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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE FILOSOFIA, CIÊNCIAS E LETRAS DE RIBEIRÃO PRETO DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

“Variabilidade populacional do ermitão Calcinus tibicen ao longo do Atlântico Ocidental avaliada

por ferramentas moleculares e morfológicas”

Silvia Sayuri Mandai

Monografia apresentada ao Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, como parte das exigências para a obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas.

RIBEIRÃO PRETO – SP

2015

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE FILOSOFIA, CIÊNCIAS E LETRAS DE RIBEIRÃO PRETO DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

“Variabilidade populacional do ermitão Calcinus tibicen ao longo do Atlântico Ocidental avaliada

por ferramentas moleculares e morfológicas”

Silvia Sayuri Mandai

Orientadora: Raquel Corrêa Buranelli Co-orientador: Fernando Luis Medina Mantelatto

RIBEIRÃO PRETO – SP 2015

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

FICHA CATALOGRÁFICA MANDAI, S.S.

“Variabilidade populacional do ermitão Calcinus tibicen ao longo do Atlântico Ocidental avaliada por ferramentas moleculares e morfológicas”

XIV+91 f. : il.

Monografia (Bacharelado em Ciências Biológicas) - Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, Departamento de Biologia, Ribeirão Preto, 2015.

Orientação: Raquel Corrêa Buranelli Co-orientador: Prof. Dr. Fernando Luis Medina Mantelatto

1. Anomura 2. Diogenidae 3. Divergência genética 4. Espécies crípticas 5. Separação alopátrica

Retirado de blanco designs – Desenhos vetorizados (www.blancodesigns.com.br)

Muitas pessoas e instituições auxiliaram de forma direta e indireta na formulação desse trabalho, mas também da minha formação acadêmica e pessoal. Por isso essa seção torna-se tão importante para mim.

Primeiramente, agradeço ao meu co-orientador, Prof. Dr. Fernando Luis Medina

Mantelatto, pelo convite para integrar o Laboratório de Bioecologia e Sistemática de

Crustáceos (LBSC) e pela oportunidade de executar esse projeto de Iniciação Científica. Além disso, apoiou-me no desenvolvimento do mesmo, orientando-me de maneira atenciosa e trazendo exemplares para análises. Ainda, agradeço pela confiança e pelas oportunidades concedidas.

Agradeço à minha querida orientadora Raquel Corrêa Buranelli, que sempre, independentemente do dia e da hora, apoiou-me no desenvolvimento e aperfeiçoamento da minha iniciação científica. Sem todos os seus esforços, dedicação e paciência, esse trabalho não teria esse rigor. Muito obrigada por tudo, inclusive por trazer material de outros países e dos “mimos” de suas viagens.

Agradeço imensamente à Universidade de São Paulo e, em especial ao Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto pela infra-estrutura e auxílio. Também minha gratidão aos funcionários da limpeza, da Secretaria, da segurança, e dos serviços de transporte e de Graduação da FFCLRP.

Agradeço à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) com o processo IC 2014/10639-1, pelo suporte financeiro concedido durante toda a execução desse projeto. Agradeço ainda aos Projetos Temáticos concedidos ao Laboratório de Bioecologia e

Sistemática de Crustáceos (LBSC): BIOTA - FAPESP (processo 2010/50188-8) e CAPES -

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Edital Ciências do Mar II -

(processo 2005/2014 - 23038.004308/2014-14). Esses auxílios permitiram o desenvolvimento desse projeto com a infraestrutura e equipamentos necessários, a participação em eventos, o

III custeio das atividades no setor de biologia molecular e a realização de coletas de campo.

Além disso, foi um prazer fazer parte de projetos temáticos tão importantes no estudo da biodiversidade de crustáceos decápodes.

Agradeço àqueles que tornaram possível a reunião de todos os espécimes necessários para o desenvolvimento desse projeto, por meio de coletas, empréstimos, doações e/ou na logística da entrega do material: Christoph D. Schubart (Universität Regensburg), Darryl L.

Felder (University of Louisiana at Lafayette, Estados Unidos), Gustav Paulay (Florida

Museum of Natural History - University of Florida, Estados Unidos) e José Luis Villalobos,

Fernando Alvarez, Juan Carlos Ojeda e Leonardo García (Universidade Nacional Autónoma de México).

Agradeço ao Centro de Recursos Biológicos e Biologia Genômica (CREBIO) do

Departamento de Tecnologia da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV) de

Jaboticabal, da Universidade Estadual Paulista (UNESP), pelos serviços prestados com as etapas de sequenciamento.

Agradeço àqueles que, de alguma forma, contribuíram para o desenvolvimento desse projeto, seja com novas ideias, auxílios na obtenção dos dados e análises: Ana Vera,

Christoph Schubart, Edvanda Carvalho, Mariana Negri (Kana), Mariana Terossi, Rafael

Robles, Sabrina Simões e Tatiana Magalhães. Agradeço a Mayara Miyazaki por todo suporte técnico na molecular. Ainda, agradeço aos outros companheiros do laboratório pelo acolhimento: Ana Gomes (Kelps), Bárbara Prado, Caio Oliveira, Carla Kuhl, Elis Pereira,

Fabrício Carvalho, Juliana Paixão, Mateus Lopes e Natália Rossi.

Agradeço a todos os docentes com os quais tive aulas nesses quatro anos de graduação, tanto do Departamento de Biologia da FFCLRP, como do Departamento de

Administração da Faculdade de Economia, Ciências Contábeis e Administração de Ribeirão

IV Preto (FEARP). Pude aprender muito com toda experiência de vocês e esse conhecimento foi muito importante na elaboração deste trabalho.

Agradeço a todos os que me orientaram em projetos durante esses anos: os professores

Celso Teixeira Mendes e Daniela Sudan. Aproveito para prestar meus agradecimentos aos docentes que permitiram que eu realizasse estágios em seus laboratórios: Claúdio Antônio

Tedesco, Maria de Lourdes Teixeira de Moraes Polizeli e Rita Tostes. Aprendi muito no período no qual trabalhei com vocês.

Agradeço aos meus companheiros da turma Biologia ILIX: Aline, Ana Laura,

Anderson, Caio, Carla, Dafne, Danilo, Elis, Enrico, Fernanda, Florença, Gabriel de Carli,

Gabriel dos Santos, Guilherme, Isabela, João Pedro, José Ikeda, Juliana, Laura, Loyná, Lucas,

Luiza, Maiara, Marcela, Marino, Olívia, Pedro, Rafael, Ricardo, Rodrigo, Vitor e Wendy.

Uma turma com a qual pude crescer muito na área profissional e pessoal. Apesar de não falar muito, adorava todos os debates calorosos que nossa turma desenvolvia em inúmeras disciplinas. Eles me acrescentaram muito. Entre os colegas de turma destaco o carinho, o companheirismo e a troca de conhecimento com o Enrico e a Jéssica.

E a todos do Café Botânico, Caio Monção (Mari), Florença Silvério (Florence),

Frederico Martins, Juliana Takata (Hashi), José Ikeda Neto (Restart), Loyná Paez, Maiara

Pereira e Thais Momente (Fake), meus sinceros agradecimentos pelos momentos inesquecíveis que passamos na faculdade. Sem dúvida a graduação teria sido menos divertida e interessante sem vocês. Viagens, açaí, Bom sabor, filmes de difícil escolha, picnics, passeios no shopping, “micos” e risadas adoráveis, tudo me remete a vocês. Adoro todos!

E aos meus queridos irmãos de coração, Franciele Amorim e Thiago dos Santos, e ao querido José Dias, Pedro Montanha, um agradecimento especial por todos os dias de convivência, loucuras e risos compartilhados. Além das cantorias, danças, festinhas, invenção de pratos, filmes com dorminhocos, jogos de baralho e “micos” inesquecíveis. Com certeza

V meus finais de semana não seriam tão malucos e engraçados sem vocês. Sem vocês não teria tantas oportunidades de conversar sobre uma diversidade de assuntos, política, educação, futuro, escolhas, economia, entre outros. Sem vocês os trilhos na Universidade seriam menos instigantes. Sem vocês não teria crescido tanto no meu lado pessoal e espiritual. Mesmo sem saber, auxiliaram-me a superar momentos complicados. Obrigada!

Agradeço a todas as pessoas que de alguma forma auxiliaram na manutenção das moradias por onde passei e em minha permanência nelas. Em especial, à Marília Equi Martins e ao senhor Antônio. E também sou grata às grandes amizades que fiz durante minhas estadias, Franciele, Marcelo, Núbia, Silvia, Thiago, Tuane e Yi Chieh.

E claro, minhas queridas amigas de longa data: Bruna, Carol, Dani, Giovana, Laysla e

Letícia. É sempre bom voltar para casa, reencontrá-las e renovar minhas energias. Os mesmos agradecimentos vão aos meus amigos do grupo de taiko Ryuukadaiko de Lins.

Agradeço a todos os membros da SGI que deram incentivos importantes durante minha jornada na faculdade, principalmente da RM-Araçatuba e da Sub-coordenadoria

Ribeirão Preto. Destaco aqui as orientações do senhor Daisaku Ikeda, tanto em seus livros, periódicos e outros materiais de estudo vindos do Japão.

E finalmente, gostaria de agradecer àquelas pessoas que são essenciais em minha vida, a base de tudo que eu sou: minha família. Meu pai Kazuo Mandai, minha mãe Haruko

Sakakura Mandai e meu irmão Guilherme Takeshi Mandai. Essas pessoas sempre me apoiaram tanto na escolha do curso, da Universidade e da cidade em que eu estudaria. Sempre foram solidários às minhas dificuldades e me orientaram nos momentos de dúvidas. Agradeço também aos meus outros familiares pelos incentivos, orientações e carinho que sempre tiveram comigo. Pela preocupação muito cuidadosa quando viajava, pelos mimos quando voltava para casa e por sempre me apoiarem de forma sensata.

MANDAI, S.S. (2015) Resumo

MANDAI, Silvia Sayuri. Variabilidade populacional do ermitão Calcinus tibicen ao longo do Oceano Atlântico avaliada por ferramentas moleculares e morfológicas. 2015. 109 f. Monografia (Graduação em Ciências Biológicas) - Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.

A variabilidade populacional tem sido um campo de estudo importante no entendimento de processos evolutivos e na obtenção de dados genéticos e fenotípicos de grupos taxonômicos. Tais informações podem ser utilizadas em estudos sobre biogeografia, demografia histórica e especiação. Nesse contexto, perfil de alta variação intraespecífica tem sido evidenciado em espécies de crustáceos decápodes marinhos com ampla distribuição geográfica, podendo, em alguns casos, indicar processos de especiação. A distribuição geográfica de Calcinus tibicen inclui extensas áreas costeiras do Atlântico Ocidental, sendo encontrado desde a Península da Flórida, nos Estados Unidos, até o estado de Santa Catarina, no Brasil. Diante disso, esse trabalho teve como objetivos avaliar a variabilidade morfológica e molecular da espécie ao longo de toda sua distribuição. Os dados moleculares foram obtidos seguindo procedimentos de extração, amplificação, purificação e sequenciamento do material genético de 75 espécimes para o gene COI e de 20 exemplares para o gene 16S, provenientes de 20 localidades. Por outro lado, os resultados sobre a morfologia e a morfometria foram baseados na análise de 98 exemplares. As redes de haplótipos apontaram a presença de dois grupos geneticamente bem definidos, os quais não compartilham haplótipos e estão separadas por 44 e 13 passos mutacionais, respectivamente, para o gene COI e 16S. Esses resultados, juntamente com as árvores filogenéticas e as matrizes de distância genética obtidas, sugerem ausência de fluxo gênico entre o grupo do Atlântico Norte e do Brasil. A Análise de Variação Molecular para o gene COI corroborou essa separação, indicando que a maior parte da variação genética (93,93%) encontrada pelo teste ocorre entre os dois grupos e apenas 0,08% está entre as localidades de cada grupo, assim como as análises discriminantes com base na morfometria, as quais apontaram essa mesma estruturação para os machos da espécie. Essa separação encontra subsídios na presença da foz do rio Amazonas, a qual coincide com o hiato de distribuição da espécie, constituindo uma importante barreira fisiológica. Esse impedimento extrínseco é significativo para as larvas da espécie (desenvolvimento anamórfico), que constituem a principal forma de dispersão para a espécie. A hipótese levantada é que esses indivíduos poderiam estar distribuídos ao longo de toda a costa do Oceano Atlântico, todavia, com o soerguimento das cadeias de montanhas dos Andes e consequente mudança no sentido de desague do rio Amazonas, diferenças genéticas passaram a serem acumuladas por fatores evolutivos diferentes em cada região (Atlântico Norte e Brasil), a ponto de podermos sugerir um possível isolamento reprodutivo entre os dois grupos, bem como a potencial existência de espécies crípticas, visto que padrões morfológicos específicos para cada grupo não foram observados.

Palavras-chave: Anomura; Diogenidae; Divergência genética; Espécies crípticas; Separação alopátrica.

MANDAI, S.S. (2015) Abstract

MANDAI, Silvia Sayuri. Population variability of the hermit crab Calcinus tibicen along the Atlantic coast evaluated by molecular and morphological tools. 2015. 109 f. Monograph (Graduation in Biological Sciences) - Faculty of Philosophy, Sciences and Letters of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto.

Population variability has become an important field mainly for the understanding of evolutionary processes and for obtaining genetic and phenotypic data of some taxa. Such information can help in other types of studies like biogeography, historical demography and speciation. In this context, high intraspecific variation patterns have been found in species of marine decapod crustaceans with wide geographical distribution, and may in some cases indicate speciation processes. The hermit crab Calcinus tibicen is considered to have a large distribution along the Atlantic Ocean coast, from the peninsula of Florida in the USA up to the state of Santa Catarina, in Brazil. Based on this, the present study aimed to evaluate the morphological and molecular variability of this species throughout its distribution. The molecular data were obtained following extraction, amplification, purification and sequencing processes of the genetic material of 75 specimens for COI gene and 20 samples for 16S gene from 20 different localities. Moreover, the results on the morphology and morphometry were based on the analysis of 98 samples. We here present evidence, based on the morphometry and on genetic data, that two groups of Calcinus tibicen (North Atlantic and Brazil) are distinct. The haplotype networks showed the existence of two genetically well-defined groups, which do not share haplotypes and that are separated from each other by 44 and 13 mutations, for COI and 16S genes, respectively. These results, along with the phylogenetic trees and matrices of genetic distance obtained, suggest no gene flow between the North Atlantic group and Brazil. The Analyses of Molecular Variance for the COI gene corroborated this separation, indicating that most part of the genetic variation (93.93%) was found between the two groups and only 0.08% is among the locations in each group. As well, the discriminant analysis based on morphometry showed the same structure for the males of the species, but no morphological patterns for each group were observed. This separation may be related to the Amazon river mouth, which coincides with a gap of distribution of the species. So, it can be an important physiological barrier especially for the larvae of Calcinus tibicen (anamorphic development), which are the main dispersion mean for the species. The hypothesis is that these individuals were probably distributed along the entire coast of the Atlantic Ocean. Nevertheless, with the uplift of the mountains in the Andes region, and the consequent shift towards of the Amazon River flow, genetic differences began to be accumulated by different evolutionary factors in each region (North Atlantic and Brazil). The results can suggest a possible reproductive isolation between the two groups, as well the potential existence of cryptic species.

Keywords: Anomura; Diogenidae; Genetic divergence; Cryptic species; Allopatric separation.

