Tesis de Posgrado

Clonado y expresión de ubicuitina en Neurospora crassa Taccioli, Guillermo 1989

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en Ciencias Químicas de la Universidad de Buenos Aires

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la Biblioteca Central Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe ser acompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis Federico Leloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the corresponding citation acknowledging the source.

Cita tipo APA: Taccioli, Guillermo. (1989). Clonado y expresión de ubicuitina en Neurospora crassa. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2233_Taccioli.pdf

Cita tipo Chicago: Taccioli, Guillermo. "Clonado y expresión de ubicuitina en Neurospora crassa". Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1989. http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2233_Taccioli.pdf

Dirección: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Contacto: [email protected] Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293 UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

CLONADO Y EXPRESION DE UBICUITINA

EN NEUROSPORA CRASSA

Guillermo Taccioli

Tesis para optar al título de Doctor en Ciencias Químicas

Director: Dr. Norberto Daniel Judewicz

1989 e? o? 33 Instituto de Investigaciones en "OZ Ingeniería Genética-y Biología Molecular (INGEBI) CONICET

AGRADECIMIENTOS

Al Dr. Héctor N. Torres por su constante apoyo y su 1nva­ luable aporte en la discusión de los proyectos de trabajo. A la Dra. Mirtha M. Flawiá por contar siempre con su in­ valorable ayuda en la solución de los problemas y su incesante empuje. Al Dr. Norberto D. Judewicz por la corrección del trabajo de tesis y por aceptar siempre la discusión de las ideas. A mis compañeros del inolvidable "Lab. 211", Gabriel 0. Aisemberg; Ricardo M. Attar; Daniel L. Altchuler; Erich Grotewold y Raúl Andino por la colaboración que me brindaron. Al Dr. Alberto R. Kornblihtt, por toda su ayuda y las in­ valorables sugerencias aportadas. A los Dres. Alejando A. Paladini (h); Mariano Levin; María T. Téllez-Iñón; Alejandro Mentaberry y Gerardo Glikin por el apo­ yo brindado en esta etapa. Al Dr. John Newbold por su colaboración en el proyecto de síntesis de oligodeoxinucleótidos. A los Dres. Richard Benarous; Jean Yves Picard y Louise Reubel por la ayuda brindada en la construcción de la genoteca de expresión. A mis compañeros, Graciela M. Bianchini; Gabriela Levitus; Patricia Levy-Yeyati; Betina Orman; Jorge Muschietti; Leonardo Erijman; Eduardo Cafferata y Ariel Wilner que además de compartir gratos momentoscolaboraron activamente en este trabajo. A la barra KILOMétrica de ingebianos que colaboró en hacer más placentero el trabajo de todos los días integrada por, Javier Cáceres; Viviana Bernath; Facundo Batista; Alejandra Mandel; Va­ lentina Carricarte; Ana Pastini; Enrique Mesri; Mercedes Goin; Andres Muro; Alejandro Schijman; Haría Laura Gómez; Laura Mora­ tinos; OmarCoeo; Fernando Bravo; Mónica Torruela; Horacio Marti­ netto; Lucio Castilla; Sonia Lafont; Claudio Eieenechloe; Claudio Alonso; Rosana Celnik; Nora Pafioe; Pablo Rabinovich y Claudia Ochat. A Norberto Malarini por eu contagioso (e incurable) buen humor y el esmerado trabajo gráfico. A Ursula Borrás por eu alegría y eficiente trabajo como secretaria.

A Adriana Urmanpor su inagotable paciencia y profesiona­ lismo en la traducción, transcripción y replicación de esta te­ E316. A María J. Alvarez, Norberto Contreras, Gabriel Paissán, Mariano Rodríguez, Marcelo, Gustavo Peace y Leonor Acevedo por el excelente trabajo técnico. INDICE

Página

.IRLIEISUMJÍZN ...... 1

ABI-REVIA'I [JIQAS ...... 4

I N'1'13013UCJCII ON ...... 7

HBLQHLTIHA...... 8

H1S“ORIA ...... 3

(“J ENZIMAS INVOLUCRADAS EN LA ACTIVACION Y CÚNJUGAClDN DE UBICUITINA ...... 11 CONJUGADOS DE UBlCUITINA A HISTONAS ...... 16 HIDROLASAS CARBOXITERMINAL DE UBICUITINA ...... 20 PROTEASA DEPENDIENTE DE UBIQUITINA/ATP ...... 23

coment...)(¿J PBDTEASAS DEPENDIENTES DE ATP EN UACTERIAS ...... 31

(¿J HHHHH ÑÜ'JCWHBGJ PAPEL DE LA CONEORMACIÜN DE LA UBICUITINA EN LA ESPECIFICIDAD DE LA DEGRADACION ...... 34 PAPEL DE tARN EN LA DEGRADACION DE SUSTRATOS ...... 36 LA REGLA DEL N-TERHINAL ...... 38 (JJOO

H .10. ALTERACION DE LA ESTRUCTURA DE UBLCUITINA Y SUS CONSECUENCIAS ...... 45 SELECTIVIDAD DE UNION DE LA ENZIMA E3 ...... 50 .12. POSIBLES SENALES PARA PROTEDLISIS ...... ‘ ...... 54 .12. La hipótesis "PES”” ...... ‘ ...... 55 O (‘J Degradación lieosomal ...... J ...... 60 .13. RESPUESTA AL ESTRES TERMICO ...... m..62 LOCALIZACION DE LA UBICUITINA EN LA SUPERFICIE n-dl-¡l-¡l-¡I-‘H .14. comunmente CELULAR Y EN EL CITOESQUELETO ...... ‘ ...... 70 Indice

GENETICA Y REGULACION DE LOS GENES DE UBICUITINA....76 Levadurae (Saccharomyees cerevísiae) ...... 76 Plantas superiores ...... 84 .15‘ Drosophila melanogaster ...... 86 .15. Chenorfiabditis elegans ...... 86 .15. Te trahymena pyr'ifoz'mís ...... 88 .15. Dictyostelium discoideum ...... 88 .15. ÏTypanosomatidae ...... 90 15. Mamíferos ...... 91 .15 (OCDÑÜU'IACÚI‘JH Pollo ...... 95

üJüJüJGJCIJCJüJü-‘IQJÜJGJ HHHHHHHHHHH .16. EVOLUCION ...... 97

MMÏLWA (,Edfid, ...... 99

[‘J[‘J Características generales ...... 99

¿o I‘J Organización del genoma ...... 101

ü.) QLQLQHEXIHLDA ...... 105

IRIESÜL'TADOS Y TJISCUSION ...... 106

ANALISIS DE LA GENOTECA DE ADN GENOMICO DE ALflguxuüaí ...... _ ...... 107 Identificación de clones positivos ...... 107

[‘J Subelonado y mapeo de restricción ...... 117 CARACTERIZACION DEL GEN DE POLIUBICUITINA ...... 123 Secuenciación ...... 123

¡buhnhhrh (“JH Identificación de los extremosdel transcripto.....123

“J(“J(“J(“JHH ¡b uu. La.) Análisis de la organización del gen...... 131

(“J yt. Análisis del Southezw genómico ...... 147

_ ii _ Indice

ANALISIS DE LA EXPRESION DEL GEN DE POLIUBICUITINA ...... ‘ ...... ‘ ...... 150

O Metodologia ...... ‘ ...... ‘ ...... \...‘150 Inhibición de la sintesis proteica por 'antibióticos ...... , ...... 150

¡“J Tratamiento térmico y otros estrés relacionados ...... , ...... ‘ ...... ‘ ...... 161 Tratamiento con análogos de aminoácidos ...... 167 Tratamiento con poliaminas ...... 189 Otras condiciones estudiadas ...... 174

Grupo: Expresión de conidiosporas ...... \ ...... ‘ . . ‘ ..176 ANALISIS DE LAS GEHOTECASDE cADN DE üi_Qzafifiai....179

H Identificación de los clones positivos ...... 179 Subclonado y mapeo de restricción ...... ‘ ...... 185 CARACTERIZACION DEL GEN DE FUSION . . T. . . . ‘ ...... ‘ . ..138 Secuenciación ...... ‘ . . . ‘ . . ‘ ‘ . ‘ ...... 138 Análisis de la secuencia ...... 183 Análisis del Southern genómico ...... 193 ANALISIS DE LA EXPRESION DEL GEN DE FUSION ...... 197 hbhhfibvhrbrbhbphnh QLWÜ'IÜICWñrPIhÜJCOCOü-‘I

C3C3rJCIIJIJEBJICJDJIEEB ...... 201

DIAKÜFIZIIJZIKIQIEES SI D113ÏP<313CJES ...... 207

REACTIVOS ...... 208 Reactivos químicos ...... 208 Enzimas ...... 210 Enzimas de restricción . . . . . ‘ . . ‘ ...... i . ‘ . . . . ‘ . ..210

NNNH NH Fosfatasa alcalina de intestino de ternero (CIP)...211

- iii — Indice

ADN ligaea del fago T4 ...... ¿1

.0. [‘J[‘J (DO) RNaea H. Digestión del tracto de poli A de mARN...

AISLAMIENTO DE ADN ...... 2]4 Aislamiento de ADNde plásmidos ...... ; ...... 214 Purificación de ADNen gran escala ...... 2]4 Purificación de ADNen pequeña escala ......

[‘JHHH Aislamiento de ADNde bacteriófagos ...... 216

OIG‘JCDGDÜ'JG'J HHHHHH Purificación de ADNdel bacteriófago X en gran escala ...... 216

(‘J[‘J Purificación de ADNdel bacteriófago X en pequeña escala ...... i ...... i ...... 217

I‘J Purificación de ADNsimple cadena de fagoe filamentoeoe ...... i ...... 218 Extracción y purificación de ADNde p¡*r'vo o es . ca...... o..a.n.o.-sun.gcaoauoo Cuantificación de ADN...... 220 ¿a Purificación de ADNpor columnas (Minicolumn—D)....

¡“J EXTRACCION Y PURIFICACION DE ARN DE Mmmm ...... 222 Purificación de ARN total ...... 222 Obtención de ARN poly A+ ...... 223

[‘J[‘JI‘J DJ[‘JH Cuantificaoión de ARN...... 224

(¿J CONSTRUCCION DE LA GENÜTECA DE ADN COPIA

EN thll ...... 225 Síntesis de ADN copia' ...... 225 Método de la RNasa H ...... 225 Método de la nucleasa Sl ...... = ...... 2°7

GOGO) CJCJÜJCIJ NHHH Acondicionamiento de los cADNdc para eu ligado... .230

_iv_ Indice

5.3.3. Clonado en el vector thll ...... 235 6.3.3.1. Ligado a los brazos del vector ...... 235 6.3.3.2. Empaquetado in vitro ...... 235 6.3.4. Titulación de los fagoe reccmbinantee ...... 735

6.4. ANALISIS DE GEHOTECAS DE FAGOS ...... 237

6.5. TRANSFORMACIONEN Etcherichia coli ...... 239 6.5.1. Preparación de células competentes “01081 Y HM522 ...... \ ...... 239 6.5.1.1 Alta eficiencia de transformación ...... i ...... 239 6.5.1.2‘ Protocolo simplificado ...... ‘ ...... 239 6.5.2. Transformación con pláemidoe ...... 239

6.8. MARCACION DE ADN ...... ‘ ...... ‘ . . . ..241 6.6.1 Técnica del rellenado de extremo (fill in) ...... 241 6.6.2. Tecnica del iniciador múltiple de secuencia al azar (random priming) ...... L ...... 241 6.6.3. Técnica de extensión del iniciador (primer extension) ...... 243 6.6.4. Técnica de ADN copia ...... 244

6.7. MAPEO CON NUCLEASA 81 ...... 246 6.7.1 Técnica de Berk & Sharp ...... 246 6.7.2. Técnica modificada ...... 247

6.8. ELECTROFORESIS EN GELES ...... 249 6.8.1. Geles de agarosa ...... i....249 8.8.1.1. Gel nativo ...... 249 6.8.1.2. Gel alcalino ...... - ...... 250 6.3.1.3. Gel deenaturalizante con formaldehído ...... 251 Indice

.3.1.4. Recuperación de ADN...... 251 .S.1.4.1. Por electroelución ...... t ...... 251 3.1.4 2 Utilizando agarosa de bajo punto de fusión ...... ‘ ‘252 8.2’ Geles de poliacrilamida ...... ‘ ...... 253 8.2.1. Separación de acidos nucleicos ...... ‘251 8.2.2. Recuperación de ADNdel gel . . . . . ‘ ...... ‘ ...... 253 8.2.3. Separación de proteínas (PAGE-S S ...... 254 8.2.4‘ Marcación in Vivo de proteínas ...... 256

9. TRANSFERENCIA Y FIJACION DE ACIDOS NUCLEICOS

A NENERANAS ...... 257 .9.1. Transferencia de ADN...... 257 .9.1.1. Tecnica de Southern ...... 257 .9.1.1.1. Transferencia a Gene ScreenR , ...... ,....257 .9.1.1.2. Técnica alcalina con Gene Screen PlusR ...... 257 9.1.1.3“ Transferencia a Gene Screen PlusH ...... 258 9.1.2. Transferencia a partir de colonias bacterianas.....258 9.1.3. Transferencia a partir de playas de fagos . . . . ‘. . . ..259

mmmmmmmmCDmmmmmmmm 9.2. Transferencia de ARN(Técnica de Northern) . . . ‘ . . . ..260

Ü) .10. TRANSFERENCIA Y FIJACION DE PROTEINAS A

NEMBBANAS ...... 261 .10.1. Electrotransferencia ...... 261 .10.2. Transferencia de playas de lisis ...... 261 .10.2.l. Técnica de la "pizzeta" ...... ‘ ...... 261

03030303 .10.2.2. Transferencia de genotecas . . . . . ‘ . . . ‘ . . . . ‘ ‘ . . ‘ ...... 262

.11. HIBRÍDACION DE ACIDOS NUCLEICOS INMOVILIZADOS. . . . ‘.263

.12. REVELADO INMUNOLOGICODE PROTEINAS INHOVILIZADAS...255 Indice

.13. SECUENCIACION DE ADN ...... 266 .13. Método de Maxam y Gilbert ...... 266 .13. 03030) Método de Sanger ...... 266

6.14. VECTORES EMPLEADOS ...... 269 .14. Vectores plásmido ...... 269

.14. h) Vectores derivados del fago ...... 270

.15. CEPAS UTILIZADAS ...... 272 6.15. Cepas bacterianas de Escherichia coli K1?...... 272

0) .15. Cepas de Eggzgfiggza_gzafifia, ...... 272

.16. MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO ...... 273 .16. Medio minimo (MM) ...... 273 .16. Medio Luria-Bertani (LB) ...... 273 .16. Medio mínimo nitrato modificado (MMN)...... 274 .16 Medio N/2 de Vogel ...... 275

.16. (J'IACÚNH 0)0>0'>0)0)0> Condiciones de tratamiento (estrés) ...... 277

.17. REFERENCIAS ...... 280

131[]31;I[()(;IR¿&IFZ[AX ...... 283

¿XIPIZIQI)Z[(313 ...... 340

POLIUBICUITINA ...... 339 Mapa de restricción ...... 339 Secuencia de a.a. deducida de la sec. nucleot...... 341 FUSION DE_UBICUITINA Mapade restricción!

Resumen

La ubicuitina es una proteína de 76 residuos aminoacídicos altamente conservada en la escala evolutiva, que se encuentra en todos los organismos eucarióticos, libre o conjugada covalente­ mente a proteinas. La función fisiológica de ubicuitina está relacionada con el camino de degradación proteica dependiente de ATPpor vía no lisosomal, con la regulación del ciclo celular y con la respuesta a diferentes condiciones de estrés. A pesar de que la ubicuitina está codificada por una fami­ lia multigenética, ninguno de ellos lo hace para la proteina ma­ dura, sino para un precursor en el que la ubicuitina se encuentra fusionada por su extremo C-terminal a si misma (arreglo en tándem cabeza-cola en poliubicuitina), o bien, a una secuencia aminoací­ dica no relacionada con motivos de unión a ácidos nucleicos. En fleurgfipgza_gnafifia,la inhibición parcial de la sintesis proteica por tratamiento con cicloheximida, pero no con puromici­ na, conducen a un aumento de la población de transcriptos de po­ liubicuitina. Otras situaciones de estres comoayuno, crecimiento en pre­ sencia de análogos de aminoácidos, estres térmico, tratamiento con arsenito de sodio, que son inductores en otros organismos de la transcripción de este gen, no tienen efecto en Henrgspgxa_gza— asa. En nuestro laboratorio-se aislaron y caracterizaron dos ge­ nes de ubicuitina de flgungfipgza_grassa que corresponden, i) al gen de poliubicuitina y ii) a un gen de fusión. Estos genes clonados reconocen especies de ARN de 1,3 y 0,7 Kb, respectivamente en Northern blots. Los análisis de Southern blots parecerían indicar la exis­ tencia de un locus único para el gen de poliubicuitina que con­ tiene 4 repeticiones en tándem cabeza-cola con un aminoácido ex­ tra fusionado al C-terminal del último monómero. Resumen

El gen de fusión de Heuzgfingrfl_grafifia corresponde a una unidad que codifica para ubicuitina ligada a una extensión de 78 aminoácidos, y su expresion se encuentra particularmente aumenta­ da en conidias germinadas y en fase logaritmica. Las extensiones de fusión de ubicuitina pertenecen a una familia de proteinas ribosomales que ademas, están involucradas en el procesamiento del rARNde ambas subunidades. En condiciones de mayor replicación celular, los mensajeros correspondientes a estos genes de fusión se expresan activamente, como se encontró en flenzgfingza_grassa. Se comprobóque el transcripto de 0,7 Kb no sufre variación en respuesta a los estrés estudiados, y que su expresión se redu­ ce por ayuno. La comparación de la secuencia aminoacidica codificada por estos genes con la encontrada en otros organismos, contribuye a confirmar la alta conservación evolutiva de esta proteina. Sin embargo, el comportamientoparticular de la respuesta al estrés en este organismo, plantea algunos nuevos interrogantes respecto a la regulación de la expresión del gen de poliubicuitina.

Abreviaturas a.a ...... ¿...... aminoácidos ADNdc...... ‘...\..\..‘.,\‘.\‘.‘.....‘ADN doblecadena ADNsc...... ADN simple cadena ADN...... ácido deoxiribonucleico AEN.,\.....\.....‘....., ..‘....‘.‘..‘...‘.‘.‘.ác1do ribonucleico BSA..‘...... seroa1búmina bovina cADN...... ADN copia Ci...... \...... ‘...Curies (lCi = 2,2x1012dpm) cm...... centímetros dATP...... ‘...... ‘....deoxiadenosina trifosfato dCTP...... ‘ ...... ‘...... decxicitosina trifcsfatc dGTP...... ; ...... de0xiguancsina trifosfato DNasaI..t.‘..‘...... ,‘..deox1r1bonucleasa I (de páncreas b0v1no) dpm...... ‘ ...... ‘.....desintegración porminuto dTP....\...‘.;.\...... ‘. .‘.\....‘..deox1timid1natrifosfatc EtBr...... ‘...... ‘\...‘.. .‘,....‘\....brcmurc deetidio hs‘...... ‘,‘.‘..‘..‘...“..“‘..‘....“.“....‘hcras Kpb..‘.“‘.‘ ...‘. .‘..‘.. ,‘...... ‘ . .“‘.103 paresde bases mxg...... n vecesla fuerzagravitatoria MAb...... “...... “.‘..“...anticuerpc mcnoclonal mA...... miliampere mARN.‘...‘...... ‘.‘,...... ‘.. \.‘.“.‘..ARN mensajero mg ...... miligramo min...... m1nutcs m1...‘...‘...... ‘...... ‘\.‘...... ‘...... ‘.‘...mililitro mM....‘...... \‘\....‘...... ‘...... \...m111molar M...... ‘ ...... mclar mmol ...... milimol nt..ng ...... ‘...... ‘...... ‘ ...... ‘...... nucleótidos ...... nanogramo nX....‘...... ‘...... \...... “concentradonveces Abreviaturas

oligodT ...... ácido oligodeoxitimidílico P/V ...... peso en volumen pb ...... L ...... pares de bases pH ...... ‘ ...... ‘ ‘ ...... ‘ ...... -log[H+] poliA ...... : ...... ácido poliadenílico rARN . . . ‘ . . . ‘ . . . . . ‘ ...... ‘ . . \ ...... \ . . . . ‘ . . . ..ARN ribosomal RNasaA...... ; ...... ribonucleasa A (de páncreas bovino) rpm ...... revoluciones por minuto tARN ...... ARN de transferencia U.V ...... l ...... ‘ ...... ‘ ...... ultravioleta ufp ...... unidad formadora de placa U...... ‘ ...... unidades de actividad enzimática V/V ...... l ...... volumen en volumen vol ...... ‘ ...... \ . ‘ ‘ . l ‘ ...... ‘ . . . . ‘ . . . ..volumen [32P] ...... isótopo radioactivo de fósforo de peso molecular 32 [358] ...... isótopo radioactivo de azufre de peso molecular 35 pg ...... microgramo

HM ...... micromolar °C ...... grados Celsius

‘Las abreviaturas de los reactivos utilizados se describen en 6.0.1.

Introducción

Fjg. 1. Representaniñn esmanial de la. Magaliuna mamita. Extra í do de Wilkinson, 1987a.

3.1.1. HISTORIA

La ubicuitina (primeramente conocida como polipéptido inmunopoiético ubícuo o UBIP) es una proteína de 8,5 kD que fue aislada por primera vez del timo bovino pero que posteriormente se la encontró en células de todos los tejidos estudiados y en la mayoría de los organismos vivos desde levaduras hasta humano (Goldstein et al, 1975).

Historia —8 Introducción

La ubicuitina podía inducir diferenciación in Vitro no sólo en protimocitos, sino también en células B (Goldstein et al, 1975; Scheid et al, 1975; Goldstein, 1976; Audya y Goldstein, 1935), via eAMPmimetizando la unión de 1a timopoietina (hormona timica aislada por Basch y Goldstein, 1974). La inducción era in­ hibida por el antagonista propranolol. Recientemente, Okabe et al (1988) encontraron un factor de crecimiento autócrino en sobrenadantes de células leucemicas humanas (LGF)que actuaba ademas, en células mieloides, eritroi­ des e, inclusive, linfoides. La secuencia aminoterminal de este factor de 20 kD era idéntica a la ubicuitina bovina. Sin embargo, la ubicuitina purificada de timo bovino no estimula el crecimien­ to en células leucémicas (Okabe et al, 1986). La secuencia completa de la ubicuitina bovina fue dada a conocer en 1975 por Schlesinger et al (1975). Las regiones de ho­ mología interna encontradas, sugieren que este gen se originó por duplicación de un gen antecesor, comose ha propuesto para otras proteínas que muestran homologia interna (Dayhoff, 1972)(Ver Fig. 2 . La ubicuitina reaparece en la literatura en 1977, como una proteina cromosómica de hígado de rata denominada A24 cova­ lentemente unida a la histona "ZAa través de un enlace isopeptí­ dico (Goldknopf y Busch, 1977; Hunt y Dayhoff, 1977). En 1980, nuevamente cobra notoriedad la ubicuitina por los trabajos de Hershko et al, en los que se mostraba que el fac­ tor proteolitico I (APFI), un polipéptido de 8 kDnecesario para la proteólisis dependiente de ATP en lisados reticulocitos, se unía covalentemente a otras proteínas, incluyendo sustratos exó­ genos proteolizables (Ciechanover et al, 1930; Hershko et a], 1980). Rápidamente se demostró que APFI era en realidad ubicuiti­ na (Wilkinson y Audhya, 1981).

Historia - 9 Introducción

.\ \ 5 A52 {gsm ARG - llñïíïiïL EÜ %m“K‘ñ ,,, máx “¡num

‘K‘áïákïïgïá’éñfiïmï2°; fi“ Í’Ïïfi‘gfiáíL‘ Afin 327%}? XAL É’Yï-Ïí :I.. . u)w ‘4 l i “25.1|.9 gg_, «us; L Mg a I I???»l ALAíi’ su; GLYlLEBBQBBQ '28 ’¿áifij“!”,WM. V .33; 38 (31.11---­ 7 ww 32% 64

LEU UL LEU ARQ LE! ARG. F18.2. 69 70 74 donde 6.6.mms-aim la hamsúggia imgrna. Los residuos sombreados con g son a.a. invariables y los residuos subrayados son aquellos que poseen sólo un cambio de base en el triplete. Los residuos sombreados con fi corresponden a aquellos a.a. en que no ha habido ni cambio de carga, ni de polaridad y que además involucran sólo.un cambio de base en el triplete. El cambio en la posición 53 es conservado. Extraido de Gabilanes et al, 1982.

Historia —10 Introducción

3.1.2. ENZIHAS INVOLUCRADAS EN LA ACTIVACION Y CONJUGACION DE UBICUITINA

La ubicuitina es la proteína eucariótica másconservada. Esta presente en citoplasma, núcleo y superficie celular. Muchasproteinas nucleares y citoplasmáticas contienen ubicuitina covalentemente unida. El enlace involucra el COOHter­ minal de la ubicuitina con grupos E-NHZde lisinas internas (en­ lace isopeptidico) o bien via el aminoterminal. Usandocromatografía de afinidad con ubicuitina unida a Sepharosa, Hershko et al (1983) y Ciechanover et al (1982) des­ cribieron el aislamiento de 3 fracciones de extracto de reticulo­ citos de conejos necesarios para la conjugación de ubicuitina a proteínas citoplasmáticas. Comoera de esperar, el CÜÜHdeubicuitina debía ser ac­ tivado para el ataque nucleofílico del grupo NHz, lo que obligaba la presencia de por lo menos, una enzima activadora E1 que segu­ ramente requería hidrólisis de ATP. La activación por E1 es en dos etapas (ver Fig.3) donde la primera involucra una adenilación y la segunda una transferencia a un cisteína de la enzima E1 a través de una unión tioléster altamente reactiva.

o Mg2+ E1-5H + ATP + Ubgo- ==== El-SH.AHP—Uh + PPi

OO

El-SH.AMP-Ub + ATP + UbÜO-H ==== El-S- g Ub.AHP-Ub + AMP + PPi Fig. 3: Afiliaciándslanhiguitinamlaenzimam

Los detalles mecanísticos de la reacción de activación fueron estudiados por muchos grupos (Hershko et al, 1981,1983; Ciechanover et al, 1981,1982; Haas y Rose, 1982; Haas et al, 1932,1983; Jakubowski y Fersht, 1981; Lipmann, 1971; Alberts et a1, 1963) y se parece a otros dos procesos de activación de ami­ noácidos ya sea por las enzimas aminoacil tARNsintetasas (Jaku­ bowski y Fersht, 1981), o en la síntesis de péptidos bacterianos con función antibiótica (Lipmann, 1971).

Enzimas - 11 Introducción

La enzima E1 es la responsable de la activación de ubi­ cuitina en todos los procesos de conjugación. Tanto los conjuga­ dos citoplasmaticos comonucleares desaparecen rápidamente en cé­ lulas de una linea de carcinoma mamario FM3AtsS5cultivadas a temperatura no permisiva, y el único defecto aparente en estas celulas es que contienen una enzima termosensible (Finley et al, 1984; Matsumoto et al, 1983). Las proteinas de la fracción II actúan como intermedia­ rias de la ubicuitina activada en la unión a los diferentes sus­ tratos proteicos. A diferencia de E1, E2 no cataliza hidrólisis de ATP. La mayoria de las proteinas E2 son homodímeros de poli­ péptidos de peso molecular inferior a 35 kD. Hasta el momento se conocen 5 miembros de esta familia E2 según estudios de Pickart y Rose (1935a). Por analogía con el papel de las acilproteinas transpor­ tadoras en la biosintesis de ácidos grasos (Alberta et al, 1963), las proteinas de la fracción E2 se llamaron transportadoras de ubicuitina. Gracias a la presencia de un grupo tiol aceptan ubi­ cuitina activada por E1 por transacilación y lo transfieren a grupos NHZ. Noexisten diferencias en las abundancias relativas de las proteinas E2, pero si con respecto al sustrato proteico sobre el que actúan. La conjugación en algunos casos también requiere de la presencia de una proteina presente en la fracción III, E3 (liga­ sa)(Ver Fig. 4). Por lo menos Z de las 5 proteinas transportadoras E2 (20 kD) y E2 (14 kD), catalizan la transferencia de ubicuitina a algunos sustratos proteicos básicos de bajo peso molecular, como las histonas y el citocromo C de levadura (Haas et a1, 1988; Haas y Bright, 1988; Pickart y Vella, 1988b), independientemente de E3, produciendo monoconjugados. Tambiénse han descripto múltiples conjugaciones sobre una misma molécula de histona a través de un mecanismo progresivo (Pickart y Vella, 1988b), como así también la transferencia a histona H3, aunque no se ha observado esta modificación in vivo (Pickart y Vella, 1988a).

Enzimas — 12 Introducción

o o u u Ez-S-ÜUb + Ez-SH _——_- El-SH + Ez-s-üUb o o Ez-S-JUbu + H-NHz HN- a Ub + Ea-SH H

+ E3-NH2

0

ESN-güb + E2-SH H

Fig.4. Beagqumgsdi transferencias ¿Laubjpnjtjna apgjvada, EScorresponde a un sustrato proteolizable y II corres­ ponde a una hietona.

Una de las enzimas del grupo E2, E2 (20 kD), resultó ser el producto del gen RADG(Jentsch et al, 1987) de levadura. Uti­ lizando extractos de E. coli que expresan el gen clonado RAD6su­ plementados con ATPy enzima E1 se logró conjugar ubicuitina a histonas. En Sacoharomyces cerevisiae, el gen RAD6juega un papel importante en la reparación de ADNpor daño por UV, rayos X y mu­ tágenos quimicos. (Tuite y Cox, 1981; Friedberg, 1983; Crame y Mortimer, 1974)‘ Ademases requerido en una variedad de funciones celulares comoser esporulación e inducción de mutagénesis (Mon­ telone et al, 1981; Haynes y Kinz, 1981). La concentración_intracelular de E2 (20 kD), que tiene probablemente funcion nuclear, baja significativamente durante la maduración de reticulocitos a eritrocitos (Pickart y Vella, 1988a). En histonas, los sitios aceptores de ubicuitina proba­ blemente queden enmascarados en el nucleosoma y existe 1a posibi­ lidad de que el conjugado sea importado al núcleo. Tambien po­

Enzimas - 13 Introducción

drian existir distintas enzimas de la familia de E2 dada su dife­ rente localización celular. Sin embargo, la membrananuclear no es permeable a proteinas mayores de 80 kD, salvo que contengan señales especificas de importación, E1 de 100 kD y Ez (35 kD) de 70 kD serian excluidas por tamaño. La localización nuclear de E2(20 kD) quedaria justifi­ cada por su función como enzima reparadora de ADN. La función de E2 (14 kD) parece estar asociada a conju­ gación en el citoplasma, pero no puede descartarse un papel extra en el metabolismo de conjugación de ubicuitina a histonas, por lo menos como transportadora de ubicuitina activada por E1 dentro del núcleo. ' Las mutantes en el gen CDC34de Succharomyces cerevisiae son defectivas en la transición de la fase Gi a S del ciclo celu­ lar (Byers, 1981; McGrath et al, 1988). Recientemente se demostró que la proteína codificada por el gen CDC34tenía gran homologia con la proteína codificada por el gen RADGyque, además, perte­ necía a la familia de proteínas transportadoras de ubicuitina E2 (34 kD)(Goebl et al, 1933). Ademásde la similaridad de sustratos in vitro, tanto RADS(nueva denominación UBCZ)como CDC34 (denominación propuesta UBC3)contienen una región de aminoácidos ácidos cerca del C-ter­ minal ausente en otras enzimas que conjugan ubicuitina como E2 (30 kD)(UBCl)imprescindible solo para la conjugación con histo­ nas. La nomenclatura UBCpropuesta por Jentsch et el (1987) deri­ va de ermjma gm conjuga ¡n'gj'nujtj‘¡'¡a. Se especula con la posibilidiad de que la enzima UB03 catalice la conjugación de ubicuitina a histonas, especificamente en fase G1del ciclo celular, preparándose para la iniciación de replicación de ADNy que la conjugación por la enzima UBCZqueda­ ría confinada a los sitios dañados en el cromosoma(Jentsch et al, 1988). Por inmunofluorescencia se vio que UBC3era una prote­ ína nuclear. Las reacciones enzimáticas requeridas para la conjuga­ ción de ubicuitina dependiente de ATPtambién fueron caracteriza­ das in vitro en plantas por Vierstra (1987). En los extractos de brotes etiolados de trigo, la conjugación era pobre, pero en ger­ men resultó ser muyactiva. Los conjugados eran similares a los encontrados por Hershkoen reticulocitos de conejo. La similitud de epitopes en­ tre E1 de plantas y animales indica la conservación evolutiva de Introducción esta enzimaal igual que ubicuitina (Hatfield y Vierstra, 1989). Preparaciones puras de E1 demostraron la presencia de tres isoen­ zimas. Esta heterogeneidad podría reflejar una diferencia de fun­ cion o de localización enzimática. E3 tiene un peso molecular de aproximadamente 250 kD y contiene una subunidad de 200 kD (Hershko et al, 1986), aunque no se conoce hasta el momentoel mecanismocatalitico. Múltiples isoenzimas con actividad ligasa con distintas especificidades fueron encontradas por Lee et al (1986). Existen varias evidencias que demuestran que el enlace involucrado en los conjugados Ub-proteína es una unión amida. El enlace es estable a agentes deenaturalizantes que disociarian un complejo no covalente (Hershko et al, 1980), comoasí también a tratamientos alcalinos, ácidos, altas concentraciones de hidroxi­ lamina y mercaptoetanol suficientes para romper cualquier enlace éster o tioléster (Houghet al, 1988). Estas propiedades quimicas son las esperadas para un enlace peptidico. El grupo carboxilo de la glicina terminal de la ubicui­ tina es el que resulta activado por la enzima E1 durante el pri­ mer paso de formación del conjugado. La eliminación de las dos glicinas terminales destruye la capacidad de formar conjugados (Hershko et al, 1981). Hershko et al (1980) demostraron que más de una molécula de ubicuitina podía conjugarse a una mismamolécula de proteina, formando conjugados múltiples.

Enzimas - 15 Introducción

3.1.3. CONJUGADOSDE UBICUITINA A HISTONAS

El primer conjugado Ub-proteína reconocido y caracteri­ zado fue la semi-histona A24. En nucleolos de hepatocitos prove­ nientes de ratas tratadas con tioacetamida o después de hepatec­ tomia parcial, el nivel de A24 decrecia notablemente (Ballal y Busch, 1973; Ballal et al, 1974,1975). Noobstante, estos trata­ mientos mantenían altos los niveles de síntesis de ARN.La prote­ ína A24 involucrada en la regulación de la expresión genetica mostró una composición aminoacídica similar a la histona H2A (Goldknopf et al, 1975; Goldknopf y Busch, 1975; Olson et al, 1976). También se demostró la presencia de ubicuitina (Hunt y Dayhoff, 1977; Goldknopf y Busch, 1978; Goldknopf y Busch, 1977) unida a la lisina 119de dicha proteina vía el enlace isopeptídi­ co. Las 4 isoproteinas de la familia H2A (West y Bcnner, 1980a) pueden formar un l %de aductoe con ubicuitina (Busch y Goldknopf, 1931). En la vecindad del sitio de unión de ubicuitina (lisina 119), se encuentra otra lisina (posición 118). Este doblete se conserva en todas las histonas H2A(Wuet al, 1986) a pesar de la divergencia de la secuencia flanqueante, Hasta el momentono ee encontró ninguna diferencia fun­ cional entre nucleosomas con HZAconjugados o no con ubicuitina (Martinson et al, 1982; DeLange et a1, 1979; Bonner y Stedman, 1979). Tampoco se vio afectada la longitud del ADNdigerido de cromatina proveniente de ambos tipos de nucleoeomas (Albright et al, 1980; Levinger y Varshavsky, 1930). La histona H2Bpuede conjugar ubicuitina (West y Bonner, 1981) en la posición de la lisina 120 (Thorne et al, 1987) con­ servada en todas las histonas H2B. El porcentaje de unión de ubicuitina en H2Bes menor que en HZA.La menor accesibilidad de la ubicuitina a la lisina en HZB(Hatch et al, 1983; Rosenberg et al, 1988), involucrada en la formación del dímero HZA-HZB (Moss et al, 1976; Bohm et al, 1932), podria explicar esta situación.

Ub-histonas - 16 Introducción

En mamíferos, aje de histonas conjugadas con ubicuitina parece ser cons,ante. Así en neuronas de la corteza cerebral de ratas, donde las células están totalmente diferencia­ das, 12-14% de H2Ay 1-2% de H2Bestán conjugadas con ubicuitina (Pina y Suau, 1985; West y Bonner, 1980b). En otras especies diferentes de mamíferos, si bien los porcentajes de conjugados son menores, el porcentaje de Ub-histo­ nas es similar. Tal es el caso de pollo (Goldknopf et al, 1930a), erizo de mar (Wuet al, 1982a), Droscphila (Levinger y Varshavs­ ky, 1982), Plodia (Pataryas et al, 1984), Tétrahymena (Fusauchi y lwai, 1985). Sin embargo, en thsarum (Mueller et al, 1985), 7% de HZAy 6% de HZBcontienen ubicuitina. La presencia de histonas con más de una molécula de ubi­ cuitina unida fue demostrada en cromatina de hepatocitos y de cé­ lulas de testículo de trucha por los grupos de Davie y Nickel (Davie et al, 1987; Nickel et al, 1987). Estos autores demostra­ ron últimamente, que la histona H2Allevaba moléculas de ubicui­ tina unidas entre_sí por enlaces isopeptídicos que involucraban la lisina 6 de ubicuitina que, a su vez, se unían a la histona a través del grupo €—NH2de la lisina 119 (Nickel y Davie, 1989). La lisina 6 de la ubicuitina, según demostraron Vijay-Kumar et al (1987a), sería uno de los residuos completamente expuestos en la superficie. El metabolismo de las semihistonas Ub-HZAy Ub-HZB(his­ tonas conjugadas con ubicuitina), ha sido bien estudiado en célu— las en división o quiescentes (Wu et al, 1981a; Seale, 1981; Trempe y Leffak, 1982; Atidia y Kulka, 1982; Raboy et al, 1986; Carlson y Rechsteiner, 1987; Carlson et al, 1987). Se vio que la ubicuitina conjugadaestá en equilibrio de interconversión rápi­ da. Varios grupos demostraron (Wu y Bonner, 1981b,1985; Wu et al, 1932b; Sariban et al, 1985) que, ni la formación de conju­ gados ni la síntesis de ubicuitina estarian ligadas a la síntesis de ADNo a la síntesis de histonas. Los niveles de Ub-HZAy Ub-HZBse reducen apreciablemen­ te durante la mitosis en cromosomasmetafásicos. Varios autores sugieren que esta disminución de Ub-HZAjugaría un papel impor­ tante en la condensación cromosómica (üatsui et al, 1979; Mueller et al, 1935). Existen evidencias que señalan que el sistema de conju­ gación de ubicuitina seria necesario para atravesar la fase G2 del ciclo celular. A temperaturas no permisivas dos mutantes ter­

Ub-histonas - 17 Introducción mosensibles de ciclo celular, línea celular E36ts20 de ovario de hamster chino y en la linea celular FM3At885,quedan detenidas en G2. Se sabe que ambas líneas poseen una enzima E1 termolábil (Finley et al, 1984; Kulka et al, 1988). Similarmente a lo que ocurre durante la eritropoiesis en pollo, la reducción del contenido de Ub-HZAtambién ocurre en la miogenesis de músculo esquelético en este organismo. Muchos ge­ nes, cuya expresión es activa en mioblastos individuales, se apa­ gan en respuesta a la diferenciación terminal y fusión celular para formar miotubos maduros (Wunsch et al, 1987). Varshavsky et al, usando técnicas de mapeo bidimensional de nucleosomas, demostraron la presencia de Ub-HZApreferentemen­ te localizada en regiones cromosómicasen transcripción activa en Drosophila (Levinger et al, 1981; Levinger y Varshavsky, 1980, 1982). Másrecientemente, un incremento preferencial de nucleo­ somas conteniendo histonas conjugadas con dos moléculas de ubi­ cuitina, fue localizado cerca del extremo 5' del gen de la dihi­ drofolato reductasa murina (Barsoum y Varshavsky, 1985). Por el contrario, Huanget al (1986) estudiando el gen de la cadena liviana k de las inmunoglobulinas en células de plasmacitoma murino MPCll no pudieron encontrar histonas H2A-B conjugadas con ubicuitina en los nucleosomas involucrados en este locus transcripcionalmente activo. En células vegetativas de Tetrahymena, los macronúcleos son transcripcionalmente activos y se dividen amitóticamente (Go­ rovsky et al, 1978). Nickel et al (1989) encontraron que las pro­ teinas cromosómicasde los macronúcleos y fracciones enriquecidas en secuencias transcripcionalmente activas contenían monoy poli­ conjugados de ubicuitina con HZAy HZB.Preferentemente, los con­ jugados con HZB se localizaban en dominios transcripcionalmente activos, mientras que Ub-HZAestaria presente tanto en regiones activas comosilenciosas de la cromatina. Es posible que HZBsea un buen sustrato para el agregado enzimático de ubicuitina sólo cuando está desplazada del dimero en el nucleosoma, durante la transcripción (Loidl, 1988; Jackson y Chalkley, 1981; Baer y Rhodes, 1983). Mezquita et al encontraron que la ubicuitina estimulaba in vitro la deacetilación de histonas (Mezquita et al, 1982).

Ub-histonas - 18 Introducción

Todas estas observaciones son consistentes con 1a *hipó­ tesis de que las histonas conjugadas con ubicuitina tienen un pa­ pel importante en el mantenimientode la estructura _cromatinica transcripcionalmente activa. ' ' '

Ub-histtnas': Introducción

3.1.4. HIDROLASAS CARBOXITERHINALDE UBICUITINA

La regeneración de las moleculas de ubicuitina a partir del gran númerode conjugados, requiere la presencia de una acti­ vidad hidrclasa. Entre los ejemplos que se conocen, se encuentran la se­ paración de ubicuitina de las semihistonas durante la metafase en distintos organismos (Goldknopf et al, 1980b; Matsui et al, 1979; Wuet al, 1981a; Seale, 1981; Mueller et al, 1985; Goldknopf et al, 1978) y la desaparición de conjugados en células FM3AtsB5 a 39°C (Mita et al, 1980; Matsumoto et al, 1983). De los datos de la organización genética aportados por varios grupos en diversos organismos, el procesamiento de la poliproteina resultante de la expresión de los tandem de ubicuitina sugeriría también la pre­ sencia de peptidasas especificas. Ademas, gran cantidad de conjugados de ubicuitina se originan por acción de las enzimas E1 y E2 sobre grupos ticles o aminos simples presentes en la célula. La hidrólisis seria la única manera de reparar estos conjugados erróneos. Rose (1983) propuso la siguiente clasificación y nomen­ clatura para las Ub-hidrolasas, enzimas que catalizan la reacción UbX + H20 Ub + XH, en base al sustrato:

Ub hidrolasa ULHo UCH(donde X es un ligando pequeño carboxi terminal no proteico)

Ub proteina liasa o UGPH(donde X es una proteina con enlace isopeptidasa isopeptidieo a ubicuitina

Ub peptidasa UGPH(donde X es una proteina con enlace peptidico a ubicuitina).

Hidrolasas —20 Introducción

El primer estudio in vivo de la presencia de actividad de hidrolasa fue llevado a cabo por Anderson et al (1981a), incu­ bando nucleolos de hepatocitos de rata comofuente enzimática y cromatina de hepatocitos comofuente del sustrato Ub-histona. Posteriormente, usando Ub-HZA,el mismo grupo (Anderson et al, 1931b) demostró la presencia de una enzima A24 liasa, que actúa sobre el enlace isopeptidico Ub-Gly-Gly-76-ENH-Lys-proteínay cu­ ya actividad aumenta asociada a cromosomasmetafásicos. Los enla­ ces isopeptidicos también fueron encontrados en colágeno (Mecha­ nic y Levy, 1953), fibrina (Pisano et al, 1968; Mataic et al, 1968), péptidoglicancs (Dezelec y Shockman,1975), proteinas de la médula capilar (Harding y Rogers, 1976) y en_la proteina ribo­ somal (811) de E. coli (Chen y Chen-Schmeisser, 1977). También Hershko et al (1980) demostraron la formación de conjugados de ubicuitina dependientes de ATP, la remoción de un péptido estable al calor posterior a la eliminación de ATP, y la capacidad de la ubicuitina removida de formar nuevos conjugados en el sistema de reticulocitos reconstituidos. Kandaet al (1984, 1936) purificaron parcialmente de ti­ mo bovino la peptidasa Ub-histona. La presencia de la enzima ci­ toplasmatica A24 liasa se encontró en muchoseucariotes pero no procariotes comoE. coli (Hatsui et al, 1932). El grupo de Goldknopf et al (1981, 1980a) demostró que la actividad de hidrolasa sobre Ub-HZAennúcleos de eritrocitos maduros de pollo es despreciable comparada con la de núcleos in­ madurosen células transcripcionalmente activas. Mztsu i (1988) recientemente identificó en células de ma­ míferos un factJrr con c pacidad supresora capaz de regular el procesamiento i li e conjugados Ub-proteina por isopeptida­ sas. Este fact or se uniri a a la enzima pero no a histonas ni a ubicuitina. Después de un tratamiento con hidroxi- o nitroso-urea a células de tumor ascítico, los niveles de conjugados Ub-histona aumentan (Dornish et al, 1981; Pipkin et al, 1982) por inhibición de la Ub-HZA liasa, segun lo comunicado por Markussen et al(1984). También la cicloneximida tiene el mismoefecto sobre los niveles de conjugados, aunque el mecanismoes menos claro en este caso (Dalay et al, 1984). Varios grupos de investigadores (Houghet al, 1986,1987) indicaron la presencia de isopeptidasas o hidrolasas con pesos moleculares entre 100 y 400 kD.

Hidrolasas - 21 Introducción

Los experimentos de Bachmair et al (1986) con proteinas de fusión recombinante Ub-B-galactosidasa ponen de manifiesto la presencia de una actividad peptidasa (UBPH).Estas proteínas de fusión al ser expresadas en levadura, pero no en E. coli, sufren un procesamiento que libera la ubicuitina del producto de fusión. Recientemente, Butt et al (1988a) comunicaron 1a purifi­ cación parcial de una endopeptidasa a-NH-Ub-proteína de reticulo­ citos de conejo. Teniendo en cuenta el procesamiento específico de proteinas hibridas con ubicuitina, se comenzóla obtención biotecnológica de proteinas de fusion recombinantes comola sub­ unidad as de la adenilato ciclasa (Gea), el fragmento soluble de la molécula CD4, el dominio proteásico de la uroquinasa humana y el K-interferón humanocon resultados preliminares exitosos (Butt et al, 1989; Ecker et al, 1989; Ecker, 1939; Sabin et al, 1989). Miller et al (1989) comunicaron el clonado de una de las hidrola­ sas de levadura capaz de olivar con precisión proteinas híbridas con ubicuitina. La eliminacion por mutagenesis dirigida de este gen (YUH-l) en cepas haploides de levaduras no provoca ningún cambio fenotípicoL sugiriendo la presencia de por lo menos otro gen que codifique para otra hidrolasa. Jannalagadda et :1 (1989) comunicaron la presencia, en extractos de reticulocitos de conejo de múltiples hidrolasas del tipo UúPH. Los estudios sobre la reaccion de la ensima activadora de ubicuitina, E2, llevados a cabo por Rose y Warms(1983), de­ mostraron que la velocidad de liberacion de PPi seguia una curva bifasica proporcional a la concentracion de DTT,existiendo reci­ clado de ubicuitina de los conjugados con DTTcon hidrólisis de ATP. ickart y Rose (1985a; 1985b) demostraron la presencia de una proteina de 30 kD con actividad de hidrolasa para Ub-AMPy Ub-DTT.También estos autores demostraron que ciertas aminas ali­ fáticas eran buenos aceptores para ubicuitina activada por E1 y sustratos de hidrolasas. Otros sustratos alternativos para estas hidrolasas podian ser complejos de ubicuitina con poliaminas li­ bres o conjugadas a macromoleculas, glicina metil ester, hidroxi­ lamina, pero no enlaces isopeptidicos. El amplio rango de especificidad de sustratos de estas enzimas (ULH)es necesario para asegurar la regeneración de ubi­ cuitina de conjugados espureos con nucleófilos comoglutation o espermidina. Esta familia de hidrolasas es inhibida por Ubal (al­ dehido de la molécula de ubicuitina)(Hershko y Rose, 1987).

Hidrolasas —22 Introducción

3.1. PROTEASA DEPENDIENTE DE UBIQUITINA/ATP

En 1980,Hershko et al propusieron que la unión de la ubicuitina a sustratos proteicos cumpliria la función de identi­ ficar aquellas proteinas destinadas a degradarse. Existen 5 ejemplos que demuestran la buena correlación que existe entre la conjugación de ubicuitina a una proteina y su rápida proteolisis: i) Cuando se agrega hemoglobina a un cultivo de células de ma­ míferos, que luego se trata con fenilhidrazina, la globina es rápidamente degradada. La concentración de conjugados Ub-globina que se forman después de la desnaturalización de la Hb es proporcional a la velocidad de la degradación de la globina (Chin et al, 1932). ii) Las proteinas que incorporan análogos de aminoácidos a su estructura son degradadas más rápidamente (Hershko et al, 1982). iii) La calmodulina de Dictyostelíum une ubicuitina en la lisina 115 y es degradada después de que se agrega a un lisado de reticulocitos; en cambio, la calmodulina bovina que no une ubicuitina por estar metilada en la lisina 115, es más es­ table (Gregori et al, 1985). iv) El fitocromo, receptor citoplasmático de luz en plantas, existe en dos formas interconvertibles que difieren en su vida media en dos órdenes de magnitud. Cuando las plantas crecidas en oscuridad reciben un pulso de luz se induce la degradación del fitocromo. Al mismo tiempo, una porción de las moleculas de fitocromo se conjuga con múltiples molécu­ las de ubicuitina (Shanklin et al, 1937; Jabben et al, 1989a,b).

V) En el caso de expresión de proteinas de fusión Ub-B-galac­ tosidasa en levaduras, se vio que la ubicuitina es rápida­ mente clivada del N-terminal de la B-galactosidasa (Bach­ mair et al, 1986). Si por mutagenesis dirigida se generan distintos residuos N-terminales, las proteinas de fusión resultantes varian considerablemente su estabilidad. Los

Proteasa - 23 Introducción

aminoácidoscomo fenilalanina, leucina, lisina, arginina, aspártico ubicados en el extremo N-terminal confieren a las proteínas de fusión una vida media corta. Se'demostró ade­ mas, que estas proteinas estan altamente conjugadae con ubicuitina.

En la linea de linfoma murino FMBAtsBS,mutante termo­ sensible para E1, la incubación a la temperatura no permisiva de 39°C inhibe el recambio intracelular de proteinas anómalas o de vida media corta (Ciechanover et al, 1984; Finley et al, 1984). Noobstante, a temperatura no permisiva, se sintetizan proteinas de respuesta a estrés térmico (hsp) y una de las características de la respuesta al estres termico es la reducción de proteólisis (Munro y Pelham, 1984; Carlson et al, 1987). El agregado de hemina a un lisado de reticulocitos inhi­ be la proteolisis, pero no la conjugación de ubicuitina (Haas y Rose, 1981). Esta inhibición también se extiende a células no eritroides, comoen plantas (Avena sativa) y levadura (Saccharo­ myces cerevisiae)(Vierstra y Sullivan, 1938). La generación de conjugados Ub-lisozima en lisados inhibidos por hemina al agre­ garse a lisados frescos no inhibidos, son degradados 10 veces más rápido que la lisozima libre (Hough_yRechsteiner, 1986). El pe­ queño tamaño y su carga positiva hacen que la lisozima sea fácil­ mente separable de sus Ub-conjugados. En 1953, Simpson demostró que la ruptura de proteinas en cortes de higado de rata requería ATP(Simpson, 1953). Más tarde, en 1930, Ciechanover et al demostraron que la activación de ubi­ cuitina consumía ATP,lo que parecia explicar el requerimiento energético para la proteolisis intracelular. Sin embargo, en 1934, Hough y Rechsteiner, y Hershko et al, demostraron que la degradación de los conjugados Ub-lisozima también requerían nu­ cleósidoe trifoefatos. En 1986, Hough et al, usando estos conjugados como sus­ trato, identificaron una proteasa dependiente de ubicuitina/ATP que por centrifugación en gradientes de glicerol sedimentaba con un coeficiente aparente de 26 S. Las propiedades de esta protesa eran similares a las observadas en el lisado completo y se sospe­ chaba que catalizaba 1a hidrólisis de la segunda molécula de ATP en la reacción dependiente de ubicuitina.(Ver Fig. 5 y 6).

Proteasa —24 Introducción

Efi S pe'ptidos

fr?”4-4-5 —G (150K 3-3QQ u! (¿Z? (9 w .> a?» "¡TZ-Run ® N")

0 A ""éáííïz Fig.5.MIF'_;¡¿¿&9 ESrepresenta un sustrato proteolizable y I? la protea­ sa dependiente de ubicuitina y de ATP. Extraido de Reche­ teiner, 1937b.

Varias proteaseas citosólicas de alto peso molecular han sido aisladas de levaduras (Achstetter et al, 19843, 1984b); Wolf, 1985), músculo esquelético (Hase et al, 1980); Dahlmann et al, 1983, 1985a, 1985b; Edmundsy Pennington, 1985; Hardy et al, 1931; Ismail y Gevers, 1983; Ishiura et al, 1985), recitulocitos de mamíferos (Waxmanet al, 1987; Etlinger et al, 1985; Ishiura y Sugita, 1986; Hough et al, 1986, 1987), eritrocitos (Murakami y Etlinger, 1986; Edmunds y Pennington, 1982; McGuire y DeMartino, 1986), hipófisis (Wilk y Orlowski, 1983, 1980; Wilk et al, 1979), cristalino (Blow et al, 1975; Ray y Harris, 1985, 1986), hígado (DeMartino y Goldberg, 1979; Rose et al, 1979; Sherman et al, 1983; Rivett, 1985a, 1985b; Tanaka et al, 1986a, 1986b); Yamamoto et al, 1986; Ishiura et al, 19363), placenta (Nojima et al, 1986; Ishiura et al, 1986b), corazón (DeMartino, 1983), pulmón (Zolfa­ ghari et al, 1937) y útero (Gregory y Notides, 1932). Los valores para el peso molecular conocido de estas enzimas se encuentran entre 400 a 1500 kD.

Proteasa - 25 Introducción

UZÑ\

pepüd05(+u?) 1u'l ¡“'z

Ex ATP ATP ErSH isopepüdasa

. - -AMP"U UrMProteina UnProteina. E _SH

E3 E1’S‘U

E2—s-u [múltiples especies de E2

Fig. 5. Qifllg del fiifiifima I 'PI' . uu-Z: precursor poliproteico fusionado a un aminoácido extra (Z); u: monómerode ubicuitina maduro; z: enlace de alta energía; subindice n = 0,1,2...: múltiples unidades de ubicuitina unidas al aceptor a través de enlaces amida. Extraido de Finley y Varshavsky, 1935.

Proteasa —26 Introducción

Waxmanet al (1987) y Fagan et al (1987) también demos­ traron la existencia de proteasas de 26 S y 20 S en higado y mús­ culo de conejo, respectivamente. ’ En 1983, McGuirre et al, trabajando con extractos libres de células de fibroblastos de riñón de hamster (BHK) demostraron la presencia de dos caminos degradativos de proteinas exógenas, uno de ellos dependiente de ubicuitina. Fraccionando el extracto por una columna de DEAE-celulosa, la fraccion que se retenia en la columna y que se eluia con alta sal, era estimulada por ATP. Si se reconstituia esta fracción con lo que no se unía, o bien con ubicuitina purificada, se estimulaba la proteolisis depen­ diente de ATPde la caseina que se usaba comosustrato. Esta mis­ ma fracción se purificó por filtración por geles en Sephacryl 5300 y se obtuvo una actividad proteásica que eluía con un peso molecular aparente de 750 kD que se estimulaba por ATP-Mg, pero no por ubicuitina. Usandoanticuerpos policlonales que reconocen manrggajna purificada de eritrocitos humanos (McGuirey DeMartino, 1986), se demostró que una enzima relacionada con macrgpaina participa en ambos caminos proteoliticos en extractos celulares de BHK. Bajo determinadas condiciones (Edmunds y Pennington, 1935), el complejo 20 S es estimulado por ATPaunque gran canti­ dad de evidencias sugieren lo contrario (Hough et al, 1987; Wax­ man et al, 1987; Wolf, 1985; Ishiura y Sugita, 1986; McGuire y DeMartino, 1986; Dahlmann et al, 1983; Hardy et al, 1981; Rivett, 1935b), lo que lleva a suponer la existencia de un complejo múl­ tiple de alto peso molecular, de tamañoy caracteristicas simila­ res a las presentes en células eucariotes o bien múltiples formas de un mismonúcleo proteolitico complejo. Las subunidades que componenla proteasa 26 S de reticu­ locitos están entre 34 a 110 kD según análisis por SBS-PAGE (Hough et al, 1937). Suponiendo la existencia de una sola copia de las subunidades de 100 y 110 kD en cada holoensima de 26 S, el peso molecular aparente calculado seria de 1 MD,que concuerda bien con lo estimado por filtración por geles, sedimentación y electroforesis en geles nativos. A diferencia de otras proteasas de alto peso molecular que sólo son estables a la inactivación termica por la presencia de nucleótidos, la proteasa de 26 S, dependiente de ATP, requiere nucleótidos hidrolizables para la degradación de conjugados Ub­ lisozima (Hershko et al, 1934; Hough et al, 1986).

Proteasa - 27 Introducción

Las propiedades como proteaeas de las enzimas 20 S y 26 S son también similares ya que ambashidrolizan caseina, pero no degradan lisozima o BSA. Sin embargo, 1a diferencia se encuentra en la proteoli­ sis dependiente de ATPde conjugados Ub-lisozima y en la estimu­ lacion por nucleotidos de la hidrólisis de péptidos (Houghet al, 1987). La enzima 26 S degrada preferencialmente conjugados, a diferencia de la enzima 20 S. Tambiénexisten diferencias en los inhibidores y activadores. La sensibilidad al PMSFde la enzima de 26 S es mayor, lo que sugiere la existencia de un sitio serina activo. En 1987, Hough et al aislaron un complejo proteico con menorcoeficiente de sedimentación que, por sus caracteristicas, parecia ser una variante de la proteasa de 26 S. El modelo pro­ puesto por los autores (ver Fig.7) sugiere que la enzima 26 S contendria subunidades que también estarian presentes en la enzi­ ma 20 S (subunidades de 21 y 32 kD).

i".

Fig. 7. Modelq estruptqral de ¡55 prntpafiafi de 2Q fi X de 25 di

de ExtraidodeHoughetal,19mzn7.

Proteasa - 28 Introducción

No fue demostrado que este complejo de menor coeficiente de sedimentación corte limitadamente conjugados Ub-lisozima. Los trabajos recientes del grupo de Hershko et al apor­ tan indicios sobre un nuevo lugar de acción de la enzima depen­ diente de ATP. En extractos de reticulocitos con reducido nivel de ATP, la proteasa de alto peso molecular no se encuentra pre­ sente. En su lugar, se aislaron 3 factores diferentes que son ne­ cesarios para la hidrólisis de los conjugados (Ganoth et al, 1988). Estos 3 factores (designados CF1-2—3)se eombinarian pa­ ra formar el complejo multienzimatico en un proceso que requeri­ ría ATP-Mg.La formación de.1 este complejo proteasico esta acompa­ ñada de un marcado aumento de la actividad degradativa de los complejos con ubicuitina; lo que indicaria que la forma multien­ zimatica seria la forma activa del sistema. Tambiéneste grupo hace notar la necesidad de la presen­ cia de ATPen forma continuada, aún después de la formación del complejo, lo que sugeriria que probablemente el ATPseria necesa­ rio en la hidrólisis de la union peptidica. Unasituacion análoga ocurre con los "spliceosomas“ involucrados en la maduración de mARNdeeucariotes, donde el ATPes requerido tanto para el arma­ do del "spliceosoma" como para_la reaccion de empalme propiamente dicha (Cheng y Abelson, 1987; Konarska y Sharp, 1987; Reed et al, 1988). Si tomamosen cuenta que la proteolisis per se es un proceso exergónico, la energia en este proceso seria requerida para selectividad o control de la reacción. Se calculó que se consume aproximadamente una molécula de ATPpor cada enlace pep­ tidico hidrolizado en el sistema de reticulocitos dependiente de ubicuitina (Bapoport et al, 1985). La nomenclatura de magrgpaina para la proteasa de 20 S y megapaina, fue propuesta por McGuireet al en 1936, para descri­ bir proteasas de alto peso molecular que contienen grupos sulfhi­ drilos. La macrgnaina se ha encontrado asociada a procesamiento de neuropeptidos en hipófisis (Wilk y Orlowski, 1933), recambio de proteinas del cristalino (Rayy Harris, 1985), degradación proteica no lisosomal en músculo esquelético (Dahlmann, 1935), degradación de glutamina sintetasa oxidada en higado (Rivett, 1985a, 1985b) y en el procesamiento de receptores esteroideos (Sherman et al, 1933; Rivett, 1935a).

Proteasa - 29 Introducción

Existen evidencias que demuestran la degradación prefe­ rencial de proteinas oxidadas (Rivett, 1985a, 1985b) por la ma­ crgpaina y que la megapaina es claramente estimulable por ATP (Hough et al, 1987). Tanto las enzimas 20 5 y 26 S son probada­ mente proteasas de serina (Bálów et al, 1986). Las propiedades de la proteasa magxgpainason similares a las atribuidas a las particulas citoplasmáticas denominadas "prosomas" por Schmid et al (1984). Esta ribonucleoproteina de coeficiente de sedimentación 19 S está compuesta por al menos 10 proteinas que se caracterizan por su gran estabilidad a concen­ tración de alta sal, urea y Sarkosyl (Shelton et al, 1970;Kleins­ chmidt et al, 1933}, comoasi tambien a su alta conservación evo­ lutiva (Martins de Sa et al, 1988). Los "Engmgsgmas”inhiben la sintesis proteica (Schmidet al, 1984) y estan implicados en el procesamiento de tARN(Castaño et al, 1986). Todas las evidencias apuntan a considerar a las magrggainas comomiembrode la clase de particulas que procesan o degradan ácidos nucleicos y protei­ nas. Existen evidencias de que las calgainas están involucra­ das en la degradación de proteinas del citoesqueleto (Vorgias y Traub, 1936), y que las megapainas en la degradación de proteinas anormales sintetizadas de novo (Ciechanover et al, 1984). Se conocen otras proteasas estimulables por ATPdiferen­ tes a la de eritrocitos. Watanabe y Kimura (1985a, 1985b), iden­ tificarrn una proteasa estimulable por ATPen mitocondria de cor­ teza adrenal bovina usando metilcaseína comosustrato. Por fil­ tra cion por geles se estimó que el peso molecular aparente era de 650 1Dy, por analisis por PAGE-SBS,que contenía una subunidad de 103 kD, lo que hacia probable que fuese un hexámero. Desde es­ te punto de vista, se asemeja a la proteina La de Eboherichia co­ li, que es un tetrámero de subunidades de 100 kD (Charette et al, 1981; Chung y Goldberg, 1981). Además, la homología se extiende a la inhibición por vanadato, el Kmde aproximadamente de 5 un para ATPy a la estimulación de la actividad ATPasapor péptidos pe­ quenos.

Proteasa —30 Introducción

3.1.6. PROTEASAS DEPENDIENTES DE ATP EN BACTERIAS

La degradación proteica especif ica tiene funciones regu­ latorias esenciales en EBCherichia coli , particularmente como respuesta a situaciones desfavorables od e estrés. Estas protea­ sas especificas también contribuyen a la economiacelular, degra­ dando proteinas anormales o dañadas, y reconociendo secuencias presentes en el interior de muchasproteinas que se exponen cuan­ do su plegamiento no es apropiado. La degradación proteica esta acoplada al estado metabó­ lico de la célula, ya que la activación de las proteasas es de­ pendiente de ATPo de otros metabolitos de alta energia. La inhi­ bición del metabolismo energético conduce a una drástica reduc­ ción en la degradación proteica. La bacteria EScherichja coli contiene dos sistemas pro­ ticos dependientes de ATP: i) el de la proteina La, ii) la multicomponentes. La proteasaLa es el producto del gen Jon, y cataliza los primeros pasos dela degradación de proteinas de conformación anormal, y algunos péptidos normales. Se trata de un tetrámero que une 4 moléculas de ATP y sólo hidroliza 2 por cada enlace peptidico hidrolizado. Sólo proteinas desnaturalizadas activan su capacidad proteolítica, mecanismo que asegura su inactividad in vivo hasta que se combinecon el sustrato. Esos sustratos protei cos inducen la unión de ATPy la liberación de ADPya unido a la enzima. Un potente inhibidor de la ensima es precisamente el ADP (Ver Fig. A pesar de que esta enzima hidroliza péptidos fluorogé­ nicos en presencia de análogos no hidrolizables de ATP, la hidró­ lisis de ATPes necesaria para la degradación proteica (Goldberg y Waxman, 1985). La secuencia completa del gen Jon muestra que la protea­ sa La contiene secuencias asociadas con la unión de ATPcomo las encontradas en otras proteinas que lo unen, pero no existe homo­ logia con otras proteasas conocidas. Goff y Goldberg (1985) mostraron que La pertenece a una proteina de respuesta a estrés térmico (hsp), conteniendo en la región 5' del gen una secuencia caracteristica de los genes HSP que codifican para estas proteinas,

Proteasas bac. —31 ‘PROTEASÓ sustrato l 3:23:50: 'W'L‘A ÁADP

¿pi 2 ¿ATP-Mg

HIDR¿Mi u SS ALOSTERICA ACHVAÜONPO R SUSTRATO W SUSTRATOS [LATP-Mgz*l

Fig. er'rlñ afffiivfifijñn1 inagggivacjén la QEQ‘hF-¡afiaLa

La proteína La no sólo se induce a alta temperatura, si­ no también en condiciones en que se generen proteinas aberrantes como durante el tratamiento con puromicina o con análogos de a.a., etc.). Por ello, quizás esté involucrada en la reducción de proteinas celulares dañadas. Los estudios genéticos muestran que proteinas inesta­ bles, comoLexA, SulA, CII, entre otras, son blancos especificos de la proteasa La (Misuzawa y Gottesman, 1982; Gottesman et al, 1931; Huremany D'Ari, 1931; Torres-Cabassa y Gottesman, 1987). Las mutantes Jon- son viables, lo que implica que su rol fisiológico es importante pero no esencial. La via de multicomponentes fue descripta por Maurizi (1987), usando caeeína con sustrato en una reacción dependiente de ATP (Katayama-Fujimura et al, 1987). Este sistema involucra

Proteasas bac. - 32 Introducción dos componentes, ambos esenciales para la degradación. Uno de ellos de 80 kD de peso molecular es una ATPasa lábil que se esta­ biliza por el nucleótido; el otro de 20 kDes un polipéptido ter­ moestable. La actividad ATPásicase induce por sustratos proteicos en la enzima reconstituida con los dos componentes. Este sistema no es afectado por una variedad de inhibidores de serin proteasas como PMSF,inhibidor de tripsina de soja, de páncreas o de clara de huevo. No obstante, las proteasas dependientes de ATPconocidas hasta el momento, Lon, RecA, Clp, no dan cuenta de toda la degra­ dación proteica energéticamente dependiente en EBCherichia coli.

Proteasas bac. - 33 Introducción

3.1.7. PAPEL DE LA CONFORMACIONDE LA UBICUITINA EN LA ESPECI­

FICIDAD DE LA DEGRADACION

Unode los destinos de los conjugados citoplasmáticos Ub-proteína es la digestión completa de la proteína blanco y la regeneración de ubicuitina. Esta via de degradación es bien cono­ ida como responsable de la eliminación de proteinas anormales o esnaturalizadas, dañadas, oxidadas o de membrana. Lo común en sta situación es la presencia de regiones hidrofóbicas expues­

«mas: as. Por otro lado, sólo pocas proteinas son degradadas por este sistema (Wilkinson, 1987b). Resulta entonces que la enzima que remueveubicuitina y las proteasas, deben actuar sobre dife­ rentes conjugadosh Trabajando con anticuerpos poli y monoclonales que reco­ nocen ubicuitina, se vio que la conformación de ubicuitina varía en diferentes conjugados (Siegelman et al, 1986) y que la hidro­ fobicidad puede causar un cambio conformacional (Wilkinson y Ma­ yer, 1986). Este cambio conformacional influye sobre la capacidad de ubicuitina para actuar comoseñal para las proteasas (Cox et al, 1986). Cox et al, trabajando con derivados mono,di, tri, y te­ traiodinados de ubicuitina, encontraron que los cambios inducidos en los tri y tetra derivados aumentabanla actividad de ubicuiti­ na en la degradación proteica. Estos cambios conformacionales no afectarian la activación ni serian importantes para el reconoci­ miento por E1, comoasí también tendrian poco efecto en la conju­ gaCion. El paso limitante en la proteolisis dependiente de ubi­ cuitina no es la conjugación sino la degradación. Unade las hi­ pótesis que podria explicar la inhibición de la degradación pro­ teica observada a altas concentraciones de derivados iodinados pero no con ubicuitina nativa, es la que postula que las protea­ sas del sistema tendrían sitios especificos de unión para Ub-con­ jugados. La unión a derivados iodinados seria de mayor afinidad que con ubicuitina libre y sólo con derivados tetraiodinados au­ menta el nivel de conjugados con inhibición de proteolisis (Cox et al, 1986).

Conformación —34 Introducción

Los derivados tri y tetra iodinados aumentan la movili­ dad proteíca, ofreciendo conformacíones alternativas que pueden unirse al sistema proteolítico. La desnaturalización proteica estaría relacionada con el grado de hidrofobicidad que se expone, producto de la interacción proteína-proteína, comoocurre en los conjugados. Varias evidencias sugieren que las enzimas que remueven la ubicuitina reconocen una conformación de la misma igual a la que adopta en HzO. Si la ubicuitina se conjuga a una proteína desnaturali­ ada, la parte hidrofóbica que expone serviría para disparar el 0b)ambio conformacíonal. Este cambio es análogo al que se vio por el agregado de alcohol. La conformación alterada sería la recono­ cida por las proteasas del sistema. En este modelo, el consumo de ATPpermitiría acercar la ubicuítina a las proteínas celulares blanco. La interacción Ub-proteína tendría asociado un mecanismo de "corrección de lectura” (proofreading), análogo al utilizado por las aminoacil tARNsintetasas. Empleandoprotocolos de purificación de ubicuitina, evi­ tando la desnaturalízacíón por calor, se descubrió que la ubicuí­ tina poseía una actividad proteolítíca intrínseca activada por un factor termolabíl de 10 kD (Fried et al, 1987). La capacidad pro­ teolítica se logró reconstítuír in vitro por el agregadode este factor a ubicuitína purificada de eritrocitos humanoscalentada o no, utilizando comosustrato B-galactosidasa. Estos autores proponen un modelo de "proteasa-ad hoc", donde la ubicuítina serviría comodominio catalítíco que, por su conjugación a la proteína blanco, convertiría el conjugado en una "nueva" proteasa (acción en cía), o bien actuaria en trans sobre otros conjugados. Además,sugieren que la ubicuitina sólo seria activa comomultimero y que estas especies se estabilizarían por Ca2+.

Conformación - 35 Introducción

3.1.8. PAPEL DE tARN EN LA DEGRADACION DE SÚSTRATOS

A pesar de los grandes progresos en la elucidación del modode acción y el papel de ubicuitina en los distintos caminos metabólicos, resta todavia por conocer la determinación de la es­ pecificidad de unión a ciertas proteinas que van a ser degrada­ das. Hace poco se conoció la importancia de un grupo a-NHz libre para que el sustrato sea reconocido por el sistema de con­ jugación de ubicuitina. Para ciertos sustratos proteolizables, la presencia de tARNera necesaria para la conjugación con ubicuitina, demostrado por la inhibición especfica por ribonucleasas y no por DNasaI de la conjugación de ubicuitina a BSA(Ciechanover et a], 1985). El agregado de tARNHí3 a células NIH/3T3 (ratón) podia restaurar la actividad proteolitica de un sistema de reticuloci­ tos de conejo previamente tratado con BNasa. Los estudios posteriores demostraron que el requerimien­ to de tARNpara la proteolisis ubicuitina-dependiente de BSA, no era necesario para la lisozima (Ciechanover et al, 1985; Ferber y Ciechanover, 1986). Tampocola formacion de conjugados entre ubicuitina y la mayoria de las proteínas endógenas aceptoras era inhibido por tratamiento con la ribonucleasa. Sin embargo, algunos conjugados endógenos Ub-proteina desaparecian después del tratamiento (Fer­ ber y Ciechanover, 1986). Probablemente el tARN participaria en una modificación covalente especifica en sustratos proteolizables, lo que haria más susceptibles su degradación por el sistema proteolitico que depende de ubicuitina. Resulta interesante hacer notar que los tres sustratos sensibles a la degradación contienen un residuo ácido en el N-terminal (Ikenaka, et al, 1963; Shearer, et al, 1967; Brew, et al, 1970). Otras proteinas con residuos ácidos en el N-terminal, como la cadena liviana k de las inmunoglobulinas humanas (proteina de Bence-Jones)(Kabat et al, 1963) y la tiro­ grobulina (Soffer, 1973), son degradadas por el camino que invo­ lucra ubicuitina y, además un tARN.En el caso de a-lactoalbúmina humana, que es homóloga en un 75%con la bovina, pero tiene un

tARN — 36 Introducción residuo N-terminal lisina, su degradación no es dependiente de tARN(Ferber y Ciechanover, 1937). Las modificaciones postraduccionales de proteínas por agregados de aminoácidos son bien conocidas en diversos organis­ mos, aunque su rol fisiológico no es claro. En bacterias, Kaji et al y posteriormente, Leibovitz y Soffer, caracterizaton una enzima soluble que catalizaba la transferencia de leucina (L) y fenilalanina (F) a proteina con residuos N-terminales básicos via tARN(Kaji et al, 1966; Leibo­ vitz y Soffer, 1989,1971; Soffer, 1973; Deutch y Soffer, 1975; Soffer y Savage, 1974). En eucariotes, se encontró una enzima que transfiere un residuo arginina a proteínas de membranasy cromo­ sómicas con residuos ácidos en el H-terminal (Soffer, 1973, 1980; Kaji, 1963, 1976; Kaji y Rao, 1976;). Ciechanoveret al purificaron y caracterizaron la argi­ nil tARN-proteína transferasa de reticulocitos de conejo. Es un complejo de alto peso molecular (360 kD) entre la arginil tARN sintetasa y la arginil tARN-proteinatransferasa que, además de E1, E2 y E3, es necesario para conjugar ubicuitina a sustratos con extremos N-terminales ácidos (Ciechanover et al, 1938). Es posible que el agregado de un residuo basico al extremo N-termi­ nal acido del sustrato fuera necesario para el reconocimiento y la union del sustrato al Ub-Es. Probablemente, el sitio en E3 al que se une el sustrato proteico este cargado negativamente y solo aquellas proteínas con N-terminal (cargado positivamente o neu­ tro), formarian complejo con E3. Comono se ha identificado ubicuitina en procariotes, seria imposible relacionar el agregado postraduccional de aminoá­ cidos con algun sistema proteolitico conocido en bacterias. El agregado postraduccional de aminoácidos a proteínas in Vivo aumenta bajo condiciones de estrés, como en el caso de daño físico a axones de células nerviosas (Shyne-Athwal et al, 1986). A pesar de que no se conoce la relevancia de esta modi­ ficación con la proteolisis por el sistema ubicuitina, cabe des­ tacar que el sistema de ubicuitina sufre también una activación bajo condiciones de estres (Bondy Schlesinger, 1985; Finley et al, 1984; Ciechanover et al, 1934).

tARN - 37 Introducción

3.1-9. LA REGLA DEL N-TERMINAL

Bachmair et al (1980) observaron que la vida media de una proteina in Vivo es función de su aminoácido N-terminal. Uti­ lizando B-galactosidasa modificada por mutagénesis dirigida en su N-terminal (Messing y Vieira, 1932; Smith, 1985) estos autores demostraron que la vida media de estas especies variaba en un rango de 2 min a más de 30 hs. Esto dio lugar a la postulación de la "regla del N-terminal", que señalaba que las proteinas con vi­ da media larga contendrian aminoácidos N-terminal "estabilizan­ tes', y los de vida mediacorta, residuos "desestabilizantes". Los del primer grupo, que contribuyen a alargar la vida media son: metionina (M), serina (S), alanina (A), treonina (T), valina (V), glicina (G), y cisteína (C); los del segundo grupo son: arginina (R), lisina (K), triptofano (W), leucina (L), fe­ nilalanina (F), tirosina (T), e histidina (H). Tambiénpor mutagénesis dirigida demostraron que la in­ serción de un codón que codifica para un aminoácido del grupo de los "estabilizantes" antes del primer codón_de B-galactosidasa recombinante, resultaba en una proteina de vida media larga (Baehmair et al, 1938). Según esta regla, los aminoácidos "deses­ tabilizantes” podrian ser tanto hidrofobicos, hidrofilicos carga­ dos o no, pero todos ellos comparten la propiedad de tener mayor radio de giro (Levitt, 1978) respecto de los pertenecientes al grupo de los "estabilizantes", a excepción de metionina. En proteinas no compartimentalizadas, tanto de eucario­ tes comode procariotes, los residuos aminoacidicos N-terminal en proteinas de vida media larga (Ti/251 h), pertenecen casi exclu­ sivamente a la clase de los "estabilizantes" según la "regla del N-terminal". Una de las proteinas de vida media corta de la que se conoce el N-terminal maduro, es la proteina cII (T1/2<3 min)(Ho et al, 1986; Banuett et al, 1986; Hoyt et al, 1982), con el resi­ duo arginina “desestabilizante” según la regla, Muchasmutaciones caracterizadas de la proteina CII que aumentan in vivo su vida media resultaron tener cambiado el N-terminal por un aminoácido del grupo de los “estabilizantes” (ejemplo, can-1; Jones y Hers­ kowitz, 1978),

Regla del N-terminal - 38 Introducción

Bachmair et al extendieron el estudio de los residuos N­ terminales a casi 300 secuencias aminoacidicas de proteinas in­ tracelulares no compartimentalizadas de vida media larga, para las que se cumple la "regla del N-terminal”. Resulta particularmente llamativo de este estudio, el sesgo hacia aminoácidos "desestabilizantes" para los residuos N­ terminales de proteinas compartimentalizadas y de secreción. En­ tre las excepciones se encuentra la RNasaA con un residuo lisina pero, no obstante, es una proteina de vida media larga, aún cuan­ do se la inyecta en oocitos de XEnopus (Lane et al, 1979). La traducción del código genét ico es sólo un paso en la secuencia de eventos que determinan el estado estacionario de ca­ da población de proteinas maduras que se encuentra en las célu­ las. Muchasde las proteinas están sujetas a modificaciones pos­ y co-traduccionales (Hold, F., 1981). Las alteraciones estructu­ rales que resultan de estas modificaciones, inducen o controlan la actividad biológica, dirigen la translocación de la proteina intra y/o extracelularmente, y afectan la estabilidad y el recam­ bio. La primera oportunidad para la modificación de un poli­ péptido se presenta cuando la cadena naciente tiene apenas 20-40 aminoácidos (Palmiter et al, 1978; Jackson y Hunter, 1970). Dos enzimas pueden actuar individualmente o en forma concertada, re­ moviendo el residuo de metionina, o bien agregando un grupo Nu­ acetilo. Se conocen con el nombre de metionina aminopeptidasa (MAP)y Nü-acetiltransferasa (NAT), respectivamente. También fue­ ron identificadas acilasas y acilamino hidrolasas, comootro gru­ po de enzimas capaces de modificar un N-terminal en eucariotes, ya sea co- o pos-traduccionalmente. ‘ Estas y otras acilasas, también pueden modificar grupos e-NHz de lisinas (Allfrey, 1977). Tanto NATcomo MAPse encuen­ tran asociadas no covalentemente a ribosomas (Driessen et al, 1985; Kerwar et al, 1971; Glener, 1971), y su distribución es ubicua en células eucarióticas con un alto grado de conservación en la especificidad de sustrato (Person et al, 1985; Sherman et al, 1935). Dos enzimas MAP han sido aisladas y clonadas de proca­ riotes (Tsunasawa et al, 1985; Sherman et al, 1985; Boissel et al, 1985; Ben-Bassat et al, 1987; Kasper et al, 1987; Miller et al, 1987; Ben-Bassat y Bauer, 1987; Burstein y Sehechter, 1978).

