Universidade Federal De Goiás Instituto De Ciências Biológicas Programa De Pós-Graduação Em Genética E Biologia Molecular

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR

PATRICIA RASTEIRO ORDIALE-OLIVEIRA

VARIABILIDADE E ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL NAS ESPÉCIES Manihot irwinii D.J. ROGERS & APPAN E Manihot violacea POHL (EUPHORBIACEAE JUSS.)

Orientadora: Profa. Dra. Thannya Nascimento Soares

GOIÂNIA-GO 2016

PATRICIA RASTEIRO ORDIALE-OLIVEIRA

VARIABILIDADE E ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL NAS ESPÉCIES Manihot irwinii D.J. ROGERS & APPAN E Manihot violacea POHL (EUPHORBIACEAE JUSS.)

Orientadora: Profa. Dra. Thannya Nascimento Soares

Dissertação apresentada à coordenação do Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular da Universidade Federal de Goiás, como exigência parcial para a obtenção do título de mestre em Genética e Biologia Molecular.

GOIÂNIA-GO 2016

“Diante da vastidão do tempo e da imensidão do universo, é um imenso prazer para mim dividir um planeta e uma época com você.” Carl Sagan

“Não explicar a ciência me parece perverso. Quando alguém está apaixonado, quer contar a todo mundo.” Carl Sagan

AGRADECIMENTOS

À Deus que sempre esteve e está comigo em todas as horas da minha vida. À Universidade Federal de Goiás, Instituto de Ciências Biologicas pela oportunidade oferecida para realização deste curso de pós-graduação. Ao Programa de Pós-Graduação de Genética e Biologia Molecular da Universidade Federal de Goiás pela oportunidade para realização do trabalho de dissertação. A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão da bolsa e aos órgãos de fomento (MCTI/CNPQ/Universal 14/2014, proc.456530/2014-2; FAPEG) que contribuiram para essa pesquisa. A Profa. Dra. Thannya Nascimento Soares pela ajuda, compreensão, orientação, oportunidade e pelos ensinamentos para realização da pesquisa. Aos professores da banca pela participação na banca de defesa da dissertação e pelas valiosas sugestões. A todos os professores pelos valiosos ensinamentos. Ao Prof. Dr. Marcos José da Silva e toda sua equipe de coleta pela disponibilização do material biológico e pelo apoio. A todos do Laboratório de Genética e Biodiversidade (LGBio) pelo valioso apoio incentivo e aprendizado. Aos colegas e amigos da Pós-Graduação pela agradável convivência. Ao meu marido, Gilsimar Antônio de Oliveria, pelo amor, paciência e incentivo. Aos meus pais, que sempre contribuíram e estiveram ao meu lado a cada etapa da minha vida. Às minhas amigas Kassia Marques Corrêia, Rejane Araújo Guimarães, Vanessa Bernardes, Ramilla dos Santos Braga e Nicole Cristina Lopes Dutra pelo apoio e momentos de diversão. Enfim, a todos aqueles que, de alguma forma, torceram por mim, dedicaram e participarm do desenvolvimento deste trabalho, o meu reconhecimento e a minha gratidão, não esquecerei a sua contribuição na minha jornada de aprendizado.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURA ______10 LISTA DE TABELAS ______12 RESUMO ______14 ABSTRACT ______15 1. INTRODUÇÃO ______16 2. OBJETIVOS ______18 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ______19 3.1. Diversidade e caracterização da Família Euphorbiaceae Juss. ______19 3.2. Gênero Manihot Mill. ______20 3.2.1. Distribuição, Diversificação e Especiação do Gênero Manihot Mill. _____ 20 3.2.2. Caracterização Botânica e Ecológica ______26 3.2.3. Importância Econômica do Gênero Manihot ______28 3.2.4. Caracterização das espécies Manihot irwinii D.J.Rogers & Appan e Manihot violacea Pohl ______29 3.3. Variabilidade genética em populações nativas do Cerrado ______32 3.3.1. Diversidade e estrutura genética populacional ______32 3.3.2. Marcadores Microssatélites em estudos genético-populacionais ______37 4. MATERIAL E MÉTODOS ______40 4.1. Área de estudo e esquema de amostragem do material biológico ______40 4.2. Obtenção dos dados moleculares ______44 4.3. Análises Estatísticas ______47 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ______49 5.1. Análise genética estatísticas de M. irwinii ______49 5.1.1. Caracterização dos locos microssatélites de M. irwinii______49 5.1.2. Variabilidade e estrutura genética nas populações da espécie M. irwinii __ 52 5.2. Análise genética de M. violacea ______57 5.2.1. Caracterização dos locos microssatélites de M. violacea ______57 5.2.2. Variabilidade e Estrutura Genética nas populações da espécie M. violacea 59 5.3. Estrutura genética entre populações das espécies M. irwinii e M. violacea no Parque Estadual da Serra dos Pireneus ______66 6. CONCLUSÕES ______69 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ______70 10

LISTA DE FIGURA

Figura 1. Mapa da distribuição do gênero Manihot. Adaptado de Duputié et al., 2011 ___ 21

Figura 2. Filogenia do gênero Manihot baseado em sequências de genes nucleares (NIA e G3pdh). Em destaque vermelho a M. violacea e em azul a M. irwinii. Adaptado de Duputié et al., 2011 ______22

Figura 3. Comparação entre a visão tradicional (a) da evolução genômica após a polipóidia e visão do novo (b). (a) Na visão clássica a evolução do genoma sugere interação mínima entre os genomas parentais e um alopoliplóide. (b) Neste exemplo, as setas indicam rearranjos genomicos. Rearranjos intragenômica são representados por áreas sombreadas nos cromossomas do diplóide B. Rearranjos intergenômicos são representados por translocação de segmentos cromossômicos preto ou branco entre os genomas de diplóide A e B. O grau de mudança genômica também pode ser influenciada por interações citoplasmática e nucleares. Ajustes do genoma devem ocorrer para restaurar a compatibilidade nuclear-citoplasmática (Soltis & Soltis, 2009) ______25

Figura 4. Fotos mostrando galhas. A. Galhas na folha da espécie M. irwinii na população de Serra dos Pireneus e B. Galhas na folha de M. violacea na população de Gama no DF; C. Galhas na folha de M. violacea na população de Silvânia. Fotos: Patrícia Rasteiro Ordiale Oliveira (Fevereiro/2016) ______32

Figura 5. Mapa indicando os pontos de coletas das populações no Estado de Goiás e no Distrito Federal das espécies M. irwinii (círculo branco) e M. violacea (círculo preto) ____ 40

Figura 6. Fotografia de Manihot irwinii localizadas em Corumbá de Goiás. A. Fruto subglobuloso e ligeiramente alongado; B. Ramos com inflorescências; C. Indivíduo localizado próximo a outras árvores. Fotos: Patrícia Rasteiro Ordiale Oliveira (Fevereiro/2016) ______42

Figura 7. Fotografia Manihot irwinii localizadas em Pirenópolis. A. Indíviduo em seu habitat; B. Ramo com inflorescências e inseto visitando polinização. C. Flor masculina. D. Fruto. Fotos: Patrícia Rasteiro Ordiale Oliveira (Fevereiro/2016) ______42

Figura 8. Fotografia de Manihot irwinii localizadas Parque Estadual da Serra dos Pireneus. A. Indíviduo com inflorescências e frutos. B. Indivíduos concentrados nas fendas da rocha. Fotos: Patrícia Rasteiro Ordiale Oliveira (Fevereiro/2016) ______43

Figura 9. Fotografia de Manihot violacea localizada no Gama-DF A. Indivíduo com folhas de três lobos e frutos. B. Frutos. C. Flores estaminadas, com brácteas vistosas. Fotos: Patrícia Rasteiro Ordiale Oliveira (Fevereiro/2016) ______43

Figura 10. Fotografia de Manihot violacea localizada na Floresta Nacional de Silvânia no município de Silvânia. A. Indivíduo com folhas de três lobos e pecíolos vináceos. B. Flor masculina. C. Flor feminina. Fotos: Patrícia Rasteiro Ordiale Oliveira (Fevereiro/2016) __ 44

Figura 11. Perfis eletroferogramas dos dois sistemas multiplex apresentado pelos sete locos microssatélites na espécie M. irwinii. A: Multiplex 01 (GA126; GA134; GA136; GA21); B: Multiplex 02 (GA12; GA131; GA16) ______50 11

Figura 12. Distribuição das frequências alélicas encontradas para os sete locos microssatélites desenvolvidos para Manihot esculenta e transferidos para M. irwinii. No eixo y estão as frequências alélicas e no eixo x os tamanhos dos alelos ______53

Figura 13. Valor de ΔK para o número de populações M. irwinii (K) mais verossímil ____ 56

Figura 14. Gráfico de barras representando os indivíduos de M. irwinii coletados em três populações mostrando a estruturação populacional em três grupos (K=3) ______56

Figura 15. Perfis eletroferogramas dos dois sistemas multiplex apresentado pelos sete locos microssatélites para a espécie M. violacea. A: Multiplex 01 (GA126; GA21; GA134; GA136); B: Multiplex 02 (GA131; GA12; GA16) ______58

Figura 16. Distribuição das frequências alélicas encontradas para os sete locos microssatélites desenvolvidos para Manihot esculenta e transferidos para M. violacea. No eixo y estão as frequências e no eixo x os tamanhos dos alelos ______61

Figura 17. Valor de ΔK para o número de agrupamento da espécie M. violacea (K) mais verossímil ______64

Figura 18. Gráfico de barras representando os indivíduos de M. violacea coletados em três populações mostrando a estruturação populacional em três grupos (K=3) ______65

Figura 19. Distribuição das frequências alélicas encontradas para os sete locos microssatélites para as populações de M. irwinii e M. violacea localizadas no Parque Estadual da Serra dos Pireneus. No eixo y estão as frequências alélicas e no eixo x os tamanhos dos alelos _____ 67

Figura 20. Resultados do programa Structure com as Populações de M. irwinii (MIRSEPGO) e M.violacea (MIVISEPGO). A. Valor de ΔK para o número de grupos (K) mais verossímil pelo método de Evanno et al. (2005). B. Gráfico de barras representando os indivíduos das espécies M. irwinii e M. violacea localizadas no Parque Estadual da Serra dos Pireneus mostrando a divisão em dois grupos (K=2) ______68

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Composição citogenética de espécies silvestres do gênero Manihot Mill ______23

Tabela 2. Lista de espécies do gênero Manihot com seu potencial econômico ______28

Tabela 4. Número de indivíduos das espécies Manihot irwinii e Manihot violacea amostradas por localidade e coordenadas geográficas (latitude, longitude e altitude) referentes aos locais de coleta. NI: número de Indivíduos ______40

Tabela 5. Oito locos microssatélites desenvolvidos para Manihot esculenta (Chavarriaga- Aguirre et al., 1998) que foram testados, quanto a amplificação, para as espécies Manihot irwinii e Manihot violacea. NA: não apresentou amplificação. (Correia et al., dados não publicados) ______45

Tabela 6. Relação dos primers utilizados e suas características: cor de marcação (fluoróforo) e Motivo de repetição (MR). TA (ºC) é a temperatura de anelamento de cada iniciador para a espécie M. irwinii e VAA é variação da amplitude alélica ______49

Tabela 8. Teste Exato de Fisher para a verificação do Equilibrío de Hardy-Weinberg nas populações de M. irwinii. Os locos destacados estão fora do EHW depois de realizada a correção por FDR (False Discovery Ratio). ______52

Tabela 10. Estimativas de estrutura genética das populações de M. irwinii, estimada com base em sete locos microssatélites. Intervalo de confiança com 95% de probabilidade sobre 10.000 randomizações por bootstraps ______55

Tabela 11. Divergência Genética (FST par a par) entre as populações de M. irwinii ______57

Tabela 12. Relação dos primers utilizados e suas características: cor de marcação (fluoróforo) e Motivo de repeticção (MR). TA (ºC) é a temperatura de anelamento de cada iniciador para a espécies e M. violacea e VAA é variação da amplitude alélica ______58

Tabela 14. Teste Exato de Fisher para a verificação do Equilibrío de Hardy-Weinberg nas populações de M. violacea. Os locos destacados estão fora do EHW depois de realizada a correção por FDR (False Discovery Ratio) ______60

Tabela 16. Estimativas de estrutura genética entre as populações de M. violacea. Intervalo de confiança com 95% de probabilidade sobre 10.000 randomizações por bootstraps ______63

Tabela 17. Divergência Genética (FST par a par) entre as populações de M. irwinii e as populações de M. violacea ______65

RESUMO

ORDIALE-OLIVEIRA, P.R. VARIABILIDADE E ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL NAS ESPÉCIES Manihot irwinii D.J. ROGERS & APPAN E Manihot violacea POHL (EUPHORBIACEAE JUSS.). 2016. 85 f. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular), Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás.

A família Euphorbiaceae é uma das maiores e mais diversificadas dentre as Angiospermas, predominam árvores e arbustos e está presente na maior parte do mundo. O gênero Manihot pertence à família Euphorbiaceae e sua origem é recente provavelmente data do mioceno e possível no sul do México. É um grupo que apresenta conjunto de cromossomos numericamente estável (2n=36). M. irwinii é uma espécie endêmica do estado de Goiás de distribuição disjunta e restrita ao cerrado rupestre e M. violacea pode ser encontrada nos estados de Goiás, Minas Gerais, Distrito Federal e Mato Grosso ocorrendo em cerrado rupestre e em outros tipos de formações campestres. A maioria dos estudos de diversidade genética no gênero são com a espécie Manihot esculenta (mandioca). Por isso é importante estudar a distribuição da variabilidade genética em populações de Manihot irwinii e Manihot violacea. Foram amostradas folhas de indivíduos de três localidades da espécie M. irwinii e outros três de M. violacea. Para a obtenção dos genótipos foram utilizados sete marcadores microssatélites desenvolvidos para Manihot esculenta e transferidos para M. irwinii e M. violacea. As seis populações foram genotipadas em analisador automático de DNA em dois sistemas multiplex. A espécie M. irwinii apresentou uma média 5,5 alelos por loco e uma diversidade moderada (He=0,446) e os valores de θ=0,241 e F=0,207 indicam alta estruturação genética entre as populações. Foi detectado para M. violacea média de 8,5 alelos por loco e uma diversidade moderada (He=0,478) e elevada divergência entre as populações de M. violacea (θ=0,420 e F=0,441). Para ambas as espécies o resultado do programa Structure contribui com esse resultado mostrando que há pouca mistura entre as populações que pode ser resultado de fluxo gênico restrito e possível atuação da deriva genética, já que os valores f global não foram significativos indicando que o sistema de cruzamento não é responsável pela alta estruturação das populações. As duas espécies que ocorrem no Parque Estadual da Serra dos Pireneus compartilham 23 alelos (M. irwinii: 76% e M. violacea: 79%), sendo que cinco alelos são exclusivos do Parque. A divergência entre as duas foi alta (θ=0,298) e menor do que encontrado entre as populações de M. violacea. É possivel que a alta porcentagem de alelos compartilhados seja vestígio de um fluxo histórico e que no presente exista uma barreira entre as espécies.

Palavras-Chave: Diversidade Genética, Microssatélites, Manihot irwnii, Manihot violacea

ABSTRACT

ORDIALE-OLIVEIRA, P.R. VARIABILITY AND GENETIC STRUCTURE OF POPULATION Manihot SPECIES irwinii D.J. ROGERS & APPAN AND Manihot violacea POHL (EUPHORBIACEAE JUSS.). 2016. 85 f. Dissertation (Master in Genetics and Molecular Biology), Institute of Biological Sciences, Federal University of Goiás.

