THÈSE Pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE GRENOBLE Spécialité : Méthodes et algorithmes en Biologie Présentée par Tarfa Mustafa Thèse dirigée par Roberto A. Geremia et codirigée par Jean Martins Préparée au sein du Laboratoire d’Ecologie Alpine Dans l'École Doctorale Ingénierie de la santé, la cognition et l’environnement Towards a metranscriptomic comparison of two alpine soils under contrasted snow cover Thèse soutenue publiquement le 28 Septembre 2011, devant le jury composé de : Rolland Marmeisse: CR CNRS Ecologie Microbienne Lyon ( rapporteur ) Denis Faure: DR CNRS, Institut des Sciences du Végétal, Gif-sur-Yvette ( rapporteur ) Lionel Ranjard: DR INRA, Genosol, Dijon ( examinateur ) Patrick Ravanel: Prof, UJF, LECA, Grenoble ( examinateur ) Jean Martins: CR CNRS, LTHE, Grenoble, ( co-directeur de thèse ) Roberto A. Geremia: DR CNRS- LECA, Grenoble, ( directeur de thèse ) Table of content Remerciements Présentation de la démarche Chapter I - literature Review 1 2.1 Soil environment in general, who is there? 1 2.1.1 Soil environment, formation and characteristics. 1 2.1.2 Soil biodiversity: definition and concept. 1 2.1.3 Microbial diversity estimations methods. 4 2.1.4 Eukaryotes as major component of soil environment. 7 2.1.4.1 Eukaryotes evolution history. 7 2.1.4.2 Fungal phylogeny. 8 2.2 Soil ecosystem, who is there, and what they are doing? 13 2.2.1 What is an ecosystem? 13 2.2.2 The soil ecosystem, concept, definition and key elements. 14 2.2.2.1 Major factors influencing soil ecosystem. 15 2.2.2.2 Above- and belowground interaction effects on ecosystem functions. 17 I. Feedbacks between below- and above ground communities. 17 II. Rhizodeposition as major factor in biogeochemical cycles of soil. 20 2.2.3 Soil ecosystem: Fungi as a major actor 23 2.3 Alpine soil as special ecosystem: 27 2.3.1 Definition and key features. 27 2.3.2 Climate changes effect on biodiversity in alpine ecosystem. 27 2.3.2.1 Snow-cover effects on seasonal succession of microbial communities. 28 2.3.2.2 Climate changes determine vegetal communities in alpine environment. 30 2.3.2.3 Snow-cover impact on plant-microorganisms interactions. 32 2.3.2.4 Biogeochemical cycles in alpine environment in function of snow-cover. 33 2.3.3 Snowmelt gradient in relation with ecosystem functions. 37 2.4 Methods for studying functional diversity of soil: 42 2.4.1 Functional diversity analysis using traditional and biochemical approaches. 42 2.4.2 Molecular approaches to solve ecological questions. 44 2.4.2.1 Historical preface. 44 2.4.2.2 Metagenomic, a step forward for understanding functional diversity. 45 2.4.2.3 Transcriptome sequencing for gene expression analysis. 47 I 2.4.2.3.1 First methodologies, advances and limitations. 47 2.4.2.3.2 Next generation sequencing, application, advances and limitations. 48 2.4.2.3.3 Tag-based approaches for gene expression profiling. 53 2.4.2.4 Metatranscriptomic approach: 55 2.4.2.4.1 Definition, concept and limitations. 55 2.4.2.4.2 Knowledge on Metatranscriptomic approach. 57 2.4.2.4.3 Drawbacks and technical limitations. 59 Résumé Chapter II - Development of total RNA extraction protocol, cDNA libraries 64 construction, and 454 pyrosequencing 63 3.1 Introduction: 3.2 Materiel and methods: 66 3.2.1 Soil samples. 66 3.2.2 Total RNA extraction. 67 3.2.2.1 Extraction method. 68 3.2.2.2 RNA purification and DNA elimination. 68 3.2.2.3 RNA quality and quantity estimation. 69 3.2.3 cDNA preparation. 69 3.2.4 454 Pyrosequencing. 70 3.3 Results and discussion: 71 3.3.1 Total RNA extraction. 71 3.3.1.1 RNA PowerSoil TM Total RNA Isolation Kit. 71 3.3.1.2 Modified protocol proposed by Bailly et al 2007. 73 3.3.2 cDNA libraries preparations. 77 3.4 Discussion: 77 Résumé Chapter III: 454 pyrosequencing data analysis 82 4.1 Introductions: 81 4.2 Material and methods: 87 4.2.1 Sequences analysis, size selection, trimming and assembly. 87 4.2.2 Taxonomical and functional analysis. 87 4.3 Results: 88 4.3.1 Row dataset preparation and assembly. 88 4.3.2 Community composition and taxonomic origin of transcripts. 92 II 4.3.2.1 Taxonomic affiliation of ribosomal reads. 92 4.3.2.2 Taxonomic affiliation of putative mRNA reads. 95 4.3.2.2.1 MG-RAST approach. 4.3.2.2.2 Blast2Go approach. 4.3.3 Functional analysis of transcripts. 96 4.3.3.1 Functional analysis using SEED subsystems (MG-RAST). 96 4.3.3.2 Functional analysis based on Gene Ontology (GO terms). 101 4.4 Discussion 109 4.4.1 Choice of studied ecosystem and what possible ecological significance. 109 4.4.2 Choice of molecular approach for ecological questions. 109 4.4.3 Qualitative and quantitative aspects of obtained dataset. 