Prospecção Nutricional E Bioativa De Sementes De Dez Espécies Vegetais Da Caatinga

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA

GEÓRGIA SAMPAIO FERNANDES

PROSPECÇÃO NUTRICIONAL E BIOATIVA DE SEMENTES DE DEZ ESPÉCIES VEGETAIS DA CAATINGA

FORTALEZA-CEARÁ 2011 GEÓRGIA SAMPAIO FERNNDES

PROSPECÇÃO NUTRICIONAL E BIOATIVA DE SEMENTES DE DEZ ESPÉCIES VEGETAIS DA CAATINGA

Tese submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Bioquímica

Orientadora: Dra. Ana de Fátima F. Urano de Carvalho

FORTALEZA-CEARÁ 2011

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará Biblioteca de Ciências e Tecnologia

F398p Fernandes, Geórgia Sampaio. Prospecção nutricional e bioativa de sementes de dez espécies vegetais da Caatinga / Geórgia Sampaio Fernandes. – 2011. 331 f. : il., enc. ; 30 cm.

Tese (doutorado) – Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciência, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Pós-Graduação em Bioquímica, Fortaleza, 2011. Área de Concentração: Bioquímica Vegetal. Orientação: Profa. Dra. Ana de Fátima Fontenele Urano Carvalho.

1. Leguminosas – valor nutricional. 2.Leguminosas - larvicida. 3.Leguminosas – atividade antimicrobiana. I. Título.

CDD 574-192 GEÓRGIA SAMPAIO FERNANDES

PROSPECÇÃO NUTRICIONAL E BIOATIVA DE SEMENTES DE DEZ ESPÉCIES VEGETAIS DA CAATINGA

Esta tese foi apresentada como parte dos requisitos necessários para obtenção do grau de Doutor em Bioquímica, outorgado pela Universidade Federal do Ceará e encontra-se à disposição dos interessados na Biblioteca do Centro de Ciências e Tecnologia da referida universidade. A transcrição de qualquer trecho desta tese é permitida, desde que seja feita em conformidade com as normas da ética científica. ______Tese aprovada em: _____/_____/_____. Geórgia Sampaio Fernandes

Dra. Ana de Fátima F. Urano de Carvalho Orientadora Universidade Federal do Ceará Depto. de Biologia

Dr. Renato de Azevedo Moreira Dra. Helena Alves de Carvalho Sampaio Universidade de Fortaleza Universidade Estadual do Ceará Centro de Ciências da Saúde Curso de Nutrição

Dra. Fernanda Maria Machado Maia Dra. Ana Lúcia Ponte Freitas Universidade Estadual do Ceará Universidade Federal do Ceará Curso de Nutrição Depto. de Bioquímica e Biologia Molecular

À minha orientadora, Ana de Fátima F. Urano de Carvalho, por toda a ajuda, o carinho, a compreensão durante todo tempo que trabalhamos juntas, como prova da minha gratidão, Ofereço.

A Deus, Ao meu esposo, Aos meus queridos filhos, A minha Família, os meus irmãos, Em especial, aos meus pais, por todo o amor, paciência, ajuda e incentivo Dedico

AGRADECIMENTOS

À Dra. Ana de Fátima Fontenele Urano de Carvalho, por ser uma orientadora única, que acompanha de perto os experimentos, questiona, discute, aconselha, dá sugestões, ajuda, incentiva e motiva todos os alunos do laboratório, além de sua contagiante alegria, mesmo no meio de tanto trabalho e problemas a resolver. À Dra. Ilka Maria Vasconcelos, por todos os ensinamentos, pelo profissionalismo, por disponibilizar seu laboratório para alguns experimentos, por ter contribuído muito para a minha formação científica, pela paciência, por todo o tempo que trabalhamos juntas e por ter me incentivado e ajudado para que eu pudesse seguir em frente. À Dra. Fernanda Maria Machado Maia, por tudo que já me ensinou, por ter sido fundamental para a minha titulação como Mestre e pela disposição em, mais uma vez, contribuir para a minha formação de Doutora. Às professoras Dra. Helena Alves de Carvalho Sampaio, Dra. Ana Cristina de Oliveira Monteiro Moreira e Dra. Ana Lúcia Ponte Freitas pela pronta disponibilidade em aceitar participar da banca examinadora. À Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Bioquímica e Biologia Molecular, na pessoa do Dr. Márcio Viana Ramos. A todos os funcionários do Departamento. A todos os professores e responsáveis por laboratórios dos Departamentos de Bioquímica e Biologia Molecular e de Biologia, que contribuíram disponibilizando os equipamentos e reagentes para a realização deste trabalho, especialmente o Laboratório de Carboidratos e Lectinas (Carbolec), na pessoa da professora Dra. Norma Maria Barros Benevides e Luana Maria Castelo Melo Silva, por serem excelentes pessoas e pela insuperável disposição em ajudar. Ao Laboratório de Proteínas Vegetais de Defesa, em especial, ao professor José Tadeu Abreu de Oliveira, por toda a infraestrutura e reagentes cedidos de seu laboratório, e por toda a disponibilidade em ensinar e ajudar. A todos seus integrantes, principalmente aos que mais me ajudaram, Fredy Albuquerque e Darcy Mayra Gondim, por toda a simpatia, gentileza, disposição, positivismo, ensinamento, enfim, por toda a grande e valiosa ajuda prestada. Ao laboratório de Toxinas Vegetais, do qual já fiz parte, por sempre disponibilizar toda a infraestrutura necessária para a realização de etapas importantes deste trabalho e aos amigos lá conquistados: Hermógenes Oliveira, por todas as dúvidas sanadas, por toda a ajuda,

incentivo, torcida e bom humor, sempre. A Janne Keila Morais por toda a torcida, todo apoio, toda força e presteza em me ajudar. A todos os outros integrantes: Henrique Pinho, Adelina Batista, Helen Costa, Daniele Bezerra, Mirella Pereira, Paulo de Paula, Raquel Rocha, Mariana Arantes, por toda a colaboração, ajuda, por toda a convivência agradável e, em especial, a minha grande amiga Juliana Gifoni, pela grande força, incentivo e orações. Ao laboratório de Bioprospecção de Recursos Regionais pelo incrível acolhimento, ótima infraestrutura e, principalmente, pelos amigos conquistados: Martônio Viana, Glauber Pacelli, Renata Silva, Priscila Caracas, Sarah Sant’ana, Gabrielle Freire, Terezinha Souza, Nathanna Mateus, Lady Bezerra, Berenice Alves e, especialmente ao Davi Farias, por toda a torcida, toda a força, otimismo, energia e alegria contagiante, enorme disposição de todos em ajudar, pela credibilidade e confiança que foi depositada em mim, enfim, o meu muitíssimo obrigada, o que ainda é muito pouco por tudo que vocês fizeram por mim. A todos os amigos e pessoas que, de forma direta ou indireta, contribuíram para a realização deste trabalho. Aos meus pais, José Gláucio e Gláucia Fernandes, pela incansável ajuda, apoio, incentivo, por cuidarem dos meus filhos para que eu pudesse concluir esse trabalho e principalmente pelas orações e amor incondicional que vocês têm por mim. Aos meus irmãos, Geritsa, Gláucio Filho e Germana e meus sobrinhos amados Lucas e Mariana, por estarem presentes em minha vida. Ao meu esposo maravilhoso, pelo enorme amor, paciência, compreensão, e ajuda nas tarefas domésticas e no cuidado com nossos filhos, tudo para que eu pudesse finalizar mais uma etapa da minha formação científica. Aos meus filhos gêmeos, Gabriel e Rafael, meus anjos amados, que só trouxeram bênçãos e alegria para a minha vida e da minha família. E, sobretudo, a Deus, por estar eternamente do meu lado me ajudando em todas as etapas da minha vida, permitindo- me a conclusão deste trabalho através de suas bênçãos.

MUITO OBRIGADA!!!!!

Este trabalho foi realizado graças ao auxílio dos seguintes Órgãos e Instituições:

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

DECIT/SCTIE/MS, por intermédio do CNPq, o apoio da FUNCAP e da SESA, com o financiamento do Projeto “Inclusão de Novos Genótipos de Feijão Caupi e de outras

Leguminosas de elevado Valor Nutricional e Funcional na Alimentação da População do

Semi-árido”.

Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação da Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, Ceará.

Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, Ceará.

Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará.

Núcleo de Controle das Endemias Transmissíveis por Vetores (NUVET), da Secretária de Saúde do Estado do Ceará.

Laboratório de Microbiologia e Imunologia do Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, Ceará.

Laboratório de Toxinas Vegetais do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, Ceará.

Laboratório de Proteínas Vegetais de Defesa do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, Ceará

Laboratório de Bioprospecção de Recursos Regionais (Bioprospec) do Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará, onde o trabalho foi desenvolvido.

SUMÁRIO

Página LISTA DE FIGURAS...... 15 LISTA DE TABELAS...... 18 LISTA DE QUADROS...... 22 ABREVIATURAS...... 23 RESUMO...... 25 ABSTRACT...... 27 CAPITULO 1. Fundamentação Teórica 29 1. LEGUMINOSAS COMO FONTE DE NUTRIENTES NA ALIMENTAÇÃO HUMANA...... 30 2. COMPOSTOS ANTINUTRICIONAIS E/OU BIOATIVOS DE LEGUMINOSAS...... 33 2.1 Compostos Antinutricionais e/ou Bioativos de Natureza Protéica ...... 34 2.1.1 Proteases...... 34 2.1.2 Inibidores de Tripsina...... 36 2.1.3 Lectinas...... 38 2.1.4 Ureases...... 40 2.1.5 Toxinas...... 41 2.1.6 Quitinases...... 42 2.1.7 βββ-1,3- glucanases...... 44 2.2 Compostos Antinutricionais e/ou Bioativos de Natureza Não Proteica...... 45 2.2.1 Alcalóides...... 46 2.2.2 Composto Fenólicos...... 47 2.2.3 Taninos...... 48 2.2.4 Saponinas...... 49 3. BIODIVERSIDADE DAS ESPÉCIES VEGETAIS DA CAATINGA COMO FONTE DE ALIMENTOS E REPOSITÓRIO DE MOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS...... 50 3.1 Caesalpinia bracteosa Tul...... 53 3.2 Caesalpinia ferrea Mart. Ex. Tul...... 54

3.3 Dioclea megacarpa Rolfe ...... 55 3.4 Enterolobium contortisiliquum (Vell.) Morong ...... 55 3.5 Erythrina velutina Willd ...... 56 3.6 Hymenaea courbaril L...... 57 3.7 Lonchocarpus sericeus (Poiret) Kunth ...... 58 3.8 Parkia platycephala Benth...... 59 3.9 Piptadenia moniliformis Benth...... 60 3.10 Senna rugosa (G.Don ) H.S.Irwin & Barneby ...... 61 CAPÍTULO 2. Prospecção Nutricional em Sementes de Leguminosas da Caatinga Cearense 65 1. CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA E JUSTIFICATIVA ...... 66 2. OBJETIVOS ...... 68 2.1 Objetivos Gerais ...... 68 2.2 Objetivos Específicos ...... 68 3. MATERIAIS ...... 69 3.1 Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga ...... 69 3.2 Animais de Laboratório e Alojamento ...... 69 3.3 Reagentes Químicos ...... 70 3.4 Componentes das Dietas ...... 70 4. MÉTODOS ...... 71 4.1 Preparação da Farinha de Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga ..... 71 4.2 Extração de Proteínas das Sementes das Espécies Vegetais ...... 71 4.3 Dosagem de Proteínas ...... 72 4.4 Composição Proximal das Sementes ...... 72 4.4.1 Umidade ...... 72 4.4.2 Proteínas Totais ...... 73 4.4.3 Lipídios Totais ...... 73 4.4.4 Matéria Mineral (Cinzas) ...... 74 4.4.5 Fibra Alimentar Total ...... 74 4.4.6 Carboidratos digeríveis ...... 75 4.4.7 Conteúdo de Energia ...... 75 4.5 Composição em Aminoácidos ...... 78 4.6 Dosagem de Compostos Tóxicos e/ou Antinutricionais ...... 78

4.6.1 Lectinas ...... 78

4.6.2 Inibidores de Tripsina ...... 79

4.6.3 Ureases ...... 80

4.6.4 Toxinas ...... 81 4.7 Determinação de Minerais ...... 81 4.8 Criação de Índice de Qualidade Nutricional para a Classificação das Espécies mais Promissoras ...... 82 4.9 Experimento Nutricional I 82 4.9.1. Avaliação da Qualidade das Proteínas das Sementes de Piptadenia moniliformis ...... 82 4.9.1.1 Preparo das Dietas Experimentais ...... 83 4.9.1.2 Procedimento Experimental ...... 84 4.9.1.3 Índices para Avaliação da Qualidade Proteica ...... 86 4.9.1.4 Parâmetros Bioquímicos Sanguíneos ...... 87

4.9.1.5 Peso Relativo dos Órgãos em Base Seca ...... 87 4.10 Experimento Nutricional II ...... 87 4.10.1. Avaliação da Qualidade das Proteínas das Sementes de Piptadenia moniliformis livre de ααα-galactosídios ...... 88 4.10.1.1 Processo de extração dos α-galactosídios ...... 88 4.10.1.2 Preparo das Dietas Experimentais ...... 88 4.11 Análise Estatística ...... 89 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 91 5.1 Composição Proximal das Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga ... 91 5.2 Composição de Aminoácidos das Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga ...... 101 5.3 Determinação de Compostos Tóxicos e/ou Antinutricionais das Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga ...... 104 5.4 Determinação da Composição de Minerais das Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga ...... 110 5.5 Classificação das Espécies Vegetais Através do Índice de Qualidade Nutricional ...... 113 5.6 Experimento Nutricional I ...... 116

5.6.1 Crescimento dos animais ...... 117 5.6.2 Variação de Peso, Dieta Ingerida e Eficiência Alimentar ...... 120 5.6.3 Balanço Nitrogenado ...... 123 5.6.4 Avaliação de Órgãos Internos dos Ratos ...... 133 5.6.5 Análise dos parâmetros séricos ...... 137 5.7 Experimento Nutricional II ...... 142 5.7.1 Crescimento dos animais ...... 142 5.7.2 Variação de Peso, Dieta Ingerida e Eficiência Alimentar ...... 144 5.7.3 Balanço Nitrogenado ...... 147 5.7.4 Avaliação de Órgãos Internos dos Ratos ...... 152 5.7.5 Análise dos parâmetros séricos dos ratos ...... 155 6. CONCLUSÃO DO CAPÍTULO ...... 160 CAPÍTULO 3. Prospecção Bioativa em Sementes de Leguminoas da Caatinga Cearense 161 1. CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA E JUSTIFICATIVA ...... 162 2. OBJETIVOS ...... 165 2.1 Objetivo Geral ...... 165 2.2 Objetivos Específicos ...... 165 3. MATERIAIS ...... 166 ...... 3.1 Sementes ...... 166 3.1.1 Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga ...... 166 3.1.2 Sementes de Piptadenia moniliformis Benth...... 166 3.2 Eritrócitos ...... 167 3.3 Microrganismos ...... 167 3.4 Animais de Laboratório e Alojamento ...... 167 3.5 Insetos e Alojamento ...... 168 3.6 Reagentes Químicos e Outros Materiais ...... 168 3.6.1. Proteínas ...... 168 3.6.2. Substratos Enzimáticos ...... 169 3.6.3 Meios de Cultura ...... 169 3.6.4 Reagentes para Eletroforese ...... 169 3.6.5 Outros Materiais ...... 169

4. MÉTODOS ...... 170 4.1 Preparação da Farinha de Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga ..... 170 4.2 Extração de Proteínas das Sementes das Espécies Vegetais ...... 170 4.3 Dosagem de Proteínas ...... 171 4.4 Detecção de Metabólitos Secundários ...... 171 4.5 Detecção e Dosagem de proteínas Bioativas ...... 172

4.5.1 Lectinas ...... 172

4.5.2 Inibidores de Tripsina ...... 172

4.5.2.1 Determinação dos Inibidores de Tripsina das sementes das dez espécies vegetasi da Caatinga ...... 172

4.5.2.2 Determinação dos Inibidores de Tripsina da Fração Proteica de Piptadenia moniliformis (Pm FP) ...... 173 4.5.3 Inibidores de Quimotripsina ...... 174 4.5.4 Ureases ...... 174 4.5.5 Quitinases ...... 175

4.5.6 β-1,3-glucanases ...... 176

4.5.7 Atividade proteolítica ...... 176 4.5.7.1 Análise qualitativa de proteases ...... 176

4.5.7.2 Atividade proteolítica total ...... 177 4.5.8 Toxinas ...... 177

4.6 Ensaios Biológicos ...... 178 4.6.1 Atividade Inibitória da Eclosão dos Ovos de Aedes aegypti ...... 178 4.6.2 Atividade Larvicida contra Aedes aegypti ...... 179 4.6.3 Análise de larvas tratadas ...... 179 4.6.4 Atividade Inibitória do Crescimento de Fungos Filamentosos em Meio Sólido ...... 180 4.6.5 Atividade Inibitória do Crescimento de Fungos Filamentosos em Meio Líquido ...... 180

4.6.6 Atividade Inibitória do Crescimento de Leveduras em Meio Líquido ...... 181 4.6.7 Atividade Inibitória do Crescimento Bacteriano em Meio sólido ...... 181

4.6.8 Atividade Inibitória do Crescimento Bacteriano em Meio Líquido ...... 182

4.7 Purificação de Proteínas com Atividade Quitinásica Presentes em 183 Sementes de Piptadenia moniliformis Benth...... 4.7.1 Fracionamento protéico com ácido tricloroacético (TCA) ...... 183 4.7.2 Cromatografia de Troca Iônica em Matriz de DEAE-celulose ...... 183 4.7.3 Cromatografias de Afinidade em Matriz de Quitina ...... 184 4.7.4 Cromatografias de troca iônica em Matriz de CM-sepharose ...... 184 4.7.5 Cromatografia de afinidade em Matriz de “ Affi-gel blue gel” ...... 185 4.7.6 Cromatografia de Troca Iônica em Matriz de Resource Q em sistema de FPLC (“Fast Protein Liquid Cromatography”) ...... 185 4.7.7 Eletroforese em Gel de Poliacrilamida ...... 186 4.8 Análise Estatística ...... 186 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 187 5.1 Seleção das Espécies Vegetais ...... 187 5.2 Sólido Solúvel e Proteínas solúveis do Extrato Bruto das Espécies Vegetais da Caatinga ...... 191 5.3 Metabólitos Secundários em Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga 191 5.4 Proteínas Bioativas em Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga ...... 194 5.5 Avaliação de Toxicidade dos Extratos Brutos de Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga ...... 200 5.6 Atividade Antimicrobiana dos Extratos Brutos de Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga ...... 204 5.7 Espécies Vegetais com Bom Perfil de Bioatividade ...... 208 5.8 Purificação de Proteínas com Atividade Quitinásica Presentes em Sementes de Piptadenia moniliformis Benth...... 212 5.9 Re-estruturação da Purificação de Proteínas com Atividade Quitinásica Presentes em Sementes de Piptadenia moniliformis Benth...... 231 5.10 Cromatográfia de Troca Iônica de F 2 em Matriz de CM-sepharose ...... 234 5.11 Cromatográfia de Troca Iônica de C1 em Matriz de Resouce Q Acoplada ao Sistema de FPLC ...... 237 5.12 Detecção e Dosagem de Proteínas Bioativas na Fração Proteica de Sementes de P.moniliformis (Pm FP) ...... 239 5.13 Ensaios Biológicos ...... 244

5. 13.1 Atividade Antifúngica – Fungos Leveduroformis e Filametosos ...... 245 5.13.1.1 Ensaio de Inbição do Crescimento de Leveduras em Meio Líquido ...... 245 5.13.1.2 Ensaio de Inbição do Crescimento de fungos filamentosos em Meio Líquido ...... 247 5. 13. 2 Atividade Antibacteriana ...... 250 5.13.2.1 Ensaio de Inibição do Crescimento de Bactérias em Meio Líquido ...... 250 5.13. 3 Atividade Inseticida ...... 252 5.13.3.1 Ensaio de Deteriminação da Atividade Inibitória da Eclosão dos Ovos de Aedes aegypti ...... 252 6. CONCLUSÃO DO CAPÍTULO ...... 259 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS ...... 260 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 262 9. ANEXOS ...... 328 9.1 Fonte da figura 2 ...... 329 9.1 Fonte da figura 8 ...... 330 9.3 Artigo publicado ...... 331

LISTA DE FIGURAS

CAPITULO 1 Página FIGURA 1 – Enzimas utilizadas no mercado mundial ...... 36 FIGURA 2 – Espécies vegetais da Caatinga Cearense ...... 63 FIGURA 3 – Vagens e Sementes de espécies vegetais da Caatinga ...... 64 CAPITULO 2 Página FIGURA 1 - Procedimento para determinação de Fibra Alimentar Total da farinha delipidada das dez sementes das dez espécies vegetais da Caatinga segundo a metodologia descrita pela AOAC (1997) ...... 77 FIGURA 2 - Curva de crescimento dos ratos (n = 6) alimentados com dietas contendo farinhas de P. moniliformis crua ( Pm Cr) e processadas termicamente por fervura ( Pm F), cozimento em micro-ondas ( Pm M) e cozimento por autoclavagem ( Pm A), comparadas com o crescimento de ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja crua (SJCr), processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP)...... 118 FIGURA 3 - Curva de crescimento dos ratos (n = 6) alimentados com dietas contendo farinhas de P. moniliformis crua ( Pm Cr), farinha de P. moniliformis crua livre de α-galactosídios ( Pm LG), farinha de soja crua adicionada de α-galactosídios (SJAG), dieta com farinha de soja crua (SJCr), comparadas com o crescimento de ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP) ...... 143 CAPITULO 3 Página FIGURA 1 – Cromatografia de troca iônica em matriz de DEAE- celulose...... 213 FIGURA 2 – Eletroforese em gel de poliacrilamida (12,5%) na presença de SDS (2,0%) e β-mercaptoetanol (2,5%) do Extrato bruto de P. moniliformis Benth e da 1 a fração proteica não retida oriunda do extrato bruto P. moniliformis de quando submetidas a cromatografia de troca iônica em matriz de DEAE-Celulose, revelada com nitrato de prata...... 216

15 FIGURA 3 – Cromatografia de afinidade em matriz de Quitina ...... 217 FIGURA 4 – Cromatografia de troca iônica em matriz de CM-Sepharose .... 219 FIGURA 5 – Cromatografia de afinidade em matriz de Affi-gel blue gel ..... 221 FIGURA 6 – Eletroforese em gel de poliacrilamida (12,5%) na presença de SDS (2,0%) e β-mercaptoetanol (2,5%) da fração proteica oriunda de D1 quando submetida à cromatografia de afinidade em matriz de “Affi- gel blue gel”, revelada com nitrato de prata ...... 224 FIGURA 7 – Cromatografia de troca iônica em matriz de CM-Sepharose ... 225 FIGURA 8 – Cromatografia de afinidade em matriz de Quitina ...... 227 FIGURA 9 – Eletroforese em gel de poliacrilamida (12,5%) na presença de SDS (2,0%) e β-mercaptoetanol (2,5%) da fração proteica oriunda de A1 quando submetida à cromatografia de afinidade em matriz de quitina, revelada com nitrato de prata ...... 228 FIGURA 10 - Esquema da tentativa de purificação de proteínas com atividade quitinásica presentes em sementes de P. moniliformis ...... 230 FIGURA 11 - Eletroforese em gel de poliacrilamida (12,5%) na presença de SDS (2,0%) e β-mercaptoetanol (2,5%) revelada com nitrato de prata das frações proteicas obtidas de do fracionamento com ácido tricloroacético (TCA) ...... 233 FIGURA 12 – Cromatografia de troca iônica em matriz de CM-Sepharose .. 235 FIGURA 13 - Eletroforese em gel de poliacrilamida (12,5%) na presença de SDS (2,0%) e β-mercaptoetanol (2,5%) revelada com nitrato de prata das proteínas do extrato bruto de P. moniliformis Benth...... 236 FIGURA 14 – Cromatografia de troca iônica em matriz de Resource Q acoplada ao sistema de FPLC ...... 238 FIGURA 15 - Eletroforese em gel de poliacrilamida (12,5%) na presença de SDS (2,0%) e β-mercaptoetanol (2,5%) revelada com nitrato de prata das frações proteicas de C1 obtidas quando submetidas a uma cromatografia de troca iônica em matriz de Resource Q acoplada ao sistema de FPLC ...... 240 FIGURA 16 – Esquema de purificação da fração proteica de sementes de P. moniliformis com elevada atividade quitinásica ...... 241 FIGURA 17 - Curvas de crescimento de quatro leveduras crescidas em

16 caldo BHI ( Brain Heart Infusion ), pH 5, 0, contendo diferentes concentrações da fração proteica de P. moniliformis ( Pm -FP) ...... 246 FIGURA 18- Curvas de crescimento de quatro fungos crescidos em caldo YPD ( Yeast Potato Dextrose ), contendo diferentes concentrações da fração proteica de P. moniliformis ( Pm -FP) ...... 248 FIGURA 19 - Curvas de crescimento de quatro cepas bactérias (2 Gram + e 2 Gram -) crescidos em caldo nutritivo (Peptona e Extrato de levedura) contendo diferentes concentrações da fração proteica de P. moniliformis (Pm -FP) ...... 251 FIGURA 20 – Fotomicrografia (50 x) das larvas de Aedes aegypti tradadas com BSA (1 mgP/ml) (a) e com Pm FP (0,225 mgP/ml) ...... 255 FIGURA 21 – Fotomicrografia (50 x) dos ovos de Aedes aegypti tratados com Pm FP (1 mgP/ml) ...... 258

17 LISTA DE TABELAS

CAPITULO 1 Página TABELA 1 – Espécies da família leguminosae endêmicas presentes na Caatinga ...... 52 CAPITULO 2 Página TABELA 1 - Composição (g/Kg) e densidade calórica (Kcal/g) das dietas controles e experimentais do experimento nutricional I ...... 85 TABELA 2 - Composição (g/Kg) e densidade calórica (Kcal/g) das dietas das dietas controles e experimentais do experimento nutricional II ...... 90 TABELA 3 – Composição proximal e de energia das sementes de dez leguminosas selvagens da caatinga ...... 95 TABELA 4 - Composição de aminoácidos das proteínas das dez sementes de leguminosas da caatinga, composição de aminoácidos de proteína vegetal (soja) e animal (clara de ovo) padrões e referências de aminoácidos para grupos de crianças em diferentes idades e requerimentos para ratos...... 102 TABELA 5 – Fatores tóxicos e/ou antinutricionais das sementes de dez espécies vegetais da caatinga ...... 105 TABELA 6 – Composição de minerais das sementes de dez espécies vegetais da caatinga e recomendação de ingestão diária (RDI) para adultos e crianças com quatro ou mais anos de idade baseado em um consumo de 2000 Kcal diárias ...... 111 TABELA 7 – Índice de Qualidade Nutricional* das espécies vegetais da caatinga em ordem decrescente ...... 115 TABELA 8 – Variação de peso, dieta ingerida e eficiência alimentar * de ratos (n = 6) submetidos a dietas contendo farinhas de P. moniliformis crua ( Pm Cr) e processadas termicamente por fervura ( Pm F), cozimento em micro-onas ( Pm M) e autoclavagem ( Pm A), comparadas com o crescimento de ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja crua (SJCr), processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP) ...... 121 TABELA 9 – Balanço de nitrogênio * dos ratos (n = 6) alimentados com dietas contendo farinhas de P. moniliformis crua ( Pm Cr) e processadas termicamente

18 por fervura ( Pm F), cozimento em micro-onas ( Pm M) e autoclavagem ( Pm A), comparadas com o crescimento de ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja crua (SJCr), processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP) ...... 124 TABELA 10 - Parâmetros nutricionais obtidos pela alimentação de ratos (n = 6) submetidos a dietas contendo farinhas de P. moniliformis crua ( Pm Cr) e processadas termicamente por fervura ( Pm F), cozimento em micro-onas ( Pm M) e autoclavagem ( Pm A), comparadas com o crescimento de ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja crua (SJCr), processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP) ...... 127 TABELA 11 – Peso seco relativo (g/100 g de peso corpóreo) de órgãos internos de ratos (n = 6) submetidos a dietas contendo farinhas de P. moniliformis crua (Pm Cr) e processadas termicamente por fervura ( Pm F), cozimento em micro- onas ( Pm M) e autoclavagem ( Pm A), comparadas com o crescimento de ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja crua (SJCr), processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP) ...... 134 TABELA 12 – Parâmetros séricos dos ratos (n=6) alimentados com dietas contendo farinhas de P. moniliformis crua ( Pm Cr) e processadas termicamente por fervura ( Pm F), cozimento em micro-onas ( Pm M) e autoclavagem ( Pm A), comparadas com o crescimento de ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja crua (SJCr), processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP) ...... 138 TABELA 13 – Variação de peso, dieta ingerida e eficiênica alimentar * de ratos (n = 6) submetidos a dietas contendo farinhas de P. moniliformis crua ( Pm Cr), farinha de P. moniliformis crua livre de α-galactosídios ( Pm LG), farinha de soja crua adicionada de α-galactosídios (SJAG), dieta com farinha de soja crua (SJCr), comparadas com o crescimento de ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP) ...... 145 TABELA 14 – Balanço de nitrogênio * dos ratos (n = 6) alimentados com dietas contendo farinhas de P. moniliformis crua ( Pm Cr), farinha de P. moniliformis crua livre de α-galactosídios ( Pm LG), farinha de soja crua adicionada de α- galactosídios (SJAG), dieta com farinha de soja crua (SJCr), comparadas com o

19 crescimento de ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP) ...... 148 TABELA 15 - Parâmetros nutricionais obtidos pela alimentação de ratos (n = 6) submetidos a dietas contendo farinhas de P. moniliformis crua ( Pm Cr), farinha de P. moniliformis crua livre de α-galactosídios ( Pm LG), farinha de soja crua adicionada de α-galactosídios (SJAG), dieta com farinha de soja crua (SJCr), comparadas com o crescimento de ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP) ...... 150 TABELA 16 – Peso seco relativo (g/100 g de peso corpóreo) de órgãos internos de ratos (n = 6) submetidos a dietas contendo farinhas de P. moniliformis crua (Pm Cr) e processadas termicamente por fervura ( Pm F), cozimento em micro- onas ( Pm M) e autoclavagem ( Pm A), comparadas com o crescimento de ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja crua (SJCr), processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP) ...... 153 TABELA 17 – Parâmetros séricos dos ratos (n=6) alimentados com dietas contendo farinhas de P. moniliformis crua ( Pm Cr) e processadas termicamente por fervura ( Pm F), cozimento em micro-onas ( Pm M) e autoclavagem ( Pm A), comparadas com o crescimento de ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja crua (SJCr), processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP) ...... 156 CAPÍTULO 3 Página TABELA 1 – Espécies vegetais utilizadas nesse estudo, nome botânico e popular, uso na medicina popular, quantidade de sólido solúvel e quantidade de proteína ...... 189 TABELA 2 – Detecção de metabólitos secundários no extrato bruto de sementes de espécies vegetais da caatinga ...... 193 TABELA 3 – Detecção e dosage m de proteínas bioativas no extrato bruto de sementes de espécies vegetais da caatinga ...... 196 TABELA 4 – Determinação de atividade tóxica do extrato bruto de sementes de espécies vegetais da caatinga para camundongos e larvas de Aedes aegypti no 3 º estádio de desenvolvimento ...... 201 TABELA 5 – Avaliação da atividade antimicrobiana em meio sólido do extrato

20 bruto de sementes de espécies vegetais da caatinga ...... 205 TABELA 6 – Determinação da atividade quitinásica das frações proteicas oriundas do extrato bruto de P. moniliformis Benth. quando submetido a uma cromatografia de troca iônica em matriz de DEAE-celulose ...... 215 TABELA 7 – Determinação da atividade quitinásica das frações proteicas oriundas de D1 quando submetidas à cromatografia de afinidade em matriz de “Affi-ge Blue gel” ...... 222 TABELA 8 – Determinação da atividade quitinásica das frações proteicas oriundas de A1 quando submetidas à cromatografia de afinidade em matriz de Quitina ...... 227 TABELA 9 – Determinação da atividade quitinásica das frações proteicas oriundas do extrato bruto de Piptadenia moniliformis Benth. quando submetidos à precipitação com ácido tricloroacético (TCA) em diferentes concentrações ...... 232

TABELA 10 – Determinação da atividade quitinásica das frações proteicas oriundas da fração TCA 2% quando submetida a uma cromatografia de troca iônica em matriz de CM-sepharose ...... 235 TABELA 11 - Detecção e Dosagem de proteínas bioativas da fração proteica de sementes de P. moniliformis ( Pm FP) ...... 243 TABELA 12 – Efeito da fração proteica de Piptadenia moniliformis ( Pm FP) sobre a eclosão dos ovos e sobrevivência de larvas em 1º estádio de Aedes aegypti após 7 dias de exposição ...... 254

21 LISTA DE QUADROS

CAPITULO 2 Página QUADRO 1 – Informações botânicas, nutricionais e antinutricionais das dez espécies de leguminosas da caatinga ...... 92

22 ABREVIATURAS

ALT Alanina aminotransferase AST Aspartato aminotransferase BANA Ná-Benzoil-DL-Arginina-p-Naftilamida BAPNA Ná-Benzoil-DL-Arginina-p-Nitroalinida BSA Albumina Sérica Bovina

CL 50 Concentração Letal Média capaz de matar 50 % organismos CM Carboximetil

DL 50 Dose Letal Média capaz de matar 50 % dos animais testados DEAE Dietilaminoetil DMAB p-dimetilaminobenzaldeído DMSO Dimetilsolfóxido DTT Ditiotreitol EB Extrato Bruto EDTA Ácido etilenodiaminotetracético FAO Organização para a Agricultura e Alimentação FAT Fibra Alimentar Total FPLC “Fast Protein Liquid Chromatography” IQN Índice de Qualidade Nutricional µgTI Micrograma de Tripsina Inibida Mo -CBP3 Proteína ligante à quitina de sementes de Moringa oleifera NPU Utilização Líquida da Proteína PAGE Eletroforese em Gel de Poliacrilamida Pm FP Fração proteica de Piptadenia moniliformis PR-proteína Proteína relacionada à patogênese SBTI Inibidor de tripsina da soja SDS Dodecil Sulfato de Sódio SST Sólidos Solúveis Totais TCA Ácido Tricloroacético TEMED N’ , N’ , N’ , N’ , tetrametiletilenodiamina

23 Tris Tris (hidroximetil) aminometano VB Valor Biológico UH Unidades de Hemaglutinação

24 RESUMO

A Caatinga possui uma vegetação heterogênea cuja biodiversidade taxonômica conta com mais de 2.000 espécies de plantas. Dentre essas, cerca de 220 pertencem à família das leguminosas com 80 espécies endêmicas, únicas desse bioma. Muitas são usadas para diversas finalidades de forma indiscriminada, reduzindo consideravelmente a diversidade e o número de espécies antes mesmo do conhecimento de suas potencialidades. Estudos que possam agregar valor econômico e viabilizar o uso racional, sustentável e a conservação das mesmas, aliada à constante busca por novas fontes de proteínas vegetais para atender à demanda crescente da população, bem como a grande necessidade de descoberta de compostos naturais que auxiliem no combate aos patógenos humanos e de plantas, são de extrema relevância. Assim, o presente estudo objetivou avaliar o potencial nutricional e bioativo de sementes de dez espécies vegetais da Caatinga destacando a espécie mais promissora. Para tanto, dez espécies de leguminosas selvagens da Caatinga foram analisadas quanto a sua composição nutricional, apresentando elevado percentual de proteína bruta (10,9 ± 0,4 a 50,0 ± 3,4 %), fibras (0,8 ± 0,0 a 52,3 ±1,0 %) e energia (1.000 a 1.804 kJ/100g), com perfil de aminoácidos comparáveis aos da soja, com maiores teores de lisina (1088 a 456 mg/gN) e histidina (199 a 918 mg/gN) e bom perfil de minerais por apreentar boas quantidades de (mg/100g de farinha) de todos eles, em especial, de ferro (3,8 a 20,2), cálcio (31 a 268), magnésio (102 a 244) e potássio (366 a 1.581). As sementes apresentaram baixas quantidades de lectinas (80 a 2.560 e 160 a 2.560 UH/gF, quando não tratadas e tratadas com enzimas, respectivamente), inibidores de tripsina (4,1 ± 0,4 a 27,4 ± 0,2 µgTI/mgF ), ureases (465 ± 13 a 47.178 ± 3.351 U/KgF) e atividade tóxica, em apenas três espécies, com DL 50 variando de 0,72 ± 0,03 a 1,12 ± 0,04 g/Kg peso. Foi determinado um índice de qualidade nutricional para todas as espécies, o qual apontou a espécie Piptadenia moniliformis Benth. (Catanduva) como detentora de melhor qualidade nutricional, sendo assim destacada e avaliada in vivo a qualidade das proteínas de suas sementes. Os processamentos térmicos (fervura, cozimento em micro-ondas e autoclavagen) e o processo de extração de α-galactosídios nas sementes dessas espécies não proporcionaram bom desempenho dos animais, tendo em vista a perda de peso apresentada. Melhoria nos parâmetros nutricionais, como NPU e VB foi verificada após a retirada de α- galactosídios dessas sementes, sugerindo que a análise de outros processamentos para o aproveitamento das proteínas de suas sementes, pode torná-las uma fonte promissora. Além do alto potencial nutricional, as dez espécies apresentam também potencial bioativo devido à presença de metabólitos secundários como alcalóides, catequinas, calchonas, auronas, flavonóis, fenóis flavonas, xantonas, flavononóis, saponinas e triterpenóides. Possuem proteínas bioativas como proteases, quitinases (0,23 ± 0,02 a 2,0 ± 0,33 nKat/mgP), β-1,3- glucanases (0,01 ± 0,0 a 0,8 ± 0,01 nKat/mgP), além de proteínas ativas contra

25 microorganismos que também são consideradas antinutricionais (lectinas, inibidores de tripsina, ureases e toxinas). A avaliação dos extratos brutos (EB) das espécies mostrou que todas são ativas contra larvas de Aedes aegipty com percentual de mortalidade variando de 13,33 ± 0,54 a 100,00 ± 0,00 % , exceto o EB de Caesalpinea bracteosa que foi ativo contra a cepa Bacillus subtilis e contra o fungo Fusarium oxysporum , juntamente como o EB de Dioclea megacarpa. A espécie Senna rugosa inibiu o crescimento das cepas Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus. Os fungos fitopatogênicos Aspergilus niger e Colletotrichum truncatum foram inibidos pelos EBs de Piptadenia moniliformis e Enterolobium contortisiliquum , que além destes, foi ativo frente a Neurospora sp. e Trichoderma viridae . A espécie P. moniliformis destacou-se por sua elevada atividade quitinásica (1,12 ± 0,0 nKat/mgP) em adição à atuação contra modelos biológicos susceptíveis a essa enzima, tendo sido escolhida para sua purificação. A fração proteica purificada de P. moniliformis (Pm FP) contém elevada atividade de quitinases e causou pequena redução no crescimento das leveduras Saccharomyces cerevisiae e Candida tropicalis , bem como da bactéria B. subtilis .

Inibiu ainda, a eclosão de ovos de A. aegypti com CI 50 de 204, 42 ± 2,19 µgP/ml e alterou a estrutura dos ovos e morfologia das larvas de primeiro estádio. A investigação do potencial nutricional e bioativo das espécies mostrou boa composição de nutrientes, em especial de proteínas e confirmou a presença de compostos bioativos de natureza proteica e de metabólitos secundários, tornando-as promissoras fontes de nutrientes e compostos antimicrobianos e anti-inseticidas que podem ser utilizados biotecnologicamente para fins agrícolas e industriais.

Palavras chaves: Caatinga, Leguminosas, Leguminosas selvagens, Piptadenia moniliformis , valor nutricional, proteínas bioativas, antimicrobiano, larvicida.

26 ABSTRACT

The Caatinga Biome shows an heterogeneous vegetation with a taxonomic biodiversity of over 2,000 species of plants. Among these, approximately 220 belong to the Leguminosae family with 80 endemic species, unique to that biome. Many are used for various purposes in an indiscriminate manner, greatly reducing the variety and number of species even before the knowledge of their potential uses. Studies that can add economic value and enable the rational, sustainable use of these species, coupled with the constant search for new sources of plant protein to meet the ever increasing demand of the population are extremely important. Similarly important is the search for natural compounds which may help to combat human and plant pathogens. Thus, this study aimed to assess the nutritional and bioactive value of the seeds of ten plant species from Caatinga, highlighting the most promising ones. For this, the seeds were analyzed for nutritional composition, showing a high percentage of crude protein (10.9 ± 0.4 to 50.0 ± 3.4%), dietary fiber (0.8 ± 0 , 0 to 52.3 ± 1.0%) and energy (1,000 kJ/100g a1.804), with amino acid profile similar to that of soybeans, with higher amounts of lysine (1088-456 mg/gN) and histidine (199-918 mg/gN) and good mineral profile, with good content (mg/100 g flour) for all of them, especially, iron (3.8 to 20.2), calcium (31 to 268), magnesium (102-244) and potassium ( 366-1581). The seeds showed low amounts of lectins (80-2560 and 160-2560 UH / gF, when untreated and treated with enzymes, respectively), trypsin inhibitor µ(4.1 ± 0.4 to 27.4 ± 0.2 GTI / mgF), urease

(465 ± 13 to 47,178 ± 3,351 U / KGF) and toxic activity in only three species, with LD 50 ranging from 0.72 ± 0.03 to 1.12 ± 0.04 g / kg body weight . Was given an index of nutritional quality for all species, which pointed to Piptadenia moniliformis Benth. species (Catanduva) as the most promising one and because of that the seeds of this species was had the quality of its proteins evaluated in vivo. The thermal processing (boiling, microwave cooking and autoclaving) as well as the removal of α-galactosides did not improve animals performance. The nutritional parameters NPU and BV were improved when the animals were fed the seeds diet after removal of the α-galactosides. This may indicate that the search for apropriate processing methods may turn these seeds a promising source of proteins. Besides the high nutritional potential, the seeds of the ten studied species also have bioactive potential due to the presence of secondary metabolites such as alkaloids, catechins, calchonas, Auron, flavonols, flavones phenols, xanthones, flavononols, saponins and triterpenoids. These seeds also have bioactive proteins such as proteases, chitinases (0.23 ± 0.02 to 2.0 ± 0.33 nkat / mg P), β-1,3-glucanase (0.01 ± 0.0 to 0.8 ± 0, 01 nkat / mg P), and proteins active against microorganisms that are also considered antinutritional factors (lectins, trypsin inhibitors, urease and toxins). The evaluation of the crude extracts (CE) of the seeds showed that all species are active against the larvae of Aedes aegipti with mortality rates ranging from 13.33

27 ± 0.54 to 100.00 ± 0.00%, except that of Caesalpinea bracteosa which similarly to the CE of Dioclea megacarpa , was active against the bacterium Bacillus subtilis and against the fungus Fusarium oxysporum . Seeds extract of Senna rugosa species was able to inhibit the growth of Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus . The pathogenic fungi Aspergillus niger and Colletotrichum truncatum were inhibited by the CE of Piptadenia moniliformis and Enterolobium contortisiliquum. The latter was also active against Neurospora sp. and Trichoderma viridae . The species P. moniliformis was distinguished for its high chitinase activity (1.12 ± 0.0 nkat / mg P) in addition to its activity against biological models susceptible to this enzyme. For these reasons attempts were made for its purification. The purified protein fraction of P. moniliformis (PmFP) contains high activity of chitinases and caused a small reduction in the growth of the yeasts Saccharomyces cerevisiae and Candida tropicalis , and of the the bacterium B. subtilis . This protein fraction also inhibits the hatching of A. aegypti eggs with IC 50 of 204. 42 ± 2.19 µgP / ml. It causes changes in the eggs structure and in the morphology of first stage larvae. Thus, investigation of bioactive and nutritional potential of the species showed good composition of nutrients, especially of proteins, and confirmed the presence of bioactive compounds from protein nature and secondary metabolites, making them promising sources of nutrients, antimicrobial and insecticides that can biotechnologically be used for agricultural and industrial purposes.

Key words: Caatinga, Pulses, wild legumes, Piptadenia moniliformis , nutritional value, bioactive proteins, antimicrobial, larvicidal.

28

Fundamentação Teórica

29 1. LEGUMINOSAS COMO FONTE DE NUTRIENTES NA ALIMENTAÇÃO HUMANA

Os vegetais mais importantes na agricultura e na alimentação humana, depois das gramíneas (cereais), são os da família das leguminosas, com sua enorme quantidade de espécies e variedades (DURANTI, 2006). As leguminosas e os cereais são considerados a base na dieta de toda sociedade, apresentando aminoácidos essenciais complementares que os tornam alimentos de boa qualidade e capazes de fornecer proteínas funcionais (SHEWRY; TATHAM, 1999; SINDHU; KHETARPAUL, 2001; BOYE et al ., 2010). As leguminosas são fontes de proteínas, carboidratos, lipídios, algumas vitaminas e minerais, sendo destacadas como fontes de proteínas, embora o principal componente de algumas delas seja o óleo. São amplamente utilizadas como fonte de proteínas na dieta do homem devido ao alto conteúdo de nitrogênio quando comparado à quantidade presente nos cereais, que é cerca de duas vezes menor. Por essa razão, são importantes na dieta de seres humanos e animais, sendo a única fonte de proteínas na alimentação humana em muitas partes do mundo, principalmente em países em desenvolvimento com elevado número de pessoas de baixa renda (SHIM; JUN; KANG, 2003; WANG et al ., 2003; CRUZ et al ., 2004; GRUSAK, 2005; GRUSAK, 2008). As proteínas provenientes de plantas fornecem aproximadamente 65% da oferta mundial de proteínas para os seres humanos e, entre as plantas, as leguminosas são consideradas a principal fonte de proteínas alimentares, variando de 20 até 40 g por 100 g de matéria seca (NORTON; BLISS; BRESSANI, 1985; MAHE; GAUSSERES; TOME, 1994). Feijões, ervilhas, favas, lentilhas, grão de bico e soja são exemplos de importantes leguminosas usadas na alimentação humana e, entre as 20 espécies mais utilizadas, os feijões (Phaseolus vulgaris e Vigna sinensis ) e as ervilhas ( Pisum sativum L) são os mais amplamente cultivados e consumidos em todo o mundo (MORROW, 1991; OFUYA; AKHIDUE, 2005). O feijão comum ( Phaseolus vulgaris ) é considerado uma das principais fontes proteicas da população brasileira (OLIVEIRA et al ., 2003) e o feijão de corda ( Vigna unguiculata ) apresenta boa fonte de vitaminas do complexo B (tiamina, niacina, riboflavina, piridoxina e ácido fólico) e de minerais, especialmente ferro, zinco, potássio e fósforo (GRANGEIRO et al ., 2005; PHILLIPS et al ., 2003). Por outro lado, sementes de leguminosas são deficientes nos aminoácidos sulfurados metionina, cisteína e, em menor escala, em triptofano. Contêm quantidades relativamente

30 baixas de certos minerais (ferro, zinco e cálcio) quando comparadas às fontes de proteínas de origem animal (carnes) (GRUSAK, 2002; SHIM; JUN; KANG, 2003). Várias espécies de leguminosas têm sido cultivadas e consumidas em larga escala em diversas zonas climáticas. Já as espécies de leguminosas selvagens são recolhidas e também consumidas, em menor escala, pelas populações rurais e tribais, além de sua utilização como fontes de proteínas em algumas partes do mundo (AMUBODE; FETUGA, 1983; RODRIGUES; TORNE, 1991; MOHAN; JANARDHANAN, 1995; SEENA; SRIDHAR; JUNG, 2005; VADIVEL; JANARDHANAN, 2005). Essa utilização de leguminosas selvagens na alimentação mostra o potencial de conversão dessas espécies selvagens em cultivadas. Muitos esforços têm sido direcionados, nesse sentido, devido à limitação de proteínas animais e ao seu alto custo, que acabam por incentivar a busca por novas fontes de proteínas de origem vegetal (ENUJIUGHA; AYODELE-ONI, 2003; CRUZ et al ., 2004; IQBAL et al ., 2006). Além disso, a necessidade de minimizar os riscos relacionados ao consumo de alimentos de origem animal, o crescente aumento populacional e o número de indivíduos que passam fome no mundo (cerca de um bilhão de pessoas) também aumentam a necessidade da busca de novas fontes de nutrientes, em especial de proteínas (DURANTI, 1999; “International Food Policy Research Institute” (IFPRI, 2011). Estudos relacionados à qualidade de proteínas como novas fontes alternativas de nutrientes são de grande importância e muitos têm sido realizados sobre leguminosas selvagens, há algum tempo, em diversas partes do mundo (RAJARAM; JANARDHANAN, 1992; ARINATHAN; MOHAN; DE BRITTO, 2003; ARUN et al ., 2003), como, por exemplo, os realizados na Nigéria com as espécies Centrosema pubescens, Tamarindus indica e Cassia alata (UKHUN e IFEBIGH, 1988, 1989; ISHOLA; AGBAJI; AGBAJI, 1990), Acacia colei e Acacia tumida, usados como alimentos pelo povo australiano e Cassia floribunda Cav pelos indianos (VADIVEL; JANARDHANAN, 2001), Vicia fava L. da região da Antália (HACISEFEROGULLARE et al ., 2003) e leguminosas selvagens do deserto de Sonora, no México (ORTEGA-NIEBLAS; VÁSQUEZ-MORENO; ROBLES- BURGUEÑO,1996). Segundo Ortega-Nieblas e colaboradores (1996), sementes e vagens de leguminosas do gênero Acacia , Olneya e Prosopis têm sido utilizadas em diversos países para consumo humano e animal. O grande número de pesquisas em torno de leguminosas selvagens pode ser explicado por serem cosideradas por Shim, Jun e Kang (2003), de alta qualidade, de alto valor nutricional e apresentarem baixos teores de fatores antinutricionais, além desse fato ter sido comprovado pelos estudos de Bravo, Grados e Saura-Calixto (1994) e Ortega-Nieblas,

31 Vásquez-Moreno e Robles-Burgueño (1996) que demonstraram que vagens de plantas do gênero Prosopis são palatáveis e possuem alto valor nutricional e baixo teor de compostos antinutricionais. Entretanto, a adaptação às condições adversas e à resistência a doenças e pestes são as principais vantagens dessas plantas (MAIKHURI; NAUTIYAL; KHALI, 1991; SRIDHAR; SEENA, 2006). Investigação de leguminosas selvagens economicamente viáveis como uma alternativa de alimento amplia as fontes de proteínas para nutrição humana. Porém, não basta apenas disponibilizar essas fontes proteicas sem antes realizar os estudos da presença de fatores antinutricionais, bem como análise de toxicidade (MAIKHURI; NAUTIYAL; KHALI, 1991; PRAKASH; MISRA, 1983; SHIM; JUN; KANG, 2003). As leguminosas são conhecidas por conterem compostos que prejudicam a utilização de seus nutrientes, especialmente de suas proteínas quando incorporados nas dietas, causando efeitos deletérios agudos ou crônicos. Esses compostos são tidos como antinutricionais e são originados tanto do metabolismo primário quanto do metabolismo secundário das plantas, os quais incluem os polifenóis, as lectinas, os inibidores de proteases, as ureases, o ácido fítico, grupos cianogênicos, alcalóides, taninos, oligossacarídeos ( α-galactosídios), as saponinas e as toxinas, sendo responsáveis pela limitação do emprego de várias espécies de leguminosas na alimentação e pelo aumento de produção de flatos (WIRYAWAN; DINGLE, 1999; SINDHU; KHETARPAUL, 2001; VASCONCELOS et al ., 2001; VASCONCELOS; OLIVEIRA, 2004; JAIN; KUMAR; PANWAR, 2009). Um dos alvos para aumentar a qualidade nutricional das leguminosas inclui a remoção de fatores tóxicos e/ou antinutricionais, de compostos que tornam os sabores indesejáveis, de alergénos potenciais e melhoria da digestibilidade (SHIM; JUN; KANG, 2003). Recentemente, pesquisas sobre o desenvolvimento e a utilização de leguminosas selvagens têm focado na superação do déficit nutricional e toxicidade de algumas dessas leguminosas cultivadas (GUIL; RODRÍGUEZ-GARCÍA; TORIJA, 1997). Existem processamentos capazes de minimizar ou mesmo excluir os efeitos deletérios dos compostos antinutricionais como é o caso do aquecimento, visto que melhora a qualidade das proteínas de leguminosas pela inativação de compostos antinutricionais termolábeis, como, por exemplo, de lectinas e inibidores de tripsina (SWAMINATHAN, 1974; CHAU; CHEUNG; WONG, 1997; WANG et al ., 1997; VIJAYAKUMARI et al ., 1998), além disso, melhora o sabor e a aceitação da dieta. O processamento que consiste na retirada da casca das sementes retira taninos, responsáveis pela diminuição da digestibilidade das proteínas (BRESSANI; ELIAS, 1980). O tratamento de hidratação das sementes ajuda na retirada da casca, facilita o cozimento e extrai 32 alguns compostos antinutricionais que são solúveis em água (DURANTI, 2006). O processo de germinação das sementes envolve o aumento de atividade enzimática de muitas enzimas (amilase, proteases, fitase, lipase) levando à hidrólise das reservas das sementes, permitindo melhor aproveitamento dos nutrientes (WIRYAWAN; DINGLE, 1999; THARANATHAN; MAHADEVAMMA, 2003; DURANTI, 2006). Os estudos referentes à qualidade nutricional de sementes de leguminosas selvagens além de contribuir para o aumento de novas fontes de proteínas e nutrientes ainda é uma das formas de valorização e preservação dos recursos naturais, tendo em vista a utilização na alimentação humana (MATUDA; NETTO, 2005). Pesquisas mostram que os grãos de leguminosas não são apenas fontes de macro e micronutrientes, são também fontes de compostos ativos capazes de aumentar a promoção de saúde dos indivíduos por prevenirem doenças cardiovasculares, diabetes tipo 2, entre outras (BAZZANO et al ., 2001; AMAROWICZ; PEGG, 2008; CHO et al ., 2007; VILLEGAS et al. , 2008; LETERME, 2002). São utilizados para diversos outros fins, incluindo produção de madeira, medicamentos, aditivos alimentares, como fontes de moléculas bioativas importantes na agricultura, o que aumenta, ainda mais, sua importância e necessidade de ampliar as suas fontes (DUTANTI, 2006).