The Euphorbiaceae family is one of the largest and most diverse of the Angiosperms, predominating trees and shrubs and is present in most of the world. The genus Manihot belongs to the family Euphorbiaceae and its origin is recent probably dates from the Miocene and possible in the south of Mexico. It is a group that presents a numerically stable set of chromosomes (2n=36). M. irwinii is an endemic species from the state of Goiás with a disjunct and restricted distribution to the rupestrian cerrado and M. violacea can be found in the states of Goiás, Minas Gerais, Distrito Federal and Mato Grosso occurring in cerrado rock and in other types of formations. Most studies of genetic diversity in the genus are with the species Manihot esculenta (cassava). That is why it is important to study the distribution of genetic variability in populations of two species Manihot irwinii and Manihot violacea. Leaves of individuals from three localities of the species M. irwinii and three others of M. violacea were sampled. To obtain the genotypes, seven microsatellite markers developed for Manihot esculenta and transferred to M. irwinii and M. violacea were used. The six populations were genotyped in an automatic DNA analyzer in two multiplex systems. The M. irwinii species presented a mean of 5,5 alleles per locus and a moderate diversity (He=0,446) and the values of θ=0.241 and F=0.207 indicated a high genetic structure among the populations. It was detected for M. violacea a mean of 8,5 alleles per locus and a moderate diversity (He=0,478) and high divergence among populations of M. violacea (θ=0.420 and F=0.441). For both species the result of the Structure program contributes with this result showing that there is little mixture between the populations that can be result of restricted genetic flow and possible action of the genetic drift, since the global f values were not significant indicating that the system of Is not responsible for the high structuring of populations. The two species that occur in the Serra dos Pireneus State Park share 23 alleles (M. irwinii: 76% and M. violacea: 79%), with five alleles being exclusive to the Park. The divergence between the two was high (θ=0.298) and lower than that found among populations of M. violacea. It is possible that the high percentage of shared alleles is trace of a historical flow and that at present there is a barrier between species.

Keywords: Genetic Diversity, Microsatellite, Manihot irwinii, Manihot violacea

1. INTRODUÇÃO

A família Euphorbiacea compreende atualmente 222 gêneros e 6.100 espécies (Judd et al., 2009) distribuídas em três subfamílias: Acalyphoideae, Crotonoideae e Euphorbioideae (APG, 2003). No Brasil ocorrem 63 gêneros e 940 espécies (Cordeiro et al., 2015a). A família Euphorbiaceae é um grupo de importancia econômica entre as Angiospermas devido à produção de borracha natural (Hevea brasiliensis), produção de biodiesel (Ricinus communis), potencial medicinal (Ricinus communis e Croton antisiphiliticus), potencial ornamental (Euphorbia milli) e utilização na alimentação (Manihot esculenta). O gênero Manihot pertence à família Euphorbiaceae, subfamília Crotonoideae tribo Manihoteae. Na revisão feita por Rogers & Appan (1973) foram descritas 98 espécies do gênero. Estudos citogenéticos, filogeográficos e filogenéticos corroboram com a hipótese de uma origem recente para o gênero Manihot (Carvalho & Guerra 2002; Chacón et al., 2008; Duputié et al., 2011). As espécies do gênero Manihot distribuem-se desde o sudoeste da América do Norte ao Norte da Argentina com duas maiores concentrações de espécies uma no México e outra no Brasil (Rogers & Appan, 1973). Possivelmente a origem do grupo ocorreu na Mesoamérica e em seguida diversificou ao longo do continente Sul Americano (Duputié et al., 2011). No Brasil ocorrem 76 espécies, sendo que no estado de Goiás ocorrem 40 espécies e no Distrito Federal 16 espécies (Cordeiro et al., 2015b). A maioria das espécies é encontrada em regiões relativamente secas e apenas algumas são encontradas em regiões de floresta tropical em locais com aberturas na floresta, e sua distribuição é esporádica e raramente dominam a vegetação local (Rogers & Appan 1973; Nassar, 2000; Nassar et al., 2008). O gênero Manihot é considerado um grupo numericamente estável que apresenta número cromossômico 2n=36 (Carvalho & Guerra 2002), devido às análises citogênicas realizadas em algumas espécies do gênero que mostraram um número fixo de cromossomos. Estudos apontam uma origem alotetraploide derivado de um número básico de x=9 (Jennigs, 1963; Rogers & Appan, 1973). As espécies M. irwinii e M. violacea ocorrem no bioma cerrado, à primeira apresenta distribuição endêmica e a segunda distribuição disjunta. M. irwinii ocorre apenas no estado de Goiás em cerrado rupestre e M. violacea pode ser encontrada nos estados de Goiás, Distrito Federal, Mato Grosso e de Minas Gerais em cerrado rupestre, campo limpo, cerrado sensu 17

stricto e cerrado antropizado entre altitudes de 900 a 1300m (Rodrigues, 2009; Cordeiro et al., 2015b). M. irwinii é um arbusto em média 1,5m, folhas alternas variando entre 3 a 5 lobos elípticos ou obovatos. M. violacea é um subarbusto de cerca de 1,0m de altura, folhas alternas variando entre 3 a 7 lobos e obovatos a elípticos, sua característica típica são as brácteas vistosas e margens das folhas vináceas. Em ambas as espécies a inflorescência possui flores pistiladas na parte inferior e as estaminadas na parte superior (Roger & Appan, 1973; Allem, 1989) e as flores pistiladas abrem antes das flores estaminadas na mesma inflorescência (Nassar et al., 2008). A diversidade genética é importante para manter a capacidade natural das espécies em responder às mudanças e manter assim a vitalidade reprodutiva (Primack & Rodrigues, 2001; Cruz et al., 2011). Assim, a perda da variabilidade pode reduzir o potencial evolutivo e aumentar o risco de extinção das populações locais (Frankham et al., 2008). A distribuição da variação genética nas populações resulta da interação dos efeitos opostos da deriva genética, que causa à divergência das populações, e do fluxo gênico, que atua de forma contrária a deriva. Em geral, há dois efeitos que o fluxo gênico causa: reduz a diferença genética entre as populações e aumenta a variação dentro das populações. (Allendorf et al., 2013). Os marcadores microssatélites podem ser usados para conhecer como a variação genética está estruturada entre as populações. Tal conhecimento pode ter implicações importantes não apenas no entendimento da biologia evolutiva e na ecologia, mas também em biologia da conservação da espécie (Balloux & Lugon-Moulin, 2002). Nos últimos anos o número de estudos de genética de populações com espécies de plantas do bioma cerrado aumentou junto com o uso dos marcadores microssatélites (Souza et al., 2016). Em espécies do cerrado os marcadores microssatélites estão sendo utilizada com diversos objetivos, como em estudos de variabilidade, estrutura genética, fluxo gênico, sistema reprodutivo em populações naturais e em bancos de germoplasma.

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral

Estudar como a variabilidade genética dos locos microssatélites se distribui nas populações das espécies Manihot irwinii e Manihot violacea.

2.2. Objetivos Específicos

- Avaliar os níveis de diversidade genética dentro das populações das espécies Manihot irwinii e M. violacea;

- Verificar se a variabilidade genética se encontra estruturada nas populações das espécies Manihot irwinii e M. violacea;

- Investigar a ocorrência de fluxo gênico histórico entre duas populações das espécies M. irwinii e M. violacea na região do Parque Estadual da Serra dos Pireneus.

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1. Diversidade e caracterização da Família Euphorbiaceae Juss.

A família Euphorbiaceae está presente na maior parte do mundo (exceto em regiões polares), ou seja, é pouco representada em zonas frias e melhor desenvolvida em regiões subtropicais e tropicais, por isso é considerada uma das maiores e mais diversificada do grupo das Angiospermas. (Souza e Lorenzi, 2008; Webster, 2013). A família possui 222 gêneros e 6.100 espécies, os principais gêneros são Euphorbia (2.400), Croton (1.300), Acalypha (400), Macaranga (250), Manihot (150), Tragia (150), Jotropha (150); Mallotus (120), Sapium (100) e Dalechampia (100) (Judd et al., 2009). No Brasil ocorrem 63 gêneros e 940 espécies, 638 são endêmicas (Cordeiro et al., 2015a). A sua estrutura vegetativa é altamente variável com grande diferença de hábitos, incluindo árvores, arbustos e herbáceas perenes e anuais (Webster, 2013). Geralmente apresentam látex e às vezes espinescentes. Possuem folhas alternas, raro opostas ou verticiladas, simples, raro compostas. As flores são unissexuadas e a inflorescência é cimosa ou racemosa às vezes altamente modificada formando pseudantos, terminais ou axilares. O fruto geralmente capsular com deiscência elástica (explosiva), abrindo-se em três mericarpos (cápsula tricoca) (Souza & Lorenzi, 2008; Sátiro & Roque, 2008). Há diversas espécies de interesse econômico, com destaque a seringueira (Hevea brasiliensis Muell. Arg.), espécie nativa da Amazônia Brasileira, de onde se extrai a matéria- prima para a produção da borracha natural (Bicalho et al., 2008). Também tem grande importância a mamoma (Ricinus communis L.) espécie africana com sementes ricas em óleo de ampla aplicação na indústria e medicinal (Severino et al., 2006; Souza e Lorenzi, 2008) e a mandioca (Manihot esculenta Crantz) que é rica em carboidratos, portanto utilizada na alimentação humana e animal, sua principal parte são as raízes tuberosas, onde se concentra maior quantidade de amido (Fialho e Vieira, 2011). As folhas da espécie Cnidoscolus chayamansa Mc Vaugh são utilizadas na alimentação como verdura (Judd et al., 2009). No Cerrado a espécie Croton antisiphiliticus Mart. conhecida como pé de perdiz é utilizada como anti-sifilítica, antiinflamatória, antireumática, e contra úlceras e eczemas (Rodrigues & Carvalho, 2001; Vila Verde et al., 2003). Diversas espécies de Euphorbiaceae são utilizadas na ornamentação principalmente por possuírem brácteas vistosas ou pela sua folhagem. O bico-de-papagaio (Euphorbia pulcherrima Willd. ex Klotzsch.) a cora-de-cristo (Euphorbia milii Des Moulins), são muito 20

utilizadas como cerca-viva, devido aos rígidos espinhos, a caracasana (Euphorbia cotinifolia L.) possui folhas vermelho-vináceas, os candelabros (Euphorbia ingens E.Mey. ex Boiss., E. trigona Miller e E. lactea Haw.) são plantas suculentas semelhantes aos cactos, mas latescente (Souza & Lorenzi, 2008). Algumas espécies produzem sementes e látex que são tóxicos ao homem e aos animais como a nogueira-de-iguapé (Aleurites moluccana L. [WilId.]), purga-de-cavalo (Joanesia princeps Vell.) e aveloz (Euphorbia tirucalli L.), o látex pode causar graves acidentes quando em contato com mucosas principalmente os olhos e as sementes quando são ingeridas (Souza & Lorenzi, 2008). Algumas espécies de Manihot selvagens são venenosas para os animais que pastam, devido ao alto teor de HCN (ácido cianídrico), essas espécies tóxicas são conhecidas pela população no Nordeste como maniçoba (“mandioca venenosa”) (Nassar, 2000). E muitas espécies dos gêneros Euphorbia e Hippomane são utilizadas como veneno para flechas e para captura de peixes (Judd et al., 2009).

3.2. Gênero Manihot Mill.

3.2.1. Distribuição, Diversificação e Especiação do Gênero Manihot Mill.

O gênero Manihot pertence à família Euphorbiaceae subfamília Crotonoideae tribo Manihoteae (Webster, 1994). O gênero é divido em 19 seções e as espécies M. irwinii e M. violacea pertencem à seção Quinquelobae (Rogers & Appan, 1973). De acordo com a última revisão do gênero feito por Rogers e Appan (1973) há 98 espécies distribuídas desde o sudoeste da América do Norte ao Norte da Argentina com duas maiores concentrações de espécies: no Sudoeste do México e no Brasil (Figura 1) (Duputié et al., 2011). Nassar (1978) expôs a existência de quatro centros de diversidade para as espécies de Manihot: (i) no sul de Goiás e leste de Minas Gerais; (ii) no sudoeste do México; (iii) nordeste do Brasil e o (iv) no sudoeste do Mato Grosso e na Bolívia (Figura 1). Em estudo citogenético Carvalho & Guerra (2002) sugeriram que a diversificação das espécies de Manihot é relativamente recente, devido à alta similaridade entre os cariótipos. Os dados de Chacón et al. (2008) indicam uma origem recente durante o final do Mioceno e em Duputié et al. (2011) os resultados corroboram com uma origem recente na Mesoamérica e colonização recente na América do sul que pode ter ocorrido após ou pouco antes da formação do Istmo do Panamá cerca de 3.5 Ma. Em análise filogenético Berry et al. 21

(2005) do gênero Croton, pertence a mesma família e subfamília de Manihot, indicaram uma origem na América e posterior dispersão a outros continentes. De acordo com Nassar et al. (2008) há microcentros de diversidade no Brasil Central devido a alta quantidade de espécies concentradas em áreas de 50 km. As regiões de Corumbá de Goiás e Goiás, cidades do estado de Goiás, são exemplos de microcentros. No Parque Estadual da Serra Dourada, localizado no estado de Goiás, foram identificadas nove espécies do gênero Manihot (Junior et al., 2013), isso demonstra que essa região também pode ser considerada um microcentro de diversidade. No Brasil ocorrem 76 espécies e dessas 66 são endêmicas do país. No estado de Goiás ocorrem 40 espécies e 13 são endêmicas, entre elas a M. irwinii. No Distrito Federal há um total de 16 espécies (Cordeiro et al., 2015b). A maior diversidade biológica ocorre no Cerrado da região Centro-Oeste, estendendo-se até a Caatinga, no Nordeste, com epicentro localizado no Distrito Federal e em regiões próximas do Estado de Goiás (figura 1) (Allem, 1994; Gulick et al., 1983 apud Alves et al., 2011). Em trabalho desenvolvido por Duputié et al. (2011) o gênero apresentou ser monofilético, e as espécies agruparam de acordo com sua biogeografia e sua ecologia, as espécies do cerrado formaram um clado bem definido e as da caatinga no Nordeste formaram outro (Figura 2).

Figura 1. Mapa da distribuição do gênero Manihot. Adaptado de Duputié et al., 2011.

Figura 2. Filogenia do gênero Manihot baseado em sequências de genes nucleares (NIA e G3pdh). Em destaque vermelho a M. violacea e em azul a M. irwinii. Adaptado de Duputié et al., 2011.

Em trabalho citogenético realizado por Carvalho & Guerra (2002) com trinta e nove cultivares de M. esculenta e oito espécies selvagens de Manihot observaram que as espécies compartilham um cariótipo comum e estável com 2n=36 (e n=18) de pequenos cromossomos metacêntricos a submetacêntricos. Hevea brasiliensis, espécie conhecida como seringueira 23

pertence também à família Euphorbiaceae, apresentou o mesmo número de cromossomos 2n=36 (Leitch et al., 1998). Veiga (2011) em seu trabalho com três variedades de mandioca e oito espécies selvagens também obtiveram resultados semelhantes, um cariótipo estável 2n=36 para todas as selvagens e para uma das variedades de mandioca doméstica apresentou cariótipo 2n=54, apenas a espécie M. leptophylla apresentou constrição secundária em posição diferente das outras, nessa espécie está próxima ao centrômero e nas outras está subterminal, por isso este polimorfismo da RON (Região Organizadora de Nucléolo) foi considerado como um marcador espécie-específico. Na Tabela 1 foram listadas algumas espécies silvestres com o respectivo número de cromossomos.

