AIX-MARSEILLE UNIVERSITE Ecole Doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé (ED SVS 62)

THESE pour obtenir le grade de

DOCTEUR D’AIX-MARSEILLE UNIVERSITE EN BIOLOGIE VEGETALE

Présentée et soutenue publiquement par Margot Loussouarn-Yvon Le 07 novembre 2017

L'ACIDE CARNOSIQUE ET LE CARNOSOL, DEUX SUPER-ANTIOXYDANTS DU ROMARIN (ROSMARINUS OFFICINALIS) Rôles, mécanismes, physiologie et applications

Laboratoire d’Ecophysiologie Moléculaire des Plantes DSV/BIAM/LEMP, UMR 7265 CNRS/CEA/AMU CEA Cadarache Composition du jury: Alain Tissier, Professeur, Leibniz-Institute of Plant Biochemistry, Halle Rapporteur Laurent Urban, Professeur, Université d’Avignon et du Pays du Vaucluse Rapporteur Stefano Caffarri, Professeur, Université d’Aix-Marseille Président Michel Havaux, Directeur de Recherche, CEA Directeur de thèse Simona Birtić, Docteur, Naturex Co-encadrante de thèse Christophe Bailly, Professeur, Université Pierre et Marie Curie Examinateur Marie-Elisabeth Cuvelier, Docteur, INRA-Agroparistech Examinatrice

Remerciements :

Tout d’abord, je souhaite exprimer ma gratitude aux membres du jury pour l’évaluation de ce travail, notamment au Professeur Laurent Urban et au Professeur Alain Tissier pour avoir accepté d’en être les rapporteurs. Je remercie le Docteur Stefano Caffarri de bien vouloir présider le jury ainsi que le Professeur Christophe Bailly et au Docteur Marie-Elisabeth Cuvelier pour leur participation à ce jury.

J’adresse également mes remerciements aux Docteurs Antoine Bily et Simona Birtić de la société Naturex de m’avoir fait confiance pendant ses 3 années pour mener à bien le sujet de thèse qu’ils m’ont proposé. Je remercie Simona Birtić en particulier pour ses conseils et son investissement quand j’en ai eu besoin.

Je souhaite remercier particulièrement le Docteur Michel Havaux, directeur du laboratoire et directeur de ma thèse, pour son accueil, son encadrement, son investissement et ses conseils précieux. Je le remercie également pour sa capacité à prendre du recul et à répondre de manière perspicace aux questions posées, qu’elles soient scientifiques, professionnelles ou personnelles. Au-delà d’un excellent directeur de thèse, je suis heureuse d’avoir rencontré une personne avec de grande qualité humaine qui a su être à l’écoute lors d’épisode personnel douloureux.

Je tiens également à remercier les personnes qui ont participé à ce projet. J’aimerais remercier le Professeur Anja Krieger-Liszkay pour m’avoir accueillie à plusieurs reprises dans son laboratoire, formée et conseillée sur les expériences de RPE. Je remercie aussi l’ingénieure Ljubica Svilar de la plateforme CRIBIOM pour son aide et son accompagnement lors des expériences de spectrométrie de masse. Je remercie toute l’équipe du GRAP (Groupe de Recherche Appliquée en Phytotechnologie) pour ses compétences techniques, et en particulier Patrice Ruellan, Frederic Espanet et Anne-Laure Benoit pour leur soutien dans les moments difficiles et pour les moments de détentes passés en leur compagnie. Je tiens à remercier chaleureusement Brigitte Ksas pour m’avoir formée aux différentes extractions et techniques HPLC du laboratoire, et surtout, je la remercie pour tous les moments agréables passés avec elle, son soutien, ses conseils et ce qu’elle est (si elle n’existait pas, il aurait fallu l’inventer).

J’adresse également un très grand Merci aux étudiants du service, avec un spécial big-up à Fred, Louis, Ivana et Inès pour les rires, l’écoute, les sorties au grand air, les soirées Games of Thrones, les discussions philosophico-scientifiques de comptoirs et pour tous les moments doux et sincères passés ensemble. Ils ont été une réelle soupape de sécurité pour moi. J’ai aussi une pensée d’amitié pour Léo et Anne qui ont suivi de près mes débuts à Cadarache et avec qui j’ai passé des moments inoubliables. En guest-star, je voudrais remercier ma meilleure amie, Alix Richard, Docteur en bien-vivre, qui me soutient depuis 18 ans dans tout ce que j’entreprends et qui a toujours cru en moi (vive le fromage, la tisane et les lits !).

Avec beaucoup d’amour, je dis un grand Merci à Gabriel et à ma grande famille pour m’avoir accompagnée et supportée ces derniers mois ardus. Ils sont contents que ce cycle se termine pour qu’un nouveau redémarre, et moi aussi. Je tiens également à transmettre ma gratitude à mes chats, Misépé, Patafoin et Snooky qui m’ont donné tellement d’amour dans les moments de solitude.

Enfin, je dédie cette thèse à mon grand-père, le Professeur André Roux, qui a insufflé le goût de la science à ma famille et à moi-même ; et à mon grand frère Sébastien, passionné de la nature à toutes les échelles, sans qui, je n’aurais pas fait de biologie.

Abréviations :

15-HEDE Acide 15-hydroxy-11,13 (Z,E)-eicosadienoique ABA Acide abscissique ADN Acide désoxyribonucléique ADNc AND complémentaire ADP Adénosine di-phosphate AE Acerola extract (actarit d’acérola) AGPI Acide gras polyinsaturé AIA Acide indole acétique AOX Alternative oxydase APX Ascorbate peroxydase ARN Acide ribonucléique ATP Adénosine tri-phosphate BET Bromure d’éthidium BHA Butylated hydroxyanisole BHT Butylated hydroxytoluene CA Carnosic acid (Acide carnosique) CARN Carnosol CAT Catalase CCD Charge coupled-device Col-0 Type sauvage columbia CPS Copalyl phosphate synthase CYP7/CYP8 Cytochrome P450 Cys Cystéine DGDG Digalactosyl diacyl glycérol DHA/MDHA Déhydroascorbate/Monodéhydroascorbate DHAR/MDHAR Déhydroascorbate réductase/Monodéhydroascorbate réductase dNTP Désoxyribonucléotides triphosphate DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl DTT Dithiothréitol EDTA Acide éthylène-diamine-tétraacétique ERE Espèces réactives électrophiles ERO Espèces réactives de l’oxygène FADH2/FAD Flavine adénine dinucléotide réduite/oxydée Fd Ferrédoxine FNR Ferrédoxine-NADP+ oxydoréductase FS Ferruginol synthase GAL l-Galactone-γ-lactone déshydrogénase GGDP Géranylgéranyl diphosphate GPX Glutathion peroxydase GR Glutathion réductase GSH/GSSG Glutathion réduit/oxydé HFS Hydroxyferruginol synthase HNE 4-hydroxy-2-nonenal HODE Acide octadécadiénoique HOTE Acide hydroxy octadécatriénoique HPLC-UV High performance liquid chromatography LA Linolenic acid LC-MS Liquid chromatography-mass spectrometry LHC Light harvesting complexe (antennes collectrices de lumière) MAPK Mitogen-activated proteine kinase MDA Malondialdéhyde MEBE Microscope électronique à balayage environnemental Met Méthionine MGDG Monogalactosyl diacyl glycérol MiS Miltiradiène synthase MSR Méthionine sulfoxide réductase MyoG Myoglobine G NAD(H) Nicotinamide adenine dinucleotide (réduit) NADP(H) Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (réduit) NCED 9-cis-epoxycarotenoide dismutase NPQ Non-photochemical quenching (piégeage non photochimique) OA/OSR Cocktails d’extraits végétaux enrichi en extrait de romarin PC/PC-OH Plastochromanol réduit/oxydé PCR Polymerase chain reaction PE Promegranate extract (extrait de grenade) PMSF Phenyl methylsulfonyl POBN 4-pyridyl-1-oxyde-N-tert-butylnitrone PQH2/PQ Plastoquinone réduite/oxydée PRX Peroxyrédoxine PSI/PSII Photosystème I/photosystème II qPCR Quantitative PCR RE Rosemary extract (extrait de romarin) RMN Résonance magnétique nucléaire RPE Résonance paramagnétique électronique RT Reverse transcriptase RubisCO Ribulose-1,5-biphosphate carboxylase/oxygénase SC Stabilisateur classique SOD Superoxyde dismutase SOSG Singlet oxygen sensor green SRX Sulfirédoxine TEMPD 2,2,6,6-tetraméthyl-4-pipéridone hydrochloride TOC Tocophérol TRX Thiorédoxine UPLC-MS Ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry XOD Xanthine oxydase

SOMMAIRE : I. Synthèse bibliographique ...... - 1 - 1. La production d’espèces réactives de l’oxygène (ERO) ...... - 3 - 1.1. L’oxygène singulet ...... - 3 - 1.2. Le radical superoxyde ...... - 4 - 1.3. Le peroxyde d’hydrogène ...... - 4 - 1.4. Le radical hydroxyle ...... - 5 - 2. Les sites de production des ERO ...... - 5 - 2.1. Les sites majoritaires de production des ERO ...... - 5 - 2.1.1. Les mitochondries ...... - 5 - 2.1.2. Les peroxysomes ...... - 7 - 2.1.3. Les chloroplastes ...... - 8 - 2.2. Les sites secondaires de production des ERO ...... - 9 - 3. Les cibles macromoléculaires des ERO ...... - 10 - 3.1. Les lipides ...... - 10 - 3.2. Les protéines ...... - 13 - 3.3. Les acides nucléiques ...... - 14 - 4. Les ERO comme molécule signal ...... - 14 - 4.1. L’oxygène singulet ...... - 15 - 4.2. Le peroxyde d’hydrogène ...... - 15 - 5. Les mécanismes ubiquitaires de défense contre les ERO chez les végétaux ...... - 16 - 5.1. Les stratégies d’évitement de la production des ERO ...... - 17 - 5.1.1. Les adaptations anatomiques ...... - 17 - 5.1.2. Les adaptations physiologiques ...... - 17 - 5.1.2.1. Les plantes en C4 et CAM ...... - 17 - 5.1.2.2. Le déplacement des chloroplastes ...... - 18 - 5.2. La détoxication des ERO dans les cellules végétales ...... - 19 - 5.2.1. Les mécanismes de détoxication enzymatique...... - 19 - 5.2.1.1. Les superoxyde dismutases ...... - 20 - 5.2.1.2. Les catalases ...... - 21 - 5.2.1.3. La glutathion peroxydase ...... - 21 - 5.2.1.4. Les enzymes du cycle ascorbate-glutathion ...... - 21 - 5.2.2. Les mécanismes de détoxication non-enzymatiques ...... - 23 - 5.2.2.1. L’ascorbate ...... - 23 - 5.2.2.2. Le glutathion ...... - 24 - 5.2.2.3. Les caroténoïdes ...... - 25 - 5.2.2.4. Les tocochromanols ...... - 28 -

5.2.2.5. Les flavonoïdes ...... - 30 - 6. L’acide carnosique, un mécanisme de défense spécifique ...... - 31 - 6.1. L’acide carnosique ...... - 32 - 6.2. La famille des Lamiacées ...... - 33 - 6.3. Le romarin : Rosmarinus officinalis...... - 35 - 6.4. L’acide carnosique dans le romarin ...... - 36 - 6.4.1. Localisation de l’acide carnosique ...... - 36 - 6.4.2. Biosynthèse de l’acide carnosique ...... - 36 - 6.4.3. Les facteurs influençant la quantité d’acide carnosique ...... - 38 - 6.5. L’acide carnosique, un antioxydant ...... - 40 - 6.5.1. In planta ...... - 40 - 6.5.2. In vitro ...... - 41 - 6.6. Les applications des extraits de romarin riches en CA ...... - 42 - 6.6.1. La cosmétique et la nutraceutique ...... - 42 - 6.6.2. L’industrie agroalimentaire ...... - 43 - 7. Contexte et objectifs de la thèse...... - 44 -

II. Matériels et méthodes ...... - 49 - 1. Oxydation in vitro de molécules biologiques ...... - 49 - 2. Rosmarinus officinalis ...... - 49 - 3. Arabidopsis thaliana...... - 50 - 4. Préparation des membranes de thylakoïdes d’Arabidopsis thaliana ...... - 51 - 5. Extraction des diterpènes à partir des trichomes par trempage des feuilles dans un solvant ...... - 51 - 6. Détermination de l’acide carnosique et du carnosol ...... - 51 - 7. Détermination des prényl lipides ...... - 52 - 8. Fluorescence de la chlorophylle...... - 52 - 9. Dosage de la chlorophylle ...... - 53 - 10. Imagerie de la peroxydation lipidique ...... - 53 - 11. Analyse biochimique de la peroxydation lipidique ...... - 53 - 1 • 12. Détection de O2 et HO par une méthode de résonnance paramagnétique électronique - 54 - 13. Analyses des métabolites par spectrométrie de masse ...... - 54 - 14. Microscopie électronique à balayage ...... - 56 - 15. Extraction des ARN totaux ...... - 56 - 16. Obtention des ADNc par transcription inverse et PCR quantitative...... - 56 - 17. Analyses statistiques ...... - 57 -

III. Résultats ...... - 61 - I. Les fonctions antioxydantes et de protecteur de lipides des diterpènes phénoliques des feuilles du romarin (Rosmarinus officinalis L.), CA et CAR ...... - 61 - 1. La protection des lipides majoritaires du chloroplaste par CA et CAR ...... - 61 - 2. Interactions du CAR et de CA avec les ERO ...... - 65 - 3. Les dérivés d’oxydation du CA in planta ...... - 70 - 4. CA et CARN exogènes protègent les membranes de thylakoïdes ...... - 74 - 5. Interactions directes du CARN avec le processus de peroxydation lipidique ...... - 74 - 6. Comparaison de deux variétés de romarin contenant des concentrations différentes en CA et CARN exposées à un stress photooxydant ...... - 76 - 7. Discussion ...... - 78 - II. Localisation et variations des niveaux des principaux diterpènes phénoliques dans le romarin ...... - 83 - 1. Localisation tissulaire ...... - 83 - 2. Variations de CA ...... - 84 - 3. Facteurs d’impact sur les variations en CA ...... - 89 - 4. Niveau d’expression de deux gènes de biosynthèse dans deux conditions différentes ..... - 91 - 5. Discussion ...... - 94 - III. Application industrielle. Protection de matrices alimentaires par deux cocktails d’extraits de végétaux enrichis en CA du romarin ...... - 101 - IV. Conclusions générales et perspectives ...... - 111 - V. Références bibliographiques ...... - 121 - VI. Annexes ...... - 159 - Publication scientifique soumise dans Plant Physiology : ...... - 166 - Présentations posters : ...... - 166 - Présentations orales : ...... - 169 -

Synthèse bibliographique

I. Synthèse bibliographique

Actuellement, une grande diversité d’espèces végétales (plus de 400 000 recensées en 2015) recouvre environ 50% de la surface émergée du globe. Elles sont présentes dans de nombreux habitats qui diffèrent dans la qualité des sols, le climat, la latitude ou l’altitude. Les végétaux sont d’une importance capitale pour le développement et le maintien de la vie sur terre. En effet, ils sont à la base de la chaîne alimentaire animale et humaine d’une part. D’autre part, ils sont responsables de la production d’oxygène nécessaire au développement de la vie. Et enfin, ils participent à la régulation des concentrations atmosphériques en CO2.

Contrairement aux autres êtres vivants, les plantes sont des organismes sédentaires et la majorité d’entre elles est fixée au sol et vit à l’interface de l’air et du sol. Ceci les a contraintes à développer des structures nécessaires à leur croissance, permettant et facilitant les échanges avec leur milieu. Le système racinaire permet l’absorption des nutriments - présents dans le sol et l’eau. Les principaux éléments minéraux absorbés sont l’azote (NO3 , + - 2- 2+ + NH4 ), le phosphore (H2PO4 , HPO4 ), le calcium (Ca ), le potassium (K ), le magnésium 2+ 2- (Mg ) et le soufre (SO4 ) (Raven et al, 1961). Les feuilles sont des organes spécialisés dans les échanges d’eau et de dioxyde de carbone, indispensables à la photosynthèse, entre l’atmosphère et la plante. Ces échanges gazeux s’effectuent au niveau de structures pluricellulaires situées sur l’épiderme inférieur appelées les stomates. L’eau et le dioxyde de carbone absorbés diffusent jusqu’aux cellules du parenchyme palissadique, riches en chloroplastes, où ils seront consommés par la photosynthèse pour produire du dioxygène et des carbohydrates selon la réaction suivante :

6 CO2 + 6 H2O (+ photon)  C6H12O6 +6 O2

Les chloroplastes possèdent deux membranes encadrant un espace intermembranaire et un stroma contenant de nombreuses protéines, des réserves d’amidon, des structures lipidiques nommées plastoglobules et un réseau dense de membranes. Ces dernières peuvent former des sacs aplatis, empilés en grana, les thylakoïdes délimitant le lumen et dans lesquelles se situent les systèmes photosynthétiques (Staehelin, 2003). Les membranes thylakoidiennes sont composées du photosystème II, d’un pool de plastoquinone, du cytochrome b6f, d’un pool de plastocyanine, du photosystème I, de ferrédoxine, de ferrédoxine-NADP+ réductase et d’une ATP synthase (Fig. 1).

- 1 -

Synthèse bibliographique

+ 2NADP H H

ADP + Pi ATP FNR

PSI Cytb ATP Stroma 6 Fd I f synthase Q  Q A B Qi F F A B Membrane PQ/PQH FX de thylakoïde 2 Q

P680 P70 - 0 Lumen 4e PSI PC

+ + H2O O + 4H 12H 2

Figure 1: Représentation schématique de la chaine photosynthétique de transport des électrons indiquant les quatre super-complexes (PSI, PSII, Cytb6f et l’ATP synthase), le transfert d’électrons et la production d’énergie. Les flèches noires et pleines représentent le flux linéaire d’électrons tandis que les flèches en tirets rouges correspondent aux flux cycliques des électrons.

Les processus du métabolisme oxygénique tels que la photosynthèse et la respiration conduit à la production d’Espèces Réactives de l’Oxygène (ERO) (Halliwell & Gutteridge, 1989). Ces ERO correspondent à des radicaux libres, des molécules actives non radicalaires et des dérivés anioniques de l’oxygène moléculaire. Environ 1% de l’oxygène présent dans les plantes est transformé en ERO dans les différentes organelles de la cellule végétale (Asada, 2006), et particulièrement dans le chloroplaste et la mitochondrie (Purvis, 1997). En condition normale de croissance, les ERO sont à faibles concentrations dans les cellules végétales ; elles jouent alors le rôle de messager induisant des réponses diverses. En condition de stress, leur concentration augmente fortement dans les cellules végétales, ils sont alors responsables des dommages oxydants sur les macromolécules telles que l’ADN, les lipides et les protéines (Wagner et al, 2004). Les stress peuvent être biotiques comme l’attaque de pathogènes ou une compétition avec d’autres plantes. Ils peuvent aussi être abiotiques tels que la sécheresse, le froid, la chaleur, les fortes intensités lumineuses, des excès de sels ou de métaux dans le sol.

- 2 -

Synthèse bibliographique

1. La production d’espèces réactives de l’oxygène (ERO)

A l’état fondamentale, la présence de deux électrons de valence non appariés de spin parallèle sur l’oxygène le rend paramagnétique et peu réactif sur des molécules organiques (Apel & Hirt, 2004). L’oxygène moléculaire peut être activé soit par l’absorption d’énergie qui 1 modifie le spin d’un des électrons non appariés produisant l’oxygène singulet ( O2) (Fig.2a), soit par des transferts successifs d’un électron monovalent (Sharma et al, 2012) générant ainsi • - • le radical superoxyde ( O2 ), le peroxyde d’hydrogène (H2O2) et le radical hydroxyle (OH ) (Fig. 2b).

a

b

Figure 2: a) Mécanisme d'absorption d'énergie par l'O2 pour inverser le spin d'un de ses électrons de

1 valence, conduisant à la production d' O2 (Khabashesku et al, 2009) ; b) Mécanismes simplifiés de génération des radicaux superoxyde, hydroxyle et du peroxyde d’hydrogène par transferts successifs d’électrons monovalents.

1.1. L’oxygène singulet

1 L’oxygène singulet ( O2) est une ERO particulière formée par transfert d’énergie. En condition de fortes intensités lumineuses, il s’agit de la principale ERO produite dans les feuilles des plantes (Krieger-Liszkay et al, 2008 ; Triantaphylides et al, 2008). Il est formé principalement au niveau du photosystème II où une absorption excessive d’énergie

- 3 -

Synthèse bibliographique lumineuse favorise la formation de chlorophylle excitée à l’état triplet (3Chl* et P680* au niveau des antennes collectrices et du centre réactionnel respectivement) qui peut transférer 3 1 son excitation à l’oxygène à l’état fondamental ( O2) pour former l’ O2 (Krieger-Liszkay, 2004 ; Triantaphylidès et al, 2008) (Fig. 2a). Il s’agit d’une molécule à haut potentiel d’oxydation avec un temps de demi-vie de l’ordre de la microseconde dans les cellules biologiques (Hackbarth et al, 2010 ; Hatz et al, 2007). Il a une affinité particulière pour les doubles liaisons conjuguées comme celles présentes dans les acides gras polyinsaturés.

1.2. Le radical superoxyde

Le radical superoxyde est formé par transfert d’un électron monovalent sur le dioxygène initiant ainsi la formation des ERO secondaires. Il est produit au niveau des mitochondries, des peroxysomes et des chloroplastes où l’absorption excessive d’énergie lumineuse conduit au transfert d’un électron du PSII et/ou de la ferrédoxine du PSI vers l’oxygène formant ainsi • - • l’ O2 . Cette ERO est également la base conjuguée du radical perhydroxyle (HO2 ) hautement réactif (Fridovich, 1983). Il s’agit d’une ERO modérément réactive avec un temps de demi- vie de l’ordre de 1 microseconde dans les cellules biologiques (Pryor, 1986). La présence • - d’une charge négative sur l’ O2 lui confère un caractère nucléophile et favorise ainsi l’interaction avec des protéines à centres Fe-S (Imlay, 2003 ; Moller et al, 2007).

1.3. Le peroxyde d’hydrogène

Le radical superoxyde peut être converti en peroxyde d’hydrogène H2O2 par acceptation d’un électron supplémentaire et de deux protons ou par réaction enzymatique catalysée par la superoxyde dismutase (SOD). Le peroxyde d’hydrogène est une ERO non radicalaire, modérément réactive avec une demi-vie d’environ 1 milliseconde dans les cellules biologiques (Moller et al, 2007 ; Makino et al, 2004). L’absence d’électron non apparié lui confère la capacité de traverser les membranes par les aquaporines (Makino et al, 2004 ; Bienert et al, 2006). Ainsi, il peut causer des dommages oxydatifs loin de son lieu de production. En conditions optimales de croissance, il est produit à faible concentration et dans ces conditions, sa stabilité et ses propriétés lui confèrent un rôle de molécule signal. En conditions de contraintes environnementales, sa concentration augmente fortement et il devient alors toxique pour les cellules. Il attaque préférentiellement les polysaccharides cellulaires, les résidus cystéine (-SH) et méthionine (-SCH3) des protéines, les groupements thiols des enzymes du cycle de Calvin, la Cu/Zn-SOD et la Fe-SOD (Halliwell et Gutteridge, 1989). Il intervient également dans la peroxydation lipidique (Kirkland, 1991). A forte

- 4 -

Synthèse bibliographique concentration, le peroxyde d’hydrogène participe à la mort cellulaire programmée (Dat et al, 2000). De plus, sa rencontre avec le radical superoxyde conduit à la formation du radical hydroxyle selon la réaction d’Haber-Weiss.

1.4. Le radical hydroxyle

Le radical hydroxyle est l’ERO la plus réactive avec un temps de demi-vie très court, de l’ordre de la nanoseconde dans les systèmes biologiques (Moller at al, 2007 ; Pryor, 1986). Dans les cellules, il est généré par le radical superoxyde et le peroxyde d’hydrogène en présence de fer (Fe(II) et/ou Fe(III)) lors de la réaction d’Haber-Weiss (Beauchamp et Fridovich, 1970) suivante :

3+ • - 2+ Fe + O2  Fe + O2

2+ 3+ - • Fe +H2O2  Fe + HO + HO (Réaction de Fenton)

• - Les processus limitant l’accumulation d’ O2 et d’H2O2 dans les cellules participent à l’inhibition de la formation d’HO•. Il a la capacité d’attaquer toutes les macromolécules constitutives des cellules biologiques (acides nucléiques, lipides et protéines) conduisant ainsi à la mort cellulaire (Halliwell, 1991 ; Pinto et al, 2003).

2. Les sites de production des ERO

Chez les eucaryotes, les ERO sont essentiellement produites par les organites cellulaires où il y a une forte activité métabolique ou un important flux d’électrons tels que les chloroplastes, les mitochondries et les peroxysomes. Il existe des sites secondaires de production d’ERO tels que le réticulum endoplasmique, la membrane plasmique, la paroi cellulaire et l’apoplaste (Das & Roychoudhury, 2014 ; Sharma et al, 2012 ; Tripathy & Oelmuller, 2012). En conditions lumineuses, les sites majeurs de production des ERO sont les chloroplastes et les peroxysomes. A l’obscurité, la majorité des ERO sont générées par les mitochondries (Choudhury et al, 2013).

2.1. Les sites majoritaires de production des ERO 2.1.1. Les mitochondries

• - Les mitochondries génèrent des ERO telles que H2O2 et O2 (Navrot et al, 2007) lors de la photorespiration au niveau de la chaine mitochondriale de transport des électrons. Ce processus permet l’oxydation du NADH ou du FADH et la formation d’une force proton

- 5 -

Synthèse bibliographique motrice au niveau des membranes internes des mitochondries (Wilson et al, 1974). La chaine mitochondriale de transport d’électrons est composée des complexes protéiques suivants : le complexe I (NADPH-ubiquinone réductase), le complexe II (Succinate-CoQ réductase), le complexe III (complexe cytochrome bc1) et le complexe IV (cytochrome c oxydase). Les complexes I et III sont les sites principaux de production des ERO (Moller et al 2007 ; Noctor • - et al, 2007). La formation de O2 est une réduction directe du O2 au niveau de la région des flavoprotéines du complexe I. La production de cette ERO est favorisée lorsqu’il y a une carence en substrat lié au NAD+. En effet, cette carence, régulée par l’hydrolyse de l’ATP, entraine une inversion du flux d’électrons du complexe II vers le complexe I (Fig. 3). Au niveau du complexe III, le transfert d’électron des ubiquinones réduites vers le cytochrome C1 conduit à la formation d’une ubisemiquinone radicalaire instable et hautement réductrice. Ce • - radical permet la fuite d’un électron vers l’O2 formant ainsi O2 (Murphy, 2009). La formation des ERO dans les mitochondries n’est pas qu’un processus de réduction directe de l’oxygène. Elles peuvent également être produites par des enzymes telles que les aconitases, productrices directes d’ERO, présentes dans la matrice mitochondriale ou les l-Galactone-γ- lactone déshydrogénase (GAL), productrices indirectes d’ERO, qui alimentent en électrons la • - chaine de transport mitochondriale (Andreyev et al, 2005 ; Rasmusson et al, 2008). L’ O2 produit dans la mitochondrie est ensuite converti en H2O2 par la SOD mitochondriale puis en autres ERO. Les mitochondries des plantes produisent des ERO en faibles quantités comparées aux mitochondries des cellules de mammifères (Purvis, 1997). Ceci peut être expliqué par la présence de l’enzyme Alternative Oxidase (AOX) dans les mitochondries des plantes. Cet enzyme est un compétiteur du complexe cytochrome bc1 pour les électrons (Maxwell et al, 1999). En effet, elles ont pour rôle le maintien de l’état réduit du pool d’ubiquinone, réduisant ainsi la production des ERO (Fig. 3).

- 6 -

Synthèse bibliographique

+ + + H H Cyt c H - • - e O - 2 e

Ubiquinone - Membrane - - e e - e Complexe mitochondriale Complexe e Complexe I Complexe II AOX III IV ATP Matrice synthase NADH O FADH2 2

+ • - + • - O2 NAD FAD H2O O2 O2 H O 2 ADP + Pi ATP

+ H Figure 3: Représentation schématique de la chaine mitochondriale de transfert des électrons et de la production d'ERO au niveau des complexes I et III. AOX : alternative oxydase, Cyt c : cytochrome c,

• - O2 : radical superoxyde

2.1.2. Les peroxysomes

Chez les plantes, les peroxysomes ont un métabolisme dit oxydatif et sont les sites majeurs de

production d’H2O2 intracellulaire (del Rio et al, 2006 ; Palma et al, 2009). Lorsque le CO2 disponible devient limitant pour la photosynthèse, la photorespiration augmente. La Ribulose

1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygénase (RuBisCO) peut utiliser l’O2 comme substrat plutôt

que le CO2, ce qui conduit à la formation de glycolate. Cette molécule est ensuite transportée

dans les peroxysomes où il est oxydé par une glycolate oxydase produisant ainsi de l’H2O2 • - (Noctor et al, 2002). Dans les matrices peroxysomales, l’ O2 est un sous-produit généré lors de la transformation de la xanthine et de l’hypoxanthine en acide urique par la xanthine oxydase. Au niveau des membranes peroxysomales, la petite chaine de transport des électrons

dépendante de la NADPH-cytochrome P450 réductase utilise l’O2 comme accepteur • - d’électron produisant ainsi l’ O2 (Lopez-Huertas et al, 1999) (Fig. 4).

- 7 -

Synthèse bibliographique

Chaine de transport Oxydases des électrons

+ NAD - e O2 - e - • - H O • - NADH 2 2 e O2 O2

O2 xanthine Acide urique XOD Matrice Membrane

Cytosol

Figure 4: Représentation schématique de la production des ERO dans les peroxysomes. H2O2 : • - peroxyde d’hydrogène ; O2 : radical hydroxyle ; XOD : xanthine oxydase

2.1.3. Les chloroplastes

1 • - Les chloroplastes génèrent des ERO telles que l’ O2, l’H2O2 et l’ O2 lors de la photosynthèse au niveau de la chaine photosynthétique de transport des électrons. Ce processus permet la production de NADPH et d’une force proton motrice au niveau des membranes permettant la formation d’ATP. La chaine photosynthétique de transport des électrons est composée du photosystème II (PSII), d’un pool de plastoquinone, du cytochrome b6f, d’un pool de plastocyanine, du photosystème I (PSI), de ferrédoxine, de ferrédoxine-NADP+ réductase et d’une ATP synthase (Fig. 5). Le PSII et le PSI sont les principaux sites de production des ERO (Day & Roychoudhury, 2014). Ce processus a lieu soit en condition sur-réductrice de la chaine de transport des électrons, soit en déséquilibre entre énergie reçue et énergie consommée en condition de stress lumineux. Ces deux états mènent à l’inhibition des processus photosynthétiques conduisant ainsi à une absorption excessive d’énergie lumineuse. La diminution des capacités de production de pouvoir réducteur par la photosynthèse conduit à la fuite d’électron au niveau des deux photosystèmes. Dans le PSII, la fuite des électrons • - peut se réaliser au niveau des sites QA et QB conduisant à la formation de l’ O2 (Cleland &

Grace, 1999). Au niveau du PSI, la fuite des électrons sur l’O2 peut provenir de la ferrédoxine suivant la réaction de Mehler (Elstner, 1991) :

• - • 2 O2 + 2 Fdred  2 O2 + Fdox

- 8 -

Synthèse bibliographique

• - Elle peut également provenir des centres FA, FB, FX. L’ O2 produit par le PSI et le PSII est

ensuite converti en H2O2 de manière spontanée ou grâce à l’intervention d’une SOD (Miller et 1 al, 2010). L’ O2 est également formé au niveau du PSII par transfert d’énergie d’une

chlorophylle excitée à l’O2. La sur-réduction de la chaine ou un déséquilibre énergétique conduisent à la surexcitation d’une chlorophylle formant ainsi une 3Chl* qui transfert son 3 1 énergie à l’ O2 pour produire l’ O2 (Asada, 2006 ; Triantaphylidès & Havaux, 2009) (Fig. 5).

2NADPH + H

ADP + Pi ATP • - FNR 1 O2 1 O2 O • - 2 O PSII O 2 ATP O Cytb6f 2 Stroma 2 Fd synthase

QA  QB Qi FA F Membrane de B PQ/PQH2 F thylakoïde X QO P680 P700 - Lumen 4e + PSI O2 + 4H PC H O 2 2 + 12H H2O

Figure 5: Représentation schématique de la chaine photosynthétique de transfert d'électrons et de la

• - production des ERO. H2O2 : peroxyde d’hydrogène ; O2 : radical hydroxyle

2.2. Les sites secondaires de production des ERO

Il existe également des sites mineurs de production d’ERO tels que le réticulum endoplasmique et la membrane plasmique. Ces deux compartiments cellulaires possèdent des oxydoréductases transporteuses d’électrons dépendantes du NADPH, enzymes pouvant

participer à la perte d’électrons vers l’O2 (Heyno et al, 2011 ; Mittler, 2002). Des ERO sont également produites au niveau de la paroi cellulaire. Au niveau de l’apoplaste, les oxalate

oxydases et les amine oxydases sont impliquées dans la production d’H2O2 d’une part (Cona et al, 2006 ; Lane, 2002). D’autre part, les peroxydases localisées dans la paroi cellulaire peuvent produire du HO• (Heyno et al, 2011).

- 9 -

Synthèse bibliographique

3. Les cibles macromoléculaires des ERO

En concentration élevée, les ERO sont capables d’attaquer les macromolécules constitutives des cellules telles que les lipides, les protéines et l’ADN. Les dommages causés à ces molécules conduisent inévitablement à la mort cellulaire.

3.1. Les lipides

Les membranes plasmiques composées de lipides permettent de garder l’intégrité des cellules, de les protéger et de réguler les interactions cellules-environnement. Chez les plantes, les lipides majoritaires des membranes chloroplastiques, principal lieu de production d’ERO, sont les galactolipides tels que le monogalactosyl diacylglycérol (MGDG) et le digalactosyl diacylglycérol (DGDG) (Kobayashi et al, 2007 ; Kelly et al, 2016). Ces lipides sont composés d’un groupement galactosyl sur lequel se trouve un glycérol portant deux acides gras polyinsaturés (AGPIs). Les AGPIs majoritaires des membranes de thylakoïdes et des membranes phospholipidiques sont l’acide linoléique (18:2) et l’acide linolénique (18:3) (Moller et al, 2007). En condition de stress, les ERO produites attaquent les lipides des membranes selon le processus de peroxydation lipidique pour former un mélange complexe d’hydroperoxydes lipidiques (Fig. 6) (Moller et al, 2007 ; Montillet et al, 2004 ; Mueller, 2004). Ce processus a pour conséquence de diminuer la fluidité et l’étanchéité membranaires. Les ERO attaquent les lipides sur les deux doubles liaisons entre les atomes de carbone des AGPIs, et sur les liaisons ester entre le glycérol et les AGPIs. Deux mécanismes contribuent à la formation d’hydroperoxydes : une réaction dite de type I médiée par les espèces radicalaires de l’oxygène et une réaction de type II médiée par l’oxygène singulet.

La peroxydation par les radicaux libres (type I) s’effectue en trois étapes distinctes : l’initiation, la propagation et la terminaison (Bawn, 1956 ; El Beltagi & Mohamed, 2013). La phase d’initiation consiste en l’abstraction d’un atome d’hydrogène (H•) d’un carbone situé entre deux doubles liaisons d’un AGPI formant ainsi un radical alkyle (L•). Ce radical réagit 3 • avec l’oxygène moléculaire ( O2) et produit des radicaux peroxyles conjugués (LOO ). Ces espèces radicalaires captent un atome d’hydrogène d’un autre AGPIs produisant un mélange • 3 d’hydroperoxydes et de nouveaux radicaux alkyles. De nouveau, ces L réagissent avec l’ O2 pour former des radicaux peroxyles. Il s’agit de la phase de propagation durant laquelle un grand nombre d’hydroperoxydes sont produits. L’étape de terminaison est caractérisée par la rencontre de deux radicaux lipidiques qui forment des produits non radicalaires, non toxiques pour les cellules (Fig. 6).

- 10 -

Synthèse bibliographique

La peroxydation de type II, aussi appelée photo-oxydation, est une réaction entre l’oxygène singulet et les AGPIs conduisant à la fixation d’O2 sur les doubles liaisons de ces derniers. Cette réaction produit également différents isomères d’hydroperoxydes. (Fig. 6)

Initiation Propagation

O ● 2 Lipides (LH) Radical alkyle (L ) ● ● HO , LO ● ● Radical peroxyle (LOO )

LH Terminaison

1 ● O2 ● ●

LOO , L

Produits non-radicalaires

Hydroperoxydes (LOOH)  HOTE et HODE

Figure 6: La peroxydation lipidique

L’oxydation de l’acide linoléique conduit à la formation de deux isomères de position, les acides 9-hydroxy- 10,12(Z,E) octadécadiénoique (9-HODE) et 13-hydroxy- 9,11(Z,E) octadécadiénoique (13-HODE). La peroxydation de l’acide linolénique produit les acides 9- hydroxy-10,12,15(E,Z,Z) octadécatriénoique (9-HOTE), 12-hydroxy-9,13,15(Z,E,Z) octadécatriénoique (12-HOTE), 13-hydroxy-9,11,15(Z,E,Z) octadécatriénoique (13-HOTE) et 16-hydroxy-9,12,14(Z,Z,E) octadécatriénoique (16-HOTE). Ces hydroperoxydes possèdent des doubles liaisons conjuguées ce qui permet leur détection en UV et leur analyse par HPLC- UV selon la méthode développée par Montillet et al (2004). L’oxydation de l’acide 1 linolénique par l’ O2 conduit à la formation spécifique des acides 10-hydroxy- 8,12,15(E,Z,Z) octadécatriénoique (10-HOTE) et 15-hydroxy- 9,12,16(Z,Z,E) octadécatriénoique (15- HOTE). Ces deux isomères ne possèdent pas de doubles liaisons conjuguées, ils n’absorbent pas dans l’UV mais peuvent être détecté en spéctrométrie de masse (Triantaphylidès et al, 1 2008). La spécificité de ces hydroperoxydes à l’ O2 fait de ces molécules des marqueurs de cette ERO (Fig. 7).

- 11 -

Synthèse bibliographique

1 Figure 7: Hydroperoxydes produits par la peroxydation de l’acide linolénique (18 :3) in vitro par l’ O2

• 1 • et l’HO . L’ O2 est généré par photoactivation de l’O2 en présence de bleu de méthylène. L’HO est

2+ produits par la réaction entre l’H202 ou le tert-BOOH et le Fe . (Triantaphylidès et al, 2008). 9- HOTE : acide 9-hydroxy-10,12,15(E,Z,Z) octadécatriénoique , 12-HOTE : acide 12-hydroxy- 9,13,15(Z,E,Z) octadécatriénoique, 13-HOTE : acide 13-hydroxy-9,11,15(Z,E,Z) octadécatriénoique, 16-HOTE : acide 16-hydroxy-9,12,14(Z,Z,E) octadécatriénoique, 10-HOTE : acide 10-hydroxy- 8,12,15(E,Z,Z) octadécatriénoique, 15-HOTE : acide 15-hydroxy- 9,12,16(Z,Z,E) octadécatriénoique.

Les hydroperoxydes sont des molécules instables. Leur dégradation produit des espèces radicalaires telles que des radicaux libres, des radicaux lipidiques et des dérivés d’aldéhyde tels que le 4-hydroxy-2-nonenal (HNE) et la malondialdéhyde (MDA) (Fig. 8). Le HNE et le

MDA peuvent faire des adduits sur les groupements –NH2 des protéines ou de l’ADN, créant des dommages secondaires sur ces macromolécules (Halliwell, 2006 ; Moller & Kristensen, 2004). Les espèces radicalaires attaquent les lipides, les protéines et l’ADN, aggravant ainsi le stress oxydant (Fig. 8).

Hydroperoxydes (LOOH)  HOTE et HODE

Malondialdéhyde (MDA) 4-hydroxyalkénal Figure 8: Produits de dégradation des hydroxyperoxydes d'acide gras polyinsaturés

- 12 -

Synthèse bibliographique

Les plantes exposées à différents stimuli de stress tels qu’une forte intensité lumineuse, d’importantes variations de température ou une sécheresse intense accumulent les peroxydes lipidiques (Havaux & Niyogy, 1999 ; Mishra et al, 2011).