2. COMPOSTOS ANTINUTRICIONAIS E/OU BIOATIVOS DE LEGUMINOSAS

A utilização de leguminosas na dieta como fonte de nutrientes, seja de proteínas, de lipídios, de fibras, de vitaminas ou minerais, têm acrescido à dieta componentes que exercem ação antinutricional como as lectinas, os inibidores de proteases, os compostos fenólicos, o ácido fítico, grupos cianogênicos, alcalóides, taninos, ureases, oligossacarídeos, as saponinas e as toxinas (CHITRA et al ., 1995; OBOH et al ., 1998; WIRYAWAN; DINGLE, 1999; BURBANO et al ., 1999; SINDHU; KHETARPAUL, 2001; VASCONCELOS et al ., 2001; VASCONCELOS; OLIVEIRA, 2004; JAIN; KUMAR; PANWAR, 2009), responsáveis pela redução de utilização e do consumo dessas plantas como alimento, conforme já mencionado. Entretanto, pequenas quantidades de componentes antinutricionais têm sido negligenciadas, porque acredita-se que uma baixa quantia de um fator antinutricional não causa problemas no sistema humano (SHIM; JUN; KANG, 2003). Ademais, muitos desses compostos antinutricionais provocam efeitos fisiológicos além daqueles associados com a nutrição

33 humana essencial, sendo considerados compostos bioativos (CHAMP, 2002; BFC, 2004; SUNEJA et al. , 2011). Efeitos fisiológicos benéficos no controle e prevenção de várias doenças metabólicas (diabetes mellitus, doença cardíaca coronária e câncer de cólon) relacionados com a inclusão de leguminosas na dieta diária já foram relatados e o interesse pelos mesmos vem aumentando devido à sua capacidade de melhorar a qualidade de vida das pessoas que sofrem de distúrbios metabólicos (SHEHATA et al ., 1988; SIMPSON et al ., 1981; THARANATHAN; MAHADEVAMMA, 2003) Os compostos antinutricionais que também são considerados bioativos são os inbidores de tripsina, as lectinas, as ureases, as toxinas (todos proteínas) e, os polifenóis, os alcalóides, os taninos, os compostos cianogênicos, as saponinas (todos metabólitos secundários), entre outros, onde uma das funções da maioria deles está relacionada à defesa de plantas contra pragas e/ou patógenos (WINK, 1998; MACEDO et al ., 2006; OLIVEIRA et al ., 2007; WIESMAN; CHAPAGAIN et al ., 2003; CHAUDHARY et al ., 2008).

2.1 Compostos Antinutricionais e/ou Bioativos de Natureza Proteica

As leguminosas contêm em suas sementes, além dos nutrientes, proteínas como inibidores de proteínas e de amilases, lectinas, proteínas de defesa e outras, que por várias razões, são importantes para a qualidade nutricional e funcional das sementes. Uma das razões da existência dessas proteínas é a capacidade de adaptação e necessidade de sobrevivência sob condições naturais para a perpetuação da espécie (MURRAY, 1979; DURANTI, 2006).

2.1.1 Proteases

As proteases são enzimas com função de catalisar a hidrólise de ligações peptídicas de proteínas. São classificadas como exopeptidases, que clivam ligações peptídicas nas extremidades das proteínas (N- e C- terminais) e endopeptidases, com atividade catalítica no interior das proteínas (FRANCO; MELO; SILVA, 1999). As endopeptidases também são conhecidas como proteinases e são classificadas de acordo com o aminoácido presente em seu

34 sítio ativo e em seu mecanismo de ação em serínica, cisteínica, aspártica e metaloproteinases (BARRETT, 1987). As quatro classes de proteinases têm sido encontradas em diferentes órgãos e tecidos das plantas (RYAN; WALKER-SIMMONS, 1981). Realizam uma grande variedade de funções em processos fisiológicos complexos. Em plantas e microorgnismos atuam na esporulação e liberação do conídio, germinação (TORNERO et al ., 1996; BEERS; JONES; DICKERMAN, 2004), reconhecimento de patógenos, indução de respostas de defesa (AVROVA et al., 1999; LIU; DAMMANN; BHATTACHARYYA, 2001), degradação de proteínas de reserva (KEMBHAVI et al ., 1993), ativação de zimogênios, degradação de proteínas defeituosas (RUDENSKAYA et al ., 1995) e morte celular programada (SOLOMON et al ., 1999). Substâncias que atuam em proteases de microorgismos podem perturbar seu desenvolvimento normal e causar inibição de seu crescimento. Em seres humanos e animais, apresenta papel crucial em muitos processos fisiológicos e patológicos, tais como catabolismo de proteínas, cogulação do sangue, liberação de hormônios, ativação de zimogênios, transporte de proteínas secretoras, crescimento e migração celular, morfogenia e desenvolvimento, inflamação, crescimento de tumores e metástase (GODFREY; WEST, 1996). Compostos capazes de atuarem em proteases tumorais poderão ser utilizados como ferramentas contra câncer (CLEMENTE et al ., 2004), como é o caso dos inibidores de proteases. Proteases provenientes de plantas de grande interesse e utilização são a papaína, bromelina, e a queratinase (MORIHARA; ODA, 1993). Suas diversas funções fazem dessa classe de proteínas importantes ferramentas bioativas usadas para uma infinidade de aplicações industriais e biotecnológicas. A FIGURA 1 mostra as enzimas utilizadas no mercado mundial. Cerca de 60 % do mercado total de enzimas são produzidas pela indústria mundial, destas uma boa parcela é usada nas áreas de alimentação e de detergentes (GODFREY; WEST, 1996; MAURER, 2004), além da farmacêutica, onde são muito utilizadas para a fabricação de pomadas cicatrizantes. Devido à participação em etapas fisiológicas importantes que ocorrem no mecanismo invasivo de tumores, assim como no ciclo de infecção de um grande número de vírus e microrganismos patogênicos, as proteases tranformam-se em um alvo quimioterápico valioso para o desenvolvimento de novos compostos farmacêuticos (MONSAN et al ., 1978; SUTAR et al ., 1986; KALISZ, 1988).

35

FIGURA 1 – Enzimas utilizadas no mercado mundial (Fonte: RAO et al ., 1998).

2.1.2 Inibidores de Tripsina

Os inibidores de tripsina são proteínas capazes de se complexarem com as enzimas tripsina e quimiotripsina inibindo a atividade catalítica das mesmas (ORRU; DEMEL, 1941; OLIVEIRA et al ., 2007) e dessa forma prejudicam o processo digestivo por reduzir a digestibilidade de proteínas, causando reações fisiológicas indesejadas como a indução de hipertrofia e hiperplasia pancreática. Posteriormente, foi descoberto que os inibidores de tripsina também afetam o crescimento quando presente em dietas contendo aminoácidos livres (LIENER, 1976; LIENER, 1994: LAJOLO; GENOVESE, 2002). Experimentos com animais mostram que seu consumo promove moderada redução no ganho de peso e uma significante redução na utilização líquida de proteínas (PUSZTAI et al ., 1992). O mecanismo de ação dos inibidores de tripsina na dieta (do tipo Kunitz e Bowman Birk), seria a supressão da regulação por “feedback” negativo da secreção pancreática através do aumento da liberação de hormônio colecistocinina (LIENER, 1994). Entretanto, de acordo com as observações de Pustzai e colaboradores (1997), esse efeito não é decorrente apenas da redução de proteases no intestino, a simples presença desses inibidores no intestino já provoca liberação do hormônio colecistocinina. Contudo, os efeitos negativos são manifestados com a alta ingestão do inibidor, como ocorre quando as sementes de leguminosas são consumidas

36 cruas, posto que são termoestáveis e o aquecimento é capaz de causar desnaturação, provocando redução considerável em sua atividade inibitória (VIDAL-VALVERDE, 1994; HABIBA, 2002). Em contraposição à sua atividade antinutricional, uma vez inativados, os inibidores de tripsina podem contribuir positivamente na dieta devido ao seu alto conteúdo de aminoácidos contendo enxofre em relação à maioria das proteínas das sementes (RYAN, 1990). Além disso, também possuem efeito de proteção contra câncer (BANERJI; FERNANDES, 1994; WANG et al ., 1999; ARMSTRONG et al ., 2000; LAJOLO; GENOVESE, 2002; MATHERS, 2002; MURILLO; CHOI; PAN, 2004). Estudos com inibidor de tripsina da soja apontam ação contra certos tumores na mama e no cólon. Sua atividade anticancerígena parece estar envolvida com o controle da atividade enzimática de tumores (KENNEDY, 1995; 1998a,b; CLEMENTE et al ., 2004). A atividade contra certos tipos de cânceres requer que o inibidor esteja em sua conformação nativa, não podendo, dessa forma, utilizar tratamento térmico prolongado ou com temperaturas muito elevadas para o preparo de leguminosas, pelo fato desse processamento ser capaz de desnaturá-lo completamente (LAJOLO; GENOVESE, 2002). No entanto, essa desnaturação não ocorre com o cozimento convencionalmente utilizado para leguminosas, antes do consumo. Os inibidores de tripsina da soja mostram atividade anti-inflamatória pela inibição de protease mediadora da inflamação, tendo sido relatada redução de colite ulcerativa em ratos (WARE et al ., 1999). Já existem patentes para o uso de inibidores de tripsina da soja no combate à obesidade, a doenças degenerativas e auto- imunes (WARE et al ., 1999; FREITAS et al ., 2003; ROSTAMI; KENNEDY, 2004; SWEENEY; MORRIS; KENNEDY, 2005). O inibidor de tripsina presente nas sementes de leguminosa possui um importante papel na defesa do vegetal contra a herbivoria, além de evidências de seu envolvimento em resposta à injúria (ECKELKAMP; EHMANN; SCHOPFER, 1993; LIN et al ., 2006; LEDOIGT et al ., 2006). Dessa forma, sua ação não se restringe somente aos seres humanos, também é responsável por causar efeitos deletérios aos insetos que se alimentam de grãos (HILDER et al ., 1987; JOHNSON et al ., 1989; McMANAUS et al ., 1995; GROSJEAN apud VAN DER POEL et al ., 1993; LAWRENCE; KOUNDAL, 2002), agindo de forma semelhante, já que impede a ação das proteases serínicas dos insetos sobre seu substrato, impedindo o aproveitamento de nutrientes, atrapalhando o desenvolvimento normal dos mesmos (URWIN et al ., 1997; MACEDO et al ., 2000). Atua frente a vários nematóides patogênicos como Globodera tabacum , Globodera pallida , e Meloidogyne incognita (WILLIAMSON; HUSSEY, 1996). É capaz de interferir, ainda, na germinação de esporos e

37 crescimento micelial de fungos fitopatogênicos (DUNAEVSKII et al ., 1997; WANG; NG, 2006b). Sua atuação frente a pragas e patógenos insere-o no grupo de proteínas bioativas com boas características para serem aproveitadas para o desenvolvimento de culturas transgênicas resistente a pragas e patógenos, como já tem sido observado (SANE et al ., 1997; ALTPETER et al ., 1999; FALCO; SILVA, 2003), podendo proteger grãos de leguminosas economicamente importantes e, quem sabe, ainda trazendo benefícios aos seres humanos.

2.1.3 Lectinas

Lectinas são proteínas ou glicoproteínas, amplamente distribuídas na natureza, que possuem como característica a ligação a carboidratos presentes na superfície celular. Apresentam especificidade e grau de afinidade variado a diferentes carboidratos, desse modo, são capazes de aglutinar eritrócitos de alguns ou de todos os grupos sanguíneos in vitro (GONZÁLEZ et al ., 2002). Apresentam mais de um papel fisiológico nas plantas, como função de proteínas de reserva, crioprotetoras e moduladoras de atividade enzimática (RÜDIGER, 1998) e principalmente, como proteínas de defesa, exercendo efeito antinutricional em insetos e animais (PEUMANS; VAN DAMME, 1995; VASCONCELOS; OLIVEIRA, 2004). O efeito antinutricional em animais ocorre pela sua capacidade de interação com glicoconjugados, encontrados nas células gástricas e nos enterócitos, interferindo negativamente no aproveitamento de nutrientes da dieta devido à sua resistência à proteólise (SAGARBIERI, 1996; SASAKI et al ., 2002, VASCONCELOS; OLIVEIRA, 2004; OLIVEIRA et al , 2004a,b). A toxicidade de lectinas, quando consumidas em dietas por animais experimentais, é caracterizada pela inibição do crescimento desses animais, por causar danos ao epitélio e indução de aumento do intestino delgado, e, por estimular a hiperplasia e a hipertrofia do pâncreas, além de diarréia, náuseas, distensão abdominal e vômitos, quando consumidas ativas por seres humanos (LIENER; SHARON; GOLDSTEIN, 1986; BARDOCZ et al ., 1992; 1996). De forma similar aos inibidores de tripsina, as lectinas também parecem estimular a secreção pancreática de enzimas digestivas, mas modulada apenas parcialmente pela colecistocinina (GRANT et al ., 1999). Outro efeito indesejado dessas proteínas é a promoção de alergia alimentar provocada por afetar a resposta imune contra a ovoalbumina (CAMPOS- VEGA et al ., 2009a).

38 O processamento térmico adequado pode reduzir essa toxicidade das lectinas, no entanto baixa temperatura ou cozimento insuficiente pode não inativar completamente a mesma (VAN DRIESSCHE, 1988; LINNER, 1994). Em contrapartida, as lectinas são consideradas moléculas bioativas há bastante tempo, por possuir numerosos efeitos já observados incluindo indução de hiperplasia do intestino delgado, mudanças na flora intestinal, atividade imunomoduladora, interferência na secreção hormonal, acesso ao sistema circulatório, afinidade por antígenos tumorais, inibição da proliferação de células leucêmicas e da resposta mutagênica, entre outras. São, por isso, consideradas ferramentas importantes na medicina. Apesar de suas inúmeras propriedades terem dificultado a sua utilização médica, numerosos relatos mostram que, em modelos animais, as lectinas podem limitar o crescimento de tumores cancerígenos no intestino através da promoção de hiperplasia do epitélio do intestino ou outros fatores e parecem estar envolvidas no decréscimo de insulina e de lipídios no sangue, o que as tornam úteis para o tratamento terapêutico de câncer e de obesidade (PUSZTAI; BARDOCZ, 1996; PUSZTAI et al ., 1998; PRYME et al ., 1998; MATSUÍ et al ., 2001; HARLAND, 2002; VEJA; PÉREZ, 2006; WONG; NG, 2006; WONG et al ., 2006; GABOR; KLAUSEGGER; WIRTH, 2001; YAN et al ., 2005; MACEDO et al ., 2006). A característica de ligação a carboidratos com variado grau de especificidade confere as lectinas multifuncionalidade e aplicação em pesquisa biomédica e biotecnológica, sendo utilizadas como agentes defensivos na agricultura, através da engenharia genética, contra predadores, por serem ativas contra fungos (CIOPRAGA et al. , 1999; MELO et al ., 2005; XIA; NG, 2005; NGAI; NG, 2007), bactérias e insetos incluindo ação contra Aedes aegypti , vetor da dengue (PEUMANS et al ., 2000; GAIDAMASHVILI; VAN STADEN, 2002; COELHO et al ., 2009). Segundo Silva e Silva (2000) podem ser úteis na investigação de estrutura de proteína e carboidratos em células, na purificação e caracterização de polissacarídeos e glicoconjugados (LIMA et al ., 1997), na estimulação da mitogênese de linfócitos (abrindo novas perspectivas no campo da imunologia) e na aglutinação de células cancerígenas, sendo utilizadas nos estudos de oncogênese (SHARON; LIS, 2004). Diante do exposto, lectinas são proteínas biologicamente ativas que podem ser aproveitadas para diversos fins e sua exploração para possíveis usos na clínica médica e na agricultura é muito atrativa.

39 2.1.4 Ureases

As ureases são enzimas (EC 3.5.1.5, uréa aminohidrolase) que catalisam a hidrólise de uréia a amônia, dióxido de carbono e água (ROSENTHAL, 1974, STAPLES; REITHEL, 1976; DIXON et al .,1980). Segundo Polacco e Holland (1993) e Sirko e Brodzik (2000), pouco se sabe sobre o papel fisiológico de ureases em plantas, embora seja abundante nos vegetais. Acredita-se que está envolvida, juntamente com a arginase, na utilização das proteínas de reserva durante a germinação (THOMPSON, 1980) e tem sido proposto papel na assimilação de uréia derivada do metabolismo de ureídeos (SHELP; IRLANDA, 1985) ou importados a partir do ambiente uma vez que a uréia é um fertilizante foliar efetivo (ZONIA; STEBBINS; POLACCO, 1995). Uma hipósete compartilhada por muitos autores é que a urease desempenha algum outro papel importante nos vegetais, porque o seu substrato, uréia, não é o principal metabólito de planta (POLACCO; HOLLAND, 1993). Supõe-se o envolvimento de urease na defesa de vegetais (CARLINI; GROSSI-DE-SÁ, 2002), uma vez que a atividade ureolítica de urease é realizada em um sítio diferente de outras atividades relatadas para ela (FOLLMER et al ., 2001, 2004), além disso a distribuição e acúmulo de urease em sementes de leguminosas durante a maturação do embrião são sugestivos de um outro importante papel fisiológico. Sabendo que existe uma isoforma de ureases de plantas (canotoxina de Canavalia ensiformis ) que é letal para ratos e camundongos, quando injetados por via intraperitoneal, que inibem fungos fitopatogênicos e são ativas contra insetos Coleoptera e Hemíptera (OLIVEIRA et al ., 1999; CARLINI; GUIMARAES, 1981; FOLLMER et al ., 2001; CARLINI; GROSSI-DE-SA, 2002), e, que urease purificada de Canavalia ensiformis também apresentaram atividade contra outros fungos fitopatogênicos (BECKER-RITT et al ., 2007), esses dados podem reforçar a possibilidade de sua participação na defesa do vegetal contra insetos e fungos fitopatogênicos. As ureases são amplamente difundidas nos vegetais, fungos e bactérias (MOBLEY e HAUSINGER, 1989). As ureases bacterianas, tais como as de Proteus mirabilis e Helicobacter pylori desempenham um importante papel na patogênese de doenças animais e humanas (MOBLEY; ISLAND; HAUSINGER, 1995; OLIVERA-SEVERO; WASSEMANN; CARLINI., 2006). A H. pylori coloniza especificamente a mucosa e as microvilosidades gástricas das células epiteliais, através de sua potente atividade ureásica, que promove a alcalinização da acidez do estômago, permitindo sua sobrevivência em um meio ácido

40 (OPLUSTIL et al ., 2001). A produção de amônia pela urease bacteriana através da hidrólise da uréia presente no estômago apresenta atividade citotóxica, aumentando a permeabilidade da célula epitelial para prótons, e talvez participe como mediadora da resposta imune local, já que é potente ativadora de monócitos in vitro (GOBERT et al ., 2002; VOLAND et al ., 2003). Embora pouco compreendido, tem sido sugerido um papel antinutricional para ureases de plantas e especula-se que sua ação possa estar relacionada com o mecanismo de ação das ureases de H. pylori no estômago (POLACCO; HOLLAND, 1993). Em concordância à teoria de urease como fator antinutricional estão os achados de Vasconcelos e colaboradores (2001), que relacionaram a qualidade nutricional da proteína da soja com a presença de vários compostos tóxicos e/ou antinutricionais e mostraram, através de uma análise de regressão, que a urease é uma variável que estava envolvida nessa toxicidade, interferindo em alguns parâmetros nutricionais. No entanto, assim como para os inibidores de tripsina e as lectinas, as ureases também são termolábeis e podem ter sua atividade reduzida por tratamento térmico, o que irá aumentar a qualidade nutricional (ZHU; RIAZ; LUSAS, 1996; RAJKO; SZABO, 1997; DUDLEY-CASH, 1999).

2.1.5 Toxinas

Segundo Sgarbieri (1996), as toxinas são encontradas em diferentes organismos, incluindo as plantas, estando envolvidas na defesa do vegetal em conjunto com outras substâncias. Quando consumidas por via oral, ou administrada por vias endovenosa ou intraperitoneal, as proteínas tóxicas provocam alterações fisiológicas em algum parâmetro biológico dos organismos que entraram em contato com determinadas quantidades das mesmas. Sua toxicidade depende da quantidade, da via e da proteína utilizada (OLIVEIRA, 2009). As toxinas vegetais são, em sua maioria, metabólitos secundários e causam riscos à saúde humana e animal que as consomem em grandes quantidades. Se essas toxinas forem consumidas em quantidades moderadas também agirão como agentes antinutricionais, com exemplo os alcalóides, os glicosídeos cianogênicos, os oxalatos, os fenóis, os inibidores de protease, os taninos, as lectinas, entre outros. Agem inibindo ou bloqueando importantes rotas do metabolismo, especialmente a digestão por agirem contra enzimas, vitaminas, minerais e, principalmente, proteínas, reduzindo o valor nutritivo do alimento (NOVAK; HASLBERGR,

41 2000). Entretanto, proteínas tóxicas tais como a soyatoxina (SYTX), a toxina da soja (SBTX) e a Glycine max toxina ( Gm -TX) isoladas e caracterizadas por Vasconcelos et al. (1994) e Siebra (1998) e Oliveira (2009), respectivamente, já foram encontradas em soja e quando injetadas por via intraperitoneal, em camundongos, ou ratos, produzem dispnéia, paralisia flácida, convulsões tônico-clônicas e morte. As toxinas da soja não são capazes de afetar parâmetros de avaliação da qualidade nutricional (ganho de peso, utilização líquida de proteínas, digestibilidade e consumo de alimentos) de ratos, mas causa efeitos negativos em alguns órgãos, como intestino delgado e pâncreas (VASCONCELOS et al ., 2001), caracterizando sua toxicidade. Muitas toxinas são relativamente termoestáveis e somente parcialmente inativadas durante o tratamento térmico. (PEUMANS; VAN DAMME, 1996; CARLINI; UDEDIBIE, 1997). Este fato torna relevante a investigação de presença de toxinas em fontes que servirão de alimentos para seres humanos e/ou animais no intuito de proteção da saúde de ambos. Estudos realizados por Morais (2010) sugerem a participação da toxina da soja (SBTX) no mecanismo de defesa de plantas, uma vez que seus níveis são aumentados em resposta a injúria mecânica e possui atividades frente a fungos fitopatogênicos. Esses achados fazem dessa proteína tóxica, ou mesmo de outras, boas candidatas para a biotecnologia em plantas, pois os genes de proteínas tóxicas já têm sido introduzidas nos genomas de culturas importantes no intuito de torná-las resistentes a patógenos e insetos e estão sendo testadas nas condições de campo ou em vias de comercialização (PEFEROEN, 1997; SCHULER et al ., 1998; JOUANIN et al ., 1998; HILDER; BOULTER, 1999).

2.1.6 Quitinases

Quitina é um homopolissacarídeo altamente estável e insolúvel, formado por ligações de resíduos de β-1,4-N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc) (BRUNNER et al ., 1998). Representa o composto orgânico mais abundante na natureza, depois da celulose (LEE et al ., 2007), por isso amplamente distribuída, estando presente nas carapaças de crustáceos, em conchas de moluscos, na cutícula, no exoesqueleto e na membrana peritrófica de insetos, e, na parede celular de fungos e de algas verde, estando ausente em plantas superiores e animais incluindo o homem (GOODAY, 1990; BRUNNER et al ., 1998; SONGSIRIRITTHIGUL et al ., 2008). Esse biopolímero tem atraído significativa atenção nas áreas farmacológicas, biomédicas, 42 nutrição e nos campos agrícolas e biotecnológicos (MUZZARELLI; JEUNIAUX; GOODAY, 1986; BRINE; SANDFORD; ZIKAKIS, 1992; YAMADA et al ., 1993; PICHYANGKURA et al ., 2002; SASHIWA et al ., 2003; TANGSADTHAKUN et al ., 2007; KACHANECHAI; JANTAWAT; PICHYANGKURA, 2008; SONGSIRIRITTHIGUL et al ., 2008), por originar oligossacarídeos como quitoligossacarídeos [(GlcNAc)6 e (GlcNAc)7], glicosaminas e GlcNAc conhecidos por possuírem várias atividades biológicas incluindo atividade antitumoral e utilização no tratamento de osteoartrite (SUZUKI et al ., 1985; SHIRO et al ., 1996). Quitinases (EC 3.2.1.14) são as principais enzimas que catalisam a hidrólise de quitina. Existem muitos tipos de quitinases em sementes de plantas e muitas sintetizam várias isoformas de quitinases (COLLINGE et al ., 1993; GRAHAM; STICKLEN, 1994), já tendo sido purificadas de sementes de cereais como a cevada (LEAH et al ., 1991) e leguminosas, como o feijão de corda (GOMES et al ., 1996), soja (YEBOAH et al ., 1998), entre outras. Essa enzima é dividida em cinco classes de acordo com sua estrutura (YAMAGAMI; ISHIGURO, 1998) e são consideradas proteínas relacionadas a patogêneses (PR-proteínas), sendo produzidas constitutivamente e não apenas em resposta a estresses bióticos ou abióticos (FLACH; PILOT; JOLLES, 1992; COLLINGE et al ., 1993). Em micro-organismos estão envolvidas na morfogênese da parede celular e processos nutritivos (EL-KATANY et al ., 2001). Devido à ausência de quitina nos vegetais é sugerido seu envolvimento na defesa de plantas contra patógenos (ONAGA; TAIRA, 2008), principalmente frente a fungos (SCHLUMBAUM et al ., 1986). O fato de a quitina ser o principal componente estrutural da parede de fungos fitopatogênicos (BARTNICK-GARCIA, 1968; WESSELS; SIETSMA, 1981) faz das quitinases importantes proteínas bioativas contra esse patógeno, demonstrando seu potencial em proteger culturas economicamente importantes (MAUCH; MAUCH-MANI; BOLLER, 1988; NIELSEN; JORGENSEN; MEKKELSEN, 1994; GOMES et al ., 1996). Entretanto, algumas quitinases não apresentam atividade antifúngica (TAIRA et al ., 2005). Seu papel fisiológico não parece ser somente de defesa de plantas, pois parece possuir diferentes papéis em diferentes espécies. Kasprzewska (2003) sugere seu envolvimento na interação com micro-organismos simbióticos e em processos de desenvolvimento (embriogênese). Além disso, está envolvida na regulação da modulação de moléculas sinais e morte celular programada (GOORMACHTIG et al ., 1998; DE JONG et al ., 1992; HELLEBOID et al ., 2000; PASSARINHO et al ., 2001).

43 As quitinases também são usadas para reciclar lixo como restos de carapaças de artrópodes, e para a produção de quito-oligossacarídeos e produção de antifúngico para seres humanos (PATIL et al ., 2000; WANG; HWANG, 2001; DAHIYA; TEWARI; HOONDAL, 2006). O uso de quitinases na Biotecnologia através da engenharia genética é uma ferramenta promissora importante para a redução dos riscos e desvantagens inerentes aos métodos e proteção tradicional, já que além da ação contra fungos, apresenta-se ativa frente a nematóides, insetos e bactérias (GOODAY, 1990; DAHIYA; TEWARI; HOONDAL, 2006). Pelo exposto, percebe-se que as aplicações biotecnológicas de quitinases são diversas e amplamente utilizadas na agricultura, indústria e proteção ambiental em plantas transgênicas (LORITO et al ., 1998; FELSE; PANDA, 1999; PATIL et al ., 2000; WANG; HWANG, 2001; KISHIMOTO et al ., 2004), conferindo um grau de importância elevado para essa proteína devido sua à vasta bioativiade.

2.1.7 βββ-1,3- glucanases

As glucanas são polímeros de carboidratos que podem ter centenas ou milhares de unidades monossacarídicas ligadas entre si por ligações glicosídicas e diferem uma das outras pelo tipo de ligação, comprimento de suas cadeias polissacarídicas e pelo grau de ramificação (BAUERMEISTER, et al ., 2010). A β-1,3-glucana, como a quitina, é um dos principais componentes estruturais da parede celular de fungos e exoesqueleto de insetos, sendo o componente encontrado em maior quantidade na parede celular de leveduras (ZHU et al ., 1994; PINHEIRO et al ., 1999; KIM; CHANG; YUN, 2004). As β-1,3-glucanas podem ser hidrolisadas pelas β-1,3-glucanases para diferentes finalidades. As β-1,3-glucanases ao degradarem as β-1,3-glucanas liberam glucose e oligossacarídeos, como produtos finais da reação, e em um período mais longo, apenas moléculas de glucose (GIESE et al ., 2006). Elas podem ser do tipo exo- (EC 3.2.1.58) ou endoglucanases (EC 3.2.1.39) e também fazem parte das PR proteínas (PR-2). São amplamente distribuídas em plantas superiores e são induzidas durante a resposta de hipersensibilidade da planta a patógenos (BUCHER et al ., 2001), participando diretamente do processo de defesa de plantas por degradarem as β-1,3-glucanas constituintes estruturais de alguns patógenos (STONE; CLARKE, 1992; SUTHERLAND, 1999; IORIO et al ., 2008; FLEURI; SATO, 2008), apresentando atividade antifúngica quando analisada in vitro 44 (MAUCH; MAUCH-MANI; BOLLER , 1998; SELA-BUURLAGE et al ., 1993; VOGELSANG; BARZ, 1993). Já tendo sido utilizada na engenharia genética, juntamente com as quitinases, para a produção de plantas transgênicas de tomate e de tabaco conferindo um aumento na resistência desses vegetais, quando comparada à ação isolada de cada uma delas, ou seja, sua atividade frente a patógenos é bem superior quando as quitinses também estão presentes e vice versa, mostrando sinergismo de ambas (STINTZI et al ., 1993; JONGEDIJK et al ., 1995; JACH et al .,1995). Os gluco-oligossacarídeos originados da atuação das β-1,3-glucanases possuem potencial bioativo e têm sido descritos como agentes antitumorais (BARBOSA et al ., 2004), imunomoduladores e indutores de resposta anti-inflamatória, mediada pelas células do sistema imune, através da indução de mediadores pró- e anti-inflamatórios. O mecanismo de ação antitumoral tem sido relacionado à indução das diversas respostas imunológicas do hospedeiro, principalmente pela ativação das células “natural killer” (NK) (BARBOSA; DEKKER; GIESE; BARBOSA; DEKKER, 2010). As β-1,3-glucanases podem ainda, auxiliar na purificação de produtos presentes em células bacterianas como peptídeos, polissacarídeos, proteínas recombinantes, ácidos nucléicos, pigmentos, enzimas, lipídios, entre outros, além do potencial de aplicação para o preparo de protoplastos e fusão celular. Ressalta-se ainda a produção de extrato de levedura (FLEURI; SATO, 2008). Portanto, As β-1,3-glucanases possuem diferentes aplicações biotecnológicas, visto que atuam sobre diversas substâncias naturais que possuem ligações β- 1,3- glicosídicas, podendo ser aplicadas na agricultura, em indústrias de alimentos (na produção de bebidas como vinhos e cervejas), farmacêutica (oligossacarídeos com atividades funcionais) e laboratorial, entre outros (DUBOURDIEU et al ., 1985; KIRK; BORCHET; FUGLSANG, 2002; BLASCO et al ., 2006; GIESE; BARBOSA; DEKKER, 2010; BARBOSA; DEKKER; GIESE, 2010).

2.2 Compostos Antinutricionais e/ou Bioativos de Natureza Não Proteica

Os metabólitos secundários são oriundos do metabolismo secundário dos vegetais, isto é, produtos que não apresentam uma função direta nas atividades bioquímicas primárias, responsáveis pelo crescimento, desenvolvimento e reprodução. Compreendem uma ampla gama de substâncias de diferentes famílias, tais como compostos fenólicos, terpenóides, óleos

45 essenciais e compostos nitrogenados como alcaloides, entre outros. São altamente induzidos em resposta ao estresse. Muitos deles são responsáveis pelos efeitos medicinais, ou tóxicos, das plantas e apresentam grande importância ecológica, uma vez que podem atuar na atração de polinizadores ou representar uma defesa química contra estresse ambiental (BALADRIN et al., 1985; Di STASI, 1995; RISPAIL; NASH; WEBB , 2005). São considerados antinutrientes, agindo como barreira para o uso de leguminosas como alimento e, simultaneamente, conferindo efeitos benéficos sendo, assim, considerados nutracêuticos, fazendo parte dos chamados alimentos funcionais (CHAMP, 2002; JAMROZ; KUBIZNA, 2008; CAMPOS-VEGA et al ., 2009a). Exemplos desses compostos são os alcaloides, compostos fenólicos, taninos, as saponinas, entre outros.

2.2.1 Alcaloides

Os alcaloides ocorrem naturalmente como aminas tóxicas produzidas pelas plantas, estando presente em diversos vegetais incluindo sementes de leguminosas como tremoço (WINK et al ., 1995). São incolores, geralmente básicos, insolúveis em água e solúveis em solventes orgânicos. Todos os alcaloides contêm nitrogênio, geralmente formando parte de uma estrutura heterocíclica. Os efeitos tóxicos de alcaloides resultam em perturbações no sistema nervoso central, processos digestivos, reprodução e sistema imunológico (LALLÈS; JANSMAN, 1998). Existem muitos alcaloides conhecidos, mas nem todos são tóxicos. Dentre esses compostos, o alcaloide quinolizinínico é o fator antinutricional mais importante e seu alto conteúdo em dietas à base de leguminosas é a razão para vários efeitos deletérios no organismo, tais como diminuição da palatabilidade, consumo e utilização da dieta (GODFREY et al ., 1985; DONOVAN et al ., 1991). Há muito tempo, é conhecida a ação dos alcaloides na defesa de plantas contra a herbivoria (WALLER; NOWACKI, 1978; WINK, 1998) e possuem efeitos antihelmínticos (HOCQUEMILLER et al . 1991; KAYSER; KIDERLEN; CROFT, 2003), antibacteriano (CASTILHOS et al ., 2007) contra, por exemplo, as espécies Escherichia coli , Pseudomonas aeruginosa , Bacillus thuringensis , Bacillus subtilus and Staphylococcus aureus (JUL et al ., 2003) e antifúngico (WINK; MOHAMED, 2003), frente os fungos fitopatogênicos Alternaria porri , Piriculata oryzae , Helminthosporium carbonum , Fusarium oxysporum e Aspergillus oryzae (JUL et al ., 2003), por exemplo. Apresentam, ainda, propriedades farmacológicas e já

46 têm sido usados para o tratamento clínico de câncer, parkinsonismo, hipertensão e desordem no metabolismo central (RATHBONE; BRUCE, 2002).

2.2.2 Composto Fenólicos

Os compostos fenólicos possuem uma ou mais hidroxilas (OH) ligados ao anel aromático, podendo apresentar vários grupos substituíntes e estão entre os metabólitos secundários mais difundidos (CASTRO et al ., 2004). Os polifenóis são exemplos destes e sua classe mais importante é a dos ácidos fenólicos que compreendem estruturas poliméricas tais como taninos hidrolisáveis, lignanas, estilbenos, e flavonóides. Os flavonoides incluem as flavonas, as isoflavonas, flavanonas, antocianidinas e os flavonois (catequinas e proantocianidinas, conhecidos como taninos condensados) (SCALBERT; WILLIAMSON, 2000; MANACH et al , 2004). Os polifenóis possuem uma enorme variedade de funções que envolvem tanto o desenvolvimento natural da planta como sua proteção contra predadores e micro-organismos patogênicos (DUTHIE; DUTHIE; KYLE, 2000; SCHIJLEN et al ., 2004; KALOGEROPOULOS et al ., 2010). Para se defenderem de predadores como os herbívoros, que incluem os seres humanos, possuem a capacidade de se ligarem a proteínas positivamente carregadas, aminoácidos e/ou cátions multivalentes ou minerais como cálcio, ferro e zinco nos alimentos (GILANI; COCKELL; SEPEHR., 2005). Assim, reduz a digestão e absorção desses nutrientes, diminuindo a qualidade do alimento. Embora considerados antinutricionais também apresentam propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias, antidiabéticas e antitumorais, contribuindo para o decréscimo de patologias degenerativas relacionadas com a idade e apresentando um papel positivo contra alguns tipos de câncer, tais como os de pulmão, próstata, pele e cólon e são associadas como baixa incidência de doenças cardiovasculares (KRIS-ETHERTON et al ., 2002), além de funções defensivas contra infecções (atividades antimicrobianas) e injúrias (DECKER,1995; BARNES; ANDERSON; PHILLIPSON, 2001; THARANATHAN; MAHADEVAMMA, 2003; PETTI E SCULLY, 2009). Dessa forma, enquanto o baixo conteúdo de fenóis é preferido para os atributos nutricionais, altos níveis desses compostos bioativos são importantes, do ponto de vista de seu uso biotecnológico, na proteção e combate de doenças para humanos e plantas.

47 2.2.3 Taninos

Os taninos são compostos fenólicos solúveis em água compreendendo um grande grupo de substâncias complexas muito disseminadas no reino vegetal. Em quase todas as famílias botânicas há espécies que contêm taninos, estando presentes em cereais como a cevada e o sorgo e em leguminosas como a fava e a ervilha, entre outras (JANSMAN, 1993). São encontrados, principalmente, nas cascas das sementes (BALOGUN; FETUGA, 1986; JOSEPHINE; JANARDHANAN, 1992). Podem ser divididos em dois grupos os hidrolisáveis e os não hidrolisáveis ou taninos condensados (FERRÃO et al ., 2003). Ambos possuem a característica de se complexarem com proteínas e polissacarídeos, impedindo a ação enzimática sobre o complexo, além de possuir afinidade de ligação a íons metálicos, tais como vanádio, ferro, cobre, manganês, alumínio, cálcio, entre outros (JANSMAN, 1993; FERRÃO et al ., 2003). Um dos efeitos antinutricionais de taninos é a redução da palatablidade devido às suas propriedades adstringentes, as quais são causadas pela formação de complexos entre os taninos e as glicoproteínas presentes na saliva, durante a mastigação (REED, 1995). Apresentam ainda redução de digestibilidade de carboidratos além das proteínas, causando redução no crescimento (VADIVEL; JANARDHANAN, 2005). Embora termoestáveis, o nível de taninos em leguminosas pode ser reduzido por simples tratamentos como retirada de suas cascas e hidratação das sementes seguidas de tratamentos térmicos como autoclavagem, por exemplo (RAO; DEOSTHALE, 1982; SIDDHURAJU; VIJAYAKUMARI; JANARDHANAN, 1996; VIJAYAKUMARI et al ., 1996; RANI; HIRA, 1998). Em contraposição às propriedades antinutricionais, os taninos, são compostos bioativos com propriedades bioquímicas e farmacológicas in vitro , incluindo atividade antioxidante, conhecida por trazer benefícios à saúde (SRIDHAR; SEENA, 2006), Apresentam efeitos antihelmintico (KAYSER; KIDERLEN; CROFT, 2003), antitumoral, antimicrobiano e antiviral (HASLAM et al ., 1989; OKUDA; YOSHIDA; HATANO, 1992; HASLAM, 1996).

48 2.2.4 Saponinas

As saponinas são moléculas estruturalmente diversas e quimicamente referidas como triterpenos e glicosídeos esteroidais. Consistem em agliconas não polares associadas a um ou mais monossacarídeos (OLESZEK, 2002), são caracterizadas por suas propriedades surfactantes e por formar espuma em soluções aquosas (OLESZEK; BIALY, 2006). Possuem inúmeras propriedades, as quais incluem a doçura e o amargor (GRENBY, 1991; KITAGAWA, 2002; HENG et al ., 2006b), formação de espumas e propriedades emulsificantes (PRICE; JOHNSON; FENWICK, 1987), hemolíticas (SPARG; LIGHT; VAN STADEN, 2004; CAMPOS-VEGA et al ., 2009a), farmacológicas e medicinais, devido à sua capacidade de redução da pressão arterial e do colesterol do fígado (OAKENFULL et al ., 1984; ATTELE; WU; YUAN, 1999), as quais levam à diminuição dos riscos de doenças cardiovasculares (KORATKAR; RAO, 1997; DURANTI, 2006). Apresentam efeito protetor contra câncer (MATHERS, 2002), aliada a propriedades antimicrobianas, anti-inseticidas (incluindo contra larva de Aedes aegypti ) e moluscicidas (WIESMAN; CHAPAGAIN, 2003; SPARG; LIGHT; VAN STADEN, 2004; SANTIAGO et al. , 2005; JAMROZ; KUBIZNA, 2008). Têm sido utilizadas em bebidas e confeitaria, bem como em produtos cosméticos (PRICE; JOHNSON; FENWICK, 1987; PETIT et al , 1995; UEMATSU; HIRATA; SAITO, 2000) e farmacêuticos (SPARG; LIGHT; VAN STADEN, 2004). Seu efeito antinutricional, provavelmente, se dá por meio da ligação a células intestinais afetando a absorção de nutrientes pela parede intestinal ou pelo aumento da permeabilidade das células do intestino delgado, levando a uma redução de transporte ativo de nutrientes através da parede intestinal (JOHNSSON; OBST; DAVIES, 1982) e, consequentemente, diminuição de crescimento (CHEEKE, 1971; JOHNSON et al ., 1986; PUSZTAI et al ., 2004; GOLAWASKA, 2007). Devido às suas propriedades variadas são utilizadas para diversos fins fazendo parte dos compostos bioativos de grande interesse industrial.

49 3. BIODIVERSIDADE DAS ESPÉCIES VEGETAIS DA CAATINGA COMO POTENCIAL FONTE DE ALIMENTOS E REPOSITÓRIO DE MOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS

Biodiversidade é definida como variedade e variabilidade entre organismos vivos e a complexidade ecológica, segundo Sandes e Diblasi (2000). O país que apresenta a maior biodiversidade do mundo é o Brasil e apesar disso, pouco se conhece dessa amplitude biológica. A Região Nordeste é coberta pelo bioma da Caatinga de clima semiárido, com plantas adaptadas fisiologicamente às condições de deficiência hídrica. A biodiversidade da flora dessa região é extremamente alta, contendo mais de 2.000 espécies de plantas (ANDRADE-LIMA,1981,1989; SAMPAIO et al., 2002, VELOSO et al ., 2002, LEAL; TABERNALLI; SILVA, 2003). Apresenta um alto índice de endemismo, tendo sido considerada, equivocadamente, por um bom período, como apresentando pouco valor biológico (TABARELLI; VICENTE, 2004). Acredita-se que a quantidade real de espécies da Caatinga é ainda mais numerosa do que a relatada, já que 41% da região nunca foi estudada e 80% ainda permanecem subamostradas (SILVA et al . 2004; TABARELLI, VICENTE, 2004). Regiões naturais são aquelas que cobrem mais de 10.000 km 2 de área contendo mais de 70% de vegetação intacta. Há pouco tempo a Caatinga foi considerada uma das 37 grandes regiões naturais do planeta, com uma pequena controvérsia, dado seu atual nível de perturbação, ou seja, pelo extenso processo de devastação ambiental provocado pelo uso insustentável dos seus recursos naturais (LEAL; TABERNALLI; SILVA, 2003). Isso, apesar de ser a única grande região natural brasileira cujos limites estão inteiramente restritos ao território nacional. Ademais, a contribuição da sua biota à biodiversidade do Brasil tem sido subestimada e pouca atenção tem sido dada à conservação da diversificada e característica paisagem desse bioma (SILVA et al ., 2003). Somente há alguns anos a Caatinga passou a ser mais estudada, mas ainda assim, pouco é conhecido em relação a suas potencialidades, já que existem espécies que ainda nem foram descritas (GIULIETTI et al ., 2004). No entanto, mesmo sendo bastante desconhecida e desvalorizada, apresenta muitas espécies vegetais que podem ser estudadas, valorizadas e portanto, conservadas. A necessidade de conservação da biodiversidade tem ganhado cada vez mais adeptos e esse número cresce à medida em que a ciência descobre novos usos para plantas, até, então, sem interesse (GIULIETTI et al ., 2004).

50 Plantas nativas da região têm sido utilizadas para diversas finalidades, tais como uso forrageiro, medicinal, apícola, para o melhoramento do solo, para a produção de carvão, lenha, vara e madeira para uso industrial. Em menor escala, são usadas na alimentação humana, devido à escassez de conhecimento. A utilização das espécies é feita de forma prejudicial e predadória, causando redução na diversidade das espécies nativas (DRUMOND et al., 2000; McCRAY; WALSH; HAMMETT, 2005). Por isso, estudos que possam viabilizar o uso racional e sustentável das mesmas são de extrema relevância. Na Caatinga, foram encontradas 215 espécies da família Leguminosae, destas, 80 são endêmicas, únicas desse bioma (GIULIETTI et al ., 2002) e os principais gêneros dessa família estão apresentados na TABELA 1. As famílias que ocorrem com maior frequência são as Cactaceae e Euphorbiaceae, sendo as espécies dos gêneros Pithecellobium , Senna e Mimosa, presentes em maior número (BIOSFERA DA CAATINGA, 2010). A família das leguminosas possui uma enorme variedade de espécies e são conhecidas por sua vasta quantidade de compostos de defesa proteicos e não proteicos, como as proteases, inibidores de protease, lectinas, quitinases, e, os alcaloides, terpenoides, os polifenóis, respectivamente (CARLINI; GROSSI-DE-SA, 2002; WINK; MOHAMED, 2003). São, ainda, fontes de macro e micronutrientes para a alimentação humana e as leguminosas selvagens são consideradas de alta qualidade e de alto valor nutricional, além de apresentarem baixos fatores antinutricionais (SHIM; JUN; KANG, 2003). Pelo exposto, a biodiversidade de leguminosas pertencentes à Caatinga é bastante útil para a prospecção de espécies no intuito da busca por novas fontes alimentares, novos fármacos e/ou por produtos para serem aproveitados industrialmente, ou para outras finalidades, uma vez que suas sementes são repositórios de moléculas bioativas, ou seja, possuem substâncias que apresentam alguma atividade sobre o metabolismo de um organismo vivo. De acordo com Rodrigues (2003), trabalhos de conhecimento da biodiversidade para conservação, manejo e bioprospecção foram, e são exaustivamente realizados em outros biomas do país (bioma Amazônico, na região norte e bioma Atlântico, na região sudeste). Sabendo que a Caatinga, dentre os biomas brasileiros, é o menos conhecido, cientificamente, tornam-se necessários estudos envolvendo espécies pertencentes a esse ecossistema, visando não só a conservação dos recursos naturais, como também o aproveitamento da biodiversidade na intenção de contribuir com o planejamento de estratégias de desenvolvimento sustentável.

51 TABELA 1 – Algumas espécies da família Leguminosae endêmicas presentes na Caatinga

Leguminosae (80)

Acacia kallunkiai Grimes &Barneby Leucochloron limae Barneby & Grimes Acacia piauhiensis Benth. Mimosa adenophylla Taub. var. armandiana (Rizzini) Barneby Aeschynomene martii Benth. Mimosa adenophylla var. mitis Barneby Arachis pusilla Benth. Mimosa brevipinna Benth. Arachis triseminata Krapov. & Gregory Mimosa caesalpiniifolia Benth. Bauhinia cacovia subsp. Blanchetiana Wunderiin Mimosa campicola Harms var. planipes Barneby Blanchetiodendron blanchetii (Benth.) Barneby & Grimes Mimosa coruscocaesia Barneby Caesalpinia calycina Benth. Mimosa exalbescens Barneby Caesalpinia gardneriana Benth. Mimosa glaucula Barneby Caesalpinia laxiflora Tul. Mimosa hor tensis Barneby Caesalpinia microphylla Mart. ex G.Don Mimosa lepidophora Rizzini Caesalpinia pyramidalis Tul. var. Pyramidalis Mimosa leptantha Benth. Calliandra aeschynomenoides Benth. Mimosa marröensis Barneby Calliandra depauperata Benth. Mimosa mensicola Barneby Calliandra duckei Barneby Mimosa misera Benth. var. Misera Calliandra imperialis Barneby Mimosa misera var. subnermis (Benth.) Barneby Calliandra leptopoda Benth. Mimosa modesta Mart. var. Modesta Calliandra macrocalyx Benth. var. aucta Barneby Mimosa modesta Mart. var. ursinoides (Harms) Barneby Calliandra macrocalyx Benth. var. Macrocalyx Mimosa niomarlei A.Fernandes Calliandra spinosa Ducke Mimosa nothopteris Barneby Calliandra squarrosa Benth. Mimosa ophthalmocentra Benth. Calliandra ulei Harms Mimosa pseudosepiaria Harms Calliandra umbellifera Benth. Mimosa setuligera Harms Chamaecrista belemii (Irwin & Barneby) var. belemii Mimosa subenervis Benth. Chamaecrista belemii var. paludicola (Irwin & Barneby) Mimosa ulbrichiana Harms Irwin & Barneby Chamaecrista brevicalyx (Benth.) Irwin & Barneby var. Mimosa xiquexiquensis Barneby elliptica (Irwin &Barneby) Irwin & Barneby Chamaecrista coradini Barneby Mysanthus uleanus (Harms) G.P.Lewis & A.Delgado Chamaecrista swainsonii (Benth.) Irwin & Barneby Parapiptadenia zehntneri (Harms) M.P.Lima & H.C.de Lima Chloroleucon dumosum (Benth.) G.P.Lewis Pterocarpus simplicifolius Barneby Klitgaard. L.P.Queiroz & G.P.Lewis Chloroleucon extortum Barneby & Grimes Senna acuruensis (Benth.) var. Acuruensis Coursetia rostrata Benth. Senna acuruensis var. caatingae (Harms) Irwin & Barneby Coursetia vicioides (Nees & Mart.) Benth. Senna acuruensis var. interjecta Irwin & Barneby Cratylia mollis Mar t. ex Benth. Senna aversiflora (Herb.) Irwin & Barneby Crotalaria holosericea Nees & Mar t. Senna gardneri (Benth.) Irwin & Barneby Dalbergia catingicola Harms Senna harleyi Irwin & Barneby Dalbergia cearensis Ducke Senna martiana (Benth.) Irwin & Barneby Dalbergia decipularis Rizzinni & A.Mattos Senna rizzin Irwin & Barneby Dioclea marginata Benth. Stylosanthes bahienses L.´t Mannetje & G.P.Lewis Hymenaea eriogyne Benth. Zornia echinocarpa (Meissner) Benth. Indigofera blanchetiana Benth. Zornia ulei Harms Fonte: GIULIETTI et al ., 2002

52 Neste contexto, as pesquisas para a identificação de novas fontes de nutrientes, em especial de proteínas, para a alimentação humana, bem como a identificação de proteínas e metabólitos secundários bioativos presentes em plantas, foram realizados em dez espécies de leguminosas pertencentes a esse bioma. As dez espécies selecionadas para os estudos foram escolhidas aleatoriamente dentre muitas outras existentes no banco de sementes do Laboratório de Bioprospecção de Recurssos Regionais (Bioprospec) devido, primeiramente, à disponibilidade de suas sementes, já seria necessário uma grande quantidade de grãos para o estudo proposto.

3.1 Caesalpinia bracteosa Tul.

A Caesalpinia bracteosa Tul. é conhecida como Catingueira no Ceará e como Pau- amarante nas demais localidades encontradas como Piauí, Bahia e Mato Grosso. Pertence à ordem Fabales, a família Leguminosae (Fabaceae), subfamília Caesalpinoidae, ao gênero Caesalpinia e a espécie Caesalpinia bracteosa Tul (CORRÊA, 1974). É uma árvore com folhas de 3-5 pinas e com flores numerosas de cor amarela, usadas medicinalmente contra doenças das vias aéreas superiores (FIGURA 2-H). Seus frutos encontram-se em vagens (FIGURA 3-2) e sua madeira possui valor regular (CORRÊA, 1974; QUEIROZ, 2002; ZIPCODE ZOO, 2010). A C. bracteosa adapta-se muito bem à maioria dos solos e climas, sendo bastante tolerante à seca. Possui um potencial forrageiro que mais demora a entrar em dormência, mantendo-se com sua folhagem em média por 238 dias após o término das chuvas, além de apresentar uma boa quantidade de proteínas (BARROS; SOUSA; ARRUDA, 1997; ARAÚJO FILHO; CARVALHO; GADELHA, 1998). A maioria dos estudos relacionados com a C . bracteosa Tul. é referente ao seu valor nutritivo para a alimentação de ruminantes e de ovelhas (ARAÚJO FILHO; CARVALHO; SILVA, 2002; NETO et al ., 2001; NETO et al ., 2004). Nenhuma pesquisa relaciona essa espécie vegetal como fonte de nutrientes para a alimentação humana e pouquíssimas pesquisas estão relacionadas à busca por compostos bioativos (GOÉS et al ., 2003) tornando esses enfoques bastante promissores.

53 3.2 Caesalpinia ferrea Mart. Ex. Tul.