Regla del N-terminal - 39 Introducción

Unestudio más sistemático del efecto del penúltimo re­ siduo aminoacidico sobre la selectividad catalitica de estas en-_ zimas, fue llevado a cabo en levadura, usando construcciones ge­ néticas por mutagénesis dirigida (Huanget al, 1987), que se re­ sume en la Fig. 9. La coincidencia de las especificidades cataliticas de las enzimas MAPy NAT con los aminoácidos "desestabilizantes", sugiere que la modificación co-traduccional del N-terminal de los polipeptidos nacientes y su posterior recambio, son eventos liga­ dos (Arfin y Bradshaw, 1988). La enzima MAPpodría estar involu­ crada en el procesamiento de proteinas de vida media relativamen­ te larga para evitar la exposición en el N-terminal de aminoáci­ dos que desestabilizan al sustrato proteico. Otra posibilidad podria involucrar proteasas que reco­ nozcan un sitio especifico en la proteina blanco que dejara en el N-terminal un residuo del grupo de los "desestabilizantes" (Var­ shavsky et al, 1988). Comoejemplo de una proteina no comparti­ mentalisada que, por procesamiento deja expuesto un aminoácido “desestabilizante” en su N-terminal, se tiene la proteína CII del fago X (Ho et al, 1938). ' Estas proteasas podrian también reconocer un motivo de la secuencia aminoacidica o una conformación especifica de la proteina blanco dañada. Este nuevo modelo de la "regla del N-ter­ minal" se podria extender a muchasde las proteínas metabólica­ mente inestables, dañadas, terminadas prematuramente, plegadas inapropiadamente, y las no bien compartimentalizadas, como así también proteínas normales de vida media corta. Según la propuesta de Bachmair et al (1986), el residuo maduro N-terminal seria reconocido y el complejo Ub-ligasa-prote­ ína se armaria in situ, seguido de la unión de ubicuitina en for­ ma procesiva sobre la proteína blanco que llevaría luego a su de­ gradación. Algunas propiedades encontradas en la proteína E3 de ma­ míferos, son consistentes con que esta enzimaparticipe en el re­ conocimiento enzimático del extremo N-terminal (Varshavsky et al, 1983; Hershko y Ciechanover, 1986; Bachmair et al, 1986; Hershko et al, 1936). La ausencia de aspártico (D) y glutámico (E) en el N­ terminal de proteínas intracelulares, puede explicarse por las especificidades de las enzimas MAPy NAT(ver Fig.9), que reten­ dria la metionina acetilada. Sin embargo, su eliminación por una acilamino hidrolasa dejaría un sustrato apropiado para la arginil

Regla del N-terminal —40 Introducción

I _1 lAc-M-X__— l ¡PI-X Acidoaspártico Isoleucina Acido glutámico Leucina Asparagina Metionina . 1 Fenilalanina l Ac-X ——————... l TirosinaLisina Glicina Histidina Alanina Arginina Serina Glutamina Treonina Triptofano

Prolina Valina Cisteina

Fig. 9. Categorias de proteínas eucarióticas producidas por modi­ ficación co-transducoional comofunción del penúltimo aminoácido(X). Extraido de Huang et al (1987).

tARN-proteina transferasa. Este modelo se comprobó in Vivo, tra­ bajando con B-galactosidasa mutada (Bachmair et al, 1986), donde la mayoria de Asp-B-galactosidasa y Gln-B-galactosidasa contenían un aminoácido extra, en general arginina, por adición postraduc­ cional. Sorprendentemente, algunos de los aminoácidos que resul­ taban ser "estabilizantes" en levadura, son significativamente "desestabilizantes" en el sistema de reticulocitos (Gonday Var­ shavsky, resultados no publicados). Con la excepción de la isoleucina (I), que es un residuo "estabilizante" en reticulocitos, los aminoácidos "desestabili­ zantes" en levadura se conservan en el sistema reticulocitos. De los 8 aminoácidos del grupo de los “estabilizantes” en levadura sólo metionina (M), valina (V), glicina (G) y prolina (P) lo son en reticulocitos, mientras que cisteina (C) se transforma en un residuo “desestabilizante” en reticulocitos.

Regla del N-terainal - 41 Introducción

Los residuos serina (S), alanina (A) y treonina (T) que pertenecen al grupo de "estabilizantes" en levadura no se mantie­ nen en el sistema reticulocitos y frecuentemente se encuentran en el N-terminal de proteínas de vida media larga que no estan com­ partimentalizadas. La diferenciación en reticulocitos está acompañada de una degradación selectiva de proteínas preexistantes; lo que lle­ va a pensar en la posibilidad de que la "regla del N-terminal" dependa del estado fisiológico de la célula (Gondaet al, 1989). Otros factores, además del reconocimiento del aminoácido N-terminal, probablemente se combinen para determinar la vida me­ dia in vivo de una proteina. Entre estos factores, se encuentran la accesibilidad y la movilidad del segmento N-terminal y las mo­ dificaciones (como acetilación) del residuo aminoterminal. Te­ niendo en cuenta que las regiones N-terminal de proteinas con mu­ chas subunidades están involucradas en las interfases entre sub­ unidades (Thornton y Sibanda, 1933), la estructura cuaternaria es otro parámetro que probablemente module la vida media in vivo. Bachmairet al (1986), utilizando fusiones de ubicuitina con dihidrofolato reducta a murina (DHFR),proteina monomérica de 220 kD cuya estructura se conoce perfectamente (Volz et al, 1982;

Stubiquitiner et al, 1984)) estudiaron el efecto del procesamien­ to in vivo en levadura. Después de la eliminación de ubicuitina de la proteina de fusión naciente, las diferentes DHFRconstrui­ das diferían en sus residuos N-terminal, comoen el caso de UB-B­ galactosidasa (Bachmair et al, 1936). Comose esperaba, las especies de DHFRque contenían re­ siduos “estabilizantes”) de acuerdo con la “regla del N-termi­ nal”, tenían vida med"ia larga. No ot ¡s tante , la presencia de un residuo desestabilizante" no producía una desestabilización in vivo. Conel objeto de dilucidar la aparente contradicción an­ terior, se agregó una región de 36 aminoácidos del N-terminal de la B-galactosidasa construida delante del N-terminal de la DHFR original. La DHFRoriginal contenía sólo 7 aminoácidos extras por construcción. Las proteínas DHFRque ahora llevaban un residuo aminoacidico "desestabilizante" seguido de esta extensión, tenían in Vivo una vida media tan corta como la B-galactosidasa corres­ pondiente. La presencia de un residuo "estabilizante" con esta extensión, conferia un aumento de la vida media comoera de espe­ rar. Estos resultados descartan un efecto de reducción de vida media por la extensión agregada y9 además, demuestran que la pre­ sencia de un aminoácido "desestabi lizante" es necesario pero no suficiente, para una eficiente desestabilización in Vivo.

Regla del N-terminal —42 Introducción

En los experimentos con B-galactosidasa (Bachmair et al, 1936), la lisina mas cerca del N-terminal está a una distancia de 15 residuos, a diferencia de lo que ocurre con la DHFRoriginal, que se encuentra a 25 del extremo. Los grupos E-NHZde la lisina, son los grupos funcionales conocidos involucrados en la formacion de la union amida, pos-traduccionalmente, con ubicuitina (Finley y Varshavsky, 1985; Hershko, 1983; Hershko y Ciechanover, 1986). La presencia de un residuo lisina interno, a una distancia apro­ piada del N-terminal, sería necesaria para iniciar la unión de ubicuitina a la proteína blanco (Bachmair y Varshavsky, 1989). Unaalternativa de la influencia de la extensión adicio­ nada anteriormente, no excluyente de la hipótesis de proximidad de un residuo lisina, involucraria ademásde la necesidad de un aminoácido"desestabilizante", suficiente accesibilidad y movili­ dad de la porción de la proteína blanco en la región del N-termi­ nal (ver Fig. 10). El requerimiento de la "movilidad" podria explicar la relativa alta estabilidad metabólica de, tanto la DHFRoriginal y otras proteinas naturales con aminoácidos "desestabilizantes", como la RNasa A, en los _ue sus regiones aminoterminales se en­ cuentran altamente ordenacas (Vols et al, 1932; Stubiquitiner et al, 1984). en la Fig. 10, exist complejo que reconoce reversiblemente el t-terminal, y s aminoácido 'desestabilizante” que se expone en el extremo N-ter­ minal de la proteina madura. Un segundo paso involucraria la captura de una lisina interna en el blanco. La distancia lineal de este residuo seria, comose vio anteriormente, critica. Aúnpara una proteina con un residuo lisina que pueda espacialmente estar próximo a su N-ter­ minal, la ausencia de movilidad conformacional en la región pró­ xima al extremo, no permitiría la unión de ambos residuos. Cuandolos dos residuos lisinas presentes en la exten­ sion agregada a la proteína de ensayo DHFR,fueron cambiados por argininas por mutagénesis dirigida, se eliminaba la influencia de la extensión, aunque el reemplazo de solo uno de ellos no tenia mayor influencia (Bachmair y Varshavsky, 1989), lo que está de acuerdo con este modelo anterior.

Regla del N-terninal —43 Introducción

Unaposibilidad adicional, que no se excluye mutuamente con la anterior, es que exista un motivo de la secuencia de la extensión que, a1 ser ubicado a una distancia apropiada del N­ terminal conteniendo un aminoácido “desestabilizante”, permita un reconocimiento especifico como blanco. Sin embargo el agregado de un tracto de poliglicinas (12 residuos) conteniendo una lisina mimetiza el efecto de la extensión de DHFR(Bachmair y Varshavs­ ky, 1989).

Conjugación procesiva de ubicuitina de la proteína blanco

1 Degradación de la proteína blanco Fig.10.Esguemadel hjggtépiqgdeLW\ c ón. My K son respectivamente los a.a. metionina y lisina. Extraido de Bachmair y Varshavsky, 1989;

Regla del N-terminal —44 l I . ‘ \_' ' —*_ _ _ _.— 'N\ s\­ ’ .. Introducción

3.1.10. ALTERACION DE LA ESTRUCTURA DE UBICUITINA Y SUS CONSECUENCIAS

La ubicuitina es una proteína neutra (pI = 6,7), que no contiene ni cisteina ni triptofano, y sólo un residuo de metioni­ na, uno de histidina y uno de tirosina. Es extremadamente resis­ tente a la desnaturalización térmica; alrededor de 85°C se en­ cuentra la temperatura de transición reversible (Cary et al, 1930). Tambiénee desnaturaliza reversiblemente por tratamiento con urea (Cary et al, 1930), cloruro de guanidinio (Lenkinski et al, 1977; Jenson et al, 1980) o alcohol (Wilkinson y Mayer, 1986). La oxidación del residuo de metionina con H202 no afecta la actividad de la proteina (Breslow et al, 1986a). De la estructura cristalina determinadapor difracción de rayos X a una resolucion de 1,3 A se pudo apreciar que la ubi­ cuitina tiene una conformación globular compacta con un núcleo hidrofóbico (Vijay-Kumar et al, 1987a,1985,1987b) y que posee dos regiones en a-hélice con 5 hebras con plegamiento hoja B (fi­ sheet) que envuelven una cara de la hélice más larga. Cerca de 90%de cadena polipeptidica se encuentra asociada con puentes de hidrógeno que, junto con el núcleo hidrofóbico serían responsa­ bles de la estabilidad termica (Ver Fig. 11). Fig.11. Extraido de Di Stefano y Wand, 1987.

Alt. estruct. ubi —45 'Introducción

El extremo C-terminal protruye del núcleo de la proteina formando una cola de 4 aminoácidos (L-R-G-G) con libre rotación en solución, involucrado en la unión a la enzima activadora de ubicuitina (E1). Recientemente se conoció el arreglo cristalino de la ubicuitina de plantas y de levadura (Vijay-Kumar et al, 1987b), .que resultó tener una estructura terciaria idéntica a la bovina. Es interesante notar que entre estas 3 especies sólo existen 4 sitios en la secuencia donde se agrupan los cambios que, además, están confinados a una única region en la estructura terciaria opuesta al C-terminal. Esto también explica la similitud tanto inmunológica comofuncional de estas tres especies proteicas. El residuo metionina N-terminal se encuentra escondido en la estructura proteica asociado por puente de hidrógeno, a través del átomo de azufre, con el de nitrógeno de la lisina 63. En la estructura nativa, este residuo no se expone al solvente. Las argininas 42, 72, 74, se localizan en la superficie de la molécula en una región cercana al C-terminal (Duerksen­ Hughes et al, 1987). Estudiando la influencia de estos residuos básicos a través de derivados con el reactivo específico, ácido 4-(oxiacetil)fenoxiacétióo, se vio que: i) El derivado en el residuo 72 no estimulaba la proteólisis ATPdependiente de [I125] BSAcomo sustrato; ii) Lo mismoocurría en el derivado en el residuo 42 o el doble derivado 42, 72. iii) El derivado en el residuo 74 también resultó inactivo en el ensayo de proteólisis pero, a diferencia de los anteriores era capaz de reaccionar con E1 y formar conjugados UB-prote­ ína.

Los residuos 42 y 72 están agrupados en una cara de la molécula, sin hacer contacto con la región de la cadena lateral, donde se encuentra el residuo 74. Cuandola tirosina en posición 59 fue nitrada (Jenson et al, 1980; Cox, 1986; Wilkinson, 1987b), el derivado obtenido se localizó en otra zona involucrada en la interacción con E1.

Alt. estruct. ubi - 46 Introducción

La histidina 68 se expone al solvente y, cuando este re­ siduo se modificó con anhidrido etoxifórmico (Cox, 1986; Wilkin­ son, 1937b), el derivado no alteró su interacción con E1, pero aumentóla proteólisis. Existen evidencias de que el efecto pri­ mario de la modificación de histidina es aumentar la unión de ubicuitina o de conjugados con ubicuitina al sistema proteolítico (Cox et al, 1986). Estos resultados sugieren que la enzima E1 sería sensi­ ble a alteraciones de la ubicuitina cerca de los residuos 59, y 72. Los componentes proteoliticos del sistema, en cambio, pare­ cerían reconocer la superficie molecular cerca de los residuos 68 y 74 (Ver Fig. 1). Los espectros de resonancia magnética nuclear de proto­ nes (IHRMN)confirmaron la estructura de plegamiento compacto que la ubicuitina adopta en solución y en la estructura cristalina (Cary et al, 1980; Lenkinski et al, 1977; DiStefano y Wans, 1987; Weber et al, 1987). Ademasde un papel en la función proteolitica, la ubi­ cuitina per se es un interesante modelo proteico por ser una mo­ lécula pequeña estable al calentamiento y a valores extremos de pH. Tiene gran tendencia a renaturalizarse, adoptando una confor­ mación biológicamente activa, aún después de tratamientos térmi­ cos o ácidos muydrásticos. Con el objeto de aclarar la función de cada segmento de la secuencia aminoacidica, el gen de la ubicuitina humanase sin­ tetizó químicamentepara facilitar la mutagénesissitio específi­ co. El mismo se dividió en módulos para mutagenizar por agregado de 8 sitios de restricción, que no alteraban su secuencia aminoa­ cidica. Estos módulos se podían reemplazar con fragmentos de ADN sintéticos, que contenían una mutación en el codón específico ("cassette mutagénesis")(Ecker et al, 1987a, 1937b). Las mutaciones seleccionadas se dividieron en 3 catego­ rías: cola, núcleo hidrofóbico y regiones de superficie. Los ge­ nes mutantes se expresaron bajo el promotor XPLen Ehcherichia coli, expresando después la inducción niveles entre 10-15%de la proteína total. De los trabajos de Ecker et al (1987c) se pueden sintetizar las conclusiones que se muestran en la Tabla I.

Alt. estruct. ubi - 47 Introducción

TABLA I Degradación Localización Actividad de BSA I ¡utante Estructura proteica del caabio con El in vitro

- ubicuitina anilal (bovina) ¡00 l ubicuitina aniaal (expresada en E. coli) 100 2 Pro-19 -—Ser,Ala-28 -—Ser, superficie 100 Blu-24 - Asp(ubicuitina de levadura de E. coli 3 Pro-19 - Ser superficie si 100 4 Lau-67 ——Asn.Leu-69 -— isn núcleo no 0 5 Gly-76 - Ala cola no 0-l0 6 Len-13 ——A cola no 0 'l Len-74 —A.Arg-72 — Ser cola no 0 8 Try-59 ——Phe superficie si 70-100 9 His-68 —-Lys superficie si 30 10 Try-59 -—Phe,His-63 —- Lys superficie si 30 ll Phe-i -—Cys superficie si 90 12 Thr-ii ——Cys superficie si 65 13 Thr-66 -—Cys superficie si 100 li Phe-l ——Cy5,Thr-li -—Cys superficie si 100 15 Phe-i -—Cys,Thr-66 - Cys superficie si 30 16 Phe-l ——Cys,Thr-14 -— Cys superficie si 20 Ihr-66 —- 076

Las mutantes en la porción de la cola fueron muy poco inmunoreactivas, mientras que las mutaciones en otras áreas no producían cambios respecto de la no mutada. Los cambios conformacionales en proteínas son esenciales para la acción de muchas enzimas y para transducción de señales por receptores. Unatécnica útil para el estudio de cambios con­ formacionales in v1vo, involucra la inserción por mutagénesis di­ rigida de cisteínas en lugares estratégicos de la secuencia pri­ maria, con el objeto de inducir por oxidación, uniones disulfuro entre cisteínas espacialmente cercanas. Esto lleva a reducir la flexibilidad de la proteína en solución.

Alt. estruct. ubi —48 Introducción

Para el caso de ubicuitina, Ecker et al (1989a), cons­ truyeron mutantes que contenían 2 cisteinas. De esas mutantes, la que contenía cisteinas en las posiciones 4/14 era activa en el ensayo de degradación proteica in vitro; mientras que la 4/66 que entrecruzaba los dos extremos sólo tenia un 20%de actividad. Ninguno de los genes de ubicuitina codifica para un mo­ nómero maduro; lo que involucra un procesamiento proteolitico pa­ ra generar ubicuitina libre. (Ver GENETICA Y REGULACIONDE LOS GENES DE UBICUITINA). Butt et al (1988b) utilizando fusiones Ub-metalotioneina parecido al sistema desarrollado por Bachmair et al (1986), en­ contraron que la endopeptidasa (UGPH)de levadura involucrada en el procesamiento de la proteina híbrida, era sensible a cambios en el C-terminal de ubicuitina. La mutación en la glicina 76 a alanina retardaba el procesamiento in vivo, mientras que la mu­ tante doble histidina 68 a lisina-glicina 76 a alanina bloqueaban directamente la función de la endopeptidasa‘ Ambasposiciones re­ sultaron ser importantes tanto en la función proteolitica, como en el procesamiento. Los cambios en otros dominios parecian no afectar el procesamiento. Es interesante destacar que estos auto­ res encontraron un bloqueo en el crecimiento celular asociado a la sobre expresión de ubicuitina. Dos de las mutantes glicina 76 a alanina e histidlna 68 a lisina mostraron el mayorefecto ci­ tostático. Las moléculas de ubicuitina que no pueden ser activa­ das para entrar en e] camino metabólico normal, inhibirian las enzimas encargadas de la regeneración de ubicuitina de los conju­ gados, perturbando su equilibrio dinámico.

Alt. estruct. ubi —49 Introducción

3.1.11. SELECTIVIDAD DE UNION DE LA ENZIMA E3

Parece razonable suponer que la selección de los sustra­ tos proteicos que se van a degradar por el camino dependiente de ubicuitina se ejerza a nivel de la conjugación. No obstante, otras reacciones pueden influir en la selectividad, tal como los mecanismosde corrección ejercidos por las isopeptidasas sobre los conjugados de UB-proteina que no van a ser degradados (Hersh­ ko et al, 1980). Hershko et al (1984b), encontraron que para la degrada­ ción de proteínas dependientes de ubicuitina era necesaria la presencia de un grupo a-NHzlibre. Noobstante, otros investiga­ dores observaron que la naturaleza del N-terminal tenia gran im­ portancia en esta vía proteolitica (Ciechanover et al, 1935; Bachmair et al, 1986; Spindler y Berk, 1984; Ferber y Ciechano­ ver, 1986,1987). Sin embargo, un cúmulo de evidencias indicarían que, además del extremo N-terminal también existen secuencias aminoa­ cídicas preferidas (ver mas adelante la hipótesis "PEST"), o es­ tructuras terciarias involucradas (Rogers et al, 1986). Rechsteiner et al sugieren que otro sistema seria el responsable ya que la energía de activación de degradación de ca­ seina (proteina enriquecida en regiones FEST), microinyectada en un sistema in vitro de reticulocitos, es menorque la necesaria si se usara el camino dependiente de ubicuitina (Rogers et al, 1980). La oxidación de residuos metionina de algunas proteínas aumenta considerablemente Ja susccptibilidad de conjugación de ubicuitina y la posterior degradación (Hershko et al, 1986). Es probable que ocurra en las células un daño oxidativo de las pro­ teínas, comoen el caso del residuo histidina implicado en la inactivación y degradación de la glutamino sintetasa (Fucci et al, 1983; Levine, 1983). No obstante. queda por demostrar si la oxidación de residuos metionina a sulfóxidos es una señal fisio­ lógica para la degradación. Los experimentos con proteina E3 purificada de reticulo­ citos de conejo, revelaron una especificidad de unión al sustra­ to, datos que se correlacionan bien con la unión de ubicuitina a

Selectiv. E3 - 50 Introducción

estos mismossustratos y la conversión funcional de las proteínas que se unían a E3 a conjugados con ubicuitina (Hershko et al, 1986). Utilizando derivados de aminoácidos, tal como ésteres metilicos, hidroxamatoso dipéptidos, se clasificó los distintos sustratos en función de la inhibición de unión a la ligasa E3 por estos derivados (Beiss et al, 1988)(ver Tabla II). Los sustratos del grupo I contenían residuosxbásicos en su N-terminal y eran inhibidos sólo por derivados de aminoácidos básicos. Unasituación similar ocurre para los del tipo II, ac­ tuando los derivados comoinhibidores especificos. Esta especifi­ cidad se refleja no sólo por la capacidad de inhibición de deri­ vados hidrofóbicos voluminosos y no por los derivados básicos a los sustratos del grupo II, sino por la necesidad en los deriva­ dos de la existencia de un grupo a-HHz libre del residuo aminoa­ cídico apropiado. Los sustratos del tipo III constituyen un grupo de pro­ as que no contienen en su N-terminal ningun residuo de la lase de los dos grupos anteriores y, ademas, la unión a E3 no se inhibe ni por derivados homólogos al aminoácido N-terminal de la proteína. Los resultados anteriores llevan a considerar la posibi­ lidad de la existencia de dos sitios de unión para E3: i) uno pa­ ra el residuo aminoacídico N-terminal ("cabeza"), y otro ii) en otra parte de proteina que contenga una secuencia de reconoci­ miento, tal comolas metioninas oxidadas ("cuerpo"). La existencia del sitio que reconocería al "cuerpo" del sustrato se sustenta en los resultados de Hershko et al con liso­ zima modificada en el N-terminal y con las metioninas oxidadas que se unían con alta afinidad a E3, y de los trabajos de Breslow et al (1986b) que demostraban la inhibición de Conjugación y de proteólisis de caseína y ESApor las mismas proteinas modificadas por acetiiación o succinilaclón en sus grupos aminos. Estas pro­ teinas con grupos aminos bloqueados, que no eran sustratos para la conjugación con ubicuitina, competían en la conjugación. Comparandoestos datos con los aportados por Bachmair et al (1986), resulta que todos los aminoácidos básicos e hidrofóbi­ cos con grupos voluminosos pertenecen al grupo de los "desestabi­ lisantes", lo que significaría que la especificidad del sitio de unión de E3 por este tipo de residuos aminoacídicos se conservó evolutivamente.

Selectiv. E3 - 51 Introducción

Todoslos sustratos pertenecientes al tipo III tienen residuos aminoacidicos N-terminal del grupo "estabilizante". Sin embargo, son degradados perfectamente por la via dependiente de ubicuitina en el sistema de reticulocitos de conejo. Las protei­ nas tipo III resultan ser las más abundantes entre las secuencias proteicas conocidas de rápido recambio (Rogers et al, 1936).

TABLA II. ESPECIFICIDAD DE LOS SITIOS DE UNION DE E3 Tipo de sustrato Residuo Competido por proteico N-terminal derivados de: Ejemplos

I básico R, L, H lisozima ribonucleasa II hidrofóbico W, F, Y, L Blactoglobulina voluminoso pepsinógeno III varios ninguno globina (V,T,P...) citocromos de levaduras

Alrededor de un 80%de la proteína celular en células de tumor ascítico de Erlich contienen su N-termina acetilado, y la mayoría se degrada por un sistema dependiente d ATP(Goldberg y St. John, 1976). Recientemente, Mayer et al (1989) demostraron que el sistema dependiente de ubicuitina podia degradar proteínas con sus extremos N-terminal bloqueados por un grupo acetilo. Hasta el momento,los sistemas de fraccionamiento utilizados por Ciechano­ ver et al (1932) y Hershko et al (1983) en la purificación de las enzimas involucradas en la conjugación de ubicuitina, perdían un factor presente en el lisado de reticulocitos utilizado. Este factor se comportaría comouna ligasa de ubicuitina y no tendría funciones de de acetilasa o acllaminohidrolasa.

Selectiv. E3 - 52 Introducción

Estos resultados modifican algunas aseveraciones y re­ fuerzan, junto con los datos aportados por Bachmair y Varshavsky (1989), la validez de la regla del N-terminal. Reiss et al (1939) estudiaron más en detalle el modo de acción de E3, caracterizando otros sitios de unión. Trabajando con conjugados marcados de Ub-lieozima, en­ contraron una unión más fuerte a E3 que la que presentaba el sus­ trato desnudo, y esta unión no era desplazada por ubicuitina li­ bre. Esto lleva a considerar no sólo que el mecanismode agregado de múltiples unidades de ubicuitina siga una via procesiva, sino también que la alteración estructural de la ubicuitina causada por su conjugación al sustrato, sea la requerida por E3. Ademásde los sitios de unión para el sustrato, E3 tam­ bién interacciona con algunas de las enzimas con que actúa con­ oertadamente. La incubación de E3 con proteinas de la familia E2 da lugar a la formación de un complejo. Se especula con la posi­ bilidad de que este complejofacilite la transferencia específica de ubicuitina activada de E2 al sustrato.

Selectiv. E3 —53 Introducción

3.1.12. POSIBLES SENALES PARA PROTEOLISIS

A pesar de la importancia del extremo N-terminal en el reconocimiento asociado a degradación proteica, existen varias razones para suponer que la "regla del N-terminal" se cumple principalmente para proteinas desnaturalizadas: i) los aminoácidos estabilizantes son aquéllos que normalmente están acetilados durante la biosíntesis. ii) la vida media (t1/2: 2-3 min) de muchas proteinas de alto recambio está en el orden de la propia sintesis proteica. iii) los estudios con RNasaA que contiene una lisina en el N­ terminal, que además est á b ien expuesta, tiene una vida me­ dia de 80 hs. (Bote y Reohsteiner, 1986; Baoker et al, 1983).

La "regla del N-terminal" funcionaria principalmente en la identificación de errores de traducción y a pesar de que no hay buena correlación en muchosdetalles explica el requerimiento de tARNen la degradación dependiente de ubicuitina en algunos sustratos (Soffer, 1973; Ciechanover et al, 1985; Ferber y Cie­ chanovher, 1987). Por estudios de microinyección se conocen dos posibles señales para proteólisis que se describen a continuación.

Señales proteól. - 54 Introducción

3.1.12.l. La hififilfifiifi "PEST"

Del examen de la secuencia aminoacidica de 10 proteinas de vida media corta (ti/2<2 hs.) se encontró que contenían una o más regiones ricas en prolina (P), acido glutamico (E), serina (S) y treonina (T)(Rogers et al, 1986). Estas regiones PEST, que varian entre 12 a 60 residuos, están generalmente flanqueadas por acumulos de aminoácidos cargados positivamente. Por la acción de una hipotética proteasa que reconoce secuencias PEST e hidroliza en los alrededores, los fragmentos resultantes contendrian residuos básicos en su N-terminal, trans­ formándose en buenos sustratos para el sistema dependiente de ubicuitina (Hershko et al, 1980) Sólo 3 de 35 proteinas examina­ das de vida media entre 20 y 220 hs. resultaron tener regiones PEST. Rechsteiner et al sugieren que la presencia de regiones FESTserian las responsables de la rápida proteólisis de las pro­ teinas que las contengan. Las regiones PEST, como secuencia señal (Von Heijne, 1936a, 1988b; Folz y Gordon, 1987), son dificiles de definir sólo en base al arreglo aminoacidico. Ademásde tener al menos una P, S/T o D/E, estas regiones compartenotras caracteristicas: i) muyprobablemente son "loops" que emergen de la superficie. ii) son sitios potenciales de fosforilación a nivel de las treoninas y serinas. iii) el residuo prolina (P) casi siempre se encuentra en un am­ biente no cargado o hidrofóbico.

Las secuencias PEST pueden estar localizadas en cual­ quier parte de la cadena polipeptidica y en número variable. Las regiones con estas secuencias repetidas o similares son comunes en proteinas que tienen secuencias asociadas a su localización. Dada la hidrofilicidad de estas regiones FEST,su localización es en general en “loops” que emergen de la superficie en extensiones terminales, y todas ellas muyprobablemente flexibles y desorde­ nadas.

Señales proteól. —55 Introducción

Las regiones PEST no causan invariablemente una rápida proteólisis comoes el caso de p53 (Oren et al, 1932), proteina­ quinasa C (Woodgett y Hunter, 1987), quinasa dependiente de cAMP (Hemmings, 1985), ciclinas (Evans et al, 1983), fitocromo (McCar­ dy y Pratt, 1986), y fructosa-l,6-bisfosfatasa (FBPasa) de leva­ dura (Jones, 1984), pero si constituyen una condición aparente­ mente necesaria. En el caso de la quinasa dependiente de CAMPse supone que la disociación en subunidades por el CAMPexpone regiones PEST presentes en ambas subunidades R2 y Cz. Estas subunidades R2 yrica. Cz aisladas, se degradan mas rapido que la holoenzima tetramé­ Otra experiencia de enmascaramiento de regiones PESTpo­ dria ser la rela;(' onada con la estabilidad del fitocromo. Es in­ teresante destaca que las secuencias PEST en esta molécula se encuentran muy ceC a del cromóforo. La luz induce el cambio con­ duce la vida media del fitocromo (Shanklin et al, 1987), y inducida por este ;ambio conformacional. La FBPasa es un buen ejemplo donde la condición de pre­ sencia de la secuencia PESTesta involucrada en la modificación y no en el enmascaramiento (Jones, 1984). Esta enzima cataliza el camino irreversible en gluconeogénesis, esencial para el creci­ miento de levadsra con etanol como fuente de carbono. Sin embar­ go, el agregado de glucosa, promueve la rápida degradación de FBPasa y otras enzimas, en un proceso dependiente de CAMP. Esta inactivacien reversible involucra fcsforilacion dependiente de CAMP.El sitio de fosforilación en la FBPasa es una serina que se encuentra en el extremo N-terminal de la secuencia PEST (Ritten­ house et al, 1986). Un interesante modelo, propuesto por Rechsteiner et al, sugiere que la fosforilación de residuos pertenecientes a las se­ cuencias PEST(S/T) convertiría a estos sitios en zonas cargadas negativamente con capacidad de unión de Ca2+ (Rogers et a1,1986). Este secuestro de Ca2+ implica un aumento de la concen­ tración local necesaria para la hidrólisis enzimática del enlace peptidico mediado por calpaina. Las regiones PESTpodrian cumplir también otras funcio­ nes en procesos diferentes al de proteólisis. Basándoseen las similitudes en la distribución de se­ cuencias PESTentre inhibidores de fosfatasa y los oncogenes myc, fbs y EEA, Rechsteiner sugirió funciones análogas (Rechsteiner,

Señales proteól. - 56 Introducción

1987). Tambiense encontró en calpafitatjna, un inhibidor de pro­ teasas, 5 secuencias PESTdistribuidas uniformemente (Emori et al, 1937). En proteinas presuntamente relacionadas con el recono­ cimiento de proteinas anormales o desnaturalizadas, existen re­ giones PEST, como por ejemplo, hsp FÜ/BJ/QÜ,grp94, prolina-4-hi­ droxilasa y nucleoplasmina (Carlson et al, 1987; Munroy Pelham, 1984). Aún más intere sa nte es la acumulación de secuencias PEST en proteinas de mutantesC homeóticos de Prosophila y en proteinas reguladoras del ciclo celular en levaduras. Además,en estos ca­ sos, las secuencias PESTse encontraron, generalmente, cerca del dominio de unión al ADN. Hasta el momento, la única proteina de vida media corta que no posee región PESTes la apometalotioneina (Monia et al, 1986). Coffino et al secuenciaron el cADNque codifica para la ornitina decarboxilasa de ratón (ti/2 z 30 min) y de Trypanosoma (ti/2 9 6 h)(Phillips et al, 1987), y encontraron que de solo 3 regiones significativamente diferentes, dos de ellas contenían secuencias PEST. Todas las proteinas que contienen secuencias PESTresul­ tan ser importantes en regulación y su alto recambio refleja su requerimiento metabólico. Entre las proteinas que contienen re­ giones PESTse encuentran (ver además, Tabla III): i) el producto de oncogenes: myc, fos, EIA, myb, p53. ii) las enzimas claves: ODC,TAT, CoAreductasa iii) las secuencias asociadas a localización, quinasas depen­ dientes de CAMPy cGMP,PK-C, fitocromo, ciclina y recepto­ res esteroideos. iv) las proteínas homeóticas de Droscphila: notch, snake, cau­ dal, fútz, even skipped, antennapedia, krüppel. v)activadasporCa3+y los inhibidores I y II de fosfatasas, timosina, proteasas vi) las proteinas regulatorias de ciclo celular de levadura.

Señales proteól. - 57 Introducción

a ubicuitina y el inhibidor cuencias similares. Aunque el hecho de que ambas molé­ iticñs citosólicos aumenta secuencias (Rechsteiner,

Por otro lado, se conoce que las proteinas que contienen regiones PEST son rápidamente degradadas en células FMBAtsBS a temperatura no permieiva, como la DDC(Glass y Gerner, 1987), e hidroximetil-glutaril CoAreductasa (Tanaïa et ai, 1986c), donde la conjugación de ubicuitina es inhibida.

Señales proteól. - 58 Introducción

TABLA III. ESTABILIDAD DE PROTEINAS CELULARES

Vida 5itocondria,liso- REy ¡cabra­ ¡edis{h) Núcleo sonas,peroxisoaas Citosol na plasnática

<2 Slá,fbs,:yc,nyb hsp?0,HT(Au),Pïso,PE-C, ó-áLAS BUG-CoA-R bsp70,p53 000,787

2-3 cáHP-PK.cGHP-PK,T0 a-2-H-R,r-GT,LIHPI

9-40 Ub CáH,GS,HT(Cd),Ub thoAC.AIAT,CAT EGF-R,EH.LDL-R,LIHPII, LIHPIII,Ha*/K*-AïPasa P450,P4503ed,Tf-B

41-200 HI.HHGI,HHG2 álT,áCT,úDH,ADK,áLD B-glu, B-galact, Cyt b5 Red,Cytb5,DPPIV AEG,CAB,CÁT,CIS,BHE CytÜx,GCBa6a,ÜfiT, G?D,LBB,3b,HYO,PAB, PC PLA,PPA,P570,SGD.V¡

>200 EZá,323,HJ,H4 HEH,GP,PGK NAD-GH a-Z-M-R: a-Z macroglobulina; AAT:aspártico amino transferasa; AzCoAc: acetil CoAcarboxilasa; Act: aetina; ADH:alcohol deehidrogenasa; ADK: adenil ato quinaea; AIAT: alanina aminotransferaea; ALD:aldoea; ARG:ar­ ginaea; B-galact: B-galaetosidase; CAB:anhidrasa carbónica; CAM:calmo­ dulina; CAMP-PK: proteina quinasa dependiente de CAMP;CAT: eatalaea; cGMP-PK:proteina quinasa dependiente de CGMP;CIS: citrato sintetasa; Cytox: citocromo oxidasa; Cyt b5: citocromo b5; 5-ALA: ó-amino levulina­ to sintetasa; DHF:dihidrofolato reductaea; DPPIV:dipeptidil dipeptida­ sa: EIA: proteina temprana de adenOVirus; EGF-R: receptor de factor de crecimiento epidérmico; EH: epóxido hidrolasa; XGT:X-glutamil transfe­ rasa; GCBase: glucocerebrosidasa; GK: glucoquinasa; GP: glucógeno fosfo­ rilasa; GPD:gliceraldehído-3P-deshidrogenasa; H1: histonas; HEM: hemo­ globina; HMGlz2:proteinas del grupo de alta movilidad; HMG-CoA-R:hi­ droximetil glutaril-CoA-reductaaa; HSP70:proteína de respuesta a estrés térmico 70; LDH:láctico deshidrogenasa; LDI-R: receptor para lipoprote­ ina de baja densidad; LIMP: proteína lisosomal integral de membrana; Mb: mioglobina; MT(Au) o (Cd): metalotioneina (Au) o (Cd); MYO: miosina; NAD-GH:NADglicohidrolasa; OAT:ornitina aminotraneferaea; ODC:orniti­ na desoarboxilasa; P450: citocromo P450; P450 Red: citooromo P450 reduc­ tasa; p53: quinaea nuclear; PK-C: proteina quinasa C; PLA: foefolipaea A2; PPA: foeforilaea A: SOD: superoxido dismutasa; TAT: tirosina amino­ transferaea; Tf-R: receptor de transferrina; UB:ubicuitina; T0: tripto­ fano oxigenasa; Vm:vinmentina. Introducción

3. 1. 12.2. I].firm-1011153I

Se conocen varios caminos que conducen a la degradación proteica que puedenestar asociados a distintas funciones (Dice, 1987). Por ejemplo, el sistema dependiente de ubicuitina podria ser el responsable primario de la eliminación de proteinas anor­ males, mientras que el camino de proteasas dependientes de Ca3+, de rearreglos de estructuras citoesqueléticas (Pontremoli y Me­ lloni, 1986) y de interacciones de membranasdel citoesqueleto­ plasma (Beckerle et al, 1937; Mellgren, 198?). Unode los papeles del camino degradativo lisosomal se­ ria el de aportar aminoácidos para síntesis proteica, o como fuente energética en células ayunadas (Dice et al, 1986). Los li­ sosomas serian responsables de la degradación de muchas proteinas de membrana (Libby y Goldberg, 1931; Masaki et al, 1987), como también de algunas proteinas del citosol de vida media larga (McElligott et al, 1985) por diferentes mecanismos (Bigelow et al, 1981; Ahlberg et al, 1935; Goldberg y St.John, 1976; Mayer y Doherty, 1986; Waterlow et al, 1978; Amenta y Brocher, 1981). Dice et al demostraron que la degradación de RNasa en fibroblastos humanosaumentaba al eliminar el suero del medio de cultivo. Otros experimentos demostraron que una secuencia de 5 aminoácidos cerca del extremo N-terminal de la RNasa (lisina-fe­ nil alanina-glutámico-arginina-glutamina (KFERQ))estaba involu­ crada en el aumento de la degradación por ayuno (Backer et al, 1983; Dice et al, 1986). Esta secuencia KFERQacoplada a lisozima o a la cadena A de la insulina se inyectó en fibroblastos y se vio un aumento de la degradación de estas proteinas en respuesta a la deprivación de nutrientes, a pesar de que el recambio de las proteinas paren­ tales no respondía a la eliminación del suero del medio de culti­ vo (Backer y Dice, 1936). Este aumentode proteólisis en fibroblastos, por la eli­ minación del suero, resulta similar a lo que ocurre en higado y en musculo esquelético en el ayuno o en ratas diabéticas (Dice et al, 1988; Berger y Dice, 1986; Chiang y Dice, 1938; Neff et al, 1981; Samaniego et al, 1981}.

Señales proteól. - 60 Introducción

McElligott et al demostraron que el aumento de la degra­ dación por privación del suero en el medio de cultivo era causado por un aumento de la velocidad de transporte de la proteina mi­ croinyectada a lisosomas (McElligott et al, 1985). La co-inyección de RNasacon un exceso molar del péptido KFERQprovocaba una inhibición del aumento de la degradación como respuesta a la eliminación del suero. Los anticuerpos anti-pépti­ do KFERQeran capaces de precipitar entre el 20-35% de las prote­ ínas citosólicas de fibroblastos humanos(Chiang y Dice, 1938). La vida media de estas proteinas inmuno-precipitables se reducía de 80 hs a 12 hs después de 12 hs de eliminación del suero en el medio de cultivo, mientras que proteínas no inmunoreactivas eran insensibles a la ausencia del suero con una vida media de aproxi­ madamente30 hs. Estos resultados se reprodujeron en higado, mús­ culo esquelético y riñón, pero no en cerebro ni testículos, como era de esperar por la conocida respuesta al ayuno de estos siste­ mas (Chiang y Dice, 1933; Berger y Dice, 1986; Waterlow et al, 1978). La secuencia exacta del pentapéptido KFERQsolo se en­ contró en la RNasa. Dos secuencias peptidicas responderian a la regulación por el suero, dadas las proteinas conocidas hasta el momento, y lo llamativo es su reconocimiento en ambas direccio­ nes, —F-RQ o QR-F—¿ Dice et al aislaron una proteina de x 80 kD tanto cito­ sól ica como asociada a membrana, que se unía específicamente a la secuencia KFERQy péptidos relacionados (Dicee t a}, en prensa; Dice, 1987).

Señales proteól. - 61 Introducción

3.1.13. RESPUESTA AL ESTRES TERMICO

Todos los organismos responden al aumento de la tempera­ tura induciendo la síntesis de un grupo de proteínas denominadas "proteinas de estrés-térmico" o hsps (heat-shOC' proteins). La hsp70 y la hspQÜ están entre las proteinas más conservadas y abundantes de esta respuesta. La inducción de varias proteinas de la familia de las hsps también se produce por otros estres diferentes al térmico, comoanoxia, etanol, tratamientos con algunos metales pesados, presencia de proteínas anómalas, exposición al arsenito de sodio, tratamientos oxidativos, daño de ADNpor agentes físicos o quími­ cos, etc. Muchasde las hsps también se encuentran presentes a la temperatura normal de crecimiento y estan involucradas en funcio­ nes vitales de la celula. La inducción de las hsps es rápida y de gran magnitud, comocorresponde a una respuesta de emergencia con el objeto de proteger a la célula del efecto deletereo del estrés impuesto. Existe una estrecha relación entre la temperatura de in­ ducción y el medio ambiente del organismo. Los tratamientos graduales con temperaturas crecientes inducen termo-tolerancia, y también tolerancia a otras formas de estrés y viceversa. Aparentmente, las hsps se inducen por estrés moderados, no letales, para proteger al organismo de estrés más severos. Entre las diversas funciones en las que las hsps están involucradas se encuentran por ejemplo, que la hsp90 interacciona con receptores esteroideos y la hsp70 y proteinas relacionadas con las "canastas" de clatrina, complejos de replicación de ADN, proteínas del reticulo endoplásmico y con el antígeno tumoral p53. Muchosde los datos conocidos son consistentes con la hipó­ tesis de que las hsps están involucradas en el plegamiento de proteínas y en el armado de complejos proteicos. Estas proteinas inducidas por aumento de temperatura to­ marian parte en el re-plegado de las estructuras dañadas por el estrés térmico o de otro origen, a través de una interacción pro­ teina-proteina con gasto de ATP.

Resp. estrés térmico - 62 Introducción

Teniendo en cuenta la cantidad de información relaciona­ da con este tED ma, se recomienda la lectura de trabajos de revi­ sión queC 'ubren en gran parte los datos que seC‘ conocen (Neidhart et al, 19.9 ; Schlesinger et al, 1982; Tanguay, 1983; Linquist y Craig, 1938; Pelham, 1936). En la mutante de ciclo celular FM3At585 caracterizada por la termosensibilidad de la ensima E1, a temperatura no permi­ siva (39°C), la síntesis de ubicuitina y de algunos miembros de la familia de hspïü se encuentra aumentada, mientras en células salvajes FM3Anoexiste inducción de hsp. Este resultado sugiere que la inactivación o sobrecarga del sistema proteolitico depen­ diente de ubicuitina conduciria a la inducción de hsp (Finley et al, 1934). En 1986, Ananthan et al propusieron la existencia de una señal inductora comúnen la respuesta a los diferentes tipos de estrés que involucraba la desnaturalización proteica. El factor de transcripción específico de los genes involucrados en esta respuesta, estaría presente en la forma inactiva en células no inducidas y su forma activa sería rápidamente degradada. Al some­ ter el sistema a un estrés, la proteina desnaturalizada competi­ ria con la forma activa del factor de transcripción HSFpor la limitada maquinariaproteolitica, lo que llevaria a una estabili­ zación del HSF. Unmodelo parecido también fue propuesto en la regula­ ción de la respuesta al estres termico en EBcherichia coli (Goff y Goldberg, 1985). En este sistema, el HSFcorrespondería al factor 032 de la ARNpolimerasa Landick et al, 1934; Phillips et al, 1934; Taylor et al, 1934). Esta subunidad es el producto del gen rpoH (htpR), y su aumentoes suficiente para activar la transcripción de los genes de heat shock (HS) selectivamente (Yamamori y Yura, 1980,1982; Neidhardt et al, 1983; Tobe et al, 1984; Bloom et al, 1936; Landick et al, 1984; Grossman et al, 1984,1987; Gross et al, 1987; Phillips et al, 1984; Straus et al, 1987; Bahl et al, 1987). El agregado de inhibidores de proteasa a cultivos bacte­ rianos aumenta la transcripción del gen Jon y la sintesis de otras hsps (Goff y Goldberg, resultados no publicados). Estos re­ sultados también sugieren que la inhibición de la proteólisis puede directamente activar los genes de

Resp. estrés térmico —63 Introducción

Tambiénes consistente conl'l‘ ste modelo, la observación que las proteinas desnaturalizadas que activan los genes de hsps en oocitos de ’Xenopusson suficientes para reducir la velocidad de degradación de otras proteinas de vida media corta (Ananthan et al, 1986). Tambien se conoce que proteínas anomalas que contienen análogos de aminoácidos son degradadas por el sistema ubicuitina, y que a la vez inducirian las hsps. La estabilidad de estas pro­ teinas anormales aumenta ademas, en celulas en las que se produjo un shock termico (Hircmi et al, 1986; Ananthan et al, 1936; Munro v Pelham, 1985). Noobstante, es dificil explicar por este modelola in­ ducción de hsps en situaciones en que la temperatura se lleva a solo 37“C (condicion de induccion para levaduras) o aun menor, comoen el caso de los peces del ártico. Se conoce que la fosforilacion del factor HSF ocurre despues del estrés termico, y se cree que esa modificación es la responsable de la activación (Berger et al, 1937; Wiederrecht et al, 1988; So‘ger y Pelham, 1938). Los promotores de los genes de HS poseen una secuencia _de ADNespecifica HSEa la que se une el factor HSF inducido por el estrés impuesto (Bienz y Pelham, 1987). En células HeLa tanto para el shoc' termico como para tratamiento con metales pesados, la transcripción de los genes de HSprocede independiente de sintesis proteica. No ocurre lo mismo para el estres produciro por tratamiento con análogos de aminoá­ cidos (Mosser et al, 1988). Resultados análogos fueron obtenidos con fibroblastos de embrión de pollo y células BHK,y son consis­ tentes con el modelo que propone el papel de las proteinas abe­ rrantes comoseñal de inducción (Kelley y Schlesinger, 1973). El mecanismo básico de activación de los genes de HS se encuentra conservado en todos los eucariotes. Jacobsen y Pelham (1988), aportan evidencias que demues­ tran que en levadura, el factor HSFesta unido al HSEin Vivo, aún en ausencia de estres v que, por lo tanto, su actividad debe­ ria estar regulada en un paso posterior al de union a ADN. Estas secuencias regulatorias HSE funcionan de manera análoga a los enhana cars (Pelham, 1982; Nu, 1934; Mirault et al, 1982; Dudler y Travers, 1984; Simon et al, 1985; Bienz y Pelham, 1986; Amin et al, 1937; Parker y Topol, 1934)) y fueron encontra­

Resp. estrés térmico —64 Introducción

dos en levadura (Wiederrecht et al, 1987; Sorger y Pelham, 1937), Drosopbila (Wiederrecht et al, 1937; Wu et al, 1987) y_ humanos (Goldenberg et al, 1987). La respuesta al estrés termico tambien afecta la expre­ sion pos-transcripcional. Se inhibe el procesamiento (splicing) del mARNyes interesante destacar la ausencia de intrones en los genes HSque se inducen en gran escala durante la respuesta al süoc' termico (Yost y Lindquist, 1936). Otros estres que inducen nsps comoel tratamiento con arsenito de sodio, análogos de ami­ noácidos o etanol inhiben in Vivo el paso de splicing, aunque es­ ta situacion no se reproduce in vitro, por ejemplo en homogenatos provenientes de celulas HeLadespues de un estres termico (Bond, 1983). Los mABNde las prote s hs}is son, ademas, selectiva­ mente traducidos durante el s e rmico, mientras otros mARN son excluidos (Lindquist, 1981; ir au lt et al, 1977; Storti et al, 1980; Kruger y Benecke, 1981; Scott y Pardue, 1981; Lawson et a1, 1984; DiNocera y David, 1933; MGarryC y Lindquist, 1935; Ultmark et al, 1936) con una reducida sintesis proteica generali­ sada. Durante la etapa de recuperación, la traducción de otros mensajeros se reanuda. Ademásde esta traduccion preferencial, los mARdde las bsps son más estables durante el estres termico que en la etapa de recuperacion (DiDomenicoet al, 1932a,b}. La cantidad de hsps que se produce como respuesta a un estres particular, esta directamente relacionada con la severidad del estres aplicado (DiDomenicoet al, 1932b}. Existe una inhibi­ ción parcial reversible, tanto de la traduccion comode la trans­ cripcion durante el periodo de sintesis de hsps (DiDomenico et al, 1982b), y la expresión de hsps aparentemente regula negativa­ mente su sintesis (DiDomenico et al, 1982a,b). Lo mismo ocurre en Escherichia coli, donde el equivalente de este regulador negativo de eucariotes, hsp70, correspondería al producto del gen dnaK (Tilly et a1, 1983). Existen por lo menos 3 genes: HSPTO, GBPTBy metalotio­ neina, cuya transcripcion se induce despues de la incubación con cadmio, cobre o zinc (Chang et a1,1937; Karin et a1,1984; Stuart et al, 1984; Watowicn y Morimoto, 1938; Wiederrecht et al, 1937), aunque el elemento HSEsolo esta presente en el HSP70. La cinéti­ ca de induccion es mas lenta en la respuesta a metales pesados y a análogos de aminoácidos frente a la que se observa por shock termico, lo que sugiere la existencia de diferentes caminos de activación del factor HSF.

Resp. estrés térmico - 65 Introducción

En algunos organismos, la ubicuitina es una proteina de respuesta a estrés térmico (hsps). Por ejemplo, en fibroblastos de embrión de pollo (Bond y Schlesinger, 1985), donde además se encontró un elemento HSE característico (Bond y Schlesinger, 1986), en levaduras (Finley et al, 1987); en células de mamíferos (humanoy hamster) que además del estrés termico también respon­ den al estres quimico por tratamiento con el agente alquilante metilmetanosulfonato (Fornace et al, 1939); en Xenopus laevis (Krone y Heikkila, 1983) y en Tetrahymena pyriformjs donde tam­ bién se identificó un elemento USE(Neves et al, 1938), En Hrosophila melanogaster, la inducción del mensajero de poliubicuitina fue de sólo 3 veces (Lee et al, 1988), aunque los resultados de Arribas et al (1986), descartan el aumento de la transcripción de ubicuitina por tratamiento térmico. La situación aun es menosclara en Dictyostelium discoi­ deum. Segun lo observado por el grupo de Müller-Taubenberger et al (1938a) los tratamientos con cadmio o por shock térmico (calor o frio) inducian de novo 1a expresión de 3 nuevos transcriptos y aumentaban la expresión de un transcripto de 1,9 Kb, codificando todos ellos para poliubicuitina con diferente númerode repeti­ ciones. Uno de estos genes de 1a familia de poliubicuitina fue caracterizado en detalle por Giorda y Ennis (1937) que además de no encontrar ningun elemento con homologia a HSEen la zona 5' de la secuencia nucleotidica, comprobóque no existia inducción del transcripto de 1,4 Kbcodificado por este gen después de un tra­ tamiento termico. Sólo los genes que codifican para poliubicuitina (ver GENETICA Y REGULACIONDE GENES DE UBlCUlTINA), son inducibles por estrés térmico en los organismos en que la ubicuitina es una pro­ teina hsp. Las mutantes de levaduras ubi 4, que tienen una dele­ ción en el gen de poliubicuitina, crecen a una velocidad compara­ ble a la salvaje, entre 23 y 36°C. Los niveles de ubicuitina li­ bre son también similares a la salvaje, indicando que esta prote­ ina sería generada por los-productos de otros genes. La pérdida de viabilidad inducida por estrés termico en la cepa ubi 4 se de­ be a la incapacidad de mantener los niveles requeridos de ubicui­ tina durante el tratamiento. Esta mutante ubi 4 es hipersensible a la exposición a 38.5“0 a diferencia de lo que ocurre con la salvaje. Además, es más sensible al crecimiento en medios conte­ niendo análogos de aminoácidos, como asi también al ayuno de fuentes de Carbono o Nitrógeno (Finley et al, 1987). La transfor­ mación con un vector apropiado que contenga por lo menos un monó­ mero del gen UBl4 complementa perfectamente esta mutación. Introducción

Teniendo en cuenta que la ubicuitina es necesaria para la degradación de proteinas anormales, probablemente exista un aumento de la demanda de ubicuitina durante la situación de es­ trés (despues de un tratamiento térmico o con análogos de aminoá­ cidos). El gen UBI4 también es necesario para el mantenimiento de la viabilidad de las esporas. La velocidad de acumulación de proteinas dañadas tanto en esporas no germinadas comoen levadu­ ras en crecimiento, puede ser significativa aún en ausencia de un estrés declarado. Sin embargo, el estado metabólico latente de la espera evitaría degradar o metabolizar estas proteínas dañadas, lo que provocaría un aumento de su concentración con el tiempo. Al germinar, las proteínas dañadas acumuladas en la espora, in­ terferirían con la reanudación del crecimiento, salvo que fueran degradadas o procesadas por el sistema dependiente de ubicuitina. En condiciones de crecimiento normal, el 40%de las mo­ léculas de ubicuitina en células HeLaestán presentes comoconju­ gados de alto peso molecular (HMH), 10%como conjugados con his­ tona, 15%comoaductos lábiles a la reducción o calentamiento, y el 35% restante como ubicuitina libre (Carlson y Rechsteiner, 1985). Utilizando células permeabilizadas de hepatoma (Raboy et al, 1936), solo el 20%de los conjugados HHHconsistia en inter­ mediarios potenciales de proteinas de vida media corta en el ca­ mino a ser degradadas. Las zonas más prominentes de estos conjugados cubrían tamaños entre 130-50 kD y algunos de bajo peso molecular cercano a 30 kD que incluye Ub-HZA.Estos conjugados de bajo peso molecu­ lar se encontraron en muchas fracciones subcelulares y solo en nucleo se localizó Ub-HZA(Raboy et al, 1986). El mismo grupo, también en cultivos celulares de hepatoma, encontró que un alto porcentaje de conjugados de alto peso molecular sedimentaba con la fracción de iDDOOOxgyse solubilizaba con deoxicolato. Estos resultados indican la asociacion a membranade estos conjugados. Despuésde un estres térmico, el pool de ubicuitina li­ bre y el nivel de conjugados Ub-histona se reduce rápidamente y predominan los conjugados “MWque ademas, no requieren sintesis proteica para su formación (Carlson et al, 1987). Este mismo grupo, además, observó una reducción en la degradación de proteinas, tanto endógenas como exógenas, BSA, he­ moglobina y ubicuitina inyectadas en celulas HeLaque habian su­ frido shock termico. Sin embargo, despues de tratamientos térmi­ cos reversibles (5 min a 45°C), la velocidad de proteólisis no variaba, y además, retornaba, junto con el nivel de ubicuitina Introducción libre, a los valores basales después de incubarlas a 37°C. En cambio, si el tratamiento era mas extenso (30 min a 45°C), ni la velocidad de proteólisis ni el nivel de ubicuitina libre retorna­ ban a los niveles basales (tratamiento letal). Los trabajos con celulas de hepatoma murino en cultivo de Parag et al (1987) indicaron que un tratamiento temporario a 43°Caceleraba en primera instancia, la degradación de proteínas de vida media larga (Z h pcs-tratamiento). Posteriormente, la ve­ lccidad retornaba al nivel inicial. Durante la primera fase exis­ tía un aumentoen la conjugación de ubicuítina a proteínas. celu­ lares que se acompañabacon una caída en los niveles de ubicuiti­ na libre y de Ub-HZA.Prolongando la incubación a 43°C, los nive­ les de los conjugados se reducían, con el correspondiente aumento de ubicuitina libre y de Uh-HZAa los niveles iniciales. La incu­ bación por pasen sucesivos a temperatura creciente no variaba el grado de proteólisis hasta 43°C ya que el mismodependía de la temperatura final. Un tratamiento termico a 45°C causó una inhi­ bición de proteólisis intracelular despues de 30 min, lo que in­ dica una inactivación térmica del sistema proteolítico. La inhibición de la sintesis de proteínas hsps, tanto con actinomicina D (2 pg/ml) como con cicloheximida (0,2 pH), no alteraba significativamente la cinética bifásica de la degrada­ ción proteica (en particular, la primera parte). ni la conjuga­ ción de ubicuitina. De estos resultados se deduce que la induc­ ción temporaria de la degradación proteica causada por el trata­ miento termico y la conjugación de ubicuitina no depende de la síntesis de proteínas hsps. Noobstante, el tratamiento con acti­ nomicina D no permitía restaurar los niveles de Ub-HZAen trata­ mientos térmicos continuados a 43°C a diferencia del tratamiento con cicloheximida. Cuando a celulas que habían sufrido un ShOC’ térmico, (que ya habían acumulado hsps) se les imponía por segunda vez otro ShOCktérmico, la degradación proteica nuevamente aumentaba al mismo nivel que durante la primera ronda de tratamiento. La presencia de hsps en el momentodel shock termico no era capaz de evitar este aumentode proteólisis (Parag et al, 1988). En Chlamydomonasreinhardtii, el estrés térmico (>40°C) induce un aumento de conjugados "MWcon una reducción del nivel de ubicuitina libre y de conjugados de 28 y 31 kD. La incubación prolongada a 40°C eleva sólo el nivel del conjugado de 28 kD y no de ubicuitina libre, a valores iniciales. Estos conjugados pare­ cerían no ser complejos Ub-hlstona (Bhimcgawara y Huto, 1989).

Resp. estrés térmico - 68 Introducción

El tratamiento térmico causa un cambio conformacional o una desnaturalización proteica que seria reconocido como señal para 1a degradacibn por el sistema dependiente de ubicuitina. Despues de la ruptura de las proteinas anormales formadas, la ve­ locidad de proteólisis intracelular disminuyea niveles basales. La sintesis de ADNparece reducirse rápidamente después de un estrés térmico, como así también los niveles de Ub-HZA. Además, el procesamiento de ARN y el armado de ribosomas, se ve también afectado. Bond et al (1988), sugirieron que los efectos inducidos por estrés estarían relacionados con los cambios en la estructura de la cromatina producto de la remoción de ubicuitina de las histonas. ' En la línea celular FM3At685(El termolábil), es amplia­ mente reconocida la condensación anormal de la cromatina cuando estas células crecen a temperatura no permisiva por ausencia de Ub-HZA(Hatsumotc et al, 1980, 1983; Maronouchi et al, 1980). En esta linea murina, la degradación proteica no aumenta en respues­ ta al tratamiento térmico a 43°C, a diferencia de lo que ocurre en la cepa salvaje FHBA.Estos resultados refuerzan la idea de que el sistema dependiente de ubicuitina esta involucrado en la degradación de proteínas desnaturalizadas por tratamiento térmico (Parag et al, 1987).

Resp. estrés térmico —69 Introducción

3.1.14. LOCALIZACION DE LA UBICUITINA EN LA SUPERFICIE CELULAR Y EN EL CITOESQUELETO

La función mejor conocida de la ubicuitina es la de mar­ cadora de proteinas destinadas a la degradación. Este mecanismo contribuye a la eliminacion tanto de proteínas normales de vida media corta, comoproteínas anormales o dañadas. En la membranacelular externa, hasta el momentose co­ nocen 3 receptores que contienen ubicuitina covalentemente unida en su estructura. El primero de ellos identificado fue la protei­ na gp94 que codifica para un receptor linfocitario (lymphocyte homing receptor — LHR)(Siegelman et al, 1986; St.John et a], 1988). Luegoapareció, también asociado a ubicuitina, el receptor murino del factor de crecimiento derivado de plaquetas (rPDGF)(Yarden et al, 1986), y el receptor de hormona de creci­ miento en higado de conejo (rGH)(Leung et al, 1987). Estas modificaciones en los receptores involucran un en­ lace isopeptidico comonormalmente ocurre con otro tipo de conju­ gados con ubicuitina. E1 receptor que está mejor caracterizado es el LHR, y de los otros solo se conoce que la expresión del CADN que codifica para el rGHes funcional en la union del ligando con alta afinidad, lo que no involucraria a ubicuitina comonecesaria en esta función. Los linfocitos de sangre aeriferica entran a los organos linfáticos (nódulos, placas de Peyer, etc.), a través de vasos sanguíneos llamados venas aos-capilares de endotelio profundo. Se demostro que la union a estos capilares era especifica y, a tr:­ ves de receptores presentes en la superficie linfocitaria, deno­ minados homjng receptora (Gallatin et al, 1983). El anticuerpo monoclonal MEL-14reconoce'especificamente los receptores involu­ crados en la union a nódulos exclusivamente y además inhibe in vitro la union a capilares de nódulos linfáticos cuando se prein­ cuban con linfocitos. Usando este anticuerpo comosonda en una genoteca de cAUHconstruida a partir de mABHaislado de un linfo" ma de celulas B (BBC-13), se detectaron clones que codificaban para ubicuitina. El MADMEL-14reconoce específicamente ubicuiti­ na desnaturaiizada o el péptido 64m76,pero no ubicuitina nativa ni los conjugados Ubuprotcinas citoplasmatjcos, lo que sugiero la capacidad de esta proteina de adoptar diferentes conformaciones (Smith y Fried, 1987). Además, los anticuerpos monoclonales con­ tra ubicuitlna reconocen antígenos de la superficie de celulas linfocitarlas.

Ubi sup. y citoesq. - 70 Introducción

También se determinó en LHRpor secuencia de aminoáci­ dos, la presencia de dos N-terminales, uno de los cuales pertene­ cia a ubicuitina. Todosestos resultados sugieren que la ubicui­ tina esta involucrada en el reconocimiento y que su presencia se­ ría critica para la interacción del receptor (LHR)con su ligando (Reichert et al, 1983; Seale, 1981). E] extremo N-terminal de la secuencia del LHRtiene 4 residuos llsinas entre los primeros 32 aminoácidos, resultando una especulación atractiva considerar este fragmento comoputati­ va zona de unión a ubicuitina vía enlace isopeptidico. Sin embargo. poco se conoce de Cómola ubicuitina alcan­ za 1a superficie celular y cómoes su transporte en ausencia de sefial conocida para su tránsito por el reticulo endoplásmico o el complejo de Golgi. Neissman sugiere que el agregado sería co-tra­ duccional mientras esté disponible todavía en citoplasma, convir­ tiendose así en un evento temprano de maduración. Es interesante destacar que el extremo N-terminal de la ubicuitina es muyhidrofohico y podria actuar comoseñal, no cla­ sioa, para la localizacion en este compartimento (Wilkinson, 1987b) como ocurre con el factor de crecimiento de leucocitos (LGF) que se secreta (Ver HiSTORlA). Tampocose conoce una explicación para la presencia de ubicuitina en la superficie celular y varias hipótesis especuian con la velocidad de degradación diferencial de los receptores in­ ternalisados con o sin ubiouitina unida (Hart, 1986), o con que los cambios conformacionales de uhicuitina podrian contribuir a la union específica de algunos receptores (Marx, 1986). Parece probable one Ja presencia de conjugados con ubi cuitina en superficie sea un fenómenomás general (Siegelman et al, 1986). Algunas especulaciones acerca de la localizacion de ubicuitina en la superficie celular fueron propuestas por Wilkin­ son (ISSTD). Meyer et a] (1936, 1987) comunicaron la inhibición, por anticuerpos monoespecificoe que reconocian ubicuitina, de la en­ trada de colina, GABA,glutamato, norepinefrina, aspartato y se­ rotonina dependiente de sodio en sinaptosomas corticales de cere­ bro de rata. Estos Ab se unen especificamente a la superficie ex_ tracelular de estos sinaptosomas, de manera saturable, en un ran­ go de concentración idéntico al que ejercen inhibición. lo que sugiere que los transportadores extracelulares o sitios cercanos sean los epitopes que reaccionan. En estas condiciones no se ob­ servó incorporación del anticuerpo por los sinaptosomas.

Uhi sup. y citoesq. —71 Introducción

Tanto el transporte de colina independiente de sodio, comola liberación de acetiicolina dependiente de calcio, no se ven afectados, indicando que el anticuerpo anti-ubicuitina no compromete la funcion de la membranaen forma general, ni depola­ riza los terminales nerviosos colinérgicos. lo que demuestra la especificidad de la inhibición por el anticuerpo. Los hallazgos de ubicuitina conjugada especificamente a histonas y moléculas presentes en la superficie celular, clara­ ,mente demuestran la presencia de la mismaen diferentes comparti­ mentos celulares. La distribución celular fue estudiada utilizando ubicui­ tina marcada con 1351; tanto libre comoconjugada está presente en citosol y nucleo (Carlson y Rechsteiner, 1887). También por microscopía electronica en células de hepntomn, Schwartz et a] (1988) lograron detectar la presencia de ubicuitina libre en ci­ toplasma, núcleo, microvellosidades, vacuolas autofágicas, liso­ somas y matriz citoplasmática. No fue localizada la presencia de ubicuitina en el caminobiosintetico de secreción, incluyendo complejo de Golgi, reticulo endoplásmico rugoso y vesículas se­ cretoras, comoasi tampoco en mitocondrias, Sin embargo, Zhuang et al (1988) comunicaron la inhibición de la inserción en membra« na por Ab anti-ubicuitina dc la monoaminoácidoxidasa sintetizada in vitro. Unhallazgo interesante del grupo de Schwartz et al es 1a abundancia relativa de señal asociada a ubicuitina en eucroma­ tina, que está de acuerdo con los resultados del grupo de Var­ shavsky et al (Levinger y Varshavsky, 1982; Barsoum y Varshavsky, 1935). Por inmunofluorescencia y microscopía electrónica en ce­ lulas BHK,Hurti et al (1988) demostraron la asociación de ubi­ cuitina con la red de microtubulos en todos los estadios del ci­ clo celular, y que la tubuljna en particular no se encontraba conjugada a ubicuitina. Estos autores proponen que la ubicuitina libre o conjugados proteicos de ubicuitina formarian parte de un nuevo grupo de proteinas asociadas a microtubulos. Ball et al (1987) también comunicaron la presencia en musculos asociados a la funcion de vuelo en Drosophila, de un conjugado estable de actina con ubicuitina, denominada nrtrina (actina de artrópodos). Todas las enfermedades neurodegenerativas (la más cono­ cida es la enfermedad de Alzheimer), se caracterizan por la dege­ neración y eventual muerte de Jan celulas nerviosas, y en algunas de estas enfermedades, las neuronas vulnerables contienen estruc"

Ubi sup. y citoesq. —72 Introducción turas fibrosas características o cuerpos de inclusión. Estas in­ clusionesto celular. fibrosas contienen elementos derivados del citoesquele­ A pesar de las diferencias morfológicas y antigénicas que presentan estos cuerpos de inclusión, la mayoría comparte un componente, la ubicuitina. Mori et al (1987) identificaron a la ubicuitina como un componente de los tramados neurofibrilares (NFT) en la enfermedad de Alzheimer, y otros grupos extendieron esta observación a otras enfermedades neurodegenerativas (ver Tabla IV)(Cole y Timiras, 1987; Perry et al, 1937; Lennox et al, 1988; Manetto et al, 1888; Lowe et al, 1988a). También en la enfermedad de Alzheimer, la proteina fos­ forilada asociada a microtúbulos, tau, se expresa en forma abe­ rrante y puede ser detectada inmunológicamente en NFTaunque Con una distribución diferente a ubicuitina (Shawy Chau, 1988). A pesar de que algunos anticuerpos monoclonales que re­ conocen ubicuitina revelan la red de microtúbulos en células en cultivo (Murti et al, 1988), la ubicuitina no se encontró conju­ gada a proteinas de citoeequeleto de donde derivan los cuerpos de inclusión. La acumulación de ubicuitina probablemente este rela­ cionada con el proceso de neuredegeneracien y no ser quedar atra­ pada con eempcnentes del citoeuqueleto durante la formacion de lee cuerpo93 de inclusión (Mare-Gallo y Andereon, 1989). Estas acumulacionesde ubicuitina sen tan caracteristi­ cas de neuronas en degeneración que, tanto depositos densos como estructuras tramadas que contienen ubicuítina, han sido encontra­ das en células del asta anterior de la médula espinal en la en­ fermedad de neurona motora (Leigh et al, 1968; Lowe et al, 1988b) y no en controles sanos. Estos cuerpos de inclusion filamentosa están muy a menudo asociados con cuerpos de Bunina que se aseme­ jan a vacuolas autofágicas (Hart et al, 1977).

Ubl sup. y citoecq. —73 Introducción

TABLAIV: Conjugación de ubicuitina en inclusiones neuronales presentes en los desórdenes neurológicos más comunes

Grado de conjugación Desorden (Enfernedad) Inclusión Inennoreactividad e ubicuitina Referencia

Alzheiner "araña neurotibrilar de Tau, fragsentos de cade- +9! Hori et al, i931 filanentos en hélice nas ledia y pesada de Cole y Tiniras, 1987 neuroíilanentos Perry et ai, 1987 Lennox et al, 1933 Shaw y Chau, 1933

Cuerpos de Hirano Actina, tau, tropoliosina Hanetto et al, 1933

Degeneración grannlo- Tubulina. nenrofilaaentos Algunos Perry et al. 1931 vacnolar (cadenas pesadas) r

Parkinson cuerpos de Levy Neuroiilanentos. actina +4} Hanetto et el, 1938 Lowe et al. 19333 Bancher et al, ¡989 Hurayana et a}, 1939 Gallouay et al, 1939

Pick cuerpos de Pick Tau, neurofilalentos ++r Hanetto et ai, 9138 (cadenas nedia y pesada) Loweet al, l933a

Parálisis progresiva Haraña nenrofibrilar Tau Algunos Lennoxet al, [933 supranuclear de tilalentos rectos y Hanetto et a1, 1938

Neurona ¡otora Inclusiones densas y 94+ Leigh et ¿1.-1933 traladas Lowe et al. 1933b

Extraido del artículo de Gallo y Anderson (1989).

La ubicuitina también se vio asociada a los cuerpos Mallory, inclusienes celulares ne relacionadas een neurodegenera­ ción, que ocurren en enfermedades hepáticas en alcohólicos y que, aparentemente, derivan del sitoesqueleto hepático (Lowe et al, 1938a; Ohta et al, 1988). Estos cuerpos de inclusión son resis­

Ubi sup. y citoesq. — Introducción tentes a.la degradación dependiente de calcio, lo que sugiere un desbalance en el equilibrio síntesis-degradación. El tratamiento con níquel o el shock térmico induce la agregación de filamentos intermedios (lF), que se localizan cerca del nucleo. Se demostró la presencia de citoqueratina y.ubicuitina en estos cuerpos de inclusión y los resultados de Cadrin et al (1989) indicarían que la conjugación de ubicuitina estaria involucrada en la agregación de los lFs. sugiriendo que el proceso de conjugación podria regu­ lar la organización de citoqueratina en la célula. La ubicuitina cumple, entre otras, una función depurado­ ra (scavenger) en la celula. La acumulación en cuerpos de incluw sien aedria explicarse comouna sobrecarga del sistema proteeli­ tico por la presencia de proteínas anormales o dañadas que in­ cluirían componentes del citoesqueleto. Otra posibilidad seria que la conjugación de ubicuitina forme parte de un mecanismo de aislamiento de proteínas anormales en una malla perinuclear de filamentos intermedios (Hare-Gallo y Anderson, 1989). Noobstante, es interesante destacar el aumento en la tinción para hierro no hemico localizado en los tramados y placas presentes en celulas provenientes de pacientes con enfermedad de Alzheimer (Hallgen y Seurandcr, 1960). Teniendo en cuenta el efecto inhibiterie de la hemina sobre la degradación dependiente de ubicuitina (Haas y Rosa, 1931), es atractivo especular con es“ ta relación. Se suman a las patologías descriptas anteriormente. otras enfe‘A... .lades neurodegcnerativas como síndrome de Downy dc" mencia pugilistica, que aumentanel espectro de etiologias en las que ubicuitina está involucrada. Probablemente, el sistema depen­ diente de ubicuitina forme parte de un camino final común que lleve a la formación o modificación de estas marañas de neurofi­ brillas, másque la ubicuitina per se sea el agente causal de to­ das estas enfermedades. El estudio in vivo de la respuesta al estrés por exposi­ ción crónica a agentes tóxicos que inducen degeneración neuronal (Uney, 1988) e isquemia (Magnusson y Hieloch, 1989), podría con­ tribuir a entender los mecanismosde acumulación de ubicuitina en los cuerpos de inclusión y su significado en las enfermedades neurcdegenerativas. Cabe recordar que en eucariotes superiores, la ubicuitina es una proteina de respuesta a estrés (ver RESPUESH TA A ESTRES TERMICO).

Ubi sup. y citoesq. —75 Introducción

3.1-15. GENETlCA Y REGULACION DE LOS GENES DE UBICUITINA

3.1.15.1. Leladunas (Saccharomycescerevisjae)

En levaduras, comoen otros eucariotes, existe una com­ pleja familia de genes que codifica para ubicuitina (Ozkaynak et al, 1987). Aunquetodos estos genes codifican para secuencias de la proteína ubicuitina, ninguno lo hace para la proteína madura sino para un precursor en la que la ubicuitina se encuentra fu­ sionada por su extremo C-terminal a si misma (arreglo en tandem cabeza-cola en poliubicuitina), o bien a una secuencia aminoací­ dica no relacionada (ver Fig. 12). Invariahlemente, la ubicuitina es el producto del procesamiento pos-traduccional de un precursor proteico. A pesar de la divergencia a nivel de la secuencia nu­ cleotidica de los genes Unll-UB14, todos ellos codifican secuen­ cias aminoacidicas idénticas para ubicuitina. Por hibridación a baja estringencia de ADNgenomico, utilizando como sonda cada uno de los 4 genes, no se reveló ninguna secuencia extra que híbrida" ra cruzadamente, que no fuera Justifieada por los datos conoci­ dos. ' La proteina de fusión que codifica al gen UBIl consiste en un monomerode ubicuitina seguido de una extensión de secuen cia no relacionada de 52 aminoácidos (Ozkaynak et al, 1987). La secuencia de la proteína de fusión codificada por el gen UBIZ e idéntica a la del gen UBll pero con un 15%de divergencia a nive nucleotídico. El tercer gen que codifica para este tipo de proteínas de fusión, es el UBl3. En este gen la secuencia de 76 aminoácidos de la extensión es muy poco homóloga con la anterior de 52 resi­ duos aminoacidicos codificada por los genes UBIl-UBIZ (Lipman y Pearson, 1985). Sin embargo, ambas extensiones comparten caracte" rísticas particulares de proteínas que hacen unión a ácidos num cleicos. Nosólo están enriquecidas en aminoácidos básicos, sino que poseen además, arreglos de cinteinas (C) (Ver Fig. 12) con motivos originalmente encontrados en el factor de transcripción de Xencpus, TFIllA (Miller eL 31,1985) denominado "zinc fingerJ".

Genes de Ubi - 76 Introducción

Organizacion de los genes de Ubi en levadura.

