UNIVERSITE D’ANTANANARIVO

ECOLE SUPERIEURE POLYTECHNIQUE

DEPARTEMENT GENIE CHIMIQUE

Mémoire de fin d’étude s en vue de l’obtention du diplôme D’INGENIEUR EN GENIE CHIMIQUE

Etude de la variabilité spatiale de la composition chimique des huiles essentielles de Tambourissa purpurea [Tul] A.DC [MONIMIACEAE ]

Présenté par : RANDRIHARISOA Marie Stéphanie Soutenu le 11 Septembre 2012 Promotion 2011

UNIVERSITE D’ANTANANARIVO

ECOLE SUPERIEURE POLYTECHNIQUE

DEPARTEMENT GENIE CHIMIQUE

Mémoire de fin d’étude s en vue de l’obtention du diplôme D’INGENIEUR EN GENIE CHIMIQUE

Etude de la variabilité spatiale de la composition chimique des huiles essentielles de Tambourissa purpurea

[Tul] A.DC [MONIMIACEAE]

Présenté par : RANDRIHARISOA Marie Stéphanie Soutenu le 11 Septembre 2012 Promotion 2011

Membres de Jury :

Président : Professeur ANDRIANARY Philippe Antoine Rapporteur : Professeur RASOLONDRAMANITRA Jocelyne Encadreur : Monsieur RAZAFIMANDEFITRA André Examinateurs : Docteur RANDRIANA Richard Fortuné Docteur ANDRIANARISON Edouard

Merci Seigneur Tout Puissant pour Ton Amour si grand et Ta Grâce permanente. « C’est par la grâce de Dieu que je suis ce que je suis» (1 Co, 15, 10)

SOMMAIRE

INTRODUCTION

Partie I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

I. PRESENTATION BOTANIQUE DE Tambourissa purpurea

II. ETAT DE LA RECHERCHE SUR T. purpurea.

III. DEFINITIONS ET UTILISATIONS DES HUILES ESSENTIELLES

Partie II : METHODES EXPERIMENTALES

IV. TRAVAUX SUR TERRAIN

V. TRAVAUX DE LABORATOIRE

Partie III : RESULTATS ET DISCUSSION

VI. RENDEMENT EN HUILE ESSENTIELLE DE T. purpurea

VII. COMPOSITION CHIMIQUE DES HUILES ESSENTIELLES DE T. purpurea

VIII. ETUDE DE LA VARIABILITE CHIMIQUE DE L’HE DE T. purpurea

CONCLUSION

Références Bibliographiques et Webographies

Annexes

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique I Remerciements

La réalisation de ce mémoire a pu aboutir grâce à l’Amour, à la Bénédiction et à la Grâce de

DIEU ainsi qu’au soutien, aux aides et à la collaboration de plusieurs personnes à qui il m’est agréable d’exprimer mes reconnaissances et mes sincères remerciements.

Je tiens à remercier respectueusement les personnes suivantes d’avoir consacré leur temps pour ce travail malgré leurs lourdes charges professionnelles :

Au Professeur ANDRIANARY Philippe Antoine, Directeur de l’Ecole Supérieure

Polytechnique d’Antananarivo qui m’a fait l’honneur d’accepter de présider cette

soutenance malgré la multiplicité de ses charges professionnelles et d'avoir eu

l'obligeance et la gentillesse de nous soutenir durant les années au sein de l’Ecole.

Au Docteur RANDRIANA Richard Fortuné , Maître de Conférences à l’Ecole

Supérieure Polytechnique d’Antananarivo, Chef de département de Génie Chimique,

qui a bien voulu juger le présent mémoire malgré ses nombreuses et lourdes tâches

et pour l’enseignement qu’il nous a dispensé.

Au Professeur RASOLONDRAMANITRA Jocelyne, Professeur titulaire du

département Génie Chimique de l’Ecole Supérieure Polytechnique d’Antananarivo, qui

malgré ses nombreuses responsabilités, a bien voulu prendre la peine d'encadrer ce

travail et également pour son soutien, ses conseils, sa disponibilité et sa gentillesse

d’avoir amélioré avec beaucoup d’attention la forme et le contenu de ce mémoire en

y consacrant même ses weekend pour les corrections.

A Monsieur RAZAFIMANDEFITRA André , Enseignant chercheur au département

Génie Chimique de l’Ecole Supérieure Polytechnique d’Antananarivo, pour son

encadrement permanent, sa grande disponibilité, son soutien, sa gentillesse, son aide

et ses précieuses contributions autant sur la technique que sur la rédaction durant

l’accomplissement de ce travail.

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique II Au Docteur ANDRIANARISON Edouard Ravalison, Maître de conférences du

département Génie Chimique de l’Ecole Supérieure Polytechnique d’Antananarivo qui

a bien voulu accepter de siéger parmi les membres de jury malgré ses grandes

responsabilités et pour l’enseignement et les conseils qu’il nous a offerts.

A Monsieur RABEHAJA Delphin , Responsable de Laboratoire d’Analyse d’Huile

Essentielle (LAHE) de l’IMRA pour les analyses en CPG et RMN 13 C de nos huiles

essentielles à l’Université de Corse, sans qui, il aurait été difficile d’achever

l’essentiel du sujet, et pour ses précieuses instructions dans les identifications.

Au Docteur RAZAFIMAMONJISON Dina Gaylor pour sa disponibilité malgré son

planning, pour son assistance, son appui et ses conseils, ceci de façon remplie

d’amabilité, en particulier dans le traitement statistique des données.

A tous les Enseignants, Techniciens de Laboratoires du département Génie Chimique

pour l’enseignement et l’appui qu’ils nous ont prodigués durant ces cinq années. Et

aussi à toutes les personnes qui m'ont aidé de près ou de loin à la réalisation de ce

mémoire.

En dernier et non le moindre, j’adresse un très grand merci à chaque membre de ma

famille. Je les remercie pour leurs appuis invétérés, qu’ils soient d'ordre moral,

physique et même financier pour que ce mémoire soit ce qu'il est aujourd'hui. Merci.

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique III Glossaire

Angine de Vincent : maladie infectieuse d’origine bactérienne se traduisant par une inflammation aiguë de la muqueuse qui tapisse la partie moyenne du pharynx située derrière la bouche

Aromathérapie : c’est la thérapie par les huiles essentielles des plantes dites aromatiques, sortes de concentrés de la puissance vitale végétale à l’activité biologique remarquable.

Chémotype : c’est le type chimique d’une plante. Il est déterminé à partir de l’analyse chimique de ses métabolites secondaires, soit de l’identité chimique du composant ayant la plus grande proportion ou composant majeur.

Décoction : Action de faire bouillir dans l’eau une substance pour en extraire les principes solubles.

Dysménorrhée : Menstruation douloureuse, difficile et irrégulière.

Endémique : Qualifie une plante native d'une région déterminée et que l'on ne trouve pas ailleurs en site naturel.

Epicarpe : Pellicule qui recouvre le fuit, communément appelé peau.

Fébrifuge : qui a la propriété de faire baisser la fièvre

Hystérie : Etat psychologique, névrose pouvant simuler diverses maladies et se manifester par des crises convulsives, des attaques, etc.

Infusion : Action de tremper une substance végétale dans un liquide dont on veut extraire les principes solubles.

Lobe : Division profonde et généralement arrondie des organes foliacés ou floraux.

Mésocarpe : Zone médiane d'un fruit, entre l'épiderme et le noyau ou les graines.

Nervure : Filet ramifié et saillant sur le limbe d'une feuille, dont la disposition détermine la forme du limbe.

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique IV Oblong : Plus long que large et arrondi aux deux extrémités.

Oboval : Oval avec la plus grande largeur en haut.

Ocytocique : qui stimule les contractions utérines lors de l’accouchement.

Pédoncule : Toute tige reliant un organe végétal à son point d'insertion sur l'ensemble du corps (ex : queue).

Pétale : chacune des pièces florales, souvent colorées et soyeuses, dont l'ensemble forme la corolle des fleurs.

Pétiole : Partie rétrécie reliant le limbe d'une feuille à la tige, près de laquelle elle s'élargit souvent en une gaine.

Pyorrhée : Ecoulement de pus. Arthrite suppurée alvéolo – dentaire.

Sempervirent : Se dit d’une forêt dont le feuillage ne se renouvelle pas selon un rythme saisonnier et qui apparaît toujours vert.

Taxon : groupe d'espèces appartenant à un niveau de la hiérarchie dans une classification d'êtres vivants

Taxonomie : regroupement méthodique et hiérarchique (d'éléments)

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique V Acronymes et abréviations °C : degré Celsius ACP : Analyse en Composante Principale AFD : Analyse Factorielle Discriminante AFNOR : Association Française de NORmalisation CC : Chromatographie sur Colonne CCM : Chromatographie sur Couche Mince CLHP : Chromatographie Liquide Haute Performance CPG : Chromatographie en Phase Gazeuse GC/MS : Chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse Ho : hypothèse nulle Ha : hypothèse alternative HE : Huile Essentielle IK : Indice de Kovats IRTF : Infra Rouge à Transformée de Fourier Max : Maximum MBG : Missouri Botanical Garden Min : Minimum PBZT : Parc botanique et Zoologique de Tsimbazaza R : Rendement RMN 13 C : Résonance Magnétique Nucléaire du carbone 13 SM : Spectrométrie de Masse spp : sous-espèce

T. purpurea : Tambourissa purpurea

TMS : Tétraméthylsilane

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique VI Liste des tableaux

Liste ...... Page Tableau 1 : Les espèces du genre Tambourissa ...... 5 Tableau 2 : Description morphologique de l’espèce T. purpurea ...... 6 Tableau 3 : Présentation des échantillons étudiés ...... 20 Tableau 4 : Rendement en HE des échantillons de T. purpurea ...... 39 Tableau 5 a : Composition chimique des huiles essentielles de feuilles de T. purpurea d’Ambatofotsy I ...... 42 Tableau 5 b : Composition chimique des huiles essentielles de feuilles de T. purpurea d’Ambatofotsy II et de Fandriana ...... 44 Tableau 5 c : Composition chimique des huiles essentielles de feuilles de T. purpurea d’Ambatofahavalo ...... 46 Tableau 6 : Comparaison des teneurs en hydrocarbures sesquiterpéniques et sesquiterpénols...... 48 Tableau 7 a : Identification de l’ α-pinène dans HE01 ...... 51 Tableau 7 b : Identification du β-sélinène dans HE01 ...... 51 Tableau 7 c : Identification du β-élémol dans HE01 ...... 52 Tableau 8 : Les familles chimiques des HE de T. purpurea ...... 55 Tableau 9 : Composition chimique des HE après sélection des variables ...... 59 Tableau 10: Test de sphéricité de Barlett ...... 62 Tableau 11: Valeurs propres et cumul de pourcentage ...... 63 Tableau 12 : Test de Lambda de Wilks ...... 66 Tableau 13 : Valeurs propres et pourcentage des axes principaux en AFD ...... 67 Tableau 14: Evaluation des effectifs des groupes d’individus ...... 69 Tableau 15 : Caractéristique descriptive des groupes d’échantillons de T. purpurea .... 70 Tableau 16 : Correspondance groupe d’affectation – site de récolte ...... 72

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique VII Liste des figures

Liste ...... Page Figure 1: Arbuste, feuilles et fruits de T. purpurea ...... 7 Figure 2: Planche botanique de trois espèces du genre Tambourissa...... 8 Figure 3 : Localisation de l’espèce T. purpurea à Madagascar ...... 10 Figure 4: Les sites de récolte par rapport à Antananarivo...... 17 Figure 5 : Herbiers de Tambourissa purpurea ...... 19 Figure 6 : Carte représentant les sites Ambatofotsy I, Ambatofotsy II et Ambatofahavalo...... 21 Figure 7: Hydrodistillateur à l’échelle de laboratoire ...... 23 Figure 8: Les méthodes d’analyse d’un mélange naturel ...... 25 Figure 9 : Comparaison des teneurs en hydrocarbures sesquiterpéniques et sesquiterpénols...... 49 Figure 10: Cercle de corrélation des variables dans le plan ½ en ACP ...... 64 Figure 11: Répartition des 18 individus de T. purpurea dans le plan ½ en ACP ...... 65 Figure 12: Représentation graphique des variables en AFD ...... 68 Figure 13 : Représentation graphique des individus en AFD...... 68 Figure 14 : Comparaison du profil des cinq groupes ...... 70

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique VIII Liste des annexes

Annexe 1 : Hydrodistillation...... a.1 Annexe 2 : Identification par utilisation des indices de Kovats...... a.2 Annexe 3 : Structures de molécules identifiées par RMN 13 C et IK dans les huiles essentielles de T.purpurea… ………….……………………………………………………………………….....a.3

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique IX Introduction

INTRODUCTION

Madagascar, grâce à son isolement et à l’ancienneté de sa formation, est le refuge exceptionnel d’espèces végétales et animales introuvables ailleurs. Madagascar compte des milliers d’espèces végétales dont au moins 2000 ont des vertus médicinales et avec un taux d’endémisme de près de 85% [28]. Un label dont jouit Madagascar est donc sa diversité biologique.

Le genre Tambourissa Sonn. est représenté par environ 43 espèces exclusivement distribuées sur les îles de l’ouest de l’océan indien : à Madagascar pour la plupart (26 spp.), aux Comores (5 spp.) et sur les îles Mascareignes : l’île Maurice (10 spp.) et l’île de la Réunion (2 spp.) [24]. Une des espèces endémiques à Madagascar est Tambourissa purpurea (MONIMIACEAE) qui est une espèce aromatique d’un intérêt thérapeutique notable. Cette plante, en particulier ses feuilles, est connue traditionnellement pour ses multiples propriétés médicinales telles que le traitement des maladies gingivales, et notamment en gargarisme dans les angines difficiles à réduire [6]. Il est intéressant de pouvoir évaluer ces pratiques traditionnelles et de vulgariser ces propriétés dès qu’elles sont prouvées. Ainsi, notre démarche consiste à extraire les biomolécules contenues dans le végétal pour en étudier les structures moléculaires sur lesquelles repose l’activité biologique. Le présent travail s’est focalisé sur l’étude des huiles essentielles du végétal et leur variabilité chimique d’un individu à un autre au sein d’une même population, et également entre individus issus de sites différents. Les corrélations pouvant exister entre variabilité chimique, diversité génétique et caractéristiques des sites de collecte sont à considérer.

Pour atteindre cet objectif, trois grandes parties sont réalisées dans cette étude. La première partie présente une synthèse bibliographique sur l’aspect botanique de l’espèce T. purpurea et sur les études déjà réalisées sur l’espèce. La deuxième partie décrit les méthodes expérimentales de nos travaux effectués sur terrain avec une présentation du matériel végétal et les sites de cueillette, et la méthodologie au

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 1 Introduction laboratoire avec notamment la description des méthodes de caractérisation des huiles essentielles où le choix des techniques d’analyse s’avère capital. Enfin, la troisième partie regroupe les résultats de caractérisation des huiles essentielles de T. purpurea ainsi que les analyses statistiques des données.