...... 1

1. Diversidade biológica e a variabilidade...... 2 2. Justificativa ...... 4 3. Ferramentas para a análise da variabilidade ...... 8 4. Objeto de estudo: Calcinus tibicen ...... 10 ...... 14

...... 16

1. Obtenção dos espécimes ...... 17 2. Obtenção dos dados moleculares:...... 17 2.1 Extração de DNA ...... 22 2.2 Amplificação do DNA - PCR ...... 23 2.3 Purificação dos produtos da PCR e reações de sequenciamento ...... 26 2.4 Amplificação dos produtos da PCR ...... 26 2.5 Precipitação e sequenciamento do DNA ...... 27 2.6 Edição das sequências ...... 27 3. Análise dos dados moleculares: ...... 28 3.1 Análises de variabilidade genética ...... 29 3.2 Teste de neutralidade ...... 29 3.3 Distância genética ...... 30 3.4 Análises filogenéticas ...... 31 3.5 Datação Molecular ...... 33 4. Obtenção e análise dos dados morfológicos ...... 33 5. Obtenção e análise dos dados morfométricos...... 36 ...... 40

1. Dados Moleculares ...... 41 1.1 Variabilidade molecular ...... 41 1.2 Teste de neutralidade ...... 45 1.3 Distância genética ...... 46 1.4 Análises Filogenéticas ...... 51 1.5 Datação molecular ...... 57 2. Dados morfológicos ...... 58

XIII

3. Dados morfométricos ...... 58 ...... 62

...... 78

...... 80

XIV

MANDAI, S.S. (2015) Introdução

1. Diversidade biológica e a variabilidade

A diversidade biológica consiste na variabilidade de organismos de todas as origens, incluindo, entre outros, os ecossistemas terrestres, aquáticos e os complexos ecológicos de que fazem parte; compreendem, ainda, a diversidade intraespecífica e genética, e os intricados ecossistemas construídos no meio ambiente (AMÂNCIO & CALDAS, 2010; PRIMACK &

RODRIGUES, 2001). Essa diversidade tem sido alvo da curiosidade humana desde seus primórdios. Em decorrência desse fato, muitos estudos têm sido traçados em busca de mais informações sobre os processos evolutivos que levaram a essa enorme diversificação da vida observada hoje, mas que foi também muito variada durante toda a história da Terra (SENE,

2009).

Seguindo-se a ideia de diversidade biológica, uma pergunta intrigante surge: “qual a origem dessa diversidade?”. A origem primordial da diversidade encontra-se nas mutações no material genético, em sequências pré-existentes. No entanto, apenas as alterações no DNA de células germinativas são transmitidas aos descendentes e, assim, somente estas têm valor evolutivo. Também é importante mencionar que essa variação, em termos evolutivos, ocorre em nível populacional e, quando essas alterações ainda permanecem após eventos de seleção natural, deriva genética e migração, elas são mantidas na população (SENE, 2009;

FREEMAN & HERRON, 2009). Neste ponto é importante ressaltar que, neste trabalho, população é considerada como o conjunto de indivíduos de uma espécie que trocam material genético entre si (deme). Essa ressalva é necessária pela existência de muitas definições para o termo.

Desse modo, essas mutações no material genético, gerando sequências nucleotídicas diferentes, podem originar proteínas distintas, alterando características bioquímicas e morfológicas, as quais caracterizam a população (FRANKHAM et al., 2008). Ademais, as modificações podem levar a diferenças nas taxas reprodutivas, de sobrevivência e

MANDAI, S.S. (2015) Introdução

comportamentais, podendo acarretar em especiação (NEGRI et al., 2012; MEDLIN et al.,

1991; MATTIUCCI et al., 1997).

Nesse contexto, a diversidade genética apresenta extrema importância na adaptação das populações a diferentes condições ambientais. E quando essas mudanças no material genético atingem certo grau, a ponto de gerar incompatibilidade reprodutiva, tanto por questões temporais, anatômicas, fisiológicas, de infertilidade ou de inviabilidade dos descendentes, pode-se dizer que se está diante de um trecho da diferenciação daquele grupo.

Assim, a análise dos eventos evolutivos responsáveis pela diferenciação de populações de uma espécie é extremamente importante para a compreensão da diversificação de um táxon, e, consequentemente, da diversidade biológica atual (AVISE, 2000).

Dessa maneira, a biodiversidade conhecida atualmente faz parte de processos evolutivos macrotemporais que levaram à diferenciação populacional e em alguns casos, à especiação (WILSON, 1988). Os processos de especiação consistem na geração de uma ou mais espécies a partir de uma única espécie, por meio de um conjunto de mutações, causadas por substituições, deleções ou adições alélicas que geram isolamento reprodutivo.

Basicamente, existem duas formas de especiação: a simpátrica e a alopátrica. No primeiro caso, o isolamento reprodutivo se dá pela evolução de barreiras reprodutivas dentro da mesma população. Por outro lado, quando barreiras físicas extrínsecas ou hábitats desfavoráveis impedem o fluxo gênico de indivíduos ou de gametas, a especiação é denominada alopátrica

(e.g. MALAY & PAULAY, 2009).

Assim, impedimentos extrínsecos de fluxo gênico podem ser determinantes na divergência genética e para a eventual evolução de barreiras de isolamento reprodutivo, que constituem o conceito biológico de espécie (AVISE, 2000). Análises sobre variabilidade genética populacional permitem que sejam interpretadas as diferenças entre populações

MANDAI, S.S. (2015) Introdução

vizinhas e a presença ou ausência de descontinuidade entre populações (MAYR, 1977;

CARVALHO-BATISTA et al., 2014).

Dessa maneira, pode-se afirmar que o estudo da variabilidade genética permitiu a descoberta de padrões de fluxo gênico e demografia histórica de organismos marinhos

(OLIVEIRA-NETO et al., 2007), indicando o potencial para adaptação local de uma população e contribuindo para o entendimento dos processos de diferenciação populacional e especiação (BOHONAK, 1999). Estratégias de manejo e de conservação da biodiversidade também necessitam do estudo dessa variabilidade, principalmente para a área de diversidade genética, evitando problemas de endocruzamento e perda de potencial adaptativo (MAYR,

1977; FRANKHAM et al., 2008; LANDE, 1988).

Além disso, estudos sobre o status taxonômico também se tornam essenciais em medidas de conservação, de modo que não seja negada proteção às espécies em perigo, e nem esforços sejam empenhados com espécies abundantes (FRANKHAM et al., 2008). E como visto, informações genéticas auxiliam na resolução de incertezas taxonômicas e na definição de unidades de manejo (LARA-RUIZ et al., 2008), principalmente quando as características morfológicas não estão bem estabelecidas.

2. Justificativa

Alguns estudos evidenciaram divergência genética entre populações de crustáceos decápodes com ampla distribuição geográfica, em particular para aquelas habitantes da costa do Atlântico Ocidental. Considerando a espécie de caranguejo Uca rapax (Smith, 1870), por exemplo, um estudo recente (LAURENZANO et al., 2013), envolvendo populações do mar do Caribe e do Atlântico Sul, evidenciou elevada diferenciação com redução de fluxo gênico entre as populações do Caribe, o que pode estar relacionado à existência de barreiras

MANDAI, S.S. (2015) Introdução

biológicas, geográficas ou fisiológicas, e uma homogeneidade gênica entre as populações do

Suriname e do Brasil.

Nas análises com a espécie de camarão carídeo Hippolyte obliquimanus Dana, 1852, também houve divergências morfológica e molecular entre as populações do Brasil e do

Caribe, mas estas não foram suficientes para separá-las em duas entidades taxonômicas

(TEROSSI & MANTELATTO, 2012). Além disso, análises moleculares e morfológicas com o ermitão Clibanarius vittatus (Bosc, 1802) indicaram uma divergência entre as populações do Brasil e do Golfo do México (NEGRI et al., 2012), esta sim culminando na proposição de ressurreição de uma entidade taxonômica esquecida (NEGRI et al., 2014). Assim sendo, espécies com ampla distribuição geográfica nesta área representam ótimos modelos para a análise dessa situação, como é o caso do ermitão Calcinus tibicen (Herbst, 1791) (Fig. 1), espécie alvo deste estudo.

FIGURA 1: Calcinus tibicen. Fêmea, CCDB 4898. Foto: Buranelli, R.C. (2014). Barra de escala = 9mm.

MANDAI, S.S. (2015) Introdução

Essa espécie apresenta distribuição geográfica que contempla extensas áreas do

Atlântico Ocidental, com registros desde a Península da Flórida, nos Estados Unidos, até o

Brasil, no Estado de Santa Catarina (Fig. 2) (NARCHI & HEBLING, 1972; COELHO &

RAMOS-PORTO, 1987; RIEGER & GIRALDI, 1997). Considerando essa distribuição ao longo de uma extensa faixa latitudinal, são altas as possibilidades de existência de barreiras ecológicas ou físicas que podem estar restringindo o fluxo gênico entre determinadas áreas.

Ainda, essa espécie apresenta um gap na distribuição/registro que coincide com a foz do rio Amazonas no Brasil (MELO, 1999). Anualmente, adentra no oceano Atlântico um volume total de 209000 m³/s de água doce deste rio (MOLINIER et al., 1995), valor correspondente a cerca de um quinto de toda água fluvial do planeta, alterando drasticamente a salinidade da região, podendo constituir uma grande barreira fisiológica à dispersão das larvas dessa espécie, entre as localidades do Atlântico Norte e do Atlântico Sul.

MANDAI, S.S. (2015) Introdução

Estados Unidos

México 9 10 7 2 8 1 4 5 12 3 6 Venezuela 11 13 14 Colômbia 15

17 Brasil

Bolívia

19 18

Argentina 20

FIGURA 2: Calcinus tibicen. Mapa com a distribuição da espécie ao longo da costa do Oceano Atlântico Ocidental (MELO, 1999). O destaque em vermelho indica as áreas nas quais existe registro para a espécie. 1: Guatemala, 2: Belize, 3: El Salvador, 4: Honduras, 5: Nicarágua, 6: Costa Rica, 7: Cuba, 8: Jamaica, 9: Haiti, 10: República Dominicana, 11: Panamá, 12: Trinidad & Tobago, 13: Guiana, 14: Suriname, 15: Guiana Francesa, 16: Equador, 17: Peru, 18: Chile, 19: Paraguai, e 20: Uruguai.

MANDAI, S.S. (2015) Introdução

Considerando o desenvolvimento larval de Calcinus tibicen e a sobrevivência das larvas em uma faixa salina restrita de 31 a 37.1 ppt (PROVENZANO, 1962), esse desague volumoso de água doce pode estar atuando como uma barreira importante para a dispersão e conectividade entre populações do táxon citado.

Além do mais, alguns trabalhos envolvendo o gênero Calcinus Dana, 1851 relatam a descrição de novas espécies, as quais anteriormente eram consideradas pertencentes a uma

única entidade taxonômica, indicando que a classificação para o gênero necessita de revisões.

Como exemplo, podem ser citados os estudos abrangendo as regiões do Pacífico oriental

(POUPIN & BOUCHARD, 2006), ilhas Austrais e Indonésia francesa (POUPIN &

LEMAITRE, 2003).

Assim, considerando a ampla distribuição de Calcinus tibicen ao longo da costa do

Oceano Atlântico Ocidental, a ausência de estudos sobre variabilidade populacional para o táxon e a presença de uma potencial barreira no fluxo gênico, é plausível supor que essa espécie constitui um ótimo modelo para o estudo de variabilidade intraespecífica que, futuramente, poderá constituir indicativos da existência de novas espécies.

Dessa forma, a fim de melhor compreender os padrões de distribuição genética e geográfica, foram objetivadas análises utilizando ferramentas moleculares e morfológicas, utilizando-se espécimes coletados ao longo da costa do Oceano Atlântico do ermitão Calcinus tibicen. Os padrões encontrados, possivelmente, poderão auxiliar no melhor entendimento dos processos evolutivos e da biogeografia da espécie alvo.

3. Ferramentas para a análise da variabilidade

O DNA mitocondrial apresenta algumas características ímpares, razão pela qual é bastante significativo para os estudos evolutivos. Primeiramente, sua característica uni parental relaciona-se à ausência de recombinação de seus alelos. Além disso, não possui

MANDAI, S.S. (2015) Introdução

histonas e tem baixa capacidade de reparo de suas enzimas com altas taxas de mutação, de cinco a dez vezes maiores que do DNA nuclear (FRANKHAM et al., 2008).

Por essa última característica, o DNA mitocondrial evolui com taxas maiores que o nuclear (AVISE et al., 1987), sendo uma importante ferramenta em estudos filogenéticos e de diferenças entre populações de uma espécie (ARIF et al., 2011; FRANKHAM et al., 2008).

Além disso, como a maioria das células apresenta muitas cópias de DNA mitocondrial

(SCHUBART et al., 2000), amostras desse material genético podem ser obtidas a partir de uma pequena quantia de tecido, sendo mais facilmente amplificado. Na área de biologia da conservação, esse tipo de DNA é utilizado principalmente na determinação da estrutura populacional, na resolução de problemas taxonômicos e na determinação de espécies ameaçadas (ARIF et al., 2011).

Entre os genes descritos para o DNA mitocondrial, estão os genes Citocromo Oxidase

I (COI) e 16S rRNA, os quais foram utilizados para as análises moleculares deste estudo.

Esses dois genes têm sido os mais utilizados como marcadores moleculares, inclusive nos estudos com crustáceos decápodes, alcançando um índice de eficiência bastante significativo

(OCAMPO et al., 2013).

O gene 16S constitui uma pequena subunidade mitocondrial com regiões hipervariáveis, e com funções essenciais para os organismos, papel na ubiquitinação e propriedades evolutivas (CASE et al., 2007). Neste último caso, pode ser citada sua capacidade conservativa com o decorrer dos anos, associada ao fato de apresentar baixas taxas de mutação ao longo das gerações. Essa qualidade permite a realização de associações de parentesco com outros grupos (WOESE, 1987). Dessa forma, as diferenças encontradas indicam extensos processos de diferenciação ao longo do tempo geológico.

Ademais, não compreende um gene codificante, mas sim estrutural, cujo transcrito, juntamente com outras proteínas mitocondriais, formam a subunidade maior dos ribossomos

MANDAI, S.S. (2015) Introdução

mitocondriais, importantes durante a tradução dos transcritos secundários em proteínas

(SCHUBART, et al., 2000). Já o gene COI é codificante, sendo que a sua tradução corresponde a uma proteína importante na cadeia respiratória da respiração celular de organismos aeróbicos (SCHUBART et al., 2000). É utilizado como uma ferramenta barcoding (HAJIBABAEI et al., 2007), sendo importante na confirmação de espécies para a taxonomia, em ecologia, em estudos evolutivos e sobre conservação. E, assim como o gene

16S, é usado em reconstruções filogenéticas (BRACKEN-GRISSOM et al., 2013).

Além disso, ele auxilia na identificação de um organismo por meio das análises de variabilidade das sequências de DNA e da comparação com outros indivíduos antes descritos, principalmente por ser bastante variável entre as populações (HAJIBABAEI et al., 2007).

Dessa maneira, é mais usado em estudos sobre variabilidade populacional do que o gene 16S, visto que apresenta taxas de divergência maiores que do 16S.

O estudo da morfologia tem sido usado durante muitos anos na verificação de diferentes estruturas, formatos, colorações, posições, entre outros, e têm sido muito utilizado na elaboração de análises de parentesco. Algumas dessas característica têm sido muito efetivas na identificação de organismos de diferentes grupos taxonômicos. No caso dos estudos de morfometria, estes têm sido usados como forma de melhor entender a estrutura estocástica de algumas espécies, como é o caso do camarão-espada Parapenaeopsis hardwickii (Miers, 1878) (TZENG, 2004).

4. Objeto de estudo: Calcinus tibicen

Os Crustacea constituem um dos mais diversos e mais bem sucedidos grupos de invertebrados (MCLAUGHLIN, 1980; MARTIN et al., 2009). Dentre os crustáceos, a ordem

Decapoda inclui uma diversidade de táxons marinhos, de água doce e semiterrestres

(MCLAUGHLIN, 1980), incluindo os caranguejos (Brachyura), ermitões e espécies

MANDAI, S.S. (2015) Introdução

relacionadas (Anomura), camarões (Dendobranchiata, Caridea e Stenopodidea), lagostas

(Palinura), dentre outros grupos menos conhecidos (MARTIN et al., 2009).

A espécie alvo desse estudo está incluída na infraordem Anomura Macleay, 1838, a qual é composta por sete superfamílias (Aegloidea Dana, 1852, Galatheoidea Samouelle,

1819, Hippoidae Latreille, 1825, Kiwaoidea Macpherson, Jones & Segonzac, 2006,

Lithodoidea Samouelle, 1819, Lomisoidea Bouvier, 1895 e Paguroidea Latreille, 1802)

(MCLAUGHLIN, 2010; DE GRAVE et al., 2009). A superfamília Paguroidea inclui os ermitões e seus representantes abrangem 62 espécies com ocorrência na costa brasileira, sendo 27 delas pertencentes à família Diogenidae Ortmann, 1892 (LEMAITRE &

TAVARES, 2015). Dos 10 gêneros reportados para a família no Brasil, o gênero Calcinus, o qual compreende 43 espéccies, é aqui representado por uma única espécie, Calcinus tibicen

(Fig. 1) (LEMAITRE & TAVARES, 2015).

