Évaluation De L'impact De L'ajout De Flocons De Macroalgues Sur Le

Évaluation de l’impact de l’ajout de flocons de macroalgues sur le développement et la bioactivité d’un fromage fonctionnel de type Camembert

Mémoire

Attara HELL

Maîtrise en Sciences et technologie des aliments Maître ès sciences (M. Sc.)

Québec, Canada

Évaluation de l’impact de l’ajout de flocons de macroalgues sur le développement et la bioactivité d’un fromage fonctionnel de type Camembert

Mémoire

Attara HELL

Sous la direction de :

Lucie Beaulieu, directrice de recherche Steve Labrie, codirecteur de recherche

Résumé

Les macroalgues Palmaria palmata et Saccharina longicruris sont riches en nutriments et contiennent des molécules antioxydantes ainsi que des inhibiteurs de l’enzyme de conversion de l’angiotensine (ECA). C’est également le cas du fromage de type Camembert. Cependant, l’impact de la combinaison de ces deux aliments sur la bioactivité globale est inconnu. Une analyse de la composition nutritionnelle des algues montre que P. palmata était la plus riche en protéines et en sucres totaux. S. longicruris avait un contenu plus élevé en fibres totales, minéraux totaux, sodium, potassium et lipides. Les capacités antioxydante et inhibitrice de l’ECA de l’extrait soluble > 1 kDa de S. longicruris étaient supérieures à celle de P. palmata. Trois différents traitements de fromages modèles ont été étudiés : un contrôle (CC), un modèle contenant 2 % de P. palmata (C2PP) et un autre contenant 2 % de S. longicruris (C2SL). Durant l’affinage (20 jours), l’évolution du pH du caillé des trois traitements était significativement similaire, partant de 4,89 et terminant à 6,77. La même tendance a été observée pour la capacité antioxydante (ORAC), débutant de 0 pour finir à 41,28 mmol TE/g de fromage. La capacité inhibitrice de l’ECA des trois traitements était significativement similaire au jour 0 (13,20%) et au jour 20 (58,27%). Par contre, C2SL n’avait pas la même courbe d’évolution que CC et C2PP. Ces résultats ont permis de valider la richesse nutritionnelle et des bioactivités des macroalgues. Aucun changement n’a été observé sur le développement et la bioactivité finale des deux fromages aux algues.

iii

Abstract

Seaweeds Palmaria palmata and Saccharina longicruris have high nutritional value and contain antioxidants and angiotensin-converting enzyme (ACE)-inhibitor compounds. This is also applicable to Camembert-type cheese. However, the impact of combining these two foods on the global bioactivity is unknown. The nutritional composition of the two dried seaweeds was characterized. P. palmata had the highest protein and total carbohydrate contents. S. longicruris had the highest contents in total fiber, total minerals, sodium, potassium and lipids. The antioxidant capacity (ORAC) and ACE-inhibitor activity of S. longicruris soluble extract > 1 kDa were higher than P. palmata. Three different types of cheese were studied: cheese control (CC) without seaweeds, cheese with 2% of P. palmata (C2PP) and cheese with 2% of S. longicruris (C2SL). During ripening (20 days), the curd pH of all treatments was significantly similar, starting from 4.89 and finishing at 6.77. The same trend was observed for their ORAC values, starting at 0 and then reached 41.28 mmol TE/g of cheese. The ACE-inhibitor capacity of the three treatments was significantly similar, at day 0 (13.20%) and day 20 (58.27%). On the other hand, C2SL did not have the same evolution curve as CC and C2PP. These results have shown and validated the nutritional value and bioactivities of seaweeds. Also, at the concentration of 2% of seaweeds, no impact was observed on the development and final bioactivities of the two seaweeds cheeses.

Table des matières Résumé ...... iii Abstract ...... iv Liste des tableaux ...... vii Liste des figures ...... viii Liste des abréviations ...... ix Remerciements ...... x Avant-propos ...... xi Chapitre 1 : Introduction ...... 1 Chapitre 2 : Revue de littérature ...... 4 2.1. Les macroalgues ...... 4 2.1.1. Généralité ...... 4 2.1.2. Composition nutritionnelle ...... 8 2.1.3. Effets bénéfiques des macroalgues sur la santé ...... 14 2.1.4. Digestibilité ...... 17 2.1.5. Produits alimentaires et aliments fonctionnels additionnés de macroalgues 18 2.2. Le fromage ...... 19 2.2.1. Généralité ...... 19 2.2.2. Différentes variétés de fromages ...... 19 2.2.3. Fabrication du fromage ...... 20 2.2.4. Les caillés modèles ...... 23 2.2.5. Défauts de contamination du fromage ...... 23 2.2.6. Rôles des constituants du fromage lors de l’affinage ...... 24 2.2.7. Bioactivités ...... 28 2.2.8. Fromages fonctionnels ...... 32 2.3. Fromages aux algues ...... 33 Chapitre 3 : Hypothèse et objectifs ...... 35 3.1. Hypothèse de recherche ...... 36 3.2. Objectifs spécifiques ...... 36 Chapitre 4: Evaluation of the impact of addition of seaweed flakes on the development of bioactivities in functional Camembert-type cheese ...... 37 Abstract ...... 38 Introduction ...... 39

Materials and Methods ...... 41 Chemicals and Reagents ...... 41 Biological Materials ...... 42 Nutritional Composition of Seaweeds ...... 42 Soluble Seaweed Extracts (SSE) ...... 43 Soft Cheese Model Curd Production (SCMC) ...... 43 Seaweeds Flakes Selection for Treatments ...... 44 SCMC Preparation and Ripening Conditions ...... 44 SCMC Water Activity (Aw) ...... 45 Water-Soluble Extract (WSE) from SCMC ...... 45 Angiotensin-Converting Enzyme (ACE)-Inhibitory Activity ...... 45 Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) Assay ...... 46 Statistical Analysis ...... 47 Results and Discussion ...... 47 Nutritional Composition of Seaweeds ...... 47 Seaweeds Extracts and Detection of Bioactivities ...... 49 Soft-Cheese Model Curds (SCMC) Water Activity (Aw) ...... 51 The pH Evolution in Core of SCMC During Ripening ...... 52 Detection of Bioactivities in SCMC During Ripening ...... 53 Conclusion ...... 57 Acknowledgments ...... 58 Chapitre 5 : Discussion et conclusion générales ...... 59 5.1. Discussion générale ...... 59 5.1.1. Retour sur l’hypothèse de la recherche ...... 59 5.1.2. Limites des méthodes expérimentales ...... 60 5.1.3. Défis technologiques ...... 61 5.1.4. Défis du projet de recherche global ...... 62 5.2. Conclusion et perspectives ...... 64 Annexes ...... 65 Fromages aux algues commercialisés ...... 65 Photos des prototypes des fromages aux algues ...... 68 Chapitre 6 : Bibliographie ...... 69

Liste des tableaux

Tableau 1. Composition des acides aminés de différentes algues et d'autres aliments ..... 10

Tableau 2. Différentes bioactivités des produits laitiers fermentés et leurs protéines précurseures ...... 29

Table 3. Nutritional composition of seaweeds in percentage of dry weight (% w/w dry weight)...... 47

Table 4. Protein contents and bioactivity of soluble seaweed extracts (> 1 kDa)...... 49

Table 5. Aw of SCMC without ripening starter cultures...... 51

Tableau 6. Différentes variétés de fromages aux algues commercialisés et leurs descriptions ...... 65

vii

Liste des figures

Figure 1. Description de la filière subflottante utilisée pour la culture des laminaires ...... 6

Figure 2. Saccharina longicruris (a) et Palmaria palmata (b) ...... 7

Figure 3. Structures de phlorofucofuroeckol A, dieckol et dioxinodehydroeckol isolés d’Ecklonia stolonifera ...... 13

Figure 4. Mécanismes potentiels des phlorotannins sur l'ECA et les radicaux libres ...... 16

Figure 5. Variétés des fromages classés selon leur méthode de coagulation et d'affinage et leur texture...... 20

Figure 6. Protocole de production de fromage à pâte molle et à croute fleurie de type Camembert ...... 22

Figure 7. Contribution du sel pour la conservation, la sécurité et la qualité générale du fromage ...... 25

Figure 8. Gradient des composés responsables de l’alcalinisation du caillé du fromage Camembert ...... 27

Figure 9. Évolution de l'activité inhibitrice de l'ECA de différents fromages à pâte ferme et semi-ferme d'origine suisse à partir d’extraits hydrosolubles...... 31

Figure 10. pH evolution of the core curds during ripening ...... 53

Figure 11. ACE-inhibition of curds during ripening ...... 56

Figure 12. Oxygen radical absorption capacity (ORAC) of curds during ripening expressed in mmol TE/g of curd (2 mg/mL)...... 57

Figure 13. Fromage prototype avec Palmaria palmata ...... 68

Figure 14. Fromage prototype avec Saccharina longicruris ...... 68

viii

Liste des abréviations

A Absorbance AAPH 2,2′-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride ACIA Agence canadienne d’inspection des aliments Aw Activité de l’eau CC* Fromage modèle témoin sans ferments d’affinage CC Fromage modèle témoin C2PP* Fromage modèle contenant 2% de Palmaria palmata sans ferments d’affinage C2PP Fromage modèle contenant 2% de Palmaria palmata C2SL* Fromage modèle contenant 2% de Saccharina longicruris sans ferments d’affinage C2SL Fromage modèle contenant 2% de Saccharina longicruris CN Caséines DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl DW Dry weight (poids sec) ECA Enzyme de conversion de l’angiotensine (ACE en anglais) EPA Eicosapentaénoïque FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations (Organisation des Nations unies pour l’alimentation et l’agriculture) GAE Équivalent d’acide Gallique HHL N-hippuryl-His-Leu IC50 Concentration inhibitrice médiane N.D. Not detected (Non détecté) ORAC Oxygen Radical Absorbance Capacity (Capacité d'absorption des radicaux libres) RH Relative humidity (Humidité relative) SCMC Soft cheese model curd (Caillé modèle de type pâte molle) SD Standard deviation (Écart-type) TE Trolox equivalent (Équivalent Trolox) w/v Weight per volume (Poids par volume) w/w Weight per weight (Poids par poids) WSE Water soluble extract (Extrait hydrosoluble)

Remerciements Pour commencer, je tiens à remercier ma directrice de recherche, Dre Lucie Beaulieu, qui m’a permis d’entreprendre un projet de recherche qui me passionne énormément. Son encadrement, sa disponibilité et sa patience m’ont permis d’être un meilleur scientifique. Avoir travaillé avec son équipe m’a également permis d’explorer de nouveaux domaines de la science et d’étancher ma soif d’apprendre et ma curiosité. Aussi, je suis très reconnaissant de sa confiance en mes capacités et de m’avoir laissé réaliser l’aboutissement de mon projet, c’est-à-dire la production pilote des fromages dans une fromagerie commerciale.

Je voudrais également remercier mon codirecteur, Dr Steve Labrie, qui m’a guidé et aidé à approfondir mes connaissances dans le domaine fromager. De plus, son encouragement et son soutien à produire les prototypes de fromages aux algues ont amplifié davantage ma motivation à réussir le projet. De plus, ses conseils sur l’organisation des idées de travail m’ont permis d’atteindre les objectifs.

Je souhaite spécialement remercier Diane Gagnon pour son temps, ses conseils, son support et son encouragement, tout au long de mes expérimentations. Aussi, je tiens à remercier Marie-Hélène Lessard pour son aide et qui m’a montré les bonnes méthodes de travail. Également, je voudrais remercier Céline Paquin, Mélanie Martineau, Pascal Lavoie et Pierre Côté pour leur soutien technique. Aussi, Frédéric Lehance qui a été toujours présent pour mes petits soucis techniques et à mettre la joie dans le laboratoire.

J’aimerais remercier les organismes subventionnaires, le Ministère de l’Agriculture, des Pêcheries et de l’Alimentation du Québec (MAPAQ) et la Fondation INITIA. Également, je souhaite souligner la coopération de nos partenaires pour ce projet de recherche soit l’INAF, Merinov et la Fromagerie des Basques.

Finalement, je tiens à remercier mes amis et collègues de travail qui ont toujours été là pour m’encourager. Puis, je désire simplement dédier toute ma gratitude à ma famille qui a fait de grands sacrifices afin que je puisse réaliser mes rêves et de franchir ce niveau d’étude.

Avant-propos Les travaux de ce mémoire de maîtrise ont été réalisés dans le cadre du projet de « Développement de fromages fonctionnels renfermant des peptides bioactifs de macroalgues d’origine québécoise » soutenus par le programme Innov'Action agroalimentaire du MAPAQ.

Le chapitre 1 correspond à la mise en contexte et à l’introduction du projet afin de souligner la pertinence de ce projet. Par la suite, au chapitre 2, une revue de littérature a été réalisée sur les caractéristiques nutritionnelles et les bioactivités des macroalgues, ainsi que ceux des fromages. Au chapitre 3, l’hypothèse et les objectifs de recherche y sont présentés.

Le chapitre 4 présente l’article scientifique rapportant la méthodologie et les résultats obtenus. Cet article, ayant comme titre «Evaluation of the impact of addition of seaweed flakes on the development of bioactivities in functional Camembert-type cheese», est actuellement en préparation pour être soumis au journal scientifique International Journal of Food Science and Technology. M. Attara Hell est l’auteur principal. Les coauteurs, Dre Lucie Beaulieu et Dr Steve Labrie, ont contribué à l’obtention des fonds de recherche et la supervision des travaux des corrections de l’article. Ils ont été également la directrice et le codirecteur de ce projet de maîtrise et ont offert l’encadrement nécessaire pour la réussite du projet.

Finalement, le chapitre 5 propose une discussion générale sur les résultats obtenus, ainsi qu’une conclusion et les perspectives du projet. Sont présentés à la fin du mémoire, les annexes contenant une liste des fromages aux algues commercialisés et des photos illustrant les fromages prototypes aux algues produits lors du présent projet, suivi de la bibliographie du mémoire et de l’article.

Chapitre 1 : Introduction

Les macroalgues sont des aliments qui suscitent de plus en plus d’intérêt. Leur production mondiale ne cesse de croître. Entre 2005 et 2014, elle a plus que doublé pour atteindre 27,3 millions de tonnes annuellement, ce qui représente une valeur économique mondiale de 6,4 milliards de dollars américains. La production mondiale provient essentiellement de culture de macroalgues en provenance d’Asie. La Chine et l’Indonésie sont les principaux producteurs avec 85,7% de la part mondiale (FAO, 2016). La consommation de ces macroalgues est également concentrée en Asie. À titre d’exemple, au Japon, la consommation moyenne de macroalgues est de 1,9 kg/an par habitant (Matsumura, 2001). Or, les pays occidentaux s’intéressent de plus en plus aux macroalgues (Hein, 2016; Mouritsen, 2012; Mouritsen et al., 2012; Rioux et al., 2017).

Traditionnellement, l’industrie alimentaire occidentale s’est surtout intéressée aux polysaccharides extraits des macroalgues utilisés comme ingrédients technologiques (Hernandez-Carmona, 2013; Mabeau & Fleurence, 1993). Aujourd’hui, la consommation des macroalgues tend à changer, car on les utilise de plus en plus comme aliment entier ou comme ingrédient. Une émergence de nouveaux produits développés à base de macroalgues marque donc les nouvelles tendances alimentaires (Rioux et al., 2017). À titre d’exemple, des produits comme des pâtes entièrement faites d’algues sont disponibles sur le marché (World Food Innovations, 2017). Plusieurs groupes de recherche se penchent aussi sur l’incorporation de macroalgues ou de leurs extraits solubles bruts dans des aliments, comme le pain, le yogourt, le jambon ou même la crème glacée (Barbieri et al., 2016; Fitzgerald et al., 2014b; Mouritsen et al., 2012; Prabhasankar et al., 2009; Tavares Estevam et al., 2016). Ces dernières recherches avaient pour but de développer de nouveaux aliments avec des saveurs typiques ou d’en améliorer les bienfaits sur la santé, afin de créer des aliments fonctionnels. En effet, les macroalgues sont riches en nutriments et contiennent notamment une quantité considérable de fibres, de minéraux et de protéines (Mabeau & Fleurence, 1993; MacArtain et al., 2007; Rioux

et al., 2007; Tibbetts et al., 2016). De plus, plusieurs études ont démontré les bioactivités des algues, qui seraient bénéfiques sur la santé humaine par leurs effets antioxydants, anticancéreux et antihypertenseurs potentiels (Beaulieu et al., 2015; Boisvert et al., 2015; Hamed et al., 2015; Liu et al., 2015; Plaza et al., 2008).

