Revista Mexicana de Ingeniería Química ISSN: 1665-2738 [email protected] Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Iztapalapa México

López-Rojo, J.P.; García-Pinilla, S.; Hernández-Sánchez, H.; Cornejo-Mazón, M. ESTUDIO DE LA FERMENTACIÓN DE KÉFIR DE AGUA DE PIÑA CON TIBICOS Revista Mexicana de Ingeniería Química, vol. 16, núm. 2, 2017, pp. 405-414 Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Distrito Federal, México

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CONTENIDO ESTUDIO DE LA FERMENTACION´ DE ´ DE AGUA DE PINA˜ CON TIBICOS Volumen 8, número 3, 2009 / Volume 8, number 3, 2009 STUDY OF THE FERMENTATION OF PINEAPLE WATER KEFIR WITH TIBICOS J.P. Lopez-Rojo´ 1, S. Garc´ıa-Pinilla2, H. Hernandez-S´ anchez´ 2, M. Cornejo-Mazon´ 1* 1 Departamento de213 Biof´ısica,Escuela Derivation and application Nacional of de the Ciencias Stefan-Maxwell Biol´ogicas,Instituto equations Polit´ecnicoNacional. Carpio y Plan de Ayala, S/N Santo Tom´asc.p. 11340 Ciudad de M´exico. 2Departamento de Ingenier´ıaBioqu´ımica,Escuela (Desarrollo y aplicación de las ecuaciones Nacional de de Stefan-Maxwell) Ciencias Biol´ogicas,Instituto Polit´ecnicoNacional. Carpio y Stephen WhitakerPlan de Ayala, S/N Santo Tom´asc.p. 11340 Ciudad de M´exico. Recibido 13 de Enero de 2017; Aceptado 24 de Enero de 2017

Resumen Biotecnología / Biotechnology Los tibicos son245 macro-colonias Modelado de de la microbioglea biodegradaciónutiles´ en parabiorreactores la elaboraci de on´lodos de kdeefir´ hidrocarburos a partir de agua totales de pidelna˜ petróleo y otros sustratos. En este trabajo se estudio´ la cinetica´ de la fermentacion´ de kefir´ de agua de pina˜ y la produccion´ de biomasa obtenida a las 53 h fue de 36.7intemperizados g que correspondieron en suelos y a sedimentos un incremento del 74.6% respecto al valor inicial, con un pH de 4.67 ± 0.02. Al finalizar la fermentacion,´ se obtuvo una reduccion´ de 1.55 unidades de pH, debido al crecimiento de los tibicos y a (Biodegradation modeling of sludge bioreactors of total petroleum hydrocarbons weathering in soil la consecuente produccion´ de etanol, favoreciendo la acidificacion´ del medio. Durante la fermentacion,´ se produce acido´ lactico,´ obteniendoand 0.477 sediments) g de acido´ lactico´ /100 mL y su cinetica´ de produccion,´ se ajusto´ a un modelo de primer orden 2 S.A. Medina-Moreno,−1 S. Huerta-Ochoa, C.A. Lucho-Constantino, L. Aguilera-Vázquez, A. Jiménez- con una R = 0.989, k = 5.49 h y t1/2 = 12.62 h. Se obtuvo una relacion´ lineal entre la tasa de produccion´ de fenoles totales y la tasa de cambioGonzález de y M. la actividadGutiérrez-Rojas antioxidante lo que indico´ que los fenoles proveen, principalmente, la actividad antioxidante pues259 duranteCrecimiento, la fermentaci sobrevivenciaon,´ estos´ y adaptación son liberados de Bifidobacterium quedando disponibles.infantis a condiciones Se encontr ácidaso´ un mayor numero´ de colonias en la microbioglea que en el kefir´ de agua. Palabras clave: tibicos, (Growth, kefir,´ survival cinetica´ and de adaptation fermentaci ofon,´ Bifidobacterium actividad antioxidante. infantis to acidic conditions) Abstract L. Mayorga-Reyes, P. Bustamante-Camilo, A. Gutiérrez-Nava, E. Barranco-Florido y A. Azaola- Tibicos are macro-coloniesEspinosa of microbioglea useful for elaboration of kefir from pineapple water. In this work, the kinetics of the fermentation265 Statistical was studied approach and the to biomass optimization produced of at 53 hfermentation of fermentation by Saccharomyces was 36.7g that cerevisiae correspond in tothe a 74.6% of the initial value, with a pH of 4.67 ± 0.02. A reduction of 1.55 pH unit was achieved at the end of the fermentation, due to growth of tibicospresence and production of Valfor® of zeolite ethanol. NaA During fermentation, lactic acid was produced reaching a value of 0.477g 2 −1 lactic acid/100mL and (Optimización the kinetics estadística was described de la fermentación with a first etanólica order model de Saccharomyces with R = 0.989, cerevisiae k = 5.49en presencia h y t 1de/2 = 12.62 h. A linear relation between total rate of production of phenols and the rate of change of antioxidant activity was found zeolita Valfor® zeolite NaA) indicating that phenols mainly provide the antioxidant activity since during fermentation they are liberated and becoming available. A higherG. number Inei-Shizukawa, of colonies H. wereA. Velasco-Bedrán, found in the microbioglea G. F. Gutiérrez-López than in theand kefir. H. Hernández-Sánchez Keywords: tibicos, kefir, fermentation kinetics, antioxidant activity. Ingeniería de procesos / Process engineering 271 Localización de una planta industrial: Revisión crítica y adecuación de los criterios empleados en 1 Introducciestaon´ decisión encuentran embebidas y levaduras, mientras (Plant site selection: Critical review and adequationque criteria la used interna in this presenta decision) una estructura esponjosa debida a la acumulacion´ de CO producido durante la Mediante microscopJ.R.´ıa electr Medina,onica´ R.L. deRomero transmisi y G.A.on´ Pérez y de 2 fermentacion´ (Lutz, 1999). barrido, Moinas et al. (1980) dilucidaron la estructura El complejo tibi produce un polisacarido´ que se de los granos de tibicos y establecieron que los encuentra constituido solo por D-glucosa, la dextrana tibicos estan´ formados por una capa externa compacta del tibi esta´ constituida principalmente por pol´ımeros y una estructura interna esponjosa. La primera esta´ del tipo D-1,6-glucopiranosil; la dextrana es insoluble densamente poblada por , Streptococcus y la produce el complejo tibi especialmente el y levaduras que se embeben en una dextrana. (Horisberger, 1969). Los tibicos estan´ constituidos por una matriz de polisacaridos,´ generalmente dextranas, dispuestos en dos capas, la externa es compacta y en ella se * Autor para la correspondencia. E-mail: [email protected] Tel 57296000 ext 62314