Os ermitões são animais amplamente reconhecidos pela presença de um abdômen membranoso, sem o padrão de calcificação observado na maioria dos crustáceos. Ao longo da história evolutiva, os ermitões passaram a utilizar conchas de moluscos, principalmente de gastrópodes, dentre outros abrigos, provavelmente como forma de proteção. Atualmente, os ermitões encontram-se divididos entre seis famílias: Coenobitidae Dana, 1851, Diogenidae,

Paguridae Latreille, 1802, Parapaguridae Smith, 1882, Pylochelidae Bate, 1888 e

Pylojacquesidae McLaughlin & Lemaitre, 2001 (MCLAUGHLIN et al., 2010).

As características diagnósticas comumente utilizadas na identificação da espécie

Calcinus tibicen são: “quelípodos desiguais, sendo o esquerdo muito maior do que o direito; dedos se movendo obliquamente, com extremidades calcárias e acuminadas; ambos os quelípodos destituídos de espinhos e setas; carapaça com metade anterior mais longa do que larga; rostro triangular ultrapassando as projeções laterais; pedúnculos oculares delgados, curvados ligeiramente para fora e ultrapassando um pouco em comprimento a largura da

MANDAI, S.S. (2015) Introdução

fronte; acículos oculares agudos, terminando em 1 ou 2 espinhos; pedúnculo antenular alcançando a porção não pigmentada dos pedúnculos oculares; e pedúnculo antenal chegando ao último terço dos pedúnculos oculares e com acículo armado com 5-7 espinhos com extremidades brancas” (MELO, 1999).

Além disso, essa espécie tem pleiópodos ímpares e normalmente apresenta uma coloração marrom-alaranjada. O reconhecimento das fêmeas se dá pela presença do gonóporo na coxa do terceiro par de pereiópodos, enquanto nos machos ocorre no quinto par, assim como para as demais espécies de ermitão.

O comportamento de uso de conchas tem sido objeto de estudo de muitas pesquisas.

Um deles associou as espécies de conchas de moluscos que os espécimes de Calcinus tibicen comumente escolhem na região de Ubatuba (Brasil), sendo que as mais frequentes foram

Stramonita haemastoma (Linnaeus, 1767), Leucozonia nassa (Gmelin, 1791) e Pisania auritula (Link, 1807) (GARCIA & MANTELATTO, 2001).

Em relação ao seu hábitat, a espécie é intermareal, sendo encontrada em águas rasas de até 30 metros (RIEGER, 1997). Apresenta desenvolvimento anamórfico (=indireto) abrangendo de VI a VIII estágios larvais (PROVENZANO, 1962). Já em relação aos estudos filogenéticos envolvendo Calcinus tibicen e seus congêneres, existem trabalhos baseados em dados dos genes COI, 16S e H3 e o tempo de vicariância entre as espécies do gênero

(MALAY & PAULAY, 2009), assim como dados provenientes de sequências do gene 16S para uma única localidade (MANTELATTO et al., 2006).

Além disso, vários aspectos sobre a biologia e o comportamento de Calcinus tibicen têm sido estudados, tais como a maturidade sexual (FRANSOZO et al., 2003), o potencial reprodutivo (MANTELATTO & GARCIA, 1999), o uso e troca de conchas (MANTELATTO

& GARCIA, 2000; GARCIA & MANTELATTO, 2000, 2001; HAZLETT, 1989), a estrutura populacional e o período reprodutivo (FRANSOZO & MANTELATTO, 1998), a influência

MANDAI, S.S. (2015) Introdução

das conchas no comportamento reprodutivo (HAZLETT & BARON, 1989), os fatores influenciando o comportamento de escolha das conchas (BROWN et al., 1993), a descrição do sistema reprodutivo masculino (AMADIO & MANTELATTO, 2009) e a associação com corais (BROWN & EDMUNDS, 2013). Todavia, nenhum estudo foi realizado no que tange a variabilidade intraespecífica dessa espécie ao longo de toda sua distribuição.

MANDAI, S.S. (2015) Objetivos

Considerando o fato de que a espécie Calcinus tibicen apresenta uma ampla distribuição ao longo do Atlântico Ocidental, associada a hiato na ocorrência entre duas grandes regiões e a ausência de estudos acerca de análises morfológicas e moleculares para a região de interesse, o presente estudo teve como meta testar a hipótese de que há estruturação populacional para a espécie Calcinus tibicen.

Para tanto, foi estabelecido o objetivo específico de avaliar a variabilidade genética e morfológica dos indivíduos de Calcinus tibicen ao longo de toda sua distribuição.

MANDAI, S.S. (2015) Material e Métodos

1. Obtenção dos espécimes

Parte dos indivíduos utilizados nas análises (Tabela 1) já se encontrava depositada na Coleção de Crustáceos do Departamento de Biologia (CCDB) da

Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto (FFCLRP/USP).

Também foram analisados materiais de empréstimo e doação de tecido das coleções carcinológicas da University of Louisiana at Lafayette Zoological Collection

(ULLZ) (Lafayette, Estados Unidos) e da Florida Museum of Natural History -

University of Florida (UF) (Gainsville, Estados Unidos). Também, foram adicionadas às análises doações de outras duas instituições: Colección Nacional de Crustaceos (CNCR) da Universidad Autónoma de México (UNAM) (Cidade do México, México) e

Universität Regensburg (Regensburg, Alemanha).

Os indivíduos coletados e doados foram identificados, etiquetados, preservados em álcool etílico 80% a temperatura ambiente, e posteriormente depositados na

CCDB/FFCLRP/USP. Para as análises, os indivíduos foram retirados de suas conchas e suas identificações foram confirmadas com base nas características diagnósticas da espécie descrito na literatura pertinente (MELO, 1999; MCLAUGHLIN, 2003).

2. Obtenção dos dados moleculares:

Os avanços metodológicos em biologia molecular têm tornado possível a resolução de várias problemáticas antes limitadas apenas às análises morfológicas, como por exemplo, na melhoria das relações filogenéticas, na inferência de fluxo gênico entre diferentes localidades e na melhor delimitação de espécies distintas

(MANTELATTO et al., 2007; KEIKHOSRAVI & SCHUBART, 2014; THIERCELIN

& SCHUBART, 2014). Além disso, existem os casos de espécies crípticas, isto é, aquelas que geneticamente são bem diferentes, porém, diferenças morfológicas muito

MANDAI, S.S. (2015) Material e Métodos nítidas não são observadas (KNOWLTON, 1986, TOURINHO et al., 2012). Para este estudo, foram feitas análises moleculares em nível do DNA mitocondrial (mtDNA), utilizando sequências parciais dos genes 16S e COI.

Para tanto, foram seguidas etapas de extração, amplificação do DNA, purificação e amplificação dos produtos da PCR, precipitação e sequenciamento do

DNA. Todos esses processos seguiram os protocolos de metodologia de

MANTELATTO et al. (2006, 2007), PILEGGI & MANTELATTO (2010) e

VERGAMINI et al. (2011) com algumas modificações, a fim de melhor adequá-los ao material analisado. A Tabela 1 indica as localidades dos espécimes analisados molecularmente.

MANDAI, S.S. (2015) Material e Métodos

TABELA 1: Continua. Relação dos espécimes de Calcinus spp utilizados nas análises, por espécie, localidade, com número da Coleção, data de coleta e número de acesso no GenBank para os genes COI e 16S. CCDB: Coleção de Crustáceos do Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo. UF: Florida Museum of Natural History - University of Florida. ULLZ: University of Louisiana at Lafayette Zoological Collection. MNHN: Muséum National d'Histoire Naturelle, Paris. *Sequências inéditas. GenBank Espécie Localidade Coleção Coleta COI 16S Flórida, Estados Unidos UF 08363 13/VI/2004 FJ620372 - Flórida, Estados Unidos UF 08364 - FJ620318 - Flórida, Estados Unidos UF 08364 - KT897517* - Flórida, Estados Unidos UF 13237 04/III/2008 KT897583* - Flórida, Estados Unidos UF 08366 - KT897577* KT897509*

KT897578* -

Flórida Keys, Estados Unidos UF 08363 13/VI/2004 KT897566* -

C. tibicen Flórida Keys, Estados Unidos UF 14983 04/III/2005 KT897567* - Flórida Keys, Estados Unidos UF 14957 15/V/2003 KT897568* -

KT897569* -

Flórida Keys, Estados Unidos UF 7060 06/IV/2004 KT897579* KT897507* Cancun, México CCDB 1148 30/VII/2003 KT897533* KT897497*

KT897580* -

Cozumel, México CCDB 1152 01/VIII/2003 KT897534* -

Cozumel, México CCDB 3021 27/X/2010 KT897545* -

KT897581* -

Belize ULLZ 15408 02/V/2014 KT897561* -

KT897562* -

Belize ULLZ 15445 05/V/2014 KT897563* -

Honduras ULLZ 14753 14/XII/2012 KT897558* KT897504*

KT897559* -

Manzanello, Costa Rica CCDB 2937 22/V/2010 KT897529* - Puerto Vargas, Costa Rica CCDB 1033 14/II/2009 KT897539* KT897498*

St. Ann, Jamaica CCDB 5749 24/IX/2013 KT897584* KT897511*

KT897585* -

KT897586* -

St. Ann, Jamaica CCDB 5750 26/V/2015 KT897588* -

St. Ann, Jamaica CCDB 5890 23/IX/2013 KT897587* -

Tobago UF 08358 03/II/2005 FJ620319 -

MANDAI, S.S. (2015) Material e Métodos

TABELA 1: Continua. GenBank Espécie Localidade Coleção Coleta COI 16S Bacolet Bay, Trinidad & Tobago UF 11266 02/II/2005 KT897573* KT897508* KT897574* -

Canoe Bay, Trinidad & Tobago UF 14985 03/II/2005 KT897575* -

KT897576* -

Bocas del Toro, Panamá CCDB 3533 05/VIII/2011 KT897525* - C. tibicen Bocas del Toro, Panamá CCDB 2557 17/II/2009 KT897535* - KT897546* -

Panamá ULLZ 13425 05/VIII/2011 KT897556* KT897503* Panamá ULLZ 13444 06/VIII/2011 KT897557* -

Muelle de la Guardia, Venezuela CCDB 1821 KT897536* - 28/VIII/2006 KT897547* - Island Margarita, Venezuela CCDB 1812 27/VIII/2006 KT897550* -

Isla Larga, Venezuela CCDB 5891 19/II/2010 KT897565* - Isla Larga, Venezuela CCDB 5892 26/III/2011 KT897564* KT897506*

Praia Meireles, CE CCDB 2653 22/V/2008 KT897542* - Praia do Pacheco, CE CCDB 4500 12/II/2013 KT897548* KT897501*

KT897551* - Serrambilpojuca, PE CCDB 4463 26/XII/2012 KT897543* KT897500*

Tamandaré, PE CCDB 2925 04/VI/2010 KT897549* -

Recife, PE CCDB 5327 17/IV/2014 KT897571* -

KT897572* -

Recife, PE CCDB 5328 17/IV/2014 KT897552* - KT897570* -

Maragogi, AL CCDB 4919 05/X/2013 KT897526* KT897492* KT897540* -

Maragogi, AL CCDB 2717 08/I/2005 KT897537* - Ilhéus, BA CCDB 3032 06/XI/2010 KT897538* -

Salvador, BA CCDB 4136 18/XII/2003 KT897541* KT897499* Madre de Deus, BA CCDB 3693 28/IV/2006 KT897518* -

Guarapari, ES CCDB 1756 03/III/2006 KT897530* -

Guarapari, ES CCDB 2254 04/XI/2006 KT897519* - Iriri, ES CCDB 4063 20/VI/2012 KT897531* KT897495*

Ilha Anchieta, SP CCDB 0576 X/1999 KT8975231* - Ilha Anchieta, SP CCDB 3165 II/1999 KT897528* KT897494* Ilha Anchieta, SP CCDB 1466 1998 KT897544* - Ilha das Couves, SP CCDB 5341 19/X/2012 KT897582* KT897510* Ilha da Vitória, SP CCDB 5287 20/X/2012 KT897553* KT897502* KT897554* - KT897555* - Ubatuba, SP CCDB 0331 18/XI/2002 KT897520* - Ubatuba, SP CCDB 0778 15/X/2001 KT897522* -

MANDAI, S.S. (2015) Material e Métodos

TABELA 1: Conclusão. GenBank Espécie Localidade Coleção Coleta COI 16S Ubatuba, SP CCDB 0769 15/X/2001 KT897527* KT897493* C. tibicen Bombinhas, SC CCDB 1884 20/IV/2007 KT897521* KT897496* KT897524* -

KT897532 - C. californiensis Troncones Guerrero, México CCDB 5629 XI/2014 KT897591* KT897514* C. explorator Ilha de Clipperton MNHN pg.7617 - FJ620320 FJ620222 C. laevimanus Mascarene, França UF 5426 17/II/2004 FJ620271 FJ620175 C. obscurus Punta Morales, Costa Rica CCDB 1710 15/IX/2005 KT897589* KT897512* C. tubularis Grécia CCDB 0747 04/IX/2002 KT897590* KT897513*

MANDAI, S.S. (2015) Material e Métodos

2.1 Extração de DNA

O tecido muscular foi retirado das articulações das quelas esquerdas e em alguns casos dos quartos pereiópodos e, então, colocado em uma solução de 600μL do tampão

Lysis Buffer. Esse tampão auxilia na lise das membranas celulares, bem como na manutenção do pH e evitando a possível ativação de endonucleases (SCORSATO &

TELLES, 2011). A esse material foi adicionado 200μL de Proteinase K (500μg/ml), com a finalidade de levar à ruptura das membranas plasmáticas, permitindo assim, a liberação dos componentes nucleares intracelulares. Em seguida, essa solução foi incubada em banho seco por 24 horas a 55ºC com eventuais homogeneizações da solução.

No segundo dia, procedeu-se à inativação da Proteinase K por incubação em gelo durante 10 minutos. Ao material sobrenadante dessa fase foi adicionada uma solução de 200μL de acetato de amônio (7,5M) como método de salting-out, o qual separa os ácidos nucléicos de outros componentes das células, como proteínas e lipídeos, por questão de solubilidade. Então, as amostras foram centrifugadas a 14000 rpm, a 18ºC por 10 minutos. Com a finalidade de decantar o DNA e então separá-lo, a solução sobrenadante foi acrescida a 600μL de Isopropanol resfriado.

Em seguida, a solução foi centrifugada nas mesmas condições da anterior e posteriormente incubada a -20°C, por no mínimo 48h. Após overnight, o material foi centrifugado por 10 minutos a 18ºC e 14000 rpm. Então, 20μL de etanol 70% foram acrescentados ao pellet formado, o qual foi centrifugado (mesmas condições da anterior), liofilizado a 60ºC durante 5 minutos no Concentrator 5301 Eppendorf®, e finalmente ressuspendido em 20μL de tampão TE. Este último é composto por hidroximetilaminometano-HCl (10mM) e EDTA (1mM), com pH 8,0.

MANDAI, S.S. (2015) Material e Métodos

Utilizando-se o espectrofotômetro Thermo NanoDrop 2000®, mediu-se a concentração de DNA e, de acordo com os valores obtidos, realizou-se a amplificação dos genes de interesse por meio da técnica Polymerase Chain Reaction - PCR (Karry

Mullis, 1983) (SAMBROOK et al., 1989). Para o gene COI, as diluições foram feitas para que a concentração final fosse de 50ng/μL, enquanto para os primers 16SH2,

16SL2, 16SH9 e 16SL9 foi de 60ng/μL. Além disso, esse espectrofotômetro permite avaliar o grau de pureza do DNA, sendo que valores mais próximos de 1,8 nas escalas

260/280 indicam maior pureza do material.

2.2 Amplificação do DNA - PCR

Com os valores das concentrações, foi realizada a amplificação de fragmentos dos genes mitocondriais 16S e COI (Fig. 3). A reação para a amplificação do DNA continha água ultrapura, tampão de PCR, MgCl2 (25mM), betaína (5M), DNTPs

(10mM), primers (10μM para os primers do gene 16S, e 20µM para os do COI), enzima

Thermus aquaticus (Taq) DNA polimerase (5U/μL) e quantidades previamente calculadas do DNA extraído, totalizando 25 μL por amostra.

