Gene der Cardenolid-Biosynthese aus Digitalis - und Isoplexis -Spezies
Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades
vorgelegt von Vanessa Jeannine Herl aus Nürnberg
Gene der Cardenolid-Biosynthese aus Digitalis - und Isoplexis -Spezies
Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades
vorgelegt von Vanessa Jeannine Herl aus Nürnberg
Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 03.11.2006 Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. D.-P. Häder Erstberichterstatter: Prof. Dr. W. Kreis Zweitberichterstatter: Prof. Dr. W. Hillen Drittberichterstatter: Prof. Dr. B. Dräger
Für meine Familie
Der Mensch hat dreierlei Wege klug zu handeln: erstens durch Nachdenken, das ist der edelste, zweitens durch Nachahmen, das ist der leichteste, und drittens durch Erfahrung, das ist der bitterste.
Konfuzius
Danksagung
Mein Dank gilt im besonderen Maße meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. Wolfgang Kreis, der mir die Gelegenheit gab, dieses interessante und spannende Thema bearbeiten zu dürfen. Er verstand es durch seine stete Diskussionsbereitschaft meinen Blick auf das Wesentliche zu fokussieren, Ergebnisse auch kritisch zu hinterfragen und hat auf diese Weise entscheidend zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen.
Ganz besonders möchte ich mich bei Herrn Dr. Frieder Müller-Uri bedanken, der durch seinen Erfahrungsschatz, seine große Gesprächs- und Diskussionsbereitschaft vor und nach Feierabend, sowie durch seine Geduld und Unterstützung meine Begeisterung für die Forschung geweckt hat.
Ein riesiges Dankeschön gilt Frau Gab(r)i(ele) Fischer, die sich für ihre exzellente technische Assistenz, unermüdliche Hilfs- und Diskussionsbereitschaft sowie für ihren unvergleichlichen Sinn für Humor mehr als nur einen „Du-bist-sooo-tapfer-Orden“ verdient hätte.
Bei Frau Jördis Frankenstein möchte ich mich im Besonderen für die geduldige Unterstützung an der HPLC, sowie für die von Humor und Improvisationstalent geprägte gemeinsame Kursbetreuungs- und Promotionszeit bedanken.
Herrn Prof. Dr. Y. Muller und Frau C. Egerer-Sieber, sowie den Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Lehrstuhls für Biotechnik, FAU Erlangen, danke ich für die konstruktive und erfolgreiche Zusammenarbeit bei der Kristallisation rekombinanter Proteine.
Weiterhin danke ich Herrn Priv. Doz. Dr. F. Klebl und W. Weber für die Möglichkeit, das Isotopenlabor nutzen zu dürfen, sowie für die Unterstützung bei der Durchführung radioaktiver Experimente.
Danken möchte ich auch Herrn Priv. Doz. Dr. V. A. R. Huss für die Generierung der Phylogramme, sowie für seine Diskussions- und Hilfsbereitschaft bei evolutionären Fragestellungen. Bei Herrn Dr. S. Schwab möchte ich mich für die Einarbeitung und Unterstützung an der GC- MS bedanken.
Mein Dank gilt auch Herrn Prof. Dr. D. Albach, Universität Mainz, für seine Diskussionsbereitschaft bezüglich der evolutionären Aspekte meiner Arbeit.
Ich möchte mich bei allen bedanken, die zur Vervollständigung des verwendeten Pflanzen-, bzw. DNA-Materials der Digitalis - und Isoplexis -Arten beigetragen haben: Frau Prof. Dr. M. Petersen, Herrn Prof. Dr. V. Melzheimer und Frau A. Berim (Universität Marburg); Herrn Prof. Dr. G. Heubl und Herrn C. Bräuchler (Universität München); Herrn Prof. Dr. J. Segura, (Universität Valencia, Spanien); Herrn DR. W. Welß (FAU Erlangen), Herrn Prof. Dr. A. Graner (Genbank Gatersleben) sowie den Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern der Botanischen Gärten in Erlangen und München.
Außerdem bedanke ich mich bei allen übrigen sowie ehemaligen Kolleginnen und Kollegen am Lehrstuhl für Pharmazeutische Biologie für die angenehme Arbeitsatmosphäre und das gute Betriebsklima.
Mein Dank gilt auch Frau Christina Müller-Uri für die Hilfe beim Beschaffen schwer zugänglicher Literatur und ihre mir entgegengebrachte Gastfreundschaft.
Meinen persönlichen Freunden möchte ich für das Interesse am Fortschritt meiner Arbeit, sowie für die Geduld beim Zuhören und Lösen von damit verbundenen Herausforderungen danken.
Ein besonderer Dank gilt meinem Vater für sein Interesse am Gelingen dieser Arbeit und seine Anerkennung meiner damit erbrachten Leistung, sowie für seine finanzielle Unterstützung während meiner Studien- und Promotionszeit.
Abschließend möchte ich mich besonders bei Michael und meinen Eltern bedanken. Ihre moralische Unterstützung und ihr Glauben an meine Stärken und Fähigkeiten, auch in Momenten und Situationen wenn es kein anderer mehr getan hat, stärkten mir immer den Rücken und haben so einen ganz besonderen Anteil am Gelingen dieser Arbeit. Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS
I EINLEITUNG ...... 1 I.1 Die Gattungen Digitalis L. und Isoplexis L...... 1 I.2 Sekundärstoffe in den Gattungen Digitalis und Isoplexis ...... 2 I.2.1 Digitanole, Saponine, Anthracenderivate und Flavonoide ...... 2 I.2.2 Cardenolide ...... 4 I.2.2.1 Medizinische Bedeutung...... 4 I.2.2.2 Strukturen der Cardenolide ...... 5 I.3 Die Cardenolid-Biosynthese ...... 7 I.4 Zielsetzung der Arbeit ...... 11
II MATERIAL UND METHODEN ...... 12 II.1 Material ...... 12 II.1.1 Wasser, DEPC-Wasser ...... 12 II.1.2 Pflanzenmaterial ...... 12 II.1.3 Lösungen...... 13 II.1.3.1 Lösungen für mikrobiologische Arbeiten ...... 13 II.1.3.2 Lösungen für die Southern-Blot-Analyse ...... 14 II.1.3.3 Lösungen für die Silberfärbung von Protein-Gelen...... 14 II.1.3.4 Lösungen für die DC-Analytik ...... 15 II.1.4 Medien ...... 15 II.1.5 Puffer ...... 16 II.1.5.1 Puffer für molekularbiologische Arbeiten ...... 16 II.1.5.2 Puffer für proteinchemische Arbeiten...... 17 II.1.6 Oligodesoxyribonukleotide (Primer)...... 19 II.1.7 Plasmide...... 20 II.1.8 Escherichia coli -Stämme...... 20 II.1.9 Geräte...... 20 II.1.10 Chemikalien...... 22 II.1.11 Kits und Enzyme...... 24 II.1.12 Verbrauchsmaterialen...... 24 II.2 Methoden...... 25 II.2.1 Isolierung genomischer DNA...... 25
I Inhaltsverzeichnis
II.2.2 Isolierung von Gesamt-RNA...... 25 II.2.3 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren...... 25 II.2.4 Aufreinigung von mRNA...... 25 II.2.5 cDNA-Synthese...... 26 II.2.6 PCR/RT-PCR ...... 27 II.2.7 Trennung und Nachweis von DNA mittels Agarosegelen ...... 27 II.2.8 Isolierung von DNA aus Agarosegelen...... 28 II.2.9 Aufreinigung von DNA...... 28 II.2.10 Subklonierung und Sequenzierung von PCR-Produkten ...... 28 II.2.10.1 Klonierung von PCR-Produkten...... 28 II.2.10.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus transformierten Bakterienzellen ...... 29 II.2.10.3 Restriktion von Plasmiden...... 29 II.2.10.4 DNA-Sequenzierung...... 29 II.2.10.5 Anlegen von Glycerolstocks...... 29 II.2.11 Phylogenetische Analytik...... 30 II.2.12 Southern-Blot-Analyse...... 30 II.2.12.1 Restriktion genomischer DNA ...... 30 II.2.12.2 Elektrophoretische Trennung von genomischer DNA im Agarosegel.....31 II.2.12.3 Southern-Blot-Verfahren ...... 31 II.2.12.4 Markierung der Sonde ...... 32 II.2.12.5 Hybridisierung und Waschen der Blots...... 32 II.2.13 Heterologe Expression in E. coli ...... 33 II.2.13.1 Konstruktion der Expressionsplasmide ...... 33 II.2.13.2 Herstellung kompetenter M15[pREP4] Zellen...... 34 II.2.13.3 Transformation kompetenter M15[pREP4] Zellen...... 34 II.2.13.4 Expression von r5β-POR und r3β-HSD ...... 34 II.2.14 Heterologe Expression von Selenomethionin-Proteinen...... 35 II.2.14.1 Herstellung kompetenter B834(DE3) Zellen...... 35 II.2.14.2 Transformation kompetenter B834(DE3) Zellen...... 35 II.2.14.3 Expression von SeMet-r5β-POR ...... 36 II.2.15 Expressionsprofil...... 36 II.2.16 Bestimmung der Proteinlöslichkeit ...... 37 II.2.17 Reinigung rekombinanter Proteine...... 37 II.2.17.1 Denaturierende His-tag-Reinigung...... 38
II Inhaltsverzeichnis
II.2.17.2 Native His-tag-Reinigung ...... 38 II.2.18 Umpuffern und Einkonzentrierung von Proteinlösungen...... 38 II.2.19 Proteinbestimmung...... 39 II.2.20 SDS-PAGE ...... 39 II.2.20.1 Herstellung der Gele ...... 39 II.2.20.2 Probenvorbereitung und Laufbedingungen...... 40 II.2.21 Isoelektrische Fokussierung...... 40 II.2.21.1 Probenvorbereitung und Laufbedingungen...... 40 II.2.22 Silberfärbung von Proteinen...... 41 II.2.23 Aktivitätsbestimmung rekombinanter Proteine ...... 41 II.2.23.1 Standard 5 β-POR-Enzymassay...... 41 II.2.23.2 Standard 3 β-HSD-Enzymassay...... 42 II.2.24 Dünnschichtchromatographie (DC)...... 43 II.2.25 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ...... 43 II.2.26 Gaschromatographie (GC)...... 44 II.2.27 Kristallisation rekombinanter Proteine...... 45
III ERGEBNISSE ...... 46 III.1 Klonierung von Genen der Cardenolid-Biosynthese aus Digitalis und Isoplexis ...... 46 III.1.1 Klonierung der Progesteron-5β-Reduktase (5β-POR) ...... 46 III.1.1.1 PCR/RT-PCR...... 46 III.1.1.2 Klonierung der PCR-Produkte...... 48 III.1.1.3 Bearbeitung erhaltener Nukleotidsequenzen...... 49 III.1.1.4 Genbankeinträge...... 51 III.1.1.5 Vergleich der Nukleotidsequenzen...... 52 III.1.1.6 Vergleich der Aminosäuresequenzen ...... 54 III.1.1.7 Phylogramm...... 56 III.1.2 Klonierung der 5-3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (3 β-HSD)...... 58 III.1.2.1 PCR/RT-PCR...... 58 III.1.2.2 Klonierung der PCR-Produkte...... 60 III.1.2.3 Bearbeitung erhaltener Nukleotidsequenzen...... 60 III.1.2.4 Genbankeinträge...... 62 III.1.2.5 Vergleich der Nukleotidsequenzen...... 63
III Inhaltsverzeichnis
III.1.2.6 Vergleich der Aminosäuresequenzen...... 64 III.2 Southern-Blot-Analyse der 5 β-POR aus D. lanata ...... 66 III.2.1 Elektrophoretische Trennung restriktierter DNA im Agarosegel ...... 66 III.2.2 Gewinnung der unmarkierten Sonde...... 66 III.2.3 Überprüfung der Markierung der Sonde...... 67 III.2.4 Southern-Blot ...... 68 III.3 Heterologe Expression von Enzymen der Cardenolid-Biosynthese aus D. lanata ...... 69 III.3.1 Expression von rekombinanter 5 β-POR (r5 β-POR) ...... 69 III.3.1.1 PCR und Ligation...... 69 III.3.1.2 Bearbeitung erhaltener Nukleotidsequenzen...... 70 III.3.1.3 Expressionsprofil...... 71 III.3.1.4 Bestimmung der Proteinlöslichkeit ...... 72 III.3.1.5 Denaturierende His-tag-Reinigung...... 73 III.3.1.6 Native His-tag-Reinigung...... 73 III.3.1.7 Nachweis der katalytischen Aktivität...... 74 III.3.1.8 Kontrollexperimente...... 75 III.3.2 Expression von rekombinanter Seleonmethionin-5β-POR (SeMet5-rβ-POR)...... 77 III.3.2.1 Native His-tag-Reinigung...... 77 III.3.2.2 Nachweis der katalytischen Aktivität...... 78 III.3.3 Expression von rekombinanter 3 β-HSD (r3 β-HSD)...... 79 III.3.3.1 PCR und Ligation...... 79 III.3.3.2 Bearbeitung erhaltener Nukleotidsequenzen...... 80 III.3.3.3 Expressionsprofil...... 80 III.3.3.4 Native His-tag-Reinigung...... 81 III.3.3.5 Nachweis der katalytischen Aktivität...... 82 III.3.3.6 Kontrollexperimente...... 82 III.4 Biochemische Charakterisierung der r5β-POR ...... 84 III.4.1 Stereospezifität...... 84 III.4.2 Cosubstrat-Spezifität...... 88 III.4.3 pH-Optimum ...... 90 III.4.4 Temperaturoptimum...... 91 III.4.5 Isoelektrischer Punkt...... 91
IV Inhaltsverzeichnis
III.4.6 Substratspezifität ...... 92 III.4.6.1 Steroide mit C3-Carbonylgruppe und C4-C5 Doppelbindung...... 93 III.4.6.2 Steroide mit C3-Hydroxylgruppe und C4-C5 Doppelbindung...... 98 III.4.6.3 Steroide mit C3-Hydroxylgruppe und C5-C6 Doppelbindung...... 99 III.4.6.4 Steroide mit C3-Carbonylgruppe und C5-C6 Doppelbindung...... 99 III.4.7 Enzymkinetik...... 100 III.4.7.1 Enzymkinetik des Cosubstrats NADPH...... 100 III.4.7.2 Enzymkinetik ausgewählter Substrate...... 101
IV DISKUSSION ...... 107 IV.1 Progesteron-5β-Reduktasen ...... 107 IV.1.1 Klonierung der 5 β-POR aus Digitalis und Isoplexis ...... 107 IV.1.2 Phylogenie...... 111 IV.1.3 Molekulare Organisation der 5 β-POR aus D. lanata ...... 116 IV.1.4 Heterologe Expression von r5 β-POR aus D. lanata ...... 117 IV.1.5 Charakterisierung der r5 β-POR...... 120 IV.1.6 Kristallisation der SeMet-r5 β-POR...... 125 IV.2 5-3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenasen ...... 127 IV.2.1 Klonierung der 3 β-HSD aus Digitalis ...... 127 IV.2.2 Heterologe Expression von r3 β-HSD aus D. lanata ...... 130 IV.2.3 Charakterisierung der r3 β-HSD ...... 131 IV.3 5 β-POR und 3 β-HSD – Mitglieder der „Short-Chain Dehydrogenase/ Reductase“ (SDR) Familie? ...... 132 IV.4 Ausblick ...... 136
V ZUSAMMENFASSUNG ...... 137 V SUMMARY ...... 138
VI LITERATURVERZEICHNIS...... 139
VII ANLAGEN ...... 150 VII.1 Abkürzungsverzeichnis ...... 150 VII.2 Alignments ...... 151 VII.2.1 Nukleotid-Alignment der Intron-haltigen 5β-POR Gensequenzen ...... 151
V Inhaltsverzeichnis
VII.2.2 Aminosäure-Alignment der 5β-POR Proteinsequenzen...... 159 VII.2.3 Nukleotid-Alignment der Intron-haltigen 3 β-HSD Gensequenzen...... 162 VII.3 Publikationsliste ...... 164
VI Einleitung
I EINLEITUNG I.1 Die Gattungen Digitalis L. und Isoplexis L. Die Gattung Digitalis L., welche allgemein auch unter der Bezeichnung „Fingerhut“ bekannt ist, stellt ein Mitglied der Veronicaceae, bzw. Plantaginaceae dar (Olmstead et al., 2001; Albach und Chase, 2004; Albach et al., 2005).
Tabelle 1: Systematische Gliederung der Gattung Digitalis L. nach Werner (1964). Sectio Subsectio Species
I. Frutescentes Benth. 1. D. obscura L. emend. Pau II. Digitalis 2. D. thapsi L. 3. D. dubia Rodr. * 4. D. heywoodii P.et M. Silva # 5. D. mariana Boiss 6. D. purpurea L. III. Grandiflorae 7. D. ciliata Trautv. Benth. em. Werner 8. D. davisiana Heyw. 9. D. atlantica Pomel 10. D. grandiflora Mill. IV. Tubiflorae Benth. Acutisepalae Werner 11. D. subalpina Br.-Bl. 12. D. lutea L. 13. D. viridiflora Lindl. Obtusisepalae Werner 14. D. parviflora Jacq. V. Globiflorae Benth. Hymenosepalae Ivan. 15. D. laevigata Waldst. et Kit. 16. D. nervosa Steud. et Hochst. ex Benth . 17. D. ferruginea L. Blepharosepalae 18. D. cariensis Boiss. ex Jaub. et Spach Ivan. em. Werner em. Werner 19. D. lanata Ehrh. * D. dubia jetzt D. minor ; # D. heywoodii jetzt Subspezies von D. mariana (Bräuchler et al., 2004; BrendaDatabase, 2006 → http://brenda.uni-koeln.de).
1 Einleitung
Sie umfasst gleichmäßig beblätterte, zwei- oder mehrjährige Kräuter (meist Rosettenstauden) und niedere Sträucher, welche nur an den Zweigenden Blätter tragen. Als Blütenstände bilden die Mitglieder der Gattung Digitalis allseitswendige oder einseitswendige Trauben mit nickenden, fingerhutförmigen Blüten aus. Die natürliche Verbreitung der 19 Spezies umfassenden Gattung Digitalis (Werner, 1964; Tabelle 1) erstreckt sich über den mediterran- mitteleuropäischen Raum. Die zwei Verbreitungsschwerpunkte bilden hierbei die Iberische Halbinsel und Marokko, sowie die Balkanhalbinsel und Kleinasien (Luckner und Wichtl, 2000). Die erste Beschreibung der Gattung Digitalis findet sich bei Linné (1753), der fünf Digitalis Arten unterschied, darunter Digitalis canariensis , welche heutzutage als Isoplexis canariensis zu der abgespalteten, eigenständigen Gattung Isoplexis L. gerechnet wird. Der Begriff Isoplexis wurde das erste Mal 1829 verwendet und bezeichnete zunächst eine Sectio Isoplexis innerhalb der Gattung Digitalis . Die morphologischen und geographischen Unterschiede zu den Digitalis -Arten führten schließlich zu einer Abspaltung als eigenständige Gattung Isoplexis (Werner, 1960 und 1961). Die Gattung Isoplexis, auch ein Mitglied der Veronicaceae, bzw. Plantaginaceae (Olmstead et al., 2001; Albach und Chase, 2004; Albach et al., 2005), umfasst Zwergbäume und Sträucher. Sie besteht aus 4 Spezies, welche als Endemiten auf einigen Kanarischen Inseln ( I. canariensis (L.) Lindl. ex G. Don, I. isabelliana (Webb.) Masf., I. chalcantha Svent. & O`Shan.), bzw. Madeira ( I. sceptrum (L.f.) Lindl. ex G. Don.) vorkommen. Die Isoplexis -Arten zeichnen sich durch eine starke Verholzung, sowie durch eine scharfe Trennung der Blütenstände (meist schopfige Blütentrauben) von den vegetativen Abschnitten aus. Diese morphologischen Merkmale unterscheiden sie deutlich von den Digitalis -Arten, mit denen sie aber phylogenetisch nahe verwandt sind (Luckner und Wichtl, 2000). Gemeinsamkeiten, aber auch Unterschiede zwischen den beiden Gattungen findet man ebenso in Bezug auf ihre Sekundärstoffe, bzw. Sekundärstoffmuster.
I.2 Sekundärstoffe in den Gattungen Digitalis und Isoplexis I.2.1 Digitanole, Saponine, Anthracenderivate und Flavonoide Neben den pharmazeutisch relevanten Cardenoliden (vgl. I.2.2) findet man in den Digitalis - und Isoplexis -Arten auch andere Sekundärstoffe, wie Digitanole (Pregnanderivate), Saponine, Anthracenderivate und Flavonoide. Obwohl die Isoplexis -Arten im Vergleich wesentlich weniger umfassend phytochemisch untersucht wurden als die Digitalis -Arten, lässt sich feststellen, dass beiden Gattungen gleiche oder ähnliche Substanzen der genannten Sekundärstoff-Gruppen enthalten. Dies unterstreicht die nahe Verwandtschaft der beiden
2 Einleitung
Gattungen zueinander. In Tabelle 2 sind die genannten Sekundärstoffe mit einigen Strukturbeispielen aufgeführt.
Tabelle 2: Sekundärstoffe der Gattungen Digitalis und Isoplexis . Gattung Digitalis Sekundärstoff mit Strukturbeispiel Gattung Isoplexis
u.a. Digifolein Digitanole Digifolein
Lanafolein O Lanafolein H Digipronin O Digipronin H Diginigenin Diginin Diginin H H O Purpronin HO
u.a. Gitogenin Steroidsapogenine u.a. Gitogenin
Tigogenin O Tigogenin
Digitogenin H O Isoplexigenin A – D HO Keine Steroidsapoge- H H Gitogenin Steroidsapogenine/Saponine HO nine/Saponine mit un- H mit ungesättigtem B-Ring O gesättigtem B-Ring. v.a. in I. sceptrum. H O OH
H H Isoplexigenin B HO
u.a. Madeirin Anthracenderivate u.a. Madeirin Pachybasin O OMe Pachybasin Digiferrol Madeirin 1,4-Dihydroxy-3- methylanthra- O OH chinon
u.a. Luteolin Flavonoide Luteolin-7-glucosid Apigenin OH Luteolin-7-glucuronid HO O Kämpferol OH Apigenin-7-glucuronid Luteolin OH O Nach Luckner und Wichtl, 2000.
3 Einleitung
I.2.2 Cardenolide I.2.2.1 Medizinische Bedeutung Cardenolide stellen die pharmazeutisch relevanten Substanzen unter den Sekundärstoffen aus Digitalis und Isoplexis dar. Während heutzutage eher Nitrate oder Schleifendiuretika vom Furosemidtyp zur Behandlung der akuten Herzinsuffizienz herangezogen werden, haben Cardenolide immer noch einen festen Platz bei der Therapie der chronischen Herzmuskelschwäche (NYHA-Stadium III und IV). Ein weiteres Anwendungsgebiet stellen supraventrikuläre Tachykardien und Tachyarrhythmien sowie Vorhofflattern und Vorhofflimmern dar (Mutschler, 2001). Der Wirkungsmechanismus der Cardenolide beruht auf einer Hemmung der Mg 2+ -abhängigen Na +/K +-ATPase. Dies führt zu einer Zunahme der intrazellulären Na +-Konzentration bei gleichzeitiger Abnahme der intrazellulären K +- Konzentration. Die Folge ist ein verringerter Transport von Ca 2+ in den Extrazellularraum durch den Na +/Ca 2+ -Austauscher, welche unter physiologischen Bedingungen drei extrazelluläre Na + gegen ein intrazelluläres Ca 2+ austauscht. Es kommt zu einer gesteigerten elektro-magnetischen Kopplung und damit zu einer erhöhten Kontraktionskraft der Herzmuskulatur (positiv inotrope Wirkung) (Mutschler, 2001). Darüber hinaus verlangsamen Cardenolide die Schlagfrequenz des Herzens (negativ chronotrope Wirkung), erschweren die Erregungsleitung (negativ dromotrope Wirkung) und begünstigen durch Senkung der Reizschwelle eine heterotrope Erregungsbildung (positiv bathmotrope Wirkung). Letzteres kann unerwünschter Weise zu ventrikuläre Extrasystolen und unter Umständen zu Kammertachykardien führen. Den genutzten, günstigen Eigenschaften der Cardenolide, die diese Substanzen zu einer wertvollen Arzneistoffgruppe machen, steht die geringe therapeutische Breite als Nachteil gegenüber. Bereits beim Überscheiten der für den therapeutischen Effekt erforderlichen Dosis um das 1,5 bis 3fache können toxische Erscheinungen, wie Arrhythmien und Benommenheit auftreten. In schweren Fällen kann es unter anderem zu partiellem bis totalem AV-Block (Atrioventrikularblock) und Kammerflimmern mit Todesfolge kommen. Bei der Therapie mit Cardenoliden muss folglich die Dosierung individuell auf den Patienten abgestimmt, und dessen Plasmaspiegel sorgfältig überwacht werden. Von den Digitalis -Glykosiden stellen heute Digoxin, Digoxin-Derivate und Digitoxin die am meisten verordneten Cardenolide dar. Die pharmakologische Wirkung aller Cardenolide ist hierbei gleich, sie unterscheiden sich aber in ihrer Pharmakokinetik (Mutschler, 2001). Im Gegensatz zu anderen Arzneimittelgruppen werden Cardenolide aufgrund ihrer komplexen Struktur noch immer aus pflanzlichem Material isoliert oder partialsynthetisch aus isolierten Cardenoliden abgewandelt.
4 Einleitung
I.2.2.2 Strukturen der Cardenolide
Bei herzwirksamen Steroidglykosiden („Herzglykosiden“) handelt es sich allgemein um C 23 - oder C 24 -Steroide, welche über ihre alkoholische 3-Hydroxylgruppe in glykosidischer Bindung mit der zyklischen Halbacetalform eines Mono-, Di-, Tri-, Tetra- oder Pentasaccharidrestes verknüpft sind (Hänsel et al., 1999). Innerhalb des Steroidgerüsts sind die Ringe A/B/C/D, sofern keine Doppelbindung im A- oder B-Ring vorliegt, meist cis-trans- cis verknüpft.
Tabelle 3: Cardenolid-Aglyka der Digitalis - und Isoplexis -Arten.
O 21 O 18 23 12 20 22 O 18 O 19 11 13 17 H 16 19 9 14 15 11 12 1 10 C 2 10 8 1 D 17 H OH 8 OH 3 5 7 B 14 16 HO 4 6 5 A H HO Konfigurationsformel 3 Konformationsformel
Trivialname Position 5 Position 12 Position 16 Vorkommen Digitoxigenin –H –H –H Digitalis , Isoplexis Gitoxigenin –H –H –OH Digitalis, Isoplexis Digoxigenin –H –OH –H Digitalis Diginatigenin –H –OH –OH Digitalis Gitaloxigenin –H –H –OCHO Digitalis
Oleandrigenin –H –H –OCOCH 3 Digitalis Uzarigenin –H ( α) –H –H Isoplexis Canarigenin 4,5 . –H –H Isoplexis Xysmalogenin 5,6 –H –H Isoplexis
Nach Luckner und Wichtl, 2000. Substituenten in den verschiedenen Positionen sind, wenn nicht anders gekennzeichnet, β-ständig.
Des Weiteren weisen herzwirksame Steroidglykoside 2 β-ständige Hydroxylgruppen an Position C-3 und C-14, sowie einen β-ständigen Lactonring an Position C-17 auf (vgl. Tabelle 3). Je nach Größe dieses Lactonrings können die herzwirksamen Steroidglykoside in zwei
5 Einleitung
Gruppen eingeteilt werden: 1.) Cardenolide (C 23 -Steroide) mit einem α,β-ungesättigtem γ-
Lactonring. 2.) Bufadienolide (C 24-Steroide) mit einem α,β-γ,δ-doppelt ungesättigtem δ- Lactonring. Sowohl in der Gattung Digitalis , als auch in der Gattung Isoplexis konnten bisher nur Herzglykoside vom Cardenolidtyp nachgewiesen werden (Tabelle 3). Bisher sind etwa 500 Cardenolidglykoside bekannt, welche sich von über 70 Aglyka (Geninen) ableiten. In Digitalis wurden bisher nur 6 dieser Aglyka (Digitoxigenin, Gitoxigenin, Digoxigenin, Diginatigenin, Gitaloxigenin, Oleandrigenin), in Isoplexis 5 Aglyka (Digitoxigenin, Gitoxigenin, Uzarigenin, Canarigenin, Xysmalogenin) nachgewiesen (Tabelle 3). Von diesen Aglyka lassen sich alle in der jeweiligen Gattung enthaltenen Herzglykoside ableiten. Während in allen Digitalis -Arten ausschließlich 5 β-kofigurierte Cardenolide vorkommen, findet man in den drei Isoplexis -Arten I. canariensis , I. chalcantha und I. isabelliana 5 α- und 5 β-konfigurierte Cardenolide, sowie solche mit 4,5 - oder 5,6 - Doppelbindung (Gavidia et al., 2002b; Schaller und Kreis, 2006) (Tabelle 3). Interessant ist auch die Tatsache, dass das Vorkommen von Cardenoliden innerhalb der Gattung Isoplexis auf die Vertreter der Kanarischen Inseln beschränkt ist, während die auf Madeira endemische Art I. sceptrum keine Cardenolide enthält. Stattdessen findet man in dieser Isoplexis -Art zahlreiche Steroidsaponine (Freire et al., 1970). Gemeinsamkeiten und Unterschiede zwischen den beiden Gattungen Isoplexis und Digitalis zeigen sich auch bei den Zuckerkomponenten der enthaltenen Cardenolide.
CH HO HO 3 CH CH O 3 3 O O HO OH OH OH HO HO MeO OH OH OH
D-Glucomethylose D-Fucose D-Digitalose (Digitalis , Isoplexis ) = 6-Desoxygalactose = Fucose-3-methylether (Digitalis , Isoplexis ) (Digitalis , Isoplexis )
CH HO 3 CH O 3 CH OH O 3 O HO OH HO OH HO OH OH OH
D-Digitoxose D-Gulomethylose D-Canarose = 2,6-Didesoxyallose = 6-Desoxygulose = 2-Desoxy-D-rhamnose (Digitalis , Isoplexis ) (Isoplexis ) (Isoplexis )
Abbildung 1: Seltene Zuckerkomponenten der Herzglykoside aus Digitalis und Isoplexis .
6 Einleitung
In Digitalis und Isoplexis findet man hier neben bekannten und verbreiteten Hexosen und Pentosen, wie D-Glucose, L-Rhamnose, L-Arabinose und D-Xylose, sehr oft so genannte „seltene“ 6-Desoxy-, 2,6-Didesoxyhexosen und deren 3-Methylether, von denen einige nur in herzwirksamen Steroidglykosiden vorkommen (Hänsel et al., 1999; Luckner und Wichtl., 2000). Als Beispiele seien hier D-Fucose (6-Desoxygalactose) und D-Digitoxose (2,6- Didesoxyallose) genannt (vgl. Abbildung 1). Isoplexis -Glykoside können neben den in Digitalis -Glykosiden enthaltenen Zuckern zusätzlich D-Canarose (2-Desoxy-D-rhamnose) und D-Gulomethylose enthalten. In Abbildung 1 sind einige der seltenen Zuckerkomponenten der Herzglykoside aus Digitalis und Isoplexis dargestellt. Treten seltene Desoxyzucker und „normale“ Zucker, wie D-Glucose, nebeneinander in der Zuckerkomponente eines Cardenolids auf, so ist das Aglykon an den seltenen Zucker gebunden, während die D-Glucose den terminalen Baustein der Zuckerkette bildet. Glykoside, welche eine terminale D-Glucose aufweisen, werden als Primärglykoside bezeichnet, während glucosefreie Glykoside die so genannten Sekundärglykoside darstellen.
I.3 Die Cardenolid-Biosynthese Obwohl die Cardenolid-Biosynthese in Digitalis Forschungsobjekt zahlreicher Arbeitsgruppen war und noch bis heute ist, konnten bis dato nicht alle Schritte vollständig aufgeklärt werden. Der putative Biosyntheseweg wurde unter anderem durch Fütterungsexperimente mit radioaktiv markierten Vorstufen, sowie durch Reinigung von an der Biosynthese beteiligten Enzymen aus unterschiedlichen Digitalis -Spezies erstellt (Übersicht s. Kreis et al., 1998). Über die Cardenolid-Biosynthese in Isoplexis ist wenig bekannt, wobei man jedoch vermuten darf, dass sie ähnlich der in Digitalis abläuft (Schaller, 1998). In Abbildung 2 ist der postulierte Biosyntheseweg der Cardenolide in Digitalis dargestellt. Man nimmt an, dass im ersten Schritt Cholesterol, unter partieller Abspaltung der Seitenkette an Position C-17, durch das Side Chain Cleaving Enzyme = SCCE (Abbildung 2, Enzym [1]) zu Pregnenolon umgesetzt wird (Pilgrim, 1972). Neben Cholesterol kommen auch andere Phytosterole, wie Sitosterol, Campesterol oder Stigmasterol als Substrate des SCCE in Betracht (Lindemann und Luckner, 1997). Das entstandene Pregnenolon wird im Anschluss zu Progesteron umgesetzt. Hierzu sind formal zwei Reaktionen nötig: 1.) Die NAD-abhängige Oxidation der Hydroxylgruppe an Position C-3 zum Intermediärprodukt 5-Pregnen-3,20-dion (Isoprogesteron). 2.) Die
7 Einleitung
Isomerisierung der Doppelbindung, was der Umsetzung von 5-Pregnen-3,20-dion (Isoprogesteron) zu 4-Pregnen-3,20-dion (Progesteron) entspricht. Beide Schritte werden nach bisheriger Auffassung von einem Enzym, der 5-3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase/ 5- 4-Ketosteroid-Isomerase = 3 β-HSD (Abbildung 2, Enzym [2]) katalysiert (Seidel et al., 1990; Finsterbusch et al., 1999). Der Beweis der Bifunktionalität der 3 β-HSD steht allerdings noch aus (Finsterbusch et al., 1999; vgl. IV.2.3).
O O
[1] [2] [3]
HO HO O Cholesterol Pregnenolon Progesteron
O O O
[4] [5] [6] OH O HO HO H H H 5β-Pregnan-3,20-dion 5 β-Pregnan-3β-ol-20-on 5 β-Pregnan-3β,14 β-diol-20-on
OH O O O
H [7] OH H OH HO HO H H 5β-Pregnan-3β,14 β,21-triol-20-on Digitoxigenin
Abbildung 2: Postulierter Cardenolid-Biosyntheseweg in Digitalis .
Der nächste Schritt in der Cardenolid-Biosynthese ist die Umsetzung von Progesteron mittels der NADPH-abhängigen Progesteron-5β-Reduktase = 5 β-POR (Abbildung 2, Enzym [3]). Durch die 5 β-POR katalysierte, stereospezifische Reduktion der 4-Doppelbindung im Ring A des Steroidgerüsts kommt es zur cis -Verknüpfung der Ringe A und B, wobei Progesteron zu 5 β-Pregnan-3,20-dion umgesetzt wird (Gärtner et al., 1990 und 1994). Da alle
8 Einleitung in der Gattung Digitalis vorkommenden Cardenolide eine 5 β-Konfiguration aufweisen (vgl. Tabelle 3) kommt diesem Enzym eine Schlüsselrolle in deren Biosynthese zu. Die in D. lanata ebenfalls nachgewiesene NADPH-abhängige Progesteron-5α-Reduktase = 5 α-POR (Wendroth und Seitz, 1990; Grigat, 2006) scheint aufgrund der 5 β-Konfiguration aller Digitalis -Cardenolide nicht an deren Biosynthese beteiligt zu sein. Eine Isomerisierung von 5α- zu 5 β-Derivaten ist bisher nicht beschrieben (Kreis et al., 1998). Die 5 α-POR konnte auch in I. canariensis nachgewiesen werden (Schaller, 1998; Grigat, 2006). Da in der Gattung Isoplexis auch 5 α-konfigurierte Cardenolide vorkommen (vgl. Tabelle 3), ist eine Beteiligung der 5 α-POR an der Biosynthese der Isoplexis -Cardenolide möglich. Das Katalyseprodukt der 5 β-POR, 5 β-Pregnan-3,20-dion, kann im Folgenden von zwei stereospezifischen Enzymen zum 3 α- bzw. 3 β-Hydroxy-5β-Pregnan-20-on umgesetzt werden. Relevant ist hierbei die NADPH-abhängige 3 β-Hydroxysteroid-5β-Oxidoreduktase = 3β-HS-5β-OR (Abbildung 2, Enzym [4]), da sie die für die Digitalis - und Isoplexis - Cardenolid-Aglyka charakteristische β-konfigurierte Hydroxylgruppe an Position C-3 einführt (vgl. Tabelle 3). Das Enzym wurde bereits im Rohextrakt aus D. purpurea und D. lanata Blättern, bzw. Suspensionskulturen anhand seiner Enzymaktivität nachgewiesen und teil- charakterisiert (Gärtner und Seitz, 1993; Seitz und Gärtner, 1994; Stuhlemmer und Kreis, 1996a). Neuere Ergebnisse sprechen allerdings dafür, dass dieser Schritt der Cardenolid- Biosynthese ebenfalls durch die 3 β-HSD (Abbildung 2, Enzym [2]) katalysiert werden könnte (Finsterbusch et al., 1999; Lindemann und Luckner, 1997; Herl et al., 2006c). Die beiden Enzyme, welche vermutlich im Anschluss die Hydroxylierung des Pregnans an Position C-14 ( β-konfiguriert) (Abbildung 2, Enzym [5]) und C-21 (Abbildung 2, Enzym [6]) katalysieren, konnten bisher weder gereinigt, noch die entsprechende Enzymaktivität nachgewiesen werden (Kreis et al., 1998). Den vorerst letzten Schritt der Cardenolid-Biosynthese stellt die Bildung von Digitoxigenin aus 5 β-Pregnan-3β,14 β,21-triol-20-on dar. Die Umsetzung erfolgt hierbei in zwei Schritten: 1.) Die Anknüpfung von Malonyl-CoA an die C21-Hydroxylgruppe, was die Bildung eines Malonsäure-Hemiesters zur Folge hat. 2.) Der Ringschluss des Malonsäure- Hemiesters zum Butenolidring. Die erste Reaktion wird durch die Malonyl-Coenzym A:21- Hydroxypregnan-21-Hydroxy-Malonyltransferase = MHPMT (Abbildung 2, Enzym [7]) katalysiert (Stuhlemmer und Kreis, 1996b; Luber, 2002). Die anschließende Bildung des Butenolidrings aus dem Malonsäure-Hemiester findet wahrscheinlich spontan, unter
Abspaltung von CO 2 und H 2O statt (Stuhlemmer und Kreis, 1996b).
9 Einleitung
Mögliche Variationen in den Cardenolidstrukturen ergeben sich u.a. durch zusätzlich β-konfigurierte Hydroxylierungen an Position C-12 (Digoxigenin, Diginatigenin) und/oder Position C-16 (Gitoxigenin, Diginatigenin) (vgl. Tabelle 3), sowie durch die große Vielzahl an unterschiedlichen Zuckerketten, welche an die verschiedenen Genine glykosidisch gebunden werden können. Allein für D. lanata ergibt sich so eine Anzahl von über 70 unterschiedlichen Cardenolidglykosiden (Luckner und Wichtl, 2000).
10 Einleitung
I.4 Zielsetzung der Arbeit Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die an der Biosynthese der Cardenolide in Digitalis beteiligten Enzyme 5-3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase/ 5- 4-Ketosteroid-Isomerase = 3β-HSD (Abbildung 2, Enzym [2]) und Progesteron-5β-Reduktase = 5 β-POR (Abbildung 2, Enzym [3]) auf molekularer und proteinchemischer Ebene zu charakterisieren. Hierzu sollten folgende Methoden zur Anwendung kommen: • Klonierung der Gene, bzw. cDNAs der 3 β-HSD und 5 β-POR aus D. lanata • Southern-Blot-Analyse der 5 β-POR aus D. lanata • Heterologe Überexpression von 3 β-HSD und 5 β-POR ( D. lanata ) in E. coli • Charakterisierung der rekombinanten Enzyme Ein weiters Ziel dieser Arbeit bestand darin, die phylogenetische Beziehung der Digitalis - Arten untereinander, sowie zu den Isoplexis -Arten auf molekularer Ebene zu untersuchen. Zu diesem Zweck sollten folgende Methoden angewendet werden: • Klonierung der 3 β-HSD und 5 β-POR Gene aus allen Digitalis - und Isoplexis -Arten • Erstellung von Stammbäumen, basierend auf den erhaltenen Gen-, bzw. Protein- Sequenzen
11 Material und Methoden
II MATERIAL UND METHODEN II.1 Material II.1.1 Wasser, DEPC-Wasser Bidestilliertes Wasser wird mit Hilfe der Milli-Q-Anlage der Firma Millipore (Carrigtwohill, Irland) gewonnen und für proteinchemische Arbeiten direkt verwendet. Zur Herstellung von DEPC-Wasser wird bidestilliertes Wasser 2 h mit 0,1 % DEPC versetzt und anschließend autoklaviert. Es findet bei molekularbiologischen Arbeiten Verwendung.
II.1.2 Pflanzenmaterial Zur Isolierung von genomischer DNA und Gesamt-RNA für PCR und RT-PCR werden junge Blätter von Digitalis - und Isoplexis -Pflanzen der entsprechenden Spezies, bzw. Subspezies verwendet.
Tabelle 4: In der vorliegenden Arbeit verwendete Digitalis - und Isoplexis -Spezies, bzw. Subspezies. D. atlantica D. nervosa D. cariensis (subsp. cariensis) D. parviflora D. ciliata D. purpurea (subsp. purpurea) D. davisiana D. sibirica D. ferruginea (subsp. ferruginea) D. subalpina D. grandiflora D. thapsi D. laevigata (subsp. laevigata) D. viridiflora D. lanata (subsp. lanata) D. sibirica D. lutea (subsp. lutea) I. isabelliana D. mariana (subsp. heywoodii) I. canariensis D. minor (subsp. minor) I. chalcantha D. minor (subsp. dubia) I. sceptrum
D. sibirica = Hybrid von D. grandiflora x D. laevigata .
Die Pflanzen werden im Gewächshaus des Lehrstuhls für Pharmazeutische Biologie und im Botanischen Garten der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen kultiviert. Pflanzen einzelner Spezies werden von Prof. Dr. M. Petersen und Prof. Dr. V. Melzheimer (Universität Marburg), Prof. Dr. A. Graner (Genbank Gatersleben), Prof. Dr. J. Segura (Universität Valencia, Spanien) sowie von Prof. Dr. G. Heubl (LMU München), zur Verfügung gestellt.
12 Material und Methoden
II.1.3 Lösungen II.1.3.1 Lösungen für mikrobiologische Arbeiten IPTG-Stammlösung (1 M) 238,30 mg IPTG werden zu 1 mL mit autoklavierten, bidestillierten Wasser gelöst und in Aliquots von je 100 L bei -20 °C bis zur Verwendung eingefroren.
Ampicillin-Stammlösung (100 mg/mL) 100 mg Ampicillin-Natriumsalz werden in 1 mL autoklavierten bidestillierten Wasser gelöst, sterilfiltriert (0,45 m CM Membranfilter) und bis zur Verwendung bei 4 °C aufbewahrt.
Kanamycin-Stammlösung (25 mg/mL) 100 mg Kanamycin-Sulfat werden in 1 mL autoklavierten bidestillierten Wasser gelöst, sterilfiltriert und bis zur Verwendung bei 4 °C aufbewahrt.
Methionin-Stammlösung (0,3 M) 44,8 mg L(-)-Methionin werden in 1 mL autoklavierten bidestillierten Wasser gelöst, sterilfiltriert und bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert.
Aminosäuren-Stammlösung (10 mg/mL) Je 2,5 mg jeder Aminosäure (L-Typ), ausgenommen Methionin, werden in 1 mL autoklavierten bidestillierten Wasser gelöst, sterilfiltriert und bis zum Gebrauch bei 4 °C gelagert.
Biotin-Thiamin-Stammlösung (10 g/mL) Je 10 g D(+)-Biotin und Thiamin-Dichlorid werden in 1 mL alkalisierten Wasser (pH 9) gelöst und anschließend sterilfiltriert. Bis zu ihrer Verwendung wird die Stammlösung bei 4 °C aufbewahrt.
13 Material und Methoden
II.1.3.2 Lösungen für die Southern-Blot-Analyse Denaturierungslösung Prähybridisierungslösung NaOH 0,5 M SDS 0,1 % NaCl 1,5 M SSC 5 x Natriumphosphat, pH 6,8 50 mM Neutralisierungslösung Natriumpyrophosphat 0,1 % Tris/HCl 0,5 M Denhardt`s Reagenz 5 x NaCl 1,5 M Heringssperma DNA 50 g/mL pH 7,0 Formamid 50 %
Hybridisierungslösung 50 x Denhardt`s Reagenz Prähybridisierungslösung 15 mL Ficoll 400 1 % radioaktiv markierte Sonde 150 L BSA 1 % PVP 1 %
II.1.3.3 Lösungen für die Silberfärbung von Protein-Gelen Fixierer Silbernitratlösung Ethanol 400 mL Silbernitrat 500 mg
Eisessig 70 mL H2O bd ab 1000 mL
H2O bd ad 1000 mL (Vor Verwendung 20 L Formaldeyhd 37 % pro 50 mL Silbernitratlösung zugeben)
Sensitivierer Entwickler Ethanol 300 mL Natriumcarbonat 25,0 g
Natriumthiosulfat 2,0 g H2O bd ad 1000 mL Natriumacetat 68,0 g (Vor Verwendung 10 L Formaldehyd 37 %
H2O bd ad 1000 mL pro 50 mL Silbernitratlösung zugeben) (Vor Verwendung 250 L Glutaraldeyhd pro 50 mL Sensitivierer zugeben)
Stopplösung EDTA 14,6 g
H2O bd ad 1000 mL
14 Material und Methoden
II.1.3.4 Lösungen für die DC-Analytik Fliesmittel I (FM I) Fliesmittel II (FM II) Dichlormethan 8 VT Dichlormethan 8 VT Ethylacetat 2 VT Acetonitril 2 VT
Fliesmittel III (FM III) Fliesmittel IV (FM IV) Trichlormethan 80 VT Dichlormethan 9,6 VT Methanol 18 VT Ethylacetat 1,3 VT
H2O bd 2 VT Methanol 1,1 VT
Anisaldeyd-RL (Jork, 1990) Jensen-Kny-RL (Jork, 1990) Anisaldehyd 2,5 mL Wässrige 3 %ige Chloramin T 2 VT Eisessig 50 mL Ethanolische 25 %ige TCA 8 VT Methanol 425 mL Schwefelsäure 25 mL
II.1.4 Medien Alle Medien werden nach der Herstellung auf pH 7.0 eingestellt, autoklaviert und vor der Verwendung gegebenenfalls mit der entsprechenden Menge Antibiotikum versetzt. LB-Medium Minimal-Medium (Budisa et al., 1995)
Trypton 1,0 % (NH 4)SO 4 7,5 mM Hefeextrakt 0,5 % NaCl 8,5 mM
NaCl 1,0 % KH 2PO 4 22 mM
K2HPO 4 47,6 mM LB-Agar MgSO4 1 mM Trypton 1,0 % Glucose 20 mM Hefeextrakt 0,5 % Ca 2+ 1 g/L NaCl 1,0 % Fe 2+* 1 g/L Agar 1,5 % Aminosäuren * 50 mg/L Thiamin * 10 g/L Biotin * 10 g/L Ampicillin * 100 mg/L (* Zugabe nach dem Autoklavieren)
15 Material und Methoden
SOC-Medium Trypton 2 % Hefeextrakt 0,5 % NaCl 10 mM KCl 2,5 mM
MgSO 4 10 mM Glucose 20 mM
II.1.5 Puffer II.1.5.1 Puffer für molekularbioloische Arbeiten TFB 1 Puffer TFB 2 Puffer RbCl 100 mM MOPS 10 mM
Mn Cl 2 50 mM RbCl 10 mM
Kaliumacetat 30 mM CaCl 2 75 mM
CaCl 2 10 mM Glycerol 15 % Glycerol 15 % pH 6,8 pH 5,8
TE-Puffer 50 x TAE-Puffer Tris/HCl 10 mM Tris/HCl 2,0 M EDTA 0,5 mM Natriumacetat 1,0 M pH 8,0 EDTA 50 mM pH 7,5
1 x TAE-Puffer 20 x SSC-Puffer 50 x TAE-Puffer 20 mL NaCl 3 M
H2O bd 980 mL Natriumcitrat 0,3 M pH 7,0
10 x DNA-Stopppuffer Glycerol 50 % Bromphenolblau 0,1 %
16 Material und Methoden
II.1.5.2 Puffer für proteinchemische Arbeiten Puffer für denaturierende His-tag-Reinigung („The QIAexpressionist“, Version 2003) Denaturierender Lysepuffer B Denaturierender Elutionspuffer D
NaH 2PO 4 100 mM NaH 2PO 4 100 mM Tris/HCl 10 mM Tris/HCl 10 mM Harnstoff 8 M Harnstoff 8 M pH 8,0 pH 4,5
Denaturierender Waschpuffer
NaH 2PO 4 100 mM Tris/HCl 10 mM Harnstoff 8 M pH 6,3
Puffer für native His-tag-Reinigung („The QIAexpressionist “, Version 2003) Nativer Lysepuffer Nativer Elutionspuffer
NaH 2PO 4 50 mM NaH 2PO 4 50 mM NaCl 300 mM NaCl 300 mM Imidazol 10 mM Imidazol 250 mM pH 8,0 pH 8,0
Nativer Waschpuffer
NaH 2PO 4 50 mM NaCl 300 mM Imidazol 20 mM pH 8,0
Puffer für SDS-PAGE 4 x Trenngelpuffer 4 x Sammelgelpuffer Tris/HCl, pH 8,8 1,5 M Tris/HCl, pH 6,8 0,5 M SDS 20 % 20 mL SDS 20 % 10 mL
H2O bd ad 1000 mL H2O bd ad 1000 mL
17 Material und Methoden
5 x SDS-Probenpuffer Elektrophoresepuffer SDS Tris/HCl, pH 6,8 225 mM Tris 3,0 g Glycerol 50 % Glycin 14,4 g SDS 5 % 10 % SDS 10 mL
Bromphenolblau 0,05 % H2O bd ad 1000 mL DTT 250 mM
Puffer für IEF IEF-Probenpuffer Kathodenpuffer Bromphenolblau 0,03 % o-Phosphorsäure 2,5 mM Glycerol 50 % Vor Verwendung entgasen
Anodenpuffer NaOH 50 mM Vor Verwendung entgasen
Puffer für Protein-Assays 5β-POR-Assaypuffer 3β-HSD-Assaypuffer (nach Gärtner et al., 1990) (nach Finsterbusch et al., 1999) HEPES-KOH, pH 8,0 100 mM NaPi, 7,8 20 mM Saccharose 250 mM Saccharose 250 mM EDTA 2 mM Natriumascorbat 10 mM β-Mercaptoethanol 10 mM
Puffer für Bestimmung des pH-Optimums Clark and Lubs solution, pH 6,0 – 8,0 Glycin-NaOH Puffer 9,0 – 10,5
KH 2PO 4 0,1 mM Glycin 0,1 mM NaOH 0,1 mM NaOH 0,1 mM
TRIS-HCl, pH 8,0 – 9,0 TRIS 0,1 mM HCl 0,1 mM
18 Material und Methoden
II.1.6 Oligodesoxyribonukleotide (Primer) Verwendete Oligodesoxyribonukleotide leiten sich von der von Gavidia und Seitz (2001) im Internet veröffentlichten Sequenz der 5 β-POR aus D. purpurea (www.pubmed.com; Acc.-Nr.: AJ310673), bzw. der 3 β-HSD aus D. lanata (www.pubmed.com; Acc.-Nr.: AJ345026; Finsterbusch et al., 1999) ab. Hierzu werden folgende im Internet zugänglichen Programme verwendet: - http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi - http://genome-www2.stanford.edu/cgi-bin/SGD/web-primer - http://alces.med.umn.edu/rawprimer.html Ausgewählte Primer werden von der Firma Eurogentec s.a. (Seraing, Belgien) bezogen, zu einer Endkonzentration von 100 M in bidestillierten, autoklavierten Wasser gelöst und bei 4 °C gelagert.
Tabelle 5: Verwendete Oligodesoxyribonukleotide (Primer).
Anwendung Bezeichnung Sequenz 5’- 3’ TM (RT-)PCR VH07bdir AAAAAATGAGCTGGTGGTGG 58 °C VH24dir TGGGCTGGAGCGATCG 54 °C HSDdira ATGTCGTCAAGCCAAGGT 56 °C HSDdirb GAHACHHCAAGATTGTTCG 58 °C HSDdirc ATGTCGTCAAAGCCAAGGTT 58 °C VH1148rev AATCCAAGAAATGAACGCAT 54 °C VH1162rev GCTTTTGCCTTGTCAATCC 56 °C VH1188rev AACCATGTCAAGGAACAATC 56 °C HSDrev CTAACGCACGACGGTGAA 56 °C Expression PORsphdir ATATGCATGCAAAAGGTTGGAAGAAGATGAC 86 °C HSDsphdir TATAGCATGCATGTCGTCAAAGCCAAGGT 84 °C PORsalrev TATAGTCGACAACCATGTCAAGGAACAATC 84 °C HSDkpnrev TATAGGTACCTAACGCACGACGGTGAAG 84 °C
A = Adenin, C = Cytosin, G = Guanin, T = Thymin
19 Material und Methoden
II.1.7 Plasmide Alle verwendeten und konstruierten Plasmide werden bei -20 °C in TE-Puffer gelagert. pCR ®2.1-TOPO ® Verwendung für Subklonierung (Invitrogen) pQE 30, pQE 31, pQE 32 Verwendung für Überexpression (Qiagen)
II.1.8 Escherichia coli -Stämme Die Stämme werden in LB-Medium mit 50 % Glycerol bei -80 °C gelagert. • One Shot ® TOP10 F- mcr A (mrr-hsd RMS-mcr BC) Φ80 lac Z M15 lac X74 rec A1 ara D139 (ara-leu )7697 gal U gal K rps L (Str R) end A1 nup G (Invitrogen) Verwendung für Subklonierung • M15[pREP4] Nal S, Str S, Rif S, Thi -, Lac -, Ara +, Gal +,Mtl -,F -,RecA +, Uvr +, Lon +, (Kan R) (Qiagen) Verwendung für heterologe Überexpression - - • B834(DE3) F- ompT hsdS B (r B m B ) gal dcm met (DE3) Verwendung für heterologe Überexpression von Selenomethionin-Proteinen
II.1.9 Geräte Analysenwaagen BP 3105 Sartorius, Göttingen Delta Range, AE166 Mettler Waagen, Bad Homburg 440-33N Kern & Sohn GmbH, Balingen-Frommern Autoklaven Autoklav TYP 23 Melag, Berlin 5075 ELVC Systec GmbH, Wettenberg Brutschrank B 5050 E Heraeus Instruments, Hanau DC-Kammer Desaga, Heidelberg DC-Tauchkammer Desage, Heidelberg DC Workstation CAB UVIS; VD mit Desaga GmbH, Heidelberg Kamera IVC TK 1360 B
20 Material und Methoden
DNA-Elektrophorese Phero-sub 1 Kammer Biometra, Göttingen Gelapparatur Biotec-Fischer GmbH, Reiskirchen Spannungsgerät Müszeripari Müvek, Esztergom, Ungarn GC HP 6890 MSD Type 5972A Hewlett-Packard-GmbH, Böblingen HP Optima 5 Column Hewlett-Packard-GmbH, Böblingen 30 m x 25 mm x 0.25µm Heizblock Stuart Scientiffic Bibby Sterlin LTD, Stone, Staffordshire, U.K. HPLC 2487 Dual λ Absorbance Detector Waters Corporation, Milford Massachusetts, USA 1525 Binary HPLC Pump Waters Corporation, Milford Massachusetts, USA 717plus Autosampler Waters Corporation, Milford Massachusetts, USA ® Symmetry C 18 5 m, Waters Corporation, Milford Massachusetts, USA 4,6 x 150 mm Column Hybridisierungsofen Herahybrid 6 Heraeus Holding GmbH, Hanau Inkubator G24 enviromental incubator New Brunswick, NJ, USA shaker Magnetrührer REC-G Janke & Kunkel GmbH & Co.KG, Staufen REC Janke & Kunkel GmbH & Co.KG, Staufen Microprocessor pH-Meter pH 537 Wissenschaftlich Technische Werkstätten, Weilheim Milli-Q Gradient A10 Millipore Corporate Headquaters, Billerica, MA, USA Phosphoimager Fuji Imagin Plates Fujifilm Photo Film Europe GmnH, Düsseldorf Fuji BAS-1500 mit Imageplates Fujifilm Photo Film Europe GmnH, Düsseldorf BAS IIIS Photometer GeneQuant pro Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg Pipetten Pipetman 20, 200, 1000 Gilson, Middleton, USA Finnpipette Digital 0,5-10 L Thermo Labsystems, Vantaa, Finnland Finnpipette Digital 5-40 L Thermo Labsystems, Vantaa, Finnland Finnpipette Digital 40-200 L Thermo Labsystems, Vantaa, Finnland
21 Material und Methoden
Protein-Elektrophorese PowerPack 300 Powersupply BioRad, München Mini-PROTEAN ® 3 Cell BioRad, München PROTEAN ® IEF-Zelle BioRad, München Schüttler Beheizbarere Schüttler Infors AG, Bottmaringen, Schweiz Gyrotory ® Water Bath Shaker New Brunswick, NJ, USA Speed-Vac Plus SC 110 A Savant Instruments, Inc. Holbrook, USA Sterilbank Meissner & Wurst, Stuttgart Szintilationszähler Tri-Carb 2100 TR PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Inc., Bostson, USA Thermocycler Personal Cycler Biometra, Göttingen T3 Thermocycler Biometra, Göttingen Thermomixer compact Eppendorf, Hamburg Ultraschallbad Sonorex Bandelin, Berlin Ultraschall-Homogenisator Sonoplus Bandelin, Berlin HD 2070 UV Stratalinker BLX-254 Vilber Lourmat, Torcy Z.I.Sud, France X-Ray Film Processor Protec Optimax Maco x-ray company, Salzburg, Österreich Zentrifugen Biofuge Fresco Heraeus GmbH, München Biofuge 13 Heraeus GmbH, München Kühlzentrifuge Sorvall RC 5B Plus Kendro, München Laborfuge 400 R Heraeus GmbH, München
II.1.10 Chemikalien [α-32 P] dCTP Amersham Biosciences Europe 21-O-Malonyldesoxycorticosteron LS Pharm. Bio., FAU, Erlangen 30 % Bis-Acrylamidlösung Applichem, Darmstadt Acetonitril LiChrosolv ® Merck, Darmstadt Agarose NEEO Ultra-Qualität Carl Roth GmbH, Karlsruhe Aminosäuren Merck, Darmstadt Canarigenin LS Pharm. Bio., FAU, Erlangen
22 Material und Methoden
Canarigenin-digitoxosid LS Pharm. Bio., FAU, Erlangen Canarigenon LS Pharm. Bio., FAU, Erlangen Digitoxigenin Roche, Mannheim Digitoxigenon LS Pharm. Bio., FAU, Erlangen DNA-Marker SmartLadder Eurogentec, Seraing, B Ethidiumbromid Carl Roth GmbH, Karlsruhe Ficoll 400 Sigma, Taufkirchen Formamid Sigma, Taufkirchen Glucose-6-Phosphat Boehringer, Mannheim Glucose-6-Phosphat-dehydrogenase Sigma, Taufkirchen Glycin Applichem, Darmstadt Heringssperma DNA Biomol, Hamburg IEF-Standartd 161-0310 BioRad, München IPTG Applichem, Darmstadt Isoprogesteron LS Pharm. Bio., FAU, Erlangen (Meitinger 2006) Methanol Rotipuran ® Carl Roth GmbH, Karlsruhe
MnCl 2 Merck, Darmstadt NAD Boehringer, Mannheim NADP Applichem, Darmstadt Natrium-EDTA Applichem, Darmstadt Natriumpyrophosphat Carl Roth GmbH, Karlsruhe Oligonukleotide Eurogentec, Seraing, B Pregnan- und Androsten-Derivate Steraloids Inc., Newport R.I.,USA Proteinmarker Precision (Plus) Protein TM Standarts BioRad, München RbCl Prolabo, Paris, F Selenomethionin Acros Organics, Geel, B Tris/HCl Sigma, Taufkirchen Trypton Applichem, Darmstadt β-Mercaptoethanol VWR, Darmstadt
Alle anderen Chemikalien werden in p.A.-Qualität von VWR (Darmstadt) oder Sigma (Taufkirchen) bezogen.
23 Material und Methoden
II.1.11 Kits und Enzyme E.Z.N.A. ® Plant DNA Mini Kit Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen E.Z.N.A. ® Plant RNA Kit Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen E.Z.N.A. ® Plasmid Miniprep Kit I (Classic-Line) Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen Oligotex ® mRNA Mini Kit Qiagen GmbH, Hilden QIAEX ® II Gel Extraction Kit Qiagen GmbH, Hilden QIAexpress ® Type IV Kit Qiagen GmbH, Hilden QIAquick ® PCR Purification Kit Qiagen GmbH, Hilden SAWADY Taq-DNA-Polymerase Kit Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen SuperScript TM III First-Strand Synthesis for Invitrogen, Karlsruhe RT-PCR TOPO TA Cloning ® Invitrogen, Karlsruhe
Alle bei molekularbiologischen Arbeiten verwendeten Enzyme werden von der Firma Promega (Mannheim) bezogen.