110 4.4.4 Assembly, as important factor for improving 454 pyrosequencing reads quality. 112 4.4.5 Phylogenetic analysis; different approaches, different databases, and as 113 consequence different results. 4.4.6 Functional annotations using MG-RAST and BLAST2GO tell different stories: 116 4.5 Conclusions and perspective. 120 Résumé References: Additional files: Article 1: Towards a metatranscriptomic comparison between two alpines soils. Article 2: Effect of plant species identity, drought stress and defoliation on the diversity of bacterial and fungal communities associated with the roots of grasses. Article 3: The dependence on porosity of the phylogenetic structure of bacterial urban sediments . III Remerciements Ce fut comme un éclair, comme un clin d’œil ! Cinq années sont passées ; la tâche est terminée mais l’aventure scientifique et l’expérience humaine n’ont fait que changer dans mon esprit et dans ma personne, ne feront que graver encore et profondément dans ma mémoire et dans mon cœur. L’expérience humaine de la thèse est parfois (ou souvent) une expérience de solitude. Mais je tiens à reconnaître qu’elle n’aurait même pas été possible sans votre accompagnement ou tout simplement sans votre présence à mes côtés. Je voudrais tout d’abord adresser mes remerciements à Rolland Marmeisse (Ecologie Microbienne, Lyon) et Denis Faure (Institut des Sciences du Végétal, Gif-sur-Yvette ) d’avoir accepté de rapporter ma thèse, ainsi que pour leurs leurs critiques sur le manuscrit. Je voudrais également remercier Lionel Ranjard (INRA Genosol, Dijon) et Patrick Ravanel (UJF-LECA, Grenoble) d’avoir accepté de faire partie du jury. A mon directeur de thèse Roberto Geremia. Malgré le fait que notre relation a passé beaucoup des étapes difficiles au sein de la parcoure de ma thèse, je tiens à te remercier de m’avoir accepté dans ton équipe et de me permettre de m’épanouir dans plusieurs domaines scientifiques et surtout l’écologie microbienne. Je te remercie également pour ta volonté à nous faire sortir des situations bloqué chaque fois. Je remercie également Jean martins pour sa participation dans la première partie de ma thèse, et malgré le fait que le plan de thèse a été largement modifié, Je n’oublierai pas son insistance p our continuer de diriger ma thèse jusqu’à la fin. Jean-marc bonville, c’est avec toi que j’ai découvert le monde de la biologie moléculaire et bioinformatique. Malgré tant de disputes et de malentendus, les deux dernières années de ma thèse passée sous ton encadrement étaient la période la plus innovante, et c’était la période où j’ai découvert le véritable monde de la recherche. Je te remercie profondément pour tout ce que tu m’as appris. Grand merci à Armelle munièr, la personne avec qui j’ai passé de très bons moments. Armelle, ta présence à mes côtés était l’un des rares éléments positifs au sein du parcours perturbé de ma thèse. Je ne peux jamais oublier l’aide précieuse que tu m’as offerte et franchement, je ne peux pas imaginer ces cinq ans de thèse sans toi. Cette thèse n’aurait pas pu voir le jour et n’aurait pas pu être menée convenablement à son terme sans les interventions !décisives de Philippe Choler. IV Le grand chef Patrick Ravanel, merci pour ta disponibilité et ton soutien, notamment dans les moments de doute et de découragement. Ce travail de thèse n’aurait pas été le même sans l’ancienne é quipe PEX, et je veux particulièrement remercier l’adorable Angélique San Miguel. Je ne peux jamais oublier tous les moments que tu m’as conforté et ta présence dans le laboratoire était pour moi un rayon de soleil très brillant. Ozgur clinck, tant des baskets de cigarettes fumées en bas de LECA, tant de souffrances partagées mais aussi tant d’espoirs et de rêves. Je te remercie pour tous les moments passés ensemble. Egalement je ne peux pas oublier le magnifique Mathieu faure, le troisième étranger dans le laboratoire avec Ozgur et moi. Abdel, tant de discussions scientifiques avec toi et beaucoup de choses partagées, je te remercie et te souhaite plein de réussite dan ta vie personnelle et professionnelle. Luci et Bahar, je vous remercie pour les moments partagés au début de ma thèse et pour l’aide scientifique précieuse que vous m’avait présentée . Grand merci pour madame Lucile Sage et monsieur Mamadu B ello, pour l’aide précieuse que vous m’avez présenté, et de pouvoir me confier à vous dans les moments difficile. Une pensée particulière pour tous les membres de l’équipe de foot « Michaiel, Fred, Franchisco, Abdel, Saiied, Julien, Max, et plein d’autres, et bien sûr notre équipe de supportrices féminin « Emma, Marie-Audri, Claire et Angélique».