Pontificia Universidad Javeriana Facultad De Ciencias Programa De Postgrado

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS PROGRAMA DE POSTGRADO

ESTUDIO FITOQUÍMICO Y SCREENING DE LA ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE LAS ESPECIES Conyza trihecatactis y Ageratina vacciniaefolia

PAOLA BORREGO MUÑOZ

TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial para optar el título de MAGISTER EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS PROGRAMA DE POSGRADOS BOGOTÁ D.C 2017

NOTA DE ADVERTENCIA

"La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia". Artículo 23 de la Resolución Nº13 de julio de 1946.

ESTUDIO FITOQUÍMICO Y SCREENING DE LA ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE LAS ESPECIES Conyza trihecatactis y Ageratina vacciniaefolia

PAOLA BORREGO MUÑOZ

APROBADO

______Dr. JUAN MARTÍNEZ PhD. Dr. ANTONIO GUZMÁN MSc. Dra. GINA MÉNDEZ PhD.

ESTUDIO FITOQUÍMICO Y SCREENING DE LA ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE LAS ESPECIES Conyza trihecatactis y Ageratina vacciniaefolia

PAOLA BORREGO MUÑOZ

______Dra. Concepción Judith Puerta Dra. Alba Alicia Trespalacios

Decana Directora de Posgrados Facultad de Ciencias Facultad de Ciencias

AGRADECIMIENTOS

A Dios por darme la fuerza, por permitirme una vez más hacer mis sueños realidad y haber puesto en mi camino aquellas personas que han sido mi soporte durante todo este tiempo.

A la Pontificia Universidad Javeriana, a mi Director Jorge Robles por sus valiosos aportes durante la realización de este trabajo, a mis compañeros de laboratorio por su amistad y cooperación constante.

A la Fundación Universitaria Juan N. Corpas, a la Rectoria, Vicerrectoría Académica y Administrativa por contribuir a la realización de los ensayos antiinflamatorios.

A mi Co-director Miguel Pombo por la confianza que siempre ha depositado en mí y por demostrarme que con amor al trabajo y constancia se alcanzan grandes logros.

A la Clínica Juan N. Corpas, al Departamento de Patología por la realización del estudio histopatológico.

A la Universidad Militar Nueva Granada, al Doctor Ericsson Coy quien me acogió y me brindo su apoyo cuando lo necesité, a los integrantes del Grupo de Investigación InQuiBio porque siempre tuvieron una sonrisa para conmigo.

A la Universidad Distrital Francisco José de Caldas, al Profesor Javier Matulevich por la toma de muestras en el equipo de EM, por su apoyo y consejos.

A toda mi familia por el amor y el apoyo incondicional, a todos aquellos que han contribuido, directa o indirectamente a la realización de este trabajo.

GRACIAS A TODOS POR TODO!!!

TABLA DE CONTENIDO

Página RESUMEN ...... 1

INTRODUCCIÓN ...... 4

OBJETIVOS ...... 5

OBJETIVO GENERAL ...... 5

OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...... 5

1. ESTADO DEL ARTE ...... 6 1.1 FAMILIA ASTERACEAE ...... 6 1.1.1 Características generales de la familia Asteraceae ...... 6 1.1.2 Distribución de la familia Asteraceae ...... 7 1.1.3 Quimiotaxonomía de la familia Asteraceae ...... 7 1.2 Género Conyza ...... 8 1.2.1 Distribución del género Conyza ...... 8 1.2.2 Usos etnobotánicos del género Conyza ...... 9 1.2.3 Actividad biológica de especies del género Conyza ...... 9 1.2.4 Estudios fitoquímicos del género Conyza ...... 10 1.3 Especie Conyza trihecatactis ...... 13 1.3.1 Características morfológicas de la especie Conyza trihecatactis ...... 13 1.3.2 Distribución de la especie Conyza trihecatactis ...... 15 1.3.3 Usos etnobotánicos de la especie Conyza trihecatactis ...... 15 1.3.4 Actividad biológica de la especie Conyza trihecatactis ...... 15 1.3.5 Estudios fitoquímicos de la Conyza trihecatactis ...... 16 1.4 Género Ageratina ...... 17 1.4.1 Distribución del género Ageratina ...... 17 1.4.2 Usos etnobotánicos del género Ageratina ...... 18 1.4.3 Actividad biológica del género Ageratina ...... 18 1.4.4 Estudios fitoquímicos del género Ageratina ...... 19 1.5 Especie Ageratina vacciniaefolia...... 22

1.5.1 Características morfológicas de la especie Ageratina vacciniaefolia ... 22 1.5.2 Distribución de la especie Ageratina vacciniaefolia ...... 22 1.5.3 Actividad biológica de la especie Ageratina vacciniaefolia ...... 23 1.5.4 Estudios fitoquímicos de la especie Ageratina vacciniaefolia ...... 24 1.6 Técnicas de uso frecuente para la determinación de metabolitos secundarios ...... 24 1.6.1 Cromatografía en Capa Fina (CCF) ...... 25 1.6.2 Cromatografía líquida acoplada a Espectrometría de Masas (HPLC- MS) ...... 25 1.6.3 Espectrometría de masas (MS) ...... 25 1.6.4 Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) ...... 26 1.7 Actividad antiinflamatoria ...... 27 1.7.1 Inflamación aguda ...... 28 1.7.2 Inflamación crónica ...... 29 1.7.3 Modelos de evaluación in vivo de la actividad antiinflamatoria ...... 30 1.8 Generalidades del Cáncer ...... 31 1.8.1 Características y biología de las células tumorales ...... 33 1.8.2 Ciclo celular tumoral ...... 33 1.8.3 Epidemiología del Cáncer ...... 34 1.8.4 Ensayos in vitro para evaluar agentes antitumorales...... 35 1.8.5 Muerte celular ...... 36 1.9 Especies reactivas del oxígeno ...... 38 1.9.1 Mecanismo de defensa antioxidante ...... 39 1.9.2 Determinación de la capacidad antioxidante ...... 40 1.9.3 Ensayo del DPPH• (1,1-difenil-2-picril-hidrazilo) ...... 41 1.10 Toxicidad aguda en Artemia salina ...... 42

2. METODOLOGÍA ...... 43 2.1 Generalidades ...... 43 2.2 Métodos de separación cromatográfica ...... 43 2.3 Técnicas para la elucidación estructural y caracterización de los compuestos aislados ...... 44

2.3.1 Espectrometría de masas (MS) ...... 44 2.3.2 Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) ...... 44 2.3.3 Cromatografía líquida acoplada a Espectrometría de Masas (HPLC- DAD-MS) ...... 44 2.3.4 Cromatografía líquida de longitud de onda variable (semipreparativa) (HPLC-VWD (semiprep)) ...... 45 2.4 Estudio fitoquímico de las partes aéreas de las especies vegetales Conyza trihecatactis y Ageratina vacciniaefolia ...... 46 2.4.1 Recolección e identificación del material vegetal ...... 46 2.4.2 Obtención de extractos ...... 46 2.4.3 Obtención de fracciones para Conyza trihecatactis ...... 47 2.4.4 Obtención de fracciones para Ageratina vacciniaefolia ...... 50 2.5 Evaluación de la actividad antiinflamatoria ...... 53 2.5.1 Edema en pata de rata inducido por λ-carragenina ...... 53 2.5.2 Análisis estadístico ...... 56 2.5.3 Consideraciones éticas ...... 56 2.5.4 Estudio Histopatológico ...... 56 2.6 Evaluación de la actividad citotóxica ...... 57 2.6.1 Mantenimiento de las líneas celulares ...... 57 2.6.2 Ensayos de citotoxicidad ...... 58 2.7 Determinación de la capacidad antioxidante por el método del DPPH• ...... 59 2.7.1 Preparación del reactivo DPPH• ...... 59 2.7.2 Capacidad captadora del radical libre DPPH• ...... 60 2.7.3 Análisis estadístico ...... 61 2.7.4 Determinación de fenoles totales ...... 61 2.8 Toxicidad aguda en Artemia salina ...... 62 2.8.1 Análisis estadístico ...... 63

3. RESULTADOS Y ANÁLISIS ...... 64 3.1 Metabolitos secundarios aislados de Conyza trihecatactis ...... 64 3.1.1 Elucidación estructural de Ct2 ...... 64

3.1.2 Elucidación estructural de Ct3 ...... 71 3.1.3 Elucidación estructural de Ct4 ...... 77 3.1.4 Elucidación estructural de MCt1 ...... 83 3.2 Evaluación de la actividad antiinflamatoria para Conyza trihecatactis ...... 96 3.2.1 Estudio histopatológico para Conyza trihecatactis ...... 101 3.3 Evaluación de la actividad citotóxica para Conyza trihecatactis ... 105 3.4 Captura del radical libre DPPH• para Conyza trihecatactis...... 114 3.4.1 Contenido total de fenoles para Conyza trihecatactis ...... 115 3.5 Toxicidad aguda en Artemia salina para Conyza trihecatactis ...... 117 3.6 Metabolitos secundarios aislados de Ageratina vacciniaefolia ...... 118

3.6.1 Análisis por Cromatografía liquida de alta eficiencia para FCHCl3 Av ...... 118 3.6.2 Análisis por Cromatografía liquida de alta eficiencia para Av1, Av2, Av3 y Av4...... 119 3.6.3 Elucidación estructural de Av5 ...... 122 3.7 Evaluación de la actividad antiinflamatoria para Ageratina vacciniaefolia ...... 131 3.7.1 Estudio histopatológico para Ageratina vacciniaefolia ...... 134 3.8 Evaluación de la actividad citotóxica para Ageratina vacciniaefolia 138 3.8.1 Captura del radical libre DPPH• para Ageratina vacciniaefolia ...... 144 3.8.2 Contenido total de fenoles para Ageratina vacciniaefolia ...... 146 3.9 Toxicidad agua en Artemia salina para Ageratina vacciniaefolia ... 146

CONCLUSIONES ...... 147

RECOMENDACIONES ...... 148

BIBLIOGRAFÍA ...... 149

ÍNDICE DE TABLAS

Página

Tabla 1. Clasificación taxonómica de Conyza trihecatactis ...... 13 Tabla 2. Clasificación taxonómica de Ageratina vacciniaefolia...... 22 Tabla 3. Componentes de los mecanismos de defensa antioxidante ...... 39 Tabla 4. Clasificación de los modelos de ensayo según su modo de reacción TAH o TE...... 40 Tabla 5. Distribución de los grupos por tratamientos para Conyza trihecatactis y Ageratina vacciniaefolia...... 54 Tabla 6. Parámetrosasociadosalarespuestainflamatoria...... 57 Tabla 7.Comparación de los desplazamientos químicos del compuesto Ct2 con los de la 3-metoxi-5,7,4’-trihidroxiflavona...... 70 Tabla 8. Comparación de los desplazamientos químicos del compuesto Ct3 con los de la apigenina...... 76 Tabla 9.Comparación de los desplazamientos químicos del compuesto Ct4 con los de la luteolina ...... 82 Tabla 11.Comparación de los desplazamientos químicos de los flavonoides presentes en la mezcla MCt1 con los de la hispidulina y apigenina...... 96 Tabla 12.Actividad antiinflamatoria de fracciones y compuestos obtenidos de Conyza trihecatactis expresada como porcentaje de inflamación...... 97 Tabla 13.Actividad antiinflamatoria de fracciones y compuestos obtenidos de Conyza trihecatactis expresada como porcentaje de inhibición de la inflamación...... 98

Tabla 14.CI50 de extractos, fracciones y compuestos de Conyza trihecatactis sobre líneas celulares tumorales 4T1, TSA y MCF-7...... 106

Tabla 15.Índice selectividad a partir de CI50 de FCH2Cl2 Ct y MCt1 sobre línea celular normal 3T3 y línea celular MCF-7...... 111

Tabla 16.Contenido total de fenoles (CTF) para FEt2O Ct y FAcOEt Ct...... 116

Tabla 17.Compuestos identificados en FCHCl3 Av...... 119

Tabla 18. Compuestos detectados e identificados tentativamente para FCHCl3 Av...... 121 Tabla 19.Comparación de los desplazamientos químicos del compuesto Av5 con los de la luteolina ...... 130 Tabla 20.Actividad antiinflamatoria del extracto y fracciones obtenidos de Ageratina vacciniaefolia expresada como porcentaje inflamación...... 131 Tabla 21.Actividad antiinflamatoria de fracciones y compuestos obtenidos de Ageratina vacciniefolia expresada como porcentaje de inhibición de la inflamación...... 132

Tabla 22.CI50 de extractos, fracciones de Ageratina vacciniaefolia sobre líneas celulares tumorales 4T1, TSA y MCF-7...... 138

Tabla 23.Índice selectividad a partir de CI50 de FCHCl3 Av sobre línea celular normal 3T3 y línea celular MCF-7...... 142

Tabla 24.Contenido total de fenoles (CTF) para FEt2O Av, FAcOEt Av y RHEt Av...... 146

ÍNDICE DE FIGURAS

Página

Figura 1. Distribución mundial de la Familia Asteraceae ...... 7 Figura 2. Distribución género Conyza...... 9 Figura 3. Características morfológicas de la especie Conyza trihecatactis ...... 14 Figura 4. Distribución en Colombia de la especie Conyza trihecatactis...... 15 Figura 5. Distribución género Ageratina...... 17 Figura 6. Distribución en Colombia de la especie Ageratina vacciniaefolia...... 23 Figura 7. Las principales manifestaciones locales de la inflamación aguda comparadas con la normalidad...... 28 Figura 8. Eventos en la transformación neoplásica...... 32 Figura 9. Fases del ciclo celular ...... 34 Figura 10. Líneas celulares tumorales ...... 36 Figura 11.Reducción de MTT a formazán ...... 38 Figura 12. Mecanismos de reacción por THA y ET...... 41 Figura 13. Reacción del DPPH• con el antioxidante ...... 42 Figura 14.Esquema de la obtención de los extractos y fracciones para Conyza trihecatactis...... 47 Figura 15.Aislamiento y purificación de MCt1...... 48 Figura 16.Aislamiento y purificación de los compuestos Ct2, Ct3 y Ct4...... 49 Figura 17.Esquema de la obtención de los extractos y fracciones para Ageratina vacciniaefolia...... 50 Figura 18.Aislamiento y purificación de los compuesto Av1, Av2, Av3 y Av4...... 51 Figura 19.Aislamiento y purificación del compuesto Av5...... 52 Figura 20. Pletismómetro y medida del volumen normal de la pata derecha...... 53 Figura 21. Actividad antiinflamatoria: Edema en pata de rata inducido por λ- carragenina...... 55 Figura 22.Metodología para evaluación de la actividad antioxidante por el método del DPPH•...... 60

Figura 23.Metodología para la determinación de fenoles totales para extractos, fracciones de Conyza trihecatactis y Ageratina vacciniaefolia...... 62 Figura 24. Ensayo de letalidad sobre A. salina...... 63 1 Figura 25.Espectro de RMN H (300MHz, Acetona-d6) de Ct2...... 65 13 Figura 26.Espectro de RMN C (75MHz, Acetona-d6) de Ct2...... 66 Figura 27.Ampliación del espectro HSQC en RMN 1H δ 3.5 a 8.7 ppm y 13C δ 70 a 140 ppm para Ct2...... 67 Figura 28. Ampliación del espectro HMBC RMN 1H δ 3.8 a 8.10 ppm y 13C δ 90 a 200 ppm para Ct2...... 68 Figura 29.Correlaciones HMBC para Ct2...... 68 Figura 30.Cromatograma a 270nm del compuesto Ct2...... 69 Figura 31.Espectro de masas en modo negativo [M+H]+del compuesto Ct2...... 69 Figura 32. Espectro de masas en modo negativo [M-H]-del compuesto Ct2...... 70 Figura 33.Espectro ultravioleta del compuesto Ct2...... 70 1 Figura 34.Espectro de RMN H (300MHz, Acetona-d6) de Ct3...... 72 Figura 35.Ampliación del espectro HSQC en RMN 1H δ 6.0 a 8.3 ppm y 13C δ 80 a 140 ppm para Ct3...... 73 Figura 36.Ampliación del espectro HMBC RMN 1H δ 6.0 a 8.2 ppm y 13C δ 90 a 190 ppm para Ct3...... 74 Figura 37.Correlaciones HMBC para Ct3...... 74 Figura 38.Cromatograma a 270 nm del compuesto Ct3...... 75 Figura 39.Espectro de masas en modo positivo [M+H]+del compuesto Ct3...... 75 Figura 40.Espectro de masas en modo negativo [M-H]-del compuesto Ct3...... 75 Figura 41.Espectro ultravioleta del compuesto Ct3...... 76 1 Figura 42.Espectro de RMN H (300MHz, Acetona-d6) de Ct4...... 78 Figura 43.Ampliación del espectro HSQC en RMN 1H δ 6.1 a 7.6 ppm y 13C δ 80 a 125 ppm para Ct4...... 79 Figura 44.Ampliación del espectro HMBC RMN 1H δ 6.1 a 7.6 ppm y 13C δ 80 a 190 ppm para Ct4...... 80 Figura 45.Correlaciones HMBC para Ct4...... 80 Figura 46.Cronograma a 270 nm del compuesto Ct4...... 81

Figura 47.Espectro de masas en modo positivo [M+H]+del compuesto Ct4...... 81 Figura 48.Espectro de masas en modo negativo [M-H]-del compuesto Ct4...... 81 Figura49.Espectro ultravioleta del compuesto Ct4...... 82 Figura 50.Espectro de masas en modo ionización electrónica para la hispidulina...... 83 Figura 51. Ruta de fragmentación propuesta para la hispidulina...... 84 Figura 52.Espectro de masas en modo ionización electrónica para la apigenina. 84 Figura 53. Ruta de fragmentación propuesta para la apigenina...... 85 1 Figura 54.Espectro de RMN H (300MHz, DMSO-d6) de la MCt1...... 86 Figura 55. Asignación de algunas señales de los flavonoides presentes en MCt1...... 86 13 Figura 56. Espectro de RMN C (75MHz, DMSO-d6) de la MCt1...... 87 Figura 57.Ampliación del espectro HSQC en RMN 1H δ 6.5 a 8.7 ppm y 13C δ 70 a 135 ppm para MCt1...... 88 Figura 58. Ampliación del espectro HSQC en RMN 1H δ 3.0 a 7.0 ppm y 13C δ 50 a 120 ppm para el flavonoide 1...... 89 Figura 59. Ampliación del espectro HSQC en RMN 1H δ 5.4 a 7.0 ppm y 13C δ 80 a 120 ppm para el flavonoide 2...... 89 Figura 60.Ampliación del espectro HMBC RMN 1H δ 6.5 a 8.0 ppm y 13C δ 100 a 190 ppm para MCt1...... 90 Figura 61.Ampliación del espectro HMBC RMN 1H δ 3.6 a 7.0 ppm y 13C δ 90 a 190 ppm para el flavonoide 1 ...... 91 Figura 62.Ampliación del espectro HMBC RMN 1H δ 5.70 a 6.60 ppm y 13C δ 90 a 180 ppm para el flavonoide 2...... 92 Figura 63.Correlaciones HMBC para el flavonoide 1...... 92 Figura 64.Correlaciones HMBC para el flavonoide 2...... 93 Figura 65.Cromatograma a 270nm de MCt1...... 93 Figura 66.Espectro de masas en modo positivo [M+H]+del flavonoide 2...... 94 Figura 67.Espectro de masas en modo negativo [M-H]-del flavonoide 2...... 94 Figura 68.Espectro ultravioleta del flavonoide 2...... 94 Figura 69.Espectro de masas en modo positivo [M+H]+del flavonoide 1 ...... 95

Figura 70.Espectro de masas en modo negativo [M-H]- del flavonoide 1...... 95 Figura 71.Espectro ultravioleta del flavonoide 1...... 95 Figura 72.Efecto antiinflamatorio de fracciones y compuestos obtenidos de Conyza trihecatactissobre el edema inducido en pata de rata con - carragenina...... 97 Figura 73.Capacidad inhibitoria de la inflamación de compuestos y fracciones obtenidos a partir de Conyza trihecatactis ...... 98 Figura 74.Efecto neto antiinflamatorio de fracciones y compuestos obtenidos de Conyza trihecatactis, calculado como el área bajo la curva...... 99 Figura 75.Comparación de los cortes histológicos entre: a. Tejido normal. b. Control negativo. c. control positivo...... 101 Figura 76.Comparación de los cortes histológicos entre: a. Tejido normal. b.

Control negativo. c. Control positivo. d. FCH2Cl2 Ct...... 102 Figura 77.Comparación de los cortes histológicos entre: a. Tejido normal. B.

Control negativo. c. Control positivo. d. FEt2O Ct...... 103 Figura 78.Comparación de los cortes histológicos entre: a. Tejido normal. b. Control negativo. c. Control positivo. d. FAcOEt Ct...... 104 Figura 79.Comparación de los cortes histológicos entre: a. Tejido normal. b. Control negativo. c. Control positivo. d. RHet Ct...... 104 Figura 80. Comparación de los cortes histológicos entre: a. Tejido normal. b. Control negativo. c. Control positivo. d. MCt1...... 105 Figura 81.Evaluación citotóxica del extracto y fracciones de Conyza trihecatactis frente a la línea celular 4T1...... 107 Figura 82.Evaluación citotóxica del extracto y fracciones de Conyza trihecatactis frente a la línea celular TSA...... 108 Figura 83. Evaluación citotóxica del extracto y fracciones de Conyza trihecatactis frente a la línea celular MCF-7...... 109

Figura 84.Cambios morfológicos de FCH2Cl2 Ct y MCt1 sobre células 4T1...... 112

Figura 85.Cambios morfológicos de FCH2Cl2 Ct y MCt1 sobre células TSA ...... 113

Figura 86.Cambios morfológicos de FCH2Cl2 Ct y MCt1 sobre células MCF-7. . 113

Figura 87.Capacidad antioxidante del extracto y fracciones de la especie Conyza trihecatactis ...... 114 Figura 88.Curva de calibración del ácido gálico para la determinación de fenoles totales...... 116 Figura 89.Nauplio de Artemia salina ...... 117 Figura 90. Cromatograma de HPLC de los principales compuestos presentes en

FCHCl3 Av...... 119 Figura 91. Cromatograma de HPLC de Av1 y Av3...... 120 Figura 92.Cromatograma de HPLC para Av2 y Av4...... 121 1 Figura 93.Espectro de RMN H (300MHz, Acetona-d6) de Av5...... 123 13 Figura 94.Espectro de RMN C (75MHz, Acetona- d6) de la Av5...... 124 Figura 95.Ampliación del espectro HSQC en RMN 1H δ 6.0 a 7.8 ppm y 13C δ 90 a 125 ppm para Av5...... 125 Figura 96.Ampliación del espectro HMBC RMN 1H δ 6.0 a 7.7 ppm y 13C δ 80 a 190ppm para Av5...... 126 Figura 97.Ampliación del espectro HMBC RMN 1H δ 7.50 a 7.9 ppm y 13C δ 100 a 180 ppm para Av5...... 126 Figura 98.Correlaciones HMBC para Av5...... 127 Figura 99.Ampliación del espectro HMBC RMN 1H δ 8.4 a 9.0 ppm y 13C δ 80 a 180ppm para Av5...... 128 Figura 100.Correlaciones HMBC para grupos OH de Av5...... 128 Figura 101. Cromatograma a 270 nm del compuesto Av5...... 129 Figura 102.Espectro de masas en modo positivo [M+H]+del compuesto Av5. ... 129 Figura 103.Espectro de masas en modo negativo [M-H]-del compuesto Av5. ... 129 Figura 104.Espectro ultravioleta del compuesto Av5...... 130 Figura 105.Efecto antiinflamatorio del extracto y fracciones obtenidos de Ageratina vacciniaefolia sobre el edema inducido en pata de rata con -carragenina. 132 Figura 106.Capacidad inhibitoria de la inflamación de compuestos y fracciones obtenidos a partir de Ageratina vacciniaefolia...... 133 Figura 107. Efecto neto antiinflamatorio del extracto y fracciones obtenidos de Ageratina vacciniaefolia, calculado como el área bajo la curva...... 133

Figura 108.Comparación de los cortes histológicos entre: a. Tejido normal. b. Control negativo. c. control positivo...... 135 Figura 109.Comparación de los cortes histológicos entre: a. Tejido normal. b.

Control negativo. c. Control positivo. d. FCHCl3 Av...... 135 Figura 110.Comparación de los cortes histológicos entre: a. Tejido normal. b.

Control negativo. c. Control positivo. d. FEt2O Av...... 136 Figura 111.Comparación de los cortes histológicos entre: a. Tejido normal. b. Control negativo. c. Control positivo d. FAcOEt Av...... 137 Figura 112.Comparación de los cortes histológicos entre: a. Tejido normal. b. Control negativo. c. Control positivo. d. RHet Av...... 137 Figura 113.Comparación de los cortes histológicos entre: a. Tejido normal. b. Control negativo. c. Control positivo. d. ExEtOH Av...... 138 Figura 114.Evaluación citotóxica del extracto y fracciones de Ageratina vacciniaefolia frente a la línea celular 4T1...... 139 Figura 115.Evaluación citotóxica del extracto y fracciones de Ageratina vacciniaefolia frente a la línea celular TSA ...... 140 Figura 116.Evaluación citotóxica del extracto y fracciones de Ageratina vacciniaefolia frente a la línea celular MCF-7...... 141

Figura 117.Cambios morfológicos de FCHCl3 Av sobre células 4T1 ...... 142

Figura 118.Cambios morfológicos de FCHCl3 Av sobre células TSA...... 143

Figura 119.Cambios morfológicos de FCHCl3 Av sobre células MCF-7...... 144 Figura 120.Capacidad antioxidante del extracto y fracciones de la especie Ageratina vacciniaefolia...... 145

LISTA DE ABREVIATURAS

AcOEt Acetato de etilo BHT Butilhidroxitolueno CC Cromatografía en Columna CCF Cromatografía en Capa Fina CF Cromatografía en Columna Flash

CH2Cl2 Diclorometano

CHCl3 Cloroformo

CI50 Concentración Inhibitoria 50

CL50 Concentración Letal 50 CLV Cromatografía Líquida el Vacío COSY COrrelated SpectroscopY CTF Contenido Total de Fenoles d Doblete dd Doble doblete DMSO Dimetilsulfóxido EDP Éter de petróleo ERO Especies Reactivas de Oxigeno EtOH Etanol eV Electrón voltios HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HPLC-MS Cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas Cromatografía líquida de longitud de onda variable HPLC-VWM (semiprep) (semipreparativa) HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence Hz Hertz IS Ìndice de Selectividad J Constante de acoplamiento J-MOD J-modulated spin-echo m/z Relación masa carga MeOH Metanol

MS Espectrometría de Masas NaOH Hidróxido de sodio NP/PEG Natural Producs-Polyethylene Glycol Reagent RMN Resonancia Magnética Nuclear RMN 13C Resonancia Magnética Nuclear de Carbono 13 RMN 1H Resonancia Magnética Nuclear de Hidrogeno s Singlete TIC Corriente iónica total Tr Tiempo de retención σ Desplazamiento químico

RESUMEN

Este trabajo se desarrolló teniendo en cuenta dos aspectos fundamentales: químico y biológico. El aspecto químico involucró procesos de extracción, fraccionamiento, aislamiento y purificación de los metabolitos secundarios presentes en las partes aéreas de las especies vegetales estudiadas; y en el aspecto biológico, los extractos etanólicos completos y las fracciones obtenidas se les evaluó la actividad antiinflamatoria (método de inducción de inflamación con -carragenina), la actividad citotóxica (método del MTT), la capacidad antioxidante (método del DPPH) con cuantificación de fenoles (método Folin-Ciocaulteu) y la toxicidad aguda en Artemia salina.

