Efecto De La Formulación Del Kéfir De Agua En Algunos Productos De Fermentación Con Tibicos”

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

“EFECTO DE LA FORMULACIÓN DEL KÉFIR DE AGUA EN ALGUNOS PRODUCTOS DE FERMENTACIÓN CON TIBICOS”

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

Que para obtener el título de Ingeniero Bioquímico

PRESENTA.

JUAN PABLO LÓPEZ ROJO

ASESORES DE TESIS

DRA. MARIBEL CORNEJO MAZÓN DR. HUMBERTO HERNÁNDEZ SÁNCHEZ

Agosto 2016

AGRADECIMIENTOS

Quiero agradecer a todas aquellas personas que fueron parte de esto, en especial:

A mi madre por ser valiente, por su amor y apoyo incondicional, por creer siempre en mí, por motivarme siempre pero sobre todo por enseñarme con su ejemplo a nunca rendirme y ser una persona trabajadora y honesta. Siempre te estaré agradecido.

A mi padre por esforzarse en mi desarrollo desde mi niñez, por ser un padre cariñoso y amoroso.

A mi hermano Iván por brindarme su apoyo en mi desarrollo profesional.

A mi asesora la Dra. Maribel Cornejo Mazón por sus conocimientos, orientación, paciencia y confianza brindada durante el desarrollo de este trabajo de investigación.

A mi coasesor el Dr. Humberto Hernández Sánchez por permitirme trabajar en el Laboratorio de Biotecnología de Alimentos brindándome toda su confianza.

A mis sinodales la Dra. Ma. Del Socorro López Cortez, Dra. María del Carmen Robles Ramírez y Dr. Gustavo Fidel Gutiérrez López por tomarse el tiempo de revisar este trabajo, pero sobre todo por compartir sus conocimientos.

A mi amiga Irma Wences por apoyarme en todo momento, motivarme a seguir adelante y hacerme reír siempre.

Finalmente a la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas y al Instituto Politécnico Nacional.

DEDICATORIA

A mis padres: Paula y Nicanor.

A mis hermanos Vladimir, Amynhé, Iván y Carolina.

A mis sobrinos.

A todos mis amigos y compañeros.

El presente proyecto de investigación se llevó a cabo en el Laboratorio de Investigación II del departamento de Biofísica y Laboratorio de Biotecnología de Alimentos del departamento de Alimentos de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional bajo la Dirección de la Dra. Maribel Cornejo Mazón y el Dr. Humberto Hernández Sánchez con el apoyo del Proyecto SIP-20141331.

ÍNDICE GENERAL. ÍNDICE GENERAL...... I ÍNDICE DE FIGURAS ...... IV ÍNDICE DE CUADROS ...... VI RESUMEN ...... VII 1. INTRODUCCIÓN ...... 1 2. ANTECEDENTES ...... 3 2.1 Fermentación ...... 3 2.1.1 Definición bioquímica de la fermentación ...... 3 2.1.2 Definición microbiológica de la fermentación ...... 3 2.2 Productos obtenidos por fermentación ...... 4 2.2.1 Bebidas fermentadas ...... 4 2.2.2 Kéfir de agua como probiótico ...... 5 2.3 Características de los tibicos ...... 6 2.3.1 Definición ...... 6 2.3.2 Origen de los tibicos ...... 7 2.3.3 Fermentación de los tibicos ...... 7 2.3.3.1 Composición nutrimental del piloncillo...... 8 2.3.3.2 Composición nutrimental del dátil...... 8 2.3.3.3 Composición nutrimental de la piña ...... 9 2.4 Microorganismos presentes en los tibicos ...... 10 2.5 Estructura de los granos de los tibicos ...... 11 2.5.1 Bioabsorción de metales mediante biomasa ...... 12 2.6 Procesos bioquímicos durante la fermentación ...... 13 2.6.1 Síntesis de compuestos bioactivos ...... 13 2.6.2 Desarrollo de aroma ...... 14 2.6.3 Subproductos de la fermentación ...... 14 3. ESTADO DEL ARTE...... 15 4. JUSTIFICACIÓN...... 16 5. OBJETIVOS ...... 17 5.2 Objetivo general ...... 17 5.3 Objetivos específicos ...... 17 6. MATERIAL ...... 18 6.2 Materias primas ...... 18

6.3 Reactivos ...... 18 6.4 Equipo ...... 20 7. MÉTODOS ...... 22 7.1 Diagrama de proceso ...... 22 7.2 Formulación de los medios de cultivo ...... 23 7.3 Fermentaciones ...... 23 7.3.1 Fermentación para la obtención del lote madre ...... 23 7.3.2 Fermentación empleando piloncillo ...... 23 7.3.3 Fermentación empleando dátil y la piña ...... 24 7.4 Muestreo de los medios en piloncillo, azúcar adicionado con dátil y azúcar adicionado con piña para las determinaciones ...... 24 7.5 Determinaciones a los tibicios ...... 25 7.5.1 Determinación de peso húmedo ...... 25 7.5.2 Determinación de humedad ...... 25 7.6 Determinaciones al kéfir de agua ...... 25 7.6.1 Determinaciones directas al kéfir de agua ...... 25 7.6.1.1 Determinación de Grados Brix (ºBx) ...... 25 7.6.1.2 Determinación de pH ...... 25 7.6.1.3 Determinación de acidez titulable ...... 26 7.6.1.4 Determinación de la concentración de alcohol ...... 26 7.6.2 Preparación de las muestras para la determinación de compuestos fenólicos y actividad antioxidante ...... 26 7.6.2.1 Determinación de capacidad antioxidante por el método DPPH .... 27 7.6.2.2 Determinación de fenoles totales ...... 28 7.6.2.3 Identificación de compuestos fenólicos por HPLC ...... 28 7.7 Determinaciones para los tibicos y kéfir de agua directa ...... 29 7.7.1 Determinación de metales por absorción atómica ...... 29 7.7.1.1 Método generador de hidruros ...... 30 7.7.1.2 Método Horno de grafito ...... 30 7.7.2 Determinaciones microbiológicas ...... 31 7.7.2.1 Bacterias aerobias en placas ...... 31 7.7.2.2 Hongos y levaduras ...... 32 7.7.2.3 Bacterias ácido-lácticas ...... 32 8 RESULTADOS Y DISCUSION ...... 33

8.1 Fermentación de activación en medio con piloncillo ...... 33 8.2 Determinaciones a los tibicos ...... 33 8.2.1 Peso Húmedo de la microbioglea ...... 33 8.2.2 Humedad de la microbioglea ...... 35 8.3 Determinaciones al kéfir de agua ...... 36 8.3.1 Grados Brix...... 36 8.3.2 Variación de pH del cultivo de kéfir ...... 37 8.3.3 Acidez titulable como ácido láctico, método adaptado de Rubio et al. (1993). 38 8.3.4 Producción de etanol ...... 41 8.4 Kéfir de agua concentrado ...... 42 8.4.1 Actividad antioxidante por el método DPPH ...... 42 8.4.2 Fenoles totales...... 45 8.4.3 Identificación de compuestos fenólicos ...... 47 8.4.3.1 Identificación de compuestos fenólicos en el medio con piloncillo . 47 8.5 Resultados de las determinaciones realizadas a la microbioglea y kéfir de agua 50 8.5.1 Determinación de metales a los tibicos y kéfir de agua...... 50 8.5.2 Determinaciones microbiológicas de microbioglea y kéfir de agua.... 52 8.5.2.1 Formulación con piloncillo, dátil y piña...... 53 9 CONCLUSIONES ...... 59 10 BIBLIOGRAFIA ...... 60 11 ANEXOS ...... 70 11.1 ANEXO 1: CURVAS DE CALIBRACIÓN ...... 70 11.2 ANEXO 2: MORFOLOGÍA COLONIAL Y MICROSCÓPICA ...... 74 11.2.1 Anexo 2.1 Morfología colonial y microscópica del medio con piloncillo 74 11.2.2 Anexo 2.2 Morfología colonial y microscópica del medio con dátil .... 77 11.3.3 Anexo 2.3 Morfología colonial y microscópica del medio con piña .... 80 11.3 ANEXO 3: PERFÍLES CROMATOGRÁFICOS DE LOS ESTÁNDARES UTILIZADOS EN LA DENTIFICACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS POR HPLC 83

III

ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1 Granos de tibicos (Moinas et al., 1980)………………………….. 6 Figura 2 Saccharomyces cerevisiae. Microscopía electrónica de barrido x7040 aumentos (Pontón et al., 2011)…………………………… 11 Figura 3 α-D-1,6-glucopiranosil con cadenas laterales 1,3……………… 12 Figura 4 Lactobacillus brevis (Vos et al., 2009)…………………………… 12 Figura 5 Gráfica de la cinética de adecuación al medio en la segunda fermentación para tibicos…………………………...... 33 Figura 6 Figura 6. Producción de biomasa de tibicos para Pl (piloncillo), Da (dátil) y Pñ (piña) expresada como promedio de las fermentaciones……………………………………………………. 34 Figura 7 Variación de sólidos solubles (°Bx) durante la fermentación con tibicos para los medios con piloncillo (Pl), dátil (Da) y piña (Pñ)…………………………………………………………………... 36 Figura 8 Variación de pH durante la fermentación con tibicos para los medios con piloncillo (Pl), dátil (Da) y piña (Pñ)…………………. 37 Figura 9 Variación de la acidez expresada como g de ácido láctico/100 ml durante la fermentación con tibicos para los medios con piloncillo (Pl), dátil (Da) y piña (Pñ)……………………………….. 39 Figura 10 Modelo matemático para cinética de primer orden aplicada a la producción de ácido láctico en las formulaciones con piloncillo, dátil y piña durante las 53 h de fermentación…………………….. 40 Figura 11 Actividad antioxidante por el método de DPPH………………….. 44 Figura 12 Contenido de fenoles totales durante la fermentación en los medios adicionados con piloncillo (Pl), dátil (Da) y piña (Pñ). (Datos obtenidos como promedio de dos fermentaciones por triplicado)……………………………………………………………. 46 Figura 13a Perfil cromatográfico por HPLC correspondiente al medio con piloncillo utilizado para la identificación de compuestos fenólicos a las 0 horas de fermentación………………………….. 48 Figura 13b Perfil cromatográfico por HPLC correspondiente al medio con piloncillo utilizado para la identificación de compuestos fenólicos a las 29 horas de fermentación………………………… 48 Figura 13c Perfil cromatográfico por HPLC correspondiente al medio con piloncillo utilizado para la identificación de compuestos fenólicos a las 53 horas de fermentación………………………… 48 Figura 14 Figura 14. Microorganismos vistos en microscopio óptico x100 del frotis directo de la microbioglea en medio con piloncillo (Tinción de Gram)………………………………………………….. 58

Figura 15 Curva tipo para la determinación de actividad antioxidante por método de DPPH expresada como µmolEquivalente Trolox/ml. 70 Figura 16 Curva de calibración de ácido gálico para la determinación de fenoles totales………………………………………………………. 72 Figura 17 Perfil cromatográfico del ácido ferúlico utilizado como estándar para la identificación de fenoles totales por HPLC………………. 83 Figura 18 Perfil cromatográfico del ácido cumárico utilizado como estándar para la identificación de fenoles totales por HPLC…… 83 Figura 19 Perfil cromatográfico del ácido caféico utilizado como estándar para la identificación de fenoles totales por HPLC………………. 84 Figura 20 Perfil cromatográfico de la epicatequina utilizado como estándar para la identificación de fenoles totales por HPLC…… 84

ÍNDICE DE CUADROS Cuadro 1 Composición nutrimental del piloncillo…………………………... 8 Cuadro 2 Composición nutrimental del fruto de dátil en base seca……… 9 Cuadro 3 Composición nutrimental de la piña fresca en base seca…….. 9 Cuadro 4 Principales estudios realizados a los tibicos……………………. 15 Cuadro 5 Materias primas utilizadas para este trabajo……………………. 18 Cuadro 6 Reactivos utilizados para este trabajo…………………………… 18 Cuadro 7 Equipo utilizado para este trabajo………………………………... 20 Cuadro 8 Porciento de humedad en la microbioglea a las 29 h de crecimiento para las tres formulaciones…………………………. 35 Cuadro 9 Comparación del pH del kefir en este trabajo con respecto a otros autores……………………………………………………….. 38 Cuadro 10 Comparación de la acidez titulable con respecto a otros autores……………………………………………………………… 39 Cuadro 11 Valores de k y t1/2 en la cinética de producción de ácido láctico de kéfir en diferentes medios.…………………………………….. 41 Cuadro 12 Concentración de alcohol en mg de etanol/ml a los diferentes tiempos durante la cinética en el kéfir para las formulaciones con piloncillo, dátil y piña………………………………………….. 42 Cuadro 13 Relación de %inhibición del radical Trolox [μmolEquivalentesTrolox/ml] para la actividad antioxidante por el método DPPH para las formulaciones con piloncillo, dátil y piña………………………………………………………………..... 43 Cuadro 14 Resultados obtenidos por absorción atómica para la determinación de metales pesados en microbioglea, kéfir de agua y agua potable……………………………………………….. 51 Cuadro 15 Morfología colonial y microscópica de la microbioglea y kéfir de agua aislada de la formulación piloncillo y crecida en medio MRS, ACE y PDA………………………………………………….. 54 Cuadro 16 Morfología colonial y microscópica de la microbioglea y kéfir de agua aislada de la formulación dátil y crecida en medio MRS, ACE y PDA………………………………………………….. 55 Cuadro 17 Morfología colonial y microscópica de la microbioglea y kéfir de agua aislada de la formulación piña y crecida en medio MRS, ACE y PDA………………………………………………….. 56

RESUMEN Los tibicos son microbiogleas o macrocolonias compuestas por bacterias y levaduras que constituyen una asociación simbiótica muy estable que se encuentran en una dextrana compuesta principalmente por unidades 1,6-D-glucopiranosil. Se han utilizado popularmente en México para producir bebidas refrescantes de bajo contenido alcohólico. Los tibicos al igual que otros microorganismos probióticos producen ácidos orgánicos que benefician a la salud humana. Se han realizado diversos estudios para conocer los microorganismos que están presentes en los tibicos, así como para cuantificar la cantidad de los productos de la fermentación con estos microorganismos. El objetivo del presente trabajo fue estudiar la cinética de producción de ácido láctico y alcohol, así como la variación de pH y °Bx durante la fermentación. Además de cuantificar la biomasa de tibicos y los metales presentes en la microbioglea y kéfir de agua, se determinó la modificación del contenido de fenoles totales e identificó microscópicamente el tipo de microorganismo mayoritario en la microbioglea y kéfir crecidos en MRS, ACE y PDA; todo esto utilizando tres medios diferentes para el crecimiento de los tibicos los cuales fueron: medio con piloncillo, medio con azúcar adicionando dátil y medio con azúcar adicionando piña. Los resultados que se obtuvieron en cuanto a la cinética de biomasa fue un crecimiento con respecto a la cantidad inicial del 61%, 61.4% y 74.6% a las 53 h de fermentación para el medio con dátil, piloncillo y piña respectivamente, siendo el medio con piña el mejor para el crecimiento de los tibicos. En cuanto a la concentración de sólidos solubles (°Bx) el medio con piña fue el que mostró mayor disminución de éstos con 1.71% seguida por el medio con piloncillo con 1.67% y el medio con dátil con 1.39% con respecto a su concentración inicial. El medio en el cual disminuyó más el pH con respecto a la cantidad inicial fue el piloncillo con 2.66 unidades seguida por el dátil con 1.59 unidades y la piña con 1.55 unidades. En cuanto a la acidez titulable expresada como g. de ácido láctico/100 ml el medio con piloncillo logró la mayor concentración a las 53 h de fermentación con 0.53 g/100 ml siendo el medio piloncillo también quien tarda menos tiempo en producir el ácido. La producción de alcohol estuvo presente en los tres medios en concentraciones de 0.04 a 0.08 mg de etanol/ml. El medio con piloncillo contiene la mayor cantidad de compuestos fenólicos con 72.21±2.46 mg equivalentes de ácido gálico/L a las 48 h de fermentación y la mayor actividad antioxidante (47.31±3.73 μmolEqTrolox/mL a las 6 h de fermentación. Los metales presentes en la microbioglea y kéfir fueron As, Hg, Pb, Cr, Cd, Al, Ba casi todos dentro del límite permisible de la NOM-127-SSA1-1994 excepto para el Hg y Cd en el kéfir. Las determinaciones microbiológicas mostraron que existe una mayor cantidad de microorganismos en la microbioglea que en el kéfir, encontrando sólo colonias de levaduras y hongos filamentosos en las placas. En las tinciones se diferenciaron levaduras alargadas de levaduras redondas y hongos filamentosos.

