Uso De Lombrices De Tierra En La Remediación De Suelos Contaminados Por Hidrocarburos

UNIVERSIDAD VERACRUZANA

INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA Y ECOLOGÍA APLICADA

USO DE LOMBRICES DE TIERRA EN LA REMEDIACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS POR HIDROCARBUROS

TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS EN ECOLOGÍA Y BIOTECNOLOGÍA

PRESENTA

BENITO HERNÁNDEZ CASTELLANOS

DIRECTOR

DR. ÁNGEL ISAURO ORTIZ CEBALLOS

CODIRECTOR

DRA. SILVIA MARIBEL CONTRERAS RAMOS

XALAPA, VERACRUZ MAYO 2013

Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada Dirección General de Investigaciones Universidad Veracruzana Programa de Posgrado

ECOBIOT-14RETD

RESULTADO DE LA EVALUACIÓN DEL DOCUMENTO DE TESIS DOCTORAL

C. BENITO HERNÁNDEZ CASTELLANOS Estudiante del Posgrado INBIOTECA, Doctorado en Ciencias en Ecología y Biotecnología, con salida laterla de maestría

PRESENTE

Por este conducto se hace de su conocimiento que el JURADO doctoral ha evaluado su Tesis doctoral intitulada “Uso de lombrices de tierra en la remediación de suelos contaminados por hidrocarburos” y ha emitido el veredicto de aprobado ya que si reúne los elementos suficientes de fondo y forma. Se autoriza continuar con los trámites administrativos para la obtención del grado en la Coordinación del Posgrado INBIOTECA.

Xalapa de Enríquez a 14 de Mayo de 2013 “Lis de Veracruz: Arte, Ciencia, Luz”

Presidente: Dr. Sergio Martínez Hernández ______

Secretario: Dr. Ángel Isauro Ortiz Ceballos ______

Vocal 1: Dra. Silvia Maribel Contreras Ramos ______

Vocal 2: Dr. Juan Carlos Noa Carrazana ______

Vocal externo: Dra. Dinora Vázquez Luna ______

Suplente: Dr. José Antonio García Pérez ______

C.c.p. Expediente correspondiente

Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada, Campus para la Cultura, las Artes y el Deporte, Zona Universitaria. Av. Culturas Veracruzanas No. 101. Col. Emiliano Zapata. Xalapa de Enríquez, Ver., Ap. Pos. 250. Tel. 01-228-8422773, 01-228-8421700 ext 10856 correo-e: [email protected].

INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA Y ECOLOGIA APLICADA UNIVERSIDAD VERACRUZANA

ECOBIOT-18DAR DECLARATORIA DE AUTORIA

Quien suscribe Benito Hernández Castellanos (Número de matrícula S09015738) estudiante del Doctorado en Ciencias en Ecología y Biotecnología con salida lateral de Maestría, hace constar que es autor del Trabajo para la obtención del Grado de (Maestría o Doctorado) intitulado: “Uso de Lombrices de tierra en la remediación de suelos contaminados por hidrocarburos” (Núm. de registro 007), el cual constituye la elaboración personal realizada únicamente con la dirección del Comité Tutoral siguiente:

Dr. Ángel Isauro Ortiz Ceballos Dra. Silvia Maribel Contreras Ramos Dr. Sergio Martínez Hernández Dr. Juan Carlos Noa Carrazana Dr. Joel Zavala Cruz

En tal sentido, manifiesto la originalidad de los conceptos, base de datos registrados (Bitácora), interpretación de los datos, conclusiones y recomendaciones. Por último, dejo establecido que los aportes intelectuales de otros autores se han referido debidamente en el texto y en la sección de literatura citada de dicho trabajo.

______Benito Hernández Castellanos

Xalapa de Enríquez, Veracruz, 31 de Mayo de 2013.

“En la utopía de ayer se incubó la realidad de hoy, así como en la utopía de mañana palpitarán nuevas realidades” José Ingenieros

AGRADECIMIENTOS

Al Dr. Ángel Isauro Ortiz Ceballos por aceptar ser el director de este trabajo de investigación, por su apoyo para la realización del mismo, así como por sus regaños y sabios consejos.

A la Dra. Silvia Maribel Contreras Ramos Codirectora de este estudio, por enseñarme que el trabajo y la dedicación son la llave para conseguir las metas, por compartirme sus conocimientos y por brindarme su amistad.

A los miembros del comité tutorial: Dr. Ángel I. Ortiz Ceballos, Dra. Silvia Maribel Contreras Ramos, Dr. Joel Zavala Cruz, Dr. Sergio Martínez Hernández, Dr. Juan Carlos Noa Carrazana, por sus consejos y comentarios a lo largo de este estudio y por ofrecerme su amistad.

A los miembros del jurado externo: Dr. José Antonio García Pérez y Dra. Dinora Vázquez Luna, por su valiosa revisión al documento de tesis.

Al Dr. Joel Zavala Cruz del Colegio de Postgraduados, por apoyarme en el muestreo de campo y la realización de los análisis físicos y químicos del suelo.

Al Dr. Luc Dendooven del Centro de Investigación y Estudios Avanzados del IPN (Cinvestav) por permitir la realización del segundo trabajo de investigación en su laboratorio, por el apoyo para realización de los análisis cromatográficos de las muestras de suelo, por compartirme sus conocimientos y por su amistad.

Al Dr. Carlos Fragoso del Instituto de Ecología (INECOL) por la identificación de las especies de lombrices.

A Delfina Pérez y Armando González por permitir el acceso a su propiedad para la realización del muestreo de campo.

A los profesores del INBIOTECA que me compartieron sus conocimientos durante sus cursos: Dr. Lázaro R. Sánchez, Dra. María del Rosario Pineda, Dr. Alejandro Castro, Dra. Lourdes Iglesias, Dr. Jorge Galindo, Dra. Norma Flores, Dr. Francisco Díaz, Dra. Diana Pérez, Dr. Dinesh Rao. Así como al personal técnico que apoyaron de alguna manera para la realización de este estudio de investigación: Patricia Gerez, Clara Córdova, Rogelio Lara.

A mis compañeritos del doctorado y grandes amigos del alma: Chava, Dulcecita Galván, Angelita, Dulcecita Murrieta, Marquito, Suria, Sué, Jorgito que comparten el gusto por el alcohol y la ciencia; y a todos los demás amigos que me apoyaron y estuvieron presentes en la realización de esta tesis.

DEDICO ESTA TESIS

A mi madré María Por ser mi inspiración y por guiar mis pasos a cada instante.

A mi hermano Héctor Por los momentos inolvidables que hemos compartido, por su apoyo incondicional y su enorme cariño.

A Lulucita Por ser una personita especial en mi vida y por su cariño.

INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA Y ECOLOGIA APLICADA UNIVERSIDAD VERACRUZANA

ECOBIOT-17A AGRADECIMIENTOS Y CREDITOS INSTITUCIONALES El presente trabajo se realizó bajo la dirección del Dr. Ángel Ortiz Ceballos dentro de la Línea de Generación y Aplicación del Conocimiento: Ecología y Manejo de la Biodiversidad Forestal y Agrícola, pertenecientes al Cuerpo Académico: Clave “CA- UVER-173” Nombre “Ecología y Manejo de la Biodiversidad Forestal” registrados en el Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada de la Universidad Veracruzana en Xalapa, Veracruz.

El trabajo doctoral se desarrolló dentro de los proyectos: Supervivencia de lombrices de tierra en suelos contaminados con petróleo y Cuidado parental en dos especies tropicales de lombrices de tierra, Aprobados por el fondo SNI-CONACyT (104289) y SEP-CONACyT (10,003-8335) mismos a los que se les agradece su apoyo.

Se agradece al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por su apoyo al estudiante con una beca académica bajo con No de becario 229668.

Se agradece al Dr. Luc Dendooven del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados de IPN (Cinvestav) por su colaboración y por permitir la realización del segundo trabajo de investigación en su laboratorio y al Dr. Carlos Fragoso del Instituto de Ecología (INECOL) por la identificación de las especies de lombrices.

Se agradece al programa de posgrado Doctorado en Ciencias en Ecología y Biotecnología, con Salida Lateral de Maestría, siendo el Coordinador el Dr. Francisco Díaz Fleischer y al Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada siendo director el Dr. Juan Carlos Noa Carrazana.

Xalapa de Enríquez, Veracruz, 31 de Mayo de 2013.

CONTENIDO

DECLARATORIA DE AUTORIA ...... 3 DEDICO ESTA TESIS ...... 6 AGRADECIMIENTOS Y CREDITOS INSTITUCIONALES ...... 7 ÍNDICE DE FIGURAS ...... 10 ÍNDICE DE TABLAS ...... 11 ABREVIATURAS ...... 13 RESUMEN GENERAL ...... 15 CAPITULO I ...... 17 Introducción ...... 17 1.1 Concepto e importancia del suelo ...... 18 1.2 Contaminación del suelo ...... 20 1.3 Hidrocarburos aromáticos policíclicos ...... 22 1.4 Metodologías para la remediación de suelos contaminados ...... 26 1.5 La biorremediación ...... 28 1.6 Importancia de las lombrices de tierra como conductores de procesos en el suelo ...... 29 1.7 La asociación mutualista entre lombrices de tierra y microorganismos del suelo potencia su capacidad digestiva ...... 33 1.8 Estudios ecotoxicológicos y de remediación utilizando lombrices de tierra ...... 35 1.9 Preguntas de investigación ...... 38 1.10 Hipótesis ...... 38 1.11 Objetivos ...... 39 1.12 Referencias ...... 40 CAPITULO II ...... 51 Earthworm Populations in an Aged Hydrocarbon Contaminated Soil ...... 51 2.1 ABSTRACT ...... 54 2.2 INTRODUCTION ...... 55 2.3 MATERIALS AND METHODS ...... 56 2.3.1 Sampling site ...... 56 2.3.2 Earthworm sampling ...... 57 2.3.3 Statistical analysis ...... 58 2.4 RESULTS ...... 59 2.4.1 Physical and chemical parameters of anthrosol soil ...... 59

2.4.2 Concentrations of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil ...... 62 2.4.3 Earthworm communities ...... 63 2.4.4 Correlation and principal component analysis ...... 65 2.5 DISCUSSION ...... 68 2.6 CONCLUSION ...... 71 2.8 REFERENCES ...... 73 CAPITULO III ...... 79 Removal of benzo (a) pyrene from soil using an endogeic earthworm Pontoscolex corethrurus (Müller, 1857) ...... 79 3. 1 Abstract ...... 81 3.2. Introduction ...... 82 3.3. Materials and Methods ...... 84 3.3.1. Material used ...... 84 3.3.2. Sampling site ...... 84 3.3.3. Sampling of soil and organic material used in the experiment ...... 85 3.3.4. Earthworms used ...... 86 3.3.5. Experimental design ...... 86 3.3.6. BaP determination in P. corethrurus tissue, soil and casts ...... 89 3.3.7. Statistical analysis ...... 90 3.4. Results ...... 91 3.4.1. Characteristics of P. corethrurus ...... 91 3.4.2. Concentration of BaP in soil ...... 92 3.5. Discussion ...... 98 3.6. Conclusion ...... 103 3.7. Acknowledgements ...... 104 3.8. References ...... 104 CAPITULO IV ...... 113 Discusión general ...... 113 4.1 Discusión general ...... 114 4.2 Conclusión ...... 120 4.3 Referencias ...... 121 ANEXOS ...... 126

INDICE DE FIGURAS

CAPÍTULO I

Figura Descripción Pág.

1 Derrame petrolero registrado en el campo petrolero Cinco 21 Presidentes, en Tabasco, México.

2 Algunos de los Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos (HAPs) 24 más estudiados en la actualidad por el riesgo a la salud humana (USEPA, 1987).

3 Imagen de la lombriz endógea Pontoscolex corethrurus. 33

CAPITULO II

Figure Description Pág.

1 Benzo(a)pyrene concentration in a) the contamination gradient and 63 b) different depths of the anthrosol soil . The different letters mean significant differences (P<0.05) and the vertical lines indicate the standard deviation.

2 Loadings and scores of principal component analysis (PCA) from 68 the component 1 and 3 of contamination gradient at different depths defined as L1 (0-0.1 m); L2 (0.1-0.2 m); L3 (0.2-0.3 m) and L4 (0.3-0.4 m) and the parameters physicals, chemicals and earthworms populations evaluated.

CAPITULO III

Figure Description Pág.

1 Concentration of benzo(a)pyrene in soil a) with the endogeic 94 earthworm „Pontoscolex corethrurus‟ () sterilized and () unsterilized soil amended with residue of Mucuna pruriens (L.), () sterilized and () unsterilized soil, and () sterilized and () unsterilized soil amended with residue of Brachiaria humidicola (Rendle), b) without the earthworm and c) in the casts of the earthworm. Soil incubated at 22 ± 3 oC for 112 days. Bars are ± STD.

ÍNDICE DE TABLAS

CAPÍTULO II

Table Description Pág.

1 Characteristics of an anthrosol soil along a transect, i.e. distance 60 from the contamination source and in different soil layers, at Cinco Presidentes, Tabasco Mexico.

2 Effect of distance from the contamination source (gradient), soil 61 layer (depth) and their interactions on soil and earthworm characteristics.

3 Characteristics of the earthworms sampled along a transect or 65 distance from the contamination source and in different soil layers.

4 Pearson correlation coefficients between soil characteristics, 66 concentration of benzo(a)pyrene (BaP) and earthworm abundance and biomass. N= Nitrogen, P= Phosphorus, K= Potassium, BaP = Benzo(a)pyrene.

CAPÍTULO III

Table Description Pág.

1 Different treatments combining sterilized or unsterilized soil 87 spiked with 100 mg kg-1 benzo(a)pyrene (BaP) amended with 30 g kg-1 dry soil Mucuna pruriens, Brachiaria humidicola or left unamended and applied or not with three juvenile earthworms (Pontoscolex corethrurus) with cleaned gut to investigate the removal of (BaP). Soil incubated aerobically at 22 ± oC for 112 days.

2 Changes in weight (g), survival (%) and benzo(a)pyrene (BaP) 92 concentration in tissueof the earthworm Pontoscolex corethrurus after being exposed to the contaminant for 112 days. Three juvenile earthworms were added to each of the following treatments: (1) Sterilized soil, (2) Sterilized soil amended with 30 g kg-1 (3%) Mucuna pruriens, (3) Sterilized soil amended with 30 g kg-1 (3%) Brachiaria humidicola, (7) Unsterilized soil, (8) Unsterilized soil amended with 30 g kg-1 (3%) M. pruriens, and (9) Unsterilized soil amended with 30 g kg-1 (3%) B. humidicola.

3 Benzo(a)pyrene (BaP) concentration (mg kg-1) applied to soil, not 95 extractable at day 0 and removed by different processes as derived from the different treatments. Between parentheses are the values that were used to calculate the suggested process. 4 Concentrations of benzo(a)pyrene (BaP) (mg kg-1) in sterilized or 96 unsterilized soil added with earthworms or not added with earthworms, or in the casts of the earthworms after 112 days. Sterilized or unsterilized soil was amended with residues of Mucuna pruriens or Brachiaria humidicola, or left unamended.

5 The effect of sterilization the soil (S), addition of organic material 97 (Unamended, or application of Mucuna pruriens or Brachiaria humidicola) and its interactions on the concentration of benzo(a)pyrene (BaP) (mg kg-1). Analysis of variance (PROC GLM, SAS, 1998) was used to test for significant differences with Tukey‟s Studentized Range (HSD) test (Type I).

ABREVIATURAS

Abreviatura Significado

HAPs Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos

BaP Benzo(a)Pireno

ATSDR Agency for Toxic Substances and Disease Registry

EPA Environmental Protection Agency

ADN Ácido desoxirribonucleico

MO Materia Orgánica

Cd Cadmio

Pb Plomo

Cu Cobre

Hg Mercurio

OECD Organisation for Economic Co-operation and Development

P. corethrurus Pontoscolex corethrurus

PAHs Polycyclic Aromatic Hydrocarbons m.a.s.l meters above sea level pH potencial de Hidrógeno

N Total Nitrogen o Nitrógeno total

P Extractable Phosphorus o Fósforo extraíble

K Total Potassium o Potasio total

SSSA Soil Science Society of America methods of soil analysis

GC Gas Chromatograph

PCA Principal Component Analysis (Análisis de Componentes Principales)

M. Pruriens Mucuna pruriens

B. humidicola Brachiaria humidicola

WHC Water Holding Capacity (Capacidad de retención de agua)

RESUMEN GENERAL

Diversos sistemas naturales y agroecosistemas han sido afectados por la contaminación, ocasionada por las actividades de la industria petrolera, como son: la exploración, extracción, traslado y refinación, siendo los derrames de petróleo crudo la principal causa de contaminación de estos ecosistemas. En el sureste de México son frecuentes los derrames de petróleo crudo principalmente como resultado de la ruptura de oleoductos y desbordamiento de las presas de las baterías de separación. En consecuencia, se han reducido los servicios ambientales que proporciona el suelo y los cuerpos de agua. Existen diferentes técnicas para la remediación de espacios contaminados, sin embargo la mayoría de estas resultan costosas, por lo que el uso de nuevas tecnologías y de menor costo para la remediación de sitios contaminados son necesarias. Recientemente se han venido desarrollando estudios con lombrices epígeas para la remediación de suelos, sin embargo las lombrices endógeas de clima tropical para este uso han sido poco estudiadas. Por lo anterior, en la primera parte de este estudio se investigó un suelo antrosol contaminado con petróleo crudo intemperizado, proveniente del campo petrolero Cinco Presidentes en

Tabasco México, para determinar cómo es afectada la presencia de lombrices de tierra. Los resultados mostraron la presencia tanto de lombrices de tierra (principalmente de la especie

Pontoscolex corethrurus) como de Benzo(a)pireno en el suelo. A pesar de que la concentración de Benzo(a)pireno estuvo muy por encima de los valores permisibles para suelos agrícolas, esto no tuvo un efecto sobre la abundancia (319 individuos m-2) y biomasa total de lombrices de tierra (43 g m-2).

Con base en estos resultados se procedió a desarrollar un experimento donde se evaluó la capacidad de la lombriz endógea Pontoscolex corethururs para la remoción del hidrocarburo poliaromático Benzo(a)Pireno en condiciones de laboratorio. Para esto, se establecieron diferentes tratamientos con lombrices, tanto en suelo estéril y no estérilizado.

El suelo fue contaminado con Benzo(a)pireno (100 mg k-1) y la concentración de éste fue medido en cada tratamiento, tanto en el suelo como en las excretas superficiales de las lombrices a diferentes tiempos: 0, 7, 28, 56 y a 112 días de experimentación. Los resultados mostraron que la lombriz endógea Pontoscolex corethurus participó significativamente en la remoción del Benzo(a)pireno (26.6 mg kg-1), y que esta remoción se potencializa aún más cuando se encuentran en conjunto con microorganismos autóctonos (36.1 mg kg-1). Se concluye que la especie endógea P. corethururs podría ser utilizada en la remediación de suelos contaminados con hidrocarburos poliaromáticos en zonas tropicales.

CAPITULO I

Introducción

1. Introducción General

1.1 Concepto e importancia del suelo

El suelo es un sistema complejo formado por partículas sólidas orgánicas e inorgánicas, aire, agua y microorganismos (Moreira et al., 2012; Chesworth, 1992). Estos elementos conocidos como fases tienen gran interacción, llevándose a cabo una enorme cantidad de reacciones químicas entre ellas. El suelo también puede considerarse como un sistema natural desarrollado a partir de una mezcla de minerales y restos orgánicos, bajo la influencia del clima y del medio biológico (Cepeda, 2007; NRCS, 2006). También se ha definido al suelo como una pequeña capa, que puede o no existir sobre la superficie y que representa el medio natural donde se concentran diversos materiales orgánicos e inorgánicos indispensables para la vida de las plantas y de los animales que guardan contacto estrecho con ellas; los estratos geológicos que integran la llamada roca madre se van transformando por efecto de la intemperización, y se combinan con sustancias orgánicas, desechos, etc. El agua y las diferentes combinaciones de los cuatro elementos más importantes (carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno) son ingredientes vitales para la constitución del suelo (Bassols, 2005).

El suelo brinda diversos servicios ambientales al constituir el medio donde crece la vegetación, y por lo tanto opera como una base de vida al abastecer a las especies animales de alimentos, energía renovable y materias primas para otros servicios. El suelo también funciona como filtro, regulador y transformador de diversas sustancias, es una fábrica de diversos compuestos y procesos del ecosistema y a la vez un agente amortiguador de

diversos impactos negativos al ambiente. Esta capacidad se deriva de su naturaleza compleja, polifásica y dinámica, de sus propiedades físicas, químicas y biológicas

(FitzPatrick, 1996). Con sus capacidades de filtro regulador y transformador, el suelo protege al ambiente en general, al agua y a las redes alimenticias en particular, contra la contaminación. El suelo también funciona como reserva genética (Becerra, 2005; Metson and Lee, 1977), al constituir el hábitat de gran diversidad de organismos adaptados para desarrollar una diversidad de funciones básicas dentro del ecosistema, como son la descomposición de residuos orgánicos, la fijación de nitrógeno atmosférico, la transformación de sustancias inorgánicas a formas asimilables para las plantas (Moreira et al., 2012, Lavelle, 1984). Casi todos los organismos que viven sobre la superficie de la tierra o dentro del suelo afectan de una o de otra manera el desarrollo de los suelos

(FitzPatrick, 1996; Henri et al., 1993).