Para la especie vegetal Conyza trihecatactis, la separación de las fracciones de diclorometano (FCH2Cl2 Ct) y acetato de etilo (FAcOEt Ct) se realizó por técnicas cromatográficas como cromatografía columna (CC), en capa fina (CCF) y preparativa (CCFP), permitiendo el aislamiento de tres compuestos tipo flavonoide entre ellos: 5,7,4´ trihidroxiflavona (apigenina), 5,7,3´,4´ tetrahidroxiflavona (luteolina) y 3-metoxi-5,7,4´trihidroxiflavona y una mezcla que contiene apigenina e hispidulina. La determinación estructural de los compuestos aislados se llevó a cabo mediante técnicas espectroscópicas de MS, RMN (experimentos 1H, 13C, J-MOD, HSQC y HMBC), HPLC-DAD-MS y por comparación con los datos reportados en la literatura. La evaluación de la actividad antiinflamatoria mostró que la fracción

FCH2Cl2 Ct a 300 mg/Kg, presentó un porcentaje de inhibición del 55,86% a la primera hora y se mantuvo hasta la 7ª hora, mostrando en estos tiempos diferencias estadísticamente significativas (p=0,0002) con respecto al control negativo. La evaluación de la actividad citotóxica por el método del MTT sobre las líneas celulares tumorales 4T1 (línea celular de tumor mamario de ratón), TSA (adenocarcinoma mamario de ratón) y MCF-7 (adenocarcinoma mamario de humano), evidenció que FCH2Cl2 Ct presentó la mayor actividad con una CI50 de 36,23 µg/mL para 4T1, 47,81 µg/mL para TSA y 46,05 µg/mL para MCF-7, esta

fracción fue probada en células normales 3T3 con una CI50 de 70,67 µg/mL. Los resultados obtenidos de la evaluación de la capacidad antioxidante mostraron que

FAcOEt Ct y la fracción éter etílico (FEt2O Ct) presentaron valores de CI50 de 25,83 µg/mL y 33,01 µg/mL respectivamente; adicionalmente, se les realizó una cuantificación de fenoles por el método de Folin-Ciocaulteu (FC). El ensayo de toxicidad aguda en Artemia salina permitió clasificar a FCH2Cl2Ct como moderadamente tóxica (CL50: 147,5 µg/mL), tomando como referencia los criterios de Clarkson (moderadamente tóxicos los extractos con CL50 entre 500-100 µg/mL) (Hamidi, Jovanova, y Panovska, 2014).

Para la especie vegetal Ageratina vacciniaefolia la separación de las fracciones de cloroformo (FCHCl3Av) y acetato de etilo (FAcOEt Av) por técnicas cromatográficas como cromatografía columna (CC), en capa delgada (CCF) y preparativa (CCFP), permitieron el aislamiento de un compuesto tipo flavonoide: 5,7,3´,4´ tetrahidroxiflavona (luteolina) y la identificación de compuestos de tipo diterpeno anteriormente reportados por Hernández (2013) y Pedrozo (2001). La elucidación estructural se realizó mediante técnicas espectroscópicas de RMN (experimentos 1H, 13C, COSY, J-MOD, HSQC y HMBC), HPLC-DAD-MS y realizando una comparación con los datos reportados en la literatura. La evaluación de la actividad antiinflamatoria mostró que la fracción FCHCl3 Av a 300 mg/Kg, presentó un porcentaje de inhibición del 59,84% a la primera hora y se mantuvo hasta la 7ª hora (p < 0,0001). Los resultados de la evaluación de la actividad citotóxica sobre las líneas de células tumorales 4T1, TSA y MCF-7, determinaron que la fracción

FCHCl3 Av fue la más activa con CI50 de 182,1 µg/mL para 4T1, 178,4 µg/mL para TSA y 168,1 µg/mL para MCF-7, esta fracción fue probada en células normales 3T3 con una CI50 de 188.6 µg/mL. Los ensayos relacionados con la evaluación de la capacidad antioxidante mostraron que el extracto etanólico (ExEtOH Av) y FCHCl3

Av presentaron un bajo potencial con valores de CI50 de 125,8 y 109,2 µg/mL respectivamente, FEt2O Av presento un moderado potencias con valores de CI50 de 45,56 µg/mL; mientras que FAcOEt Av y el residuo hidroalcohólico (RHEt Av) presentaron un alto potencial antioxidante comparado con el BHT

(Butilhidroxitolueno) con valores de CI50 de 26,04 y 20,39 µg/mL respectivamente; igualmente, a éstas fracciones se les realizó una cuantificación de fenoles por el método de FC. El ensayo de toxicidad aguda en Artemia salina permitió clasificar a

FCHCl3 Av como moderadamente tóxica (CL50: 148,8 µg/mL), tomando como referencia los criterios de Clarkson (moderadamente tóxicos los extractos con Cl50 entre 500-100 µg/mL)(Hamidi et al., 2014).

INTRODUCCIÓN

Las plantas son la segunda fuente de biodiversidad, existen entre 300.000 y 500.000 especies. En los trópicos se encuentran aproximadamente 155.000 especies de plantas superiores y 120.000 de ellas en bosques húmedos tropicales; son grandes fábricas de compuestos, eficientes, sostenibles y no contaminantes, por ello hay gran interés por parte de la comunidad científica en el estudio de su composición(Prada, 2015).

La familia Asteraceae es la más amplia de las fanerógamas, cuenta con 23.000 especies aproximadamente y con más de 1500 géneros que se encuentran distribuidos por todo el mundo, menos en la Antártida. Esta familia es reconocida por el hombre al poseer plantas alimenticias y/o medicinales (Cabrera et al. , 2000).

En Colombia, la familia Asteraceae se encuentra en todos los climas; sus especies muestran una gran variedad estructural y un notable ajuste ecológico, esto permite encontrarlas en diferentes lugares como en desiertos, manglares, cordilleras, sabanas, en la selva amazónica e incluso en los páramos (Prada, 2015)

Dentro de esta gran familia, se encuentran las especies Conyza trihecatactis y Ageratina vacciniaefolia, plantas endémicas que pertenecen a los páramos colombianos, han sido utilizadas como febrífugas, emenagogas, son aromáticas y diaforéticas; las raíces antisifilíticas y carminativas, se utilizan para corregir las afecciones intestinales, en el tratamiento del reumatismo y desordenes gastrointestinales (Hernández, 2013).

Para el desarrollo del presente trabajo se planteó como objetivo general contribuir al estudio fitoquímico de las especies Conyza trihecatactis y Ageratina vacciniaefolia, realizando el screening de la actividad biológica de extractos y fracciones obtenidas con solventes de baja, media y alta polaridad. Los resultados finalmente aportarán información importante de estas especies.

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Contribuir al estudio fitoquímico de las especies Conyza trihecatactis y Ageratina vacciniaefolia, y realizar el screening de la actividad biológica de extractos y fracciones obtenidas con solventes de baja, media y alta polaridad.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Obtener extractos y fracciones de diferentes polaridades de las partes aéreas de las especies Conyza trihecatactis y Ageratina vacciniaefolia.

Aislar, purificar y determinar la estructura química de los metabolitos secundarios mayoritarios presentes en los extractos o fracciones de las especies Conyza trihecatactis y Ageratina vacciniaefolia.

Evaluar la actividad antiinflamatoria, citotóxica, y capacidad antioxidante de los extractos y fracciones obtenidos de las especies Conyza trihecatactis y Ageratina vacciniaefolia.

Evaluar la toxicidad aguda de las fracciones que presentaron mejor actividad biológica de las especies Conyza trihecatactis y Ageratina vacciniaefolia.

1. ESTADO DEL ARTE

1.1 FAMILIA ASTERACEAE

La Familia de plantas Asteraceae Bercht. y J. Presl (1820) corresponde al Orden Asterales, Suborden Asteridae, estas tienen un valor económico para el ser humano, aunque a ella pertenecen una cantidad significativa de especies útiles desde diferentes puntos de vista. Para un gran número de pueblos en el mundo han sido de ayuda para su sustento y progreso, satisfaciendo necesidades alimenticias y medicinales (Del Vitto y Petenatti, 2009).

1.1.1 Características generales de la familia Asteraceae

Los miembros de esta familia son organismos avanzados en las seis características consideradas. El rasgo más característico de este grupo es la disposición de sus flores en cabezuelas, cada una de las cuales está rodeada por brácteas que tienen forma más o menos semejante a la de los sépalos. Con frecuencia las flores son bisexuales, y los estambres o los pistilos pueden estar ausentes o bien las flores del radio o bien en las del disco. Las cabezuelas de ciertos géneros sólo incluyen flores de disco, mientras que otras sólo poseen flores del radio. En contadas ocasiones se encuentran los sexos en cabezuelas diferentes o incluso en plantas separadas. Tienen varios rasgos especiales. El vilano, por ejemplo, actúa como paracaídas del fruto del diente de león, y se ha interpretado como un conjunto de sépalos modificados (Jensen y Salisbury, 1988).

Entre los géneros más importantes de la familia Asteraceae se encuentra el Senecio (1.250), Vermonia (1.000), Cousinia (650), Eupatorium (600), Centaurea (600), Artemisia (550), Baccharis (500) (Prada, 2015).

En el departamento de Cundinamarca se encuentran especies de los géneros Ageratina, Ageratum, Ambrosia, Artemisa, Aspilia, Baccharis, Barnadesia, Bidens, Calea, Chaptalia, Chromolaena, Clibadium, Conyza, Critoniopsis, Dahlia,

Diplostephium, Elephantopus, Emilia, Erato, Espeletia, Eupatorium, Galisonga, Gamochaeta, Gynoxys, Hypochaeris, Jungia Liabum, Llerasia, Loricaria, Lycoseris, Mikania, Montanoa, Munnozia, Mutisia, Onoseris, Oritrophium, Pentacalia, Piptocoma, Senecio, Smallanthus, Sonchus, Spilanthes, Stevia, Taraxacum, Tessaria, Verbesina, Werneria, entre otros (Mahecha, Ovalle, Camelo, Rozo, y Barrero, 2012) .

1.1.2 Distribución de la familia Asteraceae

La familia se distribuye en todo el mundo a excepción de la Antártida, pero es especialmente diversa en las regiones tropicales y subtropicales de América del Norte, los Andes, el este de Brasil, el sur de África, la región del Mediterráneo, Asia central y el suroeste de China (Figura 1) (Sánchez, 2012).

Figura 1. Distribución mundial de la Familia Asteraceae Fuente: http://www.gbif.org/species/3065

1.1.3 Quimiotaxonomía de la familia Asteraceae

El conocimiento con respecto a su composición química ha aportado datos relevantes a la taxonomía y ha explicado o facilitado el empleo de las mismas en las actividades económicas.

En general, el grupo está caracterizado por la presencia de ácidos iso- y clorogénico, isoflavonoides, lactonas sesquiterpénicas, alcoholes triterpénicos pentacíclicos, aceites esenciales (con predominio de terpenoides), alcaloides (especialmente pirrolizidínicos) y diversos derivados acetilénicos, mientras que carece de taninos verdaderos y de iridoides. La acumulación de ciertos metabolitos primarios y secundarios determina la utilidad o aplicación de las plantas. La síntesis de glúcidos en último término conduce a la formación de fructanos del tipo inulina acumulados en órganos subterráneos y semillas; son la principal reserva hidrocarbonada, de gran digestibilidad y reemplazan el almidón. La síntesis de ciclitoles también caracteriza a las Asteráceas, especialmente L-inositol y su isómero esciloinositol (Del Vitto y Petenatti, 2009).

1.2 Género Conyza

El género Conyza, comprende 50 especies, que crecen principalmente en áreas tropicales (Rios, Aristegui, Frondoy, y Gómez, 2012). Muchas especies tienen investigación en fitoquímica, identificando el contenido de compuestos acetilénicos, sesquiterpenos y diterpenos como componentes característicos. También han sido encontrados lactonas acetogeninas, flavonas y cumarinas. Conyza es un género que se relaciona estrechamente con el género Erigeron con una serie de especies intermedias que dificulta su separación. Durante mucho tiempo se consideraron Erigeron todas las especies con flores femeninas más o menos liguladas. El género Conyza comprendía solo plantas con corolas femeninas filiformes desprovistas de lígula (Ramirez, 1987).

1.2.1 Distribución del género Conyza

Las especies pertenecientes a este género representan uno de los principales ejemplos de invasiones intercontinentales desde América hacia Europa (Rios et al., 2012) (Figura 2).

Figura 2.Distribución género Conyza. Fuente: http://www.gbif.org/species/5397989

1.2.2 Usos etnobotánicos del género Conyza

En la medicina tradicional Conyza sumatrensis es utilizada para tratar la fiebre causada por la malaria en Camerún (Kamdem Boniface y Pal, 2013). En Chile Conyza bonariensis L. es empleada para curar diversas enfermedades de la piel, en especial la Pitiriasis versicolor, comúnmente conocida como “paño blanco” (Santana et al. , 2011). La especie Conyza canadensisen Pakistán es utilizada tradicionalmente como astringente, estimulante, hemostático, diurético, para el tratamiento de la diarrea , disentería, edemas, cistitis, cálculos, catarro bronquial y hemoptisis (Shakirullah y Ahmad, 2011).

1.2.3 Actividad biológica de especies del género Conyza

A varias de las especies pertenecientes a este género, se les suele atribuir actividad antibacteriana, antiinflamatoria, antitusiva, antiúlcera y espasmolítica (El-Sayed, Hussin, Mahmoud, y Alfredan, 2013).

En el estudio realizado por El-Sayed y colaboradores en los extractos de metanol:agua, cloruro de metileno y cloruro de metileno:metanol de Conyza triloba,

presentaron una importante capacidad antioxidante por el método del DPPH, comparable con el α-tocoferol y una notable disminución del crecimiento de las líneas celulares HepalC1C7 (línea hepática murina), H4IIEI (línea hepática de rata), A549 (carcinoma de pulmón humano), HT29 (adenocarcinoma de colón humano) y PC3 (adenocarcinoma de próstata humano) (El-Sayed et al. , 2013).

Un estudio realizado con el extracto etanólico de Conyza sumatrensis a una dosis de 1000 mg/Kg mostró una moderada actividad antimalárica. Esta planta ha reportado actividad antimicrobiana, analgésica y antiinflamatoria (Kamdem Boniface y Pal, 2013).

1.2.4 Estudios fitoquímicos del género Conyza

Se han realizado diferentes estudios sobre especies pertenecientes al género Conyza con el fin de identificar los metabolitos secundarios presentes y determinar su potencial biológico. De la mayoría de las especies se han aislado algunos metabolitos, entre los que sobresalen de tipo terpeno y flavonoide.

De la raíz de Conyza sumatrensis se aislaron seis triterpenos y 5 esteroles incluidos: α-amirina (1) , β-amirina (2) , taraxerol (3), glutinol (4), friedilina (5), simiarenol (6), estigmasterol (7) , sitosterol (8), espinasterol (9), y de las partes aéreas sesquiterpenos, diterpenos, triterpenos, compuestos poliacétidos, y derivados de la γ-pirona (Chai et al. , 2008).

En un estudio realizado a las partes aéreas de Conyza canadensis se aislaron y reportaron por primera vez dos compuestos: conyzolide (10) y conyzoflavona (11) (Shakirullah y Ahmad, 2011).

A partir de las partes aéreas de Conyza sumatrensis se aislaron e identificaron 11 compuestos, se reportaron por primera vez para la especie dos flavonoides: luteolina (12) y apigenina (13), siete flavonoides glicosilados entre ellos la scutellarina (14), un derivado de pirona glicosilado (ácido piromeconico-3-O-(6´-

O-[4-hidroxibenzoil]- β-D-glucopiranosido) (15), y un ácido siríngico glicosilado (ácido siríngico β-D-glucopiranosil ester) (16) (Chai et al. , 2008).

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1.3 Especie Conyza trihecatactis 1.3.1 Características morfológicas de la especie Conyza trihecatactis

En Colombia es conocida con el nombre de “venadillo”; la descripción taxonómica de la especie vegetal se presenta en la Tabla 1.

Tabla 1.Clasificación taxonómica de Conyza trihecatactis

Reino Plantae Phylum Magnoliophyta Clase Magnoliopsida Orden Asterales Familia Asteraceae Género Conyza Epíteto Específico trihecatactis Fuente: (http: //biovitual.unal.edu.co, s.f.).

Esta especie se caracteriza por ser una hierba sufruticosa generalmente en la base, parcamente hirsútula o glabra, raramente hirsuta, con ramas erectas terminadas por una panícula corimbosa modesta, generalmente densa. Capítulos 5-7 mm alto x 10- 14 mm diam. Ramas hasta 40-60 (<100) cm, arqueadas en la base o ± prostradas y radicantes, luego erectas, violáceas o verdosas, estriadas, rígidas, hírsutas con pelos ascendentes o pátulos, o glabras, copiosamente foliosas, solo ramificadas en el extremo florífero. Hojas sésiles, linear-lanceoladas, oblongas o lineares, súbitamente angostadas en el ápice, subagudas, mucronuladas, angostadas hacia la base, subamplectentes, margen con 3-4 dientes ascendentes, a veces íntegra, nervio medial conspicuo, los secundarios poco visibles; hírtulas con pelos agudos, subpátulos, copiosos o escasos; 2-9 x 0.15-1.2 cm, hacia arriba gradualmente menores, más lanceoladas y más anchas en la base, convirtiéndose gradualmente en brácteas. Panículas 2-7 cm diám, con 5-40 capítulos, foliosas en la base, con ramas ascendentes, ± hírtulas o hispídas, raramente glabras; brácteas lineares o linear, lanceioladas, agudas, semiamplectentes, hírtulas. Pedícelos ± 5 mm, hírtulos, engrosados en el extremo. Capítulos semigloboso-campanulados 5-7mm altos, 4-5 mm diám (aplanados 10-14 mm). Involucro 4.5-6 mm, generalmente violáceo; filarias triseriadas, linearlanceoladas, agudas, margen escarioso, raramente glabro, las interiores (4-)5-6 x 0.8-1.2 mm, las externas 3-4.5 x 0.6-0.8

mm. Flores ♀ 50-140, (excep. 244); corola 3.2-4.2 mm, tubo capilar 2.5 – 3.2 mm, glabro o con escasos pelos, lígula blanquecina o lilácea, oblongo-elíptica, íntegra o 2-3 dentadas, 0.5-1 mm larga, sobrepasando poco el estilo. Flores hermafroditas 6- 30; corola amarillenta 3.4-4.2 mm, algo pilósula en la parte media, túbulo 1.5-2 mm, limbo tubuloso, dientes 0.5-0.7 mm, triangular-oblongos. Ovarios comprimidos, marginados, con pelos esparcidos. Aquenios oblongoelipticos con ápice truncado y base cuneada, comprimidos, costado-marginados con pelos esparcidos o muy escasos. Receptáculo plano, alveolado, desnudo (Cuatrecasas, 1969)(Figura 3).

Figura 3. Características morfológicas de la especie Conyza trihecatactis a. hábito; b. capítulo; c. flor masculina; d. estilo de flor masculina; e. flor hermafrodita; f. estilo de flor hermafrodita; g. filaria; h. pelo de vilano ampliado; i. antera. Tomado de Cuatrecasas, 1969 (Ramirez, 1987)

1.3.2 Distribución de la especie Conyza trihecatactis

Conyza trihecatactis tan sólo es conocida en Colombia. Su centro de distribución lo constituye la Sabana de Bogotá con los cerros que la circundan, de donde se extiende a Boyacá y los Santanderes. Existe una colección proveniente de la Cordillera Central en el Departamento del Cauca (Cuatrecasas, 1969) (Figura 4).

Figura 4.Distribución en Colombia de la especie Conyza trihecatactis. Fuente: http://data.sibcolombia.net/species/189350

1.3.3 Usos etnobotánicos de la especie Conyza trihecatactis

Es utilizada en medicina tradicional para el tratamiento de reumatismo y en la cura de desórdenes gastrointestinales. También se reporta que el contacto con las hojas causa dermatitis (Torrenegra, Robles, Waibel, Lowel, y Achenbach, 1994).

1.3.4 Actividad biológica de la especie Conyza trihecatactis

En un estudio se probó que los extractos etéreos y etanólicos de la planta Conyza trihecatactis producen dermatitis por contacto por medio de la Prueba del parche, en este mismo estudio estos extractos no presentaron actividad antimicrobiana sobre las bacterias Staphylococcus aureus y Pseudomona sp. (Ramirez, 1987).

Se evaluó la actividad antiinflamatoria en edema de pata de rata inducido por lambda-carragenina, de la fracción de acetato de etilo obtenida del extracto en éter de petróleo a una dosis de 300 mg/Kg presentando porcentajes de inhibición a la 5 y 7 hora de experimentación con valores de 29,96% y 25,91% respectivamente. El estudio histopatológico confirma que esta es la fracción que mejor previene daños en el tejido como el aumento en la permeabilidad vascular, vasodilatación; a esta misma fracción se le evaluó la actividad citotóxica frente a la línea celular tumoral OCI-AML3 (leucemia mieloide aguda) comparada con el control positivo (Hernández, 2013).

1.3.5 Estudios fitoquímicos de la Conyza trihecatactis

La especie Conyza trihecatactis cuenta con muy pocos estudios fitoquímicos, los únicos reportados han sido de las partes aéreas donde fueron aislados diterpenos de tipo labdano como: ent-esclareol (17),ent-3β-hidroximanool (18), ent-manool- 13-O-β-D-xilopiranosa (19) y el ent-esclareol-13-O- β-D-xilopiranosa (20) (Hernández, 2013; Torrenegra et al. , 1994).

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1.4 Género Ageratina

El género Ageratina posee una gran variedad de especies, con un número aproximado de 290 especies. Fue nombrado en 1841 por Spach, debido a la semejanza de estas especies con el género Ageratum, aunque de acuerdo con investigaciones previas y posteriores, no se ha corroborado que exista una relación entre los géneros Ageratina y Ageratum. Anteriormente muchas especies del género Ageratina formaban parte del género Eupatorium, en 1970 Robert King y Harold Robinson con ayuda y apoyo de la información detallada de la anatomía florar, establecieron con precisión el género Ageratina, siendo este hecho la pauta para separarla del género Eupatorium (Porras, 2011).

1.4.1 Distribución del género Ageratina

Las especies pertenecientes a este género. Se encuentra en México, Centroamérica, y Andes de Suramérica con una poca extensión en el oriente de los Estados Unidos, el occidente de la India y Brasil (Pedrozo, 2001)(Figura 5).

Figura 5.Distribución género Ageratina. Fuente: http://www.gbif.org/species/5400194

1.4.2 Usos etnobotánicos del género Ageratina

Las especies del género Ageratina han sido empleadas como emolientes, galactagogos, tratamiento de heridas y cortaduras leves, coagulantes y antiinfecciosas. Muchas con acción tóxica y febrífuga, emenagogas, algunas son aromáticas, diaforéticas. Las raíces con efecto antisifilítico, carminativo y afecciones intestinales (Pedrozo, 2001).

En medicina tradicional Ageratina adenophora es utilizada en México como antiséptica, coagulante sanguíneo, analgésico, astringente, termogénico, estimulante, inductor del sueño (Samuel, Lalrotluanga, Muthukumaran, Gurusubramanian, y Senthilkumar, 2014).

En México Ageratina pichinchensis es empleada para el tratamiento de heridas de la piel, en pacientes con ulceras venosas crónicas (Romero, Zamilpa, Díaz, y Tortoriello, 2014), con micosis superficial (dermatofitosis) y para el tratamiento del dolor y ulceras gástricas (Sánchez et al. , 2013).

1.4.3 Actividad biológica del género Ageratina

Los reportes señalan que la especies Ageratina adenophorapresenta actividad antioxidante, antimicrobiana, antiséptica, potenciador de fenobarbital, antifúngica (Xu et al. , 2014). Un estudio realizado con el extracto metanólico de las hojas de A. adenophora, tiene una acción larvicida frente a Culex quinquefasciatus, disminuyendo los valores de concentracióninhibitoria 50 (CI50) y concentración letal

50 (CL50) gradualmente con los periodos de exposición (Samuel et al. , 2014) y otro en el cual se evaluó la hepatoxicidad en ratas del extracto metanólico de las hojas, mostrando en la histopatología conductos biliares dilatados, con cambios proliferativos y necrosis hepatocitaria periductal (Kaushal, Dawra, Sharma, y Kurade, 2001).

Por otra parte en un ensayo clínico (doble ciego) realizado a 103 personas, se comparó la eficacia terapéutica y la tolerabilidad de dos concentraciones del extracto estandarizado de Ageratina pichinchensis (12,6 y 16,8%) en pacientes con diagnóstico clínico de onicomicosis leve y moderada, concluyeron que las dos concentraciones poseen altas tasas de eficacia pero la formulación con la concentración a 16,8% posee una mayor efectividad (Romero et al. , 2009). En otro estudio el extracto acuoso y de hexano-acetato de etilo de las partes aéreas mostró una mejora en la herida inducida en ratas con estreptozotocina (inducción de diabetes); concluyendo que los extractos promueven la regeneración de tejido sin exhibir genotoxicidad (Romero et al. , 2014).

1.4.4 Estudios fitoquímicos del género Ageratina

Las especies pertenecientes al género Ageratina se caracterizan por poseer gran variedad de metabolitos secundarios de importancia o aplicación farmacológica, industrial o biotecnológica. Presentan gran variedad de metabolitos secundarios como: benzofuranos, monoterpenos (derivados del timol), diterpenos del tipo kaurano, sesquiterpenos que se encuentran como compuestos acíclicos, lactonas, ésteres del ácido angélico, así como crómenos y flavonoides (Porras, 2011).

En un estudio a partir del extracto con hexano de las hojas de Ageratina pichinchensis se aislaron e identificaron dos compuestos: 3,5-diprenil-4- hidroxiacetofenona (1) y encecanescina (2) (M. E. Sánchez et al. , 2013). De las partes aéreas de Ageratina adenophora se aislaron e identificaron dos nuevos monoterpenos de tipo careno: ácido (1α, 6α, 7α)-8-hidroxi-2-careno-10-oico (3), (1α, 6α)-10-hidroxi-3-careno-2-ona (4) y un monoterpeno conocido como ácido (- )-isochominico (5) (Xu et al. , 2014).

Del extracto etanólico de las hojas de Ageratina arbutifolia se aislaron cinco compuestos correspondientes a: ácido (-) kaur-16-en-19-oico (6), ácido 2-hidroxi- 6-metoxibenzoico (7), la 5-hidroxi-6-metoxi cumarina (8), quercetagetina-6-

metoxy-3-O- β-galactósido (9) y quercetina-3-O-β-galactósido (10) (Espitia y Coconubo, 1989; Espitia y Villegas, 1995). De los extractos lipofílicos tanto de hojas como de flores de la Ageratina fastigata se aislaron e identificaron dos derivados de tipo kaurano: el ent-kauran-16 β-ol (11), el ent-kauran-16,20-diol (12) y dos flavonas metoxiladas: la 5,hidroxi-7,4-dimetoxiflavona (13) y la 5-hidroxi-3,7,4´- trimetoxiflavona (14) (Torrenegra, Robles, y Pedrozo, 1995).

Dos estudios realizados de las partes aéreas de Ageratina glyptophlebia se aislaron cuatro metabolitos de tipo flavona: 5,4´-dihidroxi-6,5-dimetoxi-3-O-glicosilflavona (15) (Higuera y Espitia, 1989), 5,7,3´,4´-tetrahidroxi-6-metoxiflavona (16), 5,7,4´-trihidroxi-6,3´-dimetoxiflavona (17) y la 5,7,4´-trihidroxi-6-metoxiflavona (18) (Espitia y Salgado, 1990).

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1.5 Especie Ageratina vacciniaefolia

1.5.1 Características morfológicas de la especie Ageratina vacciniaefolia

La descripción taxonómica de la especie vegetal se presenta en la Tabla 2:

Tabla 2.Clasificación taxonómica de Ageratina vacciniaefolia. Reino Plantae Phylum Magnoliophyta Clase Magnoliopsida Orden Asterales Familia Asteraceae Género Ageratina Epíteto Específico vacciniaefolia Fuente: http: //biovitual.unal.edu.co, s.f.).

Se caracteriza por ser un arbusto ramificado de 1 m de altura, con ramas cilíndricas. Posee hojas compuestas, ovales, con peciolos cortos y base redondeada. Sus inflorescencias se presentan en corimbos terminales, con capítulos oblongos con 5 a 6 flores, escamas del involucro entre 12 y 15, de folíolos imbrincados, con cabezuelas moradas de olor agradable, corola tubulosa, glabra; ovario cuneado linear, estilo glabro y estigma bipartido. Se caracteriza por presentar vilano piloso y aquenios inmaduros (Pedrozo, 2001).

1.5.2 Distribución de la especie Ageratina vacciniaefolia

Crece en la cordillera de los Andes, especialmente en los alrededores de la Sabana de Bogotá (Pedrozo, 2001) (Figura 6).

Figura 6.Distribución en Colombia de la especie Ageratina vacciniaefolia. Fuente: http://data.sibcolombia.net/species/35999 1.5.3 Actividad biológica de la especie Ageratina vacciniaefolia

A nivel de estudios de actividad biológica, se ha evaluado la actividad antimicrobiana de los extractos de diclorometano y etanol de las hojas y flores presentando actividad frente a Bacillus subtilis. La fracción de diclorometano del extracto etanólico y éter de petróleo tienen actividad fungistática contra el Fusarium oxysporum y Trichophyton mentagrophytes con unas CI50 de 2,5 y 2,3 μg/mL respectivamente; los extractos, fracciones y compuestos no tiene actividad frente a Microsporum gypseum (Gonzalez y León, 2000).

