Universidade Do Estado Do Amazonas, Dr

INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIODIVERSIDADE E BIOTECNOLOGIA DA REDE BIONORTE

PROPAGAÇÃO IN VITRO E BIOPROSPECÇÃO DE EXTRATOS DE PLÂNTULAS DE Libidibia ferrea (FABACEAE)

DANIEL DA SILVA

MANAUS-AMAZONAS Fevereiro/2019

DANIEL DA SILVA

PROPAGAÇÃO IN VITRO E BIOPROSPECÇÃO DE EXTRATOS DE PLÂNTULAS DE Libidibia ferrea (FABACEAE)

Tese apresentada ao Curso de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade e Biotecnologia da Rede BIONORTE, no Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Biotecnologia e Biodiversidade.

Orientador: Prof. Dr. Paulo de Tarso Barbosa Sampaio

MANAUS-AMAZONAS Fevereiro/2019

FICHA CATALOGRÁFICA

Dedicatória.

“Maxime” Dedico este trabalho à minha avó “In memorian” Palmira Nonata da Silva Pereira e a minha mãe Maria das Dores Nonata da Silva, que através de suas orientações sempre me exigiram um pouco mais, fazendo-me crescer intelectualmente e moralmente, e por ter me ensinado a importância da educação. Aos meus queridos irmãos Danilo e Adonias, vocês dois sãos os melhores irmãos que a vida me proporcionou!

“Epígrafe”.

“Não existe felicidade maior na Terra do que aquela que um espírito belo e produtivo encontra em si mesmo nos momentos felizes”.

Arthur Schopenhauer

“Os grandes feitos são conseguidos não pela força, mas pela perseverança”.

Samuel Johnson

AGRADECIMENTOS

Esta tese é o resultado de um esforço conjunto, e sua produção seria impossível sem a generosidade de Deus, por sempre estar ao meu lado, ter me dado esperança, força de vontade e acima de tudo a sabedoria para a conquista de mais uma vitória pessoal e profissional. Minha gratidão ao Dr. Paulo de Tarso de Barbosa Sampaio, meu orientador e amigo, pela orientação e estímulo ao meu desenvolvimento acadêmico, profissional e pessoal. Agradeço à Dra. Angela Maria Imakawa que ajudou a desenvolver o plano de revisão desde o 1º até o 3º capítulo deste trabalho, fez muitas sugestões úteis, cujas contribuições foram significativas e evidentes no texto. Nosso técnico do Laboratório de Silvicultura e Tecnologias Digitais do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (LASTED-INPA), Eng. Florestal, Flávio Mauro Souza Bruno, de todas as formas manteve o funcionamento do laboratório e nos forneceu opiniões extremamente úteis sobre diferentes capítulos. Agradeço à Dra. Suely de Souza Costa pelo seu talento estatístico e na interpretação das análises de dados. Minha gratidão vai também para Dr. Luiz Augusto Gomes de Souza pela identificação da espécie vegetal e fornecimentos das sementes. Um agradecimento muito especial vai para Dra. Cecília Verônica Nunez, que me supervisionou no seu Laboratório de Biotecnologia e Bioprospecção do INPA e contribuiu muito para a realização deste projeto. Também estou profundamente agradecido à Fundaçao de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) e a Coordenação de Pesquisas de Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro da bolsa de estudo junto ao Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade e Biotecnologia – Rede Bionorte. Agradeço ao reitor da Universidade do Estado do Amazonas, Dr. Cleinado de Almeida Costa, meu amigo, por sua extraordinária ajuda na aquisição de passagens aéreas e diárias para participação em diversos eventos científicos nacionais e internacionais, assim como para custeio da taxa de publicação dos artigos, frutos desta tese. Sinto-me muito feliz por ter tido Dr. Spartaco Astolfi Filho, como Coordenador Geral da Rede Bionorte, o qual aprendi bastante durante a Representação Estudantil (2015-2016) e, sobretudo, foi um importante “interlecutor” nos bastidores durante a realização do doutorado sanduíche no exterior – uma mão amiga. Agradeço ao Coordenador Estadual do PPG-Bionorte/Amazonas, Dr. Jair Maia por sua ajuda e por fornecer assistência administrativa em muitas ocasiões. Em Leeds, Dra. Christine H. Foyer foi minha supervisora e crítica de primeira linha durante o meu estágio de doutoramento-sanduíche na Universidade de Leeds, Reino Unido. Dra. Barbara Kampiska contribuiu bastante para o ensino de técnicas biotecnológicas,

especialmente a microscopia confocal. Muitos colegas tiveram um papel especial em momentos importantes durante o meu estágio e por suas intervenções oportunas. Destaco: o maravilhoso casal Jonas Alvim e Fernanda Alvim, e aos colegas de laboratório: Philipa Siclair, Hayati Razak, Sarah Alomran, Yousef Hajaya todos fizeram muitos comentários incisivos e principalmente ao estímulo do network que foi fundamental durante a minha experiência nesta Universidade. Muitos outros colegas e amigos, que me auxiliaram a dar forma a este trabaho com seus comentários, sugestões e críticas. Sou profundamente grato a todos eles: MSc. Messe Elmer Torres da Silva, Universidade do Estado do Amazonas MSc. Weison Lima da Silva, Universidade Federal do Amazonas MSc. Maria Teresa Fachin Espinar, Universidade Federa do Amazonas MSc. Maria Izabel Correia Osorio, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia MSc. Adrian Arturo Arispe, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia Aos velhos amigos, por compreenderem as infinitas horas de minha ausência e que, mesmo tão longe, continuam tão perto. Não tenho espaço espaço aqui para agradecer a todas as pessoas cujos esforços contribuíram para o desenvolvimento deste projeto. Ofereço meu sincero agradecimento – e a tese pronta que eles ajudaram a finalizar. Assumo, é claro, total responsabilidade por eventuais incorreções. Quero agradecer, de modo especial, aos meus meus alunos de PIBIC e de TCC da Univesidade do Estado do Amazonas por suas inúmeras contribuições que me ajudaram a equilibrar as demandas com o tempo e o estudo. Finalmente, expresso minha profunda gratidação à minha família, especialmente a minha querida mãe - Maria das Dores Nonato da Silva - e a minha querida companheira e mulher - Josilene Cavalcante Cunha - que tiveram extraordinária paciência e me apoiaram na realização deste sonho, e dando-me força para ser um vencedor.

Muito obrigado!

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DA SILVA, Daniel. Propagação in vitro e bioprospecção de extratos de plântulas de Libidibia ferrea (Fabaceae). 2019. 125 f. Tese (Doutorado em Biodiversidade e Biotecnologia) – Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Manaus, 2019.

RESUMO

O estudo teve por objetivo estabelecer e avaliar métodos de propagação in vitro e bioprospecção de extratos de plântulas de Libidibia ferrea (Fabaceae), que possibilitará a multiplicação de genótipos superiores com potencial para uso medicinal. Os experimentos foram desenvolvidos no Laboratório de Silvicultura e Tecnologia Digitais (LASTED) e Laboratório de Bioprospecção e Biotecnologia (LABB), ambos, vinculados ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA, Manaus, AM), em parceria com o Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais (LCTV) da Universidade do Estado do Amazonas (UEA, Manaus, AM). A pesquisa contempla quatro capítulos. Capítulo I – Cultura in vitro de embriões zigóticos e sementes de L. ferrea e as respostas morfogenéticas dos explantes em relação a diferentes concentrações de reguladores de crescimento. Os resultados indicaram a viabilidade técnica da cultura de embriões zigóticos e germinação de sementes in vitro, tornando-se uma técnica alternativa para propagação in vitro desta espécie. No capítulo II - Foi avaliado o efeito de diferentes concentrações de 2,4-D e ANA isoladamente ou em combinação com BAP e TDZ para a indução de calos friáveis em explantes foliares e segmentos nodais. Os resultados demonstraram que ambos os tipos de explantes apresentaram diferenças significativas (p<0,05) na indução, morfologia e coloração dos calos. A indução máxima de calos friáveis (90%) foi obtida a partir de explantes de segmentos nodais cultivados em meio MS suplementado com 1,0 mg L-1 de 2,4-D e 5,0 mg L-1 de TDZ. Em relação ao capítulo III – Foi avaliada a influência da luz de LED azul-vermelha e LED branca na calogênese e na regeneração de plântulas in vitro de L. ferrea. A luz LED azul-vermelha estimulou a maior formação de calos friáveis e a regeneração in vitro de plântulas em relação à luz LED branca. Os resultados confirmam a eficiência da utilização da luz de LED azul-vermelha e LED branca para calogênese e a regeneração in vitro de L. ferrea. No capítulo V – Foi realizado o estudo químico e biológico diferentes metabólitos secundários, e atividades antibacterianas, antioxidantes e tóxicos. A avaliação dos extratos mostrou a presença de diferentes metabólitos secundários, e atividades antibacterianas, antioxidantes e tóxicos. Palavras-chave: Biotecnologia, Multiplicação in vitro, Otimização de protocolo, Libidibia ferrea, Planta medicinal. viii

DA SILVA, Daniel. In vitro propagation and bioprospecting of seedling extracts of Libidibia ferrea (Fabaceae). 2019. 125 f. Thesis (Doctorate in Biodiversity and Biotechnology) - National Institute of Amazonian Research, Manaus, 2019.

ABSTRACT

The objective of this study was to establish and evaluate methods of in vitro propagation and bioprospecting of seedlings extracts of Libidibia ferrea (Fabaceae), which will allow the multiplication of superior genotypes with potential for medicinal use. The experiments were developed at the Laboratory of Silviculture and Digital Technology (LASTED) and Laboratory of Bioprospecting and Biotechnology (LABB), both linked to the National Institute of Amazonian Research (INPA, Manaus, AM), in partnership with the Laboratory of Plant Tissue Culture (LCTV) of the Amazonas State University (UEA, Manaus, AM). The research includes four chapters. Chapter I - In vitro culture of zygotic embryos and seeds of L. ferrea and the morphogenetic responses of explants in relation to different concentrations of growth regulators. The results indicated the technical viability of zygotic embryo culture and seed germination in vitro, becoming as an alternative technique for in vitro propagation of this species. In Chapter II - The effect of different concentrations of 2,4-D and ANA alone or in combination with BAP and TDZ for the induction of friable calli from leaf explants and nodal segments was evaluated. The results showed that both types of explants presented significant differences (p <0.05) in callus induction, morphology and coloring. Maximum induction of friable calli (90%) was obtained from nodal segment explants cultured in MS medium supplemented with 1.0 mg L-1 of 2,4-D and 5,0 mg L-1 of TDZ. In relation to chapter III - The light influence from red-blue LED and white LED on the calogenesis and in vitro seedling regeneration of L. ferrea was evaluated. The red-blue LED light stimulated the greater formation of friable calli and the in vitro regeneration of seedlings in relation to the white LED light. The results confirm the efficiency of using red-blue LED and white LED light for calogenesis and the in vitro regeneration of L. ferrea. In chapter V - Chemical and biological study was carried out on hexane, methanolic and aqueous extracts obtained from the leaves, stems and roots of seedlings originated from the in vitro culture of L. ferrea. The evaluation of the extracts showed the presence of different secondary metabolites, and antibacterial, antioxidant and toxic activities. Keywords: Biotechnology, In vitro multiplication, Protocol optimization, Libidibia ferrea, Medicinal plant. ix

LISTA DE TABELAS

REFERENCIAL TEÓRICO Tabela 1. Classificação taxonômica de Libidibia var. ferrea ...... 20 Tabela 2. Alguns nomes populares de Libidibia ferrea conhecidos no Brasil ...... 20 Tabela 3. Aplicações terapêuticas de Libidibia ferrea na medicina popular...... 22 Tabela 4. Atividades biológicas de Libidibia ferrea...... 24 Tabela 5. Comparação entre o conteúdo energético de três comprimentos de ondas ...... 32 Tabela 6. Exemplos de fármacos obtidos de matérias-primas vegetais ...... 33

CAPÍTULO I Tabela 1. Percentagem de germinação (GER) e plantas normais (PN), número de brotos (NB), número de gemas (NG) e número de folhas (NF), comprimento dos brotos (CB), número de raízes (NR) e taxa de multiplicação (TM) obtidos de embriões zigóticos e sementes de Libidibia ferrea após 30 dias de inoculação em meio de cultura MS...... 61

CAPÍTULO II Tabea 1. Efeito de diferentes concentrações de auxinas e citocininas na indução de calos friáveis em explantes foliares e segmentos nodais de Libidibia ferrea ...... 73

CAPÍTULO III Tabela 1. Produção de calos friáveis obtidos de segmentos nodais de Libidibia ferrea, em resposta a diferentes concentrações do meio MS e da auxina 2,4-D e cultivados na ausência e presença de luz (LED azul-vermelha 470 nm e LED branca 530 nm)...... 88 Tabela 2. Produção de calos friáveis obtidos de explantes de segmentos nodais de Libidibia ferrea, em resposta a diferentes concentrações do meio B5 e da auxina 2,4-D e cultivados na ausência e presença de luz (LED azul-vermelha 470 nm e LED branca 530 nm)...... 89

CAPÍTULO IV Tabela 1. Resultado da atividade antibacteriana dos extratos de Libidibia ferrea obtido pelo método de microdiluição em caldo...... 110 Tabela 2. Escala para interpretação dos resultados da atividade antioxidante ...... 111 Tabela 3. Resultados da avaliação da capacidade antioxidante de extratos de Libidibia ferrea obtidos pelas metodologias de DPPH e Fe3+/Fenantrolina...... 112 x

LISTA DE FIGURAS

REFERENCIAL TEÓRICO Figura 1. Libidibia ferrea (Mart. Ex Tul.) L.P. QUEIROZ. (A) Aspecto geral da floração; (B) Detalhe do caule; (C) Fruto maduro; (D) Aspecto geral da semente; (E) Distribuição e ocorrência...... 21 Figura 2. Substâncias isoladas de Libidibia ferrea ...... 23 Figura 3. Princípio geral da cultura de células e tecidos vegetais ...... 25 Figura 4. Esquema geral das vias de biosíntese do metabolismo vegetal secundário (retângulos rosas) e suas conexões com o metabolismo primário (retângulos vermelhas), em detalhe os metabólitos primários (verde) e os secundários (azul)...... 34 Figura 5. Esquema de processo de descoberta de produtos naturais...... 35 Figura 6. Processo de partição com solventes de polaridade crescente...... 36 Figura 7. Reação de estabilização do Radical DPPH frente a um composto fenólico doador de hidrogênio...... 40 Figura 8. Reação da atividade redutora do íon Fe3+ a íon Fe2+ ...... 40

CAPÍTULO I Figura 1. Plântulas germinadas in vitro oriundas de embriões zigóticos (a) e sementes (b) de Libidibia ferrea inoculados em meio MS após 30 dias de cultivo (b)...... 62 Figura 2. Percentagem de regeneração (A), número de brotos (B), número de gemas (C), número de folhas (D), taxa de multiplicação (E), altura das brotações (F), número de raízes (G) e formação de calos (I) obtidos de embriões zigóticos de Libidibia ferrea após 30 dias de cultivo in vitro em meio MS suplementado com diferentes concentrações de BAP e ANA. Médias seguidas de mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Duncan (p<0,05)...... 63 Figura 3. Fases de desenvolvimento de embrião zigótico e formação de plântula de Libidibia ferrea no meio MS suplementado com 0,9 mg L-1 de BAP: Cultivo inicial do embrião zigótico (A); Germinação do embrião zigótico aos 10 dias (B); Plântula com brotos, gemas e raíz primária aos 20 dias (C); e Plântula normal após 30 dias de cultivo in vitro (D)...... 65

CAPÍTULO II Figura 1. Plântula de Libidibia ferrea cultivada in vitro como fonte de explantes utilizadas para a indução de calos friáveis (A). Segmentos nodais com formação de calos cultivados em meio MS suplementado com 2,4 D (B), ANA (C), 2,4-D e BAP (D), 2,4-D e TDZ (E), ANA e BAP (F) e ANA e TDZ (G), mantidos a 25°C±2°C sob fotoperíodo de 16 horas por 30 dias...... 74

CAPÍTULO III Figura 1. Aspectos da morfologia e coloração de calos friáveis de Libidibia ferrea obtidos de segmentos nodais cultivados em diferentes concentrações de meio MS e suplementado com 2,4-D, na ausência e presença de luz, após 30 dias de cultivo. (A) MS, (B) MS/2 e MS/4 (C) cultivados no escuro; (D) MS, (E) MS/2 e MS/4 (F) cultivados sob LED azul-vermelha 470 nm; (G) MS, (H) MS/2 e MS/4 (I) cultivados sob LED branca 530 nm. Barras = 3 cm...... 86 Figura 2. Aspectos da morfologia e coloração de calos friáveis de Libidibia ferrea obtidos de segmentos nodais cultivados em diferentes concentrações de meio B5 e suplementado com 2,4-D, na ausência e presença de luz, após 30 dias de cultivo. (A) B5, (B) B5/2 e B5/4 (C) cultivados no escuro; (D) B5, (E) B5/2 e B5/4 (F) cultivados sob LED azul-vermelha 470 nm; (G) B5, (H) B5/2 e B5/4 (I) cultivados sob LED branca 530 nm. Barras = 3 cm...... 87 Figura 3. Eletromicrografia de varredura de células de calos friáveis de Libidibia ferrea. Calos do tipo globular originados de explantes de segmentos nodais, inoculados em meios MS (A) e B5 (B), suplementado com 2,4-D e mantidos sob LED azul-vermelha; Aspectos de calos embriogênicos vistos de cima (C) e ligados por segmentos semelhantes a suspensores (seta branca) (D)...... 91 Figura 4. Eletromicrografia de transmissão da caracterização de estruturas e organelas das células meristemáticas em diferenciação após 60 dias de cultivo in vitro originados de calos friáveis de Libidibia ferrea. (A) Núcleo (seta preta) e parede celular (seta verde); Células com elevada relação núcleo citoplasmática (círculo preto) com diferenciação celular (B); Núcleos proeminentes com início da divisão celular (seta preta) formados da diferenciação do sistema vascular (C); Aspectos em vista longitudinal dos elementos vasculares das mitocôndrias (seta preta), núcleo (seta vermelha) e cloroplastos (seta verde) (D)...... 92 Figura 5. Valores médios de números de brotos (A), número de gemas (B), taxa de multiplicação (C) e comprimento das brotações (D) por explante, em resposta a diferentes concentrações de 6-benzilaminopurina (BAP) e cultivadas sob diferentes fontes de luz (LED azul-vermelha 470 nm e LED branca 530 nm) na multiplicação in vitro de Libidibia ferrea, 30 xii

dias após a inoculação. Médias seguidas de mesma letra não diferem estatisticamente, entre si, ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey...... 94 Figura 6. Plântula de Libidibia ferrea cultivada in vitro como fonte de explantes utilizadas para a regeneração in vitro (A). Aspectos das brotações cultivadas em meio de cultura MS suplementado com 0,05 mg L-1 de BAP mantidos sob LED azul-vermelha 470 nm (B-C) e LED branca 530 nm (D-E)...... 95

CAPÍTULO IV Figura 1. Extratos metanólicos de folhas (Fo), Caules (Ca) e Raízes (Ra) de plantas microprapagadas de Libidibia ferrea, eluídos com hexano/acetona 9:1 (v/v) analisadas por Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC) sob luz vísivel (A), UV 254 nm (B) e UV 365 nm (C) e reveladas com diferentes reagentes NP/PEG (D), anisaldeído sulfúrico (E), dragendorff (F) e sulftato cérico (G)...... 105 Figura 2. Extratos hexânicos de folhas (Fo), Caules (Ca) e Raízes (Ra) de Libidibia ferrea, eluídos com DCM/MeOH 1:1 (v/v) analisadas por Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC) sob luz vísivel (A), UV 254 nm (B) e 365 UV nm (C) e reveladas com diferentes reagentes NP/PEG (D), anisaldeído sulfúrico (E), dragendorff (F) e suftato cérico (G)...... 105 1 Figura 3 Espectro de RMN de H em CDCl3 (300 MHz) obtidos de extratos hexânicos de folhas (a), caules (b) e raízes (c) de Lidibia ferrea ...... 106 Figura 4. Espectro de RMN de 1H em DMSO (300 MHz) obtidos de extratos metanólicos de folhas (a), caules (b) e raízes (c) de Lidibia ferrea ...... 107 1 Figura 5. Espectro de RMN de H em DMSO-d6 (300 MHz) obtidos dos extratos metanólicos da raiz em fase DCM (a) e AcOEt (b) de plantas micropropagadas de Libidibia ferrea...... 108 Figura 6. Espectro de massas da fase DCM obtida do extrato metanólico da raiz de L. ferrea. A: Ionização por electrospray (ESI -). B: Ionização química pressão atmosférica (APCI -). C: Ionização química pressão (APCI +)...... 109 Figura 7. Taxa de mortalidade de larvas de Artemisa salina em função dos extratos testados de Libidibia ferrea...... 114

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LISTA DE ABREVIATURAS

2,4-D: Ácido 2,4-Diclorofenoxiacético 2ip: Isopenteniladenina AIA: Ácido 3-indol-acético ANA: Ácido naftalenoacético ANOA: Ácido beta-naftoxiacético ApCFA: Ácido p-clorofenoxiacético B5: Meio de Cultura de B5 Gamborg (1968) BAP: 6-benzilaminopurina DMSO: Dimetilsulfóxido ou sulfóxido de dimetilo EST: Escola Superior de Tecnologia IBA: Ácido 3-indol-butírico INPA: Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia KIN: 6-furfurilaminopurina ou cinetina LCTV: Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais LABB: Laboratório de Bioprospecção e Biotecnologia LASTED: Laboratório de Silvicultura e Tecnologias Digitais MS: Meio de Cultura de Murashige & Skoog (1962) TDZ: Tidiazuron ou N-fenil-N´-1,2,3-tiadizol-5,1-uréia UEA: Universidade do Estado do Amazonas WPm: Meio de cultura Woody Plant de Lloyd & McCown (1980) ZEA: Zeatina