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 2

PARTIE I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

Synthèse bibliographique

I. PRESENTATION BOTANIQUE DE Tambourissa purpurea

1. Systématique [48] [24]

Parmi les classifications basées essentiellement sur des critères morphologiques et anatomiques, celle de Cronquist est la plus utilisée. Elle définit l’appartenance de T. purpurea comme suit :

- Règne Plantae - Embranchement des Spermatophyta (Plantes à graines) - Sous-embranchement des Angiospermae (Plantes à fleurs) - Classe des Magnolopsidaea - Sous-classe des Magnoliideae - Ordre des Laurales - Famille des Monimiaceae - Sous-famille Mollinedioideae - Genre Tambourissa - Espèce Tambourissa purpurea

2. Généralités sur la famille des Monimiacées et le

genre Tambourissa [3] [12] [24] [46]

Les Monimiacées sont des buissons ou arbres, dioïques ou monoïques, généralement aromatiques et qui sont des plantes considérées comme toniques, stimulantes, digestives ou carminatives. Elles sont représentées à Madagascar par 5 genres et 43 espèces dont 4 genres sont endémiques de la Grande Ile :

• Phanerogonocarpus (Madagascar) • Ephippiandra(Madagascar) • Decarydendron(Madagascar) • Hedycaryopsis(Madagascar)

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 3 Synthèse bibliographique

• Tambourissa (Madagascar et Mascareignes)

Le genre Tambourissa a atteint le plus haut niveau de spécialisation morphologique florale de tous les Monimiacées malgaches dans la sous-famille Mollinedioideae et compte 26 espèces parmi lesquelles 19 sont endémiques de Madagascar (tableau 1).

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 4 Synthèse bibliographique

Tableau 1 : Les espèces du genre Tambourissa

N° Espèce Endémicité à Madagascar 1 Tambourissa amplifolia(Boj.) A. DC Non endémique 2 Tambourissa baronii Drake endémique 3 Tambourissa bathiei Cavaco endémique 4 Tambourissa capuronii Cavaco endémique 5 Tambourissa castri-delphinii Cavaco endémique 6 Tambourissa decaryana Cavaco endémique 7 Tambourissa floricostata Cavaco endémique 8 Tambourissa gracilis Perk endémique 9 Tambourissa hildebrandtii Perk endémique 10 Tambourissa humbertii Cavaco endémique 11 Tambourissa leptophylla (Tul.) A. DC Non endémique 12 Tambourissa leptophylla Drake endémique 13 Tambourissa madagascariensis Cavaco endémique 14 Tambourissa microphylla Perk endémique 15 Tambourissa nitida Danguy endémique 16 Tambourissa obovata (Tul.) A. DC Non endémique 17 Tambourissa parvifolia Bak. Endémique 18 Tambourissa pedicellata Bak Non endémique 19 Tambourissa peltata Bak Non endémique 20 Tambourissa perrieri Drake Endémique 21 Tambourissa purpurea (Tul.) A. DC Endémique 22 Tambourissa quadrifida Drake, non Sonn Non endémique 23 Tambourissa religiosa (Tul.) A. DC Non endémique 24 Tambourissa rota Bak Endémique

25 Tambourissa trichophylla Bak, une variante de Endémique Thouvenotii (Danguy) Cavaco 26 Tambourissa uapacifolia Cavaco Endémique

Source : Annals of Missouri Botanical Garden [3]

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 5 Synthèse bibliographique

3. Description Botanique de l’espèce Tambourissa

purpurea (Tul) A.DC [12] [10]

La description morphologique de l’espèce est résumée dans le tableau 2, et des représentations photographiques sont données aux figures 1 et 2.

Tableau 2 : Description morphologique de l’espèce T. purpurea

Espèce Tambourissa purpurea Morphologie générale Arbuste dioïque de 4-5 m de hauteur ou petit arbre de 8-10 m de haut ; à feuilles persistantes, à rameaux serrés droits Feuilles Feuilles oblongues-lancéolées, de 5-8 cm de long et de 1,8 - 3,5 cm de large, atténuées à cunéiformes à la base, coriaces, entières, glabres, d’un vert luisant, à nervures secondaires non proéminentes, à nervures tertiaires indistinctes ; pétiole grêle, d’environ 1 cm de long. L’appareil Les Fleurs mâles globuleuses ont environ 7 mm de diamètre, reproducteur elles sont déchirées au sommet en 4 petits lobes non étalés : étamines nombreuses ; pédicelle de 5mm de long.

Les Fleurs femelles sont solitaires, terminales, à pédicelle de 5-10 mm de long, globuleuses-filiformes, glabres, divisées au sommet en 4 petits lobes inégaux. Les fruits Les fruits sont globuleux, de la grosseur d’un œuf, qui s’ouvre à maturité en se déchirant en 4 segments qui se renversent en dehors et montre une pulpe d’un très beau rouge ;

Les fruits sont des drupes épaisses, ovales, anguleuses, brunes acuminées, de 1 cm de long.

Source : CAVACO A. [12]

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 6 Synthèse bibliographique

Figure 1: Arbuste, feuilles et fruits de T. purpurea

Source : auteur + OSSART A. et GAULIARD DIENG A. [30]

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 7 Synthèse bibliographique

Figure 2: Planche botanique de trois espèces du genre Tambourissa.

Source : CAVACO A. [12]

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 8 Synthèse bibliographique

4. Noms vernaculaires de l’espèce [6]

Cette espèce est connue sous divers noms vernaculaires tels que : • Ambora (Merina, Betsimisaraka, Tanala) • Amboraberavina (Bezanozano) • Amboramangidy (Merina) • Amboravavy (Merina, Bezanozano) • Vanaka (Betsileo, Tanala)

5. Répartition géographique [3]

L’espèce Tambourissa purpurea , plante endémique de Madagascar, est essentiellement rencontrée dans la forêt humide de moyenne altitude :

• Vers le Sud : Ambositra ; Ambalavao ; Ihosy ; Isalo. • A l’Ouest et au Nord Ouest : dans la réserve naturelle N°4 de Mahajanga ; Marovato ; Ambanja. • Vers l’Est : Mandraka ; Tamatave ; FoulePointe ; Fénérive Est ; Soanierana Ivongo ; Sainte Marie ; Morarano, sur le littoral entre Mahanoro et Vatomandry ; Ambila (forêt littorale). • Au Centre : Anjozorobe ; Tampoketsa ; Ankazobe ; Andramasina ; Park Tsimbazaza ; vallées d’Ambohimanga Sud ; Vakinankaratra ; Ambatolampy, bord de la rivière Onive, près de Tsinjoarivo. • Au Sud Est : à travers la forêt montagneuse dans les Chaînes Anosyennes de Fort Dauphin à Ranomafana, Fort Dauphin. • Localisations incertaines : Alaotra ; Centre de Majakatompo ; Antongona .

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 9 Synthèse bibliographique

La carte de la figure 3 donne une indication de la répartition géographique de l’espèce T. purpurea à Madagascar.

Figure 3 : Localisation de l’espèce T. purpurea à Madagascar

Source: Annals of Missouri Botanical Garden [3]

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 10 Synthèse bibliographique

6. Vertus thérapeutiques traditionnelles [21] [22] [37] [48]

L’espèce T. purpurea possède une large gamme d’utilisations thérapeutiques :

• La décoction de feuilles présente des propriétés fébrifuges. Ainsi, dans les angines difficiles à réduire telle que l’angine de Vincent, sa décoction est employée en gargarisme. De même, le décocté est bu, et est employé en lotion sur les lésions externes dans la syphilis secondaire.

• La plante présente aussi des effets astringents, tonifiants, hémostatiques, antalgiques, désinfectants, antiseptiques, cicatrisants. Les populations l’utilisent également pour soigner les signes de troubles mentaux, les névralgies, ou comme « tambavy » pour les enfants.

• Les tisanes ou infusés de feuilles seraient ocytociques et efficaces contre les crises d’hystérie, et les dysménorrhées.

• La feuille pilée est utilisée en odontologie populaire pour traiter les maladies de gencives, carie, pyorrhée, stomatite ; d’autres formes d’utilisation sont en masticatoire et bain de bouche ; les feuilles de T. purpurea sont utilisées comme substitut des dentifrices.

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 11 Synthèse bibliographique

II. ETAT DE LA RECHERCHE SUR T. purpurea .

A notre connaissance, les seuls travaux se rapportant à l’espèce T. purpurea sont ceux réalisés par RAZAFIMAHATRATRA [48] ; ils concernent l’étude d’HE et d’extrait brut de feuilles du végétal.

1. Etude des huiles essentielles de feuilles de T.

purpurea

RAZAFIMAHATRATRA a donné les caractéristiques des huiles essentielles de feuilles de T. purpurea : ce sont des huiles légères, d’un faible rendement (0,15%), et sont légèrement dextrogyres pour les échantillons étudiés qui ont été récoltés à Ambatofotsy pendant la période de fructification du végétal. L’identification moléculaire des constituants des HE a révélé la prédominance des composés sesquiterpéniques dans la composition chimique, dont près de 48% de sesquiterpénoïdes oxygénés, et 23,6% sous forme d’hydrocarbures.

2. Criblage phytochimique d’extrait de feuilles

L’auteur a démontré que l’extrait brut éthanolique des feuilles étudiées est riche en la plupart des familles chimiques testées (Flavonoïdes, Leucoanthocyanes Anthocyanes, Tanins et polyphénols, Stérols insaturés, Triterpènes, Stéroïdes, Désoxy – 2 – sucres), à l’exception des alcaloïdes et des saponines qui y sont absents.

3. Evaluation des activités antimicrobiennes

Les travaux de RAZAFIMAHATRATRA ont apporté les preuves d’une très bonne activité antimicrobienne de l’huile essentielle de feuilles sur les micro-organismes pathogènes Gram (+) et Gram (-), en particulier sur S. aureus , faisant de cette HE un substitut potentiel aux antibiotiques en cas d’intoxication alimentaire. A l’inverse, les extraits aux solvants organiques polaires ou apolaires ont une activité plus sélective en inhibant préférentiellement la souche S. aureus .

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 12 Synthèse bibliographique

III. DEFINITIONS ET UTILISATIONS DES HUILES ESSENTIELLES

1. Définitions d’une huile essentielle

Selon AFNOR (1992) [1], les huiles essentielles sont les composés volatils et odorants contenus dans divers organes des plantes : fleurs, feuilles, tiges, écorces, bois, brindilles, racines. Elles présentent une composition chimique complexe avec une dizaine et quelque fois une centaine de constituants qui peuvent être classés globalement en deux catégories : les composés terpéniques et les composés aromatiques. Les principaux groupes de produits sont les monoterpènes en C10 et les sesquiterpènes en C15, hydrocarbures ou produits oxygénés : oxydes, aldéhydes, éthers, alcools [34]. Ainsi, les huiles essentielles renferment plusieurs composants naturels différents aussi bien par leurs propriétés physico-chimiques que par leurs structures.

Selon AFNOR (2000) [2], l’huile essentielle est définie comme un produit obtenu à partir d’une matière végétale, soit par l’entrainement à la vapeur, soit par des procédés mécaniques à partir de l’épicarpe de citrus, soit par des procédés physiques ; elle peut subir des traitements physiques n’entrainant pas de changement significatif de sa composition.

Dans la 8 ème édition de la pharmacopée française [34], les huiles essentielles sont des produits de composition généralement assez complexe renfermant les principes volatils contenus dans les végétaux et plus ou moins modifiés au cours de la préparation.

2. Utilisations des huiles essentielles

Autrefois, les huiles essentielles avaient surtout trouvé leur usage en pharmacie. Actuellement, elles sont largement exploitées en parfumerie et cosmétologie, qui sont le débouché principal des huiles essentielles, et aussi en pharmacie et pour la préparation des arômes alimentaires. Son faible volume utile permet une grande facilité de transport

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 13 Synthèse bibliographique et d’emploi. Les huiles essentielles s’utilisent sans préparation particulière, pures ou diluées, unitairement ou en complexes synergiques ou complémentaires. En fonction de leur application, elles peuvent être groupées en trois classes : • les huiles essentielles d’intérêt médicinal • les huiles essentielles d’utilité industrielle • les huiles essentielles de parfumerie

2.1 Les huiles essentielles d’intérêt médicinal [23]

Plusieurs travaux ont montré que les huiles essentielles possèdent un large spectre d’activité antimicrobienne. Le pouvoir antimicrobien élevé des huiles essentielles est attribué à leur richesse en produits oxygénés monoterpéniques et composés phénoliques. La pharmaceutique utilise également les HE dans l’aromathérapie pour ses propriétés fonctionnelles comme antimicrobien, antiparasitaire, antiviral…

2.2 Les huiles essentielles d’utilité industrielle [49] [23]

Actuellement, les huiles essentielles prennent de plus en plus de place dans les industries agroalimentaires et les industries chimiques. En agroalimentaire, les extraits aromatiques jouent essentiellement le rôle de condiment (poivre, gingembre), d’exhausteur de goût (agrumes), d’aromatisant (menthe, thym) ou d’antioxydant et de conservateur. Les huiles essentielles sont ainsi utilisées dans les boissons, dans la confiserie, les produits laitiers carnés, les soupes, sauces, la boulangerie, la nutrition animale et l’aromatisation de la viande. Dans les industries chimiques, certaines huiles essentielles se sont montrées actives contre les insectes ravageurs en présentant un effet répulsif. Les industries de la savonnerie utilisent également les huiles essentielles.

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 14 Synthèse bibliographique

2.3 Les huiles essentielles de parfumerie [49]

Les industries de parfumerie et de cosmétique utilisent des huiles essentielles dans la formulation des produits. Ces industries consomment plusieurs quantités d’essences venant directement des pays producteurs en tant que matière première. Les huiles essentielles extraites des plantes de Madagascar telles que l’Ylang-ylang , le Palma Rosa , le Basilic entrent dans la composition de certains parfums haut de gamme.

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 15

PARTIE II : METHODES EXPERIMENTALES

Méthodes expérimentales

IV. TRAVAUX SUR TERRAIN

1. Matériel végétal

La sécrétion de l’huile essentielle n’est pas uniforme en quantité et en qualité dans les différentes parties de la plante. La composition peut varier suivant les organes de la plante concernés où les mécanismes de biosynthèse sont différents.

Les feuilles de T. purpurea sont les matières premières utilisées dans la présente étude. La quantité de feuilles nécessaire est d'environ 1500 g pour chaque opération de distillation.

2. Collecte des échantillons de Tambourissa purpurea et

sites d’études

Les huiles essentielles doivent être parfaitement définies quant à l’origine botanique des plantes mères (famille, genre, espèce, variété) et quant à leurs biotopes afin que leurs constituants moléculaires et leur composition, donc leurs propriétés, soient également bien définis et scientifiquement utilisables sans risque d’échec, d’inconvénient, voire de toxicité [23].

2.1 Sites de collecte

La collecte des échantillons a été effectuée sur deux sites où une étude récente a révélé la biodisponibilité de la plante : le résidu de forêt d’Ambatofotsy et environs (Ambatofotsy I, Ambatofotsy II et Ambatofahavalo) dans la région d’Analamanga [48], et le corridor de Fandriana. En vue d’accéder à la variabilité de la composition chimique de l’huile essentielle, la collecte d’échantillons a été effectuée arbre par arbre. Notons que les végétaux y poussent à l’état sauvage.

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 16 Méthodes expérimentales

Les images de la figure 4 indiqu ent la position géographique des sites de récolte par rapport à Antananarivo. Fandriana se trouve à une distance routière de 287 km d’Antananarivo Ville tandis qu’Ambatofotsy se trouve à 21 km de la Ville d’Antananarivo. Les autres sites (Ambatofotsy II et Ambatofahavalo) situés aux environs de la ville d’ Ambatofotsy sont dans un rayon de 5 à 15 km de celle -ci.