Publicado por la Academia Mexicana de Investigacion´ y Docencia en Ingenier´ıa Qu´ımica A.C. 405 L´opez-Rojoy col./ Revista Mexicana deIngenier ´ıaQu ´ımica Vol. 16, No. 2 (2017) 405-414

Los tibicos pueden fermentar en diversos l´ıquidos 2.2 Cin´etica de fermentaci´ona partir de azucarados, alimentandose´ del azucar´ para producir agua con pi˜na acido´ lactico,´ etanol y dioxido´ de carbono, lo que hace que el agua este´ carbonatada (Leroi y Pidoux, 1993). Para la elaboracion´ del medio (Camacho-Ruiz et al., Las levaduras oxidan el azucar´ y producen alcohol 2016), se pesaron 12.5 g de azucar´ mascabada y mientras que las bacterias oxidan el alcohol para se agregaron a 237.5 mL de agua potable en un dar lugar a acido´ acetico´ ademas´ de otros productos frasco de 1000 mL. Se adicionaron 2 g de pina˜ (4 secundarios. Los tibicos fermentan el sustrato sobre piezas) y 12 g de tibicos. A partir del lote madre se todo si contiene sacarosa y los aromas unicos´ de realizaron 8 fermentaciones por lote por duplicado y las bebidas alcoholicas´ producidas por levaduras, con posteriormente se llevo´ a cabo la cinetica,´ misma que algunas excepciones son, frecuentemente, el resultado se realizo´ durante 53 h con toma de muestras a las 0, de los componentes mencionados anteriormente 6, 10, 23, 29, 33, 48 y 53 h. (Noble, 1978; Gamero et al., 2013). Los compuestos con grupos carbonilo, azufre 2.3 An´alisisfisicoqu´ımicode k´efirde agua y varios compuestos fenolicos´ son otros tipos de subproductos de la fermentacion´ con levadura 2.3.1 Determinaci´onde s´olidossolubles (°Brix) que afectan el aroma de las bebidas alcoholicas´ Se realizo´ de acuerdo a la NMX-F-436-SCFI-2011 (Suomalainen y Lehtonen 1979). Los compuestos usando un refractometro´ ATAGO modelo 57687 carbonilo de gran interes´ son los aldeh´ıdos que (Japon)´ y se basa en obtener el ´ındice de refraccion´ son intermediarios en la formacion´ de alcoholes. de soluciones que contengan principalmente sacarosa. El diacetilo y 2,3-pentanodiona se forman durante la fermentacion´ por la descarboxilacion´ de los acidos´ α-acetolactico´ y α-aceto-α-hidroxibut´ırico 2.3.2 Determinaci´onde pH (Suomalainen y Lehtonen, 1979). Estos compuestos, Se determino´ de acuerdo a la norma NMX-F-317-S- contribuyen al aroma en productos fermentados 1978 y se realizo´ directamente del fermentado con un (Tressl et al., 1980). Los compuestos fenolicos´ potenciometro´ (HACH Sens ion 1, modelo: 51700-23, producidos durante una fermentacion´ alcoholica´ con code: 1012 s/n 0C210092. China, Electrodo: HANNA levaduras son derivados de la catalisis´ del acido´ p- instruments, part code: HI 1332B, Cot. Nr: 15324). cumarico,´ acido´ ferulico´ y vanillina (Ettayebi et al. 2003; Meaden 1998; Suomalainen y Lehtonen 1979). Los productos fenolicos´ formados por la accion´ de 2.3.3 Determinaci´onde acidez titulable la levadura son, 4-etilfenol, 4-etilguayacol, y 4-metil Se tomaron 5 mL de kefir´ en un matraz Erlenmeyer guayacol (Suomalainen y Lehtonen 1979). de 50 mL y se adicionaron 35 mL de agua destilada El objetivo del presente trabajo fue caracterizar la con 2 gotas de fenolftale´ına. La titulacion´ se realizo´ cinetica´ de kefir´ de pina˜ fermentado por tibicos, as´ı con NaOH 0.01 N hasta pH de 7 y se registro´ el como estudiar la actividad antioxidante y el contenido volumen utilizado de NaOH por muestra (Rubio et al., de compuestos fenolicos´ de este producto. 1993). La acidez titulable se expreso´ como g de acido´ lactico´ /100 mL utilizando la Ecuacion´ 1.

g acido´ lactico´ mLNaOH ∗ NNaOH(meq/mL) ∗ pEq = 100 ml Al´ıcuota*1000 (1) 2 Materiales and metodos´ Donde: mL NaOH es el gasto de NaOH; N NaOH es la normalidad del NaOH; pEq es el peso equivalente de acido´ lactico´ (0.09 g/meq) y la al´ıcuota utilizada fue 2.1 Producci´onde biomasa de 5 mL. Se siguio´ la cinetica´ de primer orden de incremento de acidez titulable, misma que fue ajustada Los tibicos fueron adquiridos en el Estado de Mexico´ e segun´ el modelo dado por la Ecuacion´ (2). hidratados en un matraz de 3 litros al que se le adiciono´ como sustrato piloncillo 5% p/v. La fermentacion´ se [A] realizo´ por 72 h (Villegas et al., 2016). ln = −kt (2) [A]0

