Universidade Do Vale Do Itajaí Programa De Pós-Graduação Em Ciência E Tecnologia Ambiental Curso De Mestrado Em Ciência E Tecnologia Ambiental

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA AMBIENTAL CURSO DE MESTRADO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA AMBIENTAL

AVALIAÇÃO DO IMPACTO AMBIENTAL DO FORMICIDA MACEX: UTILIZAÇÃO DE UMA BATERIA DE BIOTESTES AQUÁTICOS PARA ANÁLISE TOXICOLÓGICA

Renan Chiprauski Testolin

Itajaí, SC, julho 2013

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA AMBIENTAL CURSO DE MESTRADO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA AMBIENTAL

AVALIAÇÃO DO IMPACTO AMBIENTAL DO FORMICIDA MACEX: UTILIZAÇÃO DE UMA BATERIA DE BIOTESTES AQUÁTICOS PARA AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA

Renan Chiprauski Testolin

Dissertação apresentada à Universidade do Vale do Itajaí, como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciência e Tecnologia Ambiental.

Orientador: Claudemir Marcos Radetski, Dr.

Itajaí, SC, julho 2013

AGRADECIMENTOS

Ao professor Dr. Claudemir Marcos Radetski, pela orientação, confiança, amizade e disponibilidade para o desenvolvimento deste trabalho.

A minha família, em especial aos meus pais Sergio e Iris, meu irmão Alexandre e a minha companheira Tatiane, pelo apoio incondicional.

A colega de curso e grande amiga, Albertina.

Aos colegas do Laboratório de Remediação Ambiental.

A Universidade do Vale do Itajaí – UNIVALI.

A todos aqueles, que direta ou inderatamente, contribuíram para este trabalho.

iii

RESUMO As formigas desempenham um papel fundamental na ecologia dos ecossistemas. No entanto, quando as formigas se tornam indesejáveis causam prejuízos econômicos, sendo então combatidas com aplicação de formicidas. Por outro lado, o aumento da consciência ambiental e um maior rigor na legislação ambiental conclamam por uma diminuição da toxicidade dos agrotóxicos para minimizar/eliminar os impactos ambientais causados por estes produtos. Uma alternativa para este problema é a utilização de formicidas naturais em substituição aos produtos mais tóxicos disponíveis atualmente no mercado. Para a comercialização dos agroquímicos exige-se testes prévios para avaliar possíveis impactos ambientais sobre os organismos terrestres e aquáticos não-alvos. Assim, o objetivo deste estudo foi o de avaliar o impacto ambiental no ecossistema aquático causado pelo formicida natural Macex. Testes ecotoxicológicos com algas, peixes, bactérias e dáfnias, bem como testes de fitogenotoxicidade com Vicia faba e de hidrólise do diacetato de fluoresceína (atividade microbiológica) foram usados na avaliação, sendo que os resultados permitiram estabelecer a concentração máxima deste formicida que não causa toxicidade significativa nas espécies testadas. Os resultados dos testes de ecotoxicidade, com as concentrações -1 testadas de 0,03 até 2,0 g L , apresentaram valores de CE50 (ou CI50) variando de 0,49 (P. subcapitata) a > 2,0 g L-1 (D. rerio). Já para o teste de fitogenotoxicidade com V. faba, as concentrações testadas foram de 0,06 a 2,0 g L-1, onde se observou a formação de micronúcleos somente na concentração mais alta.

Palavras-chaves: Formigas; Agrotóxicos; Ecotoxicologia aquática, Vicia faba.

ABSTRACT

Ants play a key role in the ecology of the terrestrial ecosystems. However, when ants become undesirable, these organisms can cause economic losses and are then countered by the application of insecticides. But increased environmental awareness and more stringent environmental legislation calls for a reduction in the toxicity of pesticides, in order to mitigate the environmental impacts caused by these products. An alternative to this problem is the use of natural insecticides that can replace the currently commercialized toxic pesticides. Prior to marketing, agrochemicals must undergo testing to assess possible environmental impacts on aquatic and terrestrial non-target organisms. Thus, the objective of this study was to assess the environmental impact on the aquatic ecosystem caused by the natural pesticide Macex. For this purpose, ecotoxicity tests with algae, fish, daphnids and bacteria, as well as tests with Vicia faba and fluorescein diacetate hydrolysis (microbial activity), were performed in this evaluation. The results enabled us to establish that the maximum concentration of this pesticide that does not cause significant toxicity to the tested species. The EC50 (or IC50) values ranged from 0.49 (Pseudokirchneriella subcapitata) to > 2.0 g L-1 (Danio rerio). In the phytogenotoxicity test with Vicia faba, the tested concentrations ranged from 0.06 to 2.0 g L-1, but micronuclei formation was observed only at the highest concentration.

Keywords: Ants; Pesticides; Aquatic biotests, Vicia faba test.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS ...... 8 LISTA DE TABELAS ...... 9 SIGLAS E ABREVIAÇÕES ...... 10 1 INTRODUÇÃO ...... 11 2 OBJETIVOS ...... 14

2.1 Objetivo Geral ...... 14

2.2 Objetivos específicos ...... 14

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...... 15

3.1 Formigas...... 15

3.2 Aspectos Econômicos-Ambientais Relativos Às Formigas ...... 17

3.3 Agrotóxicos ...... 20

3.4 Testes ecotoxicológicos ...... 29

4 MATERIAIS E MÉTODOS...... 33

4.1 Preparação do Tóxico ...... 33

4.2 Testes de Ecotoxicidade ...... 33

4.2.1 Teste Lumistox com a bactéria Aliivibrio fischeri ...... 34

4.2.2. Teste de inibição do crescimento das algas Pseudokirchneriella subcapitata . 34

4.2.3 Teste de imobilidade com Daphnia magna ...... 35

4.2.4. Teste com peixe Danio rerio ...... 35

4.2.5. Determinação da atividade enzimática pela hidrólise da FDA...... 36

4.3 Teste de Genotoxicidade ...... 36

4.2.6 Teste de genotoxicidade com Vicia faba ...... 36

4.4. Análise estatística dos dados dos testes de ecotoxicidade ...... 37

5 RESULTADOS ...... 38

5.1 Teste de estabilidade toxicológica do macex ...... 38

5.2 Teste de toxicidade com Aliivibrio fischeri...... 39

5.3 Teste de toxicidade com Pseudokirchneriella subcapitata...... 40

5.4 Testes de Ecotoxidade do Macex com Daphnia magna...... 42

5.5 Testes de Ecotoxidade do Macex com Danio rerio ...... 43

5.6 Teste da Hidrólise Enzimática do FDA ...... 44

5.7 Teste de Genotoxicidade com Vicia faba ...... 45

6 DISCUSSÃO ...... 48 7 CONCLUSÃO ...... 52 8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 54 9 ANEXOS...... 66

9.1 Artigos ...... 66

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Ingredientes ativos mais comercializados no Brasil em 2009 em toneladas. FONTE: IBAMA, 2010...... 22

Figura 2 – Locais potenciais de ação dos inseticidas sobre o axônico e o terminais porções do nervo. Fonte: ECOBICHON, 2001...... 24

Figura 3 - Cálculo da área total de um formigueiro. FONTE: ZANETTI et al. 2005...... 27

Figura 4 – Fluxograma dos testes usados na avaliação ecotoxicológica e genotóxica do formicida Macex...... 33

Figura 5 – Valores de luminescência para as bactérias Aliivibrio fischeri expostas à diferentes concentrações do formicida Macex durante 30 minutos...... 39

Figura 6 - Valores médios da variação da fluorescência da alga Pseudokirchneriella subcapitata exposta à diferentes concentrações de Macex durante 72 h...... 41

Figura 7 - Valores médios de Daphnia magna imobilizada após 48 h de exposição a diferentes concentrações de Macex...... 42

Figura 8 - Valores médios da variação da absorbância devido à hidrólise do FDA por microorganismos presentes nas águas expostos à diferentes concentrações de Macex durante 72 h...... 44

viii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Áreas de plantio florestal com Eucalyptus e Pinus nos Estados do Brasil. FONTE: ABRAF capturado em 2012 ...... 19

Tabela 2 - Formicidas, dosagens e épocas de aplicação de alguns formicidas comercializados no Brasil. FONTE: GALLO et al. 2002...... 26

Tabela 3 - Valores de CSEO, CCEO e CI50 para as algas P. subcapitata expostas à diferentes concentrações do formicida Macex. Os valores são de 4 testes iniciados com 24 h de intervalo usando a mesma solução estoque de Macex no preparo das diluições...... 38

Tabela 4 - Valores de CSEO, CCEO e CI50 para as bactérias Aliivibrio fischeri expostas à diferentes concentrações do formicida Macex...... 40

Tabela 5 - Valores de CSEO, CCEO e CI50 para as algas P. subcapitata expostas à diferentes concentrações do formicida Macex...... 41

Tabela 6 - Valores de CSEO, CCEO e CI50 para Daphnia magna expostas à diferentes concentrações do formicida Macex...... 43

Tabela 7 - Valores médio de letalidade de Danio rerio, após 96 h de exposição à diferentes concentrações de Macex...... 43

Tabela 8 - Valores de CSEO, CCEO e CI50 para microorganismos aquáticos expostos à diferentes concentrações do formicida Macex...... 45

Tabela 9 - Ecotoxicidade do Macex obtidos através de quatro espécies de organismos- teste e outros dados de ecotoxicidade para formicidas comercializados a base de sulfluramida, fipronil e clorpirifos...... 49

SIGLAS E ABREVIAÇÕES

ABNT Associação Brasileira de Normas Técnicas

ABRAF Associação Brasileira de Produtores de Florestas Plantadas

CCEO Concentração Com Efeitos Observáveis

CE50 Concentração Efetiva (para 50% dos organismos expostos)

CI50 Concentração Inibidora (para 50% dos organismos expostos)

CL50 Concentração Letal (para 50% dos organismos expostos)

COT Carbono Orgânico Total

CSEO Concentração Sem Efeitos Observáveis

DBO Demanda Bioquímica de Oxigênio

DQO Demanda Química de Oxigênio

FDA Diacetato de Fluoresceína

IBAMA Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais

ISO International Organization for Standardization

MCN Micronúcleos

USEPA United States Environmental Protection Agency

1 INTRODUÇÃO

As formigas são um dos grupos de organismos que apresentam grande diversidade de espécies na Terra e estão presentes em todos os ecossistemas terrestres, exceto em regiões polares, algumas ilhas oceânicas e grandes altitudes (WARD, 2006). Com relação a diversidade, abundância relativa e impactos ecológicos, as formigas desempenham um papel importante em muitas comunidades, exibindo várias funções como organismos detritívoros, predadores e herbívoros. Nos ecossistemas tropicais as formigas são um componente notável, constituindo mais de 15% da biomassa animal total desses ecossistemas (BEATTIE & HUGHES, 2002).

Com relação aos insetos que se apresentam em sociedade, as formigas são as que mais se adaptaram às cidades, sendo que no Brasil estima-se que das 2000 espécies de formigas existentes, aproximadamente 50 espécies são pragas urbanas causando prejuízos na jardinagem e nas plantações urbanas (e.g., nos parques alimentando-se de sementes e desfolhando plantas) (CAMPOS-FARINHA et al., 2002). Já na agricultura, os prejuízos econômicos podem ser tanto na produção como no armazenamento. Também causam problemas em locais onde se manipulam alimentos, instituições de pesquisa, biotérios, zoológicos, museus, cabines de eletricidades e centrais telefônicas, pois são portadores de gérmens que podem contaminar estes diferentes locais.