Le fromage est un aliment qui est déjà bien établi dans la culture occidentale. Riche en nutriments, il fait partie des produits laitiers qui sont suggérés dans le guide alimentaire canadien. Il est conseillé de consommer entre 2 à 4 portions de produits laitiers par jour (Santé Canada, 2011). Aussi, cet aliment fermenté est également reconnu pour sa bioactivité. Tout comme les macroalgues, les fromages contiennent naturellement des composés ayant des effets antioxydants et antihypertenseurs (Choi et al., 2012; Crichton & Alkerwi, 2014; Crichton et al., 2012; Gupta et al., 2009; Sieber et al., 2010).

La combinaison des macroalgues et du fromage est une idée originale qui permet de créer un aliment fonctionnel. Le concept d’incorporer des macroalgues aux fromages a été exploité en Europe où ils sont déjà commercialisés, notamment Le Ti Pavez aux algues (Bretagne, France) et le Carrigaline Dillisk Seaweed Cheese (Irlande). Cependant, les produits existants sont de fabrication artisanale et aucune étude scientifique n’a exploré l’impact de la présence des macroalgues sur les bioactivités globales du fromage ainsi produit.

Des études ont démontré l’amélioration de la capacité antioxydante de certains fromages assaisonnés de fines herbes comparativement à leur formulation originale. Cela a été démontré notamment pour le feta (Apostolidis et al., 2007), de même que pour du fromage bleu dans lequel l’incorporation de poudre de brocoli a été effectuée (Sharma et al., 2011). Quant aux macroalgues, l’incorporation de 4% d’hydrolysat de protéines de la macroalgue Palmaria palmata dans le pain a démontré des effets inhibiteurs de l’enzyme de conversion de l’angiotensine-I, qui est responsable de l’hypertension artérielle (Fitzgerald et al., 2014b). Ces résultats prometteurs suggèrent une possible synergie de la combinaison des macroalgues et du fromage pour en faire un « super aliment » ou un aliment aux propriétés nutritionnelles améliorées.

Le présent projet vise à caractériser l’impact de l’ajout de flocons de macroalgues au fromage de type Camembert. Afin d’y arriver, la composition nutritionnelle des macroalgues P. palmata et S. longicruris sera caractérisée, ainsi que la mise en évidence des activités biologiques de leur extrait aqueux. Par la suite, le pH des caillés modèles de type Camembert incorporés de flocons de macroalgues et leurs bioactivités seront mesurés tout au long de l’affinage.

Cette étude est un premier pas vers la compréhension de l’impact de l’incorporation des macroalgues dans le fromage de type Camembert. Ceci permettra également de développer un nouveau type de fromage en Amérique du Nord. La création de fromages contenant des macroalgues faits d’ingrédients produits et récoltés au Québec permettrait aux fromagers québécois de se démarquer des produits importés de l’étranger dont le volume est estimé à près de 22 000 tonnes par année (Agriculture et Agroalimentaire Canada, 2016).

Chapitre 2 : Revue de littérature

2.1. Les macroalgues

2.1.1. Généralité Les algues sont considérées comme les ancêtres de la vie terrestre et sont divisées en deux grandes catégories : les microalgues (unicellulaires) et les macroalgues (pluricellulaires) (Campbell & Reece, 2007). Ce sont les macroalgues qui ont fait l’objet de cette étude. Ces dernières sont regroupées sous trois espèces différentes selon la nature de leurs pigments : les algues brunes (Phéophycées), les algues rouges (Rhodobiontes) et les algues vertes (Chlorophyceae) (MacArtain et al., 2007). Leur structure biologique est plus simple que les végétaux terrestres puisque les macroalgues ne possèdent ni racines, ni tiges, ni feuilles véritables. Elles sont composées de crampon qui ressemble à des racines leur permettant de se fixer à une surface immobile, un stipe en guise de tige et de frondes servant comme surface de la photosynthèse (Campbell & Reece, 2007; MacArtain et al., 2007).

2.1.1.1. Production des macroalgues En 2014, la production mondiale de plantes aquatiques estimée par la FAO était de 27,31 millions de tonnes. Parmi toute cette production, surtout concentrée en Asie, les macroalgues Kappaphycus alvarezii, Eucheuma spp. et Laminaria (Saccharina) japonica étaient les plus exploitées (18,65 millions de tonnes). En Amérique du Nord, la production aquacole correspondait à seulement 0,89% de la production mondiale (FAO, 2014). Elle tendra certainement à augmenter pour répondre à la demande asiatique puisque, depuis quelques années, ceux-ci sont confrontés à des problèmes importants de pollution en plus de contraintes géographiques telles que la raréfaction des zones marines disponibles (Litzler, 2012).

Les macroalgues sont exploitées de deux façons : par l’algoculture (la culture d’algues) et la récolte des algues sauvages. Les algues sont obtenues généralement par la récolte directement de leur environnement de croissance ou en bord de plages, qui sont cependant de moins bonnes qualités que celles cultivées (Beaulieu et al., 2016). Cette faible qualité est principalement expliquée par le manque de

contrôle sur leur condition au moment de la récolte, notamment quant à leur âge et à l’uniformité des espèces disponibles (Beaulieu et al., 2016). C’est pour cette raison que 95,5% de la production mondiale des algues est faite en aquaculture afin d’assurer une production plus homogène (Beaulieu et al., 2016). Au Québec, les macroalgues sont encore obtenues par les récoltes sauvages, mais la tendance change puisque de nouvelles opportunités d’affaires s’ouvrent afin de répondre à la part de marché laissée vacante par l’Asie (Beaulieu et al., 2016). La méthode de culture sur filière (corde) développée en Asie se fait de plus en plus présente pour la production des algues laminaires (Lachance et al., 2013). De façon expérimentale, plusieurs algues rouges, comme P. palmata, peuvent être cultivées en bassin, à petite échelle dans les laboratoires ou dans de grands bassins (Lionard et al., 2014).

L’algoculture se fait sur des fermes marines, qui sont des espaces délimités directement en mer (Lachance et al., 2013). Toutefois, la première étape de cette production se déroule dans des écloseries terrestres. Elle commence avec la fixation des plantules des macroalgues sur des cordes. À la suite d’une croissance de cinq semaines, qui s’effectue durant l’automne, les algues fixées aux cordes sont transportées aux fermes marines où elles sont mises à l’eau, fixées sur des filières subflottantes. Les cordes sont maintenues à des profondeurs contrôlées grâce à des flotteurs et sont attachées à des structures de béton au fond de l’eau à chacune de leur extrémité (Figure 1). Les filières sont initialement maintenues à une profondeur de 5-7 m, à la protection des intempéries de l’hiver. Au printemps, elles sont remontées à une profondeur de 3-4 m afin de permettre aux algues de maximiser leur croissance (Lachance et al., 2013). Finalement, les algues laminaires, comme S. longicruris, sont récoltées au début de l’été, lorsqu’elles ont atteint une longueur de 2 à 3 m, soit à un âge d’environ 8 à 10 mois (Lachance et al., 2013; Tamigneaux et al., 2013).

Pour les macroalgues de plus petites tailles, comme P. palmata, leur culture en bassin est possible. Les avantages de la production en bassin sont le contrôle du développement de la biomasse et la facilité de la récolte (Le Gall et al., 2004). En général, ce sont de jeunes macroalgues récoltées dans la nature qui sont mises

dans les bassins pour y être cultivées. La taille des bassins de culture peut varier selon les producteurs, par contre le principe reste essentiellement similaire. Les lieux de production sont généralement près des côtes puisque c’est l’eau de la mer qui y est directement pompée pour alimenter les bassins. Ainsi, grâce au système de pompage, l’eau des bassins est continuellement renouvelée. Selon les besoins, elle peut également être enrichie d’azote et d’autres éléments nutritifs essentiels pour la croissance des macroalgues (Beaulieu et al., 2016). De l’air est aussi injecté dans les bassins afin d’oxygéner l’eau et de simuler le mouvement des vagues dans la mer (Le Gall et al., 2004). Finalement, la luminosité peut être aussi contrôlée selon le lieu où les bassins sont installés, à l’extérieur ou à l’intérieur. L’exposition à la lumière est ajustée en fonction des besoins de croissance des macroalgues. Plusieurs études se sont d’ailleurs intéressées à l’amélioration du rendement de la production (Pang & Lüning, 2004). La Figure 2 présente deux macroalgues exploitées au Québec, S. longicruris et P. palmata.

Grâce à leur disponibilité au Québec et l’intérêt pour ces macroalgues, plusieurs entreprises productrices ont vu le jour en Gaspésie durant les dernières années. Les entreprises Varech Phare Est (2017) et Un Océan de Saveurs (2017) en sont des exemples.

Figure 1. Description de la filière subflottante utilisée pour la culture des laminaires (Lachance et al., 2013).

a) b)

Figure 2. Saccharina longicruris (a) et Palmaria palmata (b) (Pêches et Océans Canada, 2013; Tamigneaux, 2014).

2.1.1.2. Utilisation et consommation Les macroalgues ont une utilité en technologie alimentaire. Leurs polysaccharides sont extraits pour être ajoutés dans des formulations d’aliments à titre d’agents texturants (Hernandez-Carmona, 2013). L’alginate provenant des algues brunes est utilisé comme agent humectant dans les aliments préparés et procure une texture tendre et uniforme aux aliments surgelés. Quant à l’agar, il remplace la gélatine dans les formulations traditionnelles des bonbons en gel. L’agar est également utilisé pour faire des desserts de gelée végétarienne. Le gel d’agarose est également utilisé dans le domaine de la biologie moléculaire pour la réalisation de gel électrophorétiques. Aussi, la carraghénane, par sa capacité stabilisante, peut être incorporée dans les jus de fruits ou le lait au chocolat pour mettre en suspension les ingrédients solides, comme les pulpes ou la poudre de cacao (Hernandez-Carmona, 2013).

En consommation humaine, les macroalgues sont déjà bien ancrées dans les habitudes alimentaires des populations côtières, et ce, même depuis la préhistoire (Dillehay et al., 2008). Actuellement, c’est surtout en Asie, principalement au Japon, en Corée du Sud, en Chine et aux Philippines, que les macroalgues sont incluses dans la culture gastronomique (Mouritsen, 2012). Les macroalgues peuvent être consommées crues en tant que salade ou incorporées dans les soupes. Ces légumes de mer libèrent, lors de la cuisson dans l’eau, un goût salé et d’umami,

compte tenu de leur quantité importante en minéraux et la présence d’acides glutamique et aspartique (Barbieri et al., 2016). Le Nori (Porphyra yezoensis) qui est bien connu de la population occidentale, est grillé et mis en feuille et sert abondamment dans la cuisine japonaise notamment dans les sushis. Au Canada, l’algue rouge P. palmata est une tradition bien établie des populations d’origine européenne de Nouvelle-Écosse et du Nouveau-Brunswick (Chopin & Ugarte, 2006). Elle est séchée et notamment servie comme apéritif dans les bars (Mahadevan, 2015). Plus récemment, la popularité des algues a même gagné le domaine des boissons alcoolisées. L’algue brune S. longicruris fait partie des ingrédients pour le Gin du St-Laurent (Distillerie du St-Laurent, 2017) et de la bière de la brasserie Marshall Wharf Brewing Co. (Spiegel, 2014).

2.1.2. Composition nutritionnelle Comme tous les végétaux, la composition des algues est variable selon l’espèce et son environnement de croissance (Banerjee et al., 2009). Les algues sont reconnues pour leur valeur nutritionnelle élevée. Elles sont entre autres une excellente source de glucides, de protéines, de vitamines et de minéraux (MacArtain et al., 2007).

2.1.2.1. Protéines Teneur en protéines des algues Les algues rouges sont reconnues pour leur teneur élevée en protéines. Cette valeur peut atteindre 47% de la masse sèche alors que les algues brunes en contiennent entre 3 et 15% et entre 9 et 33% pour les algues vertes (Fleurence, 2004; Fujiwara- Arasaki et al., 1984; Young & Smith, 1958). Ces protéines sont composées d’une très grande diversité d’acides aminés essentiels dont la composition est très variable en fonction des espèces. Le profil en acides aminés essentiels de ces protéines est souvent comparable à d'autres protéines alimentaires telles que les légumineuses ou les œufs (Fleurence, 2004). Par exemple, pour une espèce d’algue brune comme Laminaria digitata, les acides glutamique et aspartique représentent 18% de la teneur totale en acides aminés (Augier & Santimone, 1978). En revanche, cette variabilité dans les proportions en acides aminés, selon les espèces, peut être

intéressante selon l’utilisation visée. Par exemple, l’algue P. palmata pourrait être utilisée comme un supplément en méthionine (2 mg/100 g d’algue sèche), selon une recommandation de la FAO (Fleurence, 1999). Le Tableau 1 présente la composition des acides aminés des différentes algues en comparaison avec d’autres aliments.

Facteur de conversion de la teneur en azote en teneur de protéines des algues Les méthodes de quantification de la teneur en protéines dans les aliments, comme celle de Kjeldahl, mesurent la teneur en azote total qu’ils contiennent. Cette quantité d’azote est convertie ensuite en quantité de protéines via un facteur de 6,25 (AOAC, 2002; Jones, 1931). Cependant, les algues contiennent une proportion d’azote qui n’est pas d’origine protéique. En effet, l’azote peut provenir des pigments, comme la chlorophylle et la phycoérythrine, et de composés inorganiques, comme le nitrite, le nitrate et l’ammoniac (Lourenço et al., 1998). Ainsi, l’utilisation du facteur de conversion traditionnel peut surestimer la valeur de protéines des algues. Même si la teneur en protéines peut varier par rapport à la teneur en azote d’une espèce d’algues à l’autre, des études ont été réalisées afin de déterminer le facteur de conversion adéquat. Le facteur de 4,92 a été suggéré par Lourenço et al. (2002) pour une estimation plus précise de la teneur totale en protéines des algues.

Tableau 1. Composition des acides aminés de différentes algues et d'autres aliments (tiré intégralement de Fleurence, 2004).

(1) (Augier & Santimone, 1978); (2) (Fujiwara-Arasaki et al., 1984); (3) (Fleurence, 1999); (4) (Morgan et al., 1980); (5) (Young & Smith, 1958); (6) (Fowden, 1954).

En plus de leur potentiel nutritionnel, les acides glutamique et aspartique retrouvés dans L. digitata sont également source du goût de l’umami. Cette algue est, entre autres, très proche de L. japonica qui est à l’origine de la découverte du glutamate monosodique, un rehausseur de saveur très utilisé dans la cuisine asiatique (Marcus, 2005). D’autres acides aminés contribuent également au goût des macroalgues. L’alanine et la proline contribuent au goût sucré des macroalgues, alors que l’isoleucine, la leucine et la valine retrouvées dans le dashi de P. palmata sont responsables de l’amertume (Mouritsen et al., 2012).

2.1.2.2. Lipides Les algues contiennent une faible teneur en lipides, soit jusqu’à 5% de la masse sèche (Nelson et al., 2002). La qualité des acides gras contenus dans les algues est non-négligeable puisque leur teneur en acides gras Oméga-3 et Oméga-6 représente jusqu’à la moitié de la totalité des acides gras. De plus, le ratio de ces

deux acides gras insaturés (ω6/ω3) est plus faible que 10 ce qui est idéal du point de vue nutritionnel (Mahan & Escott-Stump, 2000). Le plus haut ratio retrouvé dans les macroalgues était de 1,32 avec Himanthalia elongata, alors que P. palmata était à 0,13 (Sánchez-Machado et al., 2004). Peu importe la provenance de la macroalgue, cultivée ou sauvage, des chercheurs ont montré que P. palmata avait une abondance en acides myristique (C14:0), palmitique (C16:0) et eicosapentaénoïque (EPA) (C20:5 ω3) (Mishra et al., 1993).

2.1.2.3. Minéraux Les algues marines retrouvées dans un milieu océanique contiennent une concentration importante en minéraux. La teneur totale en minéraux varie en fonction des espèces d’algues, mais globalement, elle peut atteindre jusqu’à 45% de son poids sec (Sánchez-Machado et al., 2004; Tibbetts et al., 2016; Wang et al., 2010). Puisque ces végétaux vivent dans l’eau salée, leur teneur en sodium est très élevée. Une algue rouge comme P. palmata en contient 255,2 mg/100 g sur base humide, alors qu’une algue brune comme L. digitata en contient beaucoup plus, 624,6 mg/100 g sur base humide. D’autres minéraux importants sont également présents en proportions importantes. Par exemple, pour une portion de 8 g sur base humide de P. palmata, la teneur en potassium et en calcium est de 74,4 mg et 584,8 mg, ce qui représente 10,6% et 16,7% de l’apport quotidien suggéré, respectivement (Committee on Medical Aspects of Food and Nutrition Policy, 1991). En ce qui concerne l’iode, celui-ci peut atteindre 3 650% de la valeur quotidienne suggérée (Institut de Phytonutrition, 2004; MacArtain et al., 2007).