“El1-2

Secuencia consenso de ”Zn fíngers". _ 2-4-629'X‘2-14_@_X2-4_'­

Fig. 12EjLQL/ÏLELTIEXdela ¿Lelea de

L__+ Genes de Ubi - 77 Introducción

Estos dominios potenciales de unión a metal han sido identificados en otras proteinas parecidas al factor TFIIIAy se encuentran implicados en la union a ácidos nucleicos (Klug y Rhodes, 1987; Blumberg et al, 1937; Evans y Hollenberg, 1988). La secuencia de aminoácidos de ubicuitina es idéntica en mamíferos, ranas, peces e insectos (ver EVOLUCION),y difiere sólo en 3 aminoácidos de la secuencia de levadura (Ozkaynak et al, 1984, 1987; Wilkinson et al, 1986). Las extensiones de las proteinas codificadas por los genes UBIl-UBIStambién son alta­ mente conservadas evolutivamente (Oskaynak et al, 1987) y, en particular, la extensión de 52 aminoácidos de levadura (UBll/ UBIZ) es 83% homologa a la correspondiente de humanos (Salvesen et al, 1987)(ver EVOLUCION).Para el caso de la extensión de 76 aminoácidos íUHls), la homologia con la correspondiente en huma­ nos es de 6 % (Lund et al, 1935). Secuencias similares a los genes UBll/UB12de levadura, fueron también encontrados en Diutyostejium discoideum (Westphal et al, 1986), Trypanosoma crusi (Suindle et al, 1988) y plantas (Burke et al, 1983). La expresion del gen que codifica para poliubicuitina (UBI4) y los genes de fusión, estan regulados por el estado meta­ bólico y de desarrollo en varios organismos (Bond y Schlesinger, 1986, 1986; Dworkin-Rastl et a], 1934; Niborg et al, 1986; Gau­ sing y Barkardottir, 1986; Lund et al, 1985; Westphal et al, 1936; Ozkaynak et al, 1987; Giordu y Ennis, 198?). En levaduras, los genes UHII-UBlBse expresan durante el crecimiento exponencial. mient‘as que para UBIl/UBIZ, su ex­ presión no es detectable en etapa estacionaria y se reprimen en respuesta al ayuno o por shock termico (Ozkaynak et al, 1987). A diferencia de otros genes de levaduras, UBIQse sigue expresando durante todas estas condiciones. Un tercer patron de regulación es el que muestra e] gen UBI4, con una expresión baja durante el crecimiento exponencial, pero que sufre una gran inducción en respuesta al ayuno, shock térmico y otros estres (Ozkaynak et al, 1987; Finley et al, 1987)(ver RESPUESTAAL ESTRES TERHJCO). Por ejemplo, el agregado de agentes que dañan ADNagre­ gados durante el crecimiento exponencial, comoasi también condi­ ciones de crecimiento en alta densidad celular, son inductores del transcripto codificado por UHI4(Trcger et al, 1983; Finloy et al, 1937).

Genes de Ubi - 78 Introducción

El producto del gen UBI4parecería no ser necesario pa­ ra permitir 1a entrada a fase estacionaria, sino para la supervi­ vencia. Dicho producto, de 243 kD, consta de 5 repeticiones idén­ ticas en tandem de secuencias de ubicuitina, unidas cabeza-cola sin secuencias espaciadoras (Ozcaynak et al, 1984, 1987). La ge­ neración de ubicuitina madura implica el procesamiento de este precursor proteico en la unión glicina-metionina entre repeticio­ nes adyacentes por una proteasa que también procesaría las prote­ ínas de fusión naturales que codifican los genes UBIl-UBI3 (Bach­ mair et al, 1986). El númerode repeticiones por locus de poliubicuitina varía considerablemente entre especie y hasta entre cepas de una misma especie (Lee et al, 1933; Burke et al, 1988; Graham et al, 1989; Ozkaynak et a], 1984; Dworkin-Rastl et al, 1984; Bond y Schlesinger, 1985; Hiborg et al, 1935; Arribas et al, 1986; Gau­ sing y Barkardottir, 1986; Giorda y Ennis, 1987; Baker y Board, 1987a, 1987b; Swindle et al, 1933), lo que sugiere que estos loci sufren frecuentes eventos de recombinación desigual (Sharp y Li, 1987a). La organización comopoliproteina de ubicuitina es bas­ tante sorprendente. Sólo fueron descriptas poliproteínas como productos de genes virales (Hanecak et al, 1984) o de secreción (Douglass et al, 1934; Scheller et al, 1933), que además conteni­ an secuencias espaciadoras que se eliminaban por procesamiento. Con 1a excepción de los precursores proteicos de los factores de apareamiento de levaduras, ninguna otra poliproteina conocida te­ nía tantas repeticiones internas (Kurjan y Herskowitz, 1932; Julius et al, 1983). También se han encontrado variaciones en los genes de fusión como en Trypancsoma crusi (Swindle et al, 1983) y parási­ tos relacionados (Kirchhoff et al, 1938) en el numerode repeti­ ciones de ubicuitina asociadas (ver Irxpanosgmatidae). Todos los genes de poliubicuitina hasta el momento se­ cuenciados, con excepcion del de isnopus laevis (Dworkin-Rastl et al, 1934), contienen en el extremo C-terminal de la última repe­ tición, por lo menosun aminoácido extra que es diferente en cada especie (Lee et al, 1988; Burke et al, 1988; Graham et al, 1939; Ozkaynak et al, 198; Bond y Schlesinger, 1935; Hiborg et al, 1935; Arribas et al, 1936; Gausing y Barkardottir, 1986; Giorda y Ennis, 1987; Baker y Board, 1987a, 1937b; Swindle et al, 1988). El bloqueo que ejerce este aminoácido extra en el C-terminal de la glicina precedente, serviría para evitar la participación de la poliproteína no procesada en procesos de conjugación.

Genes de Ubi - 79 Introducción

La expresión del gen de poliubicuitina de levaduras (UBI4) está regulada por cAHP.En mutantes cyr-l (adenilato ci­ clasa termolabil), este gen se induce por bajos niveles de cAMPy es independiente de síntesis proteica de novo. El tratamiento con cicloheximida aumenta la transcripción de UBI4, y se reduce en presencia de CAMP. Como la reducción de los niveles de CAMP en levaduras, causa una detención en Go/Gl, se presume que UBl4 es específicamente requerido en esta etapa (Tanaka et al, 1988). Sin embargo, la inducción de la transcripción del gen UBI4por shock térmico es independiente de la cascada de CAMP. En levadura, las extensiones que codifican los genes UBIl y UB13, se encontraron presentes en las subunidades riboso­ males 603 y 408, respectivamente. Además, una proteína con se­ cuencia N-terminal homóloga a la extensión de 76 aminoácidos co­ dificada por el gen UBI3 fue identificada previamente como la proteina ribosomal 837 (Y824)(Finiey et al, 1989; Warner, 1933; Otaka et al, 1984). Redmany Rechsteiner (1989), utilizando anticuerpos di— rígidos a la extensión de 80 aminoácidos de mamíferos, encontra­ ron esta proteina localizada en la subunidad 408 y la identifica­ ron como la proteina ribosomal 827a (ver Hamiíeros). A pesar de que no están tan conservadas comola ubicuitina, la proteina de levadura 827 y la 327a de mamíferos, son similares. Estos resultados se refuerzan con los datos obtenidos por Müller-Taubenberger et al (1989) que localizaron, también utilizando anticuerpos dirigidos a la extensión de 52 aminoácidos de Dictyostelium discoideum, el producto del gen DUBl(Ubebe) en la subunidad 405 (ver más adelante, Qictggsïfilium disgqidggm). En la fase exponencial de crecimiento en levaduras, la mayorparte de la ubicuitina se genera a partir de las proteínas hibridas codificadas por los genes UBIi-UB13.El gen de poliubi­ 'cuitina (UB14)es prescindible en este estadío, pero es esencial. comoproveedor más importante de ubicuitina, en condiciones ad­ versas o de estrés (Finley et al, 1987). Las deleciones en los genes de fusión, a diferencia de lo que ocurrre con UBI4 (Finley et a], 1987), confieren un feno­ tipo de crecimiento lento que se acentúa muchoen mutantes ubiJ y, en menor grado, en mutantes ubi] o ubifi. Este es un efecto en la dosis génica, ya que UUII y UBIZcodifican idénticas proteínas (Ozkaynak et al, 1937). Sin embargo, la doble mutante ubil ubiZ no es viable, lo que lleva a considerar comoesenciales a los productos de los genes UBIl y UBIZfuncionalmente intercambia­ bles. Los niveles de ubicuitina libre en mutantes por deleción de

Genes de Ubi — 80 Introducción cualquiera de los 4 genes. son apenas menores que los encontrados en la cepa salvaje. La transformación con un vector que exprese ubicuitina libre aún bajo un promotor heterólogo, no rescata la doble mutante ubil ubif. Sin embargo, 1a transformación con un vector que expresa sólo la extensión del gen de fusión UBI3, ya sea bajo un promotor heterólogo o por deleción de la parte co­ rrespondiente a ubicuitina, complementa totalmente la mutación ubiJ, no sólo en el defecto de crecimiento sino también en la hi­ persensibilidad al ayuno de fuente de nitrógeno, tamaño anormal y defecto en el procesamiento de precursores de ARNribosomal pre­ sentes en estas mutantes (Finley et al, 1989). Todos estos resultados indican que las extensiones de estas proteínas híbridas tienen funciones relacionadas con el crecimiento, y que lo esencial es la función que ejerce la exten­ sión exclusivamente. La transformación de una mutante triple Ubi] ubiZ ubifi con un vector que expresara exclusivamente las extensiones de los genes de fusión UBIi y "813, no sólo induce apreciablemente el gen UBlá, unico gen proveedor de ubicuitina en esta mutante, sino que demostró que no era necesaria la fusión de ubicuitina con una extensión enriquecida en aminoácidos basicos para transportarla al núcleo como se proponía anteriormente (Ozkaynak et al, 1987). Sorprendentemente, tanto la mutante doble ubil ubi3, como ubiZ ubiS, crecen relativamente más rápido que la simple mu­ tante uij, en la que a su vez el nivel de ubicuitina libre es mayor que en cualquiera de las dobles mutantes. Teniendo en cuen­ ta que Jas simples mutantes ubil o Ubi? crecen más lentamente que la salvaje, ambas mutaciones se comportan comosupresoras débiles sobre la mutación ubi3. La relación estequeométricas de los rARN 188 a 253 están apreciablemente alterada en la mutante ubifl. Am­ bos rARNderivan de un precursor unico de 355 (ver Fig.13)(Planta y Rané, 1988; Warner, 1981). En el caso de la mutante ubiJ, el procesamiento del rARHes incompleto, reduciéndose ia velocidad de formación del 185. La mayor parte del precursor de 203 es degradado en vez de ser procesado, pero no se ve afectado el procesamiento que lleva a la formación del rARNde 255 en esta mutante. Este defecto en el procesamiento del precursor 205 no se puede explicar simple­ mente por un defecto de transporte al citoplasma, donde normal­ mente se procesa (Warner, 1981), aunque explicaría en parte el defecto en el crecimiento observado en esta mutante, ubiJ. La mu­ tación ubi] o ubiZ restaura parcialmente la estequeometria de los rARN133 a 255 en el contexto genético de la mutante ub13, lo que indica que los productos de los genes UBIl/UBIZ y UBia estan in­ volucrados en el armado o en el recambio de los ribosomas.

Genes de Ubi - 81 Introducción

358

328

278 208 V 4 258 188 Ñ nivel de procesamiento por las extensiones.

Fis. 13- Emma del m&ami.&tú& del LAI!!!deMadura.

La integración en el ADNgenomico de la mutante ub13 de una copia completa del gen UBJBsalvaje, revierte totalmente el defecto de crecimiento. Por el contrario, la integración de sólo la parte correspondiente a la extensión (ubifllïub) sólo restaura el fenotipo salvaje, si estan presentes las copias en tandem. Es­ to indica que la porción de ubicuitina correspondiente en esta proteína híbrida, a pesar de que no es estrictamente necesaria para el procesamiento del precursor de 205 premrARN,facilita es­ ta reacción, aparentemente aumentandola eficiencia de incorpora­ ción de la extensión a la subunidad 405 naciente (Finley et al, 1939). La supresión parcial del defecto de crecimiento de la mutante ub13 por las mutaciones ubi] o ubiZ, se debería a una re­ ducciJn del exceso de subunidades BUS, anormalmente alto en las mutantes abia, que podrían titular las subunidades 408 y reducir

Genes de Ubi — 82 Introducción su concentración por debajo de los niveles necesarios para una traducción eficiente. A pesar de que la unión de las dos subuni­ dades 408 y 608 ocurre después de que la subunidad 405 se unió al mARN,ambassubunidades tienen una significativa afinidad resi­ dual entre ellas, aún en ausencia de mARN(van Holde e Hill, 1974). Finley et a1 (1989) también demostraron, por la tecnica de 1mmuncblot,que existia procesamiento in Vivo de estas protei­ nas hibridas con la eliminación de la porción correspondiente de ubicuitina eficientemente. Este procesamiento rapido in vivo es característico en células eucariotas, pero no en bacterias, tal como el observado en las construcciones hibridas Ub-Bgal (Bach­ mair et al, 1986). Queda entonces ampliamente demostrado que las extensio­ nes de los genes de fusión codifican para proteínas ribosomales que forman parte de la subunidad 408 (UBI3) y 608 (UBIl/Z) de ri­ bosomas maduros traduccionalmente activos. Examinandola secuen­ cia nucleotidica en la zona 5' de los 3 genes de fusión (Ozkaynak et al, 1987), se encontró además, secuencias consenso caracterís­ ticas de genes que codifican para proteinas ribosomales (Planta y Rané, 1938), comoasí también motivos ricos en T característicos de promotores de los mismos genes (Finley et al, 1939). Ciertas proteínas conocidas como “molecular chapero­ nes“, se asocian temporariamente y no covalentemente con péptidos recientemente sintetizados, facilitando su incorporación a es­ tructuras oligoméricas, no formanparte de estas estructuras, ni contienen información para distribución esterica (Ellis, 1937; Hemmingsen, 1984; Cheng et al, 1989). En el caso de la proteína de fusión, la parte correspondiente a ubicuitina actuaría comoun "molecular chaperone" de la extensión, facilitando su incorpora­ ción a ribosomas. La asociación covalente tiene por lo menos dos ventajas adicionales, comola de proteger al ligando (extensión) en el momentode su síntesis, o bloquear su N-terminal resguar­ dandolo de la degradación (Bachmair et al, 1936), y la de elimi­ nar la necesidad de sitio de reconocimiento previo. Es muyprobable que las extensiones, comootras proteí­ nas ribosomales (Planta y Raue, 1933), tengan una vida media ex­ tremadamente corta cuando no se encuentren ensambladas en los ri­ bosomas. La parte correspondiente a ubicuitina en estas proteínas de fusión contribuiría a aumentar la eficiencia de incorporación a ribosomas nacientes por estabilización metabólica de las exten­ siones sintetisadas. A pesar de que la conjugación de la ubicui­ tina a las proteínas sirve comoseñal para la degradación, esta actividad parecería requerir cadenas ramificadas con múltiples moleculas de ubicuitina (Chau et al, 1939; Butt et al, 1938b)

Genes de Ubi — 83 Introducción

El grupo de Crooke (Ecker et al, 1989; Butt'et al, 1989) encontró que tanto en levadura comoen 5.0011 la expresión de proteínas heterólogas mejora si se las fusiona a ubicuitina. En los experimentos con levadura los niveles de ARNmensajero son normales,lo que sugiere o bien una eficiencia más alta de traduc­ ción, o una estabilización por protección del N-terminal. Otros mecanismospropuestos estarian relacionados con el plegamiento inducido por la fusión con una proteina comoubicuitina que esta energéticamente favorecido. La presencia de ubicuitina en las proteinas de fusión podría estabilizar quizás el hibrido durante la traducción hasta que el metal se coordinara.(Butt et al, 1989). Las proteínas de fusión de humanos fueron expresadas en S. cerevisiae, y en E. coli observándose sólo procesamiento en levadura (Honia et al, 1989b), generando ubicuitina intacta y la extensión. Sin embargo la incubación del producto de fusión ex­ presado en EZ coli con un lisado de reticulocitos de conejo, tam­ bién conducía a un correcto procesamiento. En concordancia con los resultados obtenidos por Finley et al (1989), la expresión de estos genes de fusión causa en S. cerevisiae una reducción en la velocidad de crecimiento. La localización cromosómica en levadura de los 4 genes de ubicuitina fue realizada por Moniaet al (1989a) por electro­ foresis en campos pulsados. El gen UBIl se localizó en el cromo­ soma 9, el UBIZ en el 11, y los genes UBI3-4, en el 12.

3.1.15.2. Elantas mantienes

Usando como sonda un clon de CADNde ubicuitina porcina (Niborg et al, 1985) Gausing y Barkardottir (1936) aislaron clo­ nes de ubicuitina de una genoteca preparada a partir de hojas de cebada (Hordeumvulgare). Estos contenían secuencias de ubicuiti­ na en tandem que sólo diferían en 3 aminoácidos con 1a secuencia bovina y sólo en dos posiciones con la de levadura. Otras secuen­ cias en plantas confirman la invariabilidad a nivel aminoacídico en este reino, comoavena (Avena sativa)(Vierstra et al, 1935, 1986); Arabidopsis thaljana (Burke et al, 1938), soja (Glyince max)(Fortin et al, 1988), girasol (Helianthus avenus)(Binet et al, 1989).

Genes de Ubi - 84 Introducción

La familia multigenetica de ubicuitina en cebada, por lo menos, está compuesta de 8-10 loci que dan lugar a 5 mARN de diferente tamaño (2000, 1700, 1300, 1100 y 700 nt). Los mensaje­ ros con mas de 1100 nt se expresan constitutivamente en la mayo­ ria de los tejidos. hojas verdes y etioladas, coleoptilos, raiz, endoperma, mientras que el transcripto de 700 nt sólo se detecta en aquéllos con activa división celular y está ausente en tejidos de hojas maduras (Gausing y Barkardottir, l936). En hojas de gra­ mineas, todas las divisiones celulares se llevan a cabo en el te­ jido meristemático basal. y las células envejecen a medida que se acercan al extremo de la hoja. El transcripto de 700 nt desapare­ ce a corta distancia de la base de la hoja. Si bien no esta confirmado por secuencia, tanto el ta­ mañocomoel estadio de desarrollo donde aparece (Hestphal et al. 1936; Giorda y Ennis, 1937; Finley et al, 1987), hacen sospechar que el transcripto de 700 nt corresponde al producto de un gen de 'fusión. Burke et al (1983) aislaron el gen de poliubicuitina de Arabidopsis thaliana (UUQ4)que contiene 5 repeticiones y 2 ami­ noácidos extras en el C-terminal de la última repetición. Estu­ dios posteriores revelaron la alta complejidad de la familia de genes que contenían ubicuitina con aproximadamente 11-12 miem­ bros. De los atros genes caracterizados, UBQByUBQ4 codifican para poliubicuitina, mientras que UBQly UBQZcodifican para ge­ nes de fusión con extension de 52 aminoácidos con intrones en am­ bas partes, UBQSy UBQ6para genes de fusion con extension de 81 aminoácidos sin intrones. Las dos familias de extensiones son ho­ mologas a las encontradas en levadura (ver Levadunas). Otro gen caracterizado, UBQT,codifica para un monómero perfecto de ubicuitina, fusionado a otro monómerode ubicuitina 74%homólogo a la forma canonica si se tiene en cuenta sustitu­ ciones de aminoácidos conservativas. No se conoce aún si este gen se expresa o es un pseudogen (Vierstra et al, 1988). La expresión en este organismo también es compleja, y por lo menos 4 mARN se acumulan en hojas verdes en un rango de tamaños entre 800 a 1900 nt. Después de un shock térmico, hay un aumento de un transcripto de 1700 nt y existe, además, una reducción del transcripto que codifica UHQ4quees singular en este organismo.

Genes de Ubi - 85 Introducción

La identificación del gen de poliubicuitina de Droso­ phila fue descripta por el grupo de Izquierdo (Arribas et al, 1986; Izquierdo et al, 1934). Usando como sonda un cADNcaracterizado por Lis et al (1981) comoperteneciente al grupo de genes débilmente inducidos por estrés térmico en Drosophila, se aisló de una genoteca de ADN genomico un clon, pPUb, que resultó codificar para otro gen poli­ ubicuitina con 13 repeticiones con caracteristicas análogas a los otros organismos (Lee et al, 1938). Las secuencias aminoacídicas de las repeticiones eran idénticas entre si, y a su vez idénticas ‘al otro gen aislado por Arribas et al (1986). Este último gen de poliubicuitina aislado, contiene 3 aminoácidosextras fusionados al C-terminal del último monómero. Existen por lo menos 2 loci para genes de poliubicuiti­ na y de los resultados de Southern blot se revela un alto poli­ morfismo, también observado por Izquierdo et al, lo que sugiere la flexibilidad de la longitud del gen de poliubicuitina, varian­ do su tamaño por recombinación desigual entre repeticiones en tandem. Lee et al (1983) también aislaron y caracterizaron un gen de fusión (UB3-D) en este organismo, con una extensión de 30 aminoácidos, 65%homólogo con la secuencia nucleotídica de la ex­ tension del gen UBI3 de levadura (Ozkaynak et al, 1987) y 82% a la extensión del correspondiente gen humano(Lund et al, 1985). Después de un estrés térmico, sólo se vio una inducción de apenas 3 veces del transcripto de 4.4 Kb (pPUB).

3.1.1.5.4. , . a" :1 ' e:

¡Grahamet al (1938) caracterizaron el gen de poliubi­ cuitina (UbiA) de Gaenorhabdjtis elegans, que consistía en tandem de 11 unidades, dando lugar a un transcripto de 2.5 kb. Otro transcripto pequeño de 700 nt (UbiB) también se reveló en la po­ blación de mensajeros analizada, pero hasta el momentono fue ca­ racterizado.

Genes de Ubi — 86 Introducción

El gen UbiAde este organismo presenta dos caracterís­ ticas interesantes que lo diferencia de todos los conocidos, son: i) la presencia de intrones en 1a zona codificante y 5'—nocodi­ ficante en el transcripto primario; ii) adquisición por "trans-splicing" de una secuencia lider de 22 nt en el transcripto maduro. Ambosmecanismos de procesa­ miento ocurren en el mismogen y tienen un importante valor evolutivo (Graham et al, 1933). El "mini exón" de 22 nucleó­ tidos también está involucrado en la maduración de 3 de 4 mensajeros maduros de actina en este organismo a partir de un ARNdador de 100 nt (Krause e Hirsh, 1987).

El mecanismode "trans-spljcing“ ya es conocido en tri­ panosomas, donde es un peoceso general que ocurre con todos los mARNe involucra el agregado en el extremo 5' de una secuencia de 35 nucleótidos que deriva de un ARNdador de 137 nucleótidos (Murphy et al, 1986; Sutton y Boothroyd, 1986; Van der Ploeg, 1936). El nivel de ambostranscriptos se mantiene relativamen­ te constante durante todo el desarrollo en la muday en estadios larvarios de resistencia a ayuno, desecación y detergentes. El transcripto que codifica la poliubicuitina no se in­ duce por estrés térmico. La secuencia aminoacídica de ubicuitina en C. elegans, difiere en sólo un residuo respecto de la de humano,y no existe variación intragénica en la secuencia de aminoácidos codificada por el gen UbiA. La conservación de la posición de los intrones en ias repeticiones en tandem, sugiere que el gen UbiAde este nematode evolucionó por una serie de duplicaoiones y eventos de recombina­ ción (Sharp y Li, 1987a) a partir de una unidad dimerica (+ —)ó trimérica (+ ——).

Genes de Ubi - 87 3.1.15.5. Introducción

El genoma de T. pyrifbrmis contiene una familia _mu1ti— genética de por lo menos 4 loci asociados con genes de ubicuiti­ na. La secuencia aminoacídica de ubicuitina codificada di­ fiere en sólo 2 residuos respecto de la correspondiente en humano (Wiborg et al, 1985). La secuencia del gen de poliubicuitina co­ difica para un residuo aminoacídico extra en el C-terminal de la última repetición. La presencia en la zona 5' no codificante del gen pTUZ de un elemento "SE (ver RESPUESTAAL ESTRESTERMICO), se correla­ ciona con la inducción del transcripto de 1.8 Kbque codifica pa­ ra poliubicuitina después de un "shock" termico o tratamiento con arsenito.

3.1.15.6. Qiptypstgligm disppjgkumz

La expresión de genes durante 1a germinación de esporas de D. discoideum, fue estudiada'por Kelly et a1 (1933). Uno de los clones de cADNque revelaba transcriptos que se expresaban durante la germinación resultó codificar para ubicuitina (pKL229). Su secuencia sólo diferia de 1a correspondiente a huma­ no en sólo 2 residuos aminoacídicos. Por estudios de Northern blot, y utilizando como sonda el clon pKL229 (DUBIQ), se encontraron 6 poblaciones de trans­ criptos 1900 nt (DUB14), 1499 nt (DUB 19 y DUBZ), 1100 nt (DUB17), 340 nt (DUBIB), 530 nt (DUBV45) y 500 nt (DUBV8), cuya expresión estaba regulada durante el desarrollo (Giorda y Ennis, 1987; Ohmachi et al, 1989). Resultados análogos fueron obtenidas por Westphal et al (1936). El transcripto de 1400 nt era el unico presente en esporas no germinadas, y después de 1,5 hs de germinación, reaparecían DUBl4, DUBl7 y DUB18, siendo las especies predominantes después de 3 hs de germinación, sólo los transcriptos mas grandes. En células en crecimiento, aparecen dos nuevos transcriptos (580 nt y 500 nt), y hay una gran reducción de los anteriores.

Genes de Ubi — 88 Introducción

La caracterización de los clones DUB14,19, 2, 17, 18, indican que todos pertenecen al grupo de poliubicuitina con 7, 5, 5, 3, 3 repeticiones en tandem, respectivamente. Los dos transcriptos pequeños de 580 nt (DUBV45)y de 500 nt (DUBVB)codifican para proteínas de fusión similares a las codificadas por los genes UBIl/Z y UBIBde levadura, respectiva­ mente (Ozkaynak et al, 1984). Los transcriptos más largos se inducen por una serie de estrés (Müller-Taubenberger et al, 1938a)(ver RESPUESTAALESTRES TERMlCO), y además por tratamientos con cicloheximida (50­ 500 pg/ml), amisomicina (40 pH) o emetina (500 HM). Conel objeto de estudiar la función de la extensión de 52 aminoácidos en los genes de fusión, Müller-Taubenberger et al (1988b) obtuvieron anticuerpos que reconocian un péptido corres­ pondiente a los aminoácidos 115-128 del extremo C-terminal de la proteina híbrida. Este Ab reconoce una especie proteica de 16 Kd, tanto en homogenatos de D, discoideum, como de bacterias trans­ formadas con un vector que expresaban la proteina híbrida. Esta proteina está presente durante el crecimiento y permanecedurante todos los estadios del desarrollo. Proteinas de tamaños similares fueron encontradas en levadura, ratón, Lejshmanja mexicana y en líneas celulares huma­ nas. En levaduras en crecimiento exponencial y en embriones de Droscphila se detecta, ademas, otra especie de aproximadamente la mitad de tamaño. Estos datos son consistentes con 1a idea de que la proteína de 15-17 kDcorresponda al hibrido sin clivar y la banda de 8 kD sólo a la extensión sin ubicuitina. Por fracciona­ miento subcelular, muypoco de esta proteína fue detectado en nú­ cleo, en membranaplasmática o en la fracción soluble citoplasma­ tica. Sin embargo, en presencia de 10 uMMg2+, la mayor parte de la proteina de 16 kD co-sedimentaba con los polisomas. Además, el producto del gen de fusión, denominado por Müller-Taubenberger et al (1988b, 1989) Ubex52, es una proteína constitutiva de la sub-unidad 403 de los ribosomas de D. discoi­ deumy no fue detectado ubicuitina libre en esta fracción. En levadura se detecta la proteina híbrida y la exten­ sión clivada, lo que sugiere un procesamiento in ViVO,a diferen­ cia de lo que ocurre en D. discoideum. No se puede descartar que sea un producto de vida media muycorta ni que el clivaje ocurra en una condición especial.

Genes de Ubi — 89 Introducción

3.1.15.7. ' r '+ r"

Kirchhoff et al (1938) aislaron clones que codificaban para ubicuitina de Trypanosoma cruzi, usando como sonda suero de ratón infectado crónicamente con este parásito. Unode los clones consistía en 4 unidades repetidas de ubicuitina en tandem, que diferían de la secuencia de levadura en 4 aminoácidos y fusiona­ das a una extensión de 52 aminoácidos, homóloga a la encontrada en levadura en los genes UBIl/Z. ' Por estudios de Southern blot y Northern blot de varias cepas de T. cruzi, de otros tripanosomas africanos y Leishmania, se determinó que los tamaños de los genes y transcriptos abarcan un espectro muy amplio en número y tamaño, haciendo muy compleja la familia multigenética en estos parásitos. El clon de referencia también incluía el miniexón de 39 nt característico de los transcriptos de este organismo, ad­ quirido por "trans-splicing". Este grupo también presenta evidencias de la expresión de transcriptos de ubicuitina especificos de estadios pero no existen cambios en el patrón por "shock" térmico. En T. cruzi, el numero total de repeticiones de ubicui­ tina varia desde 50 (cepa Corpus Christi) hasta más de 150 (cepa Sylvio-X). En Lejshmania y en tripanosomas africanos, el rango es entre 40 y 90. Hasta el momento el número mayor había sido encon­ trado en Xenopus laevis (Dworkin-Rastl et al, 1934) con 12 repe­ ticiones, y en Drosophila melanogaster con 12-15 repeticiones (Lee et al, 1988). Curiosamente a lo encontrado en otros organismos, no existen evidencias en Leishmania de genes o transcriptos que in­ volucren un monómerode ubicuitina, aunque en T. cruzi y T. bru­ cei rhodesiense, ademásde los transcriptos grandes existen tam­ bién otros con 2 o 3 repeticiones. Swindle et al (1938) estudiaron la organización genómi­ ca de los genes de T. cruzi. Este grupo encontró agrupado en un egmento del genoma de 27 Kpb más de 100 genes de ubicuitina con­ teniendo tanto poliubicuitina (PUB)comogenes de fusión (FUS). La caracterización parcial indica la presencia de 5 ge­ nes de fusión (FUS) con una unidad de ubicuitina y 5 genes PUB, cada uno de ellos compuesto de distinto número de repeticiones de

Genes de Ubi - 90 Introducción

ubicuitina, terminando con una copia de un gen de fusión. La transcripción da origen a 6 transcriptos principales con un rango de tamaño entre 0,65 y 12,5 Kb. En fase estacionaria, la trans­ cripción de los genes PUBestá aparentemente aumentada, mientras quea , 1988).la transcripción de los genes FUS, está reducida (Swindle et

31.15.13. Mamiïams

En 1935, Wiborg et al aislaron a partir de una genoteca humana, un clon que codificaba para un tándem de 9 repeticiones de ubicuitina con un aminoácido extra, valina, en el C-terminal del último monómero(UbC). También este grupo confirmó la presen­ cia de una familia multigenética y, por análisis de Northern blot, detectó por lo menos 3 poblaciones de transcriptos: UbC (2,5 Kb), UbB (1,1 Kb), UbA (0,65 Kb), tanto en humanos como en porcinos. Además,el análisis de diferentes tejidos mostró dife­ rencias en el contenido del transcripto UbA,encontrando en cor­ teza cerebral un nivel menor que en mucosa intestinal. Estos da­ tos se correlacionan con la velocidad de división celular, que es menor en cerebro. El gen UbCpresenta gran polimorfismo, con ale­ los de 7 a 9 repeticiones, lo que también contribuye a demostrar quecrítico. el numerode repeticiones que codifican para ubicuitina no es Einspanier et al (1987) caracterizaron un clon con 7 repeticiones de UbCa partir de células humanasde la granulosa de ovario, que podría corresponder a un alelo de la familia poli­ mórfica. Lund et al (1985), analizando una genoteca de cADN de hígado fetal humanocon una mezcla de oligonucleótidos que codi­ ficaban para somatomedina-C(factor de crecimiento parecido a in­ sulina), encontraron clones que resultaron contener un monómero de ubicuitina fusionado a una extensión de 80 aminoácidos, homó­ logo al UBI3de levaduras. También este grupo confirmó la presen­ cia de 3 poblaciones de transcriptos, 600, 900 y 2400 nt por aná­ lisis en Northern blot y además, identificó a este gen de fusión aislado con el transcripto más pequeño.

Genes de Ubi —91 Introducción

Salvesen et al (1987) analizando una genoteca de cADN humanacon el objeto de aislar un clon que codificara para cista­ tina A, encontraron un clon de fusión de ubicuitina con una homo­ logia de 83%con el UBIl/2 de levadura. Las secuencias 3' no codificantes que derivan de ambos genes de fusión con extensiones de 80 y 52, hibridizan especifi­ camente en Northern blot con la población UbA, lo que sugiere que estos dos transcriptos co-migran. El transcripto que codifica para la extensión de 52 aminoácidos (UbAsz) fue caracterizado en detalle por Baker y Board (1988). Este gen contiene por lo menos 5 exones determina­ dos por alineación con secuencia de clones de cADNy de pseudoge­ nes procesados. De los datos de Lund et al (1988), por lo menos 4 genes de fusión con ubicuitina homólogos al UBI3 de levadura, están presentes en el genoma humanocon un gran polimorfismo según los análisis por Southern blot (RFLP). Redmany Rechsteiner (1988) utilizando anticuerpos que reconocían específicamente una región de la extensión básica de 80 aminoácidos de la proteína híbrida de humanos, detectaron una proteína de 15 kD en homogenatos de células HeLa (humanas), po­ llo, bovino, ratón, Drosophila, Xenopusy hasta Acanthamoeba, in­ dicando que la extensión, al igual que la ubicuitina, se conserva evolutivamente. La extensión básica de esta proteína de fusión sin la parte correspondiente a ubicuitina, se detectó tanto en citoplasma comoen fracción nuclear de células HeLa, aún en con­ diciones de inhibición de síntesis proteica, lo que indica que esta extensión es una especie estable del procesamiento del pro­ ducto del gen de fusión. El tratamiento previo con RNasaA de los lisados celulares anteriores eliminaba la retención por columnas de DEAE-Sepharosa de la proteína de fusión, lo que sugería una asociación con ARN.Estos resultados se confirmaron por experi­ mentosde ultracentrifugación utilizando lisados de reticulocitos y citoplasma de células HeLa, encontrándose la extensión particu­ larmente asociada con la subunidad ribosomal 408. Por métodos in­ munológicos, Redmany Rechsteiner (1989) confirmaron la presencia de esta extensión en la subunidad menor de ribosomas eucarióti­ cos, específicamente identificada como la proteína risobomal SZ7a. 'Otras extensiones en el C-terminal diferentes a las presentadas anteriormente (UBIl-UBl3) se identificaron como aso­ ciadas a ubicuitina:

Genes de Ubi — 92 Introducción i) en el gen An-l cuyos transcriptos se segregan al polo ani­ mal en embriones de Xenopus laevis (Weeks y Melton, comuni­ cación personal) ii) en el gen humanoque codifica para una proteina de 15 kD inducible por interferón (Haas et al, 1987) iii) en otro gen humanode expresión constitutiva en el_cromoso­ ma X ("housekeepjng“) GdX(Toniolo et al, 1988). iv) en el marco de lectura abierto del togavirus BVDV(virus de la diarrea bovina) que codifica para una secuencia similar a ubicuitina en una poliproteína viral no estructural (Clarke et al, 1989).

Debido a la gran divergencia de la parte ubicuitina en estas nuevas proteínas híbridas de la secuencia canónica de ubi­ cuitina, estos péptidos no pueden servir comodadores de ubicui­ tina, a diferencia de los anteriores (UBIl-UBI3). Baker y Board (1987a),'caracterizaron un transcripto de la familia UbB, el cual contenía 3 repeticiones en tándem con un aminoácido extra (cisteína) fusionado al último monómero.La com­ paración con la secuencia publicada de UbC(Wiborg et al, 1985) revela que es producto de otro gen. Utilizando una región de la zona 3’ no codificante del clon de cADNaislado de la familia UbBcomo sonda, se aislaron 2 clones (EHB4, EHDl) de una genoteca (genómica) humana. La carac­ terización de estos clones reveló que se trata de pseudogenes procesados con 1 y 2 unidades con homología con ubicuitina humana (UbB), fusionada a un aminoácido extra: cisteína (Baker y Board, 1987a). Resultados previos de Niborg et al (1985) indicaron la presencia de clones genómicos (XHUbl y XHUbS)con el mismo número de repeticiones y zonas flanqueantes no homólogas a lHUblB (UDC). Un tercer pseudogen procesado (EHBG)también fue aisla­ do por Baker y Board (1987b) con regiones 5' y 3' flanqueantes con homologias de 68% y 90%con las regiones correspondientes a los otros aislamientos. La secuencia aminoacidica codificada para EHBGdifiere de la ubicuitina humana en 15 aminoácidos y presumi­ blemente no se transcribe in vivo. Couland et al (1988) comunicaron el aislamiento de un cuarto pseudogen con una organización muydiferente de los 3 an­ teriores de esta subfamilia, aunque con homologías significativas

Genes de Ubi — 93 Introducción

en las regiones 5' y 3' JOHotros miembros de la familia de UbB. La organización de este pseudogen involucra 4 unidades repetidas de ubicuitina con un intrón en la zona codificante. El gen UbB contiene en su región promotora un HSE (Baker y Board, resultados no publicados). Despues de un "shock" térmico, tanto UbCcomo UbBaumentan su expresión en 5 y 10 veces (Fornace et al, 1989). Otras situaciones que inducen los trans­ criptos de poliubicuitina (UbCy UbB) son los tratamientos con Ïgenteseu01na. alquilantes o ayuno de aminoácidos, comopor ejemplo iso­ Sin embargo, la deprivación de suero del medio de cul­ tivo y la consecuente detención del crecimiento, no varian el ni­ vel de los mARNdepoliubicuitina, tanto en células humanas como de roedores. La deprivación de suero o de isoleucina no inducen hspTO ni hsp27. Sin embargo, otros estrés como H202 y luz U.V. no inducen ni la transcripción de hsp70 ni de poliubicuitina, aunque estas condiciones sean fuertes inductores de daños en el material nuclear. Estos datos demuestran que la inducción de poliubicuiti­ na y de hsp70 en este sistema no está coordinada. Haas y Bright (1987) trabajando con una linea de fibro­ blastos humanos de pulmón (INR-90) encontraron que el agregado de medio fresco suplementado con suero fetal bovino a un cultivo confluente, inducia la transcripción de poliubicuitina. El factor presente en el suero responsable de este efecto no es dializable y es termoestable. Durante la inducción, la ubicuitina libre su­ fría variaciones pero la fracción conjugada permanecía constante. Trabajando con células BHK, Latchman et al (1987) ob­ servaron una inducción por infección con virus herpes simplex (HSVZ) de aproximadamente 5 veces de un transcripto de 1,7 Kb conteniendo secuencias de ubicuitina. Esta inducción es depen­ diente de la presencia de la proteína viral funcional ICP4, tam­ bién requerida para la inducción de genes virales tempranos des­ pués de la infección, y puede ocurrir en ausencia de otros pro­ ductos virales. La infección con HSVno induce la acumulación de transcriptos de 650 nt, que codifican para genes de fusión tanto en humanocomo en rata. Muyprobablemente la infección represente un proceso similar al de acumulación de proteinas anómalas media­ da,en este caso por ICP4, e induzca la transcripción-del gen de poliubicuitina y no la simple entrada del virus.

Genes de Ubi - 94 Introducción

Analizando una genoteca preparada a partir de mARNde fibroblastos de embrión de pollo sometidos a estrés térmico, Bond y Schlesinger (1985), encontraron un clon que contenía una se­ cuencia homólogaa la ubicuitina bovina. Por análisis de Nbrthern blot, este clon revelaba la presencia de por lo menosdos trans­ criptos, uno de 1,2 Kb inducible aproximadamente 5 veces por tra­ tamiento térmico. y otro de 1,7 Kb que sólo se encontraba presen­ te en células que habían sido expuestas al "shock" térmico. El análisis de las secuencias reveló la presencia de repeticiones en tándem de ubicuitina comoen levaduras (Ozkaynak et al, 1984). Posteriormente, en 1986, este mismogrupo identificó dos genes de ubicuitina que diferían en su estructura y localiza­ ción genómica. El gen designado con UbI contiene 4 repeticiones y el UbII, 3 repeticiones dispuestas en tandem que codifican para poliubicuitina. Los dos transcriptos observados (1,2 Kb y 1,7 Kb) derivan de UbI y el mayor corresponde a un precursor no procesa­ do. Durante el tratamiento térmico se inhibe el procesa­ miento (splicing) de intrones de moléculas de ARN precursoras (Yost y Linquist, 1986), lo que en este caso explicaría la apari­ ción de este mensajero de mayor peso molecular. El gen UbII parecería no codificar para ningún mARN, tanto en condiciones normales como después de un "shock" térmico. Las regiones 5' y 3' no codificantes muestran acentuada divergen­ cia en relación con la zona codificante (93%vs. 20%), como ocu­ rre en los miembros de la familia de multigenes humanOs UbB (Wiborg et al, 1985). Los niveles del transcripto UbI aumentan no sólo por shock térmico, sino también por arsenito de sodio (50 pM) y se encontró en la zona 5' de este gen, una secuencia HSEresponsable de la inducción térmica (Bcnd y Scnlesinger, 1983)(Ver RESPUESTA AL ESTRES TERMICO). Mezquita et al (1987) aislaron de una genoteca prepara­ da a partir de mARNde espermátidas de pollo, un clon con 94%de homología con UbI en la zona codificante, y que se reducía a casi un 23%en las zonas 5' y 3' flanqueantes.

Genes de Ubi — 95 Introducción

Su expresión en células germinales durante la espermio­ génesis, también lo hace diferente al transcripto codificado por UbI, y podría corresponder al segundo gen identificado, UbII, cu­ ya secuencia no ha sido publicada. Agell y Mezquita (1983) demostraron el aumento de ubi­ cuitina libre durante la espermatogenesis, alcanzando un maximo en espermátidas Jóvenes, que bajaba a niveles indetectables en espermatozoides maduros. La presencia de niveles crecientes tanto de ubicuitina libre comoconjugada en espermátides de pollo, su­ giere un posible papel de esta proteína en las alteraciones que se producen en el recambio proteico, estructura de cromatina e interacción célula-célula durante la espermatogénesis. Estos au­ tores también aislaron de esta mismagenoteca, otro clon con ho­ mologia al gen UBIl/UBI2 de levaduras.

3.1.15.10. Efifiqmen Tanaño I rep. poli- a.a.extra lensaje­ Especie Loci ubi (loci) poli Extensión ros(Kpb)

Levadura 4 5,6(1) N 76,52(2) 0,5-l,3 Drosophíla 3 21342) 3(I-Q-A) 80 4.4 Xenopus >2 :12 ­ Pollo 2 4 Y 52? 1,1 Humano ? 7-9 Y 30(4) 0,6-2,5 1,2(pseudo) C 52 Plantas cebada = K 0,7-2,0 Arabldopsís 11-12 5 2 52(2) 0,3-l.9 2(pseudo?) 31(2) C. elegans 2 ll 240,4) 0,7-2,5 T. prrifornis 4 2(S-Q) 4,3 D. Discoideun 7 5,1,3 N o L 52(1) 0,5-l,9 73(1) Trypanosonatidae ? 40-150 ¡5 loci 0,65-12,5

Genes de Ubi - 96 Introducción

3.1.16. EVOLUCION

La ubicuitina está altamente conservada en toda la es­ cala biológica aún entre organismos tan distantes comoanimales y el protozoario T. pyriformis (Fusauchi e Iwai, 1985)(ver Tablas III y VI en RESULTADOSY DISCUSION). A excepción de procariotes, la presencia de ubicuitina -fue detectada por métodos inmunológicos aun en algas, incluidas una verde (Chlamydomonareinhardtii), marrón (Laminaria angusta­ ta), roja (Porphyridium cruentum), pero no en la azul-verdosa (Synechococcus 5p.), que pertenece a los procariotes (Shimogawasa y Muto, 1989). La diferencia de sólo 3 aminoácidos entre la ubicuitina de levaduras respecto de la de animales, cambios que por otra parte son conservados en lo que respecta a polaridad y volumen molecular (Grantham, 1974), demuestran el menor grado de 'evolu— ción de la ubicuitina, comparado con el de una proteina muy con­ servada como la histona H4 (Sharp y Li, 1987a). A pesar de la ex­ trema conservación a nivel aminoacídico, es interesante analizar la diferencia en los tripletes que codifican para serina (S), pa­ ra una posición determinada en las distintas repeticiones de los genes de poliubicuitina. El aminoácido serina en la posición 20 está codificado por los tripletes AGY(Y = C ó T) en el gen huma­ no de mayor tamaño, en pollo y en Xenopus, pero en otro gen huma­ no, en Drosophila, en cebada y en los de levadura, este codon es TCN(N = cualquier base). Dadola presión evolutiva ejercida sobre la secuencia de ubicuitina, resulta poco probable pensar que estos codones ha­ yan evolucionado en etapas que no involucraran codones codifican­ tes para serina, lo que lleva a pensar en la existencia de una mutación concertada de estos dos nucleótidos. En el gen de poliubicuitina de levadura, la serina co­ dificada en la posición 28 es producto del triplete TCNen 4 re­ peticiones, y AGYen sólo una. En otras especies, el cambio seri­ na por alanina en esta posición, involucra el triplete GCN.Estas observaciones, y la preponderancia de tripletes TCNque codifican para serina 28 en el locus de levadura, implica que AGYes una mutación relativamente reciente,' después de la fijación de la serina en levadura.

Evolución - 97 Introducción

El mecanismo más común de evolución concertada es la recombinación ("crossing-over") desigual. La diferencia entre especies en el númerode repeticio­ nes de las unidades codificantes para ubicuitina por locus, y la evidencia de polimorfismos entre la población (Daworkin-Rastl et al, 1934; Lee et al, 1933; Niborg et al, 1935; Lund et al, 1938), estosapuntan loci. a que este mecanismo, es el que opera frecuentemente en Sin embargo, la conversión genética es otro de los me­ canismos que se observa en la evolución concertada y la secuencia del poliubicuitina humano con 9 repeticiones (Wiborg et al, 1985), es un ejemplo para examinar ambos procesos evolutivos. La diferencia en números de nucleótidos entre cada par, varia considerablemente. En particular, las repeticiones 4, 5, 6, difieren entre si en 3 nucleótidos, 1a repetición 2 y la 8 sólo en 4 nucleótidos, mientras que la repetición 9 en promedio, di­ fiere en 20 nucleótidos respecto de todas las anteriores. A pesar de que los eventos de homogeneización de las repeticiones vecinas 4, 5, 6, pueden explicarse por recombinación desigual, la simili­ tud particular de las repeticiones 2 y 8 es más probable que haya ocurrido por mecanismosde conversión genética. Un evento único de recombinación desigual entre estas repeticiones, produciría intermediarios con 3 y 15 repeticiones (Sharp y Li, 1987a,b).

Evolución —98 Introducción

3.2. Nburospora crassa

513--14- en fl,pragsa. Las barras en las fotos representan 10, 10, 100, 10 um a las O, 2, 12 y 24 horas de inducida la conidiación respectivamente. Extraído de Berlin y Yanofsky, 1985a.

La flegzgspgra Q;gfifig_es un hongo perteneciente a la clase Ascomycetes que se encuentra en forma natural sobre árboles o restos vegetales de áreas tropicales o subtropicales (Shear y Dodge, 1927). El hecho de'ser un eucariote inferior, con las con­ siguientes ventajas concernientes a su fácil manipulación y cul­ tivo, su menor complejidad genómica y el amplio conocimiento bio­ químico y genético de su metabolismo (Beadle y Tatum, 1945), lo

N. crassa —99 Introducción han convertido en un interesante modelopara el desarrollo de es­ tudios en Biologia Molecular. ElcrecimientovegetativodeMmmm es ópti­ mo entre 28°C y 34°C, y se puede dar a máxima velocidad, con un tzempo promedio aproximado de 3 h por cada división celular, uti­ lizando comoúnica fuente de carbono ya sea acetato, succinato, glicerol, glucosa, manosa, fructosa, xilosa, sacarosa, maltosa, celobiosa, trehalosa y polisacaridos. Comofuente de nitrógeno, puede utilizar nitrato, nitrito, amonioo aminoácidos. Requiere además, oligoelementos como sales de zinc, manganeso, cobalto, etc., y una única vitamina (biotina). En el ciclo de crecimiento vegetativo la flguzgfiggra grassa forma dos tipos de esporas asexuales, las macroconidias y las microconldias. En el ciclo de vida sexual forma un solo tipo de esporas denominadas ascosporas. Las macroconidias son de color anaranjado, ricas en ca­ rotenoides y se reproducen por gemación en el extremo de hifas especializadas de crecimiento aéreo (conidiosporo), poseen pare­ des celulares gruesas, sin poros. Son esporas latentes multinu­ cleadas (Huebscman,1952), resistentes a la desecación (Ogata, 1962), al calor, al congelamiento (Strauss, 1958), y a la acidez (Graham, 1967). Cuando se encuentran en medio adecuado, las ma­ croconidias germinan en 2 a 5 hs, restaurando el crecimiento ve­ getativo. Por tales razones estas esporas son utilizadas como inóculo de cultivos (Ver 6 1.), y sirven como"células" fertili­ zantes (masculinas) en los cruzamientos. Las microconidias se producen a partir de células no especializadas del micelio en la fase estacionaria del cultivo, son uninucleadas y de escasa viabilidad, por lo cual prácticamen­ te no son utilizadas en el laboratorio. Es importante destacar que durante la mayor parte de su ciclo biológico la fl. grasa; es haploide. La única célula diploi­ de en su ciclo de vida es el cigoto. Es además hermafrodita pues­ to que una cepa salvaje puede producir tanto macro y microconi­ dias comoascogonias. Es también heterotálica; esto significa que las macro o microconidias de un tipo de cruzamiento sólo pueden feoundar a la ascogonia del otro tipo de cruzamiento. En este sentido es importante destacar que en Neurospgza_crassa existen dos tipos de cruzamientos A y a, determinados por un solo par de alelos y fenotipicamente indistinguibles.

N. crassa - 100 Introducción

El núcleo diploide formado sufrirá luego una división meiótica seguida de dos divisiones mitóticas, que dan comoresul­ tado cuatro PareG de ascosporas o esporas sexuales, de color ne­ gro, ricas en melanina, que se alojan en una bolsa rígida denomi­ nada asco. Estas ascosporas son expulsadas al exterior a través del cuello del peritecio y pueden permanecer en estado de laten­ cia por años sin perder viabilidad, resistiendo perfectamente la desecación, el congelamiento y el calor, etc. Las ascosporas pue­ den germinar en un medio adecuado sólo si son sometidas previa­ mente a un shock térmico de 60°C.

3.2.2. Organización del gsi'LQma

En el estado haploide, la flcuxgfipgxa__gzanfiatiene 7 cromosomas, y el genoma posee un total de 2,7x 107 pb (Krumlauf y Marzluf, 1980; Perkins y Barry, 1977), apenas un órden mayor que el tamaño del genoma de E.coli. Un 90% de este ADNse encuentra como secuencias únicas y un 8%como secuencias repetitivas. Di­ chas secuencias, alrededor de 140 copias por genoma, tienen apro­ ximadamente 15 Kpb cada, están dispuestas en tándem y codifican los rARNs de 268, 17s y 5,88 (Brooks y Huang, 1972; Dutta, 1973; Free et al, 1979). A diferencia de lo que ocurre en eucariotes superiores el rABNde 58, no se encuentra en estas unidades repetitivas ni en otras agrupadas en tandem, sino que se halla disperso en el genoma (Selker et al, 1981). El restante 2%del ADNgenómico co­ rresponde a secuencias palindrómicas de aproximadamente 700 pb que están dispersas y en un número de 350 por genoma.

N. crassa - 101 Introducción

3-3. CICLOHEXIMIDA

La cicloheximida (actidiona, naramicina A) es una glu­ tarimida que fue aislada por primera vez de filtrado de cultivos de Streptamyces griseus (Leach et al, 1947) y la estructura qui­ mica fue determinada por Kornfeld (Kornfeld et al, 1949) se trata -de una 3-[2-(3,5-dimetil-Z-oxociclohexil)—2—hidroxietil]-glutari­ mida y su fórmula es la siguiente:

C") H\ PH CHI-. ___..C_..CH2< NH

Es tóxica para un gran espectro de organismos incluyen­ do hongos, plantas superiores, mamíferos (Nhiffen, 1948,1950), algas y protozoos (Palmer y Maloney, 1955; Loefer y Matney, 1952). Sin embargo, no tiene efecto alguno sobre organismos pro­ carióticos ni ribosomas mitocondriales o de cloroplasto. La acción de la cicloheximida sobre las células euca­ rióticas y en sistemas libres de células se basa en su capacidad de unirse a la subunidad 608 de los ribosomas, inhibiendo la ac­ tividad de peptidiltransferasa e impidiendo, por lo tanto, el desplazamiento de los ribosomas sobre el ARNmensajero. Buena parte de los efectos que se observan al tratar distintos organis­ moscon cicloheximida pueden atribuirse al efecto directo que tiene la cicloheximida sobre la síntesis proteica (Sisler y Sie­ gel, 1967). En Achlya ambisexualis también fue observada una in­ hibición de la sintesis de rARN(Timberlake y Griffin, 1974) y de ADN(Sullia y Griffin, 1977) independiente de la inhibición de la síntesis de proteinas. Se ha demostrado'que la cicloheximida inhibe la diso­ ciación dependiente de GTPde polisomas que normalmente acompaña la síntesis proteica (Wettstein et al, 1964). Esto está muyposi­ blemente relacionado con el aumento de 2 a 6 veces en la acumula­

Cicloheximida - 102 Introducción

ción de ciertos ARNmensajeros que se observa cuando se inhibe la síntesis de proteínas con cicloheximida, lo cual fue atribuido a un aumento en sus vidas medias (Ernest et al, 1973; Kelly et al, 1987). Este efecto sería contrario al observado al tratar con pu­ romicina, antibiótico que por su estructura se asemeja a un ami­ noacil-tARN y que tiene el efecto de producir una liberación ace­ lerada de ribosomas de los polisomas preexistentes. Desdeeste punto de vista, el efecto primario de la ci­ cloheximida se encuentra muy poco estudiado. Uno de los pocos efectos descriptos hasta el momento,lo constituye la capacidad de la cicloheximida de producir la fosforilación de la proteína 86 ribosomal cuando se inyecta en ratas (Krieg et al, 1988). Di­ chos ribosómas fosforilados tendrian ciertas ventajas en el pro­ ceso de iniciación de la sintesis proteica sobre aquéllos sin fosforilar (Duncan y McConkey, 1982; Burkhard y Traugh, 1984). Se han aislado mutaciones en varios organismos que al­ teran la sensibilidad de los ribosomas a la cicloheximida, ha­ _biendo sido clonados los genes correspondientes a las proteínas responsables de la resistencia (proteína ribosomal L29) en S. ce­ revisiae (Kaufer et al, 1933), en flLngrassa (Kreader y Heckman, 1987) y en otros eucariotes (Sutton et al, 1973). La cepa salvaje de la levadura Kluyveromyces fragilis, es resistente a la cicloheximida y sus ribosomas serían insensi­ bles a este antibiótico in Vitro (Adouette-Panvier y Davies, 1934). Asimismo, se ha descripto de la inducción de tolerancia a la cicloheximida en una serie de organismos; en Cándida malta­ °sa, la presencia de cicloheximida produce una inhibición casi completa del crecimiento, pero luego ocurre una recuperación que permite la división celular a una velocidad equivalente a la del cultivo en ausencia del antibiótico. Los ribosomas de estas célu­ las ya "adaptadas" a la cicloheximida resultaron ser insensibles a la misma en experimentos de traducción in Vitro usando ARNmen­ sajeros heterólogos, pero dicha tolerancia desaparece cuando las células "adaptadas" fueron incubadas unas horas en medio sin an­ tibiótico (Takagi et al, 1935). Un fenómeno similar fue observado en fleurgspgxa__grassa (Grotewold et al, 1938b) y Sclerotium rolfsii (Sullia y Maria, 1985). En este último, se demostró por lo menos un mecanismo de conversión de la cicloheximida a especies químicas menos tóxicas que podria contribuir a la tolerancia.

Cicloheximida —103 Introducción

En una cepa salvaje de flgnxgspgxa_gxgnfia, se ha deter­ minado que concentraciones de cicloheximida de 0,1 pg/ml (0,4 pM) producen una inhibición del crecimiento, y que concentraciones de 0,5 pg/ml (2 pM) producen una inhibición superior al 75%en la velocidad de crecimiento. Concentraciones superiores a 15 pM de cicloheximida inhiben la síntesis proteica en un valor mayor al 95%. La capacidad de la cicloheximida de inducir ciertas ac­ tividades enzimáticas en Hcgrgspgra_grafisa es un fenómeno que se conoce desde hace al menos 25 años. Algunas de estas enzimas es­ tarían relacionadas con el metabolismodegradativo y/o con la di­ ferenciación sexual, siendo esta última una respuesta general de muchos hongos sometidos a condiciones ambientales adversas. La enzima mejor estudiada en este sentido en H¿__gzasfin es la tirosinasa, responsable de la catálisis de uno de los pri­ meros pasos en el camino biosintético de la melanina, compuesto que da el característico color parduzco a los peritecios y aseos­ poras (Hirsch, 1954). La tirosinasa es indetectable en cultivos en fase loga­ ritmica o estacionaria crecidos en medio mínimo, pero se puede lograr un aumento considerable de la actividad cuando se inhibe la sintesis proteica, ya sea con actinomicina D, puromicina o ci­ cloheximida (Horowitz et al, 1970b). La máximaactividad de tiro­ sinasa lograda por inhibición de la síntesis proteica fue obteni­ da con cicloheximida en una concentración de 2 pMfinal y luego de 60 a 72 horas de agregado el inhibidor a cultivos de en fase logaritmica tardía. La inducción de esta enzima puede lo­ grarse también cuando se somete al cultivo a ayuno de nutrientes (Horowitz y Shen, 1952; Horowitz et al, 1961). Otra enzima que también es capaz de ser inducida por cicloheximida, pero que en este caso se acumula en el medio ex­ tracelular, es la lacasa, que al igual que la tirosinasa es una fenol-oxidasa. Esta enzima seria inducible por concentraciones bajas de cicloheximida (Froehner y Eriksson, 1974) y la máxima actividad de la misma en el medio extracelular, al tratar mice­ lios en fase estacionaria con 2 pMcicloheximida, se detectó 72 horas luego del agregado del inhibidor (Grotewold et al, 1988a). La L-aminoácido oxidasa es una enzima que está involu­ crada en el catabolismo de aminoácidos y su síntesis se induce con bajas concentraciones de inhibidores de la síntesis proteica (Horowitz, 1965), por carencia de nutrientes o por entrada al ci­ clo sexual (Prade y Terenzi, 1985).

Cicloheximida - 104 Introducción

Recientemente, hemosdescripto la inducción de varios ARNmensajeros que aparecerían luego del tratamiento de micelios de fl¿_gzaafia en fase estacionaria con 2 HMcicloheximida por 24 a 48 horas (Aisemberg et al, 1987,1939). Estudios realizados en nuestro laboratorio mostraron que, aunque los tratamientos con 2 uMcicloheximida de cultivos de H¿_Qrafifinen fase estacionaria, producen una inhibición de la sintesis de proteínas de un 90%en la primera hora, existe luego un recuperación gradual que después de 6 hs alcanza aproximada­ toral).mente un 45%de la actividad inicial. (Grotewold, E., tesis doc­

Cicloheximida —105

Resultados y Discusión

4.1. ANALISIS DE LA GENOTECA DE ADN GENOMICO DE fll_gnafisa 4.1.1.Iris-¡animacionde minus

Con el objeto de clonar genes de ubicuitina, se comenzóel análisis de una genoteca de ADNde fl¿_gnassa, cedida gentilmente por el Dr. C. Yanofsky. Esta genoteca fue construida a partir de ADNgenómico de la cepa salvaje StL74A, digerido parcialmente con la enzima Sau3Ay clonado en el vector XJl derivado del fago XL47.1 (descripto en 6.14.2) en el sitio BamHI. La sonda utilizada en este análisis fue un fragmento ais­ lado de una banda de un gel de agarosa (descripto en 6.9.1.4.2), proveniente del plásmido pUbZdigerido con EcoRI, que contenía la zona codificante completa con 6 repeticiones en tandem, y parte de las zonas flanqueantes 5' y 3' del gen de poliubicuitina de S. cerevisiae cedido gentilmente por el Dr. A. Varshavsky. Este in­ serto de 2,4 Kpb se marcó por la técnica de random priming des­ cripta en 6.6.2. El protocolo descripto en 6.4 detalla todos los pasos se­ guidos para el aislamiento de clones positivos. Se ilustra más adelante en Fig. 30 y Fig. 31. El númerototal de placas de lisis analizadas fue de apro­ ximadamente 6x104 ufp y se obtuvieron 8 clones positivos (XJA-H). Se ilustra el análisis de los clones amplificado por la técnica de "phage spot" en Fig.1. Las condiciones de hibridación y lavado utilizadas en el rastreo de la genoteca se optimizaron previamente en Southern blots genómicos, como el que se muestra en la Fig.3. La Fig. 2 ilustra el aspecto que presenta por tinción con EtBr el ADNgenó­ mico de fll_gxafifia o de levadura, digerido con distintas enzimas de restricción y separado por electroforesis en gel de agarosa.

Anal. Genot. ADNgenóm. - 107 — Resultados y Discusión

Fig-l. térmica di “¡aga 51.jpg, ' Los clones. X, I, Xvir son los negativos incluidos comocontrol.

Anal. Genot. ADN genóm. — 108 — Resultados y Discusión

Fig.2.mmmifimml%mifigmmmmmla aepazagién (La ADN¿Químico di geri 1:19.«mndi ¿51:6an " ' ' ds refitrjoojón. B-H: digestión con BamHI/HindIII M: marcador de peso molecular

Anal. Genot. ADN genóm. — 109 — Resultados y Discusión

Narassa SC Hlnd II BamHI ECORÍ ‘EruRX N H. ‘LcoRl ‘Hmdm. HlndlllhBamHl’pam“! EcoPI‘

2323-—-'. 1929­

1371- * 136L-—

u WimFig-B.Mmdiggmfia .d¿mmmmümfimflubïwflimdalmflnm daMmm: enmdigigngadghaia

Anal. Genot. ADNgenóm. - 110 — Resultados y Discusión

Se utilizaron las condiciones descriptas en 6.11 para baja homologia, que comose puede apreciar en el carril correspondien­ te a S, eerevisiae de la Fig.3, identifica una banda de tamaño coincidente a la descripta para levadura y de distintos tamaños para las diferentes digestiones de ADNde fl¿_gnasfia. Se preparó ADNde los clones positivos según el protocolo descripto en 6.1.2, se digirió con las enzimas EcoRI-HindIII en las condiciones descriptas en 6.0.2.1. Se separó por electrofore­ sis en agarosa 0,8%(ver 6.8.1), se transfirió (ver 6.9.1.1.2), y se hibridó en las mismas condiciones y con la misma sonda emplea­ da en la identificación de los clones (ver Fig.4 y Fig.5). Teniendo en cuenta el polylinker del vector empleado (ver 6.14.2), esta doble digestión enzimática permite analizar el ta­ maño del inserto. El patrón de bandas que se ve en la Fig.4 per­ mite identificar 4 insertos diferentes, correspondientes a los clones XJA, XJB, XJC y XJD. Las bandas positivas (Ver Fig. 4) de los distintos clones correspondían a fragmentos derivados de una digestión total con HindIlI y fueron aisladas de un gel de agarosa preparativo (ver Fig.6) para ser utilizadas comosonda sobre la mismamenbrana la­ vada del Southern blot genómico anterior (Ver Fig.3). Se reveló exactamente el mismopatrón de bandas que con la sonda heterólo­ ga. El tiempo de pre-exposición de la membranafue mayor que el de exposición después de la re-hibridación, asegurándose así que la señal obtenida provenía del último ensayo. Los cuatro clones XJA,B,C,Dse digirieron con otras combi­ naciones de enzimas para determinar un mapade sitios de restric­ ción e identificar posibles zonas superpuestas, en particular las que presentaban homologia con el gen de interés¿ Se ilustra sólo para el clon XJCen Fig.7 y Fig.8.

Anal. Genot- ADNgenóm. - 111 ­ Resultados y Discusión

Fig.4.ModelgeldgagamailümñideüBndelgsm­

Mcorresponde al marcador de peso molecular, y los asteriscos in­ dican las bandas que se observan en la Fig.5 comopositivas.

Anal. Genot. ADN genóm. — 112 — Resultados y Discusión

Fig.5. gil¿Lala.m4 mmm mnla.aguda.» hey-¡mug- radjgaquva gn andicignfifi ds: han hgmglggia.

Anal. Genot. ADNgenóm. - 113 — Resultados y Discusión

Fig.6.ífidfiñfiïmmfl,fi%dfimm%m

Los clones XJA, XJB, XJC, XJD se digirieron con HindIII. Los a6—. teriscoa identifican las bandas aisladas.

Anal. Genot. ADN genóm. — 114 — Resultados y Discusión

Fig.7. Gel de agarosa 0,8% teñido con EtBr utilizado para anali­ zar el patrón de banda del clon XJCcuando se digiere con las en­ zimas que se indican. ' X/HindIII y k/BstEII son marcadores de pego molecular descriptos en 6.8.1. ‘ *

Anal. Genot. ADN genóm- — 115 — Resultados y Discusión

_,5>35) n93 {"99 's b‘ w, '91? 9;, \. EcoRIKpnI _ i ÁHdeI í ClaI . l ü ' Eco/ClaI . . 89H '*fl’ Eco/BglII '"‘ F PstI 1; Eco/PstI i XbaI ..; Ígzfi, Eco/XbaI 5 . i L 4. XhoI y 1 l Eco/XhoI' ’ w i 1 ,J) ,' J “JJ”

MEWWMWQHWMMW­Fig.8. " ' algilmlaiiglhihnidadg lggia.

Anal. Genot. ADNgenóm. - 116 — Resultados y Discusión

Ei mapeo se completó para estos 4 clones por digestión parcial con enzimas de baja frecuencia de corte(ver 6.0.2.1), previa marcación por la técnica de fill in (ver 6.6.1) de los ex­ tremos cos del vector recortado con la enzima KpnI. Sólo existen sitios para esta enzima en el brazo más largo del vector (ver 6. 14.2). Todos estos datos permitieron tener un mapade sitios de restricción para algunas enzimas de baja frecuencia corte de una zona del genoma de N¿__crassa que cubría una zona de aproximada­ mente 8 Kpb. Los tamaños calculados por este mapa (ver Fig.11) coinci­ den con los observados en el Southern genómico de la Fig.3. 4.1.2. zmapeode

El fragmento 2,2 Kpb producto de la digestión con HindIIl del clon XJD, aislado anteriormente por la técnica de agarosa de bajo punto de fusión, fue purificado según el protocolo descripto en 6.1.5. Se ligó (ver 6.0.2.3) con un vector Bluescript +SK(ver 6.14.1) digerido con la mismaenzima y tratado con fosfatasa al­ calina según el protocolo descripto en 6.0.2.2. Se hizo la trans­ formación con el producto de la ligación según el protocolo des­ cripto en 6.5. La identificación de los recombinantes que contenían el inserto deseado se llevó a cabo por aislamiento en miniescala de ADNde plásmidos ("miniprep") de clones tomados al azar según el protocolo descripto en 6.1.1.2, y posterior análisis de los pro­ ductos de digestión con la enzima HindIII en geles de agarosa 0,8%. Se corroboró que el inserto fuese el deseado por hibrida­ ción con el fragmento de ADNutilizado en la reacción de ligado en condiciones de alta homología.

Anal. Gcnot. ADNgenóm. - 117 ­ Resultados y Discusión

Por análisis de brthern blot con la sonda heteróloga de levadura se reveló un transcripto de 1,3 Kb del ARNde fl. grassa (ver ANALISIS DE LA EXPRESION DEL GEN DE POLIUBICUITINA), y la digestión con HindIII del clon XJD mostraba una banda unica de 2,2 Kpb (ver Fig.5). Por su tamaño este fragmento parecia bastan­ te apropiado para ser subclonado y comenzar su análisis. Con el objeto de tener un mapade sitios de restricción y además, para identificar clones con orientación opuesta del in­ serto, se digirió con diferentes combinaciones de enzimas de res­ tricción y se analizaron los productos en geles de agarosa. Se hizo, además, una identificación más fina de sitios para enzimas de baja frecuencia de corte, por digestión parcial, previa marca­ ción de un extremo por la técnica de fill in (ver 6.0.2.1). A los fines de ilustrar el uso de estas técnicas, se muestran algunos ejemplos en Fig.9 y Fig.10. Con los datos anteriores se confeccionó el mapa de res­ tricción que se resume en la Fig 11. Se realizaron una serie de subclonados para ser utilizados en la secuenciación (ver Fig.11). Unade las estrategias utiliza­ das involucraba la eliminación de fragmentos de clones recombi­ nantes purificando la banda de vector con resto de inserto (ver 6.8.1.4) después de una digestión total con las enzimas de inte­ rés. En el caso de que los extremos no fueran compatibles , como en dobles digestiones o con enzimas con ambigüedad, se los trans­ formó en romos (blunt ends) por rellenado (fill in), siguiendo el protocolo descripto en 6.6.1. La nomenclatura utilizada en todos los casos refleja el fragmento que se eliminó, teniendo en cuenta que el plásmido re­ combinante de partida es el que contiene el inserto de 2,2 Kpb del kJD/HindIII clonado en el sitio HindIII del vector plásmido Bluescript +SK. La orientacion que se muestra en el mapa de la

Anal. Genot. ADNgenóm. - 118 ­ Resultados y Discusión

2212 , 22x1x ¿[fio23' ¿c5 vcé‘w é"? 03‘, "r an 'b . I ,,‘|-A-.4.J__1_l ¿“La r «- v ¿.822 ;w t: ykl322 32;: __¿ " 4929 4’ ¡371. 42st.

.702

'i; L22A Ül-n7

Fig.9. del ¿si gls-1¿gm {LE/o¡31211125519En5.]. análiaia di " ' ¿la m;:Lrlgcién. ‘ 4 En cada carril se sembró un producto de digestión parcial previa marcación por la técnica de fill in en un extremo de referencia para el análisis. Se marcó el aitio EcoRI después de una diges­ tión doble EcoRI/BamHI. M: marcador de peso molecular marcado por la técnica de Íïll in­ (pBRBZZ/Hinfl).

Anal. Genot. ADN genóm. — 119 — Resultados y Discusión

-_ S'\ 4, a \ 1*} > J )( 9,330”: ¡»aJ‘ vQ-aqsó

I w m r¡un l l ‘ . o ¡53, hp. '7'“ ‘ a n ¡Q os N L. 4 a 3'36 ¡‘ l . a nl. ' ' ,. 293 ‘ U‘ \n J . fl .- 720” b . . ¡51. \ ú 75 ‘

fielmmmggmfigmmdeammglaLüWmfl

Corresponde al clon 22128X digerido con XhoI y marcado por ‘la técnica de fill in. Cadacarril corresponde a'la digestión par­ cial con las enzimas que se indican. M: marcador de peso molecular marcado por la técnica de fill in (pBRBZZ/Hinfl).

Anal. Genot. ADNgenóm- — 120 ­ Resultados y Discusión

O———‘“1 r_, _. .———1,__—. r——" r—",_:_”_“‘l e»7_w———fi ‘————1 r——-_’ P Ea x pk x Ac Ac A: X X 8 Ea "r A: ° L“ -- I ha .Av| H1 P ñ.Ay V ¡Am Av ‘lNc ‘ S Hd Hd '. c Ea H lOObp

Polyllnker o SK bluescrípl I Polylínker 'Kvx XJ¡ EMS

Fig.11.Ma2adelnaaiiiigader_eümmiándeLfLagmenLQde

Las flechas indican la estrategia de secuenciación seguida. El tandemdeti a. flechas anchas representa las repeticiones de ubicui­ Hd: HindIII, X: XhoI, No: NcoI, P: PBtI, Ea: Eagl; Av: AvaI, Ac: Ach, S: Sau 3A, B: BamHI, C: ClaI, Hc: HincII, Bg: BglII. IS: intrón o secuencia interviniente. Las lineas engroeadas representan las zonas no codificantes 3' y 5' determinadas por Sl. El mapaen la parte inferior corresponde a los sitios de enzimas de bajo corte en la zona del genoma de fl¿_gxagfig adyacente al clon 2212 que cubre 8 Kpb.

Anal. Genot. ADN genóm. — 121 — Resultados y Discusión

Fig.11 corresponde a la del clon 2212, y la orientación inversa del inserto en el mismo vector se denominó 22XIX. Asi, por ejem­ plo, ZZIZSXcorresponde al clon 2212 al que se le eliminó la zona correspondiente a los sitios XhoImás distantes. Las dos bandas subclonadas de gran interés fueron una de 460 pb producto de la digestión con XhoI (ver Fig.11), que com­ prendía mas de una unidad de ubicuitina; y otra XhoI-HincII que corresponde al extremo 3' del gen de poliubicuitina. También se subclonaron las dos bandas XhoI flanqueantes al tandem de 2,3 y 1,3 Kpb correspondientes a los extremos 5' y 3' respectivamente. El fragmento de 1,3 Kpb se aisló del clon LJC y el fragmento XhoI de 2,3 Kpb del clon XJDutilizado para obtener el fragmento HindIII anterior de 2,2 Kpb Comose muestra en la Fig.11, tal cual fue posteriormente confirmado por secuencia, el inserto HindIII de 2,2 Kpb subclona­ do incluía la zona del polylinker del vector XJI. Según se mostró en la Fig.5, la banda HindIII correspondiente al vector XJC que se reveló con la sonda heteróloga de ubicuitina, tiene un tamaño mayor que la correspondiente a XJD, lo que confirma la extensión del clon XJCmás hacia el extremo 3' comoresultaría lógico en­ contrar en una genoteca construida por digestión parcial.

Anal. Genot. ADNgenóm. - 122 ­ Resultados y Discusión

4-2. CARACTERIZACION DEL GEN DE POLIUBlCUlTINA

4-2-1.Wp o n ;

El esquema de secuenciación se describe en la Fig.11 y la mayor parte se realizó por el método de Sanger descripto en 6.1. 3.2. Se ilustra en la Fig.12 un gel de acrilamida en que se puede leer la secuencia de dos clones. La preparación de los ADNsc rescatados con fago helper se ilustra en la Fig.13 (ver 6.1.2.3). Algunas zonas fueron secuenciadas por el método de Maxamy Gilbert. cuyo protocolo se describió en 6.13.1. Se ilustra en la Fig.14 la autorradiografía de un gel utilizado en el aislamiento de los fragmentos de interés marcados según protocolo descripto en 6.8.2.2. La secuencia del clon 2212 se presenta en la Fig.18, y el mapade restricción completo generado por el programa IBI-Pustell se agregó en el APENDICEI. Los sitios que se detallan en la Fig.11 fueron confirmados 4.2.2.por secuenciación.

El análisis de Northern blots del ARNde fll_crassa hibri­ dado en condiciones de alta estringencia a 60°C (ver 6.11) con la sonda homóloga de 460 pb (fragmento XhoI) radioactiva (ver 6.6. 2), mostró la presencia de dos transcriptos, uno de 1,3 Kpb y otro de 0,7 Kb (ver más adelante). El transcripto mayor ya había sido revelado con la sonda heteróloga de poliubicuitina de levaduras en condiciones de baja homologia.

Caract. gen poliubi - 123 ­ Resultados y Discusión

'SEH.‘,|nnal XM Ftsl(.ACIt (¡/U,‘i L u .1 m“ ‘gt i¿Km3l mu*x:

«rm». '¡ñ'n'nfñl T...“ 'I'l' A‘lgla¡gm fl!¡nn ¡al!V‘I‘m‘.AA.9. w¿l ‘! t a (WWW “ÑHJ I'Il“HL.¡ ; H lll li '."JJ' "íïïï

jllz'¡’I '.ï:;\{¿_.r.” I FH

Fig.12. Autorradiggrefie del gel definafuraliaente de 3%acrilami­ da.ufili¿edg gara anaiiaar la fiecnencianuclegfidiga. Los fragmentos analizados corresponden al: i) clon SEH que deriva del clon 2212 después de la eliminación del fragmento EagI y posteriormente HincII. ii) clon 22XIXsin el fragmento Ach (ver Fig.15). La marea utilizada fue [3553dATPy la siembra corresponde al or­ den especificado en cada carril (G,A,C,T). La posición del tracto de 7G en SEHcorresponde a la posición 260 de la secuencia (ver­ Fig.18) y la zona A3G3en XIX sin Ach a la posición 1030.

Caract. gen poliubi —124 — Resultados y Discusión

ADN control vat Vvvt Rrec Vrec

Fig.13. Gel.¿le¿su 52.621{1,83%teñidocen E1131: para ¿talk de Bluescript con mmm Lagos . 1.-‘4. El primer carril corresponde al ADNcontrol correspondiente al del fago M13 incluido en el sistema comercial de secuenciación comostandard de masa y pureza. Los carriles correspondientes a But y Vw: son purificaciones del ADNscde los fagos helper. Rrec y Vrec sen los ADNscde los rescates de un mismo plásmido recom­ binante con los des tipos de fagos helper. Se observa en estos carriles además, restos de ADNscde los fagos utilizados en elv rescate en relación apropiada en el carril Rrec.

Caract. gen poliubi —'125 — Resultados y Discusión

.m Fig.l4. emglpado para pxtnagr {[¿gmenLQEmalgadgfi. Se marcó en un extremo por la técnica de fill in el fragmento a eeeuenciar por la técnica de Maxany Gilbert. Se aprecian en la foto, bandas "enmgrgggafi" que corresponden a los cortes sobre la placa autorradiográfica que sirve como molde para extraer del gel la banda correepondiente. La nomenclatura corresponde a loe fragmentoe‘que ee generan por doble digestión con XhoI-PBtI del vector 2212 digerido y marcado en loa eitioe' Aval.