En resumen los principales servicios ambientales que presta el suelo han sido agrupados de la siguiente manera (CENAPRED, 2012) de acuerdo a sus funciones: i) actúa como filtro regulador durante la recarga de acuíferos y protección de éstos, ii) es un medio para la producción de alimentos agrícolas y pecuarios, iii) es un productor de recursos forestales, iv) constituye un hábitat biológico y reserva para la preservación de especies, v) es el lugar donde se llevan a cabo los ciclos biológicos, biogeoquímicos, y de la red trófica, y vi) es la base física para la construcción de edificaciones y servicios.

1.2 Contaminación del suelo

Los suelos cambian constantemente y muchas de las transformaciones pueden ser vitales para la existencia de los seres vivos. Un suelo sano acepta y tolera la introducción de materiales, pero si se satura su capacidad de asimilación de materiales incompatibles, puede resultar en una reducción importante de sus procesos naturales. La aplicación de fertilizantes, pesticidas, así como el derrame de hidrocarburos y el depósito de miles de toneladas de residuos sólidos, provocan una gran cantidad de cambios en las propiedades físicas, químicas y biológicas de los suelos provocando que cada vez sea más difícil la asimilación o amortiguamiento de este tipo de sustancias. Un suelo se considera contaminado cuando las propiedades físicas, químicas y biológicas han cambiado de tal forma que pierde parte o toda capacidad para cumplir las funciones de su estado natural

(Mujica and Figueroa, 1996).

En las zonas de explotación de petróleo, algunos de los contaminantes más comunes en el suelo son los hidrocarburos de petróleo derramados o depositados durante las operaciones de extracción, refinación, transferencia y comercialización de estos productos

(Figura 1), razón por la cual frecuentemente encontramos en estos lugares residuos de petróleo, combustóleo, gasolinas, diesel y turbosina (CENAPRED, 2012).

Figura 1. Derrame petrolero registrado en el campo petrolero Cinco Presidentes, en Tabasco, México.

En el sureste de México, las actividades de la industria petrolera han contaminado los ecosistemas naturales y agroecosistemas reduciendo su calidad, como resultado de los derrames de petróleo crudo, de las actividades de exploración, extracción, traslado y refinamiento (García-López et al., 2005). En el campo petrolero Cinco Presidentes, en el estado de Tabasco, son frecuentes los derrames de petróleo crudo como resultado de la ruptura de los oleoductos y presas de las baterías de separación, estaciones de compresión, deshidratadoras y petroquímicas; además, por el desbordamiento de las presas de los pozos petroleros (Zavala, 2004). Esto reduce la calidad de los suelos para servir de hábitat para los organismos y para mantener los procesos ecosistémicos, además del riesgo que puedan representar para la salud humana. Por tanto, es necesario estudiar el efecto que tienen los

derrames de petróleo crudo en el suelo y buscar alternativas biotecnologías para la remediación, de estos suelos contaminados (Zavala et al., 2005).

En la década de los ochenta, en los distritos petroleros de Villahermosa y

Comalcalco del estado de Tabasco, se documentaron derrames de petróleo crudo que contaminaron aproximadamente 1,171ha (Zavala, 1988). También, en los campos petroleros del Activo Cinco Presidentes ocurrieron 52 derrames en 25 ha cultivadas con pastos, cocotero y vegetación natural (Zavala et al., 2005). Además, en los suelos de los campos petroleros Samaria, Blasillo, Castarrical, Cunduacán y Cinco Presidentes se encontró la presencia de hidrocarburos alifáticos y poliaromáticos (Zavala, 1996; Zavala et al., 2005).

1.3 Hidrocarburos aromáticos policíclicos

Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs) son compuestos orgánicos formados por anillos aromáticos condensados, en donde algunos átomos de carbono son comunes a dos o tres anillos (Fessenden and Fessenden, 1983). La estructura de los HAPs consiste de átomos de carbono e hidrógeno (Cutright and Hwang, 2006). Son compuestos no polares, neutros e hidrofóbicos (Juhasz and Naidu, 2000). Los HAPs poseen diferentes propiedades físicas y químicas debido a su estructura química (Figura 2), y exhiben persistencia bioquímica debido a la densa nube de electrones π en ambos lados de la estructura anillar. Por lo tanto, son compuestos más resistentes al ataque nucleofílico

(Haritash and Kaushik, 2009) conduciendo a la estabilidad bioquímica. La hidrofobicidad y estabilidad de alto peso molecular de los HAPs da como resultado la persistencia de estos

compuestos en el ambiente (Kanaly and Harayama, 2000). La poca solubilidad en agua por la naturaleza hidrofóbica de los HAPs se manifiesta en una menor biodisponibilidad

(Booncham et al., 2000).

Los HPAs se producen de manera natural por incendios forestales o por actividad volcánica, y se forman debido a la combustión incompleta de compuestos orgánicos (Keith and Telliard, 1979) y a las actividades antrópicas como el vertido de petróleo crudo o refinado que en sí mismo contiene HAPs (Mohsen et al., 2009).

Figura 2. Algunos de los Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos (HAPs) más estudiados en la actualidad por

el riesgo a la salud humana (USEPA, 1987).

Entre los HAPs sobresalen los compuestos que tienen entre cuatro y seis anillos aromáticos, ya que son potencialmente carcinógenos y mutagénicos (USEPA, 1987). La agencia de protección al medio ambiente de los Estados Unidos (EPA) ha clasificado a 16 hidrocarburos poliaromáticos como contaminantes prioritarios por el riesgo que representan al ambiente y a la salud. Entre estos 16 destaca el fenantreno, antraceno y benzo(a)pireno

(BaP). El fenantreno es un compuesto de tres anillos fusionados de benceno, el antraceno con tres anillos condensados forman antraquinona cuando se oxida y cuando se reduce forma 9,10-dihidroantraceno (Eweis et al., 1999), finalmente, el benzo(a)pireno es un compuesto de cinco anillos condensados de benceno.

Los HAPs tienen solubilidad muy alta en los lípidos por tanto se absorben rápidamente en el tracto gastrointestinal de los seres humanos (Gibson and Subramanian,

1984). Los efectos mutagénicos de los HAPs en el caso del BaP es el responsable de la iniciación del tumor (Lee and Hosomi, 2001). Los HAPs distribuidos en el suelo pueden causar daño a la salud, ya que pueden pasar a la cadena alimenticia, por lo tanto, el suelo contaminado es una fuente importante de HAPs, de gran preocupación para la salud humana (Tao et al., 2006). La piel es otra vía principal de absorción de HAPs y se puede absorber por esta vía hasta el 75% del total absorbido. Las tasas de absorción de los HAPs son rápidas debido a un alto potencial de biomagnificación en la cadena trófica. En general cuanto mayor sea el número de anillos de benceno, mayor será la toxicidad de los HAPs

(Cerniglia, 1992).

El benzo(a)pireno (BaP) es un hidrocarburo aromático policíclico, subproducto de la combustión incompleta de la materia orgánica (ATSDR, 1995). El BaP posee un anillo aromático unido al pireno en la posición a. Los cristales del BaP son de color amarillo con

ligero olor, tiene una masa molecular relativa de 252.31, con punto de ebullición de 310-

312 ºC a 10 mm de Hg, punto de fusión de 179-179.3 ºC, posee una baja solubilidad en agua de 0,00162 mg/L a 25 ºC (IARC, 2010). El BaP está clasificado por la EPA como un probable carcinógeno humano, sobre la base de numerosos estudios en especies animales adultas (primates, ratas, ratones) que demuestran que BaP puede aumentar la incidencia de tumores. En estudios experimentales con animales, la exposición al BaP durante el embarazo resultó en una mayor incidencia de tumores en pulmón, hígado, ovarios y otros

órganos (Wu et al., 2003). En otros experimentos por exposición al BaP, durante el embarazo, resultó en una mayor incidencia de muerte fetal, por anomalías como exencefalia y toracosquisis (Archibong, 2002). En los seres humanos, el BaP se ha asociado con la no replicación cromosómica y errores del ADN (Ácido desoxirrobonucleico) alterado en los gametos, lo que aumenta el riesgo de cáncer (Gaspari, 2003). Altos niveles de exposición aguda en adultos se han asociado con la supresión del sistema inmune y daño a las células rojas de la sangre, lo cual puede conducir a anemia (ATSDR, 1995). La principal preocupación de los humanos por la exposición a BaP, está relacionada con la contaminación atmosférica ocasionada por fuentes industriales y en zonas donde el suelo está contaminado con BaP (ATSDR, 1995).

1.4 Metodologías para la remediación de suelos contaminados

Los métodos existentes para tratar los suelos contaminados pueden ser de naturaleza fisicoquímica, térmica o biológica y tanto unos como otros pueden aplicarse en el lugar de la contaminación o como tratamiento ex situ. Al proceso de descontaminación del suelo

también se le llama remediación (Volke, 2002). Los métodos fisicoquímicos utilizan las propiedades físicas y/o químicas de los contaminantes o del medio contaminado para degradar, separar o contener los contaminantes. Los métodos térmicos emplean el calor para descomponer o fundir los contaminantes en un suelo. En cambio, los métodos biológicos, también llamados de biorremediación, utilizan organismos vivos para la remoción o degradación de los compuestos tóxicos (Volke, 2002). A continuación, se incluye una clasificación de las diferentes técnicas empleadas, agrupadas según su naturaleza y la forma de aplicación (Ortiz et al., 2006).

1.4.1 Tratamientos in situ

Fisicoquímicos: a) Extracción con vapor, b) Lavado, c) Solidificación y estabilización, d)

Separación electrocinética.

Biológicos: a) Biorremediación, b) Fitorremediación

Los tratamientos in situ tienen la ventaja de permitir tratar el suelo sin necesidad de excavar ni transportar, además de una potencial disminución en costos. Sin embargo presenta algunas desventajas como mayores tiempos de tratamiento, pueden ser inseguros en cuanto a uniformidad (heterogeneidad en las características del suelo) y existe dificultad para verificar la eficacia del proceso (Volke, 2002).

1.4.2 Tratamientos ex situ

Térmicos: a) Desorción térmica, b) Incineración

Fisicoquímicos: a) Extracción con disolventes, b) Lavado, c) Oxido-reducción, d)

Deshalogenación química, e) Solidificación y estabilización.

Biológicos: a) Biolabranza, b) Biopilas, c) Biodegradación en reactor

Los tratamientos ex situ presentan las siguientes ventajas como: menor tiempo de tratamiento, son más seguros en cuanto a uniformidad (es posible homogenizar y muestrear periódicamente). La desventaja es que existe la necesidad de excavar el suelo, aumento en costos e ingeniería para equipos, debe ser considerada la manipulación del material y la posible exposición al contaminante (Volke, 2002).

1.5 La biorremediación

La biorremediación, se utiliza para describir una variedad de sistemas que utilizan organismos vivos (plantas, hongos, bacterias, lombrices de tierra epígeas a nivel experimental) para degradar, transformar o remover compuestos orgánicos tóxicos a productos metabólicos inocuos o menos tóxicos (Volke, 2002). Esta estrategia biológica depende de las actividades catabólicas de los organismos, y por consiguiente de su capacidad para utilizar los contaminantes como fuente de alimento y energía (Van Deuren et al., 1997).

Las rutas de biodegradación de los contaminates orgánicos, varían en función de la estructura química del compuesto y de las especies microbianas degradadoras. El proceso de biorremediación incluye reacciones de oxido-reducción, procesos de sorción e intercambio iónico, e incluso reacciones de acomplejamiento y quelación que resultan en la inmovilización (Eweis et al. 1998).

La biorremediación puede emplear organismos propios del sitio contaminado

(autóctonos) o de otros sitios (exógenos), puede realizarse in situ o ex situ, en condiciones aerobias (en presencia de oxígeno) o anaerobias (sin oxígeno) (Eweis et al., 1998). Los

procesos de biorremediación se han usado con éxito para tratar suelos, lodos y sedimentos contaminados con hidrocarburos.

Tanto la biorremediación como los tratamientos físicoquímicos y térmicos han demostrado eficiencia en la descontaminación de suelos, sin embargo los altos costos de estos últimos los hacen menos viables, aunque tienen la ventaja de realizarse en periodos cortos, a diferencia de la biorremediación que requiere tiempos más largos. Sin embargo la biorremediación presenta muchas más ventajas ya que son tecnologías benéficas y compatibles con el ambiente, los contaminanantes generalmente son destruidos, se requiere un mínimo o ningún tratamiento posterior y son relativamente más económicos. Por lo que esta biotecnología ha demostrado ser una opción viable y rentable para la remediación de suelos contaminados con compuestos a base del petróleo (Mohsen et al., 2009).

1.6 Importancia de las lombrices de tierra como conductores de procesos en el suelo

Las lombrices de tierra o también llamadas oligoquetos por las quetas o zedas existentes en su cuerpo están presentes en los suelos de casi todos los ecosistemas naturales y agroecosistemas. Su abundancia y distribución varían en función de las condiciones climáticas (temperatura y humedad), biológicas (vegetación, calidad de la materia orgánica, organismos y depredación) y del ambiente humano (labranza del suelo, aplicación de fertilizantes y plaguicidas) (Bouché, 1977).

Las lombrices de tierra con base en su distribución, hábito alimenticio, ciclo biológico, morfología y galerías se han clasificado en tres categorías ecológicas: epígeas, endógeas y anécicas. Las primeras son lombrices de 1 a 15 cm de longitud, viven sobre la

superficie del suelo, son pigmentadas y se alimentan de la hojarasca del suelo en descomposición. Las endógeas no tienen pigmentación, viven dentro del suelo (0-40 cm), se alimentan de la materia orgánica y construyen galerías. Finalmente, las anécicas son lombrices de tierra que viven dentro del suelo, construyen un sistema permanente de galerías verticales (0.0 – 2.0 m) y se alimentan de restos orgánicos que se encuentran sobre la superficie del suelo (Bouché, 1977).

Es conocido que las lombrices de tierra contribuyen en los servicios ambientales que proporcionan los ecosistemas terrestres. La actividad biológica de las lombrices de tierra como “ingenieros del ecosistema” modifica las propiedades físicas, químicas y biológicas del suelo (Lee, 1985; Lal, 1988; Lavelle et al., 1992; 1997; Blair et al., 1995;

Bohlen et al., 2004). Las lombrices juegan un importante papel en la aceleración de la descomposición y en los procesos de mineralización de la materia orgánica del suelo y en el ciclo de nutrientes (Lavelle, 1984). También está documentado que su actividad (excretas, mucus y galerías) tiene un efecto en el crecimiento de las plantas al modificar positiva y significativamente (a) la mineralización de la materia orgánica del suelo, (b) la estimulación de la actividad microbiana, (c) la reducción de plagas y enfermedades, (d) la estimulación de simbiontes, y (e) la modificación de porosidad y agregación del suelo.

Estos procesos favorecen la disponibilidad de agua, oxígeno y nutrientes para las plantas

(Edwards, 2004; Brown et al., 2004).

Las lombrices de tierra en general, son altamente benéficas para el suelo debido a que construyen canales o galerías que facilitan la penetración del aire y el agua hasta la zona de raíces dentro del suelo (Lavelle et al., 1992). Además, al ingerir el suelo y excretar sus turrículos concentran los nutrientes y de esta manera pueden ser mejor asimilados por

las plantas (Barois and Lavelle, 1986). Quizá la función más importante de las lombrices terrestres sea el dar una dinámica distinta a la porción de materia orgánica que no es asimilada, confiriéndole las características fisicoquímicas necesarias para el desarrollo de la actividad microbiana del suelo (Lavelle and Barois, 1988).

Las lombrices de tierra son un componente dominante de la fauna del suelo por su abundancia y biomasa con importante influencia sobre las funciones del suelo (Brown et al., 2000). En regiones tropicales se han reportado biomasas de 100-200 kg de masa fresca ha-1 (Lavelle et al., 1981). En un pastizal de Laguna Verde México, se encontró que las lombrices de tierra pueden ingerir 400 tn/ha/año (Lavelle et al., 1987). Lo que permite dimensionar el potencial que representan las lombrices de tierra. En México existen 93 especies de lombrices descritas, 46 nativas y 47 exóticas, al añadir 36 especies nuevas en proceso de descripción, el número total se incrementará a 129 (Fragoso, 2001). Desde el punto de vista funcional el 72% de las lombrices de tierra de México son endógeas y el resto son epígeas. En un estudio realizado en 10 sitios (dos con vegetación natural, cuatro en praderas, tres en plantaciones de cacao y un cocotero) del estado de Tabasco se registró la presencia de 13 especies de lombrices de tierra (9 nativas y 4 exóticas); de los diez sitios, la especie nativa Balanteodrilus pearsei se encontró en seis y la especie exótica

Pontoscolex corethrurus en siete y asociada con B. pearsei y Ramillona strigosa en cuatro y dos sitios, respectivamente (Fragoso, 1993). En otro estudio realizado en el mismo estado

19 especies de lombrices de tierra fueron encontradas, 14 nativas y 5 exóticas, pertenecientes a las familias Megascolecidae, Glossoscolecidae y Ocnerodrilidae (Huerta et al., 2007). Se ha mencionado la presencia de cuatro especies de lombrices de tierra encontradas en un suelo antrosol, siendo la especie exótica P. corethrurus la mas

dominante al presentar el mayor número de individuos y biomasa (Zavala-Cruz et al.,

2012) (Figura 3). En regiones tropicales predominan las lombrices endógeas (Lavelle,

1983). También en ambientes perturbados y en los bosques tropicales abundan las lombrices endógeas pues representan más del 80 % del promedio de la densidad y biomasa total (Fragoso, 2001). En Ecosistemas naturales, las selvas altas se caracterizan por tener la mayor cantidad de especies, mientras que los bosques de pino son los más pobres; en ambientes perturbados la mayor y menor riqueza corresponden a los pastizales y a los cultivos respectivamente (Fragoso, 2001). Este mismo autor en dicho estudio reportó la abundancia y biomasa total de lombrices de tierra para diferentes ecosistemas: selva alta

22-121 ind.m-2 con 3-42 g.m-2, selva mediana 8-846 ind.m-2 con 1-124 g.m-2, Bosque

Mesófilo 22-46 ind.m-2 con 6-16 g.m-2, pino-encino 17-155 ind.m-2 con 5 g.m-2, acahuales 12-230 ind.m-2 con 31 g.m-2, para pastizales 10-653 in.m-2 con 25-88 g.m-2, y para cultivo 11-557 ind.m-2 con 3-34 g.m-2.

La amplia abundancia y biomasa de las las lombrices de tierra en diferentes ecosistemas así como su enorme potencial permiten suponer su existencia en sitios contaminados por derrames petroleros como los exitentes en el sureste de México. Solo un estudio se ha realizado al respecto (Zavala-Cruz et al., 2012) por lo que es importante desarrollar inventarios sobre las diferentes especies de lombrices de tierra en sitios contaminados por hidrocarburos y su posible efecto en la remediación de suelos.

Figura 3. Imagen de la lombriz endógea Pontoscolex corethrurus.

1.7 La asociación mutualista entre lombrices de tierra y microorganismos del suelo potencia su capacidad digestiva

Algunos estudios sobre el sistema digestivo de las lombrices endógeas tropicales

(Lavelle et al., 1983; Barois and Lavelle, 1986) han demostrado que después de que el suelo es ingerido una gran cantidad de agua y materia orgánica hidrosoluble (en forma de moco intestinal), son secretados en el intestino anterior. Parte de la microflora presente en el suelo ingerido es activada por estas secreciones y es capaz de hidrolizar compuestos húmicos.

Cuando el suelo ha pasado por el intestino, la actividad microbiana no cesa bruscamente sino que, gracias al alto contenido de elementos y compuestos fácilmente asimilables así como a la materia orgánica parcialmente digerida (Scheu, 1987; Sharpley and Syers and Keeney, 1976), se mantiene algún tiempo después (Satchell, 1983; Barois,

1987). Se ha visto también que el moco cutáneo tiene un papel activador en la microflora, que se encuentra en las galerías o nidos formados por el oligoqueto puesto que constituye materia orgánica fácilmente asimilable por los microorganismos (Martin et al., 1987). Esto permite observar que existe una simbiosis entre lombrices y microorganismos, que permite una más rápida descomposición de la materia orgánica.

Barois et al. (1999), explicó que el aumento del nitrógeno mineral (N) en los casting

(turrículos o excretas) de las lombrices se debe a la actividad microbiana en el intestino del oligoqueto y a la excreción por parte de las lombrices al interior de su intestino, lo que sugiere que podría acarrear cambios en la disponibilidad de otros nutrientes. La mayor concentración inicial de amonio en los casting comparada con suelo no ingerido, es probablemente debido a que las lombrices geófagas dentro de su intestino y por el proceso digestivo están mineralizando la materia orgánica (MO) ingerida con la ayuda de la actividad bacteriana, (Laverack, 1963; Syers et al., 1979; Barois et al., 1987, 1993). Esto nos lleva a pensar si en ambientes contaminados existirán mecanismos entre lombrices de tierra y microorganismos que faciliten la descomposición de otros tipos de materiales orgánicos como el caso de hidrocarburos.

Las excretas de la lombriz presentan alta actividad y abundancia de microorganismos (hongos, actinomicetos, protozoarios, algas, mixomicetos y bacterias) cuando se les compara con suelo no ingerido. Los efectos de las comunidades de lombrices

de tierra en la actividad y biomasa de los microorganismos son dependiente del tipo de suelo y de la calidad de los recursos orgánicos disponibles en el mismo. También, los microorganismos se benefician con el desplazamiento de las lombrices al adherirse a su cuerpo o bien pueden sobrevivir al ser ingeridos y después dispersados a través de los turrículos (Lavelle and Barois, 1988; Lavelle and Gilot, 1994; Lavelle et al., 1995; Brown,

1995; Wolters and Ekschmitt, 1995; Binet et al., 1998; Brown et al., 1999).

