CHAPTER I RIASSUNTO 1 ABSTRACT 9 INTRODUCTION 10 Motility and Inflammation 10 AIMS 15
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DEVELOPMENT OF A CELL MOTILITY CHARACTERIZATION SYSTEM FOR INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGICAL APPLICATIONS Valeria Rachela Villella M M DEVELOPMENT OF A CELL MOTILITY CHARACTERIZATION SYSTEM FOR INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGICAL APPLICATIONS Valeria Rachela Villella Dottoranda: Valeria Rachela Villella Relatore: Prof. Stefano Guido Coordinatore: Prof. Giovanni Sannia La grandezza di una persona si evince nella perseveranza e nella fermezza che investe nel perseguire e realizzare i suoi grandi sogni. A chi ha creduto in me INDICE CHAPTER I RIASSUNTO 1 ABSTRACT 9 INTRODUCTION 10 Motility and Inflammation 10 AIMS 15 CHAPTER II RESULTS 16 1.The inflammatory environment of Cystic Fibrosis 16 1.1.The up-regulation of TG2 in human CFTR-defective cells 16 1.2.SUMOylation of Tissue Transglutaminase 18 1.3.Imapct of TG2 persistence in CF epithelia 23 1.4.Aggresome: a feature of CF epithelia 27 1.5.Aggresome and autophagy 28 1.6.In vivo model 36 2. Chemotaxis: Motility model 41 2.1.The 3D matrix collagen gel 41 2.2.TIME-LAPSE system 44 2.3.Calibration of system 46 2.4.Neutrophils in collagen gel: 3D model 48 2.5.T84 motility: 2D model 50 CHAPTER III CONCLUSIONS 55 CHAPTER IV MATERIALS AND METHODS 58 REFERENCES 67 APPENDIX 77 CHAPTER I RIASSUNTO Premesse scientifiche I fenomeni di interazione e migrazione cellulare sono rilevanti in diversi processi fisiopatologici dallo sviluppo embrionale all’infiammazione. Le tecnologie finora disponibili per lo studio di tali fenomeni in vitro sono in larga parte non adatte per applicazioni biotecnologiche industriali. Infatti, l’analisi delle interazioni cellulari viene spesso effettuata con saggi di biologia cellulare quali osservazioni in immunofluorescenza di campioni fissati, che sono limitate a condizioni statiche e si prestano con difficoltà a fornire misure quantitative di eventi dinamici, come la motilità cellulare, su larga scala. Scopo del progetto di tesi è lo sviluppo di un sistema innovativo per l’analisi della motilità e delle interazioni cellulari in 2D e 3D che, superando i limiti già accennati dei saggi finora disponibili, si presti a utilizzo biotecnologico industriale per future applicazioni in screening di sostanze a potenziale valenza terapeutica. In particolare, è stato sviluppato un sistema che consente l’analisi quantitativa del fenomeno di chemiotassi, in cui un gradiente di chemochine, attraverso recettori di superficie, innesca cascate di segnali intracellulari che culminano nel movimento di cellule infiammatorie in direzione del chemoattrattante (Hynes R.,Cell 2002). Si tratta di un fenomeno in cui una costante e dinamica interazione fra il microambiente e la superficie cellulare induce modificazioni dello stesso fenotipo della cellula che risponde a questi stimoli con movimenti finalistici (Ridley A, et al. Science 2003). Cio' avviene, ad esempio, per il movimento dei neutrofili in risposta all’interlechina 8 (IL-8). Il lavoro di tesi è stato organizzato nel modo seguente. In un prima fase l’attività di ricerca è stata indirizzata all’individuazione di meccanismi molecolari che regolano la risposta infiammatoria alla base della produzione di fattori chemoattraenti, come IL-8, utilizzando in particolare come modello la fibrosi cistica. Questa prima parte del lavoro di tesi è stata condotta con tecniche classiche di biologia cellulare e molecolare ed è stata finalizzata alla comprensione del meccanismo molecolare alla base della produzione di IL-8. E’ stato studiato l’effetto di un ambiente infiammatorio su fattori come la transglutaminasi (TG2) che a sua volta regola la modulazione di IL- 8. I risultati ottenuti in questa prima parte del lavoro sono stati utilizzati per la messa a punto di una cella di chemiotassi in cui neutrofili migrano in un gel di collagene tridimensionale sotto l’effetto di un gradiente di IL-8. E’ stato inoltre messo a punto un sistema di valenza trasversale per l’analisi quantitativa della migrazione collettiva di una linea cellulare (T84, utilizzata come modello nella patologia celiaca) durante il processo di confluenza in una piastra di coltura 2D. Si tratta di un ulteriore esempio dell'interazione dinamica fra cellule attraverso il quale cellule poste in piastre di coltura in apposito terreno raggiungono la confluenza muovendosi in uno spazio 2D. Questo fenomeno e' particolarmente studiato per le cellule epiteliali ed e' coordinato non solo da non ancora ben definiti stimoli esterni, ma soprattutto da modificazioni dinamiche della cellula, come la proliferazione e il riarrangiamento del citoschelestro che consentono alle cellule di entrare in contatto con le cellule vicine. La complessità di questi eventi