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En la que [A] es la concentracion´ de A al tiempo t, porcentaje de inhibicion´ a partir de la Ecuacion´ 4. La [A]o es la concentracion´ inicial de A, k es la constante curva estandar´ fue construida con Trolox y el resultado de velocidad de reaccion´ y t es el tiempo de reaccion.´ se reporta en µmoles equivalentes de Trolox/mL. Asimismo, se obtuvo el tiempo de vida media ! Abs − Abs (t1/2) de la concentracion´ inicial A (Ec. 2) que indica % Inhibicion´ = C M ∗ 100% (4) el tiempo en el que A, reduce su concentracion´ en un AbsC 50% de acuerdo a la siguiente ecuacion:´ Donde AbsC es la absorbancia control y AbsM de la 0.693 muestra. t = (3) 1/2 k 2.4.2 Determinaci´onde fenoles totales 2.3.4 Producci´onde etanol Se empleo´ la tecnica´ colorimetrica´ propuesta por Se determino´ de acuerdo a la NOM-142-SSA1-1995 Singleton y Rossi (1965) con modificaciones por con modificaciones. Se tomaron 100 mL de muestra en Ceron-Montes´ et al. (2015). Se colocaron 200 µL de un sistema de destilacion.´ El destilado se midio´ y aforo´ muestra y 200 µL del reactivo Fol´ın Ciocalteu, dejando a 100 mL con agua destilada. Posteriormente se midio´ reaccionar por 6 minutos y se detuvo la reaccion´ la concentracion´ de alcohol con un alcohol´ımetro con adicionando 4 mL de bicarbonato de sodio al 2 %. La escala °Gay Lussac a 20 ºC. La lectura obtenida se solucion´ se dejo´ reposar por 30 minutos. Al termino´ convirtio´ a mg etanol/mL utilizando la densidad del de este tiempo se midio´ la absorbancia a 765 nm en un etanol (0.789 g/mL). espectrofotometro´ Perkin-Elmer lambda 35. Se utilizo´ una curva estandar´ de acido´ galico´ y se reportaron los 2.4 Actividad antioxidante y contenido equivalentes de acido´ galico´ (EAG). fen´olico El metodo´ empleado fue propuesto por Williams et 2.5 Microbiolog´ıadel k´efirde agua de pi˜na al. (1995) con algunas modificaciones de Mishra y microbioglea et al. (2012). Se tomaron 10 mL del caldo de 2.5.1 Determinaci´onde microbioglea fermentacion´ por cada punto de la cinetica´ y se evaporaron al vac´ıo a 45°C hasta un volumen final Se tomaron 1 mL de los tibicos y kefir´ a las 29 de 3 mL (Espinosa-Velazquez´ et al., 2016; Gomez-´ h de fermentacion´ para el analisis´ morfologico.´ Las Sampedro y Zapata-Montoya, 2016). Se realizo´ una diluciones de los tibicos se realizaron hidratando 1 g dilucion´ 1:1 de metanol y HCOOH al 3% mismos en agua peptonada esteril´ al 0.1% (Escobedo, 2014). que se sonicaron a una frecuencia de 20.5 kHz Para la determinacion´ de la microbioglea se realizaron por 10 min, posteriormente fueron agitados por 30 diluciones seriadas y se inoculo´ 1 mL por dilucion´ min y finalmente centrifugados por 10 min a 3250 durante 37 h. rpm. El sobrenadante se evaporo´ al vac´ıo a 35°C hasta un volumen final de 3 mL. Los extractos se 2.5.2 Identificaci´onde bacterias aerobias mantuvieron refrigerados a 4°C hasta su uso. Previo a la determinacion´ de actividad antioxidante por DPPH Se identificaron de acuerdo a la NOM-092-SSA1- y contenido de compuestos fenolicos,´ los extractos se 1994. Se inocularon por duplicado muestras de tibicos centrifugaron a 12000 rpm por 10 min. y kefir´ preparadas segun´ la NOM-110-SSA1-1994. La siembra se realizo´ por el metodo´ de rastrillo en 2.4.1 Determinaci´on de actividad antioxidante por Agar Cuenta Estandar´ (ACE) y se dejo´ un blanco sin DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) sembrar como control. La incubacion´ fue en posicion´ invertida por 48 h a 37°C (NOM-092-SSA1-1994). Los extractos fueron filtrados a traves´ de discos con porosidad de 45 µm. La reaccion´ se inicio´ adicionando 2.5.3 Identificaci´onde hongos y levaduras una solucion´ de DPPH (50 µM) en metanol con 1 mL del extracto y se mantuvo a 25°C por 30 min en Se realizo´ de acuerdo a la NOM-111-SSA1-1994. 1 la oscuridad. Posteriormente, se midio´ la absorbancia mL de la muestra l´ıquida se coloco´ por duplicado en a 717 nm (Hernandez-Carrillo´ et al., 2015). Como cajas Petri. Se vertieron de 15 a 20 mL de medio blanco se utilizo´ metanol al 80%. Se calculo´ el Agar Papa Dextrosa (PDA) acidificado a un pH de 3.5

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L´opez-Rojoy col./ Revista Mexicana deIngenier ´ıaQu ´ımica Vol. 16, No. 2 (2017) 405-414 1 2. Tablas y Figuras 2

y se dejo´ un blanco como control. La incubacion´ se 40 38 realizo´ por metodo´ de rastrillo por 3, 4 y 5 d´ıas y para 36 la identificacion´ se utilizaron las placas conteniendo 34 entre 10 y 150 colonias. 32 30 2.5.4 Identificaci´onde bacterias acido-l´acticas 28