A espécie Caesalpinia ferrea é conhecida popularmente como Jucá e Pau-ferro. Pertence à família Leguminosae (Fabaceae) subfamília Caesalpinoidae, gênero Caesalpinia e espécie C. ferrea Mart . Ex. Tul. É encontrada em toda a região Nordeste e também no Espírito Santo e o Rio de Janeiro (na Floresta Pluvial atlântica). No Ceará é mais frequente na serra do Araripe e do Apodi (BRAGA, 1976; MAIA, 2004; APG, 2010). O porte arbóreo dessa espécie é de 10 a 15 metros de altura (FIGURA 2-B), com tronco de curto diâmetro (40 a 60 m). Sua copa possui forma redonda, ampla e bem aberta. As folhas alternas, compotas, com 2-4 pares de pinas, cada uma com 4-6 pares de folíolos de 1 a 3 cm (MAIA, 2004). Suas flores são pequenas e amarelas. Seu fruto (FIGURA 3-1) é uma vagem acastanhada, achatada, às vezes encurvada, com 6-8 cm de comprimento e 1,5 cm de largura (MAIA, 2004). A floração acontece nas épocas chuvosas e de transição chuvosa-seca que se estende do final de novembro até janeiro. Prefere solos argilosos e profundos devido à profundidade de suas raízes. Seus frutos estão maduros em meados de julho e agosto (BRAGA, 1976) e suas vagens são procuradas pelos animais silvestres e domésticos, não sendo degradada no trato digestório de ruminantes (MAIA, 2004). Cresce sobre diferentes condições, sendo encontradas às margens de rios e riachos, em tabuleiros e pés de serra. É resistente ao fogo e tolerante à sombra. É uma espécie utilizada com diversas finalidades, tais como planta ornamental, forragem, como planta medicinal para o tratamento de feridas, contusões, asma, tosse crônica, antidiarréicos, antitérmicos (MAIA, 2004). Seu extrato aquoso bruto é eficaz contra úlcera gástrica (BACCI; SERTIE, 1988). Tendo sido relatada atividade anti-inflamatória e analgésica (THOMAS; ARAÚJO; SOUZA, 1988; CARVALHO et al ., 1996). Além disso, sua madeira é utilizada na construção civil e para outras aplicações (MAIA, 2004). Suas várias aplicações medicinais mostram bom potencial para presença de compostos bioativos e o fato de animais a consumirem como alimento deve ser melhor investigado, pois pode levar à descoberta de novas fontes de alimentos.

54 3.3 Dioclea megacarpa Rolfe

A espécie Dioclea megacarpa Rolfe, apresenta nome popular de Mucunã e olho-de - boi. Pertence à família Leguminosae (Fabaceae), subfamília Faboideae, gênero Dioclea e a espécie D. megacarpa Rolfe. É uma leguminosa trepadeira cujas flores são roxas (FIGURA 2- I). No outono ela assume uma coloração amarela, as espécies adultas são grandes em tamanho e alcançam 17 m de altura (BRAGA, 1976). D. megacarpa Rolfe foi classificada de modo errôneo como D. grandiflora (Mart.) no herbário da Universidade Federal do Ceará, Prisco Bezerra, tendo como conseqüência a publicação de alguns trabalhos com a classificação incorreta dessa espécie (BATISTA, 2009). A espécie possui potencial bioativo uma vez que já foram purificadas e caracterizadas proteínas, como lectinas e inibidores de tripsina em suas sementes (FIGURA 3-3(a) e (b)) (MOREIRA et al ., 1983; CARVALHO et. al ., 1988; MELGAREJO; VEGA; PÉREZ., 2005), bem como encontradas proteínas com atividade antifúngica e com potencial inseticida contra Callosobruchus maculatus (BATISTA, 2009). Entretanto, não foi relatado nenhum dado referente a metabólitos secundários nessa espécie, nem investigação sobre a qualidade dos nutrientes presentes nas sementes.

3.4 Enterolobium contortisiliquum (Vell.) Morong

A espécie Enterolobium contortisiliquum (Vell.) Morong é vulgarmente conhecida como Orelha-de-macaco, orelha-de-negro, timbaúba, entre outros. Apresenta dois nomes botânicos: Mimosa contortisiliqua Vell. e Enterolobium timbouva Mart. (LORENZI, 1998). Faz parte da família Leguminosae (Fabaceae), subfamília Mimosoideae, gênero Enterolobium Mart. e Enterolobium timbouva Mart. e espécie Enterolobium contortisiliquum (Vell.) Morong. (CRIA, 2005). É uma espécie arbórea com altura entre 20 a 35 m e tronco medindo de 80 a 160 cm de diâmetro (FIGURA 2-E). A copa é ampla e frondosa, proporcionando ótima sombra. Suas folhas são compostas, bipinadas, com 2 a 7 jugas de pinas. As flores apresentam-se em capítulos globosos, esbranquiçados, florescendo em meados de setembro, permanecendo até novembro. A vagem é coriácea, dura e lenhosa, indeiscente, preta, incurvo-reniforme,

55 lembrando uma orelha [FIGURA 3-5(a) e (b)], explicando a origem de seu nome popular “Orelha-de-negro”. Seus frutos amadurecem nos meses de junho e julho, porém permanecem na árvore por alguns meses a mais (BRAGA, 1982; LORENZI, 1998). Foram relatados vários estudos com essa planta relacionados à sua bioatividade pela presença de compostos secundários e de algumas proteínas. As sementes de E. contortisiliquum possuem óleo essencial que apresenta ainda atividade antibacteriana (SHAHAT et al ., 2008). De acordo com a pesquisa de Hashimoto e Nishimoto (1996) o uso dessa espécie na medicina popular no tratamento de doenças parasitárias e gonorréia está associado à elevada quantidade de saponinas triterpenóides nela presente. Outras pesquisas apresentaram o isolamento de outras nove saponinas com atividade citotóxica contra macrófagos (MIMAKI et al ., 2003; 2004). Em relação às proteínas já estudadas dessa espécie, já foi isolada, a partir das sementes, uma proteína hemolítica apresentando atividade pró-inflamatória (CASTRO-FARIA-NETO et al ., 1991), um inibidor de tripsina do tipo Kunitz foi purificado e caracterizado (BATISTA et al ., 1996) e três inibidores de quimotripsina (EcCI1, EcCI2 e EcCTI) (BEZERRA, 2010), além de uma vicilina ligante à quitina, biologicamente ativa contra fungos filamentosos e insetos (MOURA et al ., 2007). Dessa forma, a espécie E. contortisiliquum pode ser considerada importante repositório de moléculas biologicamente ativas, devendo ser mais explorada. No que diz respeito à qualidade nutricional dessa leguminosa não foram encontrados relatos, sendo interessante investigá-la.

3.5 Erythrina velutina Willd.

A espécie Erythrina velutina Willd. apresenta nomes comuns, tais como Mulungu, corticeira-do-banhado, suinã, bico-de-papagaio, canivete, corticeira e sananduva. Faz parte da família Leguminosae (Fabaceae), subfamília Faboideae, gênero Erythrina e espécie E. velutina Willd. (ESALQ – USP, 2010). É uma espécie arbórea, medindo de 8 a 12 m de altura (FIGURA 2-A). O tronco possui muitos acúleos, casca lisa, com estrias longitudinais mais claras. Suas folhas são alternas, trifolioladas, com cerca de 20 cm de comprimento, apresenta folíolos ovado- deltoídes, tomentosos e mais claros na face interior. As flores são de cor vermelha, dispostas em rácemos. Seu fruto é uma vagem, semi tortuosa, com sementes em formato de feijão, de

56 cor avermelhada (FIGURA 3-9(a) e (b)), a época de frutificação é de Janeiro a Fevereiro (ESALQ – USP, 2010). A madeira dessa espécie é branca, leve, mole e porosa, usada na fabricação de palitos de fósforo. É uma planta ornamental, usada no paisagismo com sucesso. É ainda usada no sombreamento de cacaueiros e como cerca viva. Muitos pássaros procuram suas flores pelo seu néctar (ESALQ – USP, 2010). Estudos utilizando o extrato bruto das cascas de E. velutina apresentaram atividade antibacteriana contra Staphylococcus aureus e Streptococcus pyogenes . Foram identificados nas frações do extrato bruto alcaloides, ácido fênico, ácido cinâmico, α-amirina, estigmasterol, β-amirina, β -sitosterol e lupeol (VIRTUOSO; MIGUEL, 2005; VIRTUOSO et al. , 2005). Apresentam ainda lectinas (STOJANOVIC et al ., 1994; MORAES et al ., 1996; OLIVEIRA et al ., 1998), alcaloides (FOLKERS; SHAVEL, 1951) e flavonoides (DA CUNHA et al ., 1996). Possuem atividades analgésica (VASCONCELOS et al ., 2003), e anti- inflamatória (SAIDU et al ., 2000), ansiolítica (VASCONCELOS et al ., 2004; RIBEIRO et al ., 2006) e anticonvulsivante (VASCONCELOS et al ., 2007), o que mostra seu potencial farmacológico. Não foram encontradas pesquisas com utilização dessa espécie como fonte de alimento para humanos.

3.6 Hymenaea courbaril L.

É conhecida popularmente como Jatobá, farinheira, imbiúva, jabotii-timbaí, jassaí, jatabá-trapuca, jataí, jataíba, jatobá-de-anta, entre outros (LORENZI; MATOS, 2002). Faz parte da família Leguminosae (Fabaceae), subfamília Caesalpinoideae , gênero Hymenaea e espécie Hymenaea courbaril L. (ESALQ – USP, 2010). É uma árvore com 30 m de altura ou mais (FIGURA 2-C), possuindo folhas compostas, alternas, pecioladas, bifoliada, coriáceas, falciformes ou ovais, glabras. Sua inflorescência se dá em panículas terminais. Apresentam flores esbranquiçadas e frutos (2-8 cm) em forma de vagens indeiscentes, duros e de cor castanho-avermelhado, apresentando de 2 a 6 sementes [FIGURA 3-7(a) e (b)], envoltas por uma farinha. Essa farinha é dotada de grande valor nutritivo, consumida pelo homem como alimento e por animais, principalmente roedores. Floresce durante os meses de outubro a dezembro. Os frutos amadurecem a partir do

57 mês de julho (PRANCE; SILVA, 1975; CARVALHO FILHO et al ., 2003; GORCHOV et al ., 2004). Sua farinha é empregada como fonte de alimento e a madeira para obras hidráulicas, na construção civil, na fabricação de móveis, carroçarias, postes, tonéis, dormentes, construções variadas, entre outros. (LOUREIRO; SILVA; ALENCAE, 1979; LORENZI; MATOS, 2002). Produzem resinas utilizadas para a produção de vernizes (RIZZINI, 1971). Pesquisas com H. courbaril mostram a presença de óleos essenciais, taninos (PANIZZA, 1997; PINTO et al ., 2000) e, em suas folhas e casca, possuem compostos terpênicos e fenólicos com propriedades antifúngicas, antibacterianas e moluscicidas (STUBBLEBINE; LANGENHEIM, 1980; LORENZI; MATOS, 2002). Muitos estudos estão focados em seus carboidratos (Xiloglucanos, galactoxyloglucan) (TINÉ; CORTELAZZO; BUCKERIDGE, 2000; MARTIN et al., 2003; TINÉ et al ., 2006). Esses trabalhos mostram o grande potencial alimentar e como fonte de moléculas bioativas.

3.7 Lonchocarpus sericeus (Poiret) Kunth

A espécie Lonchocarpus sericeus (Poiret) Kunth é popularmente conhecida por Ingá, ingazeiro, imburana, entre outros (LORENZI, 1998). Pertence à família Leguminosae (Fabaceae), subfamília Papilionaceae, ao gênero Lonchocarpus Kunth e à espécie L. sericeus (Poiret) Kunth (CRIA, 2005). Essa espécie é uma planta arbórea, com altura variando de 4 a 20 metros e copa arredondada (FIGURA 2-D). Seu tronco é ereto e cilíndrico, com diâmetro de 30 a 70 cm e com casca ligeiramente rugosa (LORENZI, 1998). Suas folhas são compostas imparipinadas, com raque de 5 a 9 cm de comprimento, cada uma tem entre 5 e 9 folíolos opostos, com estípulas pequenas. As flores possuem coloração lilás, contendo brácteas e bractéolas. Seus frutos são vagens indeiscente, membranosa, contendo de 1 a 6 sementes [FIGURA 3-6(a) e (b)] (CORRÊA, 1984; LORENZI, 1998). As sementes são feijões de, aproximadamente, 1,5 cm de comprimento por 1 cm de largura (CORRÊA, 1984; LORENZI, 1998). A florescência ocorre principalmente entre os meses de outubro e fevereiro e o amadurecimento dos frutos se dá de junho a agosto. Essa espécie é utilizada como árvore ornamental, sua madeira é utilizada na construção civil, na fabricação de móveis, lenha, carvão, ente outros (LORENZI, 1998).

58 Em sementes de L. sericeus já foram detectadas lectinas com atividade anti- inflamatória e antimicrobiana em ratos apresentando peritonite (ALENCAR et al ., 2005), e, apresentando capacidade de redução da migração de leucócitos e de hipernocicepção inflamatória (NAPIMOGA et al ., 2007). As cascas de suas raízes possuem atividade antiedematogênica. As calchonas presentes em suas raízes apresentaram atividade citotóxica sobre células de leucemia linfocítica de origem humana (FONTENELE, 2010). Essa espécie é usada na medicina popular para tratamento de desordens intestinais e como protetor do fígado, possuindo efeito hepatoprotetor confirmado por Agbonon e Gbeassor (2009). Foi realizada avaliação de sua qualidade nutricional determinação da composição proximal, da presença de fatores antinutricionais, composição de aminoácidos, associado ao ensaio de alimentação usando ratos experimentais (PROLL et al ., 1998).

3.8 Parkia platycephala Benth.

A espécie Parkia Platycephala Benth, conhecida como Visgueiro, faveira, faveira- preta, ou fava-de-bolota, taxonomicamente é classificada como sendo da família das Leguminosae (Fabaceae), da subfamília Mimoseae , do gênero Parkia P. Browne e da espécie P. Platycephala Benth. (CRIA, 2005). É uma leguminosa arbórea, com altura de 8 a 10 cm, dotada de copa ampla (FIGURA 2-E). Suas folhas são compostas bipinadas, alternas ou opostas, de 10 a 12 cm de comprimento. Seu fruto é achatado, glabro, frequentemente enrolado, de 10 a 12 cm de comprimento [FIGURA 3-8(a) e (b)], legumes indeiscentes produzidos anualmente no meio da estação seca de seis meses de duração, entre os meses de agosto e outubro (BULHÃO; FIGUEIREDO, 2002; LORENZI, 2002). A P. Platycephala é destacada pelo potencial paisagístico, qualidade de sua madeira e por participar da exploração de energia, adubação verde e reflorestamento (BEZERRA; CARVALHO; CHAVES, 2009). As suas vagens maduras apresentam potencial forrageiro e são muito usadas na suplementação alimentar para ruminantes, especialmente caprinos e bovinos, (LORENZI; 2002; ALVES et al ., 2007) com valor nutritivo de suas vagens já investigado (ALVES, 2004). Estudos com P. Platycephala mostram o isolamento e a cristalização de uma lectina (GALLEGO DEL SOL et al ., 2002) e de uma proteína ligante a quitina presentes em suas

59 sementes (CAVADA et al ., 2005). Já foi relatada a presença de compostos fenólicos e atividade antioxidante nessa espécie (BEZERRA; CARVALHO; CHAVES, 2009). As pesquisas que a relatam como suplemento para ruminantes e de presença de proteínas e compostos secundários bioativos mostram quão promissora é essa espécie, merecendo mais investigações para maiores utilizações futuras.

3.9 Piptadenia moniliformis Benth.

P. moniliformis é conhecida popularmente como Angico, angico de bezerro, rama de bezerro, carrasco, jurema preta, marmeleiro, quipembé, catanduba, e catanduva no estado do Ceará (LEWIS, 1987; MAIA, 2004). É uma espécie pertencente à ordem Fabales , família Leguminosae (Fabaceae), s ubfamília Mimoseae , tribo Adenanthereae, gênero Piptadenia Benth., seção Pityrocarpa e espécie P. moniliformis Benth. (CRIA, 2005). Geograficamente é distribuída no Brasil pelos estados da Bahia, Ceará, Pernambuco e Piauí. Apresenta-se com uma árvore de tamanho médio, medindo 4 a 9 metros de altura, sem espinhos, dotada de copa arredondada (FIGURA 2-G). Seu tronco é tortuoso e um pouco rugoso. Possui folhas compostas, bipinadas e suas flores são branco-esverdeada quando novas, ficando quase amarela ou marron quando velhas, estando disposta em espigas de 5 a 9 centímetros de comprimento. Seu fruto é uma vagem de até 13 centímetros de comprimento, de cor marron, coriácea, curvada, contraída entre as sementes que são brancas, ovais e comprimidas (FIGURA 3-10(a) e (b)). Sua floração acontece nos meses de janeiro a março, por ocasião do período chuvoso na região, e, os frutos amadurecem nos meses de julho a setembro (MAIA, 2004). É planta decídua, heliófita, seletiva xerófita, pioneira, característica da caatinga do Nordeste brasileiro, onde é muito abundante. A sua presença é muito comum no sopé de serras e na faixa intermediária entre o litoral e o sertão, possuindo caráter invasor e um crescimento rápido. Apresenta uma produção abundante de sementes viáveis e é muito indicada para o reflorestamento com fins conservacionistas (BRAGA, 1982; MAIA, 2004). A P. moniliformis é utilizada em pequenas obras na construção civil, marcenaria leve, cabo de ferramentas, para lenha e carvão, devido à boa qualidade de suas madeiras. Por ser uma espécie de rápido crescimento, é indicada na recuperação de solos, combate à erosão além do reflorestamento (LORENZI, 1998; MAIA 2004). É empregada também na apicultura,

60 posto que suas flores são muito visitadas por abelhas haja vista a grande quantidade de néctar existente, tendo recebido grande atenção pelos interessados na produção de mel (AIRES; FREITAS, 2001; SILVA et al. , 2004). Apresenta ainda, um grande potencial forrageiro sendo palatável para bovinos, ovinos e caprinos. No entanto, há relatos pela população nativa de que os animais que consomem suas folhas cortadas, algumas horas antes, são intoxicados, ao passo que em seu estado fresco (na árvore) nada lhes acontecem (GIULIETTI et al ., 2004; MAIA, 2004; ZIPCODE ZOO, 2010). Os estudos encontrados relacionados a essa espécie possuem foco na composição florística e estrutural e na produção de mel (ARAÚJO et al ., 1998; AIRES; FREITAS, 2001; MARACAJÁ et al., 2003; SILVA et al. , 2004). Além disso, foi purificado por Cruz (2008) um inibidor de tripsina do tipo Kunitz de sementes de P. moniliformis , apresentando atividade contra larvas das moscas-das-frutas ( Ceratitis capitata ). A farinha de suas sementes apresentou efeito deletério no desenvolvimento do bruquídeo Callosobruchus maculatus, quando incorporada a dietas artificiais (COSTA, 2009), mostrando que possui potencial bioativo. Não foram encontrados relatos referentes à qualidade nutricional de suas sementes.

3.10 Senna rugosa (G.Don) H.S.Irwin & Barneb y

A espécie Senna rugosa (G. Don) H.S.Irwin & Barneby é vulgarmente conhecida como Lagarteira, pertencente à família Leguminosae (Fabaceae), subfamília Caesalpinoideae, gênero Senna e espécie S. rugosa (G. Don) H.S.Irwin & Barneby. É uma espécie arbórea, medindo 1,5 m (FIGURA 2-J). Suas folhas apresentam pecíolos pilosos. As flores são pediceladas, medindo de 2-3 cm, com pétalas amarelas. Seus frutos são legumes arredondados com 7 a 9 cm, estipitados, pilosos; possuem várias sementes (FIGURA 3-4). Sua floração é observada nos meses de fevereiro a maio e a frutificação de maio a agosto (MARTINS, 2009). . Há poucos relatos na literatura sobre a espécie S. rugosa . Uma das pesquisas com essa espécie apresenta o isolamento de antraquinona e naftopiranos (BARBOSA et al ., 2004). No entanto, no gênero Senna , a qual pertence, já foram constatadas a presença de alcaloides (ALEMAYEHU et al ., 1993; SANSORES-PERAZA et al ., 2000), quinonas (ALEMAYEHU et al ., 1993), antraquinonas, em sua cerne (MALHOTRA; MISRA, 1982), em suas sementes (ALEMAYEHU et al ., 1993) e em raízes e folhas (BARBA; DÍAZ; HERZ, 1992).

61 A espécie S. Rugosa , por ser pouco estudada e devido ao potencial apresentado por seu gênero torna-se objeto de pesquisa interessante. A pesquisa com espécies selvagens pode contemplar a interdisciplinaridade e buscar a conservação desses recursos genéticos da flora brasileira.

62

A B C

D E

F G

H I J

FIGURA 2 – Espécies vegetais da Caatinga Cearense. A - Erythrina velutina ; B - Caesalpinia ferrea ; C - Hymenaea courbaril ; D - Lonchocarpus sericeus ; E - Enterolobium contortisiliquum ; F - Piptadenia moniliformis ; G - Parkia platycephala ; H - Caesalpinia bracteosa ; I - Dioclea megacarpa ; J – Senna rugosa . (Fontes em anexo)

63

1 1 2

3 (a) 3 (b) 4

5 (a) 5 (b) 6 (a) 6 (b)

7 (a) 1 7 (a) 2 7 (b) 8 (a) 8 (b)

9 (a) 7

a)

1 10 (a) 2 10 (b) 9 (b) 10 (a) FIGURA 3 – Vagens e Sementes de espécies vegetais da Caatinga. (a) Vagens, (b) Sementes 1 - Caesalpinia ferrea ; 2 – Caesalpinia bracteosa ; 3 – Dioclea megacarpa ; 4 – Senna rugosa ; 5 - Enterolobium contortisiliquum ; 6 – Parkia platycephala ; 7 - Lonchocarpus sericeus ; 8 - Erythrina velutina ; 9 - Hymenaea courbaril ; 10 – Piptadenia moiliformis . (Fontes em anexo)

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Prospecção Nutricional em Sementes de dez Leguminosas da Caatinga Cearense

65 1. CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA E JUSTIFICATIVA

A maior diversidade genética vegetal do mundo pertence ao Brasil, contendo cerca de 60.000 espécies de plantas, o que corresponde a 75% de todas as espécies vegetais existentes nas grandes florestas, possuindo 20% de toda a flora mundial conhecida (SANT’ANA e ASSAD, 2001; CALIXTO, 2003; Ambiente Brasil-Ambiente Natural – Caatinga (2011). O único bioma exclusivo do Brasil é a Caatinga, destacada pela riqueza de sua flora com um grande número de espécies (mais de 2.000 espécies de plantas), incluindo muitas endêmicas (ANDRADE-LIMA, 1981, 1989; PRADO, 1991; LEAL; TABERNALLI; SILVA, 2003). O número real de espécies na Caatinga é, provavelmente, ainda maior, uma vez que 41% da região nunca foi investigada e 80% permanece subamostrada (TABARELLI; VICENTE, 2004). Esses percentuais mostram a biodiversidade da Caatinga, inserindo-a em um relevante cenário para a bioprospecção, tendo em vista a importância de espécies vegetais para diversos fins, incluído sua utilização como alimentos, uma vez que muitas plantas nativas desse bioma já têm sido relatadas com essa finalidade (ALMEIDA et al. , 1998; EPSTEIN, 1998). A exploração indiscriminada da vegetação da Caatinga, feita com fins meramente lucrativos, tem levado a uma crescente devastação dos ecossistemas, causando uma gradual e irreversível perda de espécies, sem que haja tempo e recursos para estudar suas potencialidades (FERREIRA, 2000; NASCIMENTO; OLIVEIRA, 2005). Assim, pesquisas com espécies nativas que venham a revelar seu potencial podem gerar conhecimentos de várias de suas propriedades e aplicabilidades, viabilizando os usos sustentáveis dessas espécies, podendo ainda despertar interesse de conservação, exploração racional e manejo desses ecossistemas. Portanto, são de grande importância estudos que mostrem o valor econômico que pode ser agregado aos produtos naturais provenientes da Caatinga, para investimento no aproveitamento sustentável dos recursos genéticos e da diversidade biológica em áreas de interesse químico, farmacêutico, agrícola e industrial (ODALIA-RÍMOLI et al. , 2000). Por outro lado, a nutrição é a necessidade básica mais importante dos seres vivos, estando diretamente ligada à saúde dos indivíduos (VADIVEL; JANARDHANAN, 2005). A desnutrição é um problema mundial, especialmente em países em desenvolvimento, com sérias consequências econômicas (FAO/WHO, 2001). Para se ter uma ideia, de acordo com a pesquisa realizada por

66 IFRPRI (International Food Policy Research Institute) em 2010, existe quase um bilhão de pessoas passando fome no mundo e, segundo o Instituto, a persistência da fome no mundo está ligada à desnutrição infantil, que se concentra em algumas regiões. A deficiência de proteínas é a principal causa da má ou desnutrição nos países em desenvolvimento (PELLETIER et al. , 1995) e o elevado preço dos produtos alimentares, inclusive da soja, pode contribuir para esse quadro (ENUJIUGHA; AYODELE-ONI, 2003). Por isso, grãos de leguminosas são fontes importantes de proteínas e em muitas regiões do mundo são a única fonte desse nutriente (DURANTI; GIUS, 1997; WANG et al ., 2003). Ademais, o aumento gradativo da população mundial e a necessidade de reduzir os riscos relacionados ao consumo de alimentos de origem animal, especialmente nos países desenvolvidos, aumentam a importância da utilização de proteínas (e outros nutrientes) de sementes de leguminosas na dieta e, consequentemente, aumento na demanda (DURANTI; SCARAFONI, 1999). O fato justifica os intensos esforços dos pesquisadores na busca por novas fontes de proteínas de plantas. As leguminosas selvagens, adaptadas a condições adversas, têm sido alvo de estudo como novas fontes alternativas de proteínas ao redor do mundo há bastante tempo (BALOGUN; FETUGA, 1986; RAVINDRAN; RAVINDRAN, 1988; SIDDHURAJU; VIJAYAKUMARI; JANARDHANAN, 1996; BRESSANI et al ., 1987; BRESSANI; SOSA, 1990; CARNOVALE; LUGARO; MARCONI, 1991; JOSEPHINE; JANARDHANAN, 1992; RAJARAM; JANARDHANAN, 1992; EKANAYAKE; JANSZ; NAIR , 2000; ARINATHAN; MOHAN; DE BRITTO, 2003; ARUN et al ., 2003; VADIVEL; JANARDHANAN, 2005; SEENA; SRIDHAR; JUNG , 2005). Isso porque, segundo Shim, Jun e Kang (2003), plantas selvagens de alta qualidade, alto valor nutricional e baixos fatores antinutricionais, já têm sido encontradas com sucesso. A necessidade de descoberta de novas fontes de proteínas e o fato da Caatinga se constituir em um repositório de espécies vegetais selvagens muito pouco exploradas, tanto sob o viés científico como econômico, serviram como bases científicas para formulação da seguinte hipótese: A Caatinga possui leguminosas selvagens com bom potencial nutricional podendo servir como fonte de novas proteínas vegetais a serem utilizadas na alimentação humana.

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2. OBJETIVOS

2.1 Objetivos Gerais

• Determinar o potencial nutricional das sementes de dez espécies de leguminosas da Caatinga • Avaliar a qualidade proteica de uma espécie promissora usando como modelo experimental ratos em crescimento.

2.2 Objetivos Específicos

• Determinar a composição centesimal de dez sementes de leguminosas da Caatinga; • Determinar a composição de aminoácidos essenciais e não essenciais das proteínas das sementes das leguminosas; • Investigar a presença de compostos tóxicos e/ou antinutricionais (lectina, inibidor de tripsina, ureases e toxinas); • Verificar o teor de minerais de importância nutricional (potássio, sódio, cálcio, magnésio, ferro, zinco, manganês, cobre, cromo e molibdênio); • Apontar espécies com melhor potencial nutricional para estudos futuros, mais aprofundados, referentes à qualidade de suas proteínas; • Selecionar uma espécie dentre aquelas com melhor potencial nutricional para a avaliação de sua qualidade proteica através de experimentos nutricionais com ratos a fim de avaliar o desempenho desses animais comparados ao controle positivo; • Avaliar métodos diferentes de processamentos na farinha das sementes da leguminosa escolhida para a diminuição dos fatores antinutricionais no intuito de melhorar a qualidade das proteínas.

68 3. MATERIAIS

3.1 Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga

Foram realizadas três expedições de coleta: janeiro de 2005, setembro de 2005 e março de 2007. As sementes das dez espécies foram coletadas com a ajuda de nativos em dois locais distintos do estado do Ceará: região de semiárido, no município de Quixadá e a na Floresta Nacional do Araripe (FLONA), uma floresta úmida no município do Crato. Cada espécie foi coletada apenas uma vez devido a diferenças na fenologia, às dificuldades pertinentes à região do semiárido que sofre secas severas e às limitações estabelecidas por agências de proteção ambiental brasileira. Apenas uma espécie teve as sementes coletadas no município de Fortaleza, no Campus do Pici da Universidade Federal do Ceará (outubro de 2006). As plantas foram identificadas e os espécimes foram depositados no Herbário Prisco Bezerra (EAC), Universidade Federal do Ceará (UFC). O nome botânico e popular das espécies utilizadas nesse trabalho, bem como seus locais de coleta e números de identificação estão apresentadas no QUADRO 1 do item 5.

3.2 Animais de Laboratório e Alojamento

Um coelho da raça Nova Zelândia com três meses de idade foi adquirido junto ao setor de cunicultura do Departamento de Zootecnia da UFC e mantido no Biotério de Manutenção do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da UFC com água e ração apropriadas ad libitum . Seu sangue foi utilizado como fonte de eritrócitos para os ensaios de aglutinação. Os ratos machos convencionais da linhagem Wistar e os camundongos machos convencionais da linhagem Swiss foram adquiridos do Biotério Central da UFC (Biocen-UFC) com três semanas de idade. Os animais foram alojados no Biotério Experimental do Laboratório de Bioprospecção de Recursos Regionais (Bioprospec), do Departamento de Biologia da UFC, com temperatura

69 (23,0 ± 2,0 ºC) e fotoperíodo (12 h claro/12 h escuro) controlados. Os ratos e os camundongos foram mantidos em número adequado em caixas de polipropileno com substrato de raspa de pinho, água e ração (Biobase, Águas Frias, Santa Catarina, Brasil) ad libitum até atingirem cerca de 60 g e 20 g, respectivamente. Todos os protocolos com animais, adotados neste trabalho, foram submetidos ao Comitê de Ética em Pesquisa Animal (CEPA) da UFC (Protocolo No. 34/09) para parecer formal, segundo a Legislação vigente (Lei No. 11.794/2008), que regulamenta a criação e uso de animais de laboratório na pesquisa científica no Brasil

3.3 Reagentes Químicos

Inibidor de tripsina da soja (Sigma T9128), tripsina de pâncreas humano (Sigma T6424), protease de Bacillus licheniformis (Sigma P3910), L-BApNA (N α-benzoil-DL-arginina-p- nitroanilida) (Sigma B3133), urease de Canavalia ensiformis (Sigma U0251), “Kit” para a determação de fibras totais (Sigma TDF100A), “Coomassie Brilliant Blue G”, Albumin sérica bovina (BSA) foram adquiridos da Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, EUA). Os kits de determinação diagnóstica de aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), fosfatase alcalina, uréia, proteína total, albumina e creatinina foram adquiridos da Bioclin (Santa Branca, Brasil).

3.4 Componentes das Dietas

As farinhas integrais das sementes de P. moniliformis cruas, tratadas termicamente e livres de α-galactosídios foram utilizadas como fonte de proteínas das dietas teste. Para a dieta padrão, foram utilizadas as farinhas integrais de sementes de soja crua e tratada termicamente, obtidas em comércio local (Jasmine, Paraná, Brasil). Foi utilizada maizena ® (Unilever, São Paulo, Brasil) como fonte de amido, D(+)-glucose anidra P.A. (dextrose) (Vetec, Rio de Janeiro,

70 Brasil) como fonte de carboidratos simples e Neofiber ® (Nuteral, Ceará, Brasil) como fonte de fibra alimentar. A fonte de lipídios das dietas foi o óleo de milho Mazola ® (Cargil, São Paulo, Brasil). As misturas de minerais e vitaminas utilizadas nas dietas foram produzidas a partir de reagentes de grau analítico, sendo obtidos comercialmente. Todos os demais reagentes utilizados foram de grau analítico e estão citados no decorrer da descrição da metodologia, assim como todos os equipamentos usados nos experimentos.

4. MÉTODOS

4.1 Preparação da Farinha de Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga

As sementes foram retiradas de suas vagens e moídas em moinho rotatório para grãos de café (Cadence, Caxias do Sul, Brasil). Em seguida, as farinhas foram peneiradas em malha de 1,0 mm 2, a fim de deixá-las bem finas e colocadas em estufa (FANEM, Modelo 002 CB, São Paulo, Brasil) a 45 ºC por 72 horas para obtenção de um material mais homogêneo e livre de umidade. As farinhas foram acondicionadas em recipientes plásticos hermeticamente fechados, em câmara fria a 4 °C, até a realização das análises.

4.2 Extração de Proteínas das Sementes das Espécies Vegetais

As farinhas das sementes foram postas em contato com o tampão fosfato de sódio 0,05 M, pH 7,0 na proporção de 1:10 (m/v) e deixada sob agitação contínua por 4 h, a 4 °C. Em seguida, a suspensão foi filtrada em pano de trama fina. O resíduo obtido foi descartado. O filtrado foi centrifugado a 13.000 x g, 30 minutos, 4 °C; o precipitado foi descartado e o sobrenadante obtido foi filtrado em papel de filtro e denominado de Extrato Bruto. A extração de proteínas foi feita para a determinação dos compostos tóxicos e/ou antinutricionais.

71 4.3 Dosagem de Proteínas

Os teores de proteínas dos extratos brutos e das frações proteicas obtidas foram determinados segundo a metodologia descrita por Bradford (1976). Brevemente, para cada 100 µl de amostra, em diferentes concentrações, foram adicionados 2,5 ml do regente de Bradford. A mistura foi agitada por alguns segundos e após 10 minutos sobre a bancada e à temperatura ambiente, procedeu-se a leitura das absorbâncias a 595 nm, em um espectrômetro Genesys 10, Spectronic Unicam (New York, EEUU). A concentração de proteínas foi estimada usando-se o fator de calibração obtido através de uma curva padrão constituída com concentrações conhecidas de albumina sérica bovina (BSA).

4.4 Composição Proximal das Sementes

4.4.1 Umidade

A umidade das sementes das dez espécies de leguminosas foi determinada seguindo a metodologia descrita pela AOAC (1998). Em triplicata, 10 g de farinha não-desidratada de sementes das dez espécies foram colocadas em recipientes limpos, secos, tarados e deixadas em estufa (FANEM, Modelo 002 CB, São Paulo, Brasil) a 110 °C por 24 horas. Após esse período, as amostras foram colocadas em dessecador até atingirem a temperatura ambiente, sendo, então, pesados e colocados novamente em estufa. Esse procedimento foi repetido de 12 em 12 horas, até obtenção de peso constante. O teor percentual de umidade foi calculado pela relação entre os pesos inicial e final da amostra.

72 4.4.2 Proteínas Totais

A quantidade de proteínas totais das farinhas das sementes das dez espécies foi determinada em triplicata segundo o método Macrokjeldahl (AOAC, 1998). Amostras de 0,5 g,

25 mL de ácido sulfúrico concentrado e 5,0 g de catalizador [K 2SO 4; CuSO 4. H2O; Selênio; (100:10:1)] foram colocados em balões de digestão de Kjeldahl, levados para um digestor [Modelo MA 448, Marconi (Piracicaba, Brasil)] e deixados por uma hora a 400 °C. Em seguida, o material digerido foi transferido para balões volumétricos de 250 mL, que tiveram seus volumes aferidos com água deionizada. A quantidade total de nitrogênio foi obtida por ensaio fotocolorimétrico como descrito por Baethgen e Alley (1989), utilizando uma curva padrão obtida com diferentes concentrações de sulfato de amônio (Merck, Darmstadt, Alemanha). O fator utilizado para a conversão do total de nitrogênio em proteínas foi de 6,25.

4.4.3 Lipídios Totais

O teor de lipídios totais das farinhas das dez sementes foi determinado, em triplicata, segundo o método descrito pela AOAC (1998). Amostras de 5 g foram pesadas em balança analítica [Bioprecisa, Modelo FA2104N (São Paulo, Brasil)] e embaladas em envelopes de papel de filtro, sendo, então, transferidas para um sistema de Soxhlet 303 mm. A extração foi contínua durante 8 h, sendo o n-hexano utilizado como solvente (150 mL). Em seguida, o solvente foi transferido para um béquer previamente pesado e completamente evaporado em capela de exaustão de gases durante 48 h. Os lipídios totais foram calculados pela diferença entre o peso inicial e final dos béqueres, para posterior cálculo do percentual em relação à amostra bruta inicial.

73 4.4.4 Matéria Mineral (Cinzas)

A matéria mineral foi determinada a partir de triplicata das amostras de farinha das dez sementes segundo metodologia descrita pela AOAC (1998). Amostras pesando 1 g foram levadas em cadinhos de porcelana a um forno mufla [Quimis, Modelo Q-318m24 (Diadema, Brasil)] e calcinizadas à temperatura de 550 °C por 4 h. O valor de matéria mineral foi determinado pela diferença entre os pesos inicial e final.

4.4.5 Fibra Alimentar Total

As análises de fibra alimentar total foram realizadas, em duplicata, segundo Prosky et al . (1988). Esta metodologia é recomendada pela AOAC (1997) e utiliza uma combinação de métodos enzimáticos e gravimétricos. Foi utilizado o kit para determinação de fibra alimentar total TDF-100A (Sigma-Aldrich Co., St Louis, EUA). Amostras delipidadas secas foram primeiramente gelatinizadas com alfa-amilase termoestável. Logo depois, foram digeridas enzimaticamente com protease e amiloglucosidase para remover as proteínas e amido, respectivamente, presentes na amostra. Em seguida, foi adicionado etanol 95% para precipitar a fibra alimentar solúvel. O resíduo foi então filtrado e lavado com etanol e acetona. Depois de secos, os resíduos foram pesados. Metade dos resíduos de cada amostra foi analisada para proteínas totais e o restante para matéria mineral, (de acordo com os tópicos 4.4.2 e 4.4.4, respectivamente). Paralelamente às amostras, foi realizado um ensaio “branco”, onde nenhuma amostra estava presente. O teor de fibra alimentar total das amostras foi calculado de acordo com a fórmula:

% FAT = R amostra - Pamostra - A amostra - B x 100 PA

74

Onde: FAT = fibra alimentar total R = peso médio do resíduo da amostra (mg), calculado pela diferença entre o R2 e o R1; P = peso médio da proteína (mg); A = peso médio da matéria mineral (mg), calculado pela diferença entre o R3 e o R1; PA = peso médio da amostra (mg).

B = R branco – P branco – A branco

O procedimento detalhado o encontra-se na FIGURA 1.

4.4.6 Carboidratos digeríveis

O percentual de carboidratos digeríveis foi calculado por diferença dos demais constituintes analisados, usando a seguinte fórmula: [100g do peso seco – (g proteínas totais + g lipídios totais + g de matéria mineral + g fibra dietética total)]/100g, de forma que o total some 100%.

4.4.7 Conteúdo de Energia

O conteúdo de energia foi estimado utilizado os fatores “Atwater” modificados, que são 17 para proteínas totais, 37 para lipídios totais e 17 para carboidratos digeríveis expressos em kJ (FAO, 2003).

75 DIGESTÃO

1,0000 g da amostra livre de umidade em tampão fosfato de sódio 0,08 M, pH 6,0 (50 mL) contendo 0,1 mL de α-amilase (kit TDF-100, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, EEUU)

Banho-maria (95 °C) por 15 min, agitação a cada 5 min

Resfriar à temperatura ambiente

Ajustar o pH para 7,3 a 7,7 com 10 mL de NaOH 0,275 M

Adicionar 0,1 mL de protease 50 mg/mL (kit TDF-100, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, EEUU)

Banho-maria a 60 ºC com agitação por 30 min

Deixar resfriar à temperatura ambiente

Ajustar o pH para 4,0 a 4,6 com 10 mL de HCl 0,325M

Adicionar 100 mL de amiloglucosidase (kit TDF-100, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, EEUU) e misturar bem

Banho-maria a 60 ºC com agitação por 30 min

Deixar resfriar à temperatura ambiente

Acrescentar um volume de etanol 95% correspondente a 4 x o volume já existente nos recipientes

Registrar o peso do cadinho livre de umidade e da celite (referido como R1 = cadinho + celite )

Deixar as soluções sedimentarem overnight à temperatura ambiente

76 Umedecer e redistribuir a camada de celite (kit TDF-100, Sigma Co., St. Louis, EEUU) em cada cadinho, usando etanol 78% FILTRAÇÃO

Aplicar sucção branda para sentar a celite e transferir o precipitado e a suspensão para o cadinho

Acrescentar 20 mL de etanol 78%, 2 porções de 10 mL de etanol 95% e 2 porções de 10 mL de acetona

Secar os cadinhos contendo os resíduos overnight em uma estufa ventilada a 105 ºC ou a vácuo a 70 ºC

Pesar os cadinhos livres de umidade (referido como R2 = cadinho + celite + resíduo )

PROTEÍNAS E CINZAS

Metade das amostras teve proteínas totais quantificadas segundo Baethgen e Alley (1989) e a outra metade foi utilizada para a determinação de a matéria mineral (registrar o peso do cadinho + amostra calcinizada = R3 ) segundo a AOAC (1990)

FIGURA 1 - Procedimento para determinação de Fibra Alimentar Total da farinha delipidada das sementes segundo a metodologia descrita pela AOAC (1997).

77 4.5 Composição em Aminoácidos

A composição em aminoácidos da farinha das sementes das dez espécies foi realizada através de cromatografia de troca-iônica em HPLC (High Performance Liquid Chromatography), adaptada a partir do método descrito por Spackman, Stein e Moore (1958). Em triplicata, 4 mg da farinha delipidada de cada amostra foi hidrolisada com 1 mL de HCl 6,0 M contendo 1% de fenol (p/v), por 22 h, a 110 ºC, em ampolas de vidro fechadas, sob atmosfera de nitrogênio. Concluída a hidrólise, as ampolas foram abertas e o HCl/fenol removido por evaporação em dessecador com pressão reduzida na presença de NaOH. Em seguida, as amostras foram dissolvidas em tampão citrato de sódio pH 2,2, filtradas em membrana de 40 µm (Millipore ®) e submetidas à análise de aminoácidos. O aminoácido aromático triptofano, sensível a hidrólise ácida, foi determinado pelo método descrito por Pintér-Szakács e Molnár-Perl (1990). Amostras contendo 12,5 mg de farinha foram colocadas em contato com 2,5 mL de reagente contendo ninhidrina a 1% dissolvida em HCl 37% + ácido fórmico 96% (2:3, v/v), por 2 h, a 35 ºC. O branco foi realizado paralelamente em condições semelhantes, mas sem ninhidrina. Em seguida, às amostras em solução foram adicionados 2,5 mL de uma mistura feita com as soluções HCl/ácido fórmico descritas e etanol absoluto (1:4, v/v). O teor de triptofano foi medido através de leitura espectrofotométrica a 380 nm, tendo como referência uma curva padrão feita com L-triptofano (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, EUA).

4.6 Dosagem de Compostos Tóxicos e/ou Antinutricionais

4.6.1 Lectinas

A presença de lectinas nas dez sementes foi avaliada através de ensaios de atividade hemaglutinante de seus Extratos Brutos (EBs), seguindo a metodologia descrita por Moreira e

78 Perrone (1977), adaptada para o uso de tubos de ensaio. Os Extratos brutos foram diluídos seriadamente com NaCl 0,9% (1:2; 1:4; 1:8; 1:16 etc) e cada diluição foi misturada (1:1) com uma suspensão a 2% de eritrócitos de coelho nativos e tratados previamente com um “pool” de proteases de Bacillus licheniformis (Sigma-Aldrich, St Louis, EEUU). O tratamento com proteases foi feito através da mistura da solução de proteases (1 mg. mL -1) com a suspensão de eritrócitos a 2%, na proporção 1:100 (v/v), por 1 h, a 4 ºC. Em seguida, as proteases foram retiradas por centrifugações e lavagens com NaCl 0,9%. Posteriormente, os tubos contendo as amostras, com o sangue nativo e tratado de cada espécie animal, foram incubados a 37 °C por 30 min e mantidos por mais 30 min à temperatura ambiente. Após esse tempo, os tubos foram centrifugados a 2000 x g, por 1 min, e a aglutinação foi visualizada a olho nu. Os resultados foram expressos como título de hemaglutinação, o qual foi definido como o recíproco da maior diluição que é capaz de provocar aglutinação visível. Essa concentração foi denotada como uma unidade de atividade hemaglutinante (UH).

4.6.2 Inibidores de Tripsina

A atividade inibitória de tripsina das dez sementes de leguminosas foi determinada de acordo com Kakade, Simons e Liener (1969) com algumas modificações. A extração dos inibidores foi realizada agitando-se, durante 3 h, em temperatura ambiente, 20 mg da amostra (farinhas das sementes das 10 espécies) em 1 mL de NaOH 0,01 N. A suspensão foi então deixada em repouso por 30 min e, em seguida, uma alíquota de 0,5 mL desta suspensão foi adicionada a 0,5 mL de NaOH 0,01 N e centrifugada a 15.000 x g, por 5 min. O sobrenadante foi utilizado para determinação da atividade dos inibidores de tripsina. Para obtenção da curva padrão de inibidor de tripsina, volumes de 10, 15, 20, 25, 30 e 35 µL de SBTI – inibidor de tripsina de soja tipo Kunitz (Sigma-Aldrich, St Louis, EEUU) dissolvido em NaOH 0,01 N, na concentração de 1 mg/mL, foram incubados com 100 µL tripsina de pâncreas bovino, dissolvido em HCl 0,001 N na concentração de 1 mg/mL, e 100 µL da solução de BAPNA – Nα-Benzoil- DL-arginina-p-nitroanilida (Sigma-Aldrich, St Louis, EEUU), dissolvido em DMSO (dimetil- 79 sulfóxido de sódio) e água destilada. O volume final de cada tubo foi ajustado para 1,6 ml com tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 8,2, contendo CaCl 2 0,02 M. Após 5 min, os tubos foram incubados a 37 ºC por 45 min. O procedimento do ensaio, realizado em triplicata, obedeceu à mesma seqüência de eventos da curva padrão, apenas substituindo o SBTI por 20 µL do sobrenadante da amostra. A reação foi interrompida pela adição de 200 µL de ácido acético 30 % (v/v) e a absorbância lida a 410 nm contra os brancos (aos quais a tripsina não foi adicionada). Os resultados foram expressos como a quantidade de tripsina ( µg) inibida por miligrama de farinha (µgTI/mgF).

4.6.3 Ureases

A determinação da atividade ureásica das dez sementes de leguminosas foi realizada de acordo com a metodologia descrita por Kaplan (1969), com algumas modificações (VASCONCELOS et al ., 1997). Uma alíquota de 0,1 mL de uma solução de ureia 500 mM foi misturada com 0,7 mL de EDTA 2%, tamponando com uma solução de fosfato de sódio 0,02 M, pH 6,5. Em seguida, 0,2 mL dos EBs das farinhas das 10 sementes foram adicionadas e as misturas foram incubadas a 37 ºC, por 15 min. Posteriormente, foram adicionadas às misturas 1,0 mL da solução A (62 g de fenol + 0,25 g de nitroprussiato de sódio/L) e 1,0 mL da solução B (43 mL de hipoclorito de sódio + 20 g de hidróxido de sódio/L), sendo deixadas a 37 ºC, por 5 min. Após esse tempo, foram adicionados 7,0 mL de água deionizada aos tubos, sendo estes cobertos com filme de PVC e agitados vigorosamente. As leituras das absorbâncias foram feitas a 625 nm e a atividade enzimática foi avaliada em relação a uma curva padrão obtida com urease (EC 3.5.1.5, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, EEUU). A atividade ureásica foi expressa como unidades de enzima por Kg de farinha (U/KgF).

80 4.6.4 Toxinas

A detecção de toxinas das sementes das dez leguminosas foi realizada por meio da avaliação da toxicidade aguda dos EBs das farinhas das sementes das respectivas espécies. Foi realizada segundo a metodologia descrita por Vasconcelos et al . (1997), através de injeção intraperitonial (0,3 mL/10 g de peso corpóreo) em camundongos machos, pesando entre 20-25 g, alimentados ad libitum com dieta peletizada comercial. Diferentes teores de proteína foram testados, de modo a encontrar a dose máxima não letal, a dose mínima capaz de causar 100% de letalidade e doses intermediárias envolvendo percentuais de morte no intervalo de 0-100%. Para toxicidade, foram considerados válidos apenas os resultados observados no período de 24 horas.

A toxicidade foi expressa como DL 50, sendo definida como a quantidade de proteína (g de proteína/Kg de peso corpóreo) necessária para produzir convulsões e morte em 50% dos animais testados.

4.7 Determinação de Minerais

A quantificação de oito elementos minerais de importância nutricional (ferro, zinco, sódio, potássio, cálcio, magnésio, manganês e cobre) foi realizada por espectroscopia de emissão atômica (ICP-OES) (OLIVEIRA et al ., 2009). Para cada espécie analisada, 200 mg de farinha de semente delipidada foram tratados com 3 mL de ácido nítrico e 1 mL de peróxido de hidrogênio 30% (v/v). Esta mistura foi aquecida em microondas (“Multiwave, Anton Par”) sob pressão, utilizando o programa “soyabean”, específico para sementes de leguminosas (35 minutos de aquecimento e 15 minutos de resfriamento). Após a decomposição das amostras, a suspensão foi aferida para 25 mL com água padrão Milli-Q. A curva de calibração foi preparada usando uma solução com padrões de cada mineral a ser quantificado. As análises foram realizadas em triplicata.

81 4.8 Criação de Índice de Qualidade Nutricional para a Classificação das Espécies mais Promissoras

Para possibilitar a comparação entre as leguminosas selvagens, os dados obtidos para proteínas totais, aminoácidos essenciais (metionina e cisteína), lipídios totais, fibra alimentar, minerais (calcio, ferro, zinco e potássio) e de fatores tóxicos e antinutricionais (lectina, inibidores de tripsina, urease e toxina) foram aplicados em um índice de seleção linear, ou otimizado, fenotípico (FARIAS, 2005). Para tanto, foi levado em consideração a importância das leguminosas como fonte de proteínas, aminoácidos essenciais, lipídios, fibras e minerais, além de incluir como atributo desejável, nesta média, a presença de níveis baixos de fatores tóxicos e antinutricionais. Para cada um desses componentes foi estabelecido, com base nos valores desejáveis, nos resultados obtidos nas análises ou em valores de referência um valor limítrofe que era mínimo para características desejáveis e máximo para as indesejáveis. Quando o valor obtido experimentalmente para uma característica desejável era maior que o valor limítrofe, o resultado era positivo e negativo se fosse menor. Para as características indesejáveis, o inverso era verdadeiro. Em seguida, cada valor foi multiplicado pelo seu peso de acordo com a característica em questão e procedeu-se a soma algébrica de cada termo. O resultado final desta soma foi, então, dividido pela soma dos pesos (SOUZA, 2010).

4.9 Experimento Nutricional I

O Experimento nutricional I foi realizado com a espécie vegetal classificada como a mais promissora para o consumo humano após a aplicação do índice de qualidade nutricional (IQN). Assim sendo, Piptadenia moniliformis Benth. foi utilizada para uma investigação in vivo da qualidade nutricional de suas proteínas.

4.9.1. Avaliação da Qualidade das Proteínas das Sementes de Piptadenia moniliformis

82

4.9.1.1 Preparo das Dietas Experimentais

Para o experimento nutricional utilizando ratos em crescimento foram preparadas sete dietas, cuja única diferença era a fonte de proteínas. Foi elaborada uma dieta isenta de proteínas, denominada dieta aproteica (AP), como controle negativo; uma dieta contendo farinha de soja processada termicamente por fervura (SJF), como controle positivo, por ser considerda padrão de proteína vegetal de boa qualidade; uma dieta contendo farinha de soja crua (SJCr); uma dieta com farinha de P. moniliformis Crua ( Pm Cr) e três dietas processadas termicamente: dieta contendo farinha de P. moniliformis processada por Fervura ( Pm F), dieta com farinha de P. moniliformis processada por cozimento em Micro-ondas ( Pm M) e dieta com farinha de P. moniliformis processada por cozimento em autoclave ou Autoclavagem ( Pm A). Para o processamento térmico por fervura, as sementes de P. moniliformis e de soja comercial foram imersas em água na proporção de 1:4 (p/v) por quatro horas, a água foi escorrida e foi, novamente, adicionada água na proporção de 1:5 (p/v) e levados em uma panela de vidro temperado a uma chapa elétrica (XMTD-702, Biomixer) para a fervura por quarenta e cinco minutos. Para o cozimento em micro-ondas, as sementes foram colocadas em recipiente apropriado com água na proporção de 1:5 (p/v) e colocado para cozinhar no micro-ondas em potência máxima (100%, que corresponde a aproximadamente 180 °C), por vinte minutos. Já para a autoclavagem, as sementes foram colocadas em recipiente apropriado com água na mesma proporção dos processamentos anteriores, levados à autoclave e mantidos sob pressão a 121º C por 20 minutos. Após os processamentos térmicos as sementes foram secas em estufa 60º C (FANEM, Modelo 002 CB, São Paulo, Brasil), moídas em moinho para grãos de café e peneiradas em malha de 1,0 mm 2 a fim de obter uma farinha bem fina. Todas as dietas formuladas foram isocalóricas e isoproteicas, exceto para a dieta aproteica, de modo a conter 100 g de proteína por Kg de dieta (100 g/Kg), ou seja, 10 % de proteína, variando apenas a fonte proteica utilizada (TABELA 1). Para preparo de todas as dietas foram adicionados 50g/Kg de uma mistura de vitaminas

[vitamina B 12 (100%) 0,5; ácido fólico 0,1; biotina (99%) 0,1; piridoxina HCl 0,2; tiamina HCl 0,2; riboflavina (99%) 0,2; pantotenato de cálcio (97,5%) 0,4; ácido nicotínico 0,6; inositol 8,0;

83 p-amino-benzóico 0,2; cloreto de colina (50%) 16,0; vitamina A 0,24; vitamina D 0,25; vitamina E 1,2; vitamina K 0,02 e amido de milho 971,79] e de Mistura de minerais [Citrato de cálcio 296,1; fosfato de cálcio monobásico 108,2; fosfato de potássio dibásico 210,1; cloreto de sódio 74,0; cloreto de potássio 119,5; carbonato de cálcio (40 %) 65,8; carbonato de magnésio 34,3; carbonato de cobre 1,1; carbonato de zinco 0,48; fluoreto de sódio 0,48 e iodeto de potássio 0,1].