VII

1. INTRODUCCIÓN La palabra fermentación proviene de una adaptación del término en latín ferrmentare, que significa “ebullir”; se utilizó porque describía la ebullición aparente que se observa durante la fabricación de vinos, a causa de la producción de dióxido de carbono, gas que se libera en forma de burbujas y provoca movimientos en el líquido.

Los alimentos fermentados son aquellos cuyo procesamiento involucra el crecimiento y la actividad de microorganismos. Existe una gran variedad de este tipo de alimentos en el mundo. Algunos de ellos como la cerveza, el vino, el vinagre, los quesos y el pan han sido extensamente estudiados, se han aislado los microorganismos que producen los cambios deseados en sus materias primas y se consumen en cualquier parte del mundo. Existen, sin embargo, un gran número de alimentos fermentados que se producen en forma regional y que no se conocen fuera de su lugar de origen. Estos alimentos forman parte importante de la dieta de muchos grupos étnicos, los cuales los han consumido desde tiempo inmemorables (García et al., 2004).

El uso de bebidas fermentadas posee una gran importancia en la vida ritual y religiosa del país. Desde épocas prehispánicas se ha recurrido al empleo e ingestión de bebidas alcohólicas no destiladas con fines diversos, entre los más importantes se encuentran aquellos que se relacionan con la religión, la medicina y los propósitos profilácticos y la longevidad humana (Godoy et al., 2003).

Los tibicos se han utilizado popularmente en México para producir bebidas refrescantes de bajo contenido alcohólico y acético conocido como tepache de tibico, cuando el tiempo de fermentación es corto, pero cuando el proceso se prolonga dicho tepache se transforma en una bebida alcohólica y después en vinagre de tibico (Taboada et al., 1986).

La aplicación de levaduras en la industria alimentaria continúa creciendo, el enfoque reciente en la mejora de la salud humana a través de la captura de un mayor valor de los productos de levadura ha llevado a un aumento en el reconocimiento del

1 potencial nutracéutico de muchos de los productos actuales y ha renovado énfasis en la investigación que demuestra la eficacia de los productos nuevos y existentes.

Algunas personas beben el tepache de tibico con la intensión de reducir peso, combatir la arteriosclerosis y prevenir algunos males cardiacos, aunque este es un uso empírico y aún no existen bases científicas para recomendarlo (Rubio et al., 1993).

Con base en lo anterior y considerando que no se ha evaluado el efecto de la fuente de carbono con respecto a los productos de la fermentación con tibicos, se determinaron: pH, ºBx, producción de etanol, producción de biomasa, actividad antioxidante, fenoles totales, compuestos fenólicos, entre otros más, utilizando tres medios de cultivo diferentes para la propagación de los tibicos.

2. ANTECEDENTES 2.1 Fermentación El concepto de fermentación se ha ido modificando con el tiempo y, actualmente, abarca una gran cantidad de procesos y productos diversos: el término se aplica tanto a procesos muy simples como a los que se desarrollan a escala industrial (con controles bien establecidos y de gran utilidad para el hombre), por lo que resulta difícil describirlo. Sin embrago, prevalecen dos criterios para su definición, uno bioquímico y otro microbiológico (García et al., 2004).

2.1.1 Definición bioquímica de la fermentación Desde el punto de vista bioquímico una fermentación se define como un proceso mediante el cual las sustancias orgánicas (sustrato) sufren una serie de cambios químicos (reducciones y oxidaciones) que producen energía.

Es importante mencionar que, en el concepto bioquímico, no se considera como fermentaciones los procesos en los que participa el oxígeno. Cuando el aceptor final de electrones es el oxígeno molecular y no una sustancia orgánica, el proceso se conoce como respiración (García et al., 2004).

2.1.2 Definición microbiológica de la fermentación Desde el punto de vista microbiológico, en la actualidad se entiende por fermentación aquel proceso en el que los microorganismos producen metabolitos o biomasa, a partir de la utilización de sustancias orgánicas, en ausencia o presencia de oxígeno.

Para el microbiólogo industrial, no hay diferencia entre fermentación y respiración, pues en ambos procesos los microorganismos hidrolizan un sustrato orgánico, ya sea en presencia o ausencia de oxigeno (García et al., 2004).

2.2 Productos obtenidos por fermentación La fermentación de alimentos se ha utilizado como un método para conservar productos alimenticios perecederos (Hui et al., 2004), debido a su valor nutricional y a la variedad de atributos sensoriales se hizo popular en muchas culturas en las cuales, incluso en la actualidad, los alimentos fermentados forman parte de su consumo diario (Liu et al., 2011).

En los productos fermentados tradicionales, el proceso de fermentación es espontánea y descontrolada. Los productos se obtienen a menudo en condiciones climáticas locales, y por lo tanto las características sensoriales y la calidad son variables. Simango, (1997) indicó que la fermentación proporciona una manera natural para reducir el volumen del material a transportar, para destruir componentes indeseables, para mejorar el valor nutritivo y el aspecto de la comida, para reducir la energía necesaria para la cocción, así como para hacer un producto más seguro.

2.2.1 Bebidas fermentadas El impacto de las levaduras en la producción de bebidas se extiende más allá de las nociones originales y populares de cerveza y vino fermentadas por Saccharomyces cerevisiae. En un contexto positivo, contribuyen a la fermentación de una amplia gama de otros productos básicos, donde diversas especies de levaduras pueden trabajar en conjunto con las bacterias y los hongos filamentosos (Herrera, 2007).

El hombre en la actualidad, dispone de diversas variedades de bebidas, entre las que destacan las alcohólicas, esencialmente se pueden dividir en tres grupos: las fermentadas, las destiladas y las tradicionales no comerciales.

La primera bebida que al parecer se conoció en México, fue el octli o pulque, cuyo uso actual se encuentra bastante generalizado, sobre todo en las áreas geográficas en donde se localiza el maguey, que es de donde se obtiene este producto. Se utilizaba básicamente de manera religiosa, ritual o medicinal.

Con la llegada de los españoles, se empezaron a cultivar sobre todo por los franciscanos en las Californias, los primeros sarmientos para la producción de uva e, incluso, en los albores de la Colonia, se intentó la producción de cerveza con base en el trigo y la cebada (Berruecos, 2007).

México tiene diversos climas y ambientes, por lo que su flora es muy variada, lo que explica la multiplicidad de bebidas fermentadas que se consumen en diferentes regiones. La más conocida es el pulque, que se hace de la fermentación del aguamiel del maguey; el tepache elaborado con piloncillo y piña o con piloncillo y tibicos se consume en casi todo el territorio nacional; el tejuino y tesgüino que tienen como sustrato maíz nixtamalizado; la tuba, vino de palma de coco; el colonche hecho con tuna, y otros más (Long, 2003). Quizá los mencionados sean los más conocidos, pero no los únicos, como los atoles agrios y los tamales agrios. Hay muchas otras bebidas alimenticias fermentadas de consumo local.

2.2.2 Kéfir de agua como probiótico Los granos de kéfir pueden ser cultivados en una solución de azúcar y agua (por ejemplo la melaza de caña), conocido como agua azucarada o kéfir de agua, los granos de kéfir de agua azucarados son muy similares a los granos de kéfir de leche en términos de su estructura, microorganismos asociados y productos formados durante el proceso de fermentación (Rodrigues et al., 2005). Los microorganismos probióticos son generalmente bacterias o levaduras reconocidas como seguros con propiedades basadas sobre la producción de ácidos orgánicos, reducción de aminas biógenas, reducción de aminas carcinogénicas, producción de péptidos antimicrobianos, etc. (Schneedorf, 2005).

En general los prebióticos azucarados son considerados oligosacáridos no digeribles pero fermentables, involucrados en la promoción de la salud para el huésped (Barbosa et al., 2011). Tales compuestos son conocidos por proporcionar mejoras en el estado nutricional además de beneficios adicionales a la salud tales como la protección contra la carcinogénesis, mutagénesis, la prevención de las

5 lesiones causadas por los radicales libres, control de la microbiota intestinal, la resistencia gastrointestinal, disminución de la presión arterial inducida por la hipertensión, actividad antimicrobiana y anti-inflamatoria en la actividad, entre otras (Schneedorf y Anﬁteatro, 2004).

2.3 Características de los tibicos 2.3.1 Definición Los tibicos también son conocidos como Tibis, granos de kéfir de agua, granos de kéfir de azúcar, cristales de agua japoneses y en la literatura antigua son conocidos como bébés, abejas africanas, ale nuts, abejas australianas, bálsamo de Gaalad, semillas de cerveza (Figura 1), (Kleber, 1921).

Figura 1. Granos de tibicos (Moinas et al. 1980). Son microbiogleas o macrocolonias compuestas principalmente por bacterias y levaduras que constituyen una asociación simbiótica muy estable, semejantes a masas gelatinosas compactas de color blanquecino o amarillento, translúcido u opalescente, de forma irregular y de tamaño variable (Moreno, 2005).

Una microbioglea es una capa mucilaginosa, que contiene bacterias y hongos, que cubre las superficies bañadas de un medio en un filtro biológico maduro, una arena de filtración lenta o en las paredes internas en donde se encuentre. En México los tibicos se utilizan en general en el ámbito doméstico (Ulloa y Herrera, 1981), algunas personas beben el fermentado de los tibicos con la intensión de reducir peso, combatir la arteriosclerosis y prevenir algunos males cardiacos (Godoy et al., 1987).

2.3.2 Origen de los tibicos Los tibicos se han utilizado popularmente en México desde la época anterior a los españoles, para producir bebidas refrescantes de bajo contenido alcohólico y acético cuando el tiempo de fermentación es corto (2-3 días), como el colonche de jugo de tuna y el tepache de jugo de diversas frutas, o de piloncillo, pero si la fermentación se prolonga por más tiempo (2 a 3 semanas) se produce el vinagre de tibicos (Ulloa et al., 1987). En Europa los tibicos también son empleados para elaborar bebidas fermentadas ácidas, ligeramente alcohólicas, conocidas como “kéfir” dulce o la cerveza de jengibre (Hesseltine, 1965; Pidiux el at. 1989).

Ruíz-Oronoz, (1932) indicó que:

“El tibico es originario de nuestro país; crece sobre los artículos de diversas especies de Opuntia y se presenta en forma de masas globulosas, transparentes, muy semejantes a los granos de arroz cocidos. El tibico en presencia de agua azucarada determina una fermentación activa del medio; produce un líquido de olor penetrante, sabor ácido y color amarillento, conocido con el nombre de vinagre de tibico, muy empleado en economía doméstica, también se emplea para elaborar bebidas refrescantes. Dejando el líquido fermentado en reposo durante cierto tiempo, se nota la formación en su superficie de zoogleas de color blanco puro que encierran cantidad de bacillos y un número menor de levaduras”

2.3.3 Fermentación de los tibicos Al comenzar a establecerse los tibicos en el medio adecuado, lo primero que se observa es un velo superficial transparente y delgado que engruesa al proseguir la fermentación. Los tibicos surgen en el fondo al espesarse y sedimentarse dicho velo. Es bueno retirarlo antes de que se precipite, para impedir que decaiga la fermentación (Mascott y Terrés, 1952). Se desarrollan en artículos y frutos de nopales, en jugos de frutas, como la piña y en agua con piloncillo o azúcar morena (Godoy, 1921).

La fermentación que se realiza por medio de tibicos, se logra a temperatura ambiente y no se sigue ninguna técnica higiénica especial (Estrada-Cuéllar, 1985). Las formulaciones caseras más utilizadas son las de los medios con piloncillo, dátil y piña.

2.3.3.1 Composición nutrimental del piloncillo El piloncillo, panela, panocha o azúcar no centrifugada es un producto alimenticio con excelentes características que se obtiene de la evaporación de los jugos de la caña de azúcar y de la caña panelera dando como resultado la cristalización de la sacarosa que contiene minerales y vitaminas, fructuosa y glucosa. El Cuadro 1 muestra la composición nutrimental del piloncillo.

Cuadro 1. Composición nutrimental del piloncillo.

Carbohidratos (%) Intervalo Minerales (mg/100g) Intervalo Totales 83.9 – 97.2 Calcio 13.7 – 240 Sacarosa 76.5 – 89.5 Magnesio 21.0 – 120 Vitaminas (µg/100g) Intervalo Sodio 3.57 – 10.9 Vitamina C 0 – 7.6 Grasas (%) 0 – 0.1

Vitamina B2 0.04 – 0.11 Humedad (%) 1.5 – 15.8

Fuente: Jaffé, 2015

2.3.3.2 Composición nutrimental del dátil. La pulpa de dátil contiene azucares que son fácilmente digestibles (70%) principalmente glucosa, sacarosa y fructosa; fibra dietaria y contiene menos proteínas y grasas. También contiene vitaminas como rivoflavina, biotinas, ácido ascórbico y fólico que son esenciales para el cuerpo. El Cuadro 2 muestra la composición nutrimental del dátil en base seca.