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ...... 17 2. REFERENCIAL TEÓRICO ...... 19 2.1 Aspectos e características botânica, distribuição geográfica e uso de Libidibia ferrea ..... 19 2.2 Propriedades teraupêuticas, químicas e farmacológicas de Libidibia ferrea ...... 22 2.3 Aspecto geral da cultura de células e tecidos vegetais ...... 25 2.4 Técnicas utilizadas para estudos de cultura de tecidos e células vegetais ...... 26 2.4.1 Micropropagação ...... 26 2.4.2 Cultura de embriões zigóticos ...... 26 2.3.3 Embriogênese somática ...... 26 2.3.4 Cultura de calos ...... 26 2.3.5 Suspensão celular ...... 27 2.3.6 Microscopia eletrônica ...... 27 2.4 Fatores que inflenciam no sucesso da cultura de tecidos ...... 27 2.4.1 Explante ...... 28 2.4.2 Assepsia ...... 28 2.4.3 Meios de cultura ...... 29 2.4.4 Sacarose ...... 30 2.4.5 Vitaminas ...... 30 2.4.6 Inositol ...... 30 2.4.7 Reguladores de crescimento vegetal ...... 30 2.4.8. Luz ...... 31 2.5 Metabólitos secundários de plantas ...... 32 2.6 Metodologias utilizadas na busca de substâncias bioativas...... 35 2.7 Fracionamento, isolamento e purificação de metabolótios secundários...... 35 2.8 Bioensaios para determinação do potencial medicinal de extratos de plantas ...... 36 2.9 Ensaios antibacterianos ...... 37 2.9.1 Métodos de difusão ...... 37 2.9.2 Métodos de diluição ...... 37 2.9.3 Bioautografia ...... 38 2.10 Antioxidantes ...... 38 2.10.1 Ensaio antirradicalar de sequestro do radical DPPH...... 39 2.10.2 Atividade redutora do íon férrico (Fe3+) a íon ferroso (Fe2+) ...... 39 xv

3. JUSTIFICATIVA ...... 42 4. OBJETIVOS ...... 43 4.1 Geral ...... 43 4.2 Específicos ...... 43 5. REFERÊNCIAS ...... 44

CAPÍTULO I ...... 55 Cultura in vitro de embriões zigóticos e sementes de Libidibia ferrea ...... 55 Introdução ...... 58 Material e Métodos ...... 59 Resultados e Discussão ...... 60 Conclusões ...... 66 Agradecimentos ...... 66 Literatura citada ...... 66

CAPÍTULO II ...... 69 Indução de calos em explantes foliares e segmentos nodais de Libidibia ferrea (Fabaceae), uma notável planta de valor medicinal ...... 69 Introdução ...... 71 Material e métodos ...... 72 Resultados e discussão ...... 72 Conclusões ...... 75 Agradecimentos ...... 75 Referências bibliográficas ...... 76

CAPÍTULO III ...... 80 Calogênese e regeneração de plantas in vitro de Libidibia ferrea (Fabaceae) ...... 80 Introdução ...... 82 Material e métodos ...... 83 Obtenção do material vegetal ...... 83 Estabelecimento in vitro ...... 83 Indução de calos em meios nutritivos com 2,4-D na ausência e presença de luz ...... 83 Regeneração in vitro ...... 84 Análise ultraestrutural de calos...... 84 Análise estatística ...... 85 Resultados e discussão ...... 85 xvi

Efeito de diferentes concentrações de 2,4-D, meios de cultura e fontes de luz no processo calogênico ...... 85 Análise ultraestrutural de calos...... 90 Regeneração in vitro ...... 93 Conclusão ...... 96 Agradecimentos ...... 96 Referências ...... 96

CAPÍTULO IV ...... 99 Bioprospecção de extratos de plantas micropropagadas de Libidibia ferrea...... 99 Introdução ...... 101 Material e métodos ...... 101 Coleta e identificação do material vegetal ...... 101 Obtenção dos extratos vegetais...... 102 Análise fitoquímica e fracionamento ...... 102 Avaliação da atividade antibacteriana...... 103 Preparo das culturas bacterianas...... 103 Atividade antioxidante ...... 103 Curvas de calibração com ácido ascórbico...... 103 Ensaio com 2,2-difenil-1-picrilhidrazila (DPPH)...... 104 Fe3+ / fenantrolina...... 104 Ensaio de toxicidade sobre Artemia salina...... 104 Análise estatística: ...... 104 Resultados e discussão ...... 105 Análise fitoquímica...... 105 Avaliação da atividade antibacteriana...... 110 Atividade antioxidante...... 111 Toxicidade frente à Artemia salina...... 113 Conclusão ...... 114 Agradecimentos ...... 114 Referências ...... 115 CONSIDERAÇÕES FINAIS ...... 117 ANEXO 1 ...... 118 ANEXO 2 ...... 120 ANEXO 3 ...... 122 17

1. INTRODUÇÃO A floresta Amazônica possui umas das biotas mais ricas do planeta ocupando 49% do território brasileiro, considerada uma fonte de oportunidades para o Brasil, em especial na pesquisa científica e tecnológica dos produtos naturais. A região Amazônica abrange uma grande diversidade de espécies que funcionam como um reservatório genético ainda pouco explorado, mas com grande potencial ornamental, cosmético, perfumaria, alimentício e farmacêutico para o bem estar humano (FERRAZ et al., 2009). Neste contexto, destaca-se a Libidibia ferrea (Fabaceae), popularmente conhecida como “pau-ferro” ou “jucá”, amplamente utilizada na medicina popular principalmente na região Norte e Nordeste do Brasil (COELHO-FERREIRA, 2009; OLIVEIRA et al., 2010). É uma espécie de notável valor medicinal, devido ao potencial do princípio ativo denominado de “Pau- ferrol A” que atua contra a topoiosomerase II humana, e inibe o crescimento das células tumorais por meio da indução de apoptose, podendo ser utilizado como importante ferramenta no tratamento da leucemia HL60 humana (NOZAKI et al., 2007; OHIRA et al., 2013a). Diversas propriedades terapêuticas já foram avaliadas revelando resultados promissores para diversas finalidades, tais como: antidiarréicos, antianêmico, antidiabético, anticancerígeno, tratamento de tuberculose, fito-fortificantes de corpo, antitérmico, antidiarréico, antifúngica, anti-inflamatório e cicatrizante e outras (FERNANDES et al., 2016; GALLÃO et al., 2013; LIMA et al., 2011; LOPES et al., 2013a; NAKAMURA et al., 2002a; NAWWAR et al., 2015; PEREIRA et al., 2012). Essa espécie vem sofrendo um intenso processo de extrativismo praticado de maneira indiscriminada de suas populações naturais, provocando a erosão genética e a a destruição do seu habitat na Amazônia (BENEDITO et al., 2012). Estudos indicam que a propagação desta espécie é viável por sementes (FILHO et al., 2005; SCALON et al., 2011), por micropropagação (SILVA et al., 2018) e por regeneração de mudas em condições ex vitro (LENHARD et al., 2013; LENHARD et al., 2010; LIMA et al., 2008; SANTOS et al., 2013). Entretanto, a baixa e irregular produção de sementes aliada, à elevada dormência tegumentar (COELHO et al., 2010a), tem limitado a produção de mudas para a recomposição das populações naturais e os plantios ex situ. Frente a esta realidade, a cultura de células e tecidos vegetais, é uma alternativa eficiente para promover a reprodução de genótipos superiores através de condições in vitro (GEORGE et al., 2008; LOYOLA-VARGAS e OCHOA-ALEJO, 2012). É uma das ferramentas biotecnológicas mais importantes que podem ser usadas nos procedimentos da engenharia celular, engenharia genética e genômica funcional (BHOJWANI e DANTU 2013a; 18

MIROSHNICHENKO et al., 2016), bem como na conservação de genótipos a longo prazo (BHOJWANI e DANTU, 2013c; LOYOLA-VARGAS; OCHOA-ALEJO, 2012). Entretanto, a cultura de células e tecidos baseia-se no fenômeno denominado de totipotência, ou seja, qualquer célula no organismo vegetal contém toda a informação genética necessária à regeneração de uma planta completa (CID e TEIXEIRA, 2014). Umas das peculiaridades da cultura de células e tecidos é a multiplicação sistematizada de plantas elites pelo processo da propagação in vitro (MORAIS et al., 2012). Além disso, pode ser empregada na produção de metabólitos secundários para fins teraupêuticos e farmacológicos (ARNALDOS et al., 2001; PEREIRA, 2009). Considerando a importância desta espécie e as vantagens das técnicas aplicadas ao cultivo in vitro, neste estudo, são abordados os métodos de propagação e produção de mudas e metabólitos secundários, na tentativa de solucionar o problema da demanda de mudas com alta qualidade genética. No primeiro capítulo foram avaliados a cultura in vitro de sementes e embriões zigóticos. No segundo capítulo, foram induzidos calos friáveis obtidos de explantes foliares e segmentos nodais. No terceiro capítulo, foi realizado a influência da luz de LEDs na calogênese e regeneração in vitro de plantas. No quarto capítulo foi realizado o estudo químico e biológico dos extratos obtidos de plantas micropropagadas de L. ferrea.

2. REFERENCIAL TEÓRICO 2.1 Aspectos e características botânica, distribuição geográfica e uso de Libidibia ferrea A classificação taxonômica de Libidibia ferrea encontra-se descrita na Tabela 1 (FORZZA et al., 2010). Recentemente, a nomenclatura de Libidibia ferrea foi modificada taxonômicamente, sendo anteriormente conhecida como Caesalpinia ferrea (QUEIROZ, 2009). Diversos estudos químicos e farmacológicos, bem como a propagação vegetativa foram relatados utilizando-se a sinonímia desta espécie, incluindo os dois primeiros capítulos publicados desta Tese. Esta espécie, pode alcançar 10-15 m de altura, com um diâmetro do tronco de 40 a 60 cm (Figura 1B). Suas folhas de árvore adulta podem medir cerca de 7-20 cm de comprimento (Figura 1A). Suas flores são pequenas e amarela com características aglomeradas (Figura 1A). Sua floração ocorre entre abril e maio e a frutificação entre maio e agosto (GALDINO et al., 2007). Os frutos são denominados de vagens, cuja dimensões médias são de 8,3 x 1,8 x 0,8 cm e tem a cor verde quando imaturo, tornando-se marrom quando maduros (Figura 1C). Eles são indeiscente, com um lado oblongo, ligeiramente achatado, na forma sinuosa. As sementes são de forma discóide ou ovoide, com uma base achatada e ápice arredondado. O tamanho médio das sementes é 0,9 x 0,5 x 0,5 cm e suas cores variam de verde claro a amarelado (Figura 1D). As sementes apresentam características opacas, firmes em consistência, e são separados em poços individuais (Figura 1F) (GALDINO et al., 2007; LORENZI e MATOS, 2002) O jucá ou pau-ferro é nativo do Brasil (Figura 1E) e é endêmico nas regiões Norte (RODRIGUES et al., 2012) e Nordeste (QUEIROZ, 2009), sendo conhecida por vários nomes descritos em diferentes estados brasileiros, conforme mostrado na Tabela 2. Além disso, a espécie é cultivada em outros países para o uso de reflorestamentos de parques e ruas conhecida como “Brazilian ironwood” (MATOS, 2007). Além disso, essa espécie pode ser utilizada para o paisagismo, proporcionando boa sombra em ruas e avenidas. Também é indicada para reflorestamentos destinados à recomposição de Áreas de Preservação Permanente (APP) que foram degradadas. Apresenta uma grande importância também na indústria madeireira, por apresentar madeira muito dura e de longa durabilidade natural. Também é empregada na construção civil, na forma de vigas, esteios, caibros, escadas (LORENZI, 1992; MAIA, 2004) e utilizada na fabricação de móveis de luxo na Índia e Sri Lanka (MAIA, 2012, 2004; STASI, 2002).

Tabela 1. Classificação taxonômica de Libidibia ferrea

Nome científico Libidibia ferrea (Mart. ex Tul.) L. P. Queiroz var. ferrea Sinonimia Caesalpinia ferrea (Mart. ex Tul.) L. P. Queiroz Reino Plantae Filo Magnoliophyta (Angiospermae) Classe Magnoliopsida (Dicotiledonae) Subclasse Rosidae Ordem Fabales Família Fabaceae Subfamília Libidibiaceae (Caesalpinioideae, Leguminosae) Espécie Libidibia ferrea (Mart. Ex Tul) L.P. Queiroz var. ferrea

Fonte: (QUEIROZ, 2009; FORZZA et al., 2010)

Tabela 2. Alguns nomes populares de Libidibia ferrea conhecidos no Brasil Nome Estado Jucá Amazonas Ibirá-obi; imirá-obi; imirá-itá; jucá e pau-ferro-da-mata Espirito Santo Muirá-itá; muirá-obi; muirapixuma; mururé; pau-ferro-do-norte Pernambuco Pau-ferro-verdadeiro Rio Grande do Sul Peroba-sobro Bahia Quiripiranga Rio de Janeiro Fonte: STASI (2002)

Figura 1. Libidibia ferrea (Mart. Ex Tul.) L.P. QUEIROZ. (A) Aspecto geral da floração; (B) Detalhe do caule; (C) Fruto maduro; (D) Aspecto geral da semente; (E) Distribuição e ocorrência.

Fonte: SANTOS et al., (2018) 22

2.2 Propriedades teraupêuticas, químicas e farmacológicas de Libidibia ferrea Na medicina popular, algumas das suas propriedades terapêuticas têm sido relatada para diferentes tipos de tratamentos de doenças (Tabela 3). Além disso, é considerada uma das 71 espécies da lista de plantas medicinais de interesse para o Sistema de Saúde Brasileiro e foi incluída no Formulário Nacional de Ervas Medicinais (BRASIL, 2011; MEDEIROS et al., 2013; RIBEIRO et al., 2014).

Tabela 3. Aplicações terapêuticas de Libidibia ferrea na medicina popular

Parte usada Uso na medicina popular Referências Expectorante (RIBEIRO et al., 2014) Casca Antidiarréicos (SIQUEIRA et al., 2012) Antianêmico e antidiabético para tratamento de (OLIVEIRA et al., 2010) distúrbios hemolíticos pulmonares (NAKAMURA et al., Prevenção do câncer Frutos 2002a) Tratamento de tuberculose (STOREY e SALEM, 1997) Fito-fortificantes de corpo (RODRIGUES, 2006) Sementes Tratamentos de hematomas e contusões (SOUZA et al., 2010) Antidiabético, antidiarreico e descongestivo para tratamento de feridas, enterocolites, reumatismo e Casca do (RIBEIRO et al., 2014; para perda de peso; sopro, dor na coluna, tosse, caule SANTOS et al., 2010) dor inflamatória dos órgãos internos e externos, dor nos ossos Pó da casca Tratamento de feridas cutâneas (OLIVEIRA et al., 2010) Raízes Antitérmico (MAIA, 2004) (LORENZI e MATOS, Frutos Antidiarréico, anticatarra e cicatrizante 2002; MAIA, 2004)

Estudos fitoquímicos (Figura 2) dos extratos hidroalcoólicos do caule, casca e folhas mostraram a presença de flavonóides, saponinas, taninos, cumarinas, esteróis e substâncias fenólicas. Da casca, derivados antracenicos e de saponinas, glicosídeos cardiotônicos, e os alcalóides também foram relatados (GONZALEZ et al., 2004). O ácido gálico e galato de metila foram isolados dos extratos etanólicos dos frutos (NAKAMURA et al., 2002b).

Figura 2. Substâncias isoladas de Libidibia ferrea

CAULE Pau-ferrol A Trímero chalcona

Acidos palmítico e octacosanoico Ácidos graxos

R = H, Ácido gálico R = CH3, Galato de metila R = C2H5, Galato de etilo FRUTOS Ácidos fenólicos

Sitosterol Terpenóide

Ácido elágico Polifenol Fonte: Costa et al., (2015)

O extrato de benzeno dos frutos desta planta forneceu sitosterol e ácidos palmítico e octacosanóico. O extrato alcoólico também forneceu ácido gálico, além do galato de etilo e ácido elágico (REBOREDO et al., 2007). O Pau-ferrol, um trímero de chalcona isolado a partir de um extrato de acetona das hastes (NOZAKI et al., 2007), é um marcador fitoquímico importante da espécie. Estudos comprovam que o jucá possui diversas propriedades farmacológicas (Tabela 4).

Tabela 4. Atividades biológicas de Libidibia ferrea Extratos Atividades biológicas Referências avaliados Atividade antioxidante (PORT’S et al., 2013) Folhas Atividades antibiofilme (TRENTIN et al., 2011) (CAVALHEIRO et al., 2009; DE S. LUNA et al., Atividade larvicida 2005) Atividade antifúngica (MARTINS et al., 2014) Atividade antioxidante (BARROS et al., 2014; DA SILVA et al., 2011) Atividade hepatoprotetiva (BARROS et al., 2014) Atividade antifertilidade (LUCINDA et al., 2010) Atividade reprodutiva (PETERS et al., 2008) Frutos Atividade antimicrobiana (MARREIRO et al., 2014) Atividade citotóxica e (BÊCCO DE SOUZA et al., 2006) clastogênica Atividade anti-tumoral (NAKAMURA et al., 2002b) (UEDA et al., 2001) Atividade anti-inflamatória e (CARVALHO et al., 1996; DIAS et al., 2013; analségica LIMA et al., 2012; PEREIRA et al., 2012) Atividade antinociceptiva (SAWADA et al., 2014) Atividade de inibição enzimática (CAVALHEIRO et al., 2009) Sementes Atividade antivírus (LOPES et al., 2013b) Atividade antifúngica (BARIANI et al., 2012) Atividades anti-inflamatória, (DE ARAÚJO et al., 2014) analgésica e antimicrobiano Atividades antioxidadentes e (BARROS et al., 2014) hepatoprotetiva Atividade hipoglicêmica (VASCONCELOS et al., 2011) Casca Atividade cardiovascular (MENEZES et al., 2007) Atividade inibitória da (NOZAKI et al., 2007; OHIRA et al., 2013b) proliferação celular e topoisomerase II humana Atividade antibacteriana (PEREIRA et al., 2006)

2.3 Aspecto geral da cultura de células e tecidos vegetais A cultura de células e tecidos vegetais é o conjunto de técnicas utilizadas para cultivar in vitro células e tecidos vegetais em meio nutritivo sintético, de composição química definida, sob condições adequadas de assepsia, nutrição e fatores ambientais visando produzir uma nova planta. Essas técnicas apresentam importância prática para área agrícola e florestal, onde aparecem como uma das metodologias mais polivalentes que tem como um dos principais objetivos a manipulação de plantas, inclusive ao nível molecular quando necessário. Além disso, tem conquistado destacada posição na recuperação de plantas; na propagação comercial; no melhoramento genético; no manejo, no intercâmbio e na conservação de germoplasma; e em outras aplicações com as pesquisas em fisiologia vegetal e produção industrial in vitro de metabólitos secundários (CARVALHO et al., 2013). A cultura de tecidos de plantas possibilita fornecer ao produtor mudas de alta qualidade genética e quantidade suficiente para suprir a necessidade do mercado em curto espaço de tempo (BHOJWANI e DANTU, 2013b). Dentre as técnicas de cultura de tecidos vegetais, destacam-se a micropropagação, a embriogênese somática, a calogênese (cultura de calos), a cultura de embriões e a suspensão celular visando à produção de metabólitos secundários (MORAIS et al., 2012), conforme mostrado na figura 3.

Figura 3. Princípio geral da cultura de células e tecidos vegetais

Fonte: KERBAUY (1997) 26

2.4 Técnicas utilizadas para estudos de cultura de tecidos e células vegetais

2.4.1 Micropropagação A micropropagação de plantas representa uma alternativa para a propagação comercial de espécies de interesse econômico, entre as quais as que apresentam propriedades medicinais com valor farmacológico reconhecido. A crescente demanda da indústria farmacêutica por plantas com alta qualidade genética e fisiológica, bem como com capacidade de síntese de metabólitos secundários, por meio do melhoramento genético, justificam a utilização desta técnica (BHOJWANI e DANTU, 2013d; DEBERGH e READ, 1991; GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998).

2.4.2 Cultura de embriões zigóticos Este tipo de cultivo tem sido usado para superar a dormência de sementes, em virtude da imaturidade do embrião ou da presença de substâncias inibidoras no endosperma; estudar os aspectos nutricionais e fisiológicos do desenvolvimento do embrião; testar a viabilidade de sementes; recuperar híbridos raros de cruzamentos incompatíveis; e como fonte de explantes devido a elevada totipotência (DODEMAN et al., 1997; HASLAM e YEUNG, 2011).

2.3.3 Embriogênese somática Embriogênese somática, adventícia ou assexual são termos usualmente empregados para designar o processo pelo qual células haplóides ou somáticas desenvolvem-se por meio de diferentes estádios embriogênicos, dando origem a uma planta, sem que ocorra a fusão de gametas. A embriogênese somática é um método importante para propagação de plantas elite in vitro, em larga escala. Além de servir de modelo para estudos básicos relacionados com a fisiologia do desenvolvimento do embrião, esse sistema vem sendo utilizado para produção de plantas transgênicas e sementes sintéticas (DODEMAN et al., 1997; MORAIS et al., 2012; ZIMMERMANNN, 2014).