Visando a proteção das culturas, o atual sistema de produção agrícola faz uso de produtos químicos estranhos às condições naturais dos agroecossistemas. Esta utilização de produtos químicos visa controlar populações de organismos em desequilíbrio, plantas daninhas e doenças que proliferam de maneira desordenada em função de ambientes favoráveis ao desenvolvimento destes organismos que são popularmente denominados de pestes (MOREIRA et al., 1996)

Dentre os produtos químicos estranhos aos ecossistemas naturais estão os pesticidas que também recebem a denominação de produtos agrotóxicos ou fitosanitários, os quais são moléculas sintetizadas para afetar determinadas reações bioquímicas de insetos, microrganismos, animais e plantas que se quer controlar ou eliminar. Busca-se desenvolver agrotóxicos com efeito específico em um dado organismo a ser eliminado, e assim, evitar que o efeito se manifeste nos outros seres que compõem os ecossistemas. Contudo, a introdução de agrotóxicos no ambiente agrícola pode provocar perturbações ou impactos ambientais, pois podem exercer uma pressão de seleção nos organismos e alterar 11

a dinâmica do ecossistema natural, tendo como conseqüência, mudanças na estrutura e na função do ecossistema (SPADOTTO et al., 2004). Por outro lado, Tiepo et al. (2010) definiram Pesticidas Verdes como biocidas naturais ou sintetizados produzidos de acordo com os princípios da química verde e que agem de forma específica sobre um alvo preciso, com o mínimo de efeitos prejudiciais ou nocivos sobre os componentes não-alvos presentes no ecossistema onde o produto foi aplicado. O Pesticida Verde na verdade é uma concepção ideal de um agrotóxico.

Enquanto as indústrias químicas se esforçam para desenvolver agrotóxicos menos impactantes para o meio-ambiente, os governos exigem, além dos estudos toxicológicos visando a proteção da saúde humana, estudos ecotoxicológicos que mostram a previsão de impacto ambiental destes produtos no ambiente antes de autorizar a comercialização dos mesmos. Nesse contexto, os testes ecotoxicológicos tem se consolidado como ferramenta importante para a compreensão dos impactos potenciais provocados por agentes químicos nas comunidades biológicas. Em decorrência da possibilidade de estender/extrapolar resultados da ecotoxicidade obtido com um organismo-teste para um grande número de organismos presentes no meio natural, esses biotestes tem sido empregados no gerenciamento, manejo e monitoramento do meio-ambiente. Assim, para o planejamento de políticas ambientais, criação de legislação específica e controle das emissões de efluentes, procede-se à avaliação de riscos ambientais e, para tanto, dados ecotoxicológicos e genotoxicológicos precisam ser gerados e usados nos setores de vigilância ambiental e de saúde publica (LOURENÇO, 2006).

Existe no mercado um formicida de composição natural denominado Macex e que, teoricamente, não deveria causar impacto ambiental significativo. Pelo fato deste produto ser usado no ecossistema terrestre, os poucos dados ecotoxicológicos existentes na literatura científica privilegiam este compartimento. Assim, Tiepo et al. (2010) sugeriram que o formicida Macex seja classificado como pesticida verde com base em testes de toxicidade com organismos terrestres: vegetais (Brassica oleracea, Lactuca sativa , Mucuna aterrima), anelídeo (Eisenia fetida) e colêmbolas (Folsomia cândida). A literatura não registra resultados de ecotoxicidade aquática e nem de genotoxicidade do Macex e sabe-se que a maioria dos agrotóxicos usados nos ecossistemas terrestres acabarão por atingir o ecossistema aquático, entrando em contato com os microorganismos e com os macroorganismos que compõem este ecossistema. É essa falta de dados ecotoxicológicos em organismos do meio aquático que justifica a escolha deste pesticida como objeto de

estudo nesta dissertação. Um teste de fitogenotoxicidade é de importância fundamental, visto que as alterações genéticas são efeitos à parte, não sendo observados nos testes ecotoxicológicos clássicos. A geração de dados preliminares servirá de base para futuras avaliações de risco ecológico que busquem um gerenciamento otimizado deste produto usado no controle das formigas que causam danos às culturas vegetais. Assim, o presente trabalho está vinculado ao laboratório de Remediação Ambiental – UNIVALI, onde o mesmo realiza estudos científicos nos diagnósticos ambientais e nas avaliação dos efeitos ecotoxicológicos e genotoxicológicos dos compostos químicos liberados no meio ambiente.

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Utilizar uma bateria de biotestes aquáticos para avaliação preliminar da ecotoxicidade e genotoxicidade potencial do formicida Macex.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Determinar as concentrações letais, efetivas ou inibidoras (ao nível de 50%) do formicida natural Macex para as espécies Danio rerio, Daphnia magna, Scenedesmus subspicatus e Aliivibrio fischeri;  Determinar se o formicida natural Macex é genotóxico ou não com o uso da espécie Vicia faba;  Determinar a concentração efetiva (ao nível de 50%) do formicida Macex nos microorganismos presentes nas águas naturais;  Estabelecer as Concentrações Sem Efeito Observado (CSEO) para todas as espécies testadas a fim de basear futuros estudos de análise de risco ecológico, permitindo o estabelecimento de valores-limites legais para este produto no meio-ambiente;

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 FORMIGAS

As formigas são um dos grupos de maior sucesso na história dos metazoários terrestres. Em média, as formigas apresentam de 15% a 20% da biomassa terrestre animal, e em regiões tropicais onde as formigas são especialmente abundantes, podem chegar a 25% ou mais. A família Formicidae soma mais de 9.500 espécies descritas e com número estimado de 3.000 a 9.000 espécies desconhecidas para a ciência (SCHULTZ, 2000). Constituem importantes componentes dos ecossistemas, não só por apresentarem uma grande biomassa animal, mas também porque as formigas agem como engenheiros dos ecossistemas (HOLLDOBLER & WILSON, 1986). Essa alta biodiversidade torna esses organismos altamentes sensíveis aos impactos ambientais, podendo reduzir essa biodiversidade (FOLGARAIT, 1998)

As formigas cortadeiras, pertencentes à tribo Attini, família Formicidae e subfamília Myrmicinae, representando um grupo especial de formigas associadas à vegetação. Neste grupo encontram-se os gêneros Atta e Acromyrmex. Embora existam outros gêneros, estes assumem pouca importância no forrageamento de plantas cultivadas (GIESEL, 2007). A tribo Attini (Hymenoptera: Formicidae) compreende 14 gêneros com aproximadamente 230 espécies de formigas descritas, que se especializaram em uma dieta essencialmente fungívora (SCHULTZ & BRADY, 2008).

Um formigueiro típico é formado internamente por dezenas ou centenas de câmaras (panelas) subterrâneas ligadas entre si e com a superfície por meio de galerias (canais). Nas diversas panelas, as formigas cultivam o jardim de fungo, criam suas larvas e depositam lixo. Externamente, o formigueiro apresenta um monte de terra solta, formado pelo acúmulo de terra extraída das câmaras, além de pequenos montículos e numerosos orifícios, denominados olheiros, os quais servem para ventilação, limpeza ou entrada de material vegetal coletado (HOLLDOBLER & WILSON, 1986). Dos olheiros de trabalho saem trilhas ou carreiros, que são os caminhos externos percorridos pelas formigas operárias à procura de material vegetal. As trilhas geralmente são superficiais e limpas (facilmente notadas) e muitas vezes bastante longas; terminam em olheiros que nem sempre indicam a localização das panelas do formigueiro (DELLA LUCIA & MOREIRA, 1993; ANJOS et al., 1998).

A população do formigueiro é constituída por indivíduos morfologicamente distintos, de acordo com suas funções na colônia. Estas formigas possuem castas permanentes e temporárias. As castas permanentes em Atta são compostas por uma fêmea áptera (rainha) fundadora do sauveiro (casta reprodutiva) e por operárias (fêmeas estéreis) que representam a maior parte da população e executam as mais variadas tarefas necessárias ao funcionamento do formigueiro. Nas castas temporárias, estão os machos (bitus) e fêmeas aladas (iças ou tanajuras), que aparecem nos formigueiros adultos anualmente, garantindo a reprodução das espécies (DELLA LUCIA et al., 1993a; GALLO et al., 2002). As operárias do gênero Atta são facilmente identificadas pela presença de três pares de espinhos no dorso do tórax (ANJOS et al., 1998; GALLO et al., 2002).

Devido aos vários efeitos que podem causar na cadeia trófica, as consequências ecológicas da ação das formigas sobre um ecossistema pode ser muito variado. No caso das espécies herbívoras, isto é, cortadeiras que cultivam um fungo simbionte, é conhecido que sua atividade cortadora nem sempre é negativa sobre a flora. Como estas espécies cortam geralmente partes específicas de plantas, podem regular o crescimento diferencial em uma mesma planta ou entre diferentes espécies de plantas, acelerando o crescimento de flores, por exemplo, ou de espécies vegetais específicas. Por sua vez, estas formigas acumulam grande quantidade de nutrientes em um só lugar, permitindo o crescimento de certos vegetais que não podem sobreviver em solo pobre dos arredores, exercendo desta forma, o papel de recicladores de nutrientes (BRASIL, 2012).

Outro efeito importante das formigas sobre um ecossistema é a predação sobre outros insetos e artrópodos (HOLLDOBLER & WILSON, 1986). Algumas espécies são muito eficientes como predadoras. É o caso das formigas-de-correção que arrasam com toda a fauna de uma zona, obrigando a colônia a migrar continuamente em busca de novos ambientes. A pressão depredadora destas e de outras formigas é tão importante que muitos organismos têm desenvolvido, durante sua evolução, mecanismos de defesa específicos contra formigas. É o caso de muitas vespas, cupins, mariposas e plantas (BRASIL, 2012).

Algumas espécies de formigas encontram-se associadas às atividades antrópicas causando incômodo, infestando aparelhos eletrônicos e podendo ainda causar sérios problemas na saúde pública quando a infestação se dá em hospitais (CAMPOS-FARINHA et al, 2002)

Segundo Boaretto & Forti (1997), para o controle de formigas cortadeiras de folhas pode-se usar métodos mecânicos, culturais, biológicos e químicos. O controle mecânico (ou manual) praticamente não é utilizado, em virtude de ser de viabilidade restrita a pequenas áreas e ninhos com até 4 meses de idade. Métodos químicos para controle de formigas cortadeiras são os mais frequentemente utilizados, sendo o produto químico aplicado diretamente nos ninhos, nas formulações em pó, líquido ou líquidos nebulizáveis, ou apresentado na forma de iscas granuladas que são aplicadas nas proximidades das colônias. Já o controle biológico certamente é uma área promissora de pesquisa, mas atualmente está clara a necessidade de conhecimentos biológicos básicos para que estratégias de controle para formigas cortadeiras possam ser de fato aplicadas. O preparo do solo como aração e gradagem podem ser importantes na eliminação de sauveiros iniciais e quenquenzeiros.