II.1.12 Verbrauchsmaterialen Amicon Ultra 10000 MWCO (Ultracell TM ) Millipore, Carrigtwohill, Irland Criterion TM IEF Gels pH 3 – 10 BioRad, München
DC-Aluminium Platten, Kieselgel 60 F 254 Merck, Darmstadt Einmal-Mikropipetten mit Ringmarke Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co. (1,2,3,4,5 L) KG Eberstadt Hybond TM -N+ Membran Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg Kodak X-Omat AR Film XAR-5 Kodak GmbH, Stuttgart PD-10 Columns (Sephadex TM G-25M) Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg Petrischalen, steril, ∅ 8,5 cm Greiner GmbH, Frickenhausen Skalpelle zum Einmalgebrauch No10 Feather Safty Razor Co., LTD, Japan Spritzenvorsatzfilter, steril, 0,45 m Membran Merck Labor, Bruchsal Zellglas Bringmann GmbH & Co., Wendelstein
Alle verwendeten Plastik-Verbrauchsmittel (Spitzen, Eppendorfgefäße, Zentrifugenröhrchen, UV-Küvetten u.v.m.) werden von der Firma Sarstedt (Nümbrecht) bezogen.
24 Material und Methoden
II.2 Methoden II.2.1 Isolierung genomischer DNA Zur Isolierung genomischer DNA wird der E.Z.N.A. ® Plant DNA Mini Kit (Peqlab) verwendet. Hierzu wird das Pflanzenmaterial mit flüssigem Stickstoff schock-gefroren und mittels Mörser und Pistill zu einem feinen Pulver zerrieben. Jeweils 200 mg gefrorenes Gewebe werden mit 600 L P1-Puffer und 10 L β-Mercaptoethanol durch Vortexen gemischt und analog der Arbeitsanleitung B des E.Z.N.A. ® Plant DNA Mini Kit (E.Z.N.A.® Plant DNA Isolation Protocol, Version 02.05) aufgearbeitet. Es wird mit 50 L bidestillierten, autoklavierten Wasser eluiert und die aliquotierte DNA bis zur weiteren Bearbeitung bei -80 °C gelagert.
II.2.2 Isolierung Gesamt-RNA Gesamt-RNA wird mit dem E.Z.N.A. ® Plant RNA Kit (Peqlab) isoliert. Das Pflanzenmaterial wird mit flüssigem Stickstoff schock-gefroren, mittels Mörser und Pistill zu einem feinem Pulver zerrieben und zu jeweils 200 g mit 600 L komplettierten RPL-Puffer durch Vortexen gemischt. Die Probenaufarbeitung erfolgt analog der Arbeitsanleitung der Firma Peqlab (E.Z.N.A.® Plant RNA Isolation Protocol, Version 04.03), wobei bei allen Arbeitsschritten die Kontamination durch RNasen zu vermeiden ist. Zur Elution der Gesamt-RNA werden 50 L bidestilliertes, autoklaviertes DEPC-Wasser verwendet. Dieses sollte vor der Elution auf 70 °C erwärmt werden um die RNA-Ausbeute zu erhöhen. Die so isolierte Gesamt-RNA wird aliquotiert und bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C aufbewahrt.
II.2.3 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren Die Konzentration der Nukleinsäuren wird photometrisch am GeneQuant pro (Amersham
Biosciences) bei 260 nm bestimmt. Einer A 260 -Einheit wird dabei einer Konzentration von 40 g RNA bzw. 50 g DNA pro mL gleichgesetzt. Als Maß für die Reinheit der jeweiligen
Präparation wird der Proteinindex P i (A 260 /A 280 ) bestimmt.
II.2.4 Aufreinigung von mRNA mRNA wird aus Gesamt-RNA durch Affinitäts-Chromatographie an Oligo-(dT)-Latex- Partikel aufgereinigt. Dafür kommt der Oligotex ® mRNA Mini Kit (Qiagen) zur Anwendung. Es werden pro Aufarbeitung nach dem Oligotex Batch Protokoll (1997) je 500 g Gesamt- RNA zur Aufreinigung herangezogen. Die so gewonnene mRNA wird bis zur weiteren Bearbeitung bei -80 °C gelagert.
25 Material und Methoden
II.2.5 cDNA-Synthese cDNA wird aus mRNA mittels des SuperScript TM III First-Strand Synthesis for RT-PCR Kit
(Invitrogen) unter Verwendung eines Oligo(dT) 15 -Pimers (Promega) generiert. Die Reaktion wird im T3 Thermocycler (Biometra) nach folgendem Schema durchgeführt:
1. Reaktionsansatz mRNA 0,5 g
Oligo(dT) 15 -Pimer 50 M dNTP-Mix 250 M je Nukleotid DEPC-Wasser ad 10 L 2. Inkubation 65 °C 5 min 3. Inkubation Eis 1 min 4. Zugabe von RT-Puffer (10 x) 1 x
MgCl 2 5 mM DTT 10 mM RNaseOUT TM 40 U SuperSkript TM III RT 200 U (Endvolumen 20 L) 5. Inkubation 50 °C 50 min 6. Abstoppen der Reaktion 85 °C 5 min 7. Zugabe von E. coli RNase H 2 U 8. Inkubation 37 °C 20 min
Die generierte cDNA wird bis zu Verwendung bei -20 °C gelagert.
26 Material und Methoden
II.2.6 PCR/RT-PCR PCR und RT-PCR werden nach Williams und Tsang (1991) durchgeführt. Dabei kommt der SAWADY Taq-DNA-Polymerase Kit (Peqlab) zum Einsatz. Jeder 50 L PCR- bzw. RT- PCR-Ansatz enthält:
Reaktionspuffer S (10 x) 1 x dNTP-Mix 500 M je Nukleotid Sense- und Antisense-Primer jeweils 1 M DNA bzw. cDNA 0,1 g
MgCl 2 0,5 mM SAWADY Taq-DNA-Polymerase 2.5 U
H2O bd ad 50 L
Der Reaktionsansatz wird kurz zentrifugiert und entweder im Personal Cycler (Biometra) oder T3 Thermocycler (Biometra) amplifiziert. Das PCR-Programm besteht aus folgenden Schritten:
1. Initiale Denaturierung 95 °C 3 min 2. Zyklen 31 x Denaturierung 95 °C 1 min Primeranlagerung X °C 1 min Kettenverlängerung 72 °C 2 min 3. Finale Kettenverlängerung 72 °C 5 min 4. Lagerung 4 °C
Die Temperatur der Primeranlagerung (Annealing-Temperatur) wird den jeweils verwendeten Primerpaaren angepasst (vgl. Tabelle 5).
II.2.7 Trennung und Nachweis von DNA mittels Agarosegelen Die Trennung und der Nachweis von amplifizierter DNA erfolgt über Agarose- Gelelektrophorese. Hierzu werden, abhängig von den zu erwartenden Fragmentlängen, 0,8 bis
2-%ige Agarosegele verwendet. Die entsprechende Menge Agarose wird zu 50 g in H 2O bd suspendiert und in der Mikrowelle bis zur klaren Lösung geschmolzen. Der auf etwa 60 °C abgekühlten Lösung wird 1 mL 50 x TAE-Puffer (Endkonzentration 1 x TAE) zugesetzt und
27 Material und Methoden das Gel gegossen. Nach dem Auspolymerisieren des Agarosegels werden die mit 0,1 VT 10 x DNA-Stopppuffer versetzten DNA-Proben in die Geltaschen aufgetragen. Als Marker wird, falls nicht anders beschrieben, 5 L DNA-Marker SmartLadder (Eurogentec) verwendet. Die Elektrophorese erfolgt in 1 x TAE und wird bei 40 mA durchgeführt. Nach Beendigung der Elektrophorese wird das Gel für 15 min in eine 0,1-%ige Ethidiumbromid-Lösung gegeben und anschließend unter UV 305-Licht ausgewertet, bzw. die relevanten DNA-Banden für eine nachfolgenden Extraktion ausgeschnitten.
II.2.8 Isolierung von DNA aus Agarosegelen
Mit Ethidiumbromid interkallatierte DNA-Banden werden unter UV 365 -Licht mit einem Skalpell aus dem Agarosegel geschnitten. Für die Extraktion der DNA aus der Agarose wird der QIAEX ® II Gel Extraction Kit (Qiagen) verwendet. Für eine höhere Konzentration der extrahierten DNA wird, abweichend der Arbeitsanleitung (QIAEX II Agarose Gel Extraction
Protocol, Version 1999. Version 1999), mit 10 L H 2O bd eluiert.
II.2.9 Aufreinigung von DNA Die Aufreinigung von amplifizierter DNA aus PCR-Ansätzen oder geschnittenen DNA- und Vektor-Fragmenten aus Restriktionsansätzen wird mit dem QIAquick ® PCR Purification Kit (Qiagen) durchgeführt. Diese Vorgehensweise eignet sich zum raschen Reinigen von DNA- Stücken zwischen 100 bp und 10 kb. Es wird nach den Vorschriften des Herstellers verfahren (QIAquick® Spin Handbook, Version 1997) und abhängig von nachfolgender Verwendung mit 10 L bis 50 L H 2O bd eluiert.
II.2.10 Subklonierung und Sequenzierung von PCR-Produkten II.2.10.1 Klonierung von PCR-Produkten Zur Klonierung von PCR- bzw. RT-PCR-Produkten wird der TOPO TA Cloning ® Kit (Invitrogen) mit dem Klonierungsvektor pCR ®2.1-TOPO ® (3,9 kb) verwendet. Es wird nach dem Protokoll des Herstellers (TOPO TA Cloning® Instruction Manual, Version R) unter Verwendung von 4 L frischen, gereinigten PCR-Produktes pro 10 L Ligationsansatz, verfahren. Die transformierten One Shot TOP10 Zellen (Invitrogen), welche vom Hersteller kompetent bezogen werden, werden auf Ampicillin-haltigen LB-Agarplatten (100 g Ampicillin/mL LB-Agar) ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Am nächsten Tag werden einzelne Kolonien gepickt und in jeweils 2 mL LB-Medium (100 g Ampicillin/mL
28 Material und Methoden
LB-Medium) über Nacht bei 37 °C, 115 Upm kultiviert. Diese Übernachtkulturen dienen zur Plasmidisolierung und einer nachfolgenden Anlage von Glycerolstocks.
II.2.10.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus transformierten Bakterienzellen Die Plasmid-Isolierung aus transformierten E. coli Zellen erfolgt mit dem E.Z.N.A. ® Plasmid Miniprep Kit I (Classic-Line; Peqlab). Hierzu werden je 1,5 mL Übernachtkultur pro Ansatz aufgearbeitet, wobei nach der Arbeitsvorschrift der Firma Peqlab (E.Z.N.A.® Plasmid Miniprep Kit I Protocol; B. Low copy-number plasmids, Version 09.05) verfahren wird. Es wird mit 50 L H 2O bd eluiert und die so aufgereinigte Plasmid-DNA bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert.
II.2.10.3 Restriktion von Plasmiden Der Verdau von Plasmiden mittels der Restriktionsendonuklease Eco RI und anschließender Agarose-Gelelektrophorese dient der Überprüfung einer erfolgreichen Insertion und der Größenkontrolle eingebauter Fragmente in den Klonierungsvektor. Jeder Eco RI- Restriktionsansatz enthält:
Plasmid-DNA 3 L 10 x Puffer H (Promega) 1 L Eco RI (12 U/ L) 1 L
H2O ad 10 L
Der Verdau wird 1 h bei 37 °C im Thermoblock durchgeführt, anschließend mit 0,1 VT 10 x DNA-Stopppuffer versetzt und mittels Agarose-Gelektrophorese (vgl. II.2.7) analysiert.
II.2.10.4 DNA-Sequenzierung Von Plasmiden mit erfolgreich eingebauten Fragmenten der entsprechenden Größe werden 2 mal je 15 L Plasmid-DNA zur Trockene gebracht und zur Sequenzierung an die Firma MWG-Biotech (Martinsried) geschickt.
II.2.10.5 Anlegen von Glycerolstocks Von flüssigen Bakterienkulturen mit erfolgreich insertierten Vektoren werden Glycerolstocks als Erhaltungskulturen angelegt. Hierzu werden 500 L Bakteriensuspension mit 500 L Glycerol vorsichtig gemischt und bis zur weitern Verwendung bei -80 °C gelagert.
29 Material und Methoden
II.2.11 Phylogenetische Analytik Die Phylogramme werden von Herrn priv. Doz. Dr. V. A. R. Huss (Lehrstuhl für molekulare Pflanzenphysiologie, FAU Erlangen) erstellt. Hierzu wird mit den Intron-freien Gen- Sequenzen ein Alignment durchgeführt. Von diesem werden Phylogramme mittels der Neighbor-Joining (NJ), der Maximum Parsimony (MP) und der Maximum Likelihood (ML) Methode abgeleitet. Bei allen Methoden wird eine Bootstrap-Analyse (Felsenstein, 1985) mit 1000 (NJ, MP), bzw. 100 (ML) Wiederholungen durchgeführt (PAUP Programm, Version 4.0b8a; Swofford, 2002). Die Parameter des NJ, MP und ML werden wie bei Huss et al. (2002) beschrieben, gewählt.
II.2.12 Southern-Blot-Analyse Bei der Technik nach Southern (1975) werden DNA Fragmente, welche z.B. durch Verdau mittels Restriktionsendonukleasen entstanden sind, zunächst nach ihrem Molekulargewicht im Agarosegel elektrophoretisch getrennt, hiernach auf einen Filter, bzw. eine Membran transferiert, fixiert und im Anschluss hybridisiert.
II.2.12.1 Restriktion genomischer DNA Die Restriktion genomischer DNA für die Southern-Blot-Analyse wird mit den Restriktionsendonukleasen Eco RI, Bam HI und Hind III durchgeführt. Jeder Ansatz setzt sich wie folgt zusammen:
DNA, genomisch 30 g 10 x Puffer (Promega) 20 L ( Eco RI → Puffer H) ( Bam HI; Hind III → Puffer E) Restriktionsendonuklease (10 U/ L) 10 L
H2O bd ad 200 L
Die Ansätze werden über Nacht bei 37 °C inkubiert, danach zusätzlich mit 4 L der jeweiligen Restriktionsendonuklease (10 U/ L) versetzt und nochmals für 1 h bei 37 °C inkubiert. Anschließend wird die DNA durch Zugabe von 0,1 VT 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 3,0 VT 96 % Ethanol für 1 h bei -80 °C gefällt. Durch Zentrifugation (13000 x g, 5 min, 4 °C) wird die DNA abgetrennt. Der Überstand wird abgegossen, die DNA mit 100 L 70 % Ethanol gewaschen und durch erneute Zentrifugation (13000 x g, 5 min, 4 °C)
30 Material und Methoden abgetrennt. Die DNA wird kurz an der Luft getrocknet und in jeweils 20 L TE-Puffer (pH 8,0) gelöst.
II.2.12.2 Elektrophoretische Trennung von genomischer DNA im Agarosegel Zu jedem Ansatz geschnittener, gefällter und gereinigter DNA (20 L) werden 2 L 10 x DNA-Stopppuffer gegeben und mit den so erhaltenen Proben ein 0,8-%iges Agarosegel (vgl. II.2.7) beladen. Die elektrophoretische Trennung der DNA erfolgt in drei Schritten:
0 cm – 1,5 cm Laufstrecke 10 mA 1,5 cm – 2,5 cm Laufstrecke 20 mA 2,5 cm – 7,0 cm Laufstrecke 40 mA
Die Entwicklung des Agarosegels erfolgt mittels 15-minütiger Inkubation in einer 0,1-%igen
Ethidiumbromid-Lösung. Danach wird das Gel bei UV 365 -Licht ausgewertet und fotografiert, bzw. abgespeichert.
II.2.12.3 Southern-Blot-Verfahren Das Agarosegel wird im Anschluss an die elektrophoretische DNA-Trennung wie folgt behandelt:
HCl (2,5 M) 10 min schwenken Denaturierungslösung (II.1.3.2) 2 x 15 min schwenken Neutralisierungslösung (II.1.3.2) 2 x 15 min schwenken
Zwischen allen Schritten wird das Gel kurz mit H 2O bd gespült.
Die Membran (HybondTM-N+ Membran; Amersham Biosciences) wird in 20 x SSC eingeweicht und die DNA nach Sambrook et al. (1989) durch Kapillarkräfte auf die Membran geblottet. Der Transfer erfolgt über Nacht in 20 x SSC. Im Anschluss wird die DNA durch doppeltes Quervernetzten (1200 J x 100) im UV-Stratalinker ® 2400 fest mit der Nylonmembran verbunden. Die Membran wird an der Luft getrocknet, bis zur weitern Verwendung in Folie eingeschweißt und bei 4 °C gelagert.
31 Material und Methoden
II.2.12.4 Markierung der Sonde Als Sonde wird 5β-POR aus D. lanata verwendet. Hierzu wird als erstes eine PCR mit dem Plasmid TOPO/ D.lan /POR als Template durchgeführt und der PCR-Ansatz mittels dem QIAquick® PCR Purification Kit (Qiagen) (vgl. II.2.9) gereinigt. Im Anschluss werden die DNA-Stränge durch 5-minütiges Erhitzten auf 100 °C getrennt und die Sonde sofort auf Eis gestellt, um ein Hybridisieren der Stränge miteinander zu verhindern. Jeder Ansatz zum Markieren der Sonde setzt sich wie folgt zusammen:
Sonde (DNA; 25 ng/ L) 28 L dGAT 10 L Hexamer-Primer 5 L EcoPol-Puffer 5 L [α-32P] dCTP (50 Ci) 5 L Klenow-Polymerase (2,5 U) 1 L
Der Ansatz wird für 30 min bei 37 °C und im Anschluss für 10 min bei 65 °C inkubiert. Es werden 16 L TE-Puffer zugegeben und nicht gebundene Nukleotide über ein Micro Bio-Spin Chromatogaphy Column (Bio-Rad) abgetrennt. Anschließend wird das Spin-Colum mit 15 L TE-Puffer gewaschen. Die Effektivität der Markierung (Einbaurate) wird mittels Szintillationszähler (Packard) ermittelt und sollte bei mindestens 50 % liegen. Die markierte DNA wird vor der Zugabe zur Hybridisierungslösung 10 min bei 95 °C denaturiert. Für die Hybridisierung der Nylonmembran (II.2.11.3) werden 130 L bis 150 L der radioaktiv markierten Sonde eingesetzt (Doppelansatz).
II.2.12.5 Hybridisierung und Waschen der Blots Um die nicht mit DNA belegte Filteroberfläche mit Fremd-DNA abzusättigen, wird die Nylonmembran im Hybridisierungsofen (Herahybrid 6) mit 15 mL Prähybridisierungslösung für 2,5 h bei 42 °C inkubiert. Anschließend werden 150 L radioaktiv markierte Sonde zugegeben. Die Hybridisierung erfolgt bei 42 °C, 20 Upm über Nacht. Im Anschluss wird die Membran wie folgt gewaschen:
1 x 30 min mit 1 x SSC; 0,1 % SDS bei RT 2 x 30 min mit 0,1 x SSC; 0,1 % SDS bei 42 °C
32 Material und Methoden
Nach dem Trocknen wird die Membran auf Whatmanpapier fixiert, in Frischhaltefolie eingeschlagen und zusammen mit einem Film (Kodak X-Omat AR Film XAR-5) in eine Filmkassette mit Verstärkerfolie eingelegt. Es wird bei -80 °C mindestens 15 h exponiert. Die Entwicklung des Films erfolgt mit dem X-Ray Film Processor Protec Optimax. Um schwächere Signale zu detektieren wurde die in Frischhaltefolie eingeschlagene Membran mittels Phosphoimager (Fuji BAS-1500 mit Imageplates) ausgewertet.
II.2.13 Heterologe Expression in E. coli Für die heterologe Expression der rekombinanten Proteine wird das pQE-30, -31, -32 System (Qiagen) verwendet. Hierbei kommt es zur Expression von Fusionsproteinen, welche 6 Histidin-Reste (His-tag) am N-terminalen Ende tragen. Über diesen „tag“ ist es im Nachfolgenden möglich die Proteine mittels Metall-Affinitätschromatographie an Ni-NTA (Nitrilotriacetic acid) zu reinigen (siehe II.2.17 ). Alle Arbeitsschritte werden, falls nicht anders beschrieben, nach dem Handbuch „The QIAexpressionist“ (Version 2003) der Firma Qiagen durchgeführt.
II.2.13.1 Konstruktion der Expressionsplasmide Nach PCR mit Primern, welche Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen enthalten, wird das PCR-Produkt gereinigt (II.2.9) und mit den entsprechenden Restriktionsendonukleasen geschnitten. Hierbei wird folgendermaßen verfahren:
Gereinigtes PCR-Produkt 8 L 10 x Puffer (Promega, Sal I → Puffer D 1 L Kpn I → Puffer J) Restriktionsendonuklease I (10 U/ L) 1 L 1,5 h; 37 °C 10 x Puffer (Promega, Sph I → Puffer K) 1 L Restriktionsendonuklease II (10 U/ L) 1 L 1,5 h; 37 °C
Die Restriktion der pQE-30, -31, -32 Vektoren wird nach demselben Restriktions-Schema unter Verwendung von jeweils 2 L Vektor und den korrespondierenden Restriktionsendonukleasen I und II durchgeführt. Nach Reinigung des geschnittenen Vektors und des geschnittenen PCR-Produkts mit dem QIAquick® PCR Purification Kit (Qiagen) (II.2.9) wird das Insert in den Vektor ligiert.
33 Material und Methoden
Jeder Ligationsansatz setzt sich wie folgt zusammen:
Geschnittenes PCR-Produkt 100 ng Geschnittener pQE-3X Vektor 70 ng 2 x Rapid Liga Fast Puffer (Promega) 5 L T4 DNA Ligase (Promega) 1 L 5 min; RT
Der Ansatz wird bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C aufbewahrt.
II.2.13.2 Herstellung kompetenter M15[pREP4] Zellen Hierzu wird eine 2 mL M15[pREP4] Übernachtkultur in Kanamycin-haltige LB-Medium (25 g Kanamycin/mL LB-Medium) kultiviert. Mit dieser werden 50 mL LB-
Medium/Kanamycin angeimpft. Die Bakterienkultur wird bis zum Erreichen einer OD 600 von ca. 0,5 bei 37 °C, 150 Upm inkubiert und anschließend für 5 min auf Eis gekühlt. Nach Zentrifugation (4000 x g; 4 °C) wird das erhaltene Bakterienpellet in 25 mL 4 °C TFB 1 Puffer resuspendiert und für 90 min bei 4 °C inkubiert. Hiernach wird erneut zentrifugiert (4000 x g; 4 °C) und das Pellet im Anschluss in 10 mL 4 °C TFB 2 Puffer aufgenommen. Die kompetenten M15[pREP4] E. coli Zellen werden zu je 200 L aliquotiert und bis zu ihrer Verwendung bei -80 °C gelagert.
II.2.13.3 Transformation kompetenter M15[pREP4] Zellen 6 L Ligationsansatz (II.2.13.1) werden zu 200 L kompetenten M15[pREP4] Zellen pipettiert und für 20 min auf Eis inkubiert. Nach Hitzeschockbehandlung bei 42 °C (90 s) werden 500 L SOC-Medium zugesetzt und der Ansatz für 90 min bei 37 °C geschüttelt (150 Upm). Von diesem Ansatz werden 100 L auf einer Ampicillin- und Kanamycin-haltige LB- Platte (100 g Ampicillin; 25 g Kanamycin pro mL LB-Agar) ausgestrichen und bei 37 °C über Nacht inkubiert. Von Einzelkolonien werden Übernachtkulturen angelegt (100 g Ampicillin; 25 g Kanamycin pro mL LB-Medium), positive Klone werden durch Sequenzierung (MWG-Biotech) ermittelt und als Glycerolstocks bei -80 °C aufbewahrt.
II.2.13.4 Expression von r5 β-POR und r3 β-HSD Von positiven Klonen der 5β-POR bzw. 3β-HSD werden 650 mL Flüssigkulturen (100 g
Ampicillin; 25 g Kanamycin pro mL LB-Medium) angelegt und bis zu einer OD 600 von ca. 0,5 bis 0,7 bei 37 °C, 550 Upm inkubiert. Durch Zugabe von IPTG (0,1 mM; 1,0 mM)
34 Material und Methoden wird die Proteinexpression induziert und die Bakterienkultur wird bei entsprechender Temperatur (4 °C; 37 °C) über einen gewissen Zeitraum (96 h; 5 h) inkubiert. Nach Ende der Inkubation werden die Bakterien durch Zentrifugation (4500 x g, 4 °C, 1 h) vom Medium abgetrennt. Das Pellet wird mit flüssigem Stickstoff schock-gefroren und bis zur Proteinreinigung bei -80 °C aufbewahrt. Die IPTG-Konzentration, sowie die Inkubations- Temperatur und Dauer sind abhängig vom Experiment und des zu exprimierenden Proteins. Die Optimierung der jeweiligen Expressionsbedingungen erfolgt analog dem Handbuch „The QIAexpressionist“ (Version 2003).
II.2.14 Heterologe Expression von Selenomethionin-Proteinen Die Herstellung von Selenomethionin (SeMet) substituierten Proteinen dient zur Aufklärung ihrer 3D-Struktur durch Röntgenkristallographie. Für die heterologe Expression von SeMet- Proteinen werden erfolgreich insertierte pQE 3X Plasmide verwendet, welche in den Methionin auxotrophen E. coli Stamm B834(DE3) transformiert werden.
II.2.14.1 Herstellung kompetenter B834(DE3) Zellen Hierzu wird eine 1 mL B834(DE3) Übernachtkultur in LB-Medium ohne Antibiotika kultiviert. Mit dieser werden 100 mL reines LB-Medium angeimpft. Die Bakterienkultur wird bis zum Erreichen einer OD 600 von 0,5 bei 37 °C, 150 Upm inkubiert und anschließend für 5 min auf Eis abgekühlt. Nach Zentrifugation (4000 x g; 4 °C) wird das erhaltene Bakterienpellet in 30 mL 4 °C TFB 1 Puffer resuspendiert und für 90 min bei 4 °C inkubiert. Nach einer erneuten Zentrifugation (4000 x g; 4 °C) werden die pelletierten Zellen in 4 mL 4 °C TFB 2 Puffer aufgenommen. Die kompetenten B834(DE3) E. coli Zellen werden zu je 100 L aliquotiert und bis zu ihrer Verwendung bei -80 °C gelagert.
II.2.14.2 Transformation kompetenter B834(DE3) Zellen Hierzu werden aus einer Übernachtkultur eines positiven (pQE 3X in M15 [pREP4]) Klons Plasmide isoliert und zur Transformation von kompetenten B834(DE3) E. coli Zellen verwendet. 100 L kompetente B834(DE3) Zellen werden mit 10 L Plasmid-Eluat versetzt und für 20 min auf Eis inkubiert. Nach Hitzeschockbehandlung bei 42 °C für 90 s erfolgt eine Inkubation bei 37 °C, 550 Upm für 90 min. Im Anschluss werden von diesem Ansatz 50 L auf eine Ampicillin-haltige LB-Platte (100 g Ampicillin/mL Medium) ausgestrichen und bei 37 °C über Nacht inkubiert. Von positiven Einzelkolonien werden Übernachtkulturen in LB-
35 Material und Methoden
Medium angelegt (100 g Ampicillin/mL Medium), welche der Herstellung von SeMet- Protein und dem Anlegen von Glycerolstocks dienen.
II.2.14.3 Expression von SeMet-r5 β-POR Es wird eine 32 mL Übernachtkultur (LB-Medium; 100 Ampicillin/mL Medium) eines positiven Klons (pQE 3X in B834(DE3)) angelegt. Mit dieser werden 650 mL Methionin- haltiges Minimal-Medium (0,3 mM Met/mL Medium) angeimpft. Die Bakterienkultur wird bis zum Erreichen einer OD 600 von 0,5 – 0,7 über Nacht bei 37 °C, 550 Upm inkubiert. Im Anschluss werden die Bakterien durch Zentrifugation (4500 x g; 4 °C; 1 h) vom Medium abgetrennt. Das erhaltene Pellet wird mit SeMet-haltigem Minimalmedium (0,3 mM SeMet/mL Medium) gewaschen. Es wird erneut zentrifugiert und das so erhaltenen Pellet in einer entsprechenden Menge SeMet-haltigem Minimalmedium (0,3 mM SeMet/mL Medium) resuspendiert, bis eine OD 600 von 0,5 – 0,7 eingestellt ist. Zur Stabilisierung des SeMets wird der Bakterienkultur 2 mM DTT zugesetzt. Nach 30 minütiger Inkubation (37 °C) wird die Expression durch Zugabe von 0,1 mM IPTG induziert und die Kultur für 96 h bei 4 °C, 550 Upm inkubiert. Hiernach werden die Bakterien durch Zentrifugation (4500 x g, 4 °C, 1 h) vom Medium abgetrennt. Das Pellet wird mit flüssigem Stickstoff schock-gefroren und bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C aufbewahrt.
II.2.15 Expressionsprofil Zur Optimierung der Expression des rekombinanten Proteins wird dieser Versuch zum Expressionsprofil durchgeführt: 15 mL Ampicillin- und Kanamycin-haltiges LB-Medium (100 g Ampicillin; 25 g Kanamycin pro mL LB-Medium) werden mit 1 mL Übernachtkultur des zu testenden Klons (in M15[pREP4]) angeimpft und bis zum Erreichen einer OD 600 von 0,5 bei 37 °C, 550 Upm inkubiert. Es wird 1 mL Bakteriensuspension entnommen (0 h = Nullwert) und anschließend die Protein-Expression durch Zugabe von IPTG (1 mM Endkonzentration) induziert. Die Bakterienkultur wird weiter bei 37 °C, 550 Upm inkubiert. Nach 1 h, 2 h, 4 h, und 6 h wird jeweils 1 mL zur Analyse entnommen. Alle Proben werden wie folgt aufgearbeitet:
Zentrifugation (5 min, 13000 x g, RT) Resuspendieren des Pellets (50 L 1 x SDS-Probenpuffer)
36 Material und Methoden
Die Proben werden für 10 min bei 95 °C denaturiert. Im Anschluss werden jeweils 18 L unverdünnt zur Analyse mittels SDS-PAGE verwendet.
II.2.16 Bestimmung der Proteinlöslichkeit 50 mL Ampicillin- und Kanamycin-haltiges LB-Medium (100 g Ampicillin; 25 g Kanamycin pro mL LB-Medium) werden mit 2 mL Übernachtkultur des positiven Klons (in M15[pREP4]) versetzt und unter Schütteln (550 Upm) bei 37 °C inkubiert. Nach Erreichen einer OD 600 von 0,5 wird 1 mL Probe entnommen (0 h = Nullwert) und im Anschluss die Protein-Expression durch Zugabe von IPTG (1 mM) induziert. Nach 6-stündiger Inkubation bei 37 °C, 550 Upm wird der Bakterienkultur erneut 1 mL Probe (6 h Wert) entnommen. Beide Proben (0 h, 6 h) werden für 5 min bei 13000 x g (RT) zentrifugiert und die Bakterienpellets danach in 1 x SDS-Probenpuffer resuspendiert (0 h = 50 L Puffer; 6 h = 100 L Puffer). Die restliche Bakterienkultur (ca. 50 mL) wird zentrifugiert (20 min, 4000 x g, 4 °C) und das Pellet in 5 mL Nativem Lysepuffer aufgenommen. Die Suspension wird mit flüssigem Stickstoff schock-gefroren und anschließend auf Eis aufgetaut. Nach Behandlung mit Ultraschall (6 x 10 s) wird erneut zentrifugiert (30 min, 10000 x g, 4 °C). Der Überstand wird abgenommen und das Pellet in 2,5 mL nativem Lysepuffer aufgenommen. Vom Überstand (= Rohextrakt A; lösliche Proteine) und dem resuspendierten Pellet (= Rohextrakt B; unlösliche Proteine) werden je 5 L mit 5 L 2 x SDS-Probenpuffer gemischt. Alle Proben werden für 10 min bei 95 °C denaturiert und direkt zur SDS-PAGE Analyse verwendet.
II.2.17 Reinigung rekombinanter Proteine Mit dem pQE-30, -31, -32 System (Qiagen) generierte rekombinante Proteine tragen an ihrem N-terminalen Ende 6 Histidin Reste. Aufgrund dieses angehängten His-tags kann das Protein durch Metall-Affinitätschromatographie an einer Ni-NTA Matrix (Nitrilotriacetic acid) gereinigt werden. NTA bindet 4 der 6 Valenzen des Nickelions, so dass die 2 verbleibenden mit dem His-tag einen Chelat-Komplex eingehen können. Es kommt zur reversiblen Bindung des Proteins an die Ni-NTA Agarose-Matrix. Imidazol, welches eine Strukturähnlichkeit mit Histidin aufweißt, kann dieses aus dem Komplex verdrängen. Dies macht man sich bei der Reinigung und späteren Elution des rekombinanten Proteins von der Ni-NTA Agarose-Matrix zu Nutze.
37 Material und Methoden
II.2.17.1 Denaturierende His-tag-Reinigung Pro Aufarbeitung wird ein aus 650 mL Bakterienkultur gewonnenes Bakterienpellet (II.2.13.4) für 15 min auf Eis aufgetaut und anschließend in 5 mL denaturierenden Lysepuffer B resuspendiert. Nach Inkubation von 60 min, 200 Upm bei RT wird zentrifugiert (13000 x g, 20 min, RT). 4 mL des Überstands (Lysat) werden mit 1 mL Ni-NTA Agarose versetzt und 60 min bei RT, 300 Upm geschüttelt. Anschließend wird nach dem Protokoll 17 (Batch purification of 6xHIS-tagged proteins from E. coli under denaturating conditions) des Handbuchs „The QIAexpressionist“ (Version 2003) die denaturierende Reinigung durchgeführt. Zur Elution des rekombinanten Proteins von der Ni-NTA Säule wird der Elutionspuffer D (4 x 0,5 mL) verwendet.
II.2.17.2 Native His-tag-Reinigung Alle Arbeitsschritte der nativen His-tag Reinigung werden bei 4 °C durchgeführt. Ein aus 650 mL Bakterienkultur gewonnenes Bakterienpellet (II.2.13.4; II.2.14.3) wird für 15 min auf Eis aufgetaut und im Anschluss in 4,5 mL nativem Lysepuffer, dem unmittelbar vorher Lysozym (1 mg/mL) zugesetzt wird, resuspendiert. Nach einer Inkubation von 30 min, 550 Upm wird die Bakteriensuspension mit Ultraschall behandelt (Sonoplus; 6 x jeweils 10 s) und anschließend für 30 min (13000 x g) zentrifugiert. 4 mL des Lysats werden mit 1 mL Ni- NTA Agarose versetzt und 60 min bei RT, 300 Upm geschüttelt. Die anschließende native His-tag-Reinigung wird nach dem Protokoll 12 (Batch purification of 6xHIS-tagged proteins from E. coli under native conditions) des Handbuchs „The QIAexpressionist“ (Version 2003) durchgeführt. Das rekombinante Protein wird mit 3 x 1 mL nativem Elutionspuffer von der Ni-NTA Säule eluiert.
II.2.18 Umpuffern und Einkonzentrierung von Proteinlösungen Um niedermolekulare Substanzen aus Proteinlösungen abzutrennen und um Proteine in die entsprechenden Assaypuffer zu überführen, wurden PD-10 Columns (Sephadex TM G-25M) verwendet. Die Säule wird zuerst mit dem jeweiligen Assaypuffer equilibriert (3 – 4 x Säulenvolumen). Anschließend wird 3 mL Proteinlösung aufgetragen. Nach deren Durchlauf wird das Protein mit 4 mL des entsprechenden Assaypuffers von der Säule eluiert. Zur Einkonzentrierung und Entsalzung von Proteinlösungen werden Amicon Ultra 10000 MWCO Säulchen verwendet.
38 Material und Methoden
II.2.19 Proteinbestimmung Die Bestimmung der Gesamt-Proteinkonzentration wird nach der Methode von Bradford (1976) durchgeführt. 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 werden in einer Mischung aus 50 mL Ethanol (96 %) und 100 mL o-Phosphorsäure (85 %) unter Rühren gelöst. Danach wird mit H 2O bd auf 1000 mL aufgefüllt und filtriert. Der Faktor des hergestellten Reagenzes wird über eine Eichgerade mittels verschiedenen Konzentrationen von Rinderserumalbumin in 0,15 M NaCl ermittelt. Zur Bestimmung der Proteinkonzentration wird die zu untersuchende Lösung mit der entsprechenden Menge Bradford-Reagenz wie folgt gemischt:
Proteinkonzentration 0,1 mg/mL 50 L proteinhaltige Lösung + 1 mL Bradford RL 0,1 – 1 mg/mL 20 L proteinhaltige Lösung + 2 mL Bradford RL
Nach 10-minütiger Inkubation wird die Absorption des gebildeten blauen Farbstoff- Proteinkomplexes gegen eine parallel mit Bradford RL versetzten Pufferlösung im Photometer bei 595 nm vermessen. Die Gesamtproteinkonzentration (mg/mL) wird folgendermaßen berechnet:
Absorption 595 x Faktor Proteinkonzentration (mg/mL) = eingesetztes Volumen an proteinhaltiger Lösung ( L)
II.2.20 SDS-PAGE Über die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wird das Molekulargewicht der gereinigten rekombinanten Proteine unter denaturierenden Bedingungen bestimmt. Es werden 12-%ige Gele verwendet. Als Molekulargewichtsmarker dienen Mischungen von Standardproteinen (1,5 L, Precision [Plus] Protein Standards TM , BioRad).
II.2.20.1 Herstellung der Gele Vor dem Gießen des Gels werden alle Glasplatten mit 70 %-igem Ethanol gereinigt und in die dafür vorgesehene Gießapparatur eingespannt. Das Trenngel setzt sich wie folgt zusammen:
Acrylamid 30 % 1600 L 4 x Trenngelpuffer 1000 L
H2O bd 1400 L TEMED 3 L APS 25 L
39 Material und Methoden
Nach Mischen der Bestandteile wird das Trenngel zügig gegossen und sofort mit 0,1-%iger SDS-Lösung überschichtet. Ist das Gel auspolymerisiet, wird die SDS-Lösung abgenommen, das Sammelgel gegossen und der Kamm gesteckt. Das Sammelgel setzt sich folgendermaßen zusammen:
Acrylamid 30 % 330 L 4 x Sammelgelpuffer 500 L
H2O bd 1170 L TEMED 3 L APS 25 L
Nach Auspolymerisierung wird das Gel in die Elektrophoreseapparatur eingesetzt und die Kammern werden mit dem Elektrophoresepuffer befüllt. Der Kamm kann nun gezogen und die Taschen des SDS-Gels mit Proben beladen werden.
II.2.20.2 Probenvorbereitung und Laufbedingungen Falls nicht anders beschrieben werden 16 L Probe mit 4 L 5 x SDS-Probenpuffer versetzt und vor dem Beladen des SDS-Gels für 10 min bei 95 °C denaturiert. Nach dem Abkühlen auf Eis wird das Gel mit je 18 L Probe pro Geltasche beladen. Es werden 1,5 L Marker (Precision (Plus) Protein Standards TM , BioRad) aufgetragen. Die elektrophoretische Trennung der Proteine erfolgt bis zum Erreichen des Trenngels bei 70 V und wird dann auf 120 V erhöht. Nach Beendigung der Elektrophorese wird das Gel aus der Apparatur genommen und die Proteine mittels Silberfärbung (siehe II.2.22) detektiert.
II.2.21 Isoelektrische Fokussierung Die isoelektrische Fokussierung dient zur Ermittlung des isoelektrischen Punkts von Proteinen. Es werden Fertiggele (BioRad) mit einen kontinuierlichen pH-Gradienten (pH 3 – 10) verwendet.
II.2.21.1 Probenvorbereitung und Laufbedingungen Um eine gute Fokussierung zu erreichen, werden die Proben möglichst salzfrei eingesetzt. Aus diesem Grund werden die rekombinanten, nativ gereinigten Proteine vor ihrer Verwendung über PD-10 Columns (II.2.18) auf Wasser umgepuffert. 10 L dieser Lösung
40 Material und Methoden werden mit 10 L IEF-Probenpuffer versetzt und auf das Gel aufgetragen. Als Marker wird 1 L des BioRad IEF-Standard 161-0310 verwendet. Anodenpuffer und Kathodenpuffer werden vor der Verwendung entgast. Die Elektrophorese wird wie folgt durchgeführt: 1 h, 100 V; 1 h, 250V; 0,5 h, 500 V. Nach dem Lauf wird das Gel aus der Kammer genommen und die Proteinbanden mittels Silberfärbung (siehe II.2.22) detektiert.
II.2.22 Silberfärbung von Proteinen Bei der Silberfärbung handelt es sich um eine sensitive Färbemethode von Proteinen, bei der diese noch im Nanogramm-Bereich detektiert werden können (Heukeshoven und Dernick, 1986). Alle Arbeitsschritte werden in einer Petrischale unter Schwenken (RT) durchgeführt. Die Entwicklung (*) erfolgt so lange, bis sich deutlich Proteinbanden auf dem Gel zeigen.
1. Fixierer 100 mL 60 min 2. Sensitiviere (incl. Glutaraldehyd) 50 mL 30 min
3. H2O 50 mL 5 min 50 mL 5 min 50 mL 5 min 4. Silbernitratlösung (incl. Formaldehyd) 50 mL 20 min
5. H2O 50 mL 10 s 6. Entwickler (incl. Formaldehyd) 50 mL nach Bedarf * 7. Stopplösung 50 mL
II.2.23 Aktivitätsbestimmung von Proteinen Die katalytische Aktivität der rekombinanten Proteine wird mittels Standard-Enzymassays überprüft. Neben dieser qualitativen Anwendung werden Standard-Enzymassays auch quantitativ, unter anderem zur Ermittlung von Km- und vmax -Werten, im Zuge der biochemischen Charakterisierung von Enzymen durchgeführt.
II.2.23.1 Standard 5 β-POR-Enzymassay Der Standard 5 β-POR-Enzymassay wird abgewandelt nach Stuhlemmer und Kreis (1996a) durchgeführt. Nach nativer His-tag-Reinigung wird die r5β-POR in 5β-POR-Assaypuffer umgepuffert und die Lösung auf einen Proteingehalt von 0,2 mg/mL eingestellt.
41 Material und Methoden
Jeder Assay setzt sich wie folgt zusammen:
Proteinlösung (0,2 mg/mL) 945 L Substratlösung (0,3 mM EK, in EtOH 96 %) 45 L Regenerierendes System 10 L NADP (6,4 mM EK) Glucose-6-phosphat (31, mM EK) Glucose-6-phosphat-Deydrogenase (42 nkat)
Das regenerierende System wird vor Gebrauch frisch in 5β-POR-Assaypuffer gelöst und zusammen mit der Proteinlösung für 10 min bei 30 °C vorinkubiert, bevor die Substratlösung zugegeben wird. Der Assay wird, falls nicht anders beschrieben bei 30 °C über 2 h durchgeführt. Als Negativkontrolle dient ein Assay mit denaturierter r5β-POR (10 min, 100 °C). Nach Ende der Inkubationszeit wird die Reaktion durch Zugabe von 1 mL Dichlormethan gestoppt. Nach Vortexen wird für 5 min (13000 x g, RT) zentrifugiert und anschließend die organische Unterphase entnommen und diese zur Trockne gebracht. Der Rückstand wird in 50 L Methanol gelöst und für die DC-, bzw. HPLC-Analytik verwendet. Für die Analyse von 5β-POR-Enzymassays mittels GC wird der Rückstand in 100 L Dichlormethan aufgenommen. Abweichungen vom Standard 5 β-POR-Enzymassay in Bezug auf Substrat- Konzentration oder Inkubationstemperatur sind im Ergebnisteil des jeweiligen Versuchs vermerkt.
II.2.23.2 Standard 3 β-HSD-Enzymassay Der Standard 3β-HSD-Enzymassay wird abgewandelt nach Finsterbusch et al. (1999) durchgeführt. Die nativ His-tag gereinigte r3 β-HSD wird in 3 β-HSD-Assaypuffer umgepuffert und die Lösung auf einen Proteingehalt von 0,2 mg/mL eingestellt. Jeder Assay setzt sich folgendermaßen zusammen:
Proteinlösung (0,2 mg/mL) 960 L Substratlösung (0,3 mM EK, in DMSO) 20 L NAD (1,0 mM EK, in Assaypuffer) 20 L
42 Material und Methoden
Die Proteinlösung wird zusammen mit NAD bei 50 °C für 10 min vorinkubiert. Nach Substratzugabe wird die Probe bei 50 °C, 550 Upm für 1 h inkubiert. Als Negativkontrolle dient ein Assay mit vorab hitze-denaturierter r3 β-HSD (10 min, 100 °C). Der Assay wird durch Zugabe von 1 mL Dichlormethan gestoppt, es wird sorgfältig gevortext und die Phasen durch Zentrifugation (5 min, 13000 x g, RT) getrennt. Der getrocknete Rückstand der organischen Phase wird in 50 µL Methanol aufgenommen und zur DC-Analytik verwendet.
II.2.24 Dünnschichtchromatographie (DC) Zur qualitativen Analyse von Standard-Enzymassays wird die DC-Analytik verwendet.
Hierzu werden auf die DC-Platte (Kieselgel 60 F 254 ) jeweils 50 L Probe und 10 L Referenzlösung strichförmig aufgetragen. Die Laufhöhe beträgt zwischen 8,5 und 19 cm. Als mobile Phase werden verschiedene Fliesmittel (FM) verwendet (vgl. II.1.3.4). Die Detektion der Substanzen erfolgt mit Anisaldehyd-RL oder Jensen-Kny-RL. In beiden Fällen wird die DC Platte kurz in der entsprechenden Reagenzlösung getaucht und bis zum Sichtbarwerden der Banden bei 100 °C auf der Heizplatte belassen. Im Anschluss erfolgt die Auswertung bei Tageslicht (Anisaldehyd-RL) oder bei 365 nm (Jensen-Kny-RL) an der DC Workstation CAB UVIS (Desaga).
II.2.25 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) Zur quantitativen, in einzelnen Fällen auch qualitativen Auswertung von Standard- Enzymassays werden die Proben mittels HPLC analysiert.
® Stationäre Phase: Symmetry C 18 5 m (4,6 x 150 mm) (Waters), bzw. ® Reprosil-Pur 120 C 18 5 m (4,6 x 250 mm) (Trentec) bei Analyse von Cortison-haltigen Assays
Mobile Phase: Fliesmittel A = H 2O bd, entgast Fliesmittel B = Acetonitril (gradient grade), filtriert, entgast Fluss: 1 mL/min Injektionsvolumen: 20 L
43 Material und Methoden
Gradientenprogramm: Zeit [min] % A % B 0 75 25 10 35 65 18 0 100 21 0 100 23 75 25 25 75 25
Hierzu wird eine nach Seidel et al. (1990) modifizierte Methode verwendet. Die Messungen werden an einer Waters 1525-Anlage mit UV-Detektor durchgeführt. Die Detektion erfolgt bei 205 nm.
II.2.26 Gaschromatographie (GC) Die GC-Analytik wird zum Trennen von 5 α- und 5 β-Pregnanen, sowie zur Auswertung ausgewählter Enzymassays verwendet. Die Messungen werden mit einer GC HP 6890 MSD Type 5972A (Hewlett-Packard) durchgeführt.
Stationäre Phase: HP Optima 5 (30 m x 25 mm x 0.25µm) (Hewlett-Packard) Trägergas: Helium Fluss: 1 mL/min Einlass-Temperatur: 280 °C Injektionsvolumen: 1 L Solvent Delay: 4 min
Temperaturprogramm: Aufheizrate Anfangstemperatur Endtemperatur Dauer [°C/min] [°C] [°C] [min] - 150 - 4 5 150 280 - - - 280 10
44 Material und Methoden
II.2.27 Kristallisation rekombinanter Proteine Die Kristallisation dient der Aufklärung der 3D-Struktur der r5 β-POR mittels Röntgenstrukturanalyse. Zu diesem Zweck wird sowohl r5 β-POR als auch SeMet- substituierte r5 β-POR verwendet. Die nativ gereinigte (SeMet-)r5 β-POR wird über PD-10 Columns auf 2,0 mM Tris/HCl pH 7,5 umgepuffert und mittels Amicon Ultra 10000 MWCO Säulchen auf eine Proteinkonzentration von ca. 10 mg/mL einkonzentriert. Die so einkonzentrierte Proteinlösung wird von Frau C. Egerer-Sieber aus der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr. Y. Muller (Lehrstuhl für Biotechnik; FAU Erlangen) zur Kristallisierung weiterverwendet. Hierbei kommt die so genannte „Hanging-Drop-Method“ zum Einsatz. Nähere Angaben zu den Methoden der Kristallisationsverfahren und Kristallisations- Bedingungen sind in bei Egerer-Sieber et al. (2006) zu finden.
45 Ergebnisse
III ERGEBNISSE III.1 Klonierung von Genen der Cardenolid-Biosynthese aus Digitalis und Isoplexis Um die Nukleotidsequenzen der Progesteron-5β-Reduktase (5β-POR) und 5-3β- Hydroxysteroid-Dehydrogenase (3β-HSD) in Digitalis - und Isoplexis -Spezies aufklären zu können, wurden die entsprechenden Gene kloniert und sequenziert.
III.1.1 Klonierung der Progesteron-5β-Reduktase (5 β-POR) III.1.1.1 PCR/RT-PCR Zur Amplifizierung der 5 β-POR wurden PCRs (II.2.6) mit genomischer DNA aus D. lanata als Kopiervorlage und folgenden Primerkombinationen durchgeführt:
Tabelle 6: Verwendete Primerkombinationen zur Amplifizierung der 5 β-POR. Primerkombination Primerpaar Annealing-Temperatur I VH07bdir/VH1188rev 56 °C II VH07bdir/VH1162rev 56 °C III VH07bdir/VH1148rev 56 °C IV VH24dir/VH1188rev 56 °C V VH24dir/VH1162rev 56 °C VI VH24dir/VH1148rev 56 °C
Auf dem anschließend durchgeführten 1-%igem Agarosegel war bei allen Primer- kombinationen ein PCR-Produkt von ca. 1250 bp erkennbar (siehe Abbildung 3).
1 2 3 4 5 6 M
ca. 1250 bp 1500 bp 1000 bp
Abbildung 3: PCR mit genomischer DNA von D. lanata . 1 – Primerkombination (PK) I; 2 – PK II; 3 – PK III; 4 – PK IV; 5 – PK V; 6 – PK VI; M – Marker.
46 Ergebnisse
Um die gesamte kodierende 5 β-POR-Sequenz zu klonieren, wurde in den nachfolgenden Versuchen die kodierende Sequenz (CDS) einschließende Primerkombination I verwendet. Es wurde eine PCR mit der Primerkombination I und genomischer DNA von 19 Digitalis -Spezies, bzw. Subspezies und 4 Isoplexis-Spezies durchgeführt. Bei Arten mit mehreren Unterarten wurde jeweils eine typische Unterart (Bräuchler et al., 2004) ausgewählt (vgl. II.1.2). In allen Fällen war es möglich, ein ca. 1250 bp großes PCR-Produkt zu amplifizieren (Abbildung 4 und Abbildung 5).
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 a) b)
ca. 1250 bp ca. 1250 bp 1500 bp 1500 bp 1000 bp 1000 bp
Abbildung 4: PCR mit Primerkombination I und genomischer DNA von Digitalis Arten. a) M – Marker; 1 – D. ferruginea ; 2 – D. lanata ; 3 – D. parviflora ; 4 – D. grandiflora ; 5 – D. thapsi ; 6 – D. purpurea ; 7 – D. mariana ; 8 – D. subalpina ; 9 – D. nervosa . b) M – Marker; 1 – D. viridiflora ; 2 – D. davisiana ; 3 – D. laevigata ; 4 – D. ciliata ; 5 – D. lutea ; 6 – D. sibirica ; 7 – D. cariensis ; 8 – D. minor subsp. minor ; 9 – D. minor subsp. dubia; 10 – D. atlantica.
M 1 2 3 4
1500 bp ca. 1250 bp 1000 bp
Abbildung 5: PCR mit Primerkombination I und genomischer DNA von Isoplexis Arten. M – Marker; 1 – I. canariensis ; 2 – I. sceptrum ; 3 – I. chalcantha; 4 – I. isabelliana .
Im Anschluss wurde eine RT-PCR (II.2.6) mit cDNA (II.2.5) von D. lanata und der Primerkombination I durchgeführt. Die hierbei verwendete cDNA wurde durch Umschreiben von mRNA (D. lanata ) erhalten (II.2.5). Wie aus Abbildung 6, ersichtlich konnte ein ca. 1170 bp großes PCR-Produkt amplifiziert werden.
47 Ergebnisse
M 1 2
1500 bp 1000 bp ca. 1170 bp
Abbildung 6: PCR und RT-PCR von D. lanata und Primerkombination I. M – Marker; 1 – PCR-Produkt (genomische DNA); 2 – RT-PCR-Produkt (cDNA).
III.1.1.2 Klonierung der PCR-Produkte Die erhaltenen (RT-)PCR-Produkte wurden im Anschluss in den Vektor pCR ®2.1-TOPO ® (3,9 kb) kloniert und in kompetente One Shot TOP10 E. coli Zellen gebracht (2.II.10.1). Aus angelegten Flüssigkulturen einzelner Kolonien wurden dann Plasmide isoliert (II.2.10.2) und mittels 1-%iger Agarosegele analysiert. Plasmide erwarteter Größe wurden auf ihre erfolgreiche Insertion mittels Eco RI-Restriktionsverdau (II.2.10.3) geprüft. In Abbildung 7 ist dies exemplarisch am Beispiel D. lanata (genomische DNA) dargestellt.
M 1 2 3
1500 bp ca. 1250 bp 1000 bp
Abbildung 7: Überprüfung der Klonierung von 5 β-POR aus D. lanata . M – Marker; 1 – PCR mit genomischer DNA und Primerkombination I; 2 – Plasmid mit Insert 5 β- POR/Primerkombination I (TOPO/POR/lanata) ; 3 – Eco RI-Restriktionsverdau vom Plasmid TOPO/POR/lanata.
Mit allen anderen Digitalis - und Isoplexis -Spezies wurde analog verfahren. Es konnte von allen Arten, ausgenommen D. atlantica , ein positiver Klon isoliert werden. Obwohl auch aus dieser Digitalis -Spezies mit den verwendeten Primern ein PCR-Produkt amplifiziert werden
48 Ergebnisse konnte (vgl. Abbildung 5), scheiterte der Versuch des Klonierens. Eine Wiederholung des Experiments war aus Mangel an Pflanzen- bzw. DNA-Material leider nicht möglich. Positive Klone wurden zum Sequenzieren geschickt (II.2.10.4).
III.1.1.3 Bearbeitung erhaltener Nukleotidsequenzen Die Sequenzen wurden nach Erhalt geprüft und bearbeitet. Dies wird exemplarisch an den genomischen DNA Sequenzen der 5 β-POR aus D. lanata gezeigt. Die Sequenz lan/I (Abbildung 8) wurde mit Primer T7, die Sequenz lan/II (Abbildung 9) mit Primer M13 sequenziert. Beide Primer sind auf dem pCR ®2.1-TOPO Vektor zu finden und dienten als „Starter“ für die Sequenzierung.
>lan/I -T7 26..646 of trace file (Plus/Minus) TGGATATCTGCAGAATTCGCCCTT AACCATGTCAAGGAACAATC TTGTAAGCTTTTGCCTTGTCAATCCAAGAA ATGAACGCATTCTTGGAGTTCCTAAATCCCAAAAAGCCATGCTCCTTGCTCTTGTTCATACTATCCAGGAAACA CTCATTCCCAAGTATAACATCACCAAACCACCAAATTCCGACATCCTTCAGTTTCGTAGGTGTCAATCCATTCT CCCTCACGATTTCCTCCCAAACCGGCTCCTTCCCCTTCATTAAATCCTGCAATTTCAAATCCACCCCTTCTTCA TACTCTCCACACCCTACTCCAAACTGCTCCGCCAACACCTTCCAAAAATGCTTCCATTTAAACACATCTCCATT ACTCACATTAAAGGCCTCGTTTTTTGCATAAGGATCCACTGCAGCCCAAATATGATGCTCCGCTATCAAATCCG CATCAGAGCAATCCGAGTACCCATCCCACGCAGCCTTACAACCAGTAAACCTCAAAACCTTTCCCTCGTGTTTG CAAATAGCTGCATAAACACAAAGGGTACCCACCAAATTCATCATACTATATGGAGAAAACCCGAATATATTCCT GGGGCGATGAACCGACCAAGTCAAAACC Abbildung 8: Erhaltene 3´-5´ 5 β-POR-Teilsequenz des Plasmids TOPO/POR/lanata. Unterstrichen: Primer VH1188rev; grau hinterlegt: Stopcodon.
> lan/II -_M13_uni__-21__ 26..733 of trace file (Plus/Plus) GCATGCTCGAGCGGCCGCCAGTGTGATGGATATCTGCAGAATTCGCCCTT AAAAAATGAGCTGGTGGTGGGCTG GAGCGATAGGCGCTGCAAAGGTAATAAGTTAACATTTATCGCATAATTGCAACAATCCTAGCTATTTATGTGTA ATCTGACTGGTAATTGGTTGAAATAGAAAAGGTTGGAAGAAGATGACGCACAGCCAAAGCATTCGAGCGTGGCG TTGATAGTTGGGGTAACCGGAATCATCGGCAACAGCCTGGCGGAGATCCTGCCACTGGCCGACACCCCCGGCGG TCCGTGGAAGGTATACGGCGTCGCCCGCCGCACCAGACCCGCCTGGCATGAGGATAATCCGATCAATTACGTCC AGTGCGACATATCCGATCCAGATGACTCCCAAGCCAAGCTGTCACCTCTGACTGATGTTACCCACGTGTTCTAC GTTACCTGGGCTAATCGATCCACCGAACAAGAAAACTGTGAAGCCAATAGCAAAATGTTCAGGAACGTGCTTGA TGCAGTTATCCCTAATTGCCCCAATTTGAAGCACATCTCATTGCAGACTGGGAGGAAGCATTACATGGGACCAT TTGAATCCTACGGGAAAATAGAATCCCATGATCCACCCTACACTGAGGATTTGCCCAGGTTGAAGTACATGAAC TTTACTATGATTAGAGGATATTATGCTTGAGGAGGTGGAGA Abbildung 9: Erhaltene 5´-3´ 5 β-POR-Teilsequenz des Plasmids TOPO/POR/lanata. Unterstrichen: Primer VH07bdir; grau hinterlegt: Startcodon.
Die bei der PCR eingesetzten Primer VH07bdir und VH1188rev wurden in den erhaltenen Sequenzen lan/I und lan/II wieder gefunden. Dies lässt den Schluss zu, dass die gewünschte 5β-POR Sequenz vollständig in den pCR ®2.1-TOPO Vektor eingebaut wurde. Zur weiteren Kontrolle wurden die Sequenzen in das im Internet frei zugängliche Programm http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST eingegeben. Dabei zeigte sich, dass lan/I als
49 Ergebnisse
3´-5´ Sequenz (Plus/Minus) (Abbildung 8) vorlag und folglich in den korrespondierenden 5´-3´ Strang umgeschrieben werden musste (http://searchlauncher.bcm.tmc.edu.seq- util/Options /revcomp.html). Die erhaltene Sequenz wurde mit der Sequenz lan/II (Abbildung 9) zu einer genomischen 5β-POR ( D. lanata) Gesamtsequenz zusammengesetzt (Abbildung 10).
ATGAGCTGGT GGTGGGCTGG AGCGATAGGC GCTGCAAAGG TAATAAGTTA ACATTTATCG 60 CATAATTGCA ACAATCCTAG CTATTTATGT GTAATCTGAC TGGTAATTGG TTGAAATAG A 120 AAAGGTTGGA AGAAGATGAC GCACAGCCAA AGCATTCGAG CGTGGCGTTG ATAGTTGGGG 180 TAACCGGAAT CATCGGCAAC AGCCTGGCGG AGATCCTGCC ACTGGCCGAC ACCCCCGGCG 240 GTCCGTGGAA GGTATACGGC GTCGCCCGCC GCACCAGACC CGCCTGGCAT GAGGATAATC 300 CGATCAATTA CGTCCAGTGC GACATATCCG ATCCAGATGA CTCCCAAGCC AAGCTGTCAC 360 CTCTGACTGA TGTTACCCAC GTGTTCTACG TTACCTGGGC TAATCGATCC ACCGAACAAG 420 AAAACTGTGA AGCCAATAGC AAAATGTTCA GGAACGTGCT TGATGCAGTT ATCCCTAATT 480 GCCCCAATTT GAAGCACATC TCATTGCAGA CTGGGAGGAA GCATTACATG GGACCATTTG 540 AATCCTACGG GAAAATAGAA TCCCATGATC CACCCTACAC TGAGGATTTG CCCAGGTTGA 600 AGTACATGAA CTTTTACTAT GATTTAGAGG ATATTATGCT TGAGGAGGTG GAGAAGAAGG 660 AGGGTTTGAC TTGGTCGGTT CATCGCCCAG GGAATATATT CGGGTTTTCT CCATATAGTA 720 TGATGAATTT GGTGGGTACC CTTTGTGTTT ATGCAGCTAT TTGCAAACAC GAGGGAAAGG 780 TTTTGAGGTT TACTGGTTGT AAGGCTGCGT GGGATGGGTA CTCGGATTGC TCTGATGCGG 840 ATTTGATAGC GGAGCATCAT ATTTGGGCTG CAGTGGATCC TTATGCAAAA AACGAGGCCT 900 TTAATGTGAG TAATGGAGAT GTGTTTAAAT GGAAGCATTT TTGGAAGGTG TTGGCGGAGC 960 AGTTTGGAGT AGGGTGTGGA GAGTATGAAG AAGGGGTGGA TTTGAAATTG CAGGATTTAA 1020 TGAAGGGGAA GGAGCCGGTT TGGGAGGAAA TCGTGAGGGA GAATGGATTG ACACCTACGA 1080 AACTGAAGGA TGTCGGAATT TGGTGGTTTG GTGATGTTAT ACTTGGGAAT GAGTGTTTCC 1140 TGGATAGTAT GAACAAGAGC AAGGAGCATG GCTTTTTGGG ATTTAGGAAC TCCAAGAATG 1200 CGTTCATTTC TTGGATTGAC AAGGCAAAAG CTTACAAGAT TGTTCCTTGA 1250 Abbildung 10: Gesamtsequenz der 5 β-POR aus genomischer DNA aus D. lanata ; unterstrichen: Intron.
