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Thesis

Paramètres photosynthétiques affectant le transport d'électrons à travers le pool de plastoquinone : la densité des photosystèmes I, le contenu de chlorophylle et l'activité d'une plastoquinol-oxydase

CEPPI, Margarita Georgina

Abstract

La présente thèse a pour buts de permettre une interprétation plus précise des cinétiques de fluorescence de la Chl a (OJIP). Elle comporte deux parties principales. La première investigue l'activité et la localisation d'une oxydase du plastoquinol, une PQH2-oxydase. Dans la seconde partie de cette thèse, une expérience est menée sur des plantes de Beta vulgaris soumises à des traitements déficients en soufre et/ou magnésium, affectant spécifiquement la quantité de photosystèmes I (PSI) ainsi que le contenu de Chl. Nos résultats montrent que l'amplitude de la phase IP de la cinétique de fluorescence OJIP peut être employée comme un indicateur de la quantité de PSI dans les feuilles. Nous estimons l'effet des changements du gradient de lumière dans les feuilles suite à la perte de Chl, et montrons que ces changements n'ont pas d'impact significatif sur l'intensité d'émission de la fluorescence de la Chl a ; en particulier, les niveaux maximal et minimal de fluorescence restent inchangés.

Reference

CEPPI, Margarita Georgina. Paramètres photosynthétiques affectant le transport d'électrons à travers le pool de plastoquinone : la densité des photosystèmes I, le contenu de chlorophylle et l'activité d'une plastoquinol-oxydase. Thèse de doctorat : Univ. Genève, 2009, no. Sc. 4175

URN : urn:nbn:ch:unige-53870 DOI : 10.13097/archive-ouverte/unige:5387

Available at: http://archive-ouverte.unige.ch/unige:5387

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1 / 1 UNIVERSITÉ DE GENÈVE FACULTÉ DES SCIENCES Département de botanique et biologie végétale Professeur Reto J. Strasser Laboratoire de bioénergétique et microbiologie Dr. Gert Schansker

Paramètres photosynthétiques affectant le transport d’électrons à travers le pool de plastoquinone : la densité des photosystèmes I, le contenu de chlorophylle et l’activité d’une plastoquinol-oxydase

THÈSE

présentée à la Faculté des Sciences de l’Université de Genève pour obtenir le grade de Docteur ès sciences, mention biologie

par Margarita Georgina CEPPI de Morbio Superiore (TI)

Thèse n° 4175

Genève Repromail, Université de Genève 2010

TABLE DES MATIERES

CHAPITRE I INTRODUCTION GENERALE...... 1 I.1. Appareil photosynthétique, structure et fonctions ...... 1 I.1.a Introduction...... 1 I.1.b Structure du chloroplaste...... 2 I.1.c Composants et structure de l’appareil photosynthétique ...... 3 I.1.d Absorption de la lumière et transport d’électrons)...... 9 I.1.e Fonctions du pool de plastoquinone (PQ) dans les réactions photosynthétiques ...... 10 I.2. Introduction à la fluorescence de la chlorophylle a...... 11 I.2.a Méthodes de mesure de la fluorescence de la Chl a...... 12 I.2.b Les mesures de transmission à 820 nm comme méthode complémentaire ...... 16 I.3. Les éléments nutritifs dans la photosynthèse ...... 16 I.3.a Le magnésium ...... 17 I.3.b Le soufre...... 18 I.3.c Le fer...... 18 I.3.d Le cuivre...... 18 I.3.e Le manganèse ...... 19

CHAPITRE II VARIABILITE DE L’ACTIVITE DE L’ENZYME PQH2-OXYDASE CHEZ DES PLANTES ANGIOSPERMES...... 21 II.1. Introduction...... 21 II.2. Matériels et méthodes ...... 23 II.2.a Matériel végétal...... 23 II.2.b Mesures de la fluorescence de la Chl a...... 23 II.2.c Protocoles double pulse...... 23 II.2.c.i Critères d’adaptation à l’obscurité pour les plantes...... 24 II.2.c.ii Cinétiques d’adaptation à l’obscurité des courbes OJIP...... 24 II.2.c.iii Cycles de mesure double pulse ...... 25 II.2.c.iv Calcul du demi-temps de réoxydation du pool de PQ...... 26 II.2.d Variabilité de la cinétique de réoxydation du pool de PQ entre les espèces ...... 28 II.2.d.i Arbre phylogénétique et facteurs écophysiologiques...... 28 II.2.d.ii Variabilité de la cinétique de réoxydation du pool de PQ au sein d’une même espèce...... 29 II.2.e Équipements de mesure...... 30 II.3. Résultats ...... 33

II.3.a Sondage in situ de l’activité de la PQH2-oxydase chez des espèces

I d’Angiospermes ...... 33 II.3.a.i Facteurs écophysiologiques et phylogénétiques ...... 33 II.3.a.ii Arbre phylogénétique ...... 33 II.3.a.iii Analyse statistique ...... 43

II.3.a.iv Sondage de l’activité de la PQH2-oxydase au sein d’une même espèce...... 44 II.4. Discussion ...... 48 II.4.a Variabilité de la cinétique de réoxydation du pool de PQ : facteurs écophysiologiques ...... 48 II.4.b Cinétiques biphasiques...... 49 II.4.c Impact de la voie métabolique ...... 49 II.4.d Importance des facteurs phylogénétiques ...... 49 II.4.e Conclusions...... 50

CHAPITRE III LOCALISATION ET INDUCTION DE L’ACTIVITE DE L’ENZYME

PQH2-OXYDASE CHEZ DES PLANTES ANGIOSPERMES ...... 51 III.1. Introduction...... 51 III.2. Matériels et méthodes...... 52 III.2.a Matériel végétal...... 52 III.2.b Matériel de mesure...... 52 III.2.c Mesure de la fluorescence de la Chl a ...... 52 III.3. Résultats...... 55

III.3.a Variation des cinétiques et type de récupération à l’obscurité de VJ...... 55

III.3.b Activité de la PQH2-oxydase au sein d’une même famille...... 55

III.3.c Activité de la PQH2-oxydase en fonction de l’âge de la feuille et du stress hydrique ...... 56

III.3.d Activité de la PQH2-oxydase en fonction de l’intensité de la lumière...... 57 III.4. Discussion ...... 59 III.4.a Impact de la luminosité, de l’âge de la feuille et du stress hydrique sur l’activité

de la PQH2-oxydase...... 59

III.4.b Concentration de PTOX et cinétique de récupération de VJ...... 59

III.4.c Localisation de l’enzyme PQH2-oxydase...... 60

III.4.d Identité de la PQH2-oxydase...... 60

III.4.e Origine et rôle possibles de la PQH2-oxydase...... 61

CHAPITRE IV PHENOMENOLOGIE DE LA DEFICIENCE DE MAGNESIUM ET DE SULFATE CHEZ BETA VULGARIS...... 63 IV.1. Introduction...... 63

II IV.2. Matériels et méthodes ...... 64 IV.2.a Matériel végétal et culture en conditions hydroponiques ...... 64 IV.2.b Equipement de mesures ...... 68 IV.2.c Mesures du matériel végétal ...... 71 IV.2.d Mesures répétées pendant le temps expérimental ...... 71 IV.2.e Mesures réalisées seulement une fois pendant l’expérience ...... 71 IV.2.f Mesures de la quantité de Chl ...... 72 IV.2.g Mesures de paramètres photosynthétiques...... 73 IV.3 Résultats ...... 79

2- 2+ IV.3.a Effets physiologiques de la déficience de SO4 et de Mg sur des plantes de Beta vulgaris...... 79 IV.3.b Croissance et biomasse des plantes en traitement...... 82 IV.3.c Détermination de la quantité de Chl ...... 83 IV.3.d Paramètres photosynthétiques : Mesures simultanées de la transmission à 820 nm et de la fluorescence de la Chl a ...... 87 IV.4. Discussion...... 97 IV.4.a Quantité de Chl et biomasse...... 97 IV.4.b Mesures de la fluorescence de la Chl a et de la transmission à 820 nm...... 97 IV.4.c Taille des antennes et chaîne de transport d’électrons...... 97 IV.4.d Fonctionnement des complexes Cyt b6/f ...... 98 IV.4.e Contributions relatives de PC et P700 aux cinétiques de re-réduction ...... 98 IV.4.f Courbes de la fluorescence de la Chl a pendant 6 pulses de lumière rouge...... 99

CHAPITRE V ÉTUDE DE LA RELATION ENTRE 'VIP (=(FP-FI)/(FM-F0) ET LE CONTENU DE P700 ET PC DETERMINE PAR LA TRANSMISSION A 820 NM...... 101 V.1. Introduction...... 101 V.2. Matériels et Méthodes...... 102 V.2.a Matériel végétal et conditions de culture ...... 102 V.2.b Mesures de paramètres photosynthétiques ...... 102 V.3. Résultats ...... 105 V.3.a L’amplitude de la phase IP en fonction du temps expérimental...... 105

V.3.b La contribution relative de IP à la courbe OJIP ('VIP) en fonction du temps expérimental ...... 105 V.3.c L’amplitude ¨Imax à 820 nm en fonction du temps expérimental ...... 108 V.3.d La transmission totale à 820 nm (I) en fonction du temps expérimental...... 108

V.3.e ƅImax/I en fonction du temps expérimental...... 111

V.3.f Corrélation entre ƅImax/I et l’amplitude IP ou ƅVIP...... 111 III V.4. Discussion ...... 115 V.4.a Approximation de la quantité de PSI avec les valeurs de la transmission à 820 nm...... 115 V.4.b Amplitudes absolues et relatives ...... 115 V.4.c Le traitement traces de sulfate et le Cyt b6/f ...... 117 V.4.d Lien entre l’amplitude de la phase IP et l’amplitude maximale de re-réduction du PSI...... 117

CHAPITRE VI EFFETS DU GRADIENT DE LUMIERE DANS DES FEUILLES SUR LES MESURES DE LA FLUORESCENCE DE LA CHL A...... 119 VI.1. Introduction...... 119 VI.2. Matériels et Méthodes ...... 121 VI.2.a Matériel végétal et conditions de culture ...... 121 VI.2.b Paramètres photosynthétiques : Mesures de la fluorescence de la Chl a...... 121 VI.2.c Détermination de la quantité de Chl ...... 121 VI.3. Résultats...... 122 VI.3.a Corrélation entre Chl rel et Chl par extraction...... 122 VI.3.b Rapport Chl a/b...... 123 VI.3.c Cinétiques de la fluorescence de la Chl a...... 125

VI.3.d Fluorescence initiale (F0) et fluorescence maximale (FM) en fonction de la quantité de Chl rel ...... 126

VI.3.e Les paramètres VI et VJ en fonction de la quantité de Chl...... 127 VI.4. Discussion ...... 128

VI.4.a Fluorescence initiale (F0) et Fluorescence maximale (FM) en fonction de la quantité de Chl relative...... 128

VI.4.b Les paramètres VI et VJ en fonction de la quantité de Chl...... 128

CHAPITRE VII DISCUSSION ET CONCLUSION GENERALE ...... 133

REMERCIEMENTS ...... 141

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES...... 143

ANNEXES ...... 153

IV LISTE DES ABREVIATIONS

Chl chlorophylle Cyt cytochrome DBMIB dibromothymoquinone, 2,5-dibromo-3-méthyl-6-isopropyl-p-benzoquinone DCMU 3-(3’,4’-dichlorophényl)-1,1-dimethylurée 2- DS traitement avec environ la moitié de la dose de SO4 du contrôle F0 fluorescence initiale (~20 μs), tous les centres réactionnels du PSII ouverts Ft intensité de la fluorescence au temps t F20Ƭs intensité initiale de la fluorescence (indépendamment de l’état redox de QA) FI intensité de la fluorescence à 30 ms -2 -1 FJ intensité de la fluorescence à 2 ou 3 ms (à 3000 Ƭmol photons m s ) -2 -1 FK intensité de la fluorescence à 300 Ƭs (à 3000 Ƭmol photons m s ) FM fluorescence maximale absolue, (tous les centres réactionnels du PSII fermés) FNR ferrédoxine-NADP+-réductase FP intensité maximale de fluorescence ; FP = FM seulement lorsque tous les centres réactionnels du PSII sont fermés I820nm transmission de la lumière à 820 nm LHCI antenne collectrice d’électrons (light harvesting complex) du PSI LHCII antenne collectrice d’électrons (light harvesting complex) du PSII MV méthylviologène, 1,1’-diméthyl-4,4’-bipyridinium-dichloride OJIP courbe de la fluorescence de la chl a définie par les noms des étapes intermédiaires P680 donneur primaire d’électrons du PSII P700 donneur primaire d’électrons du PSI PC plastocyanine PQ plastoquinone PQH2 plastoquinol PSI photosystème I PSII photosystème II PTOX plastid terminal oxidase QA première quinone accepteur d’électrons du PSII QB deuxième quinone accepteur d’électrons du PSII RL lumière rouge lointaine 2+ 2- SM traitement sans Mg et avec environ la moitié de la dose de SO4 du contrôle 2- TS traitement contenant des traces de SO4 TyrZ tyrosine Z u. a. unités arbitraires V fluorescence variable relative (double normalisation entre F0 et FM) V = (Ft-F0)/(FM-F0) ¨Imax amplitude maximale de transmission à 820 nm ƅImax/I différence entre le niveau de la transmission avec tous les P700 et les PC totalement réduits et oxydés respectivement 'VIP amplitude de la phase IP de la courbe OJIP 'VIP = (FP-FI)/(FM-F0)

V VI RESUME

La présente thèse a pour buts de contribuer à améliorer la connaissance des processus constituant la chaîne de transport d’électrons et de permettre une interprétation plus précise des cinétiques de fluorescence de la Chl a (OJIP). Elle s’articule en deux parties principales. La première investigue l’activité et la localisation d’une oxydase du plastoquinol (PQH2-oxydase). La variabilité de l’activité de cette enzyme en fonction de différents facteurs écophysiologiques est d’abord estimée à l’aide d’un sondage réalisé sur 64 espèces d’Angiospermes. La cinétique de réoxydation en obscurité du pool de plastoquinone (PQ) par la PQH2-oxydase est mesurée à l’aide d’un protocole spécifique comprenant des mesures de fluorescence. Nous observons une grande variabilité des demi-temps de réoxydation du pool de PQ entre les espèces ; les valeurs extrêmes (0.6 et 170 s) divergent par un facteur de près de 300. Par contre, les valeurs varient beaucoup moins entre les plantes d’une même espèce (facteur d’environ 3). Par ailleurs, nous observons que les facteurs écophysiologiques étudiés ne paraissent pas en mesure d’expliquer la variabilité de l’activité de la PQH2-oxydase. Des critères phylogénétiques (appartenance à une famille ou espèce) semblent plutôt être à l’origine d’une partie des différences observées. Nous étudions également la probabilité que l’oxydase terminale plastidiale PTOX, récemment découverte et identifiée comme PQH2-oxydase dans la littérature, remplisse réellement ce rôle. Nous observons que des plantes de Ranunculus glacialis possédant des concentrations élevées de PTOX ne montrent pas d’activité particulièrement élevée de l’oxydation du pool de PQ. En outre, compte tenu de la localisation de PTOX dans les lamelles du stroma, loin du pool de PQ, la cinétique majoritairement monophasique et exponentielle de réoxydation du pool de PQ semble exclure la possibilité que PTOX puisse intervenir dans ce processus. Nous suggérons donc que la PQH2-oxydase pourrait être davantage similaire aux oxydases identifiées dans le lumen des cyanobactéries. Le rôle de cette oxydase pourrait être de maintenir le stroma oxydé en obscurité, ce qui aurait pour effet d’inactiver en obscurité certaines enzymes du cycle de Calvin-Benson situées dans le stroma. Dans la seconde partie de cette thèse, une expérience est menée sur des plantes de Beta vulgaris contrôle ou soumises à des traitements déficients en soufre et/ou magnésium. Ces traitements ont pour but d’affecter spécifiquement la quantité de PSI ainsi que le contenu de chlorophylle (Chl). Nous observons que tant le contenu de Chl que la biomasse diminuent chez certaines plantes suite aux traitements ; le contenu de Chl, très variable, diverge par un facteur 5 entre les plantes étudiées au terme de l’expérience, alors que la biomasse diminue surtout dans les traitements à forte déficience en soufre et en magnésium. En outre, la perte de Chl observée ne semble pas induire de changements dans l’émission et les cinétiques de fluorescence. Nous montrons que l’amplitude de la phase IP de la courbe OJIP, qui est déterminée par le flux d’électrons à travers le PSI, est directement proportionnelle à l’amplitude maximale du signal de transmission à 820 nm (reflétant la différence entre les plastocyanines et les P700 totalement oxydés et réduits, respectivement). Ces résultats permettent de conclure que l’amplitude de la phase IP peut être employée comme un indicateur de la quantité de PSI dans les feuilles. Une analyse est également menée pour estimer l’effet des changements du gradient de lumière dans les feuilles suite à la perte de Chl. Nous montrons que ces changements n’ont pas d’impact significatif sur la cinétique d’émission de la fluorescence de la Chl a; en particulier, les niveaux maximal et minimal de fluorescence restent inchangés. Il est suggéré que des mécanismes d’adaptation des chloroplastes aux changements de la luminosité perçue peuvent expliquer l’absence d’un effet de la perte de Chl sur les mesures de la fluorescence de la Chl a. VII VIII ABSTRACT

This thesis aims at improving our understanding of photosynthetic electron transport processes, enabling a better interpretation of the Chl a fluorescence emission kinetics (OJIP). The Chl a fluorescence at room temperature originates mainly in PSII and its measurement is one of the most widely used methods in photosynthesis research. This thesis is subdivided into two main parts. The first, including Chapters II and III, presents an investigation of the activity and localisation of a plastoquinol (PQH2) oxidase. A survey of PQH2-oxidase activity of 64 angiosperm species was made. The reoxidation kinetics of the reduced plastoquinone (PQ) pool in darkness was measured using a specific fluorescence-based protocol. We observed a large variability between the PQ pool reoxidation half times of the different species, with a factor of ~300 between the extreme values (0.6 to 170 s). Variations were much smaller within a given plant species with extreme values differing by a factor of ~3. A statistical analysis of the relationship between the measured activities and several ecophysiological factors was made using the test of Kruskal-Wallis. Our results indicated that the variations in the activity of the PQH2-oxidase between plant species could not be explained by the ecophysiological factors. Phylogenetic criteria seem to explain a larger part of the observed variability. We also investigated whether a recently discovered plastid terminal oxidase (PTOX) was identical to our PQH2-oxidase, as suggested by several studies. Several observations were made. In the first place, Ranunculus glacialis plants kept under conditions favouring high levels of PTOX did not show particularly high PQH2 oxidase activities. In the second place, considering the localisation of PTOX in the stroma lamellae far away from the PQ pools in the grana, the exponential and mainly monophasic kinetics of the reoxidation of the PQ pool do not agree with the involvement of PTOX in this process. We thus suggest that the enzyme studied is not identical to PTOX; it may be more similar to oxidases found in the lumen of cyanobacteria. We propose that its function may be to maintain the stroma in an oxidised state in darkness, which is important in order to keep several enzymes of the Calvin-Benson cycle in the inactive state in darkness. In the second part of this thesis, an experiment was set up with Beta vulgaris plants subjected to sulphur and/or magnesium deficiency. Such treatments were aimed at reducing PSI and chlorophyll (Chl) content in a specific way. We observed that the Chl content as well as biomass decreased in response to the sulphate and magnesium deficiency. At the end of the treatment Chl content differed by a factor 5 between the treatments. Chlorophyll loss had very little effect on the fluorescence intensity measured. We further showed that the amplitude of the IP phase of the OJIP transient, the phase that depends on the electron flow through PSI, is directly proportional to the maximum amplitude of the 820 nm transmission signal. This parameter is a measure for the plastocyanin and P700 content of the leaf. This result allowed us to conclude that changes in the amplitude of the IP-phase may be used as a proxy for changes in the PSI content. A further analysis was performed to estimate the effect of changes in the light gradient within the leaf induced by Chl loss. The measurements showed that Chl-loss had nearly no impact on the fluorescence intensity. The maximum and minimum fluorescence levels remained unchanged during the experiment. It is suggested that adaptation to changing light conditions inside the leaf may explain this lack of effect.

IX X CHAPITRE I

INTRODUCTION GÉNÉRALE

I.1. APPAREIL PHOTOSYNTHETIQUE, STRUCTURE ET FONCTIONS

I.1.a Introduction La photosynthèse est le processus biologique caractéristique des plantes supérieures, des algues et de quelques bactéries, qui transforme l’énergie lumineuse du soleil en énergie chimique (ATP, NADPH, glucides, lipides). Grâce à leur appareil photosynthétique, les plantes captent l’énergie lumineuse et forment des molécules organiques à partir de dioxyde de carbone (CO2) et d’eau (H2O), et les emmagasinent ensuite sous forme de glucides (C6H12O6) et d’autres molécules organiques telles que les lipides et les protéines, tout en libérant de l’oxygène (O2) et de l’eau vers l’atmosphère. Ce processus peut être résumé par la réaction suivante (van Niel 1931, Whitmarsh et Govindjee 1999).

Énergie Dissipation d'énergie 6 CO2 + 12 H2O + C6H12O6 + 6O2 + 6 H2O + lumineuse sous forme de fluorescence et de chaleur On peut dire que la photosynthèse est un processus qui nourrit directement ou indirectement presque tous les êtres vivants à partir des produits organiques qui en résul- tent. Les réactions chimiques complexes liées à la photosynthèse ont lieu dans les membranes des thylakoïdes (situées à l’intérieur des chloroplastes, voir Fig. I-1), qui contiennent des molécules de chlorophylle (pigment qui donne la couleur verte aux plantes) ainsi que de nombreux complexes protéiques nécessaires pour capter l’énergie lumineuse, la transformer et la transporter dans le but de produire des molécules organiques. Dans l’espace situé autour de ces membranes, le stroma, a ensuite lieu la fixation de cette éner- gie sous forme de glucides par l’intermédiaire du cycle de Calvin. La photosynthèse comprend deux phases distinctes, l’une nécessitant de l’énergie lumineuse et l’autre non. La phase dépendante de la lumière (processus principalement photochimique de la photosynthèse), qui a lieu dans la membrane thylakoïdienne, permet de convertir l’énergie lumineuse en énergie chimique (ATP et NADPH). La deuxième phase, indépendante de la lumière, a lieu dans le stroma et comprend le cycle de Calvin- Benson, durant lequel l’énergie chimique générée durant la phase lumineuse et le CO2 sont assemblés par une série complexe de réactions pour former des glucides.

1 I.1.b Structure du chloroplaste Le chloroplaste (Fig. I-1) est une organelle en forme de disque aplati de 2 à 10 μm de diamètre, qui contient l’appareil photosynthétique où a lieu la photosynthèse. Toutes les parties vertes des plantes contiennent des chloroplastes, spécialement les feuilles. Ces organelles sont spécialement abondantes dans les cellules du mésophylle (Fig. I-2), le tissu interne de la feuille. La structure et l’origine du chloroplaste a été largement étudiée (Malkin et al. 2000, Garab et al. 2002, Shimoni et al. 2005). Ceux-ci sont d’habitude dispo- sés avec leur plus grande surface parallèle aux parois cellulaires, et sont capables de se réorienter dans la cellule sous l’influence de la lumière. L’enveloppe qui entoure le chloroplaste se compose de deux membranes séparées par un espace intermembranaire étroit (Staehelin 1975, Mustardy et Garab 2003). La structure interne du chloroplaste est complexe (Mustardy et Garab 2003, Dekker et Boe- kema 2005, Shimoni et al. 2005). A l’intérieur du chloroplaste se trouve un espace rempli d’un liquide dense, le stroma (Laetsch et Stetler 1965), où baigne un troisième comparti- ment qui possède sa propre membrane, le thylakoïde, organisé en sacs membraneux apla- tis. Les thylakoïdes contiennent un espace interne appelé lumen qui renferme une solution plus riche en protéines que le stroma (Kieselbach et al. 1999, Kramer et al. 1999) et qui joue un rôle important dans la formation d’un gradient de protons. Les thylakoïdes forment un système interconnecté unique à l’intérieur du chloroplaste, et comprennent deux types de structures : les grana (pluriel de granum), formés d’empilements de thyla- koïdes en forme de disques ressemblant à une pile de pièces de monnaie, et les lamelles du stroma, qui relient les grana entre eux (Alberstsson 2001, Mustardy et Garab 2003, Mustardy et al. 2008).

2 Fig. I-1. Section transversale d’une Feuille feuille. Les chloroplastes sont localisés dans le mésophylle (Fig. d’après Hopkins, 1999).

Parenchyme palissadique

Mésophylle Parenchyme spongieux

Fig. I-2. Le chloroplaste des plantes et ses composants de base (Nelson et Ben-Shem, 2004).

I.1.c Composants et structure de l’appareil photosynthétique L’appareil photosynthétique comprend une série de composants protéiques (Dekker et Boekema 2005) constituant une chaîne de transport d’électrons (Figs. I-3 et I-5) dans les membranes thylakoïdiennes. Les principaux composants sont le photosystème II (PSII), le cytochrome (Cyt) b6/f, le photosystème I (PSI) et l’ATP synthétase. Ces complexes protéiques sont reliés par les composants mobiles que sont le pool de plastoquinones (PQ), la plastocyanine (PC) et la ferrédoxine (Fd).

3 Fig. I-3. Membrane thylakoïdienne des chloroplastes. Elle contient les complexes pro- téiques PSII, Cyt b6/f, PSI et ATP synthétase et les composants mobiles : PC et pool de PQ. Les réactions photochimiques de la photosynthèse prennent place dans la membrane thyla- coïdale. Schéma basé sur la thèse de van Voorthuysen (1997).

Structure du PSII Le PSII est le premier complexe protéique de la chaîne de transport d’électrons. Il comprend un système d’antennes collectrices de lumière et un centre réactionnel. Les complexes du PSII et leurs antennes collectrices de lumière (voir Fig. I-4) se situent en majorité dans les grana (Andersson et Anderson 1980, Danielson et al. 2006). Les antennes collectrices sont constituées de chaînes de polypeptides contenant des centaines de molécules de pigments (de la chlorophylle a et b ainsi que des caroténoïdes). Le système d’antennes comprend une antenne interne (contenant des Chl a), proche du centre réactionnel, et un système d’antennes périphériques (contenant des Chl a et b ; Jans- son 1994). L’antenne interne possède deux sous-unités, CP43 (encodée par le gène PsbC) et CP47 (encodée par le gène PsbB) ; le système périphérique (LHCII) en possède plusieurs (Jansson 1994, Dekker et Boekema 2005). Le centre réactionnel, de structure dimérique (Ferreira et al. 2004, Loll et al. 2005), est formé de deux sous-unités protéiques, D1 (PsbA) et D2 (PsbD). Celles-ci renferment quatre molécules de Chl dans leur centre, les molécules de Chl P1 à P4 ; elles constituent le donneur primaire d’électrons du PSII, le P680, et agissent donc dans la réaction photochimique initiant le transport des électrons. Le centre réactionnel du PSII, nommé P680,

4 possède une absorption maximale de la lumière à une longueur d'onde de 680 nm (Go- vindjee et Coleman 1990). Le côté donneur du PSII comprend trois groupes de composants principaux. Deux tyrosines, TyrZ (ou YZ) et TyrD (YD), sont situées respectivement dans les protéines D1 et D2 ; un cluster de manganèse avec un ion Ca2+ et un ion Cl- sont liés à la protéine D1 ; enfin, trois protéines séparent le cluster de manganèse du lumen. Le cluster de manga- - 2+ nèse, avec ses cofacteurs Cl et Ca et la TyrZ, est souvent nommé complexe d’oxydation de l’eau. Le coté accepteur comprend deux phéophytines (Pheo) qui sont liées aux protéines D1 et D2, l’accepteur primaire du PSII, la quinone QA, qui est liée à la protéine D2, et l’accepteur secondaire, la quinone QB qui est liée à la protéine D1. Finalement, le PSII comprend encore un Cyt b559, une hémoprotéine à deux sous- unités (encodées par les gènes PsbE et PsbF) et de nombreuses autres sous-unités (enco- dées par les gènes PsbH à PsbY).

Fig. I-4. Photosystème II. L’énergie capturée par l’antenne se déplace en direction d’une paire de chlorophylles. Cette paire est appelée P680 (ou pigment 680) parce qu’elle possède un maximum d’absorption de la lumière à 680 nm. Source : Dr. Jon Nield, http://photosynthesis.sbcs.qmul.ac.uk/nield/downloads.html.

5 Structure du complexe Cyt b6/f Le Cyt b6/f (Fig. I-5) est un complexe de protéines de la membrane thylakoïdienne. Il participe au transfert d’électrons entre les photosystèmes I et II et contribue à la formation d’un gradient de protons à travers la membrane. Il comprend essentiellement quatre sous-unités : les Cyt b6 et f, la protéine fer-soufre de Rieske, et la sous-unité IV. Le Cyt b6 comporte deux groupes hème, l’un à potentiel bas situé du côté du lumen, l’autre à haut potentiel situé côté stroma. Le Cyt f possède lui un groupe hème comme composant redox actif (Stroebel et al. (2003).

Structure du PSI Le PSI est le deuxième photosystème (Fig. I-5) intervenant dans les réactions lumineuses photosynthétiques chez les plantes. Comme le PSII, il comprend un système d’antennes et un centre réactionnel. L’antenne périphérique (LHCI) est constituée des sous-unités Lhca1 à 3, qui entourent le noyau du PSI (Jansson 1994). Comme pour le PSII, le centre réactionnel du PSI est de structure dimérique, comportant les sous-unités protéiques PsaA et PsaB. Le donneur primaire d’électrons, le P700, est situé entre ces deux protéines ; il s’agit d’une paire spéciale de molécules de Chl possédant un maximum d’absorption à 700 nm. L’accepteur primaire est probablement une molécule de Chl a, A0 ; les accepteurs suivants sont A1 (une phylloquinone), trois protéines fer-soufre (FX, FB, FA) et la ferrédoxine (Fd). Les trois premiers sont rattachés à la sous-unité PsaA, tandis que FA et FB sont liés à PsaC, une sous-unité externe du PSI. La protéine PsaD constitue le point de rattachement de la Fd du côté du stroma. La plastocyanine (PC), un transporteur mobile et donneur d’électrons du P700, se rattache à la protéine PsaF (Ke 2001, Jordan et al. 2001).

Structure de l’ATP synthétase L’ATP synthétase (Fig. I-5) est un complexe protéique enzymatique constitué des deux sous-unités CF0 et CF1. La première est située dans la membrane thylakoïdienne, y formant un canal de protons ; la seconde est située sur la membrane, dans le stroma. CF1 comprend plusieurs sous-unités protéiques qui contiennent les sites de catalyse pour la synthèse de l’ATP (Abrahams et al. 1994).

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Fig. I-5. Modèle schématique de la chaîne de transport d’électrons photosynthétique, comprenant une représentation de l’organisation et de la structure des complexes protéiques participant au transport d’électrons et de protons à travers la membrane thylakoïdienne des végétaux. Source : Dr. Jon Nield, http://www.photosynthesis.sbcs.qmul.ac.uk/nield/downloads.html. Schéma basé entre autres sur les travaux de Ferreira et al. (2004, PSII), Liu et al. (2004, LCHII), Stroebel et al. (2003, Cyt b6/f), Jordan et al. (2001, PSI) et Amunts et al. (2007, LHCI-PSI). Composants mobiles de la chaîne de transport d’électrons photosynthétique Les composants mobiles intervenant dans les réactions lumineuses de la photosynthèse sont la PQ, la PC et la Fd (Fig. I-5). Ils relient entre eux le PSII, le Cyt b6/f, le PSI et l’enzyme Fd-NADP+-réductase. Les molécules de PQ sont situées entre le PSII et le complexe du Cyt b6/f. Elles constituent un « pool » de transporteurs mobiles d’électrons, avec 4 à 6 molécules par centre réactionnel du PSII (Joliot et al. 1992, Kirchhoff et al. 2000). Dans leur état oxydé, les molécules de PQ acceptent deux électrons et deux protons du PSII, formant des mo- lécules de plastoquinol (PQH2). Un pool de PQ est partagé par plusieurs PSII (voir p. ex. Heber et al. 1988). La PC est une protéine contenant du cuivre, qui transporte les électrons du Cyt f au PSI. On compte environ 0.5 à 5 molécules de PC par centre réactionnel du PSI (Klug- hammer et al. 1991, Schöttler et al. 2004). Enfin, la Fd est une protéine fer-soufre située du côté accepteur du PSI, qui prend un électron aux clusters fer-soufre du PSI et qui peut ensuite le transmettre à l’enzyme + Fd-NADPP -réductase (Ke 2001).

8 I.1.d Absorption de la lumière et transport d’électrons Les systèmes d’antennes des photosystèmes possèdent la faculté d’absorber l’énergie lumineuse du spectre visible (400 à 700 nm). L’absorption de la lumière, en ~1 fs, induit le passage de l’état énergétique fondamental (S0) à un état excité (S1, S2, S3, etc.). Les molé- cules peuvent descendre au niveau d’excitation S1 en libérant de l’énergie sous forme de chaleur. Par ailleurs, chaque niveau d’excitation comprend plusieurs sous-niveaux vibra- tionnels. Les molécules peuvent revenir au niveau S0 (en général à partir du sous-niveau S1 le plus bas) en émettant de la chaleur ou de la lumière. Ce dernier processus est nom- mé fluorescence. La lumière de fluorescence est émise à des longueurs d’onde supérieures à celles d’absorption en raison de la dé-excitation partielle des électrons (émission de chaleur). L’énergie d’excitation absorbée par une molécule de Chl d’une antenne collectrice a de fortes chances d’être ensuite transférée par résonance à une autre molécule de Chl voisine. Les systèmes d’antennes desservent les centres réactionnels des photosystèmes, où surviennent des séparations de charges induites par l’énergie d’excitation transmise par les antennes. Les séparations de charges étant réversibles, l’énergie d’excitation peut revenir à l’antenne et être réémise sous forme de chaleur ou de fluorescence (Schatz et al. 1988). Lors de la séparation de charges dans le PSII, c'est-à-dire lors de la réaction photochimique initiant le transport des électrons entre le PSII et le PSI (Dekker et al. 2000), un électron est transmis du P680 à la Pheo (molécule de chlorophylle sans Mg). Dans le cas du PSI, l’électron est transmis au P700, où se réalise la séparation de charge vers l’accepteur primaire, A0. Ces réactions durent quelques picosecondes. Les étapes suivantes du transfert d’électrons mènent à des niveaux énergétiques toujours plus bas, rédui- sant graduellement la probabilité d’une recombinaison de charges. Le cluster de manganèse, qui se trouve du côté lumen du PSII, fonctionne comme donneur d’électrons du P680 et passe par 5 niveaux redox pendant son cycle catalytique. Le passage des états (« states ») S0 à S4, correspondant à la perte de quatre électrons, il est induit par les réactions photochimiques (oxydation du cluster de manganèse par la Tyr + Z ). Le niveau S4 une fois atteint, le complexe d’oxydation de l’eau revient au niveau S0 en prélevant quatre électrons sur deux molécules d’eau, libérant une molécule d’O2 et quatre protons dans le lumen. Ces réactions interviennent en 50 à 1500 μs. Le P680+ est re- réduit par la TyrZ avec une constante de temps ƴ de 50 ns (pour les états S0 et S1) et 250 + ns (pour les états S2 et S3) ; la TyrZ est à son tour réduite par le cluster de manganèse avec des valeurs ƴ de 30 μs (S0 à S1), 100 μs (S1 à S2), 350 μs (S2 à S3) et 1000 μs (S3 à S0 ; Britt 1995). La source finale d’électrons est l’eau. Le complexe d’oxydation de l’eau (OEC) possède cinq états d’oxydation (S0 à S4). Pour une référence sur le cluster de Mn, voir Goussias et al. (2002). Après la séparation de charges dans le PSII, les électrons sont transmis au PSI à travers une série de réactions redox. De la Pheo, les électrons sont transmis à QA. QB 2- peut ensuite accepter deux électrons de QA ; une fois réduit, QB compense sa charge négative en prélevant deux protons du stroma et devient mobile. Les molécules de PQH2 9 (QBH2) diffusent vers le complexe du Cyt b6/f, où les électrons au Cyt f. La réoxydation de la PQ libère deux protons dans le lumen. La théorie du cycle Q englobe une série de réactions liées au transport photosyn- thétique d’électrons, visant à augmenter le nombre de protons transférés du stroma vers le lumen par les molécules de PQ. Selon cette théorie (Hope 2000, Allen 2004, Crofts 2004, Osyczka et al. 2005, et Fig. I-5), seul l’un des deux électrons cédés par le PQH2 vont à la protéine de Rieske, tandis que l’autre est transmis d’abord au hème à potentiel bas du Cyt b6, puis au hème à haut potentiel. Après réoxydation d’une seconde molécule de PQH2, les deux hèmes sont réduits. Une molécule de PQ est alors réduite avec deux électrons sur le côté stromal du Cyt b6/f. La PQ2- neutralise ses charges avec deux protons du stroma, puis diffuse vers le côté luménal du Cyt b6/f, où la molécule sera réoxy- dée en cédant ses deux protons au lumen. Grâce à ce processus, l’efficacité du transfert transmembranaire de protons par électron transporté par la chaîne de transport d’électrons est augmentée. Le transfert d’électrons par le pool de PQ contribue donc à la formation du gradient de protons transmembranaire : pour chaque électron transféré, un proton est trans- porté à travers la membrane. La réoxydation de PQH2 par le Cyt b6/f est considérée comme l’étape la plus lente de toute la série de réactions photochimiques (Stiehl et Witt 1969, Dietz et al. 1984, Heber et al. 1988). Les électrons passent ensuite du Cyt b6/f à la PC en 50 à 100 μs, puis à P700+ en 20 μs (molécule de PC liée au P700) ou 200 μs (migration incluse ; Haehnel et al. 1980, 1989, Drepper et al. 1996). Après A0, les étapes suivantes du transfert d’électrons sont A1 (transfert en 40 à 200 ps), plusieurs clusters fer-soufre (15-500 ns), Fd (0.5-20 μs), l’enzyme FNR, et finalement NADP+ (Ke 2001, Fig. I-5). Il existe également un autre chemin de transport d’électrons, appelé transport cyclique (par opposition au mode décrit ci-dessus, appelé transport linéaire). Dans ce schéma, les électrons provenant du PSI passent de la Fd ou du NADPH à la Fd-quinone oxydo- réductase (enzyme hypothétique) ou à la NAD(P)H déshydrogénase, enzymes probablement liées au Cyt b6/f. Ces enzymes ont la capacité de réduire la PQ, dont les électrons reviennent au P700 du PSI. Le transport cyclique d’électrons induit le passage de protons du stroma au lumen, renforçant ainsi le gradient transmembranaire de protons. L’énergie chimique générée par la photosynthèse est emmagasinée sous forme de molécules d’ATP et de NADPH qui fournissent l’énergie nécessaire à l’assimilation de CO2 dans le cycle de Calvin-Benson (Heber et al. 1986, Foyer et al. 1992). L’ATP est gé- nérée grâce au gradient électrochimique de protons à travers la membrane thylakoïdienne par l’enzyme ATP synthétase, à partir de phosphate inorganique et d’ADP.