3.2. Les protéines

• • - Les protéines sont également des cibles majeures des ERO, notamment l’HO et l’ O2 . Leur oxydation est associée au stress oxydant, au vieillissement et à certaines maladies. Au contact des ERO, les protéines peuvent subir différents types de modifications telles que l’oxydation de la chaine peptidique et sa fragmentation, la carbonylation ou l’oxydation de la chaîne latérale des acides aminés.

L’attaque de la chaine peptidique par le radical hydroxyle produit une série d’espèces radicalaires telles que des radicaux alkoxyles et des dérivés hydroxylés de protéines. Les radicaux issus de cette oxydation sont capables d’interagir avec d’autres acides aminés de la même chaine peptidique ou d’une autre chaine. L’accumulation des radicaux alkoxyles peut induire le clivage de la chaine peptidique (Garrison et al, 1962).

Toutes les chaines latérales des résidus des protéines sont sensibles à l’oxydation par les ERO et particulièrement les résidus aromatiques comme le tryptophane, la phénylalanine et la tyrosine. La modification des acides aminés tels que l’arginine, la lysine, la proline et la thréonine conduit à la dégradation protéolytique des protéines (Davies, 2005 ; Moller et al, 2007). Les acides aminés contenant des groupements thiols ou du soufre tels que la cystéine 1 • ou la méthionine sont aussi susceptibles d’être attaqués par l’ O2 ou l’HO . En effet, ces ERO peuvent soustraire un atome d’hydrogène du résidu cystéine conduisant à la formation d’un radical thiyle. L’association de deux radicaux thiyles forment un pont disulfure. L’addition d’une molécule d’O2 sur une méthionine forme un dérivé sulfoxyde (Hancock et al, 2006, Sadanandom et al, 2000). Ces deux types de modifications conduisent à la dégradation protéolytique des protéines. Les protéines portant des centres Fe-S sont plus sensibles à • - l’oxydation par l’ O2 (Das & Roychoudhury, 2014 ; Gardner & Fridovich, 1991). En conditions de stress, la quantité de protéines carbonylées augmente chez les plantes, elles sont donc fréquemment utilisées comme marqueur pour l’étude de l’oxydation des protéines par les ERO (Job et al, 2005 ; Moller et al, 2007).

Dans la plupart des cas, l’oxydation des protéines est irréversible et mène à l’agrégation puis à la dégradation de celles-ci par les systèmes de protéolyse cellulaire (Davies, 1986 ; Stadman,

- 13 -

Synthèse bibliographique

1986). Pourtant, il existe des mécanismes de réparation des acides aminés soufrés (Cys et Met) par des réductases à thiols telles que les thiorédoxines (TRX), les sulfirédoxines (SRX) et les méthionines sulfoxyde réductases (MSR). Les MSR réparent les méthionines oxydées (Met-O) en Met en utilisant les TRX comme donneur d’électron. En effet, des mutants de tabac surexpresseurs de TRX montrent une plus grande capacité des MSR à réparer les méthionines oxydées (Rey et al, 2013). Les TRX réparent également directement les protéines oxydées par réduction des ponts disulfures formés (Arnér & Holmgren, 2000). Les SRX sont chloroplastiques et portent une activité acide sulfinique réductase. Elles interviennent dans la réactivation d’une thiorédoxine peroxydase, la 2-cys-peroxydérodoxine (2-Cys-PRX) capable de réduire par réduction les peroxydes. Un mutant d’Arabidopsis dépourvu de SRX présente une accumulation de 2-Cys-PRX oxydées et la surexpression d’AtSRX augmente la tolérance d’Arabidopsis au stress photooxydant (Rey et al, 2007).

3.3. Les acides nucléiques

Les ADN nucléaires, mitochondriaux et chloroplastiques peuvent également être altérés par les ERO. Les ADN des organites énergétiques dépourvus d’histones et à proximité des sources d’ERO sont plus sensibles aux dommages oxydants (Richter, 1992 ; Das & Roychoudhury, 2014 ; Tujeta et al, 2009). L’attaque de l’ADN par les ERO engendre des délétions de base, la dimérisation des bases pyrimidines, des cassures de brin, des liaisons ADN-protéines et des modifications de base telles que l’alkylation et l’oxydation (Tujeta et al, 2001 ; Tujeta & Tujeta, 2001). L’HO• attaque les deux types de bases, purine et pyrimidine, et le squelette de désoxyribose (Halliwell & Gutteridge, 1989) ce qui peut générer des cassures 1 de brins et créer des liaisons ADN-protéines. L’ O2 attaque principalement la guanine alors • - que l’H2O2 et l’ O2 ne réagissent pas avec l’ADN (Wiseman & Halliwell, 1996). Les ERO soustraient un atome d’hydrogène du carbone d’un sucre désoxyribose ce qui conduit à la formation d’un radical désoxyribose causant la cassure du brin (Evans et al, 2004). En général, les dommages de l’ADN sont irréversibles et conduisent à la mort cellulaire.

4. Les ERO comme molécule signal

L’attaque des macromolécules cellulaires par les ERO en condition de stress est bien connue 1 (Mittler, 2002). Cependant, certaines de ces ERO telles que l’ O2 et l’H2O2 ont également un rôle de molécule signal à concentration faible ou modérée. En effet, la production d’ERO en faible quantité conduit à des modifications d’expression de gènes nucléaires induisant une

- 14 -

Synthèse bibliographique adaptation des plantes au stress, ou à la mort cellulaire programmée (Appel & Hirt, 2004 ; Triantaphylidès & Havaux, 2009).

4.1. L’oxygène singulet

L’oxygène singulet est une molécule hautement réactive à court temps de demi-vie. Des 1 études récentes ont démontré le rôle de molécule signal de l’ O2 produit par le PSII (Fischer et al 2007, Ramel et al, 2013a). En particulier, il a été proposé que cette ERO transmette le signal au noyau pour reprogrammer l’expression génétique via des médiateurs (Farmer & Davoine, 2007). Les protéines EX1 et EX2 (EXECUTEUR) ont été identifiées dans le mutant 1 flu comme molécules signal de l’ O2 (Lee et al, 2007). Les protéines GUN1-GUN6 (Genome Uncoupled), impliquées dans la biosynthèse des tetrapyroles, interviennent aussi dans la l signalisation rétrograde de O2 et H2O2 (Larkin et al, 2003 ; Woodson et al, 2011). La topoisomèrase VI a également été identifiée dans le mutant flu pour être impliquée dans la 1 régulation de l’expression de gènes de réponse à l’ O2 et à l’H2O2 (Simkova et al, 2012). En condition de stress, la protéine MBS1 (METHYLENE BLUE SENSITIVITY 1) s’accumule dans des granules cytosoliques spécifiques et fonctionne comme régulateur de l’expression de 1 gènes spécifique à l’ O2 conduisant ainsi à l’augmentation de la résistance au stress (Shao et al, 2013). Le β-carotène situé au niveau du centre réactionnel du PSII, proche du site de 1 1 production de l’ O2, forme la première ligne de défense contre l’ O2. Il a alors été suggéré que 1 les produits d’oxydation du β-carotène pourraient servir de molécules signal de l’ O2 (Ramel et al, 2012b). En condition de stress photooxydant, il a été montré que des dérivés du β- carotène, comme le β-cyclocitral, le β-ionone, l’α-ionène et le dihydroactinidiolide, 1 s’accumulent dans les feuilles. Le β-cyclocitral a été identifié comme molécule signal de l’ O2 agissant sur l’expression de gènes nucléaires entraînant une augmentation de la tolérance au stress photooxydant (Ramel et al, 2012b).

4.2. Le peroxyde d’hydrogène

1 Contrairement à l’ O2, l’H2O2 est une molécule peu réactive avec un temps de demi-vie assez long. Il joue un rôle de molécule signal à faible concentration (quelques µM) et peut traverser les membranes à travers les aquaporines ce qui lui confère un rayon d’action large. Il peut agir sur l’expression des gènes nucléaires à travers la protéine GUN1, la cascade de signalisation des MAPK (Chi et al, 2013) et la topoisomèrase VI (Simkova et al, 2012). Il peut également agir par inactivation des protéines régulatrices de la concentration en H2O2 telles que les peroxyrédoxines dont la suroxydation entraine une augmentation de la concentration locale en

- 15 -

Synthèse bibliographique cette ERO et par conséquent l’oxydation des protéines situées à proximité (Wood et al, 2003).

Il a été identifié que l’H2O2 peut induire la mort cellulaire programmée à travers l’éthylène

(de Jong et al, 2002). L’H2O2, l’acide abscissique et le calcium agissent sur la fermeture des stomates entraînant une résistance aux stress hydrique (Terzi et al, 2014 ; Zou et al, 2015).

5. Les mécanismes ubiquitaires de défense contre les ERO chez les végétaux

Les végétaux sont des organismes immobiles dits sessiles, ils sont alors incapables de fuir face aux contraintes favorisant la production d’ERO et altérant ainsi leur croissance. Afin de limiter l’accumulation de molécules oxydantes et leurs effets néfastes sur les macromolécules cellulaires, les plantes ont développé différentes stratégies. D’une part, elles ont mis en place des mécanismes d’évitement de la production d’ERO. Et d’autre part, ces organismes possèdent de nombreux mécanismes de détoxication non-enzymatiques et enzymatiques des ERO (Fig. 9).

Figure 9: Régulation du niveau d'ERO (ROS) par les antioxydants (AOX). L’équilibre est maintenu sauf si la production d’ERO est en excès ou si le pool d’antioxydant diminue, ces deux conditions conduisent à un stress oxydatif.

- 16 -

Synthèse bibliographique

5.1. Les stratégies d’évitement de la production des ERO

Les stratégies d’évitement de la production d’ERO correspondent à des adaptations anatomiques et/ou physiologiques.

5.1.1. Les adaptations anatomiques

Les plantes des milieux secs et arides limitent l’évaporation de l’eau grâce à une couche de cire épaisse pour les sclérophytes (Turner, 1994, Paoletti, 2005) et/ou grâce à la présence de trichomes augmentant la réflectance pour les trichophytes (Larcher, 2000). De plus, les plantes sont capables d’orienter leurs feuilles en fonction de la force de l’intensité lumineuse. En conditions optimales de croissance, les feuilles sont naturellement orientées en direction de la source lumineuse permettant de capter le maximum de photons et réaliser efficacement la photosynthèse. En condition de fortes intensités lumineuses, les feuilles sont alors orientées parallèlement aux rayons incidents limitant une saturation de la photosynthèse par les photons et donc la production d’ERO (Kao & Forseth, 1992). Ces mouvements sont possibles par la présence de récepteurs membranaires de la lumière bleue, les phototropines (Kagawa et al, 2001).

5.1.2. Les adaptations physiologiques 5.1.2.1. Les plantes en C4 et CAM

Les plantes dites en C4 et CAM favorisent l’activité carboxylase de la RuBisCO afin de limiter la photorespiration, source importante d’ERO dans les organismes photosynthétiques.

Les plantes en C4 fixent le CO2 dans les cellules du parenchyme en une molécule à quatre carbones. Cette molécule, transporteuse de CO2, diffuse jusqu’aux cellules de la gaine et libère le CO2 qui est utilisé par la RubisCO dans le cycle de Calvin (Edwards et al, 2001). Les plantes CAM (Métabolisme Acide des Crassulacées) ouvrent leurs stomates la nuit et fixent le

CO2 dans une molécule en C4. Cette molécule est alors stockée dans la vacuole où elle sera consommée la journée pour fournir du CO2 à la RubisCO (Dodd et al, 2002). L’ouverture des stomates la nuit limite les pertes d’eau par évapotranspiration (Fig. 10).

- 17 -

Synthèse bibliographique

Figure 10: Représentation schématique des métabolismes en C4 et CAM

5.1.2.2. Le déplacement des chloroplastes

En conditions normales de croissance, les chloroplastes sont positionnés perpendiculairement aux rayonnements ce qui leur permet de capter le maximum d’énergie lumineuse. Les plantes soumises à de fortes intensités lumineuses ont la capacité de réorganiser leurs chloroplastes. En effet, des mutants d’Arabidopsis affectés dans le déplacement des chloroplastes sont plus sensibles aux fortes intensités lumineuses que des plantes sauvages (Kasahara et al, 2002). Il a été montré qu’une forte lumière bleue agit sur la phototropine 2 (PHOT 2) qui induit une augmentation de la concentration en Ca2+ et en calmoduline intracellulaire. Ceci active les filaments d’actine et de myosine et entraine ainsi le mouvement des chloroplastes (Grabalska & Malec, 2004 ; Krzeszowiec & Gabrys, 2007 ; Anielska-Mazur et al, 2009). Il a également

été suggéré que la lumière bleue induit la production d’H2O2 qui peut agir comme molécule signal dans le mouvement des chloroplastes. L’ajout exogène d’H2O2 à des concentrations supérieures à 0,1 mM augmente la réponse des chloroplastes aux fortes lumières bleues (Wen et al, 2008). Ce mécanisme de déplacement de chloroplastes développé par les plantes limite l’absorption trop importante d’énergie lumineuse et la production d’ERO au niveau de la

- 18 -

Synthèse bibliographique chaine photosynthétique de transport des électrons (Haupt & Scheuerlein, 1990 ; Brugnoli & Björkman, 1992 ; Park et al, 1996).

5.2. La détoxication des ERO dans les cellules végétales

En conditions physiologiques normales, les ERO produites dans les différents compartiments cellulaires de la plante sont efficacement éliminés ou piégés par divers antioxydants localisés dans ces organelles (Sharma et al, 2012). Dans ces conditions, il y a un équilibre permanent entre les ERO produites et les ERO piégées par les antioxydants (Foyer & Noctor, 2005). Par contre, cet équilibre est perturbé lors d’un stress biotique ou abiotique. En effet, en condition de stress, la concentration en ERO intracellulaire augmente fortement conduisant à un stress oxydatif (Fig. 11) (Scandalios, 2005 ; Sharma et al, 2012). Chez les plantes, les mécanismes antioxydants font intervenir des enzymes et/ou des molécules de détoxication des ERO.

Mécanismes enzymatiques : -SOD -APX -CAT -MDHAR

-DHAR -GR

ERO

ERO Mécanismes non- enzymatiques :

-Ascorbate stress au tolérance

Mécanismes de défense : : défense de Mécanismes -Glutathion

Stress biotique et abiotique et biotique Stress des détoxication et Piégeage -Caroténoïdes -Tocophérols -Plastoquinones -Flavonoïdes

-Alcaloïdes la de amélioration et oxydatif stress du Limitation

Figure 11: Résumé des mécanismes antioxydants des plantes intervenant dans la défense contre les ERO produits lors de stress biotiques et abiotiques

5.2.1. Les mécanismes de détoxication enzymatique

Chez les plantes, les mécanismes antioxydants enzymatiques font principalement intervenir les enzymes suivantes : superoxyde dismutase (SOD), catalase (CAT), ascorbate peroxydase (APX), monodéhydroascorbate réductase (MDHAR), déhydroascorbate réductase (DHAR), glutathion réductase (GR) et glutathion peroxydase (GPX). Elles ont pour fonction de convertir les ERO en composés moins toxiques ou de générer des antioxydants réduits

- 19 -

Synthèse bibliographique intervenant dans la détoxication des ERO (Sharma et al, 2012). Les principales réactions catalysées par ces enzymes sont illustrées dans le tableau 1.

Antioxydants enzymatiques Réactions catalysées • - + Superoxyde dismutase (SOD) 2 O2 + 2 H  H2O2 + O2

Catalase (CAT) 2 H2O2  2 H2O + O2

Glutathion peroxydase (GPX) H2O2 + GSH  2 H2O + GSSG

Ascorbate peroxydase (APX) H2O2 + AA  2 H2O + DHA

Monodéhydroascorbate réductase MDHA + NAD(P)H  AA + NAD(P)+ (MDHAR)

Déhydroascorbate réductase DHA + 2 GSH  AA + GSSG Cycle Cycle (DHAR)

ascorbate/glutathion Glutathion réductase (GR) GSSG + NAD(P)H  2 GSH + NAD(P)+

5.2.1.1. Les superoxyde dismutases

Les SOD sont des métalloprotéines présentes dans tous les organismes aérobiques. Elles sont situées dans les compartiments subcellulaires produisant des ERO où elles jouent un rôle central de défense contre le stress oxydatif (Scandalios, 1993). Cette enzyme catalyse la • - dismutation de O2 en O2 et H2O2. Les SOD ont été classées en trois groupes suivant le type de cofacteur présent au niveau de leur site actif : Cu/Zn-SOD, Fe-SOD et Mn-SOD (Whittaker and Whittaker, 1998). Seuls les gènes des trois premières SOD sont exprimés par le génome nucléaire des plantes. Une fois produites, les enzymes sont réparties dans les différents compartiments cellulaires en fonction de leur cofacteur (Bowler et al, 1992 ; Fridovich, 1989 ; Racchi et al, 2001). Les Mn-SOD sont spécifiques aux mitochondries alors que les Fe-SOD sont exclusivement chloroplastiques. Les Cu/Zn-SOD ont été localisées dans le cytosol, les chloroplastes, les peroxysomes et les mitochondries (Bueno et al, 1995 ; Jackson et al, 1978 ; Kanematsu & Asada, 1989). Il a été montré que l’activité des SOD augmente avec le stress (Mishra et al, 2013). Chez le tabac, la surexpression de Cu/Zn-SOD chloroplastique augmente la tolérance aux stress lumineux à faible température (Gupta et al, 1993).

- 20 -

Synthèse bibliographique

5.2.1.2. Les catalases

Les CAT sont des enzymes à hème qui catalysent la dismutation de l’H2O2 en H2O et O2.

Elles sont spécifiques de l’H2O2 et présentent une faible activité contre les dérivés peroxydés.

Les peroxysomes, sites majeurs de production d’H2O2 par la photorespiration, sont également la principale localisation des CAT. Les catalases des plantes ont été classées en trois groupes basés sur le profil d’expression des gènes : les CAT de classe I sont principalement exprimées dans les tissus photosynthétiques et sont régulées par la lumière ; les CAT de classe II sont exprimées dans les tissus vasculaires ; et les CAT de classe III sont essentiellement exprimées dans les graines et les jeunes pousses (Mhamdi et al, 2010 ; Willekens et al, 1995). En outre la détoxication de l’H2O2, les catalases jouent un rôle important dans le maintien de l’équilibre redox pendant un stress oxydatif. Des mutants d’Arabidopsis (cat2) et de tabac présentant une baisse de l’activité CAT montrent une importante accumulation de glutathion oxydé (GSSG) et une diminution d’ascorbate réduit (Queval et al, 2007, 2009 ; Willekens et al, 1997).

5.2.1.3. La glutathion peroxydase

La GPX est aussi une enzyme à hème capable d’éliminer efficacement l’H2O2 et les radicaux lipidiques peroxyles en conditions physiologiques normales et de stress (Asada, 1992). Les GPX sont localisées dans le cytosol, la vacuole et la paroi cellulaire où elles participent à des processus vitaux tels que la biosynthèse de la lignine et la défense contre des stress abiotiques en dégradant l’acide indole acétique (AIA) et en consommant de l’H2O2 au cours du processus (Asada et al, 1992).

5.2.1.4. Les enzymes du cycle ascorbate-glutathion

Les enzymes du cycle ascorbate-glutathion telles que l’ascorbate peroxydase (APX), la monodéhydroascorbate réductase (MDHAR), la déhydroascorbate réductase (DHAR) et la glutathion réductase (GR) sont essentielles dans la défense contre les ERO. Ces enzymes régénèrent l’ascorbate et le GSH, et détoxifient l’H2O2 (Fig. 12). Elles ont été identifiées dans le cytosol, les chloroplastes, les mitochondries et les peroxysomes (Jimenez et al, 1997).

Les APX sont des protéines à hème qui piègent l’H2O2 et le transforment en H2O et MDHA en utilisant l’ascorbate comme agent réducteur. Il existe cinq isoformes localisées dans le cytosol, le stroma, les thylakoïdes, les mitochondries et les peroxysomes (Madhusudhan et al,

2003 ; Sharma & Dubey, 2004). Les APX ont une plus grande affinité pour l’H2O2 que les

- 21 -

Synthèse bibliographique

CAT. De plus, leur large distribution dans la cellule les rend plus performantes que les CAT qui n’agissent qu’au niveau des peroxysomes.

Le MDHA produit par la réduction de l’H2O2 catalysée par les APX est très instable et peut spontanément se dismuter en DHA et ascorbate. Afin de limiter la production de DHA tout en recyclant l’ascorbate, la MDHAR catalyse la réduction du MDHA en ascorbate en utilisant le NADPH comme donneur d’électrons (Ushimaru et al, 1997). En absence de MDHA, il a été • - montré que la MDHAR participe à la photoréduction de l’O2 en O2 dans le chloroplaste (Miyake et al, 1998). La surexpression de MDHAR chloroplastique de tomate chez Arabidopsis augmente la tolérance aux fluctuations de température et au méthyl viologène (inducteur de superoxyde) ainsi que la concentration en ascorbate (Li et al, 2010).

La DHAR catalyse la réduction du DHA en ascorbate en utilisant du GSH comme donneur d’électrons (Ushimaru et al, 1997). Cette enzyme permet de régénérer l’ascorbate dans son état réduit et de maintenir ainsi son pouvoir antioxydant. En effet, des feuilles de tabac, de maïs et de pomme de terre surexprimant la DHAR montre une accumulation d’ascorbate (Chen et al, 2003 ; Qin et al, 2011).

Le GSH est consommé dans la conversion du MDHA et du DHA en ascorbate, conduisant 1 ainsi à la formation de glutathion oxydé (GSSG). La détoxification des ERO telles que l’ O2 et l’H2O2 nécessite un ratio GSH : GSSG élevé. Le GSSG produit est alors réduit en GSH par les GR en consommant du NADPH comme pouvoir réducteur. Le mécanisme d’action des GR implique la réduction de ponts disulfure en groupement thiol libre. La surexpression de GR chez le tabac et le peuplier révèle une augmentation de la tolérance aux stress oxydatifs et une élévation des niveaux d’ascorbate dans les feuilles (Aono et al, 1993 ; Foyer et al, 1995) (Fig. 12).

Figure 12: Représentation schématique de l'activité des enzymes intervenants dans le cycle ascorbate/glutathion (Locato et al, 2013). APX : Ascorbate peroxydase ; MDHAR : Monodéhydroascorbate réductase ; DHAR : Déhydroascorbate réductase ; GR : Glutathion réductase - 22 -

Synthèse bibliographique

5.2.2. Les mécanismes de détoxication non-enzymatiques

Il existe de nombreux mécanismes antioxydants non enzymatiques ubiquitaires qui agissent comme des tampons redox cellulaires tels que l’ascorbate et le glutathion, les caroténoïdes, les tocochromanols, les plastoquinones et les flavonoïdes (Apel & Hirt, 2004).

5.2.2.1. L’ascorbate

L’ascorbate (Fig. 13) est le composé antioxydant le plus abondant chez les plantes (10-100 mM) (Noctor & Foyer, 1998), il se concentre en majorité dans les tissus photosynthétiques. Environ 90% de cet antioxydant est situé dans le cytosol ainsi que dans l’apoplaste (Shao et al, 2008 ; Smirnoff, 2007). Sa capacité à transférer ses électrons dans diverses réactions enzymatiques et non-enzymatiques lui confère un fort pouvoir antioxydant (Ashraf et al, 2008 ; Smirnoff, 2007). En conditions physiologiques normales, l’ascorbate se trouve essentiellement à l’état réduit où il fonctionne notamment comme co-facteur de la violaxanthine dé-époxydase pour favoriser la dissipation de l’excès d’énergie (Smirnoff, • - 2000). En agissant contre les ERO telles que l’ O2 et l’H2O2, il s’oxyde et forme le monodéhydroascorbate (MDHA). Cette molécule instable peut spontanément générer du déhydroascorbate (DHA) et de l’ascorbate, ou être réduite en ascorbate par l’intervention de la MDHAR (Asada et al, 2000) (Fig. 12). Lorsque des mutants d’Arabidopsis vtc1, déficients dans la synthèse de cet antioxydant, sont exposés à des UV-B et à un stress hydrique, ils montrent une augmentation de la concentration en H2O2, une perte en chlorophylle et une baisse du rendement photochimique du PSII comparé aux plantes sauvages (Gao & Zhang, 2008). Dans ces mutants, la baisse du niveau d’ascorbate est corrélée à une augmentation de la quantité en glutathion comparé au type sauvage. Cette molécule peut alors compenser l’ascorbate dans l’élimination des ERO chez les plantes. L’importance de cette molécule en tant que mécanisme antioxydant est apportée par le mutant d’Arabidopsis vtc2 qui présente une forte sensibilité aux stress environnementaux dont le stress photooxydant (Conklin et al, 1996 ; Muller-Moule et al, 2004). Ce mutant produit une faible quantité d’ascorbate qui n’est pas accompagnée par un niveau élevé en glutathion.

- 23 -

Synthèse bibliographique

Figure 13: Structure chimique de l'ascorbate

5.2.2.2. Le glutathion

Le glutathion est une importante molécule à thiol non protéique qui possède également un fort pouvoir antioxydant chez les plantes par son efficacité à éliminer les ERO (Fig. 14). Cette molécule a été localisée dans tous les compartiments cellulaires (Foyer & Noctor, 2003). En condition physiologique normale, le glutathion existe sous forme réduite (GSH). Le pouvoir réducteur de cet antioxydant est porté par un résidu central de cystéine au sein de sa structure. 1 • - • GSH peut détoxiquer les ERO telles que O2, O2 , H2O2 et HO par réaction directe avec ceux-ci, conduisant à la formation de glutathion oxydé (GSSG). Le GSH peut également protéger les macromolécules telles que les protéines, les lipides et l’ADN soit en formant des adduits avec des espèces réactives électrophiles (ERE) dans un processus de glutathiolation, soit en agissant comme donneur de protons en présence d’ERO ou d’autres radicaux libres organiques. Ces deux processus conduisent à la formation de GSSG (Asada, 2006). Un ratio réduit/oxydé élevé d’ascorbate et de glutathion est nécessaire pour éliminer les ERO. Par conséquent, ces deux antioxydants sont continuellement régénérés par le cycle ascorbate/glutathion (Foyer & Halliwell, 1976). La glutathion réductase convertit le GSSG généré en GSH selon les mécanismes décrits précédemment (Fig. 12). Le GSH participe aussi à la réduction du DHA en ascorbate par la DHAR (Asada, 2006) afin de limiter sa décomposition rapide à pH 6 en tartarate et oxalate (Noctor & Foyer, 1998). L’altération des niveaux de glutathion rend des tabacs mutants plus sensibles aux stress environnementaux dont le stress photooxydant (Conklin et al, 1996).

- 24 -

Synthèse bibliographique

Figure 14: Structure chimique du glutathion

5.2.2.3. Les caroténoïdes

Les caroténoïdes peuvent contenir de l’oxygène (xanthophylles) ou non (β-carotène). Les xanthophylles incluent la lutéine, la néoxanthine, la violaxanthine et la zéaxanthine. Ce sont des molécules importantes des complexes d’antennes du PSI et du PSII dont la lutéine est la plus abondante (Peter & Thornber, 1991 ; Ryberg et al, 1993) (Fig. 15).

Lutéine

Zéaxanthine

Violaxanthine

β-Carotène

Figure 15: Structure chimique de différents caroténoïdes

Les caroténoïdes servent de pigments accessoires collecteurs de lumière qui capturent la lumière à des longueurs d’ondes entre 400 et 500 nm puis transfèrent l’énergie aux chlorophylles (Siefermann-Harms, 1987). Les xanthophylles sont associées aux LHC (Light Harvesting Complexes) et jouent indirectement le rôle de régulateur allostérique des LHC. En condition d’excès d’énergie, les xanthophylles se détachent des LHC entrainant un

- 25 -

Synthèse bibliographique changement conformationnel de celles-ci favorisant la dissipation de l’excès d’énergie sous forme de chaleur plutôt que la collecte de photons (Horton et al, 2000). Les caroténoïdes 1 forment également la première ligne de défense de l’appareil photosynthétique contre l’ O2 (Triantaphylidès & Havaux, 2009). En effet, les xanthophylles participent à la désexcitation 3 1 de la Chl* d’une part, ce qui limite la formation d’ O2 et protège l’appareil photosynthétique de dommages photooxydants (Collins, 2001 ; Triantaphylidès & Havaux, 2009). Des mutants affectés à différents niveaux de la voie de biosynthèse des xanthophylles ont été identifiés et ont permis de révéler le rôle majeur de ces molécules dans la protection des photosystèmes. Le mutant d’Arabidopsis lut2 dépourvu en lutéine ne montre aucune différence phénotypique avec le type sauvage en condition de stress lumineux (Dall’Osto et al, 2006). Ceci est dû à une accumulation de zéaxanthine qui compense probablement la perte de lutéine dans ces conditions. De plus, le mutant d’Arabidopsis npq1, déficient en violaxanthine dé-époxydase, enzyme qui converti la violaxanthine en zéaxanthine à forte lumière, montre une diminution de l’activité NPQ (dissipation de l’excès d’énergie sous forme de chaleur) et une plus grande sensibilité aux fortes intensités lumineuses (Havaux & Niypgi, 1999 ; Niyogi et al, 1998). Le double mutant lut2/npq1 dépourvu en lutéine et en zéaxanthine ont montré une très grande photosensibilité comparée aux plantes sauvages (Baroli et al, 2004 ; Dall’Osto et al, 2006), illustrant l’importance de la zéaxanthine dans l’élimination des ERO. D’autre part, le centre réactionnel du PSII possède des molécules de β-carotène qui sont trop éloignées des chlorophylles pour agir comme les xanthophylles des complexes d’antennes (Ferreira et al, 2004 ; Havaux, 2014 ; Mozzo et al, 2008). Le β-carotène ne peut pas piéger les 3Chl* formées 1 dans le centre réactionnel du PSII et ne peut donc pas éviter la formation d’ O2. Cette 1 observation a conduit à considérer que le β-carotène agit directement sur l’ O2 en le ramenant à un état stable par captation de l’excès d’énergie (Telfer, 2005). L’excès d’énergie de 3Chl* 1 et O2 captée par les caroténoïdes est ensuite dissipé sous forme de chaleur ramenant ainsi ces antioxydants à leur état original (Edge et al, 1997 ; Stahl & Sies, 2003) (Fig. 16). Enfin, la zéaxanthine a été impliquée dans le quenching de la chlorophylle à l’état singulet (1Chl*) et la dissipation d’énergie sous forme de chaleur par un mécanisme appelé Non-Photochemical Quenching (NPQ) (Havaux & Niyogi, 1999 ; Dall’Osto et al, 2012).

- 26 -

Synthèse bibliographique

Lumen Stroma

ZE VDE

- AscH

DHA + NADP H2O H O 2 - AscH + NADPH/H

O2 DHA + H O NADP 2 H2O

+ NADPH/H

O2

Figure 16: Schéma du cycle des xanthophylles. VDE : violoxanthine dé-époxydase ; ZE : Zéaxanthine époxydase (D’après Demmig-Adams, 1990)

Des études récentes ont montré la capacité des caroténoïdes et notamment des β-carotènes à 1 réagir chimiquement avec l’ O2 selon un mécanisme de quenching chimique ou de scavenging (Ramel et al, 2012a). En effet, en conditions photooxydantes, l’accumulation in vivo d’un 1 dérivé d’oxydation du β-carotène spécifique de l’ O2, un endoperoxyde du β-carotène est corrélée à la photoinhibition du PSII. D’autres dérivés, tel que le β-cyclocitral, peuvent 1 fonctionner comme signal modifiant l’expression de gènes spécifiques du O2. Ce dérivé a été 1 identifié comme médiateur de signalisation de l’ O2 intervenant dans l’augmentation de la tolérance d’Arabidopsis à un stress photooxydant (Ramel et al, 2012b).

Les caroténoïdes sont aussi des précurseurs dans la synthèse de phytohormones telles que l’ABA (Acide abscissique) impliqué dans la dormance des graines et la résistance à la sécheresse (Parry & Horgan, 1991) et les strigolactones qui stimulent la germination (Matusova et al, 2005). L’ABA est synthétisé à partir de xanthoxine, produit de l’oxydation de violaxanthine ou de la néoxanthine par la 9-cis-epoxycarotenoide dismutase (NCED) (Qin & Zeevaart, 1999). L’oxydation enzymatique des β-carotènes par les caroténoïdes clivage dioxygénases (CCD 7 et CCD 8) conduit au carlactone, précurseur des strigolactones (et al, 2016).

- 27 -

Synthèse bibliographique

5.2.2.4. Les tocochromanols

Les tocochromanols sont des prényls lipides liposolubles possédant des propriétés antioxydantes. Ils sont synthétisés spécifiquement par les organismes photosynthétiques et sont majoritairement localisés dans les parties vertes de la plante où ils sont synthétisés par le chloroplaste. Les tocochromanols regroupent le plastochromanol (PC), les tocotriénols et les tocophérols qui sont les plus abondants. Ils sont caractérisés par la présence d’un cycle chromanol responsable de leurs propriétés spectrales et antioxydantes (Fig. 17).

Les plastochromanols sont répartis entre les membranes de thylakoïdes et les plastoglobules où ils sont synthétisés par l’enzyme tocophérol cyclase (VTE1) (Szymańska & Kruk, 2010 ; Zbierzak et al, 2010 ; Kumar et al, 2005). Des études in vitro ont montré que cette molécule 1 agit uniquement et directement sur l’ O2 pour former l’hydroxy-plastochromanol (PC-OH) (Gruszka et al, 2008). Le PC-OH a ensuite été identifié in vivo sur des plantes sauvages soumises à de fortes intensités lumineuses (Szymańska et al, 2014). Le mutant vte1 déficient 1 en PC-8 et en tocophérols montre une production accrue d’ O2 indiquant l’importance des PC dans le piégeage de cette ERO (Rastogi et al, 2014). De plus, des lignées d’Arabidopsis surexprimant la solanesyl phosphate synthase (SPS1), accumulant le PC et le plastoquinol, sont plus résistantes au stress photo-oxydant que les plantes sauvages (Ksas et al, 2015). Il a été démontré que le PC-8 est essentiel à la survie de la graine. En effet, le double mutant vte1vte2 présentant une perte de tocophérol et de PC-8 est sévèrement affecté dans le développement des graines avec une accumulation de peroxydes lipidiques alors que le mutant vte2 montrant une baisse des tocophérols et un maintien de la quantité en PC-8 affecte peu le développement. Ces résultats montrent que le PC-8 est un antioxydant essentiel pour la survie des graines (Mène-Saffrané & DellaPenna, 2010).

Les tocophérols et les tocotriénols existent sous différentes isoformes : αlpha-, béta-, gamma- et delta-. Des mutants du tabac, accumulant des tocotriénols, présentent une meilleure photo- tolérance avec une faible peroxydation lipidique et peu de dommages du PSII (Matringe et al, 2008). Ces résultats indiquent la capacité antioxydante et protectrice des tocotriénols contre la peroxydation des membranes lipidiques. In vivo, les tocophérols, sont les prenyls lipides les plus abondants. La présence de nombreux groupements méthyl sur le cycle phénolique de l’isoforme α- lui confère la plus puissante capacité antioxydante parmi les différentes isoformes (Kamal-Eldin & Appelqvist, 1996). Les tocophérols sont les composés antioxydants majoritaires des membranes biologiques et fonctionnent comme piégeur des

- 28 -

Synthèse bibliographique

ERO et des radicaux lipidiques (Diplock et al, 1989 ; Herrera & Barbas, 2001). Ils peuvent agir directement sur les ERO pour former le tocophérolquinone par oxydation d’une part. Et d’autre part, ils peuvent transférer un électron sur les radicaux peroxyl lipidiques et former par conséquent le radical tocophéroxyl. Ce dernier peut être régénéré en tocophérols par l’intervention de l’ascorbate et du GSH (Igamberdiev et al, 2004 ; Triantaphylidès & Havaux, 2009). En limitant la réaction en chaîne de peroxydation lipidique, les tocophérols sont de puissants piégeurs de radicaux libres. Des mutants d’Arabidopsis déficients en vitamine E (vte1 déficients en tocophérol cyclase et vte2 déficients en homogentisate phytyl transférase) exposés à un stress lumineux à faible température présente une plus grande sensibilité au stress oxydant que les plantes sauvages (Havaux et al, 2005). De plus, des algues traitées avec un inhibiteur de vitamine E est plus photosensible que les souches non traitées (Kruk et al, 2005). Ces expériences indiquent de manière évidente l’importance des tocophérols dans l’élimination des ERO. Le double mutant de C. reinhardtii npq1 lor1, déficient en zéaxanthine et en lutéine et accumulateur des tocophérols, montre une meilleure résistance au stress lumineux, indiquant une compensation du déficit en caroténoïdes par les tocophérols.

Figure 17: Structure chimique des tocochromanols Le chloroplaste possède également d’autres prényls lipides tels que les plastoquinones (PQ) qui peuvent jouer le rôle de piégeurs des ERO et de protecteurs de l’appareil photosynthétique contre les ERO (Fig. 18). Le rôle principal des PQ est de transférer les électrons entre le PSII et le PSI dans la chaine photosynthétique de transport des électrons (Amesz, 1973). Des études in vitro ont également mis en avant la fonction antioxydante des PQ dans la défense 1 contre les ERO où ils sont capables de piéger l’ O2 et de limiter l’étape de propagation de la peroxydation lipidique (Samson & Bruce, 1996 ; Yadav et al, 2010). Récemment, des mutants

- 29 -

Synthèse bibliographique d’Arabidopsis accumulant de la plastoquinone-9 (PQ-9) ont montré une meilleure tolérance au stress photooxydant que les plantes sauvages (Ksas et al, 2015). Ces résultats suggèrent le rôle de cette molécule comme protecteur contre les ERO chez les plantes.

Figure 18: Structure des plastoquinones

5.2.2.5. Les flavonoïdes

Les flavonoïdes sont des composés secondaires polyphénoliques, situés essentiellement dans les feuilles, les parties florales et le pollen des plantes, qui présentent également une activité antioxydante. Ils sont essentiellement localisés dans la vacuole (Kitamura, 2006 ; Yasaki, 2005) et la paroi cellulaire (Markham et al, 2000 ; Lecas & Brillouet, 1994 ; Gagne et al, 2006). En se basant sur leurs structures, ils sont classés en quatre groupes : les flavonols, les flavones, les iso-flavones et les anthocyanines (Gill et Tuteja, 2010) (Fig. 19). Chez les plantes, les flavonoïdes sont les métabolites secondaires les plus actifs et certains ont montré une activité antioxydante plus efficace que l’ascorbate et les tocophérols (Hernandez et al, 2009). Suite à des stress biotiques ou abiotiques, le niveau de flavonoïdes augmente considérablement dans les plantes (Winkel-Shirley, 2002). Une corrélation inverse entre la 1 production d’ O2 dépendante de la lumière et le niveau de flavonoïdes a été observée dans les cellules du mésophylle des feuilles de Phiryllia latifolia, suggérant l’implication de ces 1 molécules dans l’élimination de l’ O2 (Agati et al, 2007). De plus, les mutants tt4 et tt5, dépourvus en flavonoïdes, montrent une grande sensibilité aux UV-B comparée au type sauvage (Filkowski et al, 2004).

- 30 -

Synthèse bibliographique

Figure 19: Structure des différents flavonoïdes

D’autres molécules peuvent également protéger les plantes du stress oxydatif incluant les AGPIs qui peuvent agir sur les radicaux lipidiques chez Arabidopsis (Mene-Saffrane et al, 2009) et la vitamine B6 qui peut piéger efficacement l’oxygène singulet (Bilski et al, 2000 ; Havaux et al, 2009). Certaines plantes se développant dans des milieux environnementaux contraignants ont développé des mécanismes de défense spécifiques comme l’acide carnosique (CA), puissant antioxydant produit par quelques espèces originaires de la région méditerranéenne, toutes issues de la famille des Lamiacées.