Un estudio realizado mostró que los extractos de hojas, inflorescencias y raíces de A. vacciniaefolia tienen actividad antifúngica y antibacteriana. Los extractos de hojas resultaron ser los más activos. La fracción en cloroformo de hojas inhibió el crecimiento hifal de los hongos filamentosos Rhizictonia solani, Alternaria solani, Coletotrichum gloesporoides, Fusarium solani y Trichoderma viride. Los extractos de hojas, inflorescencias y raíces mostraron acción antibacteriana frente a bacterias Gram positivas: Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus y Streptococcus mutans (Pedrozo, 2001).

Se evaluó la actividad antiinflamatoria en edema de rata inducida por lamba- carragenina del extracto etanólico a una dosis de 300 mg/Kg. Los resultados

muestran que el extracto ejerce un efecto antiinflamatorio bajo comparado con el control positivo (Diclofenaco), que se evidencia desde la primera hora hasta la séptima hora de experimentación con un porcentaje de inhibición del 64,71% (Hernández, 2013).

1.5.4 Estudios fitoquímicos de la especie Ageratina vacciniaefolia

A partir de las partes aéreas se aislaron dos diterpenos pertenecientes a la familia de los kauranos y se identificaron como: ácido (-)-17-(beta-glucopiranosiloxil)- kauran-19-oico (1) y ácido(-)-16-(beta-glucopiranosiloxil)-16-ol-kauran-19-oico (2) (Huertas, Torrenegra, Rodriguez, Rojas, y Rodriguez, 2007). En otro estudio aislaron el ácido (-)-kaur-16-en-19-oico(3) y β-D-glucopiranosil éster del ácido (-)17-(β- glucopirano-siloxil)-16-hidroxi-kauran-19-oico(4) (Hernández, 2013; Pedrozo, 2001).

(1) (2)

(3) (4) 1.6 Técnicas de uso frecuente para la determinación de metabolitos secundarios

La cromatografía es una técnica con un gran número de métodos que permiten la separación, cuantificación, aislamiento e identificación de componentes en una mezcla (Gehrke y Robert, 2010). En está la muestra puede desplazarse en una fase

móvil líquida o gaseosa, por medio de una fase estacionaria fijada en una columna o superficie sólida, Esta técnica ha venido jugando un papel muy importante en la caracterización química de sustancias (Prada, 2015).

1.6.1 Cromatografía en Capa Fina (CCF)

Es el método más sencillo y rápido de cromatografía, aparte de ser relativamente económico, requiere menos absorbente y muestra. Es un tipo de cromatografía liquida, en el cual se siembran las muestras como un pequeño punto o raya sobre una placa con absorbente adecuado (fase estacionaria) según características de la muestra (Reich y Schibli, 2007). Existen al menos 25 materiales disponibles como absorbentes en CCF, el más común y útil es Silica gel, es un material poroso, amorfo de color blanco, que permite la separación de muchos tipos de compuestos (Prada, 2015).

1.6.2 Cromatografía líquida acoplada a Espectrometría de Masas (HPLC-MS)

Esta técnica permite el análisis de una amplia gama de metabolitos de alta y baja polaridad, incluyendo aquellos no volátiles, ha ganado popularidad por su sensibilidad y precisión. Mediante esta metodología se pueden detectar, separar, caracterizar y cuantificar los metabolitos de forma relativa o absoluta. El acoplamiento de un detector de MS permite resolver los problemas de identificación y cuantificación con la suficiente garantía. Cuando los detectores de masas operan en modo scan suministran información espectral muy precisa, y cuando operan en modo sim (modo de selección de ion) proporciona una alta especificidad, lo que permite el análisis cuantitativo (Prada, 2015).

1.6.3 Espectrometría de masas (MS)

Es una técnica microanalítica empleada para identificar compuestos desconocidos, cuantificar compuestos conocidos y elucidar la estructura. La detección de compuestos puede realizarse con cantidades realmente pequeñas de muestra y

obtener información característica como el peso molecular y algunas veces la estructura del analito. En todos los casos, alguna forma de energía es transferida a las moléculas a analizar para afectar la ionización. La técnica de impacto electrónico (IE), algunas de las moléculas ionizadas del analito “explotan” en una variedad de fragmentos ionizados, el patrón de fragmentaciónresultante, así como los iones residuales constituyen el espectro de masas. En principio, el espectro de masas de cada compuesto es único y poder ser usado como “huella química”. Esta técnica se fundamenta en la separación de partículas moleculares o atómicas en función de su relación masa-carga (m/z) (Osorio, 2008).

1.6.4 Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear (RMN)

Es una técnica que proporciona información estructural y estereoquímica de gran interés en un espacio de tiempo muy reducido. Se trata de una técnica no destructiva que estudia el comportamiento de ciertos núcleos atómicos (aquellos que tienen un spin nuclear distinto de cero) en presencia de un campo magnético externo. El campo magnético aplicado produce un desdoblamiento de los niveles de energía del spin nuclear (en este caso 1H y 13C), de modo que pueden inducirse transiciones entre ellos como consecuencia de la absorción de una radiación electromagnética adecuada. Los espines se comportan como pequeños imanes polarizados, presionando con su frecuencia característica alrededor al campo magnético externo, induciendo una pequeña corriente oscilante de radiofrecuencia (RF). Cuando los núcleos regresan poco a poco a su estado inicial de equilibrio alineadocon el campo magnético principal, la señal va disminuyendo de intensidad hasta hacerse cero. Esta caída de señal se conoce como caída libre de la inducción (FID= Free Induction Decay) y da lugar al espectro de RMN (Osorio, 2008).

1.6.4.1 Experimentos monodimensionales

RMN 1H: El espectro de protón muestra el valor del desplazamiento químico dependiendo del ambiente químico de cada protón (ppm), la constante de acoplamiento, la multiplicidad de cada señal (Osorio, 2008).

RMN 13C: Permite evidenciar todos los carbonos de la molécula mediante una señal única por átomo de carbono, se basa en los desplazamiento químicos observados en función del entorno de cada uno de los átomos de carbono (Osorio, 2008).

1.6.4.2 Experimentos bidimensionales

HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence): Experimento bidimensional de correlación heteronuclear (H-X), que suministra la misma información del HMQC (Heteronuclear Multiple-Quantum Correlation), con una ligera mejora en la resolución en la dimensión X. Tiene características más favorables para trabajos en los que se requiere una alta resolución y es más sensible a las modificaciones de la frecuencia. La principal desventaja del HSQC frente al HMQC es el mayor número de pulsos que utiliza, especialmente pulsos de 180° del heteroátomo, lo que provoca pérdidas de intensidad (San Feliciano, Pérez, y Del Olmo, 2008). Los espectros 1 contienen una señal para cada único protón unido al heteronúcleo considerado ( JH-

C) (Osorio, 2008).

HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation): Este experimento permite establecer correlaciones a larga distancia, haciendo uso de la mayor sensibilidad asociada a la detencción protónica. A nivel práctico, el experimento HMBC tiende a ser más robusto a las imperfecciones experimentales o a errores de calibración (San Feliciano et al. , 2008). Las principales aplicaciones son la asignación de los núcleos de carbono o nitrógeno no protonados y la correlación a larga distancia ( 2, 3 y 4 enlaces) de carbonos protonados que están separados por carbonos no protonados o por otros heteronúcleos (Osorio, 2008).

1.7 Actividad antiinflamatoria

La inflamación es una respuesta tisular y celular presente en mamíferos y otros organismos, que busca eliminar agentes patógenos y tejido dañado para dar paso a la recuperación morfológica y funcional del tejido afectado. Ha sido descrita desde la antigüedad (Celso año 10 a.C), el cual describió los signos clásicos: calor, rubor,

edema y dolor. Estos fenómenos se relacionan con los cambios morfológicos observados en el tejido lesionado (respuesta vascular y respuesta celular). Esta puede ser aguda o crónica en función de la naturaleza del estímulo y la eficacia de la reacción inicial para eliminar el estímulo o los tejidos lesionados, cada tipo de inflamación tiene sus propios cambios morfológicos y células específicas (Kumar, Abbas, Fausto, y Aster, 2010).

1.7.1 Inflamación aguda

Es una respuesta rápida del anfitrión que sirve para hacer llegar leucocitos y proteínas plasmáticas, como los anticuerpos, al foco de infección o lesión tisular (Figura 7).

Figura 7.Las principales manifestaciones locales de la inflamación aguda comparadas con la normalidad.

1. Dilatación vascular y aumento del flujo de sangre (responsable del eritema y el calor). 2. Extravasación y depósito extravascular de líquido plasmático y proteínas (edema). 3. Emigración de los leucocitos, que se acumulan en el lugar de la lesión.

Las reacciones inflamatorias agudas pueden estimularse de diferentes maneras (Kumar et al. , 2010):

• Infecciones (bacterianas, víricas, fúngicas o parasitarias) y toxinas microbianas se encuentran entre las causas más frecuentes e importantes a nivel médico de la inflamación. • Las lesiones físicas y químicas (p. ej. Lesiones térmicas como en las quemaduras o la congelación; radiación, exposición a algunas sustancias químicas. • Los cuerpos extraños (astillas, polvo, suturas) inducen típicamente una inflamación, porque provocan lesiones tisulares traumáticas porque contienen microbios. • Reacciones inmunitarias (llamadas también reacciones de hipersensibilidad) son reacciones en las que el sistema inmunitario, que, en condiciones normales, debería ser protector, produce lesiones en los tejidos del individuo.

La inflamación se disminuye sencillamente porque los mediadores inflamatorios se producen rápidamente, mientras persiste el estímulo. Conforme se desarrolla la inflamación, se activan diferentes señales de interrupción que llevan a su finalización. Estos mecanismos de terminación involucran un cambio del tipo de metabolitos del ácido araquidónico, que pasan de los leucotrienos proinflamatorios a las lipoxinas antiinflamatorias, la liberación de citosinas antiinflamatorias como ; factor de crecimiento transformante β (TGF- β) e IL-10 de los macrófagos y otras células; la producción de mediadores lipídicos, denominados resolvinas y protectinas (ácidos grasos poliinsaturados) e impulsos neurales (descarga colinérgica), que inhiben la producción de TNF (Factor de Necrosis Tumoral) en los macrófagos (Kumar et al. , 2010).

1.7.2 Inflamación crónica

Está es de duración prolongada (semanas o meses), y durante este periodo se presentan la inflamación, las lesiones tisulares y los intentos de reparación.

La inflamación crónica se observa en las siguientes condiciones (Kumar et al. , 2010): • Infecciones debidas a gérmenes difíciles de eliminar. • Enfermedades inflamatorias de mecanismo inmunitario. • Exposición prolongada a sustancias con capacidad tóxica, exógenas o endógenas.

Presenta unas características morfológicas, que a diferencia de la inflamación aguda en la que se presentan cambios vasculares, edema y una infiltraciónprincipalmente neutrofílica, la inflamación crónica se caracteriza por (Kumar et al. , 2010):

• Inflamación con células mononucleares (macrófagos, linfocitos y células plasmáticas). • Destrucción tisular promovida por el agente lesivo o células inflamatorias. • Intentos de curación por medio de la sustitución de tejido.

1.7.3 Modelos de evaluación in vivo de la actividad antiinflamatoria

Para evaluar la actividad antiinflamatoria in vivo se dispone de modelos que varían en la intensidad de la reacción (Gómez Estrada, González Ruiz, y Medina, 2011), estos pueden ser: • Modelos de inflamación aguda • Modelos de inflamación subcrónica o crónica (no detallados)

Dentro de los modelos de inflamación aguda se pueden emplear tres métodos, cada uno posee características especiales dependiendo de las condiciones bajos las cuales se realice el estudio. Estos son: • Protocolo experimental por aceite de crotón. • Edema auricular en ratón inducido por 13-Acetato de 1-12-O-tetradecanoil- forbol (TPA).

• Modelo de edema plantar inducido por λ-carragenina.

1.7.3.1 Modelo de edema plantar inducido por λ-carragenina

El método fue descrito por primera vez por Winter y Porter en 1957, y posteriormente modificado por Sughisita et al. en 1981. Ha sido uno de los métodos de mayor utilidad en la discriminación de fármacos antiinflamatorios por su sencillez y reproducibilidad. Consiste en la administración subcutánea de una pseudo soluciónde lambda-carragenina (un mucopolisacárido sulfatado extraído del alga marina Chondrus crispus y Gigartina stellata) a nivel de la aponeurosis plantar de la rata o el ratón. El producto a ensayar se puede administrar por diferentes vías sea intraperitoneal, oral, etc. La respuesta promovida por la λ carragenina es de tipo bifásica. La primera fase es mediada a través de la liberación de histamina, serotonina y quininas, mientras que la segunda fase está asociada a la liberación de prostaglandinas, bradiquinina, proteasa y lisosoma (Gómez Estrada et al. , 2011). La inyección subcutánea de la carragenina en la pata de la rata o el ratón produce inflamación y como resultado de esto la extravasación de plasma, aumento de agua en los tejidos, exudación de proteínas del plasma, junto con la extravasación de neutrófilos, debido al metabolismo del ácido araquidónico. La primera fase comienza inmediatamente después de la inyección de la lambda-carragenina y disminuye en dos horas, mientras que la segunda fase se inicia al final de la primera fase y se mantiene de tres a cinco horas (Eddouks, Chattopadhyay, y Zeggwagh, 2012).

1.8 Generalidades del Cáncer

El cáncer no se considera como una enfermedad, sino como muchos trastornos que comparten una alteración profunda de la regulación del crecimiento (Kumar et al. , 2010), se caracteriza por poseer una capacidad de proliferación incontrolada debido a daños genéticos que están asociados a la perdida de función de los genes

supresores y activación de diversos oncogenes (Figura 8) (Hanahan y Weinberg, 2000), los cuales llevan a la invasión de diferentes tejidos y órganos (Seyfried, Flores, Poff, y D’Agostino, 2014). La homeostasis en condiciones normales dentro de la célula es la encargada de regular el balance entre la proliferación, la detención del crecimiento y la apoptosis (Foster, 2008).

Existen más de cien tipos de cáncer en el mundo, que se diferencian entre sí por su comportamiento y respuesta al tratamiento. En el estudio de los tumores, las observaciones clínicas identificaron dos modelos principales de crecimiento neoplásico (Stevens, Lowe, Scott, y Damjanov, 2011):

• Si los márgenes de tumor eran bien definidos y el tumor crecía sólo de forma local, el tumor se denomina benigno. • Si los márgenes del tumor estaban mal definidos, y las células neoplásicas estaban creciendo al interior de tejidos circundantes y destruyéndolos la neoplasia (capacidad metastásica) se denomina maligna.

Figura 8. Eventos en la transformación neoplásica.

Las células normales desarrollan en genes claves que regulan el crecimiento y son transformadas en células neoplásicas.

1.8.1 Características y biología de las células tumorales

Las células tumorales pueden ser diferenciadas de las células normales por medio de otras características, como alteraciones en el citoesqueleto, por medio de la distribución y actividad de los microtúbulos cambiando su apariencia, adhesión, quimiotaxis e interacción con las células vecinas, su núcleo difiere en organización y forma, es común presenciar la secreción de enzimas que permiten la liberación celular posibilitando la invasión hacia tejidos y órganos cercanos (Faça et al. , 2008). Estas células invaden los vasos linfáticos y sanguíneos, lo que les permite tener una capacidad metastásica por todo el cuerpo (Rojas, 2015). Ante la presencia del daño celular el organismo pone en funcionamiento los diferentes mecanismos de control (necrosis, apoptosis y autofagia) para la destrucción de las células afectadas y de esta forma ayuda a minimizar el progreso del tumor maligno (Foster, 2008).

1.8.2 Ciclo celular tumoral

El ciclo celular es uno de los más importantes mecanismos regulatorios del cuerpo humano porque controla la tasa de división celular y proliferación. El ciclo celular se divide en diferentes fases (G1, S, G2 y M), que tienen que ser completados en un orden antes de que se complete la división celular (Krabbe y Margulis, 2016). La fase G1 (crecimiento 1) inicia el crecimiento a partir de una célula proveniente de la división, una segunda fase es la síntesis (S), periodo en el que tiene lugar la replicación del ADN; tras finalizar la síntesis del ADN se produce la fase G2 (crecimiento 2) donde se sintetiza el ARN y proteínas. La fase M es la etapa más llamativa del ciclo, que se compone de dos eventos: separación de los cromosomas hijos (división nuclear: mitosis) y termina generalmente en la división celular (citocinesis). Las células que salen de G1, para entrar en un estado de reposo del ciclo denominado G0, en el que permanecen activas metabólicamente pero no proliferan a no ser que sean requeridas para ello mediante las señales extracelulares apropiadas (Figura 9) (Harashima, Dissmeyer, y Schnittger, 2013)

Figura 9. Fases del ciclo celular Fuente:(Centre, 2013)

Durante las dos últimas décadas se ha puesto en manifiesto la relevancia de la desregulación del ciclo celular en el cáncer humano. Las células tumorales acumulan mutaciones que resultan en la señalización mitogénica es una respuesta defectuosa a las señales antimitogénicas que contribuyen a la proliferación no programada. Además, la mayoría de los tumores adquieren inestabilidad genómica que conduce a mutaciones adicionales, así como la inestabilidad cromosómica, un defecto responsable de los cambios numéricos en los cromosomas. Estas alteraciones dan como resultado, no solo ventajas proliferativas sino también una mayor susceptibilidad a la acumulación de alteraciones genéticas adicionales que contribuyen a la progresión del tumor y la adquisición de fenotipos más agresivos (Malumbres y Barbacid, 2009).

1.8.3 Epidemiología del Cáncer

El cáncer es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Se estima que 14,1 millones de nuevos casos se produjeron en el 2012. Los canceres de pulmón, mama, colorrectal, y de estómago representaron más del 40% de todos los casos diagnosticados en todo el mundo. En hombres el cáncer de pulmón en el más común (16,7% de todos los casos nuevos) (World Health Organization y Cancer Research UK, 2014). En mujeres el cáncer de seno es la

causa de muerte más frecuente después del cáncer de cuello uterino. Se estima que para el 2020, 1,7 millones de mujeres serán diagnosticadas con cáncer de seno, con un aumento del 26% a partir de los niveles actuales(Bravo, García, Carrascal, y Rubiano, 2014). En Colombia el Instituto Nacional de Cancerología (INC) y el Ministerio de protección social reportó 628 nuevos casos de cáncer de seno que corresponden al 20,5% (Instituto Nacional de Cancerología, 2012).

1.8.4 Ensayos in vitro para evaluar agentes antitumorales

Los ensayos in vitro son lo que se desarrollan en ambientes controlados fuera del organismo, para realizar la evaluación de agentes con potencial antitumoral se utilizan bioensayos celulares y moleculares. En los ensayos celulares con frecuencia se utilizan cultivos celulares in vitro de diferentes líneas celulares con el fin de evaluar y caracterizar la actividad biológica de extractos y fracciones; los ensayos moleculares emplean sistemas aislados como enzimas, receptores, DNA, entre otros (Rojas, 2015).

Algunas de las líneas celulares tumorales utilizadas por el laboratorio de Inmunobiología y Biología Celular de la Pontifica Universidad Javeriana para evaluar la actividad de los extractos y fracciones son:

1.8.4.1 Línea celular 4T1

Es una línea celular de tumor mamario de ratón, utilizada como modelo para la etapa IV de cáncer de mama. Esta subpoblación se caracteriza por tener una alta incidencia de metástasis espontánea a pulmón e hígado (Mancipe, 2013) (Figura10-a).

1.8.4.2 Línea celular TSA

Surgió de un ratón BALB/c a través del primer trasplante in vivo de adenocarcinoma mamario. Es una línea celular poco agresiva e inmunogénica, se caracteriza por

secretar factores estimulante de colonias de granulación y macrófagos (Rojas, 2015) (Figura10-b).

1.8.4.3 Línea celular MCF-7

Es una línea celular humana, obtenida de un tejido metastásico en efusión pleural de una paciente de género femenino, con adenocarcinoma de la glándula mamaria. Es adherente y expresan el oncogén WNT7B (Rojas, 2015) (Figura10-c).

1.8.4.4 Línea celular 3T3

Son fibroblastos primarios de embriones de ratón. Su denominación se debe a que fueron cultivados en un protocolo 3T3 es decir transferidas (T) cada tres días (3) en una densidad de 3 x 105 células (3). Son utilizadas generalmente en el cultivo de queratinocitos debido a que secretan factores de crecimiento favorables para este tipo de células; son sensibles a los virus del sarcoma y la formación de focos virales de la leucemia (Rojas, 2015) (Figura10-d).

d. Línea celular a. Línea celular 4T1 b. Línea celular TSA c. Línea celular MCF-7 fibroblastos 3T3 Tomado de: (Addexbio, Fuente: (Cavallo et al. , Tomado de: (Li, Zhang, Fuente: (Nacalai USA, 2014) 1999) y Zhang, 2013) 2014) Figura10. Líneas celulares tumorales

1.8.5 Muerte celular

La muerte celular puede ser inducida por varios aspectos. Entre ellos, el morfológico en donde se encuentra la apoptosis, necrosis y autofagia (Rojas, 2015). El aspecto funcional puede clasificarse como programada, accidental, fisiológica o patológica;

el aspecto enzimático en donde se evalúa la activación de diversas enzimas como las nucleasas, proteasas, caspasas, calpainas, catepsinas y transglutaminasas (Cifuentes, 2010).

1.8.5.1 Ensayos para verificar la muerte celular

Para definir la muerte de una célula uno de los criterios utilizados es la pérdida de la integridad de la membrana celular. Existen métodos con colorantes vitales que permiten verificar la integridad de la membrana, como el azul tripán (cromóforo derivado de la toluidina), este permite diferenciar las células viables de las muestras, ya que estás ultimas al perder integridad permiten la entrada del colorante, tiñendo el citoplasma de azul, mientras que las células viables permanecen incoloras (Cifuentes, 2010). El método del MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5- difeniltetrazol) fue desarrollado por Mosmann (Mosmann, 1983) y modificado por Denizot y Lang (Denizot and Lang, 1986), este permite medir la viabilidad y proliferación celular, consiste en la reducción metabólica del MTT por la enzima mitocondrial succinato deshidrogenasa a formazán (compuesto de color azul o purpura), permitiendo así determinar la funcionalidad mitocondrial y viabilidad de las células tratadas (Figura 11)(Cifuentes, 2010). El formazán producido se retiene en las células y se libera por solubilización con dimetilsulfóxido (DMSO), el cual se mide en un espectrofotómetro a 540 nm. Teniendo en cuenta que la cantidad de células viables será proporcional a la cantidad de formazán producido a partir de la absorbancia obtenida (Morgan et al. , 2004).

Figura 11.Reducción de MTT a formazán Fuente: (BioTek, 2009)

1.9 Especies reactivas del oxígeno

El oxígeno está asociado directamente a las condiciones de la vida aerobia, representa la fuerza motriz para el mantenimiento de la viabilidad celular y su metabolismo, así mismo involucra un potencial peligro por sus características paramagnéticas (estado gaseoso), responsable de la formación de intermediarios reducidos parcialmente y dotados de una alta reactividad conocidas como “Especies Reactivas del Oxígeno” (ERO). Dentro de las principales fuentes generadoras de ERO se encuentran: la cadena de transporte electrónico mitocondrial, los iones de metales de transición, las reacciones bioquímicas redox dependientes de O2, el exceso de ejercicio físico, la radiación ionizante proveniente de la atmósfera y por los contaminantes, humo de cigarrillo y algunos medicamentos (Tovar del Rio, 2013).

•- Las ERO tales como el anión superóxido (O 2 ), hidroxilo (•OH), peroxilo (ROO•), radicales alcoxilo (RO•) y peróxido de hidrógeno (H2O2) pueden atacar macromoléculas biológicas, causar daños en el ADN, envejecimiento celular, enfermedades originadas por el estrés oxidativo (enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas) y hasta el cáncer (Reşat et al. , 2013). El cerebro es más vulnerable al daño oxidativo debido a su elevado consumo de oxígeno resultante en

la generación de un gran números de compuestos intermediarios (Vyas, Kachhwaha, y Kothari, 2016).

1.9.1 Mecanismo de defensa antioxidante

El organismo y muchas células bajo condiciones fisiológicas utilizan mecanismos potentes de defensa para evitar la acumulación de las ERO, dentro del nivel fisiológico se encuentra el sistema microvascular, cuya función es mantener los niveles de O2 en los tejidos, a nivel bioquímico la defensa antioxidante puede ser enzimática o no enzimática. El primer componente de los mecanismos de defensa antioxidante es la barrera fisiológica que limita el paso del O2 proveniente del aire inspirado hasta las células. En la Tabla 3 se describen el resto de componentes (Tovar del Rio, 2013).

Tabla 3. Componentes de los mecanismos de defensa antioxidante Antioxidantes Primarios Antioxidantes secundarios Antioxidantes terciarios • Previenen la formación • Capturan los radicales • Son los encargados de la de nuevas EROS, libres y evitan las reparación de las convirtiéndolas en reacciones en cadena. biomoléculas dañadas. moléculas menos • Se encuentra: Vitamina • Se incluyen las enzimas perjudiciales, antes de E, C, β-caroteno y endonucleasa que puedan reaccionar. sustancias endógenas apurinica/apirimidínica y • Se destacan: Las (bilirrubina y polimerasa β, reparadoras Superóxido dismutasas ubiquinona). del ADN. (SOD), las Glutation peroxidasas (GPx) y la catalasa.

Un antioxidante puede ser definido como “cualquier sustancia que cuando está presente en concentraciones relativamente bajas, en comparación con las del sustrato oxidable, retrasa significativamente o inhibe la oxidación de dicho sustrato” (Reşat et al. , 2013). Los antioxidantes tienen un papel indispensable en la prevención de enfermedades crónicas dentro de las cuales se encuentran: la arterioesclerosis, la diabetes, el asma, la hepatitis, la artritis y el cáncer (Siddhuraju y Becker, 2007) también reducen el daño oxidativo a los componentes celulares causados por las ERO.

1.9.2 Determinación de la capacidad antioxidante

La diversidad química de los antioxidantes hace que sea difícil separarlos y cuantificarlos, pero la cooperación entre ellos proporciona una mayor protección con los ERO. Una clasificación básica de los ensayos depende del tipo de reacción y pueden ser divididos en dos categorías (Tabla 4) (Reşat et al. , 2013). Estos dos métodos se desarrollaron para medir la capacidad preventiva antioxidante de una muestra (Tovar del Rio, 2013):

1. Ensayos basados en la transferencia de átomos de hidrógeno (TAH): Estos monitorean una reacción cinética competitiva, que generalmente se componen de un generador de radical libre sintético, una prueba molecular oxidable y un antioxidante, eliminando los radicales libres por donación de un átomo de H (Figura 12).

2. Ensayos basados en la transferencia de electrones (TE): Estos involucran una reacción redox con el oxidante como indicador del punto final de reacción (Figura 12).

Tabla 4. Clasificación de los modelos de ensayo según su modo de reacción TAH o TE (Reşat et al. , 2013; Tovar del Rio, 2013). Ensayo Clasificación Ensayos basados en Capacidad de absorción del radical oxígeno (ORAC) la transferencia de Parámetro antioxidante de captura de radicales (TRAP) átomos de hidrógeno Inhibición de la oxidación del ácido linoleico (HAT) Inhibición de la oxidación de los lípidos de baja densidad (LDL) Acido 2,2′-azino-bis-3-etilbenzotiazolin-6-sulfonico (ABTS●+) Ensayos basados en 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo (DPPH●) la transferencia de Poder de reducción antioxidante del hierro (FRAP) electrones (ET) N,N- dimetil-p-fenilendiamina (DMPD)

Capacidad de reducción antioxidante del cobre (CUPRAC)

Ensayos THA

ROO + AH ROOH + A

A + ROO ROOA

Ensayos TE

Oxidante + e proveniente del Oxidante + Antioxidante (prueba) antioxidante reducido oxidado Figura 12. Mecanismos de reacción por THA y ET (Tovar del Rio, 2013).

1.9.3 Ensayo del DPPH• (1,1-difenil-2-picril-hidrazilo)

En 1985 Blois propuso este método, en el cual demostró por primera vez la capacidad del DPPH• proveniente de una molécula de cisteína. Este es conocido como un radical libre estable debido a la deslocalización de un electrón desapareado sobre la molécula completa, por lo cual esta molécula no se dimeriza, como es el caso de la mayoría de los radicales libres. La deslocalización del electrón también intensifica el color violeta intenso típico del radical, el cual absorbe en metanol a 517 nm. Cuando el sustrato antioxidante reacciona con la solución de DPPH•, este puede donar un átomo de hidrogeno como se observa en la Figura 13, debido a que el color violeta desaparece. El cambio de color se monitorea por espectrofotometría y es utilizado para la determinación de las propiedades antioxidantes (Tovar del Rio, 2013).