2.1.2.4. Sucres La quantité totale de sucres des macroalgues est, la plupart du temps, déterminée par différence, soit par la soustraction de la masse totale par la somme de la teneur en lipides, en protéines, en minéraux et en humidité (Tibbetts et al., 2016). La variation de la teneur en sucres peut être très grande selon la méthode utilisée pour mesurer les autres constituants, ce qui rend parfois difficile la comparaison entre les études (MacArtain et al., 2007).

Dans le cas des macroalgues, ce sont surtout les polysaccharides qui intéressent le domaine de la technologie alimentaire et de la nutrition. Les polysaccharides sont retrouvés en grande quantité dans la paroi cellulaire et ont un rôle très important pour la structure, la solidité et la flexibilité de la plante. Ces sucres sont aussi mis en réserve comme source d’énergie et régulent l’équilibre ionique dans la cellule (Gupta & Abu-Ghannam, 2011b).

Comme mentionné précédemment, l’alginate, la carraghénane et l’agar sont utilisés comme agents stabilisants et texturants. L’alginate provient des algues brunes, alors que la carraghénane et l’agar proviennent des algues rouges (Mabeau & Fleurence, 1993). D’autres polysaccharides sont également présents dans les algues. Parmi eux, on retrouve des xylanes, de la cellulose et des fucanes (Mabeau & Fleurence, 1993). La plupart de ces polysaccharides ne sont pas digestibles par l’humain, et sont donc considérés comme des fibres alimentaires (Southgate, 1990). Comparativement aux végétaux terrestres, les algues en contiennent autant ou même plus. Par exemple, pour une portion de 8 g de l’algue brune L. digitata ou de l’algue rouge P. palmata, la teneur en fibres totale est respectivement de 6,2 et de 5,4 g (Institut de Phytonutrition, 2004). Comparativement à du riz brun (3,8 g) et une banane (3,1 g), les algues en contiennent presque le double (Institut de Phytonutrition, 2004).

2.1.2.5. Vitamines À la suite de stress imposés dans leur environnement, les macroalgues produisent des composés de protection, dont les vitamines, qui ont un rôle comme antioxydants. Les vitamines hydrosolubles (B et C) et liposolubles (A et E) sont présentes dans les algues (MacArtain et al., 2007). La vitamine E, qui est un puissant antioxydant, est présente en grande quantité dans l’algue P. palmata (1,296 mg/8 g sous base humide d’algues) alors que l’algue laminaire L. digitata n’en contient que seulement 0,275 mg pour une portion de 8 g (sous base humide) (Institut de Phytonutrition, 2004). De plus, contrairement aux plantes terrestres, les algues contiennent la vitamine B12 surtout connue pour son abondance dans les sources animales (Norziah & Ching, 2000). Watanabe et al. (1999) a démontré que

la vitamine B12 provenant des algues est biodisponible lors de la digestion. Pour combler 30% du besoin quotidien en vitamine B12, seulement une quantité de 3 g de P. palmata séchée suffisent (CEVA, 2009).

2.1.2.6. Polyphénols Les algues brunes contiennent des polyphénols suscitant beaucoup d’intérêt à cause de leur bioactivité. Reconnus comme antioxydants et ayant la capacité d’inhiber l’ECA, les phlorotannins, sous-groupe des tannins, sont des polymères de phloroglucinol (Kim et al., 2009). La Figure 3 présente les structures du phlorofucofuroeckol A, du dieckol et du dioxinodehydroeckol isolés d’Ecklonia stolonifera. La teneur en phlorotannins est généralement supérieure dans les algues brunes provenant de l’océan Atlantique et de la région tempérée de l’océan Pacifique comparativement à celles des régions tropicales (Targett & Arnold, 1998). Cette différence pourrait être expliquée par le rôle principal de ces polyphénols dans la construction des parois cellulaires et leur rôle secondaire en tant qu’agent de protection contre les radicaux libres qui sont formés lors d’un stress oxydatif environnemental (Arnold & Targett, 2003).

Figure 3. Structures de phlorofucofuroeckol A, dieckol et dioxinodehydroeckol isolés d’Ecklonia stolonifera (Kim et al., 2009).

2.1.3. Effets bénéfiques des macroalgues sur la santé Un nombre croissant de recherches démontrent des effets bénéfiques potentiels sur la santé des composés provenant des macroalgues. Plusieurs auteurs ont fait des revues de littérature sur ce sujet (Beaulieu et al., 2016; Gupta & Abu-Ghannam, 2011a; Hamed et al., 2015; Kılınç et al., 2013; Yuan & Walsh, 2006). Les protéines et les peptides natifs ou résultants d’une hydrolyse des macroalgues ont démontré des potentiels bioactifs, par exemple, des capacités antioxydantes, antihypertensives in vitro et in vivo (Fitzgerald et al., 2012; Fitzgerald et al., 2014) et antibactériennes (Harnedy & Fitzgerald, 2011). D’autres effets bénéfiques potentiels des macroalgues incluent également les activités anti-cancers, anti-tumorales, antidiabétiques, antiallergiques et antivirales (El Gamal, 2010; Hamed et al., 2015; Harnedy & Fitzgerald, 2011; Tierney et al., 2010). Également, plusieurs études ont démontré la capacité antibactérienne et antifongique des algues (Beaulieu et al., 2015; Peres et al., 2012; Singh et al., 2015).

Dans ce présent projet, les capacités antioxydantes et inhibitrices de l’ECA (antihypertensives) in vitro sont celles qui ont été principalement étudiées.

2.1.3.1. Antioxydants Les activités antioxydantes provenant des différents composés des macroalgues ont été étudiées à plusieurs reprises dans la littérature (Munir et al., 2013). Comme mentionné préalablement, leur environnement de croissance étant très changeant et parfois rude, les algues sont exposées à des stress qui provoquent l’apparition de radicaux libres à l’intérieur de leurs cellules (Yuan et al., 2009). Ceci explique pourquoi les algues ont développé un moyen de défense en produisant plusieurs composés antioxydants (Yuan et al., 2009). La quantité de certains de ces composés varie en fonction de la saison. En effet, les algues produisent moins de glutathions, d’ascorbates, de caroténoïdes et de tocophérols durant l’hiver et le printemps puisqu’elles sont moins exposées à la lumière à cette période (Aguilera et al., 2002; Burritt et al., 2002; Yuan, 2007). La présence des polysaccharides sulfatés, comme le fucoïdane, la laminarine et l’acide alginique, contribue également

à la capacité antioxydante de certaines algues (Rocha De Souza et al., 2007; Wijesekara et al., 2011).

De plus, les polyphénols contribuent grandement aux propriétés antioxydantes des algues. La quantité de polyphénols mesurée dans S. longicruris est de 0,41 ± 0,15% de sa biomasse sèche (Schiener et al., 2014), alors qu’une quantité de 12,8 µg d’équivalent à l’acide gallique a été mesurée dans des extraits méthanoliques de P. palmata (Yuan & Walsh, 2006). Les phlorotannins sont les plus étudiés et font partie de la famille des polyphénols retrouvés en grande quantité dans les algues brunes. Leur pouvoir antioxydant est plus élevé que certains autres antioxydants connus. Comme l’ont montré Kim et al. (2009), la concentration d’efficacité médiane du pouvoir antioxydant mesuré par la méthode DPPH de trois des phlorotannins isolés d'E. stolonifera est plus basse que l’acide ascorbique (10,3 ± 0,5 µM), soit le phlorofucofuroeckol A (4,7 ± 0,3 µM), le dieckol (6,2 ± 0,4 µM) et le dioxinodehydroeckol (8,8 ± 0,4 µM).

Les protéines et les peptides des macroalgues ont également été étudiés pour leur pouvoir antioxydant (Harnedy & Fitzgerald, 2011). L’activité est associée aux protéines de la famille des phycobiliprotéines, aux peptides carnosine et au glutathion (Fleurence, 2004; Sekar & Chandramohan, 2008; Shiu & Lee, 2005). D’autres études ont identifié la protéine RuBisCo comme précurseur des peptides bioactifs chez les macroalgues (Beaulieu et al., 2016; Bondu et al., 2014). Les méthodes d’extraction combinées avec une hydrolyse enzymatique, ou non, ont été réalisées afin de favoriser une extraction d'une plus grande concentration de protéines. Des extraits d’algue P. palmata hydrolysés ont démontré des valeurs ORAC entre 35,80 et 38,78 µmol TE/g, alors que S. longicruris a démontré une bioactivité plus élevée. Un extrait aqueux de poids moléculaire de > 10 kDa avait une valeur d’environ 250 µmol TE/g (Bondu et al., 2014).

2.1.3.2. Capacité inhibitrice de l’enzyme de conversion de l’angiotensine-I (ECA) Les effets antihypertenseurs sont fréquemment mesurés indirectement en utilisant des tests in vitro. La capacité d’un composé ou d’un mélange de composés à inhiber

l’activité de l’enzyme de conversion de l’angiotensine-I en angiotensine-II (ECA) est alors mesurée (Jao et al., 2012). L’angiotensine-II est responsable de la vasoconstriction, ce qui fait augmenter la pression artérielle (Fitzgerald et al., 2004). Les deux principaux groupes de composés inhibiteurs de l’ECA étudiés chez les macroalgues sont les peptides ou protéines et les polyphénols.

En plus des effets antioxydants, les phlorotannins des algues brunes ont une très grande capacité d’inhiber l’ECA. La Figure 4 présente la double action des phlorotannins comme inhibiteurs de l’ECA et antioxydants. Afin de comparer l'efficacité des différents phlorotannins extraits d’Ecklonia cava, Wijesinghe et al. (2011) ont mesuré leur concentration minimale pour inhiber 50% de l’activité de l’ECA (IC50). Ils ont montré que le dieckol avait un IC50 de 1,47 ± 0,04 mM, alors que les autres phlorotannins, comme le triphlorethol-A et l’eckstolonol, avaient des valeurs variant entre 2,01 et 2,95 mM. Le captopril, un composé contenu dans un médicament prescrit aux personnes atteintes de l’hypertension, a été utilisé comme contrôle et avait une valeur d’IC50 de 0,025 ± 0,90 µM (Wijesinghe et al., 2011).

Figure 4. Mécanismes potentiels des phlorotannins sur l'ECA et les radicaux libres (tirée intégralement de Tierney et al., 2010).

En plus de démontrer des effets antioxydants, des extraits d’algues enrichis en peptides et protéines ont été étudiés par plusieurs chercheurs pour la capacité d’inhiber l’ECA (Harnedy & Fitzgerald, 2011). Quant aux macroalgues québécoises, une étude a montré qu’un extrait de peptides de faible poids moléculaire (< 10 kDa) issus d’extraits de P. palmata hydrolysés avec de la chymotrypsine avait un IC50 de 460,05 mg/mL (Bondu et al., 2014). L’identification des protéines précurseures ayant une meilleure activité provenant des mêmes types d’extraits a permis de retrouver l’enzyme de RuBiSCo, des allophycocyanines et des phycocyanines. Ces derniers extraits à une concentration de 5 mg/mL avaient des activités inhibant entre 49,10 et 67,74% de l’ECA (Beaulieu et al., 2016). D’autres études ont mesuré directement la capacité antihypertensive de P. palmata en utilisant des essais in vivo sur un modèle animal du rat. Une hydrolyse des protéines de cette algue rouge avec l’enzyme papaïne a été effectuée et la purification du peptide actif a permis d’identifier la séquence en acides aminés du peptide suivant : IRLIIVLMPILMA. Cet extrait de protéines hydrolysées, ayant une valeur d’IC50 de 3,34 mM, a été donné à des rats à une dose de 50 mg/kg de la masse de l’animal. Les résultats après 24 heures ont révélé une baisse de tension comparable au témoin traité avec du captopril (Fitzgerald et al., 2014a).

2.1.4. Digestibilité Malgré leur richesse nutritionnelle, la disponibilité des protéines de macroalgues n’est pas très élevée. En effet, plusieurs auteurs soulignent la faible digestibilité des protéines algales (Fujiwara-Arasaki et al., 1984; Galland-Irmouli et al., 1999; Mabeau & Fleurence, 1993). Des équipes de chercheurs ont évalué la digestibilité des protéines in vitro à partir d’extraits d’algues. Les extraits solubles de plusieurs macroalgues démontraient une digestibilité d’environ 50% avec la pancréatine à pH basique et de 70% avec la pronase par rapport à la protéine de référence, qui était la caséine (Fujiwara-Arasaki et al., 1984). La même tendance a été observée avec de la poudre de P. palmata, avec une valeur de 56% en utilisant la pepsine et la pancréatine porcine (Galland-Irmouli et al., 1999).

Plusieurs raisons peuvent expliquer la faible digestibilité des protéines des macroalgues. Certains composés contenus dans les macroalgues, tels les polyphénols, peuvent inhiber les enzymes responsables de la digestion (Chew & Rodman, 1979). De plus, les polysaccharides rendent inaccessibles les sites de coupure des protéines par les enzymes digestives. Acton et al. (1982) a démontré que le xylane présent dans les macroalgues et retrouvé principalement dans les algues rouges et vertes, peut réduire la digestibilité des protéines en les «entrapant» dans un réseau.

Une des solutions explorées afin d’augmenter la digestibilité des protéines algales est la fermentation. En utilisant des moisissures comme Aspergillus orysae, Rhizopus macroscopus et Trichoderma pseudokoningii pour effectuer la fermentation, la digestibilité des protéines a plus que doublée et peut atteindre 73% (Fleurence, 2004). La raison de cette amélioration est la capacité de ces moisissures à produire des glycosidases, comme l’endo- et l’exo-xylanase, la β-glucanase, la β- glucosidase et la cellobiohydrolase qui dégradent la paroi végétale cellulosique (Huang et al., 1983; Wey, et al., 1994).

2.1.5. Produits alimentaires et aliments fonctionnels additionnés de macroalgues En raison de leur haute teneur en nutriments et de leur potentiel bioactif, les opportunités de production d’aliments fonctionnels à partir de macroalgues sont grandes. Plusieurs publications scientifiques ont présenté des travaux effectués sur des produits carnés dans l’objectif de réduire les maladies cardiovasculaires (Cardoso et al., 2015). Par exemple, une algue brune, L. japonica a été intégrée dans un pâté de poulet et de porc afin de favoriser la réduction du taux de glucose sanguin, de la proportion de lipoprotéines sanguines de basse densité, ainsi que de la teneur en cholestérol plasmatique (Hyeon & Hwa, 2014). Aussi, dans une formulation d’un jambon, la réduction en NaCl a été également possible en le remplaçant partiellement par un extrait de P. palmata. Une réduction pouvant atteindre jusqu’à 35% du sodium ajouté a été possible sans affecter la qualité organoleptique du produit (Barbieri et al., 2016). Un autre exemple concerne des

essais en laboratoire qui ont été réalisés pour produire un pain enrichi d’extrait de P. palmata. Le but de cette dernière étude était d’obtenir un pain ayant la capacité inhibitrice de l’ECA. Les résultats ont démontré que l’extrait de protéines hydrolysées de cette macroalgue n’avait pas affecté la qualité organoleptique du pain. De plus, même après la cuisson, l’activité inhibitrice de l’ECA était toujours présente avec l’ajout de 4% de cet extrait de protéines dans la formulation (Fitzgerald et al., 2014a).

2.2. Le fromage

2.2.1. Généralité L’histoire des fromages québécois est beaucoup plus jeune que celle des fromages européens. L’influence de la culture anglaise a longtemps limité la production du fromage au Québec à celui de type Cheddar (Les Producteurs de lait du Québec, 2017). Le grand développement des variétés de fromages du Québec n’a commencé seulement qu’à la fin du XXe siècle. Aujourd’hui, plus de 450 variétés de fromages différents sont reconnues et produites au Québec (Les Producteurs de lait du Québec, 2017). Ceci démontre la connaissance et le savoir-faire fromager grandissants au Québec.

2.2.2. Différentes variétés de fromages Les variétés de fromages peuvent être classées de plusieurs façons. Au-delà de l’origine biologique du lait (vache, chèvre, brebis, etc.), les fromages peuvent être divisés selon leur texture, soit comme pâte molle, semi-ferme, ferme ou très ferme (Fox & McSweeney, 2004). Une autre façon de classer les fromages est selon leur type d’affinage. Par exemple, un fromage de type Camembert est considéré comme un fromage à pâte molle à croute fleurie. Le diagramme suivant présente les principales variétés des fromages (Fig. 5).

Figure 5. Variétés des fromages classés selon leur méthode de coagulation et d'affinage et leur texture (tirée intégralement de Fox et al., 2000).

2.2.3. Fabrication du fromage La fabrication fromagère passe par trois étapes importantes, soit la coagulation, l’égouttage et l’affinage (Johnson & Law, 2010). Le but ultime de la fabrication du fromage est la concentration du lait et ainsi d’augmenter sa durée de conservation (Johnson & Lucey, 2006).