I.1.e Fonctions du pool de plastoquinone (PQ) dans les réactions photosynthé- tiques Le pool de PQ se trouve à l’interface de plusieurs chaînes de réactions métaboliques chez les végétaux, dont la structure et le fonctionnement ne sont que partiellement connus. En plus de leur rôle dans les chaînes de transport d’électrons de la photosynthèse (transport linéaire et cyclique, voir section I.1.d), de nombreuses études suggèrent que les molécules 10 de PQ participeraient également au processus nommé cycle Q (Hope 2000, Allen 2004, Crofts 2004, Osyczka et al. 2005 ; section I.1.d) ainsi que, vraisemblablement, à une chaine de réactions de type respiratoire, généralement connue sous le nom de chlororespiration (Bennoun 1982). Des résultats expérimentaux indiquent l’existence d’un chemin alternatif de transport d’électrons, auquel participeraient les molécules de PQ. Suite à des observations indiquant l’existence de variations de l’état redox du pool de PQ dans l’obscurité, Bennoun (1982) a postulé l’existence d’une chaine respiratoire allant du NAD(P)H à l’oxygène et passant par le pool de PQ. Selon la première version de ce modèle, les molécules de PQ seraient réduites par une NAD(P)H déshydrogénase, puis réoxydées par l’oxygène molé- culaire à l’aide d’une oxydase. L’oxydation en conditions d’obscurité des molécules de plastoquinol (PQH2) a été observée tant chez des végétaux unicellulaires (algues vertes) que chez des végétaux supé- rieurs. Les cinétiques de réoxydation en obscurité sont toutefois de durée variable, et gé- néralement plus rapides chez les algues vertes que chez les plantes supérieures (Bennoun 2001). Compte tenu des différences observées dans les cinétiques, il n’est pour l’instant pas certain que les enzymes impliquées dans la réduction et la réoxydation de la PQ soient les mêmes chez les végétaux primitifs et supérieurs. Par ailleurs, des expériences réalisées sur Arabidopsis thaliana ont mené à penser que la chlororespiration pourrait être liée à la biosynthèse de caroténoïdes (Carol et al. 1999, Wu et al. 1999, Carol et Kuntz 2001). La réduction de la PQ serait couplée à une étape de désaturation dans la synthèse de ces pigments. Dans l’obscurité, quatre enzymes du cycle de Calvin-Benson – fructose-1,6- biphosphatase, sédoheptulose-1,7-biphosphatase, phosphoribulokinase et glycéraldéhyde- 3-phosphate déshydrogénase – sont inactives car leurs cystéines forment des ponts disulfures entre les groupements thiol (Scheibe 1990, Martin et al. 2000). En présence de lu- mière, les enzymes du cycle de Calvin-Benson sont activées en raison de l’état réduit de la thiorédoxine dans le stroma, qui induit l’oxydation (donc la rupture) des ponts disulfures des cystéines des enzymes. L’activité du cycle de Calvin-Benson est continuellement ajus- tée en fonction de la luminosité par une continuelle oxydation et réduction de la thioré- doxine (Buchanan 1991).

I.2. INTRODUCTION A LA FLUORESCENCE DE LA CHLOROPHYLLE A

La photosynthèse est l’un des processus biochimiques les plus importants pour les végé- taux et pour le développement de la vie sur terre en général. La compréhension de son fonctionnement fournit donc des indications précieuses sur les activités métaboliques essentielles au développement des végétaux photosynthétiques. L’activité photosynthéti- que constitue donc une mesure indirecte de l’état de santé général des plantes. La mesure de la fluorescence de la Chl a est l’une des méthodes les plus répandues pour suivre in vivo l’activité photosynthétique de tissus végétaux. Cette méthode a pour avantage d’être rapide, peu coûteuse, précise, et surtout non invasive ; elle peut être facilement appliquée à tout échantillon photosynthétique, sans nécessiter de préparations 11 complexes. Les signaux de fluorescence chlorophyllienne étant sensibles à de très nombreux facteurs, ils peuvent fournir des informations sur de nombreux processus photo- synthétiques, mais leur interprétation n’est pas toujours aisée.

I.2.a Méthodes de mesure de la fluorescence de la Chl a

Induction expérimentale de fluorescence Expérimentalement, la fluorescence chlorophyllienne peut être générée avec toute source de lumière dont la longueur d’onde est susceptible de stimuler les antennes des photosys- tèmes (lumière actinique). Cette lumière est à la fois inductrice de photosynthèse et de fluorescence. La fraction de l’énergie lumineuse réémise sous forme de fluorescence (donc non convertie en énergie chimique ni dissipée sous forme de chaleur) est variable et dépend de l’état redox des composants de la chaîne de transport d’électrons. La fluorescence mesurée expérimentalement à température ambiante provient essentiellement du PSII. Le signal de fluorescence du PSI, beaucoup plus faible, est presque indépendant de l’état redox de ses cofacteurs (Briantais et al. 1986, Byrdin et al. 2000). Lorsque les accepteurs primaires du PSII, les quinones QA, sont oxydées ou réduites, on parle de centres réactionnels ouverts ou fermés, respectivement (Duysens et Sweers 1963). Quand les molécules de QA sont majoritairement oxydées (centres réactionnels ouverts), seulement 2% environ de la lumière absorbée est réémise au travers de la fluorescence (Trissl et al. 1993). En revanche, lorsque les molécules de QA sont majoritairement réduites (centres réactionnels fermés), environ 10% de la lumière absorbée est ré- émise sous forme de fluorescence. Afin de garantir l’ouverture des centres réactionnels avant une mesure de fluorescence, une adaptation à l’obscurité de l’échantillon photosyn- thétique durant quelques minutes est nécessaire.

Signaux de fluorescence La fluorescence de la Chl a est mesurée simultanément au pulse de lumière actinique. En général, on emploie un pulse de lumière rouge d’une seconde, avec un pic d’intensité autour de 650 nm. La fluorescence émise par l’échantillon possède une longueur d’onde plus grande (cf. section I.1.d), de sorte que le signal de fluorescence peut être distingué de la source de lumière actinique à l’aide d’un filtre optique. Les mesures sont généralement effectuées sur des feuilles adaptées à l’obscurité et durent approximativement une seconde. Les signaux de fluorescence d’échantillons végétaux adaptés à l’obscurité possèdent une forme caractéristique (voir Fig. I-6). Cette forme est indicatrice de la cinétique des processus biochimiques intervenant durant un pulse de lumière actinique. Pendant l’illumination, les composants de la chaîne de transport d’électrons, initialement oxydés suite à l’adaptation à l’obscurité, sont progressivement réduits. La réduction de la quinone QA, du côté accepteur du PSII, au fil des séparations de charge dans les centres réaction- nels des PSII entraîne la fermeture de ces derniers. En conséquence, une fraction plus importante de l’énergie lumineuse reçue est restituée sous forme de fluorescence ou de

12 chaleur, ce qui implique une hausse du rendement de fluorescence. Cette évolution s’observe dans les signaux de fluorescence mesurés. Durant l’illumination continue, les valeurs de fluorescence montent rapidement du rendement minimal F0 ou O (état ouvert) jusqu’au niveau maximal FP ou P (pic). A cette phase ascendante succède une rapide diminution de la fluorescence jusqu’au niveau stationnaire final S. Lorsqu’une feuille adaptée à l’obscurité est soumise à une lumière dite saturante -2 -1 (>300 μmol photons m s ), le niveau FP correspond à un rendement maximal absolu -2 -1 appelé FM. Si l’illumination est forte (>1000 μmol photons m s ) et la résolution temporelle des mesures suffisamment élevée, deux étapes intermédiaires peuvent être détectées dans le signal de fluorescence. En utilisant une intensité de lumière saturante standard (3000 μmol photons m-2 s-1), l’étape J intervient vers 2 ms et l’étape I autour de 30 ms. On observe même parfois un point K situé entre O et J (autour de 300 Ƭs), plus pronon- cé lors d’un stress thermique (Srivastava et al. 1997). En tenant compte des trois premiè- res étapes (la phase rapide de l’induction de fluorescence), on obtient une courbe de fluorescence nommée courbe OJIP d’après Strasser et Govindjee (1991) (Fig I-6). Cette courbe est généralement représentée sur une échelle de temps logarithmique, afin de permettre la visualisation des trois étapes sur un seul graphique. La courbe OJIP (Figs. I-6 et I-7) contient trois phases distinctes : OJ, JI, et IP, qui ont rapport à trois processus différents. OJ (voir flèche et cercles ovales rouges) est lié à la réduction du côté accepteur du PSII ; JI (voir flèche et cercles ovales verts) représente la réduction du pool de PQ ; enfin, IP (voir flèche et cercles ovales bleus) représente la réduction du coté accepteur d’électrons du PSI (Schreiber et al. 1989, Schansker et al. 2005). L’étape J reflète la limitation posée par l’échange de PQH2 pour une molécule de PQ oxydée au site QB et l’étape I correspond à la limitation posée par la réoxydation du PQH2 par le complexe de Cyt b6/f (Schansker et al. 2005). Par leur sensibilité à l’état redox des composants de la chaîne de transport d’électrons, les mesures de fluorescence permettent de suivre de manière indirecte et d’interpréter de nombreux processus ayant lieu durant le transport d’électrons. Toutes les possibilités d’investigation à l’aide de mesures de fluorescence n’ont sans doute pas encore été exploitées. L’état actuel des connaissances et les hypothèses concernant l’interprétation des valeurs d’émission de la fluorescence sont résumés dans la Fig. I-7 (basée sur Schansker et al. 2005).

13 3000 3000 P I P J

ts) 2000

2000 1000 O (relative units)

0 0,01 0,1 1 10 100 1000 TiTempsme (ms) (s) 1000

Fluorescence S T Fluorescence (unités arbitraires) Fluoresence (relative uni Fluoresence (relative O 0 0 50 100 150 200 250 TimeTemps (s) Fig. I-6. La courbe intégrale de la fluorescence de la Chl a, tracée sur une échelle li- néaire de temps, montre deux cinétiques de fluorescence (Kautsky) : une augmentation rapide (OP) suivie d’une diminution de l'émission de fluorescence conduisant à l’état S. La concurrence entre la fluorescence et la photochimie dans le PSII est à l'origine de la fluorescence variable. Dans l'insertion, la courbe rapide de fluorescence de la Chl a enregistrée avec le fluorimètre Plant Efficiency Analyser (Hansatech Instruments Ltd, UK) avec une résolu- tion temporelle de 10 μs est tracée sur une échelle de temps logarithmique. Elle augmente du point F0 (50 μs) au point FP=FM (à tFmax) et indique les étapes d'intermédiaires J (2 ms) et I (30 ms) entre ces deux extrémités (d’après Hermans 2004).

14 Enzyme inactive après adaptation à l’obscurité : FNR

i 15

Phases : OJ = réduction de QA, côté accepteur du PSII JI = réduction du pool de PQ IP = réduction de Fd, côté accepteur du PSI

Etapes : J = échange d’une molécule de PQ réduite avec une molécule oxydée + I = réoxydation de PQH2 par Cyt b6/f P = ferrédoxine-NADP+-reductase (FNR) inactive

Fig. I-7. La réduction de la chaîne de transport d’électrons (en ~200 ms) représentée par la courbe OJIP. Séminaire de Gert Schansker, 2006 I.2.b Les mesures de transmission à 820 nm comme méthode complémentaire Il existe d’autres méthodes que les mesures de fluorescence de la Chl a pour estimer l’état redox des composants de la chaîne de transport d’électrons. La transmission à 820 nm constitue une méthode complémentaire permettant de suivre de manière ciblée les changements de l’état redox dans le PSI. Plus précisément, cette technique est sensible à l’état redox du P700, le centre réactionnel du PSI, de la PC et de la Fd (Klughammer et Schrei- ber 1991). A l’aide d’instruments de mesure appropriés, il est possible de mesurer simultané- ment la fluorescence et la transmission (cf. section IV.2.g). La lumière à 820 nm n’étant pas actinique, les mesures de fluorescence ne sont pas perturbées. Ces mesures parallèles permettent de cerner spécifiquement les effets des processus de transfert d’électrons au travers du PSI sur l’intensité de fluorescence (Schansker et al. 2005, 2006, 2008). Lorsque le P700 et la PC s’oxydent, une augmentation de l’absorption de la lumière autour de 800-850 nm se produit dans la feuille, ce qui induit une baisse de la transmission dans ce domaine du spectre lumineux (Klughammer et Schreiber 1991) Au contraire, en cas de réduction de ces deux complexes, l’inverse se produit. Ainsi, il est possible de suivre avec précision les changements de l’état redox du P700 et de la PC au cours d’un pulse de lumière ou d’une période d’obscurité. Il a été démontré que dans des feuilles de pois (Pisum sativum), la PC et le P700 contribuent à parts environ égales au signal de transmission (Schansker et al. 2003). La Fd y contribue également, mais de manière très marginale (< 5% du signal).

I.3. LES ELEMENTS NUTRITIFS DANS LA PHOTOSYNTHESE

Dans cette thèse, plusieurs expériences avec des carences en éléments nutritifs essentiels ont été menées. Ces expériences ont eu pour but de modifier de manière ciblée certaines fonctions liées à la photosynthèse. En effet, certains éléments nutritifs jouent un rôle clé dans des processus photosynthétiques particuliers. Les éléments nutritifs requis pour assurer la croissance et le développement des plantes sont considérés comme étant essentiels. Le caractère essentiel est principalement fondé sur deux critères formulés par Epstein (1972). Selon lui, un élément est dit essentiel si (a) en son absence la plante est incapable d’accomplir son cycle de développement complet ou (b) cet élément fait partie d’un constituant ou d’un métabolite essentiel. Selon le deuxième critère, un élément tel que le magnésium sera dit essentiel parce qu’il est un facteur indispensable à l’accomplissement de la photosynthèse. Sur la base de ces critères, il est généralement admis que 17 éléments sont essentiels pour la croissance de toutes les plantes supérieures. Chaque élément joue un rôle dans une structure donnée ou dans une fonction spé- cifique ; l’absence d’un élément essentiel se manifeste par l’apparition de symptômes biochimiques ou morphologiques liés à cette carence. Dans certains cas, les éléments de carence reflèteront nettement la fonction de l’élément. Un exemple est le jaunissement (dé-

16 nommé chlorose) dû à l’absence de magnésium (Marschner et Cakmak 1989, Godde et Dannehl 1994). La chlorose résulte d’une sensitivité plus élevée à la photoinhibition induite par l’absence de magnésium (Marschner et Cakmak 1989, Godde et Dannehl 1994, Hefer 1994). Les symptômes de carence dépendent en partie de la mobilité de l’élément dans la plante. Lorsque, dans une plante, un élément est mobilisé et exporté vers les jeunes tissus qui se développent, les symptômes de carence ont tendance à apparaître d’abord dans les tissus les plus âgés. Nous résumons ici les propriétés de quelques éléments nutritifs dont les effets sont en relation avec ce travail.

I.3.a Le magnésium Le magnésium est un élément essentiel au développement des plantes supérieures. Dans la culture en solution nutritive, il est généralement fourni sous forme de sels de magné- sium solubles dans l'eau tels que le sulfate de magnésium (MgSO4). En solution, le ma- gnésium forme des ions Mg2+, forme sous laquelle il est absorbé par les cellules des plantes. Le magnésium joue un rôle non seulement structurel mais aussi régulateur de plusieurs fonctions importantes. En tant qu'atome central, dans la porphyrine, de la molé- cule de Chl, il joue un rôle important dans la photosynthèse (Lu et al. 1995). Il est égale- ment impliqué dans la formation des protéines (il est nécessaire à la stabilisation de la structure du ribosome), des sucres, des graisses et des vitamines. On lui attribue encore le rôle de cofacteur de plusieurs enzymes ; il est important dans les réactions enzymatiques avec l’ATP de par son rôle dans la liaison de la molécule d’ATP avec le site actif de l’enzyme (Hopkins 1999). Dans la nutrition des plantes, le magnésium joue un rôle important pour l'absorption d'autres éléments nutritifs (Fischer et Bremer 1993). Par ailleurs, il est reconnu qu'une carence en magnésium persistante ralentit la formation de la chlorophylle, des sucres et des protéines.

Symptômes de la carence en magnésium Le premier symptôme en cas de carence en magnésium est une chlorose due à la destruc- tion de chlorophylles dans la région de la feuille située entre les nervures. Pour une raison encore inconnue, les chloroplastes proches des nervures sont moins sensibles à la carence de magnésium et maintiennent leur teneur en chlorophylle plus longtemps. La région internervaire peut être atteinte jusqu'à l'apparition de nécroses. La chlorose induite par une déficience de magnésium est observée en premier lieu dans les feuilles les plus âgées ainsi que celles en cours de développement (Hermans 2004). Dans les cellules, une forte réduction du nombre de grana et de lamelles du stroma et une rupture de membranes de chloroplastes ont été observées chez des plantes défi- cientes en magnésium après 8 semaines de traitement (Hall et al. 1972). En outre, des effets tels qu’une réduction du contenu de Chl ainsi qu’une baisse du rapport de Chl a/b ont été attribués à une carence en magnésium (Balakrishnan et al. 2000), tandis qu’une

17 baisse du rendement des réactions photochimiques a également été observée dans d’autres études (Laing et al. 2000).

I.3.b Le soufre

2- Les plantes absorbent le soufre sous la forme de sulfate, un anion divalent (SO4 ). Chez les plantes supérieures, le soufre est un élément essentiel. Il est particulièrement important dans la structure des protéines, où les liaisons disulfures entre cystéines et méthioni- nes adjacentes contribuent à l’élaboration de la structure tertiaire. C’est également un élément constitutif de nombre de protéines, d’enzymes et de vitamines. En particulier, il est présent dans les centres fer-soufre des protéines, qui contiennent 2 à 4 atomes de soufre. Les complexes Cyt b6/f comportant également des centres fer-soufre (protéine de Rieske), le soufre joue un rôle dans le transfert d’électrons dans les réactions photosyn- thétiques (Hopkins 1999).

Symptômes de carence en soufre Une carence en soufre induit une réduction de la synthèse protéique, qui a pour symp- tôme une chlorose générale de la feuille englobant les tissus périvasculaires. Si la synthèse de Chl n’est pas directement affectée, la capacité à former des complexes Chl-protéine stables est diminuée. Ainsi, la réduction de la synthèse protéique est susceptible d’affecter indirectement les fonctions photosynthétiques. Dans les chloroplastes, les symptômes de carence se manifestent par un nombre réduit de lamelles du stroma, et par des grana surdéveloppés comportant jusqu’à 60 disques (Hall et al. 1972).

I.3.c Le fer Le fer est un oligoélément essentiel à la croissance des plantes supérieures. Il peut être absorbé sous forme cationique (Fe3+ ou, plus fréquemment, Fe2+ qui est plus soluble). Le fer exerce deux fonctions essentielles dans la plante : il fait partie du groupe catalytique de nombreuses enzymes participant à des réactions d’oxydoréduction, et est nécessaire à la synthèse de la Chl. Il intervient dans toutes les protéines fer-soufre ou hémiques ; à ce titre, il est présent dans plusieurs composants protéiques des réactions photosynthétiques, tels que les protéines de Rieske ou les ferrédoxines. Le rôle du fer dans la synthèse de la Chl n’est pas encore bien établi. Il n’est pas certain que les enzymes actives dans ce processus soient directement fer-dépendantes ; il est possible, en revanche, que le besoin d’un apport en fer soit plus général, intervenant par exemple dans la synthèse des protéines du chloroplaste. Dans tous les cas, la carence en fer provoque une perte de Chl et une dégénérescence des chloroplastes (Lu et al. 1995, Balakrishnan et al. 2000).

I.3.d Le cuivre Le cuivre, un micronutriment essentiel aux plantes, est assimilable sous forme ionique (Cu+ ou Cu2+). Il est nécessaire au fonctionnement de nombreuses enzymes, dont la plas-

18 tocyanine (PC) ou l’oxydase des cytochromes. Le cuivre intervient dans les réactions redox des enzymes et des protéines en passant de la valence I à II ou vice-versa (George 1996, Barker et Pilbeam 2007). Le cuivre étant peu mobile dans les plantes, les symptômes de déficience se manifestent dans les parties terminales de croissance en premier. Ces symptômes sont variables selon l’espèce et comprennent généralement une chlorose, des taches nécrotiques sur les feuilles, et des feuilles tordues et fanées (Brennan et Bolland 2003).

I.3.e Le manganèse Le manganèse, absorbé par les plantes sous forme de Mn2+, est impliqué dans la structure de protéines participant à la photosynthèse et à la respiration. Il est également nécessaire au fonctionnement de nombreuses enzymes. Dans la photosynthèse, le man- ganèse joue un rôle clé dans une enzyme du complexe d’oxydation de l’eau (cluster de manganèse). Pouvant passer de la valence II à la valence IV, le manganèse participe à de nombreuses réactions d’oxydoréduction dans les enzymes (George 1996).

19 20 CHAPITRE II

VARIABILITE DE L’ACTIVITE DE L’ENZYME PQH2- OXYDASE CHEZ DES PLANTES ANGIOSPERMES

II.1. INTRODUCTION

Le pool de plastoquinone (PQ) est un porteur mobile d’électrons entre le PSII et le cytochrome b6/f (Cyt b6/f) dans la chaîne photosynthétique de transport d’électrons. Il est avéré que l’état redox du pool de PQ est un élément clé dans la régulation de plusieurs processus photosynthétiques (Bennoun 1982, Bennett 1991, Allen 1992, Vener et al. 1995, 1997). Le pool de PQ joue un rôle dans le transport linéaire d'électrons, dans la chlororespiration et le transport cyclique d'électrons autour du photosystème I (PSI) et le cycle Q (Heber et Walker 1992, Kramer et Crofts 1993, Bennoun 2001, Haldimann et Tsimilli- Michael 2002, Joët et al. 2002). Il est admis que l’interaction du complexe Cyt b6/f avec le pool de PQ à l’état ré- duit cause l’activation d’une kinase capable de la phosphorylation d’une partie des unités LHCII (light harvesting complex II) du PSII (Bennett 1991, Allen 1992). Un pool de PQ à l’état réduit peut également activer une autre kinase qui est responsable de la phosphorylation de plusieurs sous-unités du PSII (Vener et al. 1995, 1997). Récemment, Lemeille et al. (2009) ont trouvé dans la kinase du LHCII de Clamydomonas reinhardtii (Stt7) deux cys- téines, conservées dans la partie luménale de la kinase, qui sont essentielles pour l’activité de l’enzyme. Ils ont proposé que la kinase nécessiterait un pont de sulfure pour son acti- vité et que la thiorédoxine réduite serait capable de couper ce pont, rendant la kinase inactive. Ce modèle explique très bien l’effet de la thiorédoxine sur la phosphorylation de LHCII observée par Rintamäki et al (2000) dans des chloroplastes de Cucurbita pepo. On pense également que l’état redox du pool de PQ, en interagissant avec le sys- tème de la ferrédoxine/thiorédoxine, pourrait jouer un rôle dans la régulation de la transcription de plusieurs gènes liés au transport photosynthétique d’électrons (p. ex. Allen 1993, Escoubas et al. 1995, Pfannschmidt et al. 1999, Trebitsh et Danon 2001). Chez les cyanobactéries, la chaîne photosynthétique de transport d’électrons par- tage le pool de PQ avec la chaîne respiratoire (Schmetterer 1994). Bennoun (1982) a pro- posé que les chloroplastes des plantes et des algues contiendraient eux aussi non seulement une chaîne de transport d’électrons photosynthétique, mais également une chaîne respiratoire rudimentaire, fonctionnant selon un processus alternatif que Bennoun a ap- pelé chlororespiration. Selon cette théorie, le pool de PQ réduit par la chaîne de transport linéaire serait reoxydé par l’oxygène grâce à une oxydase. Par ailleurs, le transport cyclique d’électrons autour du PSI peut également être responsable d’une réduction des molécules de PQ par des enzymes catalysant le transfert

21 d’électrons entre NADPH ou Fd (par une NADPH-plastoquinone-oxydoréductase) et le pool de PQ. Pour rendre visible l’activité de cette oxydase (ci-après PQH2-oxydase), il faut créer certaines conditions expérimentales spéciales. Une possibilité consiste à appliquer un pulse saturant qui réduit la chaîne de transport d’électrons ; le transport d’électrons vers le PSI reste alors bloqué. Dans ce contexte, la PQH2-oxydase fournit le seul chemin dis- ponible pour la réoxydation du plastoquinol. Des études ont montré une relation entre l’état redox du pool de PQ et le niveau relatif de l’étape J (Haldimann et Strasser 1999, Tóth et al. 2007a). Tóth et al. (2007a) ont étudié cette relation de manière plus approfondie et ont proposé un protocole pour la mise en évidence du processus de réoxydation du pool de PQ, qui se base sur la récupé- ration de l’étape J de la courbe OJIP après un pulse de lumière saturante en obscurité. Dans cette même étude, Tóth et al. (2007a) ont montré qu’il existe des différences consi- dérables entre deux espèces végétales (Camellia japonica et Pisum sativum) dans leur vitesse de réoxydation du pool PQ en obscurité. Ainsi, il a été observé que la réoxydation du pool de PQ chez C. japonica (t½ = a6.2 s) est plus rapide que chez le petit pois (P. sativum, t½ = a42 s). Cette observation a conduit à se demander si ces différences étaient largement répandues chez les Angiospermes et si elles pouvaient être expliquées par des facteurs écophysiologiques. Pour répondre à cette question et afin de mieux comprendre le rôle physiologique de la PQH2-oxydase dans les tissus végétaux, nous avons sondé l’activité de cette enzyme (en suivant la méthode décrite ci-dessus) chez un grand nombre d’espèces de différentes parties de l’arbre évolutif des Angiospermes. Dans chaque famille, au moins deux espèces ont été mesurées afin de limiter la probabilité qu’une plante choisie représente un cas particulier à l’intérieur d’une famille. L’approche utilisée ici est peu répandue dans la littérature, mais certains auteurs (p. ex Rozema et al. 2002) ont tra- vaillé avec des approches similaires pour évaluer le rôle de facteurs évolutifs et écophy- siologiques sur certains paramètres biologiques chez un nombre important d’espèces.

22 II.2. MATERIELS ET METHODES

II.2.a Matériel végétal Les 63 espèces de plantes choisies pour ce travail appartiennent à 23 familles et à 20 ordres d’Angiospermes. En général, chaque famille est représentée par deux espèces au moins.

Lieux de mesure des plantes Plantes mesurées in situ : la majorité des plantes ont été mesurées à l’extérieur, in situ, au Jardin botanique de Genève et au Centre horticole de Lullier (Genève). Les mesures étaient faites le matin ou le soir dans la pénombre, de manière à disposer de conditions de faible intensité lumineuse pendant les mesures. Plantes mesurées en laboratoire : certaines plantes (une quinzaine) étaient disponibles en pot dans une serre du Centre horticole, où elles recevaient une intensité lumineuse relativement faible (~100 μmol photons m-2 s-1). Ces plantes ont été sorties des serres pour être mesurées en laboratoire.

II.2.b Mesures de la fluorescence de la Chl a Pour les plantes en pot comme pour les plantes in situ, des mesures de la fluorescence de la Chl a à double pulse (voir point II.2.c) ont été réalisées sur des feuilles adultes en bon état physiologique, adaptées à l’obscurité et situées à la même hauteur sur la tige. Les mesures ont été réalisées en été afin d’avoir un maximum de feuilles à disposition pour les mesures. Le clip de mesure était toujours placé sur le même site de chaque feuille.

Matériel de mesure Les mesures ont été effectuées avec un fluorimètre Handy PEA (voir section II.2.e).

II.2.c Protocoles double pulse Pour les mesures de fluorescence, deux pulses de lumière saturante rouge (3000 μmol photons m-2 s-1) sont appliqués à la feuille. Entre ces deux pulses, un intervalle variable d’adaptation à l’obscurité (¨t, entre 0.1 et 200 s) est laissé. Le rôle du 1er pulse est de réduire la chaîne de transport d’électrons. Celle-ci se trouve alors complètement réduite à la fin du premier pulse ; c’est donc également le cas du pool de PQ qui est l’objet de cette expérience. Durant l’intervalle d’obscurité ¨t, le pool de PQ se réoxyde par un chemin autre que le transport d’électrons linéaire car le Cyt b6/f, la PC et le P700 sont réduits. La courbe OJIP de fluorescence de la Chl a générée par le 2e pulse de lumière permet alors d’estimer la réoxydation de la chaîne de transport d’électrons entre les deux pulses. Comme montré par Tóth et al. (2007), la baisse de FJ peut être interprétée comme une mesure du degré de réoxydation du pool de PQ suite à l’intervalle d’obscurité. En faisant varier la durée de ces intervalles d’adaptation à

23 l’obscurité ¨t, il est possible de suivre la cinétique de réoxydation dans l’obscurité du pool de PQ.

Treize protocoles double pulse Comme montré dans la Fig. II-1, entre le temps d’obscurité les deux pulses de lumière est chaque fois différent : 0.1 s, 0.2 s, 0.5 s, 1 s, 2 s, 5 s, 10 s, 20 s, 30 s, 50 s, 70 s, 100 s, 200 s. Ainsi, chaque double pulse est indépendant l’un de l’autre. Au total, 13 doubles pulses ont été utilisés pour chacune des 63 plantes mesurées.

II.2.c.i Critères pour les temps d’adaptation à l’obscurité Temps d’obscurité des plantes exposées à la lumière Un temps d’obscurité avant les mesures double pulse était nécessaire pour les plantes in situ et les plantes en pot, afin d’assurer l’oxydation de la chaîne photosynthétique de transport d’électrons et la relaxation de plusieurs processus biochimiques déclenchés par la lumière. Les plantes adaptées à une intensité de lumière relativement faible (plantes en pot mesurées en laboratoire) ont été gardées pendant 30 minutes à l’obscurité avant le début des mesures double pulse, tandis que pour les plantes exposées à une plus forte intensité de lumière (plantes in situ, mesurées à l’extérieur), l’adaptation à l’obscurité des feuilles était plus longue (environ 1 heure avec les clips fermés).

Temps d’obscurité entre chaque double pulse Les mesures de double pulse effectuées sur chacune des 63 plantes étaient toujours sépa- rés par au moins 10 minutes d’obscurité, de façon que chaque double pulse était indé- pendant des autres. Les expériences contiennent un contrôle interne qui permet de vérifier si les intervalles d’obscurité sont suffisants. Si les premiers pulses induisent chaque fois la même courbe OJIP, le temps est considéré suffisant. Plus spécifiquement, un niveau inchangé de l’étape J implique aussi un intervalle ¨t suffisant. De plus, ce niveau FJ des premiers pulses a été utilisé comme niveau FJ minimal en obscurité.

II.2.c.ii Cinétiques d’adaptation à l’obscurité des courbes de fluorescence OJIP L’approche introduite par Tóth et al. (2007) est utilisée dans cette expérience. Comme il a été montré expérimentalement qu’il existe une corrélation linéaire entre FJ et l’état redox du pool de PQ, la baisse de FJ (ou VJ) est employée ici comme une mesure du degré de réoxydation du pool de PQ suite à un pulse de lumière saturant la chaîne de transport d’électrons. Le protocole double pulse utilisé dans ce travail est illustré dans la Fig. II-1. Le panneau A montre les cinétiques des courbes OJIP de la fluorescence de la Chl a suite à un deuxième pulse précédé d’un intervalle d’adaptation à l’obscurité ¨t variable. Il faut noter que les valeurs de fluorescence ont été normalisées selon la formule : V = (F – F0)/(FM – F0) 24 où V représente la fluorescence variable relative, comprise entre 0 et 1. Cette normalisation égalise l’amplitude de l’intensité de la fluorescence entre des feuilles différentes, permettant de comparer la cinétique des différentes courbes de fluorescence entre elles. Au fur et à mesure que les intervalles ¨t d’obscurité augmentent, le pool de PQ dispose de plus de temps pour se réoxyder.

II.2.c.iii Cycles de mesures double pulse Pour des raisons d’ordre technique, les mesures de chaque plante ont dû être réalisées en trois cycles. En effet, comme les mesures de chaque plante sont constituées de 13 protocoles de double pulse, alors que le fluorimètre utilisé avait un maximum de stockage de 5 protocoles double pulse (1 cycle), il était nécessaire vider le fluorimètre après chaque ccle de 5 mesures afin de le programmer pour le cycle suivant. Ainsi, un cycle de mesures correspond à un maximum de 5 protocoles de double pulse de fluorescence (donc 5 diffé- rents intervalles ¨t d’adaptation à l’obscurité). Un total de 3 cycles de mesurés ont étés effectués pour chaque plante mesurée. Les valeurs ont toujours été mesurées sur 5 feuilles avec un seul fluorimètre.

Plantes en pot mesurées en laboratoire Il est à noter que pour les plantes mesurées en laboratoire, les mesures ont toutes été ré- alisées sur les mêmes 5 feuilles, pour chacun des intervalles d’obscurité de chaque cycle de mesure : Cycle 1 : 0.1, 0.2, 0.5, 1 et 2 s feuilles mesurées : 1, 2, 3, 4, 5 Cycle 2 : 5, 10, 20, 30 et 50 s feuilles mesurées : 1, 2, 3, 4, 5 Cycle 3 : 70, 100 et 200 s feuilles mesurées : 1, 2, 3, 4, 5

25 Plantes in situ, mesurées à l’extérieur En revanche, pour les plantes in situ, 5 échantillons différents de 5 feuilles ont dû être employés ; un total de 25 feuilles ont été mesurées. Ceci a permis de limiter le temps né- cessaire aux mesures à l’extérieur. Cycle 1 : 0.1, 0.2, 05, 1 et 2 s feuilles mesurées : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 Cycle 2 : 5, 10, 20, 30 et 50 s feuilles mesurées : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 Cycle 3 : 70, 100 et 200 s feuilles mesurées : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25

Il faut également relever que les cycles de mesures des plantes in situ étaient séparés de 30 minutes. Cette attente était due à la nécessité de transférer les données mesurées sur la plante à l’ordinateur et au changement de programmation du fluorimètre entre chaque cycle.

II.2.c.iv Calcul du demi-temps de réoxydation du pool de PQ (t½).

La cinétique d’adaptation à l’obscurité du point VJ est représentée dans la Fig. II-1.B,en fonction de l’intervalle d’obscurité entre les deux pulses ¨t. Nous assumons qu’il s’agit d’un processus exponentiel, que nous modélisons à l’aide d’une ou deux phases exponentielles selon les équations suivantes : y = a1·exp(-x/ƴ1) + b (cinétiques monophasiques) y = a1·exp(-x/ƴ1) + a2·exp(-x/ƴ2) + b (cinétiques biphasiques) où a1 et a2 représentent les amplitudes des processus exponentiels respectifs. Le type de cinétique (mono ou biphasique) a été déterminé à l’aide d’une inspection visuelle des résultats. Les paramètres des fonctions exponentielles ont été calculés par le logiciel Microcal™ Origin™, avec lequel nous avons réalisé toute l’analyse de nos résul- tats des 63 espèces de plantes angiospermes étudiées. La cinétique de VJ permet également de déterminer graphiquement le temps néces- saire à la réoxydation de la moitié du pool de PQ (t½) : ce niveau de réoxydation correspond à la moitié de l’amplitude totale de la courbe de la cinétique de VJ (Fig. II-2). Ainsi, pour l’exemple donné dans la Fig. II-2.B (flèche bleue), on peut déterminer que le t½ de la cinétique monophasique de réoxydation de l’enzyme est t½ ~ 68 s.