6. L’acide carnosique, un mécanisme de défense spécifique

Les plantes du climat méditerranéen sont exposées à de fréquents déficits en eau, une forte intensité lumineuse, d’importantes fluctuations de température jour/nuit et une carence en nutriments (Fig. 20). Ces conditions de stress peuvent créer un déséquilibre entre les mécanismes de défense antioxydants et la quantité d’ERO générées conduisant ainsi à un stress oxydatif. Les plantes du pourtour méditerranéen possèdent les mécanismes de protection ubiquitaire du chloroplaste tels que les caroténoïdes, les tocophérols, l’ascorbate et le glutathion. En outre, certaines de ces plantes produisent l’acide carnosique (CA), molécule à haut potentiel antioxydatif in vitro qui peut participer à la protection du chloroplaste pendant un stress oxydatif.

- 31 -

Synthèse bibliographique

Figure 20: Tendances annuelles des températures et des précipitations du climat méditerranéen de la région d’Alger (36°N ;3°E)

6.1. L’acide carnosique

L’acide carnosique est un diterpène phénolique de formule C20H28O4 de poids moléculaire de

332,42 (Fig. 21). Il est composé d’une structure de type abiétane couplée à un groupe catéchol constitué de deux groupes hydroxyle O-phénolique en C11 et C12 lui conférant une capacité de piégeage des ERO analogue à d’autres antioxydants tels que l’α-tocophérol (Richheimer et al, 1996, Aruoma et al, 1996). D’une part, ce diterpène appartient à la famille des terpénoïdes ou isoprénoïdes (Hill & Connolly, 2013), large classe de plus de 50 000 métaboliques secondaires des plantes. Sa distribution cellulaire, sa voie biosynthétique, ses propriétés de liposolubilité et ses rôles sont proches de celles des tocophérols et des caroténoïdes, isoprénoïdes ubiquitaires chez les plantes. Et d’autre part, la présence d’un groupement phénolique le classe également dans la famille des polyphénols.

- 32 -

Synthèse bibliographique

1 2 3

4 5 6

7 8 9

10

Figure 21 : Structure de l'acide carnosique et de ses dérivés d'oxydation 1) acide carnosique; 2)

carnosol; 3) rosmanol ; 4) Isorosmanol ; 5) 7-méthylrosmanol ; 6) 7-méthylepirosmanol ; 7) 5,6,7,10-tetrahydroxyrosmariquinone ; 8) 11,12-di-O-méthylisorosmanol ; 9) Rosmadial ; 10) Rosmaridiphénol

Le CA a été identifié seulement dans quelques espèces de plantes qui font toutes parties de la famille des Lamiacées (Brieskorn & Dumling, 1969 ; Luis & Johnson, 2005 ; Bruno et al, 1991 ; Hossain et al, 2010 ; Achour et al, 2012 ; Djarmati et al, 1991).

6.2. La famille des Lamiacées

Les Lamiacées sont une importante famille de plantes, très répandues dans le bassin méditerranéen, regroupant environ 200 genres et plus de 6000 espèces dont la lavande, la

- 33 -

Synthèse bibliographique menthe, le basilic, le romarin, la sauge et le thym. Il s’agit de plantes herbacées et d’arbustes angiospermes et dicotylédones vraies (classification APG III (2009)). Les Lamiacées possèdent souvent des poils glanduleux (les trichomes glandulaires) et des glandes sous- épidermiques productrices d’huiles essentielles (Giuliani et al, 2011). Il s’agit également d’une source importante d’antibiotiques, d’antiseptiques, d’antiinflammatoires et d’antioxydants naturels. De ce fait, cette famille possède de nombreux intérêts économiques dans les secteurs de l’agroalimentaire, la cosmétique et la nutraceutique. Le CA, molécule antioxydante à intérêt industriel, a été identifié dans huit genres de la famille des Lamiacées : Salvia (Brieskorn & Dumling, 1969), Rosmarinus (Luis & Johnson, 2005), Lepechinia (Bruno et al, 1991), Origanum (Hossain et al, 2010), Thymus (Achour et al, 2012) et Ocinum (Jayasinghe et al, 2003) (Fig. 22). La concentration en CA varie entre les espèces considérées dont le Rosmarinus officinalis est le plus concentré en CA, suivi par certaines espèces du genre Salvia. Le romarin présente des concentrations en CA de l’ordre de 3 à 50 mg.g-1 de poids sec (Richheimer et al, 1996 ; Schwarz & Ternes, 1992 ; Wenkert et al, 1965) dépendantes de la variété, du stade de développement et des conditions environnementales (Munné-Bosch & Alegre, 2000 ; Hidalgo et al, 1998 ; Del Baño et al, 2003 ; Luis & Johnson ; 2005). Les importantes quantités de CA font du romarin une source majeure de cet antioxydant pour l’industrie.

Rosmarinus

Salvia

Lepechinia

Origanum Mentheae Perovskia

Melissa

Lamiaceae Nepetoideae Thymus

Hyssopus

Ocimeae Ocimum

Figure 22: Distribution phylogénique de l'acide carnosique dans la famille des Lamiacées.

- 34 -

Synthèse bibliographique

6.3. Le romarin : Rosmarinus officinalis

Le romarin est un arbrisseau aromatique très ramifié de 50 cm à 1,50 m très bien adapté au climat méditerranéen bien que reparti dans de nombreux écosystèmes entre 650 mètres et 1500 mètres. Il apprécie un fort ensoleillement, une atmosphère sèche et des températures chaudes. Il se trouve principalement sur des terrains arides, calcaires et pauvres en nutriments et matières organiques tels que la garrigue, le maquis et la rocaille.

Il possède un système racinaire dense et profond ce qui lui permet de puiser l’eau en profondeur pendant les épisodes de sécheresse (Comas et al, 2013 ; Zwicke et al, 2015). Ses fleurs, hermaphrodites, apparaissent en grappes de couleur bleue pâle à violette de Février à Mai et ses fruits sont des petits tetrakènes de couleur brune qui germent pendant l’été. Les feuilles persistantes sont particulièrement bien adaptées aux contraintes climatiques de la région méditerranéenne. En effet, elles sont attachées, sans pétiole, à la tige, et sont plus longues que larges, comme des aiguilles, ce qui limite la surface d’exposition aux fortes intensités lumineuses. Une cuticule épaisse et cireuse (Marin et al, 2006) réfléchit la lumière et limite l’échauffement de la feuille (Paoletti, 2005), diminuant ainsi l’évapotranspiration. Elles sont enroulées sur les bords, particulièrement pendant les périodes estivales, formant des cryptes abaxiales recouvertes de trichomes filamenteux branchés (Werker et al, 1985a) qui diminuent la couche limite et protègent les stomates des courants d’air diminuant ainsi l’évapotranspiration (Larcher, 2000). Comme la plupart des Lamiacées, la surface des feuilles de romarin possède deux types de trichomes glandulaires (Bottega & Corsi, 2000) : les peltates, peu nombreux et répartis sur la surface abaxiale des feuilles d’une part et les capitates, plus nombreux, répartis sur les surfaces adaxiales et abaxiales d’autre part (Marin et al, 2006) (Fig. 23). Contrairement aux trichomes filamenteux, ces deux types de trichomes glandulaires sécrètent et stockent de nombreux composés phénoliques, des protéines et des polysaccharides (Marin et al, 2006). Les composés phénoliques produits par le romarin sont essentiellement des flavonoïdes et des diterpènes (Mena et al, 2016).

- 35 -

Synthèse bibliographique

A B C

Figure 23: Images microscopiques des différents types de trichomes présents à la surface des feuilles de Rosmarinus officinalis : A) Section longitudinale d’un trichome filamenteux branché ; B) Section longitudinale d’un trichome glandulaire de type peltate ; C) Section longitudinale d’un trichome glandulaire de type capitate (adapté de Marin et al, 2006)

Dans les plantes, les diterpènes phénoliques sont des substances en C20 qui agissent comme hormones (la gibbérelline), régulateurs de réponse induite par blessure (acide abiétique), pigments photosynthétiques (chaîne phytyl des chlorophylles), et antioxydants (Ninomiya et al, 2004. Masuda et al, 2002 ; Vogel et al, 1996 ; McGarvey & Croteau, 1995 ; Funk & Croteau, 1994). Le diterpène majoritaire produit par le romarin est le CA.

6.4. L’acide carnosique dans le romarin

6.4.1. Localisation de l’acide carnosique

Le CA n’est pas uniformément réparti dans le romarin, il est principalement présent dans les tissus photosynthétiques tels que les feuilles (1 à 1,5 % du poids frais), les sépales (0,5 à 1 % du poids frais) et les pétales (< 0,2 % du poids frais) (del Baño et al, 2003 ; Luis & Johnson, 2005). Au niveau des feuilles de romarin, le CA s’accumule dans les trichomes glandulaires plus que dans les autres tissus foliaires (Brückner et al, 2014). Une étude de localisation subcellulaire sur des feuilles dépourvues de trichomes indique que le CA s’accumule également dans les chloroplastes (Munné-Bosch et al, 2001). De plus, il a été montré que les gènes codant pour les enzymes de biosynthèse sont essentiellement exprimés dans les trichomes (Brückner et al, 2014 ; Scheler et al, 2016).

6.4.2. Biosynthèse de l’acide carnosique

Au niveau des trichomes, le CA est produit à partir de géranylgéranyl diphosphate (GGDP), précurseur des tocophérols, des carotenoïdes et des diterpénoïdes (Yang et al, 2011 ; Umeno & Arnold, 2003). Une étude menée sur la sauge indique que la structure bicyclique de base des labdanes diterpènes provient de la cyclisation du GGDP par une copalyl phosphate synthase pour produire du copalyl diphosphate (Peters, 2010). Le GGDP est transformé en

- 36 -

Synthèse bibliographique abiétatriène, abiétane diterpène tricylique avec un cycle aromatique et de poids moléculaire de 270, par la miltiradiène synthase (MiS) (Brückner et al, 2014 ; Scheler et al, 2016). Ensuite, à partir de l’abiétatriène, une hydroxyferruginol synthase (HFS) catalyse l’ajout consécutif de deux groupements hydroxyles pour produire du ferruginol puis de l’hydroxyferruginol (Scheler et al, 2016). Enfin, l’ajout de groupement carboxylique pour donner l’acide carnosique est catalysé par trois cytochromes P450, CYP76AK6, 7 et 8 principalement localisés dans les trichomes des jeunes feuilles de romarin (Scheler et al, 2016) (Fig. 24).

Figure 24 : Représentation générale de la voie de biosynthèse de l’acide carnosique. GGDP : Géranyl géranyl diphosphate ; CPS : Copalyl phosphate synthase ; MiS : Miltiradiène synthase ; FS :

Ferruginol synthase ; HFS : Hydroxyferruginol synthase ; C20Ox (CYP76AK6-8) : Cytochrome P450 (Adapté de Scheler et al, 2016)

- 37 -

Synthèse bibliographique

6.4.3. Les facteurs influençant la quantité d’acide carnosique

Bien que présent en très grande quantité, le CA s’accumule à des niveaux différents suivant la variété (Hidalgo et al, 1998 ; Wellwood & Cole, 2004), le stade de développement et les conditions environnementales (Munné-Bosch & Alegre, 2000 ; Hidalgo et al ; 1998 ; Del Baño et al, 2003 ; Luis & Johnson ; 2005). Une étude variétale non exhaustive a été réalisée par la société Naturex indiquant que les quantités en CA varient de 1 à 2 % du poids sec dans les variétés SLT, Barbecue ou Roseus jusqu’à 5 à 5,5 % du poids sec dans les variétés Sudbury blue, VAU3 et Alderney (Fig. 25).

6 5 4 3 2 1

CA content CA (%) 0

SLT

Vau 03 Vau

Gorizia

Roseus

upright

alderney

05 VIL 09 VIL 05

albiflorus

barbecue

05 SEP SEP 05 04

05 ESC 07 ESC 05

Pyramidal

05 Star 05 10

05 BED 08 BED 05

05 MIR 05 10

05 NDL 06 NDL 05

05 VAR 05 01

05 CHA 03 CHA 05

05 AUP 01 AUP 05

05 MIN 01 MIN 05 06 CAU 05

05 VAU 05 VAU 05

05 UCH 07 UCH 05

05 COU 05 09

05 BOU 05 07

05 MOT 10 MOT 05

golden rain golden

croatie P01 croatie P07 croatie

Croatie P11 Croatie

croatie p 08 p croatie

Toscan blue Toscan

primley blue primley

greenginger

sudbury blue sudbury

Corsican blue Corsican iden blue iden boys Jessupp's upright Jessupp's

Figure 25: Etude variétale de la concentration en acide carnosique (Source : Naturex)

De plus, il a été montré que ce diterpène et son dérivé d’oxydation majoritaire, le carnosol (CAR) présentent des concentrations différentes en fonction de l’âge de la feuille. En effet, le CA et le CAR se concentrent dans les jeunes feuilles au niveau de l’apex puis leur quantité diminuent avec le développement foliaire (Božić et al, 2015 ; Brückner et al, 2014 ; Tounekti et al, 2012 ; del Baño et al, 2003) (Fig. 26).

Figure 26: Analyse LC-MS des diterpènes phénoliques majoritaires des jeunes (apex) et vieilles

feuilles de R. officinalis var. Alderney (Brückner et al, 2014)

- 38 -

Synthèse bibliographique

Des études ont également démontré que le niveau de CA du romarin dépend des conditions environnementales de croissance. Sous le climat anglais, le romarin accumule plus de ce diterpène phénolique que sous un climat méditerranéen (Tounekti & Munné-Bosch, 2012 ; Luis & Johnson, 2005 ; del Baño et al, 2003 ; Munné-Bosch et al, 2000 ; Hidalgo et al, 1998). De plus, quelle que soit la région étudiée, des variations saisonnières sont observées, le CA s’accumule de septembre à février et diminue de mars à août à l’inverse d’autres antioxydants ubiquitaires comme l’α-tocophérol (Munné-Bosch & Alegre, 2000 ; Munné-Bosch et al, 2000 ; Luis & Johnson, 2005) (Fig. 27). Des études plus approfondies ont mis en avant que le froid et les UV-B favorisent l’accumulation de CA (Luis et al, 2007a, 2007b) alors que la sécheresse (Munné-Bosch & Alegre, 2003 ; Munné-Bosch et al, 1999 ; Hidalgo et al, 1998) combinée à d’importantes fluctuations de température et de fortes intensités lumineuses (Munné-Bosch et al, 2000) affectent négativement sa concentration.

Figure 27: Analyse HPLC des variations saisonnières des abiétanes diterpènes du R. officinalis L. Expérience réalisée en champs expérimental à l’université de Barcelone. CA : Acide carnosique ; CAR : Carnosol ; MCA : Acide methoxycarnosique. (Munné-Bosch & Alegre, 2000)

Les études des facteurs environnementaux impactant la concentration en CA dans le romarin correspondent à des quantifications de ce diterpène par HPLC et n’indiquent pas les effets de conditions de croissance stressantes sur le niveau d’expression des gènes de biosynthèse du CA.

- 39 -

Synthèse bibliographique

6.5. L’acide carnosique, un antioxydant

6.5.1. In planta

Pendant l’été, les conditions environnementales de croissance (fortes intensités lumineuses, importantes fluctuations de température et de sécheresse) sont également des conditions de stress qui favorisent la production d’ERO (voir chapitre correspondant) nocifs pour les tissus photosynthétiques (Munné-Bosch & Alegre, 2001). Dans ces conditions, la concentration en CA dans les feuilles de romarin diminue alors que la quantité de dérivés oxydatifs augmentent, (Munné-Bosch et al, 1999) suggérant le rôle d’antioxydant in vivo du CA. De plus, sa structure chimique (groupe catéchol) et sa distribution tissulaire (tissus photosynthétiques) et subcellulaire (chloroplastes) sont proches des autres isoprénoïdes tels 1 que les caroténoïdes et les tocophérols, piégeur d’ O2 (Ramel et al, 2012a ; Diplock et al, 1989) et de peroxyles lipidiques respectivement (Igamberdiev et al, 2004 ; Triantaphylidès & Havaux, 2009). Par ailleurs, les espèces contenant du CA sont significativement moins abondantes en tocophérols (Abreu et al, 2008) ce qui suggère que ce diterpène pourrait être un substitut des tocophérols dans leur rôle antioxydant. Il a également été proposé qu’en conditions photooxydantes, le CA stabilise, protège et coopère avec les tocophérols et les caroténoïdes selon un mécanisme complémentaire de photoprotection (Peñuelas & Munné- Bosch, 2005). Des chloroplastes de mélisse, naturellement dépourvus en CA, complémentés en ce diterpène et exposés à un stress oxydant (choc osmotique accompagné de lumière) présentent un maintien du statut redox de l’α-tocophérol et une protection des membranes photosynthétiques comparées aux chloroplastes non complémentés (Munné-Bosch & Alegre, 2003). Ces résultats suggèrent que le CA pourrait avoir pour fonction de protéger les chloroplastes.

A ce jour, il n’y a quasiment pas d’étude in vivo sur les capacités du CA à protéger les membranes végétales du romarin contre un stress oxydant. De plus, de nombreuses études ont été réalisées sur l’impact de la sécheresse combiné à des conditions lumineuses et de température drastiques (Munné-Bosch & Alegre, 2003 ; Munné-Bosch et al, 1999 ; Hidalgo et al, 1998). Ces études ont été faites en champs expérimentaux amenant ainsi une variabilité dans les conditions de stress lumineux et de température. De plus, l’expérience en champs permet l’attaque de pathogènes induisant un stress biotique qui pourrait agir sur la quantité en CA.

- 40 -

Synthèse bibliographique

6.5.2. In vitro

De nombreuses études in vitro sur les capacités antioxydantes du CA ont été réalisées. Il semble que 90% des propriétés antioxydantes des extraits de romarin soient portées par le CA et son produit d’oxydation majoritaire, le carnosol (CAR) (Aruoma et al, 1992). L’importante contribution du CA à la réponse antioxydante des extraits de romarin est probablement attribuée à son abondance comparée aux autres composés phénoliques du romarin d’une part. D’autre part, des expériences de vieillissement accéléré (60°C pendant 10 j) montrent que le CA protège un mélange de lipides (10.5% 16:0 ; 2.1% 18:0 ; 25.5% 18:1 ; 60.8% 18:2 ; 1.1% 18:3) plus efficacement que l’α-tocophérol. De plus, elles indiquent que le CA est consommé plus rapidement que l’α-tocophérol et qu’une fois consommé, il n’y a pas d’accumulation des hydroperoxydes conjugués des AGPIs présents. Ceci suggère que les produits d’oxydation du CA possèdent des capacités antioxydantes (Huang et al, 1996). Ces résultats ont été confirmés pour le produit d’oxydation majoritaire du CA, le CAR. Des études in vitro indiquent que ces deux diterpènes protègent le méthyl linoléate et l’acide linoléique plus efficacement que l’α- tocophérol d’une oxydation générée par élévation de température (Hopia et al, 1996). Quelques études in vitro, basées sur une production non spécifique de radicaux libres générés par une augmentation de température à l’obscurité, indique que le CA pourrait être un piégeur d’ERO (Yoshimi et al, 2011 ; Zeng et al, 2001). Dans ces études, les conditions de production des ERO ne sont pas assez spécifiques pour connaître l’activité antioxydante du CA contre 1 • différentes ERO telles que O2, H2O2 ou HO . D’autre part, il a été montré que les extraits lipophiliques de romarin, contenant du CA, du CAR et d’autres diterpènes phénoliques, 1 piègent des ERO spécifiques dont l’ O2 (Wada et al, 2004).

Il a été proposé que l’activité de piégeage des radicaux libres du CA suit un mécanisme analogue aux autres antioxydants comme l’α-tocophérol. Cette activité semble être portée par deux groupements hydroxyles O-phénolique situés sur le C11 et le C12 (groupement catéchol) (Richhelmer et al, 1999) également présents sur certains dérivés d’oxydation comme le CAR (Zhang et al, 2012 ; Song et al, 2014). Actuellement, aucune étude n’indique les capacités du CA et de ses dérivés d’oxydation à préserver les lipides contre des ERO particulières. De plus, le mécanisme exact d’action de cet antioxydant est encore inconuu.

Les propriétés du CA de protection des lipides contre l’oxydation sont déjà largement utilisées dans l’industrie sous forme d’extraits de romarin.

- 41 -

Synthèse bibliographique

6.6. Les applications des extraits de romarin riches en CA

Actuellement, les grandes capacités antioxydantes du CA sont utilisées dans trois secteurs industriels : l’agroalimentaire pour la préservation des matrices lipidiques, la cosmétique comme principes actifs anti-âge et en nutraceutique comme anticancéreux, antiinflammatoire et antiadipogénique.

6.6.1. La cosmétique et la nutraceutique

Les capacités de réduction du cytochrome c, de protection de l’α-antiprotéinase (Aruoma et al, 1992) et d’inhibition de l’oxydation des lipoprotéines des cellules endothéliales aortiques humaines (Pearson et, 1997) et des membranes de cellules humaines (Caco-2) (Wijeratne & Cuppett, 2007) du CA et du CAR ont été utilisées pour développer un grand nombre d’applications du CA dans le domaine de la santé (Bruno et al, 1991). Les capacités anticancéreuses des extraits du Rosmarinus officinalis (Barni et al, 2012 ; Costa et al, 2007 ; Einbond et al, 2012 ; Lopez-Jimenez et al, 2013) sont assignées au CA (Danilenko & Studzinski, 2004 ; Rajasekaran et al, 2013). Ces capacités sont dues aux propriétés proapoptotiques (Tsai et al, 2011), antiprolifératives (Kontogianni et al, 2013), anti- angiogéniques (Lopez-Jimenez et al, 2013), chemoprotectives (Costa et al, 2007), antitumorales (Aoyagi et al, 2006 ; Sharabani et al, 2006) ou d’antiagrégant plaquettaire (Lee et al, 2007) de ces extraits de plantes qui préviennent (Nabekura et al, 2010 ; Ngo et al, 2011) voire inhibent (Barni et al, 2012 ; Bauer et al, 2012 ; Dickmann et al, 2012) l’apparition des cancers. Les effets antiinflammatoires des extraits de plantes enrichis en CA ont également été étudiés afin d’être utilisés dans le domaine de la santé (Bauer et al, 2012 ; Hadad & Levy, 2012 ; Kamatou et al, 2009) ou des cosmétiques. Ces extraits présentent une grande efficacité pour inhiber la production d’interleukine, bloquer le relargage de monoxyde de carbone et stopper la voie proto-oncogène des Scr tyrosine-kinase (Oh et al, 2012). Les extraits de plantes enrichis en CA possèdent aussi des propriétés anti-adipogéniques permettant la perte de poids et ont été prouvés efficaces dans les traitements de l’hyperglycémie (Dickmann et al, 2012 ; Ibarra et al, 2011 ; Rau et al, 2006a, b ; Tashmukhamedova et al, 1992 ; Wang et a, 2012). De plus, les extraits de romarin concentrés en CA semblent avoir des propriétés antivieillissement en préservant les lipides de la peau de l’oxydation ou par des mécanismes biophylaxiques (Calabrese et al, 2000). Les capacités chemoprotectrices (Gómez-García et al, 2013), antiinflammatoires (Reuter et al, 2007), anti-adipogéniques (Romo-Vaquero et al, 2014) et antioxydantes (Kuzmenko et al, 1999 ; Posadas et al, 2009 ; Azad et al, 2011 ; Morán

- 42 -

Synthèse bibliographique et al, 2012 ; Nieto et al, 2010 ; Jordán et al, 2014) des extraits de romarin enrichis en CA ont été confirmées in vivo par administration orale ou injection chez différents mammifères dont l’homme.

6.6.2. L’industrie agroalimentaire

Depuis plus de vingt ans, les extraits de romarin sont utilisés dans l’industrie alimentaire. Les premiers extraits de romarin utilisés comme antioxydants dans les aliments étaient des ingrédients dérivés d’oléorésines aromatisantes de romarin, ils étaient produits par extraction aux solvants. Certains extraits sont considérés comme épices pour leurs saveurs bien qu’initialement utilisés dans un but de préservation des aliments. L’identification du CA en tant qu’acteur majoritaire des propriétés antioxydantes des extraits de romarin (Schwarz & Ternes, 1992) a dû fortement influencer leur utilisation. Ces extraits sont principalement utilisés pour préserver la viande, des huiles de triglycérides ou des émulsions. Il a été montré que le CA protège les acides gras de systèmes lipidiques émulsifiés ou non contre une oxydation médiée par une augmentation de température (Hopia et al, 1996 ; Frankel et al, 1996 ; Erkan et al, 2009, Huang et al, 1996 ; Zhang et al, 2010). De plus, le CA préserve de l’oxydation des matrices carnées telles que des saucisses crues, du poulet lyophilisé, du bœuf cuit ou cru et des pilons de poulet (Ternes & Schwarz, 1995 ; Naveena et al, 2013). Des études ont également rapporté que le CA protège mieux les matrices lipidiques alimentaires que certains antioxydants synthétiques, largement utilisés. En effet, dans des conditions de vieillissement accéléré, le CA préserve plus efficacement l’huile de tournesol (Cuvelier et al, 1994 ; Erkan et al, 2009 ; Luis & Johnson, 2005 ; Zhang et al, 2010) ou l’huile de soja (Richheimer et al, 1996) que le BHT (hydroxytoluène butylé) et le BHA (hydroxyanisole butylé). De plus, il a été montré que le CA avait une plus grande activité antioxydante que les tocophérols dans l’huile de maïs (Cuvelier et al, 1994 ; Hopia et al, 1996 ; Huang et al, 1996). Pourtant, il a été montré qu’en émulsion et à 37°C, l’α-tocophérol est plus efficace que le CA pour protéger les lipides (Hopia et al, 1996). A plus forte température (60°C), ce diterpène préserve mieux les lipides de l’oxydation que l’α-tocophérol (Huang et al, 1996) même lorsque le CA est totalement consommé suggérant que les produits d’oxydation du CA pourraient contribuer à la réponse antioxydante de ce diterpène.

- 43 -

Synthèse bibliographique

7. Contexte et objectifs de la thèse

Depuis les années 90, un grand nombre d’extraits de romarin désodorisés enrichis en CA sont disponibles et leurs utilisations dans la préservation d’une large variété de matrices alimentaires ont considérablement augmenté. Aujourd’hui, la société Naturex est le leader mondial dans les extraits de romarin. Ce groupe international est expert dans l’extraction végétale et la formulation de molécules naturelles destinées à des applications dans l’industrie agroalimentaire, de la santé et de la beauté. En 2015, avec 1700 employés et 15 unités de production, Naturex affichait un chiffre d’affaire d’environ 400 millions d’euros dont 5% ont été investis dans des activités de recherche et de développement. Les principales activités de Naturex sont la recherche de nouvelles plantes extractibles à intérêt industriel, la production d’extraits, le contrôle qualité de leur produit et l’innovation. Pour Naturex, les extraits de romarin enrichis en CA sont les produits phares de la société. En 2010, après une demande de Naturex et de ses concurrents, la Commission Européenne a reconnu l’efficacité des extraits de romarin dans la préservation des matrices lipidiques alimentaires et a alors classé ces extraits comme additif alimentaire sous le numéro E392, ce qui augmente l’intérêt économique de ce produit végétal (Directives européenne 2010/67/EU et 2010/69/EU). Comme annoncé précédemment, de nombreuses études in vitro ont été réalisées, au contraire des études in planta qui sont très limitées. Afin d’améliorer les formulations de molécules, les rendements d’extraction, l’impact environnemental des extractions ou la crédibilité auprès des clients, Naturex a trouvé nécessaire de générer des connaissances scientifiques sur les propriétés antioxydantes et sur le piégeage des ERO par le CA et le CARN ainsi que leurs rôles in planta. La société a alors établi une collaboration avec le Laboratoire d’Ecophysiologie Moléculaire des Plantes (LEMP) pour son expertise dans l’étude des mécanismes antioxydants du chloroplaste. De plus, le laboratoire dispose d’une technique d’imagerie permettant de visualiser la réponse oxydante globale in vitro et in planta (Birtic et al, 2011). Enfin, le laboratoire est associé à une plateforme de culture de plantes en conditions contrôlées (Groupe de Recherche Appliquées en Phytotechnologie) permettant de faire des stress oxydants sur plantes dont les conditions lumineuses, de température, de CO2 et d’humidité sont maîtrisées.

Le CA et son dérivé d’oxydation majeur, le CAR, sont des diterpènes phénoliques spécifiques de la famille des Lamiacées présents en grande quantité dans le romarin (Rosmarinus officinalis). La présence d’un groupe catéchol suggère la capacité du CA et du CAR à piéger les ERO et les radicaux libres comme le tocophérol. De plus, leur capacité à protéger des

- 44 -

Synthèse bibliographique matrices lipidiques diverses a été largement démontré in vitro. Cependant, les conditions d’oxydation appliquées lors de ces études correspondent à une production non spécifique des ERO. Ces conditions ne permettent donc pas de distinguer l’activité antioxydante du CA et du CAR contre des ERO distinctes. De plus, les capacités du CA à préserver les membranes du romarin contre un stress photooxydant impliquant un stress essentiellement chloroplastique ne sont pas clairement établies. Dans un premier temps, ce travail de thèse a eu pour objectif de mieux comprendre l’activité antioxydante du CA et de son dérivé d’oxydation, le CAR ainsi que leur mécanisme d’action par une combinaison d’approches in vitro et in planta. Les études in vitro consistent en l’analyse de standard de CA, CARN et d’α-tocophérol notamment dans leur capacité à préserver les lipides et à piéger des ERO. In planta, deux variétés contrastées en CA ont été utilisées dans différentes conditions de stress photooxydant.

Il existe des variations saisonnières du CA dépendantes des conditions environnementales dont les cinétiques sont très différentes de l’α-tocophérol (Munné-Bosch & Alegre, 1999 ; Hidalgo et al, 1998). Ce travail de thèse a également eu pour but d’analyser les niveaux de CA, de CAR et d’α-tocophérol dans différentes conditions environnementales et d’étudier la régulation de la voie de biosynthèse du CA.

Actuellement, il existe plusieurs méthodes d’évaluation du niveau d’oxydation et de protection de matrices lipidiques mais aucune ne mesure la réponse antioxydante globale. Par conséquent, ces méthodes peuvent donner des résultats partiels voire contradictoires. De plus, l’induction de l’oxydation ne permet pas de distinguer les différents ERO. Le troisième et dernier objectif de cette thèse a donc été d’appliquer une technologie permettant la visualisation rapide de la réponse oxydante globale vis-à-vis des ERO dans des systèmes lipidiques alimentaires complexes.

- 45 -

Synthèse bibliographique

- 46 -

Matériels et méthodes

II. Matériels et méthodes 1. Oxydation in vitro de molécules biologiques

L’acide linolénique (1-3 mg/mL méthanol, obtenu de Fluka), le monogalactosyl diacylglycerol (MGDG, 1-2 mg/mL méthanol/CHCl3, de Larodan), l’α-tocophérol (de Naturex), l’acide carnosique (Extrasynthèse) et le carnosol (Sigma-Aldrich) sont complémentés avec du bleu de méthylène (concentration finale de 0,1 mM). L’oxydation de 1 ces molécules par l’ O2 est induite par exposition de l’échantillon à une lumière blanche produit par des lampes HQI (Osram) à une intensité lumineuse de 750 µmoles photon.m-2.s-1 et une température de 7°C (sauf quand spécifiée autre). Pour l’oxydation de l’acide linolénique (5-8 mg/mL méthanol), MGDG (5 mg/mL méthanol/CHCl3), l’acide carnosique et le carnosol par les radicaux hydroxyles, l’H2O2 et le chlorure de fer (réaction de Fenton) sont ajoutés à la solution. La réaction est laissée pendant 20 s.

Le 15-HEDE (acide 15-hydroxy-11,13 (Z,E)-eicosadienoique) est aussi utilisé pour oxyder l’acide linolénique in vitro. En effet, du 15-HEDE (10 µM méthanol) est incubé à 60°C pendant 10 s afin d’initier sa décomposition et produire ainsi des radicaux lipidiques. L’acide linolénique est ajouté à 5 mg/mL et peut être attaqué par les radicaux du 15-HEDE.

Le 15-HEDE est préparé à partir de l’acide éicosadiénoique et la lipoxygénase de soja selon le protocole décrit dans Martini et al (1994).

2. Rosmarinus officinalis

Deux variétés de romarin contrastées en CA sont étudiées : Sudbury blue (5,5% en CA) et Barbecue (1,5%) (Tableau 2). Afin de garantir la stabilité génétique des variétés, toutes les plantes ont été obtenues par bouturage de deux plants mères par la pépinière ‘SARL du Tilleul’ à Chateaurenard (France). Les plantes utilisées avaient entre 3 et 6 mois lors des différentes études. Les boutures se sont ensuite développées en pot avec un mélange terreau/sable (70/30) dans un phytotron sous une intensité lumineuse de 250 µmoles photons.m-2.s-1, une photopériode de 12 h, une fluctuation de température jour/nuit de 25°C/19°C et une humidité de l’ordre de 55%. Les deux variétés sont arrosées tous les deux jours avec 50 mL d’eau. Les variétés de romarin ont ensuite subi différentes conditions de croissance et de stress décrites dans le tableau 3.

- 49 - Matériels et méthodes

Tableau 2 : Contenu en CA (% de poids sec) des deux variétés cultivées en champs soumis au climat méditerranéen. Ces données, générées par la société Naturex, ont été obtenu par quantification par UPLC-MS.

Variety Sudbury blue Barbecue

Carnosic acid (%) 5,60 ± 0,31 1,48 ± 0,02

Tableau 3 : Différentes conditions de croissance appliquées pendant trois ou quatre semaines aux deux variétés de romarin Sudbury blue et Barbecue

250µE 1200µE 12h 25°C jour/12h 15°C nuit 9h 25°C jour/15h 15°C nuit 15h 25°C jour/9h 15°C nuit 12h 35°C jour/12h 15°C nuit 12h 35°C jour/12h 5°C nuit 500µE 850µE 12h 25°C jour/12h 15°C nuit

Ces traitements ont été réalisés dans les chambres de culture du Groupe de Recherche Appliquées en Phytotechnologie (GRAP). Dans toutes ces conditions, l’humidité relative est de 50% et l’arrosage se fait tous les jours. Après trois ou quatre semaines de stress, les jeunes feuilles situées à l’apex sont collectées, pesées, congelées dans de l’azote liquide et stockées à -80°C avant analyses.

3. Arabidopsis thaliana

Arabidopsis thaliana est une plante modèle utilisée pour son petit génome entièrement séquencé et pour son cycle de développement et de reproduction par autofécondation très court (six semaines de graines à graines). Les graines d’Arabidopsis thaliana cultivar Columbia Col-0 sont semées sur terreau et cultivées en phytotron sous une intensité lumineuse de 200 µmoles photons.m-2.s-1, une température de 25/18°C (jour/nuit), une photopériode de 8 h et une humidité relative de 55 %. Les plantes sont arrosées par immersion alternativement avec de l’eau et de la solution nutritive tous les deux jours. Toutes les

- 50 - Matériels et méthodes expériences menées sur A. thaliana ont été réalisées sur le génotype sauvage en conditions normales de croissance.

4. Préparation des membranes de thylakoïdes d’Arabidopsis thaliana

7 g de feuilles fraiches sont broyés pendant 2 s dans 50 mL de tampon d’extraction (330 mM de sorbitol, 50 mM de Tricine, 2 mM d’EDTA(Na2), 1 mM de MgCL2, 2 mM d’ascorbate, pH 7.7) avec 5 mM de dithiothréitol (DTT) dans un broyeur à couteau à faible vitesse. Le surnageant est retiré et mis de côté puis 50 mL de tampon d’extraction sont ajoutés pour une seconde extraction. Les extraits sont filtrés sur 4 couches de Miracloth, et le filtrat est centrifugé pendant 4 min à 1500 g à 4°C. Le culot est lavé deux fois avec du tampon d’extraction puis centrifugé pendant 4 min à 1500 g à 4 °C. Le culot lavé est re-suspendu dans

21 mL de tampon de lyse pH 7.8 (10 mM de Tricine, 10 mM de NaCl, 10 mM de MgCl2) avec 1 mM de phenyl methylsulfonyl (PMSF). La lyse est effectuée pendant 15 min avec une agitation occasionnelle toutes les 5 min. Les échantillons sont centrifugés pendant 15 min à 48400 g. Le culot est ensuite re-suspendu dans 1,75 mL de tampon de stockage (100 mM de

Tricine, 10 mM de MgCl2, 400 mM de sucrose, pH 7.8) puis stockés à -80°C avant analyses.

5. Extraction des diterpènes à partir des trichomes par trempage des feuilles dans un solvant

L’extraction de l’acide carnosique et du carnosol des trichomes des feuilles est réalisée par solvant qui est ensuite évaporé sous azote. 250 µL de méthanol avec 0,5% d’H3PO4 sont ensuite ajoutés et la solution est directement analysée par HPLC-UV, comme décrit ci- dessous. Les diterpènes des feuilles trempées dans le solvant sont ensuite extraits selon le protocole décrit ci-dessous.

6. Détermination de l’acide carnosique et du carnosol

5 mL méthanol/H3PO4 (99,5/0,5, v/v) sont ajoutés à 25 mg de feuilles fraiches. L’échantillon est alors broyé pendant 1 min avec une Ultra-turrax T25 (IKA-Werke) à 24 000 tours par min. Après centrifugation à 4500 g pendant 10 min à 4°C, le surnageant est re-suspendu dans 2,5 mL de méthanol/H3PO4 pour une seconde extraction. Après filtration sur filtre Costar PTFE de 0,45 µm, l’extrait est analysé par HPLC-UV avec une colonne phase inverse (Waters NovaPak 4 µm, 39 x 300 mm), une élution isocratique de 65/34,8/0,2 (v/v/v) -1 acétonitrile/eau/H3PO4 à un débit de 1 mL.min et une détection UV à 230 nm.

- 51 - Matériels et méthodes

7. Détermination des prényl lipides

60 mg de feuilles fraiches sont broyés pendant 1 min dans 2 mL d’éthyl acétate 100% avec une Ultra-Turrax à 24 000 tours par min. Après centrifugation pendant 3 min à 16900 g, 600 µL d’extrait sont filtrés sur filtre PTFE de 0,2 µm. L’extrait est mis à évaporer sous flux d’azote, et 1 mL de méthanol/hexane (17/1, v/v) est ajouté à l’échantillon avant analyse par HPLC-UV/fluorescence. Les échantillons sont analysés par une HPLC en phase inverse avec une colonne Phenomenex Kinetex 2,6 µm (100 x 4,6 mm) suivant un mode isocratique de méthanol/hexane (17/1, v/v) à un débit de 0,8 mL.min-1, comme décrit précédemment par Ksas et al (2015). Les tocophérols et les prényl lipides, exceptée la plastoquinone-9, sont détectés par la fluorescence à 330 nm avec une excitation à 290 nm. L’état oxydé de la plastoquinone-9 est mesuré par son absorbance à 255 nm.

8. Fluorescence de la chlorophylle

Les antennes collectrices des photosystèmes captent l’énergie lumineuse dont une partie est dissipée sous forme de chaleur et de fluorescence. A température ambiante, cette fluorescence provient essentiellement du photosystème II. Cette émission de fluorescence diminue lorsque l’activité photochimique des photosystèmes est élevée et augmente lorsque cette activité est faible. Elle permet donc d’évaluer in situ le fonctionnement du photosystème II (Maxwell & Johnson, 2000). Le principe du fluorimètre PAM-2000 (Waltz, Effeltrich, Allemagne) est décrit par Schreiber (1986). Il repose sur l’utilisation de deux sources lumineuses. La première, de faible intensité lumineuse (~0.9 µmoles photons.m-2.s-1) dans le rouge (appelée lumière non-actinique) ne modifie pas l’activité du PSII et permet d’exciter uniquement la chlorophylle. La seconde est une lumière blanche d’intensité élevée (~5000 µmoles photons.m-2.s-1, appelée lumière actinique) permettant l’induction du transfert des électrons. Les mesures de fluorescence de la chlorophylle sont réalisées sur la face adaxiale des feuilles de plantes préalablement placées à l’obscurité pendant 10 min. La fluorescence chlorophyllienne minimale F0 est mesurée grâce à la lumière rouge non actinique. Lorsqu’un flash saturant de lumière blanche (actinique) est appliqué pendant 800 ms, la fluorescence chlorophyllienne atteint son maximum (Fm). L’efficacité photochimique du PSII est estimé grâce à la formule suivante (Kitajima & Butler, 1975) :

(퐹푚 − 퐹0) 푌 = 퐹푚

- 52 - Matériels et méthodes

Ce ratio, appelé Fv/Fm est de l’ordre de 0,8 dans des plantes cultivées en conditions optimales.