Es zeigte sich eine hohe Homologie zu der veröffentlichten mRNA-Sequenz der 5β-POR aus D. purpurea (Acc.-Nr. AJ310673).
ATGAGCTGGT GGTGGGCTGG AGCGATAGGC GCTGCAAAGA AAAGGTTGGA AGAAGATGAC 60 GCACAGCCAA AGCATTCGAG CGTGGCGTTG ATAGTTGGGG TAACCGGAAT CATCGGCAAC 120 AGCCTGGCGG AGATCCTGCC ACTGGCCGAC ACCCCCGGCG GTCCGTGGAA GGTATACGGC 180 GTCGCCCGCC GCACCAGACC CGCCTGGCAT GAGGATAATC CGATCAATTA CGTCCAGTGC 240 GACATATCCG ATCCAGATGA CTCCCAAGCC AAGCTGTCAC CTCTGACTGA TGTTACCCAC 300 GTGTTCTACG TTACCTGGGC TAATCGATCC ACCGAACAAG AAAACTGTGA AGCCAATAGC 360 AAAATGTTCA GGAACGTGCT TGATGCAGTT ATCCCTAATT GCCCCAATTT GAAGCACATC 420 TCATTGCAGA CTGGGAGGAA GCATTACATG GGACCATTTG AATCCTACGG GAAAATAGAA 480 TCCCATGATC CACCCTACAC TGAGGATTTG CCCAGGTTGA AGTACATGAA CTTTTACTAT 540 GATTTAGAGG ATATTATGCT TGAGGAGGTG GAGAAGAAGG AGGGTTTGAC TTGGTCGGTT 600 CATCGCCCAG GGAATATATT CGGGTTTTCT CCATATAGTA TGATGAATTT GGTGGGTACC 660 CTTTGTGTTT ATGCAGCTAT TTGCAAACAC GAGGGAAAGG TTTTGAGGTT TACTGGTTGT 720 AAGGCTGCGT GGGATGGGTA CTCGGATTGC TCTGATGCGG ATTTGATAGC GGAGCATCAT 780 ATTTGGGCTG CAGTGGATCC TTATGCAAAA AACGAGGCCT TTAATGTGAG TAATGGAGAT 840 GTGTTTAAAT GGAAGCATTT TTGGAAGGTG TTGGCGGAGC AGTTTGGAGT AGGGTGTGGA 900 GAGTATGAAG AAGGGGTGGA TTTGAAATTG CAGGATTTAA TGAAGGGGAA GGAGCCGGTT 960 TGGGAGGAAA TCGTGAGGGA GAATGGATTG ACACCTACGA AACTGAAGGA TGTCGGAATT 1020 TGGTGGTTTG GTGATGTTAT ACTTGGGAAT GAGTGTTTCC TGGATAGTAT GAACAAGAGC 1080 AAGGAGCATG GCTTTTTGGG ATTTAGGAAC TCCAAGAATG CGTTCATTTC TTGGATTGAC 1140 AAGGCAAAAG CTTACAAGAT TGTTCCTTGA 1170 Abbildung 11: cDNA-Sequenz der 5β-POR aus D. lanata .
50 Ergebnisse
Im Vergleich der beiden Sequenzen wurde ein Intron von 80 bp (bp 40 – 119) in der 1250 bp großen genomischen 5 β-POR-Sequenz aus D. lanata gefunden (Abbildung 10). Dies konnte durch Sequenzierung der durch RT-PCR erhaltenen mRNA-Sequenz der 5 β-POR aus D. lanata bestätigt werden (Abbildung 11). Die CDS des 5 β-POR-Gens umfasste somit 1170 bp (1 – 39; 120 – 1250), welche 389 Aminosäuren kodierten. Sequenzen der anderen Digitalis - und Isoplexis -Arten wurde in gleicher Weise aufbereitet. Alle genomischen 5 β-POR-Sequenzen wiesen ein Intron an analoger Stelle im Gen auf (vgl. Tabelle 7; GenBank-Einträge).
III.1.1.4 Genbankeinträge Die Digitalis und Isoplexis 5 β-POR Gensequenzen wurden mit den abgeleiteten Aminosäuresequenzen unter folgenden Acc.-Nr. (Tabelle 7) in der Genbank NCI Databases GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi) veröffentlicht:
Tabelle 7: Genbankeinträge der 5 β-POR in NCI Database (GenBank). Pflanzen Art Acc.-Nr. Pflanzen Art Acc.-Nr. Digitalis cariensis DQ213016 D. nervosa DQ263619 D. ciliata DQ213019 D. parviflora AY585866 D. davisiana DQ213020 D. purpurea AY585868 D. ferruginea AY738711 D. subalpina AY750898 D. grandiflora AY585865 D. thapsi AY738712 D. laevigata DQ213017 D. viridiflora DQ213018 D. lanata AY585867 D. sibirica DQ213022 D. lanata AY574950; mRNA Isoplexis isabelliana DQ218317 D. lutea DQ213021 I. canariensis DQ218315 D. mariana AY738710 I. chalcantha DQ218316 D. minor DQ499643 I. sceptrum DQ218318 D. minor subsp. dubia DQ466889
D. sibirica = Hybrid von D. grandiflora x D. laevigata .
51 Ergebnisse
III.1.1.5 Vergleich der Nukleotidsequenzen
D.lan ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGAT AGGCGCTGCAAAGGTAATAATAATAAGTTAACATTTATCG 60 I.sce ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAAAGGTAA---GTTAACATTTATCG 57 D.car ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGAT AGGCGCTGCAAAGGTAATAATAATAAGTTAACATTTATCG 60 D.lae ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAA GGGTAA---GTTAACATTTATCG 57 D.ner ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAAAGGTAA---GTTGGGGACATTTATTTTTG 57 D.fer ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAA GGGTAA---GTTAACATTTATCG 57 D.obs ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAAAGGTAA---GTTAACATTTATCG 57 I.can ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCCGCAAAGGTAA---GTTAACATTTATCG 57 I.isa ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTAAAACAAAGGTAA---GTTAACATTTATCG 57 I.cha ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAAAGGTAA---GTTAACATTTATCG 57 D.sub ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAAAGGTAA---GTTAACATTTATCG 57 D.dub ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAAAGGTAA---GTTAACATTTATCG 57 D.par ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCTTTTCTGCTTTTAAGGTAA---GTTAACATTTATCG 57 D.cil ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAAAGGTAA---GTTAACATTTATCG 57 D.dav ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAAAGGTAG---GTTAACATTTATCG 57 D.gra ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAAAGGTAA---GTTAACATTTATCG 57 D.sib ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAAAGGTAA---GTTAACATTTATCG 57 D.vir ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAAAGGTAA---GTTAACATTTATCG 57 D.lut ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAAAGGTAA---GTTAACATTTATCG 57 D.pur ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAAAGGTAA---GTTA CCATT CATCG 57 D.tha ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAAAGGTAA---GTTA CCATT CATCG 57 D.mar ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAAAGGTAA---GTTA CCATT CATCG 57 D.min ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAAAGGTAA---GCCCTAC CCATT CATCG 57 ************************** *** * * * **** * * **** ** *
D.lan CATAATTGCAA------CAATCCTAGCTATTTATGTGTAATCTGACTGGTAATTGGTTG 113 I.sce CATAATTGCAA------CAATCCTAGCTATTTATGTGCCCCAATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 D.car CATAATTGCAA------CAATCCTAGCTATTTATGTGTAATCTGACTGGTAATTGGTTG 113 D.lae CATAATTGCAA------CAATCCTAGCTATTTATGTGTAATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 D.ner CATAATTGCAA------CAATCCTAGCTATTTATGTGTAATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 D.fer CATAATTGCAA------CGGGGATCCTAGCTATTTATGTGTAATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 D.obs CATAATTGAAAAAA------CAATCCTAGCTATTTATGTGTAATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 I.can CATAATTGCAA------CAATCCTAGCTATTTATGTGTAATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 I.isa CATAATTGCAA------CAATCCTAGCTATTTATGTGTAATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 I.cha CATAATTGCAA------CAATCCTAGCTATTTATGTGTAATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 D.sub CATAATTGCAA------CAATCCTAGCTATTTATGTGTAATCTGGGGGCTGGTAATTGGTTG 110 D.dub CATAATTGCAA------CAATCCTAGCTATTTATGTGTAATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 D.par CATAATTGCAATTTGCAATTTGCAATTTGCAACAATCCTAGCTATTTATGTGTAATCTGACTGGTAATTGGTTG 117 D.cil CATAATTGCAA------CAATCCTAGCTATTTATGTGT GATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 D.dav CATAATTGCAA------CAATCCTAGCTATTTATGTGT GATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 D.gra CATAATTGCAA------CAATCCTAGCTATTTATGTGT GATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 D.sib CATAATTGCAA------CAATCCTAGCTATTTATGTGT GATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 D.vir CATAATTGCAA------CAA CCCTAGCTATTTATGTGTAATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 D.lut CATAATTGCAA------CAA CCCTAGCTATTTATGTGTAATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 D.pur CATAATT ACAA------CAATCCTA CT TATTTATGTGTAATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 D.tha CATAATT ACAA------CAATCCTA CT TATTTATGTGTAATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 D.mar CATAATT ACAA------CAATCCTA CT TATTTATGTGTAATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 D.min CATAATT ACAA------CAATCCTAGCTATTTATGTGTAATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 ******* ** * * **** ********** ***** **************
Abbildung 12 : Ausschnitt des Nukleotid-Alignments der Intron-haltigen 5 β-POR Gen- sequenzen. Introns grau unterlegt; D.lan = D. lanata ; I.sce = I. sceptrum ; D.car = D. cariensis ; D.lae = D. laevigata ; D.ner = D. nervosa ; D.fer = D. ferruginea ; D.obs = D. obscura (Acc.- Nr.: AJ555127, Roca-Pérez et al., 2004); I.can = I. canariensis ; I.isa = I. isabelliana ; I.cha = I. chalcantha ; D.sub = D. subalpina ; D.dub = D. minor subsp. dubia ; D.par = D. parviflora ; D.cil = D. ciliata ; D.dav = D. davisiana ; D.gra = D. grandiflora ; D.sib = D. sibirica ; D.vir = D. viridiflora ; D.lut = D. lutea ; D.pur = D. purpurea ; D.tha = D. thapsi ; D.mar = D. mariana; D.min = D. minor .
52 Ergebnisse
Um den Grad der Homologien innerhalb der 5 β-POR Sequenzen zu ermitteln, wurden die Gen-Sequenzen der Digitalis - und Isoplexis -Spezies in einem Nukleotid-Alignment miteinander verglichen. Für das Alignments wurde das im Internet frei zugängliche Programm http://www.ebi.ac.uk/ clustalw/index.html verwendet. Das Alignment der Intron- haltigen Gensequenzen ist in Abbildung 12 in Auszügen dargestellt. Das vollständige Nukleotid-Alignment ist in den Anlagen (VII.2.1) zu finden. Übereinstimmungen der Sequenzen sind mit „ *“ gekennzeichnet, Abweichungen sind umrahmt und/oder fett dargestellt. Die Introns der Sequenzen sind in Abbildung 12 hell -grau hervorgehoben. Es fällt auf, das die Introngrößen innerhalb der Digitalis -Arten variierten: So wiesen die genomischen 5 β-POR-Sequenzen von D. lanata , D. cariensis und D. parviflora längere Introns als die anderen untersuchten Digitalis - und Isoplexis -Spezies auf. Diese waren durch genomische Sequenzen von 1247 bp mit je einem 77 bp umfassenden Intron (Position bp 40 – 116) charakterisiert. Die genomische 5 β-POR-Sequenz von D. cariensis wies die gleiche Struktur wie die von D. lanata auf (CDS: 1 – 39; 120 – 1250), während D. parviflora ein noch größeres Intron von 84 bp in der Sequenz besaß (CDS: 1 – 39; 124 – 1254) (vgl. Anlage VII.2.1). Neben den unterschiedlichen Introngrößen waren im Vergleich der CDS-Sequenzen (Intron-frei) weitere Abweichungen zu finden. Insgesamt kam es im Vergleich der jeweils 1170 Nukleotide umfassenden CDSs an 120 Positionen zu Abweichungen. Genomische und cDNA 5 β-POR-Sequenzen waren in den untersuchten Arten zu 96 % identisch. Die Abweichungen konnten eine Base einer einzelnen Sequenz betreffen (ca. 62 %), oder es traten gruppierte Abweichungen innerhalb mehrerer Sequenzen (ca. 38 %) auf. Als Beispiel für eine einzelne Abweichung sei hier das Auftreten von Guanin bei D. nervosa an Position 119 anstelle von Adenosin bei allen anderen Digitalis - und Isoplexis -Arten aufgeführt (Anlage VII.2.1). Eine gruppierte Abweichung war unter anderem an Position 144, bzw. 147 ( D. lanata , D. cariensis )/151 ( D. parviflora ) zu finden. Hier kam es zur Ausbildung von drei Gruppierungen mit je Cytosin, Thymin oder Adenosin an dieser Position (Anlage VII.2.1). Die Veränderungen in den Nukleotidsequenzen (120 Positionen) führten in 45 % der Fälle zu Veränderungen der abgeleiteten Aminosäuresequenzen (Anlage VII.2.2). Diese Veränderungen in den Basen-Folgen ließen sich zum Erstellen von Phylogrammen nutzen (siehe III.1.7).
53 Ergebnisse
III.1.1.6 Vergleich der Aminosäuresequenzen Es wurde ein Alignment auf der Ebene der 5 β-POR Aminosäuresequenzen durchgeführt. Hierzu wurden die abgeleiteten Aminosäuresequenzen in das Alignment-Programm (vgl. III.1.1.5) eingegeben, um den Grad der Übereinstimmung zu ermitteln.
D.cil MSWWWAGAIGAAKKKLEEDGGGGAPTKHSSVALLLLLVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.dav MSWWWAGAIGAAKKKLEEDDAPTKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.gra MSWWWAGAIGAAKKKLEEDDAPTKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.sib MSWWWAGAIGAAKKKLEEDDAPTKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.vir MSWWWAGAIGAAKKKLEEDDAPTKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 I.can MSWWWAGAIGAAKKKLEEDDAP SKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 I.isa MSWWWAGAIGATTTTKKKLEEDDAP SKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 I.cha MSWWWAGAIGAAKKKLEEDDAP SKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.par MSWWWAGAIGSSSSAKKKLEEDDAP SKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.fer MSWWWAGAIGAA RKKLEEDDAPPKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.lae MSWWWAGAIGAA RKKLEEDDAPPKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.ner MSWWWAGAIGAAKKKSSSSEEDDAPPKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.sub MSWWWAGAIGAAKKKLEEDDAP SKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.dub MSWWWAGAIGAAKKKLEEDDAP SKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.lan MSWWWAGAIGAAKK RLEEDDA QPKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.car MSWWWAGAIGAAKK RLEEDDAPPKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 I.sce MSWWWAGAIGAAKKKLEEDDA QPKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.obs MSWWWAGAIGAAKKKLEEDDAPPKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.lut MSWWWAGAIGAAKKKLDDDDEDDAPTKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.mar MSWWWAGAIGAAKKKLEEDDAPPKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.tha MSWWWAGAIGAAKKKLEEDDAPPKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.pur MSWWWAGAIGAAKKKLEEDDAPPKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.min MSWWWAGAIGAAKKKLEEDDAPPKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 **********:::*: :**.* .*******:*****************************
D.cil VARRTRPARRRRHEDNPINYIQCDISDPDDSQAKLSPLTDVTHVFYVTWANRSTEQENCEANS 120 D.dav VARRTRPAWHEDNPINYIQCDISDPDDSQAKLSPLTDVTHVFYVTWANRSTE PENCEANS 120 D.gra VARRTRPAWHEDNPINYIQCDISDPDDSQAKLSPLTDVTHVFYVTWANRSTEQENCEANS 120 D.sib VARRTRPAWHEDNPINYIQCDISDPDDSQAKLSPLTDVTHVFYVTWANRSTEQENCEANS 120 D.vir VARRTRPAWHEDNPINYIQCDISDPDDSQAKLSPLTDVTHVFYVTWANRSTEQENCEANS 120 I.can VARRTRPAWHEDNPINY VQCDISDPDDSQAKLS HLTDVTHVFYVTWANRSTEQENCEANS 120 I.isa VARRTRPAWHEDNPINY VQCDISDPDDSQAKLS HLTDVTHVFYVTWANRSTEQEN REANS 120 I.cha VARRTRPAWHEDNPINY VQCDISDPDDSQAKLS HLTDVTHVFYVTWANRSTEQENCEANS 120 D.par VARRTRPSSSSWHEDNPINY VQCDISDPDDSQAKLSPLTDVTHVFYVTWANRSTEQENCEANS 120 D.fer VARRTRPAWHEDNPINY VQCDISDPDDSQAKLSPLTDVTHVFYVTWANRSTEQENCEANS 120 D.lae VARRTRPAWHEDNPINY VQCDISDPDDSQAKLSPLTDVTHVFYVTWANRSTEQENCEANS 120 D.ner VARRTRPAWHEDNPINY VQCDISDPDDSQAKLSPLTDVTHVFYVTWANRSTEQENCEANS 120 D.sub VARRTRPAWHEDNPINY VQCDISDPDDSQAKLSPLTDVTHVFYVTWANRSTEQENCEANS 120 D.dub VARRTRPAWHEDNPINY VQCDISDPDDSQAKLSPLTDVTHVFYVTWANRSTEQENCEANS 120 D.lan VARRTRPAWHEDNPINY VQCDISDPDDSQAKLSPLTDVTHVFYVTWANRSTEQENCEANS 120 D.car VARRTRPAWHEDNPINY VQCDISDPDDSQAKLSPLTDVTHVFYVTWANRSTEQENCEANS 120 I.sce VARRTRPVVVVWHEDNPINY VQCDISDPDDSQAKLSPLTDVTHVFYVTWANRSTEQENCEANS 120 D.obs VARRTRPAWHEDNPINY VQCDISDPDDSQAKLSPLTDVTHVFYVTWANRSTEQENCEANS 120 D.lut VARRTRPAWHEDNPINY VQCDISDPDDSQAKLSPLTDVTHVFYVTWANRSTEQENCEANS 120 D.mar VARRTRPAWHEDNPINYIQCDISDPDDS LAKLSPLTDVTHVFYVTCCCCANRSTE PENCEANS 120 D.tha VARRTRPAWHEGGGGNPINYIQCDISDPDDS LAKLSPLAAAADVTHVFYVTWANRSTE PENCEANS 120 D.pur VARRTRPAWHEDNPINYIQCDISDPDDS LAKLSPLTDVTHVFYVTWANRSTE PENCEANS 120 D.min VARRTRPAWHEDNPINYIQCDISDPDDSQAKLSPLTDVTHVFYVTWANRPPPPTE PEN REANS 120 ******* **.*****:********** **** *:********* ***.** ** ****
Abbildung 13: Ausschnitt des Aminosäure-Alignments der 5 β-POR Proteinsequenzen. „ *“ = Übereinstimmungen der Aminosäuren; „ :“ = Ersatz der Aminosäure(n) durch strukturell sehr ähnliche Aminosäure(n); „ .“ = Ersatz der Aminosäure(n) durch ähnliche Aminosäure(n); Die Abkürzungen der Spezies sind in Abbildung 12 aufgeführt.
54 Ergebnisse
Das Aminosäure-Alignment ist Ausschnittsweise in Abbildung 13 dargestellt. Das gesamte Alignment ist in den Anlagen (VII.2.2) zu finden. Die Größenunterschiede der genomischen 5 β-POR Gensequenzen beruhten ausschließlich auf unterschiedliche Introngrößen (vgl. III.1.6) und hatten keine Auswirkung auf die Länge der CDS. Alle 5 β-PORs wurden durch 1170 bp kodiert und umfassten 389 Aminosäuren. Die abgeleiteten 5 β-POR Aminosäuresequenzen der untersuchten Arten waren zu 96 % identisch. Wie im Alignment der Gensequenzen dargestellt, wies auch der Vergleich der putativen Aminosäuresequenzen punktuelle Abweichung (72 %) und gruppierte Abweichungen (28 %) auf (Abbildung 13, Anlage VII.2.2). So zeigte die Aminosäuresequenz von D. ciliata an Position 31 eine punktuelle Veränderung. Die in allen anderen Sequenzen an dieser Position auftretende Aminosäure Isoleucin, war bei D. ciliata durch Leucin ersetzt. Als Beispiel für eine gruppierte Abweichung ist die Position 78 zu nennen. Hier bildeten sich zwei Gruppen aus, welche an dieser Position entweder ein Isoleucin oder ein Valin aufwiesen (Abbildung 13). Im Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen waren drei größere konservierte Bereiche, Position 32 – 67, 130 – 166 und 253 – 281, sowie ein konservierter Anfangs- und Endbereich erkennbar (Anlage VII.2.2).
55 Ergebnisse
III.1.1.7 Phylogramm Um Vermutungen über verwandtschaftliche Beziehungen der Digitalis - und Isoplexis -Arten aufstellen zu können, wurde ein Phylogramm basierend auf den Intron-freien 5 β-POR Gen- sequenzen erstellt (vgl. II.2.11).
D. minor
1 97/56/63 D. purpurea r
e
62/67/75 t
s
u 100/99/99 D. thapsi l
C D. mariana
D. ciliata 61/-/61
2
r
63/-/70 D. davisiana e
t
s
u 83/75/51 D. grandiflora l
C 100/100/100 D. viridiflora
D. ferruginea D. lanata 57/59/63 I. sceptrum
I. canariensis 4
r
e 99/99/96 t I. chalcantha s
u
60/59/- l 56/60/- I. isabelliana C D. laevigata 64/63/-
3
r
D. nervosa e
t
s
69/58/57 u
l
D. cariensis C D. obscura * D. parviflora
61/54/- D. subalpina D. lutea
P. tremuloides
A. thaliana
10 Änderungen
Abbildung 14: Maximum Parsimony (MP) Phylogramm der Intron-freien 5 β-POR Gen- sequenzen verschiedener Digitalis - und Isoplexis -Arten. Outgroups: A. thaliana (Acc.-Nr.: AAP37838), P. tremuloides (Acc.-Nr.: AAO63776). Die jeweiligen Bootstrap-Werte des Maximum Parsimony, Maximum Likelihood und Neighbour-Joining sind in entsprechender Reihenfolge am, bzw. über der Verzweigung (Branchpoint) angegeben (> 50 %). * = D. obscura (Acc.-Nr.: AJ555127, Roca -Pérez et al., 2004).
56 Ergebnisse
Als „outgroups“ wurden die Gensequenzen zweier Proteine mit unbekannter Funktion aus Arabidopsis thaliana und Populus tremuloides gewählt, welche große Homologien zu den 5 β- POR Gensequenzen aufwiesen. Die Bootstrap-Werte, welche sich über den jeweiligen Abzweigungen (Branchpoints) der Stammbäume befinden, stellen ein Maß für die Auflösung, d.h. für die Wahrscheinlichkeit der dargestellten Verzweigung, dar (Felsenstein, 1985). Bootstrap-Werte > 80 % entsprechen einer guten Auflösung. Mit sinkender %-Angabe sinkt auch die Verlässlichkeit der entsprechenden Darstellung. Werte unter 50 % werden als nicht mehr aussagekräftig erachtet und aus diesem Grund nicht aufgeführt. Im dargestellten Phylogramm ist eine Cluster-Bildung der Spezies D. minor , D. purpurea , D. thapsi und D. mariana zu erkennen, in welchem sich D. minor als Schwester zu den übrigen Spezies zeigt (Abbildung 14, Cluster 1). Das zweite Cluster setzt sich aus den Digitalis -Arten D. ciliata , D. davisiana , D. grandiflora und D. viridiflora zusammen. Diese Gruppe scheint innerhalb der restlichen Digitalis - und Isoplexis -Arten integriert, was jedoch nur durch eine relativ geringe Auflösung (56 %/60 %/-) untermauert wird (Abbildung 14, Cluster 2). Die verbleibenden Digitalis -Arten D. ferruginea , D. lanata , D. laevigata , D. nervosa , D. cariensis , D. obscura , D. parviflora , und D. subalpina bilden, in Schwesternschaft zu D. lutea und Cluster 2, eine letzte große Gruppe (Cluster 3), welche sich in mehrere Gruppierungen aufspaltet. Diese Verzweigungen werden allerdings nur durch relativ niedrige Auflösungen gestützt (Abbildung 14). Interessant ist die Stellung von Isoplexis : I. canariensis , I. chalcantha und I. isabelliana bilden mit einer sehr hohen Auflösung (99 %/99 %/96 %) einen Cluster innerhalb der Gattung Digitalis (Abbildung 14, Cluster 4). Auch I. sceptrum ist in Digitalis integriert, stellt sich allerdings zusammen mit D. lanata separat gruppiert dar.
57 Ergebnisse
III.1.2 Klonierung der 5-3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (3 β-HSD) III.1.2.1 PCR/RT-PCR Zur Amplifizierung der 3 β-HSD wurden PCRs (II.2.6) mit genomischer DNA aus D. lanata und den in Tabelle 8 dargestellten Primerkombinationen durchgeführt:
Tabelle 8: Verwendete Primerkombinationen zur Amplifizierung der 3 β-HSD. Primerkombination Primerpaar Annealing-Temperatur VII HSDdira/HSDrev 57 °C VIII HSDdirb/ HSDrev 57 °C IX HSDdirc/ HSDrev 57 °C
Auf dem im Anschluss durchgeführten 1-%igem Agarosegel war bei Primerkombination VII und IX ein PCR-Produkt erkennbar (Abbildung 15). Unter Verwendung von Primerkombination VIII war es, auch bei Modifikationen der PCR Bedingungen, nicht möglich ein PCR-Produkt zu amplifizieren. Um den 3 β-HSD Full-Length-Klon zu erhalten, wurden nachfolgende PCRs mit der Primerkombination VII durchgeführt.
M 1 2 3
1500 bp ca. 860 bp 1000 bp ca. 760 bp
Abbildung 15: PCR mit genomischer DNA von D. lanata . 1 – Primerkombination (PK) VII; 2 – PK VIII; 3 – PK IX.
Zur Amplifizierung von 3β-HSD Genen aus verschiedenen Digitalis - und Isoplexis -Arten wurden PCRs mit Primerkombination VII und genomischer DNA der jeweiligen Pflanzen durchgeführt. Es wurden 19 Digitalis -Spezies, bzw. -Subspezies und 4 Isoplexis -Spezies (vgl. II.1.2) getestet. Wie aus Abbildung 16 ersichtlich, ergab die PCR mit genomischer DNA von Digitalis purpurea , D. thapsi , D. ferruginea , D. grandiflora , D. mariana , D. parviflora und D. lanata jeweils ein PCR-Produkt. Aus den übrigen getesteten Digitalis -Spezies, sowie aus allen getesteten Isoplexis -Spezies, konnte kein PCR-Produkt amplifiziert werden.
58 Ergebnisse
M1234 5 6 7 8 9 M1234 5 a) b)
1000 bp 1000 bp 800 bp 800 bp 600 bp 600 bp
Abbildung 16: PCR mit Primerkombination VII und genomischer DNA. a) Digitalis - Spezies. M – Marker; 1 – D. purpurea ; 2 – D. obscura ; 3 – D. thapsi ; 4 – D. ferruginea ; 5 – D. grandiflora ; 6 – D. subalpina ; 7 – D. mariana; 8 – D. parviflora ; 9 – D. lanata. b) Isoplexis -Spezies. M – Marker; 1 – Kontrolle ( D. lanata ); 2 – I. canariensis ; 3 – I. sceptrum ; 4 – I. chalcantha; 5 – I. isabelliana .
Zur späteren Ermittlung der mRNA Sequenz wurde eine RT-PCR mit cDNA von D. lanata mit Primerkombination VII durchgeführt. Es ergab sich ein PCR-Produkt mit einer Größe von ca. 780 bp (Abbildung 17).
M 1
1000 bp 800 bp ca. 780 bp 600 bp
Abbildung 17: RT-PCR mit cDNA von D. lanata und Primerkombination VII. M – Marker; 1 – RT-PCR-Produkt.
59 Ergebnisse
III.1.2.2 Klonierung der PCR-Produkte Die amplifizierten (RT-)PCR-Produkte wurden im Folgenden in den Vektor pCR ®2.1-TOPO ® (3,9 kb) kloniert. Mit den insertierten Vektoren wurden kompetente One Shot TOP10 E. coli Zellen transformiert. Es wurde hierbei analog der Klonierung der 5 β-POR-Gene verfahren (vgl. III.1.1.2). Der erfolgreiche Einbau des 3 β-HSD Gens wurde mittels Eco RI-Restriktions- verdau (II.2.10.3) überprüft. In Abbildung 18 ist dies am Beispiel der 3 β-HSD aus D. lanata dargestellt.
M 1 2 3
1000 bp 800 bp ca. 860 bp
Abbildung 18: Überprüfung der Klonierung von 3 β-HSD aus D. lanata . M – Marker; 1 – PCR mit genomischer DNA und Primerkombination VII; 2 – Plasmid mit Insert 3β- HSD/Primerkombination VII (TOPO/HSD/lanata) ; 3 – EcoRI-Restriktionsverdau vom Plasmid TOPO/HSD/lanata.
Mit D. purpurea , D. thapsi , D. ferruginea , D. grandiflora , D. mariana und D. parviflora wurde analog verfahren. Positive Klone wurden im Anschluss sequenziert (vgl. II.2.10.4).
III.1.2.3 Bearbeitung erhaltener Nukleotidsequenzen Die Sequenzen wurden analog der unter III.1.1.3 für 5 β-POR beschriebenen Methode bearbeitet. Für die Sequenzierung der 3 β-HSD-Gene wurden die auf dem pCR ®2.1-TOPO Vektor befindlichen Primer T7 und M13 verwendet. In Abbildung 19 und Abbildung 20 sind exemplarisch die genomischen Teilsequenzen der 3 β-HSD aus D. lanata dargestellt. In Sequenz hsd/a war der bei der vorangegangenen PCR eingesetzte Primer HSDdira, in Sequenz hsd/ b der Primer HSDrev zu finden. Die genomische 3 β-HSD Sequenz wurde folglich vollständig in den pCR ®2.1-TOPO Vektor eingebaut.
60 Ergebnisse
>hsd/a -_M13_uni__-43__ 13..929 of trace file (Plus/Plus) TACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGCCCTCTAGATGCATGCTCGAGCGGCCGCCAGTGTGATGGATATCTGCA GAATTCGCCCTT ATGTCGTCAAGCCAAGGT GATGCTTCTTGTAATTTCATATCTCCATTTAGTAGATCTCAATT CCTCTAGACTAGATCTAATTAAACAGTTTATATGTTATTGACAGGTTGGAGGGTAAAGTGGCAATCATCACCGG AGCCGCTAGCGGCATCGGCGAGGAGACGGCAAGATTGTTCGTGGAGCATGGCGCCTCAGTGGTGGTGGCGGACG TCCAGGACGAATTGGGGCGCCAGGTCGTCGCTTCCGTAAACTCTGACGACAAGATAAGTTACTACCACTGCGAC GTCAGAGATGAAAAACAAGTGGCGGCCACCGTCCGCTACGCGGTGGAGAAATACGGGCGCCTCGACATCATGCT GAGCAACGCCGGAGTCTTCGGGGCCTTGATGACGAACGTAATCGATCTCGACATGGTTGACTTTGAAAATGTAT TGGCGACTAACGTGCGCGGAGTTGCCAACACTATAAAGCACGCGGCACGAGCCATGGTGGAGGGGAAGGTCAAG GGGTCCATCATTTGCACCGCCAGCGTGTCGGCGAGCCTTGGAGGCATGGGCCCGCCCGCTTACACGGCTTCCAA ACACGCCGTCCTGGGCCTAGTCAAGGGCGCTTGCGCCGAGTTGGGGGTGCACGGGATCCGAGTCAACTCGGTGG CGCCGTACGGTGTGGCGACCCCGATGCCGTGCAGTGCTTACGGAATGACACCGAGTCAGATGGAGGAGGCCAAT AACTCCAGGGCTAACTTGAAGGGGGTGGTTTTTGAAGGCTAAGCACGTAGCTGAGGCGGCTCTCTTCTTGGCTT CCGATGAGTCGGCTTATGTCAGTGGACA Abbildung 19: Erhaltene 5´-3´ 5 β-POR-Teilsequenz des Plasmids TOPO/HSD/lanata. Unterstrichen: Primer HSDdira; grau hinterlegt: Startcodon.
>hsd/b-_M13_rev__-49__ 39..902 of trace file (Plus/Minus) AGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCGCCCT CTAACGCACGACGGTGAAGCCGCCGTCTACAGCCAAGTTTT GTCCACTGACATAAGCCGACTCATCGGAAGCCAAGAAGAGAGCCGCCTCAGCTACGTGCTTAGCCTTCAAAACC ACCCCCTTCAAGTTAGCCCTGGAGTTATTGGCCTCCTCCATCTGACTCGGTGTCATTCCGTAAGCACTGCACGG CATCGGGGTCGCCACACCGTACGGCGCCACCGAGTTGACTCGGATCCCGTGCACCCCCAACTCGGCGCAAGCCG CCTTGACTAGGCCCAGGACGGCGTGTTTGGAAGCCGTGTAAGCGGGCGGGCCCATGCCTCCAAGGCTCGCCGAC ACGCTGGCGGTGCAAATGATGGACCCCTTGACCTTCCCCTCCACCATGGCTCGTGCCGCGTGCTTTATAGTGTT GGCAACTCCGCGCACGTTAGTCGCCAATACATTTTCAAAGTCAACCATGTCGAGATCGATTACGTTCGTCATCA AGGCCCCGAAGACTCCGGCGTTGCTCAGCATGATGTCGAGGCGCCCGTATTTCTCCACCGCGTAGCGGACGGTG GCCGCCACTTGTTTTTCATCTCTGACGTCGCAGTGGTAGTAACTTATCTTGTCGTCAGAGTTTACGGAAGCGAC GACCTGGCGCCCCAATTCGTCCTGGACGTCCGCCACCACCACTGAGGCGCCATGCTCCACGAACAATCTTGCCG TCTCCTCGCCGATGCCGCTAGCGGCTCCGGTGATGATTGCCACTTTACCCTCCAACCTGTCAATAACATATAAA CTGTTTAATTAGATCTAGTCTAGAGGAATTGAGATCTACTAAATGGAGA Abbildung 20 : Erhaltene 3´-5´ 5 β-POR-Teilsequenz des Plasmids TOPO/HSD/lanata. Unterstrichen: Primer HSDrev; grau hinterlegt: Stopcodon.
ATGTCGTCAA AGCCAAGGTG ATGCTTCTTG TAATTTCATA TCTCCATTTA GTAGATCTCA 60 ATTCCTCTAG ACTAGATCTA ATTAAACAGT TTATATGTTA TTGACAGGTT GGAGGGTAAA 120 GTGGCAATCA TCACCGGAGC CGCTAGCGGC ATCGGCGAGG AGACGGCAAG ATTGTTCGTG 180 GAGCATGGCG CCTCAGTGGT GGTGGCGGAC GTCCAGGACG AATTGGGGCG CCAGGTCGTC 240 GCTTCCGTAA ACTCTGACGA CAAGATAAGT TACTACCACT GCGACGTCAG AGATGAAAAA 300 CAAGTGGCGG CCACCGTCCG CTACGCGGTG GAGAAATACG GGCGCCTCGA CATCATGCTG 360 AGCAACGCCG GAGTCTTCGG GGCCTTGATG ACGAACGTAA TCGATCTCGA CATGGTTGAC 420 TTTGAAAATG TATTGGCGAC TAACGTGCGC GGAGTTGCCA ACACTATAAA GCACGCGGCA 480 CGAGCCATGG TGGAGGGGAA GGTCAAGGGG TCCATCATTT GCACCGCCAG CGTGTCGGCG 540 AGCCTTGGAG GCATGGGCCC GCCCGCTTAC ACGGCTTCCA AACACGCCGT CCTGGGCCTA 600 GTCAAGGGCG CTTGCGCCGA GTTGGGGGTG CACGGGATCC GAGTCAACTC GGTGGCGCCG 660 TACGGTGTGG CGACCCCGAT GCCGTGCAGT GCTTACGGAA TGACACCGAG TCAGATGGAG 720 GAGGCCAATA ACTCCAGGGC TAACTTGAAG GGGGTGGTTT TGAAGGCTAA GCACGTAGCT 780 GAGGCGGCTC TCTTCTTGGC TTCCGATGAG TCGGCTTATG TCAGTGGACA AAACTTGGCT 840 GTAGACGGCG GCTTCACCGT CGTGCGTTAG 870 Abbildung 21: Gesamtsequenz der 3 β-HSD aus genomischer DNA aus D. lanata ; unterstrichen: Introns.
Nach Umschreiben von hsd/b in den korrespondierenden 5´-3´ Strang (http://searchlauncher.bcm.tmc.edu.seq-util/Options /revcomp.html) wurden die beiden
61 Ergebnisse
Sequenzen zu einer vollständigen genomischen 3 β-HSD ( D. lanata ) Sequenz zusammengesetzt (Abbildung 21). Die komplettierte genomische Sequenz zeigte eine hohe Übereinstimmung mit der veröffentlichten mRNA-Sequenz der 3 β-HSD aus D. lanata von Finsterbusch et al. (1999). Des Weiteren konnte in der genomischen 3 β-HSD Sequenz ein Intron lokalisiert werden (Abbildung 21). Durch Sequenzierung der durch RT-PCR erhaltenen mRNA, bzw. cDNA Sequenz der 3 β-HSD ( D. lanata ) konnte dies bestätigt werden (Abbildung 22). Die CDS des 3β-HSD Gens aus D. lanata umfasste 780 bp, welche für 259 Aminosäuren kodierten.
ATGTCGTCAA AGCCAAGGTT GGAGGGTAAA GTGGCAATCA TCACCGGAGC CGCTAGCGGC 60 ATCGGCGAGG AGACGGCAAG ATTGTTCGTG GAGCATGGCG CCTCAGTGGT GGTGGCGGAC 120 GTCCAGGACG AATTGGGGCG CCAGGTCGTC GCTTCCGTAA ACTCTGACGA CAAGATAAGT 180 TACTACCACT GCGACGTCAG AGATGAAAAA CAAGTGGCGG CCACCGTCCG CTACGCGGTG 240 GAGAAATACG GGCGCCTCGA CATCATGCTG AGCAACGCCG GAGTCTTCGG GGCCTTGATG 300 ACGAACGTAA TCGATCTCGA CATGGTTGAC TTTGAAAATG TATTGGCGAC TAACGTGCGC 360 GGAGTTGCCA ACACTATAAA GCACGCGGCA CGAGCCATGG TGGAGGGGAA GGTCAAGGGG 420 TCCATCATTT GCACCGCCAG CGTGTCGGCG AGCCTTGGAG GCATGGGCCC GCCCGCTTAC 480 ACGGCTTCCA AACACGCCGT CCTGGGCCTA GTCAAGGGCG CTTGCGCCGA GTTGGGGGTG 540 CACGGGATCC GAGTCAACTC GGTGGCGCCG TACGGTGTGG CGACCCCGAT GCCGTGCAGT 600 GCTTACGGAA TGACACCGAG TCAGATGGAG GAGGCCAATA ACTCCAGGGC TAACTTGAAG 660 GGGGTGGTTT TGAAGGCTAA GCACGTAGCT GAGGCGGCTC TCTTCTTGGC TTCCGATGAG 720 TCGGCTTATG TCAGTGGACA AAACTTGGCT GTAGACGGCG GCTTCACCGT CGTGCGTTAG 840 Abbildung 22: cDNA-Sequenz der 3 β-HSD aus D. lanata .
Die Sequenzen der anderen bearbeiteten Digitalis -Spezies wurden entsprechend aufgearbeitet. Alle genomischen 3 β-HSD Sequenzen wiesen ein Intron an analogen Stellen im Gen auf (vgl. Tabelle 9; Genbankeinträge).
III.1.2.4 Genbankeinträge
Tabelle 9: Genbankeinträge der 3β-HSD in NCI Database (GenBank). Pflanzen Art Acc.-Nr. Digitalis lanata DQ466890 D. lanata AY844960; mRNA D. mariana AY844959 D. grandiflora AY789449 D. parviflora AY789450 D. ferruginea AY789451 D. thapsi AY789452 D. purpurea AY789453
62 Ergebnisse
Die D. lanata 3 β-HSD mRNA-Sequenz und die 3 β-HSD Gensequenzen der übrigen sequenzierten Digitalis -Spezies wurden zusammen mit den entsprechenden Aminosäure- sequenzen in der Genbank (NCI Databases GenBank; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ entrez/query.fcgi) veröffentlicht und sind unter den in Tabelle 9 aufgeführten Acc.-Nrn. zu finden.
III.1.2.5 Vergleich der Nukleotidsequenzen Die Alignments der 3 β-HSD Sequenzen auf Nukleotid-Ebene wurden mit dem Internet- Programm http://www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html durchgeführt. Es wurde je ein Alignment basierend auf den Gen- und auf den mRNA-Sequenzen erstellt.
D.par ATGTCGTCAAAGCCAAGGTGATGCTTCTTTTAATTTCATGTCTCCATTTAATAGATCTCA 60 D.tha ATGTCGTCAAAGCCAAGGTGATGCTTCTTTTAATTTCATGTCTCCATTTAATAGATCTCA 60 D.lan ATGTCGTCAAAGCCAAGGTGATGCTTCTT GTAATTTCAT ATCTCCATTTAGGGGTAGATCTCA 60 D.gra ATGTCGTCAAAGCCAAGGTGATG GTTCTT GTAATTTCAT ATCTCCATTTAATAGATCTCA 60 D.fer ATGTCGTCAAAGCCAAGGTGATGATTCTT GTAATTTCAT ATCTCCATTTAATAGATCT GA 60 D.pur ATGTCGTCAAAGCCAAGGTGATGATTCTT GTAATTTCAT ATCTCCATTTAATAGATCT GA 60 D.mar ATGTCGTCAAAGCCAAGGTGATGATTCTT GTAATTTCAT ATCTCCATTTAATAGATCT GA 60 *********************** ***** ********* ********** ******* *
D.par ATTCCTCTAGACTAGATCTAATTAAACAG------TTTATATGTTATTGAAAGGTTGGAG 114 D.tha ATTCCTCTAGACTAGATCTAATTAAACAG------TTTATATGTTATTGAAAGGTTGGAG 114 D.lan ATTCCTCTAGACTAGATCTAATTAAACAG------TTTATATGTTATTGACCCCAGGTTGGAG 114 D.gra ATTCCTCTAGACTAGATCTAATTAAGCAG------TTTAT TTGTTATTGAAAGGTTGGAG 114 D.fer ATTCCTCTAGACTAGATCTAAT GG AATGA ATTTTAATTTTATTT GTTTGTTA ATGAAAGGTTGGA T 120 D.pur ATTCCTCTAGACTAGATCTAAT GG AATGA ATTTTAATTTTATTT GTTTGTTA ATGAAAGGTTGGA T 120 D.mar ATTCCTCTAGACTAGATCTAAT GG AATGA ATACATAC--TTTAT TTGTTA ATGAAAGGTTGGA T 118 ********************** * *** * ***** *** ********
D.par GGTAAAGTGGCAATCATCACCGGGGCCGCTAGCGGCATCGGCGAGGAGGCGGCAAGATTG 174 D.tha GGTAAAGTGGCAATCATCACCGGGGCCGCTAGCGGCATCGGCGAGGAGGCGGCAAGATTG 174 D.lan GGTAAAGTGGCAATCATCACCGG AGCCGCTAGCGGCATCGGCGAGGAGAAAACGGCAAGATTG 174 D.gra GGTAAAGTGGTTTTAATCATCACCGG AGCCGCTAGCGGCATCGGCGAGGAGGCGGCAAGATTG 174 D.fer GGTAAAGTGGCAATCATCACCGG AGC TGCTAGCGGCATCGGCGAGGAGGCGGCAAGATTG 180 D.pur GGTAAAGTGGCAATCATCACCGG AGC TGCTAGCGGCATCGGCGAGGAGGCGGCAAGATTG 180 D.mar GGTAAAGTGGCAATCATCACCGG AGC TGCTAGCGGCATCGGCGAGGAGGCGGCAAGATTG 178 ********** ************ ** ********************* ***********
D.par TTCGTGGAGCATGGCGCCTCAGTGGTGGTGGCGGACGTCCAGGACGAATTGGGGCGCCAG 234 D.tha TTCGTGGAGCATGGCGCCTCAGTGGTGGTGGCGGACGTCCAGGACGAATTGGGGCGCCAG 234 D.lan TTCGTGGAGCATGGCGCCTCAGTGGTGGTGGCGGACGTCCAGGACGAATTGGGGCGCCAG 234 D.gra TTCGTGGAGCATGGCGCCTCGGGGGTGGTGGTGGCGGACGTCCAGGACGAATTGGGGCAAAACCAG 234 D.fer TTCGTGGAGCATGGCGC TTCAGTGGTGGTGGCGGACGTCCAGGACGAATTGGG TCGCCAG 240 D.pur TTCGTGGAGCATGGCGC TTCAGTGGTGGTGGCGGACGTCCAGGACGAATTGGG TCGCCAG 240 D.mar TTCGTGGAGCATGGCGC TTCAGTGGTGGTGGCGGACGTCCAGGACGAATTGGGTCGCCAG 238 ***************** ** ******************************** * ****
Abbildung 23: Ausschnitt des Nukleotid-Alignments der Intron-haltigen 3 β-HSD Gen- sequenzen. Introns sind grau unterlegt; Übereinstimmende Nukleotide sind mit „ *“ gekennzeichnet, abweichende sind farblich (weiß, grau, schwarz unterlegte, eingerahmte Basen), bzw. fett hervorgehoben. D.lan = D. lanata ; D.gra = D. grandiflora ; D.fer = D. ferruginea; D.par = D. parviflora ; D.sub = D. subalpina ; D.pur = D. purpurea ; D.tha = D. thapsi ; D.mar = D. mariana.
63 Ergebnisse
Ein Ausschnitt des Alignments der Intron-haltigen Gensequenzen ist in Abbildung 23 dargestellt. Alle Gensequenzen wiesen ein Intron im Anfangsbereich auf (Abbildung 23), welches innerhalb der Digitalis -Spezies in der Größe variierte. So zeigten D. mariana , D. purpurea und D. ferruginea ein längeres Intron als die anderen untersuchten Digitalis- Spezies. Während D. parviflora , D. thapsi , D. lanata und D. grandiflora durch eine genomische Sequenz von 870 bp mit einem Intron von bp 18 – 107 (Intronlänge 90 bp) charakterisiert waren, wies die Sequenz von D. mariana ein um 4 Nukleotide längeres Intron auf (Genlänge 874 bp; Intron: 18 – 111). Die genomischen Sequenzen von D. purpurea und D. ferruginea waren durch ein um 6 Nukleotide längeres Intron (Genlänge 876 bp; Intron: 18 – 113) charakterisiert (Abbildung 23; Anlage VII.2.3). Neben den Unterschieden die Intronlänge betreffend, traten auch Abweichungen zwischen den CDS-Sequenzen (Intron-frei) der untersuchten Digitalis-Spezies auf. Insgesamt kam es beim Alignment der CDS-Sequenzen (780 bp) an 41 Positionen zu Abweichungen. Dies konnte eine Base einer einzelnen Sequenz betreffen (= punktuelle Abweichung; 34 %), oder eine Base an gleicher Position innerhalb mehrerer Sequenzen (= gruppierte Abweichung; 66 %). Der Austausch von Cytosin durch Thymin an Position 125 bei D. grandiflora stellt beispielhaft eine punktuelle Abweichung dar (Abbildung 23). Als Beispiel für eine gruppierte Abweichung sei hier die Position 140, bzw. 144 ( D. mariana )/146 ( D. purpurea, D. ferruginea ) genannt. Hier wiesen D. parviflora , D. thapsi , D. lanata und D. grandiflora ein Cytosin auf, während bei D. ferruginea , D. purpurea und D. mariana ein Thymin auftrat (Abbildung 23). Die Veränderungen in den Nukleotidsequenzen führten in 37 % zu Veränderungen der abgeleiteten Aminosäuresequenzen (Abbildung 24). Die ermittelten 3 β-HSD Sequenzen zeigten 95 % Übereinstimmung untereinander sowie mit der 3 β-HSD mRNA-Sequenz von Finsterbusch et al. (Acc. - Nr.: AJ345026). Das vollständige Alignment der Gensequenzen ist in den Anlagen (VII.2.3) zu finden.
III.1.2.6 Vergleich der Aminosäuresequenzen Um die Homologie der 3 β-HSD Proteine innerhalb der Digitalis -Arten beurteilen zu können, wurde ein Alignment auf Ebene der Aminosäuresequenzen durchgeführt (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html). In Abbildung 24 ist dieses Alignment dargestellt. Die untersuchten 3 β-HSD Sequenzen umfassten jeweils 259 Aminosäuren, kodiert durch je 780 bp. Es waren sowohl punktuelle Abweichungen (fett hervorgehoben), als auch „geclusterte“ Veränderungen (weiß, grau, schwarz unterlegte, eingerahmte Aminosäuren) im
64 Ergebnisse
Aminosäure-Alignment zu erkennen (vgl. Abbildung 24). Hierbei stellten 33 % punktuelle und 67 % gruppierte Veränderungen in den Aminosäuresequenzen dar (Abbildung 24).
D.lan MSSKPRLEGKVAIITGAASGIGEETTTTARLFVEHGASVVVADVQDELGRQVVASVNSDDKIS 60 D.tha MSSKPRLEGKVAIITGAASGIGEEAARLFVEHGASVVVADVQDELGRQVVASVNSDDKIS 60 D.par MSSKPRLEGKVAIITGAASGIGEEAARLFVEHGASVVVADVQDELGRQVVASVNSDDKIS 60 D.gra MSSKPRLEGKVVVVVIITGAASGIGEEAARLFVEHGASVVVADVQDELGHHHHQVVASVNSDDKIS 60 D.fer MSSKPRL DGKVAIITGAASGIGEEAARLFVEHGASVVVADVQDELGRQVVASVNSDDKIS 60 D.pur MSSKPRL DGKVAIITGAASGIGEEAARLFVEHGASVVVADVQDELGRQVVASVNSDDKIS 60 D.mar MSSKPRL DGKVAIITGAASGIGEEAARLFVEHGASVVVADVQDELGRQVVASVNSDDKIS 60 *******:***.************:*********************:*************
D.lan YYHCDVRDEKQVAATVRYAVEKYGRLDIIIIMLSNAGVFGALMTNVIDLDMVDFENVLATNVR 120 D.tha YYHCDVRDEKQVAATVRYAVEKYGRLDVMMSNAGVFGALMTNVIDLDMVDFENVLATNVR 120 D.par YYHCDVRDEKQVAATVRYAVEKYGRLDVMMSNAGVFGALMTNVIDLDMVDFENVLATNVR 120 D.gra Y HHCDVRDEKQVAATVRYAVEKYGRLDVMMSNAGVFGALMTNVIDLDMVDFENVLATNVR 120 D.fer Y HHCDVRDEKQV EATVRYAVEKYGRLDVM VSNAGVFGALMT TVIDLDMVDFENVLATNVR 120 D.pur Y HHCDVRDEKQV EATVRYAVEKYGRLDVM VSNAGVFGALMT TVIDLDMVDFENVLATNVR 120 D.mar Y HHCDVRDEKQV EATVRYAVEKYGRLDVM VSNAGVFGALMT TVIDLDMVDFENVLATNVR 120 *:********** **************:*:***********.******************
D.lan GVANTIKHAARAMVEGKVKGSIICTASVSASLGGMGPPAYTASKHAVLGLVKGACAELGV 180 D.tha GVANTIKHAARAMVEGKVKGSIICTASVSASLGGMGPPAYTASKHAVLGLVKGACAELGV 180 D.par GVANTIKHAARAMVEGKVKGSIICTASVSASLGGMGPPAYTASKHAVLGLVK AACAELGV 180 D.gra GVANTIKHAARAMVEGKVKGSIICTASVSASLGGMGPPAYTASKHAVLGLVK AACAELGV 180 D.fer GVANTIKHAARAMVEG NVKGSIICTASVSASLGGMGPPAYTASKHAVLGLVK AACAELGV 180 D.pur GVANTIKHAARAMVEG NVKGSIICTASVSASLGGMGPPAYTASKHAVLGLVK AACAELGV 180 D.mar GVANTIKHAARAMVEG NVKGSIICTASVSASLGGMGPPAYTASKHAVLGLVK AACAELGV 180 ****************:***********************************.*******
D.lan HGIRVNSVAPYGVATPMPCSAYGMTPSQMEEANNSRANLKGVVLKAKHVAEAALFLASDE 240 D.tha HGIRVNSVAPYGVATPMPCSAYGMTPSQMEEANNSRANLKGVVLKAKHVAEAALFLASDE 240 D.par HGIRVNSVAPYGVATPMPCSAYGMTPSQME DANNSRANLKGVVLKAKHVAEAALFLASDE 240 D.gra HGIRVNSVAPYGVATPMPCSAYGMTPSQME DANSSRANLKGVVLKAKHVAEAALFLASDE 240 D.fer HGIRVNSVAPYGVATPMPCSAYGMTPSQME DAN CSRANLKGVVLKAKHVAEAALFLASDE 240 D.pur HGIRVNSVAPYGVATPMPCSAYGMTPSQME DAN CSRANLKGVVLKAKHVAEAALFLASDE 240 D.mar HGIRVNSVAAAAAYGVATPMPCSAYGMTGGGGSQMEEANNSRANLKGVVLKAKHVAEAALFLASDE 240 *********.*************** ****:** **************************
D.lan SAYVSGQNLAVDGGFTVVR 259 D.tha SAYVSGQNLAVDGGFTVVR 259 D.par SAYVSGQNLAVDGGFTVVR 259 D.gra SAYVSGQNLAVDGGFTVVR 259 D.fer SAYVSGQNLAVDGGFTVVR 259 D.pur SAYVSGQNLAVDGGFTVVR 259 D.mar SAYVSGQNLAVDGGFTVVR 259 ******************* Abbildung 24: Aminosäure-Alignment der 3 β-HSD Proteinsequenzen. „ *“ = Übereinstimmungen der Aminosäuren; „ :“ = Ersatz der Aminosäure(n) durch strukturell sehr ähnliche Aminosäure(n); „ .“ = Ersatz der Aminosäure(n) durch ähnliche Aminosäure(n); Die Abkürzungen der Spezies sind in Abbildung 23 aufgeführt.
An Position 47 war ausschließlich bei D. grandiflora Arginin durch Histidin ersetzt (R47H), was einer punktuellen Abweichung entsprach. An Position 62 trat eine gruppierte Abweichung auf. Hier bildeten sich zwei Gruppen aus, welche an dieser Position entweder Histidin ( D. lanata, D. thapsi , D. parviflora ) oder Tyrosin ( D. grandiflora , D. ferruginea ,
65 Ergebnisse
D. purpurea , D. mariana ) aufwiesen. Die 3β-HSD Aminosäuresequenzen stimmten zu 95 % überein.
III.2 Southern-Blot-Analyse der 5 β-POR aus D. lanata Die Anzahl von 5 β-POR Genen im D. lanata Genom wurde mittels Southern-Blot-Analyse untersucht.
III.2.1 Elektrophoretische Trennung restriktierter DNA im Agarosegel Die mit den Restriktionsendonukleasen Eco RI, Bam HI und Hind III geschnittene genomische DNA aus D. lanata (II.2.11.1) wurde in einem 0,8-%igem Agarosegel elektrophoretisch getrennt (II.2.11.2).
M 1 2 3
10000 bp 5000 bp 2500 bp 1000 bp 600 bp
Abbildung 25: Elektrophoretische Trennung der restriktierten genomischen DNA ( D. lanata ). M – Marker; 1 – Verdau mit Eco RI; 2 – Verdau mit Bam HI; 3 – Verdau mit Hind III.
Das Gel ist in Abbildung 25 dargestellt. Nach Behandlung des Agarosegels gemäß des Southern-Blot-Verfahrens (II.2.12.3) wurde die DNA auf die HybondTM-N+ Membran geblottet.
III.2.2 Gewinnung der unmarkierten Sonde Zur Gewinnung der Sonde wurden 5 PCR-Ansätze mit dem Plasmid TOPO/ D.lan /POR als Template durchgeführt und danach die amplifizierten PCR-Produkte aufgereinigt und einkonzentriert (II.2.12.4). Hierzu wurden alle 5 PCR-Ansätze über eine QIAquick® Säule
(vgl. II.2.9) gereinigt und die DNA mit 50 L H 2O bd eluiert. Die Konzentration der so gereinigten DNA betrug 50 ng/ L (Abbildung 26). Im Anschluss wurden 14 L gereinigtes
66 Ergebnisse
PCR-Produkt mit 14 L H 2O versetzt (Endkonzentration 25 ng/ L) und wie beschrieben (II.2.12.4) radioaktiv markiert.
M 1 2 3 4 5 6
1500 bp ca. 1250 bp 1000 bp
Abbildung 26: Überprüfung der Qualität und Quantität der unmarkierten Sonde. M – Marker; 1 – gereinigte Sonde (4 L); 2, 3, 4, 5, 6 – PCR-Produkt vor Reinigung (je 5 L).
III.2.3 Überprüfung der Markierung der Sonde Die Effektivität der Markierung (Einbaurate) wurde mittels Szintillationszähler ermittelt. Zu diesem Zweck wurde der markierten Sonde sowohl vor, als auch nach Abtrennung der nicht gebundenen (radioaktiven) Nukleotide, je 1 L Probe entnommen. Diese Proben wurden unverdünnt im Szintillationszähler vermessen. Die Einbaurate, welche mindestens 50 % betragen sollte, errechnete sich folgendermaßen:
Counts nach Säule (berechnet auf Gesamtvolumen nach Säule) x 100 Einbaurate [%] = Counts vor Säule (berechnet auf Gesamtvolumen vor Säule)
Tabelle 10: Bestimmung der Einbaurate mittels Szintillationszähler. Ansatz I Ansatz II Volumen vor Säule [ L] 70 78 Volumen nach Säule [ L] 60 75 Counts vor Säule (pro L Probe) 767131 588662 Counts vor Säule (berechnet auf Gesamtvolumen [ L]) 53699170 35319720 Counts nach Säule (pro L Probe) 365387 394435 Counts nach Säule (berechnet auf Gesamtvolumen [ L]) 28500186 29582625 Einbaurate [%] 53 % 83 %
67 Ergebnisse
Im Anschluss wurden die Ansätze vereinigt (135 L; 78 % Einbaurate) und zur Hybridisierung verwendet.
III.2.4 Southern-Blot Die Hybridisierung und Waschen des Blots wurde wie unter II.2.12.5 beschrieben durchgeführt. Die Detektion der Signale erfolgte mittels Kodak X-Omat Film und Phosphoimager (Abbildung 27).
1 2 3 10 kb
5 kb
3 kb
1 kb
Abbildung 27: Southern-Blot mit D. lanata DNA und 5 β-POR als Sonde. Markierung der Sonde mit [α-32P] dCTP; 1 – Verdau mit Eco RI; 2 – Verdau mit Bam HI; 3 – Verdau mit Hind III.
Der Restriktionsverdau mit Eco RI ergab 2 Banden von ca. 1,5 kb und 10,0 kb Größe. Der Verdau mit der Restriktionsendonuklease Hind III resultierte ebenfalls in 2 Banden, welche Größen von ca. 1,0 kb und 10,0 kb aufwiesen. Der Southern-Blot basierend auf dem Restriktionsverdau mit Bam HI zeigte 3 Banden mit Größen von ca. 1,0 kb, 1,5 kb und 7 kb.
68 Ergebnisse
III.3 Heterologe Expression von Enzymen der Cardenolid-Biosynthese aus D. lanata III.3.1 Expression von rekombinanter 5 β-POR (r5 β-POR) Zur heterologen Expression der 5β-POR aus D. lanata wurde das pQE-30, -31, -32 System verwendet (II.2.13). Um das rekombinante Protein im richtigen Leserahmen zu exprimieren, wurde der pQE-30 Vektor ausgewählt.
III.3.1.1 PCR und Ligation Um das 5β-POR Gen in den pQE-30 Expressions-Vektor klonieren zu können, war es nötig, sowohl das gewünschte Insert, als auch den zu verwendeten Vektor mit korrespondierenden Restriktionsendonukleasen zu schneiden. Hierbei war darauf zu achten, dass die Schnittstellen dieser Restriktionsendonukleasen innerhalb der Multiple-Cloning-Site des pQE-30 Vektors, nicht aber innerhalb der 5β-POR Sequenz lagen. Letzteres wurde mit dem Programm Webcutter 2 (http://rna.lundberg.gu.se/cutter2) überprüft. Es wurden daraufhin die beiden Restriktionsendonukleasen Sph I und Sal I ausgewählt und Primer mit den entsprechenden Schnittstellen generiert (PORsphdir/PORsalrev). Im Anschluss wurde eine Standard-PCR mit diesen Primern bei einer Annealing-Temperatur von 63 °C durchgeführt. Es konnte ein PCR- Produkt von ca. 1100 bp amplifiziert werden (Abbildung 28). Dies entsprach der mit diesen Primern zu erwartenden 5β-POR-Bande.
M 1
1500 bp ca. 1100 bp 1000 bp
Abbildung 28: PCR mit Primerkombination PORsphdir/PORsalrev und DNA von D. lanata. 1 – Marker; 2 – PCR-Produkt.
Sowohl das gereinigte PCR Produkt als auch der pQE-30 Vektor wurden mit den Restriktionsendonukleasen Sph I und Sal I geschnitten und anschließend ligiert (vgl. II.2.13.1). Mit diesem Vekor-Insert-Konstrukt wurden kompetente M15[pREP4] Zellen transformiert (II.2.13.3) und aus angelegten Bakterienkulturen Plasmide isoliert.
69 Ergebnisse
M 1 2
1500 bp 1000 bp ca. 1100 bp
Abbildung 29: Überprüfung der Insertion von 5 β-POR ( D. lanata ) in pQE-30. M – Marker; 1 – pQE-30 mit Insert 5 β-POR/Primerkombination PORsphdir/PORsalrev (= pQE-30/16); 2 –Restriktionsverdau pQE-30/16 mit Sph I und Sal I.
