Universidade de São Paulo Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto Departamento de Química Programa de Pós-Graduação em Química Estudo bioquímico comparativo da (Na+, K+)-ATPase branquial de Macrobrachium amazonicum (Heller, 1862) habitante de regiões continentais Leonardo Milani Fabri Dissertação apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Ciências, Área: Química RIBEIRÃO PRETO -SP 2019 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE FILOSOFIA, CIÊNCIAS E LETRAS DE RIBEIRÃO PRETO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA Leonardo Milani Fabri Estudo bioquímico comparativo da (Na+, K+)-ATPase branquial de Macrobrachium amazonicum (Heller, 1862) habitante de regiões continentais Versão corrigida (Versão original encontra-se na unidade que aloja o Programa de Pós-graduação) Dissertação apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Ciências, obtido no Programa de Pós-Graduação em Química Orientador: Francisco de Assis Leone Ribeirão Preto - SP 2019 FICHA CATALOGRÁFICA AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA DESDE QUE CITADA A FONTE. Fabri, Leonardo Milani Estudo bioquímico comparativo da (Na+, K+)-ATPase branquial de Macrobrachium amazonicum (Heller, 1862) habitante de regiões continentais. Leonardo Milani Fabri; Orientador: Francisco de Assis Leone -- Ribeirão Preto, 2019. 194p. : il. ; 30cm Dissertação (Mestrado) -- Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto. Programa de Pós-Graduação em Química. Área de concentração: Química 1. (Na+, K+)-ATPase. 2. Macrobrachium amazonicum. 3. Osmorregulação. FOLHA DE APROVAÇÃO Leonardo Milani Fabri Estudo bioquímico comparativo da (Na+, K+)-ATPase branquial de Macrobrachium amazonicum (Heller, 1862) habitante de regiões continentais. Dissertação apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Ciências. Área de Concentração: Química Orientador: Prof. Dr. Francisco de Assis Leone. Aprovado em:____/ ____/ ____ Banca examinadora Profº(a) Drº (a)_______________________________________________________ Instituição____________________________Assinatura_______________________ Profº(a)Drº(a).________________________________________________________ Instituição____________________________Assinatura_______________________ Profº (a) Drº (a).______________________________________________________ Instituição____________________________Assinatura_______________________ Profº (a) Drº (a).______________________________________________________ Instituição____________________________Assinatura_______________________ DEDICO Aos meus pais e irmã por todo apoio e confiança depositada em mim. Além de toda doação, sacrifícios, amor e compreensão durante esta caminhada. À minha namorada Natália por todo apoio, compreensão e ajuda durante o desenvolvimento deste trabalho. Sem vocês eu não seria capaz de realizar esta conquista, que também é de vocês. AGRADECIMENTOS Ao meu orientador, Prof. Dr. Francisco de Assis Leone pela confiança depositada em mim e por permitir o desenvolvimento deste trabalho. Por todos os ensinamentos, orientações e direcionamentos que me permitiu evoluir e aprender tanto durante o desenvolvimento deste trabalho. Ao Prof. Dr. Carlos Frederico Leite Fontes pelo acolhimento em seu laboratório para a realização dos experimentos com ATP radioativo, pela disponibilidade e discussões que contribuíram tanto para este trabalho. Ao Prof. Dr. Malson Neilson Lucena por todos ensinamentos, discussões, amizade e conselhos que contribuíram muito no desenvolvimento deste trabalho. Ao Prof. Dr. John Campbell McNamara pela colaboração científica. Ao Dr. Marcelo Rodrigues Pinto pelos cortes para a microscopia e colaboração científica. À Prof. Dra. Daniela Pereira Garçon e Prof. Dr. Rogério Oliveira Faleiros pela captura dos animais e pela colaboração e discussões. Ao Prof. Dr. Arthur Henrique Cavalcante de Oliveira pela colaboração científica. Aos meus amigos de laboratório, Cintya, Bruno e Elise por todas discussões, apoio, amizade e risadas que tornaram esta caminhada mais leve e engrandecedora. Aos demais amigos e colegas que passaram pelo laboratório e contribuíram na minha caminhada. Ao técnico André Justino pelo suporte técnico. Aos docentes e funcionários do Departamento de Química da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. A toda minha família que sempre me apoiou e acreditou em mim. Que muitas vezes me deu forças para continuar buscando meus sonhos. Meus amigos de Borborema pela compreensão da ausência, por todo carinho, apoio e companheirismo que foi importante durante esta caminhada. A todos que contribuíram de forma direta ou indireta na minha formação e que foram de extrema importância na minha caminhada. A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) pelo apoio financeiro durante o desenvolvimento deste trabalho. RESUMO FABRI, L. M. Estudo bioquímico comparativo da (Na+, K+)-ATPase branquial de Macrobrachium amazonicum (Heller, 1862) habitante de regiões continentais. 