4.9.1.2 Procedimento Experimental

A avaliação da qualidade nutricional da farinha integral crua e processada de sementes de P. moniliformis como fonte de proteínas foi realizada de acordo com a técnica descrita por Miller e Bender (1955). Ratos machos da linhagem Wistar foram adquiridos do Biotério Central após o desmame e com peso médio de 60,00 ± 5,00 g, sendo alimentados com dieta comercial peletizada (Biobase, Águas Frias, Santa Catarina, Brasil) até atingirem o peso médio de 70,00 ± 5,00 g. Grupos homogêneos de animais foram selecionados para serem submetidos a um período de adaptação de, em média, 5 dias às gaiolas metabólicas de acrílico e à dieta comercial pulverizada até atingirem um peso médio de 85,00 ± 5,0 g. Após o período de adaptação, grupos homogêneos de animais (6 animais/grupo) foram utilizados, sendo os animais distribuídos individualmente em gaiolas metabólicas, as quais possibilitam a coleta separada de fezes. Para cada grupo de animais foram oferecidas as dietas experimentais, contendo farinha de sementes de P. moniliformis crua e processadas (por fervura, por cozimento em micro-ondas e autoclavagem), e as dietas controles, uma à base de farinha de soja crua e processada termicamente por fervura e a outra isenta de proteínas. Para cada tratamento foram ofertados diariamente 15 g de dieta e água ad libitum durante 10 dias.

84 TABELA 1 - Composição (g/Kg) e densidade calórica (Kcal/g) das dietas controle [Dieta Farinha de Soja Processada por Fervura (SJF) e Dieta Aproteica – AP] e experimentais [Dieta Farinha de P. moniliformis Crua ( Pm Cr), Dieta Farinha de Soja crua (SJCr), Dieta Farinha de P. moniliformis processada por Fervura ( Pm F), dieta com Farinha de P. moniliformis processada por cozimento em Micro-ondas ( Pm M) e dieta com farinha de P. moniliformis processada por Autoclavagem ( Pm A)] do experimento nutricional I

DIETAS INGREDIENTES SJF AP SJCr Pm Cr Pm F Pm M Pm A

Farinha de soja Fervida 272,70 ______Farinha de soja crua __ __ 272,70 ______Farinha de P. moniliformis crua ______268,95 ______Farinha de P. moniliformis fervida ______267,45 __ __ Farinha de P. moniliformis em Micro-ondas ______296,91 __ Farinha de P. moniliformis Autoclavada ______309,41 Amido de milho 288,64 475,00 288,64 301,96 305,42 286,74 278,82 Glucose 150,00 150,00 150,00 150,00 150,00 150,00 150,00 Mistura de fibras (Neofiber ®) 93,20 125,00 93,20 50,94 46,44 37,78 34,11 Óleo de milho 95,46 150,00 95,43 130,22 130,69 128,56 127,66 Mistura de vitaminas 50 50 50 50 50 50 50 Mistura de minerais 50 50 50 50 50 50 50 Densidade calórica 3,91 3,90 3,91 3,93 3,93 3,94 3,94

85 A dieta consumida e o peso de cada rato foi mensurado diariamente. A partir do 5° dia de experimento, as fezes passaram a ser coletadas e congeladas. No último dia de experimento (10° dia), os animais foram deixados em jejum por 2 h e, passado esse tempo, foram levemente anestesiados com éter etílico e tiveram seu sangue retirado por punção do plexo retro-orbital, sendo coletados em tubos limpos e livres de anticoagulantes. O sangue foi centrifugado a 2000 x g, por 10 min, e soro foi coletado e armazenado a – 20 °C para posterior determinação de parâmetros sorológicos. Em seguida, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e dissecados para retirada e mensuração de seus órgãos internos [timo, coração, pulmões, baço, estômago, pâncreas, intestino delgado (duodeno, jejuno e íleo), intestino grosso, rins e fígado]. A carcaça de cada animal foi pesada. Os órgãos foram congelados, liofilizados e pesados novamente. As carcaças foram colocadas em estufa (FANEM, Modelo 002 CB, São Paulo, Brasil) a 100 °C, por 72 h, pesadas novamente e, finalmente, moídas para determinação do nitrogênio total (BAETHGEN; ALLEY, 1989). As fezes foram pesadas e, finamente moídas para a determinação do nitrogênio total pela mesma técnica descrita anteriormente.

4.9.1.3 Índices para Avaliação da Qualidade Proteica

Os índices para avaliação da qualidade proteica foram a Utilização Líquida de Proteína (NPU), Digestibilidade (D) e Valor Biológico (VB) (MILLER; BENDER, 1955). As equações utilizadas encontram-se a seguir:

NPU = N da carcaça (do grupo teste) – N da carcaça (do grupo aproteico) N ingerido do grupo teste

D = N ingerido - (N fecal do grupo teste – N fecal do grupo aproteico) N ingerido do grupo teste

86

VB = NPU X 100

D

Para o cálculo da digestibilidade verdadeira, foram utilizados os valores obtidos durante os últimos cinco dias de experimento. Para os cálculos de NPU foram usados os valores dos dez dias de experimento.

4.9.1.4 Parâmetros Bioquímicos Sanguíneos

Os parâmetros bioquímicos analisados no soro coletado dos animais foram: aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), fosfatase alcalina, ureia, proteína total, albumina e creatinina. As análises foram realizadas utilizando kits fotocolorimétricos para diagnóstico clínico, seguindo as instruções do fabricante [Bioclin (Santa Branca, Brasil)].

4.9.1.5 Peso Relativo dos Órgãos em Base Seca

Foi calculada a relação ‘peso do órgão / peso da carcaça’ para cada órgão de cada animal, em base seca. Em seguida, as médias de cada órgão para cada grupo foram comparadas e avaliadas quanto a possíveis diferenças estatisticamente significantes entre os tratamentos.

4.10 Experimento Nutricional II

87 4.10.1. Avaliação da Qualidade das Proteínas das Sementes de Piptadenia moniliformis livre de ααα-galactosídios

4.10.1.1 Processo de extração dos α-galactosídios

As sementes de P. moniliformis foram submetidas a extração dos α-galactosídios de acordo com o procedimento descrito por Gulewicz et al . (2000). Primeiramente, as sementes inteiras foram embebidas com água destilada (1:2 p/v), e ficaram em repouso por 12 h a 4 °C. Após esse período a água foi escorrida e reservada. Foi adicionado às sementes o mesmo volume anterior (1:2 p/v) de etanol a 50% (v/v), preparado com álcool etílico P.A. e a água removida do primeiro molho. As sementes foram então colocadas em banho-maria a 40 ºC onde ficaram em repouso por 18 h. Após este período, o material foi novamente escorrido e o extrato hidroalcoólico reservado. Um último molho foi realizado com etanol a 50% (v/v), desta vez preparado com álcool etílico P.A. e água destilada, por 18 h a 40 ºC. Ao fim do procedimento, as sementes foram mais uma vez escorridas e todos os extratos (o aquoso e os dois hidroalcoólicos) foram reunidos e colocados em banho-maria a 60 °C para a evaporação total do ácool. Obtendo, dessa forma, sementes de P. moniliformis livre de α-galactosídios e o extrato contendo os α- galactosídios. Posteriormente, o que restou do extrato após a evaporação do etnol, foi congelado, liofilizado e armazenado à temperatura ambiente até a utilização no preparo da dieta à base de soja crua adicionada de α-galactosídios.

4.10.1.2 Preparo das Dietas Experimentais

Para o experimento nutricional II foram elaboradas duas dietas: Uma dieta contendo farinha de P. moniliformis crua, livre de α-galactosídios (Pm LG) e outra contendo farinha de Soja comercial crua adicionada de α-galactosídios (SJAG), como fontes de proteínas. Foram utilizados os dados da dieta aproteica (AP) e da dieta farinha de soja processada termicamente

88 por fervura (SJF) e das dietas experimentais [Farinha de soja crua e farinha (SJCr) de farinha de P. moniliformis crua ( Pm Cr)] do experimento nutricional I, para comparação com as novas dietas experimentais, no intuito de verificar se houve ou não melhora na qualidade da proteína no novo processamento utilizado. Após a retirada dos α-galactosídios, as sementes de P. moniliformis foram colocadas pra secar em estufa (FANEM, Modelo 002 CB, São Paulo, Brasil), moídas em moinho para grãos de café e peneiradas em malha de 1,0 mm 2 a fim de obter uma farinha bem fina. Após a pulverização da soja crua, os α-galactosídios liofilizados foram pesados e adicionados a esta farinha na mesma proporção em que se encontravam nas sementes de P. moniliformis . Todas as dietas formuladas foram isocalóricas e isoproteicas, exceto para a Dieta Aproteica, de modo a conter 100 g de proteína por Kg de dieta (100 g/Kg), ou seja, 10 % de proteína, variando apenas a fonte proteica utilizada (TABELA 2). As vitaminas e os minerais foram preparados do mesmo modo que no experimento nutricional I e adicionados de modo a representar 5 % da massa total de cada dieta. O procedimento experimental adotado no experimento de alimentação II foi essencialmente similar ao procedimento empregado no experimento nutricional I. As determinações dos parâmetros bioquímicos sangüíneos, do peso relativo dos órgãos e dos índices para avaliação da qualidade proteica foram realizadas como descrito anteriormente para o experimento de alimentação I.

4.11 Análise Estatística

Os dados numéricos referentes aos experimentos nutricionais foram submetidos à análise de variância (One-way ANOVA) para a avaliação das possíveis diferenças entre os grupos, seguida de teste de contraste entre as médias (Teste de Tukey). O nível de significância considerado foi p < 0,05. Os testes foram realizados no programa GraphPad Prism versão 5 (GraphPad software).

89 TABELA 2 - Composição (g/Kg) e densidade calórica (Kcal/g) das dietas controles [Dieta Farinha de Soja Processada por Fervura (SJF) e Dieta Aproteica– AP] e experimentais [Dieta Farinha de P. moniliformis Crua Livre de α-galactosídios ( Pm LG), Dieta Farinha de Soja crua Adicionada de α-galactosídios (SJAG), Dieta Farinha de P. moniliformis crua ( Pm Cr), dieta com Farinha de Soja crua (SJCr)] do experimento nutricional II

DIETAS INGREDIENTES SJF AP SJCr Pm Cr Pm LG SJG

Farinha de soja Fervida 272,70 ______Farinha de soja crua __ __ 272,70 ______Farinha de P. moniliformis crua ______268,95 __ __ Farinha de P. moniliformis crua livre e α-galactosídios ______343,29 __ Farinha de soja crua adicionada de α-galactosídios ______272,70 Amido de milho 288,64 475,00 288,64 301,96 279,79 288,64 Glucose 150,00 150,00 150,00 150,00 150,00 150,00 Mistura de fibras (Neofiber ®) 93,20 125,00 93,20 50,94 0,0 93,20 Óleo de milho 95,46 150,00 95,43 130,22 126,92 95,46 Mistura de vitaminas 50 50 50 50 50 50 Mistura de minerais 50 50 50 50 50 50 Densidade calórica 3,91 3,90 3,91 3,93 3,96 3,91

90 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

O Brasil é considerado possuidor da maior biodiversidade do planeta, estimada em cerca de 20% do número total de espécies do mundo e a Caatinga está inserida nessa estatística, contribuindo na diversidade de espécies apresentando muitas plantas nativas sub-explorada, principalmente no que se refere ao seu potencial nutricional (CALIXTO, 2003; Ambiente Brasil- Ambiente Natural - Caatinga, 2011). Este patrimônio genético tem valor econômico estratégico inestimável em várias atividades devendo ser mais bem aproveitado. Diante da grande variedade de espécies da flora mundial que são utilizadas para a alimentação pela população e da possibilidade de existência de inúmeras outras com igual potencial nunca antes estudado, tornou-se relevante a seleção de algumas espécies nativas da Caatinga cearense para essa investigação. Dessa forma, dez sementes de espécies vegetais da caatinga foram selecionadas para um estudo de qualidade nutricional, inicialmente pela disponibilidade de suas sementes. Algumas informações a respeito das dez espécies escolhidas forma coletadas e encontram-se no QUADRO 1. Após levantamento bibliográfico sobre as espécies escolhidas, partiu-se para a investigação do potencial alimentar dessas espécies selvagens da Caatinga cearense. Para tanto, foi realizada a determinação da composição proximal, da composição de aminoácidos, dos fatores tóxicos e/ou antinutricionais e composição de minerais. Após análise dos dados, as espécies mais promissoras foram destacadas.

5.1 Composição Proximal das Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga

A composição proximal das sementes das dez espécies vegetais, em base seca, apresentando percentual de proteínas totais, de lipídios, de carboidratos, de fibras, de cinzas, de umidade e energia encontra-se na TABELA 3.

91 QUADRO 1 – Informações botânicas, nutricionais e antinutricionais das dez espécies de leguminosas da caatinga.

[Tipo de ambiente/vegetação: Informações sobre Nome Botânico/ Família – Subfamília Época da colheita] propriedades nutricionais e Nome popular Número de identificação antinutricionais

Caesalpinia bracteosa Tul./ [Floresta Nacional do Araripe, Catingueira floresta úmida: Jan/2005] Não avaliada EAC 39616 Caesalpinia ferrea Mart./ [Floresta Nacional do Araripe, Relato de consumo de suas Jucá, pau-ferro floresta úmida: Jan/2005] vagens por animais (MAIA, EAC 39616 2004) Fabaceae – Caesalpinoideae Vagens com farinha Hymenaea courbaril L./ [Floresta Nacional do Araripe, comestível usada por homens Jatobá floresta úmida: Jan/2005] e animais (LORENZI; EAC 38108 MATOS, 2002) Senna rugosa (G.Don) [Floresta Nacional do Araripe, H.S.Irwin & Barneby/ floresta úmida: Sep/2005] Não avaliada Lagarteiro EAC 38112

Continua

92 QUADRO 1 – Informações botânicas, nutricionais e antinutricionais das dez espécies de leguminosas da caatinga.

Continuação

[Tipo de ambiente/vegetação: Informações sobre Nome Botânico/ Família-Subfamília Época da colheita] propriedades nutricionais e Nome popular Número de identificação antinutricionais

Atividade lectínica Dioclea megacarpa Rolfe/ [Floresta Nacional do Araripe, (MOREIRA et al ., 1983) e Mucunã, olho-de-boi floresta úmida: Jan/2005] atividade inibitória de tripsina EAC 38110 (CARVALHO, 1988) Erythrina velutina Willd./ [Semiárido da Caatinga: Sep/2005] Atividade lectínica Mulungu EAC 35979 (MORAES et al ., 1996)

Fabaceae – Faboideae Composição proximal, Energia, antiutrientes, Lonchocarpus sericeus (Poiret) composição de aminoácidos e Kunth/ [Semiárido da Caatinga: Oct/2006] ensaio de alimentação com Ingá EAC 39615 ratos (PROLL et al ., 1998).

Atividade lectínica (ALENCAR et al ., 2005) Continua

93 QUADRO 1 – Informações botânicas, nutricionais e antinutricionais das dez espécies de leguminosas da caatinga.

Continuação

[Tipo de ambiente/vegetação: Informações sobre Nome Botânico/ Família-Subfamília Época da colheita] propriedades nutricionais e Nome popular Número de identificação antinutricionais

Enterolobium contortisiliquum [Floresta Nacional do Araripe, Atividade inibitória de (Vell.) Morong/ floresta úmida: Set/2005] tripsina tipo Kunitz Orelha-de-macaco, orelha-de- EAC 38115 (BATISTA et al ., 1996) negro Atividade lectínica (MANN [Floresta Nacional do Araripe, Fabaceae – Mimosoideae Parkia platycephala Benth./ et al ., 2001) vagens usadas na floresta úmida: Mar/2007] Visgueiro alimentação de ruminantes , EAC 38109 (LORENZI, 2002) Atividade inibitória de Piptadenia moniliformis Benth./ [Semiárido da Caatinga: tripsina tipo Kunitz (CRUZ, Catanduva Mar./2007] EAC 35974 2008)

94 TABELA 3 – Composição proximal e de energia das sementes de dez leguminosas selvagens da caatinga

Energia* % % em base seca Espécies vegetais (kJ/100g) Umidade ¶ Proteínas † Lipídios Carboidratos Fibras Cinzas

Caesalpinia bracteosa 1.159 15,9 ± 0,5 29,3 ± 1,5 10,9 ± 0,2 15,2 40,9 ± 0,7 3,7 ± 0,1

Caesalpinia ferrea 1.000 10,3 ± 0,6 42,7 ± 1,6 1,8 ± 0,2 12,2 37,7 ± 0,9 5,6 ± 0,2

Dioclea megacarpa 1.618 12,8 ± 0,5 44,8 ± 1,9 2,5 ± 0,0 44,9 5,3 ± 0,0 2,5 ± 0,0

Enterolobium contortisiliquum 1.291 10,3 ± 0,5 50,0 ± 3,4 3,4 ± 0,0 18,5 24,6 ± 0,3 3,5 ± 0,4

Erythrina velutina 1.299 10,3 ± 1,0 39,0 ± 3,6 12,4 ± 0,1 10,4 33,2 ± 1,4 5,0 ± 0,2

Hymenaea courbaril 1.804 11,4 ± 0,2 10,9 ± 0,4 8,0 ± 0,4 8,3 70,3 ± 0,8 2,5 ± 0,4

Lonchocarpus sericeus 1.709 6,7 ± 0,6 35,7 ± 1,6 29,6 ± 0,1 0,4 30,8 ± 0,3 3,5 ± 0,1

Parkia platycephala 1.048 10,0 ± 0,1 32,2 ± 1,9 13,4 ± 0,7 0,3 52,3 ±1,0 1,8 ± 0,1

Piptadenia moniliformis 1.390 11,4 ± 1,1 44,7 ± 2,0 7,2 ± 0,1 21,4 23,5 ± 0,2 3,2 ± 0,1

Continua

95 TABELA 3 – Composição proximal e de energia das sementes de dez leguminosas selvagens da caatinga

Continuação

Energia* % % em base seca Espécies vegetais (kJ/100g) Umidade ¶ Proteínas † Lipídios Carboidratos Fibras Cinzas

Senna rugosa 1.048 8,2 ± 0,1 22,3 ± 1,3 0,7 ± 0,0 37,8 37,3 ± 0,4 1,9 ± 0,0

8.368 50 65 300 25 §RDI - - (kJ/dia) (g/dia) (g/dia) (g/dia) (g/dia)

Média ± desvio padrão de três análises, cada uma em triplicata. * Estimado pela multiplicação do percentual de proteínas totais, lipídios totais e carboidratos digeríveis pelos fatores “Atwater” modificados, que são 17 para proteínas totais, 37 para lipídios totais e 17 para carboidratos digeríveis expressos em kJ (FAO, 2003). †N x 6,25; ¶ O teor de carboidratos foi determinada pelo cálculo da diferença percentual de todos os outros componentes de acordo com a fórmula: [100g peso seco – (g proteína bruta + g lipídio bruto + g cinzas + g fibra dietética)]/100g.; § Referência de ingestão diária de 101.9 (c) (8) iv. FDA U.S. Food and Drug Administration (2010).

96 O percentual de proteínas totais de todas as espécies analisadas apresentou-se elevado com um valor médio de 35,16 %, superior ao de leguminosas de referências comumente consumidas, como o de Phaseolus vulgaris (26,6 %) comercializados no Brasil (MECHI; CANIATTI-BRAZACA; ARTHUR, 2005), os de seis cultivares de feijão de corda que variaram de 19,5 to 26,1% (MAIA et al. , 2000), bem como de três outros cultivares de feijão de corda que apresentam média em torno de 20% (VASCONCELOS et al ., 2010), além das ervilhas que possuem, em média 25% de proteínas (SALGADO et al ., 2002). O teor de proteínas das 10 espécies variou de 10,9 ± 0,4 a 50,0 ± 3,4 %, todas apresentando valor superior a 20% com exceção da espécie Hymenaea courbaril que apresentou o menor teor de proteínas. Resultados semelhantes ou mesmo superiores aos de algumas espécies analisadas foram encontrados para leguminosas não convencionais, como várias espécies do gênero Canavalia contendo de 22,4 a 35,5% (SRIDHAR; SEENA, 2006), como os de leguminosas indianas selvagens (20,3 a 35,0%) (VADIVEL; JANARDHANAN, 2005) e de tremoço mexicanos também selvagens com 37,20 a 45,41% de proteínas em suas sementes (RUIZ; SOTELO, 2001). Ademais, algumas espécies apresentaram percentuais mais elevdos de proteínas (> 40%) tais como: E. contortisiliquum (50,0 ± 3,4%), D. megacarpa (44,8 ± 1,9%) e P. moniliformis (44,2 ± 2,0%) e C. ferrea (42,7 ± 1,6%), com valores superiores aos de fava que variam de 20 a 40%, de tremoço com média de 35% de proteínas, sendo a quantidade de proteínas dessas sementes considerada altas por Salgado et al . (2002), e valores comparáveis ou até mesmo maiores que aos de cinco cultivares de soja que variaram de 36,1 a 48,5% (VASCONCELOS et al ., 1997). As sementes de leguminosas estudadas podem ser consideradas boas fontes de proteínas já que 100 g de semente contêm de 22 a 100 % da recomendação de ingestão diária (RDI) para adultos e crianças acima de quatro anos de idade, baseado na ingestão de 2.000 calorias diárias, segundo a FDA, 2010. O percentual de lipídios presente nas sementes das dez espécies vegetais apresentou-se, de uma maneira geral, baixo e bem heterogêneo, posto que houve variação de 0,7 a 3,4 %, entre quatro espécies e, as demais, apresentaram valores um pouco mais elevados de 7,2 ± 0,1 ( P. moniliformis ) a 13,4 ± 0,7 ( P.platycephala ), exceto a espécie L. sericeus que apresentou alto percentual de lipídios em suas sementes (29,6 ± 0,1). Esta última apresentou valor maior de

97 lipídios que os encontrados para alguns cultivares de soja, importante oleaginosa produzida no Brasil, que possui 20,1 a 23,2 % de lipídios segundo o estudo de Vasconcelos et al . (2006), bem como de outras cultivares de soja avaliadas que variaram de 18,3 a 21,5% (VASCONCELOS et al ., 1997). Esse dado mostra a importância de um estudo em relação à composição dos lipídios dessa espécie como possíveis fontes de ácidos graxos mono e poliinsaturados, conhecidos por prevenirem doenças cardiovasculares. No entanto, as demais espécies apresentam valores de lipídios bem inferiores aos de outras leguminosas conhecidas como os de sementes de soja (VASCONCELOS et al ., 1997, 2006), citada acima e, sementes de grão de bico comercializada no Egito contendo 23,64 % de lipídio (ALAJAJI; EL-ADAWY, 2006). Em contrapartida, 100 linhagens de feijão de corda também apresentam baixos percentuais de lipídios, variando de 1,4 a 2,7% (NIELSEN; BRANDT; SINGH, 1993), bem como de um importante legume indiano [Vigna mungo (L.) Hepper] com valores variando de 0,5 a 3,7% do total de lipídios, sendo compatíveis com os encontrados para algumas espécies avaliadas. A quantidade de carboidratos digeríveis das espécies em estudo apresentou-se muito variada. As espécies apresentando os mais altos percentuais foram: D. megacarpa (44,9%), S. rugosa (37,8 %) e P.moniliformis (21,4%), em oposição a P. platycephala e L. sericeus possuíra os menores níveis com 0, 3 e 0,4 %, respectivamente. Nas demais os teores variaram de 8,3 a 18,5 %. Os teores de carboidratos da maioria das espécies foram baixos quando comparados aos de leguminosas não convencionais, mostrados em um estudo comparativo realizado por Sridhar e Seena (2006), tais como: Canavalia ensiformes (45,8 a 65,4%), Canavalia gladiata (45,1 a 68,5%), Canavalia marítima (44,9 a 50,5%) e de Canavalia cathartica (48,2 a 59,6%). O grão de bico, leguminosa comumente utilizada na alimentação humana, também possui elevada quantidade de carboidrato, pois varia de 41,10 a 47,42 % (ALAJAJI; EL-ADAWY, 2006), sendo superior ao encontrado para maioria das espécies, mas semelhante à quantidade apresentada por D. megacarpa (44,9 %). Dentre as 10 espécies estudadas apenas D. megacarpa (5,3%) não apresentou boa quantidade de fibras. Todas as outras apresentaram quantidades superiores a 20%, variando de 23,5 ± 0,2 % ( P. moniliformis ) a 70,3 ± 0,8 % ( H. courbaril ), quantidades consideradas elevadas, visto que a recomendação de ingestão dietética (RDI) é de 25 g por dia (FDA, 2010), a qual seria

98 facilmente alcançada com ingestão de porções diárias dessa leguminosa quando associadas a outros alimentos também contendo fibras. Além disso, algumas sementes possuem conteúdo de fibras próximo ou superior ao encontrado no feijão comum (38,6 ± 1,6 g/100g) que é considerado uma importante fonte de fibras para a população brasileira (MECHI; CANIATTI-BRAZACA; ARTHUR, 2005). Sementes selvagens de leguminosas indianas como Neonotonia wightii e Cássia floribunda possuem apenas 8,7 % e 11,7 a 13,8 % de fibra dietética em suas sementes, respectivamente (VISWANATHAN et al . 2001; VADIVEL; JANARDHANAN, 2001), o que representa menos da metade do conteúdo apresentado pela maioria das leguminosas estudadas, podendo ser, portanto, consideradas importantes fontes de fibras alimentares. O alto consumo de fibras traz benefícios fisiológicos à saúde, como a melhora do trânsito intestinal, redução dos níveis séricos de colesterol, redução nos níveis de glucose sanguínea e diminuição da concentração de insulina, levando à redução na incidência de doenças intestinais, doenças coronarianas e diabetes, respectivamente (SRIDHAR; SEENA, 2006). Em relação às cinzas, as espécies apresentaram quantidades variando de 1,8 ± 0,1 ( P. Platycephala ) a 5,6 ± 0,2 ( C. ferrea ). Muitas delas, encontram-se próximas à matéria mineral de espécies do gênero Lupinus, que variam de 3,30 a 4,20 % (RUIZ; SOTELO, 2001), de leguminosas não convencionais como Cassia floribunda, que variou de 3,4 a 5,3% (VADIVEL; JANARDHANAN, 2001) e de Styphonolobium burseroides (3,3 %) e Acacia bilimekii (5,3 %), (SOTELO et al ., 1999). Os valores da matéria mineral das espécies em estudo foram merecedores de atenção devido a sua boa quantidade, por isso foram determinados. (TABELA 6). A umidade das sementes foi elevada e apresentou valores homogêneos entre si variando de 6,7 ± 0,6 ( L. sericeus ) a 15,9 ± 0,5 ( C. bracteosa ). Resultados similares aos encontrados por Sridhar e Seena (2006) para Canavalia gladiata (7,58 a 12,2%) e Canavalia ensiformis (3,80 a 13,5%). Oitenta por cento das espécies apresentaram umidade superior à do feijão de corda, leguminosa muito consumida no nordeste do Brasil, que possui umidade variando de 6,1 a 8,9%. Umidades mais altas não prejudicam os nutrientes contidos nas sementes uma vez que alguns autores recomendam que a soja seja estocada, em média, a 12,5% de umidade para evitar a proliferação de micro-organismos e a ocorrência de hidrólise de nutrientes capazes de reduzir o valor nutritivo dos grãos (PUZZI, 2000; WEBER, 2001). Desta forma, a elevada umidade da maioria das sementes pode ser considerada favorável à preservação de sua qualidade nutricional.

99 Embora a maioria das sementes avaliadas não apresente equilíbrio em seus macronutrientes (proteínas, lipídios e carboidratos), o elevado percentual de um ou dois desses nutrientes levou à alta quantidade de energia nas sementes (TABELA 3). Todas as espécies apresentaram teor de energia igual ou superior a 1.000 kJ/100g, variando de 1.000 ( C. ferrea ) a 1.804 kJ/100g ( H. courbaril ). Esse resultado está de acordo como o estudo realizado por Seena, Sridhar e Jung (2005) com uma leguminosa selvagem da Índia, Canavalia cathartica , que apresentou 1.520 kJ/100g e com outras espécies selvagens desse mesmo gênero a Canavalia ensiformis que apresentou variação de energia de 1.470 a 1.910 kJ/100g, a C. gladiata (1.690 a 1.830 kJ/100g) e a C. marítima (1.590 kJ/100g) (SRIDHAR; SEENA, 2006), além da Cassia floribunda (1.422 – 1.444 kJ/100g) (VADIVEL; JANARDHANAN, 2001). De acordo com Kuzayali, Cowan e Sabry (1966) apud Sridhar e Seena (2006) a quantidade de energia de leguminosas comumente cultivadas varia de 1.358 a 1426 kJ/100g. No entanto, P. vulgaris possui menor quantidade de energia (955,25 kJ/100g.) que as demais (MECHI; CANIATTI- BRAZACA; ARTHUR, 2005). A energia apresentada por 100 g das leguminosas representa 12 a 22% da recomendação de ingestão dietética (RDI) segundo a FDA (2010) e as sementes que apresentaram melhor equilíbrio de macronutrientes foram: C. bracteosa , E. velutina , H. courbaril e P. moniliformis . As espécies vegetais contam com uma boa composição química elementar mostrando que esse potencial deve ser mais bem estudado para o aproveitamento de suas propriedades, principalmente por serem leguminosas selvagens que vivem em condições adversas de temperatura e umidade além de possuírem quantidades de macronutrientes que se assemelham ou mesmo se sobrepõem às de leguminosas importantes no nordeste brasileiro como é o caso do feijão de corda. O fato das espécies vegetais da Caatinga ter apresentado elevado teor proteico não é suficiente para caracterizar o valor nutritivo das proteínas nas sementes. É necessário, ainda, que na composição de seus aminoácidos, os essenciais estejam presentes e sejam totalmente disponíveis ao organismo durante o metabolismo (SGARBIERI, 1996). Para tanto, o próximo passo foi a determinação da composição dos aminoácidos das sementes das 10 espécies em estudo.

100 5.2 Composição de Aminoácidos das Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga

A composição de aminoácidos essenciais e não-essenciais das sementes das espécies vegetais analisadas está mostrada na TABELA 4. Segundo os requerimentos de aminoácidos essenciais para crianças de duas diferentes faixas etárias recomendados pela FAO/WHO/UNU (1985), a maioria das espécies atendeu aos requerimentos de treonina, valina, isoleucina, lisina e histidina, sendo os dois últimos presentes em todas as espécies com quantidades elevadas, atendendo aos requerimentos para ratos e superiores as quantidades presentes na clara do ovo, que é uma proteína de referência por possuir alto valor biológico, estando em consonância com a literatura que relata a presença de elevada quantidade de lisina nas leguminosas (GUPTA, 1982). Por outro lado, o conteúdo de outros aminoácidos essenciais como leucina, tirosina, cisteína, metionina, fenilalanina e tritofano da maioria das espécies não atenderam aos requerimentos da FAO/WHO/UNU (1985) ou não atingiram perfil dos aminoácidos da soja ou a quantidade necessária para ratos conforme apresentados na TABELA 2. A característica inerente às leguminosas de deficiência de aminoácidos sulfurados (metionina e cisteína) (GUPTA, 1982; VASCONCELOS et al., 2001; RUIZ e SOTELO, 2001) também foi apresentada pela maioria das espécies, mas inesperadamente, duas espécies ( E. velutina e P. moniliformis ) apresentaram quantidades de metionina mais elevadas que a da soja e a espécie P. platycephala apresentou maior quantidade de cistina do que a soja e até do que de clara do ovo. Esse fato também foi encontrado por Sridhar e Seena (2006) para duas leguminosas não convencionais. O resultado da análise da composição de aminoácidos das espécies mostra que, de uma maneira geral, o perfil das variedades de soja estudadas por Trugo et al . (2000) e por Vasconcelos et al . (2001) pode ser comparado aos das espécies analisadas. No entanto, as espécies E. velutina , P. platycephala , P. moniliformis e S. rugosa apresentam melhor perfil de aminoácidos quando comparado ao dessa leguminosa padrão que é uma das mais importantes fontes proteicas de plantas. As espécies destacadas merecem estudos mais consistentes para seu aproveitamento como novas fontes de proteínas.

101 TABELA 4 - Composição de aminoácidos das proteínas das sementes de dez espécies de leguminosas da caatinga, composição de aminoácidos de proteína vegetal (soja) e animal (clara de ovo) padrões e referências de aminoácidos para grupos de crianças em diferentes idades e requerimento para ratos

Aminoácidos (mg/ gN)

Espécies vegetais Essenciais Não essenciais

Thr Val Ile Leu Lys Phe Tyr Met Cys Trp His Asx Glx Ser Gly Ala Arg Pro

Caesalpinia bracteosa 358 249 23 342 862 346 262 49 45 23 344 394 587 398 432 6 1202 148

Caesalpinia ferrea 318 154 154 311 789 281 222 44 101 21 419 471 757 369 378 8 1190 184

Dioclea megacarpa 292 154 188 356 1088 304 116 0 0 11 737 494 348 203 262 33 1490 180

Enterolobium contortisiliquum 239 213 188 509 931 326 234 64 52 12 379 577 884 356 314 311 509 164

Erythrina velutina 273 346 332 457 789 524 501 132 52 131 199 341 489 292 256 302 758 209

Hymenaea courbaril 211 261 276 390 861 254 353 0 0 0 918 408 375 257 501 175 922 131 Lonchocarpus sericeus 153 191 140 358 618 211 173 16 101 29 736 568 594 274 258 262 1500 96

Parkia platycephala 242 304 236 426 970 284 218 67 211 23 258 531 818 344 296 341 574 132

Piptadenia moniliformis 255 278 229 417 939 360 224 303 73 10 296 373 490 293 326 53 1120 215 Continua

102 TABELA 4 – Composição de aminoácidos das proteínas das sementes de dez espécies de leguminosas da caatinga, composição de aminoácidos de proteína vegetal (soja) e animal (clara de ovo) padrões e referências de aminoácidos para grupos de crianças em diferentes idades e requerimento para ratos Continuação

Aminoácidos (mg/ gN)

Espécies vegetais Essenciais Não essenciais

Thr Val Ile Leu Lys Phe Tyr Met Cys Trp His Asx Glx Ser Gly Ala Arg Pro

Senna rugosa 299 288 168 421 456 265 182 0 151 65 374 789 819 434 385 386 597 238 Padrões Soja* 238 291 237 480 409 378 314 86 102 34 190 696 1140 264 242 266 532 333 Ovalbumina † 308 346 361 482 689 559 275 327 149 91 146 382 538 339 204 363 650 182 Requerimento para crianças ¶ 2 – 5 anos 212 219 175 412 362 394 156 69 119 10 – 12 anos 175 156 175 275 275 138 138 6 119 Requerimentos para ratos 250 343 312 500 375 564 282 10 156

Os valores são médias de três repetições da mesma amostra. Os valores de desvio padrão foram menores que 5% das médias. *Vasconcelos et al . (2001). †Adquiridos da Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, USA). ¶ FAO/WHO/UNU (1985).

103 Vale ressaltar ainda que a espécie E. velutina merece destaque dentre as espécies acima citadas por possuir todos os aminoácidos essenciais em quantidades adequadas com exceção de apenas um aminoácido, a cisteína, tendo apresentado também elevado teor de proteínas em suas sementes, tornado-a uma espécie bastante promissora.

5.3 Determinação de Compostos Tóxicos e/ou Antinutricionais das Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga

A qualidade nutricional das sementes como futuras fontes proteicas, além da quantidade de proteínas e qualidade de aminoácidos essenciais presentes, depende da digestibilidade e da biodisponibilidade dos aminoácidos essenciais que pode ser afetada pela presença de fatores toxicos e/ou antinutricionais. A TABELA 5 mostra a determinação da presença de compostos tóxicos e/ou antinutricionais realizada no intuito de verificar qualidade das proteínas nas sementes. Os compostos avaliados foram as lectinas, os inibidores e tripsina, as ureases e a atividade tóxica. Em relação às lectinas, nas condições testadas, só foram encontradas nas farinhas de metade das espécies avaliadas ( D. megacarpa , E. velutina , L. sericeus , P. platycephala e S. rugosa ). A maior atividade hemaglutinante foi detectada em sementes de espécie P. platycephala com 2.560 UH/g de farinha, em eritrócitos tratados e não tratados com protease. A presença de lectinas nas espécies D. megacarpa , E. velutin, L. sericeus e P. platycephala era esperado, pois já haviam sido previamente detectadas como mostra o QUADRO 1. As demais espécies com atividade lectínica apresentaram variação de 160 a 2.560 UH/g de farinha em eritrócitos tratados com protease, valores esses, maiores que os encontrados nas farinhas de diferentes genótipos de feijão de corda (99,6 a 540,3 UH/gF), nas mesmas condições (VASCONCELOS et al., 2010). No entanto, para cultivares de soja (leguminosa referência como fonte de proteínas), a atividade lectínica encontrada foi bem superior, posto que variou de 1.152 a 147.456 UH/gF (VASCONCELOS et al ., 2006). As outras cinco espécies analisadas ( C. bracteosa , C. ferrea , E. contortisiliquum , H. courbaril , P. moniliformis ) não apresentaram atividade hemaglutinante nas condições testadas.

104 TABELA 5 – Fatores tóxicos e/ou antinutricionais das sementes de dez espécies vegetais da caatinga

Lectinas * Espécies Vegetais Inibidor de Tripsina † Urease ¶ Toxina § Não tratados Tratados

Caesalpinia bracteosa ND ND 16,2 ± 0,8 11.278 ± 1.307 NL #

Caesalpinia ferrea ND ND 27,4 ± 0,2 822 ± 50 NL

Dioclea megacarpa 1.280 2.560 10,8 ± 0,1 47.178 ± 3.351 0,72 ± 0,03

Enterolobium contortisiliquum ND ND 26,2 ± 0,1 3.684 ± 173 1,12 ± 0,04

Erythrina velutina 1.280 1.280 24,0 ± 0,8 3.645 ± 171 1,01 ± 0,02

Hymenaea courbaril ND ND 4,5 ± 0,2 620 ± 28 NL

Lonchocarpus sericeus 1.280 320 8,3 ± 0,3 23.895 ± 3.388 NL

Continua

105 TABELA 5 – Fatores tóxicos e/ou antinutricionais das sementes de dez espécies vegetais da caatinga

Continuação

Lectinas * Espécies Vegetais Inibidor de Tripsina † Urease ¶ Toxina § Não tratados Tratados

Parkia platycephala 2.560 2.560 ND 5.907 ± 967 NL

Piptadenia moniliformis ND ND 8,9 ± 0,5 1.899 ± 228 NL

Senna rugosa 80 160 4,1 ± 0,4 465 ± 13 NL

Média ± desvio padrão de três análises, cada uma em triplicata, com exceção da dosagem de lectinas que foram expressas apenas as médias. ND = não detectado. * UH/gF, onde Uma UH corresponde ao valor recíproco da maior diluição capaz de provocar aglutinação visível a olho nu em eritrócitos de coelhos tratatos e não tratados com protease do Bacillus licheniformis (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA); † ( µgTI/mgF), Atividade inibitória de tripsina é expressa por µg de tripsina inibida por miligrama de farinha; ¶ (U/KgF), A atividade ureásica foi expressa como unidades de enzima por Kg de farinha; onde Um grama de urease pura contém 870.000 unidades (Sigma).

*Toxicidade aguda em camundongos (n=6) foi expressa como DL 50 . Uma DL 50 representa a quantidade de proteína em gP/Kg de peso corpóreo de camundongo capaz de produzir convulsão e morte em 50% dos animais após administração por via intraperitoneal. NL = Não letal em doses de 1g/Kg do peso corpóreo de camundongo. ND = Não detectado.

106 Fator positivo, visto que, tal atividade já foi encontrada em mais de 600 espécies de leguminosas (VADIVEL; JANARDHANAN, 2001) e segundo Mancini-filho, Lajolo, Vizeu (1979) e Pusztai (1989) as lectinas estão presentes em quantidade superiores em grãos de leguminosas e gramíneas, tendo sido detectadas em leguminosas convencionais e não convencionais como Cassia floribunda , Canavalia cathartica, Styphnolobium burseroides e Acacia bilimekii (SOTELO et al. , 1999; VADIVEL; JANARDHANAN, 2001; SEENA; SRIDHAR; JUNG, 2005). As lectinas compreendem uma classe de proteínas que interagem com carboidratos e constituem importantes fatores antinutricionais pelo fato de serem, em sua maioria, resistentes à degradação por enzimas proteolíticas e, desse modo, quando presentes na dieta, podem causar alterações nas mucosas gástrica e intestinal e no metabolismo, em geral, através da sua interação com glicoconjugados encontrados nas células gástricas e nos enterócitos, causando uma interferência não específica com a absorção e utilização de nutrientes (KORDÁS et al ., 2000, 2001; OTTE et al., 2001; SASAKI et al ., 2002, VASCONCELOS; OLIVEIRA, 2004; OLIVEIRA et al., 2004a,b). Entretanto, um processamento simples como cozimento dos grãos em elevada temperatura (100 °C), por um determinado período de tempo, inativam as lectinas, como encontrado para várias lectinas de leguminosas (LINNER, 1994). Os inibidores de tripsina foram detectados em quase todas as espécies, menos na P. platycephala. A quantidade nas espécies variou de 4,1 ± 0,4 ( S. rugosa ) a 27,4 ± 0,2 µgTI/mgF (C. ferrea ). Resultados próximos foram encontrados para sementes de feijão de corda cuja variação foi de 12,00 a 30,56 µgTI/mgF (MAIA et al ., 2000) e de três cultivares de feijão-de- corda (12,0 a 16,67 µgTI/mgF ) estudadas por Vasconcelos et al . (2010). Entretanto, as espécies analisadas apresentaram valores baixos quando comparados aos inibidores de tripsina encontrado em diferentes estudos com várias cultivares de soja, os quais variaram de 28,1 a 77,2 µgTI/mgF (ARMOUR et al ., 1998; QUEDRAOGO et al ., 1999; VASCONCELOS et al ., 2001; 2006). As espécies de leguminosas não convencionais como Cassia floribunda também apresentou inibidores de tripsina em suas sementes (16,4 a 17,4 UTI/mgP), bem como em espécies do gênero Sesbania spp, (5,25 a 14,01 µgTI/mgF), com quantidades próximas ou inferiores as encontradas neste estudo (VADIVEL; JANARDHANAN, 2001; HOSSAIN; BECKER, 2001).

107 O Inibidor de tripsina é responsável pela diminuição da digestibilidade de proteínas por se ligar à tripsina impedindo sua atuação, levando a redução de crescimento e hipertrofia pancreática (LINNER, 1994; EVENEPOEL et al ., 2000, BAJPAI; SHARMA; GUPTA, 2005). Todavia se o cozimento dos grãos de leguminosas for realizado antes de seu consumo causará, pelo menos em parte, desnaturação e inativação dessas proteínas, não afetando a digestibilidade e aproveitamento das mesmas, podendo até desempenhar um positivo efeito para saúde (DURANTI; GIUS, 1997), visto que estudos já investigam o potencial dos inibidores de tripsina na prevenção e supressão da carcinogênese, mostrando indícios de sua participação (SAITO et al ., 2007; ZHANG et al ., 2007; LIN; NG, 2008). As ureases estão presentes em todas as espécies analisadas (TABELA 5), porém apresentam-se em níveis bem diversos. A espécies D. megacarpa aparece como a detentora de maior quantidade de atividade ureásica com 47.178 ± 3.351 U de urease/kgF, seguida de L. sericeus (23.895 ± 3.388 U/kgF) e C. bracteosa (11.278 ± 1.307 U/kgF). As espécies com menor quantidade de ureases são S. rugosa (465 ± 13 U/kgF), H. courbaril (620 ± 28 U/kgF) e C. ferrea (822 ± 50 U/kgF). As demais espécies possuem valores que variam de 1.899 ± 288 a 5.907 ± 967. Cultivares de soja estudadas por Vasconcelos et al . (2001), apresentaram valores que variaram de 107.320 ± 9.470 a 219.280 ± 12.600 U/KgF, sendo seu menor valor cerca de duas vezes maior que a quantidade de urease apresentada pela espécie D. megacarpa com maior quantidade dessa enzima entre todas analisadas. Outras nove cultivares de soja apresentaram valores ainda mais altos de urease que variaram de 643.000 a 1.061.400 U/kgF (VASCONCELOS et al ., 2006). A variação no teor de urease na soja é comum, segundo Vasconcelos et al . (1997), e reflete a variabilidade ambiental e genética. O efeito antinutricional da urease não é bem compreendido, mas Polacco e Holland (1993) sugerem que sua ação parece estar envolvida com a mimetização dos efeitos observados para urease microbiana na mucosa gástrica. Além disso, no estudo de Vasconcelos et al. (2001), a análise de regressão, feita para relacionar a qualidade da proteína da soja com os compostos tóxicos e/ou antinutricionais presentes, mostrou que a urease é mais uma variável que também está envolvida interferindo em alguns parâmetros nutricionais. Todavia, mesmo a soja possuindo uma grande quantidade dessa enzima em suas sementes, essa leguminosa é bastante consumida como fonte de proteínas em diversas partes do mundo. Isso ocorre porque, de acordo com as pesquisas, quando os grãos de soja são submetidos ao tratamento térmico adequado, há uma

108 inativação suficiente de fatores antinutricionais, melhorando sua qualidade nutricional (YOSHIDA; KAJIMOTO, 1988; MARTY; CHAVEZ, 1993; MARTY; CHAVEZ; DE LANGE, 1994; QIN et al ., 1996; ZHU; RIAZ; LUSAS, 1996; RAJKO; SZABO, 1997; DUDLEY-CASH, 1999). Esse fato mostra que a presença dessa enzima provavelmente não afetará a qualidade nutricional dos gãos das espécies em estudo se também for realizado um adequado tratamento térmico antes de consumí-las. Em relação à toxicidade, a maioria das espécies não apresentou atividades tóxicas para camundongos quando seus extratos brutos foram injetados intraperitonealmente, nem mesmo na dose mais elevada (0,3 mL para 10g de peso corpóreo). Apenas três especies tiveram a capacidade de serem letais a camundongos: D. Megacarpa , E. velutina e L. sericeus , com DL 50 de 0,72 ± 0,03; 1,12 ± 0,04 e 1,01 ± 0,02 g/Kg de peso corpóreo, respectivamente. Assim mesmo, essa toxicidade foi pequena se comparada à apresentada pela soja Bays, onde sua DL 50 foi de 0,137 ± 0,02 g/kgP (VASCONCELOS et al ., 2001), representando toxicidade cerca de cinco vezes maior. A presença de toxina nas sementes foi avaliada porque, assim como para ureases, no estudo de Vasconcelos et al. (2001), essas proteínas, quando ativas, interferem de alguma maneira na qualidade nutricional dos grãos. As proteínas antinutricionais, incluindo as toxinas, são instáveis ao calor, podendo ser inativadas pelo cozimento ou outro tratamento térmico, como já descrito. O resultado aqui apresentado mostra que as sementes de leguminosas selvagens possuem componentes antinutricionais proteicos semelhantes e mesmo inferiores a muitas leguminosas comumente consumidas, o que as tornam promissoras como novas fontes de proteínas. Nesse contexto, estudo mais aprofundado com essa finalidade torna-se relevante, já que apenas a determinação de compostos relacionados com qualidade nutricionais e antinutricionais in vitro , sozinhos apenas sugerem boa ou má qualidade nutricional. Uma correlação entre os pontos fortes e fracos das sementes selvagens em estudo pode apontar aquelas mais promissoras para estudos mais refinados, portanto a determinação da quantidade de minerais presentes nesses grãos foi realizada para investigar a presença de mais uma qualidade postiva.

109 5.4 Determinação da Composição de Minerais das Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga

A TABELA 6 mostra o resultado da análise da composição de minerais nas sementes das espécies em estudo. O teor de potássio foi elevado em todas as sementes selvagens variando de 366 a 1.581 mg/100g de farinha (F), o que representa 12 a 45% da RDI (FDA, 2010). Resultado comum para a maioria das leguminosas, segundo Vadivel e Jnardhanan (2001), que também encontraram altos níveis desse mineral em sementes de Cassia floribunda , leguminosa não convencional. Altos teores de magnésio (102 a 244 mg/100 g de farinha), representando 26 a 61% RDI, zinco (1,3 a 5,6 mg/100gF), 10 a 37% RDI, manganês (1,1 a 5,2 mg/100gF), 55 a 528% RDI, cobre (360 a 2.200 µg/100gF), 36 a 110%, cromo (20 a 290 µg/100gF), 17 a 242% RDI e molibdênio (0 a 600 µg/100gF), 0 a 800% RDI foram encontrados nas sementes avaliadas. Relacionando os teores de alguns desses minerais (em mg ou µg por 100 gramas de farinha) com outras leguminosas não cultivadas, a espécie Cassia floribunda apresentou maior quantidade de magnésio (318), menor quantidade de zinco (1,7), similar quantiade de manganês (1,0) e bem inferior de cobre (0,35). Já outra espécie, a Canavalia cathartica apresentou menor teor de magnésio (5,3), maior teor de zinco (11,4) e, assim como para a outra leguminosa, similar teor de manganês (1,36) e inferior de cobre (1,10). Essa comparação mostra que a composição de minerais é muito variada entre as leguminosas e até mesmo entre uma mesma leguminosa de diferentes origens, isso devido à origem genética, origem geográfica, níveis de fertilidade do solo, da estação seca ou úmida ou ainda podem variar de um ano para o outro (OLUWATOSIN, 1998; VADIVEL; JANARDHANAN, 2001; PHILLIPS et al ., 2003; WANG et al ., 2003; SEENA; SRIDHAR; JUNG, 2005). Vale ressaltar a elevada quantidade de cálcio que variou de 31 a 268 mg/100gF e de ferro de 1,5 a 20,2 mg/100gF (correspondendo 3 a 50% da RDI e 8,3 a 112% da RDI, respectivamente) apresentada pela maioria das espécies estudadas, posto que as leguminosas são conhecidas por apresentarem baixas concentrações desses minerais além do zinco (WANG et al ., 2003).

110 TABELA 6 – Composição de minerais das sementes de dez espécies vegetais da caatinga e recomendação de ingestão diária (RDI) para adultos e crianças com quatro ou mais anos de idade baseado em um consumo de 2000 Kcal diárias.

Minerais (µg 100g -1 de Minerais (mg 100g -1 de farinha de semente) Espécies Vegetais farinha de semente)

K Na Ca Mg Fe Zn Mn Cu Cr Mo

Caesalpinia bracteosa 890 14,1 249 142 11,4 3,9 5,2 1.500 20 30 Caesalpinia ferrea 1.351 9,2 268 160 5,7 5,6 1,5 2.200 200 340 Dioclea megacarpa 738 7,8 31 111 5,2 1,8 1,6 620 280 190 Enterolobium contortisiliquum 844 9,2 41 244 20,2 2,0 2,3 890 280 20 Erythrina. Velutina 1.581 8,8 113 157 6,1 3,8 3,2 1.600 150 410 Hymenaea courbaril 366 10,2 58 117 3,8 1,5 2,5 1.040 280 70 Lonchocarpus sericeus 1.137 10,6 224 102 5,9 5,7 3,7 1500 160 320 Parkia platycephala 826 8,1 116 229 5,9 2,3 1,7 1.080 110 90 Piptadenia moniliformis 888 9,0 103 135 4,4 3,0 2,2 800 230 290 Senna rugosa 813 5,5 116 124 5,5 1,3 2,7 360 90 50 ** RDI (mg/dia) (µg /dia) 3.500 2.400 1.000 400 18 15 2,0 2.000 120 75

Os valores são médias de três repetições da mesma amostra. Os valores de desvio padrão foram menores que 5% das médias. * Não detectada pela metodologia utilizada ** Referência de ingestão diária de 101.9 (c) (8) iv. FDA U.S. Food and Drug Administration (2010). 111 Os teores de minerais encontrados nesse estudo foram bem mais elevados do que o presente em outras leguminosas selvagens e cultivadas (VADIVEL; JANARDHANAN, 2001; ONWULIRI; OBU, 2002; SEENA; SRIDHAR; JUNG, 2005). O cálcio é necessário para uma série de funções no corpo, incluindo a atividade neuromuscular, a funções na membrana, secreção hormonal, atividade enzimática, coagulação do sangue e mineralização óssea. Uma ingestão adequada de cálcio na dieta é imprecindível sendo necessária para compensar as perdas obrigatórias de cálcio no urina e os sucos digestivos, bem como perda de cálcio dos ossos (FRANCIS, 1996; FRANCIS et al ., 2006). Já o ferro é essencial ao metabolismo, atuando diretamente nas reações celulares ou como cofator para centenas de proteínas (BEARD; DAWSON; PIÑERO, 1996; CONRAD; UMBREIT; MORRE, 1999; ROY; ENNS, 2000). Portanto, essas sementes podem contribuir para manter os níveis de ingestão adequada desses minerais, caso sejam aptas ao consumo humano. Os níveis de sódio nas sementes analisadas foram baixos variando de 1,4 to 14 mg/100gF, podendo ser considerado um fator positivo já que esse mineral está presente em quase todos os alimentos tornando fácil sua adequação e, seu consumo deve ser limitado a 2,4 g por dia (FDA, 2010) a fim de evitar aumentos na pressão arterial. De uma maneira geral, o perfil de minerais encontrado nas sementes de espécies vegetais selvagens desse trabalho são parecidos aos encontrados para espécies do sul da Índia, também selvagens, dos gêneros Canavalia , Cassia e Mucuna (VADIVEL e JANARDHANAN, 2005), bem como semelhante ao relatado por Onwuliri e Obu (2002) para diferentes variedades de feijão de corda e feijão preto, só que com teores mais elevados nos minerais analisados com exceção do cálcio e do sódio. Portanto, essas sementes são boas fontes de minerais, satisfazendo parcial ou totalmente as necessidades de ingestão diária estabelecidas como referência (RDI) (TABELA 5). Estando em consonância com a afirmação de Grusak (2002) de que leguminosas são uma importante fonte de minerais na dieta com potencial de fornecer vários minerais essenciais requeridos pelo homem. Ezeagu et al . (2002) sugerem que um alimento destinado à alimentação humana ou para fins de formulação de rações é sempre necessário determinar com precisão a composição dos vários nutrientes e antinutrientes, particularmente quando for de interesse a utilização de fontes não convencionais, a fim de atingir uma utilização ótima de tais ingredientes em uma dieta. Após a análise dos constituites das sementes das dez espécies de leguminosas selvagens

112 da Caatinga pôde ser constatado que as sementes das espécies avaliadas possuem elevado potencial como fonte de proteínas, fibras e minerais, segundo a análise da composição proximal, boa composição de aminoácidos essenciais e de minerais, associados à baixa quantidade de compostos tóxicos e/ou antinutricionais, tornando-as de fato, possíveis fontes adicionais ou alternativas de proteínas para a alimentação humana ou animal. Contudo, algumas espécies são mais promissoras que outras quando todos esses parâmetros são correlacionados, devendo ser investigadas com mais afinco primeiro. Assim sendo, foi criado um índice de qualidade nutricional para a classificação das espécies mais promissoras como fonte de nutrientes afim de permitir uma investigação mais detalhada com testes que comprovem in vivo o aproveitamento e a qualidade dos nutrientes.