Figure 4: Les sites de récolte par rapport à Antananarivo.

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 17 Méthodes expérimentales

2.2 Période de collecte

Le rendement et la composition de l’huile essentielle peuvent considérablement varier selon la saison de la récolte. Très souvent, il est constaté que la période pendant laquelle le rendement est le meilleur ne coïncide pas toujours au moment où la qualité de l’essence est excellente. Il convient alors de faire une étude de l’évolution saisonnière de la composition des huiles essentielles en vue de définir la période optimale de la récolte.

La collecte des feuilles de Tambourissa a eu lieu entre le 23 mai et le 09 septembre 2011. Cette période correspond à la saison sèche sur les Hautes terres.

2.3 Traitement de la matière végétale avant transformation

Lors du stockage du végétal, l’air, la température, le soleil, l’échauffement entas des feuilles peuvent produire des modifications biochimique et physique de l’huile essentielle. Les conditions du meilleur stockage des huiles essentielles doivent être déterminées pour chaque espèce.

Etant donné la proximité des sites de collecte, les feuilles n’ont pas eu à subir de traitements particuliers. Elles sont mises dans un sachet en plastique et sont directement soumises à l’extraction de l’huile essentielle dès l’arrivée à Antananarivo, généralement le jour même de la récolte.

3. Méthodologie de détermination botanique du végétal

Chaque échantillon récolté a été mis en herbier pour être vérifié par un botaniste de MBG (Missouri Botanical Garden), puis comparé à des spécimens de l’herbarium du PBZT où s’est effectuée la détermination finale, documents à l’appui [12]. L’ambiguïté entre les espèces T. purpurea et T. rota a été ainsi définitivement levée. L’identification botanique est une étape cruciale car la composition chimique d’une HE varie en fonction de l’espèce botanique.

La figure 5 montre deux exemples d’herbiers de référence de T. purpurea qui témoignent de l’authenticité de nos échantillons.

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 18 Méthodes expérimentales

Tambourissa purpurea (Tul) A. DC. Tambourissa purpurea (Tul) A. DC

Fianarantsoa Ambalavao Antananarivo Anjozorobe

Arbuste de 2m, feuilles vertes foncées et Arbuste de 2m, feuilles vertes foncées et lisses, jeune fruit vert. lisses, fruits marron.

Figure 5 : Herbiers de Tambourissa purpurea

Source : PBZT.

4. Présentation des échantillons

Afin d’apporter une meilleure compréhension à l’exploitation des résultats, le regroupement dans le tableau 3 des échantillons d’HE obtenues s’avère utile. Les lieux et dates de collecte y sont mentionnés. Chaque HE représente un pied d’arbre.

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 19 Méthodes expérimentales

Tableau 3 : Présentation des échantillons étudiés

N° échantillons Lieu de collecte Date de collecte

HE 01 AMBATOFOTSY I 23/Mai/11

HE 02 AMBATOFOTSY I 26/Mai /11

HE 03 FANDRIANA 22/Juin/11

HE 04 AMBATOFAHAVALO 27/Juin /11

HE 05 AMBATOFAHAVALO 27/Juin /11

HE 06 FANDRIANA 02/Juillet/11

HE 07 AMBATOFOTSY I 07/Juillet /11

HE 08 AMBATOFOTSY I 07/Juillet /11

HE 09 AMBATOFOTSY I 15/Juillet /11

HE 10 AMBATOFAHAVALO 20/Juillet /11

HE 11 AMBATOFAHAVALO 20/Juillet /11

HE 12 AMBATOFOTSY I 12/Août/11

HE 13 AMBATOFOTSY II 14/Août /11

HE 14 AMBATOFOTSY II 14/Août /11

HE 15 AMBATOFOTSY II 19/Août /11

HE 16 FANDRIANA 31/Août /11

HE 17 AMBATOFAHAVALO 09/Septembre/11

HE 18 AMBATOFAHAVALO 09/Septembre/11

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 20 Méthodes expérimentales

La figure 6 montre la localisation des sites d’Ambatofotsy I, Ambatofotsy II et Ambatofahavalo l’un par rapport à l’autre .

E : 1km Figure 6 : Carte représentant les sites Ambatofotsy I, Ambatofotsy II et Ambatofahavalo.

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 21 Méthodes expérimentales

V. TRAVAUX DE LABORATOIRE

1. Extraction des HE

1.1 Généralités

Il convient de souligner l’importance de la manière dont la plante aromatique est traitée pour en extraire sa quintessence depuis sa culture jusqu’à l’extraction et le stockage de l’HE. Sa qualité et son efficacité en dépendent.

Les technologies d’extraction d’HE varient à la fois selon le type de végétaux traités (dur ou tendre), la nature de l’essence produite (volatilité, fragilité), la qualité recherchée, l’utilisation finale (parfumerie, alimentaire, pharmacie), et la capacité de charge de l’installation.

Plusieurs procédés sont connus et pratiqués, dont les plus récents sont l’extraction par micro-ondes [32] et l’extraction par fluide supercritique [33]. L’entraînement à la vapeur par hydrodistillation reste cependant la méthode la plus utilisée tant à l’échelle de laboratoire qu’à l’échelle industrielle, par la facilité et le coût moindre de sa mise en œuvre.

Le principe de l’hydrodistillation consiste à vaporiser la substance odorante contenue dans le végétal et ensuite à la liquéfier pour la recueillir. En d’autres termes, les constituants volatils de la matière végétale sont entraînés par la vapeur d’eau, puis après condensation par passage dans un réfrigérant à co-courant (la circulation de l’eau de réfrigération va dans le même sens que celle de l’HE), se séparent par différence de densité. L’eau peut être renvoyée dans la cuve d’extraction : c’est la cohobation. C’est ce procédé qui a été adopté pour l’extraction au laboratoire de chacun de nos échantillons.

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 22 Méthodes expérimentales

1.2 Technique d’extraction de T. purpurea 1.2.1 Matériels utilisés

L’extracteur comporte les éléments présents dans le montage de la figure 7, à savoir :

Un chauffe-ballon utilisé comme source de chaleur
Un ballon pour la charge de la matière végétale et l’eau
Un essencier pour séparer l’huile essentielle de l’eau florale
Un réfrigérant pour la condensation de la vapeur contenant l’huile essentielle

Figure 7: Hydrodistillateur à l’échelle de laboratoire

1.2.2 Mise en œuvre de l’extraction

Pour faciliter le chargement du ballon et l’entraînement des constituants volatils du végétal, l’échantillon est préalablement découpé en petits morceaux.

On porte à ébullition le contenu du ballon (1500 g de matière végétale et 1 L d’eau) pendant une durée de 3h environ pour chaque échantillon. Comme la densité de l’huile

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 23 Méthodes expérimentales essentielle de T. purpurea est inférieure à celle de l’eau, l’HE surnage, formant ainsi la phase supérieure.

Les huiles essentielles sont conservées dans un récipient hermétique à l’abri de la lumière et à faible température pour prévenir l’altération de la composition chimique.

2. Rendement de l’extraction en HE de T. purpurea

L’HE récupérée est pesée dans le but de déterminer le rendement pondéral. La teneur en huile essentielle du matériel végétal est donnée par la formule suivante :

(%) = 100

Où est la masse de l’huile essentielle (en g)

est la masse de la matière végétale (en g)

BENINI [5] a relevé certains facteurs techniques responsables de la variabilité en rendement des HE. Les facteurs affectant les rendements à l’extraction des huiles essentielles sont les suivants :

• une mauvaise conduite de la distillation via :  mauvaise gestion de la chauffe ;  mauvais refroidissement du système de condensation. • un matériel végétal de mauvaise qualité.

Il convient ainsi de maintenir une chauffe régulière tout au long de l’extraction, et d’assurer un système de réfrigération efficace pour une condensation optimale des vapeurs d’HE.

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 24 Méthodes expérimentales

3. Caractérisation de l’HE de T. purpurea

Les huiles essentielles se différencient des autres huiles par leur volatilité, et entre elles par leurs caractéristiques organoleptiques, leurs caractéristiques physico-chimiques et leur composition chimique.

Par insuffisance de quantité d’HE obtenue par hydrodistillation, seule la composition chimique des HE a été déterminée pour l’ensemble des échantillons HE01 à HE18.

3.1 Analyse qualitative des HE de T. purpurea

Une huile essentielle contient des composés chimiques très complexes. Il s’agit de plusieurs assemblages moléculaires très divers, ayant chacun des propriétés différentes. La nécessité d’une connaissance approfondie de ces constituants chimiques est fondamentale pour une utilisation ultérieure, surtout en thérapeutique.

La figure 8 donne un aperçu des 3 approches possibles en vue de l’identification moléculaire des constituants d’un mélange naturel, en l’occurrence ceux des huiles essentielles.

CPG-SM CPG(Ir) CPGxCPG

CPG-SM-SM CPG-IRTF CPG-SM-IRTF CLHP-SM

Voie A CLHP-CPG-SM CLHP-RMN1H

MELANGE NATUREL RMN DU CARBONE-13 IDENTIFICATION

Voie C

Voie B CC ; CCM ; SM + IR + CLHP ; CPG RMN 1H& 13C

Figure 8: Les méthodes d’analyse d’un mélange naturel

Source : TOMI F. et al [52]

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 25 Méthodes expérimentales

La voie A utilise des méthodes de couplage entre un système de séparation chromatographique et un détecteur constitué par un spectromètre.

La voie B préconise une étape d’isolement de chaque constituant du mélange préalablement à une identification basée sur les méthodes spectroscopiques.

La voie C ne nécessite aucune séparation préalable des constituants ; un spectre RMN 13 C est enregistré directement sur le mélange naturel, ce qui représente un avantage considérable. C’est une approche toute récente, mais qui trouve déjà beaucoup d’applications. C’est cette voie C qui a été adoptée dans la présente étude et nous en donnons ci-après le principe et les conditions opératoires.

3.1.1 Principe de l’identification moléculaire par la RMN13 C [31] [52]

Le principe consiste à attribuer les raies de résonance de chacun des carbones de chaque composé à partir du spectre unique du mélange par comparaison à des produits de référence répertoriés dans une bibliothèque informatisée ou banque de données. La spectroscopie RMN 13 C renseigne sur le squelette carboné de la molécule. L’individualisation des signaux du spectre du mélange dépend de plusieurs paramètres :

la complexité du mélange et le nombre de carbones constitutifs de chacun des constituants ;
les différences entre les concentrations relatives des divers constituants ;
les similitudes observées au niveau de tout ou partie des squelettes carbonés des molécules, provoquant la superposition des signaux des carbones ayant les mêmes environnements magnétiques.

Dans l’attribution de signaux à un constituant, les considérations ci-après sont à prendre en compte :

le nombre de pics observés par rapport au nombre de pics attendus pour le constituant considéré ;
le nombre de superpositions des signaux ;

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 26 Méthodes expérimentales

les variations des déplacements chimiques des carbones dans le spectre du mélange par rapport aux valeurs de référence ( ∆δ ) ;
l’intensité du signal observé qui permet éventuellement de contrôler son appartenance au constituant.

L’apport de la RMN 13 C à l’analyse d’un mélange complexe de constituants est intéressant en ce sens qu’elle permet, dès lors que leur teneur est supérieure à 0,5% et qu’ils sont présents dans les bibliothèques de référence, d’identifier rapidement et sans ambiguïté certains composés dont l’analyse par les techniques conventionnelles est problématique. D’une manière générale :

tous les carbones sont observés à l’exception des carbones quaternaires des composés minoritaires ;
les variations des déplacements chimiques sont inférieures ou égales à 0,05 ppm pour la grande majorité des carbones ;
le nombre de superpositions est limité grâce à l’étendue de la largeur spectrale (250ppm), et n’empêche aucunement l’identification d’un composé par l’observation d’au moins 50% des carbones qui lui appartiennent en propre.

En présence d’une huile essentielle très complexe, la mise en œuvre de technique telle que la RMN 13 C s’avère nécessaire pour réduire les erreurs d’identification des constituants, en particulier les sesquiterpènes.

Toutefois, il est possible d’obtenir une composition détaillée et fiable d’une huile essentielle en combinant la chromatographie rapide (chromatographie Flash) sur colonne de silice avec l’analyse par RMN 13 C des fractions.

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 27 Méthodes expérimentales

3.1.2 Conditions opératoires

Les spectres RMN ont été enregistrés sur un appareil Brüker Avance 400 opérant à 9,4 T (100,63 MHz en 13 C) avec une sonde de 5mm et à la température ambiante de 21°C. Les déplacements chimiques sont donnés en ppm ( δ) par rapport au TMS pris comme le zéro de référence. Les enregistrements de spectres RMN 13 C sont effectués avec une largeur spectrale complète de 250 ppm.

3.2 Analyse quantitative des HE de T. purpurea [27]

Les techniques chromatographiques sont largement mises en œuvre pour la détermination des teneurs relatives des différents constituants de l’huile essentielle. Comme techniques chromatographiques, on peut citer la chromatographie en phase liquide basse pression (CLBP), la chromatographie en phase gazeuse (CPG) et la chromatographie en phase liquide haute performance (CLHP). Cependant la méthode par CPG reste la plus employée dans l’analyse quantitative des huiles essentielles, car c’est la meilleure technique permettant une analyse fiable et reproductible de la qualité d’une huile essentielle. Dans la très grande majorité des cas, la quantification des composés préalablement identifiés par RMN 13 C est réalisée sans aucune difficulté par la CPG, sur colonne apolaire ou polaire en fonction de la composition et en combinant classiquement les résultats des deux colonnes quand il y a des superpositions.

3.2.1 Principe de l’analyse par CPG

Cette méthode consiste à séparer des mélanges complexes, naturellement gazeux ou volatilisés par élévation de la température, par une suite continue d’équilibres s’établissant entre une phase mobile gazeuse et une phase stationnaire liquide, ou parfois solide, placée à l’intérieur d’une colonne. Les substances parcourent la totalité de la colonne et sont détectées à son extrémité, faisant de cette méthode une chromatographie d’élution.

La nécessité de maintenir les molécules à l’état gazeux implique que toute l’opération chromatographique se réalise à une température compatible avec cet état sans provoquer leur destruction.

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 28 Méthodes expérimentales

Le détecteur du chromatographe est relié à un enregistreur qui calcule automatiquement l’aire du chromatogramme, ce qui permet d’accéder à la valeur de concentration de chaque constituant du mélange de départ.

3.2.2 Conditions opératoires

Les analyses sont effectuées sur un appareil Perkin Elmer Autosystem équipé d’une double colonne capillaire (50 m x 0,22 mm x 0,25 m), polaire (BP-20, polyéthylène glycol) et apolaire (BP-1, diméthylsiloxane) et comportant des détecteurs à ionisation de flamme.

Paramètres de l’opération :

gaz vecteur hydrogène
pression en tête de colonne : 1,4 bar
température de l’injecteur : 250°C
programmation de température 60-220 °C à 2°C/mn av ec un palier de 20 mn à 220 °C
injection en mode split.

4. Etude de variabilité de la composition chimique des

HE de T. purpurea

L’étude des variations de concentration de chaque constituant effectuée sur un grand nombre d’échantillons peut conduire à proposer des profils de composition-type d’une catégorie d’huiles essentielles données.