Cuadro 2. Composición nutrimental del fruto de dátil en base seca.

Carbohidratos Intervalo Fibra (g/100g) Intervalo (g/100g) Glucosa 17.6 – 41.4 Total 3.57 – 10.9 Fructosa 13.6 – 36.8 Insoluble 30.03 – 7.4 Sacarosa 0.5 – 33.9 Soluble 0.4 – 1.3 Minerales (mg/100g) Intervalo Vitaminas (µg/100g) Intervalo Potasio 345 – 1287 Rivoflavina 60 – 160 Magnesio 31 – 150 Tiamina 50 – 20 Calcio 5 – 206 Fenólicos (mg/100g) 3.91 – 662

Fuente: Al Farsi y Lee, 2008)

2.3.3.3 Composición nutrimental de la piña La piña posee un fruto múltiple denominado sorosis, cuya parte carnosa está constituida por la fusión de los tejidos de los frutos individuales y del eje de la inflorescencia, la composición de la piña en base seca se muestra en el Cuadro 3

Cuadro 3. Composición nutrimental de la piña fresca en base seca.

Carbohidratos g/100 g mg/100 g Azucares totales 77.19 Vitamina C 89.13 Azúcares reductores 37.52 Polifenoles totales 8.91 Minerales mg/100 g Carotenoides 0.13 Potasio 57 Calcio 6.95 pH 3.5 Hierro 4.2

Fuente: Ramírez & Pacheco, 2011.

2.4 Microorganismos presentes en los tibicos Existen diversos organismos que forman parte de estas microbiogleas. Desde el siglo pasado se han identificado principalmente a levaduras y a bacterias. Lutz (1899a, b) identificó a la levadura Saccharomyces radaisii y a la bacteria Bacillus mexicanus.

En 1932, Ruiz-Oronoz aisló e identificó la levadura Pichia radaisii y consideró a S. radaisii como sinónimo de ésta. Sin embargo, en la actualidad la identidad de esta levadura permanece incierta porque el aislamiento se perdió.

Moreno y Díaz (1932) expuso en su trabajo una somera descripción de la microbiología y análisis químico del vinagre de los tibicos, haciendo una descripción de bacterias y citó las siguientes especies: Escherichia coli, Proteus vulgaris, Bacillus subtilis y B. graveolens (posible sinónimo de B. megaterium).

En 1952, Mascott y Terrés aislaron las levaduras Saccharomyces bayanus y S.oviformis, ambas sinónimos de S. cerevisiae, y Pichia chodatii var. trumpy, P. membranifaciens). Estas levaduras también fueron encontradas por Ulloa y Herrera (1981) en tres muestras de tibicos

Moinas et al. (1980) observaron la asociación entre las levaduras y bacterias que constituyen los tibicos como una asociación mutualista. Este tipo de asociación se caracteriza por su estabilidad y porque no permite, o al menos no favorece, el desarrollo de otros microorganismos (Estrada-Cuellar, 1985)

Herrera et al. (1985) aisló cepas bacterianas de tibicos que identificaron como Klebsiella oxytoca (Flügge Lautrop), capaces de crecer en medios libres de nitrógeno combinado.

En 1985, Estrada-Cuellar registró a Brettanomyces intermedius (B. bruxellensis), y nuevamente a S. cerevisiae (Figura 2).

Figura 2. Saccharomyces cerevisiae. Microscopía electrónica de barrido x7040 aumentos (Pontón et al., 2011)

Estudios más recientes han reportado nuevos microorganismos presentes en los tibicos, Rubio et al., 1993 reportó los siguientes microorganismos:

Levaduras: Bettanomyces claussenii, Candida guilliermondii, Candida valida, Cryptococcus albidus, Rhodotorula rubra y Saccharomyces cerevisiae.

Las levaduras C. guilliermondii y C. valida son capaces de formar película, por lo que posiblemente son las responsables de la aparición de una película delgada en la superficie durante la fermentación.

2.5 Estructura de los granos de los tibicos Moinas et al. (1980) dilucidaron la estructura de los granos de tibicos. Mediante microscopía electrónica de transmisión y de barrido, establecieron que los tibicos están formados por una capa externa compacta y una estructura interna esponjosa. La primera está densamente poblada por Lactobacillus, Streptococcus y levaduras que se embeben en una dextrana.

Los tibicos están constituidos por una matriz de polisacáridos, generalmente dextranas, dispuestos en dos capas, la externa es compacta y en ella se encuentran embebidas bacterias y levaduras, mientras que la interna presenta una estructura esponjosa debido a la acumulación de CO2 producido durante la fermentación (Lutz, 1899)

El complejo tibi produce un polisacárido que se constituye solo por D-glucosa, la dextrana del tibi está constituida principalmente por polímeros del tipo D-1,6- glucopiranosil (Figura 3); la dextrana es insoluble y la produce el complejo tibi especialmente Lactobacillus brevis (Figura 4) (Horisberger, 1969).

Figura 3. α-D-1,6-glucopiranosil con Figura 4. Lactobacillus brevis cadenas laterales 1,3. (Vos et al., 2009)

Las levaduras oxidan el azúcar y producen alcohol; las bacterias oxidan el alcohol para dar ácido acético, además de otros productos secundarios. Los tibicos fermentan el sustrato sobre todo si contiene sacarosa.

Los tibicos pueden fermentar en diversos líquidos azucarados, alimentándose del azúcar para producir ácido láctico, etanol y dióxido de carbono, lo que hace que el agua esté carbonatada (Kleber, 1921).

2.5.1 Bioabsorción de metales mediante biomasa Los metales pesados constituyen un grupo cercano a los 40 elementos de la Tabla Periódica que tienen una densidad mayor o igual a 5 g/cm3. El rasgo distintivo de la fisiología de los metales pesados, es que aun cuando muchos de ellos son esenciales para el crecimiento como el Na, K, Mg, Ca, V, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn y Mo, se ha reportado que también tienen efectos tóxicos sobre las células, principalmente como resultado de su capacidad para alterar o desnaturalizar las proteínas (Passow et at., 1961). Los procesos por los cuales los organismos interactúan con los metales tóxicos son muy diversos. Sin embargo, existen en la práctica tres categorías generales de

12 procesos biotecnológicos para el tratamiento de residuos líquidos que contienen me tales tóxicos: la biosorción; la precipitación extracelular y la captación a través de biopolímeros purificados y de otras moléculas especializadas, derivadas de células microbianas. Estos procesos no son excluyentes y pueden involucrar fenómenos fisicoquímicos y biológicos (Gadd y White, 1993).

2.6 Procesos bioquímicos durante la fermentación 2.6.1 Síntesis de compuestos bioactivos Las levaduras y extractos de levaduras han sido reconocidas como una fuente de compuestos antioxidantes (Forbes et al., 1958).

Las levaduras sintetizan un número de compuestos bioactivos que pueden servir como antioxidantes. Estos han encontrado numerosos usos en alimentos para retardar la degeneración oxidativa de sustancias grasas y en suplementos nutracéuticos para mejorar la salud y el bienestar. Se componen de carotenoides, tanto el ácido orgánico como las sales de ácido cítrico, coenzima Q o ubiquinona, glutatión, furanona hidroximetilo y furanona hidroxietilo (2H), tocotrienol, α- tocoferoles (α-TOHS) y otras formas de tocoferoles , riboflavina (vitamina B2) y las flavinas derivados de ella, FMN, FAD, y 2-(4-hidroxifenil)-etanol. Otros compuestos que son producidos por levaduras y/o que están presentes en los productos fermentados por levadura o en la biomasa celular de la levadura al final de la fermentación que tienen actividad antioxidante o actividad captadora de radicales libres incluyen varios otros carotenoides oxigenados, células de levadura enriquecidas con selenio, resveratrol, octacosanol, β-glucanos derivados de la pared celular de levadura, proteínas solubles no caracterizadas que son producidas por levaduras bajo estrés oxidativo, los aminoácidos que contienen azufre, el citocromo c, (An 1996; Archibald 2003; Becker et al. 2003; Combs et al. 2002; Farid y Azar 2001;Forbes et al.1958; Forman et al.1983).

2.6.2 Desarrollo de aroma Durante la fermentación las levaduras sintetizan un gran número de compuestos que proveen aroma y sabor. Los numéricamente y cuantitativamente más grandes grupos de aroma sintetizadas por levaduras consisten en alcoholes de fusel, ácidos grasos, y sus ésteres. Estos son compuestos con un peso molecular de menos de 300 (Berry, 1995; Suomalainen y Lehtonen 1978, 1979; Noble, 1978). Se ha demostrado que estos son principalmente debido al metabolismo de la levadura ya que las diferencias significativas en su producción han sido demostradas por el uso de diferentes géneros, especies y cepas de levadura. Además de la elección de levadura, varios factores contribuyen a la producción de aroma

Los aromas únicos de las bebidas alcohólicas producidas por levaduras con algunas excepciones son frecuentemente el resultado de un patrón o específicos proporciones de los componentes enumerados anteriormente en lugar de causada por la presencia o ausencia o una concentración específica de uno o unos pocos componentes (Noble, 1978; Querol, 2006).

2.6.3 Subproductos de la fermentación El grupo carbonilo, azufre y compuestos fenólicos son otros tipos de subproductos de la fermentación con levadura que afectan el aroma de las bebidas alcohólicas (Suomalainen y Lehtonen 1979). Los compuestos de carbonilo de gran interés son los aldehídos que son intermedios en la formación de alcoholes de fusel. El diacetilo y 2,3-pentanodiona se forman durante la fermentación de la descarboxilación de los ácidos α-acetoláctico y α-aceto-α-hidroxibutírico, respectivamente (Suomalainen y Lehtonen, 1979). Estos compuestos, contribuyen al aroma en productos fermentados (Tressl et al., 1980).

Los compuestos fenólicos producidos durante una fermentación alcohólica con levaduras son derivados de la catálisis del ácido p-cumárico, ácido ferúlico y vanilína (Ettayebi et al. 2003; Meaden 1998; Suomalainen and Lehtonen 1979). Los productos fenólicos formados por la acción de la levadura consisten en 4-etilfenol, 4-etilguayacol, y 4-meti guayacol (Suomalainen y Lehtonen 1979).

3. ESTADO DEL ARTE Se han realizado diversas investigaciones a los tibicos enfocadas en la identificación de los microorganismos presentes en los tibicos, así como para conocer las propiedades bioquímicas de los mismos. En el Cuadro 4 se muestran los principales estudios en tibicos.

Cuadro 4. Principales estudios realizados a los tibicos.

Nombre del trabajo. Autores Resultados Se presenta la descripción de Brettanomyces intermedius, registrada por primera vez para los tibicos. Estudio de las levaduras El peso de los animales disminuyo y la postura de de los tibicos y pruebas de huevos también se redujo, conforme se incrementó el alimentación con aves y Taboada et al. (1986) porcentaje de tibicos en la dieta. roedores utilizando estas Con ninguna de las proporciones de tibicos utilizadas zoogleas en la dieta. en las dietas de todos los animales de estos experimentos se encontraron lesiones histológicas específicas en los órganos examinados: riñón, hígado, corazón y pulmón. Los microorganismos encontrados fueron:

Caracterización Levaduras: Sacharomyces cerevisiae. microbiológica y Bacterias mesofílicas aerobias: Bacillus brevis., bioquímica de la Rubio, (1991) fermentación de tibicos en Bacillus polymyxa, Bacillus circulans. piloncillo. El fermentado contenía: Etanol, ácido láctico.

Especies de levaduras identificadas fueron las siguientes: Brettanomices clausseni, Cándida Estudio microbiano y guilliermondii, Cándida valida. químico de la fermentación Rubio et al. (1993) de soluciones de piloncillo Se presentaron 3 tipos de fermentación durante el inoculadas con tibicos. proceso: a) Láctica-alcoholica, b) alcohólica acética, c) acética.

Algunos de las bacterias encontradas fueron: Lb. hordei, Lb. nagelii, Lb. mesenteorides. La diversidad microbiana Gulitz et al. (2011) En cuanto a levaduras se encontraron: H. valbyensis, del kéfir de agua. Lachancea fermentati, Saccharomyces cerevisiae y Zygotorulaspora floremtina. El medio de kéfir de agua es un hábitat demandante Actividad metabólica e para Lactobacillus por su baja concentración de interacciones simbióticas aminoácidos esenciales y vitaminas. de levaduras y bacterias Stadie et al. (2013) Se demostró en primer lugar que la liberación de los ácido lácticas aisladas del nutrientes esenciales de la levadura para los kéfir de agua. lactobacilos tiene que ser inducido por los lactobacilos.

4. JUSTIFICACIÓN.

Los tibicos o búlgaros de agua, son microorganismos probióticos que resultan de la asociación simbiótica entre bacterias y levaduras. Estos tienen la capacidad de descomponer el azúcar (sacarosa) en alcohol, ácido láctico y dióxido de carbono mediante fermentación; por lo que el agua del fermento conocido como kéfir de agua posee propiedades interesantes para la salud humana. Hasta ahora se tienen reportes de carácter popular, sin un sustento científico, de que el kéfir produce efecto en el combate a la obesidad y algunos tipos de cáncer de la piel.

Además, las colonias de estos microorganismos son visibles para el ojo humano, ya que forman cúmulos parcialmente transparentes de diferentes tamaños y de consistencia gelatinosa, haciendo práctica su propagación a nivel casero y a un costo muy bajo. Si bien popularmente se ha recurrido a este tipo de bebida, hasta la fecha no hay pruebas o estudios científicos que describan las diferencias en la proporción de producción de los metabolitos (alcohol, ácido láctico) cuando el búlgaro de agua es crecido en diferentes fuentes de carbono. Por lo que el presente trabajo aportará conocimiento referente a la influencia del tipo de fuente de carbono en la obtención de los diferentes metabolitos del kéfir obtenido a partir de estos microorganismos, así como su influencia en las características de la formación del grano de las colonias del kéfir.

5. OBJETIVOS 5.2 Objetivo general Estudiar algunas propiedades bioquímicas, fisicoquímicas y morfológicas de un lote de tibicos de propagación casera, durante el proceso de obtención de un kéfir de agua cuando se utiliza piloncillo, azúcar con dátil y azúcar con piña para su crecimiento.

5.3 Objetivos específicos  Cultivar un lote de tibicos de propagación casera en tres medios que contengan una fuente de carbohidrato distinta (piloncillo, azúcar mascabado con dátil y azúcar mascabado con piña).

 Estudiar la cinética de producción de ácido láctico y alcohol en el cultivo de tibicos.

 Cuantificar la biomasa de tibicos durante la cinética de fermentación en cada una de las diferentes formulaciones.