Las lombrices de tierra pueden aumentar la dispersión, actividad y crear un ambiente favorable para la multiplicación de organismos (bacterias) prevaleciendo los efectos benéficos en las interacciones entre las lombrices y los microorganismos incrementando la actividad enzimática, liberación de nutrientes, etc. (Lavelle and Barois,

1988; Judas, 1992; Lavelle and Gilot,1994; Lavelle et al., 1995; Brown et al., 1999, Barot et al., 2007). Todo esto contribuye a aumentar la posibilidad de que la interacción entre lombrices de tierra y los microorganismos faciliten la remoción de hidrocarburos en ambientes contaminados. Está documentado que la aplicación de lombrices (Eisenia fetida) en suelos contaminados decrece la concentración de hidrocarburos en el suelo (Tejada and

Masciandaro, 2011). Sin embargo no hay mucha claridad en los mecanismos que se llevan a cabo para esta remoción de contaminantes.

1.8 Estudios ecotoxicológicos y de remediación utilizando lombrices de tierra

En general, se tiene evidencia de que las lombrices de tierra, son tolerantes a diversos contaminantes químicos. Por ejemplo, se ha documentado la tolerancia de las

lombrices a metales pesados presentes en el suelo (Sinha et al., 2008), y la remoción de los mismos, e.g. Cd, Pb, Cu, Hg, por parte de especies como Eisenia fetida, Eisenia tetraedra,

Lumbricus terrestris, Lumbricus rubellus y Chlorotica allobophora. (Satchell, 1983).

También, se ha mostrado que la presencia de E. fetida contribuyó a la remoción del 91%

(1074 mg kg-1 a 96 mg kg-1) de petróleo crudo (Schaefer, 2001) y redujo en un 50% los hidrocarburos totales de petróleo de lodos industriales (Ceccanti et al., 2006). Estudios con la lombriz de tierra anécica L. terrestris registraron una disminución de la concentración de petróleo crudo (Schaefer and Filser, 2007).

En la mayoría de los estudios ecotoxicológicos se han utilizado lombrices de tierra epígeas. Por ejemplo, Eisenia fetida ha sido utilizada como testigo para diferentes contaminantes como insecticidas (Chlorpyrifos), hidrocarburos poliaromáticos (fenantreno) y metales pesados (Cadmio y Plomo) (OECD, 2000). Además, se ha documentado que E. fetida tolera suelos contaminados con concentraciones de 1.5% de petróleo crudo, mientras que Lumbricus terrestris no sobrevive a una concentración de 0.5% (Safwat et al., 2002).

Actualmente, existen muy pocos trabajos que relacionan la actividad de las lombrices con los hidrocarburos y la sensibilidad de las lombrices de tierra a estos contaminantes así como su efecto en la degradación de los mismos en el suelo es limitada (Geissen et al.,

2008; Contreras-Ramos et al., 2009). En algunos estudios se ha observado que las lombrices, en interacción con otros microorganismos del suelo, pueden coadyuvar en la remediación de suelos contaminados por hidrocarburos (Eweis et al., 1999); por lo que es importante evaluar la eficiencia de estas interacciones. Por ejemplo, Ceccanti et al. (2006) investigaron los procesos bioquímicos, incluyendo la actividad microbiana, que se presentan en los procesos de biorremediación de lodos de refinería de petróleo,

haciendouna mezcla de microorganismos, enzimas, composta y lombrices (E. fetida). El resultado de la degradación de los contaminantes fue atribuido a la acción de las lombrices de tierra y/o a estimulación microbiana. Similarmente, en otro estudio, las especies de lombrices L. terrestris y E. fetida promovieron una actividad microbiana alta y la degradación de hidrocarburos (Schaefer et al., 2005).

Se ha reportado la dificultad para extraer hidrocarburos recalcitrantes de alto peso molecular y la dificultad de los microorganismos para degradarlos (Atlas, 1995), sin embargo, la presencia de E. fetida (especie epígea) degradó en un 51, 100 y 47% el antraceno, fenantreno y el benzo(a)pireno (Contreras-Ramos et al., 2006). Asimismo, la degradación de fenantreno y fluoranteno fue reportada por ser más rápida en presencia de la lombriz L. rubellus (Ma et al., 1995). Sin embargo, la mayor parte de los ensayos que utilizan lombrices para la remediación han sido con especies epígeas.

La inclusión de especies tropicales de lombrices de tierra endógeas no han sido incluidas, por lo regular, en trabajos de investigación ecotoxicológica, por lo que es importante hacer inventarios de su presencia en sitios contaminados (Zavala-Cruz et al.,

2012). En un estudio previo (Zavala-Cruz et al., 2012) a nuestra investigación, en suelo de tipo antrosol contaminado con petróleo crudo intemperizado del campo petrolero Cinco

Presidentes, se registró una densidad alta de lombrices de tierra (210 individuos m-2) asociada a la presencia de hidrocarburos totales de petróleo. Esto sugiere que los hidrocarburos presentes no son letales para las lombrices (Zavala-Cruz et al., 2012).

Además, esta densidad alta registrada de especies endógeas, sugiere también que podrían estar promoviendo la degradación de los hidrocarburos y que serían potencialmente útiles en la remediación de suelos contaminados con estas sustancias.

Por tanto, la presente tesis doctoral tuvo como objetivos i) evaluar la presencia de lombrices de tierra en zonas contaminadas con hidrocarburos, y ii) evaluar experimentalmente en laboratorio, el potencial de la especie más conspicua en la remediación de suelos contaminados con hidrocarburos poliaromáticos (HAPs). Las principales preguntas que se respondieron con el trabajo de investigación, junto con las hipótesis y objetivos se mencionan a continuación.

1.9 Preguntas de investigación

¿Existen lombrices de tierra endógeas en suelos contaminados por HAPs, cuáles

son y cuál es la más abundante?

¿La actividad de la lombriz de tierra endógea más conspicua en los suelos

contaminados contribuye a la remoción del hidrocarburo poliaromático

benzo(a)pireno presente en el suelo?

1.10 Hipótesis

Si los suelos contaminados con hidrocarburos poliaromáticos no tienen efectos

letales para algunas especies de lombrices de tierra tolerantes, entonces, estas

pueden mantenerse y, aún, ser promovidas por la presencia de los mismos

contaminantes. Por tanto, la predicción, es que es factible encontrar alguna

comunidad de lombrices de tierra en estos sitios y ensayar experimentalmente

alguna de las especies para la remediación de suelos contaminados.

1.11 Objetivos

1) Determinar la presencia y densidad de lombrices de tierra en un suelo antrosol

contaminado por hidrocarburos del campo petrolero Cinco Presidentes.

2) Evaluar experimentalmente la remoción de benzo(a)pireno por parte de la

lombriz más abundante registrada en suelos contaminados con hidrocarburos en

el Campo Petrolero Cinco Presidentes, Tabasco México.

El presente trabajo de tesis doctoral estuvo integrado por dos estudios, un estudio de campo y un estudio experimental con los cuales se buscó dar respuesta a las preguntas de investigación de esta tésis. En el primer estudio, correspondiente al capítulo II, se muestran los resultados del trabajo de campo llevado a cabo en un suelo antrosol del Campo

Petrolero Cinco Presidentes, Tabasco México, donde se evaluó a las poblaciones de lombrices de tierra bajo un gradiente de contaminación. En el segundo estudio, correspondiente al capítulo III, se presentan los resultados de un estudio experimental en condiciones de laboratorio para determinar el efecto de la lombriz de tierra endógea

Pontoscolex corethrurus en la remoción del hidrocarburo poliaromático Benzo(a)pireno en un suelo antrosol. Finalmente, en el capítulo IV, se hace una discusión y conclusión generales de los principales resultados de la investigación.

1.12 Referencias

Archibong, A.E., 2002. Alteration of pregnancy related hormones and fetal survival in F-

344 rats exposed by inhalation to benzo(a)pyrene. Reprod.Toxicol. 16, 801-808.

Atlas, R.M.,1995. Bioremediation of petroleum pollutants. Int. Biodeter. Biodegr. 1995,

317–27.

ATSDR, 1995. Agency for Toxic Substances and Disease Registry. Toxicological Profile

for Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs). U.S. Department of Health & Human

Services.

Barois, I. 1987.Interactions entre les vers de terre geophages tropicaux et la microflore du

sol pour l'exploitation de la matiere organique du sol. Travaux des chercheurs de

Lamto (RCI) 7, 152 pp.

Barois, I., Lavelle, P. 1986. Changes in respiration rate and some physicochemical

properties of a tropical soil during transit through Pontoscolex corethrurus

(Glossoscolecidae, Oligochaeta). Soil Biol. Biochem. 18, 539-541.

Barois, I., Lavelle, P., Brossard, M., Tondoh, J., Martinez, M., Rossi, J., Senapati, B.,

Angeles, A., Fragoso, C., Jimenez, J., Decaëns, T., Lattaud, C., Kanyonyo, J.,

Blanchart, E., Chapuis, L., Brown, G., Moreno, A., 1999. Ecology of earthworm

species with large environmental tolerance and or extended distributions. In: Lavelle,

P., Brussard, L., Hendrix, P. (eds). Earthworm management in tropical

agroecosystems. CAB International, Wallingford, UK. 57-85 pp.

Barois, I., Verdier, B., Kaiser, P., Mariotti, A., Rangel, P., Lavelle, P., 1987. Influence of

the tropical earthworm Pontoscolex corethrurus (Glossoscolecidae sp) on the fixation

and mineralization of Nitrogen. In: Bonvicini-Pagliai, A.M. and Omodeo, P., (eds). On

earthworms. Mucchi, Modena Editore. Bologna, Italy, 151-158 pp.

Barois, I., Villemin, G., Lavelle, P., Toutain, F., 1993. Transformation of the soil structure

through Pontoscolex corethrurus (Oligochaeta) intestinal tract. Geoderma 56, 57-66.

Barot, S., Ugolini, A., Brikci, F.B., 2007. Nutrient cycling efficiency explains the long-term

effect of ecosystem engineers on primary production. Funct. Ecol. 21, 1-10.

Bassols, A., 2005. Geografía socioeconómica de México. Aspectos físicos y económicos

por regiones. 8ª edición. Trillas, México, 422 pp.

Becerra, A., 2005. Escorrentía, Erosión y Conservación de Suelos. 1ª reimpresión.

Universidad Autónoma de Chapingo, México, 375 pp.

Binet, F., Fayolle, L., Pussard, M., 1998. Significance of earthworms in stimulating soil

microbial activity. Biol. Fert. Soils 27, 79-84.

Blair, J.M., Parmelee, R.W., Lavelle, P., 1995. Influences of earthworms on

biogeochemistry. In: Hendrix, P.F. (ed.). Earthworm ecology and biogeography.

Lewis, Boca Raton, Florida. pp. 127-158.

Bohlen, P.J., Pelletier, D.M., Groffman, P.M., Fahey, T.J., Fisk, M.C., 2004. Influence of

earthworm invasion on redistribution and retention of soil carbon and nitrogen in

Northern temperate forests. Ecosystems 7, 13-27.

Boonchan, S., Britz, M. L., Stanley, G. A. , 2000. Degradation and mineralization of high-

molecular-weight polycyclic aromatic hydrocarbons by defined fungal-bacterial

cocultures. Appl. Environ. Microb. 66, 1007-1019.

Bouché, M.B., 1977. Strategies lombriciennes. In: Lohm, U., person T (eds) Soils

organisms as components of ecosystems. Ecol. Bull. 25, 122-123.

Brown, G. G., C.A., Brussaard, L., 2004. How earthworms effect plant growth: burrowing

into the mechanisms. In Earthworm Ecology, C. A. Edwards, Ed., pp. 13–49.

Brown, G., Barois, I., Lavelle, P., 2000. Regulation of soil organic matter dynamics and

microbial activity in the drilosphere and the role of interactions with other edaphic

functional domains. Eur. J. Soil Biols. 36, 177-198.

Brown, G., 1995. How do earthworms affect microfloral and faunal community diversity?

1995. In: Collins, H.P., Robertson, G.P., and Klug, M.J., (Eds.) The significance and

regulation of soil biodiversity. Kluwer Academic Publishers. The Netherlands. 247-

269 pp.

Brown, G., 1999. Effects of earthworms on plant production in the tropics. In arthworm

management in tropical agroecosystems, ed. P. Lavelle, L. Brussaard, and P.F.

Hensrix, Wallingford: CABI. 87-147 pp.

Brown, G., Pashanasi, B., Villenave, C., Patron, J., Senapati, B., Giri, S., Barois, I.,

Lavelle, P., Blan- chart, E., Blakemore, R., Spain, A., Boyer. J., 1999. Effects of

earthworms on plant production in tropics. Pp. 87-147. In: P. Lavelle, L. Brussaard and

P. F. Hendrix (Eds.). Earthworm management in tropical agroecosystems. CAB-

International Wallingford.

Brown, P., Long, S., Spurgeon, D., Svendsen, C., Hankard, P., 2004. Toxical and

biochemical responses of the earthworm Lumbricus rubellus to pyrene, a non-

carcinogenic polycyclic aromatic hydrocarbon. Chemosphere. 57, 1675-1681.

Ceccanti. B., Masciandaro, G., García, C., Macci, C., Doni, S., 2006. Soil bioremediation:

combination of earthworms and compost for the ecological remediation of a

hydrocarbon polluted soil. Water, Air Soil Poll. 17, 383-97.

CENAPRED., 2012, Centro Nacional de Prevención de Desastres.

http://www.cenapred.unam.mx/es/Investigacion/RQuimicos/ContaminacionSuelos/

Cepeda, J., 2007. Química de Suelos. 1ª reimpresión. Trillas, México, 167 pp.

Cerniglia, C. E., 1992. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons. Adv. Appl.

Microbiol. 3, 351-368.

Chesworth, W., 1992. Weathering systems. In: Weathering, Soils and Paleosols (eds. I.P.

Martini and W. Chesworth), pp. 19-40. Elsevier, Amsterdam.

Contreras-Ramos, S.M., Alvarez-Bernal, D., Dendooven, L., 2006. Eisenia fetida increased

removal of polycyclic aromatic hydrocarbons from soil. Environ. Pollut. 141, 396–401.

Contreras-Ramos, S.M., Álvarez-Bernal, D., Dendooven, L., 2009. Characteristics of

earthworms (Eisenia fetida) in PAHs contaminated soil amended with sewage sludge

or vermicompost. Appl. Soil Ecol. 41, 269–276.

Cutright, T. J., Hwang, S., 2006. Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs). Encyclopedia

of Chemical Processing: 2291-2299.

Edwards, C.A., 2004. Earthworm Ecology. C. A. Edwards, Ed., CRC Press, Boca Raton,

Florida, USA.

Eweis, J. B., Ergas, S., Chang, D., Schroeder, E., 1999. Principios de biorrecuperación.

McGraw Hill. Madrid, España.

Fessenden, R., Fessenden, J., 1982. Química orgánica. Grupo editorial Iberoamérica. 1078

pp.

FitzPatrick, E.A., 1996. Introducción a la ciencia del suelo. 1ª edición. Trillas, México, 288

pp.

Fragoso, C., 1993. Les peuplements de vers de terre dans l´est et sud-est du Mexique.

These de Doctorat de I´Université Paris 6. Paris, France. 228 p.

Fragoso, C., 2001. Las lombrices de tierra de México ( Annelida, oligochaeta): diversidad,

ecología y manejo. Acta Zoológica Mexicana. (N.S.) número especial 1, 131-171.

García-López, E., Zavala-Cruz, J., Palma-López, D., 2005. Caracterización de las

comunidades vegetales en un área afectada por derrames de hidrocarburos. Terra

Latinoamericana 24, 17-26.

Gaspari, L., 2003. Polycyclic aromatic hydrocarbon-DNA adducts in human sperm as a

marker of DNA damage and infertility. Mutat. Res. 535, 155-160.

Geissen, V., Gomez-Rivera, P., Huerta-Lwanga, E., 2008. Using earthworm to thes the

efficiency of remediation of oil-polluted soil in tropical Mexico. Ecotox. Environ. Safe.

71, 638-642.

Gibson, D. T., Subramanian, V., 1984. Microbial degradation of aromatic hydrocarbons.

Molecular degradation of organic compounds: 181-252.

Haritash, A. K., Kaushik, C. P., 2009. Biodegradation aspects of Polycyclic Aromatic

Hydrocarbons (PAHs): A review. J. Hazard. Mater. 169, 1-15.

Henri, M., Noti, M., Lebrun, P., 1994. The soil fuana: the other last biotic frontier.

Biodiversity and Conservation 3, 45-56.

Huerta, E., Rodriguez-Olan, J., Evia-Castillo, I., Montejo-Meneses, E., de la Cruz-

Mondragon, M., Garcia-Hernandez, R., Uribe, S., 2007. Earthworms and soil

properties in Tabasco, Mexico. Eur. J. Soil Biol. 43, 190–195.

IARC, 2010. Some non-heterocyclic polycyclic aromatic hydrocarbons and some related

exposures. IARC Monogr. Eval. Carcinog. Risks Hum. 92, 1–853.

Judas, M., 1992. Gut content analysis of earthworms (Lumbricidae) in a beechwood. Soil

Biol. Biochem. 24, 1413-1417.

Juhasz, A. L., Naidu, R.,2000. Bioremediation of high molecular weight polycyclic

aromatic hydrocarbons: a review of the microbial degradation of benzo[a]pyrene. Int.

Biodeter. Biodegr. 45, 57-88.

Kanaly, R. A., Harayama, S., 2000. Biodegradation of high-molecular-weight polycyclic

aromatic hydrocarbons by bacteria. J. Bacteriol. 182, 2059-2067.

Keith, L. H., Telliard, W. A.,1979. Priority Pollutants I-a Perspective View. Environ. Sci.

Technol. 13, 416-423.

Lal, R., 1988. Effects of macrofauna on soil properties in tropical ecosystems. Agr.

Ecosyst. Environ. 24, 101-116.

Lavelle, P., Maury, M., Serrano, V., 1981. Estudio cuantitativo de la fauna del suelo en la

región de Laguna Verde, Veracruz; Época de lluvias. Instituto de Ecología.

Publicaciones v.6, p.75-100.

Lavelle, P., 1983. The soil fauna of tropical savannas. II. The earthworm. Pp. 485-504. In:

F. Bourliere /ed.): Tropical Savannas. Elsevier.

Lavelle, P., 1984.The soil system in the humid tropics. Biol. Int. 9, 2-15.

Lavelle, P., Rangel, P., Ka Kajondo, J., 1983. Intestinal mucus production by two species

of tropical earthworm: Millsonia lamtoiana (Megascolecidae) and Pontoscolex

corethrurus (Glossoscolecidae), in: Lebrun P., André H.M., de Medts A., Grégoire-

Wibo C., Wauthy G. (Eds.), New Trends in Soil Biology, Dieu-Brichart, Louvain-la-

Neuve, Belgium, pp. 253-259.

Lavelle, P., I. Barois and I. Cruz, 1987. Adaptative strategies of Pontoscolex corethrurus

(Glossoscolecidae oligochaeta) a peregrine geophagous earthworm of the humic

tropics. Biol. Fert. Soils 51, 88-194.

Lavelle, P. 1988. Earthworm activities and the soil system.1988. Biol. Fertil. Soils 6, 237-

251.

Lavelle, P., Barois, I., 1988. Earthworm activities and the soil system. Biol. Fertil. Soils 6,

237-251.

Lavelle, P., Bignell, D., Lepage, M., Wolters, W., Roger, P., Ineson, P., Heal, O., Dhillions,

S., 1997. Soil function in a changing world: the role of invertebrate ecosystem

engineers. Eur. J. Soil Biol. 33, 159–193.

Lavelle, P., G. C., 1994. Priming effects of macroorganisms on microflora: a key process of

soil function?." In: Ritz, K., Dighton, J. and Giller, K. (eds) Beyond the biomass -

compositional and functional analysis of soil microbial communities. Wiley,

Chichester. 173-180 pp.

Lavelle, P., Lattaud, L., Trigo, D., Barois, I., 1995. Mutualism and biodiversity in soils. In:

H.P. Collins, G.P. Robertson, and M.J. Klug (Eds.) The significance and regulation of

soil biodiversity. Kluwer Academic Publishers. The Netherlands. 23-33 pp.

Lavelle, P., Melendez, G., Pashanasi, B., Schaefer, R., 1992. Nitrogen mineralization and

reorganization in casts of the geophagous tropical earthworm Pontoscolex corethrurus

(Glossoscolecidae). Biol. Fertil. Soils 14, 49-53.

Laverack, M., 1963. The physiology of earthworms. Pergamon Press, London, 206 pp.

Lee, B. D., Hosomi, M., 2001. Fenton oxidation of ethanol-washed distillation-

concentrated benzo(a)pyrene: reaction product identification and biodegradability.

Water Resour. 35, 2314-2319.

Lee, K.E., 1985. Earthworm. Their ecology and relashionships with soils and land use.

Academic Press, London, U.K. 411 pp.

Ma, W.C.H., Immerzeel, J., Bodt, J., 1995. Earthworms and food interactions on

bioaccumulation and disappearance in soil of polycyclic aromatic hydrocarbons:

studies on phenanthrene and fluoranthene. Ecotoxicol. Environ. Saf. 32, 226–232.