Die erfolgreiche Ligation dieser Plasmide wurde mittels Restriktionsverdau (analog II.2.13.1) mit den Restriktionsendonukleasen Sph I und Sal I überprüft. Wie in Abbildung 29 zu sehen, war es möglich, den positiven Klon pQE-30/16 zu isolieren. Das isolierte Plasmid pQE-30/16 wurde zur Sequenzierung eingeschickt (II.2.10.4).
III.3.1.2 Bearbeitung erhaltener Nukleotidsequenzen Die Sequenzierung von pQE-30/16 erfolgte ab den Primern pQE_for und pQE_rev mit folgendem Ergebnis: Die bei der PCR eingesetzten Primer PORsphdir und PORsalrev wurden in den erhaltenen Sequenzen pQE-30/16/I (Abbildung 30) und pQE-30/16/II (Abbildung 31) wieder gefunden, was die Schlussfolgerung zuließ, dass die gewünschte 5 β-POR Sequenz vollständig eingebaut wurde. pQE-30/16/I _pQE_for_ 6..913 of trace file (Plus/Plus) AAATTTATTTGCTTTGTGAGCGGATAACAATTATAATAGATTCAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGAA TTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGAGAGGATCG CATCACCATCACCATCAC GGATCCGCATGCAAAAGGTT GGAAGAAGATGAC GCACAGCCAAAGCATTCGAGCGTGGCGTTGATAGTTGGGGTAACCGGAATCATCGGCAACA GCCTGGCGGAGATCCTGCCACTGGCCGACACCCCCGGCGGTCCGTGGAAGGTATACGGCGTCGCCCGCCGCACC AGACCCGCCTGGCATGAGGATAATCCGATCAATTACGTCCAGTGCGACATATCCGATCCAGATGACTCCCAAGC CAAGCTGTCACCTCTGACTGATGTTACCCACGTGTTCTACGTTACCTGGGCTAATCGATCCACCGAACAAGAAA ACTGTGAAGCCAATAGCAAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATGCAGTTATCCCTAATTGCCCCAATTTGAAGCAC ATCTCATTGCAGACTGGGAGGAAGCATTACATGGGACCATTTGAATCCTACGGGAAAATAGAATCCCATGATCC ACCCTACACTGAGGATTTGCCCAGGTTGAAGTACATGAACTTTTACTATGATTTAGAGGATATTATGCTTGAGG AGGTGGAGAAGAAGGAGGGTTTGACTTGGTCGGTTCATCGCCCAGGGAATATATTCGGGTTTTCTCCATATAGT ATGATGAATTTGGTGGGTACCCTTTGTGTTTATGCAGCTATTTGCAAACACGAGGGAAAGGTTTTGAGGTTTAC TGGTTGTAAGGCTGCGTGGGATGGGTACTCGGATTGCTCTGATGCGGATTTGATAGCGGAGCATCATATTTGGG CTGCAGTGGATCCTTATG Abbildung 30: Erhaltene 5´-3´ Teilsequenz des Plasmids pQE-30/16. Grau hinterlegt: Startcodon; schwarz unterlegt: 6 x His; unterstrichen: Primer VH120sphdir.
70 Ergebnisse pQE-30/16/II _pQE_rev_ 38..1019 of trace file (Plus/Minus) GTCGACAACCATGTCAAGGAACAATC TTGTAAGCTTTTGCCTTGTCAATCCAAGAAATGAACGCATTCTTGGAG TTCCTAAATCCCAAAAAGCCATGCTCCTTGCTCTTGTTCATACTATCCAGGAAACACTCATTCCCAAGTATAAC ATCACCAAACCACCAAATTCCGACATCCTTCAGTTTCGTAGGTGTCAATTCATTCTCCCTCACGATTTCCTCCC AAACCGGCTCCTTCCCCTTCATTAAATCCTGCAATTTCAAATCCACCCCTTCTTCATACTCTCCACACCCTACT CCAAACTGCTCCGCCAACACCTTCCAAAAATGCTTCCATTTAAACACATCTCCATTACTCACATTAAAGGCCTC GTTTTTTGCATAAGGATCCACTGCAGCCCAAATATGATGCTCCGCTATCAAATCCGCATCAGAGCAATCCGAGT ACCCATCCCACGCAGCCTTACAACCAGTAAACCTCAAAACCTTTCCCTCGTGTTTGCAAATAGCTGCATAAACA CAAAGGGTACCCACCAAATTCATCATACTATATGGAGAAAACCCGAATATATTCCCTGGGCGATGAACCGACCA AGTCAAACCCTCCTTCTTCTCCACCTCCTCAAGCATAATATCCTCTAAATCATAGTAAAAGTTCATGTACTTCA ACCTGGGCAAATCCTCAGTGTAGGGTGGATCATGGGATTCTATTTTCCCGTAGGATTCAAATGGTCCCATGTAA TGCTTCCTCCCAGTCTGCAATGAGATGTGCTTCAAATTGGGGCAATTAGGGATAACTGCATCAAGCACGTTCCT GAACATTTTGCTATTGGCTTCACAGTTTTCTTGTTCGGTGGATCGATTAGCCCAGGTAACGTAGAACACGTGGG TAACATCAGTCAGAGGTGACAGCTTGGCTTGGGAGTCATCTGGATCGGATATGTCGCACTGGACGTAATTGATC GGATTATCCTCATGCCAGGCGGGTCTGGTGCG Abbildung 31: Erhaltene 3´-5´ Teilsequenz des Plasmids pQE-30/16. Grau hinterlegt: Stopcodon; unterstrichen: Primer VH1188salrev.
Sequenz pQE-30/16/I wies darüber hinaus den His-tag auf. Die Sequenz pQE-30/16/II lag als 3´-5´ Strang (Plus/Minus) vor (Abbildung 31) und musste folglich in den korrespondierenden 5´-3´ Strang umgeschrieben werden (http://search. launcher.bcm.tmc.edu.sequtil/Options/ revcomp.html). Die erhaltene Sequenz wurde mit der Sequenz pQE-30/16/I zu einer 5 β-POR (D. lanata) Sequenz zusammengesetzt. Diese wurde mit dem Programm http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST auf Übereinstimmungen mit der gewünschten 5 β-POR- Sequenz aus D. lanata überprüft.
III.3.1.3 Expressionsprofil Nach der Sequenz-Überprüfung des pQE-30/16 Klons wurden Versuche zur Überexpression durchgeführt.
M 1 2 3 4 5 [kDa] 75 50 ca. 43 kDa 37
25
15
Abbildung 32: SDS-Gel des Expressionsprofils von r5 β-POR ( D. lanata ). M – Marker (Precision Protein Standards TM , BioRad); 1 – Nullwert (vor Induktion mit IPTG, 0h); 2 – 1 h nach Induktion; 3 – 2 h nach Induktion; 4 – 4 h nach Induktion; 5 – 6 h nach Induktion.
71 Ergebnisse
Als erstes wurde die Abhängigkeit zwischen Inkubations-Dauer nach Induktion und Gen- Expression überprüft. Um dieses Expressionsprofil zu bestimmen, wurde nach II.2.15 vorgegangen. Die nach 0 h, 1 h, 2 h, 4 h, und 6 h entnommen Proben wurden mittels 12-%iger SDS-PAGE mit anschließender Silberfärbung analysiert. Abbildung 32 zeigt bei ca. 43 kDa eine induzierte Bande, welche bei 6-stündiger Inkubation am deutlichsten zu erkennen ist.
III.3.1.4 Bestimmung der Proteinlöslichkeit Zur Bestimmung der Löslichkeit der r β5-POR unter Standard-Expressionsbedingungen (37 °C 1, mM IPTG, 6 h Inkubation) wurde wie unter II.2.16 beschrieben verfahren. Die Proben wurden mittels 12-%igem SDS-PAGE mit anschließender Silberfärbung analysiert. In Abbildung 33 ist deutlich eine induzierte Bande bei ca. 43 kDa zu erkennen (Bahn 2, 6 h), welche sich hauptsächlich in der Fraktion der unlöslichen, d.h. unter nativen Bedingungen partikel- oder membrangebundenen Proteine wieder findet (Pfeile, Bahn 2 und 4).
M 1 2 3 4 [kDa] 75 ca. 43 kDa 50 37
25 20
15
Abbildung 33: SDS-Gel der Bestimmung der Proteinlöslichkeit von r5β-POR ( D. lanata ). M – Marker (Precision Plus Protein Standards TM , BioRad); 1 – Nullwert (vor Induktion mit IPTG, 0h); 2 – 6 h nach Induktion (1 mM IPTG, 37 °C); 3 – lösliche Proteine; 4 – unlösliche Proteine.
72 Ergebnisse
III.3.1.5 Denaturierende His-tag-Reinigung Um in unlöslicher Form überexprimierte r5 β-POR reinigen zu können, wurde eine denaturierende His-tag-Reinigung (II.2.17.1) durchgeführt.
M 1 2 3 4 5 6 [kDa] 75 ca. 43 kDa 50 37
25 20
15
Abbildung 34: SDS-PAGE der denaturierenden His-tag-Reinigung der r5 β-POR (D. lanata ). M – Marker (Precision Plus Protein Standards TM , BioRad); 1 – Nullwert (vor Induktion mit IPTG, 0h); 2 – 6 h nach Induktion (1 mM IPTG, 37 °C); 3 – Bakterienlysat; 4 – Säulendurchfluss; 5 – Waschfraktion; 6 – Proteineluat mit gereinigter r5 β-POR.
Hierzu wurden M15[pREP4]/pQE-30/16 Zellen aufgearbeitet, welche mit 1 mM IPTG für 6 h bei 37 °C induziert und inkubiert worden waren. Während der Reinigung wurde je eine Probe vor und nach der Induktion, sowie Proben des Bakterienlysats, des Säulendurchflusses, der Waschfraktion und der gereinigten Proteinfraktion genommen. Diese Proben wurden mittels 12-%igem SDS-PAGE (Silberfärbung) analysiert. Unter denaturierenden Bedingungen lies sich ein Protein anreichern, welches im SDS-PAGE ein Molekulargewicht von 43 kDa aufwies (Abbildung 34, Pfeil).
III.3.1.6 Native His-tag-Reinigung Für die im Anschluss folgende Charakterisierung der r5 β-POR war es nötig, das Enzym in nativer, also funktionsfähiger Form zu reinigen. Da unter Standard-Expressionsbedingungen (37 °C, 1 mM IPTG) r5 β-POR vor allem in unlöslicher Form vorlag (Abbildung 33), mussten die Expressionsbedingungen modifiziert werden, um das Protein in löslicher Form exprimieren zu können. Hierzu wurden die Bakterienkulturen mit 0,1 mM IPTG induziert und für 96 h bei 4 °C inkubiert. Es wurde wie unter II.2.17.2 beschrieben verfahren. Für eine nachfolgende SDS-PAGE-Analyse wurden während der Reinigung folgende Proben
73 Ergebnisse genommen: Bakteriensuspension vor und nach Induktion mit IPTG, Bakterienlysat, Säulendurchfluss, Waschfraktion und gereinigte Proteinfraktion (Proteineluat).
[kDa] M 1 2 3 4 5 6 75 ca. 43 kDa 50 37 25 20 15
10
Abbildung 35: SDS-PAGE der nativen His-tag-Reinigung der r5 β-POR ( D. lanata ). M – Marker (Precision Plus Protein Standards TM , BioRad); 1 – Nullwert (vor Induktion mit IPTG, 0h); 2 – 96 h nach Induktion (0,1 mM IPTG, 4 °C); 3 – Bakterienlysat; 4 –Säulend urchfluss; 5 – Waschfraktion; 6 – Proteineluat mit gereinigter r5 β-POR.
Die Proben wurden entsprechend II.2.20.2 aufgearbeitet und mittels 12-%igem SDS-PAGE mit anschließender Silberfärbung analysiert. Wie aus Abbildung 35 ersichtlich, war es möglich, die r5 β-POR nativ zu reinigen. Das Protein zeigt im denaturierenden SDS-Gel ein Molekulargewicht von 43 kDa (Pfeil). Im Durchschnitt ließen sich aus 650 mL Bakteriensuspension ca. 4,5 mg r5 β-POR reinigen.
III.3.1.7 Nachweis der katalytischen Aktivität Zum Nachweis der katalytischen Aktivität der r5 β-POR wurde ein Standard r5 β-POR- Enzymassay, wie unter II.2.23.1 beschrieben, durchgeführt. Es wurde die nativ gereinigte, auf 5β-POR-Assaypuffer umgepufferte und auf einen Proteingehalt von 0,2 mg/mL eingestellte Proteinfraktion verwendet. Als Substrat wurde Progesteron eingesetzt. Der Assay wurde mittels DC (FM I als mobile Phase) und Detektion mit Anisaldehyd-RL ausgewertet (Abbildung 36). Als Negativkontrolle wurde ein Assay mit denaturierter r5β-POR (10 min, 100 °C) verwendet (= Totkontrolle).
74 Ergebnisse
1 2 3 4 1,0
0,8 O O H H r5 β-POR 0,6 H H H H O O NADPH NADP H 0,4 Progesteron 5 β-Pregnan-3,20-dion 0,2
0
Abbildung 36: DC des Aktivitätstest der nativ gereinigten r5 β-POR ( D. lanata ). 1 – Progesteron (Referenz, Rf = 0,55); 2 – Totkontrolle; 3 – aktiver Assay; 4 – 5 β-Pregnan-3,20- dion (Referenz, Rf = 0,7). Rechts daneben: Reaktionsschema der Umsetzung von Progesteron durch r5 β-POR.
Wie aus Abbildung 36 ersichtlich, wird das Substrat Progesteron im aktiven 5β-POR- Enzymassay (Bahn 3) zu 5 β-Pregnan-3,20-dion umgesetzt (Pfeil), während in der Negativkontrolle (Bahn 2) keine Umsetzung stattfindet.
III.3.1.8 Kontrollexperimente Die Kontrollexperimente waren nötig, um Verunreinigungen mit Bakterienenzymen zu ermitteln und um sicherzustellen, dass die Reduktion von Progesteron zu 5 β-Pregnan-3,20- dion nicht durch endogene Bakterienenzyme katalysiert wird. Zu diesem Zweck wurden kompetente M15[pREP4] Zellen mit leeren pQE-30 Vektoren transformiert. Von diesen transformierten Zellen wurden im Anschluss analog II.2.13.4 Kulturen angelegt. Für die Negativkontrollen wurde entsprechend III.3.1.6 induziert und inkubiert (0,1 mM IPTG; 4 °C, 96 h). Nach Ende der Inkubation wurde eine native His-tag-Reinigung durchgeführt (II.2.17.2). Für die nachfolgende SDS-PAGE-Analyse wurden Proben vor und nach der Induktion, sowie vom Bakterienlysat, des Säulendurchflusses, der Waschfraktion und der gereinigten Proteinfraktion genommen. Die Proben wurden wie unter II.2.20.2 beschrieben aufgearbeitet und auf ein 12-%iges SDS-PAGE aufgetragen. Die Detektion erfolgte mittels Silberfärbung. Es konnte kein induziertes, gereinigtes Protein von ca. 43 kDa nachgewiesen werden (Abbildung 37). Zur Quantifizierung der mit-aufgereinigten Bakterienproteine wurden die Proteinkonzentrationen im Proteineluaten bestimmt (Methode nach Bradford, 1976) und mit
75 Ergebnisse der des gereinigten rekombinanten Proteins ins Verhältnis gesetzt: Die Verunreinigungen entsprachen ca. 2,6 % der gereinigten r5 β-POR.
M 1 2 3 4 5 6 [kDa]
75 50 37
25 20
15
Abbildung 37: SDS-PAGE der 5β-POR Negativkontrolle. M – Marker (Precision Plus Protein Standards TM , BioRad); 1 – Nullwert (vor Induktion mit IPTG, 0h); 2 – 96 h nach Induktion (0,1 mM IPTG, 4 °C); 3 – Bakterienlysat; 4 –Säulendurchfluss; 5 – Waschfraktion; 6 – Proteineluat.
Um zu überprüfen, ob die in den Proteineluaten befindlichen, endogenen Bakterienproteine eine katalytische Aktivität bezüglich der Umsetzung von Progesteron aufwiesen, wurde ein Standard-Enzymassay durchgeführt.
1 2 3 4 1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Abbildung 38: DC des Aktivitätstest der 5β-POR Negativkontrolle. FM I; Anisaldehyd-RL (10 min, 100 °C). 1 – Totkontrolle; 2 – aktiver Assay; 3 – Progesteron (Referenz, Rf = 0,55); 4 – 5 β-Pregnan-3,20-dion (Referenz, Rf = 0,7).
76 Ergebnisse
Hierzu wurde analog III.3.1.7 verfahren. Der Assay wurde mittels DC ausgewertet. Es konnte keine Umsetzung von Progesteron festgestellt werden (Abbildung 38).
III.3.2 Expression von rekombinanter Selenomethionin-5β-POR (SeMet5-rβ-POR) Die Herstellung von SeMet-r5β-POR diente der späteren Aufklärung der 3D-Struktur des Enzyms mittels Röntgenkristallographie (vgl. III.5). Für die heterologe Expression von SeMet-5β-POR wurde das pQE-30/16 Plasmid, mit welchem die erfolgreiche Überexpression der r5 β-POR in M15[pREP4]-Zellen durchgeführt worden war (vgl. III.3.1), verwendet. Hierzu wurde das isolierte pQE-30/16 Plasmid in den Methionin-auxotrophen E. coli Stamm B834(DE3) transformiert und die Überexpression der SeMet-r5β-POR wie unter II.2.14 beschrieben durchgeführt.
III.3.2.1 Native His-tag-Reinigung Bei der nativen Reinigung der SeMet-r5 β-POR wurde analog II.2.17.2 vorgegangen. Es wurde ein Bakterienpellet aus 650 mL Bakteriensuspension (II.2.14.4) aufgearbeitet. Die nachfolgende Überprüfung der Expression und Reinigung wurde mittels 12-%igem SDS- PAGE durchgeführt. Als Proben wurde Bakteriensuspension vor und nach Induktion (IPTG), Bakterienlysat, Säulendurchfluss, Waschfraktion und gereinigte SeMet-r5 β-POR-Fraktion verwendet. Die Proben wurden wie unter II.2.20.2 beschrieben aufgearbeitet.
[kDa] M 1 2 3 4 5 6
75 ca. 43 kDa 50 37 25 20
15
Abbildung 39: SDS-PAGE der nativen His-tag-Reinigung der SeMet-r5 β-POR ( D. lanata ). M – Marker (Precision Plus Protein Standards TM , BioRad); 1 – Nullwert (vor Induktion mit IPTG, 0h); 2 – 96 h nach Induktion (0,1 mM IPTG, 4 °C); 3 – Bakterienlysat; 4 – Säulendurchfluss; 5 – Waschfraktion; 6 – Proteineluat mit gereinigter SeMet-r5 β-POR.
77 Ergebnisse
In Abbildung 39 ist das 12%-ige SDS-PAGE dargestellt (Silberfärbung). Es ist deutlich die induzierte, gereinigte SeMet-r5 β-POR Bande bei 43 kDa zu erkennen. Es konnten ca. 3 mg gereinigte SeMet-r5 β-POR gewonnen werden.
III.3.2.2 Nachweis der katalytischen Aktivität Zum Nachweis der katalytischen Aktivität der SeMet-r5 β-POR wurde ein Standard r5 β-POR- Enzymassay, wie unter II.2.23.1 beschrieben, durchgeführt. Die nativ gereinigte Proteinfraktion wurde hierzu in 5β-POR-Assaypuffer umgepuffert und auf einen Proteingehalt von 0,2 mg/mL eingestellt. Als Substrat wurde Progesteron verwendet. Der Assay wurde mittels DC analysiert (FM I, Anisaldehyd-RL). Eine hitzedenaturierte Probe (10 min, 100 °C) diente als Negativkontrolle. Wie aus Abbildung 40 ersichtlich, wurde Progesteron nur im aktiven Assay (Bahn 3), nicht aber in der Kontrolle (Bahn 2), zu 5β-Pregnan-3,20-dion umgesetzt.
1 2 3 4 1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0 Abbildung 40: DC des Aktivitätstest der nativ gereinigten SeMet-r5 β-POR ( D. lanata ). 1 – Progesteron (Referenz, Rf = 0,5); 2 – Totkontrolle; 3 – aktiver Assay; 4 - 5 β-Pregnan-3,20- dion (Referenz, Rf = 0,65).
Die anschließende Kristallisation der SeMet-5β-POR wurde von der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr. Y. Muller (Lehrstuhl für Biotechnik; FAU Erlangen) durchgeführt. Sowohl r5 β- POR, als auch SeMet- r5 β-POR konnten kristallisiert und im Anschluss mittels Röntgendifraktometrie vermessen werden, wobei jedoch die SeMet-r5 β-POR Kristalle Datensätze mit höherer Auflösung ergaben. Diese wurden im Anschluss zur Berechnung des 3D-Modells verwendet. Die Ergebnisse sind in Ko-Autorenschaft mit der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr. Y. Muller (Lehrstuhl für Biotechnik; FAU Erlangen) publiziert (Egerer-Sieber et al., 2006).
78 Ergebnisse
III.3.3 Expression von rekombinanter 3 β-HSD (r3 β-HSD) Die heterologe Expression der 3 β-HSD aus D. lanata wurde mittels des pQE-30 Vektors aus dem pQE-30, -31, -32 System durchgeführt (II.2.13).
III.3.3.1 PCR und Ligation Nach der unter III.3.1.1 für die r5 β-POR beschriebenen Methode, wurden für das Einbringen des 3 β-HSD-Gens in den pQE-30 Vektor Primer mit Schnittstellen der Restriktionsendonukleasen Sph I und Kpn I (HSDsphdir/HSDkpnrev) kreiert. Mit diesen Primern wurde eine RT-PCR mit cDNA von D. lanata bei einer Annealing-Temperatur von 63 °C durchgeführt.
M 1
1000 bp 800 bp ca. 780 bp
Abbildung 41: RT-PCR mit Primerkombination HSDsphdir/HSDkpnrev und cDNA von D. lanata . 1 – Marker; 2 – PCR-Produkt.
Es konnte ein PCR-Produkt von ca. 780 bp amplifiziert werden (Abbildung 41). Das PCR- Produkt und der pQE-30 Vektor wurden, wie unter II.2.13.1 beschrieben, mit den Restriktionsendonukleasen Sph I und Kpn I geschnitten und anschließend miteinander ligiert. Im Anschluss wurden kompetente M15[pREP4] Zellen mit diesem Vektor-Insert-Konstrukt transformiert (II.2.13.3). Aus angelegten Flüssigkulturen einzelner Klone wurden Plasmide isoliert und zur Kontrolle der Ligation und Insertion mit den Restriktionsendonukleasen Sph I und Kpn I geschnitten (analog II.13.1). Es war so möglich den positiven Klon pQE-30/5 zu isolieren (Abbildung 42). Das isolierte Plasmid pQE-30/5 wurde zum Sequenzieren geschickt (II.2.10.4).
79 Ergebnisse
M 1 2
1000 bp 800 bp ca. 780 bp
Abbildung 42: Überprüfung der Insertion von 3 β-HSD ( D. lanata ) in pQE-30. M – Marker; 1 – pQE-30 mit Insert 3 β-HSD/Primerkombination HSDsphdir/HSDkpnrev (= pQE-30/5); 2 – Restriktionsverdau von pQE-30/5 mit Sph I und Kpn I.
III.3.3.2 Bearbeitung erhaltener Nukleotidsequenzen Die Sequenzierung von pQE-30/5 erfolgte mit den auf dem Expressions-Vektor befindlichen Primern pQE_for und pQE_rev. Die erhaltenen Sequenzen wurden wie unter III.3.1.2 beschrieben aufgearbeitet. Es zeigte sich, dass die 3 β-HSD Sequenz vollständig und im richtigen Leserahmen eingebaut worden war.
III.3.3.3 Expressionsprofil Zur Aufklärung des Zusammenhangs zwischen Inkubations-Dauer nach Induktion mit IPTG und Protein-Expression wurde das Expressionsprofil bestimmt (vgl. II.2.15).
M 1 2 3 4 5 [kDa]
75 50 37 ca. 30 kDa 25
Abbildung 43: SDS-Gel des Expressionsprofils von r3 β-HSD ( D. lanata ). M – Marker (Precision Plus Protein Standards TM , BioRad); 1 – Nullwert (vor Induktion mit IPTG, 0h); 2 – 1 h nach Induktion; 3 – 2 h nach Induktion; 4 – 4 h nach Induktion; 5 – 6 h nach Induktion.
80 Ergebnisse
Die nach 0 h, 1 h, 2 h, 4 h, und 6 h nach Induktion mit IPTG entnommen und aufgearbeiteten Proben wurden mittels 12-%iger SDS-PAGE mit anschließender Silberfärbung analysiert. In Abbildung 43 ist eine induzierte Bande von ca. 30 kDa zu erkennen, welche bereits nach 1h Inkubation deutlich hervortritt.
III.3.3.4 Native His-tag-Reinigung Wie aus dem Versuchen zum Expressionsprofil der r3 β-HSD ersichtlich, war es möglich, das rekombinante Protein unter Standard-Expressionsbedingungen (37 °C, 1 mM IPTG) in großer Menge überzuexprimieren. Aus diesem Grund wurde auf eine Modifizierung der Expressionsbedingungen verzichtet. Für die native His-tag-Reinigung der r3 β-HSD wurden Bakterien verwendet, welche mit 1 mM IPTG induziert und im Anschluss für 5 h bei 37 °C inkubiert worden waren. Die Reinigung wurde wie unter II.2.17.2 beschrieben durchgeführt. Während der Reinigung wurden folgende Proben genommen: Bakteriensuspension vor Induktion (1 mM IPTG), Bakteriensuspension nach Induktion und 5-stündiger Inkubation (37 °C), Bakterienlysat, Säulendurchfluss, Waschfraktion und gereinigte Proteinfraktion (Proteineluat). Die Proben wurden entsprechend II.2.20.2 aufgearbeitet und mittels 12-%igem SDS-PAGE analysiert (Silberfärbung) (Abbildung 44).
M 1 2 3 4 5 6 [kDa]
75 50 37 ca. 30 kDa 25 20
Abbildung 44: SDS-PAGE der nativen His-tag-Reinigung der r3 β-HSD ( D. lanata ).; 1 – Nullwert (vor Induktion mit IPTG, 0h); 2 – 5 h nach Induktion (1 mM IPTG, 37 °C); 3 – Bakterienlysat; 4 –Säulendurchfluss; 5 – Waschfraktion; 6 – Proteineluat mit gereinigter r3 β- HSD; M – Marker (Precision Plus Protein Standards TM , BioRad).
In Abbildung 44 (Bahn 6) ist deutlich die gereinigte r3 β-HSD mit einem Molekulargewicht von ca. 30 kDa zu erkennen (Pfeil). Aus 650 mL Bakteriensuspension konnten durchschnittlich ca. 20 mg r3β-HSD gereinigt werden.
81 Ergebnisse
III.3.3.5 Nachweis der katalytischen Aktivität Um die katalytische Aktivität der r3β-HSD zu überprüfen, wurde ein Standard 3 β-HSD- Enzymassay (vgl. II.2.23.2) durchgeführt. Hierzu wurde die nativ-gereinigte, auf r3β-HSD- Assaypuffer umgepufferte und auf einen Proteingehalt von 0,2 mg/mL eingestellte r3β-HSD verwendet. Als Substrat wurde Pregnenolon eingesetzt. Der Assay wurde mittels DC (FM I; Detektion: Anisaldehyd-RL, 10 min 100 °C) ausgewertet. Die mitgeführte Negativkontrolle (= Totkontrolle) wurde wie unter II.2.23.2 beschrieben Hitze-denaturiert. In Abbildung 45 ist die DC dargestellt. Es ist zu sehen, dass im aktiven Assay (Bahn 2) Pregnenolon katalytisch umgesetzt wird, während in der Totkontrolle (Bahn 1) keine Umsetzung stattfindet. Im aktiven Assay ist sowohl Isoprogesteron als auch Progesteron zu finden. Die r3β-HSD ist folglich enzymatisch aktiv.
1 2 3 4 1,0 O O
IPO H H 0,8 3β-HSD PO H H H H H O O 0,6 NAD NADH Pregnenolon Isoprogesteron
0,4 O H
0,2 H H Isomerase O bzw. 0 nicht enzymatische Progesteron Autoisomerisierung
Abbildung 45: DC des Aktivitätstest der nativ gereinigten r3β-HSD ( D. lanata ). 1 – Totkontrolle; 2 – aktiver Assay; 3 – Pregnenolon (PO; Referenz, Rf = 0,45); 4 - Isoprogesteron (IPO; Referenz, Rf = 0,55). Rechts daneben: Reaktionsschema der Umsetzung von Progesteron durch r5 β-HSD.
III.3.3.6 Kontrollexperimente Die 3 β-HSD Kontrollexperimente wurden durchgeführt um eventuell mit-aufgereinigte, endogene Bakterienenzyme zu ermitteln, und um deren Beteiligung an der katalytischen Umsetzung von Pregnenolon zu Isoprogesteron/Progesteron ausschließen zu können. Zur Durchführung der Kontrollexperimente wurden hierzu kompetente M15[pREP4] Zellen mit leeren pQE-30 Vektoren transformiert. Von diesen transformierten Zellen wurden im Anschluss analog II.2.13.4 Zellkulturen angelegt und diese entsprechend III.3.3.4 induziert und inkubiert (1,0 mM IPTG; 37 °C, 5 h). Danach wurde eine native His-tag-Reinigung
82 Ergebnisse durchgeführt (II.2.17.2), bei deren Verlauf Proben vor und nach der Induktion, sowie vom Bakterienlysat, vom Säulendurchfluss, der Waschfraktion und der gereinigten Proteinfraktion genommen wurden. Die Proben wurden wie unter II.2.20.2 beschrieben aufgearbeitet und mittels 12-%igem SDS-PAGE analysiert. Die Detektion erfolgte mittels Silberfärbung. Es konnte kein induziertes, gereinigtes Protein von ca. 30 kDa nachgewiesen werden (Abbildung 46).
M 1 2 3 4 5 6 [kDa]
75 50 37
25 20
15
Abbildung 46: SDS-PAGE der 3β-HSD Negativkontrolle. M – Marker (Precision Plus Protein Standards TM , BioRad); 1 – Nullwert (vor Induktion mit IPTG, 0h); 2 – 5 h nach Induktion (1,0 mM IPTG, 37 °C); 3 – Bakterienlysat; 4 –Säulendurchfluss; 5 – Waschfraktion; 6 – Proteineluat.
Zur Quantifizierung der mit-aufgereinigten Bakterienproteine wurde die Proteinkonzentration im Proteineluat bestimmt (Methode nach Bradford, 1976) und mit der der gereinigten rekombinanten 3β-HSD ins Verhältnis gesetzt: Die Verunreinigungen entsprachen ca. 0,7 % der gereinigten r3 β-HSD. Um zu überprüfen, ob die in Proteineluaten befindlichen endogenen Bakterienproteine eine katalytische Aktivität bezüglich der Umsetzung Pregnenolon aufwiesen, wurde ein 3βHSD Standard-Enzymassay durchgeführt. Hierzu wurde analog III.3.3.5 verfahren. Der Assay wurde mittels DC ausgewertet. Hierbei konnte keine Umsetzung von Pregnenolon zu Progesteron festgestellt werden (Abbildung 47).
83 Ergebnisse
1 2 3 4 1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0 Abbildung 47: DC des Aktivitätstest der r3 β-HSD Negativkontrolle (1,0 mM; 37 °C, 5 h). 1 – Totkontrolle; 2 – aktiver Assay; 3 – Progesteron (Referenz, Rf = 0,50); 4 – Pregnenolon (Referenz, Rf = 0,65)
III.4 Biochemische Charakterisierung der r5 β-POR Die nativ His-tag gereinigte r5 β-POR wurde im Folgenden biochemisch charakterisiert.
III.4.1 Stereospezifität Um die stereospezifische Reduktion der C4 – C5 Doppelbindung in ein 5 β-Produkt zu überprüfen, wurden Standard 5β-POR-Enzymassays (II.2.22.1) mit Progesteron als Substrat durchgeführt.
1 2 3 4 5 1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0 Abbildung 48: DC des r5 β-POR-Aktivitätstest. 1 – Progesteron (Referenz, Rf = 0,55); 2 – Totkontrolle; 3 – aktiver Assay; 4 – 5 β-Pregnan-3,20-dion (Referenz, Rf = 0,7); 5 – 5 α- Pregnan-3,20-dion (Referenz, Rf = 0,75).
84 Ergebnisse
a) a) 1800000 29,88 1600000 1400000
1200000
z
n a
d 1000000
n u
b 800000 A 600000 400000 200000 * #
5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 Zeit [min]
b)b) 28,58 2400000 27,92 2200000 2000000 1800000
1600000
z n
a 1400000
d n
u 1200000 b
A 1000000 800000 600000 400000 200000
5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 Zeit [min] c) c) 29,84
3000000
2500000
z 27,93
n a
d 2000000
n
u b
A 1500000
1000000 *# 500000
5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 Zeit [min]
Abbildung 49: GC Analyse der r5 β-POR Aktivität. a) Progesteron (Referenz, Rt = 29,88 min); Substanz * (Rt = 28,28 min); Substanz # (Rt = 28,73 min). b) 5 β-Pregnan-3,20-dion (Referenz, Rt = 27,92 min) und 5 α-Pregnan-3,20-dion (Referenz, Rt = 28,58 min). c) Aktiver Assay. Progesteron (Rt = 29,84 min); 5 β-Pregnan-3,20-dion (Rt = 27,93 min); Substanz * (Rt = 28,30 min); Substanz # (Rt = 28,74 min).
85 Ergebnisse
Die Assays wurden im Anschluss mittels DC und GC analysiert und ausgewertet. Für die DC wurde FM I als mobile Phase verwendet; die Detektion erfolgte mit Anisaldehyd-RL. Wie aus Abbildung 48 (Bahn 3) und Abbildung 49c ersichtlich, wurde Progesteron ausschließlich in 5β-Pregnan-3,20-dion, nicht aber in 5 α-Pregnan-3,20-dion umgesetzt. Durch GC-MS Analyse war es möglich, für beide im GC-Spektrum des aktiven Assays erkennbaren minoren Komponenten eine Masse von je 314 zu detektieren (Abbildung 50, Pfeile). Dies ließ die Schlussfolgerung zu, dass es sich bei keinem der beiden Produkte um 5α-Pregnan-3,20-dion handeln konnte, da dieses Pregnanderivat, ebenso wie 5 β-Pregnan- 3,20-dion, im Massenspektrum eine Masse von 316 aufweist (Abbildung 51, Pfeile).
a)
50000
40000
z
n
a
d n
u 30000
b A 20000
10000
40 60 80 100 120 140 160 180 200 220240 260 280 300 320 m/z b)
50000 45000 40000
35000 z
n 30000
a d
n 25000
u b
A 20000 15000 10000 5000
40 60 80 100 120 140 160 180 200 220240 260 280 300 320 m/z
Abbildung 50: Massenspektrometrische Analyse der minoren Komponenten. a) Minore Komponente * mit Rt = 28,30 min. b) Minore Komponente # mit Rt = 28,74 min.
86 Ergebnisse
a) 140000
120000
100000
z
n a
d 80000
n
u b
A 60000
40000
20000
40 60 80 100 120 140 160 180 200 220240 260 280 300 320 m/z b)
160000
140000
120000
z n
a 100000
d
n u
b 80000 A 60000 40000 20000
40 60 80 100 120 140 160 180 200 220240 260 280 300 320 m/z
Abbildung 51: Massenspektrometrische Analyse von 5 α- und 5 β-Pregnan-3,20-dion. a) 5β- Pregnan-3,20-dion (Rt = 27,93 min). b) 5α-Pregnan-3,20-dion (Rt = 28,58 min).
87 Ergebnisse
III.4.2 Cosubstrat-Spezifität Es wurde überprüft, ob bei der durch r5 β-POR katalysierten Reduktion das Reduktionsäquivalent NADPH durch NADH ersetzt werden kann. Hierzu wurde ein Standard 5β-POR-Enzymassay (II.2.23.1) mit nativ gereinigter, auf 5β-POR-Assaypuffer umgepufferte r5 β-POR und Progesteron als Substrat durchgeführt. Im regenerierenden System wurde NADP (6,4 mM) durch NAD (6,4 mM) ersetzt. Als Negativkontrolle wurde ein Assay mit denaturierter r5β-POR (10 min, 100 °C) verwendet (= Totkontrolle).
1 2 3 1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Abbildung 52: DC des r5 β-POR-Aktivitätstest mit NADH als Reduktionsäquivalent. 1 – Totkontrolle; 2 – aktiver Assay; 3 – Progesteron (Referenz; Rf = 0,5) und 5 β-Pregnan- 3,20-dion (Referenz; Rf = 0,63).
Die Assays wurden im Anschluss mittels DC und GC analysiert. Die DC wurde mit FMl I als mobile Phase durchgeführt. Die Detektion erfolgte mit Anisaldehyd-RL. Sowohl mittels DC (Abbildung 52, Pfeil Bahn 2) als auch GC (Abbildung 53, Pfeil) konnte eine geringe Umsetzung von Progesteron zu 5 β-Pregnan-3,20-dion in der Anwesenheit von NADH als Reduktionsäquivalent detektiert werden.
88 Ergebnisse
a) a) 29,85 2400000 29,90 2200000 29,84 2000000 1800000 1600000
z 27,93
n 1400000
a d
n 1200000 u
b 1000000 A 800000 600000 * 400000 27,84 * #+ 200000
5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 Zeit [min]
b) b) 3000000 29,90 2800000 29,84 2600000 2400000 2200000 2000000
z 1800000 27,93
n a
d 1600000 n
u 1400000 b
A 1200000 1000000 800000 600000 * 27,84 * + 400000 # 200000
5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 Zeit [min]
Abbildung 53: GC Analyse des r5 β-POR-Aktivitätstest mit NADH als Reduktionsäquivalent. a) Totkontrolle (Progesteron, Rt = 29,85 min; Verunreinigungen (Substanz * und # vgl. Abbildung 49). b) aktiver Assay (5β-Pregnan-3,20-dion, Rt = 27,84 (Pfeil); Progesteron, Rt = 29,90 min; Verunreinigungen (vgl. Abbildung 49): *, Rt = 28,30 min; #, Rt = 28,75 min).
89 Ergebnisse
III.4.3 pH-Optimum Zur Ermittlung des pH-Optimums der r5 β-POR wurde nativ gereinigtes, rekombinantes Enzym auf die entsprechenden Puffer unterschiedlicher pH-Werte (6,0 – 10,5) umgepuffert. Anschließend wurden die Proteinlösungen auf einen Proteingehalt von 0,2 mg/mL mit dem jeweiligen Puffer eingestellt und Standard-Enzymassays (n = 2) (II.2.23.1) mit Progesteron als Substrat durchgeführt. Es wurden folgende Puffer verwendet:
pH 6,0 – 8,0 Clark and Lubs solutions; pH 6,0; pH 6,5; pH 7,0; pH 7,5; pH 8,0 pH 8,0 – 9,0 Tris-HCl pH 8,0; pH 8,5; pH 9,0 pH 8,5 – 10,5 Glycin-NaOH Puffer pH 9,0; pH 9,5; pH 10,0; pH 10,5
Allen Puffern wurden, dem 5β-POR-Assaypuffer entsprechend, 250 mM Saccharose, 2 mM EDTA und 10 mM Mercaptoethanol zugesetzt. Die Assays wurden quantitativ mittels HPLC ausgewertet (II.2.25) und aus den erhaltenen Daten wurde graphisch das pH-Optimum der r5 β-POR ermittelt (Abbildung 54). Es ergab sich die höchste Aktivität bei pH 7,5. Oberhalb von pH 10 und unterhalb von pH 6,5 war keine Aktivität mehr zu erkennen.
m 9 ) g 8 m / t
a 7 k µ
( 6 t ä t
i 5 v i t 4 k
A 3 e
h Clark and Lubs
c 2 s i
f TRIS-HCl i 1 z
e Glycin-NaOH
p 0 s 5 6 7 8 9 10 11 pH-Wert
Abbildung 54: pH-Optimum der r5 β-POR aus D. lanata .
90 Ergebnisse
III.4.4 Temperaturoptimum Das Temperaturoptimum der r5 β-POR wurde mittels Standard 5 β-POR-Enzymassays (n = 2 – 4 ) (II.2.22.1; Substrat: Progesteron) bei verschiedenen Inkubations-Temperaturen (20 °C – 55 °C) ermittelt. Hierzu wurde die nativ gereinigte, auf 5β-POR-Assaypuffer umgepufferte und auf einen Proteingehalt von 0,2 mg/mL eingestellte Proteinlösung verwendet. Das Temperaturoptimum der r5 β-POR lag bei einer Inkubationsdauer von 2 h bei 43 °C; die Aktivierungsenergie betrug 38,64 kJ/mol (Abbildung 55).
a) b) 3,2
15 m y = -4647,5x + 17,342 n )
g 13 2,8 m / t a 11 k 2,4 9 2 7 1,6 5 spez. Akt. (µ ln spez. Akt. (µkat/kg) 3 1,2 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 0,0031 0,0033 0,0035 Temperatur (°C) 1/Temperatur (K)
Abbildung 55: Temperaturoptimum der r5 β-POR aus D. lanata . a) Einfluss der Temperatur auf die Enzymaktivität. b) Arrhenius-Auftragung zur Ermittlung der Aktivierungsenergie.
III.4.5 Isoelektrischer Punkt Der isoelektrische Punkt (IEP) der r5 β-POR wurde mittels isoelektrischer Fokussierung (IEF) ermittelt. Die Probenaufarbeitung und elektrophoretische Trennung erfolgte wie unter II.2.21 beschrieben. Für die r5 β-POR konnte so ein IEP von pH 6,5 ermittelt werden (Abbildung 56).
M 1 [pH]
7,0 6,5 pH 6,5 5,1
Abbildung 56: IEF-Gel der r5 β-POR aus D. lanata (Silberfärbung). M – Marker (BioRad IEF-Standartd); 1 – r5 β-POR.
91 Ergebnisse
III.4.6 Substratspezifität
4-Pregnen-3,20-dion 4-Androsten-3,17-dion 4-Androsten-17 β-ol-3-on
(Progesteron) (Testosteron)
O O OH H H H H H H H H H O O O A B C
4-Pregnen-21-ol-3,20-dion 4-Pregnen-21-O-acetyl-3,20-dion a) Cortison (R1 + R2 = =O)
(Cortexon) (21-O-Acetyl-Cortexon) b) Cortisol (R1 = OH; R2 = H)
OH OH O O O O R1 O R2 OH H H H
H H H H H H O O O D E F
Canarigenon 21-O-Malonyldesoxycorticosteron 4-Pregnen-3β-ol-20-on
O O O OH O O O O H H H
H OH H H H H O O HO G H I
a) Canarigenin (R = H) 4-Androsten-3β,17 β-diol 4-Pregnen-3α-ol-20-on b) Canarigenin-digitoxosid (R = Digitoxose)
O O O OH
H H H
H OH H H H H HO R O J HO K L
5-Pregnen-3β-ol-20-on Cholesterol 5-Pregnen-3,20-dion (Pegnenolon) (Isoprogesteron)
O O
H H H H H H H H H HO HO O M N O Abbildung 57: Getestete Substrate der r5 β-POR ( D. lanata ).
92 Ergebnisse
Zur Ermittlung der Substratspezifität der r5 β-POR wurden Substanzen mit unterschiedlichen strukturellen Eigenschaften auf ihre Umsetzung hin getestet. Hierzu wurden Standard 5β- POR-Enzymassays, wie unter II.2.23.1 beschrieben, mit den entsprechenden Substraten (Abbildung 57) durchgeführt. Es wurde die nativ gereinigte, in 5β-POR-Assaypuffer umgepufferte und auf einen Proteingehalt von 0,2 mg/mL eingestellte Proteinfraktion verwendet. Die Assays wurden mittels DC oder HPLC ausgewertet. Als Negativkontrollen wurden Assays mit denaturierter r5β-POR (10 min, 100 °C) verwendet (= Totkontrollen).
III.4.6.1 Steroide mit C3-Carbonylgruppe und C4-C5 Doppelbindung Es zeigte sich, dass die r5 β-POR Steroide umsetzten konnte, welche eine C3-Carbonylgruppe in Kombination mit einer C4-C5 Doppelbindung aufweisen (Abbildung 57 A – G). So wurden neben Progesteron, welches zu 5 β-Pregnan-3,20-dion reduziert wurde (Abbildung 36), auch andere Steroide mit diesen Strukturmerkmalen als Substrate akzeptiert und in ihre korrespondierenden 5 β-H-Produkte umgesetzt: 4-Androsten-3,17-dion zu 5 β-Androstan-3,17- dion (Abbildung 58), Testosteron zu 5 β-Androstan-17 β-ol-3-on (Abbildung 59), Cortexon zu 5β-Pregnan-21-ol-3,20-dion (Abbildung 60), 21-O-Acetyl-Cortexon zu 5 β-Pregnan-21-ol- 3,20-dion-acetat (Abbildung 61) und Canarigenon zu Digitoxigenon (Abbildung 62).
1 2 3 4 1,0
O O 0,8 H H 0,6 r5 β-POR H H H H O O 0,4 NADPH NADP H 4-Androsten-3,17-dion 5β-Androstan-3,17-dion 0,2
0
Abbildung 58: DC des Assays von r5 β-POR ( D. lanata ) mit 4-Androsten-3,17-dion (B) als Substrat. FM I; Detektion mit Anisaldehyd-RL (10 min, 100 °C). 1 – Totkontrolle; 2 – aktiver Assay; 3 – 4-Androsten-3,17-dion (Referenz, Rf = 0,5); 4 – 5 β-Androstan-3,17-dion (Referenz, Rf = 0,6). Rechts daneben: Reaktionsschema der Umsetzung von 4-Androsten- 3,17-dion durch r5 β-POR.
93 Ergebnisse
1 2 3 4 1,0
0,8 OH OH
H H 0,6 r5 β-POR H H H H O O 0,4 NADPH NADP H Testosteron 5β-Androstan-17β-ol-3-on 0,2
0
Abbildung 59: DC des Assays von r5 β-POR ( D. lanata ) mit Testosteron (C) als Substrat. FM I; Detektion mit Anisaldehyd-RL (10 min, 100 °C). 1 – 5 β-Androstan-17 β-ol-3-on (Referenz, Rf = 0,38); 2 – Totkontrolle; 3 – aktiver Assay; 4 – Testosteron (Referenz, Rf = 0,3). Rechts daneben: Reaktionsschema der Umsetzung von Testosteron durch r5 β-POR.
1 2 3 4 1,0 OH OH
0,8 O O
0,6 H H r5 β-POR H H H H O O 0,4 NADPH NADP H
0,2 Cortexon 5β-Pregnan-21-ol-3,20-dion
0
Abbildung 60: DC des Assays von r5 β-POR ( D. lanata ) mit Cortexon (D) als Substrat. FM I; Detektion mit Anisaldehyd-RL (10 min, 100 °C). 1 – Totkontrolle; 2 – aktiver Assay; 3 – Cortexon (Referenz, Rf = 0,35); 4 – 5 β-Pregnan-21-ol-3,20-dion (Referenz, Rf = 0,43). Rechts daneben: Reaktionsschema der Umsetzung von Cortexon durch r5 β-POR.
94 Ergebnisse
1 2 3 4 1,0 O O
O O 0,8 O O H H r5 β-POR 0,6 H H H H O O H 0,4 NADPH NADP 21-O-Acetyl-Cortexon 5β-Pregnan-21-ol-3,20-dion- 0,2 acetat
0
Abbildung 61: DC des Assays von r5 β-POR ( D. lanata ) mit 21-O-Acetyl-Cortexon (E) als Substrat. FM I; Detektion mit Anisaldehyd-RL (10 min, 100 °C). 1 – 21-O-Acetyl-Cortexon (Referenz, Rf = 0,4); 2 – Totkontrolle; 3 – aktiver Assay; 4 – 5 β-Pregnan-21-ol-3,20-dion- acetat (Referenz, Rf = 0,55). Rechts daneben: Reaktionsschema der Umsetzung von 21-O- Acetyl-Cortexon durch r5 β-POR.
1 2 3 1,0
O O O O 0,8
H H 0,6 r5 β-POR H OH H OH O O 0,4 NADPH NADP H
0,2 Canarigenon Digitoxigenon
0
Abbildung 62: DC des Assays von r5 β-POR ( D. lanata ) mit Canarigenon (G) als Substrat. FM I; Detektion mit Jensen-Kny-RL (10 min, 100 °C; UV 365 ). 1 – Totkontrolle; 2 – aktiver Assay; 3 – Canarigenon (Referenz, Rf = 0,15) und Digitoxigenon (Referenz, Rf = 0,3). Rechts daneben: Reaktionsschema der Umsetzung von Canarigenon durch r5 β-POR.
Die Substanzen Cortison und Cortisol wurden ebenfalls als Substrate akzeptiert und enzymatisch umgesetzt. Wie aus den HPLC-Profilen ersichtlich ist, wurde Cortison zu 5 β- Pregnan-17 α,21-diol-3,11,20-trion (Abbildung 63), und Cortisol zu 5 β-Pregnan-11 β,17 α,21- triol-3,20-dion (Abbildung 64) reduziert.
95 Ergebnisse
0,6 1 100,0 IS 0,5 80,0 0,4 l
i m r
t n i 60,0
n 5 o 0 0,3
t 2
e
c
U 2 A
A 0,2 40,0 %
0,1 20,0
0,0 0,0
0,0 4,0 8,0 12,0 16,0 20,0 24,0 Minuten
OH OH
O O O OH O OH H H r5 β-POR H H H H O O NADPH NADP H
Cortison 5β-Pregnan-17 α,21-diol-3,11,20-trion
Abbildung 63: HPLC-Profil des Assays von r5 β-POR ( D. lanata ) mit Cortison (Fa) als Substrat (Verwendete HPLC-Säule: Reprosil-Pur ®). 1 = Substrat Cortison (Rt = 11,8 min); 2 = Produkt 5 β-Pregnan-17 α,21-diol-3,11,20-trion (Rt = 13,4 min); IS – Interner Standard Pregnenolon (Rt = 20,2 min). Darunter: Reaktionsschema der Umsetzung von Cortison durch r5 β-POR.
96 Ergebnisse
1 2,0 100,0 1,8 1,6 80,0 l
1,4 i m r
t n 60,0 i
5 1,2 n 0 o
t 2 e 1,0
c U A
A 0,8 40,0
2 % 0,6 IS 0,4 20,0 0,2 0,0 0,0
0,0 4,0 8,0 12,0 16,0 20,0 24,0 Minuten
OH OH O O HO OH HO OH H H r5 β-POR H H H H O O NADPH NADP H
Cortisol 5β-Pregnan-11 β,17 α,21-triol-3,20-dion
Abbildung 64: HPLC-Profil des Assays von r5 β-POR ( D. lanata ) mit Cortisol (Fb) als Substrat. 1 = Substrat Cortisol (Rt = 7,8 min); 2 = Produkt 5 β-Pregnan-11 β,17 α,21-triol-3,20 dion (Rt = 8,9); IS – Interner Standard Pregnenolon (Rt = 16,1 min). Darunter: Reaktionsschema der Umsetzung von Cortisol durch r5β-POR.
Bei der Verwendung von 21-O-Malonyldesoxycorticosteron als Substrat (Abbildung 57 G), ebenfalls ein Steroid mit C3 Carbonylgruppe und C4-C5 Doppelbindung, konnte hingegen keine katalytische Umsetzung durch r5 β-POR festgestellt werden (Abbildung 65). Die Nebenbanden (Bahn 1 und 2) waren sowohl im aktiven Assay, als auch in der parallel durchgeführten Totkontrolle zu finden. Es handelte sich somit nicht um durch enzymatische Umsetzung entstandene Produkte.
97 Ergebnisse
1 2 3 1,0
0,8 O OH O OH
O O O O O O 0,6 H H r5 β-POR H H H H 0,4 O NADPH NADP O H
0,2 21-O-Malonyldesoxy- 5β-Pregnan-21-malonyl- corticosteron 3,20-dion
0
Abbildung 65: DC des Assays von r5 β-POR ( D. lanata ) mit 21-O-Malonyldesoxy- corticosteron (L) als Substrat. FM I; Detektion mit Anisaldehyd-RL (10 min, 100 °C). 1 – Totkontrolle; 2 – aktiver Assay; 3 – 21-O-Malonyldesoxycorticosteron (Referenz, Rf = 0,28). Rechts daneben: Reaktionsschema der Umsetzung von 21-O-Malonyldesoxycorticosteron durch r5 β-POR.
III.4.6.2 Steroide mit C3-Hydroxylruppe und C4-C5 Doppelbindung Steroide mit einer C3-Hydroxylgruppe in Kombination mit einer C4-C5 Doppelbindung (Abbildung 57 I – L) wurden von der r5 β-POR nicht als Substrat akzeptiert und folglich nicht in ihre korrespondierenden 5 β-Reduktionsprodukte überführt.
1 2 3 4 5 6 7 8 1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Abbildung 66: DC der Assays von r5 β-POR ( D. lanata ) mit 4-Pregnen-3α-ol-20-on (L) und 4-Pregnen-3β-ol-20-on (I) als Substrate. FM IV; Detektion mit Anisaldehyd-RL (10 min, 100 °C). 1 – 4-Pregnen-3α-ol-20-on (Referenz, Rf = 0,35); 2 – Totkontrolle des Assays mit 4- Pregnen-3α-ol-20-on; 3 – aktiver Assay mit 4-Pregnen-3α-ol-20-on; 4 – 5 β-Pregnan-3α-ol- 20-on (Referenz, Rf = 0,3); 5 – 4-Pregnen-3β-ol-20-on (Referenz, Rf = 0,38); 6 – Totkontrolle des Assays mit 4-Pregnen-3β-ol-20-on; 7 – aktiver Assay mit 4-Pregnen-3β-ol- 20-on; 8 – 5 β-Pregnen-3β-ol-20-on (Referenz, Rf = 0,4);
98 Ergebnisse
Hierbei spielte es keine Rolle ob die C3-Hydroxylgruppe in α- oder β-Konfiguration vorlag oder ob sie mit einem Zucker glykosidisch verbunden war. Es wurde keine Umsetzung von 4-Pregnen-3β-ol-20-on, Canarigenin, Canarigenin-digitoxosid, 4-Androsten-3β,17 β-diol oder 4-Pregnen-3α-ol-20-on durch r5 β-POR festgestellt. Als Beispiel ist hier die DC der Assays mit 4-Pregnen-3β-ol-20-on und 4-Pregnen-3α-ol-20-on in Abbildung 66 dargestellt.
III.4.6.3 Steroide mit C3-Hydroxylgruppe und C5-C6 Doppelbindung Steroide mit einer freien Hydroxylgruppe an C3 und einer Doppelbindung zwischen C5 und C6 wurden nicht durch r5 β-POR umgesetzt (Abbildung 57 M, N). Es kam zu keiner Reduktion von Pregnenolon oder Cholesterol (Abbildung 67).
1 2 3 4 1 2 3 a) b) 1,0 1,0
0,8 0,8
0,6 0,6
0,4 0,4
0,2 0,2
0 0
Abbildung 67: a) DC des Assays von r5 β-POR ( D. lanata ) mit Pregnenolon (M) als Substrat. FM I; Detektion mit Anisaldehyd-RL (10 min, 100 °C). 1 – aktiver Assay; 2 – Totkontrolle; 3 – 5β-Pregnan-3β-ol-20-on (Referenz, Rf = 0,48); 4 – Pregnenolon (Referenz, Rf = 0,43). b) DC des Assays von r5 β-POR ( D. lanata ) mit Cholesterol (N) als Substrat. FM I; Detektion mit Anisaldehyd-RL (10 min, 100 °C). 1 – Cholesterol (Referenz, Rf = 0,48); 2 – Totkontrolle; 3 – aktiver Assay.
III.4.6.4 Umsetzung von Steroiden mit C3-Carbonylgruppe und C5-C6 Doppelbindung Als Beispiel für ein Steroide mit C3-Carbonylgruppe in Kombination mit einer C5-C6 Doppelbindung wurde Isoprogesteron (Abbildung 57 O) als Substrat für r5 β-POR getestet. Hierbei stellte sich das Problem, dass Isoprogesteron unter Assay-Bedingungen teilweise zu Progesteron isomerisierte. Um das entstandene 5 β-Pregnan-3,20-dion auf die enzymatische Reduktion von Isoprogesteron zurückführen zu können, wurde der Assay mittels HPLC über die Verringerung von Isoprogesteron und die Erhöhung der 5 β-Pregnan-3,20-dion Konzentration quantitativ ausgewertet. Als Negativkontrollen, und um den Abbau von
99 Ergebnisse
Isoprogesteron ohne enzymatische Einwirkung quantifizieren zu können, wurden Assays mit hitzedenaturierter r5 β-POR und mit enzymfreiem Assaypuffer durchgeführt. Es konnte kein enzymatischer Abbau von Isoprogesteron mit gleichzeitigem Anstieg der 5 β-Pregnan-3,20-dion Konzentration festgestellt werden. Die Umsetzung von Steroiden mit C3-Carbonylgruppe und C5-C6 Doppelbindung wurde folglich nicht von r5 β-POR katalysiert.
III.4.7 Enzymkinetik
Zur Ermittlung der Km- und vmax -Werte des Cosubstrats NADPH und ausgewählter Substrate wurden Standard 5 β-POR-Enzymassays (n = 2 – 4) (II.2.23.1) mit nativ gereinigter, auf 5β- POR-Assaypuffer umgepufferte r5 β-POR (Proteingehalt 0,2 mg/mL) durchgeführt. Da es sich bei der 5β-POR-Reaktion um eine Mehrsubstratreaktion handelt (Cosubstrat, Substrat), wurde ein Substrat bei verschiedenen Konzentrationen mit jeweils konstant hoher Konzentration des zweiten Substrats eingesetzt. Die Assays wurden quantitativ mittels HPLC (II.2.25) analysiert. Zur graphischen Ermittlung der Km-Werte diente der Hanes-Plot.
III.4.7.1 Enzymkinetik des Cosubstrats NADPH
Der Km- und vmax -Wert von NADPH wurde bei einer konstanten Konzentration von 0,320 mM Progesteron und NADPH-Konzentrationen von 0,0065 – 0,390 mM ermittelt. In Abbildung 68a ist exemplarisch das HPLC-Profil des Assays mit einer NADPH-
Konzentration von 0,390 mM dargestellt. Für das Cosubstrat NADPH wurde so ein Km-Wert von 0,008 mM (± 0,002) und ein vmax -Wert von 31,1 nkat/mg (± 2,0) bestimmt (Abbildung 68).
100 Ergebnisse
a) 0,6 1 100,0 0,5 IS 80,0 0,4 l
i m r
t n i 60,0
n 5
o 0
t 2 0,3
e
c U A
A 40,0
0,2 % 2 20,0 0,1
0,0 0,0
0,0 4,0 8,0 12,0 16,0 20,0 24,0 Minuten b) 0,025 0,02 0,015
[S]/v 0,01 0,005 0 -0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8
[S]
Abbildung 68: a) HPLC-Profil des Standard 5β-POR-Enzymassays mit 0,390 mM NADPH. 1 = Substrat Progesteron (Rt = 15,6 min); IS = interner Standard Pregnenolon (Rt = 16,1 min); 2 = Produkt 5 β-Pregnan-3,20-dion (Rt = 16,5 min). b) Hanes-Plot zur Ermittlung des Km- und vmax -Wertes vom Cosubstrat NADPH.
III.4.7.2 Enzymkinetik ausgewählter Substrate Es wurden die kinetischen Konstanten von Progesteron, 4-Androsten-3,17-dion, Cortexon und Cortisol (vgl. Abbildung 57 A, B, D F) bestimmt. Hierbei wurden Konzentrationen von 0,010 – 1,500 mM Substrat verwendet. Als Cosubstrat wurde stets 6,4 mM NADPH eingesetzt. In Abbildung 69 (Progesteron), Abbildung 70 (4-Androsten-3,17-dion), Abbildung 71 (Cortexon) und Abbildung 72 (Cortisol) ist jeweils ein HPLC-Profil eines Assays mit dem entsprechenden Substrat, sowie der korrespondierende Hanes-Plot dargestellt.
101 Ergebnisse
a) 1 100,0
0,4 IS 80,0 l
i m 0,3 r
t n
60,0 i
5 n 0 o
t 2
e
c U 0,2 A
A 2 40,0 %
0,1 20,0
0,0 0,0
0,0 4,0 8,0 12,0 16,0 20,0 24,0 Minuten
b) 0,012
0,008 [S]/v 0,004
0 -0,16 0 0,16 0,32
[S]
Abbildung 69: a) HPLC-Profil des Standard 5β-POR-Enzymassays mit 0,160 mM Progesteron. 1 = Substrat Progesteron (Rt = 15,6 min); IS = interner Standard Pregnenolon (Rt = 16,1 min); 2 = Produkt 5 β-Pregnan-3,20-dion (Rt = 16,5 min). b) Hanes-Plot zur Ermittlung des Km- und vmax -Wertes vom Substrat Progesteron (Progesteron- Konzentrationen: 0,030 mM – 0,320 mM).
102 Ergebnisse
a) 0,6 1 100,0 0,5 IS 80,0 0,4 l
i m r
t n
60,0 i
5 n 0 o
0,3 t 2
e
c U A
A 40,0
0,2 %
2 20,0
0,0 0,0 0,0 4,0 8,0 12,0 16,0 20,0 24,0 Minuten
b) 0,1
0,05 [S]/v
0 -0,5 0 0,5 1 1,5
[S]
Abbildung 70: a) HPLC-Profil des Standard 5β-POR-Enzymassays mit 0,5 mM 4- Androsten-3,17-dion. 1 = Substrat 4-Androsten-3,17-dion (Rt = 12,5 min); 2 = Produkt 5 β- Androstan-3,17-dion (Rt = 13,9 min); IS = interner Standard Pregnenolon (Rt = 16,1 min). b) Hanes-Plot zur Ermittlung des Km- und vmax -Wertes vom Substrat 4-Androsten-3,17-dion (4-Androsten-3,17-dion-Konzentrationen: 0,040 mM – 1,500 mM).