2.3.4 Cultura de calos

Esta técnica possibilita a obtenção de grande quantidade de plantas a partir de um único explante, sendo um dos procedimentos mais eficientes na produção rápida de plantas in vitro (GALÁZ-ÁVALOS et al., 2012). O cultivo de calo in vitro é considerada uma técnica eficiente para obtenção de embriões somáticos, possibilitando elevadas taxas de multiplicação e resulta em embriões individualizados que se desenvolvem em plantas completas (BHOJWANI e DANTU, 2013b; HASLAM e YEUNG, 2011; ISAH, 2016). 27

2.3.5 Suspensão celular

Este bioprocesso é utilizado para a obtenção e proliferação de células em meio líquido, sob condição de agitação contínua, para evitar possíveis gradientes nutricionais e gasosos no meio de cultura. Além de ser uma técnica eficiente de multiplicação rápida, as suspensões celulares tem uma grande aplicação para os estudos de bioquímica, genética, citologia, fisiologia vegetal e fitopatologia. Este tipo de cultivo também é empregado na produção de metabólitos secundários ou material clonal em escala comercial pela utilização de biorreatores (GALÁZ-ÁVALOS et al., 2012; MOSCATIELLO et al., 2013).

2.3.6 Microscopia eletrônica O microscópio eletrônico de transmissão (MET) foi introduzido como ferramenta de pesquisa em meados de 1950 e sua utilização trouxe contribuições significativa ao conhecimento humano possibilitando a visualização de detalhes das amostras ao nível de escalas nanométricas nas áreas biológicas e da ciências de materais. Simultaneamente, por volta de 1950 outro importante instrumento surge denominado de microscopia eletrônica de varredura (MEV), a qual influenciou uma segunda revolução no estudo da microscopia confocal, devido à alta profundidade de campo resultando aspecto de resolução tridimensional às imagens (ALVES, 2004). Para fins de culturas de tecidos vegetal, os aspectos morfolológicos de células embriogênicas vêm sendo bastante utilizados pelas análises ultraestrutural, por meio de MEV em diversos grupos de pesquisas. Esta análise tem sido descrita em estudos de embriogênese somática para diferentes espécies, a exemplo de Bysonima intermedia (NOGUEIRA et al., 2007) e Heliconia chartaceae (ULISSES et al., 2010). Este tipo de microscopia foi bastante adequado para análise das células, demonstrando aspectos tridimensionais da estruturas celulares e morfologia externas das mesmas. Muitas estruturas celulares e macromoléculas apresentam dimensões na escala dos nanômetros, por exemplo, mitocôndrias, membranas, vacúolos, leucoplastos, entre outros podem ser visualizados por meio da MET, como demonstrado em Bysonima intermedia (NOGUEIRA et al., 2007).

2.4 Fatores que inflenciam no sucesso da cultura de tecidos

O sucesso da cultura de células e tecidos depende de vários fatores durante as etapas como: estado fisiológico da planta matriz, coleta de explantes, esterilização dos meios de 28

cultura, condições de incubação, manipulação de subculturas, uso de reguladores de crescimento, meio de cultura, luminosidade, entre outros (CID e TEIXEIRA, 2014; QUISEN e ANGELO, 2008).

2.4.1 Explante A micropropagação é um termo utilizado exclusivamente para refere-se à propagação in vitro a partir de alguma parte específica da planta baseada na capacidade morfogenética e totipotencialidade das células (BHOJWANI e DANTU, 2013d). Qualquer tecido e/ou parte da planta destinada ao uso no cultivo in vitro denomina-se explante. Deste modo, podem ser usados nas culturas: fragmentos de raízes, hipocótilos, epicótilos, cotilédones, flores e folhas, embriões, gemas axilares ou apicais e outros (CID e TEIXEIRA, 2014). A escolha do explante poderá ser determinado por vários fatores, tais como: disponibilidade de material, nível de contaminação, juvenilidade e estação do ano (CID e TEIXEIRA, 2014; QUISEN e ANGELO, 2008). Segundo GRATTAPAGLIA e MACHADO (1998), a fonte de variação do crescimento in vitro entre os explantes pode estar relacionda com o seu tamanho e com a sua posição, quando seccionado do explante de origem. DHAR e JOSHI (2005) relatam que nem todos os explantes reagem da mesma forma a uma determinada condição in vitro, conforme observado no estudo de Saussurea obvallata (planta medicinal e ornamental), verificou-se que os explantes foliares apresentaram as melhores respostas quando comparados com raízes, hipocótilo e cotilédones usados na indução de calos e de organogênese. O suplemento nutricional é outro fator que poderá variar conforme o explante. Esse aspecto nutricional será abordado um pouco mais adiante. A viabilidade do explante é um aspecto vital a ser considerado, pois muitos embriões, especialmente de sementes recalcitrantes (a exemplo de seringueira e do café, etc.), podem estar em condições não viáveis para seu cultivo in vitro (CID e TEIXEIRA, 2014).

2.4.2 Assepsia A desinfestação, ou seja, a remoção de contaminantes existentes na superfície do explante oriundo de material de campo ou de casa de vegetação, é um passo inevitável na cultura in vitro. Na tentativa de produzir plantas sadias livres de patógenos, a propagação in vitro, a partir de sementes, apresenta-se como forma viável de produção, no entanto, diversos fatores podem afetar o potencial germinativo das sementes promovendo a formação de plântulas anormais, dentre eles, a presença de microrganismos, como fungos. Sendo assim, para que a propagação in vitro torne-se fonte confiável de material asséptico, os métodos de 29

desinfestação devem ser eficazes, proporcionando a ausência de agentes patológicos (CID e TEIXEIRA, 2014; MORAIS et al., 2012). Segundo EFFEGEM et al., (2014) as substâncias mais utilizadas nos processos de desinfestação são os compostos a base de cloro ativo (2,0% a 2,5%) e etanol (70%). O hipoclorito de sódio (NaOCl) poderá ser usado em uma formulação mais concentrada (10% a 12%). Nesse caso, dada a alta concentração, o produto deverá ser usado numa forma mais dilúida, conforme observado no estudo de Libidibia ferra (SILVA et al., 2018). Outra formulação comercial para a assepsia dos explantes é o hipoclorito de cálcio (CaOCl2), geralmente a 7% (p/v). Contudo, nesse caso é recomendado previamente filtrar o produto (CID e TEIXEIRA, 2014). O uso de hipoclorito pode ser testado a diferentes concentrações e tempo de imersão, como por exemplo 0,0; 5,0; 10; 20; 30 minutos, etc. É recomendado que, durante esse tempo, os explantes fiquem sob agitação. Após esse tratamento, os explantes devem ser lavados com água destilada e autoclavada para que os resíduos do hipoclorito sejam removidos. Com relação ao fungicida benomil (cabriotop), a experiência prática também tem sido satisfatória. Por exemlo, quando as sementes de L. ferrea colhidos no campo foram tratados com hipoclorito de sódio 0,25% (v/v) – depois com benomil a 2% (v/v) por 60 minutos – e, em seguida, foram inoculados em meios de cultura, a contaminação dos explantes foi reduzida (SILVA et al., 2018). Por fim, o tipo de explante de cada espécie usadas são questões muitos importantes que necessitam ser consideradas para as fases subsequentes da propagação in vitro (KUMAR e REDDY, 2011).

2.4.3 Meios de cultura Os meios nutritivos usados na cultura de tecidos, quanto aos nutrientes, baseiam-se nas exigências de crescimento e desenvolvimento das plantas, com algumas modificações para atender às necessidades específicas das condições in vitro (CALDAS et al., 1998). A composição dos meios de cultura utilizados na micropropagação varia de acordo com a espécie e as diferentes etapas do processo, ou seja, assepsia, multiplicação e enraizamento in vitro (CID e TEIXEIRA, 2014). Dentre os meios de cultura mais utilizados para a micropropagação, destacam-se o MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962), Wood Plant Medium - WPM (LLOYD; MCCOWN, 1981) e Gamborg B5 (GAMBORG et al., 1968). Os ingredients tradicionais de um meio nutritivo são: compostos inorgânicos, orgânicos, inertes e complexas substâncias naturais (CID e TEIXEIRA, 2014). A seguir, serão elencados os ingredientes dos meios nutritivos de forma suscinta para a cultura de tecidos. 30

2.4.4 Sacarose O uso deste composto é fundamental para o crescimento das plantas, devido à fotossíntese da planta. A sacarose é um dos carboidratos mais usados na preparação de meios nutritivos. Sua concentração mais usual varia de 2% a 3%. Mas, ela pode ser utilizada em concentrações maiores de 6%, como no caso de embriões, na indução de bulbilhos de alho ou na tuberização em raízes de mandioca (CID e TEIXEIRA, 2014).

2.4.5 Vitaminas As vitaminas utilizadas na cultura de tecidos fazem parte do grupo das hidrosolúveis. Este grupo é composto por diferentes vitaminas, tais como: B1 (tiamina), B2 (riboflavina), B6 (piridoxina), ácido pantotênico, ácido nicotínico (niacina), ácido fólico, ácido ascórbico, biotina e cobalamina. Dessa lista, a tiamina, o ácido nicotínico e a pirixodina estão presentes em sua grande maioria nos meios nutritivos. Enquanto que a biotina e o ácido pantotênico são de uso mais restritos (CID e TEIXEIRA, 2014).

2.4.6 Inositol Este composto orgânico de baixo peso molecular (180 g), é solúvel em água e rotineiramente usado na preparação de meios. Eventualmente, apresenta um efeito benéfico e não se conhecem respostas inibitórias ou essenciais nas concentrações utilizadas (50 mg L-1 a 100 mg L-1) (CID e TEIXEIRA, 2014).

2.4.7 Reguladores de crescimento vegetal Os fitormônios vegetais podem ser definidos como substâncias naturais ou sintéticas (fitorreguladores) que são adicionados ao meio de cultura, com a finalidade de induzir modificações nos padrões de crescimento e desenvolvimento do explante (CID e TEIXEIRA, 2014). Os reguladores vegetais são amplamente utilizados na suplementação dos meios de cultura para suprir deficiências hormonais, e também estimular o desenvolvimento da planta durante todo o processo de propagação in vitro (MIRANSARI e SMITH, 2014). As principais classes de hormônios são as citocininas e auxinas responsáveis pela indução e multiplicação de gemas na maioria das espécies vegetais, com variações nas concentrações exógenas necessárias. Entretanto, as concentrações mais utilizadas destes hormônios, normalmente, giram em torno de 0,1 e 5,0 mg L-1 (RADEMACHER, 2015) As auxinas mais utilizadas na técnica de cultura de tecidos são: AIA (ácido 3-indol- acético), o IBA (ácido 4-indol-butírico), o 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético), o ApCFA (ácido p-clorofenoxiacético) e o ANA (ácido 1-naftalenoacético) (PEIXOTO, 2011). A ação 31

das auxinas é verificada na indução do alongamento celular e diferenciação de raízes em culturas in vitro, indução de embriogênese, o aumento da friabilidade de calos, o alongamento de entrenós (QUISEN et al., 2008). As citocininas constituem um grupo de reguladores indispensáveis à divisão celular, quebra de dormência apical, indução e proliferação de gemas axilares e diferenciação de gemas adventícias, indução de parte aérea em calos (TAIZ et al., 2017). CID e TEIXEIRA (2014) descrevem que as citocininas mais usadas em cultura de tecidos são a KIN (6- furfurilaminopurina, também conhecida como cinetina), o BAP (6-Benzilaminopurina), o 2ip (N-Isopentinilaminopurina), Zea (Zeatina) e TDZ (Thidiazuron).

2.4.8. Luz A luz, por ser fonte primária de energia relacionada à fotossíntese (HEO et al., 2006) e fenômenos morfogenéticos (TAIZ et al., 2017), é considerado um dos principais fatores que influenciam o crescimento e o desenvolvimento das plantas (GUPTA e AGARWAL, 2017). Em um laboratório de cultura de tecidos, é preciso tomar cuidado com a energia radiante para promover um bom desenvolvimento do cultivo in vitro (CID e TEIXEIRA, 2014). Tradicionalmente, a iluminação das culturas in vitro por lâmpadas de descarga de gás (LDGs), comumente lâmpadas fluorescentes (Fls) emitem luz branca com padrões de emissão de 400 a 700 nm (nanômetros), que são os comprimentos efeitivos para a fotossíntese (BANTIS et al., 2018). A morfogênese das plantas e seus aspectos relacionados são regulados principalmente por vários fotorreceptores que são ativados por fótons nas regiões azul e vermelha do espectro de luz. De acordo com CID e TEIXEIRA (2014) os fótons apresentam diferentes valores de energia. Assim, os fótons da região ultravioleta são mais energéticos que os da região vermelha (Tabela 5). Uma parcela significativa da produção espectral provenientes por LDGs não é utilizada pelo cultivo de plantas in vitro (DUTTA GUPTA e JATOTHU, 2013). Além disso, o excesso de irradiação de luz pode causar danos e oxidação nas plantas (DIETZ et al., 2016). Além do desperdício de energia devido a fótons de comprimentos de onda indesejados e excesso de irradiação de luz, os LDGs também dissipam muita energia como calor. Assim, os LDGs podem não ser a escolha ideal para iluminar as culturas mantidas in vitro, e há uma necessidade de uma fonte de luz eficiente para melhorar a taxa de micropropagação com plantio de qualidade e reduzir o custo de propagação (GUPTA; AGARWAL, 2017). Com o avanço da tecnologia, os diodos emissores de luz (LEDs) foram propostos recentemente como uma fonte de luz eficiente em termos energéticos para várias aplicações de 32

cultura de tecidos vegetais. A emissão de faixa de onda estreita e o controle dinâmico da intensidade de luz em sistemas de iluminação baseados em LED permitem a personalização da qualidade espectral para atender às necessidades das plantas (BATISTA et al., 2018). A precisão na conversão de energia elétrica para fótons de comprimentos de onda específicos na densidade de fluxo de fótons fotossintéticos (DFFF) desejada, com perda de calor insignificante, torna os LEDs mais eficientes no consumo de energia do que todas as outras fontes de iluminação artificial disponíveis (GUPTA e AGARWAL, 2017). O sucesso da regeneração de plantas in vitro depende muito da qualidade dos espectros e da eficiência de fótons das fontes de luz artificial. Os LEDs são a fonte ideal que pode fornecer espectros necessários para estimular respostas organogênicas e embriogênicas. Painéis de LED com espectros de emissão correspondentes aos espectros de absorção de fotorreceptores vegetais podem culminar na formação de plântulas influenciando a morfogênese e o metabolismo das plantas (MASSA et al., 2008). Diversos estudos demostram as aplicações bem sucedidas de LEDs que favorece o crescimento in vitro e a morfogênese de várias espécies de plantas (DUTTA GUPTA e JATOTHU, 2013).

Tabela 5. Comparação entre o conteúdo energético de três comprimentos de ondas Comprimento de onda (λ) Energia (KJ mol-1) UV (280 nm) 471 Azul (425 nm) 274 Vermelha (640nm) 181 Fonte: CID e TEIXEIRA (2014).

2.5 Metabólitos secundários de plantas Os metabólitos secundários acumuladas em plantas e microorganismos possuem um enorme valor agregado do ponto de vista econômico devido aos compostos identificados, pois poucos são aqueles utilizados como drogas, saborizantes, fragrâncias, inseticidas ou corantes (FILOVÁ, 2014). De todas as drogas usadas na medicina ocidental cerca de 25% são derivadas de plantas, quer como um composto puro (fármaco) ou como derivado de um produto de síntese natural. Mais de 50 mil metabólitos secundários já foram identificados em espécies de angiospermas, e são sintetizados em diferentes compartimentos celulares, por quatro vias de biossíntese, são elas: via do acetato malonato, do ácido mevalônico (MEV), do metileritritol fosfato (MEP) e do ácido chiquímico. Através dessas vias são formados os três principais 33

grupos de metabólitos secundários: terpenos, substâncias fenólicas e substâncias nitrogenadas (Figura 4) (MOREIRA 2015). Além destes grupos, também merecem destaque os derivados de ácidos graxos e os policetídeos aromáticos. (FRANÇA, 2017) Apesar do desenvolvimento nas áreas de síntese orgânica, microbioligia industrial e biologia molecular, parte dos fármacos continua sendo provenientes de matérias-primas vegetais. A seguir uma lista de fármacos com elevado valor terapêutica obtidos de matérias- primas vegetais é apresentada na Tabela 6.

Tabela 6. Exemplos de fármacos obtidos de matérias-primas vegetais Fármaco Utilização terapêutica Espécie Artemisina (terpenos) Antimalárico Artemisia annua L. Atropina Anticolinérgico Atropa beladona L. Cafeína Estimulante central Coffea spp. Capsaicina Anestésico tópico Capsicum spp. Colchicina Antirreumático Colchium autumnale L. Digoxina, digitoxina Cardiotônicos Digitalis purpura L. Emetina Amebicida Carapichea ipecacuanha (Broth) L. Escopolamina Antiparkinsoniano Datura spp. Estrofantina (ouabaína) Cardiotônio Strophanthus spp. Fisostigmina Antiglaucomatoso Physostigma venenosum Balf. Galantamina Anticolinesterásico Galanthus woronowii Losinsk Hiosciamina Anticolinérgico Hyoscyanus muticus L. Morfina, codeína Analgésico/antitussígeno Papaver somniferum L. Pilocarpina antiglaucomatoso Pilocarpus jaborandi Holmes Quinina, quinidina Antimalárico/antiarrítmico Cinchona spp. Reserpina Anti-hipertensivo Rauvolfia spp. Tubocurarina Bloqueador neuromuscular Chondrodendron tomenstosum Ruiz & Pav. Vimblastina, vincristina Antineoplásicos Catharantus roseus L. Fonte: BERNARDES et al., (2017)

Figura 4. Esquema geral das vias de biosíntese do metabolismo vegetal secundário (retângulos rosas) e suas conexões com o metabolismo primário (retângulos vermelhas), em detalhe os metabólitos primários (verde) e os secundários (azul).

Fonte: MOREIRA (2015) 35

2.6 Metodologias utilizadas na busca de substâncias bioativas O processo de caracterização é considerado uns dos principais métodos para a identificação de grupos de metabólitos de uma determinada espécie vegetal cuja constituição é desconhecida (REGINATTO, 2017). Esta busca pode ser feita através do fracionamento biomonitorado ou bioguiado ou de forma mais clássica, através do fracionamento dos extratos ativos e posterior avaliação das substâncias isoladas nos ensaios para o qual o extrato foi ativo (LAHLOU, 2013). Cada passo do fracionamento é geralmente guiado por um bioensaio e o processo é chamado de bioensaio (SARKER e NAHAR, 2007). O esquema a seguir (Figura 5) apresenta uma visão geral do processo tradicional biomonitorado de descoberta de drogas de um produto natural.

Figura 5. Esquema de processo de descoberta de produtos naturais.

Fonte: SARKER e NAHAR (2007)

2.7 Fracionamento, isolamento e purificação de metabolótios secundários. O procedimento para o fracionamento inicia com a avaliação biológica e também fitoquímica dos extratos vegetais através do uso de técnicas como a cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC) e de reveladores químicos e físicos. Desse modo, escolhe-se o extrato a fracionar, seja por apresentar elevada atividade biológica ou por indicar a presença de metabólitos de interesse para o grupo de pesquisa (AZMIR et al., 2013). O fracionamento é realizado utilizando diferentes técnicas como a cromatografia em coluna aberta, partição 36

liquido-liquido, cromatografia em camada delgada preparativa, cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE), entre outras (LIANG et al., 2004). No acoplamento destas técnicas, faz-se uso de métodos eficientes de separação, como CLAE e CG, com técnicas espectrométricas que funcionam para detecção, como espectrofotometria de UV-Visível (DAD), espectrometria de massas (MS e MS-MS) e ressonância magnética nuclear (RMN), fornecendo importante informações adicionais sobre a estrutura química dos componentes da amostra (LIANG et al., 2004; MUKHERJEE, 2018). O fracionamento por partição tem por objetivo separar os compostos considerando sua solubilidade e seu coeficiente de partição em diferentes solventes (REGINATTO, 2017). Para esse procedimento, a escolha dos solventes é baseada no grau de polaridade crescente (Figura 6). Portanto, as substâncias isoladas são identificadas e avaliadas quanto a suas atividades biológicas através dos bioensaios (AZMIR et al., 2013).

Figura 6. Processo de partição com solventes de polaridade crescente.

Fonte: REGINATTO (2017)

2.8 Bioensaios para determinação do potencial medicinal de extratos de plantas Bioensaios ou ensaios biológicos são testes feitos em laboratório que determinam o grau ou o efeito biológico de uma substância desconhecida ou de uma substância-teste (como drogas, hormônio, químicos, etc). Entretanto, os bioensaios diferem principalmente quanto ao tempo de exposição do organismo-teste ao agente ou substância a ser testado (ADENUBI et al., 2018; ZOU et al., 2016). 37

Dentre os tipos de bioensaios, destacam-se: os ensaios in vivo que são aqueles realizados com organismos vivos e os ensaios in vitro, que são aqueles realizados em equipamentos laboratoriais, como placas de petri e microplacas (CARVALHO, 2016a). Nos últimos 30 anos, os ensaios biológicos in vitro tem sido bastante utilizado para descoberta de novas drogas devido ao seu potencial que podem testar muitas amostras para a atividade em um curto período de tempo e em pequenas escalas (microplacas), proporcionando resultados significativos quanto ao número de réplicas suficiente para efetuar a análise estatística, como o caso dos testes antibacterianos, antioxidantes e de toxicidade frente à Artemia salina (SOUZA-MOREIRA et al., 2010).