Il est connu que la composition chimique des huiles essentielles extraites d’une même espèce est très fluctuante. Plusieurs facteurs interviennent dans la variabilité de la composition d’une huile essentielle, entraînant des modifications de sa qualité. Signalons entre autres :

• le polymorphisme chimique ou chémotype

Le premier paramètre influençant la composition chimique d’une plante est sa biosynthèse et donc son profil génétique. Au sein d’une même espèce, la composition

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 29 Méthodes expérimentales chimique d’une huile essentielle peut présenter une grande diversité ; et on emploie le terme « variétés chimiques » ou « chémotypes ». Ainsi, une même espèce peut présenter plusieurs chémotypes de profils chimiques différents. Il s’agit en fait de races chimiques.

Cette variation chimique permet de définir précisément la nature des sous-espèces, des variétés, des cultivars et des taxons des plantes aromatiques. C’est une notion capitale en aromathérapie. On utilise également la notion de chémotype pour établir une classification des huiles essentielles et pour les caractériser.

• les conditions environnementales

Les conditions environnementales, comme les facteurs écologiques et géographiques, influencent aussi la composition. La température, la quantité de lumière, la pluviométrie, les conditions édaphiques représentent autant de causes potentielles de variations de la composition chimique d’une plante aromatique donnée.

Notre principal objectif est d’évaluer la variabilité de la composition chimique selon la zone de collecte en observant l’évolution des composants qui sont régulièrement présents dans les échantillons.

Rappelons que les échantillons ont été tous récoltés de Mai à Septembre, c'est-à-dire pratiquement à la même période de saison sèche.

L’utilisation de la RMN 13 C en tandem avec les méthodes d’analyses statistiques est particulièrement adaptée à la mise en évidence de la variabilité chimique qui nécessite l’analyse d’un grand nombre d’échantillons.

On peut tirer avantage de cette démarche dans l’étude de la variabilité des HE de T. purpurea

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 30 Méthodes expérimentales

5. Méthodes d’analyses statistiques

De nos jours, les techniques statistiques se prêtent de plus en plus à de nombreux domaines (biométrie, psychométrie, mécanique statistique, théorie des décisions…). Dans ces différents domaines ou différentes branches, la première utilité accordée aux statistiques provient de l’agrégation rapide en résultats simples et concis d’une quantité importante de données de toute sorte (qualitatives, quantitatives, économiques, sociologiques…). Le but ultime est de tirer des conclusions et de pouvoir avancer des hypothèses, voire effectuer des prévisions en espérant avoir su interpréter correctement les données.

5.1 Statistique classique [29]

Dans le but de déterminer les valeurs limites des teneurs en constituants des huiles essentielles, les méthodes statistiques classiques utilisant les fonctions suivantes : minimum, maximum, moyenne, écart-type sont à appliquer.

5.1.1 La moyenne

Une fois les données recueillies et présentées sous forme de tableaux, le travail d’analyse commence par le calcul d’un nombre qui puisse résumer à lui seul l’ensemble des données. La moyenne, une valeur caractéristique d’un ensemble de nombres, est la mesure la plus couramment utilisée pour refléter la tendance centrale d’un échantillon. Elle est donnée par la formule :

∑ =

Xi : variables

∑ : Somme des x pour i variant de 1 à n i

5.1.2 L’écart-type

L'écart-type est la mesure de dispersion la plus couramment utilisée en statistique lorsqu'on emploie la moyenne pour calculer une tendance centrale. Il mesure donc la dispersion autour de la moyenne. Il est aussi utile quand on compare la dispersion de deux ensembles de données séparés qui ont approximativement la même moyenne.

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 31 Méthodes expérimentales

L’écart-type est la racine carrée de la variance ; sa formule s’écrit :

= ∑( − )

Si l’écart-type est faible, les valeurs de l’échantillon sont regroupées autour de la moyenne ; s’il est important, au-delà de 5, elles sont en revanche très dispersées.

5.2 Analyse factorielle multidimensionnelle

La méthode est abondamment décrite dans la littérature [11], [14], [16], [25], [26], [51]

D’une manière générale, l’obtention de nombreuses données expérimentales sur des populations à effectifs élevés aboutit à un volume d’informations très important qui pose alors des problèmes d’interprétations en vue de l’exploitation de ces données. Ainsi, l’analyse factorielle de ces données est devenue une opération courante pour en extraire le maximum d’informations. Elle a pour objectif de donner :

• une représentation synthétique de l’ensemble des données • la description des relations existant entre les différentes variables (ou caractères) entre elles et avec l’ensemble des individus étudiés. • la classification automatique des individus.

Les techniques couramment utilisées dans le cas de tableau de données quantitatives sont l’analyse en composantes principales ACP et l’analyse factorielle discriminante AFD. Ces méthodes assez puissantes ont trouvé leur extension aussi bien dans la démarche économique que dans des travaux d’analyse chimique.

Dans la mesure où ce sont des méthodes descriptives, elles ne s’appuient pas sur un modèle probabiliste, mais dépendent d’un modèle géométrique.

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 32 Méthodes expérimentales

Grâce au développement de l’outil informatique, leur pleine application a été rendue possible, ce qui a permis de traiter de gros fichiers de données et de résoudre certains problèmes de calcul numérique (diagonalisation de matrices,…).

Le logiciel XLSTAT 2007 qui intègre ces outils statistiques a été adopté pour le traitement des tableaux de données quantitatives sur la composition chimique des huiles essentielles de T. purpurea.

5.2.1 Tests d’hypothèses

Les deux tests de Box permettent de confirmer que l’on peut rejeter l’hypothèse nulle d’égalité des matrices de covariance intra classes et que la différence entre les matrices de covariance intra classes est significative, au seuil α= 0,05.

5.2.1.1 Test de sphéricité de Barlett

Le test de sphéricité de Barlett est un test préliminaire en Analyse en Composante Principale (ACP) permettant de vérifier la significativité de la corrélation entre les variables.

5.2.1.2 Test de Lambda de Wilks

Le test du Lambda de Wilks permet de tester si les vecteurs des moyennes pour les différents groupes sont égaux ou non dans l’Analyse Factorielle Discriminante (AFD).

5.2.2 Analyse en Composante Principale (ACP)

L’Analyse en Composante Principale (ACP), une des variantes de l’analyse multidimensionnelle, est un instrument commode pour résumer un vaste tableau de données difficilement accessible à l’analyse descriptive habituelle.

5.2.2.1 Objectif et principe

L’objectif de l’analyse en composantes principales (ACP) est purement descriptif : il s’agit « d’explorer » un ensemble d’observations rassemblées sous la forme d’un tableau de données à M individus sur N variables quantitatives. Ce tableau peut être de dimensions importantes : le nombre de lignes (d’unités statistiques) peut atteindre plusieurs centaines, et le nombre de colonnes (de variables) plusieurs dizaines.

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 33 Méthodes expérimentales

En d’autres termes, son objectif est de représenter sous forme graphique, construit de manière à ce que la dispersion entre les données soit aussi bien préservée que possible, l’essentiel de l’information contenue dans un tableau de données, ceci rendant possible la visualisation et l’analyse rapide des corrélations entre les N variables et les M observations (ou individus) initialement décrites par N variables. L’analyse en composantes principales est fondée sur le calcul des moyennes, variances et coefficients de corrélation. Les données doivent donc être quantitatives.

Dans son principe, partant d’un tableau brut sous forme de matrice, l’ACP consiste à faire un centrage et une réduction des données afin d’éviter les biais dus à la disparité des unités de mesure, puis à réduire le nombre d’axes afin de pouvoir retenir ceux qui expliquent un fort pourcentage de variance et qui, par la suite, constitueront les axes factoriels ou « composantes principales ». Ces deux processus permettront la visualisation. Les relations entre regroupements d’individus et variables seront interprétées en cherchant celles qui semblent caractéristiques de chaque regroupement.

5.2.2.2 Interprétation

Afin de faciliter la compréhension de l’interprétation, quelques règles d’interprétation des nuages projetés sont résumées comme suit :

- Une proximité entre les projections de deux points observations s’interprète comme un comportement analogue envers les N variables.

- Une proximité entre deux points variables signifie que les deux variables correspondantes sont corrélées. La corrélation est d’autant plus significative que les points représentatifs de ces variables sont plus éloignés de l’origine. La représentation des variables sur le cercle de corrélation est donc d’autant plus significative à mesure que l’on se rapproche du rayon unité. On peut alors déterminer l’origine des axes factoriels et interpréter une relation entre individus et variables.

- Une proximité entre un point variable et un point observation signifie que la variable joue un rôle important pour l’observation considérée.

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 34 Méthodes expérimentales

Les projections des points individus sur la représentation plane font apparaitre des groupes que l’on interprètera.

Le cercle des corrélations permet alors de représenter très clairement les variables qui ressortent. Les disparités sur les deux premiers axes seront constatées.

5.2.3 Analyse Factorielle Discriminante (AFD)

L’analyse factorielle discriminante est une méthode qui permet de comparer M groupes à l’aide de plusieurs variables. Elle établit la relation entre les groupes d’observations définis par une variable qualitative et plusieurs variables quantitatives. Elle présente la particularité de proposer une règle de classement des observations.

L’application de L’AFD pure n’est optimale que si le nombre d’individus est largement supérieur à celui des variables, et également si les effectifs des groupes sont du même ordre de grandeur.

5.2.3.1 Objectif et principe

L’AFD se propose de rechercher de nouvelles variables ou facteurs discriminants, combinaisons linéaires des variables originelles. Ces nouvelles variables sont les plus discriminantes vis-à-vis des groupes tout en véhiculant le maximum d’informations. Elle permet donc de justifier, et éventuellement de corriger, le classement prédéfini, en obtenant une séparation optimale des M groupes préalablement constitués. Elle détermine également les variables les plus explicatives de la répartition en groupes ou aptes à effectuer cette séparation.

L’AFD est une méthode applicable en deux étapes :

• description et représentation des individus initiaux en divers groupes ; • affectation de nouveaux individus non encore affectés avant l’analyse aux groupes constitués.

L’AFD à but descriptif a pour objectif :

• de rechercher si les groupes constitués sont différenciés par l’ensemble des caractères expérimentaux

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 35 Méthodes expérimentales

• de rechercher le (ou les) sous-ensemble(s) de caractères expérimentaux, ou éventuellement des fonctions de ces caractères qui assure une discrimination optimale des différents groupes.

Cette approche mettra en relief les caractères qui différencient le mieux les différents groupes dans la population de départ.

Dans une seconde phase, l’AFD à but décisionnel permet :

• de mettre en évidence les individus mal classés a priori en les réaffectant à leur véritable groupe d’appartenance • d’affecter de nouveaux individus à l’un des M groupes constitués, et ce, sur la base de leurs caractères expérimentaux.

Cette seconde phase est plus délicate à mettre en œuvre, car elle implique la mise au point de fonctions discriminantes stables, c’est-à-dire les plus indépendantes possibles de la population d’individus étudiée ainsi que la mise en place des tests statistiques afin de pouvoir accepter ou rejeter l’hypothèse : « tel individu peut être affecté à tel groupe », avec un risque d’erreur préalablement fixé.

Le principe de l’AFD est donc de procéder par les étapes suivantes :

• Rechercher dans l’espace à p dimensions une nouvelle base où l’on puisse travailler sur un ensemble plus réduits d’axes (2 à 3) • Eclater au maximum l’ensemble des centres de gravité des groupes pour mieux les différencier • Rassembler les individus dans chaque groupe.

5.2.3.2 Représentation des résultats et Interprétations

Il est à noter que le nombre d’axes discriminants est lié au nombre de groupes. Ainsi, à M groupes définis correspond M-1 axes discriminants. Dans la pratique, on utilise le repère constitué par les 2 premiers axes discriminants.

Les interprétations qui se font entre les axes factoriels et les variables initiales sont analogues à celles de l’ACP.

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 36 Méthodes expérimentales

Les corrélations sont retracées à trois niveaux : sur l’ensemble des observations, sur les moyennes des groupes et sur les valeurs individuelles, après élimination des différences entre les groupes.

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 37 Méthodes expérimentales

Conclusion partielle :

La détermination de la composition chimique des huiles essentielles permet de les caractériser, de mettre en évidence une éventuelle spécificité locale et d’en évaluer la qualité. L’étude des huiles essentielles a montré que le nombre de produits chimiques qui les constituent sont en général multiples, et qu’il est difficile de choisir les plus représentatifs pour définir leur qualité. Ainsi, des méthodes d’analyses statistiques, liées au progrès de l’informatique, sont préconisées afin de traiter rationnellement les données.

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 38

PARTIE III : RESULTATS ET DISCUSSION

Résultats et Discussion

VI. RENDEMENT EN HUILE ESSENTIELLE DE T. purpurea

1. Résultats expérimentaux

Le tableau 4 indique les valeurs de rendement en huile essentielle des 18 échantillons de Tambourissa purpurea par site de récolte.

Tableau 4 : Rendement en HE des échantillons de T. purpurea

AMBATOFOTSY I FANDRIANA n° HE01 HE 02 HE 07 HE 08 HE 09 HE12 HE 03 HE 06 HE 16 date 23/O5 26/05 07/07 07/07 15/07 12/08 22/06 02/07 31/08 2011

R* 0.060 0.074 0.125 0.064 0.083 0.165 0.114 0.197 0.044

AMBATOFAHAVALO AMBATOFOTSY II n° HE 04 HE 05 HE 10 HE11 HE17 HE18 HE 13 HE14 HE15 date 27/06 27/06 20/07 20/07 09/09 09/09 14/08 14/08 19/08 2011

R* 0.100 0.080 0.066 0.062 0.128 0.118 0.104 0.114 0.092

R* : Rendement en % massique

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 39 Résultats et Discussion

2. Interprétation et discussion

Dans l’ensemble, les valeurs du rendement d’extraction sont toutes très faibles et s’échelonnent entre 0,043 et 0,197%. RAZAFIMAHATRATRA [48] avait aussi trouvé des valeurs faibles de l’ordre de 0,14%.

Une analyse site par site permet de faire les commentaires ci-après :

• Sur le site d’Ambatofotsy I, les valeurs sont très variables, pouvant aller du simple à plus du double si on compare par exemple HE01 (0,060%) et HE12 (0,165%). De plus, il est constaté que pour des cueillettes réalisées le même jour, les valeurs de rendement peuvent être très différentes, comme c’est le cas pour HE07 (0,125%) et HE08 (0,064%), traduisant une certaine disparité de caractère d’un individu à l’autre. • Le même phénomène est observé avec les échantillons du site de Fandriana, avec un écart encore plus marqué entre les valeurs extrêmes : 0,044% (HE16) et 0,197% (HE06), soit un facteur de 4,6. • A l’inverse le lot de 3 échantillons d’Ambatofotsy II semble donner des valeurs plus homogènes, presque la même pour HE13 et HE14 cueillis le même jour (0,100%), et légèrement inférieure (0,092%) pour HE15 récolté 5 jours plus tard. • La disparité se manifeste à nouveau dans le lot de 6 échantillons d’Ambatofahavalo avec des valeurs de rendement qui s’échelonnent de 0,062 à 0,128%

Ainsi, le rendement en HE de T. purpurea est globalement faible lorsque la cueillette des feuilles s’effectue pendant la saison sèche sur les Hauts Plateaux. Un calendrier de récolte étalé sur l’année pourra renseigner utilement sur l’effet de la pluviosité sur le rendement en HE de T. purpurea .