103 Ergebnisse
a) 0,5 1 100,0
0,4 80,0 IS l
i m r t n 0,3
60,0 i
5 n 0 o
t 2
e
c U A
A 0,2 40,0
2 %
0,1 20,0
0,0 0,0 0,0 4,0 8,0 12,0 16,0 20,0 24,0 Minuten
b) 0,05
0,025 [S]/v
0 -2 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5
[S]
Abbildung 71: a) HPLC-Profil des Standard 5β-POR-Enzymassays mit 0,320 mM Cortexon. 1 = Substrat Cortexon (Rt = 12,2 min); 2 = Produkt 5 β-Pregan-21-ol-3,20-dion (Rt = 13,6 min); IS = interner Standard Pregnenolon (Rt = 16,1 min). b) Hanes-Plot zur Ermittlung des Km- und vmax -Wertes vom Substrat Cortexon (Cortexon-Konzentrationen: 0,320 mM – 1,500 mM).
104 Ergebnisse
a) 1 100,0
IS 0,4 80,0 l
i m r
t n i 0,3 60,0
n 5
o 0
t 2
e
c U
2 A
A 0,2 40,0 %
0,1 20,0
0,0 0,0
0,0 4,0 8,0 12,0 16,0 20,0 24,0 Minuten b) 0,008
0,004 [S]/v
0 -0,48 -0,32 -0,16 0 0,16 0,32 [S]
Abbildung 72: a) HPLC-Profil des Standard 5β-POR-Enzymassays mit 0,080 mM Cortisol. 1 = Substrat Cortisol (Rt = 7,8 min); 2 = Produkt 5β-Pregan-11 β,17 α,21-triol-3,20-dion (Rt = 8,9 min); IS = interner Standard Pregnenolon (Rt = 16,1 min). b) Hanes-Plot zur Ermittlung des Km- und vmax -Wertes vom Substrat Cortisol (Cortisol-Konzentrationen: 0,01 mM – 0,320 mM).
105 Ergebnisse
Für Progesteron konnte ein Km-Wert von 0,120 ± 0,048 mM und ein vmax -Wert von 45,0 ± 7,9 nkat/mg Protein bestimmt werden. Die Km-Werte von 4-Androsten-3,17-dion und Cortisol lagen mit 0,228 ± 0,069 mM und 0,291 ± 0,102 mM im selben Größenbereich, während sich die ermittelten vmax -Werte stärker unterschieden. So wurde für 4-Androsten-3,17-dion ein vmax -Wert von 18,5 ± 1,6 nkat/mg, für Cortisol ein vmax -Wert von 81,2 ± 16,5 nkat/mg bestimmt. Der ermittelte Km-Wert von Cortexon lag bei 1,597 ± 0,275 mM mit einem vmax - Wert von 63,3 ± 6,7 nkat/mg Protein.
Die aus den Hanes-Plots ermittelten Km- und vmax -Werte sind in Tabelle 11 nochmals zusammengefasst:
Tabelle 11: Km- und vmax -Werte der r5 β-POR
Substrat Km (mM) vmax (nkat/mg) vmax /Km Aktivität (%) Progesteron 0,120 ± 0,048 45,0 ± 7,9 375,0 100 4-Androsten-3,17-dion 0,228 ± 0,069 18,5 ± 1,6 81,1 47 Cortexon 1,597 ± 0,275 63,3 ± 6,7 39,6 33 Cortisol 0,291 ± 0,102 81,2 ± 16,5 297,0 133
106 Diskussion
IV. DISKUSSION Der postulierte Biosyntheseweg der Cardenolide in Digitalis - und Isoplexis -Spezies erstreckt sich, ausgehend vom Cholesterol, über eine Vielzahl von Zwischenprodukten (Kreis et al., 1998; Luckner und Wichtl, 2000). Neben Cholesterol können aber auch andere (Phyto-) Sterole als Vorstufen zu Cardenoliden metabolisiert werden, wie beispielsweise β-Sitosterol (Bennett et al., 1969; Lindemann und Luckner, 1997) oder auch Smilagenin (Lui und Staba, 1979). Einige der an der Synthese der Cardenolide oder an deren Transformation beteiligten Enzyme, konnten bis dato gereinigt und charakterisiert werden. So zum Beispiel die Cardenolid β-Glucohydrolasen I (May und Kreis 1997) und II (Hornberger et al., 2000), Lanatosid-15'-O-Acetyltransferase (Kandzia et al., 1998), Lanatosid 15'-O-Acetylesterase (Sutor et al., 1993; Sutor und Kreis, 1996), Digitoxin 12-Hydroxylase (Petersen und Seitz, 1985), 5-3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (Finsterbusch et al., 1999) oder die Progesteron-5β-Reduktase (Gärtner et al., 1990 und 1994). Auf molekularer Ebene ist über Digitalis und Isoplexis noch relativ wenig bekannt. So sind die Gen-Sequenzen von zwei Aldo-Keto-Reduktasen (Gavidia et al., 2002a), Acyl-CoA-Bindeprotein (Metzner et al., 2000), Phenylalanin-Ammonium-Lyase (Acc.-Nr.: DLJ002221), Chalconsynthase (Acc.-Nr.: DLAJ2526), Phytochrom A (Acc.-Nr.: DLAJ2525) und von Cyclophilin Isoformen (Scholze et al., 1999) veröffentlicht. Im Bereich von Enzymen der Cardenolid-Biosynthese und des Cardenolid-Metabolismus findet man Sequenzen der Cardenolid-16'-O-Glucohydrolase (Schöniger et al., 1998; Framm et al., 2000), Lanatosid-15'-O-Acetylesterase (Kandzia et al., 1998), 5-3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (Finsterbusch et al., 1999; Lindemann et al., 2000) und Progesteron-5β-Reduktase (Roca-Pérez et al., 2004). Zur Erweiterung des Verständnisses des Cardenolid-Biosynthesewegs auf molekularer Ebene, wurden in der vorliegenden Arbeit die Progesteron-5β-Reduktase sowie die 5-3β-Hydroxysteroid- Dehydrogenase aus verschiedenen Digitalis - und Isoplexis -Spezies kloniert, sowie aus D. lanata überexprimiert und charakterisiert.
IV.1 Progesteron-5β-Reduktasen IV.1.1 Klonierung der 5 β-POR aus Digitalis und Isoplexis Anhand der von Gavidia und Seitz (2001) im Internet veröffentlichten mRNA, bzw. cDNA Sequenz der 5 β-POR aus D. purpurea (Acc.-Nr.: AJ310673) wurden Primer für die PCR generiert. Es wurde anfänglich eine PCR mit genomischer DNA von D. lanata und allen in Frage kommenden Primerkombinationen durchgeführt. Es war unter den gewählten PCR- Bedingungen möglich, mit allen getesteten Primerkombinationen PCR-Produkte von 1200-
107 Diskussion
1250 bp zu amplifizieren. Das Ziel lag darin, möglichst die gesamte kodierende Sequenz (CDS) der 5 β-POR zu erhalten. Aus diesem Grund wurde das größte amplifizierte PCR- Produkt kloniert und sequenziert. Durch Analyse der erhaltenen Gensequenz zeigte sich, dass es möglich war, die gesamte CDS der 5 β-POR aus D. lanata zu amplifizieren. Die genomische Sequenz der 5 β-POR zeigte eine hohe Homologie zu der veröffentlichten mRNA-Sequenz der 5β-POR aus D. purpurea (Acc.-Nr.: AJ310673), wies aber im Anfangsbereich der Sequenz ein Intron mit einer Größe von 80 bp auf (bp 40 – 119). Die Exon-Intron-Struktur der 5 β-POR aus D. lanata wurde zusätzlich durch Anwendung der „GT- AG-Regel“ (Lewin, 1998; Brown und Simpson, 1998) bestätigt. Hierbei geht man davon aus, dass innerhalb einer genomischen Sequenz in den meisten Fällen Exons auf AG enden, während Introns mit GT beginnen und auf CAG enden. Bei der genomischen Sequenz der 5 β- POR traf dies, mit Ausnahme der ersten Base des letzten Triplets innerhalb des Introns, zu. Das Intron endete auf TAG anstelle von CAG. Durch die Sequenzierung des mittels RT-PCR amplifizierten DNA Stücks konnte die mRNA Sequenz der 5 β-POR aus D. lanata bestätigt werden. Die CDS des 5 β-POR-Gens umfasste folglich 1170 Basenpaare (bp 1 – 39; 120 – 1250), welche für 389 Aminosäuren kodierten (Acc.-Nr.: AY585867). Die Arbeitsgruppe um Seitz (Gärtner et al., 1994) hatte 1994 die Progesteron-5β-Reduktase (D. purpurea ) bereits gereinigt und teilsequenziert. Das größte Peptid umfasste hierbei die Aminosäuren FYYDLEDIMLEXV. Innerhalb der abgeleiteten Aminosäure-Sequenz der in der vorliegenden Arbeit klonierten, putativen 5 β-POR war dieses Peptid ebenfalls zu finden (Acc.-Nr.: AY585867, Aminosäuren 178 – 190). Mit der ermittelten 5 β-POR Gen-Sequenz ( D. lanata ) wurde nach Sequenzüberein- stimmungen in anderen, nicht zur Gattung Digitalis gehörende Pflanzenarten gesucht (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Da mittlerweile die Genome von Arabidopsis thaliana, Oryza sativa und Zea mays vollständig sequenziert sind, fand man eine große Anzahl von Übereinstimmungen mit Sequenzen, bzw. Sequenzabschnitten der Kern-DNA dieser Pflanzen. Bei diesen Nukleotid-Sequenzen handelte es sich jedoch häufig um funktionell nicht definierte Sequenzen. Um aussagekräftige Daten zu erhalten, schien es folglich sinnvoll, nach Übereinstimmungen auf Proteinebene zu suchen. Die putative 5β-POR Proteinsequenz ( D. lanata ) zeigte hierbei hohe Homologien zu einem Protein mit unbekannter Funktion aus A. thaliana (69 %; Acc.-Nr.: AAP37838), einem hypothetischen Protein aus Medicago truncatula (68 %; Acc.-Nr.: ABD33275), einem Protein unbekannter Funktion aus Populus tremuloides (67 %; Acc.-Nr.: AAO63776), dem wundinduzierten Protein AWI 31 aus A. thaliana (64 %; Acc.-Nr.: CAA68126; Yang et al., 1997) und zwei putativen Progesteron-
108 Diskussion
5β-Reduktasen aus O. sativa (51 %; Acc.-Nr.: AAT85033 und 56%; Acc.-Nr.: XP_479054). Interessant ist in diesem Zusammenhang, dass man in A. thaliana zwar die von Steroiden abgeleiteten Brassinosteroide findet, die Pflanze aber keine Cardenolide führt. An der Brassinosteroid-Biosynthese wiederum ist eine Steroid 5α-Reduktase beteiligt ( DET2 ), die bereits kloniert (Li et al., 1996) und heterolog, funktionell überexprimiert wurde (Li et al., 1997). Da alle in A. thaliana vorliegenden Brassinosteroide 5 α-konfiguriert vorliegen (Übersicht siehe Zullo et al., 2003), scheint eine Beteiligung des DET2 Proteins an deren Biosynthese wahrscheinlich. Das DET2 Protein zeigte in Homologie-Untersuchungen, trotz dessen nachgewiesener Steroid 5 α-Reduktase Aktivität (Li et al., 1997), nur 30 % Sequenzübereinstimmung mit einer Steroid 5 α-Reduktase aus Ustilago maydis (Basse et al., 2002). Mit 69 % Homologie zur 5 β-POR aus D. lanata zeigte das unbekannte Protein AAP37838 aus A. thaliana die größte Sequenzübereinstimmung auf Proteinebene. Dies lässt die Vermutung zu, dass es sich bei diesem Protein eventuell um eine 5β-Reduktase aus A. thaliana handelt. Dies müsste durch Überexpression und funktionelle Tests belegt werden. Interessant war auch die hohe Ähnlichkeit der 5 β-POR Aminosäuresequenz mit dem wundinduzierten Protein AWI 31 aus A. thaliana (64 %; Acc.-Nr.: CAA68126; Yang et al., 1997), da die Arbeitsgruppe um Pérez-Bermúdez auch eine Hochregulation der 5 β-POR in D. obscura Pflanzen als Folge klimatischer Schädigungen hatte nachweisen können (Roca-Pérez 2004). Nach Untersuchungen von Werner (1960, 1961, 1964, 1965, 1966) unterschied man 19 Digitalis - und 3 Isoplexis -Arten. Hansen und Sunding (1985) definierten neben diesen 3 Isoplexis -Spezies noch eine weitere, I. chalcantha , sodass man heute 4 Isoplexis -Arten unterscheidet ( I. canariensis, I. isabelliana, I. chalcantha, I. sceptrum ). Diese bilden, neben der 19 Spezies umfassenden Gattung Digitalis , die eigenständige Gattung Isoplexis . Anzumerken ist hierbei, dass die bei Luckner und Wichtl (2000) geführte Digitalis -Art D. dubia inzwischen allgemein als D. minor bezeichnet wird, welche aber die Subspezies D. minor subsp. dubia führt. Die bei Luckner und Wichtl (2000) als D. heywoodii ausgewiesene Digitalis -Art stellt heute eine Subspezies von D. mariana dar, sodass sich die Anzahl der Digitalis -Arten derzeit auf 18 reduziert hat (vgl. BrendaDatabase → http://brenda.uni- koeln.de). In der vorliegenden Arbeit wurde versucht, die 5 β-POR aus diesen Digitalis - und Isoplexis -Spezies zu klonieren und deren Sequenzen miteinander zu vergleichen. Des Weiteren wurde der Hybrid D. sibirica (D. grandiflora x D. laevigata ) und D. minor subsp. dubia untersucht. Mit der die CDS einschließende Primerkombination I (VH07dir/VH1188rev) wurden PCRs mit genomischer DNA der zu untersuchenden Digitalis -
109 Diskussion und Isoplexis -Arten durchgeführt. Es war möglich, aus allen untersuchten Spezies PCR- Produkte der zu erwartenden Größe zu amplifizieren. Die PCR-Produkte wurden darauf folgend kloniert und sequenziert, wobei die 5 β-POR aus D. atlantica leider nicht erfolgreich kloniert werden konnte. Die erhaltenen Gensequenzen wiesen einen großen Grad der Übereinstimmung (96 %) mit des 5 β-POR Gens aus D. lanata und der veröffentlichten mRNA-Sequenz der 5β-POR aus D. purpurea (Acc.-Nr.: AJ310673) auf. Es war folglich davon auszugehen, dass es sich bei den klonierten Genen um die 5 β-PORs der verschiedenen Digitalis - und Isoplexis -Spezies handelt. Da alle herzwirksamen Glykoside der Digitalis - Arten stets eine 5 β-Konfiguration aufweisen (Übersicht bei Luckner und Wichtl, 2000), war das Vorhandensein der 5β-POR-Gene innerhalb dieser Spezies nicht überraschend. Anders verhielt es sich mit den Isoplexis -Arten. Während I. canariensis, I. isabelliana und I. chalcantha auch 5 β-konfigurierte Cardenolide enthalten (Schaller und Kreis, 1996; Übersicht bei Luckner und Wichtl, 2000; Gavidia et al., 2002b; Schaller und Kreis, 2006), konnten bisher keine Cardenolide in I. sceptrum nachgewiesen werden (Freire et al., 1970; Gonzales et al., 1985; Schaller und Kreis, 2006). In dieser Art findet man stattdessen Steroidsaponine welche, falls an Position 5 reduziert, in 5 α-Konfiguration vorliegen (Freire et al., 1970). Trotzdem war es möglich mit den verwendeten Primern die 5 β-POR aus I. sceptrum zu klonieren und zu sequenzieren. Die Beteiligung der 5β-POR in I. sceptrum an anderen, Cardenolid-Biosynthese fremden Stoffwechselwegen, scheint eher unwahrscheinlich. Zwar beschreiben Lindemann und Luckner (1997) den Nachweis von 5 β-POR in Cardenolid-freiem Gewebe (PEMs von D. lanata ), jedoch wird dies von anderen Arbeitsgruppen in Frage gestellt, welche eine 5 β-POR-Aktivität nur in Cardenolid-haltigem Gewebe von D. lanata nachweisen konnten (Stuhlemmer et al., 1993; Stuhlemmer und Kreis, 1996a). Auch die Arbeitsgruppe um Pérez-Bermúdez (Roca-Pérez et al., 2004) postulierte einen direkten Zusammenhang zwischen der 5 β-POR-Expression und dem Cardenolidgehalt in Blättern von D. obscura . Das Vorhandensein eines 5 β-POR-Gens im I. sceptrum Genom, bei gleichzeitigem Fehlen von Cardenoliden wirft Fragen auf. Ob in dieser Isoplexis-Art beispielsweise ein Block der Cardenolid-Biosynthese vorliegt, oder ob die 5 β-POR in funktionsunfähiger Form exprimiert wird, bleibt bis zu weiteren Untersuchungen mittels Fütterungsexperimenten und der heterologen Überexpression des Proteins reine Spekulation. Um den Grad der Homologie innerhalb der ermittelten 5 β-POR Gensequenzen der Digitalis - und Isoplexis -Arten zu ermitteln, wurde je ein Alignment auf Nukleotid- und Aminosäure-Ebene durchgeführt. Alle genomischen 5 β-POR Sequenzen der analysierten Digitalis- und Isoplexis-Spezies wiesen jeweils ein Intron im Anfangsbereich auf. Wie bei
110 Diskussion
D. lanata wurden die jeweiligen Exon-Intron-Strukturen der Gensequenzen mittels der „GT- AG-Regel“ (Lewin, 1998; Brown und Simpson, 1998) überprüft. Geringfügige Abweichungen traten bei D. laevigata und D. ferruginea auf. In beiden Fällen endete das Exon auf GG anstelle von AG. Mit Ausnahme von I. isabelliana, hier endete das Intron auf CAG, endeten alle Introns, wie schon bei D. lanata , auf TAG. Die Größe der Introns war zwischen den Spezies moderat variabel. In den untersuchten Arten waren die genomischen und die cDNA 5 β-POR-Sequenzen, ebenso wie die abgeleiteten 5 β-POR Proteinsequenzen zu 96 % identisch. Auch Gene, bzw. Enzyme anderer Sekundärstoffwechselwege zeigten innerhalb entsprechender Gattungen oder Familien ähnlich große Homologien. So waren die klonierten und heterolog überexprimierten (–)-Isopiperitenol/(–)-Carveol-Dehydrogenasen der beiden Mentha -Arten M. piperitae und M. crispae zu über 99 % identisch (Ringer et al., 2005). Die Arbeitsgruppe um Martens untersuchte die molekulare Evolution innerhalb der Familie der Apiaceae basierend auf Gen-, bzw. Proteinsequenzen verschiedener Flavonoid- Dioxygenasen (Gebhardt et al., 2005). Hierbei waren die Flavanon-3β-Hydroxylasen (FHTs) verschiedener Spezies unterschiedlicher Gattungen immer noch zwischen 87 % und 97 %, die Flavon-Synthasen I (FNS I) zwischen 87 % und 91 % identisch. Untersuchungen an Pinoresinol-Lariciresinol-Reduktasen verschiedener Linum -Spezies und Forsythia intermedia zeigten im Vergleich Homologien zwischen 66 % und 75 % (Heimendahl et al., 2005).
IV.1.2 Phylogenie Die Pflanzensystematik kann, durch die Anwendung immer neuer wissenschaftlicher Methoden, Modifikationen und Änderungen erfahren. Während früher taxonomische Beziehungen und Einteilungen hauptsächlich auf morphologischen und phytogeographischen Merkmalen basierten, bietet die Molekularbiologie seit etwa zwei Jahrzehnten neue Möglichkeiten zur Berücksichtigung zusätzlicher taxonomischer Parameter. Hiervon sind auch die beiden Gattungen Digitalis und Isoplexis betroffen. Beide wurden bis vor wenigen Jahren der Familie der Scrophulariaceae zugeordnet. Durch die molekular-phylogenetischen Untersuchungen von Olmstead et al (2001) mittels Plastiden-Genen ( rbc L, ndh F, rps 2) wurden die Gattungen Digitalis und Isoplexis vorerst der Familie der Veronicaceae zugeordnet. Neuere Untersuchungen unter Verwendung anderer genetischer Marker (ITS, trn L-F, rps 16 Intron, mat K-trn K Intron) postulieren allerdings eine Zugehörigkeit beider Gattungen in die Familie der Plantaginaceae (Albach und Chase, 2004; Albach et al., 2005). Aber auch die verwandtschaftliche Beziehung der Gattungen Digitalis und Isoplexis zueinander, sowie die Phylogenie der Digitalis -Spezies untereinander wurden mit
111 Diskussion molekularbiologischen Methoden untersucht. Die ersten entsprechende phylogenetischen Analysen wurden von Carvalho und Culham (1997, 1998) mittels nrDNA Sequenzen einiger Digitalis - und Isoplexis-Spezies durchgeführt. Die Beziehungen innerhalb der Gattung Digitalis wurden, anhand von 7 Arten, von Nebauer et al. (1999, 2000) basierend auf PCR- generierten RAPD-Markern untersucht. Diese Methode wurde auch zur Aufklärung verwandtschaftlicher Verhältnisse zwischen Subspezies von D. minor herangezogen (Sales et al., 2001). Die bisher einzige molekular-phylogenetischen Analyse aller Digitalis - und Isoplexis -Arten wurde, basierend auf ITS und trn L-F Sequenzen, von Bräuchler et al. (2004) durchgeführt. Gemeinsam ist allen bisher veröffentlichten Studien die Verwendung von unspezifischen RAPD-Markern, bzw. ubiquitär vorkommenden Zellkern- und/oder Plastid- Sequenzen. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals eine phylogenetische Untersuchung der Gattungen Isoplexis und Digitalis , basierend auf Gensequenzen eines Gens des Sekundärstoffwechsels, nämlich dem 5 β-POR-Gen der Cardenolid-Biosynthese, durchgeführt. Hierzu wurde mittels der Intron-freien 5 β-POR Gen-Sequenzen verschiedener Digitalis - und Isoplexis -Arten, ein Phylogramm erstellt (Abbildung 14). Auf das Miteinbeziehen verschiedener Subspezies wurde an dieser Stelle verzichtet, da bereits Bräuchler et al. (2004) belegt hatten, dass sich diese phylogenetisch nicht signifikant voneinander unterscheiden. Die 5 β-POR von D. atlantica, konnte leider nicht kloniert und sequenziert werden (vgl. III.1.1.2) und ist folglich nicht im vorliegenden Phylogramm zu finden. In Abbildung 73 ist das in der vorliegenden Arbeit erstellten Phylogramm (vgl. auch Abbildung 14) mit dem Cladogramm von Bräuchler et al. (2004), sowie den sectionalen Einteilungen von Bräuchler et al. (2004), Werner (1965) und Heywood (1972) gegenübergestellt. Bei dem in dieser Arbeit auf den Intron-freien 5 β-POR Gen-Sequenzen verschiedener Digitalis - und Isoplexis -Arten basierenden Phylogramm ist eine Cluster-Bildung der Spezies D. minor , D. purpurea , D. thapsi und D. mariana zu erkennen (Cluster 1), welche auch im Stammbaum von Bräuchler et al. (2004) zu finden ist ( Abbildung 73 ). Diese 4 Digitalis - Arten wurden schon von Werner (1965), bzw. Heywood (1972) zu einer Sectio, der Sectio Digitalis , gruppiert (siehe Übersicht bei Luckner und Wichtl, 2000). In beiden in Abbildung 73 dargestellten Stammbäumen ist die Sonderstellung von D. minor als Schwester zu den übrigen Spezies innerhalb des beschriebenen Clusters eindeutig (Auflösung 100 %, Bräuchler et al., 2004; Auflösung 100 %/99 %/99 %, vorliegende Arbeit). Unterschiede zeigen sich aber
112 Diskussion in der Beziehungen von D. purpurea , D. thapsi und D. mariana zueinander, welche jedoch in beiden Stammbäumen nur durch relativ geringe Bootstrap-Werte gestützt werden. Das zweite Cluster in dem hier erstellten Phylogramm (Cluster 2 = D. ciliata , D. davisiana , D. grandiflora , D. viridiflora ) entspricht der bei Bräuchler et al. (2004) als „expanded Macranthae“ bezeichneten Sectio ( Abbildung 73 ). Allerdings stellt diese Sectio bei Bräuchler et al. (2004) eine Schwestergruppe zu der Sectio Digitalis dar. Bei dem in der vorliegenden Arbeit erstellten Stammbaum wiederum entspricht der beschrieben Cluster 2 einer Gruppe innerhalb der restlichen Digitalis - und Isoplexis -Arten. Dies wird jedoch nur durch eine relativ geringe Auflösung (56 %/60 %/-) untermauert. Des Weiteren schließt die bei Bräuchler et al. (2004) beschriebene Gruppe „expanded Macranthae“ D. lutea subsp. lutea ein, während die in der vorliegenden Arbeit erbrachten Ergebnisse nicht für eine Integration dieser Art in den beschriebenen Cluster 2 sprechen. Vergleicht man das Cladogramm von Bräuchler et al. (2004) mit dem hier erstellten Phylogramm, so fällt auf, dass beide Stammbäume D. viridiflora in die Gruppe der „expanded Macranthae“ (Bräuchler et al., 2004), bzw. in den beschriebenen Cluster 2 integrieren ( Abbildung 73 ). Interessant ist hierbei, dass dies nicht der Einteilung von Werner (1965) entspricht, welcher diese Digitalis - Art abgegrenzt von D. ciliata , D. davisiana , D. atlantica und D. grandiflora (= Sectio Grandiflorae ) der Sectio Tubiflorae zuordnet. Die verbleibenden Digitalis -Arten (D. ferruginea , D. lanata , D. laevigata , D. nervosa , D. cariensis , D. obscura , D. parviflora , D. subalpina ) bilden, in Schwesternschaft zu D. lutea und dem vorherig besprochenen Cluster 2, eine letzte große Gruppe (Cluster 3), welche sich weiter aufspaltet. Diese Verzweigungen werden allerdings nur durch relativ niedrige Auflösungen gestützt und entsprechen im Detail nicht den Gruppierungen des von Bräuchler et al. (2004) erstellten Cladogramms oder der sectionalen Einteilung von Werner (1965), bzw. Heywood (1972) (Abbildung 73 ). Die Gruppierung von D. subalpina und D. parviflora in der vorliegenden Arbeit entspricht hierbei eher der sectionalen Einteilung von Werner (1965). Dieser ordnet die 2 Arten in eine gemeinsame Sectio (Sectio Tubiflorae) ein, während Bräuchler et al. (2004) die Bildung von 2 neuen Sectionen vorschlägt. Interessant ist im Besonderen die Stellung von Isoplexis in dem erstellten Phylogramm. I. canariensis , I. chalcantha und I. isabelliana bilden mit einer sehr hohen Auflösung (99 %/99 %/96 %) ein Cluster (Cluster 4) innerhalb der Gattung Digitalis . Die hier ebenfalls in Digitalis integrierte Isoplexis -Art I. sceptrum stellt sich zusammen mit D. lanata separat gruppiert dar. Dies scheint aber, auch die niedrigen Bootstrap-Werten in Betracht ziehen, eher unwahrscheinlich ( Abbildung 73 ).
113 Diskussion
- Isoplexis Isoplexis Tubiflorae Grandiflorae und - und Werner (1965) Cladogramm der sect. sect. Heywood (1972)
a) a) Digitalis Digitalis ben. (2004) Digitalis Digitalis Globiflorae Globiflorae Isoplexis Isoplexis Frutescentes Frutescentes wood wood (1972) und Bräuchler Globiflorae Globiflorae Bräuchler et al., Parviflorae Subalpinae Macranthae sect. sect. expanded “ sect. Tubiflorae sect. ”* sect. sect. genus sect. sect. sect. ““ sect. ” ”# bzw. # *
L-F-Sequenzen; nach Bräuchler et al., trn d D. purpurea D. thapsi D. mariana I. isabelliana I. I. canariensis I. I. chalcantha I. D. nervosa D. laevigata D. cariensis D. minor D. ferruginea D. lanata 62/67/75 I. sceptrum I. D. subalpina D. obscura D. parviflora 64/63/- D. davisiana 99/99/96 D. ciliata D. grandiflora 100/99/99 D. viridiflora P. tremuloides P. A. thaliana D. lutea 60/59/- 61/54/- 57/59/53 ctionaler Einteilung der Gattungen 61/-/61 63/-/70 83/75/51 10 Änderungen 10 -POR -POR Gen-Sequenzen verschiedener β 56/60/- 69/58/57 97/56/63 reien 5 100/100/100
b) t t der sectionalen Einteilung von Werner (1965), Hey entsprechenden Verzweigungen (Branchpoints) angege -Spezies von Bräuchler (2004), basierend auf ITS un Isoplexis D.cariensis subsp. trojana D.lanata subsp. leucophaea Globulariatrichosantha Antirrhinum majus D.minor D.purpurea subsp. purpurea D.thapsi D.purpurea subsp. toletana D.mariana subsp. mariana D.mariana subsp. heywoodii D.grandiflora D.davisiana D.atlantica D.lutea subsp.australis (Korsika) D.lutea subsp.lutea I.sceptrum I.chalcantha I.isabelliana I.canariensis I.canariensis trichomana f. D.parviflora D.obscura subsp. obscura D.obscura subsp. laciniata D.lutea subsp.australis (Toskana) D.subalpina D.subalpina D.ferruginea subsp.schischkini D.ferruginea subsp.ferruginea D.laevigata subsp. laevigata D.nervosa D.lanata subsp. lanata D.viridiflora D.laevigata subsp. graeca D.ciliata - - und 66 60 98 64 86 61 99 100 99 99 100 100 Gegenüberstellung von Cladogramm, Phylogramm und se Digitalis 97 57 99
100 92 54 4). 93 Phylogramm der in dieser Arbeit klonierten Intron-f 96 100 b) a) Abbildung Abbildung 73: et(200 al., verschiedener Quellen. Bootstrap-Werte sind bei den verschiedenen 2004. Arten (Legende vgl. Abbildung 14), gegenübergestell
114 Diskussion
Was sich aber sagen lässt ist, dass auch die hier erhaltenen molekular-genetischen Ergebnisse für eine Wiedereingliederung von Isoplexis in die Gattung Digitalis sprechen. Dies entspricht der von Carvalho und Culham (1997), Bräuchler et al. (2004) sowie Albach et al. (2005) postulierten These. Die von ihnen mit unterschiedlichen nrDNA-Sequenzen, bzw. Plastid- Sequenzen durchgeführten Arbeiten zur Molekularsystematik sprechen alle für eine Integration von Isoplexis in die Gattung Digitalis . Unbeantwortet sind bis heute allerdings die phylogenetischen Zusammenhänge aller Cardenolid-führenden Pflanzenfamilien untereinander. Herzglykoside findet man erratisch in einzelnen Gattungen vieler unterschiedlicher Pflanzenfamilien, wie Plantaginaceae, Apocynaceae, Brassicaceae oder Liliaceae s.l.. Sogar einige Kröten- und Käfer-Arten, synthetisieren Herzglykoside. Dieses Phänomen beschränkt sich jedoch nicht nur auf diese Stoffgruppe. Auch bei anderen Sekundärstoffen, wie beispielsweise den Quinolizidinalkaloiden, tritt eine erratische Verteilung im Pflanzenreich auf (Wink 2003). Die Frage, ob dies auf eine parallele, unabhängige Entwicklung der Biosynthese für ein und dieselbe Sekundärstoffgruppe (Konvergenz), oder auf gemeinsame „Vorfahren“ beruht, bleibt bis heute für viele Sekundärstoffe, so auch die Herzglykoside, unbeantwortet (Wink 2003). Man geht aber davon aus, dass es sich in vielen Fällen um konvergente Evolution handelt (Pichersky und Gang, 2000). Dies konnte beispielsweise für die Hydroxynitril-Lyasen (Hnls) belegt werden (Hickel et al., 1996). Diese Enzyme, welche den Abbau von cyanogenen Glykosiden unter Freisetzung von HCN katalysieren, sind in vielen Arten unterschiedlicher Pflanzenfamilien zu finden. Mittels Charakterisierung gereinigter Proteine sowie Analyse molekularer Daten konnte gezeigt werden, dass sich die Hnls in den untersuchten Pflanzenfamilien unabhängig voneinander entwickelt hatten (Hickel et al., 1996). Ein besonderer Fall der konvergenten Evolution, welcher im Bereich der Sekundärstoff-Evolution gehäuft aufzutreten scheint, stellt die so genannte „repeated evolution“, also die „wiederholte Evolution“ dar. Hierbei geht man davon aus, dass sich eine neue genetische Funktion unabhängig, jedoch aus einem orthologen oder paralogen Gen entwickelt hat (Pichersky und Gang, 2000). Ein Beispiel für diese wiederholte Evolution stellt der Fall der Homospermidin- Synthase (HSS) dar. Hierbei handelt es sich um ein Enzym, welches an der Biosynthese der im Pflanzenreich sporadisch auftretenden Pyrilizidinalkaloide beteiligte ist und auch nur in den betreffenden Pflanzenarten, sowie einigen wenigen Bakterienarten zu finden ist. Molekularbiologische Untersuchungen zeigten hier, dass die pflanzliche HSS nicht direkt mit dem korrespondierenden bakteriellen Enzym verwandt ist, sich aber beide phylogenetisch von
115 Diskussion dem ubiquitär vorkommenden Enzym Deoxypusin-Synthase (DHS) ableiten (Ober und Hartmann, 1996 und 2000). Um nun die phylogenetischen Zusammenhänge der Cardenolid-führenden Pflanzenfamilien untereinander aufklären zu können, wären ähnliche molekular- phylogenetische Untersuchungen von Pflanzen der entsprechenden Gattungen, bzw. Familien mittels Genen der Cardenolid-Biosynthese denkbar. Erste Versuche zur Amplifikation und Klonierung der 5 β-POR Gene mit den in der vorliegenden Arbeit verwendeten spezifischen Primern (VH07bdir/VH1188rev) sowie DNA der Herzglykosid-führenden Pflanzen Thevetia peruviana , Asclepias curassavica , Nerium orleander , Erysimum crepidifolium , Helleborus niger , Strophanthus kombé , Adonis vernalis und Convallaria majalis brachten jedoch kein Ergebnis (Bötsch, 2005). Dies kann bereits als Hinweis auf 5 β-POR Gene mit anderer Struktur als in Digitalis oder Isoplexis , zumindest aber mit Modifikationen im Bindebereich der verwendeten Primer (Anfangs- und Endbereich), gewertet werden. Eine Möglichkeit wäre hier die Ableitung degenerierter Primer im Anfangs- und Endbereich der Gensequenz. Des Weiteren könnte nach konservierten Bereichen in veröffentlichten pflanzlichen Progesteron- 5β-Reduktase Proteinsequenzen gesucht werden. Innerhalb dieser wäre das Ableiten degenerierter Primer möglich, um damit in den zu untersuchenden Arten nach den 5 β-POR Genen zu „fischen“.
IV.1.3 Molekulare Organisation der 5 β-POR aus D. lanata Eine weitere Fragestellung war die nach der molekularen Organisation der 5β-POR. Die Sequenzierung der 5β-POR Gensequenzen hatte bereits zur Aufklärung der Exon-Intron- Struktur geführt (vgl. IV.1.1). Es sollte auch geklärt werden, ob es sich hierbei um ein Gen handelt, welches in einer hohen Anzahl von Duplikaten im Genom vorkommt („multi copy gene“, bzw. „multi-gene family“), oder ob es sich um eine eher kleine Genfamilie oder sogar um ein Einzelgen handelt. Der Restriktionsverdau mit Eco RI und Hind III ergab im Southern- Blot 2 Banden, der Verdau mit Bam HI 3 Banden. Dies lies die Schlussfolgerung zu, dass es sich bei der 5β-POR aus D. lanata um eine sehr kleine Genfamilie von wahrscheinlich nicht mehr als 2 bis maximal 3 Genen handeln sollte. Ähnlich verhält es sich mit der an der Lignan- Biosynthese beteiligten Pinoresinol-Lariciresinol-Reduktase (PLR) aus Linum usitatissimum , welche ebenfalls zu einer kleinen Genfamilie zu rechnen ist (Heimendahl et al., 2005). Interessant ist hierbei, dass es sich bei der entsprechenden PLR aus Linum album , welche zu 66 % mit der PLR aus L. usitatissimum identisch ist, wiederum um ein Einzelgen handelt (Heimendahl et al., 2005). Auch Gene anderer Sekundärstoffwechselwege kommen als
116 Diskussion
Einzelgen im entsprechenden Genom vor. Als Beispiel sei hier die Flavonoid-Hydroxylase aus Catharanthus roseus genannt (Kaltenbach et al., 1999). Im Gegensatz dazu findet man aber auch Gene, welche in einer hohen Anzahl im entsprechenden Genom vorkommen. Ein typisches Beispiel hierfür stellen die Chalcon-Synthasen (CHS) dar (u.a. Durbin et al., 2000). Aus Digitalis war es bisher möglich eine CHS zu klonieren (Acc.-Nr.: DLAJ2526), jedoch wurde deren molekulare Organisation noch nicht näher untersucht. Southern-Blot-Analysen von Chalcon-Synthasen, beispielsweise aus Perilla frutescens (Gong et al., 1997) oder auch Solanum tuberosum (Jeon et al., 1996), bestätigten, dass das CHS-Gen in dem jeweiligen Genom als „multi copy gene“ vorliegt. Für die im Anschluss an die Southern-Blot-Analyse geplante heterologe Überexpression der 5β-POR ( D. lanata ) stellte der Ausschluss zahlreicher Gen-Duplikate im Digitalis -Genom einen Vorteil dar. So konnte der Versuch der Überexpression eines evtl. nicht funktionsfähigen Pseudogens nahezu ausgeschlossen werden.
IV.1.4 Heterologe Expression von r5 β-POR aus D. lanata Bis zu diesem Zeitpunkt war der Beweis noch nicht erbracht, dass die in dieser Arbeit klonierten Gen-Sequenzen tatsächlich für funktionelle Progesteron-5β-Reduktasen kodieren würden. Es war daher nötig, eine putative 5β-POR (D. lanata ) heterolog zu exprimieren und zu charakterisieren. Mit den ursprünglich für die PCR ausgewählten Expressionsprimern war es nicht möglich mittels RT-PCR ein Intron-freies PCR-Produkt zu amplifizieren. Es wurde daher entschieden, einen direkten Primer zu generieren, welcher unmittelbar nach dem Intron anlagern sollte (PORsphdir). Dies führte zur Kürzung des im Anschluss überexprimierten Proteins um 13 Aminosäuren. Mit der Primerkombination PORsphdir/PORsalrev und genomischer DNA von D. lanata war es möglich, ein PCR-Produkt zu amplifizieren. Nach erfolgreicher Ligation mit den pQE-30 Vektor, welcher Fusions-Proteine mit einem N- terminalen 6 x His-tag translatiert, wurde mit dem entstandenen Vektor-Insert-Konstrukt pQE-30/16 kompetente M15[pREP4] Zellen transformiert. Bei den anfänglich durchgeführten Versuchen zum Expressionsprofil zeigte sich, dass bei einer Inkubation von 37 °C und 1 mM IPTG, nach 6 h eine induzierte Bande von ca. 43 kDa im SDS-PAGE zu erkennen war. Dies korrelierte größenmäßig mit der 43 kDa Hauptbande im SDS-PAGE der gereinigten 5 β-POR aus D. purpurea (Gärtner et al., 1994). Die für die Überexpression der 5 β-POR aus D. lanata verwendeten Expressionsprimer (PORsphdir/PORsalrev) wurden ebenfalls für die heterologe Überexpression der 5 β-POR aus I. canariensis herangezogen (rIc 5β-POR; Herl et al., 2006a). Die rIc 5β-POR wies im SDS-PAGE ein Molekulargewicht von 45 kDa auf.
117 Diskussion
Das Ziel lag darin, die r5 β-POR möglichst in gelöster Form überzuexprimieren, um sie im Anschluss problemlos nativ reinigen zu können. Unter physiologischen Bedingungen liegen alle bisher beschriebenen Progesteron- bzw. 4-3-Ketosteroid-5β-Reduktasen als lösliche Proteine im Cytosol vor. Hierbei spielt es keine Rolle, ob es sich um Enzyme aus tierischen Organen, wie Rattenleber (Okuda und Okuda, 1984; Mode und Rafter, 1985) und Hühnerleber (Sugimoto et al., 1990a und 1990b), oder aus Pflanzen, wie D. purpurea (Gärtner et al., 1990 und 1994) und D. lanata (Stuhlemmer und Kreis, 1996a) handelt. Es ist aber trotzdem möglich, dass ein lösliches Protein unter ungünstig gewählten Expressionsbedingungen in nicht löslicher Form heterolog überexprimiert wird. Das rekombinante Protein wird hierbei wahrscheinlich vom Wirtsorganismus (E. coli ) als fremd erkannt und in so genannte „inclusion bodies“ eingelagert. Diese Vesikel sind nur unter denaturierenden Bedingungen zu öffnen, bzw. zu lösen. Es musste folglich überprüft werden, ob die r5 β-POR unter Standard-Expressionsbedingungen (37 °C, 6 h, 1 mM IPTG) in löslicher oder unlöslicher Form exprimiert wurde. Bei den Versuchen zur Proteinlöslichkeit konnte schließlich der Hauptteil der putativen r5 β-POR in der unlöslichen Proteinfraktion nachgewiesen werden, was für die Bildung von „inclusion bodies“ während der Überexpression sprach. Mittels denaturierender His-tag-Reinigung an Ni-NTA war es aber möglich, ein Protein anzureichern, welches im SDS-PAGE ein Molekulargewicht von 43 kDa aufwies. Dies bestätigte die Vermutung der induzierten Bande von 43 kDa (SDS-PAGE) aus den Versuchen zum Expressionsprofil und zur Proteinlöslichkeit. Um die r5 β-POR auf Funktionalität zu prüfen und um sie charakterisieren zu können, musste das Enzym daher in löslicher, nativ zu reinigender Form überexprimiert werden. Die Bildung von „inclusion bodies“ kann oft durch Veränderungen in den Expressions- bedingungen verhindert oder stark reduziert werden. Man verringert hierbei die Induktor- Konzentration (IPTG) bei gleichzeitiger Erniedrigung der Expressions-Temperatur und Verlängerung der Expressions-Dauer („The QIAexpressionist“, Version 2003). Bei Expressionsbedingungen von 4 °C über 96 h mit einer IPTG Konzentration von 0,1 mM lies sich das r5 β-POR Protein in ausreichender Menge löslich überexprimieren, um es unter nativen Bedingungen mittels Ni-NTA (native His-tag-Reinigung) zu reinigen. Im SDS-PAGE zeigte die nativ gereinigte Proteinfraktion eine dominante Bande von 43 kDa. Die aus Sprosskulturen von D. purpurea gereinigte 5 β-POR zeigte im SDS-PAGE ebenfalls eine Hauptbande bei 43 kDa (Gärtner et al., 1994), während die rIc 5β-POR aus I. canariensis nach nativer His-tag-Reinigung ein Molekulargewicht von 45 kDa in SDS-PAGE aufwies (Herl et al., 2006a). Auch die Molmassen von Progesteron- bzw. 4-3-Ketosteroid-5β-Reduktasen aus
118 Diskussion tierischen Organismen lagen in der gleichen Größenordnung: Das Molekulargewicht im SDS- PAGE wurde für die 4-3-Ketosteroid-5β-Reduktase aus Rattenleber mit 37 kDa (Okuda und Okuda, 1984), bzw. 38 kDa (Mode und Rafter, 1985), für das Enzym aus Hühnerleber mit 37 kDa (Sugimoto et al., 1990b). angegeben. Im SDS-Page der nativ His-tag gereinigten r5 β-POR waren neben dem induzierten Enzym auch schwache Banden anderer mitangereicherter Proteine zu erkennen. Zwar postulierten Janknecht et al. (1991), dass in Bakterien das Auftreten von Proteinen mit benachbarten Histidinresten eher ungewöhnlich ist, dennoch ist ein so genannter „Background“ von nicht induzierten Proteinen gerade bei der nativen Reinigung an Ni-NTA häufig der Fall („The QIAexpressionist“, Version 2003). Ein Grund hierfür stellt die hohe Affinität der Ni-NTA Matrix dar, an welcher auch Proteine mit wenigen benachbarten Histidinresten gebunden werden können. Aber auch hydrophobe und/oder ionische Wechselwirkungen zwischen Proteinen und der Matrix sind beschrieben („The QIAexpressionist“, Version 2003). Durch höhere Imidazol-Konzentrationen im Waschpuffer, d.h. durch Erhöhung der Wasch-Stringenz während der Reinigung, könnte eine Verringerung des „Histidin-Backgrounds“ erzielt werden, jedoch müsste hier gleichzeitig mit einer Reduzierung der Ausbeute an r5 β-POR gerechnet werden. Unter den beschriebenen Expressions- und Reinigungs-Bedingungen betrug die Reinheit der r5 β-POR-Fraktion durchschnittlich 97,4 % und lag somit in den für die native Reinigung an Ni-NTA postulierten Bereich von > 95 % (Jahnknecht et al., 1991; QIAexpressionist“, Version 2003). Der Beweis der katalytischen Aktivität der nativ His-tag gereinigten r5 β-POR wurde mittels Standard 5 β-POR-Enzymassays erbracht: Das Protein setzte in Anwesenheit des Cosubstrats NADPH das Substrat Progesteron zu 5 β-Pregnan-3,20-dion um und war folglich enzymatisch aktiv. Verfälschungen der erbrachten Ergebnisse durch endogene Bakterienproteine konnten mittels Kontrollexperimente mit nicht insertierten pQE30 Vektor in M15[pREP4] Zellen ausgeschlossen werden (Abbildung 37 und 36). Nach erfolgreicher Überexpression der r5 β-POR, galt es nun das Enzym zu charakterisieren.
119 Diskussion
IV.1.5 Charakterisierung der r5 β-POR Neben der 5 β-POR ist in D. lanata auch eine Progesteron-5α-Reduktase (5 α-POR) zu finden (Wendroth und Seitz, 1990, Seitz und Gärtner, 1994, Stuhlemmer und Kreis, 1996a, Grigat, 2006). Molekulare Daten für dieses Enzym sind bisher jedoch noch nicht verfügbar. Während es sich bei der 5 β-POR um ein im Cytosol befindliches, lösliches Enzym handelt (Gärtner et al., 1990), ist die 5 α-POR mikrosomal am endoplasmatischen Retikulum gebunden (Wendroth und Seitz, 1990). Es stellte sich die Frage, ob die 5β-POR die C4-C5 Doppelbindung im Ring A des Pregnen-Grundkörpers tatsächlich ausschließlich zum 5 β- konfigurierten Produkt reduziert, oder ob das Enzym auch eine 5 α-Reduktase-Aktivität aufweisen könnte. Hierzu wurde innerhalb der abgeleiteten Aminosäuresequenz der hier klonierten und überexprimierten r5β-POR ( D. lanata ) nach der postulierten 5 α-POR spezifischen Steroid-Bindedomäne (Rattenleber; Isoenzym-1) gesucht (Bhattacharyya et al., 1999). Das LEG, bzw. LEGFXAF Fragment trat innerhalb der 5 β-POR Sequenz nicht auf. Aus dem tierischen System ist der 5 α-POR spezifische Hemmstoff 17 β-(N-t- butyl)Carbamoyl-4-aza-5α-androst-1-en-3-on (Finasterid) bekannt, sowie dessen Bindedomäne innerhalb des 5 α-POR Proteins (Isoenzym-1) von Ratte und Mensch (Thigpen und Russell, 1992). Laut Thigpen und Russell (1992) sind 4 strikt konservierte, benachbarte Aminosäuren (VSIV) für die Hemmstoff-Bindung verantwortlich. Auch dieses Motiv war innerhalb der 5 β-POR Proteinsequenz nicht zu finden, ebenso wenig wie die von Lombardo und Hudson (1996) veröffentlichte Bindedomäne des 5α-POR Antikörpers. Durch die erfolgreiche funktionelle Überexpression der r5 β-POR war es nun möglich, die Reduktion der C4 – C5 Doppelbindung im Ring A des Steroidgerüsts auf ihre Stereoselektivität hin zu untersuchen. Es wurden Standard 5β-POR-Enzymassays mit Progesteron als Substrat durchgeführt. Es konnte hierbei weder mittels DC, noch GC-MS eine Umsetzung von Progesteron zu der 5 α-konfigurierten Substanz 5 α-Pregnan-3,20-dion festgestellt werden. Die durch r5 β-POR katalysierte Doppelbindung-Reduktion lief folglich 5 β-stereoselektiv ab. Die enzymatische Reduktion der C4-C5 Doppelbindung im Ring A des Steroidgerüsts mittels Ketosteroid-Reduktasen erfordert ein Reduktionsäquivalent. Bei den bisher beschriebenen 5 α/5 β Ketosteroid-Reduktasen ist dies NADPH, welches nicht durch NADH ersetzt werden kann (Tomkins, 1957; McGuire und Tomkins, 1960; Okuda und Okuda, 1984; Mode und Rafter, 1985; Gärtner et al., 1990; Sugimoto et al., 1990b; Wendroth und Seitz, 1990). Bei der Überprüfung der Cosubstrat-Spezifität der r5 β-POR stellte sich heraus, dass das Substrat Progesteron auch unter Verwendung von NADH als Cosubstrat enzymatisch zu 5β-Pregnan-3,20-dion umgesetzt wurde (Abbildung 52 und 53). Diese Umsetzung fand
120 Diskussion allerdings nur in sehr geringem Maße statt. Bei einer Reinheit des verwendeten NADs von ca. 98 % kann eine geringe Verunreinigung mit NADP, welches durch das im Assay enthaltenen regenerierende System zu NADPH hätte reduziert werden können, allerdings nicht völlig ausgeschlossen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde mit gereinigtem, rekombinantem Enzym in hoher Dosis von 0,2 mg gearbeitete. Es wäre also auch möglich, dass die Menge an Reaktionsprodukt bei Versuchen mit einem aus Gewebe teilgereinigtem Protein (Gärtner et al., 1990; Wendroth und Seitz, 1990; Sugimoto et al., 1990b; Okuda und Okuda, 1984; Mode und Rafter, 1985; McGuire und Tomkins, 1960; Tomkins, 1957) unterhalb der Nachweisgrenze liegen könnte. Das ermittelte pH-Optimum der r5 β-POR lag mit pH 7,5 im gleichen Bereich wie das der aus D. purpurea teilgereinigten 5 β-POR (pH-Optimum pH 8,0; Gärtner et al., 1990), bzw. der rIc 5β-POR aus I. canariensis (pH-Optimum pH 8,5; Herl et al., 2006a). Auch 4-3- Ketosteroid-5β-Reduktasen aus tierischen Organismen zeigten ihre pH-Optima in der gleichen Größenordnung (pH 7 – 8 für Rattenleber, Mode und Rafter, 1985; Okuda und Okuda, 1984 bzw. pH 5,0 – 6,5 für Hühnerleber, Sugimoto et al., 1990b). Die höchste Aktivität wies die r5 β-POR bei 43 °C auf. Damit lag das Temperaturoptimum im gleichen Größenbereich wie das der rIc 5β-POR ( I. canariensis ) von 45 °C (Herl et al., 2006a). Das Temperaturoptimum der r5 β-POR lag um 13 °C höher als das von Gärtner et al. (1990) für die teilgereinigte 5 β-POR ( D. purpurea ) ermittelte von 30 °C. Ein möglicher Grund hierfür könnte in der um 13 Aminosäuren verkürzten Proteinstruktur der r5 β-POR liegen. Die Aktivierungsenergie der durch r5 β-POR katalysierten Reaktion betrug 38,64 kJ/mol (Abbildung 55). Der ermittelte isoelektrische Punkt (IEP) der r5 β-POR betrug, genau wie der der rIc 5β-POR aus I. canariensis (Herl et al., 2006a), 6,5 (Abbildung 56). Dies wich von dem theoretisch ermittelten IEP (5,8) der r5 β-POR ( D. lanata ) leicht ab (www.expasy.ch/ tools/pi_tool.html). Hierbei wurden bereits die Veränderungen im Protein durch den His-tag und die am N-Terminus fehlenden 13 Aminosäuren berücksichtigt. Zu der theoretischen Berechnung des IEP ist allerdings anzumerken, dass dieser sich ausschließlich aus dem Durchschnitt der pKa-Werte der im Protein befindlichen Aminosäuren berechnet und die
Sekundär-, Tertiär-, bzw. Quartärstruktur eines Proteins nicht miteinbezieht (IEP = (pK i + pK j)/2). Diese räumlichen Anordnungen spielen jedoch eine Rolle, da sie bestimmen, inwieweit NH 2- und COOH- Gruppen vom umgebenden Milieu ionisierbar sind, oder nicht. Auch bei anderen Proteinen, beispielsweise einigen humanen Acyl-CoA Dehydrogenasen,
121 Diskussion konnten deutliche Abweichungen zwischen theoretischem und im Versuch ermitteltem IEP festgestellt werden (Kräutle, 2001). Zur Ermittlung der Substratspezifität der r5 β-POR wurden verschiedene Steroide mit unterschiedlichen strukturellen Eigenschaften auf ihre Umsetzung hin getestet: Es wurde neben Progesteron auch andere Steroide mit C4-C5-Doppelbindung in Kombination mit C3- Carbonylgruppe, wie 4-Androsten-3,17-dion, Testosteron, Cortexon, 21-O-Acetyl-Cortexon, Cortisol, Cortison und Canarigenon durch r5 β-POR reduziert. Steroide mit einer Hydroxylgruppe an Position 3 und der zu reduzierenden Doppelbindung zwischen C4-C5 oder C5-C6 wurden von der r5 β-POR nicht als Substrate akzeptiert. Hierbei spielte es keine Rolle, ob die Hydroxylgruppe 3 α- oder 3 β-konfiguriert vorlag. Auch die Reduktion von Isoprogesteron, einem Steroid mit C3-Carbonylgruppe und C5-C6-Doppelbindung, wurde nicht durch r5 β-POR katalysiert. Basierend auf diesen Ergebnissen konnten für die Umsetzung durch r5 β-POR strikt erforderliche und variable Strukturmerkmale am/im Steroidgerüst definiert werden:
19 R5 R2 12 R4 essentiell → C4-C5 Doppelbindung in Kombination R1 17 11 13 18 H 16 mit C3-Carbonylgruppe (konjugiertes 9 14 1 15 Doppelbindung-System) 2 10 H 8 R3 3 4 7 variabel → Oxidationsgrad des Steroidgrundgerüsts O 5 6 (R1 – R4)
Abbildung 74: Essentielle und variable Strukturmerkmale möglicher Substrate der r5 β-POR.
Eine Ausnahme stellte die Substanz 21-O-Malonyldesoxycorticosteron dar. Sie wurde trotz C3-Carbonylgruppe und C4-C5-Doppelbindung nicht enzymatisch durch r5 β-POR umgesetzt. Die Seitenkette R4 unterschied sich bei dieser Substanz um eine endständige, zusätzliche Carboxylgruppe (COOH) von der Seitenkette des 21-O-Acetyl-Cortexons (R4 =
COCH 2OCOCH 3), welches noch durch r5 β-POR umgesetzt wurde. Sowohl die dadurch bedingte erhöhte Polarität, als auch die Größe der R4 Seitenkette des 21-O- Malonyldesoxycorticosterons könnte hierfür verantwortlich sein. Interessant war auch die Umsetzung der getesteten 21-OH-Pregnan-Derivate, da der Zeitpunkt der 21-Hydroxylierung während der Cardenolid-Biosynthese bis heute noch nicht eindeutig geklärt ist. Die Umsetzung von Cortexon, Cortisol und Cortison durch r5 β-POR stützt hier die These von
122 Diskussion
Haußmann (1994), welcher die 21-Hydroxylierung auf einer sehr frühen Pregnanstufe, wahrscheinlich Pregnenolon, postuliert. Die 5 β-POR könnte folglich innerhalb der Cardenolid-Biosynthese zu einem späteren Zeitpunkt als bisher angenommen involviert sein. Hierfür könnte auch die Reduktion von Canarigenon zu Digitoxigenon durch die r5 β-POR sprechen. Neben der 14 β-OH-Gruppe, deren Einführung während der Cardenolid-Biosynthese sowohl in zeitlicher als auch enzymatischer Hinsicht noch nicht geklärt ist, weist Canarigenon bereits einen Cardenolidring an Position C-17 auf. Zwar gehen mittlerweile einige
Arbeitsgruppen davon aus, dass die Anknüpfung der C2-Einheit (Bildung des C 23 - Grundkörpers) an Position C-21 bereits auf der Pregnenolonstufe möglich sei (Maier et al., 1986; Deluca et al., 1989; Haußmann 1994), jedoch gilt der eigentliche Lactonringschluss, der zur Bildung des Butenolidrings führt, bisher als einer der letzten Schritte der Cardenolid- Biosynthese (Leete et al., 1965; Kreis et al.,1998, Luckner und Wichtl, 2000). Hinzu kommt, dass in der Gattung Digitalis bisher keine Substanzen des Canarigenon-Typs nachgewiesen wurden (Übersicht bei Luckner und Wichtl, 2000). Diese würden aber, falls im Zuge der Cardenolid-Biosynthese die Bildung des Cardenolidrings vor der 5 β-Reduktion stattfände, die Substrate für 5 β-POR darstellen. Eine weitere offene Frage ist, an welcher Stelle in der Biosynthese der Cardenolide die 3 β-ständige Zuckerkette angeknüpft wird. Durch Fütterungsversuche mit Pregnenolonglucosid ergaben sich Hinweise, dass eine Glykosidierung bereits auf Pregnanebene vor den entsprechenden Hydroxylierungen und der 5β-Reduktion stattfinden könnte (Tschesche und Lilienweiss, 1964). Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Versuche zur Substratspezifität, bei denen sich zeigte, dass die r5 β- POR weder Substrate mit freier noch mit glykosidierter C3-Hydroxylgruppe katalytisch umsetzten konnte, stützen diese These jedoch nicht. Vom natürlichen Substrat der r5β-POR, Progesteron, sowie vom Cosubstrat NADPH und den Substraten 4-Androsten-3,17-dion, Cortexon und Cortisol wurden kinetische
Konstanten ermittelt. Die Km-Werte und relativen Aktivitäten (Herl et al., 2006b) wurden mit den publizierten Daten der 5 β-POR aus D. purpurea Sprosskulturen (Gärtner et al., 1994), sowie mit denen der r Ic 5β-POR aus I. canariensis (Herl et al., 2006a) und denen der 4-3- Ketosteroid-5β-Reduktasen aus Rattenleber (Okuda und Okuda, 1984; Mode und Rafter, 1985) und Hühnerleber (Sugimoto et al., 1990b) verglichen.
Hierbei fiel auf, dass die Km-Werte des Cofaktors NADPH bei allen Reduktasen im gleichen Bereich lagen (3,0 – 15,0 M). Während für Progesteron die Km-Werte der pflanzlichen Reduktasen 5 β-POR ( D. purpurea, r5 β-POR ( D. lanata ) und r Ic 5β-POR ( I. 4 canariensis ), in der gleichen Größenordnung lagen (34 – 215 M), lag der Km-Wert der -3-
123 Diskussion
Ketosteroid-5β-Reduktase aus Rattenleber (Okuda und Okuda, 1984) und Hühnerleber (Sugimoto et al., 1990b) deutlich tiefer (2,2 M, bzw. 4,6 M) (Tabelle 12)
Tabelle 12: Vergleich der kinetischen Konstanten verschiedener 5 β-POR und 4-3- Ketosteroid 5 β-Reduktasen Progesteron
Km ( M) r5 β-POR ( D. lanata ); Herl et al., 2006b 120,0 5β-POR ( D. purpurea ); Gärtner et al., 1994 34,0 rIc 5β-POR ( I. canariensis ); Herl et al., 2006a 215,0 4-3-Ketosteroid-5β-Reduktase ( Rattus norvegicus ); Okuda und Okuda, 1984 2,2 4-3-Ketosteroid-5β-Reduktase ( Gallus gallus ); Sugimoto et al., 1990b 4,3
NADPH
Km ( M) r5 β-POR ( D. lanata ); Herl et al., 2006b 8,0 5β-POR ( D. purpurea ); Gärtner et al., 1994 6,0 rIc 5β-POR ( I. canariensis ); Herl et al., 2006a 15,0 4-3-Ketosteroid-5β-Reduktase ( Rattus norvegicus ); Okuda und Okuda, 1984 3,0 4-3-Ketosteroid-5β-Reduktase ( Gallus gallus ); Sugimoto et al., 1990b 4,2
Die ermittelten Km-Wert der r5 β-POR aus D. lanata , die Substrate Cortisol und 4-Androsten- 3,17-dion betreffend, lagen um des zehnfache tiefer als die der rekombinanten 5 β-POR aus I. 4 canariensis . Die Km-Werte der tierischen -3-Ketosteroid-5β-Reduktase (Okuda und Okuda, 1984) waren geringer als die für die r5 β-POR ermittelten, nämlich bei 11 M (Cortisol) und 4,9 M (4-Androsten-3,17-dion) im Vergleich zu 219 M (Cortisol) und 228 M (4- Androsten-3,17-dion) bei r5 β-POR. Das Vorkommen von Cortisol und 4-Androsten-3,17- dion im tierischen Organismus, in welchem beide Substanzen auch Substrate der Ketosteroid-
5β-Reduktase darstellen können, erklärt die niedrigen Km-Werte im Vergleich zu denen der pflanzlichen Progesteron-5β-Reduktasen. Interessant war die hohe relative Aktivität für Cortisol (133 %) (Tabelle 11). Cortisol weist mehr Hydroxylgruppen am Steroidgrundgerüst auf als die anderen untersuchten Substrate. Dies führt zu einer Erhöhung der Polarität des Moleküls. Die rel. Aktivität könnte durch diese Eigenschaft des Cortisols erhöht sein, da es so möglicherweise zu einem
124 Diskussion schnelleren Diffundieren in die und aus der katalytische Tasche des Enzyms kommen könnte.
Ein Hinweis hierfür ist auch der hohe vmax -Wert von 81,2 nkat/mg (Tabelle 11). Für das Substrat Cortexon standen nur die Vergleichswerte von r5 β-POR ( D. lanata ) und r Ic 5β-POR
(I. canariensis ) zur Verfügung. Beide Km-Werte lagen mit 1597,0 M und 2373,0 M im selben Größenbereich.