La première étape de la production fromagère est la coagulation. Elle se traduit par la dénaturation des micelles de caséines du lait afin de former un gel, nommé le caillé (Fox et al., 2000). Cette étape commence par une acidification du lait par les ferments de bactéries lactiques inoculés. Des bactéries mésophiles sont ajoutées au lait pour transformer le lactose en acide lactique. L’acidification doit se faire jusqu’à pH 5,0-5,3 pour les fromages à pâte ferme et à pH 4,6 dans le cas des fromages à pâte molle, où un réseau de caséines se forme à ce moment (Johnson

& Law, 2010). Certains fromages se limitent seulement à cette étape de coagulation. D’autres nécessitent une autre réaction biochimique pour terminer la coagulation. Dans ce dernier cas, de la présure est ajoutée dans le lait acide pour favoriser davantage la fermeté du caillé. La présure commerciale est composée principalement de l’enzyme de la chymosine. C’est une coagulation dite enzymatique (Ruettimann & Ladisch, 1987).

La deuxième étape de la fabrication fromagère est l’égouttage qui consiste, en quelque sorte, à concentrer le lait. En effet, l’égouttage a pour but de retirer une grande partie de liquide du coagulum. Le caillé est coupé, brassé et mis en moule. Ainsi, le lactosérum est expulsé de la masse et seuls les protéines coagulées, principalement les caséines, le gras et les minéraux restent dans la matrice (St- Gelais & Tirard-Collet, 2002). Le salage du caillé vient ensuite et est très important afin de terminer l’égouttage. De différentes manières, en surface, dans la masse ou en saumure, ce procédé consiste à soutirer une quantité d’eau supplémentaire du caillé grâce à la force osmotique (Guinee, 2004).

Finalement, à l’étape de l’affinage, le fromage développe son goût et ses arômes. Des réactions biochimiques se produisent à l’intérieur du fromage lorsqu’il est entreposé dans des conditions adéquates. Des enzymes naturelles du lait, ou provenant des ferments bactériens et parfois fongiques, hydrolysent les protéines et les lipides pour libérer des composés aromatiques et volatils typiques de chaque fromage. Cette étape peut durer de quelques jours à plusieurs années (St-Gelais & Tirard-Collet, 2002).

Les fromages à pâte molle et à croute fleurie sont des fromages à affinage de courte durée, environ quelques semaines. Plusieurs activités biochimiques et microbiologiques s’y déroulent et sont dues à leur microflore d’affinage complexe. Cette complexité est, entre autres, la raison pour laquelle la structure de ces fromages peut être fragile et facilement perturbée (Spinnler & Gripon, 2004). La Figure 6 présente les principales étapes de production d’un fromage de type Camembert.

Figure 6. Protocole de production de fromage à pâte molle et à croute fleurie de type Camembert (tirée intégralement de Fox et al., 2000).

2.2.4. Les caillés modèles Le fromage étant une matrice complexe et contenant une très grande diversité de composés, il est difficile de produire un milieu de culture lui ressemblant. De plus, produire des fromages selon les traitements désirés peut rapidement devenir incontrôlable et couteux (Rehman et al., 2001). Ce sont pour ces raisons que depuis plusieurs années, des chercheurs se sont tournés vers les caillés modèles pour l’étude du comportement du fromage (Lessard et al., 2012; Singh & Kristoffersen, 1971). Le caillé modèle est une imitation très proche du fromage régulier, puisqu’il est fait à partir du caillé fromager qui a été stabilisé. Ainsi, cette matrice est composée de tous les éléments présents dans le fromage et offre la possibilité de contrôler la composition de celui-ci (Rehman et al., 2001). Grâce au caillé modèle, le développement de la microflore d’affinage, le changement de la structure du fromage et l’apparition des composés volatils peuvent être plus facilement étudiés (Boutrou et al., 2002; Di Cagno et al., 2006; Jollivet et al., 1993).

2.2.5. Défauts de contamination du fromage La contamination des produits fromagers par des pathogènes (Salmonella spp., Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes et Staphylococcus aureus) est une préoccupation très importante des producteurs. Des outils de contrôle, comme un système de contrôle de la qualité (HACCP) et des règles d’hygiène tout au long de la production permettent de minimiser les risques (Donnelly, 2004). Par contre, d’autres problèmes de contamination, provenant de la microflore d’altération, peuvent aussi survenir et provoquer des défauts de qualité et d’esthétique du produit fini.

Dans certains cas, le résultat de la contamination se solde en des défauts de croute ou de présentation. Souvent, ces défauts proviennent de la microflore normale du fromage. C’est un développement non désiré ou trop important d’un ferment provenant du fromage lui-même ou de la microflore de l’environnement du lieu de production (Eck & Gillis, 2006). Parmi ces problèmes, très fréquents chez les fromages à pâte molle et à croute fleurie, les accidents du «bleu» mènent à des tâches bleu-verdâtre sur la surface du fromage. Une des causes est la présence de

Penicillium expansum, une moisissure qui se développe mieux dans un milieu plus acide que Penicillium camemberti (Guéguen, 1988). Il existe également des accidents nommés «poil de chat», qui se présentent sous forme de duvet blanchâtre qui peut devenir grisâtre à noirâtre. Ce défaut est dû à des moisissures dont, entre autres, Mucor racemorus provenant de l’environnement qui contaminent la surface des fromages (Devoyod, 1988; Guéguen, 1992). Les fromages à pâte molle sont aussi assujettis au défaut de la «graisse» qui survient quand Geotrichum candidum se développe abondamment. La surface du fromage devient alors plissée et graisseuse, ce qui empêche le développement de P. camemberti (Guéguen, 1988, 1992).

2.2.6. Rôles des constituants du fromage lors de l’affinage Afin d’éviter tout problème relié aux défauts qui peuvent survenir lors de l’affinage, les rôles des principaux agents d’affinage doivent être bien compris, notamment dans le cas des fromages ayant une microflore complexe comme celle du type Camembert.

2.2.6.1. Sel Le sel est nécessaire dans le fromage et y occupe plusieurs fonctions (Fig. 7). La première est sa contribution au goût. Le sel a la capacité de masquer et de rehausser certaines saveurs développées dans le fromage durant son affinage (Hardy, 2006). La deuxième concerne son rôle dans l’expulsion de l’eau contenue dans la matrice lors de l’égouttage final du fromage. De plus, dans certains cas, il aide à former la croute du fromage. Également, le sel contrôle les réactions biochimiques (enzymatiques) et microbiologiques (contrôle des ferments, inhibition des microflores délétères). Ainsi, le fromage peut être mieux conservé (Hardy, 2006).

La présence de sel dans un aliment comme le fromage abaisse son activité de l’eau (Aw). Les réactions biochimiques qui participent au développement de saveurs et d’arômes du fromage ont besoin d’une Aw minimale. Par exemple, les réactions enzymatiques comme celles catalysées par les peroxydases sont inactives à Aw 0,85, alors que les lipases peuvent aller jusqu’à 0,1 (Ludwig, 1963). Cette

influence du sel sur les activités enzymatiques contribue aussi au développement de la texture du fromage (Fox et al., 2000). Également, en réduisant l’activité de l’eau, cela permet de contrôler le développement de l’activité des ferments. Ainsi, l’Aw du fromage diminue durant l’affinage, car le sel contribue à retirer l’eau de la matrice fromagère (Marcos & Esteban, 1982). Ainsi, ce changement d’Aw explique en partie la succession de la microflore d’affinage du fromage. Des bactéries moins halophiles peuvent se développer initialement. Ensuite, elles laisseront leur place à d’autres microorganismes plus résistants aux basses valeurs d’Aw (Hardy, 2006). Par contre, l’Aw seule ne peut pas contrôler le développement des microorganismes, car certains non désirables peuvent tout de même croître. En effet, les valeurs de l’Aw des fromages sont de 0,985 pour le Camembert, 0,950 pour le Cheddar et de 0,917 pour le parmesan (Rüegg & Blanc, 1981). Certaines moisissures, désirables ou non, sont capables de se développer à partir d’une Aw de 0,70 (Hardy, 2006). La Figure 7 résume les rôles du sel dans le fromage.

Figure 7. Contribution du sel pour la conservation, la sécurité et la qualité générale du fromage (tirée intégralement de Guinee, 2004).

2.2.6.2. Ferments d’affinage Plusieurs facteurs influencent le fromage durant son affinage. L’un des plus importants est sans doute la présence des microorganismes, soit la microflore d’affinage (Fox et al., 2000). Pour un fromage à pâte molle et à croute fleurie comme le Camembert, le rôle des ferments est primordial. Le phénomène de succession des microflores est déterminé par la composition chimique de la matrice fromagère.

Initialement, les bactéries lactiques sont introduites dans le lait lors de la fabrication, afin de réduire le pH. Ainsi, le caillé est un milieu sélectif pour la croissance microbienne. Seuls les organismes acidophiles, comme les levures et moisissures, ont la capacité de croître (Spinnler & Gripon, 2004).

Des levures, comme G. candidum, capables de résister à des pH acides (< 5), apparaissent durant les premières journées de l’affinage (Leclercq-Perlat et al., 2004). En métabolisant le lactate et en produisant de l’ammoniac, la croissance de G. candidum engendre l’élévation du pH de la surface du caillé, ce qui permet à des moisissures plus acidosensibles de se développer (Boutrou & Guéguen, 2005). Après 6 à 7 jours d’affinage, le mycélium de la moisissure P. camemberti est visible à la surface du fromage. Cette croissance est favorisée par l’élévation du pH, accentuée par G. candidum. Après 2 à 3 jours, la surface du fromage est complètement recouverte du duvet blanc de la moisissure. Ce recouvrement est voulu, car sa présence protège le fromage des autres microorganismes non désirables par encombrement de l’espace. Sa croissance accélère le changement du pH de la surface en consommant également le lactate disponible (Spinnler & Gripon, 2004). Ainsi, le pH au centre du caillé est plus acide qu’à la surface créant alors un gradient. Tout au long de l’affinage, l’élévation du pH progresse graduellement vers le centre. La Figure 8 présente les directions que prennent les différents composés responsables du changement de pH du caillé.

Figure 8. Gradient des composés responsables de l’alcalinisation du caillé du fromage Camembert (tirée intégralement de Spinnler & Gripon, 2004).

De plus, l’évolution du pH du caillé se rapprochant de la neutralité favorise l’activité des différentes enzymes présentes. Ces enzymes sont déjà présentes dans le lait (plasmine), ajoutées lors de la fabrication (présure) ou produites par les ferments lactiques ou lors de l’affinage (Boutrou & Guéguen, 2005). Elles hydrolysent des protéines et des lipides du caillé, conduisant ainsi à l’apparition des composés aromatiques et volatils responsables de la saveur et du changement de la texture typique du fromage (Boutrou & Guéguen, 2005).

Protéases Initialement, l’activité de la présure est très dominante, puisqu’elle est plus active à un pH acide. Le caillé du fromage de type Camembert contient une plus grande quantité de présure à l’intérieur de sa masse (Vassal & Gripon, 1984). L’apparition de la caséine-αs1-I est détectable partout à travers le caillé, ce qui est le résultat de la dégradation de la caséine-αs1 par la présure. Cette activité est toutefois ralentie et inhibée à la suite de l’augmentation du pH du milieu (Vassal & Gripon, 1984). Ensuite, à un pH plus près de la neutralité, ce sont les exo- et endoprotéases des levures et moisissures, combinées à celles des bactéries lactiques, qui sont activent.

L’hydrolyse des caséines α et β continue à se réaliser et à engendrer l’apparition des peptides et des acides aminés qui à leur tour sont transformés en composés aromatiques (Adda et al., 1982). Une activité trop importante des protéases peut toutefois conduire à la génération d’amertume dans le fromage (Vassal & Gripon, 1984).

Lipases Les levures et les moisissures qui composent la microflore secondaire du Camembert sont capables de produire une large gamme de lipases. Ces enzymes dégradent les triglycérides du caillé pour libérer des di- et des monoglycérides ainsi que des acides gras libres (Spinnler & Gripon, 2004). La transformation de ces composés lipidiques est très importante pour la qualité organoleptique du fromage. En ce qui concerne la texture, la présence d’une grande quantité de monoglycérides permet de donner au fromage une tendreté en bouche. Ceux-ci agissent comme agents émulsifiants, réduisant la taille des globules de gras de la matrice du fromage (Miettinen et al., 2002). Par contre, cette texture n’est pas uniforme dans l’ensemble du fromage. Les lipases étant sensibles aux pH acides, elles commencent à agir seulement en dessous de la croute du fromage et progressivement vers le centre. C’est pour cette raison qu’un fromage Camembert jeune a une texture coulante seulement à la périphérie située sous la croute (Spinnler & Gripon, 2004). Finalement, les acides gras sont des précurseurs des composés aromatiques du fromage. Ce sont les moyens et petits acides gras (4-12 carbones) qui offrent d’ailleurs les meilleurs seuils de perception olfactifs (Molimard & Spinnler, 1996).

2.2.7. Bioactivités De nombreuses études ont démontré les bioactivités in vitro des produits laitiers, notamment celles provenant des peptides. Dans le cas des produits fermentés comme le fromage, des effets immunomodulateurs, anticancéreux, hypocholestérolémiants, antimicrobiens, antihypertenseurs et antioxydants ont été mis en évidence (Choi et al., 2012; Fitzgerald & Murray, 2006; Hernández-Ledesma et al., 2005). Le Tableau 2 présente les différentes bioactivités des peptides et leurs protéines précurseures.

Tableau 2. Différentes bioactivités des produits laitiers fermentés et leurs protéines précurseures (tirée intégralement de Choi et al., 2012).

(Gobbetti et al., 2002; Hayes et al., 2007; Meisel & Bockelmann, 1999; Möller et al., 2008; Smacchi & Gobbetti, 2000; Tidona et al., 2009)

2.2.7.1. Antioxydants Plusieurs auteurs mentionnent que les peptides antioxydants proviennent principalement de l’activité protéolytique de plusieurs bactéries lactiques ajoutées ou indigènes, telles que Lactococcus lactis, Lactobacillus helveticus et Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus (Korhonen & Pihlanto, 2006). Les peptides antioxydants ont surtout été retrouvés dans les extraits solubles (Kuchroo & Fox, 1982). Selon le type de fromage, la capacité antioxydante peut varier. L’analyse du fromage Pecorino a montré une valeur ORAC stable de 20,40 µmol TE/g durant les 60 jours de son affinage (Branciari et al., 2015). Une autre étude a montré que la capacité antioxydante du fromage Cheddar augmentait durant les quatre premiers

mois de son affinage pour atteindre une inhibition de la valeur DPPH à environ 75% pour un extrait aqueux de 10 mg/mL. Une capacité antioxydante décroissante aurait graduellement été ensuite observée avant de se stabiliser entre le septième et le neuvième mois, à environ 40% d’inhibition de la valeur DPPH. Dans la même étude, une corrélation a été observée entre l’augmentation de l’activité antioxydante du fromage par rapport à l’apparition croissante des peptides de petite taille. Les peptides actifs identifiés correspondaient aux fragments f(98-105) de la caséine-β

(VKEAMAPK) et f(80-90) de la caséine-αs1 (HIQKEDVPSER) (Gupta et al., 2009). Par contre, peu d’études ont été réalisées sur les activités antioxydantes du fromage de type Camembert.

2.2.7.2. Capacité inhibitrice de l’enzyme de conversion de l’angiotensine-I (ECA) La capacité d’inhiber l’ECA du fromage provient notamment des peptides résultant de l’hydrolyse des protéines du lait par les protéases des bactéries lactiques présentes (Smacchi & Gobbetti, 2000). Cette activité varie également en fonction du type de fromage et de son âge (Sieber et al., 2010). Certains fromages, comme le Gruyère, semblent avoir une activité qui décroit avec le temps, alors que c’est le phénomène inverse pour le fromage Vacherin Fribourgeois (Sieber et al., 2010). Cependant, les auteurs de ces résultats affirment que la variation de ces activités provient davantage de la méthode de fabrication et d’entreposage durant l’affinage que seulement de la variété (Sieber et al., 2010). La Figure 9 présente l’évolution de l’activité inhibitrice de l’ECA de différents fromages d’origine suisse. Pour les fromages à pâte molle et à croute fleurie, des chercheurs ont présenté un IC50 de 1,3 mg/mL de l’extrait éthanolique d’un fromage Brie (Pripp et al., 2006). Aussi, une extraction effectuée avec le fromage Camembert dilué dans l’eau chaude pour un rapport 1 :10 a donné un IC50 de 16,0 µL/mL (Okamoto et al., 1995). Aucune étude n’a toutefois été portée sur l’évolution de la capacité inhibitrice de l’ECA durant l’affinage d’un fromage de type Camembert.

Figure 9. Évolution de l'activité inhibitrice de l'ECA de différents fromages à pâte ferme et semi-ferme d'origine suisse à partir d’extraits hydrosolubles (tirée intégralement de Sieber et al., 2010).