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 40 Résultats et Discussion

VII. COMPOSITION CHIMIQUE DES HUILES ESSENTIELLES DE T. purpurea

1. Les résultats d’analyse en CPG

Les huiles essentielles HE01 à HE18 ont été envoyées dans les laboratoires de l’Université de Corse, France pour des analyses chimiques en CPG et RMN 13 C.

La composition chimique des 18 échantillons étudiés est figurée dans le tableau 5 où les constituants sont rangés par ordre d’élution en CPG pour chaque lot provenant d’un site de récolte. L’identification moléculaire par la RMN 13 C a été confirmée par la confrontation des valeurs des IK avec celles de la banque de données. Le principe de détermination des IK est donné en annexe n°2. Les a nalyses en CPG ont parallèlement permis la quantification des constituants dans chaque échantillon étudié ; les teneurs sont rapportées dans le tableau 5.

Parallèlement, un tableau comparatif (tableau 6) suivi de la figure 9 correspondante permettent de visualiser la tendance par rapport aux 2 types de composés les plus représentés dans chaque échantillon, à savoir les hydrocarbures sesquiterpéniques et les alcools sesquiterpéniques.

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Tableau 5 a : Composition chimique des huiles essentielles de feuilles de T. purpurea d’Ambatofotsy I

AMBATOFOTSY I HE01 HE02 HE07 HE08 HE09 HE12 N° Constituants IKa IKp % 1 M1 - 920 - - - - 1.5 5.7 2 M2 - 931 - - - - 0.6 3.0 3 α-pinène 932 1026 7.4 1.6 7.7 0.1 10.0 8.4 4 camphène 945 1071 0.7 0.9 0.7 0.1 0.2 1.1 5 sabinène 966 1124 1.9 0.2 1.2 - 0.6 0.9 6 β-pinène 972 1114 1.9 0.5 1.7 - 2.2 1.5 7 p cymène 1013 1273 1.8 0.6 1.4 - 0.1 0.5 8 acétate de bornyle 1270 1579 0.8 1.9 - 2.4 - 1.1 9 α-copaène 1377 1493 0.9 0.6 0.5 1.0 1.2 0.8 10 β-panasinsène 1388 1538 0.7 - - 0.9 - - 11 β-élémène 1388 1590 3.6 4.6 4.7 6.2 0.5 0.6 12 Aristolène 1415 1575 0.8 - - - 1.3 - 13 β-caryophyllène 1418 1598 7.9 1.0 5.3 6.1 11.3 3.4 14 α-humulène 1452 1668 2.0 0.7 2.3 1.6 1.9 0.9 15 α-amorphène 1475 1687 2.1 - - - 1.3 0.3 16 germacrène D 1476 1707 1.1 0.4 2.7 - - 3.9 17 M3 1479 1688 ------18 β-sélinène 1483 1718 3.3 16.8 2.6 17.8 1.2 0.4 19 α-sélinène 1492 1722 1.7 7.6 2.4 8.8 0.5 - 20 δ-cadinène 1514 1755 0.9 0.6 1.0 1.9 1.3 1.1 21 β-sesquiphellandrène 1514 1761 0.3 - - - - - 22 β-élémol 1535 2073 3.5 23.3 7.4 1.1 5.3 4.3 23 oxyde de caryophyllène 1570 1976 2.0 - 0.9 0.6 1.0 0.2 24 guaiol 1585 2084 - 3.0 2.0 0.6 9.6 10.4 25 7-épi γ-eudesmol 1609 2096 0.6 1.2 1.4 0.8 1.8 2.3 26 M4 1609 2188 9.0 - - - 3.6 - 27 γ-eudesmol 1618 2176 4.3 2.9 7.4 5.8 1.0 3.6 28 érémophilen 11-ol 1618 2198 - - 1.5 1.9 0.6 0.8 29 cubénol 1633 2053 - - - 3.3 - - 30 β-eudesmol+ α-cadinol 1637 2243 12.1 6.0 20.9 16.6 3.3 10.9 31 M5 1638 2211 2.2 - - - 1.1 -

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AMBATOFOTSY I HE01 HE02 HE07 HE08 HE09 HE12 N° Constituants IKa IKp % 32 M6a 1638 2310 1.3 0.8 - - 0.7 1.0 33 Sélin 11-èn 4α-ol 1639 2266 0.8 4.7 0.9 3.7 - - 34 intermédéol 1644 2246 ------35 α-eudesmol 1641 2233 2.7 4.5 4.7 4.1 1.1 2.5 36 M6b 1652 2310 2.5 - - - 3.9 - 37 bulnésol 1652 2223 0.1 5.4 2.3 0.6 15.4 17.1

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Tableau 5 b : Composition chimique des huiles essentielles de feuilles de T. purpurea d’Ambatofotsy II et de Fandriana

FANDRIANA AMBATOFOTSY II HE03 HE06 HE16 HE13 HE14 HE15 HE* N° Constituants IKa IKp % % 1 M1 - 920 - 3.3 0.5 - 0.8 2.7 - 2 M2 - 931 - 1.6 - 0.7 - 0.9 - 3 α-pinène 932 1026 2.0 6.3 2.6 1.0 0.7 3.2 - 4 camphène 945 1071 0.3 0.6 0.5 0.2 0.4 0.4 1.2 5 sabinène 966 1124 0.3 0.2 0.2 0.5 2.6 0.9 - 6 β-pinène 972 1114 0.6 1.3 0.7 0.6 0.3 0.8 - 7 p-cymène 1013 1273 0.6 0.3 0.2 1.2 3.2 1.1 - 8 acétate de bornyle 1270 1579 1.1 0.8 1.8 - 0.5 - 5.8 9 α-copaène 1377 1493 1.5 1.2 1.9 1.9 1.0 2.0 - 10 β-panasinsène 1388 1538 1.4 0.3 4.0 1.3 0.9 1.1 - 11 β-élémène 1388 1590 3.5 1.0 1.2 1.4 0.8 2.9 4.2 12 Aristolène 1415 1575 2.1 - 1.0 - 1.4 - - 13 β-caryophyllène 1418 1598 3.4 4.3 13.0 26.9 3.8 25.2 3.2 14 α-humulène 1452 1668 2.5 2.2 2.8 5.6 1.7 4.5 0.6 15 α-amorphène 1475 1687 3.7 0.9 1.3 0.7 2.3 0.7 0.5 16 germacrène D 1476 1707 1.1 3.3 1.8 - 2.9 1.0 - 17 M3 1479 1688 - - - 6.9 - 5.3 - 18 β-sélinène 1483 1718 1.7 0.8 1.3 2.3 1.4 6.6 10.7 19 α-sélinène 1492 1722 0.5 0.8 0.8 1.6 0.8 3.2 4.4 20 δ-cadinène 1514 1755 1.1 1.5 3.1 1.8 1.0 2.5 - 21 β-sesquiphellandrène 1514 1761 - - - 2.5 - 2.0 - 22 β-élémol 1535 2073 1.3 19.6 0.3 1.3 26.8 2.5 7.4 23 oxyde de caryophyllène 1570 1976 1.2 0.8 3.3 11.0 0.7 4.9 1.0 24 guaiol 1585 2084 0.4 3.0 0.2 0.3 0.1 0.4 9.0 25 7-épi γ-eudesmol 1609 2096 - 1.0 0.1 - 0.5 0.2 3.1 26 M4 1609 2188 13.7 4.5 5.3 - 9.2 1.0 3.1 27 γ-eudesmol 1618 2176 2.6 2.4 - 0.4 4.4 0.6 1.4 28 érémophilen 11-ol 1618 2198 0.9 0.8 - 0.2 - - - 29 cubénol 1633 2053 - 0.7 9.3 - - - - 30 β-eudesmol+ α-cadinol 1637 2243 10.9 5.4 2.0 2.0 6.0 1.0 2.6 31 M5 1638 2211 3.3 1.3 2.6 - 2.5 - 1.6

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FANDRIANA AMBATOFOTSY II HE03 HE06 HE16 HE13 HE14 HE15 HE* N° Constituants IKa IKp % % 32 M6a 1638 2310 1.5 1.1 1.6 - - 0.9 - 33 Sélin 11-èn 4α-ol 1639 2266 - - - - - 1.7 2.1 34 intermédéol 1644 2246 - - - 3.6 - 2.1 - 35 α-eudesmol 1641 2233 1.4 4.6 0.1 0.7 6.3 0.9 1.1 36 M6b 1652 2310 1.1 - 4.8 3.5 - 1.8 - 37 bulnésol 1652 2223 1.4 5.9 0.5 0.5 - 0.7 15.7

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Tableau 5 c : Composition chimique des huiles essentielles de feuilles de T. purpurea d’Ambatofahavalo

AMBATOFAHAVALO HE04 HE05 HE10 HE11 HE17 HE18 N° Constituants IKa IKp % 1 M1 - 920 - - - - - 0.6 2 M2 - 931 ------3 α-pinène 932 1026 1.4 0.1 10.8 2.1 14.9 10.4 4 camphène 945 1071 0.1 0.3 0.2 0.3 0.4 0.2 5 sabinène 966 1124 - 0.2 0.8 0.5 0.4 0.2 6 β-pinène 972 1114 0.5 - 2.5 0.7 3.8 2.7 7 p-cymène 1013 1273 - 0.1 0.2 0.8 0.5 0.3 8 acétate de bornyle 1270 1579 - - - 0.5 0.2 - 9 α-copaène 1377 1493 1.3 - 1.1 1.3 1.0 0.7 10 β-panasinsène 1388 1538 0.5 0.2 0.5 0.9 0.5 0.4 11 β-élémène 1388 1590 0.7 6.9 0.4 6.1 8.3 7.3 12 Aristolène 1415 1575 - - 0.6 - - 1.5 13 β-caryophyllène 1418 1598 16.9 8.9 9.4 8.8 11.8 10.9 14 α-humulène 1452 1668 2.9 1.3 1.8 2.6 2.5 2.0 15 α-amorphène 1475 1687 0.5 - 1.5 0.5 0.7 2.7 16 germacrène D 1476 1707 - 0.6 - 2.7 4.3 2.6 17 M3 1479 1688 3.6 - - - - 3.0 18 β-sélinène 1483 1718 1.3 24.6 0.7 19.7 9.7 7.1 19 α-sélinène 1492 1722 0.7 12.0 - 8.2 4.4 3.0 20 δ-cadinène 1514 1755 1.9 1.2 0.7 0.7 1.2 0.9 21 β-sesquiphellandrène 1514 1761 1.3 0.7 - 0.9 0.8 1.5 22 β-élémol 1535 2073 1.4 0.8 6.6 2.4 1.4 1.3 23 oxyde de caryophyllène 1570 1976 3.8 0.9 2.8 3.3 2.7 3.1 24 guaiol 1585 2084 0.8 - 9.2 4.5 1.7 0.6 25 7-épi γ-eudesmol 1609 2096 1.2 0.5 2.2 1.8 0.4 - 26 M4 1609 2188 - - 4.8 1.1 2.3 7.7 27 γ-eudesmol 1618 2176 7.7 3.9 0.9 - 0.2 0.2 28 érémophilen 11-ol 1618 2198 1.7 1.2 - - 0.4 0.5 29 cubénol 1633 2053 1.9 1.5 - - - - 30 β-eudesmol+ α-cadinol 1637 2243 23.4 10.9 3.5 0.9 0.9 1.3 31 M5 1638 2211 - - 1.1 - 1.4 3.2

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AMBATOFAHAVALO HE04 HE05 HE10 HE11 HE17 HE18 N° Constituants IKa IKp % 32 M6a 1638 2310 - 1.1 0.7 1.6 1.4 1.2 33 Sélin 11-èn 4α-ol 1639 2266 - 4.6 - 5.8 3.1 2.8 34 intermédéol 1644 2246 1.3 - - - 1.2 2.0 35 α-eudesmol 1641 2233 5.7 2.9 0.8 1.3 - 0.4 36 M6b 1652 2310 - - 4.4 0.6 0.7 0.3 37 bulnésol 1652 2223 - 0.5 15.5 8.8 3.3 0.3

IKa : indice de rétention calculé sur une colonne apolaire IKp : indice de rétention calculé sur une colonne polaire

% : pourcentage de chaque constituant

M1, M2, M3, M4, M5, M6a, M6b : constituants non identifiés.

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Tableau 6 : Comparaison des teneurs en hydrocarbures sesquiterpéniques et sesquiterpénols.

Types de composés Hydrocarbures Sesquiterpénols sesquiterpéniques Echantillon % AMBATOFOTSY I HE 01 25.3 41.1 HE 02 32.3 51.8 HE 07 21.5 49.4 HE 08 44.3 39.1 HE 09 20.5 48.4 HE 12 11.4 53.1 AMBATOFOTSY II HE 13 52.9 23.5 HE 14 18 56.5 HE 15 57 18.7 HE * 23.6 48.1 AMBATOFAHAVALO HE 04 31.6 48.9 HE 05 56.4 28.8 HE 10 16.7 52.5 HE 11 52.4 32.1 HE 17 45.2 21.1 HE 18 43.6 24.9 FANDRIANA HE 03 22.5 39.7 HE 06 16.3 51.1 HE 16 32.2 30.1

HE * : RAZAFIMAHATRATRA [48]

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60

50

40

30 Hydrocarbures sesquiterpéniques 20 Sesquiterpénols 10

0 HE 12 HE 14 HE 09 HE 07 HE * HE 01 HE 02 HE 08 HE 13 HE 15 AMBATOFOTSY

60

50

40

30 Hydrocarbures sesquiterpéniques 20 Sesquiterpénols 10

0 HE 10 HE 04 HE 18 HE 17 HE 11 HE 05

AMBATOFAHAVALO

60 50 40

30 Hydrocarbures 20 sesquiterpéniques 10 Sesquiterpénols 0 HE 06 HE 03 HE 16 FANDRIANA

Figure 9 : Comparaison des teneurs en hydrocarbures sesquiterpéniques et sesquiterpénols.

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2. Illustration de la méthode d’identification par

RMN 13 C sur quelques exemples

Prenons le cas de l’échantillon HE01, et choisissons 3 de ses constituants, par exemple l’ α-pinène, le β-sélinène et le β-élémol, représentatifs de 3 squelettes terpéniques.

La banque de données contient les valeurs de déplacement chimique des 10 carbones de l’ α-pinène pur de référence ; ces valeurs figurent dans la colonne « δ référence » du tableau 7 a où elles sont rangées par ordre décroissant, avec en vis-à-vis les carbones qui leur correspondent.

L’exercice consiste à présent à rechercher dans le spectre RMN 13 C de HE01 10 valeurs de déplacement chimique se rapprochant le plus des δ référence ; elles sont reportées dans la colonne « δ trouvé » du tableau 7 a. On considère que la correspondance est bonne lorsque la variation ∆δ entre δ référence et δ trouvé ne dépasse pas 0,09 ppm. L’identification de l’ α-pinène dans HE01 est ainsi réalisée.

La même démarche appliquée à l’ α-pinène, étant appliquée au β-sélinène puis au β- élémol, permet de dresser les tableaux 7 b et 7 c. C’est de cette façon que les 37 constituants rapportés dans le tableau 5 ont été identifiés.