Caract. gen políubi —126 — Resultados y Discusión

La identificación de los extremos 3' y 5' se efectuó por la técnica de protección a la digestión por la nucleasa Sl (ver 6.7). Para la ubicación del extremo 3' se siguió el protocolo descripto en 6.7.2 y los ADNsc utilizados cubrían las zonas que se muestran en la Fig.15 (3'88). La sonda utilizada en la hibridación fue el clon 2212 mar­ cado por randompriming en condiciones de alta estringencia. La porción protegida permitió localizar el extremo 5' a1­ rededor de la posición 1980 de la secuencia que se muestra en la Fig.18. Para la determinación del extremo 5' se siguió el protoco­ lo descripto en 6.7.1, y la extensión se realizó a partir del si­ tio Ach, comose muestra en la Fig.15, recortándose con la enzi­ ma SacI. Los resultados se ilustran en la Fig.17 comprobándose, además, la aparición de un fragmento correspondiente a una zona del segundo exón (banda de 184 nt) como era de esperar. El-ARN total de fl¿_gxnfisn utilizado en ambos ensayos se purificó de cultivos de la cepa salvaje tratados con cicloheximi­ da (TI) en condiciones descriptas en 6.16.5. En estas condiciones de cultivo, existe un aumento de aproximadamente 20 veces en los niveles de ARN de poliubicuitina (ver más adelante, en ANALISIS DE LA EXPRESION DEL GEN DE POLIUBICUITINA). Los controles sin ARNreflejan la especificidad de la pro­ tección, ya que la digestión de la sonda en la mayoria de los ca­ sos fue completa. En el carril (-) de la Fig.16 queda un resto sin digerir de la sonda SXZH,pero no se ve protección específica alguna que afecte la interpretación. Se acota así el extremo3' al sitio HincII en la posición 2040 de la secuencia.

Caract. gen poliubi - 127 ­ Resultados y Discusión

. SX x¡x5A SGXÍ'3“ C:::::::::::::::%iïg:3 C::: :::::::::::::::::SEH

X Ac Ac AcX X HC

Hd HC Ea Hd

@ Polylinker ' SK bluescript 100w I Polylinker KvxAJ1 Ü IS

Fig.15. Efignéma¿La¿gta-Mmmm ¿EL¡QEHum de] im: 5.1.1.“, dg_pgljuhqujtjna, Se muestra el mapa del clon 2212 y los fragmeñtoa utilizados en la determinación de los extremos 3' utilizando ADNsc(3'ss)‘ como se indica en líneas abiertas. Conflecha se indica la dirección. de la extenfiión para generar la sonda utilizada en la localiza­ ción del extremo 5' (S'ext).

Caract. gen poliubí —128 u Resultados y Discúsión

EVE-16.“.-' 1%utilizado en la del eximmg5' de].Liam-191112302 gli 9Q l j gghjal; j 33'ng, Los fragmentos de ADNecutilizados son los indicados según el es­ quema de la Fig.15. La banda empleada corresponde al clon 2212 en condiciones de alta estringenoia. Los carriles con el signo (+) indican incubación con ARNtotal de .a,(TI), el signo (-) indica "sin ARN".El carril sin sig­ no, corresponde a la sonda sin tratamiento (INPUT)en cada terna. Mrepresentalar. el carril utilizado para marcadores de peso moleouv Las flechas indican los fragmentos protegidos.

Caract. gen poliubi —129 — Resultados y Discusión

199­ 184­

Fig.17. ¿Leal¿al¿LaMmm 5%Mmmm­ lizante: WW'T'dg gn La 539.431255113121¿la' ' maga pm" ubica}; gl extremg ,‘í' del Lrarmñrjpm. (+) incubado con ARNtotal de fl. Qrfifififi.(TI) (—) sin ARN. El carril a la izquierda del que Güntíene el signo (—)correspon­ de al (IHPUT). ­ M: marcadüres de peso malecular.

Caract. gen poliubi —130 — Resultados y Discusión

En el carril correspondiente a la sonda entera, 2212, no se llega a ver la segunda protección de alrededor de 200 nt (pri­ mer exón) por las limitaciones del método, pero confirma la zona putativa para el sitio del extremo3'. La sonda SEH(clon 2212 sin el fragmento EagI, en que pos­ teriormente se eliminó el fragmento HincII), se utilizó comocon­ trol interno del método para visualizar un fragmento pequeño de tamaño conocido. La Fig.17 muestra el resto de sonda sin digerir, que se explica por re-annealing. El producto de la extensión se separó en un gel nativo con el consecuente aislamiento de un fragmento de ADNdc. Las bandas que se ven en el carril (+) son específicas de la protección, ya que no se observan en el carril INPUTni el (-).

4.2.3. Análifiifi de la organizacion del ¿en

La secuencia completa del clon 2212 se detalla en la Fig. 18, la que incluye las zonas codificante, no codificante y flan­ queantes de ambos extremos. Encontramos en este gen, 4 unidades repetidas que codifi­ can para monómerosde ubicuitina ubicadas cabeza-cola sin secuen­ cias espaciadoras, como es característico de los genes de poli­ ubicuitina en otros organismos. Sin embargo, la presencia de un intrón en la región codificante, en este caso en el primer tan­ dem, es una característica distintiva que sólo se ha encontrado hasta ahora en el gen de poliubicuitina de C. elegans (Graham. et al, 1988).

Caract. gen poliubi - 131 ­ 1 ¡í ,1! tlf tlf >|< 1 AAGUTTGTCAAGATGCTGGCAAAGTAACGAGAAGTCGAGATGGCACTCTCGGATTTGTAA *WT**W 61 ACAACTGAAACTCGAAGGTCCGTCGTCCAGCCACATGCAGATCATTCTTTGGCTTATTCA ¡F 2k * 7k 7k :k 121 TCCAGAGAGAACCTAACTGAAGCAGGGCAAACAGCCGCTGAGGTGACTGACGCATTGACt ¡If 7k 2k 3k :0" :lr. 181 GGGCAAACGGCTGGGTGAGTGCCCGCCACTGCAGAAGGCGTTGACAGTGCGATCAATCAG

:F rk :1" 71€ 7k. :k 241 CCGCGGTCACTGTTGGGGGGGATGTCCAACCACTCCTGCCAACGGGCAACAGCCAACAGT Ill. 3k :k tk 2k. :k 30 1 CAAGGGGGAAACTGTCGTC'I'GACTGGC'l"I'CTTCTCGCGCCTTCCCTCCAC'I'TCTCTG'I'CA .1; :k :k :In :k. ' 2k 361 CTCCCAACCGCCAAGTGGCTTGTGCGTGGCCTGTCAGTGAAGGTGAGTGACACACCACTC

:k 1k 2k >01 7k >k 421 ACACCGTGGCAGGCGTTGCAAACGGACCAGTGACGATCGACTTGGGACCTGGCACCTTTC :Ir tir. :i ¡ir fl! 7k 481 CGCTTCCACTCCAGTCCCGTCACCTCTTCCCTTCACTCAGccccGCTTCGTTCCCTTTCC :lr. ¡lr :Ir «1K * 7k­ 541 CAGGAGTGGAAGCCTGGCCTCCGAAGTTCGCCATCCTGATTCCTGCCACTTCCGCCGCAG

601 CCAGCACCTGAACCTACTF7k ¡ T1TAATCCTCCCCGCCCATCTGCATCCCCGATTCCATTTC 1 :Ir. :Il tk >k :Ir' :k ill. >k tk tk 661 TTCCGCTTTCACCATCTCTCTCCATCGCCATCATCGCAGGAGTGTTCATCCACGCACATA ;k r}: :k :t: 7k. :k 721 TCATTCCCGCCACTCGATTCTAGTCATTTCGCTTCATCCATCAACAGTQQAÏÏQGTCCAC >k :lr X ¡k 1k 781 TGCACAACCCCCAIQ AIG CAG ATT TTC GTC AAG ACT TGIAAGITATGCACG MQIFVK * 7k . . 832 CTCACCGCATCATCACTTTACCATCGATCGACCGATGQIAAQÏATCTCTTCGCAH.TG L

:k. 7k :Ix: ak. :k. 889 ACC GGC AAG ACC ATC ACC CTC GAG GTC GAG TCG TCG GAT ACC ATT TGKTITLEVESSDTI tk tk. >lr. 2k 934 GAC AAT GTC AAG CAA AAG ATT CAG GAC AAG GAG GGC ATT CCC CCC DNVKQKIQDKEGIPP :k tk ‘4‘. * >|< 979 GAC CAG CAG CGC TTG ATT TTT GCC GGC AAG CAG TTG GAG GAT GGC DQQRLIFAGKQLEDG 2k 2k 7k >k 1024 CGC ACC CTT TCC GAC TAC AAC ATC CAG AAG GAG TCT ACC CTC CAC RTLSDYNIQKESTLH 7k :k k :|r. 2k 1089 CTT GTC CTC CGC CTG CGC GGT GGT ATG CAA ATC TTC GTC AAG ACT L' V L B L B G G M Q I F V K T 3k. :k. 2+. :|r. 1114 CTT ACC GGC AAG ACC ATC ACC CTT GAG GTG GAA TCG TCC GAC ACT LTGKTITLEVESSDT m w m * * 1159 ATP GAC AAC GTC AAG CAA AAG ATC CAA GAC AAG GAG GGC ATT CCT IDNVKQKIQDKEGIP

Fig.18. Semanala rmmmm y.(Laamixmáaidgfi1mm cLel¿en ¿LaMuncuiiim de HJLasaa. >k 7k iii tlf CCC CAG CAG CGT CTC ATT TTC GCC GGC AAG CAG CTT'GAA GAC PDQQRLIFAGKQLED .zk :rtk :|r_ 2k GGC CGC ACT TTG AGC TACAAC ATT CAG AAG GAG TCT ACC CTT 1RTLoDYN1 n" I QKEoTL ' f‘ 7k" tf tk CAT CTC CTT CTT CCT CTA CCC CCT CCT ATC CAC ATT TTC CTT AAC HLvLRLPCCnQIFvK * ú 1 m T 1339 ACG CTT ACC CCC AAC ACC ATT ACt CTC CAC GTT CAC TCT TCC CAC TLTCKTITLEv ssD

W. ¡k 2k 2k. 1384 ACC ATC CAC AAC CTA AAC CAA AAC ATC CAC CAC AAC CAC CCT ATC TIDNvKQKIQDKECI

FF. 7k 3‘ W. W­ CCA CCT CAT CAC CAC CCT CTC ATT TTC CCT CCA AAC CAC CTC CAC PPDCQPLIFACKQLF 3k 7k f >k CAT CCT CCC ACC CTC TCC CAC TAC AAC ATT CAC AAC CAC ACC ACC DCRTLsDYNIQKEsT

¡k 3k >01. 3k. :Ir CTC CAC TTC CTC CTC CCT CTT CCT CCT CCT ATC CAC ATT TTC-GTC

L H L* v L R ¡K L C Cïk I'll 62 I * F v AAC ACC TTC ACC CCC AAC ACC ATT ACC CTC CAA CTC CAC TCT TCC KTLTCKTITLEvEss 3k 3k ¡k X FIC CAT ACC ATT CAT AAC CTC AAC CAA AAC ATC CAC CAC AAC CAC CCT DTIDNvKQKIQDKEC W. 7K 3K 3' ATC CCC CCT CAC CAC CAC CCT CTC ATC TTT CCT CCT AAC CAC TTG 1PPDQQRLIFACKQL :or :Ir. 3k xr. * CAC CAT CCC CCC ACC CTC TCT CAT TAC AAC ATT CAG AAC CAC ACC EDCRTLsDYNIQKEs 3!" >k 2k :k. ACT CTT CAC TTC CTC CTC CCC CTC CCT CCC CCC CAC TAA CCCCATTC TLHLvLRLRCCQ­ m * x m m * TCCTCTTTCTTTCTCATTCTTCATCACCACCAACCCTTCATTTCCCCCTTCACCCTTTAT ik >K 7k >K ÍK 7K TCCCTTACTTATTCCATCCATCCCTTCCCAAATCATCACAACCATCAAACACCCCATATC

3k 3k 7k 3K W- 3k TACCCCCAATCTAATCCCACACCCTTCATACATACACCCATCCCATAATAAACACTATAT ‘ 7k * * TÉACGGTCTCAXACATGATGTÉTCTTGGTGATTTGCIIQIQIQÏQAATTCGTGAGCTTTT

GÉTATTCCCGTÉAACCTGTCAÉCTGGTCAATÉGGGGATGGAÉTCGGACGTGÏAAGTCAAG

AÉGGTGGTGCAÉTGGGTTGGTXCACACCGTGÉGAGGTGACCÉTTGCGTGGCÉGAAAGTGG

CÉCCCTTTTTGÉTGGACAAGAÏGCATCATACÉTGAAAGATAÉGTACCGACCÉCCGAGTTCm AGTTGCGCTAGTCCGGCCGTGGAGCCCTCCCTCCCCCCC Resultados y Discusión

Las secuencias dadoras, receptoras y el consenso interno para el procesamiento de este intrón, corresponden perfectamente al consenso encontrado en otros genes ya caracterizados de EL grassa (Germannet al, 1988).

Massa GTAAGT ACTAAC —7- 19——CAG CGGT S. cerevisiae GTATGT TACTAACA——18-53——CAG T Eucariotes superiores GTAAGT CAG

Estas secuencias se encuentran resaltadas y subrayadas en las posiciones 820 para la región dadora (GTAAGT),870 para la zona de reconocimiento interno (GCTAACT)y 895 para la región aceptora (CAG)en la Fig.18. El intrón no tiene ninguna secuencia particularmente inte­ resante. Su pequeño tamaño (68 pb) es característico de este as­ comicete (Germann et al, 1988). Se comprobóque este intrón se procesaba correctamente cuando se analizaron clones de cADN(ver más adelante). Las regiones promotoras de los genes de eucariotes se de­ finen por una serie de elementos característicos, a saber: TATA box o consenso de Goldberg-Hogness, normalmente localizado 30­ 100 pb hacia el extremo 5' (upstream) del sitio de iniciación de transcripción que tiene una secuencia consenso 5'-TATA(A/T)A(A/ T)-3' (Cordon et al, 1980; Struhl, 1986; Breathnach y Chambon, 1981), el sitio de capping cerca del inicio de transcripción con una secuencia consenso PyCATTCPur(Sures et al, 1978), y una CCAATboxque también puede ser activa en la orientación inverti­

Caract. gen poliubi - 134 — Resultados y Discusión da (McKnight y Tijan, 1986; Graves et al, 1986), que normalmente se localiza entre 50-130 pb upstream del sitio de iniciación de transcripción (Wasylyk, 1986; Struhl,1986). Comparandolas regiones 5'-flanqueantes de los genes de NL grassa_hasta ahora caracterizados, se observa una cierta variabi­ lidad. Algunos contienen secuencias análogas a la TATAbox a la distancia esperada (Roberts et al, 1988; Kinnaird y Fincham, 1983; Arends y Sebald, 1984; Munger et al, 1985), y otros sólo una zona rica en ATupstream del sitio de iniciación de la trans­ cripción (Schechtman y Yanofsky, 1983; Rutledge, 1984). La secuencia CCAATboxtambién suele estar ausente (Balan­ ce, 1986). El examen de la secuencia de la región 5' del gen de poli­ ubicuitina de fll__gzafifia reveló una TATAboxpotencial (posición 620) alrededor de 180 pb upstream del codón de iniciación, y aproximadamente25 pb del sitio putativo de inicio de transcrip­ ción con una homología apropiada TATTTAArodeada de una zona rica en GC, como también fue descripto. En la posición 460, a una distancia de 160 pb upstream del TATAbox, se encontró una secuencia CCCAAGTenla cadena comple­ mentaria con cierta homología con la CCAATbox. La otra secuencia homóloga a este elemento se encontraría muy alejada (TCAATen la posición 235). Con respecto a la secuencia consenso del sitio de capping en la posición 760 (subrayada en la Fig.18), se localizó un arre­ glo nucleotidico homólogo CCATTCGa 30 pb del inicio de traduc­ ción. Tambiénes importante analizar las secuencias adyacentes al sitio de iniciación de la traducción, bastante conservadas en eucariotes superiores, involucradas en la fidelidad de iniciación (Kozak, 1987). En particular en fll_gznfi&a, los datos recogidos de

Caract. gen poliubi —135 — Resultados y Discusión

las secuencias hasta el momentodescriptas siguen un consenso re­ presentado por 5'-(A/C)(A/G)(T/A/C)CA(C/A)(C/A)ATGG-3' (Burns y Yanofsky, 1989). La región adyacente correspondiente en este caso localiza­ da a partir de la posición 790 es CCCCATCATGC,70%homóloga a la anterior. Cabedestacar que varios autores consideran las posi­ ciones más criticas la 1,3,4 a partir del ATG,lo que se cumple apropiadamente. La presencia de G en el sitio adyacente del ATG nunca se cumple para los genes de ubicuitina, ya que esa posición es invariante para el segundo a.a.[g1utamina (Q)] cuyos codones son CA(A/G). De los datos de protección a la nucleasa Sl, se ubicó el extremo 5' del mARNalrededor de la posición 650 a una distancia relativa apropiada respecto de los elementos regulatorios. Según lo descripto por Arends y Sebald (1984) y Giles et al (1985), el tamaño de la región 5' no codificante de genes de fl¿_g:assa ca­ racterizados estaban entre 50 y 400 pb; Las secuencias flanqueantes al putativo sitio de inicia­ ción de la transcripción tienen una homologia importante según lo descripto por Corden et al (1980), 5'-YYCAYYYYY-3'(Y=pirimidi­ na). En este caso, la secuencia flanqueante TTCCATTTCT,estaría a una distancia de 25 pb del TATAbox. En la mayoria de los genes de hongos filamentosos y leva­ duras, el sitio de iniciación del transcripto está precedido por una secuencia rica en pirimidinas (Ballance, 1986), tal comoocu­ rre en este caso. Debemosademás tener en cuenta que una característica bas­ tante general en los genes de N¿__crassa es la iniciación de transcripción en sitios múltiples (Ballance, 1936; Arends y Se­ bald, 1984).

Caract. gen poliubi —136 ­ Resultados y Discusión

En toda la región 5'—nocodificante secuenciada, no existe un consenso que justifique la presencia de un intrón potencial. Los clones de cADNanalizados (LG1 y C1) confirman este dato has­ ta una distancia de 110 pb "upstream" del ATG(Ver más adelante). Hasta el momento no se encontraron en este organismo in­ trones mayores de 400 pb. Si bien la metodologia apropiada para la determinación exacta del extremo 5' involucraría la secuenciación de un CADN sintetizado a partir de un iniciador (primer), lo más 5' de la secuencia codificante conocida, los datos obtenidos por la meto­ dologia de protección a la nucleasa Sl son válidos, dentro del error experimental, teniendo en cuenta las consideraciones ante­ riores. No se encontró ninguna secuencia con homologia importante con el "motivo" de HSE (CT-GAA-TTC-AG)en la zona 5' no codifi­ cante. Esto se correlaciona con la ausencia de inducción por tra­ tamiento térmico del mARNquecodifica para este gen en fl¿_grflfififi (ver mas adelante). Sin embargo, en la posición 562 se localizó una secuencia palindrómica (QGAAGIIQQ)queparece corresponder a un resabio de dicho elemento HSE. La zona 3' no codificante del gen de poliubicuitina de HL Qzassa también fue analizada, encontrándose una secuencia idénti­ ca al consenso AATAAAlocalizada 13-30 pb upstream del sitio de poliadenilación en genes eucariotes superiores. Esta secuencia consenso estaria relacionada con el procesamiento, comoseñal de clivaje y en agregado de poliA a los transcriptos primarios (Be­ noist et al, 1980; Nevins y Wilson, 1981; Proudfoot y Brownlee, 1976). La secuencia AATAAAenel gen de poliubicuitina de N¿_ngr asa está en la posición 1960 a una distancia de 180 pb del final de traducción, y no se encontró otra secuencia consenso en 400 pb

Caract. gen poliubi - 137 — Resultados y Discusión analizadas en esta zona, aunque vale la pena destacar la presen­ cia, en la hebra opuesta, de la secuencia TATATTTenla posición 1970 De los genes de fl¿_gzassa en que se analizó la zona 3', no siempre se encontró una secuencia consenso, relacionada con» el procesamiento. McLandelanet al identificaron una secuencia consenso YGTGTYYY(Y=Co T), localizada en la región 3' downstream, de la señal de poliadenilación relacionada con la eficiencia de termi­ nación de mARNen el 67% de los genes de mamíferos. Hasta el mo­ mento, ninguno de los genes conocidos de fl¿_grassa contenía una secuencia homóloga, aunque sí se veia una zona rica en T y G en su lugar (Birnsteil et al, 1985). En el caso del gen de poliubicuitina alrededor de la po­ sición 2100 existe una secuencia 100%homóloga TTGTGTCTC(subra­ yada en Fig. 18) a una distancia apropiada (50 pb) del posible extremo 3', con un enriquecimiento periférico de T y G. También existe una secuencia 75% homóloga, TGGTGATTT,en la posición 2000. Otras secuencias encontradas en varios genes eucarióticos, TTCAAAoderivados similares, a una distancia de 20 a 60 pb down­ stream de la señal de poliadenilación, también se consideran como implicadas en el procesamiento de este extremo (Urano et a1, 1986). En la posición 1980, a 20 pb del sitio de la señal AATAAA, se encontró una secuencia similar CTCAAA,quepodría tener signi­ ficación. El análisis de la región 3'-no codificante en el gen de poliubicuitina de H. atacan tampoco reveló una combinación de se­ cuencias consenso que justificara la presencia de ningún intrón. Cabe destacar que los clones de cADNanalizados (LG1 y Cl) no su­ peraron la posición 1975, lo que no se contradice con la ¡locali­

Caract. gen poliubi - 138 ­ Resultados y Discusión zación de -1a putativa señal de poliadenilación en la posición 1960 y además confirmaron la ausencia de intrones en la zona abarcada. La coincidencia de las secuencias de los clones genómi­ cos y de cADNpermite asegurar que el gen de poliubicuitina ais­ lado es el que se transcribe (ver ANALISIS DE GENOTECASDE cADN, más adelante). Si bien no se pudo determinar el extremo 3' con precisión, ya que de los clones de cADNanalizados ninguno contenía el trac­ to de poliA característico, las señales potenciales encontradas coinciden bastante bien con los datos de protección a la nucleasa Sl obtenidos. La importancia de todos estos "motivos" implicados en la regulación de la expresión de este gen, sólo podrá establecerse mediante un análisis funcional que no fue realizado en este caso. Sin embargo, es interesante hacer notar la presencia de estos po­ tenciales elementos regulatorios. Resulta interesante comentar también, la presencia de al­ gunas secuencias que se repiten o forman palindromes, tanto en la zona 5'-como en la 3 —nocodificante, que por el momentono tie­ nen homología o secuencias regulatorias conocidas, ni se tienen datos de su importancia en el gen de poliubicuitina analizado. Las secuencias repetidas tienen un valor estadístico, si tomamosen cuenta que para un arreglo al azar de 4 bases diferen­ tes, la probabilidad de encontrar una secuencia de 5 bases en un orden determinado, sin ambigüedad, es de 1/45 = 1/1024. Ambaszo­ nas analizadas tienen una extensión menor a este valor, lo que implica que arreglos de más de 5 bases repetidos son estadística­ mente significativos. Los datos se resumen en la Tabla I.

Caract. gen poliubi —139 — Resultados y Discusión

TABLA I

Localización Motivo Posición en la secuencia

Extremo 5' y CCCGCCACT 202,726 zona flanqueante AGGCGTTG 216,429 TTCATCCA 117,705,753 GGTGAGTG 194,402 CCACTGCA 206,777 GGGCAAAC 145,181 GCAAACGG 133,436 CAACAGTC 294,762 TCCTGCCA 274,581 CAGCCGC 152,238 AACAGCC 150,283 GAACCTA 129,610 AACTGAA 63,135 ATCATTC 101,720 CCACT 206,270,347,485,585,729,776 CCATC 570,635,671,681,687,757

Hairpins AGIGCCCGCQACI 188 CAAGJI'GG01'13. 372 QGIIGCAMQG. 432 MAQGGAGIQQAA 537 Repeticiones invertidas QAAGGGGQAAQ 230

Extremo 3' y TGGGTTGG 1871,2103 zona flanqueante TGATGAC 1311,1883 CTTGGTG 1752,1992 GTCTCAA 1976,2011 GGCCGAA 1913,2139 CAAGATG 2087,2167 Hairpin QÏQAATTCGIQAQ 2014 Repeticiones invertidas ML""" (511mm 1793

Caract. gen poliubi —140 ­ Resultados y Discusión

En particular, en la posición 630, a 5 pb del TATAbox, se encuentra en la hebra no codificante, una secuencia TGGGCGGGGcon alta homologia con el consenso descripto por Kadonaga et al (1986) 5'-(G/T)GGGCGG(G/A)(G/A)(C/T)-3'para el sitio de unión del factor de transcripción Spl de la ARNpolimerasa Il. Comoocurre en la mayoría de los organismos, el gen de poli­ ubicuitina codifica para un aminoácido extra fusionado al C-termi­ nal de la última repetición (ver 3.1.15), que en el caso de fl¿_grat asa es la glutamina (Q). En la secuencia aminoacidica de la Fig 18, las metioninas iniciales de cada repetición están resaltadas y recuadradas. La preferencia en el uso de codones (codon bias) está de acuerdo con el encontrado por otros autores en los genes caracteri­ zados de H¿_Qrfifififl. La exclusión de codones con A en la tercera po­ sición (ver Tabla II, tripletes resaltados), y la gran preferencia por tripletes que finalicen en pirimidinas donde C se encuentra más a menudo que T (Orbach et al, 1986; Kinnaird y Fincham, 1983), co­ rrelacionan el nivel de la expresión genética con el númerode co­ dones utilizados. Los genes que se expresan constitutivamente (his­ tonas H3, H4, Woudt et al, 1983; glutamato deshidrogenasa, Kinnaird y Fincham, 1983; B-tubulina, Orbach et al, 1986), utilizan un núme­ ro limitado de codones, a diferencia de los genes que están muyre­ gulados (trpl, Schechetman y Yanofsky, 1983; hisJ, Legerton y Yanofsky, 1985; lacasa, Germannlet al, 1988). En particular, la po­ liubicuitina de fl¿_grassa está codificada por el 75%de los codones posibles para todos los aminoácidos involucrados mientras que, por ejemplo, la lacasa utiliza el 97%. Es interesante también destacar el uso poco frecuente de co­ dones AGN(N=cualquier base) para serina (S) y arginina (R), tam­ bién descripto por Kinnaird y Fincham (1983).

Caract- gen poliubi - 141 ­ Resultados y Discusión

TABLA II - USO DE CODONES.

TTT F 2 TCT S 5 TAT Y 0 TGT C 0 TTC F 6 TCC S 4 TAC Y 4 TGC C 0 TTA L O TCA S 0 TAA - TGA - 0 TTG L 8 TCG S 4 TAG 0 TGG N 0

CTT L 10 CCT P 3 CAT H CGT R 7 CTC L 12 CCC P 3 CAC H 3 CGC R CTA L 1 CCA P 1 CAA Q 6 CGA R 0 CTG L 5 CCG P 1 CAG Q 23 CGG R 1

ATT I 16 ACT T 6 AAT N 1 AGT S 0 ATC I 12 ACC T 16 AAC N 7 AGC S 3 ATA I fl ACA T fl AAA K 0 AGA R 0 ATG M 4 ACG T 6 AAG K 28 AGG R 0

GTT V 3 GCT A 2 GAT D 9 GGT G 10 GTC V 8 GCC A 2 GAC D 15 GGC G 13 GTA V 1 GCA A 0 GAA E 3 GGA G GTG V 4 GCG A 0 GAG E 17 GGG G 0

La comparación de la secuencia aminoacídica de ubicuitina con la de otras especies se ilustra en la Tabla III, y difiere en un solo aminoácido con la de S. cerevisiae en la posición 28 y en tres posiciones con la de humano(19,24,28). Todos estos cambios se encuentran en zonas de conocida variabilidad.

Caract. gen poliubi - 142 ­ Resultados y Discusión

TABLA III — COMPARACION DE LA SECUENCIA DE A.A. CODIFICADA POR EL GEN DE POLIUBICUITINA.

* 3k * Humano,pollo,rata, > :MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPP Xénopus,mosca,trucha Plantas B: S D S. cerevisiae C: S D S Mmmm D: S D Q D.discoideum E: G N T.cruzi F: A S D C.elegans G: A T.pirifbrmis H D A

* * * x Humano,pollo,rata, A:DQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGG Xenopus,mosca,trucha Plantas S. cerevisiae Nsnrgfipgra_gnañ&a D.discoideum T.cruzi C.elegans

T.pirifbrmis :EQ'Z'JLTJUOUJ

Caract. gen poliubi - 143 ­ Resultados y Discusión

La presencia del intrón en la parte oodifioante conduce a la partición del triplete que codifica para leucina (L) en posi­ ción 8 y este tipo de interrupciones también ee encontró en otros genes caracterizados de flL_gnassa.(Harnieh et al, 1985; Hager et al, 1986; Sachs et al, 1989). La comparación de la secuencia nucleotídica con la de otras especies indica una homología de 70-75% en promedio con ubiouitina de levadura o de Xenopus, 75-80% con pollo, y 70-72% con humano. En la Tabla IV se ilustra la comparación de la secuencia nucleotidica entre las repeticiones del poliubicuitina de fl¿_gnah asa y con la porción de ubicuitina del gen de fusión fl. grasaa (ver mae adelante). Se indica el número de nucleótidoe en que di­ fiere en oada comparación, y entre paréntesis el porcentaje de homología. En el caeo del gen de fusión, no incluye los 15 nu­ eleótidos del extremo 5' de la parte codifioante de ubicuitina. Los valores en loe reouadroe corresponden a los promedios corres­ pondientee. TABLADEW IV - COMPARACION DE LA SECUENCIA NUCLEOTIDICA DE UBICUITINA fl repetición

1 2 3 4 FUS 1 36(84) 41(82) 40(82) 32(86) 2 40(32) 57(75) 29(87) 3 31(88) 27(88) 4 88% 30(87)

Caract. gen poliubi —144 ­ Resultados y Discusión

En la Tabla V se ilustra el ueo de codonee de serina, en particular, comparandolas distintas posiciones.

TABLA V — USO DE CODONES DE SERINA. fi posición Tandem ü 19 20 57 65

1° —TCN- -TCN— -TCH— -TCN—

2° —TCN— -TCN— -AGY— -TCN—

3° —TCN— —TCN— —TCN— —AGY—

4° -TCN— —TCN- -TCN- —AGY­

Fus(UBI) -TCH- -AGY— -TCN— -AGY—

El aminoácido serína (S) está codificado por 2 grupos de codonee AGY(szirimidina) y TCN(N=cua1quier base). Comose vio anteriormente (ver 3.1.16. EVOLUCION),el codón AGYes producto de una mutación concertada reciente, a partir de la fijación de TCNen levadura. Los datos en N¿_gzafifiacoinciden perfectamente con el es­ tudio evolutivo realizado por Sharp y Li (1987a,b), donde al igual que en levaduras existe un solo codón AGYpor cada tandem de 4 en 2 de las posiciones: 57 y 65. Cabe destacar que ia secuencia aminoacidica de las 4 repe­ ticiones presentes en el gen de poliubicuitina y la secuencia aminoacidica parcial correspondiente a la proteina de fusión, son idénticas.

Caract. gen poliubi —145 ­ Resultados y Discusión

Loe genes Mmmm hasta el momento caracterizados, 6011.:

Subunidad V de la citocromo oxidasa Sachs et al, 1989 Carrier ADP/ATP Arends y Sebald, 1934 ATPasa Hager et al, 1986 Subunidad Fe-S de la ubiquinol­ citocromo C reduetasa Harnisch et al, 1985 Genes expresados diferencialmente durante la conidiaeión Berlin y Yanofsky,1985a,b CPC-1 (gen homólogo al GCN4de Paluh et al, 1983 levadura) Am(glutamato deshidrogenasa) annaird et al, 82 Kinnaird y Fincham, 1983 Qa-4 (3-dihidro shikimato-dehidratasa) Rutledge, 1984 Cu-metalotioneina Münger et al, 1985 histonas H3 y H4 Woudt et al, 1983 HIS-3 (gen involucrado en la bio­ síntesis de histidina) Legerton y Yanofsky, 1985 represor del gen Qa Huiet y Giles, 1986 CON-8(gen asociado a la conidiación) Roberts y Yanofsky, 1989 B-tubulina Orbach et al, 1986 TRP-3(triptofano sintetaea) Burns y Yanofsky, 1989 Lacasa (beneendiol-oxígeno-oxido­ reduetasa EC 1.10.3.2) Germann et al, 1988 Proteína riboeomal homóloga a cyb-Z Kreader y Heckman, 1987

Caract. gen poliubi —146 ­ Resultados y Discusión

4.2.4.AnálisisdeSouthern

Se hizo un análisis por Southern blot del ADN genómico utilizando comosonda el clon 2212 (fragmento 2,2 Kpb que incluye zonas codificantes y flanqueantes del gen de poliubicuitina de u; (massa). La digestión del ADNtotal de fl¿_gxafisa con XhoI mostraba sólo 3 bandas de 2,3; 1,3 y 0,5 Kpb al hibridar con la sonda ho­ móloga en condiciones de alta estringencia (ver 6.11), aunque el lavado se realizó en 0,5 X SSC /1% SDS a 60°C (ver Fig. 19). Esta condición de estringencia intermedia se empleó con el objeto de identificar otros loci que contuviesen secuencias homó­ logas a ubicuitina. En el carril de la doble digestión BamHI/HindIIIse iden­ tificó una banda intensa de aproximadamente 3,6 Kpby otra de 1,1 Kpb. De acuerdo con el mapa de restricción del clon aislado (ver Fig. 11), se puede comprobar que las 3 bandas XhoI que apa­ recen en la autorradiografia, puedenjustificarse por los sitios mapeados para esta enzima. Sólo que la banda de 100 pb no se re­ veló en el Southern blot por su tamaño reducido. El tamaño de la banda más intensa obtenida por la doble digestión coincide perfectamente con la encontrada inicialmente por hibridación con la sonda heteróloga (ver Fig. 3). Las bandas tenues de z 7 Kpb y 4,8 Kpb podrían explicarse por digestión parcial, según lo observado tras digestión simple (ver Fig. 3) y de acuerdo con el mapa construido del clon aislado (Fig. 11). La banda de aproximadamente 1,1 Kpb no se_puede justificar con los datos de este clon de poliubicuitina; sin embargo, la presencia de otro gen conteniendo al menos la secuencia de un mo­

Caract. gen poliubi —147 ­ f2; Resultados y Discusión n._,'_'g¿.-' .. I nómero¿e ubicu1t1¿:??como en el caso de ïéeígenéávdé_fusión,.dé ubicuitina, podría dar cuenta de la misma (VOÉÜ4{5&3){- I ‘h C' Los,datos anteriores parecerian indicar i; rréséñcia de un' Bolo locas para el gen de poliubicuiting-en¡fiqfé?organismo; i '

füCaract. sei-poliubilzïl48 d Resultados y Discusión

1 2 3

i ““m' 22

oHM} as ._- a—.. 23

Um

0]

Fig.19. fingiágrn.hlgi_genámico de ADEde fli_crafiaa. El producto de la digestión con XhoI se separó en los carriles 1 y 3, y con BamHI/HindIII en carril 2. Se hibridó con el clon 2212 en condiciones de eetringencia intermedias 0,5 X SSC/1%SDS60°C.. En cada carril se sembró aproximadamente 20 pg de ADN.

Caract. gen poliubi - 149 — Resultados y Discusión

4.3. ANALISIS DE LA EXPRESION DEL GEN DE POLIUBICUITINA

4.3.0. “flLQdQIQEÍQ

El análisis de la expresion, se hizo por la técnica de Northern blot descripta en 8...2. La preparación de ARNse des­ cribió en 6.2. y las condiciones de cultivos se detallan en 6. 16.5, cho así también la nomenclatura utilizada para cada condi­ cion. En todos los geles se sembraron cantidades comparables de ARNtotal la que se aclara en cada caso en la leyenda de la figu­ ra.

4.3.1. ¿Lela musica2Q):tratamientoconan­ tjhjóthQfi

El estudio de la respuesta a la inhibición parcial de la síntesis proteica por tratamiento con cicloheximida en fl¿_grafifia, es un modelo estudiado por nuestro grupo de trabajo que comenzó con el clonado de genes de respuesta temprana (E. Grotewold, Te­ sis doctoral) y tardía (Aisemberg et al, 1987,1989). Unode estos últimos, resultó tener homología con un miembrode la superfami­ lia del eitocromo P450 (Attar et al, 1989). El grupo de Varshavsky et al (Ver 3.1.13) describió por primera vez la relación de la ubicuitina con 1a respuesta a con­ diciones adversas o de estrés y, además, la importancia del gen de poliubicuitina en la viabilidad de esporas. Comose muestra en la Fig.20, el tratamiento de cultivos en estado estacionario con dosis de cicloheximida que inhiben parcialmente la síntesis proteica (z 75%), provoca un incremento de aproximadamente 20 veces en la acumulación del mensajero de

Anal- Expres. poliubi. —150 ­ Resultados y Discusión

Fig.20. ‘l e. ".I df; lg; emgzwcgggjóngg:[Q5Wa dí '¡}-.'_. olgjtjna ‘51: ¡€35-dgimatamjfinïq pan giglqherímjda. Carril (l) ARNtotal de la condición TH, (2) T43, (3) TI prove­ niente de la cepa 8’1 aje. En cada carril se sembró 40 pg de ARN total y la sonda util zada fue el fragmento de 460 pb XhoI en condiciones de estring(DH-<1 ndia intermedia 0,5 X SSC60°C. Las flechas indican la localización de las bandas de rARN 258 (23550 nt) y 178 (1795 nt

Anal. Expres. poliubi. —151 — Resultados y Discusión poliubicuitina (ver Fig.21). En condiciones de ayuno sin trata­ miento con el antibiótico, no se observa este aumento sino que, por el cantrario, existe una disminución de hasta 2 veces en los niveles de este transcripto. Se detectó ademas un segundo mARN,mas pequeño, de 0,7 Kb presente sólo en cultivos en etapa exponencial y que desaparecía durante el ayuno con o sin el agregado del antibiótico. Este re­ sultado también sirve para demostrar que el aumento de los nive­ les de poliubicuitina no responde a una desregulación inespecífi­ ca del sistema por tratamiento con el antibiótico, ya que el mARN más pequeño no sufre acumulación, y su reducción se relaciona con la deprivación de nutrientes (ver 4.5). El lavado en condiciones de alta estringencia sólo permi­ tió detectar al mensajero de poliubicuitina de 1,3 Kb. Las bandas más tenues de peso molecular mayor a 1,3 Kb no se caracterizaron. En la Fig.21 se observa el efecto de la puromicina, otro inhibidor de la síntesis proteica en eucariotes, que actúa por un mecanismodiferente al de cicloheximida. Comose puede apreciar, no existe aumento en los niveles del ABNmensajero de poliubicui­ tina por tratamiento con puromicina (Pur) respecto del control sin tratamiento (SA). Conel objeto de descartar algún efecto especifico de la cicloheximida independiente de la inhibición de la síntesis pro­ teica, se procedió a ensayar el estudio de la expresión en la mu­ tante cyh-J, resistente a la cicloheximida. Esta cepa contiene una mutación en la proteina ribosomal L29, blanco de este anti­ biótico que, por otra parte, ha sido clonada en fli_gnafisa (Krea­ der y Heckman, 1937). Comose ilustra en la Fig.22, en la mutante cyh-I la ex­ presión de los transcriptos de ubicuitina parecería no ser afec­ tada por la presencia del antibiótico, ya sea desde el principio

Anal. Expres. poliubi. —152 ­ Resultados y Discusión

TI Pur SA P TI 1/20 v..v.‘4m.wqmq.

Fig-Zl- Woí . “ v a: le. expreejr’mdetrenaqriptgfi de L;bjm;j— Ling e11 candigirmefi sie inl‘zibigio'n en fiiíntefijfi Qr(¿f¿t=a]'ga_ El olon 2212 fue utilizado comosonda en condiciones de alta es­ tringenoia. Se sembró 60 pg de cada muestra. SAcontrol correspondiente sin tratamiento, Pur tratado con puro­ mieina, P tratado con putrescina. El carril TI corresponde a otroe grupee de experimentos (ver Fig.20) y ee agregó como refe­ rencia. Su dilución 1/20 (T1 1/20) aproximadamente coincidiría con el nivel del cultivo estacionario sin tratamiento (SA).

Anal. Expres. poliubí. —153 — Resultados y Discusión

71. 7/.¡_____._.___._ CYH-1 74 Cepa GhSCHX conCHX SinCHX 24hSCHX T t 'ento TÍ T43 (cm (C10) (c9) (ce) 'aam'

..i_.._!.w_.,.__._J_.__..,

Fig.22. lammm mmmgym. Las condiciones de tratamiento y crecimiento se describen en 6. 16.5. Se sembró 70 pg de cada mueetra. . Se hibrido en condiciones de alta estringencia con el clon 2212 y el clon 011 (ver más adelante).

Anal. Expres. poliubi. - 154 ­ Resultados y Discusión

(Fig.22, C10) o por 6 hs en una fase exponencial tardía, lo que descartaria en principio que el antibiótico per se no actuaria como inductor. La presencia del transcripto de 0,7 Kb se ve disminuida rzspecto del control (T43) tal comoocurría en la cepa salvaje en estadios alejados de la fase exponencial (ver Fig.20). Por otra parte, el tratamiento corto (por 6 hs) en la fase exponencial de un cultivo de N¿_gxassa_de la cepa salvaje con una concentración 100 veces mayor de cicloheximida a la utilizada an­ teriormente, produce un aumento no mayor de 3 veces del trans­ cripto de poliubicuitina (ver Fig.25, carril 74 CHX)lo que su­ giere que la inhibición de la sintesis proteica per se no justi­ ficaria el aumentoobservado en condiciones de tratamiento con cicloheximida menosdrásticas. En D. discoideum, 1a inhibición de la sintesis proteica aumenta apreciablemente los niveles de los transcriptos de ubi­ cuitina de mayorpeso molecular (ver 3.1.15.6). En este organismo el tratamiento con concentraciones entre 50-500 pg/ml de cicloheximida, en etapa estacionaria, por 2 hs produce una acumulación de mensajeros de poliubicuitina, cuyo má­ ximo se alcanza con 250 pg/ml cicloheximida para la cual la inhi­ bición de la incorporación de a.a. a proteínas es de un 90%. El mismopatrón de inducción se vio con otros inhibidores de elonga­ ción, comoanisomicina y emetina (Müller-Taubenberger et al, 1988). Estos autores también demuestran que la acumulación de es­ tos transcriptos no se debe a una estabilización generalizada de mARNportratamiento con cicloheximida (Kelly et al, 1987). Si bien en nuestro sistema no se descartó una estabiliza­ ción generalizada, esta parece poco probable por! i) el aumento continuo en los niveles de ARNde poliubiquitina aún en presencia del inhibidor; y ii) el aumento de aproximadamente 20 veces en los niveles del transcripto, lo que resulta excesivo en compara­

Anal. Expres. poliubi. - 155 ­ Resultados y Discusión ción con los valores que se conocen. La existencia de inducción por tratamiento con cicloheximida fue demostrado por nuestro gru­ po para otros transcriptos (Aisemberg et al, 1987,1989). Muyprobablemente el tratamiento con cicloheximida afecte tanto la estabilidad comola velocidad de transcripción del men­ sajero de poliubicuitina. Aunqueno se tienen datos que la avalen fl. grassa, esta segunda hipótesis en se comprobóen otros orga­ nismos (Elder et al, 1934; Singleton et al, 1988). Tampocoparece probable la eliminación de un represor de alto recambiopor inhibición de síntesis proteica (Kelly et al, 1989; Elder et al, 1984; Greenberg et al, 1986; Singleton et al, 1988) ya que el tratamiento con puromicina no produjo ninguna acumulacióndel transcripto de poliubicuitina. Es interesante destacar que, por estudios realizados en nuestro laboratorio (Grotewold et al, 1939) y por Martegani y Alberghina(1979), la respuesta al agregado de 2 HM cicloheximida a los cultivos de N¿_Qxasfia en fase estacionaria involucra una inhibición inicial de la incorporación de [353] metionina a pro­ teinas, superior al 30%en la primera hora, con una recuperación parcial entre las 3 y 6 hs hasta sólo un 45%de inhibición. En el caso de poliubicuitina, recien a las 24 hs pos-tra­ tamiento se detecta una pequeña acumulación que aumenta con el tiempo y no coincide con la etapa de máximainhibición. Por otra parte,los mARNidentificados por nuestro grupo, alcanzan su máximode inducción en esta etapa tras la inhibición parcial de sintesis proteica. Cabe destacar la acción de la cicloheximida en la produc­ ción de polipéptidos incompletos que se mantienen unidos a poli­ somas. Probablemente estos polipéptidos no se pliegan apropiada­ mente, y adoptan conformaciones anómalas. Uno de los factores que gatilla la respuesta del camino de degradación proteica depen­ diente de ubicuitina es, precisamente, la presencia de proteínas

Anal. Expres. poliubi. - 156 ­ Resultados y Discusión

anómalas inducidas por estrés o por sintesis defectuosa. La inhi« bición parcial continuada podria acumular estos péptidos, aborta­ dos en su elongación, y servir comouna señal inductora. Elder et al (1988) reportaron la presencia de un- consenso en el gen de B-actina murino, responsable de la regulación por suero y cicloheximida, homólogo al elemento SREdescripto por Mo­ hum et al (1987). Dicha secuencia no fue localizada en la región 5'-no codificante del gen de poliubicuitina de fl¿_gxafisa. Lamen­ tablemente, no se tienen bien caracterizadas hasta el momentolas regiones 5' de los genes clonados por nuestro grupo que responden a tratamientos con cicloheximida, comopara pensar en alguna se­ cuencia regulatoria común o "CHXbox". De los resultados con la cepa cyh-I resistente a la ciclo­ heximida, se puede en principio, descartar algún efecto del anti­ biótico per se, modificado o asociado a alguna otra molécula, salvo el que se involucra con la proteína ribosomal L29, en la acumulacióndel transcripto de poliubicuitina.

En levaduras, Tanaka et al (1983) encontraron que la ex­ presión del gen de poliubicuitina (UBI4) se inducia por trata­ mientos con cicloheximida y ademas era regulado negativamente por CAMP.El tratamiento de las mutantes cyr1—2(adenilato ciclasa deficiente) en fase exponencial con 0,5 mMCAMP,reprimian la ex­ presión del gen UBI4. Con el objeto de investigar una posible regulación por CAMPdel gen de poliubicuitina en N¿_9Iflfifiñ, se decidió encarar el estudio con la mutante cr-J (crisp). Esta mutante posee muy bajos niveles de CAMPytiene un fenotipo característico sin mi­ celio aéreo que revierte en medio sólido por tratamiento con el nucleótido cíclico (Terenzi et al, 1974,1976). Tambiénposee al­ gunas alteraciones en la producción y regulación de ciertas exo­ enzimas (Jorge y Terenzi, 1980) y capacidad de utilizar glicerol como fuente de carbono.

Anal. Expres. poliubi. - 157 — Resultados y Discusión

La Fig. 23 ilustra las bandas características de los rARN teñidae con EtBr en el gel de agaroea, y en la Fig. 24 se muestra el Northern blot correspondiente al análisis de la expresión del transcripto de poliubicuitina en esta cepa crisp. Comoee puede apreciar, si bien ya se detecta una induc­ ción a las 24 hs de tratamiento con cicloheximida, en la mutante cr-l (Fig. 24, carril 3 y 4) no existe regulación de los niveles del transcripto de poliubicuitina por CAMP(Fig. 24, carriles pa­ res) que, por otra parte. en la cepa cr-I son comparables con los encontrados en la cepa salvaje (ver Fig. 39). Estos datos también son esperablee en este sistema en el que el CAMPnoregula a los transcriptoe de poliubicuitina.

Anal. Expres. poliubi. - 158 ­ Resultados y Discusión

HHHHÉH

Fig-ZB.Si]. Lfif’éLeñidgmnELE:ent

Las flechas indi-ca n las bandas de las especies ribeeomalee. Se sembró en cada Parril 22 pg.

‘ Anal. Expres. poliubi. —159 ­ Resultados y Discusión

¡dglgíldfilafigühihfifladgmgm

Anal. Expres. poliubí. * 160 ­ Resultados y Discusión

4 . 3 . 2 . Dfijzflm Ie“ Lía Lis;I‘m ("¿g'gE flf‘pfi h i QQfi (lg fifii l, [‘é fi [‘fi las: Í gma ¡lí'zfi

Ademásde la hipertermia, diversos estímulos comoel ayu­ no, el tratamiento con etanol, metales pesados, agentes oxidan­ tes, análogos de a.a,, arsenito de sodio u otros inhibidores me­ tabólicos, disparan una respuesta caracteristica que se manities­ ta por un rápido incremento de la expresión de un grupo de genes asociados a la misma (ver RESPUESTAALESTRES TERMICO3.1.13.) La respuesta a estres térmico (“heat shock") fue estudiada en hongos filamentosos y en particular en N¿_gxafifiapor Plesofs­ ky-Vig y Brambl (1985), y el grupo de Kapoor (Kapoor y Lewis, 1987; Curle y Kapoor, 1988; Kapoor, 1986). Por tratamiento a 47°C, en H, grassa se produce una estimulación de la sintesis de alrededor de 11 proteínas de z 15 a 97 kD (Kapoor y Lewis, 1987). A pesar de que el patrón es parecido al encontrado en otros orga­ nismos, en N¿_gzasfiase observan algunas diferencias, en especial en proteinas de bajo peso molecular. Las proteinas más abundantes de esta respuesta son las pertenecientes a las familias nhspïü, nhsp80 y hspgü. Las .dos primeras y una proteina especifica de z 40 kD se inducen también por tratamiento con arsenito de sodio 100 HM.Este reactivo actúa comodesacoplante de la fosforilación oxidativa y su efecto se describió en varios organismos (Johnston et al, 1930; Atkinson y Dean, 1985). En Drosophila, el tratamiento con arsenito induce 1a sin­ tesis de polipéptidos de 84 y 70 kD, pero ninguna otra proteína hsp (Vincent y Tanguay, 1982). En D. Discoideum, por el contra­ rio, se comunicóuna total insensibilidad al tratamiento con una concentración de 1 mMde este agente (Rosen et al, 1985). En muchos sistemas biológicos, como en fibroblastos de em­ brión de pollo, levadura, Dyctiostelium y Drosophila, entre otros, el shock termico induce la transcripción del mARNdepoli­

Anal. Expres. poliubi. - 161 — Resultados y Discusión

ubicuitina, por lo cual se considera a la ubicuitina como una proteína hsp en estos sistemas (ver RESPUESTAALESTRESTERMICO). En fl. grafifia se analizaron los niveles de los transcriptos de ubicuitina luego de aplicar un breve shock térmico o de agre­ gar arsenito de sodio al cultivo. En la Fig. 25 se ilustra el perfil característico de pro­ teínas marcadas con [355] metionina separadas en un gel de acri­ lamida desnaturalizante (PAGE-SDS)(ver6.8.2.3. y 6.8.2.4.) des­ pués de un tratamiento por 1 hora a 47°C o con 250 pMarsenito de sodio a 30°C. El obtenido por Kapoor y Lewis (1987) para ambos estres en este organismo es similar al observado en nuestro labo­ ratorio. De las mismas condiciones estudiadas, se procedió a pre­ parar ABN total para su análisis por Northern blot usando como sonda el fragmento XhoI de 460 pb del clon 2212. Ambostratamientos muestran que no existe variación alguna en los transcriptos de ubicuitina respecto del control, como se puede apreciar en la Fig. 26. Sin embargo, es interesante desta­ car la menor movilidad del transcripto mayor que es más acentuada en el carril correspondiente nal tratamiento con arsenito, mien­ tras que en el transcripto menorno se aprecian diferencias sig­ nificativas. Si bien por tratamientos con arsenito o por shock térmico también existe una inhibición del mecanismo de procesamiento (splicing) in vivo de los transcriptos primarios (Bond, 1988), la diferencia de tamaño en nuestro caso no se podría detectar en un gel de estas caracteristicas considerando que el intrón es de só­ lo 70 nt. Por otra parte, Carrazana et al (1988) comunicaron el au­ mento de tamaño del tracto de poli A en el transcripto de vaso­ presina en respuesta a estres osmotico.

Anal. Expres. poliubi. —162 — Resultados y Discusión

Fig.25.Mimami/sirmfimmmamnífis]

La marcación de proteínas con [355] metionina se realizó según 6. 8.2.4. y la separación en geles de acrilamida desnaturalizantes (PAGE-SBS)segúnprotocolo descripto en 6.8.2...

Anal. Expres. poliubi. —163 * Resultados y Discusión

ASO2 (L HS

3‘r

¿“V' . Sm‘AIMÏRM‘mW'va

x É” í

i

E Fig.26.V"..'

Las condiciones de hibridación y laa cantidades.sembradas se des­ criben en Fig.20.

Anal. Expres. poliubi. - 164 ­ Resultados y Discusión

Conel objeto de analizar si ocurría una situación pareci­ da comoproducto de los tratamientos anteriores, se eliminó el tracto de poli A por tratamiento con RNasa H según el protocolo descripto en 6.0.2.4. Sin embargo, no se pudo demostrar que el aumento de tamaño se debiese al incremento del tracto de poli A (resultados no mostrados). En la mutante de N¿_grnfisa_deficiente en adenilato ciclasa cr-l (crisp), se observó una mayorresistencia a un tratamiento hipertérmico letal (50 °C) que en la cepa salvaje. Otras cepas crisp que contenían niveles normales de CAMPnopresentaban esta termotolerancia constitutiva (Cruz et al, 1988). Además,en S. cerevisiae la mutante cyr-J, que produce bajos niveles de CAMP, constitutivamente presenta 3 proteínas hsp y es resistente a tra­ tamientos hipertérmicos letales, propiedad que se elimina por el agregado de CAMP(Shin et al, 1987). Por otra parte, Tanaka et al (1988) mostraron que en esta misma cepa de levadura, la expresión del gen de poliubicuitina (UBI4) se veía aumentada y era negati­ vamente regulada por CAMP.Sin embargo, cuando el transcripto de poliubicuitina se inducía por shock térmico, no existia regula­ ción por el nucleótido cíclico. Es interesante destacar que los transcriptos de ubicuitina en la mutante cr-I de N¿_gzasfia no son regulables por CAMP, ni tienen niveles superiores a los encontrados en la cepa salvaje (ver Fig. 37). El nivel de los transcriptos de ubicuitina después de un shock térmico no fue analizado en esta mutante. A diferencia de lo-encontrado en D. discoideum por Müller­ Taubenberger et al (1988), el tratamiento con CdClz (100 uM) pro­ dujo una disminución de los niveles de ambos transcriptos de ubi­ cuitina en N¿_gzafifia según se muestra en la Fig. 27. Curle y Ka­ poor (1988) demostraron la ausencia de inducción del transcripto correspondiente al gen HSP70por tratamiento de fli_gxassa con CdClz.

Anal. Expres. poliubi. - 165 ­ Resultados y Discusión

HS CHX SPE PUÏ CONÏ FA

{ES ¡Hg-27. 13. mmmmgqnanálgggadaaa. Se sembró 40 pg de ARNtota l en cada carril y se usó como sonda. La nomenclatura utiliz ad a se deBJribiS en 6.18.4. - .

Anal. Expres. poliubi. - 166 ­ Resultados y Discusión

El shock frio (4°C por 12 hs) tampoco produjo un aumento de poliubicuitina comoocurre en D. discoideum (Müller-Taubenber­ ger et al ,1988)(resultados no mostrados). La respuesta a un shock hipotermico fue estudiada por Maniak y Nellen (1938) para otros transcriptos regulados durante el desarrollo en D. disoci­ deumy en Drosophila por Burton et al (1988).

4.3.3. Tratamiento son análogos de aminoácidos

Muchosde los análogos de aminoácidos pueden ser incorpo­ rados a proteínas en lugar de los naturales, afectando la estruc­ tura proteica y produciendo defectos en el metabolismo celular. En bacterias, la sustitución de arginina por su análogo canavani­ na produce importantes efectos, comoinhibición generalizada de síntesis y aumento de la degradación proteica (Goldberg, 1972). La muerte celular sobreviene también por bloqueo de nuevas rondas de síntesis de ADN(Schachtele y Rogers, 1965). En células eucarióticas ocurre una degradación selectiva de proteínas aberrantes que incorporan análogos de a.a. en su es­ tructura (David, 1973; Knowles y Ballard, 1976). Una de las enzimas más caracterizadas de fl¿_gra&sa, la fe­ nol oxidasa tirosinasa, cuya síntesis de novo es inducida por an­ tibióticos que son inhibidores .de síntesis proteica, también se dereprime por tratamiento con análogos de aminoácidos, como la p­ fluorofenilalanina y L—etionina (Horowitz, 1970a). La inducción de tirosinasa por el análogo de fenilalanina es específicamente inhibida por el aminoácido natural, y la de L­ etionina por metionina. Se comprobó que ambos análogos se incor­ poraban a proteínas. En la linea celular murina FMBAtsBS,que contiene una mu­ tación termosensible en la enzima E1, el tratamiento con análogos de aminoácidos produce la activación del sistema dependiente de

Anal. Expres. poliubi. - 167 ­ Resultados y Discusión ubicuitina por el cual las proteinas'anómalas son degradadas (Finley et al, 1934; Ciechanover et al, 1984). La sorprendente hipersensibilidad de las mutantes ubi4 (deleción en el gen de po­ liubicuitina) de levaduras al crecimiento en un medio conteniendo análogos de aminoácidos, sugiere que la degradación de proteínas anormales depende de ubicuitina también en este organismo (Finley et al, 1987)(Ver 3.1.15). ¡Porotra parte, la presencia de proteinas anormales sirve comoseñal inductora de respuesta a estrés, involucrando la acti­ vación de los genes de HS (Ananthan et al, 1986; Hiromi et al, 1986; Kelley y Schlesinger, 1978)(Ver 3.1.13). Hasta el momento _no se puede afirmar que el tratamiento con análogos de aminoácidos produzca un aumento en los niveles de ubicuitina libre o conjugada en los organismos estudiados. Ade­ más, resultaba interesante conocer la respuesta de fl¿_gxnsfia a un tipo de estrés tan importante que producía también inhibición de síntesis proteica, y un aumentode la degradación de proteínas anormales. Se analizó la expresión de ubicuitina en cultivos de la cepa salvaje, tratados con análogos de aminoácidos que se incor­ poran a proteínas, comop-fluorofenilalanina, canavanina o D-L etionina. El análisis de Northern blot (ver Fig. 27) muestra que no existe aumentoen los niveles de ninguno de los dos transcriptos después del tratamiento con los dos análogos que se detallan (Fig. 27, carril FAy CAN) en relación al ARNcontrol (Fig. 27, carril CONT). El tratamiento con D-L etionina tampoco produjo ninguna inducción (resultados no mostrados). Comose vio anteriormente, en N¿__Qxflfififlla inducción de los genes de ubicuitina, en particular el de poliubicuitina, no seria requerida para responder al estrés térmico ni al tratamien­ to con análogos de aminoácidos o puromicina. Todas estas condi­

Anal. Expres. poliubi. - 168 ­ Resultados y Discusión ciones tienen en común una acentuada producción de polipéptidos anormales deletereos para el metabolismocelular. Podría ocurrir que los niveles internos de ubi cu itina madura fueran suficientes para responder al estrés impuesto.

4.3. 4. TmLamLenLQcon ¿eliminas

El rol de las poliaminas in vivo está poco claro, pero se sabe que estos compuestos son indispensables tanto a nivel de re­ plicación, transcripcion y traducción (Tabor y Tabor, 1984). Las poliaminas espermidina y putrescina, se encuentran presentes tanto en eucariotes comoen procariotes. En fl. grassa, la putrescina sólo puede sintetizarse a partir de ornitina en una reacción catalizada por la enzima ornitina decarboxilasa (CDC) (Paulus et al, 1982).(Ver ESQUEMA1). Esta enzima clave de la síntesis de poliaminas, sufre cam­ bios en su actividad específica, y su nivel de expresión varía en respuesta a factores externos comoestímulos tróficos u hormona­ les, o a la inhibición de la síntesis de poliaminas (Pegg, 1986; Tabor y Tabor, 1984). En H¿_Qrflfifia,la putrescina y la espermidina controlan ne­ gativamente su síntesis y su degradación (Davis et al, 1985; Bar­ nett et al, 1983). Los pools de putrescina y espermidina en fl; gzassa son muy bajos y particularmente la espermina no tiene efecto sobre la ODC(Davis et al, 1985; Paulus y Davis, 1982). Debido a la compartimentalizacion permanente de las polla­ minas sintetizadas, la ODCresponde realmente a la velocidad de síntesis más que al pool presente (Davis et al, 1985). En otros eucariotes, las poliaminas regulan la 0DG por otros mecanismos, incluyendo control de transcripción (Katz y Ka­ hana, 1987; Olsen y Spizz,1986) y traducción (Kahana y Nathans, 1985).

Anal. Expres. poliubi. e 169 ­ Resultados y Discusión

5 6 SAM

Metlonlnn—> S-adenïssllmetlonlna—->decmbox"¡do)

Glutamato

\ spa-72 3 4

emana-Y Putrescina Espermidina Espermina CO , / G Metlladenoslna Arglnina urea

aga

1- arginasa 2- ODC 3- espermidina sintetasa 4- espermina sintetasa 5- SAMsintetasa 6- SAMdecarboxilasa

ESQUEMA1:MMM-¿mg ¿Lalaa mliaminafi fill Mim

Anal. Exprea. poliubi. —170 ­ Resultados y Discusión

La reducción del nivel intracelular de poliaminas por el compuesto 2-difluorometilornitina (DEMO),inhibidor "suicida" de la ODC(Metcalf et al, 1978), produce una disminución de la pro­ liferación celular, que puede ser restaurada por el agregado de una de las poliaminas (Porter y Bergeron, 1983; Casero et al, 1984). En células de carcinoma de colon humano (QQLQ aaa), este tratamiento disminuye específicamente la expresión de c-myc y au­ menta los niveles de ODCy B-actina (Celano et al, 1988). En nú­ cleos aislados de esta mismalinea celular, el agregado de esper­ midina resulta esencial para la transcripción de genes relaciona­ dos con el crecimiento como c-myc y c-fbs (Celano et al, 1989). La estimulación del crecimiento también produce un aumento de los niveles de ODCy del oncogen c-myc (Stupzinsky et al, 1988; Hei­ kkila et al, 1987). Numerososestudios muestran que la concentración de polia­ minas produce efectos en la estructura cromatínica y en el ADN (Sunkara et al, 1979; Pohjanpelto y Knuntila, 1932). Trabajando con una línea de fibroblastos murinos BP-A31, Medranoet al (1986) encontraron que el tratamiento con ciclone­ ximida (0,2 pg/ml) inducía la resistencia a altas concentraciones de DFMO(5-10 mM)y, además, permitía la proliferación celular con bajos niveles de poliaminas. Otros inhibidores de sintesis proteica comohistidinol o puromicina, no conferían esta capaci­ dad. La inhibición proteica por tratamientos con DFMOlresultó en principio, una buena razón para encarar el estudio de la ex­ presión de.ubicuitina en fl¿_gxaa&a,comorespuesta a este trata­ miento. Sin embargo, también resultaba atractivo, conociendo la relación de las poliaminas con la fidelidad de traducción, utili­ zar este inhibidor de la ODCcomoinductor de proteinas anorma­ les.

Anal. Expres. poliubi. - 171 ­ Resultados y Discusión

La mutante spe-J es una cepa de fl¿_grafisa deficiente en 0DG,que requiere poliaminas para su crecimiento. El pasaje a un medio sin poliaminas por 24 hs después de un crecimiento por igual período en presencia de 1 mMespermidina, no causó varia­ ciones en el nivel del mARNdepoliubicuitina; comoasí tampoco en el patrón de bandas de proteinas marcadas in Vivo con [353] metionina (ver 6.8.2.4), observado en PAGE-SUS(resultados no mostrados). Se prefirió entonces, provocar una depleción de poliaminas en la cepa salvaje por tratamiento con DEMO. En la'Fig.28 se muestra el Northern blot correspondiente a este análisis. Se puede apreciar que no existe una inducción im­ portante por este tratamiento (comparar 74/DFMOcon74). Sin em­ bargo, un resultado inesperado es la notable reducción en los ni­ veles de ARNde poliubicuitina, luego del agregado de espermidi­ na. No se conoce en otros sistemas que la espermidina regule ne­ gativamente la expresión o la estabilidad de este transcripto. Si bien el primer resultado con la mutante no mostraba di­ ferencia cuando se la ayunaba de espermidina, la concentración inicial utilizada para el crecimiento (1 mM)podría ser lo sufi­ cientemente elevada comopara ejercer una putativa regulación ne­ gativa, aún después de 24 hs de deprivación de la poliamina. Los resultados del análisis de incorporación de [35S]-me— tionina a material TCAprecipitable para estas últimas condicio­ nes de crecimiento (Grotewold, E., Tesis doctoral), mostraron los siguientes valores:

tratamiento %inhibición 74/spe 100 74/DFMO 62 74/spe/DFHO 96 spe-I 72

Anal. Expres. poliubi. - 172 — ,Resultados y Discusión

74 74 spe‘ 7% 7% 74 CHX DFMO DFMO spe spe

,..--\._.

diFig.23. la. ¿antflenz dalMmmm 192;);gil estudio ¿lapelium'ggitina. df" La rgggnagjg’n M 9911'amjnfifi. e sembró 25 pg de ARNtotal en cada carril y se usó como sonda

LT‘CD l clon 2212 hibridado en condiciones de alta estringencia aunque

Ü"-e lavó en 0,5 X SSC/1% SDS a 60°C. La nomenclatura Se describe en 6.16.4.

Anal. Expres. poliubi. —173 — Resultados y Discusión

El tratamiento con 2,5 mMDEMOinduce claramente la sínte­ sis de por lo menos 3 polipéptidos que coinciden en tamaño con los que se inducen por 2 pMcicloheximida (Grotewold, E., Tesis doctoral). Nuestro grupo también observó que el tratamiento con DFMOprovocaba la acumulación de 3 transcriptos cuyos genes ha­ bían sido clonados por su inducción con cicloheximida (enviado a publicación). El tratamiento con putrescína en etapa estacionaria del crecimiento, no produce ningún efecto en los niveles del trans­ cripto de poliubicuitina (ver Fig.21, carril P). De igual manera, el agregado de putrescina en etapa exponencial no influye en los niveles de los transcriptos de ubicuitina (ver Fig. 27, carril PUT). Nuevamente se ve una pequeña disminución por el agregado de espermidina también en esta condición (Fig. 27, carril SPE). Hasta el momento no se conoce en ningún organismo, una re­ gulación negativa, por alta concentración de poliaminas, a nivel transcripcional. Los resultados son reproducibles.y muestran especificidad para espermidina frente a putrescina. Es interesante agregar que la ODCes una de las proteinas de más alto recambio que se conoce, y que no es degradada vía el sistema ubicuitina.

4.3.5. Qtnas condiciones estudiadas

Se analizó la posibilidad de que otras condiciones desfa­ vorables fueran capaces de modificar los niveles de los trans­ criptos de ubicuitina en la cepa salvaje de fl¿_gxafisa. Tanto el pasaje a medios ajustados a valores extremos de pH (4,0 y 8,0), no compatibles con el desarrollo fisiológico del hongo, como a medios con alta concentración salina (500 mM- 1 M

Anal. Expres. poliubi. - 174 ­ Resultados y Discusión

NaCl) por espacio de 6 o 24 hs, no mostraron efecto alguno sobre los niveles del mARNdepoliubicuitina. No ha sido descripto que ninguno de estos tratamientos fuera capaz de ejercer un efecto inhibitorio sobre la maquinaria biosintética de proteínas, aunque se CJÚOCSHvarios ejemplos en que estas condiciones extremas im­ ponen un estres que, a su ves, induce una respuesta asociada. El tratamiento con cloramfenicol (ng/ml) tampocp produjo diferencias en la acumulacióndel transcripto de poliubicuitina. Estos resultados negativos no han sido mostrados. Comose vio en la Fig. 20, el ayuno provocado por el ago­ tamiento de nutrientes en la etapa estacionaria no aumenta los niveles del mARNdepoliubicuitina. Una condición más drástica comoel pasaje del micelio de fase estacionaria, a una solución de buffer fosfato 100 mMpH: 6,0, tanto en la cepa salvaje (re­ sultados no mostrados) entre 6 y 72 hs de tratamiento, comoen la cepa er-J (ver Fig. 24, carriles 5 y 6), no muestra ningún cambio en los niveles de ambostranscriptos de ubicuitina. No obstante, bajo estas severas condiciones de ayuno, nuestro grupo detectó la inducción de 2 transcriptos involucrados en la respuesta temprana a cicloheximida (E. Grotewold, Tesis doctoral). Otros autores ha­ bían descripto la sintesis de novo de ciertas enzimas, como la tirosinasa, L-aminoácidooxidasa, lacasa, etc. (Horowitz, 1965; Marzluf, 1981; Reinert y Marzluf, 1975; Sikora y Marzluf, 1982a, b; Nahmy Marzluf, 1987; Hasunuma et al, 1976; Prade y Terenzi, 1985). La exposición a ayunos parciales en medios carentes de fuente de C o de S, tampoco condujo a una señal inductora para el transcripto de poliubicuitina. Se ha descripto asimismo, la in­ ducción de proteasas extracelulares por estos tipos de ayunos (Cohen y Drucker, 1977). Otro ejemplo de deprivación de nutrientes que tampoco tuvo incidencia en los niveles del transcripto de poliubicuitina de fl+ grana; fueron los experimentos que se llevaron a cabo con la cepa

Anal. Expres. poliubi. —175 ­ Resultados y Discusión

M246auxótrofa para aminoácidos aromáticos.(Ver 6.16.4.). El pa­ saje a un medio sin aminoácidos aromáticos y su incubación por 48 hs no produjo ninguna diferencia en el nivel de mARNdepoliu­ bicuitina, contribuyendo asiy a descartar al ayuno como inductor, a diferencia de lo que ocurre en levadura (Finley et al, 1987), en la que este gen seria necesario para mantener la viabilidad celular después de las condiciones drásticas impuestas por la de— privación4.3.6. de nutrientes. en

Un sin numero de cambios metabólicos se producen durante la germinación de las conidiosporas de H¿_Qxflfififi.El contenido de polirribosomas en las conídiosporas secas es menor del 3%, mien­ tras que la simple exposición al agua durante la cosecha lleva esa proporción a casi el 30%(Mirkes, 1974). La síntesis proteica se inicia inmediatamentedespués de la suspensión de las conidiosporas en el medio de incubación. Después de 60 minutos, la velocidad de síntesis de ARNsufre un aumento sorprendente, alcanzando un maximo a las 2 hs (Bonnen y Brambl, 1983). El contacto con agua es suficiente para inducir el armado de polisomas y para disparar la síntesis proteica. El metabolismo de una fuente de C sería necesario para desarrollar velocidades máximasde síntesis y para iniciar una sintesis de ARNnormal. Conel objeto de analizar el patrón de expresión de los transcriptos de ubicuitina durante este importante proceso meta­ bólico, se preparó ARNde conidiosporas germinadas y sin germinar (latentes). Las conidiosporas se cosecharon según lo descripto en 6. 6.3, y para evitar eventos metabólicos tempranos de germinación, a cosecha se realizó en frio.

Anal. Expres. poliubi. —176 — Resultados y Discusión

En.la Fig. 29 se observa que no existen cambios en el ni­ vel del mARNdepoliubicuitina en respuesta a este cambio metabó­ lico, pero es interesante destacar la presencia del transcripto más pequeño de 0,7 Kb después de la germinación. El transcripto mayor forma parte de la reserva de ARNen las conidiosporas dur­ mientes. Vale la pena recordar que este transcripto de 0,7 Kb ya se encontraba disminuido en etapa estacionaria (ver Fig. 20). Las condiciones que promueven la conidiación, como por ejemplo, el agotamiento de nutrientes, llevarían a reducir el ni­ vel de este transcripto pequeño, y a preservar el de poliubi­ cuitina en las formas resistentes de las conidiosporas. En S. ce­ revisiae, el gen de poliubicuitina (UBI4)es necesario para man­ tener la viabilidad de las esporas, y los genes de fusión (UBIl­ UBI3)son indetectables en la etapa estacionaria de crecimiento (Finley et al, 1987). En D. discoideum (Giorda y Ennis, 1987), y en cebada (Gausing y Barkardottir, 1986),existe una buena corre­ lación entre la aparición de los transcriptos pequeños, asociados con los genes de fusión, 'y los estadios de crecimiento con alta tasa de división celular. Los resultados en fl. engaña correlacionan perfectamente, ya que ambas situaciones, crecimiento exponencial y la germina­ ción de las conidiosporas, cumplen con las expectativas de acuer­ do a lo observado en otros organismos (ver ANALISISDELGEN DE FUSION).

Anal. Expres. poliubi. —177 ­ Resultados y Discusión

'Fig.29.gwwrmwmmrszgr>I»'-"* n n ww;a WWW“? ¡5:54 V .!. P H. Las condiciones de hibridación se describen en la Fig.20. Se sem­ bró 40 pg de ARNtotal proveniente de eonidiosporas latentes (ea­ rril no G) y germinadas (carril G).

Anal. Expres. poliubi. —178 ­ Resultados y Discusión 4.4.1.4.4. ANALISIS DE LAS GENOTECASDE cADN DE Ni_grassa.

Con el objeto de aislar clones de cADNcorrespondientes a la poliubicuitina (ver 4.2) y también al transcripto de 700 pb expresado preferencialmente en condiciones de mayor replicación celular, se comenzó el análisis de dos genotecas de cADNde EL engaña. Unagenoteca fue construida en nuestro laboratorio (ver 6.3) a partir de ARNpoliA+ extraído de micelio de la cepa salva­ je tratados con cicloheximida (T1). La otra genoteca de cADN(ce­ dida gentilmente por el Dr. RajBandhari) corresponde a la pobla­ ción de ARN proveniente de micelios no tratados, en crecimiento exponencial. El vector de clonado en ambos casos fue el fago thll (descripto en 8.14.2) y el procedimiento empleado en ambas geno­ teeas incluye la incorporación de linkers de EcoRI comose deta­ lla en 6.3. El protocolo descripto en 6.4 detalla todos los pasos se­ guidos para el aislamiento de clones positivos, y se ilustran en las Figs. 30 y 31. La sonda utilizada en este análisis correspondía a un fragmento XhoI del clon 2212, aislado de un gel de agarosa (ver 6.8.1.4.2). Este fragmento se marcó por la técnica de random priming descripta en 6.6.2. El númerototal de playas de lisis analizadas fue de apro­ ximadamente 3x104 ufp por cada genoteca, y se tomaron los 20 clo­ nes que daban las señales más fuertes en cada una de ellas. Las condiciones de hibridación y lavado utilizadas en el rastreo de las genotecas fueron las descriptas anteriormente en la Fig. 20.

Anal. Genot. de cADN — 179 — Resultados y Discusión

Fig.30.Análifiifidfilfiggnmdiañflfl. ' Primera ronda de rastreo de clones. Las flechas señalan las pla­ yas positivas que coincidían ademáscon el filtro duplicado.

Anal. Genot. de cADN — 180 — ' Resultados y Discusión

Fig-Bl.BandaiW de El filtro inferior corresponde a la segunda ronda de rastreo de clones positivos. Se ve claramente un enriquecimiento de señal positiva. El filtro superior corresponde a la- última ronda de rastreo. Todas las playas reeultan ser positivas arribando así al clonado. '

Anal. Genot. de cADN — 181 — Resultados y Discusión

Se preparó ADNde los clones positivos según el protocolo descripto en 6.1.2, se digirió con EcoRIen las condiciones des­ criptas en 6.0.2.1, se separó por electroforesis en gel de agaro­ sa 1%(ver 6.8.1), se transfirió (ver 6.9.1.1.1), y se hibrido en las mismas condiciones y con la misma sonda empleada en la iden­ tificación de los clones (ver Figs. 32 y 33). Resulta interesante destacar que todos los clones que pro­ venían de la genoteca construida con ARNproveniente de cultivos tratados con cicloheximida (nomenclatura XLGde los clones), con­ tenían insertos mayores de 1 Kpb. Cabe recordar que en esta con­ dición, según se mostró en la Fig. 20, existe una acumulación del transcripto de poliubicuitina de 1,3 Kb, y apenas se detecta el transcripto de 0,7 Kb. Por otra parte, en la genoteca de CADNproveniente de cul­ tivos de la fase exponencial, los clones positivos aislados (no­ menclatura XC) se pueden dividir en dos, de acuerdo a que el ta­ maño del inserto superara o no zl Kpb. Cuando la membrana de la Fig. 33 se lavó en condiciones de alta estringencia (ver 6.11), la señal proveniente de las bandas correspondiente a los clones con insertos menores de 700 pb (clo­ nes XC11y 103) se desvanecía. Parecía entonces probable que los clones X011 y XC3contu­ vieran insertos derivados del transcripto de 0,7 Kb. Resulta difícil explicar las dos bandas positivas presen­ tes en el XLGZsi tenemos en cuenta que de los datos de secuencia del gen de poliubicuitina (ver Fig. 18) no existe, en la zona co­ dificante, ningún sitio EcoRIque Justifique la escisión del in­ serto. Tampocoparece probable la incorporación de dos fragmentos en el mismo vector que den una señal positiva con una misma son­ da. Todos los demás clones analizados presentaron una banda única de inserto.

Anal. Genot. de cADN — 182 ­ Resultados y Discusión

"z 2.1 K .

a.

F-l«2‘13P1‘"

Fig.32. ¿La.LQEL(¿12m(la «JAEN. Gel de agarosa 1%teñido con EtBr utilizado en el análisis clones de CADNdigeridos con ECORI. Nomenclatura LG y C ¿e deh_ criba en‘el texto; el carril M corresopnde a las marcadores da peso molecular.

Anal. Genot. de CADN — 183 — Resultados y Discusión

LOS [GZ [0‘ M C8 C7 C6 C5 Cl. C3 Cl

224—

Fig.33. 19ssiones Se hibrido en las mismascondiciones utilizadas en el rastreo de la genoteea (ver texto). Se indican con fleehas las bandas sub— elonadas, pertenecientes a los fragmentos ECORI de los clones

XLGI, X03 y lCl. La señal de la banda X03 se desvanece cuando seu. lava a alta estringeneia (resultados no mostrados).