Entre os fatores comportamentais que podem influenciar no controle das formigas cortadeiras destacam-se: a comunicação química, a sensibilidade olfativa, a capacidade de aprendizagem, a seletividade e a produção de substâncias antibióticas. A comunicação química (via odores) é muito importante na defesa e na agressividade, na seleção de plantas, nas atividades sociais, corte e acasalamento e em outros tipos de comportamento. Essa comunicação química é essencial no sucesso das colônias de cortadeiras (MARINHO et al., 2006), sendo que estas causam impactos econômicos significativos, o que é abordado na seção seguinte.

3.2 ASPECTOS ECONÔMICOS-AMBIENTAIS RELATIVOS ÀS FORMIGAS No Brasil existem muitas áreas reflorestadas que apresentam problemas com as formigas. Por exemplo, as formigas cortadeiras estão entre as pragas mais importantes em fazendas brasileiras, porque seus ataques vorazes ocorrem durante o ano todo, se espalhando pelo país. O dano é imenso, trazendo prejuízos às culturas pequenas e grandes, culturas de frutas e legumes e pastos, sendo assim consideradas também como a praga "número 1” entre as empresas de reflorestamento (BRASIL, 2012), o que se tem se verificado também com outras espécies de formigas em outros países (GUTRICH et al., 2007).

Entre os problemas silviculturais dessas florestas implantadas, sobressaem as formigas cortadeiras dos gêneros Atta (saúvas) e Acromyrmex (quenquéns), que

alcançaram o nível de praga pela magnitude dos prejuízos que causam aos plantios de pastagens ou florestais (MACARONI et al., 1963; NICKELE et al., 2009). Os danos das formigas cortadeiras são mais expressivos nas plantas exóticas do que nas nativas, isso se deve provavelmente devido à baixa co-evolução existente entre esses grupos (DELLA LUCIA & VILELA, 1993).

Assim, as pastagens têm seu desenvolvimento prejudicado, pois o ataque de formigas leva à morte das plântulas e à má formação do pasto. Além do mais, as formigas competem diretamente com o gado pelo recurso forrageiro da área. Estudos demonstram que 10 sauveiros adultos ocupam uma área de 715 m² e consomem em média 21 kg de capim por dia, o equivalente a um boi em regime de pasto (GALLO et al., 2002).

No Brasil, as espécies vegetais mais usadas nos reflorestamentos são o Pinus e o Eucalyptus, sendo que as formigas cortadeiras destacam-se como as principais pragas, principalmente nas fases de pré-corte (áreas de reforma ou condução da floresta) e após o plantio ou no início da condução de brotação.

Segundo a Associação Brasileira de Produtores de Florestas Plantadas (ABRAF, 2013), a área ocupada de plantios em 2011 de Eucalyptus e Pinus no Brasil totalizou 6.515.844 há sendo 74,8% correspondente à área de plantios de Eucalyptus e 25,2% aos plantios de Pinus. A Tabela 1 apresenta os valores das áreas de plantio das respectivas espécies acima citadas nos diferentes estados do Brasil. Percebe-se na Tabela 1 que os estados do Paraná e Santa Catarina se destacam em áreas reflorestadas por Pinus por causa do clima predominante, pois a espécie rende mais em climas temperados, suportando melhor temperaturas mais baaixas.

As formigas cortadeiras causam danos significativos em plantios homogêneos, os quais favorecem o desenvolvimento dessas pragas pela falta de predadores naturais nas áreas de plantio. Assim, essas formigas são consideradas como fatores limitantes ao desenvolvimento da cultura, causando tanto perdas diretas, como a morte e a redução do crescimento de mudas e árvores; quanto indiretas, como a diminuição da resistência das árvores a outras pragas (ANJOS et al., 1993).

Tabela 1 – Áreas de plantio florestal com Eucalyptus e Pinus nos Estados do Brasil. FONTE: ABRAF capturado em 2012

Florestas Plantadas no Brasil (Km2) UF Eucalyptus Pinus Total % MG 1.401.787 75.408 1.477.195 22,70% SP 1.031.677 156.726 1.188.403 18,20% PR 188.153 658.707 846.860 13,00% BA 607.440 21.520 628.960 9,70% SC 104.686 538.254 642.941 9,90% RS 280.198 164.806 445.004 6,80% MS 475.528 11.871 487.399 7,50% ES 197.512 2.546 200.058 3,10% PA 151.378 - 151.378 2,30% MA 165.717 - 165.717 2,50% GO 59.624 10.760 70.384 1,10% AP 50.099 445 50.543 0,80% MT 58.843 - 58.843 0,90% TO 65.502 850 66.352 1,00% PI 26.493 - 26.493 0,40% RJ 8.844 - 8.844 0,10% OUTROS 470 - 470 0,00% TOTAL 4.873.951 1.641.893 6.515.844 100,00%

Segundo Zanetti et al. (2002), o ataque realizado pelas formigas cortadeiras é de maneira intensa e constante, podendo ocorrer danos em qualquer fase do desenvolvimento da planta, ocasionados por cortes de folhas, brotos, ramos finos e flores, os quais são carregados para o interior de ninhos subterrâneos, dificultando o seu controle.

Zanetti et al. (2002; 2004) descrevem dados quantitativos sobre o impacto das ações das formigas sobre plantas. Assim, estudos com Eucalyptus saligna demonstraram que as árvores desfolhadas à 100 % deixaram de produzir cerca de 40% da madeira no ano seguinte à desfolha e que as árvores com 50% de desfolha reduziram a produção da madeira em 13,2% no ano seguinte, comparativamente às árvores não desfolhadas. Já para o caso da espécie Pinus caribaea atacada pelas formigas, o crescimento em altura das árvores diminuiu em 12%, enquanto o diâmetro diminuiu de 17,4% e a mortalidade média aumentou em 11,7%. Quando árvores de Eucalyptus grandis de 6 meses de idade são

desfolhadas, elas tem 99,3% de probabilidade de morrerem, enquanto diminuem seus crescimentos de altura e diâmetro em 31,7% e 25,1%, respectivamente, provocando uma redução de 61,6% na produção da madeira, comparativamente às árvores não desfolhadas. As árvores com idade de 1 a 3 anos são as mais susceptíveis aos ataques das formigas, sendo que um desfolhamento total retarda significativamente o crescimento das mesmas, mas dois ou três desfolhamentos consecutivos geralmente levam as plantas à morte. Ainda segundo Zanetti et al. (2002), estudos demonstraram que a perda de rendimento em volume de madeira na espécie Pinus spp provocada por 5 formigueiros de Atta sexdens ficou em 14% e que quando a densidade de formigueiros da espécie Atta laevigata for maior que 30/ha em plantios de Pinus caribaea com menos de 10 anos de idade, há uma redução de mais de 50% na produção de madeira/ha. De uma maneira geral, há uma perda anual de 0,87% na produção do volume de madeira de Eucalyptus para cada 2,76 m2 de sauveiro/ha (ZANETTI et al., 2004).

Para evitar todas estas perdas produtivas, as empresas de reflorestamento tem empregado o controle químico de formigas cortadeiras de forma sistemática, através de iscas, termonebulização e fumigantes, sendo o aspecto econômico das operações de grande importância, em virtude dos altos custos envolvidos (FORTI & BOARETTO, 1997). Nesse sentido, 75% dos custos e do tempo gasto no controle de pragas florestais dizem respeito ao combate das formigas cortadeiras (ZANETTI et al., 2002)

Algumas considerações sobre o uso de agrotóxicos são abordadas nas seção seguinte.

3.3 AGROTÓXICOS

Os agrotóxicos e afins são definidos como os produtos originários de processos físicos, químicos ou biológicos que são destinados ao uso nos setores de produção, no armazenamento e beneficiamento de produtos agrícolas, nas pastagens, na proteção de florestas (nativas ou implantadas) e de outros ecossistemas, e também de ambientes urbanos (jardins e indústriais), cuja finalidade seja alterar a composição da flora ou da fauna, a fim de preservá-las da ação danosa de seres vivos considerados nocivos, podendo ser ainda substâncias e produtos empregados como desfolhantes, dessecantes, estimuladores e inibidores de crescimento (BRASIL, 2002).

Segundo Pope (2005), agrotóxicos são substâncias ou mistura de substâncias destinadas a prevenir, destruir, repelir ou mitigar qualquer praga (roedores, insetos, nematóides, fungos, plantas daninhas, de outras formas de planta terrestre ou aquático ou vida animal ou vírus, bactérias ou outros microorganismos, exceto os vírus, bactérias, ou outros microrganismos sobre ou dentro do homem. Pode ser também qualquer substância ou mistura de substâncias destinadas à utilização de um regulador de crescimento de planta, desfolhantes, dessecantes. No termo agrotóxico estão incluídos os termos herbicidas, inseticidas, nematicidas, fungicidas e fumigantes do solo, sendo que estas substâncias representam um grupo diversificado de produtos químicos inorgânicos e orgânicos (IMFELD & VUILLEUMIER, 2012).

De uma forma resumida, os agrotóxicos têm como objetivo o controle dos seres vivos considerados indesejáveis para a conservação de outros seres vivos, produtos ou do meio ambiente. Os agrotóxicos possuem em sua composição substâncias químicas tóxicas, denominadas ingredientes ativos, que interferem na atividade biológica normal dos seres vivos alvos de controle. O ingrediente ativo é o agente químico, físico ou biológico que confere eficácia aos agrotóxicos e afins (BRASIL, 1989).

A Figura 1 apresenta os ingredientes ativos para os quais há maior comercialização de agrotóxicos no Brasil. No entanto, no levantamento desses dados foi utilizado apenas valores declarados em marcas comerciais de produtos formulados.

Figura 1 – Ingredientes ativos mais comercializados no Brasil em 2009 em toneladas. FONTE: IBAMA, 2010.

Quando aplicados diretamente no solo, os agrotóxicos podem ser degradados por vias químicas, por fotólise ou por ação de microorganismos. Contudo as moléculas com alta persistência, ou seja, baixas taxas de degradação podem permanecer no ambiente sem sofrer qualquer alteração por um longo período (AMARANTE JUNIOR et al., 2006). Essas moléculas podem ser adsorvidas pelas partículas do solo, dessorvidas a partir dessas mesmas partículas, sofrer lixiviação e atingir os lençóis subterrâneos ou sofrer carreamento e atingir águas superficiais (VIJVER et al., 2008). Já nos ambientes aquáticos, os agrotóxicos podem sofrer adsorção ou dessorção das partículas de sedimentos, ser degradados por vias químicas, biológicas ou fotólise, bem como ser volatilizados. No ar, as moléculas na forma de gás ou de vapor podem ser transportadas por muitos quilômetros, atingindo áreas a grandes distâncias da região de aplicação (AMARANTE JUNIOR et al., 2006).

Para o presente trabalho, o interesse sobre agrotóxicos recai mais especificamente sobre os inseticidas, os quais são produtos à base de substâncias químicas ou agentes biológicos, de ação direta ou indireta, que provocam a morte dos insetos. Quimicamente, podem ser classificados de diferentes modos, sendo que uma delas é a divisão dos

inseticidas em três grandes grupos: os organoclorados; os inibidores da colinesterase (fosforados orgânicos e carbamatos) e os piretróides naturais e sintéticos (IBAMA, 2010).