5.5 Classificação das Espécies Vegetais Através do Índice de Qualidade Nutricional

O valor nutricional das sementes das leguminosas depende da presença de macro- e micronutrientes, bem como da ausência de fatores tóxicos e/ou antinutricionais, os quais depreciam a qualidade dos alimentos e causam respostas fisiológicas adversas (SHIMELIS; RAKSHIT, 2005). Dessa forma, a análise em conjunto dos principais compostos detectados nas sementes de leguminosas podem predizer a qualidade nutricional de cada espécie analisada e apontar aquelas mais promissoras como fonte de nutrientes para estudos futuros mais aprofundados, utilizando modelos biológicos para experimentos in vivo . Para tanto, um Índice de Qualidade Nutricional (IQN) foi estabelecido, aplicando pesos arbitrários, de acordo com o grau de importância atribuído a cada composto analisado. Ao teor de proteínas foi atribuído peso cinco (5), seguido do teor de dois aminoácidos essenciais, conhecidos por serem deficientes em leguminosas, metionina e cisteína, com peso quatro (4). Tendo sido escolhido para determinação do índice devido, sua deficiência geralmente ser um dos fatores limitantes ao aproveitamento das proteínas de leguminosas. Sendo as leguminosas fontes de minerais e de fibras, estes aparecem logo em seguida, na mesma ordem de importância, sendo atribuído para a quantidade de ambos peso equivalente a três (3). Foram destacados alguns minerais (cálcio, ferro, zinco e potássio) como característica do IQN por serem mais importantes

113 na alimentação humana. Para o teor de lipídios, o peso foi dois (2), escolhidos para determinar o IQN por ser um macronutriente importante na representação da quantidade de energia, bem como por ser fonte de gordura mono e poli-insaturadas benéficas à saúde. E, por último, ficaram os fatores antinutricionais, já que reduzem a qualidade dos nutrientes, como peso um (1). A cada uma das características consideradas foi estabelecido um valor limítrofe. Para o percentual da composição proximal (proteínas, lipídios e fibras), foi estabelecido que seria a média dos teores das próprias sementes (34,5%, 9%, 28,6%, em base seca, respectivamente), pelo fato de seus valores serem superiores aos encontrados na Tabela Brasileira de Composição de Alimentos (TACO, 2006), para feijão comum e para o feijão de corda, consideradas leguminosas importantes e muito consumidas no Brasil, especialmente na região Nordeste desse país. Em relação aos aminoácidos essenciais (Metionina e Cisteína), o valor limítrofe foi considerado igual ao teor daqueles presentes na soja (VASCONCELOS et al ., 2001), devido ser uma leguminosa utilizada como padrão de referência. Os minerais tiveram valor limítrofe de acordo com a quantidade (mg/g) apresentada pelo feijão comum (carioca) cru (TACO, 2006). Para os fatores antinutricionais, devido à baixa quantidade apresentada pelas dez sementes de leguminosas quando comparadas às quantidades de leguminosas mundialmente consumidas como soja e feijão comum, foram atribuídos para as lectinas e toxinas apenas SIM ou NÃO, sendo o SIM equivalente a zero e o NÃO equivalente a 1. Já para os inibidores de tripsina e para as ureases foram utilizados como limítrofe as próprias médias das dez sementes (9,94 µgTI/mgF e 13 U/gF). A TABELA 7 mostra a classificação das espécies, de acordo com o índice de qualidade nutricional (IQN) aplicado, em ordem decrescente, da mais promissora para a menos promissora. O IQN foi capaz de apontar quais espécies apresentaram o maior número de características desejáveis para o propósito de serem utilizadas como fonte de alimentos, destacando especialmente as proteínas, posto que o maior peso (peso 5) foi atribuído a elas. As três espécies mais promissoras segundo o IQN, em ordem decrescente, foram: P. moniliformis > P. platycephala > E. Velutina . A variação do índice entre as dez espécies foi grande, de -24,04 ( D. Megacarpa ) a 23,71 ( P. Moniliformis ).

114 TABELA 7 – Índice de Qualidade Nutricional* das espécies vegetais da caatinga em ordem decrescente

ESPÉCIES VEGETAIS ÍNDICE DE QUALIDADE NUTRICIONAL

Piptadenia moniliformis 23,71

Parkia platycephala 13,32

Erythrina Velutina 1,51

Caesalpinia ferrea - 2,78

Senna rugosa - 6,08

Lonchocarpus sericeus - 6,45

Enterolobium contortisiliquum - 6,90

Caesalpinia bracteosa -10,99

Hymenaea courbaril - 21,66

Dioclea megacarpa - 24,04

* Índice calculado multiplicando-se cada valor em excesso ou em falta, resultante da diferença dos valores desejados (valores limítrofes atribuídos), previamente estabelecidos pelo seu peso atribuído arbitrariamente, seguido da soma algébrica de cada termo. O resultado final desta soma é dividido pela soma dos pesos de cada componente.

115 A espécie P. moniliformis Benth., detentora do maior IQN (23,71), possui um elevado percentual de proteínas (44,7%) contendo todos os aminoácidos essenciais, incluindo metionina e cisteína, atendendo à recomendação para crianças (nas faixas de 2 – 5 e 10 – 12 anos) segundo a FAO/WHO/UNU (1985), com exceção de apenas cisteína, triptofano e tirosina, além de possuir teor razoável de lipídios (7,2%) e de carboidratos (21,4%), os quais, juntamente com as proteínas a torna boa fonte de energia (1.390 kJ/100 g). Rica fonte de fibras (23,4%) e matéria mineral (3,2%), contendo boas quantidades de todos eles. Dentre os fatores antinutricionais de natureza proteica avaliados apresenta apenas baixas quantidades de inibidores de tripsina (8,9 µgTI/mgF) e de urease (1.899 U/g). Justificando, portanto, sua colocação como primeiro lugar pelo IQN. As demais espécies avaliadas também apresentaram bom perfil nutricional e a posição de sua classificação de acordo com o IQN ou valores negativos do mesmo não significam que elas não poderão ser uma fonte promissora de nutrientes para futuras utilizações na alimentação humana e/ou animal. Posto que, o índice foi aplicado no intuito de escolher qual semente deveria ter prioridade nas análises de incorporação em dieta para animais experimentais para avaliar sua qualidade in vivo , já que as determinações in vitro, sozinhas, não garantem o real aproveitamento dos nutrientes por parte dos organismos que os consomem. Existe uma série de outros fatores que podem interferir na utilização de nutrientes que não foram determinados e, por isso, precisam ser detectados e mais bem avaliados. Nesse sentido, a espécie P. moniliformis Benth. foi escolhida para a avaliação da qualidade de suas proteínas in vivo por meio de experimentos de alimentação utilizando ratos em crescimento.

5.6 Experimento Nutricional I

O experimento nutricional I foi conduzido para avaliar a qualidade nutricional in vivo das proteínas das sementes de uma leguminosa selvagem, P. moniliformis Benth., espécie vegetal classificada como a mais promissora segundo o IQN (TABELA 7) e destacada devido ao bom perfil de sua composição química elementar e de suas qualidades mencionadas anteriormente. O primeiro experimento teve o propósito de avaliar, em ratos em crescimento, a qualidade das

116 proteínas das farinhas das sementes de P. moniliformis crua e processada termicamente por três diferentes métodos (fervura, cozimento em micro-ondas e autoclavagem) e comparar o desenvolvimento de animais alimentados com a farinha de uma leguminosa padrão, mundialmente consumida com fonte de proteínas, a soja. Para tanto, foram elaboradas sete dietas, conforme descrito no item 4.9.1.1. Uma dieta contendo farinha de P. moniliformis crua como fonte de proteínas ( Pm Cr), três dietas com farinha de P. moniliformis processada termicamente como fontes de proteínas, sendo um processamento a fervura ( Pm F), o outro o cozimento em micro-ondas ( Pm M) e o último autoclavagem ( Pm A). Foi utilizada uma dieta com farinha das sementes de soja crua (SJCr), para fins comparativos, uma dieta contendo farinha de sementes de soja processada termicamente por fervura (SJF) como padrão positivo, e uma dieta isenta de proteína ou aproteica (AP), como padrão negativo. As dietas foram denominadas conforme especificado entre parênteses e foram oferecidas para ratos em crescimento para a análise dos parâmetros nutricionais.

5.6.1 Crescimento dos animais

A dieta contendo farinha de P. moniliformis crua ( Pm Cr) usada como fonte de proteínas (100 g de proteínas por Kg de dieta) proporcionou menores taxas de crescimento nos ratos, quando comparada com a dieta padrão, soja tratada termicamente por fervura (SJF), considerada uma excelente fonte proteica de origem vegetal, bem como quando comparadas à dieta contendo farinha de soja crua (SJCr) (FIGURA 2). Os três processamentos térmicos [fervura ( Pm F), cozimento em micro-ondas ( Pm M) e autoclavagem ( Pm A)] realizados na farinha das sementes de P. moniliformis , antes de compor as dietas, de forma a minimizar os efeitos antinutricionais, aumentar a disponibilidade de aminoácidos e, assim, melhorar a digestibilidade das proteínas, não foram eficazes em aumentar o desempenho dos animais em relação a dieta contendo a mesma farinha crua. Ao contrário, proporcionaram maior decréscimo na curva de crescimento do que aquela apresentada pela dieta à base de soja crua (SJCr) e curva de crescimento semelhante a do grupo de animais que receberam dieta isenta de proteínas (AP).

117

120

110

100

90

80 (g) Peso 70

60

50

0 12 3 4 5 6 7 8910

Dias

SJF SJCr PmCr PmF PmA PmM AP

FIGURA 2 - Curva de crescimento dos ratos (n = 6) alimentados com dietas contendo farinhas de Piptadenia moniliformis crua ( Pm Cr) e processadas termicamente por fervura ( Pm F), cozimento em micro-onas ( PmM) e cozimento por autoclavagem ( Pm A), comparadas com o crescimento de ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja crua (SJCr), processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP).

118 Os processamentos realizados em farinhas de leguminosas possuem o intuito de aumentar a biodisponibilidade proteica, uma vez que o valor nutritivo e a digestibilidade proteica de farinha de leguminosas cruas são baixos e, segundo Liener (1962), Khattab, Arntfield e Nyachoti (2009), devem ser submetidos ao tratamento térmico. Além disso, já foi descrito na literatura que farinhas de leguminosas cruas não são capazes de proporcionar bom crescimento e desenvolvimento em amimais experimentais (RUBIO et al ., 1991; VASCONCELOS et al ., 2001; SEENA; SRIDHAR; JUNG, 2005). Foram escolhidos três tratamentos térmicos, dois mais convencionais (fervura e cozimento em micro-ondas) e o outro, menos convencional (autoclavagem 121º C por 20 minutos). Os três tratamentos são capazes de aumentar o conteúdo de aminoácidos essenciais nas sementes de leguminosas, incluindo os sulfurados (ALAJAJI; EL-ADAWY, 2006; KHATTAB; ARNTFIELD; NYACHOTI, 2009), sendo a autoclavagem mais eficiente, e, também escolhido devido sua utilização por alguns pesquisadores na mesma intenção proposta nesse trabalho (melhoria da digestibilidade e redução de fatores tóxicos e/ou antinutricionais) (ALONSO; AGUIRRE; MARZO, 2000; JIMÉNEZ-MARTÍNEZ et al ., 2001; REHMAN; SHAH, 2005; SIDDHURAJU; BECKER, 2005). A idéia era comparar a eficiência dos três tratamentos, mas isso não foi possível porque todos levaram a uma redução no crescimento dos animais tal como a farinha não processada. Resultados semelhantes foram encontrados por pesquisadores quando administraram dietas à base de farinha de leguminosas selvagens como Enterolobium cyclocarpium (PROLL et al. , 1998), Canavalia ensiformis e Mucuna pruriens (AGBEDE e ALETOR, 2005) tratadas termicamente, para ratos em crescimento, ocasionando perda de peso nos animais experimentais desses estudos. Por outro lado, ratos alimentados com dietas à base de farinha de outra leguminosa selvagem ( Canavalia cathartica ) cozida, conseguiram aumentar seu peso, embora tenha sido pouco em relação ao controle com dieta à base de caseína (SEENA et al ., 2006). O baixo ganho de peso desse estudo realizado por Seena et al . (2006) foi atribuído às lectinas tipo ConA por terem sido resistentes ao tratamento térmico. Esse fator limitante de C. cathartica não pode ser atribuído à dieta contendo farinha das sementes de P. moniliformis cozida por não ter sido detectado lectinas na composição de sua farinha crua. Portanto, a redução da curva de crescimento pelos animais deve ser atribuída a outros fatores não termolábeis que possam estar interferindo em seu aproveitamento.

119 5.6.2 Variação de Peso, Dieta Ingerida e Eficiência Alimentar

A TABELA 8 mostra o resultado da variação de peso, dieta ingerida e eficiência alimentar dos ratos alimentados por dez dias com as dietas à base de farinha de soja e de P. moniliformis crua e processada termicamente por fervura, cozimento em micro-ondas e por autoclavagem, bem como pelas dietas padrão: soja fervida e dieta isenta de proteínas. Os grupos experimentais que receberam dietas contendo farinha de P. moniliformis crua (Pm Cr) e processada termicamente ( Pm F, Pm A e Pm M), como fonte de proteínas, apresentaram variação de peso (Peso inicial – Peso final) negativa e significativamente (p < 0,05) diferente em relação a dieta controle positivo (SJF) a qual obteve um aumento no peso de 13,82 ± 6,17 g em dez dias de experimento. As dietas experimentais Pm Cr, Pm F, Pm A e Pm M tiveram variação de peso similares de -17,87 ± 4,28 g, -16,72 ± 2,52 g, -20,32 ± 1,78 g e -17,57 ± 4,58 g, respectivamente, não diferindo significantemente (p < 0,05) da perda de peso apresentada pelo grupo que consumiu dieta aproteica (-22,50 ± 1,81 g). Os ratos alimentados com dieta contendo farinha de soja crua também perderam peso (-9,46 ±1,33 g), embora menos que os demais grupos. Na pesquisa de Giami (2005), os ratos alimentados com dietas contendo farinha de novas linhagens de feijão de corda ( Vigna unguiculata ) crua como fontes de proteínas também apresentaram perda de peso com variação de -2,87± 0,04 a -5,02 ± 0,06 g. Existem relatos na literatura com estudos de alimentação em ratos utilizando farinha de leguminosas cruas que também não promovem o ganho de peso e crescimento de animais (KAKADE et al ., 1972; FETUGA; BABATUNDE; OYENUGA, 1973; KADAM et al ., 1987). No entanto, após algum tipo de processamento na farinha dessas leguminosas, o ganho de peso dos ratos é melhorado significativamente, como o encontrado para farinha de feijão de corda após o tratamento térmico por fervura e por cozimento no vapor (GIAMI, 2005), bem como para outras leguminosas após a fervura (WALKER; KOCHHAR, 1982; KADAM et al ., 1987; OYELEKE, 1992). Ratos alimentados com dieta à base de farinha da leguminosa não convencional ( Canavalia Cathartica ) obtiveram ganho de peso de 4,43 ± 0,67 e 8,27 ± 0,95 g para o tratamento com sementes assadas e para as sementes cozidas sob pressão, respectivamente.

120 TABELA 8 – Variação de peso, dieta ingerida e eficiência alimentar * de ratos (n = 6) submetidos a dietas contendo farinhas de Piptadenia moniliformis crua ( Pm Cr) e processadas termicamente por fervura ( Pm F), cozimento em micro-ondas ( Pm M) e autoclavagem ( Pm A), comparadas com o crescimento de ratos alimentados com dieta contendo farinha de soja crua (SJCr), processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP).

Variação de Peso (g) Dietas Dieta Ingerida (g) Eficiência Alimentar # (Peso inicial – Peso final)

a a a SJF 13,82 ± 6,17 104,78 ± 15,77 0,11 ± 0,05 b b b SJCr -9,46 ±1,33 78,80 ± 7,43 -0,13 ± 0,02 c c c Pm Cr -17,87 ± 4,28 51,05± 3,10 -0,35 ± 0,09 c c c Pm F -16,72 ± 2,52 52,97 ± 4,04 -0,32 ± 0,05 c c c Pm A -20,32 ± 1,78 50,27 ± 3,67 -0,41 ± 0,05 c c c Pm M -17,57 ± 4,58 50,92 ± 4,64 -0,34 ± 0,06 c b c AP -22,50 ± 1,81 68,30 ± 6,1 -0,33 ± 0,02

Média ± desvio padrão. Letras iguais na vertical referem-se a resultados não diferentes estatisticamente ( p > 0,05), para o teste de Variância Simples (One-way ANOVA) seguida de Teste de Tukey. * Os valores estão expressos em g/rato. # Eficiência alimentar = Variação de peso (g)/dieta ingerida (g)

121 No entanto, esses valores ainda são pequenos quando comparados aos apresentados pelos animais que consumiram a dieta padrão caseína (33,27 ± 1,13 g) (SENNA et al ., 2005). Ganho de peso por parte dos animais não foi verificado neste trabalho, mesmo após três diferentes tratamentos térmicos. Resultados similares foram encontrados por Proll et al . (1998) administrando dietas para ratos em crescimento, à base de uma leguminosa não convencional (Enterolobium cyclocarpium ), tratada termicamente, que também não foi capaz de promover aumento de peso nos animais, ao contrário, ocasionou uma perda de 10,0 ± 4,2 g. Dietas à base da leguminosa selvagem ( Amburana cearensis ) crua e tratada termicamente ocasionaram grandes perdas de peso nos animais (- 24,85 ± 3,56 e - 18,54 ± 2,05 g, respectivamente) que foram atribuídas ao seu baixíssimo consumo dietético (FARIAS, 2009). O grupo experimental que recebeu a dieta padrão (SJF) foi o que apresentou maior consumo voluntário da dieta, atingindo 104,78 ± 15,77 g por animal, durante o experimento. Por outro lado, os tratamentos que apresentaram menor consumo, não diferindo estatisticamente entre si, foram os das dietas experimentais Pm Cr, Pm F, Pm A e Pm M, cuja pequena variação foi de 50,27 ± 3,67 g a 52,97 ± 4,04 g por animal, o que representa um consumo cerca de duas vezes menor em relação ao consumo do grupo da dieta padrão positivo (SJF). Os ratos que consumiram a dieta SJCr ingeriram quantidades maiores que as consumidas pelos grupos testes e quantia semelhantes aos ratos que utilizaram a dieta isenta de proteínas (AP). O baixo consumo das dietas dos grupos testes pode ter ocorrido pela baixa palatabilidade, embora as leguminosas normalmente tenham sua qualidade melhorada após o tratamento térmico. Muitas vezes, o odor é fator crucial na aceitação da dieta por parte dos animais, segundo Martínez-Villaluenga et al . (2007). Foi observado, durante a pesagem diária das sobras das dietas, que aquelas contendo farinha de P. Moniliformis , quando em contato com água, ou seja, quando estavam molhadas pelos animais, exalava um odor característico muito forte, lembrando o odor de β-mercaptoetanol ou compostos que contêm enxofre. Os compostos responsáveis por este odor podem também estar relacionados com o baixo consumo alimentar, mesmo após o tratamento térmico. Talvez presença, nessa semente, do elevado teore de compostos sulfurados, como é o caso da metionina, possa explicar esse fato. Consequentemente, a eficiência alimentar, ou seja, a relação entre o ganho de peso e a dieta ingerida, segue a mesma tendência do ganho de peso para cada grupo que, por sua vez, está intimamente ligada ao consumo de dieta por parte do animal. Assim, os animais que receberam

122 dieta à base de soja tratada termicamente por fervura, tiveram maior consumo de dieta e maior ganho de peso, apresentando maior eficiência alimentar com índice de 0,11 ± 0,05. Os animais que se alimentaram das dietas ( Pm Cr, Pm F, Pm A e Pm M) dos grupos teste, consumiram cerca da metade da quantidade de dieta consumida pelos animais do grupo da dieta padrão (SJF) e cerca de 35% menos que o grupo que consumiu dieta a base de farinha de soja crua (SJCr), não apresentando diferença significativa para os grupos teste em suas eficiências alimentares, as quais foram negativas, caracterizando ineficiência alimentar (TABELA 8). As curvas de crescimento dos animais dos grupos teste refletiram essa ineficiência alimentar com curva decrescente no mesmo patamar do grupo que recebeu dieta isenta de proteínas. Resultado de ineficiência alimentar também foi verificado por Farias (2009), ao avaliar a qualidade da proteína da leguminosa não convencional Amburana cearensis crua e processada termicamente por fervura. Na ocasião, o consumo alimentar dos animais de ambas as dietas foi bem menor que o apresentado para as dietas teste deste trabalho, com perda de peso de 24,85 ± 3,56 g, para dieta com farinha de A. cearensis crua e de 18,20 ± 2,05 g, para dieta com farinha de A. cearensis cozida, perda essa até mesmo superior à do grupo aproteico desse estudo (-10,20 ± 0,76 g). Taxas reduzidas de eficiência alimentar também foram verificadas para dietas à base de leguminosas não convencionais como a de Adansonia digiata (0,04 ± 0,04) e de Enterolobium cyclocarpium (- 0,14 ± 0,06) (Proll et al ., 1998).

5.6.3 Balanço Nitrogenado

Um dos métodos empregados na determinação da qualidade proteica é a determinação do balanço nitrogenado que se refere à relação entre o nitrogênio ingerido e o nitrogênio excretado. É considerado positivo quando a ingestão de nitrogênio é maior que sua excreção e negativo quando ocorre o inverso, refletindo na baixa utilização das proteínas pelo organismo. O resultado do balanço nitrogenado, referente aos últimos cinco dias de experimentos, como dieta ingerida, nitrogênio ingerido e nitrogênio fecal, estão apresentados na TABELA 9.

123 TABELA 9 – Balanço de nitrogênio * dos ratos (n = 6) alimentados com dietas contendo farinhas de Piptadenia moniliformis crua ( Pm Cr) e processadas termicamente por fervura ( Pm F), cozimento em micro-ondas ( Pm M) e autoclavagem ( Pm A), comparadas com o de ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja crua (SJCr), processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP).

Dieta Nitrogênio Nitrogênio NF/N Dietas Ingerida (D) Ingerido (N) Fecal (NF) x 100

SJF 55,48 ± 8,59ª 0,85 ± 0,16ª 0,12 ± 0,02 ab 14,69 ± 1,44ª

SJCr 34,35 ±5,24 b 0,55 ± 0,08 b 0,11 ± 0,04 a 21,33 ± 3,87ª b

Pm Cr 26,62 ± 1,22 bc 0,43 ± 0,02 bc 0,10 ± 0,02 a 23,85 ± 2,96 b

Pm F 25,58 ± 2,39 c 0,41 ± 0,04 bc 0,15 ± 0,01 abc 38,0 ± 5,61 c

Pm A 24,20 ± 2,42 c 0,39 ± 0,04 c 0,19 ± 0,03c 51,39 ± 5,09 d

Pm M 25,58 ± 2,59 c 0,41 ± 0,04 bc 0,17 ± 0,05 bc 38,31 ± 6,41 c

Média ± desvio padrão. Letras iguais na vertical referem-se a resultados não diferentes estatisticamente ( p > 0,05), para o teste de Variância Simples (One-way ANOVA) seguida de Teste de Tukey. * Os valores estão expressos em g/rato e referem-se aos últimos cinco dias de experimento.

124 Os ratos alimentados com a dieta contendo soja cozida (SJF), como única fonte de proteínas, obtiveram o maior consumo de dieta nos últimos cinco dias de experimento (55,48 ± 8,59 g). A ingestão dietética de ratos alimentados com dietas cuja fonte de proteínas era a farinha de P. moniliformis crua e tratada temicamente ( Pm Cr, Pm F, Pm A e Pm M), foram significativamente ( p < 0,05) inferiores, cerca de duas vezes menor àquela verificada para a dieta padrão. A quantidade de nitrogênio ingerido pelos animais pertencentes aos grupos teste ( Pm Cr: 0,43 ± 0,0 g; Pm F: 0,41 ± 0,04 g; Pm A: 0,39 ± 0,04 e Pm M: 0,41g ± 0,04 g), seguiu a mesma tendência da ingestão de dieta nos últimos cinco dias, em torno da metade do nitrogênio ingerido pelo grupo que consumiu a dieta SJF (0,85 ± 0,16). Embora tenham sido encontradas diferenças significativas ( p < 0,05) nas quantidades de dietas ingeridas entre os diferentes grupos testes e o controle, a ingestão de nitrogênio dos grupos alimentados com as dietas Pm Cr, Pm F e Pm M foi similar àquela do grupo que recebeu a dieta à base de soja crua (0,55 ± 0,0 g). A quantidade de nitrogênio ingerido nos grupos testes ( Pm Cr, Pm F, Pm A e Pm M) também foram inferiores aos observados para leguminosas não convencionias como Adansonia digitata (0,95 ± 0,04 g), Enterolobium cyclocarpium ( 0,79 ± 0,08 g) e Sesbania pachycarpa (0,94 ± 0,02 g) no estudo de Proll et al . (1998). Em relação à excreção de nitrogênio fecal, o maior nível de excreção de nitrogênio foi apresentado pelo grupo de ratos que utilizaram a dieta Pm A (0,19 ± 0,03 g), embora não tenham diferido significativamente dos outros tratamentos térmicos. O grupo de animais que fizeram uso da dieta SJF (padrão) excretou 0,12 ± 0,02 g de nitrogênio em suas fezes, quantidade semelhante à excretada pelos grupos que consumiram as dietas SJCr (0,11 ± 0,04 g), Pm Cr (0,10 ± 0,02 g) e Pm F (0,15 ± 0,0 g). A excreção de nitrogênio fecal dos animais alimentados com as dietas teste e padrão desse experimento foram próximas às encontradas para ratos alimentados com dieta à base de clara do ovo (que contém proteínas de alto valor biológico) que foi de 0,12 ± 0,01 g e de uma cultivar de soja cozida (0,16 ± 0,01 g). Além disso, também excretaram menores quantidades que essa mesma cultivar de soja crua (0,36 ± 0,02), apresentadas no estudo de Vasconcelos et al . (2001), bem como das leguminosas da pesquisa de Proll et al . (1998), Adansonia digitata (0,32 ± 0,03 g), Enterolobium cyclocarpium (0,46 ± 0,06 g) e Sesbania pachycarpa (0,24 ± 0,006 g).

125 Contudo, a quantidade de nitrogênio ingerida pelos grupos teste foi bem inferior que a ingerida pelo grupo padrão, o que torna a excreção de nitrogênio dos grupos teste elevada, refletindo no índice que relaciona a excreção de nitrogênio fecal com a ingestão do nitrogênio dietético (FN/N x 100) presente na TABELA 9, onde, é inversamente proporcional ao nitrogênio ingerido, sendo tanto menor quanto maior a quantidade de nitrogênio ingerido e vice versa, já que os níveis de excreção fecal entre todos os tratamentos foram bem próximos. Dessa forma, o maior índice foi encontrado para o grupo de ratos que ingeriram a dieta Pm A (51,39 ± 5,09). Os menores valores desse índice (FN/N x 100) foram 23,85 ± 2,96 para a dieta padrão SJF, 14,69 ± 1,44 para a dieta Pm Cr e 21,33 ± 3,87 para Pm F, os quais não diferiram estatisticamente (P < 0,05), mostrando que os tratamentos de cozimento em micro-ondas e autoclavagem foram inferiores à fervura no que diz respeito ao aproveitamento de proteínas, por terem apresentado maiores taxas de excreção de nitrogênio. Portanto, os animais dos grupos experimentais retiveram menos nitrogênio no organismo do que os animais do grupo controle. A excreção de nitrogênio aumentada é geralmente associada à presença de fatores tóxicos e/ou antinutricionais por muitos autores, já que prejudicam a digestão e/ou a absorção das proteínas. Dessa forma, outros fatores antinutricionais que não foram aqui pesquisados podem estar interferindo no aproveitamento das proteínas dos grupos testados. Outros parâmetros nutricionais puderam ser avaliados através do ensaio nutricional com ratos, tais como a Digestibilidade, a Utilização Líquida de Proteína (NPU) e Valor Biológico, conforme mostrado na TABELA 10. Para todos os parâmetros nutricionais avaliados, o grupo que se alimentou da dieta contendo soja tratada termicamente por fervura (padrão) foram significativamente ( p < 0,05) superiores aos verificados para os grupos teste, com exceção da digestibilidade do grupo de animais que consumiram a dieta Pm Cr, por não ter diferido significativamente do grupo da dieta padrão. A dieta contendo soja crua não diferiu estatisticamente da dieta padrão para nenhum parâmetro nutricional avaliado. A digestibilidade avaliada foi a verdadeira que leva em consideração, também, a excreção de nitrogênio endógena, ou seja, as perdas que ocorrem naturalmente no organismo, o que pode ser avaliado a partir dos animais que não consumiram proteína durante o experimento (AP).

126 TABELA 10 - Parâmetros nutricionais obtidos pela alimentação de ratos (n = 6) com dietas contendo farinhas de Piptadenia moniliformis crua ( Pm Cr) e processadas termicamente por fervura ( Pm F), cozimento em micro-ondas ( Pm M) e autoclavagem ( Pm A), comparadas com o crescimento de ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja crua (SJCr), processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP).

Digestibilidade NPU Valor Biológico Dietas (%) (%) (%)

SJF 90,95 ± 0,95 a 44,35 ± 8,19ª 0,49 ± 0,15 a

SJCr 88,97 ± 5,73 a 39,63 ± 8,92ª 0,45 ± 0,13 a

Pm Cr 87,10 ± 3,30 a -20,86 ± 5,15 b -0,23 ± 0,07 b

Pm F 73,45 ± 4,71 b -29,22 ± 8,07 b -0,40 ± 0,12 b

Pm A 64,66 ± 5,83 c -28,20 ± 9,30 b -0,53 ± 0,16 b

Pm M 73,18 ± 6,30 b -40,88 ± 3,53 c -0,42 ± 0,15 b

Média ± desvio padrão. Letras iguais na vertical referem-se a resultados não diferentes estatisticamente ( p > 0,05), para o teste de Variância Simples (One- way ANOVA) seguida de Teste de Tukey.

127 A digestibilidade apresentada pela dieta Pm Cr (87,10 ± 3,3 %) foi estatisticamente semelhante à apresentada pela dieta SJCr (88,97 ± 5,73%) e superior àquela apresentada pelas dietas contendo P. moniliformis tratadas termicamente [ Pm F (73,45 ± 4,71 %), Pm A (73,18 ± 6,30) e Pm M (64,66 ± 5,83)], as quais não diferiram entre si. Esse dado prova que o tratamento térmico realizados com o intuito de aumentar a digestibilidade pelo aumento da disponibilidade de proteínas e por redução de ativação dos fatores antinutricionais termolábeis não atingiu seu objetivo. Percentuais de digestibilidade similares foram encontradas para três leguminosas indígenas chinesas, tratadas termicamente, Phaseolus angularis (75,2 ± 0,62 %), Phaseolus calcaratus (70,1 ± 2,48 %) e Dolichos lablab (75,8 ± 2,57 %) (WONG; CHEUNG, 1998). A digestibilidade das sementes da leguminosa Canavalia cathartica tanto assadas (53,48 ± 0,87 %) quanto cozidas sob pressão (56,01 ± 0,31%) foi inferior à do grupo padrão caseína (90,46 ± 1,25), bem como para as encontradas para as dietas testes (Pm Cr, Pm F, Pm A e Pm M). A baixa digestibilidade de Canavalia cathartica foi atribuída, pelo menos em parte, à presença de lectinas (SEENA; SRIDHAR; JUNG, 2005). A utilização líquida de proteína (NPU) que significa o percentual de nitrogênio ingerido que ficou retido no organismo, foi superior para a dieta padrão, com 44,35 ± 8,19 %, não diferindo significativamente da dieta SJCr com 39,63 ± 8,92 %. Os grupos das dietas teste contendo P. moniliformis crua e tratada termicamente ( Pm F, Pm A e Pm M) não apresentaram valores de NPU significativamente diferentes entre si, mas os valores calculados para esse parâmetro foram negativos, o que significa que o nitrogênio ingerido não foi utilizado para promover o crescimento e desenvolvimento dos animas, apresentando desempenho inferior ou semelhante ao do grupo que consumiu dieta isenta de proteína (AP), conforme já verificado através da curva de crescimento na FIGURA 2 e pela perda de peso apresentada pelos animais do grupo teste na TABELA 8. Baixo percentual de NPU (20,9 ± 6.7 %) foi verificado para um grupo de animais que apresentou perda de peso (- 10,0 ± 4,2 g) ao consumirem uma dieta contendo proteínas da farinha de Enterolobium cyclocarpium (leguminosa não convencional) tratadas termicamente (PROLL et al ., 1998). Embora o balanço nitrogenado tenha sido positivo, baixos percentuais de NPU foram encontrados por Seena, Sridhar e Jung (2005) para a leguminosa ( Canavalia cathartica ) assada

128 (24,97 ± 1,61 %) e cozida sob pressão (27,06 ± 0,94 %), quando comparados ao da dieta padrão caseína (79,57 ± 1,61). Portanto, parece comum a baixa retenção de nitrogênio para testes iniciais com leguminosas selvagens. No entanto, se for levado em consideração o fato de que a soja consumida mundialmente já vem sendo melhorada geneticamente, estudada e analisada há muito tempo, e, quando consumida crua também não proporciona bom desempenho nos animais experimentais, pode-se dizer que as leguminosas selvagens, incluindo a P. moniliformis aqui estudada, são importantes futuras fontes de proteínas para a utilização humana, bastando, para isso, mais estudos na tentativa de melhorar o aproveitamento desse potencial. O valor biológico associa a digestibilidade com o NPU, assim reflete o percentual de proteínas digeridas e absorvidas que ficaram retidas no organismo. O resultado do valor biológico foi semelhante ao do NPU, onde através do cálculo deste último, não foi verificada a retenção de nitrogênio nos ratos alimentados com as dietas testes contendo P. moniliformis cruas ou tratadas termicamente. Desse modo, os percentuais de valores biológicos também foram negativos, mostrando que embora as proteínas possam ter sido digeridas elas não foram absorvidas e nem retidas nos animais, tendo sido excretadas nas fezes, conforme demonstrado pela elevada quantidade de nitrogênio fecal, em comparação com a dieta SJF. O valor biológico da dieta à base de soja crua (0,45 ± 0,13 %) não diferiu daquele calculado para a dieta à base de soja fervida (0,46 ± 0,15 %). Dietas à base de sementes de Canavalia cathartica assadas e cozidas sob vapor apresentaram valor biológico relativamente baixo 46,68 ± 2,43% e 48,31 ± 1,58 %, respectivamente (SEENA; SRIDHAR; JUNG, 2005), o que foi atribuído à presença de lectinas remanescentes que não foram inativadas com os tratamentos térmicos. Sabe-se que a qualidade das proteínas em uma dieta é afetada por compostos antinutricionais que se ligam a elas, que interagem com o trato intestinal ou atuam sobre enzimas digestivas impedindo seu aproveitamento, podendo levar a um aumento de perdas proteicas, aumentando o conteúdo de nitrogênio fecal (VADIJVEL; JANARDHANAN, 2005). Além disso, a ação destes sobre o consumo da dieta e a eficiência alimentar também deve ser considerada (PROLL et al ., 1998). Tendo sido atribuído aos compostos antinutricionais (alcaloides, taninos, inibidores de tripsina e lectinas), em muitos trabalhos, o desempenho não satisfatório dos animais alimentados com leguminosas selvagens (CARNOVALE; LUGARO; MARCONI, 1991; PROLL

129 et al., 1998; CHANG; BAILEY; COLLINS., 1994; WONG; CHEUNG, 1998; SEENA; SRIDHAR; JUNG, 2005). Entre os compostos proteicos antinutricionais e/ou tóxicos analisados na farinha de sementes de P. moniliformis (TABELA 5), só foram encontrados inibidor de tripsina (8,9 ± 0,5 µgTI/mgF) e de urease (1.899 ± 228 U/KgF). Ainda assim, a quantidade desses fatores antinutricionais é bem inferior ao encontrado para vários cultivares de soja (VASCONCELOS et al ., 2001; 2006). No trabalho citado, os animais alimentados com dieta à base de soja fervida (SJF) não tiveram excreção de nitrogênio fecal aumentada, em comparação com outros trabalhos, justamente por que estes compostos interferentes serem termolábeis e consideravelmente reduzidos, conforme demonstrado nos trabalhos de Seena, Sridhar e Jung (2005) e de Vadivel e Pugalenthi (2008) ou completamente desaparecidos com tratamentos térmicos segundo Habiba (2002) e de acordo com o encontrado para os inibidores de tripsina do feijão comum, soja, fava, ervilha, entre outros (TRUGO et al ., 2000; EL-HADY; HABIBA, 2003). Outros compostos antinutricionais proteicos que não foram analisados neste trabalho são os inibidores de quimiotripsina e de α-amilase, contudo também são termolábeis e reduzidos com o aquecimento. O desempenho dos animais alimentados com as dietas contendo P. moniliformis crua não diferiu estatisticamente (P < 0,05) daqueles que consumiram as dietas contendo P. moniliformis tratadas termicamente, nem mesmo através de autoclavagem, o que leva à conclusão de que os fatores antinutricionais de natureza termolábil não foram os principais componentes prejudiciais dessa dieta. Outros compostos antinutricionais de natureza não proteica, ou seja, oriundos do metabolismo secundário, dependendo do tipo e da quantidade consumida por animais, causam perda de peso e redução de digestibilidade (CHEEKE; PALO 1995; DEARING; FOLEY; MCLEAN, 2005; SORENSEN; MCLISTER; DEARING , 2005; FROBERG; IBRAHIM; FURBEE, 2007). Os metabólitos secundários de P. moniliformis foram analisados qualitativamente, tais como alcaloides, taninos, compostos fenólicos, saponinas e triterpenoides, entre os quais foi determinada, apenas, a presença de compostos fenólicos como fenóis, flavonas, flavonóis e xantonas (dados não mostrados nesse capítulo). Os compostos fenólicos são responsáveis por reduzir a digestão e absorção de proteínas e minerais, levando a uma redução no aproveitamento desses nutrientes (GILANI; COCKELL; SEPEHR, 2005). Todavia, são parcialmente reduzidos com o tratamento térmico, como fervura, de acordo com o verificado para

130 feijão de corda (OLOGHOBO; FETUGA, 1984), para soja (KAKADE et al., 1972; GIAMI, 2002), bem como para novas linhagens de feijão de corda (GIAMI, 2005) e para ervilhas, grãos de bico e lentilhas (XU; CHANG, 2008). Os remanescentes desses compostos na farinha de P. moniliformis , após o aquecimento, poderiam estar contribuindo pra o aumento da excreção fecal de nitrogênio, mas não é o fator limitante, posto que nenhum tratamento térmico foi capaz de melhorar nenhum parâmetro nutricional, nem mesmo a autoclavagem pôde proporcionar leve melhora no desempenho dos animais. A presença de grandes quantidades de proteínas do tipo globulinas em leguminosas diminui a digestibilidade das dietas devido à alta estabilidade de sua conformação nativa dificultar a ação das enzimas digestivas. No entanto, o tratamento térmico é capaz de desnaturá- las, abrindo sua estrutura, tornando-as menos resistentes a proteases, facilitando seu aproveitamento (WALKER; KOCHHAR, 1982). Além dos tratamentos térmicos não terem melhorado a digestibilidade das proteínas em relação à dieta à base de P. moniliformis crua, a pesquisa de COSTA (2009) mostrou que a fração globulínica representa apenas 6 % do extrato bruto de P. moniliformis , o que descarta completamente a possibilidade dessas proteínas serem as principais responsáveis por estarem prejudicando a qualidade das proteínas. Os ratos reduzem ou rejeitam o consumo dietético quando a qualidade da proteína não é boa, ou seja, quando é pobre em aminoácidos essenciais (DE ANGELIS, 1986; KOEHNLE; RUSSEL; GIETZEN, 2003). A farinha de P. moniliformis possui um bom perfil contendo todos os aminoácidos essenciais (TABELA 4), possuindo inclusive metionina (em quantidade cerca de três vezes mais que o recomendado para crianças de 2 a 5 anos (FAO/WHO/UNU, 1985), não atendendo à essa recomendação apenas em cisteína, triptofano, que juntamente com a metionina são conhecidamente deficientes em leguminosas (GRUSAK, 2002; SHIM; JUN; KANG, 2003), além da tirosina. A baixa ou mesmo a elevada quantidade de alguns aminoácidos essenciais podem ter contribuído para o consumo mais baixo das dietas experimentais em relação à dieta padrão, acarretando menor ingestão de nitrogênio, mas não justifica o não aproveitamento do nitrogênio ingerido, pelo menos para a manutenção do peso corpóreo. A explicação mais plausível para a não melhora dos tratamentos térmicos em relação à farinha de P. moniliformis crua, pode estar no fato de a elevada temperatura ou prolongado período de cozimento poder reduzir a quantidade de alguns aminoácidos essenciais, como já

131 verificado por alguns autores (MAIA, 1996; FARIAS, 2009) ou devido à reação de aminoácidos com açúcares (reação de Maillard), juntamente com a formação de complexos com os compostos fenólicos, tornando as proteínas indisponíveis (UZOGARA; OFUYA, 1992). É sugerido que a não retenção de nitrogênio em experimentos de alimentação com ratos pode ser atribuída, mais provavelmente, ao teor de carboidratos não digeríveis elevados (EZEAGU et al ., 1996). As substâncias indigeríveis, além das fibras incluem os oligossacarídeos não digeríveis ou α-galactosídios, que são responsáveis por limitar o consumo de leguminosas como feijão de corda e tremoço ( Lupinus albus ) por muitas pessoas em todo o mundo (ONYENEKWE; NJOKU AMEH, 2000; PRICE et al . apud MARTÍNEZ-VILLALUENGA; FRÍAS; VIDAL-VALVERDE, 2006) Os α-galactosídios são substâncias causadoras de flatos que não são digeridas em seres humanos devido à ausência de α-galactosidase, por isso são fermentadas por micro-organismos no intestino, produzindo dióxido de carbono, hidrogênio e metano (WANG et al ., 2003). Segundo Shim, Jun e Kang (2003) a presença desses α-galactosídios é uma das principais razões pelas quais as leguminosas não desempenham papel principal na alimentação animal e humana, uma vez que causam desconforto e diarreia em animais, dificultando sua aceitação como alimento (SRIDHAR; SEENA, 2006). Os α-galactosídios que fazem parte da família rafinose são: rafinose, estaquiose, verbascose e ajugose (GRIESHOP; REESE; FAHEY JR., 2001) Os grãos de leguminosas possuem elevada quantidade de carboidratos solúveis, especialmente aqueles pertencentes à família dos oligossacarídeos rafinose. O processamento dos grãos é uma forma padrão de manipulação para a utilização das leguminosas contendo α- galactosídios. Devido à sua relativa estabilidade ao aquecimento, esse tratamento não é capaz de eliminar seus efeitos indesejáveis (CERNING-BEROARD, 1976; ONIGBINDE; AKINYELE, 1983). O cozimento por 40 minutos do feijão de corda reduz em até 40% o nível de oligossacarídeos (rafinose e estaquiose) (ONYENEKWE, et al ., 2000). Outros tratamentos têm sido empregados com a mesma finalidade e incluem hidratação, retirada das cascas (SOMIARI; BALOGH, 1993), tratamento enzimático (THANANUNKUl et al ., 1976), fermentação (REDDY; SALUNKHE, 1980), germinação (TRUGO et al ., 1990), extrusão de alta temperatura (BOREJSZO; KHAN , 1992) e ultrafiltração (OMOSAIYE; CHERYAN; MATHEWS, 1978). Entretanto, nenhum desses métodos, com exceção da germinação, é suficiente para uma redução significativa dos agentes causadores de flatos (ONYENEKWE, et al ., 2000; ARANDA et al .,

132 2001). Contudo, Gulewicz e colaboradores (2000), desenvolveram um procedimento simples de extração de α- galactosídios em lentilhas e ervilhas que foi utilizada com sucesso para a redução desses agentes causadores de flatos em tremoço ( Lupinus albus var. multolupa ), com elevada redução, permanecendo apenas de 0,5 a 1% dos agentes causadores de flatos. A extração desses compostos não ocasionou grandes variações no teor de macro- e micronutrientes presentes em tremoço e aumentou a importância nutricional dessa leguminosa (MARTÍNEZ- VILLALUENGA; FRÍAS; VIDAL-VALVERDE, 2006). Diante do exposto e baseado na observação da presença de gases no intestino dos ratos, além do forte odor, característico de farinha de P. moniliformis (conforme já mencionado) ter sido verificado durante o sacrifício dos animais para a retirada de seus órgãos, após o final do experimento nutricional, os α-galactosídios apresentaram fortes indícios de serem os responsáveis pelo consumo moderado das dietas testes (à base de farinha de P. moniliformis ), bem como pelo aumento de excreção fecal, tendo prejudicado o desempenho dos animais, devendo ser mais bem analisados. No intuito de verificar o estado nutricional e indícios de toxicidade das dietas experimentais, o sangue dos animais foi coletado e os parâmetros séricos avaliados. Posteriormente, os ratos foram dissecados e seus órgãos internos avaliados.

5.6.4 Avaliação de Órgãos Internos dos Ratos

A análise do peso seco relativo dos órgãos (peso dos órgãos/peso da carcaça) foi realizada para observar possíveis alterações decorrentes do consumo das dietas experimentais, cujo resultado pode ser observado na TABELA 11. Foi observada uma atrofia do timo dos grupos que consumiram as dietas experimentais (Pm Cr, Pm F, Pm A e Pm M) em relação ao grupo que recebeu a dieta padrão SJF e a dieta SJCr, tendo sido mais proeminente para o grupo da dieta Pm Cr.

133 TABELA 11 – Peso seco relativo (g/100 g de peso corpóreo) de órgãos internos de ratos (n = 6) submetidos a dietas contendo farinha de Piptadenia moniliformis crua ( Pm Cr) e processadas termicamente por fervura ( Pm F), cozimento em micro- ondas ( Pm M) e autoclavagem (Pm A), (comparado com ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja crua (SJCr), processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP).

Dietas ÓRGÃOS SJF SJCr Pm Cr Pm F Pm A Pm M AP (g/100g)

Timo 0,23 ± 0,04ª 0,23 ± 0,03ª 0,12 ± 0,03 b 0,16 ± 0,02 bc 0,17 ± 0,02 c 0,14 ± 0,02 bc 0,16 ± 0,02 bc

a Coração 0,30 ± 0,02 0,31 ± 0,03 ac 0,38 ± 0,03 ab 0,37 ± 0,04 ab 0,42 ± 0,10 b 0,35 ± 0,04 ab 0,39 ± 0,04 bc

Pulmões 0,42 ± 0,05 a 0,55 ± 0,02 b 0,63 ± 0,04 bc 0,60 ± 0,06 bc 0,65 ± 0,05 c 0,61 ± 0,05 bc 0,69 ± 0,06 c

Baço 0,18 ± 0,01ª 0,20 ± 0,02 a 0,23 ± 0,03ª 0,21 ± 0,02 a 0,22 ± 0,03 a 0,22 ± 0,04ª 0,20 ± 0,02ª

Estômago 0,53 ± 0,04 a 0,61 ± 0,06 ab 0,79 ± 0,08 c 0,74 ± 0,07 bc 0,76 ± 0,10 bc 0,70 ± 0,06 bc 0,78 ± 0,13 c

Duodeno 0,80 ± 0,14 a 0,92 ± 0,16ª 1,05 ± 0,15ª 0,94 ± 0,10 a 0,96 ± 0,20ª 0,95 ± 0,22ª 0,93 ± 0,19ª

a Jejuno 0,79 ± 0,16 0,87 ± 0,25ª 0,95 ± 0,13ª 0,87 ± 0,12 a 0,82 ± 0,21ª 0,91 ± 0,05ª 0,89 ± 0,14ª

Íleo 0,58 ± 0,09ª 0,73 ± 0,17ª b 0,81 ± 0,14 b 0,82 ± 0,21 ª b 0,69 ± 0,18ª b 0,71 ± 0,13ª b 0,67 ± 0,08ª b

Intestino Grosso 0,72 ± 0,08 ad 0,96 ± 0,08 bd 1,04 ± 0,10 bcd 1,21 ± 0,09 c 1,21 ± 0,18 c 1,16 ± 0,13 bc 0,87 ± 0,11 d

Continua

134 TABELA 11 – Peso seco relativo (g/100 g de peso corpóreo) de órgãos internos de ratos (n = 6) submetidos a dietas contendo farinha de Piptadenia moniliformis crua ( Pm Cr) e processadas termicamente por fervura ( Pm F), cozimento em micro- ondas ( Pm M) e autoclavagem (Pm A), (comparado com ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja crua (SJCr), processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP). Continuação

Órgãos Dietas

(g/100g) SJF SJCr Pm Cr Pm F Pm A Pm M AP

Pâncreas 0,31 ± 0,07ª 0,44 ± 0,06 ab 0,39 ± 0,14ª 0,36 ± 0,05 a 0,33 ± 0,07ª 0,33 ± 0,03 a 0,60 ± 0,20 b

Fígado 4,28 ± 0,40ª 4,33 ± 0,33ª 5,27 ± 0,29 b 4,40 ± 0,30ª 4,85 ± 0,88 ab 4,78 ± 0,34 ab 4,48 ± 0,31 ab

Rins 0,79 ± 0,07 a 0,98 ± 0,08 b 1,29 ± 0,06 c 1,21 ± 0,10 c 1,29 ± 0,17 c 1,18 ± 0,16 cd 1,03 ± 0,07 bd

Média ± desvio padrão. Letras iguais na horizontal referem-se a resultados não diferentes estatisticamente ( p > 0,05), para o teste de Variância Simples (One-way ANOVA) seguida de Teste de Tukey.

135 Atrofia de timo também foi verificada para ratos alimentados com dietas contendo globulinas de feijão de corda como fontes de proteínas, a qual não foi capaz de proporcionar crescimento e desenvolvimento adequado dos animais (FERNANDES, 2005b). Resultado semelhante de atrofia de timo também havia sido relatado por Rubio et al . (1999) para ratos alimentados com proteínas de grão de bico. Houve um aumento em órgãos como os pulmões, estômago e íleo dos grupos das dietas experimentais ( Pm Cr, Pm F, Pm A e Pm M), comparável ao ocorrido para o grupo da dieta aproteica, embora não tenha sido significativamente diferente (p > 0,05) do grupo que consumiu a dieta à base de soja crua, exceto pelo estômago do grupo da dieta Pm Cr. Tamanho aumentado dos rins, fígado e do intestino grosso também foi verificado para os grupos das dietas experimentais em relação ao grupo da dieta SJF. Aumento do fígado foi constatado apenas pelo grupo da dieta Pm Cr. O aumento relativo no tamanho de estômago, rins e fígado também foram verificados para ratos alimentados com dieta à base de Amburna cearensis (leguminosa selvagem), a qual proporcionou drástica perda de peso nos animais durante o período experimental (FARIAS, 2009). Dieta à base de soja crua também proporcionou aumento no estômago, fígado, intestino grosso, intestino delgado e nos pulmões de ratos (VASCONCELOS et al ., 2001). Aumento de órgãos vitais parece ser uma tentativa do organismo para se manter vivo em caso de perda de reservas de energia. Os outros órgãos internos avaliados não apresentaram diferenças significativas ( p > 0,05), quando comparados ratos mantidos nas quatro dietas experimentais com a dieta padrão SJF, com exceção do coração do grupo da dieta Pm A e do fígado do grupo da dieta Pm Cr. As alterações ocorridas no tamanho dos órgãos parecem estar mais associadas à desnutrição sofrida por parte dos animais do que propriamente à toxicidade de compostos que poderiam estar presentes na dieta. Os tratamentos térmicos realizados nas sementes de P. moniliformis não interferiram no tamanho dos órgãos avaliados em relação às sementes dessa leguminosa crua, não sendo, portanto, capazes de evitar aumentos ou diminuições nos órgãos.