 Determinar la modificación del contenido de fenoles totales durante la fermentación de los tibicos.

 Identificar compuestos fenólicos mediante HPLC durante la fermentación de los tibicos.

 Identificar microscópicamente el tipo de microorganismo mayoritario en la microbioglea estudiada.

 Determinar y cuantificar los metales presentes en la microbioglea y el agua fermentada del kéfir estudiado.

6. MATERIAL 6.2 Materias primas Cuadro 5. Materias primas utilizadas para este trabajo.

Material Características. Agua potable Agua potable marca Bonafont Azúcar mascabada D’Xilou all natural Dátil Dátil seco marca el jeque Piloncillo Sólido, marca libre. Piña Fresca, marca libre Tibicos Fueron proporcionados por consumidores de tibicos del Estado de México, cuya producción es casera.

6.3 Reactivos Cuadro 6. Reactivos utilizados para este trabajo.

Reactivo Características Ácido caféico ≥98.0% Cat: C0625-2G, PCode: 1001576547, CAS:

331-39-5, PM: 180.16, C9H8O4, marca: Sigma-Aldrich. Ácido clorhídrico 0.1 N Solucion volumétrica valorada, marca: Hycel. Ácido p-cumárico ≥98.0% (HPLC) Cat: C9008-1G, PCode: 1001457328,

PM: 164.16, C9H8O3, marca: Sigma-Aldrich. Ácido ferúlico 99%, Cat: 128708, PCode: 101329822, PM 194.18,

C10H10O4, marca: Sigma-Aldrich. Ácido fórmico Reactivo analítico 90%, Cat: 0129-05, PM: 46.030, HCOOH, marca: J. T. Baker. Ácido gálico (3,4,5- 97.5-102.5% (titration), Cat.: G7384-100 G, PM:

Trihydroxybenzoic acid) 170.12, C7H6O5, marca: Sigma-Aldrich.

Agua grado HPLC Analítico/cromatografía, Cas: 7732-18-5, 18.02, H2O. Agua tipo II Bidestilada, Cod: 30310, marca: Golden bell

Bicarbonato de sodio Grado analítico. DPPH (2,2-Diphenyl-1- Free radical, Cat.: D913-2, Ec: 217-591-8, CAS: pikril-hydrazyl) 18988-66-4, PM: 394.32, C18H12N5O6, marca: Sigma- Aldrich. Epicatequina ≥90% (HPLC), Cat: E1753-1G, PCode: 100930380,

PM: 290.27, C15H14O6, marca: Sigma-Aldrich. Etanol Reactivo analítico, 96º GL, marca: AZ Folin-Ciocalteu Phenols reagent, Cat: F9252-500ML, PCode: 1001365966, Lot: SHBB8897V, marca: Sigma-Aldrich. Metanol ACS, Cat: 06123, CAS: 67-56-1, Lot: 423332, PM:

32.04, CH3OH, marca: Fermont.

Metanol grado HPLC  Analítico/Cromatografía, ≥99.9%, CAS: 67-56-1, 32.04, CH3OH NaOH 0.01 N Solución volumétrica valorada, Cat: 1406, Lot: 302320, marca: Hycel. Persulfato de potasio. Grado analítico. Trolox 97%, Cat.: 238813, Pcode: 101084906, CAS: 53188-

(6-Hydroxy-2,5,7,8- 07-1, Lot: BCBF4547V, PM: 250.29, C14H18O4, marca: tetramethylchromate- Sigma-Aldrich. 2carboxylic acid

6.4 Equipo Cuadro 7. Equipo utilizado para este trabajo.

Equipo Descripción OHAUS analytical plus, Modelo: AP110S, serial no. Balanza analítica. P0820, Cap. 110g/0.1 mg, power req. 110-120 V-110 mA, 220-240 V-55 mA, frecuencia 59-60 Hz- 160 mAT. Swedish. OHAUS precisión plus, modelo: TP400S, serial no. Balanza granataria. 1806, cap. 400 g/0.01 g. power req: 17 VDC 230 mA. Florham Park, NJ. USA. FRICON, modelo: TGH 6SG. (R290Aa) Cod: 19508. Refrigerador horizontal. Votage:220-240 V -50 HZ, potencia absorbida 120 W. consumo 2.3 KWh/24h ULTRASONIC CLEANER, brason 1200, brasonic, Sonicador. modelo: B1200R-1, SR: 26373, Cat: 452E, 117 V 50/60 Hz, 0.7 amps. THE DUCKER COMPANY, modelo: 611, serial no. Centrífuga C32-5, 4507 NW, 120 V, 60 Hz, 1.0 Amps, 103RDAVE, Sunrise, FL 33351. Centrífuga Marca:Hettich, modelo: universal 30 RF Refractómetro de Abbe ATAGO 1T, modelo: NAR-1T, serial no. 943931, ATAGO CO. LTD, Japan. HACH Sens ion 1, modelo: 51700-23, code: 1012 s/n Potenciómetro 0C210092. China. Electrodo: HANNA instruments, part code: HI 1332B, Cot. Nr: 15324 Parrilla IKA, modelo: C-MAG HS751, serie: 07155598, 120 V- 50/60 Hz., 1020 W, IP21. Espectrofotómetro Lambda 35, Perkin-Elmer.

Cromatógrafo de HPLC AGILENT TECHNOLOGIES, 1200, Infinity series, 1260 infinity. Columna para HPLC Licrochart RP-18 (Merck-Hitachi, Darmstadt, Alemania) Lámpara de bario Photron, lámpara de cátodo hueco Lámpara de arsénico Agilent technologies, lámpara de cátodo hueco Lámpara de cromo Agilent technologies, lámpara de cátodo hueco, multi elemental, Fe-Co-Ni-Mn-Cu-Cr Lámpara de cadmio y Agilent technologies, lámpara multi elemental, Ag-Cd- plomo Pb-Zn. Lámpara de mercurio Agilent technologies, lámpara de cátodo hueco Lámpara de aluminio Varian, lámpara de cátodo hueco. Autoclave. All American, modelo No.75X, 120 volts, 50/60 Hz, 13.75 AMP, 1650 watts. Espectrofotómetro de Marca Varian, modelo: SpectrAA220. absorción atómica. Horno de grafito Marca Varian, modelo: GTA 110, 240 volts, 50/60 Hz. Generador de hidruros Marca Varian, modelo: VGA-77, 120 volts, 49/61 Hz.

7. MÉTODOS 7.1 Diagrama de proceso

7.2 Formulación de los medios de cultivo Piloncillo: se pesó 12.5 g de piloncillo y se agregó 237.5 ml de agua potable para obtener una concentración de 5% P/V, éste medio se puso en un frasco de 1L y se le adicionaron 21 g de tibicos.

Dátil: Se pesaron 12.5 g de azúcar mascabada y se agregó 237.5 ml de agua potable, éste medio se puso en un frasco de 1L, se agregó 2 g de dátil cortado en 4 piezas, finalmente se adicionó 21 g de tibicos.

Piña: Se pesaron 12.5 g de azúcar mascabada y se agregó 237.5 ml de agua potable, éste medio se puso en un frasco de 1L, se agregó 2 g de piña cortado en 4 piezas, finalmente se adicionó 21 g de tibicos.

7.3 Fermentaciones 7.3.1 Fermentación para la obtención del lote madre Se adicionó 209 g de tibicos provenientes del Estado de México previamente hidratados en un matraz de 3 L y se adicionó como sustrato piloncillo al 5% p/v, la fermentación se detuvo a las 72 h tiempo en el que se formó la biomasa suficiente para las determinaciones.

7.3.2 Fermentación empleando piloncillo Los tibicos que se utilizaron son de origen casero, no obtenidos de forma comercial, los cuales estaban ya hidratados, se lavaron con agua destilada al iniciar las fermentaciones (Rubio et al., 1993).

Se adicionó 21 g de tibicos hidratados

*Piloncillo(5% en peso/volumen) En un frasco de 1 L se adicionó 250 ml de sustrato*

7.3.3 Fermentación empleando dátil y la piña Dátil y piña.

Ingredientes: 237.5 ml de agua potable, 12.5 g azúcar, 21 g tibicos, *fruto a utilizar

*Se utilizó 2 g de dátil cortado en 4 trozos para 250 ml, 2 g de piña para 250 ml.

Se adicionó 21 g Se adicionó Se agregó 12.5 g de tibicos en un 237.5 ml de de azúcar frasco de 1 L agua

Se tapó el Se dejó fermentar por Se agregó el frasco con 53 horas a 26 ºC fruto manta de cielo

Se tomaron muestras a las 0, 6, 10, 23, 29, 33, 48 y 53 horas para las determinaciones.

7.4 Muestreo de los medios en piloncillo, azúcar adicionado con dátil y azúcar adicionado con piña para las determinaciones A partir del lote madre se realizaron 8 fermentaciones por lote por duplicado para cada medio (piloncillo, dátil y piña) y se realizaron las determinaciones en los tiempos establecidos 0, 6, 10, 23, 29, 33, 48 y 53 h en la cual cada determinación se hizo por triplicado. Los resultados se expresan como un promedio del duplicado para cada medio.

7.5 Determinaciones a los tibicios 7.5.1 Determinación de peso húmedo El peso húmedo de los tibicos se determinó mediante la filtración en un tamiz de plástico de peso conocido, se separó la biomasa del agua fermentada y se pesó la biomasa con el tamiz en una balanza calibrada y por medio de diferencia de peso se conoció la masa de los tibicos.

7.5.2 Determinación de humedad Se determinó de acuerdo a la metodología AOAC, 1996. El kéfir fermentado se filtró y determinó el peso húmedo de los tibicos. Posteriormente los tibicos se sometieron a un proceso de secado a 60 ºC durante 7 horas, la humedad se calculó por diferencia de peso.

7.6 Determinaciones al kéfir de agua 7.6.1 Determinaciones directas al kéfir de agua 7.6.1.1 Determinación de Grados Brix (ºBx) Se realizó de acuerdo a la NMX-F-436-SCFI-2011 usando el método del refractómetro. Se basa en el índice de refracción de soluciones que contengan principalmente sacarosa. Este índice, es una medida exacta de la concentración de sustancia disuelta en soluciones que contengan principalmente sacarosa.

7.6.1.2 Determinación de pH Se determinó de acuerdo a la norma NMX-F-317-S-1978 y se realizó directamente del fermentado con un potenciómetro bien calibrado.

7.6.1.3 Determinación de acidez titulable Se tomó una muestra de 5 ml del kéfir en un matraz Erlenmeyer de 50 ml. Posteriormente se adicionó 35 ml de agua destilada pH=7 y 2 gotas de fenolftaleína, se tituló con NaOH 0.01 N hasta la neutralización y se anotó el gasto de NaOH para cada muestra (Rubio et al., 1993). Para reportar la cantidad de acidez titulable expresada como g de ácido láctico/100 ml se utilizó la fórmula No. 1

g Ácido láctico mL NaOH∗N NaOH∗pEq. = ∗ 100…………………….. (1) 100 mL 5 ml∗1000

Donde: ml NaOH= mililitros de NaOH gastados en la valoración. N NaOH= Normalidad del NaOH. (meq/ml) pEq.= Peso equivalente de ácido láctico (0.09 g/meq) 5= alícuota.

7.6.1.4 Determinación de la concentración de alcohol El grado de alcohol se determinó tomando como referencia la NOM-142-SSA1-1995 modificando el método. Se tomaron 100 ml de muestra y se colocó en un sistema de destilación. El destilado obtenido se midió y aforó a 100 ml con agua destilada. Posteriormente se midió la concentración de alcohol con un alcoholímetro con escala °Gay Lussac a 20 ºC. La lectura obtenida se convirtió en mg etanol/ml utilizando la densidad del etanol.

7.6.2 Preparación de las muestras para la determinación de compuestos fenólicos y actividad antioxidante Para las determinaciones de actividad antioxidante y fenoles totales se tomaron 10 ml de cada muestra (0, 6, 10, 23, 29, 33, 48 y 53 h.) para cada una de las tres formulaciones (piloncillo, dátil y piña), se evaporó al vacío a 45 °C hasta obtener un volumen de 3 ml, posteriormente con los 3 ml de muestra evaporada al vacío se realizó una dilución 1:1 de metanol y HCOOH al 3%, se sonicó a una frecuencia de 20.5 Khz por 10 minutos, posteriormente se mantuvo en agitación por 30 minutos, se centrifugó por 10 minutos a 3250 rpm en una centrifuga Drukcer 611 T, se obtuvo

26 el sobrenadante y se evaporó al vacío a 35 °C hasta obtener un volumen de 3 ml, se refrigeró a 4 °C para su posterior uso.

Antes de usar la muestra previamente tratada para las determinaciones de actividad antioxidante y DPPH estas se centrifugaron a 12’000 rpm por 10 minutos en una centrifuga.

Para la determinación de compuestos fenólicos por HPLC se tomaron 10 ml de cada muestra (0, 6, 10, 23, 29, 33, 48 y 53 h.) para cada una de las tres formulaciones (piloncillo, dátil y piña), se evaporó al vacío a 45 °C hasta obtener un volumen final 1 ml se refrigeró a 4 °C hasta su uso. Antes de utilizar la muestra en el equipo de HPLC se filtró en discos con porosidad de 45 µm (ver 7.6.2.3)

7.6.2.1 Determinación de capacidad antioxidante por el método DPPH Se basa en la reducción del radical DPPH* por un antioxidante (DPPH*+A* DPPH- A) o por especies de radicales (DPPH*+R* DPPH-R) lo cual resulta en una disminución de absorbancia a 515 nm, usando un método espectrofotométrico (Brand-Williams et al., 1995). Esta técnica evalúa la capacidad de las antocianinas y los fenoles para secuestrar al radical DPPH* lo que ocasiona una disminución en la absorbancia, a mayor capacidad antioxidante del componente en estudio, la disminución de la absorbancia será más pronunciada. (Nava, 2009).

Se utilizó el radical libre 2,2-difenil-1-picrihidrazil de 50 µM en metanol al 80%, para poder llegar a esta concentración se pesó 0.0012 g. de DPPH y se aforó a 50 ml con metanol al 80%, se llevó a sonicación por 5 minutos.

El ensayo consistió en mezclar 300 µL de muestra tratada agregando 2700 µL de DPPH 50 µM, seguido de 30 minutos de reposo en la oscuridad (Chen et al., 1999), después de éste tiempo se midió la absorbancia a 515 nm en un espectrofotómetro Perkin-Elmer Lambda 35 utilizando metanol al 80% como blanco.

Se calculó el porcentaje de inhibición de la muestra problema a partir de la fórmula No 2:

퐴푏푠 −퐴푏푠 % 퐼푛ℎ𝑖푏𝑖푐𝑖ó푛 = ( 퐶표푛푡푟표푙 푀푢푒푠푡푟푎) ∗ 100………………………. (2) 퐴푏푠퐶표푛푡푟표푙

Donde:

퐴푏푠퐶표푛푡푟표푙: Es la absorbancia de DPPH sin reaccionar con la muestra.