Segundo Costa (2008), os inseticidas desempenham um papel mais relevante no controle dos insetos (como pragas), particularmente nos países em desenvolvimento. Todos os inseticidas químicos em uso hoje são neurotóxicos e agem por interferência no sistema nervoso dos organismos-alvo. O sistema nervoso central dos insetos é altamente desenvolvido e não tão diferentes dos mamíferos, bem como o sistema nervoso periférico que também apresenta semelhanças com os organismos superiores (ECOBICHON, 2001). Desta maneira os inseticidas não são seletivos em relação a espécie alvo no que diz respeito a toxicidade e os mamíferos, incluindo os humanos, são altamente sensíveis a sua toxicidade. Quando essa seletividade existe, esta é muita vezes, devido as diferenças na via de desintoxicação existentes entre insetos e humanos (COSTA 2008).

Muitos inseticidas afetam o sistema nervoso em diferentes locais. O desenvolvimento desses compostos tem sido baseado em relações específicas estrutura/atividade requerendo a manipulação de uma estrutura química básica com intuito de se obter uma forma ideal que afeta uma reação bioquímica específica em um organismo alvo. Esses locais ou reações específicos e/ou mecanismo de ação pode ser semelhantes em todas as espécies, no entanto, a dosagem (nível de exposição e duração) irá ditar a intensidade dos efeitos biológicos. Os locais potencias de ação dos inseticidas e suas interferências no transporte de íons de sódio, potássio, cálcio e cloretos nas membranas celulares podem ser visto na Figura 2 onde ocorre a inibição das atividades enzimáticas especificas ou a contribuição para a liberação e/ou a persistência dos transmissores químicos nas terminações nervosas (ECOBICHON, 2001).

Figura 2 – Locais potenciais de ação dos inseticidas sobre o axônico e o terminais porções do nervo. Fonte: ECOBICHON, 2001.

Entre a diversidade de produtos em que os invertebrados podem ser expostos, os inseticidas são o grupo com os maiores efeitos, seguido dos fungicidas. Isto é em parte devido à presença de receptores específicos bioquímicos (e.g., colinesterases, canais de íons) que são os alvos da ação inseticida e que são encontradas em todas as espécies de insetos (STRAALEN, 2004).

Os efeitos dos inseticidas (ou de qualquer agrotóxico) sobre a microflora do solo são de suma importância, devido ao fato de que muitas funções microbianas são fundamentais para a produção agrícola, sustentabilidade do solo e da qualidade ambiental (TOPP, 2003). O mecanismo de ação dos inseticidas em organismos microbianos pode ser diferente do

que os apresentados para os organismos alvos (i.e., insetos). Em microorganismos, os inseticidas tem apresentado interferência na respiração, na fotossíntese, em reações de biossíntese, bem como no crescimento, divisão e composição molecular (DELORENZO et al., 2001).

A literatura registra dados sobre a eficácia dos formicidas atualmente mais comercializados no Brasil, os quais são: sulfluramida, fipronil e clorpirifós. A sulfluramida (N- etilperfluoroctano sulfonamida) é o ingrediente ativo da isca granulada de Mirex-S Max, Dinagro-S, AttaMax e Pikapau sendo esses os produtos mais comercializadas no Brasil. Para esses produtos de isca granulado (0,6% de ingrediente ativo), Cameron (1990) relatou que 1,8 g.m-2 de formigueiro foi suficiente para controlar a formiga A. texana. O metabólito perfluoroctano sulfonamida (DESFA), atua no organismo no processo de fosforilação oxidativa, em nível mitocondrial, interrompendo a produção de ATP (SCHNELLMAN & MANNING, 1990).

O clorpirifos (O, O-dietilo O-3 ,5,6-tricloro-2-piridil fosforotioato) como formicida em isca é comercializado no Brasil como Fersol 480 EC e Landrin-F, entre outros. Oliveira & Zanuncio (1997) testaram este produto a base de clorpirifos para o controle da formiga Atta laevigata, mas as iscas são eficazes apenas quando a aplicação é realizada simultaneamente com um processo de fumigação (FORTI et al, 2003; TOMLIN, 2000). O Clorpirifós age por contato e ingestão. Como todo inseticida organofosforado, o clorpirifós liga-se ao centro esterásico da acetilcolinesterase (AChE), impossibilitando-a de exercer sua função, ou seja, hidrólise do neurotransmissor acetilcolina (ACh), em colina e ácido acético. Nos insetos, interfere com a transmissão dos impulsos nervosos, levando-os à paralisia e morte (TOMLIN, 2000).

O fipronil, comercializado como Blitz, Frontline, Regent 800 WG e outros, apresenta ação tóxica retardada na colônia de formigas, sendo eficaz em testes de laboratório a uma concentração de 5 ppm (FORTI & BOARETTO, 1997). O fipronil pertence à família dos fenilpirazóis. Seu mecanismo de ação baseia-se no bloqueio pré e pós-sináptico da passagem dos íons cloro pelos neurotransmissores (ácido gama amino butírico – GABA), matando os organismos por hiper-excitação (TOMLIN, 2000).

A Tabela 2 nos mostra as dosagens de alguns inseticidas comumentemente usados no combate de formigas cortadeiras.

Tabela 2 - Formicidas, dosagens e épocas de aplicação de alguns formicidas comercializados no Brasil. FONTE: GALLO et al. 2002.

Compasso (área média Época Formicida Dosagem/m2 de uma aplicação) aconselhável

Líquido

fenitrotion 5 ml + 0,5 L água 2 m2 Chuvosa (Sumithion 50 E)

clorpirifós (Lorsban 5 ml + 0,5 L água 2 m2 Chuvosa 480)

Pó

fipronil (Reagente 0,25 g + 0,5 L 50 ml/olheiro (aplicar em - 800 WG) água 2 olheiros)

permetrina (K- 30 g 3 m2 Seca Othrine 2%) Iscas fipronil (Blitz) 10 g - Seca

sulfuramida (Mirex-s) 10 g - Seca

A área do formigueiro é que determina a dosagem da maioria dos formicidas. Dentre as formas de calcular essa área, destaca-se a seguir o método da área total de terra solta. Por meio desse método, a área é obtida através da multiplicação do maior comprimento pela maior largura da área ocupada pelos montículos de terra solta (ZANETTI et al., 2005). Para economizar na quantidade de formicida usado, pode-se calcular área individual de cada ninho. As dimensões podem ser medidas com o auxílio de uma trena, ou com passadas largas de aproximadamente 1 metro.

Área Total = comprimento AB x comprimento CD (•) = olheiro de abastecimento.

Figura 3 - Cálculo da área total de um formigueiro. FONTE: ZANETTI et al. 2005.

Forti et al. (2003) compararam a eficiência formicida de iscas formulados com sulfluramida – 0.3% (Mirex-S Max e Dinagro-S), fipronil – 0.003% (Blitz) e clorpirifos – 0.125% (Pikapau) no controle da formiga Atta capiguara, cortadora de gramíneas. Foram avaliados a frequência de transporte das iscas, a devolução das iscas, a frequência de corte e cargas, a quantidade de formigas e a quantidade de solo solto nos ninhos. Estes parâmetros foram avaliados durante 232 dias após o tratamento e os autores concluíram que as iscas dos produtos Blitz e Pikapau não foram adequados para o controle de Atta capiguara, enquanto que Mirex-S Max (8 g m-2) e Dinagro-S (10 g m-2) apresentaram alta eficiência no controle das formigas.

Atualmente, o controle de formigas cortadeiras em áreas reflorestadas tem sido feito quase que exclusivamente com a aplicação de inseticidas convencionais, que podem provocar impactos negativos ao ambiente e ao homem. Alternativamente ao uso de inseticidas sintéticos, surgem outros produtos e métodos de controle, como o uso de produtos naturais, os quais têm sido utilizados para controlar pragas animais, doenças de plantas e ervas daninhas, desde os tempos antigos. As plantas têm sido as mais importantes fontes de pesticidas naturais durante séculos e preparações padronizadas para o ingrediente(s) ativo(s) através de métodos analíticos modernos tornou-se disponível nas últimas décadas, tornando possível a fabricação de produtos confiáveis (UJVÁRY, 2010).

Um produto considerado alternativo por sua composição natural é o formicida Macex, fabricado pela Macex do Brasil, localizada na cidade de Caçador, SC. A empresa afirma em seu site (www.macex.com.br) que este formicida é eficaz contra as formigas cortadeiras dos 27

gêneros Atta e Acromyrmex, os quais são os gêneros que causam maior impacto nas plantações brasileiras. A composição química do Macex é a seguinte: cafeína (0,04%), ácidos graxos (palmítico -1.5%, oleico -1.9%, linoleico – 6.2% e esteárico -0.4%), sendo que polpas de maçã e de cítricos agem como agentes atraentes.

Uma revisão da literatura não mostrou dados toxicológicos para os ácidos graxos concluindo-se que deve ser a cafeína o ingrediente ativo deste formicida. A cafeína é um alcalóide da família metilxantina, agindo como um produto químico de defesa em certas plantas e mostrando propriedades repelentes ou tóxicas (ARAQUE et al., 2007). As metilxantinas, incluindo a cafeína e a teofelina, são naturalmente produzidas em frutos, sementes e folhas de certas espécies de chás, café, cacau e cola. Entretanto, as metilxantinas naturais e sintéticas inibem a alimentação dos insetos e também são pesticidas, nas concentrações encontradas nas plantas. Esses efeitos são ocasionados principalmente pela inibição da atividade de fosfodiesterase e um aumento no ciclo intracelular do monofosfato de adenosina. Já em concentrações mais baixas, as metilxantinas são sinérgicos potentes de outros pesticidas por ativar a adenilato ciclase, a qual cataliza a conversão de ATP à AMPc em insetos (NATHANSON, 1984).

Enquanto a cafeína pode ser considerado um inseticida (ARAQUE et al., 2007), seria interessante avaliar se o produto Macex apresenta um impacto ecotoxicológico quando em contato com diferentes organismos que compõem os ecossistemas. O conhecimento pelo diagnóstico ecotoxicológico dos problemas causados pelo uso de agrotóxicos é de suma importância para uma visão prospectiva na avaliação do impacto ambiental das atividades relacionadas à agricultura, incluindo o uso de inseticidas. Essa informação pode subsidiar o desenvolvimento de alternativas que conduzem à sustentabilidade dos agroecossistemas (MOREIRA et al., 1996). Assim, com respeito às características do Macex, não se tem dados ecotoxicológicos deste formicida no ecossistema aquático, mas Tiepo et al. (2010) publicaram um artigo abordando a ecotoxicidade deste produto sobre organismos terrestres incluindo plantas (Brassica olaracea, Lactuca sativa e Mucuna aterrima), anelídeos (Eisenia foetida), colêmbolas (Folsomia candida) e microorganismos (hidrólise do diacetato de fluoresceína – FDA). O estudo mostrou que a maior concentração testada (i.e., 50 g kg-1 de solo seco) não apresentou toxicidade para os organismos testados. Esta ausência de toxicidade para estes diverssos organismos fez com que os autores sugerissem que o formicida Macex fosse considerado um formicida ambientalmente correto, isto é, com baixo impacto sobre os organismos não-alvos (TIEPO et al., 2010).