136 5.6.5 Análise dos parâmetros séricos

Os parâmetros séricos analisados foram: as proteínas totais, albumina, ureia, fosfatase alcalina, aspartato-aminotransferase (AST), alanina-aminotransferase (ALT) e creatinina, estando descritos na TABELA 12. O maior nível de proteínas totais foi verificado no grupo da dieta padrão SJF (4,40 ± 0,25 g/dL), o qual foi estatisticamente igual (p > 0,05) ao verificado para o grupo da dieta Pm Cr (4,34 ± 0,18 g/dL). Esse mesmo teor de proteínas totais foi apresentado para o grupo de animais que consumiram dieta à base de proteína animal, a proteína da clara do ovo (4,40 ± 0,09 g/dL) (CAMPELLO et al ., 2009), embora os valores de referência para proteínas totais seja de 6 a 8,5 mg/dL. Resultado semelhante foi encontrado por Farias (2009) para ratos alimentados com dieta à base de Amburana cearensis tratada termicamente, os quais apresentaram níveis de proteínas totais (5,24 ± 0,11 g/dL) semelhantes ao da dieta do grupo controle à base de proteínas da clara do ovo (5,04 ± 0,37 g/dL). O grupo que utilizou a dieta SJCr apresentou nível de proteínas totais semelhante ao dos grupos experimentais que consumiram as dietas à base de P. moniliformis processadas termicamente ( Pm F, Pm M e Pm A), cuja variação foi de 3,70 ± 0,27 a 3,87 ± 0,30 g/dL, estes sendo inferiores aos valores encontrados para o grupo da dieta padrão SJF (5,04 ± 0,37 g/dL). Esse parâmetro sérico avalia o metabolismo proteico, onde a síntese das principais proteínas totais (albumina, globulina e fibrinogênio) está diretamente relacionada com o estado nutricional do animal (GONZÁLEZ; SILVA, 2006). A redução dessas proteínas no plasma está ligada a falhas hepáticas, transtornos renais e intestinais, hemorragias, deficiência na nutrição, entre outras, sendo esta última a causa da depleção de proteínas plasmáticas, neste trabalho, dada a elevada perda de peso apresentada pelos animais que consumiram as dietas experimentais, refletindo na baixa disponibilidade de aminoácidos para a síntese proteica.

137 TABELA 12 – Parâmetros séricos dos ratos (n=6) alimentados com dietas contendo farinhas de Piptadenia moniliformis crua ( Pm Cr) e processadas termicamente por fervura ( Pm F), cozimento em micro-onas ( Pm M) e autoclavagem ( Pm A), comparadas com o crescimento de ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja crua (SJCr), processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP).

PARÂMETROS ANALISADOS DIETAS Proteínas Fosfatase * ** Albumina Ure ia AST ALT Creatinina totais Alcalina (g/dL) (mg/dL) (U/mL) (U/mL) (mg/dL) (g/dL) (U/L)

4,40 ± 0,25ª 3,02 ± 0,16ª c 30,33 ± 6,22 ab 181,97 ± 39,54 a 13,73 ± 0,88 a 14,99 ± 0,58 a 0,63 ± 0,08 a SJF

3,78 ± 0,19 b 3,09 ± 0,15 ac 41,92 ± 5,72 a 171,37 ± 14,69 a 9,25 ± 0,80 b 10,69 ± 1,98 ab 0,52 ± 0,05 a SJCr

Pm Cr 4,34 ± 0,18 ac 3,65 ± 0,52 b 37,93 ± 6,53 ab 136,00 ± 42,63 ac 13,83 ± 1,10 a 14,92 ± 5,25 ab 3,23 ± 0,68 b

Pm F 3,70 ± 0,27 b 2,92 ± 0,12 ac 35,10 ± 8,25 ab 80,78 ± 9,83 b 12,39 ± 2,32 ab 10,42 ± 0,66 b 0,53 ± 0,05 a

Continua

138 TABELA 12 – Parâmetros séricos dos ratos (n=6) alimentados com dietas contendo farinhas de Piptadenia moniliformis crua ( Pm Cr) e processadas termicamente por fervura ( Pm F), cozimento em micro-onas ( Pm M) e autoclavagem ( Pm A), comparadas com o crescimento de ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja crua (SJCr), processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP).

Continuação

PARÂMETROS ANALISADOS DIETAS Proteínas Fosfatase Albumina Ure ia AST * ALT ** Creatinina totais Alcalina (g. dL -1) (mg. dL -1) (U. mL -1) (U. mL -1) (mg/dL) (g. dL -1) (U. L -1)

Pm A 3,87 ± 0,30 bc 2,77 ± 0,21 c 37,84 ± 6,03 ab 111,76 ± 14,94 bc 11,96 ± 2,38 ab 11,14 ± 1,0 ab 0,55 ± 0,12 a

Pm M 3,73 ± 0,27 b 2,93 ± 0,15 ac 31,30 ± 8,08 ab 94,90 ± 19,27 bc 11,37 ± 1,18 ab 12,00 ± 0,85 ab 0,51 ± 0,08 a

4,37 ± 0,43 ac 3,26 ± 0,22 ab 27,39 ± 6,16 b 144,00 ± 42,31 ac 13,83 ± 1,10 a 13,48 ± 3,18 ab 3,27 ± 1,52 b AP

Média ± desvio padrão. Letras iguais na horizontal referem-se a resultados não diferentes estatisticamente ( p > 0,05), para o teste de Variância Simples (One-way ANOVA) seguida de Teste de Tukey. * AST: Aspartato aminotransferase. ** ALT: Alanina aminotransferase 139 Assim, os tratamentos térmicos realizados nas sementes de P. moniliformis parecem ter promovido maior catabolismo proteico que o encontrado para o grupo da dieta Pm Cr, talvez por não terem sido capazes de remover por completo os fatores antinutricionais presentes, associados a uma redução de alguns aminoácidos essenciais, conhecidamente, provocada pelo aquecimento de longa duração ou alta temperatura, sendo, este último fator não ocorrido para a dieta a base de P. moniliformis crua. Os níveis de albuminas séricas para os tratamentos avaliados foram bem próximos entre si, variando de 2,77 ± 0,21 g/dL ( Pm A) a 3,65 ± 0,52 ( Pm Cr) g/dL com pouca diferença estatísitica, sendo o grupo Pm Cr e Pm A os únicos a apresentarem diferença significante em relação ao grupo da dieta SJF. As albuminas são muito abundantes no plasma, podendo representar uma importante reserva de proteína. Sua concentração pode ser afetada pelo estado nutricional, catabolismo, entre outros fatores (GONZÁLEZ, 2000). A restrição proteica reduz a síntese de albumina, devido à baixa e desequilibrada disponibilidade de aminoácidos, levando a uma diminuição de seus níveis plasmáticos (COWARD et al. , 1977; SMITH; LUNN, 1984). A mesma diminuição dos níveis de proteínas totais dos grupos das dietas experimentais à base de P. moniliformis tratadas termicamente foi observado para albuminas em relação a Pm Cr. Os níveis de ureia plasmática dos animais que utilizaram as dietas experimentais ( Pm Cr, Pm F, Pm A e Pm M) foram estatisticamente semelhantes (p > 0,05) aos de grupo padrão positivo (SJF) e aos do grupo da SJCr, estando dentro dos níveis normais. A ureia é o produto final do metabolismo de proteínas, assim há correlação com o metabolismo orgânico e reflete a função renal (KHON; DINEEN; RUSSEK-COHEN, 2005). Seus níveis encontram-se normais (10 a 40 mg/dL) quando existe equilíbrio entre perfusão e função renal, conteúdo proteico da dieta e catabolismo proteico. Elevado catabolismo de proteínas eleva os níveis de ureia sanguínea, principalmente se estiver associado a falhas nas taxas de filtração dos rins, os quais não serão capazes de excretá-las corretamente (KHON; DINEEN; RUSSEK-COHEN, 2005). Talvez o tamanho aumentado dos rins, do grupo de animais que consumiram a dieta à base de P. moniliformis crua e tratadas termicamente, seja devido a um aumento de sua atividade na tentativa de excretar a ureia e manter seus níveis normais no sangue. Níveis de creatinina também avaliam a função renal e são mais precisos do que a ureia para a determinação de danos renais devido à sua independência de fatores como dieta, grau de

140 hidratação e catabolismo proteico, quando elevada. Em relação ao nível de creatinina os grupos de animais que consumiram as dietas teste tratadas termicamente ( Pm F, PmA e Pm M) não apresentaram diferença estatística (p > 0,05) em relação ao grupo da dieta padrão SJF. O grupo da dieta Pm Cr apresentou-se com níveis bem mais elevados (3,23 ± 0,68 mg/dL), comparáveis aos do grupo da dieta AP (3,27 ± 1,52 mgdL), valores esses, superiores ao valor de referência que é de 0,60 a 1,30 mg/dL. Esse resultado mostra que, provavelmente, a capacidade de filtração renal foi prejudicada com o consumo de dieta Pm Cr testada e que os tratamentos térmicos avaliados, apesar de não terem sido eficientes nutricionalmente, parecem não ter prejudicado a função renal. As enzimas fosfatase alcalina, AST e ALT avaliam a função hepática e níveis elevados estão associados a lesões no fígado. Os níveis de fosfatase alcalina apresentaram-se elevados, de uma forma geral, sem diferença significante entre os animais do grupo padrão SJF (181,97 ± 39,54 U/L) e dos grupos SJCr (171,37 ± 14,69 U/L) e Pm Cr (136,00 ± 42,63 U/L). Os grupos dos ratos que consumiram as dietas processadas termicamente não diferiram de forma significantemente entre si, nem em relação ao grupo da dieta aproteica (AP), nos níveis de fosfatase alcalina. A mesma elevação dos níveis dessa enzima como encontrados aqui, inclusive para o padrão positivo, já foi verificado no estudo de Couto et al. (2008), para ratos sadios alimentando- se de ração comercial (158 ± 19,42 U/L) e no estudo de Farias (2009), para ratos em dieta à base de clara do ovo (133,36 ± 13,03 U/L), sem explicações definidas. As outras enzimas indicadoras da função hepática, AST e ALT, não apresentaram alterações em seus níveis, estando todos os animais dos grupos experimentais ( Pm Cr, Pm F, PmA e Pm M) com teores semelhantes estatisticamentes (p > 0,05) aos do padrão SJF, com exceção dos níveis de ALT para Pm F que foram inferiores ao controle positivo. Os parâmetros séricos das dietas experimentais também não demonstraram danos hepáticos, apenas uma provável alteração na função renal com o uso da dieta Pm Cr por prte dos animais, além de confirmaram a presença de elevado catabolismo proteico e desnutrição dos animais. Na tentativa de descobrir o fator responsável pelo não aproveitamento das proteínas, bem como melhorar a qualidade nutricional das proteínas presentes em sementes de P.moniliformis , um novo experimento nutricional foi realizado.

141 5.7 Experimento Nutricional II

A suspeita de que os principais responsáveis pelo moderado consumo das dietas teste à base de P. moniliformis , bem com pelo não crescimento e desenvolvimento dos ratos tenham sido os α-galactosídios, levou à condução de um novo experimento nutricional utilizando dietas à base de farinha de P. moniliformis crua livre de α-galactosídios ( Pm LG), comparados com dietas à base de farinha de soja crua adicionada dos α-galactosídios (SJAG). Os α-galactosídios foram extraídos das sementes de P. moniliformis (conforme descrito no tópico 4.10.1.1) e adicionados à dieta contendo soja crua na mesma proporção em que eram encontrados na farinha de P. moniliformis crua (4,55 % da farinha). Os resultados referentes às dietas contendo farinha de soja cura (SJC), dieta contendo farinha de P. moniliformis crua ( Pm Cr), bem como as dietas padrões contendo farinha de soja tratada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteínas (AP), foram utilizados do experimento nutricional I para fins comparativos, tendo como padrões positivo (SJF) e negativo (AP). De forma semelhante ao experimento nutricional I, as dietas foram denominadas conforme especificadas nos parênteses e foram oferecidas para ratos em crescimento para a análise dos parâmetros nutricionais.

5.7.1 Crescimento dos animais

A curva de crescimento dos animais alimentados com as dietas teste contendo farinha de P. moniliformis crua livre de α-galactosídios ( Pm LG) e farinha de soja crua adicionada de α- galactosídios (SJAG) como fonte de proteínas está mostrado no gráfico da FIGURA 3.

142

120

110

100

90

80 Peso(g)

70

60

50

0 1 2 3 4 5 6 7 8 910

Dias

SJF SJCr SJAG PmCr PmLG AP

FIGURA 3 - Curva de crescimento dos ratos (n = 6) alimentados com dietas contendo farinhas de Piptadenia moniliformis crua ( Pm Cr), farinha de P. moniliformis crua livre de α-galactosídios (Pm LG), farinha de soja crua adicionada de α-galactosídios (SJAG), dieta com farinha de soja crua (SJCr), comparadas com o crescimento de ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP).

143 Os ratos alimentados com a dieta (SJAG) apresentaram um decréscimo na curva de crescimento levemente maior do que aquele obtido pela soja crua, embora não tenha sido significativo. Ao passo que os animais que consumiram a dieta Pm LG mostraram curva de crescimento tendendo a um menor decréscimo do que a encontrada para aqueles que consumiram a dieta ( Pm Cr), estando em um patamar um pouco superior à curva de crescimento dos ratos que fizeram uso da dieta aproteica, ou seja perderam menos peso do que o grupo da dieta AP. Portanto, o processo de extração de α-galactosídios parece ser mais eficiente do que os processamentos térmicos realizados nas sementes de P. moniliformis , posto que a curva de crescimento para os mesmos foi igual a do grupo aproteico. No entanto, o crescimento dos ratos só foi observado para aqueles que consumiram a dieta padrão (SJF), os quais apresentaram curva ascendente. A expectativa de uma grande melhora no crescimento dos animais com dietas elaboradas após a extração dos agentes causadores de flatos não foi alcançada, já que foi observada apenas uma pequena diferença para a curva decrescente de crescimento desses animais.

5.7.2 Variação de Peso, Dieta Ingerida e Eficiência Alimentar

A variação de peso, dieta ingerida e a eficiência alimentar das dietas controle (SJF, AP) e experimentais (SJCr, SJAG, Pm Cr e Pm LG), podem ser observados na TABELA 13. Os ratos alimentados com dieta à base de soja crua adicionada de α-galactosídios (SJAG) apresentaram perda de peso inferior (-6,74 ± 1,44 g), embora não estatisticamente diferente (p > 0,05), dos animais alimentados com dieta à base de soja crua (SJCr) (-9,46 ±1,33 g), mostrando que a adição desses compostos antinutricionais não foram capazes de aumentar a perda de peso dos animais. Resultado semelhante em relação a não alteração de peso, foi encontrado por Zdunczyk et al. (1998) em um estudo realizado em ratos alimentados com uma dieta contendo caseína como fonte de proteínas, adicionada de elevada quantidade de α-galactosídios, onde também não houve diferença estatística no ganho de peso dos animais comparadas com a mesma dieta isenta de α-galactosídios.

144 TABELA 13 – Variação de peso, dieta ingerida e eficiênica alimentar * de ratos (n = 6) submetidos a dietas contendo farinhas de Piptadenia moniliformis crua ( Pm Cr), farinha de P. moniliformis crua livre de α-galactosídios ( Pm LG), farinha de soja crua adicionada de α- galactosídios (SJAG), dieta com farinha de soja crua (SJCr), comparadas com o crescimento de ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP).

Dietas Variação de Peso (g) Dieta Ingerida (g) Eficiência Alimentar #

a a a SJF 13,82 ± 6,17 104,78 ± 15,77 0,11 ± 0,05

SJCr -9,46 ±1,33 b 78,80 ± 7,43 b -0,13 ± 0,02 bc

SJAG -6,74 ± 1,44 b 72,08 ± 4,98 bd -0,09 ± 0,02 c

cd c d Pm Cr -17,87 ± 4,28 51,05 ± 3,10 -0,35 ± 0,09

Pm LG -12,08 ± 2,90 bc 61,12 ± 5,46 cd -0,21 ± 0,06 b

AP -22,50 ± 1,81 d 68,30 ± 6,10 d -0,33 ± 0,02 d

Média ± desvio padrão. Letras iguais na vertical referem-se a resultados não diferentes estatisticamente ( p > 0,05), para o teste de Variância Simples (One-way ANOVA) seguida de Teste de Tukey. * Os valores estão expressos em g/rato. # Eficiência alimentar = Variação de peso (g)/dieta ingerida (g)

145 Por outro lado, foi observado um decréscimo, não estatisticamente diferente, na perda de peso dos ratos alimentados com dieta à base de farinha de P. moniliformis livre de α- galactosídios ( Pm LG), (-12,08 ± 2,90 g) comparados àqueles que consumiram a dieta contendo farinha de P. moniliformis íntegra ( Pm Cr) (-17,87 ± 4,28 g). A perda de peso dos ratos alimentados com as dietas teste não foi superior à apresentada pelo grupo que consumiu dieta aproteica (AP). Dietas à base de tremoço contendo alto teor de α-galactosídios comparada com a mesma dieta pobre em α-galactosídios não apresentaram diferença significante no ganho de peso. No entanto uma leve diminuição no ganho de peso foi verificado com a adição desses compostos (ZDUNCZYK et al. , 1998). Em relação à ingestão dietética, os ratos que se alimentaram da dieta SJAG (72,08 ± 4,98 g) não diferiram significativamente daqueles que consumiram SJCr (78,80 ± 7,43 g), apesar da quantidade ingerida de dieta SJAG ter sido um pouco menor em relação à outra dieta. A mesma tendência foi observada para as dietas Pm LG e Pm Cr, onde o consumo foi de 61,12 ± 5,46 g e de 51,05 ± 3,10 g, respectivamente, sendo estatisticamente iguais. A retirada de α-galactosídios da farinha de P. moniliformis teve uma leve tendência de melhora do consumo dessas dietas por parte dos ratos, mas não foi o fator mais limitante, tendo em vista que o aumento real de consumo não foi observado. A adição de α-galactosídios a dietas à base de tremoço também não foi capaz de interferir no consumo da dieta por parte dos animais, ao contrário, o consumo foi significativamente superior ao do grupo de animais que consumiram a mesma dieta com baixo teor de α-galactosídios (ZDUNCZYK et al. , 1998). Mesmo com o aumento de consumo dietético por parte dos animais alimentados com dieta Pm LG não ter ocorrido de forma significante e a perda de peso continuar evidente, foi constatada uma melhora no índice de eficiência alimentar (-0,21 ± 0,06) em relação àquele verificado para animais de ingeriram a dieta Pm Cr (-0,35 ± 0,09), posto que houve diferença significante. O que não significa que o aproveitamento da dieta ingerida aconteceu, já que os valores da eficiência alimentar continuaram negativos. Não houve diferença estatística para o índice de eficiência alimentar em relação aos animais que consumiram dietas SJCr (-0,13 ± 0,02) e SJAG (-0,09 ± 0,02), tendo sido sutilmente melhor para este último grupo.

146 5.7.3 Balanço Nitrogenado

A TABELA 14 apresenta os resultados referentes às quantidades de dieta ingerida, nitrogênio ingerido e nitrogênio fecal referentes aos últimos cinco dias de experimento. A maior ingestão dietética e, consequentemente, de nitrogênio ingerido foi apresentada pelos ratos que utilizaram a dieta padrão SJF (55,48 ± 8,59 g, 0,85 ± 0,16 g, respectivamente). Não houve diferença significante entre o consumo de dieta e de nitrogênio nos demais grupos, (SJCr vs. SJAG, nem Pm Cr vs. Pm LG). No entanto, a excreção de nitrogênio fecal foi significativamente maior para os animais que consumiram a dieta Pm LG (0,16 ± 0,0 3g) do que para aqueles que fizeram uso da Pm Cr (0,10 ± 0,02 g). A excreção de nitrogênio fecal dos ratos alimentados com Pm LG, bem como para todas as outras dietas, não diferiram estatisticamente (p < 0,05) daqueles alimentados com a dieta padrão SJF. O índice que relaciona a excreção de nitrogênio fecal com o nitrogênio ingerido, mostra que o grupo da dieta Pm Cr (23,85 ± 2,96) diferiu estatisticamente do grupo que fez uso da dieta Pm LG (30,76 ± 3,08), significando que, aparentemente, menos nitrogênio ficou retido neste último grupo, pois ambos os grupos ingeriram a mesma quantidade de nitrogênio, mas o grupo da dieta Pm LG excretou mais nitrogênio. O processo utilizado para a extração de α-galactosídios, parece não ter interferido no índice (FN/N x 100) em relação aos processamentos térmicos realizado nas sementes de P. moniliformis como fervura e (38,0 ± 5,61) cozimento em micro- ondas (38,31 ± 6,41), mostrados na TABELA 9. O grupo da dieta SJCr (21,33 ± 3,87) apresentou o índice que relaciona o nitrogênio excretado sobre nitrogênio ingerido melhor, parecendo reter mais nitrogênio, quando comparado ao grupo da dieta SJAG (26,39 ± 1,54). Dados mais conclusivos podem ser verificados com a análise dos parâmetros nutricionais, tais como digestibilidade, utilização líquida de proteína (NPU) e valor biológico (TABELA 15). Para todos os parâmetros avaliados, os animais que se alimentaram com dieta padrão SJF continuaram com melhor desempenho, apresentando maior percentual de digestibilidade (90,95 ± 0,95 %), de retenção (NPU de 44,35 ± 8,19 %) e aproveitamento das proteínas (VB de 0,49 ± 0,09).

147 TABELA 14 – Balanço de nitrogênio * dos ratos (n = 6) alimentados com dietas contendo farinhas de Piptadenia moniliformis crua ( Pm Cr), farinha de P. moniliformis crua livre de α- galactosídios ( Pm LG), farinha de soja crua adicionada de α-galactosídios (SJAG), dieta com farinha de soja crua (SJCr), comparadas com o crescimento de ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP).

Dieta Nitrogênio Nitrogênio FN/N Dietas Ingerida (D) Ingerido (N) Fecal (FN) x 100

SJF 55,48 ± 8,59ª 0,85 ± 0,16ª 0,12 ± 0,02 ab 14,69 ± 1,44ª

SJCr 34,35 ± 5,24 b 0,55 ± 0,08 b 0,11 ± 0,04 ac 21,33 ± 3,87 b

SJAG 34,87 ± 3,05 b 0,56 ± 0,05 b 0,15 ± 0,02 bc 26,39 ± 1,54 cd

Pm Cr 26,62 ± 1,22 b 0,43 ± 0,02 b 0,10 ± 0,02 a 23,85 ± 2,96 bd

Pm LG 31,73 ± 3,91 b 0,51 ± 0,06 b 0,16 ± 0,03 b 30,76 ± 3,08 c

Média ± desvio padrão. Letras iguais na vertical referem-se a resultados não diferentes estatisticamente ( p > 0,05), para o teste de Variância Simples (One-way ANOVA) seguida de Teste de Tukey. * Os valores estão expressos em g/rato e referem-se aos últimos cinco dias de experimento.

148 Isso, resultou em um aumento ponderal de 13,82 ± 6,17 g, comparável ao apresentado para o grupo de ratos alimentados com dietas a base do genótipo Bays de soja cozida (17,3 ± 1,5 g), na pesquisa de VASCONCELOS et al . (2001). A digestibilidade do grupo de animais que consumiram a dieta SJAG (82,00 ± 1,70 %) foi significativamente menor do que a apresentada pelo grupo de ratos das dietas SJCr (88,97 ± 5,73 %), A adição dos oligossacarídeos indigeríveis parece ter prejudicado a digestão das proteínas presentes na soja. Resultado semelhante foi observado no estudo de Brasil et al. (2010), onde a digestibilidade de soja delipidada e autoclavada livre de α-galactosídios (91,28 ± 2,07 %) foi estatisticamente maior do que aquela contendo os α-galactosídios (87,14 ± 2,98 %). Por outro lado, a digestibilidade apresentada pelo grupo de ratos que consumiram a dieta Pm LG (78,54 ± 3,60 %) foi reduzida em comparação com aquele que utilizaram a dieta Pm Cr (87,10 ± 3,30 %). A digestibilidade observada no grupo de animais que consumiram a dieta à base de caseína adicionada de α-galactosíeos (90,5%) não diferiu estatisticamente daqueles que usaram a mesma dieta com baixos teores de α-galactosíeos (94,4%) (ZDUNCZYK et al. , 1998), já o grupo de animais da dieta à base de tremoço com alto teor de α-galactosíeos (85,6 %) apresentou menor percentual de digestibilidade em comparação ao grupo da dieta contendo tremoço com baixo teor de α-galactosíeos (88,9 %) (ZDUNCZYK et al. , 1998). Apesar da digestibilidade do grupo de animais da dieta Pm LG ter sido reduzida o NPU, ou seja o percentual de retenção de nitrogênio no organismo foi consideravelmente aumentado (19,66 ± 5,99 %), em relação ao grupo da dieta Pm Cr (-20,86 ± 5,15 %), bem como o valor biológico foi significativamente melhorado, posto que passou de -0,23 ± 0,07 % ( Pm Cr) para 0,29 ± 0,09 % ( Pm LG), mostrando indícios de que o processo de extração dos α-galactosídios contribuiu para uma melhora, embora muito pequena, nos parâmetros nutricionais. A adição de α-galactosídios à dieta à base de soja crua resultou na significativa redução do percentual de retenção de nitrogênio (NPU) de 39,63 ± 8,92 % para 18,24 ± 6,83 % e do valor biológico de 0,45 ± 0,13 % para 0,22 ± 0,08 %.

149 TABELA 15 - Parâmetros nutricionais obtidos pela alimentação de ratos (n = 6) submetidos a dietas contendo farinhas de Piptadenia moniliformis crua ( Pm Cr), farinha de P. moniliformis crua livre de α-galactosídios ( Pm LG), farinha de soja crua adicionada de α-galactosídios (SJAG), dieta com farinha de soja crua (SJCr), comparadas com o crescimento de ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP).

Digestibilidade NPU Valor Biológico Dietas (%) (%) (%)

SJF 90,95 ± 0,95 a 44,35 ± 8,19ª 0,49 ± 0,09 a

SJCr 88,97 ± 5,73 a 39,63 ± 8,92ª 0,45 ± 0,13 a

SJAG 82,00 ± 1,70 bc 18,24 ± 6,83 b 0,22 ± 0,08 b

Pm Cr 87,10 ± 3,30 ab -20,86 ± 5,15 c -0,23 ± 0,07 c

Pm LG 78,54 ± 3,60 c 19,66 ± 5,99 b 0,29 ± 0,09 b

Média ± desvio padrão. Letras iguais na vertical referem-se a resultados não diferentes estatisticamente ( p > 0,05), para o teste de Variância Simples (One-way ANOVA) seguida de Teste de Tukey.

150 Muito embora a melhora ou a piora dos parâmetros nutricionais com a extração ou adição de α-galactosídios, respectivamente, às dietas não tenham sido refletida em alterações significativas nos pesos dos ratos entre os grupos alimentados por essas dietas ( Pm Cr vs. Pm LG e SJCr vs. SJCAG), esse resultado pode levar à suposição de que o processo utilizado para a extração dos α-galactosídios pode ter sido realizado com sucesso, causando uma redução no seu conteúdo. Outros parâmetros de avaliação da qualidade da proteína in vivo utilizado nos estudos de Zdunczyk et al. (1998) e de Brasil et al . (2010) para a avaliação da performance dos animais alimentados com dietas adicionadas de α-galactosídios foram o PER (razão de eficiência proteica) e o NPR (razão de eficiência líquida de proteína). Uma dieta à base de tremoço com teor de α-galactosídios reduzido, comparada a outra adicionada de elevado teor desses compostos, apresentou modificação significativa no percentual do PER que passou de 2,40 % para 2,15 %. Já a adição de α-galactosídios à dieta à base de caseína apresentou um decréscimo não significante de 2,59 % para 2,53 % no PER (ZDUNCZYK et al., 1998). O inverso foi observado no estudo de Brasil et al . (2010) com a adição desses oligossacarídeos à dieta à base de soja delipidada e autoclavada, no qual tanto o PER quanto o NPR passaram de 2,63 ± 0,14 % e 3,56 ± 0,16 na dieta livre de oligossacarídeo, para 2,71 ± 0,22 % e 3,53 ± 0,22 na dieta adicionada desses compostos, não havendo diferença estatística para ambos os parâmetros entre os dois grupos. Segundo Graham e colaboradores (2002), a redução na quantidade de oligossacarídeos indigeríveis diminui a viscosidade do alimento ingerido prolongando o período de tempo da dieta no intestino, permitindo melhor ação enzimática sobre o substrato e consequentemente aumento na absorção de nutrientes pela mucosa intestinal, por isso o percentual de digestibilidade aumenta em alguns experimentos. O aumento no percentual de digestibilidade com a remoção de α- galactosídios em P. moniliformis não ocorreu, contudo proporcionou melhora nos outros parâmetros nutricionais, estando de acordo com a pesquisa de Seve et al . (1989), na qual a retirada de α-galactosídios da farinha da soja trouxe benefícios, mas pequena influência na digestibilidade e utilização de nitrogênio na dieta de leitões. A extração dos α-galactosídios parece ter sido eficiente por ter sido capaz de causar uma pequena melhora no desempenho dos animais, conforme o ocorrido para as sementes de tremoço segundo o estudo de Martínez-Villaluenga, Frias e Vidal-Valverde, 2006. Além disso, este

151 processo pode ter retirado, ainda, outros compostos que também poderiam estar prejudicando o desempenho dos animais. No entanto, para uma análise mais conclusiva seria necessária a detecção e quantificação dos α-galactosídios antes e depois do processamento em sementes de farinha de P. Moniliformis , bem como a determinação de outros compostos antinutricionais. Os antinutrientes mostram não só a redução na utilização de nutrientes, mas também causam toxicidade se ingeridas em grandes quantidades (SHIM; JUN; KANG, 2003). A análise macroscópica de órgãos internos e de alguns parâmetros séricos foi realizada para verificar se as mudanças nos tamanhos dos órgãos eram evitadas com o novo processamento realizado nas sementes de farinha de P. Moniliformis .

5.7.4 Avaliação de Órgãos Internos dos Ratos

A TABELA 16 mostra o peso seco relativo dos órgãos tais como timo, coração, pulmões, baço, estômago, duodeno, jejuno, íleo, intestino grosso, intestino delgado, pâncreas, fígado e rins dos ratos avaliados após serem sacrificados ao final do décimo dia de experimento. O processo de extração dos α-galactosídios das sementes de P. Moniliformis e sua adição à dieta à base de farinha de soja crua, como fonte de proteínas, não ocasionou alteração em nenhum órgão interno analisado, quando comparado aos animais que se alimentaram com a mesma dieta na forma íntegra, ou seja, quando Pm LG e Pm Cr, e, SJAG e SJCr, foram comparadas entre si. O grupo dos animais que ingeriram dietas à base de soja íntegra ou adicionada de α- galactosídios teve órgãos internos estatisticamente iguais aos observados para o grupo da dieta padrão SJF, com exceção dos pulmões, do intestino grosso e dos rins que foram maiores. O aumento desses órgãos pode estar relacionado à desnutrição verificada para esses dois grupos experimentais conforme já verificado em outros estudos, onde o aumento dos mesmos também foi constatado em animais que também não apresentaram bom estado nutricional (VASCONCELOS et al ., 2001; FARIAS, 2009).

152 TABELA 16 – Peso seco relativo (g/100 g de peso corpóreo) de órgãos internos de ratos (n = 6) submetidos a dietas contendo farinhas de Piptadenia moniliformis crua ( Pm Cr) e processadas termicamente por fervura ( Pm F), cozimento em micro-ondas (Pm M) e autoclavagem ( Pm A), comparadas com o crescimento de ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja crua (SJCr), processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP)

Dietas

Órgãos SJF SJCr SJAG Pm Cr Pm LG AP

b Timo 0,23 ± 0,04ª 0,23 ± 0,03ª 0,22 ± 0,03 a 0,12 ± 0,03 0,12 ± 0,03 b 0,16 ± 0,02 b

a Coração 0,30 ± 0,02 0,31 ± 0,03ª 0,34 ± 0,03ª b 0,38 ± 0,03 b 0,37 ± 0,02 b 0,39 ± 0,04 b

Pulmões 0,42 ± 0,05 a 0,55 ± 0,02 b 0,60 ± 0,06 bc 0,63 ± 0,04 bc 0,64 ± 0,08 bc 0,69 ± 0,06 c

Baço 0,18 ± 0,01ª 0,20 ± 0,02ª b 0,19 ± 0,02ª b 0,22 ± 0,03 b 0,22 ± 0,02 b 0,20 ± 0,02ª b

a Estômago 0,53 ± 0,04 0,61 ± 0,16 a 0,64 ± 0,03 a 0,79 ± 0,08 b 0,81 ± 0,05 b 0,78 ± 0,13 b

Duodeno 0,80 ± 0,14 a 0,92 ± 0,16ª 0,85 ± 0,21ª 1,05 ± 0,15ª 0,94 ± 0,15ª 0,93 ± 0,19ª

a Jejuno 0,79 ± 0,16 0,87 ± 0,25ª 0,90 ± 0,13ª 0,95 ± 0,13ª 0,89 ± 0,13ª 0,89 ± 0,14ª

Íleo 0,58 ± 0,09ª 0,73 ± 0,17ª b 0,70 ± 0,13ª b 0,81 ± 0,14ª b 0,74 ± 0,12ª b 0,67 ± 0,08ª b

Continua

153 TABELA 16 – Peso seco relativo (g/100 g de peso corpóreo) de órgãos internos de ratos (n = 6) submetidos a dietas contendo farinhas de Piptadenia moniliformis crua ( Pm Cr) e processadas termicamente por fervura ( Pm F), cozimento em micro-ondas ( Pm M) e autoclavagem ( Pm A), comparadas com o crescimento de ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja crua (SJCr), processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP).

Continuação

Dietas

Órgãos SJF SJCr SJAG Pm Cr Pm LG AP

Intestino Grosso 0,72 ± 0,08 a 0,96 ± 0,08 bc 0,99 ± 0,12 bc 1,04 ± 0,10 bc 1,07 ± 0,11 b 0,87 ± 0,11 ac

Pâncreas 0,31 ± 0,07 a 0,44 ± 0,06 ab 0,56 ± 0,23 ab 0,39 ± 0,14ª b 0,33 ± 0,03 a 0,60 ± 0,20 b

Fígado 4,28 ± 0,40 a 4,33 ± 0,33ª 4,50 ± 0,40ª 5,27 ± 0,29 b 5,35 ± 0,34 b 4,48 ± 0,31 a

Rins 0,79 ± 0,07 a 0,98 ± 0,08 b 1,01 ± 0,03 b 1,29 ± 0,06 c 1,30 ± 0,11 c 1,03 ± 0,07 b

Média ± desvio padrão. Letras iguais na horizontal referem-se a resultados não diferentes estatisticamente ( p > 0,05), para o teste de Variância Simples (One-way ANOVA) seguida de Teste de Tukey.

154 Para o grupo dos ratos que se alimentaram das dietas à base de P. Moniliformis íntegra e livre de α-galactosídios, foi verificado atrofia no timo em relação aos três grupos das dietas base de soja. Além disso, o aumento nos órgãos como coração, pulmões, baço e estômago, intestino grosso, fígado e rins em relação ao grupo do controle positivo, sendo esses três últimos com tamanho maior até do que o grupo que recebeu a dieta isenta de proteína. O processo de extração dos α-galactosídios, assim como os tratamentos térmicos realizados em sementes de P. Moniliformis também não impediu a diminuição do tamanho de timo ou o aumento de determinados órgãos. Esse resultado pode estar associado ao fato de esse processamento não ter ocasionado melhora significativa no estado nutricional dos ratos que fizeram uso dessa dieta, posto que a perda de peso não foi impedida.

5.7.5 Análise dos parâmetros séricos dos ratos

A TABELA 17 apresenta o resultado dos parâmetros séricos analisados [Proteínas totais, albuminas, Uréia, fosfatase alcalina, aspartato-aminotransferase (AST), alanina-aminotransferase (ALT) e creatinina]. Não foi observada diferença estatística no teor de proteínas totais entre o grupo da dieta padrão positiva (SJF) e o da dieta dos grupos testados (SJAG, Pm LG). Teores significativamente maiores de proteínas totais e de albuminas foram encontrados para o grupo da dieta SJAG com 5,07 ± 1,35 g/dL e 3,67 ± 0,44 g/dL em relação a SJCr com 3,78 ± 0,19 g/dL e 3,09 ± 0,15 g/dL, respectivamente. Indicando que a adição de α-galactosídios não foi capaz de causar alterações nos níveis séricos de proteínas relacionadas ao metabolismo. Níveis estatisticamente iguais para os parâmetros proteínas totais, albuminas e ureia foram verificados para o grupo de ratos alimentados com as dietas Pm Cr e Pm LG, sugerindo que o estado nutricional desses grupos são parecidos. A ureia encontrou-se aumentada de forma significativa para o grupo da dieta SJAG (51,23 ± 21,56 mg/dL) em relação ao grupo da dieta SJCr (41,92 ± 5,72 mg/dL). O aumento dos rins, embora não de forma significativa, foi verificado para o grupo da dieta SJAG em relação ao grupo da dieta à base de soja crua.

155 TABELA 17 – Parâmetros séricos de ratos (n=6) alimentados com dietas contendo farinhas de Piptadenia moniliformis crua ( Pm Cr) e processadas termicamente por fervura ( Pm F), cozimento em micro-ondas ( Pm M) e autoclavagem ( Pm A), comparadas com o crescimento de ratos alimentados com a dieta contendo farinhas de soja crua (SJCr), processada termicamente por fervura (SJF) e dieta isenta de proteína (AP)

PARÂMETROS ANALISADOS

Proteínas Fosfatase DIETAS Albumina Ure ia AST * ALT ** Creatinina totais Alcalina (g/dL) (mg/dL) (U/mL) (U/mL) (mg/dL) (g/dL) (U/L)

4,40 ± 0,25ª b 3,02 ± 0,16ª 30,33 ± 6,22 ab 181,97 ± 39,54 a 13,73 ± 0,88 a 14,99 ± 0,58 a 0,63 ± 0,08 a SJF 3,78 ± 0,19 b 3,09 ± 0,15 ac 41,92 ± 5,72 bc 171,37 ± 14,69 a 9,25 ± 0,80 b 10,69 ± 1,98 a 0,52 ± 0,05 a SJCr

5,07 ± 1,35 a 3,67 ± 0,44 b 51,23 ± 21,56 d 117,33 ± 70,71 a 13,58 ± 2,02 a 2,50 ± 1,29 b SJAG 13,74 ± 1,67ª 4,34 ± 0,18 ab 3,65 ± 0,52 bc 37,93 ± 6,53 abc 136,00 ± 42,63 a 13,83 ± 1,10 a 14,92 ± 5,25 a 3,23 ± 0,68 b Pm Cr 4,97 ± 0,46 a 3,83 ± 0,42 b 41,50 ± 14,11 cd 110,93 ± 61,87 a 14,11 ± 1,40ª 14,41 ± 1,98 a 3,54 ± 1,19 b Pm LG ab abc a a a a b AP 4,37 ± 0,43 3,26 ± 0,22 27,39 ± 6,16 144,00 ± 42,31 13,83 ± 1,10 13,48 ± 3,18 3,27 ± 1,52

Média ± desvio padrão. Letras iguais na horizontal referem-se a resultados não diferentes estatisticamente ( p > 0,05), para o teste de Variância Simples (One-way ANOVA) seguida de Teste de Tukey. * AST: Aspartato aminotransferase. ** ALT: Alanina aminotransferase

156 Em relação à creatinina, os teores obtidos para os grupos da dieta SJF mostraram-se inferiores de forma significativa em relação aos demais, com exceção para o grupo da dieta SJCr (0,52 ± 0,05 mg/dL), sendo esta última estatisticamente diferente da SJAG (2,50 ± 1,29 mg/dL), que apresentou maior teor de creatinina. O grupo da dieta contendo P. moniliformis livre de α-galctosídeos não diferiu, para esse parâmetro, do grupo da mesma dieta contendo esses oligosacarídeos. A dosagem sanguínea de enzimas fosfatase alcalina, AST e ALT, realizada para avaliar nível toxicidade hepática por parte das dietas experimentais, mostrou que, provavelmente, não houve dano ao fígado, posto que os níveis verificados não foram aumentados (não houve diferença estatística) entre nenhum dos grupos testes avaliados (SJCr vs. SJAG e Pm Cr vs. Pm LG) em comparação ao controle positivo (SLF). A perda de peso elevada, por parte dos animais dos grupos experimentais que se alimentaram de dietas à base de farinha de P. moniliformis cruas ou processadas por tratamento térmico (fervura, cozimento em micro-ondas e por autoclavagem) e por extração de α-galactosídios, pode estar associado a um conjunto de fatores e não a um fator isolado como foi pensado em relação aos α-galactosídios. Foi observado que o processamento para a sua retirada melhorou a retenção de nitrogênio por parte dos animais, mas não foi possível uma redução na perda de peso, muito menos aumento ponderal. Assim sendo, a presença de compostos fenólicos detectada, os quais prejudicam a digestão e absorção das proteínas (GILANI; COCKELL; SEPEHR, 2005), bem como de outros compostos antinutricionais conhecidos, que não foram avaliados, como o ácido fítico, grupos cianogênicos e de L-DOPA (3,4-dihidroxi L -fenilalanina), podem ter contribuído para a performance insatisfatória desses grupos de animais, já que são relativamente resistentes ao calor. O ácido fitico pode interferir na biodisponibilidade de minerais bivalentes, amido, proteínas e enzimas, devido sua capacidade de formar complexos com esses compostos, alterando a digestibilidade e absorção desses nutrientes (ÉSTEVEZ; CASTILLO- FIGUEROLA; ÝANEZ, 1991; PALLAUF; RIMBACH, 1997; PROLL et al ., 1998; VIDAL- VALVERDE et al ., 1994), ou provocar efeitos adversos como flatulência (ZHOU; ERDMAN, 1995). Para combater o ácido fítico, polifenóis e os inibidores de tripsina, Sindhu e Khetarpaul (2001) e Beal e Mehta (1985), sugerem além do aquecimento, a utilização da fermentação ou da germinação de leguminosas , uma vez que tais compostos apresentam certa estabilidade ao calor e para ressaltar o valor nutritivo dos grãos.

157 Outro importante ponto a ser questionado é a baixa aceitação das dietas teste, em comparação com a ingestão de dieta padrão (SJF), que pode ter sido prejudicada pela presença de compostos responsáveis pelo forte odor apresentado pela farinha de P. moniliformis , já que o aumento significativo do consumo da dieta não foi verificado com o processo de extração de α-galactosídios. Remover os componentes indesejáveis é essencial para melhorar a qualidade das leguminosas no intuito de ser efetivamente usado para a alimentação animal e humana. Por isso, muitos estudos como este têm sido realizados por vários pesquisadores na tentativa de reduzir os fatores antinutricionais das leguminosas. A modificação de seus tipos e quantidades via manipulação genética podem ter consequências catastróficas, segundo Khattab e Arntfield (2009), visto que os mesmos desempenham importantes papéis na defesa das plantas (OBENDORF, 1997; SCALBERT, 1991; WANG et al ., 2003). Então, de acordo com Khattab e Arntfield (2009), a melhor maneira de tentar solucionar esse problema é a utilização de métodos simples e mais econômicos, como os utilizados neste trabalho (hidratação, fervura, cozimento em micro-ondas e autoclavagem) ou outros como a retirada das cascas, maceração, fermentação (ZAMORA; VEUM, 1979; REDDY; SALUNKHE; SHARMA, 1980), germinação (NNANNA; PHILIPS, 1990; AL-KAISEY; AL-HADITHI; ALWAN , 1996; AL- KAISEY; AL-HADITHI; SAHEAD, 1997), irradiação gama (RAO; VAKIL, 1983; ABU- TARBOUSH, 1998) ou, ainda, a associação de alguns deles para melhorar a qualidade de grãos de leguminosas. A irradiação de alimentos tem sido reconhecida como um método confiável e seguro para preservação, melhora da qualidade higiênica e do valor nutricional dos alimentos (DIEHL, 2002; GAMPBELL et al .,1983; AL-KAISEY et al ., 2002). Podendo ser um método de escolha na tentativa de aumentar a utilização de leguminosas selvagens como a P. moniliformis . O isolamento de frações proteicas também se apresenta como uma alternativa promissora para a melhoria de qualidade nutricional das proteínas de sementes de leguminosas quando comparadas à farinha integral crua, conforme verificado em vários estudos, incluindo o realizado com sucesso por Farias (2009), onde após o isolamento de frações protéicas da farinha das sementes de Amburana cearensis, foi evidente a melhora no desenpenho e crescimento dos ratos alimentados com essa fração quando comparados com a dieta à base de frarinha das mesmas sementes na forma íntegra, a qual causava não só perda de peso, mas morte dos animais. A boa composição nutricional das sementes de P. moniliformis , conforme demonstrada pela determinação de macro e micronutrientes e pelo índice de qualidade

158 nutricional, o qual a apontou como a semente com melhor perfil nutricional dentre as avaliadas, mostra o quão promissora é essa semente. Por tudo o que foi exposto, é de grande importância uma melhor investigação no intuito de descobrir que componentes são os reais responsáveis pelo não aproveitamento de seus nutrientes pelos animais, incluindo a busca por métodos de processamento capazes de aumentar a biodisponibilidade de seus nutrientes e assim, futuramente, ela poderá fazer parte da alimentação humana e/ou animal. Esse trabalho chama a atenção para a relevância de estudos in vivo com animais, além da determinação de sua composição in vitro na busca de novas fontes de leguminosas antes de serem liberadas para a alimentação humana. Contribui para agregação de valor às espécies analisadas e, talvez, possa aumentar a conscientização da população sobre a necessidade de preservação da biodiversidade vegetal da Caatinga para o Brasil, devido aos diversos benefícios que podem ser propiciados.

159 6. CONCLUSÃO DO CAPÍTULO

As sementes das espécies vegetais da Caatinga cearense apresentam um elevado potencial nutricional, como elevado teor de proteínas, apresentando bom perfil de aminoácidos essenciais e de minerais, são importantes fontes de fibras e energia, além de conterem baixos compostos tóxicos e/ou antinutricionais, com perfis comparáveis ou mesmo superiores ao de outras leguminosas selvagens, bem como ao de leguminosas mundialmente consumidas. O índice de qualidade nutricional (IQN) destacou as espécies P. moniliformis Benth., P. platycephala Benth e E. velutina Willd como as três espécies contendo maior número de características desejáveis do ponto de vista nutricional, sendo a detentora do maior IQN a espécie P. moniliformis Benth., a mais promissora fonte de nutrientes para a alimentação humana e animal. Os experimentos nutricionais realizados para avaliar a qualidade das proteínas das sementes de P. moniliformis Benth. cruas e submetidas a diferentes processamentos (tratamentos térmicos por fervura, cozimento em micro-ondas, autoclavagem, e extração de α-galactosídios) não foram capazes de proporcionar um bom desempenho dos animais, apenas melhores percentuais de parâmetros nutricionais foram verificados para o processo de extração de α-galactosídios. Outros processamentos devem ser testados para um melhor aproveitamento dos nutrientes existentes em P. moniliformis Benth.

160

Prospecção Bioativa em Sementes de dez Leguminoas da Caatinga Cearense

161 1. CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA E JUSTIFICATIVA

As doenças em plantas sempre foram e continuam sendo motivos de grandes preocupações, já que perdas sempre ocorreram e esse quadro vem se agravando, uma vez que os prejuízos na produção mundial são de um terço por ano devido ao ataque de fitopatógenos (BAJWA; KHALID; CHEEMA, 2003; CHAPAGAIN; WIESMAN; LAHKIM, 2007). Mundialmente os insetos causam perdas de 15% da produção agrícola total, gerando gastos de mais de 100 bilhões de dólares. Os fungos, sozinhos, são responsáveis por 70% das principais doenças das plantas e mais de 100 espécies de fungos causam doenças pós-colheita, o que leva a uma perda agrícola de mais de 20% em diversas culturas (AGRIOS, 2000; LAWRENCE; KOUNDAL, 2002; LEE et al ., 2003; TRIPTHI; DUBEY, 2004). Por essas razões, muitas entidades consideram que os agroquímicos são insumos importantes e imprescindíveis para a produção mundial de alimentos, levando à constante liberação desses produtos no meio ambiente. Foi estimado um aumento em torno de 1.900% em cinqüenta anos (KARUNGI et al ., 2000). Contudo, essas substâncias químicas estão associadas a uma série de desvantagens, entre as quais a falta de especificidade, o aumento da incidência de resistência sobre aplicações prolongadas e os riscos ambientais inerentes à toxicidade residual que levam ao desequilíbrio ecológico, causando grande impacto ambiental. Dada essas limitações, a busca por controles alternativos é de extrema relevância, destacando-se a descoberta de novos compostos seguros e renováveis, de ocorrência natural e fácil obtenção (LIU et al. , 2001; MENDIETA; GIUDICI; LA CANAL, 2004; WANG et al. , 2005 a,b; BALE; VAN LENTEREN; BIGLER, 2008; DAYAN; CANTRELL; DUKE, 2009). Não só as plantas sofrem com os micro-organismos patogênicos, pois nas últimas décadas, a incidência de infecção fúngica em humanos, especialmente em pacientes imunodeprimidos, tem crescido rapidamente devido ao aumento de sobrevida desses pacientes ocasionados pelos avanços na medicina. Em contraposição, esses mesmos pacientes sofrem sérias conseqüências quando infectados por fungos, justamente por existir poucos ou, às vezes, nenhum tratamento eficiente para os mesmos. Aliado a isso, o aparecimento de fungos patogênicos resistentes às terapias atuais, a escassez de compostos antifúngicos e a toxicidade das drogas atualmente disponíveis incentivam o uso de compostos antifúngicos naturais e seus derivados sintéticos com potencial promissor para o uso clínico (SELITRENNIKOFF, 2001).

162 Outro micro-organismo causador de grandes infecções em humanos, principlamente, infecções hospitalares e comunitárias são as bactérias, sendo responsáveis pela morte de mais de 14 milhões de pessoas, representando uma média de 26 % da mortalidade global. Isso se deve ao surgimento de micro-organismos resistentes aos antibióticos, decorrente, sobretudo, do uso indiscriminado dos quimioterápicos antimicrobianos, restringindo a utilização dos mesmos e, ao mesmo tempo, mostrando a importância da busca de novos compostos bioativos no arsenal terapêutico com efeito antimicrobiano (LEVY, 2005; BECKER et al ., 2006; SILVEIRA et al ., 2007). Os insetos que se alimentam de sangue também prejudicam a saúde humana por serem vetores de doenças graves e de difícil controle como é o caso da dengue, dengue hemorrágica, febre amarela, encefalite japonesa e malária. A prevalência dessas e de outras doenças estão aumentando nas zonas tropicais e subtropicais (SUTTHANONT et al ., 2010) e o mosquito Aedes aegypti , principal vetor da dengue, é responsável pela infecção de cerca de cinqüenta milhões de pessoas por ano, tendo levado à morte inúmeros indivíduos (WHO, 2009; JANSEN e BEEBE, 2010). O principal controle da dengue é seu vetor, o qual tem sido combatido com inseticidas sintéticos, que ainda são necessários, especialmente em situações de surto epidêmico e súbito aumento de mosquitos adultos. O uso desses produtos causa impacto econômico na saúde pública mundial (YAICHAROEN et al ., 2005; NATHAN; KALAIVANI; SEHOON, 2006). No intuito de minimizar os danos causados ao homem e ao ambiente pela excessiva utilização de agroquímicos, bem como de fungicidas e inseticidas sintéticos, os bioprodutos vegetais tornam-se bem atraentes principalmente por serem, em geral, mais biodegradáveis (SHAALAN et al ., 2005), mas também por serem eficientes no combate aos insetos e micro-organismos nocivos e praticamente atóxicos (FERNANDES, 2000). Os vegetais produzem muitas substâncias a partir de seu metabolismo primário e secundário para se defenderem do ataque de patógenos. Nesse sentido, muitas plantas de biomas brasileiros têm sido usadas como medicamentos naturais pela população local para o tratamento de muitas doenças, incluindo micoses. Muitas delas foram estudadas apresentando comprovadas propriedades antimicrobianas, importantes no combate a fungos e bactérias (SOUZA et al ., 2002; DUARTE et al ., 2005; BERTINI et al ., 2005; CRUZ et al ., 2007; BOTELHO et al ., 2007). Considerando o fato de que apenas 8% das espécies vegetais brasileiras foram estudas em busca de moléculas bioativas (AMORIM et al. , 2003), a Caatinga ser um bioma com extrema diversidade de plantas medicinais, ainda pouco exploradas (ALMEIDA et al ., 2006),

163 e que há grande necessidade de descoberta de compostos naturais que auxiliem no combate aos patógenos humanos e de plantas, surgiu a seguinte hipótese:

A Caatinga possui espécies vegetais repositórias de compostos bioativos frutos do metabolismo primário e secundário das plantas capazes de atuarem frente a micro- organismos patogênicos para o homem e/ou para plantas.

164 2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

• Avaliar o potencial bioativo das sementes de dez espécies de plantas da caatinga, identificar as espécies mais promissoras para estudos futuros e investigar a atividade dos compostos bioativos de uma das espécies promissoras frente a modelos biológicos de importância clínica e fitopatológica.

2.2 Objetivos Específicos

• Determinar a presença de alguns metabólitos secundários biologicamente ativos no extrato bruto das dez sementes vegetais da caatinga; • Investigar a presença de algumas proteínas bioativas (lectina, inibidor de tripsina, urease, quitinase, β-1,3-glucanase e protease) no extrato bruto das sementes das dez plantas da caatinga; • Determinar a atividade tóxica do extrato bruto de sementes de espécies vegetais da caatinga para ratos e larvas de Aedes aegypti no 3 º estádio de desenvolvimento; • Avaliar a presença de atividade antimicrobiana do extrato bruto de espécies vegetais da caatinga; • Apontar espécies vegetais com bom perfil de compostos bioativos promissoras para estudos futuros; • Selecionar, dentre as espécies promissoras, uma espécie contendo compostos bioativos que apresente diversas funções e aplicações biotecnológicas e/ou industriais; • Isolar total ou parcialmente o composto bioativo da espécie selecionada e determinar sua atividade contra leveduras, fungos filamentosos, bactérias e contra Aedes aegypti , inseto vetor da dengue.