Para a amplificação das regiões de interesse do DNA foram utilizados os primers COH6 e COL6b para o gene COI, enquanto para o gene 16S, foram empregados os primers 16SL2 e 16SH2 para os exemplares do Brasil, e 16SH9 e

16SL9, para os do Atlântico Norte (Consultar a Tabela 2 para as sequências nucleotídicas). Os primers (=iniciadores) permitem a amplificação das amostras de

DNA ligando-se a partes específicas do DNA e permitindo que a enzima Taq DNA

Polimerase complemente a fita molde (WATSON, et al., 1997). O uso de diferentes primers para o gene 16S ocorreu por causa da não amplificação pelo uso de apenas um deles.

MANDAI, S.S. (2015) Material e Métodos

TABELA 2: Sequências dos primers utilizados durante a fase de anelamento da amplificação dos genes de interesse, por meio da técnica da PCR.

Gene Primers Sequências nucleotídicas Referência COH6 5’-TADACTTCDGGRTGDCCAAARAAYCA-3’ SCHUBART & HUBER, COI COL6b 5’-11 ACAAATCATAAAGATATYGG-3’ 2006 16SH2 5’-AGATAGAAACCAACCTGG-3’ SCHUBART et al., 2000 16SL2 5’-TGCCTGTTTATCAAAAACAT-3’ 16S 16SH9 5’-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3’ PALUMBI & BENZIE, 16SL9 5’-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3’ 1991

Essa amplificação foi realizada no termociclador Veriti 96 Well Thermal Cycler

da Applied Biosystems®, com adequação dos ciclos termais de acordo com os

marcadores utilizados. No caso do COI: desnaturação inicial de 94°C, por 2 minutos,

seguida de 35 ciclos de desnaturação, anelamento dos primers e extensão,

respectivamente (94°C por 30 segundos; 50°C por 30 segundos e 72°C por 1 minuto) e

extensão final por 2 min a 72°C (Fig. 3). Para o gene 16S tem-se: desnaturação inicial

de 95°C, por 5 minutos, seguida de 40 ciclos de desnaturação, anelamento dos primers e

extensão, nessa ordem (95°C por 45 segundos; 48°C por 45 segundos e 72°C por 1

minuto), e extensão final por 3 minutos a 72°C.

MANDAI, S.S. (2015) Material e Métodos

FIGURA 3: Representação de um ciclo da Polimerase Chain Reaction (PCR) para os primers COH6 e COL6b do gene Citocromo Oxidase I. Modificado de Otto Heringer e Viviane Siratuti. Disponível em: .

Os resultados das amplificações foram observados pela técnica de eletroforese com gel de agarose 1% e posteriormente fotografados na câmera C-7070 da Olympus, através de um transiluminador (UV Transilluminator M20 da UVP®), utilizando os marcadores GelRed e Loading (Fig. 4).

FIGURA 4: Imagem de gel de eletroforese da PCR, indicando bandas. Cada banda indica que a amplificação do material genético foi bem sucedida. O primeiro poço indica o marcador de peso molecular, enquanto o último é o controle negativo (=Branco), indicando que não houve contaminação do coquetel de reagentes sem DNA.

MANDAI, S.S. (2015) Material e Métodos

2.3 Purificação dos produtos da PCR e reações de sequenciamento

Após a PCR, os produtos foram purificados com o uso de 20μL do kit de purificação SureClean®, passando por etapas de incubação à temperatura ambiente, agitação em vórtex, centrifugação a 14000 rcf, adição de etanol 70%, remoção de sobrenadante e secagem no Concentrator 5301 Eppendorf®. Em seguida, os pellets secos foram ressuspendidos em 42µL de água ultrapura e deixados em banho seco a

65°C durante 40 minutos. Por fim, a concentração de DNA foi mais uma vez quantificada no Thermo NanoDrop 2000®, e então, o material foi enviado para o Centro de Recursos Biológicos e Biologia Genômica (CREBIO) do Departamento de

Tecnologia da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV) de Jaboticabal, da

Universidade Estadual Paulista (UNESP), onde as reações de PCR de sequenciamento, purificação e sequenciamento ocorreram.

2.4 Amplificação dos produtos da PCR

A amplificação do DNA por meio da PCR de sequenciamento foi realizada por meio de uma reação em um volume total de 10 µL contendo quantidades previamente calculadas do produto de PCR purificado que totalize 50ng, 3µL de tampão de sequenciamento (Save money 2,5X), 1µL de BigDye® Terminator Cycle Sequencing versão 3.1 (Applied Biosystems), quantidade previamente calculada do primer que totalize 10 pM e quantidade de água bidestilada estéril que complete 10µL.

A PCR de sequenciamento ocorreu com desnaturação inicial a 96°C durante 1 minuto, seguida de 39 ciclos. Cada ciclo consiste em uma desnaturação a 96°C, por 15 segundos, um anelamento dos primers a 48 ou 50°C (depende do primer) por 15 segundos, e uma etapa de polimerização a 60°C por 4 minutos. Após esses ciclos, as amostras foram mantidas a 4°C.

MANDAI, S.S. (2015) Material e Métodos

2.5 Precipitação e sequenciamento do DNA

A precipitação dos produtos da PCR de sequenciamento envolveu adição de

80µL de Isopropanol 75% a cada reação, seguida de leve agitação no vórtex e incubação

à temperatura ambiente durante 15 minutos. As amostras foram centrifugadas a 3040G, em centrífuga de placas Rotanta 46R (Hettich) com rotor para microplacas por 30 minutos a 20°C. Após precipitação do DNA, o sobrenadante foi descartado e as amostras foram lavadas com 200µL de etanol 70% duas vezes. Então, houve centrifugação a 3040G por 10 minutos a 20°C, na mesma centrífuga Rotanta 46R. As amostras foram secas a vácuo, ressuspendidas em 10µL de formamida e desnaturadas por 5 min a 95°C. Por fim, as amostras foram submetidas ao sequenciamento no sequenciador automático ABI 3730 XL DNA Analyzer (Applied Biosystems, Foster

City, California), conforme recomendações sugeridas pelo fabricante.

2.6 Edição das sequências

As sequências obtidas foram confirmadas por meio do sequenciamento de ambas as fitas e obtenção de uma sequência consenso e alinhamento por meio do programa

BioEdit 7.0.9.0 (HALL, 1999), de acordo com parâmetros predefinidos no programa

Clustal W (THOMPSON et al., 1994). As regiões dos primers e regiões não legíveis das sequências foram excluídas. Os fragmentos obtidos foram então submetidos ao sistema

Basic Local Alignment Search Tool (BLASTn) do National Center for Biotechnology

Information (NCBI) com a finalidade de confirmar suas respectivas identidades, em comparação com o banco de dados de sequências nucleotídicas da mesma plataforma

(http://blast.ncbi.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi).

MANDAI, S.S. (2015) Material e Métodos

3. Análise dos dados moleculares:

Com a finalidade de se avaliar a variabilidade intraespecífica entre indivíduos de

Calcinus tibicen oriundos de diferentes localidades, bem como a relação entre os indivíduos provenientes das diferentes regiões, foram realizadas análises filogenéticas, de distância genética e de variação genética. Para tanto, as sequências parciais dos genes de interesse foram alinhadas pelo método Clustal W no programa BioEdit 7.0.9.0. Ao final das análises moleculares, as sequências parciais dos genes COI e 16S foram depositadas no banco de dados GenBank da plataforma online do NCBI

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Os números de acesso para cada uma delas estão na Tabela 1.

Para as análises filogenéticas e de distância genética, algumas espécies congêneres foram adicionadas, tais como Calcinus californiensis Bouvier, 1898,

Calcinus explorator Boone, 1930, Calcinus laevimanus (Randall, 1840), Calcinus obscurus Stimpson, 1859 e Calcinus tubularis (Linnaeus, 1767), cujas informações e números de acesso no Genbank estão listadas na Tabela 1. Para enraizamento das topologias e para as análises de distância genética, algumas espécies pertencentes à infraordem Anomura foram adicionadas às análises: Clibanarius sclopetarius (Herbst,

1796) (acesso Genbank - COI: JN671584; 16S: JN671523), Dardanus insignis

(Saussure, 1858) (acesso Genbank - COI: KT897593; 16S: KT897516), Pagurus pseudosculptimanus Muñoz, Cuesta & Raso, 2014 (acesso Genbank - COI: KF962983;

16S: KF962987), Petrochirus diogenes (Linnaeus, 1758) (acesso Genbank - COI:

KT897592; 16S: KT897515) e Pachycheles monilifer (Dana, 1852) (acesso Genbank -

COI: KC858108; 16S: KC858095).

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3.1 Análises de variabilidade genética

Para a análise dos haplótipos e diferenciação genética, foram seguido os mesmos métodos de VERGAMINI et al. (2011). O número de haplótipos, bem como o índice de diversidade haplotípica foram calculados no programa DnaSP 4.10.9 (ROZAS &

ROZAS, 1999). O método Median-Joining do programa Network (BANDELT et al.,

1999) foi empregado para a construção de redes de haplótipos, com preparação dos dados no programa DnaSP.

Com a finalidade de se avaliar a diferenciação genética e calcular os índices de fixação (FCT, FSC, FST), uma Análise de Variância Molecular (AMOVA) foi realizada, considerando a variação em cada sítio nucleotídico separadamente, no programa Arlequin (EXCOFFIER et al., 1992), também com o intuito se quantificar a porcentagem de variação entre os grupos, entre as localidades do mesmo grupo e entre os exemplares da mesma localidade. Contudo, essa análise foi realizada apenas com o gene COI, visto que a presença de mais de um indivíduo por localidade é um dos requisitos para o programa.

A partir das redes de haplótipos e da Análise de Variância Molecular

(AMOVA), foi possível analisar respectivamente, quais haplótipos são ou não compartilhados e qual a porcentagem de variação. Além do mais, foi verificado o número de substituições por localidade e quantas delas são transições e transversões.

3.2 Teste de neutralidade

A teoria neutralista ou neutralismo da evolução molecular propõe que grande parte da variação genética nas populações é resultado dos fatores evolutivos, mutação e deriva genética e não de seleção natural (DURET, 2008). Além disso, sugere que os polimorfismos de uma população apresentam fitness muito semelhante (DURET, 2008).

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Dessa maneira, a fim de buscar desvios em relação à neutralidade, foram realizados testes (Tajima’s D e Fu’s) no programa Arlequin, no qual se estabelece uma hipótese nula de neutralidade e uma alternativa, em que os valores observados são significativamente diferentes daqueles esperados pelo modelo de Wright-Fisher

(HOLLANDA-CARVALHO, 2011). Quando desvios, acompanhados de valores de p significativos, são observados, indicam seleção (seleção balanceadora ou efeito carona) ou mudanças na estrutura populacional (expansão, retração ou efeito-gargalo), dependendo se o valor de D ou FS é positivo ou negativo (HOLLANDA-CARVALHO,

2011).

3.3 Distância genética

As matrizes de divergência genética foram calculadas no programa MEGA 6, por meio do modelo de substituição Kimura 2-parâmetros (KIMURA, 1980). Dessa forma, foi possível avaliar a variação intra e interespecífica (com os mesmos grupos externos que da análise anterior). Após a obtenção das distâncias genéticas dos pares, foram construídas, no programa Microsoft Excel 2010, matrizes de distância genética entre os pares de localidades, bem como histogramas representando as frequências de pares de localidades por intervalo de distância genética.

Do mesmo modo, foram avaliadas as porcentagens de distância genética, para o gene COI, entre os indivíduos das ilhas costeiras do estado de São Paulo (Ilha Anchieta,

Ilha das Couves e Ilha da Vitória) e dos exemplares de regiões costeiras para a mesma região. Essa separação foi realizada, a fim de inferir o fluxo gênico entre essas áreas e também porque os fatores evolutivos sobre os espécimes de ilhas podem ser diferentes daqueles de regiões continentais, podendo acarretar alterações significativas entre eles

(STUESSY et al., 2014; FURLAN, et al., 2012).

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Além disso, foi observado que alguns exemplares do Brasil (PE) apresentavam uma diferença de coloração, especialmente na região das quelas, sendo uma mais esverdeada e outra mais alaranjada (Fig. 5). Como a coloração tem se configurado como um critério taxonômico importante para o gênero (MALAY & PAULAY, 2009), apesar de ser um parâmetro dificultoso, pois necessita de materiais frescos, também foi construída uma matriz de distância genética com o intuito de verificar se existem diferenças significativas entre eles, ou se isso é apenas uma alteração consequente de fatores ecológicos (e.g. alimentação).

FIGURA 5: Exemplares de Calcinus tibicen de uma mesma localidade (Brasil - Pernambuco), evidenciando diferenças de coloração nas quelas. A: macho, CCDB 5328. B: macho, CCDB 5327. Barras de escala equivalentes a 10 mm (A) e 11 mm (B).

3.4 Análises filogenéticas

O objetivo central da inferência filogenética versa a obtenção de uma estrutura que represente a história evolutiva de um cluster de organismos, utilizando para tanto, dados descritos e comparáveis entre esses indivíduos (ZWICKL, 2006). Por muitos anos, apenas os dados morfológicos foram usados, sendo que mais recentemente, dados 31

MANDAI, S.S. (2015) Material e Métodos sobre sequências de DNA também têm sido empregados, principalmente pela facilidade e rapidez com que muitos caracteres podem ser avaliados e testados estatisticamente

(ZWICKL, 2006).

Um dos métodos que passaram a ser usados nesse campo foi o de Máxima

Verossimilhança (=Maximum likelihood method), o qual se propõe a identificar as topologias altamente prováveis de demonstrar essa história evolutiva (ZWICKL, 2006).

Esse método analisa cada posição nucleotídica do alinhamento e então, avalia todas as

árvores filogenéticas possíveis, bem como a probabilidade de cada uma (CAICEDO &

ROMERO-CAMPERO, 2012). Com esses valores, a árvore mais provável, é escolhida

(ZWICKL, 2006).

Uma vez construída a árvore, é necessário avaliar seu nível de robustez, ou seja, o quanto os ramos da árvore são suportados estatisticamente (EFRON et al., 1996).

Para tanto, um dos métodos mais amplamente usados (e.g. OCAMPO et al., 2013) é o proposto por FELSENSTEIN (1985), o de bootstrap, uma técnica computacional muito

útil em problemas de estimação não paramétrica (EFRON et al., 1996), por consecutivas trocas e observação do número de repetições para determinado resultado

(CAICEDO & ROMERO-CAMPERO, 2012). Para cada ramo é calculada uma porcentagem de ocorrências de acordo com as árvores construídas, sendo também um critério para a escolha da árvore mais provável (CAICEDO & ROMERO-CAMPERO,

2012).

Dessa forma, com o intuito de se verificar a relação entre os indivíduos provenientes de diferentes localidades, foram feitas análises filogenéticas, utilizando-se o método de busca Maximum Likelihood (FELSENSTEIN, 1973; 1981), por meio da ferramenta RAxML - HPC Black Box 7.2.7 (Randomized Axelerated Maximum

Likelihood) (STAMATAKIS, 2006), implementada no sistema online CIPRES

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(Cyberinfrastructure for Phylogenetic Research) (http://www.phylo.org). Foi utilizado o modelo de substituição GTR+Γ+I - General Time Reversible (TAVARÉ, 1986) + Gama

+ sítios invariáveis-, especificado pelo RAxML e a consistência das topologias foi avaliada pelo método de rapidbootstrap (STAMATAKIS et al., 2008). As topologias foram visualizadas e editadas no programa MEGA 6.

3.5 Datação Molecular

Foi realizada uma análise de datação molecular, utilizando-se apenas dados obtidos para o gene COI, a fim de se avaliar o tempo de divergência entre os clados da espécie Calcinus tibicen. Para isso, foi utilizado um relógio molecular estrito, por meio de análises bayesianas, no programa Mr. Bayes v3.2.2 (RONQUIST et al., 2012). O modelo de substituição de nucleotídeos utilizado foi TrN+I+G, selecionado pelo

Critério de Informação Bayesiano (BIC), no software jModelTest v2.1.4 (DARRIBA et al., 2012). A análise foi feita com 5x106 gerações e a calibração do relógio foi realizada utilizando-se o fóssil Calcinus agnoensis Beschin et al., 2005, com datação de, aproximadamente, 44,6Ma (BRACKEN-GRISSOM et al., 2013). A topologia final foi visualizada e editada no software FigTree v1.4.0.