IV.1.6 Kristallisation der SeMet-r5 β-POR Die Kristallisation der SeMet-r5 β-POR sollte der Aufklärung der dreidimensionalen Struktur des Proteins mittels Röntgendifraktometrie dienen. Die heterologe Expression von SeMet- r5 β-POR wurde hierfür in dem Methionin auxothropen E. coli Stamm B834(DE3) durchgeführt. Das Protein konnte mittels His-tag-Reinigung an Ni-NTA nativ gereinigt werden und zeigte die erwartete Größe von ca. 43 kDa. Die katalytische Aktivität des Enzyms ging durch die SeMet-Substitution nicht verloren. Hierbei bleibt jedoch festzustellen, dass unter den gewählten Versuchsbedingungen eine geringfügige Menge an unsubstituiertem Protein in der Probe nicht völlig ausgeschlossen werden konnte (Budisa et al., 1995).
Abbildung 75: Kristalle der r5 β-POR aus D. lanata (Egerer-Sieber et al., 2006).
Beim Sequenzvergleich der r5 β-POR in Datenbanken für dreidimensionale Proteinstrukturen konnten nur sehr geringe Übereinstimmungen mit anderen Reduktasen gefunden werden. Die größte Homologie in der MODBASE Datenbank (Pieper et al., 2004) zeigte sich mit 19 % zu der GDP-Mannose-4,6-Dehydratase aus E. coli (PBD code 1db3; Berman et al. 2002). Hiervon lies sich ableiten, dass es sich bei r5 β-POR ebenfalls um ein Protein der NAD(P)(H) abhängigen „Rossmann-fold“ Superfamilie (Rossmann und Argos, 1976; Branden und Tooz,
125 Diskussion
1999) handeln könnte. Bekräftigt wurde diese Annahme durch das Auffinden eines NADP(H)
Rossmann-Motivs X 2GX 2GX 2GX 5 in der Aminosäuresequenz der 5β-POR (Acc.-Nr.: AY585867; I31 -V-G-V-T-G-I-I-G-N-S-L-A-E-44 ). Die endgültige Bestätigung sollte durch die Aufklärung der 3D-Struktur folgen. Hierzu wurde die SeMet-r5 β-POR von der Arbeitsgruppe um Prof. Dr. Y. Muller (Lehrstuhl für Biotechnik, FAU Erlangen) kristallisiert (Abbildung 75) und mittels Röntgendifraktometrie analysiert. Mit den so erhaltenen Daten konnten erste Strukturen der Elektronen-Dichte der r5 β-POR abgeleitet werden (Abbildung 76) (Egerer- Sieber et al., 2006). Die Abbildungen 75 und 76 wurden freundlicherweise von der Arbeitsgruppe um Herrn Prof. Dr. Muller zur Verfügung gestellt.
a) b)
Abbildung 76: 3D-Darstellung der Elektronen-Dichte der r5 β-POR (Egerer-Sieber et al., 2006). a) Region mit α-Helix-Struktur. b) Region mit β-Faltblatt-Struktur.
An der Aufklärung der kompletten dreidimensionalen Struktur der r5 β-POR wird derzeit von der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr. Y. Muller (Lehrstuhl für Biotechnik, FAU Erlangen) gearbeitet.
126 Diskussion
IV.2 5-3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase IV.2.1 Klonierung der 3 β-HSD aus Digitalis Zur Klonierung der 3β-HSD aus Digitalis -Arten wurden Primer von der im Internet veröffentlichten mRNA, bzw. cDNA Sequenz der 3β-HSD ( D. lanata ) (www.pubmed.com; Acc.-Nr.: AJ345026; Finsterbusch et al., 1999) abgeleitet. Durch PCRs mit allen in Frage kommenden Primerkombinationen und genomischer DNA von D. lanata als Template, zeigte sich, dass die Amplifikation des größten PCR-Produkts unter Verwendung von Primerkombination VII (HSDdira/HSDrev) möglich war. Durch anschließendes Klonieren und Sequenzieren dieses PCR-Produkts ließ sich nachweisen, dass es sich hierbei um die 3β- HSD aus D. lanata handelte. Die Sequenz war mit der von Finsterbusch et al. (1999) veröffentlichten mRNA Sequenz (Acc.-Nr.: AJ345026), sowie mit dem 700 bp 3 β-HSD Fragment von Lindemann et al. (2000) nahezu identisch, schien aber im Anfangsbereich ein Intron aufzuweisen. Durch Anwendung der „GT-AG-Regel“ (Lewin, 1998; Brown und Simpson, 1998) konnte die vermutete Intron-Exon-Struktur der 3 β-HSD aus D. lanata bekräftigt werden: Das Exon endete auf AG; während das Intron mit GT begann und auf CAG endete. Bestätigt wurde die angenommene mRNA Sequenz der 3 β-HSD ( D. lanata ) durch Sequenzierung des durch RT-PCR amplifizierten PCR-Produkts. Die CDS der 3 β-HSD aus D. lanata umfasste somit 780 bp, welche für 259 Aminosäuren kodierten. Die von Finsterbusch et al. (1999) sequenzierten 3 β-HSD-Peptidfragmente wurden in der abgeleiteten Aminosäuresequenz der hier klonierten 3 β-HSD gefunden: V 11 AIITGAASGIG EETARLFVEH 32 ; Y 83 RLDIMLSNAGVFGAL 99 ; H 228 VAEAALFLASD-ESAYV 244 (Acc.- Nr.: AY844960). Mit der ermittelten Gensequenz der 3 β-HSD aus D. lanata wurde nach Sequenz- Übereinstimmungen in anderen Organismen gesucht. Neben zahlreichen Übereinstimmungen mit Chromosomen-Sequenzen unbekannter Funktion von A. thaliana , Z. mays und O. sativa (vgl. IV.1.1), fanden sich auch Homologien zu Gensequenzen für Proteine mit bekannter Funktion. Unter diesen zeigten sich die größten Übereinstimmungen mit 2 Oxidoreduktasen (61 %; Acc.-Nr.: NM_130280 und 61 %; Acc.-Nr.: NM_130282) und mit 2 putativen Alkohol-Dehydrogenasen (ADHs) aus A. thaliana (61 %; Acc.-Nr.: AY063106 und 61 %; Acc.-Nr.: AF370319). Alignments auf Nukleotidebene ergaben, dass beide ADHs und die Oxidoreduktase NM_130282 eine identische Gensequenz aufwiesen. Eine hohe Übereinstimmung zeigte sich auch zu der tasselseed2-like short chain dehydrogenase/reductase aus Otatea acuminata (46 %; Acc.-Nr.: DQ384247). Schon die Arbeitsgruppe um Luckner (Finsterbusch et al., 1999) wies beim Sequenzvergleich der von
127 Diskussion ihnen erhaltenen Peptidfragmente auf die Übereinstimmung mit einem tasselseed2 Protein aus Z. mays (DeLong et al., 1993) hin. Diese Proteine sollen bei der Geschlechtsdetermination bei Pflanzen eine Rolle spielen und stehen in der Diskussion am pflanzlichen Steroid- Metabolismus beteiligt zu sein (DeLong et al., 1993; Finsterbusch et al., 1999). Von der Gensequenz der 3 β-HSD ( D. lanata ) ließ sich deren putative Aminosäure- sequenz ableiten. Mit dieser wurde nach Sequenzübereinstimmungen mit anderen Organismen auf Proteinebene gesucht. Interessant war hier die große Anzahl an gefundenen Proteinen mit jeweils hoher Sequenzübereinstimmung (502 Einträge). Bei diesen Proteinen handelte es sich vornehmlich um (putative) Alkohol-Dehydrogenasen (u.a. aus Lycopersicon esculentum , A. thaliana , Z. mays ), Oxidoreduktasen ( A. thaliana ), Hydroxysteroid- Dehydrogenasen ( O. sativa ) und Short Chain Dehydrogenasen/Reduktasen (u.a. O. sativa , A. thaliana , Lactuca sativa , Solanum tuberosum , Flagellaria indica , Pisum sativum , Nicotina tabacum , Comamonas testosteroni ). Des Weiteren fand sich ein hohes Maß an Sequenzhomologie mit einer (-)-Isopiperitenol-Dehydrogenase aus Mentha x piperita (47 %; Acc.-Nr.: AAU20370; Ringer et al., 2005) und einer Secoisolariciresinol-Dehydrogenase aus Forsythia x intermedia (49 %; Acc.-Nr.: AF352735; Xia et al., 2001). Bei beiden Proteinen handelte es sich um Enzyme, welche in der jeweiligen Pflanze an der Biosynthese sekundärer Pflanzenstoffe beteiligt sind. Der 3 β-HSD aus D. lanata strukturell ähnliche Proteine fand man folglich in einer Vielzahl von Pflanzen und Mikroorganismen, welche keine Cardenolide produzieren. Auch die Aktivität der 3 β-HSD wurde bereits in Pflanzen nachgewiesen, die keine Herzglykoside bilden, zum Beispiel in S. tuberosum und N. tabacum , sowie in Cardenolid-freien Zellkulturen von N. tabacum und D. lanata (Seidel et al., 1990; Finsterbusch et al., 1999). Die Arbeitsgruppe um Luckner konnte sogar die höchste Aktivität der 3 β-HSD in Pflanzenteilen von D. lanata nachweisen, die keine Cardenolide produzierten (Lindemann und Luckner, 1997; Lindemann et al., 2000). Auch Stuhlemmer und Kreis (1996a) sahen keinen Zusammenhang zwischen 3 β-HSD Aktivität und Cardenolidgehalt in Sprosskulturen von D. lanata . Das Auftreten von 3 β-HSD strukturell sehr ähnlichen Proteinen in unterschiedlichen Pflanzen und Mikroorganismen, sowie der Nachweis von 3 β-HSD Aktivität in Cardenolid-freien Pflanzen und Geweben, stützt die Hypothese, dass 3 β-HSD auch an Cardenolid-Biosynthese „fremden“ Stoffwechselwegen beteiligt sein könnte (Finsterbusch et al., 1999; Lindemann et. al., 2000). Analog der Vorgehensweise bei 5 β-POR (VI.1.1) wurde versucht, die 3 β-HSD aus allen zur Verfügung stehenden Digitalis- und Isoplexis -Arten zu klonieren. Hierzu wurden PCRs mit der für D. lanata erfolgreich getesteten Primerkombination VII (HSDdira/HSDrev)
128 Diskussion und genomischer DNA der zu untersuchenden Pflanzen durchgeführt. Es stellte sich allerdings heraus, dass es nicht möglich war, aus allen getesteten Digitalis - und Isoplexis - Arten PCR-Produkte zu amplifizieren. Das Ausbleiben eines PCR-Produkts in den entsprechenden Digitalis und Isoplexis Spezies infolge eines Fehlens der 3 β-HSD in diesen Arten ist unwahrscheinlich. Wahrscheinlicher sind Sequenzunterschiede im Bindebereich der hier verwendeten direkten und/oder reversen Primer (Anfangs- und/oder im Endbereich der 3β-HSD Gene) innerhalb der Digitalis - und Isoplexis -Arten. Um doch noch möglichst alle 3 β- HSD Gene der getesteten Digitalis - und Isoplexis -Spezies klonieren und sequenzieren zu können, wären mehrere Ansätze denkbar: Zum Einen könnten degenerierte Primer vom Anfangs- und Endbereich der 3 β-HSD Gene abgeleitet werden. Eine weitere Möglichkeit wäre die Generierung von Primern, welche man innerhalb der konservierten Bereiche der bisher erfolgreich klonierten 3 β-HSD Gene ableiten könnte. Da die 3 β-HSD zu der Gruppe der Alkohol-Dehydrogenasen (ADH) zu zählen ist, wäre auch eine Primer-Ableitung an spezifischen ADH-Domänen denkbar. Mit den hier verwendeten spezifischen Primern konnte die 3β-HSD neben D. lanata , zusätzlich aus D. purpurea , D. thapsi , D. ferruginea , D. grandiflora , D. mariana und D. parviflora kloniert und sequenziert werden. Die Gen-Sequenzen wiesen eine hohe Homologie untereinander, sowie zu der publizierten mRNA, bzw. cDNA Sequenz der 3 β-HSD (Acc.-Nr.: AJ345026, Finsterbusch et al., 1999) auf (95 %). Wie schon die Gen-Sequenz der 3 β-HSD aus D. lanata , wiesen auch alle anderen aus genomischer DNA amplifizierten 3 β-HSD Sequenzen ein Intron im Anfangsbereich auf. Die Exon-Intron-Strukturen der Gensequenzen wurden mittels der „GT- AG-Regel“ (Lewin, 1998; Brown und Simpson, 1998) überprüft. Eine Abweichung von der Regel trat bei der ersten Base des letzten Triplets innerhalb des Introns auf: Mit Ausnahme von D. lanata endete das Intron bei allen anderen Digitalis Spezies auf AAG anstelle von CAG. Wie schon bei den 5 β-POR Gensequenzen beobachtet, traten auch bei den 3β-HSD Sequenzen moderate Unterschiede in den Intronlängen auf. In den untersuchten Arten waren die genomischen, sowie die cDNA 3β-HSD-Sequenzen und die abgeleiteten 3β-HSD Proteinsequenzen zu 95 % identisch. Damit lag der hier ermittelte Grad der Homologie in der gleichen Größenordung wie der in anderen Studien verschiedener Sekundärstoffwechsel- Gene, bzw. Enzyme, unterschiedlicher Pflanzen-Gattungen oder Familien errechnete (vgl. IV.1.1).
129 Diskussion
IV.2.2 Heterologe Expression von r3 β-HSD aus Digitalis lanata Einer der frühen Schritte im postulierten Cardenolid-Biosyntheseweg ist die Umsetzung von Pregnenolon zu Progesteron (Kreis et al., 1998). Hierzu sind formal zwei enzymatische Reaktionen nötig: 1.) Die Reduktion der Carbonylgruppe an Position C3 zur Hydroxylgruppe mittels einer 3 β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (3 β-HSD; EC 1.1.1.51; Pregnenolon → Isoprogesteron). 2.) Die Isomerisierung der C5-C6 zur C4-C5 Doppelbindung mittels einer 3- Oxosteroid- 4- 5-Isomerase (KSI; EC 5.3.3.1; Isoprogesteron → Progesteron). Bei Säugetieren sind beide Enzymaktivitäten auf einem Enzym vereint, welches membrangebunden am endoplasmatischen Retikulum oder den Mitochondrien vorliegt (Luu- The et al., 1988 und 1991; Morel et al., 1997; Thomas et al., 1988; Simard et al., 2005). Bei der mikrobiellen 3α-HSD, 3 β-HSD und 3β/17 β-HSD aus Comamonas testosteroni (syn. Pseudomonas testosteroni ) wiederum handelt es sich um lösliche Enzyme, welche keine Isomerase-Aktivität aufweisen (Talalay und Wang, 1955; Yin et al., 1991; Oppermann und Maser, 1996). Bisher war nicht klar, ob in Pflanzen die Dehydrogenase und Isomerase Aktivität der 3 β-HSD auf einem Enzym vereint vorliegen. Bei der 3 β-HSD aus D. lanata handelt es sich um ein im Cytosol befindliches, lösliches Protein (Seidel et al., 1990; Finsterbusch et al., 1999), welches im Sequenzvergleich auf Proteinebene mehr Ähnlichkeit mit mikrobiellen, als mit tierischen HSDs aufweist (Finsterbusch et al., 1999, Lindemann et al., 2000). Dennoch setzte die aus Sprosskulturen von D. lanata gereinigte 3 β-HSD Pregnenolon zu Progesteron um, schien also auch eine Isomerase Aktivität aufzuweisen (Finsterbusch et al., 1999). Hierbei konnte aber nicht ausgeschlossen werden, dass Spuren von mitaufgereinigter KSI für die Isomerisierung verantwortlich waren (Finsterbusch et al., 1999). Durch die in dieser Arbeit durchgeführte heterologe Überexpression der 3 β-HSD aus D. lanata sollte geklärt werden, ob das Enzym nur 3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase oder auch 3-Oxosteroid- 4- 5-Isomerase Aktivität besitzt. Mit Expressionsprimern (HSDsphdir/HSDkpnrev) wurde eine RT-PCR mit cDNA von D. lanata durchgeführt. Das amplifizierte PCR-Produkt wurde in den Expressionsvektor pQE- 30 ligiert, welcher Fusions-Proteine mit einem 6 x His-tag translatiert. Durch Transformation kompetenter M15[pREP4] Zellen mit dem entstandenen Vektor-Insert-Konstrukt pQE-30/5 wurde die Zelllinie zur Überexpression der r3 β-HSD erhalten. Anfänglich wurde ein Versuch zum Expressionsprofil der r3 β-HSD durchgeführt, welcher mittels SDS-PAGE ausgewertet wurde. Hierbei zeigte sich bereits nach 1 h Inkubation mit 1 mM IPTG bei 37 °C deutlich eine induzierte Bande von ca. 30 kDa, welche nach längerer Inkubationsdauer stärker hervortrat. Die aus Sprosskulturen von D. lanata gereinigte 3 β-HSD wies im SDS-PAGE eine Bande von
130 Diskussion
29 kDa auf (Finsterbusch et al., 1999). Im Vergleich zum Expressionsprofil der r5 β-POR wurde bei der der r3 β-HSD das induzierte Protein unter Standard-Expressionsbedingungen (37 °C, 6 h, 1 mM IPTG) in großer Menge überexprimiert (vgl. Abbildung 29 und 43). Es wurde folglich auf eine Modifikation der Expressionsbedingungen verzichtet. Unter Standard- Expressionsbedingungen (37 °C, 6 h, 1 mM IPTG) überexprimierte r3 β-HSD konnte problemlos mittels nativer His-tag Reinigung an Ni-NTA gereinigt werden. Die gereinigte r3 β-HSD zeigte im SDS-PAGE ein Molekulargewicht von ca. 30 kDa, was der induzierten Bande aus dem Versuch zum Expressionsprofil, und den 29 kDa der aus Sprosskulturen von D. lanata gereinigten 3 β-HSD entsprach (Finsterbusch et al., 1999). Mikrobielle Hydroxysteroid-Dehydrogenasen aus C. testosteroni liegen mit 25 kDa für die 3 β-HSD (Yin et al., 1991) und 28 kDa für die 3 α-HSD/Carbonyl-Reduktase (Oppermann und Maser, 1996; Maser et al., 2000) im selben Größenbereich, während 3 β-HSDs aus dem tierischen System deutlich höhere Molekulargewichte aufweisen (Thomas et al., 2004; Simard et al., 2005). In Anwesenheit des Cosubstrats NAD setzte die gereinigte r3 β-HSD das Substrat Pregnenolon zu Isoprogesteron um, wobei auch Progesteron erkennbar war (vgl. IV.2.3). Die Reinheit der nativ His-tag gereinigt r3 β-HSD betrug durchschnittlich 99,3 % und lag damit im dem von Janknecht et al (1991) für die native Reinigung an Ni-NTA postulierten Reinheitsgrad von > 95 %. Verfälschungen der katalytischen Aktivität durch endogene mitaufgereinigte Bakterienproteine in der r3 β-HSD Fraktion konnten durch Kontrollexperimente ausgeschlossen werden.
IV.2.3 Charakterisierung der r3 β-HSD Neben der r3 β-HSD-katalysierten Umsetzung von Pregnenolon zu Isoprogesteron war auch eine Umlagerung von Isoprogesteron zu Progesteron festzustellen. Dass diese Umlagerung nicht durch die r3 β-HSD katalysiert wurde, sondern dass es sich hierbei um nicht enzymatische Isomerisierung handelte, konnte mittlerweile nachgewiesen werden (Herl et al., 2006c eingereicht). Bei der r3 β-HSD aus D. lanata handelt es sich folglich um eine 3 β- Hydroxysteroid-Dehydrogenase (EC 1.1.1.51) ohne 3-Oxosteroid 4- 5-Isomerase Aktivität. Die spontane Isomerisierung von Isoprogesteron zu Progesteron wurde bereits von Finsterbusch et al. (1999) beschrieben, jedoch konnte damals nicht eindeutig belegt werden, dass es sich hierbei nicht um eine durch 3β-HSD katalysierte enzymatische Reaktion handelte. Aus diesem Grund waren Untersuchungen mit rekombinanter r3 β-HSD notwendig. Die weitere Charakterisierung der r3 β-HSD wurde von Jördis Frankenstein, Lehrstuhl für Pharmazeutische Biologie, FAU Erlangen, durchgeführt.
131 Diskussion
IV.3 5 β-POR und 3 β-HSD – Mitglieder der „Short-Chain Dehydrogenase/Reductase“ (SDR) Familie? Die untersuchten Enzyme, (r)5β-POR und (r)3β-HSD gehören zu der Enzym-Klasse der Oxidoreduktasen (EC-Klassifikation 1; Katalyse von Redoxreaktionen). Üblicherweise können Oxidoreduktasen in eine der folgenden Enzym-Superfamilien eingeordnet werden: a) Aldo-Keto-Reductase (AKR) Familie b) Short-Chain Dehydrogenase/Reductase (SDR) Familie c) Medium-Chain Dehydrogenase/Reductase (MDR) Familie d) Long-Chain Alcohol Dehydrogenase (LCAD) Familie Die Mitglieder der einzelnen Superfamilien sind durch verschiedene Eigenschaften, Sequenzmerkmale in der Protein-Primärstruktur und/oder ihrer Tertiär- bzw. Quartärstruktur charakterisiert: AKRs sind meist monomere Proteine von ca. 320 Aminosäuren (Jez et al., 1997; Jez und Penning, 2001; Hyndman et al., 2003). Sie benötigen NAD(P)(H) als Cosubstrat, welches aber nicht mittels einer Rossmann-Faltung an das Enzym gebunden wird (Wilson et al., 1992 und 1995; Hoog et al., 1994; El-Kabbani et al., 1995; Jez et al., 1997). SDRs sind meist Homodimere oder Homotetramere mit einer Proteingröße der Monomere von ca. 250 Aminosäuren (Jörnvall et al., 1995; Jez et al., 1997; Keller et al., 2006). Es sind aber auch SDRs mit einer Größe von mehr als 350 Aminosäuren beschrieben (Jörnvall et al., 1995 und 1999; Kallberg et al., 2002). SDRs benötigen als Cosubstrat NAD(P)(H) (Jörnvall et al., 1995; Jez et al., 1997; Oppermann et al., 1997). Sie weisen eine Rossmann-Faltung als Cosubstrat-Bindedomäne auf, welche sich eher am N-terminalen Ende des Proteins befindet (Thatcher und Sawyer, 1980; Jez et al., 1997). MDRs sind meist oligomere Proteine mit Untereinheiten von je ca. 350 Aminosäuren (Persson et al., 1994; Jörnvall et al., 1999). Zu ihnen zählt eine Vielzahl von Zn-abgängigen Enzymen. Es sind aber auch einige Enzyme beschrieben, die keine Zn-vermittelte Katalyse betreiben (Jörnvall et al., 1999 und 2001). LCADs sind Zn-abhängige Proteine mit einer Größe von mehr als 350 Aminosäuren. Üblicherweise liegen LCADs als Oligomere vor (Jörnvall et al., 1987; Jez et al., 1997). Den vier Superfamilien ist gemeinsam, dass sie jeweils Enzyme verschiedener Funktionen aus unterschiedlichen Organismen enthalten. Die Aminosäuresequenzen ihrer Mitglieder sind extrem variabel, was zur Folge hat, dass in jeder Familie nur wenige Aminosäuren, bzw. Aminosäuremotive als konserviert gelten.
132 Diskussion
Aufgrund von sequenzierten Polypeptiden der aus Sprosskulturen von D. lanata gereinigten 3 β-HSD wurde vermutet, es könne sich bei diesem Enzym um ein Mitglied der SDR Familie handeln. Die Polypeptide zeigten ein hohes Maß an Homologie zu mikrobiellen Hydroxysteroid-Dehydrogenasen der SDR Familie (Finsterbusch et al., 1999). Des Weiteren konnten Finsterbusch et al. (1999) nachweisen, dass es sich bei der nativ gereinigten 3 β-HSD um ein Homodimer handelte, wie es für SDRs charakteristisch ist (Jörnvall et al., 1995; Jez et al., 1997; Keller et al., 2006). Durch die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der hier klonierten 3 β-HSDs war es möglich, nach postulierten konservierten Motiven der SDR Familie zu suchen. Die „klassische“ SDR Familie zeichnet sich durch folgende konservierten
Motive aus: Cofaktor Bindestelle GX 2-3GXG im N-terminalen Bereich; katalytische Domäne
SX 12 YX 4K im Mittelteil der Aminosäuresequenz (Jörnvall et al., 1995 und 1999; Oppermann et al., 1997 und 2003). Beide Motive waren in unveränderter Form in allen abgeleiteten Aminosäuresequenzen der klonierten 3β-HSDs zu finden. In Abbildung 77 ist dies exemplarisch an der Aminosäuresequenz der 3 β-HSD aus D. lanata dargestellt:
MSSKPRLEGKVAIITGGGGAASGGGGIGGGGEETARLFVEHGASVVVADVQDELGRQVVASVNSDDKIS 60 GGGXXXGG GGGXGGGG
YYHCDVRDEKQVAATVRYAVEKYGRLDIMLSNAGVFGALMTNVIDLDMVDFENVLATNVR 120
GVANTIKHAARAMVEGKVKGSIICTASSSSVSASLGGMGPPAYYYYTASKKKKHAVLGLVKGACAELGV 180 SSSXXXXXXXXXXXXYS YYYXXXKKKK
HGIRVNSVAPYGVATPMPCSAYGMTPSQMEEANNSRANLKGVVLKAKHVAEAALFLASDE 240
SAYVSGQNLAVDGGFTVVR 259 Abbildung 77: Konservierte Motive der klassischen SDR Familie in der 3 β-HSD Aminosäuresequenz von D. lanata (Acc.-Nr.: AY844960).
Auch die Größe der 3β-HSD lag mit 259 Aminosäuren im Bereich der SDRs (Jörnvall et al., 1995; Jez et al., 1997; Keller et al., 2006). Zusammenfassend ist festzustellen, dass die aufgeführten Struktur- und Sequenzmerkmale, sowie die Eigenschaften des Enzyms die These von Finsterbusch et al. (1999) stützen, dass es sich bei der 3β-HSD aus Digitalis um ein Mitglied der SDR Familie handelt. Die 4-3-Ketosteroid-5β-Reduktasen aus Mensch und Ratte gehören zu der Familie der AKRs (Hyndman et al., 2003). In der Literatur wird beschrieben, dass es sich bei der 5 β- POR aus Digitalis ebenfalls um ein Mitglied der AKR Familie handeln könnte (Gavidia et al., 2002a). Dagegen sprach, dass sowohl in den abgeleiteten Aminosäuresequenzen aller hier klonierten 5 β-PORs, als auch in der 3D-Struktur der r5β-POR ein Rossmann-Motiv
133 Diskussion
(Abbildung 13; Aminosäure 31 – 44), bzw. eine Rossmann-Faltung nachgewiesen werden konnte (IV.1.6). AKRs hingegen binden ihr Cosubstrat nicht mittels Rossmann-Faltung (Wilson et al., 1992 und 1995; Hoog et al., 1994; El-Kabbani et al., 1995; Jez et al., 1997). Hinzu kommt, dass die aus D. purpurea (Sprosskulturen) gereinigte 5 β-POR nativ als Homopolymer vorlag (Gärtner et al., 1994), während Enzyme der AKR Familie meist Monomere sind (Jez et al., 1997; Jez und Penning, 2001; Hyndman et al., 2003). Auch waren die für AKRs beschriebenen konservierten Motive nicht in den abgeleiteten Aminosäuresequenzen der klonierten 5 β-PORs zu finden (Jez et al., 1997; Jez und Penning, 2001). Die Zugehörigkeit der 5 β-POR aus Digitalis und Isoplexis in die Familie der Aldo- Keto-Reduktasen ist folglich eher unwahrscheinlich. Dies wurde auch von anderer Seite bestätigt (M. Penning, Department of Pharmacology, University of Pennsylvania, Schol of Medicine, USA; persönliche Mitteilung). Durch die Zn-unabhängige Katalyse der (r)5β-POR schied die LCAD Familie ebenso aus, wie die MDR Familie durch das Fehlen der konservierten MDR-Motive (Persson et al., 1994; Jörnvall et al., 1999) in den abgeleiteten Aminosäuresequenzen der klonierten 5 β-PORs. Allerdings konnten auch nicht die klassischen konservierten Motive der SDR Familie (TGX 2-3GXG und SX 12 YX 4K; Jörnvall et al., 1995 und 1999; Oppermann et al., 1997) in den 5 β-POR Sequenzen lokalisiert werden. Innerhalb der SDR Familie finden sich aber auch Enzyme mit Modifikationen der konservierten Motive. So weist unter anderem die Dihydropteridin-Reduktase aus Ratte (Dhpr_Rat; Acc.-Nr.:
P11348; Shahbaz et al., 1987) eine Cofaktor-Bindestelle von GX 2GX 2G anstelle der klassischen GX 2-3GXG Bindedomäne auf (Jörnvall et al., 1995). Dies entspricht den putativen Cofaktor Bindedomänen der 5 β-PORs aus Digitalis und Isoplexis (Abbildung 13, Position 33 – 39; Abbildung 78). Kallberg et al. (2002) postulieren zusätzliche Variabilitäten die katalytische Domäne SX 12 YX 4K betreffend. Es werden unter anderem SDRs beschrieben, bei denen innerhalb der katalytischen Domäne das Lysin durch Asparagin ersetzt ist (SX 12 YX 4N). Bei den abgeleiteten Aminosäuresequenzen der hier klonierten 5 β-PORs aus Digitalis - und Isoplexis -Spezies findet sich exakt dieses Motiv an Position 200 – 216 (Anlage VII.2.2) wieder. In Abbildung 78 sind die SDR Motive der Cosubstrat Bindedomäne und der katalytischen Domäne in der Aminosäuresequenz der 5β-POR aus D. lanata dargestellt.
134 Diskussion
MSWWWAGAIGAAKKRLEEDDAQPKHSSVALIVGGGGVTGGGGIIGGGGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 GGGXXGG GGGXXGGGG
VARRTRPAWHEDNPINYVQCDISDPDDSQAKLSPLTDVTHVFYVTWANRSTEQENCEANS 120
KMFRNVLDAVIPNCPNLKHISLQTGRKHYMGPFESYGKIESHDPPYTEDLPRLKYMNFYY 180
DLEDIMLEEVEKKEGLTWSSSSVHRPGNIFGFSPYYYYSMMNNNNLVGTLCVYAAICKHEGKVLRFTGC 240 SSSXXXXXXXXXXXXYS YYYXXXNNNN
KAAWDGYSDCSDADLIAEHHIWAAVDPYAKNEAFNVSNGDVFKWKHFWKVLAEQFGVGCG 300
EYEEGVDLKLQDLMKGKEPVWEEIVRENGLTPTKLKDVGIWWFGDVILGNECFLDSMNKS 360
KEHGFLGFRNSKNAFISWIDKAKAYKIVP 389 Abbildung 78: Motive der SDR Familie in der 3 β-POR Aminosäuresequenz von D. lanata (Acc.-Nr.: AY585867).
Die Größe der 5 β-POR lag mit 389 Aminosäuren noch im Bereich der SDRs (Jörnvall et al., 1995 und 1999; Kallberg et al., 2002). Die aufgeführten Struktur- und Sequenzmerkmale, sowie die Eigenschaften des Enzyms in Betracht ziehend, sollte die 5 β-POR aus Digitalis und Isoplexis ein neues Mitglied der Short-Chain Dehydrogenasen/Reductase Familie darstellen.
135 Diskussion
IV.4 Ausblick Durch die in dieser Dissertation erbrachten Ergebnisse ergeben sich unter anderem folgende weitere Aspekte für zukünftige Projekte: • Man geht davon aus, dass die Cardenolid-Biosynthese in Digitalis ausschließlich innerhalb der Blätter stattfindet (Luckner und Wichtl, 2000), was bis dato aber noch nicht erwiesen ist. Mittels Expressionsstudien der 5 β-POR von verschiedenen Digitalis -Pflanzenteilen unterschiedlichen Alters könnte dies nun näher untersucht werden. • Ein weiteres Forschungsziel stellt die Regulation der 5 β-POR und 3 β-HSD Genexpression innerhalb der Pflanze auf molekularer Ebene dar. Dies ist von besonderem Interesse, da die Fähigkeit zur Cardenolid-Biosynthese in Digitalis unter anderem von der morphologischen Differenzierung der Pflanze abzuhängen scheint (Eisenbeiß et al., 1999). • Die Kristallisation der r5 β-POR ermöglicht die Aufklärung der 3D-Struktur des Enzyms. Nach der Fertigstellung des vollständigen 3D-Modells werden Rückschlüsse auf die an der Katalyse beteiligten Aminosäuren möglich sein. Durch Site-Directed- Mutagenesis könnte dies näher untersucht werden. Eine Bestätigung der in IV.4 postulierten Substrat- und Cosubstrat-Bindedomänen wäre so möglich. • Der Nachweis des 5 β-POR Gens im I. sceptrum Genom bei gleichzeitigem Fehlen von Cardenoliden in dieser Isoplexis -Art wirft Fragen auf. Zur Aufklärung könnte die heterologe Überexpression des Enzyms sowie Untersuchungen des betreffenden Promotors beitragen. • Das Fernziel liegt im so genannten „Metabolic engenineering“. Durch gerichtete molekulare Eingriffe in den Cardenolidstoffwechsel wird eine gezielte Beeinflussung der Zusammensetzung bzw. der Menge an gebildeten Herzglykosiden angestrebt. Um den Syntheseweg gerichtet beeinflussen zu können, müssen genaue Kenntnisse der Regulation auf Ebene der Gene, Enzyme, Kompartimentierung, sowie des Transports („Metabolic flux“) und der Anreicherung der Intermediärprodukte, bzw. Sekundärstoffe vorliegen (Verpoorte und Memelink, 2002). In Bezug auf die Biosynthese der Cardenolide in Digitalis ist dies noch nicht der Fall. Die in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Erkenntnisse bilden eine bisher nicht vorhandene Ausgangsbasis für diese Forschungsaktivitäten.
136 Zusammenfassung
V ZUSAMMENFASSUNG In der vorliegenden Arbeit standen die an der Biosynthese der Cardenolide in Digitalis und Isoplexis beteiligten Enzyme 5-3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (3 β-HSD) und Progesteron-5β-Reduktase (5 β-POR) im Mittelpunkt der Untersuchungen. Unter Verwendung von spezifischen Primern und DNAs bzw. cDNAs verschiedener Digitalis - und Isoplexis -Arten wurden die 5 β-POR Gene aus 19 Digitalis -Spezies, bzw. Subspezies und 4 Isoplexis -Spezies amplifiziert, kloniert und sequenziert. Sowohl die erhaltenen 5 β-POR Nukleotidsequenzen, sowie die daraus abgeleiteten Aminosäuresequenzen wiesen mit 96 % Homologie ein hohes Maß der Übereinstimmung auf. Alle klonierten 5β-POR Sequenzen wurden in der Genbank NCI Database veröffentlicht. Die durchgeführte Southern-Blot-Analyse konnte die 5 β-POR in D. lanata als ein Mitglied einer kleinen Genfamilie identifizieren. Zur Aufklärung verwandtschaftlicher Beziehungen der Digitalis - und Isoplexis -Arten wurde ein Phylogramm basierend auf den 5β-POR Gensequenzen ausgewählter Digitalis - und Isoplexis -Spezies erstellt. Um die 5 β-POR aus D. lanata weiter charakterisieren zu können, wurde das Enzym als His-tag Fusions-Protein in E. coli heterolog überexprimiert (r5 β-POR). Bei optimalen Expressionsbedingungen war es möglich, die r5 β-POR in löslicher und funktioneller Form zu exprimieren. Die nativ His-tag gereinigte r5 β-POR wurde bezüglich ihrer Substratspezifität, kinetischen Parameter und biochemischen Eigenschaften charakterisiert. Zur Aufklärung der 3D-Struktur des Enzyms wurde sowohl r5 β-POR, als auch SeMet-r5 β-POR hergestellt. Unter Berücksichtigung der strukturellen und proteinchemischen Eigenschaften wurde die 5β-POR der Enzym-Superfamilie der Short- Chain-Dehydrogenases/Reductases (SDR) zugeordnet. Zur Klonierung der 3β-HSD wurden PCRs, bzw. RT-PCRs mit spezifischen Primern und DNAs, bzw. cDNAs verschiedener Digitalis - und Isoplexis -Arten durchgeführt. Es konnten die 3β-HSD Gene aus 7 Digitalis -Spezies amplifiziert, kloniert und sequenziert werden. Die erhaltenen Nukleotidsequenzen waren, ebenso wie die daraus abgeleiteten 3β-HSD Aminosäuresequenzen, zu 95 % homolog. Die klonierten 3β-HSD Sequenzen wurden in der Genbank NCI Database veröffentlicht. Die 3β-HSD aus D. lanata konnte als His-tag Fusions-Protein in E. coli funktionell überexprimiert werden (r3β-HSD). Nach nativer His-tag Reinigung wurde die r3β-HSD charakterisiert. Aufgrund der strukturellen und proteinchemischen Eigenschaften der 3 β-HSD konnte das Enzym, wie die 5 β-POR, als ein Mitglied der Short-Chain-Dehydrogenase/Reductase Superfamilie (SDR) eingeordnet werden.
137 Summary
V SUMMARY This thesis focused on the enzymes 5-3β-hydroxysteroid dehydrogenase (3 β-HSD) and progesterone 5 β-reductase (5 β-POR), both involved in cardenolide biosynthesis in the genera Digitalis and Isoplexis . 5β-POR genes from 19 Digitalis species/subspecies and 4 Isoplexis species were amplified, cloned and sequenced, using specific primers and corresponding DNA or cDNA, respectively. The nucleotide sequences as well as the deduced amino acid sequences showed a high degree of homology (96 %). All 5 β-POR sequences obtained were published in GenBank NCI Database. Southern blot analysis identified 5 β-POR from D. lanata to be a member of a small gene family. Using 5 β-POR genes of selected Digitalis and Isoplexis species, a phylogram was constructed, elucidating phylogenetic relationships between the genera Digitalis and Isoplexis . With a view to characterising 5β-POR from D. lanata further, the enzyme was heterologously expressed in E. coli as a recombinant His-tagged protein (r5 β- POR). Optimised conditions for protein expression facilitated the expression of r5 β-POR in a soluble and functional form. The His-tagged r5 β-POR was purified under native conditions and afterwards characterised with regard to substrate specificity, kinetic constants and biochemical properties. To elucidate the 3-D structure of the enzyme, r5 β-POR as well as SeMet-r5 β-POR was produced. Taking the structural and biochemical properties of the enzyme into account, 5 β-POR was identified as a new member of the short-chain dehydrogenase/reductase family (SDR). With the purpose of cloning 3 β-HSD genes from Digitalis and Isoplexis , PCR/RT- PCR amplifications were carried out using specific primers and DNA or cDNA of several Digitalis and Isoplexis species, respectively. In this process 3 β-HSD genes from 7 Digitalis species were successfully amplified, cloned and sequenced. The nucleotide sequences obtained as well as the amino acid sequences deduced showed a high degree of homology (95 %). All 3β-HSD sequences have been published in GenBank NCI Database. Subsequent 3β- HSD from D. lanata was functionally expressed in E. coli as a recombinant His-tagged protein (r3 β-HSD). After purification of the recombinant enzyme under native conditions, r3 β-HSD was characterised. Structural and biochemical properties of the 3 β-HSD classified this enzyme, as in the case of 5 β-POR, as a member of the short-chain dehydrogenase/reductase family (SDR).
138 Literaturverzeichnis
VI LITERATURVERZEICHNIS
Albach, D.C., Chase, M.W., 2004. Incongruence in Veroniceae (Plantaginaceae): evidence from two plastide and a nuclear ribosomal DNA region. Mol. Phylogenet. Evol. 32, 183-197.
Albach, D.C., Meudt H.M., Oxelman, B., 2005. Piecing together the “new” Plantaginaceae. Am. J. Bot. 92 (2), 297-315.
Basse, C.W., Kerschbamer, C., Brustmann, M., Altmann, T., Kahmann, R., 2002. Evidence for a Ustilago maydis steroid 5 α-reductase by functional expression in Arabidopsis det2-1 mutants. Plant Physiol. 129 (2), 717-732.
Bennett, R.D., Heftmann, E., Winter, B.J., 1969. A function of sitosterol. Phytochemistry 8, 2325-2328.
Berman, H.M., Battistuz, T., Bhat, T.N., Bluhm, W.F., Bourne, P.E., Burkhardt, K., Feng, Z., Gilliland, G.L., Iype, L., Jain, S., Fagan, P., Marvin, J., Padilla, D., Ravichandran, V., Schneider, B., Thanki, N., Weissig, H., Westbrook, J.D., Zardecki, C., 2002. The Protein Data Bank. Acta Crystallogr. D58, 899-907.
Bhattacharyya, A.K., Wang, M., Rajagopalan, K., Taylor, M.F., Hiipakka, R., Liao, S., Collins, D.C., 1999. Analysis of the steroid binding domain of rat steroid 5 α-reductase (ioenzyme-1). Steroids 64, 197-204.
Bötsch, R., 2005. Klonierung, heterologe Expression und Charakterisierung der 5 β- Progesteron-Reduktase aus Isoplexis canariensis (L.) Lindl. ex G. Don. Diplomarbeit 2005, FAU Erlangen.
Bradford, M.M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248- 254.
Branden, C.-I., Tooze, J., 1999. Introduction to Protein Structure. New York, Garland.
Bräuchler, C., Meinberg, H., Heubl, G., 2004. Molecular phylogeny of the genera Digitalis L. and Isoplexis (Lindley) Loudon (Veronicaceae) based on ITS- and trnL-F sequences. Plant Syst. Evol. 248, 111-128.
Brown, J.W., Simpson, C.G., 1998. Splice site selection in plant pre-mRNA-splicing. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49, 77-95.
Budisa, N., Steipe, B., Demange, P., Eckerskorn, C., Kellermann, J., Huber, R., 1995. High- level biosynthetic substitution of methionine in proteins by its analogs 2-aminohexanoic acid, selenomethionine, telluromethionine and ethionine in Escherichia coli . Eur. J. Biochem. 230, 788-796.
Carvalho, J.A., Culham, A., 1997. Phylogenetic and biogeographic relationships of the genera Isoplexis (Lindl.) Benth. and Digitalis L. (Scrophulariaceae – tribe Digitaleae): nuclear DNA evidence. Amer. J. Bot. 84 (6 Suppl.), 180.
139 Literaturverzeichnis
Carvalho, J.A., Culham, A., 1998. Conservation status and preliminary results on the phylogenetics of Isoplexis (Lindl.) Benth. (Scrophulariaceae). Bol. Mus. Mun. Funchal, Sup. no. 5, 109-127.
DeLong, A., Calderon-Urrea, A., Dellaporta, S.L., 1993. Sex determination gene TASSELSEED2 of maize encodes a short-chain alcohol dehydrogenase required for stage- specific floral organ abortion. Cell 74 (4), 757-768.
Deluca, M.E., Seldes, A.M., Gros, E.G., 1989. Biosynthesis of digitoxin in Digitalis purpurea. Phytochemistry 28, 109-111.
Durbin, M.L., McCaig, B., Clegg, M.T., 2000. Molecular evolution of the chalcone synthase multigene family in the morning glory genome. Plant Mol. Biol. 42, 79-92.
Egerer-Sieber, C., Herl, V., Müller-Uri, F., Kreis, W., Muller, Y.A., 2006. Crystallization and preliminary crystallographic analysis of selenomethionine-labelled progesterone 5 β-reductase from Digitalis lanata Ehrh. Acta Crystallogr. F62, 186-188.
Eisenbeiß, M., Kreis, W., Reinhard, E., 1999. Cardenolide biosynthesis in light- and dark- grown Digitalis lanata shoot cultures. Plant Physiol. Bioch. 37, 13-23.
El-Kabbani, O., Judge, K., Ginell, S.L., Myles, D.A., DeLucas, L.J., Flynn, T.G., 1995. Structure of porcine aldehyde reductase holoenzyme. Nat. Struct. Biol. 2, 687-692.
E.Z.N.A. ® Plant DNA Isolation Protocol, 2005. E.Z.N.A. ® Plant DNA Mini Kit, Peqlab Biotechnolgie GmbH, Version 02.05.
E.Z.N.A. ® Plant RNA Isolation Protocol, 2003. E.Z.N.A. ® Plant RNA Kit Peqlab Biotechnolgie GmbH, Version 04.03.
E.Z.N.A. ® Plasmid Miniprep Kit I Protocol; B. Low copy-number plasmids, 2005. E.Z.N.A. ® Plasmid Miniprep Kit I (Classic-Line), Peqlab Biotechnolgie GmbH, Version 09.05.
Felsenstein, J., 1985. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. Evolution 39, 783-791.
Finsterbusch, A., Lindemann, P., Grimm, R., Eckerskorn, C., Luckner, M., 1999. 5-3β- hydroxysteroid dehydrogenase from Digitalis lanata Ehrh. – a multifunctional enzyme in steroid metabolism? Planta 209, 478-486.
Framm, J.J., Peterson, A., Thoeringer, C., Pangert, A., Hornung, E., Feussner, I., Luckner, M., Lindemann, P., 2000. Cloning and functional expression in Escherichia coli of a cDNA encoding cardenolide 16’-O-glucohydrolase from Digitalis lanata Ehrh. Plant Cell. Physiol. 41, 1293-1298.
Freire, R., Gonzáles, A., Suárez, E., 1970. New sources of steroid sapogenins – VIII »Sceptrumgenin and isoplexigenin A,B,C and D from Isoplexis sceptrum «. Tetrahedron 26, 3233-3244.
140 Literaturverzeichnis
Gärtner, D.E., Keilholz, W., Seitz, H.U., 1994. Purification, characterization and partial peptide microsequencing of progesterone 5 β–reductase from shoot cultures of Digitalis purpurea. Eur. J. Biochem. 225, 1125-1132.
Gärtner, D.E., Seitz, H.U., 1993. Enzyme activities in cardenolide-accumulating, mixotrophic shoot cultures of Digitalis purpurea L. J. Plant. Physiol. 141, 269-275.
Gärtner, D.E., Wendroth, S., Seitz, H.U., 1990. A stereospecific enzyme of the putative biosynthetic pathway of cardenolides. Characterization of a progesterone 5 β-reductase from leaves of Digitalis purpurae L. FEBS Lett. 271, 239-242.
Gavidia, I., Pérez-Bermúdez, P., Seitz, H. U., 2002a. Cloning and expression of two novel aldo-keto reductases from Digitalis purpurea leaves . Eur. J. Biochem. 269, 2842-2850.
Gavidia, I., Seitz, H.U., Pérez-Bermúdez, P., Vogler, B., 2002b. LC-NMR applied to the characterisation of cardiac glycosides from three micropropagated Isoplexis species. Phytochem. Anal. 13, 266-271.
Gebhardt, Y., Witte, S., Fokmann, G., Luka čin, R., Matern, U., Martens, S., 2005. Molecular evolution of flavonoid dioxygenases in the family Apiaceae. Phytochemistry 66, 1273-1284.
Gong, Z., Yamazaki, M., Sugiyama, M., Tanaka, Y., Saito, K., 1997. Cloning and molekular analysis of structural genes involved in anthocyanin biosynthesis and expressed in a forma- specific manner in Perilla frutescens . Plant Mol. Biol. 53, 915-927.
Gonzales, A.G., Breton, J.L., Navarro, E., Boada, J., Rodriguez, R., 1985. Phytochemical study of Isoplexis chalcantha . Planta Med. 51, 9-11.
Grigat, R., 2006. Die Progesteron-5α-Reduktase. Hemmbarkeit und Einflüsse auf die Cardenolidbiosynthese in Digitalis lanata und Isoplexis canariensis . Dissertation 2006, FAU Erlangen.
Hänsel, R., Sticher, O., Steinegger, E., 1999. Pharmakognosie – Phytopharmazie. Springer- Verlag Berlin Heidelberg, pp. 570-597.
Hansen, A., Sunding, P., 1985. Flora of Macaronesia. Checklist of vascular plants. Sommerfeltia 1, 1-176. Oslo.
Haußmann, W., 1994. Einfluss von C 21 - und C 23 -Steroidvorstufen auf den Herzglykosidgehalt in Gewebekulturen von Digitalis lanata Ehrh. Dissertation 1994, Eberhard-Karls-Universität Tübingen.
Heimendahl von, C.B.I., Schäfer, K.M., Eklund, P., Sjöholm, R., Schmidt, T.J., Fuss, E., 2005. Pinoresinol-lariciresinol reductases with different stereospecificity from Linum album and Linum usitatissimum . Phytochemistry 66, 1254-1263.
Herl, V., Fischer, G., Bötsch, R., Müller-Uri, F., Kreis, W., 2006a. Molekular cloning and expression of progesterone 5 β-reductasse (5 β-POR) from Isoplexis canariensis . Planta Med. (im Druck).
141 Literaturverzeichnis
Herl, V., Fischer, G., Müller-Uri, F., Kreis, W., 2006b. Molecular cloning and heterologous expression of progesterone 5 β-reductase from Digitalis lanata Ehrh. Pytochemistry 67, 225- 231.
Herl, V., Frankenstein, J., Müller-Uri, F., Meitinger, N., Kreis, W., 2006c. 5-3β- Hydroxysteroid dehydrogenase (3 β-HSD) is not associated with 5-3β-ketosteroid isomerase (KSI) in recombinant 3 β-HSD from Digitalis lanata Ehrh. Plant Phsiol. (eingereicht).
Heukeshoven, J., Dernick, R., 1986. Neue Ergebnisse zum Mechanismus der Silberfärbung. In: Radola, B.J. (Ed.) Elektrophorese-Forum '86, Technische Universität München, München, pp. 22-27.
Heywood, V.H., 1972. Flora europaea notulae systematicae ad floram europeam spectantes No. 13. Scrophulariaceae: Digitalis . Bot. J. Linn. Soc. 65(4), 357.
Hickel, A., Hasslacher, M., Griengl, H., 1996. Hydroxynitrile lyases: Functions and properties. Physiol. Plantarum 98, 891-898.
Hoog, S.S., Pawlowski, J.E., Alzari, P.M., Penning, T.M., Lewis, M., 1994. Three- dimansional structure of rat liver 3 alpha-hydrohysteroid/dihydrodiol dehydrogenase: a member of the aldo-keto reductase superfamily. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 2517-2521.
Hornberger, M., Böttigheimer, U., Hillier-Kaiser, A., Kreis, W., 2000. Purification and characterisation of the cardenolide-specific ß–glucohydrolase CGH II from Digitalis lanata leaves. Plant Physiol. Bioch. 38, 929-936.
Huss, V.A.R., Ciniglia, C., Cennamo, P., Cozzolino, S., Pinto, G., Pollio, A., 2002. Phylogenetic relationships and taxonomic position of Chlorella -like isolates from low pH environments (pH < 3.0). BMC Evol. Biol. 2:13.
Hyndman, D., Bauman, D.R., Heredia, V.V., Penning, T.M., 2003. The aldo-keto reductase superfamily homepage. Chem.-Biol. Interact. 143-144, 621-631.
Janknecht, R., de Martynoff, G., Lou, J., Hipskind, R.A., Nordheim, A., Stunnenberg, H. G., 1991. Rapid and efficient purification of native histidine-tagged protein expressed by recombinant vaccinia virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8972-8976.
Jeon, J.H., Kim, H.S., Choi, K.H., Joung, Y.H., Joung, H., Byun, S.M., 1996. Cloning and characterization of one member of the chalcon synthase gene family from solanum tuberosum L. Biosci. Biotech. Bioch. 60(11), 1907-1910.
Jez, J.M., Bennett, M.J., Schlegel, B.P., Lewis, M., Penning, T.M., 1997. Comparative anatomy of the aldo-keto reductase superfamily. Biochem. J. 326, 625 –636.
Jez, J.M., Penning, T.M., 2001. The aldo-keto reductase (AKR) superfamily: an update. Chem-Biol. Interact. 130-132, 499-525.
Jork, H., 1990. Thin Layer Chromatography: Reagents and Detection Methods, Vol. 1, In: Thin-Layer-Chromatography, Jork, H., Funk, W. Fischer, W. (Eds.) VCH Publishers, New York, pp. 195-198.
142 Literaturverzeichnis
Jörnvall, H., Höög, J.-O., Persson, B., 1999. SDR and MDR : completed genome sequences show these protein families to be larg, of old origin, and of complex nature. FEBS Letters 445, 261-264.
Jörnvall, H., Persson, B., Jeffery, J., 1987. Characteristics of alcohol/polyol dehydrogenases. The zinc-containing long-chain alcohol dehydrogenases. Eur. J. Biochem., 167 (2), 195-201.
Jörnvall, H., Persson, B., Krook, M., Atrian, S., Gonzalez-Duarte, R., Jeffery, J., Ghosh, D., 1995. Short-chain dehydrogenases/reductases (SDR). Biochemistry 34, 6003-6013.
Jörnvall, H., Shafqat, J., Persson, B., 2001. Variations and constant patterns in eukaryotic MDR enzymes. Conclusions from novel structures and characterized genomes. Chem-Biol. Interact. 130-132, 491-498.
Kallberg, Y., Oppermann, U., Jörnvall, H., Persson, B., 2002. Short-chain dehydrogenases/reductases (SDRs). Coenzyme-based functional assignments in completed genomes. Eur. J. Biochem. 269, 4409-4417.
Kaltenbach, M., Schröder, G., Schmelzer, E., Lutz, V., Schröder, J., 1999. Flavonoid hydroxylase from Catharanthus roseus : cDNA, heterologous expression, enzyme properties and cell-type specific expression in plants. Plant J. 19 (2), 183-193.
Kandzia, R., Grimm, R., Eckerskorn, C., Lindemann, P., Luckner, M., 1998. Purification and characterization of lanatoside 15’-O-acetylesterase from Digitalis lanata Ehrh. Planta 204 (3), 383-389.
Keller, B., Volkmann, A., Wilckens, T., Moeller, G., Adamski, J., 2006. Bioinformatic identification and characterization of new members of short-chain dehydrogenase/reductase superfamily. Mol. Cell. Endochrinol. 248, 56-60.
Kräutle, F.-G., 2001. Struktur und Funktion humaner Acy-CoA Dehydrogenasen. Untersuchungen zum „Sudden Infant Death Syndrome“. Dissertation 2001, Universität Konstanz.
Kreis, W., Hensel, A., Stuhlemmer, U., 1998. Cardenolide biosynthesis in foxglove. Planta Med. 64, 491-499.
Leete, E., Gregory, H., Gros, E.G., 1965. Biosynthesis of plant steroids. I. The origin of the butenolide ring of digitoxigenin. J. Am. Chem. Soc. 87, 3475-3479.
Lewin, J.J., 1998. Molekularbiologie der Gene. Spektrum, Akad. Verlag, Heidelberg, Berlin.
Li, J., Nagpal, P., Vitart, V., McMorris, T.C., Chory, J., 1996. A role of brassinosteroids in light-dependent development of Arabidopsis . Science 272, 398-401.
Li, J., Biswas, M.G., Chao, A., Russel, D.W., Chory, J., 1997. Conservation of function between mammalian and plant steroid 5 α-reductases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 3554- 3559.
143 Literaturverzeichnis
Lindemann, P., Finsterbusch, A., Pangert, A., Luckner, M., 2000. Partial cloning of a 5-3β- hydroxysteroid dehydrogenase from Digitalis lanata . In: Okamoto, M., Ishimura, Y., Nawata, H. (Eds.), Molecular Steroidogenesis, Proceedings of the Yamada Conference LII. Universal Academy Press, Frontiers Science Series 29 - XXIV, Tokyo, Japan, pp. 333-334.
Lindemann, P., Luckner, M., 1997. Biosynthesis of pregnane derivatives in somatic embryos of Digitalis lanata. Phytochemistry 46, 507-513.
Linné von, C., 1753. Species plantarum, Vol. II: 562-1200. Imperensis Laurentii Salvii, Holmiae.
Lombardo, M.E., Hudson, P.B., 1996. Immunochemical detection of 5 α-reductase in human serum. Steroids 61, 651-656.
Luber, E., 2002. Reinigung der Malonyl-Coenzym A: 21-Hydroxypregnan 21-Hydroxy- Malonyl-transferase und Versuche zur Isolierung einer Steroid-21-Hydroxylase aus Digitalis lanata Ehrh. Dissertation 2002, FAU Erlangen.
Luckner, M., Wichtl, M., 2000. Digitalis . In: Luckner, M., Wichtl, M. (eds.), Digitalis, WVGmbH, Stuttgart, pp. 1-352.
Lui, J.H.C., Staba, E.J., 1979. Effects of precursors on serially propagated Digitalis lanata leaf and root cultures. Phytochemistry 18, 1913-1916.
Luu-The, V., Cote, M., Labrie, F., 1988. Purification and characterization of human placental 3β-hydroxysteroid dehydrogenase/ 4- 5-isomerase. Clin. Invest. Med. 11, C-200.
Luu-The, V., Takahashi, M., de Launoit, Y., Dumont, M., Lachance, Y., Labrie, F., 1991. Evidence for distinct dehydrogenase and isomerase sites within a single 3 β-hydroxysteroid dehydrogenase/5-ene-4-ene isomerase protein. Biochemistry 30, 8861-8865.
Maier, M.S., Seldes, A.M., Gros, E.G., 1986. Biosynthesis of the butenolide ring of cardenolides in Digitalis purpurea . Phytochemistry 25, 1327-1329.
Maser, E., Möbus, E., Xiong, G., 2000. Functional expression, purification, and charakterization of a 3α-hydroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase from Comamonas testosteroni . Biochem. Bioph. Res. C. 272, 622-628.
May, U., Kreis, W., 1997. Purification and characterisation of the cardenolide-specific β- glucohydrolase CGH I from Digitalis lanata leaves. Plant Physiol. Bioch. 35, 523-532.
McGuire, J.S., Tomkins, G.M., 1960. The mechanism of double bond saturation in 4-3- ketosteroid. Fed. Proc. 19, 24.
Meitinger, N., 2006. KSI in Digitalis lanata . Master Thesis 2006, FAU Erlangen.
Metzner, M., Ruecknagel, K.P., Knudsen, J., Kuellertz, G., Mueller-Uri, F., Diettrich, B., 2000. Isolation and characterization of two acyl-CoA-binding proteins from proembryogenic masses of Digitalis lanata Ehrh. Planta 210, 683-685.
144 Literaturverzeichnis
Mode, A., Rafter, I., 1985. The sexually differentiated 4-3-ketosteroid 5 β-reductase of rat liver. Purification, characterization, and quantitation. J. Biol. Chem. 260, 7137-7141.
Morel, Y., Mebarki, F., Rheaume, E., Sanchez, R., Forest, M.G., Simard, J., 1997. Structure- function relationships of 3 β-hydroxysteroid dehydrogenase: contribution made by the molecular genetics of 3 β-hydroxysteroid dehydrogenase deficiency. Steroids 62, 176-184.
Mutschler, E., 2001. Arzneimittelwirkungen – Lehrbuch der Pharmakologie und Toxikologie. WVGmbH, Stuttgart, pp. 440-477.
Nebauer, S.G., del Castillo-Agudo, L., Segura, J., 1999. RAPD variation within and among natural populations of outcrossing willow-leaved foxglove ( Digitalis obscura L.). Theor. Appl. Genet. 98, 985-994.
Nebauer, S.G., del Castillo-Agudo, L., Segura, J., 2000. An assessment of genetic relationships within the genus Digitalis based on PCR-generated RAPD markers. J. Theor. Appl. Genet. 100, 1209-1216.
Ober, D., Hartmann, T., 1996. Homospermidin synthase, the first pathway-specific enzyme of pyrrolizidine alkaloid biosynthesis, envolved from deoxypusine synthase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 14777-14782.
Ober, D., Hartmann, T., 2000. Phylogenetic origin of a secondary pathway: the case of pyrrolizidine alkaloids. Plant Mol. Biol. 44, 445-450.
Okuda, A., Okuda, K., 1984. Purification and characterization of 4-3-keto-steroid 5 β- reductase. J. Biol. Chem. 259, 7519-7524.
Oligotex Batch Protocol, 1997. Oligotex ® mRNA Mini Kit. Qiagen GmbH, Version 1997.
Olmstead, R.G., dePamphilis, C.W., Wolfe, A.D., Young, N.D., Elisons, W.J., Reeves, P.A. , 2001. Desintegration of the Scrophulariacea. Am. J. Bot. 88, 348-361.
Oppermann, U.C., Filling, C., Berndt, K.D., Persson, B., Benach, J., Ladenstein, R., Jörnvall, H., 1997. Active site directed mutagenesis of 3 β/17 β-hydroxysteroid dehydrogenase establishes differential effects on short-chain dehydrogenase/reductase reactions. Biochemistry 36, 34-40.
Oppermann, U., Filling, C., Hult, M., Shafqat, N., Wu, X., Lindh, M., Shafqat, J., Nordling, E., Kallberg, Y., Persson, B., Jörnvall, H., 2003. Short-chain dehydrogenases/reductases (SDR) : the 2002 update. Chem. Biol. Interact. 143-144, 247-253.
Oppermann, U.C., Maser, E., 1996. Characterization of a 3 α-hydroxysteroid dehydrogensae/carbonyl reductase from the gram-negative bacterium Comamonas testosteroni . Eur. J. Biochem. 241; 744-749.
Persson, B., Zigler Jr, J.S., Jörnvall, H., 1994. A super-family of medium-chain dehydrogenases/reductases (MDR). Sub-lines including ζ-crystallin, alcohol and polyol dehydrogenases, quinine oxidoreductases, enoyl reduktases, VAT-1 and other proteins. Eur. J. Biochem., 226, 15-22.
