INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIODIVERSIDADE E BIOTECNOLOGIA DA REDE BIONORTE PROPAGAÇÃO IN VITRO E BIOPROSPECÇÃO DE EXTRATOS DE PLÂNTULAS DE Libidibia ferrea (FABACEAE) DANIEL DA SILVA MANAUS-AMAZONAS Fevereiro/2019 DANIEL DA SILVA PROPAGAÇÃO IN VITRO E BIOPROSPECÇÃO DE EXTRATOS DE PLÂNTULAS DE Libidibia ferrea (FABACEAE) Tese apresentada ao Curso de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade e Biotecnologia da Rede BIONORTE, no Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Biotecnologia e Biodiversidade. Orientador: Prof. Dr. Paulo de Tarso Barbosa Sampaio MANAUS-AMAZONAS Fevereiro/2019 FICHA CATALOGRÁFICA Dedicatória. “Maxime” Dedico este trabalho à minha avó “In memorian” Palmira Nonata da Silva Pereira e a minha mãe Maria das Dores Nonata da Silva, que através de suas orientações sempre me exigiram um pouco mais, fazendo-me crescer intelectualmente e moralmente, e por ter me ensinado a importância da educação. Aos meus queridos irmãos Danilo e Adonias, vocês dois sãos os melhores irmãos que a vida me proporcionou! “Epígrafe”. “Não existe felicidade maior na Terra do que aquela que um espírito belo e produtivo encontra em si mesmo nos momentos felizes”. Arthur Schopenhauer “Os grandes feitos são conseguidos não pela força, mas pela perseverança”. Samuel Johnson AGRADECIMENTOS Esta tese é o resultado de um esforço conjunto, e sua produção seria impossível sem a generosidade de Deus, por sempre estar ao meu lado, ter me dado esperança, força de vontade e acima de tudo a sabedoria para a conquista de mais uma vitória pessoal e profissional. Minha gratidão ao Dr. Paulo de Tarso de Barbosa Sampaio, meu orientador e amigo, pela orientação e estímulo ao meu desenvolvimento acadêmico, profissional e pessoal. Agradeço à Dra. Angela Maria Imakawa que ajudou a desenvolver o plano de revisão desde o 1º até o 3º capítulo deste trabalho, fez muitas sugestões úteis, cujas contribuições foram significativas e evidentes no texto. Nosso técnico do Laboratório de Silvicultura e Tecnologias Digitais do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (LASTED-INPA), Eng. Florestal, Flávio Mauro Souza Bruno, de todas as formas manteve o funcionamento do laboratório e nos forneceu opiniões extremamente úteis sobre diferentes capítulos. Agradeço à Dra. Suely de Souza Costa pelo seu talento estatístico e na interpretação das análises de dados. Minha gratidão vai também para Dr. Luiz Augusto Gomes de Souza pela identificação da espécie vegetal e fornecimentos das sementes. Um agradecimento muito especial vai para Dra. Cecília Verônica Nunez, que me supervisionou no seu Laboratório de Biotecnologia e Bioprospecção do INPA e contribuiu muito para a realização deste projeto. Também estou profundamente agradecido à Fundaçao de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) e a Coordenação de Pesquisas de Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro da bolsa de estudo junto ao Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade e Biotecnologia – Rede Bionorte. Agradeço ao reitor da Universidade do Estado do Amazonas, Dr. Cleinado de Almeida Costa, meu amigo, por sua extraordinária ajuda na aquisição de passagens aéreas e diárias para participação em diversos eventos científicos nacionais e internacionais, assim como para custeio da taxa de publicação dos artigos, frutos desta tese. Sinto-me muito feliz por ter tido Dr. Spartaco Astolfi Filho, como Coordenador Geral da Rede Bionorte, o qual aprendi bastante durante a Representação Estudantil (2015-2016) e, sobretudo, foi um importante “interlecutor” nos bastidores durante a realização do doutorado sanduíche no exterior – uma mão amiga. Agradeço ao Coordenador Estadual do PPG-Bionorte/Amazonas, Dr. Jair Maia por sua ajuda e por fornecer assistência administrativa em muitas ocasiões. Em Leeds, Dra. Christine H. Foyer foi minha supervisora e crítica de primeira linha durante o meu estágio de doutoramento-sanduíche na Universidade de Leeds, Reino Unido. Dra. Barbara Kampiska contribuiu bastante para o ensino de técnicas biotecnológicas, especialmente a microscopia confocal. Muitos colegas tiveram um papel especial em momentos importantes durante o meu estágio e por suas intervenções oportunas. Destaco: o maravilhoso casal Jonas Alvim e Fernanda Alvim, e aos colegas de laboratório: Philipa Siclair, Hayati Razak, Sarah Alomran, Yousef Hajaya todos fizeram muitos comentários incisivos e principalmente ao estímulo do network que foi fundamental durante a minha experiência nesta Universidade. Muitos outros colegas e amigos, que me auxiliaram a dar forma a este trabaho com seus comentários, sugestões e críticas. Sou profundamente grato a todos eles: MSc. Messe Elmer Torres da Silva, Universidade do Estado do Amazonas MSc. Weison Lima