4. Obtenção e análise dos dados morfológicos

De acordo com os caracteres utilizados na taxonomia do gênero Calcinus, bem como em diagnoses e descrições, foram selecionados alguns caracteres de maior variabilidade nesse grupo e os mais utilizados como diagnose para Calcinus tibicen

(Fig. 6). Esses caracteres estão organizados na Tabela 3 e foram usados nas comparações entre os 98 indivíduos. Todas as observações foram feitas utilizando o estereomicroscópio M205 C LEICA® provido de câmara clara.

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FIGURA 6: Continua. Morfologia externa de um ermitão de Calcinus tibicen. A: Modificado de MELO, 1999; B: Modificado de MCLAUGHLIN, 2003.

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FIGURA 6: Conclusão. C- Representação do terceiro maxilípede do aparelho bucal; modificado de LEMAITRE & WATABE, 2005. D- Modificado de OLGUÍN, 2012.

TABELA 3: Lista de caracteres escolhidos para a realização das análises morfológicas dos espécimes de Calcinus tibicen ao longo do Atlântico Ocidental.

Caracter Característica Analisada Escudo cefalotorácico Formato e ornamentação Rostro Formato Acículo ocular Formato e número de espinhos Antena Número de segmentos Antênula Disposição e número de segmentos Acículo antenal Disposição e número dos espinhos Terceiro maxilípede Disposição e número de segmentos Quelípodo direito Número de tufos de cerdas Segundo e terceiro pares de pereiópodos Número e disposição dos espinhos e tufos de cerdas Télson Formato dos lobos Urópodos Formato e ornamentação

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5. Obtenção e análise dos dados morfométricos

Para este estudo, algumas medidas foram obtidas a fim de se verificar a existência ou não de diferença intraespecífica significativa. Os valores foram obtidos utilizando-se um paquímetro digital STARRETT® 727 (0,01mm). Para tanto, foram medidos 98 exemplares, sendo que a maioria deles também foi utilizada para as análises moleculares. Ao todo foram medidas 13 estruturas para cada indivíduo (Fig. 7): comprimento do escudo cefalotorácico (CE), largura do escudo cefalotorácico (LE), largura da fronte (LF), comprimento do pedúnculo ocular (CPO), largura do pedúnculo ocular (LPO), comprimento da diagonal da quela direita (CQ), largura da quela direita

(LQ), comprimento do penéultimo e último segmentos do abdômen juntos (CT), largura do penúltimo segmento do abdômen (LT) e comprimentos dos segmentos do terceiro pereiópodo direito [dáctilo (DA), própodo (PR), carpo (CAR), mero (ME) e ísquio

(ISQ)]. Foi feita uma separação entre machos e fêmeas, devido a possíveis dimorfismos sexuais, sendo que os primeiros foram caracterizados pela presença de gonóporo na coxa dos quintos pereiópodos, enquanto as fêmeas os apresentavam na coxa dos terceiros pereiópodos.

Inicialmente, os valores das medidas foram logaritmizados utilizando o logaritmo natural “ln”, cuja base é o número irracional de Euler. Foi feita uma separação entre os machos e as fêmeas do grupo Atlântico Norte e do Brasil e então, foram separados em quatro grupos, com as seguintes composições (Tabela 4):

TABELA 4: Constituição de cada grupo para as análises morfométricas de Calcinus tibicen, em relação ao sexo e à localização geográfica, e os respectivos números amostrais por grupo (N).

Grupo Sexo Localização N 1 Fêmea Atlântico Norte 12 2 Macho Atlântico Norte 22 3 Fêmea Brasil 20 4 Macho Brasil 44

MANDAI, S.S. (2015) Material e Métodos

Em seguida, foram construídos gráficos de dispersão para cada agrupamento de medidas em cada grupo mencionado acima, sendo que para cada um, uma linha de tendência e uma equação da reta eram obtidas. Todas as medidas foram padronizadas de acordo com a equação alométrica a seguir, com o intuito de remover os efeitos do crescimento alométrico e tamanho de espécimes de diferentes idades. Assim, reduz-se o efeito das variações da variável independente (comprimento do escudo cefelotorácico) em relação às variáveis dependentes (todas as outras medidas apresentadas anteriormente), sendo Yi* o valor padronizado pela equação alométrica; Yi, a medida logaritmizada da característica a ser padronizada; “x-barra”, a média das medidas logaritmizadas para a medida do escudo cefalotorácico de cada grupo; Xi, a medida logaritmizada da mesma estrutura mencionada anteriormente; e b, a constante que acompanhava a variável x nos gráficos construídos para a mesma variável dependente

(TZENG, 2004).

Posteriormente, no programa Statistica foi realizada uma Análise Discriminante a fim de buscar evidências da existência de diferenças morfométricas entre os indivíduos do Atlântico Norte e do Brasil, como também determinar quais estruturas foram mais relevantes nessa divisão (se existente). O poder de discriminação de cada variável dependente foi analisado pelos índices Wilks’lambda associados aos valores estatísticos de F e P. Os valores mais próximos de zero indicam alta discriminação, por outro lado, aqueles perto de 1 apontam baixo poder discriminante.

Além disso, foi feito um teste do Chi-quadrado para avaliar as variáveis canônicas (“Roots”) com o objetivo de evidenciar graficamente a plotagem dos pontos

MANDAI, S.S. (2015) Material e Métodos das medidas dos grupos. Todos procedimentos estatísticos seguiram premissas propostas em TZENG (2004).

MANDAI, S.S. (2015) Material e Métodos

FIGURA 7: Representações das estruturas medidas. A e B: Modificados de MELO, 1999; C: Modificado de OLGUÍN, 2012. CE: comprimento do escudo cefalotorácico, LE: largura do escudo cefalotorácico, LF: largura da fronte, CPO: comprimento do pedúnculo ocular, LPO: largura do pedúnculo ocular, CQ: comprimento da diagonal da quela direita, LQ: largura da quela direita, CT: comprimento do penúltimo e último segmentos do abdômen juntos, LT: largura do penúltimo segmento do abdômen, DA: comprimento do dáctilo, PR: comprimento do própodo, CAR: comprimento do carpo, ME: mero, e ISQ: comprimento do ísquio.

MANDAI, S.S. (2015) Resultados

1. Dados Moleculares

Para as análises moleculares, os espécimes foram reunidos em diferentes localidades.

No Brasil, os indivíduos foram agrupados em seus respectivos estados. Já no caso do

Atlântico Norte, cada localidade apresenta o nome de seu respectivo país (Tabela 1).

1.1 Variabilidade molecular

A partir de 75 sequências parciais do gene mitocondrial COI com 608 pares de bases cada, de 75 espécimes procedentes de 20 localidades, foram definidos 46 haplótipos, sendo 40 deles individuais. A diversidade haplotípica calculada pelo programa DNAsp foi de 95,35%, fato corroborado pelo grande número de haplótipos individuais. Além do mais, foram encontrados 83 sítios variantes. O haplótipo mais frequente foi o H1, sendo compartilhado por

12 indivíduos de 7 localidades brasileiras diferentes. Para este gene, a média de bases nitrogenadas observadas nas sequências foi de: A = 36,68%, T = 24,01%, C = 22,70% e G =

16,61%.

Em relação ao gene 16S, foram definidos 6 haplótipos, sendo 4 deles individuais a partir de 20 sequências parciais de 518 pares de bases de 20 localidades diferentes. A diversidade haplotípica foi de 70% com 19 sítios variantes. O haplótipo com mais indivíduos foi o H1, sendo compartilhado por 11 espécimes de 9 localidades distintas. Para este gene, as médias de bases nitrogenadas observadas nas sequências foram de: A = 32,24%, T = 34,75%,

C = 18,15% e G = 14,86%.

Ambas as redes de haplótipos (Fig. 8), construídas pelo método de Median-Joining, apresentaram uma estruturação genética em dois grupos, sendo um representado pelos indivíduos pertencentes ao Brasil (indicados pelos estados do CE, PE, AL, BA, ES, SP, e SC) e outro por exemplares oriundos do Atlântico Norte (representados pelos Estados Unidos,

México, Belize, Honduras, Costa Rica, Jamaica, Trinidad & Tobago, Panamá e Venezuela).

MANDAI, S.S. (2015) Resultados

FIGURA 8: Continua. Calcinus tibicen (COI). Redes de haplótipos construídas pelo método Median- Joining, indicando a distribuição dos 46 haplótipos (H) identificados para o gene COI, e 6 para o 16S. O tamanho dos círculos é proporcional à frequência do haplótipo. Os traçados em preto indicam passos mutacionais individuais. A estrela em rosa indica a presença de 44 passos mutacionais, enquanto a azul aponta 13. Os triângulos em vermelho indicam os vetores médios, representando haplótipos que a análise supõe existir, mas que ainda não foram amostrados. Para consultar as localidades correspondentes, verificar a Tabela 1.

MANDAI, S.S. (2015) Resultados

FIGURA 8: Conclusão. Calcinus tibicen (16S).

MANDAI, S.S. (2015) Resultados

Em relação ao gene COI, o grupo do Brasil é constituído por 31 espécimes, apresentando 28 haplótipos. Já o grupamento Atlântico Norte é formado por 44 indivíduos distribuídos em 18 haplótipos, sendo que cada haplótipo é o conjunto de variantes genéticas normalmente relacionadas a polimorfismos de um nucleotídeo único, em um cromossomo

(SENE, 2009). Assim, a presença de um único nucleotídeo diferente é capaz de gerar um haplótipo diferente nas análises. Por outro lado, para o gene 16S são observados 10 espécimes em 2 haplótipos para o grupo do Brasil, e 10 indivíduos em 4 haplótipos para o Atlântico

Norte.

Os haplótipos brasileiros e do Atlântico Norte encontram-se, no máximo, a 3 e a 2 passos mutacionais distantes uns dos outros para os genes COI e 16S, respectivamente. Não há compartilhamento de haplótipos entre os indivíduos desses dois grupos em ambos os casos.

Um total de 44 passos mutacionais separam os haplótipos do Brasil e do Atlântico Norte para o gene COI, e para o gene 16S, a separação foi por 13 mutações. Este fato pode ser explicado por este gene ser mais conservado que o COI.

Com base nesses resultados das redes de haplótipos indicando dois grupos genéticos principais, foi realizada a Análise de Variância Molecular (AMOVA) O que se observou, foi que a maior parte de toda variação genética encontrada pelo programa ocorre entre os dois grupos (93,93%), sendo que outros 5,98% da variação está entre os indivíduos de cada localidade. Ainda, apenas 0,08% da variação ocorre entre as localidades de cada grupo, com

índice de significância FST de p<0,001.

Para esses resultados, os índices de fixação utilizando estatística F para todos os loci do gene COI foram de: FSC: 0.1356, FST: 0.94026, e FCT: 0.93934, sendo essas taxas respectivamente, entre as localidades de um grupo, entre todas as localidades e entre os grupos.

Nessas análises foram verificados os número de substituições, sendo que a maioria foi considerada como transições (Tabela 5), ou seja, substituições únicas envolvendo

MANDAI, S.S. (2015) Resultados nucleotídeos de tipos químicos iguais, isto é, a troca de uma purina (= Adenina ou Guanina) por outra purina, ou de uma pirimidina (= Citosina ou Timina) por outra pirimidina

(SNUSTAD & SIMONS, 2013) (Tabela 5).

TABELA 5: Calcinus tibicen. Quantidade e tipos de substituições encontradas nas localidades analisadas para o gene COI. FLO: Estados Unidos, Florida; KEY: Flórida Keys, Estados Unidos; MEX: México; BEL: Belize; HON: Honduras; CR: Costa Rica; JAM: Jamaica; TT: Trinidad & Tobago; PAN: Panamá; VEN: Venezuela; CE: Ceará; PE: Pernambuco; AL: Alagoas; BA: Bahia; ES: Espírito Santo; SP: São Paulo; ANC: Ilha Anchieta; COU: Ilha das Couves; VIT: Ilha da Vitória; e SC: Santa Catarina. Grupo Localidades Transições Transversões Substituições FLO 8 1 9 KEY 6 1 7 MEX 6 0 6 BEL 9 1 10 América do Norte HON 1 0 1 CR 3 0 3 JAM 7 1 8 TT 12 1 13 PAN 6 0 6 VEN 6 0 6 CE 6 0 6

PE 6 0 6 AL 3 0 3

BA 4 0 4 Brasil ES 4 0 4 SP 1 0 1 ANC 5 0 5 COU - - - VIT 1 0 1 SC 4 0 4 Média - 4,900 0,250 5,150 σ - 2,972 0,444 3,297

1.2 Teste de neutralidade

Esse teste apontou valores de Tajima’s D negativos e significativos para os indivíduos de ambos os grupos (p<0,05), indicando seleção purificadora ou expansão demográfica dos grupos (HOLLANDA CARVALHO, 2011) (Tabela 6). Do mesmo modo, a estatística Fu’s

FS sugeriu expansão demográfica recente ou efeito carona, indicando um excesso de alelos

(HOLSINGER, 2006 - 2012; OCAMPO et al., 2013) (Tabela 6).

MANDAI, S.S. (2015) Resultados

TABELA 6: Calcinus tibicen. Valores dos testes de neutralidade Tajima’s D e Fu’s FS, calculados no programa Arlequin.

Teste de neutralidade Localidades do Localidades Desvio Média Atlântico Norte do Brasil padrão TESTE TAJIMA’S D -2.12037 -2.12638 -2.12337 0.00425 p-value 0.00300 0.00500 0.00400 0.00141 TESTE FU’S FS -24.97389 -12.63316 -18.80353 8.72621 p-value 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000

1.3 Distância genética

A distância genética é a medida comumente utilizada para a diferenciação genética entre populações e espécies bem definidas. Geralmente esse valor aumenta com o nível de isolamento reprodutivo, mas essa relação pode apresentar “ruídos” (FRANKHAM et al.,

2008). Os resultados estão indicados de duas formas, matrizes de distância genética (Tabela 7) e histogramas (Fig. 9).

MANDAI, S.S. (2015) Resultados

Figura 9: Calcinus tibicen. Histogramas com as frequências de distâncias genéticas obtidas entre as localidades analisadas. As barras de A e B são, respectivamente, para o gene COI e 16S. Resultados obtidos pelo método Kimura-2 parâmetros no programa MEGA. I- variação intraespecífica dentro de cada grupo; II- variação intraespecífica entre os grupos; III- variação interespecífica em relação à Calcinus tibicen.

MANDAI, S.S. (2015) Resultados

TABELA 7: Continua. Calcinus tibicen (COI). Matrizes de distância genética (em porcentagem) para os genes mitocondriais COI e 16S, obtidas pelo método Kimura-2 parâmetros no programa MEGA. São apresentadas comparações entre todas as localidades analisadas, sendo que os valores em negrito indicam variação intraespecífica entre os grupos Atlântico Norte e Brasil. FLO: Flórida, Estados Unidos; KEY: Flórida Keys, Estados Unidos; MEX: México; BEL: Belize; HON: Honduras; CR: Costa Rica; JAM: Jamaica; TT: Trinidad & Tobago; PAN: Panamá; VEN: Venezuela; CE: Ceará; PE: Pernambuco; AL: Alagoas; BA: Bahia; ES: Espírito Santo; SP: São Paulo; ANC: Ilha Anchieta; COU: Ilha das Couves; VIT: Ilha da Vitória; e SC: Santa Catarina.