Martin, A., Cortez, L., Barois, I., Lavelle, P., 1987. Les mucus de vers de terre: moteurs de

leurs interactions avec la microflore. Rev. Ecol. Biol.Sol 24, 549-558.

Martin-Gil, J., Navas-Gracia, L.M., Gomez-Sobrino, E., Correa-Guimaraes, A., Hernandez-

Navarro, A., Sanchez-Bascones, S. M., 2007. Composting and vermicomposting

experiences in the treatments and bioconversion of asphaltens from the Prestige oil

spill. Bioresource Technol. 99, 1821–1829.

Metson, A., Lee, R., 1977. Soil Chemistry in Relation to the New Zealand Genetic Soil

Classification. Soil Science 123, 345-423.

Mohsen, A., 2009. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in

petroleum contaminated soils. Iranian Journal of Chemistry and Chemical Engineering.

28, 53-59.

Moreira, F., Huising, F., Bignell, D., 2012. Manual de biología de suelos tropicales.

Muestreo y caracterización de la biodiversidad bajo suelo. 1ª edición. Instituto

Nacional de Ecología, México, 337 pp.

Mujica, Violeta., Figueroa, J., 1996. Contaminación Ambiental causas y control.

Universidad Autónoma Metropolitana. Primera edición, México, 367 pp.

Natural Resources Conservation Service (NRCS). 2006. Soils Fundamental Concepts.

http://urbanext.illinois.edu/soil/concepts/concepts.pdf.

Organization for Economic Co-operation and Development (OECD). 2000. Guideline for

Testing Organic Chemicals. Proposal for New Guideline: Earthworms Reproduction

Test (Eisenia fetida/andrei). http://www.oecd.org.

Ortiz, I., Sanz, J., Dorado, M., Villar, S., 2006. Técnicas de recuperación de suelos

contaminados. Universidad de Alcalá. Primera edición, España, 105 pp.

Safwat, H., Hanna, S., Weaver, R.W., 2002. Earthworm survival in oil contaminated soil.

Plant Soil 240, 127–132.

Satchell, J., 1983. Earthworm microbiology. In: Earthworm Ecology: From Darwin to

Vermiculture, Chapman and Hall, London. 351-364 pp.

Schaefer, M., 2001. Earthworm in crude oil contaminated soils: Toxicity tests and effects

on crude oil degradation. Environ, Asses. Remed. 8, 35-37.

Schaefer, M., 2003. Behavioral endpoints in earthworm ecotoxicology. Evaluation of

different test systems in soil toxicity assessment. J. Soil. Sediment. 3, 79-84.

Schaefer, M., Filser, J., 2007. The influence of earthworm and organic additives on the

biodegradation of oil contaminated soil. Appl. Soil Ecol. 36, 53-62.

Schaefer, M., Peterson. SO., Filser, J., 2005. Effects of Lumbricus chlorotica and Eisenia

fetida on microbial community dynamics in oil-contaminated soil. Soil Biol. Biochem.

37, 2065–2076.

Scheu, S., 1987. Microbial Activity and nutrient dynamics in earthworm cast (Lumbricidae)

Biol. Fert. Soils 5, 230-234.

Sharpley, A N., Syers, JK., 1977. Potential role of earthworms casts for the phosphorous

enrichment of runoff waters. Soil Biol Biochem. 8, 341-346.

Shina, R., Bharambe, G., Ryan, D., 2008. Converting wasteland into wonderland by

earthworms a low-cost nature´s technology for soil remediation: a case study of

vermiremediation of PAHs contaminated soil. The Environmentalist. 28, 466-475.

Syers, J., Keeney, A., 1979. Cycling of nitrogen by surface-casting earthworm in a pasture

ecosystem. Soil Biol.Biochem. 11, 181-185.

Tao, S., Jiao, X. C., Chen, S. H., Liu, W. X., Coveney, R. M., Zhu, L. Z., Luo, Y. M. 2006.

Accumulation and distribution of polycyclic aromatic hydrocarbons in rice (Oryza

sativa). Environ. Pollut. 140, 406-415.

Tejada, M., Masciandaro, G., 2011. Application of organic wastes on a benzo(a)pyrene

polluted soil. Response of soil biochemical properties and role of Eisenia fetida.

Ecotox. Environ. Safe. 74, 668–674.

USEPA., 1987. United States Environmental Protection Agency (USEPA) list. 16 prioritary

pollutant polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs). N.Y. USA.

Volke Tania. 2002. Tecnologías de remediación para suelos contaminados. Primera

edición. Instituto Nacional de Ecología. México, D.F.

Wolters, V., Ekschmitt, K., 1995. Earthworm effets on the use of C sources by

microoganisms: Non-linear response to temperature alteration. Biol. Fert. Soils 19,

109-114.

Wu, J., 2003. Assessment of metabolites and AhR and CYP1A1 mRNA expression

subsequent to prenatal exposure to inhaled benzo(a)pyrene. Int.J.Dev.Neurosci. 21,

333-346.

Zavala-Cruz, J., 1988. Regionalización natural de la zona petrolera de Tabasco. INIREB,

Gobierno del Estado de Tabasco, México. 182 pp.

Zavala-Cruz, J., 1996. Impacto de las actividades petroleras sobre la hidrología superficial

del distrito Agua Dulce. Tabasco, México. Pp. 505-520. In: Vázquez-Botello, A. JL

Rojas-Galaviz (eds.). Golfo de México. Contaminación e impacto ambiental:

diagnóstico y tendencias. Universidad Autónoma de Campeche. Campeche, México.

Zavala-Cruz, J., 2004. Índices de contaminación por petróleos y prácticas de recuperación

de suelos con pastizal en el Activo Cinco Presidentes Tabasco. Tesis Doctoral. Colegio

de Postgraduados. Texcoco, México.

Zavala-Cruz, J., Gavi-Reyes, F., Howard, R., Ferrera-Cerrato, R., 2005. Derrames de

petróleo en suelos y adaptación de pastos tropicales en el Activo Cinco Presidentes.

Terra Latinoamericana 23, 293-302.

Zavala-Cruz, J., Trujillo-Capistrán, F., Ortiz-Ceballos, G., Ortiz-Ceballos, A., 2012.

Tropical endogeic earthworm population in a pollution gradient with weathered crude

oil. Research Journal of Environmental Sciences. DOI: 10.3923/rjes.

CAPITULO II

Earthworm Populations in an Aged Hydrocarbon Contaminated Soil

En este capítulo se presenta la información generada en el estudio de campo, del cual se obtuvo un artículo científico que ya ha sido aceptado para publicación en la revista:

Research Journal of Environmental Sciences

For Asia For North America For UK & Europe Science Alert Science Alert Science Alert 20 Cecil Street No. 14-01 244, 5th Avenue, No. 2218, 26 York Street Equity Plaza, Singapore 049705 NY 10001, New York, USA London, W1U 6PZ, UK Fax: +65 67 22 06 18 Fax: +1-888-777-8532 Fax: +44-208-196-2333

Dr. Benito Hernandez, nill

Subject: Acceptance Letter for Article No. 50827-RJES-AJ

It's a great pleasure for us to inform you that below mentioned manuscript has been accepted for publication in Research Journal of Environmental Sciences as Research Article on the recommendation of the reviewers.

Earthworm Populations in an Aged Hydrocarbon Contaminated Soil Title:

Author's Name: Benito Hernandez-Castellanos, J. Zavala-Cruz, S. Martínez-Hernández, L. Dendooven, S.M. Contreras- Ramos, J.C. Noa-Carrazana, C. Fragoso and A.I. Ortíz-Ceballos

Receiving Date: February 10, 2013

Revised on: March 06, 2013

Accepted on: March 28, 2013

Regards

Earthworm Populations in an Aged Hydrocarbon Contaminated Soil

1B. Hernández-Castellanos, 2J. Zavala-Cruz, 1S. Martínez-Hernández, 3L. Dendooven,

4S.M. Contreras-Ramos, 1J.C. Noa-Carrazana, 5C. Fragoso and 1A.I. Ortíz-Ceballos

1Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada (INBIOTECA), Universidad Veracruzana,

Av. de las Culturas Veracruzanas No. 101 (Campus USBI) Col. Emiliano Zapata, C.P.

91090 Xalapa, Veracruz, México

2 Colegio de Postgraduados-Campus Tabasco. H. Cárdenas, Tabasco, CP 95500, México

3 Laboratorio de Ecología de Suelos, Cinvestav, Av. Instituto Politécnico Nacional 2508, C.

P. 07360 México D.F., México

4 Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco A.C.

(CIATEJ), Guadalajara, Jalisco, México

5 Red de Biodiversidad y Sistemática. Instituto de Ecología AC. A.P. 63, CP. 91000,

Xalapa Ver. México

Corresponding Author: B. Hernández-Castellanos, E-mail: [email protected], Tel. +52

22 8842 2773, Fax: +52 22 8842 2773. Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada

(INBIOTECA), Universidad Veracruzana, Veracruz, México

2.1 ABSTRACT

Hydrocarbon contamination is known to reduce the soil microfauna, but little is known about the sensibility of endogeic earthworms towards it. The aim of this study was to investigate how the earthworm biomass and abundance was affected by a petroleum contamination. Endogeic earthworms were studied in an anthrosol soil contaminated with hydrocarbons after an oil spill in „Cinco Presidentes‟ (Tabasco, Mexico) 20 years ago.

Monoliths of 0.5  0.5  0.4 m were taken along a transect at 10, 20, 30, 40 and 80 m from the origin of the oil spill. Each monolith was divided in four layers (0-0.1, 0.1-0.2, 0.2-0.3 and 0.3-0.4 m) and the number of earthworms, soil characteristics and the concentration of polycyclic aromatic hydrocarbons (phenanthrene, anthracene and benzo(a)pyrene (BaP) were determined. BaP was detected, while anthracene and phenanthrene were not found.

On average, the total abundance of the earthworms was 319 individuals m-2 with an average biomass of 43 g m-2, but their abundance was not correlated with the presence of BaP.

Three different species of earthworms were detected with Pontoscolex corethrurus, an endogeic earthworm, the most abundant (75%). Based on the results obtained, the presence of P. corethrurus in the contaminated site indicated its tolerance towards BaP and its possible use in the remediation of hydrocarbon contaminated soils.

Key words: Benzo(a)pyrene, bioremediation, ecotoxicology, endogeic earthworms,

Pontoscolex corethrurus

2.2 INTRODUCTION

In the southeast of Mexico, the petrochemical industry activities have contaminated the environment, principally in the state of Tabasco, where oil spills has been reported frequently, with damage to fauna and flora (Perez-Armendariz et al., 2010). Oil spills caused by ruptures of oil ducts have polluted soils, reducing soil quality. Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) found in crude oil are composed by two or more aromatic fused-rings (Haritash and Kaushik, 2009) they are toxic and persistent in the environment and some can remain in the soil for a long time (Bojes and Pope, 2007). Among the 16

PAHs considered as priority pollutants for their toxicity to the environment and humans, benzo(a)pyrene (BaP) is potentially carcinogenic and mutagenic (USEPA, 1987). Although phenanthrene and anthracene have been reported to have no genotoxic and carcinogenic effect (Moody et al., 2001), they have been found to be toxic to fish and algae (Sutherland et al., 1992).

Earthworms have different important functions in the soil. They improve soil structure and contribute to organic matter decomposition and nutrient cycling. Earthworms burrow through the soil, excrete mucus, while their castings concentrate nutrients and soil microorganisms. Consequently, they improve the physical and chemical characteristics of a soil (Richardson et al., 2009). Numerous studies have been done to investigate the effect of earthworms on soil fertility, but their sensibility to hydrocarbon contamination and their ability to survive in these polluted environments is limited (Geissen et al., 2008).

Earthworms have been studied in different ecosystems of the southeast of Mexico

(Ortiz-Ceballos and Fragoso, 2004; Huerta et al., 2012), but few studies included hydrocarbon-contaminated sites (Zavala-Cruz et al., 2012) Earthworms can tolerate PAHs

contamination, but their survival is affected when contamination reaches critical concentrations (Contreras-Ramos et al., 2006; Tejada and Masciandaro, 2011). As such, their abundance in a contaminated soil might be used as an indicator of the level of pollution (De Silva et al., 2009). Additionally, earthworms that survive in contaminated areas might be used to remediate contaminated sites. The study reported here investigated the earthworm population in an anthrosol soil from campo petrolero Cinco Presidentes

(Tabasco, Mexico) contaminated 20 years ago. The objectives of this study were to i) to characterize the hydrocarbon contaminated soil, ii) to identify and count the earthworms at

10, 20, 30, 40 and 80 m from the source of the contamination in the 0-0.1, 0.1-0.2, 0.2-0.3 and 0.3-0.4 m soil layers, and iii) determine if the contamination has an effect on the earthworm abundance and biomass.

2.3 MATERIALS AND METHODS

2.3.1 Sampling site

The sampling site was located in Cinco Presidentes in the state of Tabasco, Mexico

(17° 45‟ and 18° 12‟ NL and 93° 45‟ and 94° 08‟ WL) at 10 m.a.s.l. The sampling site was near an artificial lake and the sampled soil was contaminated due to an oil spill 20 years ago. The weather is wet with a mean annual temperature of approximately 26 ºC. The natural vegetation is composed of palm trees, bushes, lowland floodplains with mangroves and hydrophytes, grassland, and multiple or perennial farming. The annual average precipitation is 1800 mm. The main activities in this area are oil extraction, agriculture and livestock farming (Zavala-Cruz et al., 2005).

2.3.2 Earthworm sampling

On the border of the artificial lake, three transects were made away from the contamination source. In each transect, a monolith (0.5  0.5  0.4 m) was taken at 10, 20,

30, 40 and 80 m from the contamination source. Each monolith was divided in four 0.1 m layers, resulting in a total of 60 soil samples (three transects, five sampling points and four layers) (Anderson and Ingram, 1993). Earthworms were extracted manually from each soil sample. The earthworms were collected and kept in glass beakers containing 4% formaldehyde.

In the laboratory, the formaldehyde was substituted by alcohol (75%), morfo species were separated, grouped by age as adults (clitellum present) or juveniles (without clitellum), counted and weighed. Number of species, abundance (individuals m-2) and biomass were determined.

From each soil sample (n = 60), one kg of sample was taken to determine soil characteristics. The particle size distribution, pH, organic material, total nitrogen (N), extractable phosphorus (P) and total potassium (K) content were determined. All the techniques for the physical and chemical parameters mentioned above are included in the

Official Mexican Norm (Norma Oficial Mexicana NOM-021-SEMARNAT, 2000), and they are based on the Soil Science Society of America methods of soil analysis (SSSA,

1996). Additionally, a 200 g sub-sample was taken to analyse the content of anthracene, phenanthrene and BaP. The PAHs were extracted from soil (Song et al., 1995) and determined by an Agilent 4890D gas chromatograph (GC). Details of the technique used to extract the PAHs can be found in Contreras-Ramos et al. (2008). Briefly, 1.5 g of soil was

weighted and mixed with 3 g anhydrous sodium sulphate and 10 ml acetone was added shaken on a vortex and sonicated for 20 min. The PAHs extracted with acetone were separated from the soil by centrifugation at 13 700  g for 15 min. The same procedure was repeated three times and the filtered extracts were concentrated to 2 ml and then analyzed for phenanthrene, anthracene and BaP by GC.

2.3.3 Statistical analysis

Significant difference between soil characteristics, earthworm populations and concentrations of anthracene, phenanthrene and BaP as a result of distance from the contamination source, soil depth and their interaction were determined by analysis of variance (ANOVA) and based on the least significant difference using the general linear model procedure (P<0.05) (PROC GLM, SAS Institute Inc., 1989). Soil and earthworm characteristics and concentrations of BaP were separately explored with a principal component analysis (PCA) using PROC FACTOR (SAS Institute Inc., 1989). Phenantrene and anthracene were not found in the studied zone. The matrix of 11 columns (abundance and biomass of earthworms, particle size distribution (sand, loam and clay), pH, organic material, total N and K, extractable P, and concentration of BaP and 60 lines (rows) was used for principal component analysis.

2.4 RESULTS

2.4.1 Physical and chemical parameters of anthrosol soil

The organic material, total N, extractable P, showed significant differences within the soil profile between 0-0.1 m and 0.3-0.4 m, and mostly at 30, 40 and 80 m from the contamination source (Table 1). In the profile and at that distance, the organic material decreased significantly from an average of 20 g kg-1 to 5 g kg-1, while total N decreased from 1.4 to 0.5 g kg-1 and extractable P from 1.9 to 0.7 mg kg-1.

Table 1. Characteristics of an anthrosol soil along a transect, i.e. distance from the contamination

source and in different soil layers, at Cinco Presidentes, Tabasco Mexico.

 Distance from the contamination source (m) Soil Soil layer  characteristics (m) 10 20 30 40 80 MSD a

 pH 0-0.1 5.5 A b a c 6.1 A a 6.0 A a 5.8 A a 5.9 A a 0.9 0.1-0.2 5.3 A a 5.6 A a 5.9 A a 5.8 A a 5.9 A a 0.8 0.2-0.3 5.3 A a 5.7 A a 6.2 A a 6.0 A a 6.1 A a 1.1 0.3-0.4 5.3 A a 5.7 A a 6.1 A a 6.0 A a 6.1 A a 1.3 MSD 1.3 1.5 0.6 0.6 0.6  Organic material 0-0.1 32 A a 42 AB a 20 A a 24 A a 18 A a 73 (g kg-1) 0.1-0.2 30 A a 36 B a 11 B a 15 AB a 11 AB a 71 0.2-0.3 25 A a 53 AB a 5 BC a 9 B a 7 B a 105 0.3-0.4 29 A a 57 A a 4 C a 8 B a 5 B a 122 MSD 73 19 6 13 8  Total nitrogen 0-0.1 0.8 A a 0.9 A a 1.3 A a 1.5 A a 1.4 A a 1.0 (g kg-1) 0.1-0.2 0.9 A a 0.5 A a 0.9 AB a 1.3 A a 0.9 AB a 1.1 0.2-0.3 0.8 A a 0.9 A a 0.6 B a 0.8 A a 0.5 B a 1.0 0.3-0.4 1.2 A a 0.4 A a 0.4 B a 0.8 A a 0.4 B a 1.4 MSD 1.6 1.4 0.6 0.8 0.7  Extractable 0-0.1 4.6 A a 2.2 A a 1.8 A a 2.1 A a 2.1 A a 3.6 phosphorus 0.1-0.2 3.6 A a 1.5 A a 1.2 B a 1.3 A a 1.4 AB a 2.6 (mg kg-1) 0.2-0.3 2.8 A a 1.2 A a 0.8 B a 0.9 A a 0.6 B a 2.4 0.3-0.4 2.3 A a 1.2 A a 0.8 B a 0.9 A a 0.6 B a 2.3 MSD 5.4 1.8 0.5 1.4 1.3  Total potassium 0-0.1 0.23 A a 0.21 A a 0.20 A a 0.16 A a 0.13 A a 0.24 (cmol kg-1) 0.1-0.2 0.08 A a 0.10 A a 0.09 AB a 0.11 A a 0.11 A a 0.12 0.2-0.3 0.10 A a 0.13 A a 0.06 B a 0.10 A a 0.05 A a 0.17 0.3-0.4 0.06 A a 0.16 A a 0.08 AB a 0.09 A a 0.06 A a 0.20 MSD 0.21 0.26 0.12 0.14 0.13  a MSD: minimum significance difference, b values with the same capital letter are not significantly different between the soil layers (between the rows) (P<0.05), c values with the same letter are not significantly different for the distance from the contamination source (between the columns) (P<0.05).

The pH and extractable P were significantly affected by the distance from the source of contamination (gradient) (P<0.05 and P<0.0001), total N, extractable P and total K by depth (P=0.0079, P=0.003 and P=0.0009), but none of the soil characteristics was affected by the interaction between depth and gradient (Table 2). Only clay, loam and sand content were significantly affected by gradient, depth and their interactions (gradient  depth)

(P>0.0001).

Table 2. Effect of distance from the contamination source (gradient), soil layer (depth) and their interactions

on soil and earthworm characteristics.

2.4.2 Concentrations of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil

Only BaP was detected in the contaminated soil. Its concentration was significantly larger at 10 m (37mg kg-1) of the source of contamination than at other distances and significantly higher in the 0-0.1 m layer (39.3 mg kg-1) than in the other layers (Figure 1a, b). The BaP concentration in the soil decreased significantly with depth and gradient.

Distance from the contamination source, depth and their interactions had a significant effect on the concentration of BaP (P< 0.0001) (Table 2).

Figure 1 a)

50 a 0.3-0.4 m 0.2-0.3 m 40 0.1-0.2 m 0-0.1 m 30 c

dry soil)

1 1 - 0 10 20 30 40 80

Contamination gradient (m)

50 a 80 m 40 m 40 30 m 20 m Benzo(a)pyreneconcentration (mg kg 30 10 m b

20 b b

0 0-0.1 0.1-0.2 0.2-0.3 0.3-0.4

Depth (m)

Figure 1. Benzo(a)pyrene concentration in a) the contamination gradient and b) different depths of the

anthrosol soil . The different letters mean significant differences (P<0.05) and the vertical lines

indicate the standard deviation.