da Silva, Universidade Federal do Amazonas MSc. Maria Teresa Fachin Espinar, Universidade Federa do Amazonas MSc. Maria Izabel Correia Osorio, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia MSc. Adrian Arturo Arispe, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia Aos velhos amigos, por compreenderem as infinitas horas de minha ausência e que, mesmo tão longe, continuam tão perto. Não tenho espaço espaço aqui para agradecer a todas as pessoas cujos esforços contribuíram para o desenvolvimento deste projeto. Ofereço meu sincero agradecimento – e a tese pronta que eles ajudaram a finalizar. Assumo, é claro, total responsabilidade por eventuais incorreções. Quero agradecer, de modo especial, aos meus meus alunos de PIBIC e de TCC da Univesidade do Estado do Amazonas por suas inúmeras contribuições que me ajudaram a equilibrar as demandas com o tempo e o estudo. Finalmente, expresso minha profunda gratidação à minha família, especialmente a minha querida mãe - Maria das Dores Nonato da Silva - e a minha querida companheira e mulher - Josilene Cavalcante Cunha - que tiveram extraordinária paciência e me apoiaram na realização deste sonho, e dando-me força para ser um vencedor. Muito obrigado! vii DA SILVA, Daniel. Propagação in vitro e bioprospecção de extratos de plântulas de Libidibia ferrea (Fabaceae). 2019. 125 f. Tese (Doutorado em Biodiversidade e Biotecnologia) – Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Manaus, 2019. RESUMO O estudo teve por objetivo estabelecer e avaliar métodos de propagação in vitro e bioprospecção de extratos de plântulas de Libidibia ferrea (Fabaceae), que possibilitará a multiplicação de genótipos superiores com potencial para uso medicinal. Os experimentos foram desenvolvidos no Laboratório de Silvicultura e Tecnologia Digitais (LASTED) e Laboratório de Bioprospecção e Biotecnologia (LABB), ambos, vinculados ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA, Manaus, AM), em parceria com o Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais (LCTV) da Universidade do Estado do Amazonas (UEA, Manaus, AM). A pesquisa contempla quatro capítulos. Capítulo I – Cultura in vitro de embriões zigóticos e sementes de L. ferrea e as respostas morfogenéticas dos explantes em relação a diferentes concentrações de reguladores de crescimento. Os resultados indicaram a viabilidade técnica da cultura de embriões zigóticos e germinação de sementes in vitro, tornando-se uma técnica alternativa para propagação in vitro desta espécie. No capítulo II - Foi avaliado o efeito de diferentes concentrações de 2,4-D e ANA isoladamente ou em combinação com BAP e TDZ para a indução de calos friáveis em explantes foliares e segmentos nodais. Os resultados demonstraram que ambos os tipos de explantes apresentaram diferenças significativas (p<0,05) na indução, morfologia e coloração dos calos. A indução máxima de calos friáveis (90%) foi obtida a partir de explantes de segmentos nodais cultivados em meio MS suplementado com 1,0 mg L-1 de 2,4-D e 5,0 mg L-1 de TDZ. Em relação ao capítulo III – Foi avaliada a influência da luz de LED azul-vermelha e LED branca na calogênese e na regeneração de plântulas in vitro de L. ferrea. A luz LED azul-vermelha estimulou a maior formação de calos friáveis e a regeneração in vitro de plântulas em relação à luz LED branca. Os resultados confirmam a eficiência da utilização da luz de LED azul-vermelha e LED branca para calogênese e a regeneração in vitro de L. ferrea. No capítulo V – Foi realizado o estudo químico e biológico diferentes metabólitos secundários, e atividades antibacterianas, antioxidantes e tóxicos. A avaliação dos extratos mostrou a presença de diferentes metabólitos secundários, e atividades antibacterianas, antioxidantes e tóxicos. Palavras-chave: Biotecnologia, Multiplicação in vitro, Otimização de protocolo, Libidibia ferrea, Planta medicinal. viii DA SILVA, Daniel. In vitro propagation and bioprospecting of seedling extracts of Libidibia ferrea (Fabaceae). 2019. 125 f. Thesis (Doctorate in Biodiversity and Biotechnology) - National Institute of Amazonian Research, Manaus, 2019. ABSTRACT The objective of this study was to establish and evaluate methods of in vitro propagation and bioprospecting of seedlings extracts of Libidibia ferrea (Fabaceae), which will allow the multiplication of superior genotypes with potential for medicinal use. The experiments were developed at the Laboratory of Silviculture and Digital Technology (LASTED) and Laboratory of Bioprospecting and Biotechnology (LABB), both linked to the National Institute of Amazonian Research (INPA, Manaus, AM), in partnership with the Laboratory of Plant Tissue Culture (LCTV) of the Amazonas State University (UEA, Manaus, AM). The research includes four chapters. Chapter I -