퐴푏푠푀푢푒푠푡푟푎: Es la absorbancia del DPPH después de 30 minutos de reacción con la muestra. Para medir la capacidad antioxidante se realizó una curva tipo de Trolox desde 50 µM hasta 250 µM (ver anexo 1) por lo que la capacidad antioxidante se expresó en micro-moles equivalente Trolox por mililitro.

7.6.2.2 Determinación de fenoles totales El análisis se realizó por medio de la técnica colorimétrica del contenido total de fenoles propuesta por Singleton y Rossi (1969). La técnica consistió en colocar 200 µL de muestra previamente tratada más 200 µL del reactivo Folín Ciocalteu, se dejó reaccionar por 6 minutos y se detuvo la reacción adicionando 4 mL de bicarbonato de sodio al 2 %, se dejó reposar por 30 minutos. Al término de éste tiempo se midió la absorbancia a 765 nm en un espectrofotómetro Perkin-Elmer lambda 35. Se utilizó una curva tipo de ácido gálico desde 50 hasta 400 ppm (ver anexo 1) para expresar los resultados como equivalentes de ácido gálico.

7.6.2.3 Identificación de compuestos fenólicos por HPLC El análisis de HPLC se llevó a cabo en un cromatógrafo para líquido LiCro-Chart (Merck, Darmstadt, Alemania) C18. 250 x 4 mm, Tamaño de partícula 5µM. Como solventes se utilizaron una solución de ácido fórmico al 5% (Solvente A) y metanol grado HPLC (Solvente B), con un caudal de 1 mL/minuto. La elución se realizó en gradiente, comenzando con un 2% del solvente B hasta alcanzar un 32% del solvente B a los 30 minutos, un 40% de B a los 40 minutos y un 95% de B a los 50

28 minutos, pasando entonces a ser isocrático al 98% de B durante 5 minutos (García Alonso et Al., 2012). Los perfiles cromatográficos se registraron a los 280 mn.

Los estándares utilizados para la determinación de compuestos fenólicos por HPLC fueron:

Ácido caféico, Ácido cumárico, Ácido ferúlico y Epicatequina, se disolvieron cada uno de los estándares en metanol grado HPLC para obtener concentraciones de 25, 50, 100 y 200 ppm. Se filtraron en discos de 45 µm de porosidad y se pasaron 800 µL a viales para su uso.

7.7 Determinaciones para los tibicos y kéfir de agua directa 7.7.1 Determinación de metales por absorción atómica Se realizó la determinación de metales por duplicado para los tibicos, agua fermentada y agua potable utilizada en la fermentación de acuerdo a la NMX-AA- 051-SCFI-2001.

En el caso de los tibicos se sometieron a una predigestión en parrilla de calentamiento y consistió en pesar 0.5 g de tibicos, se le adicionó 10 ml de HNO3, se colocó en un baño de arena a 65 °C durante 30 minutos, posteriormente se sometió a la digestión.

Para la digestión de tibicos se tomaron los 10 ml de la pre digestión y se llevaron a la autoclave All American modelo No. 75X por 45 minutos una vez que la temperatura alcanzó un intervalo entre 122-126 °C y la presión de 1.15 a 1.36 atm, posterior a esto se procedió a determinar los metales presentes en los tibicos.

Para la digestión del fermentado (kéfir de agua) y agua potable se tomaron por separado 45 ml de cada uno y se le adicionó 3 ml de HNO3 y 2 ml de HCl ambos ácidos concentrados y grado analítico, posteriormente se digirieron en la autoclave All American en las mismas condiciones que los tibicos, para ser utilizados en la determinación de metales.

7.7.1.1 Método generador de hidruros Para la determinación de Hg y As se recurrió al método generador de hidruros que consistió en instalar la lámpara de mercurio y arsénico, se seleccionó la longitud de onda de 253.7 mn y 193.7 nm para mercurio y arsénico respectivamente, se alineó la lámpara a su máxima energía, se alineó el accesorio para atomizar la muestra, se ajustó el rayo de luz de la lámpara, se ajustaron los flujos de gas de aire y acetileno. Se alineó la celda de cuarzo en el rayo de luz y se esperó de 20 a 30 min para su estabilización en la flama antes de iniciar el análisis; se colocó en el recipiente del reductor una disolución de borohidruro de sodio en hidróxido de sodio y conectó el recipiente al sistema, se abrió el suministro de gas inerte y ajustó la presión, se conectó el vaso de reacción al sistema generador y esperó el tiempo suficiente para que todo el aire se purgue del sistema, entonces se registró el cero en el espectrofotómetro (autocero), se conectó el vaso de reacción que contiene el testigo de reactivos, se purgó el sistema hasta eliminar completamente el aire posteriormente se permitió la entrada de la disolución de borohidruro de sodio hasta obtener la lectura del blanco, se limpió el sistema haciendo pasar agua o ácido clorhídrico diluido. Se inyectó 15 μl/min de muestra.

7.7.1.2 Método Horno de grafito Este método se utilizó para la determinaciones de los metales Ba, Cr, Cd, Pb y Al. Se estableció la corriente de la lámpara para cada metal, se seleccionó el ancho de banda espectral óptimo, el cual depende de cada elemento en particular, se colocó la longitud de onda en el espectrofotómetro para cada metal la cual fue de 253.5, 357.9, 228.8, 283.3 y 309.3 nm para bario, cromo, cadmio, plomo y aluminio respectivamente, se alineó el tubo de grafito, se programó el flujo de gas inerte, gas alterno y de agua de enfriamiento, se seleccionó el programa para cada uno de los metales. Se inyectó 5 ml/min de muestra.

7.7.2 Determinaciones microbiológicas Se tomó la muestra de tibico y agua fermentada (kéfir) a las 29 horas de fermentación para los medios con piloncillo, dátil y piña.

Para el caso de las diluciones del grano de tibico, se tomó 1 g de muestra y se trató de homogenizar con agua peptonada estéril al 0.1% (Escobedo, 2014) y para el caso del agua fermentada se tomó directamente del kéfir. De estas muestra se realizaron diluciones decimales en serie de 10-1 hasta 10-5 en 9 ml de agua peptonada estéril al 0.1%. Se inocularon para el crecimiento de cada grupo microbiano alícuotas de 1 ml de las diluciones 10-3 a 10-5 para los medios con piloncillo, dátil y piña.

7.7.2.1 Bacterias aerobias en placas Se realizó la determinación para bacterias aerobias en placa de acuerdo a la NOM- 092-SSA1-1994 que consistió en distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que la inoculación. Se marcaron las cajas en sus tapas con los datos pertinentes previamente a su inoculación y se corrió por duplicado

Después de inocular las diluciones de las muestras preparadas según la NOM-110- SSA1-1994, Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico, en las cajas Petri se agregó de 12 a 15 ml del medio preparado, se mezcló mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporación del inóculo en el medio. Se dejó solidificar. Se incluyó una caja del medio Agar Cuenta Estándar sin inóculo por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo de esterilidad.

El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorporó al diluyente hasta que finalmente se adicionó el medio de cultivo a las cajas, no excedió de 20 minutos. Se incubaron las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) por 48 h y una temperatura de 35±2 °C (NOM-092-SSA1-1994).

7.7.2.2 Hongos y levaduras De acuerdo a la NOM-111-SSA1-1994 se colocó por duplicado en cajas Petri 1 ml de la muestra líquida directa o de la dilución primaria, utilizando para tal propósito una pipeta estéril.

Se vertió de 15 a 20 ml de agar papa dextrosa acidificado a un pH de 3.5, fundido y mantenido a 45 ± 1 °C en un baño de agua. El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución primaria y el momento en que es vertido el medio de cultivo, no excedió de 20 minutos.

Se mezcló cuidadosamente el medio PDA con seis movimientos de derecha a izquierda, seis en el sentido de las manecillas del reloj, seis en el sentido contrario y seis de atrás para adelante, sobre una superficie lisa. Se permitió que la mezcla se solidificara dejando las cajas Petri reposando sobre una superficie horizontal fría.

Se preparó una caja control con 15 ml de medio PDA, para verificar la esterilidad.

Se invirtieron las cajas y colocaron en la incubadora a 25 ± 1°C.

Se verificaron las colonias de cada placa después de 3, 4 y 5 días de incubación. Después de 5 días, se seleccionaron aquellas placas que contenían entre 10 y 150 colonias para las tinciones.

7.7.2.3 Bacterias ácido-lácticas De acuerdo al método de Rubio, M. (2003) modificado, se vertió en cajas Petri de 15 a 20 ml de medio MRS, fundido y mantenido a 45 ± 1 °C en un baño de agua.

Se permitió que el medio agar se solidificara dejando las cajas Petri reposar sobre una superficie horizontal fría, se esperó a que el agar se solidificara. Una vez solidificado se adicionó 1ml de muestra sobre el agar y dispersó por toda la caja Petri con la ayuda de una varilla de vidrio, se esperó a que se secara la muestra, se incubó a 35±1 °C por 48 horas.

8 RESULTADOS Y DISCUSION 8.1 Fermentación de activación en medio con piloncillo Se realizó la fermentación de activación por duplicado, se lavaron los tibicos y se les adicionó el sustrato (piloncillo) para poder realizar la fermentación.

Como se observa en la Figura 5 la concentración de ácido láctico al tiempo de 53 h fue de 0.2995 g/100mL

0.350 6.000

0.300 5.000 0.250 4.000 0.200 3.000 0.150 pH 2.000 0.100 Acidez

Ácido Ácido láctico (g/100 ml) 1.000 0.050 pH

0.000 0.000 0 10 20 30 40 50 60 t (h)

Figura 5. Gráfica de la cinética de adecuación al medio en la segunda fermentación para tibicos.

8.2 Determinaciones a los tibicos 8.2.1 Peso Húmedo de la microbioglea Se inició la fermentación con 21 g de biomasa como se muestra en la Figura 6 y se obtuvo un incremento de 61.4%, 61% y 74.6% de biomasa a las 53 h para piloncillo, dátil y piña respectivamente. La influencia del medio fisicoquímico en dónde se desarrollan los tibicos es muy importante, el pH al cual crecen mejor los tibicos es a un pH cercano a 4.0 (Stadie et al., 2013) que concuerda con el crecimiento de tibicos en éste estudio ya que el mayor crecimiento se obtuvo en el medio que contenía piña la cual inició la fermentación con un valor de pH de 4.67±0.02 en comparación

33 con el piloncillo y dátil que iniciaron la fermentación con un valor de 6.14±0.06 y 4.97±0.03 respectivamente. Se utilizó el software Minitab 17 el cual realizó un análisis de varianza de una vía y se observó que no hay diferencia significativa (p=0.05) en cuanto al crecimiento de los tibicos para las tres formulaciones.

Los tibicos muestran un crecimiento positivo en las 3 formulaciones. Esto es evidencia de que el pH en el tiempo cero de fermentación afecta la producción de biomasa (Ulloa y Herrera, 1981).

38.0 36.0 34.0 32.0 Pl 30.0 Da 28.0 Pñ 26.0

Peso Peso de biomasa(g) 24.0 22.0 20.0 0 10 20 30 40 50 60 Tiempo (h)

Figura 6. Producción de biomasa de tibicos para Pl (piloncillo), Da (dátil) y Pñ (piña) expresada como promedio de las fermentaciones.

De acuerdo a Horisberger (1969), los tibicos forman dextranas con los azúcares presentes en el medio en el que crecen. Comparando el dátil con la piña, el primero contiene mayor cantidad de azúcares presentes como fructosa (Al Farsi and Lee, 2008), el cual no es un azúcar fácil de utilizar para los tibicos (Reiβ, 1990), el mejor desarrollo que mostraron los tibicos fue en el medio que contenía piña.

Reiβ reportó en 1990 que después de 18 días de fermentación con higos el incremento en peso de los tibicos con respecto a la cantidad original fue del 70%, lo que es congruente con el valor obtenido en el presente trabajo a las 53 horas de fermentación.

Una característica muy importante de los tibicos es la cantidad humedad que contiene la microbioglea por lo que es importante saber el porcentaje de ésta presente en los tibicos.

8.2.2 Humedad de la microbioglea Los tibicos están constituidos principalmente por una matriz de dextrana que forma redes (Horisberger, 1969), es por esto que retienen una gran cantidad de agua y por lo que la humedad presente en ellos es muy alta, conteniendo alrededor del 83% como se muestra en el Cuadro 8 para las tres formulaciones.

La dextrana que forma a la microbioglea es sintetizada principalmente por Lactobacillus brevis (Daker y Staycey, 1938) y está constituida principalmente de unidades de1,6-D-glucopiranosil y forma dos capas, una externa que está poblada por microorganismos y una capa interna que se ahueca durante el proceso de fermentación debido a la acumulación de CO2, al quedar hueca esta capa interna puede retener una gran cantidad de agua, por eso la humedad de los tibicos es muy alta; dicha estructura es insoluble en agua (Horisberger, 1969).

El porciento de humedad que se obtuvo en la muestra estudiada (Cuadro 8) es similar al 83% de humedad reportado por Ulloa y Herrera (1981).

Cuadro 8. Porciento de humedad en la microbioglea a las 29 h de crecimiento para las tres formulaciones.

Muestra del kéfir adicionado con: %Humedad Piña 83.83 ±0.12 Dátil 83.63 ±0.09 Piloncillo 83.79 ±0.11 Se realizaron por duplicado.

8.3 Determinaciones al kéfir de agua 8.3.1 Grados Brix. Los tibicos al estar activos utilizan los azúcares que contienen como sustrato los medios de crecimiento (Rubio, 1993), por lo que la concentración de estos azúcares disminuye y se ve reflejado en la concentración de grados Brix conforme se desarrolla la cinética.

La concentración de azúcar va disminuyendo en las tres formulaciones durante la fermentación. Como se observa en la Figura 7, la mayor concentración de azúcares expresados como ºBx se encontró en la piña, seguida en contenido por el dátil y piloncillo. La concentración de azucares disminuyó 1.71% (de 5.03 a 3.32), 1.39% (de 4.98 a 3.59) y 1.67% (de 4.52 a 2.85) para la piña, dátil y piloncillo, respectivamente.

De acuerdo al análisis de varianza de una vía se observó que existe diferencia significativa (p=0.05) entre los medios piloncillo y piña, piloncillo y dátil; pero no hay diferencia significativa entre el medio con dátil y piña.

Figura 7. Variación de sólidos solubles (°Bx) durante la fermentación con tibicos para los medios con piloncillo (Pl), dátil (Da) y piña (Pñ).