3.4 TESTES ECOTOXICOLÓGICOS

Segundo Lourenço (2006), os testes ecotoxicológicos constituem o elemento fundamental da Ecotoxicologia, os quais permitem avaliar o efeito da relação entre dose, tempo de resposta e efeitos dos organismos em teste, possibilitando estimar o potencial tóxico do agente químico testado. O mesmo autor ainda cita que o potencial tóxico de uma substância é calculado por meio de vários parâmetros que caracterizam sua ação, não em um individuo isolado, mas em uma população. Os organismos vivos podem exibir diferentes reações a uma mesma substância tóxica, dependendo do metabolismo próprio da espécie, das quantidades absorvidas e do tempo de exposição. Desta forma, os parâmetros de avaliação de toxicidade podem compreender desde alterações fisiológicas, bioquímicas e histológicas e até a letalidade. Os testes de toxicidade são divididos basicamente em dois tipos, o agudo e o crônico, podendo ainda estes serem estáticos (sem renovação do meio) e dinâmicos (com renovação do meio).

A ecotoxicidade, assim como a toxicidade humana, seja crônica ou aguda, é muito variável entre os agrotóxicos. Produtos muitos tóxicos para um organismo podem não ser para outros e vice-versa. Entretanto, organismos muitos sensíveis a um dado agrotóxico podem não ser expostos a ele em concentrações ou doses superiores aos níveis tóxicos sendo que a exposição é função da biodisponibilidade do agrotóxico ao organismo-teste (SPADOTTO, 2006).

A mensuração da sensibilidade (resposta) de um organismo frente à qualidade do seu ambiente em função do tempo pode ser denominada de biomonitoramento, o qual pode ser a nível bioquímico, fisiológico, morfológico e comportamental (KNIE & LOPES, 2004). Toda essa sensibilidade depende não somente do fator a ser monitorado, mas também do nível nutricional, idade do organismo, sexo, fase de desenvolvimento, características genéticas, competição entre indivíduos ou espécies, além de fatores laboratoriais/ambientais como luminosidade e temperatura do local onde o organismo é exposto (MAGALHÃES & FERRÃO FILHO, 2008).

A escolha dos organismo-testes geralmente segue alguns critérios, tais como: abundância e disponibilidade; representação ecológica; cosmopolitismo da espécie; conhecimento da sua biologia, fisiologia e hábitos alimentares; estabilidade genética e uniformidade de suas populações; baixo índice de sazonalidade; sensibilidade constante e apurada; importância comercial; facilidade de cultivo em laboratório e, se possível, a espécie

deve ser nativa para a melhor representatividade dos ecossistemas estudados (KNIE & LOPES, 2004).

Varias espécies de organismos vem sendo empregadas internacionalmente em testes de toxicidade, gerando subsídios importantes para uma melhor avaliação e caracterização dos efeitos agudos e crônicos de diversos agentes tóxicos por si só ou quando presentes em corpos receptores. Em outros termos, os testes de ecotoxicidade são ferramentas muito importantes nas avaliações de riscos ecológicos provocados por produtos químicos. Dentre os principais grupos de organismos utilizados em ensaios laboratoriais, destacam-se: microalgas, microcrustáCCEOs, equinóides, poliquetas, oligoquetas, peixes e bactérias, representando os mais diversos ecossistemas e níveis tróficos (MAGALHÃES; FERRÃO FILHO, 2008).

Assim, os testes de toxicidade são ferramentas desejáveis para avaliar a qualidade das águas e/ou a carga poluidora de efluentes, uma vez que somente as análises físico- químicas tradicionalmente realizadas (e.g., DQO, DBO, COT, concentrações de metais e de outras substâncias de caráter orgânico ou inorgânico), cujos limites encontram-se estabelecidos nas legislações ambientais, não são capazes de distinguir entre as substâncias que afetam os sistemas biológicos e as que são inertes no ambiente e, por isso, não são suficientes para avaliar o potencial de risco ambiental dos contaminantes (BOUDOU & RIBEYRE, 1989; FERRARI et al., 2004; PANDARD et al., 2006).

Segundo Warne (2003), em uma mistura, três tipos de efeitos combinados são referenciados: potenciação, sinergismo e antagonismo. A potenciação descreve os casos em que a toxicidade da mistura é igual à esperada por adição do efeitos tóxicos de cada um dos elementos da mistura. Já o sinergismo descreve casos em que a toxicidade da mistura está mais elevada do que o esperado se a mistura fosse aditivo. Por último, o antagonismo de uma mistura é realçada quando a sua toxicidade é menor do que a soma das toxicidades do substâncias que compõem a mistura (WANE, 2003; PANOUILLÈRES et al., 2007).

Um outro tipo de resposta paralela à toxicidade clássica é a genotoxicidade, a qual são agressões ao material genético. Há muito tempo já se conhece que no meio-ambiente existem muitos agentes físicos e químicos capazes de provocar alterações no material genético dos seres vivos (KIHLMAN, 1956), definidos aqui como agentes genotóxicos. O interesse maior de estudar os agentes genotóxicos é que esta classe de poluentes ameaça a integridade dos ecossistemas, pois estes dependem da sobrevivência e reprodução das

espécies/populações. Nesse sentido, a proteção das espécies/populações depende do desenvolvimento de sistemas eficazes de deteção de agentes genotóxicos no ar, na água e no solo. Uma abordagem mais pragmática do ponto de vista ambiental é a realização de testes in vivo e/ou in situ, os quais durante suas execuções experimentais integram as muitas variáveis ambientais que podem influenciar no potencial genotóxico de uma substância química (KLEKOWSKI, 1982; SANDHU et al., 1994). Entre os organismos que podem ser usados nestas avaliações genotóxicas, os vegetais ocupam um lugar de destaque (GRANT, 1994, COTELLE et al., 1999)

Dentre os vegetais que podem ser utilizados, o teste com a espécie Vicia faba pode ser considerado um dos mais simples (MA, 1982), permitindo variações experimentais maiores, o que é de interesse para o presente projeto. O teste com V. faba geralmente é baseado em aberrações cromossômicas e/ou formação de micronúcleos que podem ter origem clastogênica (quebra de cromossomos pelo tóxico) ou aneugênica (não-migração de algum cromossomo durante a divisão celular), sendo inclusive padronizado por organizações como a Associação Francesa de Normalização (AFNOR) e Organização Internacional de Padronização (ISO) para o caso da detecção de águas e solos contaminados (AFNOR, 2004; ISO, 2010).

Com relação ao impacto do formicida sobre os micro-organismos aquáticos, a hidrólise de FDA é um método que avalia a atividade hidrolítica indiscriminada e tem sido correlacionada positivamente com a respiração dos micro-organismos no solo (SCHNÜRER & ROSSWALL, 1982). Em particular, a atividade enzimática proporciona catálise de diversas reações que são necessárias ao ciclo de vida dos microrganismos, na decomposição de resíduos orgânicos durante o ciclo de nutrientes e na formação da matéria orgânica e na estrutura do solo (BURNS, 1978). Diversas pesquisas utilizando FDA para determinar a atividade enzimática já foram evidenciadas. As atividades enzimáticas (FDA, urease e β – glicosidase) serviram como indicadoras do potencial da funcionalidade dos ecossistemas e, aliadas aos demais atributos biológicos, tornam-se boas indicadoras da qualidade microbiológica de uma amostra (CARVALHO, 2005).

Por outro lado, as alterações de comportamento podem ser resultantes dos efeitos tóxicos e o comportamento dos organismos intoxicados permite explorar os possíveis mecanismos de intoxicação envolvidos na ação dos tóxicos (HODGSON, 2010). As formigas, sendo organismos eussociais (vivendo em comunidades), podem ter suas

mobilidades, comportamento e percepções alteradas pela influência do tóxico absorvido, pois sabe-se que mudanças de comportamento podem ter bases fisiológicas e/ou neurológicas (HODGSON, 2010). Qualquer mudança de comportamento nos organismos que vivem em comunidade pode inviabilizar a cooperação entre os organismos e destruir a comunidade (AYASSE et al., 2001).

4 MATERIAIS E MÉTODOS

A Figura 4 apresenta a sequência metodológica utilizada neste trabalho para a avaliação do formicida. Os testes de ecotoxicidade foram realizados no Laboratório Ecotec, localizado no município de Balneário Camburiú. Já os testes de genotoxicidade e hidrolise do FDA foram realizados no laboratório de Remediação Ambiental da UNIVALI. As metodologias empregadas no presente estudo foram baseadas em trabalhos publicados e são descritas a seguir.

Teste de Teste da hidrólise Preparação do Testes Teste de estabilidade enzimática do Resultados Macex ecotoxicológicos Genotoxicidade toxicológica FDA

Figura 4 – Fluxograma dos testes usados na avaliação ecotoxicológica e genotóxica do formicida Macex.

4.1 PREPARAÇÃO DO TÓXICO

Como o formicida Macex é comercializado na forma de pequenos grãos (iscas), este foi macerado usando um almofariz e pilão, obtendo assim um pó que foi homogeneizado em água destilada levemente aquecida, com intuito de facilitar a diluição e com uma temperatura máxima de 45 °C para que não ocorra a degradação térmica dos compostos, em um período de duas horas, sob agitação na concentração de 5 g L-1. Em seguida houve a diluição desta solução em diferentes concentrações que foram usadas na exposição dos organismos-testes.

4.2 TESTES DE ECOTOXICIDADE

Para a realização dos testes ecotoxicológicos foram utilizados neste trabalho cinco organismos testes, sendo eles: Danio rerio, Daphnia magna, Scenedesmus subspicatus, Aliivibrio fischeri e Vicia faba e uma mistura de microorgaanismos presentes nas águas naturais.

4.2.1 Teste Lumistox com a bactéria Aliivibrio fischeri

O teste bacteriano de inibição de luminescência utilizando Aliivibrio fischeri (anteriormente conhecido como Aliivibrio fischeri) como organismo-teste (Lumistox, Dr.Bruno Lange, Düsseldorf, Alemanha) foi realizado de acordo com a norma ISO (1996), seguindo as condições protocolares (23°C ± 2°C, com pH igual a 7 e tempo de exposição de 30 min.). O reagente bacteriano liofilizado foi obtido a partir da Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM # 7151 N, Braunschweig, Alemanha). Executou-se três ensaios diferente em duplicata a fim de avaliar a variabilidade do processo, onde o composto 3,5 diclorofenol a 6 mg L-1 foi utilizado com controle positivo. A diluição da amostra de formicida que causou 50% de inibição de luminescência das bactérias com relação às bactérias–controles (CI50) foi calculada pelo programa acoplado ao equipamento (Luminômetro), usando a interpolação gráfica.

4.2.2. Teste de inibição do crescimento das algas Pseudokirchneriella subcapitata

A espécie de alga utilizada foi a Pseudokirchneriella subcapitata (no passado conhecida por Selenastrum capricornutum) Chodat (cepa 86.81 SAG, Göttingen, Alemanha). Realizaram-se três testes com as algas de acordo com a ISO (1990), tendo, em cada teste, três replicas para cada concentração e controle. Como controle positivo utilizou-se dicromato de potássio. A densidade da mistura foi ajustada para 10.000 células.mL-1 através de diluição com meio ISO. Já os frascos do ensaio foram incubados em um agitador (100 rpm), com iluminação contínua de 70 mE m-2 s-1 com lâmpadas brancas fluorescentes (luz fria) e temperatura de 23 ± 2°C. Após 72 h de incubação, realizou-se a medição do efeito inibidor com base na atividade fluorescente (excitação/emissão foram fixados em comprimentos de ondas 488/685 nm) com um espectrofotômetro Shimadzu RF-551 (Kyoto, Japão).