Peso de biomasa (g) de biomasa Peso 26 Se llevo´ a cabo de acuerdo al metodo´ de Rubio et al. 24 (2014) con modificaciones. Se empleo´ el agar MRS 22 20 adicionando 1 mL y se incubo a 36°C por 48 h. Se 0 10 20 30 40 50 60 Tiempo (h) mantuvo un blanco como control. 3 Fig. 1. Produccion´ de biomasa de tibicos en agua de 4 Figura 1. Producción de biomasa de tibicos en agua de piña. 2.6 An´alisisestad´ıstico pina.˜ 5,5 Todos los ensayos se realizaron por triplicado y se expresaron como media ± error estandar.´ Se llevo´ 5

a cabo un ANOVA utilizando el software SigmaStat Brix) Brix) 3.5 (Systat Software Inc., EE.UU.), el nivel de ° 4,5 significancia para cada prueba fue 2α = 0.05. Todos los analisis´ estad´ısticos se realizaron con el software 4

Design Expert y XLSTAT. solubles ( Sólidos 3,5

3 3 Resultados y discusiones 0 10 20 30 40 50 60 5 Tiempo (h) Fig. 2. VariaciManuscritoon´ de sometido solidos´ a la Revista solubles Mexicana del de I kngenieríaefir´ de Química agua1 3.1 Producci´onde biomasa del fermentado 6 Figura 2. Variación de sólidos solubles del kéfir de agua de piña. de tibicos en agua de pi˜na de pina.˜ 4,8

Como se observa en la Figura 1, la produccion´ de 4,6

biomasa obtenida a las 53 h fue del 36.7 g que 4,4

corresponden a un incremento del 74.6% respecto 4,2

al valor inicial, con un pH de 4.67 ± 0.02. Stadie 4

et al. (2013) reportan que el pH optimo´ para el pH 3,8 crecimiento de tibicos es cercano a 4.0. Horisberger 3,6 (1969) reporto´ que, durante la fermentacion,´ los 3,4 tibicos forman dextranas con los azucares´ presentes en 3,2 el medio, por lo que la disponibilidad de los azucares´ 3 0 10 20 30 40 50 60 en la pina˜ facilita la produccion´ de biomasa. Por Tiempo (h) otro lado, Reib (1990) observo´ que, a los 18 d´ıas de 7 Fig. 3. Variacion´ de pH del kefir´ de agua de pina.˜ fermentacion´ con higos, la produccion´ de biomasa de 8 Figura 3. Variación de pH del kéfir de agua de piña. los tibicos alcanzo´ un 70% del valor inicial, lo que Manuscrito sometido a la Revista Mexicana de Ingeniería Química2 Durante las 53 h de fermentacion´ se presento´ indica que es mas´ eficiente la produccion´ de biomasa una disminucion´ de 1.71% °Brix (de 5.03 a 3.32) en pina˜ que en higos pues se realizo´ en un tiempo debido al uso de los azucares´ como sustrato durante considerablemente mas´ corto. Asimismo, el porcentaje la fermentacion´ (Rubio, 1993). de humedad encontrado en nuestro producto fue del 83.83 ± 0.12% que es similar al reportado por Ulloa y En la Figura 3, se observa la variacion´ de pH Herrera (1981). durante la fermentacion.´ Al finalizar la misma se obtuvo una reduccion´ de 1.55 unidades de pH, debido 3.2 An´alisisfisicoqu´ımicodel k´efirde agua al crecimiento de los tibicos y a la consecuente produccion´ de etanol, favoreciendo la acidificacion´ En la Figura 2, se observa el contenido de solidos´ del medio. El pH en medios con fruta como la pina,˜ solubles (°Brix) durante la fermentacion´ de tibicos en disminuye debido a la formacion´ de acidos´ lactico´ y pina.˜ acetico´ a partir de etanol (Rubio, 1991; Liu, 2011).

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0,6 45

40 0,5 35

0,4 30

25 0,3 20 0,2

15 Ácido láctico (g/100 mL) (g/100 Ácidoláctico 0,1 10

5

0 Capacidad de Antioxidante (µmolEqTrolox/mL) Antioxidante de Capacidad 0 10 20 30 40 50 60 0 Tiempo (h) 0 6 24 29 33 36 48 53 9 Tiempo (h) 16 10 FiguraFig. 4. 4.Producción Producci de ácidoon´ láctico de delacido´ kéfir de agua lactico´ de piña. del kefir´ de agua 17 FiguraFig. 7. Variación 7. Variaci de la actividadon´ de antioxidante la actividad del kéfir de agua antioxidante de piña. del kefir´ de pina.˜ de agua de pina.˜ 3,5 y = 0,0549x + 0,0384 3 R² = 0,9892 La produccion´ de etanol (Figura 6) fue de 0.08

2,5 mg/mL a las 29 h de fermentacion.´ El tiempo al

2 cual se encontro´ la concentracion´ maxima´ depende de la disponibilidad de los azucares´ presentes en cada 1,5 Ln Ln (A/Ao) medio, pues de esto depende, el crecimiento de los 1 microorganismos (Rubio et al., 1993). Su produccion´ 0,5 se atribuye principalmente a la presencia de levaduras 0 0 10 20 30 40 50 60 fermentadoras como S. cerevisiae, C. guilliermondii, Tiempo (h) as´ı como a las bacterias B. polymyxa, B. coagulans, y 11 Fig. 5. Modelo matematico´ de la cinetica´ de primer bacterias heterolacticas,´ que son capaces de producir 12 Figuraorden 5. Modelo aplicado matemático a para la produccicinética de onprimer´ de ordenacido´ aplicado lactico´ a la producción en el de etanol a partir de la fuente de carbono (Rubio et al., 13 ácido láctico en el kéfir de agua de piña. Manuscrito sometido a la Revista Mexicana de Ingeniería Química7 kefir´ de agua de pina.˜ 1993).