26 Oncidium marshallianum

Réoxidation du pool de PQ 1.0

0.1 s 1.0 0.2 s 0.9 pulse

0.5 s e 0.8 1.0 s 2.0 s 5.0 s 0.6 0.8

10.0 s J t½ = 68 s J

20.0 s V 0.4 30.0 s J 0.7 50.0 s 70.0 s 0.2 A B 100.0 s 0.6 200.0 s

Fluorescence relative du 2 0.0 W = 68 s 0.5 0.01 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 Temps d'illumination (ms) Intervalle d'obscurité 't (s)

Fig. II-1. Expérience double pulse. A : Cinétique de récupération à l’obscurité des courbes OJIP de la fluorescence de la Chl a suivie en utilisant un deuxième pulse saturant de lumière rouge. Les courbes OJIP de la fluorescence de la Chl a ont été double normalisées entre les er valeurs Fo et FM avec le Fo du 1 pulse. Chaque courbe correspond à un intervalle d’obscurité ƅt différent, comme indiqué sur la légende à gauche sur une échelle de temps logarithmique.

B : Cinétique d’adaptation à l’obscurité de VJ. Les valeurs VJ des courbes OJIP de la fluorescence de la Chl a (symboles carrés fermés) ont permis d’obtenir une courbe avec une seule fonction exponentielle (cinétique monophasique, t½ = 68 s) à partir des valeurs représentées en A. N = 5 pour chaque ¨t mesuré.

27 II.2.d Variabilité de la cinétique de réoxydation du pool de PQ entre les espèces

II.2.d.i Arbre phylogénétique et facteurs écophysiologiques

Arbre phylogénétique Dans cette étude, on a considéré un ensemble de 23 familles provenant de différentes parties de la classification phylogénétique des Angiospermes avec en général au moins deux espèces mesurées par famille (63 espèces au total). Les familles ont été choisies sur la base de leur accessibilité, du nombre de leurs représentants (genres et espèces), de leur abondance dans la flore et de leur importance économique. Il a été employé une sé- quence de classification des familles qui reflète la compréhension actuelle de leurs relations phylogénétiques, basée sur des analyses cladistiques récentes et proposée par l’Angiosperm Phylogeny Group en 1998 (Judd et al. 2002). L’arbre phylogénétique présenté ici (Fig. II-3, ci-dessous) expose quelques-uns des principaux clades choisis des Angiospermes. Il s’agit d’une adaptation de l’arbre pré- senté par l’Angiosperm Phylogeny Group (1998), basé sur les caractères morphologiques et les séquences nucléotidiques de rbcL, atpB et de l’ADN ribosomique nucléaire 18S. Afin de déterminer quels facteurs sont susceptibles d’expliquer la variabilité des t½ de réoxydation du pool de PQ entre les espèces, nous avons classé les espèces en groupes selon des critères écophysiologiques (facteurs environnementaux ou biologiques).

Facteurs écophysiologiques En plus de la classification phylogénétique, nous avons pris en compte les six facteurs écophysiologiques suivants: 1. le type de cinétique de réoxydation du pool de PQ (mono ou biphasique, selon que la cinétique a été calculée avec un fit de 1 ou 2 fonctions exponentielles ; voir section II.2.c.iv), 2. l’exposition lumineuse préférée, 3. l e type de sol préféré (taux d’humidité), 4. le climat préféré, 5. la persistance de la feuille et 6. la voie métabolique (C3, C4 ou CAM). Le type de cinétique, la persistance de la feuille et la voie métabolique sont considé- rées ici comme facteurs physiologiques tandis que le type de sol préféré, le climat préféré et l’exposition lumineuse préférée des plantes étudiées sont des facteurs écologiques.

Analyse statistique Pour déterminer quels facteurs écophysiologiques et phylogénétiques ont une influence sur la cinétique de réoxydation du pool de PQ, nous avons effectué un test statistique sur les groupes de chacun des six facteurs mentionnés ci-dessus, visant à déterminer si les 28 cinétiques de réoxydation présentent des différences significatives entre les groupes. Plus précisément, nous avons testé si au moins l’un des groupes se différencie significativement de tous les autres. Dans le cas des cinétiques biphasiques, nous avons retenu le t½ correspondant à la phase de plus dominante. Nous avons employé le test de Kruskal-Wallis, un test non paramétrique basé sur les rangs des données ; il permet de déterminer si plusieurs échantillons de données proviennent de la même population ou non. Il s’agit d’une généralisation du test de Mann- Whitney-Wilcoxon pour plus de deux échantillons (Kruskal et Wallis 1952). Etant non paramétrique, le test ne postule pas une distribution normale des données. L’hypothèse zéro (H0) correspond à l’affirmation qu’aucun des groupes ne se différencie des autres ; tous les groupes appartiennent à la même population. L’alternative (HA) postule qu’au moins un des groupes se différencie significativement des autres. Le niveau de significati- vité choisi pour le test est de 0.05.

II.2.d.ii Variabilité de la cinétique de réoxydation du pool de PQ au sein d’une même espèce Afin d’investiguer la variabilité des t½ de réoxydation au sein d’une même espèce, nous avons mesuré la fluorescence de la Chl a sur un grand nombre de feuilles appartenant à des plantes de trois espèces (voir Tableau II.-1) : 1. un arbre C3 avec des feuilles persistantes, 2. une plante C3 (feuilles non persistantes), et 3. une plante C4. Dans le but d’obtenir des résultats représentatifs, les mesures ont été effectuées en faisant varier différents paramètres écophysiologiques tels que l’âge des feuilles, l’exposition à la lumière ou la position dans la plante. Nous avons suivi le protocole de double pulse (voir section II.2.c ci-dessus), mais avec des intervalles d’obscurité ¨t fixes ; nous n’avons donc pas mesuré la cinétique de réoxydation entière (¨t variant entre 0.1 et 200 s). Le t½ mesuré (voir Tableau II.2 et Annexe II, sondage des Angiospermes) a été choisi comme valeur ¨t pour chaque espèce. Le but était d’obtenir un pool de PQ réoxy- dé à plus ou moins 50%, car l’effet de ¨t sur les valeurs mesurées y était le plus grand. Le plan de mesures est résumé dans le Tableau II-1.

29 Tableau II-1. Schéma des mesures de double pulse de fluorescence à ¨t fixe, permettant d’estimer la variabilité du demi-temps de réoxydation du pool de PQ (t½).

Espèce Famille ¨t N° de Paramètres de variabilité feuilles 1. Ilex aquifolium Aquifoliacées 3 s, 10 s 81 Âge des feuilles (houx) Exposition à la lumière 2. Pisum sativum Fabacées 30 s 58 Âge des feuilles (petit pois) 3. Zea mays Poacées 20 s 102 Position dans la plante (feuille supé- (maïs) rieure, moyenne ou inférieure) Position dans la feuille (centre ou bord)

II.2.e Equipement de mesures L’émission de la fluorescence de la Chl a a été mesurée avec un appareil Handy PEA (Plant Efficiency Analyser, Hansatech Instruments, King’s Lynn, Norfolk, UK). Handy PEA est composé de trois accessoires (Fig. II-2.A) : le clip, le boîtier et la tête de mesures. Le clip réunit l’échantillon végétal à la tête de mesure, et garantit une mesure sans perte de lumière actinique aussi bien sur le terrain qu’en laboratoire. Il est formé de deux parties en plastique qui permettent de sélectionner un morceau d’échantillon végétal, pour focaliser la lumière sur un disque précis. Il permet d’isoler les feuilles de la lumière ambiante en rabattant une languette d’aluminium (facilement retirée au moment de la mesure). Le boîtier contient une batterie, diverses fiches de connexion (avec la tête de mesures, l’ordinateur et le chargeur) et contient aussi un mini-ordinateur. La tête permet d’illuminer l’échantillon et de mesurer la fluorescence. L’illumination consiste en un pulse de 1 s de lumière rouge avec un pic à 650 nm (demi- largeur spectrale de 22 nm) et une intensité maximale de ~3000 μmol photons m-2 s-1, et est fournie par trois diodes électroluminescentes (LEDS). La lumière est focalisée sur la feuille (disque de 5 mm de diamètre).

30 A

Fig. II-2. A : Fluorimètre Handy PEA. B : Différents spectres : absorption de la feuille (leaf absorption), émission des diodes électroluminescentes et fluorescence de la Chl a et filtrage de transmission. (Figure du manuel de Handy PEA, Hansatech Instruments 2001).

Les signaux de fluorescence sont détectés grâce à une photodiode (cellule photoé- lectrique) à haute performance équipée d’un filtre. Ce filtre sert à éviter que la lumière rouge émise par les diodes électroluminescentes ne soit captée par le récepteur. Le signal capté est ensuite digitalisé dans le boîtier à une résolution de 12 bits. Les valeurs sont enregistrées dans le boîtier avec un intervalle d’acquisition de 10 μs entre 20 μs et 0.3 ms. Comme l’induction de fluorescence devient plus lente avec le temps, l’intervalle d’acquisition diminue également. Il est de 0.1 ms entre 0.3 ms et 3 ms, de 1 ms entre 3 et 30 ms, 10 ms entre 30 et 300 ms et 100 ms entre 300 ms et 3 s. L’importance était d’utiliser des pulses qui durent exactement le temps nécessaire pour obtenir la reduction de la chaîne de transport d’électrons (c’est-à-dire d’aller jusqu’à FM), mais pas plus longtemps.

31 Pour le transfert des données à un logiciel tableur (feuille calcul), nous avons utilisé le programme Biolyzer (R. Maldonado-Rodriguez, Laboratoire de Bioénergétique, Université de Genève).

32 II.3. RESULTATS

II.3.a Sondage in situ de l’activité de la PQH2-oxydase chez des espèces d’Angiospermes

II.3.a.i Facteurs écophysiologiques et phylogénétiques

Le Tableau II-2 résume le sondage de l’activité de la PQH2-oxydase suivie à l’aide de mesures de double pulse (voir Matériaux et méthodes, section II.2.C) sur un set de 63 espèces dans 23 familles appartenant à 20 ordres de différentes parties de la classification phylogénétique des Angiospermes. Les t½ mesurés varient entre 0.6 s (Cyperus longus, Juncales/Cyperaceae) et 170 s (Vriesea zamorensis, Bromeliales/Bromeliaceae). (Il est à noter que dans le cas des cinéti- ques biphasiques, nous ne tenons compte dans l’analyse statistique que du t½ correspondant à la phase dont l’amplitude est la plus importante.) Les valeurs observées varient donc par un facteur d’environ 300 entre les espèces. Par ailleurs, on peut noter que la ma- jorité des cinétiques mesurées sont monophasiques (40 sur 63).

II.3.a.ii Arbre phylogénétique La Fig. II-3 montre l’arbre phylogénétique (voir point II.2.d.i) et les valeurs moyennes des t½ pour chacune des 23 familles analysées dans notre sondage. Ces valeurs moyennes ont été calculées à partir des valeurs t½ des espèces de chaque famille du Tableau II-2, dans le but de représenter la distribution des différentes cinétiques de récupération dans l’arbre évolutif des 63 espèces étudiées. Sur la base de nos résultats, il n’est pas possible d’observer une véritable tendance évolutive dans les cinétiques de réoxydation du pool de PQ. Les cinétiques lentes ou rapides semblent distribuées aléatoirement dans le tableau phylogénétique. Les différences entre les familles sont toutefois considérables, variant de 0.7 s (Juncales/Cyperaceae) à 145 s (Bromeliales/Bromeliaceae), soit un facteur d’environ 200 entre deux familles qui sont très proches (à côté une de l’autre) dans l’arbre phylogénétiques.

33 Tableau II-2. Sondage de la variabilité de l’activité de PQH2-oxydase (mesurés sur la base de la récupération de l’étape J de la courbe OJIP suite à un pulse saturant) chez 63 espèces de plantes angiospermes. Les facteurs écophysiologiques propres à chaque espèce sont mis en évidence en relation avec le t½ de réoxydation du pool de PQ (voir section II.2.b). Pour les cinétiques biphasiques de récupération de l’étape J, les pourcentages se réfèrent à l’importance relative (en termes d’amplitude) de chacune des deux phases (voir section II.2.c).

Classification Facteurs écophysiologiques Phylogénétique 1. Type de cinétique 2. Exposition lumi- 4. Climat préféré 5. Feuillage 6. Métabolisme Ordre /Famille (t½) neuse préférée Genre/espèce 3. Type de sol préféré Magnoliales/Magnoliaceae Angiospermes primitives 1. Liriodendro tulipifera 15 Soleil à ombre Tempéré Non persistant C3 Sol humide

34 2. Magnolia liliflora 24 Soleil à ombre Tempéré Non persistant C3 Sol humide 3. Magnolia stellata Biphasique Soleil à ombre Tempéré Non persistant C3 15 (80%) Sol humide 295 (20%) 4. Magnolia soulangeana Biphasique Soleil à ombre Tempéré Non persistant C3 3.8 (55%) Sol humide 85 (45%) 5. Magnolia virginiana 37 Soleil à ombre Tempéré Non persistant C3 Sol humide 6. Magnolia grandiflora Biphasique Soleil à ombre Tempéré Persistant C3 6.2 (54%) Sol humide 50 (46%) Asparagales/Iridaceae Monocot. 7. Iris germanica 5.1 Soleil Tempéré Non persistant C3 Sol humide 8. Iris foetidissima 17 Soleil Tempéré à méditerranéen Persistant C3 Sol humide à trempé Asparagales/Orchidaceae Monocot. Epiphytes en rég. trop. Herbacées 9. Ludisia discolor 72 Pénombre Tropical à subtropical Persistant C3 Sol humide 10. Oncidium marshallianum 68 Pénombre Tropical à subtropical Persistant C3 Sol humide Liliales/Uvulariaceae 35 Monocot. Herbacées à rhizo- mes rampants 11. Tricyrtis hirta 29 Pénombre à ombre Tempéré à tropical Non persistant C3 Sol humide 12. Tricyrtis macropoda 41 Pénombre à ombre Tempéré à tropical Non persistant C3 Sol humide 13. Uvularia grandiflora 145 Ombre Tempéré à tropical Non persistant C3 Sol humide Liliales/Liliaceae Monocot. Herbacées à bulbes 14. Lillium x hybridum Biphasique Soleil Tempéré Non persistant C3 2 (70%) Sol humide 19 (30%) Bromeliales/Bromeliaceae Monocot. Herbacées 15. Guzmania lingulata Biphasique Pénombre Tropical Persistant C3 1.8 (15%) Sol humide à sec 120 (85%) 16. Vriesea zamorensis Biphasique Pénombre Tropical Persistant C3 6.5 (10%) Sol humide à sec 170 (90%) Juncales/Cyperaceae Monocot. 17. Cyperus longus Biphasique Soleil à pénombre Tempéré Non persistant C4 0.6 (73%) Sol trempé 4.9 (27%) 18. Cyperus alternifolius Biphasique Soleil à pénombre Tropical Persistant C3 0.7 (76%) Sol humide à trempé 36 12 (24%) Poales/Poaceae Dicot. Graminées, herbacées 19. Hordeum vulgare Biphasique Soleil Tempéré Non persistant C3 2.6 (77%) Sol humide à sec 21 (23%) 20. Zea mays 21 Soleil Tropical à tempéré Non persistant C4 Sol humide 21. Coix lacryma-jobi 1.8 Soleil Tropical Non persistant C4 Sol humide 22. Saccharum officinarum 1.9 Soleil Tropical Persistant C4 Sol humide 23. Sorghum bicolor 1.2 Soleil Tropical Non persistant C4 Sol humide 24. Oryza sativa 34 Soleil Tropical Non persistant C3 Sol trempé 25. Miscanthus sinensis Biphasique Soleil Tempéré Non persistant C4 1.9 (79%) Sol humide à sec 44 (21%) Ranunculales/Ranunculaceaes Dicot. Plantes herbacées 26. Aconitum lamarckii 3.5 Soleil à pénombre Tempéré Non persistant C3 Sol humide 27. Anemone hupehensis Biphasique Soleil à pénombre Tempéré Non persistant C3 25 (42%) Sol humide 131 (58%) 28. Trollius europaeus 27 Soleil à pénombre Tempéré Non persistant C3 Sol humide 29. Aquilegia alpina 22 Soleil à pénombre Tempéré Non persistant C3 Sol humide 30. Actaea spicata Biphasique Ombre à pénombre Tempéré Non persistant C4 37 1.2 (82%) Sol humide 25.4 (18%) Caryophyllales/Cactaceae Dicot. Plantes succulentes. 31. Schlumbergera x buckleyi Biphasique Soleil à pénombre Aride Persistant CAM 8.8 (61.7%) Sol sec 64 (39%) 32. Selenicereus anthonyanus Biphasique Soleil à pénombre Aride Persistant CAM 3.2 (76%) Sol sec 22 (24%) Caryophyllales/ Chenopodiaceae Dicot. 33. Chenopodium album 30 Soleil à pénombre Tempéré Non persistant C3 Sol humide 34. Beta vulgaris 35 Soleil à pénombre Tempéré à subtropical Non persistant C3 Sol humide Saxifragales/Saxifragaceae Dicot. Herbacées 35. Saxifraga cuneifolia 15 Pénombre Tempéré Non persistant C3 Sol humide 36. Darmera peltata 22 Pénombre Tempéré Non persistant C3 Sol humide à trempé Saxifragales/Crassulaceae Dicot. 37. Crassula ovata Biphasique Soleil à pénombre Tempéré à subtropical Persistant CAM 2.7 (74%) Sol sec 16 (26%) 38. Kalanchoe x hybrida 3.5 Ombre Tropical Persistant CAM Sol sec Geraniales/Geraniaceae Dicot. Herbacées ou arbustes 38 39. Geranium endressii Biphasique Soleil à ombre Tempéré Non persistant C3 29 (54%) Sol humide 89 (46%) 40. Geranium himalayense 29 Soleil à ombre Tempéré à tropical Non persistant C3 Sol humide à sec 41. Geranium tuberosum Biphasique Soleil à ombre Tempéré à méditerranéen Non persistant C3 22.1 (58%) Sol humide 138.6 (42%) 42. Geranium robertianum 32 Pénombre Tempéré Non persistant C3 Sol humide à sec 43. Pelargonium peltatum 9 Soleil Méditerranéen Persistant C3 Sol sec 44. Pelargonium x hortorum 12 Soleil à pénombre Méditerranéen Persistant C3 Sol sec à humide Fabales/Fabaceae Dicot. Légumineuses. 45. Pisum sativum 40 Soleil Méditerranéen Persistant C3 Sol humide 46. Phaseolus vulgaris 44 Soleil Tempéré à subtropical Non persistant C3 Sol humide à sec 47. Dorycnium rectum 40 Soleil à mi ombre Méditerranéen Persistant C3 Sol sec à humide Fagales/Fagaceae Dicot. Arbres ou arbustes 48. Fagus sylvatica 30 Soleil à pénombre Tempéré Non persistant C3 Sol humide 49. Quercus robur 66 Soleil Tempéré Non persistant C3 Sol humide 50. Quercus ilex 56 Soleil Méditerranéen Non persistant C3 39 Sol humide Brassicales/Brassicaceae Dicot. Herbacées 51. Arabidopsis thaliana 46.5 Soleil à pénombre Tempéré Non persistant C3 Sol humide 52. Brassica oleraceae 5.5 Soleil Tempéré Persistant C3 Sol humide 53. Hugueninia tanacetifolia 60 Soleil Tempéré Non persistant C3 Sol humide Malvales/Malvaceae Dicot. Herbacées, arbustes et quelques arbres 54. Lavatera olbia 6.2 Soleil Méditerranéen Non persistant C3 Sol humide Malvales/Tiliaceae Dicot. Arbres, arbustes 55. Tilia cordata Biphasique Soleil à pénombre Tempéré Non persistant C3 5 (71%) Sol humide 35 (29%) Cornales/Hydrangeaceae Dicot. 56. Hydrangea macrophylla Biphasique Soleil à pénombre Tempéré à méditerranéen Non persistant C3 1.2 (78%) Sol humide 21.1 (22%) 57. Hydrangea arborescens Biphasique Soleil à pénombre Tempéré Non persistant C3 1.2 (86%) Sol humide 2.6 (14%) Ericales/Theaceae Dicot. Arbres et arbustes 40 58. Camellia japonica 3.2 Soleil à pénombre Tempéré à subtropical Non persistant C3 Sol humide 59. Camellia sinensis Biphasique Soleil à pénombre Tropical à subtropical Non persistant C3 1.7 (73 %) Sol humide 28 (27%) 60. Rhododendron ponticum Biphasique Pénombre Tempéré Persistant C3 5.7 (58%) Sol humide 27 (42%) Gentiales/Apocynaceae Dicot. 61. Vinca minor 11.6 Soleil à pénombre Tempéré Persistant C3 Sol sec à humide 62. Vinca mayor 20.6 Pénombre à ombre Tempéré Persistant C3 Sol sec à humide Celastrales/Aquifoliaceae Dicot. 63. Ilex aquifolium 8.2 Soleil à pénombre Tropical à tempéré Persistant C3 Sol humide à sec 41 heaceae: ~3.5 s Hydrangeaceae: ~1.2 s T Apocynaceae: ~16 s Aquifoliaceae: ~8 s s aceae: ~6 s Dicotylédones Saxifragales /Saxifragaceae: ~19 Saxifragales /Crassulaceae : ~2.7 s aceae: ~51 s g Ranunculaceae: ~33 s Caryophyllales /Chenopodiaceae: ~33 s Caryophyllales /Cact Malvaceae: ~6 s Geraniaceae: ~22 s Fa Brassicaceae: ~37 s Fabaceae: ~41 s Monocotylédones Uvulariaceae: ~72 s Liliaceae: ~2 s / / sparagales /Iridaceae ~11.5 : s sparagales /Orchidaceae: ~70 s s Magnoliaceae: ~20.5 s Liliales A A Liliales 2 0.7 s 9. Cyperaceae: ~ Poaceae: ~ Bromeliaceae : 145 s rbre phylogénétique des A Fig. II-3. Angiospermes représentant les moyennes de t½ la récupération l’étape J pour les différentes familles mesurées.

42 II.3.a.iii Analyse statistique Afin d’estimer la significativité des différences entre les t½ mesurés sur les différentes espèces, le test de Kruskal-Wallis a été appliqué aux valeurs mesurées, réparties en niveaux (groupes) pour chaque facteur écophysiologique. Les résultats sont résumés dans le Tableau II-3.

Tableau II-3. Résultats du test de Kruskal-Wallis appliqué à 63 espèces, classées selon six facteurs écophysiologiques et phylogénétiques. Voir section II.2.d.i (facteurs écophysiologi- ques) pour les détails sur le choix des niveaux de chaque facteur.

Facteur Nombre de ni- P-value Différence signifi- veaux (groupes) cative oui/non 1. Type de cinétique 2 0.0001 Oui 2. Lumière 3 0.0636 Non 3. Type de sol 3 0.5080 Non 4. Climat 4 0.9054 Non 5. Persistance 2 0.4449 Non 6. Métabolisme (C3, 2 4.42·10-5 Oui C4, CAM)

Avec le niveau de significativité choisi (0.05), seuls les facteurs « métabolisme » et « type de cinétique » montrent des différences statistiquement significatives. Il est à noter que les deux p-values sont très petites, ce qui indique que les différences sont très significatives selon ce test.

Facteur « voie métabolique » en fonction du t½ Dans le cas du métabolisme, ces résultats montrent que les espèces de plantes de type C3 présentent des cinétiques de réoxydation du pool de PQ beaucoup plus lentes que les es- pèces de type C4 et CAM (26.7 contre 4.6 s). Néanmoins, pour les plantes C4 on peut noter que dans notre étude, cette classe des plantes est dominée par des espèces de deux familles très proches (Poaceae et Cyperaceae) et dans ce cas, on ne peut pas exclure une explication phylogénétique. Le Tableau II-4 montre une sélection des valeurs t½ appartenant Poaceae et Cy- peraceae (extraits du Tableau II-2). On observe que les valeurs t½ à l’intérieur de ces deux familles sont indépendantes de la voie métabolique car on y trouve des valeurs t½ rapides tant en C3 qu’en C4. Ces résultats, nos confirment que les valeurs t½ rapides existent dans les voies métaboliques C3 ou C4 pour ces deux familles.

43 On observe également dans le Tableau II-4 deux valeurs t½ plutôt lentes faisant figure d’exception (Zea mays, Oryza sativa) par rapport aux autres valeurs rapides des familles Poaceae et Cyperaceae.

Tableau II-4. Valeurs t½ rapides des espèces C3 et C4 appartenant aux familles Poaceae et Cyperaceae.

Classification Phylogénétique t½, s Métabolisme Ordre /Famille : Genre/espèce Juncales/Cyperaceae : Cyperus longus 0.6 C4 Cyperus alternifolius 0.7 C3 Poales/Poaceae : Coix lacryma-jobi 1.8 C4 Hordeum vulgare 2.6 C3 Zea mays 21 C4 Oryza sativa 34 C3

Facteurs « type de cinétique » et « environnement lumineux préféré » en fonction du t½ Pour le facteur « type de cinétique », la phase dominante des cinétiques biphasiques est en général plus rapide que les cinétiques de type monophasique (11.4 contre 29.1 s). Le facteur « environnement lumineux préféré » est faiblement non significatif. En l’occurrence, les espèces de plantes préférant l’ombre ou la pénombre présentent des ci- nétiques plus lentes que les autres (53.2 contre 18.9 et 20.8 s). Un échantillon plus grand serait probablement nécessaire pour déterminer l’impact de ce facteur sur la cinétique de réoxydation du pool de PQ.

II.3.a.iv Sondage de l’activité de la PQH2-oxydase au sein d’une même espèce Les résultats de l’analyse des cinétiques de réoxydation du pool de PQ au sein des diffé- rentes espèces d’Angiospermes montrent que les t½ de réoxydation varient par un facteur d’environ 300 entre les espèces. Toutefois, afin d’estimer la significativité de ces dif- férences, il est nécessaire de connaître la variabilité de ces t½ au sein d’une même espèce. Si les variations à l’intérieur d’une espèce sont petites comparées aux différences entre les espèces, alors il est possible de considérer nos résultats comme significatifs. Nous avons effectué des mesures répétées sur trois espèces avec un intervalle ǻt d’obscurité fixe (voir section II.2c et Fig. II-1 pour le protocole et Tableau II-1 pour le plan de mesures). A partir des valeurs de l’étape J de la courbe OJIP du 2e pulse, il est possible de déterminer la fraction toujours réduite du pool de PQ (section II-2.C). Il convient de rappeler que le demi-temps de réoxydation du pool de PQ (t½) est défini comme le temps nécessaire pour atteindre une fraction oxydée de 50 %.

44 Dans le cas de Ilex aquifolium (Figs. II-4 et II-5), nous disposons de deux valeurs ¨t choisies autour du t½ de 8.2 s déterminé dans le sondage des Angiospermes (Tableau II.2 et Annexe II). Pour un ¨t de 10 s entre les deux pulses de lumière rouge, les valeurs sont comprises entre 0.2 et 0.4 environ. En l’espace de 10 s d’obscurité, le pool de PQ est donc toujours réoxydé à plus de 50 % dans les feuilles de Ilex aquifolium. On peut en conclure que le ½ t du pool de PQ est en général inférieur à 10 s dans cette espèce. En laissant 3 s d’obscurité, la fraction toujours réduite du pool de PQ est générale- ment comprise entre 0.45 et 0.8 (en excluant deux valeurs extrêmes). Les valeurs mesu- rées sont donc environ égales ou supérieures à 50 %. En d’autres termes, 3 s correspond approximativement au t½ de réoxydation dans les cas les plus rapides ; dans la majorité des cas, le t½ est supérieur à cette valeur. A partir des résultats obtenus avec deux ¨t dif- férents, on peut déduire que sur les feuilles étudiées, les t½ sont compris entre environ 3 s et moins de 10 s ; les valeurs varient donc par un facteur d’environ 3. Pour Zea mays et Pisum sativum, nous ne disposons que d’un seul ¨t entre les deux pulses. Les valeurs mesurées sur Zea mays (Fig. II-6) se situent entre 0.3 et 0.6 (mis à part une valeur extrême). Celles de Pisum sativum (Fig. II-7) varient entre 0.25 et 0.75 environ. Cela indique que la vitesse de réoxydation varie dans une fourchette relativement res- treinte. On remarque que la variabilité des t½ de réoxidation semble augmenter lorsqu’on considère des plantes dont la cinétique de réoxydation du pool de PQ est plus lente. Ce- pendant, on peut supposer qu’en termes relatifs, cette variabilité reste relativement constante. On constate par ailleurs que les paramètres biotiques considérés semblent expliquer une partie de la variabilité des t½ mesurés. Ainsi, chez Pisum sativum les feuilles plus âgées ont des valeurs plus élevées (cinétique plus lente) ; cet effet n’est pas clair chez Ilex aquifolium. En outre, les plantes Ilex davantage exposées au soleil montrent des fractions rédui- tes plus élevées, ce qui indique également une cinétique de réoxydation plus lente. Chez Zea mays, ce sont les feuilles supérieures qui ont les fractions réduites les plus élevées. Ce- la signifie qu’il y a plutôt une corrélation négative entre l’activité de la PQH2-oxydase et l’exposition à la lumière. Nos résultats ne permettent pas d’estimer directement la variabilité de la cinétique de réoxydation du pool de PQ au sein des espèces d’angiospermes. Toutefois, nous pou- vons exclure que ces différences soient comparables à celles observées entre les espèces (de l’ordre d’un facteur 300). Chez Ilex aquifolium, nous avons relevé des différences d’un facteur 3 environ. Il est vraisemblable que ces différences soient du même ordre de grandeur chez les deux autres espèces considérées. Ceci permet de conclure que les variations observées entre les espèces sont significatives.

45 Ilex aquifolium 1.0 Feuilles à l'ombre Feuilles exposées au soleil Intervalle : 3 s 0.8

0.6

0.4

Fraction réduite Feuilles jeunes Feuilles âgées

0.2

0.0 020406080 Feuille

Fig. II-4. Fraction toujours réduite du pool de PQ dans des feuilles de Ilex aquifolium suite à un pulse de lumière rouge et 3 s d’obscurité. Ces mesures ont été réalisées in situ sur un arbre adulte pendant août 2007.

Ilex aquifolium 1.0 Feuilles à l'ombre Feuilles exposées au soleil 0.8 Intervalle : 10 s

0.6

Feuilles jeunes Feuilles âgées 0.4 Fraction réduite Fraction

0.2

0.0 0 204060 Feuille

Fig. II-5. Fraction toujours réduite du pool de PQ dans des feuilles de Ilex aquifolium suite à un pulse de lumière rouge et 10 s d’obscurité. Ces mesures ont été réalisées in situ sur le même arbre que dans la Fig II-4 pendant juillet 2007.

46 Zea mays 1.0 Bord de la feuille Centre de la feuille 0.8 Intervalle : 20 s

Feuilles inférieures F. moyennes F. supérieures 0.6

0.4 Fraction réduite

0.2

0.0 0 20406080100 Feuille

Fig. II-6. Fraction toujours réduite du pool de PQ dans des feuilles de Zea mays suite à un pulse de lumière rouge et 20 s. Ces mesures ont été réalisées in situ, sur un champ de Zea mays, en juin 2007.

Pisum sativum 1.0 Intervalle : 30 s

0.8

0.6

0.4 Fraction réduite Fraction

Feuilles âgées F. d'âge moyen Feuilles jeunes 0.2

0.0 0 102030405060 Feuille

Fig. II-7. Fraction toujours réduite du pool de PQ dans des feuilles de Pisum sativum suite à un pulse de lumière rouge et 30 s d’obscurité. Ces plantes ont été mesurées au laboratoire ; elles proviennent de plantes cultivées en pot dans une serre.

47 II.4. DISCUSSION

II.4.a Variabilité de la cinétique de réoxydation du pool de PQ : facteurs éco- physiologiques Dans notre sondage de la variabilité de la cinétique de réoxydation du pool de PQ après un 1er pulse saturant de lumière rouge qui réduit la chaîne de transport d’électrons, nous avons indirectement cherché à mesurer l’activité de l’enzyme PQH2-oxydase. Suite à un pulse saturant (voir protocoles double pulse, section II.2.c), la PQH2-oxydase fournit, dans ces conditions, le seul chemin permettant d’obtenir une réoxydation du pool de PQ. La rapidité de ce processus est une mesure de l’activité de l’enzyme PQH2-oxydase. Pour comprendre le rôle physiologique de cette enzyme dans les tissus végétaux, il est intéressant de savoir si son activité est déterminée par des facteurs écophysiologiques. En d’autres termes, on essaye de mieux caractériser cette enzyme. Les mesures in situ de ce sondage tiennent compte des conditions écologiques des plantes et des caractéristiques physiologiques des espèces dans chaque famille de plantes.

Variabilité entre espèces Le sondage décrit dans ce chapitre permet d’estimer dans quelle mesure l’activité de cette oxydase peut varier d’une espèce à une autre. Il a été observé que les valeurs t½ de la ci- nétique de réoxydation du pool de PQ varient par un facteur d’environ 300 entre les 63 espèces mesurées, et que ces variations sont significatives par rapport aux différences ob- servées au sein d’une même espèce (voir section II.3.iv).

Approches écophysiologiques Nous examinons dans quelle mesure il est possible d’expliquer les différences dans l’activité de la PQH2-oxydase par des facteurs écophysiologiques tels que l’exposition à la lumière, le climat, le type de sol, le type de métabolisme et la persistance des feuilles. Les trois premiers facteurs sont considérés ici comme des facteurs écologiques et les deux derniers sont considérés comme des facteurs physiologiques. Ces facteurs ont été étudiés dans ce chapitre. Les différences de cinétiques t½ observées entre les espèces pourraient donc être causées par les variations des facteurs écophysiologiques propres à chaque espèce ou famille. Pour estimer l’importance de ces facteurs, nous avons évalué à l’aide d’un test statistique la significativité des différences entre les groupes de chaque facteur (voir section II.3.a.iii). Les résultats de ce test indiquent que deux facteurs ont un impact clairement significatif sur le t½, soit le type de voie métabolique – C3, C4 ou CAM – et le type de cinétique – monophasique ou biphasique. Ces deux facteurs sont d’ordre physiologique. Comme mentionné ci-dessus, les plantes C4 et CAM montrent des valeurs de t½ extrê- mement élevées. La majorité des plantes C4 mesurées appartiennent à deux familles (Poa- ceae et Juncaceae) et la totalité des plantes CAM appartiennent à deux familles de plantes succulentes : Cactaceae et Crassulaceae. Le degré d’exposition préférée à la lumière, un

48 facteur écologique, est faiblement non significatif. Ainsi, il semble que des facteurs éco- physiologiques puissent expliquer une partie des variations de l’activité de la PQH2- oxydase entre les espèces.

II.4.b Cinétiques biphasiques Nous avons observé que certaines cinétiques de réoxydation du pool de PQ étaient biphasiques. D’un point de vue physiologique, cela pourrait signifier qu’il existe deux processus de réoxydation distincts. Toutefois, l’existence de deux enzymes accomplissant la même fonction de réoxydation du même pool de PQ paraît peu plausible. Par ailleurs, les plantes C4 possèdent bien deux types de chloroplastes, mais nous avons également ob- servé des cinétiques biphasiques chez des plantes C3. Une explication possible de l’existence de deux phases de réoxydation est que la distribution et la quantité de l’enzyme PQH2-oxydase pourraient être variables, par exemple en fonction de la profondeur de la feuille. Pour éclaircir cette question, des mesures de l’activité de l’enzyme des deux côtés de la feuille pourraient être utiles. L’obtention de résultats différents de chaque côté par rapport aux amplitudes relatives serait une indication en faveur de cette dernière hypothèse.

II.4.c Impact de la voie métabolique

Selon notre test statistique, le type de métabolisme (C3, C4 ou CAM) a un impact significatif sur l’activité de la PQH2-oxydase. Toutefois, on peut se demander s’il s’agit d’un effet évolutionnaire ou réellement métabolique. Ainsi, les familles Cyperaceae et Poaceae, qui comprennent une proportion importante d’espèces de métabolisme C4, présentent des cinétiques très rapides indépendamment de la voie métabolique. Il est donc probable que dans ces exemples, la rapidité des cinétiques de réoxydation soit davantage due à l’appartenance à une famille qu’à la voie métabolique. Vu le nombre relativement faible de familles comprenant des plantes C4 et CAM, il n’est pas possible d’attribuer l’effet ob- servé au type de voie métabolique avec certitude.