Anal. Genot. de CADN — 184 — 4.4.2. Resultados y Discusión

Se eligieron los insertos correspondientes a los clones lLGl, lCl, X03 (ver Fig. 33 indicados con flechas) y X011. De los clones analizados, XLGly lCl contenían los inser­ tos de mayor tamaño que comparado con el tamaño del transcripto de poliubicuitina comprendía una copia de tamaño casi completo (fall length). Todas estas bandas se aislaron por la técnica de electroe­ lución en geles nativos de agarosa descripta en 6.8.1.4.2. Se subclonó en el sitio EcoRIdel vector plásmido Bluescript (ver 6. 14.1), comose describió anteriormente en 4.1.2. La identificación de los recombinantes se realizó como se describió en 4.1.2, pero la enzima utilizada en este caso fue EcoRI. Se mantiene la nomenclatura para los plásmidos recombinan­ tes conteniendo los insertos correspondientes. La digestión de los clones C3 y C11 con diferentes enzimas de baja frecuencia de corte y combinaciones de las mismas, se analizó en geles de agarosa. Estas técnicas se ilustraronloportu— namente en 4.1.2. Se.confeccionó así un mapade sitios para enzimas de res­ tricción que se ilustra en la Fig. 34 y se identificaron fragmen­ tos de tamaños semejantes en estos dos clones, lo que daba un in­ dicio de que el clon Cs era una copia menos completa que 011 del mismotranscripto. Se marcó por la tecnica de random priming los 'plásmidos que contenían al inserto correspondiente a la banda Cs y C11, y ambos reconocieron un transcripto de 0,7 Kb que se_acumulaba pre­ ferencialmente durante la germinación de las conidiosporas como se ilustra en la Fig. 35.

Anal. Genot. de cADN — 185 — Resultados y Discusión

X A: Al: Hd fi“ . .i EV f——>._-—| JOOD .UBI moidy ._r El n-residuo toil Polylinker-Bluescripl

Fig.34. Manade münimián del sign 011. Esquemade la distribución de sitios para enzimas de restricción de baja frecuencia de corte del clon de cADNquecodifica para la proteína de fusión con ubicuitina. Se incluye la estrategia de secuenciación seguida.

Anal. Genot. de cADN- 186 ­ ni Fig.35. Qdeijg’ pa [a Qtjqbfiínfl dj: Íflfiién. n ‘ L Se hibrido con el clon 011 marcado por random priming en condi­ ciones de alta homologia. Se sembró 40 pg de ARNtotal provenien­ te de conidiosporas latentes (carril 1) y de conidiosporaa germi— nadaa (carril 2) según condiciones descriptas en 6.16.4.

Anal. Genot. de cADH — 187 — Resultados y Discusión

4.5. CARACTERIZACION DEL GEN DE FUSION 4.5.1.Malagón

E1 esquema de secuenciación por el método de Sanger del clon C11 se describe en la Fig. 34. La preparación de ADNsc se describió en 6.1.2.3. También se secuenció completamente el clon 03 y se comprobó que corres­ pondía a una copia parcial de la encontrada en el clon 011. El mapa de restricción del clon plasmídico 011 generado por el programa IBI-Pustell se agregó en el APENDICEII. Los sitios que se detallan en la Fig. 34 fueron confirma­ dos por secuenciación. 4.5-2- Análisisde la muela

La secuencia completa del clon C11 se detalla en la Fig. 36, la que incluye la mayor parte de la región oodificante y 3'­ no codificante. Los primeros 200 nucleótidos corresponden a la parte de ubicuitina, estando ausente sólo los primeros 15 nt (N-terminal). La secuencia que sigue en el mismomarco de lectura fusionada a la anterior sin "espaciador", corresponde a una extensión de 78 a.a. enriquecida en residuos básicos (z 30%). Además,contiene un motivo de residuos de cisteínas del tipo de "Zn fíngers" asociado a la unión a ácidos nucleicos. Este gen tiene gran homología con la familia de genes de fusión de ubicuitina con extensiones de 76780 a.a¿ Se puede ver en la TABLAVI que, además de conservar el motivo de unión a metal y de contener una región rica en a.a. bá­ sicos, posee una secuencia de lisinas agrupadas, característica de este tipo de genes cerca del extremo ligado a ubicuitina (sub­ rayada en la secuencia).

Caract.Gen de fusión - 188 — Resultados y Discusión

>k 2k. W. tlf 1 AAG ACC CTC ACG GGC AAG ACT ATC ACC CTT GAG GTG GAG TCT KTLTGKTITLEVE3 * * x X 43 AGC GAC ACC ATC GAC AAT GTC AAG CAG AAG ATC CAG GAC AAG SDTIDNVKQKIQDK >k :Ir. 2k. m 85 GAG GGC ATC CCC CCT GAC CAG CAG CGC CTG ATC TTC GCT GGC EGIPPDQQRLIFAG * m * * 127 AAG CAG CTC GAG GAT GGC CGC ACC CTC TCC GAC TAC AAC ATC KQLEDGRTLsDYNI

>I< >k >k >IKZ >k. 169 CAG AAG GAG AGC ACC CTC CAC CTC GTG CTT CGC CTC CGT GGT QKESTLHLVLRLRG * :k 2k >Il’. 211 GGT GGT AAG AAG AGA AAA AG AAG GTC TAC ACC ACC CCC AAG GGKKRKK'KVYTTPK

253 AAG ATC AA CAC AAG CGC AAA AAG ACC AAA CTC GCT GTG CTC KIKHKRKKTKLAVL >k 7k * * 295 AAG TAC TAC AAG GTC GAC TCC GAC GGC AAG ATC GAG CGT CTT KYYKVDSDGKIERL **** 337 CGC CGC GAG TGC CCT AAC GAG ACC TGC GGT GCC GGT GTC TTC RRECPNETCGAGVF >k * >k >k :k 379 ATG GCC GCC ATG CAG GAT CGT CAG TAC TGC GGT CGC TGC CAC MAAMQDRQYCGRCH ¡k :lr: 7k. 3k 421 CTC ACC TAC GTC TTC GAG AAG AGC TCT TAA ATTGCTGGAAAGCTT LTYVFEKSS­ 7k. * * 2k >k :k 466 AGQQQAAÏGATCTGGGACGGEGAAIQACAATACCACATCTCGCTAGGATCGGAAC 2k 2k :k * >Ir 521 TTATGTACGGCGTTTTGAGCGGACATCAGGGTACCTTTACACTGGCGAGGGAAAG 1< >k 576 GAAAAACGGGAAIGGCATGACCAACTTGGCCGAAAA mmmmfia.Fig.36. numF-' 1:4"y.cha r0-dfimisla¿alLa?

Caract.Gen de fusión —189 — Resultados y Discusión

TABLA VI K k m m Drosophila AKKBKKKNYSTPKKIKHKRKKVKLAVLKYYKVDENGKIHRLRRE mmm G V.T T TD E Humano S T N S S.cerevisiae G V T H S AE VTK D.discoideum K T A VL R LR F K VL

>k * 2k *

fl¿gzasfiaDrosophila PGEN N T GAGVFMAAHEDRHY HQ Q GK R HNLTFVFSKPEEK Y E 55-­ Humano SDE R S F C YC N D S.cerevisiae SNPT L N K L HSVYKVNA---­ D.discoideum A T Q AN Q HS L KKSK

También en la TABLA VI, se puede observar que hay zonas hipervariables bien definidas, lo que sugiere la existencia de una marcada presión evolutiva en esta parte de la secuencia, pro­ pia de las proteínas conservadas. La región que codifica para ubicuitina se comparó con los otros tandem del poliubicuitina en TABLAIV. El uso de codones de serina se ilustró en la TABLAV.La secuencia aminoacidica (aun­ que parcial) de esta zona, muestra completa homología con la co­ rrespondiente del poliubicuitina de Hl_gxassa, incluyendo también el cambio en la posición 28 respecto de la secuencia de levadura. La homología a nivel aminoacídico de la extensión es de 72% con S. cerevisiae, 64% con D. discoideum, y de 76% con Prosa­ phila. Seria bastante razonable pensar, en virtud de la similitud de secuencia y organización genética, que la proteína codificada por este gen de fusión cumpla funciones similares a las encontra­ das en otros organismos. No obstante no se realizó ningún experi­ mentoque localizara la proteina híbrida o su extensión en ribo­ somas .

Caract.Gen de fusión - 190 — Resultados y Discusión

Si bien no se pudo determinar el sitio exacto de poliade­ nilación, es interesante destacar los siguientes datos: i) el tamaño del transcripto identificado es de 750 pb y el clon 011 contiene 600 pb. ii) la región 5'—nocodificante del gen de poliubicuitina tiene alrededor de 150 pb. iii) la zona 3'—nocodificante del gen de poliubicuitina posee alrededor de 200 pb. iv) en el gen de fusión de fl. craafia cerca de la posición 580 se encontró una zona rica en A, flanqueada por zonas ricas en GC. v) a 30 pb donnstream de esta zona, se encuentra el final del clon de cADNque termina a su vez en 4A.

Sería razonable considerar a la región rica en A alrededor de la posición 580 comoseñal de poliadenilación, aunque no clá­ sica, y al tracto de A final comouna cola trunca de poli A pro­ ducto del recorte de la nucleasa 81 en la preparación de cADNdc. Tambiénes interesante señalar la presencia de secuencias repetidas'que se resumen en la TABLAVII.

TABLA VII Posición Localización Motivo de la secuencia Extremo 3' y GGGGAATGA 467,484 zona flanqueante GGGAATG 467,434,684 GGAAA 657,860,675

Háizpin QQIIIACACTGGCGAGGQAAA 653

Caract.Gen de fusión —191 — Resultados y Discusión

TABLA VIII - USO DE CODONES.

TTT F 0 TCT S 2 TAT Y 0 TGT C 0 TTC F '3 TCC S 2 TAC Y 6 TGC C 4 TTA L 0 TCA S 0 TAA - 1 TGA — 0 TTG L 0 TCG S 0 TAG 0 TGG W 0

CTT L 3 CCT P 2 CAT H 0 CGT R 3 CTC L 9 CCC P 2 CAC H 3 CGC R 7 CTA L 0 CCA P 0 CAA Q 0 CGA R O CTG L 1 CCG P 0 CAG Q 8 CGG R 0

ATT I 0 ACT T 1 AAT N 1 AGT S 0 ATC I 8 ACC T 10 AAC N 2 AGC S 3 ATA I 0 ACA T 0 AAA K 3 AGA R 1 ATG M 2 ACG T 1 AAG K 20 AGG R 0

GTT V 0 GCT A 2 GAT D 2 GGT G 6 GTC V 5 GCC A 3 GAC D 7 GGC G 5 GTA V 0 GCA A 0 GAA E 0 GGA G 0 GTG V 3 GCG A 0 GAG E 9 GGG G 0

No se encontró ninguna secuencia digna de resaltar comúna Em.las regiones 3'—no codificantes de ambosgenes de ubicuitina de La preferencia en el uso de codones, ilustrada en la TABLA VIII, está de acuerdo con el encontrado por otros autores en ge­ nes caracterizados de fl¿_nxassn y con el gen de poliubicuitina (ver 4.2.3., TABLAII).

Caract.Gen de fusión —192 — Resultados y Discusión

La exclusión de codones con A en la tercera posición (TA­ BLAVIII, tripletes resaltados), y la gran preferencia por tri­ pletes que contengan pirimidinas en la última posición, también es característico de este gen. El uso limitado de codones, 5 %de los posibles, coincide muy bien con lo propuesto por Kinnaird y Fincham (1933) para genes de expresión constitutiva (ver 4.2.3). Resulta curioso que el triplete GGGquecorresponde a gli­ cina no haya sido utilizado al igual que en el gen de poliubicui­ tina. Tanto la secuencia de este gen de fusión como la del poli­ ubicuitina fueron registradas en el banco de datos EMBL(Heidel­ berg) con los códigos de acceso X15338 UBI3 y X13140 UBI, respec­ tivamente. 4.5.3. delSouthern

Se hizo un análisis por Southern blot del ADN genómico utilizando como sonda el fragmento de 0,8 Kpb del clon X011 y el clon 2212 que incluye el fragmento de 2,2 Kpb del gen de poliubi­ cuitina hibridado en condiciones de alta estringencia (ver 6.11). En la Fig. 37a se observa el patrón de bandas que hibridan con el gen de fusión que incluye tanto la parte de ubicuitina co­ mo la extensión. En el carril 1, la digestión con XhoI permite apreciar 2 bandas fuertes, una cerca de 3,5 Kpb y otra >6 Kpb. En el mapa de restricción del gen de fusión (Fig. 34), se observa la presencia de por lo menos un sitio XhoI dentro de la zona codificante de ubicuitina, que podria justificar la presencia de por lo menos 2 bandas en el Southern blot. I En la Fig. 37h se analiza el patrón de bandas obtenido luego de hibridar la misma membrana, sin previo lavado, con el clon 2212 que contiene sólo secuencias de ubicuitina. Las bandas

Caract.Gen de fusión - 193 ­ Resultados y Discusión

M 4 I" a ‘I 1‘' ' é x 1.072I5090. >> x ' 3054» -._..«4 [vu¿_. —2036 . *.,‘,. i4 P »—mu- >¡un Í

wwe ‘ -srs« w > w a

Fig.37. , genñmjnn di fl 9333553, En el carril 1/3 se separ) el producto de la digestión de 10 pg de ADN genómioo de HL_QXflfifiQcon XhoI y en el carril 2/4 el co­ rreapondiente con BamHI/HindIII. Carril Mcorresponde a marcador de peso molecular. En la parte a, la sonda utilizada es el clon C11 y en la parte b ¡se rehibridó con el Clon 2212 sin previo lavado de 1a meqirana.

Caract.Gen de fuéión —194 — Resultados y Discusión

caracteristicas correspondientes a los fragmentos XhoIde 2,3; 1,3 y 0,5 Kpb aparecen (carril 3) comoera de esperar (ver tam­ bién Fig. 19). Se puede apreciar, aunque un poco desvanecida, la señal correspondiente a la banda de tamaño >6 Kpb que se veia en la Fig. 37a, que podria corresponder a la región homólogade poliu­ bicuitina del gen de fusión, y que desaparece la señal de la ban­ da de 3,5 Kpb. Cabe agregar que en la Fig. 37a se puede observar también la banda de 1,3 Kpb (carril 1) correspondiente a un frag­ mentoXhoIdel poliubicuitina, revelado por hibridación cruzada. Conviene recordar que, según los datos presentados en la TABLAIV, el porcentaje promedio de homología entre la parte de ubicuitina del gen de fusión y las unidades del tandem de poli­ ubicuitina, es de 87%,lo que justifica la hibridación crusada que se comenta. Comparando los carriles 2 y 4 de la Fig. 37 (a y b, res­ pectivamente) para 1a doble digestión BamHI-HindIII, se puede apreciar 2 de las bandas; una de 2,8 Kpb y otra de 1,2 Kpb que son más intensas, tras hibridar con la sonda de fusión. El mapa de restricción de la Fig. 34 muestra por lo menos un sitio HindIII que podria justificar estas bandas para el gen de fusión. La banda de 4 Kpb del carril 4 se observa también en el carril 2, producto de la hibridación cruzada que ya se había ob­ servado en la Fig. 19. En esta misma Fig. 19, se habia encontrado una banda extra de z 1,3 Kpb que no se podia asignar al gen de poliubicuitina y que resulta derivada de este gen de fusión. La mayoría de las bandas presentes observadas en este aná­ lisis pueden ser asignadas, ya sea al ubicuitina o bien al gen de fusión. Parecería que no existieran otros locí que contuvieran secuencias de ubicuitina, lo que llevaría a considerar la ausen­ cia de otros genes de fusión. Si bien no se puede descartar la

Caract.Gen de fusión - 195 ­ _ . -i_ReeuLtadoe__'y_Discusión presencia 'de otros mARNde .ubicuitina que" (só-¡hieren ¿són 106.. 'ar'naé lizados, no existen más de dos señales. en 106 Northern- bl’otj mos­ trados anteriormente¡.lp que está de acuerdo en principio con ‘10 encontrado pOr análisis en Southern blotsr

Caractfiéh de fhsióñ A 196 é: Resultados y Discusión

4.6. ANALISIS DE LA EXPRESION DEL GEN DE FUSION

La expresión del gen de fusión se analizó en Northern blot y como se puede observar en la Fig. 38 (carriles 1 y 4), su ex­ presión acompañaa las situaciones donde la sintesis proteica es muyactiva, comola etapa exponencial del crecimiento y la germi­ nación de las conidiosporas (ver 4.3.4). Comoen otros organismos (ver 3.1.15), el ayuno lleva a una desaparición de la señal de los transcriptos codificados 'por los genes de fusión (Fig. 38, carril 2). Por tratamiento con 2 pHcicloheximida del cultivo en es­ tado estacionario (carril 4), aún en condiciones de alta estrin­ gencia y utilizando como sonda al clon 011, se detecta el mARNde poliubicuitina dado que su expresión esta aumentada en esa condi­ ción (ver Fig. 20), mientras el transcripto de fusión casi no se observa, comoera de esperar. Tanto en levaduras (Finley et al, 1989) y D. discoideum (Müller-Taubenbergcr et al, 1988), como en mamíferos (Redman y Rechsteiner, 1939), se demostró que las extensiones de los genes de fusión están involucradas en el procesamiento del rARNy que pertenecen a una familia de proteínas ribosomales. Comose comentó anteriormente, seria lógico suponer que en fll_crassa, la extensión de 78 aminoácidos cumpla una función aná­ loga en virtud de su hemología de secuencia. Sin embargo, por los datos de Southern blot parecería que existe un solo locas con homologia a uno solo de los genes de fu­ sión hasta ahora identificados (ver 3.1.15.1). Lamentablemente, no se pudo conseguir una sonda de ADNcomprendiendo la secuencia de la extensión de 52 aminoácidos correspondiente al otro gen de fusión descripto en otros organismos, para intentar la búsqueda en Northern y en Southern blot. No obstante, también es intere­

Anál. Exp. gen de fusión- 197 — Resultados y Discusión

«wm _<-0.7

1721938.de la dalWimMímica

La sonda utilizada fue el clon C11 hibridado en.condiciones de alta estringenoia. Se sembró 60 pg de ARNtotal de H¿_Qrafififi de: carril (1)‘ coni— diosporas germinadas, (2) TH, (3) T43, (4) T1. Ver nomenclatura en 6.18.5. Se indican los tamaños (Kb) aproximados de los das tranacriptos revelados. ‘

Anál. Exp. gen de fusión- 198 — Resultados y Discusión

sante comentar que el análisis de los clones aislados de la geno­ teca de cADNcon homología a ubicuitina, no haya revelado fusio­ nes con extensiones del otro grupo. De las situaciones de estrés estudiadas, ninguna condujo a un aumento en los niveles de este transcripto, comoera de espe­ rar en función de lo encontrado en otros organismos, donde sólo los genes poliubicuitina se han encontrado asociados a la res­ puesta a condiciones desfavorables. En la Fig. 39 se ilustran algunos ejemplos, tanto en la cepa salvaje comoen la mutante crisp, del patron de expresión de los mensajeros de ubicuitina. El tratamiento de la cepa salvaje con DFMOproduce un des­ censo en los niveles del transcripto de 0,7 Kb, y comose vio an­ teriormente (ver 4.3.4), esta condición producía una reduccion relativa de alrededor de 62%en la incorporación de [355] metio­ nina a proteinas. Esta inhibición parcial de la síntesis proteica podría justificar la menor demandade productos relacionados con la maquinaria biosintética, comolo serían las extensiones de 78 aminoácidos. El análisis de la expresión del transcripto de 0,7 Kb en respuesta a otras condiciones adversas, se ilustra en la Fig. 27.

Anál. Exp. gen de fusión- 199 — Resultados y Discusión

(“sp-1 r“—“- *‘ "”""' w" " “‘ ‘ — 1 11 omo A505 c 1L Y nz 111 11 1 + - + — + — CAMP Pü Pü + + — — CXH

. ' ‘ ' ‘ i.

¿.! - l i ;W 13—;n . O.7——>ÍL ' x am a MW W

Fig.39.V-vu‘ vz»gh:la dr:lQfi ¿La¿2.321­

Se utilizó como sonda los clones 011 y 2212 en condiciones de a1­ ta estringencia. Se sembró en cada carril 45 pg de ARNtotal. Las flechas grúesas indican la posición de las bandas de 253 y 178 de los rARN. Ver nomenclatura en 6.18.5. Los valores de ica tamaños de los transcriptos se indican en Kb.

Anál. Exp. gen de fusión- 200 — ONCLUSIONE Conclusiones

Unade las múltiples funciones de la ubicuitina que se describió últimamente es su relación con la respuesta a condicio» nes adversas y de estrés. Además,la ubicuitina resulta esencial para la viabilidad de esporas en levadura. Siguiendo con el modelo iniciado por nuestro grupo del es­ tudio de la respuesta de fl¿_grasfia a la inhibición parcial de la síntesis proteica, resultó interesante analizar la expresión de una proteína conocida involucrada en la respuesta al estrés en otros organismos. Se realizó con éxito el clonado de un gen de poliubicuiti­ na rastreando con una sonda heteróloga de ubicuitina de levadura, una genoteca de fragmentos del genoma de H¿_Qrfififlfl. Si bien lo apropiado hubiese sido comenzar con el analisis de una genoteca de cADNde expresión, el tamaño de la proteina en cuestión y la ausencia en fli_grafifin de intrones de gran tamaño, justificaba este protocolo. El gen clonado de poliubicuitina, se caracterizó a nivel nucleotídico por secuenciación, encontrándose además, homologia significativa con ciertos consensos caracterizados de otros orga­ nismos, relacionados con el control de la transcripción. En fll__nrassa, la organización del gen de poliubicuitina involucra 4 monómerosdispuestos en tandem cabeza-cola sin se­ cuencias espaciadoras, fusionado a un a.a. extra en el C-terminal del tandem. Contiene además, un intrón de 67 pb en el primer mo­ nómero que se escinde perfectamente, según lo que se comprobó por análisis del cADN.Este analisis sirvió, además, para demostrar que el gen de poliubicuitina clonado es el que se expresa; Las secuencias consenso involucradas en la maduración del transcripto (splícing) están de acuerdo con el consenso encontra­ do en otros genes de fl¿_crafifia.

- 202 Conclusiones

Cabe destacar la presencia de secuencias repetidas de 6 o más nucleótidos distr'buidos tanto en la región 3' como5'—noco­ dificante, comoasi también arreglos palindrómicos presuntamente significativos. El tamaño de la región 5'—nocodificante es de alrededor de 150 nt y la 3'-no codificante de aproximadamente 200 nt, lo que está de acuerdo con lo encontrado en otros genes caracteriza­ dos en este organismo. La secuencia aminoacidica deducida presenta un solo cambio en comparación con la de levadura en la posición 28 (ver TABLA III), y un solo aminoácido extra en el C-terminal de la última repetición. El uso de codones está de acuerdo con lo comunicado para genes constitutivos en H¿_Qnflfififl(ver TABLAII). El porcentaje de homología a nivel nucleotídico entre las repeticiones es en pro­ medio 88%, de acuerdo a lo esperado. Por análisis de Southern blot del ADNgenómico, se deter­ minó la presencia de un solo locas para este gen. Por análisis de la expresión del gen de poliubicuitina en Northern blot, se encontró que el tratamiento con 2 uMciclohexi­ mida de micelios en etapa estacionaria, produce un aumento en el nivel del transcripto de poliubicuitina de aproximadamente20 ve­ ces (ver Fig.20). En condiciones de ayuno, sin tratamiento con el antibióti­ co, no se observa este aumento, aún en condiciones más drásticas, comopasaje a buÍÏEr fosfato, ayunos parciales en medios carentes de fuentes de C o S o deprivación de nutrientes llevados a cabo con la mutante de Hl_cxnfifia M246auxótrofa para a.a. aromáticos. El tratamiento con puromicina, otro inhibidor de la sinte­ sis proteica en eucariotes, que actúa por un meCanismo diferente a la cicloheximida, no produjo cambios en los niveles del trans­

— 203 ­ Conclusiones cripto de poliubicuitina. Además,el tratamiento por 6 hs con una concentración de cicloheximida que provoca una inhibición de más del 90%, sólo aumentó levemente los niveles del transcripto ante­ rior. Todosestos datos llevan a descartar, en principio, que la inhibición de la síntesis proteica sea el agente que dispara el aumento de los niveles de poliubicuitina. Sin embargo, por datos indirectos, tampoco la estabilización de mARNpor cicloheximida podría explicar el aumento (ver 4.3.1). Con la idea de descartar algún efecto especifico de la ci­ cloheximida, se analizó la respuesta al tratamiento con este agente en la mutante de N¿_gzassncyh-J resistente al antibióti­ co. De los datos obtenidos se deduce que la cicloheximida per se no sería el agente que gatilla el aumentoen los niveles del transcripto de poliubicuitina. El mecanismo de acción de la cicloheximida involucra un congelamiento en la sintesis de proteínas, con la producción de polipéptidos incompletos que se mantienen unidos a polisomas. Re­ sulta atractivo postular que las conformaciones anómalas que pro­ bablemente adopten estos péptidos abortados en su elongación, in­ duzcan la respuesta del camino de degradación proteica dependien­ te de ubicuitina. Noobstante, el tratamiento con análogos de a.a. que se incorporan a proteínas, comocanavanina, p-fluorofenilalanina y D-Letionina, no modificaron el nivel de este transcripto. Tampocose encontró, como en levadura, alguna influencia del nivel de CAMPen la expresión del mARNdepoliubicuitina, ni que mutantes cr-I (adenilato ciclasa deficiente) que presentan bajos niveles de CAMPtuvieran una expresión aumentada respecto de la cepa salvaje.

— 204 ­ Conclusiones

A diferencia de lo encontrado en muchos organismos, el mARNdepoliubicuitina en H¿_grassa_no se induce por estres tér­ mico, ni por tratamientos relacionados, comopor ejemplo, arseni­ to de sodio o CdClz. Si bien la ubicuitina está reconocidamente relacionada con la respuesta a estrés en muchos organismos, como en pollo, humano y levadura entre otros, en N¿_grasfia_la inducción del mARNdepo­ liubicuitina parecería no ser necesaria para responder a una va» riedad de situaciones de estrés. Todos estos tratamientos tienen en comúnuna acentuada producción de polipéptidos anormales deletéreos para el metabo­ lismo celular e incompatibles con el desarrollo normal. Probablemente los niveles internos de ubicuitina madura sean suficientes para soportar todas estas situaciones drásticas. Lamentablemente, la determinación de niveles de ubicuitina no pu­ do realizarse ni tampocopudo determinarse la existencia de cam­ bios en los niveles de los conjugados con ubicuitina después de los distintos tratamientos. Los anticuerpos gentilmente cedidos por otros grupos de trabajo, necesitaban ser purificados por co­ lumnas de afinidad, previo a su uso, y los volúmenes obtenidos no permitieron un rendimiento adecuado. Los ensayos realizados en western blot con los anticuerpos recibidos mostraron resultados dificiles de interpretar. Las condiciones que promueven la conidiación, como por ejemplo el agotamiento de nutrientes, llevaría a preservar. el transcripto de poliubicuitina en las formas resistentes de las conidiosporas con niveles comparables al de crecimiento exponen­ cial. Sin embargo, durante la germinación de conidiosporas, au­ menta significativamente el nivel de otro transcripto de ubicui­ tina de 0,7 Kb. Su expresión también es importante en la etapa Conclusiones exponencial y decrece en situaciones de ayuno o en conidiosporas latentes. Este transcripto se caracterizó por secuenciación y resul­ tó codificar para una proteína de fusión con ubícuitina, análoga a la codificada por el gen UB13de levaduras. De los datos conocidos en humano, D. discoideum y levadu­ ras, los genes de fusión con ubicuitina pertenecen a una familia de proteínas ribosomales involucrados en el procesamiento del rARN. La homología de secuencia (ver TABLAVI) hace lógico supo­ ner que en Nl_anfifin la extensión de 78 a.a. cumpliria una fun­ ción análoga y que aumentaría su expresión en situaciones de alto nivel de síntesis proteica. Comoera de esperar, las situaciones de estrés impuestas no afectan el nivel del transcripto pequeñode ubicuitina. El análisis por Southern blot indica probablemente la sola existencia de estos dos genes de ubicuitina en fll_nrflfisa. Estos resultados aparecerán publicados en la revista Nucl, Acids Res. (1989) 17, 6153 y en GE E (1989), en prensa.

Materiales y Métodos

6.0. REACTIVOS 6.0.1. BEAQIIMQEQfllfllfifiñ Los reactivos utilizados fueron en general de calidad p. a., mientras no se indique otra cosa, y cuando no se aclara co­ rresponde a SIGMA. De la firma Hallinkrodt se utilizaron: cloruro de sodio (NaCl), alcohol isoamílico, ácido acético glacial (HAcO),acetato de amonio (NH4AcO), dodecil sulfato de sodio (SDS), acetato de potasio (KACO),fosfato diácido de sodio (NaHzPO4), fosfato mono­ ácido de sodio (NaHPO4), etilendiamino tetracetato disódico (EDTA),ácido tricloroacético (TCA). Los reactivos utilizados para secuenciación fueron de calidad "biología molecular" de las firmas Bethesda Research Lab. (BRL)como la acrilamida, H,N'-metilen bisacrilamida; urea; N,N, N',N'—tetrametil etilendiamina (TEHED);isopropil tiogalactósido (IPTG) 5bromo-4cloro-31ndolil-B-di-galacto piranósido (X-gal). Alternativamente se utilizó productos de Bio Had, Merck o Carlo Erba de calidad similar. La puromicina.2HCl (hidrato) y la dimetil formamida (DMF)fue de Aldrich Chem. Co. El poli A sintético de Miles, y los compuestos radioactivos de NewEngland Nuclear (NEN-Dupont). El orcinol (3,5-dihidroxitolueno) fue de Synchemica (Searie Co ). El etanol absoluto, ácido clorhídrico, éter etílico y el cloroformo utilizados fueron de Merck. La sacarosa para cultivo y el Silic-Glass fueron de Pa­ blo Zubizarreta Ward. La formamida (Merck) y. el formaldehído (Carlo Erba) se deionizaron con una resina mixta (MBB-Amberlite, Bio Rad) y se guardaron congelados a —20°C.El fenol (Bando, grado técnico) se purificó por destilación fraccionada, se neutralizó con 1 volumen de buffer Tris-HCl 1 MpH: 8,0; 1 volumen de buffsr Tris-HCl 0,1 MpH: 3,0 y un volumen de 2-mercaptoetanol 0,2%, y se guardó a -20°C. Salvo expresa indicación, la desproteinización de las soluciones de ácidos nucleicos se llevó a cabo por extracciones sucesivas de la fase acuosa con PCA (fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (2522421) y posterior extracción con CA (cloroformo­ alcohol isoamílico (24:1)). Se trató en ambas extracciones de no contaminar la fase acuosa qUe se estaba removiendo-con la inter­ fase. La resuspensión del material nucleico se hizo en H20bi­ destilada autoclavada y para las precipitaciones se siguió el si­ guiente protocolo:

Reactivos - 208 Materiales y Métodos

* Se agregó a la fase acuosa 1/10 vol de NaACO3M(solución de NaAoO3Mllevada a pH: 5,2 con ácido acético glacial) * 2 volúmenes de etanol absoluto * 20 min a -70°C. Se dejó 5 min a temperatura ambiente * Centrifugación 12000xg El protocolo detallado de extracciones con PCAy Ch, y el de precipitaciones con NaAeOse describe en 6.1.1.2, pero en lo sucesivo me referirá a extracciones con PCAy CAy precipita­ ción con NaAcO.yetanol. Los rotores utilizados en las centrifugaciones fueron 8834 (para tubos de hasta 40 ml) y G83 (para envases plásticos de 500 m1) de la firma Sorvall. La relación de rpm con los de fuerza centrífuga relativa a la del campo gravitatorio (RCF)se puede calcular según la siguiente fórmula: RCF = 11.17 r N2 10-5 r: radio del rotor utilizado expresado en cm N: rpm empleadas. En la tabla I se presentan los datos de RCFempleados y sus correspondientes valores en rpmpara los dos rotores utiliza­ dos.

TABLA I rpm 8834 G83 3000 1100 1500 4000 1900 5000 3000 4300 7000 5900 3300 10000 12000 15000 27000

Para las centrifugaciones en tubos Eppendorf (1,5 m1) se utilizó una microcentrífuga de mesa que alcanzaba aproximadamente 12000xg. Para la preparación de soluciones, so siguió Maniatis et al (1982). La abreviatura de los siguientes reactivos orgánicos (SIGMA)corresponde a la formulación que se detalla. MOPS ácido 3-(N-morfolino) propano sulfónico TRIS Tris (hidroximetil) amino metano PIPES ácido piperazin-N,N'—bis (etansulfónico) HEPESácido N-2-hidroxietilpiperazin-N-2-etansulfónico PMSF fluoruro de fenilmetil sulfonilo

Reactivos - 209 Materiales y Métodos

6.0.2. EHZII.’[A5. 6.0.2.1. Enzimasdemetían Las endonucleasas de restricción utilizadas se obtuvie­ ron de distintas fuentes comerciales: NewEngland Biolabs, Inc., Boheringer Mannheim, Appligene. Se utilizó en minipreparaciones, 5 U de enzima por ug de ADNque se triplicó cuando se necesitó digerir ADNgenómico. En ningún caso el volumen de enzima agregada superó el 10%del volu­ menfinal de mezcla de reacción, para evitar concentraciones in­ terferentes de glicerol. Salvo para la enzima SmaI que se incubó a 25°C, Tan a 65°C, las demás se incubaron a 37°C entre 45 min y 2 hs. Para el caso de la enzima Eagl, se usó 10 U/ug ADNa 37°C toda la noche. Los buffers de incubación utilizados se detallan en la Tabla II. En la Tabla III se resume las enzimas y las condiciones de uso, tomando como referencia lo recomendado por New England Biolabs, en lo que respecta a la concentración de NaCl y su in­ fluencia en la actividad enzimática. TABLA II buffer Tris.HCl MgClz NaCl ESA DTT 10X (mM) (mM) (mM) (pg/ml) (mM)

(HS) Alta sal 500 pH: 3,0 100 1500 -— ——

(C) core 500 100 1

(LS) Baja sal

C + HS = volúmenes iguales de ambos buffers para alcanzar una concentración NaCl 100 mMfinal. buffer SmaI 1X: KCl 20 mM Tris.HCl pH: 8,0 6 mM MgClz ' 6 mM B-mercaptoetanol 6 mM ESA 100 HE/ml

Reactivos —210 Materiales y Métodos

TABLA III

S C LS C + HS LS + KCl (mM)

BstEII Aval Ach BgllI AatII 50 EagI(XmaI) BamHI Banl HínclI BclI 75 DdeI Cial Kpnl Hinfi HhaI 10 NcoI EcoRI Nari Pstl HpaI 20 SalI HaeIII Sacl Sau3A HpaII 10 XhoI HindIII Stul NruI 50 SchIRsaI Taql XbaI

En los cases en que .se realizó la digestión con enzimas que utilizaban condiciones diferentes, e bien se suplementó la mezcla con HaCl o se precipitó con etanol y se resuspendió en el buffér adecuado para esta nueva enzima. Los mapas de restricción de los fragmentos de ADNse determi­ naron por digestiones simples y dobles que se analizaron por electroforesis en geles de agarosa nativos (descripción en 6. 8.1). En algunos casos fue útil marcar un extremo del ADNpor la tecnica de fill in (descripción en 6.6.1) y digerir parcial­ mente con enzimas apropiadas. La digestión parcial consistió en retirar alicuotas a diferentes tiempos de la incubación con la enzima de restricción y frenar la reacción depositando cada alícuota en un tubo conteniendo 1 ul de EDTA0,5 M. Las muestras se analizaron finalmente por electroforesis en geles de agarosa o acrilamida, según los tamaños a analizar. También se agregó exceso de ADN sin marcar, para controlar mejor la digestión.

.2.2. Ermfatasa alcalina de intestim de Lrueme‘ (CIE) Se utilizó CIP de Boheringer Mannheim(1 U/ul). Despues de finalizada la incubación con .la enzima de restricción (aproximadamente 5 pmoles de extremos 5' protruyentes), se agregó 1 pl de CIP en un volumen final de 100 pl en el mismo buffér de corte. Se incubó por 30 min a 37°C y se inactivó 10 min a 65°C, con agregado de EDTAhasta una concentración final de 50 mM. Se extrajo con un volumen de PCA y CA.

Reactivos - 211 Materiales y Métodos

— oe precipit) CJÚ etanol\ El peílet Se resuependió en HZO.

8.0.2.3. ADflLigaaa del iago 14 — Los ensayos ee llevaron a Cabo con 1 U de T4 ADNligasa de NewEngland Biolabe. — La mezcla de reacción contenía: buffer ligaea 10X 2 ul DTT 100 mH 2

espermidina 10 mH L .E ¡.4 enzima 1 pl — Las reacciones se llevaron a cabo en 20 ui y1 a espermidina fue el reactivo que se agregó justo antes del a enzima para evitar precipitación del material nucleico. — La temperatura de incubación varió: 12°C para extremos EcoRl, 14-16°C para los demas. El tiempo de incubación fue de aproximadamente 12 he. — El buffer ligasa 10Xcontenía: buffer Tris.HCl pH: 7,6 660 mM MgClz 66 mM ATP 2 mM BSA 1 mg/ml

6 0.2.4. RNaaaH. Digestión dei iracin de nai; fi de mABfl (Cakazana et al, 1988) El ARNtotal de NeurOSDoracrassa se purificó según lo descripto en 6.2.1. El material utilizado y las precauciones de manejo fueron análogas a los descriptoe en 8.¿.i.l 4 La RNaea H utilizada fue de Boheringer Hannheim.

"91911991-"­ mARN

RNAaseH

Fig. 1 Esquema del método.

Reactivos —212 Materiales y Métodos a. "Annfifi l j ng" Se incubó el ARN2 min a 65°C y luego se dejó enfriar lenta­ mente hasta 22°C aproximadamente 30 min. La mezcla de reaccion contenía: ARNtotal (220 ug) 4 ul KCl 1M 1 ul oligo dTlZ-IB lmg/ml 3 ul EDTA-lmM 1 ul b.H20 1 pl Se incubó con RNasa H para digerir el híbrido formado en la cola de poli A del ARN.El control utilizado se hizo reempla­ zando el oligonuclcotido por H20. A la mezcla de incubación se agregó: DTT 10 mM 3 pl MgClz 100 mH 3 ul Tris.HCl pH: 7,5 500 mM 3 ul RNasa H (1,4 U/ul) 1 ul KCl 1M 1,4 ul BSA 5 mg/ml 3 ul H20 5,6u1 Se inoubó 30 min a 37°C. c, ‘ o o f­ Se llevó a un volumen final de 170 ul con HzOy se agregó 5 pl de EDTA 0,5 M. Se extrajo con 100 pl de PCA y CA. Se precipitó (sin carrier) con etanol. Se resuspendió el pellet en H20. Se corrió en geles desnaturalizantes con formaldehído (des­ cripción en 6.8.1,3), y se transfirió por la técnica de Northern deecripta en 6.9.2.

Reactivos - 213 Materiales y Métodos

6.1. AISLAMIENTO DE ADN

6.1. 1. AISLAMIEHIQ DE ADMDE ELAEMJDQE(Birnboim-Doly, 1979) 6.1. 1.1.WMMengnanmala Con una colonia aislada de bacterias, transformadas con un plásmido que confiere resistencia a Ampicilina, se inoculó 5 ml de medio LB (conteniendo 100 pg/ml de Ampicilina) y se dejó crecer a 37°C con agitación, hasta que el cultivo estuvo saturado.( DOSOOzl) Se inoculó 500 ml del mismo medio con antibiótico y se dejó crecer a 37°Ccon agitación hasta saturación (toda la noche). Se centrifugó 10 min a 5000xg, se descartó el sobrenadante y se resuspendió el precipitado en B ml de TGE(Tris-HCl 25 mH, pH: 8,0; glucosa 50 mM; EDTA10 mM), para lavar restos de me­ dio de cultivo. Se repite la operación y se resuspende el pellet en 8 ml TGE. Se añadieron 16 ml de HaOH0,2 N-SDS 1% (P/V); se mezcló sua— vemente por inversión y se dejó 5 min a temperatura ambiente. Se agregó 12 ml de KAcO5M (pH:5 ,2) frio (Por 100 ml de so­ lución: KAcO5 M, 60 ml; HAcOglac ial 11,5 ml; H20 28,5 ml) y se mezcló suavemente por inversión. Se dejó 10 min en hielo. Se centrifugó a 10000xg, 30 min a 4°C. Se recuperó el sobre­ nadante y se agregaron al mismo 0,6 volúmenes de isopropanol. Se dejó 15 min a temperatura ambiente y se mezcló. Se centrifugó a 12000xg, 30 min; se descartó el sobrenadante y se resuspendió en 7 ml de TE (Tris-HCl, pH: 7,5, 10 mH; EDTA 1 mM). Se añadió 500 pl de bromuro de etidio 1% (P/V). Se mezcló y se dejó 15 min a temperatura ambiente. Se centrifugó 10 min a 10000xg y se sacó el sobrenadante. Se eliminan de este modolos complejos proteína-Etidio. Se pesó y se agregó 1 g de CsCl por g de solución. Se centrifugó a 40000 rpm, durante 36 horas en un rotor Beckmann 50 Ti a 20°C. Se extrajo la banda de ADNplasmidico con una pipeta Pasteur previa eliminación del volumen de solución superior a la ban­ da. Conviene utilizar una lámpara de U.V. para identificar con seguridad la banda. El bromurode etidio se eliminó mediante repetidas extraccio­ nes con n-butanol (saturado en H20). Se diluyó la muestra con H20 hasta un volumen final de 8 ml. Se agregó 0,8 ml NaAcO3M(pH: 5,2) y dos volúmenes de etanol absoluto. Se dejó 20 min a —70°C. Se centrifugó 10000xg por 10 min.

Aislamiento de ADN- 214 Materiales y Métodos

Se eliminó el sobrenadante. Se lavo el pellet con etanol 80%(V/V). Se dejó secar y se resuspendió en 500 ul de “20.

.1. 1.2. Euriiicaeián de ADNaegueñaescala Se inocularon 5 ml de medio LB (conteniendo 100 pg/ml de Am­ picilina) con una colonia aislada de bacterias transformadas con un plásmido que otorga resistencia a Ampicilina y se dejo crecer hasta saturación, a 37°C, con agitacion. Se centrifugó a 5000xg, 10 min; se descarto el sobrenadante y se resuspendió en 1 m1 de TGE. Se transfirió a un tubo Eppendorf, se centrifugó durante 2 min a 12000xg. Se eliminó el sobrenadante. El precipitado bacteriano se resuspendió en 100 ul de TGE. Se agregaron 200 ul de NaOH0,2 N-SDS 1% (P/V). Se mezcló suavemente por inversión (para reducir contaminación con ADN cromosómico que se rompe mecánicamente). Se dejó 5 min a temperatura ambiente. Se agregó 150 ul de HaAcO5M (pH: 5,2), se mezcló suavemente por inversión, y se dejó 10 min en hielo. Se centrifugo 10 min a lZOOng y se recuperó el sobrenadante con cuidado de no remover el pellet (restos celulares y ADN cromosómico). Se hiso una extracción con PCA. Se centrifugó 5 min a IZOOOKQparaseparar fases. Se hizo una nueva extracción con CAde la fase acuosa. Se centrifugó 1 min a 12000xg. Se extrajo la fase acuosa y se agregó 1/10 de volumen de NaAc 3M (pH: 5,2) y 2 volúmenes de etanol absoluto. Se centrifugó 5 min a 12000xgy se descartó el sobrenadante. El pellet se resuspendió en 200 ul de H20. Se añadieron 2 ul de una solución de 10 mg/ml de RNasa A y se incubó 30 min a 37°C. Se tomó la precaución de hervir previa­ mente la solución de RNasapara eliminar cualquier contamina­ ción con DNasas. Se agregó 20 ul de NaAcO3M (pH: 5,2) y 350 pl de etanol. Se dejó 10 min a temperatura ambiente; se centrifugó y se re­ suspendió en 20 ul de HZO. En general, 3 pl de esta solucion son suficiente para cortar con enzimas de restricción.

Aislamiento de ADN- 215 Materiales y Métodos

.2. AlfiLAMlEHIQ DE ADMDE BAQIEBIJ .005 .1. 2.1. Euriiigaglán ds ADEdel hacisxiofasg X, en gran escala a. Aislamiento del tags (Yamamotoet al, 1970) Se tomo una colonia aislada de bacterias K302 o LE392, s; sembró en 100 ml de medio LB-Mgal que se agrego maltosa 0,2% final y se creció a 37°C, hasta saturación. La presencia de Mg2+es muy importante para mantener la inte­ gridad de la cápside del fago X. El crecimiento bacteriano en presencia de maltosa permite una adsorción del fago más efi­ ciente ya que el azucar induce el operón maltosa. Entre los genes que codifican este vector está lamh que funciona como receptor para el fago X. Se midió la densidad óptica, se apartó una alícuota del cul­ tivo, conteniendo #1010 células (1 ODsoo=8x10Bbacterias/ml); se centrifugó y se resuspendió en SM (NaCl 100 mM; MgSO4 10 mM;Tris-HCl, pH: 7,5, 50 mM,gelatina 0,1%). La infección se llevó a cabo en 3 ml de SMcon 5-10x107 ufp y 1010 bacterias. Se adsorbió 20 min a 37°C, luego se inoculó la preparación anterior a 500 ml de LB-Mg(a 37°C) y se cultivó a 37°C, du­ rante toda la noche, con agitación intensa (250 rpm). Se añadió 10 ml de cloroformo y se incubó por 30 min más a 37°C. Si el cultivo no presenta aspecto de haber existido li­ sis bacteriana, se lo deja toda la noche a 4°C. Se agregó 50 pl solución madre DNasaI/RNasaA 10 mg/ml y se dejó 30 min a temperatura ambiente con el objeto de hidroli­ zar el material nucleico celular y mejorar el rendimiento de la precipitación del fago. Se disolvió en esta suspensión 29,2 g de NaCl (l Mfinal). Se incubó en hielo durante 1 hora. Se centrifugó 15 min a 8300xg a 4°C para eliminar todo debris celular. A1 sobrenadante se le agregó polietilenglicol (PEG) 8000 y se disolvió lentamente hasta una concentracion final de 10%P/V. Se mantuvo 90 min en hielo, y los fagos se precipitaron por oentrifugación a 8300xg, 20 min (4°C). Se descartó el sobrenadante; y el pellet se resuspendió en 20 mi de SM(en esta etapa se tiene una idea del rendimiento de fagos). ' Se hiso una extracción con un volumen de cloroformo para eli­ minar el PEG. Para separar fases se centrifugó 15 min 1900xg a 4°C y se extrajo la fase acuosa sin perturbar la interfase. La fase acuosa se centrifugó 30 min a 38000 rpm en rotor Beckman 50 Ti.

Aislamiento de ADN- 216 Materiales y Métodos

El pellet (firme pero transparente) se resuspendió en 1,5 m1 de SM; y se extrajo 2 veces con cloroformó; se volvió a cen­ trifugar y se resuspendió en 3 m1 de SM. b. Lisis del rings 1 anriïicagión de su ADE Se agregó EDTA,proteinasa K y SDS, en ese orden, a una con­ centración final de 20 mM,50 pg/ml y 0,5% (P/V), respectiva­ mente. Se incubó 60 min a 65°C. Se realizaron las siguientes extracciones de forma secuen­ cial: PCA, CA. Se precipitó con etanol (12000xg, 5 min) y se resuspendió en 200 nl de H20. Se trató la preparación anterior con RNasa A (2 ul de una som lución 10 mg/ml), 30 min a 37°C. Be extrajo con PCA y CA. Se agregó 20 ul HaAcO3M (pH: 5,2) y 350 nl etanol absoluto. Se dejó 10 min a temperatura ambiente, se centrifugó y se re­ suspendió en 300 ul de H20.

.2.2. Enriíicación de ADNdel hacierióïago X, en Qfiflnfiñfi escala (Davis et al, 1986) Se inoculó a partir de una colonia de LE392, 5 ml de medio LB-Mgcon el agregado de maltosa y se dejó crecer a 37°C con agitación durante toda la noche. En un tubo Falcon estéril de 50 ml conteniendo 10 m1 LB/Mgse agregó 200 ul del cultivo anterior y un taco de agarosa pro­ veniente de una playa de lisis (#107 upf). Se dejó creciendo con agitación a 37°C hasta que se comprobó una lisis franca (reducción de la turbiedad de los cultivos inoculados con fagos respecto de un control en paralelo con bacterias solamente). Aproximadamentese alcanzó entre las 8­ 12 hs de incubación. Se agregó 200 ul de cloroformo y se siguió la incubación por 2 min-a 37°C. Se centrifugó por 10 min a 3000xg para eliminar restos bacte­ rianos. Se sacó el sobrenadante (el lisado se puede mantener a 4°C con unas gotas de cloroformo como inhibidor de crecimiento bacteriano), y se agregó 10 ml de TMbuffer (50 mM Tris-HCl pH: 7,4-10 mM M3504) y 32 ul de una solución madre RNasaA­ DHasaI (10 mg/ml). Se incubó 15 min a temperatura ambiente. Se le agregó 2 m1 de una solución de HaCl 5M y 2,2 g PEG 8000 sólido. Se agitó hasta obtener una completa disolución y se incubó 15 min en hielo.

Aislamiento de ADN- 217 Materiales y Métodos

centrifugó 10 min a 12000xg a 4°C. resuspendió el pellet de fagos en 500 ul de TMy se extra­ la fase acuosa con 1 volumen de cloroformo. repitió la extracción de la fase acuosa con cloroformo. agregó 25 ul de 0,5 M EDTApH: 8,0, 50 ul de 5 M NaCl.

CD('DLT'CIL'I‘CD extrajo la fase acuosa con PCAy CA. LÏ' tomó la fase acuosa y se le agregó 1 ml de etanol absoluto se incubó 10 min a -70°C. ’<'1I'J)U1U1ÜÏLJ-ÜÍÜÏISe centrifugó 10 min a 12000xg y el pellet se resuspendió en HZO. (El rendimiento es de aproximadamente 2-5 ug de ADN por mililitro de lisado de título 1010ufp/ml).

.2.3. Melón de Am}.¡1111111131cadenade fisng Magnum A partir de una colonia de NM522bacteriana que contiene el plásmido Bluescript recombinante crecido en LB conteniendo ampicilina, se inoculó 5 ml de medio LBcon ampicilina y se incubó a 37°C con agitación toda la noche. Se inoculó 50 ml de medio LB con 1 ml del cultivo saturado anterior y se cultivó a 37°C con muchaagitación hasta una densidad ópti;a de alrededor de 0,3 (aproximadamente 1,5 hs de cultivo). Se agregó fago helper (el titulo debe estar entre 3x108­ 109 ufp/ul para VOS-HI3 o 177-109 ufpful para R403) a una multiplicidad de infección de 20:1 (fago a células) y se con­ tinuó el crecimiento por 6-3 hs a 37“C. Si el titulo es me­ nor, seguir el procedimiento anterior, pero con células NM522 que provengan de una colonia crecida en medio mínimo e infec­ tar con una multiplicidad de 0,1. Conviene tener buena aerea­ ción del cultivo, la que se logra con buena agitación y en una relación 1:5 de volumen de medio de cultivo con respecto al volumen del Erlenmeyer. Se centrifugó dos veces en tubos estériles 15 min a 10000xg. El lisado es estable a 4°C. No se agregó cloroformo para la conservación. Es conveniente tener un lisado libre de bacte­ rias para no contaminar la preparación con ADN cromosómico que interfiere posteriomente en la secuenciación. Se procedió a precipitar el fago agregando 1/4 del volumen del sobrenadante de una solución 3,5 M NH4A00 pH: 7,5-20% PEG3000 (300 pl solución precipitante + 1,2 ml sobrenadan­ te). ' Se mezcló por inversión y se dejó a temperatura ambiente por 20 min. Se centrifugó 10 min a 12000xg. Se sacó el sobrenadante y se volvió a centrifugar por 1 min para remover mejor el resto de PEGque quedó en las paredes, eliminando el resto del sobre­

Aislamiento de ADN- 218 Materiales y Métodos

nadante por aspiración. (Esta etapaes muy importante, pues los restos de PEG contribuyen al ruido de fondo en la secuencia de ADNde simple cadena). Se resuspende en HzOy se extrae con 1 volumen PCA y poste­ riormente con 1 volumen CA (400 pl). Se precipita con etanol y se resuspende el pellet en B20 (20 Ml). Se analizó la eficiencia de recuperación por electroforesis en geles de agarosa 0,8% nativo (descriptos en 6.8.1 . Se utilizó una técnica rápida de mini-rastreo de ADNde fagos recombinantes a partir de los sobrenadantes después de la in­ fección. El análisis de hizo en geles de agarosa 0,8% nativo (descripción en 6.8.1). Se mezcló: sobrenadante 10 ul SDS 2% h 1 ul buffer de sembrado BPB 3 ul Se sembró directamente en el gel que posteriormente se tiñó con EtBr 0,5 pg/ml por 5 min y se visualizo con U.V. Tambiense utilizo otra tecnica rápida de identificación de clones complementarios (C-test). El método se basa en el rc­ tardo de la migración en un gel de agarosa 0,8% nativo de un ADNsc al formar un hibrido doble cadena con otro ADNsc que contenga secuencias complementarias al primero. Se mezcló en un tubo Eppendorf 20 pl del sobrenadante de in­ fección destinado a la preparación de ADNsc del recombinante A con igual volumen del sobrenadante del recombinante B. Como controles se preparó 20 ul de cada uno de los sobrenadantes por separado, con 20 pl de SSC 1X. Se agregó 1 pl de SDS 2%y 50 pl de vaselina liquida. Se incubó 90 min a 65°C y se agregó 5 pl de buffér de sembra­ do BPB. Se sembró 15 ul de la mezcla en gel. Finalizada la corrida, se tiñó con EtBr y se comparó la movilidad relativa de las muestras. El retardo respecto de los controles indica la existencia de secuencias de ADNcomplementarias.

6. 1. 3.WÏWMAMMNEHIW El ADNtotalde NQWGRQI‘LQÜB65a se preparó por una modificación del método de Blin y Stafford (Blin y Stafford, 1976). Se cosechó el micelio por filtración y se lavó con H20desti­ lada. Se liofilisó durante 24 hs y se molió en un mortero bajo ni­ trógeno líquido.

Aislamiento de ADN- 219 Materiales y Métodos

El polvo congelado resultante se volcó sobre una solución de: EDTA 0,1 M pH: 3,0 Sarcosyl 1% proteinasa K 100 ug/ml (solución acuosa madre 10 mg/ml) Se mezcló bien para evitar grnmos y se dejó incubando a 50°C toda la noche con baja agitación (100 rpm). Se extrajo 3 veces con PCA. La mezcla se hace por inversión suave para evitar ruptura mecanica del ADN,v la separación de fases se-hace durante 10 min a 7000xg. Conviene reextraer la fase orgánica con TE para mejorar el rendimiento. Se extrajo una vez con CA. La fase acuosa se dializó contra un gran exceso de TE durante toda la noche a 4°C. Se precipitó con etanol y el pellet se disolvió en TE (1/10 del volumen original del homogenato). Se trató con RNasa A 100 pg/ml (libre de DNasas) a una con­ centración final de 100 ng/ml 1 hora a 37°C. Se agregó 1/20 del volumen de NaAcO3M (pH: 5,2) y 1,5 volú­ menes de etanol absoluto frio. Se homogeneizó suavemente con una varilla de vidrio a la vez que se la hacia rotar para enrollar las hebras de ADN.De es­ ta forma se obtiene no sólo un material nucleico más limpio respecto de la precipitación, sino que se enriquece en mate­ rial de alto peso mlecular. Se lavó con etanol absoluto el ADNenrollado, y se evaporó el etanol. Se resuspendió en H20 en un volumen mínimo y se guardó a 4°C. El rendimiento es de aproximadamente unos 100 pg de ADN por cada gramo de micelio (peso húmedo).

6.1.4. QHANIIEIQACIQN DE ADN Se estimó en geles de agarosa (descripción en 6.8.1.1. 1), con patrones de masa conocida y tamaño comparables, por la intensidad de fluorescencia desarrollada al iluminar con luz U. V., el material nucleico previamente teñido con EtBr. 6.1.5. EHBIEIQAQIQH DE ADN EQB QQLHMHAB(HlfllQQhflüfl;D ñlQüA) El ADNproveniente de distintas preparaciones, electroe­ luciones en geles, geles de bajo punto de fusión, minipreparacio­ nes, puede ser purificado y/o concentrado usando resinas comer­ ciales empaquetadas en minicolumnas. El protocolo es simple, fá­ cil y eficiente, con buena recuperación de la muestra.

Aislamiento de ADN- 220 Materiales y Métodos a. ‘. ‘rv" Se lavó la columna con 1-2 ml de solución HSB. Se equilibró con 5 m1 de LSB. b."Eegada" del ADM La muestra de ADNse diluyó a aproximadamente 5 m1 en LSB. Se utilizó-un prefiltro provisto por el fabricante para eli­ minar restos de sustancias particuladas de la solución que impidan tener un buen flujo de carga. Se pasó lentamente la muestra con el prefiltro incorporado y se recicló 2 veces más (sin prefiltro) para mejorar el rendi­ miento de unión del ADNa la columna. Se desconectó el prefiltro y se lavó con 2-3 ml de LSB. Se eluvó con 400 ul de HSB. Todos los pasos se realizaron a temperatura ambiente y el pa­ saje por la columna se hizo con jeringa de 5 ml para aplicar presión. Se puede utilizar también cuando la muestra proviene de aga­ rosa bajo punto de fusión, pero en ese caso el equilibrio y carga se hacen con soluciones preentibiadas a 37°C para man­ tener la fluidez del gel. El ADN se concentró por precipitación etanólica. Se agregó 1 m1 de etanol absoluto y se dejó precipitando 20 min a -70°C. Se centrifugó 15 min a 12000xg y el pellet se resuspendió en H20, La columna está concebida para flujos en única dirección, desde el adaptador Luer para Jeringa hacia 1a punta; un flujo en dirección opuesta provocaría una perdida de resina. La ca­ pacidad de cada columna es de alrededor de 50 ug de ADNdc. Los bufÏErs utilizados son:

LSB HSB

NaCl 0,2 M l M Tris.HCl pH: 7,3-7,5 20 mM 20 mM EDTA l mM 1 mM

Aislamiento de ADN—221 Materiales y Métodos

6.2. EXTRACCIONY PURIFICACION DE ARN DE fleupgfipgxn_grafisa 6.2. 1_ PUBIEIQAQIQNDE ABNIQIAL (Reinert et al, 1981) Se cosechó el micelio por filtración. Se lavó con H20destilada. Se liofilizó durante 24 hs y se molió en un mortero bajo ni­ trógeno liquido. Se agregó bolitas de vidrio (glass beads SIGMAtype.I 75-150 pm) para mejorar la ruptura del micelio y aumentar el rendimiento. Se volcó el polvo congelado sobre una mezcla 1:1 PCAy buffer de extracción EB. buffer acetato de sodio 0,1 MpH: 5,¿'7 EDTA 10 mM SDS 4% La alta concentracion de detergente empleada es esencial para inhibir Rflasas endógenas. Se utilizó 7,5 g del liofilizado con 150 ml de EB. Inmediatamente, se homogeneizó con un desintegrador'de teji­ dos Ultra-Turrax durante 2 min a la máximavelocidad. Se centrifugó a continuación durante 10 min a 12000xg a 4°C. Durante el resto del proceso de purificación, se mantuvieron las preparaciones en hielo, excepto cuando se indique otra cosa. Para prevenir 1a contaminación con cualquier nucleasa de ori­ gen externo (presente en la piel), el material de vidrio se horneó durante 2 hs a 180°C, el material de plástico y las soluciones acuosas se autoclavaron y se trabajó con guantes. Estas precauciones se siguieron para todas las manipulaciones con ARN. Se extrajo la fase acuosa (superior) y se reextrajo la fase organica con 1/2 volumen de EB (respecto del volumen inicial). Se homogeneizóy se separaron las fases por centri­ fugación (10000xg 10 min). Se juntaron las fases acuosas y se extrajo con CA. A la fase acuosa resultante se agregó 1/20 de volumen de SDS 10%y se llevó a 100 pg/ml de proteinasa K. Se incubó 1 h a 37°C. El empleo de la proteasa permite eliminar cualquier nu­ cleasa remanente. Se agrego el mismo volumen de SDS 10% y se extrajo con PCA y Se precipitó con etanoln Se resuspendió en H20bidestilada estéril en un volumen mini­ mo (solucion opalescente). Conviene calentar a 65°C para ace­ lerar la resuspensión del pellet. Se agregó 3 volúmenes de NaAcO 4M (solucion'de NaAcO4 M que se llevó a pH: 5,2 con ácido acético glacial) frio. Se dejó 10 min en hielo.

Extracción de ARN- 222 Materiales y Métodos

Estas condiciones de precipitación favorecen la recuperación de ARNde alto peso molecular con reducida contaminación por ADN.Se puede repetir esta precipitación para eliminar más ADNaunque se pierde bastante material. Se centrifugó 20 min a 20000xg a 4°C. Se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el pellet en Hzo. El ARNse guardó congelado a -70°C. El rendimiento aproximado es de l mg de ARNtotal por gramo de micelio-(peso húmedo). El criterio de integridad fue co­ rroborado en geles desnaturalizantes con formaldehído (des­ cripción en 6.8.1.1.3) por la presencia de las dos bandas abundantes y tipicas de los ARNribosomales y la presencia de la mayoria del material con una migración menor a la del co­ lorante marcador de movilidad.

6.2.2. QBIEflQlQfl DE ARMEQLX A+ (Aviv y Leder, 1972) La cromatografía en columnas de oligo dT-celulosa permi­ te enriquecer el ARNtotal en mARN. Se utilizaron columnas de 1 m1 de volumen asentado, que permiten procesar hasta 10 mg de ARNtotal. Todas las operaciones se realizaron a temperatura ambiente, excepto cuando se indique lo contrario. - Lavado de la columna: 1) 3 m1 H20 2) 3 ml NaOH 0,1 M — EDTA 5 mM 3) 5 ml H20 Se controló que el pH del H20de elución hubiera bajado a los valores iniciales. Se equilibró la columna con 5 ml del buffér de carga (BC)1X Tris-HCl 40 mMpH: 7,6 LiCl 0,5 M EDTA 1 mM SDS 0,2% (El uso de LiCl en lugar del habitual NaCl es conveniente pa­ ra prevenir la posible precipitación del RDS). La muestra está en H20 a una concentración máxima de 2,5 mg/ ml. Se calentó durante 10 min a 65°C 500 ul de la solución para desestabilizar la estructura secundaria del ARNy se enfrió rápidamente en hielo. Se agregó 500 ul de BC'ZX y se sembró en la columna. Se recogió el percolado, se calentó 5 min a 65°C y se volvió a sembrar. Este percolado corresponde aproximadamente al 93% del ABNtotal (poli A-). Se repitió este ciclo 3 veces mas como maximo, con el resto de la muestra.

Extracción de ARN—223 Materiales y Métodos

Se lavó la columna con 10 m1 de BC 1X y, posteriormente, 5 ml de buffér de lavado (BL) 1X: buffer Tris-HCl 20 mMpH: 7,6 LiCl 0,1 M EDTA 1 mM SDS 0,1% El poly A ARNse eluyó en 2 m1 de: buffér Tris-HCl 10 mMpH: 7,6 EDTA 1 mM SDS 0,05% Tanto el percolado comoel eluído se precipitaron con NaAcO 3M(pH: 5,2) pero con 2,5 volúmenes de etanol absoluto frio durante 30 min a -70°C. Se centrifugó 10 min a 12000xg a 4°C. Se sacó el sobrenadante y resuspendió el precipitado en un volumen minimo de H20. La columna, una vez regenerada, lista para otra purificación, si no se volvia a usar inmediatamente se deshidrató con 10 ml de etanol absoluto y se guardó a -70°C. .3. WLM DEABN(Schneider,1957) A 0,33 ml de cada muestra, se agregó 0,67 ml de reactivo de orcinol: orcinol 1% FeCla.6H20 0,5% (disueltos en HCl concentrado) El reactivo se preparó en el momento. Se incubó 20 min en baño de agua hirviendo. Se midió absorbancia a 660 nm. Se usó como standard poli A sintético. Unaunidad de absorbancia representa 25 pg/ml de ARNy la reacción no es interferida por ADNni proteínas. Tambiénen algunas ocasiones se leyó directamente la absor­ bancia a 260 nm, suponiendo que una unidad de absorbancia co­ rresponde a 37 pg/ml.

Extracción de ARN—224 Materiales y Métodos

CONSTRUCCION DE LA GENOTECA DE ADN COPIA EN thll (Huynh et al, 1985) .1. ñINIEñLñDELADHCÁEIAQADfl)

El ABNpoli A+ obtenido de cultivo de H2313216.201“. inducidos TI (descripción en 6.16.5) fue preparado según la tée­ nica deseripta en 6.2.2.

6.3 1.1. Máigdg de la Buesa H Se utilizaron los reactivos comerciales para la sintesis de cADNde la firma Amersham. Se siguió estrictamente el protocolo para 1 y 5 pg. a. Siniesis de la grimera cadena Los reactivos se agregaron en el orden sugerido por el pro­ veedor para evitar cualquier reacción de precipitación. Para la escala de 1 ug, la mezcla de reacción contenía: buffer 5X 4 ul PPi(pirofosfato de sodio) 1 pl HPRI(inhibidor de ribonuclesas de placenta humana) 1 pl deoxi MIX 2 ul oligo dT 1 pl a[32P] dCTP 2 ul ARN poli A+ 1 pl H20 7 pl Se agregó 20 U de transcriptasa reversa (20 U/ul). Se incubó 1 hora a 42°C y se dejó en hielo. Las manipulaciones se llevaron a cabo con todas las precau­ ciones descriptas en 6.2.1 para evitar degradación del ARN. Previo al agregado del ARNpoli A+ se incubó 2 min a 70°C pa­ ra rompersu estructura secundaria y permitir una eficiente síntesis del CADN. La evaluación de la incorporación se realizó por precipita­ ción con TCA10%según el siguiente protocolo: 1) Se sacó 1 ul de la mezcla de reacción después de la incu­ bación con la enzima y se le agregó 30 ug de ADNde timo (comocarrier). 2) Se agregó 5 ml de TCA 10%frio, y se dejó incubando en hielo durante 15 min. 3) Se filtro usando discos Whatmann GF y se lavo con TCA 10% frio y posteriormente con EtOH. 4) Se conto la radioaetividad en el filtro; una vez seco al aire, con una mezcla centelleadora Tolueno-Omnifluor en condiciones apropiadas para el nucleido en cuestión.

Genoteca de cADN — 225 Materiales y Métodos

L V Comocontrol de cpm totales se contó una alícuota de 2 pl filtro.de una dilución 1/20 de la mezcla agregada directamente al En nuestro caso, el porcentaje de incorporación de marca ra­ dioactiva fue de 1,36% que representa, aproximadamente, un 19% de ARNcopiado (190 ng). Se apartó 1 ul de la mezcla después de la síntesis de la pri­ mera cadena para analizar por electroforesis. Para eliminar restos de ARN, la alícuota de mezcla se trató según el si­ guiente protocolo: EDTA 0,5 M 3 ul ADN timo 20 ug NaOH 3N 3 ul 30 min a 37°C HAcO BN 3 ul Etanol absoluto 60 ul ummmmmSe dejó a -20°C toda la noche. La reacción de segunda cadena contiene los siguientes reactivos: Mezcla de la 1a cadena 16 ul buffer 2da cadena 37,5 pl a[32P] dCTP (BOOOCi/mmol) 2 pl Ribonucleasa H (E. coli) 1 ul DNApol I (E. coli) 6,6 ul (23 U) Hzo 37 ul Después del agregado de los reactivos en hielo, se mezcló y se dejó incubando 1 h a 12°C y luego 1 h a 22°C. Se centrifugó por unos segundos y se agregó en hielo 2 U de T4 ADNpolimerasa. Se mezcló y se incubó 10 min a 37°C. La reacción se detuvo agregando 10 pl EDTA0,25 M pH; 8,0 y 10 pl SDS 10%. Se sacó 2 pl de una 'dil 1/20 para cpm totales y 3 pl para precipitar con TCA10%como se describió para la primera ca­ dena. El rendimiento de sintesis de la segunda cadena fue de aproximadamente 70%respecto de la primer cadena. 0.Euriiicaciándelcanü Se hicieron dos extracciones con un volumen PA y luego 2 más con 2 volúmenes de éter etílico. Se dejó 10 min a 70°C para remover el éter por evaporación. Se precipitó con etanol y NH4AcOyse dejó'a -20°C toda la noche (descripción 6.6.2.2). Se resuependió en 50 ul de HzOy se repitió la precipitación. Por último, se resuependió en 26 pl de H20.

Genoteca de cADN — 226 Materiales y Métodos l U}D e apartó 1 pl para análisis por electroforesis. d. análifiifi da laa fiíífilfifi fiinLgLiaadáfi Con las alícuotas apartadas se corrió un gel alcalino de 1,4% (deacripción en 6.8.1.2 y, usando marcadüres de peso male» cular se Gümparóel BSPGÜtFÜdetamaños sintetizadüs (ver Eig.2}.

x, (¿5 " , ‘ wV6 v'b fl

Í I 5

—23130 - 9400 Fig. 2. Autorradiografía . - 5557 del gel alcalino. Marca­ ción sólo en primera ca" _ 2322 dana (la), sólo en la se­ \ _ 2027 gunda cadena (2a).

‘"

;

i

e. Efiggama da ¿1332515. Ver Fig. 3.

6.3.1.2. MéLQdQds la nuslggga 51 Otra alternativa de síntesis de CDNAesel que utiliza la nuclasa Sl para eliminar el asa formada después de la síntesis de la segunda cadena (ver esquema de síntesis}.

Genoteca de CADN— 227 Materiales y Métodos

a. fiintsfiifi de.la minera cadena Se comenzópor eliminar la estructura secundaria del ARN por dos metodologías alternativas diferentes: 1) tratamiento con metil mercurio: Poli A+ 1 pg/Hl 2,5 ul Hidróxido de metil mercurio 25 mM 2 ul Se dejó 10 min a temperatura ambiente. Se agregó B-mercaptoetanol 0,7 M 1 ul y se dejó en hielo. 2) tratamiento térmico (2 min a 70°C). Las muestras de ARNdesnaturalizadas por las diferentes meto­ dologías se procesaron por separado. La mezcla de reacción contenía: RNAsin R 25 (U/ul) 4 ul buffer 1a cadena 10X 5 ul d(ACGT)TP 10 mM 5 ul oligo (dT)1z-1e 0,75 ul a[32P]dCTP (3000 Ci/mmol,10pCi/pl) 2 ul “20 csp 50 ul AMVtranscriptasa reversa 15 U/pl 3 ul Se incubó 1 h a 42°C. El buffér de primera cadena 10Xcontenía: Tris.HCl pH: 8,5 0,5 M KCl 0,4 M MgClz 0,1 M DTT 4 mM Para evaluar la eficiencia de incorporación de la marca, se depositó una alícuota de reacción (0,5 pl) antes de agregada la enzima y otra después de la incubación sobre filtros Whatmann DE81. Los filtros se lavaron 4 veces (5 min cada una) en K2HP04 0,5 M, 1 min en H20, y una vez en alcohol. Se midió una dilución apropiada de la muestra para determinar cpmtotales y también los filtros, utilizando el canal para 32P del contador de centelleo. Se calculó el porcentaje de incorporación que fue de 1,73% para el caso del ARNdesnaturalizado por calor, y de 1,37% para el de hidroximetil mercurio. Se apartó 1 ul para análisis por electroforesis. hamiltïdslamgnndacadena La síntesis de la segunda cadena involucra la copia de la primera cadena utilizada, usando comoiniciador el propio extremo 3' de la primera cadena.

Genoteca de CADN- 228 Materiales y Métodos

A la mezcla de la primer cadena se le agregó: buffer 2a cadena 2X 50 ul d(ACGT)TP 10 mM 1 ul enzima de Klenow 5 U/ul 5 pl El buffer de segunda cadena contenía: Hepee pH: 6,9 0,1 M KCl 0,1 H MgClz 20 mn Se incubó toda la noche a 15 °C. Se sacó 1 ul para análisis por electroforesis. La incorporación en esta etapa fue de 2,8% y 1,8% para el que provenía del protocolo de deenaturalización térmica o con hi­ droximetil mercurio, respectivamente. La reacción se detuvo por el agregado de 4 ul de EDTA0,5 M. c. Mmmm QdelcncADudohlecadeua El exceso de nucleótidoe se separó en una columna de Sephadex 6100 equilibrada con el buffer de corrida. Se agregó 3 ul del buffer de sembrado BPBdescripto en 6.8.1. 1. a la muestra, y se corrió a temperatura ambiente regulando el flujo a 4-5 ml/h. La columna se construyó en una pipeta de b ml, y el buffer de corrida contenía: TriS.HCl pH: 7,5 10 mM NaCl 100 mM EDTA 0,1 mM Se recolectaron fracciones de 150 ul y se construyó el perfil de elución contando cada fracción. A los fines de optimizar la recuperación, lo que se sembró en la columna fue la suma de cADNobtenida por las dos técnicas de deenaturalización del ARNinicialmente procesadas por se­ parado. Se juntaron las fracciones que contenían marca excluidas por la columna. d. Diga-¿m'«'2ncon nucleafia a: A la fracción que contenía cADNdc se le agregó 1/10 del vo­ lumen de buffér 51 10Xy nucleaea Sl hasta una concentracion final de 350 U/ml. Se incubo a 37°C por 30 min. El buffer Sl 10 X contenía: NaAcO pH: 4,8 0,3 H HaCl 0,5 M ZnSO4 10 mM glicerol 50% La reaccion se detuvo agregando EDTAhasta una concentración final de 10 mM. .

Genoteca de cADN- 229 Materiales y Métodos

Se apartó una alícuota para su análisis por electroforesis.

L1) Eurifigagián del cADN Se extrajo la fase aouosa con un volumen de fenol. etílico.Se reextrajo dos veces la fase acuosa con 2 volúmenes de éter Se evaporó el éter a 37°C. De1 agregó 30 ul/ml de fase acuosa de NaCl 5 H y 2,5 volúmenes de etanol absoluto, y se dejó a —20°Ctoda la noche. Se centrifugó 15 min a 12000xg. Se eliminó el sobrenadante y se lavó el pellet con etanol 70%. Se secó el pellet. Se resuspendió el pellet en 26 pl de “20. f. ¿nanE16.dem Con las alícuotas que se tomaron de la reacción de primera cadena, segunda cadena, y después del tratamiento con nucleasa Si, se sembró un gel alcalino de 1,4%. Se siguió el mismo análi­ sis que en 6.3.1.1.d. A diferencia con el método de la RNasaH, la síntesis de la segunda cadena produce un aumento al doble de tamaño, que de­ bería revertirse por el tratamiento regulado con nucleasa Sl. g. Esgusmade sintesis. Ver Fig. 3.

6.3.2. AQQHDLQLQHAHLEHIQDEL QADH da RARA EH LlfiADQ Se siguió por separado los cADNpor las dos metodologías RNasa H y Sl. Se agregó a las soluciones de cADN dc (26 pl) los si­ guientes reactivos: ' buffér EcoRI metilasa 2X 33 pl S-adenosil metionina 800 HM 6 pl EcoRI metilasa 20 U/pl 2 ul Se inoubó 15 min a 37°C y se detuvo la reacción por “incuba­ ción durante 10 min a 70°C. El buffér EcoRI metilasa 2Xcontiene: Tris.HCl pH: 7,5 100 mM EDTA 2 mM DTT 10 mM Después de la metilaeión de los sitios EcoRI del cADNdc, se procedió a dejar extremos romosutilizando la técnica de Íïll in (descripta en 6.6.1) sólo a la preparación proveniente del protocolo con nucleasa Sl. Se agrego a la mezcla anterior 7,5 pl de MgClz 0,1 M; 7,5 ul de la mezcla de deoxinucleóti­

Genoteca de cADN- 230 Materiales y Métodos

dos d(ACGT)TP 0,2 mH y 5 U de enzima de Hienow. Se incubo 15 min a temperatura ambiente, y se detuvo 1a reacción agregando 2 pl de EDTA 0,5 M. Se extrajo la fase acuosa con 90 ul de fenol, se reextrajo la fase orgánica con 40 ul de TE. Se juntaron las fases acuosas y se reextrajeron con 60 ul de fenol. Se sacó la fase acuosa y se extrajo 3 veces con éter etílico. .e evaporo el solvente a 37°C. Se precipitó el material nucleico con NaAcOy 2,5 volúmenes de etanol. El pellet se resuspendió en 6 pl de H20 y se agregó: buffer de ligasa 10X 1 pl EcoRIlinkers fosforilados 0,5 ug/pl 2 pl T4 ADNligasa j 1 pl Se incubó a 12°C por 40 h. ‘ El buffer ligasa 10Xcontenía: .¿p Tris.HCl pH: 7,8 015 MV MgClz l 0,1 M DTT 0,1 M ATP 10 mM A la mezcla de reacción anterior se le agregó: buffer EcoRI 2X 15 pl H20 1,5 pl Se calentó 10 min a 70°C para inactivar la ligasa y se agre­ go. DTT 0,1 M 2 ul EcoRI 120 U/ul 1,5 pl Se incubó 3 hs a 37°C y se agregó 1 ul de EDTA0,5 M para de­ tener la reacción. El buÍÏEr EcoRI 2X contenía: Tris.HCl pH: 7,5 50 mM Mg504 10 mM NaCl 200 mM Se realizó un control de ligada y de recorte con enzima EcoRIutilizando los linksys. Se procedió a marcar los extremos 5' de los linkers fosforilados, siguiendo el protocolo de intercambio descripto por Maxamy Gilbert (1980) que se detalla a continuación: ADN5'P (1-50 pmoles) 5 pl HZÜ 25 pl buffér reacción 5 pl ADP 5 mM 3 pl 3[32P]ATP (IOOOCi/mmol)(100 pmoles) 10 ul T4 PNK 20 U/ul 1 ul

Genoteca de cADN- 231 Materiales y Métodos

Se incubó a 37°C por 30 min. El bufÏEr de reacción contenía: Imidazol.HCl pH: 6,6 500 mM MgClz 50 mM DTT 50 mM espermidina 1 mM EDTA 1 mM Después de 1a marcación de extremos, una alícuota se pu­ so a ligar en condiciones análogas a las que se utilizarian para unir estos oligonucleótidos al vector. Se mantuvootra alícuota sin tratamiento. Finalizada la reacción de ligado, una parte de la mezcla se incubó en condiciones semejantes a las que se iban a utilizar con la endonucleasa EcoRI. Se sembró en un gel 18%acrilamida desnaturalizante (descripto en 6.8.2.1) las tres alícuotas (una sin tratar,otra ligada,y otra ligada y cortada con EcoRI), y se reveló por radio­ autografía. s. Selección del QBDHdc no: tamaño Con el objeto de remover el exceso de linkers y de fraccionar por tamaño los cADNdc se empleó una columna de Sepharosa-4B corrida a temperatura ambiente. La columna se armó en una pipeta de 1 m1 y se equilibró con el mismobuffer de corrida anterior. Se recogió 3 gotas por tubo (50-60 ul) a un flujo de aproxi­ madamente0,5-0,6 ml/h. El perfil de elución se determinó contando las cpm de cada tubo. Se sembró una alícuota de 1 cada 3 tubos para su análisis por electroforesis en gel de agarosa alcalino.(ver Fig. 4). Se juntaron las fracciones que contenían tamaños promedios mayor de 500 pb. h. Esguemade sintesis“ Ver Fig. 3

Fig. 3. Esquema de construcción de la genoteca de cADN.