0,09 Manuscrito sometido a la Revista Mexicana de Ingeniería Química4

0,08 3.3 Actividad antioxidante y contenido de 0,07

0,06 compuestos fen´olicos 0,05 La actividad antioxidante analizada por DPPH 0,04 se observa en la Figura 7. Durante el tiempo 0,03 de fermentado se observo´ una disminucion´ de 0,02 Producción de(mg/mL) etanol Producción actividad antioxidante durante las primeras 24 horas 0,01 y posteriormente un incremento hasta la actividad 0 0 6 24 29 33 36 48 53 inicial debido a la concentracion´ de acido´ lactico,´ Tiempo (h) enzimas intracelulares y extracelulares (Dom´ınguez- 14 15 FigurFig.a 6.6. Producción Producci de etanolon´ ende el kéfir etanol de aguaen de piña. el kefir´ de agua de pina.˜ Hernandez´ et al., 2016) que var´ıan durante la fermentacion´ (Rubio et al., 1993) y por la presencia La variacion´ de acidez titulable durante la de flavonoides y compuestos fenolicos´ presentes en fermentacion,´ se observa en la Figura 4. Durante la la pina˜ (Hossain y Rahman, 2011; Perez-Alonso´ et fermentacion,´ se produce acido´ lactico,´ obteniendo al., 2015). Los resultados de Lin y Chang (2000) 0.477 g de acido´ lactico´ /100 mL. Estudios reportados indican que la capacidad de eliminacion´ de radicales de fermentados de piloncillo muestran una acidez de de las celulas´ intactas y los extractos intracelulares 0.34 g de acido´ Manuscrito lactico´ sometido/100 a la mL Revista (Radazzo Mexicana etde I alngeniería., 2016) Química5 de B. longum y L. acidophilus contribuyen al efecto que es menor a la obtenida en agua de pina.˜ La cinetica´ antioxidante. Alsayadi et al. (2013) encontraron se ajusto´ a una cinetica´ de primer orden con una R2 = que las muestras de kefir´ de agua presentan una 0.989 (Figura 5) y los parametros´ correspondientes a excelente capacidad de captacion´ de los radicales en la produccion´ de acido´ lactico´ durante la cinetica´ de comparacion´ con otros estudios realizados con leche fermentacion´ (Ec. 2 y Ec. 3) fueron, k = 5.49 h−1 y de soya, suero de leche, leche de vaca, leche de cabra t1/2 = 12.62 h. y leche de arroz.

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25 los fenoles proveen, principalmente, la actividad antioxidante pues durante la fermentacion,´ estos´ 20 son liberados quedando disponibles. Los bajos

15 valores encontrados de concentracion´ de fenoles pueden deberse a la poca fruta que se anade˜ al 10 medio y cuyos compuestos fenolicos´ se liberaron durante la fermentacion,´ dejando expuestos los

5 grupos hidroxilo. Las producciones de sabores Fenoles Totales (mg Gálico/L) Ác. (mg Totales Fenoles fenolicos´ en bebidas fermentadas se atribuyen a 0 0 6 24 29 33 36 48 53 cepas de Saccharomyces cerevisiae y otros generos´ de Tiempo (h) levaduras como Rhodotorula, Candida, Cryptococcus, 18 Fig. 8. Produccion´ de fenoles totales en el kefir´ de agua Pichia, Hansenula, Dekkera, y Brettanomyces 19 Figura 8. Producción de fenoles totales en el kéfir de agua de piña. de pina.˜ que contrubuyen a malos “sabores fenolicos”´ en 18 productos vin´ıcolas (Coghe et al. 2004; Edlin et 16 al. 1995; Shinohara et al. 2000). Adicionalmente, 14 los microorganismos que se han encontrado en 12 R² = 0,9961 tibicos son Saccharomyces cerevisiae, Pichia 10 radaisii, Brettanomyces intermedius, Bettanomyces 8 Gálico/Lh) claussenii, Candida guilliermondii, Candida valida, 6 Cryptococcus albidus, Rhodotorula rubra (Ru´ız- 4 Oronoz, 1932; Estrada-Cuellar, 1985; Rubio et