Tabela 1. Composição citogenética de espécies silvestres do gênero Manihot Mill Espécies N 2n Referências* M. anômala Pohl 18 36 Veiga, 2011; Nassar, 2000b M. caerulescens Pohl 18 36 Carvalho e Guerra, 2002 M. carthaginensis 18 36 Carvalho e Guerra, 2002 (Jacquin) Müll. Arg M. diamantinensis Allem 18 36 Carvalho e Guerra, 2002 Veiga, 2011; Carvalho e Guerra, 2002; M. dichotoma Ule 18 36 Nassar, 2000b M. flabellifolia Pohl 18 36 Veiga, 2011 M. glaziovii Müll. Arg. 18 36 Veiga, 2011 M. glaziovii Müll. Arg. 18 36 Carvalho e Guerra, 2002; Nassar, 2000b M. gracilis Pohl 18 36 Nassar, 2000b M. handroana N.D. Cruz - 36 Nassar, 2000b M. humilis Müll. Arg. - 36 Nassar, 2000b M. irwinii 18 36 Veiga, 2011 M. jolyana N.D. Cruz - 36 Nassar, 2000b M. leptophylla Pax & 18 36 Veiga, 2011 Hoffm. M. nana Müll. Arg 18 - Nassar, 2000b M. olighanta 18 - Nassar, 2000b M. peruviana Müll. Arg. 18 36 Veiga, 2011 M. tomentosa Pohl 18 36 Veiga, 2011; Nassar, 2000b M. tripartita (Spreng.) 18 36 Nassar, 2000b Müll. Arg. M. tweedieana Müll.Arg. - 36 Nassar, 2000b M. zehntneri Ule 18 - Nassar, 2000b *Com adaptações de Nassar, 2000b.

A duplicação do genoma é frequente em plantas mesmo naquelas que são considerados diplóides. Cerca de 70% das angiospermas apresentam eventos de poliploidia na sua ancestralidade, e a sua alta incidência em muitos grupos de plantas indica que a poliploidia foi importante na origem e evolução de plantas silvestres e cultivadas (Masterson, 24

1994; Schifino-Wittmann, 2004; Judd et al., 2009). Há duas formas principais de poliploidia: (i) autopoliploidia união de três ou mais conjuntos cromossômicos da mesma espécie; (ii) e a alopoliploidia união de dois ou mais genomas de espécies diferentes, formando híbridos. Devido às divergências nos cromossomos de diferentes genomas pode ocorrer o não pareamento deles durante a meiose e as diferenças no número cromossômico entre espécies geralmente levam a redução na taxa de fertilidade em híbridos e na criação de barreiras interespecíficas (Judd et al., 2009). Alguns poliplóides podem passar por diploidização (figura 3), ou seja, ao longo do tempo apresentam comportamento meiótico típico de diplóide. Mas antes o genoma do poliplóide sofre uma reestruturação e consequentemente comportar-se como um diplóide (Wolfe, 2001; Schifino-Wittmann, 2004). Essa reestruturação pode ser mediada por elementos transponíveis, reorganização cromossômica e silenciamento gênico (Soltis & Soltis, 1999). Além disso, ocorrem alterações no padrão da expressão gênica em que os genes duplicados podem ser perdidos, retidos ou mantidos como duplicatas muitas vezes passando por subfuncionalização (retenção por duplicação de genes com diferenciação da função original) e neofuncionalização (adquirem nova função por duplicação) (Comai, 2005). O aumento do genoma por poliploidia fornece material genético livre para mutações em genes novos pelos quais a seleção natural pode atuar, como resultado os poliplóides tendem a ter distribuições maiores e colonizar habitats mais extremos do que seus parentes diplóides (Comai, 2005). Mesmo com o elevado número de cromossomos encontrados nas espécies selvagens de Manihot (Tabela 1), elas comportam-se como diplóide, por isso acredita-se que um evento de poliplodização antecipou o surgimento de todo o grupo e é responsável pela sua especiação rápida e uma fraca barreira interespecífica, facilitando a hibridização entre as espécies dentro do gênero (Nassar, 2002). Estudos apontam uma origem alotetraploide para o gênero Manihot derivado do número básico x=9 (Jennigs, 1963; Rogers & Appan, 1973).

Apomixia é uma forma de reprodução assexuada através da semente, em que ela se forma sem fertilização (Hand & Koltunow, 2014). A progênie de uma planta apomítica é geneticamente idêntica à planta mãe. A maioria dos apomíticos é poliplóide e foi proposta como conseqüência de hibridização e/ou duplicação do genoma, ou seja, eventos de poliploidização (Carman, 1997). Mas a poliploidia isolada não é suficiente para induzir a apomixia, já que nem todos poliplóides são apomíticos. Muitos dos apomíticos naturais são considerados como facultativos, porque apresentam capacidade de reproduzir tanto sexuadamente como assexuadamente (Hand & Koltunow, 2014). A apomixia é frequente nas espécies de Manihot, esse processo desempenha importante papel na especiação em todo o gênero. E a alopoliploidia fornece uma ampla variabilidade genética e a apomixia mantém genótipos que podem ser favorecidos em determinados nichos, e a apomixia facultativa mantém a variabilidade genética por meio da reprodução sexual (Nassar, 2002; Nassar et al., 2007; Nassar et al., 2008b). Em estudo com microssátelites de Nassar & Colevatti (2005) e de Nassar et al. (2007) com clone de mandioca cultivada, apresentou progênies com genótipos iguais a mães 26

isso indica possível apomixia. Como foi verificada a incidência de sacos multiembrionários no clone, além disso, a alta esterilidade do clone e a maturação das flores pistiladas e estaminadas serem em tempos diferentes, excluem-se a autopolinização como uma causa para os alelos idênticos na sua prole. A espécie selvagem M. glaziovii apresentou apenas um genótipo diferente da mãe, indicando tanto apomixia como fecundação cruzada. Nassar et al. (2008b) identificou apomixia através do exame do saco embrionário em um híbrido natural entre M. tripartita e M. caerulescens. A combinação de hibridismo e poliploidia apoia a ideia de que ambos os fenômenos devem ter desempenhado um papel importante na evolução da apomixia nas espécies de Manihot. O hibridismo leva a novos tipos que podem ser adaptáveis para determinados ambientes, enquanto poliploidia aumenta os genes responsáveis por apomixia e assim conserva esses genótipos nas populações (Freitas & Nassar, 2013).

3.2.2. Caracterização Botânica e Ecológica

As espécies do gênero podem ser subarbustos, arbustos, árvores ou trepadeiras, normalmente produzem látex em quantidade variável e contém glicosídeos cianogênicos. São caulescentes ou acaulescentes, a folhas estão dispostas no caule de forma alterna, roseta, variando de três a nove lobos ou inteiras. Os pecíolos são cilíndricos, basais, verde amarelados ou vináceos. As inflorescências são terminais de cor verde-vináceas, a maioria das espécies é monóica (Rogers & Appan, 1973; Nassar et al., 2008a). Em muitas espécies as flores pistiladas abrem antes das flores estaminadas na mesma inflorescência e a polinização é feita por insetos (Nassar et al., 2008a). Em estudo de Nassar & Carvalho (1990) com 9 espécies (Manihot heptaphylla, M. neusana, M. pseudoglaziovii, M. pilosa, M. pohlii, M. glaziovii, M. zehntneri, M. dichotoma, M. cearulescens) mantidas na Estação Biológica da UnB (Universidade de Brasília) observaram maior frequência de visitações das espécies de abelhas Apis mellifera (70,4%) e Bombus morio (5,6%). E em trabalho de Silva et al. (2001) com variedades de Manihot esculenta a espécie Apis mellifera foi o principal polinizador. Na espécie M. esculenta Crantz, planta monóica, as flores masculinas formam-se na parte superior em maior número e as flores femininas formam-se na parte basal em menor número na inflorescência. As flores femininas abrem uma semana antes das flores masculinas na mesma inflorescência. Contudo, em inflorescências diferentes podem abrir simultaneamente as flores masculinas e as femininas. Então a autofecundação e a fecundação cruzada podem ocorrer. É uma espécie preferencialmente alógama e altamente heterozigota 27

devido ao caráter protogênico da espécie. Há forte depressão endogâmica ocasionada pela autofecundação mesmo não existindo barreiras genéticas ou fisiológicas que impeça a sua ocorrência (Nolasco, 2011). Os frutos são capsulares deiscentes com três lóculos, as sementes podem ter carúncula que variam em tamanho (Nassar, 2000b) ou indeiscentes com sementes grandes que não possuem carúncula (Duputié et al. 2011). Algumas espécies possuem adaptações para mirmecocoria associados com dormência prolongada das sementes enterradas, nelas as sementes são lançadas por deiscência explosiva da cápsula. A carúncula das sementes é rica em lipídios que funciona como elaiossomo que atrai formigas que as consomem e enterram (Duputié et al,. 2011). Em estudo do pericarpo em duas espécies de Manihot realizado por Oliveira & Oliveira (2009) observaram na espécie M. caerulescens, com cápsula indeiscente, que o seu pericarpo juntamente com as sementes compõe o diásporo e este pericarpo tem mais reserva nutritiva que outra espécie M. tripartita que tem cápsula deiscente onde o diásporo é a própria semente e a dispersão a princípio é autocórica e a participação do pericarpo na dispersão limita-se à exposição da semente. Neste mesmo estudo em observações pessoais de campo encontram formigas alimentando-se dos frutos de M. caerulescens, desta maneira a indeiscência pode ter se desenvolvida como adaptação do pericarpo na dispersão já que apresenta compostos nutritivos que podem ser utilizados pelos dispersores sem causar danos a semente. As espécies de Manihot são esporádicas na sua distribuição e raramente dominam a vegetação local (Nassar, 2000b; Nassar et al., 2008a). A maioria das espécies é encontrada em regiões relativamente secas e apenas algumas são encontradas em regiões de floresta tropical com aberturas na floresta. Apresentam sensibilidade ao frio e por isso o seu limite de altitude nos trópicos é de aproximadamente 2000 metros (Rogers & Appan, 1973.) e a maioria das espécies são danificados pelo gelo com poucas exceções (M. grahamii e M. neusana) cuja distribuição nativa inclui áreas com geadas ocasionais (Nassar et al., 2008a). Muitas arbustivas e subarbustivas adaptadas a períodos de seca como as nativas do Cerrado brasileiro geralmente durante a estação seca perdem suas folhas (Nassar, 2000). Espécies do tipo árvore como M. glaziovii e M. pseudoglaziovii são encontradas no nordeste do Brasil, enquanto que as espécies de habito arbustivo e subarbustivo são encontradas no Brasil Central (Nassar et al., 2008a).

3.2.3. Importância Econômica do Gênero Manihot

A mandioca é um dos mais importantes alimentos básicos na dieta humana, é a quinta mais importante fonte de carboidratos no mundo, a quarta na América do Sul e a terceira na África. Nas pesquisas desenvolvidas com mandioca, uma lacuna é a falta de estudos das espécies silvestres brasileiras do gênero Manihot (Alves et al., 2011). Espécies selvagens Manihot são importantes fontes de genes que podem ser utilizados em programas de melhoramento para combater a estresses bióticos e abióticos, bem como para a melhoria da qualidade de raízes de mandioca (Nassar et al., 2008a; Alves et al., 2011). Líns et al. (2014) obtiveram resultados que mostraram potencial para a produção de biodiesel a partir das sementes da M. glaziovii. Essa também apresenta potencial comercial para a produção de borracha e para ornamentação (Rogers & Appan, 1973) e tem sido utilizada no melhoramento da mandioca para transferência de resistência ao mosaico vírus (Alves et al., 2011). Na Tabela 2 encontram-se outras espécies com seu potencial econômico.

Tabela 2. Lista de espécies do gênero Manihot com seu potencial econômico. Espécies Potencial Econômico M. alutacea D.J.Rogers & Appan. Ornamental; Tolerante a solos ricos em cálcio. M. anomala Pohl Apresenta grandes raízes; Tolerante a solos ricos em cálcio e hibridiza com M. esculenta produzindo prole fértil M. caerulescens Pohl Muito tolerante a seca; Sementes comestíveis M. dichotoma Ule Tolerante a seca, rápido crescimento, as folhas apresentam altos níveis de caroteno e contem altos níveis de minerais e proteínas M. fruticulosa D.J.Rogers & Possui raízes comestíveis Appan. M. gracilis Pohl Contém baixa quantidade de HCN M. leptophlylla Pax Extremamente tolerante ao Xanthomonas manihotis; forma sementes grandes e comestíveis M. neusana Nassar Fonte de genes de apomixia; Resistencia Xanthomonas manihotis M. oligantha Pax Hibridiza com mandioca e produz grandes raízes M. peltata Pax Potencial ornamental e tolerância a solos tóxicos M. pentaphylla Pohl Tolerante a seca e a solos ricos em cálcio. M. procumbens Muell. Arg. Tolerante a solo tóxico principalmente com magnésio M. reptans Pax Resistente ao Xanthomonas manihotis e solos ricos em cálcio M. stipularis Pax & K. Hoffmann Tolerante a solos tóxicos e a solos ricos em cálcio Adaptado de Nassar et al., 2008a.

3.2.4. Caracterização das espécies Manihot irwinii D.J.Rogers & Appan e Manihot violacea Pohl

No gênero as espécies M. irwinii e M. violacea estão agrupadas na Seção Quinquelobae. É a segunda maior seção do gênero, com espécies que apresentam como principais características, inflorescências racemosas e folhas 3 a 5 lobos, discolores, com face abaxial glauca e tonalidades vináceas nos pecíolos e nervuras (Silveira, 2012). Em Rogers & Appan (1973) a seção Quinquelobae possui o total de 14 espécies, mas na revisão feita por Allem (1989) conclui a existência de 10 espécies (Tabela 3), e aparentemente as alterações feitas por Allem (1989) não foram acatadas. No entanto, algumas destas espécies apresentam uma situação controvérsia (Neto et al., 2014).

Tabela 3. Lista sequencial das 14 espécies do gênero Manihot seção Quinquelobae como foi apresentando por Roger & Appan (1973) e nova demostração feita por Allem (1989), com suas respectivas distribuições. Rogers & Appan Allem (1989) Distribuição* (1973) M.acuminatissima M. sagitto-patita (incluiu M. acuminatissima) TO/GO M. sagitto-patita M. tripartita*** (incluiu M. xavantinensis) DF/GO M.xavantinensis M. sparsifolia MT M. sparsifolia M.hilariana (incluiu M. falcata) GO/DF M.falcata** M.pruinosa MG/GO M.pruinosa M.quinqueloba TO/GO/MS/MT M.quinqueloba M. alutacea GO/MT M. alutacea M.violacea var. violacea GO M.violacea M.violacea var. jacobinensis GO/DF/MG M.jacobinensis M.violacea var. divergens BA M.divergens M.violacea var.cecropiifolia GO/MG M.irwinii M.irwinii GO M.cecropiifolia M. mossamedensis GO/DF M. mossamedensis - GO * Distribuição de acordo com Cordeiro et al. (2015) no Reflora (), em que a maioria das espécie encontram-se classificadas como na coluna de Rogers & Appan (1973); **apenas a espécie M. falcata se tornou sinônimo de M. hilariana e foi aceito no reflora; ***M. tripartita pertence a seção Grandibracteatae.