II.4.d Importance des facteurs phylogénétiques Comme les différences entre espèces sont importantes, nos résultats laissent penser que les facteurs phylogénétiques (appartenance à une espèce ou famille) jouent un rôle important dans l’activité de la PQH2-oxydase. De plus, il semble plausible que l’effet des facteurs écophysiologiques (en particulier de la voie métabolique) sur l’activité de l’enzyme puisse être expliqué au moins en partie en termes d’appartenance à une famille, c’est-à- dire par des facteurs phylogénétiques. Toutefois, ces différences entre familles ne semblent pas suivre de tendance évolu- tive claire, comme observé dans la Fig. II-3. Certaines familles proches en termes phylo- génétiques montrent des valeurs t½ rapides, comme c’est le cas des espèces appartenant aux Poaceae et Cyperaceae. Deux exceptions à cette tendance sont Zea mays et Oryza sativa (valeurs t½ plus élevées). Toutefois, ces espèces ont pour particularité d’être deux céréa- les qui ont subi un long processus de sélection au cours de leur évolution au point de de-

49 venir les céréales le plus répandues et les plus consommées par l’homme (Diamond 2005). De ces observations, nous concluons que les variations de l’activité de l’enzyme PQH2-oxydase semblent pouvoir être expliquées essentiellement par la position des espè- ces respectives dans l’arbre phylogénétique, c’est-à-dire par l’appartenance de la plante à une espèce ou une famille.

II.4.e Conclusions Les mesures de la cinétique de réoxydation du pool de PQ après un pulse saturant suivi d’une période d’obscurité variable montrent qu’il existe des différences atteignant un facteur de 300 dans l’activité de l’enzyme PQH2-oxydase entre les 63 plantes mesurées. Tou- tefois, les variations entre espèces ne semblent pas gouvernées par des sélections évoluti- ves mais plutôt aléatoires. Nous avons également observé que certains facteurs écophy- siologiques, tels que le type de métabolisme et le type de cinétique ont un impact statistiquement significatif sur l’activité de l’enzyme. Pour déterminer avec précision quels facteurs contrôlent l’activité de la PQH2-oxydase, une étude de plus grande ampleur serait nécessaire. Toutefois, notre sondage suffit à estimer une fourchette de variation de l’activité de l’enzyme ainsi qu’à identifier les facteurs pouvant influencer son fonctionnement, tels que le type de cinétique et la voie métabolique.

50 CHAPITRE III

LOCALISATION ET INDUCTION DE L’ACTIVITE DE

L’ENZYME PQH2-OXYDASE CHEZ DES ESPECES D’ANGIOSPERMES

III.1. INTRODUCTION

Bennoun (1982) a proposé l’existence d’une enzyme agissant dans la réoxydation en obscurité du pool de PQ dans le cadre d’une chaîne de type respiratoire à travers la membrane thylakoïdienne. Une candidate pour une oxydase terminale d’une chaîne respiratoire a été récemment identifiée (Carol et al. 1999, Wu et al. 1999). Cette enzyme, dénommée PTOX dans la littérature pour plastid terminal oxidase, possède une séquence génétique similaire à celle de l’oxydase alternative des mitochondries (Berthold et Stenmark 2003). Une étude de Lennon et al. (2003) a montré que l’enzyme PTOX est située principalement dans les lamelles du stroma, du côté stromal (extérieur) de la membrane. Un rôle important de cette enzyme pourrait être de réguler l’état redox du pool de PQ, en particulier sous conditions de stress (Streb et al. 2005, Shahbazi et al. 2007). Streb et al. (2005) ont proposé qu’en déviant une partie du flux d’électrons des molécules de PQH2 vers l’oxygène, l’enzyme agirait comme une sorte de « soupape de sécurité », évacuant ainsi l’excès d’électrons produits par le PSII. Rosso et al. (2006), en revanche, sont arrivés à la conclusion opposée. Une fonction établie de l’enzyme PTOX est de jouer un rôle dans la synthèse des caroténoïdes dans les chloroplastes des plantes supérieures (Carol et al. 1999, Wu et al. 1999). Avec ces observations, nous cherchons ici à déterminer si la PQH2-oxydase étudiée dans le Chapitre II est la PTOX et s’il est possible d’établir un lien entre notre PQH2- oxydase et les situations de stress. Nous avons étudié si des changements de l’activité de cette enzyme peuvent se produire, par exemple en fonction de l’intensité de la lumière, de la quantité d’eau fournie aux plantes (stress hydrique) ou de l’âge des feuilles. Ces mesures visent à compléter le sondage de l’activité de la PQH2-oxydase réalisé au chapitre précédent (section II.2.a). Nous analysons ensuite nos résultats dans le contexte de la discussion actuelle sur le rôle et la localisation de l’enzyme PQH2-oxydase.

51 III.2. MATERIELS ET METHODES

III.2.a Matériel végétal

Etude de la localisation et de l’identité PQH2-oxydase Deux espèces appartenant à la famille Ranunculaceae ont été utilisées pour cette étude : Trollius europaeus (voir Section II.2, plante in situ) et Ranunculus glacialis. La deuxième espèce a été cultivée par le Dr. P. Streb (Université Paris XI) et mesurée pour nous par le Dr. S. Z. Tóth (Centre de Recherche Biologique, Szeged). Après la germination, la croissance de Ranunculus glacialis s’est déroulée dans une chambre froide à une température de 5° et sous une intensité de lumière de 100 μmol photons m-2 s-1, soit des conditions permettant de maintenir un niveau élevé de PTOX (Prof. G. Cornic, comm. pers.).

Etude d’une possible induction de l’activité de la PQH2-oxydase chez 4 espèces d’Angiospermes Quatre espèces, parmi les 63 espèces d’Angiospermes étudiées au Chapitre II (section II.2.a), ont étés choisies ici pour l’étude d’une possible induction de l’activité de l’enzyme PQH2-oxydase : Pisum sativum (C3), Beta vulgaris (C3), Hordeum vulgare (C3) et Zea mays (C4) Après la germination, la croissance des plantes s’est déroulée pendant 6 semaines (temps expérimental) dans une serre. Les conditions expérimentales de croissance étaient les suivantes : 20-25°C pendant la journée et a14°C pendant la nuit, avec une photopériode de 16h de lumière (100 μmol photons m-2 s-1) et 8h d’obscurité.

III.2.b Matériel de mesure Les mesures ont été effectuées avec un fluorimètre Handy PEA (Hansatech Instruments Ltd., UK, voir Chapitre II, section II.2.e).

III.2.c Mesures de la fluorescence de la Chl a (protocole double pulse) Voir protocole de mesures « double pulse », chapitre II, section II.2.c et Fig. II-1. Trollius europaeus a été mesurée in situ (voir section II.2.a) alors que Ranunculus glacialis a été mesurée en laboratoire (par le Dr. S. Z. Tóth) en suivant le protocole double pulse. Les espèces Pisum sativum (C3), Beta vulgaris (C3), Hordeum vulgare (C3) et Zea mays (C4) ont été séparées deux semaines après la germination en trois groupes expérimentaux : 1. contrôle (et variations selon l’âge de la feuille), 2. variations de l'intensité de lumière et 3. stress hydrique (voir Tableau III-1). Les mesures de la fluorescence à double pulse ont été réalisées pendant trois à quatre semaines à température ambiante tous les deux à trois jours, sur des feuilles adultes âgées de deux semaines au début de l’expérience. Trois plantes de chaque espèce et de chaque groupe ont été mesurées en alternance chaque semaine.

52 Mesures en fonction de l’âge de la feuille sur les plantes contrôle Douze plantes de ce groupe ont continué à être mesurées jusqu'à la fin de l’expérience sous les conditions expérimentales mentionnées ci-dessus (16h de lumière à 100 μmol photons m-2 s-1). Ces plantes étaient arrosées chaque jour.

Mesures de plantes sous stress hydrique Douze plantes ont été arrosées, pendant 4 semaines, tous les 3 jours avec environ 1 dl d’eau seulement, soit beaucoup moins que les plantes contrôle (arrosées tous les jours), et sous les mêmes conditions lumineuses que ci-dessus (16h de lumière à 100 μmol photons m-2 s-1). La plupart des feuilles mesurées sous stress hydrique présentaient des symptômes tels qu’un enroulement des bords, un état légèrement fané ou une turgescence moindre par rapport au contrôle.

Mesures de plantes sous différentes intensités de lumière Les plantes ont été cultivées pendant une semaine (Hordeum vulgaris) ou deux semaines (Pisum sativum, Zea mays et Beta vulgaris) sous 100 umol photons m-2 s-1, avant le placement sous deux intensités de lumière différentes. Les plantes ont été par la suite mesurées durant une semaine supplémentaire sous 100, 200 et 400 μmol photons m-2 s-1 (voir exemple de Pisum sativum, Fig VI-1). Ces plantes étaient arrosées chaque jour.

53 Tableau III-1. Espèces d’Angiospermes utilisées pour les mesures de la fluorescence de la Chl a (protocole double pulse) distribuées en 3 groupes expérimentaux : 1. Contrôle 2. Intensités de lumière 3. Stress hydrique. Les plantes de chaque groupe ont été mesurées en alternance pendant le temps expérimental. Les mesures des feuilles des plantes contrôle (toujours sous une intensité de 100 μmol photons m-2 s-1) ont permis de suivre l’effet de l’âge de la feuille sur l’activité de l’enzyme.

N° de plantes de chaque groupe Espèces 1. Contrôle 2. Intensités de lumière 3. Stress hydrique 100 200 400 100 μmol photons m-2 s-1

Pisum sativum (C3)3 3 3 3

Beta vulgaris (C3)3 3 3 3

Hordeum vulgare (C3)3 3 3 3

Zea mays (C4)3 3 3 3

400 μmol photons m-2 s-1

200 μmol photons m-2 s-1

100 μmol photons m-2 s-1 (plantes contrôle)

Fig. III-1. Placement des plantes de Pisum sativum en croissance pour l’étude de l’activité de la PQH2-oxydase en fonction et de l’intensité de la lumière (100, 200 ou 400 μmol photons m-2 s-1) et de l’âge de la feuille (plantes contrôle).

54 III.3. RESULTATS

III.3.a Variation des cinétiques et type de récupération à l’obscurité de VJ Dans le chapitre précédent, nous avons mis en évidence (a) l’existence d’une large différence dans les t½ de récupération de FJ (VJ) des espèces appartenant à différentes familles d’Angiospermes, et (b) le caractère majoritairement monophasique des cinétiques de récupération. La Fig. III-2 montre 4 espèces d’Angiospermes étudiées dans le Chapitre II. On observe différents t½ de récupération de VJ ; les cinétiques sont monophasiques. Les formes des courbes sont similaires. En comparaison avec la courbe de Sorghum bicolor, les autres courbes sont seulement décalées en direction de temps plus lents, mais la forme de la courbe reste plus ou moins identique.

enter text here 1.0

0.9 Ludisia discolor 0.8 (t½ = 72 s)

J 0.7 V

0.6 Sorghum Pelargonium bicolor 0.5 hortorum (t½ = 1.2 s) (t½ = 12 s) Fagus sylvatica 0.4 (t½ = 30 s)

0.1 1 10 100 1000 Temps (s)

Fig. III-2. Différences dans la récupération en obscurité de la cinétique de l’étape J chez différentes espèces d’Angiospermes. Ces cinétiques correspondent à la récupération en obscurité de VJ avec un fit d’une seule fonction exponentielle (cinétiques monophasiques).

III.3.b Activité de la PQH2-oxydase au sein d’une même famille La Fig. III-3 montre deux plantes appartenant à la même famille des Ranunculaceae : Ranunculus glacialis et Trollius europaeus. Ces deux plantes montrent des cinétiques monophasiques similaires, avec de t½ = 40 s et 27 s, respectivement. Ces valeurs sont proches et relativement lentes par rapport aux valeurs t½ rapides trouvées dans le sondage réalisé au Chapitre II (voir exemples de la Fig. III-2).

55 1.0 1.0 Ranunculus glacialis Trollius europaeus

0.9 0.9

0.8 0.8 J V

0.7 0.7

0.6 0.6

0.5 0.5

0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 Temps (s)

Fig. III-3. Cinétiques d’adaptation à l’obscurité de VJ de Ranunculus glacialis et de

Trollius europaeus. Les valeurs VJ des courbes OJIP de la fluorescence de la Chl a (points rouges) sont approximées avec une seule fonction exponentielle (cinétique monophasique, t½ = 40 et 27 s, respectivement). N = 5 pour chaque protocole ¨t mesuré (protocole double pulse).

III.3.c Activité de la PQH2-oxydase en fonction de l’âge de la feuille et du stress hydrique Les t½ de réoxydation du pool de PQ chez les quatre espèces d’angiospermes Pisum sativum (C3), Beta vulgaris (C3), Hordeum vulgare (C3) et Zea mays (C4) ont été suivis dans le temps expérimental pour les plantes contrôle et sous stress hydrique (Fig. III-4). On n’observe pas de variation importante des t½ de réoxydation en fonction du temps expérimental, ni de différence claire entre les valeurs de plantes contrôle et de plantes sous stress hydrique. Indépendamment des cinétiques rapides (Hordeum vulgare et Zea mays) ou lentes (Pisum sativum et Beta vulgaris) de réoxydation du pool de PQ, les valeurs restent constantes, ou augmentent (dans le cas de Pisum sativum). Le fait que Zea mays est une plante C4 ne semble pas causer de différence par rapport aux plantes C3 (Hordeum vulgare, Pisum sativum et Beta vulgaris) de cette expérience. Pour Pisum sativum, les valeurs en fonction de l’âge de la feuille (plantes contrôle) montrent des valeurs t½ en légère augmentation (mis à part une valeur extrême).

56 Contrôle Pisum sativum Contrôle Beta vulgaris Stress hydrique Pisum sativum Stress hydrique Beta vulgaris

A Contrôle Hordeum vulgare B Contrôle Zea mais Stress hydrique Hordeum vulgare Stress hydrique Zea mays 100 100 90 90 80 80 70 70 60 60 50 40 50 30 pool de PQ (s) pool de PQ 20 15 1/2 t

5 5

0 0 0 5 10 15 20 25 30 03691215 Temps (jours de traitements)

Fig. III-4. Evolution temporelle de l’activité de la PQH2-oxydase (exprimée par le t½) en fonction de l’âge des feuilles contrôle et des feuilles sous conditions de stress hydrique. Les feuilles contrôle sont représentées par des symboles fermés et les feuilles sous stress hydrique par des symboles ouverts chez quatre espèces d’Angiospermes. (A) Pisum sativum et Hordeum vulgare. (B) Zea mays et Beta vulgaris. N = 5 pour chaque protocole de ¨t mesuré (protocoles double pulse).

III.3.d Activité de la PQH2-oxydase en fonction de l’intensité de la lumière Afin d’évaluer la variabilité de l’activité de l’enzyme en fonction l’intensité de la lumière chez les quatre espèces de plantes, des valeurs de t½ de la PQH2-oxydase ont été obtenues à partir des mesures de double pulse et représentés dans le Tableau III-2. Les résultats montrent qu’il n’y a pas de tendance de variabilité claire dans les valeurs de t½ de réoxydation du pool de PQ ; les valeurs mesurées ne permettent pas de mettre en évidence une dépendance entre l’activité de l’enzyme PQH2-oxydase et l’intensité de la lumière. Aucune des espèces ne montre de tendance importante. Afin de vérifier la fiabilité des résultats obtenus, des graines ont été mises à germer une deuxième fois afin de répéter l’expérience sous les mêmes conditions ; les valeurs des deux expériences étaient très similaires (valeurs non montrées). Une moyenne des valeurs des deux expériences a été calculée et est montrée dans le Tableau III-2.

57 Tableau III-2. Valeurs de t½ de la cinétique de l’enzyme PQH2-oxydase pour la réoxydation du pool de PQ pour quatre espèces de plantes : Pisum sativum, Beta vulgaris, Zea mays, Hordeum vulgare. Ces valeurs représentent la moyenne de deux expériences indépendantes. Les mesures ont été faites après une semaine d’adaptation des plantes aux trois intensités de lumière. N = 10 pour chaque ¨t mesuré.

Intensité de lumière t½ (s) (μmol photons m-2 s-1) Pisum sativum Beta vulgaris Zea mays Hordeum vulgare 100 27 ± 3.0 70 ± 7.9 9.2 ± 0.7 3.9 ± 0.6 200 36 ± 0.7 72 ± 20.9 7.2 ± 1.8 3.2 ± 0.2 400 19 ± 1.2 67 ± 7.3 9.2 ± 0.2 2.7 ± 0.4

58 III.4. DISCUSSION

III.4.a Impact de la luminosité, de l’âge de la feuille et du stress hydrique sur

l’activité de la PQH2-oxydase Les résultats présentés dans la Fig. III-3 et le Tableau III-2 ne permettent pas de mettre en évidence un effet de ces facteurs sur l’activité de l’enzyme PQH2-oxydase. En particulier, l’âge de la feuille ne semble pas avoir d’impact sur l’activité de l’enzyme. Toutefois, les observations faites dans les Figs. II-4 à 7 du chapitre II indiquent que les feuilles âgées présentent, pour un ƅt donné, des fractions réduites du pool de PQ plus élevées, c’est-à-dire des t½ de réoxydation plus lents. Il est possible que les différences entre feuilles jeunes et âgées observées dans les Figs. II-4 à 7 du Chapitre II soient dues non à l’âge lui-même mais à l’ordre de croissance des feuilles. Il est par exemple concevable que les feuilles poussant en premier présentent des activités de PQH2-oxydase plus élevées que celles générées par la suite, peut-être en raison de concentrations différentes de cette enzyme. Par ailleurs, l’ordre de croissance affecte également le placement des feuilles sur la plante ; dans les plantes mesurées, les feuilles jeunes étaient situées dans la partie supérieure de la plante. Ainsi, les feuilles dites « âgées », en raison de leur situation dans la partie inférieure des plantes, reçoivent moins de luminosité que les feuilles jeunes. Il est donc également possible que les différences mesurées soient dues en réalité à des différences de luminosité et non d’âge. Toutefois, cette dernière hypothèse serait en contradiction avec les observations faites dans les Figs. II-4 à 6, selon lesquelles les feuilles exposées au soleil ou situées dans la partie supérieure de la plante présentent des demi-temps (t½) de réoxydation du pool de PQ plus lents (c’est-à-dire des fractions réduites plus élevées) que celles situées à l’ombre.

III.4.b Concentration de PTOX et cinétique de récupération de VJ Streb et al. (2005) ont montré que l’espèce Ranunculus glacialis, adaptée aux conditions extrêmes de haute montagne, présente des concentrations de PTOX élevées par rapport à des plantes de plaine. Placée dans des conditions tempérées (22°C) et de basse intensité lumineuse, la concentration de PTOX baisse de manière marquée pour atteindre des niveaux comparables à ceux observés sur d’autres espèces de la même famille. Ces observations ont permis aux auteurs d’envisager un rôle comme chemin alternatif pour des électrons à partir de PQH2 avec l’enzyme PTOX comme intermédiaire face à des situations de stress (particulièrement thermique ou lumineux). Il convient également de noter que Streb et al. (2005) ont trouvé des niveaux de PTOX bas chez Trollius europaeus, que nous employons comme espèce de référence ici. Les plantes de Ranuculus glacialis mesurées ici ont été maintenues dans des conditions capables de maintenir des niveaux de PTOX élevés (G. Cornic, comm. pers.) Nos observations, basées sur des moyennes de 5 mesures, montrent un t½ de

59 réoxydation du pool de PQ de 40 s chez Ranunculus glacialis. Cette valeur est plus élevée que celle de Trollius euroapeus et aussi plutôt élevée comparée aux t½ d’autres espèces de la même famille (voir Fig. III-3 et Tableau II-2). Ainsi, la présence d’une forte concentration en PTOX ne semble pas jouer de rôle dans la vitesse de réoxydation du pool de PQ en obscurité suite à un pulse de lumière. Nos observations, en revanche, sont en accord avec celles de Rosso et al. (2006).

III.4.c Localisation de l’enzyme PQH2-oxydase Les résultats d’études précédentes ont montré que l’enzyme PTOX, responsable de la réoxydation du pool de PQ en obscurité, est majoritairement située dans les lamelles du stroma des membranes thylakoïdiennes (Lennon et al. 2003). Nos mesures de l’activité de la PQH2-oxydase chez des espèces d’Angiospermes ont permis de calculer des t½ variables d’une espèce à l’autre, avec des valeurs comprises entre 0.6 et 170 s (section II.2.a). Le demi-temps du transport d’électrons linéaire par le Cyt b6/f varie entre 5 ms (pool de plastoquinone réduit) et 20 ms (pool de plastoquinone plutôt oxydé ; Kramer et al. 1999). Or, même chez les plantes où l’activité de la PQH2- oxydase est particulièrement élevée, le transport linéaire n’est pas concurrencé par l’activité de la PQH2-oxydase. Si notre PQH2-oxydase était la PTOX, cela impliquerait une diffusion des molécules de PQH2 entre les grana – où se trouvent les pools de PQ – et les lamelles du stroma – où se trouve la PTOX. Le caractère exponentiel et monophasique des cinétiques (rapides et lentes, voir Fig. III-2) est en contradiction avec une diffusion des molécules de PQH2 entre grana et stroma. En effet, les courbes exponentielles et monophasiques sont typiques d’une réaction enzymatique et non d’un processus de diffusion, suggérant plutôt que l’enzyme responsable de la réoxydation est proche du pool de PQ. Or, celui-ci est situé dans les grana (Albertsson 2001), donc loin des lamelles du stroma.

III.4.d Identité de la PQH2-oxydase L’ensemble des observations réalisées jusqu’ici laissent penser que les processus de réoxydation observés dans notre expérience pourraient être dus à une enzyme autre que PTOX. Plusieurs arguments mènent à cette conclusion. Premièrement, nous avons observé que les hautes concentrations de PTOX chez Ranunculus glacialis, résultant possiblement d’une adaptation au stress lumineux et thermique, ne sont aucunement corrélées avec une activité élevée de la PQH2-oxydase en obscurité (section III.1.b). Un deuxième argument résulte des types de t½ de réoxydation observées. La majorité des cinétiques sont monophasiques et exponentielles, et nous n’observons pas de composante de diffusion. Or, le placement de PTOX dans les lamelles du stroma (Lennon et al. 2003) implique que les molécules de PQH2 devraient diffuser des grana au stroma pour être oxydées, avant de revenir dans les grana. Sur la base de nos résultats, cette hypothèse paraît peu probable.

60 Sur la base de ces arguments, nous proposons que l’enzyme étudiée dans cette thèse et dénommée PQH2-oxydase n’est pas l’enzyme PTOX, mais plutôt qu’il s’agit de deux enzymes différentes, accomplissant également des fonctions différentes.

III.4.e Origine et rôle possibles de la PQH2-oxydase Dans son hypothèse d’origine, Bennoun (1982) supposait que les plantes supérieures contenaient une chaîne respiratoire similaire à celle des cyanobactéries. Les cyanobactéries renferment au moins 4 oxydases terminales différentes (Pils et al. 2004, Hart et al. 2005). Cependant, plusieurs de ces enzymes prélèvent leurs électrons de la PC ou du Cyt c, ce qui semble peu probable chez les végétaux supérieurs. Une étude réalisée sur des feuilles de Pisum sativum traitées au DBMIB a montré que la réoxydation du pool de PQ n’était pas ralentie (Schansker et al. 2005). Pour cette raison, les oxydases acceptant des électrons de la PC sont des candidates peu plausibles pour accomplir le rôle de PQH2-oxydase chez les plantes supérieures. En revanche, un gène codant une oxydase bd-quinol a été détectée chez plusieurs espèces de cyanobactéries (Pils et al. 2004, Hart et al. 2005) ; cette oxydase pourrait être une candidate alternative au rôle de PQH2-oxydase. Des études récentes ont discuté la question de l’existence possible d’un chemin alternatif de transport d’électrons au moyen de la PQH2-oxydase (Streb et al. 2005, Rosso et al. 2006). Dans cette discussion, nos observations sont plutôt en accord avec celles de Rosso et al. (2006), qui ont montré que la PQH2-oxydase ne joue pas de rôle de soupape de sécurité en conditions de stress. En effet, l’activité de la PQH2-oxydase est beaucoup plus lente que celle du complexe Cyt b6/f dans le processus de réoxydation du pool de PQ (voir section III.4.d). Il semble donc physiquement impossible que la PQH2-oxydase puisse fournir une alternative significative au transport linéaire d’électrons. Un rôle possible de la PQH2-oxydase découle d’observations faites par Yoshida et al. (2007). Ceux-ci ont observé que le mutant pgr5 d’Arabidopsis thaliana (dans lequel le transfert d’électrons de Fdred à la PQ est supposé être inactif) possède un stroma particulièrement réduit. Ceci se reflète par exemple dans une activité plus élevée de l’enzyme NADP-MDH, dont l’activité est contrôlée par l’état redox de la ferrédoxine (Martin et al. 2000, Scheibe 1990). Les auteurs de l’étude ont également observé qu’un plus grand nombre d’équivalents réducteurs sont exportés vers les mitochondries chez ce mutant, induisant une augmentation de l’activité de l’oxydase alternative des mitochondries. Ces résultats indiquent clairement qu’un stroma réduit a des conséquences physiologiques pour les chloroplastes. L’étude de Yoshida et al. (2007) laisse penser qu’un rôle important de la PQH2-oxydase pourrait être de maintenir le stroma dans un état suffisamment oxydé en obscurité, dans le but de réguler l’activité de plusieurs enzymes. En effet, certaines enzymes du stroma sont maintenues inactives en obscurité grâce au stroma oxydé (Chapitre I, section I.1.e, Martin et al. 2000, Scheibe 1990). Les observations de Yoshida et al. (2007) montrent qu’un stroma plus réduit maintiendrait ces enzymes dans un état actif. Plus généralement, les grandes variations observées dans l’activité de la PQH2- oxydase semblent indiquer que cette enzyme ne joue pas de rôle physiologique dont la rapidité est essentielle à la survie de la plante. Il est probable que la PQH2-oxydase soit 61 active dans des processus où la cinétique ne joue pas un rôle capital. Ces réflexions sont en accord avec l’hypothèse selon laquelle un des rôles de la PQH2-oxydase serait de contribuer à maintenir le stroma oxydé dans l’obscurité ; un tel processus est probablement peu sensible à des variations de l’activité de la PQH2-oxydase telles qu’observées dans notre sondage.

62 CHAPITRE IV

PHENOMENOLOGIE DE LA DEFICIENCE EN MAGNESIUM ET EN SULFATE DE BETA VULGARIS

IV.1. INTRODUCTION

Pour leur développement, les plantes ont besoin d’obtenir par leur alimentation des nutriments dits « essentiels » (voir Introduction générale, section I.3). Chacun de ces nutriments est nécessaire à l’accomplissement de fonctions vitales spécifiques, dont certaines sont liées à la photosynthèse. Dans ce chapitre, des expériences ont été menées avec deux nutriments essentiels, 2+ 2- le magnésium (sous forme de Mg ) et le soufre (sous forme de sulfate SO4 ). Ces deux éléments jouent un rôle dans les processus photosynthétiques : le magnésium est un constituant central de la molécule de Chl (Bock et al. 1994, Glusker et al. 1999), tandis que le soufre est présent dans plusieurs protéines actives dans les réactions biochimiques de la photosynthèse (Hopkins 1999). Ainsi, en appliquant des traitements déficients en l’un de ces nutriments, il est possible de manipuler de manière ciblée certaines fonctions photo- synthétiques. Hermans et al. (2004) ont mené des expériences de déficience en magnésium sur des plantes de betterave sucrière (Beta vulgaris L.) et ont observé, en plus d’une perte de biomasse, une diminution du nombre d’antennes du PSII ainsi qu’une perte de centres réactionnels du PSI. Plusieurs expériences induisant une déficience en soufre ont égale- ment mis en évidence des effets sur le contenu de Chl et sur le rendement photosynthéti- que (Lencioni et al. 1997, Kastori et al. 2000, Bouranis et al. 2003). Dans ce chapitre, nous avons cherché à reproduire ces observations sur des plantes de Beta vulgaris en croissance hydroponique avec une variation du contenu de magnésium de 0 à 1 mM. En plus de la carence en magnésium, nous avons étudié l’effet d’une déficience en soufre, avec une 2- concentration de SO4 variant entre 2.1 μM et 1.88 mM. Cette expérience a pour but de déterminer s’il est possible de modifier les quantités de PSI et/ou de Chl présentes dans les feuilles. Nous présentons ici le déroulement de nos expériences et leurs résultats, en détail- lant l’ensemble des effets des traitements sur la physiologie des plantes étudiées. Les ré- sultats de plusieurs protocoles visant à mesurer différentes fonctions photosynthétiques sont également analysés. Ces observations serviront de base pour les analyses menées dans les chapitres suivants.

63 IV.2. MATERIELS ET METHODES

IV.2.a Matériel végétal et culture en conditions hydroponiques Des graines de Beta vulgaris (var. altissima, fournies par le Jardin botanique de Genève) ont été rincées plusieurs fois à l’eau distillée et mises à germer pendant une semaine dans des pots plastiques de 5 L contenant du terreau commercial de tourbe. Trois jours après la germination, des plantules similaires en taille et en état de développement ont été trans- férées pour trois semaines dans quatre bacs contenant chacun 4 L de solution nutritive complète (solution contrôle). La culture en milieu liquide, telle qu’appliquée dans cette expérience, consiste à placer une plantule dans un trou (voir flèche rouge, Fig. IV-1 C) percé dans un couvercle de polystyrène placé sur un bac. Les racines se développent ainsi dans la solution nutritive du bac. Il faut noter que la solution a dû être renouvelée réguliè- rement (tous les 4 jours) afin de maintenir les éléments nutritifs, le pH et l’oxygène néces- saires à la croissance des plantes. La Fig. IV-1 présente les conditions de croissance en solution nutritive dans les 4 bacs des plantes étudiées dans cette expérience. Après 2-3 semaines dans la solution con- trôle, un transfert des plantes dans des solutions contrôle et de traitement a été fait. Le jour de ce transfert est le jour 0 de l’expérience. Un seul bac contenait la solution con- trôle jusqu’à la fin de l’expérience, pendant que les trois autres bacs contenaient des solu- 2+ 2- tions différenciées, en Mg et/ou en SO4 , par rapport au bac contrôle.

Solution nutritive complète (contrôle) La composition de la solution hydroponique contrôle a été ici légèrement modifiée à partir de Cakmak et al. (1994). La solution contrôle contenait les composants suivants : Macronutriments : Micronutriments : Ca(NO3)2·4H2O (2 mM) NaCl (10 μM) KH2PO4 (0.25 mM) (NH4)6Mo7O24 (0.01 μM) K2SO4 (0.88 mM) H3BO3 (10 μM) MgSO4·7H2O (1 mM) CuSO4·5H2O (0.10 μM) MnSO4·H2O (1 μM) ZnSO4 (1 μM) FeEDTA (20 μM) Le pH de la solution a été ajusté à 5.6-5.8.

64 Solutions nutritives déficientes en soufre et/ou en magnésium (traitements) Trois solutions nutritives hydroponiques ont été utilisées comme traitements : 1. Traitement DS : possédant environ la moitié de la dose de sulfate (demi-sulfate) du contrôle : 0.88 mM de K2SO4 ont été remplacés par 1.75 mM de KNO3 (cf. Gilbert et al. 1997), portant la concentration de sulfate à 1 mM au lieu de 1.88 mM dans le contrôle. 2- 2. Traitement TS : contenant seulement des traces de sulfate (2.1 PM de SO4 ) par rapport au contrôle : 0.88 mM de K2SO4 et 1 mM de MgSO4·7H2O ont été rem- placés par 1.75 mM KNO3 et 1 mM de MgCl2·6H2O, respectivement (cf. Gilbert et al. 1997). 3. Traitement SM : sans magnésium et avec environ la moitié de la dose de sulfate du contrôle : 1 mM de MgSO4·7H2O a été remplacé par 1 mM de Na2SO4 et 0.88 mM de K2SO4 par 1.75 mM KNO3 (cf. Cakmak et al. 1994). 2+ 2- Les concentrations totales de Mg et de SO4 dans le contrôle et leur diminution ou absence dans les traitements sont présentées dans le Tableau IV-1. On peut remar- 2+ 2- quer que la variation de la quantité de Mg et de SO4 est déterminée par les macronutriments K2SO4 (0.88 mM) et MgSO4·7H2O (1 mM), car la composition des micronutriments ne varie pas.

65 Tableau IV-1. Conditions minérales de croissance des plantes en solutions hydroponiques : contrôle et traitements. La colonne I présente les noms des traitements de croissance des plantes de Beta vulgaris ; la colonne II contient les symboles correspondants. Ces noms ou symboles (marqués en italique dans la colonne I et II) sont utilisés dans toutes les légendes et commentaires des figures et des tableaux des chapitres concernés. La colonne III 2+ 2- montre uniquement les concentrations totales approximatives de Mg et de SO4 . Ces concentrations sont les seules à changer dans les traitements ; les autres minéraux dans les solutions hydroponiques des traitements restent identiques par rapport au contrôle.

I II III Solutions hydroponiques Symboles Concentrations (mM) de 2+ 2- utilisés Mg et de SO4 2- Contrôle : solution nutritive complète C ~1.88 mM SO4 , 1 mM Mg2+ 2- Traitement « Demi-sulfate » : DS ~1 mM SO4 , 2- 2+ ~½ concentration de SO4 par rapport au con- 1 mM Mg trôle 2- Traitement « Traces de sulfate » : TS ~2.1 μM SO4 , 2- 2+ presque sans SO4 par rapport au contrôle 1 mM Mg 2- Traitement « Sans magnésium » : SM 1 mM SO4 , 2- 2+ ~½ concentration de SO4 par rapport au con- 0 mM Mg trôle, et sans Mg2+

66 Fig. IV-1. Culture hydroponique de Beta vulgaris. Des plantes de Beta vulgaris ont été cul- tivées dans quatre bacs contenant chacun une solution nutritive différente dans une serre à température de 20-25°C pendant la journée et ~14°C pendant la nuit, avec une photopériode de 16h de lumière / 8h d’obscurité. L’intensité lumineuse de ~200-220 μmol photons m-2s-1 a été surveillée par des mesures régulières et maintenue en adaptant la distance entre les feuilles et la source de lumière pendant la croissance des plantes. La lumière additionnelle était fournie par des lampes de 400 W (OSRAM HQIT). Chaque bac à 4 L de solution hydroponique contenait 40 plantes. Les traitements des plantes ont été menés pendant 4 semaines, du jour 0 (début du traitement) jusqu’au jour 29 (fin des traitements). Cette période représente le temps expérimental de cette expérience.

C DS TS SM

B C A. Contrôle et traitements en culture hydroponique de Beta vulgaris, jour 0. B. Les plantes en culture hydroponique après 5 jours de traitement. C. Les plantes placées sur un plateau de po- lystyrène expansé avec les racines (flèche rouge) dans la solution hydroponique du bac. D. 2e paire de feuilles (flèches creuses) et 3e paire de feuilles (flèches pleines). Sur ces deux paires de feuilles, des mesures de Chl et des paramètres photosynthétiques dans le temps D expérimental ont été réalisées.

67 IV.2.b Equipement de mesures

Chlorophyll Content Meter L’appareil montré dans la Fig. IV-2 A, le « Chlorophyll Content Meter » (modèle CL-01, Hansatech Instruments Ltd, UK), a été employé pour les mesures de quantité de Chl relative (Chl rel) sur des feuilles intactes de Beta vulgaris. Tous les deux ou trois jours, des mesures ont été faites dans l’obscurité sur la 2e et la 3e paire de feuilles des plantes contrôle et des traitements. Cet instrument détermine des valeurs relatives de Chl en utilisant des mesures de transmission à double longueur d'onde d'absorbance (620 nm et 940 nm) sur des feuilles. La valeur relative de Chl est montrée dans les unités de la gamme 0 - 2000. Les mesures prennent moins de la moitié d’une seconde, et un maximum de 60 mesures peuvent être faites, avec la possibilité de calculer la valeur moyenne. A la fin de l’expérience (jour 29), ces mesures de valeurs de Chl relative ont été calibrées contre des valeurs du contenu de Chl obtenu par extraction.

A B

Fig. IV-2. A. Chlorophyll Content Meter, utilisé pour suivre le contenu de Chl in vivo durant l’expérience. B. Spectrophotomètre. Appareil employé pour mesurer le contenu de Chl obtenue par extraction à l’acétone à 80% v/v. Ces mesures ont été réalisées sur des feuilles récoltées à la fin de l’expérience (jour 29).