2.9 Ensaios antibacterianos As plantas podem contribuir na descoberta de novos antibióticos, pois é possível que produtos naturais antimicrobianos possam ser biossintetizados para prevenir e/ou combater o ataque de microorganismos patogênicos às plantas (GUIMARÃES et al., 2010). Os principais métodos microbiológicos para avaliar a atividade antibacteriana estão classificados em três tipos: métodos de difusão, métodos de diluição e bioautografía (RIOS et al., 1988). As técnicas de difusão têm sido amplamente usadas para avaliar extratos de plantas com atividade antimicrobiana (RAMIREZ e CASTAÑO, 2009).

2.9.1 Métodos de difusão De acordo com VANDEN BERGHE e VLIETINCK (1991), os ensaios de difusão são métodos quantitativos, nos quais o efeito pode ser graduado. A difusão consiste em uma substância a ser ensaiada em um meio de cultura sólido e inoculado com o microrganismo. A partir desse processo de difusão ocorre o aparecimento de um halo, no qual não há crescimento do microorganismo, denominado halo de inibição. Diversos tipos de reservatórios podem ser utilizados incluindo discos de papel, cilindros de porcelana ou de aço inoxidável e poços feitos no meio de cultura (VALGAS et al., 2007). RIOS et al., (1988) relata que a substância ou extrato a ser testado é colocado em contato com o meio de cultura inoculado, e a maneira como se processa esse contato define os diferentes métodos de difusão, dentre eles, método do disco difusão, método dos cilindros e método de poços

2.9.2 Métodos de diluição O método de diluição em caldo é uma técnica in vitro realizada através de macrodiluição em tubos, e microdiluição em microplacas de 96 poços, os quais são preparados adicionando- se concentrações seriadas da substância que está sendo avaliada, colocando-se uma solução 38

padrão do inóculo das bactérias teste, sendo estas posteriormente incubadas durante 24 horas (VALGAS, et. al., 2007). Após incubação, o crescimento do microrganismo é determinado pela leitura visual direta ou turbidimétrica pelo uso de espectrofotômetro em diferentes comprimentos de onda adequados (VANDEN BERGHE e VLIETINCK, 1991). A avaliação do método de diluição é observado de forma quantitativa à atividade de uma determinada substância antimicrobiana frente às bactérias, determinando a concentração mínima inibitória (CMI), cuja concentração mais baixa da substância testada é capaz de inibir o crescimento bacteriano após o tempo de incubação. Enquanto que a concentração mínima bactericida (CBM) é considerada como concentração da substância testada capaz de evitar ou impedir o crescimento de bactérias, a qual é determinada depois de realizar-se uma subcultura em placas de ágar sem o antibacteriano, com o conteúdo dos poços onde não houve aparente crescimento de bactérias no ensaio do CMI (CLSI 2002).

2.9.3 Bioautografia Conforme RIOS et al., (1988) relatam que os ensaios bioautográficos são aqueles que empregam placas de cromatografia de camada fina (CCF) para a análise. Neste contexto, os compostos separados por CCF são colocados por contato em placas de ágar previamente inoculadas com o microrganismo teste. Tais zonas de inibição de crescimento microbiano indicam a presença de substâncias antimicrobianas (BRANDÃO, 2004). Estes métodos apresentam enorme importância na pesquisa de compostos antimicrobianos vegetais, pois permitem a localização direta dos constituintes ativos a partir de uma matriz complexa sendo, portanto, considerado um método qualitativo (HOSTETTMANN e MARSTON, 1994; HOSTETTMANN e TERREAUX, 2000).

2.10 Antioxidantes Antioxidantes são substâncias químicas ou produtos biológicos capazes de agir contra os danos normais causados pelos efeitos do processo fisiológico de oxidação (ZAMORA, 2007). Tanto nutrientes (vitaminas e minerais) como enzimas (proteínas no corpo que ajudam as reações químicas) são considerados antioxidantes. Acredita-se que os antioxidantes ajudam na prevenção do desenvolvimento de doenças crônicas, como o câncer, doenças cardíacas, derrame, Mal de Alzheimer, artrite reumatoide e catarata, por esta razão têm sidos realizados estudos nas buscas dos compostos antioxidantes (KORGE et al., 2008; MANSUROĞLU et al., 2015; PAN et al., 2013). 39

O estresse oxidativo ocorre quando a produção de moléculas prejudiciais, denominadas de radicais livres, está além da capacidade protetora das defesas antioxidantes. Os radicais livres são átomos químicamente ativos ou moléculas que apresentam um número ímpar de elétrons na sua órbita externa, a exemplo de ânion superóxido, o radical hidroxila, os metais de transição, como o ferro e o cobre, o ácido nítrico e o ozônio, considerados radicais livres (GENESTRA, 2007). Ensaios in vitro têm demonstrado a importância de dietas ricas em frutas e vegetais pela presença de antioxidantes que ajudam no combate aos radicais livres, que em consumo moderado, são benéficos à saúde humana. Em contrapartida alguns testes in vitro e in vivo demonstram que, em certas condições e concentrações erradas, algumas das substâncias com efeitos antioxidantes podem apresentar o efeito contrário, sendo necessários mais estudos para estabelecer o papel desses compostos na prevenção de doenças. No entanto, muitos ensaios in vitro são utilizados para determinar o potencial antioxidante de determinada amostra (CARVALHO, 2016).

2.10.1 Ensaio antirradicalar de sequestro do radical DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazil). Este ensaio apresenta grande importância na ciência dos antioxidantes devido ser relativamente simples de reproduzir e utilizar um radical estável (CHEN et al., 2013), ele é usado para determinar a capacidade da substância em transferir elétrons ou doar átomos de hidrogênio para estabilizar o radical livre (Figura 7), fazendo com que o radical, que possui uma coloração roxa com absorção máxima em 515 nm, adquira uma coloração amarelada. Atividade é proporcional pela perda da absorbância em 515 nm, quanto maior a perda, maior será a atividade antioxidante da amostra (CARVALHO, 2016b).

2.10.2 Atividade redutora do íon férrico (Fe3+) a íon ferroso (Fe2+) O ensaio da atividade redutora do íon Fe3+ a Fe2+, analisa a capacidade que determinada amostra tem de transferir elétrons e, consequentemente, reduzir íons metálicos ou radicais livres, medindo assim a sua capacidade redutora. Para esse teste utiliza-se um complexo incolor de TPTZ com íon Fe3+, que ao ser reduzido a Fe2+ ganha uma coloração azul intensa com absorção máxima em 593 nm. Entretanto, a atividade redutora de determinada amostra é proporcional ao ganho de absorção, quanto maior o ganho mais eficiente é a amostra, como observado na Figura 8 (CARVALHO, 2016b).

Figura 7. Reação de estabilização do Radical DPPH frente a um composto fenólico doador de hidrogênio.

Fonte: Adaptado de TEIXEIRA et al., (2013)

Figura 8. Reação da atividade redutora do íon Fe3+ a íon Fe2+

Fonte: Adaptado de KESIĆ et al., (2015)

2.11 Toxidade frente à Artemia salina Outro teste amplamente utilizado na busca por substâncias bioativas é o teste de citotoxicidade frente à Artemia salina Leach (camarão de alga salgada), principalmente por ser um método rápido, confiável e de baixo custo (MEYER et al., 1982) possibiltando selecionar extratos que podem conter substâncias antitumorais (MCLAUGHLIN et al., 1998). Este teste é um complemento importante para a atividade inseticida, pois é importante que a substância esteja ativa sobre o inseto e não seja tóxica para outros organismos. MAYORGA et al., (2010) descrevem que o ensaio com esse microcrustáceo é utilizado rotineiramente em laboratórios de todo o mundo para pré-triagem de extratos de plantas com potencial medicinal (por exemplo, antimicrobianos ou antiparasitários), e para a detecção de efeitos citotóxicos.

3. JUSTIFICATIVA O trabalho justifica-se pela necessidade de aprofundamentos dos estudos de propagação in vitro e bioprospecção de extratos de plântulas micropropagadas de Libidibia ferrea, que possibilitará a multiplicação de genótipos superiores com potencial para uso medicinal. As diversas propriedades terapêuticas e/ou medicinais desta espécie, é de grande interesse econômico para a indústria farmacêutica, devido ao princípio ativo denominado “Pau-ferrol” que inibe o crescimento das células cancerígenas. Isto gerou a sua inclusão na Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao Sistema Único de Saúde (RENISUS) que aborda 71 espécies de importância medicinal e aplicadas na saúde pública no Brasil (BRASIL, 2011; MEDEIROS et al., 2013; RIBEIRO et al., 2014).

4. OBJETIVOS

4.1 Geral Estabelecer protocolos de propagação in vitro e prospecção química e biológica dos extratos de plântulas micropropagadas de Libidibia ferrea.

4.2 Específicos  Estabelecer a germinação de sementes e embriões zigóticos in vitro no meio MS suplementados com BAP e ANA;  Avaliar diferentes concentrações das auxinas 2,4-D e ANA e sua interação com as citocininas TDZ e BAP na indução de calos em explantes foliares e segmentos nodais;  Avaliar o efeito da luz de LEDs na calogênese e regeneração de plantas in vitro;  Realizar o estudo do potencial fitoquímico e biológico dos extratos de folhas, caule e raízes de plantas originadas do cultivo in vitro.

5. REFERÊNCIAS

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CAPÍTULO I

Cultura in vitro de embriões zigóticos e sementes de Libidibia ferrea

Artigo elaborado e publicado de acordo com as normas da Revista Hoehnea

Cultura in vitro de embriões zigóticos e sementes de Libidibia ferrea1

Daniel da Silva2,5, Angela Maria Imakawa3, Suely de Souza Costa4 e Paulo de Tarso Barbosa

Sampaio3,4

1. Parte da Tese de Doutorado do primeiro Autor 2. Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade e Biotecnologia - Rede Bionorte, Escola Superior de Ciências da Saúde, Universidade do Estado do Amazonas, Avenida Carvalho Leal 1777, Cachoeirinha, 69065-00, Manaus, AM, Brasil 3. Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais, Escola Superior de Tecnologia, Universidade do Estado do Amazonas, Avenida Darcy Vargas 1200, Parque Dez de Novembro, 69065-020 Manaus, AM, Brasil 4. Laboratóro de Silvicultura e Tecnologias Digitais, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Rua da Lua s/n, Conjunto Morada do Sol, Aleixo, 69060-082, Manaus, AM, Brasil 5. Autor para correspondência: [email protected] 57

ABSTRACT - (In vitro culture of zygotic embryos and seeds of Libidibia ferrea). The objective of this work was to evaluate the germination of zygotic embryos of Libidibia ferrea seeds in vitro and the morphogenetic responses of the explants to different concentrations of growth regulators. Seeds and zygotic embryos were inoculated in MS culture medium and maintained in a growth room at 25 ± 2 °C and photoperiod of 16 hours for 30 days. The results showed that the multiplication rate of seed germination in vitro was higher than for zygotic embryos. However, zygotic embryos in MS medium supplemented with 0,9 mg L -1 de BAP showed the highest percentage of regeneration (50%), number of shoots (3.25), buds (2.85) and leaves (3.15), multiplication rate (27.75) and shoot length (1.96 cm). Zygotic embryos and seeds in vitro cultured allowed the multiplication of a larger number of healthy seedlings, proving to be an alternative technique for L. ferrea propagation.

Keywords: auxins, cytokinins, tissue culture, morphogenesis, pau-ferro.

RESUMO - (Cultura in vitro de embriões zigóticos e sementes de Libidibia ferrea). O objetivo deste trabalho foi avaliar a germinação in vitro de embriões zigóticos e sementes de Libidibia ferrea e as respostas morfogenéticas dos explantes em relação a diferentes concentrações de reguladores de crescimento. As sementes e os embriões zigóticos, foram inoculados em meio de cultura MS e mantidos em sala de crescimento com temperatura de 25 ± 2 °C, e 16h de fotoperíodo por 30 dias. Os resultados mostraram que a taxa de germinação in vitro de sementes foi superior em relação aos explantes originados de embriões zigóticos. Entretanto, os embriões zigóticos em meio MS suplementado com 0,9 mg L-1 de BAP apresentaram a maior percentagem de regeneração (50%), número de brotos (3,25), gemas (2,85) e folhas (3,15), taxa de multiplicação (27,75) e comprimento de brotos (1,96 cm). A cultura in vitro de embriões zigóticos e sementes possibilitou a multiplicação de maior número de plântulas sadias, revelando-se uma técnica alternativa para propagação desta espécie.

Palavras-chave: auxinas, citocininas, cultura de tecidos, morfogênese, pau-ferro.

Introdução Libidibia ferrea (pau-ferro ou jucá) é uma planta arbórea brasileira de potencial econômico e de interesse farmacêutico; devido ao princípio ativo denominado de “Pau-ferrol” extraído dos caules de plantas juvenis, utilizado contra a topoiosomerase II humana, que inibe o crescimento das células por meio da indução de apoptose, podendo ser utilizado como importante ferramenta no tratamento da leucemia HL60 humana (Nozaki et al. 2007; Ohira et al. 2013). A propagação de L. ferrea é viável por sementes (Scalon et al. 2011) e por mudas (Lima et al. 2008; Lenhard et al. 2010). A propagação in vitro é uma ferramenta da biotecnologia vegetal que explora a totipotência da natureza das células vegetais, o que possibilita a reprodução de genótipos superiores in vitro (Gatti et al. 2016) através de pequenos fragmentos de tecido vivo (explantes) isolados de um organismo e cultivados em um meio nutritivo. Tais avanços têm aumentado às perspectivas de manipulações genéticas a serem utilizadas, em diversos campos da biotecnologia de plantas (Paiva et al. 2012). Espécies lenhosas como L. ferrea geralmente, quando micropropagadas, apresentam baixa taxa de multiplicação e enraizamento in vitro (Silva et al. 2018), portanto é necessário aperfeiçoar os métodos de propagação visando aumentar a produção massal de plantas sadias e uniformes, por meio da multiplicação de genótipos selecionados, disponibilizando mudas para plantios ex-situ e possibilitando a reintrodução de plantas produzidas em seu habitat natural. A técnica de cultura de embriões zigóticos consiste na totipotencialidade da célula vegetal que pode influenciar no desenvolvimento e regeneração da planta inteira, resultando na rápida multiplicação de plantas (Liu et al. 2007). O cultivo de embriões zigóticos pode ser utilizado na superação da dormência de sementes causada pela imaturidade do embrião ou pela presença de substâncias inibidoras no endosperma, avaliar aspectos nutricionais e fisiológicos do desenvolvimento do embrião e a viabilidade de sementes, visando ampliar os conhecimentos dos processos germinativos (George et al. 2008). O objetivo do estudo foi avaliar a germinação in vitro de embriões zigóticos e sementes de L. ferrea; assim como, a resposta morfogenética in vitro de embriões zigóticos em relação a diferentes concentrações de 6-benzilaminopurina (BAP) e do ácido 1-naftalenoacético (ANA).

Material e Métodos Os experimentos foram realizados de março a outubro de 2016 no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais (LCTV) pertencente à Escola Superior de Tecnologia (EST) da Universidade do Estado do Amazonas (UEA). Foram utilizadas sementes de L. ferrea com boa maturidade fisiológica armazenadas em temperatura ambiente, provenientesdo Banco de Sementes do Laboratório de Microbiologia e Fertilidade do Solo, Instituto Nacional da Pesquisa da Amazônia (INPA). O meio de cultura utilizado foi o MS (Murashige e Skoog 1962). O pH do meio do meio foi aferido para 6,0 antes da autoclavagem à temperatura de 121 ºC e pressão de 1 atm por 15 minutos. As culturas foram mantidas em sala de crescimento com temperatura de 25 ± 2 °C e 16 h de fotoperíodo com intensidade luminosa de 52 μmol m-2 s-1, provenientes de duas lâmpadas fluorescentes brancas frias. Estabelecimento e germinação in vitro – Inicialmente, as sementes foram escarificadas em pedra de esmeril, na região lateral do lado oposto ao hilo até atingir um desgaste leve do tegumento para possibilitar a absorção de água. Após a escarificação, as sementes foram lavadas com detergente neutro e enxaguadas em água corrente por um minuto. Em seguida, foram imersas em solução de Carbendazim® 2,0% (v/v) por 1 hora sob agitação constante a 100 rpm. A seguir, as sementes foram imersas em álcool 70% durante 1 minuto e depois mergulhadas na solução de hipoclorito de sódio (NaOCl) 0,25% (v/v) por 30 minutos sob agitação. Após a desinfestação, as sementes foram lavadas 4 vezes com água destilada e autoclavada e, em seguida, imersas em recipiente com água destilada vedado com filme de policloreto de vinila (PVC) durante 24 horas para embebição. Após este período, foi feita a incisão horizontal no centro da semente, separando os cotilédones com auxílio de pinça para a remoção do embrião zigótico, sob condições assépticas, em câmara de fluxo laminar. Os explantes foram inoculados em tubos de ensaio (25 x 150 mm) contendo 10 mL de meio de cultura MS. Após 30 dias os explantes foram avaliados quanto à porcentagem de germinação, número de brotos, gemas e folhas, comprimento de brotos, porcentagem de plantas normais (ausência ou crescimento atrofiado da parte aérea, ausência de plúmula e/ou expansão foliar), número de raízes e taxa de multiplicação (nº de brotos x nº gemas) de acordo com a metodologia de Santos et al. (2006). O delineamento experimental da germinação in vitro foi o inteiramente casualizado composto por 6 repetições compostas por 5 unidades experimentais. Os resultados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as médias comparadas pelo teste de Duncan com nível de significância de 5%. 60

Resposta morfogenética – Os embriões zigóticos oriundos das sementes foram inoculados em frascos de ensaios (119 x 70 mm) contendo 40 mL de meio de cultura MS suplementados com diferentes concentrações do ANA e BAP, num total de 12 tratamentos: T1: Controle; T2: 0,9 mg L-1 de BAP; T3: 1,8 mg L-1 de BAP; T4: 3,6 mg L-1 de BAP; T5: 0,18 mg L-1 de ANA; T6: 0,37 mg L-1 de ANA + 0,9 mg L-1 de BAP; T7: 0,18 mg L-1 de ANA + 1,8 mg L-1 de BAP; T8: 0,18 mg L-1 ANA + 3,6 mg L-1 de BAP; T9: 0,37 mg L-1 de ANA; T10: 0,37 mg L-1 de ANA + 0,9 mg L-1 de BAP; T11: 0,37 mg L-1 de ANA + 1,8 mg L-1 de BAP e T12: 0,37 mg L-1 ANA + 3,6 mg L-1 de BAP. Após 30 dias da inoculação, avaliaram-se: a percentagem de regeneração de embriões, o número de brotos e gemas, taxa de multiplicação, comprimento de brotos, número de raízes e porcentagem de formação de calo. O delineamento experimental da resposta morfogenética foi inteiramente casualizado em esquema fatorial 4 x 3 (concentrações de BAP x concentrações de ANA) totalizando 12 tratamentos, composto por 5 repetições, cada uma constituída por 4 unidades experimentais. Os dados obtidos foram submetidos à ANOVA e as médias comparadas pelo teste de Duncan com nível de significância de 5%. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa ASSISTAT® versão 7.7.

Resultados e Discussão O início da germinação de sementes ocorreu entre o sétimo e o décimo dia. O resultado é semelhante ao observado por Medeiros Filho et al. (2005) que constataram que o tempo médio de germinação de sementes de L. ferrea escarificadas em casa de vegetação e sala de crescimento (germinador) foi de 7,8 e 10,5 dias, respectivamente. Observou-se que não houve diferença significativa (p < 0,05) entre as taxas de germinação de sementes (46,67%) e embriões zigóticos (66,67%) (Tabela 1). No entanto, a germinação das sementes in vitro apresentou maior número de brotos (1,93), gemas (1,33) e raízes (3,40), comprimento do broto (1,82 cm) e taxa de multiplicação dos explantes quatro vezes maior em relação aos explantes originados de embriões zigóticos de L. ferrea (Tabela 1).

Tabela 1. Percentagem de germinação (GER) e plantas normais (PN), número de brotos (NB), número de gemas (NG) e número de folhas (NF), comprimento dos brotos (CB), número de raízes (NR) e taxa de multiplicação (TM) obtidos de embriões zigóticos e sementes de Libidibia ferrea após 30 dias de inoculação em meio de cultura MS.