Figura 13.Reacción del DPPH• con el antioxidante La reacción es medida como (Ainicial-Afinal) y la capacidad antioxidante es reportada como el valor de la concentración inhibitoria cincuenta (CI50), definida como la concentración del antioxidante requerida para reducir la absorbancia del DPPH• a la mitad (Reşat et al. , 2013).

1.10 Toxicidad aguda en Artemia salina

En 1982 Meyer et al. Desarrollaron un bioensayo para determinar la toxicidad por medio de la larva de un crustáceo de mar (Artemia salina Leach). Es un método que se caracteriza por su rapidez, confiabilidad y bajo presupuesto, se utiliza como vía inicial de tamizaje citotóxico de extractos o fracciones para discriminar aquellas muestras con elevada toxicidad, ya que presenta una buena correlación con la toxicidad in vitro (Martínez et al. , 2006).

2. METODOLOGÍA

Este trabajo se desarrolló teniendo en cuenta dos aspectos fundamentales: químico y biológico. El aspecto químico involucró procesos de extracción, fraccionamiento, aislamiento y purificación de los metabolitos secundarios presentes en las partes aéreas de las especies vegetales Conyza trihecatactis y Ageratina vacciniaefolia; y en el aspecto biológico, a los extractos etanólicos completos y a las fracciones obtenidas se les evaluó la actividad citotóxica (método del MTT), la actividad antiinflamatoria (método de inducción de inflamación con λ-carragenina), la actividad antioxidante (método del DPPH) con cuantificación de fenoles (método Folin-Ciocaulteu) y la toxicidad aguda en Artemia salina.

2.1 Generalidades

El estudio fitoquímico se llevó acabo empleando métodos cromatográficos, espectrométricos, espectroscópicos, para realizar los procesos de aislamiento, purificación y elucidación de los compuestos obtenidos.

2.2 Métodos de separación cromatográfica

Los extractos y fracciones obtenidas fueron sometidos a separaciones sucesivas empleando cromatografía líquida al vacío (CLV), cromatografía en columna (CC) bajo gravedad, cromatografía en columna flash (CF), y cromatografía en capa fina preparativa (CCFP); cada subfracción obtenida fue monitoreada por cromatografía en capa fina (CCF) utilizando cromatofolios en Silica gel 60G F254 y Silica gel 60 RP-

18 F254S, para CLV se empleó Silica gel 60 (230-400 Mesh ASTM) marca Merck, para la CC se empleó Silica gel 60 (70-230 Mesh ASTM), para la CF se utilizó Silica gel 60 (230-400 Mesh ASTM) marca Merck. Los criterios de selección de las fracciones que se llevaron a purificación fueron la cantidad de fracción y la complejidad del perfil cromatográfico en la CCF. El control de pureza se realizó por CCF empleando reveladores como: luz ultravioleta (onda corta: 254 nm y onda

larga: 365 nm), y NP/PEG (Natural Producs-Polyethylene Glycol Reagent). Los disolventes empleados para las separaciones cromatográficas fueron de grado analítico.

2.3 Técnicas para la elucidación estructural y caracterización de los compuestos aislados

2.3.1 Espectrometría de masas (MS)

Los espectros de masas de los compuestos aislados, fueron tomados en un equipo SHIMADZU MS QP2010, ubicado en la Universidad Distrital Francisco José de Caldas, cuenta con una sonda de inserción directa y analizador de masas cuadrupolar. El modo de ionización fue por ionización electrónica (IE) a 70 eV y la temperatura de la cámara de ionización fue de 230ºC.

2.3.2 Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear (RMN)

Los espectros de RMN (1H, 13C, J-MOD, HSQC y HMBC) fueron tomados en un espectrómetro Bruker Avance III del laboratorio de RMN de la Pontifica Universidad Javeriana. Los análisis se realizaron a 300 MHz para 1H, 75 MHz para 13C, empleando solventes deuterados (DMSO-d6 y Acetona-d6) y como referencia interna el tetrametilsilano (TMS).

2.3.3 Cromatografía líquida acoplada a Espectrometría de Masas (HPLC-DAD- MS)

Elanálisis de las fracciones y compuestos fue perfilado por HPLC-DAD-MS, utilizando un equipo LC-MS Shimadzu Prominence QP2020 y LC-DAD del laboratorio de Química Bioorgánica de la Universidad Militar Nueva Granada (Campus Cajicá), cada muestra se pasó por un filtro PTFE de 0.2 µm. La separación de los componentes se llevó acabo en una columna Phenomenex Sinergy RP-C18 (150mm x 4,6mm, 5m) utilizando el sistema de LC-MS que consta de un módulo

de separación equipado con un detector de masas con analizador quadrupolar. El caudal fue de 0,6 mL/min. Las fases móviles empleadas fueron ácido fórmico (HCOOH) al 0,1% agua como eluyente A y acetonitrilo (ACN) como eluyente B, las cuales se determinaron en ensayos previos para la obtención de perfiles con buena resolución y selectividad. El tiempo total de ejecución fue de 35 min usando el siguiente gradiente lineal de múltiples etapas: 0 min 10%B, 20 min 70% B, 22-23 min 80% B, 26-28 min 100% B, 31 min 50% B, y finalmente 33-35 min, 10% B. El volumen de inyección fue de 10 L (2,5 mg/mL para fracciones y para compuestos 1mg/mL). Los compuestos y fracciones se chequearon con una longitud de onda entre 190-800 nm, las longitudes de onda de monitoreo seleccionadas fueron de 190 y 270 nm. Para la detección por espectrometría de masas, se utilizó un espectrómetro Shimadzu LC2020, interfase de ionización electrospray, ESI, modo positivo (SCAN 50- 800 m/z), bloque de calentamiento 450ºC, temperatura de línea de solvatación 300ºC, voltaje del detector 1,25 kV, flujo de gas de nebulización (N2)

1,3 L/min y gas de secado (N2) 9,0 L/min.

2.3.4 Cromatografía líquida de longitud de onda variable (semipreparativa) (HPLC-VWD (semiprep))

El análisis de las fracciones y compuestos aislados por HPLC-VWD (semiprep) se llevó a cabo en el laboratorio de Química Bioorgánica de la Universidad Militar Nueva Granada (Campus Cajicá), utilizando un equipo Shimadzu Prominence con detector de arreglo de diodos SPD M20A, columna Phenomenex Luna RP-C18 de 150mm x 10,0mm, 5m, El caudal fue de 2 mL/min. Las fases móviles utilizadas fueron ácido trifluoracetico (TFA) y agua al 0.005% como eluyente A y Metanol (MeOH) como eluyente B, las cuales se determinaron en ensayos previos para la obtención de perfiles con buena resolución y selectividad. El tiempo total de ejecución fue de 47 minutos usando el siguiente gradiente lineal de múltiples etapas: 0 min 10% B, 13-19 min 40% B, 38-40 min 70% B, 42-47 min 10% B, la longitud de onda de monitoreo seleccionada fue de 270 nm y volumen de inyección de 50L (50 mg/mL).

2.4 Estudio fitoquímico de las partes aéreas de las especies vegetales Conyza trihecatactis y Ageratina vacciniaefolia

A continuación, se presenta la metodología empleada para la identificación de las especies vegetales, obtención de extractos y fracciones, aislamiento y purificación de los metabolitos secundarios.

2.4.1 Recolección e identificación del material vegetal

La especie vegetal Conyza trihecatactis fue recolectada en el Páramo de Sumapaz en el embalse de la regadera (coordenadas geográficas 4º 23´3´Ń, 74º 10´17´É) y la especie vegetal Ageratina vacciniaefolia en el Páramo de Cruz Verde (coordenadas geográficas 4º 34´00´Ń, 74º 02´00´É), en los meses de enero-marzo y agosto-septiembre del 2014. Una muestra testigo fue enviada al Herbario Nacional de Colombia las cuales fueron identificadas bajo el número COL2766158 y COL422104 respectivamente.

2.4.2 Obtención de extractos

Para cada una de las dos especies estudiadas se siguió la siguiente metodología.

Se tomaron 3,5 Kg de hojas, tallos y flores (partes aéreas), se llevaron al proceso de secado en un horno con convección forzada a una temperatura de 50ºC por dos días. Posteriormente, el material fue pulverizado en un molino de bolas, obteniéndose 1,5 Kg de material vegetal seco y molido (MVSM).

A partir de 1,5 Kg (partes aéreas) secos y molidos se realizó una extracción Soxhlet, con éter de petróleo (40-60ºC), se floculo con acetona, se filtró y concentro a presión reducida a 40ºC. Al residuo (Marco 1) se le realizó una extracción continua en Soxhlet con Etanol (EtOH), se floculó con agua (24 horas en frío) y posteriormente se filtró.

2.4.3 Obtención de fraccionespara Conyza trihecatactis

El extracto etanólico obtenido de la especie Conyza trihecatactis (ExEtOH Ct) fue sometido a un fraccionamiento líquido-líquido continuo con solventes de polaridad creciente obteniéndose fracciones de diclorometano (FCH2Cl2 Ct), éter etílico

(FEt2O Ct), acetato de etilo (FAcOEt Ct) y un residuo hidroalcohólico (RHEt Ct). Los pesos y porcentajes de rendimiento se discriminan en la Figura 14.

Figura 14. Esquema de la obtención de los extractos y fracciones para Conyza trihecatactis.

2.4.3.1 Fracción diclorometano de Conyza trihecatactis (FCH2Cl2 Ct)

10,57 g se fraccionaron a través de CLV, utilizando disolventes en orden creciente de polaridad empezando con: éter de petróleo (EDP), diclorometano (CH2Cl2), acetato de etilo (AcOEt), etanol (EtOH) y metanol (MeOH).

0,864 g de FCH2Cl2-EDP se fraccionaron por CC empleando como fase estacionaria Silica gel 60 (70-230 Mesh ASTM) y como fase móvil EDP-AcOEt (1:1), obteniendo 37 fracciones, que se unieron en 11 según monitoreo por CCF. La fracción 11 al ser lavada con MeOH, se obtuvo un sólido de color amarillo (13,8 mg) denominado MCt1. (Ver Figura 15)

Figura 15. Aislamiento y purificación de MCt1.

2.4.3.2 Fracción acetato de etilo de Conyza trihecatactis (FAcOEt Ct)

7,65 g se fraccionaron por CLV, utilizando disolventes en orden creciente de polaridad empezando con: éter de petróleo (EDP), diclorometano (CH2Cl2), acetato de etilo (AcOEt) y metanol (MeOH).

1,5 g de FAcOEt- AcOEt se fraccionaron por medio de una CF, utilizando como fase estacionaria Silica gel 60 (230-400 Mesh ASTM) y como fase móvil una mezcla en gradiente empezando con CHCl3-MeOH (99:1) y terminando de eluir con MeOH, obteniendo 355 fracciones que se unieron en 50 según perfil por CCF. En la fracción 13 precipitó un sólido de color amarillo (3 mg) denominado Ct2, en la fracción 29 se obtuvo 3,1 mg de un sólido de color amarillo denominado Ct3. En las fracciones 36- 38 precipitó un sólido amarillo (88,7 mg) el cual se volvió a fraccionar por CC empleando como fase móvil CHCl3-MeOH (95:5) en gradiente, terminando de eluir con MeOH, obteniendo 102 fracciones, que se unieron en 13 según monitoreo por CCF. En las fracciones 7, 8, 9 y 10 por procesos de recristalización se obtiene un sólido de color amarillo (4,8mg) denominado Ct4 (Ver Figura 16).

Figura 16. Aislamiento y purificación de los compuestos Ct2, Ct3 y Ct4.

2.4.4 Obtención de fracciones para Ageratina vacciniaefolia

El extracto etanólico obtenido de la especie Ageratina vacciniaefolia (ExEtOH Av) fue sometido a un fraccionamiento líquido-líquido continuo con solventes de polaridad creciente obteniéndose fracciones de cloroformo (FCHCl3 Av), éter etílico

(FEt2O Av), acetato de etilo (FAcOEt Av) y un residuo hidroalcohólico (RHEt Av). Los pesos se discriminan en la Figura 17.

Figura 17. Esquema de la obtención de los extractos y fracciones para Ageratina vacciniaefolia.

2.4.4.1 Fracción cloroformo de Ageratina vacciniaefolia (FCHCl3 Av)

La fracción FCHCl3 Av se llevó a un análisis por HPLC-DAD-MS, para realizar un perfil cromatográfico, y se fraccionó utilizando cromatografía liquida semipreparativa (HPLC UV-Vis) obteniendo 32 fracciones. En la fracción 32 precipitó un sólido (48,6 mg) denominado Av1, en las fracciones 34-35 se obtuvo 10,5 mg de un sólido blanco llamado Av2. Estos sólidos se monitorearon por CCF, en comparación con patrones previamente aislados (Hernández, 2013; Pedrozo, 2001), dentro de los que se encuentran: β-D-glucopiranosil éster del ácido(-)-17-(β-xilopiranosa)-kauran- 19-oico (NKD), ácido kaur-16-en-19-oico (AKA), el ácido (-)9,15-dihidroxikaur-16- en-19-oico (KdA) y el β-D-glucopiranosil éster del ácido (-)9,15-dihidroxikaur,16- en-19-oico (PA) los cuales también fueron analizados por HPLC-DAD-MS.

2 g de FCHCl3 Av se fraccionaron por medio de CF, utilizando como fase móvil en gradiente mezclas de CHCl3-MeOH (9:1,8:2,7:3,6:4 y 5:5), se obtuvieron 103 fracciones. En las fracciones 70,71,72 precipitó un sólido de color blanco denominado Av3 (16 mg), en las fracciones 85-87 se obtuvo 20 mg de un sólido de color blanco denominado Av4. La metodología empleada para el aislamiento y purificación de los compuestos Av3 y Av4 de la fracción de cloroformo de Ageratina vacciniaefolia se muestra en la Figura 18.

Figura 18. Aislamiento y purificación de los compuesto Av1, Av2, Av3 y Av4.

2.4.4.2 Fracción acetato de etilo de Ageratina vacciniaefolia (FAcOEt Av)

3g se fraccionaron por medio de una CLV utilizando como fase estacionaria Silica gel RP-18 y como fase móvil mezclas EtOH-H2O en relación (5:5, 6:4, 7:3, 8:2 y 9:1) y por último se terminó de eluir en EtOH y CHCl3.

1,06g de FAcOEt-EtOH se fraccionaron en una CC empleando como fase estacionaria Silica gel RP-18 y como fase móvil una mezcla en gradiente de H2O- EtOH, terminando de eluir con EtOH, se obtuvieron 157 fracciones. En las fracciones 104-113 precipitó un sólido de color amarillo (100 mg), la separación se realizó mediante CCFP utilizando placas de Silica gel RP-18 de 20x20 y 2 mm de espesor, la placa se corrió tres veces para garantizar la separación completa de los compuestos, se utilizó como fase móvil H2O-EtOH (1:1), y como revelador vainillina sulfúrica, obteniendo un sólido de color amarillo (12,7 mg) denominado Av5. (Ver Figura 19).

Figura 19. Aislamiento y purificación del compuesto Av5.

2.5 Evaluación de la actividad antiinflamatoria

2.5.1 Edema en pata de rata inducido por λ-carragenina

Este experimento se realizó en el Bioterio de la Fundación Universitaria Juan N. Corpas. Para el estudio fueron empleadas ratas Wistar suizas albinas hembras con un peso corporal entre 130 a 180 g. Todos los animales fueron dispuestos en cajas estándar a temperatura ambiente (20± 2°C) y ciclos de luz/oscuridad de 12 horas, se les suministro alimento balanceado (LabDiet) y agua ad libitum. Antes de la administración de los tratamientos, los animales se dejaron en ayuno por 12 horas con libre acceso al agua (CYTED, 1995).

A los animales se les retiró el agua únicamente durante el tiempo del experimento, con el fin de garantizar uniformidad en la hidratación y minimizar la variabilidad en la respuesta edematosa.

Cuarenta y dos ratas fueron distribuidas aleatoriamente en 7 grupos de 6 animales cada uno. Se midieron los volúmenes normales de la pata derecha en un pletismómetro digital marca Ugo Basile, modelo 7140 (Figura 20a-b).

a. Pletismómetro marca Ugo Basile, modelo 7140 b. Medición del volumen normal de la pata derecha. Figura 20. Pletismómetro y medida del volumen normal de la pata derecha.

Los grupos se distribuyeron de la siguiente manera para cada una de las especies vegetales (Tabla 5).

Tabla 5.Distribución de los grupos por tratamientos para Conyza trihecatactis y Ageratina vacciniaefolia (Hernández, 2013).

Especies vegetales Grupos Conyza trihecatactis Ageratina vacciniaefolia 1 FCH2Cl2 Ct (300mg/Kg) FCHCl3 Av (300mg/Kg) 2 FEt2O Ct (300mg/Kg) FEt2O Av (300mg/Kg) 3 FAcOEt Ct (300mg/Kg) FAcOEt Av (300mg/Kg) 4 RHEt Ct (300mg/Kg) RHEt Av (300mg/Kg) 5 MCt1 (70mg/Kg) ExEtOH Av (300mg/Kg) 6 Control – (EtOH: Tween 20: Agua (10:5:85)) 7 Control + (Diclofenaco: 100 mg/Kg)

La lambda-carragenina fue obtenida de sigma–aldrich y el diclofenaco utilizado fue el medicamento genérico.

Todos los tratamientos fueron administrados por vía intraperitoneal (ip) (Figura 21- a), media hora después la inflamación de la pata derecha de cada rata, fue inducida mediante la inyección de 0,1 mL de una solución de lambda-carragenina al 1%, en la aponeurosis plantar (Figura 21-b-c). La medida del volumen de la pata derecha inflamada se realizó por inmersión utilizando el pletismómetro digital (Figura 21-d) (Saltan Çitoǧlu, Bahadir Acikara, Sever Yilmaz, y Özbek, 2012).

b. Administración de solución a. Tratamientos administrados vía de lambda-carragenina al 1%, ip. en la aponeurosis plantar.

c. Respuesta inflamatoria inducida d. Medida del volumen de la por lambda-carragenina. pata derecha inflamada. Figura 21. Actividad antiinflamatoria: Edema en pata de rata inducido por λ-carragenina.

Las mediciones se hicieron por duplicado y se registraron a la 1,3,5 y 7 hora después del inicio del experimento. El porcentaje de inflamación fue calculado con la siguiente formula: 푉표 − 푉푡 % 푑푒 𝑖푛푓푙푎푚푎푐𝑖ó푛 = 푥 100 푉표 Siendo, Vt: Volumen de la pata inflamada a un tiempo determinado. Vo: Volumen normal de la pata en el tiempo inicial.

El porcentaje de inhibición fue calculado mediante la siguiente expresión:

푋푐표푛푡푟표푙 − 푋푔푟푢푝표 % 푑푒 𝑖푛ℎ𝑖푏𝑖푐𝑖ó푛 = 푥 100 푋푐표푛푡푟표푙

Donde, Xcontrol es el porcentaje de inflamación promedio del grupo control negativo a un tiempo determinado y Xgrupo es el porcentaje de inflamación promedio de un grupo sometido a tratamiento con un extracto específico a un tiempo determinado (CYTED, 1995).

2.5.2 Análisis estadístico

Los resultados fueron expresados como la media ± SEM (Error estándar de la media). Para determinar las diferencias entre los diferentes tratamientos se realizó un análisis de varianza a una vía y la prueba de Tukey. Una p<0,05 fue considerada como significativa. Para el análisis se empleó el programa GraphPad Prism 6.0. Adicionalmente, el porcentaje neto de inhibición se calculó obteniendo el área bajo la curva de inflamación vs. tiempo.

2.5.3 Consideraciones éticas

Los animales fueron manejados según los criterios éticos y protocolos de manejo de animales de experimentación según la OECD documento 404 (OECD, 2002).

2.5.4 Estudio Histopatológico

Se siguieron las siguientes etapas para el proceso histopatológico, comenzando con fijación del tejido en formol al 10%, para detener la autolisis tisular posteriormente deshidratación tisular por inmersión sucesiva en etanol al 96%, alcohol isopropílico, xilol y por último una impregnación en parafina. Se secciona el tejido con micrótomo a 4 micras de espesor, se tiñe con coloración básica de hematoxilina y eosina (Lester, 2010) y se evalúa las láminas histológicas con microscopio óptico convencional (MOTIC BA310) a 40,100 y 400 aumentos. Este procedimiento se realizó en el Departamento de Patología de la Clínica Juan N. Corpas.

En el estudio histopatológico se evaluaron los siguientes parámetros morfológicos macro y microscópicos asociados a la respuesta inflamatoria tisular (Kumar et al. , 2010) (Tabla 6):

Tabla 6. Parámetros asociados a la respuesta inflamatoria (Kumar et al. , 2010).

PARÁMETROS MACROSCÓPICOS PARÁMETROS MICROSCÓPICOS

1. Edema: Cantidad anormalmente elevada de líquido en los espacios tisulares intercelulares. 2. Respuesta vascular: Dilatación del calibre vascular 1. Eritema: Enrojecimiento cutáneo y congestión (aumento del flujo sanguíneo) de un vaso, inducido por congestión capilar. fenómenos que facilitan la migración de células 2. Edema: Tumoración del tejido. inflamatorias. 3. Infiltrado inflamatorio: Cantidad y tipo de células inflamatorias (neutrófilos) que abandonan los vasos sanguíneos e infiltran el tejido afectado por la respuesta inflamatoria.

2.6 Evaluación de la actividad citotóxica

Para la realización de la prueba citotóxica se utilizaron las líneas celulares adherentes: 4T1 (línea celular de tumor mamario de ratón), TSA (adenocarcinoma mamario de ratón) y MCF-7 (adenocarcinoma mamario de humano) y 3T3 (línea de fibroblastos de origen murino).

2.6.1 Mantenimiento de las líneas celulares

Las células adherentes fueron mantenidas en medio RPMI-1640 (Eurobio, Toulose, FR) suplementado con suero fetal bovino (SFB) inactivado al (10%), 2 mM L- glutamina, 100 U/mL penicilina, 100 μg/mL estreptomicina, 0.01 M buffer Hepes, 1 mM piruvato de sodio (Eurobio) y se incubaron en atmosfera húmeda 37 °C y 5% de CO2. Cuando las células adherentes alcanzaron un 75% de confluencia, fueron tratadas con tripsina/EDTA 1X (Eurobio) por 4 minutos, posteriormente lavadas con

buffer fosfato salino 1X (PBS) y resuspendidas en medio RPMI-1640 suplementado (Rojas, 2015).

2.6.2 Ensayos de citotoxicidad

Los diferentes extractos y fracciones fueron evaluados sobre líneas celulares tumorales a través de la observación directa al microscopio, utilizando diferentes aumentos y examinando los siguientes parámetros: vacuolas intracelulares, resto celulares, células muertas y efecto sobre la adherencia celular. Para el ensayo de citotoxicidad, y cálculo de la CI50, se utilizó el ensayo con 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]- 2,5-difenil tetrazolio (MTT) (Rojas, 2015).

2.6.2.1 Determinación de la proliferación mediante el método de MTT

Para este método dependiendo de la tasa de replicación, células adherentes (3x103 células/pozo) y fibroblastos 3T3 (6x103 células/pozo), fueron cultivadas en placas de 96 pozos fondo redondo con 100 µL/pozo de medio RPMI- 1640 suplementado y se incubaron durante 12 horas a 37ºC, 5% CO2 para permitir formación de monocapa y observar una confluencia al menos de 20%. Tras la incubación, se tomaron 4 µL de los stocks de las fracciones (25 mg/mL) en un volumen final de 200 µL de RPMI- 1640 suplementado. A partir de allí se realizaron diluciones en serie con un factor 1:2 partiendo de 250 µg/mL hasta 1,95 µg/mL. El solvente utilizado para la dilución del extracto (etanol o DMSO 0,01% v/v), se evaluó como control negativo para cada prueba con el mismo volumen empleado para las fracciones, es decir entre un 1 y 2 % v/v. Como control positivo se empleó la Doxorrubicina (DOXO) a una concentración de 5 µM a 0,039 µM (Rojas, 2015).

Tras 48 horas con los tratamientos, el medio fue eliminado por inversión y se adicionaron 100 µL/ pozo de medio RPMI sin rojo de fenol y 50 µL/pozo de MTT en buffer fosfato salino (PBS) 1X. Las placas fueron incubadas durante 4 horas a 37ºC,

5% CO2, los cristales de formazán fueron disueltos por adición de 100 µL de

dimetilsulfóxido (DMSO) durante 30 minutos. La absorbancia fue leída a 540 nm en el fotómetro para microplacas MultiskanTM FC. Los valores de concentración inhibitoria 50 (CI50) se definieron como la concentración de los extractos que generó la inhibición del 50% del crecimiento de las células tumorales. Para calcular las

(CI50) de los tratamientos sobre las líneas celulares, se determinó el % de viabilidad empleando las ocho concentraciones decrecientes a partir de 250 µg/mL junto con el control positivo y negativo descrito anteriormente (Rojas, 2015).

Estos ensayos se realizaron de acuerdo con los protocolos estandarizados en el Laboratorio de Inmunobiología y Biología Celular de la Pontificia Universidad Javeriana.

2.6.2.2 Análisis estadístico

Mediante el programa GraphPad Prims 6.0, se calcularon las concentraciones inhibitorias 50, mediante una regresión no lineal, (CI50) en μg/mL. Los valores de los ensayos obtenidos se presentan como la media ± SEM. Los datos fueron analizados, mediante un análisis de varianza (ANOVA-2way) y las diferencias entre grupo control y los grupos tratados se determinaron a través de la prueba de Bonferroni. Se consideraron diferencias significativas para p<0,05.

2.7 Determinación de la capacidad antioxidante por el método del DPPH

2.7.1 Preparación del reactivo DPPH

La solución del radical libre DPPHse preparó en un balón aforado cubierto por papel aluminio a una concentración de 30 mM en metanol (MeOH) grado analítico y se transfirió a un frasco ámbar cubierto en papel aluminio para evitar su rápida descomposición.

2.7.2 Capacidad captadora del radical libre DPPH

Se utilizó el método planteado por Brand-Williams et al. (1995), con algunas modificaciones propuestas por Prada (2015).

A partir de una solución metanólica de 2,5 mg/mL, se agregó 2,5 µL, 5 µL, 10 µL, 20 µL y 40 µL del extracto y las fracciones a una placa de 96 pozos, cada pozo se llevó a 50 µL con metanol, posteriormente se adicionó 170 µL de DPPH 30 mM. La mezcla se mantuvo a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de medir su absorbancia a 520 nm. Se utilizó metanol como control negativo y los valores fueron comparados frente a un antioxidante comercial (BHT). Cada medida tuvo tres replicas. Para esto se siguió el protocolo descrito en la Figura 22.

Figura 22. Metodología para evaluación de la actividad antioxidante por el método del DPPH.

Con las absorbancias obtenidas se calculó el porcentaje de inhibición (%I) con la siguiente ecuación:

퐴푐표푛푡푟표푙(−) − (퐴푒푥푡푟푎푐푡표 표 푓푟푎푐푐𝑖ó푛 30푚𝑖푛) % 푑푒 퐼푛ℎ𝑖푏𝑖푐𝑖ó푛 = [ ] 푥100 퐴푐표푛푡푟표푙(−)

Donde, Acontrol (-): Absorbancia del control negativo (DPPH+MeOH)

Aextracto: Absorbancia de los extractos y fracciones después de 30min (promedio)

Este procedimiento fue realizado en el laboratorio de Fitoquímica de la Fundación Universitaria Juan N. Corpas.

2.7.3 Análisis estadístico

Mediante el programa GraphPad Prism 6.0, se construyeron las curvas dosis- respuesta y mediante una regresión no lineal, se calcularon las concentraciones inhibitorias 50 (CI50) en μg/mL.

2.7.4 Determinación de fenoles totales

Se tomó la metodología descrita por Mangalhães L. et al (2010) con modificaciones realizadas por Tovar del Rio (2013), como se observa en la Figura 23. Solo se evaluaron los extractos o fracciones que presentaron mejor capacidad antioxidante por el método del DPPH•.

Este ensayo se realizó en un lector de microplacas Elisa Accu Reader M965, utilizando una técnica espectrofotométrica y una placa de Elisa con 96 pozos; el reactivo Folin–Ciocaulteu se diluyó 1:50 (v/v) en agua.

La curva de calibración de ácido gálico se realizó tomando las siguientes concentraciones: 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 y 400 ppm (μg/mL). La concentración de los extractos y fracciones fue de 92, 184 y 368 μg/mL, concentraciones a las cuales las fracciones presentaron mayor capacidad antioxidante. El sistema de dilución se tomó como el control negativo (Acontrol(-)), 100 μL de los extractos y fracciones a las diferentes concentraciones se midieron espectrofotométricamente para descartar la absorbancia de los mismos (A blanco). Todas soluciones fueron medidas a una longitud de onda de 750nm.