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Tableau 7 a : Identification de l’α-pinène dans HE01

N° type de δ Constituant δ trouvé intensité Carbone carbone référence

α-pinène C2 -C 144.49 144.51 5.94

10 C3 -CH 116.05 116.03 37.39

C1 -CH 47.10 47.03 49.98 2 C5 -CH 40.79 40.73 45.69 1 3 7 C6 -C 37.98 38.04 7.73 6 8 4 C4 -CH2 31.47 31.46 46.64 5 C7 -CH2 31.29 31.26 64.96 9 C10 -CH3 26.38 26.36 71.77

C8 -CH3 22.97 22.99 60.06

C9 -CH3 20.81 20.81 54.38

Tableau 7 b : Identification du β-sélinène dans HE01

N° type de δ Constituant δ trouvé intensité Carbone carbone référence

β-sélinène C11 -C 150.97 150.97 2.74

C4 -C 150.78 150.79 2.16 14 C -CH2 108.17 108.17 17.12 1 9 12 C15 -CH2 105.38 105.36 63.27 2 8 10 C5 -CH 49.89 49.88 15.04

5 7 C7 -CH 45.87 45.85 14.81 3 4 13 6 C1 -CH2 41.97 41.96 18.25 H 11 C9 -CH2 41.18 41.17 23.31 15 C3 -CH2 36.91 36.91 76.43 12 C10 -C 35.98 36.01 3.32

C6 -CH2 29.50 29.48 16.82

C8 -CH2 26.82 26.83 23.67

C2 -CH2 23.48 23.48 31.89

C13 -CH3 21.02 21.02 17.09

C14 -CH3 16.34 16.32 67.55

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Tableau 7 c : Identification du β-élémol dans HE01

N° type de δ Constituant δ trouvé intensité Carbone carbone référence

β-élémol C1 -CH 150.24 150.23 10.94

14 C4 -C 147.86 147.87 3.51 9 1 C3 -CH2 112.05 112.05 14.74 2 8 10 C2 -CH2 109.88 109.90 12.83 C -C 72.70 72.72 5.53 3 7 11 4 12 5 C5 -CH 52.73 52.68 15.14 6 11 C7 -CH 49.35 49.33 17.38 OH C9 -CH2 39.89 39.86 21.10 15 13 C10 -C 39.69 39.70 8.07

C6 -CH2 28.50 28.47 25.98

C12 et -CH3 27.10 27.12 100.00

C13

C15 -CH3 24.79 24.79 69.51

C8 -CH2 22.57 22.55 18.42

C14 -CH3 16.60 16.57 17.22

Concernant l’intensité de chaque carbone, elle est forte si la teneur du constituant est forte, et inversement. De plus, elle dépend du nombre d’atomes d’hydrogène qui lui est attaché ; au sein d’une même molécule, on observe souvent une plus grande intensité pour un carbone rattaché à 3 atomes d’hydrogène comparé aux autres carbones. Ainsi, il est remarqué que les carbones quaternaires présentent une faible valeur d’intensité par rapport aux autres types de carbone. Et, dans les cas où la molécule a une teneur faible, il devient difficile d’identifier le carbone quaternaire.

Il arrive qu’un carbone se trouve en superpositions avec d’autres carbones d’autre(s) molécule(s) ; leurs intensités s’additionnent, et ces carbones paraîtront plus intenses que les carbones de même environnement chimique (ex : cas du C 12 et C 13 du β- élémol).

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3. Interprétation

L’analyse en CPG montre que les 18 échantillons comportent chacun une trentaine de constituants. La teneur en un constituant peut varier considérablement d’un échantillon à l’autre ; citons en exemple le β-caryophyllène qui fait 27% dans HE13 et seulement 1% dans HE02.

Concernant les produits identifiés, ce sont tous des composés mono- et sesquiterpénoïdes avec une répartition très en faveur des produits sesquiterpénoïdes qui présentent une grande variété de squelettes, et des teneurs pouvant atteindre 27% comme le β-caryophyllène dans HE13, ou encore le β-élémol dans HE14. On compte 13 structures d’hydrocarbures sesquiterpéniques et 16 structures de sesquiterpénoïdes oxygénés, ces derniers sont exclusivement sous forme d’alcools.

A l’inverse, les monoterpènes sont seulement représentés par 8 structures dont 7 hydrocarbures parmi lesquels l’ α-pinène se démarque par sa teneur appréciable qui peut atteindre 15% dans HE17 ; les autres monoterpènes sont de faible teneur, généralement inférieure à 1%.

Par ailleurs, le tableau 6 comparatif et la figure 9 indiquent que selon le site de récolte, la tendance est soit à la formation de sesquiterpénols et au détriment de celle des hydrocarbures, soit l’inverse, et il y a aussi la possibilité où les 2 types de composés sont quantitativement équilibrés.

Globalement, les échantillons issus d’Ambatofotsy I et II ont une teneur en sesquiterpénols supérieure à celle des hydrocarbures sesquiterpéniques. L’échantillon qui a été étudié par RAZAFIMAHATRATRA [48], et noté HE* dans le tableau 6 est aussi à tendance sesquiterpénols majeurs, et il provient aussi d’Ambatofotsy.

A l’inverse, la plupart des échantillons d’Ambatofahavalo ont une teneur plus faible en sequiterpénols qu’en hydrocarbures sesquiterpéniques.

Quant à ceux issus de Fandriana, la tendance est à l’équilibre hydrocarbures sesquiterpéniques-sesquiterpénols.

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4. Etude statistique

Le traitement des données du tableau 5 par la statistique classique permet de dresser le tableau 8 où les constituants sont regroupés par familles chimiques, et évalués individuellement par une teneur moyenne.

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Tableau 8 : Les familles chimiques des HE de T. purpurea

Min Max Moyenne Ecart-type Composés % % %

hydrocarbures monoterpéniques M1 0.5 5.7 2.3 1.8 M2 0.6 3.0 1.4 0.9 α-pinène 0.1 14.9 5.0 4.4 camphène 0.1 1.1 0.4 0.3 sabinène 0.2 2.6 0.6 0.7 β-pinène 0.0 3.8 1.2 1.0 p-cymène 0.1 3.2 0.7 0.8 TOTAL 11.6

produits oxygénés monoterpéniques acétate de bornyle 0.2 2.4 1.1 0.7 TOTAL 1.1

hydrocarbures sesquiterpéniques α-copaène 0.5 2.0 1.2 0.4 β-panasinsène 0.2 4.0 0.9 0.9 β-élémène 0.4 8.3 3.2 2.7 Aristolène 0.6 2.1 1.3 0.5 β-caryophyllène 1.0 26.9 9.7 7.0 α-humulène 0.7 5.6 2.3 1.1 α-amorphène 0.3 3.7 1.3 1.0 germacrène D 0.4 4.3 2.3 1.3 M3 3.0 6.9 4.7 1.7 β-sélinène 0.4 24.6 6.5 7.7 α-sélinène 0.5 12.0 3.5 3.6 δ-cadinène 0.6 3.1 1.4 0.6 β-sesquiphellandrène 0.3 2.5 1.4 0.7 TOTAL 39.7

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produits oxygénés sesquiterpéniques β-élémol 0.3 26.8 7.0 8.6 oxyde de caryophyllène 0.2 11.0 2.5 2.5 Guaiol 0.1 10.4 2.9 3.5 7-épi γ-eudesmol 0.1 2.3 1.1 0.7 M4 1.0 13.7 5.2 3.7 γ-eudesmol 0.2 7.7 2.9 2.4 érémophilèn 11-ol 0.2 1.9 1.0 0.5 cubénol 0.7 9.3 3.3 3.5 β-eudesmol+ α-cadinol 0.9 23.4 7.3 6.9 M5 1.1 3.3 2.0 0.9 M6a 0.7 1.6 1.1 0.3 sélin 11-èn 4a-ol 0.8 5.8 3.4 1.8 intermédéol 1.2 3.6 2.0 0.9 α-eudesmol 0.1 6.3 2.7 2.0 M6b 0.3 4.8 2.3 1.7 bulnésol 0.1 17.1 5.2 5.8 TOTAL 52.1

Les 37 composants identifiés se répartissent dans les quatre familles chimiques suivantes :

• les hydrocarbures monoterpéniques : ils représentent 11,6% de la composition chimique totale de l’huile essentielle de T. purpurea où l’ α-pinène d’une teneur moyenne de 5% est le constituant majeur monoterpénique, suivi des composants non identifiés M1, M2 et du β-pinène de teneur respective 2,3% ; 1,4% et 1,2%.

• les produits oxygénés monoterpéniques : l’HE de feuilles de Tambourissa purpurea renferme un ester qui ne représente que 1,1% de la composition chimique totale de l’huile essentielle, et c’est l’acétate de bornyle.

• les hydrocarbures sesquiterpéniques : ils représentent 39,7% de la composition chimique totale de l’huile essentielle de T. purpurea où le constituant le

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plus représenté est le β-caryophyllène (9,7%), et dans l’ordre décroissant les constituants suivants : β-sélinène (6,5%), M3 (4,7%), α-sélinène (3,5%), β-élémène (3,2%), de teneurs moyennes non négligeables.

• les produits oxygénés sesquiterpéniques : ils représentent 52,1% de la composition chimique totale de l’huile essentielle de T. purpurea avec une teneur moyenne en β-eudesmol+ α-cadinol de 7,3% et en β-élémol de 7,0% comme constituants majeurs. Les constituants M4 (5,2%) et bulnésol (5,2%) ne sont pas à écarter de cette caractérisation. Les produits tels que le sélin 11-èn 4α-ol (3,4%), le cubénol (3,3%), le guaiol (2,9%), le γ-eudesmol (2,9%), l’α-eudesmol (2,7%), l’oxyde de caryophyllène (2,5%) ont aussi des valeurs moyennes appréciables.

Discussion et Conclusion :

L’étude de la composition chimique des HE de feuilles de Tambourissa purpurea effectuée à l’aide de la CPG et de la RMN 13 C a permis d’identifier et de quantifier 37 constituants qui sont exclusivement des composés terpénoïdes :

des hydrocarbures terpéniques faisant une moyenne de 51.3% du total, et répartis en 7 monoterpènes et 13 sesquiterpènes.

des terpénoides oxygénés représentés pour une très large part par des sesquiterpénols, soit 52,1% en moyenne, où le β-eudesmol+ α-cadinol et le β- élémol sont les plus prépondérants.

Par ailleurs, il est constaté d’après les valeurs des écart-types que certains constituants sont très dispersés, et de ce fait, ces composés présentent une disparité importante. Ce sont les composés suivants, par ordre d’écart-type décroissant : β-élémol (8,6), β- sélinène (7,7), β-caryophyllène (7), β-eudesmol+ α-cadinol (6,9) et bulnésol (5,8).

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VIII. ETUDE DE LA VARIABILITE CHIMIQUE DE L’HE DE T. purpurea

1. Choix des variables

Dans cette étude, seuls les constituants dont la teneur est supérieure à 10% dans au moins un échantillon seront pris en considération, car ils peuvent être considérés comme caractéristiques de l’HE de T. purpurea. Ces composés sont les suivants : α- pinène, β-caryophyllène, β-sélinène, α-sélinène, β-élémol, oxyde de caryophyllène, guaiol, M4, β-eudesmol+ α-cadinol, bulnésol, soit 10 composés.

Compte tenu de cette sélection, le profil de chaque échantillon est présenté dans le tableau 9. Ce tableau constituera la matrice des données statistiques dans les analyses factorielles ; les 10 composés sont les variables et les 18 échantillons sont les individus.

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Tableau 13 : Composition chimique des HE après sélection des variables

Variables oxyde β- β-caryophyl- de α-pinène β-sélinène α-sélinène β-élémol Guaiol M4 eudesmol bulnésol lène caryophyl- +α-cadinol Individus lène HE01 7.4 7.9 3.3 1.7 3.5 2.0 0.0 9.0 12.1 0.1 HE02 1.6 1.0 16.8 7.6 23.3 0.0 3.0 0.0 6.0 5.4 HE03 2.0 3.4 1.7 0.5 1.3 1.2 0.4 13.7 10.9 1.4 HE04 1.4 16.9 1.3 0.7 1.4 3.8 0.8 0.0 23.4 0.0 HE05 0.1 8.9 24.6 12.0 0.8 0.9 0.0 0.0 10.9 0.5 HE06 6.3 4.3 0.8 0.8 19.6 0.8 3.0 4.5 5.4 5.9 HE07 7.7 5.3 2.6 2.4 7.4 0.9 2.0 0.0 20.9 2.3 HE08 0.1 6.1 17.8 8.8 1.1 0.6 0.6 0.0 16.6 0.6 HE09 10.0 11.3 1.2 0.5 5.3 1.0 9.6 3.6 3.3 15.4 HE10 10.8 9.4 0.7 0.0 6.6 2.8 9.2 4.8 3.5 15.5 HE11 2.1 8.8 19.7 8.2 2.4 3.3 4.5 1.1 0.9 8.8 HE12 8.4 3.4 0.4 0.0 4.3 0.2 10.4 0.0 10.9 17.1 HE13 1.0 26.9 2.3 1.6 1.3 11.0 0.3 0.0 2.0 0.5 HE14 0.7 3.8 1.4 0.8 26.8 0.7 0.1 9.2 6.0 0.0 HE15 3.2 25.2 6.6 3.2 2.5 4.9 0.4 1.0 1.0 0.7 HE16 2.6 13.0 1.3 0.8 0.3 3.3 0.2 5.3 2.0 0.5 HE17 14.9 11.8 9.7 4.4 1.4 2.7 1.7 2.3 0.9 3.3 HE18 10.4 10.9 7.1 3.0 1.3 3.1 0.6 7.7 1.3 0.3

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2. Regroupement des individus

Chaque échantillon d’HE comporte 1 ou 2 constituants majeurs qui sont mis en exergue dans le tableau 9, et qui permettent de prévoir un classement des HE par chémotype. Nous proposons les groupes suivants :

2.1 Chémotype βeudesmol+αcadinol

HE07 est le seul échantillon que l’on peut ranger avec certitude dans ce groupe. Le taux en ces produits est de 21%, et il n’y a aucun autre constituant quantitativement intéressant dans l’échantillon. Provisoirement, HE01 sera classé dans ce chémotype car ( β-eudesmol+ α-cadinol) constitue son produit majeur même si le taux est seulement de 12,1%. Enfin, HE04 qui affiche un taux élevé de 23,4% sera aussi retenu dans ce groupe malgré une présence importante de β-caryophyllène (16,9%).

2.2 Chémotype βcaryophyllène

Les échantillons HE13 et HE15 sont sans ambiguïté de chémotype β-caryophyllène car la teneur en ce produit y est de 27% et 25% respectivement. De plus, ce sont les rares échantillons de tout le lot qui renferment le composé M3. L’échantillon HE16 pourrait être affecté dans ce groupe, mais avec réserve car sa teneur en β-caryophyllène est seulement de moitié celle de HE13 et HE15.

2.3 Chémotype βélémol

Les échantillons HE06 et HE14 sont de chémotype β-élémol ; ce produit est, en effet le seul constituant de teneur élevée dans ces huiles, les valeurs sont respectivement de près de 20% et 27%. De plus, les alcools sesquiterpéniques sont plus importants que les hydrocarbures dans les échantillons de ce groupe.