2.4.3 Earthworm communities

Three endogenic earthworm species were found. Pontoscolex corethrurus

(Pontoscolecidae family), Glossodrilus sp. (Glossoscolecidae family) and Dichogaster saliens (Acanthodrilidae family). The abundance of Pontoscolex corethrurus was the

highest (75%), with 88% of the total earthworm biomass. Glossodrilus sp. contributed 21% to the total number of earthworms and 11% to the total biomass, while the Dichogaster saliens contributed only 4% of the total number and 1% of the total biomass. The number of P. corethrurus (431 individuals) juveniles was higher than the number of adult forms

(289 individuals). Glossodrilus sp. also had more juvenile (153) than adult forms (50), whereas the specie Dichogaster saliens had a lower number of juvenile (14 individuals) than adult forms (22 individuals).

The abundance (density) and biomass of earthworms was significantly larger in the

0-0.1 m layer than in the other layers, except 80 m from the origin of the contamination where it was similar in the 0-0.1 and 0.1-0.2 m layer (P<0.05) (Table 3). Depth had a significant effect on abundance and biomass of earthworms (P<0.0001), but not the distance from the contamination or the interaction between depth and gradient (Table 2).

Table 3. Characteristics of the earthworms sampled along a transect or distance from the contamination

source and in different soil layers.

2.4.4 Correlation and principal component analysis

The abundance and biomass of the earthworms was positively and significantly correlated to the TN and TK, and silt content in soil (P<0.05) (Table 4). Also, the concentration of BaP was significantly correlated with the distance and soil depth (P<0.05)

(Table 2). The abundance and biomass of the earthworms was negatively and significantly correlated to the sand content in the soil (P<0.05).

Table 4. Pearson correlation coefficients between soil characteristics, concentration of benzo(a)pyrene (BaP)

and earthworm abundance and biomass. N= Nitrogen, P= Phosphorus, K= Potassium, BaP =

Benzo(a)pyrene.

The PCA revealed that most soil samples were grouped in the upper right quadrant

(positive or small negative PC1 and a positive PC2) or in the lower left quadrant (negative

the contamination. Soils in the upper right quadrant have a positive PC1, i.e. higher in silt content, soil organic material content and total N, and a positive PC2, i.e. high in BaP and total K. Soils in the lower left quadrant have opposite characteristics, i.e. higher in sand and clay content and high in pH.

The PCA revealed that most soil samples were grouped in the upper right quadrant

(positive or small negative PC1 and a positive PC2) or in the lower left quadrant (negative

PC1 and a negative PC2) (Figure 2). Soils in the upper right quadrant are generally from the top layer and generally found near the origin of contamination, while those in the lower left quadrant are generally from the deeper soil layers and farther away from the origin of the contamination. Soils in the upper right quadrant have a positive PC1, i.e. higher in silt content, soil organic material content and total N, and a positive PC2, i.e. high in BaP and total K. Soils in the lower left quadrant have opposite characteristics, i.e. higher in sand and clay content and high in pH.

Fig. 3 2.5 L1-10 m

2 Benzo(a)pyrene Abundancy Biomass 1.5 Available P L1-20 m Loam L1-80 m 1 Total K L2-20 m L2-10 m L1-30 m L3-10 m 0.5 L3-20 m L1-40 m Soil organic matter 0 L4-30 m L4-20 m Total N pH L4-40 m Factor 1: 0.31 -0.5 L3-80 m L4-10 m L4-80 m -1 L3-30 m L3-40 m L2-80 m L2-40 m -1.5 Clay Sand L2-30 m -2 Factor 2: 0.21 -2.5 -2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5

0.30.60.91.21.52.50 -1.5-1.2-0.9-0.6-0.3 Factor 2 L1-40 m Factor 1 2-1.5 -1.2 -0.9 -0.6 -0.3 0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 L1-30 m Figure 2. Loadings and scores of principalBenzo(a)pyrene component analysisAbundancy (PCA) fromBiomass the component 1 and 3 of 1.5 Available P contamination gradient at differentTotal K depths definedL1-20 m as L1 (0-0.1 m); L2 (0.1-0.2 m); L3 (0.2-0.3 m) 1 Clay Loam and L4 (0.3-0.4 m) and the parameters physicals, chemicalsL2-40 and m earthworms populations evaluated. 0.5 L2-80 m Total N

2.5 DISCUSSION-0.5

The-1 concentration of phenanthrene in crude oil is on average 146 mg kg-1, anthracene -1.5 4.3 mg kg-1 and BaP 1.5 mg kg-1 (Kerr and Melton, 1999). Although, the BaP concentration -2 in crude oil is the lowest, it was that only component that was found in the soil 20 years -2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 after contamination. BaP is more resistant to microbial degradation than both phenanthrene and anthracene (Lily et al., 2009). BaP might also be less availability for microorganisms in soil limiting its removal (Opuene et al., 2007). The average concentration found at the sampling site was 3.1 mg BaP kg-1, with values ranging from 0 to 29 mg kg-1. Some values

exceed the maximum amount permissible for soils with farming activity (2 mg kg-1)

(USEPA, 1993; CCME, 1999). Similar values (8.3-33.6 mg kg-1) have been reported earlier for BaP concentrations in soil at Cinco Presidentes (Cram et al., 2004). In other industrial coastal areas of Mexican, the BaP concentration in soil was 1.65 mg kg-1 (Iturbe et al.,

2004). Similar concentrations (1.3-3.0 mg kg-1) have been reported at contaminated sites in

New England (Bradley et al., 1994) and Nigeria (0.4-1.13 mg kg-1) (Duke and Albert,

2007). In this study, maximum BaP concentrations were found in the top soil layer.

Hydrocarbons are absorbed mainly on the organic material, which has a polarity more similar to that of hydrocarbons. The organic material content was higher in the top soil layer so the amount of BaP leached out to the lower soil layers was small (Cram et al.,

2004; Adams et al., 2009).

The abundance and biomass of the earthworms found in this study was generally higher than reported for other pastures in the southeast of Mexico (Ortiz-Ceballos and

Fragoso, 2004; Huerta et al., 2012) and for other tropical regions of the world (Nunes et al.,

2006; Marichal et al., 2010). A previous study in the same area found 210 earthworm m-2 and 38.1 g biomass m-2 (Zavala-Cruz et al., 2012). More earthworms (319 individuals m-2) with a larger total biomass (43.1 g m-2) were found in this study. As such, no negative effect on the earthworm population was found of the oil spill that occurred 20 years ago.

Pontoscolex corethrurus is often found in pasture soils of sub-tropic and tropic regions

(Lavelle and Gilot, 1994), e.g. central and southeastern Tabasco (Mexico), in the south of

Brazil and south west of Colombia (Huerta et al., 2006; Nunes et al., 2006; Marichal et al.,

2010). The high abundance of P. corethrurus in this study suggested better adaptative partenogenetic strategies, faster growing and a higher tolerance to a wide range of different

soil conditions compared to the other two morfo-species (Lavelle et al., 1987). This might allow them to tolerate hydrocarbons better than other earthworms. Considering their particular characteristics and the presence and high abundance of this species in many human alternated ecosystems, such as cropping systems, pastures and urban areas (Brown et al., 2006), may indicate their relative tolerance to various contaminants in the soil (Buch et al., 2011). In ecotoxicology study, the absence of earthworms has been indicative of contamination, as these organisms are highly sensible to toxic compounds (De Silva et al.,

2009). In this study, however, a high abundance of P. corethrurus in the contaminated soil indicated a certain tolerance towards hydrocarbons and the potential this species might have in remediation of hydrocarbon-contaminated soil.

Several studies have been reported on the importance of earthworms in the removal of hydrocarbons (Geissen et al., 2008; Sinha et al., 2008; Contreras-Ramos et al., 2009;

Tejada and Masciandaro, 2011). The majority of these studies were done in regions with a temperate climate and few investigations have been done in tropical regions. Additionally, most studies with earthworms in PAHs contaminated soils have been done with epigeic species, such as E. fetida, and Eisenia andrei, while endogeic or anecic earthworms might be more important due to their ecological characteristics. Epigeic earthworms are species that live above the mineral soil surface, typically in the litter layers of forest soils, anecic earthworms live in permanent vertical burrows in mineral soil layers, while endogeic earthworms make horizontal non-permanent burrows, mainly in the uppermost 0.1–0.15 m of soil (Bouche, 1977). In tropical environments, endogeic earthworm species are dominant

(Nunes et al., 2006). At the contaminated site, the endogeic earthworm P. corethrurus was the most abundant (75%) contributing 88% of the biomass. The presence of the endogeic

earthworm P. corethrurus indicated that it was able to live in contaminated environments, in these sense further studies are necessary to evaluate its tolerance and potential to remove

PAHs from soil.

The PCA analysis showed that abundance and biomass of the earthworms was directly related to the soil nutrient content (i.e. total N, soil organic material, extractable P) and that they preferred higher amounts of loam in the soil. This might indicate that the earthworms preferred a lighter soil, but not a sandy or clayey, rich in organic material with high amounts of nutrients. These characteristics were found generally in the top soil layers so more earthworms were found there. The abundance of earthworms was generally higher near the source of contamination so that a possible effect of hydrocarbons on the earthworms was minimal after 20 years.

2.6 CONCLUSION

The endogeic earthworm P. corethrurus was the dominant earthworm species in the studied tropical soil contaminated by an oil spill 20 years ago. The larger abundance and biomass of P. corethrurus in the top 0.1 m layer was due to it being richer in organic material than the lower soil layers and having a lighter soil texture. The abundant presence of P. corethrurus in the contaminated soil with BaP suggested a tolerance to PAHs and its potential in soil remediation.

2.7 ACKNOWLEDGEMENTS

We thank the land owners for the facilities regarding this study. Benito Hernández-

Castellanos received grant-aided support from Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología

(CONACyT) México (project Num.104289), to Delfina Pérez and Armando González for allowing Access to their properties.

2.8 REFERENCES

Adams, R.H., D. Olan-Castro, F.J. Guzman-Osorio and I.J. Diaz-Ramirez, 2009.

Relationship between geomorphology and contamination with weathered hydrocarbons

in an old river levee/marsh association. Int. J. Environ. Sci. Tech., 6: 527-538.

Anderson, J.M. and J.S.I. Ingram, 1993. Tropical Soil Biology and Fertility: A Handbook

of Methods. 2nd Edn., CAB. International, Oxfordshire, Wallingford, UK., ISBN: 0-

85198-821-0.

Bojes, K.H. and P.G. Pope, 2007. Characterization of EPA‟s 16 prioritary pollutant

polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in tank button solids and associated

contaminated soils at oil exploration and production sites in Texas. Regul. Toxicol.

Pharmcol., 47: 288-295.

Bouche, M.B., 1977. Strategies Lombriciennes. In: Soil Organisms as Components of

Ecosystems, Lohm, U. and T. Persson (Eds.). Vol. 25, Natural Science Research

Council, Stockholm, Sweden, pp: 122-132.

Bradley, J.N., B.H. Magee and S.L. Hallen, 1994. Background level of the polycyclic

aromatic hydrocarbons (PAH) and selected metals in New England urban soil. J. Soil

Contam., 3: 349-361.

Brown, G.G., S.W. James, A. Pasini, D. Nunes, N. Benito, P. Martins and K. Sautter, 2006.

Exotic peregrine and invasive earthworms in Brazil: Diversity distribution and effects

on soils and plants. Carib. J. Sci., 42: 339-358.

Buch, A., G.G. Brown, C. Niva, K. Dieter and L. Lourencato, 2011. Life cycle of

Pontoscolex corethrurus (Muller, 1857) in tropical artificial soil. Pedobiologia, 54: 19-

25.

CCME., 1999. Canadian Soil Quality Guidelines For The Protection Of Environmental

And Human Health. In: Canadian Environmental Quality Guidelines, CCME (Ed.).

Canadian Council of Ministers of the Environment, Winnipeg, MB, Canada.

Contreras-Ramos, S.M., D. Alvarez-Bernal and L. Dendooven, 2009. Characteristics of

earthworms (Eisenia fetida) in PAHs contaminated soil amended with sewage sludge

or vermicompost. Appl. Soil Ecol., 41: 269-276.

Contreras-Ramos, S.M., D. Alvarez-Bernal and L. Dendooven, 2008. Removal of

polycyclic aromatic hydrocarbons from soil amended with biosolid or vermicompost in

the presence of earthworms (Eisenia fetida). Soil Biol. Biochem., 40: 1954-1959.

Contreras-Ramos, S.M., D. Alvarez-Bernal and L. Dendooven, 2006. Eisenia fetida

increased removal of polycyclic aromatic hydrocarbons from soil. Environ. Pollut.,

141: 396-401.

Cram, S., C. Siebe, R. Ortiz-Salinas and A. Herre, 2004. Mobility and persistence of

petroleum hydrocarbons in peat soils of south-eastern Mexico. Soil Sediment Contam.,

13: 341-360.

De Silva, P.M.C.S. and C.A.M. van Gestel, 2009. Comparative sensitivity of Eisenia

andrei and Perionyx excavatus in earthworm avoidance tests using soil types in the

tropics. Chemosphere, 17: 1609-1613.

Duke, O. and I.O. Albert, 2007. Carcinogenic Potency of polycyclic aromatic

hydrocarbons. Bull. Chem. Soc. Ethiop., 21: 437-443.

Geissen, V., P. Gomez-Rivera, E.H. Lwanga, R.B. Mendoza, A.T. Narcias and E.B.

Marcias, 2008. Using earthworms to test the efficency of remediation of oil-polluted

soil in tropical Mexico. Ecotoxicol. Environ. Safety, 71: 638-642.

Haritash, A.K. and C.P. Kaushik, 2009. Biodegradation aspects of polycyclic aromatic

hydrocarbons (PAHs): A review. J. Hazard. Mater., 169: 1-15.

Huerta, E., C. Fragoso, J. Rodriguez-Olan, I. Evia-Castillo, E. Montejo-Meneses, M. De la

Cruz-Mondragon and R. Garcia-Hernandez, 2006. Presence of exotic and native

earthworms in principal agro-and natural systems in central and south-eastern Tabasco,

Mexico. Carib. J. Sci., 42: 359-365.

Huerta, E. and J.C. Van der Wal, 2012. Soil macro-invertebrates abundance and diversity in

home gardens in Tabasco Mexico vary with soil texture organic matter and vegetation

cover. Eur. J. Soil. Biol., 50: 68-75.

Iturbe, R., R.M. Flores, C.R. Flores and L.G. Torres, 2004. TPH-contaminated mexican

refinery soil: Health risk assessment and the first year of changes. Environ. Monit.

Assess., 91: 237-255.

Lily, M.K., A. Bahuguna, K. Dangwal and V. Garg, 2009. Degradation of benzo(a)pyrene

by a novel strain Bacillus subtilis BMT4i (MTCC9447). Braz. J. Microbiol., 40: 884-

892.

Kerr, J.M. and R. Melton, 1999. Polyaromatic hydrocarbon content in crude oils around the

world. Proceedings of the SPE/EPA Exploration and Production Environmental

Conference, March 1-3, 1999, Austin, Texas.

Lavelle, P., I. Barois and I. Cruz, 1987. Adaptative strategies of Pontoscolex corethrurus

(Glossoscolecidae oligochaeta) a peregrine geophagous earthworm of the humic

tropics. Biol. Fert. Soils, 51: 88-194.

Lavelle, P. and C. Gilot, 1994. Priming Effects of Macroorganisms on Microflora: A Key

Process of Soil Function? In: Beyond the Biomass-Compositional and Functional

Analysis of Soil Microbial Communities, Ritz, K., J. Dighton and K.E. Giller (Eds.).

John Wiley and Sons, Chichester, pp: 173-180.

Marichal, R., A. Feijoo, C. Praxedes, D. Ruiz and A. Carvajal., 2010. Invasion of

Pontoscolex corethrurus (Glossoscolecidae, Oligochaeta) in landscapes of the

Amazonian deforestation arc. Applied Soil Ecol., 46: 443-449.

Moody, J.D., J.P. Freeman, D.R. Doerge and C.E. Cerniglia, 2001. Degradation of

phenanthrene and anthracene by cell suspensions of Mycobacterium sp. Strain PYR-1.

Applied Environ. Microbiol., 67: 1476-1483.

Nunes, D., A. Pasini, N.P. Benito and G.G. Brown, 2006. Earthworm diversity in four land

use systems in the region of Jaguapita Parana State Brazil. Carib. J. Sci., 42: 331-338.

Official Mexican Norm NOM-021-SEMARNAT, 2000. Specifications of fertility, Salinity,

Soil classification, survey, sampling and analysis. Official Journal of the Federation.

Mexico City.

Opuene, K., I.E. Agbozu and L.E. Ekeh, 2007. Identification of perylene in sediments:

Occurrence and diagenetic evolution. Int. J. Environ. Sci. Tech., 4: 457-462.

Ortiz-Ceballos, A.I. and C. Fragoso, 2004. Earthworm populations under tropical maize

cultivation: The effect of mulching with velvetbean. Biol. Fertil. Soils, 39: 438-445.

Perez-Armendariz, B., D. Martinez-Carrera, M. Calixto-Mosqueda, J. Alba and R.

Rodriguez-Vasquez, 2010. Filamentous fungi remove weathered hydrocarbons from

polluted soil of tropical Mexico. Rev. Int. Contam. Ambie., 26: 193-199.

Richardson, D.R., B.A. Snyder and P.F. Hendrix, 2009. Soil moisture and temperature:

Tolerance and optima for a non-native earthworm species Amyntas agrestis

(oligochaeta: Opisthopora: Megascolecidae). Southeast. Nat., 8: 325-334.

SAS Institute Inc., 1989. Statistic Guide for Personal Computers. Version 6.04, Edn. SAS

Institute, Cary.

Sinha, R.K., G. Bharambe and D. Ryan 2008. Converting wasteland into wonderland by

earthworms a low-cost nature´s technology for soil remediation: A case study of

vermiremediation of PAHs contaminated soil. Environmentalist, 28: 466-475.

Song, Y.F., Z.Q. Ou, T.H. Sun, A. Yediler, G. Lorinci and A. Kettrup, 1995. Analytical

method for polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in soil and plants samples. Chin.

J. Appl. Ecol., 6: 92-96.

Sutherland, J.B., A.L. Selby, J.P. Freeman, P.P. Fu, D.W. Miller and C.E. Cerniglia, 1992.

Identification of xyloside conjugates formed from anthracene by Rhizoctonia solani.

Mycol. Res., 96: 509-517.

SSSA, 1996. Methods of Soil Analysis. In: Chemical Methods Part 3. Sparks, D.L. (Ed).

Soil Science Society of America, University of Michigan. Pp. 1390.

Tejada, M. and G. Masciandaro, 2011. Application of organic wastes on a benzo(a)pyrene

polluted soil. Response of soil biochemical properties and role of Eisenia fetida.

Ecotox. Environ. Saf., 74: 668-674.

USEPA, 1987. United states environmental protection agency (USEPA) list. 16 Prioritary

Pollutant Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs). USA.

USEPA, 1993. Provisional guidance for quantitative risk assessment of polycyclic aromatic

hydrocarbons. EPA/600/R-93/089. U.S. Environmental Protection Agency.

Zavala-Cruz, J., Gavi-Reyes, F., Howard, R., Ferrera-Cerrato, R., 2005. Derrames de

petróleo en suelos y adaptación de pastos tropicales en el Activo Cinco Presidentes.

Terra Latinoamericana 23, 293-302.

Zavala-Cruz, J., Trujillo-Capistrán, F., Ortiz-Ceballos, G., Ortiz-Ceballos, A., 2012.

Tropical endogeic earthworm population in a pollution gradient with weathered crude

oil. Research Journal of Environmental Sciences. DOI: 10.3923/rjes.

CAPITULO III

Removal of benzo (a) pyrene from soil using an endogeic earthworm Pontoscolex corethrurus (Müller, 1857)

En este capítulo se presenta la información generada en el experimento 2, del cual se obtuvo un artículo científico que ya fue publicado en la revista: Applied Soil Ecology

Removal of benzo (a) pyrene from soil using an endogeic earthworm Pontoscolex

corethrurus (Müller, 1857)

B. Hernández-Castellanos a* , A. Ortíz-Ceballos a , S. Martínez-Hernández a , J.C. Noa-

Carrazana a , M. Luna-Guido b , L. Dendooven b , S. M. Contreras-Ramos c

a Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada (INBIOTECA), Universidad Veracruzana, Av. de las Culturas Veracruzanas No. 101 Col. Emiliano Zapata, C.P. 91090 Xalapa, Veracruz, México,

b Laboratory of Soil Ecology, ABACUS, Cinvestav, Av. Instituto Politécnico Nacional

2508, C.P. 07360 México D. F., México,

c Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco A.C.

(CIATEJ), Av. Normalistas 800, C.P. 44270 Guadalajara, Jalisco, México.

*Corresponding author B. Hernández-Castellanos, E-mail: [email protected], Tel. +52

22 8842 2773, Fax: +52 22 8842 2773

3. 1 Abstract

The endogeic earthworm Pontoscolex corethrurus (Müller, 1857) was the most abundant species (75%) in soil contaminated with hydrocarbons, mostly benzo(a)pyrene (BaP), in the state of Tabasco (Mexico). The earthworm P. corethrurus was tested for its capacity to remove 100 mg BaP kg-1 from an Anthrosol soil (sterilized or not) and amended with legume Mucuna pruriens (L.) DC. var. utilis (Wall. ex Wight) Baker ex Burck (3%) or the grass Brachiaria humidicola (L.) DC (3%) (recently renamed as Urochloa humidicola

(Rendle) Morrone & Zuloaga) in an aerobic incubation experiment. P. corethrurus removed 26.6 mg BaP kg-1 from the sterilized soil and application of B. humidicola as feed increased this to 35.7 mg BaP kg-1 and M. pruriens to 34.2 mg BaP kg-1 after 112 days. The autochthonous microorganisms removed 9.1 mg Bap kg-1 from the unsterilized soil and application of B. humidicola increased this to 18.0 mg BaP kg-1 and M. pruriens to 11.2 mg

BaP kg-1. Adding P. corethrurus to the unsterilized soil accelerated the removal of BaP and

36.1 mg kg-1 was dissipated from soil. It was found that the autochthonous microorganisms removed BaP from soil, but addition of P. corethrurus increased the dissipation 4-fold. The endogeic earthworm P. corethrurus can thus be used to remediate hydrocarbon- contaminated soils in tropical regions.