9. Dosage de la chlorophylle

La chlorophylle est extraite de feuilles fraiches broyées à l’aide de l’Ultra-Turrax à 24 000 tours par min dans 1 mL de méthanol/H3PO4 (99,5/0,5, v/v). Après centrifugation, la chlorophylle présente dans le surnageant est mesurée au spectrophotomètre mono-faisceau UV-visible « Varian Cary 50 Scan » aux absorbances de 652,4 nm et 665,2 nm. La teneur en chlorophylle est ensuite calculée grâce aux formules suivantes en µg.mL-1 (Lichtenthaler & Wellburn, 1983) :

- Chlorophylle a : 16,72 A665,2 – 9,28 A652,4

- Chlorophylle b : 34,09 A652,4 – 15,28 A665,2

10. Imagerie de la peroxydation lipidique

Les peroxydes lipidiques sont observés par imagerie d’autoluminescence (Havaux et al, 2006). Les signaux d’autoluminescence sont attribués à la décomposition spontanée des peroxydes lipidiques (Birtic et al, 2011). L’émission spontanée de photon de la plante entière de romarin est mesurée après 2,5 h à l’obscurité par une caméra équipée d’un CCD (charge- coupled device) refroidie à l’azote liquide, comme décrit dans Birtic et al (2011). Le temps d’acquisition est de 20 min et le regroupement des pixels est de 2 x 2. Le niveau d’oxydation in vitro d’une solution de MGDG ou C18 :3 est aussi mesuré par cette méthode, sans obscurité préalable et avec un regroupement des pixels de 5 x 5. Les signaux de luminescence sont analysés et quantifiés avec le logiciel ImageJ.

11. Analyse biochimique de la peroxydation lipidique

Après oxydation in vitro, une solution de 30% (w/v) de MGDG est broyée avec une Ultra-

Turrax T25 (IKA-Werk) dans du méthanol/ CHCl3 (50/50, v/v) contenant 5 mM de triphenyl phosphine, 1 mM d’hydroxytoluène butylé (BHT) et 1 M d’acide citrique. L’acide 15- hydroxy-11,13(Z, E)-eicosadienoique est ajouté comme standard interne. Après centrifugation

à 700 g pendant 5 min à 4°C, la phase organique (CHCl3) est évaporée sous courant d’azote à 40°C pendant 30 min. Puis, la phase organique est resolubilisée dans de l’éthanol et du NaOH (3,5 M). L’échantillon est hydrolysé à 80°C pendant 30 min. Le pH est ensuite ajusté entre 4 et 5 par ajour d’acide citrique (1M) et les hydroxy acides gras sont alors extraits avec un mélange hexane/éther (50/50). Les isomères d’HOTE (acide hydroxy octadecatriénoique,

- 53 - Matériels et méthodes produit par oxydation de l’acide linolénique) et les isomères d’HODE (acide hydroxy octadecadienoique, produit par oxydation de l’acide linoléique) sont séparés et quantifiés par une HPLC-UV en phase normale, comme décrit précédemment par Montillet et al (2004).

1 • 12. Détection de O2 et HO par une méthode de résonnance paramagnétique électronique

Les expériences de piégeage de spin, avec du 4-pyridyl-1-oxyde-N-tert-butylnitrone (4- POBN) pour détecter la formation des radicaux hydroxyles, sont réalisées en utilisant 50 µM d’H2O2, 50 mM de 4-POBN et 50 mM de Fe-EDTA en présence ou en absence d’acide carnosique, de carnosol ou d’α-tocophérol. Pour détecter l’oxygène singulet, la sonde de spin 2,2,6,6-tetraméthyl-4-pipéridone hydrochloride TEMPD (100 mM) est illuminée pendant 2 min à 1000 µmoles photons.m-2.s-1 avec 100 µM de rose Bengale en présence et en absence d’acide carnosique, de carnosol ou d’α-tocophérol.

Les spectres RPE sont réalisés à température ambiante dans une cellule standard plate en quartz par le spectromètre ESP-300 X-band (Bruker, Rheinstetten, Allemagne). Les paramètres utilisés sont les suivants :

- Fréquence des micro-ondes 9,73 GHz - Fréquence de modulation 100 kHz - Amplitude de modulation 1 G - Puissance des micro-ondes 63 milliwatt pour TEMPD et 6,3 milliwatt pour 4-POBN - Récepteur de gain 2 x 104 - Constante de temps 40,96 ms - Nombre de scans 16

13. Analyses des métabolites par spectrométrie de masse

Les analyses de spectrométrie de masse sont effectuées à la plateforme CRIBIOM (CHU de la Timone, Marseille, France). La méthode LC-MS utilisée a été développée à partir des méthodes de Zhang et al (2012) et Song et al (2014). Les échantillons sont dilués dans de l’acétonitrile/eau (65/35, v/v) puis analysés par UPLC/MS/MS. La chromatographie de séparation est réalisée avec une Dionex Ultimate 3000 (Thermo Fischer Scientific) constitué d’une pompe de séparation rapide (RS) (LGP-3400 RS), un échantillonneur automatique (WPS-3000 TRS) et un compartiment à colonne (TCC-3000 RS) gérée par le logiciel Chromeleon 6.8. Une colonne en phase inverse Hypersil Gold (100 nm x

- 54 - Matériels et méthodes

2.1 mm x 1.9 µm) (Thermo Scientific, Les Ulis, France) est utilisée pour la séparation des composés. Les mesures des masses précises sont réalisées par le spectromètre de masse Q- Exactive Plus (Thermo Fischer Scientific, Bremen, Allemagne) avec une sonde d’ionisation par électronébulisation chauffée (Heated Electrospary Ionization, H-ESI II). Le logiciel Thermo Xcalibur 3.0.63 est utilisé pour la configuration des instruments, le control du système de LC-MS pendant l’acquisition et le traitement des données. L’application Tune Q Exactive Plus 2.5 est utilisée pour le control direct du spectromètre de masse. Le four de la colonne est maintenu à 40°C, alors que la température de la chambre des échantillons est programmée à 4°C. La phase mobile est composée d’une solution aqueuse à 0.1% d’acide formique (A) et d’acétonitrile à 0.1% d’acide formique (B), éluée selon le programme suivant : 0-10 min, 40-80% B, 10-12 min, 80% B, 12-2.1 min, 80-40% B, 12.1-18 min, 40% B. Le débit est fixé à 0.4 mL/min et le volume d’injection est de 5 µL. Les analyses de LC-HRMS sont réalisées avec une calibration externe dans le mode d’ionisation positif et négatif, fournissant ainsi une précision de masse de l’ordre de 3 ppm. Les températures de la sonde H-ESI et des capillaires de transfert sont maintenues à 310°C et 320°C, respectivement. Le voltage de la nébulisation est fixé à 3500 V et le niveau de la lentille S-lens RF à 55. Les gaines et les gaz auxiliaires sont maintenus à 30 et 8 unités arbitraires. La puissance de la résolution de masse est fixée à 70 000 de largeur totale à la moitié du maximum (FWHM) pour un m/z de 200, le temps maximal d’injection à 250 ms et la commande automatique de gain (AGC) à 10e6. Les spectres de LC-MS sont acquis dans une plage de masse m/z de 80 à 700. Les analyses MS/MS sont réalisées avec un spectromètre de masse Q-Exactive Plus (Thermo Fischer Scientific, Bremen, Allemagne) en utilisant des expériences de suivi des réactions parallèles (HCD). Dans ce but, la puissance de résolution est fixée à 70 000 pour un m/z de 200, la cible de l’AGC à 1e6 et le temps maximal d’injection de 250 ms. Les ions précurseurs sont isolés dans une fenêtre d’isolation de 2 m/z dans le quadrupôle puis ils sont fragmentés dans la chambre de collision de haute énergie (higher collision energy, HCD) sous des énergies de collision normalisées, préalablement déterminées. Le logiciel Thermo Xcalibur 3.0.63 est utilisé pour la programmation des instruments et le contrôle du système de LC-MS pendant l’acquisition et le traitement des données. L’acide carnosique et l’isorosmanol sont obtenus de Sigma, le carnosol est acheté chez Extrasynthèse (Genay, France), et le rosmanol et l’acide 12-O-methylcarnosique sont obtenus de Phytolab (Vestenbergsgreuth, Allemagne). Les métabolites dérivés de l’acide carnosique pour lesquels les standards ne sont pas disponibles sont quantifiés en utilisant le facteur de conversion de l’acide carnosique.

- 55 - Matériels et méthodes

14. Microscopie électronique à balayage

Cette méthode permet de s’assurer que les trichomes sont extraits lors du trempage des feuilles dans du dichlorométhane. Des feuilles de romarin sont trempées dans du dichlorométhane pendant 30 s puis la surface abaxiale des feuilles est examinée au microscope électronique à balayage environnemental (MEBE) opérant à 30kV. Les échantillons sont placés sur une plaque en platine de 5 mm de diamètre dans la chambre d’analyse du microscope à une pression en vapeur d’eau de 600 Pa à 2°C.

15. Extraction des ARN totaux

50 mg de feuilles sont broyés en poudre fine au pilon mortier dans de l’azote liquide. 500 µL de triazol et 200 µL de chloroforme isoamylique 24 :1 sont ajoutés à la poudre. Après 5 min de centrifugation, le surnageant est homogénéisé dans de l’éthanol 70% (1/1, v/v) permettant la précipitation des acides nucléiques. Le mélange est ensuite déposé sur une colonne du kit d’extraction d’ARN « Nucleospin® RNA II » (Macherey-Nagel) permettant la rétention des acides nucléiques précipités. Le tampon MDB permettant le dessalage de l’échantillon est ajouté à la colonne. Après centrifugation, l’ADN est éliminé par un traitement de 15 min à la rDNase puis la colonne est lavée quatre fois pour éliminer l’ADN et les protéines résiduelles. Le premier lavage est réalisé avec 200 µL de tampon RAW2, puis la colonne est lavée deux fois avec 600 µL de RAW3. Enfin le dernier lavage est fait avec 250 µL de RA3. Après séchage de la colonne, les ARN sont élués avec 40 µL d’eau RNase free qui déstabilisent les liaisons hydrogènes établies entre les ARN et la membrane de silice. Afin de concentrer les ARN, les 40 µL sont déposés une deuxième fois sur la colonne. L’échantillon est ensuite dosé par spectrophotométrie UV pour mesurer l’absorbance à 260 nm, longueur d’onde d’absorption des acides nucléiques. La pureté de l’échantillon est évaluée par gel d’agarose à 1% BET et en mesurant les ratios d’absorbance 260/280 et 260/230 qui doivent être supérieurs à 2,28, 280 nm et 230 nm correspondant respectivement aux longueurs d’onde d’absorption des protéines et molécules organiques.

16. Obtention des ADNc par transcription inverse et PCR quantitative

Les ADNc sont obtenus à partir de 500 ng d’ARN total en utilisant le kit PrimeScript™ Reverse Transcriptase (Takara, Japon). Le mélange réactionnel de transcription inverse (RT) comprend 500 ng d’ARN totaux, 50 µM d’oligos dT et 500 µM de chacun des nucléotides

- 56 - Matériels et méthodes libres. Les ARN sont dénaturés pendant 5 min à 65°C puis placés dans la glace. Ensuite, un mélange contenant le tampon RT, un inhibiteur de RNase et l’enzyme PrimeScript RTase est ajouté au tube. La réaction se déroule à 50°C pendant 1h. Les produits de RT sont ensuite dilués pour avoir une concentration d’ADNc de 2,5 ng/µL. Ces ADNc sont alors quantifiés par le système de PCR en temps réel Lightcycler 480 (Roche, Suisse). 3 µL de mélange réactionnel contenant le SYBR Green I Master (Roche, Suisse), 5 µM des amorces directes et inverses (Tableau 4) et de l’eau, sont ajoutés à 2 µL d’ADNc repartis dans une plaque de 384 puits. Le programme PCR utilisé est 10 min à 95°C, 40 cycles de 20 s à 95°C, 20 s à 62°C et 15 s à 72°C. La plaque est ensuite lue à 76°C et afin de vérifier les produits de PCR, un courbe de fusion est réalisée de 70°C à 95°C avec une lecture toutes les 0,5°C avec 10 s entre chaque mesure. Les données sont analysées en utilisant la méthode du ΔCt (Livak & Schmittgen, 2001) avec le facteur d’élongation 4a comme gène de référence.

Tableau 4 : Séquences des amorces utilisées pour la PCR en temps réel

Gène Amorce (5' --> 3') Dir: ACGCAGATAAATGGCTATACAATCC CYP76AK7/KX431219 Inv: ATTCAGCCCCTCCTTCAAGTTCC Dir: TGGATAGCGAGATTGATTTTGGAG CYP76AK8/KX431220 Inv: TCTGGAGTTGTTTGGATTCTGCC Dir: ACGAGATGGGAATAAAGGAGGAG elf4a Inv: ATCCTCACCCACACTTTTGCCTC

17. Analyses statistiques

Tous les échantillons sont préparés et analysés en tripliqua. Les différences statistiques entre les mesures des différents traitements sont analysées par un t-test de Student avec le logiciel Microsoft Excel. Les différences sont considérées significatives lorsque le niveau de probabilité P est inférieur à 0,05. Un, deux ou trois astérisques est attribué pour 0,01 < P < 0,05, 0,005 < P < 0,01 et P < 0,005 respectivement.

- 57 - Matériels et méthodes

- 58 - Résultats

III. Résultats I. Les fonctions antioxydantes et de protecteur de lipides des diterpènes phénoliques des feuilles du romarin (Rosmarinus officinalis L.), CA et CARN

1. La protection des lipides majoritaires du chloroplaste par CA et CARN

Le lipide monogaloctosyl diacylglycérol (MGDG solubilisé dans du méthanol/chloroforme) est 1 oxydé par de l’ O2 généré par illumination du bleu de méthylène, un photosensibilisateur. Exposé à la lumière, le bleu de méthylène passe de l’état singulet (1DyH) à l’état triplet (3DyH). Lors de sa relâche à l’état singulet, il transfert son énergie d’excitation à l’oxygène moléculaire 3 1 ( O2) qui devient de l’oxygène singulet ( O2) (Fig.28).

1 Figure 28 : Schéma du mécanisme de production de l' O2 par un photosensibilisateur, le bleu de méthylène. Comme attendu (Birtic et al, 2011), l’image prise avec une camera CCD refroidie de haute sensibilité (Fig. 29A) indique que la solution de MGDG émet de la luminescence après le traitement d’oxydation. L’émission de photons provient des espèces luminescentes, telles que des carbonyles à l’état triplet et de l’oxygène singulet, produites par la lente décomposition des peroxydes lipidiques (Cifra & Pospisil, 2014). Il a été montré que le signal de luminescence émis est corrélé avec le niveau de peroxydation des lipides (Birtic et al, 2011). L’ajout de CA 1 (60 et 120 µM) à la solution de MGDG avant l’oxydation à l’ O2 entraîne une diminution importante de l’intensité du signal de luminescence (Fig. 29A & 29B), indiquant une baisse de l’oxydation du MGDG et un faible niveau de peroxydes lipidiques. La protection du MGDG 1 contre l’oxydation par l’ O2 est également observée avec le CARN et l’α-tocophérol (α-TOC). L’activité protectrice de ce dernier apparait moins efficace que celles portées par le CARN et

- 61 - Résultats le CA. Des observations similaires sont obtenues lors d’expériences réalisées avec l’acide linolénique (C18 :3) au lieu du MGDG (Fig. 30). Ces résultats indiquent que le CA et le CARN protègent tous les deux les lipides avec une plus grande efficacité que l’α-tocophérol. L’analyse 1 des HOTE et des HODE après oxydation de MGDG par l’ O2 en présence ou l’absence de CA ou de CARN permet de confirmer les effets de protections de ces diterpènes (Fig. 29C). Le niveau de ces deux types d’hydroperoxydes est considérablement réduit par le CA et le CARN.

Carnosic acid B 140 Carnosol A 120 Tocopherol 100 Carnosic acid 80 * + 60 ** 40 *

- Luminescence (rel.) 20 Carnosol 0 0 60 120 Concentration (µM) Control C 120 CA 60µM 100 CARN 60µM Tocopherol 80 ** ** 60 40

0 60 120 µM 20 ***

HOTE HOTE HODEor (rel.) 0 HOTE HODE

1 1 Figure 29 : Effets du CA, CARN et TOC sur des oxydations in vitro de MGDG par l’ O2. O2 est produit par illumination pendant 30 min d’une solution de lipides (MGDG) en présence de bleu de méthylène. (A-

1 C) l’oxydation du MGDG par l’ O2 en présence de 60 µM ou 120 µM de CA, CARN et TOC. A) Images de luminescence des solutions oxydées. La palette de couleur indique l’intensité du signal du noir (0) au blanc (valeur la plus haute). B) Quantification des signaux de luminescence. Les données sont normalisées sur la valeur du signal de l’échantillon contrôle, qui ne contient pas d’antioxydant. C) Quantification des hydroxy acides gras (HOTE et HODE). Les données sont normalisées sur les valeurs contrôles d’HOTE et HODE mesurées en l’absence d’antioxydant. CA : acide carnosique ; CARN : carnosol.

- 62 - Résultats

A B 140 Contrôle 120 Acide + carnosique 100 Carnosol Tocophérol Contrôle CA 60 80 ** *** 60 ***

40 Luminescence Luminescence (rel.) CARN 60 TOC 60 - 20 0

1 Figure 30 : Effets du CA, CARN et TOC sur des oxydations in vitro d'acide linolénique (18:3) par O2.

1 O2 est produit par illumination pendant 30 min d’une solution d’acide linolénique en présence de bleu

1 de méthylène. (A-C) l’oxydation du MGDG par l’ O2 en présence de 60 µM de CA, CARN et TOC. A) Images de luminescence des solutions oxydés. La palette de couleur indique l’intensité du signal du noir (0) au blanc (valeur la plus haute). B) Quantification des signaux de luminescence. Les données sont normalisées sur la valeur du signal de l’échantillon contrôle, qui ne contient pas d’antioxydant. CA :

acide carnosique ; CARN : carnosol ; TOC : tocophérol

2+ L’oxydation du MGDG par des radicaux hydroxyles produit par l’H2O2 et du Fe (réaction de Fenton), conduit également à une émission de luminescence (Fig. 31A & 31B). L’ajout de CARN à 60 et 600 µM à la solution de MGDG entraine une baisse marquée du signal de luminescence (Fig. 31B & 31D) indiquant que ce diterpène protège ce galactolipide contre l’oxydation par HO•. Etonnamment, l’addition de CA ne diminue pas le signal de luminescence mais, au contraire, elle augmente fortement la luminescence du MGDG après oxydation par les radicaux hydroxyles (Fig. 31A & 31C), même à une concentration de 600 µM. En réalité, l’augmentation de luminescence provient du CA lui-même qui émet de la luminescence après oxydation comme le montre l’effet du HO• sur le CA en l’absence de lipides. Cette augmentation de luminescence ne provient ni de l’HO• ni du CA comme le montre l’image de 2+ luminescence du mélange d’H2O2 et de Fe et la solution de CA sans ERO. Le CA réagit avec les radicaux libres et s’oxyde pour former des dérivés du CA luminescents. La figure 32 montre 1 que la quantité de CA diminue fortement quand les lipides sont oxydés par l’ O2 ou les radicaux hydroxyles alors que le niveau de CARN est très peu affecté. En conséquence, l’activité protectrice des lipides du CA ne pouvant être étudiée avec la technique d’autoluminescence, nous avons alors appliqué la méthode HPLC de quantification des HOTE et des HODE. Le niveau des hydroxyperoxydes est considérablement diminué en présence de CA et de CARN

- 63 - Résultats

(Fig 31E), ce qui révèle que ces deux diterpènes protègent le MGDG de l’oxydation par les radicaux hydroxyle.

A ● ● MGDG+OH OH . +CA 0µM +CA 60µM +CA 600µM +CA 0µM +CA 600µM CA 600µM +

- B

D 120 Carnosol CARN 0 60 600 µM 100 400 C Carnosic acid 80 350 MGDG +OH●+ CA 0µM .) 60

300 MGDG + OH● + CA 60µM ** rel 250 MGDG + OH● + CA 600µM 40 OH● + CA 600µM **

200 Luminescence(rel.) CA 600µM 20 150 OH● 0 100

Luminescence( 0 60 600 50 Concentration (µM) -

E Control 120 CA 60µM 100 CARN 60µM 80 ** ** 60 *** 40 ***

HOTE HOTE HODE or (rel.) 20 0 HOTE HODE

Figure 31 : Effets de 60 et 600 µM de CA et de CARN sur des oxydations in vitro de lipides par HO• produit par la réaction de Fenton. A) Images de luminescence d’une solution de MGDG oxydé par les radicaux libres 2+ en présence ou absence de CA. La luminescence du mélange H2O2+Fe et du CA en présence ou en absence de HO• est mesuré comme contrôle. B) Image de luminescence du MGDG oxydé par HO• avec ou sans CARN.

C) Quantification des signaux de luminescence de la Fig. 2A. Les données sont normalisées sur les valeurs des signaux contrôles mesurés sans antioxydant. D) Quantification des signaux de luminescence de la Fig. 2B. E) Quantification des hydroxy acides gras (HOTE et HODE). Les données sont normalisées sur les valeurs d’HOTE et d’HODE mesurées en l’absence d’antioxydant.

- 64 - Résultats

B A 120 singlet oxygen 120 hydroxyl radical

100 100 carnosic acid 80 80 carnosol

decrease (%) 60 60

40 40

Diterpene 20 20 0 0

Figure 32 : Diminution des concentrations CA et en CARN lors de l’oxydation in vitro de l’acide

1 linolénique (C18:3) par A) O2 (produit par illumination du bleu de méthylène ou B) HO• (produit par la réaction de Fenton). Les résultats sont exprimés en % de la concentration initiale et les données sont des valeurs moyennes de 3 expériences indépendantes ± SD.

2. Interactions du CARN et de CA avec les ERO

La fig. 33 confirme la dégradation du CA lors d’une oxydation par les radicaux hydroxyles. En • 2+ effet, en condition d’oxydation par les HO générés par la réaction de Fenton (H2O2 + Fe ), la concentration du CA chute rapidement alors que le CARN s’accumule en parallèle (Fig. 33A). 1 L’oxydation du CA par l’ O2 entraine le même phénomène avec des vitesses de disparition du CA et d’accumulation du CARN plus lentes comparées aux HO•. De manière saisissante et • 1 contrastée, la concentration du CARN est stable en présence d’HO et de O2 signifiant que le CARN est résistant à l’oxydation (Fig. 33B). Ces résultats indiquent la grande sensibilité du CA à l’oxydation par les ERO suggérant que l’activité antioxydante de ce diterpène peut relever d’un piégeage chimique des ERO.

- 65 - Résultats

A B Radical hydroxyle Radical hydroxyle

300 300 Carnosol Carnosic 250 250 acid 200 200 150 carnosol 150 100 100

50 Concentration(µM) 50 Concentration(µM) 0 0 0 10 20 30 0 10 20 30 40 Time (min) Time (min) C D Oxygène singulet Oxygène singulet

300 Carnosic 600 Carnosol 250 acid 500 200 400 150 300 100 200

Carnosol Concentration(µM) 50 Concentration(µM) 100 - 0 0 10 20 30 0 10 20 30 40 Time (min) Time (min)

1 Figure 33 : Cinétique d’évolution des concentrations en CA et CARN soumis à une oxydation par O2

• 1 ou HO . L’ O2 est généré par illumination du bleu de méthylène, et les radicaux hydroxyles sont produits

2+ par la réaction de Fenton avec de l’H2O2 et du Fe . A et C) acide carnosique ; B et D) carnosol.

1 Dans la figure 34, l’ O2 est généré par l’illumination du rose Bengale et quantifié avec la sonde 1 de spin TEMPD spécifique de l’ O2 (Hideg et al, 2011). L’ajout de CA réduit fortement l’amplitude du signal de résonance paramagnétique électronique (RPE) du TEMPD à partir de faibles concentrations (10 µM) (Fig. 34A & 34B). L’analyse des spectres RPE confirme les 1 résultats de la figure 33 et montre que le CARN ne piège pas l’ O2. En effet, 60 µM de CARN ont un effet très faible sur l’amplitude du signal RPE du TEMPD (Fig. 34C). Ces résultats 1 confirment que le CARN ne peut pas éliminer l’ O2 dans la même gamme de concentrations que le CA bien qu’il protège les lipides contre une oxydation dans ces ordres de concentrations. 1 Nous avons également étudié les effets de l’α-tocophérol, un piégeur connu de l’ O2 (Foote et al, 1974 ; Di Mascio et al, 1990). Les effets de piégeage du tocophérol est visible à des concentrations de l’ordre de la millimolaire (Fig. 34D), ce qui indique que le tocophérol est un 1 piégeur de O2 moins efficace que le CA.

- 66 - Résultats

2mT A B 100% CA 0µM 80% 60% 40% CA 10µM 20%

EPR EPR signal decrease(%) 0% CA 30µM 0 10 20 30 40 50 60 Concentration (µM) C 2mT CA 45µM CARN 0µM

CA 60µM

CARN 60µM D 2mT TOC 0mM

E

TOC 1mM 100% 80% 60% 40% TOC 5mM 20% 0% EPR EPR signal decrease(%) 0 2 4 6 8 10 Concentration (mM) TOC 10mM

1 1 Figure 34 : Capacité de piégeage de l' O2 par le CA et le CARN. L’ O2 est généré par 5 min d’illumination de 100 µM de rose Bengale en présence de la sonde de spin TEMPD. A) Effet des différentes concentrations en CA sur le spectre RPE du TEMPD. B) Quantification de la baisse de l’amplitude du signal induite par une augmentation de la concentration en CA. C) Effet du CARN sur le spectre RPE du TEMPD. D) Effet de TOC sur le spectre RPE du TEMPD. E) Quantification de la diminution de l’amplitude du signal RPE lors de l’augmentation de la concentration en TOC.

- 67 - Résultats

La sonde de spin POBN est utilisée pour mesurer les radicaux hydroxyles générés par la réaction de Fenton par la méthode de spectroscopie RPE (Hideg et al, 2011). Le CA est capable de piéger cette ERO (Fig. 35A & 35B) alors que le CARN n’a aucun effet sur la concentration de cette ERO (Fig. 35C). Les données des Fig. 34 et 35 confirment que le CA et le CARN réagissent différemment face aux ERO bien qu’ils protègent tous les deux les lipides contre la peroxydation lipidique induite par les ERO (Fig. 29 & 31).

A 4mT B

100 CA 0µM 80 60

40

20 CA 10µM EPR EPR signal decrease(%) 0 0 20 40 60 Concentrations (µM)

CA 30µM C 4mT CARN 0µM

CA 45µM

CA 60µM CARN 60µM

CARN 120µM

CARN 300µM

Figure 35 : Piégeage des radicaux hydroxyles par le CA et le CARN. HO• est généré par la réaction de 2+ Fenton avec H2O2 et Fe en présence de la sonde de spin POBN. A) Effet de concentrations différentes en CA sur le spectre RPE du POBN. B) Quantification de la diminution de l’amplitude du signal RPE induit par une augmentation de concentrations en CA. C) Effet du CARN sur le spectre RPE du POBN.

- 68 - Résultats

1 • Les dérivés du CA (dont le CARN) générés lors de son oxydation in vitro par l’ O2 ou le HO (Tableau 5) sont caractérisés par chromatographie liquide couplée à de la spectrométrie de masse (LC-HRMS). Des standards authentiques sont utilisés pour déterminer les temps de rétention, les m/z, les spectres de masse totale et de fragmentation (MS/MS) du CA et du CARN (Annexes 1 et 2), permettant l’identification sans équivoque de ces composés dans les solutions oxydées et les extraits de feuilles de romarin. L’oxydation du CA est confirmée par la diminution du pic de CA et par la production concomitante de CARN. Une variété de composés 1 • obtenue par l’oxydation du CA par l’ O2 et l’HO est détectée. Il y a une forte similitude entre 1 • les profils d’oxydation du CA par l’ O2 et le HO . Les structures du rosmanol et de l’isorosmanol sont confirmées par mise en correspondance de leur temps de rétention et leur spectre de fragmentation avec ceux des composés de référence (Annexes 3, 4 et 5). Le rosmaridiphénol, le 11,12-O-methylrosmanol, le 7-méthylrosmanol, le 7-méthylepirosmanol, les isomères de rosmadial et le 5,6,7,10-tetrahydroxyrosmariquinone sont putativement identifiés par comparaison des temps de rétention et des spectres de fragmentation obtenus expérimentalement, sur les solutions de CA oxydé et les extraits de feuilles de romarin, avec les données bibliographiques (Annexes 6,7,8,9 et 10).

- 69 - Résultats

Tableau 5 : Liste des dérivés d’acide carnosique mesurés par UPLC-MS après oxydation in vitro du

1 • CA par l’ O2 et l’HO

Masse RT - ● 1 Nom des produits m/z (M-H) OH O2 molaire (min)

Carnosic acid (1) 332.43 7.4 331.19039  

Carnosol (2) 330.41 5.7 329.17474  

Rosmanol (3) 346.42 2.6 345.16965  

Rosmaridiphenol (10) 316.43 6.6 315.19547  

7-methyl-epirosmanol (6) 360.44 5.5 359,1853  

7-methyl-rosmanol (5) 360.44 5.1 359,1853  

Isorosmanol (4) 346.42 2.3 345.16965  

11,12-di-O-methylrosmanol (8) 374.47 6.6 373.20009  

Isomères rosmadial (9) 344.40 6.2; 6.6; 7.1 343.16965  

Isomères 5,6,7,10- 302.41 6.9; 8.2 301.17982   tetrahydrohydroxyrosmari-quinone (7)

3. Les dérivés d’oxydation du CA in planta

1 • Certains composés détectés in vitro après oxydation du CA par l’ O2 et l’HO (Tableau 5) sont également retrouvés dans des feuilles de romarin cultivé en conditions contrôles : rosmanol, isorosmanol, rosmaridiphénol, 7-méthyl-epirosmanol, 7-méthyl-rosmanol et 5,6,7,10- tetrahydroxyrosmariquinone, indiquant une oxydation chronique du CA par les ERO dans les feuilles (Fig. 36). En accord avec cette conclusion, l’adaptation à l’obscurité pendant 30h de plantes de romarin entraine une forte diminution de la quantité de ces composés (Fig. 37), confirmant le lient avec la lumière et la production d’ERO asoociées dans les chloroplastes.

En conditions de stress, le CA diminue fortement, le CARN s’accumule (Fig. 36) et la concentration de nombreux produits d’oxydation, incluant le rosmanol, isorosmanol, 7-méthyl- epirosmanol, 7-méthyl-rosmanol et 5,6,7,10-tetrahydroxyrosmariquinone, augmentent fortement dans les feuilles de romarin (Fig. 36). Ces résultats ne confirment pas l’accumulation

- 70 - Résultats du rosmanol, de l’isorosmanol et du méthylisorosmanol observée dans des romarins exposés à un stress hydrique en champs (Munné-Bosch et al, 1999), mais ceci peut être relié à l’utilisation de conditions de croissance très différentes. L’accumulation des dérivés d’oxydation dans des feuilles de romarin, suite à l’exposition à une forte lumière et une température élevée, soutient l’idée que la perte de CA observée dans ces conditions (Fig. 36) résulte de sa dégradation oxydative par les ERO.

- 71 - Résultats

Carnosic acid Carnosol Rosmanol Isorosmanol 50 10 0,8 0,4 *** ***

DW) 40 8 *** 1

- 0,6 0,3 30 *** 6 0,4 0,2 20 4 0,2 10 2 0,1

0 0 0 0 Concentration(µg.mg Control Stress Control Stress Control Stress Control Stress

5,6,7,10- 7-methylepirosmanol 7-methylrosmanol tetrahydroxyrosmariquinone Rosmaridiphenol

0,06 * 0,015 0,15 1,0

DW) **

1 1 *

- 0,8

0,04 0,01 0,10 0,6

0,4 0,02 0,005 0,05 0,2

0 0 0,00 0,0 Concentration(µg.m Control stress Control stress Control Stress Control Stress

Figure 36: Produits d'oxydation du CA in planta. Les plantes de romarin sont cultivées sous deux conditions différentes (conditions contrôles : 250 µmoles photon.m-2.s-1, 25°C jour/15°C nuit, 12 h ;

conditions de stress : 1200 µmoles photon.m-2.s-1, 35°C jour/5°C nuit, 12 h). Les métabolites du CA sont mesurés dans les feuilles de romarin par UPLC-MS.

- 72 - Résultats

Carnosic acid Carnosol Isorosmanol

60 8 0,8

DW) 1 - 6 0,6 40 4 0,4 20 *** 2 0,2 ***

Concentration (µg.mg Concentration 0 0 0 Light Dark Light Dark Light Dark

Rosmaridiphenol Rosmanol 7-methylrosmanol 0,25 1,2 0,01

DW) 1 - 0,2 0,008 0,8 0,15 0,006 0,1 0,4 0,004 0,002 0,05 *** 0,0 0

Concentration (µg.mg Concentration 0 Light Dark Light Dark Light Dark

5,6,7,10- tetrahydroxyrosmariquinone 7-methylepirosmanol 0,20

DW) 0,0012

1 - 0,15 0,0008 0,10 0,0004 0,05 *** *** 0,00 0 (µg.mg Concentration Light Dark Light Dark

Figure 37 : Effets de l’adaptation à l’obscurité (30 h) sur les niveaux des différents métabolites oxydés du CA dans les feuilles de romarin. Les valeurs correspondent à la moyenne de 3 expériences indépendantes ± SD.

- 73 - Résultats

4. CA et CARN exogènes protègent les membranes de thylakoïdes

Il a été montré que l’ajout de CA à des membranes de chloroplastes soumis à un choc osmotique à forte lumière préserve l’α-tocophérol et réduit les dommages oxydatifs (Munné-Bosch & Alegre, 2003). De plus, une consommation marquée du CA ajouté a été observée pendant le traitement à forte lumière. Nous avons réalisé des expériences similaires d’ajout de CA ou de CARN à des membranes de thylakoïdes préparées à partir de feuilles d’Arabidopsis thaliana, une espèce dépourvue en ces diterpènes. Les suspensions de thylakoïdes sont exposées pendant 2 h à forte lumière (3000 µmoles de photons.m-2.s-1), causant des dommages photooxydatifs dont la perte de chlorophylle et l’accumulation de produits de la peroxydation lipidique (HOTE) (Fig. 38A & 38B). L’ajout de CA ou de CARN aux membranes en suspension réduit considérablement les dommages photooxydatifs. En effet, la perte de chlorophylle est réduite à 5% (contre 30% de perte dans les échantillons contrôles) par le CA et le CARN, et la peroxydation lipidique est beaucoup plus faible. Ces résultats confirment que le CA et le CARN peuvent protéger les membranes biologiques et fonctionner comme protecteurs des lipides membranaires in vivo.

A Control B

30 )

1 450 CA 50µM -

chl

CARN 50µM 1 20 - 300

*** * (%) 10 150 *** *** Perte en chlorophylle chlorophylle en Perte 0 0 HOTE(µmol.µg

Figure 38 : Effet du CA et du CARN sur les membranes de thylakoïdes d'Arabidopsis exposées à une forte intensité lumineuse. Les suspensions de thylakoïdes sont exposées à une lumière blanche de lampe PFD de 3000 µmoles.m-2.s-1 pendant 2 h. A) Diminution du contenu en chlorophylle après le traitement lumineux. B) HOTE avec ou sans ajout de 50 µM de CA ou de CARN aux suspensions de membranes.

5. Interactions directes du CARN avec le processus de peroxydation lipidique

Le CARN est résistant à l’oxydation par les ERO, pourtant lorsque cette oxydation est placée dans un environnement lipidique, une perte de CARN est observée (Fig. 32). Ceci suggère que le CARN pourrait interagir avec le mécanisme de peroxydation des lipides et être dégradé lors de sa réaction avec des produits de l’oxydation lipidique. Il a été montré que les hydroperoxydes lipidiques sont capables d’induire des dommages membranaires et de la peroxydation lipidique

- 74 - Résultats sur des cellules en culture (Wijeratne & Cuppett, 2006). En se basant sur ces observations, nous avons réalisé des oxydations in vitro d’acide linolénique par l’hydroperoxyde 15-HEDE (l’acide 15-hydroxyeicosadiénoique) à l’obscurité et en absence d’ERO ou de générateur d’ERO. L’oxydation de l’acide linolénique est indiquée par l’augmentation du signal de luminescence en présence de 15-HEDE (Fig. 39A). La luminescence du 15-HEDE seul est plus élevée que celle de l’acide linolénique seul mais plus faible que celle de l’acide linolénique associé au 15-HEDE. Ceci est probablement dû à la décomposition spontanée des hydroxyperoxydes et la génération d’espèces luminescentes. L’ajout de 60 µM ou 120 µM de CARN au mélange d’acide linolénique + 15-HEDE diminue significativement le signal de luminescence (par 30% et 40% respectivement, Fig. 39B). Ces résultats indiquent que le CARN inhibe le processus de peroxydation lipidique. Le CARN ne modifie pas la luminescence intrinsèque du 15-HEDE indiquant que ce diterpène n’intervient pas dans la décomposition des hydroperoxydes. Contrairement au CARN, le CA n’a pas d’effet sur l’oxydation de l’acide linolénique induite par le 15-HEDE (Fig. 39B). Les effets du CA et du CARN sur l’oxydation des lipides selon un processus indépendant des ERO ont également été testés in vivo. Les blessures sont connues pour entrainer une activité des lipoxygénases dans les feuilles, causant une peroxydation lipidique enzymatique (Chavin et al, 2013) et induisant une émission de photons (Birtic et al, 2011). Dans la Fig. 39C, les feuilles sont blessées avec un scalpel à l’obscurité. Comme précédemment montré (Birtic et al, 2011), les blessures peuvent être visualisées par l’émission de luminescence associée à l’oxydation des lipides. Comparée à des feuilles pré-infiltrées avec un tampon, les feuilles pré-infiltrées avec du CARN montrent un signal de luminescence considérablement réduit. En accord avec les résultats in vitro (Fig. 39B), le CARN peut réduire la peroxydation lipidique in planta selon un mécanisme différent du piégeage des ERO. En adéquation avec les résultats obtenus in vitro, le CA n’est pas capable d’inhiber la peroxydation lipidique des feuilles d’Arabidopsis blessées. Ces résultats pris ensemble mettent en avant la différence d’activité antioxydante du CA et du CARN, impliquant une interaction directe avec les ERO par piégeage ou avec le processus de peroxydation des lipides, respectivement.

- 75 - Résultats

A B Carnosol 120 * 120 Carnosic acid 100 100 80 * 80 * 60 60 40 40 20 20

0 0 Luminescence Luminescence level (%) Luminescence Luminescence level (%) LA 15-HEDE LA + 15- 0 60 120 HEDE Concentration (µM) C + D +

- - 0 60 M carnosol 60 µM carnosic acid

140 140 0 (%)

(%) 120 120

100 100 level

level * 80 80 60 60 40 40 20 20

0 Luminescence 0 Luminescence Luminescence 0 60 0 60 Concentration (µM) Concentration (µM) Figure 39: Inhibition par le CARN de la peroxydation lipidique non médiée par les ERO. A) induction de l’oxydation de l’acide linolénique (LA) par l’hydroxyperoxydes 15-HEDE à l’obscurité, mesuré par l’émission de luminescence. B) Effet de 60 et 120 µM de CARN ou de CA sur l’oxydation de l’acide linolénique par le 15-HEDE. C et D) Effet du CA et du CARN sur des feuilles d’Arabidopsis blessées par scalpel

6. Comparaison de deux variétés de romarin contenant des concentrations différentes en CA et CARN exposées à un stress photooxydant

Comme montré dans la Fig. 40A, les feuilles de la variété Barbecue contiennent substantiellement moins de CA et de CARN que la variété Sudbury blue. Comme attendu à partir des résultats de la Fig. 36, l’exposition à forte lumière et haute température entraine une perte drastique de CA dans les deux variétés (Fig. 40A), laquelle est accompagnée par une augmentation des niveaux de CARN (Fig. 40B). Pourtant, ces effets sont moins prononcés dans la variété Barbecue comparés à Sudbury blue. Les dommages photooxydatifs sur les lipides dans les plantes cultivées à forte lumière ou en conditions contrôles sont visualisés dans les deux variétés par imagerie d’autoluminescence (Fig. 40C). De manière intéressante, les plantes

- 76 - Résultats de Barbecue exposées aux conditions de stress sont plus luminescentes comparées à Sudbury blue, indiquant plus de stress oxydatif et de peroxydation lipidique dans la variété Barbecue. La corrélation trouvée dans l’expérience de la Fig. 40 entre le contenu en CA et CARN des feuilles et la tolérance du romarin au stress photooxydatif est en accord avec la fonction protectrice de ces diterpènes observés in vitro (fig. 29, 31 et 38).