Plusieurs peptides ont été identifiés comme ayant une capacité d’inhiber l’ECA. Les fractions de la caséine-αs1 f(1-9), f(1-7) et f(1-6) ont été retrouvées dans le fromage Festivo (Ryhänen et al., 2001). Dans le fromage Gouda, la fraction f(1-9) de la caséine-αs1 a également été identifiée, mais aussi la fraction f(60-68) de la caséine- β (Saito et al., 2000). Finalement, pour le fromage Mozzarella, la fraction de la caséine-β f(58-72) a également présenté une capacité inhibitrice de l’ECA équivalente (Smacchi & Gobbetti, 1998).

2.2.8. Fromages fonctionnels Le fromage présente déjà d’excellentes qualités nutritionnelles et bioactives. Toutefois, des chercheurs se sont intéressés à renforcer davantage les bienfaits de ce produit (Giroux et al., 2013; Pouliot-Mathieu et al., 2013). Un des sujets fréquemment étudiés est la possibilité d’augmenter le pouvoir antioxydant du fromage et de le supplémenter en polyphénols.

Des études ont été réalisées afin d’incorporer une quantité de 0,5 mg/mL d’extrait phénolique dans du lait servant à produire du fromage (Han et al., 2011). Neuf fromages différents ont été produits avec de la catéchine, du gallate d’épigallocatéchine, de l’acide tannique, de l’acide homovanillique, de l’hespérétine, du flavone, de l’extrait de raisin, de l’extrait de thé vert ou de la poudre de canneberge (Han et al., 2011). Les résultats ont montré que le fromage témoin avait une activité antioxydante de 8,82 TE/g, alors que les fromages enrichis avaient des valeurs allant de 26,94 à 31,14 TE/g. Le fromage contenant l’extrait de raisin a démontré la plus forte capacité antioxydante (Han et al., 2011).

Sharma et al. (2011) ont incorporé de la poudre de brocoli dans un fromage de type Bleu. Les meilleurs résultats ont été obtenus avec de la poudre de brocoli séché par lyophilisation, ayant conservé la plus grande quantité de polyphénols et le plus grand pouvoir antioxydant. Le fromage préparé avec une concentration de 3% de poudre de brocoli (sur base sèche du fromage) a démontré une quantité de plus du double en polyphénols totaux (3 389,9 GAE µg/g, équivalent d’acide Gallique) par rapport au témoin (1 298,5 GAE µg/g). La concentration de poudre de brocoli a dû cependant être augmentée à une concentration de 5% afin d’améliorer significativement son pouvoir antioxydant, ayant une valeur de 25,4 AAE µg/g (équivalent d’acide ascorbique) comparativement au témoin qui avait une valeur de 12,6 AAE µg/g. Cette concentration pouvait être augmentée jusqu’à 20% avant que la qualité organoleptique du fromage ne soit plus acceptable, entre autres au niveau du goût.

Apostolidis et al. (2007), quant à eux, ont mesuré le pouvoir antioxydant et la capacité inhibitrice de l’ECA de différents fromages commerciaux, originaux et contenant des épices. Leurs résultats ont montré que les fromages Cheddar (ail et aneth) et le feta (oignon, poivron rouge et aneth), contenant des épices, avaient un pouvoir antioxydant supérieur à leur formulation originale. Leur capacité d’inhibition du DPPH était d’environ 30% pour les fromages originaux et environ 60% pour ceux additionnés d’épices. Par contre, trois fromages Roquefort commerciaux montraient un pouvoir antioxydant supérieur, même en absence d’épices. Ces fromages avaient un pouvoir d’inhibition du DPPH d’environ 90%. Aucune différence significative n’a été mise en évidence quant à la capacité inhibitrice de l’ECA pour le fromage original comparé au fromage épicé.

2.3. Fromages aux algues Dans le contexte de l’ouverture des frontières pour les produits alimentaires, de plus en plus de produits étrangers se retrouvent en concurrence directe avec les produits québécois. Avec l’Accord économique et commercial global (AECG) entre le Canada et l’Union européenne (UE), l’industrie québécoise des produits laitiers comme celle du fromage devra faire face aux produits concurrents européens (Conseil des industriels laitiers du Québec Inc., 2017). Le développement de nouveaux fromages ayant des valeurs ajoutées pourrait être une solution. Offrir un fromage plus riche en nutriments ayant une nouvelle saveur et fait à 100% de produits québécois pourrait alors devenir une des raisons de se distinguer de la concurrence européenne. L’incorporation des macroalgues P. palmata et S. longicruris dans le fromage pourrait être envisageable puisqu’elles sont riches d’un point de vue nutritionnel. Par exemple, elles contiennent une teneur importante en fibres, protéines et minéraux (MacArtain et al., 2007). Également, elles contiennent des composés bioactifs bénéfiques pour la santé humaine, possédant notamment des capacités antioxydantes et antihypertensives démontrées grâce à des essais effectués in vitro (Beaulieu et al., 2016). Ces mêmes capacités bioactives sont aussi retrouvées dans le fromage (Choi et al., 2012).

Des fromages aux algues sont déjà produits et commercialisés en Europe (l’Annexe 1 présente une liste des fromages aux algues retrouvés sur les différents sites internet commerciaux). Plusieurs vantent le bienfait et la richesse nutritionnelle des fromages aux algues. Le goût de l’iode ou de la mer provenant des algues y est attribué à plusieurs reprises. Toutefois, aucune étude scientifique n’a étudié l’impact de la présence des macroalgues sur le développement et les bioactivités globales du fromage.

Plusieurs défis peuvent être associés à ce projet. Premièrement, des composés antimicrobiens présents dans les macroalgues pourraient interférer notamment sur le développement des moisissures et des levures en surface lors de l’affinage du fromage de type Camembert. Une diminution de la production des composés bioactifs intrinsèques au fromage pourrait être observée, ce qui est non désiré. De plus, deux principaux défis pourraient devoir être surmontés par le fait d’incorporer les macroalgues sous la forme de flocons et non d’extraits concentrés de composés bioactifs : 1) il pourrait y avoir un manque d’uniformité dans la dispersion des flocons de macroalgues dans la matrice fromagère; et ainsi 2) un déséquilibre entre la qualité organoleptique du produit et l’apport en bienfaits sur la santé que peuvent offrir les macroalgues. En comparaison, pour une même quantité de flocons et d’extraits, les flocons seraient moins concentrés en composés bioactifs.

Chapitre 3 : Hypothèse et objectifs

Les informations présentées dans la section de la revue de littérature ont permis de mettre en évidence la richesse nutritionnelle et les bioactivités des macroalgues ainsi que des fromages. Les deux aliments ont distinctement été étudiés dans le but de développer de nouveaux aliments fonctionnels, soit comme ingrédients servant à l’enrichissement d’un aliment, soit comme matrice alimentaire qui peut être enrichie. L’association de ces deux aliments est envisageable. La production d’un fromage avec une nouvelle saveur, typique des macroalgues, bénéficierait également de la valeur nutritionnelle de ces dernières. Par exemple, l’incorporation de flocons de macroalgues dans le fromage pourrait fournir des fibres alimentaires au fromage.

Les fromages aux algues déjà existants ont été développés de façon artisanale. Aucune donnée scientifique n’a été rapportée sur l’impact de l’ajout de macroalgues sur le développement du fromage et sa bioactivité durant son affinage. Ces informations sont importantes dans le cadre du développement éventuel d’un fromage à pâte molle et à croute fleurie comme le Camembert enrichi aux algues.

3.1. Hypothèse de recherche

L’incorporation de 2% de flocons de macroalgues, Palmaria palmata ou Saccharina longicruris, augmente la valeur nutritive du fromage de type Camembert et n’interfère pas avec le développement du processus d’affinage et de ses bioactivités.

3.2. Objectifs spécifiques

Obj. 1. Évaluer des propriétés nutritionnelles et bioactives des macroalgues.

1.1. Caractériser la composition nutritionnelle des macroalgues; 1.2. Mesurer la bioactivité des extraits solubles > 1 kDa des macroalgues.

Obj. 2. Suivre le développement et la bioactivité à l’intérieur des caillés modèles durant l’affinage.

1.3. Produire des caillés modèles contenant des flocons de macroalgues; 1.4. Mesurer le développement du pH du cœur des caillés modèles durant l’affinage; 1.5. Mesurer la bioactivité des extraits solubles des caillés modèles durant l’affinage, aux jours 0, 5, 10, et 20.

Chapitre 4: Evaluation of the impact of addition of seaweed flakes on the development of bioactivities in functional Camembert-type cheese

Running title: Development of bioactivities in algae cheeses

Attara Hella,b, Steve Labriea and Lucie Beaulieua,b * a) Institut sur la nutrition et les aliments fonctionnels (INAF), Département des Sciences des aliments, 2425, rue de l’Agriculture, Université Laval, Québec, G1V 0A6, Canada b) Collectif de Recherche Appliquée aux Bioprocédés et à la chimie de l’Environnement CRABE, Université du Québec à Rimouski, 300 allée des Ursulines, Rimouski, QC, G5L 3A1, Canada

*Author to whom correspondence should be addressed; Lucie Beaulieu, Institut sur la nutrition et les aliments fonctionnels (INAF), Département des sciences des aliments, Université Laval, 2425 rue de l’Agriculture, Québec (Québec) Canada, G1V 0A6; tel. : +1-418-656-2131, # 4767; office 1405; fax: +1-418-656-3353; e-mail: [email protected]

Article soumis pour publication dans le journal International Journal of Food Science & Technology.

Abstract In the aim of developing a functional food, the impact of adding Palmaria palmata or Saccharina longicruris, to Camembert-type cheese on both the antioxidant capacity (ORAC) and ACE-inhibitor activity have been studied. The nutritional composition showed that P. palmata had the highest total protein and carbohydrate contents while S. longicruris demonstrated the highest total fiber and minerals contents. The bioactivities determined in the S. longicruris soluble extract were the highest. Three cheese model curds were studied: cheese control (CC), 2% of P. palmata (C2PP) and 2% of S. longicruris (C2SL). During ripening (20 days), the curd pH of all treatments was significantly similar (p < 0.05), as their ORAC values, starting at 0 and reaching 41.28 mmol TE/g. The ACE-inhibitor activity of the three treatments was significantly similar (p < 0.05), at day 0 (13.20%) and day 20 (58.27%). No significant impact was observed on the development and final bioactivities of the two seaweeds Camembert-type cheeses.

Keywords: seaweeds, Palmaria palmata, Saccharina longicruris, Camembert cheese, ACE-inhibitor, antioxidant.

Introduction Seaweeds have a long tradition in Asian cuisine but are progressively becoming attractive in occidental countries (Hein, 2016). They have an economic role through their use as food, either as sources of basic ingredients or as dietary supplements, with an estimated economic value of US $6.4 billion in 2016 (FAO, 2016). Seaweed extracts have long been used as technological ingredients (agar, carrageenan, alginate) for food preparations (Mabeau & Fleurence, 1993) but now the interest is turning on whole seaweeds as part of food (Mouritsen, 2012; Rioux et al., 2017). Globally, three interesting aspects of seaweeds have been attracting the food science world. The first is their nutritional value. Rich in dietary fiber, proteins/peptides, minerals (e.g. iodine), polyphenols, vitamins (e.g. B12) and polyunsaturated fatty acids (omega-3), some of these elements are in higher concentration than in terrestrial plants such as calcium, iron and copper (Mabeau & Fleurence, 1993; MacArtain et al., 2007; Rioux et al., 2007; Tibbetts et al., 2016). The second aspect of interest in seaweeds is the potential of their bioactive compounds, which could provide health benefits. Indeed, several studies have highlighted their antimicrobial, antioxidant, angiotensin-I converting enzyme (ACE) inhibition capacities, cardioprotective, neuroprotective and anti-inflammatory effects as well as beneficial impacts on gut function and microbiota (Beaulieu et al., 2015; Boisvert et al., 2015; Cardoso et al., 2015; Hamed et al., 2015; Liu et al., 2015; Plaza et al., 2008). The third aspect is their incorporation into products or dishes that are appealing to the general public and that may optimize their culinary potential. Already used in Japan to make dashi, seaweeds such as Kombu (Saccharina japonica) provide the umami flavor to the traditional base broth. It is for this same reason that occidental chefs and scientists are trying to find a way to introduce seaweeds in their traditional dishes. Red seaweed like Palmaria palmata (dulse) has been incorporated in bread, fresh cheese and ice cream (Mouritsen et al., 2012). In addition, in Canada, the alcoholic drink industry is interested in this exotic flavor source. The brown seaweed Saccharina longicruris (sugar kelp) is part of the ingredients of the St-Laurent Gin (Distillerie du St-Laurent, 2017) and Marshall Wharf Brewing Co. beers (Spiegel, 2014).

Protein digestibility is also an important factor to take into consideration in the evaluation of the nutritional value and algal food quality. This is variable according to the species and can be limited by the presence of compounds such as glycosylated protein, polysaccharides, lectins and phenolic compounds (Fleurence, 1999, 2004; Galland-Irmouli et al., 1999; Goñi et al., 2002; Wong & Cheung, 2001). Some studies have suggested that fermenting seaweeds can increase the protein digestibility and the bioavailability of nutrients (Marrion et al., 2003; Uchida & Miyoshi, 2013; Wu et al., 2010). To support the growing health and well-being market, new seaweed-based food can be developed. Functional food containing seaweeds or their extracts (Cardoso et al., 2015), such as bread (Fitzgerald et al., 2014), fermented milk (Tavares Estevam et al., 2016), yogurt (O’Sullivan et al., 2015) and pasta (Prabhasankar et al., 2009) have been suggested. Also, seaweeds can be used as a table salt substitute for reducing sodium content in food. To reach the same salty taste as NaCl, seaweeds extract containing 43% less sodium have been used (Lee, 2011). Replacing NaCl by P. palmata extract did not have any impact on ham transformation process development (Barbieri et al., 2016). Characterization of the nutritive quality and the bioactive compounds of seaweeds, combined with the development of foods will increase the visibility and acceptance of this resource by offering recipes or dishes that incorporate seaweed products. It is thus a crucial time to document the properties of seaweeds to inform and inspire the food industry.

Incorporating seaweeds in cheese could be a good way to create a new functional food. Cheese has previously proved its high nutritional value. It contains proteins, lipids, calcium, vitamins (A, D and B12), riboflavin and other components, which are good for human nutrition (Weinberg et al., 2004). In addition, cheese has health benefit properties. As clinically proven, increasing dietary dairy food is associated with better cardiovascular health (Crichton & Alkerwi, 2014; Crichton et al., 2012). In addition, many authors have shown both ACE-inhibition and antioxidant capacities of cheese (Choi et al., 2012; Gupta et al., 2009; Sieber et al., 2010). Furthermore, cheese has considerable sodium content, between 0.5% to 2.5% sodium chloride (NaCl) (Dugat-Bony et al., 2016). Thus, using seaweeds to reduce sodium contents in cheese could also be an interesting avenue. Only a few artisanal cheeses, that

include seaweeds, are currently on the market, such as “Le Ti Pavez” and “Tomme d’Iroise aux algues”, both from Brittany (France). In Ireland, seaweeds are also included in some dairy products (Mouritsen et al., 2013). Among these are the semi- soft cheese such as “Carrigaline Dillisk Seaweed Cheese” and a hard cheese, such as “Dilliskus”. Nevertheless, according to the authors’ knowledge, no study on the impact of adding seaweeds to cheese has been reported. A soft and surface-ripened cheese like Camembert is a good model to study. Due to its complexity, disturbing the fragile equilibrium of its biochemistry could have consequences on its ripening (Spinnler & Gripon, 2004). Additionally, in this cheese variety, free fatty acids (FFA) are released during the ripening period and contribute to the cheese flavor (Urbach, 1993). Oxidation of FFA in soft cheese has been observed during the ripening period (Delgado et al., 2009). Addition of antioxidant compounds from green tea to protect cheese fatty acids against oxidation has been reported (Huvaere et al., 2011). This finding suggests a potential similar role for seaweed components.

The ultimate objective of this study was to support the development of two functional cheeses containing seaweed flakes, namely one with Palmaria palmata and one with Saccharina longicruris. Firstly, the nutritional composition characterization of seaweeds was performed. Secondly, both the ACE-inhibitory and antioxidant activities were analyzed on seaweed aqueous extracts. Finally, the influence of seaweed flakes in a soft cheese model Camembert curd during the ripening period by measuring the pH evolution, ACE-inhibitory and antioxidant activities were studied.

Materials and Methods Chemicals and Reagents 2,2′-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride (AAPH), fluorescein and 6- hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox), N-hippuryl-His-Leu (HHL), sodium phosphate monobasic monohydrate, sodium phosphate dibasic heptahydrate, ammonium sulfate and enalapril were acquired from Sigma-Aldrich (Oakville, ON, Canada). The 1,4-dioxane reagent was from Fisher (Ottawa, ON, Canada) and glycine cyanuric chloride was from VWR (St. Catharines, ON, Canada).