Keywords: bioremediation, polycyclic aromatic hydrocarbons, recalcitrant, tropical earthworm, autochthonous microorganisms.

3.2. Introduction

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) found in crude oil contain two or more aromatic fused-rings (Haritash and Kaushik, 2009). They are toxic and persistent in the environment (Bojes and Pope, 2007). Among the 16 PAHs considered as priority pollutants for their toxicity to the environment and humans, benzo(a)pyrene (BaP) is listed as potentially carcinogenic and mutagenic (US EPA, 1987).

Earthworms improve soil structure and contribute to organic matter decomposition and nutrient cycling (Ortiz-Ceballos et al., 2007; Marhan et al., 2007). Earthworms burrow through the soil, excrete mucus, while their castings concentrate nutrients and soil microorganisms (Eisenhauer, 2010). Consequently, they improve the physical and chemical characteristics of a soil (Brown et al., 2004; Richardson et al., 2009).

The earthworm Pontoscolex corethrurus (Müller, 1857) is one of the most widespread peregrine earthworms, and shows a very broad tolerance to different environmental conditions (Lavelle et al., 1987; Zavala-Cruz et al., 2012). This earthworm is generally found in the top 30 cm of the soil and has a high organic matter assimilation efficiency

(Lavelle et al., 1995) allowing it to survive even in very poor soils, with the capacity to colonize new habitats (Lavelle et al., 1987). The presence and high abundance of this species in many human-altered ecosystems may indicate its tolerance to various contaminants in the soil (Buch et al., 2011; Zavala-Cruz et al., 2012). For instance, P. corethrurus was found in a soil contaminated with BaP (Hernández-Castellanos et al.,

2012).

The population, distribution and activity of earthworms are associated with the quality of the ingested organic matter. Some authors, such as Ortiz-Ceballos et al. (2004, 2005), found that Mucuna pruriens (L.) DC. var. utilis (Wall. ex Wight) Baker ex Burck improved growth and reproduction of the earthworm Balanteodrilus pearsei. García and Fragoso

(2003) found that the highest weight obtained with the endogeic earthworm P. corethrurus was when soil was added with mucuna-sawdust. Similar results were found by Huerta et al.

(2005) when M. pruriens var. utilis was used to feed Polypheretima elongata. Valckx et al.

(2011) determined short-term food preferences of Lumbricus terrestris using residues of lacy phacelia (Phacelia tanacetifolia BENTH.), Italian ryegrass (Lolium multiflorum

LAM.), oats (Avena sativa L), yellow mustard (Sinapis alba L) and rapeseed (Brassica napus L). They found that Italian ryegrass residues were preferred as food either fresh or partly decomposed. M. pruriens is commonly found in the tropics and has been used as food for earthworms (García and Fragoso, 2003; Ortiz-Ceballos et al., 2005).

Numerous studies have shown that application of organic material to a PAHs contaminated soil can increase biodegradation of the pollutant (Xu and Obbard, 2003; Xu et al., 2003; Tejada and Masciandaro, 2011). In recent years earthworms have been used to remediate contaminated soils (Wen et al., 2004). Earthworms maintain the aerobic conditions in soil through continuous mixing thus favouring degradation of contaminants

(Coutiño-González et al., 2010). They increase organic substrate availability for autochthonous soil microorganisms thereby increasing microbiological and biochemical soil activity (Wolters, 2000). Most importantly, however, earthworms facilitate and increase the contact between contaminants and soil microorganisms (Hickman and Reid,

2008).

The effects of earthworms on the removal of PAHs, which serve as a model for soil contaminated with petroleum or as a remediation test, have been reported by several authors (Ma et al., 1995; Eijsackers et al., 2001; Contreras-Ramos et al., 2008; Geissen et al., 2008; Hickman et al., 2008; Tejada and Masciandaro, 2011). However, not many studies have been done with tropical endogeic earthworms to remediate PAHs contaminated soil.

The aim of this study was to investigate i) the removal of BaP in presence or absence of the endogeic earthworm P. corethrurus and ii) how the addition of organic material as feed for the earthworm affected the bioremediation process in sterilized and unsterilized soil.

3.3. Materials and Methods

3.3.1. Material used

The benzo(a)pyrene (BaP) was obtained from Sigma-Aldrich (USA) with purity > 96%, acetone from Meyer (USA) with purity >99.5%.

3.3.2. Sampling site

The sampling site is located in Cinco Presidentes in the state of Tabasco, Mexico (17°

45‟ and 18° 12‟ NL and 93° 45‟ and 94° 08‟ WL) at 10 m.a.s.l. The weather is wet with annual average temperature of 26 °C. The natural vegetation is composed of palm trees,

bushes, a lowland floodplain with mangroves and hydrophytes, some grass areas, and multiple and perennial farming. The annual average precipitation is 2000-3000 mm. The main activities in this area are oil extraction and agriculture.

3.3.3. Sampling of soil and organic material used in the experiment

At the sampling site, 30 kg soil was collected from the 0-20 cm layer of five different quadrants (3  3 m) and transported to the laboratory. The soil from each quadrant was 5 mm sieved separately and characterized. This field-based sampling was maintained in the laboratory incubation experiment. The soil with pH-H2O 5.8 had an organic C content of

15.7 g kg-1, a total N content of 1.2 g kg-1 total nitrogen, 2.5 mg kg-1 available P and a particle size distribution with sand 880 g kg-1, silt 40 g kg-1 and clay 80 g kg-1.

Brachiaria humidicola is the typical vegetation at the site where the earthworms were collected. Approximately 10 kg of the grass B. humidicola (L.) DC (3%) (recently renamed as Urochloa humidicola (Rendle) Morrone & Zuloaga) was collected at the sampling site, taken to the laboratory, air-dried and milled in a mechanic mill so that particles of < 1 mm were obtained. Approximately 10 kg of M. pruriens var utilis (Rendle) Schweick was collected along the federal highway Xalapa-Veracruz at km 140 (19º 20‟ N and 96º 32‟ W)

Mexico, taken to the laboratory, air-dried and milled in a mechanic mill so that particles of

< 1 mm were obtained. The total C content of M. pruriens was 511 g kg-1 and total N 38 g kg-1 while total C was 454 g kg-1 and total N 19 g kg-1 for B. humidicola.

3.3.4. Earthworms used

The earthworm P. corethrurus was collected manually from the top 20 cm soil layer at the soil-sampling site and taken to the laboratory for cultivation. The earthworms were cultivated in laboratory conditions in an Anthrosol soil with 35-40% of water content at 26

ºC for ten months. Juvenile earthworms of the third generation were used in this experiment.

3.3.5. Experimental design

Twelve different treatments with five replicates were applied to sterilized or unsterilized soil spiked with BaP (100 mg kg-1 dry soil) combining the addition of the earthworms with two types of organic material (unamended, M. pruriens or B. humidicola). In a previous study, the epigeic earthworm Eisenia fetida survived concentrations of BaP raging from 50 to 200 mg kg-1 (Contreras-Ramos et al., 2006), so it was hypothesized that P. corethrurus could survive similar concentrations. Additionally, the high application rate of BaP 100 mg kg-1 allows to study factors controlling its removal, although in general lower concentrations of BaP (8.3-33.6 mg kg-1) have been reported in petroleum contaminated soil (Cram et al., 2004). Details of the different treatments applied can be found in Table 1.

Table 1. Different treatments combining 500 g of sterilized or unsterilized soil spiked with 100 mg kg-1

benzo(a)pyrene (BaP) amended with 30 g kg-1 dry soil Mucuna pruriens, Brachiaria humidicola or

left unamended and applied or not with three juvenile earthworms (Pontoscolex corethrurus) with

cleaned gut to investigate the removal of (BaP). Soil incubated aerobically at 22 ± oC for 112 days.

Ninety juvenile earthworms of the species P. corethrurus were left without food for 24 h and washed with distilled water to clean their gut. The earthworms were weighed (0.127 

0.1 g, n=3) and kept in Petri dishes on wet filter paper until used. In an additional experiment, antibiotics were added to the Petri dishes to eliminate all bacteria in the gut of

the earthworms, but all earthworms died. As such, the earthworms applied to the soil still had some bacteria in their guts.

Thirty sub-samples of 10 g soil were applied to 500 ml glass recipients (8  18  6 cm).

The BaP was dissolved in acetone and added to the soil samples at a concentration of 100 mg kg-1 dry weight. The soil was mixed, left to stand for 30 min so that most of the acetone could evaporate, then 490 g soil was added and mixed. Ten sub-samples were amended with 30 g kg-1 (3%) M. pruriens and ten with 30 g kg-1 B. humidicola. The soil in each recipient was mixed (also soil not amended with organic material) and adjusted to 80% water holding capacity (WHC) by adding distilled water. Three cleaned juvenile earthworms were than added to half of the soil samples of each treatment. Three earthworms were applied to the microcosms, which is similar to densities observed in field studies (173  133 individuals m-2) (Huerta et al., 2007; Marichal et al., 2010).

Thirty sub-samples of 500 g soil amended with or without 3% M. pruriens or B. humidicola were sterilized in glass recipients (8  18  6 cm) with pressurized steam at 121

ºC for 30 min supplied by an autoclave. This process was repeated three times with an interval of a day (Wolf and Skipper, 1996). The BaP was added as described earlier under sterile conditions, the soil was adjusted to 80% WHC with sterile distilled water and three cleaned juvenile earthworms were added to half of the soil-samples of each treatment.

All glass recipients were covered with plastic to conserve soil moisture so that the earthworms could not escape and were incubated at 22  2 oC for 112 days. Each week the recipients were weighted and the moisture was adjusted by adding distilled water when was necessary. After 0, 7, 28, 56 and 112 days, a 5 g sub-sample of soil was selected randomly

taken from each glass recipient and analyzed for BaP as described below. In treatments with earthworms, casts found on the soil surface were collected for further BaP analysis.

After 112 days, earthworm biomass, survival and production of cocoons was determined.

Earthworms were weighed and prepared to measure BaP in their tissues.

3.3.6. BaP determination in P. corethrurus tissue, soil and casts

The earthworms were placed on filter paper for 24 h to allow their guts to empty.

Earthworms were cleaned and washed with distilled water, frozen in liquid N2, crushed and ground using a mortar, mixed with 1.5 times their weight of Na2SO4 and added to a plastic tube (Wagman et al., 2001). The saponiphication method to remove fat from earthworms was used as described in Contreras-Ramos et al. (2009). Briefly, 0.5 M KOH solution and hexane 1:1 (v/v) was added to the plastic tube and the mixture sonicated at 45 ºC for 10 min. The mixture was centrifuged at 13700  g for 15 min and the tube was submerged in dry ice for 1 min to freeze the tissue sediment. The solvent was decanted into a 20 ml vial,

5 ml hexane was added and the procedure of sonication, centrifugation and decanting was repeated twice. The extracts were cleaned on a 10% deactivated alumina column, activated with hexane and eluted with acetone and passed through a 0.45 µm syringe filter, concentrated to 1 ml and analyzed by Gas Chromatography (GC) fitted with an FID detector.

The BaP in soil, worm surface casts and tissue of the earthworm was extracted with an exhaustive technique (Song et al., 1995). Details of the extraction technique can be found

in Contreras-Ramos et al. (2008). Briefly, a sub-sample of 1.5 g soil was weighted, mixed with 3 g anhydrous sodium sulphate and 10 ml acetone was added. The mixture was shaken on a vortex and sonicated for 20 min. The PAHs extracted with acetone were separated from the soil by centrifugation at 13700  g for 15 min. The same procedure was repeated three times and the filtered extracts were concentrated to 2 ml and then analyzed on an

Agilent 4890D GC equipped with an FID detector set at 310 ºC fitted with an HP-5 capillary column (15 m by 0.53 mm, film thickness 1.5 µm).

3.3.7. Statistical analysis

Concentrations of BaP were subjected to one-way analysis of variance using PROC GLM

(SAS, 1989) to test for significant differences between sterilized and unsterilized soil and to test for significant differences between soils amended with B. humidicola or M. pruriens.

Additionally, concentrations of BaP were subjected to a three-way analysis of variance using PROC GLM (SAS, 1989) to test for significant differences between the addition of the earthworms, sterilization, organic material application and their interactions.

3.4. Results

3.4.1. Characteristics of P. corethrurus

The number of earthworms declined in each of the treatments added with BaP after 112 days, except in the unsterilized unamended soil (Table 2). The survival of P. corethrurus in the unsterilized soil amended with M. pruriens and in the sterilized soil amended B. humidicola was significantly lower than in the unamended unsterilized soil (P < 0.05). The weight of the earthworms decreased significantly in the sterilized soil amended with M. pruriens or B. humidicola, but not in the other treatments (P < 0.05). The amount of BaP in the tissue of the earthworms ranged from 3.8 to 14.5 mg BaP kg-1, but was not significantly different between the treatments (P < 0.05).

Table 2. Changes in weight (g), survival (%) and benzo(a)pyrene (BaP) concentration in tissue of the

earthworm Pontoscolex corethrurus after being exposed to the contaminant for 112 days. Three juvenile

earthworms were added to each of the following treatments: (1) Sterilized soil, (2) Sterilized soil amended

with 30 g kg-1 (3%) Mucuna pruriens, (3) Sterilized soil amended with 30 g kg-1 (3%) Brachiaria

humidicola, (7) Unsterilized soil, (8) Unsterilized soil amended with 30 g kg-1 (3%) M. pruriens, and (9)

Unsterilized soil amended with 30 g kg-1 (3%) B. humidicola.

3.4.2. Concentration of BaP in soil

On average, 7.9 mg of the 100 mg BaP applied to soil (mean of all treatments) was not extractable immediately after application (Fig. 1a, b) (Table 3). After 112 days, an additional 11.0 mg of the added BaP was not extractable. As such, a total of 18.9 mg or

18.9% was sequestered on the soil matrix after 112 days.

In the unsterilized soil not amended with earthworms, the largest amount of BaP was removed biologically by the autochthonous soil microorganisms in soil amended with B. humidicola (18.0 mg) and the least in the unamended soil (9.1 mg) (Table 3). The removal of BaP in sterile and unsterilized soil amended with earthworms was fastest within the first week (Fig. 1a). Thereafter, dissipation continued, but at a slower rate. The gradient of the curve suggested that removal of BaP might continue after 112 days. The earthworms removed 26.6 mg BaP kg-1 from the sterilized soil. That increased to 35.7 mg BaP kg-1 soil when B. humidicola was added additionally and to 34.2 mg BaP kg-1 soil when M. pruriens was applied. The combination of the autochthonous soil microorganisms and the earthworm removed 36.1 mg BaP kg-1 from the unsterilized soil and that increased to 48.3 mg BaP kg-1 soil when B. humidicola was applied as feed.

Fig. 1 a) Soil with earthworms b) Soil without earthworms c) Casts of the earthworms 100

) -1

Sterile soil + Mucuna pruriens Sterile soil 20 Concentration of benzo(a)pyrene(mg kg benzo(a)pyrene(mg of Concentration Sterile soil + Brachiaria humidicola Soil + Mucuna pruriens Soil Soil + Brachiaria humidicola 0 0 14 28 42 56 70 84 98 112 0 14 28 42 56 70 84 98 112 0 14 28 42 56 70 84 98 112 Time (days)

Figure 1. Concentration of benzo(a)pyrene in soil a) with the endogeic earthworm „Pontoscolex corethrurus‟

() sterilized and () unsterilized soil amended with residue of Mucuna pruriens (L.), ()

sterilized and () unsterilized soil, and () sterilized and () unsterilized soil amended with residue

of Brachiaria humidicola (Rendle), b) without the earthworm and c) in the casts of the earthworm.

Soil incubated at 22 ± 3 oC for 112 days. Lines are mean± STD.

Table 3. Benzo(a)pyrene (BaP) concentration (mg kg-1) applied to soil, not extractable at day 0 and removed

by different processes as derived from the different treatments (see Table 1). Between parentheses

are the values that were used to calculate the suggested process.

The concentration of BaP in the casts of the earthworms followed a similar pattern as found in the soil, independent of application of feed or sterilizing the soil (Fig. 1c). The concentration of BaP in the casts was affected significantly by adding organic material, but not sterilizing the soil (P < 0.05) (Table 4).

Table 4. Concentrations of benzo(a)pyrene (BaP) (mg kg-1) in sterilized or unsterilized soil added with

earthworms Pontoscolex corethrurus or not added with earthworms, or in the casts of the earthworms

after 112 days. Sterilized or unsterilized soil was amended with residues of Mucuna pruriens or

Brachiaria humidicola, or left unamended.

Sterilizing the soil without adding earthworms significantly increased the residual concentration of BaP compared to the unsterilized soil after 112 days, independent of

adding organic material (P < 0.05) (Table 4). In the soil added with earthworms, the residual concentration of BaP was higher in the sterilized soil compared to the unsterilized soil when B. humidicola was added or when no organic material was added (P < 0.05). In the sterilized and unsterilized soil added with earthworms, application of organic material had no effect on the concentration of BaP compared to the unamended soil (P < 0.05).

The interaction between organic material application and sterilizing the soil had no significant effect on the concentration of BaP in the worm casts and in the soil with or without earthworms (Table 5).

Table 5. The effect of sterilization the soil (S), addition of organic material (Unamended, or application of Mucuna pruriens or Brachiaria humidicola) and its interactions on the concentration of benzo(a)pyrene (BaP) (mg kg-1) in soils with and without the earthworm Pontoscolex corethrurus and in earthworms casts. Analysis of variance (PROC GLM, SAS, 1998) was used to test for significant differences with Tukey‟s Studentized Range (HSD) test (Type I).

3.5. Discussion

The endogeic earthworm P. corethrurus was not affected by 100 mg BaP kg-1 added to soil or the BaP found in its tissue. In unsterilized soil the survival of the earthworms was

100%. However, when M. pruriens or B. humidicola were added, the survival decreased to

< 50%. Consequently, the added plant material did not favour growth of P. corethrurus when exposed to BaP. In a preliminary study, no negative effect on P. corethrurus was found when 200 mg BaP was applied to soil (data not shown). Contreras-Ramos et al.

(2006) found no negative effect on E. fetida when the earthworm was added to a soil spiked with 50, 100 or 150 mg kg-1 BaP. However, there are no similar reports with P. corethrurus. Other studies have reported that the sterilization process, high concentrations of a contaminant and long-time exposure inhibit growth, reduce reproduction and induce weight loss when the earthworms are exposed to different pollutants (Novais et al., 2010), a mixture of PAHs (Gomez-Eyles et al. 2011; Contreras-Ramos et al., 2009) and crude oil

(Geissen et al., 2008).

No cocoons of P. corethrurus were found in the contaminated soil. The absence of cocoons might be due to the lower soil temperature (22  2 oC) during incubation as P. corethrurus is a tropical species requiring slightly higher temperatures (23-27 oC) for reproduction (Lavelle et al., 1987). Most likely BaP inhibited the production of cocoons, although Contreras-Ramos et al. (2006) found cocoons in soil spiked with 150 mg kg-1 of

BaP, but using E. fetida as the test species.

Weight changes in earthworms after being exposed to BaP for 112 days could be an indicator of chemical stress, which might be linked to changes in energy efficiency that

ultimately inhibit growth (Wu et al., 2011). Weight loss of the earthworms in the sterilized soil was related to a mutualism between earthworms and microorganisms (Contreras-

Ramos et al., 2009). It is clear, however, that the concentration of the contaminant, its properties and the duration of exposure will have an effect on the growth and the survival of earthworms (Wu et al., 2011; Ma et al., 2012). In this experiment, the survival of earthworms was lower in treatments amended with M. pruriens and B. humidicola in both the sterilized and unsterilized soil suggesting that survival of P. corethrurus was related directly to the contaminant.

The concentration of BaP found in earthworm tissues was higher than reported by

Contreras-Ramos et al. (2009) with E. fetida exposed to a mixture of three PAHs, i.e. BaP at 50 mg kg-1, phenanthrene and anthracene. These authors found 316 µg BaP kg-1 in the tissues of the earthworms when kept in sterilized soil amended with vermicompost after 56 days. In this study, the highest amount of BaP (14 mg kg-1) was found in sterilized soil amended with 3% M. pruriens. Differences in the concentration of BaP in the tissue of the earthworm might be due to the different species used or differences in soil characteristics.

The technique used to determine the concentration of BaP in soil extracted on average

92.1 mg kg-1 of the 100 mg kg-1 applied. In previous experiments, similar amounts were extracted with the same technique (Buco et al., 2004; Betancur-Galvis et al., 2006;

Contreras-Ramos et al., 2008). For instance, Contreras-Ramos et al. (2006) reported a recovery for BaP of 90 mg kg-1 and 144 mg kg-1 when 100 mg kg-1 and 150 mg kg-1 was added. It is clear that the type of PAHs added and soil characteristics will affect extraction recovery from soil. For instance, Contreras-Ramos et al. (2008) reported that 6% anthracene, 3% phenanthrene and 4% BaP was not extractable from soil after 70 days.