Em alguns trabalhos fica evidente a divergência no uso da classificação das espécies, em que autores utilizam Rogers & Appan (1973) e outros Allen (1989), a seguir exemplos. No trabalho de Rodrigues (2007) foi considerada duas variedades a M. violacea var. violacea e a M. violacea var. cecropiifolia. Em estudo de pólen com espécies selvagens Vieira (2010) tratou M. violacea e M. cecropiifolia como duas espécies distintas. E Roger & Appan (1973) descrevem duas subespécies da M. violacea, a M. violacea subsp. violacea e M. violacea 30

subsp. recurvata, que são utilizadas pelo Reflora a primeira tem distribuição no estados de Goiás, Distrito Federal e Minas Gerais e a segunda é restrita ao estado de Goiás (Cordeiro et al., 2015). A maioria das espécies de Manihot é variável em relação a suas estruturas vegetativas, em contraste com a morfologia das flores. Essa característica e a produção frequente de formas híbridas tornam difícil a diferenciação entre as espécies com base na morfologia (Rogers & Appan, 1973). Duputié et al. (2011) evidenciam alta plasticidade no gênero, ou seja, podem assumir formas diferentes em ambientes distintos, e então sugeriram cautela na diferenciação das espécies. A M. irwinii é endêmica do estado de Goiás (Allem, 1989; Cordeiro et al., 2015b), cresce em encostas rochosas (cerrado rupestre) (Allem, 1989). O cerrado rupestre é um tipo de fitofisionômia predominante herbáceo-arbustivo, com a presença eventual de arvoretas pouco desenvolvidas de até dois metros. Abrange um complexo de vegetação que agrupa paisagens em microrelevos, ocupando trechos de afloramento rochosos e geralmente ocorre em altitudes superiores a 900 metros (Sano & Almeida, 1998). M. irwinii é um arbusto de 1,5m de altura, completamente glabo. As folhas são alternas com 3-5 lobos, e folhas associadas com inflorescência frequentemente não lobadas. Lobos elípticos ou obovatos, ápice agudo, obtuso ou caudado, não simétricos. Inflorescências racemo terminal (ocasionalmente axilares) com flores pistilatas restritas na parte inferior e flores estaminadas verde-amareladas com quantidade considerável de pigmenação arroxeadas. Frutos em cápsula subglobosa, ligeiramente alongada, superfície lisa sem asas proeminentes ápice arredondado, deiscência septicida. (Rogers & Appan, 1973; Allem, 1989). Em trabalho de Veiga (2011) a espécie M. irwinii apresentou regularidade meiótica sugerindo estabilidade cariotípica (2n=36) inclusive quanto ao tamanho, morfologia e número diplóide. M. violacea ocorre no Distrito Federal, Goiás, Mato Grosso e Minas Gerais (Rogers & Appan, 1973; Allem, 1989; Cordeiro et al., 2015b). A espécie é encontrada em torno de 1000m de altitue e é comum após a passagem do fogo (Rogers & Appan, 1973). Ocorre em campo limpo, campo rupestre, cerrado sensu stricto e cerrado antropizado (Rodrigues, 2009) e muitas vezes próximos a rodovias (Allem, 1989). A espécie M. violacea é um subarbusto de cerca de 1,0m de altura, totalmente glabo. As folhas são alternas, e apresenta polimorfismo foliar com lobos foliares obovais a elípticos ou lanceolados, folhas de 3-7 lobos, e característica típica da espécie são folhas glabras brácteas vistosas e folhas com margens inteiras vináceas. Folhas associadas com a inflorescência frequentemente não apresentam lobo. Apresenta pecíolos, nervuras, brácteas e 31

flores em tons violetas. Inflorescências racemo terminal ou ocasionalmente axilar, flores masculinas e femininas, ereto ou pendente, todas as partes glabras. Flores pistiladas restritas a inferior da inflorescência (Rogers & Appan, 1973; Allem, 1989; Rodrigues, 2007). Existem contradições sobre a presença e ausência de carúncula nas duas especies, em Rogers & Appan (1973) consta a presença de carúncula em ambas e em Allem (1989) não contém carúncula. Na espécie M. esculenta as flores femininas abrem antes das masculinas, mas pode ocorrer florescimento ao mesmo tempo de flores masculinas e femininas em inflorescências diferentes então pode ocorrer fecundação cruzada e autofecundação, mas sofre forte depressão endogâmica (Nolasco, 2011). Não foram encontrados trabalhos que relatassem o tipo de sistema de cruzamento da espécie M. irwinii e M. violacea. O sistema de cruzamento pode influenciar na variação genética dentro da população dependendo do sistema reprodutivo (Loveless & Hamdrick, 1984; Ghazoul, 2005). Em estudo de Rodrigues (2007) a M. violacea apresentou ampla distribuição no Distrito Federal, e pode ser encontrada ocorrendo em simpatria com Manihot gracilis, M. pusilla, M. triphylla, M. nana e M. sparsifolia. No mesmo estudo observaram coleópteros visitando as plantas e encontraram populações no Parque Nacional de Brasília florescendo durante a época seca. Em Duputié et al. (2011) encontraram forte relação entre as espécies M. violacea, M. cecropiifolia e M. irwinii e em Silveira (2012) as espécies M. violacea e a M. cecropiifolia também apresentaram forte relação. No estudo filogenético do gênero a espécie M. violacea apareceu próxima de M. jacobinensis e a M. irwinii está mais relacionada com M. esculenta subsp. esculenta (Chacón et al., 2008). Baseado em análises morfológicas do complexo M. violacea e outras espécies de Manihot, Neto et al. (2014) encontraram a formação de dois grupos: no primeiro reuniu os três indivíduos de M. violacea ssp. jaconbiensis de três localidades diferentes (Lençóis-BA, Mucugê-BA e Embrapa-BA) e no segundo reuniu M. violacea, M. violacea var. cecropiifolia e M.violacea var. divergens e M. caerulescens (espécie da caatinga). Em Duputié et al. (2011) utilizaram sequências de DNA de três indivíduos de M. violacea, dois localizados nos municípios de Alexânia-GO e de Goiás-GO e o terceiro do município de Lençóis-BA que não agrupou com os outros dois (Figura 2). Foram observadas estruturas nas folhas das duas espécies, na Serra dos Pireneus (M. irwinii), no Gama e Silvânia na espécie M. violacea que são semelhantes as que ocorrem na espécie de mandioca domesticada idênticas a verrugas (Figura 4). O Jatrophobia brasiliensis (mosca-das-galhas) faz a postura endofiticamente na folha, e sua presença induz uma reação 32

da planta com a formação de cecídia ou galha (verrugas) (Dias, 2004), possivelmente ele pode estar causando as galhas nas M. violacea e M. irwinii. Apesar da pouca importância econômica, podem ocorrer altas infestações em plantios de mandioca (M. esculenta) jovens, retardando o crescimento da planta (Dias, 2004). Em estudo de Araujo et al. (2011) identificaram na Serra dos Pirenus 62 tipos de galhas em 28 famílias botânicas dentre essas a família Euphorbiaceae ocorrendo em 3 espécies de Manihot.

A B C

3.3. Variabilidade genética em populações nativas do Cerrado

3.3.1. Diversidade e estrutura genética populacional

Variabilidade genética é a diversidade de alelos encontrada nos locos presente em um grupo de estudo, e geralmente é observada pela frequência alélica, número de alelos e heterozigosidade (Frankham et al., 2008; Ferreira, 2008). Medir a freqüência de heterozigotos é importante, uma vez que cada heterozigoto carrega diferentes alelos e representa a existência de variação (Weir, 1996). Logo a variabilidade é a matéria prima necessária para que a seleção natural atue e assim permitir a adaptação e evolução das espécies e a sua adequação às mudanças ambientais (Frankham et al., 2008; Ferreira, 2008). A diversidade genética é importante para manter a capacidade natural de responder a todos os tipos de mudanças bióticas e abióticas (Primack & Rodrigues, 2001; Cruz et al., 2011) e a sua perda reduz o potencial evolutivo e aumenta o risco de extinção (Frankham et 33

al., 2008). Quantificar essa variabilidade dentro das populações é crucial para avaliar como as espécies enfrentam o ambiente e se mantém vivas e reprodutivas ao longo dos tempos (Ribeiro & Rodrigues, 2006). Nos últimos anos o número de estudos de genética de populações com espécies de plantas do bioma cerrado tem aumentado (Souza et al., 2016), assim conhecer a diversidade genética contribui no desenvolvimento de projetos de conservação mais eficientes. Em relação ao hábito, as árvores são as mais estudadas seguidas pelas ervas, arbustos, subarbustos e trepadeiras (Souza et al., 2016). E os principais tipos fitofisionômicos ou habitat que essas espécies ocorrem são o cerrado stricto sensu, cerradão e mata de galeria (Souza et al., 2016). Estudo sobre variabilidade genética de espécies do cerrado mostrou que a maioria das espécies foi representada pelas famílias Fabaceae, Asteraceae e Bignoniaceae. A Caryocar brasiliense foi a espécie com maior número de estudos (8 publicações) seguida por Eugenia dysenterica (7 publicações) e Dipteryx alata (7 publicações) (Souza et al., 2016). A variabilidade genética é introduzida continuamente nas populações pela mutação e por fluxo gênico e é perdida por deriva genética, por endocruzamentos e pela seleção natural (Nei, 1987; Judd et al., 2009). O fluxo gênico gera novos polimorfismos nas populações, e aumenta o tamanho efetivo da população local (a capacidade de resistir a mudanças aleatórias nas freqüências alélicas) opondo-se, assim a deriva genética aleatória, gerando novas combinações de genes em que a seleção pode atuar (Balloux & Lugon-Moulin, 2002). A extensão da variação nas populações é resultado de forças que tendem a produzir diferenciação genética e forças que tendem a produzir homogeneização. A mutação, a deriva genética e a seleção natural favorecendo condições ambientais locais levam a diferenciação genética nas populações e o movimento de gametas e indivíduos opõem-se a diferenciação (Slatkin, 1987). A Migração retarda a diferenciação consideravelmente, e mesmo uma pequena quantidade de migração é suficiente para evitar qualquer diferenciação (Nei, 1975). O termo diferenciação genética significa que as freqüências alélicas entre as subpopulações se tornam diferentes (Hartl & Clark, 2010). A estrutura genética pode ser definida como a distribuição da variabilidade genética entre e dentro de populações, ou mesmo, como a distribuição não aleatória de alelos ou de genótipos no espaço e no tempo (Loveless & Hamrick, 1984). A estrutura genética resulta da ação conjunta de mutação, migração, seleção e deriva que por sua vez operam dentro do contexto histórico e biológico de cada espécie. Fatores ecológicos que afetam a reprodução e dispersão são importantes na determinação da estrutura genética (Hamrick, 1982; Loveless & Hamrick, 1984). 34

Há diversos métodos desenvolvidos para estimar a variação genética e a estrutura genética das populações com aplicações variadas. Em geral podem ser utilizadas três metodologias para avaliar a estrutura genética das populações: estatísticas-F (FST) de Wright

(Wright, 1951), Diversidade Genética ou Estatística GST de Nei (Nei, 1973) e Coeficiente de Coancestria (θ) (Weir & Cockerham, 1984). Esses métodos possuem uma base genética semelhante e as estimativas obtidas por elas são análogas (Holsinger & Weir, 2009). Além desses existem outros parâmetros que também são utilizados para medir o grau de estruturação genética (RST, ΦST e QST). O GST está mais relacionado com o FST, e é utilizado como uma medida da diferenciação genética entre populações. No entanto, GST é um parâmetro adequado de diferenciação genética apenas quando a contribuição de deriva genética para as diferenças entre as populações não é de interesse. Em contraste, RST (para dados de microssatélites) e ΦST (para dados de sequência moleculares) são úteis numa grande variedade de contextos em que é importante para ter em conta as distâncias mutacionais entre os alelos, e QST é útil na análise de dados de características quantitativas (Holsinger & Weir, 2009). Estudo sobre tendências de artigos de genética de populações com plantas do bioma cerrado, mostrou que os estimadores mais utilizados foram os ΦST, θ e GST , sendo o ΦST o mais utilizado nas publicações para analisar a presença e o nível de diferenciação genética entre as populações de plantas do cerrado. (Souza et al., 2016).

Se o valor de FST é pequeno, significa que as frequências de alelos em cada população são semelhantes, e se for grande, significa que as frequências de alelos são diferentes (Holsinger & Weir, 2009). O valor de FST varia de zero a um. Um FST=1 indica populações com diferentes alelos fixados entre elas e que não há diversidade dentro delas, e quando o FST=0 indica populações com frequências alélicas iguais e, portanto não há diferença genética entre as populações. Valores de FST entre zero e um podem ser interpretados como diferentes níveis de estruturação (Balloux & Lugon-Moulin, 2002). Para isso Hartl & Clark (2010) sugeriram quatro orientações qualitativas para interpretação do FST: (i) 0 – 0,05: pequena diferenciação genética; (ii) 0,05 – 0,15: diferenciação genética moderada; (iii) 0,15 – 0,25: grande diferenciação genética; (iv) > 0.25: diferenciação genética muito grande. O sistema reprodutivo das plantas é considerado um dos principais fatores que influenciam a estrutura genética (Loveless & Hamrick, 1984). E a morfologia floral está intimamente relacionada com o sistema de reprodução, uma vez que a autogamia só ocorre em plantas hermafroditas ou monóicas. Espécies dióicas possuem fecundação cruzada e, 35

portanto, podem ter maiores áreas de cobertura e menor diferenciação populacional. Muitas vezes a biologia floral está relacionada com o mecanismo de polinização (Loveless & Hamrick, 1984). Existem elementos do comportamento dos polinizadores que são relevantes para a reprodução das plantas e pode contribuir para o isolamento, tais como o comportamento de busca, extensão de forrageamento e sua dieta (Ghazoul, 2005). Em escalas locais o comportamento de forrageamento de polinizadores está fortemente ligado à disponibilidade dos recursos florais. Em escalas espaciais maiores, de dezenas a centenas de metros, o tamanho floral se torna importante, pois com a diminuição da densidade de plantas ocorre uma maior necessidade de atrair polinizadores de mais longe e consequentemente decresce a variedade de pólens que são compatíveis em cada flor. Plantas raras são suscetíveis a transferência de pólen interespecífico, pois os polinizadores generalistas forrageam de forma dependente da frequência das plantas mostrando maior regularidade de espécies comuns ou formas florais. O padrão e capacidade de movimentação dos polinizadores contribuem para a eficiência dos animais como polinizadores (Ghazoul, 2005). O fluxo gênico através do pólen depende de alguns fatores, como a distância entre as plantas, a temperatura e a umidade, que influenciam a viabilidade do pólen, o sincronismo no florescimento entre a planta doadora e receptora do pólen, a cor das flores, que está relacionada à atratividade com a atração do polinizador, e a quantidade de pólen (Schuster, 2013). No Parque Estadual da Serra de Caldas em Goiás foi observado o comportamento do polinizador em resposta ao aumento da disponibilidade de recurso floral e concluíram que plantas com muitas flores podem fornecer uma maior quantidade de alimento em um mesmo local, de modo que o visitante floral não precise se locomover por grandes distâncias em busca de atender suas necessidades energéticas (Gonçalves et al., 2002). A dispersão de sementes a longa distância e o estabelecimento de plântulas evita divergência das populações. Dispersão por gravidade ou explosiva deposita sementes perto das plantas mães, e isso aumenta a estrutura familiar reduzindo o tamanho efetivo e promove a divergência entre populações (Loveless & Hamrick, 1984). A espécie Zeyheria montana, planta arbustiva da família Bignoniaceae endêmica do