Spectrophotomètre La quantité de Chl dans un tissu végétal peut être détectée par spectrophotométrie. Cette technique nécessite une extraction de la Chl à l’acétone (80% v/v) et l’emploi d’un spec- trophotomètre Lambda 3 UV/Vis (Perkin-Elmer, Zoug, Suisse, voir Fig. IV-2 B). Pour mesurer la quantité de Chl a et b par extraction, trois disques de 5 mm de diamètre ont été découpés de chaque paire de feuilles à l’aide d’un d’emporte-pièce en métal. Ces disques ont été ensuite placés dans une éprouvette en plastique contenant une bille de verre, à laquelle on a ajouté de l’azote liquide. Le tout a été ensuite passé au vortex (Genie 2, Bender et Hobein AG, Zurich, Suisse) jusqu’à obtention d’une poudre. Trois millilitres d’acétone à 80% v/v (Merck, Bâle, Suisse) ont ensuite été ajoutés à cette poudre et le mélange a été passé au vortex pendant 30 s afin de dissoudre la Chl. Le tout

68 a ensuite été transvasé dans une éprouvette en verre (tube-échantillon sans bille de verre) et centrifugé (Universal/K25, Hettick, Tuttlingen, Allemagne) à 4000 rotations par mi- nute pendant 8 minutes. Un dépôt s’est formé au fond de chaque tube-échantillon, contenant des déchets de cellules. Dans la partie soluble se trouvait la Chl extraite. Cette partie soluble a été trans- férée dans un tube à spectrophotomètre. Après avoir étalonné le spectrophotomètre pour l’acétone, l’absorption de chaque échantillon a été mesurée à 647 et 664 nm (Porra et al. 1989). Le spectrophotomètre se base sur un principe dérivé de la loi de Beer-Lambert :

A = [Chl ]· ƥABS · I

où : A = absorbance ; [Chl ] = concentration de Chl dans l’échantillon ; ƥABS = coefficient d’absorption de la Chl (constante pour les conditions données) et I = constante liée à l’épaisseur de la cuvette contenant l’échantillon traversé par la lumière. Les tubes ont étés constamment protégés de la lumière pendant toute l’expérience afin de limiter autant que possible la dégradation de la Chl.

PEA Senior Le fluorimètre PEA Senior (Fig. IV-3) utilisé est un prototype de l’année 2001 fabriqué par Hansatech Ltd., UK. Cet instrument permet de réaliser des mesures simultanées de la fluorescence de la Chl a et de la transmission à 820 nm. PEA Senior, tout comme Handy PEA (voir chapitre II), est composé de trois accessoires (Fig. IV-3) : le clip, le boîtier (unité de contrôle) et la tête de mesure de la fluorescence de Chl a (avec, en plus, un détecteur de la transmission à 820 nm dans le cas de PEA Senior). Pour PEA Senior, la première valeur pour les changements de la transmission est enrégistrée à 400 μs. L’intensité de lumière d’excitation maximale est de 1800 μmol photons m-2 s-1. Cette lumière est produite par quatre diodes électrolumines- centes rouges (longueur d’onde de 650 nm, comme pour Handy PEA). La lumière rouge lointaine continue permet d’exciter de manière préférentielle le PSI. La source de lumière rouge lointaine est une diode QDDH73520 (Quantum Devices Inc.), filtrée à 720 ± 5 nm. La lumière employée pour mesurer les changements d’état redox du PC, du P700 et de la Fd est modulée (33.3 kHz), filtrée à 830 ± 20 nm, et est fournie par une diode OD820 (Opto Diode Corp.). La lumière transmise à 820 nm est détectée de l’autre côté de la feuille (Fig. IV-3). L’exécution de commandes telles que la mise sous et hors tension des diodes prend environ 250 μs. La mise sous tension de la lumière rouge et le début de la mesure sont syn- chronisés. Pour la lumière rouge lointaine, il y a un décalage de 250 μs entre la mise sous tension de la lumière et le début de l’enregistrement. Chaque mesure comprend trois parties. D’abord, la transmission est mesurée sans amplification, afin d’obtenir une valeur de transmission totale (I). La transmission est ensuite mesurée avec une amplification d’un facteur de 50, puis ajustées ; cette mesure fournit une valeur de transmission à t = 0 s. Cette étape est suivie de mesures cinétiques.

69 La programmation des mesures du PEA Senior est très flexible. Le PEA Senior permet de suivre les mesures en temps réel.

Détecteur de tramsmis- sion à 820 nm

Clip feuille

Tête de mesure de fluorescence

Transmission à 820 nm (PSI) Fluorescence directe (PSII)

Unité de contrôle

Fig. IV-3. Pea Senior. Photo d’après la thèse de Szilvia Z. Tóth (2007).

70 IV.2.c Mesures du matériel végétal Dans cette expérience, les mesures ont été réalisées sur des feuilles intactes et adaptées à l’obscurité de plantes de Beta vulgaris sous contrôle et sous traitements en culture hydroponique (voir Tableau IV-1), âgées de 27 jours au début des traitements (jour 0). Les feuilles des plantes mesurées étaient en bon état physiologique au début de l’expérience. L’appareil de mesures utilisé était toujours placé sur le même endroit de chaque feuille au moment des mesures. Les mesures ont été réalisées sur deux paires de feuilles : x la 2e paire, déjà développée au moment du transfert des plantes dans les solutions hydroponiques des traitements; x la 3e paire, formée pendant les traitements. Les feuilles de la 2e paire, âgées de 10 jours au début des traitements, ont été suivies entre le jour 0 et le jour 29. Celles de la 3e paire, formées pendant les traitements, ont été suivies entre le jour 14 (début des mesures) et le jour 26 (fin des mesures pour la 3e paire de feuilles).

IV.2.d Mesures répétées pendant le temps expérimental Pendant le temps expérimental, les mesures suivantes ont été réalisées sur la 2e et la 3e paire : x Chl relative (Chl rel, section IV.2.f ). x Plusieurs protocoles de mesures d’émission de la fluorescence de la Chl a et de la transmission à 820 nm (section IV.2.g) : protocole « réduction-oxydation- réduction » de la chaîne de transport d’électrons, protocole de re-réduction de P700+ et PC+ après un pulse de lumière rouge lointaine, et un protocole d’adaptation à la lumière (non analysé ici). Ces mesures ont été effectuées tous les deux à trois jours.

IV.2.e Mesures réalisées seulement une fois pendant l’expérience Les mesures suivantes ont été effectuées une seule fois pendant l’expérience : x la résistance du Cyt b6/f au flux d’électrons entre le pool de PQ réduit et le PSI en utilisant des feuilles traitées avec du méthylviologène (jour 29)

x la dépendance de la courbe OJIP (F300, FJ et FI) à l’intensité de la lumière pour la construction des courbes de saturation en fonction des traitements (jour 27) x l’induction de la photosynthèse, suivie par six pulses de lumière de 10 s consé- cutives avec 30 s d’obscurité entre les pulses (jour 22) x les spectres d’émission de la fluorescence de Chl a à 77 K (jour 28) x la quantité de Chl par extraction à l’acétone (feuilles récoltées le jour 29, section IV.2.f) x le poids sec et humide (jour 29).

71 A l’exception des autres mesures qui ont été faites seulement sur la 2e et la 3e paire de feuilles, les mesures du poids sec et humide ont été faites sur l’ensemble de la plante (racines, bulbe et feuilles-tiges).

IV.2.f Mesures de la quantité de Chl

Chl relative (Chl rel) Ces mesures destinées à suivre le contenu de Chl en fonction du temps expérimental ont étés réalisées avec un « CL-01 Chlorophyll Content Meter » (pour les détails de l’appareil de mesures, voir section IV.2.b), tous les deux à trois jours (temps expérimental) sur la 2e et la 3e paire de feuilles des plantes contrôle et de plantes sous traitements. Les mesures de la Chl rel, réalisées en obscurité, étaient décalées d’une heure par rapport aux mesures des paramètres photosynthétiques afin d’éviter toute interaction entre les mesures. Dans une étude précédente, des mesures de la Chl rel ont été effectuées sur des feuilles non adaptées à l’obscurité (dans les serres illuminées) ; les résultats mon- traient beaucoup de variations dans le temps expérimental. Ceci nous a amenés à réaliser nos mesures de Chl rel dans l’obscurité dans cette expérience.

Chl par extraction à l’acétone (80% v/v) La quantité de Chl a également été déterminée en utilisant un spectrophotomètre (voir section IV.2.b) et en suivant la méthode de Porra et al. (1989). La récolte des feuilles pour l’extraction des pigments a été effectuée à la fin de l’expérience (jour 29 du traitement) ; 7 paires de feuilles de la 2e et 3e paire de chaque traitement ont été prélevées. Ces feuilles ont été surgelées dans de l’azote liquide et mesurées dix semaines plus tard. Il y avait ainsi 14 paires de feuilles pour chaque traitement, appartenant à 7 plantes différentes, qui ont été utilisées pour déterminer le contenu de Chl par extraction à l’azote liquide et à l’acétone à 80%. Les équations utilisées pour convertir l’absorption des échantillons à 664 nm (A664) et à 647 nm (A647) en concentrations de chlorophylle (μg/ml) par extraction à l’acétone sont les suivantes (Porra et al. 1989) : Chl a = 12.25 A664 – 2.55 A647

Chl b = 20.31 A647 – 4.91 A664

Chl a + b = 17.76 A647 – 7.34 A664

72 IV.2.g Mesures de paramètres photosynthétiques

Protocole réduction-oxydation-réduction (ROR) Un protocole à été conçu pour la création d’une transition de la chaîne de transport d’électrons de l’état complètement oxydé à l’état complètement réduit. Le même protocole a permis de mesurer la phase IP de la courbe OJIP. Ce protocole fournit aussi les courbes OJIP des feuilles avec des chaînes de transport d’électrons adaptées à l’obscurité et oxydées par un pulse rouge lointain (RL). Les trois pulses de lumière utilisés (voir Fig. IV-4) dans ce protocole de réduction- oxydation-réduction (ROR) sont : un 1er pulse rouge de 1800 μmol photons m-2 s-1, un pulse RL de 200 μmol photons m-2 s-1 et un 2e pulse rouge de 1800 μmol photons m-2 s-1. Les panneaux A et B présentent les courbes OJIP induites par les pulses de lumière rouge (cf. section I.2.a pour l’interprétation des courbes OJIP). La Fig. IV-4 C-E montre les trois mesures de la transmission utilisées pour déterminer l’amplitude maximale de la transmission à 820 nm. Dans l’obscurité, PC et P700 sont à l’état réduit tandis que PQ, QA, QB et le côté accepteur du PSI (clusters fer-soufre, Fd) sont oxydés. Le panneau C montre l’effet d’un premier pulse rouge de 0.7 s : une oxydation initiale de PC et P700, suivie 20 ms plus tard d’une re-réduction par des électrons arrivant du PSII. Le résultat final est une chaîne de transport d’électrons réduite, car l’enzyme FNR est inactive en obscurité. Dans la Fig. IV-4 D intervient un pulse RL de 15 s qui suit le 1er pulse rouge. La lumière RL excite préférentiellement le PSI, ce qui a pour conséquence d’évacuer les élec- trons de la chaîne de transport d’électrons. Durant la première seconde d’illumination par lumière RL, il n’y a pas de changements dans le signal de la transmission, car pendant ce temps seul le pool de PQ devient oxydé. Seulement après l’oxydation du pool de PQ, la PC et le P700 deviennent oxydés. La Fig. IV-4 E montre l’effet d’un 2e pulse de lumière rouge (2 s). En quelques centaines de ms, la chaîne de transport d’électrons passe d’un état oxydé à un état réduit. Comme indiqué dans le panneau E, la différence entre l’état oxydé et réduit est défini comme l’amplitude maximale (ƅImax) qui est utilisée comme une mesure du contenu total de P700 et PC. La Fig. IV-5 montre le principe de la technique des mesures de la transmission à 820 nm. P700+ et PC+ absorbent la lumière à 820 nm mieux que le P700 et la PC. Cette différence est représentée dans la Fig. IV-5 A par un plus petit nombre de flèches rouges verticales qui traversent la feuille en présence de P700+ et PC+ qu’en présence de P700 et PC. La Fig. IV-5 B montre le même type de signal de la transmission à 820 nm que la Fig. IV-4 C.

73 1er pulse rouge pulse rouge lointain 2e pulse rouge 0.7 s, 1800 µmol photons m-2 s-1 15 s, 200 µmol photons m-2 s-1 2 s, 1800 µmol photons m-2 s-1 1600 1600 (u.a.) a 1200 A 1200 B

800 800

400 400 Fluorescence de laChl

0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000

2000 2000 2000 max I

1600 1600 1600 '

820nm C I D E

1200 1200 1200 Ampl. maximale = maximale Ampl. 800 800 800 1 10 100 1000 1 10 100 1000 10000 1 10 100 1000 Temps (ms)

Fig. IV-4. Protocole réduction-oxydation-réduction (ROR). Les courbes de la fluorescence de la Chl a et de la transmission à 820 nm sont montrées sur une échelle logarithmique. Le protocole consiste en trois pulses de lumière : un 1er pulse rouge de 1800 μmol photons m-2 s-1; un pulse RL de 200 μmol photons m-2 s-1; et un 2e pulse rouge de 1800 μmol photons m-2 s-1. Les panneaux A et B montrent les deux courbes de la fluorescence de la Chl a mesu- rées pendant les deux pulses de lumière rouge. En C, D et E sont représentées les trois courbes de la transmission (I820) mesurées pendant chaque phase du protocole. Le panneau E

montre comment l’amplitude maximale réductible/oxydable (ƅImax) est dérivé de la diffé- rence entre le niveau maximal (chaîne de transport d’électrons réduite) et minimal (chaîne de transport d’électrons oxydée) de la transmission induite par le 2e pulse rouge.

74 A B Lumière modulée à 820 nm ~820 nm ~820 nm P700P700 P700 PC P700PC PC PC

P700 P700+ (u. a.) PC P700 + + PC P700 820 nm I P700+ PC+ P700 P700+ P700 PC PC PC+ Arrivée des électrons provenant du PSII

Temps (ms)

Fig. IV-5. Relation entre l’état redox de P700 et PC et la transmission à 820 nm. A. Les flèches verticales rouges dans la partie supérieure représentent la lumière à 820 nm émise par une diode électroluminescente ; les flèches rouges dans la partie inférieure représentent la lumière à 820 nm qui a traversé la feuille. B. Mesure du signal de la transmission à 820 nm induit par un pulse rouge de 650 nm (1800 μmol photons m-2s-1). Image d’après Tóth (2006).

75 Protocole de re-réduction de PC+ et P700+ en obscurité après un pulse rouge lointain Les changements dans le niveau de la transmission à 820 nm reflètent des changements de l’état redox de PC et P700. En tirant profit du fait que les vitesses de re-réduction suite à un pulse rouge lointain (RL) diffèrent (la PC+ est re-réduite plus lentement que le P700+), on peut estimer la contribution de ces 2 composants à l’amplitude totale de transmission (Schansker et al. 2003). Ici, cette approche nous a permis de suivre des changements dans les contributions de PC et P700 au signal de transmission à 820 nm en fonction de la durée des traitements. La Fig. IV-6 montre en détail le protocole de re- réduction de PC et P700 en obscurité après un pulse RL. Comme montré dans la Fig. IV-6, ce protocole comprend trois étapes : 1. un pulse RL de 15 s et de 200 μmol photons m-2 s-1 ; 2. un intervalle d’obscurité de 80 s ; 3. un pulse RL de 20 s et de 200 μmol photons m-2 s-1. La transmission à 820 nm est enregis- trée pendant toute la durée du protocole. Cinq répétitions ont été réalisées pour chaque traitement (pour la 2e paire de feuilles les jours 0, 3, 5, 7, 19 et 29 et pour la 3e paire de feuilles les jours 14, 17, 19, 21, 24, 26). Dans des feuilles rigides comme celles de Camellia, le signal de transmission à 820 nm est très stable. En revanche, dans des feuilles plus molles comme celles de betterave ou de petit pois, il est probable que des changements osmotiques puissent fortement affecter le niveau de transmission à 820 nm, indépendamment des changements dans l’état redox de P700 ou PC (G. Schansker, observations non publiées). Ce problème se manifeste aussi dans la Fig. IV-4 D, où l’amplitude du changement du signal à 820 nm est plus grande que celle mesurée dans la Fig. IV-4 E.

76 Lumière de mesure modulée à 820 nm

RL RL 720 nm Obscurité 720 nm 80 s 15 s 20 s

Mesures : transmission 820 nm

Fig. IV-6. Protocole de re-réduction de PC+ et P700+ en obscurité après un pulse rouge lointain (RL) de 15 s (200 μmol photons m-2 s-1). Un 1er pulse de lumière RL de 15 s est suivi de 80 s d’obscurité et d’un 2e pulse RL de 20 s. La transmission à 820 nm est enregistrée pendant toute la durée de la mesure. La ligne verte représente une feuille mesurée dans ce protocole.

Traitement au méthylviologène (MV) Pour les traitements au MV (1,1ŷ-diméthyl-4,4ŷ-bipyridinium-dichloride, Fluka, Allema- gne), une solution de 200 μM de MV a été appliquée sur les deux cotés des feuilles intactes (2e et 3e paire) avec un pinceau fin. Les feuilles n’ont pas été détachées et les plantes ont été gardées pendant la nuit en obscurité complète avant que les mesures ne soient réalisées. En présence de MV, on peut créer une chaîne de transport d’électrons avec un pool de PQ réduit et un PSI oxydé (Schansker et al. 2005). Ceci permet l’étude de la résis- tance du complexe Cyt b6/f au passage d’électrons. Le protocole de cette expérience est le suivant : un traitement au MV a été appliqué sur des feuilles (2e et 3e paire) de plantes sous traitement TS, ainsi que sur des feuilles contrôle de la 3e paire. Après le traitement au MV, ces feuilles ont été soumises à un pulse de lumière actinique rouge (1800 μmol photons m-2 s-1) d’une durée de 700 ms, suivi de 2 s d’obscurité. Pendant cette phase d’obscurité, la transmission de la lumière RL (820 nm) a été mesurée. Ces mesures de transmission montrent la cinétique de réduction de la PC et de P700+ au cours de ces 2 s d’obscurité.

Mesures de la dépendance des courbes OJIP à l’intensité de la lumière

La dépendance des valeurs F300 μs, FJ et FI de la courbe OJIP à l’intensité de la lumière a été déterminée pour la 3e feuille du contrôle et des trois traitements. Ces mesures ont été effectuées le jour 27 du traitement, avec neuf intensités lumineuses différentes entre 300

77 et 3000 μmol photons m-2 s-1. Pour permettre une comparaison des différentes courbes, toutes les données ont été divisées par leur valeur F0. Pour le traitement TS, la valeur de F0 a été estimée sur la base de la Fig. IV-4.

Mesure du poids sec et humide des plantes Au terme de 4 semaines de traitements (jour 29), 10 plantes de chaque traitement ont été choisies pour la détermination du poids humide et du poids sec des parties aériennes (tige et feuilles), bulbaire et racinaire. Ces trois parties ont été séparées et leur poids humide a été déterminé. Ensuite, ces mêmes parties ont été séchées à 80°C dans une étuve pendant 48 h et leur poids sec a été mesuré. Le changement relatif (%) du poids sec (PVS) des parties aérienne, bulbaire et racinaire par rapport au contrôle a été calculé selon la formule:

PVS = (1-(Y/X))*100

Y et X sont les moyennes des valeurs du poids sec mesuré des échantillons stressés (traitements) et non stressés respectivement (contrôle).

78 IV.3. RESULTATS

2- 2+ IV.3.a Effets physiologiques de la déficience de SO4 et de Mg sur des plantes de Beta vulgaris Les effets des traitements SM, TS, DS et du contrôle dans les plantes de Beta vulgaris ont été suivis sur la 2e et 3e paire de feuilles. Ces effets sont résumés dans les Figs. IV-7, IV-8 et le Tableau IV-2 ci-dessous. La 3e paire de feuilles est apparue pendant les traitements (3 jours après le transfert dans les solutions déficientes). Pour les plantes cultivées en solution DS, les premiers symptômes sont apparus environ 9 jours après le début du traitement. De manière inat- tendue, les plantes s’y présentaient plus grandes et avec des feuilles plus vertes que dans le contrôle. Des symptômes de déficience sont également apparus dans les traitements TS et SM, sur les jeunes feuilles (3e paire) formées après le transfert dans ces traitements. Les plantes sous traitement SM présentaient des feuilles cartonnées avec des bords nécrosés qui gagnaient graduellement toute la feuille, mais quelques zones restaient vertes, comme celles situées autour de la veine principale. La phénoménologie des plantes de Beta vulgaris est représentée photographiquement de manière résumée dans la Fig. IV-8.

79 Jour 0 :

A TS Contrôle DS SM

Jour 29 :

Symptômes C D E

Fig. IV-7. Plantes de Beta vulgaris, contrôle et traitements TS, DS et SM. A : Jour 0, début des traitements. B: Jour 29, fin de l’expérience : comparaison des effets des traite- 2- e ments. C. Symptômes du traitement à traces de SO4 (TS) de la 3 paire de feuille. D. Chlo- roses entre les veines, typiques du traitement sans Mg2+ (SM) des 3es paires de feuilles. E. Dé- tails des chloroses et des dommages nécrotiques de la 3e paire de feuilles du traitement SM.

80 2- 2+ ! [SO4 ] Mg [mM] 2- 2- 2- TS = ~0 mM SO4 DS = 1 mM SO4 C = ~1.88 mM SO4 1mM Mg2+ 1mM Mg2+ 1mM Mg2+

1 ] 2+ [ Mg [ !

0 2+ SM = 0mM Mg 2- 2- SO 1 mM SO 4 4 [mM]

0 1 1.88 2 Fig. IV-8. Représentation photographique des effets des déficiences en SO4 et en Mg2+ chez des plantes de Beta vulgaris en culture hydroponique. Ces effets sont obtenus par 2- 2+ des variations des concentrations de SO4 et de Mg , respectivement. La flèche horizontale bleue montre de gauche à droite les plantes en traitements à concentration progressive de 2- 2- SO4 : TS (~2.1 μM SO4 ), DS (1 mM) et C (1.88 mM), mais avec une concentration de Mg2+ qui est maintenue constante (1 mM). La flèche verticale rouge montre de bas en haut les plantes en solution nutritive dont la concentration de Mg2+ augmente d’un bac à l’autre : 2+ 2- SM (0 mM Mg ) et DS (1 mM). La concentration de SO4 est maintenue constante (1 mM) dans ces deux bacs.

81 Tableau IV-2. Phénoménologie des plantes de Beta vulgaris sous l’effet des trois traitements, du jour 0 au jour 29. Les plantes étaient âgées de 20 jours au début des traitements.

Jours de Jours de Phénoménologie (2e ou 3e paire) croissance traitement des plantes 27 0 Jour 0 : Début des 3 traitements (DS, TS et SM) Début du temps de mesures expérimentales de la 2e paire de feuilles 30 3 Apparition 3e paire de feuilles 36 9 Apparition des symptômes DS : Plantes plus grandes et feuilles plus vertes 37 10 Apparition des symptômes TS : 3es feuilles plus allongées et vert clair 41 14 Début du temps de mesures expérimentales de la 3e paire de feuilles Apparition des symptômes SM : 3es feuilles cartonnées 44 17 Symptômes SM : 3es feuilles cartonnées et à bord nécrosé 46 19 Symptômes SM : 3es feuilles pliées et nécrosées 56 29 Fin des mesures des 2es et 3es paires de feuilles

IV.3.b Croissance et biomasse des plantes en traitement

Poids sec des plantes Les pourcentages de réduction et d’augmentation des poids secs des parties aérienne, bulbaire et racinaire sont représentés dans le Tableau IV-3.

Tableau IV-3. Pourcentage de variation (augmentation ou réduction) du poids sec (var. ps), par rapport au contrôle ; moyenne et erreur standard (moy. ± es), des parties aé- riennes (feuilles + tige), bulbaire et racinaire. Ces valeurs ont été obtenues au terme des traitements (n = 10).

Plantes Partie aérienne Partie bulbaire Partie racinaire (feuilles + tige) Moy. ± Var. ps Moy. ± Var. ps Moy. ± Var. ps Var. tot. es (%) es (%) es (%) moy. ps (%) Contrôle 1.5 ± 0.3 0.6 ± 0.1 0.2 ± 0.0 DS 1.8 ± 0.2 + 19 0.7 ± 0.1 + 22 0.3 ± 0.1 + 22 + 21 TS 0.8 ± 0.3 - 45 0.5 ± 0.1 - 21 0.1 ± 0.1 - 44 - 35 SM 1.4 ± 0.5 - 7 0.4 ± 0.3 - 35 0.1 ± 0.1 - 30 - 23

Après quatre semaines de traitement, les traitements TS et SM ont entraîné une ré- duction du poids sec des parties aérienne, bulbaire et racinaire. Le traitement TS a affecté

82 de manière importante (~-45 %) les parties aérienne et racinaire et moins la partie bulbaire (-21 %) des plantes, alors que le traitement SM a affecté de manière homogène (~-32 %) les parties bulbaire et racinaire en épargnant la partie aérienne (-7 %). En revanche, le traitement DS présente une augmentation homogène du poids sec moyen pour toutes les parties de la plante.

IV.3.c Détermination de la quantité de Chl

Chl relative en fonction de la Chl par extraction La Fig. IV-9 montre le contenu de Chl (a+b) obtenu par extraction en fonction du contenu relatif de Chl (Chl rel) des 2es et 3es paires de feuilles de Beta vulgaris. Le contenu de Chl par extraction de chaque panneau de la Fig. IV-9 est représenté en différentes unités (pourcentage par volume de solution extraite, μg de Chl par mg de feuille et μg de Chl par cm2 de feuille). Dans les trois cas, les valeurs sont fortement cor- rélées, mais on peut noter que la corrélation est moins bonne si la Chl extraite est expri- mée en μg par mg de feuille. Une comparaison des Figs. IV-9 A et C montre que la Chl exprimée par ml de solution extraite et par cm2 de feuille donne de résultats très similaires. La Fig. IV-9 implique que les mesures de Chl rel sont une expression du contenu de Chl par cm2. Nous observons que les contenus de Chl varient par un facteur de plus de 5 entre les valeurs minimales et maximales. Pour chaque traitement et chaque feuille (2e ou 3e paire), une fourchette de valeurs est obtenue. Déjà pour un jour, une distribution homo- gène des valeurs de contenu de Chl est observée pour le contrôle et tous les traitements ensembles. Cela montre que le système choisi (contrôle et traitements) permet l’étude de l’effet du contenu de Chl de la feuille sur les mesures de fluorescence. Les traitements TS et SM donnent des valeurs de Chl les plus petites, alors que les quantités les plus élevées sont observées dans le contrôle et le traitement DS. Par ailleurs, la 3e feuille est la plus affectée par les traitements SM et TS où on observe les valeurs les plus basses de Chl avec une tendance à l’hétérogénéité (une partie des feuilles reste verte alors que l’autre devient chlorotique). La 3e feuille est aussi celle qui contient le plus de Chl dans le cas du contrôle et du traitement DS.

83 20 20 A B 16 16

12 12

8 8 Chl rel

4 4

0 0 4 6 8 10 12 14 16 18 20 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 Chl (µg Chl /ml) Chl (µg de Chl / mg feuille)

20 e C 2 Feuille. Contrôle 16 3e Feuille. Contrôle 2e Feuille. DS 12 3e Feuille. DS e Chl rel 8 2 Feuille. SM 3e Feuille. SM 4 2e Feuille. TS 0 e 20 30 40 50 60 70 80 90 100 3 Feuille. TS Chl (µg Chl / cm2 feuille)

Fig. IV-9. Contenu de Chl rel en fonction du contenu de Chl par extraction. Chl par extraction exprimée en : A. μg Chl / ml d’acétone (80% v/v) ; B. μg Chl / mg de feuille ; C. μg Chl / cm2 feuille. Mesures effectuées le jour 29.

84 Contenu de Chl rel Les mesures de la Chl rel sur des feuilles de Beta vulgaris (2e et 3e paire de feuilles ; voir point IV.2.f) ont été faites dans le but d’évaluer l’effet de la quantité de Chl et des changements du gradient de lumière sur les cinétiques des courbes OJIP de fluorescence (Chapitre 6). Dans la Fig. IV-10, on voit que pour le contrôle et le traitement DS, la tendance de l’évolution du contenu de Chl rel dans la 2e paire de feuilles est presque stable jusqu’à la fin de l’expérience, avec une légère tendance à augmenter pendant les 12 premiers jours et à diminuer légèrement par la suite. Cette tendance peut s’expliquer par l’apparition de la 3e paire de feuilles. L’évolution de la quantité de Chl rel dans le traitement TS montre pour la 2e paire de feuilles la même tendance légèrement croissante que le contrôle pour les 12 premiers jours, suivie d’une perte progressive de 32% par rapport au contrôle à la fin de l’expérience (jour 29). Cette diminution pourrait être due à l’effet du traitement ou à la sénescence de la feuille. Les plantes du traitement SM (Fig. IV-10) montrent pour la 2e paire de feuilles une tendance constante similaire au contrôle jusqu’au jour 18 du traitement, et ensuite une perte progressive qui atteint 40% (jour 29) par rapport au contrôle. Cette diminution pourrait être aussi due à l’effet du traitement ou à la sénescence de la feuille. La 3e paire de feuilles formée sous les traitements TS et SM (TS et SM) montre des valeurs de contenu de Chl constamment plus petites que la 2e paire de feuilles, et en diminution jusqu’à la fin de l’expérience. Dans le traitement DS et le contrôle, le contenu de Chl rel de la 3e paire de feuilles est similaire à celui de la 2e paire (Fig. IV-10, contrôle et DS). Ces observations confirment le fait que les traitements TS et SM ont un impact né- gatif sur la quantité de Chl rel des 2es et 3es paires de feuilles, cet impact étant plus marqué sur la 3e paire formée sous les traitements. Ces tendances à la diminution de la quantité de Chl sont en concordance avec la perte de biomasse (poids sec) dans les 4 traitements (voir section IV.3.b).

85 e 25 25 2 Feuille 3e Feuille 20 20

15 15

10 10

5 Contrôle 5 DS

0 0 0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30 25 25 Chl rel 20 20

15 15

10 10

5 TS 5 SM

0 0 0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30 Temps (jours de traitement)

Fig. IV-10. Evolution de la Chl rel mesurée sur les feuilles de Beta vulgaris (2es et 3es paires) dans le temps expérimental du contrôle et des trois traitements : DS, TS et SM. Moyennes de 20 mesures ± erreur standard.

86 IV.3.d Paramètres photosynthétiques : mesures simultanées de la transmission à 820 nm et de la fluorescence de la Chl a

Mesures de la fluorescence de la Chl a La Fig. IV-11 montre les courbes de la fluorescence de la Chl a mesurées le jour 24 sur la 3e paire de feuilles du contrôle et des 3 traitements DS, TS et SM. Ce jour fournit un bon exemple de l’effet induit par les traitements sur la courbe de la fluorescence de la Chl a par rapport au contrôle. La forme de la courbe OJIP est affectée spécifiquement par le traitement TS, par une hausse des niveaux F0, FJ et FI (indiqués par les trois flèches bleues). Le traitement SM affecte l’amplitude totale de l’émission de fluorescence de la Chl a (flèche bleue), laquelle diminue d’environ 25% par rapport au contrôle et au traitement TS (qui ne montrent pas d’effet sur l’amplitude totale de la fluorescence). A l’opposé du traitement SM, le traitement DS montre une amplitude totale légèrement plus grande que le contrôle.

Mesures de la transmission à 820 nm

e La Fig. IV-12 montre la transmission à 820 nm (I820 nm) mesurée le jour 24 sur la 3 paire de feuilles du contrôle et des 3 traitements DS, TS et SM. Les mesures des traitements TS et SM montrent les amplitudes de la transmission à 820 nm (ƅI) les plus petites avec un effet spécifiquement plus marqué pour le traitement TS, où l’on constate que les 3 amplitudes de la transmission à 820 nm sont plus petites que pour le contrôle et les autres traitements (voir exemple de ƅI émise par le 2e pulse rouge, montrée par la flèche orange, dans la Fig. IV-12 TS). Le traitement DS montre une amplitude légèrement plus grande par rapport au contrôle.

87 Feuilles adaptées à l'obscurité Jour 24 3e feuille Feuilles pré-illuminées avec lumière rouge lointaine

1400 1400 1400 1400

1200 1200 1200 1200 (u.a.) a

1000 1000 1000 1000

800 800 800 800

600 600 600 600 Fluorescence de la Chl Chl de la Fluorescence 400 400 400 400 Contrôle DS TS SM

200 200 200 200 0.01 0.1 1 10 100 1000 0.01 0.1 1 10 100 1000 0.01 0.1 1 10 100 1000 0.01 0.1 1 10 100 1000 Temps (ms)

Fig. IV-11. Mesures de la fluorescence de la Chl a sur des plantes de Beta vulgaris, au jour expérimental 24 du contrôle et des trois traitements DS, TS et SM. L’émission de fluorescence a été mesurée sur les feuilles des 3es paires de Beta vulgaris lors de l’application d’un 1er pulse saturant de lumière rouge (650 nm) sur des feuilles adaptées à l’obscurité (courbe noire) et lors d’un 2e pulse saturant de lumière rouge (650 nm) sur les mêmes feuilles pré- illuminées avec une lumière RL (voir Fig. IV-4 pour le protocole). Ces courbes ont été tra- cées sur une échelle de temps logarithmique (n = 10-20).

88 1er pulse lumière rouge Pulse lumière rouge lointaine e Jour 24 3 Feuille 2e pulse lumière rouge

2000

1800

1600

1400 820 nm I 1200

1000 ' I 800

600 Contrôle DS TS MS

10 1000 10 1000 10 1000 10 1000 Temps (ms)

Fig. IV-12. Mesures de la transmission à 820 nm sur des plantes de Beta vulgaris. Dans le contrôle et les trois traitements sont représentées les trois courbes de la transmission e (I820) mesurée sur les feuilles adaptées à l’obscurité de la 3 paire de Beta vulgaris pendant chaque phase du protocole (voir Fig. IV-4). La troisième sous-figure à partir de la gauche (traitement TS) montre l’amplitude réductible/oxydable (ƅI) dérivée d’une différence entre les niveaux maximal (PC et P700 réduits) et minimal (PC et P700 oxydés) de la transmission induite par le 2e pulse rouge. Ces courbes ont été tracées sur une échelle de temps logarithmique (n = 10-20).

89 Cinétique de re-réduction de PC+ et P700+ en obscurité après un pulse rouge lointain (RL) La re-réduction en obscurité de PC+ et P700+ (voir section IV.2.g) après un pulse RL a permis de déterminer si des changements des contributions relatives de PC et P700 au signal de transmission à 820 nm sur des feuilles de Beta vulgaris surviennent sous l’effet des 3 traitements et du contrôle (voir aussi chapitre V). En conditions contrôle, la phase de re-réduction de PC (W = 7-14 s) est plus lente que celle de P700 (W = 1.2-1.6 s, Schans- ker et al. 2003), ce qui permet une séparation des cinétiques correspondant aux contributions de PC et P700 à la transmission à 820 nm. Des exemples de courbes de re-réduction obtenues sont montrés dans la Fig. IV- 13. Un fit avec deux fonctions exponentielles a été calculé pour chaque courbe ; la phase rapide est attribuée au P700 et la phase lente à la PC (Schansker et al. 2003)

90 3e Feuille

800 Jour 14 800 Jour 17 800 Jour 19 Contrôle DS 600 600 600 TS SM 400 400 400

200 200 200

0 0 0 10 1000 100000 10 1000 100000 10 1000 100000

(u.a.) 1000 800 Jour 21 1200 Jour 24 Jour 26 800 820 nm I 600 900 600

400 600 e 3 Feuille 400

200 300 200

0 0 0 10 1000 100000 10 1000 100000 10 1000 100000 Temps (ms)

Fig. IV-13. Cinétiques de re-réduction de P700+ et PC+ (mesurées par transmission à 820 nm) de feuilles de la 3e paire provenant de plantes de Beta vulgaris en fonction du temps expérimental du contrôle et des trois traitements DS, TS et SM (n = 5).

91 Traitement au méthylviologène (MV) L’un des effets secondaires possibles du traitement TS porte sur l’activité des complexes Cyt b6/f. En effet, le Cyt b6/f contient un cluster de fer-soufre dans la protéine de Rieske (Ke 2001, Stroebel et al. 2003). En cas de déficience en sulfate, il est possible que la quantité ou le fonctionnement du Cyt b6/f soient affectés. Ceci pourrait possiblement avoir un impact sur l’amplitude de la phase IP, qui joue un rôle central dans le Chapitre V de cette thèse. Afin de cerner l’effet de la déficience en sulfate sur le complexe Cyt b6/f, une ex- périence a été conduite sur des feuilles soumises à la fois au traitement TS et à un traitement au MV. Le MV catalyse le transfert d’électrons du côté accepteur du PSI vers l’oxygène et permet à l’électron d’éviter le blocage transitoire de l’enzyme FNR inactive en obscurité. Lors d’un fort pulse de lumière rouge sur une feuille adaptée à l’obscurité, la présence du MV permet au PSI de rester presque complètement oxydé, car les électrons sont rapidement transmis à l’oxygène. Le pool de PQ, en revanche, est réduit, car la ré- oxydation de PQH2 par le Cyt b6/f représente la réaction la plus lente de la chaîne de transport d’électrons (Schansker et al. 2008). Durant la phase d’obscurité qui suit dans ce protocole (voir section IV.2.g), les électrons de PQH2 sont transférés en direction de la PC+ et de P700+. La cinétique de ce processus de réduction (mesurée par la transmission à 820 nm) indique alors la résistance du Cyt b6/f au transport d’électrons. Les résultats obtenus montrent que les feuilles de plantes soumises au traitement TS ont une cinétique de réduction plus lente que les feuilles contrôle (Fig. IV-14). Ceci confirme l’hypothèse d’un effet du traitement TS sur l’activité ou la quantité des complexes Cyt b6/f, qui montrent une plus grande résistance au flux d’électrons qu’en l’absence de traitement.