Figura 23. Metodología para la determinación de fenoles totales para extractos, fracciones de Conyza trihecatactis y Ageratina vacciniaefolia.

2.8 Toxicidad aguda en Artemia salina

Se valoró la actividad tóxica de los extractos o fracciones que presentaron mejor actividad citotóxica por el método del MTT en nauplios de Artemia salina por el método descrita en el CYTED (1995). Para la eclosión de los huevos, se preparó el agua de mar a partir de 190 g de sal marina en 5 L de agua destilada. Se colocaron aproximadamente 500 mg de huevos de A. salina, luz artificial y una bomba de oxígeno con burbujeo lento, después de tres días se transfieren la mayor cantidad de nauplios a un vaso de precipitado con agua de mar fresca. Los extractos o fracciones se prepararon a las concentraciones de 1000, 100 y 10 ppm, transfiriendo en cada pozo 300, 30 y 3 μL respectivamente, a cada pozo se le agregaron 10 nauplios y la dilución del extracto o fracción requerida, y se agregó agua de mar hasta completar 3 mL. A cada pozo de le agrego una gota de suspensión de levadura como alimento. Cada ensayo se realizó por triplicado (Figura 24).

Figura 24. Ensayo de letalidad sobre A. salina Después de 24 horas, se contó y anotó el número de sobrevivientes en cada concentración.

2.8.1 Análisis estadístico

Los resultados fueron analizados utilizando una regresión Probit empleando el programa Minitab 17.0. para determinar la concentración letal 50 (CL50).

3. RESULTADOS Y ANÁLISIS

Dentro de los resultados obtenidos del estudio fitoquímico de las especies Conyza trihecatactis y Ageratina vacciniaefolia se encuentra el aislamiento, purificación y determinación estructural de los metabolitos secundarios obtenidos, y la evaluación de la actividad citotóxica, actividad antiinflamatoria, capacidad antioxidante, cuantificación de fenoles y toxicidad agua en Artemia salina de extractos y fracciones que presentaron los menores valores de CI50 en la actividad citotóxica.

3.1 Metabolitos secundarios aislados de Conyza trihecatactis

La purificación por cromatografía en columna de las fracciones de diclorometano y acetato de etilo, obtenidas a partir del extracto etanólico de las partes aéreas de la especie Conyza trihecatactis condujo al aislamiento y determinación de tres flavonoides identificados como: 3-metoxi-5,7,4´trihidroxiflavona (Ct2), apigenina (Ct3) y luteolina (Ct4) y una mezcla de flavonoides denominada MCt1 conformada por apigenina e hispidulina. Los compuestosfueron elucidados por métodos espectroscópicos y por comparación con los datos descritos en la literatura.

3.1.1 Elucidación estructural de Ct2

El compuesto Ct2 (3 mg) es un sólido amarillo, el cual presentó una mancha de color violáceo oscuro en CCF vista a la luz UV de 365 nm, que al ser revelada con NP/PEG y vista en longitud de onda larga, se observa una fluorescencia de color amarillo.

El sólido Ct2 se analizó por RMN y en el espectro RMN 1H (Figura 25) se observan señales correspondientes a hidrógenos de tipo aromático en la región de 6 a 8 ppm. A campo bajo del espectro se observa un singlete a δ 13.25 característico de un grupo OH fenólico que forma puente de hidrogeno con un grupo carbonilo, lo cual permite considerar la presencia de un grupo hidroxilo en los carbonos C-3 o C-5 de

un núcleo flavonoide. Las señales δ 7.02 (d, J= 8.9Hz, 2H) y δ 7.95 (d, J= 8.9Hz, 2H) se pueden asignar a los protones de las posiciones H-3’, H-5’ y H-2’, H-6’ respectivamente, al anillo B del flavonoide. La señal en δ 6.63 (d, J= 1.4Hz, 1H) y δ 6.67 (d, J= 1.4Hz, 1H) pueden ser atribuidas a los protones de las posiciones H-8 y H-6 del anillo A del flavonoide. La señal δ 3.87 (s, 3H) es característica de hidrógenos tipo metoxilo.

1 Figura 25.Espectro de RMN H (300MHz, Acetona-d6) de Ct2.

En el experimento J-MOD (Figura 26) se puede apreciar 9 señales de carbonos, de las cuales 4 corresponden a carbonos cuaternarios o metilénicos y las 5 faltantes a carbonos metínicos o metílicos. La señal de δ 183.5 corresponde a un grupo carbonilo, las señales de δ 94.6, 103.6, 116.8, 123.2, 129.2, 153.6 y 161.7 correspondientes a carbonos de tipo aromático, la señal de δ 60.6 a un carbono de tipo metoxilo.

13 Figura 26.Espectro de RMN C (75MHz, Acetona-d6) de Ct2.

En el espectro HSQC (Figura 27) se pudo establecer la conectividad del proton de δ 3.87 con el carbono δ 60.6 y los protones de δ 6.63 y δ 6.67 con los carbonos δ 94.6 y δ 103.6 respectivamente. El hidrogeno δ 7.02 con el carbono de δ 116.7 y el protón de δ 7.95 con el carbono δ 129.2.

(3.87, 60.6)

(6.63,94.6 )

(6.67, 103.6)

(7.02, 116.7)

(7.95, 129.2)

Figura 27.Ampliación del espectro HSQC en RMN 1H δ 3.5 a 8.7 ppm y 13C δ 70 a 140 ppm para Ct2.

Con el espectro HMBC (Figura 28), se realizó la asignación de las demás señales correspondientes a Ct2. En el anillo B las señales de los hidrógenos H-2’, H-6’ y H- 3’, H-5’ (δ 7.95 y δ 7.02) presentan correlación con los carbonos C-1’ y C-4’ (δ 123.2 y δ 161.7 respectivamente). En el anillo C al carbono C-2 se le asigno δ 153.6 por la correlación que presenta con el protón H-8 (δ 6.63), al carbono C-4 se le asigno δ 183.5 por la correlación con el hidrógeno H-6 (δ 6.67). La señal en δ 104.6 se le asignó al carbono C-10 debido a las correlaciones que se observaron con los H-6 y H-8 (δ 6.67 y δ 6.63) y a C-9 se le asigno la señal en δ 156.6 al presentar la correlación con el H-8 (δ 6.63). La señal en δ 164.3 se le asignó al carbono C-7 al tener correlación con el H-6 (δ 6.67) y la señal en δ 3.87 presenta correlación con el C-3 (δ 131.3), las correlaciones anteriormente mencionadas se muestran en la Figura 29.

(6.67, 104.6) (6.63,104.6)

(7.02, 116.8)

(7.02, 123.2) (3.87, 131.3) (7.95, 129.2)

(6.63,153.6) (7.02, 161.7) (6.63,156.6) (7.95, 161.7) (6.67,164.3)

(6.67,183.5)

(6.63,183.5)

Figura 28.Ampliación del espectro HMBC RMN 1H δ 3.8 a 8.10 ppm y 13C δ 90 a 200 ppm para Ct2.

Figura 29. Correlaciones HMBC para Ct2.

Para confirmar la estructura propuesta para el compuesto Ct2 se realizó un análisis de HPLC-DAD-MS (Figura 30) para determinar el ion molecular y el espectro UV-

Vis. Datafile Name:C13_2.lcd Sample Name:C13 Sample ID:C13 mAU % 270nm,1nm (1.00) B.Conc 4000

75.0 3000

2000 50.0

1000 25.0

0 0.0 11.50 11.75 12.00 12.25 12.50 12.75 min Figura 30. Cromatograma a 270nm del compuesto Ct2.

En modo positivo [M+H]+ (Figura 31) se presenta un ion de m/z 301 y en modo negativo [M-H]- (Figura 32) un ion de m/z de 299, en la Figura 33 se observa el espectro UV-Vis del compuesto Ct2 presentando máximos de absorción de 217, 274 y 334 nm característicos de compuestos de tipo flavonoide de acuerdo con los datos reportados en la literatura (Al-Dabbas et al. , 2011; Park et al. , 2011) se confirma que el compuesto corresponde a la 3-metoxi-5,7,4’-trihidroxiflavona.

Inten.(x1,000,000) 8.0 301 7.0

6.0

5.0

4.0

3.0

2.0

1.0 342

0.0 124 146 174 206 249 287 351 391 437 455 504 534 573 608 654 681 696 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 m/z Figura 31. Espectro de masas en modo positivo [M+H]+del compuesto Ct2.

Inten.(x1,000,000) 8.0 299 7.0

6.0

5.0

4.0

3.0

2.0

1.0 413 277 345 362 599 0.0 113 148 194 213 246 412 445 495 535 548 631 683 714 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 m/z Figura 32. Espectro de masas en modo negativo [M-H]-del compuesto Ct2.

mAU

750 11.649/ 1.00 334

500

274

217 297

250 247

225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 nm Figura 33. Espectro ultravioleta del compuesto Ct2.

Después del análisis de los datos de RMN, HPLC-DAD-MS y de la comparación con los datos reportados en la literatura, se asignaron los desplazamientos químicos para cada uno de los carbonos e hidrógenos de la molécula, la cual se identificó como 3-metoxi-5,7,4’-trihidroxiflavona. En la Tabla 7 se resumen los desplazamientos químicos obtenidos para el compuesto Ct2 y los descritos para este compuesto según Ajish et al. (2015) y Ren et al. (2012), tomados a diferentes frecuencias RMN 1H (500 y 400 MHz) RMN 13C (125 y 100.6 MHz) empleando como disolvente Acetona-d6.

Tabla 7.Comparación de los desplazamientos químicos del compuesto Ct2 con los de la 3-metoxi- 5,7,4’-trihidroxiflavona (Ajish et al. , 2014; Ren et al. , 2012).

Ct2* 3-metoxi-5,7,4’-trihidroxiflavona Posición RMN 1H RMN 13C RMN 1H** RMN 13C RMN 1H*** RMN 13C 2 - 153.6 - 156.9- 155.9 - 156.9 3 - 131.3 - 138.3 - 139.3 4 - 183.5 - 178.7 - 179.6 5 13.2 (s, OH,1H) 164.3 12.81 (s, OH,1H 162.1 12.81 (s, OH,1H 163.3 6.67 (d, 6.26 (d, J=2.0Hz, 6.26 (d, 6 103.6 98.5 99.5 J=1.4Hz, 1H) 1H) J=1.9Hz, 1H)

7 - 164.3 - 163.9 - 164.9 6.63 (d, 6.50 (d, J=2.0Hz, 6.50 (d, 8 94.6 93.6 94.6 J=1.4Hz, 1H) 1H) J=1.9Hz, 1H) 9 - 156.6 - 156.9- 155.9 - 157.9 10 - 104.6 - 105.1 - 106.1 1’ - 123.2 - 121.8 - 122.8 7.95 (d, 8.04 (d, J=9.0Hz, 8.03 (d, 2’ 129.2 130.3-129.6 131.3 J=8.9Hz, 2H) 2H) J=8.9Hz, 2H) 7.02 (d, 7.02 (d, J=9.0Hz, 7.03 (d, 3’ 116.8 115.5 116.5 J=8.9Hz, 2H) 2H) J=8.9Hz, 2H) 4’ - 161.7 - 160.0 - 161.0 7.02 (d, 7.02 (d, J=9.0Hz, 7.03 (d, 5’ 116.7 115.5 116.5 J=8.9Hz, 2H) 2H) J=8.9Hz, 2H) 7.95 (d, 8.04 (d, J=9.0Hz, 8.03 (d, 6’ 129.2 130.3-129.6 131.3 J=8.9Hz, 2H) 2H) J=8.9Hz, 2H) 3-OCH3 3.87 (s, 3H) 60.6 3.87 (s, 3H) 59.3 3.87 (s, 3H) 60.3 1 13 *Datos obtenidos a 300MHz para RMN H y 75MHz en RMN C (solvente Acetona-d6) 1 13 ** Datos obtenidos a 500MHz para RMN H y 125MHz en RMN C (solvente Acetona-d6) 1 13 *** Datos obtenidos a 400MHz para RMN H y 100.6MHz en RMN C (solvente Acetona-d6)

3.1.2 Elucidación estructural de Ct3

El compuesto Ct3 (3,1 mg) es un sólido amarillo, el cual mostró una mancha de color violeta oscuro en CCF a la luz UV de onda larga, al ser revelada con NP/PEG y vista a la luz UV de 365 nm mostró una fluorescencia de color amarillo verdoso.

El sólido Ct3 fue analizado por RMN. En el espectro de 1H presentado en la Figura 34, se observan señales que corresponden a hidrógenos de tipo aromático en la región de 6 a 8 ppm. A campo bajo del espectro se observa una señal en δ 13.03 característica de un grupo OH fenólico que forma puente de hidrogeno con un grupo carbonilo lo cual permite considerar la presencia de un grupo OH en la posición C3 o C5 de un núcleo flavonoides. Las señales de δ 6.27 (singlete ancho) y δ 6.56 (singlete ancho) se pueden asignar a los hidrógenos en las posiciones H-6 y H-8 respectivamente del anillo A del flavonoide. La señal de δ 7.02 (d, J=8.8Hz, 2H) puede ser asignada a los protones en posiciones H-3’ y H-5’ y la señal de δ7.95 (d, J=8.8Hz, 2H) a los protones en las posiciones H-2’ y H-6’ del anillo B del flavonoide.

1 Figura 34. Espectro de RMN H (300MHz, Acetona-d6) de Ct3.

El experimento HSQC (Figura 35) permitió establecer la conectividad de los protones δ 6.27 y δ 6.56 con los carbonos δ 98.7 y δ 93.8 respectivamente. El hidrogeno δ 6.04 con el carbono de δ 103.1, el hidrogeno δ 7.04 con el carbono δ 115.9 y el hidrogeno δ 7.95 con el carbono δ 128.3.

(6.56,93.8 )

(6.27,98.7 )

(6.64,103.1 )

(7.04,115.9 )

(7.95,128.3 )

Figura 35.Ampliación del espectro HSQC en RMN 1H δ 6.0 a 8.3 ppm y 13C δ 80 a 140 ppm para Ct3.

Con el espectro HMBC (Figura 36), se realizó la asignación del resto de señales del compuesto Ct3. En el anillo A, el protón H-6 (δ 6.27) presenta correlación con los C-8, C-9 y C-10 (δ 93.8, 162.7 y 104.6 respectivamente). El hidrogeno H-8 (δ6.56) presenta correlación con los carbonos C-6, C-9 y C-10 (δ 98.7, 157.2 y 104.6 respectivamente). En el anillo C al C-2 se le asigno δ 163.7 por la correlación con los hidrógenos H-2’, H-6’ y H-3 (δ 7.95 y 6.64), el hidrogeno H-3 (δ 6.64) presenta correlación con el C-4 (δ 182.0) y con el C-2 (δ 163.7). En el anillo B la señal C-1’ se le asigno la señal de δ 122.5 por la correlación con los protones H-3 y H-3’, H-5’ (δ 6.62 y 7.04), al carbono C-4’ se le asigno la señal de δ 160.8 por su correlación con los hidrógenos H-2’, H-4’ y H-3’, H-5’ (δ 7.95 y 7.04). Las correlaciones descritas anteriormente se muestran en la Figura 37.

(6.27,93.8) (6.56,98.7 ) (6.27,104.6) (6.64,104.6) (6.56,104.6) (7.04,115.9 )

(6.64,122.5)

(7.95,128.3 ) (7.04,122.5 )

(6.56,157.2 ) (7.95,160.8 ) (7.04,160.8 ) (6.27,162.7) (7.95,163.7) (6.64,163.7)

(6.64,182.0)

Figura 36.Ampliación del espectro HMBC RMN 1H δ 6.0 a 8.2 ppm y 13C δ 90 a 190ppm para Ct3.

Figura 37. Correlaciones HMBC para Ct3.

Para corroborar la estructura propuesta para el compuesto Ct3 se realizó un análisis de HPLC-DAD-MS (Figura 38) para determinar el ion molecular y el espectro UV- Vis. En modo positivo [M+H]+ (Figura 39) se presenta un ion de m/z 271 y una señal + con m/z 312 de un aducto de acetonitrilo (CH3CN) [M+H+41] y en modo negativo [M-H]- (Figura 40) un ionde m/z de 269, en la Figura 41 se observa el espectro UV-

Vis del compuesto Ct3 presentando máximos de absorción de 267 y 336 nm característicos de flavonoides, de acuerdo con los datos reportados en la literatura Datafile Name:C29_2.lcd Sample Name:C48-69 (Allaoua et al. , 2016) se confirmaSa mqueple I Del:C 4compuesto8-69 corresponde a la apigenina. mAU % 270nm,1nm (1.00) B.Conc 2000 75.0 1500

50.0 1000

500 25.0

0 0.0 11.00 11.25 11.50 11.75 12.00 12.25 min Figura 38. Cromatograma a 270 nm del compuesto Ct3.

Inten.(x100,000) 271 312 5.0

4.0

3.0

2.0 430 463 1.0 451 537 395 519 577 595 637 667 681 0.0 107 151 188 209 235 311 345 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 m/z Figura 39. Espectro de masas en modo positivo [M+H]+del compuesto Ct3.

Inten.(x100,000) 269

5.0

4.0 539

3.0

2.0 383 1.0 285 332 457 342 410 487 628 683 0.0 111 151 171 207 251 517 570 599 667 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 m/z Figura 40. Espectro de masas en modo negativo [M-H]-del compuesto Ct3.

mAU

11.529/ 1.00 336

750 267

500 281 246

250

0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm Figura 41. Espectro ultravioleta del compuesto Ct3.

Después del análisis de los datos por RMN y HPLC-DAD-MS y de la comparación con los datos reportados en la literatura, se asignaron los desplazamientos químicos para cada uno de los hidrógenos y carbonos del compuesto, el cual se identificó como la apigenina. En la Tabla 8 se resumen los desplazamientos químicos, asignados para el compuesto Ct3 y los descritos para este compuesto según Teles et al. (2015) y Allaoua et al. (2016).

Tabla 8.Comparación de los desplazamientos químicos del compuesto Ct3 con los de la apigenina (Allaoua et al. , 2016; Teles et al. , 2015).

Ct3* Apigenina Posición RMN 1H RMN 13C RMN 1H** RMN 13C RMN 1H*** RMN 13C 2 - 163.7 - 164.3 - 164.6 3 6.64 (s, 1H) 103.1 6.78 (s, 1H) 103.4 6.59 (s, 1H) 102.4 4 - 182.0 - 182.3 - 182.4 5 13.3(s, 0H), 167.7 12.96(s, 0H), 162.0 no reporta 161.8 6.19 (d, J = 1.8 Hz, 6 6.27 (s ancho) 98.7 99.4 6.21 (s, 1H) 98.7 1H) 7 - 162.7 - 164.7 - 164.9 6.48 (d, J = 1.8 Hz, 8 6.57 (s ancho) 93.7 94.5 6.49 (s, 1H) 93.5 1H) 9 - 157.2 - 157.9 - 149.5 10 - 104.6 - 104.2 - 103.9 1’ - 122.5 - 121.7 - 122.3 7.95 (d, J = 8.8 7.92 (d, J = 8.8 Hz, 7.40 (d, J = 8.8 2’ 128.3 129.0 127.5 Hz, 2H) 2H) Hz, 2H) 7.04 (d, J = 8.8 6.93 (d, J = 8.8 Hz, 6.90 (d, J = 8.8 3’ 115.9 116.5 115.3 Hz, 2H) 2H) Hz, 2H) 4’ - 160.8 161.7 158.0 7.04 (d, J = 8.8 6.93 (d, J = 8.8 Hz, 6.90 (d, J = 8.8 5’ 115.9 116.5 115.3 Hz, 2H) 2H) Hz, 2H) 7.95 (d, J = 8.8 7.92 (d, J = 8.8 Hz, 7.40 (d, J = 8.8 6’ 128.3 129.0 127.5 Hz, 2H) 2H) Hz, 2H) 1 13 *Datos obtenidos a 300MHz para RMN H y 75MHz en RMN C (solvente Acetona-d6) 1 13 ** Datos obtenidos a 400MHz para RMN H y 100MHz en RMN C (solvente DMSO-d6) 1 13 *** Datos obtenidos a 500MHz para RMN H y 500MHz en RMN C (solvente CD3OD -d6)

3.1.3 Elucidación estructural de Ct4

El compuesto Ct4 (4,8 mg) es un sólido amarillo, el cual mostró en CCF una mancha de color violáceo oscuro, que al ser revelada con NP/PEG y vista a la luz UV de 365 nm se observó una fluorescencia de color amarillo-naranja.

Este sólido fue analizado por RMN. En el experimento de 1H (Figura 42) se observan señales que corresponden a protones de tipo aromático en la región de 6 a 8 ppm. La señal de δ 13.04 que aparece en campo bajo del espectro es característica de un grupo OH fenólico que forma puente de hidrógeno con un grupo carbonilo, lo cual podría indicar la presencia de un grupo OH en C-3 o C-5 de un flavonoide. Las señales de δ 6.25 (d, J=2.2 Hz, 1H) y δ 6.53 (d, J=2.2 Hz, 1H) podrían asignarse a los protones de las posiciones H-6 y H-8 del anillo A del flavonoide. La señal en δ 7.02 (d, J=8.3Hz, 1H) se puede asignar al hidrógeno en posición H-5´, la señal en δ 7.48 (dd, J=8.3-2.2 Hz, 1H) al protón en posición H-6’ y la señal de δ 7.50 (d, J=2.2 Hz, 1H) al protón en posición H-2’.

1 Figura 42. Espectro de RMN H (300MHz, Acetona-d6) de Ct4.

El espectro HSQC (Figura 43) permitió establecer la conectividad de los hidrógenos δ 6.25, 6.53 y 6.58 con los carbonos δ 99.7, 94.6 y 103.3 respectivamente. El protón en δ 7.02 con el carbono δ 116.1, el hidrógeno δ 7.48 con el carbono en δ 120.1 y el protón en δ 7.51 con el carbono δ114.1.

(6.53,94.6 )

(6.25,99.7 )

(6.58,103.3 )

(7.5,114.1 )

(7.02,116.1 )

(7.48,120.1)

Figura 43.Ampliación del espectro HSQC en RMN 1H δ 6.1 a 7.6 ppm y 13C δ 80 a 125 ppm para Ct4.

Con el experimento HMBC (Figura 44) se realizó la asignación de las demás señales que corresponden al compuesto Ct4. En el anillo B la señal en δ 150.1 se asignó al C-4’ debido a las correlaciones que tiene con los protones H-2’, H-5’ y H- 6’ (δ 7.5, 7.02 y 7.48 respectivamente). La señal en δ 122.8 se le asignó al carbono C-2’ por las correlaciones con los hidrógenos en posiciones H-5’y H-3 (δ 7.02 y 6.58), al carbono C-3’ se le asigna la señal en δ 146.4 por la correlación con el H-5’ (δ 7.02). En el anillo C al carbono C-2 se le asigna la señal en δ 164.1 debido a las correlaciones con los protones H-3, H-2’ y H-6’ (δ 6.58, 7.5 y 7.48 respectivamente). En el anillo A al C-10 se le asigno la señal de δ 104.2 por las correlaciones con los hidrógenos H-3 (δ 6.58), H-6 (δ 6.25) y H-8 (δ 6.53). Las señales en δ 157.4 y δ 164.5 se les asignaron a los carbonos C-9 y C-7 por su correlación con el H-8 (δ6.53). Las correlaciones anteriormente descritas se muestran en la Figura 45.

(6.25,94.6 )

(6.53,99.7 ) (6.53,104.2 ) (6.25,104.2 ) (6.58,104.7) (7.48,114.1) (7.5,120.1) (7.02,122.8) (6.58,122.8)

(7.5,150.1) (7.02,146.4)

(7.02,150.1) (7.48,150.1) (6.53,157.4) (7.5,164.1) (7.48,164.1) (6.58,164.1) (6.53,164.5)

(6.58,183.0)

Figura 44.Ampliación del espectro HMBC RMN 1H δ 6.1 a 7.6 ppm y 13C δ 80 a 190ppm para Ct4.

Figura 45. Correlaciones HMBC para Ct4. Para conformar la estructura propuesta para el compuesto Ct4 se realizó un análisis de HPLC-DAD-MS (Figura 46) para determinar el ion molecular y el espectro UV- Vis. En modo positivo [M+H]+ (Figura 47) se presenta un ion de m/z 287 y una señal + con m/z 328 de un aducto de acetonitrilo (CH3CN) [M+H+41] yen modo negativo

[M-H]- (Figura 48) un ion de m/z de 285, en la Figura49 se presenta el espectro UV- Vis del compuesto Ct4 mostrando máximos de absorción de 266 y 346 nm característicos de flavonoides, de acuerdo con los datos reportados en la literatura (Farag, Farag, Abdelrahman, Azzam, y El-Kashoury, 2015; Pamplona et al. , 2015), Datafile Name:C48-70.lcd Sample Name:C48-69 se confirma que el compuesto correspondeSample ID:C48-6 9a la luteolina. mAU % 270nm,1nm (1.00) B.Conc

3000 75.0

2000 50.0

1000 25.0

0 0.0 10.00 10.25 10.50 10.75 11.00 11.25 11.50 11.75 min Figura 46. Cronograma a 270 nm del compuesto Ct4.

Inten.(x1,000,000) 328 1.00

287 0.75

0.50

0.25 347 443 479 613 150 195 223 241 293 392 413 493 518 545 583 629 0.00 124 178 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.0 500.0 525.0 550.0 575.0 600.0 625.0m/z Figura 47. Espectro de masas en modo positivo [M+H]+ del compuesto Ct4.

Inten.(x1,000,000) 285 1.00

0.75

0.50

0.25 399 287 465 543 315 345 503 107 147 167 180 213 227 241 378 419 437 485 525 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.0 500.0 525.0 m/z Figura 48. Espectro de masas en modo negativo [M-H]-del compuesto Ct4.

mAU 10.822/ 1.00

500 6

400 4

2 6

300 6

2 1

200 8

2 2

100 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 nm Figura49.Espectro ultravioleta del compuesto Ct4.

Luego del análisis de los datos de RMN, HPLC-MS y de la comparación con los datos reportados en la literatura, se realizó la asignación de los desplazamientos químicos para cada carbono e hidrógeno presentes en la molécula, la cual se identificó como luteolina. En la Tabla 9 se presentan los desplazamientos químicos obtenidos para el compuesto Ct4 y los descritos para la luteolina según Ismail et al. (2014) y Ma, Liu, Zhan y Chen (2016).

Tabla 9.Comparación de los desplazamientos químicos del compuesto Ct4 con los de la luteolina (Ismail et al. , 2014; Ma, Liu, Zhan, y Chen, 2016)

Ct4* Luteolina Posición RMN 1H RMN 13C RMN 1H** RMN 13C RMN 1H*** RMN 13C 2 - 164.1 - 165.7-165.1 - 167.1 3 6.58 (s) 103.3 6.55 (s) 102.5 6.91 (s) 105.2 4 - 183.0 - 182.6 - 184.0 5 13.02 (s, 0H) 163.3 12.1 (s, 0H) 161.8 13.7 (s, 0H) 164.1 6.25 (d, J =2.2 6.73 (d, J = 1.5 Hz, 6 99.7 6.21 (d, 1H) 99.3 101.2 Hz, 1H) 1H) 7 - 164.5 - 162.2 - 166.1 6.53 (d, J = 2.2 6.73 (d, J = 1.5 Hz, 8 94.6 6.45 (d, 1H) 94.4 96.1 Hz, 1H) 1H) 9 - 157.4 - 158.3 - 159.8 10 - 104.2 - 103.9 - 106.3 1’ - 122.8 - 122.4 - 124.2 7.5 (d, J=2.2 2’ 114.1 7.39 (d, 1H) 114.2 7.9 (d, J = 1.5 Hz, 1H) 115.9 Hz, 1H) 3’ - 146.4 - 145.9 - 149.0 4’ - 150.1 - 149.9 - 153.0 7.02 (d, J = 8.3 6.91 (d, J = 8.5 7.29 (d, J = 8.5 Hz, 5’ 116.6 No reporta 118.1 Hz, 1H) Hz, 1H) 1H) 7.48 (dd, J = 7.40 (dd, J = 8.5 7.53 (dd, J = 8.5-1.5 6’ 120.1 119.2 120.8 8.3-2.2 Hz, 1H) Hz, 1H) Hz, 1H) 1 13 *Datos obtenidos a 300MHz para RMN H y 75MHz en RMN C (solvente Acetona-d6) 1 13 ** Datos obtenidos a 500MHz para RMN H y 125MHz en RMN C (solvente Acetona-d6) 1 13 *** Datos obtenidos a 500MHz para RMN H y 125MHz en RMN C (solvente Pyr -d6)

3.1.4 Elucidación estructural de MCt1

La mezcla MCt1 (13,8 mg) es un sólido amarillo, con un punto de fusión de 270-285 ºC, la cual presentó dos manchas de color violeta oscuro al ser observada bajo luz UV de 365 nm en la CCF; al ser reveladas con NP/PEG y nuevamente observadas bajo luz UV de longitud de onda larga se observó una mancha con fluorescencia de color amarillo verdoso.