145 Literaturverzeichnis
Petersen, M., Seitz, H.U., 1985. Cytrochrome P-450-dependent digitoxin 12 β-hydroxylase from cell cultures of Digitalis lanata . FEBS Lett. 188, 11-14.
Pichersky, E., Gang, D.R., 2000. Genetics and biochemistry of secondary metabolites in plants: an evolutionary perspective. Trends Plant Sci. 5(10), 439-445.
Pieper, U., Eswar, N., Braberg, H., Madhusudhan, M.S., Davis, F.P., Stuart, A.C., Mirkovic, N., Rossi, A., Marti-Renom, M.A., Fiser, A., Webb, B., Greenblatt, D., Huang, C.C., Ferrin, T.E., Sali, A., 2004. MODBASE, a database of annotated comparative protein structure models and associated resources. Nucleic Acids Res. 32, D217-D222.
Pilgrim, H., 1972. ′Cholesterol side-chain cleaving enzyme ′ Aktivität in Keimlingen und in vitro kultivierten Geweben von Digitalis purpurea . Phytochemistry 11, 1725-1728.
QIAEX II Agarose Gel Extraction Protocol, 1999. QIAEX ® II Gel Extraction Kit. Qiagen GmbH, Version 1999.
QIAquick ® Spin Handbook; PCR Purification Kit Protocol, 1997. Qiagen GmbH, Version 1997.
Ringer, K.L., Davis, E.M., Croteau, R., 2005. Monoterpene metabolism. Cloning, expression and charakterization of (-)-isopiperitenol/(-)-carveol dehydrogenase of peppermint and spearmint. Plant Physiol. 137, 863-872.
Roca-Pérez, L., Boluda, R., Gavidia, I., Pérez-Bermúdez, P., 2004. Seasonal cardenolide production and Dop5 βr gene expression in natural populations of Digitalis obscura. Phytochemistry 65, 1869-1878.
Rossmann, M.G., Argos, P., 1976. Exploring structural homology of proteins. J. Mol. Biol. 105, 75-95.
Sales, E., Nebauer, S.G., Mus, M., Segura, J., 2001. Population genetic study in the Balearic endemic plant species Digitalis minor (Scrophulariaceae) using RADP markers. Am. J. Bot. 88, 1750-1759.
Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor, New York.
Schaller, F., 1998. In vitro -Kultivierung von Isoplexis canariensis (L.) Lindl. Ex G. Don und Untersuchungen zum Cardenolidgehalt. Dissertation 1998, FAU Erlangen.
Schaller, F., Kreis, W., 1996. Clonal propagation of Isoplexis canariensis . Planta Med. 62, 450-452.
Schaller, F., Kreis, W., 2006. Cardenolide genin pattern in Isoplexis plants and shoot cultures. Planta Med. (im Druck).
Scholze, C., Peterson, A., Diettrich, B., Luckner, M., 1999. Cyclophilin isoforms from Digitalis lanata . Sequences and expression during embryogenesis and stress. J. Plant Physiol. 155, 212-219.
146 Literaturverzeichnis
Schöniger, R., Lindemann, P., Grimm, R., Eckerskorn, C., Luckner, M., 1998. Cardenolide 16’-O-glucohydrolase from Digitalis lanata. Purification and characterization. Planta 205, 477-482.
Seidel, S., Kreis, W., Reinhard, E., 1990. 5-3β-Hydroysteroid dehydrogenase/ 5- 4- ketosteroid isomerase (3 β-HSD), a possible enzyme of cardiac glycoside biosynthesis, in cell cultures and plants of Digitalis lanata EHRH. Plant Cell Rep. 8, 621-624.
Seitz, H.U., Gärtner, D.E., 1994. Enzymes in cardenolide-accumulating shoot cultures of Digitalis purpurea L. Plant Cell Tiss. Org. 38, 337-344.
Shahbaz, M., Hoch, J.A., Trach, K.A., Hural, J.A., Webber, S., Whiteley, J.M., 1987. Structural studies and isolation of cDNA clones providing the complete sequence of rat liver dihydropteridine reductase. J. Biol. Chem. 262(34), 16412-16416.
Simard, J., Ricketts, M.-L., Gingras, S., Soucy, P., Feltus, F.A., Melner, M.H., 2005. Molecular biology of the 3 β-hydroxysteroid dehydrogenase/ 5- 4 isomerase gene family. Endocr. Rev. 26, 525-582.
Southern, E.M., 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98, 503-517.
Stuhlemmer, U., Hausmann, W., Milek, F., Kreis, W., Reinhard, E., 1993. 3 alpha- hydroxysteroid-5 beta-oxidoreduktase in tissue cultures of Digitalis lanata . Z. Naturforsch. 48c, 713-721.
Stuhlemmer, U., Kreis, W., 1996a. Cardenolide formation and activity of pregnane-modifying enzymes in cell suspension cultures, shoot cultures and leaves of Digitalis lanata . Plant Physiol. Bioch. 34, 85-91.
Stuhlemmer, U., Kreis, W., 1996b. Does malonyl coenzyme A:hydroxypregnane 21-hydroxy malonytransferase catalyze the first step in butenolide ring formation? Tetrahedron Lett. 37, 2221-2224 (1996b)
Sugimoto, Y., Ohta, Y., Morikawa, T., Yamashita, T., Yoshida, M., Tamaoki, B., 1990a. In vitro metabolism of testosterone on hepatic tissue of chicken ( Gallus domesticus ). J. Steroid Biochemistry 35, 271-279.
Sugimoto, Y., Yoshida, M., Tamaoki, B., 1990b. Purification of 5 β-reductase from hepatic cytosol fraction of chicken. J. Steroid Bioch. Mol. Biol. 37, 717-724.
Sutor, R., Kreis, W., Hoelz, H., Reinhard, E., 1993. Acetyl coenzyme A:digitoxin 15`-O- acetyltransferase from Digitalis lanata plants and suspension cultures. Phytochemistry 32, 569-573.
Sutor, R., Kreis, W., 1996. Partial purification and characterization of the cell-wall-associated lanatoside 15'-O-acetylesterase from Digitalis lanata suspension cultures. Plant Physiol. Bioch. 34, 763-770.
147 Literaturverzeichnis
Swofford, D.L., 2002. PAUP*. Phylogenetic Analysis using parsimony (*and other methods). Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts.
Talalay, P., Wang, V.S., 1955. Enzymic isomerization of 5-3-ketosteroids. Biochem. Biophys. Acta 18, 300-301.
Thatcher, D.R., Sawyer, L., 1980. Secondary-structure prediction from the sequence of Drosophila melanogaster (fruitfly) alcohol dehydrogenase. Biochem. J. 187, 884-886.
The QIAexpressionist, 2003. QIAexpress ® Type IV Kit. Qiagen GmbH, Version 2003.
Thigpen, A.E., Russell, D.W., 1992. Four-amino acid segment in steroid 5 α-reductase 1 confers sensitivity to finasteride, a competitive inhibitor. J. Biol. Chem. 267, 8577-8583.
Thomas, J.L., Berko E.A., Faustino, A., Myers, R.P., Strickler, R.C., 1988. Human placental 3β-hydroxy-5-ene-steroid dehydrogenase and steroid 5 →4-ene-isomerase: purification from microsomes, substrate kinetics, and inhibition by product steroids. J. Steroid Biochemistry 31, 785-793.
Thomas, J.L, Duax, W.L., Addlagatta, A., Kacsoh, B., Brandt, S.E., Norris, W.B., 2004. Structure/function aspects of human 3 β-hydroxysteroid dehydrogenase. Mol. Cell. Endocrinol. 215, 73-82.
Tomkins, G.M., 1957. The enzymatic reduction of 4-3-ketosteroids. J. Biol. Chem. 225, 13- 24.
TOPO TA Cloning ® Instruction Manual, 2004. TOPO TA Cloning ®. Invitrogen, Version R.
Tschesche, R., Lilienweiss, G., 1964. Cardenolid-Biosynthese aus Pregnenolonglucosid. Z. Naturforsch. 19b, 265-266.
Verpoorte R., Memelink, J., 2002. Engineering secondary metabolite production in plants. Curr. Opin. Biotech. 13, 181-187.
Wendroth, S., Seitz, H.U., 1990. Characterization and localization of progesterone 5 α- reductase from cell cultures of foxglove ( Digitalis lanata EHRH). Biochem. J. 266, 41-46.
Werner, K., 1960. Zur Nomenklatur und Taxonomie von Digitalis L. Bot. Jahrb. 79, 218-254.
Werner, K., 1961. Wuchsform und Verbreitung als Grundlagen der taxonomischen Gliederung von Digitalis L. Diss., Halle (ined.).
Werner, K., 1964. Die Verbreitung der Digitalis-Arten. Wiss. Z. Univ. Halle-Wittenberg, Math.-Naturwiss. Reihe 13, 453-486.
Werner, K., 1965. Taxonomie und Phylogenie der Gattungen Isoplexis (Lindl.) Benth. und Digitalis L. Rep. spec. nov. 1965, 70, 109-135.
Werner, K., 1966. Die Wuchsformen der Gattungen Isoplexis (Lindl.) Benth. und Digitalis L. Bot. Jahrb. 1966, 85, 88-149.
148 Literaturverzeichnis
Williams, B., Tsang, A., 1991. A maize gene expressed during embryogenesis is absisic-acid- inducible and highly conserved. Plant Mol. Biol. 16, 919-923.
Wilson, D.K., Bohren, K.M., Gabbay, K.H., Quiocho, F.A., 1992. An unlikely sugar substrate site in the 1.65 A structure of the human aldose reductase holoenzyme implicated in diabetic complications. Science 257, 81-84.
Wilson, D.K., Nakano, T., Petrash, J.M., Quiocho, F.A., 1995. 1.7 A structure of FR-1, a fibroblast growth factor-induced member of the aldo-keto-reductase family, complexed with coenzyme and inhibitor. Biochemistry 34, 14323-14330.
Wink, M., 2003. Evolution of secondary metabolites from an ecological and molecular phylogenetic perspective. Phytochemistry 64, 3-19.
Xia, Z.-Q., Costa, M.A., Pelissier, H.C., Davin, L.B., Lewis, N.G., 2001. Secoisolariciresinol dehydrogenase purification, cloning and functional expression. Implications for human health protection. J. Biol. Chem. 276, 12614-12623.
Yang, K.Y., Moon, Y.H., Choi, K.H., Kim, Y.-H., Eun, M.-Y., Guh, J.-O., Kim, K.-C., Cho, B.-H., 1997. Structure and expression of the AWI 31 gene specifically induced by wounding in Arabidopsis thaliana . Mol. Cells 7, 131-135.
Yin, S.J., Vagelopoulos, N., Lundquist, G., Jörnvall, H., 1991. Pseudomonas 3 β- hydroxysteroid dehydrogenase. Primary structure and relationships to other steroid dehydrogenases. Eur. J. Biochem. 197, 359-365.
Zullo, M.A.T., Kohout, L., De Azevedo, M.B.M., 2003. Some notes on the terminology of brassinosteroids. Plant Growth Regul. 39, 1-11.
149 Anlagen
VII ANLAGEN VII.1 Abkürzungsverzeichnis Amp. Ampicillin APS Ammoniumpersulfat bd bidestilliert bp Basenpaare cDNA Komplementäre DNA CDS kodierende Sequenz DC Dünnschichtchromatographie DEPC Diethylpyrocarbonat DNA Desoxyribonukleinsäure DNase Desoxyribonuklease dNTP´s Desoxynukleosidtriphosphate DTT 1,4-Dithiothreitol ehem. ehemals EK Endkonzentration FM Fliesmittel HPLC Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactosid Kan. Kanamycin Km Michaelis-Menten-Konstante LB-Medium Luria-Bertani-Medium mRNA messenger RNA OD x optische Dicht bei x nm PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PVP Polyvinylpyrrolidon RNA Ribonukleinsäure RNase Ribonuklease RT Raumtemperatur RT-PCR Reverse Transkriptase PCR SDS Natriumdodecylsulfat Taq Thermus aquaticus TEMED N,N,N`,N`-Tetramethylethylendiamin TM Handelsname TM Schmelztemperatur von Primern Tris Tris-(Hydroxymethyl)-aminoethan U Unit u.a. unter anderem Upm Umdrehungen pro Minute UV Ultraviolett VT Volumenteile
(Standardabkürzungen entsprechen dem SI-Einheitensystem)
150 Anlagen
VII.2 Alignments VII.2.1 Nukleotid-Alignment der Intron-haltigen 5 β-POR Gensequenzen D.lan ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGAT AGGCGCTGCAAAGGTAATAATAATAAGTTAACATTTATCG 60 I.sce ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAAAGGTAA---GTTAACATTTATCG 57 D.car ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGAT AGGCGCTGCAAAGGTAATAATAATAAGTTAACATTTATCG 60 D.lae ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAA GGGTAA---GTTAACATTTATCG 57 D.ner ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAAAGGTAA---GTTGGGGACATTTATTTTTG 57 D.fer ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAA GGGTAA---GTTAACATTTATCG 57 D.obs ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAAAGGTAA---GTTAACATTTATCG 57 I.can ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCCGCAAAGGTAA---GTTAACATTTATCG 57 I.isa ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTAAAACAAAGGTAA---GTTAACATTTATCG 57 I.cha ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAAAGGTAA---GTTAACATTTATCG 57 D.sub ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAAAGGTAA---GTTAACATTTATCG 57 D.dub ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAAAGGTAA---GTTAACATTTATCG 57 D.par ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCTTTTCTGCTTTTAAGGTAA---GTTAACATTTATCG 57 D.cil ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAAAGGTAA---GTTAACATTTATCG 57 D.dav ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAAAGGTAG---GTTAACATTTATCG 57 D.gra ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAAAGGTAA---GTTAACATTTATCG 57 D.sib ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAAAGGTAA---GTTAACATTTATCG 57 D.vir ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAAAGGTAA---GTTAACATTTATCG 57 D.lut ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAAAGGTAA---GTTAACATTTATCG 57 D.pur ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAAAGGTAA---GTTA CCATT CATCG 57 D.tha ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAAAGGTAA---GTTA CCATT CATCG 57 D.mar ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAAAGGTAA---GTTA CCATT CATCG 57 D.min ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATCGGCGCTGCAAAGGTAA---GCCCTAC CCATT CATCG 57 ************************** *** * * * **** * * **** ** *
D.lan CATAATTGCAA------CAATCCTAGCTATTTATGTGTAATCTGACTGGTAATTGGTTG 113 I.sce CATAATTGCAA------CAATCCTAGCTATTTATGTGCCCCAATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 D.car CATAATTGCAA------CAATCCTAGCTATTTATGTGTAATCTGACTGGTAATTGGTTG 113 D.lae CATAATTGCAA------CAATCCTAGCTATTTATGTGTAATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 D.ner CATAATTGCAA------CAATCCTAGCTATTTATGTGTAATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 D.fer CATAATTGCAA------CGGGGATCCTAGCTATTTATGTGTAATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 D.obs CATAATTGAAAAAA------CAATCCTAGCTATTTATGTGTAATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 I.can CATAATTGCAA------CAATCCTAGCTATTTATGTGTAATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 I.isa CATAATTGCAA------CAATCCTAGCTATTTATGTGTAATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 I.cha CATAATTGCAA------CAATCCTAGCTATTTATGTGTAATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 D.sub CATAATTGCAA------CAATCCTAGCTATTTATGTGTAATCTGGGGGCTGGTAATTGGTTG 110 D.dub CATAATTGCAA------CAATCCTAGCTATTTATGTGTAATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 D.par CATAATTGCAATTTGCAATTTGCAATTTGCAACAATCCTAGCTATTTATGTGTAATCTGACTGGTAATTGGTTG 117 D.cil CATAATTGCAA------CAATCCTAGCTATTTATGTGT GATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 D.dav CATAATTGCAA------CAATCCTAGCTATTTATGTGT GATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 D.gra CATAATTGCAA------CAATCCTAGCTATTTATGTGT GATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 D.sib CATAATTGCAA------CAATCCTAGCTATTTATGTGT GATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 D.vir CATAATTGCAA------CAA CCCTAGCTATTTATGTGTAATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 D.lut CATAATTGCAA------CAA CCCTAGCTATTTATGTGTAATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 D.pur CATAATT ACAA------CAATCCTA CT TATTTATGTGTAATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 D.tha CATAATT ACAA------CAATCCTA CT TATTTATGTGTAATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 D.mar CATAATT ACAA------CAATCCTA CT TATTTATGTGTAATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 D.min CATAATT ACAA------CAATCCTAGCTATTTATGTGTAATCTGACTGGTAATTGGTTG 110 ******* ** * * **** ********** ***** **************
D.lan AAATAGAAAA GGTTGGAAGAAGATGACGCAC AGCCAAAGCATTCGAGCGTGGCGTTGATA 173 I.sce AAATAGAAAAAGTTGGAAGAAGATGACGCAC AGCCAAAGCATTCGAGCGTGGCGTTGATA 170 D.car AAATAGAAAA GGTTGGAAGAAGATGACGCACCGCCAAAGCATTCGAGCGTGGCGTTGATA 173 D.lae AAATAGAAAAAGTTGGAAGAAGATGACGCACCGCCAAAGCATTCGAGCGTGGCGTTGATA 170 D.ner AAATAGAAGGGGAAGTCCCCGGAAGAAGATGACGCACCGCCAAAGCATTCGAGCGTGGCGTTGATA 170 D.fer AAATAGAAAAAGTTGGAAGAAGATGACGCACCGCCAAAGCATTCGAGCGTGGCGTTGATA 170 D.obs AAATAGAAAAAGTTGGAAGAAGATGACGCACCGCCAAAGCATTCGAGCGTGGCGTTGATA 170 I.can AAATAGAAAAAGTTGGAAGAAGATGACGCACCG TCAAAGCATTCGAGCGTGGCGTTGATA 170 I.isa AAACCCCAGAAAAAGTTGGAAGAAGATGACGCACCG TCAAAGCATTCGAGCGTGGCGTTGATA 170 I.cha AAATAGAAAAAGTTGGAAGAAGATGACGCACCG TCAAAGCATTCGAGCGTGGCGTTGATA 170 D.sub AAATAGAAAAAGTTGGAAGAAGATGA TGCACC ATCAAAGCATTCGAGCGTGGCG CTGATA 170 D.dub AAATAGAAAAAGTTGGAAGAAGATGA TGCACC ATCAAAGCATTCGAGCGTGGCG CTGATA 170 D.par AAATAGAAAAAGTTGGAAGAAGATGA TGCACCG TCAAAGCATTCGAGCGTGGCG CTGATA 177 D.cil AAATAGAAAAAGTTGGAAGAAGATGGGGGCGCACCGACAAAGCATTCGAGCGTGGCG CTGTTTTTA 170 D.dav AAATAGAAAAAGTTGGAAGAAGATGACGCACCGACAAAGCATTCGAGCGTGGCG CTGATA 170
151 Anlagen
D.gra AAATAGAAAAAGTTGGAAGAAGATGACGCACCGACAAAGCATTCGAGCGTGGCG CTGATA 170 D.sib AAATAGAAAAAGTTGGAAGAAGATGACGCACCGACAAAGCATTCGAGCGTGGCG CTGATA 170 D.vir AAATAGAAAAAGTTGGAAGAAGATGACGCACCGACAAAGCATTCGAGCGTGGCG CTGATA 170 D.lut AAATAGAAAAAGTTGGATTTTGAAGATGACGCACCGACAAAGCACCCCTCGAGCGTGGCG CTGATA 170 D.pur AAATAGAAAAAGTTGGAAGAAGATGACGC TCCGCCAAAGCATTCGAGCGTGGCG CTGATA 170 D.tha AAATAGAAAAAGTTGGAAGAAGATGACGC TCCGCCAAAGCATTCGAGCGTGGCG CTGATA 170 D.mar AAATAGAAAAAGTTGGAAGAAGATGACGCACCGCCAAAGCATTCGAGCGTGGCG CTGATA 170 D.min AAATAGAAAAAGTTGGAAGAAGATGACGCACCGCCAAAGCATTCGAGCGTGGCG CTGATA 170 *** **** * ** *** ******* ** * ******* ************ ** **
D.lan GTTGGGGTAACCGGAATCATCGGCAACAGCCTGGCGGAGATCCTGCCACTGGCCGACACC 233 I.sce GTTGGGGTAACCGGAATCATCGGCAACAGCCTGGCGGAGATCCTGCCACTGGCCGACACC 230 D.car GTTGGGGTAACCGGAATCATCGGCAACAGCCTGGCGGAGATCCTGCCACTGGCCGACACC 233 D.lae GTTGGGGTAACCGGAATCATCGGCAACAGCCTGGCGGAGATCCTGCCACTGGCCGACACC 230 D.ner GTTGGGGTAACCGGAATCATCGGCAACAGCCTGGCAAAAGAGATCCTGCCACTGGCCGACACC 230 D.fer GTTGGGGTAACCGGAATCATCGGCAACAGCCTGGCGGAGATCCTGCCACTGGCCGACACC 230 D.obs GTTGGGGTAACCGGAATCATCGGCAACAGCCTGGCGGAGATCCTGCCACTGGCCGACACC 230 I.can GTTGGGGTAACCGGAATCAT AGGCAACAGCCTGGCGGAGATCCTGCCACTGGCCGACACC 230 I.isa GTTGGGGTAACCGGAATCAT AGGCAACAGCCTGGCGGAGATCCTGCCACTGGCCGACACC 230 I.cha GTTGGGGTAACCGGAATCAT AGGCAACAGCCTGGCGGAGATCCTGCCACTGGCCGACACC 230 D.sub GTTGGGGTAAC TGGAATCATCGGCAACAGCCTGGCGGAGATCCTGCCACTGGCCGACACC 230 D.dub GTTGGGGTAAC TGGAATCATCGGCAACAGCCTGGCGGAGATCCTGCCACTGGCCGACACC 230 D.par GTTGGGGTAACCGGAATCATCGGCAACAGCCTGGCGGAGATCCTGCCGCTGGCCGACACC 237 D.cil GTTGGGGTAACCGGAATCATCGGCAACAGCCTGGCGGAGAT TCTGCCACTGGCCGA TACC 230 D.dav GTTGGGGTAACCGGAATCATCGGCAACAGCCTGGCGGAGAT TCTGCCACTGGCCGA TACC 230 D.gra GTTGGGGTAACCGGAATCATCGGCAACAGCCTGGCGGAGAT TCTGCCACTGGCCGA TACC 230 D.sib GTTGGGGTAACCGGAATCATCGGCAACAGCCTGGCGGAGAT TCTGCCACTGGCCGA TACC 230 D.vir GTTGGGGTAACCGGAATCATCGGCAACAGCCTGGCGGAGAT TCTGCCACTGGCCGA TACC 230 D.lut GTTGGGGTAACCGGAATCATCGGCAACAGCCTGGCGGAGAT TCTGCCACTGGCCGACACC 230 D.pur GTTGGGGTAAC TGGAATCATCGGCAACAGCCTGGCGGAGATCCTGCC GCTGGCCGACACC 230 D.tha GTTGGGGTAAC TGGAATCATCGGCAACAGCCTGGCGGAGATCCTGCC GCTGGCCGACACC 230 D.mar GTTGGGGTAAC TGGAATCATCGGCAACAGCCTGGCGGAGATCCTGCC GCTGGCCGACACC 230 D.min GTTGGGGTAACCGGAATCATCGGCAACAGCCTGGCGGAGATCCTGCCGCTGGCCGACACC 230 *********** ******** ************** ***** ***** ******** ***
D.lan CCCGGCGGTCCGTGGAAGGTATACGGCGTCGCCCGCCGCACCAGACCCGCCTGGCATGAG 293 I.sce CCCGGCGGTCCGTGGAAGGTATACGGCGTCGCCCGCCGCACCAGACCCGTTTTCTGGCATGAG 290 D.car CCCGGCGGTCCGTGGAAGGTATACGGCGTCGCCCGCCGCACCAGACCCGCCTGGCATGAG 293 D.lae CCCGGCGGTCCGTGGAAGGTATACGGCGTCGCCCGCCGCACCAGACCCGCCTGGCATGAG 290 D.ner CCCGGCGGTCCGTGGAAGGTATACGGCGTCGCCCGCCGCACCAGACCCGCCTGGCATGAG 290 D.fer CCCGGCGGTCCGTGGAAGGTATACGGCGTCGCCCGCCGCACCAGACCCGCCTGGCATGAG 290 D.obs CCCGGCGGTCCGTGGAAGGTATACGGCGTCGCCCGCCGCACCAGACCCGCCTGGCATGAG 290 I.can CCCGGCGGTCCGTGGAAGGTATACGGCGTCGCCCGCCGCACCAGACCCGCCTGGCATGAG 290 I.isa CCCGGCGGTCCGTGGAAGGTATACGGCGTCGCAAAACGCCGCACCAGACCCGCCTGGCATGAG 290 I.cha CCCGGCGGTCCGTGGAAGGTATACGGCGTCGCCCGCCGCACCAGACCCGCCTGGCATGAG 290 D.sub CCCGGCGGTCCGTGGAAGGTATACGGCGTCGCCCGCCGCACCAGACCCGCCTGGCATGAG 290 D.dub CCCGGCGGTCCGTGGAAGGTATACGGCGTCGCCCGCCGCACCAGACCCGCCTGGCATGAG 290 D.par CCCGGCGGTCCGTGGAAGGTATACGGCGTCGCCCGCCGCACCAGACCCTTTTCCTGGCATGAG 297 D.cil CCCGGCGGTCCGTGGAAGGTATACGGCGTCGCCCGCCGCACCAGACCCGCCAAAAGGCATGAG 290 D.dav CCCGGCGGTCCGTGGAAGGTATACGGCGTCGCCCGCCGCACCAGACCCGCCTGGCATGAG 290 D.gra CCCGGCGGTCCGTGGAAGGTATACGGCGTCGCCCGCCGCACCAGACCCGCCTGGCATGAG 290 D.sib CCCGGCGGTCCGTGGAAGGTATACGGCGTCGCCCGCCGCACCAGACCCGCCTGGCATGAG 290 D.vir CCCGGCGGTCCGTGGAAGGTATACGGCGTCGCCCGCCGCACCAGACCCGCCTGGCATGAG 290 D.lut CCCGGCGGTCCGTGGAAGGTATACGGCGTCGCCCGCCGTTTTACCAGACCCGCCTGGCATGAG 290 D.pur CCCGGCGGTCCGTGGAAGGTATACGGCGTCGCCCGCCGCACCAGACCCGCCTGGCATGAG 290 D.tha CCCGGCGGTCCGTGGAAGGTATACGGCGTCGCCCGCCGCACCAGACCCGCCTGGCATGAG 290 D.mar CCCGGCGGTCCGTGGAAGGTATACGGCGTCGCCCGCCGCACCAGACCCGCCTGGCATGAG 290 D.min CCCGGCGGTCCGTGGAAGGTATACGGCGTCGCCCGCCGCACCAGACCCGCCTGGCATGAG 290 ******************************** ***** ********* * ********
D.lan GATAATCCGATCAATTACGTCCAGTGCGACATATCCGATCCAGATGACTCCCAAGCCAAG 353 I.sce GATAATCCGATCAATTACGTCCAGTGCGACATATCCGATCCAGATGACTCCCAAGCCAAG 350 D.car GATAATCCGATCAATTACGTAAAACAGTGCGACATATCCGATCCAGATGACTCCCAAGCCAAG 353 D.lae GATAATCCGATCAATTACGTCCA ATGCGACATATCCGATCCAGATGACTCCCAAGCCAAG 350 D.ner GATAATCCGATCAATTACGTCCAGTGCGACATATCCGATCCAGATGACTCCCAAGCCAAG 350 D.fer GATAATCCGATCAATTACGTCCA ATGCGACATATCCGATCCAGATGACTCCCAAGCCAAG 350 D.obs GATAATCCGATCAATTACGTCCAGTGCGACATATCCGATCCAGATGACTCCCAAGCCAAG 350 I.can GATAATCCGATCAATTACGTCCAGTGCGACATATCCGATCCAGATGACTCCCAAGCCAAG 350 I.isa GATAATCCGATCAATTACGTCCAGTGCGACATATCCGATCCAGATGACTCCCAAGCCAAG 350 I.cha GATAATCCGATCAATTACGTCCAGTGCGACATATCCGATCCAGATGACTCAAAACAAGCCAAG 350
152 Anlagen
D.sub GATAATCCGATCAATTACGTCCAGTGCGACATATCCGATCCAGATGACTCCCAAGCCAAG 350 D.dub GATAATCCGATCAATTACGTCCAGTGCGACATATCCGATCCAGATGACTCCCAAGCCAAG 350 D.par GATAATCCGATCAATTACGTCCAGTGCGACATATCCGATCCAGATGACTCCCAAGCCAAG 357 D.cil GATAATCCGATCAATTAC ATCCAGTGCGACATATCCGATCCAGATGACTCCCAAGCCAAG 350 D.dav GATAATCCGATCAATTAC ATCCAGTGCGACATATCCGATCCAGATGACTCCCAAGCCAAG 350 D.gra GATAATCCGATCAATTAC ATCCAGTGCGACATATCCGATCCAGATGACTCCCAAGCCAAG 350 D.sib GATAATCCGATCAATTAC ATCCAGTGCGACATATCCGATCCAGATGACTCCCAAGCCAAG 350 D.vir GATAATCCGATCAATTAC ATCCAGTGCGACATATCCGATCCAGATGACTCCCAAGCCAAG 350 D.lut GATAATCCGATCAATTACGTCCAGTGCGACATATCCGATCCAGATGACTCCCAAGCCAAG 350 D.pur GATAATCCCCCCATCAATTAC ATCCAGTGCGACATATCCGATCCAGATGACTCCC TAGCCAAG 350 D.tha GGGGGTAATCCGATCAATTAC ATCCAGTGCGACATATCCGATCCAGATGACTCCC TAGCCAAG 350 D.mar GATAATCCGATCAATTAC ATCCAGTGCGACATATCCGATCCAGATGACTCCC TAGCCAAG 350 D.min GATAATCCGATCAATTAC ATCCAGTGCGACATATCCGATCCAGATGACTCCCAAGCCAAG 350 * ****** ********* * ** ************************** * *******
D.lan CTGTCACCTCTGACTGATGTTACCCACGTGTTCTACGTTACCTGGGCTAATCGATCCACC 413 I.sce CTGTCACCTCTGACTGATGTTACCCACGTGTTCTACGTTACCTGGGCTAATCGATCCACC 410 D.car CTGTCACCTCTGACTGATGTTACCCA TGTGTTCTACGTTACCTGGGCTAATCGATCCACC 413 D.lae CTGTCACCTCTGACTGATGTTACCCA TGTGTTCTACGTTACCTGGGCTAATCGATCCACC 410 D.ner CTGTCACCTCTGACTGATGTTACCCA TGTGTTCTACGTTACCTGGGCTAATCGATCCACC 410 D.fer CTGTCACCTCTGACTGATGTTACCCA TGTGTTCTACGTTACCTGGGCTAATCGATCCACC 410 D.obs CTGTCACCTCTGACTGATGTTACCCACGTGTTCTACGTTACCTGGGCTAATCGATCCACC 410 I.can CTGTCAC ATCTGACTGATGTTACCCACGTGTTCTACGTTACCTGGGCTAATCGATCCACC 410 I.isa CTGTCAC ATCTGACTGATGTTACCCACGTGTTCTACGTTACCTGGGCTAATCGATCCACC 410 I.cha CTGTCAC ATCTGACTGATGTTACCCACGTGTTCTACGTTACCTGGGCTAATCGATCCACC 410 D.sub CTGTCACCTCTGACTGATGTTACCCACGTGTTCTACGTTACCTGGGCTAATCGATCCACC 410 D.dub CTGTCACCTCTGACTGATGTTACCCACGTGTTCTACGTTACCTGGGCTAATCGATCCACC 410 D.par CTGTCACCTCTGACTGATGTTACCCACGTGTTCTACGTTACCTGGGCTAATCGATCCACC 417 D.cil CTGTCACCTCTGACTGATGTTACCCACGTGTTCTACGTTACCTGGGCTAATCGATCCACC 410 D.dav CTGTCACCTCTGACTGATGTTACCCACGTGTTCTACGTTACCTGGGCTAATCGATCCACC 410 D.gra CTGTCACCTCTGACTGATGTTACCCACGTGTTCTACGTTACCTGGGCTAATCGATCCACC 410 D.sib CTGTCACCTCTGACTGATGTTACCCACGTGTTCTACGTTACCTGGGCTAATCGATCCACC 410 D.vir CTGTCACCTCTGACTGATGTTACCCACGTGTTCTACGTTACCTGGGCTAATCGATCCACC 410 D.lut CTGTCACCTCTGACTGATGTTACCCACGTGTTCTACGTTACCTGGGCTAATCGATCCACC 410 D.pur CTGTCACCTCTGACTGATGTTACCCACGTGTTCTACGTTACCTGGGCTAATCGATCCACC 410 D.tha CTGTCACCTCTGGGGGCTGATGTTACCCACGTGTTCTACGTTACCTGGGCTAATCGATCCACC 410 D.mar CTGTCACCTCTGACTGATGTTACCCACGTGTTCTACGTTACCTGTTTTGCTAATCGATCCACC 410 D.min CTGTCACCTCTGACTGATGTTACCCACGTGTTCTACGTTACCTGGGCTAATCGACCCCCCACC 410 ******* **** ************* ***************** ********* *****
D.lan GAACAAGAAAACTGTGAAGCCAATAGCAAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATGCAGTTATC 473 I.sce GAACAAGAAAACTGTGAAGCCAATAGCAAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATGCAGTTATC 470 D.car GAACAAGAAAACTGTGAAGCCAATAGCAAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATGCAGTTATC 473 D.lae GAACAAGAAAACTGTGAAGCCAATAGCAAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATGCAGTTATC 470 D.ner GAACAAGAAAACTGTGAAGCCAATAGCAAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATGCAGTTATC 470 D.fer GAACAAGAAAACTGTGAAGCCAATAGCAAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATGCAGTTATC 470 D.obs GAACAAGAAAACTGTGAAGCCAATAGCAAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATGCAGTTATC 470 I.can GAACAAGAAAACTGTGAAGCCAATAGCAAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATGCAGTTATC 470 I.isa GAACAAGAAAAC CGTGAAGCCAATAGCAAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATGCAGTTATC 470 I.cha GAACAAGAAAACTGTGAAGCCAATAGCAAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATGCAGTTATC 470 D.sub GAACAAGAAAACTG CGAAGCCAATAGCAAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATGCAGTTATC 470 D.dub GAACAAGAAAACTG CGAAGCCAATAGCAAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATGCAGTTATC 470 D.par GAACAAGAAAACTG CGAAGCCAATAGCCCCCAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATGCAGTTATC 477 D.cil GAACAAGAAAACTG CGAAGCCAATAGCAAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATGCAGTTATC 470 D.dav GAAC CAGAAAACTG CGAAGCCAATAGCAAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATGCAGTTATC 470 D.gra GAACAAGAAAACTG CGAAGCCAATAGCAAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATGCAGTTATC 470 D.sib GAACAAGAAAACTG CGAAGCCAATAGCAAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATGCAGTTATC 470 D.vir GAACAAGAAAACTG CGAAGCCAATAGCAAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATGCAGTTATC 470 D.lut GAACAAGAAAACTG CGAAGCCAATAGCAAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATAAAACAGTTATC 470 D.pur GAAC CAGAAAACTG CGAAGCCAATAGCAAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATGCAGTTATC 470 D.tha GAAC CAGAAAACTG CGAAGCCAATAGCAAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATGCAGTTATC 470 D.mar GAAC CAGAAAACTG CGAAGCCAATAGCAAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATGCAGTTATC 470 D.min GAAC CAGAAAAC CGCGAAGCCAATAGCAAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATGCAGTTATC 470 **** ******* * ************ *********************** ********
D.lan CCTAATTGCCCCAATTTGAAGCACATCTCATTGCAGACTGGGAGGAAGCATTACATGGGA 533 I.sce CCTAATTGCCCCAATTTGAAGCACATCTCATTGCAGACTGGGAGGAAGCATTACATGGGA 530 D.car CCTAATTGCCCCAATTTGAAGCACATCTC TTTGCAGACTGGGAGGAAGCATTACATGGGA 533 D.lae CCTAATTGCCCCAATTTGAAGCACATCTCATTGCAGACTGGGAGGAAGCATTACATGGGA 530 D.ner CCTAATTGCCCCAATTTGAAGCACATCTCATTGCAGACTGGGAGGAAGCATTACATGGGA 530
153 Anlagen
D.fer CCTAATTGCCCCAATTTGAAGCACATCTCATTGCAGACTGGGAGGAAGCATTACATGGGA 530 D.obs CCTAATTGCCCCAATTTGAAAAAACACATCTCATTGCAGACTGGGAGGAAGCATTACATGGGA 530 I.can CCTAATTGCCCCAATTTGAAGCACATCTCGTTGCAGACTGGGAGGAAGCATTACATGGGA 530 I.isa CCTAATTGCCCCAATTTGAAGCACATCTCGTTGCAGACTGGGAGGAAGCATTACATGGGA 530 I.cha CCTAATTGCCCCAATTTGAAGCACATCTCGTTGCAGACTGGGAGGAAGCATTACATGGGA 530 D.sub CCTAATTGCCCCAATTTGAAGCACATCTCATTGCAGACTGGGAGGAAGCATTACATGGGA 530 D.dub CCTAATTGCCCCAATTTGAAGCACATCTCATTGCAGACTGGGAGGAAGCATTACATGGGA 530 D.par CCTAATTGCCCCAATTTGAAGCACATCTCATTGCAGACTGGGAGGAAGCATTACATGGGTTTT 537 D.cil CCTAATTGCCCCAATTTGAAGCACATCTCATTGCAGACTGGGAGGAAGCATTACATGGGA 530 D.dav CCTAATTGCCCCAATTTGAAGCACATCTCATTGCAGACTGGGAGGAAGCATTACATGGGA 530 D.gra CCTAATTGCCCCAATTTGAAGCACATCTCATTGCAGACTGGGAGGAAGCATTACATGGGA 530 D.sib CCTAATTGCCCCAATTTGAAGCACATCTCATTGCAGACTGGGAGGAAGCATTACATGGGA 530 D.vir CCTAATTGCCCCAATTTGAAGCACATCTCATTGCAGACTGGGAGGAAGCATTACATGGGA 530 D.lut CCTAATTGCCCCAATTTGAAGCACATCTCATTGCAGACTGGGAGGAAGCATTACATGGGA 530 D.pur CCTAATTGCCCCAATTTGAAGCACATCTCATTGCAGACTGGGAGGAAGCATTACATGGGA 530 D.tha CCTAATTGCCCCAATTTGAAGCACATCTCATTGCAGACTGGGAGGAAGCATTACATGGGA 530 D.mar CCTAATTGCCCCAATTTGAAGCACATCTCATTGCAGACTGGGAGGAAGCATTACATGGGA 530 D.min CCTAATTGCCCCAATTTGAAGCACATCTCATTGCAGACTGGGAGGAAGCATTACATGGGA 530 ******************** ******** *****************************
D.lan CCATTTGAATCCCCCTACGGGAAAATAGAATCCCATGATCCACCCTACACTGAGGATTTGCCC 593 I.sce CCATTTGAATCGTACGGGAAAATAGAATCCCATGATCCACCCTACACTGAGGATTTGCCC 590 D.car CCATTTGAATCGTACGGGAAAATAGAATCCCATGATCCACCCTACACTGAGGATTTGCCC 593 D.lae CCATTTGAATCGTACGGGAAAATAGAATCCCATGATCCACCCTACACTGAGGATTTGCCC 590 D.ner CCATTTGAATCGTACGGGAAAATAGAATCCCATGATCCACCCTACACCCCCGAGGATTTGCCC 590 D.fer CCATTTGAATCGTACGGGAAAATAGAATCCCATGATCCACCCTACACTGAGGATTTGCCC 590 D.obs CCATTTGAATCGTACGGGAAAATAGAATCCCATGATCCACCCTACACTGAGGATTTGCCC 590 I.can CCATTTGAATCGTACGGGAAAATAGAATCCCATGATCCACCCTACACTGAGGATTTGCCC 590 I.isa CCATTTGAATCGTACGGGAAAATAGAATCCCATGATCCACCCTACACTGAGGATTTGCCC 590 I.cha CCATTTGAATCGTACGGGAAAATAGAATCCCATGATCCACCCTACACTGAGGATTTGCCC 590 D.sub CCATTTGAATCGTACGGGAAAATAGAATCCCATGATCCACCCTACACTGAGGATTTGCCC 590 D.dub CCATTTGAATCGTACGGGAAAATAGAATCCCATGATCCACCCTACACTGAGGATTTGCCC 590 D.par CCATTTGAATCGTACGGGAAAATAGAATCCCATGATCCACCCTACTTTTCTGAGGATTTGCCC 597 D.cil CCATTTGAATCGTACGGGAAAATAGAATCCCATGATCCACCCTACACTGAGGATTTGCCC 590 D.dav CCATTTGAATCGTACGGGAAAATAGAATCCCATGATCCACCCTACACTGAGGATTTGCCC 590 D.gra CCATTTGAATCGTACGGGAAAATAGAATCCCATGATCCACCCTACACTGAGGATTTGCCC 590 D.sib CCATTTGAATCGTACGGGAAAATAGAATCCCATGATCCACCCTACACTGAGGATTTGCCC 590 D.vir CCATTTGAATCGTACGGGAAAATAGAATCCCATGATCCACCCTACACTGAGGATTTGCCC 590 D.lut CCATTTGAATCGTACGGGAAAATAGAATCCCATGATCCACCCTACACTGAGGATTTGCCC 590 D.pur CCATTTGAATCGTACGGGAAAATAGAATCCCATGATCCACCCTACACTGAGGAT ATGCCC 590 D.tha CCATTTGAATCGTACGGGAAAATAGAATCCCATGATCCACCCTACACTGAGGAT ATGCCC 590 D.mar CCATTTGAATCGTACGGGAAAATAGAATCCCATGATCCACCCTACACTGAGGAT ATGCCC 590 D.min CCATTTGAATCGTACGGGAAAATAGAATCCCACCCCGATCCACCCTACACTGAGGATTTGCCC 590 *********** ******************** ************ * ****** *****
D.lan AGGTTGAAGTACATGAACTTTTACTATGATTTAGAGGATATTATGCTTGAGGAGGTGGAG 653 I.sce AGGTTGAAGTACATGAACTTTTACTATGATTTAGAGGATATTATGCTTGAGGAGGTGGAG 650 D.car AGGTTGAAGTACATGAACTTTTACTATGATTTAGAGGATATTATGCTTGAGGAGGTGGAG 653 D.lae AGGTTGAAGTACATGAACTTTTACTATGATTTAGAGGATATTATGCTTGAGGAGGTGGAG 650 D.ner AGGTTGAAGTACATGAACTTTTACTATGATTTAGAGGATATTATGCTTGAGGAGGTGGAG 650 D.fer AGGTTGAAGTACATGAACTTTTACTATGATTTAGAGGATATTATGCTTGGGGGGGAGGTGGAG 650 D.obs AGGTTGAAGTACATGAACTTTTACTATGATTTAGAGGATATTATGCTTAAAAAGGAGGTGGAG 650 I.can AGGTTGAAGTACATGAACTTTTACTATGATTTAGAGGATATTATGCTTGAGGAGGTGGAG 650 I.isa AGGTTGAAGTACATGAACTTAAAATACTATGATTTAGAGGATATTATGCTTGAGGAGGTGGAG 650 I.cha AGGTTGAAGTACATGAACTTTTACTATGATTTAGAGGATATTATGCTTGAGGAGGTGGAG 650 D.sub AGGTTGAAGTACATGAACTTTTACTATGATTTAGAGGATATTATGCTTGAGGAGGTGGAG 650 D.dub AGGTTGAAGTACATGAACTTTTACTATGATTTAGAGGATATTATGCTTGAGGAGGTGGAG 650 D.par AGGCCCCTGAAGTACATGAACTTTTACTATGATTTAGAGGATATTATGCTTGAGGAGGTGGAG 657 D.cil AGGTTGAAGTACATGAACTTTTACTATGATTTAGAGGATATT TTGCTTGAGGAGGTGGAG 650 D.dav AGGTTGAAGTACATGAACTTTTACTATGATTTAGAGGATATT TTGCTTGAGGAGGTGGAG 650 D.gra AGGTTGAAGTACATGAACTTTTACTATGATTTAGAGGATATTATGCTTGAGGAGGTGGAG 650 D.sib AGGTTGAAGTACATGAATTTTTTTTACTATGATTTAGAGGATATTATGCTTGAGGAGGTGGAG 650 D.vir AGGTTGAAGTACATGAACTTTTACTATGATTTAGAGGATATTATAAAACTTGAGGAGGTGGAG 650 D.lut AGGTTGAAGTACAT TAACTTTTACTATGATTTAGAGGATATTATGCTGGGGGAGGAGGTGGAG 650 D.pur AGGTTGAAGTACAT TAACTTTTACTATGATTTAGAGGATATTATGCTTGAGGAGGTGGAG 650 D.tha AGGTTGAAGTACAT TAACTTTTACTATGATTTAGAGGATATTATGCTTGAGGAGGTGGAG 650 D.mar AGGTTGAAGTACAT TAACTTTTACTATGATTTAGAGGATATTATGCTTGAGGAGGTGGAG 650 D.min AGGTTGAAGTACAT TAACTTTTACTATGATTTAGAGGATATTATGCTTGAGGAGGTGGAG 650 *** ********** ** ** ********************* * ** **********
154 Anlagen
D.lan AAGAAGGAGGGTTTGACTTGGTCGGTTCATCGCCCAGGGAATATATTCGGGTTTTCTCCA 713 I.sce AAGAAGGAGGGTTTGACTTGGTCGGTTCATCGCCCAGGGAATATATTCGGGTTTTCTCCA 710 D.car AAGAAGGAGGGTTTGACTTGGTCGGTTCATCGCCCAGGGAATATATTCGGGTTTTCTCCA 713 D.lae AAGAAGGAGGGTTTGACTTGGTCGGTTCATCGCCCAGGGAATATATTCGGGTTTTCTCCA 710 D.ner AAGAAGGAGGGTTTGACTTGGTCGGTTCGGGGTCGCCCAGGGAATATATTCGGGTTTTCTCCA 710 D.fer AAGAAGGAGGGTTTGACTTGGTCGGTTCATCGCCCAGGGAATATATTCGGGTTTTCTCCA 710 D.obs AAGAAGGAGGGTTTGACTTGGTCGGTTCATCGCCCAGGGAATATATTCGGGTTTTCTCCA 710 I.can AAGAAGGAGGGTTTGACTTGGTCGGTTCATCGCCCAGGGAATATATTCGGGTTTTCTCCA 710 I.isa AAGAAGGAGGGTTTGACTTGGTCGGTTCATCGCCCAGGGAATATATTCGGGTTTTCTCCA 710 I.cha AAGGGGGAGGAGGGTTTGACTTGGTCGGTTCATCGCCCAGGGAATATATTCGGGTTTTCTCCA 710 D.sub AAGAAGGAGGGTTTGACTTGGTCGGTTCATCGCCCAGGGAATATATTCGGGTTTTCTCCA 710 D.dub AAGAAGGAGGGTTTGACTTGGTCGGTTCATCGCCCAGGGAATATATTCGGGTTTTCTCCA 710 D.par AAGAAGGAGGGTTTGACTTGGTCGGTTCATCGCCCAGGGAATATATTCGGGTTTTCTCCA 717 D.cil AAGAAGGAGGGTTTGACTTGGTCGGTTCATCG TCCAGGGAATATATTCGGGTTTTCTCCA 710 D.dav AAGAAGGAGGGTTTGACTTGGTCGGTTCATCG TCCAGGGAATATATTCGGGTTTTCTCCA 710 D.gra AAGAAGGAGGGTTTGACTTGGTCGGTTCATCG TCCAGGGAATATATTCGGGTTTTCTCCA 710 D.sib AAGAAGGAGGGTTTGACTTGGTCGGTTCATCG TCCAGGGAATATATTCGGGTTTTCTCCA 710 D.vir AAGAAGGAGGGTTTGACTTGGTCGGTTCATCG TCCAGGGAATATATTCGGGTTTTCTCCA 710 D.lut AAGAAGGAGGGTTTGACTTGGTCGGTTCATCG TCCAGGGAATATATTCGGGTTTTCTCCA 710 D.pur AAGAAGGAGGGTTTGACTTGGTCGGTTCATCG TCCAGGGAA CATATTCGGGTTTTCTCCA 710 D.tha AAGAAGGAGGGTTTGACTTGGTCGGTTCATCG TCCAGGGAA CATATTCGGGTTTTCTCCA 710 D.mar AAGAAGGAGGGTTTGACTTGGTCGGTTCATGCGCGCGC TCCAGGGAA CATATTCGGGTTTTCTCCA 710 D.min AAGAAGGAGGGTTTGACTTGGTCGGTTCATCG TCCAGGGAA CATATTCGGGTTTTCTCCA 710 *** ************************ * ******** ******************
D.lan TATAGTATGATGAATTTGGTGGGTACCCTTTGTGTTTATGCAGCTATTTGCAAACACGAG 773 I.sce TATAGTATGATGAATTTGGTGGGTACCCTTTGTGTTTATGCAGCTATTTGCAAACACGAG 770 D.car TATAGTATGATGAATTTGGTGGGTACCCTTTGTGTTTATGCAGCTATTTGCAAACACGAG 773 D.lae TATAGTATGATGAATTTGGTGGGTACCCTTTGTGTTTATGCAGCTATTTGCAA GCACGAG 770 D.ner TATAGTATGATGAATTTGGTGGGTACCCTTTGTGTTTATGCAGCTATTTGCAA GCACGAG 770 D.fer TATAGTATGATGAATTTGGTGGGTACCCTCTGTGTTTATGCAGCTATTTGCAAACACGAG 770 D.obs TATAGTATGATGAATTTGGTGGGTACCCTTTGTGTTTATGCAGCTATTTGCAAACACGAG 770 I.can TACCCCAGTATGATGAATTTGGTGGGTACCCTTTGTGTTTATGCAGCTATTTGCAAACACGAG 770 I.isa TATAGTATGATGAATTTGGTGGGTACCCTTTGTGTTTATGCAGCTATTTGCAAACACGAG 770 I.cha TATAGTATGATGAATTTGGTGGGTACCCTTTGTGTTTATGCAGCTATTTGCAAACACGAG 770 D.sub TATAGTATGATGAATTTGGTGGGTACCCTTTGTGTTTATGCAGCTATTTGCAAACACGAG 770 D.dub TATAGTATGATGAATTTGGTGGGTACCCTTTGTGTTTATGCAGCTATTTGCAAACACGAG 770 D.par TATAGTATGATGAATTTGGTGGGTACCCTTTGTGTTTATGCAGCTATTTGCAAACACGAG 777 D.cil TATAGTATGATGAAT CTGGCCCCGGGTACCCTTTGTGTTTATGCAGCTATTTGCAAACACGAG 770 D.dav TATAGTATGATGAAT CTGGTGGGTACCCTTTGTGTTTATGCAGCTATTTGCAAACACGAG 770 D.gra TATAGTGGGGTGATGAAT CTGGTGGGTACCCTTTGTGTTTATGCAGCTATTTGCAAACACGAG 770 D.sib TATAGTATGATGAAT CTGGTGGGTACCCTTTGTGTTTATGCAGCTATTTGCAAACACGAG 770 D.vir TATAGTATGATGAAT CTGGTGGGTACCCTTTGTGTTTATGCAGCTATTTGCAAACACGAG 770 D.lut TATAGTATGATGAATTTGGTGGGTACCCTTTGTGTTTATGCAGCTATTTGCAAGCACGAG 770 D.pur TATAGTATGATGAATTTGGTGGG CACCCT GTGCCCCGTTTATGCAGCTACCCCTTGCAAACACGAG 770 D.tha TATAGTATGATGAATTTGGTGGG CACCCT GTGTGTTTATGCAGCTATTTGCAAACACGAG 770 D.mar TATAGTATGATGAATTTGGTGGG CACCCT GTGTGTTTATGCAGCTATTTGCAAACACGAG 770 D.min TATAGTATGATGAATTTGGTGGGTACCCTTTGTGTTTATGCAGCTATTTGCAAACACGAG 770 ** *** ******** *** *** ***** ** ************* ****** ******
D.lan GGAAAGGTTTTGAGGTTTACTGGTTGTAAGGCTGCGTGGGATGGGTACTCGGATTGCTCT 833 I.sce GGAAAGGTTTTGAGGTTTACTGGTTGTAAGGCTGCGTGGGATGGGTACTCGGATTGCTCT 830 D.car GGAAAGGTTTTGAGGTTTACTGGTTGTAAGGCTGCGTGGGATGGGTACTCGGATTGCTCT 833 D.lae GGAAAGGTTTTGAGGTTTACTGGTTGTAAGGCTGCGTGGGATGGGTACTCGGATTGCTCT 830 D.ner GGAAAGGTTTTGAGGTTTACTGGTTGTAAGGCTGCGTGGGATGGGTACTCGGATTGCTCT 830 D.fer GGAAAGGTTTTGAGGTTTACTGGTTGTAAGGCTGCGTGGGATGGGTACTCGGATTGCTCT 830 D.obs GGAAAGGTTTTGAGGTTTACTGGTTGTAAGGCTGCGTGGGATGGGTACTCGGATTGCTCT 830 I.can GGAAAGGTTTTGAGGTTTACTGGTTGTAAGGCTGCGTGGGATGGGTACTCGGATTGCTCT 830 I.isa GGAAAGGTTTTGAGGTTTACTGGTTGTAAGGCTGCGTGGGATGGGTACTCGGATTGCTCT 830 I.cha GGAAAGGTTTTGAGGTTTACTGGTTGTAAGGCTGCGTGGGATGGGTACTCGGATTGCTCT 830 D.sub GGAAAGGTTTTGAGGTTTACTGGTTGTAAGGCTGCGTGGGATGGGTACTCGGATTGCTCT 830 D.dub GGAAAGGTTTTGAGGTTTACTGGTTGTAAGGCTGCGTGGGATGGGTACTCGGATTGCTCT 830 D.par GGAAAGGTTTTGAGGTTTACTGGTTGTAAGGCTGCGTGGGATGGGTACTCGGATTGTTTTTCT 837 D.cil GGAAAGGTTTTGAGGTTTACTGGTTGTAAGGCTGCGTGGGATGGGTACTCGGATTGCTCT 830 D.dav GGAAAGGTTTTGAGGTTTACTGGTTGTAAGGCTGCGTGGGATGGGTACTCGGATTGCTCT 830 D.gra GGAAAGGTTTTGAGGTTTACTGGTTGTAAGGCTGCGTGGGATGGGTACTCGGATTGCTCT 830 D.sib GGAAAGGTTTTGAGGTTTACTGGTTGTAAGGCTGCGTGGGATGGGTACTCGGATTGCTCT 830 D.vir GGAAAGGTTTTGAGGTTTACTGGTTGTAAGGCTGCGTGGGATGGGTACTCGGATTGCTCT 830 D.lut GGAAAGGTTTTGAGGTTTACTGGTTGTAAGGCTGCGTGGGATGGGTACTCGGATTGCTCT 830 D.pur GG GAAGCCCCTTTTGAGGTTT CCTGGTTGTAAGGCTGCGTGGGATGGGTACTCGGATTGCTCT 830
155 Anlagen
D.tha GG GAAGGTTTTTTTTAGGTTT CCTGGTTGTAAGGCTGCGTGGGATGGGTACTCGGATTGCTCT 830 D.mar GG GAAGGTTTTGAGGTTT CCTGGTTGTAAGGCTGCGTGGGATGGGTACTCGGATTGCTCT 830 D.min GG GAAGGCCCCTTTGAGGTTT CCTGGTTGTAAGGCTGCGTGGGATGGGTACTCGGATTGCTCT 830 ** *** *** ****** ************************************* ***