% Distância genética 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 1.FLO 0,0-1,0 2.KEY 0,0-1,0 0,2-0,9 3.MEX 0,0-1,0 0,0-0,9 0,2-0,9 4.BEL 0,0-1,2 0,0-1,2 0,0-1,2 0,5-0,9 5.HON 0,0-0,9 0,0-0,7 0,0-0,7 0,0-1,0 0,2 6.CR 0,2-0,9 0,0-0,7 0,2-0,7 0,2-1,0 0,2-0,5 0,5 7.JAM 0,2-1,0 0,0-0,9 0,2-0,9 0,2-1,2 0,2-0,5 0,0-0,7 0,3-0,7 8.TT 0,0-1,4 0,0-1,2 0,0-1,2 0,0-1,4 0,0-0,9 0,0-0,5 0,0-1,0 0,3-1,2 9.PAN 0,0-1,2 0,0-1,0 0,0-1,0 0,0-1,4 0,0-0,5 0,0-0,9 0,0-0,9 0,0-1,2 0,0-0,9 10.VEN 0,0-1,0 0,0-0,9 0,0-0,9 0,0-1,2 0,0-0,7 0,0-0,7 0,0-0,9 0,0-1,2 0,0-1,0 0,0-0,9 11.CE 8,2-9,1 8,1-9,3 8,3-9,3 8,5-9,5 8,5-9,3 8,3-9,1 8,5-9,5 8,3-9,7 8,5-9,3 8,3-9,1 0,5-0,9 12.PE 8,2-9,3 8,1-9,5 8,3-9,5 8,5-9,7 8,5-9,5 8,3-9,3 8,5-9,7 8,3-9,9 8,5-9,9 8,3-9,3 0,0-1,0 0,0-0,9 13.AL 8,2-9,1 8,1-9,3 8,3-9,3 8,5-9,5 8,5-9,3 8,3-9,1 8,5-9,5 8,3-9,7 8,5-9,7 8,3-9,1 0,0-0,9 0,0-0,7 0,2-0,5 14.BA 8,2-9,0 8,1-9,1 8,3-9,1 8,5-9,3 8,5-9,1 8,3-8,9 8,5-9,3 8,3-9,5 8,5-9,5 8,3-8,9 0,0-0,9 0,0-0,9 0,0-0,7 0,3-0,7 15.ES 8,3-9,1 8,1-9,3 8,3-9,3 8,5-9,5 8,5-8,9 8,3-9,1 8,5-9,1 8,3-9,3 8,5-9,3 8,3-9,1 0,3-0,9 0,2-0,7 0,2-0,5 0,2-0,7 0,3-0,5 16.ANC 8,2-8,9 8,1-8,9 8,3-8,9 8,5-9,1 8,5-8,9 8,3-8,7 8,5-9,1 8,3-9,3 8,5-9,3 8,3-8,7 0,0-1,6 0,0-1,4 0,0-1,2 0,0-1,4 0,3-1,2 0,2-0,9 17.COU 8,6-8,9 8,5-9,1 8,7-9,1 8,9-9,3 8,9-9,1 8,7-8,9 8,5-9,1 8,7-9,5 8,9-9,5 8,7-8,9 0,5-0,9 0,5-0,9 0,5-0,7 0,3-0,7 0,5-0,7 0,7-1,4 - 18.VIT 8,2-8,7 8,1-8,9 8,3-8,9 8,5-9,1 8,5-8,9 8,3-8,7 8,9-9,3 8,3-9,3 8,5-9,3 8,3-8,7 0,0-1,0 0,0-0,9 0,0-0,7 0,0-0,9 0,3-0,7 0,0-0,9 0,3-0,4 0,0-0,2 19.UBT 8,0-8,5 7,9-8,7 8,1-8,7 8,3-8,9 8,3-8,7 8,1-8,5 8,3-8,9 8,3-9,1 8,3-9,1 8,5-8,1 0,0-1,0 0,0-0,9 0,0-0,7 0,0-0,9 0,3-0,7 0,0-0,9 0,7-0,9 0,0-0,3 0,0-0,2 20.SC 8,2-8,5 8,1-8,7 8,3-8,7 8,5-8,9 8,5-8,7 8,3-8,5 8,5-8,9 8,3-9,1 8,5-9,1 8,3-8,5 0,0-1,2 0,0-1,0 0,0-0,9 0,0-1,0 0,0-0,9 0,0,-1,0 0,7-1,0 0,0-0,5 0,0-0,5 0,3-0,7

MANDAI, S.S. (2015) Resultados

TABELA 7: Continua. Calcinus tibicen (COI).

% Dist. genética 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 14,3- 14,1- 14,3- 14,3- 14,3- 14,5- 14,5- 14,3- 14,1- 16,5- 17,0- 17,0- 17,0- 16,7- 17,0- 17,0- 16,7- 16,7- 21.C.californiensis 14,5 17,7 14,7 14,7 14,7 15,0 14,5 15,0 15,2 14,5 14,5 17,2 17,7 17,4 17,7 17,4 17,4 17,2 17,0 17,0 13,1- 13,3- 13,5- 13,5- 13,5- 13,8- 13,8- 13,8- 13,3- 17,1- 17,1- 17,1- 17,4- 16,9- 17,4- 17,4- 17,1- 16,9- 22.C. explorator 13,8 17,4 13,8 13,8 14,0 14,2 14,2 13,8 14,0 14,0 14,2 13,8 17,4 17,6 17,6 17,8 17,6 17,8 17,6 17,4- 17,4 22,8- 22,5- 22,8- 22,8- 23,0- 22,8- 23,0- 22,5- 22,5- 23,1- 23,6- 23,3- 23,1- 23,3- 23,6- 23,6- 23,6- 23,3- 23. C. laevimanus 23,0 23,1 18,3 22,4 23,5 23,5 23,3 23,5 23,3 22,3 23,3 23,5 23,0 23,6 23,8 23,6 23,6 23,8 24,1 23,8 23,8 23,8 15,8- 15,8- 15,6- 15,8- 15,6- 15,8- 15,8- 15,6- 15,8- 16,5- 17,0- 17,0- 17,0- 17,2- 17,2- 17,0- 16,7- 24.C. obscurus 15,8 17,2 17,7 5,5 15,8 18,3 16,5 16,3 16,0 16,7 16,3 16,3 16,5 16,3 16,3 17,2 17,7 17,2 17,4 17,7 17,4 17,2 172 22,3- 22,0- 22,3- 22,5- 22,3- 22,5- 21,8- 22,5- 22,0- 19,5- 19,7- 19,7- 19,7- 20,0- 20,0- 20,0- 19,7- 25.C. tubularis 22,5 20,0 20,0 18,0 19,6 18,5 19,3 22,8 22,5 23,0 22,8 22,5 22,8 22,8 22,8 22,5 20,0 20,0 20,0 20,0 20,4 20,2 20,2 20,2 25,7- 25,7- 25,9- 26,5- 26,2- 25,9- 26,2- 25,9- 26,2- 26,5- 26,5- 26,5- 26,5- 25,5- 26,3- 26,3- 26,3- 26. C. sclopetarius 26,2 26,5 26,8 24,3 26,7 26,7 25,5 25,8 27,0 26,7 27,0 27,0 26,7 26,7 27,0 26,7 27,0 26,8 27,1 26,8 26,8 26,5 26,5 26,5 25,5 24,1- 24,1- 24,4- 24,4- 24,4- 24,6- 24,4- 24,1- 25,7- 25,4- 25,7- 25,4- 25,4- 25,7- 25,7- 25,7- 25,4- 27. D. insignis 24,6 24,6 25,9 24,0 26,0 22,2 23,0 21,3 25,7 25,1 25,1 24,9 24,9 24,6 24,9 25,1 24,6 25,9 26,2 26,2 25,9 26,2 25,9 25,9 25,9 25,7 22,9- 23,2- 23,4- 23,4- 23,7- 23,4- 22,7- 23,7- 23,2- 24,8- 25,3- 25,3- 24,8- 25,3- 25,5- 25,5- 25,3- 28.P.pseudosculptimanus 23,7 25,5 25,3 23,8 24,1 22,5 23,6 20,6 20,0 19,4 23,9 23,7 23,9 23,9 23,9 23,9 24,2 23,9 23,7 25,5 25,8 25,5 25,5 25,5 25,8 25,8 25,5 23,8- 24,0- 23,8- 24,0- 23,8- 23,8- 23,8- 24,0- 24,0- 25,6- 25,3- 25,6- 25,1- 25,3- 25,8- 25,8- 25,8- 25,3- 29. P. diogenes 24,0 25,3 21,9 25,6 23,7 23,6 23,0 21,7 17,7 19,8 24,5 24,5 24,8 24,8 24,5 24,5 24,8 24,5 24,5 25,8 26,1 25,8 25,8 25,8 26,1 26,1 26,1 25,5 25,7- 25,7- 25,7- 25,7- 26,0- 26,0- 26,0- 25,7- 26,0- 27,8- 27,5- 27,8- 27,5- 27,8- 27,8- 27,5- 27,5- 30.P. molinifer 26,0 28,0 27,8 26,4 30,5 28,8 25,5 25,6 25,1 24,0 21,7 24,6 26,2 26,0 26,2 26,2 26,2 26,5 26,5 26,0 26,2 28,0 28,3 28,3 28,0 28,3 28,0 27,8 28,0

MANDAI, S.S. (2015) Resultados

TABELA 7: Conclusão. Calcinus tibicen (16S).

% Distância genética 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 1.FLO

2.KEY 0,5

3.MEX 0,5 0,0

4.BEL 0,5 0,0 0,0

5.HON 0,8 0,2 0,2 0,2

6.CR 0,5 0,0 0,0 0,0 0,2

7.JAM 0,5 0,0 0,0 0,0 0,2 0,0

8.TT 0,7 0,2 0,2 0,2 0,5 0,2 0,2

9.PAN 0,5 0,0 0,0 0,0 0,2 0,0 0,0 0,2

10.VEN 0,5 0,0 0,0 0,0 0,2 0,0 0,0 0,2 0,0

11.CE 2,0 1,8 1,8 1,8 2,0 1,8 1,8 2,0 1,8 1,8

12.PE 2,0 1,8 1,8 1,8 2,0 1,8 1,8 2,0 1,8 1,8 0,0

13.AL 2,0 1,8 1,8 1,8 2,0 1,8 1,8 2,0 1,8 1,8 0,0 0,0

14.BA 2,0 1,8 1,8 1,8 2,0 1,8 1,8 2,0 1,8 1,8 0,0 0,0 0,0

15.ES 2,0 1,8 1,8 1,8 2,0 1,8 1,8 2,0 1,8 1,8 0,0 0,0 0,0 0,0

16.ANC 2,0 1,8 1,8 1,8 2,0 1,8 1,8 2,0 1,8 1,8 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

17.COU 2,0 1,8 1,8 1,8 2,0 1,8 1,8 2,0 1,8 1,8 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

18.VIT 2,0 1,8 1,8 1,8 2,0 1,8 1,8 2,0 1,8 1,8 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

19.UBT 2,0 1,8 1,8 1,8 2,0 1,8 1,8 2,0 1,8 1,8 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

20.SC 2,3 2,0 2,0 2,0 2,3 2,0 2,0 2,3 2,0 2,0 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

21.C.californiensis 5,2 4,9 4,9 4,9 5,2 4,9 4,9 5,2 4,9 4,9 4,1 4,1 4,1 4,1 4,1 4,1 4,1 4,1 4,1 4,4

22.C. explorator 5,5 5,2 5,2 5,2 5,5 5,2 5,2 5,5 5,2 5,2 4,4 4,4 4,4 4,4 4,4 4,4 4,4 4,4 4,4 4,7 2,8

23.C. laevimanus 8,5 8,2 8,2 8,2 8,5 8,2 8,2 8,5 8,2 8,2 6,8 6,8 6,8 6,8 6,8 6,8 6,8 6,8 6,8 7,1 6,2 6,3

24.C. obscurus 5,7 5,5 5,5 5,5 5,7 5,5 5,5 5,7 5,5 5,5 4,7 4,7 4,7 4,7 4,7 4,7 4,7 4,7 4,7 4,9 0,5 3,3 6,8

25.C. tubularis 11,7 11,7 11,7 11,7 12,0 11,7 11,7 12,0 11,7 11,7 11,4 11,4 11,4 11,4 11,4 11,4 11,4 11,4 11,4 11,7 10,8 10,2 9,3 11,4

26,C. sclopetarius 19,7 19,4 19,4 19,4 19,7 19,4 19,4 19,7 19,4 19,4 18,7 18,7 18,7 18,7 18,7 18,7 18,7 18,7 18,7 19,1 20,4 19,7 19,0 20,4 18,3

27.D. insignis 22,5 22,2 22,2 22,2 22,5 22,2 22,2 22,5 22,2 22,2 23,3 23,3 23,3 23,3 23,3 23,3 23,3 23,3 23,3 23,6 22,5 22,9 23,7 22,5 22,9 25,5

28.P.pseudosculptimanus 26,2 26,2 26,2 26,2 26,6 26,2 26,2 25,9 26,2 26,2 26,6 26,6 26,6 26,6 26,6 26,6 26,6 26,6 26,6 27,0 27,3 28,1 28,1 27,3 26,3 27,3 27,3

29. P. diogenes 20,7 20,0 20,0 20,0 20,4 20,0 20,0 20,3 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,3 19,3 20,4 19,4 19,3 19,0 20,2 16,1 27,7 30.P. molinifer 26,8 26,4 26,4 26,4 26,1 26,4 26,4 26,8 26,4 26,4 26,8 26,8 26,8 26,8 26,8 26,8 26,8 26,8 26,8 26,5 27,9 28,7 28,1 27,9 29,2 29,4 27,7 26,2 23,6

MANDAI, S.S. (2015) Resultados

Além disso, foram calculadas as distâncias genéticas para o gene COI entre os indivíduos do estado de São Paulo de regiões costeiras e de ilhas. Entretanto, nenhuma diferença significativa foi encontrada (Tabela 8).

TABELA 8: Calcinus tibicen. Porcentagem de variação para o gene COI entre indivíduos das ilhas do estado de São Paulo e a região continental de Ubatuba (SP).

% de Variação 1 2 3 4 1. Ilha Anchieta, SP 0,2-0,8

2. Ilha da Vitória, SP 0-1,0 0-0,3

3. Ilha das Couves, SP 0,6-1,3 0,1 -

4. Ubatuba, SP 0-0,8 0-0,5 0,6-0,8 0,2- 0,3

O mesmo foi feito entre os indivíduos que apresentaram diferença de coloração

(Fig. 6) e apenas uma variação pequena foi encontrada (Tabela 9).

TABELA 9: Calcinus tibicen. Porcentagem de variação para o gene COI entre indivíduos do estado de Pernambuco com diferentes colorações nas quelas: esverdeado (claro) versus marrom- alaranjado (escuro).

% de Variação 1 2 3 4 1. Claro -

2. Claro 0,2 -

3. Escuro 0,2 0,3 -

4. Escuro 0,8 0,6 0,9 -

1.4 Análises Filogenéticas

Em relação ao gene COI, foram analisados 75 espécimes de 20 localidades diferentes (Tabela 1), sendo que, para enraizamento da topologia, foram utilizadas sequências das espécies Clibanarius sclopetarius, Dardanus insignis, Pagurus pseudosculptimanus, Petrochirus diogenes e Pachycheles molinifer. Também foram empregadas sequências de outras espécies do gênero Calcinus: Calcinus californiensis,

MANDAI, S.S. (2015) Resultados

Calcinus explorator, Calcinus laevimanus, Calcinus obscurus e Calcinus tubularis. O alinhamento final consistiu em 85 sequências de 608 pares de base cada.

Em relação ao gene 16S, 20 sequências de indivíduos de Calcinus tibicen mais sequências dos mesmos indivíduos usados nas análises para o gene COI foram empregados para enraizamento da topologia e como grupos externos. O alinhamento final consistiu em 30 sequências de 542 sítios, contando com os gaps. Somadas a essas análises, foi construída uma árvore filogenética concatenada para os dois genes mitocondriais COI e 16S.

As três topologias para os genes COI e 16S evidenciaram dois clados principais, ambos suportados por altos índices de bootstrap: um com os exemplares pertencentes a outros gêneros da infraordem Anomura (Clibanarius sclopetarius,

Dardanus insignis, Pagurus pseudosculptimanus, Petrochirus diogenes e Pachycheles molinifer), e um clado com os espécimes do gênero Calcinus. No caso deste último, observa-se que as espécies Calcinus leavimanus e Calcinus tubularis são as mais distantes de Calcinus tibicen, enquanto Calcinus californiensis, Calcinus explorator e

Calcinus obscurus permaneceram como grupos externos mais próximos de Calcinus tibicen, sendo que em ambos os casos, altos índices de bootstrap também foram obtidos. Considerando o clado formado por indivíduos de Calcinus tibicen, observou-se o agrupamento em dois grupos, um com os espécimes pertencentes ao Atlântico Norte e outro com os do Brasil, também com alta robustez.

MANDAI, S.S. (2015) Resultados

FIGURA 10: Continua. Calcinus tibicen (COI). Árvores filogenéticas para os genes COI e 16S, individuais e concatenada, obtidas pelo método de busca RAxML - HPC Blacx Box na plataforma CIPRES. Os valores apresentados correspondem aos índices de significância para 1000 réplicas de bootstrap, sendo que as porcentagens menores que 50% não estão representadas. Para consulta das localidades designadas, ver Tabela 1. A: Atlântico Norte, B: Brasil.