El sólido MCt1 fue analizado empleando MS por inyección directa y en la TIC obtenida se evidenciaron dos señales que al comparar sus espectros de masas con los almacenados en la librería NIST 08 permitió identificar la hispidulina y la apigenina con un 90% de coincidencia.

El espectro de masas correspondiente a la Figura 49, pertenece a la señal que aparece en un tiempo de retención (Tr) de 6,77 min muestra el ion molecular a m/z 300 siendo este mismo el pico base, correspondiente con la fórmula molecular

C16H12O6, las señales en m/z 285, 257, 167, 139, 121, 119 y 118 que de acuerdo con la literatura corresponden a hispidulina (Reutrakul et al. , 2004; Seghiri, Mekkiou, Boumaza, y Benayache, 2006).

Figura 49. Espectro de masas en modo ionización electrónica para la hispidulina. Otras señales características corresponden a m/z: 285 el cual es atribuible a la pérdida de CH3 (M-15), a partir de este se origina el pico a m/z 257 que se da por la pérdida de CO (M-28). La señal a m/z 121 se debe a la ruptura del carbono 2 y 3 del anillo C (ver Figura 50) (Mabry y Markham, 1975).

Figura 50. Ruta de fragmentación propuesta para la hispidulina.

El TIC muestra una señal característica a Tr de 7,57 min, el espectro de masas de la Figura 51 corresponde al segundo componente de MCt1,en este se observa el ion molecular a m/z 270, que esta en concordancia con la fórmula molecular

C15H10O5, también se observan las señales en m/z 242, 153 y 121 que de acuerdo con lo reportado en la literatura corresponde a apigenina (Kavvadias, Monschein, y Riederer, 2003).

Figura 51.Espectro de masas en modo ionización electrónica para la apigenina. El pico a m/z 242 corresponde a la pérdida de CO (M-28), la ruta de fragmentación del ion molecular está en condicionada por una ruptura retro Diels Alder, para generar el fragmento a m/z 153 por la perdida del anillo C y B. La señal a m/z 121 resultó de la ruptura del anillo C. En la Figura 52 se propone la ruta de fragmentación para la apigenina.

Figura 52. Ruta de fragmentación propuesta para la apigenina.

La mezcla MCt1 también fue analizada por RMN 1H y 13C, para confirmar sus estructuras.

1 En el espectro de RMN H (300MHz, DMSO d6) presentado en la Figura 53 se observan señales correspondientes a protones aromáticos en la región de 6 a 8 ppm. A campo bajo del espectro se observan dos señales a δ 12.9 y 13.02 características del grupo OH fenólico que forma puente de hidrógeno con un grupo carbonilo; lo cual permite considerar la presencia de dos compuestos y la presencia de un grupo hidroxilo en la posición C3 o C5 de un núcleo flavonoide.

Las señales de δ 6.92 (d, J=8.5 Hz, 4H) y δ 7.89 (d, J=8.5 Hz, 4H) se pueden asignar a los hidrógenos en las posiciones H-3’, H-5’, y H-2’, H-6’ respectivamente del anillo B de los dos flavonoides presentes en la mezcla siendo estas señales comunes para los dos compuestos.

1 Figura 53. Espectro de RMN H (300MHz, DMSO-d6) de la MCt1.

La señal en δ 6.58 (s, 1H) puede ser asignada al protón en posición H-8 del anillo A de uno de los flavonoides, al cual también le fue atribuida la señal de δ 3.74 (s, 3H) característica de protones de tipo metoxilo. Las señales de 6.18 (singlete ancho) y δ 6.47 (singlete ancho) pueden ser atribuidas a los protones en las posiciones H-6 y H-8 ubicados en el anillo A del segundo flavonoide. En la Figura 54 se muestra la asignación de señales a cada uno de los flavonoides presentes en la mezcla.

Flavonoide 1 Flavonoide 2 Figura 54.Asignación de algunas señales de los flavonoides presentes en MCt1.

En el espectro RMN 13C (J-MOD) para la mezcla MCt1 tomado a 75 MHz en DMSO d6, (Figura 55); se pueden observar 14 señales de carbonos, de las cuales 9 corresponden a carbonos cuaternarios o metilénicos y las 5 restantes a carbonos metílicos o metínicos. De estas señales se resaltan por su desplazamiento químico la de δ 182.3 correspondiente a un grupo carbonilo, las señales de δ 94.5, 102.5; 104.1, 116.2, 121.4, 128.6, 131.6, 152.6, 153.0, 157.7, 161.3, 164.0 y 182.3 correspondiente a carbonos aromáticos y la de δ 60.16 característica de carbonos tipo metoxilo.

13 Figura 55. Espectro de RMN C (75MHz, DMSO-d6) de la MCt1.

La conectividad de cada hidrógeno con el carbono al cual se encuentra unido, se realizó mediante el análisis del espectro HSQC (Figura 56). El hidrogeno de δ 6.72 con el carbono de δ 102.7; el de δ 6.92 con el carbono δ 116.32 y el protón de δ 7.89 con el carbono de δ 128.9; estas señales son comunes para los flavonoides 1 y 2 presentes en la mezcla.

(6.72,102.7)

(6.92,116.32)

(7.89,128.6)

Figura 56. Ampliación del espectro HSQC en RMN 1H δ 6.5 a 8.7 ppm y 13C δ 70 a 135 ppm para MCt1.

En la Figura 57 se observa la asignación de hidrógenos y carbonos pertenecientes al flavonoide 1; como el protón de δ 3.74 con el carbono δ 60.34 y el hidrogeno de δ 6.58 con el carbono de δ 94.5. Las señales de δ 6.18 con el carbono δ 99.3 y la del protón de δ 6.47 con el carbono 94.1 (Figura 58) fueron asignadas al flavonoide 2.

(3.74, 60.34)

(6.58,94.5)

Figura 57.Ampliación del espectro HSQC en RMN 1H δ 3.0 a 7.0 ppm y 13C δ 50 a 120 ppm para el flavonoide 1.

(6.47,94.1)

(6.18, 99.3)

Figura 58.Ampliación del espectro HSQC en RMN 1H δ 5.4 a 7.0 ppm y 13C δ 80 a 120 ppm para el flavonoide 2.

Con el espectro HMBC (Figura 59) se logró establecer que los anillos B y C del núcleo flavonoide son iguales para los dos compuestos presentes en la mezcla MCt1. En el anillo B los protones H-3 (δ 6.72), H-2’- H6’ (δ 7.89) y H-3’-H5’ (δ 6.92) presentan correlación con los carbonos C-1’ (δ 121.6) y C-4’ (δ 161.3). En el anillo C al C-2 se le asigno δ 164.3 por la correlación que presenta con los protones H-2’- H6’ (δ 7.89) y H-3 (δ 6.72). La señal de H-3 (δ 6.72) presentó correlación con los carbonos C-2 (δ 164.3), C-4 (δ 182.3), C-10 (δ 104.2) y C-1’ (δ 121.6).

(6.72,104.2)

(6.92,116.3)

(6.92,121.6) (6.72,121.6) (7.89,128.9)

(7.89,161.3) (6.92,161.3) (6.72,164.3)

(7.89,164.3)

(6.72,182.5)

Figura 59. Ampliación del espectro HMBC RMN 1H δ 6.5 a 8.0 ppm y 13C δ 100 a 190 ppm para MCt1.

Para diferenciar los dos flavonoides presentes en la mezcla se asignaron las correlaciones del anillo A de cada uno de ellos de la siguiente manera: para el flavonoide 1 la señal de δ 3.74 presenta correlación con el C-6 (δ 131.7), la señal en δ 6.58 muestra correlación con los carbonos C-4 (δ 182.3), C-5 (δ 152.6), C-6 (δ

131.6), C9 (δ 153.1) y C-10 (δ 104.2) las correlaciones descritas anteriormente se muestran en la Figura 60.

(6.58,104.2)

(6.58,131.6) (3.74, 131.7)

(6.58,152.6)

(6.58,153.1)

(6.58,182.3)

Figura 60. Ampliación del espectro HMBC RMN 1H δ 3.6 a 7.0 ppm y 13C δ 90 a 190 ppm para el flavonoide 1

Para el flavonoide 2 la señal del H-6 (δ 6.18) correlaciona con los carbonos C-9 (δ 157.7) y C-10 (δ 103.8). La señal del H-8 (δ 6.47) correlaciona con los carbonos C5 (δ 161.1) y con el C-10 (δ 103.8). Las correlaciones anteriormente mencionadas se presentan en la Figura 61.

(6.47,103.8) (6.18,103.8)

(6.47,157.7) (6.18,161.1)

Figura 61. Ampliación del espectro HMBC RMN 1H δ 5.70 a 6.60 ppm y 13C δ 90 a 180 ppm para el flavonoide 2.

Las correlaciones descritas anteriormente se muestran en la Figura 62 y Figura 63.

Figura 62. Correlaciones HMBC para el flavonoide 1.

Figura 63. Correlaciones HMBC para el flavonoide 2.

Para confirmar las estructuras propuestas para los flavonoides 1 y 2 presentes en la mezcla MCt1 se realizó D unataf ile análisis Name:Mx Fl deavC _ HPLC11.lcd -DAD-MS (Figura 64) para Sample Name:MxFlavC determinar el ion molecular y elSa mespectrople ID:MxF laUVvC -Vis. mAU % 270nm,4nm (1.00) B.Conc 1500 75.0

1000 50.0

500 25.0

0 0.0 14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 19.0 20.0 21.0 22.0 23.0 min Figura 64. Cromatograma a 270nm de MCt1.

En el tiempo de retención de 15.60 min, en modo positivo [M+H]+ (Figura 65) se presenta un ion de m/z 271 y en modo negativo [M-H]-(Figura 66) un ion de m/z de 269, en la Figura 67 se presenta el espectro UV-Vis del flavonoide 2 mostrando máximos de absorción de 267 nm y 334 nm característicos de compuestos de tipo flavonoide (Tsimogiannis, Samiotaki, Panayotou, y Oreopoulou, 2007), de acuerdo con los datos reportados en la literatura se confirma que el compuesto corresponde a la apigenina.

Inten.(x1,000,000) 2.0 271 1.5

1.0 312 0.5 331 270 0.0 224 239 255 289 301 330 348 367 372 389 394 407 416 432 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 m/z Figura 65. Espectro de masas en modo positivo [M+H]+ del flavonoide 2.

Inten.(x1,000,000) 2.0 269 1.5

1.0

0.5

271 0.0 216 227 237 253 287 299 312 329 341 353 367 383 399 405 428 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 m/z Figura 66.Espectro de masas en modo negativo [M-H]- del flavonoide 2.

mAU 15.482/ 1.00 750

500

334 267

250 282 246

0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 nm Figura 67. Espectro ultravioleta del flavonoide 2.

En el tiempo de retención de 15.90 min en modo positivo [M+H]+ (Figura 68) se muestra un ion con m/z de 301. En modo negativo [M-H]- se presenta un ion de m/z en 299 (Figura 69). En el espectro UV (Figura 70) del flavonoide 1 se observan los máximos de absorción en 272 nm y 334 nm, señales características de flavonoides. Estos datos fueron comparados con los reportados por Wang et al., (2015), encontrado que el compuesto corresponde a la hispidulina.

Inten.(x1,000,000) 6.0 301

5.0

4.0

3.0

2.0

1.0 342 0.0 286 298 312 331 354 365 378 396 412 427 434 450 462 477 487 497 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.0 m/z Figura 68. Espectro de masas en modo positivo [M+H]+ del flavonoide 1

Inten.(x1,000,000) 2.0 299

1.5

1.0

0.5

269 105 0.0 133 172 231 245 345 369 411 435 463 513 550 583 599 644 682 724 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 m/z Figura 69. Espectro de masas en modo negativo [M-H]- del flavonoide 1.

mAU 16.059/ 1.00

500

214

208 334

250 272

297 247

0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 nm Figura 70. Espectro ultravioleta del flavonoide 1.

Luego del análisis de los datos de RMN, MS, HPLC-DAD-MS y de la comparación con datos reportados en la literatura, se determinó que el flavonoide 1 corresponde a hispidulina y el flavonoide 2 la apigenina. En la Tabla 10 se resumen los desplazamientos químicos obtenidos para el flavonoide 1 los descritos para la hispidulina según Chao et al. (2015), tomados a diferente frecuencia, RMN-1H (500

13 MHz) RMN C (125 MHz) empleando como disolvente DMSO-d6 y para el flavonoide 2 los descritos por Teles et al. (2015), tomados a diferente frecuencia, 1 13 RMN H (400 MHz) RMN C (100 MHz) empleando como disolvente DMSO-d6.

Tabla 10.Comparación de los desplazamientos químicos de los flavonoides presentes en la mezcla MCt1 con los de la hispidulina y apigenina (Chao et al. , 2015; Teles et al. , 2015).

Flavonoide 1* Hispidulina** Flavonoide 2* Apigenina*** Posición RMN 1H RMN 13C RMN 1H RMN 13C RMN 1H RMN 13C RMN 1H RMN 13C 2 - 164.3 - 163.8 - 164.3 - 164.3 3 6.72 (s, 1H) 102.7 6.77 (s, 1H) 102.4 6.72 (s, 1H) 102.7 6.78 (s, 1H) 103.4 4 - 182.3 - 182.1 - 182.3 - 182.3 13.02 (s, 13.07 (s, 12.9 (s, 12.9 (s, 5 152.6 152.8 161.1 162.0 OH,1H) OH,1H) OH,1H) OH,1H) 6.18 (d, 6.19 (d, 6 - 131.6 - 131.4 99.3 99.4 J=1.8Hz, 1H) J=1.8Hz, 1H) 7 - 158.4 - 157.3 - - 164.7 6.47 (d, 6.47 (d, 8 6.58 (s, 1H) 94.4 6.59 (s, 1H) 94.3 94.4 94.5 J=1.8Hz, 1H) J=1.8Hz, 1H) 9 - 153.0 - 152.4 - 157.7 - 157.9 10 - 104.2 - 104.1 - 103.8 - 104.2 1’ - 121.6 - 121.2 - 121.6 - 121.7 7.89 (d, 7.92 (d, 7.89 (d, 7.92 (d, 2’ 128.6 128.5 128.6 129.0 J=8.5Hz, 4H) J=8.5Hz, 4H) J=8.5Hz, 4H) J=8.7Hz, 2H) 6.92 (d, 6.93 (d, 6.92 (d, 6.93 (d, 3’ 116.3 116.0 116.3 116.5 J=8.5Hz, 4H) J=8.5Hz, 4H) J=8.5Hz, 4H) J=8.5Hz, 2H) 4’ - 161.3 - 161.2 - 161.3 - 161.7 6.92 (d, 6.93 (d, 6.92 (d, 6.92 (d, 5’ 116.3 116.0 116.3 116.5 J=8.5Hz, 4H) J=8.5Hz, 4H) J=8.5Hz, 4H) J=8.7Hz, 2H) 7.89 (d, 7.92 (d, 7.89 (d, 7.92 (d, 6’ 128.6 128.5 128.6 129.0 J=8.5Hz, 4H) J=8.5Hz, 4H) J=8.5Hz, 4H) J=8.7Hz, 2H) 6-OCH3 3.74 (s, 3H) 60.34 3.75 (s, 3H) 60.0 - - - - 1 13 *Datos obtenidos a 300MHz para RMN H y 75MHz en RMN C (solvente DMSO-d6) 1 13 ** Datos obtenidos a 500MHz para RMN H y 125MHz en RMN C (solvente DMSO-d6) 1 13 *** Datos obtenidos a 400MHz para RMN H y 100MHz en RMN C (solvente DMSO-d6)

3.2 Evaluación de la actividad antiinflamatoria para Conyza trihecatactis

Se evaluó la actividad antiinflamatoria de FCH2Cl2 Ct, FEt2O Ct, FAcOEt Ct, RHEt Ct y MCt1 y se compararon con el diclofenaco, fármaco antiinflamatorio no esteroideo de uso frecuente.

En la Tabla 11 y Figura 71 se muestra el efecto antiinflamatorio de los diferentes tratamientos a los diferentes tiempos de experimentación. El efecto antiinflamatorio de FEt2O Ct y MCt1 a la primera hora de experimentación fue de 47,62% y 31,53% respectivamente, mostrando en este tiempo diferencia estadísticamente significativa con respecto al grupo control negativo (EtOH: Tween 20: Agua

(10:5:85)), p<0,005. A la 3, 5 y 7 horas de experimentación disminuyo el efecto antiinflamatorio evidenciándose un aumento en los porcentajes de inflamación.

A la primera hora de experimentación, las fracciones FCH2Cl2 Ct, FAcOEt Ct y RHEt Ct presentaron porcentajes de inflamación de 15,52%, 8,94% y 23.86%, respectivamente, manteniéndose hasta la 5ª h, mostrando en estos tiempos diferencias estadísticamente significativas con respecto al control negativo, *** p<0,0001.

Tabla 11. Actividad antiinflamatoria de fracciones y compuestos obtenidos de Conyza trihecatactis expresada como porcentaje de inflamación.

TRATAMIENTOS (% DE INFLAMACIÓN) TIEMPO (EtOH: Tween 20: Diclofenaco (Horas) FCH Cl Ct FEt O Ct FAcOEt Ct RHEt Ct MCt1 Agua (10:5:85) 2 2 2 Control (+) Control (-) T1 15,52± 5,96 47,62±21,9 8,94±3,16 23,86±7,94 31,53±5,67 10,53±7,99 88,16±13,6 T3 22,19±5,35 56,85±11,4 26,57±9,28 36,58±11,8 51,08±4,19 19,84±12,3 142,83±21,1 T5 28,12±5,91 50,14±6,93 36,44±9,13 57,50±14,9 64,06±8,63 29,07±6,09 93,76±12,8 T7 44,14±10,4 80,55±10,8 39,25±11,4 40,23±14,3 90,08±13,2 25,90±11,1 85,09±10,3

140

120

ó i

c 100 a *

m *

a 80

f n

i ***

60 e

d ***

40 *** % 20 0 t t t t 1 o - C C C C t c l t t C o l 2 O a r C E E M n t t 2 O .H fe n H 2 E c o o . A R l C C F . ic . F F D Figura 71. Efecto antiinflamatorio de fracciones y compuestos obtenidos de Conyza trihecatactissobre el edema inducido en pata de rata con -carragenina.

*** p<0,0001. * p<0,005 con respecto al grupo control negativo.

En la Tabla 12 y Figura 72 se muestran los promedios de los porcentajes de inhibición de la inflamación en los cinco grupos tratados en los tiempos: 1, 3, 5 y 7 horas de experimentación. FCH2Cl2 Ct y FAcOEt Ct presentaron los mayores

porcentajes de inhibición a la primera hora después de comenzar el estudio (91,06% y 84,48%) y los valores menores a la séptima hora de seguimiento (55,86% y 60,75%, respectivamente).

El mayor efecto antiinflamatorio de FEt2O Ct, RHEt Ct y MCt1 se observa a la primera hora de experimentación (52,38%, 76,14% y 68,47%, respectivamente).

Tabla 12. Actividad antiinflamatoria de fracciones y compuestos obtenidos de Conyza trihecatactis expresada como porcentaje de inhibición de la inflamación.

TIEMPO TRATAMIENTOS (% DE INHIBICIÓN) (Horas) FCH2Cl2 Ct FEt2O Ct FAcOEt Ct RHEt Ct MCt1 T1 84,48 52,38 91,06 76,14 68,47 T3 77,81 43,15 73,43 63,42 48,92 T5 71,88 49,86 63,56 42,50 35,94 T7 55,86 19,45 60,75 59,77 9,92

100 *** ***

*** * n

ó *

i 50

d 0

-50 t t t t 1 o - C C C C t c l t t C a ro l 2 O E E M n t C t 2 H e n 2 O . f o H E c R o C . A l C . F . ic F F D Figura 72. Capacidad inhibitoria de la inflamación de compuestos y fracciones obtenidos a partir de Conyza trihecatactis

*** p<0,0001. * p<0,005 con respecto al grupo control negativo.

El efecto antiinflamatorio neto, calculado como el área bajo la curva de porcentaje de inflamación vs. tiempo, es de 80,14 para FCH2Cl2 Ct, 171,1 para FEt2O Ct, 87,11 para FAcOEt Ct, 126,1 para RHEt y 175,9 para MCt1. El grupo tratado con diclofenaco (control positivo) 67,15 y 323,2 para el control negativo (Figura 73).

MCt1 F.Et2O Ct F. CH2Cl2 Ct Diclofenaco F. AcOEt Ct R.HEtOH Ct Control 175.9 171.1 80.14 67.13 87.11 126.1 323.2

400

300 C

U 200 A

100

0 t t t t 1 o l C C C C t c o C tr l 2 O t H a C E M n n t 2 O tO fe o H 2 .E c E o C C F A H l . . . ic F F R D Figura 73. Efecto neto antiinflamatorio de fracciones y compuestos obtenidos de Conyza trihecatactis, calculado como el área bajo la curva.

El modelo de inflamación inducido por -carragenina es ampliamente utilizado para la evaluación de compuestos con alto potencial antiinflamatorio. La administración subcutánea de una solución de carragenina a nivel de la aponeurosis plantar de la rata, desencadena reacciones de carácter inflamatorio mediada por la liberación de diferentes autacoides (histamina, serotonina, bradicinina, prostaglandinas), además diferentes factores del complemento que están implicados en la amplificación de la respuesta (Chuqui, 2013). La -carragenina provoca un edema local que se incrementa gradualmente, usualmente es un evento de dos fases que dura de 1 a 5 horas, la fase inicial (1-1.5h) predomina un edema no fagocitico, seguido de una segunda fase con un incremento de la formación del edema que persiste hasta por 5 horas. Se sabe que varios mediadores están involucrados en distintas etapas del edema inducido por -carragenina, a la fase inicial (hasta 1.5 h) se le atribuye la liberación de histamina, 5-hidroxitriptamina, bradicinina, factor de activación plaquetario y serotonina. A la 3era hora de la aplicación se observa una exhaustiva inflamación fagocitaria, con un gran número de neutrófilos y edema tisular (Rauf et al. , 2016). La última fase esta mediada por prostaglandinas (PGE1 y PGE2, PGF2). La respuesta vascular máxima ocurre aproximadamente a las 6 horas de la administración y coincide con la fase mediada por las prostaglandinas. La extravasación de proteínas ocurre durante toda la respuesta al agente edematógeno. La migración celular, fundamentalmente leucocitos

polimorfonucleares, comienza a las 2 horas de haberse inyectado el agente (Chuqui, 2013).

La actividad antiinflamatoria mostrada por FCH2Cl2 Ct, FAcEOt Ct y MCt1, puede explicarse por la presencia de flavonoides, debido a que estos compuestos por medio de su acción antioxidante (capacidad de capturar radicales libres), les permite actuar contra el daño tisular debido a la formación de radicales libres que se generan como subproducto de las rutas de lipoxigenasas y cicloxigenasa (Matulevich, 2013).

Dentro de los compuestos identificados en MCt1 y aislados de FAcOEt Ct se encuentran la apigenina, hispidulina, luteolina y la 3-metoxi-5,7,4’-trihidroxiflavona. En un estudio realizado por Je-Hyuk et al. (2007) observaron que la apigenina inhibe la producción de óxido nítrico (NO), y la expresión de ciclooxigenasa-2 (COX-2), y suprime la adhesión celular. Clavin et al. (2007) mostraron en su estudio que los tres flavonoides (nepetina, jaceosidina e hispidulina) aislados de la fracción de diclorometano de Eupatorium arnotiianum presentan actividad antiinflamatoria en el ensayo de edema en oreja inducido por TPA.

Los efectos antiinflamatorios in-vitro e in-vivo han sido reportados para varios flavonoides; algunos flavonoides 6-metoxilados son activos en diferentes modelos experimentales. Las flavonas que presentan sustituciones en el anillo B son capaces de inhibir el granuloma inducido por cotton-pellet (cuerpo extraño), el edema inducido en pata de rata por -carragenina y el edema inducido en oreja de ratón por TPA, sin embargo la influencia del patrón de sustitución en la inhibición de la inflamación no se comprende todavía completamente (Clavin et al. , 2007).

Análisis previos de la relación estructura–actividad de los flavonoides mostraron que el doble enlace en la posición C-2, C-3 del anillo C con la función oxo en la posición C-4, junto con la presencia de cuatro hidroxilos en C-5, C-7, C-3’ y C-4’, en la posición del anillo B, presentan altos efectos antiinflamatorios (Francisco et al. , 2014). Un estudio realizado por Chen et al. en 2014, mostró quela luteolina inhibe la expresión y secreción de HMGB1, HMGB1-mejorado en la producción de factores

100

pro-inflamatorios, como factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-) y NO (Chen et al. , 2014).

Se ha observado que la presencia de un grupo OH en posición C-4’ es esencial para la actividad antiinflamatoria, en el estudio realizado por Mohamed et al. (2014) los resultados concuerdan con los estudios previos atribuidos a la actividad antiinflamatoria de los flavonoides para el doble enlace entre C-2 y C-3, la presencia de un grupo metoxi en C-3 y C-7.

3.2.1 Estudio histopatológico para Conyza trihecatactis

En el estudio histopatológico de los grupos tratados, se evaluaron los siguientes cambios morfológicos: edema (acumulo de líquido intersticial), respuesta vascular (congestión y vasodilatación) e infiltrado celular del tejido (cantidad y tipo de células inflamatorias presentes, el esperado son los neutrófilos). Se realizó una comparación histológica de cada tejido tratado con las fracciones frente al tejidode una pata normal.

Se observó que el tejido tratado con el control negativo (EtOH: Tween 20: Agua (10:5:85)) presentó ligeras hemorragias, infiltrado celular importante, edema y congestión vascular severas. En el control positivo (diclofenaco) se observó edema e infiltrado polimorfonuclear, pero en menor cantidad y la respuesta vascular fue leve (Figura 74).

a. b. c. Figura 74.Comparación de los cortes histológicos entre: a. Tejido normal. b. Control negativo. c. control positivo.

101

El perfil histopatológico para FCH2Cl2 Ct (Figura 75) presentó infiltrado celular leve, edema moderado y una respuesta vascular incipiente, estos cambios morfológicos son semejantes a los observados en el control positivo.

a. b.

c. d. Figura 75.Comparación de los cortes histológicos entre: a. Tejido normal. b. Control negativo. c. Control positivo. d.FCH2Cl2 Ct.

En los tejidos tratados con FEt2O Ct (Figura 76) se aprecia infiltrado celular, edema y congestión vascular moderados, menores que los observados en el control negativo.

102

a. b.

c. d. Figura 76. Comparación de los cortes histológicos entre: a. Tejido normal. B. Control negativo. c. Control positivo. d.FEt2O Ct.

Se observó en los tejidos tratados con FAcOEt Ct infiltrado celular moderado, edema y respuesta vascular leve, estos cambios morfológicos son semejantes a los observados con el diclofenaco (control positivo) (Figura 77).

a. b.

103

c. d. Figura 77. Comparación de los cortes histológicos entre: a. Tejido normal. b. Control negativo. c. Control positivo. d. FAcOEt Ct.

El perfil histológico de RHEt Ct (Figura 78), muestra infiltrado celular importante, edema y congestión vascular moderados.

a. b.

c. d. Figura 78. Comparación de los cortes histológicos entre: a. Tejido normal. b. Control negativo. c. Control positivo. d.RHEt Ct.

Para MCt1 (Figura 79) se aprecia infiltrado celular importante, edema y repuesta vascular moderadas; un tanto menores que las observadas con el control negativo.

104

a. b.

b. d. Figura 79. Comparación de los cortes histológicos entre: a. Tejido normal. b. Control negativo. c.Control positivo. d.MCt1.

3.3 Evaluación de la actividad citotóxica para Conyza trihecatactis

Para determinar la actividad citotóxica, las células tumorales 4T1, MCF-7, TSA y 3T3 fueron tratadas con el extracto y las fracciones obtenidas de las partes aéreas de Conyza trihecatactis (ver Figura 14) en una placa de 96 pozos, con un rango de concentraciones comprendido entre 250 µg/mL y 1,95 µg/mL. Uno de los parámetros empleados para comparar la citotoxicidad entre los diferentes extractos y fracciones es la concentración inhibitoria 50 (CI50) que corresponde a la inhibición del 50% del crecimiento de las células tumorales.