165 3. MATERIAIS

3.1 Sementes

3.1.1 Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga

A coleta das sementes das espécies vegetais foi realizada na Caatinga, na Floresta Nacional do Araripe e na zona costeira no estado do Ceará, no nordeste do Brasil. As sementes selvagens (100 - 1000 g) foram coletadas durante o período seco (janeiro de 2005 a março de 2007), com a ajuda de nativos. Apenas uma colheita foi realizada devido às dificuldades pertinentes à região do semiárido que sofre secas severas e às limitações estabelecidas por agências de proteção ambiental brasileira. As plantas foram identificadas e os espécimes foram depositados no Herbário Prisco Bezerra (EAC), Universidade Federal do Ceará (UFC).

3.1.2 Sementes de Piptadenia moniliformis Benth.

O primeiro lote das sementes de P. moniliformis foi obtido de vagens maduras, coletadas em uma área de caatinga arbórea, mais precisamente, na fazenda “Não me Deixes”, no município de Quixadá, no sertão central do estado do Ceará. Um ramo terminal com folhas e frutos foi coletado, prensado e desidratado para posterior identificação e incorporação ao acervo do Herbário Prisco Bezerra (EAC), Universidade Federal do Ceará (UFC), sob a identificação EAC 35974 O segundo lote de sementes foi originado dos depósitos de armazenamento do banco de sementes do Ibama, da floresta do Araripe (Crato, CE).

166 3.2 Eritrócitos

Eritrócitos utilizados nos ensaios de aglutinação foram obtidos de amostras de sangue de coelho albino adulto (linhagem Nova Zelândia), mantido no Biotério de Manutenção do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da UFC.

3.3 Micro-organismos

As bactérias Gram-positivas Bacillus subtilis ATCC 6633 e Staphylococcus aureus ATCC 25923, e as Gram-negativas Enterobacter aerogens ATCC 13048, Klebsiella pneumoniae ATCC 10031, Pseudomonas aeruginosa ATCC 25619 e Salmonella choleraesuis ATCC 10708, assim como, as cepas dos fungos fitopatogênicos Aspergillus niger , Colletotrichum musae , C. truncatum, Fusarium oxysporum , F. solani , Mucor sp., Neurospora sp., Penicillium herguei , Pithium oligandrum , Phomopsis sp. Rhizoctonia solani foram cedidas pelo Laboratório de Ecologia Microbiana e Biotecnologia (LEMBIOTECH), do Departamento de Biologia da UFC. As leveduras Candida albicans , C. tropicalis, Pichia anômala e Saccharomyces cerevisiae foram obtidas de isolados clínicos, identificadas e mantidas pelo referido laboratório.

3.4 Animais de Laboratório e Alojamento

Um coelho da raça Nova Zelândia com três meses de idade foi adquirido junto ao setor de cunicultura do Departamento de Zootecnia da UFC. O coelho foi mantido no Biotério de Manutenção do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da UFC com água e ração apropriadas fornecidas ad libitum. Os camundongos machos convencionais da linhagem Swiss foram adquiridos do Biotério Central da UFC (Biocen-UFC) com 3 semanas de idade. Os animais foram alojados no Biotério Experimental do Laboratório de Bioprospecção de Recursos Regionais (Bioprospec), do Departamento de Biologia da UFC, com temperatura (23,0 ± 2,0 ºC) e fotoperíodo (12 h claro/12 h escuro) controlados. Os camundongos foram

167 mantidos em número adequado em caixas de polipropileno com substrato de raspa de pinho, água e ração (Biobase, Águas Frias, Santa Catarina, Brasil) ad libitum até atingirem cerca de 60 g e 20 g, respectivamente. Os protocolos com animais, adotados neste trabalho, foram submetidos à aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal (CEPA) da UFC, que adota os preceitos do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).

3.5 Insetos e Alojamento

Ovos e larvas em 3º estádio de Aedes aegypti foram obtidos de uma colônia de mosquitos mantida no NUVET/SESA (Núcleo de Controle de Endemias Transmissíveis por Vetores da Secretaria de Saúde do Estado do Ceará). Os insetos (ovos e larvas) foram mantidos no insetário do Bioprospec com umidade 40 - 50%, temperatura 27 – 30 ºC e fotoperíodo 12 h claro/12 h escuro, e alimentados, diariamente, com ração para tartaruga (Reptolife, Alcon, Camboriú, Brasil). Os insetos remanescentes dos experimentos e o excedente foram sacrificados por fervura em água por 15 min.

3.6 Reagentes Químicos e Outros Materiais

3.6.1. Proteínas

Albumina sérica bovina (BSA), inibidor de proteína da soja (SBTI), marcadores de massa molecular e proteases foram adquiridos da Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, EEUU) e da AMRESCO Inc. (Ohio, EEUU).

168 3.6.2. Substratos Enzimáticos

Os substratos sintéticos BApNA (N α-benzoil-DL-arginina-p-nitroanilida), substrato proteico Azocaseína, Glucuronidase (ECP 3.2.1.31) e Lamnarina foram adquiridos da Sigma- Aldrich Co. (St. Louis, EEUU).

3.6.3 Meios de Cultura

Agar batata, agar Mueller-Hinton, agar nutritivo, agar sabouraud, caldo nutritivo, caldo TGE (Triptona, Glucose e Extrato de levedura) e caldo BHI (“Brain-Heart Infusion”) foram obtidos da Difco, Becton, Dickinson and Company (Sparks, EEUU).

3.6.4 Reagentes para Eletroforese

Acrilamida, Coomassie Brilliant Blue R-250, Dodecil Sulfato de Sódio (SDS), TEMED ( N´ , N’ , N' , N' - tetrametiletilenodiamina), trizma-base, metilenobisacrilamida, β- mercaptoetanol, nitrato de prata e demais reagentes foram comprados das empresas Amersham Biosciences (Piscataway, EEUU), Sigma-Aldrich Co. (St Louis, EEUU), Acros Organics (Geel, Bélgica) e AMRESCO Inc. (Ohio, EEUU).

3.6.5 Outros Materiais

Quitina coloidal, p-dimetilaminobenzaldeido (DMAB), quitina, membrana de diálise com “cut off” de 12.000 e ditiotreitol (DTT), foram obtidos da Sigma-Aldrich Co., St Louis, USA. As matrizes cromatográficas de DEAE-Celulose e CM-Sepharose foram obtidas da GE HeathCare, Uppsala, Suécia. Affi-gel-Blue-gel da BioRads, Hercules, California, EEUU. Os demais reagentes foram de grau analítico e provenientes de diferentes fornecedores. 169 4. MÉTODOS

4.1 Preparação da Farinha de Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga

As sementes foram retiradas de suas vagens e moídas em moinho rotatório para grãos de café (Cadence, Caxias do Sul, Brasil). Em seguida, as farinhas foram peneiradas em malha de 1,0 mm 2 a fim de deixá-las bem finas e colocadas em estufa (FANEM, Modelo 002 CB, São Paulo, Brasil) a 45 ºC por 72 horas para obtenção de um material mais homogêneo e livre de umidade. As farinhas foram acondicionadas em recipientes de plásticos hermeticamente fechados, em câmera fria a 4 °C, até a realização das análises.

4.2 Extração de Proteínas das Sementes das Espécies Vegetais

As farinhas das sementes foram postas em contato com o tampão fosfato de sódio 0,05 M, pH 7,0 ou com o tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2 ou em água destilada na proporção de 1:10 (m/v) e deixada sob agitação contínua por 4 h, a 4 °C. Em seguida, a suspensão foi filtrada em pano de trama fina. O resíduo obtido foi descartado. O filtrado foi centrifugado a 13.000 x g, 30 minutos, 4 °C; o precipitado foi descartado e o sobrenadante obtido foi filtrado em papel de filtro e denominado de Extrato Bruto. A extração de proteínas feita com o tampão fosfato de sódio 0,05 M, pH 7,0, foi utilizada para a determinação das atividades de: toxicidade aguda para camundongos, lectinas, proteases, antibacterianas e antifúngicas. Para a determinação do extrato sólido solúvel e de atividade larvicida ( Aedes aegipty ) foi realizada a extração de proteínas com água destilada e para a determinação da atividade quitinásica, β-1,3 – glucanásicas e purificação das proteínas com atividade quitinásica bem como todos os ensaios utilizados com a fração purificada, foram realizados com o tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2.

170 4.3 Dosagem de Proteínas

Os teores de proteínas dos extratos brutos e das frações proteicas obtidas foram determinados segundo a metodologia descrita por Bradford (1976). Brevemente, para cada 100 µl de amostra, em diferentes concentrações, foram adicionadas 2,5 ml do regente de Bradford. A mistura foi agitada por alguns segundos e após 10 minutos sobre a bancada e à temperatura ambiente, procedeu-se a leitura das absorbâncias a 595 nm, em espectrômetro tipo Genesys 10, Spectronic Unicam, New York, EEUU. A concentração de proteínas foi estimada utilizando-se o fator de calibração obtido através de uma curva padrão constituída com concentrações conhecidas de albumina sérica bovina (BSA). A absorbância a 280 nm foi usada para estimar o conteúdo de proteínas nos eluatos das matrizes cromatográficas.

4.4 Detecção de Metabólitos Secundários

O estudo fitoquímico de determinação qualitativa de metabólitos secundários foi realizado utilizando os protocolos descritos por Matos (1997). Inicialmente, foi realizada uma extração alcóolica da farinha integral seca das sementes das 10 espécies na proporção de 1:3 (p/v), por 72 h, com duas trocas consecutivas de álcool etílico 95 %. Entre as trocas, os sobrenadantes foram armazenados em frascos âmbar e, posteriormente, concentrados por rotaevaporação. Esse procedimento foi repetido três vezes. O concentrado obtido foi armazenado a - 20 ºC, sendo descongelados e ressuspendidos em volume mínimo de álcool para a realização das análises de detecção de várias classes de metabólitos. A análise foi feita através da adição de reagentes específicos e observação de mudança de cor, aparecimento de precipitado ou formação de espuma, os quais eram indicativos de presença de diferentes tipos de metabólitos. Os metabólitos secundários analisados foram: taninos; fenóis; alcaloides; saponinas; antocianinas e antocianidinas; flavonas, flavonois e xantonas; chalconas e auronas; flavonoides; leucoantocianidinas; triterpenoides; catequinas; esteroides e flavononas.

171 4.5 Detecção e Dosagem de proteínas Bioativas

4.5.1 Lectinas

A presença de lectinas nas 10 sementes foi avaliada através de ensaios de atividade hemaglutinante de seus Extratos Brutos (EBs), seguindo a metodologia descrita por Moreira e Perrone (1977), adaptada para o uso de tubos de ensaio. Os Extratos brutos foram diluídos seriadamente com NaCl 0,9% (1:2; 1:4; 1:8; 1:16 etc) e cada diluição foi misturada (1:1) com uma suspensão a 2% de eritrócitos de coelho nativos e tratados previamente com um “pool” de proteases de Bacillus licheniformis (Sigma-Aldrich, St Louis, EEUU). O tratamento com proteases foi feito através da mistura da solução de proteases (1 mg/mL) com a suspensão de eritrócitos a 2%, na proporção 1:100 (v/v), por 1 h, a 4 ºC. Em seguida, as proteases foram retiradas por centrifugações e lavagens com NaCl 0,9%. Os tubos contendo os EBs, suas diluições, o sangue nativo e tratado foram incubados a 37 °C, durante 30 min, e depois, por mais 30 min à temperatura ambiente. Após esse tempo, os tubos foram centrifugados a 2000 x g, por 1 min, e a aglutinação visualizada a olho nu. Os resultados foram expressos como título de hemaglutinação, o qual foi definido como o recíproco da maior diluição que é capaz de provocar aglutinação visível. Essa concentração foi denotada como uma unidade de atividade hemaglutinante (UH).

4.5.2 Inibidores de Tripsina

4.5.2.1 Determinação dos Inibidores de Tripsina nas sementes

A atividade inibitória de tripsina foi determinada de acordo com Kakade et al . (1969) com algumas modificações. A extração dos inibidores foi realizada agitando-se, durante 3 h, em temperatura ambiente, 20 mg da amostra (farinhas das sementes das 10 espécies) em 1 mL de NaOH 0,01 N. A suspensão foi então deixada em repouso por 30 min e, em seguida, uma alíquota de 0,5 mL desta suspensão foi adicionada a 0,5 mL de NaOH 0,01 N e centrifugada

172 a 15.000 x g, por 5 min. O sobrenadante foi utilizado para determinação da atividade dos inibidores de tripsina. Para obtenção da curva padrão de inibidor de tripsina, volumes de 10, 15, 20, 25, 30 e 35 µL de SBTI – inibidor de tripsina de soja tipo Kunitz (Sigma-Aldrich, St Louis, EEUU) dissolvido em NaOH 0,01 N, na concentração de 1 mg/mL, foram incubados com 100 µL tripsina de pâncreas bovino, dissolvido em HCl 0,001 N na concentração de 1 mg/mL, e 100 µL da solução de BAPNA – Nα-Benzoil-DL-arginina-p-nitroanilida (Sigma- Aldrich, St Louis, EEUU), dissolvido em DMSO (dimetil-sulfóxido de sódio) e água destilada. O volume final de cada tubo foi ajustado para 1,6 ml com tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 8,2, contendo CaCl 2 0,02 M. Após 5 min, os tubos foram incubados a 37 ºC por 45 min. O procedimento do ensaio, realizado em triplicata, obedeceu à mesma seqüência de eventos da curva padrão, apenas substituindo o SBTI por 20 µL do sobrenadante da amostra. A reação foi interrompida pela adição de 200 µL de ácido acético 30 % (v/v) e a absorbância lida a 410 nm contra os brancos (sem adição de tripsina). Os resultados foram expressos como a quantidade de tripsina ( µg) inibida por miligrama de farinha ( µgTI/mgF).

4.5.2.2 Determinação dos Inibidores de Tripsina da Fração Proteica de Piptadenia moniliformis (Pm FP)

A atividade inibitória sobre a tripsina de Pm FP foi determinada de acordo com Erlanger et al . (1961). Vinte microlitros (20 µl) de solução de tripsina bovina (0,3 mg/mL em HCl 0,0025 M) foram pré-incubados, por 15 min a 37 °C, com tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5 e 0,1 mL da solução teste. Após esse período, a reação foi iniciada adicionando-se 0,2 mL de azocaseína 1% em tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5. Decorridos 30 min, a reação foi interrompida adicionando-se 0,3 mL de solução de TCA 20%. A mistura de reação foi centrifugada a 10.000 x g, por 10 min e o sobrenadante alcalinizado com NaOH 2 N na proporção 1:2 (v/v), a fim de intensificar a cor do produto da clivagem da azocaseína pela enzima. A leitura das absorbâncias foi realizada a 440 nm. Provas em branco foram realizadas em duplicata e os testes em triplicata. Os resultados foram expressos em Percentual de Inibição (%) e Unidade de Inibição (UI), definida como o decréscimo em 0,01 da absorbância a 440 nm.

173 4.5.3 Inibidores de Quimotripsina

A atividade inibitória sobre a quimotripsina de Pm FP foi determinada de acordo com Erlanger et al . (1961). Vinte microlitros de solução (20 µl) de quimotripsina bovina (0,1 mg/mL em tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5 contendo CaCl 0,02 M) foram pré-incubados, por 15 min a 37 °C, com o mesmo tampão e 0,1 mL da solução de Pm FP. Após esse período, a reação foi iniciada adicionando-se 0,2 mL de azocaseína 1% em tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5. Decorridos 30 min, a reação foi interrompida adicionando-se 0,3 mL de solução de TCA 20%. A mistura de reação foi centrifugada a 10.000 x g, por 10 min e o sobrenadante alcalinizado com NaOH 2 N na proporção 1:2 (v/v), a fim de intensificar a cor do produto da clivagem da azocaseína pela enzima. A leitura das absorbâncias foi realizada a 440 nm. Provas em branco foram realizadas em duplicata e os testes em triplicata. Os resultados foram expressos em Percentual de Inibição (%) e Unidade de Inibição (UI), definida como o decréscimo em 0,01 da absorbância a 440 nm.

4.5.4 Ureases

A determinação da atividade ureásica foi realizada de acordo com a metodologia descrita por Kaplan (1969), com algumas modificações (VASCONCELOS et al ., 1997). Uma alíquota de 0,1 mL de uma solução de uréia 500 mM foi misturada com 0,7 mL de EDTA 2%, tamponando com uma solução de fosfato de sódio 0,02 M, pH 6,5. Em seguida, 0,2 mL dos EBs das farinhas das 10 sementes foram adicionadas e as misturas foram incubadas a 37 ºC, por 15 min. Posteriormente, foram adicionados às misturas 1,0 mL da solução A (62 g de fenol + 0,25 g de nitroprussiato de sódio/L) e 1,0 mL da solução B (43 mL de hipoclorito de sódio + 20 g de hidróxido de sódio/L), sendo deixadas a 37 ºC, por 5 min. Após esse tempo, foram adicionados 7,0 mL de água deionizada aos tubos, sendo estes cobertos com filme de PVC e agitados vigorosamente. As leituras das absorbâncias foram feitas a 625 nm e a atividade enzimática foi avaliada em relação a uma curva padrão obtida com urease (EC 3.5.1.5, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, EEUU). A atividade ureásica foi expressa como unidades de enzima por Kg de farinha (U/KgF).

174 4.5.5 Quitinases

As atividades quitinolíticas foram determinadas segundo o método colorimétrico descrito por Boller (1993), usando como parâmetro a liberação de N-acetil-D-glucosamina (NAG) a partir da ação hidrolítica das enzimas sobre a quitina coloidal Boller (1992). Inicialmente, a atividade quitinolítica total foi determinada por incubação de 250 µL da amostra (EBs das sementes das 10 espécies, frações cromatográficas e Pm FP) com 250 µL da quitina coloidal (10 mg/ml), a 37 °C, durante 1 h, em seguida, fervidos em banho-maria a 98 °C por 5 minutos. Os tubos, após resfriamento, foram centrifugados a 10.000 x g, 25 °C, por 10 minutos, e alíquotas de 300 µL foram retiradas e incubadas com 10 µL da solução de glucoronidase (EC 3.2.1.31), a 37 °C, por 1 h. A solução de glucoronidase usada nos ensaios foi preparada por diálise da preparação bruta de Helix pomatia (Tipe HP-2, 132.000 Unidades/ml) com tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2, e diluição (10 vezes) com o mesmo tampão de reação. Esta segunda etapa enzimática também foi interrompida por meio de fervura em banho-maria, durante 10 minutos. Para determinação da quantidade de NAG liberada a partir da quitina coloidal sob ação de enzimas quitinolíticas, 310 µl do hidrolizado foram acrescidos de 190 µl de tampão acetato de sódio 50 mM, pH 6,0 e 100 µl de tetraborato de sódio e potássio 0,6 M. A mistura reacional foi aquecida em banho-maria a 98 ºC, por 5 minutos. Após resfriamento, 1 ml da solução de ρ-dimetilaminobenzaldeido (DMAB), foi adicionado à mistura reacional e incubado em banho-maria a 37 ºC por 20 minutos. A solução de DMAB foi preparada dissolvendo-se 10,0 g de DMAB em 100 mL de ácido acético glacial contendo 12,5% (v/v) de ácido clorídrico 11,5 M. As leituras de absorbância foram feitas no comprimento de onda de 585 nm. Para cálculo da quantidade de açúcar liberado na reação, uma curva padrão construída com concentrações variadas (100 a 500 µM) de N-acetil-D- glucosamina foi utilizada (REISSIG; SROMENGER; LELOIR, 1955). A atividade quitinolítica foi expressa em nanokatal (nKat) por mg de proteína (nKat/mgP), onde 1 nKat equivale a 1 nmol de N-acetil-D-glucosamina liberado por segundo.

175 4.5.6 β-1,3-glucanases

A atividade de β-1,3-glucanase foi avaliada de acordo com o método descrito por Boller (1993), pelo qual se detecta a glucose liberada no meio reacional como conseqüência da hidrólise da laminarina, usada como substrato. A solução de laminarina (2 mg/mL), diluída em tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2, foi aquecida a 60 °C, por 10 minutos, e exaustivamente dialisada contra o mesmo tampão para remoção de glucose livre. Alíquotas de 100 µL da amostra (EBs das sementes das 10 espécies, frações cromatográficas e Pm FP) foram incubadas com 900 µL da solução de laminarina, a 50 °C, por 30 minutos. Em seguida, foi adicionado 1 mL da solução “D” (1 mL da solução “B” + 25 mL da solução “A”) e a mistura incubada a 100 °C, por 20 minutos. A solução “A” continha 25 g de carbonato de sódio + 25 g de tartarato de sódio e potássio + 20 g de bicarbonato de sódio + 200 g de sulfato de sódio anidro + H2O grau Milli-Q q.s.p. 1000 mL. A solução “B” continha 15 g de sulfato de cobre pentahidratado + 20 µL de ácido sulfúrico concentrado + H2O grau Milli-Q, q.s.p. 100 mL. Após resfriamento dos tubos, foi adicionado 1 mL da solução “C” (3 g de arseniato de sódio heptahidratado + H2O grau Milli-Q q.s.p. 25 mL), e estes agitados até a completa remoção de gases sendo, então, deixados em repouso por 5 minutos. As leituras de absorbância foram feitas a 520 nm. Para cálculo da quantidade de açúcar liberado na reação foi utilizada uma curva padrão construída a partir de concentrações variadas de glucose (7,5 a 240 µg/mL), preparadas em tampão acetato de sódio 0,05 M, p H 5,2. A atividade de β-1,3- glucanase foi expressa em nKat/mgP, onde 1 nKat equivale a 1 nmol de glucose liberado por segundo.

4.5.7 Atividade proteolítica

4.5.7.1 Análise qualitativa de proteases

A determinação qualitativa de proteases foi realizada pela análise da hidrólise da gelatina de acordo com a metodologia descrita por Lima et al . (2008), com algumas modificações. O pó da gelatina obtida comercialmente foi dissolvido em 200 ml de água fria.

176 A solução foi colocada no forno de micro-ondas por 30s, em potência alta. Logo em seguida, 3 ml da amostra (extrato bruto das dez sementes das espécies, água como controle negativo e proteases de Bacillus licheniformis (1 mg) (Sigma-Aldrich, St Louis, EEUU ), como contrle positivo) foi adicionado em 10 ml da solução de gelatina e homogeniado. Em seguida, foram mantidos a 4 °C por 30 minutos, para ocorrer a geleificação. A ocorrência ou não de proteólise foi determinada por meio da geleificação observada indiretamente mediante a viscosidade do meio. A reação foi positiva quando a gelatina permaneceu líquida após refrigeração, indicando que foi hidrolisada por proteases. A reação foi considerada negativa quando o meio se ressolidificou durante o período em que esteve em baixa temperatura.

4.5.7.2 Atividade proteolítica total

A determinação da atividade proteolítica das amostras foi realizada de acordo com a metodologia descrita por Xavier-filho et al . (1989), utilizando azocaseína como substrato inespecífico. Soluções de 1mg/ml de Pm FP em tampão fosfato de sódio 50 mM pH 7,0 foram centrifugadas (10.000 x g, 4ºC, 10 min). Alíquotas de 100 µl do sobrenadante foram incubadas com 40 µl de DTT 3 mM ou 40 µl de tampão (sem DTT) por 10 min para a ativação das proteases. Posteriormente, foram adicionados 200 µl de azocaseína 1% e a solução foi incubada a 37 ºC por uma hora. A reação foi interrompida com a adição de ácido tricloroacético (TCA) 20 %. As Amostras foram centrifugadas a 10.000 x g por 10 min e uma alíquota de 400 µl do sobrenadante foi alcalinizada com 400 µl de NaOH 2N. A leitura em espectofotômetro foi realizada em uma absorbância a 420 nm. Uma Unidade de Atividade (UA) foi definida como a quantidade de enzima que produz um aumento de 0,01 unidades de absorbância a 420 nm. Os resultados foram expressos em atividade específica, ou seja, UA por micrograma de proteína.

4.5.8 Toxinas

A detecção de toxinas foi realizada por meio da avaliação da toxicidade aguda dos EBs

177 das farinhas das sementes das 10 espécies. Sendo realizada segundo a metodologia descrita por Vasconcelos et al . (1997), através de injeção intraperitonial (0,3 mL/10 g de peso corpóreo) em camundongos machos, pesando entre 20-25 g, alimentados ad libitum com dieta peletizada comercial. Diferentes teores de proteína foram testados, de modo a encontrar a dose máxima não letal, a dose mínima capaz de causar 100% de letalidade e doses intermediárias envolvendo percentuais de morte no intervalo de 0-100%. Para toxicidade, foram considerados válidos apenas os resultados observados no período de 24 horas. A toxicidade foi expressa como DL 50, a quantidade de proteína (g de proteína/Kg de peso corpóreo) necessária para produzir convulsões e morte em 50% dos animais testados.

4.6 Ensaios Biológicos

4.6.1 Atividade Inibitória da Eclosão dos Ovos de Aedes aegypti

O ensaio de atividade inibitória da eclosão dos ovos de Aedes aegypti por Pm FP, em diferentes concentrações, foi realizado de acordo com a metodologia descrita por Ramos et al . (2006), com algumas modificações. Os testes foram realizados em triplicata e sob condições ideais de temperatura (27 ± 2 °C) e umidade (80% ± 10), com fotoperíodo de 12h claro/12 h escuro. Tiras de papel contendo 20 ovos, contados em um estereomicroscópio (Tecnival), foram mergulhadas em 5 mL de cada amostra ( Pm FP 1; 0,5; 0,250; 0,225; 0,200 e 0,175 mgP/ml e os controles negativo albumina sérica bovina (BSA) (1 mgP/ml) e água destilada), todas contendo 1% de álcool etílico absoluto, dispostas em tubos de ensaio. Após, 72 h, à temperatura ambiente, foi contado o número de larvas vivas ou mortas em cada amostra e, a partir disso, foi calculado o número de ovos não-eclodidos, o percentual de inibição da eclosão dos ovos e, por fim, foram retirados os ovos não eclodidos para observações de possíveis alterações no estereomicroscópio.

A CI 50, ou seja, a concentração capaz de inibir 50% de eclosão, foi calculada através de teste estatístico Probit (FINNEY, 1971).

178 4.6.2 Atividade Larvicida contra Aedes aegypti

O ensaio de avaliação da atividade larvicida contra A. aegypti pelos EBs das sementes das 10 espécies, foi realizado de acordo com a metodologia de WHO (2005), com algumas modificações. Vinte larvas em 3º estádio larval foram coletadas com pipetas Pasteur, colocadas em papel filtro para remover o excesso de água e então transferidas com um pincel para copos plásticos descartáveis de 150 ml contendo, em cada um, 100 mL de EB de cada semente. A mortalidade e a sobrevivência foram monitoradas durante as primeiras três horas do experimento e registradas após 24 horas de exposição à temperatura ambiente (25 ◦C). As larvas foram consideradas mortas quanto nenhum movimento foi detectado após serem tocadas com uma escova fina. Foi contado o número de larvas vivas ou mortas em cada amostra e, a partir disso, foi calculado o percentual de mortalidade. O experimento foi realizado em triplicata, para cada extrato, em três análises diferentes e água destilada foi usada como controle negativo.

4.6.3 Análise de larvas tratadas

As larvas de 1º estádio que se encontravam vivas após o teste de inibição de eclosão de ovos com o tratamento de Pm FP (0,225 mgP/ml) foram coletadas com pipetas Pasteur, colocadas em papel filtro para remover o excesso de água e então transferidas com um pincel para tubos de ensaio contendo água destilada e submetidas à temperatura de -20°C por aproximadamente 5 min, a fim de deixá-las letárgicas. Após esse tempo, foram depositadas em tampão cacodilato de sódio 0,1 M pH 7,2 com paraformaldeído 4% para fixação (a 4ºC). Após duas horas de fixação, as larvas foram retiradas e colocadas sobre lâminas, onde o excesso de tampão de fixação foi retirado e foi acrescentada uma gota de glicerol. Lamínulas foram colocadas cuidadosamente sobre as larvas, e a amostra foi observada em estereomicroscópio.

179 4.6.4 Atividade Inibitória do Crescimento de Fungos Filamentosos em Meio Sólido

O ensaio de inibição do crescimento de fungos filamentosos fitopatogênicos pelos EBs das sementes das 10 espécies em meio sólido foi realizado seguindo a metodologia descrita por Roberts e Selitrennikoff (1990), com algumas modificações. Foram utilizados os seguinte fungos filamentosos: Aspergillus niger , Colletotrichum musae , C. truncatum, Fusarium oxysporum , F. solani , Mucor sp., Neurospora sp., Penicillium herguei , Pithium oligandrum , Phomopsis sp. Rhizoctonia solani e Trichoderma viridae . As culturas de fungos foram inoculadas como “pellets” de 8 mm no centro de placas de ágar batata. As placas foram incubadas em temperatura ambiente por 48 h ou mais, dependendo da velocidade de crescimento de cada fungo. Discos de papel de filtro com 3 cm de diâmetro foram colcados aproximadamente 5 mm da borda da placa de Petri. Foram injetados nos discos 300 µL de EB de cada semente (esterilizados em filtro Millipore® de 0,22 µm de poro) e os controles BSA (10 mg. mL -1), tampão fosfato de sódio 0,05 M, pH7,0 (controle negativo), NaCl 0,9% (controle negativo) e nistatina 100.000 UI.mL -1 (EMS, Hortolândia, São Paulo) (controle positivo). As placas foram novamente incubadas à temperatura ambiente até o crescimento restante dos fungos em presença das amostras. A formação de halos ao redor dos poços indicou inibição do crescimento fúngico.

4.6.5 Atividade Inibitória do Crescimento de Fungos Filamentosos em Meio Líquido

O ensaio de inibição do crescimento de fungos filamentosos fitopatogênicos por Pm FP em meio líquido foi realizado seguindo a metodologia descrita por Freire et al . (2002), com algumas modificações. Para o ensaio foram utilizados os seguintes fungos fitopatogênicos: Aspergillus niger , Fusarium solani , Penicillium herguei e Rhizoctonia solani. Inicialmente, os fungos filamentosos foram repicados da micoteca para placas estéreis de agar batata e incubadas a 37 ºC, por uma semana, sendo, então, utilizados no experimento, após a obtenção da suspensão de esporos. Placas de microtitulação de poliestireno (estéreis), contendo 96 poços, foram postas em câmara de fluxo laminar e a cada poço adicionados 100 µL de meio YPD (“Yeast Peptone Dextrose”, Difco Co., EEUU) estéril, seguidos de 10 µL da suspensão de esporos (2 x 10 5 esporos. mL -1) e 100 µL de cada amostra estéril (esterilização em filtro 180 Millipore® de 0,22 µm de poro), Pm FP (500; 250; 125; 62,5 e 31,25 µg/ml) e dos controles negativos ovoalbumina (500 µg/ml), tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2 (controle negativo) e peróxido de hidrogênio 0,1 M (controle positivo). Em seguida, as placas de microtitulação foram submetidas a uma leitura inicial de absorbância a 630 nm em leitor de microplacas, seguidas de novas leituras a cada 12 h, até um total de 72 h. Entre os intervalos de tempo, as placas foram incubadas em estufa a 37 °C.

4.6.6 Atividade Inibitória do Crescimento de Leveduras em Meio Líquido

O ensaio de inibição do crescimento das leveduras Candida albicans , C. tropicalis Saccharomyces cerevisiae , e Pichia anomala por Pm FP, foi realizado de acordo com a metodologia descrita por Ribeiro et al . (2007), com algumas modificações. Inicialmente, as leveduras foram repicadas para placas estéreis de agar saboraud e incubadas a 37 ºC, por 24 - 48 h, sendo, então, utilizadas no experimento. Nas placas de microtitulação de poliestireno (estéreis), contendo 96 poços, foram adicionados, em cada poço, 100 µL de caldo BHI (Brain and Hearth Infusion, Difco Co., EEUU), com pH ajustado para 5,0, contendo uma concentração de células leveduriformes correspondente a uma leitura de absorbância de 0,05, comprimento de onda de 600 nm, seguidos seguidos de 100 µL de cada amostra estéril (esterilização em filtro Millipore® de 0,22 µm de poro), Pm FP (500; 250; 125; 62,5; 31,25 e 15,62 µg/ml) e os controles: ovoalbumina (500 µg/ml) como controle negativo, e o formol (0,04%), como controle positivo. Em seguida, as placas de microtitulação foram submetidas a uma leitura inicial de absorbância a 600 nm em uma leitora de microplacas, seguidas de novas leituras a cada 6 h, até um total de 48 h. Entre os intervalos de tempo, as placas foram incubadas em estufa a 37 °C.

4.6.7 Atividade Inibitória do Crescimento Bacteriano em Meio sólido

A atividade antibacteriana foi determinada pelo método de difusão em meio sólido, segundo a metodologia de Soares et al . (2007), na qual as bactérias Bacillus subtilis ATCC

181 6633 , Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterobacter aerogens ATCC 13048, Klebsiella pneumoniae ATCC 10031, Pseudomonas aeruginosa ATCC 25619 e Salmonella choleraesuis ATCC 10708 foram cultivadas em caldo nutritivo (BHI – “Brain Heart Infusion” – DIFCO®) e incubado a 37°C por 24 horas em microaerofilia através do método da chama da vela. Após a observação da turvação do meio, procedeu-se a semeadura da bactéria em placa de Petri contendo o meio de cultura Ágar Müller Hinton (DIFCO®) pela técnica de inundação. Foram realizadas perfurações no meio de cultura de 6 mm de diâmetro. Nos orifícios foram inseridos 50 ml de amostra [EB de cada semente (esterilização em filtro Millipore® de 0,22 µm de poro) e os controles BSA (10 mg/mL), tampão fosfato de sódio 0,05 M, pH7,0 (controle negativo) e solução de clorexidina a 0,12% (controle positivo)]. As placas foram incubadas em estufa bacteriológica a 37°C por um período de 24 horas. Com o objetivo de controlar o estudo e assegurar a sua reprodutibilidade, os experimentos foram realizados em triplicata. Foi considerado positivo quando a amostra era capaz de produzir halos de inibição em torno da amostra analisada.

4.6.8 Atividade Inibitória do Crescimento Bacteriano em Meio Líquido

O ensaio de atividade inibitória do crescimento bacteriano em meio líquido de Pm FP foi realizado de acordo com o protocolo descrito por Hissa et al. (2008) . Foram utilizadas as bactérias Gram-positivas Bacillus subtilis ATCC 6633 e Staphylococcus aureus ATCC 25923, e as Gram-negativas Enterobacter aerogens ATCC 13048 e Salmonella choleraesuis ATCC 10708. Inicialmente, as bactérias foram repicadas da bacterioteca para placas estéreis de agar nutritivo e incubadas a 37 ºC, por 24 h, sendo, então, utilizadas no experimento. O ensaio foi realizado em meio líquido da seguinte forma: placas de microtitulação de poliestireno (estéreis), contendo 96 poços, foram postas em câmara de fluxo laminar e a cada poço adicionados 100 µL de caldo nutritivo contendo células bacterianas numa concentração de 10 7 UFC. mL -1 (absorbância entre 0,1 e 0,2, a 600 nm), seguidos de 100 µL de cada amostra estéril (esterilização em filtro Millipore® de 0,22 µm de poro), Pm FP (500; 250; 125; 62,5 e 31,25 µg/ml), de Ovoalbumina (500 µg/ml), como controle negativo e de Formol 0,4%, como controle positivo. Em seguida, as placas de microtitulação foram submetidas a uma leitura inicial de absorbância a 600 nm em uma leitora de microplacas, seguidas de novas

182 leituras a cada 4 h, até um total de 24 h. Entre os intervalos de tempo, as placas foram incubadas em estufa a 37 °C.

4.7 Purificação de Proteínas com Atividade Quitinásica Presentes em Sementes de Piptadenia moniliformis Benth.

4.7.1 Fracionamento proteico com ácido tricloroacético (TCA)

O extrato bruto obtido de sementes de P.moniliformis foi submetido à precipitação com solução aquosa de TCA 10%. Alíquotas de 4 mL de extrato bruto foram precipitadas com solução aquosa de TCA 10%, em banho de gelo, para obter frações proteicas com concentração final de 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 e 3% de TCA. Decorridos 30 min da adição lenta de TCA em constante agitação, as frações proteicas foram centrifugadas a 12.000 x g por 30 minutos a 4 0C e os sobrenadantes obtidos dialisados contra água destilada e submetidos a ensaio de determinação de atividade quitinásica. Após essa primeira análise, a fração proteica obtida após adição de TCA na concentração final de 2% apresentou maior atividade específica para quitinase. Tendo em vista esse resultado, o restante do extrato bruto foi submetido ao mesmo tratamento e a fração proteica, denominada F 2, foi utilizada nas etapas subseqüentes pra a obtenção de Pm FP.

4.7.2 Cromatografia de Troca Iônica em Matriz de DEAE-celulose

Uma alíquota do extrato bruto de P.moniliformis (30 mgP) foi aplicada em matriz de DEAE-celulose (14,0 cm x 2,7 cm), previamente equilibrada com tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2. A coluna foi percolada com o mesmo tampão de equilíbrio, até a completa remoção das frações proteicas não retidas. A eluição das proteínas retidas na matriz foi realizada com a adição sequencial de 0,2 M e 0,4 M de NaCl. a cromatografia foi realizada em um fluxo de 30 mL/h, sendo coletadas frações de 6,0 mL por tubo. Todo o procedimento foi monitorado através de leituras das absorbâncias em 280 nm, bem como através de ensaio de

183 atividade quitinásica e eletroforese. A fração que encerrou maior atividade específica para quitinase após ser reunida, foi dialisada exaustivamente contra água destilada e posteriormente, liofilizada.

4.7.3 Cromatografias de Afinidade em Matriz de Quitina

A matriz cromatográfica quitina foi utilizada do mesmo modo, em duas ocasiões, diferindo apenas da amostra utilizada. A amostra [D1 - Primeira fração não retida em matriz de DEAE-Celulose (11,4 mgP) ou A1 -primeira fração proteica não retida na matriz de “Affi- gel blue gel” (10 mgP)] foi ressuspendida em tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2 e aplicada à coluna de cromatografia de afinidade em matriz de quitina equilibrada com o mesmo tampão. A amostra permaneceu por meia hora em contato com a matriz, antes do início da retirada das proteínas não retidas. Posteriormente, a matriz foi percolada com esse mesmo tampão até a remoção das proteínas não adsorvidas na matriz. A retiradas das proteínas que interagiram com a matriz se deu por meio da aplicação de ácido acético 0,05 M e, após zerada a leitura a 280 nm, uma eluição adicional com tampão glicina 0,01 M, pH 9,0 foi realizada. As proteínas não retidas foram retiradas a um fluxo de 30 mL/h e as retidas a 45 ml/h. As frações foram coletadas em 3 ml (cromatografia utilizando amostra D1) e 1,5 ml (cromatografia utilizando amostra A1) por tubo. Todo o procedimento foi monitorado por leituras das absorbâncias a 280 nm. A cromatografia utilizando a amostra A1, foi acompanhada da realização de determinação de atividade quitinásica e de eletroforese.

4.7.4 Cromatografias de troca iônica em Matriz de CM-sepharose

A matriz de CM-Sepharose foi utilizada para a realização de três Cromatografias com uso de três amostras diferentes: amostra 1 (D1 - 31,35 mgP), amostra 2 (A1) e amostra 3 (F 2 – fração oriunda da precipitação encerrando 2% de TCA). A coluna foi equilibrada com tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,2 e uma amostra foi aplicada. A fração proteica não retida foi eluída com o tampão de percolação da coluna. As proteínas retidas foram eluídas com a adição de NaCl ao tampão de equilíbrio nas seguintes condições: 0,2 M, 0,6 M e 1M de

184 NaCl (amostra 1), 1 M de NaCl (amostra 2) e 0,25M de NaCl (amostra 3). A cromatografia seguiu em um fluxo de 30 mL/h. As frações foram coletadas em 6, 5 e 3 mL por tubo para as amostras 1,3 e 3 mL, respectivamente. Todo o procedimento foi monitorado por leituras das absorbâncias a 280 nm e acompanhada da realização de determinação de atividade quitinásica. As frações oriundas dessa cromatografia com a amostra 3 (F 2) foram exaustivamente dialisadas contra água e lofilizadas, bem como utilizadas para verificação do perfil por eletroforese.

4.7.5 Cromatografia de afinidade em Matriz de “Affi-gel blue gel”

A matriz de Affi-gel blue gel (12,5 cm x 1,7 cm) foi equilibrada com o tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2 e D1 - 1ª Fração proteica não retida na matriz de DEAE (3,33 mgP) foi ressuspendida no mesmo tampão de equilíbrio e aplicada a matriz. Após o contato de meia hora com a matriz, as frações proteicas não retidas foram eluídas com o tampão de percolação da coluna e a fração proteica retida foi eluída com a adição de 0,4 M de NaCl ao tampão de equilíbrio. Fluxo para a retiradas das proteínas não retidas foi de 20 mL/h e o fluxo para a saída das proteínas retidas foi de 30 ml/h. Foram coletadas frações de 3,0 mL por tubo. Todo o procedimento foi monitorado através de leituras das absorbâncias em 280 nm, bem como através de ensaio de atividade quitinásica e eletroforese. A fração que encerrou maior atividade específica para quitinase após ser reunida, foi dialisada exaustivamente contra água destilada e posteriormente, liofilizada.

4.7.6 Cromatografia de Troca iônica em Matriz de Resource Q Sistema de de FPLC (“Fast Protein Liquid Cromatography”)

A Cromatografia de troca iônica em matriz de Resource Q (6,4 mm x 30 mm) acoplada ao sistema de FPLC foi realizada com a aplicação de C1 (2 mgP) – Fração proteica não retida na matriz de CM-sepharose realizada com amostra 3 (F 2), após o equilíbrio dessa matriz com o tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,2. As proteínas não retidas foram eluídas com o tampão de percolação da coluna e as proteínas retidas foram eluídas com a adição de

185 0,1 M de NaCl ao tampão de equilíbrio. A cromatografia correu em um fluxo de 0,5 mL/min e as frações coletadas forma de 0,5 mL por tubo. Todo o procedimento foi monitorado através de leituras das absorbâncias em 280 nm, bem como através de ensaio de atividade quitinásica e eletroforese.

4.7.7 Eletroforese em Gel de Poliacrilamida

As frações obtidas de algumas cromatografias conforme descritas foram analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida, na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS), seguindo a metodologia de Laemmli (1970), adaptadas para uso em placas. Foram utilizados géis de concentração com 3,5% e de separação de 12,5% de acrilamida. As amostras proteicas (3 µg) foram dissolvidas em tampão de amostra (Tris-HCl 0,0625 M, pH6,8 com SDS 2%, glicerol, azul de bromofenol e β-mercaptoetanol). As amostras foram aquecidas a 100 °C, durante 10 min, e centrifugadas a 10.000 x g, durante 5 min, a 4 °C. Em seguida, 25 µL de cada amostra foi aplicado em poços feitos em um gel vertical de 2 mm de espessura. As corridas foram conduzidas a uma corrente constante de 20 mA por placa, durante 1,5 h. as bandas proteicas foram visualizadas revelando-se o gel com nitrato de prata (BLUM; BEIER; GROSSA, 1987). Como padrão de massa molecular foram usadas miosina (212 kDa), β-galactosidase (116 kDa), fosforilase B (97,4 kDa), albumina sérica bovina (66,2 kDa), albumina do ovo (45,0 kDa), anidrase carbônica (31,0 kDa), inibidor de tripsina da soja (21,4/ 19,7 kDa) e lisozima (14,2 kDa) (AMRESCO Inc., Ohio, EEUU) e α-lactoalbumina do leite bovino - 14,2 kDa, inibidor de tripsina da soja – 20,1 kDa, tripsinogênio do pâncreas bovino – 24,0 kDa, anidrase carbônica bovina 29,0 kDa, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de músculo de coelho 36,0 kDa, albumina do ovo – 45,0 kDa, albumina bovina – 66,0 kDa da Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, EEUU).

4.8 Análise Estatística

Os dados foram apresentados como média ± desvio padrão das triplicatas. Para outras

186 análises, os dados foram mostrados como média de três determinações e os valores de desvio- padrão foram omitidos uma vez que mostraram valores inferiores a 5% da média.

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Seleção das Espécies Vegetais

A existência de uma imensa quantidade de espécies vegetais a serem exploradas, torna difícil a seleção daquelas que devem ser investigadas quanto ao seu potencial bioativo (farmacológico, industrial e biotecnológico), por isso relatos da medicina popular costumam ser eficazes na identificação de espécies vegetais potencialmente terapêuticas, auxiliando nas pesquisas que visam a utilização de compostos de plantas para a produção de fitoterápicos, por exemplo (FETROW; ÁVILA, 1999, MACIEL et al ., 2002). As espécies vegetais utilizadas neste estudo para a avaliação do potencial bioativo, foram as mesmas utilizadas para a avaliação do potencial nutricional e foram escolhidas devido, principalmente, à presença de substâncias classificadas como fatores ‘antinutricionais’, as quais, muitas delas (inibidores de proteases, lectinas, ureases), são substâncias bioativas (SUNEJA et al. , 2011), onde uma de suas funções relaciona-se com a defesa de plantas contra pragas e patógenos (MACEDO et al ., 2006; OLIVEIRA et al ., 2007 CHAUDHARY et al ., 2008). Além disso, a disponibilidade de suas sementes e o uso na medicina popular pelas propriedades terapêuticas apresentada por algumas delas, também contribui para a seleção e investigação de compostos ativos (TABELA 1). O uso de plantas para o tratamento de doenças no mundo contribui significativamente para o cuidado com a saúde. No Brasil, muitas plantas são utilizadas na forma de extrato bruto, infusões ou emplastos no tratamento de infecções comuns, sem nenhuma evidência científica, tornando-se necessário validar o uso das mesmas (HOLETZ et al ., 2002; SOUZA et al ., 2004). Várias plantas são utilizadas para o tratamento de infecções respiratórias e, na TABELA 1 podemos ver algumas delas como: C. bracteosa , C. ferrea , E. velutina , e espécies do gênero Hymenaea .

187 TABELA 1 – Espécies vegetais utilizadas nesse estudo, nome botânico e popular, uso na medicina popular, quantidade de sólido solúvel e quantidade de proteína

Sólido solúvel do Quantidade de proteína Espécies vegetais Uso medicinal popular Extrato (mg/ml) Nome Científico/ Nome Popular (mg/ml)

Vermífugo, tratamento de 28,11 ± 0,08 2,17 ± 0,02 Caesalpinia bracteosa Tul. (Catingueira) infecções respiratórias, hepatite, disenteria e anemia (MAIA ,2004) Tratamento de doenças nos 28,14 ± 0,54 1,40 ± 0,01 Caesalpinia ferrea Mart. (Jucá, pau-ferro) brônquios, nos pulmões e diabetes (MAIA ,2004) Tratamento de pedra nos rins, 26,33 ± 1,09 7,46 ± 0,73 disfunções da glândula próstata e Dioclea megacarpa Rolfe (Mucunã, olho-de-boi) ações analgésicas (BATISTA, 1993; BATISTA et al. , 1995)* Enterolobium contortisiliquum (Vell.) Morong Anti-inflamatório (AGRA et al. , 35,23 ± 1,54 3,13 ± 0,15 (Orelha-de-macaco, orelha-de-nego) 2007) calmante, sudorífica, emoliente e 32,25 ± 1,37 7,71 ± 0,66 Erythrina velutina Willd. (Mulungu) anestésica local, insônias, tosse e Vermífugo (AGRA et al. , 2007) Continua

188 TABELA 1 – Espécies vegetais utilizadas nesse estudo, nome botânico e popular, uso na medicina popular, quantidade de sólido solúvel e quantidade de proteína Continuação

Sólido solúvel do Quantidade de proteína Espécies vegetais Uso medicinal popular Extrato (mg/ml) Nome Científico/ Nome Popular (mg/ml)

Tratamento bronquites, problemas 11,80 ± 0,10 1,13 ± 0,07 estomacais, atividades analgésicas e anti-inflamatórias Hymenaea courbaril L. (Jatobá, Madeira nova) (MARSAIOLI; LEITÃO FILHO; DE CAMPELO, 1975; CORREA, 1984; NEVES et al. , 1993)* Laxativo e hepatoprotetor 33,29 ± 1,22 7,70 ± 0,81 Lonchocarpus sericeus (Poiret) Kunth (Ingá) (AGBONON; GBEASSOR, 2009) Antidiarréica e tratamento e 28,50 ± 0,82 1,32 ± 0,08 Parkia platycephala Benth. (Visgueiro) feridas (MARTINS,1989)

Piptadenia moniliformis Benth. (Catanduva) Leucorréia (REITZ, 1950)* 36,70 ± 1,36 4,30 ± 0,21

Feridas e antidartroso 54,71 ± 2,02 2,40 ± 0,11 Senna rugosa (G.Don) H.S.Irwin & Barneby (MOREIRA, 1862; CASTRO, (Lagarteiro) 1878)

Média ± desvio padrão de três análises, cada uma em triplicata * Uso medicinal popular referente apenas ao gênero devido à ausência de relatos na literatura sobre a espécie. 189 O estudo dessas espécies pode levar à descoberta de compostos antimicrobianos ou até mesmo imunomoduladores, como ocorreu com uma planta nativa do sul da África, Pelargonium sidoides , que é comercializada na Alemanha há mais de cinqüenta anos para tratamento de infecções causadas por bactéiras (HAANWINCKEL; MIGOWISKI; REI, 2006). Assim, a análise da TABELA 1 mostra que a espécie vegetal que apresentou atividade anti-inflamatória foi a E. contortisiliquum e as propriedades analgésicas estavam presentes em espécies dos gêneros Dioclea e Hymenaea . C. bracteosa e o gênero Dioclea são usados popularmente no tratamento de distúrbios renais, E. velutina e C. bracteosa são utilizadas como vermífugo, C. ferrea no tratamento de diabetes, S. rugosa como antidartoso e o gênero Piptadenia para o tratamento de feridas e leucorréia, sendo os três últimos, sinais e sintomas indicativos de ação antifúngica (FENNER et al ., 2006). Dentre as espécies citadas, E. velutina e C. bracteosa destacaram-se por apresentar mais propriedades terapêuticas distintas e, muito provavelmente, pode conter mais compostos bioativos. Além dessas plantas, várias outras da flora brasileira são empregadas na medicina popular, com eficiente atividade medicinal, utilizadas com finalidade antisséptica, antifúngica e no tratamento de doenças infecciosas (HOLETZ et al ., 2002; SOUZA et al ., 2004). A pesquisa realizada por Lima et al. (2005) avaliou a existência de atividade antibacteriana de extratos brutos, de diferentes partes da planta, de vinte e cinco espécies brasileiras usadas na medicina popular e mostrou que, entre os quarenta e nove extratos testados, catorze foram ativos contra bactérias, comprovando a bioatividade de plantas usadas na medicina popular. Através do estudo foi possível também o isolamento do composto responsável pela atividade biológica por separações bioguiadas. Esse e outros estudos têm confirmado a presença de atividade antimicrobiana em plantas medicinais (ALVES et al ., 2000; HOLETZ et al ., 2002; SARTORI et al ., 2003; CAMPOS et al ., 2007; LIMA et al ., 2005). A diversidade de espécies presentes na flora brasileira tem intensificado a busca de novos agentes antimicrobianos de ocorrência natural pela necessidade de combater a resistência de micro-organismos a exposições sucessivas a compostos sintéticos (ADEBAJO; OLOREK; ALADESANMI, 1989; BRITO; BRITO 1993; MIGUEL et al ., 1996; LIMA, 2001; YUNES; FILHO, 2001; SCHAECHTER et al ., 2002). Neste intuito, é relevante um “screening” de determinação de compostos bioativos nas dez espécies escolhidas para estudo.

190 5.2 Sólido Solúvel e Proteínas solúveis do Extrato Bruto das Espécies Vegetais da Caatinga

O sólido solúvel do extrato bruto das dez espécies foi determinado pela pesagem de 1 ml extrato bruto liofilizado, feito na intenção de comparação com a quantidade de proteínas. Percebe-se, pela TABELA 1, que a quantidade de sólido solúvel do extrato bruto das espécies vegetais é bem maior do que a quantidade de proteínas extraídas de suas sementes, variando de 11,80 ± 0,10 ( H. courbaril ) a 54,71 ± 2,02 mg/ml ( S. rugosa ), ao passo que as proteínas variam de 1,13 ± 0,07 ( H. courbaril ) a 7,71 ± 0,66 mg/ml ( E. velutina ). As espécies C. bracteosa e E. velutina , destacadas por suas propriedades terapêuticas diversas, apresentam 28,11 ± 0,08 e 32,25 ± 1,37 mg/ml de sólido solúvel e 2,17 ± 0,02 e 7,71 ± 0,06 mg/ml de proteínas, respectivamente. Em termos percentuais, as proteínas de E. velutina representam cerca de 24% do total do sólido solúvel de seu extrato bruto e o de C. bracteosa representa apenas 7,72%. A espécie C. ferrea apresenta quantidade ainda menor de proteínas (1,40 ± 0,01), representando cerca de 5% em relação ao sólido solúvel (28,14 ± 0,54). Esses dados mostram que as propriedades terapêutcas apresentadas por essas espécies podem ser devido não só as proteínas, mas também devido a presença de outras substância que, por ventura, possam ser extraídos juntamente com as proteínas, como os metabólitos secundários (que também se apresentam como compostos bioativos), carboidratos e outras substâncias solúveis. Comparações mais concretas a respeito da relação proteínas/sólido solúvel tornam-se mais claras após identificação tanto de compostos proteicos como de sustâncias originadas do metabolismo secundário de plantas e investigação de atividades biológicas dos extratos das espécies em estudos. Assim, o correlacionamento poderá nos levar aos objetivos almejados que é apresentar espécies promissoras para o isolamento de compostos bioativos.