8.3.2 Variación de pH del cultivo de kéfir En la Figura 8 se muestra que el descenso del pH para el dátil fue de 1.59 unidades, mientras que para el piloncillo fue de 2.66 unidades y para la piña fue de 1.55 unidades. De acuerdo al análisis de varianza no existe diferencia significativa (p=0.05) entre los medios que contienen dátil y piña, pero sí existe diferencia significativa entre el medio con piloncillo y los dos anteriores.

Los tibicos al estar activos comienzan a consumir el azúcar del medio, esto con el fin de crecer. Como resultado del consumo de azúcares está la producción de biomasa, etanol y ácidos orgánicos (Ulloa y Herrera, 1981) favoreciendo la acidificación del medio. El pH disminuye porque se forma ácido láctico (Rubio, 1993) y ácido acético a partir de etanol (Liu, 2015).

7.00

6.00

5.00

4.00 pH 3.00

2.00

1.00

0.00 0 6 24 29 33 36 48 53 Piloncillo 6.14 6.04 5.96 4.49 4.33 4.09 3.69 3.49 Dátil 4.97 4.56 4.25 3.96 3.83 3.67 3.47 3.38 Piña 4.67 4.48 4.26 3.99 3.67 3.46 3.30 3.12

Figura 8. Variación de pH durante la fermentación con tibicos para los medios con piloncillo (Pl), dátil (Da) y piña (Pñ).

En el Cuadro 9 se muestran los valores reportados por diferentes autores en donde se observa que el pH determinado en el presente estudio se encuentra en el orden reportado en dichas investigaciones. Cabe destacar que las fuentes de carbohidratos utilizados por los autores indicados son de naturaleza distinta a las probadas en el presente trabajo.

Cuadro 9. Comparación del pH del kéfir en este trabajo con respecto a otros autores.

En este estudio Reiß, J., 1990 Laureys y De Vust, 2014 Piloncillo Dátil Piña Medio Dátil Azúcar de caña. estándar 3.69 3.47 3.30 4.5 Nd 3.45

Medio estándar: reportado en contenido de glucosa.

8.3.3 Acidez titulable como ácido láctico, método adaptado de Rubio et al. (1993). De acuerdo a la naturaleza de la fermentación estudiada en el presente trabajo el ácido láctico es el producido en mayor proporción durante la fermentación de los tibicos (Rubio, 1993), la producción de este ácido se debe a la presencia de bacterias ácido-lácticas que han sido encontradas en los tibicos como Lactobacillus brevis (Orla-Jean, 1969; citado por Godoy et al., 2003) y Lactococcus lactis (Lister).

Como se puede observar en la Figura 9 el medio con piloncillo es el que contiene una mayor acidez ya que alcanza una concentración de 0.53 g de ácido láctico/100 ml y esto también se ve reflejado en el pH, pues en este medio bajó 2.66 unidades siendo la formulación que bajo más su pH, por esta razón que se justifica la cantidad de ácido láctico presente en el medio, en comparación con la piña que muestra la menor acidez del medio, ya que se reporta 0.477 g de ácido láctico/100 ml y su pH bajo 1.47 unidades por lo que es congruente el resultado. Cabe destacar que el piloncillo se utilizó como única fuente de carbono para este medio, en cambio, para el medio con dátil y piña, además de los 2 g de fruto se adicionó 12.5 g de azúcar. A pesar de las diferencias en la acidez, el análisis de varianza no mostró diferencia significativa (p=0.05) entre los medios de piloncillo, dátil y piña.

La cantidad de ácido láctico producida es realmente pequeña puesto que los microorganismos en los tibicos representan muy poca proporción en comparación con la microbioglea (Ulloa et al., 1987).

0.60

0.50

0.40

0.30

0.20

Ácidoláctico (g/100 ml) 0.10

0.00 0 6 24 29 33 36 48 53 Piloncillo 0.02 0.03 0.04 0.14 0.17 0.23 0.44 0.53 Dátil 0.04 0.11 0.16 0.20 0.22 0.33 0.47 0.49 Piña 0.03 0.03 0.05 0.12 0.15 0.19 0.35 0.48

Figura 9. Variación de la acidez expresada como g de ácido láctico/100 ml durante la fermentación con tibicos para los medios con piloncillo (Pl), dátil (Da) y piña (Pñ).

En el Cuadro 10 se comparan las concentraciones de acidez titulable en este trabajo expresada como g de ácido láctico/100 ml y la acidez titulable realizada por Radazzo et al. (2016). La concentración de acidez titulable realizado por Radazzo et al. (2016) fue menor a la realizada en el presente trabajo.

Cuadro 10. Comparación de la acidez titulable con respecto a otros autores.

En este estudio Radazzo et al., 2011 𝑔 á푐𝑖푑표 푙á푐푡𝑖푐표 𝑔 á푐𝑖푑표 푙á푐푡𝑖푐표

100 푚푙 100 푚푙 Piloncillo Dátil Piña Piloncillo 0.53 0.49 0.48 0.34

Se aplicó la fórmula No. 3 de una cinética de primer orden para modelar la producción de ácido láctico en las tres formulaciones (Wang y Xu, 2007).

[퐴] 푙푛 = 푘푡 ………………………...…….. (3) [퐴]0

Dónde: [A]=es el contenido de g. de ácido láctico/100 ml en un tiempo t, [A]0=Es el contenido de g. de ácido láctico/100 ml al inicio de la observación; k= es la constante de velocidad de reacción (horas-1) t=es el tiempo en horas.

En la Figura 10 se muestran los resultados obtenidos de la aplicación del modelo lineal de primer orden para la producción de ácido láctico. Se confirma que la producción de ácido láctico se ajustó al modelo lineal (R2≥85% para dátil, R2≥95% para piloncillo y piña).

Piloncillo Dátil Piña 3.5

2.5 y = 0.0414x + 0.6591 R² = 0.853 y = 0.0549x + 0.0384 2 R² = 0.989

1.5 Ln Ln (A/Ao) 1 y = 0.0608x + 0.0301 0.5 R² = 0.978 0 0 10 20 30 40 50 60 Tiempo (h)

Figura 10. Modelo matemático para cinética de primer orden aplicado a la producción de ácido láctico en las formulaciones con piloncillo, dátil y piña durante las 53 h de fermentación.

Al comenzar la fermentación se genera ácido pirúvico, formado como intermediario; éste es reducido por las enzimas de las diferentes bacterias presentes en los tibicos y así se produce el ácido láctico (Godoy et al., 2003). La concentración de ácido láctico dependerá del tipo de sustrato que se le adicione.

Asimismo, se determinó el periodo producción media (t1/2) que es el tiempo en el que se alcanza la mitad de producción de ácido láctico.

Se utilizó la fórmula No. 4 para medir el periodo de producción media

0.693 푡 = …………………………………. (4) 1/2 푘 Donde: k = Constante de velocidad. t1/2 = Periodo medio de producción.

En el Cuadro 11 se muestran los parámetros de la producción de ácido láctico para las tres formulaciones durante las 53 horas de fermentación.

Cuadro 11. Valores de k y t1/2 en la cinética de producción de ácido láctico de kéfir en diferentes medios.

-3 -1 Medio de cultivo k x 10 (horas ) t1/2 (horas) Piloncillo 6.08 11.40 Dátil 4.14 16.74 Piña 5.49 12.62

Se observa que la velocidad de formación de ácido láctico es mayor en el medio compuesto únicamente de piloncillo.

8.3.4 Producción de etanol En el Cuadro 12 se observa que para el piloncillo la concentración máxima fue de 0.08 mg de etanol/ml, alcanzado a las 29 horas, para el dátil la concentración máxima fue 0.04 mg/ml y ésta se obtuvo a las 10 horas y por último la concentración máxima para la piña fue de 0.08 mg/ml a las 29 horas de fermentación. El tiempo al cual se encontró la concentración máxima depende de la disponibilidad de los azúcares presentes en cada medio, pues de esto depende el crecimiento de los microorganismos (Rubio et al., 1993).

Cuadro 12. Concentración de alcohol en mg de etanol/ml a los diferentes tiempos durante la cinética en el kéfir para las formulaciones con piloncillo, dátil y piña.

Tiempo Piloncillo Dátil Piña (horas) (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) 0 0 0 0 6 0 0 0 10 0 0.04 0.04 23 0.04 0.04 0.08 29 0.08 0 0.08 33 0.08 0 0.04 48 0 0 0 53 0 0 0 Datos obtenidos del promedio de 2 fermentaciones. Rubio et al. 1993 realizó la determinación de etanol a las 96 h en un duplicado de fermentado con tibicos utilizando una solución de piloncillo al 5% y el resultado que obtuvo para la fermentación 1 fue una concentración de 0.18 mg/ml, mientras que en la segunda fermentación obtuvo una concentración de 0.12 mg/ml.

La producción de etanol puede atribuírsele principalmente a la presencia de levaduras fermentadoras como S, cerevisiae, C. guilliermondii, así como a las bacterias B. polymyxa, B. coagulans, y bacterias heterolácticas, que son capaces de producir etanol a partir de la fuente de carbono (Rubio el al., 1993).

8.4 Kéfir de agua concentrado 8.4.1 Actividad antioxidante por el método DPPH Como se muestra en el Cuadro 13 y Figura 11 el kéfir (agua fermentada) presenta actividad antioxidante, y se puede observar que existen variaciones con respecto al tiempo en cada uno de los medios, esto puede atribuirse a la presencia de ácido láctico, enzimas intracelulares y extracelulares (Muneer Alsayadi et al., 2013), que van variando durante la fermentación debido a su metabolismo (Rubio et al., 1993).

Cuadro 13. Relación de %inhibición del radical Trolox [μmolEquivalentesTrolox/ml] para la actividad antioxidante por el método DPPH para las formulaciones con piloncillo, dátil y piña Tiempo Piloncillo Dátil Piña (h) 훍퐦퐨퐥퐄퐪. 퐓퐫퐨퐥퐨퐱 훍퐦퐨퐥퐄퐪. 퐓퐫퐨퐥퐨퐱 훍퐦퐨퐥퐄퐪. 퐓퐫퐨퐥퐨퐱 풎풍 풎풍 풎풍 0 21.64±3.16 33.06±3.82 35.46±1.72 6 47.31±3.73 6.26±2.05 22.86±0.95 10 29.27±1.66 22.06±1.62 25.09±0.23 23 9.51±1.47 40.24±3.06 35.17±0.62 29 17.23±2.89 25.16±1.36 38.20±0.02 33 20.23±1.91 38.91±3.64 30.53±1.56 48 23.29±2.42 33.30±2.65 29.52±0.16 53 34.63±0.24 34.29±2.81 35.39±0.25

Datos obtenidos como promedio de dos fermentaciones por triplicado.

Para el medio con piloncillo se observan variaciones durante la fermentación en la capacidad antioxidante. A las 23 horas de fermentación se encontró la mínima capacidad antioxidante (9.51±1.47 µmolEq.Trolox/ml) y el máximo se obtuvo a las 6 horas de fermentación con un valor de 47.31±3.73 µmolEq.Trolox/ml.

En el medio con dátil se obtuvo una cantidad de 6.26±2.05 µmolEq.Trolox/ml a las 6 horas de fermentación, mientras que a las 23 horas se alcanzó la máxima actividad de 40.24±3.06 µmolEq.Trolox/ml.

La capacidad antioxidante durante las 53 horas de fermentación del medio con piña mostró variación, teniendo un valor mínimo de 22.86±0.95 µmolEq. Trolox/ml a las 6 horas y un valor máximo de 38.2±0.02 µmolEq. Trolox/ml a las 29 horas.

Las propiedades antioxidantes en piloncillo han sido atribuidas a su contenido de polifenoles basado en la correlación significativa entre el contenido total de fenoles del piloncillo y su actividad antioxidante (Walter, 2015). El medio con piña presenta actividad antioxidante esto puede deberse a los productos que se formaron durante

43 la fermentación, también por la presencia de flavonoides y compuestos fenólicos presentes en la piña de inicio (Hossain & Rahman, 2011). La fruta de dátil tiene diferentes tipos de compuestos fenólicos, los cuales tiene diferentes actividades antioxidantes, a pesar de esto los fenoles no son los únicos fitoquímicos responsables de la actividad antioxidante en dátiles, puede haber algunos otros constituyentes no fenólicos presentes que están exhibiendo la actividad antioxidante (Ramchoun et al., 2015).

50.00 Piloncillo 45.00 Dátil Piña 40.00

35.00

30.00

25.00

20.00

µmolEq.Trolox/ml 15.00

10.00

5.00

0.00 0 6 24 29 33 36 48 53 Tiempo (h)

Figura 11. Actividad antioxidante por el método de DPPH

Los resultados de Lin y Chang (2000) indican que la capacidad de eliminación de radicales de las células intactas y los extractos intracelulares de B. longum y L. acidophilus contribuye al efecto antioxidante. Muneer Alsayadi et al (2013) encontraron que las muestras de kéfir de agua presentan una excelente capacidad de captación de los radicales en comparación con otros estudios realizados con leche de soya, suero de leche, leche de vaca, leche de cabra y leche de arroz.

Los extractos libres de células en algunas cepas de bacterias ácido-lácticas han mostrado una actividad antioxidante con tasas de inhibición de la auto-oxidación de

44 ascorbato (Muneer Alsayadi et al., 2013). Mecanismos antioxidantes tales como la capacidad quelante de iones metálicos y el barrido de especies reactivas del oxígeno contribuyen la capacidad antioxidante (Lin y Yen, 1999).

8.4.2 Fenoles totales. En la Figura 12 se muestran el cambio en el contenido de compuestos fenólicos durante la fermentación de los medios con piloncillo, dátil y piña utilizando tibicos.

El medio con piloncillo es el que alcanzó mayor concentración de compuestos fenólicos durante la fermentación (72.21±2.46) seguido por el dátil que obtuvo una concentración máxima de 21.75±5.13 y la piña con una concentración máxima de 19.78±0.31, todos expresados como mg equivalentes de ácido gálico/L; el tiempo en el que se produjo la mayor concentración de fenoles totales fue a las 48 horas de fermentación para el piloncillo y dátil, mientras que para la piña fue a las 53 horas de fermentación.

Los ácidos fenólicos constituyen una de las principales clases de metabolitos secundarios de las plantas, contienen un anillo de benceno hidroxilado con uno o más grupos carboxilos (Mansouri et al., 2005).

Se ha observado que el índice de fenoles antioxidantes es una medida combinada de la calidad y cantidad de antioxidantes en los vegetables (Elliot, 1999). Más del 80% de la capacidad antioxidante total en frutas y vegetales proviene de los ingredientes distintos de las vitaminas antioxidantes (Miller y Rice-Evans, 1997).

