluderas i summan av växtsteroler. Metod A separerar inte piken för sitostanol från den näst eluerande piken av Δ5-avenasterol, och kan således anses vara otillräcklig för att bemöta kraven på regleringarna.3 Som det syns i resultaten, är den angivna sitostanolkoncentrationen för hög i resultaten erhållna med metod A jämfört med de andra metoderna, och ungefär summan av sitostanol och Δ5-avenasterol. Dessa är markerade med röda rutor i Tabell 8. De fyra metodernas separation av sitostanol och Δ5- avenasterol presenteras som utklipp av kromatogrammen i Figur 9. Metod B uppnår en delvis Datafile Name:AV-11_NMKL_soy-sterol_5.gcdDatafile Name:AV-13_Clement_soy-sterol_4.gcdDatafile Name:AV-7_Srigley2015_soy-sterol_13.gcdDatafile Name:AV-9_AOCS_soy-sterol_4.gcd Sample Name:AV-11_NMKL_COFCO_5Sample Name:AV-13_Clement_COFCO_4Sample Name:AV-7_Srigley2015_Cofco_13Sample Name:AV-9_AOCS_COFCO_HPZ1709050_4 Sample ID:B6902 Sample ID:RS1662 Sample ID:RS1610separationSample ID:RS1640mellan sitostanol och Δ5-avenasterol, och analysresultaten är jämförbara med uV uV uV uV 110000 dem erhållna från metoder med en bra separation. Således kunde den delvisa separationen 40000 20000 175000 100000 anses tillräcklig, speciellt i analys av det här specifika provet. Om fördelningen av steroler var 35000 90000 17500 olika, kunde dock pikarna överlappa mer och resultaten vara mer avvikande. Metoderna C 150000 80000 30000 och D uppnår en bra separation mellan sitostanol och Δ5-avenasterol, med hjälp av längre 15000 125000 70000 körprogram. 25000 12500 100000 60000 20000 50000 10000 75000 40000 15000 7500 A B C D 50000 30000 10000 5000 20000 25000 5000 2500 10000 0 0 0 0

4,25 4,50 4,75 5,0021,5 5,2522,0 5,5022,5 5,7523,0 6,0023,522,5 6,2524,020,025,06,5024,5 6,7525,022,527,5 25,57,00 25,030,026,07,25 26,57,5027,532,5 27,07,75 30,027,535,08,00 28,08,2532,537,528,58,50 35,029,040,08,75 29,5 9,0037,542,530,0 9,25 30,540,045,0 min31,0 42,547,531,5 32,045,050,0 32,5 min47,552,5 50,055,0 min 52,5 min Figur 9. Separation av sitostanol (första piken) och Δ5-avenasterol i metoderna A, B, C och D.

Metodernas styrkor och svagheter med avseende på GC-körprogram och provpreparering presenteras i Tabell 9. Främsta styrkan för metod A är det snabba isotermiska körprogrammet. Analysresultaten är repeterbara, och provprepareringen kräver en låg mängd intern standard. Svagheten för metod A, utöver är att ingen separation mellan sitostanol och Δ5-avenasterol ses, är att provprepareringen är tidskrävande. Provet värms upp under upplösningsskedet och kyls sedan ner, före den späds ut till rätt volym. Lösningsmedel evaporeras före tillsatsen av silyleringsreagensen, vilket också kan ta ett tiotal minuter. Evaporeringen möjliggör dock att mindre mängd prov och ISTD kan användas. I de övriga tre metoderna värms provet inte då det löses upp. Körprogrammet för metod B är

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______betydligt längre än den för metod A, men kortare än de två andra metodernas. Temperaturprogrammet är ett ramp-program, vilket betyder att tiden mellan analyser i en serie blir längre, i och med att instrumentet ska kylas ner mellan körningarna. Provprepareringen är relativt snabb, då ingen uppvärmning av provet görs, och lösningsmedlet evaporeras inte före silylering. Provprepareringen kräver dock en stor mängd intern standardlösning (5 ml per prov), vilket gör att kostnaden för en analys är betydligt högre jämfört med metoderna A och C. Dessutom måste ny standardlösningen prepareras antingen väldigt ofta, eller i stora mängder åt gången. Ifall den görs ofta medför det mer arbete i och med att nya standardlösningars renhet måste försäkras (se kapitel 3.1.2). Provprepareringen för metod C inkluderar evaporering av den interna standardens lösningsmedel, vilket förlänger analystiden jämfört med metoderna B och D. Lösningsmedlet som används för både interna standardlösningen och provprepareringen är kloroform, och prov rekommenderas förvaras i frysen tills användning. Ifall en större mängd ISTD-lösning prepareras, antogs också den måsta förvaras i frysen, och låta värmas upp till rumstemperatur före användning, vilket var relativt tidskrävande. Metod D ha så gott som samma körprogram som metod C, och provprepareringen är liknande till metod B, och har således samma styrkor och svagheter med dessa.

Tabell 9. Jämförelse av tid på körprogram samt provprepareringen för metoderna A-D. Metod GC-körprogram Provpreparering Metod A Snabbt körprogram Tidskrävande provpreparering 15 minuter Prissmart provpreparering Isotermisk på 300 °C Koncentration på ISTD: 0,6 mg/ml Helium som bärgas Flöde: 1,2 ml/min Metod B Medellångt körprogram Provprepareringen kräver mycket 45 minuter intern standard Ramp 200–300 °C Relativt snabb provpreparering Vätgas som bärgas Koncentration på ISTD: 5 mg/ml Flöde: 1,5 ml/min Metod C Långsamt körprogram Tidskrävande provpreparering 69 minuter Koncentration på ISTD: 5 mg/ml Ramp 250-265-250 °C Vätgas som bärgas Flöde: 1 ml/min Metod D Långsamt körprogram Provprepareringen kräver en stor 71 minuter mängd intern standard Ramp 250-265-250 °C Relativt snabb provpreparering Vätgas som bärgas Koncentration på ISTD: 5 mg/ml Flöde: 1 ml/min

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Utöver skillnaden i resultaten för sitostanol och Δ5-avenasterol förekommer endast mindre skillnader mellan specifika växtsteroler. En större skillnad kan dock ses i den lägre mängden totala växtsteroler samt totala eluerade i metoderna C och D jämfört med metoderna A och B. Metod B har dessutom värden som överskrider 100 gram per 100 gram prov på totala steroler samt totala eluerade. Värdena för C och D är sinsemellan jämförbara, och de lägre värdena kunde således bero på körprogrammet, i och med att de är så gott som samma i de två metoderna. Temperaturen på programmen är lägre jämfört med A och B (se Tabell 9) vilket kunde ge lägre elueringsgrad. Också flödeshastigheten i metoderna C och D är låg, med tanke på att vätgas används. Dessa inställningar på parametrarna kan vara orsaken till de lägre totala värdena på eluerade, och syns i kromatogrammen som dålig pikform.

Pikbredden i metoderna C och D är större jämfört med de två andra metoderna. De bredare pikarna har lägre intensitet, och kunde orsaka att väldigt små pikar inte detekteras, utan blir en del av baslinjen. Pikformerna för sitosterol i de fyra metoderna presenteras i Figur 10. Sitosterol valdes i och med att den är den växtsterolen med högst koncentration i provet och effekten av överlastning synsDatafile Name:HSte__B6903_AV-11_NMKL_COFCO_6_Batman_18.4.2019_008.gcd tydligast, men också för att beskriva och ge exempel på Sample Name:AV-11_NMKL_COFCO_6 Sample ID:B6903 uV Datafile Name:Srigley2018__RS1677_AV-13_Clement_1-100_COFCO_6_Robin_25.4.2019_009.gcd 200000 FID1 Sample Name:AV-13_Clement_1-100_COFCO_6 Sample ID:RS1677 pikbreddningen.190000 I metod A eluerar sitosterol inom 0,2 minuter, och arean av piken är ungefär uV 180000 95000 170000 90000 160000 85000 Sitosterol 150000 Sitosterol 80000 140000 75000 B 130000 70000 120000 A 65000 110000 60000 100000 55000 90000 50000 80000 45000 70000 40000 60000 35000 50000 30000 40000 25000 30000 20000 20000 15000 10000

10000 Sitostanol 0

5000 Sitostanol -10000 Delta-5-Avenasterol 0 -20000 -5000 Datafile Name:Srigley2018__RS1629_AV-7_Srigley2015_Cofco_run2_15_Robin_9.4.2019_004.gcd Datafile Name:Srigley2018__RS1642_AV-9_AOCS_COFCO_HPZ1709050_6_Robin_15.4.2019_007.gcd 29,20 29,25 29,30 29,35 29,40 29,45 29,50 29,55 29,60 29,65 29,70 29,75 min 8,150 8,175 8,200 8,225 Sample Name:AV-7_Srigley2015_Cofco_run2_158,250 8,275 8,300 8,325 8,350 8,375 8,400 8,425 8,450 8,475Sample Name:AV-9_AOCS_COFCO_HPZ1709050_68,500 min Sample ID:RS1629 Sample ID:RS1642 uV uV 32500 40000

37500 30000

35000 Sitosterol

27500 Sitosterol 32500 25000 D 30000 C 27500 22500

25000 20000 22500 17500 20000

17500 15000

15000 12500 12500 10000 10000

7500 7500

5000 5000

2500

Sitostanol Delta-5-Avenasterol

0 2500

Sitostanol Delta-5-Avenasterol -2500 0

-5000 -2500 44,00 44,25 44,50 44,75 45,00 45,25 45,50 45,75 46,00 44,25 46,25 44,50 46,50 44,75 46,75 45,00min 45,25 45,50 45,75 46,00 46,25 46,50 46,75 min Figur 10. Pikformen av sitosterol i metoderna A-D.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

610 000. I metod B eluerar sitosterol inom 0,3 minuter, och pikarean är ungefär 434 000. I metod C eluerar sitosterol på ungefär 1 minut, och pikarean är omkring 825 000. I metod D eluerar sitosterol också på ungefär 1 minut, och pikarean är omkring 629 000. De streckade linjerna ritades in i Figur 10 för att illustrera symmetrin och ge en tydligare bild av lutningen av pikarna, som tyder på överlast. Överlast av kolonnen (eng. column overload), innebär att injektionen innehåller för mycket steroler jämfört till kolonnens kapacitet.

Höjden på pikarna skiljer sig speciellt då A och B jämförs mot C och D, vilket är presenterat i Figur 11. Här är sitosterolpikarna överlappade för att tydligare se skillnaderna, då skalan är samma för alla. Körprogrammen för C och D ger breda låga pikar, vilket inte är optimalt då ett snabbt körprogram önskas. Desto bredare pikar desto färre ryms i ett tidsfönster – om uV 110000 Data1:AV-11_NMKL_soy-sterol_5.gcd FID1 analysenData2:AV-13_Clement_soy-sterol_5.gcd vill försnabbas måste FID_SPL pikbredden fås ner. Data3:AV-7_Srigley2015_soy-sterol_run2_14.gcd FID_SPL 100000 Data4:AV-9_AOCS_soy-sterol_5.gcd FID_SPL

90000 80000 A 70000 B

60000

50000 40000 C 30000 D 20000

10000

-10000

Figur-20000 11. Jämförelse av pikformen av sitosterol för metoderna A-D. 44,1 44,2 44,3 44,4 44,5 44,6 44,7 44,8 44,9 45,0 45,1 45,2 45,3 45,4 45,5 45,6 45,7 min En skillnad i repeterbarhet i form av avvikande RSD-värden kan ses mellan metoderna. Speciellt de sterolerna med lägre koncentrationer kunde avvikelserna vara större. I det här arbetet analyserade endast en serie med prov per metod. För att få ett pålitligare värde på repeterbarheten borde samma analyser ha utförts i triplikat under fem dagars intervall. Detta gjordes inte i det här arbetet, och RSD-värdena gäller alltså bara för en analys som utförts i triplikat under en dag. Metoderna B och D har väldigt liknande provprepareringar, men RSD- värdena är lägre för metod B. Metoderna C och D har däremot liknande GC-program, och oftare högre värden på RSD. Förutom provprepareringen kunde alltså också körprogrammet påverka värdena.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

I metoderna B, C och D delas piken för intern standard upp i två delar, i och med att diastereomeren 5β-kolestan-3β-ol finns med som en orenhet (Figur 12). I dessa metoder ska de båda pikarnas area räknas till den interna standardens, antingen genom att i beräkningarna summa ihop dem, eller sammansätta pikarna då kromatogrammen bearbetas. Datafile Name:AV-9_AOCS_soy-sterol_4.gcd Sample Name:AV-9_AOCS_COFCO_HPZ1709050_4 I metod A separeras dessa inte. Sample ID:RS1640 uV

20000

17500

15000

12500

10000

7500

5000

2500 ISTD 0

20,0 22,5 25,0 27,5 30,0 32,5 35,0 37,5 40,0 42,5 45,0 47,5 50,0 52,5 min

Figur 12. Piken och strukturen för den interna standarden 5β-kolestan-3α-ol, samt orenheten 5β-kolestan-3β-ol.