En la Tabla 13, se muestran las CI50 obtenidas para el extracto y fracciones de C. trihecatactis sobre las diferentes líneas celulares tumorales.

105

Tabla 13. CI50 de extractos, fracciones y compuestos de Conyza trihecatactis sobre líneas celulares tumorales 4T1, TSA y MCF-7.

Líneas Celulares Tratamientos 4T1 TSA MCF-7 ExEtOH Ct 166,5 201,7 >250

FCH2Cl2 Ct 36,23 47,81 46,05 CI50 (µg/mL) FEt2O Ct 86,85 77.65 117,3 FAcOEt Ct 137,4 164,5 192,3 RHEt Ct >250 >250 >250 MCt1 109,2 97.48 23,58

Como se puede observar en la Figura 80, las células 4T1 tratadas con FCH2Cl2 Ct,

FEt2O Ct y MCt1 presentaron una disminución de la viabilidad celular con respecto al DMSO como control negativo. Al determinar la CI50 se determinó que FCH2Cl2 Ct es la fracción que presentó la mayor actividad citotóxica con respecto al control negativo (DMSO), mostrando 0% de células vivas a las primerasconcentraciones

(250 y 125 g/mL) y de 14,25% a la concentración de 62,5 g/mL con una CI50 de

36,23 g/mL. De igual manera, FEt2O Ct y MCt1 presentaron un porcentaje de células vivas de 3,45% y 10,30% respectivamente a la primera concentración (250

g/mL) con un valor de CI50 de 86,55 g/mL para Fet2O Ct y de 109,2 g/mL para MCt1 (Tabla 13). ExEtOH Ct mostró un porcentaje de células viables de 24,8% a la concentración| de 250 g/mL con un valor de CI50 de 166,5 g/mL. FAcOEt Ct solo alteró la viabilidad celular a la mayor concentración (250 g/mL). Por el contrario, RHEt Ct presenta baja actividad citotóxica sobre esta línea celular con una viabilidad mayor a 50% en las concentraciones evaluadas.

106

Figura 80. Evaluación citotóxica del extracto y fracciones de Conyza trihecatactis frente a la línea celular 4T1.

El efecto citotóxico fue evaluado utilizando la técnica de MTT. Como control negativo se utilizó DMSO y como control positivo la Doxorrubicina (DOXO) a concentraciones de 5 hasta 0,03 µM. La significancia estadística fue evaluada por ANOVA a dos vías con respecto al control negativo por medio de la prueba de Bonferroni. a:**** p<0.0001;b:***p<0.0005;c:**p<0.001;d:*p<0.05

Para las células TSA tratadas con el extracto y las fracciones de C. trihecatactis

(Figura 81), se observó que FCH2Cl2 Ct mostró cerca del 2% de células viables a las concentraciones más altas (250 y 125 g/mL) y a la concentración de 62,5g/mL presentó 25,06% de células viables, con una CI50 de 47,81 g/mL (Tabla 13). En cuanto a FEt2O Ct mostró 0% de células viales a la mayor concentración (250 g/mL) y de 38,80% a 125 g/mL. Para FAcOEt Ct y MCt1 a 250 g/mL se observó el 22,69% de células viables y 5,7% respectivamente, mientras que para MCt1 a la concentración de 125 g/mL presentó un porcentaje de células vivas de 22,8%, con una CI50 de 77,65 g/mL para FEt2O Ct y de 97,48 g/mL para MCt1 (Tabla 13).

107

130

120 M

E 110 S

100

s 90

e l

b 80 c

a i

v 70

s a a

a 60

l u l 50 a é a

C 40 a a % 30 a 20 10 a a a a 0 Doxorrubicina ExEtOH Ct FCH2Cl2 Ct FEt2O Ct FAcOEt Ct RHEt Ct MCt1 DMSO

Extractos y mg/mL fracciones 250 125 62,5 31,25 15,62 7,81 3,90 1,95 Doxorrubicina 5 2,5 1,25 0,62 0,31 0,15 0,07 0,03 mM

Doxorrubicina (CI 0,27 mM) 50 FAcOEt Ct (CI50 164,5 mg/mL) ExEtOH Ct (CI 201,7 mg/mL) 50 RHEt Ct (CI50 > 250 mg/mL) FCH2Cl2 Ct (CI50 47,81mg/mL) MCt1 (CI50 97,48 mg/mL) FEt O Ct (CI 77,65 mg/mL) DMSO (Contro negativo) 2 50 Figura 81.Evaluación citotóxica del extracto y fracciones de Conyza trihecatactisfrente a la línea celular TSA.

El efecto citotóxico fue evaluado utilizando la técnica de MTT. Como control negativo se utilizó DMSO y como control positivo la Doxorrubicina (DOXO) a concentraciones de 5 hasta 0,03 µM. La significancia estadística fue evaluada por ANOVA a dos vías con respecto al control negativo por medio de la prueba Bonferroni. a:**** p<0.0001;b:***p<0.0005;c:**p<0.001;d:*p<0.05

En la Figura 82 se observa que FCH2Cl2 Ct y MCt1 disminuyen la viabilidad celular en la línea MCF-7 de forma dosis dependiente. FCH2Cl2 Ct presentó un porcentaje de células viables de 3,99%, 5,08% y 20,16% a las concentraciones de 250, 125 y

62,5 g/mL, respectivamente, con una CI50 de 46,05 g/mL (Tabla 13). MCt1 fue el tratamiento que mayor actividad citotóxica presentó frente a los demás, debido a que el porcentaje de viabilidad observado fue menor al 50% a las concentraciones de 250, 125 y 62,5 g/mL, presentando un valor de CI50 de 23,58 g/mL (Tabla 13).

108

Figura 82.Evaluación citotóxica del extracto y fracciones de Conyza trihecatactis frente a la línea celular MCF-7.

El efecto citotóxico fue evaluado utilizando la técnica de MTT. Como control negativo se utilizó DMSO y como control positivo la Doxorrubicina (DOXO) a concentraciones de 5 hasta 0,03 µM. La significancia estadística fue evaluada por ANOVA y con respecto al control negativo por medio de la prueba Bonferroni. a:**** p<0.0001;b:***p<0.0005;c:**p<0.001;d:*p<0.05

Para el tratamiento FCH2Cl2 Ct se observó una disminución de la viabilidad a las concentraciones más altas, frente a las líneas celulares 4T1, TSA y MCF-7, siendo está la fracción que presentó la mayor actividad citotóxica. FEt2O Ct no presentó un efecto muy marcado sobre la viabilidad celular. ExEtOH Ct, FAcOEt Ct y RHEt Ct no tuvieron ningún efecto citotóxico sobre las líneas 4T1, TSA y MCF-7.

A diferencia de los resultados obtenidos con 4T1 y TSA para MCt1, se observó un marcado efecto citotóxico sobre MCF-7, mostrando un efecto dosis dependiente. Al

109

comparar estos resultados con los trabajos realizados sobre la mezcla MCt1 (apigenina e hispidulina) se ha reportado que la apigenina es un flavonoide no mutagénico, que tiene propiedades antitumorales frente a las células de melanoma A2058 y A375, mostrando una disminución significativa de la proliferación de las células por el método del MTT (Hasnat, Pervin, Lim, y Lim, 2015). Esta flavona inhibe el crecimiento de células de cáncer maligno humano a través de la detención del ciclo celular y la apoptosis, induce significativamente la citotoxicidad en células de leucemia humana ( U937, THP-1 y HL60) por medio de la activación de la ruta de la caspasa (Jayasooriya et al. , 2012); también ejerce una propiedad quimiopreventivo causando detención del ciclo celular, en una estudio realizado por Salama, et al. (2012) , observaron que un grupo metoxi en posición C-6 y un grupo hidroxilo en posición C-4’ aumenta ligeramente la actividad citotóxica de los compuestos.

Las funciones antitumorales de algunas flavonas son en gran parte debido a su capacidad de eliminar los radicales oxígeno, atenuar la actividad NF-kappaB, suprimir COX-2 de la expresión genética, inhibir varios genes importantes para la regulación del ciclo celular y para prevenir infecciones virales (Mamadalieva et al. , 2011).

Teniendo en cuenta que la mayoría de fármacos con actividad antitumoral presentan toxicidad frente a células normales (Rojas, 2015), es de suma importancia ensayar los tratamientos que presentaron la mayor actividad citotóxica (FCH2Cl2 Ct y MCt1) sobre células normales o fibroblastos. Para evaluar el efecto citotóxico de FCH2Cl2 Ct y MCt1 sobre células normales se utilizaron fibroblastos primarios de embriones de ratón (3T3), los tratamientos fueron puestos sobre placas de 96 pozos a diferentes concentraciones (rango de 250 a 1,95 g/mL). Como la tasa de replicación de la línea celular 3T3 es menor que las células tumorales, fue necesario determinar la selectividad citotóxica de FCH2Cl2 Ct y MCt1. El índice de selectividad (IS) se calcula (Rojas, 2015):

퐶퐼50 3푇3 퐼푆 = 퐶퐼50 퐶é푙푢푙푎 푇푢푚표푟푎푙 푀퐶퐹 − 7

Si el valor es >1, indica que las fracciones son más citotóxicas para las células

110

tumorales que para las células normales, si es <1, indica lo contario (Rojas, 2015).

En la Tabla 14 se presentan los IS calculados para FCH2Cl2 Ct y MCt1, lo cual muestra que no presentan actividad citotóxica considerable frente a la línea celular 3T3, el índice de selectividad fue >1 para los dos tratamientos, indicando que

FCH2Cl2 Ct y MCt1 son más citotóxicas para las células tumorales que para las células normales, sin embargo, es importante resaltar que MCt1 presenta un IS mayor a 10,60 por lo que la evaluación de esta mezcla en modelos animales resultaría relevante debido a su baja toxicidad frente a las células normales.

Tabla 14. Índice selectividad a partir de CI50 de FCH2Cl2 Ct y MCt1 sobre línea celular normal 3T3 y línea celular MCF-7

Líneas Celulares Índice de Tratamientos MCF-7 3T3 selectividad CI50 (µg/ml) FCH2Cl2 Ct 46,05 70,65 1,53 MCt1 23,58 > 250 >10,60

Debido a los resultados obtenidos en el ensayo de citotoxicidad para FCH2Cl2 Ct y

MCt1 (CI50 menores a 50 µg/mL en al menos 1 línea evaluada), se decidióobservar el efecto de estos dos tratamientos sobre las diferentes líneas celulares tumorales a una concentración de 125 µg/mL. Tal como se observar en las fotografías de las placas de los cultivos de las líneas 4T1 comúnmente observados en células tumorales que están en proceso de muerte, tales como: aparición de vesículas intracelulares y alteraciones en la morfología celular (Figura 83), los cuales también se evidencian en el control positivo (Panel 84D), adicionalmente se observa una baja densidad celular en los pozos tratados. En el caso de las líneas TSA (Figura 84) y MCF-7 (Figura 85), tratadas con FDCM Ct se observan células no adheridas (forma redondeada) (Paneles 84A y 85A). Asi mismo, se evidencia que esta fracción presenta mayor actividad citotóxica sobre las líneas de origen murino (4T1 y TSA) en comparación con MCt1 (Panel 86B); esta mezcla de flavonoides disminuye de forma marcada la densidad celular de la línea MCF-7. Los cambios en morfología y densidad celular se establecieron a partir de la comparación de los

111

efectos del tratamiento en diferentes campos frente al control negativo (Paneles 84D, 85D y 86D).

A B

C D

Figura 83. Cambios morfológicos de FCH2Cl2 Ct y MCt1 sobre células 4T1.

Las células 4T1, fueron tratadas con diferentes concentraciones de FCH2Cl2 Ct y MCt1 por 48 horas. Se evaluaron los cambios por observación directa al microscopio utilizando el objetivo de 20X. (A)FCH2Cl2 Ct. (B). MCt1 (C). Control negativo (DMSO), (D). Control positivo (DOXO 5 µM).

A B

112

C D

Figura 84. Cambios morfológicos de FCH2Cl2 Ct y MCt1 sobre células TSA

Las células TSA, fueron tratadas con diferentes concentraciones de FCH2Cl2 Ct y MCt1 por 48 horas. Se evaluaron los cambios por observación directa al microscopio utilizando el objetivo de 20X. (A)FCH2Cl2 Ct. (B). MCt1 (C). Control negativo (DMSO), (D). Control positivo (DOXO 5 µM).

A B

C D

Figura 85. Cambios morfológicos de FCH2Cl2 Ct y MCt1 sobre células MCF-7.

Las células MCF-7, fueron tratadas con diferentes concentraciones de FCH2Cl2 Ct y MCt1 por 48 horas. Se evaluaron los cambios por observación directa al microscopio utilizando el objetivo de 20X. (A). FCH2Cl2 Ct. (B). MCt1 (C). Control negativo (DMSO), (D). Control positivo (DOXO 5 µM).

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3.4 Captura del radical libre DPPH• para Conyza trihecatactis

En la figura Figura 86 se muestran los resultados obtenidos de la evaluación de la capacidad antioxidante. ExEtOH Ct, FCH2Cl2 Ct y RHEt Ct mostraron la más baja capacidad con valores de CI50 de 81,19 μg/mL, 45,56 μg/mL y 63,69 μg/mL respectivamente. FAcOEt Ct y FEt2O Ct fueron los tratamientos más activos, presentaron valores de CI50 de 25,83 μg/mL y 33,01 μg/mL respectivamente, indicando que se requiere una concentración del antioxidante baja para inhibir el 50% de la concentración de radicales libres respecto a los demás tratamientos.

Figura 86. Capacidad antioxidante del extracto y fracciones de la especie Conyza trihecatactis

En estudios realizados para la especie Conyza bonariensis, evaluaron el extracto acuoso por el método del DPPH, mostrando 92,72% de inhibición a una concentración de 200 μg/mL, concluyendo que los resultados obtenidos a todas las concentraciones evaluadas, podría ser atribuible a la presencia de compuestos fenólicos (Baldissera et al., 2011). En otro estudio, se observó que el extracto etanólico inhibió en un 94,57% a una concentración de 0,05 mg/mL (Thabit et al., 2015).

114

Se reportaron criterios de selección para extractos vegetales con base en el CI50; considerando de alto potencial antioxidante aquellos con valores menores a 30 μg/mL, con moderado potencial ubicados en un rango entre 30 μg/mL y 100 μg/mL y de bajo potencial antioxidante aquellos con un CI50 por encima de 100 μg/mL (Tovar del Rio, 2013). De acuerdo a lo anterior todos los tratamientos presentan un moderado potencial antioxidante.

La fracción FAcOEt Ct presentó una alta capacidad antioxidante, resultado esperado, teniendo en cuenta que se identificaron tres flavonoides: 3-metoxy-5,7,4’- trihidroxiflavona (Ct2), apigenina (Ct3) y luteolina (Ct4)), compuestos con capacidad antioxidante reportada. Los compuestos fenólicos al ser ácidos débiles actúan como • donantes de átomos de hidrógeno, capaces de reaccionar con O2 por medio de diferentes mecanismos, dependiendo de su naturaleza y el número de sustituyentes del anillo fenólico, es por ello que los fenoles se oxidan con facilidad y actúan como antioxidantes. Así mismo, los flavonoides presentan ciertas características para su actividad de captación de radicales libres, incluyendo la presencia de grupos hidroxilo en las posiciones C-3 y C-5, así como el doble enlace conjugado en C-2 y C-3 con una función oxo en C-4, y también los dos grupos hidroxilos del anillo B (Prada, 2015).

3.4.1 Contenido total de fenoles para Conyza trihecatactis

La determinación de los fenoles totales presentes en las fracciones de Conyza trihecatactis se realizó por el método de Folin-Ciocalteu (Magalhães, Santos, Segundo, Reis, y Lima, 2010), para aquellas fracciones que presentaron la mejor capacidad de capturar radicales libres por el método del DPPH.

Se realizó la curva de calibración del ácido gálico, presentando un coeficiente de correlación de 0,9899 (Figura 87); la cual permitió establecer el contenido de fenoles totales para FEt2O Ct y FAcOEt Ct.

115

Figura 87. Curva de calibración del ácido gálico para la determinación de fenoles totales. En la Tabla 15 se presenta el contenido total de fenoles (CTF) en equivalente de

ácido gálico (EAG) (g de ácido gálico (AG) / mg de fracción (Fr)) para FEt2O Ct y FAcOEt Ct.

Tabla 15. Contenido total de fenoles (CTF) para FEt2O Ct y FAcOEt Ct.

Concentración EAG Muestras (µg/mL) (µg AG/mg Fr) 368 326,5 FAcOEt Ct 184 232,0 92 50 368 354,5

FEt2O Ct 184 263,5 92 71

En muchos estudios se ha demostrado la relación que existe entre el contenido de fenoles y la capacidad antioxidante, sin embargo no se podría considerar quela capacidad que tienen las fracciones de capturar radicales libres sea solo por la presencia de compuestos fenólicos, debido a que en su composición química pueden existir otros metabolitos secundarios que pueden contribuir a su eficiencia antioxidante (Tovar del Rio, 2013).

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3.5 Toxicidad aguda en Artemia salina para Conyza trihecatactis

El bioensayo de Arteria salina (Figura 88) es un método desarrollado en 1982 por Meyer et al., que permite determinar la citotoxicidad en la larva de este crustáceo que es altamente sensible a una gran variedad de sustancias químicas, es fácil de manipular en el laboratorio, genera resultados confiables en cuanto a la alternativa poco costosa, sencilla y rápida.

Figura 88. Nauplio de Artemia salina Fuente: Autor 2015.

El procedimiento consistió en exponer las fracciones que presentaron la mayor actividad citotóxica frente a las líneas celulares ensayadas de Conyza trihecatactis

(FCH2Cl2 Ct) a nauplios de Artemia salina parta determinar valores de concentración letal 50 (CL50).

La toxicidad de los extractos o fracciones provenientes de plantas se expresan como valores de CL50, teniendo en cuenta se valoran comparando los índices de toxicidad de Meyer o Clarkson. De acuerdo con los índices de Meyer, los extractos con CL50 <1000 μg/mL son considerados tóxicos, y con valores >1000 μg/mL son considerados como no tóxicos. Los criterios de toxicad de Clarkson clasifica a los extractos en el siguiente orden: extractos con CL50 por encima de 1000 μg/mL son no tóxicos, CL50 de 1000-500 μg/mL son poco tóxicos, CL50 de 500-100 μg/mL medianamente tóxicos y CL50 de 100-0 μg/mL altamente tóxicos (Hamidi, Jovanova, y Panovska, 2014)

117

La toxicidad FCH2Cl2 Ct presentó una CL50 de 147,5 μg/mL y teniendo en cuenta el criterio de Clarkson puede clasificarse como medianamente tóxica.

3.6 Metabolitos secundarios aislados de Ageratina vacciniaefolia

La purificación por cromatografía líquida semipreparativa y cromatografía en columna de la fracciones de cloroformo (FCHCl3 Av) y acetato de etilo (FAcOEt Av), obtenidas a partir del extracto etanólico de las partes aéreas de la especie Ageratina vacciniaefolia condujo al aislamiento e identificaciónpor HPLC-DAD-MS de terpenos denominados Av1 , Av2 , Av3 y Av4, comparados con los aislados por Hernández, (2013) Se aisló un flavonoide denominado Av5 identificado como luteolina, este compuesto fue elucidado por métodos espectroscópicos y por comparación con los datos descritos en la literatura.

3.6.1 Análisis por Cromatografía liquida de alta eficiencia para FCHCl3 Av

Mediante el análisis por HPLC-DAD-MS se detectó la presencia de cuatro compuestos de tipo diterpeno, aislados e identificados en estudios anteriores (Hernández, 2013; Pedrozo, 2001). En la Figura 89 se presenta el cromatograma de FCHCl3 Av comparado con los cuatro compuestos mayoritarios. Además, con ayuda de sus espectros de masas se identificaron los compuestos, cuyos datos se presentan en la Tabla 16.

118

FCH33CCl3l3A Avv PA NKD KdA AKA

5 10 15 20 25 30 Tiempo (min)

Figura 89. Cromatograma de HPLC de los principales compuestos presentes en FCHCl3 Av.

Tabla 16.Compuestos identificados en FCHCl3 Av.

Tr TIPO DE m/z Nº NOMBRE (min) COMPUESTO [M+H]+ β-D-glucopiranosil éster del Ácido (-)9,15- 1 10.50 dihidroxikaur,16-en-19-oico (PA) Diterpenoide 497 β-D-glucopiranosil éster del Ácido(-)-17-(β- 2 12.88 Diterpenoide 645 xilopiranosa)-kauran-19-oico (NKD) 3 14.50 ácido (-)9,15-dihidroxikaur-16-en-19-oico (KdA) Diterpenoide 335 4 30.30 ácido kaur-16-en-19-oico (AKA) Diterpenoide 303

3.6.2 Análisis por Cromatografía liquida de alta eficiencia para Av1, Av2, Av3 y Av4.

En el análisis realizado por HPLC con DAD, se encontró que Av1 y Av3 (Figura 90) presentan similitud con el pico 3 que corresponde al ácido (-)9,15-dihidroxikaur-16- en-19-oico (KdA).

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KdA Av3 Av1

5 10 15 20 25 30 Tiempo (min)

Figura 90.Cromatograma de HPLC de Av1 y Av3.

Av2 y Av4 (Figura 91) presentan similitud con el pico 1 que corresponde al β-D- glucopiranosil éster del Ácido (-)-17-(β-xilopiranosa)-kauran-19-oico (NKD), con ayuda de sus espectros de masas se identificaron tentativamente los compuestos, cuyos datos se presentan en la Tabla 17.

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NKD Av4 Av2

5 10 15 20 25 30 Tiempo (min)

Figura 91.Cromatograma de HPLC para Av2 y Av4.

Tabla 17. Compuestos detectados e identificados tentativamente para FCHCl3 Av.

Tr TIPO DE m/z Nº NOMBRE (min) COMPUESTO [M+H]+ Av1 14.56 ácido (-)9,15-dihidroxikaur-16-en-19-oico (KdA) Diterpenoide 335 β-D-glucopiranosil éster del ácido(-)-17-(β- Av2 12.88 Diterpenoide 645 xilopiranosa)-kauran-19-oico (NKD) Av3 14.56 ácido (-)9,15-dihidroxikaur-16-en-19-oico (KdA) Diterpenoide 335 β-D-glucopiranosil éster del ácido(-)-17-(β- Av4 12.76 Diterpenoide 645 xilopiranosa)-kauran-19-oico (NKD)

En la identificación tentativa realizada para FCHCl3 Av, se identificaron dos compuestos de tipo terpenoide, que presentaron similitud en el tiempo de retención (Tr) y en el espectro de masas, con los compuestos aislados y determinados en estudios realizados para esta especie.

Está técnica de cromatografía es de mucha utilidad y funciona como complemento a otras técnicas como es el caso de HPLC-MS. La identificación es tentativa, pues se basa en el tiempo de retención y en un espectro de masas de baja resolución, los cuales pueden alterarse al igual que los datos espectrales por variaciones indeseables e inevitables, una de ellas puede ser causadas por cambios en la

121

anchura y posición del pico, que pueden generarse por la versatilidad de las condiciones de la muestra y por la inestabilidad del instrumento (Prada, 2015).

3.6.3 Elucidación estructural de Av5

El compuesto Av5 (12,8 mg) es un sólido amarillo, el cual mostró por CCF una mancha de color violáceo oscuro, que al ser revelada con NP/PEG y vista a la luz UV de 365 nm se observó una fluorescencia de color amarillo-naranja.

Este sólido fue analizado por RMN. En el experimento de 1H (Figura 92) se observan señales que corresponden a protones de tipo aromático en la región de 6 a 8 ppm. La señal de δ 13.01 que aparece en campo bajo del espectro es característica de un grupo OH fenólico que forma puente de hidrógeno con un grupo carbonilo, lo cual podría indicar la presencia de un grupo OH en C-3 o C-5 de un flavonoide. Las señales de δ 6.27 (d, J=2.1Hz, 1H) y δ6.54 (d, J=2.1Hz, 1H) podrían asignarse a los protones de las posiciones H-6 y H-8 del anillo A del flavonoide. La señal en δ 7.02 (d, J=8.3Hz, 1H) se puede asignar al hidrógeno en posición H-5´, la señal en δ 7.49 (dd, J=8.3-2.2 Hz, 1H) al protón en posición H-6’ y la señal de δ 7.52 (d, J=2.2 Hz, 1H) al protón en posición H-2’.

122

1 Figura 92. Espectro de RMN H (300MHz, Acetona-d6) de Av5.

En el experimento J-MOD (Figura 93) se puede apreciar 15 señales de carbonos, de las cuales 9 pueden ser carbonos cuaternarios o metilénicos y las 6 faltantes a carbonos metínicos o metílicos. La señal en δ 183.0 corresponde a un grupo carbonilo, las señales de δ 94.7, 99.7, 104.2, 105.3, 114.1, 116.6, 120,1, 123.8, 146.4, 150.1, 158.8, 163.3, 164.9 y 165.1 correspondientes a carbonos de tipo aromático.

123

13 Figura 93. Espectro de RMN C (75MHz, Acetona- d6) de la Av5.

El espectro HSQC (Figura 94) permitió establecer la conectividad de los hidrógenos δ 6.27, 6.54 y 6.60 con los carbonos δ 99.7, 94.7 y 104.2 respectivamente. El protón en δ 7.02 con el carbono δ 116.6, el hidrógeno δ 7.49 con el carbono en δ 120.1 y el protón en δ 7.52 con el carbono δ 114.1.

124

(6.54, 94.7)

(6.27, 99.7)

(6.60, 104.2)

(7.52, 114.1)

(7.02, 116.6)

(7.49, 120.1)

Figura 94.Ampliación del espectro HSQC en RMN 1H δ 6.0 a 7.8 ppm y 13C δ 90 a 125 ppm para Av5.

Con el experimento HMBC (Figura 95, Figura 96) se realizó la asignación de las demás señales que corresponden al compuesto Av5. La señal en δ 123.8 se le asignó al carbono C-1’ por las correlaciones con los hidrógenos en las posiciones H-5’ y H-3 (δ 7.02 y 6.60), al carbono C-3’ se le asigna la señal en δ 146.4 por la correlación con el H-5’ (δ 7.02). En el anillo A al C-10 se le asigno la señal de δ 105.3 por las correlaciones con los hidrógenos H-3 (δ 6.60), H-6 (δ 6.25) y H-8 (δ 6.54). Las señales en δ 158.8 y δ 164.9 se les asignaron a los carbonos C-9 y C-7 por su correlación con el H-8 (δ 6.54). En el anillo C al carbono C-2 se le asigna la señal en δ 165.1 debido a las correlaciones con los protones H-3, H-2’ y H-6’ (δ 6.60, 7.52 y 7.49 respectivamente). En el anillo B la señal en δ 150.1 se asignó al C-4’ debido a las correlaciones que tiene con los protones H-2’, H-5’ y H-6’ (δ 7.52, 7.02 y 7.49 respectivamente) (Figura 97).

125

(6.27, 94.7) (6.53, 99.7) (6.60, 105.3) (6.53, 105.3) (6.27, 105.3) (7.02, 114.1)

(7.02, 123.8) (6.60, 123.8)

(7.02, 146.4)

(7.02, 150.1) (6.53, 158.8) (6.27, 163.3) (6.60, 165.1) (7.02, 165.1) (6.53, 164.9)

(6.60, 183,0)

Figura 95.Ampliación del espectro HMBC RMN 1H δ 6.0 a 7.7 ppm y 13C δ 80 a 190 ppm para Av5.

(7.49, 114.1)

(7.52, 120.1)

(7.52, 146.4) (7.52, 150.1) (7.49, 150.1)

(7.52, 165.1)

(7.49, 165.1)

Figura 96.Ampliación del espectro HMBC RMN 1H δ 7.50 a 7.9 ppm y 13C δ 100 a 180 ppm para Av5.

126

Figura 97. Correlaciones HMBC para Av5.

Las señales que se muestran en el espectro HMBC (Figura 98) de δ 8.49, 8.85 y 9.70 corresponden a los grupos OH de las posiciones C-7, C-3’ y C-4’ respectivamente. La señal en δ 8.49 (s, 1H, OH) presenta correlación con los carbonos C-2’ (δ 114.1), C-3’ (δ 146.4) y C-4’ (δ 150.1). La señal en δ 8.85 (s, 1H, OH) mostró correlación con C-3’ (δ 146.4), C-4’ (δ 150.1) y C-5’ (δ 116.6) y la señal en δ 9.70 (s, 1H, OH) permite correlacionarlo con las señales de los carbonos en posición C-6 (δ 99.7), C-7 (δ 164.9) y C-8 (δ 94.7). Las correlaciones anteriormente descritas se muestran en la Figura 99.