Cerrado, apresentou entre oito populações uma estimativa de variação ΦST =0,160 indicando uma alta estruturação populacional, essa divergência entre as populações de acordo com os autores pode ser resultado do processo de dispersão que ocorre pelo vento e da espécie ser alógama e apresentar autoincompatibilidade (Bertoni et al., 2007). 36

A distribuição geográfica de algumas espécies é mais ampla do que a sua capacidade de dispersão de indivíduos, então as populações são muitas vezes geneticamente diferenciados devido a um isolamento por distância, ou seja, populações com estreita proximidade são geneticamente mais semelhantes do que as populações mais distantes (Balloux & Lugon- Moulin, 2002). Em trabalho com Hevea brasiliensis, espécie da família Euphorbiaceae, usando marcadores RFLP foi observado uma forte estruturação geográfica entre as populações dos estados do Acre, Rondonia e Mato Grosso, ou seja, a variabilidade genética está organizada de acordo com a localização geografica das áreas estudadas (Besse et al., 1994). Le Guen et al. (2009) encontraram valor alto de diferenciação genética entre as populações de Hevea brasiliensis que pode ser causado pela localização geográfica dentro da rede hidrográfica amazônica e pelo isolamento por distância entre as populações pertencentes a diferentes bacias hidrográficas. Fluxo gênico ocorre geralmente dentro de espécies, mas há exemplos de fluxo gênico interespecífico (Slatkin, 1985). O fluxo pode ser classificado em vertical quando envolve populações da mesma espécie ou horizontal quando ocorre entre espécies diferentes aparentadas ou não (Borém, 2005; Cruz et al., 2011). Há barreiras que impedem o fluxo gênico entre espécies próximas, estas são conhecidas como barreiras de isolamento reprodutivo. Em seguida alguns tipos: (i) Isolamento Temporal: floradas em diferentes épocas do ano ou do dia; (ii) Isolamento de hábitat: duas espécies ocupam habitas diferentes; (iii) Isolamento Floral: adaptações florais para atrair polinizadores diferentes previnem ou evitam o fluxo entre muitas espécies, estas adaptações se manifestam através da estrutura floral ou através de efeitos na conduta dos polinizadores; (vi) Sistema Reprodutivo: mudança de polinização cruzada para reprodução por autofertilização ou por apomixia; (v) Incompatibilidade: o pólen atinge o estigma de outra espécie, o estilete desta última em geral não permitirão o crescimento do tubo polínico estranho em direção ao óvulo; (vi) Inviabilidade do híbrido: incapacidade do híbrido em atingir a maturidade e reprodutiva; (vii) Isolamento floral do híbrido: ausência de polinizadores cujo parentais estão adaptados a polinizadores diferentes; (viii) Esterilidade do híbrido: os híbrido são viáveis, mas seus cromossomo não pareiam durante a meiose devido ao número de cromossomos ou diferenças que impedem o pareamento (Judd et al., 2009). O fluxo gênico causa mudança na frequência alélica devido ao movimento de gameta, indivíduos ou grupos de indivíduos de uma população para outra. Em um grupo de populações completamente isoladas a deriva genética sozinha tende a fixar alelos distintos em 37

diferentes populações locais. Qualquer fluxo gênico entre as populações pode impedir a fixação completa, mas o fluxo deve exceder um determinado nível para evitar a diferenciação genética substancial devido à deriva genética (Wright, 1931; Slatkin, 1987). Lefèvre & Charrier (1993) identificaram utilizando marcadores isoenzimáticos a hibridização natural entre a mandioca cultiva com a espécie selvagem M. glaziovii em coleção de germoplasma na África. Em estudo realizado por Duputié et al. (2007) usando dados moleculares e morfológicos identificaram híbridos formando uma continuidade entre a espécie de mandioca doméstica (Manihot esculenta) e uma espécie selvagem Manihot sp. E a variação fenotípica foi fortemente correlacionado com o grau de hibridação, tal como determinado por meio de marcadores moleculares.

3.3.2. Marcadores Microssatélites em estudos genético-populacionais

Marcadores moleculares podem ser provenientes de qualquer tipo de dado molecular que forneça um polimorfismo entre os organismos a serem comparados. Os marcadores moleculares podem ser utilizados em análises genéticas com diversos objetivos, como identificação de clones, linhagens, híbridos, cultivares, teste de paternidade, estimativa de diversidade, fluxo gênico, taxa de cruzamento, parentesco, na construção de mapas genéticos (Buso et al., 2003) e podem ser empregados na análise da estrutura genética da população de espécies de plantas cultivadas e também de selvagens (Zucchi et al., 2002). Os microssatélites têm sido a classe mais amplamente aplicado de marcadores moleculares utilizados em estudos genéticos, com aplicações em diversos campos da genética, como na conservação genética, genética de populações, melhoramento genético e testes de paternidade (Oliveira et al., 2006). Ao longo dos anos houve um aumento no uso dos marcadores microssatélites em trabalhos desenvolvidos com plantas do cerrado, devido à disponibilização e popularização das metodologias e pela possibilidade de transferibilidade desses marcadores entre espécies próximas do ponto de vista evolutivo (Souza et al., 2016). As regiões microssatélites também são conhecidas como SSR (Simple Sequence Repeats) ou STR (Short Tandem repeats) são regiões compostas por repetições em tandem de mono-, di-, tri-, tetra-, penta- ou hexanucleótideos dispostos ao longo do genoma da maioria dos eucariotos e dos procariotos (Tautz, 1989; Powell et al., 1996; Ellegren, 2004; Oliveira et al., 2006). 38

Marcadores microssatélites fornecem informações importantes para investigar processos genéticos que ocorrem nas populações como os padrões de fluxo gênico, variação genética e a ocorrência de deriva genética (Heywood & Iriondo, 2003). As características descritas a seguir permitem que os SSR sejam considerados marcadores ideais para a identificação e discriminação de genótipos e estudos de genética de populações (Tautz, 1989): (i) são codominantes, ou seja, ambos os alelos de um indivíduo heterozigoto são visualizados, (ii) são altamente multialélicos, numa população onde potencialmente todos os alelos daquele loco podem ser detectados e discriminados e (iii) e são frequentes e distribuídos ao acaso, permitindo a mais completa cobertura de qualquer genoma. (Weber & May, 1989; Litt & Luty, 1989; Ferreira & Grattapaglia, 1998). Em espécies do cerrado os marcadores microssatélites estão sendo utilizada com diversos objetivos, como em estudos de variabilidade, estrutura genética, fluxo gênico, sistema reprodutivo em populações naturais e em bancos de germoplasma. Alguns exemplos de estudos com aplicações diversas dos microssatélites: Tabebuia aurea (Rosa, 2012), Hymenaea stigonocarpa (Moreno, 2009); Tabebuia ochracea (Moreira et al., 2009); Caryocar brasiliense (Collevatti et al., 2001); Eugenia dysenterica (Zucchi et al., 2003; Rodrigues, 2012); Dipteryx alata (Soares, 2009); Copaifera langsdorffii (Antiqueira et al., 2014) e Tibouchina papyrus (Lima, 2011). Para a família Euphorbiaceae há trabalhos que apresentam o desenvolvimento de marcadores microssatélites: Manihot esculenta (Chavarriaga-Aguire et al., 1998); Croton floribundus (Silvestrini et al., 2013); Ricinus communis (Bajay et al., 2011); Jatropha curcas (Bressan et al., 2012); Hevea brasiliensis (Bindu Roy et al., 2004). Estudos de amplificação cruzada e transferibilidade também são relatados dentro da família: Manihot (Roa et al., 2000); Jatropha (Bressan et al., 2012). Bressan et al. (2012) tentaram realizar amplificação cruzada com outras espécies dentro da família, porém de gêneros diferentes (Manihot esculenta, Ricinus communis e Hevea brasiliensis) mas não obtiveram êxito. Os microssatélites dentro da família são utilizados para analisar a diversidade genética de banco de germoplasmas como da espécie Jatropha curcas (Rosadoa et al., 2010) e Hevea brasiliensis (Le Guen et al., 2009) e também conhecer a diversidade genética e a estrutura de populações naturais com a de Croton floribundus. (Silvestrini et al., 2015). No gênero Manihot os microssatélites estão sendo utilizados na caracterização genética de coleções de espécies silvestres de Manihot e variedade de mandioca (Manihot esculenta) (Silveira, 2012). Há estudos sobre clones de mandioca e de suas etnovariedades, 39

propagadas vegetativamente por meio de pedaços do caule, para caracterizar a diversidade genética (Fregene et al., 2003; Elias et al., 2004; Siqueira, 2008; Oliveira et al., 2012) Fregene et al. (2003) avaliaram 283 acessos de variedades de mandioca da África (Tanzânia e Nigéria) e da América (Brasil, Colômbia, Peru, Venezuela, Guatemala, México) e obtiveram o nível de heterozigosidade alto entre os países, e o Brasil e a Colômbia apresentaram os maiores índices de diversidade. Os microssatélites são usados também em estudos evolutivos de Manihot esculenta (Olsen & Schaal, 2001) e hibridização entre a cultivada (Manihot esculenta) e espécies selvagens (Olsen & Schaal, 2001; Nassar & Collevatti, 2005; Duputié et al., 2007).

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Área de estudo e esquema de amostragem do material biológico

O material biológico para o presente estudo foi coletado em regiões de ocorrência das espécies de Manihot irwinii e Manihot violacea no Estado de Goiás e no Distrito Federal pela equipe do Professor Dr. Marcos José da Silva especialista em Euphorbiaceae. Nas áreas de coletas foram amostrados em média 30 indivíduos em três populações de cada espécie (Tabela 4 e Figura 5).

Tabela 4 - Número de indivíduos das espécies Manihot irwinii e Manihot violacea amostradas por localidade e coordenadas geográficas (latitude, longitude e altitude) referentes aos locais de coleta. NI: número de Indivíduos. Espécie Localidade Código NI Longitude Latitude Altitude Corumbá de Goiás-GO MIRCORGO 33 48,76861 15,84028 1067m Manihot Pirenópolis-GO MIRPIRGO 27 49,03458 15,71680 730m irwinii Serra dos Pireneus-GO MIRSEPGO 37 48,83333 15,76819 1157m Total 97 Serra dos Pireneus-GO MVISEPGO 27 48,91672 15,83394 925m Manihot Gama-DF MVIGAMDF 28 48,19086 15,97464 1023m violacea Silvânia-GO MVISILGO 40 48,65328 16,64550 928m Total - 95 - - -

Figura 5. Mapa indicando os pontos de coletas das populações no Estado de Goiás e no Distrito Federal das espécies M. irwinii (círculo branco) e M. violacea (círculo preto).

O primeiro ponto de coleta da espécie M. irwinii está localizado próximo ao município de Corumbá de Goiás entre a rodovia GO414 e o Rio Corumbá próximo ao Salto de Corumbá (ponto turístico da região) em uma propriedade privada, no local há grandes alforamentos rochosos e escoamento de água sobre as rochas em direção ao Rio Corumbá e uma mata com árvores com mais de 2m de altura, os indivíduos apresentam pecíolos e nervuras em tom amarelados a vináceos (Figura 6). O segundo ponto está no município de Pirenópolis próximo a rodovia GO338 e está próximo a um curso de água e há pequenos afloramentos de rochas, os indivíduos apresentam pecíolos e nervuras vináceas bem marcante (Figura 7). O terceito ponto está localizado na Serra dos Pireneus em campo rupestre e é possível ver indivíduos da espécie crescendo entre as fendas das rochas (Figura 8-B), e muitos indivíduos apresentam pecíolos e nervuras das folhas em tons amarelados a vináceos (Figura 8). O primeiro ponto da espécie M. violacea está localizado no Distrito Federal próximo a cidade satélite Gama nas proximidades da rodovia BR060, o local apresenta variação do relevo com presença de afloramentos rochosos esparsados, os indivíduos têm baixa altura e possuem pecíolos e bordas das folhas em tom vináceo característico da espécie (Figura 9). O segundo ponto está localizado na Floresta Nacional de Silvânia (FLONA-Silvânia) no município de Silvânia, na unidade são encontrados vários tipos de vegetação que compõem o bioma Cerrado, tais como: campo sujo, cerrado sentido restrito, cerradão, floresta de galeria, floresta mesofítica de interflúvio e vereda (Francener et al., 2012). Os indivíduos da FLONA apresentam pecíolos vináceos a amarelos e as bordas das folhas de algumas apresentam tom amarelado (Figura 10). As espécies M. irwinii e M. violacea ocorrem no Parque Estadual da Serra dos Pireneus que está entre os municípios de Pirenópolis, Corumbá de Goiás e Cocalzinho de Goiás no estado de Goiás. O Parque foi criado em 1987 e compreende regiões de cerrado sensu stricto, campo sujo, floresta úmida semi-decídua, floresta de galeria e vegetação de formação rupestre (Araujo et al., 2007).

A C

C D

A B

As folhas dos indivíduos foram acondicionadas em sacos plásticos com sílica gel esférica, para a diminuição da umidade do tecido vegetal, com o objetivo de conservar o material coletado para extração do DNA e diminuir a quantidade de metabolitos secundários que interferem na qualidade da extração. Em seguida as mesmas foram encaminhadas ao Laboratório de Genética & Biodiversidade da Universidade Federal de Goiás (LGBio/UFG) localizado no Instituto de Ciências Biológicas I (ICB I) em Goiânia-GO, para obtenção e análise dos dados moleculares.

4.2. Obtenção dos dados moleculares

O DNA total de cada indivíduo foi extraído do tecido foliar seco, de acordo com o protocolo de Doyle e Doyle (1987), este protocolo utiliza CTAB (Cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide) um detergente catiônico. O protocolo de extração passa por cinco etapas básicas de acordo com o descrito em Ferreira e Grattapaglia (1998): (i) o tecido é submetido à maceração mecânica para romper as paredes e membranas celulares; (ii) o tecido macerado é ressuspendido na solução de CTAB (Tris 100mM, pH8.0, EDTA 20mM, NaCl 1,4M, CTAB 2%, PVP 1% e água) que é um tampão detergente e antioxidante que visa a solubilização de membranas lipoprotéicas, desnaturação de proteínas e proteção do DNA da 45

ação das enzimas de degradação e deixa-o em banho-maria a 64ºC entre 30 minutos e 1 hora; (iii) é adicionado em cada tubo solução de clorofórmio e álcool-isoamílico e posteriormente centrifugado, resultado em uma fase orgânica inferior e outra fase aquosa superior, onde são capturados o DNA, RNA e alguns polissacarídeos; (iv) o DNA é precipitado com isopropanol e (v) utiliza-se um tampão Tris-EDTA contendo RNAse para degradar o RNA, e ressuspende o DNA genômico. A concentração e a integridade do DNA extraído de cada indivíduo foram avaliadas utilizando a técnica de eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio. Cada amostra foi preparada contendo 3µL de DNA com 4µL de tampão de carregamento e em uma cuba de eletroforese horizontal contendo tampão TBE (Tris-Borato-EDTA) na concentração de 1x. Os padrões de massa molecular λ DNA (10ng/µL, 20ng/µL, 50ng/µL, 100ng/µL, 200ng/µL) foram utilizados para estimar a concentração de DNA. Ao final do processo o gel foi colocado sobre a luz ultravioleta no fotodocumentado LPIX da Loccus Biotecnologia para captura da imagem do gel. A quantificação foi realizada por comparação visual entre λ DNA e amostras de DNA no gel. Após a quantificação o DNA foi diluído a uma concentração de 1,5ng/µL. Foram utilizados oito marcadores microssatélites (GA21, G126, GA134, GA136, GA12, GA16, GA131 e GAGG5) desenvolvidos por Chavarriaga-Aguirre et al. (1998) para Manihot esculenta. O grupo de pesquisa do Laboratório de Genética e Biodiversidade (LGBio) da Universidade Federal de Goiás, Correia et al. (dados não publicados) testaram a amplificação cruzada, para algumas espécies de Manihot dentre elas M. irwinii e M. violacea (Tabela 5).