MANDAI, S.S. (2015) Resultados

FIGURA 10: Continua. Calcinus tibicen (16S).

MANDAI, S.S. (2015) Resultados

FIGURA 10: Conclusão. Calcinus tibicen (Análise filogenética concatenada para os genes COI e 16S).

MANDAI, S.S. (2015) Resultados

1.5 Datação molecular

Utilizando o fóssil de Calcinus agnoensis (ver BRACKEN-GRISSOM et al., 2013) como ponto de calibração, foram obtidas datações (Fig. 11). Pode-se dizer que a divergência entre os grupo do Atlântico Norte e do Brasil de Calcinus tibicen ocorreu por volta de 4,7Ma.

FIGURA 11: Calcinus tibicen. Árvore filogenética para o gene COI, obtida pelo método de inferência Bayesiana (modelo TrN+I+G), contendo um cronograma de tempo de divergência. Números nos nós correspondem ao tempo de divergência em milhões de anos e as barras correspondem ao intervalo de 95% de credibilidade. (C = calibração).

MANDAI, S.S. (2015) Discussão

2. Dados morfológicos

Foram analisadas 10 estruturas da morfologia externa (Tabela 10) de 98 indivíduos de

Calcinus tibicen. O que se observou foi uma baixa variação nas características do escudo cefalotorácico, rostro, antena, antênula, terceiro maxilípede, télson e urópodos, e uma alta variação em relação ao número de espinhos do acículo ocular, ao número de espinhos e tufos de cerdas do dáctilo dos segundo e terceiros pares de pereiópodos, e à quantia de tufos de cerdas da quela direita. Entretanto, nenhuma característica morfológica que distinguisse um grupo do outro (Atlântico Norte e Brasil), como apontada pela estruturação genética, foi observada pelas características utilizadas.

3. Dados morfométricos

Para as análises de morfometria tradicional foram realizadas medições de 98 indivíduos de Calcinus tibicen. Do total, foram observados 4 subgrupos: 12 fêmeas (G1) e 22 machos (G2) do Atlântico Norte, e 20 fêmeas (G3) e 44 machos (G4) do Brasil. O tamanho do escudo cefalotorácico (variável independente) variou de 0,92 a 2,13mm (comprimento) e de

0,75 a 2,00mm (largura).

As relações morfométricas dos 4 subgrupos analisados pelo método Wilks’ Lambda apresentaram diferenças estatísticas significativas nas variáveis dependentes largura do escudo cefalotorácico (LE), largura do pedúnculo ocular (LPO), comprimento do dáctilo do terceiro pereiópodo (DA), comprimento do mero do terceiro pereiópodo (ME) e comprimento do penúltimo e último segmentos do abdômen juntos (CT) (Tabela 10).

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TABELA 10: Calcinus tibicen. Poder discriminante de cada variável morfométrica e seu respectivo valor de significância (p-value). Os valores em negrito indicam a aceitação da hipótese alternativa de que há diferença estatisticamente significativa entre os indivíduos analisados para aquela variável. LE: largura do escudo cefalotorácico, CF: comprimento da fronte, CPO: comprimento do pedúnculo ocular, LPO: largura do pedúnculo ocular, DA: comprimento do dáctilo, PRO: comprimento do própodo, CAR: comprimento do carpo, ME: comprimento do mero, ISQ: comprimento do ísquio, CQ: comprimento da diagonal da quela, LQ: largura da quela, CT: comprimento do penúltimo e último segmentos do abdômen juntos, e LT: largura do penúltimo segmento do abdômen.

Variáveis Wilks’ Lambda F p-value LE 0.050655 8.430930 0.000060 CF 0.041294 1.821702 0.149641 CPO 0.039520 0.569217 0.636856 LPO 0.050098 8.037688 0.000093 DA 0.045750 4.967515 0.003228 PRO 0.040798 1.471396 0.228399 CAR 0.039059 0.243750 0.865553 ME 0.043827 3.610133 0.016682 ISQ 0.039442 0.513652 0.674009 CQ 0.041458 1.937137 0.130017 LQ 0.039769 0.744783 0.528452 CT 0.045791 4.996720 0.003118 LT 0.040320 1.133798 0.340349

A Análise discriminante demonstrou diferenças estatísticas significativas entre os seguintes subgrupos: fêmeas do Atlântico Norte (G1) com machos do Atlântico Norte (G2) e do Brasil (G4); machos do Atlântico Norte (G2) com todos os outros subgrupos (G1, G3 e

G4); e machos (G4) e fêmeas (G3) do Brasil (Tabela 11). Considerando os dois grupos

Atlântico Norte e Brasil, apenas não há diferença significativa entre as fêmeas de cada grupo.

TABELA 11: Calcinus tibicen. Valores de significância da análise discriminante entre 4 subgrupos. Os valores em negrito indicam a aceitação da hipótese alternativa de que há diferença estatisticamente significativa entre os indivíduos analisados para aquela variável. G1: Fêmeas do Atlântico Norte; G2: Machos do Atlântico Norte; G3: Fêmeas do Brasil; e G4: Machos do Brasil.

p-values Subgrupo G1 G2 G3 G4

G1 0.002932 0.126781 0.000000

G2 0.002932 0.000005 0.000000

G3 0.126781 0.000005 0.000000

G4 0.000000 0.000000 0.000000

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Além disso, o teste das raízes indicou as duas raízes mais significativas e discriminantes (Tabela 12).

TABELA 12: Calcinus tibicen. Teste do Chi-quadrado com raízes sucessivamente removidas. Os valores em negrito indicam a aceitação da hipótese alternativa de que há diferença estatisticamente significativa entre os indivíduos analisados para aquela variável.

Raízes Valor de R Wilks' Chi- p-value removidas Eigen Canônico Lambda quadrado 0 11.76916 0.960045 0.038714 287.7625 0.000000 1 0.78545 0.663263 0.494345 62.3501 0.000030 2 0.13298 0.342594 0.882629 11.0492 0.439150

A Análise discriminante (Fig. 12) apontou a existência de uma estruturação morfométrica entre os machos de Calcinus tibicen, os do Atlântico Norte e os do Brasil. De outro modo, as fêmeas de ambos os grupos se sobrepuseram no gráfico.

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-01

Root 2

-02

-03

-04

-05

G_1:1 -06 G_2:2 -08 -06 -04 -02 00 02 04 06 G_3:3 Root 1 G_4:4 FIGURA 12: Calcinus tibicen. Análise canônica dos 4 subgrupos G1, G2, G3 e G4. Destaque para a estruturação morfométrica entre os machos de Calcinus tibicen do Atlântico Norte (em vermelho) e do Brasil (em rosa). G1: Fêmeas do Atlântico Norte; G2: Machos do Atlântico Norte; G3: Fêmeas do Brasil; e G4: Machos do Brasil.

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Para a espécie em estudo observou-se o agrupamento dos indivíduos em clados

únicos, tanto nas filogenias para o gene COI quanto para o 16S, sendo suportada por elevados valores de bootstrap (Fig. 10), corroborando assim, a monofilia do táxon. Esses resultados indicam elevada congruência no que tange a relação entre os indivíduos de diferentes localidades e validam a identidade taxonômica delas como Calcinus tibicen, sendo esse resultado corroborado por estudos recentes acerca das relações filogenéticas entre os representantes do gênero Calcinus (MALAY & PAULAY, 2009). No entanto, observou-se uma consistente separação genética entre os indivíduos das localidades das regiões do

Atlântico Norte e do Brasil.

Dentre as espécies de crustáceos decápodes cujas populações já foram avaliadas com relação à variabilidade intraespecífica, foi observada uma separação entre os indivíduos da espécie de camarão Hippolyte obliquimanus do Brasil e do Mar do Caribe, utilizando-se o gene COI, mas o mesmo não foi observado em relação ao gene 16S (TEROSSI &

MANTELATTO, 2012). No caso de Calcinus tibicen, tanto para o gene COI, que é altamente variável, quanto para o gene 16S, o qual é mais conservado, a separação entre regiões geográficas foi evidente, resultado análogo ao obtido com a espécie de ermitão Clibanarius vittatus (NEGRI et al., 2012), o qual posteriormente foi separado em duas entidades taxonômicas. Dessa forma, mesmo entre as partes mais conservadas do DNA mitocondrial, há diferenças entre esses dois grupos ao longo do Oceano Atlântico.

Assim como todas as análises, as análises de variância genética e a construção da rede de haplótipos para os genes mitocondriais COI e 16S também indicaram uma nítida separação em dois grupos: Atlântico Norte e Brasil (Fig. 8). Analisando a rede de haplótipos, não se observa compartilhamento de haplótipos entre os exemplares dos dois grupos, indicando uma estruturação geográfica para a espécie, com base nas ferramentas utilizadas.

Em relação ao gene 16S, o qual é menos variável que o COI, apenas Santa Catarina não

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compartilhou haplótipo com as outras localidades do Brasil. Entretanto, apenas uma unidade mutacional os separou. Para o grupo do Atlântico Norte, somente os indivíduos da Flórida,

Honduras e Trinidad & Tobago não compartilhavam haplótipos, separados, por no máximo, 2 passos mutacionais.

Dessa forma, pode-se dizer que há fluxo contínuo entre os indivíduos dentro de cada grupo, mas o mesmo não ocorre entre os grupos de Calcinus tibicen. Em uma análise com o camarão Atya scabra (Leach, 1816), uma forte estruturação genética também foi encontrada, sendo observados quatro grupos: Brasil + Caribe, Caribe, África e México (OLIVEIRA,

2014). Apesar disso, o ciclo de vida anfídromo dessa espécie parece propiciar uma conectividade em larga escala de distâncias, permitindo o fluxo gênico, por exemplo, entre localidades do mar do Caribe, do Brasil e de localidades do mar do Caribe com o Brasil

(OLIVEIRA, 2014). Da mesma maneira, para Calcinus tibicen, a proximidade genética encontrada dentro de cada grupo relaciona-se a existência de fases larvais planctônicas que propiciam um elevado poder de dispersão para a espécie. Ainda, o baixo índice de fixação

FSC encontrado (0.1356) entre as localidades dentro de cada grupo, sugerem baixa diferenciação genética dentro dos mesmos (WRIGHT, 1978).

Considerando a estruturação genética entre dois grupos geográficos para Calcinus tibicen, a configuração de um provável isolamento reprodutivo é indicada pela separação por

44 e 13 passos mutacionais para os genes COI e 16S, respectivamente e pelos elevados

índices de FCT e FST. Considerando esses índices de fixação e os altos valores encontrados

(0.93934 e 0.94026, respectivamente), há indicativos de altos níveis de diferenciação genética entre os grupos. Esses índices relacionam-se ao cálculo de distância genética entre os haplótipos e valores acima de 0.25 sugerem elevada estruturação genética (WRIGHT, 1978).

Essa divisão também foi sustentada pela AMOVA, em relação ao gene COI, a qual revelou

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que a maior parte da variação genética encontrada está entre os dois grupos analisados

(93,93%), enquanto apenas 0,08% da variação é encontrada dentro das localidades.

Adicionalmente, esse estudo contribuiu para a validação da técnica do DNA barcoding como ferramenta complementar aos estudos taxonômicos, filogenéticos e populacionais mais tradicionais, aumentando o poder conclusivo dos outros métodos (HAJIBABAEI et al., 2007).

Nesse contexto, esse estudo mostrou que essa ferramenta foi eficiente na separação dos grupos analisados para o gene mitocondrial COI, sendo observados os barcoding gaps, assim como no estudo com as espécies de caranguejos do gênero Calyptraeotheres Campos, 1990

(OCAMPO et al., 2013) (Fig. 9).

Essa variação intraespecífica observada de forma acentuada entre os grupos previamente citados está relacionada principalmente às substituições pontuais do tipo transição (Tabela 5). De maneira geral, as transições são mais comuns que transversões, porque as enzimas de reparo do DNA podem reconhecer mais facilmente um erro de duplicação associado a transversões, visto que as transições causam menos disrupção na hélice de DNA, já que nesse caso não há alteração do número de anéis da cadeia da base nitrogenada (A e G apresentam dois anéis, enquanto C e T têm um anel na cadeia)

(FREEMAN & HERRON, 2009). Esse fato contribui para os polimorfismos da espécie, bem como pode interferir no fitness desses espécimes (FREEMAN & HERRON, 2009).

Os índices obtidos pelos testes Tajima’s D e Fu’s (Tabela 6) informam processos demográficos e o tipo de seleção. Neste estudo, nos dois testes os valores foram negativos, podendo ambos indicar expansão demográfica, a qual pode ter ocorrido após o surgimento da barreira fisiológica do rio Amazonas. Ainda, o teste Tajima’s D aponta seleção purificadora, em que as substituições estariam sendo deletérias aos indivíduos do grupo. Já para o teste

Fu’s, os números negativos também podem sugerir efeito carona, sendo que as substituições permanecem no material genético por estarem ligadas a outro gene de seleção positiva. A

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estruturação genética encontrada em duas demes, auxilia a compreender um pouco melhor sobre os processos evolutivos de cada um dos grupos.

Um critério complementar utilizado na taxonomia do gênero Calcinus tem sido o padrão de coloração, por ser bastante variado e notável, abrangendo importante valor adaptativo e de reconhecimento reprodutivo, podendo até se tornar uma barreira reprodutiva, como evidenciado para duas espécies de caranguejos, Uca mjoebergi (Rathbun, 1924) e Uca capricornis (Crane, 1975) (DETTO et al., 2006). Diferenças de coloração foram observadas entre alguns indivíduos de Calcinus tibicen (Fig. 6) com as cores verde escuro e marrom- alaranjado. Contudo, as análises baseadas no material genético deles apontaram homogeneidade genética entre esses indivíduos (variação entre 0,2 e 0,6% - Tabela 9), sugerindo que esses dois padrões de coloração são polimorfismos do grupo e que, provavelmente, estão relacionados a questões ecológicas e não de intercruzamento diferenciado.

Além disso, nesse estudo, as ilhas costeiras do estado de São Paulo, ilha Anchieta, ilha das Couves e ilha da Vitória foram consideradas como localidades diferentes para análises, sendo distantes a 2,3Km, 3,8Km e 11,2Km da costa, respectivamente. Entretanto, os resultados indicaram que não há diferença genética significativa entre as ilhas e a região costeira (variação de 0 a 1,3% - Tabela 8). Dessa forma, o fluxo gênico entre essas duas áreas ocorre, principalmente pela dispersão larval, e é favorecido pelas curtas distâncias entre as ilhas analisadas e a porção continental do estado de São Paulo.

Sobre a variabilidade genética intraespecífica para Calcinus tibicen, os valores oscilaram bastante, sendo que entre os indivíduos de um mesmo grupo, ou seja, Brasil ou

Atlântico Norte, foi de 0 a 1,6% para o gene COI e de 0 a 2,3% para o 16S (Tabela 7). Entre os grupos Atlântico Norte e Brasil, essa diferença foi entre 7,9 e 9,9% (COI). Já a distância entre as espécies do gênero Calcinus foi de 13,1 a 14,1% (COI) e de 4,1 a 12,0% (16S),

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enquanto em relação às espécies de outros gêneros foi de 22,7 a 28,3% (COI) e de 18,7 a

27,0% (16S).

Para Calcinus tibicen, esses foram os valores encontrados, entretanto, esses índices são muito variados entre os diversos grupos dentro de Crustacea. Um estudo com diversos taxa em Crustacea indicou uma variação de 0 a 2,5% ao nível de espécie e de 4,9 a 23,6% em termos interespecíficos (COSTA et al., 2007). Apesar de, neste presente estudo, a distância intraespecífica encontrada ter sido maior quando comparada ao estudo citado, assim como no trabalho com Atya scabra, em que se observou uma variação de 0 a 8,6% (OLIVEIRA, 2014), a variação de Calcinus tibicen com a espécie filogeneticamente mais próxima (Calcinus explorator) é de 13,8 a 17,4% (COI), ou seja, é maior que a intraespecífica (entre os grupos de

Calcinus tibicen variou de 7,9 a 9,9% para o gene COI). Todavia, essa alta variação entre os grupos e baixa dentro dos grupos pode indicar uma diferenciação recente em termos geológicos, sendo que o grupo do Atlântico Norte e do Brasil seriam espécies mais proximamente relacionas do que com Calcinus explorator. No caso das espécies de ermitões

Clibanarius vittatus e Clibanarius symmetricus (Randall, 1840), recentemente considerados como espécies diferentes, a variação é de 5,18 a 7,29% (NEGRI et al. 2014), valores menores que dos encontrados para Calcinus tibicen. Somado a isso, um estudo com o gênero Calcinus apontou uma variação intraespecífica de 0 a 6% e interespecífica de 4 a 25% (MALAY &

PAULAY, 2009). Nesse caso, a variação intraespecífica entre os grupos de Calcinus tibicen também estaria no intervalo interespecífico para Calcinus.