127

(9.70, 94.7)

(9.70, 99.7)

(8.49, 114.1)

(8.85, 116.6)

(8.85, 146.4) (8.49, 146.4)

(8.85, 150.1) (8.49, 150.1)

(9.70, 164.9)

Figura 98.Ampliación del espectro HMBC RMN 1H δ 8.4 a 9.0 ppm y 13C δ 80 a 180 ppm para Av5.

Figura 99. Correlaciones HMBC para grupos OH de Av5.

Para confirmar la estructura propuesta para el compuesto Av5 se realizó un análisis de HPLC-DAD-MS (Figura 100) para determinar el ion molecular y el espectro UV- Vis. En modo positivo [M+H]+ (Figura 101) se presenta un ion de m/z 287 y una + señal con m/z 328 de un aducto de acetonitrilo (CH3CN) [M+H+41] y en modo negativo [M-H]- (Figura 102) un ion de m/z de 285, en la Figura 103 se presenta el espectro UV-Vis del compuesto Av5 mostrando máximos de absorción de 266, y 348 nm característicos de flavonoides, de acuerdo con los datos reportados en la

128

literatura (Farag et al. , 2015; Pamplona et al. , 2015), se confirma que el compuesto Datafile Name:AV104-113_42.lcd corresponde a la luteolina. Sample Name:AV104-113 Sample ID:AV104-113 mAU psi 2500 270nm,1nm (1.00) B.Conc Pump A Pressure

2000 2500

1500 2000 1000

500 1500

0 1000 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 min

Figura 100. Cromatograma a 270 nm del compuesto Av5.

Inten.(x1,000,000) 287 1.5

1.0

328 0.5

0.0 151 192 239 266 365 432 448 503 520 572 598 636 697 719 758 805 833 866 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 m/z Figura 101. Espectro de masas en modo positivo [M+H]+ del compuesto Av5.

Inten.(x1,000,000) 285 1.00

0.75

0.50 571

0.25 110 994 399 633 656 805 846 900 0.00 194 317 353 429 506 531 722 750 955 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 m/z Figura 102. Espectro de masas en modo negativo [M-H]- del compuesto Av5.

129

mAU 400 13.867/207 1.00

300 348

200

253

266

262 236

100 282

200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 nm Figura 103. Espectro ultravioleta del compuesto Av5.

Luego del análisis de los datos de RMN, HPLC-DAD-MS y de la comparación con los datos reportados en la literatura, se realizó la asignación de los desplazamientos químicos para cada carbono e hidrógeno presentes en la molécula, la cual se identificó como luteolina. En la Tabla 18 se presentan los desplazamientos químicos obtenidos para el compuesto Av5 y los descritos para la luteolina según Ismail et al. (2014) y Ma et al. (2016).

Tabla 18.Comparación de los desplazamientos químicos del compuesto Av5 con los de la luteolina (Ismail et al. , 2014; Ma et al. , 2016)

Av5* Luteolina Posición RMN 1H RMN 13C RMN 1H** RMN 13C RMN 1H*** RMN 13C 2 - 165.1 - 165.7-165.1 - 167.1 3 6.60 (s) 104.2 6.55 (s) 102.5 6.91 (s) 105.2 4 - 183.0 - 182.6 - 184.0 5 13.01 (s, 0H) 163.3 12.1 (s, 0H) 161.8 13.7 (s, 0H) 164.1 6.27 (d, J =2.1 6.73 (d, J = 1.5 6 99.7 6.21 (d, 1H) 99.3 101.2 Hz, 1H) Hz, 1H) 7 - 164.5 - 162.2 - 166.1 6.54 (d, J = 2.1 6.73 (d, J = 1.5 8 94.6 6.45 (d, 1H) 94.4 96.1 Hz, 1H) Hz, 1H) 9 - 157.4 - 158.3 - 159.8 10 - 104.2 - 103.9 - 106.3 1’ - 122.8 - 122.4 - 124.2 7.52 (d, J=2.2 7.9 (d, J = 1.5 Hz, 2’ 114.1 7.39 (d, 1H) 114.2 115.9 Hz,1H) 1H) 3’ - 146.4 - 145.9 - 149.0 4’ - 150.1 - 149.9 - 153.0 7.02 (d, J = 8.3 6.91 (d, J = 8.5 7.29 (d, J = 8.5 5’ 116.6 No reporta 118.1 Hz, 1H) Hz, 1H) Hz, 1H) 7.48 (dd, J = 7.40 (dd, J = 8.5 7.53 (dd, J = 8.5- 6’ 120.1 119.2 120.8 8.3-2.2 Hz, 1H) Hz, 1H) 1.5 Hz, 1H) 1 13 *Datos obtenidos a 300MHz para RMN H y 75MHz en RMN C (solvente Acetona-d6) 1 13 ** Datos obtenidos a 500MHz para RMN H y 125MHz en RMN C (solvente Acetona-d6) 1 13 *** Datos obtenidos a 500MHz para RMN H y 125MHz en RMN C (solvente Pyr -d6)

130

3.7 Evaluación de la actividad antiinflamatoria para Ageratina vacciniaefolia

Se evaluó la actividad antiinflamatoria de ExEtOH Av, FCHCl3 Av, FEt2O Av, FAcOEt Av y RHEt Av, los cuales se compararon con el diclofenaco como control positivo.

En la Tabla 19 y Figura 104 se presenta el efecto antiinflamatorio de los diferentes tratamientos a los diferentes tiempos de experimentación. El efecto antiinflamatorio de FCHCl3 Av y ExEtOH Av a la primera hora de experimentación fue de 38,08% y 38,76% respectivamente, mostrando en este tiempo diferencia estadísticamente significativa frente al grupo control negativo (EtOH:Tween 20:Agua (10:5:85)), p<0,005. FEt2O Av y RHEt Av solo mostraron actividad a la primera hora de experimentación con porcentajes de inflamación de 41,04% y 38,66%. A la 3, 5 y 7 horas de experimentación disminuyó el efecto antiinflamatorio evidenciándose un aumento en los porcentajes de inflamación.

FCHCl3 Av presentó un porcentaje de 38.02% para la primera hora y se mantiene hasta la quinta hora de experimentación con un porcentaje de 31.06%, mostrando en estos tiempos diferencias estadísticamente significativas con respecto al control negativo, ** p<0,0001.

Tabla 19. Actividad antiinflamatoria del extracto y fracciones obtenidos de Ageratina vacciniaefolia expresada como porcentaje inflamación.

TRATAMIENTOS (% DE INFLAMACIÓN) (EtOH: Tween TIEMPO Diclofenaco 20: Agua (Horas) FCHCl3 Av FEt2O Av FAcOEt Av RHEt Av ExEtOH Av Control (+) (10:5:85) Control (-) T1 38,02±9,81 41,04±6,06 67,21±11,2 38,66±9,18 38,76±11,4 10,53±7,99 88,16±13,6 T3 53,93±8,58 86,09±6,76 112,88±11,4 75,34±15,2 54,53±16,6 19,84±12,3 142,83±21,1 T5 37,62±6,42 80,49±7,30 94,39±9,11 94,20±17,0 61,19±9,64 29,07±6,09 93,76±12,8 T7 31,06±8,95 63,90±9,69 84,77±7,53 68,81±9,94 69,33±4,95 25,90±11,1 85,09±10,3

131

140

120

ó i

c 100

a m

a 80

l *

n i

60 **

e d

40 % 20 0 v v v v o - A A v A A c l A t a ro l 3 O t E H n t C 2 E O e n t O H t f o H E c R E lo C F x c C F A E i F D Figura 104. Efecto antiinflamatorio del extracto y fracciones obtenidos de Ageratina vacciniaefolia sobre el edema inducido en pata de rata con -carragenina.

** p<0,0001. * p<0,005 con respecto al grupo control negativo.

En la Tabla 20 y Figura 105 se muestran los promedios de los porcentajes de inhibición de la inflamación en los 6 grupos tratados en los tiempos: 1, 3, 5 y 7 horas de experimentación. FCHCl3 Av presentó los mayores porcentajes de inhibición a la primera hora después de comenzar el estudio (61,98%) y los valores menores a la séptima hora de seguimiento (68,94%).

Tabla 20. Actividad antiinflamatoria de fracciones y compuestos obtenidos de Ageratina vacciniefolia expresada como porcentaje de inhibición de la inflamación.

TIEMPO TRATAMIENTOS (% DE INHIBICIÓN) (Horas) FCHCl3 Av FEt2O Av FAcOEt Av RHEt Av ExEtOH Av T1 61,98 58,96 32,79 61,34 61,24 T3 46,07 13,91 -12,88 24,66 45,47 T5 62,38 19,51 5,61 5,80 38,81 T7 68,94 36,10 15,23 31,19 30,67

132

100

80 ** n

ó *

i 60

b i

h 40

d 20

% 0

-20

v v v v o - A A v A A c l A t a ro l 3 O t E H n t C 2 E O e n t O H t f o H E c R E lo C F x c C F A E i F D Figura 105. Capacidad inhibitoria de la inflamación de compuestos y fracciones obtenidos a partir de Ageratina vacciniaefolia. El efecto antiinflamatorio neto, calculado como el área bajo la curva de porcentaje de inflamación vs. tiempo, es de 126,1 para FCHCl3 Av, 219,1 para FEt2O Av , 283,3 para FAcOEt Av, 223,3 para RHEt Av y 169,8 para ExEtOH Av. El grupo tratado con diclofenaco (control positivo) 67,15 y 323,2 para el control negativo (Figura 106).

400

300 C

U 200 A

100

0 v v v v o - A A A v A c l A t a ro H l 3 O t E n t O C 2 E e n t t O H f o E H E c R lo x C F c C E F A i F D Figura 106. Efecto neto antiinflamatorio del extracto y fracciones obtenidos de Ageratina vacciniaefolia, calculado como el área bajo la curva.

La actividad antiinflamatoria mostrada por FCHCl3 Av, puede deberse a la presencia de los triterpenos identificados por HPLC-DAD-MS. En un estudio realizado en edema de pata de rata inducido por -carragenina, el extracto etanólico de las partes

133

aéreas de Ageratina vacciniaefolia presentó solo actividad a la primera hora de experimentación con un porcentaje de inflamación del 20.5%, después de la 3, 5 y 7 hora disminuyó su actividad antiinflamatoria; de los compuestos aislados e identificados en esta especie, se encuentra el ácido-(-)9, 15-dihidroxikaur-16-en-19- oico y el β-D-glucopiranosil éster del ácido(-)-17-(β-xilopiranosa)-19-oico, estos compuestos no presentaron actividad antiinflamatoria importante, solo a la primera hora de experimentación con porcentajes de inflamación de 20,22% y 31,49% respectivamente (Hernández, 2013).

Dentro de los compuestos identificados en FCHCl3 Av se encuentra el ácido kaur- 16-en-19-oico, del cual se ha reportado una interesante actividad antiinflamatoria, debido a que promueve un decrecimiento significativo del factor de necrosis tumoral- alfa (TNF-), interleucina-1 (IL-1) (De Lima et al. , 2015), también inhibe el óxido nítrico (NO), la liberación de prostaglandinas E2 (PEG2) y la cicloxigenasa-2 (COX- 2)(Choi, Shin, Jung, Choi, y Kim, 2011).

3.7.1 Estudio histopatológico para Ageratina vacciniaefolia

En el estudio histopatológico de los grupos tratados, se evaluaron los siguientes cambios morfológicos: edema (acumulo de líquido intersticial), respuesta vascular (congestión y vasodilatación) e infiltrado celular (cantidad y tipo de células inflamatorias en este caso neutrófilos). Se realizó una comparación histológica de cada tejido tratado con el tejido de una pata normal.

Se observó que el tejido tratado con el control negativo (EtOH: Tween 20: Agua (10:5:85)) presentó ligeras hemorragias, infiltrado celular importante, edema y congestión vascular severos. En el control positivo (diclofenaco) se observó edema e infiltrado polimorfonuclear neutrófilo moderados, la respuesta vascular fue leve (Figura 107).

134

a. b. c. Figura 107.Comparación de los cortes histológicos entre: a. Tejido normal. b. Control negativo. c. control positivo.

El perfil histopatológico para FCHCl3 Av (Figura 108) presentó infiltrado celular y edema moderados y una respuesta vascular incipiente, estos cambios morfológicos son semejantes a los observados en el control positivo.

a. b.

c. d. Figura 108.Comparación de los cortes histológicos entre: a. Tejido normal. b. Control negativo. c. Control positivo. d.FCHCl3 Av.

135

En los tejidos tratados con FEt2O Av (Figura 109) se aprecia un infiltrado celular y edema moderados, la congestión vascular fue leve, estos cambios fueron semejantes a los observados en el control negativo.

a. b.

c. d. Figura 109.Comparación de los cortes histológicos entre: a. Tejido normal. b. Control negativo. c. Control positivo. d. FEt2O Av.

Se observó en los tejidos tratados con FAcOEt Av un infiltrado celular severo, edema y respuesta vascular moderadas, estos cambios morfológicos son semejantes a los observados con el control negativo (Figura 110).

a. b.

136

c. d. Figura 110.Comparación de los cortes histológicos entre: a. Tejido normal. b. Control negativo. c. Control positivo d. FAcOEt Av.

El perfil histológico de RHet Av (Figura 111), muestra un infiltrado celular severo, edema y congestión vascular moderados cambios semejantes a los observados en el control negativo.

a. b.

c. d. Figura 111.Comparación de los cortes histológicos entre: a. Tejido normal. b. Control negativo. c.Control positivo. d. RHEt Av.

137

Para ExEtOH Av (Figura 112) se aprecia un infiltrado celular y edema moderado, la repuesta vascular es leve; menores que los observados con el control negativo.

a. b.

c. d. Figura 112.Comparación de los cortes histológicos entre: a. Tejido normal. b. Control negativo. c.Control positivo. d. ExEtOH Av.

3.8 Evaluación de la actividad citotóxica para Ageratina vacciniaefolia

En la Tabla 21, se muestran las CI50 obtenidas para el extracto y fracciones de A. vacciniaefolia sobre las diferentes líneas celulares tumorales.

Tabla 21. CI50 de extractos, fracciones de Ageratina vacciniaefolia sobre líneas celulares tumorales 4T1, TSA y MCF-7.

Líneas Celulares Tratamientos 4T1 TSA MCF-7 ExEtOH Av >250 200,1 >250 CI50 (µg/ml) FCHCl3 Av 182,1 178,4 168,1

FEt2O Av 235,7 240,5 242,4 FAcOEt Av >250 >250 >250 RHEt Av >250 >250 >250

138

Los tratamientos FCHCl3 Av, FAcOEt Av y ExEtOH Av inducen únicamente a la primera concentración (250 g/mL) una disminución de la viabilidad superior al 50% de las células 4T1 (Figura 113); además se observa que FCHCl3 Av es la fracción que presenta la mayor actividad citotóxica con un valor de CI50 de 182,1 g/mL (Tabla 21) y un 21,08% de células viables a la primera concentración (250 g/mL). Los tratamientos FAcOEt Av y RHEt Av no inducen ningún efecto en la viabilidad celular en ninguna de las concentraciones evaluadas.

190 180 170 160

M 150

E 140

S ±

130

s 120 e

l 110 b

a 100

i v

s 80 a

l 70 u l 60 a é a

C 50 40 % 30 a 20 10 0 Doxorrubicina FCHCl3 Av FEt2O Av FAcOEt Av RHEt Av ExEtOH Av DMSO

Extractos y mg/mL fracciones 250 125 62,5 31,25 15,62 7,81 3,90 1,95 Doxorrubicina 5 2,5 1,25 0,62 0,31 0,15 0,07 0,03 mM

Doxorrubicina (CI50 0,090 mM) FAcOEt Av (CI50 > 250 mg/ml)

FCHCl3 Av ( CI50182,1 mg/ml ) RHEtOH Av (CI50> 250 mg/ml)

FEt2O Av ( CI50 235,2 mg/ml ) ExEtOH Av ( CI50> 250 mg/ml) DMSO (Contro negativo) Figura 113.Evaluación citotóxica del extracto y fracciones de Ageratina vacciniaefolia frente a la línea celular 4T1

El efecto citotóxico fue evaluado utilizando la técnica de MTT. Como control negativo se utilizó DMSO y como control positivo la Doxorrubicina (DOXO) a concentraciones de 5 hasta 0,03 µM. La significancia estadística fue evaluada por ANOVA y con respecto al control negativo por medio de la prueba Bonferroni’. a:**** p<0.0001;b:***p<0.0005;c:**p<0.001;d:*p<0.05

139

Sobre las células TSA (Figura 114), todas las fracciones disminuyen la viabilidad celular en al menos un 50% en la primera concentración, sin embargo, dicha actividad no es dosis dependiente, siendo FCHCl3 Av la fracción más citotóxica con una CI50 de 178,4g/mL (Tabla 21).

120 110

100 M

E 90

S ±

s e

l 70

b a

i 60 a v a a

s 50

l u l 40

é a C

30 % 20 10 a 0 Doxorrubicina FCHCl3 Av FEt2O Av FAcOEt Av RHEt Av ExEtOH Av DMSO

Extractos y mg/mL fracciones 250 125 62,5 31,25 15,62 7,81 3,90 1,95 Doxorrubi cina 5 2,5 1,25 0,62 0,31 0,15 0,07 0,03 mM

Doxorrubicina ( CI50 0,27 µM) FAcOEt Av (CI50 >250 mg/mL)

FCHCl3 Av ( CI50 178,4 mg/mL) RHEtOH Av (CI50 > 250 mg/mL) ExEtOH Av ( CI 200,1 mg/mL) FEt2O Av ( CI50 240,5 mg/mL) 50 DMSO (Contro negativo) Figura 114.Evaluación citotóxica del extracto y fracciones de Ageratina vacciniaefoliafrente a la línea celular TSA

El efecto citotóxico fue evaluado utilizando la técnica de MTT. Como control negativo se utilizó DMSO y como control positivo la Doxorrubicina (DOXO) a concentraciones de 5 hasta 0,03 µM. La significancia estadística fue evaluada por ANOVA y con respecto al control negativo por medio de la prueba Bonferroni a:**** p<0.0001;b:***p<0.0005;c:**p<0.001;d: *p<0.05

En la Figura 115 se observa que FCHCl3 Av y FEt2O Av disminuyen la viabilidad celular en la línea MCF-7 a la primera concentración (250 g/mL), mostrando 3,18% y 25,25% de células viables con CI50 de 168,1 g/mL y 242,2 g/mL, respectivamente. Los demás tratamientos no alteraron la viabilidad celular.

140

130 120 110

100 M

E 90

s 80

e l

b 70

i v

s a

l 50

l é

C 40

% 30 a 20

10 a 0 Doxorrubicina FCHCl3 Av FEt2O Av FAcOEt Av RHEt Av ExEtOH Av DMSO

Extractos y mg/mL fracciones 250 125 62,5 31,25 15,62 7,81 3,90 1,95 Doxorrubicina 5 2,5 1,25 0,62 0,31 0,15 0,07 0,03 mM

Doxorrubicina (CI 0,043 µM) 50 FAcOEt Av (CI50 > 250 mg/mL) FCHCl3 Av (CI50168,1 mg/mL) RHEtOH Av (CI50 > 250 mg/mL) FEt2O Av ( CI50242,2 mg/mL) ExEtOH Av ( CI50 > 250 mg/mL) DMSO (Contro negativo) Figura 115.Evaluación citotóxica del extracto y fracciones de Ageratina vacciniaefolia frente a la línea celular MCF-7.

El efecto citotóxico fue evaluado utilizando la técnica de MTT. Como control negativo se utilizó DMSO y como control positivo la Doxorrubicina (DOXO) a concentraciones de 5 hasta 0,03 µM. La significancia estadística fue evaluada por ANOVA y con respecto al control negativo por medio de la prueba Bonferroni. a:**** p<0.0001;b:***p<0.0005;c:**p<0.001;d:*p<0.05.

Estudios realizados en algunos diterpenos de tipo kaurano, determinan que estos inducen la apoptosis en algunas células de cáncer, como en la línea HL-60 (leucemia humana) (Nagashima et al. , 2003). En pruebas realizadas con células 3T3-L1 (fibroblastos murinos), se observó que los diterpenos ensayados a 5 g/mL no mostraron una reducción significativa en la viabilidad después de 24 horas de tratamiento (Vargas et al. , 2015)

En la Tabla 22 se presenta el índice de selectividad calculada para FCHCl3 Av; aunque ésta fracción no presenta actividad citotóxica considerable frente a la línea celular 3T3, el índice de selectividad fue menor que uno (<1), indicando que FCHCl3

141

Av es más citotóxica para las células tumorales que para las células normales.

Tabla 22. Índice selectividad a partir de CI50 de FCHCl3 Av sobre línea celular normal 3T3 y línea celular MCF-7.

Líneas Celulares Índice de Tratamientos CI50 (µg/ml) MCF-7 3T3 selectividad FCHCl3 Av 168.1 188.6 >1

Debido a que los resultados obtenidos en el ensayo de citotoxicidad no presentaron un efecto muy marcado sobre la viabilidad celular, se observo el efecto sobre la morfología de las líneas celulares tumorales a la concentración de 125 µg/mL de

FCHCl3 Av; analizando los resultados, los análisis por observación directa al microscopio de las células 4T1 (Figura 116), TSA (Figura 117) y MCF-7 (Figura 118) después del tratamiento, no se evidenciaron cambios en la densidad celular y en la estructura de las células en comparación con el grupo control negativo (Paneles 117B, 118B y 199B).

A B

Figura 116. Cambios morfológicos de FCHCl3 Av sobre células 4T1

142

Las células 4T1, fueron tratadas con diferentes concentraciones de FCHCl3 Av por 48 horas. Se evaluaron los cambios por observación directa al microscopio utilizando el objetivo de 20X. (A) FCHCl3 Av. (B). Control negativo (DMSO), (C). Control positivo (DOXO 5 µM).

A B

Figura 117. Cambios morfológicos de FCHCl3 Avsobre células TSA.

Las células TSA, fueron tratadas con diferentes concentraciones de FCHCl3 Av por 48 horas. Se evaluaron los cambios por observación directa al microscopio utilizando el objetivo de 20X. (A) FCHCl3 Av. (B). Control negativo (DMSO), (C). Control positivo (DOXO 5 µM).

A B

143

Figura 118. Cambios morfológicos de FCHCl3 Avsobre células MCF-7.

Las células MCF-7, fueron tratadas con diferentes concentraciones de FCHCl3 Av por 48 horas. Se evaluaron los cambios por observación directa al microscopio utilizando el objetivo de 20X. (A) FCHCl3 Av. (B). Control negativo (DMSO), (C).Control positivo (DOXO 5 µM).

3.8.1 Captura del radical libre DPPH• para Ageratina vacciniaefolia

En la Figura 119 se observa que el extracto y las fracciones obtenidas de A. vacciniaefolia presentaron capacidad antioxidante.

Los resultados muestran que ExEtOH Av y FCHCl3 Av presentaron valores con valores de CI50 de 125,8 μg/mL y 109,2 μg/mL, respectivamente. Los tratamientos

FEt2O Av, FAcOEt Av y RHEt Av fueron los más activos con CI50 de 46,29 μg/mL, 26,04 μg/mL y 20,39 μg/mL respectivamente, demostrando que se necesita de una concentración baja para poder inhibir el 50% de la concentración de radicales libres en relación a los demás tratamientos.

144

100 90

n ó

i 70 c

i 60

b i

h 50

n i

e d 30 % 20 10 0 ExEtOH Av FCHCl3 Av FEt2O Av FAcOEt Av RHEt Av BHT

ExEtOH Av ( CI 125,8 mg/mL) 50 FAcOEt Av (CI50 26,04 mg/mL) FCHCl Av ( CI 109,2 mg/mL) 3 50 RHEt Av (CI50 20,39 mg/mL) FEt O Av ( CI 46,29 mg/mL) BHT ( CI 32,68 mg/mL) 2 50 50

Figura 119. Capacidad antioxidante del extracto y fracciones de la especie Ageratina vacciniaefolia.

De acuerdo con los valores reportados de CI50 de ExEtOH Av y FCHCl3 Av presentaron un bajo potencial antioxidante, FEt2O Av presentó un bajo potencial antioxidante, mientras que FAcOEt Av y RHEt Av evidencian un alto potencial antioxidante comparado con el BHT (Tovar del Rio, 2013).

La actividad reportada para FCHCl3 Av, podría explicarse por la presencia de diterpenos de tipo kaurano que han mostrado en diferentes estudios actividad inhibitoria sobre la peroxidación lipídica (Thirugnanasampandan, Jayakumar, Narmatha, Martin, y Rajendra, 2008)

Como se explicó anteriormente, es posible que la presencia de compuestos fenólicos jueguen un papel crucial en el barrido e inhibición de los radicales libres (Çarikçi, Kiliç, Azizoǧlu, y Topçu, 2012), esto podría explicar que FAcOEt Av y RHEt Av presenten una importante capacidad antioxidante.

145

3.8.2 Contenido total de fenoles para Ageratina vacciniaefolia

En la Tabla 23 se presenta el contenido total de fenoles (CTF) en equivalente de

ácido gálico (EAG) (g de ácido gálico (AG) / mg de fracción (Fr)) para FEt2O Av, FAcOEt Av y RHEt Av.

Tabla 23. Contenido total de fenoles (CTF) para FEt2O Av, FAcOEt Av y RHEt Av.

Concentración EAG Muestras (µg/mL) (µg AG/mL Fr) 368 340,5 FEt2O Av 184 151,5 92 120 368 358 FAcOEt Av 184 232 92 125,5 368 361,5 RHEt Av 184 239 92 130,5

3.9 Toxicidad agua en Artemia salina para Ageratina vacciniaefolia

La toxicidad FCHCl3 Av presentó una CL50 de 148,8 μg/mL y teniendo en cuenta el criterio de Clarkson puede clasificarse como medianamente tóxica.

146

CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos del trabajo fitoquímico realizado a las partes aéreas de Conyza trihecatactis permitió el aislamiento e identificación de tres flavonoides: 3- metoxi-5,7,4’- trihidroxiflavona, apigenina, luteolina y una mezcla (hispidulina y apigenina), y para la especie Ageratina vacciniaefolia se aisló e identificó el flavonoide: luteolina, todos estos compuestos se reportan por primera vez para las especies.

Las fracciones FAcOEt Ct, FAcOEt Av y RHEt Av presentaron la mejor capacidad antioxidante con valores CI50 >30 µg/mL, posiblemente por la presencia de compuestos fenólicos y flavonoides.

Las fracciones FCH2Cl2 Ct, FAcOEt Ct y FCHCl3 Av presentaron unas actividad antiinflamatoria comparable al antiinflamatorio no esteroideo diclofenaco, adicionalmente el estudio histopatológico demostró una disminución del proceso inflamatorio respecto al control negativo, actividad que puede ser explicada por la presencia de compuestos de tipo flavonoide y diterpeno identificados en estas fracciones.

De acuerdo con los resultados obtenidos en el ensayo de citotoxicidad se puede concluir que FCH2Cl2 Ct presentó mayor citotoxicidad sobre la línea celular tumoral

4T1 (CI50 36,25 µg/mL) y MCt1 sobre la línea celular tumoral MCF-7 (CI50 23,58 µg/mL) posiblemente por la presencia de compeustos de tipo flavonoide, mientras que FCHCl3 Av presentó una moderada actividad citotóxica, posiblemente por la presencia de compuestos de tipo diterpeno, resultados que concuerdan con los reportados en la literatura para la especie Ageratina vacciniaefolia.

Los resultados obtenidos del estudio de toxicidad aguda, las fracciones FCH2Cl2 Ct y FCHCl3 Av se clasificaron como moderadamente tóxicas, tomando como referencia el criterio de Clarkson.

147

RECOMENDACIONES

Obtener cantidades mayores de compuestos, para poder evaluar su actividad antiinflamatoria, citotóxica y capacidad antioxidante.

Realizar nuevas investigaciones con otros modelos biológicos que permitan reafirmar la actividad antiinflamatoria de los extractos y fracciones ensayadas.

Se recomienda aislar los compuestos identificados como responsables de la capacidad antioxidante para las fracciones FAcOEt Ct, FAcOEt Av y RHEt Av, para ser evaluados y de esta manera validar la información.

Para la fracción FCH2Cl2 Ct y MCt1 que mostraron actividad citotoxicidad sobre las líneas tumorales evaluadas, se recomienda continuar con estudios que permitan establecer el tipo de muerte celular inducida por la fracción (apoptosis vs necrosis) y los efectos a largo plazo sobre cultiuvos de líneas celulares (ensayo de clonogenicidad), y de acuerdo a estos resultados plantear la posibilidad de realizar experimentos en animales para determinar la actividad antitumoral.

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BIBLIOGRAFÍA

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