e' ulteriormente provata dal fatto che le cellule stesse, interagendo con le cellule vicine vanno incontro a differenziamento come nel caso delle linee cellulari epiteliali intestinali T84 in cui la confluenza induce produzione di enzimi di superficie, quali la lattasi, propri delle cellule mature. Questo processo di migrazione 1 CHAPTER I collettiva viene inoltre influenzato dagli stessi fattori, studiati nella prima parte del lavoro di tesi, che regolano la produzione di IL-8. Le motivazioni per lo sviluppo del sistema biotecnologico di analisi dei fenomeni di interazione e motilità cellulare oggetto di questa tesi sono da ricercarsi in ambito patologico. Infatti, nel panorama cosi' complesso della motilità e interazione fra cellule in un determinato microambiente la ricerca dei fattori che determinano le modifiche cellulari che conducono all'interazione rappresenta un elemento di grande interesse in patologia umana in quanto il decorso di malattie croniche e' spesso influenzato da alterazioni dei meccanismi di interazione fra cellule. Un esempio e' fornito dal comportamento cellulare in patologie neoplastiche in cui il controllo della invasività delle cellule cancerose rappresenta il goal di terapie anti-tumorali. Infine lo studio del "movimento" e della sua direzionalità in patologia umana puo' non riguardare cellule in toto o sistemi di cellule in un ambiente specifico. La "motilità" e' infatti anche una caratteristica del compartimento intracellulare in cui organelli, aggregati di proteine e le stesse proteine si muovono all'interno della cellula secondo regole ben definite. Un esempio e' rappresentato dal trafficking di proteine in membrana e dal loro continuo reciclying fra la membrana e gli endosomi nonche' la progressione verso i compartimenti degradativi intracellulari. Meccanismi di "movimenti" intracellulari sono alla base di complessi meccanismi di degradazione quali l'autofagia e compoprtano anche un riarrangiamento del citoscheletro che regola la motilità "esterna" dell'intera cellula. In un panorama cosi' complesso l'identificazione dei fattori che possono disregolare il complesso sistema della motilità in senso lato e' pertanto di grande interesse e la identificazione di molecole potenzialmente capaci di modulare questi processi puo' avere enormi implicazioni terapeutiche per applicazioni biotecnologiche industriali. La scelta di modelli di malattia idonei allo studio dei fattori putativamente coinvolti nei meccanismi di motilità/interazione cellulare dovrebbe basarsi essenzialmente sulla evidenza che questi meccanismi costituiscono un elemento patogenetico della malattia e non un semplice evento bystander. La comprensione di una pathway specifica puo' aprire la strada alla identificazione di sostanze capaci di modulare questi processi biologici e rappresentare molecole eventualmente implementabili nella terapia di molte patologie umane. Come già accennato, nel corso del dottorato di ricerca sono stati utilizzati diversi modelli cellulari di due differenti patologie umane, la Fibrosi Cistica e la Celiachia che hanno come fattore comune valori elevati della Transglutaminasi tissutale (TG2), un enzima multifunzionale con un ruolo patogenetico noto in diverse patologie umane, che induce cross-linking di proteine substato o espleta altre funzioni quali una attività isomerasica o di G protein (Malorni, W., et al. 2008, Curr. Pharm. Des). La Fibrosi Cistica, la piu' comune malattia monogenica ad esito letale nella popolazione caucasica, dovuta a mutazioni del gene CFTR, e' caratterizzata, fra l'altro, da infiammazione polmonare a prevalente componente neutrofilica in risposta ad elevata secrezione di IL8 con ricorrenti infezioni batteriche (Smith, J. J., et al. Cell. 1996; Ratjen, F., and G. Doring. 2003. Lancet). Nella prima parte del lavoro di tesi, sono state utilizzate linee cellulari epiteliali per identificare la pathway mediata da TG2 che porta ad incrementati livelli di IL8 e di infiammazione. Sono stati quindi validati inibitori specifici di questa pathway ed individuato il meccanismo di controllo dell'infiammazione e della secrezione di IL8 in vitro e in vivo in 2 diversi modelli animali di malattia. La celiachia, una intolleranza permanente a determinate sequenze peptidiche della gliadina del frumento e delle prolamine di orzo e segale, e' una comune intolleranza 2 CHAPTER I alimentare con una prevalenza di 1:100 nella popolazione generale, e caratterizata da una disregolazione della risposta immune mucosale innata ed adattativa con componente autoimmune (Sollid LM. Nat Rev Immunol 2002). E' ampiamente dimostrato come la gliadina induca aumentata espressione e attivazione della proteina TG2 che esercita un ruolo patogenetico nella malattia. Nella prima parte del lavoro di tesi, sono state utilizzate linee cellulari epiteliali intestinali per studiare i meccanismi