I och med att analysresultaten för de enskilda växtsterolerna i regel är i samma storleksklass anses det att de fyra metoderna som evaluerats i det här arbetet är i sig fungerande för analys av koncentrerade växtsteroler, men med vissa restriktioner. Endast tre metoder visade en tillräcklig separation av alla de enskilt reglerade växtsterolerna. Metod A separerar inte sitostanol från Δ5-avenasterol, och uppfyller således inte kravet ställda i EU-regleringarna, fastän de totala och de flesta enskilda växtsterolerna är jämförbara med resultaten erhållna i andra metoder. Även de låga värdena på totala växtsteroler som erhållits i metoderna C och D kunde vara ett problem för att bemöta EU-regleringarna, beroende på växtsterolens ursprung. Metoderna C och D är dock de enda av de fyra evaluerade metoderna som har en fullständig separation av sitostanol och Δ5-avenasterol.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______5.2 Metodutvecklingen

Målet med metodutvecklingen var att hitta ett snabbare körprogram än de presenterade i metoderna B, C och D, med tillräcklig separation av sitostanol och Δ5-avenasterol. Då samma kolonn med stationära fasen 5 % difenyl – 95 % dimetylpolysiloxan användes i alla analyser, var de modifierbara parametrarna temperatur och flödeshastighet. Vätgas valdes som bärgas för alla nya metoder i och med att snabbare körprogram med samma upplösning kan erhållas.

Det koncentrerade växtsterolprovet som analyserades innehöll inga detekterbara mängder av de senare eluerande växtsterolerna cykloartanol, 24-metylencykloartanol och citrostadienol. För att bestämma en lämplig längd på tiden för de utvecklade metoderna borde ett prov innehållande citrostadienol, som eluerar sist, analyseras. Analystiderna presenterade i det här arbetet är således inte fastslagna. Fördelningen av steroler är olika beroende på dess ursprung, till exempel innehåller växtsteroler från rybs brassikasterol, medan det inte finns i växtsteroler från trä (se Tabell 1 i kapitel 2.1). Trä har å andra sidan mycket mer sitostanol, vilket kan försvåra en bra separation av det och den närliggande piken för Δ5-avenasterol, i och med att piken då är mycket större och överlappar då mer med den mindre piken. Därför skulle det vara fördelaktigt att i metodutveckling analysera varierande sorters prov, för att försäkra lämpligheten för alla. Alternativt måste prov med olika ursprung analyseras med olika metoder. Behovet och målet med analyserna kan variera – hur noggranna resultat krävs och vilka enskilda steroler måste kvantifieras noga?

5.2.1 Analysresultat

Translationer gjordes för metoderna A, B och D. För translationerna av metod A, som är presenterade i Tabell 10, syns inga större skillnader i resultaten. Mängden totala steroler samt totala eluerade är litet högre i både A-1 och A-2 jämfört med metod A. Translationerna av metod B är presenterade i Tabell 11, och alla tre modifieringar har väldigt liknande resultat. I modifieringarna har koncentrationerna av ergosterol samt klerosterol lagts till enligt identifikationer från metod D. RSD-värdena är i många fall höga i metoderna B-1 och B-2. Translationerna av metod D är presenterade i Tabell 12. De enskilda koncentrationerna är igen jämförbara sinsemellan, men RSD-värdena är i regel lägre i metoderna D-1 och D-2 jämfört med D. Totala sterolerna och totala eluerade är något högre i metod D-1. Utöver translationerna utvecklades åtta övriga isotermiska GC-program. Resultaten för dessa är presenterade i Tabell 13 (IT-1–IT-4) och Tabell 14 (IT-5–IT-8). Resultaten är sinsemellan jämförbara. Växtsteroler med låga koncentrationer har i många fall höga RSD-värden.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Tabell 10. Analysresultat av metodtranslationer och andra optimeringar av metod A.

Metod A Metod A-1 Metod A-2 g/100 g SD RSD (%) g/100 g SD RSD (%) g/100 g SD RSD (%) Brassikasterol 2,6 0,02 0,7 2,7 0,03 1,1 2,7 0,02 0,9 Kampesterol 25,0 0,04 0,2 25,2 0,08 0,3 25,2 0,08 0,3 Kampestanol 0,5 0,01 1,1 0,5 0,01 1,0 0,5 0,01 2,0 Stigmasterol 24,8 0,06 0,2 25,2 0,10 0,4 25,1 0,11 0,4 Sitosterol 41,5 0,05 0,1 42,2 0,13 0,3 42,2 0,15 0,3 Sitostanol 1,7 0,01 0,5 1,6 0,02 1,2 1,6 0,03 1,5 Kolesterol 0,3 0,00 0,6 0,3 0,00 1,1 0,3 0,01 4,1 Kolestanol 0,0 0,01 86,7 id id id id id id Ergosterol ------24-Metylenkolesterol ------Klerosterol (+Δ5,23-Stigmastadienol) ------Stigmast-22-en-3-ol ------Ergost-7-en-3-ol ------Stigmasta-5,7,22-trien-3-ol ------Δ5-Avenasterol ------Stigmasta-5,24-dienol 0,5 0,00 0,5 0,5 0,00 0,5 0,5 0,02 4,2 Stigmast-7-enol 0,4 0,00 0,7 0,4 0,01 1,4 0,4 0,01 1,5 Δ7-Avenasterol 0,1 0,00 3,0 0,1 0,00 0,7 0,1 0,01 4,5 Övriga steroler 1,7 0,01 0,9 1,7 0,01 0,5 1,6 0,04 2,5 Totala steroler 99,0 0,12 0,1 100,3 0,28 0,3 100,1 0,29 0,3 Totala eluerade 100,1 0,14 0,1 101,6 0,28 0,3 101,4 0,27 0,3 Växtsterolerna kvantifieras i gram per 100 gram koncentrerat växtsterolprov. SD: standardavvikelsen av tre parallella körningar i g/100 g. RSD: relativa standardavvikelsen. Kromatogrammen är presenterade i Bilaga 1.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Tabell 11. Analysresultat av metodtranslationer och andra optimeringar av metod B.

Metod B Metod B-1 Metod B-2 Metod B-3 g/100 g SD RSD (%) g/100 g SD RSD (%) g/100 g SD RSD (%) g/100 g SD RSD (%) Brassikasterol 2,7 0,02 0,9 2,6 0,02 0,7 2,6 0,01 0,4 2,6 0,02 0,9 Kampesterol 25,1 0,11 0,4 25,2 0,08 0,3 25,1 0,10 0,4 25,1 0,08 0,3 Kampestanol 0,5 0,02 4,5 0,5 0,01 1,5 0,5 0,01 2,6 0,5 0,00 0,7 Stigmasterol 25,1 0,10 0,4 25,3 0,14 0,5 25,0 0,15 0,6 25,1 0,12 0,5 Sitosterol 42,1 0,17 0,4 42,5 0,22 0,5 41,9 0,21 0,5 42,1 0,19 0,4 Sitostanol 0,8 0,00 0,3 0,8 0,04 4,6 0,8 0,03 3,6 0,8 0,02 2,4 Kolesterol 0,3 0,01 3,4 0,2 0,00 1,0 0,3 0,00 1,0 0,3 0,00 1,1 Kolestanol ------Ergosterol - - - 0,1 0,01 5,5 0,1 0,01 9,8 0,1 0,02 14,7 24-Metylenkolesterol 0,4 0,03 6,7 0,3 0,00 1,0 0,2 0,02 9,7 0,3 0,01 2,5 Klerosterol (+Δ5,23-Stigmastadienol) - - - 0,4 0,03 7,9 0,4 0,02 4,0 0,4 0,00 1,0 Stigmast-22-en-3-ol 0,5 0,00 0,9 0,5 0,01 2,9 0,5 0,01 1,0 0,5 0,00 0,5 Ergost-7-en-3-ol 0,4 0,02 3,8 0,4 0,02 5,8 0,6 0,02 4,3 0,4 0,02 4,9 Stigmasta-5,7,22-trien-3-ol 0,4 0,01 1,6 0,1 0,01 7,1 0,1 0,01 8,8 0,1 0,00 2,5 Δ5-Avenasterol 0,8 0,01 0,6 0,8 0,05 6,0 0,9 0,02 2,6 0,8 0,01 1,7 Stigmasta-5,24-dienol 0,5 0,01 1,6 0,5 0,01 2,7 0,5 0,02 3,6 0,5 0,00 0,4 Stigmast-7-enol 0,4 0,00 0,7 0,4 0,01 1,9 0,4 0,02 4,7 0,4 0,00 0,1 Δ7-Avenasterol 0,1 0,00 3,4 0,1 0,00 2,4 0,1 0,02 17,4 0,1 0,00 0,8 Övriga steroler ------Totala steroler 100,1 0,46 0,5 100,8 0,56 0,6 100,0 0,55 0,6 100,4 0,37 0,4 Totala eluerade 101,3 0,52 0,5 101,8 0,63 0,6 101,0 0,60 0,6 101,4 0,34 0,3 Växtsterolerna kvantifieras i gram per 100 gram koncentrerat växtsterolprov. SD: standardavvikelsen av tre parallella körningar i g/100 g. RSD: relativa standardavvikelsen. Kromatogrammen är presenterade i Bilaga 1.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Tabell 12. Analysresultat av metodtranslationer och andra optimeringar av metod D.

Metod D Metod D-1 Metod D-2 g/100 g SD RSD (%) g/100 g SD RSD (%) g/100 g SD RSD (%) Brassikasterol 2,6 0,04 1,6 2,6 0,01 0,3 2,6 0,02 0,7 Kampesterol 24,6 0,17 0,7 24,8 0,10 0,4 24,6 0,06 0,2 Kampestanol 0,3 0,04 11,0 0,4 0,01 1,9 0,5 0,00 0,8 Stigmasterol 24,8 0,08 0,3 24,8 0,13 0,5 24,7 0,10 0,4 Sitosterol 41,2 0,26 0,6 41,4 0,18 0,4 40,9 0,12 0,3 Sitostanol 0,6 0,00 0,7 0,7 0,01 1,7 0,6 0,01 1,3 Kolesterol 0,2 0,01 4,1 0,2 0,00 1,6 0,2 0,00 1,4 Kolestanol ------Ergosterol 0,0 0,01 12,6 0,0 0,01 0,3 0,1 0,01 12,6 24-Metylenkolesterol 0,4 0,03 7,9 0,3 0,01 2,8 0,4 0,02 5,9 Klerosterol (+Δ5,23-Stigmastadienol) 0,3 0,01 3,7 0,3 0,01 2,5 0,2 0,13 86,6 Stigmast-22-en-3-ol 0,4 0,03 7,8 0,5 0,01 1,3 0,5 0,01 1,3 Ergost-7-en-3-ol 0,3 0,06 22,0 0,3 0,03 9,2 0,3 0,00 0,9 Stigmasta-5,7,22-trien-3-ol ------Δ5-Avenasterol 0,6 0,00 0,7 0,8 0,01 1,7 0,7 0,01 1,2 Stigmasta-5,24-dienol 0,4 0,02 5,7 0,4 0,00 0,8 0,4 0,01 3,9 Stigmast-7-enol 0,3 0,12 3,4 0,4 0,02 4,9 0,3 0,01 2,6 Δ7-Avenasterol 0,1 0,03 27,7 0,0 0,05 173,2 0,1 0,00 3,3 Övriga steroler ------Totala steroler 97,1 0,58 0,6 98,1 0,38 0,4 96,9 0,13 0,1 Totala eluerade 97,7 0,57 0,6 98,5 0,37 0,4 97,5 0,23 0,2 Växtsterolerna kvantifieras i gram per 100 gram koncentrerat växtsterolprov. SD: standardavvikelsen av tre parallella körningar i g/100 g. RSD: relativa standardavvikelsen. Kromatogrammen är presenterade i Bilaga 1.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Tabell 13. Analysresultat för de utvecklade isotermiska metoderna 1–4.