Genoteca de cADN- 232 Materiales y Métodos

Método de la Nucleasa 51 Método dela RNasa H

mARN 5'An3' mARN y A" 3 AMV transcriplasa reversa °“9°‘d7h24s

o 'J A n 3, cADN sc 3 ( Ïn 5 Tn 5,

ADN Polimerasa I E.coli RNasa H Tn5' -_-i'__..An

ADN polímero su I Nucleasu 5| . ï¿ ADNpolímerasa

T cADNdc A“l'l ¿ADN dc —

Eco RI Metilaso Me_.¡_.L—_ Me

Eco R I “Linkers”

Me Eco RI Me.._¡___ Rl :2: _. __ ADN'vectorA Me fracdonomlenlo por Eco Rl :2.Me tamano (>500bp) :1.E "°wo/

Empaquetado"in vitro" 5T ¡1T A Recombinanle

Genoteca de cADN —233 Materiales y Métodos a) pm 5000 "'- Ellnt.pornucueaaa 8' '+‘8Imeoln por HNaaa H

4000 4“ +f\_ï_

3000" A' H N\É?«Ï 2000—— + \\H/;b\%\ + + :F.‘

1000”" h \\\ “Fx”

/Á '\w&.‘¡’\w 16 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 # fraccion

19 "¿336 ‘33 a

Fig.4 íalemLQn 99.1: tamaña dj; .LQE}.QADE a) Perfil de elución de la columna de Sepharoee 4B. b) Autorradiografía del gel alca« lino de laa fracciones que se indican (lfi_sint. por RNaSaH).

Genoteca de CADN* 234 Materiales y Métodos

6.3 .3. QLQHADQDE LEE QADHdi EH EL ÏEQIQB Xgfill 6.3. 3.1.MagicalQQMazosdelm Se coprecipitó a -20°C'toda la noche con NaAcOy etanol los brazos defosforilados del vector thll (0,1 ng)con distintas relaciones de inserto (0,4 y 1,5 ng, aproximadamente). Se resuspendió en 4,5 ul en buffér ligasa 1X. Se incubó la mezcla por 15 min a 42°C y se dejó enfriar len­ tamente a temperatura ambiente con el objeto de obtener conm catémeros (aprox. 2°C/min). Se agregó 0,5 pl de T4 ADNligasa a cada tubo y se incubó la reacción por 16 he a 12°C. Para inactivar la ligasa se incubó 10 min a 70°C. Se siguió en paralelo un control con inserto conocido. 6.3. 3.2. Se descongelaron los extractos de empaquetados y se dejaron rápidamente en hielo. Se utilizó 6,5 ul de extracto, al que se agregó la mezcla de ligada. Primero se hizo una prueba piloto para tener noción de los volúmenes de mezcla a empaquetar. Se evaluó la efi­ ciencia de empaquetadocon thll salvaje. Se incubó 2 hs a temperatura ambiente, y se paró la reacción con 200 pl de SM(descripto en 6.1.2.1) más 10 ul de cloro­ formo. Se guardó a 4°C.

.4. IL'LLLAQILHI)DEEAGQEBEQQMBLHANIEE; Se infectó una alícuota de 200 ul de células Y1090 competen­ tes (descripción en 6.4) con diluciones diferentes del mate­ rial empaquetado. Las diluciones se realizaron en SM. Se incubó 20 min a 37°C. Se agregó: IPTG 50 mM 20 pl Xgal 2% (en DMF) 40 pl Agarosa blanda (LB-Mg) 3 ml (fundida mantenida a 50°C) Se volcó rápidamente sobre una placa de Petri (100 mm) que contenía agar LB-Mg.Se dejó secar por 15 min.y se incubó in­ vertida a 37°C toda la noche. Se contó el número de playas azules y blancas (recombinantes) de cada una de las placas. Se incluyo controles que permitieran analizar la eficiencia de empaquetadeo (#103 ufp/ug vector), del nivel basal dado por los brazos del vector y de la eficiencia de ligada con un inserto de referencia (#105ufp/pg).

Genoteca de cADN- 235 Materiales y Métodos

Conocidos los datos anteriores, se procedió a aumentar de es­ cala de ligada con 1 ug de brazos del vector y a empaquetar toda la mezcla. Se procedió a titular la genoteca (library), que en este caso fue de 2,5x105 ufp/pg vector con 20%recombinantes (relación playas blancas sobre azules). Para la amplificación de la genoteca se utilizó placas de Pe­ tri de 150 mm, y se agrego 500 ul de células Y1090 con 2x104 ufp comoanteriormente (descripción en 6.4). Se incubó a 42°C hasta que se pudiese apreciar el mínimo in­ dicio de playas (aproximadamente 3-4 hs), y se agregó 10 ml de SMfrío. ' Se dejó con suave balanceo durante toda la noche a 4°C. Se recogió el sobrenadante y se centrifugó a 1100xg durante 10 min a 4°C para remover el debris celular. Se le agregó al sobrenadante unas gotas de cloroformo, y se guardo a 4°C. Se tituló la genoteca amplificada, arrojando, en mi caso, un titulo de 1,5x107 ufp/ul.

Genoteca de cADN- 236 Materiales y Métodos

6.4. ANALISIS DE GENOTECAS DE FAGOS Los procedimientos desarrollados para la identificación de clones de fagos por homología con una sonda de ADN clonado fueron comunes tanto para una genoteca de ADNcopia o genómica. La diferencia más importante es en el tipo de cepa bacteriana huésped que fue utilizada cuando se uso una sonda de ADNo SE identificó con anticuerpos el clon que expresara el péptido de­ terminado. En los casos en que se usó una sonda de ADNmarcada, las cepas utilizadas fueron K802o LE392(descripción en 6.15.1). - Con una colonia aislada, se inoculó 5 ml de medio LB-Mg-mal­ tosa (descripción en 6.18.2), y dejo crecer a 37°C toda la noche con buena agitación. Se centrifugó 5 min a 1100xg y se resuspendió en 1/2 del vo­ lumen en 10 mMMg504estéril. Las células se mantuvieron a 4°C. Distintas diluciones en SM(descripto en 6.1.2.1) de la sus­ pension de fagos se incubaron por 20 min a 37°C con 60 ul de las celulas competentes para permitir la infección. Finalizada la incubación, se agregó 4 m1de agarosa blanda LB-Mg(descripcion en 8.16.2.b) fundida mantenida a 56°C, y se volcó sobre una caja de Petri de 100 mmconteniendo LB-Mg sólido. Se dejó secar por 15 min y se incubó invertida a 37­ 42°C hasta aparicion de playas. Conviene también infectar en paralelo con l virulento y visualizar el tipo de playas par­ ticulares que se producen, para evaluar la viabilidad celular (playas muygrandes y transparentes). Determinado el titulo de la genoteca y comprobadala viabili­ dad celular, se procedió a sembrar aproximadamente entre 1-3x 104 ufp de fagos de la genoteca por cada caja de Petri de 150 mm. Se utilizó el mismoprocedimiento anterior, pero usando 300 ul de suspensión -celular y 8 ml de medio agarosa blanda. Después del crecimiento se dejó 1 h a 4°C para endurecer la capa de agarosa y se procedió a transferir las playas a fil­ tros de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell o HybondC), se­ gun el protocolo descripto en 6.9.1.3. Unavez identificadas las señales con caracteristicas de po­ sitivos (punto redondeado intenso con aspecto de cometa, que ademásse repite en el filtro duplicado por superposición de los mismos), se saco el taco de agar correspondiente por as­ piración con una pipeta Pasteur recortada en su punta. Se dejó eluyendo en un tubo Eppendorf estéril con 1 ml de SM como mínimo 3 hs a temperatura ambiente, .o toda la noche a 4°C. Se guardó con una gotas de cloroformo a 4°C.

Análisis de genotecas —237 Materiales y Métodos

Esta nueva suspensión de fagos ahora enriquecida en el clon de interés, se utilizo para repetir los pasos de titulación, transferencia e identificación. En todos los casos se siguiow ron 3 rondas de clonado hasta obtener el 100%de las playas tivas.sembradas a muy baja densidad (30-50 ufp/placa 100 mm) posi­ Comodatos de referencias se puede considerar que el taco de agar contiene aproximadamente 103-107 ufp y que se espera que, comomáximo(siempre que se posicione bien los filtros), 1 de 10 placas en la primer ronda sean positivas. A partir de la suspensión de fagos que provenía de una playa única bien aislada, se siguió con los protocolos de amplifi­ cación. Se infectó una alícuota de 100 ul de suspensión bacteriana con aproximadamente 3-5x103 ufp para obtener un crecimiento casi confluente en una placa de 100 mm, con el mismo protoco­ lo anterior. Después del crecimiento se agregó 4 m1 de SMy se dejó con balanceo suave por 3 hs como mínimo a temperatura ambiente, o toda la noche a 4°C. Se tomó el sobrenadante y se agregó 100 ul de cloroformo. Se centrifugó 10 min a 4000xg a 4°C para eliminar el debris ce­ lular. El titulo aproximadodespués de la amplificación es 105-107 ufp/pl. El sobrenadante se guardó a 4°C con unas gotas de cloroformo. A partir de este stock amplificado, se preparó ADNen gran escala (descripción en 6.1.2.1). Para la caracterización final de los clones, se agregó sobre un césped de bacterias competentes depositadas por la tecnica de agarosa blanda (LB-Mg) como máximo 5 pl de las suspensio­ nes de fagos stock. Se dejó secar durante 10 min y se incubó a 42°C (phage-spot). Se transfirió según se describió en 6.9. 1.3, incluyendo controles negativos (X virulento o thll sal­ vaje). '

Análisis de genotecas - 238 Materiales y Métodos

6.5. TRANSFORMACIONENEscherichin_ggli 6.5.1. EREBABAQLQHDE QELuhAa QQHBEIEHIEE MQLQELI umaaz 6.5.1.1.A11a detrmmíormacién Se inoculó 5 ml de medio de cultivo LBcon una colonia aisla­ da de MClOSl ó NMSQZy se incubó toda la noche a 37°C. Se tomó 1 ml del cultivo anterior y se inoculó en 100 ml de LB (contenidos en un Erlenmeyer de 250 ml). Se dejó crecer a 37°C, con gran agitación durante 1,5 hs para MClOSly 2 hs para NM522. Se centrifugó 10 min a 3000xg, se resuspendió el pellet bac­ teriano en 40 ml de beI* frio y se dejó en hielo 20 min. Se oentrifugó 10 min a llOOxg y el precipitado se resuspendio en 4 ml de beIIiW frio. Se dejó en hielo 5 min y, luego, se transfirió a tubos Eppendorf, en alicuotas de 200 pl. Se congeló por inmersión en nitrógeno liquido y, luego, se guardó a -70°C. Ïihbk Iíhll** KAoO 30 mn PIPES 10 mH KCl 100 mM KCl 10 mM CaClz 10 mM CaClz 75 mm MnClz 50 mH Glicerol 15%(V/V) Glicerol 15%(V/V) Se llevó a pH: 5,8 con HAoO, Se llevó a pH: 6,5 con KOH,

6.5.1.2. 229322912 filmEliiicaflg (Mandel e Higa, 1970) Idem anterior, pero se resuspende primero en 1/10 vol 30 mMCaClz (Merck) y luego en 1/50 del volumen inicial en CaClz 100 mM-15%glicerol. La eficiencia de transformación con este protocolo al­ canza 10B transformantes por pg de plásmido.

6.5.2. IBAHEEQBUAQLQMQQHELAfifllDQfi Se descongeló una alícuota de bacterias competentes 1 min en H20y se dejó 10 min en hielo (si las bacterias competentes se prepararon en el momento, este paso se obvio). ' Se agregó 60 ul de bacterias a un tubo Eppendorf conteniendo hasta 10 pl de la suspensión de ADN.Se dejó 30 min en hielo. Se incubó 1 min a 42”C y se.puso en hielo.

Transformación en ElQQli - 239 Materiales y Métodos

Se agregó 0,5 m1 de LB, precalentado a 37°C, y se incubó a la mismatemperatura, durante 45 min para permitir expresar el pláemido. Se tomó una alícuota de 200 pl y se sembró, mediante rastri­ liado, en placas de Petri con LBagar, conteniendo Ampicilina (100 pg/ml). Se incubó a 37°C en_eetufa por 12-16 hs.

Transformación en.E¿QQli - 240 Materiales y Métodos

6.6. MARCACION DE ADN

5.6.1. IEQHLQA DEL BELLEHADQDEEKIBEHQ (fill in) Se utilizó esta técnica para marcar moléculas de ADNcon extremos 3' recesivoe. El método se basa en la incorporación de deoxinucleótidoe marcados en el fosfato a utilizando el fragmento de Klenow de la ADNpolimeraea I.

Se partió de 1 ug de ADNcon extremos 3' recesivo y se incubó con la siguiente mezcla: dNTPs (0,5 mMc/u) excepto uno 1 pl a[32P]—dXTP faltante (BOOOCi/mmol) 20 pCi core buffer 10X(descripto en 6.0.2.1) 1 ul enzima de Klenow 1U/p1 1 ul H20 csp 30 ul Tiempo de reacción 20 min a temperatura ambiente. b. "El u Se agregó 1 ul de todos los dNTPs 250 un final en cada uno de ellos, y se dejó 10 min a temperatura ambiente. c. Ilumiïacián de la enaima La polimerasa se inactivo por calentamiento durante 20 min a 65°C. d. Sepa [figjgïn ¿Leg-L¡'¡Ih'zlfig'stjdgfi¡1Q jnngrpprarmfi Según 6.6.2.c.

6.6.2. ÏEQHLCA(" DEL.MMM mm" ") MELIIBLE DE.SEGUEHLZIAALAZAR Feinberg y Vogelstein (1983 y 1984) introdujeron el uso de secuencias hexanucleotidicas al azar para iniciar la sintesis de ADN(en templados desnaturalizados) en numerosos sitios a lo largo de la molécula. La cantidad de ADNsintetizado en general es mayor que la cantidad inicial de templado; lo que supone un desplazamiento de cadena en crecimiento. Esto provoca que una misma región sea copiada mas de una vez en el proceso de síntesis; permitiendo el uso de pequeñas cantidades de templado de ADN.

Marcación de ADN- 241 Materiales y Métodos

Es uno de los métodos que permite la marcación de sondas con actividad especifica (aproximadamente, 5H10x103cpm/pg) muy alta, y la incorporación llega a cerca del 60%de la marca utiliv zada. Se utilizó el equipo de reactivos comerciales de la fir­ ma Amershampara llevar a cabo las reacciones. a. del3231112151512 La muestra de ADN(25-100 ng) en un volumen de 21 pl se des­ naturalizó por calentamiento a 100°C por 2 min. Se dejó en hielo. b. Sintesis Se agregó: buffer 5-,¡11 ESA/primer 5 “1 BdHTPexcepto uno 4 pl c/u a[32P]dXTP faltante (BOOOCi/mmol) fi ul enzima Q “1 Se incubó 5 hs a temperatura ambiente o alternativamente se dejó toda la noche. La muestra de ADNen general conviene linealizarla para mejo­ rar la deenaturalización, y así optimizar la incorporación de los nucleótidos. También se puede utilizar esta reacción para marcar ADN en trozos de gel de agarosa de bajo punto de fusión (descripción en 6.8.1.4.2). Conviene que el volumen ADN/agarosa que con­ tiene 25 ng de ADNno sea superior a 25 ul. aElimimiándelgfinugleátidgenommmadoa Se agregó 5 pl de EDTA0,5 Mpara quelar el Mg2+presente y frenar la actividad enzimática. Se agregó 5 pg de ADNdeenaturalizado de esperma de salmón o de timo (Conviene no invertir el orden de agregado para ase­ gurarse de que no ee utilice ademas, el templado del ADN de carrier). Se agregó 1/2 de todo el volumen anterior de NH4AcO7,5 M pH: 7,0 y 2 volúmenes de etanol (calculado sobre el volumen resultante después del agregado de NH4ACO)(1vol+0,5 vol NH4Ac+3 vol EtÜH) Se incubó 20 min a —70°C. Se centrifugó 15 min a 12000xg y se resuspendió el pellet en 200 ul de HzO. Se repitió la operación de precipitado y se reeuspendio fi­ nalmente en 100 pl de HZÜ.

Marcación de ADN- 242 Materiales y Métodos

El uso de NH4AcOfrente a NaAcO tiene la ventaja de re­ ducir la precipitación de nucleótido libre y, después de la se­ gunda precipitación menos de 10%queda remanente.

6. 6. 3_ mm DEmansionDELWim extension") a_ Infiancjfin en“ El inipjfidgr (primer annealing) ADNcadena simple 22 pg (preparado según protocolo 8.1‘2.3.) TMN 10X 1,5 pl Iniciador (primer universal 1,5 ul de M13) 0,5 pmol/pl H20 csp 15 ul Se hirvió 2 min para eliminar estructura secundaria y se baja a 67°C. Se dejó enfriar lentamente a temperatura ambiente. (Es acon­ sejable que la velocidad de enfriamiento sea lenta para favo­ recer el apareamiento del oligonucleótido de 17-mero con el templado. Comomáximo 1°C/min). El buffér TMN10Xtiene 1a siguiente composición: NaCl 100 mM Tris-HCl pH: 8,0 100 mM MgClz 50 mM b. Extfinfijén del jnjcjadgr Se incubó los 15 ul de la mezcla anterior con deoxinucleóti­ dos frios y uno de ellos radioactivo (marcado en posición a con 32P) y enzima ADNpolimerasa I fragmento mayor (Klenow), 60 min a 25°C. dTTP 5 mM 1 pl dCTP 5 mM 1 pl dATP 5 mM 1 ul dGTP 0,5mM 0,5u1 a[32P] dGTP (30000i/mmol) 7 ul TMN 10X 2 ul H20 . 5,5pl Enzima de Klenow (IOU/pl) 2 pl Posteriormente se agregó 3 pl de una mezcla de los 4 dNTPs 1 mMpara cada uno de.ellos y se incubó por 30 min a tempera­ tura ambiente. Se inactivó la enzima comoen 6.6.1.c.

Marcación de ADN- 243 Materiales y Métodos mkcsutecgnemnncleafiademmm; Se recortó con la endonucleasa de restricción apropiada, se­ gún especificación del proveedor descripta en ???, en un vo­ lumen final de 100 pl. d _ ñfipfi ¡‘g’(315)“ Ell‘g'gdng'ztc') fi] ntfifi j fi Se corrió un gel nativo de poliacrilamida de porcentaje apro­ piado según protocolo descripto en 6.8.2.1. Se agregó a la muestra colorante de siembra (azul de bromo fenol) sin ningún tratamiento posterior. Se reveló el gel por autorradiografía y se eluyó la banda en 400 ul de NaAcO0,3M pH: 5,2 (dilución 1/10 de la solución de NaAcO3MpH: 5,2 ) preparado como se describió en la purifi­ cación de ARN6.2.1. a 37°C toda la noche (una buena alterna­ tiva es eluir la banda 6 hs a 42°C).

6.6.4. IEQHLQA DEL ADN QQEIA Se sintetizó [3ZP] ADNcde alta actividad específica a a.r de ARNpoli A+purificado según el protocolo descripto en Se partió de 1 pg de ARNque se incubó (previamente 1 min a 90°C) durante 3 hs a 42°C en una mezcla que contenía: bufÏEr Tris.HCl pH: 8,3 50 mM MgClz 5 mM KCl 30 mM DTT 2 mM dGTP 50 pM dCTP 50 HM dTTP 50 “M a[32P]dATP (3000 Ci/mmol) 10 ul dATP 2,2 HH oligo dle-za 2 H8 transcriptaea reversa (AMV) 40 U volumen final de la reacción 100 pl La reacción ee detuvo con 10 pl de EDTA0,5 M,

Marcación de ADN- 244 Materiales y Métodos

b. Hidrélifiifi del ARN Se agregó 10 ug de ADN de timo desnaturalizado y 13 pl de NaÜH 3 M. Se incubó 30 min a 37°C. Se neutralizó con 13 ul de ácido acético 3 M.

Se utilizó una columna de 2 m1 de Sepharose CL-4Bequilibrada y corrida en TE Se recogieron fracciones de 100 ul aproximadamente, y se tra­ zó el perfil de elución con los valores de cpmobtenidos por un detector de radioactividad. La actividad específica de es­ te tipo de sonda es de alrededor de 5x108 cpm/pg.

Marcación de ADN- 245 Materiales y Métodos

6.7. MAPEO CON NUCLEASA Sl Para la precisa identificación de aquellas secuencias genómicas que se transcriban en ARN,es necesario conocer el si­ tio de iniciación y terminación del transcripto, comoasí también las secuencias que se eliminan durante el procesamiento del ARN primario. El principio de los protocolos de mapeo con Sl se basan en la capacidad de hidrólisis selectiva de ácidos nucleicos pre­ sentes como simple cadena.

6.7.1. lEQfllEADEBEBfiSa SHARE(1.911) a. mmm mn ABN(annealing) Se utilizó entre 25-100 pg ARNtotal de Negxgfipgxa_gnafifiapu­ rificado según 6.2.1. El fragmento de ADN utilizado se marcó por la técnica de primer extension descripta en 6.6.3. y se aisló la banda (descripta en 6.8.2.2). El material utilizado y las precauciones de su manejo fueron análogas a las descriptas en 6.2.1. Se agregó el ARNtotal y 2 pl de poli A sintético 5,3 ug/ml a la solución que contenía la elución de la banda. Se copreci­ pitó con etanol. El control sin ARNse realizó reemplazando el ARNde flenxgfir pgxa_crassa por 15 pl tARN 1 ug/ml. Se centrifugó por 10 min a 12000xg. b. “jr .10” Se resuspendió en 12,5 pl de R-Joop buffer: PIPES pH: 6,4 40 mM EDTA pH: 8,0 1 mM NaCl 0,4 M Formamida deionizada 80% (V/V) Se agregó 2 gotas de vaselina liquida para evitar la evapora­ ción . Se calentó a 80°C, 3 min, para separar las cadenas del ADN. Se incubó durante 12-16 hs a 52°C.

Mapeo 81 - 246 Materiales y Métodos 0.12a1amienmgcrinucleasa51 Se agregó a cada tubo 250 pl de la siguiente solución: Sl buffer 1X 1,1 m1 Nucleasa 51 (4OOU/ul) 4 ul ADNde esperma de salmón (lOmg/ml) desnaturalizado por calor 2,3 pl El buffer 51 1Xcontenía: NaAcO (pH: 4,5) 30 mM NaCl 250 mM ZnClz 1 mM Se centrifugó 1 min a 12000xg. Se incubó 1 h a 37°C. Se extrajo sucesivamente con 300 pl de PCAy CA. Se precipitó con etanol con 10 ug tARN. d. mmm de..Lamuestra Se resuspendió en buffer desnaturalizante. Se hirvió 2 min. Se sembró en un gel de poliacrilamida desnaturalizante (des­ cripción en 6.8.2.1). Se reveló por autorradiografia (descripción en 6.11.c). e. CQnLrQIfifi em};leaflpfi Ademásdel control sin ARNespecífico (reemplazado por tARN), se incorporó el de ADNsin tratamiento como referencia del tamaño inicial de la muestra (IHPUT). Se obtuvo por precipitación con 10 ug tARNy siembra directa en las condiciones de las otras muestras. 6-7-2.WW La utilización de ADNsc frio en el ensayo de protección de la nucleasa Sl fue una modificación realizada en nuestro labo­ ratorio. Este protocolo alternativo soluciona la dificultad que se presenta algunas veces de obtener sondas uniformemente marca­ das de gran tamaño (R.M. Attar, comunicación personal). Tambien incorpore la transferencia alcalina, la que acelera el trabajo.

Mapeo Sl — 247 Materiales y Métodos

a. lnguhacián con ARE Idem técnica anterior, pero se utilizó ADNsimple cadena pu­ rificado de fagos recombinantes, descripta en 6.1.2.3. Se coprecipitó ARNtotal con ADNse. Para un volumen de 40 pl: ARNtotal 25-100 pg ADN sc 400 ng poli A sintético (5,3ug/ml) 2 pl El control sin ARNcontenía tARN 10 ug. b. Idemanterior c. idem anterior d. Tratamiento de la mnfifitra Se resuspendió en buÍÏér alcalino, se sembró un gel alcalino (descripción en 6.8.1.2). Se transfirió sin otro tratamiento a Gene Screen Plus por la técnica de transferencia alcalina, descripta en 6.9.1.1.2. Se hibrido (ver 6.11) con la sonda marcada según 6.6.2. co­ rrespondiente, revelándose por autorradiografia. e. CQntrQ | es em];| ga glgfi Idem como en el caso anterior, salvo que el INPUT aqui lo representa la siembra de 20 pg de ADNsc directamente en el gel.

Mapeo Sl — 248 Materiales y Métodos

6.8. ELECTROFORESIS EN GELES

5-3-1- GELEB DE AfiABQfiA La descripción de la preparación de los geles está des­ cripta en Maniatis et al (1982). Se empleó agarosa de bajo punto de fusión en algunos casos, pero los procedimientos empleados en la preparación y corridas fueron similares a los utilizados con agarosa común. La única diferencia estuvo en la temperatura de incubación durante la gelificación y de corrida, que en el caso de agarosa de bajo punto de fusión fue de 4°C, mientras que para agarosa normal temperatura ambiente.

6.8.1.1. Gel natjvg El buffer de preparación del gel y el de corrida utili­ zado fue indistintamente TBE 1X o TAE 1X. La formulación de soluciones madres de los bufférs: buffer TBE 10X: Tris base 108 g Acido bórico 55 g EDTA (pH: 8,0) 0,5 M 40 m1 H20 csp 1 l .buffer TAE50X: Tris base 242 g ácido acético glacial. 57,1 ml EDTA (pH: 8,0) 0,5 M 100 ml Previo al sembrado del gel, .se agregó a cada muestra 1/3 de volumen de buffer de sembrado. Se usaron geles horizontales y el gradiente de voltaje utilizado fue comomáximo8 V/ompara una buena resolución. En el caso de minigeles se llegó a utilizar 20 V/cm. Buffer de sembrado (BPB): azul de bromofenol 0,25% Buffer TAE o TBE 1X glicerol 50% Se agregó bromuro de etidio (EtBr) a la solución de agarosa, pero no al buffér de corrida, a una concentración de 0,5 pglml (solución madre de EtBr 1%en H20). Se observó el ADNpor iluminación directa del gel con luz UV de 300 nmy, cuando fue necesario, se lo fotografió con una máquinaPolaroid MP-4y película de alta sensibilidad, Pola­ roid 667. Se utilizó también un filtro rojo (RPC4). Usando tiempos de exposición de unos pocos segundos se pueden detectar 10 ng de ADN en una única banda de 5 mmde ancho (Sharp et al, 1973).

Electroforesis en geles - 249 Materiales y Métodos

Comomarcadores de peso molecular, se usaron el ADNdel fago 1 cortado con: HindlIl (23130, 9416, 6555, 4361, 2322, 2067, 564, 125pb); BstEII (8453, 7242, 6369, 5687, 4822, 4324, 3675, 2323, 1929, 1371, 1264, 702, 224, 117) EcoRI (21226, 7421, 5804, 5643, 4878, 3530) BglII (22010, 13286, 9688, 2392, 651, 415) SmaI (19397, 12200, 8614, 8271) EcoRI/HindIII (21226, 5148, 4973, 4277, 3530, 2028, 1904, 1584, 1330, 983, 831, 564, 125); el plásmido pAT153/PvuII/8 cortado con Hinfl (1360, 517, 396, 298, 220/1, 154, 145 y 75); y el plásmido pBR322 cortado con Hian (1631, 517, 506, 396, 344, 298, 220/1, 154, 75) También se utilizó los marcadores comerciales "1 Kb DNA ladder“ (BRL)que contienen los siguientes fragmentos: 75, 142. 154, 200, 220, 298, 344, 394, 516, 506, 1018, 1635, 2036, 3054, 4072, 5090, 6108, 7126, 8144, 9162, 10180, 11198, 12216. La movilidad resulta proporcional al logaritmo de peso molecular (Helling et al, 1974). - Cuando fue necesario correr muestras que contenían fragmentos marcados, se incluyó marcadores de peso molecular radioacti­ vos por la técnica de fill in descripta en 6.6.1. En los casos en que fue necesario poner a exponer el gel que contenía muestras radioactivas, se procedió a fijarlo en TCA 7% (P/V) por 30 min. Se lo transfirió a una hoja de papel Whatmann3MMy se lo cu­ brió con Saran-Wrap. Se secó a 80°C con vacio en un secador de geles. Para la exposición, se siguio el protocolo descripto en 6. 6.8.1.2.11.c. La preparación del gel se realizó en NaCl 50 mM-EDTA1 mM. Se equilibró en el buffér de corrida NaOH30 mM-EDTA1 mM. La preparación en el buÍÏEFalcalino produciría la hidrólisis del polisacárido. La corrida se realizó a 4°C. El buffer de sembrado utilizado se componede: HaOH 30 mM EDTA 1 mM Ficoll 3% Verde de bromo cresol 0,025% Finalizada la corrida, si fue necesario exponerlo, se siguió comoen 6.8.1.1.

Electroforesis en geles —250 Materiales y Métodos

6.8.1.3. Llei definaturalizrmm con fornmlswh1do. Se utilizó para separar ARNtota] o poliA+ en condicio­ nes desnaturalizantes que eliminaran la estructura secundaria. Se preparó agarosa 1,5% con el agregado de formaldehído 6% y buffer HAE1X (Lehrach et a1, 1977). El buffér HAE10X contiene: MÚPB 0,2 M NaAcO 50 mM EDTA 10 mM pH: 7,0 llevado con NaOH Los agregados a la solución de agarosa autoclavada se hicieron a 65°C. El formaldehído utilizado fue previamente deionizado y se controló que su pH no fuera menor de 5. La cuba en que se rea­ lizó la corrida, comoasí también el peine que se utilizó para moldear los pocillos de siembra fueron enjuagados con solución de SDS 10%para reducir la contaminación con RNasas. - La muestra se disolvió en H20 autoclavada y se agrego los si­ guientes reactivos hasta alcanzar la concentración final in­ dicada. buÍÏEr MAE 1X formamida 50% formaldehído 6% Posteriormenteturalisarla. la muestra se incubó 10 min a 65°C para desna­ Antes de sembrar, se agregó 2 ul de BPB estéril y 2 ul de EtBr 0,1% (dil 1/10 de solución madre) para 30 ul de mezcla. Comocriterio de integridad, como así también como marcadores de peso molecular (rARN de flggxgapgza_gzafisa_l7s (2,1 Kb) y 288 (4,1 Kb)) se utilizó las caracteristicas bandas de los ARNribosomales. La visualización fue directa con lámpara de U.V. y cuando fue necesario fotografiarlo, se siguió el protocolo descripto en 6.8.1.1. La corrida se hizo a temperatura ambiente 8 V/cm pero se agregó buffér hasta cubrir apenas el gel para evitar remover formaldehído del gel e indirectamente de la muestra; Conviene homogeneizar el buffer de corrida en ambas cámaras de la cuba aún en corridas cortas.

6.8.1.4. Baquperacion de ADN 6.8.1.4.1. Por electroelución Se cortó la porción del gel que contenía la banda de interes con un bisturí (previamente se ubicó 1a banda con la ayuda de una lámpara de U.V.).

Electroforesis en geles - 251 Materiales y Métodos

En una zona "limpia" del mismogel se recort) un pocillo rec­ tangular que pudiera contener al trozo de gel con la banda. Los cortes se continuaron unos 2 cm hacia el cátodo, dejando una "solapa" de gel. Se preparó un trozo, mas grande que el pocillo, de membrana de diálisis pretratada con: I. 2% NazCOs; 1 mM EDTA, 10 min a 100°C. II. Varios enjuagues de agua destilada. III. Almacenada a 4°C en HZO. Se tapizó el pocillo con la membrana, de modoque esta sobre­ saliera por tres lados, y se introdujo por debajo de la "so­ lapa". Dentro del pocillo tapizado se depositó el trozo de gel con la banda. Se rellenó con buffér de corrida (el buffér de la cuba no debe cubrir el gel). Se corrió por 1 hora a 150 V. A continuación, se retiró la membranasin cortar la corriente con una pinza y se colocó, con el lado que contiene el ADNhacia abajo, sobre una gota de buÍÏEr TE (150 ul) depositada sobre un trozo de plástico. Se presionó la membrana varias veces y se pasó por una 2a. y a una 3a. gota. Conviene asegurarse de que la banda se haya impactado en la membranapor visualización con lámpara de U. V Se juntó las 3 gotas en un tubo Eppendorf y se extrajo una vez con PCA y otra con CA. Se precipitó con etanol. Se resuspendió el pellet en H20. Conviene correr un minigel con una alícuota para verificar 1a extracción y estimar masa. La purificación de ADNpor esta metodología permite utilizar el material nucleico para la mayoría de reacciones enzimáti­ cas (ligación, corte con endonucleasas de restricción, marca­ do, entre otras; comoasí también para transformación).

.8. 1.4.2. Utilizando agarosa de bajo punto de fusión Se preparó el gel (no mayor de 1%). Se localizó la banda de ADN de interés por iluminación COTI luz U.V. y se cortó el trozo de gel deseado. Se añadió al mismo, 3 m1 de Hzo por gramo de trozo de agarosa y se calentó 5 min a 65°C, para fundir el gel. Se mantuvolíquido a 37°C para realizar diferentes reacciones enzimáticas o para agregar a células competentes y transfor­ mar, según protocolo descripto en 8.5.

Electroforesis en geles - 252 Materiales y Métodos

.2. GELEB DE EQLIAEBLLAMLDA .2.1. Segaracián de acidos nncleiggs a. Ersnaracién 1 corrida ds los geles Los geles se prepararon a partir de una solución madre acri­ lamida 30% (P/V)-bisacrilamida 1%(P/V). El porcentaje de acrilamida del gel varió entre 4%y 20%, se­ gún el tamaño de los fragmentos de ADNa separar. El buffér de siembra, el del gel y el de 1a corrida fue siem­ pre TBE1X (descripción en 6.8.1.1.). Los geles desnaturalizantes (secuenciación de ADN,mapeo con Sl) se armaron con urea, a una concentracion final de 8 M. Se utilizó una concentración TEMEDde0,1% (V/V) y de persul­ fato de sodio de 0,1% (P/V). La solución de persulfato con­ viene prepararla en el momento (solución madre 10%en H20). La preparación de los geles fue similar a la descripta por Maniatis et al (1982) y se corrieron a potencia constante (45 H para geles medianos y 60 Wpara geles anchos). Ambos vidrios fueron tratados con_fiiljg;glas¿J b. ñiemhra Los geles se pre-corrieron por 30 min a la mismapotencia an­ tes de sembrar la muestra. Para geles nativos se utilizó el buffer de sembrado BPB des­ cripto en 6.8.1.1. Para los geles desnaturalizantes se utili­ zó un buffér con formamida, descripto en 6.13 (Tabla IV) y se hirvió la muestra por 5 min antes de sembrar. c. " "+­ En los casos en que fue necesario secar el gel para ponerlo a exponer, se procedió a fijarlo previamente en ácido acético 10%—metanol10% por 15 min. Se lo transfirió a un papel Whatmann SMN,se cubrió con Saran-Nrap. Se lo secó a 80°C con vacío en un secador de geles. Para la exposición se siguió el protocolo descripto en 6. 11. c.

.2.2. Recuperacion de ADMdel gel Se corrió el gel hasta que el colorante alcanzara la distan­ cia deseada. Se cortó la corrida, se separaron los vidrios y se envolvió el vidrio que contenía al gel con Saran-Nrap.

Electroforesis en geles - 253 Materiales y Métodos

Se hicieron marcas aeimétricae (con marcador) en la placa pa­ ra eu posterior posicionado. Se puso a exponer lü'min a temperatura ambiente sin pantalla intensificadora, y ee reveló según protocolo descripto en 6. 11.c. Se hizo una ventanita en la placa autorradiográfica en la zo­ na que correspondía a la banda. Se reubicó la placa en la mismaposición original y se recor­ tó (con un bisturí) la zona del gel que quedaba visible a traves de la ventanita. Se saco la porción del gel y se la dejo eluyendo durante toda la noche a 37°C en 400 pl de NaAcO0,3 M(pH: 5,2). Se recuperó el ADNpor precipitación etanolica con el agrega­ do de carrier.

.8. 2.3. Separación de ptgteinafi (BAGE-5H&)(Laemnli,1970) a. Benamach1L

Se utilizaron geles planos verticales de 0,35 mmde 628136601.“ de poro único. Para mejorar la resolución de las muestras, se incluyó un gel concentrador. Los detalles de preparación: Gel manada): acrilamida-N,N'-metilen bieacrilamida (30:1) 12,5% buffer Tris-HCl pH: 8,8 0,36 SDS 0,1% II. Gel emma.than acrilamida-N,N'—metilen bisacrilamida (30:1) 5% buffer Tris-HCl pH: 6,8 0,13 M SDS 0,1% Se usó comobuffer de corrida Tris-glicina 25 mMpH: 8,8-SDS 0,1%. El buffer Tris-glicina 10x contiene: glicina 144 g Tris base 30,5 g H20 csp 1 l

Electroforesis en geles - 254 Materiales y Métodos b. “tamiento de la nuestra Las muestras fueron tratadas con 1 volumen de buffer desnatu­ ralizante 2X: SDS 2% 2-mercaptoetanol 2% Tris-glicina pH: 8,8 50 mM azul de bromofenol 0,02% Se hirvió durante 5 min antes de sembrar. La corrida se comenzó a 15 mAhasta la entrada del colorante al gel separador, y luego se prosiguió a 30 mAhasta que el colorante alcanzase el final. Se usó los siguientes marcadores de peso molecular: fosfori­ lasa b (94000), albúmina (87000), ovoalbúmina (43000), anhi­ drasa carbónica (30000), inhibidor de tripsina (20100), y a­ lactoalbúmina (14400). Finalizada la corrida, si fue necesario exponerlo y/o visua­ lizar las bandas, se siguió con el protocolo de tinción. c. {mmm Se incubó con agitación por 2 hs a temperatura ambiente en el colorante: Coomasie blue R-250 0,05% metanol 40% TCA 10% d.glicerol 10% El lavado se realizó con agitación a temperatura ambiente en metanol 45% - ácido acético 10% —glicerol 10% (con varios cambiostraste. de solución decolorante) hasta obtener.un buen con­ En los casos en que se corrieron muestras radioactivas y -fue necesario exponer el gel, se lo transfirió a un papel Whatmann 3HM,se lo cubrió con Saran-hïap y se lo secó a 30°C con vacío. ­ Si la marca utilizada era [358] se pretrató: 1. 30 min en H20 2. 60 min en salicilato de sodio 1 M 3. 30 min en H20 Para la exposición se siguió el protocolo descripto en 6.11. c.

Electroforesis en geles - 255 6.8.2.4. WaiMateriales y Métodos La marcación de proteínas in vivo se llevó a cabo en cultivos de 30 ml por 2 he con 12 pCi/ml de L[35S] metionina (1100pCi/ mmol)en las condiciones de interés. Se filtró el micelio y ee lavó con abundante H20destilada. Se congeló para poder molerlo en mortero y ee homogeneizó con Dounceen el buffer de diálisis. Se centrifugó el homogenato 5 min a 12000xg. Se dializó toda la noche a 4°C en: Sacaroea 10% PMSF 10 uM Trie-glicina 1X Se determinó la incorporación de radioactividad a material insoluble en TCAcaliente según el siguiente protocolo: 1) Se depositó una alícuota del homogenato en filtros Hhatmann GF. 2) Se eumergió en TCA 10% hirviendo. 3) Se le agregó abundante hielo. 4) Se lavó con etanol absoluto frío. 5) Se lavó con acetona fría.Todos los pasos fueron de 10 min. 6) se eeeó el filtro al aire y se contó con tolueno-Omni­ fluor. Se analizó el patrón proteico en geles de poliacrilamida PAGE-SUS(descripción en 6.8.2.3).

Electroforesis en geles - 256 Materiales y Métodos

6.9. TRANSFERENCIA Y FIJACION DE ACIDOS NUCLEICOS A MEMBRANAS

6.9.1. IBANBEEBENQLA DE A1211 6.9.1.1.Tecnicade 6.9.1.1.1. Transferencia a Gene ScreenR (“ENResearch Product­ DUPONT)(descripcionen 6.8.1.1) Despuesde finalizada la electroforesis, se fotografió el gel y se lo transfirió a un recipiente adecuado. Se incubó en HCl 0,25 H por 15 min a temperatura ambiente pa­ ra favorecer la transferencia de fragmentos grandes por depu­ rinacion. Sólo se realizó esta incubación en el caso de transferencia de ADNgenómico o para fragmentos mayores a 20 Kb. Posteriormente se incubó en NaOH 0,2 N-NaCl 0,6 M durante naturalizar.30 min a temperatura ambiente con agitación suave, para desm A continuacion, se equilibró en fosfato de sodio 25 mm pH: 6,5 por 1 hora con 3 cambios de buffer. El ADNse transfirió según el método de Southern (Southern, 1975) a una membrana Gene ScreenR. La membrana fue previamente humectada en el mismo buffer de equilibro del gel, que también se usó para la transferencia capilar. Después de aproximadamente 16 hs de transferencia, se retiro la membrana, se marcó con tinta china los pocillos de siembra y se eliminó posibles restos de agarosa que pudieran haber quedado adheridos. Todas las manipulaciones de la membranase hicieron evitando el contacto directo con la piel, para no engrasarla. El protocolo seguido corresponde al recomendadopor el fabri­ cante. Por último, se secó entre dos hojas de papel Nhatmann BMMy se horneó a 80°C por 2 hs para fijar el ADNa la fase sólida. Se siguió con el protocolo de hibridación descripto en 6.11.

6.9.1.1.2. Tecnica alcalina con Gene Screen PlusR (Reed, K.C. y Mann, D.A., 1935) Idem a) hasta la despurinación. . Incubación en NaOH 0,4 N-NaCl 0,6 M por 20 min con dos cambios de buffér. Transferencia del mismomodoanterior, pero en el buffer al­ calino de equilibrio y la membranase prehibridizó en H20.

Transf.ác.nucl. a membranas —257 Materiales y Métodos

Finalizada la transferencia, se neutralizd la membrana con 0,5ffer. M Tris pH: 7,0-HaCl 1 M por 30 min con dos cambios de bu­ Se dejó secar la membranaal aire, y según especificaciones del fabricante no es necesario el horneado para este tipo de membrana. Se siguió con el protocolo de hibridación descripto en 6.11.

.9. 1.1.3. Transferencia a Gene Screen PlusR Idemb) hasta la desnaturalización al A continuación se neutralizó el gel Tris-HCl (pH: 7,5) 0,5 M-NaCl 1,5 Mdurante 30 min a temperatura ambiente. Se cortó un trozo de membranade transferencia del tamaño del gel, se lo sumergió en H20deionizada y, posteriormente, se la dejó 15 min en SSC 10X (NaCl 1,5 M-citrato de sodio 0,15 M pH: 7,0). Se utilizo un sistema de transferencia igual al descripto por Haniatis et al (1932). Se dejó 16-24 hs y, luego, se sumergió la membrana en NaOH 0,4 N, durante 1 min. ' Se descartó la solución anterior y se neutralizó con Tris-HCl (pH: 7,5)—SSC 2X. Se dejó secar a temperatura ambiente. Se siguió con el protocolo de hibridación descripto en 6.11.

.9. 1.2.Iztansfsmmúaa decolonias¡lam a.(Grunstein y decum-¡ias Hogness, 1975) Se coloco un papel de filtro Whatmanntipo 541 (marcado ade­ cuadamente) sobre la superficie de la caja de Petri donde ha­ bian crecido los clones (master plate guardada a 4°C). Tener cuidado de que no queden burbujas de aire entre el papel y el agar. Se incubó 15-30 seg a temperatura ambiente, marcándose la ca­ ja de Petri respecto de las marcas de los filtros. b. Ruptura de las bacterias 1 desnaturalisacién del DNA Se tomó los filtros con una pinza y se puso, de a uno por vez, en el recipiente con la solución I (ver mas adelante). Se dejó 5 min. Esta operación limita la difusion del plasmido durante la desnaturalisación y la neutralización.

Transf.ác.nucl. a membranas- 258 Materiales y Métodos

Se pasó el filtro al recipiente que contiene la solución II y se coloco el conjunto sobre un recipiente conn| gua hirviente por5 min a una temperatura mayor que 80°C. Por ultimo, se paso a solución III y se dejo 5 min a tempera­ tura ambiente. Se pasó a solución IV por 5 min. secarEl filtro al aire. se pasó a etanol 95%y se lo mantuvo 1 min. Se dejó Se procedió con el protocolo de hibridación según 6.11. Soluciones: SDS 10% (sólo un papel Nhatmann BMMembebido en ella). II. Solución desnaturalizante: 0,5 MNaOH;1,5 H NaCl. II I Solución neutralizante: 0,5 MTris-Cl (pH: 7,4); 1,5 MNaCl. IV. SSC 2X: 0,03 M citrato de sodio; 0,3 M NaCl pH: 7,0.

.9. 1.3. aRaul: de de{agota(BentonyDa­ a.vis, 1977) de.¡llanas Se partió de una placa de Petri que contenía entre 100-1000 playas de lisis. Se dejó a 4°C por una hora, para endurecer el agar blando. Posteriormente se colocó un filtro de nitrocelulosa sobre la placa, evitando la formacion de burbujas. Los filtros de nitrocelulosa utilizados fueron Schleicher & Schuell BA85 o Hybond C (Amersham), indietintamente. Se dejo humectar completamente, con una incubación de 1 min a temperatura ambiente. Se poeicionó pinchando con una aguja mojada en tinta china, dejando marcas asimétricas en la membranay en el agar. b.kanmmml Usandopinzas, se levantó con cuidado (sin perturbar la pelí­ cula de agar), y se transfirió a un recipiente conteniendo solucion II (se dejó la cara que miraba a la placa para arri­ ba). Se incubó 1 min. ¡rent '" 'Qn Posteriormente, se transfirió a un segundo recipiente conte­ niendo solución III por 5 min. Finalmente se pasó a la solución IV y se dejó 5 min. Se secó el filtro en 2 hojas de papel WhatmannSMM. Se horneó 2 hs a 80°C entre hojas de papel Whatmann BMM. Se procedió con el protocolo de hibridación según 6.11.

Transf.ác.nucl. a membranas —259 Materiales y Métodos

8.9.2. IRAHEEEREHQLADEAEN-(Ificniga ds flgrhhfirn) Finalizada la corrida (descripción en 6.8.1.3), se fotografió el gel y se lo trato según el siguiente protocolo: 1) 15 min en NaOH50 mM(hidrólisis parcial para favorecer transferencia de material de alto peso molecular. Se puede evitar para mensajeros menores de 2000 bases). [‘J ) Se neutralizó durante 30 min en Tris-HCl 0,1 MpH: 7,5 con agitación a temperatura ambiente. 3) Se equilibró con el buffér de transferencia (fosfato de sodio 25 mMpH: 8,5) por 30 min. Por último se transfirió por capilaridad a Gene Screen según el arreglo de la técnica de Southern (Southern, 1975) por 16 hs. Se lavó la membrana, se secó y se puso a hornear a 80°C entre 2 hojas de papel Whatmann BMMpor 2 hs. No solo se fija el ARNa la membrana, sino que se elimina el formaldehído remanente. Se posicionaron las bandas de los ARNribosomales por visua­ lización de la fluorescencia del EtBr unido al irradiar la membrana con luz U.V. Se siguió con el protocolo de hibridación descripto en 6.11.

Transf.ác.nucl. a membranas- 260 Materiales y Métodos

6.10. TRANSFERENCIA Y FIJACION DE PROTEINAS A MEMBRANAS

6 10 1- EJJHZLRQIRAHEEEREHQLA Se utilizó un equipo para electrotrnnsferencia de la firma Bio Rady se siguió el protocolo provisto por el fabricante para el armado. El buffer de transferencia fue Tris-glicina 1X(descripto en 6.8.2.3) - metanol 20%, y la corrida se realizó a 4°C durante toda la noche (216 hs) a intensidad de corriente constante (60-80 mA). La membrana utilizada fue Hybond C extra (Amersham) y las instrucciones para su manipulación fueron las sugeridas por el proveedor. Finalizada la corrida, se desmontóla rejilla y se posicionó los pocillos de siembra. Se siguió con el protocolo de revelado inmunológico descripto en 6.12. Conviene utilizar marcadores de pesos moleculares pre-teñidos para corroborar la eficiencia de la transferencia, como así también evaluar la corrida del gel. Es importante el correcto posicionamiento de la rejilla, de tal manera que la migración proteica tenga la polaridad co­ rrecta.

5.10.2. 'LRAHBEEBENCIADEmsm DE mas. 6.10.2.1. ¡Lam de la minera“ Técnica desarrollada por Hesri, E. y Levitus, G. (comu­ nicación personal) que permite transferir, sin la necesidad de agregado de IPTG, a membranasde nitrocelulosa el producto de fu­ sión de clones en thll y revelarlo por tecnicas inmunológicas. Se agregó por la técnica de agar blando, 600 pl de células Y1090competentes (descriptas en 6.4) a una placa de LB-Mg­ Ampicilina. Se dejo secar por 15 min y se incubó 30 min a 37°C para per­ mitir el desarrollo bacteriano. Se dejó secar por 15 min y se sembró entre 1-3 pl de la sus­ pension de fagos amplificada (descripcion en 6.4) a analizar. Se incubó entre 30-40 min a 42°C para permitir el desarrollo de los fagos. (A esta altura no se llega a distinguir playas de lisis francas). Se colocó un trozo de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell) o HybondC (Amersham), indistintamente, cubriendo la zona en la que se depositó los fagos, y se dejó inoubando por 2 hs a 37°Cpara permitir el crecimiento, expresión y transferencia conjunta.

Transf. proteínas —261 Materiales y Métodos

Se levantó el filtro y se lavo en TBS1X, y se siguió con el protocolo de revelado inmunológico descripto en 6.12.

6.10.2.2. Iranfiferencia di ¿ancianas Se partió de una placa de Petri (150 mm)que contenía 4x104 ufp, según protocolo descripto en 6.4, crecida a 42°C (2­ 4 hs) hasta apenas detectar playas de lisis incipientes. Se colocó un filtro de nitrocelulosa tratado con IPTG, como se describe a continuación, y se dejó durante 3 h a 37°C. Si fuera necesario poner un segundo filtro, se lo dejaría incu­ bando durante toda la noche a 4°C con el mismopretratamiento para el filtro. Se posicionó apropiadamente el filtro y se levantó cuidadosa­ mente, y se lavo en TBS 1X. Se siguió con el protocolo de re­ velado inmunológico descripto en 6.12. Pretratamiento del filtro: Se humecta en IPTG 10 mM 2) Se retira y se seca entre dos hojas de papel Whatmann SMM con el objeto de eliminar el exceso de solución 3) Se repiten los pasos 1) y 2).

Transf. proteínas —262 Materiales y Métodos

.11. HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS INMOVILIZADOS a. Hjhrjdaqjóu La solución de hibridación empleada en todos los casos conte­ nía: SSC (descripción en 6.9.1.2) 5X Dernhardt 5X SDS 1% ADNdesnaturalizado de timo de ternero 100 ug/ml poly A sintético 1 ug/ml formamida 50% La aclución de Denhardt 5X contiene: Ficoll 1 mg/ml, polivi­ nilpirrolidona 1 mg/ml, albúmina bovina (fracción V) 1 mg/m]. Se usó 50 ul de solución por cm? de membrana y se dejó prehi­ bridando a 42°C por 30 min. . Las hibridaciones y prehibridaciones se llevaron a cabo en bolsas de polietileno termoeelladae, con agitación moderada en baños de agua. Se colocó como máximo dos filtros del mismo tipo de membranacon la superficie conteniendo el material nucleico inmovilizado hacia el exterior. Posteriormente a la prehibridación, se inyectó con jeringa de 1 ml la sonda marcada (previamente hervida 5 min) y se rese­ lló la bolsa. Se empleó aproximadamente entre 5x105-103 cpm por ml. La temperatura de hibridación fue de 34°C para condiciones de baja homologia y 42°C para alta homologia. El tiempo de hibridación fue entre 12-18 hs. Finaliaada la hibridación, se eliminó la sonda. b. Luayarlrm Se sacó la membranade la bolsa y se la eumergió en la solu­ ción de lavado a temperatura ambiente. Se hicieron 2 lavados con agitación de 30 min cada uno a di­ ferentes temperaturas y concentración de SSCpara eliminar la unión inespecífica de la sonda. Para baja homologia se usó 3x SSC-1% SDS 42°C, y para alta homología 0,2xSSC-1%SDS 65-68°C, mientras no se aclare otra condición. Se sacaron los filtros al aire y se fijaron con cinta adhesi­ va a una superficie rígida (cartón o cartulina). Se cubrieron con Saran-WTap. En los casos en que se necesitó rehibridar la membrana, se eliminó previamente la sonda anterior por incubación de la membrana 20 min a 95-100°C en H20 tanto para Southern como para Northern blote.

Hibrid.ác.nucleicos - 263 Materiales y Métodos

O. x1333115512 La exposición se hizo con película CURIXRpl (Agfa-Gevaert) o HyperfilmTN—MP (Amereham), indistintamente. Se empleópantalla intensificadora de tungeteno-calcio-fósfo­ ro (Dupont Cronex Lighting Plus), si la marca era 32P. En e5­ te caso se expuso a -70°C. Cuando la marca empleada era [355] o para geles de secuencia­ ción con [32P], la exposición fue a temperatura ambiente y sin pantalla intensificadora. Después de la exposición, se siguió el siguiente protocolo: 1. Se sumergió en revelador Agfa-Gevaert G150hasta obtener la relación señal/ruido de fondo apropiada. 2. Se pasó a una solución detenedora (ácido acético 2,5%). 3. Se dejó en fijador Agfa-Gevaert G334 por 5 min. 4 Se lavó con abundante agua y se dejó secar.

Hibrid.ác.nucleicos - 264 Materiales y Métodos

6. 12. REVELADO INMUNOLOGICO DE PROTEINAS INMOVILIZADAS Todos los procedimientos se realizaron a temperatura ambiente y con agitación salvo cuando se indiquen otras condicio­ ÏJÜB . Se dejó por 30 min el filtro en la solución TES-MG(ver mas abajo) con el objeto de bloquear la unión inespecifica de proteinas a la membrana. Se agregó el primer anticuerpo (dil 1/200) en una solución TES-HGTweeny se dejo 2 hs. Si el procesamiento debia conti­ nuar al otro dia, se dejó a 4”C posteriormente. Se lavó 4x10 min en TBS-Tween. Se incubó 15 min en TBS-MG-Tweeny se agregó el segundo Ab (anti primer anticuerpo) biotinilado, y se dejó 60 min. Se lavó 4x10 min en TBS-Tween. Incubación con VECTASTAIN(Vector Lab. Inc.) por 40 min. El reactivo se prepara en el momentopor agregado de 2 gotas de cada uno de los reactivos a 10 ml de TBS. Se deja por lo menos 30 min antes de usar. Se lavó 3x2 min en TBS 1X. Se procedió al revelado agregando la solución (preparada en el momento) a la membrana. - La reacción se detiene con TBS-metanol o con H20. Solución de revelado: 6 mg de 4 cloro-B-naftol (Merck) se disuelven en 2 ml de al­ cohol metilico frio. Eeta solución ee vuelca sobre 10 ml de TBS 1X que contiene 0,1 M de imidazol. Se agrega 10 ul de H202 100 vol y se agita hasta homogeneizar. TES-10X 0,5 M Tris.HCl pH: 8 1,5 M NaCl TES-MG 2% glicina en TBS 1X 3% leche en polvo descremada Tween 20 concentracion final 0,05%

Revelado inmunológico - 265 Materiales y Métodos

6.13. SECUENCIACION DE ADN

6.13.1. MEIQDQDE MAXAMXGILBERI (Maxam y Gilbert, 1977) Los fragmentos de ADNa secuenciar fueron obtenidos por corte con endonucleasas de restricción, marcado por fill in (ver 6. 6.1.) y recortados con una segunda enzima de restricción. Estos fragmentos fueron separados por electroforesis en gel de poliacrilamida, de porcentaje adecuado, y eluidos del gel de la manera descripta en 6.8.2.2. A1 fragmento de ADNcontenido en la solución de elucion se le agregó 10 ng de tARNcarrier y 900 ul de etanol. Se dejó 20 min a -70°C y se centrifugó a 12000xg, 10 min. El precipitado de ADNmarcado se resuspendió en 30 pl de H20. Se realizaron en forma sucesiva las reacciones descriptas en la Tabla IV.

6.13.2‘ HEIQDQ DE EAHQEE El principio del método de Sanger (1977) se basa en la terminación de la reacción de síntesis enzimática de ADNpor in­ corporación de nucleótidcs análogos. La modificación de la ADNpolimerasa del fago T? por Tabor y Richardson (1987)(nombre comercial Sequenase(3) de la firma USB), permitió contar con una enzima con particulares ca­ racterísticas (alta actividad procesiva, baja actividad exonu­ cleolitica 3'—5', incorporación eficiente de análogos, etc.), muy útiles en la reacción de secuenciación. Los reactivos utilizados Pon los provistos comercial­ mente por la firma USBCorp., bajo el nombre de SEQUENASE. Se siguió el protocolo descripto por el fabricante, que se resume a continuación: ' a. "Annealing" Se agregó a la mezcla de reacción Iniciador 1 ul buffer Sequenase 2 ul ADNsimple cadena (1-2 ug) H20 csp 10 pl Se calentó 2 min a 65°C y se dejó enfriar lentamente hasta 35°C.

Secuenciación de ADN- 266 Materiales y Métodos

Tabla IV. MÉLQQQ de aeonenpiagiún de ADN,de Haxam & Gilbert

DC MG G hCyC

DHSbuffer 200w! H¡Ü(sólo a T+C) 20v1 NaCl 5H(sólo a C) 20pl ¿DHcarrier ¿ong ADNcarrier 40pg ADNcarrier 40ue ADNcarrier ávug ADN 31?! Sul ADN 31Pi 5p! ADN 31?! Ml ADN 31P3 5ul

Soluc A>C 20pl HCOOH901 25pl DHSD(1/10) y... 'C .­ Hidrazina 20vl 5 nin a 85°C 5 Iin a 17’0 15 s a 20'C 3 nin a 17°C NaAc [H 100pl TáC STOP 20091 DHS STOP 50v! TJC STÚP JODul ARNcarrier bflpg ARNcarrier 50pg ARNcarrier 509g ARNcarrier 50ug Etanol 150pl Etanol 750w! Etanol 150vl Etanol 150pl

«e cejó 10 min a —70"C 10) U CD centrifugó a 12000xg, 5 min *Se resuspendió en 300 pl de NaAcO0,3 M pH: 5,2 frío *Se añadieron 750 pl de etanol “Se dejó a —70°C, 15 min *Se centrifugó 10 min. Eliminar bien el eobrenadante Se resuspendió en 25 pl de Piperidina 1 M Se calentó a 90°C, 30 min (15 min, centrifugaoión,15 min) Se agregaron 25 pl de NaAcO0,6 M (pH: 5,2 Se añadieron 125 ul de etanol Se deió a -70°C, 20-30 min y se eentrifugó 15 min Se repite 1a precipitación (pasos marcadoscon asterisco) Resuepensión en 15 pl de "colorantes en formamida" Se calentó a 100°C, 5 min y se sembró en un gel de poliacri­ lamida con 8 Murea (ver 6.8.2.1) a. Se usaron en general, entre 100000 y 300000 cpm, por reacción. b. DNS:Dimetilsulfato. La dilución es-en DMSbuffer. o. Colorantes en formamida = formamida deionizada 80% (V/V); TBE 1X; azul de bromofenol 0,1%; xilene-cianol 0,1% Solución A>C DMS buffer DMS STOP C+T STOP 1,2N NaOH Cacodilato de Na NaAcO 1,5 M NaAeÜ 0,3 M 1 mMEDTA (pH: 8,0)“ 50 mM (pH: 7,0) (pH: 5,2) EDTA (pH: 8,0) 1 mM B-MSH 1,0 M EDTA 0,1 M M3012 10 mM 010,7 g/50 m1 pH: 8,4 ajustar con ácido cacodílico 1 M(6,9 g/SO m1)

Secuenciación de ADN- 267 Materiales y Métodos b. filmacion Se agregó a la mezcla de iniciador-templado (10 pl) los si­ guientes reactivos: DTT 0,1 M 1 ul mezcla de marcado 2 pl* a-[3SSJdATP 0,5 ul Sequenaee Z pl :k (se utilizó dilución en H20 1/10.o 1/5, según rango que se queria leer). La enzima Sequenasa se diluyó 1/8 en TE frio y se utilizó en el momento.En algunas situaciones se reemplazó el dideoxitio­ nucleótidolo. por su análogo con 32P siguiendo el mismo protoco­ Se mezcló y se dejó 5-10 min a temperatura ambiente.

Se tomaron alicuotas de 3,5 pl de las mezclas de marcado y se agregó sobre 2,5 ul cada uno de las mezclas que contenían los diferentes dideoxinucleótidos previamente entibiados a 37°C (sólo 1 min). Se continuó la incubación a 37°C por 5 min. Se agregó 4 ul de la solución que contenía el colorante en d.«islamformamida. Se desnaturalizó por calentamiento durante 2 min a 75-80°C y se sembró en un gel de poliacrilamida desnaturalizante (urea 8 M)(deecripción en 6.8.2.1).

Secuenciación de ADN—268 Materiales y Métodos

6.14. VECTORES EMPLEADOS

6.14.1 VEQTQRESPLASMIM) 'El plásmido Bluescript desarrollado por Stratagene Cloning System fue el utilizado en todas las construcciones nece­ sarias para subclonados. Se comporta como un "fagósmido", le que significa su capacidad de mantenerse como plásmido en una cepa huésped de Es­ cherichia coli F+ y capacidad de encapsidar una hebra de ADN en fagos filamentosos en presencia de fagos helper, ya que contiene la región intergénica del fago F1. Esta región codifica todas las funciones gls requeridas para empaquetar y replicar el fago. Los fagos helpers utilizados (R408 y VOS-MIS),son de­ rivados de M13. De las 4 combinaciones comerciales del vector se usó las positivas (M13+)en donde la hebra que se excreta es la codi­ ficante del gen de B-galactosidasa. La orientación del polylinker lleva la siguiente convención +KS, para la que el sitio para la enzima KpnI está más cerca del promotor de lacZ, y el sitio de restricción para la enzima SalI más alejado. La orientación in­ versa es +SK. ' Este vector contiene, además, promotores para la ARNpo­ limerasa del fago T4 y T7 en orientaciones inversas, lo que per­ mite la transcripción in vitro del inserto. Tambienpuede utili­ zarse comovector de expresión de proteina de fusión con B-galac­ tosidasa en condiciones apropiadas. La secuencia del fago helper no contiene homologia con el iniciador (primer) universal de M13,permitiendo la secuencia­ ción de los fagos recombinantes por el método de Sanger, descrip­ to en 6.13.2. La purificación de ADNscse describió en 6.1.2.3. Los plásmidos Bluescript no se replican comoel fago M13reduciendo la posibilidad de pérdida de fragmentos de ADNdel inserto. El empaquetado en estos vectores recombinantes es más eficiente que para M13salvaje,debido a su menor tamaño (3,5 Kb), dos ventajas que, entre otras, hacen a estos plásmidos eficientes vectores de clonado. El mapay la secuencia del polylinker se muestran en la Fig.5.

Vectores —269 "-2.6..:1“...1

7|"un:

( ------.ITACAU€708¡out­

-'.«u?!Pto-ur ¡Wycfitcufllá' .;“.73¡It-nt."

''5'IWÏSMÏTEZCMÏTIS’

Sac!

Anal :Iull¡I'll

¡cell

KSPolylinker SKPolylinker hu! FIG.5.MapadelVectorBluescript. ExtraídodelcatálogodelproveedorStratageneTM

hd

Rel hl!ml lllnefll

llpnl-r

Cial

ora-nm“:­ u"zu-r-,\"¡pr

Int-uun!un!uu

(-I'CtmmAJ-HHS'

[coll2:9'7llI'M!“

¡evilv:;:

un...

teolv

Pvull'¡2 Pvnll"7: l'nni5"“ fiLh-756 HULI'lI'LHCLONlNCSITE T]PROHOTER ¿16 T7PROHOTER Ch]HallH l'Il'l-l'

Aflll¡IS!

Q’ÏCMMT’üml'-’ iall Noel12“ l!'fl-I H:-c:! ¡{El

LAGCTfCMGGTIKCJ‘->

ha”hy!

mi

Sulhullot:o“Sul¡quitan-INH 'r-l:ullIncl lSsnll1

Ml3+

BLUESCRIPT

Y?Pn-t

SsplZflhs

H¡ro-MH")-I 17Pra-n:-''l

Innl25‘"

uude'fl-’1"¡ru-r Seal2s2| IUdlPrl-r

PvulZlnlz Pam?-IS'MTmKÏA'KJ‘-D a-)1-i Csul1‘30

ClrlOl2|25 Materiales y Métodos 6.14.2 MENEAME DELEAQQX Se utilizó el vector thll para la construcción de la genoteca de ADNcopia descripta en 6.3. Este vector está espe­ cialmente diseñado para expresar los insertos clonados como pro­ teína de fusión con B-galactosidasa, lo que permite no sólo la búsqueda de clones de interés utilizando una sonda de ácido nu­ cleico, sino la búsquedacon anticuerpos especificos. La descripción del genomadel bacteriófago se muestra en la Fig.6. La genoteca de flgungfipgza_granfia (cepa 74-1A) que con­ tenia fragmentos de ADN cromoeómicos fue cedida gentilmente por el Dr. Yanofsky. El vector utilizado fue un derivado del fago XL47.1 (Loenen y Brammar, 1980), denominado XJl (Mullins et al, 1984). Se creó por sustitución de los fragmentos de 2,0 y 2,3 Kpb EcoRI-BamHIpor el polylinker sintético de 95 pb de nVX (Seed, 1983). La secuencia de sitios de restricción del polylinker de nVXes: EcoRI-ClaI-HindIII-Xbal-BglI1-P6t1-BamHI-ECORI. El sitio clonado fue BamHI, y el ADNcromosómico fue digerido parcialmente con la enzima Sau3Aque deja extremos com­ patibles con los que contenía el vector digerido. El genoma del bacteriófago XL47.1 se muestra en la Fig.7. Materiales y Métodos

1p go y) ¿o q0kb

M13 FI all ¡is bdc R: NulAl llWB l CDEFIZUVG ll llllllll H LKI J_l_l J l I h! ll nogam Lllll lllNrelclclOP ll ll llllll O SR LI L aágmxosom LL LLLLLLÉL I .111; (2‘31 gUma]; LL L ¿Loc1: gE kkm3EE><53LE mg: tulg 533XE m g i s m5 8 g E :m.58

Plac P I<-IacZ— o o CIB o7 |nin5 Sam100 .' I EcoRI

Genotipo llacfi erXBO 01857 EFIX4° ninñ szíküo SamlOO Capacidad : 0-4.Bkb Sitios de clonado: EboRl 3'....QAQ QII BAEggg 5' gln phe glu ala Promotor : Plac Recon. de recomb.: Lac- fenotipo en huésped LacZ­ Fig.8. Mapadel vector thll extraido del manualde laboratorio "Cloning Vectors". Pouwels et al. (1985).

1p ao io 10 q0kb

Nu3 F ll f M al! IIS bfl cll cro R1 "¿ALI?BLc l H lILlKl’lJ l ¡"ll si?m JNI(ri:c r__lolL L L LL ¿L¿L¿LE',‘_ ¿L‘LLL E LL L ¿i I ccuczIUoDrroI“Q °Ec'°.c°SE bars; °t2>

bol chiA r - elogamN ¡""434 l. \ L u x gucrlM-¿g .:.u.u.__&nm:>;_v_n_4 C:“¿L I L* LI LL n: “1m335 8 m g lSé Genotipo XsthX10 chiAlBl (srlll-Z) erXBO imm434cI­ erX40 nin5 shndIIIXSO szíkfio Capacidad 5.2-14.7kb (BamHI); 9.4-18.9kb (EboRI); 7.8 —17.3kb(HindIII) Sitio de clonado (BamHI), (EcoRI)(HindIII), (SalI) "Prop. de recomb. cI-, Gam-, Int-, Red­ Fig. 7. Mapadel vector XL47.1 extraido de la misma fuente.

Vectores - 271 6.15. CEPAS UTILIZADAS 6.15.1. QEEAEBAQIEBLAHASDEEsghcxighia_ggli_ñlz mQ1Qfi]:F-, araD139, A (ara, leu) 7696,4A1acY74, galU-, galK­ , hsr-, h6m+, StrA (Baeck et al, 1983). 3392: hst+, hde+, ga1-, met-, supE (Wood, 1966). Nflfifiz: recA+ (supE, thi, ( A lac-proAB), hsdñ, {F', proAB, lach, lacZAMlñ} (Mead et a1, 198.5). X1990 (ATCCÜBTIQT):A 1acU169 proA+ A.(lon araD) 139, StrA, SupF [trp022tTn10](pHCS)(Young y Davis, 1983). LEQQR:F-, hst514 (rx, mx), eupE44, supFüB, lach o ¿A (lachY)6, galKZ, galTZZ, metBl, trpBSfi, X- (Murray et al, 1977).

6.15.2. QEBAEDENQJAIQEEQI‘BW Tipo de apa­ reamiento FGSCÜ Alelo St.Lawrenoe 74 A (salvaje) cyh-Z A 4071 KH13 spa-1 (UDC-) A 4268 TP138 crisp-l a 488 B123 M246 (gaa-, arom9-) A

Cepás - 272 Materiales y Métodos

6.16. MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO Todos los medios se esterilizaron por autoclavado 20 mln a 1 atm, salvo expresa indicación.

6.16.1. flEDlQ HlfllüQ (HM) Mezclar en el momentolas siguientes soluciones esteri­ lizadas separadamente: Agar 3% (2X) 100 ml sales M9 10X 20 ml Mg804 1 M 400 pl CaClz 1 M 20 pl Vitamina BI (tiamina) 1% 80 pl glucosa 20% e"I ml La vitamina se preparó en H20estéril en un recipiente estéril. Conviene agregar el CaClz en último término para evitar la precipitación de sales. ' ' La formulación de sales M9 10Xes la siguiente: NazHPO4 8 g KH2P04 3 g NaCl 0,5 g NH4C1 1 g H20 csp 1 1 Ajustar pH: 7,4 con NaOH

6.16.2. MEDLQLQRLA;BEKIAHL (LB) Bactotriptona (DIFCO) 0 g Extracto de levadura (DIFCO) 5 g NaCl 0 g H20 csp 1 l Se llevó a pH: 7,4 con NaOH a) Mfifligsólido: se agregó 15 g/l de agar (DIFCO). b) Media LB agargfia hlandgr Se adicionó 7 g/l de agarosa (BRL). c) LB;Hg: se suplemento con MgSO4.7 H20 1 g/l. d) LH;Ampigilina: Se agregó a partir de una solución madre 100 mg/ml (IOUOX) conservada a -20°C. Para evitar la descomposicióndel antibiótico, el agregado en el caso de medio sólido se realizó posteriormente a su este­ rilización enfriado entre 55-60°C. e) LB;maltgfia: Se usó 'una concentración final de 0,2% a partir de una solución 10% (P/V)(50X). Se preparó disolviendo el azúcar en recipiente estéril con Hzüestéril.

Medios y cond. de cultivo —273 Materiales y Métodos

6.16.3. üEDlQ MlfllüQ HLÏBAIQ MQDIEIQADQ(HHH)

KNatartrato 5 g NaHOs 3 g KH2P04 3 g Sacaroea 10 g glicerol 10 ml solución de oligoelementos 1 ml solución de bíotina 0,1 mi (5% en 50% EtoH) MgSO4.7H20 0,5 g CaClz UI]- NaCl 0,1 g Hzü csp J l agar 2G g El pH del MMNes de 5,6. La solución de oligoelementos es la misma usada en el medio de Vogel (ver 6.16.4). Las condiciones de conidiación en las que se utiliza este medio son: - Se inoculó con suspensión de conidias 200 ml de MMNen un Er­ lenmeyer de 2 . Se incubó a 34°C toda la noche sin agitación. Se dejó 24 hs a temperatura ambiente. Se dejó crecer en Erlenmeyer invertido con aireación humidi­ ficada por una semana en habitación bien iluminada. estéril.Se agregó HZOestéril y se resuspendió el micelio en forma Se filtró por lana de vidrio para eliminar el micelio en con­ diciones de esterilidad. La suspensión de conidias se guardó congelada a -20°C. Este medio, desarrollado por-Horowitz (1947), contiene nitrato comoúnica fuente de nitrógeno. Si bien el crecimiento es menor que en el medio de Vogel, la inducción de conidiación es mayor. La modificación fue desarrollada por Wainwright, S.D. (1959).

Medios y cond. de cultivo —274 Materiales y Métodos

6.16.4. MEDLQH/Z DE YÜQEL La solución salina madre 100Xcontiene: Na citrato.5HzO 150 g KH2P04 (anhidro) 250 g NH4N03 100 g MgSO4.7H20 10 g CaClz.2H20 5 g solución biotina 5 ml (5% en EtoH50%) solución de microelementos 5 m1 H20 csp 1 l La solución de oligoelementos contiene: ácido cítrico H20 5 g ZnSO4.H20 5 g (HH4)Fe804.6H20 1 g CuSO4.5H20 0,25 g MnSOq.H20 0,05 g H3B03 (anhidro) 0,15 g NazMoO4.2H20 0,05 g H20 csp 100 ml Conviene disolver el CaClz en H20 y agregar por goteo lentamente para evitar precipitación de sales. Es aconsejable di­ solver las sales en el orden que se encuentran. La solución madre y la de oligoelementos se mantienen en frasco color caramelo 'con el agregado de unos mililitros de cloroformo para evitar creci­ miento bacteriano. La solución de biotina‘se guardó congelada a -70°C. Se utilizó este medio (Vogel,-1956), para el crecimien­ to y mantenimiento de las cepas de Nsnrgsnora_nnafisn. Las condiciones básicas de cultivo fueron 28-30°C con 0,5% o 2%sacarosa, según el caso. La aereación fue provista por agitación para los cultivos de 1 l de volumen máximo, y por bur­ bujeo, alternativamente. El inóculo utilizado fue de macroconidias en una con­ centración aproximada de 105/ml. En medios normales, el crecimiento de Nenrgsngra es di­ fuso y no restringido. La reduCción de la fuente de carbono (0,4% sacarosa) y el agregado de L-sorbosa (máximo 1%) al medio, induce el crecimiento colonial con escasa conidiación (Tatum et al, 1949). El aislamiento de cepas a partir de una suspensión de conidias en dilución apropiada puede realizarse en medio N de Vo­ gel sólido con 0,4% sacarosa-0,8% L-sorbosa. Este procedimiento

Medios y cond. de cultivo —275 Materiales y Métodos es necesario para tener cepas cr(cr15p) sin contaminación con re­ vertantes salvajes que suelen aparecer por sucesivos repiques (David y de Serres, 197D). ' El fenotipo de colonias de cepas crisp se presenta como un "botón" compacto sin micelio aéreo. La mutante auxótrofa para aminoácidos aromáticos se creció con un suplemento de L-Phe, L-Tyr, L-Trp en una concentra­ ción final de 80 pg/ml para cada uno; ácido p-amino benzoico 2 pg/ml e inositol 0,2 mg/ml (Lambowitz, A.M., 1983). La mutante cyh-2 se la mantuvo con una presión de se­ lección de_10 pH cicloheximida.

Medios y cond. de cultivo —276 Materiales y Métodos

. 16. 2.1.1“¿3)

Nomenclatura üedio Vogel 44/2 Crechiento 30'C(hs) Tratamiento Ce“

TI 0,51 sacarosa 30 hs 48 hs ciclohexinida Zu! 74 TnTu ' 43hal44hs (6 días) ----- '

conid G 21 sacarosa 2,5 hs 10" conid/litro

PUR 0,51 sacarosa 43 hs 10 hs purolicina.2HCl(hidrato) lag/al (1.3|H) P putrcscina.ZHCl 4,6ng/a1 (29aH) Et ' dL-etionina 0.4|g/ll SA 118 hs ----­

' Cdh 21 sacarosa 36 hs 3 hs CdClz 20pg/Il ' CHX ' ' ' ciclohcxillda 250pg/Il4830uñ) ‘ 5pm cspcraldina.3fl01 0,3ag/al ' Put. putrescina.2HCl lag/Il(6|H) ' CA ' canavanina.504 200pg/Il FA ' ' p-F-tenilalanina 200ug/ll CONT ' 39 hs ----­

C 2! sacarosa 25 hs ----­ HS ' 24 hs l h 47' ASO ' 24 hs HaAst 2509!

Medios y cond. de cultivo —277 Materiales y Métodos

Nosenclatura Hedlo Vogel N/Z Creclliento 30'C(hs) Tratamiento Cepa

C4 0,5! sacarosa 12 hs cloranfenicol Zag/nl en 3.31 BtoB

C5 12 hs 3,31 EtoH

CB 24 hs ciclohexinlda 2p! (560pg/l)

69 66 crb-l

010 ' 66 ' +2pHciclohexinida

Cll 0,5! sacarosa 60 6 hs ciclohexilida 2p!

I 89 cr-l

II 66 21 hs cAüP 125ul

III ciclohexisida 2p!