The total dietary fiber assay kit was purchased from Megazyme (Chicago, Illinois, USA). The ultrapure water (18.2 MΩ) was produced by a PURELAB Ultra system

(ELGA LabWater, Lane End, UK). Food grade calcium chloride (CaCl2) was from Fromagex (Rimouski, QC, Canada).

Biological Materials Seaweed samples were collected directly from the Gulf of Saint Lawrence (Canada) and provided by É. Tamigneaux (Merinov, Grande-Rivière, QC, Canada). Palmaria palmata samples were harvested from the Forillon area (QC, Canada) between October and November 2015 and Saccharina longicruris samples were harvested from the Newport area (Chandler, Qc, Canada) between October and December 2015. Both seaweeds were dried by air at 30°C for 24 hours in a laboratory dryer before partially grinding using STEPHAN Microcut (Hameln, Germany). Dried seaweeds were stored in the dark at 4°C in separate plastic bags of 500 g. Raw milk was provided by a local cheese factory (Fromagerie Les Rivières, QC, Canada). The freeze-dried commercial starter cultures were Flora Danica (DK-2970; Chr. Hansen, Hørsholm, Denmark), Geotricum candidum (Choozit GEO17 LYO, Danisco, France) and Penicillium camemberti (Choozit PC SAM 3 LYO, Danisco, France). The rennet was Chymax 100% Chymosine (Hansen Inc., Milwaukee, USA). The angiotensin- converting enzyme (ACE) was from rabbit lungs (SIGMA-ALDRICH, St-Louis, MO, USA).

Nutritional Composition of Seaweeds Dried seaweeds were reduced into powder using a mortar grinder (RM 100, Retsch, Newtown, PA, US) combined with liquid nitrogen. Moisture and ash (minerals) were determined by the Association of Official Analytical Chemists (AOAC) methods (2002), 950.46 and 950.46, respectively. Total proteins were analyzed by Kjeldahl method (AOAC 988.05, 2002), the conversion factor for nitrogen of 4.92 has been applied (Lourenço et al., 2002). For the determination of total lipid content, the method described by Blight and Dyer (1959) was used. The total carbohydrate estimation was done by subtracting the sum of the percentage of moisture, proteins, lipids and ash (Wang et al., 2010). The total dietary fiber was performed by

enzymatic gravimetric method (AOAC 985.29, 2002). The sodium and potassium contents in seaweeds were performed by solubilizing the samples based on Parkinson and Allen (1975) and measured by Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP) (Optima4300DV, Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA) by the Laboratoire de Géomorphologie et de Sédimentologie (LGS) (University Laval, QC, Canada). All analyses were performed in triplicate.

Soluble Seaweed Extracts (SSE) Extraction of water soluble compounds > 1 kDa from seaweeds was prepared according to previous work (Beaulieu et al., 2015; Bondu et al., 2014). Thirty grams of seaweed powder was dissolved in 500 mL of phosphate buffer (20 mM, pH 7) with constant agitation by using a magnetic bar for 24 hours at room temperature. The mixture was then centrifuged at 4,000 x g, 4°C for 45 min (RC-5B Refrigerated Superspeed centrifuge, GMI Inc., Ramsey, MN, USA). The supernatant was recovered and stored at 4°C and the extraction was repeated with the resulting pellet. The first and the second supernatants were pooled together for the next steps. The SSE was precipitated by adding an equal volume of 80% saturated ammonium sulfate to the supernatant and gently agitated at 4°C overnight. The mixture was centrifuged at 10,000 x g, 4°C for 60 min. The pellet was diluted with ultrapure water and the solution was desalted using a membrane with pore size of 1 kDa (MWCO 1kDa, Pur-A-Lyser, Millipore) for 48 hours at 4°C. The resulting retentate was freeze- dried. The total proteins were quantified using the TruSpec N nitrogen analyzer (Leco Corporation, St. Joseph, MI) based on the Dumas method (Chang, 2010). The SSE was stored in the dark in a vacuum bag at 4°C until bioactivity analysis.

Soft Cheese Model Curd Production (SCMC) The production of Camembert SCMC was performed according to Lessard et al. (2012). Briefly, a volume of 200 L of crude milk was pasteurized at 72.8°C for 16 sec (Promak solution Inc., Saint-Romuald, QC, Canada, 2015) and cooled at 32°C. The acidification of the milk was done by inoculating lactic starter culture (Flora Danica) dissolved at 1% in UHT milk, following the manufacturer’s indication. Then, a CaCl2 solution (45% w/v) was added at 0.3 mL/L of total milk. The rennet (CHY-MAX 100%

Chymosin) was dispersed at pH 6.27 at 0.15 mL/L of milk. The coagulation took 14 min followed by 52 min of hardening. The hard curd was cut into pieces of approximately 2 cm³ and shaped into 12 cm diameter polyurethane molds. The molds were turned three times, at 30, 60 and 180 min. The shaped curd was left for 8 hours at room temperature. Without salting, the curd was freeze-dried (50-SRC, Virtis, Gardiner, NY, USA), grinded and irradiated at 5 KGy. SCMC powder was stored in sealed bags at -20°C.

Seaweeds Flakes Selection for Treatments Dried seaweeds flakes were obtained by precooling in liquid nitrogen and grinding with culinary mixer (Magic bullet, Homeland Housewares, Los Angeles, CA, USA). The flakes were selected by sieves, between 2.00 mm and 4.00 mm for P. palmata and between 1.00 mm and 2.00 mm for S. longicruris. The average size of the flakes was obtained by an image-processing program (ImageJ, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). For P. palmata the average size was 13.85 ± 6.00 mm² and 2.76 ± 1.67 mm² for S. longicruris.

SCMC Preparation and Ripening Conditions The SCMC preparation and ripening were adapted from Lessard et al. (2012). Three different types of cheese were studied: cheese control (CC) without seaweeds, cheese with 2% (w/w) of P. palmata (C2PP) and cheese with 2% (w/w) of S. longicruris (C2SL). The SCMC preparation started by adding seaweed flakes and mixed with salty water (NaCl). The CC was without seaweeds and had a concentration of 2% (w/w) of NaCl. According to the chemical characteristics of seaweeds, water and NaCl added to each preparation were adjusted to obtain 57% (w/w) of moisture and 0.787% (w/w) of sodium in the global SCMC. Ripening starter cultures, G. candidum and P. camemberti, were added according to the supplier’s indications in all assays. After mixing, a portion of 55 g of the wet SCMC was placed into 250 mL glass jars (Bernardin; Jarden Branded Consumables, Richmond Hill, ON, Canada) and compacted to the bottom, which formed the shape of half a Camembert cheese. The jars were covered with a cheese wrapping paper (Amcor Kirkland, Kirkland, QC, Canada). Finally, they were placed into a ripening

room at 14°C with 90% relative humidity during 10 days, following by 10 days at 4°C. Samples were taken at days 0, 5, 10 and 20. For each day and each treatment, six separate repetitions were performed (n=6). The pH of the curd core was measured with a glass electrode (FC200, Hanna instruments Canada inc., Laval, QC, Canada). Thereafter, the whole curd was mixed by hand with a spatula and stored at -20°C in dark sealed bags.

SCMC Water Activity (Aw) The Aw values were measured on SCMC prepared without ripening starter cultures. The three treatments CC*, C2PP* and C2SL* were placed in AquaLab sample cups with covers (Decagon Devices inc., Pullman, WA, USA) and placed into ripening room at 14°C with 90% relative humidity. Sampling was done at day 0, 1 and 4. Aw values were measured with a Water Activity Meter (Model 3TE, Decagon Devices inc., Pullman, WA, USA). Treatments were performed using five replicates.

Water-Soluble Extract (WSE) from SCMC The extraction of water soluble compounds from SCMC was based on Kuchroo & Fox (1982). Each frozen sample was reduced into powder using a cryogenic grinder (Cryomill, Retsch, Newtown, USA) in a 50 mL grinding jar with a 25 mm diameter ball for two cycles of 1 min at 25 Hz. An amount of 5 g of frozen curd powder was added to 20 mL of ultrapure water for a ratio of 1:5 in a 50 mL Falcon tube. This mixture was vortexed during 30 min at room temperature and incubated at 37°C for 60 min. The mixture was centrifuged at 5000 rpm for 30 min at 4°C (Centrifuge 5804R, Eppendorf, Mississauga, ON, Canada) in order to remove the solid layer of lipids floating on the top of the solution. The aqueous phase was filtered firstly with a paper filter (Whatman No. 1, Buckinghamshire, UK) in a vacuum system and completed with a 0.45 µm syringe filter (Filtropur S 0.45, Sarstedt, Nümbrecht, Germany). Finally, the WSE was aliquoted and stored at -20°C until analysis.

Angiotensin-Converting Enzyme (ACE)-Inhibitory Activity The ACE-inhibitory activity was performed using a spectrophotometry method developed by Hayakari et al. (1978) and also used by Bondu et al. (2014) for seaweed extracts. A volume of 20 µL of extracts, from SSE or WSE of SCMC, was

mixed to 20 µL of ACE at 250 mU/mL (borate buffer, pH 8.3, 1 M NaCl) and 80 µL of phosphate buffer, pH 8.3. The enalapril was used as positive control. Each solution was incubated at 37°C for 10 min. During the same time, a replicate of each sample was put at 95°C in a bath in order to obtain a negative control (Blank), where ACE was inactivated. Then, 40 µL of ACE substrate, 6.25 mM of HHL (N-Hippuryl- His-Leu hydrate), were added to all samples and incubated at 37°C for 60 min, followed by 10 min at 95°C. A volume of 360 µL of reactive 2,4,6-trichloro-s-triazine (TT, 3% v/v in 1,4-dioxane) was added into the tube and vortexed until enzymatic coloration. Finally, samples were centrifuged by a microcentrifuge at 2,000 x g (MiniStar, VWR, St. Catharines, ON, Canada) before filling a clear microplate (96 Well, Clear F-Bottom, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany) with 200 µL of the SSE or WSE of SCMC and the absorbance (A) was determined at 382 nm (Multiskan Spectrum, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). The percentage of ACE-inhibition was calculated by using this following formula:

(퐴 − 퐴 ) 퐴퐶퐸 𝑖푛ℎ𝑖푏𝑖푡𝑖표푛 (%) = 퐶표푛푡푟표푙 푆푎푚푝푙푒 × 100 (퐴퐶표푛푡푟표푙 − 퐴퐵푙푎푛푘)

A determination of the IC50 of seaweed extracts was done by a serial dilution based on Bondu et al. (2014). For the WSE of SCMC, the analysis was performed with a single dilution (0.1 g/mL).

Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) Assay Antioxidant activities were determined by the oxygen radical absorbance capacity (ORAC) method (Bondu et al., 2014; Cao et al., 1993; Cao & Prior, 1999). The reagents were prepared in phosphate buffer (75 nM, pH 7.4). In a black microplate (96 Well, Black U-Shape, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany), a volume of 25 µL of extract or Trolox (standard) was mixed to 150 µL of Fluorescein (0.1 µM). A serial dilution was done for seaweed extracts (0.5-1.5 mg/mL for P. palmata and 0.1-0.5 mg/mL for S. longicruris) and a single dilution at 2 mg/mL for the WSE of SCMC. The microplate was subsequently incubated at 37°C for 30 min in the dark. Just before reading, 50 µL of 2,2′-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride (AAPH) solution (150 nM) was rapidly added to each well. The

fluorescence was read at 485 nm and 583 nm as detection wavelengths at 37°C (Synergy H1, Biotek, Winooski, USA). ORAC values were expressed in mmol equivalent Trolox per gram of sample (mmol TE/g). Assays were performed in four replicates.

Statistical Analysis Nutritional composition results and seaweeds extract bioactivities were expressed as means ± standard deviation of triplicate measurements. For SCMC extract bioactivities, the results were calculated with six different repetitions of each treatment and each time point. SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) version 24.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL) was used to perform statistical analyses. Means differences were compared using the one-way and multivariate analysis followed by Scheffé test with P ≤ 0.05.

Results and Discussion Nutritional Composition of Seaweeds The seaweed nutritional composition is presented in Table 3. The total protein content of the two seaweed species studied was similar, which was 10.34 ± 0.11% on a dry weight basis (DW) for P. palmata and 9.49 ± 0.13% DW for S. longicruris, respectively. The protein content of P. palmata from the Gaspé coast was in the common reported range of 8 to 35% (Morgan et al., 1980) for this species, but lower in comparison to previous studies (16.58 ± 0.99% DW) on samples collected in 2012 from the same climate area (Pabos beach, Qc, Canada) and harvested during the same season (Bondu et al., 2014). The protein content of S. longicruris was similar to samples harvested in July 2011 (Bondu et al., 2014) but slightly lower than reported by Boisvert et al. (2015) (12.95%). This difference could be explained by the different harvest time. For example, Rioux et al. (2009) have shown that S. longicruris harvested in November had lower protein content than the one harvested during July. Lipids content in P. palmata was between 1 and 2% and similar to previous studies (Boisvert et al., 2015; Morgan et al., 1980; Rioux et al., 2007; Sánchez-Machado et al., 2004). The lipid content in S. longicruris was higher than others reported values (Boisvert et al., 2015; Rioux et al., 2007). Also, this

difference could be explained by the variation of chemical composition in function of the season and the temperature of the environment where seaweeds grow (Mishra et al., 1993; Nelson et al., 2002; Rioux et al., 2009). Ash (minerals) content was 13.95 ± 0.33% DW for P. palmata and almost twice as much for S. longicruris (34.37 ± 0.20% DW) which is in accordance with literature (Boisvert et al., 2015; Sánchez- Machado et al., 2004; Wang et al., 2010). S. longicruris had higher sodium (39.14 ± 0.87 mg/g DW) and potassium (72.13 ± 2.22 mg/g) contents in comparison with P. palmata, 14.42 ± 0.36 mg/g DW and 39.60 ± 1.34 mg/g DW, respectively, as described by Jard et al. (2012). For both seaweeds, the mineral content values were in the range reported in the literature (Mabeau & Fleurence, 1993; Morgan et al., 1980). Total sugar content was lower in S. longicruris (53.22 ± 0.38% DW) than in P. palmata (74.25 ± 0.33% DW). The values reported by other authors for S. longicruris were 57.80% and 69.59% (Boisvert et al., 2015; Rioux et al., 2007). P. palmata had a total sugar content higher than samples from nearby areas, Pabos beach (QC, Canada) (69.62 ± 1.16%) and Newport (QC, Canada) (67.96 ± 2.21%) harvested during the same period of the year (Beaulieu et al., 2016). From other geographical areas, Wang et al. (2010) and Mishra et al. (1993) reported a value of 61.5% (Iceland) and 66.4% (Nova Scotia, Canada), respectively. In each case, it was in the range of 38% to 74% demonstrated by other authors (Morgan et al., 1980). Fiber content, which is included in the total sugar content, corresponded to 40.87 ± 0.17% DW for P. palmata and 46.35 ± 0.17% DW for S. longicruris, respectively. This fiber content, quite similar for both seaweeds, was higher than values reported by Jard et al. (2012) for both seaweeds (22.1% for P. palmata and 36.4% for S. longicruris). As published by Mabeau & Fleurence (1993), edible seaweeds contain 33% to 50% total fiber. With the objective to create a new functional food with new flavor, the nutritional characterization could be very relevant (Lee, 2011; Mouritsen et al., 2012). By knowing the content of major minerals in seaweeds, the amount of salt added or replaced could be adjusted to respect the original sodium content in the product. Also, seaweeds could be a source of edible fiber introduced into food, which initially lacks this nutrient, such as cheese.

Table 3. Nutritional composition of seaweeds in percentage of dry weight (% w/w dry weight).

P. palmata S. longicruris Moisture 7.11 ± 0.15 7.81 ± 0.18 Proteins 10.34 ± 0.11 9.49 ± 0.13 Lipids 1.48 ± 0.24 2.92 ± 0.20 Ash 13.95 ± 0.33 34.37 ± 0.20 Sugars 74.25 ± 0.33 53.22 ± 0.38 Fiber 40.87 ± 0.17 46.35 ± 0.17 Sodium (mg/g) 14.42 ± 0.36 39.14 ± 0.87 Potassium (mg/g) 39.6 ± 1.34 72.13 ± 2.22 Note: Each value is presented as mean ± SD (n = 3)

Seaweeds Extracts and Detection of Bioactivities

Water-soluble molecular weight compounds > 1 kDa from seaweed extracts after dialysis showed average extraction yields of 6.2% for P. palmata and 1.0% for S. longicruris corresponding to protein extraction yields of 3.30% and 11.53%, respectively. For P. palmata, the protein extraction yield obtained using phosphate buffer at pH 7 (6.2%) was lower than other studies using the same extraction method (11.40%) (Bondu et al., 2014) as well as using other processes such as ultrasonication and dialysis (10.01%) (Fitzgerald et al., 2012; Galland-Irmouli et al., 1999). For S. longicruris, the protein extraction yield was higher (11.53%) than a previous study, which has shown a protein extraction yield of around 8.6% using phosphate buffer at pH 7 (Bondu et al., 2014). The grinding method could also explain the higher yield extraction of this present study. As suggested by Beaulieu et al. (2016), grinding by using liquid nitrogen could reduce the seaweed powder to thinner particles and facilitate the extraction. The protein extraction yield could be reduced by the presence of polysaccharides and their interaction within protein matrixes. Indeed, it might be explained by the capacity of seaweed fiber to entrap proteins in their structure (Horie et al., 1995; Marrion et al., 2003) leading to a lesser amount of proteins in the aqueous fraction.