Metod IT-1 Metod IT-2 Metod IT-3 Metod IT-4 g/100 g SD RSD (%) g/100 g SD RSD (%) g/100 g SD RSD (%) g/100 g SD RSD (%) Brassikasterol 2,6 0,01 0,3 2,6 0,01 0,3 2,7 0,02 0,9 2,7 0,02 0,6 Kampesterol 25,0 0,01 0,02 25,1 0,04 0,2 25,0 0,02 0,1 25,1 0,07 0,3 Kampestanol 0,5 0,02 3,8 0,5 0,01 2,8 0,5 0,01 2,8 0,5 0,01 1,4 Stigmasterol 25,0 0,05 0,2 25,1 0,08 0,3 25,1 0,06 0,2 25,0 0,08 0,3 Sitosterol 41,8 0,04 0,1 42,1 0,13 0,3 41,9 0,03 0,1 41,9 0,11 0,3 Sitostanol 0,7 0,04 5,7 0,8 0,02 2,6 0,7 0,02 2,2 0,7 0,00 0,6 Kolesterol 0,2 0,00 0,3 0,3 0,00 1,9 0,2 0,00 1,6 0,3 0,00 1,2 Kolestanol ------Ergosterol 0,0 0,02 36,8 0,1 0,01 21,7 0,0 0,01 20,0 0,1 0,03 32,4 24-Metylenkolesterol 0,3 0,04 14,5 0,3 0,06 18,7 0,3 0,01 2,7 0,3 0,04 13,1 Klerosterol (+Δ5,23-Stigmastadienol) 0,3 0,02 5,0 0,3 0,05 13,9 0,3 0,05 18,1 0,3 0,00 0,3 Stigmast-22-en-3-ol 0,5 0,01 1,9 0,5 0,00 0,8 0,5 0,00 0,2 0,5 0,00 0,4 Ergost-7-en-3-ol 0,4 0,06 14,5 0,4 0,01 2,1 0,3 0,05 14,9 0,4 0,03 7,1 Stigmasta-5,7,22-trien-3-ol ------Δ5-Avenasterol 0,7 0,07 10,2 0,8 0,05 6,3 0,7 0,01 1,2 0,7 0,01 1,3 Stigmasta-5,24-dienol 0,4 0,01 2,7 0,4 0,01 3,3 0,4 0,01 2,3 0,4 0,01 1,4 Stigmast-7-enol 0,4 0,01 2,5 0,4 0,01 2,0 0,4 0,01 2,2 0,4 0,00 0,9 Δ7-Avenasterol 0,1 0,01 12,6 0,1 0,00 2,2 0,1 0,01 10,4 0,1 0,01 5,3 Övriga steroler ------Totala steroler 99,0 0,20 0,2 99,6 0,35 0,4 99,1 0,17 0,2 99,3 0,23 0,2 Totala eluerade 99,7 0,27 0,3 100,4 0,44 0,4 99,7 0,29 0,3 99,8 0,26 0,3 Växtsterolerna kvantifieras i gram per 100 gram koncentrerat växtsterolprov. SD: standardavvikelsen av tre parallella körningar i g/100 g. RSD: relativa standardavvikelsen. Kromatogrammen är presenterade i Bilaga 1.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Tabell 14. Analysresultat för de utvecklade isotermiska metoderna 5–8.

Metod IT-5 Metod IT-6 Metod IT-7 Metod IT-8 g/100 g SD RSD (%) g/100 g SD RSD (%) g/100 g SD RSD (%) g/100 g SD RSD (%) Brassikasterol 2,6 0,01 0,4 2,6 0,01 0,5 2,6 0,02 0,7 2,7 0,02 0,6 Kampesterol 25,1 0,08 0,3 25,1 0,09 0,3 25,0 0,06 0,2 25,1 0,05 0,2 Kampestanol 0,5 0,01 1,5 0,5 0,00 0,6 0,5 0,01 1,1 0,5 0,01 1,1 Stigmasterol 25,1 0,09 0,4 25,1 0,09 0,4 25,0 0,07 0,3 25,0 0,06 0,2 Sitosterol 42,2 0,10 0,2 42,1 0,12 0,3 41,9 0,08 0,2 41,9 0,05 0,1 Sitostanol 0,8 0,01 1,0 0,8 0,01 0,8 0,8 0,01 1,3 0,8 0,04 4,8 Kolesterol 0,3 0,00 1,0 0,3 0,00 1,9 0,3 0,00 0,6 0,3 0,00 0,7 Kolestanol ------Ergosterol id id id 0,0 0,01 21,9 0,1 0,01 10,1 0,1 0,03 24,0 24-Metylenkolesterol 0,3 0,02 4,5 0,3 0,01 3,9 0,3 0,02 5,6 0,3 0,02 6,1 Klerosterol (+Δ5,23-Stigmastadienol) 0,3 0,01 2,4 0,3 0,01 3,0 0,3 0,01 3,3 0,4 0,04 12,0 Stigmast-22-en-3-ol 0,5 0,00 0,5 0,5 0,00 0,6 0,5 0,00 0,8 0,5 0,01 2,9 Ergost-7-en-3-ol 0,4 0,03 7,5 0,4 0,03 6,2 0,4 0,02 6,5 0,5 0,04 7,6 Stigmasta-5,7,22-trien-3-ol ------Δ5-Avenasterol 0,7 0,00 0,3 0,7 0,00 0,6 0,7 0,01 0,9 0,7 0,06 7,4 Stigmasta-5,24-dienol 0,4 0,01 1,8 0,4 0,01 1,7 0,4 0,01 2,8 0,4 0,00 0,6 Stigmast-7-enol 0,4 0,00 0,8 0,4 0,01 1,9 0,4 0,01 1,8 0,4 0,01 2,6 Δ7-Avenasterol 0,1 0,00 3,6 0,1 0,01 7,1 0,1 0,00 2,1 0,1 0,01 4,5 Övriga steroler ------Totala steroler 99,7 0,25 0,3 99,7 0,32 0,3 99,3 0,20 0,2 99,5 0,13 0,1 Totala eluerade 100,5 0,25 0,3 100,4 0,31 0,3 99,8 0,19 0,2 99,9 0,16 0,2 Växtsterolerna kvantifieras i gram per 100 gram koncentrerat växtsterolprov. SD: standardavvikelsen av tre parallella körningar i g/100 g. RSD: relativa standardavvikelsen. id: inte detektera. Kromatogrammen är presenterade i Bilaga 1.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

5.2.2 Jämförelse av de utvecklade metoderna

Kromatogrammen för alla utvecklade metoder presenteras i Bilaga 1. Parametrarna för optimeringarna av metoderna A, B och D presenteras i Tabell 6 i kapitel 4. I och med att metod C och D har väldigt liknande GC-program, modifierades endast en av dem, i det här fallet metod D. Provprepareringen var densamma för alla utvecklade metoder. Den modifierades från metod A, eftersom användningen av intern standard var sparsam och priset således mindre. Genom att lämna bort uppvärmningen i samband med att lösa upp proven sparades åtminstone 30 minuter. För att i framtiden ytterligare försnabba provprepareringen, kunde möjligheten att avstå evaporeringen av lösningsmedlen före silylering undersökas, så som i metod B och D. Många av de utvecklade metoderna har höga RSD-värden, speciellt för de växtsteroler som har låg koncentration. Som diskuterat i kapitel 4.1.2 borde analyserna utföras under flera dagars intervall, för att få en bättre bild av repeterbarheten.

Metodernas prestation av separering jämförs här enligt separationen av sitostanol och Δ5- avenasterol, i och med att alla metoder har en duglig separation av de övriga fem reglerade växtsterolerna. I metoderna A, A-1 och A-2 är analysresultaten i samma storleksklass sinsemellan, och således är fördelarna med modifikationerna den sparade tiden på ungefär 2,5 minuter. Tiden för analysen kunde förkortas genom bytet av bärgas från helium till vätgas. I och med att metod A inte har en tillräcklig separation av sitostanol och Δ5-avenasterol, uppfyller inte heller modifikationerna det kravet.

Metoderna B-1, B-2 och B-3 hade inga större skillnader jämfört med metod B. Mängden stigmasta-5,7,22-trien-3-ol var lägre i alla de utvecklade metoderna, vilket kunde bero på en felaktig identifiering i processeringen av kromatogrammen. Analystiden för metod B var 45 minuter, och den kunde sänkas i metoderna B-2 och B-3. För att jämföra separationen av de utvecklade metoderna mot metod B presenteras separationen av sitostanol och Δ5- avenasterol för samtliga metoder i Figur 13. Figuren visar att separationen av dessa två pikar är sämre i de utvecklade metoderna, och att en högre grad av överlappning förekommer. Speciellt i den snabbaste metoden B-2 är separationen bristfällig.

Datafile Name:Srigley2018__RS1676_AV-13_Clement_1-100_COFCO_5_Robin_25.4.2019_008.gcd Sample Name:AV-13_Clement_1-100_COFCO_5 Sample ID:RS1676 uV

40000 ISTD

37500

Sitosterol Stigmasterol 35000 Campesterol

32500 Datafile Name:Srigley2018__RS1916_AV-40_soy_Clement_efficiency_3_Robin_18.9.2019_016.gcd Datafile Name:Srigley2018__RS1906_AV-40_soy_Clement_translated_3_Robin_18.9.2019_004.gcd 30000 Datafile Name:Srigley2018__RS1911_AV-40_soy_Clement_speed_3_Robin_18.9.2019_010.gcdSample Name:AV-40_soy_Clement_efficiency_3 Sample Name:AV-40_soy_Clement_translated_3 Sample Name:AV-40_soy_Clement_speed_3Sample ID:RS1916 Sample ID:RS1906 27500 uV Sample ID:RS1911 uV uV