Variáveis Explantes GER (%) PN (%) NB NG NF CB (cm) NR TM Embriões 66,67 a 13,33 a 0,83 b 0,40 b 1,70 a 0,52 b 0,76 b 0,50 b zigóticos Sementes 46,67 a 20,0 a 1,93 a 1,33 a 3,40 a 1,82 a 4,03 a 2,50 a Médias seguidas de mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Duncan (p<0,05)

Observa-se que a taxa de formação de plântulas normais (Figura 1) originadas da germinação in vitro de embrião zigótico (13,33%) e de sementes (20%) foi considerada baixa em relação ao crescimento das plântulas. Tais diferenças podem ser atribuída a perdas por contaminação microbiana e ao estádio de latência no desenvolvimento das plântulas cultivadas in vitro, o que resultou na ausência de expansão foliar bem como na germinação de explantes. Esta observação possivelmente está relacionada à elevada pressão osmótica que reduz o crescimento de plantas e afeta o metabolismo celular agindo como barreira para a expansão foliar (Pinheiro & Chaves 2011). Sobre a hipótese, esperava-se obter grande número de brotações de embriões zigóticos cultivados in vitro, devido à elevada totipotência destes explantes (Bhojwani & Dantu 2013). O menor número de brotos e gemas ocorreu nos embriões zigóticos, e possivelmente está relacionado com brotos de ápice fasciculada e o menor alongamento entrenós (Figura 1A). Ao contrário das plântulas originadas da germinação de sementes que apresentaram maior alongamento dos entrenós e uniformidade (Figura 1B). O resultado possibilita estabelecer a cultura in vitro de L. ferrea, tendo em vista que, a partir de uma plântula é possível produzir 10 segmentos nodais. 62

Figura 1. Plântulas germinadas in vitro oriundas de embriões zigóticos (a) e sementes (b) de Libidibia ferrea inoculados em meio MS após 30 dias de cultivo (b).

A menor taxa de multiplicação de plântulas oriundas de embriões zigóticos, em relação às sementes, sugere a necessidade de realizar novos estudos sobre a resposta morfogenética da regeneração de embriões zigóticos, considerando o fato de que os embriões zigóticos são explantes com tecido de elevada totipotência (Kumar & Reddy 2011). O efeito das concentrações dos hormônios como resposta morfogenética apresentou diferenças significativas (p < 0,05) quando os explantes de L. ferrea foram submetidos às concentrações isoladas de BAP (Figura 3A). A concentração 0,9 mg L-1 de BAP (T2) no meio MS estimulou a maior percentagem de regeneração (50%), número de brotos (3,25), gemas (2,85) e folhas (3,15), taxa de multiplicação (27,75) e comprimento do broto (1,96) por explante (Figuras 2A, 2B, 2C, 2D, 2E e 2F). A interação de ANA com BAP influenciam na oxidação de explantes, sendo que nas maiores concentrações utilizadas reduziu significativamente a indução de brotos (Figura 2B). Concentrações excessivas de citocininas e auxinas quando aplicadas ao meio de indução de brotos podem comprometer as brotações a partir dos eixos embrionários o que prejudica o crescimento dos explantes, além de ser um fator de redução da taxa de multiplicação (Wójcikowska & Gaj 2017). 63

Figura 2. Percentagem de regeneração (A), número de brotos (B), número de gemas (C), número de folhas (D), taxa de multiplicação (E), altura das brotações (F), número de raízes (G) e formação de calos (I) obtidos de embriões zigóticos de Libidibia férrea após 30 dias de cultivo in vitro em meio MS suplementado com diferentes concentrações de BAP e ANA. Médias seguidas de mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Duncan (p<0,05).

Na cultura de tecidos, os reguladores de crescimento em baixas concentrações no crescimento e desenvolvimento de plantas (Cid & Teixeira 2014). Este fato foi observado nos explantes de L. ferrea tratados com a menor concentração de BAP, que estimulou a maior taxa de regeneração embriões zigóticos (Figuras 2A e 3B) e de brotos (Figuras 2B e 3C). Resultados similares foram observados por Fonseca et al. (2014) que verificaram a maior taxa de regeneração de embriões zigóticos de Erythrina velutina Willd. (Leguminosae) quando cultivadas in vitro em meio MS suplementado com 4 µM de BAP. No desenvolvimento dos embriões zigóticos, observou-se redução do número de gemas quando os explantes foram submetidos a concentrações isoladas de ANA, ou em combinações de ANA com BAP (Figura 2C). A redução do número de gemas observadas pode estar relacionada com as altas concentrações de auxina/citocinina que inibiram o desenvolvimento das gemas laterais e adventícias nos explantes de L. ferrea. As citocininas são responsáveis pela divisão celular, quebra de dormência apical e indução de proliferação de gemas axilares em explantes cultivadas in vitro (Miransari & Smith 2014). A taxa de multiplicação (Figura 2E) dos embriões zigóticos foi superior (27,75) ao observado por (Silva et al. 2018) que trabalharam com explantes de segmentos nodais e gemas axilares da espécie (10,06). O comprimento médio dos brotos oriundos do embrião zigótico cultivado apenas com a concentração 0,9 mg L-1 de BAP foi de 1,96 cm (Figura 2F e 3D). Observou-se ainda, que as maiores concentrações de BAP e ANA resultaram no menor crescimento dos brotos (Figura 2F). Miao et al. (2016) relatam que a capacidade dos tecidos responderem ao crescimento e o desenvolvimento de brotações dependem de vários fatores endógenos e/ou exógenos e suas interações. Foi observada a formação de raízes em todos os tratamentos, porém o meio de cultura com a ausência de reguladores de crescimento (T1) apresentou a maior média (2,15 raízes/explante), que diferiu significativamente das demais combinações de auxina e citocinina (Figura 2G). As auxinas naturais ou sintéticas geralmente não conseguem estimular a formação de raízes in vitro. Souza & Pereira (2007) reportam que determinadas espécies vegetais, especialmente lenhosas, enraízam com dificuldade na presença de auxinas, indicando que outros fatores podem influenciar no enraizamento in vitro.

Figura 3. Fases de desenvolvimento de embrião zigótico e formação de plântula de Libidibia ferrea no meio MS suplementado com 0,9 mg L-1 de BAP: Cultivo inicial do embrião zigótico (A); Germinação do embrião zigótico aos 10 dias (B); Plântula com brotos, gemas e raíz primária aos 20 dias (C); e Plântula normal após 30 dias de cultivo in vitro (D).

As diferentes combinações do BAP com ANA reduziram significativamente a indução de raízes (Figura 2G). As citocininas geralmente quando são adicionadas ao meio de cultura promovem a formação de brotações adventícias; enquanto as auxinas estimulam a formação do sistema radicular em tecidos que apresentam predisposição ao enraizamento (Jardim et al. 2010). Os explantes de L. ferrea quando submetidos às concentrações isoladas de ANA apresentaram baixa taxa de enraizamento (Figura 2G). Na formação de calos, observou-se que a interação de ANA e BAP apresentou diferença significativa (Figura 2H) e a combinação de 0,37 mg L-1 de ANA + 1,8 mg L-1 de BAP (T11) promoveu a maior percentagem de formação de calos marrons e compactos (70%), seguidos das concentrações 0,37 mg L-1 de ANA + 0,9 mg L-1 de BAP (T6) e 0,37 mg L-1 de ANA + 3,6 66

mg L-1 de BAP (T12) ambos com 55%, e 40% com o uso de 0,37 mg L-1 de ANA + 0,9 mg L -1 de BAP (T10). As células ou tecidos, geralmente possuem competência para se diferenciarem devido às respostas morfogenéticas em relação a diferentes reguladores de crescimento (Elhiti et al. 2013) (Figura 2H). As plântulas obtidas neste estudo apresentaram fenótipo normal, mas foram observados casos de alterações na morfologia das folhas e no caule das plântulas, que apresentava-se mais largo e com frequente produção de calos na base. Almeida et al. (2001) reporta que esses variantes somaclonais ocorrem em plantas regeneradas a partir de calos obtidos dos explantes epicótilos e folhas cotiledonares, onde são relatadas maiores índices de variação somaclonal.

Conclusões As maiores taxas de regeneração e multiplicação de embriões zigóticos de L. ferrea foram obtidas em meio de cultura MS suplementado com 0,9 mg L-1 de BAP. Na ausência de regulador de crescimento foi verificada a maior média (2,15) de raízes/explantes, beneficiando a sobrevivência das plântulas. Os resultados apontaram a importância de avaliar a composição mineral do meio de cultura e dos reguladores de crescimento, visando a determinar as condições ótimas para o processo de propagação de L. ferrea a partir de sementes e embriões zigóticos para fins comerciais bem como para iniciativas de conservação e multiplicação in vitro da espécie.

Agradecimentos Os autores agradecem a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) pela concessão de bolsa ao primeiro autor pelo Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade e Biotecnologia da Universidade do Estado do Amazonas (Bionorte/UEA). Ao Dr. Luiz Augusto Gomes de Souza do Instituto Nacional de Pesquisas de Amazônia (INPA) pela identificação e fornecimento das sementes de L. ferrea.

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CAPÍTULO II

Indução de calos em explantes foliares e segmentos nodais de Libidibia ferrea (Fabaceae), uma notável planta de valor medicinal

Artigo elaborado e publicado de acordo com as normas da Revista de Ciências Agrárias de Portugal

Indução de calos friáveis em explantes foliares e segmentos nodais de Libidibia ferrea (Fabaceae), uma notável planta de valor medicinal

Induction of friable callus in leaf explants and nodal segments of Libidibia ferrea (Fabaceae), a remarkable plant medicinal value

Daniel da Silva1,2*, Angela Maria Imakawa2 e Paulo de Tarso Barbosa Sampaio2,3

1 Rede Bionorte, Escola Superior de Ciências da Saúde (ESA), Universidade do Estado do Amazonas (UEA), Avenida Carvalho Leal 1777, Cachoeirinha, 69065-001, Manaus, Brasil 2Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais, Escola Superior de Tecnologia (EST), Universidade do Estado do Amazonas (UEA), Avenida Darcy Vargas 1200, Parque Dez de Novembro, 69065-020, Manaus, Brasil 3Laboratório de Silvicultura e Tecnologias Digitais, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), Rua da Lua s/n, Conjunto Morada do Sol, Aleixo, 69060-082, Manaus, Brasil (*E-mail: [email protected])

RESUMO

Libidibia ferrea é uma espécie arbórea que ocorre na Amazônia, muito utilizada contra bronquites, reumatismo e úlceras gástricas. Estudos recentes revelam que o princípio ativo denominado de “Pau-ferrol A” encontrado em plântulas jovens apresenta atividade contra a topoisomerase II humana. Objetivou-se com este trabalho obter calos friáveis em explantes foliares e segmentos nodais para estudos posteriores em embriogênese somática. Avaliou-se o efeito de diferentes concentrações de 2,4-D e ANA isoladamente ou em combinação com BAP e TDZ na calogênese. Nossos resultados demonstraram que ambos os tipos de explantes selecionados apresentaram diferenças significativas (p<0,05) na indução, morfologia e coloração dos calos. A indução máxima de calos (90%) foi obtida a partir de explantes de segmentos nodais cultivados em meio MS suplementado com 1,0 mg L-1 de 2,4-D e 5,0 mg L-1 de TDZ, mantendo os explantes em condição de fotoperíodo de 16 horas por 30 dias com temperatura de 25°C±2°C. Os resultados obtidos de calogênese de L. ferrea possibilitam estudos futuros na área de embriogênese somática.

Palavras-chave: Cultura de calos, Regeneração, Libidibia ferrea, Planta medicinal.

ABSTRACT

Libidibia ferrea is a tree species that occurs in the Amazon, widely used against bronchitis, rheumatism and gastric ulcers. Recent studies have shown that the substance called "Pau-ferrol A" found in young seedlings has activity against human topoisomerase II. The objective of this work was to obtain friable callus from leaf explants and nodal segments for further studies on somatic embryogenesis. The effect of different concentrations of 2,4-D and ANA alone or in combination with BAP and TDZ on callogenesis was evaluated. Our results demonstrated that both types of explants selected showed significant differences (p <0.05) in callus induction, morphology and coloring. Maximum callus induction (90%) was obtained from nodal segment explants cultured in MS medium supplemented with 1.0 mg L-1 of 2,4-D and 5,0 mg L-1 of TDZ, maintaining the explants in photoperiod condition of 16 hours for 30 days with a temperature of 25°C ± 2°C. The results obtained from the callogenesis of L. ferrea made possible future studies on somatic embryogenesis.

Key words: Callus culture, Regeneration, Libidibia ferrea, Medicinal plant. 71

INTRODUÇÃO Libidibia ferrea (Fabaceae), popularmente conhecida como “pau-ferro” ou “jucá”, é uma espécie arbórea amplamente utilizada na medicina popular principalmente na região Norte e Nordeste do Brasil (Coelho-Ferreira, 2009; Oliveira et al., 2010). Plântulas jovens de L. ferrea possuem um princípio ativo denominado de “Pau-ferrol A” que atua contra a topoisomerase II humana, e inibe o crescimento das células por meio da indução de apoptose, podendo ser utilizado como importante ferramenta no tratamento da leucemia HL60 humana (Nozaki et al., 2007; Ohira et al., 2013). Alguns grupos de pesquisas estão desenvolvendo estudos promissores visando à obtenção de produtos fitoterápicos a serem utilizados em seres humanos (Nakamura et al., 2002; Lima et al., 2011; Pereira et al., 2012; Gallão et al., 2013; Lopes et al., 2013; Zhang et al., 2013; Nawwar et al., 2015; Fernandes et al., 2016). O uso desta espécie vem aumentando de maneira significativa nos últimos anos, o que levou à exploração indiscriminada de todos os indivíduos adultos em idade de reprodução, além de causar a erosão genética, reduzindo as populações nativas e comprometendo a sua regeneração natural (Benedito et al., 2012). Estudos indicam que a propagação de L. ferrea é viável por sementes (Scalon et al., 2011), por micropropagação (Silva, 2015) e por mudas em condições ex vitro (Lenhard et al., 2013; Santos et al., 2013). Entretanto, a baixa produção de sementes aliada à elevada dormência tegumentar de L. ferrea (Coelho et al., 2010), tem limitado a produção de mudas visando a reposição das populações naturais e os plantios ex situ, sendo necessário e urgente o emprego de técnicas de reprodução, a exemplo da cultura in vitro, que é uma das principais ferramentas da biotecnologia vegetal que explora a totipotência da natureza das células vegetais (Bhojwani e Dantu, 2013a), possibilitando a reprodução in vitro de genótipos superiores (George et al., 2008; Loyola-Vargas e Ochoa-Alejo, 2012). Desse modo, diversas partes da planta como gemas, meristemas apicais, embriões, segmentos de caule e raízes podem ser cultivadas in vitro em meio nutritivo apropriado em ambiente asséptico (George et al., 2008). A cultura de calos in vitro é considerada uma técnica eficiente para obtenção de embriões somáticos, possibilitando elevadas taxas de multiplicação que resultam em embriões que se desenvolvem em plantas completas (Haslam e Yeung, 2011; Bhojwani e Dantu, 2013b; Isah, 2016). A organogênese indireta de L. ferrea pode constituir uma alternativa importante para multiplicação em larga escala de genótipos selecionados para desenvolvimento de fitofármacos (Ali et al., 2016). O presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito de diferentes concentrações das auxinas 2,4-D e ANA e sua interação com as citocininas TDZ e BAP na indução de calos, em 72

explantes foliares e segmentos nodais de L. ferrea, visando a embriogênese somática e/ou suspensão celular.

MATERIAL E MÉTODOS Os estudos experimentais foram realizados no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais (LCTV) pertencente à Escola Superior de Tecnologia (EST) da Universidade do Estado do Amazonas (UEA). Foram utilizados como explantes segmentos nodais e folhas cotiledonares que foram excisados de plântulas micropropagadas e cultivadas em meio de cultura MS (Murashige e Skoog, 1962) sem a adição de reguladores de crescimento (Silva, 2015). Os segmentos nodais foram seccionados em fragmentos de 1 cm e as folhas em 1 cm2, sendo que nos explantes foliares foram feitos pequenos cortes para aumentar o contato com o regulador de crescimento. Os explantes foram inoculados em frascos de vidro de 250 ml, contendo 40 ml de meio de cultura MS, suplementado com 30 g L-1 de sacarose, solidificado com 7 g L-1 de ágar e acrescido com diferentes concentrações das auxinas: ácido 1-naftaleno-acético (ANA) e 2,4- diclorofenoxiacético (2,4-D), isoladamente ou em combinação com citocininas: 6- benzilaminopurina (BAP) e tidiazuron (TDZ) (Quadro 1). O pH do meio foi ajustado para 6,0 antes da autoclavagem a 120°C por 20 minutos. As culturas foram mantidas no escuro por 7 dias em sala de crescimento, com temperatura de 25°C±2°C, e então foram incubadas sob um fotoperíodo de 16 horas por 30 dias com intensidade luminosa de 52 μmol.m-2.s-1, provenientes de duas lâmpadas fluorescentes brancas frias (GE.85W). Após 30 dias de cultivo, os explantes foram avaliados quanto à taxa de indução (%) e natureza dos calos (cor e textura). O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado composto por seis repetições por tratamento, sendo cada repetição constituída por 5 unidades experimentais (n=30). Os dados foram submetidos à análise de variância e para a comparação das médias dos tratamentos foi aplicado o teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade, utilizando o software ASSISTAT versão 7.7.

RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados (Quadro 1) mostram que os explantes de L. ferrea cultivados em meio MS suplementado com diferentes concentrações de 2,4-D e ANA, isoladas ou em combinação com BAP e TDZ apresentaram diferenças significativas (p<0,05) na indução, morfologia e 73

coloração dos calos em explantes foliares e segmentos nodais. A iniciação de calos foi alcançada a partir dos explantes dentro de 25-30 dias de inoculação.

Quadro 1 - Efeito de diferentes concentrações de auxinas e citocininas na indução de calos friáveis em explantes foliares e segmentos nodais de Libidibia ferrea Reguladores de Folhas Segmentos nodais Concentração crescimento Indução de Cor e Indução de Cor e (mg L-1) vegetal Calos (%) Textura calos (%) textura Controle 0,0 0,0 b --- 0,0 f --- 1,0 0,0 b --- 10 ef Verde claro, friável 2,4 D 3,0 0,0 b --- 26 de Verde claro, friável 5,0 0,0 b --- 43,33 bc Branco, friável 1,0 0,0 b --- 0,0 f --- ANA 3,0 0,0 b --- 0,0 f --- 5,0 0,0 b --- 40 cd Verde escuro, compacto 1,0 + 3,0 0,0 c --- 80 ab Verde escuro, compacto 2,4 D + BAP 3,0 + 5,0 26,67 a Verde branco, friável 26,67 de Marrom, compacto 5,0 + 3,0 3,33 b Verde branco, friável 43,33 cd Translúcida, úmido 2,4 D + TDZ 1,0 + 5,0 26,67 a Marrom, compacto 90 a Verde claro, friável 3,0 + 3,0 0,0 b --- 86,67 a Marrom, compacto ANA + BAP 5,0 + 5,0 44,67 a Verde claro, friável 46,67 bc Verde escuro, compacto 1,0 + 3,0 0,0 b --- 71,42 ab Verde escuro, compacto ANA + TDZ 3,0 + 5,0 40 a Verde claro, friável 80 ab Verde claro, friável Médias seguidas de mesma letra não diferem estatisticamente, entre si, ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Duncan

A concentração de 1,0 mg L-1 de 2,4-D associado com 5,0 mg L-1 de TDZ no meio MS induziu a maior porcentagem (90%) de calos friáveis em explantes de segmentos nodais. Enquanto que a concentração de 5,0 mg L-1 de ANA em combinação com 5,0 mg L-1 de BAP promoveu a maior porcentagem (44,67%) de calos friáveis em explantes foliares (Quadro 1). Estes resultados evidenciam que o uso de auxinas associada à citocinina estimulam a formação de calo nos explantes de segmentos nodais e foliares desta espécie. As respostas às concentrações de auxinas e citocininas foram associadas à fase de desenvolvimento dos explantes, indicando que a resposta morfogenética de um tecido in vitro depende da interação destas classes de reguladores (Ślesak et al., 2017). Alguns estudos caracterizam os calos embriogênicos pela coloração. Aspectos translúcido-brancos ou amarelados dos calos são considerados friáveis e com potencial para formarem embriões somáticos (Singh et al., 2015). Neste estudo foram observados que os calos originados de explantes foliares e segmentos nodais na interação de auxinas e citocininas 74

apresentaram coloração heterogênea, podendo identificar áreas de cores translúcidas, marrom- escuro e verdes claros ou escuros (Quadro 1 e Figura 1). Essas grandes diferenças na indução de calos podem ser explicadas quando os explantes foram mantidos nas fases escura e clara. O crescimento de tecidos vegetais organizados in vitro geralmente é inibido pela luz. Entretanto, as divisões celulares do explante e o crescimento de calo podem ser inibidos pela presença de luz (George et al., 2008). No entanto, alguns explantes necessitam ser cultivados em condições escuras, a fim de aumentar a eficiência do calo e reduzir a secreção de compostos fenólicos, que geralmente afetam os explantes que sobrevivem (Tan et al., 2010).

Figura 1 - Plântula de Libidibia ferrea cultivada in vitro como fonte de explantes utilizadas para a indução de calos friáveis (A). Segmentos nodais com formação de calos cultivados em meio MS suplementado com 2,4 D (B), ANA (C), 2,4-D e BAP (D), 2,4-D e TDZ (E), ANA e BAP (F) e ANA e TDZ (G), mantidos a 25°C±2°C sob fotoperíodo de 16 horas por 30 dias.