Following protein extraction, bioactivity assays were performed. Results showed that S. longicruris extract had overall higher bioactivities than P. palmata (Table 4). The

ACE-inhibitory potency (IC50) of S. longicruris, calculated as the concentration of sample (mg/mL) required producing 50% ACE-inhibition, was sixty-seven times less than P. palmata, which was 0.41 mg/mL in comparison with 27.69 mg/mL. The antioxidant capacity measured using the oxygen radical absorbance capacity (ORAC) method, showed ORAC values of 328.97 ± 27.52 mmol TE/g for S. longicruris extract and of 56.90 ± 5.06 mmol TE/g for P. palmata extract. Results obtained in the present study display higher bioactivities in comparison with other authors. Bondu et al. (2014) reported an ACE IC50 of 460.05 mg/mL for < 10 kDa fraction of P. palmata hydrolyzed with chymotrypsin. In this previous study, the determined ORAC value of S. longicruris was less than 250 µmol TE/g for a > 10 kDa fraction and the antioxidant activity has decreased for the fraction hydrolyzed with enzymes (chymotrypsin and trypsin). Other studies reported lower antioxidant activity with extracts obtained by different methods, which have demonstrated higher protein concentrations. For example, Wang et al. (2010) obtained an ORAC value of 35.8 µmol TE/g for P. palmata extract produced using a combined enzymatic and water extraction procedure. It was in the same range of values as Yuan et al. (2009), with methanol extracts corresponding to 36.42 and 38.78 µmol TE/g of extract. The hydrolysis of protein extracts from vegetables can increase the bioactivity, such as antioxidant and ACE-inhibition (Hur et al., 2014; Tavano, 2013). However, depending on the hydrolysis degree, if overexposed, resulting compounds could also lose their bioactivity, as proven for peanut protein hydrolysate (Jamdar et al., 2010). The bioactivity also depends on the extraction procedure used, which could be correlated to a complex mixture of various compounds present in the extracts. Water-soluble molecular-weight compounds > 1 kDa from both S. longicruris and P. palmata extracts could include active molecules such as proteins, polyphenols and polysaccharides. For instance, polysaccharides from seaweeds such as sulfated polysaccharides, alginate, laminaran and fucoidan (50 kDa) have shown high antioxidant capacity (Chattopadhyay et al., 2010; Wang et al., 2008). Also, polyphenols from seaweeds have shown antioxidant capacity as potential

ingredients (Wang et al., 2010; Yuan et al., 2005; Yuan & Walsh, 2006). Among these compounds, phlorotannins are polyphenols strongly attached to seaweed proteins, especially abundant in brown seaweeds (Stern et al., 1996), and are also recognized as antioxidants and ACE-inhibitors (Jung et al., 2006; Wijesinghe et al., 2011). These results confirmed the antioxidant and ACE-inhibition capacities of both seaweeds. Therefore, in addition to their nutritional value, the seaweeds’ bioactivity could contribute to increasing the health benefits in food (Cardoso et al., 2015; Mahadevan, 2015). Additionally, the antioxidant capacity of seaweeds has potential to contribute in food preservation (Gupta & Abu-Ghannam, 2011b).

Table 4. Protein contents and bioactivity of soluble seaweed extracts (> 1 kDa).

Palmaria palmata Saccharina longicruris Proteins (%) 19.20 ± 0.14 30.89 ± 0.40

IC50 of ACE-inhibitor (mg/mL) 27.69 0.41 ORAC (TE mmol/g) 56.90 ± 5.06 328.97 ± 27.52

Soft-Cheese Model Curds (SCMC) Water Activity (Aw) Aw results of SCMC without starter and ripening cultures are presented in Table 5. By excluding starter and ripening cultures, Aw values of SCMC were only affected by the presence of seaweeds. At day 0, the control (CC*) had the highest Aw value (0.982 ± 0.001) comparatively to C2PP* (0.976 ± 0,001) and C2SL* (0.975 ± 0.002). Thus, until day 4, both CC* (0.981 ± 0.001) and C2PP* (0.978 ± 0.001) did not have significant different values and C2SL* had the lowest Aw value of 0.976 ± 0.002. The control and C2SL* showed constant Aw during this time and Aw of C2PP* slightly increased after four days. Leclercq-Perlat et al. (2013) have reported that the Aw value measured from a Camembert cheese was 0.976. This value was lower than the value obtained in the present study. It could be due to the different NaCl contents, which were higher: 3.5% comparatively to 2%. Nevertheless, the lower Aw value of C2SL* could affect chemical reactions inside the curds. Taking into account Aw, by estimating the equivalence of total NaCl in cheese by the Marcos and Esteban (1982) and Guinee (2004) method, at day 4, NaCl contents corresponded to 3.363% for CC* and 4.248% for C2SL*. This difference in NaCl contents could affect

enzymatic activities (Fox & Walley, 1971) and consequently could limit the amount of produced bioactive peptides (Choi et al., 2012).

Table 5. Aw of SCMC without ripening starter cultures.

Day 0 1 4 CC* 0.982 ± 0,001 0.980 ± 0,001 0.981 ± 0,001 C2PP* 0.976 ± 0,001 0.979 ± 0,003 0.978 ± 0,001 C2SL* 0.975 ± 0,002 0.976 ± 0,001 0.976 ± 0,002

The pH Evolution in Core of SCMC During Ripening Three different types of cheeses were studied: cheese control (CC) without seaweeds, cheese with 2% (w/w) of P. palmata (C2PP) and cheese with 2% (w/w) of S. longicruris (C2SL). Figure 10 presents the pH evolution during ripening of SCMC. For the control curd, the initial core pH of 4.87 ± 0.01 increased to 5.04 ± 0.12 at day 5, to 6.08 ± 0.33 at day 10 and then slightly increased to 6.80 ± 0.18 at day 20 at the end of ripening. This pH evolution corresponds to what is generally reported for Camembert-type cheese as described by Liu & Puri (2008), within the first 20 days. The pH of cheese curds is correlated to the fungus growth and its proteolytic activities (Leclercq-Perlat et al., 2015; Leclercq-Perlat et al., 2004). The results obtained show no significant difference between the three treatments. Thus, the addition of seaweeds into SCMC at a concentration of 2% in a Camembert type- cheese preparation did not seem to influence the normal evolution of the curd pH.

1 4 °C a t 9 0 % R H 4 °C 8

C C

C 2 P P

H 6 p C 2 S L

4 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5

D a ys

Figure 10. pH evolution of the core curds during ripening. CC: control, C2PP: curd with 2% of Palmaria palmata, C2SL: Curd with 2% of Saccharina longicruris. Values are the mean ± SD (n=6). Detection of Bioactivities in SCMC During Ripening In general, ACE-inhibitory activity increased significantly from day 0 to day 10 in all WSE (Fig. 2). Then, the activity was stable from day 10 to day 20. However, a significant decrease of activity was observed between day 10 and day 20 for cheese with 2% of S. longicruris (C2SL). More specifically, on day 0, for the three treatments, ACE-inhibitory activities were the lowest, without significant differences. The values were 15.50 ± 4.49% (CC), 13.74 ± 2.48% (C2PP) and 10.37 ± 3.64% (C2SL), respectively. On day 5, ACE-inhibitory activities displayed were 37.28 ± 5.28% for CC and 39.53 ± 1.67% for C2PP, which were significantly higher than C2SL with 24.94 ± 5.28%. On day 10, ACE-inhibitory activities of CC (57.76 ± 1.62%) and C2PP (56.38 ± 6.27%) continued to increase, but was less marked for C2SL (68.27 ± 5.37%), which was significantly higher. Finally, on day 20, the three SCMC demonstrated the same activity (CC: 59.80 ± 5.12%; C2PP: 55.77 ± 7.22%; C2SL: 59.25 ± 7.69%). Only a few studies have measured ACE-inhibitory activity of

Camembert cheese samples. An ACE IC50 value of 0.16 mg/mL has been reported by Okamoto et al. (1995) for a dry water soluble extract (WSE) obtained by hot water extraction from a commercial Camembert cheese. Also, an ACE-inhibitory activity of

69.1% in WSE at a concentration of 0.25 mg/mL of peptides, obtained by concentrating peptides using hydrophobic chromatography, have been determined in another commercial Camembert cheese (Saito et al., 2000). Comparatively to the control of this present study, at day 20, commercial cheeses studied by other authors seemed to have slightly lower bioactivity, but the age of these cheeses was not indicated. At day 0, the same activity obtained for the three treatments suggested that at this stage of ripening, seaweeds did not contribute to the global bioactivity, the curd was the only source of the major bioactive compounds. At day 5, the lower ACE-inhibition detected for C2SL could be due to higher presence of salts surrounding the S. longicruris flakes in comparison to P. palmata flakes; a higher mineral content was determined in S. longicruris (34.37 ± 0.20% DW) compared to P. palmata (13.95 ± 0.33% DW). As reported by Kelly et al. (1996) and Kristiansen et al. (1999), salts could affect protease activities, which can explain a low production of ACE-inhibition peptides from native casein (CN). We could hypothesize that the bioactive compounds might be released differently through the fermentation process. After 10 days, C2SL showed a higher ACE-inhibitory activity than CC and C2PP. This difference could be explained by the high bioactivity of crude

S. longicruris, which had an ACE-inhibitor IC50 of 0.41 mg/mL of WSE comparatively to 27.69 mg/mL of WSE for P. palmata, and its bioactive compounds could be more easily extracted. Many studies have reported that fermenting seaweeds allowed a better protein exposure to enzymatic sites and increased their extractability and bioactivity (Fitzgerald et al., 2012; Lee et al., 2016; Marrion et al., 2003). For instance, fractions of these seaweeds produced by enzymatic hydrolysis, exhibited higher in vitro antioxidant and ACE-inhibitory activities than the parent proteins. These precursor proteins have been associated with the enzyme ribulose-1,5- diphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco) and pigments (allophycocyanin, phycocyanin, phycoerythrin) (Bondu et al., 2014). At the end of ripening, the slight decrease of ACE-inhibitory activity for C2SL compared to CC and C2PP, observed between day 10 and day 20, could be explained by the high degree of hydrolysis, the pH level and the protein size at that moment. As mentioned previously, the bioactivity of vegetables could be lower when it was exposed to a high degree of

hydrolysis (Jamdar et al., 2010). Also, in brown seaweeds, the presence of active compounds such as phlorotannins is well known. They are polyphenols with potential antioxidant and ACE-inhibitory capacities (Wijesinghe et al., 2011). Phlorotannins are linked to proteins, which could precipitate near to a neutral pH and this phenomenon would be more accentuated if the linked proteins were small in size (Stern et al., 1996). During ripening, proteins were reduced to smaller sizes by protease actions (Rank et al., 1985) and could increase links to phlorotannins. Phlorotannins could have precipitated and possibly were not or less present in the WSE. This could be a reason for the decrease of ACE-inhibition activity in C2SL WSE at day 20. The same observation was also reported on commercial herbal cheese. The same ACE-inhibitory capacity was similar between regular cheese and herbal cheese (Apostolidis et al., 2007).

Many authors studied the way to increase antioxidant capacity in cheese. A most common solution is adding high polyphenol vegetable extracts in the formulation of cheese (Carocho et al., 2015; Giroux et al., 2013; Han et al., 2011). The oxygen radical absorption capacity (ORAC) of curds WSE during the ripening period is showed in Figure 12. The results were obtained from 2 mg/mL (w/v) of SCMC diluted in water and expressed in Trolox equivalent per gram of cheese curds (mmol TE/g). Overall, the evolution of the antioxidant activity was similar between the three treatments. At this concentration, the antioxidant capacity was not detected at day 0. The measured ORAC values increased significantly, from day 5 to day 20 for all SCMC. The addition of seaweeds into SCMC did not show an impact on the antioxidant capacity already present in cheese itself during the 20 days of ripening. Therefore, a seaweed concentration of 2%, did not seem to be sufficient to improve the antioxidant activities of SCMC. Based on the quantity added to the cheese and the results obtained for WSE, the theoretical contribution of antioxidant in cheese represented around 0.07 mmol TE for the cheese bioactivity. According to the lowest antioxidant activity of SCMC, at day 5, the global value was 5.45 ± 0.99 mmol TE/g of curd. The contribution of seaweed antioxidant activity is negligible. A comparison could be made with a study achieved on a cheese mixed with broccoli powder (Sharma et al., 2011). These authors have demonstrated that the total antioxidant

capacity started to increase significantly by using 5% of broccoli powder in cheese. In the same paper, the authors showed that the total polyphenol in cheese was significantly higher with only 3% of broccoli powder in cheese. To obtain these results, fresh broccoli had to be freeze-dried; a conventional drying did not give the same high result. Considering this information, the negligible contribution of seaweeds on the global antioxidant activity of cheese might be explained by their low content in cheese and the way that they were dried. For instance, Cruces et al. (2016) reported that the brown seaweed Lessonia spicata dried by air had both lower antioxidant activity and phlorotannins content in comparison to freeze-dried seaweeds. Apostolidis et al. (2007) have reported that commercial herbal cheese had better antioxidant activity than the same cheese without herbs (Cabot cheese and feta cheese), but the concentration of added herbs was not indicated.

This evaluation of antioxidant and ACE-inhibition capacities on SCMC showed that the addition of 2% seaweed flakes in Camembert cheese did not affect positively or negatively its global bioactivity.

8 0 d c d c d c c c 6 0 C C

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Figure 11. ACE-inhibition of curds during ripening. CC: control, C2PP: curd with 2% of Palmaria palmata, C2SL: Curd with 2% of Saccharina longicruris. Values are the mean ± SD. In each bar, different letters mean significant differences between samples (p < 0.05, n=6).

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Figure 12. Oxygen radical absorption capacity (ORAC) of curds during ripening expressed in mmol TE/g of curd (2 mg/mL). CC: control, C2PP: curd with 2% of Palmaria palmata, C2SL: Curd with 2% of Saccharina longicruris. Values are the mean ± SD. In each bar, different letters mean significant differences between samples (p < 0.05, n=6). At day 0, the activity was not detected (N.D.). Conclusion Nutritional composition of P. palmata and S. longicruris was characterized and the antioxidant and ACE-inhibitory capacities were measured on their soluble extract > 1 kDa. Both seaweeds showed that they were nutritionally rich and showed bioactivities. The impact of their presence in Camembert model cheese during ripening was also measured. The pH values of the curd seaweed cheeses were similar and were evaluated in comparison to the control without seaweeds. Their final bioactivity was also similar to the control. However, cheese with S. longicruris showed a potential of higher ACE-inhibitory activity on day 10. To the author’s knowledge, it was the first time that the evolution of ACE-inhibition of Camembert cheese during ripening has been reported.

This study confirmed the potential of seaweeds to be combined with a fermented food, such as a cheese, without causing a negative impact on the global evolution of the product. Their presence could increase the diversity and the nutritional content by maintaining the total sodium content. Seaweed cheeses add edible fiber, which are absent in regular cheese. The next step of the study could be to reduce the total

sodium by using only the minerals from seaweeds as a salt source. In addition, further studies on the impact of seaweeds on the microflora of the cheese are under investigation in our laboratory. A commercial production of cheeses containing seaweed is planned as well as their sensorial analysis.

Acknowledgments The authors wish to thank Éric Tamigneaux and Isabelle Gendron-Lemieux (Merinov, Grande-Rivière, QC, Canada) for providing the seaweeds and for Palmaria palmata and Saccharina longicruris photograph’s; Diane Gagnon (Department of Food Sciences, University Laval, QC, Canada) and Marie-Hélène Lessard (Laboratoire de mycologie alimentaire, University Laval, QC, Canada) for their technical expertise; Maria Pacheco-Oliver (National Research Council, QC, Canada) for her involvement in the presubmission review of this paper. Authors would also like to thank the Institute of Nutrition and Functional Foods (INAF, QC, Canada), and the Ministère de l’Agriculture, des Pêcheries et de l’Alimentation du Québec (MAPAQ) for their financial support.

Chapitre 5 : Discussion et conclusion générales

5.1. Discussion générale 5.1.1. Retour sur l’hypothèse de la recherche Le but de ce projet de maîtrise était d’étudier l’impact de l’ajout de flocons de macroalgues sur le développement du processus d’affinage et de la bioactivité d’un fromage de type Camembert, dans l’intention d’en faire un fromage fonctionnel.