Los fenoles que se encuentran en el piloncillo pueden deberse al origen de este ya que se ha encontrado compuestos fenólicos en las hojas, tallos y jugo de la caña de azúcar, tanto en formas libres o unidas, así como en el proceso de fabricación de piloncillo (Manohar et al., 2014). Baliga et al. (2011) identificó algunos fenóles en la fruta de dátil: ácido o-cumárico, ácido p-cumárico, ácido ferúlico, entre otros más, por lo que la cantidad de fenoles totales presentes en este trabajo puede deberse a la presencia de alguno de éstos ácidos fenólicos.

Se ha encontrado que alimentos fermentados con Lactobacillus se enriquecen en derivados fenólicos, con alta biodisponibilidad y actividad biológica, a través de rutas de bioconversión en las que participan descarboxilasas y reductasas de ácidos fenólicos y que la ruta metabólica depende fuertemente de factores intrínsecos del sustrato (Fillanino et al., 2015)

70.00

60.00

50.00

40.00

30.00

20.00 PPM (mg PPM (mg ácidogálico/L)

10.00

0.00 0 6 24 29 33 36 48 53 Piloncillo 36.76 51.57 55.07 64.26 61.45 66.89 72.21 70.15 Dátil 19.54 16.15 21.03 19.81 21.20 19.82 21.75 17.82 Piña 14.76 15.26 13.48 16.81 17.41 14.60 15.40 19.78

Figura 12. Contenido de fenoles totales durante la fermentación en los medios adicionados con piloncillo (Pl), dátil (Da) y piña (Pñ). (Datos obtenidos como promedio de dos fermentaciones por triplicado)

Randazzo et al. (2016). Desarrollaron bebidas fermentadas con tibicos para consumo moderado adicionado con jugos de frutos para cada bebida a los cuales les determinó la cantidad de fenoles totales dando como resultado 176.4 mg/L para el kefir adicionado con jugo de manzana y 61.69 mg/L para kefir adicionado con jugo de uva ambos expresados como mg equivalentes ácido gálico/L (ppm equivalentes ácido gálico).

Con lo cual se verifica que la cantidad de compuestos fenólicos presente en el kefir de agua depende del fruto que se utiliza.

8.4.3 Identificación de compuestos fenólicos Se llevó a cabo la identificación de compuestos fenólicos mediante la técnica HPLC para las formulaciones de piloncillo, dátil y piña. Se tomaron muestras a las 0, 29 y 53 h de fermentación para cada una de las formulaciones. Las muestras fueron evaporadas al vacío esto con el fin de concentrarlas y así poder observar mejor los perfiles cromatográficos, posteriormente se filtraron en discos con porosidad de 45 µm. En el anexo 3 se muestran los perfiles cromatográficos de los estándares utilizados para la identificación.

Se muestran los perfiles cromatográficos obtenidos a 280 nm para la identificación de compuestos fenólicos en el medio con piloncillo, que fue el único que presentó cantidades mínimas de fenólicos en los perfiles cromatográficos; en los medios con piña y dátil no se detectó presencia de compuestos fenólicos por esta técnica.

8.4.3.1 Identificación de compuestos fenólicos en el medio con piloncillo Para el caso del piloncillo se observa en la Figura 13a) que es a las 0 h de fermentación que se identificaron pequeñas cantidades de ácido cafeico, ácido cumárico y ácido ferúlico a los tiempos de retención de 26.1, 33.5 y 39.9 minutos respectivamente. A las 29 horas de fermentación se puede observar en la Figura 13b) que sólo se encuentran presentes la epicatequina y el ácido ferúlico con un tiempo de retención de 26.8 y 36.5 minutos respectivamente y por último las 53 horas de fermentación se observa en la Figura 13c) que se identificaron los compuestos epicatequina y ácido ferúlico a los tiempos de retención de 27 y 36.7 minutos respectivamente.

Sólo el ácido ferúlico se encontró en los tres puntos de la cinética de fermentación, la epicatequina se encontró en dos puntos de la cinética de fermentación (29 y 54 h), mientras que el ácido cumárico y cafeico se encontró sólo al inicio de la fermentación (0 h).

Figura 13a). Perfil cromatográfico por HPLC correspondiente al medio con piloncillo utilizado para la identificación de compuestos fenólicos a las 0 horas de fermentación.

Figura 13b). Perfil cromatográfico por HPLC correspondiente al medio con piloncillo utilizado para la identificación de compuestos fenólicos a las 29 horas de fermentación.

Figura 13c). Perfil cromatográfico por HPLC correspondiente al medio con piloncillo utilizado para la identificación de compuestos fenólicos a las 53 horas de fermentación.

Los compuestos fenólicos encontrados en el medio con piloncillo pueden deberse en sí a los que presenta el piloncillo, ya que la planta de caña de azúcar con la que se produce el piloncillo suministra pigmentos primarios de bajo peso molecular como flavonoides, clorofilas, carotenoides, xantofilas y compuestos fenólicos los cuales contribuyen con aproximadamente el 30% del color del azúcar en bruto (Walter, 2015). Abbas et al., 2014 realizó un estudio del perfil fenólico de la planta de caña de azúcar en el cual por medio de la técnica de HPLC encontraron 12 compuestos fenólicos donde se encuentran el ácido cafeico, ácido ferúlico, epicatequina y ácido cumárico, mismos que se encontraron en este trabajo. Las cantidades encontradas en este trabajo son muy pequeñas por lo que tal vez los compuestos fenólicos encontrados en el medio fermentado se deben a los presentes en el piloncillo disuelto en el medio, sin embrago, también puede deberse al metabolismo de las levaduras durante la fermentación.

Los compuestos fenólicos producidos durante la fermentación alcohólica por levaduras son derivados de la catálisis del ácido p- cumárico, cumárico y vanílico, los cuales suelen ser de origen vegetal (Ettayebi et al. 2003; Meaden 1998; Suomalainen and Lehtonen 1979). Los productos formados por la acción de levaduras consisten en 4-etilfenol, 4- etilguayacol, and 4- metilguayacol (Dias et al. 2003; Meaden 1998; Suomalainen and Lehtonen 1979).

La producción de sabores fenólicos en bebidas fermentadas se atribuyen a cepas de Saccharomyces cerevisiae y otros géneros de levaduras como Rhodotorula, Candida, Cryptococcus, Pichia, Hansenula, Dekkera, and Brettanomyces que contrubuyen a malos sabores fenólicos en productos vinícolas (Coghe et al. 2004; Edlin et al. 1995; Shinohara et al. 2000).

De los microorganismos que se mencionaron anteriormente, los que se han encontrado en tibicos son Saccharomyces cerevisiae, Pichia radaisii, Brettanomyces intermedius, Bettanomyces claussenii, Candida guilliermondii, Candida valida, Cryptococcus albidus, Rhodotorula rubra (Ruíz-Oronoz, 1932;

Estrada-Cuellar, 1985; Rubio et al., 1993). Por lo que estos microorganismos pueden ser los responsables de los fenoles presentes en el kéfir de agua de tibicos.

8.5 Resultados de las determinaciones realizadas a la microbioglea y kéfir de agua 8.5.1 Determinación de metales a los tibicos y kéfir de agua. Los efectos de los metales que se encuentran en aguas potables y en algunos productos comerciales sobre la salud humana, pueden ir desde el intervalo de benéficos, causantes de problemas y hasta tóxicos, esto es dependiendo de su concentración, por lo que su cuantificación en cuerpos de agua es importante (NMX- AA-051-SCFI-2001)

Se realizó absorción atómica de acuerdo a la NMX-AA-051-SCFI-2001 para la determinación de metales a las muestras de tibicos (base seca) crecidas en piloncillo, kéfir de agua del medio con piloncillo y agua potable utilizada para la fermentación, los resultados obtenidos se presentan a continuación.

El Cuadro 14 muestra los resultados obtenidos para tibicos en base seca, kefir y agua potable, como se puede observar para tibicos existe una baja cantidad de metales en la microbioglea siendo el Hg y Cd los más bajos con 0.01 mg/Kg y el más alto Al con 16 mg/Kg. En kéfir el de menor concentración es el As con 0.0008 mg/L y el de mayor concentración es el Al con 0.076 mg/L. En el agua potable que se utilizó para la fermentación el de menor concentración es el As con 0.0006 mg/L y el de mayor concentración el Ba con 0.050 mg/L.

Comparando el agua utilizada para la fermentación con la NOM-127-SSA1-1994 se observa que sólo el mercurio no entra dentro de los límites permisibles.

Cuadro 14. Resultados obtenidos por absorción atómica para la determinación de metales pesados en microbioglea, kéfir de agua y agua potable.

Resultados de la identificación Parámetro *Microbioglea Kéfir de agua Agua potable NOM-127 (Base seca) L.P. (mg/Kg) (mg/L) (mg/L) (mg/L) Arsénico 0,05 0,0008 0,0006 0,05 Mercurio 0,01 0,007 0,006 0,001

Plomo 0,7 <0.052 <0,0052 0,025 Cromo 1.7 0,016 0,0055 0,05

Cadmio 0,01 0,036 <0,0048 0,005 Aluminio 16 0,076 0,016 0,20 Bario 2.4 0,031 0,050 0,70 <: Menor al límite de cuantificación, L.P. = Límite permisible, *evaluados mediante la técnica acreditada por la EMA para lodos activados.

Los metales encuentran su camino en las bebidas alcohólicas en diferentes etapas ya través de varias fuentes, incluyendo materias primas, elaboración de la cerveza, productos fermentados, tipo de procesos y equipos utilizado, embotellado, envejecimiento / almacenamientos (Pohl, 2007).

Se han realizado estudios para conocer la concentración de metales en bebidas alcohólicas fermentadas, Ibanez et al. (2008) muestran, que en el caso del Brandy la cantidad de Cu va de un intervalo de 2.0 a 14.6 mg/L, de 2.3 mg/L para el Fe y 0.224 para el Pb; para el Cognac presenta un intervalo de 0.005 a 5.31 mg/L de Cu, 0.1 mg/L de Fe y un rango de 0.008 a 0.42 mg/L para Pb; para el vino presenta cantidad máxima de 14.3 mg/L de Al, 0.052 mg/L de Cd, 7.62 mg/L de Cu, 23.7 mg/L de Fe y 1.125 mg/L de Pb.

Como se puede observar, la concentración de metales que presenta el kéfir de agua es mucho menor a las que presentan las bebidas antes mencionadas, por lo que en

51 cantidad de metales, el kéfir de agua es confiable en contenido de metales y en un grado no tóxico.

Los metales presentes en los tibicos y kéfir de agua pueden deberse a muchos metales iónicos presentes en el suelo y posteriormente absorbidos a través del suelo a las plantas de la cual una bebida alcohólica es preparada (FSA, 1998), por ejemplo el tipo de suelo, tratamientos agroquímicos y la contaminación alrededor del lugar. Cabe señalar que estas muestras fueron crecidas en el medio con piloncillo, es decir, a partir del azúcar de caña.

El proceso por el cual se lleva a cabo la fermentación también está relacionado con la cantidad de metales presentes, por ejemplo la cerveza contiene una mayor cantidad de Ni que bebidas destiladas (Ibanez et al., 2008).

Los efectos de los iones metálicos sobre los humanos pueden variar mucho, existen efectos tóxicos entre los más conocidos son los de los iones Pb (II) y Cd (II). Por el contrario la presencia de ciertos iones metálicos en bebidas alcohólicas es benéfica, pues puede proveer un buen camino para el consumo de nutrientes en moderadas concentraciones como Ca, Co, Cr, Cu, Fe, K, Mn, Mg, Ni (Ibanez et al., 2008).

8.5.2 Determinaciones microbiológicas de microbioglea y kéfir de agua El kéfir de agua de tibicos es consumido en hogares mexicanos en condiciones no estériles, es por esto que se decidió realizar pruebas microbiológicas de manera general para ver la morfología colonial y microscópica y así saber qué tipo de microorganismos están presentes tanto en la microbioglea como en el kéfir de agua obtenidos con los diferentes sustratos.

Se describió la morfología colonial para cada uno de los medios, además se realizaron 2 tinciones una de Gram y una segunda con cristal violeta para observar la morfología microscópica, los resultados se muestran a continuación:

8.5.2.1 Formulación con piloncillo, dátil y piña. En los Cuadros 15, 16 y 17 se muestra la morfología colonial de los microorganismos aislados de la formulación con piloncillo, dátil y piña crecidos cada uno en los medios Man, Rogosa y Sharpe (MRS), Agar Cuenta Estándar (ACE) y Papa Dextrosa Agar (PDA).

En todos los casos el número de colonias encontradas en la dilución 10-3 es mayor en la microbioglea que en el kéfir, indicando que la microbioglea alberga los microorganismos (Laureys & De Vuyst, 2014), en cuanto a la morfología microscópica se recurrió a la tinción de Gram para poder observar mejor las colonias de los microorganismos que crecieron en MRS y ACE. Lo que se obtuvo fue una colonia correspondiente a levadura alargada. Para la morfología microscópica en medio PDA se recurrió a la tinción de Gram y tinción con cristal violeta para poder observar mejor a los microorganismos; lo que se encontró fue colonias de levaduras alargadas y levaduras redondas además de acoesporas presentes en hifas. En los Anexos 2.1, 2.2 y 2.3 se pueden observar los resultados obtenidos para los medios con piloncillo, dátil y piña respectivamente.

Cuadro 15. Morfología colonial y microscópica de la microbioglea y kéfir de agua aislada de la formulación piloncillo y crecida en medio MRS, ACE y PDA.

Piloncillo en medio MRS Microbioglea Kefir Dilución -3 -3 Forma Circular Circular Color Blanco Blanco Borde Entero Entero Superficie Lisa Lisa Elevación Convexa Convexa Luz reflejada Traslucido Traslucido Luz transmitida Opaco Opaco Aspecto Húmedo Húmedo Tinción de Gram Negativa Negativa

Piloncillo en medio ACE Microbioglea Kefir Dilución -3 -3 Forma Puntiforme Puntiforme Color Crema Crema Borde Entero Entero Superficie Lisa Lisa Elevación Convexa Convexa Luz reflejada Mate Mate Luz transmitida Opaco Opaco Aspecto Húmedo Húmedo Tinción de Gram Negativa Negativa

Piloncillo en medio PDA Microbioglea Kefir Dilución -3 -3 Forma Rizoide Rizoide Color Rosa pálido Rosa pálido Borde Ramoso Ramoso Superficie Filamentosa Filamentosa Elevación Convexa rugosa Convexa rugosa Luz reflejada Mate Mate Luz transmitida Opaco Opaco Aspecto Seco Seco Cristal violeta Alargadas y circulares Alargadas y circulares Tinción de Gram Negativa Negativa Man, Rogosa y Sharpe (MRS); Agar Cuenta Estándar (ACE); Papa Dextrosa Agar (PDA).