25000 60000 ISTD

ISTD Aino Visuri Pro gradu-avhandling

30000 ISTD

70000 Sitosterol

22500

Sitosterol Sitosterol

______Stigmasterol

Campesterol

Stigmasterol

Campesterol Stigmasterol 20000 25000 60000 50000 Campesterol

17500 50000 20000 40000 B-1 B-2 B-3 15000 B

12500 40000 15000 30000 10000 30000

7500 10000 20000 20000

5000 Brassicasterol 5000 Brassicasterol 10000 Brassicasterol

2500 10000 Brassicasterol

Ergost-7-en-3-ol

Sitostanol

Delta-5-Avenasterol

Sitostanol

Ergost-7-en-3-ol

Delta-5-Avenasterol

Stigmast-22-en-3-ol

Stigmasta-5,24-dienol

Stigmast-7-enol

Delta-5-Avenasterol

24-Methylene cholesterol

Campestanol

Sitostanol

Ergost-7-en-3-ol

Stigmast-22-en-3-ol

Stigmasta-5,7,22-trien-3-ol

Stigmasta-5,24-dienol

Campestanol

Stigmast-7-enol

Cholesterol

Sitostanol Delta-5-Avenasterol

24-Methylene cholesterol

Delta-7-avenasterol

Stigmast-22-en-3-ol

Clerosterol d5,23-Stigmastadienol + Clerosterol

Unk

Campestanol

Stigmasta-5,24-dienol

Unk

24-Methylene cholesterol

Ergost-7-en-3-ol Stigmast-7-enol

Unk

Clerosterol d5,23-Stigmastadienol + Clerosterol

Unk

Stigmast-22-en-3-ol

Unk

Cholesterol Delta-7-avenasterol

Unk

Stigmasta-5,7,22-trien-3-ol Unk

0 Unk

Stigmasta-5,24-dienol

Unk

Campestanol

Cholesterol

Unk

24-Methylene cholesterol

Unk Unk

Stigmasta-5,7,22-trien-3-ol

Unk Unk

Stigmast-7-enol

Unk

Delta-7-avenasterol

Clerosterol d5,23-Stigmastadienol + Clerosterol

Ergosterol

Unk

Ergosterol Unk

Unk

Cholesterol

Unk

Unk Unk

Unk

Stigmasta-5,7,22-trien-3-ol Delta-7-avenasterol Unk

0 Unk

Unk

Ergosterol Unk

Unk

Unk Unk

Unk

Unk Unk 0 0 Unk -2500 23,0 23,5 24,0 24,5 25,0 25,5 26,0 26,5 27,0 27,5 28,0 28,5 29,0 29,5 30,0 30,5 31,0 31,5 min -10000 -5000 16,25 16,50 16,75 17,00 17,25 17,50 17,75 18,00 18,25 18,50 18,75 19,00 19,25 19,50 19,75 20,00 20,25 20,50 20,75 21,00 21,25 21,50 21,75 22,00 min 24,0 24,5 25,0 25,511,25 26,011,50 11,7526,5 12,0027,0 12,2527,5 12,50 28,0 12,75 28,513,00 29,013,25 13,5029,5 13,7530,0 14,0030,5 14,25 31,0 14,50 min 14,75 15,00 15,25 15,50 min Figur 13. Separation av sitostanol och Δ5-avenasterol i metoderna B, B-1, B-2 och B-3.

Datafile Name:Srigley2018__RS1642_AV-9_AOCS_COFCO_HPZ1709050_6_Robin_15.4.2019_007.gcd Sample Name:AV-9_AOCS_COFCO_HPZ1709050_6 Resultaten för metod D är jämförbara med de erhållna från metoderna D-1 och D-2. Sample ID:RS1642 uV Separationen jämförs igen med hjälp av sitostanol och Δ5-avenasterol, och presenteras i

9000 ISTD

8500 Figur 14.Sitosterol Separationen mellan dessa föreningar är bra i både metod D-1 och D-2. Båda dessa

Stigmasterol Campesterol 8000 utvecklade metoder presenterar betydligt snabbare analystider med tillräcklig separation av 7500

7000 de reglerade sterolerna. Som diskuterat i kapitel 4.1.2, var pikbredden hög och pikhöjden låg

6500 Datafile Name:Srigley2018__RS1901_AV-40_gradu_soy_efficiency_3_Robin_18.9.2019_005.gcd i metodSample D Name:AV-40_gradu_soy_efficiency_3. I metoderna D-1 och D-2 är pikarna smalare och högre. De totala sterolerna och 6000 Datafile Name:Srigley2018__RS1896_AV-40_gradu_soy_speed_3_Robin_18.9.2019_004.gcd Sample Name:AV-40_gradu_soy_speed_3 Sample ID:RS1901 uV Sample ID:RS1896 5500 27500 totala eluerade har dock fortfarande litet lägre värden än i de andra metoderna.

uV ISTD

5000 25000

ISTD Sitosterol

4500 Stigmasterol 22500 Campesterol

25000 Sitosterol Stigmasterol 4000 20000 Campesterol

3500 20000 17500 D D-1 D-2

3000 15000 15000

2500 12500 Brassicasterol

2000 10000 10000

1500 7500 Brassicasterol

1000 Brassicasterol

5000 5000

Sitostanol

Delta-5-Avenasterol

Stigmast-22-en-3-ol 24-Methylene cholesterol

500 2500 Campestanol

Ergost-7-en-3-ol

Fucosterol + unk + Fucosterol

Cholesterol

Stigmast-7-enol

Clerosterol d5,23-Stigmastadienol+

Sitostanol

Delta-5-Avenasterol

Sitostanol

Delta-5-Avenasterol

Stigmast-22-en-3-ol

24-Methylene cholesterol

Campestanol

Stigmast-22-en-3-ol

Unk

24-Methylene cholesterol Campestanol

Delta-7-avenasterol

Ergost-7-en-3-ol

Cholesterol

Fucosterol + unk+ Fucosterol

Unk

Ergost-7-en-3-ol

Clerosterol d5,23-Stigmastadienol + Clerosterol

Fucosterol + unk+ Fucosterol

Unk Ergosterol

Stigmast-7-enol

Cholesterol

Unk

Clerosterol d5,23-Stigmastadienol + Clerosterol Stigmast-7-enol

Unk

Ergosterol

Unk

Delta-7-avenasterol

Unk

Unk Ergosterol 0 0 0 Delta-7-avenasterol

-2500 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0 32,5 35,0 37,5 40,0 42,5 45,0 47,5 50,0 52,5 min -5000 14,0 15,0 16,0 17,0 18,0 19,0 20,0 21,0 22,0 23,0 24,0 25,0 26,0 27,0 28,0 29,0 30,0 31,0 32,0 33,0 34,0 35,0 min 11,0 12,0 13,0 14,0 15,0 16,0 17,0 18,0 19,0 20,0 21,0 22,0 23,0 24,0 25,0 26,0 min Figur 14. Separation av sitostanol och Δ5-avenasterol i metoderna D, D-1 och D-2.

Åtta isotermiska metoder utvecklades för att undersöka ifall en isotermisk separation av sitostanol och Δ5-avenasterol är möjlig med stationära fasen 5 % difenyl – 95 % dimetylpolysiloxan. Isotermiska program är snabbare än ramp-program om en serie analyser körs, i och med att ingen nedkylning måste göras efter varje analys. Pikbredden och -höjden i metod D lyfte fram misstankar om att temperaturen i programmet är för lågt, och samtidigt visar metod D att separationen av växtsteroler är långsam med 250 °C. Metod A med ett isotermiskt program på 300 °C separerar å andra sidan inte sitostanol från Δ5-avenasterol.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Således valdes tre temperaturer (260 °C, 265 °C och 270 °C) för programmen. Dessa kombinerades med tre olika linjära hastigheter (40 cm/s, 50 cm/s och 60 cm/s) för att undersöka hur det påverkar separationen. Kombinationerna är presenterade i Tabell 15. Analysresultaten för alla åtta isotermiska metoder är jämförbara, och inga definitiva mönster mellan variation i temperatur och linjär hastighet kan märkas. Metoderna IT-1 och IT-3 hade de lägsta temperaturen på 260 °C, och litet lägre totala steroler samt totala eluerade. Skillnaden är dock så liten att det skulle krävas fler körningar för att försäkra att det är betydligt. Resultaten tyder på att de nya metoderna har en tillräcklig separation mellan sitostanol och Δ5-avenasterol, då resultaten jämförs mot de erhållna från metoder med fullständig separation.

Tabell 15. De isotermiska GC-programmens temperaturer samt linjära hastigheter.

Metod Linjär hastighet (cm/s) Temperatur (°C)

IT-1 60 260 IT-2 50 265 IT-3 50 260 IT-4 60 265 IT-5 40 265 IT-6 40 270 IT-7 50 270 IT-8 60 270

De isotermiska programmens separation av sitostanol och Δ5-avenasterol presenteras i Figur 15. Från figuren får man visuellt den bilden att de program med linjära hastigheten 40 cm/s har bättre separation. Metoderna med 270 °C (IT-6, IT-7 och IT-8) uppnår inte en lika bra separation, alltså kan temperaturen antas vara för hög. Också metod IT-4, med linjära hastigheten 60 cm/s och temperaturen 265 °C, har en litet sämre separation, vilket tyder på att 60 cm/s kan vara för snabbt i kombination med den temperaturen. Separationen för metoden IT-1, med samma linjära hastighet men lägre temperatur (260 °C) är dock bra, och IT-5 med 265 °C och 40 cm/s gav också en bra separation. IT-3 med låg temperatur och 50 cm/s linjär hastighet gav även den en bra separation. Av dessa tre metoder med bra separation är IT-1 snabbast, följt av IT-3 och IT-5. Resultaten visar att det är möjligt att få en duglig separation av växtsteroler med stationära fasen 5 % difenyl – 95 % dimetylpolysiloxan och ett isotermiskt temperaturprogram. Dessa metoder, vars analystid är under 30 minuter, är betydligt snabbare än de befintliga metoderna med tillräcklig separation.

Datafile Name:AV-41_gradu-soy_isotherm-260_linvel-50_3.gcdDatafile Name:Srigley2018__RS1954_AV-42_soy-sterol_iso-265-lv-60_3_Robin_26.9.2019_004.gcd Datafile Name:AV-41_gradu-soy_isothermal-260_3.gcdDatafile Name:AV-41_gradu-soy_isothermal-265_3.gcd Sample Name:AV-41_gradu-soy_isotherm-260_linvel-50_3Sample Name:AV-42_soy-sterol_iso-265-lv-60_3 Sample Name:AV-41_gradu-soy_isothermal-260_3Sample Name:AV-41_gradu-soy_isothermal-265_3 Sample ID:RS1941 Sample ID:RS1954 Sample ID:RS1931 Sample ID:RS1936 uV uV uV

uV 12000 ISTD

15000 ISTD 14000 ISTD

30000 ISTD 11000

Sitosterol Sitosterol 13000 Sitosterol

Datafile Name:Srigley2018__RS1950_AV-42_soy-sterol_4_Robin_26.9.2019_007.gcdSitosterol Stigmasterol

27500 Stigmasterol

Campesterol

Stigmasterol

Campesterol Stigmasterol

10000 Campesterol 12000 Aino Visuri Pro gradu-avhandling Sample12500 Name:AV-42_soy-sterol_4 25000 ______Sample ID:RS1950 9000 11000 22500 uV 8000 10000 10000 20000 9000 50000 7000 17500 8000 6000 7000 IT-4

15000 7500 IT-1 IT-2 IT-3 Brassicasterol 45000 5000 6000

12500 Brassicasterol Brassicasterol 4000 5000 10000 5000 4000 40000 3000 7500 Datafile Name:Srigley2018__RS1962_AV-42_soy-sterol_iso-270-lv-60_3_Robin_26.9.2019_004.gcd3000 Datafile Name:Srigley2018__RS1970_AV-42_soy-sterol_iso-270-lv-50_3_Robin_27.9.2019_004.gcdDatafile Name:Srigley2018__RS1978_AV-42_soy-sterol_iso-270-lv-60_correct_3_Robin_27.9.2019_004.gcd Sample Name:AV-42_soy-sterol_iso-270-lv-60_correct_3 2000 Brassicasterol Sample Name:AV-42_soy-sterol_iso-270-lv-60_3Sample Name:AV-42_soy-sterol_iso-270-lv-50_3 5000