D.lan GATGCGGATTTGATAGCGGAGCATCATATTTGGGCTGCAGTGGATCCTTATGCAAAAAACCCC 893 I.sce GATGCGGATTTGATAGCGGAGCATCATATTTGGGCTGCAGTGGATCCTTATGCAAAAAAT 890 D.car GATGCGGATTTGATAGCGGAGCATCATATTTGGGCTGCAGTGGATCCTTATGCAAAAAAT 893 D.lae GATGCGGATTTGATAGCGGAGCATCATATTTGGGC GGCAGTGGATCCTTATGCAAAAAAT 890 D.ner GATGCGGATTTGATAGCGGAGCATCATATTTGGGC GGCAGTGGATCCTTATGCAAAAAAT 890 D.fer GATGCGGATTTAAAAATAGCGGAGCATCATATTTGGGCTGCAGTGGATCCTTATGCAAAAAAT 890 D.obs GATGCGGATTTGATAGCGGAGCATCATATTTGGGCTGCAGTGGATCCTTATGCAAAAAAT 890 I.can GATGCGGATTTGATAGCGGAGCATCATATTTGGGC GGCAGTGGATCCTTATGCAAAAAAT 890 I.isa GATGCGGATTTGATAGCGGAGCATCATATTTGGGC GGCAGTGGATCCTTATGCAAAAAAT 890 I.cha GATGCGGATTTGATAGCGGAGCATCATATTTGGGC GGCAGTGGATCCTTATGCAAAAAAT 890 D.sub GATGCGGATTTGATAGCGGAGCATCATATTTGGGC GGCAGTGGATCCTTATGCAAAAAAT 890 D.dub GATGCGGATTTGATAGCGGAGCATCATATTTGGGC GGCAGTGGATCCTTATGCAAAAAAT 890 D.par GATGCGGATTTGATAGCGGAGCATCATATTTGGGCTGCAGTGGATCCTTATGCAAAAAAT 897 D.cil GATGCGGATTTGATAGCGGAGCATCATATTTGGGC GGCAGTGGATCCTTATGCAAAAAAT 890 D.dav GATGCGGATTTGATAGCGGAGCATCATATTTGGGC GGCAGTGGATCCTTATGCAAAAAAT 890 D.gra GATGCGGATTTGATAGCGGAGCATCATATTTGGGC GGCAGTGGATCCTTATGCAAAAAAT 890 D.sib GATGCGGATTTGATAGCGGAGCATCATATTTGGGC GGCAGTGGATCCTTATGCAAAAAAT 890 D.vir GATGCGGATTTGATAGCGGAGCATCATATTTGGGC GGCAGTGGATCCTTATGCAAAAAAT 890 D.lut GATGCGGATTTGATAGCGGAGCATCATATTTGGGC GGCAGTGGATCCTTATGCAAAAAAT 890 D.pur GGGGGTGC AGATTTGATAGCGGAGCATCATATTTGGGC GGCAGTGGATCCTTATGCAAAAAAT 890 D.tha GATGC AGATTTGATAGCGGAGCATCATATTTGGGC GGCAGTGGATCCTTATGCAAAAAAT 890 D.mar GATGC AGATTTGATAGCGGAGCATCATATTTGGGC GGCAGTGGATCCTTATGCAAAAAAT 890 D.min GATGC AGATTTGATTTTTGCGGAGCATCATATTTGGGC GGCAGTGGATCCTTATGCAAAAAAT 890 * *** ***** ** ******************** ***********************
D.lan GAGGCCTTTAATGTGAGTAATGGAGATGTGTTTAAATGGAAGCATTTTTGGAAGGTGTTG 953 I.sce GAGGCCTTTAATGTGAGTAATGGAGATGTGTTTAAATGGAAGCATTTTTGGAAGGTGTTG 950 D.car GAGGCCTTTAATGTGAGTAATGGAGATGTGTTTAAATGGAAGCATTTTTGGAAGGTGTTG 953 D.lae GAGGCCTTTAATGTGAGTAATGGAGATGTGTTTAAATGGAAGCATTTTTGGAAGGTGTTG 950 D.ner GAGGCCTTTAATGTGAGTAATGGAGATGTGTTTAAATGGAAGCATTTTTGGAAGGTGTTG 950 D.fer GAGGCCTTTAATGTGAGTAATGGAGATGTGTTTAAATGGAAGCATTTTTGGAAGGTGTTG 950 D.obs GAGGCCTTTAATGTGAGTAATGGAGATGTGTTTAAATGGAAGCATTTTTGGAAGGTGTTG 950 I.can GAGGCCTTTAATGTGAGTAATGGAGATGTGTTTAAATGGGGGGAGCATTTTTGGAAGGTGTTG 950 I.isa GAGGCCTTTAATGTGAGTAATGGAGATGTGTTTAAATGGAAGCATTTTTGGAAGGTGTTG 950 I.cha GAGGCCTTTAATGTGAGTAATGGAGATGTGTTTAAATGGAAGCATTTTTGGAAGGTGTTG 950 D.sub GAGGCCTTTAATGTGAGTAATGGAGATGTGTTTAAATGGAAGCATTTTTGGAAGGTGTTG 950 D.dub GAGGCCTTTAATGTGAGTAATGGAGATGTGTTTAAATGGAAGCATTTTTGGAAGGTGTTG 950 D.par GAGGCCTTTAATGTGAGTAATGGAGATGTGTTTAAATGGAAGCATTTTTGGAAGGTGTTG 957 D.cil GAGGCCTTTAATGTGAGTAATGGAGATGTGTTTAAATGGAAGCATTTTTGGAAGGTGTTG 950 D.dav GAGGCCTTTAATGTGAGTAATGGAGATGTGTTTAAATGGAAGCATTTTTGGAAGGTGTTG 950 D.gra GAGGCCTTTAATGTGAGTAATGGAGATGTGTTTAAATGGAAGCATTTTTGGAAGGTGTTG 950 D.sib GAGGCCTTTAATGTGAGTAATGGAGATGTGTTTAAATGGAAGCATTTTTGGAAGGTGTTG 950 D.vir GAGGCTTTTTTTAATGTGAGTAATGGAGATGTGCCCCTTAAATGGAAGCATTTTTGGAAGGTGTTG 950 D.lut GAGGCGGGGTTTAATGTGAGTAATGGAGATGTGTTTAAATGGAAGCATTTTTGGAAGGTGTTG 950 D.pur GAGGCCTTTAATGTGAGTAATGGAGATGTGTTTAAATGGAAGCATTTTTGGAAGGTGTTG 950 D.tha GAGGCCTTTAATGTGAGTAATGGAGATGTGTTTAAATGGAAGCATTTTTGGAAGGTGTTG 950 D.mar GAGGCCTTTAATGTGAGTAATGGAGATGTGTTTAAATGGAAGCATTTTTGGAAGGTGTTG 950 D.min GAGGCCTTTAATGTGAGTAATGGAGATGTGTTTAAATGGAAGCATTTTTGGAAGGTGTTG 950 ***** ************************ ******** ********************
D.lan GCGGAGCAGTTTGGAGTAGGGGGGTGTGGAGAGTATGAAGAAGGGGTGGATTTGAAATTGCAG 1013 I.sce GCGGAGCAGTTTGGAGTAGAGTAAAATGGAGAGTATGAAGAAGGGGTGGATTTGAAATTGCAG 1010 D.car GCGGAGCAGTTTGGAGTAGAGTGTGGAGAGTATGAAGAAGGGGTGGATTTGAAATTGCAG 1013 D.lae GCGGAGCAGTTTGG GGTAGAGTGTGGAGAGTATGAAGAAGGGGTGGATTTGAAATTGCAG 1010 D.ner GCGGAGCAGTTTGG GGTAGAGTGTGGAGAGTATGAAGAAGGGGTGGATTTGAAATTGCAG 1010 D.fer GCGGAGCAGTTTGGAGTAGAGTGTGGAGAGTATGAAGAAGGGGTGGATTTGAAATTGCAG 1010 D.obs GCGGAGCAGTTTGG GGTAGAGTGTGGAGAGTATGAAGAAGGGGAAAAGGATTTGAAATTGCAG 1010 I.can GCGGAGCAGTTTGGAGTAGAGTGTGGAGAGTATGAAGAAGGGGTGGATTTGAAATTGCAG 1010 I.isa GCGGAGCAGTTTGGAGTAGAGTGTGGAGAGTATGAAGAAGGGGTGGGGGGTTTGAAATTGCAG 1010 I.cha GCGGAGCAGTTTGGAGTAGAGTGTGGAGAGTATGAAGAAGGGGTGGATTTGAAATTGCAG 1010 D.sub GCGGAGCAGTTTGG GGTAGAGTGTGGAGAGTATGAAGAAGGGGTGGATTTGAAATTGCAG 1010 D.dub GCGGAGCAGTTTGG GGTAGAGTGTGGAGAGTATGAAGAAGGGGTGGATTTGAAATTGCAG 1010 D.par GCGGAGCAGTTTGG GGTAGAGTGTGGAGAGTATGAAGAAGGGGTGGATTTGAAATTGCAG 1017 D.cil GCGGAGCAGTTTGG GGTAGAGTGTGGAGAGTATGAAGAAGGGGTGGATTTGAAATTGCAG 1010
156 Anlagen
D.dav GCGGAGCAGTTTGG GGTAGAGTGTGGAGAGTATGAAGAAGGGGTGGATTTGAAATTGCAG 1010 D.gra GCGGAGCAGTTTGG GGTAGAGTGTGGAGAGTATGAAGAAGGGGTGGATTTGAAATTGCAG 1010 D.sib GCGGAGCAGTTTGG GGTAGAGTGTGGAGAGTATGAAGAAGGGGTGGATTTGAAATTGCAG 1010 D.vir GCGGAGCAGTTTGG GGTAGAGTGTGGAGAGTATGAAGAAGGGGTGGATTTGAAATTGCAG 1010 D.lut GCGGAGCAGTTTGG GGTAGAGTGTGGAGAGTATGAAGAAGGGGTGGATTTGAAATTGCAG 1010 D.pur GCGGAGCAGTTTGG GGTAGAGTGTGGAGAGTATGAAGAAGGGGTGGATTTGAAATTGCAG 1010 D.tha GCGGAGCAGTTTGG GGTAGAGTGTGGAGAGTATGAAGAAGGGGTGGATTTGAAATTGCAG 1010 D.mar GCGGAGCAGTTTGG GGTAGAGTGTGGAGAGTATGAAGAAGGGGTGGATTTGAAATTGCAG 1010 D.min GCGGAGCAGTTTGG GGTCCCCGAGTGTGGAGAGTATGAAGAAGGGGTGGATTTGAAATTGCAG 1010 ************** ** * ** ******************** ** *************
D.lan GATTTAATGAAGGGGAAGGAGCCGGTTTGGGAGGAAATCGTGAGGGAGAATGGATTGACA 1073 I.sce GATTTAATGAAGGGGAAGGAGCCGGTTTGGGAGGAAATCGTGAGGGAGAATGGATTGATTTTA 1070 D.car GATTTAATGAAGGGGAAGGAGCCGGTTTGGGAGGAAATTTTTGTGAGGGAGAATGAAAAATTGACA 1073 D.lae GATTTAATGAAGGGGAAGGAGCCGGTTTGGGAGGAAATCGTGAGGGAGAATGGATTGACA 1070 D.ner GATTTAATGAAGGGGAAGGAGCCCCCCGTTTGGGAGGAAATCGTGAGGGAGAATGGATTGACA 1070 D.fer GATTTAATGAAGGGGAAGGAGCCGGTTTGGGAGGAAATCGTGAGGGAGAATGGATTGACA 1070 D.obs GATTTAATGAAGGGGAAGGAGCCGGTTTGGGAGGAAATCGTGAGGGGGGGGAATGGATTGACA 1070 I.can GATTTAATGAAGGGGAAGGAGCCGGTTTGGGAGGAAATCGTGAGGGAGAATGGATTGACA 1070 I.isa GATTTAATGAAGGGGAAGGAGCCGGTTTGGGAGGAAATCGTGGGGGGGGAGAATGGATTGACA 1070 I.cha GATTTAATGAAGGGGAAGGAGCCGGTTTGGGAGGAAATCGTGAGGGAGAATGGATTGACA 1070 D.sub GATTTAATGAAGGGGAAGGAGCCGGTTTGGGAGGAAATCGTGAGGGAGAATGGATTGACA 1070 D.dub GATTTAATGAAGGGGAAGGAGCCGGTTTGGGAGGAAATCGTGAGGGAGAATGGATTGACA 1070 D.par GATTTAATGAAGGGGAAGGAGCCGGTTTGGGAGGAAATCGTGAGGGAGAATGGATTGACA 1077 D.cil GATTTAATGAAGGGGAAGGAGCCGGTTTGGGAGGAAATCGTGAGGGAGAATGGATTGACA 1070 D.dav GATTTAATGAAGGGGAAGGAGCCGGTTTGGGAGGAAATCGTGAGGGAGAATGGATTGACA 1070 D.gra GATTTAATGAAGGGGAAGGAGCCGGTTTGGGAGGAAATCGTGAGGGAGAATGGATTGACA 1070 D.sib GATTTAATGAAGGGGAAGGAGCCGGTTTGGGAGGAAATCGTGAGGGAGAATGGATTGACA 1070 D.vir GATTTAATGAAGGGGAAGGAGCCGGTTTGGGAGCCCCAAATCGTGAGGGAGAATGGATTGACA 1070 D.lut GATTTAATGAAGGGGAAGGAGCCGGTTTGGGAGGAAATCGTGAGGGAGAATGGATTGACA 1070 D.pur GATTT GATGAAGGGGAAGGAG GCGGTTTGGGAGGAAATCGTGAGGGAGAATGG GTTGACA 1070 D.tha GATTT GATGAAGGGGAAGGAG GCGGTTTGGGAGGAAATCGTGAGGGAGAATGG GTTGACA 1070 D.mar GATTT GATGAAGGGGAAGGAG GCGGTTTGGGAGGAAATCGTGAGGGAGAATGG GTTGACA 1070 D.min GATTT GATGAAGGGGAAGGAGACAAAAGTTTGGGAGGAAATCGTGAGGGAGAATGG GTTGACA 1070 ***** *************** * ********* **** *** *** ***** **** *
D.lan CCTACGAAACTGAAGGATGTCGG AATTTGGTGGTTTGGTGATGTTATACTTGGGAATGAG 1133 I.sce CCTACGAAACTGAAGGATGTCGG AATTTGGTGGTTTGGTGATGTTATACTTGGGAATGAG 1130 D.car CCTACGAAACTGAAGGATGTCGGGATTTGGTGGTTTGGTGATGTTATACTTGGGAATGAG 1133 D.lae CCTACGAAACTGAAGGAT ATCGGGATTTGGTGGTTTGGTGATGTTATACTTGGGAATGAG 1130 D.ner CCTACGAAACTGAAGGAT ATCGGGATTTGGTGGTTTGGTGATGTTATACTTGGGAATGAG 1130 D.fer CCTACGAAACTGAAGGAT ATCGGGATTTGGTGGTTTGGTGATGTTATACTTGGGAATGAG 1130 D.obs CCTACGAAACTGAAGGATGTTTTTGGGATTTGGTGGTTTGGTGATGTTATACTTGGGAATGAG 1130 I.can CCTACGAAACT TAAGGATGTCGGGATTTGGTGGTTTGGTGATGTTATACTTGGGAATGAG 1130 I.isa CCTACGAAACT TAAGGATGTCGGGATTTGGTGGTTTGGTGATGTTATACTTGGGAATGAG 1130 I.cha CCTACGAAACT TAAGGATGTCGGGATTTGGTGGTTTGGTGATGTTATACTTGGGAATGAG 1130 D.sub CCTACGAAACTGAAGGAT ATCGGGATTTGGTGGTTTGGTGATGTTATACTTGGGAATGAG 1130 D.dub CCTACGAAACTGAAGGAT ATCGGGATTTGGTGGTTTGGTGATGTTATACTTGGGAATGAG 1130 D.par CCTACAAAAAAACTGAAGGATGTCGGGATTTGGTGGTTTGGTGATGTTATACTTGGGAATGAG 1137 D.cil CCTACGAAACTGAAGGAT ATCGGGATTTGGTGGTTTGGTGATGTTATACTTGGGAATGAG 1130 D.dav CCTACGAAACTGAAGGAT ATCGGGATTTGGTGGTTTGGTGATGTTATACTTGGGAATGAG 1130 D.gra CCTACGAAACTGAAGGAT ATCGGGATTTGGTGGTTTGGTGATGTTATACTTGGGAATGAG 1130 D.sib CCTACGAAACTGAAGGAT ATCGGGATTTGGTGGTTTGGTGATGTTATACTTGGGAATGAG 1130 D.vir CCTACGAAACTGAAGGATGTCGGGATTTGGTGGTTTGGTGATGTTATACTTGGGAATGAG 1130 D.lut CCTACGAAACTGAAGGATGTCGGGATTTGGTGGTTTGGTGATGTTATACTTGGGAATGAG 1130 D.pur CCTACGAAACTGAAGGAT ATCGGGATTTGGTGGTTTGGTGATGTTATACTTGGGAATGA A 1130 D.tha CCTACGAAACTGAAGGAT ATCGGGATTTGGTGGTTTGGTGATGTTATACTTGGGAATGA A 1130 D.mar CCTACGAAACTGAAGGAT ATCGGGATTTGGTGGTTTGGTGATGTTATACTTGGGAATGA A 1130 D.min CCTACGAAACTGAAGGATGTCGGGATTTGGTGGTTTGGTGATGTTATACTTGGGAATGAG 1130 ***** ***** ****** * ** ***********************************
D.lan TGTTTCCTGGATAGTATGAACAAGAGCAAGGAGCATGGCTTTTTGGGATTTAGGAACTCC 1193 I.sce TGTTTCCTGGATAGTATGAACAAGAGCAAGGAGCATGGCTTTTTGGGATTTAGGAACTCC 1190 D.car TGTTTCCTGGATAGTATGAACAAGAGCAAGGAGCATGGCTTTTTGGGATTTAGGAACTCC 1193 D.lae TGTTTCCTGGATAGTATGAACAAGAGCAAGGAGCATGGCTTTTTGGGATTTAGGAACTCC 1190 D.ner TGTTTCCTGGATAGTATGAACAAGAGCAAGGAGCATGGCTTTTTGGGATTTAGGAACTCC 1190 D.fer TGTTTCCTGGATAGTATGAACAAGAGCAAGGAGCATGGCTTTTTGGGATTTAGGAACTCC 1190 D.obs TGTTTCCTGGATAGTATGAACAAGAGCAAGGAGCATGGCTTTTTGGGATTTAGGAACTCC 1190 I.can TGTTTCCTGGATAGTATGAACAAGAGCAAGGAGCATGGCAAAATTTTGGGATTTAGGAACTCC 1190 I.isa TGTTTCCTGGATAGTATGAACAAGAGCAAGGAGCATGGCCCCCTTTTGGGATTTAGGAACTCC 1190
157 Anlagen
I.cha TGTTTCCTGGATAGTATGAACAAGAGCAAGGAGCATGGCTTTTTGGGATTTAGGAACTCC 1190 D.sub TGTTTCCTGGATAGTATGAACAAGAGCAAGGAGCATGGCTTTTTGGGATTTAGGAACTCC 1190 D.dub TGTTTCCTGGATAGTATGAACAAGAGCAAGGAGCATGGCTTTTTGGGATTTAGGAACTCC 1190 D.par TGTTTCCTGGATAGTATGAACAAGAGCAAGGAGCATGGCTTTTTGGGATTTAGGAACTCC 1197 D.cil TGTTTCCTGGATAGTATGAACAAGAGCAAGGAGCATGGCTTTTTGGGATTTAGGAACTCC 1190 D.dav TGTTTCCTGGATAGTATGAACAAGAGCAAGGAGCATGGCTTTTTGGGATTTAGGAACTCC 1190 D.gra TGTTTCCTGGATAGTATGAACAAGAGCAAGGAGCATGGCTTTTTGGGATTTAGGAACTCC 1190 D.sib TGTTTCCTGGATAAAAATATGAACAAGAGCAAGGAGCATGGCTTTTTGGGATTTAGGAACTCC 1190 D.vir TGTTTCCTGGATAGTATGAACAAGAGCAAGGAGCATGGCTTTTTGGGATTTAGGAACTCC 1190 D.lut TGTTTCCTGGATAGTATGAACAAGAGCAAGGAGCATGGCTTTTTGGGATTTAGGAACTCC 1190 D.pur TGTTT TCTGGATAGTATGAA TAAGAGCAAGGAGCATGGCTTTTTGGGATTTAGGAACTCC 1190 D.tha TGTTT TCTGGATAGTATGAA TAAGAGCAAGGAGCATGGCTTTTTGGGATTTAGGAACTCC 1190 D.mar TGTTT TCTGGATAGTATGAA TAAGAGCAAGGAGCATGGCTTTTTGGGATTTAGGAACTCC 1190 D.min TGTTT TCTGGATAGTATGAACAAGAGCAAGGAGCATGGCTTTTTGGGATTTAGGAACTCC 1190 ***** ******* ****** ****************** ********************
D.lan AAGAATGCGTTCATTTCTTGGATTGACAAGGCAAAAGCTTACAAGATTGTTCCTTGA 1250 I.sce AAGAATGCGTTCATTTCTTGGATTGACAAGGCAAAAGCTTACAAGATTGTTCCTTGA 1247 D.car AAGAATGCGTTCATTTCTTGGATTGACAAGGCAAAAGCTTACAAGATTGTTCCTTGA 1250 D.lae AAGAATGCGTTCATTTCTTGGATTGACAAGGCAAAAGCTTACAAGATTGTTCCTTGA 1247 D.ner AAGAATGCGTTCATTTCTTGGATTGACAAGGCAAAAGCTTACAAGATTGTTCCTTGA 1247 D.fer AAGAATGCGTTCATTTCTTGGATTGACAAGGCAAAAGCTTACAAGATTGTTCCTTGA 1247 D.obs AAGAATGCGTTCATTTCTTGGATTGACAAGGCAAAAGCTTACAAGATTGTTCCTTGA 1247 I.can AAGAATGCGTTCATTTCTTGGATTGACAAGGCAAAAGCTTACAAGATTGTTCCTTGA 1247 I.isa AAGAATGCGTTCATTTCTTGGATTGACAAGGCAAAAGCTTACAAGATTGTTCCTTGA 1247 I.cha AAGAATGCGTTCATTTCTTGGATTGACAAGGCAAAAGCTTACAAGATTGTTCCTTGA 1247 D.sub AAGAATGCGTTCATTTCTTGGATTGACAAGGCAAAAGCTTACAAGATTGTTCCTTGA 1247 D.dub AAGAATGCGTTCATTTCTTGGATTGACAAGGCAAAAGCTTACAAGATTGTTCCTTGA 1247 D.par AAGAATGCGTTCATTTCTTGGATTGACAAGGCAAAAGCTTACAAGATTGTTCCTTGA 1254 D.cil AAGAATGCGTTCATTTCTTGGATTGACAAGGCAAAAGCTTACAAGATTGTTCCTTGA 1247 D.dav AAGAATGCGTTCATTTCTTGGATTGACAAGGCAAAAGCTTACAAGATTGTTCCTTGA 1247 D.gra AAGAATGCGTTCATTTCTTGGATTGACAAGGCAAAAGCTTACAAGATTGTTCCTTGA 1247 D.sib AAGAATGCGTTCATTTCTTGGATTGACAAGGCAAAAGCTTACAAGATTGTTCCTTGA 1247 D.vir AAGAATGCGTTCATTTCTTGGATTGACAAGGCAAAAGCTTACAAGATTGTTCCTTGA 1247 D.lut AAGAATGCGTTCATTTCTTGGATTGACAAGGCAAAAGCTTACAAGATTGTTCCTTGA 1247 D.pur AAGAATGCGTTCATTTCTTGGATTGACAAGGCAAAAGCTTACAAGATTGTTCCTTGA 1247 D.tha AAGAATGCGTTCATTTCTTGGATTGACAAGGCAAAAGCTTACAAGATTGTTCCTTGA 1247 D.mar AAGAATGCGTTCATTTCTTGGATTGACAAGGCAAAAGCTTACAAGATTGTTCCTTGA 1247 D.min AAGAATGCGTTCATTTCTTGGATTGACAAGGCAAAAGCTTACAAGATTGTTCCTTGA 1247 *********************************************************
Introns grau unterlegt; D.lan = D. lanata ; I.sce = I. sceptrum ; D.car = D. cariensis ; D.lae = D. laevigata ; D.ner = D. nervosa ; D.fer = D. ferruginea ; D.obs = D. obscura (AJ555127, Roca-Pérez et al., 2004); I.can = I. canariensis ; I.isa = I. isabelliana ; I.cha = I. chalcantha ; D.sub = D. subalpina ; D.dub = D. minor subsp. dubia ; D.par = D. parviflora ; D.cil = D. ciliata ; D.dav = D. davisiana ; D.gra = D. grandiflora ; D.sib = D. sibirica ; D.vir = D. viridiflora ; D.lut = D. lutea ; D.pur = D. purpurea ; D.tha = D. thapsi ; D.mar = D. mariana; D.min = D. minor subsp. minor.
158 Anlagen
VII.2.2 Aminosäure-Alignment der 5 β-POR Proteinsequenzen D.cil MSWWWAGAIGAAKKKLEEDGGGGAPTKHSSVALLLLLVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.dav MSWWWAGAIGAAKKKLEEDDAPTKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.gra MSWWWAGAIGAAKKKLEEDDAPTKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.sib MSWWWAGAIGAAKKKLEEDDAPTKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.vir MSWWWAGAIGAAKKKLEEDDAPTKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 I.can MSWWWAGAIGAAKKKLEEDDAP SKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 I.isa MSWWWAGAIGATTTTKKKLEEDDAP SKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 I.cha MSWWWAGAIGAAKKKLEEDDAP SKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.par MSWWWAGAIGSSSSAKKKLEEDDAP SKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.fer MSWWWAGAIGAA RKKLEEDDAPPKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.lae MSWWWAGAIGAA RKKLEEDDAPPKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.ner MSWWWAGAIGAAKKKSSSSEEDDAPPKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.sub MSWWWAGAIGAAKKKLEEDDAP SKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.dub MSWWWAGAIGAAKKKLEEDDAP SKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.lan MSWWWAGAIGAAKK RLEEDDA QPKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.car MSWWWAGAIGAAKK RLEEDDAPPKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 I.sce MSWWWAGAIGAAKKKLEEDDA QPKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.obs MSWWWAGAIGAAKKKLEEDDAPPKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.lut MSWWWAGAIGAAKKKLDDDDEDDAPTKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.mar MSWWWAGAIGAAKKKLEEDDAPPKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.tha MSWWWAGAIGAAKKKLEEDDAPPKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.pur MSWWWAGAIGAAKKKLEEDDAPPKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 D.min MSWWWAGAIGAAKKKLEEDDAPPKHSSVALIVGVTGIIGNSLAEILPLADTPGGPWKVYG 60 **********:::*: :**.* .*******:*****************************
D.cil VARRTRPARRRRHEDNPINYIQCDISDPDDSQAKLSPLTDVTHVFYVTWANRSTEQENCEANS 120 D.dav VARRTRPAWHEDNPINYIQCDISDPDDSQAKLSPLTDVTHVFYVTWANRSTE PENCEANS 120 D.gra VARRTRPAWHEDNPINYIQCDISDPDDSQAKLSPLTDVTHVFYVTWANRSTEQENCEANS 120 D.sib VARRTRPAWHEDNPINYIQCDISDPDDSQAKLSPLTDVTHVFYVTWANRSTEQENCEANS 120 D.vir VARRTRPAWHEDNPINYIQCDISDPDDSQAKLSPLTDVTHVFYVTWANRSTEQENCEANS 120 I.can VARRTRPAWHEDNPINY VQCDISDPDDSQAKLS HLTDVTHVFYVTWANRSTEQENCEANS 120 I.isa VARRTRPAWHEDNPINY VQCDISDPDDSQAKLS HLTDVTHVFYVTWANRSTEQEN REANS 120 I.cha VARRTRPAWHEDNPINY VQCDISDPDDSQAKLS HLTDVTHVFYVTWANRSTEQENCEANS 120 D.par VARRTRPSSSSWHEDNPINY VQCDISDPDDSQAKLSPLTDVTHVFYVTWANRSTEQENCEANS 120 D.fer VARRTRPAWHEDNPINY VQCDISDPDDSQAKLSPLTDVTHVFYVTWANRSTEQENCEANS 120 D.lae VARRTRPAWHEDNPINY VQCDISDPDDSQAKLSPLTDVTHVFYVTWANRSTEQENCEANS 120 D.ner VARRTRPAWHEDNPINY VQCDISDPDDSQAKLSPLTDVTHVFYVTWANRSTEQENCEANS 120 D.sub VARRTRPAWHEDNPINY VQCDISDPDDSQAKLSPLTDVTHVFYVTWANRSTEQENCEANS 120 D.dub VARRTRPAWHEDNPINY VQCDISDPDDSQAKLSPLTDVTHVFYVTWANRSTEQENCEANS 120 D.lan VARRTRPAWHEDNPINY VQCDISDPDDSQAKLSPLTDVTHVFYVTWANRSTEQENCEANS 120 D.car VARRTRPAWHEDNPINY VQCDISDPDDSQAKLSPLTDVTHVFYVTWANRSTEQENCEANS 120 I.sce VARRTRPVVVVWHEDNPINY VQCDISDPDDSQAKLSPLTDVTHVFYVTWANRSTEQENCEANS 120 D.obs VARRTRPAWHEDNPINY VQCDISDPDDSQAKLSPLTDVTHVFYVTWANRSTEQENCEANS 120 D.lut VARRTRPAWHEDNPINY VQCDISDPDDSQAKLSPLTDVTHVFYVTWANRSTEQENCEANS 120 D.mar VARRTRPAWHEDNPINYIQCDISDPDDS LAKLSPLTDVTHVFYVTCCCCANRSTE PENCEANS 120 D.tha VARRTRPAWHEGGGGNPINYIQCDISDPDDS LAKLSPLAAAADVTHVFYVTWANRSTE PENCEANS 120 D.pur VARRTRPAWHEDNPINYIQCDISDPDDS LAKLSPLTDVTHVFYVTWANRSTE PENCEANS 120 D.min VARRTRPAWHEDNPINYIQCDISDPDDSQAKLSPLTDVTHVFYVTWANRPPPPTE PEN REANS 120 ******* **.*****:********** **** *:********* ***.** ** ****
D.cil KMFRNVLDAVIPNCPNLKHISLQTGRKHYMGPFESYGKIESHDPPYTEDLPRLKYMNFYY 180 D.dav KMFRNVLDAVIPNCPNLKHISLQTGRKHYMGPFESYGKIESHDPPYTEDLPRLKYMNFYY 180 D.gra KMFRNVLDAVIPNCPNLKHISLQTGRKHYMGPFESYGKIESHDPPYTEDLPRLKYMNFYY 180 D.sib KMFRNVLDAVIPNCPNLKHISLQTGRKHYMGPFESYGKIESHDPPYTEDLPRLKYMNFYY 180 D.vir KMFRNVLDAVIPNCPNLKHISLQTGRKHYMGPFESYGKIESHDPPYTEDLPRLKYMNFYY 180 I.can KMFRNVLDAVIPNCPNLKHISLQTGRKHYMGPFESYGKIESHDPPYTEDLPRLKYMNFYY 180 I.isa KMFRNVLDAVIPNCPNLKHISLQTGRKHYMGPFESYGKIESHDPPYTEDLPRLKYMNLLLLYY 180 I.cha KMFRNVLDAVIPNCPNLKHISLQTGRKHYMGPFESYGKIESHDPPYTEDLPRLKYMNFYY 180 D.par QQQMFRNVLDAVIPNCPNLKHISLQTGRKHYMGPFESYGKIESHDPPYSQ SSSEDLPRLKYMNFYY 180 D.fer KMFRNVLDAVIPNCPNLKHISLQTGRKHYMGPFESYGKIESHDPPYTEDLPRLKYMNFYY 180 D.lae KMFRNVLDAVIPNCPNLKHISLQTGRKHYMGPFESYGKIESHDPPYTEDLPRLKYMNFYY 180 D.ner KMFRNVLDAVIPNCPNLKHISLQTGRKHYMGPFESYGKIESHDPPYTEDLPRLKYMNFYY 180 D.sub KMFRNVLDAVIPNCPNLKHISLQTGRKHYMGPFESYGKIESHDPPYTEDLPRLKYMNFYY 180 D.dub KMFRNVLDAVIPNCPNLKHISLQTGRKHYMGPFESYGKIESHDPPYTEDLPRLKYMNFYY 180 D.lan KMFRNVLDAVIPNCPNLKHISLQTGRKHYMGPFESYGKIESHDPPYTEDLPRLKYMNFYY 180 D.car KMFRNVLDAVIPNCPNLKHISLQTGRKHYMGPFESYGKIESHDPPYTEDLPRLKYMNFYY 180 I.sce KMFRNVLDAVIPNCPNLKHISLQTGRKHYMGPFESYGKIESHDPPYTEDLPRLKYMNFYY 180
159 Anlagen
D.obs KMFRNVLDAVIPNCPNLKHISLQTGRKHYMGPFESYGKIESHDPPYTEDLPRLKYMNFYY 180 D.lut KMFRNVLDTTTTVIPNCPNLKHISLQTGRKHYMGPFESYGKIESHDPPYTEDLPRLKY INFYY 180 D.mar KMFRNVLDAVIPNCPNLKHISLQTGRKHYMGPFESYGKIESHDPPYTED MPRLKY INFYY 180 D.tha KMFRNVLDAVIPNCPNLKHISLQTGRKHYMGPFESYGKIESHDPPYTED MPRLKY INFYY 180 D.pur KMFRNVLDAVIPNCPNLKHISLQTGRKHYMGPFESYGKIESHDPPYTED MPRLKY INFYY 180 D.min KMFRNVLDAVIPNCPNLKHISLQTGRKHYMGPFESYGKIESHDPPYTEDLPRLKY INFYY 180 :*******:*************************************:**:*****:*:**
D.cil DLEDILLEEVEKKEGLTWSVHRPGNIFGFSPYSMMNLAAAAGTLCVYAAICKHEGKVLRFTGC 240 D.dav DLEDILLEEVEKKEGLTWSVHRPGNIFGFSPYSMMNLVGTLCVYAAICKHEGKVLRFTGC 240 D.gra DLEDI MLEEVEKKEGLTWSVHRPGNIFGFSPYSVVVVMNLVGTLCVYAAICKHEGKVLRFTGC 240 D.sib DLEDI MLEEVEKKEGLTWSVHRPGNIFGFSPYSMMNLVGTLCVYAAICKHEGKVLRFTGC 240 D.vir DLEDIILEEVEKKEGLTWSVHRPGNIFGFSPYSMMNLVGTLCVYAAICKHEGKVLRFTGC 240 I.can DLEDI MLEEVEKKEGLTWSVHRPGNIFGFSPYSMMNLVGTLCVYAAICKHEGKVLRFTGC 240 I.isa DLEDI MLEEVEKKEGLTWSVHRPGNIFGFSPYSMMNLVGTLCVYAAICKHEGKVLRFTGC 240 I.cha DLEDI MLEEVEKEEEEEGLTWSVHRPGNIFGFSPYSMMNLVGTLCVYAAICKHEGKVLRFTGC 240 D.par DLEDI MLEEVEKKEGLTWSVHRPGNIFGFSPYSMMNLVGTLCVYAAICKHEGKVLRFTGC 240 D.fer DLEDI MLGEVEKKEGLTWSVHRPGNIFGFSPYSMMNLVGTLCVYAAICKHEGKVLRFTGC 240 D.lae DLEDI MLEEVEKKEGLTWSVHRPGNIFGFSPYSMMNLVGTLCVYAAICKHEGKVLRFTGC 240 D.ner DLEDI MLEEVEKKEGLTWSVRRRRRPGNIFGFSPYSMMNLVGTLCVYAAICKHEGKVLRFTGC 240 D.sub DLEDI MLEEVEKKEGLTWSVHRPGNIFGFSPYSMMNLVGTLCVYAAICKHEGKVLRFTGC 240 D.dub DLEDI MLEEVEKKEGLTWSVHRPGNIFGFSPYSMMNLVGTLCVYAAICKHEGKVLRFTGC 240 D.lan DLEDI MLEEVEKKEGLTWSVHRPGNIFGFSPYSMMNLVGTLCVYAAICKHEGKVLRFTGC 240 D.car DLEDI MLEEVEKKEGLTWSVHRPGNIFGFSPYSMMNLVGTLCVYAAICKHEGKVLRFTGC 240 I.sce DLEDI MLEEVEKKEGLTWSVHRPGNIFGFSPYSMMNLVGTLCVYAAICKHEGKVLRFTGC 240 D.obs DLEDI MLKKKKEVEKKEGLTWSVHRPGNIFGFSPYSMMNLVGTLCVYAAICKHEGKVLRFTGC 240 D.lut DLEDI MLEEVEKKEGLTWSVHRPGNIFGFSPYSMMNLVGTLCVYAAICKHEGKVLRFTGC 240 D.mar DLEDI MLEEVEKKEGLTWSVHAAAAPGNIFGFSPYSMMNLVGTLCVYAAICKHEGKVLRF PGC 240 D.tha DLEDI MLEEVEKKEGLTWSVHRPGNIFGFSPYSMMNLVGTLCVYAAICKHEGKVFFFFRF PGC 240 D.pur DLEDI MLEEVEKKEGLTWSVHRPGNIFGFSPYSMMNLVGTLCVYAATTTTCKHEGKLLLLLRF PGC 240 D.min DLEDI MLEEVEKKEGLTWSVHRPGNIFGFSPYSMMNLVGTLCVYAAICKHEGKAAAALRF PGC 240 *****:* ****:*******: ***********:***.******** ****** :**.**
D.cil KAAWDGYSDCSDADLIAEHHIWAAVDPYAKNEAFNVSNGDVFKWKHFWKVLAEQFGVECG 300 D.dav KAAWDGYSDCSDADLIAEHHIWAAVDPYAKNEAFNVSNGDVFKWKHFWKVLAEQFGVECG 300 D.gra KAAWDGYSDCSDADLIAEHHIWAAVDPYAKNEAFNVSNGDVFKWKHFWKVLAEQFGVECG 300 D.sib KAAWDGYSDCSDADLIAEHHIWAAVDPYAKNEAFNVSNGDVFKWKHFWKVLAEQFGVECG 300 D.vir KAAWDGYSDCSDADLIAEHHIWAAVDPYAKNEAFNVSNGDVLLLLKWKHFWKVLAEQFGVECG 300 I.can KAAWDGYSDCSDADLIAEHHIWAAVDPYAKNEAFNVSNGDVFKWEEEEHFWKVLAEQFGVECG 300 I.isa KAAWDGYSDCSDADLIAEHHIWAAVDPYAKNEAFNVSNGDVFKWKHFWKVLAEQFGVECG 300 I.cha KAAWDGYSDCSDADLIAEHHIWAAVDPYAKNEAFNVSNGDVFKWKHFWKVLAEQFGVECG 300 D.par KAAWDGYSDCSDADLIAEHHIWAAVDPYAKNEAFNVSNGDVFKWKHFWKVLAEQFGVECG 300 D.fer KAAWDGYSDCSDADLIAEHHIWAAVDPYAKNEAFNVSNGDVFKWKHFWKVLAEQFGVECG 300 D.lae KAAWDGYSDCSDADLIAEHHIWAAVDPYAKNEAFNVSNGDVFKWKHFWKVLAEQFGVECG 300 D.ner KAAWDGYSDCSDADLIAEHHIWAAVDPYAKNEAFNVSNGDVFKWKHFWKVLAEQFGVECG 300 D.sub KAAWDGYSDCSDADLIAEHHIWAAVDPYAKNEAFNVSNGDVFKWKHFWKVLAEQFGVECG 300 D.dub KAAWDGYSDCSDADLIAEHHIWAAVDPYAKNEAFNVSNGDVFKWKHFWKVLAEQFGVECG 300 D.lan KAAWDGYSDCSDADLIAEHHIWAAVDPYAKNEAFNVSNGDVFKWKHFWKVLAEQFGVGGGGCG 300 D.car KAAWDGYSDCSDADLIAEHHIWAAVDPYAKNEAFNVSNGDVFKWKHFWKVLAEQFGVECG 300 I.sce KAAWDGYSDCSDADLIAEHHIWAAVDPYAKNEAFNVSNGDVFKWKHFWKVLAEQFGVEYYYYG 300 D.obs KAAWDGYSDCSDADLIAEHHIWAAVDPYAKNEAFNVSNGDVFKWKHFWKVLAEQFGVECG 300 D.lut KAAWDGYSDCSDADLIAEHHIWAAVDPYAKNEAFNVSNGDVFKWKHFWKVLAEQFGVECG 300 D.mar KAAWDGYSDCSDADLIAEHHIWAAVDPYAKNEAFNVSNGDVFKWKHFWKVLAEQFGVECG 300 D.tha KAAWDGYSDCSDADLIAEHHIWAAVDPYAKNEAFNVSNGDVFKWKHFWKVLAEQFGVECG 300 D.pur KAAWDGYSDCSGGGGADLIAEHHIWAAVDPYAKNEAFNVSNGDVFKWKHFWKVLAEQFGVECG 300 D.min KAAWDGYSDCSDADLIAEHHIWAAVDPYAKNEAFNVSNGDVFKWKHFWKVLAEQFGVECG 300 ***********.*****************************:**:************ *
D.cil EYEEGVDLKLQDLMKGKEPVWEEIVRENGLTPTKLKDIGIWWFGDVILGNECFLDSMNKS 360 D.dav EYEEGVDLKLQDLMKGKEPVWEEIVRENGLTPTKLKDIGIWWFGDVILGNECFLDSMNKS 360 D.gra EYEEGVDLKLQDLMKGKEPVWEEIVRENGLTPTKLKDIGIWWFGDVILGNECFLDSMNKS 360 D.sib EYEEGVDLKLQDLMKGKEPVWEEIVRENGLTPTKLKDIGIWWFGDVILGNECFLDNNNNMNKS 360 D.vir EYEEGVDLKLQDLMKGKEPVWEQQQQIVRENGLTPTKLKD VGIWWFGDVILGNECFLDSMNKS 360 I.can EYEEGVDLKLQDLMKGKEPVWEEIVRENGLTPTKLKD VGIWWFGDVILGNECFLDSMNKS 360 I.isa EYEEGVGGGGLKLQDLMKGKEPVWEEIVGGGGENGLTPTKLKD VGIWWFGDVILGNECFLDSMNKS 360 I.cha EYEEGVDLKLQDLMKGKEPVWEEIVRENGLTPTKLKD VGIWWFGDVILGNECFLDSMNKS 360 D.par EYEEGVDLKLQDLMKGKEPVWEEIVRENGLTPTKLKD VGIWWFGDVILGNECFLDSMNKS 360 D.fer EYEEGVDLKLQDLMKGKEPVWEEIVRENGLTPTKLKDIGIWWFGDVILGNECFLDSMNKS 360 D.lae EYEEGVDLKLQDLMKGKEPVWEEIVRENGLTPTKLKDIGIWWFGDVILGNECFLDSMNKS 360 D.ner EYEEGVDLKLQDLMKGKEPVWEEIVRENGLTPTKLKDIGIWWFGDVILGNECFLDSMNKS 360
160 Anlagen
D.sub EYEEGVDLKLQDLMKGKEPVWEEIVRENGLTPTKLKDIGIWWFGDVILGNECFLDSMNKS 360 D.dub EYEEGVDLKLQDLMKGKEPVWEEIVRENGLTPTKLKDIGIWWFGDVILGNECFLDSMNKS 360 D.lan EYEEGVDLKLQDLMKGKEPVWEEIVRENGLTPTKLKD VGIWWFGDVILGNECFLDSMNKS 360 D.car EYEEGVDLKLQDLMKGKEPVWEEIVRENEEEELTPTKLKD VGIWWFGDVILGNECFLDSMNKS 360 I.sce EYEEGVDLKLQDLMKGKEPVWEEIVRENGLIIIIPTKLKD VGIWWFGDVILGNECFLDSMNKS 360 D.obs EYEEGEEEEDLKLQDLMKGKEPVWEEIVRGGGGNGLTPTKLKD VGIWWFGDVILGNECFLDSMNKS 360 D.lut EYEEGVDLKLQDLMKGKEPVWEEIVRENGLTPTKLKD VGIWWFGDVILGNECFLDSMNKS 360 D.mar EYEEGVDLKLQDLMKGKE AVWEEIVRENGLTPTKLKDIGIWWFGDVILGNECFLDSMNKS 360 D.tha EYEEGVDLKLQDLMKGKE AVWEEIVRENGLTPTKLKDIGIWWFGDVILGNECFLDSMNKS 360 D.pur EYEEGVDLKLQDLMKGKE AVWEEIVRENGLTPTKLKDIGIWWFGDVILGNECFLDSMNKS 360 D.min EYEEGVDLKLQDLMKGKETVWEEIVRENGLTPTKLKD VGIWWFGDVILGNECFLDSMNKS 360 ***** .***********.***:** * * ******:*****************.****
D.cil KEHGFLGFRNSKNAFISWIDKAKAYKIVP 389 D.dav KEHGFLGFRNSKNAFISWIDKAKAYKIVP 389 D.gra KEHGFLGFRNSKNAFISWIDKAKAYKIVP 389 D.sib KEHGFLGFRNSKNAFISWIDKAKAYKIVP 389 D.vir KEHGFLGFRNSKNAFISWIDKAKAYKIVP 389 I.can KEHGIIIILGFRNSKNAFISWIDKAKAYKIVP 389 I.isa KEHGLLLLLGFRNSKNAFISWIDKAKAYKIVP 389 I.cha KEHGFLGFRNSKNAFISWIDKAKAYKIVP 389 D.par KEHGFLGFRNSKNAFISWIDKAKAYKIVP 389 D.fer KEHGFLGFRNSKNAFISWIDKAKAYKIVP 389 D.lae KEHGFLGFRNSKNAFISWIDKAKAYKIVP 389 D.ner KEHGFLGFRNSKNAFISWIDKAKAYKIVP 389 D.sub KEHGFLGFRNSKNAFISWIDKAKAYKIVP 389 D.dub KEHGFLGFRNSKNAFISWIDKAKAYKIVP 389 D.lan KEHGFLGFRNSKNAFISWIDKAKAYKIVP 389 D.car KEHGFLGFRNSKNAFISWIDKAKAYKIVP 389 I.sce KEHGFLGFRNSKNAFISWIDKAKAYKIVP 389 D.obs KEHGFLGFRNSKNAFISWIDKAKAYKIVP 389 D.lut KEHGFLGFRNSKNAFISWIDKAKAYKIVP 389 D.mar KEHGFLGFRNSKNAFISWIDKAKAYKIVP 389 D.tha KEHGFLGFRNSKNAFISWIDKAKAYKIVP 389 D.pur KEHGFLGFRNSKNAFISWIDKAKAYKIVP 389 D.min KEHGFLGFRNSKNAFISWIDKAKAYKIVP 389 ****:************************
„ *“ = Übereinstimmungen der Aminosäuren; „ :“ = Ersatz der Aminosäure(n) durch strukturell sehr ähnliche Aminosäure(n); „ .“ = Ersatz der Aminosäure(n) durch ähnliche Aminosäure(n); Abkürzungen siehe Anlage VII.2.1.
161 Anlagen
VII.2.3 Nukleotid-Alignment der Intron-haltigen 3 β-HSD Gensequenzen D.par ATGTCGTCAAAGCCAAGGTGATGCTTCTTTTAATTTCATGTCTCCATTTAATAGATCTCA 60 D.tha ATGTCGTCAAAGCCAAGGTGATGCTTCTTTTAATTTCATGTCTCCATTTAATAGATCTCA 60 D.lan ATGTCGTCAAAGCCAAGGTGATGCTTCTT GTAATTTCAT ATCTCCATTTAGGGGTAGATCTCA 60 D.gra ATGTCGTCAAAGCCAAGGTGATG GTTCTT GTAATTTCAT ATCTCCATTTAATAGATCTCA 60 D.fer ATGTCGTCAAAGCCAAGGTGATGATTCTT GTAATTTCAT ATCTCCATTTAATAGATCT GA 60 D.pur ATGTCGTCAAAGCCAAGGTGATGATTCTT GTAATTTCAT ATCTCCATTTAATAGATCT GA 60 D.mar ATGTCGTCAAAGCCAAGGTGATGATTCTT GTAATTTCAT ATCTCCATTTAATAGATCT GA 60 *********************** ***** ********* ********** ******* *
D.par ATTCCTCTAGACTAGATCTAATTAAACAG------TTTATATGTTATTGAAAGGTTGGAG 114 D.tha ATTCCTCTAGACTAGATCTAATTAAACAG------TTTATATGTTATTGAAAGGTTGGAG 114 D.lan ATTCCTCTAGACTAGATCTAATTAAACAG------TTTATATGTTATTGACCCCAGGTTGGAG 114 D.gra ATTCCTCTAGACTAGATCTAATTAAGCAG------TTTAT TTGTTATTGAAAGGTTGGAG 114 D.fer ATTCCTCTAGACTAGATCTAAT GG AATGA ATTTTAATTTTATTT GTTTGTTA ATGAAAGGTTGGA T 120 D.pur ATTCCTCTAGACTAGATCTAAT GG AATGA ATTTTAATTTTATTT GTTTGTTA ATGAAAGGTTGGA T 120 D.mar ATTCCTCTAGACTAGATCTAAT GG AATGA ATACATAC--TTTAT TTGTTA ATGAAAGGTTGGA T 118 ********************** * *** * ***** *** ********
D.par GGTAAAGTGGCAATCATCACCGGGGCCGCTAGCGGCATCGGCGAGGAGGCGGCAAGATTG 174 D.tha GGTAAAGTGGCAATCATCACCGGGGCCGCTAGCGGCATCGGCGAGGAGGCGGCAAGATTG 174 D.lan GGTAAAGTGGCAATCATCACCGG AGCCGCTAGCGGCATCGGCGAGGAGAAAACGGCAAGATTG 174 D.gra GGTAAAGTGGTTTTAATCATCACCGG AGCCGCTAGCGGCATCGGCGAGGAGGCGGCAAGATTG 174 D.fer GGTAAAGTGGCAATCATCACCGG AGC TGCTAGCGGCATCGGCGAGGAGGCGGCAAGATTG 180 D.pur GGTAAAGTGGCAATCATCACCGG AGC TGCTAGCGGCATCGGCGAGGAGGCGGCAAGATTG 180 D.mar GGTAAAGTGGCAATCATCACCGG AGC TGCTAGCGGCATCGGCGAGGAGGCGGCAAGATTG 178 ********** ************ ** ********************* ***********
D.par TTCGTGGAGCATGGCGCCTCAGTGGTGGTGGCGGACGTCCAGGACGAATTGGGGCGCCAG 234 D.tha TTCGTGGAGCATGGCGCCTCAGTGGTGGTGGCGGACGTCCAGGACGAATTGGGGCGCCAG 234 D.lan TTCGTGGAGCATGGCGCCTCAGTGGTGGTGGCGGACGTCCAGGACGAATTGGGGCGCCAG 234 D.gra TTCGTGGAGCATGGCGCCTCGGGGGTGGTGGTGGCGGACGTCCAGGACGAATTGGGGCAAAACCAG 234 D.fer TTCGTGGAGCATGGCGC TTCAGTGGTGGTGGCGGACGTCCAGGACGAATTGGG TCGCCAG 240 D.pur TTCGTGGAGCATGGCGC TTCAGTGGTGGTGGCGGACGTCCAGGACGAATTGGG TCGCCAG 240 D.mar TTCGTGGAGCATGGCGC TTCAGTGGTGGTGGCGGACGTCCAGGACGAATTGGG TCGCCAG 238 ***************** ** ******************************** * ****
D.par GTCGTCGCTTCCGTAAACTCTGACGACAAGATAAGTTACTACCACTGCGACGTCAGAGAT 294 D.tha GTCGTCGCTTCCGTAAACTCTGACGACAAGATAAGTTACTACCACTGCGACGTCAGAGAT 294 D.lan GTCGTCGCTTCCGTAAACTCTGACGACAAGATAAGTTACTACCACTGCGACGTCAGAGAT 294 D.gra GTCGTCGCTTCCGTAAACTCTGACGACAAGATAAGTTAC CACCACTGCGACGTCAGAGAT 294 D.fer GTCGTCGCTTCCGTAAACTCTGACGACAAGATAAGTTAC CACCACTGCGACGTCAGAGAT 300 D.pur GTCGTCGCTTCCGTAAACTCTGACGACAAGATAAGTTAC CACCACTGCGACGTCAGAGAT 300 D.mar GTCGTCGCTTCCGTAAACTCTGACGACAAGATAAGTTAC CACCACTGCGACGTGGGGAGAGAT 298 *************************************** ************* ******
D.par GAAAAACAAGTGGCGGCCACCGTCCGCTACGCGGTGGAGAAATACGGGCGCCTCGACGTC 354 D.tha GAAAAACAAGTGGCGGCCACCGTCCGCTACGCGGTGGAGAAATACGGGCGCCTCGACGTC 354 D.lan GAAAAACAAGTGGCGGCCACCGTCCGCTACGCGGTGGAGAAATACGGGCGCCTCGACAAAATC 354 D.gra GAAAAACAAGTGGCGGCCACCGTCCGCTACGCGGTGGAGAAATACGGGCGCCTCGACGTC 354 D.fer GAAAAACAAGTGG AGGCCACCGTCCGCTACGCGGTGGAGAAATACGGGCGCCTCGACGTC 360 D.pur GAAAAACAAGTGG AGGCCACCGTCCGCTACGCGGTGGAGAAATACGGGCGCCTCGACGTC 360 D.mar GAAAAACAAGTGG AGGCCACCGTCCGCTACGCGGTGGAGAAATACGGGCGCCTCGACGTC 358 ************* ******************************************* **
D.par ATGATGAGCAACGCCGGAGTCTTCGGTGCCTTGATGACGAATGTAATCGATCTCGACATG 414 D.tha ATGATGAGCAACGCCGGAGTCTTCGGTGCCTTGATGACGAATGTAATCGATCTCGACATG 414 D.lan ATG CTGAGCAACGCCGGAGTCTTCGG GGCCTTGATGACGAA CGTAATCGATCTCGACATG 414 D.gra ATGATGAGCAACGCCGGAGTCTTCGG GGCCTTGATGACGAACGTAATCGATCTCGACATG 414 D.fer ATGGTGAGCAACGCCGGAGTCTTCGG GGCCTTGATGACGA CC GTAATCGATCTCGACATG 420 D.pur ATGGTGAGCAACGCCGGAGTCTTCGG GGCCTTGATGACGA CC GTAATCGATCTCGACATG 420 D.mar ATGGTGAGCAACGCCGGAGTCTTCGG GGCCTTGATGACGA CC GTAATCGATCTCGACATG 418 *** ********************** ************* ******************
D.par GTTGACTTTGAAAATGTATTGGCGACTAACGTGCGCGGAGTTGCCAACACTATAAAGCAC 474 D.tha GTTGACTTTGAAAATGTATTGGCGACTAACGTGCGCGGAGTTGCCAACACTATAAAGCAC 474 D.lan GTTGACTTTGAAAATGTATTGGCGACTAACGTGCGCGGAGTTGCCAACACTATAAAGCAC 474 D.gra GTTGACTTTGAAAATGTATTGGCGACTAACGTGCGCGGAGTTGCCAACACTATAAAGCAC 474
162 Anlagen
D.fer GTTGACTTTGAAAATGTATTGGCGACTAACGTGCGCGG GGTTGCCAA TACTATAAAGCAC 480 D.pur GTTGACTTTGAAAATGTATTGGCGACTAACGTGCGCGG GGTTGCCAA TACTATAAAGCAC 480 D.mar GTTGACTTTGAAAATGTATTGGCGACTAACGTGCGCGG GGTTGCCAA TACTATAAAGCAC 478 ************************************** ******** ************
D.par GCGGCACGAGCCATGGTGGAGGGGAAGGTCAAGGGGTCCATCATTTGCACCGCCAGCGTG 534 D.tha GCGGCACGAGCCATGGTGGAGGGGAAGGTCAAGGGGTCCATCATTTGCACCGCCAGCGTG 534 D.lan GCGGCACGAGCCATGGTGGAGGGGAAGGTCAAGGGGTCCATCATTTGCACCGCCAGCGTG 534 D.gra GCGGCACGAGCCATGGTGGAGGGGAAGGTCAAGGGGTCCATCATTTGCACCGCCAGCGTG 534 D.fer GCGGCACG CGCCATGGTGGAGGGGAA TGTCAAGGGGTCCATCATTTGCACCGCCAGCGTG 540 D.pur GCGGCACG CGCCATGGTGGAGGGGAA TGTCAAGGGGTCCATCATTTGCACCGCCAGCGTG 540 D.mar GCGGCACG CGCCATGGTGGAGGGGAA TGTCAAGGGGTCCATCATTTGCACCGCCAGCGTG 538 ******** ***************** *********************************
D.par TCGGCGAGCCTTGGAGGCATGGGCCCGCCCGCTTACACGGCTTCCAAACACGCCGTCCTG 594 D.tha TCGGCGAGCCTTGGAGGCATGGGCCCGCCCGCTTACACGGCTTCCAAACACGCCGTCCTG 594 D.lan TCGGCGAGCCTTGGAGGCATGGGCCCGCCCGCTTACACGGCTTCCAAACACGCCGTCCTG 594 D.gra TCGGCGAGCCTTGGAGGCATGGGCCCGCCCGCTTACACGGCTTCCAAACACGCCGTCCTG 594 D.fer TCGGCGAG TCTTGGAGGCATGGGCCCGCCCGCTTACACGGCTTCCAAACACGCCGT TCTG 600 D.pur TCGGCGAG TCTTGGAGGCATGGGCCCGCCCGCTTACACGGCTTCCAAACACGCCGT TCTG 600 D.mar TCGGCGAG TCTTGGAGGCATGGGCCCGCCCGCTTACACGGCTTCCAAACACGCCGT TCTG 598 ******** *********************************************** ***
D.par GGCCTGGTCAAGGCGGCTTGCGCCGAGTTGGGGGTGCACGGGATCCGAGTCAACTCGGTG 654 D.tha GGCCT AGTCAAGG GC GCTTGCGCCGAGTTGGGGGTGCACGGGATCCGAGTCAACTCGGTG 654 D.lan GGCCT AGTCAAGG GC GCTTGCGCCGAGTTGGGGGTGCACGGGATCCGAGTCAACTCGGTG 654 D.gra GGCCTGGTCAAGGCTGCTTGCGCCGAGTTGGGGGTGCACGGGATCCGAGTCAACTCGGTG 654 D.fer GGCCTGGTCAAGGCGGCTTGCGCCGAGTTGGGGGTGCACGGGATCCGAGTCAACTCGGTG 660 D.pur GGCCTGGTCAAGGCGGCTTGCGCCGAGTTGGGGGTGCACGGGATCCGAGTCAACTCGGTG 660 D.mar GGCCTGGTCAAGGCGGCTTGCGCCGAGTTGGGGGTGCACGGGATCCGAGTCAACTCGGTG 658 ***** ******* *********************************************
D.par GCGCCGTACGGTGTGGCGACCCCGATGCCGTGCAGTGCTTACGGAATGACACCGAGTCAG 714 D.tha GCGCCGTACGGTGTGGCGACCCCGATGCCGTGCAGTGCTTACGGAATGACACCGAGTCAG 714 D.lan GCGCCGTACGGTGTGGCGACCCCGATGCCGTGCAGTGCTTACGGAATGACACCGAGTCAG 714 D.gra GCGCCGTACGGTGTGGCGACCCCGATGCCGTGCAGTGCTTACGGAATGACACCGAGTCAG 714 D.fer GCGCCGTACGGTGTGGCGACCCCGATGCCGTGCAGTGCTTACGGAATGACACCGAGTCAG 720 D.pur GCGCCGTACGGTGTGGCGACCCCGATGCCGTGCAGTGCTTACGGAATGACACCGAGTCAG 720 D.mar GCGGGGGCGTACGGTGTGGCGACCCCGATGCCGTGCAGTGCTTACGGAATGACAGGGGGGGGGAGTCAG 718 *** *********************************************** *******
D.par ATGGAGGACGCCAATAACTCCAGGGCTAACTTGAAGGGGGTGGTTTTGAAGGCTAAGCAT 774 D.tha ATGGAGGA GGCCAATAACTCCAGGGCTAACTTGAAGGGGGTGGTTTTGAAGGCTAAGCAT 774 D.lan ATGGAGGA GGCCAATAACTCCAGGGCTAACTTGAAGGGGGTGGTTTTGAAGGCTAAGCACCCC 774 D.gra ATGGAGGACGCCAATA GCTCCAGGGCTAACTTGAAGGGCCCCGTGGTTTTGAAGGCTAAGCAT 774 D.fer ATGGAGGACGCCAA CTG CTCCAGGGCTAA TTTGAAGGGGGTGGTTTTGAAGGCTAAGCAT 780 D.pur ATGGAGGACGCCAA CTG CTCCAGGGCTAA TTTGAAGGGGGTGGTTTTGAAGGCTAAGCAT 780 D.mar ATGGAGGA GGCCAATAACTCCAGGGCTAACTTGAAGGGGGTGGTTTTGAAGGCTAAGCAT 778 ******** ***** ************ ******** ********************
D.par GTGGGGGCTGAGGCGGCTCTCTTCTTGGCTTCCGATGAGTCGGCTTATGTCAGTGGGCAAAAC 834 D.tha GTAGCTGAGGCGGCTCTCTTCTTGGCTTCCGATGAGTCGGCTTATGTCAGTGGGCAAAAC 834 D.lan GTAGCTGAGGCGGCTCTCTTCTTGGCTTCCGATGAGTCGGCTTATGTCAGTGGAAAACAAAAC 834 D.gra GTAGCTGAGGCGGCTCTCTTCTTGGCTTCCGATGAGTCGGCTTATGTCAGTGGGCAAAAC 834 D.fer GTAGCTGAGGCGGCTCTCTTC CTTGCTTCCGATGAGTCGGCTTATGTCAGTGGGCAAAAC 840 D.pur GTAGCTGAGGCGGCTCTCTTC CTTGCTTCCGATGAGTCGGCTTATGTCAGTGGGCAAAAC 840 D.mar GTAGCTGAGGCGGCTCTCTTCTTGGCTTCCGATGAGTCGGCTTATGTCAGTGGGCAAAAC 838 ** ****************** * ***************************** ******
D.par TTGGCTGTCGACGGCGGCTTCACCGTCGTGCGTTAG 870 D.tha TTGGCTGTCGACGGCGGCTTCACCGTCGTGCGTTAG 870 D.lan TTGGCTGTAAAAGACGGCGGCTTCACCGTCGTGCGTTAG 870 D.gra TTGGCTGTCGACGGCGGCTTCACCGTCGTGCGTTAG 870 D.fer TTGGCTGTCGACGGCGGCTTCACCGTCGTGCGTTAG 876 D.pur TTGGCTGTCGACGGCGGCTTCACCGTCGTGCGTTAG 876 D.mar TTGGCTGTCGACGGCGGCTTCACCGTCGTGCGTTAG 874 ******** ***************************
Intron grau unterlegt; Abkürzungen siehe Anlage VII.2.1.
163 Anlagen
VII.3 Publikationsliste Paper • Herl, V., Fischer, G., Müller-Uri, F., Kreis, W., 2006. Molecular cloning and heterologous expression of progesterone 5 β-reductase from Digitalis lanata Ehrh. Phytochemistry 67, 225-231. • Herl, V., Frankenstein, J., Müller-Uri, F., Meitinger, N., Kreis, W., 2006. 5-3β- Hydroxysteroid dehydrogenase (3 β-HSD) is not associated with 5-3-ketosteroid isomerase (KSI) in recombinant 3 β-HSD from Digitalis lanata Ehrh. Plant Physiol. Biochem. (eingereicht). • Herl, V., Fischer, G., Bötsch, R., Müller-Uri, F., Kreis, W., 2006. Molecular cloning and expression of progesterone 5 β-reductase (5 β-POR) from Isoplexis canariensis . Planta Med. 72, 1163 – 1165. • Herl, V., Müller-Uri, F., Kreis, W., 2006. Molecular evolution of the genus Digitalis L. (in Vorbereitung). • Egerer-Sieber, C., Herl, V., Müller-Uri, F., Kreis, W., Muller, Y.A., 2006. Crystallization and preliminary crystallographic analysis of selenomethionine-labelled progesterone 5 β-reductase from Digitalis lanata Ehrh. Acta Cryst. F62, 186-188.
Vorträge • Herl, V., Fischer, G., Müller-Uri, F., Kreis, W., 2005. Molecular cloning and expression of recombinant progesterone 5 β-reductase from Digitalis lanata Ehrh. XVII International Botanical Congress, Vienna 2005. • Herl, V., Fischer, G., Müller-Uri, F., Kreis, W., 2005. Genes of the cardenolide biosynthesis in Digitalis species. 5. Kurt-Mothes-Doktoranden-Workshop Sekundär- stoffwechsel, IPB-Halle/MPI-Jena 2005.
Poster • Herl, V., Bradacs, G., Müller-Uri, F., Kreis, W., 2003. Differential gene expression in Digitalis lanata Ehrh. 51 st Annual Congress of the Society for Medical Plant Research, Kiel 2003. • Herl, V., Fischer, G., Müller-Uri, F., Kreis, W., 2005. Molecular cloning and expression of a recombinant 3 β-hydroxysteriod dehydrogenase from Digitalis lanata Ehrh. International Congress and 53 rd Annual Meeting of the Society for Medical Plant Research, Florence 2005.
164 Anlagen
• Frankenstein, J., Herl, V., Müller-Uri, F., Kreis, W., 2005. Substrate specificity and kinetic properties of recombinant ∆5-3β-hydroxysteroid dehydrogenase from Digitalis lanata Ehrh. International Congress and 53 rd Annual Meeting of the Society for Medical Plant Research, Florence 2005. • Frankenstein, J., Herl, V., Müller-Uri, F., Kreis, W., 2005. 3β-Hydroxysteroid dehydrogenase (3 β-HSD) from Erysimum crepidifolium Rchb. XVII International Botanical Congress, Vienna 2005. • Kreis, W., Müller-Uri, F., Herl, V., Frankenstein, J., 2005. Cloning and expression of two genes involved in cardenolide biosynthesis from Digitalis lanata. Terpnet 2005, The Phytochemical Society of Europe, Wageningen 2005. • Müller-Uri, F., Herl, V., Fischer, G., Kreis, W., 2006. Heterologous expression of progesterone 5 β-reductase (5 β-POR) from Isoplexis canariensis . International Congress and 54th Annual Meeting of the Society for Medical Plant Research, Helsinki 2006.
165
Lebenslauf Persönliche Angaben Geburtsdatum 13.11.1975 Geburtsort Nürnberg Staatsangehörigkeit deutsch Familienstand ledig Eltern Angelika Rönnau (geb. Matheis) und Leo Herl
Schulbildung / beruflicher Werdegang 09/1982 – 08/1986 Volksschule Veitsbronn (Grundschule) 09/1986 – 06/1995 Wolfgang Borchert Gymnasium in Langenzenn (Bayern); Abschluss Abitur 05/1996 – 04/2001 Pharmaziestudium an der Friedrich-Alexander-Uni- versität (FAU) Erlangen-Nürnberg; 1. Staatsexamen 04/1999 2. Staatsexamen 05/2001 05/2001 – 11/2001 Pharmaziepraktikum in der Egidien-Apotheke in Nürnberg 12/2001 – 05/2002 Pharmaziepraktikum bei Heumann Pharma GmbH in Feucht 09/2002 3. Staatsexamen; Pharmazeutische Prüfung 10/2002 Approbation als Apothekerin 09/2002 – 11/2006 Promotion am Lehrstuhl Pharmazeutische Biologie an der FAU Erlangen-Nürnberg
Berufspraxis 12/1995 – 03/1996 Praktikum bei Heumann Pharma GmbH in Feucht 08/2002 – 09/2002 Wissenschaftliche Hilfskraft am Lehrstuhl Pharmazeu- tische Biologie an der FAU Erlangen-Nürnberg Seit 09/2002 Wissenschaftliche Mitarbeiterin am Lehrstuhl Pharma- zeutische Biologie an der FAU Erlangen-Nürnberg Seit 02/2003 Nebentätigkeit als Apothekerin in der Lohhofapotheke in Herzogenaurach