O efeito da interação de auxinas e citocininas associado à presença ou ausência de luz na cultura de calos de espécies medicinais da família Fabaceae têm sido relatado na literatura. Em estudos realizados com Stryphnodendron adstringens a presença de 2,4-D no meio de cultivo favorece a indução de calos na presença e ausência de luz, porém, quando os meios foram suplementados com baixas concentrações de BAP, na ausência de luz produziram calos com maiores rendimentos (Castro et al., 2009). Werner et al. (2009) observaram que os explantes de foliólolos juvenis de Libidibia echinata cultivados com baixa concentração de 2,4- D (5 e 20 mg L-1) e foliólolos jovens tratados com altas concentrações de 2,4-D (50 e 100 mg L-1) geraram calos sem diferenças significativas entre luz e escuro. A formação de calos de L. ferrea obtidos neste estudo é atribuída à adição exógena da combinação de reguladores de crescimento ao meio de cultura que estimulou a proliferação celular devido os explantes de segmentos nodais apresentarem capacidade para a indução da calogênese. Alguns autores relatam resultados semelhantes em espécies da família Fabaceae. Fonseca et al. (2014) constataram que a interação de 10µM BAP e 2,0 µM de ANA estimularam a formação de calos em Eriythina velutina. Da mesma forma, foi observado por Rady e Nazif (1997), que a combinação de 2,0 mg L-1 de 2,4-D com 2,0 mg L-1 de BAP estimulou significativamente a produção de calos obtidos de hipocótilos de Cassia acutifolia. Rodrigues et al. (2017), em estudo realizado com Poincianella pyramidalis, constataram que o uso de 1,0 mg L-1 de 2,4-D associado a 2,0 mg L-1 de Picloram foi eficiente na indução de calos independentemente do tipo de explante utilizado.

CONCLUSÕES É possível promover o estabelecimento in vitro de Libidibia ferrea pela formação de calos friáveis a partir de segmentos nodais. Os explantes foliares na ausência e presença de luz associada ao uso de reguladores de crescimento induziram baixa porcentagem de calos friáveis. A formação de calos pode ser obtida em meio MS suplementado com 1,0 mg L-1 2,4-D + 5,0 mg L-1 TDZ.

AGRADECIMENTOS Os autores agradecem a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) pela concessão de bolsa de doutorado ao primeiro autor. Ao Dr. Luiz Augusto Gomes de Souza do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA) pela identificação e obtenção das sementes de Libidibia ferrea. 76

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CAPÍTULO III

Calogênese e regeneração de plantas in vitro de Libidibia ferrea (Fabaceae)

Artigo elaborado de acordo com as normas da In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant

Calogênese e regeneração de plantas in vitro de Libidibia ferrea (Fabaceae)

Daniel da Silva*1,3 Angela Maria Imakawa3 Kamylla Rosas Vieira Guedes3 Flávio Mauro Souza Bruno3 Paulo de Tarso Barbosa Sampaio1,3 1,3 Rede Bionorte, Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade e Biotecnologia, Escola Superior de Ciências da Saúde, Universidade do Estado do Amazonas, Av. Carvalho Leal 1777, Cachoeirinha, 69065-001, Manaus, AM, Brasil, Orcid: https://orcid.org/0000-0002-9217- 4213. 1,3Laboratório de Silvicultura e Tecnologias Digitais, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Rua da Lua s/n, Conjunto Morada do Sol, Aleixo, 69060-082, Manaus, AM, Brasil. * Autor para correspondência: [email protected] / Telefone: +55 92 36431842

Resumo Libidibia ferrea é uma espécie de alto valor medicinal, com usos terapêuticos no tratamento da bronquite, gastrite, anemia e inflamações em geral. Este estudo teve como objetivo estabelecer protocolos para a indução de calos embriogênicos e a regeneração in vitro desta espécie. Foram avaliados os efeitos de diferentes diluições de meios de cultura MS e B5 e concentrações de 2,4-D (0,0; 2,21; 4,42; 6,63 e 8,84 mg L-1) cultivados na ausência ou presença de duas fontes de luz, (1) LED azul- vermelha e (2) LED branca na indução de calos. Foi testado o efeito de 6-BAP (0, 0,05, 0,5 e 1,0 mg L- 1) na multiplicação in vitro de brotações. Os meios MS e B5 em concentrações originais suplementados com 2,21 e 4,42 mg L-1 de 2,4-D induziram 100% de formação de calos friáveis cultivados sob LED azul-vermelha, enquanto que explantes cultivados em meios B5 e MS/2 com 6,63 mg L-1 de 2,4-D e mantidos sob LED branca apresentaram 93,33% e 86,67% de formação de calos, respectivamente. O meio MS acrescido com 0,05 de mg L-1 de BAP sob LED azul-vermelha estimulou maior taxa de multiplicação das brotações (15,06) em relação a LED branca (6,50). Concluimos que é possivel a calogenêse e a propagação in vitro desta espécie em meios de cultura MS e B5 nutritivos na presença de luz LED azul-vermelha e LED branca, como fonte alternativa para a produção de metabólitos secundários.

Palavras-chave: micropropagação, fonte de luz, planta medicinal, pau-ferro

Abstract Libidibia ferrea is a species of high medicinal value, with therapeutic use in the treatment of bronchitis, gastritis, anemia and inflammation in general. This study aimed to establish protocols for the induction of embryogenic calli and the in vitro regeneration of this species. The effect of different dilutions of MS and B5 culture media and concentration of 2,4-D (0,0, 2,21, 4,42, 6,63 and 8,84 mg L-1) grown in the absence or presence of two light sources, (1) blue-red LED and (2) white LED was evaluated on callus induction. The effect of 6-BAP (0, 0.05, 0.5 and 1.0 mg L-1) on the in vitro multiplication of shoots was tested. MS and B5 media at original concentration supplemented with 2.21 and 4.42 mg L-1 of 2,4-D induced 100% formation of friable calli cultivated under blue-red LED, while explants cultured on B5 and MS/2 media with 4.42 mg L-1 of 2,4-D and kept under white LED presented 93.33% and 86.67% of callus formation, respectively. The MS medium added with 0.05 mg L-1 of BAP under blue-red LED stimulated a higher multiplication rate of shoots (15.06) than white LED (6.50). We conclude that it is possible to calogenese and in vitro propagation of this species on nutritious MS and B5 media in the presence of blue-red LED light and white LED, as an alternative source for the secondary metabolites production.

Keywords: micropropagation, light source, medicinal plant, ironwood 82

Introdução A região Amazônica abrange uma grande diversidade de espécies que funcionam como um reservatório genético ainda pouco explorado, mas com grande potencial ornamental, cosmético, perfumaria, alimentício e farmacêutico para o bem estar humano (Ferraz et al. 2009). Neste contexto, destaca-se a Libidibia ferrea (Mart ex Tull.) L. P. Queiroz, popularmente conhecida como pau-ferro ou jucá, pertencente à família Fabaceae, é uma espécie medicinal e com usos terapêuticos indicados para o tratamento da bronquite, gastrite, anemia e inflamações em geral. Estudos demonstram o efeito benéfico dos compostos fenólicos presentes no jucá (Nozaki et al. 2007; Ohira et al. 2013). Diversos estudos relatam protocolos para a propagação in vitro e calogênese de L. ferrea (Santos et al. 2018; Silva et al. 2018c). Entretanto, não existem trabalhos relacionados com os diodos emissores de luz (LEDs) como fonte de iluminação para a regeneração de plantas in vitro e calogênese desta espécie. A partir dos avanços tecnológicos ocorridos nas últimas décadas, os diodos emissores de luz (LEDs) possuem características mais eficientes em comparação às lâmpadas fluorescentes e incandescentes, comumente usadas como fontes de radiação convencional. O comprimento de onda específico, massa e volume, longo período de vida e baixo aquecimento são elementos que contribuem para a aquisição de um sistema de resfriamento menos potente e que consequentemente, consumirá menos energia, reduzindo os custos na produção de mudas in vitro (Rocha et al. 2010). Vários são os relatos encontrados na literatura que indicam o uso de LEDs como fonte de luz alternativa bastante promissora e com aplicação comercial por apresentar características ímpares às lâmpadas tradicionais usadas na sala de cultivo in vitro de plantas frutíferas e ornamentais como morangueiro (Rocha et al. 2013) e orquídea (Shin et al. 2008). Segundo Batista et al. (2018) a quantidade e particularmente a qualidade da luz é considerada um dos principais fatores que podem proporcionar maior quantidade de clorofila e carotenoides, assim como crescimento e desenvolvimento de brotações. Assim, o uso desta tecnologia para os estudos de calogênese e da regeneração in vitro em L. ferrea possibilitará a otimização dos métodos de propagação in vitro de mudas de boa qualidade genética e uniformidade. O objetivo do estudo foi avaliar o efeito do uso de LEDs azul-vermelha e branca na regeneração in vitro e calogênese de L. ferrea visando o estabelecimento da embriogênese somática e/ou suspensão celular.

Material e métodos Obtenção do material vegetal O presente estudo foi conduzido no Laboratório de Silvicultura e Tecnologias Digitais do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (LASTED-INPA). As sementes de L. ferrea foram provenientes do Banco de Sementes do Laboratório de Microbiologia e Fertilidade do Solo do INPA, coletadas de árvores nativas do Campus do V-8, INPA, Manaus, Brasil. O material vegetal foi identificado pelo Prof. Dr. Luiz Augusto Gomes de Souza e a excicata encontra-se registrada no herbário do INPA, sob o número 228.022.

Estabelecimento in vitro Para o estabelecimento in vitro, as sementes foram desinfestadas e germinadas in vitro, conforme procedimento proposto por Silva et al. (2018a). As sementes foram submetidas ao método de escarificação mecânica para a quebra da dormência. Em seguida foram lavadas com detergente neutro e enxaguadas em água corrente por um minuto. Posteriormente, foram imersas em solução de Carbendazim® 2,0% (v/v) por 1 hora, em seguida, numa solução de álcool 70% por 1 minuto. A seguir, foram imersas em solução de hipoclorito de sódio de 0,25% (v/v) por 30 minutos em agitador magnético, e posteriormente foram lavadas quatro vezes com água destilada estéril e autoclavada e inoculadas em tubos de ensaio (25x150mm) contendo 10 mL de meio de cultura MS, acrescido de 30 g L-1 de sacarose e 7 g L-1 de agar, e mantidos em sala de crescimento por 30 dias.

Indução de calos em meios nutritivos com 2,4-D na ausência e presença de luz Os segmentos nodais foram excisados de plântulas provenientes do estabelecimento in vitro (Figura 6A) e foram inoculados em frascos de vidro de 250 ml em meio MS (Murashige e Skoog, 1952) (M5519, Sigma®) e B5 (Gamborg 1989) (G5768, Sigma®) nas concentrações originais e nas concentrações diluídas duas e quatro vezes, suplementados com 30 g L-1 de sacarose e diferentes concentrações de 2,4-D (0,0; 1,10; 2,21; 4,42 e 6,63 mg L-1). No entanto, para o meio B5 foram acrescidos: piridoxina (1 mg L-1), mio-inositol (100 mg L-1), tiamina (10 mg L-1) e ácido nicotínico (1 mg L-1). Todos os meios foram solidificados com 7,0 g L-1 ágar e o pH ajustado em 5,8 antes da autoclavagem. As culturas foram mantidas em sala de crescimento a 25±2 ºC, no escuro, e presença de luz com fotoperíodo de 16 horas, intensidade luminosa de 31±1 µmol m-2s-1 fornecida por diferentes fontes de luz (LED azul-vermelha Tecnal® TEC-LAMP-060 FS 470 nm e Tachiba® LED branca T8-TUBE LAMP 530 nm) (Figuras 3C e 3E). A avaliação foi realizada quanto à porcentagem da área do explante ocupada 84

por calo, e natureza dos calos (cor e textura), após 30 dias da inoculação. O delineamento utilizado foi o inteiramente casualizado, em fatorial 3x3x5 (meio x luminosidade x concentrações de 2,4-D) com 3 repetições por tratamento, sendo cada repetição composta por cinco explantes.

Regeneração in vitro As brotações provenientes do estabelecimento in vitro (Figura 6A) foram inoculadas em frascos de vidro com capacidade de 250 mL, contendo 40 mL de meio MS acrescido de 30 g L-1 de sacarose, 7 g L-1 de ágar e suplementado com BAP (6-benzilaminopurina) nas concentrações de 0,0; 0,05; 0,10; 0,50 e 1,0 mg L-1. O pH foi ajustado para 5,8 após a adição do ágar e em seguida foi autoclavado a uma temperatura de 121ºC a 1,5 atm durante 20 minutos. As culturas foram mantidas em sala de crescimento, conforme descrito na fase anterior (Figuras 3C e 3E). Após 30 dias, os explantes foram avaliados quanto ao número de brotos, número de gemas, taxa de multiplicação, bem como o comprimento médio da brotação. O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, em esquema fatorial 2 x 5 (fonte de luz x concentrações de hormônios), com dez tratamentos e 6 repetições, sendo cada repetição constituída por cinco explantes.

Análise ultraestrutural de calos Calos de L. ferrea cultivados in vitro em meios MS e B5 suplementados com 2,4-D e sob LED azul-vermelha após 60 dias foram imersos em solução fixadora Karnovisk (pH 7,2) por um período mínimo de 2 h. Posteriormente, foram lavadas em tampão cacodilato de sódio três vezes por 15 minutos cada, e pós-fixadas em solução ferrocianeto de potássio (7,5%) e ósmio (2%) por 1 hora em temperatura ambiente. Após esse procedimento, foram lavadas três vezes em tampão cacodilato de sódio por 15 minutos cada. Para análise em microscopia eletrônica de varredura, as amostras foram desidratadas a etanol (50; 70; 90 e 100% por duas vezes) por 15 minutos. Após, foram para o aparelho de ponto crítico para a secagem e então montadas em stubs para metalização com ouro. As amostras foram observadas no Microscópio Eletrônico de Varredura FEI QUANTA 250. Para análise em microscopia eletrônica de transmissão, as amostras foram desidratadas a acetona (7,5; 15; 30; 70; 80; 90 e 100 % por três vezes) durante 15 minutos. Após a desidratação, foi realizada inclusão em resina (EPON) e acetona em diferentes proporções: 1:2 (4 h); 1:1 (12 h); 2:1 (6 h) e resina 100% (12 h). Posteriormente, o material foi colocado em molde adequado e conduzido para polimerização em estufa a 60°C por 72 h. Após foi a 85

realizada a ultramicrotomia e as secções ultrafinas foram conduzidas para telas de cobre e procedeu-se a contrastação em acetato de uranila e citrato de chumbo. A observação das amostras foi realizada em Microscópio Eletrônico de Transmissão Tecnai Spirit iCorr. As análises foram realizadas na Unidade de Microscopia Avançada do Centro Nacional de Biologia Estrutural e Bioimagem (CENABIO), da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Brasil.

Análise estatística Os resultados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e para a comparação das médias dos tratamentos foi aplicado o teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade, utilizando o software MINITAB® versão 18.

Resultados e discussão

Efeito de diferentes concentrações de 2,4-D, meios de cultura e fontes de luz no processo calogênico Os resultados mostraram que os explantes de L. ferrea cultivados em meios MS e B5 suplementados com diferentes concentrações de 2,4-D, quando associados a diferentes fontes de luz apresentaram diferenças significativas (p <0,05) na indução, morfologia e coloração dos calos (Figuras 1 e 2). A iniciação de calos foi observada no período de 20-30 dias de inoculação. Foi observado que segmentos nodais inoculados em meio MS suplementado com 2,21 e 4,42 mg L-1 de 2,4-D na presença da luz de LED azul-vermelha formaram calos friáveis (100%), assim como em meio MS/2 e B5 acrescido de 2,21 mg L-1 de 2,4-D (Tabelas 1 e 2). Por outro lado, explantes cultivados sob LED branca, tanto no meio B5 como no MS/2 suplementados com 6,63 mg L-1 de 2,4-D apresentaram, respectivamente, 93,33% e 86,67% de formação de calos (Tabela 1 e 2). Esses resultados são superiores quando comparados com estudo realizado por Silva et al. (2018b) que observaram baixa formação de calos (40%) em explantes foliares cultivados sob lâmpadas fluorescentes brancas frias com intensidade luminosa de 52 µmol.m-2.s-1.

Fig 1. Aspectos da morfologia e coloração de calos friáveis de Libidibia ferrea obtidos de segmentos nodais cultivados em diferentes concentrações de meio MS e suplementado com 2,4-D, na ausência e presença de luz, após 30 dias de cultivo. (A) MS, (B) MS/2 e MS/4 (C) cultivados no escuro; (D) MS, (E) MS/2 e MS/4 (F) cultivados sob LED azul-vermelha 470 nm; (G) MS, (H) MS/2 e MS/4 (I) cultivados sob LED branca 530 nm. Barras = 3 cm.

Fig 2. Aspectos da morfologia e coloração de calos friáveis de Libidibia ferrea obtidos de segmentos nodais cultivados em diferentes concentrações de meio B5 e suplementado com 2,4-D, na ausência e presença de luz, após 30 dias de cultivo. (A) B5, (B) B5/2 e B5/4 (C) cultivados no escuro; (D) B5, (E) B5/2 e B5/4 (F) cultivados sob LED azul-vermelha 470 nm; (G) B5, (H) B5/2 e B5/4 (I) cultivados sob LED branca 530 nm. Barras = 3 cm.

Tabela 1. Produção de calos friáveis obtidos de segmentos nodais de Libidibia ferrea, em resposta a diferentes concentrações do meio MS e da auxina 2,4-D e cultivados na ausência e presença de luz (LED azul-vermelha 470 nm e LED branca 530 nm).

Meio de 2,4-D Indução de calos (%) -1 cultura (mg L ) Escuro LED Colorida LED Branca 0,0 0 d 0 c 0 d 2,21 60 a 100 a 53,33 ab

4,42 40 ab 100 a 53,33 ab MS 6,63 20 bc 80 ab 53,33 ab 8,84 40 ab 86,67 a 40 bc 0,0 0 d 0 c 0 d 2,21 60 a 100 a 73,33 ab

4,42 26,67 bc 86,67 a 40 bc MS /2 6,63 6,67 d 93,33 a 86,67 a

8,84 0 d 86,67 a 80 a 0,0 0 d 0 c 0 d 2,21 40 ab 86,67 a 60 ab

4,42 0 d 86,67 a 60 ab MS /4 6,63 0 d 80,00 ab 26,67 c 8,84 13,33 c 60,00 b 33,33 c

Médias seguidas de mesma letra não diferem estatisticamente, entre si, ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.

Na ausência de luz, o meio B5 acrescido de 2,4-D (2,21 mg L1) induziu a maior porcentagem de calos (80%), em comparação com os meios B5/2 e B5/4. Foi possível verificar que o meio MS suplementado com mesma concentração de 2,4-D estimulou a maior formação de calos (60%) no escuro (Tabela 2). Resultados semelhantes foram relatados por Castro et al. (2009), que observaram as maiores formações de calos em Stryphnodendron adstringens cultivados na ausência de luz.

Tabela 2. Produção de calos friáveis obtidos de explantes de segmentos nodais de Libidibia ferrea , em resposta a diferentes concentrações do meio B5 e da auxina 2,4-D e cultivados na ausência e presença de luz (LED azul-vermelha 470 nm e LED branca 530 nm).

Meio de 2,4-D Indução de calos (%) cultura (mg L-1) Escuro LED Colorida LED Branca

0,0 0 f 0 e 0 d

2,21 80 a 100 a 40 bc B5 4,42 40 b 100 a 73,33 ab 6,63 33,33 bc 100 a 93,33 a 8,84 26,67 bc 93,33 a 66,67 ab 0,0 0 f 0 e 0 d

2,21 13,33 de 80 ab 66,67 ab

4,42 20 cd 80 ab 40 bc B5 /2 6,63 6,67 e 73,33 ab 60 ab 8,84 6,67 e 60 abc 53,33 bc 0,0 0 f 0 e 0 d 2,21 26,67 bc 73,33 a 60 ab

4,42 6,67 d 20 d 53,33 bc B5 /4 6,63 0 f 40 bcd 53,33 bc 8,84 33,33 bc 26,67 d 33,33 c Médias seguidas de mesma letra não diferem estatisticamente, entre si, ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.

Os calos formados nas diferentes concentrações de 2,4-D apresentaram coloração heterogênea (brancas, verdes claros e escuros ou translúcidas), aspecto granuloso e friável. Observou-se a formação de estruturas semelhantes a embriões globulares na maioria dos explantes (Figura 1 e 2). Estas estruturas são características da primeira dediferenciação do tecido, sendo o primeiro indício de sucesso num protocolo que visa à obtenção de embriogênese somática. Entre as auxinas, o 2,4-D em menores concentrações tem se mostrado eficiente para a indução de calos friáveis, a exemplo de Caesalpinia echinata (Fabaceae) (Werner et al. 2009) e e Stryphnodendron adstringens (Castro et al. 2009). Souza et al. (2018) relatam que as concentrações e as diluições do meio de cultura e os reguladores de crescimento, acarretam efeitos profundos sobre a resposta morfogenética do explante nas diferentes fases do cultivo in vitro. Por outro lado, os reguladores de crescimento podem atuar e controlar os processos de desenvolvimento de células e tecidos vegetais em meio de cultura, bem com a divisão e diferenciação celular, organogênese, dormência e biossíntese de metabólitos secundários (Laurain-Mattar and Ptak 2018).