100

In this research, the amount of contaminant that was extractable in the sterilized soil was

83 mg kg-1 after 112 days. As such, 9.1 mg kg-1 was sequestered in the soil. However, some of the BaP might have been lost through volatilization, but it can be speculated that the amount will be low. The concentration of contaminant applied, soil characteristics and the time of the incubation all affect the amount of contaminant sequestered (Tejada et al.,

2007). Also, the amount sequestered will be larger in a heavy soil rich in organic matter as the contaminant can get fixed on the soil and organic matter matrix. For instance, Yang et al. (2010) reported that the fraction of BaP extracted with n-butanol decreased with increased soil organic matter content. Similar results were reported by Shor et al. (2003), where they found a negative correlation between OM-rich sediment fractions and the extracted fraction of PAHs including BaP. Additionally, the time that a contaminant is in contact with the soil matrix is also important. It is clear that the longer the contaminant is in contact with the soil matrix, the larger the amount that will be sequestered.

Our results suggest that P. corethrurus and gut microorganisms increased the removal of

BaP from soil. It is well documented that autochthonous microorganisms can remove PAHs from soil, even a recalcitrant component such as BaP (Haritash and Kaushik, 2009;

Juwarkar et al., 2010; Teng et al., 2010; Fernández-Luqueño et al., 2011; Megharaj et al.,

2011). Numerous organisms have been isolated from soil that can degrade BaP (Johnsen et al., 2005; Steffen et al., 2007; Wang et al., 2008). For instance, phylotypes belonging to the genera of the Actinomycetales (Actinobacteria), i.e. Nocardioides, Rhodococcus and

Streptomyces, are known degraders of PAHs. These genera have been studied intensively and have been shown to metabolize PAHs or have genes that encode for enzymes involved in the degradation of PAHs (Cébron et al., 2008; Chaudhary et al., 2011). In addition,

101

application of the earthworm P. corethrurus will improve aeration, liberate nutrients and stimulate microbial activity thereby accelerating the removal of a contaminant from a soil.

Soil characteristics, such as aeration and pH, are known to affect the removal of PAHs from soil. Degradation of anthracene is higher in aerobic conditions than in anaerobic conditions (Cuevas et al., 2012) and a high pH can inhibit fungal activity and thus the removal of PAHs from soil (Brady and Weil, 2002).

Application of organic material stimulates microbial activity and that in turn might lead to a larger removal of a contaminant from soil. For instance, Tejada and Masciandaro

(2011) found that the content of BaP decreased (28.2% and 22.1%) when municipal solid waste and poultry manure were added. The application of organic material might also stimulate the earthworm activity further increasing the removal of BaP. Although it has often been reported that the application of organic material stimulated the removal of BaP this was not the case in this study. It is clear, that an increase in the activity of soil microorganisms and the removal of an organic contaminant depend on the amount and composition of the added organic material, and soil characteristics (Tejada et al., 2007).

Application of B. humidicola or M. pruriens as feed had no significant effect on the removal of BaP from soil. This might be due to the fact that P. corethrurus is an endogeic earthworm that lives generally in the top 30 cm soil layer (Lavelle et al., 1987; Zavala-Cruz et al., 2012; Hernández-Castellanos et al., 2012). P. corethrurus as a geophagous earthworm feeds on the organic material in soil and not directly on litter so it does not need extra organic material for burrowing (Ortiz-Ceballos et al., 2009; Bunch et al., 2011).

Other authors reported that addition of organic material (10% or 40%) had no significant effect on the removal rate of PAHs, e.g. phenanthrene, from soil (Eijsackers, et al., 2001).

102

In other studies, the addition of organic matter to contaminated soil favoured the removal of the xenobiotics as soil microbial activity increased (Tejada, 2009). However, the effect of the organic material added on the removal of the contaminant depended on its chemical composition (Tejada, 2009).

Other earthworms, such as E. fetida, live on the soil surface and in the upper soil layers and are more dependent on organic material application for survival.

Addition of earthworms increased the removal of BaP from the sterilized soil compared to the unsterilized soil without earthworms. Similar results were found by Contreras-Ramos et al. (2006, 2008) and Tejada and Masciandaro (2011) using the earthworm E. fetida. The contribution of the earthworms themselves in the removal of BaP is still debated, but it can be assumed that it is small (Dendooven et al., 2011), although in this study the removal of

BaP by P. corethrurus in the sterilized soil was considerable (26.6 mg kg-1). It has to be remembered, however, that not all the microorganisms could be removed from the gut of the earthworm. Consequently, when the earthworms started to burrow through the soil, the microorganisms remaining in the earthworm gut recolonized the soil and contributed to

BaP removal (Lapied et al., 2009). Although the earthworm activity was not measured, burrows were observed in all treatments and casts were found on the soil surface. This suggested the microorganisms in the gut of the earthworm could recolonize the soil when the earthworm burrowed through the soil. In this study, the removal of BaP from the sterilized soil was lower than in the unsterilized soil so it can be assumed that it took time for the earthworms to burrow through the soil and for the gut microorganisms to recolonize the sterilized soil.

103

The most important limitations for using epigeic earthworms to remediate hydrocarbon- contaminated soil are their initial cost, the need for adequate and sufficient food, and a constant high soil water content (Contreras-Ramos et al., 2008; Dendooven et al., 2011).

The endogeic P. corethrurus will be less dependent on the application of feed so the overall cost to remediate a contaminated site might be marginally lower than when other earthworms, such as E. fetida, are used.

However, considering that an contaminated area of 1 ha contaminated in the uppermost

10 cm and a soil bulk density 1.3 kg dm3 contains 1300000 kg soil, then 33800 kg earthworms would be required per ha according to Contreras-Ramos et al. (2008), who added five earthworms (E. fetida) to 50 g soil with a weight of 1.3 g. In this study, 0.381 g earthworms was added to 500 g soil, so, considering the same conditions, a lower amount of earthworms will be required, i.e. 991 kg earthworms ha-1. Assuming that 1 kg of P. corethrurus costs the same as E. fetida, i.e. 40 USD, than applying a reduced amount of earthworms to a contaminated soil is still expensive.

3.6. Conclusion

Autochthonous microorganisms removed BaP from soil, but adding the endogeic earthworm P. corethrurus accelerated its removal. The burrowing earthworm might have improved the contact between the soil microorganisms and BaP thereby accelerating its removal. P. corethrurus remained active in soil spiked with 100 mg kg-1 BaP although no cocoons were formed. Application of organic material as feed did not increase the removal of the BaP from soil. As such, the endogeic earthworm P. corethrurus can be used in remediation of petroleum-contaminated soils in tropical regions without requiring feed.

104

3.7. Acknowledgements

This research was funded by Cinvestav and SEP-CONACyT (10003/8335). B. H.-C. received grant-aided support (No. 229668) from „Consejo Nacional de Ciencia y

Tecnología (CONACyT)’ (México).

3.8. References

Betancur-Galvis, L.A., Alvarez-Bernal, D., 2006. Bioremediation of polycyclic aromatic

hydrocarbon-contaminated saline–alkaline soils of the former Lake Texcoco.

Chemosphere 62, 1749–1760.

Bojes, H., Pope, P., 2007. Characterization of EPA 16 prioritary pollutant polycyclic

aromatic hydrocarbons (PAHs) in tank bottom solids and associated contaminated soils

at oil exploration and production sites in Texas. Regul. Toxicol. Pharm. 47, 288–295.

Brown, G.G., Edwards, C.A., Brussaard, L., 2004. How earthworms affect plant growth:

burrowing into the mechanisms. In: Edwards, C.A. (Ed.), Earthworm Ecology, CRC

press. pp. 13–49.

Buch, A.C., Brown, G. G., Niva, C.C., Sautter, K.D., Lourençato, L.F., 2011. Life cycle of

Pontoscolex corethrurus (Müller, 1857) in tropical artificial soil. Pedobiologia 54, 19–

25.

Buco, S., Moragues, M., Doumenq, P., Noor, A., Mille, G., 2004. Analysis of polycyclic

aromatic hydrocarbons in contaminated soil by Curie point pyrolysis coupled to gas

105

chromatography mass spectrometry, an alternative to conventional methods. J.

Chromatogr. A. 1026, 223–229.

Cébron, A., Norini, M.P., Beguiristain, T., Leyval, C., 2008. Real-Time PCR

quantification of PAH-ring hydroxylating dioxygenase (PAH-RHD alpha) genes from

Gram positive and Gram negative bacteria in soil and sediment samples. J. Microbiol.

Meth. 73, 148–159.

Chaudhary, P., Sharma, R., Bala, S., Nain, L., 2011. Bioremediation of PAH by

Streptomyces sp. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 86, 268–271.

Contreras-Ramos, S.M., Alvarez-Bernal, D., Dendooven, L., 2006. Eisenia fetida increased

removal of polycyclic aromatic hydrocarbons from soil. Environ. Pollut. 141, 396-401.

Contreras-Ramos, S.M., Álvarez-Bernal, D., Dendooven, L., 2008. Removal of polycyclic

aromatic hydrocarbons from soil amended with biosolid or vermicompost in the

presence of earthworms (Eisenia fetida). Soil Biol. Biochem. 40, 1954–1959.

Contreras-Ramos, S.M., Álvarez-Bernal, D., Dendooven, L., 2009. Characteristics of

earthworms (Eisenia fetida) in PAHs contaminated soil amended with sewage sludge

or vermicompost. Appl. Soil Ecol. 41, 269–276.

Coutiño-González, E., Hernández-Carlos, B., Gutiérrez-Ortiz, R., Dendooven, L., 2010.

The earthworm Eisenia fetida accelerates the removal of anthracene and 9, 10-

anthraquinone, the most abundant degradation product, in soil. Int. Biodeterior.

Biodegrad. 64, 525–529.

Cram, S., Siebe, C., Ortíz-Salinas, R. Herre, A., 2004. Mobility and persistence of

petroleum hydrocarbons in peat soils of south-eastern Mexico. Soil Sediment Contam.

13, 439–458.

106

Cuevas, B.G., Melendez-Estrada, J., Contreras, R., Amezcua-Allieri, M.A., 2012.

Anthracene Removal using Activated Soil Reactors. Soil Sediment Contamin. 21, 31-

41.

Dendooven, L., Alvarez-Bernal, D., Contreras-Ramos, S.M., 2011. Earthworms, a means to

accelerate removal of hydrocarbons (PAHs) from soil? A mini-review. Pedobiologia

54, 187–192.

Eijsackers, H., Van Gestel, C., De Jonge, S., Muijs, B., Slijkerman. D., 2001. Polycyclic

aromatic hydrocarbon-polluted dredged peat sediments and earthworms: a mutual

interference. Ecotoxicology 10, 5–50.

Eisenhauer, N., Ho, V., Moeser, J., Scheu, S., 2010. Synergistic effects of microbial and

animal decomposers on plant and herbivore performance, Basic. Appl. Ecol. 11, 23–

34.

Fernández-Luqueño, F., Valenzuela-Encinas, C., Marsch, R., Martínez-Suárez, C.,

Vázquez-Núñez, E., Dendooven, L., 2011. Microbial communities to mitigate

contamination of PAHs in soil-possibilities and challenges: a review. Environ. Sci.

Pollut. Res. 18, 12–30.

García, J.A., Fragoso, C., 2003. Influence of different food substrates on growth and

reproduction of two tropical earthworm species (Pontoscolex corethrurus and

Amynthas cortices). Pedobiologia 47, 754–763.

Geissen, V., Gomez-Rivera, P., Lwanga, E.H., Mendoza, R.B., Narcías, A.T., Marcías,

E.B., 2008. Using earthworm to the efficiency of remediation of oil-polluted soil in

tropical Mexico. Ecotox. Environ. Safe. 71, 638–642.

107

Gomez-Eyles, J. L., Sizmur, T., Collins, C. D., Hodson, M. E., 2011. Effects of biochar and

the earthworm Eisenia fetida on the bioavailability of polycyclic aromatic

hydrocarbons and potentially toxic elements. Environmental Pollution 159, 616–622.

Haritash, A.K., Kaushik, C.P., 2009. Biodegradation aspects of polycyclic aromatic

hydrocarbons (PAHs): a review. J. Hazard. Mater. 169, 1–15.

Hickman, Z, Reid, B., 2008. Increased microbial catabolic activity in diesel contaminated

soil following addition of earthworms (Dendrobaena veneta) and compost. Soil Biol.

Biochem. 40, 2970–2976.

Hickman, Z., Swindell, A.L., Allan, I.J., Rhodes, A.H., Hare, R., Semple, K.T., Reid, B.J.,

2008. Assessing biodegradation potential of PAHs in complex multi-contaminant

matrices. Environ. Pollut. 156, 1041–1045.

Huerta, E., Fragoso, C., Barois, I., Lavelle, P., 2005. Enhancement of growth and

reproduction of the tropical earthworm Polypheretima elongata (Megascolecidae) by

addition of Zea mays and Mucuna pruriens var. utilis litter to the soil. Eur. J. Soil Biol.

41, 45–53.

Huerta, E., Rodriguez-Olan, J., Evia-Castillo, I., Montejo-Meneses, E., de la Cruz-

Mondragon, M., Garcia-Hernandez, R., Uribe, S., 2007. Earthworms and soil

properties in Tabasco, Mexico. Eur. J. Soil Biol. 43, 190–195.

Johnsen, A.R., Wick, L.Y., Harms, H., 2005. Principles of microbial PAH degradation in

soil. Environ. Pollut. 133, 71–84.

Juwarkar, A., Singh, S., Mudhoo, A., 2010. A comprehensive overview of elements in

bioremediation. Rev. Environ. Sci. Biotechnol. 9, 215–288.

108

Lapied, E., Nahmani, J., Rousseau, G.X., 2009. Influence of texture and amendments on

soil properties and earthworm communities. Appl. Soil Ecol. 43, 241–249.

Lavelle, P., Lattaud, C., Trigo, D., Barois, I., 1995. Mutualism and biodiversity in soils.

Plant Soil. 170, 23–33.

Lavelle, P., Barois, I., Cruz, I., 1987. Adaptative strategies of Pontoscolex corethrurus

(Glossoscolecidae, oligochaeta), a peregrine geophagous earthworm of the humic

tropics. Biol. Fert. Soils. 51, 188–194.

Ma, L.L., Ma, C., Shi, Z.M., Li, W.M., Xu, L., Hu, F., Li, H.X., 2012. Effects of

fluoranthene on the growth, bioavailability and anti-oxidant system of Eisenia fetida

during the ageing process. Eur. J. Soil Biol. 50, 21–27.

Ma, W.C.H., Immerzeel, J., Bodt, J., 1995. Earthworms and food interactions on

bioaccumulation and disappearance in soil of polycyclic aromatic hydrocarbons:

studies on phenanthrene and fluoranthene. Ecotoxicol. Environ. Saf. 32, 226–232.

Marhan, S., Langel, R., Kandeler, E., Scheu, S., 2007. Use of stable isotopes (13C) for

studying the mobilisation of old soil organic carbon by endogeic earthworms. Eur. J.

Soil Biol. 43, S201–S208.

Marichal, R., Feijo, M.A., Praxedes, C., Ruiz, D., Carvajal, A.F, Oszwald, J., Hurtado, M.,

Brown, G.G, Grimaldi, M., Desjardins, T., Sarrazin, M., Decaëns, T., Velasquez, E.,

Lavelle, P., 2010. Invasion of Pontoscolex corethrurus (Glossoscolecidae,

Oligochaeta) in landscapes of the Amazonian deforestation arc. Appl. Soil Ecol. 46,

443–449.

109

Megharaj, M., Ramakrishnan, B., Venkateswarlu, K., Sethunathan, N., Naidu, R., 2011.

Bioremediation approaches for organic pollutants: a critical perspective. Environ. Int.

37, 1362–75.

Müller, F., 1857. Lumbricus corethrurus, Burstenschwanz. Archiv. Fur. Naturg. 23, 6–113.

Novais, S. C., Soares, M. V. M. A., Amorim, M. J. B., 2010. Can avoidance in Enchytraeus

albidus be used as a screening parameter for pesticides testing? Chemosphere 79, 233–

237.

Ortiz-Ceballos, A.I., Fragoso, C., 2004. Earthworm populations under tropical maize

cultivation: the effect of mulching with Velvetbean. Biol. Fert. Soils 39, 438-445.

Ortiz-Ceballos, A.I., Fragoso, C., Equihua, M., Brown, G.G., 2005. Influence of food

quality, soil moisture and the earthworm Pontoscolex corethrurus on growth and

reproduction of the tropical earthworm Balanteodrilus pearsei. Pedobiologia 49, 89–

98.

Ortiz-Ceballos, A.I., Fragoso, C., Brown, G.G., 2007. Synergistic effects of the tropical

earthworm Balanteodrilus pearsei and Mucuna pruriens as green manure in maize

growth and crop production. Appl. Soil Ecol. 35, 356-362.

Ortiz-Ceballos, A.I., Hernández-García, M.E.C., Galindo-González, 2009. J. Nest and

Feeding Chamber Construction for Cocoon Incubation in the Tropical Earthworm:

Pontoscolex corethrurus In: Karmegam, N. (Ed) Vermitechnology I. Dynamic Soil,

Dynamic Plant 3 (Special Issue 2), 15-18.

Richardson, D.R., Snyder, B.A., Hendrix, P.F., 2009. Soil moisture and temperature:

tolerances and optima for a non-native earthworm species, Amynthas agrestis

Oligochaeta: Opisthopora: Megascolecidae) Southeast. Nat. 8, 325–334.

110

SAS, 1989. Statistic Guide for Personal Computers. Version 6.04. SAS Institute, North

Carolina.

Shor, L.M., Rockne, K.J., Taghon, G.L., Young, L.Y., Kosson, D.S., 2003. Desorption

kinetics for field-aged polycyclic aromatic hydrocarbons from sediments. Environ. Sci.

Technol. 37, 1535–44.

Song, Y.F., Ou, Z.Q., Sun, T.H., Yediler, A., Lorinci, G., Kettrup, A., 1995. Analytical

method for polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in soil and plants samples.

Chinese J. Appl. Ecol. 6, 92–96.

Steffen, K.T., Schubert, S., Tuomela, M., Hatakka, A., Hofrichter, M., 2007. Enhancement

of bioconversion of high-molecular mass polycyclic aromatic hydrocarbons in

contaminated non-sterile soil by litter-decomposing fungi. Biodegradation 18, 359–

369.

Tejada, M., Masciandaro, G., 2011. Application of organic wastes on a benzo(a)pyrene

polluted soil. Response of soil biochemical properties and role of Eisenia fetida.

Ecotox. Environ. Safe. 74, 668–674.

Tejada, M., 2009. Application of different organic wastes in a soil polluted by cadmiun:

Effects on soil biological properties. Geoderma 153, 254–268.

Tejada, M., Hernández, M.T., García, C., 2007. Application of two organic wastes in a soil

polluted by lead: effects on the soil enzymatic activities. J. Environ.Qual. 36, 216–225.

Teng, Y., Luo, Y., Sun, M., Liu, Z., Li, Z., Christie, P., 2010. Effect of bioaugmentation by

Paracoccus sp. strain HPD-2 on the soil microbial community and removal of

polycyclic aromatic hydrocarbons from an aged contaminated soil. Bioresource

Technol. 101, 3437–3443.

111

US EPA, 1987. United States Environmental Protection Agency (USEPA) list. 16 prioritary

pollutant polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs).

Valckx, J., Cordón, A., Govers, G., Hermy, M., Muys, B., 2011. Food and habitat

preferences of the earthworm Lumbricus terrestris L. for cover crops. Pedobiologia 54,

1–6.

Wagman, N., Strandberg, B., Tysklind, M., 2001. Dietary uptake and elimination of

selected polychlorinated biphenyl congeners and hexachlorobenzene in earthworms.

Environ. Toxicol. Chem. 20, 1778–1784.

Wang, S., Chanock, S., Tang, D., Li, Z., Jedrychowski, W., Perera, F.P., 2008. Assessment

of interactions between PAH exposure and genetic polymorphisms on PAH-DNA

adducts in African American, Dominican, and Caucasian mothers and newborns.

Cancer Epidem. Biomar. 17, 405–413.

Wen, B., Hu, X., Liu, Y., Wang, W., Feng, M., Shan, X., 2004. The role of earthworms

(Eisenia fetida) in influencing bioavailability of heavy metals in soils. Biol. Fert. Soils

40, 181–187.

Wolf, D.C., Skipper, H., 1996. Soil sterilization. In: Sparks, D.L. (Ed.), Methods of Soil

Analysis. Microbiological and Biochemical Properties. Part 2. Soil Science Society of

America Inc., American Society of Agronomy, Inc., Madison, Wisconsin, p. 1085.

Wolters, V., 2000. Invertebrate control of soil organic matter stability. Biol. Fert. Soils 31,

1–19.

Wu, S., Wu, E., Qiu, L., Zhong, W., Chen, J., 2011. Effects of phenanthrene on the

mortality, growth, and anti-oxidant system of earthworms (Eisenia fetida) under

laboratory conditions. Chemosphere 83, 429–434.

112

Xu, R., Obbard, J., 2003. Effect of nutrient amendments on indigenous hydrocarbon

biodegradation in oil-contaminated beach sediments. J. Environ. Qual. 32, 1234–1243.