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Velocidad Fenoles Totales Ác.(mgde Cambio Velocidad de al., 1993). Estos microorganismos pueden ser los 0 responsables de la presencia de los fenoles en el kefir´ 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Velocidad de Cambio de Capacidad Antioxidante (µmolEqTrolox/mLh) de agua de tibicos. 20 21 FiguraFig. 9 9.. Velocidad Velocidad de cambio de de cambiocapacidad antioxidante de capacidad con relación antioxidante a la velocidad de 22 cambiocon relacidel contenidoon´ de a fenoles la velocidad totales. de cambio del contenido de 3.4 Microbiolog´ıadel k´efirde agua de pi˜na 23 fenoles totales.Manuscrito sometido a la Revista Mexicana de Ingeniería Química8 En la Tabla 1, se presenta la morfolog´ıa colonial de Los extractos libres de celulas´ en algunas cepas las macrocolonias y microbioglea de kefir´ de agua de bacterias acido-l´ acticas´ han mostrado una actividad de pina˜ en los medios de cultivos MRS, ACE y antioxidante con tasas de inhibicion´ de la auto- PDA. Las morfolog´ıas y crecimientos en la tercera oxidacion´ de ascorbato (Alsayadi et al., 2013). dilucion´ presentaron las mismas caracter´ısticas entre Mecanismos antioxidantes tales como la capacidad la microbioglea y el kefir,´ por lo que el kefir´ albergo´ quelante de iones metalicos´ y el barrido de especies los mismos microorganismos que la microbioglea reactivas del ox´ıgeno contribuyen a la actividad (Laureys y De Vuyst, 2014). La morfolog´ıa observada antioxidante (Lin y Yen, 1999). correspondio´ a colonias de levaduras alargadas y En la Figura 8, se muestra la produccion´ de fenoles redondas, as´ı como a ascosporas con hifas. totales durante las cineticas´ de fermentacion,´ con una Se encontro´ un mayor numero´ de colonias en concentracion´ maxima´ de 19.78±0.31 mg equivalentes la microbioglea que en el kefir´ de agua debido a de acido´ galico´ /L a las 53 h. Randazzo et al. (2016) que los tibicos estan´ formados por una capa externa Manuscrito sometido a la Revista Mexicana de Ingeniería Química9 desarrollaron bebidas fermentadas con tibicos para compacta y una estructura interna esponjosa. La consumo moderado adicionado con jugos de frutos primera esta´ densamente poblada por bacterias y para cada bebida a los cuales les determino´ la cantidad levaduras que se embeben en la dextrana, mientras de fenoles totales dando como resultado 176.4 mg/L que la interna presenta una estructura esponjosa para el kefir´ adicionado con jugo de manzana y 61.69 debido a la acumulacion´ de CO2 producido durante la mg/L para kefir´ adicionado con jugo de uva ambos fermentacion´ (Lutz, 1999; Moinas et al. 1980). expresados como mg equivalentes acido´ galico´ /L. No obstante, la ausencia de Lactobacillus no se En la Figura 9 se muestra la relacion´ entre observo´ como´ lo reporto´ Ronald (2007), donde el la tasa de produccion´ de fenoles totales y la tasa complejo tibi produce un polisacarido´ de dextrana de cambio de la actividad antioxidante. Se obtuvo constituido principalmente por D-1,6-glucopiranosil, una relacion´ lineal (R2= 0.996) lo que indico´ que insoluble y producido por Lactobacillus brevis.

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24 Tabla 1. Morfología colonial de la microbioglea y kéfir de agua de piña e incubada en medio MRS, ACE y PDA.

MRS ACE PDA

Microbioglea Kéfir Microbioglea Kéfir Microbioglea Kéfir Dilución -3 -3 -3 -3 -3 -4 Forma Circular Circular Puntiforme Puntiforme Rizoide Rizoide Color Crema Crema Crema Crema Rosa pálido Rosa pálido Borde Entero Entero Entero Entero Ramoso Ramoso Superficie Lisa Lisa Lisa Lisa Filamentosa Filamentosa Elevación Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa rugosa Convexa rugosa Luz Traslucido Traslucido Mate Mate Mate Mate reflejada Luz Opaco Opaco Opaco Opaco Opaco Opaco transmitida Aspecto Húmedo Húmedo Húmedo Húmedo Seco Seco Tinción de Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Gram Cristal Alargadas y Alargadas y NA NA NA NA violeta circulares circulares 25 Man-Rogosa-Sharpe (MRS), Agar Cuenta Estándar (ACE), Papa Dextrosa Agar (PDA), No Aplica (NA).

Sin embargo, la manera de crecer bacterias acido- indico´ que los fenoles proveen, principalmente, la lacticas´ es en un ambiente microaerof´ılco en medio actividad antioxidante pues durante la fermentacion,´ MRS (Rubio et al. 1993). A su vez, el kefir´ de estos´ son liberados quedando disponibles. Se encontro´ agua es un medio muy demandante para el genero´ un mayor numero´ de colonias en la microbioglea que Lactobacillus debido a su baja concentracion´ de en el kefir´ de agua. aminoacidos´ esenciales (Stadie et al., 2013) limitando su crecimiento. Agradecimientos Microorganismos presentes en los tibicos como mesenteroides (Pidoux, 1989) ManuscritoLos autoressometido a agradecen la Revista Mexicana a CONACyT de Ingeniería e IPN Química por10 otorgar considerados seguros para la salud humana, financiamiento para la investigacion.´ son productores de dextranas (Duboc y Mollet, 2001). Las dextranas, producidas principalmente Nomenclatura por Leuconostoc, Lactobacillus, Streptococcus, y Weissella, difieren en el tipo de enlace glucos´ıdico, mL NaOH N NaOH gasto de NaOH en mL edad, grado y tipo de ramificacion,´ longitud de normalidad de NaOH cadena, peso molecular, distribucion´ y conformacion´ pEq peso equivalente de acido´ lactico´ de cadena polimerica.´ Esta variacion´ es influenciada AbsC absorbancia control por la cepa, condiciones de cultivo y composicion´ del AbsM absorbancia de la muestra medio (Yang et al., 2015), por lo que en el kefir´ de agua de pina˜ es posible considerar la presencia de una Referencias mezcla de dichos microorganismos. Alsayadi, M., Al Jawfi, Y., Belarbi, M., y Sabri, F. Z. (2013). Antioxidant potency of water kefir. The Conclusiones Journal of Microbiology, Biotechnology and Durante la fermentacion´ por tibicos en agua de pina,˜ Food Sciences 2, 2444. se incremento´ la biomasa inicial en 74.6%, alcanzando Brand-Williams, W., Cuvelier, M. y Berset, C. un pH de 4.67±0.02 y una humedad de 83.83 ± 0.12%. (1995). Use of a free radical method to La concentracion´ final de acido´ lactico´ obtenida fue evaluate antioxidant activity. Food Science and de 0.477 g de acido´ lactico´ /100 mL y se produjo Technology 28, 25-30. linealmente con un R2 = 0.989. La produccion´ de etanol fue de 0.08 mg/mL a las 29 h de fermentacion´ Camacho-Ruiz, M.A., Camacho-Ruiz, R.M., con una actividad antioxidante de 19.78±0.31 mg Armendariz, M., Ramirez-Velasco, L., Asaff- equivalentes de acido´ galico´ /L la cual no presento´ Torres, A., Levasseur, A., Mateos-Diaz, J.C., diferencia significativa durante el fermentado. La y Rodriguez, J.A. (2016). Corn bran as relacion´ de tasa de produccion´ de fenoles totales y potential substrate for high production of de cambio de actividad antioxidante fue lineal lo que feruloyl and acetylxylan esterases by solid state