Tabela 5. Oito locos microssatélites desenvolvidos para Manihot esculenta (Chavarriaga- Aguirre et al., 1998) e testados, quanto a amplificação, para as espécies Manihot irwinii e Manihot violacea. NA: não apresentou amplificação. (Correia et al., dados não publicados). M. irwnii M. violacea Locos Fluorósforo TAºC TAºC GA21 VIC 56ºC 58ºC GA126 NED 56ºC 60ºC Multiplex 1 GA134 6’FAM 56ºC 58ºC GA136 PET 56ºC 58ºC GAGG5 VIC NA 54ºC GA12 6’FAM 56ºC 58ºC Multiplex 2 GA16 NED 56ºC 62ºC GA131 PET 56ºC 60ºC

Cada loco foi testado separadamente com três indivíduos, e posteriormente foram avaliados os dois sistemas multiplex. O loco GAGG5 mesmo não apresentando amplificação satistatória para a espécie M. irwinii (Tabela 5) foi testado no analisador automático. Após as adequações necessárias os sistemas multiplex foram utilizados para a genotipagem das populações de M. irwinii e M. violacea. As reações de PCR (Reação em Cadeia de Polimerase) foram realizadas em sistema simples, que consiste em amplificar as regiões microssátelites de cada indivíduo com um par de primers de cada vez. O volume final da reação foi de 10µL, a qual continha o tampão da enzima 10x com MgCl2 (500mM KCl, 100mg/ml Tris-HCl pH 8.4 1% Triton X-100), 1,3 de BSA (Albumina Bovina–10mg/ml), 0,9µL de dNTP (2,5µM) e 0,15 µL de enzima Taq- Polimerase (5unidades/µL), e 0,65µL de água ultrapura Mili-Q. A amplificação dos fragmentos foi realizada em termociclador Veriti® 96-Well 9902 (Applied Biosystem), cujo programa de termociclagem seguia três etapas: (i) desnaturação por aquecimento à 94ºC por cinco minutos; (ii) 30 ciclos de amplificação com 94ºC por minuto e um minuto para anelamento dos primers de acordo com sua TAºC e extensão de um minuto à 72ºC; (iii) extensão final de 72ºC por 45 minutos. Os produtos de PCR passaram por eletroforese horizontal em gel de agarose 3%, imerso em TBE 1x submetido a uma corrente elétrica de 70W por aproximadamente uma hora. A presença de amplificação foi verificada em fotodocumentador. Para a genotipagem em sistema multiplex os produtos de amplificação de cada primer (1µL) de um sistema foram misturados em uma placa (placa mãe). A preparação das amostras para o analisador automático constitui-se de pegar 1µL da mistura da “placa mãe” dos produtos de amplificação dos primers de cada multiplex, acrescido de 8,75 µL de formamida Hi-Di (Applied Biosystems) e 0,25µL de marcador GeneScanTM 600LIZ dye Size Standard v. 2.0. Essa mistura foi desnaturada por aquecimento a 95ºC por 5 minutos, seguido de resfriamento por um minuto. A eletroforese capilar foi conduzida no equipamento ABI3500-Applied Biosystems. Para detectar e estimar o tamanho dos alelos por meio da fluorescência emitida foi utilizado o programa Data Collection (Applied Biosystems). Posteriormente os valores definidos no Data Collection foram importados para o programa GeneMapper 5.0 (Applied Biosystems), onde o genótipo de cada indivíduo foi obtido. A confirmação da existência de cada alelo foi realizada por montagem de uma escada alélica, que consisti em preparar uma 47

nova eletroforese capilar para cada loco utilizando o menor número possivel de indivíduos que representem todos os alelos.

4.3. Análises Estatísticas

Os locos microssatélites foram avaliados no programa Micro-checker versão 2.2.3 (Oosterhout et al., 2004), para cada espécie separadamente. Esse programa auxilia na identificação de erros de genotipagem devido a alelos não amplificados (alelos nulos), dropout e stutter. Com auxilio do programa Identity 1.0 (Wagner & Sefc, 1999) estimou-se a Probabilidade de Exclusão de Paternidade (Q) e a Probabilidade de identidade (PI). A Probabilidade de Exclusão de Paternidade analisa a capacidade de um dado conjunto de locos excluir uma falsa paternidade. Essa probabilidade depende das frequências alélicas de todos os locos, e não dos genótipos em particular (Weir, 1996). A Probabilidade de Identidade é a probabilidade de amostrar dois indivíduos aleatoriamente em uma população que exibem o mesmo genótipo (Paetkau et al., 1995). Com isso é possível mostrar se o conjunto de marcadores utilizados possui alto poder de discriminação individual em todas as populações. As frequências genotípicas de cada loco foram submetidas ao teste de aderência às proporções de equilíbrio de Hardy-Weinberg, pelo teste exato de Fisher, implementado no programa GDA (Lewis & Zaykin, 2000). Para verificar a significância do teste foram realizadas 10.000 randomizações, para obtenção dos valores de p e em seguida no Excel foi feito a correção False Discovery Ratio (FDR) para cada loco em cada população. O teste de aderência ao equilíbrio de ligação também foi realizado no programa GDA com 10.000 randomizações e o resultado foi transferido ao Excel para calculo do FDR. Os parâmetros para caracterização dos locos e para diversidade genética das populações de M. irwinii e M. violacea, foram estimados pelo programa FSTAT 2.9.3 (Goudet, 2002) e o programa GDA. Foram estimadas as frequências alélicas, o número de alelos (A), heterozigosidade esperada sob o equilíbrio de Hardy-Weinberg (He) e heterozigosidade observada (Ho), e o índice de fixação intrapopulacional (f) por loco e por população de cada espécie. A presença de alelos privados nas populações de cada espécie foi implementado pelo GDA para cada espécie. E para verificar a presença de alelos raros foi utilizada a tabela de frequência alélicas para identificar os alelos com frequência menor que 0,05 em cada população (Cruz et al., 2011). 48

Wright (1951) introduziu FST como um dos três parâmetros inter-relacionados para descrever a estrutura genética de populações diplóides. Esses parâmetros são: FIT, a correlação entre gametas dentro de um indivíduo relativo a toda a população; FIS, a correlação entre gametas dentro de um indivíduo relativo à população ao que o indivíduo pertence; e FST, a correlação entre gametas escolhidos aleatoriamente dentro de uma mesma população em relação à totalidade de populações (Holsinger & Weir, 2009). O programa FSTAT calcula os estimadores f, F e θ propostos por Weir & Cokerham (1984), que são análogos aos índices de coeficiente de fixação de Wright (FIS=f; FIT=F; FST=θ). Para verificar a significância dos valores médios de F, f e θ estimou-se o intervalo de confiança a 95% de probabilidade, por meio do método bootstrap, com 10.000 reamostragens sobre os locos. Para verificar a estruturação genética e identificar o possíveis subgrupos das espécies M. irwinii e M. violacea foi utilizado o programa Structure 2.3.4 (Pritchard et al., 2000). E para determinar se há mistura entre as populações de M. irwinii e M. violacea que ocorrem próximas na Serra dos Pireneus foi utilizado o mesmo programa. Structure é baseado em clusterização pelo método Bayesiano para inferir a estrutura populacional com dados de genótipos. As análises foram realizadas com o modelo “admixture”, onde as frequências alélicas foram correlacionadas. Cada indivíduo é ordenado por probabilidade a k populações, no caso que se admite mistura os indivíduos serão atribuídos a populações com maior nível de parentesco. Para determinar o melhor número de grupos (k), foi utilizado k variando entre 1 e 6, com 1.000.000 de randomizações do Método de Monte Carlo pela Cadeia de Markov (MCMC), burn-in de 10.000 e 30 interações para cada corrida (k). Para determinar qual k é mais provável foi utilizado a estatística Delta K desenvolvida por Evanno et al. (2005).

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Análise genética estatísticas de M. irwinii

5.1.1. Caracterização dos locos microssatélites de M. irwinii

Os marcadores mostraram um bom perfil de amplificação (Figura 11), apenas o loco GAGG5 apresentou perfil do eletroferograma insatisfatório no GeneMapper, por isso não foi utilizado nas análise com as populações. O programa Micro-checker não indicou erros de genotipagem para os setes locos. A quadriplex (GA21, GA126, GA134 e GA136) foi a mesma utilizada por Chavarriaga-Aguire et al. (1998) para Manihot esculenta e por Roa et al. (2000) para espécies selvagens (M. aesculifolia, M. brachyloba, M. carthaginensis, M. esculenta subsp. flabellifolia, M. esculenta subsp. peruviana e M. tristis). Chavarriaga-Aguirre et al. (1998) utilizaram a temperatura de anelamento 56ºC com todos os marcadores a mesma usada para M. irwinii (Tabela 6). A maior amplitude do tamanho de variação do tamanho dos alelos foi verificada no loco GA134 e a menor para o loco GA16 (Tabela 6). Em Roa et al. (2000) apresentou o GA126 apresentou maior amplitude, dentro das espécies ocorre variação na amplitude e em Mühlen et al. (2013) maior amplitude para GA126 e GA131.

Tabela 6. Relação dos primers utilizados e suas características: cor de marcação (fluoróforo); TA (ºC) é a temperatura de anelamento de cada iniciador para a espécie M. irwinii e VAA é variação da amplitude alélica. Nome do Par de Fluoróforo VAA (pb) TA (ºC) Primers GA21 VIC 103-107 56ºC Multiplex 01 GA126 NED 204-208 56ºC GA134 6’FAM 309-337 56ºC GA136 PET 156-172 56ºC GA12 6’FAM 132-146 56ºC Multiplex 02 GA16 NED 101-103 56ºC GA131 PET 88-98 56ºC

A B GA126 GA12

GA134

GA131

GA136

GA16 GA21

Os sete locos analisados apresentaram entre 3 (GA21; GA126; GA16) e 11 alelos (GA134). Foi verificado alto polimorfismo para o loco GA134 em outras espécies de Manihot e variedades de mandioca doméstica, Olsen & Schaal (2001) encontraram 19 alelos e Chavarriaga-Aguire et al. (1998) obtiveram 15 alelos. Em duas variedades de mandioca doce e amarga o GA134 apresentou 13 alelos seguido pelo GA131 com 11 alelos (Mühlen et al., 2013). Mas outros autores indicam os locos GA131 e GA126 com maior número de alelos 21 e 20 respectivamente (Roa et al., 2000) e em acessos de M. esculenta o GA134 apresentou 2 alelos (Siqueira et al., 2011). Os locos apresentaram média de 5,5 alelos por loco, um valor baixo quando se leva em consideração o que é esperado para locos microssatélites, que são teoricamente multialélicos (Ferreira & Grattapaglia, 1998; Ellegren, 2004). Em comparação com os valores médios de alelos encontrados para espécies nativas do Cerrado M. irwinii mostrou maior média do que o encontrado para Tibouchina papyrus Pohl. (3,5) (Lima, 2011), Dipteryx alata Vog. (4,5) (Soares et al., 2013) e Pterodon emarginatus Vog. (5) (Santana, 2014) e igual a Anarcadium humile St. Hill. (5,5) (Cota et al., 2012). Em duas variedades de mandioca domesticada Mühlen et al. (2013) obtiveram média de 9,9 alelos por loco e Siqueira et al. (2011) em acesso de M. esculenta apresentou média de 3,4 alelos por loco. Essa diferença pode estar relacionada à quantidade de indivíduos analisados em cada trabalho, já que Mühlen et al. (2013) amostrou mais de 400 e Siqueira et al. (2011) 20 plantas, pois quanto a maior amostragem maior as chances de acessar diferentes alelos. 51

O valor de diversidade média para todos os locos apresentou média diversidade (0,547). A heterozigosidade observada (Ho) para a todos os locos foi menor que a heterozigosidade esperada (He), indicando uma possível deficiência de heterozigotos. O loco GA134 apresentou maior diversidade genética entre os marcadores (0,844) e o GA16 mostrou menor diversidade (0,251) (Tabela 7). A diversidade média dos locos de M. irwinii em relação a outras espécies da família Euphorbiaceae foi maior do que em Ricinus communis (0,403) (Bajay et al., 2011) e menor do que em Manihot esculenta (0,650) (Mühlen et al., 2013) e Hevea brasiliensis (0,739) (Le Guen et al., 2009). Dentro da família Euphorbiacea as espécies Ricinus communis (Bajay et al., 2011) e Hevea brasiliensis (Le Guen et al., 2009) mostraram Ho menor que He o mesmo ocorre dentro do gênero Manihot em que a maioria das espécies selvagens (Roa et al., 2000) e duas variedade de mandioca doméstica (Mühlen et al., 2013). A probabilidade de exclusão de paternidade para a espécie foi igual a 0,963, com estes valores os marcadores utilizados mostraram ter capacidade moderada de excluir uma falsa paternidade para a espécie, uma vez que uma ótima probabilidade de exclusão de paternidade seria de 0,99 (Mommens et al., 1998). Os valores de Probabilidade de Identidade para esta bateria de locos foram iguais a PI=2,218684x10-5. Este valor sugere que existe um moderado poder de discriminação individual em todas as populações, ou seja, a probabilidade de amostrar dois indivíduos aleatoriamente na mesma população é moderada na espécie M. irwinii para o conjunto de marcadores utilizados. Em estudo com espécie doméstica de mandioca e M. glaziovii, Nassar & Collevatti (2005) obtiveram valores da probabilidade de identidade com poder médio de distinção entre os indivíduos de PI=1,56527x10-5 para a domesticadas e PI=1,71202x10-6 para a M. glaziovii.

Tabela 7. Caracterização dos locos da espécie M. irwinii avaliada por sete locos microssatélites. A: número de alelos por loco; He: heterozigosidade esperada; Ho: heterozigosidade observada; Q: probabilidade de exclusão de paternidade e PI: Probabilidade de Identidade. Locos A He Ho Q PI GA21 3 0,646 0,474 0,353 0,200 GA126 3 0,499 0,464 0,227 0,339 GA134 11 0,844 0,726 0,684 0,045 GA136 7 0,733 0,660 0,522 0,105 GA12 6 0,541 0,474 0,329 0,247 GA16 3 0,251 0,196 0,115 0,589 GA131 6 0,314 0,309 0,180 0,482 Média 5,5 0,547 0,472 0,963 2,218x10-5 * Os valores de f foram significativos para o nível de significância corrigido por Bonferroni 0,00714. 52

5.1.2. Variabilidade e estrutura genética nas populações da espécie M. irwinii

Desvio significativo do Equilíbio de Hardy-Weinberg (p<0,05) foi observado apenas no loco GA136 (em uma população analisada: MIRSEPGO) e os demais locos apresentaram aderência ao EHW (Tabela 8). A análise de desequilíbrio de ligação demonstrou que os pares de locos analisados apresentaram associação aleatória e desta maneira são úteis na realização das análises genético-populacionais.