Além disso, com intuito de verificar a estabilidade tóxica do Macex, foram realizados 4 ensaios com algas colocadas em microplacas (96 poços) em dias consecutivos de acordo com o procedimento descrito no Radetski et ai. (1995), usando sempre a solução de agente tóxico preparada no primeiro dia. Nestes testes com as microplacas, a pré-cultura de algas com idade de 3-d foi preparada de meio ISO concentrado 2 vezes. A densidade celular da mistura foi ajustada a 40.000 células.mL-1 e 110 µL dessa solução de algas foi micro

pipetado em 60 poços da microplacas (os poços exteriores não foram usados), onde também foram acrescentados 110 µL das soluções tóxicas concentradas 2 duas vezes (água para os controles). Aos se misturarem, as soluções de algas e de tóxico caem pela metade pela diluição entre elas. Antes da incubação, cada microplaca foi selada em sacos plásticos transparente para minimizar a evaporação durante o período de exposição. Ao fim de 72 h, os conteúdos das microplacas foram novamente suspensos e o volume total de cada poço foi micro-pipetado para uma frasco contendo 20 ml de uma solução eletrolítica (Isoton II, Coulter-França, Paris, França). O fator de diluição foi estimado em 20/0,22, tendo a evaporação sido inferior a 5%. As algas foram enumeradas com um contador Coulter (modelo ZM, a abertura da célula de 70 mm). A determinação da porcentagem de inibição, a área sob a curva de crescimento foi calculada com apenas dois tempos de exposição (exemplo 0 e 72 h). A determinação da concentração inibidora de 50% do crescimento (CI50) foi determinada pelo método Probit.

4.2.3 Teste de imobilidade com Daphnia magna

O teste de imobilização de Daphnia magna com duração de 48 horas foi realizado em conformidade com a norma ISO (1999) à 23±2°C, utilizando 5 indivíduos para cada réplica (com menos de 24 horas de vida) em copos de vidro de 50 mL com 30 mL do meio teste contendo o tóxico. Dois ensaios diferentes (em triplicatas) foram realizados para cada concentração do formicida e controle a fim de avaliar a variabilidade do processo, tendo o dicromato de potássio com controle positivo à 0,9 mg L-1. Após 48 h de exposição foi verificado o número de indivíduos imobilizados, o que permitiu a determinação do valor de CE50 através do teste de Fischer.

4.2.4. Teste com peixe Danio rerio

Os testes de toxicidade estáticos foram conduzidos de acordo com a norma ISO (1993) utilizando Danio rerio. As amostras de peixes zebras Danio rerio Hamilton Buchanan, foram obtidos a partir de um fornecedor comercial (indivíduos jovens, recém eclodidos) e aclimatados ás condições de teste com água sem cloro (pH: 8,1; condutividade: 56 mS.cm-1;

-1 -1 -1 OD: 10,5 mg L ; dureza total: 88 mg mg L de CaCO3; alcalinidade: CaO 71 mg mg L ) 9 dias antes da experiência. A concentração de oxigénio dissolvido nas soluções-teste foi medida no início e no fim da experiência utilizando um eletrodo de Oxigénio. Os peixes

foram expostos à diferentes concentrações de Macex durante 96 h, com três replicas de quatro indivíduos por diluição e colocados em frascos de 2,5 L de solução de teste ligeiramente arejadas sob 23±2°C, onde para os controles foi utilizado água da torneira sem cloro. Realizaram-se dois diferentes testes para cada concentração do tóxico a fim de verificar a variabilidade do processo, sendo que para o controle positivo utilizou-se dicromato de potássio (concentração de 97 mg mg L-1). Após 96 h de exposição foi verificado o número de indivíduos mortos, o que permitiu a determinação do valor de CI50 através do teste de Fischer.

4.2.5. Determinação da atividade enzimática pela hidrólise da FDA.

O método consiste em quantificar o Diacetato de Fluoresceína [3’,6’- diacetilfluoresceina (FDA)] hidrolisada em amostras que contém microorganismos. O teste foi iniciado com a preparação de uma solução tampão de fosfato de sódio 60 mM, pH 7,6

(8,7 g de K2HPO4 + 1,3 g KH2PO4 para 1 L de água), sendo que o pH foi ajustado com o HCl 0,01M. As amostras de água coletadas em campo foram distribuídas em tubos de ensaios (5 mL de amostra) em três repetições para cada amostra. Concluída esta fase, acrescentou-se 0,2 mL da solução de FDA (concentração final no tubo del 2 mg.mL-1). A preparação da solução de FDA foi feita pela dissolução de 40 mg de Diacetato de Fluoresceína (FLUKA) em 1 mL acetona p.a. e 15 mL água destilada. Posteriormente a esta etapa os frascos sem formicida e com diferentes concentrações do formicida foram fechados com folhas de alumínio e incubados na temperatura de 27ºC por até 72 h. As amostras foram analisadas no espectrofotômetro à 490 nm (Espectrofotômetro INSTRUTHERM, Modelo UV 1100). Os resultados foram expressos de forma bruta, em valores de variação das unidades de absorbância. A determinação da concentração inibidora de 50% da coloração (CI50) foi determinada pelo método Probit.

4.3 TESTE DE GENOTOXICIDADE

4.2.6 Teste de genotoxicidade com Vicia faba

Para os testes de genotoxicidade foram utilizadas sementes secas de Vicia faba. Um protocolo já publicado foi adotado com pequenas modificações para este teste (AFNOR, 2004). As sementes foram deixadas em água deionizada durante 24 h e depois se colocará as sementes entre duas camadas de algodão molhado a 22 ºC para 36

durante 3 dias para que a germinação pudesse ocorrer. Após a remoção das pontas das raízes primárias, as plantas foram colocadas em solução nutritiva Hoagland a 22 ºC durante 4 dias para promover o desenvolvimento de raízes secundárias. O formicida foi diluído em solução de Hoagland em uma série de diluição partindo da concentração de 5 g.L-1, tendo como controle negativo uma solução de Hoagland e controle positivo a hidrazida maleica (10 μM) (HM; CAS No. 123-33-1) diluído em solução nutritiva de Hoagland. Colocou-se 3 plantas de Vicia faba em cada recipiente contendo 100 mL da solução-teste em triplicatas por concentração, sendo que a exposição ocorreu em lugar escuro e com duração 72 horas sem renovação do meio de exposição. Após a exposição, as raízes secundárias foram lavadas com água deionizada em abundância. Para o teste de micronúcleo, a ponta de cada raiz foi cortada e fixada durante a noite em solução de Carnoy (25% de ácido acético glacial: etanol 75%, v:v) a 4 ºC e armazenada, se necessário, em etanol a 70% a 4 ºC. Em seguida, as pontas de raízes foram hidrolisadas em HCl 1 N a 60 ºC durante 6 minutos e esmagadas entre uma lâmina e uma lamela, sendo coradas com solução a 1% de aceto-orceína. As frequências de micronúcleos foram numeradas com 1.000 células por ponta de raiz (duas raízes por réplica) em um microscópio com aumento de 400X. Ao mesmo tempo, houve a anotação do número de células mitóticas. A razão entre o número de células na mitose e do número total de células é chamado o índice mitótico (IM), sendo este indicador de citotoxicidade, enquanto que o número de micronúcleos é indicador de gentoxicidade.

4.4. ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS DADOS DOS TESTES DE ECOTOXICIDADE

A análise estatística foi realizada através de um microcomputador utilizando o programa TOXSTAT 3.0. Utilizou-se o teste de William (P 0,05) para obter a concentração sem efeitos observáveis (CSEO) e menor concentração com efeitos observáveis (CCEO), após a verificação da normalidade pelo teste de Shapiro-Wilk e a homogeneidade da variância pelo teste de Hartley. Em alguns casos (peixe e dafnídeos) foi utilizados o teste de Fischer (P 0.05). Por fim, os valores de CI50 ou CE50 foram calculados por interpolação gráfica ou análise Probit.

5 RESULTADOS

5.1 TESTE DE ESTABILIDADE TOXICOLÓGICA DO MACEX

Em virtude da duração dos testes ecotoxicológicos, procurou-se conhecer a estabilidade tóxica do formicida Macex em solução em função do tempo. Assim, um experimento foi concebido para verificar se os compostos sofriam degradação em solução, o que se poderia perceber pela diminuição de sua toxicidade em função do tempo. Os resultados dos testes realizados com a mesma solução estoque do formicida, mas com idades diferentes, são mostrados na Tabela 3.

Intervalo de Dia CSEO (g L-1) CCEO (g L-1) CI50 (g L-1) Confiança (95%) 0,06 0,12 0,63 1

0,03 0,06 0,49 2

0,52 – 0,60 0,06 0,12 0,59 3

0,06 0,12 0,55 4

As leituras para os testes foram realizadas durante 4 dias com intervalo de 24 horas, totalizado para o ultima leitura um total de 7 dias após o preparo da solução estoque. Os resultados da Tabela 3 mostram que o Macex em solução é estável para o período testado, pois se contarmos desde o dia do preparo da solução estoque até o último dia do último teste. Assim, no conjunto dos dados obtidos, a CI50 média dos 4 testes foi de 0,56 g L-1 com um desvio-padrão de ± 0.06 g L-1 e um coeficiente de variação de 10.6%. Esta estabilidade tóxica do Macex assegura que os resultados dos testes não sofreram nenhum viés devido à degradação intrínseca do produto em solução. A estabilidade da toxicidade do produto pode ser explicada pela composição do formicida, pois os ácidos graxos e a cafeína não são facilmente degradados ou hidrolisados em solução com pH próximo do neutro. Entretanto,

não se realizou analise química para cada leitura e sim, só para a solução estoque a qual mostrou valor similar à concentração nominal com variação de concentração menor do que 10 % entre a concentração medida e a concentração nominal.

5.2 TESTE DE TOXICIDADE COM ALIIVIBRIO FISCHERI.

O teste de ecotoxicidade mais realizado no mundo em termos de custo e rapidez é o que utiliza a bactéria marinha bioluminescente Aliivibrio fischeri, o qual recebe o nome de Microtox® ou Lumistox®. Nesse teste é medida a redução da luminescência emitida naturalmente pela bactéria quando ela é posta em contato com um agente tóxico, o qual inibe a atividade da enzima luciferase. O tempo de duração do teste varia entre 15 e 60 min. Este teste é considerado rápido, sensível, fácil de executar e de baixo custo que pode ser utilizado no controle da poluição das águas e efluentes industriais, tendo este teste o maior banco de dados ecotoxicológicos. Em termos de amostras testadas. Apesar dessas vantagens é um teste criticado por empregar uma bactéria marinha de pouco significado ecológico (ZAGATTO e BERTOLETTI, 2006), no entanto, o metabolismo e o comportamento da A. fischeri é parecido com os das bactérias heterotróficas presentes no meio ambiente. Conforme mostra a Figura 4, houve diferença significativa na luminescência bacteriana entre os microrganismos controles e os que foram expostos ao formicida Macex.

Figura 5 – Valores de luminescência para as bactérias Aliivibrio fischeri expostas à diferentes concentrações do formicida Macex durante 30 minutos.