www.rmiq.org 411 L´opez-Rojoy col./ Revista Mexicana deIngenier ´ıaQu ´ımica Vol. 16, No. 2 (2017) 405-414

fermentation. Revista Mexicana de Ingenier´ıa Ettayebi, K., Errachidi, F., Jamai, L., Tahri- Qu´ımica15, 11-21. Jouti, M. A., Sendide, K., y Ettayebi, M. (2003). Biodegradation of polyphenols Ceron-Montes,´ G.I., San Martin-Martinez,´ E., Yanez-˜ with immobilized Candida tropicalis under Fernandez,´ J., Quezada-Cruz, M., y Castro- metabolic induction. FEMS Microbiology Munoz,˜ R. (2015). Preliminary purification of Letters 223, 215-219. anthocyanins from blue corn by adsorption and electrophoresis. Revista Mexicana de Ingenier´ıa Gamero, A., Tronchoni, J., Querol, A., y Belloch, Qu´ımica14, 99-108. C. (2013). Production of aroma compounds by cryotolerant Saccharomyces species and Coghe. S., Benoot, K., Delvaux, F., Vanderhaegen, hybrids at low and moderate fermentation B., y Delvaux, F. R. (2004). Ferulic acid release temperatures. Journal of Applied Microbiology and 4-vinylguaiacol formation during brewing 114, 1405-1414. and fermentation: indications for feruloyl Gomez-Sampedro,´ L.J. y Zapata-Montoya, J.E. esterase activity in Saccharomyces cerevisiae. (2016). Obtaining of antioxidant peptide from Journal of Agricultural and Food Chemistry 52, bovine plasma hydrolysates and effect of the 602-608. degree of hydrolysis on antioxidant capacity. Revista Mexicana de Ingenier´ıa Qu´ımica 15, Dom´ınguez-Hernandez,´ C.R., Garc´ıa-Alvarado, 101-109. M.A., Garc´ıa-Galindo, H.S., Salgado- Cervantes, M.A., y Beristain,´ C.I. Hernandez-Carrillo,´ J.G., Valdez-Fragoso, A., Welti- (2016). Stability, antioxidant capacity and Chanes, J., y Mujica-Paz,´ H. (2015). Tracing bioavailability of nano-emulsified astaxanthin. phenolic compounds through manufacturing of Revista Mexicana de Ingenier´ıa Qu´ımica 15, edible films from orange and grapefruit peels. 457-468. Revista Mexicana de Ingenier´ıa Qu´ımica 14, 567-578. Duboc, P., y Mollet, B. (2001). Applications of exopolysaccharides in the dairy industry. Horisberger, M. (1969). Structure of the dextran of International Dairy Journal 11, 759-768. the tibi grain. Carbohydrate Research 10, 379- 385. Edlin, D. A., Narbad, A., Dickinson, J. R., y Hossain, M. A., y Rahman, S. M. (2011). Total Lloyd, D. (1995). The biotransformation of phenolics, flavonoids and antioxidant activity simple phenolic compounds by Brettanomyces of tropical fruit pineapple. Food Research anomalous. FEMS Microbiology Letters 125, International 44, 672-676. 311-315. Laureys, D., y De Vuyst, L. (2014). Microbial species Escobedo, M. (2014). Aislamiento e identificacion´ diversity, community dynamics, and metabolite de levaduras de la bebida fermentada por kinetics of water kefir fermentation. Applied and los “tibicos”. Tesis de licenciatura. Escuela Environmental Microbiology 80, 2564-2572. Nacional de Ciencias Biologicas.´ Pp: 132. Leroi, F., y Pidoux, M. (1993). Detection of Espinosa-Velazquez.,´ R., Dorantes-Alvarez, R., interactions between and lactic acid Gutierrez-L´ opez,´ G.F., Garc´ıa-Armenta, E., isolated from sugary kefir grains. Sanchez-Segura,´ L., Perea-Flores, M.J., Journal of Applied Bacteriology 74, 48-53. Ceballos-Reyes, G.M., y Ort´ız Moreno., A. Lin, M. Y., y Chang, F. J. (2000). Antioxidative effect (2016). Morpho-structural description of unripe of intestinal bacteria Bifidobacterium longum and ripe avocado pericarp (Persea americana ATCC 15708 and Lactobacillus acidophilus mill var. drymifolia) description. Revista ATCC 4356. Digestive Diseases and Sciences Mexicana de Ingenier´ıaQu´ımica15, 469-480. 45, 1617-1622. Estrada-Cuellar, J. (1985). Estudio de las levaduras Lin, M. Y., y Yen, C. L. (1999). Antioxidative ability de los tibicos y de la madre del vinagre. Tesis of lactic acid bacteria. Journal of Agricultural Biolog´ıa, Facultad de Ciencias, UNAM. and Food Chemistry 47, 1460-1466.