Em relação às análises morfológicas, nenhuma estruturação foi observada para o táxon analisado, sendo que os caracteres eram muito variados entre e dentro dos grupos. Todavia, a identificação de estruturas diferentes têm se mostrado difícil, como no caso dos ermitões

Clibanarius vittatus e Clibanarius symmetricus, antes considerados como uma espécie só, em

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que a única diferença encontrada entre os dois foi uma alteração no padrão de coloração na face lateral do carpo dos pereiópodos (NEGRI, et al., 2014).

Apesar da morfologia não ter apontado um padrão de separação dos grupos, as medidas de 13 estruturas do ermitão Calcinus tibicen apontaram a divisão dos machos em dois grupos: aqueles do Atlântico Norte e os do Brasil, resultado oposto ao encontrado para o camarão Pontophilus norvegicus (M. Sars, 1861), em que nenhum tipo de estruturação foi observada nas localidades estudadas (DE GRAVE & DIAZ, 2001). Contudo, a mesma separação não foi observada para as fêmeas de Calcinus tibicen, sendo que permaneceram em um mesmo agrupamento na análise discriminante. Essa separação entre machos do Atlântico

Norte e do Brasil pode indicar um possível isolamento reprodutivo entre os grupos. No caso das espécies de camarão Farfantepenaeus brasiliensis (Latreille, 1917) e Farfantepenaeus paulensis (Pérez-Farfante, 1967), a morfometria foi importante para apontar as estruturas significamente diferentes entre as espécies, mas, apesar disso, não foi considerada como confiável para a identificação dessas espécies, consideradas mormologicamente muito similares (TEODORO, 2014).

Por conseguinte, embasados no não compartilhamento de haplótipos, na alta diferenciação genética intraespecífica entre os grupos do Atlântico Norte e do Brasil e na separação entre os machos dos dois grupos, mas sem diferenças morfológicas, as quais possam diferenciar claramente os dois grupos, pode ser que estejamos frente a espécies crípticas, reprodutivamente isoladas.

São denominadas como espécies crípticas aquelas que, aos olhos humanos, não podem ser separadas morfologicamente, mas que apresentam diferenças genéticas, comportamentais, fisiológicas, bioquímicas, entre outras, que as diferenciam (KNOWLTON, 1986). Todavia, é importante lembrar que os indivíduos de uma espécie são entidades que na natureza se reconhecem, independentemente das classificações antropocêntricas (SENE, 2009). Estudos

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com outros crustáceos também evidenciaram a presença de espécies crípticas, como é o caso dos camarões de água doce da bacia amazônica, Palaemon carteri (Gordon, 1935) e

Palaemon ivonicus (Holthuis, 1950) (CARVALHO et al., 2014) e da espécie de lagosta

Panulirus argus (Latreille, 1804) (TOURINHO et al., 2012). Sendo assim, sabendo que a espécie Calcinus tibicen foi descrita por Herbst no ano de 1791, mas sem definição sobre a localidade-tipo e os holótipos, apesar dos esfroços de vários autores (e.g. SOUZA & SEREJO,

2007), uma potencial nova espécie pode ser proposta, sendo pertencente ou ao grupo do

Atlântico Norte ou do Brasil, ainda denominada de Calcinus sp.

Portanto, os resultados indicaram uma separação entre os grupos do Atlântico Norte e do Brasil, por meio de análises moleculares utilizando os genes mitocondriais COI e 16S. A partir de então, buscou-se entender quais barreiras físicas e/ou ecológicas poderiam estar dificultando ou extinguindo o fluxo gênico entre esses dois grupos. Uma hipótese foi elaborada, segundo seu padrão de estruturação genética e morfométrica (para os machos), associado à ampla distribuição da espécie Calcinus tibicen.

Analisando sua distribuição ao longo da costa do Oceano Atlântico Ocidental, uma provável explicação para essa divisão pode estar ligada ao gap de distribuição de Calcinus tibicen na região da foz do rio Amazonas. Nesta área, ocorre o deságue de um volume significativo de água doce, o qual altera de forma abrupta a salinidade da região. Como, para muitos crustáceos, inclusive para a espécie em estudo, as larvas configuram-se como principal forma de dispersão, alterações no ambiente podem se tornar importantes barreiras ao fluxo gênico.

Como citado anteriormente, a espécie apresenta desenvolvimento anamórfico com relato da existência de VI a VIII estágios larvais com duração de 32 a 42 dias

(PROVENZANO, 1962). Nesse período de desenvolvimento, as formas larvais,

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principalmente as marinhas, são as mais susceptíveis às mudanças de salinidade do ambiente, podendo esse fator ser essencial para suas sobrevivências.

Somado a isso, durante os períodos de crescimento, desenvolvimento e reprodução dos indivíduos, são requeridas condições mais próximas àquelas de melhor desempenho dos organismos (BEGON et al., 2006). Em outras palavras, um intervalo menor de variação das condições ideais é necessário em comparação às condições apenas de sobrevivência (BEGON et al., 2006). De tal modo, como nos estágios larvais uma grande quantidade energética é despendida durante o desenvolvimento, alterações na salinidade poderiam ser muito prejudiciais, podendo mesmo ser letais.

Ainda em relação à salinidade, esta foi considerada como fator abiótico limitante para a distribuição de três espécies de ermitões, Clibanarius vittatus, Loxopagurus loxochelis

(Moreira, 1901) e Isocheles sawayai Forest & de Saint Laurent, 1968, em uma região estuarina (SANT’ANNA et al., 2006). Dessa forma, a foz do rio Amazonas no Oceano

Atlântico, coincidindo com o hiato de distribuição de Calcinus tibicen, provavelmente também pode se conformar como fator limitante importante para a espécie estudada.

Além disso, experimentos em laboratório com larvas de Calcinus tibicen indicaram que elas sobreviveram em uma faixa de salinidade variando de 31,1 a 37,07 ppt

(PROVENZANO, 1962). Entretanto, em um ambiente natural, existem outros fatores (e.g. temperatura, disponibilidade de alimentos) ao longo da distribuição geográfica da espécie que estão interagindo com a variação de salinidade. Pode ser que alguns espécimes sobrevivam naquela região, mas em estado de baixa taxa metabólica, entretanto, tais condições não permitiriam o crescimento e reprodução destes, levando a não continuidade desses agrupamentos, como também impediriam a transposição pela foz do rio Amazonas, processo que necessitaria de um alto investimento energético. Desse modo, a distribuição da espécie não é apenas limitada por barreiras físicas que impedem o fluxo de larvas e adultos, mas

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também por fatores limitantes, chamados de barreiras ecológicas. Estas restringeriam as taxas de sobrevivência das larvas, crescimento e reprodução dos indivíduos.

Em vista disso, pode-se dizer que há uma separação alopátrica, configurada pela foz do rio Amazonas, a qual atuaria como uma importante barreira fisiológica para Calcinus tibicen. Essa estruturação torna-se um aspecto de grande contribuição no processo de separação da espécie, com possíveis chances de especiação. Com base nesses argumentos, é proposta uma hipótese em relação à alta variabilidade genética encontrada entre o grupo do

Atlântico Norte e do Brasil e à biogeografia da espécie.

Provavelmente, após o surgimento da espécie por processos de diferenciação genética, ação de fatores evolutivos e especiação (cladogênese), esta apresentou dispersão por toda a costa do Oceano Atlântico Ocidental. Como dito, essa dispersão deve-se principalmente aos estágios larvais, quando os indivíduos possuem alta capacidade de dispersão.

Dessa maneira, supondo que a espécie apresentava uma distribuição sem hiatos e que provavelmente tivesse uma estruturação genética homogênea (pelo fluxo gênico ocorrer), o que teria provocado essa divergência genética observada atualmente? Estudos geológicos indicam a ocorrências de um importante evento geológico para a América do sul durante o

Cenozóico médio: o soerguimento das atuais cordilheiras dos Andes, resultante de vários anos de deslocamento das placas tectônicas da região.

Apesar de hoje a região andina ser marcada por extensas cadeias montanhosas, antes de elas existirem, essa região era marcadamente mais plana (CARVALHO & ALMEIDA,

2010. A atual cordilheira dos Andes sofreu várias alterações, sendo duas, nos últimos 200 milhões de anos, consideradas como principais: 1- separação do continente sul-americano da

África e migração para oeste, gerando uma tensão com a placa de Nazca, e causando espessamento da crosta e as primeiras elevações da região; 2- intensificação dos esforços convergentes no limite com a placa de Nazca, gerando um cordão montanhoso e resultando na

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subducção da placa de Nazca por baixo da placa sul-americana e consequente espessamento da placa sul-americana (CARVALHO & ALMEIDA, 2010). Este último evento ocorreu no final do Mesozóico.

Com a última conformação das placas mencionadas, entretanto, houve um aumento dos esforços na borda oeste da América do Sul no início do Oligoceno (34Ma), acelerando mais o soerguimento dos Andes (CARVALHO & ALMEIDA, 2010). Essa intensificação culminou em alterações ambientais e climáticas para a região, como a mudança do clima

úmido para o desértico na Patagônia, a dificuldade de escoamento das águas do Pantanal mato-grossense, e a inversão de sentido da drenagem do rio Amazonas, do Oceano Pacífico para o Atlântico (CARVALHO & ALMEIDA, 2010).

FIGURA 13: Representação da escala geológica em milhões de anos (Ma). Destaque para a Era Cenozóica, quando ocorreram importantes atividades tectônicas na região andina. Disponível em: .

A estrutura da Amazônia fazia parte de uma região maior que a conhecida atualmente, contemplando as áreas atuais mais o Orinoco e Magdalena, sendo conhecida como “Pan-

Amazônia” (HOORN et al., 2010) e marcada pelo predomínio de rios.

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Um soerguimento a leste da Cordilheira no Mioceno médio levou à primeira modificação do rio Amazonas, mas ainda sem uma conexão com o Atlântico, porém, já havia uma ligação com o antigo sistema fluvial do Orinoco, o qual desembocava no Caribe. Mais ao final do Mioceno, por volta de 10Ma, quando a parte norte dos Andes se elevou, mudanças importantes ocorreram: o rio Orinoco alterou seu curso e o rio Amazonas estabeleceu conexão com o Oceano Atlântico, interrompendo a ligação Amazonas-Caribe, tendo se estabelecido definitivamente em torno de 7Ma (HOORN et al., 1995; 2010).

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FIGURA 14: Mudanças na estrutura geológica e fluvial da região do Amazonas, culminando com a alteração no sentido de desague do rio Amazonas, do Oceano Pacífico para o Atlântico. Retirado de: HOORN et al., 1995.

Portanto, o rio Amazonas antes desembocava no Oceano Pacífico e, por essas alterações de altitude, passou a desaguar no Oceano Atlântico. Assim, essa alteração de salinidade poderia dificultar e até mesmo impedir a dispersão de larvas de Calcinus tibicen do

Brasil para o Atlântico Norte e do contrário também. Sendo assim, os indivíduos de Calcinus tibicen do Atlântico Norte e do Brasil podem ter desenvolvido adaptações diferentes, ao longo dos anos. Esse fato, associado ao fluxo gênico restrito entre elas, está promovendo diferenças genéticas bastante acentuadas entre ambas e direcionando a uma separação alopátrica. Este perfil deixa clara a existência de grupos geneticamente distintos e, portanto, com características distintas, que devem ser relevadas, por exemplo, em ações de conservação da biodiversidade especificas para cada região. 74

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Desse modo, essa divergência em composição genética, observada em todas as análises, baseada em adaptações a diferentes ambientes, podem conferir um isolamento reprodutivo entre os dois grupos. Além do mais, os resultados obtidos pela datação molecular vão de encontro com a hipótese biogeográfica proposta, visto que o período de divergência calculado para os dois grupos de Calcinus tibicen foi de aproximadamente 4,7Ma (Fig. 11) e, pela literatura, a conformação do rio Amazonas como a atual teria se estabelecido por volta de

7Ma.

Além disso, outro fator que pode estar contribuindo na redução de fluxo gênico entre os dois grupos são as correntes marítimas distribuídas pela costa Ocidental do continente americano. De modo geral, as correntes de água em movimento são importantes na transferência de energia (calor) dos trópicos para os polos e são direcionadas pelo vento

(circulação horizontal) ou pela densidade da água (circulação vertical ou termoalina)

(MENDES & SOARES-GOMES, 2007). Em um estudo com espécies de caranguejo do gênero Persephona Leach, 1817, foi evidenciada um papel imporante das correntes marítimicas com diferentes direções de fluxo no processo de especiação (MAGALHÃES,

2012). Para o presente estudo, duas correntes foram consideradas como tendo papel importante no estabelecimento da estruturação genética encontrada: a corrente do Brasil e a

Sul-Equatorial. Ambas são correntes que transportam água quente e surgem de um processo de bifurcação, no Cabo de São Roque, da corrente Sul Equatorial. Esta é originada da corrente de Benguela, a qual parte da costa sul-Ocidental do continente africano transportando água fria (BISCHOF et al., 2004). A corrente do Brasil passa pela região do Nordeste e vai sentido ao sul do Brasil, enquanto a corrente Sul Equatorial passa pela região do Nordeste e segue sentido Norte do continente americano (Fig. 15).

MANDAI, S.S. (2015) Discussão

FIGURA 15: Mapa com as principais correntes do planeta Terra. Destaque para as correntes do Brasil e a Sul Equatorial. O triângulo em roxo indica a mudança de nomenclatura da corrente Sul Equatorial para a corrente das Guianas. S. Equatorial C.: Corrente Sul Eqautorial; Brazil C.: Corrente do Brasil; N. Equatorial C.: Corrente Norte Equatorial.

A corrente do Brasil inicia-se em torno de 9°S e vai até os 38°S, onde encontra a corrente das Malvinas (corrente fria), resultando na região de Convergência Subtropical do

Atlântico Sul. De outra forma, a corrente Sul Equatorial se movimenta no sentido leste-oeste na altura da linha do Equador, sendo que, na região da Guiana, passa a ser chamada de

Corrente das Guianas, seguindo rumo a América Central e do Norte (MENDES & SOARES-

GOMES, 2007).

As larvas, em geral, apresentam dois tipos de dispersão, uma passiva, acompanhando o fluxo das águas oceânicas, ou ativa, deslocando-se para as regiões de interesse com maior gasto energético (COWEN & SPONAUGLE, 2009). Logo, essas correntes com sentidos opostos, atuando sobre as larvas de dispersão passiva, podem ser outros fatores abióticos que auxiliam na determinação dessa estruturação genética observada.

Sendo assim, essas correntes promoveriam uma conectividade genética entre os indivíduos de

MANDAI, S.S. (2015) Discussão

cada grupo (Atlântico Norte ou Brasil), no entanto, promoveriam dificuldades à dispersão larval entre esses grupos.

Portanto, com base na estruturação genética e morfométrica para os machos, foi possível obseravar uma estruturação geográfica para a espécie Calcinus tibicen. Isso, somado a acontecimentos biogeográficos, a estudos de fatores abióticos e à própria biologia de

Calcinus tibicen permitiram um melhor entendimento da distribuição/dispersão da espécie em estudo, bem como de sua variabilidade.

MANDAI, S.S (2015) Conclusões

As divergências em nível dos genes mitocondriais COI e 16S, bem como da morfometria para os machos indicam uma separação entre os indivíduos de Calcinus tibicen em dois grupos: Atlântico Norte e Brasil. Dados geológicos como o soerguimento das cadeias andinas e consequente mudança do desague do rio Amazonas para o Oceano Atlântico, coincidindo com o período de divergência desses dois grupos e somado ao volume significativo de água doce despejada na foz deste rio, sugerem que o rio Amazonas pode se configurar como uma barreira importante na transposição de larvas da espécie em estudo da costa brasileira para a do Atlântico Norte. Além disso, propõe-se a existência de espécies crípticas para o táxon Calcinus tibicen esugere-se a realização de outros estudos em relação aos dois grupos como forma de melhor suportar essa divisão.

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