Cuadro 16. Morfología colonial y microscópica de la microbioglea y kéfir de agua aislada de la formulación dátil y crecida en medio MRS, ACE y PDA.

Dátil en medio MRS Microbioglea Kefir Dilución -3 -3 Forma Circular Circular Color Blanco Blanco Borde Entero Entero Superficie Lisa Lisa Elevación Convexa Convexa Luz reflejada Traslucido Traslucido Luz transmitida Opaco Opaco Aspecto Húmedo Húmedo Tinción de Gram Negativa Negativa

Dátil en medio ACE Microbioglea Kefir Dilución -3 -3 Forma Puntiforme Puntiforme Color Crema Crema Borde Entero Entero Superficie Lisa Lisa Elevación Convexa Convexa Luz reflejada Mate Mate Luz transmitida Opaco Opaco Aspecto Humedo Húmedo Tinción de Gram Negativa Negativa

Dátil en medio PDA Microbioglea Kefir Dilución -3 -3 Forma Rizoide Rizoide Color Rosa pálido Rosa pálido Borde Ramoso Ramoso Superficie Filamentosa Filamentosa Elevación Convexa rugosa Convexa rugosa Luz reflejada Mate Mate Luz transmitida Opaco Opaco Aspecto Seco Seco Cristal violeta Ascas con ascosporas Ascas con ascosporas Tinción de Gram Negativa Negativa Man, Rogosa y Sharpe (MRS); Agar Cuenta Estándar (ACE); Papa Dextrosa Agar (PDA).

Cuadro 17. Morfología colonial y microscópica de la microbioglea y kéfir de agua aislada de la formulación piña y crecida en medio MRS, ACE y PDA.

Piña en medio MRS Microbioglea Kefir Dilución -3 -3 Forma Circular Circular Color Crema Crema Borde Entero Entero Superficie Lisa Lisa Elevación Convexa Convexa Luz reflejada Traslucido Traslucido Luz transmitida Opaco Opaco Aspecto Húmedo Húmedo Tinción de Gram Negativa Negativa

Piña en medio ACE Microbioglea Kefir Dilución -3 -3 Forma Puntiforme Puntiforme Color Crema Crema Borde Entero Entero Superficie Lisa Lisa Elevación Convexa Convexa Luz reflejada Mate Mate Luz transmitida Opaco Opaco Aspecto Húmedo Húmedo Tinción de Gram Negativa Negativa

Piña en medio PDA Tibicos Kefir Dilución -3 -4 Forma Rizoide Rizoide Color Rosa pálido Rosa pálido Borde Ramoso Ramoso Superficie Filamentosa Filamentosa Elevación Convexa rugosa Convexa rugosa Luz reflejada Mate Mate Luz transmitida Opaco Opaco Aspecto Seco Seco Cristal violeta Alargadas y circulares Alargadas y circulares Tinción de Gram Negativa Negativa Man, Rogosa y Sharpe (MRS); Agar Cuenta Estándar (ACE); Papa Dextrosa Agar (PDA).

Se encontró un mayor número de colonias en la microbioglea que en el kéfir de agua esto por qué que los tibicos están formados por una capa externa compacta y una estructura interna esponjosa. La primera está densamente poblada por bacterias y levaduras que se embeben en la dextrana, mientras que la interna presenta una estructura esponjosa debido a la acumulación de CO2 producido durante la fermentación (Lutz, 1899; Moinas et al. 1980).

Como se puede observar en los cuadros anteriores se encontraron en todas las formulaciones sólo levaduras y hongos filamentosos, se esperaba encontrar algunas bacterias del genero Lactobacillus, esto porque de acuerdo con Ronald (2007) el complejo tibi produce un polisacárido de dextrana que está constituido principalmente por D-1,6-glucopiranosil, es insoluble y lo produce especialmente Lactobacillus brevis, sin embargo la manera de crecer bacterías acido-lacticas es en un ambiente microaerofílco en medio MRS (Rubio et al. 1993), es decir, en presencia de bajas concentraciones de oxígeno, pero en este trabajo las placas con medio MRS se crecieron en un ambiente aerobio por lo que se favoreció el crecimiento de levaduras. Además el kéfir de agua es un medio muy demandante para el género Lactobacillus debido a su baja concentración de aminoácidos escenciales (Stadie et al., 2013) lo que limita su crecimiento.

Se realizó un frotis directo de la muestra de tibicos crecida en piloncillo para poder verificar los resultados, se hizo tinción de gram para poder observar su morfología microscópica y lo que se obtuvo fue, como muestra la Figura 16, algunos hilos punteados. Además de microorganismos cocos alargados, se han encontrado otros microorganismos presentes en los tibicos como Leuconostoc mesenteroides (Pidoux, 1988). Leuconostoc es una bacteria ácido-láctica y se considera generalmente como seguro para la salud humana, algunas de éstas bacterias ácido lácticas producen dextranas (Duboc y Mollet, 2001). Las dextranas, que se producen principalmente a partir de especies Leuconostoc, Lactobacillus, Streptococcus, y Weissella, difieren en el tipo de enlace glucosídico, edad, el grado y tipo de ramificación, longitud de cadena, peso molecular, distribución y conformación de cadena polimérica. Esta variación es influenciada por la cepa,

57 condiciones de cultivo y composición del medio (Yang et al., 2015), por lo que no solo Lactobacillus brevis produce dextranas.

Se han realizado estudios para conocer la diversidad microbiana que existe en los tibicos en la cual han encontrado bacterias, levaduras y hongos como se describe en los antecedentes en donde se nombran todos los microorganismos encontrados en la microbioglea de tibicos.

Figura 14. Microorganismos vistos en microscopio óptico x1000 del frotis directo de la microbioglea en medio con piloncillo (Tinción de Gram).

9 CONCLUSIONES  La muestra de tibicos utilizada mostró evidencia de actividad microbiana.  Comparativamente entre los medios probados (piña, dátil y piloncillo) se obtuvo que:  La piña con azúcar mascabado indujo a mayor producción de biomasa de tibicos comparativamente con el dátil y piloncillo, incrementándose 74.52% de su peso inicial (21 g).  El medio con piloncillo, presentó la mayor producción de ácido láctico (0.53 g de ácido láctico/100 ml)  La humedad de la microbioglea en los diferentes medios se mantuvo similar entre ellos, siendo el promedio de las 3 diferentes formulaciones de 83.75% cercano al valor que reporta Ulloa (1987) de 83%.  La mayor actividad antioxidante se obtuvo durante la fermentación del medio que contenía piloncillo.  El medio que presenta mayor cantidad de compuestos fenólicos es el piloncillo.  En cada uno de los diferentes medios probados se determinó que existe una relación entre la capacidad antioxidante y los compuestos fenólicos.  Los compuestos fenólicos identificados por HPLC en el kéfir fermentado con piloncillo fueron: Ácido ferúlico, Ácido cumárico, Ácido ferulico y Epicatequina.  Los valores de metales presentes en tibicos, kéfir de agua y agua potable se encontraron dentro de los límites permisibles por la norma establecida para el consumo humano excepto por el metal Hg que tiene una concentración mayor al límite permisible.  En el análisis por microscopio óptico se detectaron hongos filamentosos y levaduras en las muestras de tibicos.

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11 ANEXOS 11.1 ANEXO 1: CURVAS DE CALIBRACIÓN  Curva tipo de µmolEquivalentes Trolox/ml para la determinación de capacidad antioxidante por el método de DPPH empleando metanol al 80% como disolvente.

Concentración Absorbancia % de inhibición µmolEq. Trolox promedio 50 0.3989 37.71405 100 0.3116 51.34024 150 0.1233 80.75262 200 0.0767 88.02373 250 0.0265 95.86218

120

100

% inhibición % 40 y = 0.306x + 24.845 R² = 0.9372 20

0 0 50 100 150 200 250 300 µmolEquivalente Trolox /ml

Figura 15. Curva tipo para la determinación de actividad antioxidante por método de DPPH expresada como µmolEquivalente Trolox/ml

A continuación se presentan los cálculos para la expresión de la capacidad antioxidante por método DPPH, por regresión lineal se obtuvo la ecuación de la recta, se empleó la ecuación obtenida en la Figura 15.

Ecuación de la recta obtenida por regresión lineal:

µ푚표푙퐸푞. 푇푟표푙표푥 % 퐼푛ℎ𝑖푏𝑖푐𝑖ó푛 = 0.306 ( ) + 24.845 푚푙

Con la ecuación obtenida se interpoló para obtener la concentración deseada, se despejó el valor de % de inhibición de la concentración y se sustituyó el valor (el primer valor de absorbancia del kefir en piloncillo):

µ푚표푙퐸푞. 푇푟표푙표푥 46.9 = 0.306 ( ) + 24.845 푚푙

Despejando µ푚표푙퐸푞.푇푟표푙표푥 (X en la ecuación de la recta) 푚푙

µ푚표푙푀퐸푞. 푇푟표푙표푥 46.9 − 24.845 µ푚표푙퐸푞. 푇푟표푙표푥 = ( ) = 73.8366 푚푙 0.306 푚푙

Y se multiplica por 0.3 (factor de dilución que se obtuvo durante el proceso de concentración de la muestra).

µ푚표푙퐸푞. 푇푟표푙표푥 µ푚표푙퐸푞. 푇푟표푙표푥 µ풎풐풍푬풒. 푻풓풐풍풐풙 = (73.8366 ) ∗ 0.3 = ퟐퟏ. ퟔퟒ 푚푙 푚푙 풎풍

 Curva tipo de calibración de equivalentes de ácido gálico para la determinación de fenoles totales expresada como ppm (mg equivalentes ácido gálico/L)

Concentración Absorbancia (ppm) promedio 50 0.2 100 0.3 150 0.5 200 0.7 250 0.9 300 1.1 350 1.3 400 1.6

1.8

1.6

1.4

1.2

1.0

0.8 Absorbancia 0.6 y = 0.0041x - 0.1021 0.4 R² = 0.9969 0.2

0.0 0 100 200 300 400 500 PPM (mg ácido gálico/L)

Figura 16. Curva de calibración de ácido gálico para la determinación de fenoles totales.

A continuación se presentan los cálculos para la expresión de fenoles totales como equivalentes de ppm de ácido gálico, por regresión lineal se obtuvo la ecuación de la recta, se empleó la ecuación obtenida en la Figura 16.

Ecuación de la recta obtenida por regresión lineal:

퐴 = 0.0041(푝푝푚 Á푐𝑖푑표 𝑔á푙𝑖푐표) − 0.1021

Con la ecuación obtenida se interpoló para obtener la concentración deseada, se despejó el valor de ppm de ácido gálico de la concentración y se sustituyó el valor de la absorbancia (el primer valor de absorbancia del kefir en piloncillo):

0.4002 = 0.0041(푝푝푚 Á푐𝑖푑표 𝑔á푙𝑖푐표) − 0.1021

Despejando ppm Ácido láctico (X en la ecuación de la recta):

0.4002 + 0.1021 푝푝푚 Á푐𝑖푑표 𝑔á푙𝑖푐표 = = 122.5203 푝푝푚 Á푐𝑖푑표 𝑔á푙𝑖푐표. 0.0041

Y se multiplica por 0.3 (factor de dilución que se obtuvo durante el proceso de concentración de la muestra).

(122.5203 푝푝푚 Á푐𝑖푑표 𝑔á푙𝑖푐표) ∗ (0.3) = ퟑퟔ. ퟖ 풑풑풎 Á풄풊풅풐 품á풍풊풄풐.

11.2 ANEXO 2: MORFOLOGÍA COLONIAL Y MICROSCÓPICA 11.2.1 Anexo 2.1 Morfología colonial y microscópica del medio con piloncillo Morfología colonial y microscópica de la microbioglea y kéfir de agua aislada de la formulación piloncillo y crecida en medio Man, Rogosa y Sharpe (MRS).

Morfología microscópica Tinción de Gram

Morfología colonial y microscópica de la microbioglea y kéfir de agua aislada de la formulación con piloncillo y crecida en medio Agar Cuenta Estándar (ACE)

Morfología microscópica Tinción de GRAM

Morfología colonial y microscópica de la microbioglea y kéfir de agua aislada de la formulación con piloncillo y crecida en medio Papa Dextrosa Agar (PDA).

Morfología microscópica

Tinción con Cristal Violeta

11.2.2 Anexo 2.2 Morfología colonial y microscópica del medio con dátil Morfología colonial y microscópica de la microbioglea y kéfir de agua aislada de la formulación con dátil y crecida en medio Man, Rogosa y Sharpe (MRS).

Morfología microscópica Tinción de GRAM

Morfología colonial y microscópica de la microbioglea y kéfir de agua aislada de la formulación con dátil y crecida en medio Agar Cuenta Estándar (ACE)

Morfología microscópica

Tinción de GRAM

Morfología colonial y microscópica de la microbioglea y kéfir de agua aislada de la formulación con dátil y crecida en medio Papa Dextrosa Agar (PDA).

Morfología microscópica

Tinción de GRAM

Tinción con Cristal Violeta

11.3.3 Anexo 2.3 Morfología colonial y microscópica del medio con piña

Morfología colonial y microscópica de la microbioglea y kéfir de agua aislada de la formulación con piña y crecida en medio Man, Rogosa y Sharpe (MRS).

Morfología microscópica Tinción de GRAM

Morfología colonial y microscópica de la microbioglea y kéfir de agua aislada de la formulación con piña y crecida en medio Agar Cuenta Estándar (ACE).

Morfología microscópica Tinción de GRAM Forma de levadura Forma de levadura

Morfología colonial y microscópica de la microbioglea y kéfir de agua aislada de la formulación con piña y crecida en medio Papa Dextrosa Agar (PDA).

Piña en medio PDA Microbioglea Kefir Dilución -3 -4 Forma Rizoide Rizoide Color Rosa pálido Rosa pálido Borde Ramoso Ramoso Superficie Filamentosa Filamentosa Elevación Convexa rugosa Convexa rugosa Luz reflejada Mate Mate Luz transmitida Opaco Opaco Aspecto Seco Seco

Morfología microscópica

Tinción de GRAM

Tinción con cristal violeta

11.3 ANEXO 3: PERFÍLES CROMATOGRÁFICOS DE LOS ESTÁNDARES UTILIZADOS EN LA DENTIFICACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS POR HPLC

Figura 17. Perfil cromatográfico del ácido ferúlico utilizado como estándar para la identificación de compuestos fenólicos por HPLC.

Figura 18. Perfil cromatográfico del ácido cumárico utilizado como estándar para la identificación de compuestos fenólicos por HPLC.

Figura 19. Perfil cromatográfico del ácido cumárico utilizado como estándar para la identificación de compuestos fenólicos mediante HPLC.

Figura 19. Perfil cromatográfico de la epicatequina utilizada como estándar para la identificación de compuestos fenólicos mediante HPLC.