A Carnosic acid B Carnosol Sudbury blue 10 120 120 10 Barbecue 100 100 8 8 80 *** 80

DW) 6

DW) 6

1

1 - 60 60 - 4 4 *

40 40 (µg.mg 20 20 (µg.mg 2 *** 2

0 0 0 0 Stress Control Stress Control

C Sudbury blue Barbecue

Stress

Barbecu

e Contrôle

- +

Figure 40 : Comparaison de deux variétés de romarin (Sudbury blue et Barbecue) possédant des

- concentrations différentes en CA. Contrôle : plantes cultivées à faible lumière (250 µmoles photon.m 2.s-1, 25°C jour/15°C nuit, 12 h) et stress : plantes ayant poussé à forte lumière et température élevée (1200 µmoles photon.m-2.s-1, 35°C jour/5°C nuit, 12 h). A) Concentration en CA, B) concentration en CARN, C) Image d’autoluminescence de la peroxydation lipidique du romarin. A) et B) Les données

sont des valeurs moyennes de 3 expériences indépendantes ± SD.

- 77 - Résultats

7. Discussion

Cette étude confirme que le CA est un puissant antioxydant. D’une part, elle montre que ce diterpène phénolique protège efficacement les lipides contre des oxydations in vitro (solutions de lipides) et in vivo (biomembranes). Et d’autre part, cette étude donne des indications sur le mécanisme antioxydant du CA. Ce composé possède une forte réactivité vis-à-vis des ERO, il est rapidement oxydé et converti en une variété de métabolites au cours du processus. Ainsi, le CA agit comme un piégeur d’ERO qui les élimine lors de cette réaction d’oxydation. L’oxygène singulet, une forme réactive de l’oxygène, et les radicaux libres peuvent être éliminés par le CA, conduisant à l’accumulation de molécules oxydées, communes entre les deux types d’oxydation. Ces dérivés d’oxydation du CA sont observés dans les feuilles de romarin, en conditions contrôle et de stress. Une adaptation prolongée à l’obscurité des plantes de romarin entraine une baisse marquée de leur concentration. Ceci indique une oxydation chronique du CA dans les plantes exposées à la lumière et suggère que le CA joue un rôle de protection, non seulement en condition d’excès d’énergie lumineuse quand la production des ERO est attendue élevée, mais aussi sous faible intensité lumineuse. Ceci est en accord avec des observations préalables montrant la présence de produits de dégradation d’acide gras polyinsaturés 1 spécifique de l’ O2 dans les feuilles des plantes exposées à une faible intensité lumineuse, 1 indiquant la production continue d’ O2 dans des chloroplastes illuminés (Triantaphylidès et al, 2008). Ce phénomène a conduit au concept que les lipides membranaires agissent comme antioxydants qui capturent les ERO (Schmid-Siegert et al, 2016). Il pourrait être étendu au pool de CA dans les feuilles de romarin.

De manière intéressante, le CARN, dérivé d’oxydation majoritaire du CA, a été caractérisé comme étant un antioxydant et un protecteur de lipides aussi efficace que le CA. Ces résultats sont en accord avec les travaux précédents qui ont montré un effet de protection du CARN contre la peroxydation lipidique dans des microsomes et liposomes (Aruoma et al, 1992). Des études précédentes ont montré que d’autres métabolites dérivés du CA tels que le rosmanol, l’epirosmanol ou le rosmaridiphenol possèdent des capacités antioxydantes. Par exemple, le CARN, le rosmanol et l’epirosmanol sont capables d’inhiber l’oxydation in vitro des lipoprotéines (Zeng et al, 2001). Le méthyl carnosate a été rapporté pour être plus actif que le CA dans la protection d’émulsions de triglycérides à 60°C (Huang et al, 1996). Le rosmanol et l’epirosmanol inhibent la peroxydation lipidique des mitochondries et des microsomes (Haraguchi et al, 1995), et l’activité antioxydante du rosmanol et du 20-déoxocarnosol a été observée en utilisant le test antioxydant du DPPH (Escuder et al, 2002). L’activité antioxydante

- 78 - Résultats in vitro du rosmanol, de l’epirosmanol, de l’isorosmanol a été identifiée plus importante que celle de l’α-tocophérol (Nakatani & Inatani, 1984). Ainsi, quand il piège les ERO, le CA peut générer une variété d’antioxydants secondaires. Ce processus en cascade amplifie probablement la puissance antioxydante du CA et constitue un mécanisme de défense efficace. De plus, les feuilles de romarin sont capables d’accumuler ce diterpène en très grandes quantités (représentant plusieurs % du poids secs des feuilles) alimentant ainsi le piégeage des ERO et la réponse antioxydante du CA.

Le CARN est beaucoup plus résistant face à l’oxydation par les ERO que le CA pourtant il protège les lipides de l’oxydation aussi efficacement que le diterpène majoritaire. Au contraire 1 • du CA, le CARN ne diminue pas la concentration de l’ O2 et du HO en solution. Ces capacités de piégeage chimique apparaissent ainsi plus faibles que celles du CA, et donc l’activité antioxydante du CARN présente un mécanisme différent qui n’implique pas une réaction directe avec les ERO. Ce diterpène pourrait agir directement avec les radicaux lipidiques et par conséquent bloquer le processus de réaction en chaine de la peroxydation lipidique. Cette idée est supportée par l’effet inhibiteur du CARN sur la peroxydation lipidique induite in vitro par un hydroperoxyde lipidique ou in vivo par l’action d’une lipoxygenase. Cet effet est observé à l’obscurité en conditions non productrices d’ERO, le CARN peut agir en interférant avec le processus de peroxydation lipidique jouant ainsi le rôle de blocage de l’oxydation des lipides comme les tocophérols (Tavadyan et al, 2007). Ce phénomène n’est pas observé avec le CA. Dans le cas du tocophérol, le radical tocophéroxyl et la tocophérol quinone formés pendant ce processus sont recyclés par des réducteurs tels que l’ascorbate (Liebler et el, 1986, Szarka et, 2012) ou par réactions enzymatiques (Eugeni Piller et al, 2014). Un mécanisme de recyclage similaire pourrait avoir lieu pour le CARN. De manière intéressante, il a été montré que la carnosol quinone, une forme oxydée du CARN, est converti en CARN dans de l’eau contenant un solvant (Masuda et al, 2005). De même, des traitements thermiques de la carnosol quinone dans une solution de lipides peut reformer du CARN (Masuda et al, 2001). Ces résultats suggèrent la possibilité d’un mécanisme de recyclage pour ce diterpène, lequel permet la reprise de l’activité antioxydante en conditions oxydatives. De plus, il a été montré que l’efficacité antioxydante du CARN surpasse celle du CA dans des modèles membranaires (Perez-Fons et al, 2009 & 2006). Cet effet est attribué à l’amélioration de l’organisation des lipides par le CARN dans la partie hydrophobique de la membrane, contribuant probablement à la stabilisation membranaire et à entraver la propagation des radicaux. Indépendamment du mécanisme exact portant la fonction antioxydante du CARN, le fait que le mode d’action du

- 79 - Résultats

CA et de son premier dérivé d’oxydation soit différent élargit le spectre d’action des diterpènes du romarin dans la défense des plantes contre un stress oxydatif.

Le CA est exclusivement présent dans quelques espèces de la famille des Lamiacées, telles que le romarin, la sauge et l’origan (Hossain et al, 2010 ; Birtic et al, 2015). Pourtant, certaines espèces des Lamiacées, telles que le basilic et le thym, accumulent du CARN plutôt que du CA. La plupart des espèces contenant du CA et du CARN sont des plantes méditerranéennes qui peuvent s’adapter à des conditions climatiques drastiques et par conséquent, doivent se protéger du stress oxydatif. Alors que les propriétés antioxydantes in vitro du CA ont conduit à de nombreuses applications en agroalimentaire et en médecine (Birtic et al, 2015), l’évidence d’un rôle antioxydant in planta n’a pas été démontré. La principale source d’information sur cet aspect est le travail pionnier de Munné-Bosch et de son équipe qui ont montré l’interdépendance entre la concentration en CA et celle d’autres molécules antioxydantes de bas poids moléculaire dans les feuilles de romarin (Munné-Bosch & Alegre, 2003) ainsi que la présence d’abiétanes diterpènes oxydés dans des plantes de romarin cultivées en champs pendant l’été (Munné-Bosch et al, 1999). Le travail présenté ici est dans la continuité des études précédentes et fournit plusieurs arguments appuyant l’idée que le CA porte une fonction antioxydante in planta. Premièrement, le CA et le CARN protègent les membranes de chloroplaste contre une oxydation induite par une forte lumière. Comme les biomembranes sont les cibles d’oxydation lors de fortes intensités lumineuses, de sécheresse et de hautes températures (Schwab & Heber, 1984 ; Conde et al, 2011), l’accumulation de ces antioxydants est bénéfique dans les conditions climatiques méditerranéennes. Dans le romarin, il existe une large diversité des niveaux de concentrations en CA dans les feuilles (Wellwood & Cole, 2004). Des expériences préliminaires ont permis d’analyser la concentration en CA dans des feuilles d’une large gamme de variétés de romarin d’origines différentes. La variété Barbecue a une faible concentration en CA. En conditions contrôles dans un phytotron, la concentration foliaire en CA est 40% plus faible dans la variété Barbecue que dans la variété Sudbury blue. Aussi, en conditions de stress, Barbecue présente une concentration plus faible en CARN que Sudbury blue. De manière intéressante, les faibles concentrations en CA et CARN sont corrélées avec une résistance au stress photooxydant plus faible, en accord avec le rôle de ces diterpènes dans la résistance du romarin au stress photooxydant. De plus, la fonction du CA en tant que piégeur chimique des ERO, la présence de dérivés oxydés du CA dépendants de la lumière et de leur accumulation marquée dans des plantes exposées à des conditions de stress indiquent que l’action antioxydante de piégeage des ERO a lieu in vivo.

- 80 - Résultats

- 81 - Résultats

- 82 - Résultats

II. Localisation et variations des niveaux des principaux diterpènes phénoliques dans le romarin

1. Localisation tissulaire Le CA et le CARN sont essentiellement présents dans les tissus photosynthétiques (Munné- Bosch & Alegre, 2001, Luis & Johnson, 2005) et, dans les feuilles, ils ont été localisés dans les chloroplastes (Munné-Bosch & Alegre, 2001). Pourtant, le CA et le CARN ont également été trouvés répartis entre les trichomes à la surface des feuilles et les tissues foliaires internes (Bozic et al, 2015). Cette répartition a été estimée par trempage des feuilles de romarin (pendant 30 s) dans du dicholorométhane afin d’extraire les composés hydrophobiques des trichomes. Comme montré dans la Fig. 41B, ce traitement permet de vider les trichomes glandulaires alors que les cellules de l’épiderme ne semblent pas altérées. Après trempage, le CA et le CARN sont détectés dans le solvant (Fig. 41A), indiquant que ces composés sont stockés dans les trichomes. Pourtant, les quantités de diterpènes présents dans cette fraction sont relativement faibles, représentant moins de 10% des quantités totales. Donc, dans la variété Sudbury blue étudiée ici, le CA et le CARN sont essentiellement stockés dans les tissus internes des feuilles. La répartition du CA et du CARN entre les trichomes et les tissus internes n’est pas significativement modifiée par une croissance en conditions de stress (1200 µmoles photon.m- 2.s-1, 35°C jour/5°C nuit) (Fig. 41A).

- 83 - Résultats

A Carnosol Carnosic acid Solvent 100 100 Leaves

80 80

60 60

40 40 Quantité relative (%) relative Quantité 20 (%) relative Quantité 20

0 0 Control Stress Control Stress B Avant trempage Après trempage

m

µ 50

Figure 41: Localisation tissulaire de CA et CARN dans les feuilles de romarin (Sudbury blue) cultivées dans deux conditions différentes de lumière et de température (250 µmoles photons m-2 s-1 à 25/15°C

(jour/nuit) [control] ou 1200 µmoles photons m-2 s-1 at 35/5°C [stress]). A) CA et CARN ont été mesurés dans les feuilles et dans la partie solvant après trempage (représentatif des composés stockés dans les trichomes). B) Images de trichomes glandulaires du romarin, avant et après trempage des feuilles dans le solvant , prises par microscope électronique à balayage. Les données sont la moyenne des valeurs de trois expériences indépendantes ±SD.

2. Variations de CA Les feuilles de romarin sont connues pour accumuler une grande quantité de CA (3 à 5,5% du poids sec des feuilles) dépendante des conditions environnementales de croissance (Birtic et al, 2015). Sous le climat anglais, le romarin accumule plus de ce diterpène phénolique que sous un climat méditerranéen (Tounekti & Munné-Bosch, 2012 ; Luis & Johnson, 2005 ; del Baño et al, 2003 ; Munné-Bosch et al, 2000 ; Hidalgo et al, 1998). De plus, des variations saisonnières sont observées, le CA s’accumule de septembre à février et diminue de mars à août à l’inverse d’autres antioxydants ubiquitaires comme l’α-tocophérol (Munné-Bosch & Alegre, 1999 ; Munné-Bosch et al, 2000 ; Luis & Johnson, 2005) (Fig. 27 cf. Chapitre 1 : introduction). Des études en champs plus approfondies ont mis en avant que le froid et les UV-B favorisent

- 84 - Résultats l’accumulation de CA (Luis et al, 2007a, 2007b) alors que la sécheresse (Munné-Bosch & Alegre, 2003 ; Munné-Bosch et al, 1999 ; Hidalgo et al, 1998) combinée à d’importantes fluctuations de température et de fortes intensités lumineuses (Munné-Bosch et al, 2000) affectent négativement sa concentration. Pourtant, l’impact de chacun de ces paramètres sur les concentrations en diterpènes phénoliques dans le romarin n’a pas été déterminé. De plus, la société Naturex récolte le romarin, nécessaire à la production d’extraits riches en CA, dans la région du Mont Atlas au Maroc. Les périodes de récolte sous soumises à une réglementation marocaine stricte et ont lieu essentiellement en été, saison, à priori, non favorable à l’accumulation de CA (Munné-Bosch & Alegre, 1999 ; Munné-Bosch et al, 2000 ; Luis & Johnson, 2005). Par conséquent, l’étude des paramètres influençant les niveaux en diterpènes phénoliques pourrait permettre de trouver les conditions favorables à une accumulation du CA. Dans le but de mettre en place des champs de romarin pour avoir un meilleur rendement en CA et en accord avec l’agronome de Naturex, Nicolas Jegouick, la variété de romarin Sudbury blue (5,5 % du poids sec des feuilles de plantes cultivées en champs) a été soumise à douze conditions environnementales pendant quatre semaines. Afin de déterminer à quelle(s) saison(s) le romarin accumule le plus de CA et donc la meilleure période de récolte, certaines de ces combinaisons miment les saisons méditerranéennes (Tableau 6). Ces expériences nous ont permis d’étudier l’impact de l’intensité lumineuse, les fluctuations de températures et la photopériode sur les niveaux de CA, CARN, α-tocophérol et plastochromanol-8 dans les jeunes feuilles de romarin. Le tableau 6 résume les douze combinaisons des trois paramètres.

Tableau 6 : Plan d'expérience pour l’étude de l’impact de l’intensité lumineuse, des variations de températures et de la photopériode sur les concentrations en CA, CARN, α-Tocophérol et Plastochromanol-8.

12h/12h 9h/15h 15h/9h 250µE Automne Printemps 1200µE 25°C j/15°C n Hiver 500µE

850µE 250µE

35°C j/15°C n 1200µE Eté 250µE 35°C j/5°C n 1200µE

- 85 - Résultats

La Fig. 42 indique que le CA représente plus de 10% du poids sec des jeunes feuilles en condition contrôle de croissance (250 µmoles photons.m-2.s-1, 12h et 25°C jour/15°C nuit). Le dérivé d’oxydation majoritaire du CA, le CARN, est moins abondant (~2 µg.mg-1 du poids sec des feuilles chez Sudbury blue) bien qu’il représente 0,2% du poids sec en condition contrôle. Nous avons également analysé l’α-tocophérol et le plastochromanol-8, qui sont des antioxydants plastidiques ubiquitaires (Kruk et al, 2014, Kruk et al, 2016) (Fig. 43). En condition contrôle, l’α-tocophérol et le plastochromanol-8 sont retrouvés dans les feuilles de romarin dans des concentrations notablement plus faibles que le CARN, respectivement 0,1 µg.mg-1 et 0,01 µg.mg-1 du poids sec des feuilles. Quelles que soient les conditions, on n’observe aucune augmentation de la concentration en CA par rapport à la condition contrôle. En effet, le niveau en CA atteint une concentration maximale de l’ordre de 11% qu’aucun des trois paramètres étudiés n’augmente suggérant que la quantité de CA dans les feuilles de romarin est déterminée génétiquement. Au contraire, certaines conditions entraînent une perte de CA. Comparativement à la condition contrôle, la culture de romarin à 1200 µmoles photons.m-2.s-1 ne modifie pas la quantité de CA alors qu’à 500 et 800 µmoles de photons.m- 2.s-1, des pertes significatives (~50%) en CA, α-tocophérol et plastochromanol-8 sont observées. La diminution de la concentration en CA dans ces conditions n’est pas accompagnée d’une augmentation de la quantité en CARN. L’augmentation de 10°C de la température de jour (250 µmoles.m-2.s-1, 12h/12, 35°C/15°C) conduit à une baisse du niveau de CA (9%) associée à une faible augmentation du CARN ainsi qu’une perte de 80% d’α-tocophérol comparée à la condition contrôle. Ce résultat suggère la consommation du CA pendant son activité antioxydante en condition de stress léger avec une conversion partielle en CARN. La diminution de la température de nuit (250 µmoles de photon.m-2.s-1, 12h/12, 35°C/5°C) entraîne une perte de CA significative de 55%. Ce phénomène n’est pas accompagnée par une augmentation du niveau de CARN (2,5 µg.mg-1 du PS) mais par une légère accumulation de l’α-tocophérol comparée à la condition 250 µmoles de photon.m-2.s-1, 12h/12, 35°C/15°C. Comparativement à la condition contrôle, la modification de la photopériode (250 µmoles de photon.m-2.s-1, 9h/15 ou 15h/9, 25°C/15°C) n’impacte pas les concentrations en CA et CARN (~10% et ~0,2% respectivement) mais elle diminue fortement les concentrations en α- tocophérol (~0,01 µg.mg-1) et plastochromanol-8 (~0,003 µg.mg-1). Ces résultats indiquent que les meilleurs périodes de récolte sont de l’automne au printemps. Il serait donc plus intéressant pour Naturex d’avoir des champs de romarin en région tempérée, où les températures ne sont pas très élevées et la durée d’ensoleillement est limitée, plutôt qu’en région méditerranéenne. En outre, ces résultats suggèrent que ces trois paramètres ne sont pas pondérés de la même

- 86 - Résultats manière dans leur impact sur la concentration en CA. Il semble que les températures de jour et de nuit et l’intensité lumineuse ont un impact fort sur les quantités de ce diterpène alors que la photopériode a un effet plus faible.

La quantité de CA semble particulièrement affectée lorsque certains paramètres sont associés (Fig. 42A). En effet, la culture de romarin sous forte lumière et longue photopériode (1200 µmoles de photon.m-2.s-1, 15h/9, 25°C/15°C) entraîne une perte d’environ 30% de CA comparée à la condition contrôle. Cette perte est plus importante que dans les romarins cultivés sous forte lumière ou en photopériode longue impliquant un fort impact de l’association de ces deux paramètres. De plus, la combinaison forte lumière et température de jour élevée (1200 µmoles de photon.m-2.s-1, 12h/12, 35°C/15°C) conduit à une baisse de CA de l’ordre de 70% comparée à la condition contrôle (Fig. 42A) et une augmentation du CARN (x2 environ) (Fig. 42B) ce qui implique l’activité antioxydante du CA dans ces conditions de stress et sa conversion partielle en CARN. Cette perte est inexistante sous une forte lumière (1200 µmoles de photon.m-2.s-1, 12h, 25°C/15°C) et elle est seulement de 20% sous haute température de jour (250 µmoles de photon.m-2.s-1, 12h/12,la 35°C/15°C) ce qui suggère un fort effet de la combinaison de l’intensité lumineuse et de la température de jour sur les niveaux du diterpène phénolique majoritaire du romarin. Dans ces conditions, des accumulations légères d’α- tocophérol et importantes de plastochromanol-8 (x4 environ) sont observées, suggérant une activation de la voie de biosynthèse de ces prenyls lipides en conditions de stress (Fig. 43). Enfin, la culture de romarin sous des conditions drastiques de lumière et de température de jour et de nuit (1200 µmoles photons.m-2.s-1 et 35°C jour/5°C nuit) conduit à une forte diminution de CA d’environ 80% (Fig. 42A). Simultanément, la perte de CA est associée à une augmentation marquée des niveaux de CARN (x3 environ) par rapport à la condition contrôle (Fig. 42B), impliquant la consommation du CA pendant son activité antioxydante en condition de stress avec une conversion partielle en CARN. Une perte de CA est également observée en conditions de faible lumière et de température élevée (250 µmoles de photons.m-2.s-1, 35°C j/5°C n) mais il n’y a pas d’augmentation concomitante de la concentration en CARN. La combinaison intensité lumineuse et température de nuit ont un effet fort sur les quantités de CA. De fortes accumulations d’α-tocophérol (x3,5) et de plastochromanol-8 (x4) sont également observées (Fig. 43) après l’exposition du romarin à une forte intensité lumineuse et une température élevée, indiquant un comportement qui contraste avec celui du CA. Ce phénomène a été préalablement observé pour le CA et l’α-tocophérol dans la sauge et le romarin exposés à un stress hydrique (Munné-Bosch & Alegre, 2003).

- 87 - Résultats

A Acide carnosique

140

120

de PS) de 1 - 100 *

80 *** *** *** 60 *** 40 *** *** 20

Concentration(µg.mg 0 Intensité lumineuse 250 1200 250 1200 250 1200 250 1200 250 1200 500 850 Photopériode 12/12 12/12 9/15 9/15 15/9 15/9 12/12 12/12 12/12 12/12 12/12 12/12 Température jour/nuit 25/15 25/15 25/15 25/15 25/15 25/15 35/15 35/15 35/5 35/5 25/15 25/15

B Carnosol

8 *

7 du du PS)

1 - 6 5 4 *** 3 * *** 2 * *** ***

1 Concentration(µg.mg 0 Intensité lumineuse 250 1200 250 1200 250 1200 250 1200 250 1200 500 850 Photopériode 12/12 12/12 9/15 9/15 15/9 15/9 12/12 12/12 12/12 12/12 12/12 12/12 Température jour/nuit 25/15 25/15 25/15 25/15 25/15 25/15 35/15 35/15 35/5 35/5 25/15 25/15

Figure 42 : Les diterpènes phénoliques majoritaires dans les feuilles de deux variétés de romarin (Sudbury blue et Barbecue) cultivées dans douze conditions différentes résumées dans le tableau 6. A) CA, B) CARN. Les données représentent les valeurs moyennes de quatre expériences indépendantes ± SD.

- 88 - Résultats

A α-Tocophérol

0,4 *** 0,35

du du PS) 0,3

1 - 0,25 0,2 0,15 0,1 * 0,05 *** * *** *** *** ***

Concentration(µg.mg 0 Intensité lumineuse 250 1200 250 1200 250 1200 250 1200 250 1200 500 850 Photopériode 12/12 12/12 9/15 9/15 15/9 15/9 12/12 12/12 12/12 12/12 12/12 12/12 Température jour/nuit 25/15 25/15 25/15 25/15 25/15 25/15 35/15 35/15 35/5 35/5 25/15 25/15

B Plastochromanol-8

0,05 *** 0,045

du du PS) *** 1 - 0,04 0,035 0,03 0,025 0,02 0,015 0,01 *

Concentration(µg.mg *** *** 0,005 *** *** *** 0 Intensité lumineuse 250 1200 250 1200 250 1200 250 1200 250 1200 500 850 Photopériode 12/12 12/12 9/15 9/15 15/9 15/9 12/12 12/12 12/12 12/12 12/12 12/12 Température jour/nuit 25/15 25/15 25/15 25/15 25/15 25/15 35/15 35/15 35/5 35/5 25/15 25/15

Figure 43 : Les prenyls lipides dans les feuilles de deux variétés de romarin (Sudbury blue et Barbecue) cultivées dans douze conditions différentes résumées dans le tableau 6. A) α-tocophérol, B) Plastochromanol-8. Les données représentent les valeurs moyennes de quatre expériences indépendantes ± SD.

3. Facteurs d’impact sur les variations en CA L’analyse de la Fig. 42A met en avant les effets de l’intensité lumineuse, l’écart de température jour/nuit et de la photopériode sur les quantités de CA. L’hypothèse est que les températures de jour et de nuit ont un impact plus fort que les deux autres facteurs sur les variations en CA mais que l’intensité lumineuse influence plus les niveaux de ce diterpène que la modification de la photopériode (Fig. 41 & 42). Afin de déterminer l’impact de chaque paramètre sur les variations

- 89 - Résultats en CA, une modélisation statistique par ANOVA a été réalisée. L’analyse du tableau 7 indique que pour chacun des paramètres étudiés, la différence entre les groupes est significative. L’intensité lumineuse (F = 48.78, ddl = 36, P = 9.165e-13) et les températures de jour (F = 114.15, ddl = 36, P = 1.03e-12) et de nuit (F = 37.54, ddl = 36, P = 4.707e-07) influencent fortement la concentration en CA dans le romarin. La photopériode (F = 6.84, ddl = 36, P = 0.003) a un effet plus faible que les deux autres paramètres bien que son impact sur la quantité de CA soit significatif.

Tableau 7 : Analyse statistique ANOVA de l'impact des trois paramètres étudiés sur la concentration en CA dans la variété de romarin Sudbury blue. Signification de P : 0 < *** < 0.001 < ** < 0.01 < * < 0.05

Nombre Paramètres étudiés Groupes Moyenne F P d’échantillons 250 4 106,33 Intensité lumineuse 500 4 64,21 48.78 9.165e-13 *** (µmoles photon.m-2.s-1) 850 4 60,48 1200 4 109,40 12h/12h 4 106,33 Photopériode 9h/15h 4 102,00 6.84 0.003 ** 15h/9h 4 105,04 35/15 4 91,00 Température nuit (°C) 37.54 4.707e-07 *** 35/5 4 41,50 25/15 4 106,33 Température jour (°C) 114.15 1.030e-12 *** 35/15 4 91,00

La tableau 8 met en avant que la combinaison des paramètres ‘intensité lumineuse + température de jour’ (F = 34.21, ddl = 36, P = 1.107e-06) a une influence très significative sur la concentration en CA. Les différences entre les groupes des combinaisons de paramètres ‘intensité lumineuse + photopériode’ (F = 6.35, ddl = 36, P = 0.004) et ‘intensité lumineuse + température de nuit’ (F = 11.52, ddl = 36, P = 0.002) sont également significatives. Ces combinaisons de paramètres impactent la concentration en CA avec un effet moindre que ‘intensité lumineuse + température de jour’.

- 90 - Résultats

Tableau 8 : Analyse statistique ANOVA de l'impact de combinaisons des trois paramètres étudiés sur la concentration en CA dans la variété de romarin Sudbury blue. Codes de l’analyse statistique : 0 < *** < 0.001 < ** < 0.01 < * < 0.05

Nombre Moyennes Paramètres étudiés Groupe F P d'échantillons (µg.mg-1 PS)

250 12h/12 4 106,33 1200 12h/12 4 109,40 Intensité lumineuse 250 9h/15 4 101,99 (µmoles photon.m-2.s-1) + 6.35 0.004 ** photopériode 1200 9h/15 4 99,79 250 15h/9 4 105,04 1200 15h/9 4 77,94 250 35°C/15 4 90,99 Intensité lumineuse 1200 35°C/15 4 34,73 (µmoles photon.m-2.s-1) + 11.52 0.002 ** Température nuit (°C) 250 35°C/5 4 41,49 1200 35°C/5 4 22,39 250 25°C/15 4 106,33 Intensité lumineuse 1200 25°C/15 4 109,40 (µmoles photon.m-2.s-1) + 34.21 1.107e-06 *** Température jour (°C) 250 35°C/15 4 90,99 1200 35°C/15 4 34,73

Une échelle d’influence des paramètres et combinaisons de paramètres impactant significativement les quantités en CA, a été établie grâce à une analyse ANOVA par étape. Les résultats mettent en avant que l’ordre d’influence est le suivant : température de jour > intensité lumineuse > température nuit > ‘intensité lumineuse + température jour’ > ‘intensité lumineuse + température nuit’ > photopériode > ‘intensité lumineuse + photopériode’.

4. Niveau d’expression de deux gènes de biosynthèse dans deux conditions différentes La Fig. 43 indique une accumulation de l’α-tocophérol et du plastochromanol-8 après l’exposition du romarin à une forte intensité lumineuse et une température élevée, indiquant un comportement qui contraste avec celui du CA (Fig. 42). Ce phénomène a été préalablement observé pour le CA et l’α-tocophérol dans la sauge et le romarin exposés à un stress hydrique (Munné-Bosch & Alegre, 2003). Cette augmentation des niveaux de tocochromanols est due à l’activation des gènes de biosynthèse par un signal transmis par les ERO générées en conditions de stress oxydatif (Collakova & DellaPenna, 2003b, Tang et al, 2011, Chaudhary & Khurana, 2009). En réponse au stress oxydant, l’expression des gènes de biosynthèse des tocochromanols

- 91 - Résultats est activée ce qui génère une augmentation de la biosynthèse de ces molécules et ainsi leur accumulation. En revanche, les résultats de la Fig. 42 ne montrent aucune hausse du niveau de CA, suggérant une détermination génétique de la quantité de ce diterpène dont l’expression des gènes de biosynthèse ne serait pas activée par les facteurs abiotiques tels que l’intensité lumineuse, les variations de température ou la photopériode. Après une culture de romarin de la variété Sudbury blue pendant quatre semaines dans trois conditions différentes, le niveau d’expression des gènes CYP7 et CYP8, intervenant dans les dernières étapes de la voie de biosynthèse du CA (Scheler et al, 2016), a été vérifié par RT- qPCR. Les trois conditions de culture sont les suivantes : - Conditions optimales : 250 µmoles de photon.m-2.s-1, 12h, 25°C jour/18°C nuit - Conditions douces : 250 µmoles de photon.m-2.s-1, 9h/15h, 25°C jour/18°C nuit - Conditions drastiques : 1200 µmoles de photon.m-2.s-1, 35°C jour/5°C nuit La Fig.44 indique une augmentation du niveau d’expression des gènes de biosynthèse CYP7 et CYP8 (x8 environ), codant pour des cytochromes P450, chez le romarin cultivé en conditions optimales de croissance (250 µmoles de photon.m-2.s-1, 12h, 25°C jour/18°C nuit). Ce résultat indique une production accrue de CA et explique l’accumulation importante de ce diterpène (11% du PS) dans ces conditions. Le transfert des romarins en conditions de jours courts (250 µmoles de photon.m-2.s-1, 9h/15h, 25°C jour/18°C nuit), où la concentration en CA est identique à celle de la condition contrôle (11%), conduit à une diminution de moitié du niveau d’expression des gènes CYP7 et CYP8. La culture de la variété Sudbury blue en conditions drastiques de croissance (1200 µmoles de photon.m-2.s-1, 35°C jour/5°C nuit), où la quantité en CA diminue fortement (2% du PS) et celle en CARN est multipliée par trois, entraîne une baisse de moitié du niveau d’expression des gènes de biosynthèses du CA. Ces résultats suggèrent que la voie de biosynthèse du CA n’est pas amplifiée par les facteurs abiotiques tels que l’intensité lumineuse, la photopériode et les fluctuations de température, contrairement à la voie de biosynthèse des tocophérols (Collakova & DellaPenna, 2003b, Tang et al, 2011, Chaudhary & Khurana, 2009). Il semble que la voie du CA est inhibée dans ces deux conditions. Nos résultats indiquent que le CA n’est pas un antioxydant qui répond rapidement aux conditions de stress, par ajustement de sa voie de biosynthèse. Au contraire, le romarin semble constituer un pool très important de CA en conditions non stressantes de croissance. Ce pool est ensuite consommé dans des situations de stress oxydantes quand son activité antioxydante est mobilisée.

- 92 - Résultats

CYP7

1 0,8 0,6 0,4 250µE 9h 25°C/18°C 0,2 1200µE 12h 35°C/5°C 0

0 4 Niveau Niveau d'expression normalisé Durée d'expérience (semaine)

CYP8

1

0,8 normalisé 0,6 0,4 250µE 9h 25°C/18°C

d'expression 0,2 1200µE 12h 35°C/5°C 0

Niveau 0 4 Durée d'expérience (semaine)

Figure 44: Niveau d'expression des gènes de biosynthèse du CA analysé par RT-qPCR dans des romarins cultivés sous trois conditions différentes. A) CYP7, B) CYP8. Les valeurs représentent la moyenne de trois expériences indépendantes ±SD.

- 93 - Résultats

5. Discussion Cette étude confirme la localisation du CA et du CARN dans les tissus photosynthétiques, et plus particulièrement dans les tissus foliaires du romarin à des concentrations équivalentes à celles préalablement observées : ~80 mg.g-1 PS des feuilles de CA et ~1 mg.g-1 PS des feuilles de CARN (del Baño et al, 2003, Luis & Johnson, 2005). De plus, les résultats indiquent que ces diterpènes sont répartis entre les trichomes (~6 et 7 % pour CA et CARN respectivement) et les tissus internes des feuilles (~94 et 93% pour CA et CARN respectivement). Cette distribution n’est pas modifiée par la culture des romarins en condition de stress oxydant. Cette répartition entre les trichomes et les tissus internes des feuilles a déjà été observée chez la sauge et le romarin. Chez la sauge (Salvia officinalis), le CA se trouve majoritairement dans les trichomes alors que le CARN se situe dans les tissus internes des feuilles (Bozic et al, 2015). Une étude de Brückner et al (2014) indique qu’après élimination des trichomes, les tissus foliaires contiennent relativement plus de CARN (~40%) que de CA. La présence du dérivé d’oxydation majoritaire du CA dans les tissus internes suggère la consommation du CA pendant son activité antioxydante. De plus, les trichomes isolés contiennent principalement du CA avec une petite quantité de CARN. L’ensemble de ces constatations implique donc une contribution importante du CA localisé dans les trichomes. Pourtant, les données de spectroscopie de masse de Brückner et al (2014), en abondance relative, ne permettent pas de chiffrer la répartition du CA et du CARN entre les trichomes et la feuille entière. Cette étude a été réalisée sur des feuilles prélevées pendant la période végétative de romarins cultivés en pleine terre et sous serre. Nos analyses ont été faites sur des feuilles non fleuries de romarin cultivés en pot et en phytotron au mois de février, pendant la première floraison du romarin. Malgré la culture en conditions contrôlées, certaines plantes ont fleuri (non utilisées) suggérant que les plantes ont répondu à une ou des modifications de paramètre du phytotron. Ces modifications auraient pu générer un stress léger conduisant à la floraison de certaines plantes et nécessitant le recrutement du CA dans les tissus internes et dans les feuilles. Le transport du CA pendant la floraison du romarin a été préalablement observée par del Baño et al (2003). Bien qu’initialement présent dans les fleurs, le CA augmente dans ces organes alors qu’il diminue dans les feuilles suggérant un transport du CA. Ceci expliquerait également les résultats de répartition identique entre la condition contrôle et la condition de stress. Brückner et al (2014) et Scheler et al (2016) ont également montré que les gènes de biosynthèse du CA sont majoritairement exprimés dans les trichomes glandulaires. Ces résultats impliquent que ces structures pourraient être les principaux organes producteurs de CA. La production de terpènes par les trichomes glandulaires a également été observée chez les conifères et la menthe où ces structures

- 94 - Résultats synthétisent des monoterpènes, précurseurs des diterpènes (Fahn, 1979, Gershenzon et al, 1989). Une fois synthétisés dans les trichomes, les précurseurs du CA ou le CA lui-même, peuvent être transportés dans une cellule foliaire où ils peuvent être respectivement convertis en CA ou en dérivés. Par ailleurs, les études de localisation subcellulaire ont jusqu’ici révélé que le CA est localisé dans les plastides. Munné-Bosch & Alegre, 2001 ont détecté plus de CA (~6x) dans les chloroplastes de feuilles de romarin que dans la feuille entière, indiquant que le CA est concentré dans les chloroplastes. Il n’a pas été détecté dans le réticulum endoplasmique, l’appareil de golgi ou la membrane plasmique (Munné-Bosch & Alegre, 2001). Au vu de ses caractéristiques lipophiliques, il est probablement localisé dans les parties membranaires du chloroplaste.

Comme préalablement observé, cette étude montre que la concentration en CA dans le romarin est dépendante des facteurs environnementaux (Birtic et al, 2015 ; Tounekti & Munné-Bosch, 2012 ; Luis & Johnson, 2005 ; del Baño et al, 2003). De plus, nos résultats associés aux études statistiques ont mis en avant que l’intensité lumineuse et les variations de température sont les principaux paramètres d’influence sur les quantités en CA dans le romarin. En conditions stressantes de lumière et de fluctuation de température, la concentration en CA diminue et les quantités de CARN et d’α-tocophérol augmentent fortement dans le romarin. L’impact de la lumière et des températures de jour élevées a déjà été observé sur des romarins cultivés en champ en condition de sécheresse (Munné-Bosch et al, 1999, Munné-Bosch & Alegre, 2000 ; Luis & Johnson, 2005). L’interaction sécheresse, forte lumière et température de jour élevée pendant l’été méditerranéen conduit à l’accumulation des produits d’oxydation du CA tels que le rosmanol, l’isoromanol et le 11-12-di-O-methyl isorosmanol générés pendant son activité antioxydante (cf. résultats chapitre I). Une étude menée sur la sauge cultivée en champs en condition de stress hydrique indique que la quantité de CA est la plus faible et la concentration des produits d’oxydation (rosmanol et isorosmanol) la plus importante quand l’intensité lumineuse est la plus forte (à midi) suggérant un impact fort de la lumière sur le niveau du CA (Munné-Bosch et al, 2001). De plus, la culture de deux variétés de romarin, contrastées en quantité de CA, en condition de stress froid conduit à une augmentation de la concentration en CA et une diminution de la quantité de CARN. Ces données suggèrent que soit le froid active l’expression des gènes de biosynthèse du CA ce qui expliquerait l’augmentation du niveau en CA pendant l’automne et l’hiver (Munné-Bosch & Alegre, 2000 ; Luis & Johnson, 2005) ; soit dans ces conditions, la consommation du CA est faible, d’où une faible concentration en CARN. Nos résultats avancent l’hypothèse que les variations saisonnières de CA (Luis & Johnson,

- 95 - Résultats

2005) sont causées par les modifications de l’intensité lumineuse et des variations de températures jour/nuit qui ont lieu lors de l’évolution des saisons. Actuellement, la société Naturex récolte principalement le romarin manuellement dans les hauteurs du Mont Atlas au Maroc. Cette activité est soumise aux réglementations du Maroc notamment sur les périodes de récolte au printemps et en été où les intensités lumineuses sont élevées, les fluctuations de températures sont fortes et la sécheresse importante. Cette étude indique que les périodes de printemps et d’été ne sont pas propices à l’obtention d’un niveau élevé en CA dans les feuilles de romarin. De plus, la culture de plante dans une région espagnole (faible pluviométrie, fortes intensités lumineuses, fluctuations de températures jour/nuit importantes) (Munné-Bosch & Alegre, 2000) indique des concentrations en CA plus faibles que la culture dans une région anglaise (haute pluviométrie, intensités lumineuses faibles, peu de fluctuations de températures jour/nuit) (Luis & Johnson, 2005). Par conséquent, il serait intéressant pour Naturex de récolter les romarins du Mont Atlas à l’automne et en hiver ou de développer des champs de culture dans une région plus humide avec un ensoleillement faible et des écarts de température jour/nuit moins importants.