92 TS (3efeuille) TS (2efeuille) Contrôle (3efeuille) 800 1.2

600 1.0 0.8

400 0.6 (u.a) 820 nm

I 0.4 200 0.2 A B 0 0.0 Changements rel. de la transmission -0.2 1 10 100 1000 1 10 100 1000 Temps (ms)

Fig. IV-14. A. Cinétiques de transmission à 820 nm lors d’une réduction de la PC et de P700 dans des feuilles traitées avec 200 μM de MV, mesurées au cours des 2 s d’obscurité suite à un pulse rouge de 0.7 s (1800 μmol photons m-2 s-1). Des feuilles (2e et 3e paire) de plantes de Beta vulgaris soumises au traitement TS, ainsi que des feuilles non traitées de la 3e paire (contrôle) ont été mesurées. Après le traitement de MV, ces feuilles ont été soumises à un pulse de lumière actinique rouge d’une durée de 700 ms, suivi de 2 s d’obscurité. B. Changements relatifs de la transmission à 820 nm, obtenus par double normalisation pour permettre une comparaison des cinétiques des différentes courbes (n = 10).

Courbes de la fluorescence de la Chl a (OJIP) en fonction de l’intensité de la lumière

La Fig. IV-15 montre la dépendance de F300 μs, FJ et FI (par rapport à F0) à l’intensité de la lumière (3e paire de feuilles). Les résultats indiquent que pour les feuilles de plantes des traitements DS et SM, la dépendance à l’intensité de la lumière de F300 μs/F20 μs, FJ/F20 μs et FI/F20 μs est très similaire à celles de feuilles des plantes contrôle. Si l’on admet que les étapes de la courbe OJIP suivent la réduction de la chaîne de transport des électrons, cela montre clairement que les changements de l’activité du transport d’électrons induits par ces traitements sont faibles.

93 En revanche, dans le cas du traitement TS, les intensités de fluorescence sont sys- tématiquement plus élevées que les valeurs du contrôle. De plus, la fluorescence aux temps 300 μs, 3 ms (J) et 30 ms (I) montre une saturation à des intensités de la lumière plus basses dans le cas des autres traitements et du contrôle. Les résultats indiquent que le pool de PQ est davantage réduit dans les plantes TS que dans le contrôle (cf. Tóth et al. 2007). La Fig. IV-15 C montre que le niveau de saturation de FI/F20 μs est plus élevé pour les plantes TS, ce qui s’explique par une phase IP plus petite (voir Chapitre V).

Contrôle DS 5 SM TS

20 µs 20 µs 4 20 µs / F / F / F 300 µs 30 ms 3 ms F F 3 F

1 A B C 0 1000 2000 3000 0 1000 2000 3000 0 1000 2000 3000 Intensité de lumière (µmol photons m-2 s-1)

Fig. IV-15. Dépendance à l’intensité de la lumière de l’intensité de la fluorescence de la Chl a (normalisée sur F0 (20 μs) à 300 μs (A), J (3 ms) (B) et I (30 ms) (C) des courbes de la fluorescence OJIP pour les conditions suivantes : contrôle, DS, SM et TS. Les mesures ont été réalisées sur les 3es paires de feuilles de plantes de Beta vulgaris, le jour 24 du traitement (n = 10).

94 Courbes de la fluorescence de la Chl a (OJIP) pendant 6 pulses de lumière séparés par 30 s d’obscurité L’effet de six forts pulses de lumière sur la chaîne de transport d’électrons du contrôle et des trois traitements est montré dans la cinétique de la courbe OJIP de la fluorescence de la Chl a de la Fig. IV-16. On peut observer que les cinétiques des courbes OJIP induites par les différents pulses de lumière se ressemblent entre elles, à l’exception de la trace induite par le premier pulse. On peut également noter la présence d’un creux (voir flèches oranges) bien marqué dans la cinétique OJIP durant les pulses 2 à 6 du contrôle et des traitements DS et SM. Le traitement TS est le seul à ne pas montrer de creux. De manière générale, l’intensité de la fluorescence diminue entre les pulses 2 et 6. Cet effet est probablement dû à l’adaptation progressive à la lumière de la feuille et à l’activation de l’enzyme FNR. Les cinétiques des pulses 2 à 6 des traitements TS et SM sont beaucoup plus rap- prochées que dans le contrôle et le traitement DS (cercles noirs dans la Fig. IV-16). L’intensité de la fluorescence diminue moins au fil des pulses que dans le cas du contrôle et du traitement DS. Cela indique une adaptation à la lumière plus lente dans les plantes TS et SM.

95 pulse 1 pulse 2 1600 1600 Côntrole DS pulse 3 pulse 4 1200 1200 pulse 5 pulse 6

800 800 (u.a.) a 400 400

0.01 0.1 1 10 100 1000 10000 0.01 0.1 1 10 100 1000 10000

1600 TS 1600 SM

1200 1200

Fluorescence de la Chl 800 800

400 400

0.01 0.1 1 10 100 1000 10000 0.01 0.1 1 10 100 1000 10000 Time (ms)

Fig. IV-16. Mesures de la fluorescence de la Chl a induite par 6 pulses de lumière consécutifs sur des plantes de Beta vulgaris du contrôle et des trois traitements DS, TS et SM. L’émission de fluorescence a été mesurée sur les feuilles des 3es paires de Beta vulgaris lors de l’application de six forts pulses de lumière rouge à 650 nm, séparés par 30 s d’obscurité ; n = 4 à 8. L’interprétation des flèches orange et des cercles noirs est expliquée dans le texte.

96 IV.4. DISCUSSION

Les expériences décrites dans ce chapitre avaient pour but de comprendre les réponses physiologiques de plantes aux traitements DS, TS et SM, et de déterminer s’il est possible de manipuler les quantités de Chl et de PSI présentes dans les feuilles à l’aide de traitements déficients en nutriments essentiels (magnésium et/ou soufre).

IV.4.a Quantité de Chl et biomasse Dans la Fig. IV-9, nous observons que le contenu de Chl à la fin de l’expérience varie considérablement d’une plante à l’autre, par un facteur 5 entre les valeurs extrêmes. Un autre symptôme des traitements est la perte de biomasse. Les mesures du poids sec (Tableau IV-3) ont montré que les traitements TS et SM ont un impact négatif sur la biomasse des plantes. Dans le cas du traitement sans magnésium (SM), le bulbe et les racines sont nettement plus affectés que la tige et les feuilles. Ceci est typique d’une carence en magnésium, où le transport des sucres des feuilles vers les racines et le bulbe est en- travé (Fischer et Bremer 1993, Cakmak et al. 1994, Hermans et al. 2005). En revanche, dans le traitement à traces de sulfate (TS), la perte de poids est relativement homogène et prononcée.

IV.4.b Mesures de la fluorescence de la Chl a et de la transmission à 820 nm Les effets des traitements DS, TS et MS par rapport au contrôle ont été observés par des mesures de la courbe OJIP de la fluorescence de la Chl a et sur des mesures de la transmission à 820 nm sur la 3e paire de feuilles. Le traitement TS montre spécifiquement plus d’effet que les autres traitements sur la courbe OJIP et sur la transmission à 820 nm. Il a été signalé qu’un traitement à déficience de sulfate peut occasionner un état plus réduit du pool de PQ (Godde et Dannehl 1994), observable dans la cinétique OJIP par une hausse des niveaux F0, FJ et FI comme c’est le cas de l’exemple montré dans la Fig. IV-11 du traitement TS. Les mesures de la transmission, également sensibles aux traitements, montrent une amplitude ƅI plus petite aussi dans le cas du traitement TS, ce qui implique que ce traitement a un effet particulièrement marqué sur le transfert d’électrons vers le PSI ou sur le PSI lui-même (Fig. IV-12).

IV.4.c Taille des antennes et chaîne de transport d’électrons Nous avons mesuré la dépendance des cinétiques d’émission de fluorescence à l’intensité de la lumière (Fig. IV-15). Les résultats de cette expérience montrent que mis à part le traitement TS, la dépendance de l’intensité de la fluorescence à l’intensité de la lumière ne varie pas entre les traitements ni par rapport au contrôle. Le panneau A montre l’intensité de fluorescence à 300 μs, soit après environ une seule séparation de charges à une intensi- té de lumière de 3000 μmol photons m-2 s-1 (Schreiber et Neubauer 1990, Lazár et Pos- píšil 1999). La fluorescence à ce moment est uniquement dépendante de la photochimie, et dépend fortement de la taille des antennes. Les intensités de fluorescence étant toutes

97 identiques (excepté le traitement TS), nous en déduisons que les réactions photochimiques et la taille des antennes ne sont pas affectés par les traitements. Les panneaux B et C de la Fig. IV-15 (intensités de fluorescence à 3 et 30 ms respectivement) reflètent quant à eux aussi bien des processus photochimiques que biochimiques. Les intensités de fluorescence étant là aussi constantes (en omettant toujours le traitement TS), on peut estimer que le fonctionnement de la chaîne de transport d’électrons n’est pas modifié par les traitements jusqu’à 30 ms (soit jusqu’à la fin de la ré- duction du pool de PQ pendant un pulse de lumière rouge). Le cas du traitement TS est particulier. Dans le cas d’une déficience en soufre, il est établi que le pool de PQ reste partiellement réduit en obscurité. Pour cette raison, les ci- nétiques de fluorescence sur des plantes déficientes en soufre présentent des intensités de fluorescence plus élevées sur les étapes O à I (cf. section IV.3.d et Godde et Dannehl 1994, Dannehl et al. 1996). C’est la raison pour laquelle les plantes soumises à ce traitement présentent des intensités de fluorescence systématiquement plus élevées. En outre, la saturation à des intensités de lumière plus basses est un autre effet d’une réduction partielle du pool de PQ, car moins d’électrons sont nécessaires pour réduire la chaîne de transport d’électrons.

IV.4.d Fonctionnement des complexes Cyt b6/f Chez les plantes supérieures, une déficience en soufre est susceptible d’affecter aussi le fonctionnement des complexes de Cyt b6/f. Ceux-ci renferment en effet une protéine contenant un cluster fer-soufre (protéine de Rieske, cf. I.1.c). Nous avons donc mené une expérience visant à estimer l’effet des traitements déficients en sulfate sur la résistance au flux d’électrons posé par les complexes Cyt b6/f. Dans ce but, du méthylviologène (MV) a été employé. Cette substance a pour effet de capter les électrons du côté accepteur du PSI, évitant ainsi le blocage de la chaîne de transport d’électrons dû à l’inactivité de l’enzyme FNR après une phase d’obscurité. Les cinétiques de réduction de la PC et de P700 (mesurées par transmission à 820 nm) deviennent ainsi contrôlées par l’activité des Cyt b6/f lors de la réoxydation du pool de PQ. Nos résultats, observés sur des cinétiques de transmission normalisées (Fig. IV-14 B), montrent des cinétiques plus lentes dans le cas des traitements à traces de sulfate (TS), par un facteur d’environ 2. Ce ralentissement du flux d’électrons peut être dû à un fonctionnement moins efficace des complexes Cyt b6/f ou à une réduction de leur nombre.

IV.4.e Contributions relatives de PC et P700 aux cinétiques de re-réduction Dans le cadre du protocole de re-réduction de PC et P700 (section IV.2.g), nous avons cherché à savoir dans quelle mesure les contributions relatives de PC et P700 à l’amplitude de réduction variaient d’une mesure à l’autre. Cette information est importante pour l’interprétation des changements dans l’amplitude du ƅImax de ces mesures (voir Chapitre V). Nous observons que les cinétiques de re-réduction de PC et P700, mesurées par la transmission à 820 nm, sont variables d’une mesure à l’autre (Fig. IV-13). En particulier, la contribution de PC et de P700, mesurée par l’amplitude de chacune des phases expo- 98 nentielles, est également variable. Compte tenu de cette variabilité, nous considérerons dans le Chapitre V uniquement la tendance de variation des contributions relatives de PC et P700.

IV.4.f Courbes de la fluorescence de la Chl a pendant 6 pulses de lumière rouge Lors du 2e pulse, après 30 s d’obscurité, la chaîne de transport d’électrons se trouve dans la situation suivante : QA est en grande partie oxydé (ce dont témoigne le niveau F0 plus élevé que lors du 1er pulse), le pool de PQ est réduit et le coté accepteur d’électrons du PSI est également partiellement oxydé. Dans le cas des traitements SM et surtout TS, les niveaux de fluorescence baissent de manière moins importante au fil des pulses de lumière ; l’adaptation à la lumière est plus lente. Nous attribuons ceci à une diminution de la quantité de PSI dans les feuilles, qui a pour effet d’entraver le flux d’électrons, induisant ainsi des intensités de fluorescence élevées même après activation de l’enzyme FNR.

99 100 CHAPITRE V

ETUDE DE LA RELATION ENTRE

ƅVIP (=(FP-FI)/(FM-F0)) ET LE CONTENU DE P700 ET PC DETERMINE PAR LA TRANSMISSION A 820 NM

V.1. INTRODUCTION

Les mesures de fluorescence de la Chl a sont presque toujours utilisées comme une mesure de l’état redox du PSII. Cependant, il est aujourd’hui aisé de montrer que la courbe de la fluorescence de la Chl a est représentative de la chaîne de transport d’électrons entière (Schansker et al. 2003, 2005). Autrement dit, la courbe OJIP contient aussi de l’information sur le PSI. Schreiber et al. (1989) ont observé, au moyen de mesures simultanées de la fluorescence de la Chl a et des changements de la transmission à 820 nm, que la phase de re-réduction de la transmission à 820 nm de chloroplastes intacts d’épinard va en parallèle avec la phase I2-P (nommée IP par Strasser et al. 1995) de la fluorescence de la Chl a. Cette observation a été confirmée par des études réalisées sur des feuilles intactes de plantes de Pisum sativum (Schansker et al. 2003, 2005), qui montrent qu’il y a un effet du transfert d’électrons qui passent par le PSI sur la cinétique de la courbe de la fluorescence de la Chl a OJIP. Cet effet persiste si on utilise une intensité de lumière de 15’000 μmol photons m-2 s-1 (Schansker et al. 2006). A partir de l’observation précédente, la question suivante est traitée dans ce chapitre : « Si l’on diminue spécifiquement la quantité de PSI, quel est l’effet sur la phase IP de la courbe OJIP de fluorescence ? » Hermans et al. (2004) décrivent qu’une déficience de magnésium selon Cakmak et al. (1994) provoque une diminution relativement spécifique de la quantité de PSI. Dans ce chapitre, on a élargi l’envergure des traitements pour tenter d’obtenir une gamme d’effets différents sur le contenu de PSI. Trois traitements ont été choisis (voir Chap. IV) : (a) des plantes cultivées dans une solution nutritive sans magnésium et avec environ la moitié de la dose de sulfate du contrôle (traitement SM), (b) avec environ la moitié de la dose de sulfate du contrôle (DS) et (c) contenant seulement de traces de sulfate (TS). L’importance du sulfate pour le PSI réside dans le fait que ce dernier contient 3 clusters de FeS (Ke 2001, Amunts et al. 2007). Un protocole a été conçu permettant d’obtenir une mesure de la quantité de PSI. Cette mesure a été utilisée pour voir s’il existe une relation entre la phase IP (voir aussi Chapitre IV, section IV.2.g) de la courbe OJIP et la quantité de PSI.

101 V.2. MATERIELS ET METHODES

V.2.a Matériel végétal et conditions de culture Voir section IV.2.a pour les détails.

V.2.b Mesures de paramètres photosynthétiques La Fig. V-1 illustre sur une feuille contrôle de Beta vulgaris adaptée à l’obscurité le protocole utilisé dans ce chapitre. Ce protocole est conçu de manière à produire premièrement une chaîne de transport d’électrons réduite avec un premier pulse de lumière rouge (0.7 s, 1800 μmol photons m-2 s-1, panneau A), suivi d’une oxydation de la chaîne de transport d’électrons avec un pulse rouge lointain (15 s, 200 μmol photons m-2 s-1, panneau B). L’intensité de la lumière rouge lointaine est relativement basse ; pendant le temps nécessaire au processus d’oxydation, il existe le risque qu’une dérive se produise (un changement de la transmission à 820 nm non accompagné d’un changement de l’état redox de P700 ou PC). Un deuxième pulse rouge permet de passer en moins d’une seconde de l’état complètement oxydé à l’état complètement réduit (panneau C). L’amplitude maximale de transmission à 820 nm (ƅImax) est déterminée sur la base du signal de transmission mesuré par ce deuxième pulse rouge comme indiqué dans panneau C de la. Fig. V-1. Le ƅImax est une mesure pour la quantité de PC et P700 dans la feuille et est utilisé ici comme une mesure/approximation de la quantité de PSI. L’amplitude Ï à 820 nm indiquée en panneau A est plus petite que Ïmax pour des feuilles de plantes contrôle. Cela est dû au fait que le système ne s’oxyde que partiellement durant le premier pulse rouge, en raison de l’afflux d’électrons du PSII ; cette amplitude ne représente donc pas l’amplitude maximale de la transmission à 820 nm (mais voir ci-dessous pour des feuilles stressées). Ce protocole a été suivi pour le contrôle et les trois traitements. Comme mentionné ci-dessus, la valeur Ïmax a été déterminée pour être utilisée dans ce chapitre comme un indicateur du contenu de PSI, dans le but d’étudier la corrélation avec l’amplitude de la phase IP obtenue avec des mesures de fluorescence de la Chl a (voir chapitre IV, section IV.2.g).

Valeurs ¨I820nm induites par les deux pulses de lumière rouge

Dans la Fig. V-2 A et B, les valeurs de Ï820nm (déterminées comme indiqué sur la Fig. V- 1 A et C) de la 2e et 3e feuille de Beta vulgaris du traitement TS sont présentées en fonction du temps expérimental. Pendant les derniers jours du traitement TS, les valeurs Ï820nm du 1er pulse rouge deviennent plus grandes que celles induites par le 2e pulse rouge, aussi bien dans la 2e que dans la 3e feuille. Cette situation pose un problème car elle ne correspond pas aux observations faites dans le contrôle et les autres traitements, où Ïmax est obtenue avec le 2e pulse rouge (Fig. V-1 C). Nous nous sommes alors interrogés sur la er possibilité d’utiliser l’amplitude Ï820nm induite par le 1 pulse rouge du traitement TS comme une alternative pour mesurer Ïmax. Pour clarifier cette question, nous avons 102 e procédé à une analyse des valeurs Ï820nm des premiers jours du traitement TS de la 3 feuille afin de déterminer dans quelle mesure les valeurs Ï820nm obtenues avec les deux pulses rouges sont représentatives de l’amplitude maximale Ïmax. On observe que pour e la 2 feuille durant les 12 à 15 premiers jours du traitement TS, les valeurs Ï820nm induites par le 2e pulse rouge sont supérieures à celles obtenues avec le premier ; cette situation est similaire au contrôle et aux autres traitements. En revanche, pour le jour 14 et 17, les e valeurs Ï820nm obtenues avec les deux pulses rouges sont presque identiques pour la 3 feuille. Dans la Fig. V-2 C sont représentées les courbes de la transmission à 820 nm de la 3e feuille du traitement TS générées par le 2e pulse rouge pour chaque jour mesuré. Celles-ci décrivent un plateau (voir flèche rouge, jour 14, mais le même phénomène est observé pour le jour 19) pour la valeur Imax. Le fait que la transmission reste à un certain niveau maximal pendant quelque temps indique que le côté accepteur du PSI est resté inactif après avoir atteint le niveau Imax, et cela implique une réduction complète de la chaîne de transport d’électrons. On peut en conclure que pour les premiers jours mesurés e de la 3 feuille du traitement TS, le Ïmax a réellement pu être déterminé en utilisant la courbe induite par le deuxième pulse rouge. Le fait que les valeurs Ï820nm des deux pulses rouges sont similaires (voir Fig. V-2 A et B, 3e feuille, premiers jours mesurés du traitement TS) nous permet de dire que le premier pulse rouge est également e représentatif de Ïmax pour le traitement TS de la 3 feuille. C’est pour cette raison que nous voulons postuler que les valeurs Ï du 1er pulse rouge peuvent également être utilisées comme des valeurs représentatives de l’amplitude Ïmax pour les 3 derniers jours mesurés (2e et 3e feuilles du traitement TS). C’est ainsi qu’on a interprété ces valeurs dans les Fig. V-5 à Fig. V-9.

A B C e 1 pulse rouge pulse rouge lointain 2e pulse rouge

2000 2000 2000 max I ' I < I < max. I ' (u.a.) 1500 1500 1500 ' 820 nm 820 I

1000 1000 1000 Ampl. maximale =

1 10 100 1000 1 10 100 1000 10000 1 10 100 1000 Temps (ms)

103 Fig. V-1. Protocole pour déterminer l’amplitude maximale de transmission à 820 nm

(ƅImax) illustré pour une feuille de Beta vulgaris contrôle adaptée à l’obscurité. Les trois phases du protocole (les panneaux A-C) sont représentées sur une échelle de temps logarithmique. panneau A : 1er pulse rouge, 0.7 s, 1800 μmol photons m-2 s-1,; panneau B : pulse rouge lointain, 15 s, 200 μmol photons m-2 s-1 ; panneau C : 2e pulse rouge, 2 s, 1800 μmol photons -2 -1 m s . L’amplitude maximale réductible/oxydable (ƅImax) est déterminée comme indiqué

dans le panneau C. L’amplitude ƅI indiquée dans le panneau A est plus petite que ƅImax pour des feuilles de plantes contrôle.

e 2 Feuille 3e Feuille A Traitement TS B Traitement TS 1000 1000 1er pulse rouge 800 800 2e pulse rouge

600 600 (u.a.)

400 400 820 nm I

' 200 200

0 5 10 15 20 25 30 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Temps (jours de traitement) C

e 500 3 Feuille Jours de traitement TS : 2e pulse rouge 400 Jour 14

300 Jour 17 (u.a) Jour 19 200

820 nm Jour 21 I 100 Jour 24 Jour 26 0 Jour 28 1 10 100 1000 Temps (ms)

Fig. V-2. Evolution de l’amplitude ¨I(max) dans le temps pour le traitement à traces de sulfate (TS). Panneaux A et B : valeurs de ¨I (déterminées comme indiqué dans la Fig. V- 1 A et C) de la 2e et 3e feuille, respectivement, de Beta vulgaris dans le traitement TS en fonction du temps expérimental ; moyennes de 15 à 20 mesures. C : courbes de la e e transmission à 820 nm (I820nm) de la 3 feuille du traitement TS, induites par le 2 pulse rouge, en fonction des jours de mesure. Les courbes ont été déplacées de sorte que les valeurs minimales soient égales à zéro. Chaque courbe est une moyenne de 20 mesures ou plus. Pour la référence à la flèche rouge, voir texte. 104 V.3. RESULTATS

V.3.a Amplitude de la phase IP en fonction du temps expérimental La Fig. V-3 représente l’amplitude de la phase IP au fil des jours de traitement. Pour la 2e feuille, on observe une diminution de l’amplitude de la phase IP en fonction du temps tant pour le contrôle que pour les traitements ; cette diminution est plus forte dans le cas du traitement à traces de sulfate (TS). Dans la 2e feuille (développée avant le début des traitements), cette tendance est possiblement due à la sénescence de la feuille. Pour la 3e feuille (développée pendant les traitements), l’amplitude IP montre une tendance plutôt constante dans le temps, tant pour le contrôle que pour le traitement « demi- sulfate » (DS) ; par contre, l’amplitude de la phase IP a tendance à diminuer dans le temps pour les traitements « sans magnésium » (SM) et TS. Le traitement TS de la 3e feuille commence et finit avec les valeurs d’amplitude IP les plus basses.

V.3.b La contribution relative de IP à la courbe OJIP ('VIP) en fonction du temps expérimental

Dans la Fig. V-4, les valeurs de 'VIP ont été calculées de la façon suivante : ƅVIP = (FP- FI)/(FM-F0). ƅVIP représente l’amplitude de la phase IP par rapport à la fluorescence variable de la Chl a émise par le PSII. Si l’on compare les valeurs ƅVIP (Fig. V-4) avec les valeurs de l’amplitude IP (Fig. V-3), on peut constater que dans le temps, les tendances sont les mêmes pour la 2e et la 3e feuille. L’exception est le traitement SM de la 3e feuille, où la tendance de l’amplitude de la phase IP à diminuer dans le temps (Fig. V-3) a presque disparu après normalisation (Fig. V-4).

105 Contrôle DS 700 TS SM 600

500

400

300 Amplitude IP (u.a.) IP Amplitude 200

100 e 2 Feuille 3e Feuille 0 0 5 10 15 20 25 30 14 16 18 20 22 24 26 Temps (jours de traitement)

Fig. V-3. Amplitude IP en fonction du temps du temps expérimental. Moyennes de 8 à 21 mesures. Les valeurs sont représentées avec l’erreur standard.

106 Contrôle 0.5 A DS B TS SM 0.4

IP 0.3 V '

0.2

0.1

2e Feuille 3e Feuille 0.0 0 5 10 15 20 25 30 15 18 21 24 27 30 Temps (jours de traitement)

Fig. VI-4. 'VIP en fonction du temps expérimental. Moyennes de 8 à 21 mesures. Les valeurs sont représentées avec l’erreur standard.

107 V.3.c L’amplitude ¨Imax à 820 nm en fonction du temps expérimental

L’amplitude Ïmax est définie comme la différence entre les niveaux de transmission déterminés quand la chaîne de transport d’électrons est oxydée et réduite respectivement (voir Fig. V-1 C). La Fig. V-5 représente Ïmax en fonction du temps de traitement. Dans e la 2 paire de feuilles, après environ 12 jours de traitement, les valeurs ƅImax ont tendance à diminuer. Cette tendance est plus prononcée dans le cas du traitement TS. Dans la 3e paire de feuilles de la même Fig. V-5, les amplitudes mesurées restent globalement plus constantes pour le contrôle et le traitement DS. Pour les traitements SM et TS, les valeurs Ïmax ont tendance à diminuer avec le temps. Les valeurs de Ïmax sont les plus basses du début du traitement TS dans la 3e feuille. e e On peut remarquer que tant pour la 2 que pour la 3 feuille, les valeurs Ïmax montrent une variabilité considérable d’un jour à l’autre.

V.3.d La transmission totale à 820 nm (I) en fonction du temps expérimental

Afin d’élucider si les valeurs ¨Imax à 820 nm représentées dans la Fig. V-5 étaient sensibles aux caractéristiques optiques de la feuille, nous avons procédé à une analyse des mesures de la transmission totale (I) à 820 nm, lesquelles peuvent être sensibles à certaines caractéristiques de la feuille comme son épaisseur ou sa structure (paramètres intrinsèques de la feuille). Ces mesures de I (Fig. V-6), obtenues sans amplification et sans offset, mettent également en évidence une grande variabilité des valeurs d’un jour à l’autre dans les feuilles mesurées, indiquant une variabilité biologique considérable.

108 Contrôle A DS B 1400 TS SM 1200

1000 (u.a.) 800 max I ' 600

400

e 200 2 Feuille 3e Feuille

0 5 10 15 20 25 30 15 18 21 24 27 Temps (jours de traitement)

Fig. V-5. A et B : valeurs ¨Imax en fonction du temps expérimental. Les ¨Imax ont été déterminés comme montré dans la Fig. V-1. Moyennes de 8 à 21 mesures. Les valeurs sont représentées avec l’erreur standard.

109 Contrôle DS 140000 A TS B SM

120000

100000

80000

60000 I (Transmission totale à 820 nm)

e 2 Feuille 3e Feuille 40000 0 5 10 15 20 25 30 15 18 21 24 27 30 Temps (jours de traitement)

Fig. V-6. A et B : transmission totale à 820 nm (I) dans le temps expérimental. Les mesures sont faites sans offset et en absence d’autre lumière que celle de 820 nm. Moyennes de 8 à 21 mesures. Les valeurs sont représentées avec l’erreur standard.

110 V.3.e ƅImax/I en fonction du temps expérimental

Dans la Fig. V-7, les valeurs de Ïmax/I ont été calculées. Les valeurs Ïmax/I de la Fig. V-7 présentent les mêmes tendances que les valeurs non corrigées (Ïmax) de la Fig. V-5, avec cependant une considérable diminution de la variabilité d’un jour à l’autre. Ceci montre que la variabilité biologique des caractéristiques optiques est un facteur important pour expliquer la variabilité des valeurs de transmission mesurées.

V.3.f Corrélation entre ƅImax/I et l’amplitude IP ou 'VIP

Afin de déterminer s’il y a une corrélation entre ƅImax/I et l’amplitude de la phase IP, le paramètre ƅImax/I a été représenté graphiquement en fonction de l’amplitude IP (Fig. V- 8) et ƅVIP (Fig. V-9). Une régression linéaire a été appliquée aux données de l’ensemble des feuilles (2es et 3es feuilles), qui représentent environ 900 mesures indépendantes. Les régressions linéaires obtenues sont montrées dans les deux panneaux de chaque figure. Premièrement, on peut observer qu’une droite de régression permet de décrire les mesures obtenues avec les deux feuilles. Deuxièmement, il est surprenant de constater que la droite de régression de Fig. V-9 passe presque exactement par l’origine. Cela signifie qu’il y a une très bonne proportionnalité linéaire entre le ƅImax/I et l’amplitude de la phase ƅVIP pour les traitements étudiés.

111 Contrôle 0.018 A DS B TS 0.016 SM 0.014

0.012

/ I 0.010 max I ' 0.008

0.006

0.004

0.002 2e Feuille 3e Feuille 0.000 0 5 10 15 20 25 30 14 16 18 20 22 24 26 Temps (Jours de traitement)

Fig. V-7. A et B : valeurs ƅImax/I en fonction du temps. Moyennes de 8 à 21 mesures. Les valeurs sont représentées avec l’erreur standard.

112 0.012 2e Feuille 3e Feuille

0.010

0.008 / I Max. I

' 0.006

0.004 Contrôle DS 0.002 TS SM

0.000 0 100 200 300 400 0 100 200 300 400 Amplitude IP (u.a.)

Fig. V-8. A et B : valeurs ƅImax/I en fonction de l’amplitude IP. La droite de régression montrée dans les deux panneaux a été déterminée sur la base de l’ensemble des données des deux panneaux (soit environ 900 mesures indépendantes). Moyennes de 8 à 21 mesures. Les valeurs sont représentées avec l’erreur standard.

113 e e 0.012 A 2 Feuille B 3 Feuille

0.010

0.008 /I max I

' 0.006

0.004 Contrôle DS TS 0.002 SM

0.000 0.00.10.20.30.0 0.1 0.2 0.3

'VIP

Fig. V-9. A et B : valeurs ƅImax/I en fonction de 'VIP . La droite de régression montrée dans les deux panneaux a été déterminée sur la base de l’ensemble des données des deux panneaux (soit environ 900 mesures indépendantes). Moyennes de 8 à 21 mesures. Les valeurs sont représentées avec l’erreur standard.

114 V.4. DISCUSSION

V.4.a Approximation de la quantité de PSI avec les valeurs de la transmission à 820 nm Le niveau de la transmission à 820 nm dépend de l’état redox de la PC et de P700. La différence entre le niveau minimal (entièrement oxydé) et le niveau maximal (entièrement réduit) de la transmission (ƅImax/I) est une mesure de la quantité totale de PC et P700. Dans ce chapitre, nous avons utilisé ces valeurs ¨Imax/I comme une mesure de la quantité de PSI. Cette approximation est justifiée du moment que les contributions relatives de la PC et de P700 au signal de transmission restent à peu près constantes. En effet, un changement des contributions relatives de la PC et de P700 peut entraîner des changements dans le signal de transmission qui ne sont pas liées à la quantité de PSI. Afin de cerner l’importance de cet effet, nous avons estimé le rapport entre PC et P700 en fonction du temps expérimental (Fig. V-10, voir Fig. IV-12 pour les mesures de re- réduction qui forment la base de l’analyse montrée dans la Fig. V-10). Les résultats montrent que le rapport entre les contributions de la PC et de P700 au processus de réduction du PSI reste relativement stable au fil des traitements DS, SM et TS, malgré les grandes variations d’un jour à l’autre de la phase lente, vraisemblablement en raison d’une dérive à laquelle des feuilles à texture non rigide – comme celles de Beta vulgaris – sont sensibles. Seul le contrôle montre une diminution de l’amplitude de la phase lente (PC) par rapport à la phase rapide (P700), laquelle reste stable. Ainsi, sur la base de ces résultats, il n’existe aucune indication que les contributions relatives de la PC et de P700 à la cinétique de réduction changent en raison des traitements administrés aux plantes. Le paramètre ¨Imax/I est donc dans la majorité des cas étudiés une bonne mesure pour des changements dans la quantité du PSI.

V.4.b Amplitudes absolues et relatives Pour la 3e feuille, la fluorescence variable montre une tendance constante dans le temps pour le contrôle et les traitements DS et TS. Au contraire, dans le cas du traitement SM, tant la fluorescence variable que l’amplitude de la phase IP diminuent dans le temps (comparer les Figs. V-3 et IV-11). En considérant les valeurs d’amplitude de la phase IP normalisées sur la fluorescence variable (IPrel), on peut constater que cette tendance disparaît presque totalement (Fig. V-4 B). L’amplitude absolue peut donc donner une impression erronée. En d’autres termes, le traitement SM illustre l’importance de considérer les valeurs relatives lorsque l’amplitude de la fluorescence variable change pendant le temps de traitement. Pour les feuilles contrôle, peu de variabilité est observée et pour cette raison l’amplitude Ï à 820 nm a été utilisée dans plusieurs publications précédentes (Schansker et al. 2005, 2006, Tóth et al. 2007b). En revanche, en comparant les Fig. V-5 et Fig. V-7 on peut constater que l’utilisation de Ïmax/I (Fig. V-7) au lieu de Ïmax (Fig. V-5) élimine

115 une grande partie de la variabilité biologique des mesures présentées ici. Il semble nécessaire d’utiliser ¨Imax/I à la place de ¨I afin de compenser la variabilité biologique couramment présente.

800 C 800 DS

600 600

400 400

200 200

0 0 14 16 18 20 22 24 26 14 16 18 20 22 24 26

800 TS 800 SM Amplitude (u.a.)Amplitude phase rapide ('P700') phase lente ('PC') 600 600

400 400

200 200

0 0 14 16 18 20 22 24 26 14 16 18 20 22 24 26 Temps (jours de traitement)

Fig. V-10. Phase rapide (P700) et lente (PC) du signal de I820nm après un pulse rouge lointain en fonction du temps expérimental. Moyennes de 8 à 21 mesures.

116 V.4.c Le traitement TS et le Cyt b6/f Dans le chapitre précédent, nous avons noté que la déficience en sulfate induite par le traitement TS affecte le Cyt b6/f (voir section V.3.4.c). Sur la base de cette observation, on pourrait s’attendre à observer un ralentissement de la réoxydation du pool de PQ dû à l’effet du traitement TS au Cyt b6/f (possiblement une diminution de la quantité de Cyt b6/f). Cette situation peut se traduire par une diminution de la phase IP sans effet parallèle sur ¨Imax/I, qui serait visible par des points situés à gauche de la ligne de régression linéaire pour les valeurs les plus petites. Cependant, cet effet ne se révèle pas dans la Fig. V-9 B (3e feuille) ; cet effet n’est donc pas suffisamment important pour avoir un impact visible sur la contribution relative de la phase IP.

V.4.d Lien entre l’amplitude de la phase IP et l’amplitude maximale de re- réduction du PSI Les résultats montrés dans les Figs. V-8 et V-9 indiquent qu’il existe une corrélation entre l’amplitude de la phase IP (amplitude IP ou ¨VIP) et l’amplitude maximale de re- réduction du PSI (Ïmax/I). Ce dernier paramètre peut être considéré comme un indicateur de la quantité de PSI. Nos résultats indiquent donc que l’amplitude de la phase IP de la courbe de transition OJIP de la fluorescence varie en parallèle avec la quantité de PSI pour une intensité de lumière donnée; ces deux paramètres sont corrélés d’une manière presque linéaire. Dans les Figs. V-8 et V-9, les valeurs sont représentées avec une régression linéaire obtenue avec près de 900 mesures. En comparant les Figs. V-8 A et V-9 A, on voit pour e la 2 feuille une meilleure corrélation entre les valeurs de Ïmax/I et ¨VIP qu’entre les valeurs de Ïmax/I et IP. Dans la Fig. V-8 A, on observe pour les valeurs les plus grandes de Ïmax/I des changements des valeurs IP non liés à des changements des valeurs Ïmax/I. Dans la Fig. V-9 A, cette déviation de la linéarité est beaucoup moins prononcée. On peut également constater que la droite de régression passe par l’origine dans la Fig. V- 9, ce qui n’est pas le cas de la Fig. V-8. Par contre, pour les valeurs de Ïmax/I plus petites et pour la troisième feuille les différences entre les deux approches sont moins grandes. En général, on peut conclure que l’utilisation de l’amplitude ¨VIP donne les meilleurs résultats pour les traitements étudiés.