196p. Dissertação de Mestrado – Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, 2019. O camarão Macrobrachium amazonicum é um espécie diádroma, que apresenta uma ampla distribuição na América do Sul. Os camarões palemonídeos hiperregulam em água doce, sendo este processo energizado pela (Na+, K+)-ATPase e V(H+)-ATPase presentes no tecido branquial desses animais. Este trabalho teve como objetivo caracterizar e comparar as propriedades moleculares, bioquímicas e cinéticas da (Na+, K+)-ATPase e V(H+)-ATPase branquial de M. amazonicum de populações que habitam a Bacia do Rio da Prata (Paraná- Paraguai), proporcionando um melhor entendimento do processo osmorregulatório envolvido na invasão do ambiente dulcícola desta espécie. A (Na+, K+)-ATPase branquial de M. amazonicum recém capturado nos Rios Tietê e Grande apresentou atividade máxima de -1 -1 aproximadamente 130 nmol Pi min mg de proteína, representando cerca de 75% da atividade ATPase total. As propriedades cinéticas da (Na+, K+)-ATPase branquial destas duas populações apresentam grande semelhança entre si, porém são divergentes se comparadas a outras populações de M. amazonicum. De forma inédita, neste trabalho foi realizada a caracterização cinética da (Na+, K+)-ATPase branquial de M. amazonicum após a aclimatação em alta salinidade, utilizando os animais do Rio Tietê aclimatados em salinidade em 21 ‰S durante 10 dias. Essa aclimatação resultou na provocou a diminuição de aproximadamente 60% na atividade ATPase da (Na+, K+)-ATPase branquial (52,1 ± 1,9 nmol Pi min-1 mg-1 de proteína). A afinidade da enzima para os seus diferentes moduladores também foi alterada, sugerindo alterações na regulação da enzima com a aclimatação. Nos animais recém capturados a atividade insensível à ouabaína é composta principalmente pelas atividades da V(H+)-ATPase, Na+ e/ou K+-ATPase e F-ATPase, enquanto nos animais aclimatados ela é constituída pelas atividades da Ca2+-ATPase, Na+- e/ou K+-ATPase e F-ATPase. Atividade V(H+)-ATPase foi encontrada somente nos animais recém capturados. A V(H+)-ATPase branquial de M. amazonicum recém capturado apresentou uma atividade de 27,2 nmol Pi min- 1 mg-1 de proteína (Rio Tietê) e 16,7 nmol Pi min-1 mg-1 de proteína (Rio Grande). As afinidades aparentes da V(H+)-ATPase branquial de M. amazonicum de Rio Tietê para os seus moduladores foram inferiores aos valores encontrados para a população do Rio Grande. A eletroforese desnaturante (SDS-PAGE) da fração microsomal do tecido branquial de M. amazonicum sugere algumas diferenças de expressão proteica, sendo que a subunidade α da (Na+, K+)-ATPase apresentou apenas uma única banda imunorreativa (≈110kDa). A (Na+, K+)-ATPase localiza-se predominantemente ao longo do septo intralamelar nas brânquias e a aclimatação em alta salinidade durante 10 dias não causou mudanças nesta distribuição, sugerindo que a adaptação dos animais não depende da disponibilidade da enzima na membrana celular. A atividade da (Na+, K+)-ATPase branquial de M. amazonicum é alterada tanto pela presença do peptídeo FXYD2 exógeno, quanto pela fosforilação pelas proteínas quinases A e C endógenas em uma proteína da família FXYD presente na fração microsomal destes animais. Considerando que a alteração da atividade da (Na+, K+)-ATPase é dependente da salinidade, os resultados deste trabalho podem ser relevantes para uma melhor compreensão do processo osmorregulatório do M. amazonicum. ABSTRACT FABRI, L. M. A comparative biochemical study of the gill (Na+, K+)-ATPase from populations of Macrobrachium amazonicum (Heller, 1862) inhabiting continental waters. 196 pp. Dissertação de Mestrado. – Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, 2019. The freshwater shrimp Macrobrachium amazonicum is a diadromous species that has a wide distribution throughout South America. The palaemonid shrimps hyper-osmoregulate their hemolymph in fresh water, a process energized by the (Na+, K+)-ATPase and V(H+)- ATPase present in their gill tissue. In this study, we characterized and compared the molecular, biochemical and kinetic properties