As diluições pela metade e pela quarta parte dos meios MS e B5 promoveram baixo percentual de formação de calos quando os explantes foram mantidos no escuro em comparação com a presença de luz. Esta grande diferença no desenvolvimento dos explantes, provavelmente ocorre porque as vias bioquímicas e metabólicas básicas que funcionam nas plantas que crescem sob condição ex vitro são conservadas nas células e tecidos cultivados in vitro, por essa razão, os meios de cultivo devem adequar os nutrientes necessários ao metabolismo das células para o crescimento e diferenciação dos tecidos (Taiz et al. 2017). A formação de calos friáveis de L. ferrea originados de segmentos nodais, foi estimulado pelo uso das auxinas 2,4-D e ANA quando associadas com as citocininas BAP e TDZ (Silva et al. 2018b). De maneira análoga, estudo conduzido por Santos et al. (2018) constatou que foi possível a calogênese desta espécie com o uso de 2,4-D e BAP em diferentes concentrações. Para Bhojwani e Dantu (2013a) a utilização de substâncias reguladores de crescimento tem se mostrado de importância fundamental para o estabelecimento da competência e determinação de células. Outro aspecto relevante é a redução do número de subcultivos que seriam necessários para dar manutenção ao crescimento contínuo de calos friáveis, fato observado neste estudo, que torna o custo deste protocolo menos oneroso, em razão da acumulação de produtos da biossíntese de metabólitos secundários derivados da formação de calos no período de 30 dias (Figura 1 e 2). A otimização da calogênese de L. ferrea com diferentes fatores exógenos como o tipo e diluição de meio de cultura, diferentes concentrações de macro e micronutrientes, reguladores de crescimento e qualidade da luz foram testados com sucesso no processo calogênico desta espécie (Silva et al. 2018b).

Análise ultraestrutural de calos A Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) mostrou a presença de células com forma isodiamétrica esférica semelhantes a embriões somáticos em estágio globular característico de células meristemáticas (Kumar and Reddy 2011), como observado na Figura 3A e 3B. Esses resultados corroboram com Guillou et al. (2018) que também obtiveram maior formação calogênica utilizando a auxina 2,4-D para a indução da diferenciação celular visando a formação de calos embriogênicos de Theobroma cacao. Os calos embriogênicos, em sua maioria, são compostos por células meristemáticas com dimensões relativamente pequenas e com citoplasma denso (Holme and Petersen 1996). O processo de indução, que parte de uma única célula somática influencia diretamente as células totipotentes, as quais, durante sua desdiferenciação podem responder a tais estímulos 91

desencadeando processos de rotas bioquímicas da totipotencialidade. Este fenômeno implica na condição endógena permissiva para chegar a constituir uma célula em um embrião somático (Zimmermannn 2014). A morfologia celular isodiamétrica, observada nos calos induzidos a partir de segmentos nodais neste estudo (Figura 3C e 3D), foi semelhante à das células de calos de Poincianella pyramidalis (Fabaceae), uma vez que o 2,4-D induziu a formação de calos friáveis com competência embriogênica (Rodrigues et al. 2017). Foram relatados por Sartor et al. (2014), com a utilização de 2,4-D para a indução de calos em Dalbergia nigra (Fabaceae), obtendo células arredondadas e em divisão celular.

Fig 3. Eletromicrografia de varredura de células de calos friáveis de Libidibia ferrea. Calos do tipo globular originados de explantes de segmentos nodais, inoculados em meios MS (A) e B5 (B), suplementado com 2,4-D e mantidos sob LED azul-vermelha; Aspectos de calos embriogênicos vistos de cima (C) e ligados por segmentos semelhantes a suspensores (seta branca) (D).

Fig 4. Eletromicrografia de transmissão da caracterização de estruturas e organelas das células meristemáticas em diferenciação após 60 dias de cultivo in vitro originados de calos friáveis de Libidibia ferrea. (A) Núcleo (seta preta) e parede celular (seta verde); Células com elevada relação núcleo citoplasmática (círculo preto) com diferenciação celular (B); Núcleos proeminentes com início da divisão celular (seta preta) formados da diferenciação do sistema vascular (C); Aspectos em vista longitudinal dos elementos vasculares das mitocôndrias (seta preta), núcleo (seta vermelha) e cloroplastos (seta verde) (D).

A formação de massas de células sob influência de meios de cultura e luminosidade apresentaram células mais agregadas e em formatos esféricos, demonstrando o potencial morfogenético de ambos os fatores utilizados, uma vez que células com formato isodiamétrico são características de formação embriogênica (Ipekci e Gozukirmizi 2004; Steiner et al. 2005). Esses aspectos morfológicos foram observados neste estudo com a presença de vacúolos e 93

cloroplastostos, com núcleos densamente corados e elevada relação citoplasmática (RNP) (Figura 4). De acordo com Guillou et al. (2018), estas características são típicas de células que permaneceram muito tempo em contato com o regulador de crescimento possibilitando o início de formação do processo calogênico. O MEV é uma importante ferramenta que contribui para a identificação da capacidade morfogenética de explantes cultivados in vitro. Considerando os resultados obtidos, por esta técnica, ratifica-se o potencial embriogênico dos segmentos nodais de L. ferrea, indicando que este tipo de explante quando cultivado em meios de cultura (MS e B5) contendo a auxina 2,4- D e cultivados sob a luz de LED é um fator crucial para a sinalização de desdiferenciação celular possibilitando a embriogênese somática.

Regeneração in vitro A interação entre fonte de luz e BAP apresentou efeito significativo sobre número de brotos, número de gemas, taxa de multiplicação e comprimento médio das brotações. O maior número de brotos formados por explante foi obtido com o uso de 1,0 mg L-1 de BAP (3,70), seguido de 0,05 mg L-1 de BAP (3,67) cultivados sob LED azul-vermelha. Foi observado que o tratamento de 0,10 mg L-1 de BAP estimulou o maior número de brotos (2,56) cultivados sob LED branca (Figura 5A). Resultados similares foram obtidos por Nhut et al. (2003) que observaram o maior número de brotações cultivadas sob LED azul-vermelha. Foi constatado que os explantes cultivados no meio MS acrescido de 0,05 de mg L-1 de BAP mantidos sob LED azul-vermelha induziu o maior número de gemas (3,13) e maior taxa de multiplicação (15,06) quando comparado com os demais tratamentos, demonstrando que, neste caso, a qualidade e quantidade de luz influenciaram significativamente no processo de indução de gemas e multiplicação das brotações (Figuras 5B e 5C). Quanto ao comprimento médio da brotação, o meio MS com adição de 0,05 mg L-1 de BAP estimulou o maior comprimento (22,03 mm) de brotação mantido sob LED azul-vermelha. Enquanto que, na presença de LED branca as brotações de maior comprimento foram aquelas cultivadas no meio MS acrescido de 0,10 mg L-1 de BAP (16,01 mm) e 0,05 mg L-1 de BAP (15,23 mm) (Figura 5D). As citocininas podem estimular ou inibir processos fisiológicos e dentre elas o BAP tem sido o mais indicado para promover a proliferação de partes aéreas e indução de gemas adventícias in vitro (Grattapaglia e Machado 1998; Ferreira et al. 2016), como evidenciado neste estudo. A interação e o balanço entre reguladores de crescimento adicionados ao meio de cultura são responsáveis pelo crescimento e morfogênese in vitro (Bhojwani e Dantu 2013b). 94

Em estudo realizado por Silva et al. (2018) observaram que a indução de brotos por explante de L. ferrea foi superior em meio de cultura suplementado com BAP comparado com thidiazuron (TDZ) ou cinetina (KIN) na avaliação do potencial de multiplicação das brotações. Avaliando a resposta das brotações de framboseiras cultivadas sob diferentes fontes de luz, Rocha et al. (2013a) verificaram que o comprimento das brotações cultivadas sob LED vermelha foi superior às lâmpadas fluorescentes. Heo et al. (2006) demonstram que brotações cultivadas in vitro de videira sob LED vermelha apresentaram o dobro do comprimento daquelas mantidas sob as lâmpadas fluorescentes.

Fig 5. Valores médios de números de brotos (A), número de gemas (B), taxa de multiplicação (C) e comprimento das brotações (D) por explante, em resposta a diferentes concentrações de 6-benzilaminopurina (BAP) e cultivadas sob diferentes fontes de luz (LED azul-vermelha 470 nm e LED branca 530 nm) na multiplicação in vitro de Libidibia ferrea, 30 dias após a inoculação. Médias seguidas de mesma letra não diferem estatisticamente, entre si, ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.

Morini and Muleo (2003) descrevem que a exposição contínua ao escuro e à faixa de luz do vermelha promovem modificações na morfologia da cultura, entre as quais, menor expansão das folhas, entrenós alongados e redução da síntese de clorofila, carotenóides e antocianinas. Embora a luz branca seja a mais utilizada na cultura de tecidos, neste trabalho, os melhores resultados foram obtidos com a luz colorida (azul-vermelha) (Figura 6B e 6D).

Fig 6. Plântula de Libidibia ferrea cultivada in vitro como fonte de explantes utilizadas para a regeneração in vitro (A). Aspectos das brotações cultivadas em meio de cultura MS suplementado com 0,05 mg L-1 de BAP mantidos sob LED azul-vermelha 470 nm (B-C) e LED branca 530 nm (D-E).

De acordo com Taiz et al. (2017), os fótons de comprimento de onda de 400 a 700nm são utilizados na fotossíntese e cerca de 85 a 90% dessa radiação é absorvida pela folha, sendo o restante refletida na superfície foliar ou transmitida através da folha. Isto provavelmente justifique os resultados obtidos com o uso de LED colorida neste trabalho. Cid e Teixeira (2014) reportam que a luz da região azul pode estimular um tipo de organogênese (raiz/brotos) enquanto a luz vermelha pode induzir respostas morfogênicas. No entanto, a presença constante ou excessiva de citocininas e de auxinas no meio de indução de brotos podem desencadear uma série de efeitos hormonais endógenos dos explantes (Lemos 2014; Gupta e Agarwal 2017). Diferentes resultados sobre a regeneração in vitro testando o fotoperíodo e intensidade luminosa foram relatados na família Fabaceae. Na multiplicação in vitro de Libidibia pyramidalis, foi constatado que os reguladores de crescimento vegetal (KIN, BAP e TDZ) nas concentrações testadas (0,0–16 µM) não foram eficientes para promover a indução de brotos 96

em segmentos nodais sob fotoperíodo de 16 h e intensidade luminosa de 60 μmol m-2 s-1 (Silva et al. 2014). Por outro lado, em Mimosa caesalpiniifolia (Bezerra et al. 2014) e Amburana acreana (Fermino Junior e Scherwinski-Pereira 2012) foram observados aumentos na taxa de multiplicação das brotações com o uso do BAP mantidos sob fotoperíodo de 16 h e intensidade luminosa de 45 µmol.m-2.s-1 e 38 mmol m-2 s-1, respectivamente.

Conclusão Calos friáveis de segmentos nodais de Libidibia ferrea apresentam células de aspecto sugestivo de embriões somático em estágio globular. O desenvolvimento de calos friáveis é favorecido por inoculação em meios de cultura MS e B5, diluídos em até 50% da concentração original, acrescidos de 2,21 mg L-1 da auxina 2,4-D, e mantidos sob luz de LED azul-vermelha. Entretanto, quando cultivados sob luz de LED branca a formação de calos friáveis em segmentos nodais desta espécie é favorecido por inoculação em meios de cultura B5, MS diluído em até 50%, ambos, acrescidos de 6,63 mg L-1 da auxina 2,4-D. A ausência de luz é desfavorável à formação de calos friáveis em segmentos nodais desta espécie. A formação de brotos e gemas de segmentos nodais de L. ferrea é favorecida em meio de cultura MS, acrescido de BAP, e mantidos sob luz de LED azul-vermelhoa. Portanto, o uso das fontes de luz LEDs é uma alternativa viável para a micropropagação desta espécie.

Agradecimentos Os autores agradecem a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) pela concessão de bolsa de doutorado ao primeiro autor. Ao Dr. Luiz Augusto Gomes de Souza do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia pela doação das sementes de Libidibia ferrea. À Unidade de Microscopia Avançada do Centro Nacional de Biologia Estrutural e Bioimagem da Universidade Federal do Rio de Janeiro pela análise ultraestrutural.

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CAPÍTULO IV

Bioprospecção de Extratos de Plantas Micropropagadas de Libidibia ferrea (Fabaceae) Produzidas a Partir da Cultura de Tecidos

Artigo elaborado de acordo com as normas da International Journal of Pharmacology

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Bioprospecção de Extratos de Plantas de Libidibia ferrea (Fabaceae) Produzidas a Partir da Cultura de Tecidos

1Daniel da Silva, 1,2Paulo de Tarso Barbosa Sampaio, 2Maria Izabel Correia Osorio, 2Maria Teresa Fachin-Espinar 2Cecília Veronica Nunez 1Rede Bionorte, Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade e Biotecnologia, Escola Superior de Ciências da Saúde - ESA, Universidade do Estado do Amazonas – UEA, Av. Carvalho Leal1777, Cachoeirinha, 69065-000, Manaus, AM, Brasil 2Laboratório de Bioprospecção e Biotecnologia, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA, Av. André Araújo 2.936, Petrópolis, 69067-375, Manaus, AM, Brasil

Autor correspondente: Daniel da Silva, [email protected] / Telefone: +55 92 36431842 Resumo Introdução e Objetivo: O estudo teve por objetivo investigar a prospecção fitoquímica e biológica dos extratos hexânicos, metanólicos e aquosos obtidos das folhas, caules e raízes de plantas originadas do cultivo in vitro de Libidibia ferrea, como fonte alternativa para a produção de compostos biologicamente ativos. Material e Métodos: Os extratos e as fases foram avaliados por RMN de 1H, espectrometria de massas e bioensaios antioxidante (DPPH e Fe3+/fenantrolina), toxicidade sobre Artemia salina e antibacteriano pelo método de micro diluição em caldo Mueller-Hinton frente à Staphylococcus aureus, Salmonella enteritidis, Aeromonas hydrophila, Klebsiella apneumoniae, Edwardsella tarda, Staphylococcus epidermidis, Acinetobacter baumannii, Citrobacter freundii. Resultados: A fase diclometano obtida do extrato metanólico da raiz revelou a presença dos sinais característicos de “pau ferrol”. Os extratos hexânicos de folhas e caule mostraram atividade antibacteriana ativos frente a oito bactérias testadas. Para obtenção dos extratos metanólicos das folhas, caules e raízes, utilizou-se a metodologia de Fe3+/Fenantrolina e foi observado atividades antioxidante em todos os extratos. Ao avaliar a toxicidade dos extratos sobre A. salina na concentração inicial de 1000 μg/mL, foi observado que o extrato hexânico dos caules mostrou-se mais tóxico, uma vez que induziu a maior taxa de mortalidade (90%) das larvas. Conclusão: A avaliação dos extratos mostrou a presença de diferentes metabólitos secundários, e atividades antibacterianas, antioxidantes e tóxicos.

Palavras-chave: Antibacteriano; antioxidante; citotóxico; atividades biológicas; Amazônia.

Abstract Introduction and Objective: This study aimed to investigate prospecting the phytochemical and biological of the hexane, methanolic and aqueous extracts obtaine of the leaves, stems and roots from in vitro culture plants of Libidibia ferrea. Material and Methods: Extracts and phases were evaluated by 1H NMR, mass spectrometry and antioxidant bioassays (DPPH and Fe3 + / phenanthroline), toxicity on Artemia salina and antibacterial by the microdilution method in Mueller-Hinton broth against Staphylococcus aureus , Salmonella enteritidis, Aeromonas hydrophila, Klebsiella apneumoniae, Edwardsella tarda, Staphylococcus epidermidis, Acinetobacter baumannii, Citrobacter freundii. Results: The dichloromethane phase obtained from the methanolic extract of the root revealed the presence of the characteristic signals of "pau ferrol". The hexane extracts of leaves and stem showed active antibacterial activity against eight bacteria tested. Fe3+ / Phenantroline methodology was used for obtaining the methanolic extracts of leaves, stems and roots, the and antioxidant activities were observed in all the extracts. When evaluating the toxicity of the extracts on A. salina at the initial concentration of 1000 μg / mL, it was observed that the hexane extract of the stems was more toxic, as it induced the highest mortality rate (90%) of the larvae. Conclusion: The evaluation of the extracts showed the presence of different secondary metabolites, and antibacterial, antioxidant and toxic activities.

Keywords: Antibacterial; antioxidant; cytotoxic; biological activities; Amazon. 101

INTRODUÇÃO

Libidibia ferrea, conhecida popularmente como jucá ou pau-ferro, planta medicinal amazônica pertencente à família Fabaceae nativa do Brasil, amplamente distribuída principalmente no Norte e Nordeste1. Na medicina popular, o pó da casca de L. ferrea é usado no tratamento de feridas cutâneas com bons resultados, o que desperta grande interesse nos estudos biotecnológicos e farmacológicos dessa espécie2,3. Algumas das suas propriedades terapêuticas têm sido descritas, tais como anti-inflamatória, antibacteriana e analgésica4, imunoestimulante5, antirruga6 e cicatrizante 7. Cavalheiro et al.8 mostraram que o extrato aquoso das sementes de L. ferrea tem potencial larvicida contra Aeades aegypti, podendo ser utilizado como importante ferramenta no controle da dengue no Brasil. Estes mesmos autores, relataram a presença das atividades celulásica, amilásica e anticoagulante. Recentemente, três dímeros da chalcona: pau-ferrol A, pau-ferrol B e pau-ferrol C, foram isolados dos caules de plantas adultas desta espécie. Esses dímeros de chalcona mostraram efeito inibitório contra topoisomerase II humana e induziram apoptose em células HL60 de leucemia humana9,10, que é considerada um alvo clínico para drogas anticancerígenas. A qualidade e a quantidade de substâncias ativas obtidas diretamente da natureza ou de plantas cultivadas em campo são frequentemente heterogênea, uma vez que é dependente das condições ambientais, resultando em estresses bióticos e abióticos. Entretanto, esses problemas podem ser superados e controlados com o cultivo in vitro de plantas11,12. Esse bioprocesso poderá contribuir para a manipulação do metabolismo de plantas de L. ferrea, visando gerar substâncias ativas com valor mais alto à de plantas em campo13,14,15. O objetivo deste estudo foi realizar a bioprospecção dos extratos aquosos, metanólicos e hexânicos das folhas, caules e raízes obtidos a partir de plantas micropropagadas de Libidibia ferrea, devido à escassez de estudos fitoquímicos e biológicos relacionados ao cultivo in vitro desta espécie e por apresentar metabólitos secundários de interesse farmacêutico, como alcalóides e flavonóides.

MATERIAL E MÉTODOS Coleta e identificação do material vegetal: O estudo foi realizado no Laboratório de Bioprospecção e Biotecnologia do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia - INPA. Foram utilizadas plantas micropropagadas16 com boa maturidade fisiológica, as quais foram cultivadas por três anos no viveiro do Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais da Escola Superior de 102

Tecnologia da Universidade do Estado do Amazonas. A excicata do material vegetal encontra- se registrada no herbário do INPA, sob o número 228.022.

Obtenção dos extratos vegetais: O material vegetal foi separado em folhas (100,02 g), caules (100,50 g) e raízes (100,43 g), secos em estufa a 40 °C e triturado em moinho de facas para o preparo dos extratos. O material seco e moído foi primeiramente extraído com hexano, usando ultrassom (UNIQUE, modelo USC-2800) por 20 min. Após o solvente foi filtrado e novamente extraído com hexano, sendo este procedimento repetido (totalizando três extrações). Após a extração com hexano, o material vegetal (torta) foi seco e extraído com metanol (MeOH, 2L), também com auxílio de ultrassom por 20 min, filtrado e este procedimento repetido mais duas vezes. Posteriormente, o material vegetal foi seco e extraído com água, usando ultrassom por 20 min. Os extratos filtrados foram concentrados utilizando evaporador rotativo (FISATOM, Modelo 802/Brasil) sob pressão reduzida em temperatura <50°C, obtendo assim os extratos hexânicos (1,12 g), metanólico (11,24g) e aquosos (7,83) das folhas; hexânicos (0,500 g), metanólico (1,45 g) g) e aquosos (18,69 g) dos caules e hexânicos (3,45 g), metanólicos (5,36 g) e aquosos (20,9 g) das raízes.

Análise fitoquímica e fracionamento: As análises iniciais dos extratos foram realizadas por cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC), empregando-se cromatofolhas de alumínio com sílica gel impregnado com indicador de fluorescência UV254 (Alugram SIL

G/UV254). As amostras foram eluídas com os seguintes sistemas:hexano/acetona 9:1, diclorometano (DCM)/Metanol 1:1, acetona/metanol 1:1 de acordo com a polaridade das amostras.Para a revelação das substâncias presentes nas placas cromatográficas foram utilizados: luz ultravioleta (λ: 254 e 365 nm), anisaldeído sulfúrico, sulfato cérico, dragendorff e NP PEG. O extrato metanólico das raízes (1 g) foi submetido à partição líquido-líquido, obtendo- se as fases: DCM, acetato de etila (AcOEt) e hidroalcoólica, que foram posteriormente avaliadas por separado. Inicialmente foi solubilizado com uma mistura de MeOH/H20 (50:50) e posteriormente extraído com DCM e AcOEt. A fase DCM (1 g) foi aplicada em cromatofolha de sílica e eluída com sistemas como: DCM/acetona (8:2), DCM/AcOEt ( 9:1), DCM/MeOH (9:1). Para a avaliação da fase AcOEt por CCDC foram utilizados os seguintes sistemas: DCM/AcOEt (3:7), acetona/AcOEt (1:1), AcOEt/MeOH (9:1), DCM/MeOH (9:1). Já a fase hidrometanólica foi eluída com os sistemas: 100% MeOH e a combinação de DCM/MeOH (9:1, 7:3 e 8:2). Todos os extratos foram analisados por Ressonância Magnética Nuclear de 1H, 103

em aparelho Bruker, modelo DRX-300 (7,05 T), na frequência de 300 MHz dissolvidas a solvente deuterado.