Les résultats de la caractérisation de la composition nutritionnelle des macroalgues P. palmata et S. longicruris ont confirmé leur potentiel comme source de nouveaux éléments nutritifs à ajouter au fromage. Les fibres étant en grande concentration dans les macroalgues, elles ajouteront un nutriment « santé » au fromage qui possède déjà une qualité nutritionnelle d’intérêt. La mesure de bioactivité des macroalgues a permis de connaitre leur contribution sur la bioactivité finale du fromage dans lequel elles ont été incorporées. Finalement, en ce qui a trait à la détection des bioactivités des fromages, malgré une évolution différente de C2SL durant l’affinage, la présence des macroalgues n’a pas nui à la capacité inhibitrice de l’ECA du fromage final, au moment où ils sont prêts à être consommés. C’est également le même constat qui a été fait pour leur capacité antioxydante.

Ainsi, la première partie de l’hypothèse initiale du projet a été confirmée. En raison de la teneur élevée en fibre des flocons de macroalgues, leur incorporation à la proportion de 2 % augmente la diversité nutritive du fromage de type Camembert, puisque celui-ci n’en contient pas originellement. De plus, étant donné que la bioactivité des fromages avec et sans macroalgues était similaire après la période d’affinage, la présence de ces macroalgues n’a pas nui significativement à la production des composés bioactifs du fromage. Finalement, d’après l’évolution du pH, la courbe obtenue pour les fromages aux algues était similaire à celle du témoin, ce qui suggère que la présence des flocons de macroalgues n’a pas perturbé le développement normal du fromage. Ceci appuie la deuxième partie de l’hypothèse de recherche.

5.1.2. Limites des méthodes expérimentales Suite à l’analyse des résultats obtenus, plusieurs améliorations expérimentales peuvent être suggérées. La première partie du projet consistait en la caractérisation de la composition nutritionnelle et de la bioactivité des macroalgues. De façon générale, les résultats étaient comparables avec d’autres qui sont retrouvés dans la littérature. Par contre, afin de mieux comparer les résultats de la bioactivité des macroalgues par rapport à celle des fromages aux algues, la même méthode d’extraction des composés solubles aurait pu être utilisée, soit celle qui ne nécessitait pas de précipitation. De cette manière, l’activité du même groupe de composés solubles aurait été comparée entre les deux produits. Ainsi, la proportion de la contribution des macroalgues à la bioactivité finale des fromages aurait pu être mieux illustrée. De plus, ceci permettrait de comparer les deux méthodes d’extraction des composés solubles des macroalgues et de valider si la méthode utilisée est adaptée aux fromages contenant des macroalgues. Ainsi, cela pourrait également valider la similitude des résultats de la bioactivité entre les fromages aux algues et le fromage témoin.

L’analyse sensorielle des fromages générés n’a pas pu être réalisée, mais permettrait d’obtenir des informations importantes. Pour des raisons d’éthiques et de précaution sanitaire, les caillés modèles ne pouvaient pas être consommés. Par contre, sans être introduits dans le dispositif expérimental du projet, des fromages prototypes réalisés avec la collaboration d’une fromagerie partenaire ont été produits de manière à être comestibles. Ainsi, des observations sensorielles informelles ont pu être faites par les membres de l’équipe de recherche. Tout d’abord, en ce qui a trait à l’apparence, les deux fromages aux algues étaient recouverts d’un duvet blanc, caractéristique d’un fromage à croute fleuri, sans différence visible avec le fromage témoin. Les Figures 13 et 14 retrouvées en annexe présentent les prototypes des deux fromages aux algues. Aussi, dans le cas du fromage avec P. palmata, un teint plus rosé de la pâte du fromage était observable, ceci pourrait être expliqué par la migration des pigments rouges de la macroalgue vers le fromage. Ensuite, en ce qui a trait à la texture, le fromage contenant S. longicruris semblait être plus sec et plus ferme que celui avec

P. palmata et le témoin. De plus, la texture fibreuse des flocons d’algues, surtout dans le cas de S. longicruris, était perceptible en bouche. En ce qui concerne le goût, le fromage avec S. longicruris était plus salé que les deux autres. Cette différence pourrait potentiellement s’expliquer par la teneur élevée en minéraux de l’algue brune, surtout en sodium et potassium. Néanmoins, l’observation la plus importante dans les deux fromages aux algues était leur goût iodé. Selon la sensibilité des personnes, ce goût « marin » pouvait être ressenti à différentes intensités. Cela avait une influence sur l’appréciation globale du produit. Pour le fromage avec P. palmata, à la mise en bouche, son goût iodé était très intense, pour plusieurs personnes, cela rappelait la plage et les marées basses. Cette forte intensité faisait en sorte que les personnes n’ayant pas été habituées au goût iodé ont moins apprécié le produit. En ce qui concerne le fromage avec S. longicruris, l’apparition d’un goût iodé était seulement perceptible après quelques secondes en bouche et de façon moins intense. Cela rendait ce dernier plus appréciable pour les personnes plus sensibles à ce goût. Pour celui-ci, des notes d’arôme d’asperge et de poivron vert ont été rapportées, ainsi que le goût plus piquant du fromage bleu, mais plus subtilement. Il en demeure que ces tests ont été réalisés qu’une seule fois et sans optimisation du procédé et de la formulation, ni l’utilisation d’un panel expert. Des optimisations de la fabrication devront être réalisées avant de conduire, dans des conditions standardisées, une évaluation sensorielle.

5.1.3. Défis technologiques L’incorporation de flocons de macroalgues entières était un défi technologique en soi. Il était nécessaire de contrôler l’uniformité de leur dispersion dans la matrice fromagère afin d’éviter des problèmes de texture et de fusion des grains de fromage pendant le moulage. De plus, étant donné qu’aucune publication scientifique concernant l’incorporation de macroalgues dans les fromages n’était disponible, il était impossible de comparer les résultats obtenus avec d’autres recherches.

De façon plus appliquée, des optimisations devront être réalisées afin d’assurer une production du fromage à l’échelle commerciale. L’uniformité de la dispersion des flocons de macroalgues dans la masse et les caractéristiques organoleptiques des

fromages faits de différents lots de macroalgues doivent être constantes. En effet, suite à une entente de convention de recherche, une production pilote a été réalisée à la Fromagerie des Basques. Les fromages obtenus donnaient des résultats différents des prototypes en laboratoire de transformation alimentaire. La qualité organoleptique était très variable d’une fois à l’autre. Afin de corriger cette variation, un contrôle de l’origine et du procédé de transformation des macroalgues serait nécessaire.

5.1.4. Défis du projet de recherche global Du point de vue de la recherche, plusieurs aspects de ce présent projet sont à améliorer ou à explorer davantage. Compte tenu de sa caractéristique exploratoire et nouvelle, les mesures et les expériences réalisées étaient nécessaires afin d’établir les premiers fondements qui seront utiles dans un processus de développement d’un fromage fonctionnel. Dans cette première étape, seulement un paramètre a été étudié pour les deux fromages aux algues, soit l’incorporation de 2 % de flocons de macroalgues sèches dans un caillé de Camembert, tout en respectant la même teneur en sodium finale que celle du fromage témoin. Selon les résultats obtenus, les 2 % de flocons de macroalgues n’étaient pas suffisants pour améliorer la bioactivité globale du fromage. Par contre, le résultat plus élevé de la capacité inhibitrice de l’ECA obtenu avec le fromage contenant S. longicruris au jour 10 donne une piste de réflexion à la possibilité de produire du fromage aux algues ayant une plus grande capacité inhibitrice de l’ECA. Certainement, ces premières étapes étaient loin de la finalité où les fromages aux algues pourraient être qualifiés de « fonctionnels ». En effet, selon les normes de l’Agence canadienne d’inspection des aliments (ACIA), pour qu’un aliment puisse être appelé « aliment fonctionnel », des études cliniques sur l’aliment ou l’ingrédient cible dans l’aliment doivent être réalisées pour déterminer leur concentration et leurs effets exacts sur le consommateur (ACIA, 2016a).

Des optimisations supplémentaires des fromages aux algues pourraient éventuellement permettre d’atteindre une allégation santé. En effet, puisque les deux macroalgues ont une teneur élevée en potassium, et que celui-ci peut agir

comme substitut du sodium dans les aliments, la quantité de sodium ajouté aux fromages pourrait potentiellement être réduite. Il a en effet été publié que le sodium peut être partiellement remplacé par du potassium sans toutefois avoir des effets sur leur qualité organoleptique et leur conservation (Grummer et al., 2013). Subséquemment, les mêmes productions fromagères pourraient être refaites, mais en réduisant la teneur en sodium total provenant du saumurage et en compensant par l’apport en minéraux des macroalgues. Ainsi, dans le cas où la teneur en sodium total pouvait être réduite d’au moins 25 %, le fromage aux algues pourrait avoir l’allégation légale de « teneur réduite en sel », selon les exigences de l’Agence canadienne d’inspection des aliments (ACIA, 2016b).

Dans le contexte où le projet avait pour but de développer des fromages québécois à valeurs ajoutées, afin de se démarquer de la concurrence internationale, les fromages aux algues semblent être bien accueillis par la population. Presque toutes les personnes ayant eu connaissance du projet, soit le public ayant assisté à des présentations scientifiques ou simplement des consommateurs ayant goûté à des prototypes des fromages, semblent s’intéresser énormément aux produits. Les caractères de nouveauté et les caractéristiques du produit le rapprochant d’un aliment fonctionnel ont probablement un potentiel et une étude de marché pourrait confirmer cette possibilité.

Finalement, afin d’améliorer la commercialisation des fromages aux algues, les résultats de leurs bienfaits nutritionnels et les caractères typiques de ceux-ci devraient continuer à être étudiés et diffusés en parallèle de leur mise en vente. Ainsi, les fromages aux algues seront vus à la fois comme un produit alimentaire, mais aussi comme un aliment fonctionnel appuyé par des résultats scientifiques.

5.2. Conclusion et perspectives Puisque ce projet a été le premier à étudier les fromages aux algues, d’autres aspects de ce produit doivent être étudiés. D’un point de vue fondamental, la mesure du degré d’hydrolyse des protéines du fromage, la caractérisation des peptides bioactifs et la mesure de la teneur en polyphénols des fromages aux algues à différentes étapes de l’affinage pourraient être réalisées. Ces analyses permettront d’identifier et de mieux comprendre les changements biochimiques dus à la présence des macroalgues, surtout dans le cas du fromage contenant S. longicruris. La stabilisation de la capacité inhibitrice de l’ECA de ce fromage à partir de la 10e journée d’affinage pourrait être également explorée. La durée de conservation des fromages aux algues pourrait être également étudiée, puisque les macroalgues contiennent des composés antifongiques. De plus, d’un point de vue microbiologique, l’identification de la composition et la charge de la microflore du fromage pourraient aussi être déstabilisées. En effet, les macroalgues ont leur propre microflore indigène qui vient s’additionner aux ferments d’affinage du fromage, sans compter les peptides antimicrobiens qu’elles peuvent contenir. C’est d’ailleurs une étude qui se poursuit dans notre équipe de recherche. De plus, la réduction du sodium ajouté pourrait être également explorée, puisque les macroalgues en contiennent déjà beaucoup, sans compter les autres minéraux. Ainsi, un fromage aux algues réduit en sodium pourrait avoir des qualités nutritionnelles améliorées. Finalement, une production fromagère à l’échelle pilote a été réalisée afin d’en évaluer l’appréciation générale du consommateur. Notre partenaire industriel, la Fromagerie des Basques, a démontré un intérêt et envisage la commercialisation.

Annexes

Fromages aux algues commercialisés Tableau 6. Différentes variétés de fromages aux algues commercialisés et leurs descriptions

Fromages Illustration Description Origine

Trouville Le Trouville aux algues est une base de Pavé Calvados, aux algues d’Auge, fromage normand, un « mix » entre le Pont- Basse- L’Évêque et le Livarot, frotté avec un calvados pour Normandie lui former sa « morge » et ensuite recouvert d’algues et porté à maturité pendant 15 jours environ. Par la suite, il sera « essuyé » et mis en hâloir, le temps de son affinage, pendant 6 semaines : ce procédé explique son « moelleux » et son parfum puissant au goût plutôt agréable, légèrement iodé.

http://www.fromagerie- tourrette.com/fromage/trouville-aux-algues

Embruns L’affinage est réalisé dans un mélange de trois Nantes, aux algues algues : le nori, le kombu et la dulse qui se récoltent France par les pêcheurs des Côtes-D’Armor. Son goût iodé lui apporte une saveur énergique.

https://androuet.com/Embruns-aux-algues-941.html

Fromage de Un chèvre tout juste égoutté et très frais qui est Bretagne chèvre aux roulé par nos soins dans un mélange finement algues coupé de 3 algues différentes ! Sa pâte, fragile regorge de sérum (petit lait), elle est souple et fondante. Le fait de le recouvrir d'algues lui donne un goût iodé frais et agréable.

http://www.fromagerie- martin.com/fiche_produit.php?id=23109

Ti pavez Le Ti Pavez, “pavé local” en breton, est un fromage Bretagne à pâte pressée demi-cuite. Fabriqué entre terre et mer, avec du lait entier de vache et des algues du Finistère, il est ensuite affiné à l’eau de mer.

http://www.savourezlabretagne.com/ca1/synagri.nsf/ pages/le-ti-pavez

http://www.lafermedelintan.fr/nos-fromages/ti-pavez/

Rochefort Enrichi aux algues d'Ouessant, ce fromage affiné à Namur, aux algues Rochefort est une véritable petite merveille. Belgique

https://www.biendecheznous.be/rochefort-aux- algues

Biévénois Brabant N/D aux algues flamand, vertes ou https://www.biendecheznous.be/fromage/varietes- Belgique rouges de-fromages/fromage-de-ferme-bievenois-aux- algues-vertes

Dulses Fromage demi-dur au lait cru de vache Bio. Flandre orientale, Tire son nom de l'algue bretonne qui est incorporée Belgique au caillé doux ainsi qu'une pointe d'ail. Le Dulses fumé existe également.

https://www.biendecheznous.be/fromage/varietes- de-fromages/dulses

Tomme aux C’est le mélange terre et mer de notre ferme qui Bretagne algues réveillera vos papilles. Les algues nous viennent de l’île de Quemenes, une île près d’Ouessant (lien dans : aux alentours). Trois sortes d’algues sont utilisées : la dulse, la laitue et le nori.

http://fermedekeroudy.fr/wp- content/uploads/2013/02/tomme-algues.jpg

Teifi Teifi Seaweed is our Teifi Natural Gouda-style Ceredigion, seaweed cheese with locally harvested seaweed added Angleterre during the cheesemaking process. It has a dense, smooth and creamy texture and a mellow flavor that gets stronger with age. We use laver seaweed which is a popular ingredient in Welsh cuisine. The seaweed adds a mild saltiness. A great favorite of the late Paverati. This cheese is very versatile and loses nothing when heated. It's excellent when toasted or grilled; as it melts in strings and it's great on pizza.

http://www.teificheese.co.uk/shop/seaweed

Carrigaline A very unique cheese that must be tried! This Ireland dillisk creamy cheese gives off subtle tastes of the Atlantic, seaweed ideal with sea salt crackers and don't forget all those cheese wonderful health benefits that come with eating seaweed. It would be rude not to!

http://www.carrigalinecheese.com/our-cheese.html

Molkerei’s The goat cheese gets three days to mature. In the St. Anna- Goat course of time they have made exciting parochie, cheese with combinations. Goat Cheese with green herbs, garlic Pays-Bas Seaweed and onion or tapenade. Their latest invention therefore, seaweed, is in your box. With a layer of sunflower oil over it, and a nice packaging and that’s it!

http://demolkerei.nl/en/the-molkereis-goat-cheese- with-seaweed/

Sea weed A magnificently simple creation using the goodness Pays-Bas gooda of traditional extra creamy Dutch Gooda® mixed with an extra sprinkling of naturally salty and delicious seaweed. You may think you have tasted something like this before but chances are slim that you have treated yourself to anything of its kind.

http://cheeselandinc.com/seaweed-cheese.html

Dilliskus This semi-hard cheese, made from raw cow's milk, County is flavored with handpicked dillisk and is stronger Kerry, than the Kilcummin. This dark red seagrass Ireland speckles the cheese’s pale yellow hue and brings a hint of salt to this harvest of land and sea.

http://www.thelittlecheeseshop.ie/product/dilliskus-2/

Photos des prototypes des fromages aux algues

Les photos suivantes présentent les fromages prototypes produits durant ce présent projet de maîtrise. Les deux produits sont incorporés de 2% de flocons d’algues séchées.

Figure 13. Fromage prototype avec Palmaria palmata.

Figure 14. Fromage prototype avec Saccharina longicruris.

Chapitre 6 : Bibliographie

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