IV ciclohexilidaacAHP 125“!

v pasaje buffet fosf.‘

VI_ pasaje buffer íosf. + cAHP 1259!

t buffer fosfato 100 ll pH: 6,0

Medios y cond. de cultivo - 278 Materiales y Métodos

Noaenclatura Hedio Vogel "/2 Creciliento 30’C{hs) Trataliento Cepa

125 0.5% sac.supleaent. 60 12 hs sin a.a.aroaatlcos ¡246 con a.a.aroaát.

245 24 hs '

12 72 pasaje al IÍBIO ledio 24 B4 (nuevo)

SPE- 21 sacarosa+espera.llh 24 20 ha sin esperlidina spe-l

SPE+ ll pasaje al lisao ledlo (nuevo)

spe-1- 60 spa-l

74 DFHO/SPE 36 24 hs DFHO 2.5 ¡H 74

14 SPE 60

14 DFHO 21 sacarosa 36 24 hs DEBO2,5 al

Medios y cond. de cultivo —279 Materiales y Métodos

6.17. HEFERENClAS

Aviv, H. y Leder, P. (1972) FToc. Nátl. Acad. Sci. USA69, 1408. Baeck, E., Feil, G. y Strohmaier, V. (1983) EWBÜJ. 2, 555. Benton, W.D. y Davis, R.W. (1977) Science 196, 180. Berk, A.J. y Sharp, P.A. (1978) PToc. Nati. Acad. Sci. USA 75, 1274. ' Birnboim, H.C. y Doly, J. (1979) Nucl. Acids Res. 7, 1513. Blin, N. y Stafford, B.w. (1976) Nucl. Acids Res. 3, 2303. David, R.H. y de Serres, F.J. (1970) Méth. Ehzymol. 17,79. Davis, L.G., Dioner, M.D. y Battery, J.F. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Section 12-1, Elsevier Science Publishing 00., Inc. Feinberg, A. y Vogelstein, B. (1983) Mol. Biochem. 132, 6 (Adden­ dum 137, 266 (1984). Grunstein, M. y Hogness, D. (1975) füvc. Natl. Acad. Sci. USA72, 396. Helling, R.B., Goodman, H.M. y Boyer, H.W. (1974) J. Viral. 14, 1235. Horowitz, N.H. (1947) J. Biol. Chem. 17, 255. Laemmli, U.K. (1970) Nature 227, 680. Lambowitz, A.M. (1983) füoc. Natl. Acad. Sci. USA80, 1058. Lehrach, H., Diamond, D.,-Wozney, J.M. y Boedker, H. (1977) BIOÏ Chemistry 16, 4743. Loenen, N.A. y Brammar, W.J. (1980) Gene 10, 249. Lowry, O.H , Rosebrough, N.J., Farr, A.L. y Randall, R.J. (1951) J. Biol. Chem. 193, 267. Mandel, M. y Higa, A. (1970) J. Mol. Biol. 53, 154.

Referencias - 280 Materiales y Métodos

Maniatie, T., Fritech, E.F. y Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,New York, U.S.A. Maniatie, T., Hardison, R.C., Lacy, E., Lauer, J., O'Connell, C., Quon, D., Sim, D.K. y Efstradiatis, A. (1978) Cell 15, 687. Maxam, A. y Gilbert, W. (1977) Proa. Nati. Aead. Sci. USA74,560. Mead, D.A., Skorupa, E.S. y Kemper, B. (1985) Núcl. Acid. Res. 13, 1103. Mullins, J.I., Brady, D.S., Binari Jr., R.C. y Colter, S.M.(1984) Nature 308, 858. Murray, N.E., Brammer, W.J. y Murray, K. (1977) Mol. Gen. Genet. '150, 53. Parnee, J.R., Velan, E., Feleenfeld, L., Ramanathan,L., Ferrini, U., Apella, E. y Dieman, J.G. (1931) FToe. Nati. Acad. Sci. USA 78, 2253. Pelham, H.R.B. y Jackson, R.J. (1976) Eur. J. Biochem. 67, 247, Reed, K.C., y Mann, D.A. (1985) Nucleic Acids Res. 3, 7207 Reinert, W.R., Patel, V.B. y Giles, N.M. (1981) Mol. Gel]. Biol. 1, 829. Sanger, F., Miklen, S. y Coulson, A. (1977) PToe. Natl. Acad.Scí. USA 74, 5463. Schneider, W.C. (1957) Methods in Ehzymology 3, 680. Seed, B. (1983) Nucleie Aeids Res. 11, 2427. Sharp, P.A., Sudgen, B. y Sambrook, J. (1973) Biochemistry 12, 3055. Southern, E. (1975) J. Nel. Biol. 98, 503. Tabor, S. y Richardson, C. (1987) FToc. Natl. Head. Sci. USA 84, 4767. Tatum, E.L., Barrante, R.W. y Cutter, Jr., V.M. (1949)- Science 109, 509. Vogel, H.J. (1956) Microb. Genet. Bull. 13, 42.

Referencias —281 Materiales y Métodos

Wainwright, S.D. (1959) Can.J. Biochem. IWywiol. 37, 1417. Wood, W.B. (1966) J. Mbl..Biol. 16, 118. Yamamoto, K.R., Alberta, B.M., Benzinger, R., Lawhorne, L. y Treiber, G. (1970) Virology 40, 734. Young, R.A. y Davis, R.W. (1983) Science 222, 773. Cakazana, E.J., Paeieka, K.B. y Magzoub, J.A. (1988) Mblec. cell. Biol. 8(6), 2267. Huynh, T.V., Young, R.A., Davis, R.W. (1985) DNA cloning. A practical approach. D.M. Glover ed. (IRL Press Oxford. Washing­ ton), vol.I, cap. 2. Maxam, A.M; y Gilbert, W. (1980) Methods in Enzymology 65 (part 3.

Referencias - 282

Bibliografía

Achstetter, T., Ehmann, G., Osaki, A. y Wolf, D.H. (1984a) Proteolysis in eukaryotic cells: Proteinase yscE, a new yeast peptidase. J. Biol. Chem. 259, 13344. Achstetter, T., Emter, 0., Ehmann, C. y Wolf, D.H. (1934b) Proteolysis in eukaryotic Cells: Identification of multiple proteolytic enzymes in yeast. J. Biol. Chem. 259, 13334. Addouette-Panvier, A. y Davies, J.E. (1984) Mol. Gen. Genet. 194, 310. Agell, N. y Mezquita, C. (1988) Cellular content of ubiquitin and formation of ubiquitin conjugates during chicken spermatogenesis. Biochem. J. 250, 883. Ahlberg, J., Berkenstam, A., Henell, F. y Glaumann, H. (1985) Degradation of short and long-lived proteins in isolated rat liver lysosomes: Effects of pH, temperature, and proteolytic inhibitors. J. Biol. Chem.260, 5847. Aisemberg, G.O., Grotewold, E., Taccioli, G.E., y Judewicz, N.D. (1989) A major transcript in the response of fl¿_gzafian to protein synthesis inhibition by cycloheximide. EXP. Mycol. 13, 121. Aisemberg, G.0 , Taccioli, G.E.,Grotewold, E., y Judewicz, N.D. (1937) Differential gene expression promoted by cycloheximide in fl¿_grafiaa. Exp. MTCOJ.11, 122. Alberts, A.w., Goldman, P. y Vagelos, P.R. (1963) The condensation reaction of fatty acid synthesis. J. Biol. Chem. 238, 557. Albright, 8.0., Wiseman, J.M., Lange, R.A. y Garrard, W.T. (1980) Subunit structures of different electrophoretic forms of nucleosomes. J. Biol. Chem. 255, 3673. Allfrey, V.G. (1977) In: Chromatin and chromosomestructure (Li, H.S. and Eekhardt, R.A., Eds.), pp. 187-191, Academic Press, New York. Amenta, J. y Brocher, S. (1981) Mechanisms of protein turnover in cultured cells. Life Sci. 28, 1195. Amin, J., Mestril, R., Schiller, P., Dreano, M. y Voellmy, R. (1987) Organization of the Drosophila melanogaster hsp70 heat shock regulation unit. No}. Cell. Biol. 7, 1055.

- 284 ­ Bibliografia

Ananthan, J., Goldberg, A.L. y Voellmy, R. (1986) Abnormal proteins serve as eukaryotic stress signals and trigger the activation of heat shock genes. Science 232, 522. Anderson, H.N., Ballal, N.R., Goldknopf, I.L. y Busch, H. (1981a) Protein A24lyase activity in nucleoli of thioacetamide-treated rat liver reduces histone 2A and ubiquitin from conjugated protein A24. Biochemistry 20, 1100. Anderson, H.N., Goldknopf, Z.L. y Busch, H. (1981b) Protein A24 lyase is an isopeptidase. FEBSLett. 132, 210. Arends, H. y Sebald, W. (1984) Nucleotide sequence of the cloned mRNAand gene of the ADP/ATP carrier from HQQLQfiQQLfl_QLafififi.EHBÜ J. 3, 377. Arfin, S.M. y Bradshaw, R.A. (1988) Cotranslational processing and protein turnover in eukaryotic cells. Biochemistry 27, 7979. Arribas, C., Sampedro, J. e Izquierdo, M. (1986) The ubiquitin genes in Drosophila melanogaster: Transcription and polymorphism. Biochimica et Biophysica Acta 868, 119. Atidia, J. y Kulka, R.G. (1982) Formation of conjugates by 125I­ labeled ubiquitin microinjected into cultured hepatoma cells. FEBS Lett. 142, 72. Atkinson, B.G. y Dean, R.L. (1985) Effects of stress on the gene expression of amphibian, avian and mammalianblood cells. In changes in eukaryotic gene expression in response to environment­ al stress. Edited by B.G. Atkinson and D.B. Walden, Academic Press, NewYork, pp. 159-181. Attar, H.N., Grotewold, E., Taccioli, G.E., Aisemberg, G.0., Torres, H.N. y Judewics, N.D. (1989) Cicloheximida inducible gene of fl. grafisa belongs to the cytochrome P450 superfamily. Nucl. Acids. Ebs., en prensa. Audhya, T. y Goldstein, G. (1985) Thymopoietin and ubiquitin. Methods in Ehzymology 116, 279. Bachmair, A. y Varshavsky, A. (1989) The degradation signal in a short-lived protein. Cell 56, 1019. Bibliografia/

Bachmair, A., Finley, D. y Varshavsky, A. (1936) In Vivo half life of a protein is a function of its aminoterminal residue. Science 234, 179. Backer, J.M. y Dice, J.F. (1986) Covalent linkage of ribonuclease S-peptide to microinjected proteins causes their intracellular degradation to be enhanced during serum withdrawal. FToc. Nati. Acad. Sci. USA83, 5830. Backer, J.M., Bourrett, L. y Dice, J.F. (1983) Regulation of catabolism of microinjected ribonuclease A requires the amino­ terminal 20 amino acids. Proa. Nat]. Acad. Sci. USA80, 2166. Baer, B.W. y Rhodes, D. (1983) Eukaryotic RNApolymerase II binds to nucleosome cores from transcribed genes. Nature 301, 482. Bahl, H., Echols, H., Straus, D.B., Court, D., Crowl, R. y Georgopoulos, C.P. (1987) Induction of the heat shock response of Escherichia coli through stabilization of 033 by the phage cIII protein. Genes Dev. 1, . Baker, B.T. y Board, P.G. (1988) Molecular analysis of human ubiquitin genes: UbA52gene structure and UbC coding-unit-number polymorphism. Current Chmmunications in Nules. Biol. The Ubiquitin System (ed. M. Schlesinger, A. Hershko). Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 36-42. Baker, R.T. y Board, P.G. (1987a) The human ubiquitin gene family: Structure of a _gene and pseudogenes from the Ub B subfamily. Nuel. Aeids. Res. 15, 443. Baker, B.T. y Board, P.G. (1987b) Nucleotide sequencing of a human ubiquitin Ub B processed pseudogene. Nucl. Acids. Res. 15, 4352. Balance, D.J. (1986) Yeast 2, 229-326. Ball, E., Karlik, C.C., Beall, C.J., Saville, D.L., Sparrow, J C., Bullard, B. y Fyrberg, E.A. (1987) Arthrin, a myofibrillar protein of insect flight musclei is an actin-ubiquitin conjugate. Cell 51, 22 Ballal, N.R. y Busch, H. (1973) Two .dimensional gel electrophoresis of acid-soluble nucleolar proteins of Walker 256 carcinosarcoma. cancer Res. 33, 2737.

- 286 ­ Bibliografía

Ballal, N.R., Goldknopf, I L., Goldberg, D.A. y Busch, H. (1974) The dynamic state of liver nucleolar proteins as reflected by their changes during administration of thioacetamide. Life Sci. 14, 1835. Ballal, N.R., Kang, Y.S.J., Olson, N.0.J. y Busch, H. (1975) Changesin nucleolar proteins and their phosphorylation patterns during liver regeneration. J. Biol. Chem.250, 5921. Bálow, R.M., Tomkinson, B., Ragnarsson, U. y Zetterqvist, 0. (1986) Purification, substrate specificity, and classification of tripeptidyl peptidase II. J. Biol. Chem.261, 2409. Bancher, C., Lassmann, H., Budka, H., Jellinger, K., Grundke­ Iqbal, I., Iqbal, K., Niche, G., Seitelberger, F. y Wisniewski, H.M. (1989) An antigenic profile of Lewy bodies: Immunocyto­ chemical indication for protein phosphorylation and ubiquitin­ ation. J. of Neuropathol. and Exp. Neurology 48, . Banuett, F., Hoyt, M.A., McFarlane, L., Echols, H. y Herskowitz, I. (1986) hÍïB, a new E. coli locus regulating lysogeny and the level of bacteriophage X cII protein. J. Mol. Biol. 187, 213. Barnet, G.R , Seyfzadeh, M. y Davis, R.H. (1988) Putrescine and spermidine control degradation and synthesis of ornithine decarboxylase in fl¿_crafifin. J. Biol. Chem. 263, 10005. Barsoum, J. y Varshavsky, A. (1985) Preferential localization of variant nucleosomes near the 5'—end of the mouse dihydrofolate reductase gene. J. Biol. Chem. 260, 7688. Basch, R. y Goldstein, G. Induction of T-cell differentiations in Vitro by thymin, a purified polypeptide hormone of the thymus (1974) PToc. Natl. Acad. Sci. USA71(4), 1474. Beadle, G.W. y Tatum, E.L. (1945) Ann. J. Botany 32, 678. Beckerle, M., Burridge, K., DeMartino, G. y Croall, D. (1987) Colocalization of calcium-dependent protease II and one of its substrates at sites of cell adhesion. Céll 51, 5 Ben-Bassat, A. y Bauer, K. (1987) Amino-terminal processing of proteins. Nature 326, 315.

- 287 — Bibliografía

Ben-Bassat, A., Bauer, K., Chang, 5.Y., Myambo, K., Boosman, A, y Chang, 5., (1987) Processing of the initiation methionine from proteins: Properties of the E. coli methionine aminopeptidase and its gene structure. J. Bacteriol. 169, 751. Benoist, C., O'Hare, K.0., Breathnach, R. y Chambon, P. (1980) Nucl. Acids Res. 8, 127. Berg, J.M. (1985) Potential metal-binding domains in nucleic acid binding proteins. Science 232, 485. Berger, J. y Dice, J. (1986) Proteolysis in cultured cells during prolonged serum deprivation and replacement. Am.J. Physiol. 251, 0748-0753. Berlin, V. y Yanofsky, C. (1985a) Protein changes during the asexual cycle of Neuzgfipgxa_grgfifia. Mol. Cell. Biol. 5, 839. Berlin, V. y Yanofsky, C. (1985b) Isolation and characterization of genes differentially expressed during conidiation of Mol. Céll. Biol. 5, 849. Bienz, M. y Pelham, H.R B. (1986) Heat shock regulatory elements function as an inducible enhancer in the Xenopus hsp70 gene and when linked to a heterologous prometer. Gel} 45, 753. Bienz, M. y Pelham, H.R B. (1987) Mechanisms of heat-shock gene activation in higher eukaryotes. Adv. Genet. 243, Bigelow, 3., Hough, R. y Rechsteiner, M. (1981) The selective degradation of injected proteins occurs principally in the cytosol rather than in lysosomes. cell 25, . Binet, M.N., Steinmez, A. y Tessier, L.H. (1939) The primary structure of sunflower (Helianthus annus) ubiquitin. Nucl. Acids. Res. 17, 2119. Birnsterl, M.L., Busslinger, M. y Strub, K. (1985) Transcription termination and 3'processing: the end is in site Call 41, 349. Bloom, M., Skelly, 8., VanBogelen, R., Neidhardt, F., Brot, N. y Weissbach, H. (1986) In Vitro effect of the Escherichia coli heat shock regulatory protein on expression of heat shock genes. J. Bacteriol. 166, 380.

— 288 ­ Bibliografia

Blow, A.M.J., Van Heyningen, R. y Barrett, A.J. (1975) Metal­ dependent proteinase of the lens: Assay, purification and properties of the bovine enzyme. Biochem. J. 145, 591. Blumberg, H., Eisen, A., Sledziewski, A., Bader, D. y Young, E.T. (1987) Twozinc fingers of a yeat regulatory protein shown by genetic evidence to be essential for its funcion. Nature 328, 443. Bohm, L., Briand, G., Sautiere, P., y Crane-Robinson, C. (1982) Proteclytic digestion studies of chromatin core-histone structure: Identification of the limit peptides from histone HZB. Eur. J. Eiochem. 123, 299. Boissel, J P., Kasper, T J., Shah, 8., Malone, J.I. y Bunn, H.F. (1985) Amino-terminal processing of proteins: Hemoglobin South Florida, a variant with retention of initiator methionine and N­ acetylation. PToc. Nat]. Acad. Sci. USA82, 8448. Bond, U. (1983) Heat shock but not other stress inducers leads to the disruption of a sub-set of snRNPsand inhibition of in Vitro splicing in HeLa Cells. EMBOJ. 7, 3509. Bond, U. y Schlesinger, M.J. (1985) Ubiquitin is a heat-shock protein in chicken embryo fibroblasts. Mol. Cell Biol. 5, 949. Bond, U. y Schlesinger, M.J. (1986) The chicken ubiquitin gene contains a heat shock promoter and expresses an unstable mRNAin heat-shocked cells. lol. Céll. Biol. 6, 4602. Bonnen, A. y Brambl, R. (1983) Germination physiology of Ni arafifia_conidia. ERP. MYCOJ.7, 197. Bonner, W.M. y Stedman, J. (1979) Histone 1 is proximal to histone 2A and A24. PToc. Nati. Acad. Sci. USA76, 2190; Breslow, E., Chauhan, Y., Daniel, R. y Tate, S. (1986a) Role of methionine-I in ubiquitin conformation and activity. Biochem. Biophys. Res. Commun. 138, 437. Breslow, E., Daniel, R., Ohba, R. y Tate, S. (1986b) Inhibition of ubiquitin-dependent proteolysis by non-ubiquitinable proteins. J. Biol. Chem. 261, 6530.

— 289 ­ Bibliografía

Brew, K., Castellino, F.J., Vanaman, T.C. y Hill, R.L. (1970) The complete amino acid sequence of bovine a-lactalbumin. J. Biol. Chem. 245, 4570. Brooks, R.R. y Huang, P.C. (1972) Biochem. Genet. 6, 41. Brown, I.R. y Rush, 8.J. (1984) Induction of a 'stress' protein in intact mammalianorgans after the intravenous administration of sodium arsenite. Biochem. Biophys. Res. Commun.120, 150. Burke, T.J., Callis, J. y Vierstra, R.D. (1938) Characterization of a polyubiquitin gene from Arabidopsis thaliana. Mb]. Gen. Genet. 213, 435. Burkhard, S.J. y Traugh, J.A. (1984) FEd. PToc. 43, 177. Burns, D.M. y Yanofsky, C. (1988) Nucleotide sequence of the ueuzgspgra_g:as&g trp-3 gene encoding tryptophan synthetase and comparison of the try-3 polypeptide with its homologs in Saccharomyces cerevisiae and Escherichia coli. J. Biol. Chem. 264, 3840. Burstein, Y. y Schechter, I. (1978) Biochemistry 17, 2392. Burton, V,, Mitchell, H.K., Young, P. y Petersen, N.S. (1938) Heat shock protection against cold stress of D. melanogaster. Mol. Cell. Biol. 8, 3550. Busch, H. y Goldknopf, I.L. (1981) Mol. Cell. Biochem. 40, 173. Butt, T., Jonnalagadda, 5., Monia, B., Sternberg, E., Marsh, J., Stadel, J., Ecker, D. y Crooke, S. (1988a) Increased expression of cloned gene products as ubiquitin fusion proteins. Journal Cell Biology 107(6), Part 3, ref.1712. Butt, T.R., Jonnalagadda, 8., Monia, B., Sternberg, E., Marsh, J.A., Stadel, J., Ecker, D.J, y Crooke, S.T. Ubiquitin fusion augments the yield of cloned gene products in Ehcherichia coli (1989) Pwoc. Nati. Acad. Sci. USA86, 2540. Butt, T.R., Khan, M.I., Marsh, J., Ecker, D.J. y Crooke, S.T. (1988b) Ubiquitin-Metallothinein fusion protein expression in yeast. J. Biel. Chem. 263, 16364.

— 290 ­ Bibliografía

Byers, B. (1981) Life cycle of Saccharomyces cereviciae. Molecular genetics in yeast, füvc. Alfred Benson Symp. 16, 119. Cadrin, M“, Perry, G., Ohta, H., Kawahara, H., Marceau, N. y French, S.W. (1989) Ubiquitin: A commonphenomenon in cytokeratin aggregates: an in vivo and in vitro study. FHSEBJ.3(3), Ref. 568. Carlson, N. y Rechsteiner, M. (1987) Microinjection of ubiquitin: Intracellular distribution and metabolism in HeLa cells maintained under normal physiological conditions. J. Cell. Biol. 104, 537. Carlson, N., Rogers, S. y Rechsteiner, M. (1987) Microinjection of ubiquitin: Changes in protein degradation in HeLa cells subjected to heat-shock. J. Cell Biol. 104, 547. Carrazana, E.J., Pasieka, K.B. y Magzoub, J.A. (1988) The vasopression mRNApolyA tract is unusually long and increases during stimulation of vasopressin. Gene expression in vivo. Mol. cell. Biol. 8, 2267. Cary, P D., King, D.S., Crane-Robinson, C., Bradbury, H., Rabbani, A., Goodwin, G.H. y Johns, E.W. (1980) Structure studies on two high-mobility-group proteins from calf thymus. HMG-14and EMP-20(ubiquitin), and their interaction with DNA. Eur. J. Biochem. 112, 557. Casero, R A., Bergeron, .R.J. y Porter, C.W. (1984) J. cell Physiol. 121, 476. Castaño, J.G., Ornberg, R., Koster, J.G., Tobian, J.A. y Zasloff, M. (1986) Eucaryotic pre-tRNA 5' processing nuclease: Copurification with a complexcylindrical particle. Cbll 46, 377. Celano, P., Baylin, S.B. y Casero Jr., R.A. (1989) Polyamines differentially modulate the transcription of growth-associated genes in human colon carcinoma cells. J. Biol. Chem. 264, 8922. Celano, P., Baylin, S.B., Giardello, F.M., Nelkin, B.D. y Casero, Jr., R.A. (1988) Effect of polyamine depletion on c-myc expression in human colon carcinoma cells. J. Biol. Chem. 263, 5491.

- 291 — Bibliografia

Chang, 8.0.) Wooden, S.K., Nakaki, T., Kim, Y.K., Lin, A.Y., Kung, L., Attenello, J.W. y Lee, A.S. (1937) Rat gene encoding the 78-kDa glucose-regulated protein GRP78: its regulatory sequencee and the effect of protein glycoeylation on its expression. Proa. Nati. Acad. Sci. USA84, 680. Charette, M.F., Henderson, G.W. y Markovitz, A. (1981) ATP­ hydrolyeie-dependent proteaee activity of the Jon (capR) protein of EBeherichia coli K-lZ. PToc. Netl. Acad. Sci. USA78, 4728. Chau, V., Tobias, J.W., Bachmair, A., Marriott, D., Ecker, D.J., Gonda, D.K. y Varehaveky, A. (1989) A multiubiquitin chain is confined to specific lyeine in a targeted ehort-lived protein. Science 243, 1576. Chen, R. y Chen-Schmeieser, U. (1977) Proa. Nat]. Acad. Sci. USA 74, 4905. Cheng, M.Y., Hartl, F.U., Martin, J., Pollock, R.A., Kaloueek, F., Neupent, W., Hallberg, E.M., Hallberg, R.L. y Horwlch, A.L. (1989) Mitochondrial heat-shock protein hspSÜ is essential for aeeembly of proteina imported into yeaet mitochondria. Nature 337, 620. Cheng, 8.0. y Abeleon, J. (1987) Genes Dev. 1, 1014. Chiang, H.L. y Dice, J. (1933) Peptide eequencee that target proteins to lyeoeomee for enhanced degradation during eerum withdrawal. J. Biol. Chem. 263, 6797. Chin, D.T., Kuehl, L. y Recheteiner, M. (1982) Conjugation of ubiquitin to denatured hemoglobinis proportional to the rate of hemoglobin degradation in HeLa cells. Proa. Nati. Acad. Sci. USA 79, 5857. Chung, C.H. y Goldberg, A.L. (1981) The product of the Jon (capR) gene in EBeherichia coli ie the ATP-dependentprotease, proteaee La. Proa. Nati. Head. Sci. USA78, 4931. Ciechanover, A., Elias, 8., Heller, H. y Herehko, A. (1982) "Covalent affinity“ purification of ubiquitin-activating enzyme. J. Biol. Chem. 257, 2537. I

— 292 ­ Bibliografía

Ciechanover, A., Ferber, 8., Ganoth, D., Elias, 8., Hershko, A. y Arfin, S. (1988) Purification and eharaeterization of arginyl­ tRNA-proteintransferase from rabbit reticulooytes. J. Biol. Chem. 263, 11155. Ciechanover, A., Finley, D. y Varshavsky, A. (1984) Ubiquitin dependenceof selective protein degradation demonstrated in the mammaliancell cycle mutant ts35. Céll 37, . Ciechanover, A., Heller, H., Elias, S., Haas, A.L. y Hershko, A. (1980) ATP-dependent conjugation of reticuloeyte proteins with the polypeptide required for protein degradation. Prcc. Nat]. Acad. Sci. USA77, 1365. Ciechanover, A., Heller, H., Katz-Etzion, R. y Hershko, A. (1981) Activation of the heat-stable polypeptide of the ATP-dependent proteolytie system. Fch. Nati. Acad. Sci. USA78, 761. Ciechanover, A., Wolin, S.L., Steitz, J.A. y Lodish, H.F. (1985) Transfer RNAis an essential component of the ubiquitin and ATP­ proteolytic system. Fch. Nat}. Acad. Sci. UBA82, 1341. Clarke, L.E. et al (1939) Nature 337, 705. Cohen, L.B. y Drucker, H. (1977) Arch. Biochem. Biophys. 182, 601. Cole, G.M. y Timiras, P.S. (1937) Ubiquitin-protein conjugates in Alzheimer's lesions. Neurosci} Lett. 79, 207. Corden, J., Wasylyk, B., Buchwalder, A., Sassone-Corsi, P., Kedinger, C. y Chambon, P. (1980) Promoter sequences of eukaryotic protein-coding genes. Science 209, 1406. Cowland, J.B., Wiborg, O. y Vuust, J. (1988) Human ubiquitin genes: One memberof the UbBgene subfamily is a tetramerio non­ processed pseudogene. FE.S Lett. 231, 187. Cox, M.J. (1986) Chemical modification of ubiquitin, M.S. Thesis, EmoryUniversity. Cox, M.J., Haas, A.L. y Wilkinson, K. (1986) Role of ubiquitin conformatiehs in the speeifieity of protein degradation: Iodinated derlvatlves with altered conformations and activities. Archives cf Biochemistry and Bicphysics 250, 400.

- 293 — Bibliografía

Crame, J. y Mortimer, R. (1974) A genetic study of X-ray sensitive mutante in yeast. Mútant Res. 24, 281. Cruz, A.K., Terenzi, H.F., Jorge, J.A. y Terenzi, H.F. (1988) Cyclic AMP-dependent eonstitutive thermotolerance in the adenylate cyclase-deficient cr-J (crisp) mutant of N¿__g:assa. Carr. Genet. 13, 451 Curle, C.A. y Kapoor, M. (1988) Expression of heat shock genes of H¿__Qr effect of hyperthermia and other stresses on mRNA levels. Can. J. Nicrob. 66, 81. Dahlmann, B. (1985) High Mr cysteine proteinases from rat skeletal muscle. Biochem. Soc. TTans. 13, 1021. Dahlmann, B., Kuehn, L. y Reinauer, H. (1983) Identification of three high molecular mass eysteine proteinase from rat skeletal muscle‘ FEFE Lett. 160, 243. Dahlmann, B., Kuehn, L., Rutschmann, M. y Reinauer, H. (1985a) Purification and characterization of a multicatalytic high­ molecular-mass proteinase from rat skeletal muscle. Biochem. J. 228, 161. Dahlmann, B., Rutschmann, N., Kuehn, L. y Reinauer, H. (1985b) Activation of the multicatalytic proteinase from rat skeletal muscle by fatty acids or sodium dodecyl sulphate. Biochem. J. 228, 171. Dalay, N., Kirdar, B. y Bermek, E. (1984) The effect of cycloheximide on nuclear uHZAcontent. Ekperientia 40(12), 1398. David, A.E. (1973) Assembly of the VSVenvelope: incorporation of viral polypeptides into host plasma membrane. J. Mol. Biol. 76, 135‘ Davie, J., Delcuve, G., Nickel, B., Mayer, R. y Bailey, G. (1987) Changes in the histone HZAvariant H2A.Zand poly-ubiquitinated histone species in developing trout testis. Biochemistry 26, 4417. Davis, R.H., Krasner, G.N., Di Gangi, J.J. y Ristow, J.L. (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. USA82, 4105.

— 294 ­ Bibliografía

Dayhoff, M.O. (1972) Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C. DeLange, R.J., William, L.C. y Martinson, H.G. (19793. Identification of interacting aminoacids at the histone 2A-2B binding site. Biochemístry 18, 1942. DeMartino, G.N. (1983) Identification of a high molecular weight alkaline protease in rat heart. J. No}. Cell. Cárdiol. 15, . DeMartino, G.N. y Goldberg, A.L. (1979) Identification and partial purification of an ATP-stimulated alkaline protease in rat liver. J. Biol. Chem. 254, 3712. Deutch, G.E. y Soffer, H.L. (1975) FToc. Nhtl. Acad. Sci. USA72, 405. Dezelec, P. y Shockman, G. (1975) J. Biol. Chem. 250, 6806. Dice, J. (1987) Molecular determinante of protein half-lives in eukaryotio cells. FASEBJ. 1, 349. Dice, J., Backer, J., Chiang, H.L. y Goff, S. Lysosomal degradation of microinjected proteins. Bjochem. Soc. TTans. En prensa. ­ Dice, J.F., Chiang, H.L., Spencer, E.P. y Backer, J.M. (1986) Regulation of catabolism. of microinjected ribonuclease A. J. Biol. Chem. 261, 6853. DiDomenico, B.J., Bugaisky, G.E. y Lindquist, 8.8. (1982a) Heat shock and recovery are mediated by different translational mechanisms. Proa. Nat]. Acad. Sci. USA79, 6181. DiDomenico, B.J., Bugaisky, G.E. y Lindquist. 5.8. (1982b) The heat shock response is self-regulated at both the transcriptional and posttranscriptional levels. ¿Eli 31, 593. DiNocera, P.P. y Dawid, I.B. (1933) Transient expression of genes introduced into cultured cells of Drosophila. PToc. Natl. Head. Sci. USA80, 7095. ' DiStefano, D.L. y Wand, J. (1987) Two-dimentional lH NMRstudy of humanubiquitin: A main chain directed assignment and structure analysis. Biochemistry 26, 7272.

- 295 ­ fBibliografía

Dornish, J.M. y Smith-Kielland, I. (1931) Increase in protein A24 following treatment of Ehrlich ascites tumor cells with 1-methyl­ l-nitrosourea and 1,3-bis(2-chloroethy1)-1—nitrosourea. FEFE ¿ett. 136, 41. Douglass, J. et al. (1984) Ann. Rev. Biochem. 53, 665. Driessen, H.P.C., de Jong, W.W., Tesser, G.1. y Bloemendal, H. (1985) CFC CTit. Rev. Biochem. 18, 281. Dudler, R. y Travers, A.A. (1984) Upstream elements necessary for optimal function of the h5p70 promoter in transformed flies. 0911 38, 1. Duerksen-Hughes, P.J., Xu, X. y Wilkinson, K.D. (1987) The ubiquitin binding sites of the activating enzymeand proteases: Evidence for differential interactions around Arg-74 of ubiquitin. Bioehemistry 26, 6980. Duncan, R. y McConkey, E. (1982) Ehr. J. Bïochem. 123, 535. Dutta, S.K. (1973) Biochem. Biophys. Acta 324, 482. Dworkin-Rastl, E., Shrutkowski, A. y Dworkin, M.B. (1984) Multiple ubiquitin mRNAsduring XEnopus laevis development contain tandem repeats of the 76 amino acid coding sequence. Cbll 39, 321. Ecker, D.J., Butt, T.R., Marsh, J., Khan, M.I., Sternberg, E.J., Margolis, N., Monia, B.P., Jonnalagadda, S., Weber, P.L., Mueller, L. y Crooke, S.T. (19870) Ubiquitin, nature's most conserved protein as a model for protein engineering. Protein Structure, Folding, and Design 2, Alan R. Liss, Inc. pp. 119-129. Ecker, D.J., Butt, T.R., Marsh, J., Sternberg, E., Shatzman, A., Dixon, J.S., Weber, P.L. y Crooke, S.T. (1989a) Ubiquitin function studied by disulfide engineering. J. Biol. Chem. 264, 1337. Ecker, D.J., Butt, T.R., Marsh, J., Sternberg, E.J., Margolis, M., Monia, B.P., Jonnalagadda, 5., Khan, M.I., Weber, P.L., Mueller, L. y Crookes, S.T. (1987b) Gene synthesis, expression, structures, and functional activities of site-specific mutantsof ubiquitin. J. Biol. Chem. 262, 14213.

- 296 ­ Bibliografía

Ecker, D.J., Khan, M.I., Marsh, J., Butt, T. y Crooke, S.T. (1987a) Chemical synthesis and expression of a cassette adapted ubiquitin gene. J. Biol. Chem. 262, 3524. Ecker, D.J., Stadel, J.M., Butt, T.R., Marsh, J.A., Monia, B.P., Powers, D.A., Gorman, J.A., Clark, P.E., Warren, F., Shatzman, A., y Crooke, S.T. (1989) Increasing gene expression in yeast by fusion to Ubiquitin. J. Biol. Chem. 264, 7715. Edmunds, T. y Pennington, R.J.Tu (1932) A high-molecular weight peptide hydrolase in erythrocytes. Int. J. Biochem. 14, 701. Edmunds, T. y Penningtonh B.J.T. (1985) A high molecular weight peptide hydrolase from rat skeletal muscle, in: Intracellular Protein Catabolism (E A. Khairallah, J.S. Bond and J.N.C. Bird, eds.), Alan R. Liss, NewYork, pp. 235-237. Einspanier, F., Sharma, H.S. y Scheit, K.H. (1937) Cloning and sequence analysis of a cDNA encoding poly-ubiquitin in human ovarian granulosa cells. Biochem. Biophys. Res. Cbmmun.147, 581. Elder, P.K., Schmidt, L J., Ono, T. y Getz, M.J. (1984) Specific stimulation of actin gene transcription by EGFand cycloheximide. Proc. Nat}. Acad. Sci. USA81, 7478. Ellis, J. (1987) Proteins as molecular chaperons. Nature 328, 378. Emori, Y, Kawasaki, H., Imajok, 8., Imahori, K. y Suzuki, K. (1987) Endogenous inhibitor for calcium-dependent cysteine protease contains four internal repeats that could be responsible for its multiple reactive site. PToc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 3590. Ernest, M.J., DeLap, L. y Feigelson, P. (1978) J. Biol. Chem. 253, 2895. Etlinger, J.D. y Goldberg, A.L. (1977) PToc, Natl. Acad. Sci. USA 74, 54. Etlinger, J.D., McMullen, H., Rieder, R.F., Ibrahim, A., Janeczko, R.A. y Marmorstein, S. (1985) Mechanisms and control of ATP-dependentproteolysis, in: Intracellular PToteín Cátabolism (E.A. Khairallah, J.S. Bond, and J.W.C. Bird, eds.), Alan R. Liss, NewYork, pp. 47-60.

- 297 — Bibliografia

Evans, R.M. y Hollenberg, 5.“. (1938) Zinc Fingers: Gilt by association. Cell 52, . Evans, T., Rosenthal, E.T., Youngblom, J., Distel, D. y Hunt, T. (1983) Cyclin: a protein specified by maternal mRNAin sea urchin eggs that is destroyed at each cleavage division.-Céll 33, 339. Fagan, J.M., Waxman, L. y Goldberg, A.L. (1937) Skeletal muscle and liver contain a soluble ATP+ ubiquitin-dependent proteolytic system. Biochem. J. 243, 335. Ferber, S. y Ciechanover, A. (1986) Transfer RNAis required for conjugation of ubiquitin to selective substrates of the ubiquitin- and ATP-dependent proteolytic system. J. Biol. Chem. 261, 3128. Ferber, S. y Ciechanover, A. (1987) Role of arginine-tRNA in protein degradation by the ubiquitin pathway. Nature 326, 808. Finley, D. y Varshavsky, A. (1985) The ubiquitin system: Functions and mechanisms. Trends Biochem. Sci. 10, 343. Finley, D., Bartel, B. y Varshavsky, A. (1989) The tails of ubiquitin precursors are ribosomal proteins whose fusion to ubiquitin facilitated ribosome biogenesis. Nature 338, 394. Finley, D., Ciechanover, A., y Varshavsky, A. (1984) Thermolability of ubiquitin-activating enzymefrom the mammalian cell cycle mutant ts85. Cell 37, 43. Finley, D., Ozkaynak, E. y Varshavsky, A. (1987) The yeast polyubiquitin gene is essential for resistance to high temperatures, starvation and other stresses. cell 48, 1035. Folz, R.J. y Gordon, J. (1987) Computer-assisted predictions of signal peptidase processing sites. Biochem. Biophys. Res. Commun. 146, 870. Fornace Jr., A.J., Alamo Jr., I., Hollander, C. y Lamoreaux, E. (1989) Ubiquitin mRNAis a major stress-induced transcript in mammalian cells. Nucl. Acid. Res. 17, 1215. Fortín, M.G., Purohit, S.K. y Verma, D.P.S. (1988) The primary structure of soybean (Glycine max) ubiquitin is identical to other plant ubiquitins. Nucl. Acids. Res. 16, 11377.

— 298 ­ Bibliografía

Free, S.J., Rice, P.H. y Metzenberg, K.L. (1979) J. Bacteriol. r? 137. 1¿a 19. Fried, V.A., Smith, H.T., Hildebrandt, E. y Weiner, K. (1987) Ubiquitin has intrinsic proteolytic activity: Implication for cellular regulation. PToc. Nati. Acad. Sci. USA84, 3685. Friedberg, E. (1983) DNA repair p506, W.H. Freeman, San Francisco. Froehnerg 8.0. y Eriksson, E. (1974) J. Bacteriol. 120, 450. Fucci, L., Oliver, C.H., Coon, M.J. y Stadtman, E.R. (1983) Inactivation of key metabolic enzymesby mixed-function oxidation reactions: Possible implication in protein turnover and aging. Proc. Nati. Acad. Sci. USA80, 1521. Fusauchi, Y. y Iwai, K; (1985) Tetrahymena ubiquitin-histone conjugate uH2A.Isolation and structural analysis. J. Bjochem. 97, 1467. Gallatin, W.M., Weissman, I.L. y Butcher, E.C. (1983) A cell surface molecule involved in organ-specific homing of lymphocytes. Nature 304, 30. Galloway, P.G., Bergeron, C. y Perry, G. (1989) The presence of tau distinguishes Lewy bodies of diffuse Lewybody disease from those of idiopathic Parkinson disease. Neurosci. Lett. 100, 6. Ganoth, D., Leshinsky, E., Eytan, E. y Hershko, A. (1988) A multicomponent system that degrades proteins conjugated to ubiquitin. J. Biol. Chem. 26, 12412. Gausing, K. y Barkardottir, R. (1986) Structure and expression of ubiquitin genes in higher plants. Eur. J. Biochem. 158, 57. Gavilanes, J.G., Gonzales de Buitrago, G., Perez-Castells, R. y Rodriguez, R. (1932) Isolation, Characterization, and amino acid sequence of a ubiquitin-like protein from insect eggs. J. Biol. Chem. 257, 10267. Germann, U.A., Müller, G., Hunziker, P.E. y Lerch, K. (1988) Characterization of two allelic forms of fleurgfipgng__granfia laccase. J. Biol. Chem. 263, 885.

- 299 ­ Bibliografía

Gilee N.H., Case, M.E., Baum,J., Greever, R., Huiet, L., Patel, V. y Tyler, B. (1985) Nicrobiol. Rev. 49, 338. Giorda, R. y Ennie, H.L. (1987) Structure of two developmentally regulated Dictyostelium discoideum ubiquitin genes. Molec. Cell. Biol. 6, 2097. Glass, J.R. y Gerner, E.W. (1937) Spermidine mediates degradation of ornithine decarboxylase 'by a non-lysosomal, ubiquitin­ independent mechaniem. J. Cell. Physiol. 130, 133. Goebl, M., Yochem, J., Ientech, 5., McGrath, J., Varshavsky, A. y Byere, B. (1988) Science 241, 1331. Goff, S.A. y Goldberg, A.L. (1985) Production of abnormal proteins in EBcherichia coli stimulates transcription of Jon and other heat-shock genes. Cell 41, 587. Goldberg, A. y St.John, A. (1976) Intracellular protein degradation in mammalianand bacterial cells. Part 2. Annu. Rev. Biochem. 45, 747. Goldberg, A.L. (1972) Degradation of abnormal proteins in E. coli. PToc. Net]. Acad. Sci. USA69, 422. Goldberg, A.L. y Waxman, L. (1985) The role of ATPhydrolyeie in the breakdown of proteins and peptidee by protease La from Ebcherichia coli. J. Biol. Chem. 260, 12029. Goldenberg, C., Luo, Y., Fenna, M., Baler, R. y Voellmy, B. (1987) Purified human factor, HHTF, activates a heat-shock promoter in a Hela cell-free transcription system. Goldknopf, I.L. y Busch, H. (1975) Remarkable eimilarities of peptide fingerprinte of histone 2A and nonhistone chromosomal protein A24. Biochem. Biophys. Res. Commun.65, 951. Goldknopf, I.L. y Busch, H. (1977) Isopeptide linkage between non-hietone and hietone 2Apolypeptidee of chromoeomalconjugate­ protein A24. PTOC. Nati. Acad. Sci. USA74, 864. Goldknopf, II.L. y Busch, H. (1973) Modification of nuclear proteins: The ubiquitin-hietone 2A conjugate, in: The Cell Nucleus, Vol.VI, Academic Press, NewYork, pp.149—180.

- 300 ­ Bibliografia

Goldknopf, I.L., Cheng, 8., Anderson, M.W. y Busch, H. (1981) Loss of endogenous nuclear protein A24 lyase activity during chicken erythropoiesis. Biochem. Bjophys. Res. Cbmmun.4, 1464. Goldknopf, I.L., French, M.F., Dashal, Y. y Busch, H. (1978) A reciprocal relationship between contents of free ubiquitin and protein A24-its conjugate with histone 2Ain chromatin fractions obtained by the DNAseII, Mg2+procedure. Biochem. Biophys. Ets. Commun. 84, 786. Goldknopf, I.L., Sudhakar, 8., Rosenbaum, F. y Busch, H. (1980b) Timing of ubiquitin synthesis and conjugation into protein A24 during the HeLa cell cycle. Biochem. Biophys. Res. Commun.95, 1253. Goldknopf, I L., Taylor, C.N., Baum, R.M., Yeoman, L.C., Olson, M.OJ., Prestayko, A.W. y Busch, H. (1975) Isolation and characterization of protein A24, a "histone-non-histone chromosomal protein”. J. Biol. Chem. 250, 7182. Goldknopf, I.L., Wilson, G., Ballal, N.R. y Busch, H. (1980a) Chromatin conjugate protein A24is cleaved and ubiquitin is lost during chicken embryo erythropoiesis. J. Biol. Chem. 255, 10555. Goldstein, G. (1976) Molecular control of proliferation and cytodifferentiation (Papaconstantinou, ed,) p.197. Academic Press, New York. Goldstein, G., Scheid, M., Hammerling, _U., Boyser, E.A., Schlesinger, D.H. y Niall, H.A. (1975) Isolation of a polypeptide that has lymphocyte-differentiating properties and is probably represented universally in living cells. PToc. Nati. Acad. Sci. USA72(1), 11. Gorovsky, M., Glover, C., Johmann, C., Keevert, J., Mathis, D. y Samuelson, M. (1978) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 42, 493. Gottesman, 8., Gottesman, M.E., Shaw, J.E. y Pearson, M.L. (1981) Protein degradation in E. coli: The Jon mutation and bacteriophage X N and cII stability. cell 24, 220. Graham, J.D. (1967) Neurospora Néwsletter 11, 14.

— 301 ­ Bibliografía /

Graham, E., Jones, D. y Candido, P.M. (1989) UbiA, the major polyubiquitin locus in Caenerfiabditis elegans, has unusual structure features and is constitutively expressed. Mol. CEI]. Biol. 9, 268. Graham, R.W., Van Doren, K., Bektesh, S. y Candido, E.P. (1988) Maturation of the major ubiquitin gene transcript in Cáenorhabdí­ tis elegans involves the acquisition of a trans-spliced leader. J. Biol. Chem. 263, 10415. Grantham, R. (1974) Aminoacid difference formula to help explain protein evolution. Science 185, 862. Graves, B.J., Johnson, P.F. y McKnight, S.L. (1986) CBJJ 44, 565. Greenberg, M.E., Hermanowski, A.L. y Ziff, E.B. (1986) Effect of the protein synthesis inhibitors and growth factor activation of c-fos, c-myc and actin gene transcription. Mel. 0911. Biol. 6, 1050. Gregori, L., Marriott, D., West, C.M. y Chau, V. (1985) Specific recognition of calmodulin from Dictyostelium discoideum by the ATP, ubiquitin-dependent degradative pathway, J. Biol. Chem. 260, 5232. Gregory, M.R. y Notides, A.C. (1982) Characterization of two uterine proteases and their actions on the estrogen receptor. Biochemistry 21, 6452. Gross, C., Cowing, D., Erickson, J., Grossman, A., Straus, D., Walter, W. y Zhou, Y.N. (1987) Regulation of the heat-shoc response in Escherichia eelí. In: NewFrontiers in the Study of Gene thctions (G. Poste and S.T. Crooke, eds ), Plenum Press, New York, pp. 21-32. ' Grossman, A.D., Erickson, J.W. y Gross, C.A. (1984) The htpR gene product of Escherichia coli is a sigma factor for heat-shock promoters. Cell 38, 383. Grossman, A.D., Straus, D.B., Walter, W.A. y Gross, C.A. (1987) 032 synthesis can regulate the synthesis of heat shock proteins in Ehcheriehia coli. Genes Dev. 1, 179. Grotewold, E., Taccioli, G.E., Aisemberg, G.0. y Judewicz, N.D. (1988a) A single-step purification of an extracellular fungal laccase in N. Graena. NIRCENJournal 4, 357.

- 302 ­ Bibliografía

Grotewold, E., Taccioli, G.E., Aisemberg, G.0. y Judewicz, N.D. (1988b) Early response and induced tolerance to cycloheximide in N¿_gzassa. Current Genetics, en prensa. Haas, A. y Bright, P. (1988) Resolution and characterization of putative ubiquitin carrier protein isozymes from rabbit reticulocytes. J. Biol. Chem.263, 13258. Haas, A., Bright, P., y Jackson, V. (1988) Functional diversity amongputative E2 isozyme in the mechanismof ubiquitin-histone ligation. J. Biol. Chem. 263, 13268. Haas, AJL. y Bright, P. (1987) The dynamics of ubiquitin pools within cultured humanlung fibroblasts. J. Biol. Chem.262, 345. Haas, A.L. y Rose, I.A. (1981) Hemin inhibits ATP-dependent ubiquitin-dependent proteolysis! Role of hemin in regulating ubiquitin conjugate degradation. PToc. Nat}. Acad. Sci. USA 78, 6845. Haas, A.L. y Rose, I.A. (1982) The mechanism of ubiquitin activating enzyme:A kinetic and equilibrium analysis. J. Biol. Chem. 257, 10329. Haas, A.L., Ahrens, P., Bright, P.M. y Ankel, H. (1987) Interferon induces a lS-Kilodalton protein exhibiting marked homology to ubiquitin. J. Biol. Chem. 262,.11315. Haas, A.L., Warms, J.B.V. y Rose, I.A. (1983) Ubiquitin adenylate: Structure and role in ubiquitin activation. Biochemistry 22, 4383. Haas, A L., Narms, J.B.V., Hershko, A. y Rose, I.A. (1982) Ubiquitin-activating enzyme: Mechanism and role in protein­ ubiquitin conjugation. J. Biol. Chem.257, 2543. Hager, K.M., Mandala, S.M., Davenport, J.w., Speicher, D.W., Benz, Jr., E.J. y Slayman, C.W. (1936) Amino acid sequence of the plasma membrane ATPase of Neungspgra crasas: Deduction from genomic and cDNAsequences. FToc. Natl. Acad. Sci. USA83, 7693. Hallgen, B. y Sourander, P. (1960) The non-haemin iron in the cerebral cortex in Alzheimer's disease. J. Neurochem.5, 307. Hanecak, R. et al. (1984) CEI} 37, 1063.

- 303 ­ Bibliografía

Harding, H. y Rogers, G. (1976) Biochim. Biophys. Acta 427, 315. Hardy, M.F., Mantle, D., Edmunds, T. y Pennington, R.J.T. (1931) A high-molecular-weight enzyme from ekeletal muscle which hydrolyeee chymotrypein eubetratee‘ Biochem. Soc. 7Tans. 9, 218. Harnisoh, U., Weiss, H. y Sebald, W. (1935) The primary structure of the iron-eulfur eubunit of ubiquinol-oytoohrome o reductase from flegzgfipgra, determined by cDNAand gene sequencing. Ehr. J. Biochem. 149, 95. Hart, G.W. (1936) Ubiquitination of cell-surface glycoproteins. TIBS 11, 272. Hart, M.N., Cancilla, P.A., Frommes, S. y Hirano, A. (1977) Anterior horn cell degeneration and Bunina-type inclusions associated with dementia. Acta. Neuropathol. 38, 225. Haee, J., Kobaehi, K., Nakai, H., Miteui, K., Iwata, K. y Takadera, T. (1930) The quaternary structure of carp muscle alkaline protease. Biochim. Biophys. Acta 611, 205. Haeunuma, K.A., Toh-E., A. y Ishikawa, T. (1976) Biochim. Biophys. Acta 432, 223. Hatch, C.L., Bonner, N.M. y Moudrianakis, E.N. (1983) Differential accesibility of the aminoand carboxy termini of histone' H2A in the nucleosome and its histone subunits. Biochemistry 22, 3016. Hatfield, P. y Vierstra, R. (1989) Ubiquitin-dependent proteolytic pathway in wheat germ: Isolation of multiple forms of ubiquitin-activatin enzyme, E1. Biochemístry 28, 735. Hayhee, B. y Kina, B. (1981) in: The molecular biology of the yeast Saccharomycescerevisjae: Life cycle and inheritance (J. Strathern, E. Jones & J. Broac, eds.) Cold Spring Harbor, N.Y., PP.371-414. Heikkila, R., Schwab, G., Wickstrom, E., Loongloke, S., Pluznik, D.H., Watt, R. y Neckers, L.M. (1987) Nature 328, 445. Hemmings, B.A. (1985) Regulation of cAMP-dependent protein kinase in oultured cells. Carr. Top. Cell. Regal. 27, 7.

- 304 — Bibliografía

Hemmingsen, 5.“. et al. (1984) Nature 333, 330. Hershko, A. (1983) Ubiquitin: Roles in protein modification and breakdown. Cell 34, 11. Hershko, A. y Ciechanover, A. (1986) The ubiquitin pathway for the degradation of intracellular proteins. ETog. Nucleic Acids Res. no1. Biol. 33, 19. Hershko, A. y Rose, I. (1987) Ubiquitin-aldehyde: A general inhibitor of ubiquitin-recycling processes. Esos. Natl. Acad. Sci. USA84, 1829. Hershko, A., Ciechanover, A., Heller, H., Haas, A.L. y Rose, I.A. (1980) Proposed role of ATPin protein breakdown: Conjugation of proteins with multiple Chains of the polypeptide of ATP-dependent proteolysis. Proa. Nhtl. Acad. Sci. USA77, 1783. Hershko, A., Cieohanover, A., y Rose, I.A. (1981) Identification of the active amino acid residue of the polypeptide of ATP­ dependent protein breakdown. J. Biol. Chem. 256, 1525. Hershko, A., Eytan, E., Cieehanover, A. y Haas, A.L. (1982) Immunoehemioalanalysis of the turnover of ubiquitin-protein eonjugates in intact cells. J. Biol. Chem.257, 13964. Hershko, A., Heller, H., Elias, S. y Ciechanover, A. (1983) Components of ubiquitin-protein ligase system: Resolution, affinity purifioation, and role in protein breakdown.J. Biol. Chem. 258, 3206. Hershko, A., Heller, H., Eytan, E. y Reiss, Y. (1986) The protein substrate binding site of the ubiquitin-protein ligase system. J. Biol. Chem. 261, 11992. Hershko, A., Heller, H., Eytan, E., Kaklij, G. y Rose, I.A. ,(1984b) Role of the a-amino group of protein in ubiquitin­ mediated protein breakdown. Proa. Natl. Acad. Sci. USA81, 7021. Hershko, A., Leshinksy, E., Ganoth, D. y Heller, H. (1984) ATP­ dependent degradation of ubiquitin-protein eonjugates. Proc. Nati. Acad. Sci. USA81, 1619.

— 305 ­ Bibliografía

Hiromi, Y., Okamoto, H., Gehring, W.J. y Hotta, Y. (1936) Germline transformation with Drosophjla melanogaster mutant actin genes induces constitutive expression of heat shock genes. Céll 44, 293. Hirsch, H.M. (1954) Physjol. Füantarum 7, 72. Ho, Y.S., Wulff, D. y Rosenberg, M. (1986) Protein-nucleic interactions involves in transcription activation by the phage X regulatory protein cII, in: Régulation of GeneEkpression (I. Booth and C. Higgins, eds.), Cambridge University Press, New York, pp. 79-103. Horowitz, N.H. (1985) Biach. Bipphys. Res. Commun.18, 686. Horowitz, N.H. y Shen, 8.0. (1952) J. Biol. Chem. 197, 513. Horowitz, N.H., Fling, M., Feldman, H.M., Pall, M.T. y Froehner, 8.0. (1970a) Derepression of tyrosinase synthesis in Henrgfipgra by amino acid analogs. Dev. Biol.21, 147. Horowitz, N.H., Fling, M., Hacleod, H. y Watanabe, Y. (1961) Cold Spring Harbor Symp. Quant, Biol. 26, 233. Horowitz, N.H., Macleod Feldman, H. y Pall, M.L. (1970b) J. Biol. Chem. 245, 2784. Hough, R. y Rechsteiner, M. (1984) Effects of temperature on the degradation of proteins in rabbit reticulocyte lysates and after injection into HeLacells. Proa. Nati. Acad. Sci. USA81, 90. Hough, R. y Rechsteiner, M. (1988) Ubiquitin-lysozyme conjugates: Purification and susceptibility to proteolysis. J. Biol. Chem. 261, 2391. Hough, R., Pratt, G. y Rechsteiner, M. (1986) Ubiquitin-lysozyme conjugates: Identification and characterization of an ATP­ dependent protease from rabbit reticulocyte lysates. J. Biol. Chem. 261, 2400. Hough, R., Pratt, G. y Rechsteiner, M. (1987) Purification of two high molecular weight proteases from rabbit reticulocyte lysate. J. Biol. Chem..262, 8303.

—. _ Bibliografia

Hoyt, M.A., Knight, D.M., Dae, A. Miller, H.I. y Echole, H. (1982) Control of phage X development by stability and synthesie of cII protein: Role of the viral cIII and host hfïA, himA and himD genes. CEI] 31, 565. Huang, SL, Elliot, R.C., Liu, P.S., Koduri, R.K., Weickmann, J.L., Lee, J H., Blair, L.C., Ghosh-Dastidar, P., Bradshaw, R.A., Bryan, K.M., Einarson, B., Kendall, R., Kolacz, K.N. y Saito, K. (1987) Biochemistry 26, 8242. Huang, S.Y., Barnard, M.B., Xu, M., Mateui, 8.1., Rose, S.M. y Garrard, W.T. (1986) The active immunoglobulin kappa chain gene is packaged by non-ubiquitin-conjugated nucleoeomes. PToc. Nati. Acad. Sci. USA83, 3738. Huebechman, C. (1952) Mycologia 44, 599. Huiet, L. y Giles, N. (1986) The qa repressor gene of flggzgñpgza Qzaafia: Wild-type and mutant nucleotide sequences. PToc. Nati. Acad. Sci. USA83, 3381. Huisman, O. y D'Ari, R. (1981) An inducible DNA replication-cell division coupling mechaniem in E. coli. Nature 290, 797. Hultmark, D., Klemenz, R. y Gehring, W.J. (1986) Translational and transcriptional control elements in the untranelated leader of the heat-shock gene hspZQ. Cell 44, 429. Hunt, L.T. y Dayhoff, M.0. (1977) Amino-terminal sequence and identity of ubiquitin and the nonhietone componentof nuclear protein A24. Biochem. Biophys, Res. bmmun. 74, 650. Ikenaka, T., Shimada, K. y Mateushima, Y. (1963) The N-terminal amino acid of eoybean trypeine inhibitor. J. Biochem. 54, 193. Iehiura, S. y Sugita, H. (1986) Ingenein, a high-molecular-mase alkaline proteaee from rabbit reticulocyte. J. Biochem. 100, 753. Ishiura, 8., Nojima, M., Yamamoto, T., Fuchiwaki, T., Okuyama, T., Furuya, H. y Sugita, H. (1986b) Effects of linoleic acid and catione on the activity of a novel high-molecular weight proteaee, ingenein, from human placenta. Int. J. Biochem. 18, 765.

—3o7— Bibliografía

Ishiura, 0.,f" Sano, M., Kamakura, K. y Sugita, H. (1985) Isolation of two forms of the high-molecular mass serine protease, ingensin, from porcine skeletal muscle. EEESLett. 189, 119. Ishiura, .S., Yamamoto, T., Nojima, M. y Sugita, H. (l986a) Ingensin, a fatty-acid-activated serine proteinase fromrat liver cytosol. Biochim. Biophys. Acta 882, 305. Ismail, F. y Gevers, w. (1983) A high-molecular-weight cysteine endopeptidase from rat skeletal muscle. Biochim. Biophys. Acta 742, 399. Izquierdo, M., Arribas, C., Galceran, J., Burke, J. y’ Cabrera, V.M. (1984) Characterization of a Drosophila repeat mapping at the early ecdysone puff 63F and present in many eukaryotic genomes. Biochim. Biophys. Acta 783, 114. Jabben, M., Shanklin, J. y Vierstra, R. (1989a) Ubiquitin­ phytochrome conjugates. J. Biol. Chem. 264, 4998. Jabben, M., Shanklin, J. y Vierstra, R.D. (1989) Red light­ induced accumulation of ubiquitin-phytochrome conjugates in both monocots and dicots. Plant Physiol. 90, 380. Jackson, R. y Hunter,'T. (1970) Nature(London) 227, 672. Jackson, V. y Chalkley, R. (1981) A reevaluation of new histone deposition on replicating chromatin. J. Biol. Chem.256, 5095. Jacobsen, B.K. y Pelham, H R.B. (1988) Constitutive binding of yeast heat shock factor to DNAin Vivo. No]. Cell. 3101.8, 5040. Jakubowski, H. y Fersht, A.R. (1981) Alternative pathways for editing non-cognate amino acids by aminoacyl-tRNA synthetases. Nucl. Acids Res. 9, 3105. Jenson, J., Goldstein, G. y Breslow, E. (1980) Physical-chemical properties of ubiquitin. Biochim. Biophys. Acta 624, 378. Jentsch, 5., McGrath, J. y Varshavsky, A. (1988) The ubiquitin­ protein ligase system of S. cerevisiae. Current communication in Molecular Biology. The ubiquitin system (M. Schlesinger & A. Hershko) Cold Spring Harbor, NewYork, 1864139.

- 308 — Bibliografía

Jentech, 5., McGrath, J.P. y Varehaveky, A. (1987) The DNArepair gene RADBencodee a ubiquitin-eonjugating enzyme. Nature 329, 131. Johnston, D., Oppermann, H., Jackson, J. y Levinson, W. (1980) Induction of four proteins in chick embryo cells by sodium arsenite. J. Biol. Chem. 255, 6975. Jones, E.N. (1984) The synthesis and function of proteases in Saccharoyces: Genetic approaches. Annu. Rev. Genet. 18, 233. Jones, M.O. y Herekowitz, I. (1978) Mutante of bacteriophage X which do not require the cIII gene for efficient lysogenization. Virology'88, 199. Jonnalagadda, S., Butt, T.R , Monia, B.P. Mirabelli, C.K., Gotlib, L., Ecker, D.J. y Crooke, S.T. (1989) Multiple (Alpha-NH­ ubiquitin) protein endoproteases in cells. J. Biol. Chem. 264, 10637. Jorge, J.A. y Terenzi, H.Fu (1980) Develop. Biol. 74, 231. Julius, D. et al. (1933) Cell 32, 839. Kabat, E.A., Wu, T.T., Bilofsky, H. y Reid-Miller, M. (1983) Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Washington, DC, pp. 14-29. Kadonaga, J.T., Jones, K.A. y Tijan, R. (1986) Promoter-epecific activation of RNA polymeraee II transcription by Spl. TIBS 11, 7 . Kahana, C. y Nathans, D. (1985) J. Biol. Chem. 260, 15390. Kaji, A., Kaji, H. y Novelli, G.D. (1966) J. Biol. Chem. 240, 1185. Kaji, H. (1968) Biochemistry 7, 3844. Kaji, H. (1976) Biochemistry 15, 5121. Kaji, H. y Rao, P. (1976) EEES Lett. 66, 194.

— 309 ­ Bibliografía

Kanda, F., Matsui, S.L., Sykes, D.E. y Sandberg, A,A. (1984) Affinity of chromatin structures for isopeptidase, Biochem. Bio­ phys. Res. Commun. 122, 1296. Kanda, F., Slykes, D.E., Yasuda, H., Sandberg, A.A. y Matsui, S. I. (1986) Substrate recognition of isopeptidase: Specific cleavage of the E-(a-glycyl) lysine linkage in ubiquitin-protein conjugates. Biochim. Biophys. Acta 870, 64. Kapoor, M. (1986) A study of the effect of heat shock and metal ions on protein synthesis in fl.'g;afifia. Int. J. Biochem. 18, 15. Kapoor, M. y Lewis, J. (1987) Alteration of the protein synthesis pattern in N¿_gxañnacells by hyperthermal and oxidative stress. Can. J. Microb. 33, 162. Karin, M., Haslinger, A., Holtgreve, H., Richards, R I., Krauter, P., Westphal, H.M. y Beato, M. (1984) Characterization of DNA sequences through which cadmium and glucocorticoid hormones induce humanmetallothionein-IIa gene. Nature (London) 308, 513. Kasper,_T.J., Boissel, J.P. y Bunn, H.F. (1987) Specificity of N­ terminal amino-peptidase: Analysis by site-directed mutagenesis. Abstr. ASBCMeeting, Fed. Proc. 46, 1980-1981. Katayama-Fujimura, Y., Gottesman, S. y Maurizi, M.R. (1987) A multiple-component, ATP-dependentprotease from EBcherichia coli. J. Biol. Chem. 262, 4477. Katz, A. y Kahana, C. (1987) Transcriptional activation of mammalianornithine decarboxylase during stimulated growth. Mb}. Cell Biol. 7, 2641. Kaufer, N.F., Fried, M.M., Schwindinger, H.F., Jasin, M. y Wainter, J.R. (1983) Nuc. Acids Res. 11, 3123. Kelley, P.M. y Schlesinger, M.J. (1978) The effect of amino acid analog and heat shock on gene expression in chicken embryo fibroblasts. Ce11 15, 1277. Kelly, K., Cochran, B.H., Stiles, C.D. y Leder, P. (1983) Cell­ specific regulation of the c-myc gene by lymphocyte mitogens and PDGF. Céll 35, 603.

- 310 — Bibliografía

Kelly, L.J., Kelly, R. y Ennie, H.L. (1983) Characterization of cDHAclones specific for eequencee developmentally regulated during Dictyostelium discoideum spore germination. Mol. Cbll. Biol. 3, 1943.

Ssály. R.. Shaw. D.R. y Ennie, H.L. (1987) Hbl. Cbll Biol. 7. Kerwar, S.S., Weissbach, H. y Glener, G.G. (1971) Arch. Biochem. Biophys. 143, 336. Kinnaird, J.H. y Fincham, J.R.S. (1983) The complete nucleotide sequence of the flegxgfipgxa_gxasfin am (NADP-Specific glutamate dehydrogenaee) gene. Gene 26, 253. Kinnaird, J.H., Keighren,M.A., Kinsey, J A., Eaton, M. y Fincham, J.R.S. (1932) Cloning of the am (glutamate dehydrogenase) gene of 20)Neurgfipgxa_gzafina ' through the use of a synthetic DNAprobe. Gene Kirchhoff, A.V., Kim, K.S., Engman, D.M. y Donelson, J.E. (1988) Ubiquitin genes in Trypanosomatidae. J. Biol. Chem.263, 12693. Kleinechmidt, J.A., Hügle, B., Grund, C. y Franke, W.W. (1983) The 22 S eylinder partielee of X. Jaevis. I. Biochemical and electron microscopio characterization. Eur. J. Cell Biol. 32, 143. Klug, A. y Rhodes, D. (1987) 'Zinc fingers': a novel protein motiv for nucleic acid recognition. TIBS12, 464. Knowles, S.E. y Ballard, F.J. (1978) Selective control of the degradation of normal and aberrant proteins. Biochem. J. 156, 609. Konarska, M.m. y Sharp, P.A. (1987) Cell 49, 763. Kornfeld, E.C., Jonee, R.G. y Parke, T.V. (1949) J. Am. Chem. Soc. 71, 150. Kozak, M. (1987) Nucl. Acids Res. 15, 8125. Krause, M. e Hireh, D. (1987) A trans-epliced leader sequence on actin mRNAin C. elegans. Cell 49, 753

— 311 — Bibliografía

Kreader, C.A. y Heckman, J.E. (1937) Isolation and character­ ization of a flegrgspora_grassa ribosomal protein gene homologous to CYHZof yeast. Nucl. Acids Res. 15, 9027. Krieg, J., Hofsteenge, J. y Thomas, G. (1988) J. Biol. Chem. 263, 11473. Krone, P.H. y Heikkila, J.J. (1988) Analysis of hsp30, hsp70 and ubiquitin gene expression in Xenopuslaevis tadpole. Development 103, 59. Krüger, C. y Benecke, B.J. (1981) In vitro translation of Drosophila heat-shock and non-heat-shock mRNAsin heterologous and homologouscell-free systems. Céll 23, 595. Krumlauf,fiR. y Marzluf, G.A. (1980) J. Biol. Chem. 255, 1133. Kulka, R., Raboy, B., Schuster, ‘., Parag, H., Diamond, G., Ciechanover, A. y Marcus, M. (1983) A Chinese hamster cell cycle mutant arrested at G2 phase has a temperature-sensitive ubiquitin-activating enzyme, E1, J. Biol. Chem.263, 15726. Kurjan, J. y Herskowitz, I. (1982) Cell 30, 933. Landick, R., Vaughn, V., Lau, E.T,, VanBogelen, R.A., Erickson, W. y Neidhardt, 5.0. (1984) Nucleotide sequence of the heat shock regulatory gene of Escherichia coli suggests its protein product may be a transcription factor. Cell 38, 174. Lane, C., Shannon, S. y Craig, R. (1979) Sequestration and turnover of guinea-pig milk proteins and chicken ovalbumin in Xenopus oocytes. Eur. J. Biochem. 101, 485. Latchman, D.S., Estridge, J.K. y Kemp, L.M. (1987) Transcriptional induction of the ubiquitin genes during herpes simplex virus infection is dependent upon the viral immediate­ early protein ICP4. Nuel. Acids Res. 15, 7283. Lawson, R., Mestril, R., Schiller, P. y Voellmy, R. (1984) Expression of heat shock a-galactosidase hybrid genes. M01. Gen. Genet. 198, 116. ‘ Leach, B.E., Ford, J.H. y Nhiffen, A.J. (1947) J. Am. Chem. Soc. 69, 474.

- 312 ­ Bibliografía

Lee, H., Simon, J.A. y Lis, J.T. (1983) Structure and expression of ubiquitin genes of Drosophila melanogaster. Mol. Cbll. Biol. 8, 4727. Lee, P.L. y Midelfort, C F., Murakami, K. y Hatcher, V.B. (1986) Mutiple forms of ubiquitin-protein ligase: Binding of activated ubiquitin to protein substrates. Biochemistry 25, 3134. Legerton, T.L. y Yanofsky, C. (1985) Cloning and characterization of the multifunctional his-3 gene of flenzgfipgra_gzaafia. Gene 39, 129. Leibovitz, M.J. y Soffer, R.L. (1989) Biochem. Biphys. Res. Cbmmun. 36, 47. Leibovitz, M.J. y Soffer, R.L. (1971) PToc. Nati. Acad. Sci. USA 68, 1866. Leigh, P.N., Anderton, B.H., Dodson, A., M.Gallo, J., Swash, M. y Power, D.M. (1938) Ubiquitin deposite in anterior horn cells in motor neurone disease. Neurosci. Lett. 93, 197. Lenkinski, R.E., Chen, D.M., Glickson, J.D. y Goldstein, G. (1977) Nuclear magnetic resonance studies of the denaturation of ubiquitin. Biochim. Bíophys. Acta 494, 126. Lennox, G., Lowe, J., Morell, K., Landon, M. y Mayer, R.J. (1983) Ubiquitin is a componentof neurofibrillary tangles in a variety of neurodegenerative diseases. Neurosci. Lett. 94, 211. Leung, D.w., Spencer, S.A., Cachianes, G., Hammonds, R.G., Collins, C., Henzel, W.J., Barnard, R., Waters, M.J. y Wood, W.I. (1987) Growth hormone receptor and serum binding protein: Purification cloning and expression. Nature 330, 537. Levine, R.L. (1983) Oxidative modification of glutamine synthetase. Inactivation is due to loss of one histidine residue. J. Biol. Chem. 258, 11823. Levinger, L. y Varshavsky, A. (1980) High-resolution fraction­ ation of nucleosomes: Minor particles, "whiskers", and separation of mononucleosomes containing and lacking A24 semihistone. FToc. Nati. Acad. Sci. USA77, 3244.

— 313 — Bibliografía

Levinger, L. y Varshavsky, A. (1982) Selective arrangement of ubiquitinated and D1protein-containing nucleosomes within the Drosophila genome. Cell 28, 375. Levinger, L., Barsoum, J. y Varshavsky, A. (1981) Twodimensional hybridization mapping of nucleosomes. Comparison of DNA and protein patterns. J. Mel. Bici. 146, 287. Levitt, M. (1978) A simplified representation of protein conformation for rapid simulation of protein folding. J. M01 Biol. 104,'59. Libby, P. y Goldberg, A. (1981) Comparison of the control and pathways for degradation of the acetylcholine receptor and average protein in cultured muscle cells. J. Cell. Physiol. 107, 185. Lindquist, S. (1981) Regulation of protein synthesis during heat shock. Nature 293, 311. Lindquist, S. y Craig, E.A. (1938) The heat-shock proteins. Ann. Rev. Genet. 22, 631. Lipman, D.J. y Pearson, W.R. (1985) Rapid and sensitive protein similarity searches. Science 227, 1435. Lipmann, F. (1971) Attempts to map a process evolution of peptide biosynthesis. Science 173, 875. Lis, J.T., Neckameyer, W., Dubensky, R. y Costlow, N. (1981) Cloning and characterization of nine heat-shock-induced mRNAsof Drcsophila melancgaster. Gene 15, 67. Loefer, J.B. y Matney, T.S. (1952) Physiol. Ecol. 25, 272. Loidl, P. (1988) Towards an understanding of the biological function of histone acetylation. FEBSLett. 227, 91. Lowe, J., Blanchard, A., Morrell, K., Lennox, G., Reynolds, L., Billet, M., Landon, M. y Mayer, R.J. (1988a) Ubiquitin is a commonfactor in intermediate filaments inclusion bodies of diverse type in man, including those of Parkinson's disease, Pick's disease, and Alzheimer's disease, as well as Rosenthal fibres in astroeytomas, cytoplasmic bodies in muscle, and Mallory bodies in alcoholic liver disease. J. Futbol. 155, 9.

— 314 ­ Bibliografía

Lowe, J., Lennox, G., Jefferson, D., Morrell, K., McQuire, D., Gray, T., Landon, M., Doherty, F.J. y Mayer, R,J. (1988b) A filamentous inclusion body within anterior horn neurones in motor neurone disease defined by immunocytochemical localization of ubiquitin. Neurosci. Lett. 94, 203. Lund, P.K., Moats-Staats, B. y Simmons, J.G. (1988) Family of humanubiquitin genes. Current communications in Mblec. 3101.. The Ubiquitin System (ed. M. Schlesinger, A. Hershko). Cbld Spring Harbor Laboratory, pp. 43-49. Lund, P.K., Moats-Staats, B.M., Simmons, J.G., Hoyt, E., D'Ercole, A.J., Martin, E. y Van Wyk, J.J. (1985) Nucleotide sequence analysis of a CUNAencoding humanubiquitin reveals that ubiquitin is synthesized as a precursor. J. Biol. Chem. 260, '7609. Magnusson, K. y Wieloch, T. (1989) Neurosci. Lett. 94, 264. Manetto, V., Perry, G., Tabaton, M., Mulvihill, P., Fried, V., Smith, H., Sambetti, P. y Autilio-Gambetti, L. (1988) Ubiquitin is associated with abnormalcytoplasmic filaments characteristic of neurodegenerative diseases. füvc. Nati. Acad. Sci. USA 85, 4501. Maniak, M. y Nellen, W. (1988) A developmentally regulated membraneprotein gene in Dictyostelium discoideum is also induced by heat shock and cold shock. No}. Cell. Biol. 8, 153. Marc Gallo, J. y Anderson, B.H. (1989) Ubiquitin variations in nerves. Nature 337, 7. Markussen, G., Smith-Kielland, I. y Dornish, J. (1984) Inhibition of protein A24 ligase by nitrosoureas. EEESLett. 176, 426. Martegani, E. y Alberghina, L. (1979) Intracellular protein degradation in H¿_anfifia. J. Biol. Chem. 254, 7047. Martins de Sa, C., Grossi de Sa, M.F., Akyakat, 0., Broders, F., Scherrer, K., Horsch, A. y Schmid, H.P. (1986) Prosomes: Ubiquity and inter-species structural variation. J, Mol. Biol. 187, 479. Martinson, H,G., True, R., Lau, C.K. y Mehrabian, M. (1932) Histone-histone interactions with chromatin, Preliminary location of multiple contact sites between histones 2A, 28, and 4. Biochemistry 18, 1075. Bibliografía

Marunouohi, T., Yasuda, H., Matsumoto, Y. y Yamada, M. (1980) Disappearance of a chromosomalbasic protein from cells of a mouse temperature-sensitive mutant defective in histone phosphorylation. Biochem. Biophys. Res. Cbmmun.95, 126. Marx, J.L. (1986) Ubiquitin moves to the cell surface. Science 231, 8. Marzluf, G.A. (1981) Microbiol. Rev. 45, 437. Masaki, H., Yamamoto, A. y Tashiro, Y. (1987) Cytochrome P-450 and NADPH-cytochrome P-450 reductase are degraded in the autolysosomes of rat liver. J. CEI}. Biol. 104, 1207. Matacic, S. y Loewy, A. (1968) Biochem. Biophys, Res. Cbmmun. 30, 356. Matsui, S. (1988) Suppressors for isopeptidase: A possible regulator to determine the steady-state level of ubiquitinated proteins. J. CEI] Biology 107(6), part 3, ref.2227. Matsui, 5.1., Seon, B. y Sandberg, A. (1979) Disappearance of a structural chromatin protein A24in mitosis: Implications for molecular basis of chromatin condensation. PToc. Nat}. Acad. Sci. USA 76, 6386. Matsui, S.L., Sandberg, A.A., Negoro, 8., Seon, B.K., y Goldstein, G. (1982) Isopeptidase: A novel eukaryotic enzyme that cleaves isopeptide bonds. Proa. Nati. Acad. Sci. USA79, 1535. Matsumoto, Y., Yasuda, H., Mita, 5., Marunouchi. T. y Yamada, M. (1980) Evidence for involvement of H1 histone phosphorylation in chromosome condensation. Nature 284, 131. Matsumoto. Y.I., Yasuda, H., Marunonuchi, T. y Yamada, M.A. (1983) Decrease in uH2A(protein A24) of a mouse temperature sensitive mutant. FE S Lett. 151, . Maurizi, M.R. (1987) Degradation in VÍÉFO' of bacteriophage X N protein by Jon protease from EScherichia coli. J. Biol. Chem. 262, 2696. Mayer, A., Siegel, N.R., Schwartz, A.L. y Ciechanover, A. (1989) Degradation of proteins with acetylated amino termini by the ubiquitin system. Science 244, 1480.