117 118 CHAPITRE VI

EFFETS DU GRADIENT DE LUMIERE DANS LES FEUILLES SUR LES MESURES DE FLUORESCENCE DE LA CHL A

VI.1. INTRODUCTION

Dans les feuilles des plantes, les chlorophylles des photosystèmes situés dans les chloroplastes absorbent la lumière dans le but de transformer l’énergie lumineuse en énergie chimique. Le mésophylle de la feuille contient de nombreux chloroplastes ; il est composé de deux couches possédant des structures (voir Fig. I-1, section I.1.b) et des fonctions différentes. On y trouve des cellules allongées constituant le parenchyme palissadique, situé dans la couche supérieure ou adaxiale de la feuille. On pense qu’elles fonctionnent comme des « guides » des rayons lumineux et qu’elles contribuent à une distribution optimale de la lumière à l’intérieur de la feuille (Vogelmann et Martin 1993). L’autre structure présente dans le mésophylle est le parenchyme spongieux ; il est composé de cellules d’une forme irrégulière et situé dans la couche inférieure ou abaxiale de la feuille. Ces irrégularités sont la cause des espaces intercellulaires qui jouent un rôle important dans l’échange de CO2 et d’O2 par les feuilles (Parkhurst 1994). Cette couche provoque aussi une dispersion de la lumière. Dans une feuille intacte, les caractéristiques optiques de la feuille ont un effet sur des processus tels que l’absorption, la dispersion, la réflexion, la transmission et la focalisation de la lumière. Tous ces processus contribuent à créer un gradient de lumière à l’intérieur de la feuille (Vogelmann 1993). On peut également noter que l’absorption dans le bleu et le rouge est plus forte que dans le vert. Les photons sont graduellement absorbés par les chlorophylles au fur et à mesure de leur pénétration dans la feuille (Sun et al. 1998, Rappaport et al. 2007). Ainsi, les chlorophylles des couches supérieures du mésophylle sont exposés à plus de photons que celles des couches inférieures de la feuille (Terashima et Saeki 1983, Koizumi et al. 1998, Evans 1999). Les chloroplastes des couches inférieures s’adaptent à leur environnement lumineux, donc à une intensité de lumière réduite (Evans et al. 1993, Sun et al. 1996, Koizumi et al. 1998). Il a été suggéré que la cinétique OJIP de la courbe de la fluorescence de la Chl a mesurée sur une feuille intacte est le résultat d’une combinaison de contributions provenant de couches différentes, chacune irradiée par une intensité de lumière différente (Hsu et Leu 2003). Cela implique que l’émission de la fluorescence des couches inférieures a une cinétique similaire à celle de feuilles illuminées avec une intensité de lumière faible. Hsu et Leu (2003) ont proposé l’hypothèse que la phase JI représente la fluorescence émise par les photosystèmes II des couches inférieures de la feuille. Cette interprétation a des conséquences pour des études de stress chez les plantes. Un symptôme fréquent d’un stress est une perte de chlorophylle qui, selon le concept de Hsu 119 et Leu, va diminuer le gradient de lumière et par conséquent réduire l’amplitude de la phase JI. Toutefois, ce changement n’est aucunement lié au comportement des photosystèmes II. En d’autres termes, sur la base de l’hypothèse de Hsu et Leu (2003), une modification de la cinétique de la courbe OJIP induite par un stress peut être interprétée de plusieurs manières. Sušila et al. (2004) ont conclu, sur la base de données théoriques et d’expériences réalisées sur des suspensions de membranes thylacoïdales de Pisum sativum, que le gradient de lumière actinique à travers la feuille peut affecter significativement la forme de la cinétique OJIP ; cependant, leurs simulations théoriques n’ont pas suggéré que le gradient de lumière de la feuille est bien à l’origine de la phase JI comme suggéré par Hsu et Leu (2003). En revanche, ils ont conclu que la valeur des paramètres VJ et VI est proportionnelle à l’intensité de la lumière appliquée à l’échantillon, et inversement proportionnelle au gradient de lumière à l’intérieur de l’échantillon (déterminé par la quantité de Chl) et à l’épaisseur de l’échantillon. En considérant les deux hypothèses et les données citées ci-dessus, on peut se poser la question suivante : une modification graduelle de la quantité de chlorophylle dans des feuilles intactes induit-t-elle des changements dans la cinétique et dans l’amplitude de la fluorescence de la chlorophylle a ? Si tel est le cas, comment ces changements se manifestent-ils ? Cette étude doit nous permettre d’évaluer le rôle du gradient de lumière dans la cinétique de fluorescence OJIP. Nous suivons donc une approche différente que Hsu et Leu (2003) ou Sušila et al. (2004), dont les expériences avaient un caractère statique – la quantité de Chl a été modifiée en ajoutant une deuxième feuille ou en augmentant la quantité de membranes thylacoïdales. Une telle approche statique ne change pas les caractéristiques photosynthétiques du matériel ajouté. Au contraire, dans l’expérience décrite ici, les chloroplastes ont suffisamment de temps pour s’adapter à leur nouvel environnement lumineux. En utilisant les caractéristiques d’émission des courbes OJIP de la fluorescence de la chlorophylle a, nous investiguons la réponse de l’appareil photosynthétique à la perte graduelle de chlorophylle induite par trois traitements différents. Cette étude est réalisée dans la 2e et 3e paire de feuilles de jeunes plantes de Beta vulgaris (voir Chap. V), comprenant des plantes cultivées dans des solutions nutritives contenant a) environ la moitié de la dose de sulfate du contrôle et pas de magnésium (traitement SM), b) environ la moitié de la dose de sulfate du contrôle (DS) et c) des traces de sulfate seulement (TS). Les résultats de cette étude montrent que d’autres processus que le gradient de lumière actinique déterminent la forme de la cinétique de la courbe OJIP.

120 VI.2. MATERIELS ET METHODES

VI.2.a Matériel végétal et conditions de culture Voir Chapitre IV, section V.2.a pour les détails.

VI.2.b Paramètres photosynthétiques : Mesures de la fluorescence de la Chl a Voir Chapitre IV, section IV.2.g (protocole ROR) pour les détails.

VI.2.c Détermination de la quantité de Chl Voir Chapitre IV, section IV.2.f. pour les détails.

121 VI.3. RESULTATS

VI.3.a Corrélation entre les valeurs de Chl rel et le contenu de Chl par extraction à l’acétone (80%, v/v) exprimé en μg/cm2 de feuille de Beta vulgaris Afin de calibrer les mesures du contenu de Chl rel faites pendant le temps expérimental, les valeurs Chl rel et Chl par extraction ont été corrélées. Les mesures ont été faites en parallèle sur les mêmes feuilles de Beta vulgaris (2e et 3e paire de feuilles) lors du dernier jour expérimental (jour 29). La Fig. VI-1 montre qu’il y a une très bonne corrélation linéaire entre le contenu de Chl rel et le contenu total de Chl en μg/cm2 de la feuille obtenu par extraction.

2e Feuille Contrôle 20 3e Feuille Contrôle 2e Feuille DS 3e Feuille DS 16 2e Feuille SM 3e Feuille SM 12 2e Feuille TS 3e Feuille TS Chl rel 8

0 20 40 60 80 100 Chl (µg Chl /cm2 feuille)

Fig. VI-1. Relation entre le contenu total de Chl (μg/cm2 de feuille) obtenu par extraction des 2e et 3e paires de feuilles (Beta vulgaris) et le contenu de Chl rel mesuré sur les mêmes feuilles. Un total de 14 paires de feuilles (7 paires de la 2e feuille et 7 de la 3e feuille) de 7 plantes différentes ont été mesurées pour chaque traitement et pour le contrôle. Trois échantillons ont été pris de chaque paire de feuilles.

122 VI.3.b Rapport Chl a/b La détermination de la quantité de Chl par extraction à l’acétone (80% v/v, voir section V.3.a) des 2e et 3e paires de feuilles des trois traitements et du contrôle a également été effectuée dans le but d’estimer la taille des antennes des photosystèmes sous l’effet des traitements. On peut utiliser le rapport Chl a/b comme une mesure de la taille des antennes, car les antennes internes des photosystèmes contiennent seulement de la Chl a et possèdent une taille fixe, tandis que les antennes externes contiennent de la Chl a et b et sont de taille variable. Il est important de noter que le rapport Chl a/b du PSI est supérieur à celui du PSII ; par conséquent, une baisse du rapport Chl a/b peut également être observé en cas de perte spécifique de PSI (Bassi et al. 1990, Porra 2002).

Effet de la déficience de sulfate sur le rapport Chl a/b Dans la Fig. VI-2, on observe pour la 2e feuille que les contenus de Chl a et b du traitement DS sont les plus élevés par rapport au contrôle et aux autres traitements (panneaux A et B). Une corrélation entre le contenu de sulfate et la quantité de Chl a et b est également visible dans les panneaux A et B pour les traitements DS, MS et TS : on observe ainsi que pour ces traitements, la quantité de Chl a et b diminue parallèlement au contenu de sulfate. Le rapport Chl a/b (panneau C) reste plus ou moins constant, sauf pour le traitement DS où il est plus petit. Il ne semble donc pas lié au contenu de sulfate. Pour la 3e feuille, on observe qu’il y a une corrélation entre le rapport Chl a/b et la quantité de sulfate dans la solution hydroponique. Ainsi, dans le panneau F, on voit que les traitements SM et DS – tous les deux possèdent la même quantité de sulfate (environ moitié moins que le contrôle) – ont des rapports Chl a/b très similaires. De plus, dans le cas du traitement TS - qui contient la même quantité de magnésium mais seulement de traces de sulfate par rapport au contrôle - le rapport Chl a/b diminue encore davantage. Les contenus de Chl a et b de la 3e feuille sont également corrélés avec la quantité de sulfate (panneaux A et B). L’absence de magnésium (traitement SM) contribue également à diminuer le contenu de Chl a et b par rapport au traitement DS.

123 A B C

12 3.0

4 TS2 a/b C2 DS2 SM2 DS2 9 2.8 C2 SM2 a b SM2 3 C2 TS2 Chl Chl TS2 DS2

6 chl Rapport 2.6

3 2.4

D E F C3 C3 12 3.0

4 DS3 DS3 C3 a/b

9 2.8 DS3 a b 3 SM3 SM3 Chl Chl SM3

6 chl Rapport 2.6 TS3 TS3 2 TS3

3 2.4 Traitements

Fig. VI-2. Contenu de Chl (Pg/ml) obtenue par extraction à l’acétone (80% v/v) de la 2e (moitié supérieure) et la 3e paire (moitié inférieure) de feuilles de Beta vulgaris pour le dernier jour expérimental (jour 29) pour le contrôle et le trois traitements. Panneau A et D : Chl a; Panneau B et E : Chl b et Panneau C et F : rapport Chl a/b. Les contenus de Chl a et b ont étés calculés en utilisant les formules de Porra et al. (1989). 14 paires de feuilles (7 paires de la 2e feuille et 7 de la 3e feuille) de 7 plantes différentes ont étés mesurés pour chaque traitement et pour le contrôle. Trois échantillons ont étés pris de chaque paire de feuilles pour l’extraction de la Chl à l’acétone. Dans l’axe horizontal de chaque panneau de la Fig. VI- 2 sont représentés le contrôle et les trois traitements : contrôle (2e et 3e paire de feuilles) = C2, C3 ; traitements (2e et 3e paire de feuilles) : DS (DS2, DS3) ; TS (TS2, TS3) ; SM (SM2, SM3). Les valeurs sont indiquées comme moyenne ± erreur standard.

124 VI.3.c Cinétiques de la fluorescence de la Chl a : jour 26 du temps expérimental La Fig. VI-3 montre les cinétiques de la courbe de la fluorescence de la Chl a (OJIP) de la 3e feuille pour le jour 24 du contrôle et des traitements DS, SM et TS. Pour le traitement TS (3e feuille), plus de 2/3 de la Chl a (Fig. VI-2 A) est perdue par rapport au contrôle, mais l’amplitude maximale de l’émission de la fluorescence de la Chl e a (FM) n’est pas affectée (Fig. VI-3). Pour le traitement SM (3 feuille), la moitié de la Chl a est perdue (Fig. VI-2 A) et l’amplitude de l’émission de la fluorescence de la Chl a est diminuée d’environ un quart (Fig. VI-3). On peut observer aussi dans la Fig. VI-3 que la cinétique de la fluorescence de la Chl a du traitement TS montre une hausse des valeurs F0, FJ et FI par rapport aux courbes des autres traitements. Le traitement TS provoque une oxydation du pool de PQ, ce qui explique la hausse des intensités de F0 et FJ (Godde et Dannehl 1994, Tóth et al. 2007a). La diminution de l’amplitude de la phase IP est déterminée par la diminution de la quantité de PSI (Chapitre IV).

1600 3e feuille

1400 (u.a.) a 1200

1000

800 Contrôle DS 600 TS SM

Fluorescencede la Chl 400

200 0.1 1 10 100 1000 10000 Temps (ms)

Fig. VI-3. Courbes d’émission de fluorescence de la Chl a (OJIP) de la 3e paire de feuilles de plantes de Beta vulgaris, mesurées le jour 26 du temps expérimental: contrôle et traitements DS, TS et SM.

125 VI.3.d Fluorescence initiale (F0) et maximale (FM) en fonction de la quantité de Chl relative

La Fig. VI-4 montre l’intensité de l’émission de fluorescence (OJIP) aux étapes F0 et FM, mesurée en fonction de la quantité relative de Chl pour le contrôle et les trois traitements sur des feuilles (2e et 3e paire) adaptées à l’obscurité. Pour le contrôle et le traitement DS, on n’observe aucun lien entre les deux paramètres : les valeurs F0 et FM restent constantes, indépendamment de la Chl rel. Dans les traitements TS et SM, les valeurs de la 2e feuille ne montrent en général pas d’effet important de la diminution de la Chl rel au fil du temps expérimental sur l’intensité des étapes F0 et FM par rapport au contrôle. En e revanche, pour la 3 feuille on remarque que les valeurs FM diminuent dans le traitement SM (C), et que F0 augmente dans le cas du traitement TS (D).

F 2e feuille 1800 1800 M F 3e feuille 1600 1600 M F 2e feuille 1400 1400 O F 3e feuille 1200 1200 O

300 A 300 B 200 200

M 100 Contrôle 100 Traitement DS

, F 0 0

O 0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 F 1800 1800 1600 1600 1400 1400 1200 1200

300 C 300 D 200 200 100 Traitement SM 100 Traitement TS 0 0 0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 Chl rel

Fig. VI-4. Intensité de F0 et FM en fonction des valeurs de Chl rel, mesurées sur la 2e et la 3e paire de feuilles de Beta vulgaris : contrôle (A) et traitements DS (B), SM (C) et TS (D). Les valeurs sont indiquées comme moyenne ± erreur standard (n = 7-20).

126 VI.3.e Les paramètres VI et VJ en fonction de la quantité de Chl La Fig. VI-5 montre les valeurs de fluorescence relative aux étapes J et I en fonction du contenu de Chl rel. Les valeurs de Chl rel ne semblent que marginalement liées aux valeurs de fluorescence variable relative VJ et VI, avec une très légère augmentation de VJ e et VI lorsque la Chl rel diminue. La 3 feuille des traitements TS (Fig. VI-4 C et D, triangles verts et bleus) constitue une exception, montrant une augmentation de VJ et VI (plus marquée dans le traitement TS) lorsque la Chl rel diminue en raison d’une chaîne de transport d’électrons plus réduite (voir Chapitre IV).

e 1.0 1.0 VJ , 2 feuille e VI , 2 feuille 0.8 0.8 e VJ , 3 feuille 0.6 0.6 e VI , 3 feuille

0.4 0.4

0.2 0.2 Traitement DS I Contrôle 0.0 0.0 , V

J 0 4 8 12 16 20 0 4 8 12 16 20 1.0 1.0 V

0.8 0.8

0.6 0.6

0.4 0.4

0.2 0.2 Traitement SM Traitement TS 0.0 0.0 0 4 8 12 16 20 0 4 8 12 16 20 Chl rel

Fig. VI-5. Fluorescence variable relative VJ et VI en fonction des valeurs de Chl rel. Ces mesures ont été faites sur la 2e et la 3e paire de feuilles du contrôle (A) et des traitements DS (B), SM (C) et TS (D). Les valeurs sont indiquées comme moyenne de 7 à 20 mesures ± erreur standard.

127 VI.4. DISCUSSION

Dans cette expérience, nous avons induit, à l’aide de traitements déficients en magnésium et/ou en sulfate, des changements du contenu de Chl dans des feuilles de Beta vulgaris. Bien qu’il parût justifié de supposer que les changements de la quantité de Chl devraient se refléter dans la cinétique et l’amplitude de la fluorescence chlorophyllienne, nous n’avons pas observé cet effet dans nos résultats.

VI.4.a Fluorescence initiale (F0) et Fluorescence maximale (FM) en fonction de la quantité de Chl relative

Sur la base de nos résultats, on peut dire que les valeurs de fluorescence minimale (F0) et maximale (FM) ne sont généralement pas liées au contenu de Chl des feuilles. Nous observons seulement deux exceptions au sein de la 3e paire de feuilles, dont chacune peut être expliquée par un phénomène particulier : e (a) Dans le traitement SM (3 feuille), FM baisse parallèlement à la quantité de Chl. On peut penser que cela est dû à un effet indirect de type « spillover » lié au manque de Mg2+. En effet, les ions Mg2+ contrôlent la chélation de la membrane thylacoïdienne. En cas de déficience en magnésium, les thylacoïdes, normalement empilés en grana (cf. Chapitre I, section I.1.b), se détachent (Hall et al. 1972). Les photosystèmes II et I, habituellement éloignés car situés respectivement dans les grana (empilements de thylakoïdes) et dans les marges des grana, se retrouvent rapprochés, si bien que l’énergie excédentaire (spillover energy) peut être échangée directement entre les photosystèmes. Le PSI étant plus efficace dans l’utilisation de l’énergie d’excitation, le résultat est un transfert d’énergie du PSII vers le PSI, induisant une baisse de FM (voir Trissl et Wilhelm 1993). (b) La hausse de F0 en parallèle à la baisse du contenu de Chl durant le traitement TS (3e feuille) est due à un pool de PQ plus réduit en obscurité (Godde et Danehl, 1994). Mis à part ces deux cas particuliers, l’amplitude de la fluorescence de la Chl a, telle qu’exprimée par les deux valeurs extrêmes FM et F0, ne montre pas de dépendance de la quantité de Chl.

VI.4.b Les paramètres VI et VJ en fonction de la quantité de Chl Nous avons également étudié l’évolution des deux autres étapes de la courbe de fluorescence OJIP, les étapes J et I (ou VJ et VI en valeurs normalisées), dans le cadre du contrôle et des traitements induisant des changements des quantités de Chl dans les feuilles. Les résultats sont similaires à ceux observés pour FM et F0 : l’intensité (normalisée) de la fluorescence mesurée semble indépendante du contenu de Chl. Les seules exceptions sont, à nouveau, les traitements TS et SM, vraisemblablement en raison des mêmes effets particuliers discutés ci-dessus. Par rapport à d’autres études sur le lien entre quantité de Chl et fluorescence, nos expériences ont pour particularité d’être dynamiques, c’est-à-dire que l’application de traitements sur plusieurs semaines laisse en théorie à la plante le temps de s’adapter au

128 stress causé. Il est connu que l’appareil photosynthétique des feuilles peut s’adapter à son nouvel environnement lumineux ; cette adaptation peut se manifester de plusieurs manières (Chow et Anderson 1987a, b). Ces observations laissent penser qu’un processus d’adaptation similaire aurait pu se produire dans les plantes étudiées, de sorte que les cinétiques de fluorescence ne semblent pas affectées par une diminution de la quantité de Chl.

129 130 DISCUSSION ET CONCLUSION GENERALE

131 132 CHAPITRE VII

DISCUSSION GENERALE

VII.1. CONTENU DE LA THESE

Les expériences montrées dans cette thèse sont des applications des méthodes dévelop- pées pendant les dernières années au laboratoire de bioénergétique de l’Université de Ge- nève. La première moitié de la thèse consiste en une étude écophysiologique axée principalement sur un test de l’état redox du pool de PQ proposé par Tóth et al. (2007a). Dans la deuxième moitié de la thèse, des approches expérimentales développées par Schansker et al. (2003, 2005, 2006) et Tóth et al. (2007b) sont appliquées à l’étude des déficiences de magnésium et de sulfate. Cette partie de l’étude contient plusieurs éléments méthodolo- giques.

VII.2. UNE CHAINE RESPIRATOIRE DANS LES PLANTES SUPERIEURES

On pense que les cyanobactéries constituent les ancêtres des chloroplastes des plantes supérieures et des algues. Contrairement aux cellules eucaryotes, les cyanobactéries ne possèdent pas de mitochondries ; en revanche, elles disposent de chaînes respiratoires qui partagent les pools de PQ avec les chaînes de transport d’électrons photosynthétiques (Pils et al. 2004, Hart et al. 2005). Dans les cyanobactéries, quatre oxydases qui pourraient jouer le rôle de l’oxydase terminale de la chaîne respiratoire ont été identifiées (Pils et al. 2004, Hart et al. 2005). En 1982, Bennoun a proposé que les chloroplastes des plantes supérieures pourraient eux aussi contenir des chaînes respiratoires similaires à celles des cyanobactéries ; il a nommé ce type d’activité « chlororespiration ». Dix-sept ans plus tard, deux groupes ont identifié une plastoquinol-oxydase dans les chloroplastes (Carol et al. 1999, Wu et al.. 1999). Les chercheurs ont immédiatement trouvé un lien entre cette enzyme et la syn- thèse des caroténoides. Mais en même temps, il a été proposé que cette enzyme jouerait peut-être aussi le rôle de l’oxydase terminale comme proposé par Bennoun en 1982 (voir p. ex. Bennoun 2001). Pour cette raison, cette enzyme a été nommée plastid terminal oxidase ou PTOX. Quelques années plus tard, une étude de Lennon et al. (2003) a caractérisé la localisation de PTOX : sur le côté stromal des lamelles du stroma – c’est-à-dire près des plastoglobuli où se déroule la synthèse des caroténoides, mais loin des pools de plastoquinones de la chaîne de transport d’électrons. De plus, la localisation du côté du stroma implique qu’une chaîne respiratoire classique qui traverse le pool de plastoquinone n’existe pas si PTOX est l’oxydase terminale de cette chaîne. Dans les chapitres II et III, des études ont été menées dans le but de résoudre deux questions : 1. L’enzyme responsable de la réoxydation du pool de PQ est-elle PTOX ? et 2. Quel est le rôle physiologique de l’enzyme responsable de la réoxydation du pool de PQ ? Il existe des indices en

133 faveur de l’hypothèse selon laquelle cette enzyme pourrait jouer un rôle de soupape de sécurité, comme proposé par plusieurs auteurs (Streb et al. 2005, Shahbazi et al. 2007).

VII.3. ACTIVITE DE L’OXYDASE DU POOL DE PLASTOQUINONE

Dans les Chapitres II et III, nous avons réalisé un sondage de l’activité de l’oxydase du pool de PQ (la PQH2-oxydase) chez un grand nombre d’espèces d’Angiospermes. Paral- lèlement, des expériences ont été réalisées sous différentes conditions de croissance, afin de déterminer la variabilité de l’activité de la PQH2-oxydase en fonction de paramètres écophysiologiques.

VII.3.a Variabilité de l’activité de la PQH2-oxydase En réalisant des mesures de fluorescence selon un protocole précis dit de « double pulse » (Chap II, section II.2.c), nous avons pu mettre en évidence la réoxydation en obscurité du pool de PQ par la PQH2-oxydase. Nos résultats ont montré une variabilité importante de l’activité de l’enzyme selon les espèces, les valeurs extrêmes de demi-temps (t½) de réoxydation étant séparées par un facteur de 300 environ (de 0.6 à 170 s). Par ailleurs, parmi les différents facteurs écophysiologiques étudiés, seuls le type de métabolisme (C3, C4 ou CAM) et le type de cinétique de réoxydation du pool de PQ (mono ou biphasique) ont pu expliquer de manière statistiquement significative une partie de la variabilité observée de l’activité de la PQH2-oxydase. Cependant, la majorité des plantes C4 et CAM étudiées faisaient partie de deux familles (Poaceae et Cyperaceae, et Crassulaceae et Cactaceae, respectivement) où les valeurs étaient généralement sembla- bles, y compris chez les espèces de type C3 qui se trouvent dans ces deux familles. Par ailleurs, les différences entre les familles d’espèces semblent plus importantes que celles entre les espèces d’une même famille. Comme les différences d’activité entre les espè- ces/familles de végétaux sont importantes, nous concluons des observations précédentes que le facteur clé pour expliquer l’activité de la PQH2-oxydase est probablement l’appartenance à une espèce ou famille, c’est-à-dire des critères d’ordre phylogénétique. Il est possible que l’impact observé du type de métabolisme ne soit qu’un reflet des diffé- rences entre les familles de plantes. La signification du type de cinétique ne peut pas être déterminée de manière claire sur la base de nos résultats. Comme il paraît peu probable que deux enzymes accomplis- sent la même fonction en parallèle, nous estimons possible que les enzymes de PQH2- oxydase dans les espèces montrant des cinétiques biphasiques ne soient pas réparties de manière homogène dans la feuille, de sorte que l’activité de l’enzyme (et donc la cinétique de réoxydation) pourraient varier. La vérification de cette hypothèse nécessiterait toutefois des mesures complémentaires.

VII.3.b PTOX et la réoxydation du pool de PQ en obscurité Plusieurs auteurs ont émis l’hypothèse que la PTOX pourrait jouer un rôle protecteur lors de situations de stress lumineux, en offrant un chemin alternatif au flux linéaire

134 d’électrons (Streb et al. 2005, Shahbazi et al. 2007). Sur la base de ces observations, nous avons mené plusieurs expériences visant à déterminer la probabilité que la PTOX soit l’oxydase du pool de PQ. En d’autres termes, nous avons cherché à déterminer s’il est plausible que la PTOX soit notre PQH2-oxydase.

PTOX comme agent protecteur en cas de stress Une première expérience a été réalisée sur des spécimens de plantes de Ranunculus glacialis acclimatés à des conditions de haute altitude. Dans de telles conditions, il a été montré que cette plante possède des concentrations de PTOX particulièrement élevées, peut-être comme mesure de protection face aux stress lumineux et thermiques présents à haute altitude (Streb et al. 2005). Des plantes de Ranunculus glacialis ont été maintenues dans des conditions induisant des niveaux élevés de PTOX par le Dr. Streb à Paris ; de plus, le Dr. Tóth a mesuré ces plantes pour nous. Les résultats de ces mesures montrent toutefois que la cinétique de réoxydation du pool de PQ n’est pas particulièrement rapide (t½ = 40 s), et même plutôt lente comparée à d’autres plantes de la même famille comme Trollius europeus au Jardin Botanique de Genève (Fig. III-3) et une autre espèce contenant des niveaux bas de PTOX (Streb et al. 2005). La concentration de PTOX ne semble donc pas influencer la vitesse de réoxydation du pool de PQ en obscurité. En outre, d’autres mesures effectuées sur des plantes soumises à un stress lumineux ou hydrique n’ont également pas pu mettre en évidence un changement dans la cinétique de réoxydation du pool de PQ.

Localisation de l’oxydase du pool de PQ Comme mentionné dans la section VII-2, Lennon et al. (2003) ont montré que la PTOX était située majoritairement dans les lamelles du stroma. Nous avons mesuré des t½ de réoxydation du pool de PQ compris entre 0.6 et 170 s selon les espèces. Ces résultats paraissent peu compatibles avec une localisation de la PQH2-oxydase dans les lamelles du stroma. En effet, le caractère monophasique et exponentiel de la plupart des cinétiques observées, ainsi que leur rapidité, rendent peu probable un aller-retour des molécules de PQH2 entre les grana et les lamelles du stroma en quelques secondes sans des effets sur les cinétiques exponentielles.

L’oxydase du pool de PQ comme alternative au transport linéaire d’électrons L’hypothèse selon laquelle la PTOX offrirait un chemin alternatif pour le transport d’électrons implique qu’elle devrait être en mesure de concurrencer le complexe Cyt b6/f dans l’oxydation du pool de PQ. Or, il est connu que le demi-temps de réoxydation des molécules de PQH2 par le complexe Cyt b6/f est de 5 à 20 ms (Kramer et al. 1999). Ce processus est donc beaucoup plus rapide que celui catalysé par l’oxydase du pool de PQ, dont le t½ est de l’ordre de grandeur d’une seconde dans les cas les plus rapides de notre sondage. Il paraît ainsi peu plausible que notre PQH2-oxydase puisse offrir un chemin alternatif significatif au transport linéaire d’électrons en cas de situations de stress.

135 VII.3.c Identité de la PQH2-oxydase Les observations présentées dans la section précédente rendent peu probable l’hypothèse du rôle de la PTOX comme oxydase du pool de PQ. Nos résultats indiquent que l’enzyme responsable de l’oxydation du pool de PQ, la PQH2-oxydase, doit être une autre ; nous suggérons que la PTOX et la PQH2-oxydase sont deux enzymes différentes, accomplissant des fonctions différentes.

Candidates alternatives au rôle de PQH2-oxydase Comme mentionné dans la section VII-2, selon l’hypothèse originale de Bennoun (1982), la chaîne chlororespiratoire présente dans les chloroplastes était supposée être similaire à celle observée chez les cyanobactéries. Or, les cyanobactéries renferment plusieurs oxydases terminales (Pils et al. 2004, Hart et al. 2005) susceptibles d’avoir évolué en une PQH2-oxydase. Toutefois, certaines de ces oxydases qui acceptent leurs électrons de la PC (Pils et al. 2004, Hart et al. 2005) sont des candidates peu plausibles pour expliquer l’origine de la PQH2-oxydase (voir Schansker et al. 2005 et section III.4.e). En revanche, une oxydase bd-quinol, dont le codage a été détecté dans les gènes de certaines espèces de cyanobactéries, pourrait être une candidate alternative au rôle de PQH2-oxydase.

Rôle possible de la PQH2-oxydase Les résultats présentés dans les Chapitres II et III de cette thèse semblent écarter l’hypothèse que la PQH2-oxydase puisse offrir un chemin alternatif au flux d’électrons, car l’activité de l’enzyme est trop faible pour concurrencer le complexe Cyt b6/f dans la réoxydation du pool de PQ. Cette conclusion est en accord avec les résultats des études de Rosso et al. (2006). Toutefois, les résultats de Yoshida et al. (2007) laissent envisager un autre rôle physiologique possible de la PQH2-oxydase. Par l’étude du mutant pgr5 d’Arabidopsis thaliana – une enzyme qui joue un rôle dans le transfert d’électrons de Fdred dans le stroma aux molécules de PQ du pool de PQ – les auteurs montrent que l’existence d’un stroma relativement réduit en obscurité laisse plusieurs enzymes normalement inactives en obscurité dans un état actif. Ces enzymes sont régulées par l’état redox de la thiorédoxine (Martin et al. 2000, Scheibe 1990). On peut donc supposer qu’un rôle important de la PQH2-oxydase pourrait être de maintenir le stroma dans un état oxydé en obscurité. Par ailleurs, sur la base des variations importantes de l’activité de la PQH2-oxydase observées entre les espèces d’Angiospermes, nous supposons que cette enzyme doit accomplir une fonction dans laquelle la rapidité du processus ne joue pas un rôle capital dans la survie de la plante.

136 VII.4. EXPERIENCES SUR LA QUANTITE DE PSI ET DE CHL

VII.4.a Caractérisation des traitements Des plantes de Beta vulgaris ont été cultivées en solutions différenciées, en magnésium et/ou de soufre par rapport au contrôle. Dans le Chapitre IV, les effets de ces traitements ont été étudiés et comparés aux paramètres mesurés sur des plantes contrôle. Nous avons observé que tant la biomasse (poids sec des plantes) que la quantité de Chl ont été affec- tées, mais à des degrés divers selon les plantes et les traitements. A la fin de l’expérience, les quantités de Chl mesurées variaient par un facteur 5 entre les valeurs extrêmes. Quant à la biomasse, elle a été négativement affectée dans les traitements TS et SM (-35 et -23 %, respectivement), et les effets étaient différenciés selon la partie de la plante (partie aé- rienne, racinaire ou bulbaire). Par contre, le traitement DS (demi-sulfate) montrait des valeurs similaires ou même supérieures à celles du contrôle, mais l’effet sur l’activité pho- tosynthétique des chaînes de transport d’électrons restait limité (voir p. ex. Fig. IV-15), en accord avec les observations de Hall et al. (1972).

Paramètres photosynthétiques Deux paramètres ont été étudiés : l’émission de fluorescence de la Chl a ainsi que la transmission à 820 nm. Les mesures de fluorescence ont montré peu de changements au fil du temps expérimental et peu de différences entre les traitements, à l’exception de deux effets. Le premier est observé dans le traitement SM (sans magnésium) et consiste en une baisse du niveau maximal (FM) de fluorescence. Le second effet est lié au traitement TS (traces de sulfate) et se manifeste par une hausse des niveaux F0, FJ et FI (Fig. IV-11 et Figs. VI-3 à 5). Notre hypothèse pour expliquer le premier effet concerne le rôle important joué par les ions magnésium dans l’empilement des thylakoïdes (grana). En l’absence de magnésium, les grana se disloquent (Hall et al. 1972), de sorte que les antennes des PSII (situées majoritairement dans les grana) peuvent se retrouver proches des PSI (situés dans les marges des grana). Ce rapprochement peut entraîner un transfert direct d’énergie d’excitation entre le PSII et le PSI, causant une baisse de l’émission de fluorescence. Cet effet a été mentionné dans la littérature sous le nom d’« effet spillover » (voir Trissl et Wilhelm 1993). Quant au second effet observé dans les plantes sous traitement TS, il peut être expliqué par le fait que la déficience de sulfate peut engendrer un état plus réduit du pool de PQ (Godde et Dannehl 1994). Ce dernier constituant étant en équilibre redox avec d’autres constituants de la chaîne de transport d’électrons (en particulier QA ; p. ex. Tóth et al. 2007a), cet état plus réduit se traduit par une hausse de l’étape FJ des courbes de fluorescence. En conclusion, l’émission de fluorescence des plantes sous traitements n’est pas modifiée par rapport au contrôle, mis à part les deux cas spéciaux mentionnés ci-dessus. On peut en conclure que le fonctionnement de la chaîne de transport d’électrons n’est que peu ou pas affecté par les traitements, en dépit de la baisse de la quantité de Chl ob- servée chez certaines plantes ainsi que de la perte de biomasse sous certains traitements. 137 VII.4.b Amplitude IP et amplitude maximale de re-réduction du PSI (Ïmax/I) L’un des buts de notre expérience sur des plantes de Beta vulgaris était d’affecter la quanti- té de PSI de manière ciblée. Sur la base de mesures de transmission à 820 nm, nous avons observé dans le Chapitre V que le traitement TS avait effectivement un effet clair sur la quantité de PSI dans les feuilles. Pour cette étude, on a conçu un protocole (Fig. IV-4) permettant de mesurer l’amplitude totale de réduction du PSI (désignée par Ïmax/I) ; nous avons pu montrer que cette amplitude est un bon indicateur de la quantité de PSI dans les feuilles. L’obtention de quantités de PSI variables selon les traitements nous a permis d’étudier l’effet de la concentration de PSI sur l’amplitude de la phase IP de la courbe de fluorescence et sur l’amplitude de transmission Ïmax/I. Nous avons pu mettre en évi- dence le fait que la contribution relative de la phase IP à la courbe OJIP en termes d’amplitude (¨VIP) était presque linéairement proportionnelle à l’amplitude Ïmax/I. Cela signifie que l’amplitude de la phase IP est également une bonne mesure de la quantité de PSI (Figs. V-8 et V-9).

VII.4.c Rôle du gradient de lumière dans les mesures de fluorescence Compte tenu de la perte de Chl observée dans les feuilles de certaines plantes soumises aux traitements, il est probable que le gradient de lumière à l’intérieur des feuilles soit modifié. En effet, une concentration de Chl faible implique que la lumière peut pénétrer plus profondément dans les feuilles. Or, les résultats de certaines études semblent indiquer que les caractéristiques des courbes de fluorescence sont variables selon la profondeur de la feuille, en raison de propriétés optiques différentes selon les couches. Hsu et Leu (2003) ont émis l’hypothèse que la phase JI (3 à 30 ms) serait due aux signaux de fluorescence provenant des couches inférieures des feuilles. Compte tenu de ces observations, nous avons cherché à déterminer si la modification du gradient de lumière entraine des modifications dans les courbes d’émission de fluorescence qui pourraient avoir un impact sur l’interprétation des résultats de nos expériences. Dans notre étude, nous observons que l’intensité de la fluorescence est indépen- dante du contenu de Chl (FM et F0, Fig. VI-4), mis à part deux effets spécifiques liés aux traitements TS et SM (voir section VII.2.a ci-dessus et Chapitre VI). La cinétique de l’émission de fluorescence (en valeurs normalisées) n’est pas non plus très sensible au contenu de Chl. Il semble que les niveaux VJ et VI soient légèrement plus saturés, en accord avec les résultats d’une étude de Sušila et al. (2004). On peut en conclure que la diminution de la quantité de Chl dans certains traitements (TS en particulier) et les changements dans le gradient de lumière qui en découlent n’ont pas d’effet significatif sur la forme des cinétiques d’émission de fluorescence. Dans notre expérience, les plantes ont le temps de s’adapter au stress causé par les déficiences en nutriments. Or, il est démon- tré que les plantes disposent de mécanismes d’adaptation à un changement des conditions lumineuses (Chow et Anderson 1987a, b). Sous les conditions plus dynamiques de notre étude, les effets du gradient de lumière sur la cinétique de la courbe OJIP tels que rapportés par Hsu et Leu (2003) ne sont pas observés. Cela implique également que des

138 mesures de fluorescence peuvent constituer une bonne méthode pour des études de stress chez les plantes.