L’analyse par RT-qPCR des gènes de biosynthèse du CA, après quatre semaines de culture dans trois conditions différentes, montre qu’en condition contrôle, le niveau d’expression des gènes de biosynthèse du CA augmente au cours du temps alors qu’en conditions non stressantes ou de stress le niveau d’expression diminue. Pourtant, la quantité de CA ne baisse qu’en condition de stress indiquant que les variations de CA observées ne sont pas la conséquence d’une modification du niveau d’expression de ces gènes mais d’une consommation de ce diterpène pendant son activité antioxydante. De plus, les conditions appliquées n’indiquent pas d’augmentation de la concentration du CA par rapport à la condition contrôle impliquant que le niveau de ce diterpène est génétiquement déterminé. Dans le romarin, les facteurs environnementaux ne semblent pas induire les gènes de biosynthèse du CA contrairement aux gènes de biosynthèse de l’α-tocophérol. En effet, il est connu que les quantités d’α-tocophérol sont dépendantes des facteurs abiotiques comme l’intensité lumineuse (Collakova & DellaPenna, 2003b ; Porfirova et al, 2002 ; Szymanska & Kruk, 2010 ; Ksas et al, 2005), la sécheresse (Chaudhary & Khurana, 2009 ; Tang et al, 2011) et les changements de températures (Oh et al, 2003 ; Chaudhary & Khurana, 2009). Ces facteurs de stress abiotiques induisent la production d’ERO qui joueront alors le rôle de molécules signal pour l’induction des gènes de biosynthèse des tocochromanols. Ceci explique l’augmentation de l’α-tocophérol et du plastochromanol-8 dans nos expériences de culture de romarin en conditions de stress lumineux

- 96 - Résultats et de température comme préalablement observée pour le tocophérol (Munné-Bosch et al, 1999 ; Munné-Bosch & Alegre, 2000). Nos résultats suggèrent donc qu’à l’inverse des tocophérols, les facteurs de stress abiotiques tels que les fortes intensités lumineuses et les importantes fluctuations de températures, n’induisent pas les gènes de biosynthèse du CA. Pourtant, la culture de romarin en cellule contrôlée par l’équipe de Luis (2007) montre que la concentration de CA augmente et la quantité de CARN diminue en condition de température froide (12°C jour/6°C nuit). Ces observations pourraient suggérer que le froid induit les gènes de biosynthèse du CA mais aucune étude confirmant cette hypothèse n’a été réalisée. De plus, il a été montré que les niveaux de CA sont également dépendant du stade de développement foliaire (del Baño et al, 2003). Les feuilles jeunes apicales du romarin contiennent une grande quantité en CA qui diminue avec l’âge de la feuille. Ces observations sont à relier avec le niveau d’expression des gènes de biosynthèse qui est plus élevé dans les jeunes feuilles que dans les feuilles âgées (Scheler et al, 2016 ; Brückner et al, 2014). Ce phénomène est également observé dans la sauge qui contient plus de CA dans ses jeunes feuilles que dans ses feuilles âgées du fait d’une expression des gènes de biosynthèse plus intense (Brückner et al, 2014 ; Scheler et al, 2016). Il a également été montré que, dans la sauge, les niveaux de CA et de CARN augmentaient fortement (18% et 290% respectivement) avec la senescence. Ces données renforcent l’hypothèse que les facteurs abiotiques ne modifient pas le niveau d’expression des gènes de biosynthèse du CA. En résumé, les nouvelles feuilles de romarin constituent un pool important de CA ou de ses précurseurs dans les trichomes. Ce pool, une partie de celui-ci ou les précurseurs de CA seraient alors transportés dans les tissus internes des feuilles, par un mécanisme qui reste à déterminer. Le CA serait consommé tout au long de la vie de la feuille et en particulier lors des périodes estivales où le CA agit comme antioxydant face aux stress abiotiques.

- 97 - Résultats

- 98 - Résultats

III. Application industrielle. Protection de matrices alimentaires par deux cocktails d’extraits de végétaux enrichis en CA du romarin

La société Naturex produit et vend des cocktails d’extraits de végétaux pour leurs propriétés antioxydantes. Les produits phares de la société Naturex sont les extraits de romarin qui sont vendus essentiellement sur le marché agroalimentaire. Afin de tester l’efficacité de deux de ces cocktails enrichis en extraits de romarin dont la composition exacte est tenue au secret industriel (OA : extrait d’acérola et de romarin et OSR : extrait de grenade et de romarin), une cinétique d’oxydation à la lumière et au froid (700 µmoles photon.m-2.s-1, 7°C) a été réalisée sur de la viande (chair à saucisse) non traitée (contrôle d’oxydation) et traitée avec un stabilisateur classique (nitrites, noté SC), de l’OA ou de l’OSR. Après traitement, une image de luminescence est prise avec une caméra CCD refroidie. Comme expliqué dans les chapitres précédents, l’émission spontanée de photons par des molécules biologiques provient d’espèces luminescentes produites par la décomposition des peroxydes lipidiques (Cifra & Pospisil, 2014, Birtic et al, 2011).

La figure 45 montre un signal maximal de luminescence pour les échantillons non traités après 30 min d’exposition à la lumière indiquant leur oxydation. L’ajout des différents stabilisateurs conduit à une diminution du signal de luminescence de 50%, 45% et 35% pour le SC, l’OA et l’OSR respectivement, indiquant une baisse de l’oxydation et un plus faible niveau de peroxydes lipidiques. Ces données montrent donc que l’OA protège la viande de l’oxydation avec autant d’efficacité que le SC alors que l’OSR est légèrement moins efficace. Après ce temps d’exposition, le signal des contrôles diminue suggérant qu’il faut un maximum de 30 min pour oxyder la totalité des lipides de l’échantillon. Pourtant, les différents stabilisateurs continuent de protéger la viande. Après 1 h d’oxydation, la perte du signal est de l’ordre de 30% pour les trois traitements indiquant une protection équivalente. Après 2 h d’exposition à la lumière, l’OSR a le même signal de luminescence que le contrôle d’oxydation indiquant que l’effet protecteur est limité dans le temps. L’OA et le stabilisateur classique diminue le signal de 30% et bien que la luminescence soit très faible après une nuit d’oxydation, les mêmes résultats sont observés pour ce long traitement. Ces données indiquent que l’OA protège lla viande de l’oxydation aussi efficacement que le traitement habituel alors que l’OSR est moins efficace.

- 101 - Résultats

A B OSR C Durée 150 d’exposition + à la lumière 100 0 min 50

- Luminescence (rel.) 0 OA SC Control OSR OA Classical 150 stabiliser OSR C + 100 30 min 50

- Luminescence (rel.) 0 OA SC Control OSR OA Classical 150 stabiliser OSR C + 100

1h 50

- Luminescence (rel.) 0 OA SC Control OSR OA Classical 150 stabiliser OSR C + 100

2h 50

Luminescence (rel.) 0 - Control OSR OA Classical OA SC stabiliser 150 OSR C + 100

Overnight 50 Luminescence Luminescence (rel.) 0 - Control OSR OA Classical OA SC stabiliser Figure 45 : Effets de deux cocktails enrichis en extraits de romarin sur une cinétique d’oxydation de la viande. L’oxydation est générée par illumination (700 µmoles photons.m-2.s-1) à froid (7°C) des échantillons. A) Images de l’oxydation des échantillons traités ou non. La palette de couleur indique l’intensité du signal du noir (0) au blanc (valeur la plus haute). B) Quantification des signaux de luminescence par le logiciel ImageJ. C : contrôle ; SC : stabilisateur classique (nitrites); OA et OSR : cocktails enrichis en extrait de romarin dont la composition exacte est tenue au secret industriel.

- 102 - Résultats

La même expérience a été réalisée sur une cinétique courte de 10, 20 et 30 min afin de tester l’efficacité des traitements dans la fenêtre d’oxydation. La figure 46 indique une oxydation maximale après 20 min d’exposition à la lumière. A ce temps d’oxydation, la perte du signal est de 30% pour les cocktails et de 40% pour le SC indiquant une meilleure protection des échantillons de viande par le SC contre une oxydation à la lumière de faible durée. A T10 min, l’OSR est le traitement qui protège le mieux, suivi de SC. A T30 min, le SC est le traitement le plus efficace, suivi de l’OA puis de l’OSR. L’OSR semble donc protéger la viande au début de l’exposition mais sa protection est courte tandis que l’OA semble protéger les saucisses aussi efficacement que le traitement classique (SC). Ces résultats mettent en avant que les cocktails d’extraits de végétaux peuvent remplacer les traitements classiques. Les figures 45 et 46 montrent aussi l’utilité de notre technique d’imagerie de luminescence de haute sensibilité pour tester l’efficacité d’extraits végétaux sur des matrices lipidiques alimentaires.

- 103 - Résultats

A OSR C B Durée d’exposition + 150 à la lumière 100 0 min

50 -

OA SC Luminescence (rel.) 0 control OSR OA Classical OSR C stabiliser 150 + 100 10 min 50

- Luminescence (rel.) SC 0 OA Control OSR OA Classical stabiliser

OSR C 150 + 100

20 min 50

Luminescence (rel.) - 0 OA SC control OSR OA Classical stabiliser 150 OSR C + 100

30 min 50

- Luminescence (rel.) 0 Control OSR OA Classical OA SC stabiliser

Figure 46 : Effets de deux cocktails enrichis en extraits de romarin sur une cinétique courte d’oxydation d’échantillons de viande. L’oxydation est générée par illumination (700 µmoles photons.m-2.s-1) à froid

(7°C) des saucisses. A) Images de luminescence. La palette de couleur indique l’intensité du signal du noir (0) au blanc (valeur la plus haute). B) Quantification des signaux de luminescence par le logiciel ImageJ. C : contrôle ; SC : stabilisateur classique ; OA et OSR : cocktails enrichis en extrait de romarin.

- 104 - Résultats

Afin de déterminer si l’oxydation observée est bien causée par la lumière, les échantillons traités ou non avec des extraits ont été placées à l’obscurité et à froid pendant 20 min. La figure 47 montre un signal de luminescence plus faible qu’à la lumière, indiquant que l’oxydation de la viande n’est pas spécifique à la lumière mais elle est amplifiée par celle-ci. De plus, OA et OSR protègent la viande à l’obscurité. Ces résultats suggèrent que la viande subit deux types • d’oxydation, une autooxydation par des ERO comme H2O2 et HO produit par l’intervention 2+ d’une SOD et par la réaction entre le Fe présent dans la myoglobine de la viande et l’H2O2 (réaction de Fenton), respectivement (Fig. 48) et une photooxydation par des ERO générées par 1 la lumière telle que O2.

20 min, 7°C à la lumière de -2 -1 20 min, 7° C à l’obscurité 700 µmoles photon.m .s

OSR C OSR C

+

-

OA CS OA CS Figure 47 : Image de luminescence d’échantillons de viande traités ou non après 20 min à froid (7°C) : A) à l’obscurité, B) à 700 µmoles photon.m-2.s-1

- 105 - Résultats

2+ ++ Fe MbO 3+ Fe 2 Fe +O2 +Mb

•‾ O 2

• H O OH 2 2

•‾ 2+ 3+ O Fe Fe 2

Figure 48 : Représentation schématique de la production d’ERO responsable de l’autooxydation des lipides présents dans la viande. Mb : Myoglobine (Figure extraite et simplifiée de Bauchart et Picard, 2010)

Sous une forte intensité lumineuse, des molécules dites photosensibles peuvent être excitées et 3 transférer leur excitation sur l’oxygène moléculaire ( O2) générant ainsi de l’oxygène singulet 1 ( O2) (Fig 49).

1 Figure 49 : Schéma du mécanisme de production de l' O2 par un photosensibilisateur, le bleu de méthylène.

- 106 - Résultats

Les échantillons de viande contiennent une grande quantité de myoglobine (MyoG). Ces molécules possèdent un hème composé d’un cycle porphyrinique qui pourraient les rendre photosensible de par la présence de nombreuses conjugaisons (Fig. 50).

Figure 50 : Groupe hème de la myoglobine, en rouge le cycle porphyrinique

Afin de déterminer la photosensibilité de la myoglobine et son rôle dans l’oxydation de la viande, l’acide linolénique (LA, C18 :3) a été illuminé en présence ou non de bleu de méthylène 1 (un photosensibilisateur connu générateur d’ O2) ou de myoglobine. Puis les échantillons ont été placés sous la caméra CCD. La figure 50A montre une luminescence importante du LA en présence de myoglobine comparable à l’échantillon avec le bleu de méthylène. De plus, la myoglobine seule exposée à la lumière n’émet pas de luminescence, indiquant que la luminescence observée provient uniquement de l’oxydation du LA. Ces résultats suggèrent que la MyoG, présente dans la viande, génère de l’oxygène singulet en présence de lumière, oxydant ainsi les lipides. L’ajout d’extrait de romarin, d’acérola ou de grenade conduit à une perte du signal de luminescence indiquant que ces extraits végétaux protègent les lipides de l’oxydation générée par la MyoG (Fig 51B).

- 107 - Résultats

A LA LA+MB MyoG LA+MyoG +

-

B LA+MyoG PE AE (punicalagins, RE (CA) (ascorbic acid) ellagic acid) +

-

Figure 51 : Effet des extraits de romarin, d‘acérola et de grenade sur des oxydations in vitro d’acide 1 1 linolénique par une ERO, suspectée être de l’ O2. L’ O2 serait généré lors de l’illumination de la MyoG

à froid pendant 20 min (700 µmoles photons.m-2.s-1, 7°C). Image de luminescence A) du LA oxydé par ERO générée par MB ou de la MyoG et B) du LA oxydé par ERO générée par MyoG en présence ou en absence d’extraits de végétaux. RE : extrait de romarin ; AE : extrait d’acérola ; PE : extrait de grenade.

1 L’hypothèse selon laquelle la MyoG est un agent photosensible capable de produire de l’ O2 1 pourrait être vérifiée par dosage de l’ O2 à l’aide de la sonde de fluorescence Singlet Oxygen Sensor Green (SOSG). Ce même dosage, réalisé sur des échantillons de MyoG en présence ou absence d’extraits végétaux, permettrait de savoir si ces derniers agissent sur la production d’ERO ou sur la réaction en chaîne de la peroxydation lipidique. Dans le cas des extraits de romarin, dont la principale molécule active est le CA, l’extrait va agir comme piégeur d’ERO. A ce jour, aucune étude n’a mis en avant la photosensibilité de la MyoG. En revanche, il est connu que la protoporphyrine IX, produit de dégradation de la MyoG est une molécule 1 photosensible génératrice d’ O2 (Galbis-Martinez et al, 2012 ; Glaeser et al, 2011). Un dosage de cette molécule dans les cinétiques d’oxydation permettrait de répondre à cette question.

L’oxydation de la viande a lieu à la lumière (photooxydation) comme à l’obscurité (autooxydation). Afin de déterminer si les extraits de végétaux protègent contre l’autooxydation et /ou la photooxydation, il serait intéressant de faire une quantification des isomères d’hydroperoxydes de l’acide linolénique 9-, 10-, 12, -13, 15-, et 16-HOTE après oxydation du LA par l’oxygène singulet (généré par illumination de la protoporphyrine IX) ou par les

- 108 - Résultats

2+ radicaux hydroxyles (généré par la réaction de Fenton H2O2+Fe ), en présence ou non 1 d’extraits de végétaux. La protection des extraits contre une oxydation O2 (photooxydation) conduirait à la baisse des niveaux du 10- et du 15-HOTE, spécifiques de cette ERO et la protection contre l’autooxydation indiquerait une perte des autres HOTE (Triantaphylidès et al, 2008 ; Fig. 52).

1 Figure 52 : Peroxydation de l’acide linolénique (18 :3), 10- et 15-HOTE sont spécifiques de O2. Figures extraites de Triantaphylidès et al 2008.

- 109 - Résultats

- 110 - Conclusions générales et perspectives

IV. Conclusions générales et perspectives

Le pourtour méditerranéen, dont le romarin (Rosmarinus officinalis L.) est originaire, est une région exposée à de fréquentes sécheresses, une forte luminosité et d’importants écarts de température jour/nuit (Fig. 20 cf. Chapitre 1 : Introduction). Lorsque toutes ces conditions sont réunies en été, elles peuvent créer un déséquilibre dans la plante entre ses mécanismes de défense et la quantité d’ERO générée, conduisant à un stress oxydant. Le romarin est un arbuste méditerranéen, très bien adapté à ces conditions de climat sec et chaud avec une forte intensité lumineuse l’été, de par sa morphologie et sa composition biochimique en antioxydants (chapitre I.6.3), et plus particulièrement en CA, le diterpène majoritaire de cette plante (~5% du PS). Ce diterpène phénolique est composé d’une structure abiétane couplée à un groupe catéchol (Fig. 21 cf. Chapitre 1 : Introduction) lui conférant une capacité de piégeage des ERO (Richheimer et al, 1996, Aruoma et al, 1996). L’activité antioxydante du CA est déjà largement utilisée dans des applications industrielles (Hopia et al, 1996 ; Frankel et al, 1996 ; Erkan et al, 2009 ; Huang et al, 1996, Zhang et al, 2010).

Cette étude confirme que le CA est une molécule avec une forte activité antioxydante. Le CA protège les lipides contre des oxydations in vitro (lipides en solution) et in vivo (biomembranes). Il a une forte réactivité vis-à-vis des ERO permettant ainsi leur élimination. Au cours de ce 1 processus, le piégeage de l’ O2 et des radicaux libres conduit à l’accumulation de molécules oxydés, communes entre les deux types d’oxydation. Ces dérivés d’oxydation sont retrouvés dans les feuilles de romarin aussi bien en condition contrôle qu’en conditions de stress suggérant que le CA joue un rôle de protection constitutif quelle que soit la quantité d’ERO produites. Le dérivé d’oxydation majoritaire du CA, le CARN, a également été caractérisé comme étant un protecteur de lipides aussi efficace que le CA, ce qui est en accord avec des études précédentes indiquant un effet de protection du CARN contre la peroxydation lipidique dans des microsomes et liposomes (Aruoma et al, 1992). De plus, il a été montré que d’autres dérivés du CA ont des capacités antioxydantes comme le rosmanol, l’epirosmanol, le methyl carnosate et le 20-déoxocarnosol (Zeng et al, 2011 ; Huang et al, 1996 ; Haraguchi et al, 1995 ; Escuder et al, 2002), certaines avec une efficacité plus importante que l’α-tocophérol (Nakatani & Inatani, 1984). Ainsi le piégeage des ERO par le CA conduit à l’accumulation d’antioxydants secondaires qui amplifieront la réponse antioxydante rendant le mécanisme de défense très 1 • efficace. Cependant, contrairement au CA, le CARN ne diminue pas la quantité d’ O2 et d’HO indiquant qu’il est plus résistant à l’oxydation alors qu’il protège les lipides aussi efficacement que le CA. L’activité antioxydante du CARN présente donc un mécanisme différent où cette

- 111 - Conclusions générales et perspectives molécule n’agit pas directement sur les ERO mais plutôt sur le processus de peroxydation lipidique. Cette idée est confortée par l’action inhibitrice du CARN sur des oxydations de lipides à l’obscurité induites in vitro par un hydroperoxyde lipidique ou in vivo par l’action d’une lipoxygenase, deux conditions non productrices d’ERO). Le CARN peut donc agir en interférant avec le processus de peroxydation lipidique jouant ainsi le rôle de blocage de l’oxydation des lipides comme les tocophérols (Tavadyan et al, 2007). Le phénomène d’inhibition de la réaction en chaîne de la peroxydation lipidique n’est pas observé avec le CA. De plus, le CARN est plus efficace que le CA dans des modèles membranaires (Perez-Fons et al, 2010&2006) car il améliorerait l’organisation des lipides dans la partie hydrophobique de la membrane, ce qui contribuerait à la stabilisation membranaire et à limiter la propagation des radicaux. Le fait que le mode d’action du CA et de son dérivé majeur d’oxydation soit différent élargit le spectre d’action des diterpènes du romarin dans la défense des plantes contre un stress oxydant. Les structures du CA et de ses dérivés sont très proches, pourtant elles conduisent à des mécanismes d’action différents. Il serait intéressant de comprendre plus finement la base de cette différence, par exemple en oxydant le CA in vitro par l’oxygène singulet à partir de 18O et de bleu de méthylène exposé à la lumière. Une analyse par RMN permettrait de 18 1 déterminer le site de fixation de l’ ( O2) sur le CA qui ne sera plus disponible dans le CARN, bloquant ainsi le piégeage des ERO par ce diterpène sans enlever sa capacité d’interaction avec les lipides oxydés. La détermination des modes d’action des autres dérivés d’oxydation serait un plus dans la compréhension du mécanisme de protection particulier du CA. D’autre part, certains standards sont actuellement disponibles et peuvent être utilisés dans les mêmes types expériences que le CA et le CARN dans cette étude. Enfin, une étude a conduit à penser que le CA agirait en synergie avec l’α-tocophérol par recyclage du radicaux tocophéryl en α- tocophérol (Hopia et al, 1996). Un dosage d’α-tocophérol sur un échantillon de MGDG oxydé en présence de cette molécule, dans lequel du CA est ajouté ou non après oxydation de MGDG permettrait d’éclaircir ce point. Une autre étude avance que le CA agit comme première barrière de défense suivie par les antioxydants ubiquitaires (Munné-Bosch & Alegre, 2003). Un dosage du CA et de l’α-tocophérol sur une cinétique d’oxydation du MGDG permettrait de déterminer si le CA intervient en premier dans la protection des lipides.

La plupart des espèces contenant du CA et du CARN sont des plantes méditerranéennes qui peuvent s’adapter à des conditions climatiques drastiques, et par conséquent, doivent se protéger du stress oxydant. Les propriétés antioxydantes in vitro du CA ont conduit à de nombreuses applications en agroalimentaire et en médicine (Birtic et al, 2015) mais l’évidence

- 112 - Conclusions générales et perspectives d’un rôle antioxydant in planta n’a pas été démontré. Les travaux pionniers de Munné-Bosch et de son équipe ont montré l’interdépendance entre la quantité de CA et celles d’autres molécules antioxydantes de bas poids moléculaire dans les feuilles de romarin (Munné-Bosch & Alegre, 2003) ainsi que la présence d’abiétanes diterpènes oxydés dans des plantes de romarin cultivées en champs pendant l’été (Munné-Bosch et al, 1999). Nous avons montré que le CA et le CARN protègent les membranes de chloroplastes contre une oxydation induite par une forte lumière. Lors de fortes intensités lumineuses, de sécheresse et de hautes températures, les biomembranes sont des cibles d’oxydation (Schwab & Heber, 1984 ; Conde et al, 2011), par conséquent l’accumulation de ces antioxydants est bénéfique dans les conditions climatiques méditerranéennes. En conditions contrôles dans un phytotron, la concentration foliaire en CA est 40% plus faible dans la variété Barbecue que la variété Sudbury blue. En condition de stress, la quantité de CARN est également plus faible dans la variété Barbecue que Sudbury blue. De manière intéressante, il y a corrélation entre les faibles concentrations en CA et CARN et une plus faible résistance au stress photooxydant. Ces résultats sont en accord avec le rôle de ces diterpènes dans la résistance du romarin au stress photooxydant. De plus, la fonction du CA en tant que piégeur chimique des ERO, la présence de dérivés oxydés du CA dépendant de la lumière et de leur accumulation marquée dans des plantes exposées à des conditions de stress indiquent que l’action antioxydante de piégeage des ERO a lieu in vivo. Une étude d’autres variétés contrastées cultivées en conditions de stress permettrait de confirmer la protection des lipides par le CA in vivo et son rôle d’antioxydant. Une étude similaire sur des espèces non productrices de CA complémentées avec les gènes de la voie de biosynthèse de ce diterpène confirmerait également le rôle du CA.

Cette étude confirme la répartition du CA et du CARN entre les trichomes et les tissus internes des feuilles avec une accumulation dans les tissus internes principalement. Cette distribution a déjà été observée chez la sauge et le romarin mais dans ces études, le CA est essentiellement dans les trichomes et le CARN se situe dans les tissus internes (Bozic et al, 2015, Brückner et al, 2014). La présence du CARN dans les tissus internes des feuilles suggère la consommation du CA pendant son activité antioxydante. De plus, il a été montré que les gènes de biosynthèse du CA sont essentiellement exprimés dans les trichomes (Brückner et al, 2014 ; Scheler et al, 2016). Ces résultats suggèrent d’une part que les trichomes contribuent fortement à la synthèse et à l’alimentation en CA dans les feuilles du romarin. D’autre part, ces données conduisent à l’idée d’un système de transport du CA ou de ses précurseurs entre les trichomes et les tissus internes (Fig. 53). Un transport du CA a déjà été suggéré par del Baño et son équipe (2003)

- 113 - Conclusions générales et perspectives pendant la floraison où un recrutement du CA dans les fleurs est observé. Il a également été montré que la CA se situe en grande quantité dans les chloroplastes par rapport à la feuille entière (Munné-Bosch & Alegre, 2001) indiquant que cette organelle est le lieu d’attribution du CA où il jouera son rôle antioxydant. Afin de déterminer la dynamique de transport du CA entre les trichomes et les tissus internes, il serait intéressant de faire un suivi de la répartition du CA sur des romarins soumis aux variations saisonnières, en utilisant par exemple chambre de culture capable de générer des conditions microclimatiques réalistes comme la technologie ImaPlant de la plateforme GRAP.

Notre étude met également en avant que la concentration en CA dans le romarin est dépendante des facteurs abiotiques. Ces résultats ont déjà été observés sans pondération des facteurs d’impact sur les niveaux en CA (Birtic et al, 2015 ; Tounekti & Munné-Bosch, 2012 ; Luis & Johnson, 2005 ; del Baño et al, 2003). L’intensité lumineuse et les fluctuations de température sont les principaux facteurs d’influence sur la concentration en CA. Pourtant, aucune des conditions testées ne conduit à l’accumulation de CA comparée à la condition contrôle suggérant que la quantité de ce diterpène est génétiquement déterminée et est maximale en absence de stress. L’analyse de l’expression des gènes de biosynthèse dans différentes conditions indique qu’il n’y a pas d’effet inducteur des facteurs abiotiques sur l’expression des gènes de biosynthèse du CA. Ces résultats montrent qu’à l’inverse des tocophérols, la quantité de CA n’est pas dépendante d’une modification de l’expression des gènes de biosynthèse par l’intensité lumineuse, les fluctuations de température importante ou la photopériode. En effet, il est connu qu’en conditions de stress lumineux (Collakova & DellaPenna, 2003b ; Porfivora et al, 2002 ; Szymanska & Kruk, 2010 ; Ksas et al, 2005), de stress hydrique (Chaudhary & Khurana, 2009 ; Tang et al, 2011) et/ou de stress thermique (Oh et al, 2003 ; Chaudhary & Khurana, 2009), la voie de biosynthèse des tocophérols est activée afin de constituer un pool important de cet antioxydant. Une fois le stress passé, ce pool de tocophérol redescend à un niveau basal alors que le pool de CA est constitué pendant le développement foliaire jusqu’à maturité de la feuille. Ce pool est ensuite consommé pendant toute la durée de vie de la feuille, et particulièrement pendant les périodes drastiques de l’été où il agit comme protecteur des membranes contre le stress oxydant. D’ailleurs, le romarin reprend sa croissance et génère de nouvelle feuille entre septembre et octobre lors du retour de conditions plus douces et non stressantes. Il serait intéressant d’approfondir la recherche de facteur abiotique régulant les quantités de CA en réalisant une étude plus exhaustive.

- 114 - Conclusions générales et perspectives

Cette étude a permis de confirmer la protection des lipides d’une matrice alimentaire complexe (la saucisse) par plusieurs extraits de romarin et a montré l’intérêt de l’imagerie d’autoluminescence pour étudier ces effets. Les données montrent que la protection antioxydante par le CA est aussi efficace que le traitement classique actuel qui consiste en l’application de nitrite dans la viande. Les résultats indiquent également que l’oxydation des saucisses à la lumière est due à la présence de MyoG en grandes quantités dans la viande. La MyoG ou un de ses produits d’oxydation, la protoporphyrine IX exposée à une forte lumière 1 pourraient générer de l’ O2 par transfert de l’énergie d’excitation sur l’oxygène moléculaire. Les extraits testés protègent l’acide linolénique d’une oxydation par la lumière en présence de 1 MyoG. La production d’ O2 par la MyoG illuminée pourrait être vérifiée par un dosage de cette 1 ERO en utilisant la sonde de fluorescence SOSG. La production d’ O2 par la protoporphyrine IX est connue (Galbis-Martinez et al, 2012 ; Glaeser et al, 2011), il serait alors intéressant de réaliser un dosage de cette molécule dans des échantillons de MyoG exposés à la lumière. Un 1 dosage des hydroperoxydes de l’acide linolénique spécifiques de l’ O2 (10- et 15-HOTE) dans des échantillons composés d’acide linolénique, de MyoG en présence ou non d’extrait de végétaux permettrait de clarifier le type d’oxydation sur lequel agissent ces extraits.

Les figures 53 et 54 résument les principales conclusions de ce travail. Le CA est biosynthétisé dans les trichomes. Certaines conditions, qui restent à déterminer (âge des feuilles, conditions de stress) conduisent au recrutement de ce diterpène dans les cellules des tissus internes où il peut être consommé lors d’un stress oxydant (Fig. 52). En condition de stress oxydant, il y a production d’ERO en grandes quantités. Dans ces conditions, le CA du romarin protège les membranes biologiques par piégeage des ERO ce qui produit une série de dérivés d’oxydation, dont le CARN. Ces produits d’oxydation sont également des protecteurs des membranes biologiques en intervenant au niveau de la réaction en chaîne de la peroxydation lipidique. Contrairement au tocophérol, la culture de romarin en condition de stress oxydant conduit à une consommation du CA sans compensation par stimulation de la voie de biosynthèse (Fig. 53). Le romarin a ainsi développé un système antioxydant original qui participe probablement à sa bonne adaptation aux conditions parfois extrêmes du climat méditerranéen.

- 115 - Conclusions générales et perspectives

TRANSPORT

CA ERO

CARN et autres

dérivés d’oxydation

Figure 53 : Représentation schématique de la localisation du CA et du CARN dans les feuilles de romarin.

- 116 - Conclusions générales et perspectives

TOC CA

STIMULATION ERO DE LA VOIE DE

STRESS OXYDANT BIOSYNTHESE

PIÉGEAGE

Dérivés d’oxydation CARN CA TOC

PROTECTION CONTRE LA PEROXYDATION LIPIDIQUE

Figure 54 : Représentation schématique des mécanismes d’action du CA et de ses dérivés d’oxydation en comparaison de l’action du tocophérol.

- 117 - Conclusions générales et perspectives

- 118 -

- 119 -

- 120 -

Références bibliographiques

V. Références bibliographiques

Abreu, M.E., and Munné-Bosch, S. (2008). Salicylic acid may be involved in the regulation of drought-induced leaf senescence in perennials: A case study in field-grown Salvia officinalis L. plants. Environmental and Experimental Botany 64, 105–112.

Abreu, M.E., Müller, M., Alegre, L., and Munné-Bosch, S. (2008). Phenolic diterpene and α-tocopherol contents in leaf extracts of 60 Salvia species. Journal of the Science of Food and Agriculture 88, 2648–2653.

Achour, S., Khelifi, E., Attia, Y., Ferjani, E., and Noureddine Hellal, A. (2012). Concentration of antioxidant polyphenols from Thymus capitatus extracts by membrane process technology. Journal of Food Science 77.

Agati, G., Matteini, P., Goti, A., and Tattini, M. (2007). Chloroplast-located flavonoids can scavenge singlet oxygen. New Phytologist 174, 77–89.

Amesz, J., Pulles, M.P.J., and Velthuys, B.R. (1973). Light-induced changes of fluorescence and absorbance in spinach chloroplasts at −40 °C. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics 325, 472–482.

Andreyev, A.Y., Kushnareva, Y.E., and Starkov, A.A. (2005). Mitochondrial metabolism of reactive oxygen species. Biochemistry (Moscow) 70, 200–214.

Anielska-Mazur, A., Bernaś, T., and Gabryś, H. (2009). In vivo reorganization of the actin cytoskeleton in leaves of Nicotiana tabacum L. transformed with plastin-GFP. Correlation with light-activated chloroplast responses. BMC Plant Biology 9, 64.

Aoyagi, Y., Takahashi, Y., Satake, Y., Takeya, K., Aiyama, R., Matsuzaki, T., Hashimoto, S., and Kurihara, T. (2006). Cytotoxicity of abietane diterpenoids from Perovskia abrotanoides and of their semisynthetic analogues. Bioorganic & Medicinal Chemistry 14, 5285–5291.

- 121 - Références bibliographiques

Apel, K., and Hirt, H. (2004). REACTIVE OXYGEN SPECIES: Metabolism, Oxidative Stress, and Signal Transduction. Annual Review of Plant Biology 55, 373–399.

Arnér, E.S.J., and Holmgren, A. (2000). Physiological functions of thioredoxin and thioredoxin reductase: Thioredoxin and thioredoxin reductase. European Journal of Biochemistry 267, 6102–6109.

Aruoma, O.I., Halliwell, B., Aeschbach, R., and Löligers, J. (1992). Antioxidant and pro-oxidant properties of active rosemary constituents: carnosol and carnosic acid. Xenobiotica 22, 257–268.

Asada, K. (1992). Ascorbate peroxidase - a hydrogen peroxide-scavenging enzyme in plants. Physiologia Plantarum 85, 235–241.

Asada, K. (2000). The water-water cycle as alternative photon and electron sinks. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences 355, 1419–1431.

Asada, K. (2006). Production and Scavenging of Reactive Oxygen Species in Chloroplasts and Their Functions. PLANT PHYSIOLOGY 141, 391–396.

Ashraf, M., Athar, H.R., Harris, P.J.C., and Kwon, T.R. (2008). Some Prospective Strategies for Improving Crop Salt Tolerance. In Advances in Agronomy, (Elsevier), pp. 45–110.

Azad, N., Rasoolijazi, H., Joghataie, M.T., and Soleimani, S. (2011). Neuroprotective Effects of Carnosic Acid in an Experimental Model of Alzheimer’s Disease in Rats. Cell Journal (Yakhteh) 13, 39–44.

Bagnoli, F., Danti, S., Balla, I., and Racchi, M.L. (2001). Differential activity of catalase and superoxide dismutase in seedlings and in vitro micropropagated oak (Quercus robur L.). Plant Cell Reports 20, 169–174. del Baño, M.J., Lorente, J., Castillo, J., Benavente-García, O., del Río, J.A., Ortuño, A., Quirin, K.-W., and Gerard, D. (2003). Phenolic Diterpenes, Flavones, and Rosmarinic Acid Distribution during the Development of Leaves, Flowers, Stems, and Roots of Rosmarinus officinalis. Antioxidant Activity. Journal of Agricultural and Food Chemistry 51, 4247–4253.

- 122 - Références bibliographiques

Baroli, I., Gutman, B.L., Ledford, H.K., Shin, J.W., Chin, B.L., Havaux, M., and Niyogi, K.K. (2004). Photo-oxidative Stress in a Xanthophyll-deficient Mutant of Chlamydomonas. Journal of Biological Chemistry 279, 6337–6344.

Bauchart, D., Picard, B. (2010). Muscle et viande de ruminant. Synthèses (INRA). Editions Quae

Bauer, J., Kuehnl, S., Rollinger, J.M., Scherer, O., Northoff, H., Stuppner, H., Werz, O., and Koeberle, A. (2012). Carnosol and Carnosic Acids from Salvia officinalis Inhibit Microsomal Prostaglandin E2 Synthase-1. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 342, 169–176.

Bawn, C. (1956). Anti-Oxidation. Nature 178, 775–777.

Beauchamp, C., and Fridovich, I. (1970). A mechanism for the production of ethylene from methional. The generation of the hydroxyl radical by xanthine oxidase. J. Biol. Chem. 245, 4641–4646.

Bienert, G.P., Schjoerring, J.K., and Jahn, T.P. (2006). Membrane transport of hydrogen peroxide. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes 1758, 994–1003.

Bilski, P., Li, M.Y., Ehrenshaft, M., Daub, M.E., and Chignell, C.F. (2000). Symposium-in-Print Vitamin B6 (Pyridoxine) and Its Derivatives Are Efficient Singlet Oxygen Quenchers and Potential Fungal Antioxidants. Photochemistry and Photobiology 71, 129.

Birtić, S., Ksas, B., Genty, B., Mueller, M.J., Triantaphylidès, C., and Havaux, M. (2011). Using spontaneous photon emission to image lipid oxidation patterns in plant tissues: Plant autoluminescence emanates from oxidized lipids. The Plant Journal 67, 1103–1115.

Birtić, S., Dussort, P., Pierre, F.-X., Bily, A.C., and Roller, M. (2015). Carnosic acid. Phytochemistry 115, 9–19.

- 123 - Références bibliographiques

Bottega, S., and Corsi, G. (2000). Structure, secretion and possible functions of calyx glandular hairs of Rosmarinus officinalis L. (Labiatae). Botanical Journal of the Linnean Society 132, 325–335.

Bowler, C., Montagu, M.V., and Inze, D. (1992). Superoxide Dismutase and Stress Tolerance. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 43, 83–116.

Božić, D., Papaefthimiou, D., Brückner, K., de Vos, R.C.H., Tsoleridis, C.A., Katsarou, D., Papanikolaou, A., Pateraki, I., Chatzopoulou, F.M., Dimitriadou, E., et al. (2015). Towards Elucidating Carnosic Acid Biosynthesis in Lamiaceae: Functional Characterization of the Three First Steps of the Pathway in Salvia fruticosa and Rosmarinus officinalis. PLOS ONE 10, e0124106.

Brewer, P.B., Yoneyama, K., Filardo, F., Meyers, E., Scaffidi, A., Frickey, T., Akiyama, K., Seto, Y., Dun, E.A., Cremer, J.E., et al. (2016). LATERAL BRANCHING OXIDOREDUCTASE acts in the final stages of strigolactone biosynthesis in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences 113, 6301–6306.

Brieskorn, C.H., and Dömling, H.-J. (1969). Carnosolsäure, der wichtige antioxydativ wirksame Inhaltsstoff des Rosmarin- und Salbeiblattes. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung 141, 10–16.

Brückner, K., Božić, D., Manzano, D., Papaefthimiou, D., Pateraki, I., Scheler, U., Ferrer, A., de Vos, R.C.H., Kanellis, A.K., and Tissier, A. (2014). Characterization of two genes for the biosynthesis of abietane-type diterpenes in rosemary (Rosmarinus officinalis) glandular trichomes. Phytochemistry 101, 52–64.

Brugnoli, E., and Bjôrkman, O. (1992). Chloroplast movements in leaves: Influence on chlorophyll fluorescence and measurements of light-induced absorbance changes related to pH and zeaxanthin formation. Photosynthesis Research 32, 23–35.

Bruno, M., Savona, G., Piozzi, F., de la Torre, M.C., Rodriguez, B., and Marlier, M. (1991). Abietane diterpenoids from Lepechinia meyeni and Lepechinia hastata. Phytochemistry 30, 2339–2343.

- 124 - Références bibliographiques

Bueno, P., Varela, J., Gimenez-Gallego, G., and del Rio, L.A. (1995). Peroxisomal Copper,Zinc Superoxide Dismutase (Characterization of the Isoenzyme from Watermelon Cotyledons). Plant Physiology 108, 1151–1160.

Calabrese, V., Scapagnini, G., Catalano, C., Dinotta, F., Geraci, D., and Morganti, P. (2000). Biochemical studies of a natural antioxidant isolated from rosemary and its application in cosmetic dermatology. Int J Tissue React 22, 5–13.

Chaudhary, N., and Khurana, P. (2009). Vitamin E biosynthesis genes in rice: Molecular characterization, expression profiling and comparative phylogenetic analysis. Plant Science 177, 479–491.

Chen, Z., Young, T.E., Ling, J., Chang, S.-C., and Gallie, D.R. (2003). Increasing vitamin C content of plants through enhanced ascorbate recycling. Proceedings of the National Academy of Sciences 100, 3525–3530.

