Diseño E Implementación De Nuevas Herramientas Para La Solubilización, Evolución Y Cristalogénesis De Proteínas”
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Tesis de Doctorado Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA) “Diseño e implementación de nuevas herramientas para la solubilización, evolución y cristalogénesis de proteínas” Magister Agustín Correa Tutor: Dr. Pedro M. Alzari Co-Tutor: Dr. Pablo Oppezzo Tribunal: Dr. Alejandro Buschiazzo Dr. Gualberto González Dr. Pablo Aguilar “Sin experimentación no hay verdad” Aristóteles 384-322 a.C. Contenido RESUMEN: ..................................................................................................................................... 3 INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................. 7 1. Expresión de proteínas recombinantes en E. coli, desafíos y soluciones ............................. 7 1.1 Generalidades ................................................................................................................. 7 1.2 Primeros pasos a seguir para la expresión de una PR. .................................................... 8 1.3 Promotores para la producción de PR y secuencias cercanas ........................................ 9 1.4 Cepas de E. coli utilizadas para la expresión de PRs ..................................................... 11 1.5 Condiciones de cultivo .................................................................................................. 15 1.6 Proteínas de Fusión o “tags”. ........................................................................................ 16 1.7 Evaluación de la expresión en forma HTS ..................................................................... 19 1.8 Renaturalización de cuerpos de inclusión ..................................................................... 20 1.9 Evolución dirigida para la expresión soluble de PR ....................................................... 21 1.10 Caracterización proteica.............................................................................................. 23 2. Generación de proteínas de unión ...................................................................................... 24 2.1 Generalidades ............................................................................................................... 24 2.2 Diferentes “scaffolds” para la generación de proteínas de unión y sus aplicaciones. .. 25 2.3 Diferentes métodos de selección para la obtención de “binders” ............................... 32 3. Cristalogénesis: nuevas estrategias para un viejo problema .............................................. 37 3.1 Generalidades ............................................................................................................... 37 3.2 Determinación de dominios o fragmentos proteicos para su cristalización ................. 39 3.3 Remoción de sitios glicosilados ..................................................................................... 40 3.4 Reducción de la entropía de superficie (SER) ................................................................ 41 3.5 Simetrización sintética de proteínas ............................................................................. 42 3.6 Fusión con proteínas para la cristalización ................................................................... 43 3.7 Proteínas de unión como chaperonas de cristalización ................................................ 45 OBJETIVOS ................................................................................................................................... 48 RESULTADOS ............................................................................................................................... 50 1. Generación de nuevas herramientas para la expresión soluble de PR. .......................... 50 2. Aplicación y caracterización de una nueva librería de Afitinas como inhibidores enzimáticos de glicosidasas. .................................................................................................... 63 3. Generación de nuevas herramientas para la cristalogénesis de PRs. ............................. 79 3.1 Fusiones covalentes al extremo C-terminal de CelD con proteínas blanco .................. 79 1 3.2 Generación de superficies de unión en CelD para obtener cristales de complejos entre CelD y la proteína blanco. ................................................................................................... 88 Materiales y métodos ............................................................................................................. 96 DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES ................................................................................................... 103 BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................................ 121 ANEXO I: .................................................................................................................................... 138 Tuning different expression parameters to achieve soluble recombinant proteins in E. coli: Advantages of high-throughput screening............................................................................ 138 ANEXO II: ................................................................................................................................... 155 Overcoming the solubility problem in E. coli: available approaches for recombinant protein production. ............................................................................................................................ 155 2 RESUMEN: El estudio de las proteínas y su rol biológico en la fisiología humana ha sido motivo de numerosas investigaciones tanto para las áreas de las ciencias básicas (estudios biofísicos, bioquímicos o estructurales) como aplicadas (biotecnología, salud humana, etc.). En este contexto la disponibilidad de la estructura tridimensional proteica, principalmente mediante la cristalografía de rayos X, ha sido fundamental para el entendimiento de las diversas funciones proteicas. Uno de los primeros impedimentos para el estudio funcional de las proteínas por técnicas cristalográficas ha sido la obtención de una proteína específica en estado puro y en cantidades suficientes. La posibilidad de alcanzar estas características raramente se logra directamente del huésped natural llevando a la producción de la proteína en forma recombinante como única alternativa posible. Dentro de los posibles huéspedes el más ampliamente utilizado es Escherichia coli (E. coli), que si bien en muchos casos permite producir y purificar grandes cantidades de proteínas recombinantes (PRs), se estima que sólo un 30% de los genes clonados en esta bacteria se logran expresar de forma soluble y homogénea (1). Sin embargo, mediante la evaluación de diversas variables como ser diferentes promotores procariotas, proteínas de fusión, temperatura de inducción entre otras, es posible incrementar las probabilidades de obtener un producto soluble, homogéneo y en cantidades óptimas (2, 3). Parte de este trabajo de Tesis está abocado a generar metodologías que faciliten la obtención de proteínas solubles y en estado homogéneo. Con el objetivo de evaluar la mayor cantidad de variables en el menor tiempo posible, es que en el presente trabajo se generó una serie de 12 vectores de expresión en E. coli, que permiten realizar un clonado con alta eficiencia en paralelo e independiente de la secuencia (4). La disponibilidad de esta técnica es un factor fundamental para cuando se trabaja con distintas construcciones y varias PRs en simultáneo. En esta tesis, además de generar esta serie de vectores, se propone el uso de una nueva proteína de fusión para ayudar en la expresión soluble de distintas PRs. Esta proteína de fusión corresponde a una versión truncada de la endoglucanasa D (CelDnc) de Clostridium thermocellum, siendo una proteína termostable y expresada en cantidades masivas en E. coli (5). Nuestro trabajo muestra que esta proteína de fusión puede llevar a una mejora en la obtención del producto soluble y que al menos para una de las proteínas estudiadas se comporta igual o mejor, que otras proteínas de fusión difundidas comercialmente como MBP, SUMO, DsbC y Trx. Uno de los principales avances y aplicaciones más fascinantes de las PRs es su aplicación en la medicina. La generación de moléculas que pueden ser inyectadas en seres humanos con fines terapéuticos y/o de diagnóstico abre una puerta de gran interés en el campo de la medicina 3 (6). En este sentido, la generación de pequeñas moléculas (100-800 Da) que pueden funcionar como inhibidores de distintas enzimas y receptores ha tenido mucho éxito en el tratamiento contra diversos tipos de cáncer como es el caso de los inhibidores de tirosina quinasa: Erlotinib (Tarceva®), Imatinib (Gleevec®) y Dasatinib (Sprycel®) entre otros (7). Sin embargo este tipo de compuestos se encuentra con el problema que difícilmente pueden inhibir interacciones proteína-proteína, lo que muchas veces puede ser de gran utilidad en diversas terapias contra el cáncer (8). Los Anticuerpos monoclonales (AcMo), han surgido como una alternativa importante, cuando se requiere de interacciones más complejas o bien la activación del propio sistema inmune para la destrucción específica de la célula tumoral. Estas moléculas de mayor tamaño (>150 kDa) y mayor complejidad estructural y funcional están siendo cada vez más utilizadas en numerosas aplicaciones médicas para el tratamiento de diferentes patologías infecciosas, inmunes, cardiovasculares y diversos tipos de cáncer (9). Por ejemplo el anticuerpo