2500 Sample ID:RS19622000 Sample ID:RS1970 Sample ID:RS1978 Delta-5-Avenasterol

35000 Sitostanol

Sitostanol

Delta-5-Avenasterol

Sitostanol

Stigmast-22-en-3-ol Delta-5-Avenasterol uV Campestanol

uV 1000 uV 24-Methylene cholesterol

Stigmast-22-en-3-ol

24-Methylene cholesterol Stigmasta-5,24-dienol

2500 Ergost-7-en-3-ol Campestanol

1000 Cholesterol

Stigmast-22-en-3-ol

Clerosterol + + d5,23-StigmastadienolClerosterol

Stigmast-7-enol 24-Methylene cholesterol

32500 Campestanol

Stigmasta-5,24-dienol

Cholesterol

Ergost-7-en-3-ol

Clerosterol + + d5,23-StigmastadienolClerosterol Stigmast-7-enol

Sitostanol

Ergost-7-en-3-ol Stigmasta-5,24-dienol

Cholesterol

Delta-5-Avenasterol

Unk

Clerosterol + + d5,23-StigmastadienolClerosterol

Stigmast-7-enol Unk

14000 Unk

24-Methylene cholesterol

Ergosterol

Stigmast-22-en-3-ol

Delta-7-avenasterol

Campestanol

Unk

Ergost-7-en-3-ol Stigmasta-5,24-dienol

Unk Unk

Cholesterol

Unk Unk

Unk

Clerosterol + + d5,23-StigmastadienolClerosterol

Stigmast-7-enol

Unk

Delta-7-avenasterol

Ergosterol

Unk

ISTD

Unk

Ergosterol

Unk

Unk Unk

Delta-7-avenasterol

Ergosterol

ISTD

Delta-7-avenasterol

Unk

Unk Unk

Unk

ISTD Unk Unk 150000 0 0 0 13000 30000

30000 Sitosterol

Sitosterol

Stigmasterol

Campesterol

Stigmasterol Stigmasterol 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,0 10,5 9,011,0 11,510,0 12,0 12,511,027500 13,0 6,0 12,013,5 6,514,0 13,07,014,5 7,515,0 14,0 15,58,0 16,015,08,5 Campesterol 16,59,0 16,017,0 9,5 17,5 10,017,018,0 10,5 min18,011,0 11,519,0 12,0 20,012,5 13,021,0 13,5 min14,0 14,5 15,0 15,5min 120007,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,0 10,5 11,0 11,5 12,0 12,5 Campesterol 13,0 13,5 14,0 14,5 15,0 15,5 16,0 16,5 17,0 17,5 18,0 min 12500 25000 11000 25000 10000 22500 20000 9000 10000 20000 8000 17500 IT-8 7000 IT-5 IT-6 IT-7

15000 7500 15000 Brassicasterol 6000 12500 Brassicasterol 5000 10000 5000 10000 4000 7500 Brassicasterol 3000 5000 2500 5000

2000

Sitostanol

Delta-5-Avenasterol

Sitostanol

Delta-5-Avenasterol Sitostanol

2500 Delta-5-Avenasterol

Stigmast-22-en-3-ol

Campestanol

24-Methylene cholesterol

Stigmast-22-en-3-ol

Campestanol

Stigmasta-5,24-dienol

Ergost-7-en-3-ol

24-Methylene cholesterol

24-Methylene cholesterol Clerosterol + + d5,23-StigmastadienolClerosterol

1000 Cholesterol

Ergost-7-en-3-ol

Stigmasta-5,24-dienol

Stigmast-7-enol

Cholesterol

Clerosterol + + d5,23-StigmastadienolClerosterol

Stigmast-7-enol

Cholesterol

Ergost-7-en-3-ol

Clerosterol + + d5,23-StigmastadienolClerosterol

Stigmast-7-enol

Unk

Ergosterol

Delta-7-avenasterol

Unk

Ergosterol

Delta-7-avenasterol

Unk

Unk Unk

Unk

Ergosterol

Unk

Unk Unk

Delta-7-avenasterol

Unk Unk 0 Unk 0 0 0

5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,0 10,5 11,0 11,5 12,0 12,5 13,0 min 2,5 5,0 7,5 10,08,0 8,5 9,0 9,512,56,5 10,0 7,010,5 11,07,5 15,011,58,0 12,0 8,512,5 17,513,09,0 13,59,5 14,0 10,014,520,010,515,0 15,511,0 16,0 11,522,516,5 12,017,0 17,512,5 18,025,013,0 18,5 13,519,0 min 14,027,5 14,5 15,0 minmin

Figur 13. Separation av sitostanol och Δ5-avenasterol i de utvecklade isotermiska metoderna.

Med resultaten erhållna i det här arbetet uppfyller fem metoder målsättningen av att optimera metoder med avseende på tid och separation. Av metodtranslationerna är dessa D-1 och D-2. Resultaten av dessa är jämförbara med de erhållna av metod D, men dock litet lägre totala steroler samt totala eluerande än i de resterande metoderna. Av isotermiska programmen uppfyller metoderna IT-1, IT-3 och IT-5 målsättningen.

Hastighetsoptimering kan ses som viktigt speciellt för rutinanalyser, som man gör flera av i dagen. Försnabbandet har flera fördelar, bland annat aktivare användning av dyra instrument, fler analyser per dag och snabbare resultat i akuta fall.57 I och med att en stor mängd tid sätts på provprepareringen förblir den totala analystiden fortfarande ganska lång. Ifall vidare utveckling av de gaskromatografiska analysmetoderna av växtsteroler önskas, borde speciellt provprepareringen försnabbas. Gaskromatografiska parametrar som kunde testas för snabbare analys inkluderar förkortning av kolonnen och användning av en kolonn med mindre inre diameter,57 som till exempel 0,25 µm. Mindre inre diameter medför dock mindre kapacitet, vilket kan vara problematiskt för rutinerad analys med höga provmängder.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______5.3 FT-NIR-spektroskopi i växtsterolanalys

Tolkningen av FT-NIR-mätningarna kräver kemometri. Växtsterolproven som analyserats med FT-NIR-spektroskopi analyserades också med en referensmetod, i det här arbetet användes gaskromatografi. Koncentrationerna av referensmetoden matades in i det till instrumentet tillhörande dataprogrammet, och kalibreringskurvor erhölls genom att sätta de beräknade värdena av koncentrationerna mot referensvärdena. Kalibreringskurvan som gjordes för den totala växtsterolhalten presenteras i Figur 16. Utöver den gjordes kalibreringskurvor för fyra enskilda växtsteroler; brassikasterol, kampesterol, sitosterol och stigmasterol, och samtliga presenteras i Figur 17.

Figur 14. Kalibreringskurva för totala växtsterolerna.

För att få fungerande kalibreringsmodeller kan det krävas en stor mängd prover. I det här arbetet mättes NIR-spektret av endast 16 växtsterolprover, av vilka en uteslöts från kalibreringen. Det uteslutna provet användes senare som okänt prov för att testa kalibreringen. I tidigare arbeten för utveckling av kalibreringar för växtsteroler har till exempel 7312 och 3963 prover inkluderats. För att få en mer pålitlig modell borde alltså fler kalibreringsprov inkluderas.

För att få en bra modell är det dessutom viktigt att ha ett brett koncentrationsintervall för de undersökta föreningarna.12 I kalibreringskurvorna presenterade i det här arbetet är provkoncentrationerna inte jämnt fördelade. Själva intervallet är också ganska snävt, proverna med lägst koncentration totala steroler innehöll ändå ca 89 gram per 100 gram prov. Inkludering av prover som skulle fylla glappen kunde fara fördelaktigt, och likaså prover med lägre halt totala växtsteroler.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

a) Brassikasterol

b) Kampesterol

c) Sitosterol

d) Stigmasterol

Figur 15. Kalibreringskurvor för fyra växtsteroler: brassikasterol, kampesterol, sitosterol och stigmasterol.

Genom att kvantifiera NIR-spektret av det uteslutna sterolprovet, som var samma prov som analyserats igenom hela arbetet, erhölls de resultat som presenteras i Tabell 16. Man kan se att resultaten i detta specifika fall är riktgivande, då det jämförs med analysresultaten som erhölls med gaskromatografi, som presenterades i tidigare kapitel. Överanpassning (eng. overfitting) kan dock vara ett problem då provmängden för kalibreringarna är låg. Det kan resultera i en till synes fungerande modell och att kalibreringen fungerar för de befintliga proven, men att modellen ändå inte är robust och fungerande för framtida okända prover.63 Att kalibreringarna dessutom provades med endast ett okänt prov ger inte en pålitlig modell, och fler okända prov borde användas.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Tabell 16. Resultat från NIR-mätningarna jämfört med de erhållna från GC-mätningarna. Beräknad från NIR-spektra GC-analysresultat Differens Växtsterol (g/100 g) (g/100 g) (g/100 g) Brassikasterol 1,8 2,7 -0,9 Kampesterol 28 25,1 2,9 Stigmasterol 25,2 25,2 0,0 Sitosterol 40,1 42,2 -2,1 Totala steroler 100 99,2 0,8

En del data fattas för den här delen av arbetet, och det i samband med den låga mängden kalibreringsprov gör att inga större slutsatser kan dras av FT-NIR-spektroskopins duglighet för analys av koncentrerade växtsteroler. Växtsteroler har tidigare kvantifieras i oljor med dugliga resultat, vilket tyder på att det är möjligt att använda FT-NIR-spektroskopi för analys av växtsteroler.12,63 Det kan vara värt att göra en bättre evaluering, om en snabb analysmetod önskas.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______6 SAMMANFATTNING

Växtsteroler förekommer naturligt i låga koncentrationer i flera växtarter. De har visats ha en kolesterolsänkande effekt i människan, och därför har livsmedel berikats med dessa, för att uppnå en koncentration med hälsofrämjande verkan. Växtsterolkoncentrationerna och växtsterolernas sammansättning är reglerade bland annat på EU-nivå, vilket sätter krav på analysmetoderna. Sex växtsteroler ska enskilt kunna kvantifieras i en blandning.

Fyra befintliga gaskromatografiska metoder för analys av växtsteroler jämfördes på basis av bland annat separation, tid och provpreparering. GC-metoderna klarade av att analysera det koncentrerade växtsterolprovet med i regel jämförbara resultat, men endast tre av dessa uppnådde bra separation av alla reglerade steroler. Dessa tre metoder hade relativt långa GC-analystider, från 45 minuter till 71 minuter, och provprepareringarna var antingen tidskrävande eller dyra.

Femton metoder utvecklades på basis av de fyra evaluerade, med målet att erhålla snabbare metoder med tillräcklig separation. Av de utvecklade metoderna uppfyllde fem kravet på tillräcklig separation och snabbare GC-program. Provprepareringen som användes i de nya metoderna var prissmart, men krävde evaporering av lösningsmedel, vilket medförde litet längre tid. Analysresultaten tyder på att det är möjligt att uppnå en duglig separation av en växtsterolblandning (med speciell fokus på sitostanol och Δ5-avenasterol) med ett isotermiskt temperaturprogram och en kolonn med stationära fasen 5 % difenyl – 95 % dimetylpolysiloxan. De utvecklade metoderna anses vara en bra kompromiss mellan separation och tidsanvändning. Ifall tidsanvändningen vill vidare optimeras borde utvecklingen koncentreras på provprepareringen.

Även snabbanalys med FT-NIR-spektroskopi utfördes, men i och med låg provmängd kan inga slutsatser dras av dess duglighet. Resultaten stöder dock vidare undersökning, ifall en snabbanalysmetod önskas.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______7 REFERENSER

(1) Moreau, R. A.; Nyström, L.; Whitaker, B. D.; Winkler-Moser, J. K.; Baer, D. J.; Gebauer, S. K.; Hicks, K. B. Phytosterols and Their Derivatives: Structural Diversity, Distribution, Metabolism, Analysis, and Health-Promoting Uses. Prog. Lipid Res. 2018, 70, 35–61.

(2) Europaparlamentets och rådets förordning (EU) 2015/2283 av den 25 november 2015 om nya livsmedel och om ändring av Europaparlamentets och rådets förordning (EU) nr 1169/2011 och upphävande av Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 258/97 och kommissionens förordning (EG) nr 1852/2001. EUT L 327, s. 1–22, 11.12.2015.

(3) Srigley, C. T.; Haile, E. A. Quantification of Plant Sterols/Stanols in Foods and Dietary Supplements Containing Added Phytosterols. J. Food Compos. Anal. 2015, 40, 163– 176.

(4) Dutta, P. C.; Normén, L. Capillary Column Gas-Liquid Chromatographic Separation of Δ5-Unsaturated and Saturated Phytosterols. J. Chromatogr. A 1998.

(5) Duchateau, G. S. M. J. E.; Bauer-Plank, C. G.; Louter, A. J. H.; van der Ham, M.; Boerma, J. A.; van Rooijen, J. J. M.; Zandbelt, P. A. Fast and Accurate Method for Total 4- Desmethyl Sterol(s) Content in Spreads, Fat-Blends, and Raw Materials. JAOCS 2002, 79 (3), 273–278.