Chi, G., Wei, M., Xie, X., Soromou, L.W., Liu, F., and Zhao, S. (2013). Suppression of MAPK and NF-κB Pathways by Limonene Contributes to Attenuation of Lipopolysaccharide-Induced Inflammatory Responses in Acute Lung Injury. Inflammation 36, 501–511.

Choudhury, S., Panda, P., Sahoo, L., and Panda, S.K. (2013). Reactive oxygen species signalling in plants under abiotic stress. Plant Signalling & Behaviour 8, e23681.

Christensen, K.B., Jørgensen, M., Kotowska, D., Petersen, R.K., Kristiansen, K., and Christensen, L.P. (2010). Activation of the nuclear receptor PPARγ by metabolites isolated from sage (Salvia officinalis L.). Journal of Ethnopharmacology 132, 127–133.

Cifra, M., and Pospíšil, P. (2014). Ultra-weak photon emission from biological samples: Definition, mechanisms, properties, detection and applications. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 139, 2–10.

Cleland, R.E., and Grace, S.C. (1999). Voltammetric detection of superoxide production by photosystem II. FEBS Letters 457, 348–352.

- 125 - Références bibliographiques

Collakova, E. (2003). The Role of Homogentisate Phytyltransferase and Other Tocopherol Pathway Enzymes in the Regulation of Tocopherol Synthesis during Abiotic Stress. PLANT PHYSIOLOGY 133, 930–940.

Collins, A.R. (2001). Carotenoids and genomic stability. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis 475, 21–28.

Comas, L.H., Becker, S.R., Cruz, V.M.V., Byrne, P.F., and Dierig, D.A. (2013). Root traits contributing to plant productivity under drought. Frontiers in Plant Science 4.

Cona, A., Rea, G., Angelini, R., Federico, R., and Tavladoraki, P. (2006). Functions of amine oxidases in plant development and defence. Trends in Plant Science 11, 80–88.

Conde, A., Martins, V., Noronha, H., Conde, C.A. da S., Fontes, N., and Gerós, H. (2011). Solute transport across plant cell membranes. CanalBQ-Journal of the Portuguese Biochemical Society 7, 20–34.

Conklin, P.L., Williams, E.H., and Last, R.L. (1996). Environmental stress sensitivity of an ascorbic acid-deficient Arabidopsis mutant. Proceedings of the National Academy of Sciences 93, 9970–9974.

Costa, S., Utan, A., Speroni, E., Cervellati, R., Piva, G., Prandini, A., and Guerra, M.C. (2007). Carnosic acid from rosemary extracts: a potential chemoprotective agent against aflatoxin B1. An in vitro study. Journal of Applied Toxicology 27, 152–159.

Cuvelier, M.E., Berset, C., and Richard, H. (1994). Antioxidant Constituents in Sage (Salvia officinalis). Journal of Agricultural and Food Chemistry 42, 665–669.

Cuvelier, M.-E., Richard, H., and Berset, C. (1996). Antioxidative activity and phenolic composition of pilot-plant and commercial extracts of sage and rosemary. Journal of the American Oil Chemists’ Society 73, 645–652.

Dall’Osto, L., Lico, C., Alric, J., Giuliano, G., Havaux, M., and Bassi, R. (2006). Lutein is needed for efficient chlorophyll triplet quenching in the major LHCII antenna complex of higher plants and effective photoprotection in vivo under strong light. BMC Plant Biology 6,

- 126 - Références bibliographiques

32.

Dall’Osto, L., Holt, N.E., Kaligotla, S., Fuciman, M., Cazzaniga, S., Carbonera, D., Frank, H.A., Alric, J., and Bassi, R. (2012). Zeaxanthin protects plant photosynthesis by modulating chlorophyll triplet yield in specific light-harvesting antenna subunits. Journal of Biological Chemistry 287, 41820–41834.

Danilenko, M., and Studzinski, G.P. (2004). Enhancement by other compounds of the anti-cancer activity of vitamin D3 and its analogs. Experimental Cell Research 298, 339–358.

Das, K., and Roychoudhury, A. (2014). Reactive oxygen species (ROS) and response of antioxidants as ROS-scavengers during environmental stress in plants. Frontiers in Environmental Science 2.

Dat, J., Vandenabeele, S., Vranovἀ, E., Van Montagu, M., Inzé *, D., and Van Breusegem, F. (2000). Dual action of the active oxygen species during plant stress responses. Cellular and Molecular Life Sciences (CMLS) 57, 779–795.

Davies, K.J.A. (1986). Intracellular proteolytic systems may function as secondary antioxidant defenses: An hypothesis. Journal of Free Radicals in Biology & Medicine 2, 155–173.

Davies, M.J. (2005). The oxidative environment and protein damage. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics 1703, 93–109.

Demmig-Adams, B. (1990). Carotenoids and photoprotection in plants: A role for the xanthophyll zeaxanthin. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics 1020, 1–24.

Dickmann, L.J., VandenBrink, B.M., and Lin, Y.S. (2012). In Vitro Hepatotoxicity and Cytochrome P450 Induction and Inhibition Characteristics of Carnosic Acid, a Dietary Supplement with Antiadipogenic Properties. Drug Metabolism and Disposition 40, 1263–1267.

- 127 - Références bibliographiques

Diplock, A.T., Xu, G.-L., Yeow, C.-L., and Okikiola, M. (1989). Relationship of Tocopherol Structure to Biological Activity, Tissue Uptake, and Prostaglandin Biosynthesis. Annals of the New York Academy of Sciences 570, 72–84.

Djarmati, Z., Jankov, R.M., Schwirtlich, E., Djulinac, B., and Djordjevic, A. (1991). High antioxidant activity of extracts obtained from sage by supercritical CO2 extraction. Journal of the American Oil Chemists Society 68, 731–734.

Dodd, A.N., Borland, A.M., Haslam, R.P., Griffiths, H., and Maxwell, K. (2002). Crassulacean acid metabolism: plastic, fantastic. Journal of Experimental Botany 53, 569–580.

Edge, R., McGarvey, D.J., and Truscott, T.G. (1997). The carotenoids as anti-oxidants — a review. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 41, 189–200.

Edwards, G.E., Franceschi, V.R., Ku, M.S.B., Voznesenskaya, E.V., Pyankov, V.I., and Andreo, C.S. (2001). Compartmentation of photosynthesis in cells and tissues of C4 plants. Journal of Experimental Botany 52, 577–590.

Einbond, L.S., Wu, H., Kashiwazaki, R., He, K., Roller, M., Su, T., Wang, X., and Goldsberry, S. (2012). Carnosic acid inhibits the growth of ER-negative human breast cancer cells and synergizes with curcumin. Fitoterapia 83, 1160–1168.

El-Beltagi, H.S., and Mohamed, H.I. (2013). Reactive oxygen species, lipid peroxidation and antioxidative defense mechanism. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca 41, 44.

Ellis, D., and Thomas, R.C. (1976). Microelectrode measurement of the intracellular pH of mammalian heart cells. Nature 262, 224–225.

Elstner, E.F. (1991). Oxygen radicals — Biochemical basis for their efficacy. Klinische Wochenschrift 69, 949–956.

Erkan, N., Ayranci, G., and Ayranci, E. (2009). A kinetic study of oxidation development in sunflower oil under microwave heating: Effect of natural antioxidants. Food Research International 42, 1171–1177.

- 128 - Références bibliographiques

Escuder, B., Torres, R., Lissi, E., Labbé, C., and Faini, F. (2002). Antioxidant Capacity of Abietanes from Sphacele Salviae. Natural Product Letters 16, 277–281.

Eugeni Piller, L. (2014). Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle. Frontiers in Plant Science 5.

Evans, M.D., Dizdaroglu, M., and Cooke, M.S. (2004). Oxidative DNA damage and disease: induction, repair and significance. Mutation Research/Reviews in Mutation Research 567, 1–61.

Fahn, A. (1979). Secretory tissues in plants (London ; New York: Academic Press).

Farmer, E.E., and Davoine, C. (2007). Reactive electrophile species. Current Opinion in Plant Biology 10, 380–386.

Ferreira, K.N. (2004). Architecture of the Photosynthetic Oxygen-Evolving Center. Science 303, 1831–1838.

Filkowski, J., Kovalchuk, O., and Kovalchuk, I. (2004). Genome stability of vtc1, tt4, and tt5 Arabidopsis thaliana mutants impaired in protection against oxidative stress. The Plant Journal 38, 60–69.

Fischer, B.B., Krieger-Liszkay, A., Hideg, É., Šnyrychová, I., Wiesendanger, M., and Eggen, R.I.L. (2007). Role of singlet oxygen in chloroplast to nucleus retrograde signalling in Chlamydomonas reinhardtii. FEBS Letters 581, 5555–5560.

Foote, S.., Ching, T.-Y., and Geller, G.G. (1974). Chemistry of singlet oxygen—xviii. rates of reaction and quenching of α-tocopherol and singlet oxygen. Photochemistry and Photobiology 20, 511–513.

Foyer, C.H. (2005). Redox Homeostasis and Antioxidant Signalling: A Metabolic Interface between Stress Perception and Physiological Responses. THE PLANT CELL ONLINE 17, 1866–1875.

- 129 - Références bibliographiques

Foyer, C.H., and Halliwell, B. (1976). The presence of glutathione and glutathione reductase in chloroplasts: A proposed role in ascorbic acid metabolism. Planta 133, 21–25.

Foyer, C.H., and Noctor, G. (2003). Redox sensing and signalling associated with reactive oxygen in chloroplasts, peroxisomes and mitochondria. Physiologia Plantarum 119, 355–364.

Foyer, C.H., Souriau, N., Perret, S., Lelandais, M., Kunert, K.J., Pruvost, C., and Jouanin, L. (1995). Overexpression of Glutathione Reductase but Not Glutathione Synthetase Leads to Increases in Antioxidant Capacity and Resistance to Photoinhibition in Poplar Trees. Plant Physiology 109, 1047–1057.

Frankel, E.N., Huang, S.-W., Aeschbach, R., and Prior, E. (1996). Antioxidant Activity of a Rosemary Extract and Its Constituents, Carnosic Acid, Carnosol, and Rosmarinic Acid, in Bulk Oil and Oil-in-Water Emulsion. Journal of Agricultural and Food Chemistry 44, 131–135.

Fridovich, I. (1989). Superoxide dismutases. An adaptation to a paramagnetic gas. J Biol Chem 264, 7761–7764.

Funk, C., and Croteau, R. (1994). Diterpenoid Resin Acid Biosynthesis in Conifers: Characterization of Two Cytochrome P450-Dependent Monooxygenases and an Aldehyde Dehydrogenase Involved in Abietic Acid Biosynthesis. Archives of Biochemistry and Biophysics 308, 258–266.

Gagné, S., Saucier, C., and Gény, L. (2006). Composition and Cellular Localization of Tannins in Cabernet Sauvignon Skins during Growth. Journal of Agricultural and Food Chemistry 54, 9465–9471.

Galbis-Martínez, M., Padmanabhan, S., Murillo, F.J., and Elías-Arnanz, M. (2012). CarF mediates signaling by singlet oxygen, generated via photoexcited protoporphyrin IX, in Myxococcus xanthus light-induced carotenogenesis. Journal of Bacteriology 194, 1427–1436.

- 130 - Références bibliographiques

Gao, Q., and Zhang, L. (2008). Ultraviolet-B-induced oxidative stress and antioxidant defense system responses in ascorbate-deficient vtc1 mutants of Arabidopsis thaliana. Journal of Plant Physiology 165, 138–148.

Gardner, P.R., and Fridovich, I. (1991). Superoxide sensitivity of the Escherichia coli aconitase. Journal of Biological Chemistry 266, 19328–19333.

Garrison, W.M., Jayko, M.E., and Bennett, W. (1962). Radiation-induced oxidation of protein in aqueous solution. Radiation Research 16, 483–502.

Gershenzon, J., Maffei, M., and Croteau, R. (1989). Biochemical and Histochemical Localization of Monoterpene Biosynthesis in the Glandular Trichomes of Spearmint (Mentha spicata). PLANT PHYSIOLOGY 89, 1351–1357.

Gill, S.S., and Tuteja, N. (2010). Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants. Plant Physiology and Biochemistry 48, 909–930.

Giuliani, C., Maleci Bini, L., Papa, F., Cristalli, G., Sagratini, G., Vittori, S., Lucarini, D., and Maggi, F. (2011). Glandular Trichomes and Essential Oil Composition of Endemic Sideritis italica (Mill.) Greuter et Burdet from Central Italy. Chemistry & Biodiversity 8, 2179–2194.

Glaeser, J., Nuss, A.M., Berghoff, B.A., and Klug, G. (2011). Singlet Oxygen Stress in Microorganisms. In Advances in Microbial Physiology, (Elsevier), pp. 141–173.

Gómez-García, F., López-Jornet, M., Álvarez-Sánchez, N., Castillo-Sánchez, J., Benavente-García, O., and Vicente Ortega, V. (2013). Effect of the phenolic compounds apigenin and carnosic acid on oral carcinogenesis in hamster induced by DMBA. Oral Diseases 19, 279–286.

Grabalska, M., and Malec, P. (2007). Blue Light-induced Chloroplast Reorientations in Lemna trisulca L. (Duckweed) are Controlled by Two Separable Cellular Mechanisms as Suggested by Different Sensitivity to Wortmannin. Photochemistry and Photobiology 79, 343–348.

- 131 - Références bibliographiques

Gruszka, J., Pawlak, A., and Kruk, J. (2008). Tocochromanols, plastoquinol, and other biological prenyllipids as singlet oxygen quenchers—determination of singlet oxygen quenching rate constants and oxidation products. Free Radical Biology and Medicine 45, 920–928.

Gupta, A.S., Webb, R.P., Holaday, A.S., and Allen, R.D. (1993). Overexpression of Superoxide Dismutase Protects Plants from Oxidative Stress (Induction of Ascorbate Peroxidase in Superoxide Dismutase-Overexpressing Plants). Plant Physiology 103, 1067–1073.

Gutteridge, J.M.C., and Halliwell, B. (1989). 1 Iron toxicity and oxygen radicals. Baillière’s Clinical Haematology 2, 195–256.

Hackbarth, S., Schlothauer, J., Preuß, A., and Röder, B. (2010). New insights to primary photodynamic effects – Singlet oxygen kinetics in living cells. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 98, 173–179.

Hadad, N., and Levy, R. (2012). The synergistic anti-inflammatory effects of lycopene, lutein, β-carotene, and carnosic acid combinations via redox-based inhibition of NF-κB signaling. Free Radical Biology and Medicine 53, 1381–1391.

Halliwell, B. (1991). Reactive oxygen species in living systems: Source, biochemistry, and role in human disease. The American Journal of Medicine 91, S14–S22.

Halliwell, B. (2006). Reactive Species and Antioxidants. Redox Biology Is a Fundamental Theme of Aerobic Life. PLANT PHYSIOLOGY 141, 312–322.

Hancock, J. (2006). Doing the unexpected: proteins involved in hydrogen peroxide perception. Journal of Experimental Botany 57, 1711–1718.

Haraguchi, H., Saito, T., Okamura, N., and Yagi, A. (1995). Inhibition of Lipid Peroxidation and Superoxide Generation by Diterpenoids from Rosmarinus officinalis. Planta Medica 61, 333–336.

Harborne, J.B., and Tomas-Barberan, F.A. (1991). Ecological chemistry and biochemistry of plant terpenoids (Clarendon Press Oxford, UK).

- 132 - Références bibliographiques

Haupt, W., and Scheuerlein, R. (1990). Chloroplast movement. Plant, Cell and Environment 13, 595–614.

Havaux, M. (2005). Vitamin E Protects against Photoinhibition and Photooxidative Stress in Arabidopsis thaliana. THE PLANT CELL ONLINE 17, 3451–3469.

Havaux, M. (2014). Carotenoid oxidation products as stress signals in plants. The Plant Journal 79, 597–606.

Havaux, M., and Niyogi, K.K. (1999). The violaxanthin cycle protects plants from photooxidative damage by more than one mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences 96, 8762–8767.

Havaux, M., Triantaphylides, C., and Genty, B. (2006). Autoluminescence imaging: a non-invasive tool for mapping oxidative stress. Trends in Plant Science 11, 480–484.

Havaux, M., Ksas, B., Szewczyk, A., Rumeau, D., Franck, F., Caffarri, S., and Triantaphylidès, C. (2009). Vitamin B6 deficient plants display increased sensitivity to high light and photo-oxidative stress. BMC Plant Biology 9, 130.

Hernández, I., Alegre, L., Van Breusegem, F., and Munné-Bosch, S. (2009). How relevant are flavonoids as antioxidants in plants? Trends in Plant Science 14, 125–132.

Herrera, E., and Barbas, C. (2001). Vitamin E: action, metabolism and perspectives. Journal of Physiology and Biochemistry 57, 43–56.

Heyno, E., Mary, V., Schopfer, P., and Krieger-Liszkay, A. (2011). Oxygen activation at the plasma membrane: relation between superoxide and hydroxyl radical production by isolated membranes. Planta 234, 35–45.

Hidalgo, P.J., Ubera, J.L., Tena, M.T., and Valcárcel, M. (1998). Determination of the Carnosic Acid Content in Wild and Cultivated Rosmarinus officinalis. Journal of Agricultural and Food Chemistry 46, 2624–2627.

- 133 - Références bibliographiques

Hideg, É., Deák, Z., Hakala-Yatkin, M., Karonen, M., Rutherford, A.W., Tyystjärvi, E., Vass, I., and Krieger-Liszkay, A. (2011). Pure forms of the singlet oxygen sensors TEMP and TEMPD do not inhibit Photosystem II. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics 1807, 1658–1661.

Hill, R.A., and Connolly, J.D. (2013). Triterpenoids. Nat. Prod. Rep. 30, 1028–1065.

Hopia, A.I., Huang, S.-W., Schwarz, K., German, J.B., and Frankel, E.N. (1996). Effect of Different Lipid Systems on Antioxidant Activity of Rosemary Constituents Carnosol and Carnosic Acid with and without α-Tocopherol. Journal of Agricultural and Food Chemistry 44, 2030–2036.

Horton, P., Ruban, A.V., and Wentworth, M. (2000). Allosteric regulation of the light-harvesting system of photosystem II. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences 355, 1361–1370.

Hossain, M.B., Rai, D.K., Brunton, N.P., Martin-Diana, A.B., and Barry-Ryan, C. (2010). Characterization of Phenolic Composition in Lamiaceae Spices by LC-ESI-MS/MS. Journal of Agricultural and Food Chemistry 58, 10576–10581.

Huang, S.-W., Frankel, E.N., Schwarz, K., Aeschbach, R., and German, J.B. (1996). Antioxidant Activity of Carnosic Acid and Methyl Carnosate in Bulk Oils and Oil-in-Water Emulsions. Journal of Agricultural and Food Chemistry 44, 2951–2956.

Ibarra, A., Cases, J., Roller, M., Chiralt-Boix, A., Coussaert, A., and Ripoll, C. (2011). Carnosic acid-rich rosemary (Rosmarinus officinalis L.) leaf extract limits weight gain and improves cholesterol levels and glycaemia in mice on a high-fat diet. British Journal of Nutrition 106, 1182–1189.

Igamberdiev, A.U., Seregélyes, C., Manac’h, N., and Hill, R.D. (2004). NADH-dependent metabolism of nitric oxide in alfalfa root cultures expressing barley hemoglobin. Planta 219, 95–102.

- 134 - Références bibliographiques

Imlay, J.A. (2003). Pathways of Oxidative Damage. Annual Review of Microbiology 57, 395–418.

Jackson, C., Dench, J., Moore, A.L., Halliwell, B., Foyer, C.H., and Hall, D.O. (1978). Subcellular Localisation and Identification of Superoxide Dismutase in the Leaves of Higher Plants. European Journal of Biochemistry 91, 339–344.

Jayasinghe, C., Gotoh, N., Aoki, T., and Wada, S. (2003). Phenolics Composition and Antioxidant Activity of Sweet Basil (Ocimum basilicum L.). Journal of Agricultural and Food Chemistry 51, 4442–4449.

Jimenez, A., Hernandez, J.A., del Rio, L.A., and Sevilla, F. (1997). Evidence for the Presence of the Ascorbate-Glutathione Cycle in Mitochondria and Peroxisomes of Pea Leaves. Plant Physiology 114, 275–284.

Job, C. (2005). Patterns of Protein Oxidation in Arabidopsis Seeds and during Germination. PLANT PHYSIOLOGY 138, 790–802. de Jong, A., Yakimova, E., Kapchina, V., and Woltering, E. (2002). A critical role for ethylene in hydrogen peroxide release during programmed cell death in tomato suspension cells. Planta 214, 537–545.

Jordán, M.J., Castillo, J., Bañón, S., Martínez-Conesa, C., and Sotomayor, J.A. (2014). Relevance of the carnosic acid/carnosol ratio for the level of rosemary diterpene transfer and for improving lamb meat antioxidant status. Food Chemistry 151, 212–218.

Kagawa, T. (2001). Arabidopsis NPL1: A Phototropin Homolog Controlling the Chloroplast High-Light Avoidance Response. Science 291, 2138–2141.

Kamal-Eldin, A., and Appelqvist, L.-Å. (1996). The chemistry and antioxidant properties of tocopherols and tocotrienols. Lipids 31, 671–701.

Kamatou, G.P.P., Viljoen, A.M., and Steenkamp, P. (2010). Antioxidant, antiinflammatory activities and HPLC analysis of South African Salvia species. Food Chemistry 119, 684–688.

- 135 - Références bibliographiques

Kao, W.-Y., and Forseth, I.N. (1992). Dirunal leaf movement, chlorophyll fluorescence and carbon assimilation in soybean grown under different nitrogen and water availabilities. Plant, Cell and Environment 15, 703–710.

Kasahara, M., Kagawa, T., Oikawa, K., and Suetsugu, N. (2002). Chloroplast avoidance movement reduces photodamage in plants. Nature 420, 829.

Kelly, A.A., and Feussner, I. (2016). Oil is on the agenda: Lipid turnover in higher plants. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids 1861, 1253–1268.

Khabashesku, O., and Ellis, B. (2009). Singlet oxygen oxidized materials and methods of making and using same (Google Patents).

Kirkland, J.B. (1991). Lipid peroxidation, protein thiol oxidation and DNA damage in hydrogen peroxide-induced injury to endothelial cells: role of activation of poly(ADP-ribose) polymerase. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research 1092, 319–325.

Kitajima, M., and Butler, W.L. (1975). Excitation spectra for Photosystem I and Photosystem II in chloroplasts and the spectral characteristics of the distribution of quanta between the two photosystems. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics 408, 297–305.

Kitamura, S. (2006). Transport of Flavonoids: From Cytosolic Synthesis to Vacuolar Accumulation. In The Science of Flavonoids, E. Grotewold, ed. (New York, NY: Springer New York), pp. 123–146.

Kobayashi, K., Kondo, M., Fukuda, H., Nishimura, M., and Ohta, H. (2007). Galactolipid synthesis in chloroplast inner envelope is essential for proper thylakoid biogenesis, photosynthesis, and embryogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences 104, 17216–17221.

- 136 - Références bibliographiques

Kontogianni, V.G., Tomic, G., Nikolic, I., Nerantzaki, A.A., Sayyad, N., Stosic-Grujicic, S., Stojanovic, I., Gerothanassis, I.P., and Tzakos, A.G. (2013). Phytochemical profile of Rosmarinus officinalis and Salvia officinalis extracts and correlation to their antioxidant and anti-proliferative activity. Food Chemistry 136, 120–129.

Krieger-Liszkay, A. (2004). Singlet oxygen production in photosynthesis. Journal of Experimental Botany 56, 337–346.

Krieger-Liszkay, A., Fufezan, C., and Trebst, A. (2008). Singlet oxygen production in photosystem II and related protection mechanism. Photosynthesis Research 98, 551–564.

Kruk, J., Holländer-Czytko, H., Oettmeier, W., and Trebst, A. (2005). Tocopherol as singlet oxygen scavenger in photosystem II. Journal of Plant Physiology 162, 749–757.

Kruk, J., Szymańska, R., Cela, J., and Munne-Bosch, S. (2014). Plastochromanol-8: Fifty years of research. Phytochemistry 108, 9–16.

Kruk, J., Szymańska, R., Nowicka, B., and Dłużewska, J. (2016). Function of isoprenoid quinones and chromanols during oxidative stress in plants. New Biotechnology 33, 636–643.

Krzeszowiec, W., and Gabrys, H. (2007). Phototropin Mediated Relocation of Myosins in Arabidopsis thaliana. Plant Signaling & Behavior 2, 333–336.

Ksas, B., Becuwe, N., Chevalier, A., and Havaux, M. (2015). Plant tolerance to excess light energy and photooxidative damage relies on plastoquinone biosynthesis. Scientific Reports 5.

Kumar, R., Raclaru, M., Schüßeler, T., Gruber, J., Sadre, R., Lühs, W., Zarhloul, K.M., Friedt, W., Enders, D., Frentzen, M., et al. (2005). Characterisation of plant tocopherol cyclases and their overexpression in transgenic Brassica napus seeds. FEBS Letters 579, 1357–1364.

Kuzmenko, A.I., Morozova, R.P., Nikolenko, I.A., Donchenko, G.V., Richheimer, S.L., and Bailey, D.T. (1999). Chemiluminescence determination of the in vivo and in vitro antioxidant activity of RoseOx® and carnosic acid. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 48, 63–67.

- 137 - Références bibliographiques

Land, E.T. (1990). Free Radicals in Biology and Medicine. International Journal of Radiation Biology 58, 725–725.

Lane, N. (2003). Oxygen: the molecule that made the world (Oxford: Oxford University Press).

Larcher, W. (2000). Temperature stress and survival ability of Mediterranean sclerophyllous plants. Plant Biosystems - An International Journal Dealing with All Aspects of Plant Biology 134, 279–295.

Larkin, R.M. (2003). GUN4, a Regulator of Chlorophyll Synthesis and Intracellular Signaling. Science 299, 902–906.

Lecas, M., and Brillouet, J.-M. (1994). Cell wall composition of grape berry skins. Phytochemistry 35, 1241–1243.

Lee, KP., Kim C., Landgraf F., Apel K. (2007). EXECUTER1- and EXECUTER2-dependent transfer of stress-related signals from the plastid to the nucleus of Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A, 104(24): 10270-10275.

Li, M., Ma, F., Liang, D., Li, J., and Wang, Y. (2010). Ascorbate Biosynthesis during Early Fruit Development Is the Main Reason for Its Accumulation in Kiwi. PLoS ONE 5, e14281.

Liebler, D.C., Kling, D.S., and Reed, D.J. (1986). Antioxidant protection of phospholipid bilayers by alpha-tocopherol. Control of alpha-tocopherol status and lipid peroxidation by ascorbic acid and glutathione. J. Biol. Chem. 261, 12114–12119.

Locato, V., Cimini, S., and Gara, L.D. (2013). Strategies to increase vitamin C in plants: from plant defense perspective to food biofortification. Frontiers in Plant Science 4.

LóPez-Huertas, E., Corpas, F.J., Sandalio, L.M., and Del RíO, L.A. (1999). Characterization of membrane polypeptides from pea leaf peroxisomes involved in superoxide radical generation. Biochemical Journal 337, 531–536.

- 138 - Références bibliographiques

López-Jiménez, A., García-Caballero, M., Medina, M.Á., and Quesada, A.R. (2013). Anti-angiogenic properties of carnosol and carnosic acid, two major dietary compounds from rosemary. European Journal of Nutrition 52, 85–95.

Luis, J.C., and Johnson, C.B. (2005). Seasonal variations of rosmarinic and carnosic acids in rosemary extracts. Analysis of their in vitro antiradical activity. Spanish Journal of Agricultural Research 3, 106.

Luis, J.C., Martín, R., Frías, I., and Valdés, F. (2007a). Enhanced Carnosic Acid Levels in Two Rosemary Accessions Exposed to Cold Stress Conditions. Journal of Agricultural and Food Chemistry 55, 8062–8066.

Luis, J.C., Pérez, R.M., and González, F.V. (2007b). UV-B radiation effects on foliar concentrations of rosmarinic and carnosic acids in rosemary plants. Food Chemistry 101, 1211–1215.

Madhusudhan, R., Ishikawa, T., Sawa, Y., Shigeoka, S., and Shibata, H. (2003). Characterization of an ascorbate peroxidase in plastids of tobacco BY-2 cells. Physiologia Plantarum 117, 550–557.

Makino, N., Sasaki, K., Hashida, K., and Sakakura, Y. (2004). A metabolic model describing the H2O2 elimination by mammalian cells including H2O2 permeation through cytoplasmic and peroxisomal membranes: comparison with experimental data. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects 1673, 149–159.

Marin, M., Koko, V., Duletić-Laušević, S., Marin, P.D., Rančić, D., and Dajic-Stevanovic, Z. (2006). Glandular trichomes on the leaves of Rosmarinus officinalis: Morphology, stereology and histochemistry. South African Journal of Botany 72, 378–382.

Markham, K.R., Ryan, K.G., Gould, K.S., and Rickards, G.K. (2000). Cell wall sited flavonoids in lisianthus flower petals. Phytochemistry 54, 681–687.

- 139 - Références bibliographiques

Mascio, P.D., Devasagayam, T.P.A., Kaiser, S., and Sies, H. (1990). Carotenoids, tocopherols and thiols as biological singlet molecular oxygen quenchers. Biochemical Society Transactions 18, 1054–1056.

Masuda, T., Inaba, Y., and Takeda, Y. (2001). Antioxidant Mechanism of Carnosic Acid: Structural Identification of Two Oxidation Products. Journal of Agricultural and Food Chemistry 49, 5560–5565.

Masuda, T., Inaba, Y., Maekawa, T., Takeda, Y., Tamura, H., and Yamaguchi, H. (2002). Recovery Mechanism of the Antioxidant Activity from Carnosic Acid Quinone, an Oxidized Sage and Rosemary Antioxidant. Journal of Agricultural and Food Chemistry 50, 5863–5869.

Masuda, T., Kirikihira, T., and Takeda, Y. (2005). Recovery of Antioxidant Activity from Carnosol Quinone: Antioxidants Obtained from a Water-Promoted Conversion of Carnosol Quinone. Journal of Agricultural and Food Chemistry 53, 6831–6834.

Matringe, M., Ksas, B., Rey, P., and Havaux, M. (2008). Tocotrienols, the Unsaturated Forms of Vitamin E, Can Function as Antioxidants and Lipid Protectors in Tobacco Leaves. PLANT PHYSIOLOGY 147, 764–778.

Matusova, R. (2005). The Strigolactone Germination Stimulants of the Plant-Parasitic Striga and Orobanche spp. Are Derived from the Carotenoid Pathway. PLANT PHYSIOLOGY 139, 920–934.

Maxwell, K., and Johnson, G.N. (2000). Chlorophyll fluorescence—a practical guide. Journal of Experimental Botany 51, 659–668.

Maxwell, P.H., Wiesener, M.S., Gin-Wen, C., and Clifford, S.C. (1999). The tumour suppressor protein VHL targets hypoxia-inducible factors for oxygen-dependent proteolysis. Nature 399, 271.

McGarvey, D.J. (1995). Terpenoid Metabolism. THE PLANT CELL ONLINE 7, 1015–1026.

- 140 - Références bibliographiques

Mena, P., Cirlini, M., Tassotti, M., Herrlinger, K., Dall’Asta, C., and Del Rio, D. (2016). Phytochemical Profiling of Flavonoids, Phenolic Acids, Terpenoids, and Volatile Fraction of a Rosemary (Rosmarinus officinalis L.) Extract. Molecules 21, 1576.

Mène-Saffrané, L., and DellaPenna, D. (2010). Biosynthesis, regulation and functions of tocochromanols in plants. Plant Physiology and Biochemistry 48, 301–309.

Mène-Saffrané, L., Dubugnon, L., Chételat, A., Stolz, S., Gouhier-Darimont, C., and Farmer, E.E. (2009). Nonenzymatic oxidation of trienoic fatty acids contributes to reactive oxygen species management in Arabidopsis. Journal of Biological Chemistry 284, 1702–1708.

Mhamdi, A., Queval, G., Chaouch, S., Vanderauwera, S., Van Breusegem, F., and Noctor, G. (2010). Catalase function in plants: a focus on Arabidopsis mutants as stress-mimic models. Journal of Experimental Botany 61, 4197–4220.

Miller, G., Suzuki, N., Ciftci-Yilmaz, S., and Mittler, R. (2010). Reactive oxygen species homeostasis and signalling during drought and salinity stresses. Plant, Cell & Environment 33, 453–467.

Mishra, A., Kumar, S., Bhargava, A., Sharma, B., and Pandey, A. (2011). Studies on in vitro antioxidant and antistaphylococcal activities of some important medicinal plants. Cell Mol Biol 57, 16–25.

Mishra, P., Bhoomika, K., and Dubey, R.S. (2013). Differential responses of antioxidative defense system to prolonged salinity stress in salt-tolerant and salt-sensitive Indica rice (Oryza sativa L.) seedlings. Protoplasma 250, 3–19.

Mitsuko A., Akihiro K., Hikaru S., Kiyoshi T., Noriaki K. (1993). Enhanced Tolerance to Photooxidative Stress of Transgenic Nicotiana tabacum with High Chloroplastic Glutathione Reductase Activity, Plant and Cell Physiology, Volume 34, Issue 1, Pages 129–135.

Mittler, R. (2002). Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends in Plant Science 7, 405–410.

- 141 - Références bibliographiques

Miyake, C., Schreiber, U., Hormann, H., Sano, S., and Kozi, A. (1998). The FAD-Enzyme Monodehydroascorbate Radical Reductase Mediates Photoproduction of Superoxide Radicals in Spinach Thylakoid Membranes. Plant and Cell Physiology 39, 821–829.

Møller, I.M., and Kristensen, B.K. (2004). Protein oxidation in plant mitochondria as a stress indicator. Photochem. Photobiol. Sci. 3, 730–735.

Møller, I.M., Jensen, P.E., and Hansson, A. (2007). Oxidative Modifications to Cellular Components in Plants. Annual Review of Plant Biology 58, 459–481.

Montillet, J.-L., Cacas, J.-L., Garnier, L., Montané, M.-H., Douki, T., Bessoule, J.-J., Polkowska-Kowalczyk, L., Maciejewska, U., Agnel, J.-P., Vial, A., et al. (2004). The upstream oxylipin profile of Arabidopsis thaliana: a tool to scan for oxidative stresses: Lipid peroxidation in Arabidopsis. The Plant Journal 40, 439–451.

Morán, L., Andrés, S., Bodas, R., Prieto, N., and Giráldez, F.J. (2012). Meat texture and antioxidant status are improved when carnosic acid is included in the diet of fattening lambs. Meat Science 91, 430–434.

Moreno, S. (2012). Carnosic acid inhibits the proliferation and migration capacity of human colorectal cancer cells. Oncology Reports.

Mozzo, M., Passarini, F., Bassi, R., van Amerongen, H., and Croce, R. (2008). Photoprotection in higher plants: The putative quenching site is conserved in all outer light-harvesting complexes of Photosystem II. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics 1777, 1263–1267.

Mueller, M.J. (2004). Archetype signals in plants: the phytoprostanes. Current Opinion in Plant Biology 7, 441–448.

Muller-Moule, P. (2004). Ascorbate-Deficient Mutants of Arabidopsis Grow in High Light Despite Chronic Photooxidative Stress. PLANT PHYSIOLOGY 134, 1163–1172.

- 142 - Références bibliographiques

Munné-Bosch, S., and Alegre, L. (2000). Changes in carotenoids, tocopherols and diterpenes during drought and recovery, and the biological significance of chlorophyll loss in Rosmarinus officinalis plants. Planta 210, 925–931.

Munne-Bosch, S., and Alegre, L. (2001). Subcellular Compartmentation of the Diterpene Carnosic Acid and Its Derivatives in the Leaves of Rosemary. PLANT PHYSIOLOGY 125, 1094–1102.

Munne-Bosch, S., and Alegre, L. (2003). Drought-Induced Changes in the Redox State of alpha -Tocopherol, Ascorbate, and the Diterpene Carnosic Acid in Chloroplasts of Labiatae Species Differing in Carnosic Acid Contents. PLANT PHYSIOLOGY 131, 1816–1825.

Munné-Bosch, S., Schwarz, K., and Alegre, L. (1999). Enhanced Formation of α-Tocopherol and Highly Oxidized Abietane Diterpenes in Water-Stressed Rosemary Plants. Plant Physiology 121, 1047–1052.

Munné-Bosch, S., Alegre, L., and Schwarz, K. (2000). The formation of phenolic diterpenes in Rosmarinus officinalis L. under Mediterranean climate. European Food Research and Technology 210, 263–267.

Munné-Bosch, S., Mueller, M., Schwarz, K., and Alegre, L. (2001). Diterpenes and antioxidative protection in drought-stressed Salvia officinalis plants. Journal of Plant Physiology 158, 1431–1437.

Murphy, M.P. (2009). How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochemical Journal 417, 1–13.

Nabekura, T., Yamaki, T., Hiroi, T., Ueno, K., and Kitagawa, S. (2010). Inhibition of anticancer drug efflux transporter P-glycoprotein by rosemary phytochemicals. Pharmacological Research 61, 259–263.

Nakatani, N., and Inatani, R. (1984). Two Antioxidative Diterpenes from Rosemary (Rosmarinus officinalis L.) and a Revised Structure for Rosmanol †. Agricultural and Biological Chemistry 48, 2081–2085.

- 143 - Références bibliographiques

Naveena, B.M., Vaithiyanathan, S., Muthukumar, M., Sen, A.R., Kumar, Y.P., Kiran, M., Shaju, V.A., and Chandran, K.R. (2013). Relationship between the solubility, dosage and antioxidant capacity of carnosic acid in raw and cooked ground buffalo meat patties and chicken patties. Meat Science 95, 195–202.

Navrot, N., Rouhier, N., Gelhaye, E., and Jacquot, J.-P. (2007). Reactive oxygen species generation and antioxidant systems in plant mitochondria. Physiologia Plantarum 129, 185–195.

Ngo, S.N.T., Williams, D.B., and Head, R.J. (2011). Rosemary and Cancer Prevention: Preclinical Perspectives. Critical Reviews in Food Science and Nutrition 51, 946–954.

Nieto, G., Díaz, P., Bañón, S., and Garrido, M.D. (2010). Dietary administration of ewe diets with a distillate from rosemary leaves (Rosmarinus officinalis L.): Influence on lamb meat quality. Meat Science 84, 23–29.

Ninomiya, K., Matsuda, H., Shimoda, H., Nishida, N., Kasajima, N., Yoshino, T., Morikawa, T., and Yoshikawa, M. (2004). Carnosic acid, a new class of lipid absorption inhibitor from sage. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 14, 1943–1946.

Niyogi, K.K. (1998). Arabidopsis Mutants Define a Central Role for the Xanthophyll Cycle in the Regulation of Photosynthetic Energy Conversion. THE PLANT CELL ONLINE 10, 1121–1134.

Noctor, G. (2002). Drought and Oxidative Load in the Leaves of C3 Plants: a Predominant Role for Photorespiration? Annals of Botany 89, 841–850.

Noctor, G., and Foyer, C.H. (1998). ASCORBATE AND GLUTATHIONE: Keeping Active Oxygen Under Control. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 49, 249–279.

Noctor, G., De Paepe, R., and Foyer, C.H. (2007). Mitochondrial redox biology and homeostasis in plants. Trends in Plant Science 12, 125–134.

- 144 - Références bibliographiques

Oh, J., Jo, H., Cho, A.R., Kim, S.-J., and Han, J. (2013). Antioxidant and antimicrobial activities of various leafy herbal teas. Food Control 31, 403–409.

Palma, J.M., Corpas, F.J., and del Río, L.A. (2009). Proteome of plant peroxisomes: new perspectives on the role of these organelles in cell biology. PROTEOMICS 9, 2301–2312.

Paoletti, E. (2005). Ozone slows stomatal response to light and leaf wounding in a Mediterranean evergreen broadleaf, Arbutus unedo. Environmental Pollution 134, 439–445.

Park, Y.I., Chow, W.S., and Anderson, J.M. (1996). Chloroplast Movement in the Shade Plant Tradescantia albiflora Helps Protect Photosystem II against Light Stress. Plant Physiology 111, 867–875.

Parry, A.D., and Horgan, R. (1991). Carotenoid metabolism and the biosynthesis of abscisic acid. Phytochemistry 30, 815–821.