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2.4 Chémotype βsélinène

Les échantillons HE05 et HE11 appartiennent clairement à ce groupe avec une teneur en β-sélinène qui est de 25% et 20% respectivement. On peut y inclure HE02 et HE08 pour leur teneur en β-sélinène qui est assez importante, de l’ordre de 18%. Notons que tous ces échantillons contiennent aussi de l’ α-sélinène à une teneur de 8 à 12%.

2.5 Chémotype bulnésol

On classera HE09, HE10 et HE12 dans ce groupe pour le taux en bulnésol qui se situe au-delà de 15%. Signalons toutefois la présence dans ces échantillons de constituants à des teneurs de l’ordre de 10% à côté du bulnésol, et qui sont l’ α-pinène et le β- caryophyllène.

REMARQUE :

Dans certains échantillons, ce sont 2 produits à la fois qui présentent un taux élevé.

• C’est le cas de HE02 qui contient à la fois le β-sélinène à près de 17% et le β-élémol à 23,3%, mais certains détails sont en faveur de l’affectation de HE02 dans le chémotype β-sélinène, comme l’absence de M1, M2, M3, M5 et une faible teneur en α-pinène qui caractérisent les individus de ce groupe, en l’occurrence HE05 et HE11.

• De même pour HE04, on note un taux élevé en β-caryophyllène (17%) et en β-eudesmol+ α-cadinol (23,4%). Il sera classé dans ce dernier groupe car à l’inverse des individus du groupe β-caryophyllène, il ne contient pas M3.

• Pour l’échantillon HE08, ce sont les composés β-sélinène, (β- eudesmol+ α-cadinol) qui présentent un taux de 17% chacun. Il a été affecté dans le groupe β-sélinène pour les mêmes arguments donnés pour HE02.

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Ces échantillons sont provisoirement répartis dans l’un ou l’autre des groupes établis précédemment, mais il se peut qu’ils forment eux aussi des chémotypes à part. Les cas des échantillons HE03, HE17, HE18 sont encore plus délicats par le fait que les composés les plus importants quantitativement ont une teneur d’environ 10% seulement, ce qui rend difficile leur classement. D’où l’intérêt de faire appel aux outils plus puissants que sont l’ACP et l’AFD.

3. Analyse en composante principale

3.1 Test de sphéricité de Barlett

L’analyse procède préalablement par un test d’hypothèses. Dans le tableau 10 sont rassemblés les résultats du test de Barlett.

Tableau 10: Test de sphéricité de Barlett

Khi² (Valeur observée) 193.033 Khi² (Valeur critique) 61.656 DDL 45 p-value < 0.0001 alpha 0.05

La valeur de Khi 2 critique est inférieure à celle de la valeur de Khi 2 observée. Au seuil α = 0,05, on peut rejeter l’hypothèse nulle Ho d’absence de corrélation significative entre les variables et retenir l'hypothèse alternative Ha qu’au moins l'une des corrélations entre les variables est significativement différente de 0. La corrélation entre les variables est donc significative.

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3.2 Valeurs propres en ACP

Le traitement par ACP des données du tableau 9 conduit à la détermination des valeurs propres de la matrice. Les variables sont désormais représentées sous forme de Composantes Principales F1, F2, F3 qui sont des combinaisons linéaires des variables.

Tableau 11: Valeurs propres et cumul de pourcentage

F1 F2 F3 Valeur propre 3.05 2.40 1.98 Variabilité (%) 30.51 24.05 19.82 cumul % 30.51 54.56 74.39

Les valeurs rapportées dans le tableau 11 indiquent que la première composante principale F1 rassemble 30.51% de l’information totale, tandis que la deuxième composante principale F2 en véhicule 24.05%. Les deux premières composantes principales sont déjà représentatives des variables car leur pourcentage cumulé est supérieur à la moyenne avec 54.56%. En combinant les trois premières composantes principales, il y a 74.39% de l’information totale qui sont véhiculés, ce qui est plus que suffisant.

3.3 Représentations graphiques des variables et des individus

en ACP

Les composants ayant des coefficients de corrélation proche de 1 ont les mêmes tendances significatives, c'est-à-dire si l’un des composants possède un pourcentage élevé, l’autre en a aussi. Ainsi, l’ α-sélinène et le β-sélinène sont deux variables voisines et fortement corrélées comme le montre la figure 10. De même que le bulnésol et le guaiol sont fortement corrélés. Ensuite vient la corrélation entre l’oxyde de caryophyllène et le β-caryophyllène. Enfin, les variables α-pinène, guaiol et bulnésol se corrèlent assez faiblement.

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Variables (axes F1 et F2 )

1 oxyde de carophyllène 0.75 β-caryophyllène

0.5 α-pinène 0.25 M4

0 bulnésol F2 (24.05 (24.05 F2 %) -0.25 guaiol α-sélinène β-eudesmol+α- β-sélinène cadinol -0.5

β-élémol -0.75

-1 -1 -0.75 -0.5 -0.25 0 0.25 0.5 0.75 1 F1 (30.51 %)

Figure 10: Cercle de corrélation des variables dans le plan ½ en ACP

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Observations (axes F1 et F2 : 54.56 %)

8

6 HE13

4 HE15

HE17 HE18

HE16 2 HE04 F2 (24.05 %) (24.05 F2 HE10

HE09 HE01 0 HE03 HE11 HE07

HE06 HE12 HE14 HE05 -2 HE08

HE02

-4 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10

F1 (30.51 %)

Figure 11: Répartition des 18 individus de T. purpurea dans le plan ½ en ACP

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La représentation graphique de la figure 11 est intéressante car elle montre clairement qu’il y a une bonne séparation en cinq groupes des individus suivant les axes F1/F2 :

• Le groupe 1 rassemble les individus HE 01, HE 03, HE 04, HE 07 qui sont riches en (β-eudesmol+ α-cadinol) • Les individus HE 13, HE 15, HE 16, HE 17, HE 18 ont été affectés au groupe 2 où le β-caryophyllène et l’oxyde de caryophyllène prédominent • Le groupe 3, riche surtout en β-élémol rassemble les individus HE 02, HE 06 et HE 14. • Le groupe 4, constitué des individus HE 05, HE 08, HE 11, est caractérisé par la forte teneur en β-sélinène et α-sélinène • Le groupe 5 regroupe les individus HE 09, HE 10 et HE 12 qui sont riches en bulnésol, en guaiol et éventuellement en α-pinène.

4. Analyse Factorielle Discriminante

L’AFD va permettre de vérifier la légitimité du classement proposé, et de confirmer les constituants les plus discriminants entre ces groupes.

4.1 Test du Lambda de Wilks

Le test d’hypothèses relatif à l’AFD a donné les résultats présentés dans le tableau 12

Tableau 12 : Test de Lambda de Wilks

Lambda 0.000 F (Valeur observée) 9.895 F (Valeur critique) 2.103 DDL1 40 DDL2 17 p-value < 0.0001 alpha 0.05

D’après ces résultats, au seuil de signification α=0,05, on peut rejeter l’hypothèse nulle Ho d’égalité des vecteurs espérances des 5 groupes et garder l’hypothèse alternative

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Ha (au moins l’un des vecteurs moyens est différent d’un autre). La valeur de F critique est inférieure à la valeur de F observée. La différence entre les barycentres des groupes est significative.

4.2 Valeurs propres en AFD

Le tableau 13 indique la valeur propre et le pourcentage des axes principaux

Tableau 13 : Valeurs propres et pourcentage des axes principaux en AFD

F1 F2 F3 F4 Valeur propre 109.24 30.09 8.80 4.30 Discrimination (%) 71.66 19.74 5.77 2.82 % cumulé 71.66 91.41 97.18 100.00

La première composante principale (axe F1) explique à elle seule 71,66% de l’information totale. Sa combinaison linéaire avec la 2 ème composante principale explique 91,41% de l’information, ce qui est suffisamment représentatif des variables, car leur pourcentage cumulé est largement supérieur à 50%, réduisant la contribution des axes F3 et F4 à une part négligeable.

4.3 Répartition en groupes des individus

La comparaison des résultats montrés dans les figures 10 et 12 fait constater que les corrélations entre les variables obtenues en ACP sont retrouvées en AFD. D’après la représentation graphique de la figure 13, le traitement par AFD a pu classer les individus à partir des nouvelles fonctions déterminées par la combinaison linéaire des variables ; les échantillons d’huiles essentielles de T. purpurea sont classés en cinq groupes (M), et les quatre axes discriminants (M-1=4) sont nécessaires pour différencier les cinq centres de gravité.

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1

0.75

0.5 β-caryophyllène Guaiol oxyde de α-pinène bulnésol 0.25 caryophyllène

0 β-eudesmol+α- β-sélinène cadinol F2 (19.74 (19.74 F2 %) -0.25 α-sélinène M4

-0.5

-0.75 β-élémol -1 -1 -0.75 -0.5 -0.25 0 0.25 0.5 0.75 1 F1 (71.66 %)

Figure 12: Représentation graphique des variables en AFD

Figure 13 : Représentation graphique des individus en AFD.

Ces cinq groupes sont nettement séparés, et les 18 échantillons sont répartis dans leur groupe d’appartenance. Un recensement au niveau de chaque groupe permet de dresser le tableau 14 qui donne le pourcentage des populations des groupes.

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 68 Résultats et Discussion

Tableau 14: Evaluation des effectifs des groupes d’individus

Groupe Effectifs % G1 4 22.22 G2 5 27.78 G3 3 16.67 G4 3 16.67 G5 3 16.67

G1 et G2 sont les plus populeux avec respectivement 22,22% et 27,78% de l’effectif total, et G3, G4 et G5 ont le même pourcentage de populations, soit 16,67% de l’ensemble. Tous les individus sont ainsi classés sans équivoque, et les résultats de l’AFD confirment ceux obtenus par l’ACP, c'est-à-dire la répartition en cinq groupes des huiles essentielles de T. purpurea .

4.4 Caractérisation des groupes en AFD

En considérant l’ensemble des individus appartenant à un même chémotype, un profil type de chaque chémotype peut être établi par le calcul de la teneur moyenne en chaque constituant. Ceci a été réalisé, et a conduit à la caractérisation chimique des chémotypes G1 à G5 comme présenté dans le tableau 15 et à la figure 14 :

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Tableau 15 : Caractéristique descriptive des groupes d’échantillons de T. purpurea

Variable\Classe G1(%) G2(%) G3(%) G4 (%) G5(%)

α-pinène 4.63 6.42 2.86 0.78 9.71 β-caryophyllène 8.39 17.55 3.03 7.91 8.01 β-sélinène 2.22 5.37 6.32 20.69 0.76 α-sélinène 1.36 2.58 3.05 9.6 6 0.15 β-élémol 3.41 1.36 23.24 1.4 2 5.37 oxyde de caryophyllène 1.98 4.98 0.49 1.5 9 1.31 guaiol 0.77 0.65 2.03 1.71 9.71 M4 5.66 3.26 4.56 0.36 2.80 β-eudesmol+ α-cadinol 16.81 1.46 5.77 9.49 5.91 bulnésol 0.93 1.06 3.75 3.28 15.96

25.000 α-pinène

20.000 β-caryophyllène β-sélinène

15.000 α-sélinène

β-élémol

10.000 oxyde de caryophyllène Teneur en% guaiol

5.000 M4

β-eudesmol+α- cadinol 0.000 bulnésol G1 G2 G3 G4 G5

Figure 14 : Comparaison du profil des cinq groupes

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• Le groupe G1 est caractérisé par une présence importante en (β- eudesmol+ α-cadinol) avec 16,81%. Des teneurs appréciables en β- caryophyllène (8,39%) et en M4 (5,63%) sont également remarquées.

• Le groupe G2 est riche en β-caryophyllène avec 17,55%. Ce groupe se distingue aussi de tous les autres par sa teneur non négligeable en oxyde de caryophyllène, 4,9% dans G2, et moins de 2% chez les autres groupes.

• Le groupe G3 est caractérisé par une teneur importante de 23,24% en β- élémol, seul l’oxyde de caryophyllène est de faible teneur ( ˂0,5%), tous les autres constituants sont à des teneurs supérieures à 2%.

• Le groupe G4 se démarque par une teneur élevée en β-sélinène de 20,69%. L’ α-sélinène (9,66%) et le β-caryophyllène (7.91%) sont les hydrocarbures sesquiterpéniques importants qui accompagnent ce composé majeur, en même temps que les sesquiterpénols β-eudesmol+ α-cadinol (9,49%).

• Le groupe G5 est caractérisé par la prédominance du bulnésol (15.96%). Des teneurs assez importantes en guaiol (9,74%), en α-pinène (9,71%) et en β- caryophyllène (8%) sont aussi observées.

4.5 Influence du site de récolte

Connaissant l’origine géographique des échantillons, on va pouvoir établir la correspondance entre groupe d’appartenance et site de récolte pour chaque individu. La récapitulation présentée dans le tableau 16 s’appuie sur les données de la figure 13.

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 71 Résultats et Discussion

Tableau 16 : Correspondance groupe d’affectation – site de récolte

Individus par site de récolte Groupe Ambatofotsy I Fandriana Ambatofahavalo Ambatofotsy II

G1 HE 01, HE 07 HE 03 HE 04 -

G2 - HE 16 HE 17, HE 18 HE 13, HE 15

G3 HE 02 HE 06 - HE 14

G4 HE 08 - HE 05, HE 11 -

G5 HE 09, HE 12 - HE 10 -

La lecture du tableau 16 fait constater que certains chémotypes ne sont pas trouvés dans certains sites où évolue l’espèce végétale T. purpurea ; c’est le cas du chémotype à β-élémol (G3) qui est absent du site Ambatofahavalo. Sur ce site, pas moins de 6 échantillons ont été récoltés, et aucun ne répond au critère du chémotype à β-élémol.

A Fandriana, ce sont les chémotypes à β-sélinène (G4) et à bulnésol (G5) qui sont absents, et les trois échantillons récoltés sont dispersés en 3 chémotypes différents, G1, G2 et G3.

Si l’on considère globalement les sites d’Ambatofotsy I et II, on y trouve l’ensemble des 5 chémotypes identifiés, c'est-à-dire que le végétal s’y est beaucoup diversifié.

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Discussion et Conclusion :

L’étude chimique des huiles essentielles de T. purpurea au moyen de l’Analyse en Composante Principale et de l’Analyse Factorielle Discriminante, a permis de mettre en évidence cinq chémotypes pour l’huile essentielle :

• Le chémotype à β-eudesmol+ α-cadinol, • Le chémotype à β-caryophyllène, • Le chémotype à β-élémol, • Le chémotype à β-sélinène, • Le chémotype à bulnésol.

Les chémotypes ne semblent pas être spécifiques à un site donné, et l’on a pu observer que 2, 3, 4 voire 5 chémotypes peuvent se retrouver en un même lieu.

Les arbres d’un même site sur lesquels ont été effectuées les récoltes évoluent dans le même environnement écologique et climatique. De plus, ils sont au même stade du cycle végétatif au moment des cueillettes.

Ces facteurs ne peuvent donc raisonnablement expliquer la tendance de répartition des individus de T. purpurea, et l’on privilégie l’hypothèse d’une différence d’âge entre les arbres, ou encore celle de paramètres génétiques qui sont des caractéristiques intrinsèques à chaque individu.

Ces résultats montrent la complexité d’une exploitation des HE de T. purpurea si elle est basée sur le concept de chémotype, ce qui nous amène à préconiser une classification selon la teneur globale en hydrocarbures sesquiterpéniques et en sesquiterpénols.