Xu, R., Obbard, J.P., Tay, E.T., 2003. Optimization of slow-release fertilizer dosage for

bioremediation of oil-contaminated beach sediment in a tropical environment. World J.

Microbiol. Biotechnol. 19, 719–725.

Yang, Y., Zhang, N., Xue, M., Tao, S., 2010. Impact of soil organic matter on the

distribution of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in soils. Environ. Pollut. 158,

2170–2174.

Zavala-Cruz, J., Trujillo-Capistrán, F., Ortiz-Ceballos, G., Ortiz-Ceballos, A., 2012.

Tropical endogeic earthworm population in a pollution gradient with weathered crude

oil. Research Journal of Environmental Sciences. DOI: 10.3923/rjes.

113

CAPITULO IV

Discusión general

114

4.1 Discusión general

La presencia de lombrices de tierra en sitios contaminados por hidrocarburos ha sido poco estudiada, en un trabajo previo en el campo petrolero Cinco Presidentes, se detectaron altos niveles de contaminación con hidrocarburos totales de petróleo (604.57 a

11885.11 mg/kg) y la presencia de lombrices de tierra (Zavala-Cruz et al., 2012). Esto concuerda con el presente estudio. Sin embargo, los resultados mostraron sólo la presencia de benzo(a)pireno (0 a 29 mg kg-1) , esto podría deberse a su alta hidrofobicidad, estructura y alto peso molecular que lo hacen recalcitrante en el suelo (Kaushish et al., 2009, Eweis et al., 2003). Además, el BaP es más resistente a la degradación microbiana (Kaushish et al.,

2009). La ausencia de fenantreno y antraceno sugiere que el suelo al ser un pasivo ambiental con más de 20 años de contaminación, estos ya han sido fotodegradados y/o removidos por la actividad de los organismos del suelo y por las condiciones climáticas

(Corona et al., 2005). También, en los campos petroleros de Samaria, en el estado de

Tabasco, se observaron concentraciones de benzo(a)pireno de 0.15-0.57 mg/kg (Zavala-

Cruz et al., 2003) y en el mismo campo Cinco Presidentes de 0.1-1.5 mg/kg (Ortiz et al.,

2007); en otras partes del mundo como en Nueva Inglaterra (Bradley, 1994) y Nigeria

(Duke, 2007) de 1.3-3 y 0.4-1.13 mg/kg, respectivamente.

En ambientes naturales se ha encontrado la mayor diversidad de lombrices de tierra

(Huerta, 2005; Fragoso, 2001), sin embargo, también es conocida su presencia aunque en menor abundancia en agroecosistemas como pastizales, cultivos perennes y policultivos

(Fragoso, 2001). En los ambientes tropicales de México, las especies endógeas (72%) son la categoría ecológica predomínante de las comunidades de lombrices de tierra (Fragoso,

2001). En el pastizal del sitio de estudio se encontró que la lombriz de tierra endógea

115

Pontoscolex corethrurus de la familia Pontoscolecidae, presentó la mayor abundancia y biomasa (75% y 88% respectivamente), similar a la abundancia documentada por Zavala-

Cruz et al. (2012) en la misma zona. La presencia de la lombriz endógea P. corethrurus concuerda con lo observado en otros agroecosistemas de pastizales donde las especies exóticas son muy abundantes (Edwards et al., 1995; Lavelle et al., 1994), sin embargo esos sitios no se han reportado como contaminados a diferencia del presente trabajo. La mayor abundancia de P.corethrurus en este estudio en comparación con las otras dos especies también encontradas (Dichogaster saliens de la familia Acanthodrilidae, y Glossodrilus sp. de la familia Glossoscolecidae sp.) sugiere mejores estrategias adaptativas; partenogenética, crecimiento rápido (Lavelle et al., 1987) y una amplia tolerancia a diferentes condiciones del suelo que le permite vivir en presencia de los hidrocarburos.

En diversos trabajos de investigación ecotoxicológica se ha mencionado que la ausencia de lombrices de tierra es un indicador de contaminación del sitio, por la sensibilidad que estos organismos presentan a compuestos tóxicos (Wang et al., 2010;

Bindesbol et al., 2009; Mangala et al., 2009; Jones et al., 2008; Schaefer, 2003; Shakir et al., 2002). Sin embargo, en este trabajo se encontró a la especie exótica con alta abundancia en un ambiente contaminado, lo que presupone una alta tolerancia al contaminante y un potencial que pudiera tener esta especie de lombriz en la remediación de suelos contaminados por hidrocarburos. Los resultados, también mostraron que la abundancia de lombrices no esta influenciada por la mayor concentración del benzo(a)pireno; además, la mayor distribución vertical de las lombrices de tierra en los primeros 10 cm de profundidad del suelo se asoció significativamente y en forma positiva con el contenido de nutrientes y

116

limo, y negativamente con la arena. Esto se debe probablemente a que las lombrices de tierra prefieren para su alimentación partículas más finas con mayor aporte nutricional.

Por otro lado, diversos trabajos de investigación relacionan el papel de las lombrices en la remoción de hidrocarburos (Tejada and Masciandaro, 2011; Contreras-Ramos et al.,

2009; Sinha et al., 2008; Geissen et al., 2008; Contreras-Ramos et al., 2008; Ceccanti et al.,

2006, Álvarez-Bernal et al., 2006; Schaefer, 2005; Achazi and Van-Hestel, 2003; Callaham et al., 2002.). Sin embargo, la mayoría de estos estudios fueron hechos en regiones con clima templado, por lo que pocos trabajos han sido desarrollados en regiones tropicales.

Adicionalmente, la mayoría de los estudios con lombrices en suelo contaminado con HPAs han sido realizados con especies epígeas, tal como E. fetida y Eisenia andrei, mientras que lombrices endógeas o anécicas podrían ser más importantes debido a sus características ecológicas. En ambientes tropicales las especies de lombrices endógeas son las más dominantes (Nunes et al., 2006). En el sitio contaminado estudiado en este trabajo, la lombriz endógea P. corethrurus fue la más abundante, lo que indica que esta especie es capaz de vivir en ambientes contaminados con concentraciones que sobre pasan los limites permitidos por la Norma Oficial Mexicana 138.

De tal manera que al evaluar la capacidad de la lombriz P. corethrurus para remover

100 mg kg-1 de BaP, los resultados demostraron que la lombriz endógea P. corethrurus aparentemente no fue afectada por los dicha concentración de BaP aplicado al suelo o por el BaP acumulado en su tejido (< 10%). Sin embargo no se obtuvieron capullos y las lombrices perdieron peso. Esto concuerda con los resultados observados en un estudio previo pero con la especie E. fetida donde no se observaron efectos negativos en la lombriz al ser expuesta a suelo contaminado con 50, 100 y 150 mg de BaP (Contreras-Ramos et al.,

117

2006). Concentraciones semejantes de BaP a las de este trabajo fueron encontrados en el tejido de la lombriz E. fetida por Contreras-Ramos et al. (2009). Sin embargo en nuestro estudio, no fueron encontrados capullos en el suelo contaminado durante la experimentación. Esto pudo deberse a la temperatura (22  2 oC), ya que al ser P. corethrurus una especie tropical requiere más altas temperaturas para su reproducción. Sin descartar la posibilidad de que la concentración de BaP inhibió la formación de capullos.

La disminución de peso de las lombrices después de ser expuestas a BaP por 112 días podría ser un indicador de estrés y estar relacionado a cambios en la eficiencia energética que se refleja en inhibición del crecimiento (Wu et al., 2011). Es claro que las características, concentración del contaminante y el tiempo de exposición tienen un efecto directo sobre el peso y supervivencia de las lombrices (Wu et al., 2011; Ma et al., 2012).

Los resultados de este estudio indicaron que P. corethrurus participó en la remoción de BaP (26.6 mg kg-1) en el tratamiento con suelo estéril, lo cual sugiere que la especie podría participar en la remoción de BaP de forma directa. Driscoll y McElroy (1997) reportaron que otros anélidos tales como poliquetos acuáticos son capaces de metabolizar benzo(a)pireno, porque ellos poseen al citocromo P450 que participa en la degradación de este compuesto. En otro estudio se reportó la presencia del citocromo P450 en la lombriz epígea Eisenia fétida (Zhang et al., 2006).

Por otro lado la aplicación de material orgánico (B. humidicola y M. pruriens) a los tratamientos con lombrices incrementó la remoción a 35.7 y 34.2 mg kg-1 respectivamente, después de 112 días sin ser esto significativo en comparación con el tratamiento con lombrices y suelo estéril. En otros estudios la aplicación de material orgánico si incrementó

118

la remoción de contaminantes del suelo, la adición de estos materiales facilitaron la remoción de hidrocarburos poliaromáticos (Contreras-Ramos et al., 2006; Tejada and

Masciandaro, 2011). La adición de P. corethrurus al suelo no estéril, removió 36.1 mg kg-1 de BaP, esto podría deberse a que la especie participa de forma indirecta en la remoción, ya que las lombrices endógeas facilitan la aireación en el suelo y estimulan la actividad microbiana (Bohlen et al., 2004) lo que favorece la biodegradación, además de facilitar el contacto de los microrganismos con el contaminante y de esta forma los hace disponibles.

La aplicación de B. humidicola como alimento para P. corethrurus en el suelo no estéril incrementó la remoción de BaP (48.3 mg kg-1) pero sin ser esto significativo en comparación con el suelo no estéril con lombrices, por lo que la aplicación de B. humidicola o M. pruriens no tuvo efecto significativo en la remoción de BaP del suelo.

Esto podría deberse a que P. corethrurus siendo una lombriz endógea y geófaga con rápida adaptabilidad a condiciones extremas no requiere material orgánico adicional para la realización de sus actividades en el suelo. P. corethrurus al vivir generalmente en los primeros 30 cm de la superficie del suelo es menos dependiente de la aplicación de material orgánico que otras especies de lombrices tal como la epígea E. fetida.

En otros estudios la aplicación de material orgánico estimuló la actividad microbiana y la remoción, por ejemplo Tejada y Masciandaro (2011) encontraron que el contenido de

BaP disminuyó (28.2% and 22.1%) cuando material orgánico en forma de residuos sólidos municipales fueron adicionados. Está claro que el efecto del material orgánico adicionado que participa en la remoción de un contaminante depende de la cantidad y composición de este y de las características del suelo (Tejada et al., 2007).

119

Por otra parte, la concentración de BaP en el suelo fue similar a lo encontrado en los turrículos de la lombriz, lo que indica que la actividad de las lombrices fue tal que el suelo fue completamente mezclado por las lombrices después de 112 días. También podría sugerirse que la lombriz P. corethrurus y los microorganismos de su intestino pueden jugar un papel importante en la remoción de BaP.

La mayor remoción de BaP se presentó cuando estuvieron presentes las lombrices endógeas de la especie P. corethrurus junto con los microrganismos autóctonos

(tratamiento no estéril), lo que significa que la especie facilita de manera significativa la remoción del contaminante.

En el caso de las lombrices epígeas tales como E. fétida y E. andrei, la mayor limitante para ser utilizadas en la remediación de suelos contaminados con hidrocarburos es el costo

(Contreras-Ramos et al., 2008; Dendooven et al., 2011), ya que son requeridos grandes volúmenes de material orgánico para su uso. En el caso de la especie endógea P. corethrurus, al ser menos dependiente de la aplicación de material orgánico, el costo de la remediación en un sitio contaminado podría ser marginalmente más bajo. Es necesario llevar ahora estos estudios a una etapa en campo y en laboratorio con la ayuda de herramientas moleculares identificar el posible gen que exprese a la proteína encargada de la remoción.

120

4.2 Conclusión

La lombriz endógea Pontoscolex corethrurus fue la especie dominante en un suelo antrosol contaminado con hidrocarburos del petróleo (BaP), su presencia indica tolerancia a estos contaminantes. Esta especie promovió la remoción de BaP de un suelo contaminado en condiciones de laboratorio. Su presencia potencializa y acelera junto con los microorganismos del suelo la remoción de BaP. Por los resultados obtenidos la lombriz endógea P. corethrurus podría ser utilizada en la remediación de suelos contaminados por hidrocarburos en regiones tropicales, siempre y cuando se manejen volúmenes semejantes a los utilizados en este estudio 208 individuos m-2 como mínimo.

121

4.3 Referencias

Achazi, R.K., Van-Gestel, CAM., 2003. In: Douben PET, editor. PAHs: an

Ecotoxicological Perspective, Ecological and Environmental Toxicology Series.

Chichester: John Wiley and Sons. 173–90.

Alvarez-Bernal, D., García-Diaz, L., Contreras-Ramos, S.M., Dendooven, L., 2006.

Dissipation of polycyclic aromatic hydrocarbons from soil added with manure or

vermicompost. Chemosphere. 65, 1642–51.

Bindesbol, A., Bayley, M., Damgaard, C., Holmstrup, M., 2009. Impacts of heavy metals,

polyaromatic hydrocarbons, and pesticides on freeze tolerance of the earthworm

Dendrobaena octaedra. Environmental Toxicology and Chemistry 28, 2341-2347.

Bohlen, P.J., Pelletier, D.M., Groffman, P.M., Fahey, T.J., Fisk, M.C., 2004. Influence of

earthworm invasion on redistribution and retention of soil carbon and nitrogen in

Northern temperate forests. Ecosystems 7, 13-27.

Bradley, J.N., B.H. Magee and S.L. Hallen, 1994. Background level of the polycyclic

aromatic hydrocarbons (PAH) and selected metals in New England urban soil. J. Soil

Contam. 3: 349-361.

Callaham, M.A; Stewart, AJ., Alarcon, C., McMillen, SJ., 2002. Effects of earthworm

(Eisenia fetida) and wheat (Triticum aestivum) strawadditions on selected properties of

petroleumcontaminated soils. Environ. Toxicol. Chem. 21, 1658–63.

Ceccanti. B., Masciandaro, G., García, C., Macci, C., Doni, S., 2006. Soil bioremediation:

combination of earthworms and compost for the ecological remediation of a

hydrocarbon polluted soil. Water Air Soil Poll. 17, 383-97.

122

Contreras-Ramos, S.M., Alvarez-Bernal, D., Dendooven, L., 2006. Eisenia fetida increased

removal of polycyclic aromatic hydrocarbons from soil. Environ. Pollut. 141, 396-401.

Contreras-Ramos, S.M., Álvarez-Bernal, D., Dendooven, L., 2008. Removal of polycyclic

aromatic hydrocarbons from soil amended with biosolid or vermicompost in the

presence of earthworms (Eisenia fetida). Soil Biol. Biochem. 40, 1954–1959.

Contreras-Ramos, S.M., Álvarez-Bernal, D., Dendooven, L., 2009. Characteristics of

earthworms (Eisenia fetida) in PAHs contaminated soil amended with sewage sludge

or vermicompost. Appl. Soil Ecol. 41, 269–276.

Corona, R.L., Iturbe, R.A., 2005. Atenuación natural en suelos contaminados con

hidrocarburos. Ingeniería, investigación y tecnología. VI. 2. 119-126.

Dendooven, L., Alvarez-Bernal, D., Contreras-Ramos, S.M., 2011. Earthworms, a means to

accelerate removal of hydrocarbons (PAHs) from soil? A mini-review. Pedobiologia

54, 187–192.

Duke, O. and I.O. Albert, 2007. Carcinogenic Potency of polycyclic aromatic

hydrocarbons. Bull. Chem. Soc. Ethiop., 21: 437-443.

Edwards, C.A., Bohlen, P.J., Linden, D.H., Subler, S., 1995. Earthworms in

agroecosystems. In: P. F. Hendrix (Ed.) Earthworm ecology and biogeography in north

America. Lewis Publishers. Boca Raton, N.Y. USA. pp. 185-214.

Eweis, J. B., Ergas, S., Chang, D., Schroeder, E., 2003. Principios de Biorrecuperación.

McGraw Hill. Madrid, España.

Fragoso, C., 2001. Las lombrices de tierra de México ( Annelida, oligochaeta): diversidad,

ecología y manejo. Acta Zoológica Mexicana. (N.S.) número especial 1, 131-171.

123

Geissen, V., Gomez-Rivera, P., Lwanga, E.H., Mendoza, R.B., Narcías, A.T., Marcías,

E.B., 2008. Using earthworm to the efficiency of remediation of oil-polluted soil in

tropical Mexico. Ecotox. Environ. Safe. 71, 638–642.

Huerta, E., Fragoso, C., Barois, I., Lavelle, P., 2005. Enhancement of growth and

reproduction of the tropical earthworm Polypheretima elongata (Megascolecidae) by

addition of Zea mays and Mucuna pruriens var. utilis litter to the soil. Eur. J. Soil Biol.

41, 45–53.

Jones, A., Spurgeon, J., Svendsen, C., Griffin, L., 2008. A metabolomic based approach to

assessing the toxicity of the polyaromatic hydrocarbon pyrene to the earthworm

Lumbricus rubellus. Chemosphere 71, 601-609.

Kaushish, L., Bahuguna, A., Dangwal, K., 2009. Degradation of benzo(a)pyrene by a novel

strain Bacillus subtilis BMT4i (MTCC9447). Braz. J. Microbiol. 40, 884–892.

Lavelle, P. and C. Gilot, 1994. Priming Effects of Macroorganisms on Microflora: A Key

Process of Soil Function? In: Beyond the Biomass-Compositional and Functional

Analysis of Soil Microbial Communities, Ritz, K., J. Dighton and K.E. Giller (Eds.).

John Wiley and Sons, Chichester, pp: 173-180.

Lavelle, P., Barois, I., Cruz, I., 1987. Adaptative strategies of Pontoscolex corethrurus

(Glossoscolecidae, oligochaeta), a peregrine geophagous earthworm of the humic

tropics. Biol. Fert. Soils. 51, 188–194.

Ma, L.L., Ma, C., Shi, Z.M., Li, W.M., Xu, L., Hu, F., Li, H.X., 2012. Effects of

fluoranthene on the growth, bioavailability and anti-oxidant system of Eisenia fetida

during the ageing process. Eur. J. Soil Biol. 50, 21–27.

124

Mangala, P., De Silva, C., Van Gestel, C., 2009. Comparative sensitivity of E. andrei and

Perionyx excavates in earthworm avoidance tests using two soil types in the tropics.

Chemosphere 77, 1609-1613.

Nunes, D., A. Pasini, N.P. Benito and G.G. Brown, 2006. Earthworm diversity in four land

use systems in the region of Jaguapita Parana State Brazil. Carib. J. Sci., 42: 331-338.

Ortiz, R., Siebe, C., Díaz, G., Cram, S., 2007. Fuentes de hidrocarburos en suelos

orgánicos. Terra Latinoamericana 25, 105-113.

Schaefer, M., 2003. Behavioral endpoints in earthworm ecotoxicology. Evaluation of

different test systems in soil toxicity assessment. J. Soil Sediment. 3, 79-84.

Shakir, H., and Weaver, R., 2002. Earthworm surrival in oil contaminated soil. Plant Soil

240, 127-132.

Sinha, R.K., G. Bharambe and D. Ryan 2008. Converting wasteland into wonderland by

earthworms a low-cost nature´s technology for soil remediation: A case study of

vermiremediation of PAHs contaminated soil. Environmentalist, 28: 466-475.

Tejada, M., Hernández, M.T., García, C., 2007. Application of two organic wastes in a soil

polluted by lead: effects on the soil enzymatic activities. J. Environ.Qual. 36, 216–225.

Tejada, M., Masciandaro, G., 2011. Application of organic wastes on a benzo(a)pyrene

polluted soil. Response of soil biochemical properties and role of Eisenia fetida.

Ecotox. Environ. Safe. 74, 668–674.

Wang, S., Yan, Z., Guo, G., Lu, G., Wang, Q., Li, F., 2010. Ecotoxicity assessment of aged

petroleum sludge using a suite of effects- based end points in earthworm E. fetida.

Environ. Monit.Assess. 169, 417-428.

125

Wu, S., Wu, E., Qiu, L., Zhong, W., Chen, J., 2011. Effects of phenanthrene on the

mortality, growth, and anti-oxidant system of earthworms (Eisenia fetida) under

laboratory conditions. Chemosphere 83, 429–434.

Zavala-Cruz, J., Gavi-Reyes, F., Howard, R., Ferrera-Cerrato, R., 2005. Derrames de

petróleo en suelos y adaptación de pastos tropicales en el Activo Cinco Presidentes.

Terra Latinoamericana 23, 293-302.

Zavala-Cruz, J., Trujillo-Capistrán, F., Ortiz-Ceballos, G., Ortiz-Ceballos, A., 2012.

Tropical endogeic earthworm population in a pollution gradient with weathered crude

oil. Research Journal of Environmental Sciences. DOI: 10.3923/rjes.

Zhang, W., Song, F., Gong, P., Sun, T.H., Zhou, Q.X.,Liu, M., 2006. Earthworm

cytochrome P450 determination and application as a biomarker for diagnosing PAH

exposure. J. Environmen. Monit. 8, 963-967.

126

ANEXOS

ANEXO 1. Artículo publicado en la revista Research Journal of Enviromental

Sciences.

127

ANEXO 2. Artículo publicado en la revista Applied Soil Ecology.

128

ANEXO 3. Constancia del trabajo presentado en el XXXVII Congreso Nacional de la

Ciencia del Suelo. Zacatecas, Zacatecas, 2012.

129

ANEXO 4. Constancia del trabajo presentado en el XXXVII Congreso Nacional de la

Ciencia del Suelo. Zacatecas, Zacatecas, 2012.