Biogeografía De Aislamientos Del Género Bacteriano Methylobacterium , Asociados a Las C a C T Á C E a S Cylindropuntia Spp
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Benemérita Universidad Autónoma D e P u e b l a Instituto de Ciencias Biogeografía de aislamientos del género bacteriano Methylobacterium , asociados a las c a c t á c e a s Cylindropuntia spp . T e s i s que para obtener el título de Maestría en Ciencias (Microbiología) P r e s e n t a Q.F.B. Mary Jose Salas Limón Director de tesis: D.C. Luis Ernesto Fuentes Ramírez Coasesora de tesis: D.C. María del Rocío Bustillos Cristales D i c i e m b r e 2020 1 Agradecimientos Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por el otorgamiento de la beca nacional de manutención a nivel Maestría. Se agradece a la Vicerrectoría de Investigación y Estudios de Posgrado por el apoyo otorgado para la conclusión de esta tesis dentro del Programa IV. Investigación y Posgrado. Apoyar a los programas de posgrado para lograr su incorporación al Padrón Nacional de Calidad. Indicador establecido en el Plan de Desarrollo Institucional 2017-2021. A la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla y el Instituto de Ciencias por ser parte de mi formación académica y apoyar mi proyecto. Al D.C. Luis Ernesto Fuentes Ramírez y la D.C. María del Rocío Bustillos Cristales por todo su apoyo, paciencia, enseñanza, por permitirme ser parte de su equipo de trabajo. A mi comité tutoral, D.C. Ricardo Carreño López, D.C. Miguel Castañeda Lucio, D.C. José Antonio Munive Hernández, por ser parte importante de mi formación académica. Gracias por todos sus comentarios y apoyo, un verdadero honor el aprender de ustedes. A la D.C. Verónica Quintero Hernández y la D.C. Vianey Marín Cevada, por sus revisiones a este trabajo. A mis compañeros de generación, Alma, Dulce, Enrique, Gaby, Giselle, María, Mónica, Uriel y Vero, por todos los buenos momentos juntos. A mis compañeros de laboratorio, Roberto, Rigel, Sandy, Bere, por su apoyo y enseñanzas. 2 Dedicatoria Para mi familia: Sergio, Josefina y Marylu, gracias a ustedes y para ustedes. Y para quien me hace sentir siempre como en casa, Oscar. 3 Índice Resumen ................................................................................................................................................. 6 Introducción ............................................................................................................................................. 8 1. Cactaceae ................................................................................................................................... 8 2. Reserva de la Biosfera Tehuacán-Cuicatlán .............................................................................. 8 3. Cylindropuntia ............................................................................................................................. 9 4. Comunidades microbianas asociadas a cactáceas .................................................................. 10 5. Metilotrofia ................................................................................................................................. 11 5.1. Metabolismo metilotrófico bacteriano................................................................................ 12 5.2. Oxidación del metanol ....................................................................................................... 12 6. Methylobacterium ...................................................................................................................... 14 7. Biogeografía Bacteriana De Plantas ......................................................................................... 15 8. Fingerprinting genómico ............................................................................................................ 15 8.1. BOX-PCR .......................................................................................................................... 16 Antecedentes ........................................................................................................................................ 17 Justificación ........................................................................................................................................... 18 Hipótesis................................................................................................................................................ 18 Objetivo general .................................................................................................................................... 18 Objetivos específicos ........................................................................................................................ 18 Materiales y métodos ............................................................................................................................ 19 1. Muestreo ................................................................................................................................... 19 2. Aislamiento ................................................................................................................................ 21 3. PCR en colonia ......................................................................................................................... 21 4. Extracción de ADN .................................................................................................................... 22 5. Amplificación de la región de ADN que codifica la subunidad 16S rRNA ................................ 22 6. Análisis de fragmentos de restricción de la amplificación del gen 16S rRNA (ARDRA) .......... 22 7. Secuenciación de ADN ............................................................................................................. 23 8. Análisis de secuencia ................................................................................................................ 23 9. Variabilidad genética ................................................................................................................. 23 Resultados y discusión de resultados ................................................................................................... 24 1. Aislamientos metilotróficos de la filosfera y endosfera de Cylindropuntia sp. .......................... 24 2. Caracterización genética ........................................................................................................... 26 3. Análisis de huellas genómicas BOX-PCR ................................................................................ 40 4. Methylobacterium sp. asociado a Cylindropuntia sp. ............................................................... 42 Conclusiones ......................................................................................................................................... 46 Perspectivas .......................................................................................................................................... 46 Referencias ........................................................................................................................................... 47 Anexos .................................................................................................................................................. 54 4 Índice de figuras Figura 1. Ubicación de la Reserva de la Biosfera Tehuacán-Cuicatlán ................................................. 9 Figura 2. Esquema general del metabolismo metilotrófico bacteriano. ................................................ 13 Figura 3. Localización de sitios de muestreo. ....................................................................................... 19 Figura 4. Cactáceas muestreadas. ....................................................................................................... 20 Figura 5. Morfología colonial en medio sólido MMS de cepas aisladas de Cylindropuntia sp. ............ 24 Figura 6. Aislamientos epifitos y endófitos por morfotipo de cactácea. ................................................ 25 Figura 7. Preferencia de los aislamientos por cofactor empleado ........................................................ 25 Figura 8. Conjunto de resultados obtenidos por PCR en colonia del gen 16S rRNA .......................... 29 Figura 9. Fragmentos de restricción obtenidos a partir del uso de la enzima de restricción CfoI en amplificados 16s rRNA .......................................................................................................................... 32 Figura 10. Análisis de fragmentos de restricción obtenidos a partir del uso de la enzima de restricción HinfI en amplificados de 16S rRNA. ..................................................................................................... 34 Figura 11. Árbol filogenético basado en las secuencias del gen 16S rRNA de 28 aislados. .............. 39 Figura 12. Análisis BOX-PCR de 30 aislados de Cylindropuntia sp. .................................................... 41 Figura 13. Aislamientos epifitos y endófitos de Methylobacterium sp. confirmados y presuntivos aislados de Cylindropuntia sp., organizados por morfotipo. ................................................................. 43 Índice de tablas Tabla 1. Caracterización genética de 40 aislamientos de filosfera y endosfera de Cylindropuntia sp. 38 Tabla 2. Aislamientos caracterizados por secuenciación del gen 16S rRNA, agrupados por morfotipo y compartimento aislado. ...................................................................................................................... 45 5 Resumen El género bacteriano Methylobacterium se encuentra distribuido en una amplia variedad de ambientes. Un ambiente