Ainsi, les échantillons provenant d’Ambatofotsy I sont des HE riches en sesquiterpénols, ceux provenant d’Ambatofotsy II et d’Ambatofahavalo sont des HE riches en hydrocarbures sesquiterpéniques, tandis que le cas des HE de Fandriana est moins tranché probablement en raison du faible nombre d’échantillons récoltés.

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 73 Conclusion générale

CONCLUSION

Cette étude a pour but d’observer la variabilité de la composition chimique des huiles essentielles de T. purpurea sur 18 arbres répartis dans quatre zones d’étude dans le but d’apprécier l’effet de la zone de collecte.

Les 18 échantillons de feuilles sont soumis individuellement à l’hydrodistillation, fournissant 18 échantillons d’huile essentielle. Les rendements sont tous de faible valeur, ne dépassant pas 0,2% pour la période de cueillette de Mai à Septembre qui correspond à la saison sèche sur les sites étudiés. L’analyse par la RMN 13 C, une méthode récemment appliquée à l’identification chimique de mélanges naturels, combinée à la chromatographie en phase gazeuse (CPG), a permis l’obtention d’un reflet de la composition chimique de l’huile essentielle de T. purpurea et l’évaluation précise de la concentration des constituants considérés comme importants. Il s’avère que l’HE de T. purpurea est riche en composés de type sesquiterpéniques qui forment plus de 90% de l’HE, ce qui confirme les résultats de RAZAFIMAHATRATRA au sujet du rendement et de la composition chimique. Les données chimiques ont été traitées par des analyses statistiques multidimensionnelles qui a aboutit à classer les 18 huiles essentielles dans cinq groupes distincts numérotés de G1 à G5 :

• G1 à teneur importante en β-eudesmol+ α-cadinol (16,81%) regroupe deux échantillons d’Ambatofotsy I, un de Fandriana et un d’Ambatofahavalo • G2 à teneur importante en β-caryophyllène (17,55%), est formé par deux échantillons d’Ambatofotsy II, un de Fandriana et deux d’Ambatofahavalo • G3 à teneur élevée en β-élémol (23,24%), est constitué par un échantillon de Fandriana, un d’Ambatofotsy I et un d’Ambatofotsy II • G4 à forte teneur en β-sélinène (20,69%), est constitué par deux échantillons d’Ambatofahavalo et un d’Ambatofotsy I • G5, caractérisé par une teneur importante en bulnésol (15.96%) est formé par deux échantillons d’Ambatofotsy I et un d’Ambatofahavalo.

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 74 Conclusion générale

Il est constaté que sur un même site peuvent cohabiter des arbres donnant des HE de différentes qualités, ce qui pourrait s’expliquer par une différence d’âge des arbres ou encore par une différence de caractères génétiques.

Vu le nombre relativement limité d’échantillons récoltés, il serait prématuré d’affirmer l’existence de chémotypes pour l’HE de T. purpurea ; néanmoins, compte tenu de la caractéristique commune à ces HE d’être constituées majoritairement des composés sesquiterpéniques hydrocarbures et alcools, nous proposons de classer ces HE en fonction de la prépondérance en l’une ou l’autre de ces deux familles chimiques.

Il est à noter que l’exploitation de ce végétal est loin d’être achevée, et de nombreuses études sont encore à entreprendre sur l’espèce T. purpurea et ses huiles essentielles, notamment :

• d’approfondir l’étude de la variabilité par un échantillonnage élargi ; • d’établir la structure moléculaire des constituants non identifiés ; • d’évaluer les activités antimicrobiennes des groupes G1 à G5 en vue d’une utilisation thérapeutique.

Les facteurs environnementaux tels que la pédologie, la pluviométrie, … sont aussi à considérer dans une étude ultérieure.

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 75 Références bibliographiques et Webographiques

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Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique 80

Annexes

Annexes

ANNEXE 1 : HYDRODISTILLATION

Matériels : • Hydrodistillateur composé d’un bec Bunsen • Balance analytique • Flacon de 10 ml • Une seringue

Mode opératoire :

• Prise d’essais : échantillon frais • Arracher les feuilles de l’échantillon frais, les grosses tiges seront jetées • Peser l’échantillon frais à 0,01 près • Introduire l’échantillon dans un ballon de 2 litres. Prendre la précaution de ne pas trop tasser les échantillons dans le ballon, de bien les repartir dans toute sa contenance afin d’éviter une mauvaise répartition de la température • Ajouter des pierres ponces afin de régulariser la température • Remplir de l’eau jusqu’au deux tiers du ballon • Placer le raccord de réduction entre le ballon et l’essencier en mettant un peu de graisse neutre (silicone) pour assurer l’étanchéité et faciliter le démontage de l’appareil • Ouvrir le robinet du réfrigérant pour faire circuler l’eau • Allumer le feu en réglant le gaz pour avoir la température adéquate • A la fin de la distillation, prélever l’essence surnageant l’eau en ouvrant le robinet de l’essencier et récupérer l’essence dans un flacon préalablement taré • Sécher l’Huile Essentielle en utilisant une seringue de 10 ml • Peser de nouveau le flacon sur une balance de précision a 0,0001 g près.

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique a-1 Annexes

ANNEXE 2 : Identification par utilisation des indices de Kovats

L’identification d’une substance peut être facilitée par le calcul de son Indice de Kovats qui, pour une phase stationnaire déterminée, repose sur la comparaison de son temps de rétention et ceux de deux alcanes linéaires consécutifs qui encadrent la substance. L’indice de Kovats se mesure en coinjectant l’huile essentielle et un mélange de paraffines normaux.

En programmation de température, l'indice de Kovats est donné par la formule :

′ − ′ = 100 + 100 ′ ′() −

: nombre d’atomes de carbone du paraffine normal

+ : nombre d’atomes de carbone du paraffine normal

′ : temps de rétention corrigé du paraffine normal éluant avant le composé X

′() : temps de rétention corrigé du paraffine normal éluant après le composé X

′ : temps de rétention corrigé du composé X

On peut avoir une présomption de la nature d’une substance considérée en comparant son indice de rétention avec celui donné par les tables de références.

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique a-2 Annexes

ANNEXE 3 : Structures de molécules identifiées par RMN 13 C et IK dans l’huile essentielle de T. purpurea

Monoterpènes hydrocarbonés

α-pinène Camphène β-pinène p-cymène Sabinène Monoterpènes oxygénés

O

O acétate de bornyle

Les sesquiterpènes hydrocarbonés

H

α-copaène β-élémène β-panasinsène

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique a-3 Annexes

aristolène

β-caryophyllène α-humulène

α-sélinène δ-cadinène β-sesquiphellandrène

Les sesquiterpènes oxygénés

O

OH

OH β-élémol guaiol oxyde de caryophyllène

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique a-4 Annexes

1

7

OH OH OH γ 7-épi -eudesmol γ-eudesmol ∆9,10 érémophilèn 11-ol

OH OH

OH cubénol β-eudesmol α-cadinol

H OH OH OH

sélin 11-èn 4 α-ol intermédéol α-eudesmol

OH

bulnésol

Mémoire de fin d’études/Département Génie Chimique a-5

TABLE DES MATIERES

INTRODUCTION ...... 1

Partie I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ...... 3

I. PRESENTATION BOTANIQUE DE Tambourissa purpurea ...... 3

1. Systématique ...... 3

2. Généralités sur la famille des Monimiacées et le genre Tambourissa ...... 3

3. Description Botanique de l’espèce Tambourissa purpurea (Tul) A.DC ...... 6

4. Noms vernaculaires de l’espèce ...... 9

5. Répartition géographique ...... 9

6. Vertus thérapeutiques traditionnelles ...... 11

II. ETAT DE LA RECHERCHE SUR T. purpurea...... 12

1. Etude des huiles essentielles de feuilles de T. purpurea ...... 12

2. Criblage phytochimique d’extrait de feuilles ...... 12

3. Evaluation des activités antimicrobiennes ...... 12

III. DEFINITIONS ET UTILISATIONS DES HUILES ESSENTIELLES ...... 13

1. Définitions d’une huile essentielle ...... 13

2. Utilisations des huiles essentielles ...... 13

2.1 Les huiles essentielles d’intérêt médicinal ...... 14

2.2 Les huiles essentielles d’utilité industrielle ...... 14

2.3 Les huiles essentielles de parfumerie ...... 15

Partie II : METHODES EXPERIMENTALES ...... 16

IV. TRAVAUX SUR TERRAIN ...... 16

1. Matériel végétal ...... 16

2. Collecte des échantillons de Tambourissa purpurea et sites d’études ...... 16

2.1 Sites de collecte ...... 16

2.2 Période de collecte ...... 18

2.3 Traitement de la matière végétale avant transformation ...... 18

3. Méthodologie de détermination botanique du végétal ...... 18

4. Présentation des échantillons ...... 19

V. TRAVAUX DE LABORATOIRE ...... 22

1. Extraction des HE ...... 22

1.1 Généralités ...... 22

1.2 Technique d’extraction de T. purpurea ...... 23

1.2.1 Matériels utilisés ...... 23

1.2.2 Mise en œuvre de l’extraction ...... 23

2. Rendement de l’extraction en HE de T. purpurea...... 24

3. Caractérisation de l’HE de T. purpurea ...... 25

3.1 Analyse qualitative des HE de T. purpurea ...... 25

3.1.1 Principe de l’identification moléculaire par la RMN 13 C ...... 26

3.1.2 Conditions opératoires ...... 28

3.2 Analyse quantitative des HE de T. purpurea ...... 28

3.2.1 Principe de l’analyse par CPG ...... 28

3.2.2 Conditions opératoires ...... 29

4. Etude de variabilité de la composition chimique des HE de T. purpurea ...... 29

5. Méthodes d’analyses statistiques ...... 31

5.1 Statistique classique ...... 31

5.1.1 La moyenne ...... 31

5.1.2 L’écart-type ...... 31

5.2 Analyse factorielle multidimensionnelle ...... 32

5.2.1 Tests d’hypothèses ...... 33

5.2.1.1 Test de sphéricité de Barlett ...... 33

5.2.1.2 Test de Lambda de Wilks ...... 33

5.2.2 Analyse en Composante Principale ...... 33

5.2.2.1 Objectif et principe ...... 33

5.2.2.2 Interprétation...... 34

5.2.3 Analyse Factorielle Discriminante ...... 35

5.2.3.1 Objectif et principe ...... 35

5.2.3.2 Représentation des résultats et Interprétations ...... 36

Partie III : RESULTATS ET DISCUSSION ...... 39

VI. RENDEMENT EN HUILE ESSENTIELLE DE T. purpurea ...... 39

1. Résultats expérimentaux ...... 39

2. Interprétation et discussion ...... 40

VII. COMPOSITION CHIMIQUE DES HUILES ESSENTIELLES DE T. purpurea ...... 41

1. Les résultats d’analyse en CPG ...... 41

2. Illustration de la méthode d’identification par RMN 13 C sur quelques exemples ...... 50

3. Interprétation ...... 53

4. Etude statistique ...... 54

VIII. ETUDE DE LA VARIABILITE CHIMIQUE DE L’HE DE T. purpurea ...... 58

1. Choix des variables ...... 58

2. Regroupement des individus ...... 60

2.1 Chémotype β-eudesmol+ α-cadinol ...... 60

2.2 Chémotype β-caryophyllène ...... 60

2.3 Chémotype β-élémol ...... 60

2.4 Chémotype β-sélinène ...... 61

2.5 Chémotype bulnésol...... 61

3. Analyse en composante principale ...... 62

3.1 Test de sphéricité de Barlett ...... 62

3.2 Valeurs propres en ACP ...... 63

3.3 Représentations graphiques des variables et des individus en ACP ...... 63

4. Analyse Factorielle Discriminante ...... 66

4.1 Test du Lambda de Wilks ...... 66

4.2 Valeurs propres en AFD ...... 67

4.3 Répartition en groupes des individus ...... 67

4.4 Caractérisation des groupes en AFD ...... 69

4.5 Influence du site de récolte ...... 71

CONCLUSION ...... 74

Références Bibliographiques et Webographies ...... 76

Auteur : Mademoiselle RANDRIHARISOA Marie Stéphanie Titre : « Etude de la variabilité spatiale de la composition chimique des huiles essentielles de Tambourissa purpurea [Tul] A.DC [MONIMIACEAE]. » Nombre de pages : 80 Nombre de tableaux : 16 Nombre de figures : 14 RESUME Ce travail est consacré à l’étude de l’influence du site de récoltes sur la qualité de l’huile essentielle de feuilles de Tambourissa purpurea (MONIMIACEAE), plante endémique et médicinale de Madagascar. Les sites sélectionnés sont localisés à Analamanga sur le résidu de forêt d’Ambatofotsy, et dans le corridor de Fandriana. L’identification des constituants chimiques des huiles essentielles a été réalisée au moyen de la RMN 13 C et de la CPG. Le traitement des données des 18 HE par analyses statistiques multidimensionnelles (ACP et AFD) a établi l’existence d’une diversité interspécifique au niveau de l’espèce où les individus peuvent être rangés dans cinq groupes : le groupe G1 à forte teneur en β-eudesmol+ α-cadinol (16,81%), le groupe G2 à forte teneur en β-caryophyllène (17,55%), le groupe G3 à forte teneur en β-élémol (23,24%), le groupe G4 à forte teneur en β-sélinène (20,69%) et le groupe G5 qui est caractérisé par une teneur majoritaire en bulnésol (15,96%). Il n’y a pas de lien évident entre site de récolte et profil de l’HE, toutes les HE étudiées sont à prédominance de constituants sesquiterpénoïdes qui sont des hydrocarbures et des alcools, et une classification basée sur les teneurs relatives en ces deux familles de composés a été proposée.

Mots clés : Tambourissa purpurea , Monimiacée, huiles essentielles, composition chimique, Analyses multidimensionnelles, RMN 13 C, CPG.

SUMMARY The present work concerned the study of the effect of the harvest sites on the chemical composition of the essential oil of leaves of Tambourissa purpurea (MONIMIACEAE), an endemic and medicinal plant of Madagascar. The selected sites are localized in the Analamanga region on the Ambatofotsy forest residue, and in the Fandriana corridor. The identification of the chemical constituents of the essential oils was performed by means of 13C NMR spectroscopy and GC methods. The data processing of 18 essential oils by multidimensional statistical analysis (PCA an DFA) stated an interspecific diversity at the level of the species for which the individuals can be divided into five groups : group G1 with high content in β-eudesmol+ α-cadinol (16.81%), group G2 with high content in β-caryophyllene (17.55%), group G3 with high content in β-elemol (23.24%),group G4 with high content in β-selinene (20.69%), and group G5 with bulnesol as the major component (15.96%). There was no obvious relationship between the site of harvest and the chemical composition of the essential oil. It was found that sesquiterpene hydrocarbons and sesquiterpene alcohols are the major components of all the essential oils studied, and a classification based on the relative contents in these two families of compounds was proposed.

Key words : Tambourissa purpurea, Monimiaceae, essential oils, chemical composition, multidimensional analysis, RMN 13 C, CPG.

RAPPORTEUR : Pr RASOLONDRAMANITRA Jocelyne, ENCADREUR : Monsieur RAZAFIMANDEFITRA André ADRESSE DE L’AUTEUR : Lot II N 187 LG Soavinandriana. Antananarivo 101. e-mail : [email protected]