- 316 — Bibliografía

Mayer, R. y Doherty, F. (1986) Intracellular protein catabolis ‘State of the art. EEESLett.198, 181. McCurdy, D.W. y Pratt, L.H. (1986) Immunogold electron microscopy of the phytochrome in Avena: Identification of intracellular sites responsible for phytochromesequestering and enhanced pel­ latability. J, Gel} Biol. 103, 2541. McElligott, M., Miao, P. y Dice, J. (1985) Lysosomal degradation of ribonuclease A and ribonuclease S-protein microinjected into human fibroblasts. J. Biol. Chem. 260, 11986. McGarry, TQJ, y Lindquist, S. (1985) The preferential translation of Drosophila hsp70 mRNArequires sequences in the untranslated leader. Cell 42, 903. McGrath, J., Jentch, S. y Varshavsky, A. (1988) Molecular genetic analysis of the yeast ubiquitin-protein ligase system. J. Cell Biology 107(8), part 3, ref. 3476. McGuire, M.J. y DeMartino, G.N. (1986) Purification and char­ acterization of a high molecular weight proteinase (macropain) from human erythrocytes. Bjochim. Biophys. Acta 873, 279. McGuire, M.J., Croall, D.E. y DeMartino, G.H, (1983) ATP­ stimulated proteolysis in soluble extract of BHKcells 21/013 cells. Arch. Biochem. Biophys. 263, 273. McKnight, S. y Tijan, R. (1986) 0911 46, 795. McLauchlan, J., Gaffney, D., Whitton, J.L. y Clements, J,B. (1985) Nucl. chds Res. 13, 4 . Mechanic, G. y Levy, M. (1958) J, Am. Chem. Soc. 81, 1889. Medrano, E.E., Burrone, 0.8., Ferrer, M.M., Cafferata, E.G.A. y Algranati, I.D. (1986) A novel mechanismof resistance to a­ difluoromethylornithine induced by cycloheximide. EEESLett. 206, 106. Mellgren, R.L. (1987) Calcium-dependent protease: An enzyme system active at cellular membrane. FHSEBJ. 1, 110. Messing, J. y Vieira, J. (1932) A new pair of M13vectors for selecting either DNAstrand of double-digest restriction fragments. Gene 19, 269. Bibliografia

Metcalf, B.W., Bey, P., Danzin, 0., Jung, M.J., Caeara, P. y Veveet, J.P. (1978) J. Am. Chem. Soc. 100, 2551. Meyer, E.M., West, C.M. y Chau, V. (1936) Antibodiee directed against ubiquitin inhibit high.affinity [3H] choline uptake in rat cerebral cortieal eynaptoeomee. J. Biol. Chem.261, 14365. Meyer, E.M., West, C.M.h Stevens, B.R., Chau, V., Nguyen, M. y Judkine, J.H. (1987) Ubiquitin-directed antibodies inhibit neuronal transportere in rat brain eynaptoeomes. J. of Neurochemistry 49, 1815. Mezquita, J., Chiva, M., Vidal, 5., Mezquita, C. (1982) Effect of high mebility group non-hietone proteins BMG-20(ubiquitin) and BMG-17on hietone deacetylase activity assayed in Vitro. Nuol. Acids Res. 10, 1731. Mezquita, J., Oliva, R. y Mezquita, C. (1987) Newubiquitin mRNA expressed during chicken spermiogeneeis. Nucl. Acido Res. 15, 9604. Mezquita, J., Pau, M. y Mezquita, C. (1988) cDNA encoding a chicken ubiquitin-fusion protein identical to the corresponding human protein. Nucl. Aeids Res. 16, 11838. Miller, C.G., Strauch, K.L., Kukral, A.M., Miller, J.L., Wingfield, P T., Mazzei, G.J., Werlen, R.C., Graber, P. y Movva, N.R. (1987) N-terminal methionine-specific peptidase in Salmonella typhimurium. Proa. Natl. Acad. Sci. USA84, 2718. Miller, H.I., Henzel, W.J., Ridgway, J.B., Kuang, W.J., Chisholm, V. y Liu, C.C. (1939) Cloning and expression of a yeaet ubiquitin-protein cleaving activity in E. coli. Biotechnology 7, 698. A Miller, J., McLachlan, A.D. y Kiug, A. (1985) Repetitive zinc­ binding domains in the protein transcription factor IIIA from XEnopus oocytes. EHBÜJ. 4, 1609. Mirault, ME., Goldschmidt-Clermont, M., Moran, L., Arrigo, A.P. y Tieeierez, A. (1977) The effect of heat shock on gene expression in Drosohpila melanogaster. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 42, 819. Bibliografía

Mirault, M,E., Southgate, R. y Delwart, E. (1982) Regulation of heat-shock genes: A DNA sequence upstream of Drosophila hspTO genes is essential for their induction in monkeycells. EHBÜJ. 1, 1279. Mirkes, P.E. (1974) Polysomes, ribonucleic acid and protein synthesis during germination of fll_nrafifinconidia. J. Bacteriol. 117, . Mirkes, P.E. (1977) Role of the carbon source in the activation of ribonucleic acid synthesis during the germination of conidia. Exp. Mycol. 1, 271. Mita, 8., Yasuda, H., Marunouchi, T., Ishiko, S. y Yamada, M. (1980) A temperature-sensitive mutant of cultured mouse cells defective in chromosomecondensation. ERP. Cell Res. 126, 7 Mizusawa, S. y Gottesman, S. (1982) Protein degradation in Escherichia coli: The Jon gene controls the stability of SulA protein. Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 353. Mohum,T., Garrett, N. y Treisman, R. (1937) Xenopus cytoskeletal actin and human c-fcs gene promoters share a conserved protein­ binding site. EWBÜJ. 6, 667. Monia, B.P., Butt, T.R., Ecker, D J., Mirabelli, C.K. y Crooke, S.T. (1986) Metallothionein turnover in mammaliancells. J. Biol. Chem. 261, 10957. Monia, B.P., Ecker, D.J., Jonnalagadda, 8., Marsh, J., Gotlib, L., Butt, T.R. y Crooke, S.T. (1989b) Gene synthesis, expression, and processing of humanubiquitin carboxyl extension proteins. J. Biol. Chem. 264, 4093. Monia, B.P., Haskell, K.M., Ecker, J.R., Ecker, D.J. y Crooke, S.T. (1989a) Chromosomalmapping of the ubiquitin gene family in Saccharomycescerevisiae by pulsed field gel electrophoresis. Nucl. Acids. Res. 17, 3611. Montelone, B., Prakash, S. y Prakash, L. (1981) Recombination and mutagenesis in RADBmutante of Saccharomyces cereviciae: Evidence for multiple functions of the EADS gene. Mol. Gen. Genet. 184, 410.

— 319 ­ Bibliografía

Mori, H., Kundo, J. y Ihara, Y. (1987) Ubiquitin is a component of paired helical filaments in Alzheimer's disease. Science 235, 1641. Moss, T., Cary, P.D., Aberchrombie, B.D., Crane-Robinson, C. y Bradley, E.M. (1976) A pH-dependent interaction between histones H2Aand HZBinvolving secondary and tertiary folding. Eur. J. Biochem. 71, 337. Mosser, B.D., Theodorakis, N.G. y Morimoto,R.I. (1988) Coordinate changes in heat shock element-binding activity and hsp70 gene transcription rates in humancells. Hal. Cell. Biol. 8, 4736. Mueller, B.D., Yasuda, H., Hatch, C.L., Bonner, W.M.y Bradbury, E.M. (1985) Identification of ubiquitinated HZAand HZBin PMysa­ Arumpolycephalum: Disappearance of these proteins at metaphase and reappearance at anaphase. J. Biol. Chem. 260, 5147. Muller, 5., Briand, J.P. y Van Regenmortel, M.H.V. (1988) Presence of antibodies to ubiquitin during the autoimmune res­ ponse associated systemie lupus erythematosus. FToc. Nat}. Acad. Sci. USA85, 8176. Müller-Taubenberger, A., Graack, H.R., Grohmann, L., Schleicher, M. y Gerisch, G. (1989) An extended ubiquitin of Dictyostelium is located in the small ribosomal subunit. J. Biol. Chem.264, 5319. Müller-Taubenberger, A., Hagmann, J., Noegel, A. y Gerisch, G. (1988a) Ubiquitin gene expression in Dictyostelium in induced by heat, cold shock, cadmiumand. inhibitors of protein synthesis. Journal of Cell Science 90, 51. Müller-Taubenberger, A., Westphal, M., Jaeger, E., Noegel, A. y Gerisch, G. (1988b) Complete cDNAsequence of a Dictyostelium ubiquitin with a carboxy-terminal tail and identification of the protein using an anti-peptide antibody. EEESLett. 229, 273. Münger, K., Germann, U.A. y Lerch, K. (1935) Isolation and structural organization of the N¿_QIñEfificopper metallothionein gene. EWBÜJ. 4, 2665. Munro, S. y Pelham, H.R.B. (1984) Use of peptide tagging to detect proteins expressed from cloned genes: Deletion mapping functional domains from Drosophila hsp 70. EHBÜJ. 3, 3087.

- 320 ­ Bibliografía

Munro, S. y Pelham, H.R.B. (1985) What turns cn heat shOck genes? Nature 317, 477. Murakami, K. y Etlinger, J.D. (1936) Endogenous inhibitor of nonlysosomal high molecular weight protease and calcium-dependent protease. FToc. Nail. Acad. Sci. USA83, 7588. Murayama, 8., Ookawa, Y., Mori, H., Nakano, I., Ihara, Y., Kuzuhara, S. y Tomonaga, M. (1989) Immunocytochemical and ultrastructural study of Lewybody-like hyaline inclusions in familial amyotrophiclateral sclerosis. Acta Nauropathol. (Berl) 78, 143. Murphy, WaJ., Watkins, K.P. y Agabian, N. (1986) 0611 47, 517. Murti, K.G., Smith, H.T. y Fried, V.A. (1938) Ubiquitin is a component of the microtubule network. Proa. Nátl. Acad. Sci. USA 85, 3019. Nahm, H.B. y Marzluf, G.A. (1987) J. Bacteriol. 169, 1943. Neff, N., Bourret, L., Miao, P. y Dice, J. (1981) Degradation of proteins microinjected into IME-90humandiploid fibroblasts. J. Cell Biol. 91, 184. ' Neidhardt, F.C., VanBogelen, R.A. y Lau, E.T. (1983) Molecular cloning and expression of a gene that controls the high­ termperature regulon of EScherichia coli. J. Bacteriol. 153, 597. Neidhardt, F.C., VanBogelen, R.A. y Vaugh, V. (1984) The genetic and regulation of heat-shock proteins. Ann: Rev. Genet. 18, 295. Neves, A.M., Barahona, I., Galego, L. y Rodrigues-Pousada, C. (1988) Ubiquitin genes in Tetrahymena pyrifbrmis and their expression during heat shock. Gene 73, 87. Nevins, J.R. y Wilson, “.0. (1981) Nature 290, 113. Nickel, B. y Davie, J. (1989) Structure of polyubiquitinated histone H2A. Biochemistry 28, 9 4. Nickel, B;, Allis, C. y Davie, J. (1989) Ubiquitinated histone HZB is preferentially located in transcriptionally active chromatin. Biochemistry 28, 958.

- 321 ­ Bibliografía

Nickel, B., Roth, 5., Cook, R., Allis, C. y Davie, J. (1987) Cáncer Res. 47, 5407. Nojima, H., Ishiura, 5., Yamamoto, T., Okuyama, T., Furuya, H. y Sugita, H. (1986) Purification and characterization of a high­ molecular-weight protease, ingensin, from human placenta. J. Biochem. 99, 1605. Ogata, N.N. (1962) Neurospera Newsletter 1, 13. Ohmachi, T., Giorda, 8., Shaw, D.R., Ennis, H.L. (1989) Molecular organization of developmentally regulated D. discoideum ubiquitin cDNAs. Bioehem. 28, 5226. Ohno, 8., Emori, Y., lmajoh, 5., Kawasaki, H., Kiearagi, M. y Suzuki, K. (1984) Evolutionary origin of a calcium-dependent protease by fusion of genes for a thiol protease and a calcium­ binding protein. Nature(London) 312, 566. Ohta, M., Marceau, N., Perry, G., Manetto, V., Gambetti, P., Autilio-Gambetti, L., Metuzals, J., Kawahara, H., Cadrin, M. y French, s.w. (1988) Ubiquitin is present on the cytokeratin intermediate filaments and Mallory bodies of hepatocytes. Laboratory Investigation 59, 848. Ükabe, T., Fujisawa, H., Sato, 5., Mihara, A., Fujiyoshi, N. y Takaku, F. (1936) Aminoterminal sequence identity of a novel autorine growth factor and ubiquitin. Fed. fumo. 45, 1716. Olsen, EuM. y Spizz, G. (1936) Mol. Cell Biol. 6, 2792. Olson, M.0.J., Goldknopf, I;L., Guetzow, K.A., James, G.T., Hawkins, T.C., Mays-Rothberg, C.J. y Busch, H. (1976) The NHz­ and GOGH-terminalamino acid sequence of nuclear protein A24. J. Biol. Chem. 251, 5901. Orbach, M.J., Porro, E.B. y Yanofsky, C. (1936) Cloning and characterization of the gene for a-tubulin from a benomyl­ resistant mutant of NQQIQSDQKQ_"QEaEñaandits use as a dominant selectable marker. No}. (bli. Biel. 6, 2452. Oren, M., Maltzman, W. y Levine, A.J. (1932) Post-translational regulation of the 54K cellular tumor antigen in normal and transformed cells. M01. Cell. Biol. 1, 101.

- 322 ­ Bibliografía

Oeofeky, L., Morandi, A., Profeuna, L., Autilio-Gambetti, L. y Gambetti, P. (1938) Induced neuronal inclusione containing ubiquitin, tau, neurofilanente epitopee. J. Cell Biology 107, Part 3, Ref. 1663. Otaka, E., Higo, K. e Itoh, T. (1984) Nolec. Gen. Genet. 195, 544. Ozkaynak, E., Finley, D. y Varshavsky, A. (1984) The yeast ubiquitin gene: Head-to-tail repeats encoding a polyubiquitin precursor protein. Nature 312, 663. Ozkaynak, E., Finley, D., Solomon, M.J. y Varshavsky, A. (1987) The yeast ubiquitin genes: A family of natural gene fusions. ENBÜ J. 6, 1429. Palmer, C. y Maloney, T.E. (1955) J. Sci. 55, 1. Palmiter, R.D., Gagnon, J. y Walsh, K.A. (1978) PToc. Nat}. Acad. Sci. USA75, 94. Paluh, J.L., Orbach, M.J., Legerton, T.L. y Yanofsky, C. (1988) The cross-pathway control gene of Neurgfingra__gzafisa, cpc-l, encodes a protein similar to GCN4 of yeaet and the DNA-binding domain of the oncogene v-jun-encoded protein. Proa. Nat}. Head. Sci. USA85, 3728. Parag, H.A., Raboy, B. y Kulka, R.G. (1938) Effect of heat shock on protein degradation in mammalian cells: Involvement of ubiquitin system. ¿NFOJ, 6, 55. Parker, 0.5. y Topol, J. (1984) A Drosophila RNApolymerase II transcription factor binde to the regulatory site of an hsp70 gene. 0611 37, 273. Pataryas, T.A., Sekeri-Pataryas, K.T., Bonner, W.M.y Marinou, V.A. (1984) Histone variante of the insect Flodia interpunctella during metamorphoeie. Temp.Bjochem. Physíol. 77B, 749. Paulue, T.J. y Davis, R.H. (1982) Biochem. Bïophys. Res. Commun. 104, 223. Pegg, A.E. (1986) Biochem. J. 234, 249.

- 323 ­ Bibliografía

Pelham, H.R.B. (1982) A regulatory upetream promoter element in the Drosophila hsp70 heat-shock gene. CEI} 30, 517. Pelham, H.R.B. (1936) Speculations on the functions of the major heat shock and glucose-regulated proteins. ¿bil 46, 956. Mini­ review. Perkins, D.D. y Barry, E.G. (1977) Adv. Genet. 19, 133. Perry, G., Friedman, R., Shaw, G. y Chan, V. (1937) Ubiquitin is detected in neurofibrillary tangles and senile plaque neurites of Alzheimer's disease brains. PToc. Nat}. Acad. Sci. USA84, 3033. Person, B., Flinta, C., Von Heijne, G. y Jornvall, H. (1985) Eur. J. Biochem. 152, 524. Phillips, M.A., Coffino, P. y .Wang, C.C. (1987) Cloning and sequencing of the ornithine decarboxylase gene from Trypanosoma brucei. J. Biol. Chem. 262, 8721. Phillips, T.A., VanBogelen, R.A. y Neidhardt, F.C. (1984) The Jon(CápR) gene product of Escherichia coli is a heat shock protein. J. Bacteriol. 159, 283. Pickart, C. y Vella, A. (1988a) Levels of active ubiquitin carrier proteins decline during erythroid maturation. J. Biol. Chem. 263, 12028. Pickart, C. y Vella, A. (1988b) Ubiquitin carrier protein­ catalyzed ubiquitin transfer to histones. J. Biol. Chem. 263, 15076. Pickart, C.M. y Rose, I.A. (1985a) Functional heterogeneity of ubiquitin carrier proteins. J. Biol. Chem.260, 1573. Pickart, C.M. y Rose, I.A. (1985b) Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolaee acts on ubiquitin carboxyl-terminal amides. J. Biol. Chem. 261, 7903. Pina, B. y Suau, P. (1985) Core histone variante and ubiquitinated histones 2Aand 2B of rat cerebral cortex neurona. Biochem. Bíophys. Res. Commun. 133, 505.

- 324 ­ Bibliografía

Pipkin, J., Anson, J., Hinson, w. y Hudson, J. (1982) The effect of isoproterenol and hydroxyurea on the presence of ubiquitin and protein A24in the rat salivary gland. Biochimica et Biophysjca Acta 699, 155. Pisano, J., Finlayson, J. y Reyton, M. (1968) Science 160, 892. Planta, R.J. y Rané, H.A. (1983) TTends Genct. 4, 64. Plesofsky-Vig, N. y Brambl, R. (1985) The heat shock response of fungi. EXP. Mchl. 9, 1187. Pohjanpelto, P. y Knuntila, S. (1982) EXP. Cell. Res. 141, 333. Pontremoli, S. y Melloni, E. (1986) Extralysosomal protein degradation. Annu. Rev. Bicchem. 55, 455. Porter, C.W. y Bergeron, R.J. (1983) Science 219, 1083. Prade, A.P. y Terenzi, H.F. (1935) Arch. Nícrcbicl. 143, 37; ibid 229, 1. Proudfoot, N.J. y Brownlee, G.G. (1976) Nature 263, 211. Raboy, B., Parag, H.A. y Kulka, R.G. (1986) Conjugation of 1251­ ubiquitin to cellular proteins in permeabilized mammaliancells: Comparison of mitotic and interphase cells ENBOJ. 5, 863. Rapoport, 5., Dubiel, W. y Müller, M. (1985) FEFE Lett. 180, 249. Ray, K. y Harris, H. (1985) Purification of neutral lens endopeptidase: Close similarity to a neutral proteinase in pituitary. Pch. Natl. Acad. Sci. USA82, 7645. Ray, K. y Harris, H. (1986) Comparative studies on lens neutral endopeptidase and pituitary neutral proteinase: Two closely similar enzymes. FEBSLett. 194, 91. Rechsteiner, M. (1987) Do myc, fos and EIA function as protein phosphatase inhibitors? Bicchcm. Bjcphys. Res, Ccmmun.143, 194. Rechsteiner, M. (1987b) Ubiquitin-mediated pathways for intracellular proteolysis. Ann. Rev. Cell, BicI.-3,

— 325 ­ Bibliografía

Reehsteiner, M. (1938) Ubiquitin. Beehsteiner ed. Plenum Press, New York,'cap 12. Redman, K.L. y Rechsteiner, M. (1988) Extended reading frame of a ubiquitin gene encodes a stable, eonserved, basic protein. J. Biol. Chem. 263, 4926. Redman, K.L. y Reehsteiner, M. (1939) Identification of the long ubiquitin extension as ribosomal protein SZ7a. Nature 338, 438. Reed, R., Griffith, J. y Maniatis, T. (1988) Cell 53, 949. Reichert, R.A., Gallatin, W.M.. Weissman, I.L. y Butcher, E.C. (1983) J. Exp. Ned. 157, 813. Reinert, W.R. y Marzluf, G.A. (1975) Mb}. Gen. Genet. 139, 39. Reiss, Y., Heller, H. y Hershko, A. (1989) Binding sites of ubiquitin-protein ligase. Bindingof ubiquitin-protein eonjugates and of ubiquitin-carrier protein. J. Biol. “hem.264, 10378. Reiss, Y., Kaim, D. y Hershko, A. (1988) Specificity of binding of MHz-terminalresidue of protein to ubiquitin-protein ligase. Use of aminoacid derivatives to characterize specific binding sites. J. Biol. Chem. 263, 2963. Bittenhouse, J., Harrscn, P.B., Kim, J.N. y Marcus, F. (1986) Amino acid sequence of the phespherylatien site of yeast (Saccharomycescerevisiae) fructose-l,B-biphosphatase. J. Biol. Chem. 261, 3939. Rivett, A.J. (1935a) Preferential degradation of the oxidatively modified form of glutamine synthetase by intracellular mammalian proteases. J. Biol. Chem. 260, 300. Rivett, A.J. (1985b) Purification of a liver alkaline protease which degrades oxidatively modified glutamine synthetase. J. Biol. Chem. 260, 12800. Roberts, A.N. y Yanofsky, C. (1989) Genes expressed during conidiation in flgungfipQra__gxafiugzcharacterization of con-8. Nucl. Acids Res. 17, 197. Rogers, 5., Wells, R. y Reehsteiner, M. (1986) Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: The PEST hypothesis. Science 234, 364.

- 326 ­ Bibliografía

Rose, I.A. y Warms, J.V.B. (1953) An enzyme with ubiquitin carboxy-terminal esterase activity from reticulocytes, Biochem­ jstry 22, 4234. Rose, I.A., Warms, J.V.B. y Hcrshko, A. (1979) A high molecular weight protease in liver cytosol. J. Biol. Chem.254, 8135. Rose, J.A. (1933) Ubiquitin. Rechsteiner ed. Plenum Press, New York, cap.5. Rosen, E., Sivertsen, A., Fertel, R.A., Wheeler, S. y Loomis, N.F. (1985) Heat shock genes of Dictyosteljum.ln changes in eukaryotic gene expression in response to environmental stress. Edited by B.G. Atkinson and D.B. Walden, Academic Press, New York, pp. 257-258. Rosenberg, N.L., Smith, R.M. y Rill, R.L. (1986) The action of chymotrypsin on nucleosome cores. J. Biol. Chem, 261, 12375. Rote, K.V. y Rechsteiner, M. (1936) Degradation of proteins microinjected into HeLacells: the role of substrate flexibility. J. Biol. Chem. 261, 15430. Rutledge, B. (1984) Molecular characterization of the qa-4 gene of Masnommm. Gene32, 275. Sabin, E.A., Lee-Ng, C.T., Shuster, J.R. y Barr, P.J. (1989) High-level expression and in vivo processing of chimeric ubiquitin fusion proteins in S. cerevisiae. Biotechnology 7, 705. Sachs, M.S., Bertrand, H., Metzenberg, R.L. y Rathandary, U.L. (1989) Cytochrome oxidase subunit V gene of Near : DNAsequences, chromosomal mapping. and evidence of the aya-4 locus specifies the structural gene for subunit V. Mol. Cell. Biol. 9, 566. ' Salvesen, G., Lloyd, C. y Farley, D. (1987) cDNAencoding a human homolog of yeast ubiquitin. Nucl. Acids Res. 15, 5485. Samaniego, F., Berry, F. y Dice J. (1981) Selective depletion of small, basic, nonglycosylated proteins in diabetes. Biochem. J. 198, 149. Sariban, E., Wu, R.S., Erickson, L.C. y Bonner, W.M. (1985) Interrelationships of proteins and DNA synthesis during replication of mammaliancells. No]. CEI}. Biol. 5, 1279. Bibliografia

Schachtele, C.F. y Rogers, P. (1965) Cananavanine death in E. coli. J. No}. Biol. 14, 474. Scheid, M.P., Goldstein, G., Hammerling, U. y Boyse, E.A. (1975) Lymphocytedifferentiaticn from precursor cells in vitro. Annals New York Academy of Sciences 249, 541. Scheller, R.H. et al. (1933) Sell 32, 7. Schlesinger, D.H., Goldstein, G. y Niall, H.D. (1975) The complete amino acid sequence of ubiquitin, an adenylate cyclase stimulating polypeptide probably universal in living cells. Bio­ chemistry 14(10), 2214. Schlesinger, M.J. y Bond, U. (1987) Ubiquitin genes. Üxfbrd Surv. Eukaryotic Genes 4, 77. Schlesinger, M.J., Ashburner, M. y Tissieres, A. (1982) Heat shock from bacteria to man. Cbld Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory. Schmid, H.P., Akhayat, 0., Martins de Sa, C., Puvion,F., Koehler, K. y Scherrer, K. (1984) The prosome: An ubiquitous morphologic­ ally distinct RNPparticle associated with repressed mRNPsand containing specific BcBNAand a characteristic set of proteins. ¿HBO J. 3, 29. Schmit, J.C. y Brody, S. (1976) Biochemical genetica of fl¿_gxgfifia conidial germination. Bacteriol. Rev. 40, 1. Schwartz, A.L., Ciechanover, A., Brandt, R.A. y Genze, H.J. (1988) Immunoelectron microscopic localization of ubiquitin in hepatoma cells. EHBOJ. 7, 2961. Scott, M.P. y Pardue, M.L. (1931) Translational control in lysates of Drosophíla melanogaster cells. PToc. Nati. Acad. Sci. USA 78, 3353. Seale, R. (1931) Rapid turnover of the histone-ubiquitin conjugate, protein A24. Nucl. Acids Res. 9, 3151. Selker, E.U., Yanofsky, C., Driftmier, K., Metzenberg, R.L., Alzner-DeWeerd, B. y Rathandary, U.L. (1931) cell 24, 819.

- 328 — Bibliografia

Shanklin, J., Jabben, M. y Vieretra,R.D. (1987) Red light-induced formation of ubiquitin-phytochrome conjugatee: Identification of possible intermediatee of phytochrome degradation. Proa. Nati. Acad. Sci. USA84, 359. Sharp, P.H. y Li, W.H. (1987a) Ubiquitin genes as a paradigm of concerted evolution of tandem repeats. J. Mol. Evo}. 25, 58. Sharp, P.M. y Li, W.H. (1987b) Molecular evolution of ubiquitin genes. TFEE2, 328. Shaw, G. y Chau, V. (1988) Ubiquitin and microtubule-associated protein tau immunoreactivityeach define distinct structures with differing distributions and solubility properties in Alzheimer brain. FToc. Nat}. Acad. Sci. USA85, 2854. Shear, C.L. y Dodge, B.G. (1927) J. Agric. Res. 34, 1019. Shearer, W.T., Bradehaw, R.A., Gurd, F.R.N. y Peters, T., Jr. (1967) The amino acid sequence and copper(II)-binding properties of peptide (1-24) of bovine eerum albumin. J. Biol. Chem. 242, 5451. Shelton, E., Kuff, E.L., Maxwell, E.S. y Harrington, J.T. (1970) Cytoplaemicparticles and aminoacyl transferase I activity. J. Cell Biol. 45, 1. Sherman, F., Stewart, J.W. y Tsunasawa, S. (1985) Methionine or not methionine at the beginning of a protein. BioEssays 3, 27. Sherman, M.T., Moran, M.C., Tuazon, F.B. y Stevens, Y.w. (1983) Structure, diesociation, and proteolyeie of mammaliansteroid receptore. J. Biol. Chem. 258, 10366. 'Shimogawara, K. y Muto, S. (1989) Heat shock induced change in protein ubiquitination in Chlamydomonas.Plant Céll Physiol. 30, 9. Shin, D.T., Mateumoto, K., Iida, H., Uno, I. e Ishikawa,T. (1987) Hal. Cell. Biol. 7, 244. Shyne-Athwal, 8., Riccio, R.V., Chakraborty, G. e Ingoglia, N.A. (1986) Protein modification by amino acid addition is increaee d in crushed eciatic but not optic nervee. Science 231, 603.

- 329 — Bibliografía

Siegelman, M., Bond, M.W.y Gallatin, W.M. ([986) Cell surface molecule .associated with lymphocyte homing is a ubiquitinated branched-chain glycoprotein. Science 231, 823. Sikora, L. y Marzluf, G.A. (1982a) J. Bacteriol. 150, 1287. Sikora, L. y Marzluf, G.A, (1932b) Mol. Gen. Genet. 139, 39 Simon, J A., Sutton, C A., Lobell, R.B., Glaser, R. y Lis, J.T. (1985) Determinants of heat shock-induced chromosome' puffing. cell 40, 805. Simpson, M.V. (1953) The release of labeled amino acids from the proteins of rat liver slices. J. Biol. CWem.201, 143. Singleton, C.K., Manning, S.S. y Feng, Y. (1988) Effect of protein synthesis inhibition on gene expression during early development of Dictyostelium discoideum. Hal. Cell. Biol. 8, 10. Smith, H.T. y Fried, V.A. (1987) Monoclonal antibodies to ubi­ quitin differentially recognize conjugates: Identification. of epitopes. Féd. FToc. 46(6), 2087. Ref. 943. Smith, M. (1985) In Vitro mutagenesis. Anna. Rev. Genet. 19, 423. Soffer, R.L. (1973) J. Biol. Chem. 248, 8424. Soffer, R.L. (1973) Post-translational modification of proteins catalyzed by aminoacyl-tRNA-protein transferases. Mol. Obll Biochem. 2, 3. Soffer, R.L. (1980) in Transfer RNA:Biological Aspects (8611, D., Abelson, J.N. and Schimmel, P., eds.), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NewYork, pp. 493-505. Soffer, R.L. y Savage, M. (1974) PToc, Nat}. Acad. Sci. USA 71, 1004. Sorger, P.K. y Pelham, H.R.B. (1987) Purification and character­ ization of a heat shock element binding protein from yeast. EMBU J. 6, 3035. Sorger, P.K. y Pelham, H.R.B. (1988) Yeast heat shock factor is an essential DNA-binding protein that exhibits temperature­ dependent phosphorylation. Cell 54, 855.

- 330 ­ Bibliografía

Sorger, P.K., Lewis, M.J. y Pelham, H.R.B. (1987) Heat shock factor is regulated differently in yeast and HeLacells. Nature 328, 81. Spindler, K. y Berk, A.J. (1984) Rapid intracellular turnover of adenovirus 5 early region 1Aproteins. J. Viral. 52, 706. St.John, T., Gallatin, N.M., Siegelman, M., Smith, H.T., Fried, V.A. y Weissman, I.L. (1936) Expression cloning of a lymphocyte homing receptor cDNA:Ubiquitin is the reactive species. Science 231, 845. Storti, R.V., Scott, H.P., Rich, A. y Pardue, M.L. (1980) Trans­ lational control of protein synthesis in response to heat-shock in Droscphíla melancgaster cells. cell 22, 825. Straus, D.B., Walter, W.A. y Gross, C.A. (1937) The heat shock response of E. coli is regulated by changes in the concentration of 032. Nature 329, 348. Strauss, B.S. (1958) J. Gen. Microbicl. 18, 658. Struhl, K. (1936) in Maximizing gene expression. (Reznikoff, N. y Gold, L., ed), pp. 35-78, Butterworths, Boston. Stuart, G.W., Searle, P.F., Chen, H Y., Brinster,R.L. y Palmiter, R.D. (1934) A 12-base-pair DNA motif that is repeated several times in metallothionein gene promoters confers metal regulation to a heterologous gene. chc. Nati. Acad. Sci. USA81, 7318. Stubiquitiner, D., Ibrahimi, I., Cutler, D., Dobberstein, B. y Bujard, -H. (1984) A novel in vitro transcription-translation system: Accurate and efficient synthesis of single proteins from cloned DNAsequences. ENBOJ. 3, . Stupzinski, G.P , Brelvi, 2.8., Feldman, 8.0. y Watt, R.A. (1986) Science 234, 467. Sullia, S.B. y Griffin, DHH.(1977) Biochim. Bicphys. Acta 475, 14. Sullia, S.B. y Maria, R. (1985) Adquired cycloheximide resistance in fl¿_g[ns&aand Sclerotium rolfsii. Prcc. Indian Acad. Sci. 95, 417.

— 331 ­ Bibliografía

Sunkara, P.S., Pargac, M.B., Nishioka, K. y Rao, P,N. (1979). J, Cell. Physiol. 98, 451. Sures, I., Lowry, J. y Kedes, L,H. (1978) The DNAsequence of sea urchin (S. purpuratus) HZA, HZBy H3 histone coding and spacer sequences. cell 15, 1033. Sutton, C.A., Ares, Jr., M. y Hallberg, R.L. (1978) PToc. Nati. Acad. Sci. USA75, 3158. Sutton, R.E. y Boothroyd, J.C. (1936) Cell 47, 527. Swindle, J., Ajioka, J., Eisen, H., Sanwal, B., Jacquemot, C., Browder, Z. y Buck, G. (1938) The genomic organization and transcription of the ubiquitin genes of Trypanosomacruzi. EMBÜ 21. Tabor, C.W. y Tabor, H. (1984) Ann. Rev. Biochem. 53, 749. Takagi, M., Kawai, 8., Takata, Y., Tanaka, N., Sunairi, M., Miyazaki, M. y Yano, K. (1985) Induetion of cycloheximide resistance in Cbndida maltosa by modifying the ribosomes. J. Gen. Appl. Microbiol. 31, 267. Tanaka, K., Kunio, I., Ichihara, A., Waxman,L. y Goldberg, A. (IQBSa) A high molecular weight protease in the eytoeol of rat liver. I. Purification, enzymological properties, and tissue distribution. J. Biol. Chem.261, 15197. Tanaka, K., Matsumoto, K. y Toh-e, A. (1988) Dual regulation of the expression of the polyubiquitin gene by cyclic AMPand heat shock in yeast. EWBÜJ. 7, 495. Tanaka, K., Yoshimura, T., Ichihara, A., Kamayama,K. y Takagi, T. (1986b) A high molecular weight proteaee in the cytosol of rat liver. II. Properties of the purified enzyme. J. Biol. Chem.261, 15204. Tanaka, R.D., Li, A C., Fogelman, A.M. y Edwards, P.A. _(1986c) Inhibition of lysosomal protein degradation inhibitis the basal degradation of 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl coenzymeA reductase. J. Lipid RES. 27, 261. Tanguay, R.M. (1983) Genetic regulation during heat shock and functions of heat-shock protein: A review. Can. J. Biochem. Cell. Biol. 61, 414. Bibliografía

Taylor, W.E., Straus, D.B , Grossman, A.D., Burton, Z.F., Gross, C.A. y Burgess, R.R. (1984) Transcription from a heat-inducible prometer causes heat shock regulation of the sigma subunit of Escherichia coli RNApolymerase. 0211 38, 371. Terenzi, H.F., Flawiá, M.M. y Torres, H.N. (1974) A Negzgspgrg grasfia_morphological mutant showing reduced adenylate cyclase activity. Biochem. Biophys. Res. Commun.58, 9 0. Terenzi, H.F., Flawiá, M.M., Téllez-Iñon, M.T. y Torres, H.N. (1976) Control of Negxgsnpra_grassa morphology by cyclic AMP and dibutyril cyclic AMP.J. Bacteriol. 126, 91. Thorne, A.W., Sautiere, P., Briand, G. y Crane-Robinson, C. (1987) The structure of ubiquitinated histone HZB. EMBÜJ. 6, 1005. Thornton, J.M. y Sibanda, B.L. (1983) Aminoand carboxy-terminal regions in globular proteins. J. No1. Biol. 167, 443. Tilly, K., McKittrick, N.M., Zylicz, M. y Georgopoulos, C. (1983) The dnaKprotein modulates the heat-shock response of Escherichia coli. Cbll 34, 641. Timberlake, W.D. y Griffin, D.H. (1974) Biochim. Biophys. Acta 353, 248. Tobe, T., Ito, K. y Yura, T. (1984) Isolation and physical mappingof temperature-sensitive mutants defective in heat-shock induction of proteins in Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 195, 10. Toniolo, D., Persio, M. y Alcalay, M. (1988) A "housekeeping" gene on the X chromosomeencodes a protein similar to ubiquitin. Proa. ht}. Acad. Sci. USA85, 851. Torres-Cabassa, A.S. y Gottesman, S. (1987) Capsule synthesis in Escherichia coli K-lZ is regulated by proteolysis. J. Bacteriol. 169, 981. Treger, J.M., Heichman, K.A. y McEntee, K. (1988) Expression of the yeast UBI4gene increases in response to DNA-damaging agents and in meiosis. N01. Cell. Biol. 3, 1132.

- 333 ­ Bibliografía

Trempe, J. y Leffak, M. (1982) Assembly of semihistone A24. Nucl. Acids Res. 10, 5467. Tsunasawa, 8., Steward, J.W. y Sherman, F. (1985) Amino-terminal processing of mutant forms of yeast iso-1-eytochrome c: The speeificities of methionine aminopeptidase. J. Biol. Chem. 260, 5382. ­ Tuite, M. y Cox, B. (1981) RADSgene of Saccharomyces cereviciae codes for two mutationally separable DNArepair function. Mb}. Cell. Biol. l, 153. Ultmark, D., Klemenz, R. y Gehring, N.J. (1986) Translational and transeriptional control elements in the untranslated leader of the heat-shock gene hspZZ. CEI} 44, 429. Uney, J.B. (1988) FEFE Lett. 235, 215. Urano, T., Watanabe, K., Sakai, M. y Tamaoki, T. (1986) The human albumin gene. Characterization of the 5' and 3' flanking regions and the polymorphic gene transcripts. J. Biol. Chem. 261, 3244. Van der Ploeg, L.H.T. (1936) Cbll 47, 479. van Holde, K.E. e Hill, W.E, (1974) En Ribosomes (eds. Nomura, M., Tissieres, A. and Lengyel, P. Cold Spring Harbor Lab., New York, 53-91. Varshavsky, A., Bachmair, A., Finley, D., Gonda, D. y Wünning (1988) In: Ubiquitin (Rechsteiner, ed.), chapter 11. Vierstra, R. (1937) Demostration of ATP-dependent, ubiquitin­ conjugating activities in higher plants. Plant. Physiol. 84, 332. Vierstra, R. y Sullivan, M.L. (1938) Heniminhibits ubiquitin­ dependent proteolysis in both a higher plant and yeast Biechemistry 27, 3290. Vierstra, R.D., Burke, T.J., Callis, J., Hatfield,,P.M., Jabben, M., Shanklin, J. y Sullivan, M.L. (1988) Characterization of the ubiquitin-dependent proteolytic pathwayin higher plants. Current Communications in Molec. 3101.. The Ubiquitin System ,(ed. M. Schlesinger, A. Hershko). Cbld Spring Harbor Laboratory, pp. 119­ 125.

- 334 ­ Bibliografía

Vierstra, R.D., Langan, S.M. y Haas, A.L. (1985) Purification and initial characterization of ubiquitin fromthe higher plant, Avena sativa. J. Biol. Chem. 260, 12015. Vierstra, R.D., Langan, S.M. y Schaller, G.E. (1986) The complete amino acid sequence of ubiquitin from the higher plant, Avena sativa. Biochemistry 25, 3105. Vijay-Kumar, 8., Bugg, C.E., Wilkinson, K.D. y Cook, W.J. (1985) Three-dimensional structure of ubiquitin at 2.8 A resolution. PToc. Nat}. Acad. Sci. USA82, 3582. Vijay-Kumar, 8., Bugg, C.E., Wilkinson, K.D., Vierstra, R.D. y Cook, W.J. (1987b) Comparison of three-dimensional structures of yeast and oat ubiquitin with humanubiquitin. J. Biol. Chem. 262, 6396. Vijay-Kumar, 8., Bugg, E. y Cook, W. (1987a) Structure of ubiquitin refined at 1.8Á resolution. J. No}. Biol. 194, 525. Vincent, M. y Tanguay, R.M. (1932) Different intracellular distributions of heat shock and arsenite-induced proteins in Drosophila Kc cells. Possible relation with the phosphorylation and translocation of a major cytoskeletal protein. J. No]. Biol. 162, 365. Volz, K.W., Mathews, D.A., Alden, R.A., Freer, B.T., Hansoh, C., Kaufman, B.T. y Kraut, J. (1982) Crystal structure of avian dihydrofolate reductase containing phenyltriazine and NADPH.J. Biol. Chem. 257, 2523. Von Heijne, G. (1986a) A new method for predicting signal sequence cleavage sites. Nucl. Acids Res. 14, 4683. Von Heijne, G. (1986b) Towards a comparative anatomy of N­ terminal topogenic protein sequences. J. M01. Biol. 189, 239. Vorgias, C.E. y Traub, P. (1986) Efficient degradation in vitro of all intermediate filament subunit proteins by the Ca2+­ activated neutral thiol proteinase from ehrlich ascites tumor cells and porcine kidney. Biosci. Rep, 6, 57. Warner, J.B. (1931) The molecular biology of the yeast, Saccharo— myces cerevisiae. Metabolism and gene expression (eds. Strathern, J., Jones, E. and Broach, J.) Cold Spring Harbor Lab., New York, 529-560.

- 335 ­ Bibliografia

Warner, J.R. (1989) A marriage of convenience or necessity? Nature 338, 379. Wasylyk, B. (1986) in Maximizing gene expression. (Reznikoff, W. y Gold, L., ed), pp. 79-99, Butterworths, Boston. Watabe, 8. y Kimura, T. (1985a) ATP-dependent protease in bovine adrenal cortex: Tissue specificity, subcellular localization and partial characterization. J. Biol. Chem,260, 5511. Watabe, S. y Kimura, T. (1935b) Adrenal cortex mitochondrial enzyme with ATP-dependent protease and protein-dependent ATPase activities: Purification and properties. J. Biol. Chem. 260, 14498. Waterlow, J., Garlick, P. y Millward, D. (1978) Protein turnover in mammalian tissued and in the whole body. Amsterdam: North­ Holland. Watowich, 8.8. y Morimoto, R.I. (1988) Complex regulation of heat shock and glucose-reponsive genes in humancell. M01. Cell. Biol. 8, 393. Waxman, L., Fagan, J.M. y Goldberg, A.L. (1987) Demonstration of two distinct high molecular weight proteases in rabbit reticulocytes, one of which degrades ubiquitin conjugates. J. Biol. Chem. 262, 2451. Weber, P., Brown, S.C. y Mueller, L. (1987) Sequential lH NMR assignments and secondary structure identification of human ubiquitin. Biochemistry 26,7282. West, M. y Bonner, W. (1980b) Histone 2B'can be modified_by the attachment of ubiquitin. Nucl. Acids Res. 8, 4671. West, M.H.P. y Bonner, W.M. (1980a) Histone 2A: A heteromorphous family of eight protein species. Biochemistry 19, 3238. West, M.H.P. y Bonner, W.M. (1981) Histone 2B can be modified by the addition of ubiquitin. Nucl. Acids Res..10, 4671. Westphal, M., Müller-Taubenberger, A., Noegel, A. y Gerisch, G. (1986) Transcript regulation and carboxyl terminal extension of ubiquitin in Dictyostelium discoideum. FEBSLett. 209, 92.

- 336 — Bibliografía

Wettstein, F.O., Noll, M. y Pemnan, S, (1964) Biochim. Biophys. Acta 87, 525. Whiffen, A.J. (1948) J. of Bacteriology 56, 283. Whiffen, A.J. (1950) MYcologia 42, 253. Wiborg, 0., Pedersen, M.S., Wind, A., Berglund, L.E., Marcker, K.A. y Vuust, J. (1985) The human ubiquitin multigene family: somegenes contain multiple directly repeated ubiquitin coding sequences. EHBÚJ. 4, 755. Wiederrecht, G., Seto, D. y Parker, C.S. (1938) Isolation of the gene encoding the S. cerevisiae heat shock transcription factor. Cell 54, 841. Wiederrecht, G., Shuey, D.J., Kibbe, W.A. y Parker, C.S. (1987) The Saccharomycesand Drosophila heat shock transcription factors are identical in size and DNAbinding properties. 0211 48, 507. Wilk, S. y Orlowski, M. (1980) Cation-sensitive neutral endopeptidase: Isolation and specificity of the bovine pituitary enzyme. J. Neurochem, 35, 1172. Wilk, S. y Orlowski, M. (1983) Evidence that pituitary cation­ sensitive neutral endopeptidase is a multicatalytic protease complex. J. Neurcchem. 40, 842. Wilk, S., Pearce, S. y Orlowski, M. (1979) Identification and partial purification of a cation-sensitive neutral endopeptidase from bovine pituitaries. Life Sci. 24, 457. Wilkinson, K.D. (1987a) Purification and structural properties of ubiquitin. In: Ubiquitin. Rechsteiner (ed.) PlenumPress, New York, chapter 1. Wilkinson, K.D. (1987b) Protein ubiquitination: a regulatory post-translational modification. Antícancer DrugDesign 2, 211. Wilkinson, K.D. y Audhya, T. (1981) Stimulation of ATP-dependent proteolysis requires ubiquitin with the C-terminal sequence arg­ gly-gly. J. Biol. Chem.256, 9235. Wilkinson, K.D. y Mayer, A.N. (1986) Alcohol-induced conformational changes of ubiquitin. Arch. Biochem. Biophys. 250, 390.

- 337 ­ Bibliografia

Wilkinson, K.D., Cox, M.J., O'Connor, L.B. y Shapira, R. (1936) Structure and activities of a variant ubiquitin sequence from baker's yeast. Biochemistry 25, 4999. Wold, F. (1981) In vivo chemical modification of protein post translational modification. Anna. Rev. Biochem. 50, 783. Wolf, D.H. (1985) Proteinases, proteolysis and regulation in yeast. Biochem. Soc. Trans. 13, 279. Woodgett, J.R. y Hunter T. (1987) Immunological evidence for two physiological forms of protein kinase C. No}. Cell. Biol. 7, 85. Woudt, L.P., Pastink, A., Kempers-Veenstra, A.E., Jansen, A.E.M., Mager, W.H. y Planta, R.J. (1933) The genes coding for histone H3 and H4 in flegxgsggra_gxafisa are unique and contain intervening sequences. Nucl. Acids Res. 11, 5347. Wu, C. (1984) Activati ng protein factor binds in vitro to upstream control sequences in heat shock gene chromatin. Nature 311, 81. Wu, C., Wilson, 8., Walker, B., Dawid, I., Paisley, T., Zimarino, V. y Ueda, H. (1987) Purification and properties of Drosophila heat shock activator protein. Nature 238, 1247. Wu, R.S. y Bonnet, W.M. (1981b) Separation of basal histone synthesis from S-phase histone synthesis in dividing cells. Cbll 27, 321. Wu, B.S. y Bonner, W.M. (1985) Mechanism for differential sensitivity of the chromosomeand growth cycles of mammalian cells to the rate of protein synthesis. M01.Cell. Biol. 5, 2959. Wu, 8.5., Kohn, K.W. y Bonnet, W.M. (1981a) Metabolism of ubiquitinated histones. J. Biol. Chem.256, 5916. Wu, R.S., Nishioka, D. y Bonner, W.M. (1982a) Differential conservation of histone 2A variante between mammals and sea urchins. J. cell Biol. 93, 426. Wu, R.S., Panusz, H., Hatch, C.L. y Bonnet, W.M. (1986) Histones. CRCCrit. Rev. 20, 201.

- 338 ­ Bibliografía

Wu, R.S., Tsai, S. y Bonner, W.M. (1932b) Patterns of histone variant synthesia can distinguish Go from G1 cells. Cell 31, 367. Wunsch, A., Haas, L. y Lough, J. (1987) Dev. Biol. 119, 85. Yamamori, T. y Yura, T. (1980) Temperature-induced eynthesis of specific proteins in E. coli: Evidence for transcriptional control. J. Bacteriol. 142, 843. Yamamori, T. y Yura, T. (1982) Genetic control of heat-shock protein synthesis and its bearing on growth and thermal resistance in Etcherichia coli KIZ. Proc. Nat}. Acad. Sci. USA 79, 860. Yamamoto, T., Nojima, M., Ishiura, S. y Sugita, H. (1986) Purification of the two forms of the high-molecular-weight neutral proteinase ingensin from rat liver. Biochim. Biophys. Acta 882, 297. Yarden, Y., Escobado, J.A., Kuang, W.J., Yang-Feng, T.L., Daniel, T.0., Tremble, P.M., Chen, E.Y., Ando, M.E., Harkins, R.N., Francke, U., Fried, V.A., Ullrich, A. y Williams, L.T. (1986) Structure of the receptor for platelet-derived growth factor helps define a family of closely related growth factor receptora. Nature 323, 226. Yost, H.J. y Lindquist, Sn (1986) RNAsplicing is interrupted by heat shock and is recued by heat shock protein synthesis. Cell 45, 184. Zhuang, 2., Chau, V. y McCanley, R. (1988) MAO-Binsertion into outer membranein inhibited by Ab anti ubiquitin. J. Cell. Biol. 107(6), Part 3, Ref. 1955. Zolfaghari, R., Baker, C.R.F.,Jr., Canizaro, P.C., Amirgholami, . y Behal, F.J. (1987) A high-molecular-mass neutral endopeptidase-24.5 from human lung. Biochem. J. 241, 129.

— 339 —

Apéndice I

8.1. RQLLHBIQHIÏLHA 8.1.1 nana dí naaïniaaián

400 800 1200 1600 2000 —————————+--———————+————-——-—+---——-———+—---————- ——————— Acc 1 ------——+--——-——-—+-—-——-*——+——m—-——-—+—-————-—-+—-————­ Aha I —————————+—--——————+--—-———--+——————---+-——--————+-—-*—-­ Alu I * ————————+-——*—————+ —————————+*——_——*——+ —————————+m—————­ Ava I —————————+-————————+——*——————+————*—*——+————-----+-—---—— Ava I —* ———————+—*———————+—————————+------——+——* ——————+——————­ Ban I —————————+-r—-———--+-—-—————-+———--—-——+----——-—-+-—-*——— Ban 1 —————————+——-———-——+-—-—-—---+-—-——-———+———-——-——+--—--x— Bbv I ------——+-——*—*———+——--m—-——+*w—--—*—-+——*—-———-+—-—-——­ Bbv I —————————+--k—---——+————-——-—+———---—-—+——-*-—--—+———-——­ Bcl I —————————+-——--—-——+-——-—-—--+——-——*-—-+---—————-+----—-­ Bgl I —————————+---————-—+-——-—————+-————————+——-—*-———+—----—— Bgl ------——+-—w——————+—————————+-—-——————+—————--—-+--——-—— Bsp —————*———+ —————————+—————————+———————*m+———*—————+—————*_ BssH II ———————--+——-*---——+-—--—--—-+-—-———---+——---————+—-———-— BstE II ———————--+-————————+-—-—-—-—-+-—-—---—-+—-——---——+--—*——­ BstN I ------——+-*—*—--——+---——————+----—*———+*—-—---——+——--—-— Cla 1 ———————--+——-—----—+-*——-—--—+----—————+——---———-+-—----­ Dde I ———m—-———+-—1*—————+ —————————+------——+—————————+——————­ Dpn I —-*——*-——+—*—*———-—+—*—--——-—**————m———+m* ———————+——————­ Eco K ------——+--—*—-———+---—————-+-——--——--+————---——+--—--—— Eco RI' —* ———————+-——m——_—-+*—_*__—*—x———*—*——*+m ——————m—+——————­ Eco RI* —————————+-——--————+--————-—-+---—--—--+—-—-———-—+**---—— Eco RII —————————+—m—*———-—+—————————+-—-——*——-+*———————-+----—-­ EcoP 15 —————————+-——*—-——-+-—--—*—--+—*-—-—*--+—-*-—--—-+-—————­ EcoP I —————————+-——*-————+—-—*—-——*+-—-———-——*-—-—-——--+——-———— EcoP I ------——+--*———--—+----—--——+——-—---—-+---—-—--*+------­ Fnu4HI ———*——*-—+———**————+————**———+m*————*——+-*—*m—-——+——-———­ Fok I —————-*_—+———*—————+—————*———+———————*—+—-*——————+—*————— Fok I ——*—————*+—__*_*—**+ ————.—*———+—————————+——————*——+——————­ Hae I —————————*---*————-+--—————-—+-—--—--——+-——--———-+—-----­ Hae II —————————+-——*—————+-———*-———+—————————+—————————+———*——— Hae III —————————*———*———-—+—————*———+—*———————+——*—*——*—+-—-*—*_ Hga I ------—-+—-*———---+—--————--+*—-——*—-—+-*————---+----——­ Hga I _———m————+———*—————+ —————————+-——*———-—+ —————————+——————­ Hgi A I ------——+---—---—-+——-——-—--+——————-**+——-*——-——+-—--———

- 339 ­ Apéndice I

Hng I ------——+—————————+—————————+—————————+—————————+---*___ Hha 1 ———————-*+———*———--+————*——*-+ —————————+---—*————+———*—*­ HinP I ------—-*+-——*-——-—+--——*——*-+ —————————+----*————+———*—*_ Hinc II -----*-——+ ------——+------——+—————————+———————-—+—*——-—— Hind III *——————--+—-—*-----+------——+------——+------——+——————­ Hinf I —-—-- - - ——+---**—*-*+——**—-***+—_m—*————+*—-——*—*—+—*--——— Hpa II ———-*—_—-+—-—*--———+-—*——*—*—+*——*———-—+--* ——————+-————*— th 1 ————**———+*——*-————+ —————————+—————————+—————————+*——*——— th I —————————+—-*———*——+*—*-—-—-*+ —————————+—————————+----- —­ Mbo I --*——*———+—** ——————+—*———————**————*———+**———————+----- —­ Mbo II —————————+—-—*-—-——+—————————+-*———————+------——+----- —­ Mbo II ————————*+——*———*-—+—#—————*—+--*—*———**———*—————+ ——————­ Mnl 1 ————————**——*—**———+——*———**-+*———*——*—+———**——-—+---- -—* Mnl I ———*————-+--* ——————+——**—*——**———*—**——+—** ——————+—-*———— Nae I —————————+-——*——-—-+—---—*—--+*------——+------——+----- —­ Nar I —————————+------——+------——+------——+------——+—--*—-­ Nci I —-——*-—-—+ —————————+—————————+—————————+—————————+——————­ Nco I ------——+------——+------——+------——+-----—*--+----- —­ Nla 111 ——*——————+-—-*—————* —————————+—————————+---- —-**—* ——————­ Nla IV ————————-+—*----- ——+------——+------——+-—*---- ——+---*—*— Nsi I ------——+------——+—————————+—————————+———————--+—-—-*—— Pet I —----*—-—+ —————————+—————————+------——+—————————+—————-— Pvu I —————————+—*———————+-* ———————+—————————+—————————+----- —­ Pvu II ------——+--—*——---+------——+------——+—————————+----- —­ Rru I ------——+—--*-———-+------——+—————————+—————————+----- —­ Rsa I —————————+-——*————-+------——+—————————+—————————+-—*—*—— Rsh I —————————+-w ———————+-m ———————+—————————+—————————+----- —­ Sau 3A ——*——*———+—x* ——————+—*———————**—-——*—--+** ———————+——————­ Sau 96 I —*——————-+—*—*——-—-+ —————————+------+——* ——————+——————­ Sca I ————————-+—-—*—-—--+ —————————+—————————+—————————+——————­ sch I -——-*——-—+-*—*-—-——+ —————————+-————*—--+*————————+——————­ SfaN I —————————+—--*—-*-—+—k ———————+—————————+---- ——*——+--——*—— SfaN 1 * ———————-+—-* ——————+-w ————————+—————————+————————*+-——-*4— SnaB I —————————+—————————+------——+—————————+—————————+---—*—­ sph I —————————+--—*—---—+ —————————+------——+—————————+----- —­ sst II ——————*—-+—————————+------——+------——+------——+——————­ Stu I ————————-+-——*—-——-+ ------——+—————————+—————————+——————— Taq 1 ** ———————+—*——————*+—**——————*-———*—*—-*------——+----- —­ Tha 1 ______*—*+———*—————+ ———————m—+-—* ——————+—————————+——————­ Tth 111 I ------——+—————————+--—*—----*—————————+------——+----- —­ Tth 111 II————*———-+ ————————-+———*—*-——*—*———————+------——*——————­ Tth 111 II —————————+—————————+------——+—————————+———————--* ——————­ Xho I ------——+------——+--*---- ——+-—-—*—*--+—————————+----- —­ Xho II —————————+—————————+—————————*—————*——-+*————————+------­ XmaIII ------——+------——+------+-* ----- ——+------+---—-*­ an I —————————+-——*——---+ ------——+—————————+—————————+—————-— xor 11 ————————-+—m ———————+—* ———————+ —————————+—————————+——————­

- 340 — Apéndice I

8.1-2. Secuencia di í-fi. dadngidn da la flgaugngia nualfigiidiga.

PUSTELLSEQUENCEANALYSISPROGRAMSInternational Biotechnologies, Inc.

DNA SEQUENCE TRANSLATION PROGRAM Version 4.0

TRANSLATED SEQUENCE OF UBITANDEM

10 20 30 40 5 0 *** ‘k i AAG CTT GTC AAG ATG CTG GCA AAG TAA CGA GAA GTC GAG ATG GCA CTC TCG GAT TTG K L V K M L EMALSDL S L S R C W QSEKN S R W H S R I C A C Q D A G KVRST R D G T L G F V 60 70 80 90 100 110 >l< * 1k* * 7k TAA ACA ACT GAA ACT CGA AGG TCC GTC GTC CAG CCA CAT GCA GAT CAT TCT TTG GCT T ET R R S VV Q P H A D H S L A K QL KL E G P SS S H M Q I I L W L N N NS K V R RP A T C R S F F G L

120130 140 15 0 160 17 0 :k* 1‘ TAT TCA TCC AGA GAG AAC CTA ACT GAA GCA GGG CAA ACA GCC GCT GAG GTG ACT GAC YSRENLT E A G Q T A A E V T D IGH PERTL K Q K Q P L R L T FAI QREP­ S R N S R G R 180 190 200 210 220 3k >k 2k >k .k GCA TTG ACt GGG CAA ACG GCT GGG TGA GTG CCC GCC ACT GCA GAA GGC GTT GAC AGT ALTGQTA—P A T A E G V D S H L GLECK R G P P L Q K A L III V I DAWSAW N G V R H C R R R Q C 230 240 250 260 270 280 ‘k i * >01 3k >lf. . , GCG ATC AAT CAG CCG CGG TCA CTG TTG GGG GGG ATG TCC AAC CAC TCC TGC CAA CGG AINQPRSLLGG'M S N H S C Q R R S ISGHCWGR G C P T T P AN G D Q SAVTVGGA D V Q P L L PT G

- 341 ­ Apéndice I

290 300 310 320 330 340 7k >k 2k * * * GCA ACA GCC AAC AGT CAA GGG GGA AAC TGT CGT CTG ACT GGC TTC TTC TCG CGC CTT TANSQGGNCRLTGFFSRL QQPTVKGETVV-LASSRAF NSQQSRGKLSSDWLLLAP 350 360 370 380 390 >k * *7k * CCC TCC ACT TCT CTG TCA TCC TCC CAA CCG CCA AGT GGC TTG TGC GTG GCC TGT CAG PSTSLSSSPPSGLCVACQ PPLLCHPPNRQVACAWPVS LHFSVILPTAKWLVRGLSV 400 410 420 430 440 450 ¡1!7k * * ' ‘¡k ‘k, TGA AGG TGA GTG ACA CAC CAC ACA CCG TGG CAG GCG TTG CAA ACG GAC CAG TGA CGA -R-VTHHTPWQALQTDQ-R EGE-HTTHRGRRCKRTSDD KVSDTPHTVAGVANGPVT 460 470 480 490 500 510 * >k ,1K :k >k * TCG ACT TGG GAC CTG GCA CCT TTC CGC TTC CAC TCC AGT CCC GTC ACC TCT TCC CTT STWDLAPFRFHSSPVTSSL RLGTWHLSASTPVPSPLPF DLGPGTFPLPLQSRHLFPS 520 530 540 550 560 570 7k* 7k * 7k .‘k CAC TCA Gcc ccG CTT CGT TCC CTT TCC ACG GAG TGG AAG CCT GGC CTC CGA AGT TCG HSAPLRSLSTENKPGLRSS TQPRFVPFPRSGSLASEVR LSPASFPFHGVEAWPPKFA 580 590 600 610 620

CCA TCC TGA TTC CTG CCA CTT CCG CCG CAG CCA GCA CCT GAA CCT ACT TAT TTA ATC PS-FLPLPPQPAPEPTYLI HPDSCHFRRSQHLNLLI-S ILIPATSAAAST-TYLFNP 630 640 650 660 670 680 :k 2k * 7k * * CTC CCC GCC CAT CTG CAT CCC CGA TTC CAT TTC TTC CGC TTT CAC CAT CTC TCT CCA LPAHLHPRFHFFRFHHLSP SPPICIPDSISSAFTISLH PRPSASPIPFLPLSPSLSI

— 342 ­ Apéndice I

690 700 710 720 730 740 ¡k >k >k * * >41 TCG CCA TCA TCG CAG GAG TGT TCA TCC ACG CAC ATA TCA TTC CCG CCA CTC GAT TCT SPSSQECCoST H I S F P P LD S RHHRRSVHRP T Y H S R H SI L AIIAGVFIAH H I I P A T RF

750 760 770 78 0 790

>lk * * AGT CAT TTC GCT TCA TCC ATC AAC AGT CCA TTC GTC CAC TGC ACA ACC CCC ATC ATG S H F A S S I NSPFVHCTT I M V I S L H P SVTHS S T A Q P PS C S F R F I H QSQI P L H N P HH A 800 810 820 830 840 850 4k‘* * * >k * CAG ATT TTC GTC AAG ACT TGT AAG TTA TGC ACG CTC ACC GCA TCA TCA CTT TAC CAT QTI F V K T C K LC L T ASSLYH RAF S S R L V S Y R S P H H H FT I DHF R Q D L V M A H R I I T LP S

860 870 880 89 0 900 91 0 >I< * * * * * CGA TCG ACC GAT GCT AAC TAT CTC TTC GCA GTG ACC GGC AAG ACC ATC ACC CTC GAG RTDANYL FA V T G K T I T L E DR—PMLTIS SQ P A R P S P S R ID RC-LSL RS R H H P R G 920 930 940 950 960. * 3! * 3C 3k GTC GAG TCG TCG GAT ACC ATT GAC AAT GTC AAG CAA AAG ATT CAG GAC AAG GAG GGC VESSDTIDNVKQKIQDKEG SSRIPTMSR L S K R F R T RR A RVGYHQCQV A D Q G H 970980 990 1000 1010 1020 x x * * ATT CCC CCC GAC CAG CAG CGC TTG ATT TTT GCC GGC AAG CAG TTG GAG GAT GGC CGC IPAP D Q Q R L I F G K Q L E DRG F PSP T S A F L P A S S W R MA A S P P A C R Q A V G G WP H 1030 1040 1050 1060 1070 1080 *.\.k JL tk 2k * ACC CTT TCC GAC TAC AAC ATC CAG AAG GAG TCT ACC CTC CAC CTT GTC CTC CGC CTG T L S D Y N I Q K ES T LHLVLRL P F P T T T S R R S L P S T L S SA C P F R L Q H P E G V Y P P P C P PP A

- 343 ­ Apéndice I

1090 1100 1110 1120 1130 1140 * 4< * * ti >Ik CGC GGT GGT ATG CAA ATC TTC GTC AAG ACT CTT ACC GGC AAG ACC ATC ACC CTT GAG RGGMQIFVKTLTGKTITLE AVVCKSSSRLLPARPSPLR RWYANLRQDSYRQDHHP­ 1150 1160 1170 1180 1190 un >k ak ur un GTG GAA TCG TCC GAC ACT ATC GAC AAC GTC AAG CAA AAG ATC CAA GAC AAG GAG GG VESSDTIDNVKQK1QDKEG WNRPTLSTTSSKRSKTRRA GIVRHYRQRQAKDPRQGGH 1200 1210 1220 1230 1240 1250 >|< >k 2k * * * ATT CCT CCC GAT CAG CAG CGT CTC ATT TTC GCC GGC AAG CAG CTT GAA GAC GGC CGC IPPDQQRLIFAGKQLEDGR FLPISSVSFSPASSLKTAA S S R S A A S H F R R Q A A - R. R P H 1260 1270 1280 1290 1300 1310 * * * 7k * .1! ACT TTG AGC GAC TAC AAC ATT CAG AAG GAG TCT ACC CTT CAT CTC GTT CTT CGT CTA TLSDYNIQKESTLHLVLRL L-ATTTFRRSLPFISFFVY FERLQHSEGVYPSSRSSST 1320 1330 1340 1350 1360 7k 7k * * ¡K CGC GGT GGT ATG CAG ATT TTC GTT AAG ACG CTT ACC GGC AAG ACG ATT ACt CTC GAG RGGMQIFVKTLTGKTITLE AVVCRFSLRRLPARRLLSR RWYADFR—DAYRQDDYSRG 1370 1380 1390 1400 1410 1420

>k 21K >|< 2k * * GTT GAG TCT TCC GAC ACC ATC GAC AAC GTA AAG CAA AAG ATC CAG GAC AAG GAG GGT VESSDTIDNVKQKIDKEG LSLPTPSTT-SKRSRTRRV -VFRHHRQRKAKDPGQGGY 1430 1440 1450 1460 1470 1480

ATC CCA CCT GAT CAG CAG CGT CTC ATT TTC GCT GGA AAG CAG CTC GAG GAT GGT CGC IPPDQQRLIFAGKQLEDGR SHLISSVSFSLESSSRMVA PTHFRHKAARGNSH-SAAS

— 344 ­ Apéndice I

1490 1500 1510 1520 1530 7k * 2k >lt' 2k ACC CTC TCC GAC TAC AAC ATT CAG AAG GAG AGC ACC CTG CAC TTG GTG CTC CGT CTT TLSDYNIQKESTLHLVLRL PSPTTTFRRRAPCTWCSVF PLRLQHSEGEHPALGAPSS 1540 1550 1560 1570 1580 1590

CGT GGT GGT ATG CAG ATT TTC GTC AAG ACC TTG ACG GGC AAG ACG ATT ACG CTG GAA RGGMQIFVKTLTGKTITLE VVVCRFSSRP—RARRLRwK wNYADFRQDLDGQDDYAGS 1600 1610 1620 1630 1640 1650 * * m * * * GTC GAG TCT TCG GAT ACG ATT GAT AAC GTG AAG CAA AAG ATC CAG GAC AAG GAG GGT VESSDTIDNVKQKIQDKEG SSLRIRLIT—SKRSRTRRV RVFGYD-—REAKDPGQGGY 1660 1670 1680 1690 1700. 1710 ‘4€ * * :k >k :6! ATC CCG CCT GAC CAG CAG CGT CTG ATC TTT GCT GGT AAG CAG TTG GAG GAT GGC CGG I P P D 'Q Q R L I F A G K Q L E D G R SRLTSSV-SLLVSSNRMAG PA—PAASDLCW—AVGGWPD 1720 1730 1740 1750 1760

kk >k' ¡k 30K. >IK ACC CTC TCT GAT TAC AAC ATT CAG AAG GAG AGC ACT CTT CAC TTG GTG CTG CGC CTC TLSDYNIQKESTLHLVLRL PSLITTFRRRALFTWCCAS PL-LQHSEGEHSSLGAAPP 1770 1780 1790 1800 1810 1820

l m ik >|K 7k * * CGT GGC GGC CAG TAA GCG GAT TGT CGT CTT TGT TTC TGA TTC TTG ATG ACG AGC AAG RGGQ-ADCRLCF-FLMTSK VAASKRIVVFVSDS--RAR wRPVSGLSSLFLILDDEQG 1330 1840 1850 1860 1870 1880 * >|< >k 2k * * GGT TCA TTT GGG CGT TCA GCG TTT ATT GGG TTA CTT ATT GCA TCC ATG GGT TGG GAA GSFGRSAFIGLLIASMGWE VHLGVQRLLGYLLHPNVGK FINAFSVYwVTYCIHGLGN Apéndice I

1890 1900 1910 1920 1930 * >k ATG ATG ACA ACC ATG AAA CAG GGC ATA TCT AGG CCG AAT CTA ATG GCA CAC GCT TCA M M TT M KQ G I PMNL A H A S P NRLA Y GR W H T L H D D NAESH TG H I G R F I 1940 1950 1960 1970 1980 1990

‘k ‘k’ TAC ATA CAG CGA TGC CAT AAT AAA GAC TAT ATT TAC GGT CTC AAA CAT GAT GTC TCT Y I Q R C H N DYIYGK H D V S T Y S D AII I FST V N M M S L H T A M LLY R S T L L 2000 2010 2020 2030 2040 2050 >k 'k Jr. * rk 7k TGG TGA TTT GCT TGT GTC TCA ATT CGT GAG CTT TTG TTA TTC CCG TCA ACC TGT CAT WAPSTCHCVSIRELLLF G D V SSF C Y R Q P V I V I AVF I V N S S 2060 2070 2080 2090 2100

7k * 71‘? ¡IC * CTG GTC AAT TGG GGA TGG AGT CGG ACG TGT AAG TCA AGA TGG TGG TGC AGT GGG TTG L V N W. G W S R T C KSRW W C S G L W S I G V G R V A V G W G Q L E S D V V Q W V G 2110 2120 2130 2140 2150 2160 ‘k * 7k * :k * GTA CAC ACC GTG CGA GGT GAC CGT TGC GTG GCC GAA AGT GGC GCC CTT TTT GGT GGA V H T V R G D R C V A E S G A L F G G Y T P C E V T V A N P K V A P F L V D H R A R P L R G R K W R P F W W T

2170 2180 2190 200 2210 2'?L2 0 *l .4< tk \kt 4‘. x CAA GAT GCA TCA TAC GTG AAA GAT ACG TAC CGA CCG CCG AGT TCA GTT GCG CTA GTC QDAYKDTYRPPSVA LV HTDRR V Q L R S PTAE F S C A S P

- 346 ­ Apéndice II

8.2. EflfilQH_DE_flBlQQLIlflA 8.2.1. Magadi

100 200 300 400 500 600 —-———————+—-————---+——-————-—+——————--—+-—————-—-+---———---+-— Acc I -—————--—+-—--—————+—--*——--—+*——-—--——+—--——-—--+---—-—---+—— Alu I ———--—-——+--—m-—-——+--—--————+——--—----+---—*—*—-+--————---+—— Ava I ———-—-——-+———*—----+———--————+—-———-——-+----—————+——----—--+-— Ban I ————————-+—-—————--+—-—---—--+---——-*——+———————-—+-——-—*—-—+-— Ban II --—-—————+—-———----+--————---+--———————+—-—-*——-—+—---———--+-­ Bbv I ———-————-+-*——*————+—————————+—-———-——-+-—-—-————+---———-——+-­ Bbv I ———--————+—-—-—————+--—--———-+-—---—-—-+*—-——-—--+---————--+-— Bsp 1286 —————————+———————-*+—————————*-———*————+———-*————+—-—————-—+-­ BstN I ———————*—+—————----+———--————+--—--——--+-——————-—+--———--—-+-— Dde I ————-————+—-—-——--—+———————--+-———————-+—-———-*—-+——-——----+-­ Dpn I ______m_+_*———————+—————w———+fi—*—————_m_-__———*—+—*———————+—— Eco RI' —----——*—+—-——————-+-———-————+————-—-—-+-—-———-——+--—--e———+-— Eco RI* —-———————+———-————-+——---—-—-+-——————-—+-———*——--+--——-—-——+-­ E00 RII -—-———-m-+—-——-—-——+—--—--—-—+--————--—+—————-———+--—————--+-­ EcoP 15 ————————L+—-—*—————+——-——————+———-——--—+-——-————-+———-———--+—— EcoP I —-—*—————+———-—-—--+---—-————+*———————*+———-————-+—————-—-—+—­ EcoP I -————————+----—————+*————-———+——-—-———-+-—---—---+——-————--+—— Fnu4HI —————————+*--**-—-—+—————————+-—-m———-*+-*—--——--+---———---+-­ Fok I —————————+—-———*———+--—————-—+————-—-—-+-—————---+--——-—---+-­ Fok I ———————*—+———--m—-—+---———-——+------——-+—————-———+—-—-————-+-­ Hae II ——--—-——-+—*——————-+—————————+——-——-———+---—————-+--———————+—— Hae III —_———————+————*————+—————————+————————m+—————————+—————————+*— Hga I —-—————--+--—----—-+———--————+—*-——-——-+———-—-———+—————————+—— Hgi A I —————————+————————*+—————————*—————————+————m————+-—-———--—+—— Hha I ——--————-+-*———————+————-—*——+———-——--—+---—--—-—+----——--—+—­ HinP I -——--————+*—--—————+———-——*——+—-————---+-—-——----+--—---—--+-— Hinc II -——-—————+———————-—+-———————-+*——-————-+—----—-——+-----—--—+-— Hïnd III —--—-———-+---—————-+—--—-——--+-—————-——+—-—---*——+--——--———+-­ Hinf I —-—*————-+-————-——-+—-—————--+-*-——————+——--——-—-+----—----+-­ Hpa II ——-——---—+————-——--+——--—————+——————*-—+——————-——+-----—--—+-­ ¡{ph I —*—————-—+--——-———-+-——-—----+--———————+—*————--—+——-————-—+-­ Kpn I ———-——7——+———————--+-——————--+--—---———+--—--—-—-+---—-*—-—+—— Mbo I -—__———*—+—m———————+-————*———+——#——--——*——-———-*—+-*——-————+-— Mbo II ———-—-——*+—————————+———*——*——+-————————+—————*———+-————-———+—— Hbo II -————————+*———-————+—-—-———-—+-—m———*——+——*——-—-—+—-——————-+—— Mnl I —*_——————+——————*——*—w———————+—-——————-+———*———--+-————————+—— Mnl I ——*—-——*-+——m—--——-+—————————+—————-—--+-—--———-—+——---*—--+—­

— 347 ­ Apéndice II

Nla III —————————+—————————+—————————+————————w. ————————-+ —————————*—— tua 1V —————————+—————————+—————————+————"¿——+ —————————+—-———*———+—— Rru I —————————+—————————+—————————*————————-+*------——+------——+-­ 36a 1 —————————+—————————+—————————m———————"+4: ————————+——*——#———+—­ Sal I ------——+—————————+------+* ————————+—————————+------——+-­ Sau 3A ——————-#-+-* ———————+—————m———+——*——————m———————*-+-# ----- ——+-­ sea I ------——+------——+------—* ————————-+*——————--+—————————+-­ sch I —————-—*—+ ------——+—————————+—————————+—————————+—————————+-­ SfaN I —————————*—————————+———————--# ——————— + —— + + set I —————————+—————————+------——+—————————+---—*---—+ —————————+-­ Taq I —————*—--+--—*—--—-+------+*—* ---- ——+--—*—-—--+------——+-­ Tha ------——+------——+—————————+-——-*-———+—————————+————————--+—— Tth 111 I —-—-—*———+------——+------——+—————————+—————————+------——+-­ Tth 111 II ------*-+--——*---—+ ------—*—+—————————+------——+------——+-­ xho I —————————+-——*-————+------——+———————--+ —————————+—————————+-­ Xho II —————--*—+ —————————+—————————+—————————+—————————+—————————+-­ Apéndice II

8.2.2. FaF-¡t'glP't" di fi_fil dprllapidfi ie- la Epfqapnpjfi nuplpq-rídj‘HÏI

PUSTELLSEQUENCEANALYSISPROGRAMSInternational Biotechnologies, Inc. DNA SEQUENCE TRANSLATION PROGRAM Version 4.0

TRANSLATED SEQUENCE OF UBIFUS

10 20 30 40 50 3k >k ik >k * AAG ACC CTC ACG GGC AAG ACT ATC ACC CTT GAG GTG GAG TCT AGC GAC ACC ATC GAC KTLTGKTITLEVESSDTID RPSRARLSPLRWSLATPST DPHGQDYHP-GGV—RHHRQ 60 70 80 90 100 110 w m m k * m AAT GTC AAG CAG AAG ATC CAG GAC AAG GAG GGC ATC CCC CCT GAC CAG CAG CGC CTG NV.QKIQDKEGIPPDQQRL MSSRRSRTRRASPLTSSA­ CQAEDPGQGGHPP-PAAPD 120 130 140 150 160 170

ATC TTC GCT GGC AAG CAG CTC GAG GAT GGC CGC ACC CTC TCC GAC TAC AAC ATC CAG KQLEDGRTLSDYNIQ SSLASSSRMAAPSPTTTSR LRWQAARGWPHPLRLQ‘HPE 180 190 200 210 220

AAG GAG AGC ACC CTC CAC CTC GTG CTT CGC CTC CGT GGT GGT GGT AAG AAG AGA AAA KESTLHLVLRLRGGGKKRK RRAPSTSCFA5VVVVRREK GEHPPPRASPPWWW-EEKK 230 240 250 260 270 280

3kv ik HK >k a< * AAG AAG GTC TAC ACC ACC CCC AAG AAG ATC AAG CAC AAG CGC AAA AAG ACC AAA CTC KKVYTTPKKIKHKRKKTKL RRSTPPPRRSSTSAKRPNS EGLHHPQEDQAQAQKDQTR

- 349 ­ Apéndice II

290 300 310 320 330 340 >k * kk >|< 1k >k' GCT GTG CTC AAG TAC TAC AAG GTC GAC TCC GAC GGC AAG ATC GAG CGT CTT CGC CGC AVLKYYKVDSDGKIERLRR LCSSTTRSTPTARSSVFAA CAQVLQGRLRRQDRASSPR 350 360 370 380 390 ¡k 3k * TIC 2k GAG TGC CCT AAC GAG ACC TGC GGT GCC GGT GTC TTC ATG GCC GCC ATG CAG GAT CGT ECPNETCGAGVFMAAMQDR SALTRPAVPVSSWPPCRIV VP—RDLRCRCLHGRHAGSS 400 410 420 430 440 450 HI - ‘k “k ïk :k XC CAG TAC TGC GGT CGC TGC CAC CTC ACC TAC GTC TTC GAG AAG AGC TCT TAA ATT GCT QYCGRCHLTYVFEKSS-IA STAVAATSPTSSRRALKLL VLRSLPPHLRLREELLNCW 460 470 480 490 500 510

ik 31K. >k 7k 2k ¡‘IL' GGA AAG CTT AGG GGA ATG ATC TGG GAC GGG GAA TGA CAA TAC CAC ATC TCG CTA GGA GKLRGMIWDGE-QYHISLG ESLGE-SGTGNDNTTSR-D KA—GNDLGRGMTIPHLARI 520 530 540 550 560 570 * >|< * * ak * TCG GAA CTT ATG TAC GGC GTT TTG AGC GGA CAT CAG GGT ACC TTT ACA CTG GCG AGG SELMYGVLSGHQGTFTLAR RNLCTAF—ADIRVPLHWRG GTYVRRFERTSGYLYTGEG 580 590 600 610 rk * * 3k GAA AGG AAA AAC GGG AAT GGC ATG ACC AAC TTG GCC GAA AA ERKNGNGMTNLAE KGKTGMA-PTWPK KEKREWHDQLGRK

— 350 ­