412 www.rmiq.org L´opez-Rojoy col./ Revista Mexicana deIngenier ´ıaQu ´ımica Vol. 16, No. 2 (2017) 405-414

Liu, S. N., Han, Y., y Zhou, Z. J. (2011). Lactic acid D.J. (2015). Stabilization of phenolic bacteria in traditional fermented Chinese foods. compounds from Opuntia oligacantha forst by Food Research International 44, 643-651. microencapsulation with agave sap (aguamiel). Revista Mexicana de Ingenier´ıa Qu´ımica 14, Lutz, M. L. (1999). Recherches biologiques sur la 579-588. consitution du tibi. Bulletin Trimestriel de la Soci´et´ede Mycologie Fran¸cais15, 68-70. Pidoux, M. (1989). The microbial flora of sugary kefir grain (the gingerbeer plant): Meaden, P. (1998). Brewers’ . International biosynthesis of the grain from Lactobacillus Dairy Federation special issue 9801. Yeasts in hilgardii producing a polysaccharide gel. the dairy industry: positive and negative aspects. MIRCEN Journal of Applied Microbiology and International Dairy Federation, Brussels, Biotechnology 5, 223-238. Belgium, 162-172. Randazzo, W., Corona, O., Guarcello, R., Francesca, Moinas, M., Horisberger, M., y Bauer, H. (1980). N., Germana,` M. A., Erten, H. y Settanni, The structural organization of the Tibi grain L. (2016). Development of new non-dairy as revealed by light, scanning and transmission beverages from Mediterranean fruit juices Archives of Microbiology 128 microscopy. , 157- fermented with water kefir . 161. Food Microbiology 54, 40-51. Mishra, K., Ojha, H. y Chaudhury, N.K. (2012). Ronald, A. (2007). Frutoterapia: Nutrici´ony Salud. Estimation of antiradical properties of Editorial EDAF. Madrid antioxidants using DPPH assay: A critical review and results. Food Chemistry 130, 1036- Rubio M. T. (1991). Caracterizacion´ microbiologica´ 1043. y bioqu´ımica de la fermentacion´ de tibicos en piloncillo. Tesis de Biolog´ıa. Facultad de NMX-F-317-S-1978. Determinacion´ de pH en ciencias. UNAM. alimentos. Determination of pH in foods. Normas Mexicanas. Direccion´ General de Rubio, M. T., Lappe, P., Wacher, C., y Ulloa, Normas. M. (1993). Estudio microbiano y qu´ımico de la fermentacion´ de soluciones de NMX-F-436-SCFI-2011 Industria azucarera y piloncillo inoculadas con tibicos. Revista alcoholera - determinacion´ de grados Brix en Latinoamericana de Microbiolog´ıa35, 19-31. jugos de especies vegetales productoras de azucar´ y materiales azucarados - metodo´ del Rubio, R., Jofre,´ A., Mart´ın, B., Aymerich, T., y refractometro.´ Garriga, M. (2014). Characterization of lactic acid bacteria isolated from infant faeces as Noble, A. (1978). Aroma. In: Peterson MS, Johnson potential starter cultures for fermented AH (ed.) Encyclopedia of Food. AVI, Westport, sausages. Food Microbiology 38, 303-311. CT, USA, pp 50-51. Norma Oficial Mexicana. NOM-092-SSA1-1994. Ruiz-Oronoz, M. 1932. Estudio micologico´ de las Metodo´ para la cuenta de bacterias aerobias en zoogleas conocidas vulgarmente como tibicos. Anales del Instituto de Biolog´ıa,UNAM 3 placa. , 183- 190. Norma Oficial Mexicana NOM-111-SSA1-1994. Metodo´ para la cuenta de mohos y levaduras en Shinohara, T., Kubodera, S., y Yanagida, F. (2000). alimentos. Distribution of phenolic yeasts and production of phenolic off-flavors in wine fermentation. Norma Oficial Mexicana NOM-142-SSA1- Journal of Bioscience and Bioengineering 90, 1995. Bebidas alcoholicas.´ Especificaciones 90-97. sanitarias. Etiquetado sanitario y comercial. Singleton, V. L., y Rossi, J. A. (1965). Colorimetry Perez-Alonso,´ C., Campos-Montiel, R.G., of total phenolics with phosphomolybdic- Morales-Luna, E., Reyes-Mungu´ıa, A., phosphotungstic acid reagents. American Aguirre-Alvarez,´ G., y Pimentel-Gonzalez´ Journal of Enology and Viticulture 16, 144-158.

www.rmiq.org 413 L´opez-Rojoy col./ Revista Mexicana deIngenier ´ıaQu ´ımica Vol. 16, No. 2 (2017) 405-414

Stadie, J., Gulitz, A., Ehrmann, M. A., y Vogel, Ulloa, M., Herrera-Suarez,´ T., y Lappe-Oliveras, P. R. F. (2013). Metabolic activity and symbiotic (1987). Fermentaciones tradicionales ind´ıgenas interactions of lactic acid bacteria and yeasts de Mexico.´ isolated from water kefir. Food Microbiology 35, 92-98. Villegas, E., Tellez-T´ ellez,´ M., Rodr´ıguez, A., Carreon-Palacios,´ A.E., Acosta-Urdapilleta, Suomalainen, H., y Lehtonen, M. (1979). The M.L., Kumar-Gupta, V., y D´ıaz-God´ınez, production of aroma compounds by yeast. G. (2016). Laccase activity of Pycnoporus Journal of the Institute of Brewing 85, 149-156. cinnabarinus grown in different culture systems. Tressl, R., Bahri, D., y Kossa, M. (1980). In: Revista Mexicana de Ingenier´ıa Qu´ımica 15, Charalambous G (ed) The analysis and control 703-710. of less desirable flavors in foods and beverages. Academic, NewYork, USA, pp 293-318 Yang, Y., Peng, Q., Guo, Y., Han, Y., Xiao, H., y Zhou, Z. (2015). Isolation and Ulloa, M., y Herrera, T. (1981). Estudio de Pichia characterization of dextran produced by membranaefaciens y Saccharomyces cerevisiae, Leuconostoc citreum NM105 from manchurian levaduras que constituyen parte de las zoogleas sauerkraut. Carbohydrate Polymers 133, 365- llamadas t´ıbicos en Mexico.´ 372.

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