139 140 REMERCIEMENTS

Je tiens avant tout à remercier le Professeur Reto J. Strasser pour m’avoir donné l’occasion de travailler dans son laboratoire et de réaliser cette thèse ainsi que pour ses excellentes qualités humaines et scientifiques.

Je tiens à remercier les membres du jury: Prof. Reto J. Strasser, Professeur à l’Université de Genève Dr. G. Schansker, biologiste à l'Université de Genève Prof. Filippo Bussotti, Professeur à l’Université de Florence (Italie) qui m’ont fait l'honneur de faire partie du jury, et qui ont accepté de juger ce travail.

Je remercie également : x Dr Gert Schansker pour ses nombreuses corrections, sa disponibilité et son soutien tout au long de cette thèse ; x Mon fils Paulo Ceppi pour son excellent soutien et les nombreuses révisions qu’il a ef- fectuées ; x Mme Ariane Fehr, pour son aide précieuse dans la partie finale de cette thèse ; x Dr François Barja pour ses conseils et sa disponibilité ; x M. Abdallah Oukarroum, qui à toujours su me répondre avec bonne humeur et gentil- lesse ; x Mme Malou Chapuis pour son amabilité et son joyeux caractère ; x Mme Cristina Barrao et Dr Marta Cotado-Sampayo pour les excellents moments par- tagés ensemble ; x Dr Szilvia Z. Tóth pour les mesures et données apportées à cette thèse ; x Tous mes collègues et collaborateurs du Laboratoire de Microbiologie et de Bioéner- gétique pour leur aide, leur amabilité et leurs services ; x Les collaborateurs du Centre Horticole de Lullier et du Jardin Botanique de Genève qui m’ont apporté leur aide et m’ont permis d’utiliser leurs plantes pour les mesures ; x M. Vincent Gibon de l’Ecole d’Ingénieurs Agronomes de Lullier pour la révision de données des solutions hydroponiques ; x M. Ruben Colombo, Dominique Verdel et Gilles Villanova, du Centre Horticole de Lullier, qui ont fourni des plantes nécessaires à cette recherche.

Ma reconnaissance va au Fonds Ehrhardt-Hornung, qui m’a permis de financer les deux premières années de ma thèse.

Enfin, je remercie les membres de ma famille pour leur appui et leur affection, et mes amis pour leur soutien et leur solidarité tout au long de ma thèse. Je remercie en particulier Mme Marcela Gay, Dr Louis-Jean Gay et Dr Michel Magistris pour leurs services professionnels ainsi que pour et leur grande sympathie et leurs qualités humaines.

141 142 RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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152 ANNEXES

153 154 Annexes I et II

Contenu

Section de l’annexe Genre : espèce 1 Magnoliales : 1. Liriodendro tulipifera 2. Magnolia liliflora 3. Magnolia stellata 4. Magnolia soulangeana 5. Magnolia virginiana 6. Magnolia grandiflora 2 Asparagales : 6. Iris germanica 7. Iris foetidissima 9. Ludisia discolor 10. Oncidium marshallianum Liliales : 11. Tricyrtis hirta 12. Tricyrtis macropoda 3 13. Uvularia grandiflora 14. Lillium x hybridum 15. Guzmania lingulata 16. Vriesea zamorensis Juncales : 17. Cyperus longus 18. Cyperus alternifolius 4 Poales : 19. Hordeum vulgare. 20. Zea mays 21. Coix lacryma-jobi 22. Saccharum officinarum 23. Sorghum bicolor 24. Oryza sativa (riz) 5 Poales : 25. Miscanthus sinensis Ranunculales : 26. Aconitum lamarckii 27. Anemone hupehensis 28. Trollius europaeus 29. Aquilegia alpina 30. Actaea spicata 6 Carophylliales : 31. Schlumbergera x buckleyi 32. Selenicereus anthonyanus 33. Chenopodium album 34. Beta vulgaris Saxifragales : 35. Saxifraga cuneifolia 36. Darmera peltata

155 7 37. Crassula ovata 38. Kalanchoe x hybrida Geraniales : 39. Geranium endressi 40. Geranium himalayense 41. Geranium tuberosum 42. Geranium robertianum 8 43. Pelargonium peltatum 44. Pelargonium x hortorum Fabales : 45. Pisum sativum 46. Phaseolus vulgaris 47. Dorycnium rectum Fagales 48. Fagus sylvatica 9 49. Quercus robur 50. Quercus ilex Brassicales : 51. Arabidopsis thaliana 52. Brassica oleraceae 53. Hugueninia des alpes Malvales : 54. Lavatera olbia 10 55. Tilia cordata 56. Hydrangea macrophylla 57. Hydrangea arborescens Ericales/Theaceae : 59. Camelia semis 60. Rhododendron ponticum Gentiales/Apocynaceae : 61. Vinca minor 11 62. Vinca mayor Calastrales : 63. Ilex aquifolium

156 Annexe I

Caractéristiques de la cinétique des courbes de la fluorescence de la Chl a (OJIP) lors de l’application d’un pulse saturant de lumière rouge (650 nm) aux feuilles adaptées à l’obscurité, des espèces appartenant à différents ordres d’angiospermes (Chapitres I à III). Cette cinétique est représentée sur une échelle de temps logarithmique. Les courbes OJIP de la fluorescence de la Chl a ont été double normalisées entre les valeurs Fo et FM. Les courbes sont des moyennes de 13 mesures.

157 1.0 Liriodendron 1.0 Magnolia 1.0 Magnolia stellata tulipifera liliflora 0.8 0.8 0.8

0.6 0.6 0.6

0.4 0.4 0.4

0.2 0.2 0.2

0.0 0.0 0.0 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 1.0 Magnolia 1.0 Magnolia 1.0 Magnolia 158 soulangeana virginiana grandiflora 0.8 0.8 0.8

0.6 0.6 0.6 V (Fluorescence variable relative) relative) variable V (Fluorescence 0.4 0.4 0.4

0.2 0.2 0.2

0.0 0.0 0.0 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 Temps (ms)

Annexe I-1 1.0 Iris germanica 1.0 Iris foetidissima 1.0 Ludisia discolor

0.8 0.8 0.8

0.6 0.6 0.6

0.4 0.4 0.4

0.2 0.2 0.2

0.0 0.0 0.0 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 1.0 Oncidium 1.0 Tricyrtis hirta 1.0 Tricyrtis 159 marshallianum macropoda 0.8 0.8 0.8

0.6 0.6 0.6 V (Fluorescence variable relative) relative) variable V (Fluorescence 0.4 0.4 0.4

0.2 0.2 0.2

0.0 0.0 0.0 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 Temps (ms)

Annexe I-2 1.0 Uvularia 1.0 Lilium 1.0 Guzmania grandiflora Lis asiatique lingulata 0.8 0.8 0.8

0.6 0.6 0.6

0.4 0.4 0.4

0.2 0.2 0.2

0.0 0.0 0.0 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 1.0 1.0 1.0 Cyperius 160 Vriesea Cyperus longus zamorensis alternifolius 0.8 0.8 0.8

0.6 0.6 0.6 V (Fluorescence variable relative) variable V (Fluorescence 0.4 0.4 0.4

0.2 0.2 0.2

0.0 0.0 0.0 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 Temps (ms)

Annexe I-3 1.0 Hordeum vulgare 1.0 Zea mays 1.0 Coix lacryma-jobi 0.8 0.8 0.8

0.6 0.6 0.6

0.4 0.4 0.4

0.2 0.2 0.2

0.0 0.0 0.0 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 1.0 Saccharum 1.0 Sorghum bicolor 1.0 Oryza sativa 161 officinarum 0.8 0.8 0.8

0.6 0.6 0.6 V (Fluorescence variable relative) relative) variable V (Fluorescence 0.4 0.4 0.4

0.2 0.2 0.2

0.0 0.0 0.0 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 Temps (ms)

Annexe I-4 1.0 Miscanthus 1.0 Aconitum lamarckii 1.0 Anemone sinensis hupehensis 0.8 0.8 0.8

0.6 0.6 0.6

0.4 0.4 0.4

0.2 0.2 0.2

0.0 0.0 0.0 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 1.0 Trollius europaeus 1.0 Aquilegia alpina 1.0 Actaea spicata 162

0.8 0.8 0.8

0.6 0.6 0.6 V (Fluorescence variable relative) variable V (Fluorescence 0.4 0.4 0.4

0.2 0.2 0.2

0.0 0.0 0.0 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 Temps (ms)

Annexe I-5 1.0 Schlumbergera 1.0 Selenicereus 1.0 Chenopodium album x buckleyi anthonyanus 0.8 0.8 0.8

0.6 0.6 0.6

0.4 0.4 0.4

0.2 0.2 0.2

0.0 0.0 0.0 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 1.0 Beta vulgaris 1.0 Saxifraga cuneifolia 1.0 Darmera peltata 163

0.8 0.8 0.8

0.6 0.6 0.6 V (Fluorescence variable relative)

0.4 0.4 0.4

0.2 0.2 0.2

0.0 0.0 0.0 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 Temps (ms)

Annexe I-6 1.0 Crassula ovata 1.0 Kalanchoe 1.0 Geranium x hybrida endressi 0.8 0.8 0.8

0.6 0.6 0.6

0.4 0.4 0.4

0.2 0.2 0.2

0.0 0.0 0.0 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000

164 1.0 Geranium 1.0 Geranium 1.0 Geranium himalayense tuberosum robertianum 0.8 0.8 0.8

0.6 0.6 0.6 V (Fluorescence variable relative) relative) variable V (Fluorescence 0.4 0.4 0.4

0.2 0.2 0.2

0.0 0.0 0.0 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 Temps (ms)

Annexe I-7 1.0 Pelargonium 1.0 Pelargonium 1.0 Pisum sativum peltatum x hortorum 0.8 0.8 0.8

0.6 0.6 0.6

0.4 0.4 0.4

0.2 0.2 0.2

0.0 0.0 0.0 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 1.0 Phaseolus 1.0 Dorycnium 1.0 Fagus 165 vulgaris rectum sylvatica 0.8 0.8 0.8

0.6 0.6 0.6 V (Fluorescence variable relative) 0.4 0.4 0.4

0.2 0.2 0.2

0.0 0.0 0.0 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 Temps (ms)

Annexe I-8 1.0 Quercus robur 1.0 Quercus ilex 1.0 Arabidopsis thaliana

0.8 0.8 0.8

0.6 0.6 0.6

0.4 0.4 0.4

0.2 0.2 0.2

0.0 0.0 0.0 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 1.0 Brassica oleraceae 1.0 Hugueninia des alpes 1.0 Lavatera olbia 166

0.8 0.8 0.8

0.6 0.6 0.6

V (Fluorescence variable relative) 0.4 0.4 0.4

0.2 0.2 0.2

0.0 0.0 0.0 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 Temps (ms)

Annexe I-9 1.0 Tilia cordata 1.0 Hydrangea macrophylla 1.0 Hydrangea arborescens

0.8 0.8 0.8

0.6 0.6 0.6

0.4 0.4 0.4

0.2 0.2 0.2

0.0 0.0 0.0 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 167 1.0 Camelia semis 1.0 Rhododendron ponticum 1.0 Vinca minor

0.8 0.8 0.8

0.6 0.6 0.6

V (Fluorescence variable relative) 0.4 0.4 0.4

0.2 0.2 0.2

0.0 0.0 0.0 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 Temps (ms)

Annexe I-10 1.0 Vinca mayor Ilex aquifolium

0.8

0.6

0.4

0.2 V (Fluorescence relative)

0.0 168 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 Temps (ms)

Annexe I-11 Annexe II

Cinétiques d’adaptation à l’obscurité (¨t) de VJ. Les valeurs VJ des courbes OJIP de la fluorescence de la Chl a (symboles carrés fermés) ont permis d’obtenir des courbes avec une ou deux fonctions exponentielles (cinétique monophasique ou biphasique). N = 5 pour chaque ¨t mesuré (Chapitre II, section II.2.c).

169 1.0 1.0 1.0

0.9 0.9 0.9

0.8 0.8 0.8

0.7 0.7 0.7

0.6 0.6 Liriodendron 0.6 Magnolia liliflora Magnolia tulipifera stellata 0.5 0.5 0.5 J 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 V 1.0 1.0 1.0 170

0.9 0.9 0.9

0.8 0.8 0.8

0.7 0.7 0.7

0.6 0.6 0.6 Magnolia Magnolia x Magnolia virginiana soulangeana grandiflora 0.5 0.5 0.5 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 Temps (s)

Annexe II-1 1.0 1.0 1.0

0.9 0.9 0.9

0.8 0.8 0.8

0.7 0.7 0.7 0.6 0.6 0.6 0.5 0.5 Iris foetidissima Iris germanica 0.5 Ludisia discolor 0.4 0.4

J 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 171 V 1.0 1.0 1.0

0.9 0.9 0.9

0.8 0.8 0.8

0.7 0.7 0.7

0.6 0.6 0.6 Oncidium Tricyrtis Tricyrtis hirta 0.5 marshallianum 0.5 0.5 macropoda

0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 Temps (s)

Annexe II-2 1.0 1.0 1.0

0.9 0.9 0.9

0.8 0.8 0.8

0.7 0.7 0.7

0.6 0.6 0.6

0.5 Lilium 0.5 Guzmania 0.5 x hybridum lingulata Cyperus longus 0.4 0.4 0.4 J 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 V 1.0 1.0 1.0 172

0.9 0.9 0.9

0.8 0.8 0.8

0.7 0.7 0.7

0.6 0.6 0.6 Vriesea Cyperius Uvularia zamorensis alternifolius grandiflora 0.5 0.5 0.5 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 Temps (s)

Annexe II-3 1.0 1.0 1.0

0.9 0.9 0.9 0.8 0.8 0.8 0.7 0.7

0.6 0.6 0.7 Coix Hordeum vulgare Zea mays 0.5 0.5 0.6 lacryma-jobi J 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 V 173 1.0 1.0 1.0

0.9 0.9 0.9

0.8 0.8 0.8

0.7 0.7 0.7

0.6 0.6 0.6 Saccharum Sorghum 0.5 0.5 Oryza sativa officinarum 0.5 bicolor 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 Temps (s)

Annexe II-4 1.0 1.0 1.0

0.9 0.9 0.9 0.8 0.8 0.8 0.7 0.7 0.7 0.6 0.6 0.6 0.5 0.5 Miscanthus Aconitum Anemone sinensis 0.4 lamarckii 0.5 hupehensis 0.4

J 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 174

V 1.0 1.0 1.0

0.9 0.9 0.9

0.8 0.8 0.8

0.7 0.7 0.7

0.6 0.6 0.6

0.5 Trollius europaeus 0.5 Aquilegia alpina 0.5 Actaea spicata

0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 Temps (s)

Annexe II-5 1.0 1.0 1.0

0.9 0.9 0.9

0.8 0.8 0.8 0.7 0.7 0.7 0.6 0.6 0.6 0.5 Schlumbergera Selenicereus 0.5 x buckleyi anthonyanus 0.5 Chenopodium album 0.4

J 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 175 V 1.0 1.0 1.0

0.9 0.9 0.9 0.8 0.8

0.8 0.7 0.7

0.6 0.7 0.6

0.5 Beta vulgaris Saxifraga cuneifolia 0.5 Darmera peltata 0.6 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 Temps (s)

Annexe II-6 1.0 1.0 1.0

0.9 0.9 0.8 0.8 0.8 0.7 0.7 0.6 0.6 0.6 0.5 0.4 0.5 Kalanchoe Geranium 0.4 Crassula ovata x hybrida endressi

J 0.4 0.2

V 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 1.0 1.0 1.0 176

0.9 0.9 0.9

0.8 0.8 0.8

0.7 0.7 0.7 0.6 0.6 0.6 0.5 Geranium Geranium Geranium himalayense 0.5 tuberosum 0.5 robertianum 0.4 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 Temps (s)

Annexe II-7 1.0 1.0 1.0

0.9 0.9 0.9

0.8 0.8 0.8

0.7 0.7 0.7 0.6 0.6 0.6 Pelargonium 0.5 Pelargonium 0.5 0.5 peltatum x hortorum Pisum sativum 0.4 0.4 J 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 V 1.0 1.0 1.0 177

0.9 0.9 0.9

0.8 0.8 0.8

0.7 0.7 0.7 0.6 0.6 0.6 0.5 Phaseolus 0.5 Dorycnium 0.5 Fagus 0.4 vulgaris rectum sylvatica 0.4 0.4 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 Temps (s)

Annexe II-8 1.0 1.0 1.0

0.9 0.9 0.9 0.8 0.8 0.8 0.7 0.7 0.7 0.6 0.6 0.6 0.5 0.5 0.4 Quercus robur Quercus ilex 0.5 Arabidopsis thaliana 0.4 J 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 V 178 1.0 1.0 1.0

0.9 0.9 0.9 0.8 0.8 0.8 0.7 0.7 0.7 0.6 0.6 0.6 0.5

0.5 0.4 Brassica oleraceae 0.5 Hugueninia des alpes Lavatera olbia 0.4 0.3 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 Temps (s)

Annexe II-9 1.0 1.0 1.0

0.9 0.9 0.9 0.8 0.8 0.8 0.7 0.7 0.7 0.6 0.6 0.6 0.5 0.5 0.5 Hydrangea Hydrangea 0.4 Tilia cordata macrophylla 0.4 arborescens 0.3 0.4 J 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 V 1.0 1.0 1.0 179

0.9 0.9 0.9 0.8 0.8 0.8 0.7 0.7 0.7 0.6 0.6 0.6 0.5

0.4 Camelia semis 0.5 Rhododendron ponticum 0.5 Vinca minor 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 Temps (s)

Annexe II-10 1.0 1.0

0.9 0.9

0.8 0.8

J 0.7 V 0.7 0.6

0.6 0.5

180 Vinca mayor Ilex aquifolium 0.4 0.5 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 Temps (s)

Annexe II-11 Annexe III

Dans chaque page de l’Annexe III, un facteur écophysiologique est représenté avec les niveaux (groupes) correspondants. Un total de six facteurs ont été évalués au moyen du test de Kruskal-Wallis (Chapitre II, section II.3.a), afin d’identifier un possible effet de ces facteurs sur la cinétique de réoxydation du pool de PQ. La cinétique de réoxydation est exprimée par le demi-temps : t½ (s).

Contenu

Section de Facteur Niveaux l’annexe (groupes) 1 Type de cinétique (2) - Mono ou - Biphasique 2 Exposition lumineuse préférée (3) - Soleil, - Soleil à Ombre ou - Mi-ombre à ombre 3 Type de sol préféré (taux (3) - Sols secs ou salés d’humidité) - Sol humide - Sol trempé, marécageux à immergé 4 Climat préféré (4) - Arctique, - Tempéré, - Climat tropical à semi-tropical ou - Méditerranéen à aride 5 Persistance de la feuille (2) - Persistant - Non persistant

6 Voie métabolique (3) C3, C4 ou CAM

Légende des tableaux b = cinétique biphasique (valeurs calculées à partir d’une courbe avec deux fonctions exponentielles)

181 Annexe III-1 t½ (s) Famille Monophasique Biphasique Apocynaceae 11.6 Apocynaceae 20.6 Aquifoliaceae 8.2 Brassicaceae 46.5 Brassicaceae 5.5 Brassicaceae 60.0 Bromeliaceae (b) 1.8 Bromeliaceae (b) 6.5 Cactaceae (b) 8.8 Cactaceae (b) 3.2 Chenopodiaceae 30.0 Chenopodiaceae 35.0 Crassulaceae 2.7 Crassulaceae (b) 3.5 Cyperaceae (b) 0.6 Cyperaceae (b) 0.7 Fabaceae 40.0 Fabaceae 44.0 Fabaceae 40.0 Fagaceae 30.0 Fagaceae 66.0 Fagaceae 56.0 Geraniaceae 29.0 Geraniaceae 32.0 Geraniaceae 9.0 Geraniaceae 12.0 Geraniaceae (b) 29.0 Geraniaceae (b) 22.1 Hydrangeaceae (b) 1.2 Hydrangeaceae (b) 1.2 Iridaceae 5.1 Iridaceae 17.0 Liliaceae (b) 2.0 Magnoliaceae 15.0 Magnoliaceae 37.0 Magnoliaceae 24.0 Magnoliaceae (b) 6.2

182 Annexe III-1

t½ (s) Famille Monophasique Biphasique Malvaceae 6.2 Orchidaceae 72.0 Orchidaceae 68.0 Poaceae 21.0 Poaceae 1.8 Poaceae 1.9 Poaceae 1.2 Poaceae 34.0 Poaceae (b) 2.6 Poaceae (b) 1.9 Ranunculaceae 3.5 Ranunculaceae 8.0 Ranunculaceae 22.0 Ranunculaceae (b) 131.0 Ranunculaceae (b) 1.2 Saxifragaceae 15.0 Saxifragaceae 22.0 Theaceae 3.2 Theaceae (b) 1.7 Theaceae (b) 5.7 Tiliaceae (b) 5.0 Uvulariaceae 29.0 Uvulariaceae 41.0 Uvulariaceae 145.0 Moyenne 28.56 11.80

183 Annexe III-2 t½ (s) Famille Soleil Soleil à Ombre Mi-ombre à ombre Apocynaceae 11.6 Apocynaceae 20.6 Aquifoliaceae 8.2 Brassicaceae 5.5 Brassicaceae 60.0 Brassicaceae 46.5 Bromeliaceae (b) 120.0 Bromeliaceae (b) 170.0 Cactaceae (b) 8.8 Cactaceae (b) 3.2 Chenopodiaceae 30.0 Chenopodiaceae 35.0 Crassulaceae 3.5 Crassulaceae (b) 2.7 Cyperaceae (b) 0.6 Cyperaceae (b) 0.7 Fabaceae 44.0 Fabaceae 40.0 Fabaceae 40.0 Fagaceae 66.0 Fagaceae 56.0 Fagaceae 30.0 Geraniaceae 9.0 Geraniaceae 29.0 Geraniaceae 12.0 Geraniaceae 32.0 Geraniaceae (b) 29.0 Geraniaceae (b) 22.1 Hydrangeaceae (b) 1.2 Hydrangeaceae (b) 1.2 Iridaceae 5.1 Iridaceae 17.0 Liliaceae (b) 2.0 Magnoliaceae 15.0

184 Annexe III-2

t½ (s) Famille Soleil Soleil à Ombre Mi-ombre à ombre Magnoliaceae 37.0

Magnoliaceae 24.0 Magnoliaceae (b) 6.2 Malvaceae 6.2 Orchidaceae 72.0 Orchidaceae 68.0 Poaceae 21.0 Poaceae 1.8 Poaceae 1.9 Poaceae 1.2 Poaceae 34.0 Poaceae (b) 2.6 Poaceae (b) 1.9 Ranunculaceae 3.5 Ranunculaceae 8.0 Ranunculaceae 22.0 Ranunculaceae (b) 131.0 Ranunculaceae (b) 1.2 Saxifragaceae 15.0 Saxifragaceae 22.0 Theaceae 3.2 Theaceae (b) 1.7 Theaceae (b) 5.7 Tiliaceae (b) 5.0 Uvulariaceae 29.0 Uvulariaceae 41.0 Uvulariaceae 145.0 Moyenne 28.25 17.91 69.22

185 Annexe III-3 t½ (s) Famille Sols secs ou salés Sol humide Sol trempé, (stress hydrique ou marécageux à osmotique) immergé

Apocynaceae 11.6 Apocynaceae 20.6 Aquifoliaceae Brassicaceae 46.5 Brassicaceae 5.5 Brassicaceae 60.0 Bromeliaceae (b) 1.8 1.8 Bromeliaceae (b) 6.5 6.5 Cactaceae (b) 8.8 Cactaceae (b) 3.2 Chenopodiaceae 30.0 Chenopodiaceae 35.0 Crassulaceae 3.5 Crassulaceae (b) 2.7 Cyperaceae (b) 0.6 Cyperaceae (b) 0.7 Fabaceae 44.0 Fabaceae 40.0 Fabaceae 40.0 Fagaceae 30.0 Fagaceae 66.0 Fagaceae 56.0 Geraniaceae 12.0 Geraniaceae 32.0 32.0 Geraniaceae 9.0 Geraniaceae 29.0 Geraniaceae (b) 29.0 29.0 29.0 Geraniaceae (b) 22.1 22.1 Hydrangeaceae (b) 1.2 Hydrangeaceae (b) 1.2 Iridaceae 5.1 Iridaceae 17.0 Liliaceae (b) 2.0

186 Annexe III-3

t½ (s) Famille Sols secs ou salés Sol humide Sol trempé, (stress hydrique ou marécageux à osmotique) immergé

Magnoliaceae 15.0

Magnoliaceae 24.0 Magnoliaceae 37.0 Magnoliaceae (b) 6.2 Malvaceae 6.2 Orchidaceae 72.0 Orchidaceae 68.0 Poaceae 21.0 Poaceae 1.8 Poaceae 1.9 Poaceae 1.2 Poaceae 34.0 Poaceae (b) 2.6 Poaceae (b) 1.9 Ranunculaceae 3.5 Ranunculaceae 8.0 Ranunculaceae 22.0 Ranunculaceae (b) 131.0 Ranunculaceae (b) 1.2 Saxifragaceae 22.0 Saxifragaceae 15.0 Theaceae 3.2 Theaceae (b) 1.7 Theaceae (b) 5.7 Tiliaceae (b) 5.0 Uvulariaceae 29.0 Uvulariaceae 41.0 Uvulariaceae 145.0 Moyenne 19.84 26.17 16.13

187 Annexe III-4 t½ (s) Famille Climat Arctique Climat Climat tropical à Climat méditer- tempéré semi-tropical ranéen à aride Apocynaceae 11.6 Apocynaceae 20.6 20.6 Aquifoliaceae 8.2 8.2 Brassicaceae 5.5 Brassicaceae 60.0 Brassicaceae 46.5 Bromeliaceae (b) 1.8 1.8 Bromeliaceae (b) 6.5 6.5 Cactaceae (b) 8.8 Cactaceae (b) 3.2 Chenopodiaceae 30.0 Chenopodiaceae 35.0 Crassulaceae 3.5 3.5 Crassulaceae (b) 2.7 2.7 Cyperaceae (b) 0.6 0.6 0.6 Cyperaceae (b) 0.7 0.7 0.7 Fabaceae 44.0 44.0 Fabaceae 40.0 Fabaceae 40.0 Fagaceae 30.0 Fagaceae 66.0 Fagaceae 56.0 Geraniaceae 29.0 29.0 Geraniaceae 32.0 Geraniaceae 12.0 12.0 Geraniaceae 9.0 Geraniaceae (b) 29.0 29.0 Geraniaceae (b) 22.1 22.1 Hydrangeaceae (b) 1.2 1.2 Hydrangeaceae (b) 1.2 1.2 1.2 Iridaceae 5.1 Iridaceae 17.0 17.0 Liliaceae (b) 2.0 Magnoliaceae 15.0 Magnoliaceae 24.0

188 Annexe III-4 t½ (s) Famille Climat Arctique Climat Climat tropical à Climat méditer- tempéré semi-tropical ranéen à aride Magnoliaceae 37.0 Magnoliaceae (b) 6.2 Malvaceae 6.2 Orchidaceae 72.0 Orchidaceae 68.0 Poaceae 21.0 21.0 21.0 Poaceae 1.8 1.8 1.8 Poaceae 1.9 1.9 Poaceae 1.2 1.2 Poaceae 34.0 34.0 Poaceae (b) 2.6 2.6 2.6 Poaceae (b) 1.9 1.9 Ranunculaceae 3.5 3.5 Ranunculaceae 8.0 8.0 Ranunculaceae 22.0 22.0 Ranunculaceae (b) 131.0 131.0 Ranunculaceae (b) 1.2 1.2 Saxifragaceae 15.0 Saxifragaceae 22.0 Theaceae 3.2 Theaceae (b) 1.7 Theaceae (b) 5.7 Tiliaceae (b) 5.0 5.0 Uvulariaceae 29.0 29.0 Uvulariaceae 41.0 41.0 Uvulariaceae 145.0 145.0 Moyenne 18.63 23.72 24.03 14.81

189 Annexe III-5 t½ (s) Famille Persistant Non persistant Apocynaceae 11.6 Apocynaceae 20.6 Aquifoliaceae 8.2 Brassicaceae 60.0 Brassicaceae 46.5 Brassicaceae Bromeliaceae (b) 1.8 Bromeliaceae (b) 6.5 Cactaceae (b) 8.8 Cactaceae (b) 3.2 Chenopodiaceae 30.0 Chenopodiaceae 35.0 Crassulaceae 3.5 Crassulaceae (b) 2.7 Cyperaceae (b) 0.7 Cyperaceae (b) 0.6 Fabaceae 40.0 Fabaceae 40.0 Fabaceae 44.0 Fagaceae 30.0 Fagaceae 66.0 Fagaceae 56.0 Geraniaceae 29.0 Geraniaceae 32.0 Geraniaceae 12.0 Geraniaceae Geraniaceae (b) 29.0 Geraniaceae (b) 22.1 Hydrangeaceae (b) 1.2 Hydrangeaceae (b) 1.2 Iridaceae 5.1 Iridaceae 17.0 Liliaceae (b) 2.0 Magnoliaceae 37.0 Magnoliaceae 15.0

190 Annexe III-5 t½ (s) Famille Persistant Non persistant Magnoliaceae 24.0 Magnoliaceae (b) 6.2 Malvaceae 6.2 Orchidaceae 72.0 Orchidaceae 68.0 Poaceae 1.9 Poaceae 21.0 Poaceae 1.8 Poaceae 1.2 Poaceae 34.0 Poaceae (b) 2.6 Poaceae (b) 1.9 Ranunculaceae 3.5 Ranunculaceae 8.0 Ranunculaceae 22.0 Ranunculaceae (b) 131.0 Ranunculaceae (b) 1.2 Saxifragaceae 15.0 Saxifragaceae 22.0 Theaceae 3.2 Theaceae (b) 5.7 Theaceae (b) 1.7 Tiliaceae (b) 5.0 Uvulariaceae 29.0 Uvulariaceae 41.0 Uvulariaceae 145.0 Moyenne 18.36 25.90

191 Annexe III-6 t½ (s) Famille C3 C4 / CAM Apocynaceae 11.6 Apocynaceae 20.6 Aquifoliaceae 8.2 Brassicaceae 46.5 Brassicaceae 60.0 Brassicaceae 5.5 Bromeliaceae (b) 1.8 Bromeliaceae (b) 6.5 Cactaceae (b) 8.8 Cactaceae (b) 3.2 Chenopodiaceae 30.0 Chenopodiaceae 35.0 Crassulaceae 3.5 Crassulaceae (b) 2.7 Cyperaceae (b) 0.7 Cyperaceae (b) 0.6 Fabaceae 40.0 Fabaceae 44.0 Fabaceae 40.0 Fagaceae 30.0 Fagaceae 66.0 Fagaceae 56.0 Geraniaceae 29.0 Geraniaceae 32.0 Geraniaceae 9.0 Geraniaceae 12.0 Geraniaceae (b) 29.0 Geraniaceae (b) 22.1 Hydrangeaceae (b) 1.2 Hydrangeaceae (b) 1.2 Iridaceae 5.1 Iridaceae 17.0 Liliaceae (b) 2.0 Magnoliaceae 15.0 Magnoliaceae 24.0 Magnoliaceae 37.0

192 Annexe III-6

t½ (s) Famille C3 C4 / CAM Magnoliaceae (b) 6.2 Malvaceae 6.2 Orchidaceae 72.0 Orchidaceae 68.0 Poaceae 34.0 Poaceae 21.0 Poaceae 1.8 Poaceae 1.9 Poaceae 1.2 Poaceae (b) 2.6 Poaceae (b) 1.9 Ranunculaceae 3.5 Ranunculaceae 8.0 Ranunculaceae 22.0 Ranunculaceae (b) 131.0 Ranunculaceae (b) 1.2 Saxifragaceae 15.0 Saxifragaceae 22.0 Theaceae 3.2 Theaceae (b) 1.7 Theaceae (b) 5.7 Tiliaceae (b) 5.0 Uvulariaceae 29.0 Uvulariaceae 41.0 Uvulariaceae 145.0 Moyenne 26.7 4.6

193 194 . Annexe IV

Evolution de l’hétérogénéité des courbes de fluorescence de la Chl a (OJIP) mesurées sur six jours différents pendant une expérience sur des plantes de Beta vulgaris (contrôle et traitements ä déficience en sulfate et/ou magnésium (Chapitres IV à VI). L’émission de fluorescence a été mesurée lors de l’application d’un pulse saturant de lumière rouge (650 nm) sur des feuilles (2e et 3e paire) adaptées à l’obscurité. Les courbes ont ensuite été tra- cées sur une échelle de temps logarithmique.

195 Annexe IV-1

Beta vulgaris, 2e feuille. Contrôle Jour 0 Jour 3 Jour 5 1600 1600 1600

1200 1200 1200

800 800 800 (u.a.) a

400 400 400 196 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000

Jour 7 Jour 19 Jour 29 1600 1600 1600

1200 1200 1200 Fluorescence de la Chl Chl de la Fluorescence 800 800 800

400 400 400

0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 Temps (ms) Annexe IV-2

Beta vulgaris, 3e feuille. Contrôle Jour 14 Jour 17 Jour 19 1600 1600 1600

1200 1200 1200

800 800 800 (u.a.) a

400 400 400 197 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000

Jour 21 Jour 24 Jour 26 1600 1600 1600

1200 1200 1200 Fluorescence de la Chl Chl de la Fluorescence 800 800 800

400 400 400

0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 Temps (ms) Annexe IV-3

e 2- Beta vulgaris, 2 feuille. Traitement demi-SO4

Jour 0 Jour 3 Jour 5 1600 1600 1600

1200 1200 1200

800 800 800 (u.a.) a

400 400 400

198 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000

Jour 7 Jour 19 Jour 29 1600 1600 1600

1200 1200 1200 Fluorescence de la Chl

800 800 800

400 400 400

0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 Temps (ms) Annexe IV-4

e 2- Beta vulgaris, 3 feuille. Traitement demi-SO4 Jour 14 Jour 17 Jour 19 1600 1600 1600

1200 1200 1200

800 800 800 (u.a.) a

400 400 400 199 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000

Jour 21 Jour 24 Jour 26 1600 1600 1600

1200 1200 1200 Fluorescence de la Chl de la Fluorescence 800 800 800

400 400 400

0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 Temps (ms) Annexe IV-5

e 2- Beta vulgaris, 2 feuille. Traitement à traces de SO4 Jour 0 Jour 3 Jour 5 1600 1600 1600

1200 1200 1200

800 800 800 (u.a.) a

400 400 400

200 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000

Jour 7 Jour 19 Jour 29 1600 1600 1600

1200 1200 1200 Fluorescence de la Chl Fluorescence

800 800 800

400 400 400

0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 Temps (ms) Annexe IV-6

e 2- Beta vulgaris, 3 feuille. Trataitement à traces de SO4 Jour 14 Jour 17 Jour 19 1600 1600 1600

1200 1200 1200

800 800 800 (u.a.) a

400 400 400 201 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000

Jour 21 Jour 24 Jour 26 1600 1600 1600

1200 1200 1200 Fluorescence de la Chl de la Fluorescence 800 800 800

400 400 400

0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 Temps (ms) Annexe IV-7

Beta vulgaris, 2e feuille. Traitement sans Mg2+

Jour 0 Jour 3 Jour 5 1600 1600 1600

1200 1200 1200

800 800 800 (u.a.) a

400 400 400

202 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000

Jour 7 Jour 19 Jour 29 1600 1600 1600

1200 1200 1200 Fluorescence de la Chl de la Fluorescence 800 800 800

400 400 400

0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 Temps (ms) Annexe IV-8

Beta vulgaris, 3e feuille. Traitement sans Mg2+ Jour 14 Jour 17 Jour 19 1600 1600 1600

1200 1200 1200

800 800 800 (u.a.) a

400 400 400

203 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000

Jour 21 Jour 24 Jour 26 1600 1600 1600

1200 1200 1200 Fluorescence de la Chl Fluorescence

800 800 800

400 400 400

0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000 Temps (ms)