Tabela 8. Teste Exato de Fisher para a verificação da aderência ao Equilibrío de Hardy- Weinberg nas populações de M. irwinii. Os locos destacados estão fora do EHW depois de realizada a correção por FDR (False Discovery Ratio). Locos MIRCORGO MIRPIRGO MIRSEPGO GA21 1,0000 0,5039 0,1481 GA126 1,0000 0,0347 0,5239 GA134 0,0274 0,2922 0,0675 GA136 0,1011 0,5152 0,0002 GA12 0,3701 1,0000 0,2250 GA16 1,0000 0,1805 0,8456 GA131 1,0000 1,0000 0,1871

Foram detectados 68 alelos com os sete locos nas três populações de M. irwinii. As frequências alélicas por loco nas populações estão apresentadas na figura 12, em que é possível observar a distribuição e a abundância dos alelos entre e dentro das populações de M. irwinii. Foram identificados 20 alelos privados (29,41%), sendo que três estão na população MIRCORGO, cinco na MIRPIRGO e 12 na MIRSEPGO. O fluxo gênico torna homogêneas as frequências dos alelos entre as populações, portanto a presença de alelos privados pode indicar alguma restrição ao fluxo (Slaltkin, 1985). Foram identificados alelos raros em todas as populações, os alelos raros são aqueles que apresentam frequência menor que 0,05 em cada população (Cruz et al., 2011). A espécie M. irwinii apresentou total de 11 alelos raros, sendo que na população MIRCORGO foram verificados 2, MIRPIRGO 3 e em MIRSEPGO 6. Os alelos raros são suscetíveis a perda por causa da deriva genética (Allendorf et al., 2013), e pode ser verificado a perda de alelos em três locos (GA126, GA16 e GA131) da população MIRCORGO que apresentaram alelos fixados. 53

1 GA21 1 GA126 0.8 0.8 0.6 0.6 0.4 0.4 0.2 0.2 0 0 103 105 107 204 206 208

1 GA134 0.9 MIRCORGO 0.8 0.7 MIRPIRGO 0.6 MIRSEPGO 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 309 311 317 321 323 325 327 329 331 333 337

1 GA136 1 GA16 0.8 0.8 0.6 0.6 0.4 0.4 0.2 0.2 0 0 156 158 160 162 164 166 172 101 103 105

1 GA12 1 GA131 0.8 0.8

0.6 0.6

0.4 0.4

0.2 0.2

0 0 132 136 138 140 144 146 88 90 92 94 96 98

O valor médio de heterozigosidade esperada (He) foi de 0,446 variando entre 0,171 a 0,780 e a heterozigosidade média observada (Ho) de 0,468 variando entre 0,111 e 0,889. Em espécies endêmicas do cerrado e de porte arbustivo como a M. irwinii, encontraram uma 54

heterozigosidade esperada média de 0,529 em nove populações de Coccoloba cereifera Schwacke (Moreira et al., 2010), e Lychonophora ericoides Mart. e L. pinaster Mart. (0,406 e 0,307) (Vieira, 2012) valores menores que da M. irwinii. Espécies do cerrado pertencentes à família Euphorbiaceae mostraram valor médio de diversidade (0,597) (Souza, 2014). A população que apresentou menor diversidade foi a MIRCORGO (0,317) e a população MIRSEPGO mostrou maior valor de diversidade (0,580). Os valores de Ho e He se aproximam relativamente nas três populações. A baixa diversidade na MIRCORGO pode estar relacionada aos locos com apenas um alelo, GA126 (204), GA 16 (105) e GA131 (98), e também por ser uma população situada em uma propriedade privada próxima a uma rodovia, o contrário ocorre com MIRSEPGO que está em uma área de proteção ambiental (Parque Estadual Serra dos Pireneus). Os valores He e Ho de cada população apresentaram diferenças mínimas, sendo que nas populações MIRCOGO e MIRPIRGO o valor de hereterozigosidade esperada foi menor que a observada, enquanto que na população de MIRSEPGO apresentou He maior que Ho, neste ultimo indica possivel excesso de homozigotos. Encontraram resultados similares entre espécie de Manihot deficiência de heterozigotos em Roa et al. (2000) utilizando marcadores microssátelites. Os valores globais obtidos para o índice de fixação intrapopulacional (f) (Tabela 9) não foram significativos, ou seja, não há diferenças significativas entre as frequências genotípicas observadas e esperadas para o Equilíbrio de Hardy-Weinberg, logo as populações não apresentam endogamia decorrente do sistema reprodutivo.

Tabela 9. Estimativas de diversidade genética das três populações de Manihot irwinii. (A) número total de alelos; (He) heterozigosidade esperada; (Ho) heterozigosidade observada; (f) índice de endogamia; N: número de indivíduos; M: apresentaram apenas um alelo. MIRCORGO MIRPIRGO MIRSEPGO N=33 N=27 N=37 Locos A He Ho f A He Ho f A He Ho f GA21 2 0,506 0,515 -0,019 3 0,448 0,556 -0,246 3 0,496 0,378 0,239 GA126 1 M M - 3 0,635 0,889 -0,410 2 0,505 0,568 -0,125 GA134 4 0,568 0,697 -0,231 6 0,754 0,692 0,084 9 0,780 0,778 0,003 GA136 4 0,636 0,697 -0,097 3 0,565 0,481 0,151 4 0,666 0,757 -0,138 GA12 3 0,509 0,606 -0,195 2 0,201 0,222 -0,106 4 0,644 0,541 0,162 GA16 1 M M - 2 0,171 0,111 0,355 3 0,450 0,432 0,039 GA131 1 M M - 3 0,314 0,370 -0,185 5 0,520 0,541 -0,040 Global 2,3 0,317 0,359 -0,136 3,1 0,441 0,475 -0,077 4,3 0,580 0,571 0,017 Os valores de f não foram significativos para o nível de significância corrigido por Bonferroni 0,00238.

O valor do parâmetro θ foi significativo e igual a 0,241 sugerindo alta estruturação genética entre as populações. O valor do índice de fixação total (F) também foi significativo e diferente de zero (0,207), o que indica que a diferenciação encontrada entre as populações pode ser devido aos efeitos da deriva genética, uma vez que não foram observados valores significativos para o índice de fixação intrapopulacional (f). Esse resultado mostra que a taxa de cruzamento aleatório dentro das populações é maior em relação aos cruzamentos entre as populações (Wright, 1943), contribuindo para estruturação da variabilidade genética. Em cinco populações utilizando oito marcadores AFLP da espécie Croton antisyphiliticus Mart. que pertence a mesma família do gênero Manihot, apresentou um valor maior de divergência genética (FST=0,383) que o encontrado para a espécie M. irwinii. A C. antisyphiliticus é um tipo de subarbusto que realiza polinização cruzada e a sua dispersão e feita por formigas e seu fluxo gênico é restrito (Oliveira et al., 2016). Em outro estudo, Vieira (2012) utilizou marcadores microssatélites em análises genéticas com três populações da espécie Lychonophora ericoides, conhecida como arnica que é endêmica do cerrado rupestre de distribuição disjunta e sua dispersão de sementes ocorre pelo vento, obteve um valor de estrutura genética alta (FST=0,370). Desta maneira as populações podem ser consideradas estruturadas, com diferenciação genética alta entre as três populações, isso significa que 24% da variação genética encontram-se entre as populações e, consequentemente, 76% desta variação ocorre dentro das populações.

A análise de estruturação genética populacional realizada com a abordagem Bayesiana mostra a formação de três subgrupos (K=3) (Figura 13). Esse resultado corrobora com os altos valores de estruturação encontrados para a espécie M. irwinii. 56

Figura 13. Valor de ΔK para o número de populações M. irwinii (K) mais verossímil.

A figura 14 mostra claramente a estruturação encontrada entre as populações e mostra que a MIRSEPGO possui uma composição genética com uma pequena mistura das outras duas populações. A população MIRSEPGO está geograficamente localizada entre as outras duas populações que poderia explicar essa mistura. Esta população também apresenta o maior valor de diversidade genética (Tabela 10) e esta situada em um local de preservação ambiental (Parque Estadual da Serra dos Pireneus) o que pode explicar o padrão encontrado. A população MIRPIRGO mostrou maior mistura com a MIRSEPGO esse resultado é compatível com o valor de FST entre as duas (0,153). E indica um possível isolamento da população MIRCORGO, este fato é confirmado pelos altos valores de FST encontrado entre a população MIRCOGO e as outras populações MIRSEPGO (0,293) e MIRPIRGO (0,268) (Tabela 11 e Figura 13).

O FST esta diretamente relacionada com a variância na frequência dos alelos dentro da população e quando é alto significa que as frequências dos alelos são diferentes. A deriva causa flutuações aleatórias nas frequências de alelos ao longo do tempo, devido ao acaso, levando a diferenças entre populações que são descritas pela distribuição de frequências dos alelos entre essas populações (Holsinger & Weir, 2009) e também causa a perda de variação genética dentro das populações (Wright, 1943; Futyama, 2002).

Figura 14. Gráfico de barras representando os indivíduos de M. irwinii coletados em três populações mostrando a estruturação populacional em três grupos (K=3). 57

Tabela 11. Divergência Genética (FST par a par) entre as populações de M. irwinii. MIRCORGO MIRPIRGO MIRSEPGO MIRCORGO 0,000 MIRPIRGO 0,268 0,000 MIRSEPGO 0,293 0,153 0,000

Como os valores de f global não foram significativos então o sistema de cruzamento provavelmente não é reponsável pela estruturação das populações. Então a alta diferenciação observada entre as populações de M. irwinii (Tabela 10 e Figura 14) pode ser causado pela dispersão limitada da espécie que pertence a um gênero em que os frutos podem ser dispersos por autocoria, explosiva ou/e formigas (Rogers & Appan, 1973; Duputié et al., 2011). A dispersão por gravidade ou explosivos deposita as sementes perto das plantas mães e promove a divergência entre populações (Loveless & Hamrick, 1984). Um sistema de dispersão de curto alcance leva a diferenciação não só entre populações pequenas, mas também em grandes populações (Wright, 1943). O processo da deriva pode ser a força atuante nas populações de M. irwinii responsável pela estruturação genética causando a perda e a fixação de alelos juntamente com o limitado fluxo gênico entre as populações. O fluxo gênico entre as populações pode impedir a fixação e a diferenciação, mas o fluxo deve exceder um determinado nível para evitar a diferenciação genética devido à deriva genética (Wright, 1931; Slatkin, 1987).

5.2. Análise genética de M. violacea

5.2.1. Caracterização dos locos microssatélites de M. violacea

Após os testes de genotipagem em analisador automático dos oito primers e dos sistemas multiplex para a espécie M. violacea, foi necessário realizar ajuste nas temperaturas do loco GA21 e GA12. O loco GAGG5 apresentou um perfil eletroferograma insatisfatório, sendo descartado das análises com as populações, desta maneira foi definido um sistema multiplex com três primers e outro com quatro, totalizando sete locos com bons perfis como o definido para a espécie M. violacea (Figura 15 e Tabela 12). A análise de qualidade da genotipagem realizada no programa Micro-checker indicou erros de genotipagem para os locos GA134 (MVIGAMDF) e GA131 (MVISEPGO), para os quais foram identificados alelos nulos. Alelos nulos foram detectados para algumas 58

espécies do gênero Manihot em Roa et al. (2000). Os alelos nulos são sugeridos pelo programa quando há excesso de homozigotos (Oosterhout et al., 2004). É comum encontrar alelos nulos em estudos de genética de população (Chapuis & Estoup, 2007). No loco GA131 além de alelos nulos foi detectada a presença de stutter, que é indicado pelo programa quando há deficiência de heterozigotos e alelos que diferem em tamanho de uma única repetição do motivo (Oosterhout et al., 2004). Os marcadores GA134 e GA136 foram os que apresentaram maior amplitude como ocorreu para M. irwinii.

Tabela 12. Relação dos primers utilizados e suas características: cor de marcação (fluoróforo). TA (ºC) é a temperatura de anelamento de cada iniciador para a espécies e M. violacea e VAA é variação da amplitude alélica. Nome do Par de Fluoróforo VAA(pb) TA (ºC) Primers GA21 VIC 101-105 60ºC Multiplex 01 GA126 NED 204-208 60ºC GA134 6’FAM 297-367 58ºC GA136 PET 152-186 58ºC GA12 6’FAM 132-158 59ºC Multiplex 02 GA16 NED 101-125 62ºC GA131 PET 80-106 60ºC

A GA126 B GA131

GA21 GA12

GA134 GA136

GA16 GA136

Os locos apresentaram média de 8,5 alelos, valor semelhante foi encontrado para Lychnophora ericoides (8,6) (Rabelo et al., 2011). Em comparação com os valores médios de 59

alelos de outras espécies nativas do Cerrado, os valores encontrandos no presente estudo foi menor que os encontrados para Eugenia dysenterica (10,4) (Zucchi et al., 2002), Byrsonima crassifólia (10,4) (Bernardes, 2014) e para espécie do mesmo gênero M. esculenta (9,9) (Mühlen et al., 2013). Os locos apresentaram uma alta diversidade (0,677). Os sete locos analisados apresentaram entre 3 (GA21 e GA126) e 19 alelos no lovo GA134 seguido pelo GA12 com 12 alelos. O loco GA126 apresentou os mesmos tamanhos de alelos (204, 206, 208) encontrados na espécie M. irwinii (Figura 12 e 16). O valor médio de heterozigosidade observada (Ho) foi menor que a media de heterozigosidade esperada (He). O loco GA134 apresentou maior diversidade genética (0,862) e a menor diversidade foi verificada no loco GA126 (0,434). A probabilidade de exclusão de paternidade para M. violacea foi de 0,990, esse valor mostra que os marcadores possuem uma alta capacidade de excluir uma falsa paternidade, já que 0,99 é um valor ótimo de probabilidade de exclusão de paternidade (Mommens et al., 1998). Os valores de Probabilidade de Identidade para esta bateria de locos na espécie M. violacea foi de PI=5,701395x10-7. Tais valores sugerem que existe um bom poder de discriminação individual em todas as populações.

Tabela 13. Caracterização dos locos da espécie M. violacea avaliadas por sete locos microssatélites. A: número de alelos por loco; He: heterozigosidade esperada; Ho: heterozigosidade observada; Q: probabilidade de exclusão de paternidade e PI: Probabilidade de Identidade. Locos A He Ho Q PI GA21 3 0,506 0,234 0,204 0,358 GA126 3 0,434 0,284 0,202 0,386 GA134 19 0,862 0,674 0,720 0,035 GA136 8 0,746 0,389 0,519 0,106 GA12 12 0,798 0,716 0,635 0,059 GA16 7 0,697 0,326 0,443 0,146 GA131 8 0,698 0,474 0,475 0,130 Média 8,5 0,677 0,442 0,991 5,701x10-7 * Os valores de f foram significativos para o nível de significância corrigido por Bonferroni 0,00714.