(6) Laakso, P. Analysis of Sterols from Various Food Matrices. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2005, 107 (6), 402–410.

(7) Laakso, P. H. Determination of Plant Stanols and Plant Sterols in Phytosterol Enriched Foods with a Gas Chromatographic-Flame Ionization Detection Method: NMKL Collaborative Study. J. AOAC Int. 2014, 97 (4), 1097–1108.

(8) Srigley, C. T.; Hansen, S. L.; Smith, S. A.; Abraham, A.; Bailey, E.; Chen, X.; Chooi, S. H.; Clement, L. M.; Dao, M.; Fardin Kia, A. R.; et al. Sterols and Stanols in Foods and Dietary Supplements Containing Added Phytosterols: A Collaborative Study. J. Am. Oil Chem. Soc. 2018, 95 (3), 247–257.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

(9) Clement, L. M.; Hansen, S. L.; Costin, C. D.; Perri, G. L. Quantitation of Sterols and Steryl Esters in Fortified Foods and Beverages by GC/FID. J. Am. Oil Chem. Soc. 2010, 87 (9), 973–980.

(10) McNair, H. M.; Miller, J. M. Basic Gas Chromatography, 2nd ed.; John Wiley & Sons, Inc.: Hoboken, New Jersey, 2009.

(11) Subramanian, A.; Rodriguez-Saona, L. Fourier Transform Infrared (FTIR) Spectroscopy. In Infrared Spectroscopy for Food Quality Analysis and Control; Elsevier Inc., 2009; s. 145–178.

(12) Özdemir, İ. S.; Dağ, Ç.; Özinanç, G.; Suçsoran, Ö.; Ertaş, E.; Bekiroğlu, S. Quantification of Sterols and Fatty Acids of Extra Virgin Olive Oils by FT-NIR Spectroscopy and Multivariate Statistical Analyses. LWT - Food Sci. Technol. 2018, 91, 125–132.

(13) Moss, G. P. International Union of Pure and Applied Chemistry and International Union of Biochemistry: Joint Commission on Biochemical Nomenclature: Nomenclature of Steroids. Pure Appl. Chem. 1989, 61 (10), 1783–1822.

(14) Quílez, J.; García-Lorda, P.; Salas-Salvadó, J. Potential Uses and Benefits of Phytosterols in Diet: Present Situation and Future Directions. Clin. Nutr. 2003, 22 (4), 343–351.

(15) Piironen, V.; Lindsay, D. G.; Miettinen, T. A.; Toivo, J.; Lampi, A. M. Plant Sterols: Biosynthesis, Biological Function and Their Importance to Human Nutrition. J Sci Food Agric 2000, 80 (7), 939–966.

(16) Moreau, R. A.; Whitaker, B. D.; Hicks, K. B. Phytosterols, Phytostanols, and Their Conjugates in Foods: Structural Diversity, Quantitative Analysis, and Health- Promoting Uses. Prog. Lipid Res. 2002, 41 (6), 457–500.

(17) Phillips, K. M.; Ruggio, D. M.; Toivo, J. I.; Swank, M. A.; Simpkins, A. H. Free and Esterified Sterol Composition of Edible Oils and Fats. J. Food Compos. Anal. 2002, 15 (2), 123–142.

(18) Cantrill, R. Phytosterols, Phytostanols and Their Esters (CTA); 2008.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

(19) Schwartz, H.; Ollilainen, V.; Piironen, V.; Lampi, A. M. Tocopherol, Tocotrienol and Plant Sterol Contents of Vegetable Oils and Industrial Fats. J. Food Compos. Anal. 2008, 21, 152–161.

(20) Phillips, K. M.; Ruggio, D. M.; Ashraf-Khorassani, M. Phytosterol Composition of Nuts and Seeds Commonly Consumed in the United States. 2005.

(21) Wang, M.; Zhang, L.; Wu, X.; Zhao, Y.; Wu, L.; Lu, B. Quantitative Determination of Free and Esterified Phytosterol Profile in Nuts and Seeds Commonly Consumed in China by SPE/GC–MS. LWT - Food Sci. Technol. 2019, 100, 355–361.

(22) Normén, L.; Johnsson, M.; Andersson, H.; Van Gameren, Y.; Dutta, P. Plant Sterols in Vegetables and Fruits Commonly Consumed in Sweden. Eur J Nutr 1999, 38, 84–89.

(23) Fernandes, P.; Cabral, J. M. S. Phytosterols: Applications and Recovery Methods. Bioresour. Technol. 2007, 98, 2335–2350.

(24) Ferrari, R. A.; Esteves, W.; Mukherjee, K. D.; Schulte, E. Alteration of Sterols and Steryl Esters in Vegetable Oils during Industrial Refining. J. Agric. Food Chem. 1997, 45, 4753–4757.

(25) Pine Chemistry - Arboris https://arboris-us.com/evergreen-solutions/pine-chemistry/ (hämtat 23 mars 2021).

(26) Ostlund, R. E. Phytosterols in Human Nutrition. Annu. Rev. Nutr 2002, 22, 533–549.

(27) SciFinder - Sign In https://sso.cas.org/as/U4bhJ/resume/as/authorization.ping (hämtat 1 juni 2020).

(28) Corrêa, R. C. G.; Peralta, R. M.; Bracht, A.; Ferreira, I. C. F. R. The Emerging Use of Mycosterols in Food Industry along with the Current Trend of Extended Use of Bioactive Phytosterols. Trends Food Sci. Technol. 2017, 67, 19–35.

(29) AbuMweis, S. S.; Barake, R.; Jones, P. J. H. Plant Sterols/Stanols as Cholesterol Lowering Agents: A Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Food Nutr. Res. 2008, 52.

(30) Zawistowski, J.; Jones, P. Regulatory Aspects Related to Plant Sterol and Stanol Supplemented Foods. J. AOAC Int. 2015, 98 (3), 750–756.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

(31) Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 258/97 av den 27 januari 1997 om nya livsmedel och nya livsmedelsingredienser. EUT L 043, s. 1–6, 14.2.1997.

(32) Kommissionens genomförandeförordning (EU) 2017/2470 av den 20 december 2017 om upprättande av en unionsförteckning över nya livsmedel i enlighet med Europaparlamentets och rådets förordning (EU) 2015/2283 om nya livsmedel. EUT L 351, s. 72–201, 30.12.2017.

(33) U.S. Food and Drug Administration https://www.fda.gov/ (hämtat 20 december 2019).

(34) Sorenson, W. R.; Sullivan, D. Determination of Campesterol, Stigmasterol, and Beta- Sitosterol in Saw Palmetto Raw Materials and Dietary Supplements by Gas Chromatography: Collaborative Study. J AOAC Int. 2007, 90 (3), 670–678.

(35) International Organization for Standardization. Determination of individual and total sterols contents — Gas chromatographic method — Part 1: Animal and vegetable fats and oils; ISO 12228-1:2014; Genève, 2014.

(36) American Oil Chemists' Society. Sterols and Stanols in Food and Dietary Supplements Containing added Phytosterols; AOCS Official Method Ce 12-16; Urbana, IL, 2017.

(37) Nordic Committee on Food Analysis. Plant stanols and plant sterols. Determination in phytosterol enriched foods with gas chromatograph (GC-FID); NMKL 198; Bergen, 2014.

(38) Toivo, J.; Phillips, K.; Lampi, A. M.; Piironen, V. Determination of Sterols in Foods: Recovery of Free, Esterified, and Glycosidic Sterols. J. Food Compos. Anal. 2001, 14 (6), 631–643.

(39) Nyström, L.; Paasonen, A.; Lampi, A.-M.; Piironen, V. Total Plant Sterols, Steryl Ferulates and Steryl Glycosides in Milling Fractions of Wheat and Rye. J. Cereal Sci. 2007, 45, 106–115.

(40) Nyström, L.; Schär, A.; Lampi, A.-M. Steryl Glycosides and Acylated Steryl Glycosides in Plant Foods Reflect Unique Sterol Patterns. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2012, 114 (6), 656–669.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

(41) Fibigr, J.; Šatínský, D.; Solich, P. A UHPLC Method for the Rapid Separation and Quantification of Phytosterols Using Tandem UV/Charged Aerosol Detection – A Comparison of Both Detection Techniques. J. Pharm. Biomed. Anal. 2017, 140, 274– 280.

(42) Mo, S.; Dong, L.; Hurst, W. J.; van Breemen, R. B. Quantitative Analysis of Phytosterols in Edible Oils Using APCI Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. Lipids 2013, 48 (9), 949–956.

(43) Breinhölder, P.; Mosca, L.; Lindner, W. Concept of Sequential Analysis of Free and Conjugated Phytosterols in Different Plant Matrices. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 2002, 777 (1–2), 67–82.

(44) Soria, A. C.; Rodríguez-Sánchez, S.; Sanz, J.; Martínez-Castro, I. Gas Chromatographic Analysis of Food Bioactive Oligosaccharides. In Food Oligosaccharides: Production, Analysis and Bioactivity; John Wiley & Sons, Ltd, 2014; s. 370–398.

(45) Snow, N. H. Inlet Systems for Gas Chromatography. In Modern Practice of Gas Chromatography; Grob, R. L., Barry, E. F., Eds.; John Wiley & Sons, Inc.: Hoboken, NJ, USA, 2004; s. 461–489.

(46) Vitha, M. F. Chromatography: Principles and Instrumentation, 1st ed.; John Wiley & Sons, Inc.: Hoboken, New Jersey, 2017.

(47) Restek. How to Choose a GC Inlet Liner:Simplify Selection Based on Injection Type https://www.restek.com/Technical-Resources/Technical-Library/General- Interest/gen_GNAR1991B-UNV#01 (hämtat 30 november 2020).

(48) PerkinElmer. GC Inlet Liners. Split and Splitless Liners. https://www.perkinelmer.com/se/category/liners (hämtat 30 november 2020).

(49) GL Sciences. Janssen, H. G. Selecting the Injection Mode in Capillary Gas Chromatography. https://www.glsciences.eu/ap-note/002.pdf (hämtat 30 november 2020).

(50) Rahman, M. M.; Abd El-Aty, A. M.; Choi, J.-H.; Shin, H.-C.; Shin, S. C.; Shim, J.-H. Basic Overview on Gas Chromatography Columns. In Analytical Separation Science; Wiley- VCH Verlag GmbH & Co. KGaA: Weinheim, Germany, 2015; s. 823–834.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

(51) Barry, E. F. Columns: Packed and Capillary; Column Selection in Gas Chromatography. In Modern Practice of Gas Chromatography; Grob, R. L., Barry, E. F., Eds.; John Wiley & Sons, Inc.: Hoboken, NJ, USA, 2004; s. 65–191.

(52) Costin, C. D.; Hansen, S. L.; Chambers, D. P. Using Theoretical Correction Factors for Quantitative Analysis of Sterols and Sterol Concentrates. JAOCS, J. Am. Oil Chem. Soc. 2009, 86 (2), 111–118.

(53) Piironen, V.; Toivo, J.; Lampi, A.-M. Plant Sterols in Cereals and Cereal Products. Cereal Chem. J. 2002, 79 (1), 148–154.

(54) Winkler, J. K.; Rennick, K. A.; Eller, F. J.; Vaughn, S. F. Phytosterol and Tocopherol Components in Extracts of Corn Distiller’s Dried Grain. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 6482–6486.

(55) Aitzetmüller, K.; Brühl, L.; Fiebig, H.-J. Analysis of Sterol Content and Composition in Fats and Oils by Capillary-Gas Liquid Chromatography Using an Internal Standard. Comments on the German Sterol Method. Lipid - Fett 1998, 100 (9), 429–435.

(56) Chen, Y. Z.; Kao, S. Y.; Jian, H. C.; Yu, Y. M.; Li, J. Y.; Wang, W. H.; Tsai, C. W. Determination of Cholesterol and Four Phytosterols in Foods without Derivatization by Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. J. Food Drug Anal. 2015, 23 (4), 636–644.