Pearson, D.A., Frankel, E.N., Aeschbach, R., and German, J.B. (1997). Inhibition of Endothelial Cell-Mediated Oxidation of Low-Density Lipoprotein by Rosemary and Plant Phenolics. Journal of Agricultural and Food Chemistry 45, 578–582.

Penuelas, J., and Munnebosch, S. (2005). Isoprenoids: an evolutionary pool for photoprotection. Trends in Plant Science 10, 166–169.

Pérez-Fons, L., Aranda, F.J., Guillén, J., Villalaín, J., and Micol, V. (2006). Rosemary (Rosmarinus officinalis) diterpenes affect lipid polymorphism and fluidity in phospholipid membranes. Archives of Biochemistry and Biophysics 453, 224–236.

Pérez-Fons, L., GarzÓn, M.T., and Micol, V. (2010). Relationship between the Antioxidant Capacity and Effect of Rosemary (Rosmarinus officinalis L.) Polyphenols on Membrane Phospholipid Order. Journal of Agricultural and Food Chemistry 58, 161–171.

Pertino, M.W., and Schmeda-Hirschmann, G. (2010). The corrected structure of rosmaridiphenol, a bioactive diterpene from Rosmarinus officinalis. Planta Medica 76, 629–632.

- 145 - Références bibliographiques

Peter, G.F., and Thornber, J.P. (1991). Biochemical composition and organization of higher plant photosystem II light-harvesting pigment-proteins. Journal of Biological Chemistry 266, 16745–16754.

Peters, R.J. (2010). Two rings in them all: The labdane-related diterpenoids. Natural Product Reports 27, 1521.

Phillips, C.I. (1976). Letter: Beta-blockers in the treatment of chronic simple glaucoma. Br Med J 1, 584.

Pinto, E., Sigaud-kutner, T.C.S., Leitao, M.A.S., Okamoto, O.K., Morse, D., and Colepicolo, P. (2003). Heavy metal-induced oxidative stress in algae1. Journal of Phycology 39, 1008–1018.

Porfirova, S., Bergmuller, E., Tropf, S., Lemke, R., and Dormann, P. (2002). Isolation of an Arabidopsis mutant lacking vitamin E and identification of a cyclase essential for all tocopherol biosynthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences 99, 12495–12500.

Posadas, S.J., Caz, V., Largo, C., De la Gándara, B., Matallanas, B., Reglero, G., and De Miguel, E. (2009). Protective effect of supercritical fluid rosemary extract, Rosmarinus officinalis, on antioxidants of major organs of aged rats. Experimental Gerontology 44, 383–389.

Pryor, W.A. (1986). Oxy-Radicals and Related Species: Their Formation, Lifetimes, and Reactions. Annual Review of Physiology 48, 657–667.

Purvis, A.C. (1997). Role of the alternative oxidase in limiting superoxide production by plant mitochondria. Physiologia Plantarum 100, 165–170.

Qin, A., Shi, Q., and Yu, X. (2011). Ascorbic acid contents in transgenic potato plants overexpressing two dehydroascorbate reductase genes. Molecular Biology Reports 38, 1557–1566.

- 146 - Références bibliographiques

Queval, G., Issakidis-Bourguet, E., Hoeberichts, F.A., Vandorpe, M., Gakière, B., Vanacker, H., Miginiac-Maslow, M., Van Breusegem, F., and Noctor, G. (2007). Conditional oxidative stress responses in the Arabidopsis photorespiratory mutant cat2 demonstrate that redox state is a key modulator of daylength-dependent gene expression, and define photoperiod as a crucial factor in the regulation of H2O2-induced cel: Photoperiod and H2O2 signalling. The Plant Journal 52, 640–657.

Queval, G., Thominet, D., Vanacker, H., Miginiac-Maslow, M., Gakière, B., and Noctor, G. (2009). H2O2-Activated Up-Regulation of Glutathione in Arabidopsis Involves Induction of Genes Encoding Enzymes Involved in Cysteine Synthesis in the Chloroplast. Molecular Plant 2, 344–356.

Rabinowitch, H.D., and Fridovich, I. (1983). Superoxide radicals, superoxide dismutases and oxygen toxicity in plants. Photochemistry and Photobiology 37, 679–690.

Rajasekaran, D., Manoharan, S., Silvan, S., Vasudevana, K., Baskaran, N., and Palanimuthu, D. (2012). Proapoptotic, Anti-Cell Proliferative, Anti-Inflammatory And Antiangiogenic Potential Of Carnosic Acid During 7,12 Dimethylbenz[A]Anthracene-Induced Hamster Buccal Pouch Carcinogenesis. African Journal of Traditional, Complementary and Alternative Medicines 10.

Ramel, F., Birtic, S., Cuine, S., Triantaphylides, C., Ravanat, J.-L., and Havaux, M. (2012a). Chemical Quenching of Singlet Oxygen by Carotenoids in Plants. PLANT PHYSIOLOGY 158, 1267–1278.

Ramel, F., Birtic, S., Ginies, C., Soubigou-Taconnat, L., Triantaphylides, C., and Havaux, M. (2012b). Carotenoid oxidation products are stress signals that mediate gene responses to singlet oxygen in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences 109, 5535–5540.

Ramel, F., Ksas, B., Akkari, E., Mialoundama, A.S., Monnet, F., Krieger-Liszkay, A., Ravanat, J.-L., Mueller, M.J., Bouvier, F., and Havaux, M. (2013). Light-Induced Acclimation of the Arabidopsis chlorina1 Mutant to Singlet Oxygen. The Plant Cell 25, 1445–1462.

- 147 - Références bibliographiques

Rasmusson, A.G., Geisler, D.A., and Møller, I.M. (2008). The multiplicity of dehydrogenases in the electron transport chain of plant mitochondria. Mitochondrion 8, 47–60.

Rastogi, A., Yadav, D.K., SzymańSka, R., Kruk, J., SedlářOvá, M., and PospíšIl, P. (2014). Singlet oxygen scavenging activity of tocopherol and plastochromanol in Arabidopsis 1 thaliana : relevance to photooxidative stress: O 2 scavenging by tocopherol and plastochromanol. Plant, Cell & Environment 37, 392–401.

Rau, O., Wurglics, M., Dingermann, T., Abdel-Tawab, M., and Schubert-Zsilavecz, M. (2006a). Screening of herbal extracts for activation of the human peroxisome proliferator-activated receptor. Die Pharmazie-An International Journal of Pharmaceutical Sciences 61, 952–956.

Rau, O., Wurglics, M., Paulke, A., Zitzkowski, J., Meindl, N., Bock, A., Dingermann, T., Abdel-Tawab, M., and Schubert-Zsilavecz, M. (2006b). Carnosic acid and carnosol, phenolic diterpene compounds of the labiate herbs rosemary and sage, are activators of the human peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Planta Medica 72, 881–887.

Raven, P.H., Evert, R.F., and Eichhorn, S.E. (2007). Biologie végétale: traduction de la 7e édition américaine par Jules Bouharmont ; révision scientifique de Carlo Evrardt (Bruxelles: De Boeck).

Rey, P., Bécuwe, N., Barrault, M.-B., Rumeau, D., Havaux, M., Biteau, B., and Toledano, M.B. (2007). The Arabidopsis thaliana sulfiredoxin is a plastidic cysteine-sulfinic acid reductase involved in the photooxidative stress response: Reduction of overoxidized peroxiredoxin by sulfiredoxin. The Plant Journal 49, 505–514.

Rey, P., Sanz-Barrio, R., Innocenti, G., Ksas, B., Courteille, A., Rumeau, D., Issakidis-Bourguet, E., and Farran, I. (2013). Overexpression of plastidial thioredoxins f and m differentially alters photosynthetic activity and response to oxidative stress in tobacco plants. Frontiers in Plant Science 4.

Richheimer, S.L., Bernart, M.W., King, G.A., Kent, M.C., and Beiley, D.T. (1996). Antioxidant activity of lipid-soluble phenolic diterpenes from rosemary. Journal of the American Oil Chemists’ Society 73, 507–514.

- 148 - Références bibliographiques

Richhelmer, S., Bailey, D., Bernart, M., Kent, M., Vininski, J., and Anderson, L. (1999). Antioxidant activity and oxidative degradation of phenolic compounds isolated from rosemary.

Richter, C. (1992). Reactive oxygen and DNA damage in mitochondria. Mutation Research/DNAging 275, 249–255. del Rio, L.A. (2006). Reactive Oxygen Species and Reactive Nitrogen Species in Peroxisomes. Production, Scavenging, and Role in Cell Signaling. PLANT PHYSIOLOGY 141, 330–335.

Romo-Vaquero, M., Selma, M.-V., Larrosa, M., Obiol, M., García-Villalba, R., González-Barrio, R., Issaly, N., Flanagan, J., Roller, M., Tomás-Barberán, F.A., et al. (2014). A Rosemary Extract Rich in Carnosic Acid Selectively Modulates Caecum Microbiota and Inhibits β-Glucosidase Activity, Altering Fiber and Short Chain Fatty Acids Fecal Excretion in Lean and Obese Female Rats. PLoS ONE 9, e94687.

Ryberg, H., Ryberg, M., and Sundqvist, C. (1993). Plastid ultrastructure and development. Pigment-Protein Complexes in Plastids: Synthesis and Assembly 25–62.

Sadanandom, A., Poghosyan, Z., Fairbairn, D.J., and Murphy, D.J. (2000). Differential Regulation of Plastidial and Cytosolic Isoforms of Peptide Methionine Sulfoxide Reductase in Arabidopsis. Plant Physiology 123, 255–264.

Samson, G., and Bruce, D. (1996). Origins of the low yield of chlorophyll a fluorescence induced by single turnover flash in spinach thylakoids. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics 1276, 147–153.

Scandalios, J.G. (1993). Oxygen stress and superoxide dismutases. Plant Physiology 101, 7.

Scandalios, J.G. (2005). Oxidative stress: molecular perception and transduction of signals triggering antioxidant gene defenses. Brazilian Journal of Medical and Biological Research 38, 995–1014.

- 149 - Références bibliographiques

Scheler, U., Brandt, W., Porzel, A., Rothe, K., Manzano, D., Božić, D., Papaefthimiou, D., Balcke, G.U., Henning, A., Lohse, S., et al. (2016). elucidation of the biosynthesis of carnosic acid and its reconstitution in yeast. Nature Communications 7, 12942.

Schmid-Siegert, E., Stepushenko, O., Glauser, G., and Farmer, E.E. (2016). membranes as structural antioxidants recycling of malondialdehyde to its source in oxidation-sensitive chloroplast fatty acids. Journal of Biological Chemistry 291, 13005–13013.

Schreiber, U. (1986). Detection of rapid induction kinetics with a new type of high-frequency modulated chlorophyll fluorometer. Photosynthesis Research 9, 261–272.

Schwab, K.B., and Heber, U. (1984). Thylakoid membrane stability in drought-tolerant and drought-sensitive plants. Planta 161, 37–45.

Schwarz, K., and Ternes, W. (1992). Antioxidative constituents of Rosmarinus officinalis and Salvia officinalis: II. Isolation of carnosic acid and formation of other phenolic diterpenes. Zeitschrift Für Lebensmittel-Untersuchung Und -Forschung 195, 99–103.

Shao, H., Chu, L., Shao, M., Jaleel, C.A., and Hong-mei, M. (2008). Higher plant antioxidants and redox signalling under environmental stresses. Comptes Rendus Biologies 331, 433–441.

Shao, N., Duan, G.Y., and Bock, R. (2013). A Mediator of Singlet Oxygen Responses in Chlamydomonas reinhardtii and Arabidopsis Identified by a Luciferase-Based Genetic Screen in Algal Cells. The Plant Cell 25, 4209–4226.

Sharabani, H., Izumchenko, E., Wang, Q., Kreinin, R., Steiner, M., Barvish, Z., Kafka, M., Sharoni, Y., Levy, J., Uskokovic, M., et al. (2006). Cooperative antitumor effects of vitamin D3 derivatives and rosemary preparations in a mouse model of myeloid leukemia. International Journal of Cancer 118, 3012–3021.

Sharma, P., and Dubey, R.. (2004). Ascorbate peroxidase from rice seedlings: properties of enzyme isoforms, effects of stresses and protective roles of osmolytes. Plant Science 167, 541–550.

- 150 - Références bibliographiques

Sharma, P., Jha, A.B., Dubey, R.S., and Pessarakli, M. (2012). Reactive Oxygen Species, Oxidative Damage, and Antioxidative Defense Mechanism in Plants under Stressful Conditions. Journal of Botany 2012, 1–26.

Shingai, Y., Fujimoto, A., Nakamura, M., and Masuda, T. (2011). Structure and Function of the Oxidation Products of Polyphenols and Identification of Potent Lipoxygenase Inhibitors from Fe-Catalyzed Oxidation of Resveratrol. Journal of Agricultural and Food Chemistry 59, 8180–8186.

Siefermann-Harms, D. (1987). The light-harvesting and protective functions of carotenoids in photosynthetic membranes. Physiologia Plantarum 69, 561–568.

Simkova, K., Moreau, F., Pawlak, P., Vriet, C., Baruah, A., Alexandre, C., Hennig, L., Apel, K., and Laloi, C. (2012). Integration of stress-related and reactive oxygen species-mediated signals by Topoisomerase VI in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences 109, 16360–16365.

Smirnoff, N. (2000). Ascorbate biosynthesis and function in photoprotection. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences 355, 1455–1464.

Song, Y., Yan, H., Chen, J., Wang, Y., Jiang, Y., and Tu, P. (2014). Characterization of in vitro and in vivo metabolites of carnosic acid, a natural antioxidant, by high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 89, 183–196.

Stadtman, E.R. (1986). Oxidation of proteins by mixed-function oxidation systems: implication in protein turnover, ageing and neutrophil function. Trends in Biochemical Sciences 11, 11–12.

Staehelin, L.A. (2003). Chloroplast structure: from chlorophyll granules to supra-molecular architecture of thylakoid membranes. Photosynthesis Research 185–196.

Stahl, W., and Sies, H. (2003). antioxidant activity of carotenoids. Molecular Aspects of Medicine 24, 345–351.

- 151 - Références bibliographiques

Stofer Vogel, B., Wildung, M.R., Vogel, G., and Croteau, R. (1996). abietadiene synthase from grand fir (abies grandis) cdna isolation, characterization, and bacterial expression of a bifunctional diterpene cyclase involved in resin acid biosynthesis. Journal of Biological Chemistry 271, 23262–23268.

Sumio K., Kozi A. (1989). CuZn-Superoxide Dismutases in Rice: Occurrence of an Active, Monomeric Enzyme and Two Types of Isozyme in Leaf and Non-Photosynthetic Tissues, Plant and Cell Physiology, Volume 30, Issue 3, Pages 381–391

Szarka, G.D., Stark, B.H., and Burrow, S.G. (2012). Review of Power Conditioning for Kinetic Energy Harvesting Systems. IEEE Transactions on Power Electronics 27, 803–815.

Szymanska, R., and Kruk, J. (2010). Plastoquinol is the Main Prenyllipid Synthesized During Acclimation to High Light Conditions in Arabidopsis and is Converted to Plastochromanol by Tocopherol Cyclase. Plant and Cell Physiology 51, 537–545.

SzymańSka, R., Nowicka, B., and Kruk, J. (2014). Hydroxy-plastochromanol and plastoquinone-C as singlet oxygen products during photo-oxidative stress in Arabidopsis: Hydroxy-prenyl lipids as singlet oxygen products. Plant, Cell & Environment 37, 1464–1473.

Tang, Y.L., Ren, W.W., Zhang, L., and Tang, K.X. (2011). Molecular cloning and characterization of a tocopherol cyclase gene from Lactuca sativa (Asteraceae). Genetics and Molecular Research 10, 693–702.

Tashmukhamedova, M.A., Mukhina, O.A., Syrov, V.N., Khushbaktova, Z.A., Katkova, S.P., and Kosovskiĭ, M.I. (1992). [Hypoglycemic activity of bicyclic diterpenoids of the clerodane series as compared to adebit and maninil]. Probl Endokrinol (Mosk) 38, 48–50.

Tavadyan, L., Khachoyan, A., Martoyan, G., and Kamal-Eldin, A. (2007). Numerical revelation of the kinetic significance of individual steps in the reaction mechanism of methyl linoleate peroxidation inhibited by α-tocopherol. Chemistry and Physics of Lipids 147, 30–45.

Telfer, A. (2005). Too much light? How β-carotene protects the photosystem II reaction centre. Photochemical & Photobiological Sciences 4, 950.

- 152 - Références bibliographiques

Ternes, W., and Schwarz, K. (1995). Antioxidative constituents of Rosmarinus officinalis and Salvia officinalis: IV. Determination of carnosic acid in different foodstuffs. Zeitschrift Für Lebensmittel-Untersuchung Und -Forschung 201, 548–550.

Terzi, R., Kadioglu, A., Kalaycioglu, E., and Saglam, A. (2014). Hydrogen peroxide pretreatment induces osmotic stress tolerance by influencing osmolyte and abscisic acid levels in maize leaves. Journal of Plant Interactions 9, 559–565.

Tounekti, T., and Munné-Bosch, S. (2012). Enhanced Phenolic Diterpenes Antioxidant Levels Through Non-transgenic Approaches. Critical Reviews in Plant Sciences 31, 505–519.

Tounekti, T., Abreu, M.E., Khemira, H., and Munné-Bosch, S. (2012). Canopy position determines the photoprotective demand and antioxidant protection of leaves in salt-stressed Salvia officinalis L. plants. Environmental and Experimental Botany 78, 146–156.

Triantaphylidès, C., and Havaux, M. (2009). Singlet oxygen in plants: production, detoxification and signaling. Trends in Plant Science 14, 219–228.

Triantaphylides, C., Krischke, M., Hoeberichts, F.A., Ksas, B., Gresser, G., Havaux, M., Van Breusegem, F., and Mueller, M.J. (2008). Singlet Oxygen Is the Major Reactive Oxygen Species Involved in Photooxidative Damage to Plants. PLANT PHYSIOLOGY 148, 960–968.

Tripathy, B.C., and Oelmüller, R. (2012). Reactive oxygen species generation and signalling in plants. Plant Signalling & Behavior 7, 1621–1633.

Tsai, C.-W., Lin, C.-Y., Lin, H.-H., and Chen, J.-H. (2011). Carnosic Acid, a Rosemary Phenolic Compound, Induces Apoptosis Through Reactive Oxygen Species-Mediated p38 Activation in Human Neuroblastoma IMR-32 Cells. Neurochemical Research 36, 2442–2451.

Turner, I.M. (1994). Sclerophylly: Primarily Protective? Functional Ecology 8, 669.

Tuteja, N., and Tuteja, R. (2001). Unravelling DNA Repair in Human: Molecular Mechanisms and Consequences of Repair Defect. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 36, 261–290.

- 153 - Références bibliographiques

Tuteja, N., Singh, M.B., Misra, M.K., Bhalla, P.L., and Tuteja, R. (2001). Molecular Mechanisms of DNA Damage and Repair: Progress in Plants. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 36, 337–397.

Tuteja, N., Ahmad, P., Panda, B.B., and Tuteja, R. (2009). Genotoxic stress in plants: Shedding light on DNA damage, repair and DNA repair helicases. Mutation Research/Reviews in Mutation Research 681, 134–149.

Umeno, D., and Arnold, F.H. (2003). A C35 Carotenoid Biosynthetic Pathway. Applied and Environmental Microbiology 69, 3573–3579.

Ushimaru, T., Maki, Y., Sano, S., Koshiba, K., Asada, K., and Tsuji, H. (1997). Induction of Enzymes Involved in the Ascorbate-Dependent Antioxidative System, Namely, Ascorbate Peroxidase, Monodehydroascorbate Reductase and Dehydroascorbate Reductase, after Exposure to Air of Rice (Oryza sativa) Seedlings Germinated under Water. Plant and Cell Physiology 38, 541–549.

Wada, M. (2004). Evaluation of quenching effects of non-water-soluble and water-soluble rosemary extracts against active oxygen species by chemiluminescent assay. Food Chemistry 87, 261–267.

Wagner, D. (2004). The Genetic Basis of Singlet Oxygen-Induced Stress Responses of Arabidopsis thaliana. Science 306, 1183–1185.

Wang, T., Takikawa, Y., Tabuchi, T., Satoh, T., Kosaka, K., and Suzuki, K. (2012). Carnosic acid (CA) prevents lipid accumulation in hepatocytes through the EGFR/MAPK pathway. Journal of Gastroenterology 47, 805–813.

Wellburn, A.R., and Lichtenthaler, H. (1984). Formulae and Program to Determine Total Carotenoids and Chlorophylls A and B of Leaf Extracts in Different Solvents. In Advances in Photosynthesis Research, C. Sybesma, ed. (Dordrecht: Springer Netherlands), pp. 9–12.

- 154 - Références bibliographiques

Wellwood, C.R.L., and Cole, R.A. (2004). Relevance of Carnosic Acid Concentrations to the Selection of Rosemary, Rosmarinus officinalis (L.), Accessions for Optimization of Antioxidant Yield. Journal of Agricultural and Food Chemistry 52, 6101–6107.

Wen, F., Xing, D., and Zhang, L. (2008). Hydrogen peroxide is involved in high blue light-induced chloroplast avoidance movements in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany 59, 2891–2901.

Wenkert, E., Fuchs, A., and McChesney, J.D. (1965). Chemical Artifacts from the Family Labiatae. The Journal of Organic Chemistry 30, 2931–2934.

Werker, E., Ravid, U., and Putievsky, E. (1985). Structure of glandular hairs and identification of the main components of their secreted material in some species of the Labiatae. Israel Journal of Botany 34, 31–45.

Whittaker, M.M., and Whittaker, J.W. (1998). A Glutamate Bridge Is Essential for Dimer Stability and Metal Selectivity in Manganese Superoxide Dismutase. Journal of Biological Chemistry 273, 22188–22193.

Wijeratne, S.S.K., and Cuppett, S.L. (2006). Lipid Hydroperoxide Induced Oxidative Stress Damage and Antioxidant Enzyme Response in Caco-2 Human Colon Cells. Journal of Agricultural and Food Chemistry 54, 4476–4481.

Wijeratne, S.S.K., and Cuppett, S.L. (2007). Potential of Rosemary (Rosemarinus officinalis L.) Diterpenes in Preventing Lipid Hydroperoxide-Mediated Oxidative Stress in Caco-2 Cells. Journal of Agricultural and Food Chemistry 55, 1193–1199.

Willekens, H. (1997). Catalase is a sink for H2O2 and is indispensable for stress defence in C3 plants. The EMBO Journal 16, 4806–4816.

Willekens, H., Inzé, D., Van Montagu, M., and van Camp, W. (1995). Catalases in plants. Molecular Breeding 1, 207–228.

- 155 - Références bibliographiques

Wilson, D.F., Stubbs, M., Oshino, N., and Erecinska, M. (1974). thermodynamic relations between the mitochondrial oxidation-reduction reactions and cellular atp levels in ascites tumor cells and perfused rat liver. Biochemistry 13, 5305–5311.

Winkel-Shirley, B. (2002). biosynthesis of flavonoids and effects of stress. Current Opinion in Plant Biology 5, 218–223.

Wiseman, H., and Halliwell, B. (1996). damage to dna by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer. Biochemical Journal 313, 17.

Wood, Z.A., Schröder, E., Robin Harris, J., and Poole, L.B. (2003). structure, mechanism and regulation of peroxiredoxins. Trends in Biochemical Sciences 28, 32–40.

Woodson, J.D., Perez-Ruiz, J.M., and Chory, J. (2011). heme synthesis by plastid ferrochelatase i regulates nuclear gene expression in plants. Current Biology 21, 897–903.

Yadav, D.K., Kruk, J., Sinha, R.K., and Pospíšil, P. (2010). singlet oxygen scavenging activity of plastoquinol in photosystem ii of higher plants: electron paramagnetic resonance spin-trapping study. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics 1797, 1807–1811.

Yang, W., Cahoon, R.E., Hunter, S.C., Zhang, C., Han, J., Borgschulte, T., and Cahoon, E.B. (2011). vitamin e biosynthesis: functional characterization of the monocot homogentisate geranylgeranyl transferase: vitamin e biosynthesis: monocot hggt. The Plant Journal 65, 206–217.

Yazaki, K. (2005). transporters of secondary metabolites. Current Opinion in Plant Biology 8, 301–307.

Zbierzak, A.M., Kanwischer, M., Wille, C., Vidi, P.-A., Giavalisco, P., Lohmann, A., Briesen, I., Porfirova, S., Bréhélin, C., Kessler, F., et al. (2010). intersection of the tocopherol and plastoquinol metabolic pathways at the plastoglobule. Biochemical Journal 425, 389–399.

Zhang, Y., Yang, L., Zu, Y., Chen, X., Wang, F., and Liu, F. (2010). oxidative stability of sunflower oil supplemented with carnosic acid compared with synthetic antioxidants during accelerated storage. Food Chemistry 118, 656–662.

- 156 - Références bibliographiques

Zhang, Y., Smuts, J.P., Dodbiba, E., Rangarajan, R., Lang, J.C., and Armstrong, D.W. (2012). degradation study of carnosic acid, carnosol, rosmarinic acid, and rosemary extract ( rosmarinus officinalis l.) assessed using hplc. Journal of Agricultural and Food Chemistry 60, 9305–9314.

Zheng, W., and Wang, S.Y. (2001). antioxidant activity and phenolic compounds in selected herbs. Journal of Agricultural and Food Chemistry 49, 5165–5170.

Zou, J.-J., Li, X.-D., Ratnasekera, D., Wang, C., Liu, W.-X., Song, L.-F., Zhang, W.-Z., and Wu, W.-H. (2015). arabidopsis calcium-dependent protein kinase8 and catalase3 function in abscisic acid-mediated signalling and h2o2 homeostasis in stomatal guard cells under drought stress. The Plant Cell 27, 1445–1460.

Zwicke, M., Picon-Cochard, C., Morvan-Bertrand, A., Prud’homme, M.-P., and Volaire, F. (2015). What functional strategies drive drought survival and recovery of perennial species from upland grassland? Annals of Botany 116, 1001–1015.

- 157 - Références bibliographiques

- 158 - Annexes

VI. Annexes

Annexe 1 : Chromatogramme de l’ion extrait (XIC) du CA, m/z 331,19039 avec une précision de masse de 5 ppm dans : A) une solution du produit standard, B) un extrait de feuille de romarin, C) une solution de CA oxydé in vitro et leur spectre de masse (full MS) (D, E et F) et leur spectre de fragmentation (MS/MS) (G, H et I), respectif au temps de rétention de 7,4 min. La solution de standard est analysée dans les mêmes conditions chromatographiques et de spectrométries de masse que l’extrait de feuille de romarin et la solution oxydée, permettant une comparaison des temps de rétention, des spectres de masse (full MS) et de fragmentation (MS/MS) et l’identification précise du CA. Pour les expériences de MS/MS, 30% de l’énergie de collision normalisée est appliquée pour la fragmentation de la molécule déprotonée.

- 159 -

Annexes

Annexe 2 : XIC du CARN, m/z 329,17474 avec une précision de masse de 5 ppm dans : A) une solution du produit standard, B) un extrait de feuille de romarin, C) une solution de CA oxydé in vitro et leur spectre de masse (full MS) (D, E et F) et leur spectre de fragmentation (MS/MS) (G, H et I), respectif au temps de rétention de 5,7 min. La solution de standard est analysée dans les mêmes conditions chromatographiques et de spectrométries de masse que l’extrait de feuille de romarin et la solution oxydée, permettant une comparaison des temps de rétention, des spectres de masse (full MS) et de fragmentation (MS/MS) et l’identification précise du CARN. Pour les expériences de MS/MS, 20% de l’énergie de collision normalisée est appliquée pour la fragmentation de la molécule déprotonée.

- 160 -

Annexes

Annexe 3 : XIC de l’isorosmanol, m/z 345,16965 avec une précision de masse de 5 ppm dans : A) une solution du produit standard, B) un extrait de feuille de romarin, C) une solution de CA oxydé in vitro avec un agrandissement au temps de rétention attendu (D) et leur spectre de fragmentation (MS/MS) dans la solution standard (E) et dans la solution oxydée (F) au temps de rétention de 2,3 min. La solution de standard est analysée dans les mêmes conditions chromatographiques et de spectrométries de masse que l’extrait de feuille de romarin et la solution oxydée, permettant une comparaison des temps de rétention, des spectres de masse (full MS) et de fragmentation (MS/MS) et l’identification précise de l‘isorosmanol. Pour les expériences de MS/MS, 45% de l’énergie de collision normalisée est appliquée pour la fragmentation de la molécule déprotonée.

- 161 -

Annexes

Annexe 4 : XIC du rosmanol, m/z 345,16965 avec une précision de masse de 5 ppm dans : A) une solution du produit standard, B) un extrait de feuille de romarin, C) une solution de CA oxydé in vitro avec un agrandissement au temps de rétention attendu (D) et leur spectre de fragmentation (MS/MS) dans la solution standard (E) et dans la solution oxydée (F) au temps de rétention de 2,6 min. La solution de standard est analysée dans les mêmes conditions chromatographiques et de spectrométries de masse que l’extrait de feuille de romarin et la solution oxydée, permettant une comparaison des temps de rétention, des spectres de masse (full MS) et de fragmentation (MS/MS) et l’identification précise du rosmanol. Pour les expériences de MS/MS, 45% de l’énergie de collision normalisée est appliquée pour la fragmentation de la molécule déprotonée.

- 162 -

Annexes

Annexe 5 : XIC des potentiels 7-méthylrosmanol (5,1 min) et 7-méthylepirosmanol (5,5 min), m/z 359,1853 avec une précision de masse de 5 ppm dans : A) un extrait de feuille de romarin, B) une solution de CA oxydé in vitro et leur spectre de fragmentation (MS/MS) respectif (C et D ; E et F) à 5,1 et 5,5 min. Les informations obtenues à partir des spectres MS/MS sont en accord avec les données de la littérature (Song et al, 2014 ; Mena et al, 2016 ; Zhang et al, 2012). Pour les expériences de MS/MS, 30% de l’énergie de collision normalisée est appliquée pour la fragmentation de la molécule déprotonée.

- 163 -

Annexes

Annexe 6 : XIC d’isomères probables du rosmadial, , m/z 343,15400 avec une précision de masse de 5 ppm dans : A) un extrait de feuille de romarin, B) une solution de CA oxydé in vitro et leur spectre de fragmentation (MS/MS) respectif (C et D ; E et F) à 6,2 et 6,5 min. Les informations obtenues à partir des spectres MS/MS sont en accord avec les données de la littérature (Mena et al, 2016 ; Zhang et al, 2012). Pour les expériences de MS/MS, 30% de l’énergie de collision normalisée est appliquée pour la fragmentation de la molécule déprotonée.

- 164 -

Annexes

Annexe 7 : XIC des isomères potentiels du 5,6,7,10-tetrahydroxyrosmariquinone, m/z 301,17982 avec une précision de masse de 5 ppm dans : A) un extrait de feuille de romarin, B) une solution de CA oxydé in vitro et leur spectre de fragmentation (MS/MS) respectif (C et D ; E et F) à 7 et 8,2 min. Les informations obtenues à partir des spectres MS/MS sont en accord avec les données de la littérature (Song et al, 2014 ; Mena et al, 2016 ; Zhang et al, 2012). Pour les expériences de MS/MS, 50% de l’énergie de collision normalisée est appliquée pour la fragmentation de la molécule déprotonée.

- 165 -

Annexes

Annexe 8 : XIC du rosmaridiphénol potentiel, m/z 315,19547 avec une précision de masse de 5 ppm dans : A) un extrait de feuille de romarin, B) une solution de CA oxydé in vitro et leur spectre de fragmentation (MS/MS) respectif (C et D) au temps de rétention 6,6 min. Les informations obtenues à partir des spectres MS/MS sont en accord avec les données de la littérature (Ivanovic et al, 2009 ; Mena et al, 2016 ; Kontogianni et al, 2013). Pour les expériences de MS/MS, 40% de l’énergie de collision normalisée est appliquée pour la fragmentation de la molécule déprotonée.

Annexe 9 : XIC du potentiel 11,12-O-diméthylrosmanol, m/z 373,20095 avec une précision de masse de 5 ppm dans : A) un extrait de feuille de romarin, B) une solution de CA oxydé in vitro et son spectre de fragmentation (MS/MS)(C) au temps de rétention de 6,7 min. Les informations obtenues à partir des spectres MS/MS sont en accord avec les données de la littérature (Zhang et al, 2012). Pour les expériences de MS/MS, 20% de l’énergie de collision normalisée est appliquée pour la fragmentation de la molécule déprotonée. L’isomère détecté à 7,6 min ne correspond pas aux données de la littérature. Un fragment obtenu au m/z de 331,1921 indique probablement qu’une partie de la structure de la molécule est identique à celle du CA, et par conséquent que cette molécule est un produit de dégradation du CA.

- 166 -

- 167 -

Publication scientifique soumise dans Plant Physiology : Carnosic acid and carnosol, two major antioxidants of rosemary, act through different mechanisms Margot Loussouarn, Anja Krieger-Liszkay, Ljubica Svilar, Antoine Bily, Simona Birtić, Michel Havaux* CEA Cadarache, CNRS UMR 7265 BVME, Aix Marseille Université, Laboratoire d’Ecophysiologie Moléculaire des Plantes, F-13108 Saint-Paul-lez-Durance, France (M.L., M.H.) ; Naturex, 250 rue Pierre Bayle, BP 81218, F- 84911 Avignon Cedex 9, France (M.L., A.B., S.B.) ; Institut de Biologie Intégrative de la Cellule, CNRS, CEA Saclay, Institut de Biologie et de Technologie de Saclay, Université Paris-Sud, Gif-sur-Yvette, France (A. K.-L.) ; CRIBIOM, Laboratoire Nutrition, Obésité et Risque Thrombotique, Aix-Marseille Université, INRA, INSERM, 130O5 Marseille, France (L.S.).

Présentations posters : - Rencontre annuelle des doctorants des CEA de France (Porquerolles, 10/2014) - 23ème rencontre annuelle de l’école doctorale (Luminy, 04/06/2015) - Congrès européen de la fédération des sociétés européennes de la biologie végétale (Prague, 06/2016) - Journée de l’institut du BIAM, CEA, Cadarache (Cadarache, 09/2016)

Présentations orales : - 23ème rencontre annuelle de l’école doctorale (Luminy, 04/06/2015) Biochemical, metabolic and functional aspects of diterpenoids from Rosmarinus officinalis and theirs applications. - Séminaire interne de l’institut de biosciences et biotechnologies d’Aix-Marseille (Cadarache, 24/11/2016) L’acide carnosique et le carnosol, les super-antioxydants du romarin.

- 168 -

- 169 -

- 170 -

Résumé L’acide carnosique (CA) et le carnosol (CARN), deux diterpènes phénoliques spécifiques de la famille des Lamiacées, sont présents en abondance dans le romarin. Le CA extrait à partir de cette plante est largement utilisé dans l’industrie agroalimentaire, nutraceutique et cosmétique pour ses propriétés antioxydantes portées par la présence d’un groupe catéchol. Malgré un grand nombre d’applications industrielles, le rôle de ce composé in planta n’a reçu que très peu d’attention. De plus, il existe peu de données sur les mécanismes antioxydants du CA et de son principal dérivé d’oxydation, le CARN, contre les espèces réactives de l’oxygène (ERO). Enfin, en dépit du travail pionnier de Munné-Bosch et son équipe, l’impact des facteurs abiotiques sur la dynamique de consommation et la régulation de la voie de biosynthèse du CA a été peu étudié.

Résultats : Des analyses par HPLC-UV et imagerie d’autoluminescence révèlent que le CA et le CARN protègent les lipides (acide 1 • linolénique, MGDG et biomembranes) contre des oxydations in vitro médiées par les ERO telles que O2 et HO . Pourtant, lors de la préservation des lipides, des analyses de spectrométrie de masse indique que le CA est oxydé en une variété de dérivés, dont le CARN, alors que le CARN résiste. L’utilisation d’une sonde de spin et de la spectroscopie RPE montre que le CA est un piégeur chimique des ERO, contrairement au CARN. L’action inhibitrice du CARN sur des oxydations de lipides à l’obscurité induites in vitro par un hydroperoxyde lipidique ou in vivo par l’action d’une lipoxygenase (condition non productrice d’ERO) indique que le CARN interfère avec le processus de peroxydation lipidique bloquant ainsi l’oxydation des lipides. Des études in vivo de deux variétés de romarin contrastées en CA exposées à un stress photooxydant montrent que le CA protège les lipides in planta. Une étude non-exhaustive des variations de CA, de CARN et d’α-tocophérol en fonctions des facteurs abiotiques met en avant qu’une forte intensité lumineuse et d’importantes fluctuations de températures favorisent la réponse antioxydante du CA qui s’oxyde en CARN et l’accumulation d’α-tocophérol. Des analyses de RT-qPCR montrent que les facteurs abiotiques ne stimulent pas la voie de biosynthèse du CA, contrairement à celle de l’α-tocophérol. La technique d’imagerie d’autoluminescence montre que les extraits de romarin protègent des matrices alimentaires (viandes) à la lumière et à l’obscurité aussi bien que les traitements classiques aux nitrites.

Conclusions : En condition de stress oxydant, le CA du romarin préserve les membranes biologiques par piégeage des ERO produisant une série de dérivés d’oxydation, dont le CARN, qui protègent également les membranes biologiques en bloquant la réaction en chaîne de la peroxydation lipidique. Contrairement au tocophérol, la culture de romarin en condition de stress oxydant conduit à une consommation du CA sans compensation par stimulation de la voie de biosynthèse. Le romarin a ainsi développé un système antioxydant original qui participe probablement à sa bonne adaptation aux conditions parfois extrêmes du climat méditerranéen.

Mots clés : acide carnosique, carnosol, diterpènes phénolique, antioxydants, ERO, stress oxydant, peroxydation lipidique

Abstract Carnosic acid (CA) and carnosol (CARN), two phenolic diterpenes specific of the Lamiaceae family, are highly abundant in rosemary species. CA extracted from rosemary is used by the food, nutrition-health and cosmetic industries for its antioxidative features, possibly endowed by it catechol group. Despite numerous industrial applications, the role of CA in planta has received very little attention. Moreover, our knowledge is scarce on the antioxidative mechanisms of CA or of its major oxidative derivative, CARN, against reactive oxygen species (ROS). Lastly, in spite of the pioneer work by the Munné-Bosch’s team, the impact of abiotic factors on the consumption and biosynthesis dynamics of CA has so far not been investigated extensively.

Results: Analyses, using HPLC-UV and luminescence imaging revealed that CA and CARN protect lipids (linolenic acid, MGDG 1 • and biomembranes) from in vitro oxidation mediated by ROS such as O2 and HO . However, upon ROS oxidation of lipids, mass spectrometric analyses indicated that CA was oxidized into various derivatives, including into CARN, while CARN resisted. Using spin probes and EPR detection, we confirmed that CA, rather than CARN, is a ROS quencher. The inhibitory effect of CARN on lipid peroxidation induced in vitro by a lipid hydroperoxide or in vivo by lipoxygenase (ROS non-producing conditions) indicated that CARN interferes with lipid peroxidation by blocking this process. In vivo studies of two rosemary varieties contrasted in their CA content exposed to photooxidative stress showed that CA protects lipids in planta. A non-exhaustive study of CA, CARN and α-tocopherol variations in response to abiotic factors showed that high light and temperature fluctuations lead to CA oxidation into CARN and to α-tocopherol accumulation. RT-qPCR analyses revealed that abiotic factors do not stimulate CA biosynthesis genes in contrast with the α-tocopherol pathway. Luminescence imaging showed that rosemary extracts are able to protect food matrices (meat) against oxidation in the light and in darkness as efficiently as classical treatments with nitrites.

Conclusions: Under oxidative stress condition, rosemary CA preserves biological membranes by ROS scavenging, hence producing a set of oxidative derivatives, including CARN, which protect biological membranes by blocking the lipid peroxidation chain reaction. Growth of rosemary under oxidative stress conditions led to CA consumption without compensatory biosynthesis. Thus, rosemary has developed an original antioxidative mechanism which is probably an important component of the adaption capacities of this species to the Mediterranean climate conditions.

Key words: carnosic acid, carnosol, phenolic diterpenes, antioxidants, ROS, oxidative stress, lipid peroxidation