5.2.2. Variabilidade e Estrutura Genética nas populações da espécie M. violacea

Desvios significativos do Equilíbio de Hardy-Weinberg (p<0,05) foram observados nos locos GA131 (MVISEPGO) e GA21 (MVISILGO) e os demais locos apresentaram aderência ao EHW (Tabela 14). A análise de desequilíbrio de ligação demonstrou que os 60

pares de locos analisados apresentaram associação aleatória e desta maneira são úteis na realização das análises genético-populacionais para M. violacea.

Tabela 14. Teste Exato de Fisher para a verificação da aderência ao Equilibrío de Hardy- Weinberg nas populações de M. violacea. Os locos destacados estão fora do EHW depois de realizada a correção por FDR (False Discovery Ratio). Locos MVISEPGO MVIGAMDF MVISILGO GA21 0,3067 0,0796 0,0000 GA126 0,5886 0,1517 0,2165 GA134 0,7694 0,0336 0,3408 GA136 1,0000 0,7689 0,6881 GA12 0,7517 0,9964 0,7417 GA16 1,0000 0,0598 1,0000 GA131 0,0002 0,1281 1,0000

Foi identificado um alto número de alelos (100) para os sete locos nas três populações de M. violacea. As frequências alélicas por loco estão apresentadas na Figura 14, na qual é possível observar a distribuição e a abundância dos alelos entre e dentro das populações de M. violacea. Foram verificados 31 alelos privados (31%), sendo que 6 estão na população MVISEPGO, 21 na MVIGAMDF e 4 na MVISILGO. Foi identificado um total de 30 alelos raros em todas as populações de M. violacea, sendo que na população MVISEPGO foram identificados 9, na MVIGAMDF 16 e na MVISILGO 5. A população MVIGAMDF obteve o maior número de alelos (Tabela 16), maior quantidade de alelos privados e raros e apresentou maior diversidade entre as três populações. A população MVISILGO situada em local de preservação (Floresta Nacional de Silvânia) foi a que apresentou a menor quantidade de alelos exclusivos e raros e seu índice de diversidade foi o menor. Na população MVISILGO foi identificado apenas um alelo para o loco GA126, pode resultar em deficiência global de heterozigotos, mesmo quando as populações individuais estão em equilíbrio de Hardy-Weinberg (Frankham et al., 2012).

1 GA21 1 GA126

0.5 0.5

0 0 101 103 105 204 206 208

1 0.9 GA134 0.8 MVISEPGO 0.7 MVIGAMDF 0.6 MVISILGO 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 297 299 309 317 319 321 323 325 327 329 331 333 335 343 345 351 359 361 367

1 1 GA136 GA16 0.8 0.8 0.6 0.6 0.4 0.4 0.2 0.2 0 0 152 158 160 162 164 166 168 186 101 103 105 107 113 123 125

1 GA12 1 GA131 0.9 0.9 0.8 0.8 0.7 0.7 0.6 0.6 0.5 0.5 0.4 0.4 0.3 0.3 0.2 0.2 0.1 0.1 0 0 80 86 88 90 92 94 104 106 132 134 136 138 140 142 144 146 148 150 152 158

As três populações apresentaram valor médio de heterozigosidade esperada igual a 0,478 variando entre 0,025 a 0,889 e a heterozigosidade observada foi de 0,458 variando entre 0,025 e 0,786. O valor médio de diversidade genética indicou uma moderada diversidade nas 62

populações de M. violacea. Valores próximos de heterozigosidade foram encontrado entre as espécies de Euphorbiaceae do cerrado (0,597) (Souza, 2014) e a espécie M. irwinii (0,446). A população MVISILGO apresentou menor valor de diversidade (0,331) e a população MIRGAMDF apresentou maior diversidade (0,644). Os valores globais obtidos para o índice de fixação intrapopulacional (f) nas populações MVISEPGO e MVISILGO (Tabela 15) não foram significativos, sugerindo a que as frequências alélicas estão seguindo a proporção esperada do EHW. A população MVIGAMDF apresentou f significativo diferente de zero (f=0,106), sugerindo excesso de homozigotos, por outro lado essa população apresentou alelos nulos para o loco GA134 que também pode ser responsáveis pelo excesso de homozigotos. Em Le Guen et al. (2009) encontraram deficiência de heterozigotos para populações de Hevea brasiliensis que pertence a mesma família da M. violacea. Em estudo de Duputié et al. (2007) todas os grupos estudados (M. esculenta e Manihot sp.) apresentaram déficit de heterozigotos. E Roa et al. (2000) com espécies de Manihot identificaram excesso de homozigotos e também foi confirmado a presença de alelos nulos.

Tabela 15. Estimativa de diversidade genética das três populações de Manihot violacea, avaliadas com sete locos microssatélites. (A) número total de alelos; (He) heterozigosidade esperada; (Ho) heterozigosidade observada; (f) índice de endogamia; N: número de indivíduos. M: apresentaram apenas um alelo. MVISEPGO MVIGAMDF MIVSILGO N=27 N=28 N=40 Locos A He Ho f A He Ho f A He Ho f GA21 3 0,520 0,615 -0,189 3 0,257 0,179 0,309 2 0,025 0,025 0,000 GA126 3 0,520 0,593 -0,143 3 0,536 0,393 0,270 1 M M - GA134 8 0,605 0,630 -0,041 17 0,889 0,714 0,199 4 0,705 0,675 0,043 GA136 4 0,240 0,259 -0,083 8 0,717 0,679 0,054 4 0,282 0,275 0,028 GA12 4 0,632 0,667 -0,055 7 0,786 0,786 0,000 5 0,635 0,700 -0,103 GA16 3 0,174 0,185 -0,066 7 0,662 0,643 0,030 3 0,186 0,200 -0,075 GA131 4 0,523 0,222 0,580 5 0,661 0,643 0,028 2 0,480 0,525 -0,093 Global 4,1 0,459 0,453 0,014 7,1 0,644 0,577 0,106* 3 0,331 0,343 -0,037 *Valor significativo para o índice ajustado para nível de Bonferoni de 0,00238.

O valor do parâmetro θ foi alto e significativo e igual a 0,420. O valor do índice de fixação total (F) foi significativo e diferente de zero (F=0,441) o que indica que a deriva genética possa estar atuando na diferenciação genética encontrada entre as populações, já que não foram detectados valores significativos para o índice de fixação intrapopulacional global (f). Desta maneira as populações podem ser consideradas muito estruturadas, com 63

diferenciação genética alta entre as três populações, isso significa que 42% da variação genética encontram-se entre as populações e, consequentemente, 58% desta variação ocorre dentro das populações. Em análise com três populações de Tibouchina papyrus Pohl uma árvore endêmica de cerrado rupestre e de distribuição disjunta, apresentou um alto valor de diferenciação igual a 0,712 (Collevatti et al., 2012) outra espécie Coccoloba cereifera endêmica de cerrado rupestre restrita a Serra do Cipó em Minas Gerais também apresentou diferenciação moderada

FST=0,123 (Moreira et al., 2010). Olsen & Schaal (2001) encontraram valor igual de diferenciação para M. esculenta subsp. flabellifolia (FST=0,420) e para a espécie M. pruinosa um valor menor mas alto (FST=0,280) indicando alta estrutura genética entre essas populações. M. irwinii também apresentou divergência alta (θ=0,241), esses resultados de estrutura genética para as espécies do mesmo grupo podem indicar um padrão encontrado dentro do gênero Manihot. Fatores ecológicos afetam a reprodução e a dispersão e são particularmente importantes na determinação da estrutura genética (Loveless & Hamrick, 1984). Padrão de estruturação genética encontrado para as espécies do gênero Manihot pode ser explicado por uma limitada dispersão de sementes e de pólen.

Tabela 16. Estimativas de estrutura genética entre as populações de M. violacea. Intervalo de confiança com 95% de probabilidade sobre 10.000 randomizações por bootstraps. θ F f 0,420 0,441 0,036 Intervalo de 0,284 0,305 -0,019 Confiança 0,561 0,571 0,088

A partir da abordagem Bayesiana em análise no Structure os resultados indicaram a formação de três subgrupos. Este resultado foi obtido pelo método de Evanno et al. (2005) através do maior valor de ΔK que representa um K=3 (Figura 17).

Figura 17. Valor de ΔK para o número de agrupamento da espécie M. violacea (K) mais verossímil.

A figura 18 gerada pelo programa Strucutre mostra claramente a divisão das populações em três subgrupos e apresentando pouca relação entre MVISILGO e as outras duas populações indicando um possivel isolamento, enquanto que em MVISEPGO apresenta maior mistura com a população MVIGAMDF que demonstrou um pouco de composição das outras duas populações.

O valores de FST par a par (Tabela 17) confirmam o resultado do Structure mostrando um isolamento da população MVISILGO e as populações MVISEPGO (0,524) e MVIGAMDF (0,390). E as populações MVISEPGO e MVIGAMDF apresentaram menor divergência (0,319) relativa. A diferenciação entre a população é dependente de níveis de fluxo gênico, e espera se que esteja relacionado com a capacidade de dispersão das espécies e o grau de isolamento entre as populações (Frankham et al., 2012). Subespécies são populações parcialmente diferenciadas dentro de uma espécie, são populações que estão no meio do processo evolutivo de divergência no sentido da especiação completa (Frankham et al., 2012). Um dos motivos que levou Allem (1989) a revisar a seção Quinquelobae está relacionado ao fato de algumas das suas espécies terem sido mal delimitadas, havia também a suspeita de que algumas das espécies dentro da seção possam corresponder, na prática, a espécies crípticas e levou a questão do que fazer com elas (Allem, 1989). As alterações feitas por Allem (1989) para a espécie M. violacea não são consideradas pelo Reflora (Programa Reflora – Flora do Brasil - http://floradobrasil.jbrj.gov.br/) que reconhece a divisão da espécie em duas subespécies (M. violacea subsp. violacea e M. violacea subsp. recurvata). Considerando o fato que as populações aqui estudadas possam ser subespécies diferentes poderia explicar a alta divergência encontrada entre elas, já que estão 65

passando por diferenciação na direção da especiação completa e a deriva genética e um fluxo gênico restrito entre as populações podem estar contribuindo para esse processo.

Figura 18. Gráfico de barras representando os indivíduos de M. violacea coletados em três populações mostrando a estruturação populacional em três grupos (K=3).

Tabela 17. Divergência Genética (FST par a par) entre as populações de M. irwinii e as populações de M. violacea. MVISEPGO MVIGAMDF MVISILGO MVISEPGO 0,000 MVIGAMDF 0,319 0,000 MVISILGO 0,524 0,390 0,000

A alta diferenciação observada entre as populações de M. violacea (Tabela 17 e Figura 18) pode ser consequência da dispersão restrita da espécie, quando a capacidade de dispersão da espécie é limitada a probabilidade de acasalamentos ocorrerem com indivíduos que nasceram próximos entre si é maior (Loveless & Hamrick, 1984; Futuyama, 2002). Dentro do gênero Manihot a polinização pode ser realizada por insetos (Nassar, 2008) e as sementes podem ser dispersas por autocoria, explosiva ou/e formigas (Rogers & Appan, 1973; Duputié et al,. 2011). A elevada quantidade de alelos exclusivos encontrado nas populações de M. violacea

(31%) e altos valores de FST par a par (Tabela 17) corroboram com hipótese de restrição do fluxo entre as populações, já que a presença de alelos exlcusivos pode ser um indicativo de restrição ao fluxo gênico (Botrel et al., 2006). E desta maneira, a deriva genética atua durante sucessivas gerações levando a fixação de alelos e a perda de outros ao acaso e consequentemente leva a diferenciação entre as populações.

5.3. Estrutura genética entre populações das espécies M. irwinii e M. violacea no Parque Estadual da Serra dos Pireneus

As populações MIRSEPGO e MVISEPGO compartilham 23 alelos entre elas, sendo que a primeira possui um total de 30 alelos (76%) e a segunda um total de 29 alelos (79%). Entre esses alelos compartilhados, cinco alelos, de três locos GA134 (309 e 331), GA12 (132 e 136) e GA131(88), são exclusivos das duas populações. Quando há muitos alelos em comum pode demonstrar que duas espécies são estreitamente relacionadas (Nei, 1975). A população MIRSEPGO apresentou 12 alelos exclusivos em relação às outras populações da mesma espécie M. irwinii. Todos os alelos privados da MIRSEPGO são compartilhados com a espécie M. violacea e estão presentes na MIVISEPGO. Dos 6 alelos privados encontrados na MVISEPGO 5 alelos são exclusivos da Serra dos Pireneus e o alelo 86 do loco GA131 é encontrado apenas nela. Na figura 19 estão representadas as frequências alélicas por loco, na qual é possível observar a distribuição e a abundância dos alelos entre as duas populações. Não há muita diferença nos valores He, Ho e da média de alelos por loco entre as duas populações analisadas (Tabela 9 e Tabela 15). A MIRSEPGO (0,580) apresentou maior diversidade genética que a MVISEPGO (0,459).

1 GA21 1 GA126 0.8 0.8 0.6 0.6 0.4 0.4 0.2 0.2 0 0 101 103 105 107 204 206 208

1 GA134 0.8 MIRSEPGO 0.6 MVISEPGO 0.4 0.2 0 309 311 317 323 325 327 329 331 333 337

1 GA136 1 GA12 0.8 0.8 0.6 0.6 0.4 0.4 0.2 0.2 0 0 156 158 164 166 168 132 134 136 140 146

1 GA16 1 GA131 0.8 0.8 0.6 0.6 0.4 0.4 0.2 0.2 0 0 101 103 105 86 88 90 92 94 96

A análise no programa Structure indicou a formação de dois subgrupos, para as populações das espécies, conforme o esperado. Este resultado já era esperado por se tratar de duas espécies. Este resultado foi obtido pelo método de Evanno et al. (2005) através do maior valor de ΔK que representa um K=2 (Figura 20). A população M. irwinii apresentou possuir maior mistura genética com a MVISEPGO que houve fluxo maior, pode ser em direção da espécie M. irwinii. 68

Os resultados apresentados no presente estudo demonstram vestigios de um fluxo histórico sendo que hoje já pode existir barreira reprodutiva entre as duas espécies. Na figura 19 pode-se ver claramente uma diferenciação entre as duas espécies mesmo com grande quantidade de alelos compartilhados que pode ser resultado de uma divergência recente que é comum no gênero Manihot. O valor de diferenciação entre as duas populações foi alto e significativo (θ=0,298), entretanto menor que os valores encontrados entre as populações de M. violacea (Tabela 17). Entre uma população de M. esculenta e uma espécie selvagem foi encontrado um valor menor de diferenciação (θ=0,183) (Duputié et al., 2007), em relação ao observado neste estudo. Na figura 2 que representa a filogenia do gênero Manihot (Duputié et al., 2011) observa-se uma proximidade entre as espécie M. violacea e M. irwinii.

6. CONCLUSÕES

-As espécies M. iwinii e M. violacea apresentaram moderada variabilidade genética, que se encontra fortemente estruturada nas populações avaliadas.

- A divergência genética observada entre as populações da espécie M. violacea é mais alta do que a observada entre as espécies na Serra dos Pireneus (MIRSEPGO e MVISEPGO), o que sugere que M. violacea seja um complexo de espécies que deve ser melhor estudada sob o ponto de vista taxonômico.

- As populações das espécies M. irwinii e M. violacea da Serra dos Pireneus (MIRSEPGO e MVISEPGO) apresentam alta porcentagem de alelos compartilhados e cinco alelos são exclusivos. Entretanto, é necessário realizar estudos mais específicos para verificar a ocorrência de fluxo gênico contemporâneo entre estas espécies.

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