Avaliação da atividade antibacteriana: Foram utilizadas tanto bactérias gram-positivas e gram-negativas de interesse clínico ou do agro-negócio como: Staphylococcus aureus (ATCC 12600), Salmonella enteritidis (ATCC 6051), Aeromonas hydrophila (ATCC 7966), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883), Edwardsella tarda (ATCC 15947), Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228), Acinetobacter baumannii(ATCC 19606-143), Citrobacter freundii (ATCC 8090), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145).

Preparo das culturas bacterianas: A atividade antibacteriana foi avaliada pelo método de micro diluição em caldo, seguindo orientações propostas por CLSI17. Os extratos e as frações foram inicialmente solubilizados em dimetilsulfóxido (DMSO) a 5%, e em seguida realizadas diluições sucessivas até a obtenção das concentrações de 1000 a 7,8 μg/mL. Para a realização do ensaio, o inoculo foi previamente ajustado em espectrofotômetro, obtendo-se uma absorbância entre 0,08 e 1,00 em 625 nm (o que equivale à escala 0,5 de McFarland), este então foi diluído 20 vezes. Assim, o volume final de bactéria aplicado em cada poço foi de aproximadamente 5x104 UFC. Em seguida foram adicionados em cada um dos poços (microplaca de 96 poços) 5 μL desta solução de inoculo e 95 μL de cada concentração do extrato.Para o controle negativo foram utilizados 95 μL de caldo Müeller Hinton contendo 5% de DMSO e 5 μL de inoculo. Para o controle positivo foram utilizados 95 μL do antibiótico oxitetraciclina na concentração de 125 μg/mL e 5 μL de inóculo.

Atividade antioxidante: O potencial antioxidante dos extratos foi avaliado pelas metodologias quantitativas de DPPH e Fe3+/fenantrolina. Segundo Martins et al.18 os resultados obtidos foram expressos em equivalência ao ácido ascórbico (antioxidante padrão).

Curvas de calibração com ácido ascórbico: Inicialmente foram preparadas as soluções de: 2,2-difenil-1- (2,4,6-trinitrofenil)-hidrazila DPPH (28 µg/mL); Fe3+ fenantrolina de 0,25% e uma solução de ácido ascórbico com água deionizada a uma concentração inicial de 900 µg/mL, a partir da qual foram preparadas diluições resultando nas seguintes concentrações: 0; 90; 180; 360; 540 e 720 µg/mL. Para obtenção da curva de calibração com DPPH foram adicionados em seis micro-tubos 990 µL de DPPH mais 10 µL da solução de ácido ascórbico nas diferentes concentrações. Após 30 minutos, foi realizada a leitura da absorbância em espectrofotômetro 104

no comprimento de 517 nm. Para a obtenção da curva de calibração de Fe 3+/ Fenantrolina foram adicionados em seis novos micro-tubos 10 μL da solução de ácido ascórbico nas diferentes concentrações, mais 10 μL da solução padrão de Fe3+ e 980 µL da solução 1,10- fenantrolina 0,25%. Após 1 hora, foi realizada a leitura da absorbância em espectrofotômetro no comprimento de 508 nm.

Ensaio com 2,2-difenil-1-picrilhidrazila (DPPH): Para determinação da absorbância da reação entre o DPPH e os extratos foram utilizados 990 µL de DPPH (28 µg/mL em metanol) e 10 µL da solução de cada um dos extratos a uma concentração de 0,5 mg/mL, em triplicata. Como controle negativo foi utilizado 990µL de DPPH (28 µg/mL em metanol) e 10 µL de água deonizada. Após 30 minutos, foi realizada a leitura da absorbância em espectrofotômetro no comprimento de 517 nm.

Fe3+ / fenantrolina: Para avaliação da atividade antioxidante dos extratos foram utilizados 980 µL da solução de 1,10-fenantrolina e adicionados 10 µL da solução de Fe3+ e 10 µL da solução dos extratos a uma concentração de 0,5 mg/mL. A água deonizada foi utilizada como controle negativo. Após 60 minutos foi realizada a leitura da absorbância em espectrofotômetro no comprimento de 508 nm.

Ensaio de toxicidade sobre Artemia salina: O ensaio foi realizado seguindo a metodologia proposta por Meyer et al.19. Foram utilizados para eclosão 10 mg de cistos de A. salina, os quais foram colocados numa solução salina (3,8%). As condições de crescimento utilizadas para a eclosão dos cistos foram de temperatura de 25 a 28 °C e iluminação em lâmpada fluorescente durante 48 horas. Após o período de eclosão, as larvas foram transferidas para placas de 24 poços, sendo estas distribuídas 10 larvas de A. salina para cada poço. Em cada placa, foram realizados os controles da solução salina, do solvente e o controle positivo. Os extratos foram adicionados nos poços do teste, na concentração inicial de 1000 μg/mL. As placas com as larvas de A. salina foram mantidas por 24 horas sob iluminação de lâmpada fluorescente. Após esse período, foi avaliado o número de larvas sobreviventes por cada poço.

Análise estatística: O delineamento foi o interiamente casualizado e todos os testes foram realizados em triplicata. Os resultados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e para a comparação das médias dos tratamentos foi aplicado o teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade, utilizando o software MINITAB® versão 18.

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RESULTADOS E DISCUSSÃO

Análise fitoquímica: A prospecção fitoquímica dos extrato metanólico dos caules e raízes (Figura 1) quando submetidos à análise por CCDC demonstram a presença de terpenos quando revelados com Ce(SO4)2, devido a coloração marrom característico desta classe química. Resultados similares foram observados com os extratos hexânicos (Figura 2).

Fig. 1: Extratos metanólicos de folhas (Fo), Caules (Ca) e Raízes (Ra) de plantas microprapagadas de Libidibia ferrea, eluídos com hexano/acetona 9:1 (v/v) analisadas por Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC) sob luz vísivel (A), UV 254 nm (B) e UV 365 nm (C) e reveladas com diferentes reagentes NP/PEG (D), anisaldeído sulfúrico (E), dragendorff (F) e sulftato cérico (G).

Fig. 2: Extratos hexânicos de folhas (Fo), Caules (Ca) e Raízes (Ra) de Libidibia ferrea, eluídos com DCM/MeOH 1:1 (v/v) analisadas por Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC) sob luz vísivel (A), UV 254 nm (B) e 365 UV nm (C) e reveladas com diferentes reagentes NP/PEG (D), anisaldeído sulfúrico (E), dragendorff (F) e suftato cérico (G).

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Uma das características dos extratos mais apolares é a presença majoritária de esteroides e ácidos graxos, isto foi observado nos extratos hexânicos das folhas, caules e raízes quando analisados os espectros de RMN 1H (300 MHz) dos mesmos, onde foi observada a presença de sinais de duplo dupleto com deslocamento nas regiões entre 4,0 e 4,5 ppm (Figura 3) característicos de triglicerídeos, sendo que dos três extratos analisados o das folhas foi o que apresentou menor intensidade de sinais nessa região.

1 Fig. 3: Espectro de RMN de H em CDCl3 (300 MHz) obtidos de extratos hexânicos de folhas (a), caules (b) e raízes (c) de Lidibia ferrea

Ao analisar os espectros de RMN 1H dos extratos metanólicos e aquosos das folhas, caule e de raízes, foi possível observar uma grande concentração de sinais com deslocamentos entre 3,0 – 4,0 ppm, região correspondente aos açucares, principalmente nos extratos metanólicos dos caules. Por outro lado, observou-se também que os extratos metanólicos das folhas e raízes, ambos, apresentavam a presença majoritária de sinais na região dos aromáticos (6,5 – 7,0 ppm) (Figura 4). Suponha-se que nos extratos metanólicos de folhas e raízes seja possível obter flavonoides glicosolados, como relatado por Nawwaret al.20 o qual isolou e 107

identificou nove substancias fenólicas obtidas a partir do extrato hidroalcoólico das folhas de L. ferrea. Estudos de caracterização fitoquímica realizados por Magalhães et al.21 e por Gonzales et al. 22 constaram a possível presença dos principais grupos de metabólitos secundários como saponinas, ácidos orgânicos, açúcares redutores, esteroides e triterpenóides, fenóis e taninos nos extrato glicólico de folhas e hidroalcoólicos do caule, casca e folha de L. ferrea, respectivamente.

Fig. 4: Espectro de RMN de 1H em DMSO (300 MHz) obtidos de extratos metanólicos de folhas (a), caules (b) e raízes (c) de Lidibia ferrea

A análise do espectro de RMN1H da fase DCM obtida do extrato metanólico da raiz (Figura 5) indicou a presença dos sinais característicos da substância “pau ferrol”, o qual foi confirmado com os resultados obtidos por espectrometria de massas, onde foi possível observar um pico majoritário com um íon molecular [M-H]- com m/z 765.1969 condizente com a fórmula molecular C45H34O12 (Figura 6). É importante destacar que este é o primeiro relato obtido de plantas originadas do cultivo in vitro de L. ferrea, cujo estudo poderá contribuir para o desenvolvimento de produtos fitoterápicos a partir do uso sustentáviel, sem comprometer a sua 108

biodiversidade, além de diminuir e/ou minimizar o efeito da erosão genética desta espécie, tornando-se desnecessário a extração desse material de suas populações naturais. Ao contrário, relatado por Nozaki et al.9,23 que esta substância “pau-ferrol” foi isolada anteriormente a partir da casca do caule obtidos de plantas adultas provenientes do seu habitat natural. .

1 Fig. 5: Espectro de RMN de H em DMSO-d6 (300 MHz) obtidos dos extratos metanólicos da raiz em fase DCM (a) e AcOEt (b) de plantas micropropagadas de Libidibia ferrea.

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Fig. 6: Espectro de massas da fase DCM obtida do extrato metanólico da raiz de L. ferrea. A: Ionização por electrospray (ESI -). B: Ionização química pressão atmosférica (APCI -). C: Ionização química pressão (APCI +).

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Avaliação da atividade antibacteriana: A tabela 1 mostra os resultados da atividade antibacteriana dos extratos analisados onde é possível observar que o extrato hexânico das folhas foi o que apresentou o melhor resultado com uma concentração inibitória mínima (CIM) de 500 µg/mL frente às bactérias gram-positivas: S. aureus e S. epidermidis. Por outro lado, quando avaliados frente às bactérias gram-negativas foi possível verificar que os extratos hexânicos, metanólicos e aquosos do caule foram os que apresentaram uma maior capacidade de inibir o crescimento das seguintes bactérias: S enteritidis, A. hydrophila, E. tarda, A. baumanii e C. freundii. Já os extratos hexânicos, metanólicos e aquosos das folhas apresentaram atividade antibacteriana frente às S. enteritidis, K. pneumoniae, E. tarda e A.baumanii. Os extratos hexânicos, metanólicos e aquosos da raiz não apresentaram atividade frente às bactérias testadas como mostrado na Tabela 1.

Tabela 1: Resultado da atividade antibacteriana dos extratos de Libidibia ferrea obtido pelo método de microdiluição em caldo. Parte da planta/Extrato CIM (µgmL-1)* Microorganismos Folha Caule Raiz testados Hexano MeOH H2O Hexano MeOH H2O Hexano MeOH H2O Bactéria gram- positiva Staphylococcus 500 -** - 1000 - - - - - aureus Staphylococcus 500 1000 ------epidermidis Bactéria gram- negativa Salmonella enteritidis 1000 - - 500 500 500 - - - Aeromonashydrophila - - - 1000 1000 - - - - Klebsiella 500 - 1000 ------pneumoniae Edwardsella tarda - 500 1000 500 - 1000 - - - Acinetobacter 500 - - - 1000 - - - - baumani Citrobacter freundii - - - 500 500 - - - - Pseudomonas ------aeruginosa *O controle positivo utilizado foi oxitetraciclina a uma concentração de 125 gmL-1 **não apresentou atividade

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Os resultados obtidos corroboram pesquisas que avaliaram a atividade antibacteriana de L. ferrea frente às S. aureus, S. mutans, S. sobrinus, S. mitis, S. sanguis e L. casei, obtendo resultados significativos21,24. Adicionalmente, foi testada a eficiência antibacteriana do extrato obtido dos frutos desta planta contra C. albicans, S. mutans, S. salivarium, S. oralis e L. casei pelo método da microdiluição, confirmando que os extratos de L. ferrea possuem atividade antimicrobiana contra estes patógenos orais. Outros estudos realizados com diferentes extratos hexânicos e metanol das folhas e caules de pau-ferro também apresentaram atividade antimicrobiana8,25,26. Ademais, diversos estudos estão sendo realizados com a finalidade de avaliar como os extratos de L. ferrea podem ser utilizados como fitomedicamento27.

Atividade antioxidante: A avaliação da atividade antioxidante foi realizada medindo a capacidade de sequestro de radicais livres do DPPH e de redução de Fe 3+. Os resultados obtidos foram expressos em equivalência com o ácido ascórbico e interpretados, conforme a escala mostrada na tabela 2. Os extratos metanólicos das raízes apresentaram uma atividade antioxidante moderada quando empregada a metodologia com DPPH. No entanto, ao utilizar a metodologia de Fe3+/Fenantrolina, os três extratos metanólicos apresentam os maiores valores médios de potencial antioxidantes quando comparado com os demais tratamentos, uma vez que a equivalência com ácido ascórbico foi observada no intervalo de 0 – 1 (alto potencial). Por outro lado, os extratos hexânicos e aquosos das folhas, caules, raízes, não apresentaram atividade antioxidante para ambas às metodologias utilizadas (Tabela 3). Esse resultado pode ser devido ao fato de que nos extratos vegetais as moléculas com maior atividade antioxidante são os compostos fenólicos, os quais se encontram principalmente nos extratos metanólicos28.

Tabela 2: Escala para interpretação dos resultados da atividade antioxidante 20 Analise da atividade antioxidante (mg Escala de comparação de extrato/ mg de ácido ascórbico) Menor que 1,0 Muito ativo Entre 1,1 e 2,0 Ativo Entre 2,1 e 3,0 Atividade moderada Maior que 3,1 Inativo

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Tabela 3: Resultados da avaliação da capacidade antioxidante de extratos de Libidibia ferrea obtidos pelas metodologias de DPPH e Fe3+/Fenantrolina. Ensaio com DPPH Ensaio com 3+ /Fenantrolina Valores médios Valores médios Parte da Extratos Equiv.(mg de extrato/ planta Equiv. (mg de extrato/ 2+ |ΔABS517| [AA]eq [Fe ] [AA]eq mg de ácido mg de ácido ascórbico) ascórbico) 0,014* ± Hexano -0,192 ± 0,069 -29,061 ± 12,928 0,141 ± 0,005 0,374 ± 0,008 13,37 ± 0,281 0,008 Folha MeOH 0,156 ± 0,033 1,090 ± 0,296 4,802 ± 1,198 1,542 ± 0,040 2,562 ±0,063 1,95 ± 0,048 H2O 0,135 ±0,005 0,905 ± 0,047 5,532 ± 0,279 1,192 ± 0,065 2,015 ± 0,102 2,49 ± 0,126 Hexano 0,003 ± 0,003 -0,295 ± 0,024 -17,009 ± 1,332 -0,012 ± 0,026 0,136 ± 0,040 39,43 ± 13,435 Caule MeOH 0,176 ± 0,006 1,277 ± 0,055 3,919 ± 0,168 1,552 ± 0,094 2,578 ±0,147 1,94 ± 0,115 H2O 0,059 ± 0,001 0,216 ± 0,010 23,195 ± 1,158 0,513 ± 0,040 0,955 ± 0,062 5,25 ± 0,332 Hexano 0,004 ± 0,003 -0,286 ± 0,031 -17,625 ± 2,067 0,023 ± 0,021 0,191 ± 0,033 26,76 ± 4,980 Raiz MeOH 0,307 ± 0,010 2,460 ± 0,093 2,034 ± 0,076 2,273 ± 0,158 3,703 ± 0,247 1,35 ± 0,094 H2O 0,117 ± 0,007 0,739 ± 0,059 6,795 ± 0,558 0,843 ± 0,030 1,471 ± 0,047 3,40 ± 0,109 *Valor expresso como média (n=3) ± desvio padrão 113

O DPPH é considerado um radical estável que permite avaliar a capacidade de compostos como sequestradores de radicais, tendo sua absorção máxima a 517 nm. Quando o DPPH recebe um elétron o um radical hidrogênio torna-se um composto mais estável e sua absorção diminui. Há vários relatos que demonstram o potencial antioxidante em diferentes partes de dessa planta. Port’s et al.29 ao avaliar a infusão das folhas de L. ferrea, observaran que esta especie apresentou o maior teor total de compostos fenólicos (68,13mg de equivalentes de ácido gálico/grama-GAE/g) e capacidade antioxidante [68,13±15,93mg (GAE/g)] quando empregados os ensaios de DPPH e β-caroteno.Estudos realizados por Barroset al30 demonstraram que o extrato aquoso de frutos secos de L. ferrea apresentam atividade antioxidante quando utilizado as metodologias com DPPH, ΔABS, radical aniônico superóxido e β-caroteno. Enquanto, os extratos de casca de L. ferrea também demonstraram atividade antioxidante usando um ensaio de base celular. Em outro estudo, o extrato hidroalcoólico de frutas de L. ferrea foi testado usando cinco métodos antioxidantes (fosfomolibdênio e ensaios de redução de potência, superóxido, peróxido de hidrogênio e óxido nítrico) e capacidade de proteção do DNA. Os resultados também mostraram atividade antioxidante potente, que foi atribuída ao maior conteúdo fenólico31.

Toxicidade frente à Artemia salina: Os extratos de L. ferra foram testados para avaliar o seu potencial tóxico frente às larvas de A. salina na concentração inicial de 1000 μg/mL. Nesta concentração, os extratos avaliados apresentaram diferença significativa (p<0,05) para atividade tóxica (Figura 7). Os melhores resultados foram obtidos a partir dos extratos hexânicos das folhas, caules e raízes. O extrato hexânico dos caules induziu a maior taxa de mortalidade (90%) das larvas de A. salina, seguidos dos extratos das folhas e raízes, ambos, promoveram 50% de mortalidade.O valor para um extrato ser considerado como tóxico é de 50% de mortalidade das larvas32. Portanto, é importante salientar que este estudo é inicial, de modo que a aplicação de outros métodos de análise citotóxica destes extratos são necessários, incluindo os ensaios de citotoxicidade utilizando células de mamíferos. Diversos estudos têm sido relatos na literatura sobre o potencial dos extratos de L. ferrea da toxicidade frente à A. salina. Luna et al. 33 avaliou o extrato etanólico de folhas de esta espécie que apresentou toxicidade frente à A. salina (68%).Outras pesquisas de citotoxicidade demonstraram que o extrato hidroalcoólico das folhas de L. ferrea apresentaram atividade citotóxica utilizando o ensaio de vermelha neutro frente às linhagens de células HaCaT20. 114

Fig. 7: Taxa de mortalidade de larvas de Artemisa salina em função dos extratos testados de Libidibia ferrea. *Médias seguidas de mesa letra não diferem estatisticamente, entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste Tukey.

CONCLUSÃO A análise cromatográfica revelou a presença de terpenos em extratos metanólicos e hexânicos de caule e raízes, e presença de compostos aromáticos (fenóis e flavonoides) em extratos metanólicos de folhas e raízes de plantas micropropagadas de Libidibia ferrea. A análise de RMN revelou a presença da substância "pau-ferrol" obtida do extrato metanólico das raízes de plantas propagadas in vitro desta espécie. Os ensaios biológicos testados neste estudo demonstraram que os extratos hexânicos, metanólicos e aquosos de folhas e caule de plantas cultivadas in vitro de L. ferrea apresentam atividade antibacteriana. Por outro lado, os extratos metanólicos de folhas, caule e raízes apresentam atividade antioxidante. Entretanto, os três extratos hexânicos desta espécie apresentam toxicidade frente à Artemia salina.

AGRADECIMENTOS Os autores agradecem a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) pela concessão de bolsa de doutorado ao primeiro autor. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq e pelos auxílios financeiros concedidos. 115

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CONSIDERAÇÕES FINAIS

A propagação in vitro através da germinação de sementes e embriões zigoticos in vitro apresenta-se como alternativa para produção de mudas de Libidibia ferrea. É importante destacar que os resultados obtidos por meio da técnica calogênese possibilitam estudos futuros nas áreas de embriogênese somática e/ou suspensão celular, bem como o desenvolvimento de um banco de germoplasma in vitro visando o melhoramento genético desta espécie. A bioprospecção dos extratos de plantas originadas do cultivo in vitro de L. ferrea, revelou a presença da substância “pau-ferrol” e, sobretudo, de compostos aromáticos (fenóis e flavonoides) e terpenos. Além disso, os ensaios biológicos testados neste estudo em extratos de plantas micropropagadas desta espécie demonstram potencial antimicrobiano, antioxidante e citotóxica. É importante salientar que a substância “pau-ferrol” apresentada neste estudo é promissor, uma vez que este é o primeiro relato sobre o potencial de plântulas provenientes do cultivo in vitro desta espécie. No entanto, recomenda-se estudos adicionais para correlacionar a presença de metabólitos secundários visando o desenvolvimento de produtos fitoterápicos. Considerando a importância desta espécie para Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao Sistema Único de Saúde do Brasil (RENISUS), bem como as técnicas aplicadas ao cultivo in vitro, neste estudo, evidenciou que os métodos de propagação e produção de mudas e metabólitos secundários utilizados são vantajosos para solucionar o problema da demanda de mudas com alta qualidade genética de L. ferrea, possibilitando à recomposição das populações naturais e os plantios ex situ.

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ANEXO 1

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ANEXO 2

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ANEXO 3 123

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