(57) Klee, M. S.; Blumberg, L. M. Theoretical and Practical Aspects of Fast Gas Chromatography and Method Translation. J. Chromatogr. Sci. 2002, 40, 234–247.

(58) Agilent. GC Method Translation Software. https://www.agilent.com/en/support/gas- chromatography/gcmethodtranslation (hämtat 8 januari 2021).

(59) Stuart, B. H. Infrared Spectroscopy: Fundamentals and Applications, 1st ed.; John Wiley & Sons, Ltd, 2004.

(60) Modern Techniques for Food Authentication, 2nd ed.; Sun, D.-W., Ed.; Elsevier Inc., 2018.

(61) Esteve Agelet, L.; Hurburgh Jr, C. R.; Hurburgh, C. R. A Tutorial on Near Infrared Spectroscopy and Its Calibration. Crit. Rev. Anal. Chem. 2010, 40 (4), 246–260.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

(62) Thermo Fisher Scientific. Advantages of Fourier-Transform Near-Infrared Spectroscopy. Application Note 50771, 2006. https://www.thermofisher.com/document-connect/document- connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS- Assets%2FCAD%2FApplication- Notes%2FD14181.pdf&title=QWR2YW50YWdlcyBvZiBGb3VyaWVyLVRyYW5zZm9ybS BOZWFyLUluZnJhcmVkIFNwZWN0cm9zY29weQ== (hämtat 23 mars 2021).

(63) Özdemir, İ. S.; Karaoğlu, Ö.; Dağ, Ç.; Beki̇roğlu, S. Assessment of Sesame Oil Fatty Acid and Sterol Composition with FT-NIR Spectroscopy and Chemometrics. Turk J Agric 2018, 42, 444–452.

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

8 BILAGOR

8.1 Bilaga 1

Bilaga 1 presenterar de erhållna kromatogrammen.

Metod A Datafile Name:AV-11_NMKL_soy-sterol_5.gcd Sample Name:AV-11_NMKL_COFCO_5 Sample ID:B6902 uV

175000

150000

125000

100000

75000

50000

25000

4,25 4,50 4,75 5,00 5,25 5,50 5,75 6,00 6,25 6,50 6,75 7,00 7,25 7,50 7,75 8,00 8,25 8,50 8,75 9,00 9,25 min

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Metod B Datafile Name:AV-13_Clement_soy-sterol_4.gcd Sample Name:AV-13_Clement_COFCO_4 Sample ID:RS1662 uV 110000

100000

90000

80000

70000

60000

50000

40000

30000

20000

10000

0 21,5 22,0 22,5 23,0 23,5 24,0 24,5 25,0 25,5 26,0 26,5 27,0 27,5 28,0 28,5 29,0 29,5 30,0 30,5 31,0 31,5 32,0 32,5 min

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Metod C Datafile Name:AV-7_Srigley2015_soy-sterol_13.gcd Sample Name:AV-7_Srigley2015_Cofco_13 Sample ID:RS1610 uV

40000

35000

30000

25000

20000

15000

10000

5000

22,5 25,0 27,5 30,0 32,5 35,0 37,5 40,0 42,5 45,0 47,5 50,0 52,5 55,0 min

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Metod D Datafile Name:AV-9_AOCS_soy-sterol_4.gcd Sample Name:AV-9_AOCS_COFCO_HPZ1709050_4 Sample ID:RS1640 uV

20000

17500

15000

12500

10000

7500

5000

2500

20,0 22,5 25,0 27,5 30,0 32,5 35,0 37,5 40,0 42,5 45,0 47,5 50,0 52,5 min

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Metod A-1 Datafile Name:Srigley2018__RS1921_AV-40_soy_NMKL_translated_3_Robin_19.9.2019_004.gcd Sample Name:AV-40_soy_NMKL_translated_3 Sample ID:RS1921 uV

70000 ISTD

Sitosterol Stigmasterol 60000 Campesterol

50000

40000

30000

20000

10000 Brassicasterol

Sitostanol

Campestanol

Other sterol 1 Other sterol

Other sterol 2 Other sterol Stigmasta-5,24-dienol

Stigmast-7-enol

Other sterol 3 Other sterol

Cholesterol

Unk

Delta-7-avenasterol

Unk

Unk Unk

Unk Unk Unk Unk Unk

Unk Unk 0 Unk

3,25 3,50 3,75 4,00 4,25 4,50 4,75 5,00 5,25 5,50 5,75 6,00 6,25 6,50 min

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Metod A-2 Datafile Name:Srigley2018__RS1926_AV-40_soy_NMKL_efficiency_3_Robin_19.9.2019_010.gcd Sample Name:AV-40_soy_NMKL_efficiency_3 Sample ID:RS1926 uV

35000 ISTD

30000 Sitosterol

Stigmasterol Campesterol

25000

20000

15000 Brassicasterol 10000

5000 Sitostanol

Campestanol

Other sterol 1 Other sterol

Other sterol 2 Other sterol

Stigmasta-5,24-dienol

Stigmast-7-enol

Other sterol 3 Other sterol

Cholesterol

Unk

Delta-7-avenasterol

Unk

Unk Unk

Unk Unk Unk

Unk Unk 0 Unk

-5000 3,25 3,50 3,75 4,00 4,25 4,50 4,75 5,00 5,25 5,50 5,75 6,00 6,25 min

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Metod B-1 Datafile Name:Srigley2018__RS1906_AV-40_soy_Clement_translated_3_Robin_18.9.2019_004.gcd Sample Name:AV-40_soy_Clement_translated_3 Sample ID:RS1906 uV

30000 ISTD

Sitosterol

Stigmasterol Campesterol 25000

20000

15000

10000

5000 Brassicasterol

Ergost-7-en-3-ol

Sitostanol

Delta-5-Avenasterol

Stigmast-22-en-3-ol

Stigmasta-5,24-dienol

Campestanol

Stigmast-7-enol

24-Methylene cholesterol

Clerosterol d5,23-Stigmastadienol + Clerosterol

Unk

Cholesterol Delta-7-avenasterol

Stigmasta-5,7,22-trien-3-ol

Unk Unk

Unk

Ergosterol

Unk

Unk Unk 0 Unk

-5000 24,0 24,5 25,0 25,5 26,0 26,5 27,0 27,5 28,0 28,5 29,0 29,5 30,0 30,5 31,0 min

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Metod B-2 Datafile Name:Srigley2018__RS1911_AV-40_soy_Clement_speed_3_Robin_18.9.2019_010.gcd Sample Name:AV-40_soy_Clement_speed_3 Sample ID:RS1911 uV

70000 ISTD

Sitosterol Stigmasterol 60000 Campesterol

50000

40000

30000

20000

10000 Brassicasterol

Delta-5-Avenasterol

Sitostanol

Stigmast-22-en-3-ol

Campestanol

Stigmasta-5,24-dienol

24-Methylene cholesterol

Ergost-7-en-3-ol Stigmast-7-enol

Clerosterol d5,23-Stigmastadienol + Clerosterol

Cholesterol

Stigmasta-5,7,22-trien-3-ol

Delta-7-avenasterol

Unk

Ergosterol Unk

Unk

Unk Unk 0 Unk

-10000 11,25 11,50 11,75 12,00 12,25 12,50 12,75 13,00 13,25 13,50 13,75 14,00 14,25 14,50 14,75 15,00 15,25 15,50 min

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Metod B-3 Datafile Name:Srigley2018__RS1916_AV-40_soy_Clement_efficiency_3_Robin_18.9.2019_016.gcd Sample Name:AV-40_soy_Clement_efficiency_3 Sample ID:RS1916 uV

60000 ISTD

Sitosterol

Stigmasterol Campesterol 50000

40000

30000

20000

10000

Brassicasterol

Ergost-7-en-3-ol

Sitostanol Delta-5-Avenasterol

Stigmast-22-en-3-ol

Stigmasta-5,24-dienol

Campestanol

24-Methylene cholesterol

Stigmast-7-enol

Clerosterol d5,23-Stigmastadienol + Clerosterol

Unk

Cholesterol

Stigmasta-5,7,22-trien-3-ol Delta-7-avenasterol

Unk

Ergosterol Unk

Unk

Unk Unk

Unk

Unk Unk 0 Unk

16,25 16,50 16,75 17,00 17,25 17,50 17,75 18,00 18,25 18,50 18,75 19,00 19,25 19,50 19,75 20,00 20,25 20,50 20,75 21,00 21,25 21,50 21,75 22,00 min

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Metod D-1 Datafile Name:Srigley2018__RS1896_AV-40_gradu_soy_speed_3_Robin_18.9.2019_004.gcd Sample Name:AV-40_gradu_soy_speed_3 Sample ID:RS1896

uV ISTD

25000 Sitosterol

Stigmasterol Campesterol

20000

15000

10000

5000 Brassicasterol

Sitostanol

Delta-5-Avenasterol

Stigmast-22-en-3-ol

24-Methylene cholesterol

Campestanol

Ergost-7-en-3-ol

Cholesterol

Fucosterol + unk+ Fucosterol

Clerosterol d5,23-Stigmastadienol + Clerosterol

Stigmast-7-enol

Unk

Ergosterol

Unk Delta-7-avenasterol 0 Unk

-5000 11,0 12,0 13,0 14,0 15,0 16,0 17,0 18,0 19,0 20,0 21,0 22,0 23,0 24,0 25,0 26,0 min

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Metod D-2 Datafile Name:Srigley2018__RS1901_AV-40_gradu_soy_efficiency_3_Robin_18.9.2019_005.gcd Sample Name:AV-40_gradu_soy_efficiency_3 Sample ID:RS1901 uV

27500 ISTD

25000

Sitosterol Stigmasterol 22500 Campesterol

20000

17500

15000

12500

10000

7500

5000 Brassicasterol

2500

Sitostanol

Delta-5-Avenasterol

Stigmast-22-en-3-ol

24-Methylene cholesterol Campestanol

Ergost-7-en-3-ol

Fucosterol + unk+ Fucosterol

Cholesterol

Clerosterol d5,23-Stigmastadienol + Clerosterol Stigmast-7-enol

Unk

Unk Ergosterol 0 Delta-7-avenasterol

-2500

14,0 15,0 16,0 17,0 18,0 19,0 20,0 21,0 22,0 23,0 24,0 25,0 26,0 27,0 28,0 29,0 30,0 31,0 32,0 33,0 34,0 35,0 min

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Metod IT-1 Datafile Name:AV-41_gradu-soy_isothermal-260_4.gcd Sample Name:AV-41_gradu-soy_isothermal-260_4 Sample ID:RS1932 uV 80000

70000

60000

50000

40000

30000

20000

10000

1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 12,0 13,0 14,0 15,0 16,0 17,0 18,0 19,0 20,0 21,0 min

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Metod IT-2 Datafile Name:AV-41_gradu-soy_isothermal-265_4.gcd Sample Name:AV-41_gradu-soy_isothermal-265_4 Sample ID:RS1937 uV

80000

70000

60000

50000

40000

30000

20000

10000

1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 12,0 13,0 14,0 15,0 16,0 17,0 18,0 19,0 20,0 21,0 22,0 23,0 24,0 min

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Metod IT-3 Datafile Name:AV-41_gradu-soy_isotherm-260_linvel-50_4.gcd Sample Name:AV-41_gradu-soy_isotherm-260_linvel-50_4 Sample ID:RS1942 uV

70000

60000

50000

40000

30000

20000

10000

2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 min

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Metod IT-4 Datafile Name:Srigley2018__RS1955_AV-42_soy-sterol_iso-265-lv-60_4_Robin_26.9.2019_005.gcd Sample Name:AV-42_soy-sterol_iso-265-lv-60_4 Sample ID:RS1955 uV

65000

60000

55000

50000

45000

40000

35000

30000

25000

20000

15000

10000

5000

1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 12,0 13,0 14,0 15,0 16,0 17,0 18,0 19,0 20,0 21,0 22,0 23,0 24,0 min