-1 Assim, para A. fischeri, o valor de CI50 foi de 0,89 g L , enquanto os valores de CSEO e CCEO foram de 0,12 g L-1 e 0,25 g L-1, como podem ser vistos na Tabela 4. Os valores dos coeficientes de variação, geralmente menores que 15%, são aceitáveis, visto que a literatura preconiza como valor aceitável de até 20%. Baseado nesses valores obtidos nos testes, o Macex apresenta baixa toxicidade, podendo assim concluir que a quantidade solubilizada do formicida no meio ambiente não afetará significativamente a atividade bacteriana dos ecossistemas aquáticos. O único estudo de ecotoxicologia aquática sobre o Macex encontrado na literatura e que usou A. fischeri, mostrou uma CI50 de 0,98 g L-1, com CSEO e CCEO de 0,25 e 0,50 g L-1, o que são valores muito próximos daqueles obtidos no presente trabalho (BURGA-PEREZ et al., 2013).

Tabela 4 - Valores de CSEO, CCEO e CI50 para as bactérias Aliivibrio fischeri expostas à diferentes concentrações do formicida Macex.

Macex CV CSEO CCEO CI50 Intervalo de Luminescência (g L−1) (%) (g L−1) (g L−1) (g L−1) confiança (95%) 0 1,23 15,2 0,03 1,21 12,8 0,06 1,28 9,5 0,12 1,19 13,7 0,12 0,25 0,89 0,87-0,91 0,25 1,04 10,6 0,5 0,89 12,3 1 0,4 15,9

5.3 TESTE DE TOXICIDADE COM PSEUDOKIRCHNERIELLA SUBCAPITATA.

Quando se trata de um teste crônico em meio aquático relativamente rápido, as algas ocupam lugar de destaque, pois a cada cerca de 20 h, uma nova geração de algas é formada. Os ensaios com algas também possibilitam determinar o potencial de eutrofização que os outros organismos aquáticos não medem. A Figura 5 mostra os resultados dos ensaios de inibição do crescimento das algas P. subcapitata expostas à diferentes concentração de Macex.

Figura 6 - Valores médios da variação da fluorescência da alga Pseudokirchneriella subcapitata exposta à diferentes concentrações de Macex durante 72 h.

-1 -1 Após análise estatítica obteve-se um valor de CI50 de 0,49 g L , CSEO de 0,06 g L e CCEO de 0,12 g L-1 (tabela 5) O estudo de Burga-Pérez et al. (2013) com Macex e P.

-1 subcapitata encontrou um valor de CI50 de 0,79 g L , com valores de CSEO e CCEO de 0,25 e 0,50 g L-1, respectivamente. Estes valores não são tão próximos aos encontrados neste trabalho realizado em Erlenmeyers, pois os testes realizados por Burga-Pérez et al. (2013) foram realizados em microplacas.

Tabela 5 - Valores de CSEO, CCEO e CI50 para as algas P. subcapitata expostas à diferentes concentrações do formicida Macex. Macex CV CSEO CCEO CI50 Intervalo de Fluorescência (g L−1) (%) (g L−1) (g L−1) (g L−1) confiança (95%) 0 1,49 13,5 0,03 1,54 14,9 0,06 1,42 10,8 0,12 1,21 13,5 0,06 0,12 0,49 0,44-0,54 0,25 1,09 18,1 0,5 0,71 11,5 1 0,31 20,3

5.4 TESTES DE ECOTOXIDADE DO MACEX COM DAPHNIA MAGNA.

Na Ecotoxicologia, o uso de espécies de pequeno porte e ciclo de vida não muito longo se mostram ideal nos estudos em laboratórios. A espécie Daphnia magna (entre outros cladóceros) tem o protocolo de cultivo em laboratório bem estabelecido e não apresenta muitas dificuldades para sua manutenção (ZAGATTO & BERTOLETTI, 2006). As dáfnias são importantes nas cadeias alimentares e são fonte significativa de alimento para peixes, como também são sensíveis a vários contaminantes do ambiente aquático (COSTA, 2008). Além disso, a reprodução assexuada desses crustáCCEOs por partenogênese garante a produção de organismos geneticamente idênticos permitindo, assim, a obtenção de organismos-teste com sensibilidade constante.

A Figura 6 mostra os resultados dos ensaios de mobilidade do cladócero Daphnia magna expostos à diferentes concentração de Macex.

Figura 7 - Valores médios de Daphnia magna imobilizada após 48 h de exposição a diferentes concentrações de Macex.

Os resultados da Tabela 5 mostram uma baixa toxicidade do formicida Macex face -1 ao cladócero Daphnia magna, uma vez que os valores CE50 foi de 0,68 g L e para o CSEO o valor foi de 0,12 g L-1 e CCEO de 0,25 g L-1, sendo esses valores próximos aos obtidos para A. fischeri e P. subcapitata. No estudo de Burga-Perez et al. (2013), os valores de CE50 encontrados para D. magna foi de 0,82 g L-1, enquanto os valores de CSEO e CCEO foram respectivamente de 0,25 e 0,50 g L-1.

Tabela 6 - Valores de CSEO, CCEO e CI50 para Daphnia magna expostas à diferentes concentrações do formicida Macex. Macex Imobilidade CSEO CCEO CE50 Intervalo de CV (g L−1) (%) (g L−1) (g L−1) (g L−1) confiança (95%) 0 0 - 0,03 0 - 0,06 0 - 0,12 6,7 12,3 0,12 0,25 0,68 0,61-0,75 0,25 20 13,1 0,5 43,3 15,8 1 80 14,6

5.5 TESTES DE ECOTOXIDADE DO MACEX COM DANIO RERIO

Os principais representantes dos consumidores secundários nas cadeias alimentares são os peixes (GHERARDI-GOLDSTEIN et al., 1990). Diversas espécies de peixes são utilizadas como bioindicadores. No Brasil a espécie mais utilizada é o Danio rerio, o qual é vulgarmente conhecido como peixe paulistinha ou peixe zebra. Outra espécie recomendada pela ABNT é Pimephales promelas (ABNT, 2004). Os peixes, por serem considerados como importante recurso alimentício, podem ser a principal via de contaminação de produtos químicos tóxicos para o homem, via bioacumulação, daí a sua importância como organismos indicadores.

A Tabela 7 mostra os resultados dos ensaios de letalidade do peixe Danio rerio expostos à diferentes concentração de Macex.

Tabela 7 - Valores médio de letalidade de Danio rerio, após 96 h de exposição à diferentes concentrações de Macex.

Macex Letalidade CSEO CCEO CL50 Intervalo de CV (g L−1) (%) (g L−1) (g L−1) (g L−1) confiança (95%)

0 0 - 0,06 0 - 0,12 0 - 0,25 0 - 1 2 >2 - 0,5 0 - 1 0 - 2 12,5 16,9 43

Os valores obtidos no teste de ecotoxicidade para Danio rerio nas diferentes concentrações do Macex não foram suficiente para calcular uma CL50. Entretanto os valores obtidos para CSEO e CCEO foram de 1,00 g L-1 e 2,00 g L-1 respectivamente. Assim os resultados sugerem uma baixo impacto ambiental do Macex para peixes após exposição aguda.

5.6 TESTE DA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO FDA

O impacto do Macex sobre a atividade hidrolítica dos microorganismos presentes nas águas naturais foi analizada pela variação da absorbância relativa à hidrólise do FDA, a qual forma a fluoresceína, deixando a solução com coloração verde. Assim, a Figura 8 mostra os resultados dos ensaios de variação da absorbância provocada pela hidrólise da FDA quando exposta aos microorganismos aquáticos expostos à diferentes concentração de Macex.

Figura 8 - Valores médios da variação da absorbância devido à hidrólise do FDA por microorganismos presentes nas águas expostos à diferentes concentrações de Macex durante 72 h.

Assim, para a hidrólise do FDA pelos microorganismos apresentados na Tabela 8, o

-1 -1 valor de CI50 foi > 1,0 g L , enquanto os valores de CSEO e CCEO foram de 0,25 g L e 0,50 g L-1. Estes valores podem ser comparados com os valores obtidos com o outro microorganismo usado neste trabalho, a bactéria A. fischeri, cujo valor de CI50 foi de 0,89 g L-1, enquanto os valores de CSEO e CCEO foram de 0,12 g L-1 e 0,25 g L-1. Poder-se-ía

concluir que os microorganismos naturais são um pouco mais resistentes à toxicidade do Macex, mas mesmo assim, o valor da CI50 foi relativamente alto, com baixa probabilidade de causar efeitos nefastos aos microorganismos, pois dificilmente encontraremos situações no meio ambiente onde o Macex estará em concentrações tão elevadas quanto estas.

Tabela 8 - Valores de CSEO, CCEO e CI50 para microorganismos aquáticos expostos à diferentes concentrações do formicida Macex. Macex CV CSEO CCEO CI50 Intervalo de Absorbância (g L−1) (%) (g L−1) (g L−1) (g L−1) confiança (95%) 0 0,95 15,8 0,03 0,99 16,9 0,06 0,88 17,8 0,12 1,02 16,5 0,25 0,5 >1 - 0,25 0,87 17,0 0,5 0,71 14,9 1 0,61 14,2

5.7 TESTE DE GENOTOXICIDADE COM VICIA FABA

A Figura 3 apresenta o índice mitótico e as frequências de micronúcleos obtidos na exposição de Vicia faba em diferentes concentrações do formicida. As concentrações de Macex até 0,25 g L-1 não promoveram efeitos no índice mitótico da Vicia faba, mas as concentrações de 0,5 e 2,0 g L-1 apresentaram uma diminuição estaticamente significativa no índice mitótico.

Em relação as frequência de micronúcleos, foi observado a não-indução para concentrações inferiores de 2,0 g L-1, enquanto que, o controle positivo (isto é, B2) mostrou um aumento significativo na frequência de micronúcleos em comparação com o controle negativo, ou seja, B1 (solução Hoagland).

Mcn/1000 células

60 Mcn 12

IM * 50 10

IM (%) * 40 8 **

30 6

20 4 * 10 2 **

0 0 0 0.125 0.25 0.5 2 HM Formicida (g L-1)

Figura 9 - Média (± DP) da frequência de micronúcleos (Mcn/1000 células) e índice mitótico (IM, %) em raízes de Vicia faba expostas 48h ao formicida Macex HM (hidrazida maleica): controle positivo. * diferença estatisticamente significativa com relação ao controle (P ≤ 0.05) ** diferença estatisticamente significativa com relação ao controle (P ≤ 0.01).

Na literatura não há relatos sobre a genotoxicidade/mutagenicidade dos ingredientes do Macex nas concentrações utilizadas para este estudo. A cafeína, possível ingrediente ativo do Macex, foi relatada como sendo fracamente mutagênica em alguns modelos animais não mamíferos. Nos ensaios de Salmonella (teste de Ames), não houve mutagenicidade e este composto (cafeína) não teve efeitos significativo na frequência de indução nas trocas de cromátides irmãs (KIHLMAN & STURELID, 1978)

Apesar do número pequeno de ensaios utilizados neste estudo, esses resultados são promissores em relação aos impactos ambientais a partir da genotoxicidade, pois enquanto o Macex não apresenta este efeito, o formicida clorpirifos tem sido relatado como genotóxico para a espécie de peixe da espécie Channa punctatus e em leucócitos de ratos (ALI et al., 2008; PORICHHA et al., 1998; RAHMAN et al., 2002.). Também há estudos relatando este

produto como genotóxico para células de raízes das plantas Crepis capilares, Allium cepa e para ensaio de micronúcleo com Tradescantia (ASITA & MAKHALEMELE, 2008; DIMITROV & GADEVA 1997; RODRIGUES et al., 1998).