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Metod IT-5 Datafile Name:Srigley2018__RS1950_AV-42_soy-sterol_4_Robin_26.9.2019_007.gcd Sample Name:AV-42_soy-sterol_4 Sample ID:RS1950 uV

50000

45000

40000

35000

30000

25000

20000

15000

10000

5000

2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 min

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Metod IT-6 Datafile Name:Srigley2018__RS1963_AV-42_soy-sterol_iso-270-lv-60_4_Robin_26.9.2019_005.gcd Sample Name:AV-42_soy-sterol_iso-270-lv-60_4 Sample ID:RS1963 uV

60000

55000

50000

45000

40000

35000

30000

25000

20000

15000

10000

5000

1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 12,0 13,0 14,0 15,0 16,0 17,0 18,0 19,0 20,0 21,0 22,0 23,0 24,0 min

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Metod IT-7 Datafile Name:Srigley2018__RS1971_AV-42_soy-sterol_iso-270-lv-50_4_Robin_27.9.2019_005.gcd Sample Name:AV-42_soy-sterol_iso-270-lv-50_4 Sample ID:RS1971 uV

70000

60000

50000

40000

30000

20000

10000

1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 12,0 13,0 14,0 15,0 16,0 17,0 18,0 19,0 20,0 21,0 22,0 23,0 24,0 min

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Metod IT-8 Datafile Name:Srigley2018__RS1979_AV-42_soy-sterol_iso-270-lv-60_correct_4_Robin_27.9.2019_005.gcd Sample Name:AV-42_soy-sterol_iso-270-lv-60_correct_4 Sample ID:RS1979 uV

80000

70000

60000

50000

40000

30000

20000

10000

0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 12,0 13,0 14,0 15,0 16,0 17,0 18,0 19,0 20,0 21,0 22,0 23,0 24,0 min

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______8.2 Bilaga 2

1. Brassicasterol

CAS registry number: 474-67-9

Molecular formula: C28H46O

Molecular weight: 398,68 g/mol

Other names:

• Ergosta-5,22-dien-3-ol, (3β, 22 E) –

2. Campesterol

CAS registry number: 474-62-4

Molecular formula: C28H48O

Molecular weight: 400,68 g/mol

Other names:

• Ergost-5-en-3-ol, (3β, 24 R) –

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

3. Campestanol

CAS registry number: 474-60-2

Molecular formula: C28H50O

Molecular weight: 402,70 g/mol

Other names:

• Ergostan-3-ol, (3β, 5α, 24 R) –

4. Stigmasterol

CAS registry number: 83-48-7

Molecular formula: C29H48O

Molecular weight: 412,69 g/mol

Other names:

• Stigmasta-5,22-dien-3-ol, (3β, 22 E) –

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

5. Sitosterol

CAS registry number: 83-46-5

Molecular formula: C29H50O

Molecular weight: 414,71 g/mol

Other names:

• Stigmast-5-en-3-ol, (3β)- • β-Sitosterol

6. Sitostanol

CAS registry number: 83-45-4 (19466-47-8?)

Molecular formula: C29H52O

Molecular weight: 416,72 g/mol

Other names:

• Stigmastan-3-ol, (3β, 5α) –

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

7. Cholesterol

CAS registry number: 57-88-5

Molecular formula: C27H46O

Molecular weight: 386,65 g/mol

Other names:

• Cholest-5-en-3-ol, (3β) –

8. Cholestanol

CAS registry number: 80-97-7

Molecular formula: C27H48O

Molecular weight: 388,67 g/mol

Other names:

• Cholestan-3-ol, (3β, 5α) – • Dihydrocholesterol

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

9. Ergosterol

CAS registry number: 57-87-4

Molecular formula: C28H44O

Molecular weight: 396,65 g/mol

Other names:

• Ergosta-5,7,22-trien-3-ol, (3β, 22 E) –

10. 24-Methylene cholesterol

CAS registry number: 474-63-5

Molecular formula: C28H46O

Molecular weight: 398,66 g/mol

Other names:

• Ergosta-5,24(28)-dien-3-ol, (3β) –

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

11. Clerosterol

CAS registry number: 2364-23-0

Molecular formula: C29H48O

Molecular weight: 412,69 g/mol

Other names:

• Stigmasta-5,25-dien-3-ol, (3β, 24 S) –

12. Stigmast-22-en-3-ol

CAS registry number: 65494-30-6

Molecular formula: C29H50O

Molecular weight: 414,71 g/mol

Other names:

• Stigmast-22-en-3-ol, (3β, 5α, 22 E, 24ξ) – • Δ22-Stigmastenol

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

13. Ergost-7-en-3-ol

CAS registry number: 70095-94-2

Molecular formula: C28H48O

Molecular weight: 400,68 g/mol

Other names:

• Ergost-7-en-3-ol, (3β, 24 R) – • Δ7-campesterol

14. Stigmasta-5,7,22-trien-3-ol

CAS registry number: 481-19-6

Molecular formula: C29H46O

Molecular weight: 410,67 g/mol

Other names:

• Stigmasta-5,7,22-trien-3-ol, (3β)-

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

15. Δ5-Avenasterol

CAS registry number: 18472-36-1

Molecular formula: C29H48O

Molecular weight: 412,69 g/mol

Other names:

• Stigmasta-5,24(28)-dien-3-ol, (3β)-

16. Stigmasta-5,24-dienol

CAS registry number: 17605-67-3

Molecular formula: C29H48O

Molecular weight: 412,69 g/mol

Other names:

• Stigmasta-5,24(28)-dien-3-ol, (3β, 24 E)- • Stigmasta-5,24-dien-3-ol • Fucosterol

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

17. Stigmast-7-enol

CAS registry number: 521-03-9

Molecular formula: C29H50O

Molecular weight: 414,71 g/mol

Other names:

• Stigmast-7-en-3-ol, (3β, 5α)- • Δ7-Stigmastenol

18. Δ7-Avenasterol

CAS registry number: 23290-26-8

Molecular formula: C29H48O

Molecular weight: 412,69 g/mol

Other names:

• Stigmasta-7,24(28)-dien-3-ol, (3β, 5α, 24 Z)-

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

19. Cycloartanol

CAS registry number: 4657-58-3

Molecular formula: C30H52O

Molecular weight: 428,73 g/mol

Other names:

• 9,19-Cyclolanostan-3-ol, (3β)-

20. 24-Methylene cycloartenol

CAS registry number: 1449-09-8

Molecular formula: C31H52O

Molecular weight: 440,74 g/mol

Other names:

• 24-Methylene cycloartanol • 9,19-Cyclolanostan-3-ol, 24-methylene-, (3β)-

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

21. Citrostadienol

CAS registry number: 474-40-8

Molecular formula: C30H50O

Molecular weight: 426,72 g/mol

Other names:

• Stigmasta-7,24(28)-dien-3-ol, 4-methyl-, (3β, 4α, 5α, 24Z)-

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______8.3 Bilaga 3

Tabell B3.1 presenterar de gaskromatografiska parametrarna för de fyra evaluerade metoderna från litteraturen. Tabell B3.2 presenterar samtliga metoders provpreparering.

Tabell B3.1. GC-parametrar av fyra metoder för analys av växtsteroler. GC-parametrar Metod A Metod B Metod C Metod D

Referens (7) (9) (3) (8)

Injektor: Split 1:50 Injektor: Split 1:100 Injektor: Split 1:25 Injektor: Split 1:25 Bärgas: Helium Bärgas: Väte Bärgass: Väte Bärgas: Väte GC-inställningar Flödeshastighet: 0,8 ml/min Flödeshastighet: 1,0 ml/min Flödeshastighet: 1,0 ml/min Injektionsvolym: 1 µL Injektionsvolym: 1 µL Injektionsvolym: 1 µL Injektionsvolym: 1 µL Tryck i inloppet: 13,6 psi Tryck i inloppet: 9 psi Flödeshastighet Flödeshastighet Flödeshastighet luft 450 ml/min luft 400 ml/min luft 400 ml/min FID-inställningar H2 40 ml/min H2 30 ml/min H2 30 ml/min N2 45 ml/min N2 30 ml/min N2 30 ml/min 5 % fenyl-95 % metylpolysiloxan 5 % fenyl-95 % metylpolysiloxan 5 % fenyl-1 % vinyl-94 % metylpolysiloxan HP-5 eller SE-54 Längd: 30 meter Längd: 30 meter Längd: 30 meter Längd: 30 meter Kolonn inre diameter: 0,32 mm inre diameter: 0,25 mm inre diameter: 0,32 mm inre diameter: 0,32 mm filmtjocklek: 0,25 µm filmtjocklek: 0,25 µm filmtjocklek: 0,25 µm filmtjocklek: 0,25 µm Injektionstemperatur: 310 °C Injektionstemperatur: 325 °C Injektionstemperatur: 290 °C Injektionstemperatur: 290 °C Detektionstemperatur: 310 °C Detektionstemperatur: 325 °C Detektionstemperatur: 290 °C Detektionstemperatur: 290 °C Program: 200-300 °C, 3 °C/min, håll 11,67 Program: 250 °C i 60 min, ramp 15 °C/min Program: 250 °C i 60 min, ramp 15 °C/min Temperaturprogram Program: 300 °C (isotermisk) min till till 265 °C i 5 min, nedkyl till 250 °C, håll 3 min 265 °C i 7 min, nedkyl till 250 °C, håll 3 min Total tid: 15 minuter Total tid: 45 minuter Total tid: 69 minuter Total tid: 71 minuter

Aino Visuri Pro gradu-avhandling ______

Tabell B3.2. Provprepareringsparametrar för metoderna A-D för analys av växtsteroler. Provpreparation Metod A Metod B Metod C Metod D

Referens (7) (9) (3) (8)

5β-cholestan-3α-ol 5β-cholestan-3α-ol 5β-cholestan-3α-ol 5β-cholestan-3α-ol Intern standard 0,6 mg/ml i 1-propanol 5 mg/ml i toluen 5mg/ml i kloroform 5 mg/ml i toluen 500 µL lösning per prov 5 ml ISTD lösning per prov 500 µL lösning per prov 5 ml ISTD lösning per prov ca 1,6-3,2 mg/ml prov i THF ca 15,4 mg/ml prov i toluen och silylerings- ca 10 mg/ml prov i kloroform ca 7,7 mg/ml prov i toluen och silylerings- 500 µL provlösning till analys reagens (pyridin + BSTFA (1 % TMCS)) 200 µL provlösning till analys reagens (pyridin + BSTFA (1 % TMCS)) Provpreparation lösningsmedlet evaporeras 300 µL provlösning till analys med 1 ml lösningsmedlet evaporeras inte 300 µL provlösning till analys med 1 ml 250 µL pyridin och 250 µL BSTFA (1 % 100 µL pyridin och 200 µL BSTFA (1 % TMCS) toluen och lite natriumsulfat TMCS) toluen och lite natriumsulfat steroler: 2,67 – 5,33 mg/ml steroler: 3,55 mg/ml steroler: 2,86 mg/ml steroler: 1,79 mg/ml Mängden prov och ISTD i vialen ISTD: 1 mg/ml ISTD: 0,88 mg/ml ISTD: 0,29 mg/ml ISTD: 0,88 mg/ml förhållande: 2,67-5,33 mg steroler/1 mg ISTD förhållande: 4,03 mg steroler/1 mg ISTD förhållande: 9,86 mg steroler/1 mg ISTD förhållande: 2,03 mg steroler/1 mg ISTD steroler: 2,67-5,33 µg steroler: 3,55 µg steroler: 2,86 µg steroler: 1,79 µg Estimerad mängd injicerat prov ISTD: 1 µg ISTD: 0,88 µg ISTD: 0,29 µg ISTD: 0,88 µg SPLIT 1:50 → ca 52-104 ng prov till kolonnen SPLIT 1:100 → ca 35,1 ng prov till kolonnen SPLIT 1:25 → ca 110 ng prov till kolonnen SPLIT 1:25 → ca 68,8 ng prov till kolonnen