6 DISCUSSÃO

A crise de biodiversidade que se observa atualmente é devido, entre outras causas, à presença de substâncias químicas tóxicas liberadas no meio ambiente. No caso dos agrotóxicos, um estudo recente analizou os índices de biodiversidade de invertebrados em riachos da França, Alemanha e Austrália (BEKETOV et al., 2013). Estes autores constataram perdas de até 42% para certas famílias e espécies, mesmo em regiões onde o uso de agrotóxicos está bem regulamentada, obedecendo aos padrões de proteção ambiental. Para se evitar este tipo de problema, é de fundamental importância o uso dos testes de ecotoxicidade antes de se liberar o produto para o mercado e mesmo depois de ser liberado, pois pode haver casos em que as transformações ambientais deixam os metabólitos do produto mais perigosos. Também podem existir espécies de organismos não testados previamente que possam ser sensíveis a este produto e/ou metabólitos. A Tabela 9 mostra baixos efeitos a curto prazo (testes agudos) de ecotoxicidade em diferentes espécies de organismos aquáticos. Com base nesses valores, é possível descrever a toxicidade do Macex como não sendo altamente tóxico, apresentando CE(CI)50 maiores que 0,1 g L-1, limite aceito como sendo não tóxico (KAMRIN, 1977). Essa baixa ecotoxicidade pode ser explicado pelo fato que os ingredientes do Macex não são tóxicos e também pelo fato que o produto comercializado mostra baixa solubilidade em água. Nesse sentido, alguns estudos realizados em várias regiões do mundo mostram que a porcentagem dos produtos utilizados na agricultura que atingem os ambientes aquáticos é geralmente baixa (JURY et al., 1987; SOLOMON et al., 1996). Deve-se salientar que os bioensaios utilizados para este estudo incluem organismos- testes requeridos pela Diretiva 91/414/CEE para os novos produtos químicos industriais (MARTINS et al. 2007).

Parâmetros -1 Organismos Produto (mg L ) (CI, CL ou Teste CE50) Macex Sulfluramida Fipronil Clorpirifos Inibição de 890 (30 > 100 2,8 Bacteria - luminescência min) (30 min) (30 min) >1000 Microorganismos Hidrólise FDA - - - (72 h) Inibição de 490 Alga 68,1 (96 h) 0,16 (96 h) 3,0 (96 h) crescimento (72 h) 680 Dafnia Imobilidade 0,39 (48 h) 0,19 (48 h) 0,0017 (48 h) (48 h) > 2000 Peixe Letalidade 9,9 85 0,43 (96 h)

Segundo a classificação de toxicidade aguda da Organização Mundial da Saúde (OMS), a sulfluramida é classificada como pouco perigoso, enquanto finopropil e clorpirifos são classificados como moderadamente perigosos. Entretanto, de acordo com os dados publicados, a ecotoxicidade destes inseticidas é diferente, com finopropil e clorpirifos sendo classificados como altamentes ecotóxicos (BARRON & WOODBURN 1995; GUNASEKARA et al. 2007) e enquanto sulfluramida e considerando como ligeiramente ecotóxico (KRIEGER, 2001).

No caso do Macex, a classificação da OMS para testes de toxicidade em ratos, permite classificar este inseticida como “Improvável que seja perigoso”, onde o valor de CE (CI ou CL)50 é maior que 100 mg kg-1 de peso corporal no teste oral agudo. Devido a este elevado valor tóxico apresentado pelo Macex, este não pode ser classificado de acordo com a Diretiva Europeia 93/67/CEE (Comissão Européia 1996). O principal composto ativo de ação deste químico (provavelmente a cafeína), interfere com os sistemas semioquimicos e não pode ser considerado um produto tóxico na concentração presente no Macex. Isto é apoiado com base em observações em campo, onde se verificou que as formigas não foram mortas pela a ingestão do produto, mas sim na alteração comportamental e por consequência desestruturação social da colônia, levando as mortes individuais.

Com relação aos ensaios de genotoxicidade realizados neste estudo, aplicou-se um teste ambiental baseado no ensaio de micronúcleos da V. Faba. Os níveis de citoxicidade

de um agente pode ser observado pelo índice mitótico, uma vez que este reflete o índice de freqüência da divisão celular, sendo considerado como um parâmetro importante na determinação da taxa de crescimento da raiz (FERNANDES et al. 2007). Os efeitos adversos genotóxicos e/ou mutagênicos dos pesticidas através da alteração genéticas induzidas nas sementes, leva à alterações na constituição genética na populações, o que é motivo de preocupação fundamental em se pensando em um ecossistema, pois um tempo prolongado de exposição crônica pode levar a mudanças na estrutura do ecossistema (WURGLER & KRAMERS 1992). Além disso, a presença de genotoxinas em qualquer compartimento ambiental é indesejável, em particular no ponto de vista de risco para os humanos (WURGLER & KRAMERS, 1992).

Os resultados mostram que o formicida Macex apresenta genotoxicidade apenas em concentrações muito altas (não realísticas), na ordem do ppmil para a V. faba. No entanto, os resultados mostraram que o índice mitótico (IM) da V. faba diminuiu significamente em uma concentração de 0,5 mg L-1 de formicida. O IM reflete a atividade mitótica dos meristemas e a diminuição deste índice é sinal de citoxicidade (AFNOR, 2004; SMAKA- KINCL et al., 1996; ÜNYAYAR et al., 2006). Além disso, a inibição da multiplicação celular prejudicará o crescimento das raízes (FUSCONI et al., 2006; NOODÉN, 1969). Assim, o aumento é resultados da indução da divisão celular, evento que pode ser caracterizado como prejudicial para as células (HOSHINA, 2002), mas ainda há pouca informação disponível na literatura em relação ao estudo relacionado ao índice mitótico e o desenvolvimento das plantas.

Os diferentes compartimentos ambientais estão recebendo cada vez mais mais produtos químicos de variadas composições, os quais necessitam de avaliações ecotoxicológicas, não só previamente à colocação no mercado, como após o uso no meio ambiente para poder avaliar o impacto ambiental em função das transformações que possam ter ocorrido durante a estadia e passagem da substância nos diferentes compartimentos. O contato desses produtos químicos com os organismos desses compartimentos acaba dificultando a compreensão de quais substâncias são mais perigosas para a fauna e para a flora. Os ensaios em laboratório ajudam nessa compreensão, pois pode-se trabalhar com uma única substância e assim, pode-se obter dados dos efeitos dessa substância em vários tipos de organismos (PAULUS, 2005; KLAUSENER et al., 2007).

Uma questão importante e que tem relação com o objetivo deste tabalho é a translocação/transferência das substâncias químicas entre os compartimentos. Nesse aspecto, o formicida natural Macex é aplicado no solo, mas existe a possibilidade de que parte do produto chegue no ecossistema aquático, principalmente pelo fenômeno de carreamento pelas águas das chuvas (PEREIRA et al., 2009; POGÃCEAN & GAVRILESCU, 2009), pois na forma de isca, este formicida é resistente à solubilização e a via de entrada deste formicida nos organismos é a via gástrica. Como já citado, Tiepo et al. (2010) publicaram um trabalho sobre a ecotoxicidade deste produto em alguns organismos terrestres, contudo, até a elaboração deste projeto de dissertação, não se encontrou na literatura nenhum trabalho de ecotoxicidade deste produto sobre organismos aquáticos, com exceção do trabalho de BURGA-PEREZ et al. (2013). Assim, os dados levantados nesta dissertação podem servir de base para futuros trabalhos relativos à ecotoxicidade do formicida Macex.

Do ponto de vista etológico, a base da estrutura social das formigas é o sistema de comunicação, sendo essencial para a troca de informações entre esses insetos e manutenção da ordem no formigueiro. Em virtude da falta de dados toxicológicos da cafeína frente às formigas é necessário também outros estudos com insetos sociais da ordem Himenoptera (por exemplo, abelhas e cupins) para avaliar os impactos do Macex nesse tipo de espécies e pesquisas mais detalhadas para compreender o mecanismo de ação do Macex com intuito de obter mais informações sobre o efeito no sistema de comunicação, o qual poderia justificar o conceito de formicida disruptor semiótico nesses insetos sociais.

7 CONCLUSÃO

Com relação a ecotoxicidade do Macex, os resultados mostraram que a alga P.

-1 subcapitata (CI50 de 0,49 g L para 72-h) foi a mais sensível das espécies estudada seguido -1 -1 por D. magna (CI50 de 0,68 g L para 48-h). As bactérias A. fischeri (CI50 0,89 g L para 30 min) apresentaram a menor toxicidade, juntamente com os microorganismos responsáveis -1 -1 pela hidrólise do FDA (CI50 >1,0 g L para 72 h) e o peixe D. rerio (CL50 > 2,0 g L para 24- h). Com base nos dados obtidos a partir dos testes de ecotoxicidade, o formicida Macex pode ser classificado como um produto de baixa toxicidade e baixo impacto sobre organismos não-alvos.

Nas concentrações testadas no teste de genotoxicidade (0,06 à 1,0 g L-1), não foi observado genotoxicidade, no entanto as concentrações de 0,5 g L-1 e 2,0 g L-1 mostraram diminuição do índice mitótico para V. faba, sendo que para a concentração de 2,0 g L-1 houve um aumento significativo no número de micronúcleos. Assim, os resultados mostraram que o Macex pode ser classificado como genotóxico, mas em altas concentrações em comparação a outros formicidas.

A possibilidade de lixiviação do Macex, evitando assim a dispersão do mesmo no meio ambiente e a interação das moléculas do inseticida com as partículas do solo antes destas atingirem as águas superficiais e subterrâneas pode fazer com que a ecotoxicidade potencial do Macex seja mais baixa comparativamente aos resultados dos biotestes em laboratório. Outro aspecto ambiental relacionado a utilização de formicidas é o fato de que estes não são utilizados apenas no contexto agrícola, pois as formigas estão presentes também em ambientes urbanos (GREY et al., 2005). Assim, o combate desses insetos por autoridades públicas, empresas privadas e manutenção de jardins particulares são potenciais consumidores dos formicidas e a exposição das pessoas á esses compostos tóxicos poderia ser evitada utilizando produtos de baixa toxicidade. A baixa genotoxicidade e ecotoxicidade deste formicida é devido ao seu mecanismo de ação, o qual possivelmente interfere nos sistema semioquímicos de comunicação entre os insetos, o que é especifico para os organismos da ordem dos Himenópteros.

Esses dados de toxicidade aquática do Macex podem ser muito úteis para gestores ambientais e comunidade científica. Entretanto, devido ao número limitado de testes e condições testadas, este estudo também deve ser considerado como uma investigação

inicial dos possíveis problemas decorrentes da aplicação do formicida no ambiente, sendo necessário uma maior amplitude de testes buscando conhecer aspectos específicos deste formicida frente a diferentes organismos.

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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9 ANEXOS

9.1 ARTIGOS