5.3 Metabólitos Secundários em Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga

O estudo fitoquímico de detecção dos metabólitos secundários foi realizado devido às propriedades químicas e farmacêuticas por eles apresentados que os tornam compostos bioativos e, que já foram isolados, apresentando eficiência comprovada na proteção da saúde

191 de seres humanos e de plantas (WATSON et al., 2001; RASKIN et al., 2002; REDDY; ODHAV; BHOOLA, 2003; FORBEY et al., 2009). O resultado desse estudo está mostrado na TABELA 2. A maioria das espécies avaliadas apresentou saponinas em seus extratos brutos, com exceção das espécies P. moniliformis e C. bracteosa . e, apenas três espécies ( E. contortisiliquum , H. courbaril e S. rugosa ) não apresentaram flavonas, flavonoides e xantonas. Em contrapartida, antocianinas, antocianidina, esteroides, flavanonas e leucoantocianidinas eram ausentes em todas as espécies, e apenas a espécie C. ferrea continha catequinas em seu extrato bruto, assim como as chalconas e auronas só estavam presentes em S. rugosa e os flavononois em H. courbaril . Os taninos foram encontrados nas espécies de C. bracteosa e C. ferrea , nesta última os fenóis também eram presentes, assim como em P. moniliformis e S. rugosa . Já os triterpenoides, só foram encontrados em E. velutina , L. sericeus e, também, na S. rugosa . Nas espécies C. bracteosa , D. megacarpa , E. velutina e L. sericeus foi detectado a presença de alcaloides em seus extratos brutos. Os compostos fenólicos compreendem os flavonoides, xantonas, antocianinas, as catequinas e os taninos. Os flavonoides são substâncias de constituição variada, por isso são divididos em diferentes classes, tais como flavonois, flavonas, isoflavonas, chalconas, auronas e flavanonas (HAHLBROCK, 1981; HARBORNE, 1984; ASOLINI et al. , 2006). Segundo Barnes; Anderson e Phillipson (2001), os compostos fenólicos têm propriedades anti- inflamatórias, antimicrobianas, antitumorais e antidiabéticas e foram encontrados em todas as espécies vegetais analisadas nesta pesquisa, com exceção da espécie E. contortisiliquum (TABELA 2). A pesquisa realizada por Asolini et al. (2006), comprovou as propriedades antibacterianas e antioxidante dos compostos fenólicos encontrados em extratos aquosos e etanólicos de arruda ( Ruta graveolens ), camomila ( Matricaria chamomilla ), macela (Achyrocline satureioides ), alcachofra ( Cynara scolymus ), erva-mate ( Ilex paraguariensis ), tanchagem ( Plantago major ), malva ( Malva silvestris ), sálvia ( Salvia officinalis ), capim- limão ( Cymbopogon citratus ) e alecrim ( Rosmarinus officinalis ), o que mostra a potencialidade desses compostos. Além dos compostos fenólicos, foram analisados os metabólitos secundários pertencentes à classe dos terpenos: as saponinas e os triterpenoides. As saponinas dentre suas inúmeras propriedades, destacam-se por suas propriedades farmacológicas, medicinais, hemolíticas, antimicrobiana e inseticida (ATTELE; WU; YUAN, 1999; ODA et al ., 2000;

192 TABELA 2 – Detecção de metabólitos secundários no extrato bruto de sementes de espécies vegetais da caatinga

Anto- Cate- Chalco- Esteroi- Fenóis Flavano flavonas, Flavono Leucoan Saponi- Taninos Triterpe -nas flavonois, cianinas quinas nas, des -nois -tociani- nas -noides Espécies Alcaloi- xantonas des antocia- (taninos auronas dinas Vegetais nidinas caté- quicos )

1 C. bracteosa +1 ______+ _ _ _ + _

C. ferrea _ _ + _ _ + _ + _ _ + + _

D. megacarpa + ______+ _ _ + _ _

E. ______+ _ _ _ contortisiliquum

E. velutina + ______+ _ _ + _ +

H. courbaril ______+ _ + _ _

L. sericeus + ______+ _ _ + _ +

P. platycephala ______+ _ _ + _ _

P. moniliformis _ _ _ _ _ + _ + _ _ _ _ _

S. rugosa _ _ _ + _ + _ _ _ _ + _ +

+ 1 : detectado; _1 : Não detectado 193 SPARG; LIGHT; VAN STADEN, 2004). Podem ser utilizadas ainda várias aplicações incluindo produção de cosméticos e produtos farmacêuticos (PRICE; JOHNSON; FENWICK, 1987; PETIT et al ., 1995; UEMATSU; HIRATA; SAITO, 2000; SPARG; LIGHT; VAN STADEN, 2004). As saponinas estavam presentes na maioria dos extratos de sementes das espécies utilizadas neste estudo, assim como também foi encontrada e isolada de sementes da espécie Mimusops laurifolia (ESKANDER et al ., 2006). Os metabólitos secundários, da classe dos compostos nitrogenados estudados, foram os alcaloides que são compostos altamente tóxicos, associados à defesa de plantas contra a herbivoria há bastante tempo (WALLER; NOWACKI, 1978; WINK, 1998). Os alcaloides possuem propriedades farmacológicas e têm sido usados para o tratamento clínico de câncer, parkinson, hipertensão e desordem no metabolismo central (RATHBONE; BRUCE, 2002). Esses compostos foram encontrados em quatro espécies de plantas deste estudo ( C. bracteosa , D. megacarpa , E. velutina e L. sericeus ), como citado anteriormente. Esses dados mostram a existência de compostos secundários biologicamente ativos nas espécies estudadas que são de interesse para as indústrias farmacêuticas, cosméticas e agrícolas, podendo se constituir, ao lado da indução de resistência, mais uma forma potencial de controle alternativo de doenças em plantas cultivadas. A espécie que se destaca neste estudo fitoquímico é a C. ferrea por apresentar mais metabólitos secundários e de duas classes diferentes (compostos fenólicos e terpenos), embora as outras espécies também sejam igualmente promissoras.

5.4 Proteínas Bioativas em Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga

A família das leguminosas (Fabaceae) é conhecida por sua variedade de compostos de defesa de plantas, originados tanto do metabolismo secundário, tais como os compostos fenólicos, alcaloides, terpenoides, quanto do metabolismo primário, como lectinas, proteases quitinases, glucanaes e inibidores de proteases. Todos, conhecidamente apresentam atividades inseticida, antifúngica e antibacteriana (GOMES et al. , 1996; FRANCO; MELO, 2000; CARLINI; GROSSI-DE-SÁ, 2002; WINK; MOHAMED, 2003 KIM et al. , 2005; KAKU et al ., 2006; VAN LOON et al ., 2006; OLIVEIRA et al. , 2007; REVINA et al., 2010), além de outras propriedades com aplicabilidades na prática medica.

194 Partindo desse pressuposto, foi realizada a detecção e dosagem de proteínas bioativas nos extratos das sementes selecionadas. O conteúdo de lectina, inibidor de tripsina, urease, quitinase, β-1,3-glucanase e a análise qualitativa de atividade proteolítica estão mostrados na TABELA 3. A atividade lectínica contra eritrócitos de coelhos não tratadas e tratadas com protease foi encontrada nas espécies: D. megacarpa (1.280 / 2.560 UH/gP), E. velutina (1.280 / 1.280 UH/gP), L. sericeus (1.280 / 2.560 UH/gP), P. platycephala (2.560 / 2.560 UH/gP) e S. rugosa (80 / 160 UH/gP). Após o tratamento das células de eritrócitos com protease, foi verificado aumento de atividade hemaglutinante em apenas três espécies. A presença de lectinas no extrato bruto de D. megacarpa era esperada devido ao isolamento prévio das lectinas glucose/manose específica e lactose específica realizados por Moreira et al . (1983) e Melgarejo, Vega e Pérez (2005) respectivamente. O mesmo é válido para E. velutina e L. sericeus pelo fato de já terem sido detectadas atividades hemaglutinantes nessas espécies (MORAES et al., 1996; PROLL et al., 1998). Entretanto, duas novas fontes de lectinas foram encontradas. As sementes de vegetais, em especial de leguminosas, são ricas fontes de lectinas (MANCINI-FILHO; LAJOLO; VIZEU ,1979; PUSZTAI, 1989;VEJA; PÉREZ, 2006), por isso já foram purificadas a partir de várias sementes incluindo as do gênero Artocarpus (TRINDADE et al ., 2006), de Crotalaria pallida (REGO et al., 2002), em sementes de Moringa oleifera (SANTOS et al., 2005) e também, foi detectada no extrato bruto de sementes de uma espécie de leguminosa selvagem ( Acácia constricta ) com título de hemaglutinação de 419 UH/mgP, sendo purificada posteriormente (GUZMÁN-PARTIDA et al., 2004). As lectinas são consideradas ferramentas importantes na pesquisa biomédica e biotecnológica onde são amplamente utilizadas. Isso se deve a capacidade de ligação a carboidratos com alto grau de especificidade que pode ser comprável a especificidade de anticorpos. Assim, essas proteínas são muito utilizadas na engenharia genética como proteínas de defesa de plantas contra predadores, mas também bastante analisadas para usos em campos clínicos, pelas suas propriedade de afinidade por antígenos de células tumorais, podendo ser usadas em estudos imunohistoquímicos e celulares, sendo potenciais ferramentas bioadesivas na entrega de drogas; podem impedir a proliferação de células leucêmicas, inibir resposta mitogênicas, entre outras (MATSUÍ et al ., 2001; GABOR; KLAUSEGGER; WIRTH, 2001; YAN et al ., 2005; VEJA; PÉREZ, 2006; WONG e NG, 2006; WONG et al ., 2006; MACEDO

195 TABELA 3 – Detecção e dosagem de proteínas bioativas no extrato bruto de sementes de espécies vegetais da caatinga

Inibidor β-1,3- * ¶ § Espécies vegetais Lectina Urease Quitinase # Protease** de tripsina † glucanase

Não tratadas Tratadas

Caesalpinia bracteosa ND ND 16,2 ± 0,8 11.278 ± 1.307 1,55 ± 0,12 0,3 ± 0,05 -

Caesalpinia férrea ND ND 27,4 ± 0,2 822 ± 50 2,0 ± 0,33 ND -

Dioclea megacarpa 1.280 2.560 10,8 ± 0,1 47.178 ± 3.351 0,26 ± 0,04 0,04 ± 0,01 +

Enterolobium contortisiliquum ND ND 26,2 ± 0,1 3.684 ± 173 0,34 ± 0,03 0,08 ± 0,04 -

Erythrina velutina 1.280 1.280 24,0 ± 0,8 3.645 ± 171 0,23 ± 0,02 0,02 ± 0,01 +

Hymenaea courbaril ND ND 4,5 ± 0,2 620 ± 28 0,55 ± 0,04 0,01 ± 0,0 -

Lonchocarpus sericeus 1.280 320 8,3 ± 0,3 23.895 ± 3.388 0,24 ± 0,02 0,05 ± 0,01 -

Parkia platycephala 2.560 2.560 ND 5.907 ± 967 0,66 ± 0,05 0,13 ± 0,02 +

Continua

196 TABALA 3 - Detecção e dosagem de proteínas bioativas no extrato bruto de sementes de espécies vegetais da caatinga Continuação

* # Lectina Inibidor ¶ β-1,3-glucanase Espécies vegetais Urease Quitinase § Protease** de tripsina †

Não Tratadas Tratadas

Piptadenia moniliformis ND ND 8,9 ± 0,5 1.899 ± 228 1,12 ± 0,0 0,21 ± 0,04 +

Senna rugosa 80 160 4,1± 0,4 465 ± 13 0,32 ± 0,03 0,8 ± 0,01 -

Média ± desvio padrão de três análises, cada uma em triplicata, com exceção da dosagem de lectinas que foram expressas apenas as médias. ND = não detectado. * UH/gP, onde Uma UH corresponde ao valor recíproco da maior diluição capaz de provocar aglutinação visível a olho nu em eritrócitos de coelhos tratatos e não tratados com protease do Bacillus licheniformis (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA); † ( µgTI/mgF), Atividade inibitória de tripsina é expressa por µg de tripsina inibida por miligrama de farinha; ¶ (U/KgF), A atividade ureásica foi expressa como unidades de enzima por Kg de farinha; § Atividade quitinásica está expressa em nKat/mgP, onde 1 nKat representa 1 nmol de N-acetil-D-glucosamina liberado por segundo. #Atividade β-1,3-glucanásica está expressa em nKat/mgP, onde 1 nKat equivale a 1 nmol de glucose liberado por segundo. ** + = detectado e – Não detectado através de atividade gelatinásica.

197 et al ., 2007). Dessa forma, a presença das lectinas em algumas das espécies de leguminosas avaliadas é interessante para estudos na área agrícola e médica. Os inibidores de proteinase, incluindo os da classe serínica, são intensamente estudados em relação a sua atuação na defesa de plantas em resposta aos estresses abióticos e, principalmente, bióticos frente ao ataque de vários micro-organismos patogênicos (FRANCO; MELO, 2000; CARLINI; GROSSI-DE-SÁ, 2002; BREITENEDER; RADAUER, 2004; KIM et al ., 2005) São, também, compostos protéicos de grande interesse por agirem como moduladores, desempenhando papéis em uma variedade de funções fisiológicas importantes tais como coagulação sanguínea, fibrinólise, apoptose, desenvolvimento, inflamação e ativação do complemento em humanos (VAN GENT et al ., 2003; LU et al ., 2008). Dentre outras numerosas funções, ainda possuem propriedades antivirais e anticarcinogênicas. (KENNEDY, 1998a,b; ZHANG et al ., 2007; LIN; NG, 2008). Todas as espécies apresentaram inibidores de tripsina com exceção de P. platycephala (TABELA 3). A espécie S. rugosa apresentou menor capacidade de inibir tripsina (4,1 ± 0,4 µgTI/mgF) e C. ferrea destacou-se por inibir com mais eficiência essa enzima (27,4 ± 0,2 µgTI/mgF), seguida de E. contortisiliquum (26,2 ± 0,1 µgIT/mgF) e E. velutina (24,0 ± 0,8 µgTI/mgF). A quantidade de tripsina inibida encontrada por Vasconcelos et al . (2010) em três cultivares de feijão-de-corda variou de 12,0 ± 1,12 a 16,67 ± 1,42 gTI/KgF, sendo esses valores menores que os encontrados para essas sementes de leguminosas, se for levado em consideração a unidade utilizada para a atividade enzimática (expressar em µgIT/mgF é o mesmo que expressar em gTI/KgF). A simples presença dessa atividade pode levar a purificação do inibidor que é uma substância com diversas atividades biológicas interessantes a serem aplicadas em diferentes áreas. A TABELA 3 mostra que a urease encontra-se presente em todas as sementes das espécies avaliadas, com quantidades que variam de 465 ± 13 ( S. rugosa ) a 47.178 ± 3.351 ( D. megacarpa ) de urease/KgF, sendo menor que aquelas presentes em sementes de soja, cujos valores variaram de 107.320 ± 9,47 a 219.280 ± 2,60 U de urease/KgF (VASCONCELOS et al ., 2001), mostrando o potencial bioativo dessas espécies nativas da caatinga, posto que as ureases possuem papel na defesa de plantas contra insetos Coleoptera e Hemíptera , sendo mais tóxicas do que inibidores de α-amilase, inibidores de proteinases e do que algumas lectinas (CARLINI et al ., 1997; CARLINI; GROSSI-DE-SÁ, 2002). Além disso, também possuem função de ativação de plaquetas sanguíneas (FOLLMER, 2008), as quais podem ser aproveitadas pelas indústrias agrícolas e farmacêuticas.

198 Foi determinada a presença de proteínas relacionadas à patogênese como quitinases e β-1,3-glucanases. Assim como as outras proteínas, as quitinase e as glucanases foram escolhidas por apresentarem diversas propriedades as quais podem ser utilizadas para diversos fins. Essas enzimas também estão envolvidas na defesa das plantas contra patógenos, principalmente fungos (BOLLER et al. , 1983; MAUCH; MAUCH-MANI; BOLLER, 1988; MAJEAU et al. , 1990; GOMES et al. , 1996; RADUTOIU et al . 2003; KASPRZEWSKA, 2003; KAKU et al . 2006; ALCAZAR-FUOLI et al. , 2010), podendo ser utilizadas para biotecnologia. Além disso, as quitinases também são úteis em processos de bioconversão de lixo (restos de crustáceos) em produtos derivados de quitina, que podem ser aproveitados, e, podem, ainda, ser aplicadas na medicina,através de seu uso para produção de quitoligossacarídeos, glicosaminas e GlcNAc, por apresentar atividades antitumorais. (DAHIYA; TEWARI; HOONDAL, 2006). Mostram, assim, seu grande potencial farmacológico. Nas espécies utilizadas nessa pesquisa todas apresentaram atividade quitinolítica e quase todas foram capazes de catalisar a quebra hidrolítica de ligações β-1,3-glucosídicas, menos a espécie C. ferrea . Em geral, os extratos brutos das sementes de todas as espécies mostraram uma alta atividade da enzima quitinase em relação à atividade apresentada por alguns genótipos de soja, cuja variação foi de 0,26 a 0,44 nKat/mgP (SIEBRA, 2004). No entanto, algumas se sobressaíram: C. ferrea (2,0 ± 0,33 nKat/mgP), C. bracteosa (1,55 ± 0,12 nKat/mgP) e P. moniliformis (1,12 ± 0,0 nKat/mgP), podendo ser utilizadas para a purificação de quitinases. Em relação as β-1,3-glucanases, ao contrário das quitinases, a maioria das espécies apresentou baixa atividade e algumas apresentaram atividade razoável ( C. bracteosa - 0,3 ± 0,05 nKat/ml; P . platycephala - 0,13 ± 0,02 nKat/ml; P. moniliformis - 0,21 ± 0,04), embora mais baixa que as atividades encontradas por Souza (2001) em sementes de dois genótipos de soja 9,84 e 12,06 nKat/mgP. Todavia, a presença dessas enzimas em sementes de espécies nativas subexploradas no campo científico, contribui para estudos futuros que visam aprimorar o uso dessas espécies. A atividade proteolítica das espécies vegetais foi detectada pela capacidade de degradar ou não gelatina, como substrato inespecífico. Poucas espécies foram capazes de degradar gelatina, limitando a atividade proteolítica a apenas quatro espécies: D. megacarpa , E. velutina , P. platycephala e P. moniliformis . Entretanto, são necessários ensaios mais específicos de atividades proteolíticas para uma real afirmação de ausência dessa atividade apresentada por algumas das espécies testadas. 199 As proteases também estão envolvidas na defesa da planta com papéis distintos, atuando na percepção, sinalização e execução do processo de defesa (VAN DER HOORN; JONES, 2004), Além disso, também participam da esporulação e liberação conidial, germinação, modificação de proteínas, regulação da expressão gênica e morte celular programada (TORNERO 1996; BEERS; JONES; DICKERMAN, 2004). Em animais e seres humanos, as proteases são importantes para o catabolismo de proteínas, coagulação sanguínea, inflamação, crescimento e migração celular, morfogenia e desenvolvimento, crescimento de tumores e metástases, liberação de hormônios, transporte de proteínas, entre outras (GODFREY; WEST 1996). As diversas funções das proteases fazem essa classe de proteínas bastante promissoras para aplicações nas indústrias farmacêuticas. A hipótese de que as sementes de plantas nativas da caatinga apresentam proteínas com potencial bioativo foi comprovada, pois os extratos brutos de todas as espécies apresentaram pelo menos três proteínas bioativas e, em duas espécies ( D. megacarpa e E. velutina) estavam presentes todas as proteínas bioativas avaliadas. Os extratos brutos de P. moniliformis , P. platycephala e de S. rugosa destacaram-se por apresentar quase todas as proteínas testadas com exceção de apenas uma delas. Assim, qualquer uma das dez espécies poderia ser escolhida para isolamento total ou parcial de uma ou mais proteínas detectadas e avaliação de suas atividades biológicas para futuras aplicações nas indústrias farmacêuticas, agrícolas ou, até mesmo, na indústria de cosmético.

5.5 Avaliação de Toxicidade dos Extratos Brutos de Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga

O ensaio de toxicidade aguda foi realizado em camundongos injetando-se os extratos brutos das espécies por via intraperitoneal,visando a detecção de substâncias tóxicas (toxinas) nos extratos brutos das dez sementes das espécies vegetais. Alterações fisiológicas como dispnéia, convulsões tônico-clônicas, culminando na morte dos animais, caracterizam a presença de toxinas. Estas são encontradas em diferentes organismos compondo o arsenal de defesa em conjunto com outros compostos (SGARBIERI, 1996). Tem sido relatada a presença de proteínas tóxicas em vegetais, como por exemplo na soja, onde já foram purificadas três toxinas. Morais (2010) sugere a participação das proteínas

200 tóxicas presentes em sementes de soja na defesa do vegetal, tornando essas proteínas potencialmente importantes para o uso na agricultura. Diante dessa possibilidade, a busca por toxinas nesses extratos brutos tornou-se relevante. Os dados da TABELA 4 mostram que as espécies D. megacarpa , E. contortisiliquum e

E. velutina são tóxicas para camundongos, apresentando DL 50 de 0,72 ± 0,03; 1,12 ± 0,04 e 1,01 ± 0,02 g/Kg de peso corpóreo, respectivamente. No entanto, essa toxicidade foi bem menor do que a relatada para o genótipo de soja Bays, no qual a DL 50 foi de 0,137 ± 0,02 g/kgP (VASCONCELOS et al ., 2001). De uma maneira geral, pode-se dizer que as espécies avaliadas não são boas fontes de toxinas vegetais, já que apenas três possuíram atividades tóxicas, sendo ainda, relativamente baixa. Após a verificação de várias substâncias biologicamente ativas nos extratos brutos das sementes das dez espécies vegetais escolhidas nesta pesquisa, partiu-se para a avaliação das atividades frente a modelos biológicos, os quais são reconhecidamente afetados por várias substâncias aqui encontradas. O ensaio de determinação de toxicidade dos extratos brutos das dez espécies para larvas de A. aegypti foi conduzido, com larvas de terceiro estádio, no intuito de associar a presença de atividade biológica com os compostos bioativos encontrados nos extratos brutos avaliados. Esse modelo biológico foi escolhido devido ao sério problema de saúde pública pelo qual passa o Brasil e outras regiões do mundo, enfrentando epidemias de dengue, doença contra a qual não existe vacina e cujo controle baseia-se principalmente no combate ao vetor. É, pois, de grande relevância pesquisar fontes naturais de substâncias inseticidas para ajudar a contornar o sério problema do aumento de resistência desses insetos aos inseticidas sintéticos comumente utilizados (MACORIS et al ., 1999; TAUIL, 2002; LAURENTINO DE CARVALHO et al., 2004; BRAGA; VALLE, 2007; JANSEN; BEEBE, 2010). Os extratos brutos das sementes das espécies vegetais avaliadas mostraram um elevado percentual de atividade larvicida com exceção das espécies C. Bracteosa - para a qual não foi detectada toxicidade para as larvas - H. Courbaril e S. Rugosa , as quais apresentaram baixo percentual de mortalidade, girando em torno de 15%. Ao contrário, as espécies D. megacarpa , E . Contortisiluquum e P. Moniliformis apresentaram percentual de mortalidade de larvas de 100%, tornando essas espécies promissoras para o auxílio do combate ao vetor da dengue. Em consonância com esse resultado, uma pesquisa realizada por Ferreira et al . (2009), utilizando o extrato bruto de sementes de M. oleifera Lamarck também apresentou toxicidade para larvas de A. Aegypti com uma LC 50 de 1.260 µg/ml. 201 TABELA 4 – Determinação de atividade tóxica do extrato bruto de sementes de espécies vegetais da caatinga para camundongos e larvas de Aedes aegypti no 3 º estádio de desenvolvimento

Toxicidade aguda Atividade larvicida Espécies vegetais * (DL 50 g/Kg) (% de mortalidade larval de 3º Esdádio)

Caesalpinia bracteosa NL ND

Caesalpinia férrea NL 85,04 ± 3,84

Dioclea megacarpa 0,72 ± 0,03 100,0 ± 0,0

Enterolobium contortisiliquum 1,12 ± 0,04 100,0 ± 0,0

Erythrina velutina 1,01 ± 0,02 75,12 ± 1,89

Hymenaea courbaril NL 13,33 ± 0,54

Lonchocarpus sericeus NL 70,09 ± 2,34

Parkia platycephala NL 70,09 ± 2,34

Piptadenia moniliformis NL 100,0 ± 0,0

Senna rugosa NL 16,67 ± 0,78

* Toxicidade aguda em camundongos (n=6) foi expressa como DL 50 . Uma DL 50 representa a quantidade de proteína em gP/Kg de peso corpóreo de camundongo capaz de produzir convulsão e morte em 50% dos animais após administração por via intraperitoneal. NL = Não letal em doses de 1g/Kg do peso corpóreo de camundongo. ND = Não detectado. Média ± desvio padrão de três análises, cada uma em triplicata.

202 A espécie D. megacarpa contém em seu extrato bruto, todas as proteínas bioativas analisadas e, dentre elas, as lectinas, a presença de atividade proteolítica e toxicidade aguda para camundongos, merecem destaque. Isso porque, embora existam poucos relatos na literatura sobre a atividade larvicida de proteínas de origem vegetal contra Ae. Aegypti, um dos estudos se refere às lectinas de sementes de Myracrodruon urundeuva, mostrando atividade larvicida (SÁ et al ., 2008), outro realizado por Ramos et al ., (2006) relata a toxicidade de proteases cisteínicas para larvas desse inseto e, ainda, toxinas proteicas Cry de Bacillus thuringiensis israelensis (Bti ) também causam mortalidade nas larvas de Ae. Aegypti (BRAVO; GILL; SOBERÓN, 2007). Além das proteínas, a espécie D. megacarpa também apresenta metabólitos secundários como saponinas com propriedades inseticidas e os alcaloides que são altamente tóxicos. Saponinas e óleos essenciais com propriedades larvicidas, repelentes ou deterrentes a ovoposição de Ae. Aegypti, já foram relatadas (MURUGAN; MURUGAN; NOORTHEEN, 2007; CHAPAGAIN; SAHARAN; WIESMAN, 2008; CORIA et al ., 2008; SILVA et al ., 2008). Nesse contexto, esses compostos presentes nesta espécie podem estar envolvidos na toxicidade às larvas do vetor, sozinhas, associadas ou mesmo devido à existência de outras substâncias ativas para insetos que também estão presentes na espécie, mas que não foram estudadas. De forma semelhante, a espécies E. Contortisiluquum também apresentou saponinas em seu extrato bruto, além de outras proteínas, também apresentdas por P. moniliformis que são igualmente prejudiciais ao desenvolvimento dos insetos como os inibidores de tripsina, ureases, as quitinases e presença de proteases, sendo estas últimas pertencentes apenas a P. moniliformis . A preocupação com o meio-ambiente intensifica as buscas por substâncias ativas mais biodegradádeis e seguras, como os bioinseticidas, contra o mosquito da dengue. Nesse sentido, os extratos de plantas têm sido avaliados como fontes naturais de inseticidas e muitos ensaios larvicidas vêm sendo conduzidos com o terceiro (usados nesse estudo) e quarto estádio larval (LUNA et al ., 2005; KIRAN et al ., 2006; MURUGAN; MURUGAN; NOORTHEEN, 2007; COELHO et al ., 2009). As espécies analisadas neste trabalho merecem atenção, no que diz respeito à atividade tóxica para larvas desse inseto, como futuras fonte de inseticidas naturais.

203 5.6 Atividade Antimicrobiana dos Extratos Brutos de Sementes das Espécies Vegetais da Caatinga

Dando continuidade aos ensaios biológicos, quatro espécies de bactérias, sendo duas Gram-negativas ( Klebsiella pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa ) e duas Gram-positiva (Staphylococcus aureus e Bacillus subtilis ) e doze espécies de fungos filamentosos Aspergillus niger, Colletotrichum musae, Colletotrichum truncatum, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Mucor sp., Neurospora sp., Penicillium herguei, Phomopsis sp., Pythium oligandrum, Rhizoctonia solani e Trichoderma viridae foram selecionadas para a avaliação de atividade antibacteriana utilizando os extratos brutos das sementes das dez espécies em estudo (TABELA 5). A atividade antibacteriana foi verificada para as espécies C. bractosa contra Bacillus subtilis e S. rugosa contra Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus , ambas bactérias Gram- positivas. A pesquisa de Lima et al. (2005) também mostrou forte inibição no crescimento de cepas da bactéria Staphylococcus aureus quando em contato com os extratos de diferentes partes das espécies Schinus terebinthifolius , Lafoensia pacari , Serjania lethalis e Jatropha elliptica . A bactéria Gran-negativa Pseudomonas aeruginosa , assim como neste estudo, também não foi inibida pelo extrato salino das sementes da leguminosa Stryphnodendron obovatum Benth. (VASCONCELOS et al. , 2004). O grupo de bactérias Gram-positivas parece ser mais susceptível às substâncias antibacterianas de plantas do que o grupo das bactérias Gram-negativas, segundo a conclusão de Kumar et al. (2006) após a realização de um “screening” com vários extratos de plantas medicinais, frente aos dois grupos bacterianos. No entanto, o perfil químico de seletividade contra Gram-positivas não é restrito apenas aos compostos de plantas, mas sim um fenômeno geral observado em muitos antibióticos (SCHAECHTER et al. , 1999; BASILE et al. , 2000) Acredita-se que a maior resistência encontrada por parte das bactérias Gam-negativas seja à existência de uma membrana externa adicional que dificulta a entrada de substâncias tóxicas na célula (SCHAECHTER et al. , 2002). De uma maneira geral, extratos de sementes de plantas possuem alta atividade antibacteriana (BASILE, 1997 apud TALAS-OĞRA Ş et al. , 2005), já que muitos estudos mostram potentes proteínas antimicrobianas purificada de sementes (KUMARASAMY et al. , 2002).

204 TABELA 5 – Avaliação da atividade antimicrobiana em meio sólido do extrato bruto de sementes de espécies vegetais da caatinga

Micro-organismos Testados

Espécies vegetais Bacterias Fungos

Gram - Gram +

Kp Pa Sa Bs AN CM CT FO FS M N PH P PO RS TV

C. bracteosa -1 - - +2 - - - + ------C. férrea ------D. megacarpa ------+ ------E. contortisiliquum - - - - + - + - - - + - - - - + Er. Velutina ------H. courbaril ------P. platycephala ------L. sericeus ------Pi. Moniliformis - - - - + - + ------Se. Rugosa - - + + ------

Kp: Klebsiella pneumoniae ; Pa: Pseudomonas aeruginosa; Sa: Staphylococcus aureus; Bs: Bacillus subtilis; AN: Aspergillus niger; CM: Colletotrichum musae; CT: Colletotrichum truncatum; FO: Fusarium oxysporum; FS: Fusarium solani; M: Mucor sp.; N: Neurospora sp.; PH: Penicillium herguei; P: Phomopsis sp; PO: Pythium oligandrum; RS: Rhizoctonia solani; TV: Trichoderma viridae. ¹ Não apresentou halo de inibição. 2 Apresentou halo de inibição.

205 Uma vasta gama de proteínas de defesas é produzida pelos vegetais em diferentes locais, por isso várias proteínas antibacterianas e/ou antifúngicas têm sido purificadas, sendo classificadas como tioninas, defensinas, proteínas de transferência de lipídios, quitinases, proteínas ligantes a quitina, β-1,3-glucanases, lectinas, permatinas, 2S albuminas, proteínas inativadoras de ribossomos, peptídeos tipo-heveína, proteínas tipo-knotina, entre outras (CAMMUE et al. ,1995; BROEKAERT et al. , 1997; WANG et al ., 2001; KUMARASAMY et al. , 2002; KELEMU; CARDONA; SEGURA, 2004). Nos extratos de C. bractosa e S. rugosa também foram detecdados a presença de proteínas antibacterianas e/ou antifúngias como quitinases e maiores quantidades de β-1,3- glucanases (TABELA 3) que podem estar envolvidas com a presença da atividade antibacteriana encontrada. Além das proteínas, alguns metabólitos secundários como alcaloides, flavonas, flavonois, xantonas, taninos foram encontrados em C. bractosa, e, calchonas, auronase, fenóis, saponinas e triterpenótides em S. rugosa (TABELA 2). A espécie vegetal Schinus terebinthifolius é conhecida por possuir triterpenos, fenóis e flavonóis (HEGNAUER, 1964 apud LIMA et al , 2005) e seu extrato etanólico, o qual extrái metabólitos secundários, é capaz de inibir o crescimento de Staphylococcus aureus , Pseudomona aeruginosa e Candida albicans (MARTINEZ et al ., 1996; GUERRA et al ., 2000). Assim, não só os compostos proteicos podem atuar frente às bactérias, mas também os compostos oriundos do metabolismo secundário do vegetal existentes nessas espécies. Em relação à avaliação da atividade antifúngica, as espécies C. bracteosa e D. megacarpa foram capazes de inibir o crescimento do fungo Fusarium oxysporum . A espécie P. moniliformis impediu o crescimento dos fungos Aspergillus niger e Colletotrichum truncatum e a espécie E. contortisiliquum apresentou maior potencial antifúngico, uma vez que prejudicou o crescimento de um maior número de fungos ( A. niger , Colletotrichum truncatum , Neurospora sp. e Trichoderma viridae ) (TABELA 5). O “screening” do ensaio antifúngico com as dez espécies vegetais da caatinga mostrou que quatro espécies exibiram atividade contra os fungos testados, significando que 40% das plantas estudadas são fontes potenciais de agentes antifúngicos. Esse resultado foi de grande valia, haja vista as pesquisas de Kelemu, Cardona e Segura (2004), que investigaram o extrato bruto de 26 espécies de leguminosas na busca por propriedades antifúngicas e somente uma delas apresentou forte atividade frente ao fungo Rhizoctona solani ; e a de Schmourlo et al . (2005) que investigou os extratos de dezesseis plantas medicinais e alimentares sobre a inibição do crescimento de três fungos, obtendo atividade antifúngica significante em seis espécies, que representa 37% da potencialidade das espécies. 206 As plantas sintetizam muitos peptídeos e proteínas antifúngicas para se defenderem do ataque de patógenos que são valiosos na proteção de grãos economicamente importantes (NG, 2004; WANG; NG, 2006a; LAM; NG, 2009). Por isso, têm recebido bastante atenção por parte dos pesquisadores que cada vez mais buscam a purificação de peptídeos e/ou proteínas antifúngicas em sementes de leguminosas (CHU; LIU; NG, 2003; WANG; NG, 2005; WaNG e NG, 2006b). Muitos desses compostos produzidos pelas plantas também exercem ação deletéria aos fungos patogênicos para o homem (SELITRENNIKOFF, 2001; PELEGRINI et al ., 2009; PARK; LEE, 2009). Dada a importância clínica, têm sido isoladas novas proteínas exercendo essa ação (AGIZZIO et al. , 2006). Em relação às proteínas bioativas encontradas nas espécies que apresentaram atividade contra fungos (TABELA 5), todas continham inibidor de tripsina, quitinases e β-1,3- glucanases (TABELA 3). Atividade proteolítica estava presente em P. moniliformis e D. megacarpa , esta última apresentando ainda as lectinas. Dentre os compostos secundários estudados, foram encontrados alcaloides em uma espécie que apresentou atividade antifúngica, compostos fenólicos em duas espécies e saponinas em três espécies. Todos esses compostos possuem propriedades antimicrobianas (BENNET; WALLSGROVE, 1994; ATTELE; ; WU; YUAN, 1999; ODA et al ., 2000; BARNES; ANDERSON; PHILLIPSON, 2001; RATHBONE; BRUCE, 2002; SPARG; LIGHT; VAN STADEN, 2004; ASOLINI et al ., 2006) que podem estar envolvidas na atividade antifúngica encontrada. De acordo com TALAS-OĞRA Ş et al. (2005), a triagem de atividade antimicrobiana permite a seleção de extratos de plantas com propriedades úteis para estudos farmacêuticos e bioquímicos. Assim sendo, a identificação de proteínas e de metabólitos secundários que possuem ação antifúngica já relatada na literatura, associando a própria atividade biológica encontrada, pode levar à purificação bioguiada de um desses agentes ou mesmo de outros que não foram testados e contribuir futuramente para minimização de perdas na agricultura com a utilização da biotecnologia, bem como contribuir com a indústria farmacêutica na fabricação de medicamentos capazes de reduzir o desenvolvimento de doenças causadas por fungos patogênicos ao homem.

207 5.7 Espécies Vegetais com Bom Perfil de Bioatividade

Todas as espécies vegetais estudadas apresentaram compostos bioativos frutos do metabolismo primário e do metabolismo secundário e, algumas, apresentaram atividades frente a modelos biológicos patológicos para o homem e/ou para as plantas, então dependendo do composto ou da atividade de interesse qualquer uma das dez espécies pode ser escolhida para um estudo mais aprofundado. Entretanto, no que diz respeito à presença de compostos bioativo associados às atividades biológicas apresentadas neste estudo, as espécies C. bracteosa , D. megacarpa , E. contortisiliquum , P. moniliformis e S. rugosa , apresentam melhor perfil bioativo. A espécie C. bracteosa é usada na medicina popular, através de seus extratos, para o tratamento de varias enfermidades, entre elas, o tratamento de infecções respiratórias (MAIA 2004). Neste trabalho, essa espécie destacou-se por apresentar compostos fenólicos (flavonas, flavonois, xantonas e taninos) e alcaloides, dentre os metabólitos secundários, e, inibidores de tripsina, ureases, elevada atividade de quitinase e β-1,3 – glucanases, dentre as proteínas bioativas avaliadas. Além disso, essa espécie também foi capaz de inibir o crescimento da bactéria Gram-positiva B. subtilis que embora benéfica para as plantas (ARAÚJO, 2008) é causadora de doenças oportunistas em pacientes imunodeprimidos (JAWETZ; MELNICK; ADELBERG, 1998). O extrato dessa espécie também apresentou inibição do crescimento do fungo fitopatogênico Fusarium oxysporum . A propriedade terapêutica apresentada pela espécie C. bracteosa para o tratamento de infecções respiratórias e os efeitos deletérios para a cepa de B. subtilis podem estar associados à presença dos compostos fenólicos e alcaloides, devido a evidente atividade antimicrobiana por eles já relatadas (RATHBONE; BRUCE, 2002; HOLLEY; PATEL, 2005). A correlação entre compostos fenólicos e testes de inibição do crescimento de bactérias, inclusive de B. subtilis, também foi feita por Asolini et al . (2006), tendo sido comprovada. Por outro lado, as proteínas bioativas também podem contribuir para esse efeito terapêutico e para a inibição do crescimento da bactéria B. subtilis , bem como do fungo F. oxysporum . Exemplos de proteínas com atividade antifúngica capaz de inibir o crescimento do fungo F. oxysporum são: a lectina do germe de trigo (WGA) (CIOPRAGA et al. , 1999) e uma proteína ligante ligante à quitina

(Mo -CBP 3) purificada de Moringa oleífera Lamarck (GIFONI, 2009). No entanto, outras proteínas como quitinases, β-1,3 – glucanases, inibidores de tripsina também possuem propriedades antifúngicas e podem causar prejuízo ao fungo em questão. 208 Foram encontrados em D. megacarpa metabólitos secundários como alcaloides, saponinas e compostos fenólicos (flavonas, flavonois e xantonas), além disso, todas as proteínas bioativas dosadas estavam presentes nessa espécie incluindo as toxinas. Vale ressaltar a elevada quantidade de ureases encontradas. O seu extrato bruto foi, ainda, capaz de causar 100% de mortalidade em larvas de Ae. Aegypti e de inibir o crescimento do fungo F. oxysporum. A ação contra o fungo F. oysporum pode ser causada por proteínas como as lectinas, por já ter sido encontrado a WGA com essa atuação (CIOPRAGA et al. , 1999), bem como qualquer uma das outras proteínas encontradas nessa espécie, conforme mencionado anteriormente. Há, ainda, a possibilidade de ação dos compostos secundários encontrados. A atividade frente ao Ae. Aegypti foi muito boa, podendo ter sido ocasionada por proteases, quitinases, inibidor de tripsina ou mesmo compostos secundários como os alcaloides, que são altamente tóxicos, e saponinas por já terem apresentado potente atividade larvicida contra o vetor da dengue (WIESMAN; CHAPAGAIN, 2003; SANTIAGO et al. , 2005). A espécie E. contortisiliquum destacou-se primeiramente por seu espectro de atuação frente aos fungos filamentosos, tendo sido capaz de inibir A. niger , C. truntcatum , Neurspora sp. e T. viridae e, em segundo lugar, por sua ótima atividade contra as larvas de Ae. Aegypti (100% mortalidade). Apresentou saponinas (metabólito secundário), inibidor de tripsina, ureases, quitinases, toxinas e baixa atividade de β-1,3 – glucanases. Todos esses compostos podem sozinhos ou em conjunto estar prejudicando o crescimento dos fungos. Esses micro- organismos são responsáveis pelas perdas mais importantes em culturas desde do início do cultivo de plantas por seres humanos (HARVEY, 1978), tornando seu controle de grande importância. Na literatura, a capacidade das quitinases purificadas do germe do trigo de inibir o crescimento do fungo T. viridae foi descrito por Schlumbaum et al . (1986). Morais, em 2007, mostrou que o fungo A. niger tem seu crescimento prejudicado quanto posto em contato com uma toxina da Soja (SBTX). O fungo C. truncatum , causador de antracnose na soja, está envolvido em perdas consideráveis desta cultura no Brasil (WRATHER et al ., 1997), por isso sustâncias que atuem em seu controle são de grande interesse. Em relação à forte atividade larvicida apresentada por E. contortisiliquum , as saponinas podem ser as responsáveis, bem como qualquer outra substância capaz de interagir com alguma parte da larva, como por exemplo, as quitinases por serem capazes de degradar quitinas que estão presentes na membrana peritrófica dos insetos, ou mesmo agir sobre sua cutícula (KRAMER; MUTHUKRISHNAN, 2005).

209 Já a espécie P. moniliformis destacou-se por sua forte atividade quitinolítica e razoável atividade de β-1,3 – glucanases e de ureases em adição alta toxicidade apresentada às larvas de Ae. Aegipty, capazes de causar 100% de mortalidade. Apresentou ainda, inibidores de tripsina e a presença de atividade proteolítica, bem como de fenóis, flavonas, flavonois, xantonas e taninos. Ademais é utilizada na medicinda popular para tratar sinais e sintomas que são indicativos de ação antifúngica e foi encontrada atividade contra os fungos A. niger e C. truncatum . O uso de plantas medicinais no tratamento de doenças de pele, incluindo infecções fúngicas, é uma prática antiga adotada em muitas regiões do mundo (IROBI; DARAMBOLA, 1993). Este uso tem sido apoiado pela ciência através do isolamento de compostos com atividade antifúngica a partir de extratos de plantas (COSTA et al ., 2000; PASSOS et al ., 2002). Portanto, a existência de agentes antifúngicos no extrato bruto de P. moniliformis auxilia na comprovação de seu uso medicinal. As xantonas, assim como outros compostos fenólicos, também foram descritas como possuidores de atividade antifúngica (REYES- CHILPA; JIMENEZ-ESTRADA; ESTRADA MUÑIZ, 1997; MOREL et al ., 2000; KHAN; KIHARA; OMOLOSO, 2002; ZHANG et al ., 2002; HAY et al ., 2003). Os flavonoides são substâncias sintetizadas nas plantas em resposta a infecções microbianas (TSUCHIYA et al ., 1996; COWAN, 1999), por isso podem estar envolvidas nas atividades apresentadas. As quitinases e β-1,3 – glucanases são comumente estudadas como antifúngicos por hidrolisarem quitina e β-1,3 – glucanos que são os biopolímeros majoritários presentes na parede celular dos fungos (WEBSTER, 1986). Muitas dessas enzimas que foram isoladas de vegetais apresentaram atividade contra fungos fitopatogênicos isoladamente (SHENOY et al. , 2006; HO; NG 2007; COTA et al ., 2007; ONAGA; TAIRA 2008; KUO et al . 2008) ou em sinergismo (STINTZI et al ., 1993; JACH et al ., 1995). Somando-se a isso, as quitinases também possuem atividades inseticidas por serem capazes de atuar nas estruturas contendo quitina presentes em insetos (KRAMER; MUTHUKRISHNAN, 2005). De acordo com o encontrado para P. moniliformis , já foi descrito que proteínas contendo quitinas de B. thuringiensis apresentaram-se tóxicas para larvas de Ae. aegypti , causando alto percentual de mortalidade (THAMTHIANKUL et al. , 2001). O que merece destaque para a espécie S. rugosa é a capacidade de impedir o crescimento de bactérias S. aureus e B sibtilis e a presença de metabólitos secundários de diferentes classes como: compostos fenólicos – clachonas e fenóis; terpenos - saponinas e triterpenoides. Apresentou baixa atividade larvicida para o mosquito da dengue e baixa

210 atividade de inibidor de tripsina e de urease. Possui também atividade hemaglutinante, quitinases e elevada atividade de β-1,3 – glucanases. Um metabólito secundário da família dos terpenos já foi isolado da espécie vegetal Acmela brasiliensis Spreng e possui atividades antibacterianas (WILKINS et al ., 2002), antifúngicas (SARTORI et al ., 2003), larvicida (BATISTA; CHIARI; OLIVEIRA, 1999) e antinociceptiva (BLOCK et al ., 1998). Inclusive já foi demonstrado que os terpenos são ativos contra diversos micro-organismos (COWAN, 1999; DORMAN; DEANS, 2000; WILKINS, 2002). Diante disso, pode-se especular a ação de saponinas e triterpenoides encontrados em S. rugosa contras as espécies S. aureus e B sibtilis . Ademais, compostos fenólicos com propriedades antimicrobianas efetivas contra S. aureus e resistentes à meticilina já foram encontradas e muitos desses compostos foram isolados (XU; LEE, 2001; ZACCHINO et al. , 2001). As proteínas encontradas nessa espécie também podem estar atuando contra bactérias. S. aureus e B subtilis são bactérias patogênicas para seres humanos e responsáveis por graves infecções em pacientes imunodeprimidos (RANG; DALE; RITTER, 1997; SCHAECHTER et al ., 2002), por isso seu controle é de extrema importância e a espécie S. rugosa pode ser estudada nessa intenção. Na presença de patógenos (fungos, bactérias e vírus) as plantas produzem compostos com propriedades que permitem sua proteção contra os ataques, por essa razão muitos autores referem-se às plantas usadas na medicina tradicional como uma das fontes de pesquisa mais promissoras para novos compostos biológicos ativos (ZACCHINO et al ., 1998; URBINA et al ., 2000; ZACCHINO et al ., 2001; SARTORI et al ., 2003), fato esse, também comprovado neste trabalho. A busca por subtâncias antifúngicas converge na procura por alvos específicos para as células de fungos, tais como inibidores de biossíntese do ergoesterol, inibição de topoisomerases ou ainda compostos que atuem na parede celular uma vez que a célula fúngica é semelhante às células humanas e por isso, muitos compostos ativos acabam sendo tóxicos para o homem, devendo ter utilização restrita (ZACCHINO et al. , 2001). De forma semelhante, compostos inseticidas atuantes em alvos que não estão presentes nos seres humanos são relevantes para seu uso na engenharia genética, de forma a proteger culturas economicamente importantes, sem causar prejuízo aos seres que irão consumir alguma parte dessa planta. Dessa forma, a quitina torna-se um alvo de interesse por não fazer parte da constituição do homem e, as quitinases se sobressaem por atuarem nesse composto. As quitinases são amplamente usadas na biotenologia para a produção de protoplastos (MANOCHA; ZHONGHUA, 1997), para o controle biológico de patógenos de plantas (fungos, insetos, bactérias) para a bioconversão de produtos, bem como na indústria 211 farmacêutica para a produção de quitohexoses e quitopentoses devido suas propriedades antitumorais e produção de antifúngicos para o homem (DAHIYA; TEWARI; HOONDAL, 2006). Diante do grande potencial de utilização das quitinases, a espécie vegetal apresentando a mais elevada atividade específica dessa enzima e concomitante atividade biológica em modelos possivelmente susceptíveis a essa enzima e, ainda, que apresentem grande necessidade de combate, foi escolhida para sua purificação. A espécie que melhor se enquadrou nessa categoria foi a P. moniliformis Benth., sendo utilizada para um estudo mais aprofundado de suas quitinases.

5.8 Purificação de Proteínas com Atividade Quitinásica Presentes em Sementes de Piptadenia moniliformis Benth.

A espécie vegetal P. moniliformis Benth. selecionada, destacou-se, principalmente, devido à presença de elevada atividade quitinásica no extrato bruto dialisado de suas sementes, além de ser repositório de outras moléculas biologicamente ativas, como já relatado anteriormente. Dessa forma, a atividade quitinásica foi escolhida para monitorar a purificação da(s) proteína(s) responsável(éis) por essa atividade. A purificação da(s) quitinase(s) presente(s) em sementes de P. moniliformis , iniciou-se com a obtenção do extrato bruto (EB) a partir da farinha de suas sementes como descrito no item 4.2 que apresentou um rendimento de 33,07 ± 1,22 mgP/gF. Uma alíquota do extrato bruto (30 mgP) foi submetida à cromatografia de troca iônica em matriz de DEAE-celulose, previamente equilibrada com o tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2. As proteínas não retidas na matriz foram eluídas com o mesmo tampão de equilíbrio, resultando em três frações proteicas, denominadas D1 – primeira fração não retida na matriz de DEAE-celulose; D2 – segunda fração não retida na matriz de DEAE-celulose e D3 – terceira fração não retida na matriz de DEAE-celulose. Em seguida, foi adicionado 0,2 M de NaCl para a retirada de D4 (primeira fração retida na matriz de DEAE-celulose) e, logo após, adicionado 0,4 M de NaCl para a eluíção de D5 (segunda fração retida na matriz de DEAE-celulose) (FIGURA 1).

212

1 0,45 D1 D3 0,9 0,4 D2 0,8 0,35 0,7 0,3 0,6 0,25 0,5 0,2 0,4 D4 [ [ de ] NaCl ABS 280 nm 280 ABS 0,15 0,3 0,2 D5 0,1 0,1 0,05 0 0 1 16 31 46 61 76 91 106 121 136 151 166 181 fração 6 ml

FIGURA 1 – Cromatografia de troca iônica em matriz de DEAE-celulose. Extrato bruto (30 mgP), preparado a partir de farinha das sementes de Piptadenia moniliformis Benth., foi aplicado em matriz de DEAE-celulose (14,0 cm x 2,7 cm), equilibrada com tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2. As frações proteicas não retidas foram eluídas com o tampão de percolação da coluna e denominadas D1 - 1ª Fração proteica não retida na matriz de DEAE, D2 - 2ª Fração proteica não retida na matriz de DEAE, D3 - 3ª Fração proteica não retida na matriz de DEAE. As frações proteicas retidas foram eluídas com a adição de 0,2 M e 0,4 M de NaCl ao tampão de equilíbrio e denominadas de D4 - 1ª fração proteica retida na DEAE e D5 - 2ª fração proteica retida na DEAE. Fluxo: 30 mL/h; Frações: 6,0 mL/tubo.

213 Desse modo, o extrato bruto de P. moniliformis foi separado em cinco frações proteicas, sendo três não retidas (D1, D2 e D3) e duas retidas (D4 e D5), mostrando a eficiência da matriz trocadora aniônica, DEAE-celulose, na separação das proteínas dessa semente, que é uma vantagem, devido o grau de heterogeneidade de proteínas aí presentes. O Extrato bruto de P. moniliformis e as cinco frações proteicas obtidas após o processo de cromatografia em matriz de DEAE-celulose foram dialisados e submetidas à determinação de atividade quitinásica, no intuito de verificar a fração detentora de maior atividade. O resultado apresentado na TABELA 6 mostra, que todas as frações proteicas apresentaram atividade de quitinase, mas aponta D1 como a fração de maior atividade quitinásica (3,74 ± 0,18 nKat/mgP) em relação as demais (D2, D3, D4 e D5), posto que variaram de 0,11 ± 0,03 (D5) a, no máximo, 0,64 ± 0,15 (D2). O valor de atividade quitinásica obtido para D1 é cerca de 3 vezes maior que o valor obtido para o extrato bruto dialisado (1,13 ± 0,03), mostrando um aumento na purificação das proteínas com atividade de quitinase e confirmando a eficiência dessa cromatografia para o que foi proposto. Então, essa fração proteica foi escolhia para dar continuidade ao processo de purificação, sendo avaliada suas proteínas por eletroforese. O perfil eletroforético do extrato bruto (EB) de P. moniliformis e de D1 pode ser visualizado na FIGURA 2. No extrato bruto (raia 2) há uma predominância de bandas proteicas entre 50 e 20 kDa, apresentando maior concentração de proteínas nas faixas de 40, 36, 24 e 20 kDa que são massas moleculares relativamente baixas (< 45 kDa). Em D1 as faixas de maior concentração de proteínas verificadas em EB não estavam mais presentes, mas o número de bandas proteicas foi aumentado, estendendo-se de, aproximadamente, uma altura de 80 até 14,0 kDa, com maior número de bandas entre as alturas de 66 a 20 kDa. Esse fato pode ser explicado devido ao aumento de purificação de umas proteínas em detrimento de outras, o que as tornam mais visíveis. D1 foi dialisada ( cut-off 12 kDa) exaustivamente contra água, liofilizada e, posteriormente, submetida à cromatografia de afinidade em matriz de quitina (FIGURA 3). Uma alíquota de D1 foi ressuspendida em tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2 (11,4 mgP) e aplicada em coluna de cromatografia de afinidade em matriz de quitina, equilibrada com o mesmo tampão. Esse procedimento resultou na obtenção de uma fração não retida (Q1), obtida apenas com o tampão de equilíbrio, e de duas outras frações retidas, sendo a primeira eluída com ácido acético 0,05 M e denominada Q2 e a segunda fração proteica retida na matriz de quitina foi eluída com tampão glicina 0,01 M, pH 9,0 e denominada Q3.

214 TABELA 6 – Determinação da atividade quitinásica das frações proteicas oriundas do extrato bruto de Piptadenia moniliformis Benth. quando submetido a uma cromatografia de troca iônica em matriz de DEAE-celulose

FRAÇÕES PROTEICAS ATIVIDADE QUITINÁSICA nKat/mgP

Extrato Bruto dialisado 1,13 ± 0,03 D1 3,74 ± 0,18 D2 0,64 ± 0,15 D3 0,40 ± 0,07 D4 0,18 ± 0,03 D5 0,11 ± 0,03

Média ± desvio padrão de três análises, cada uma em triplicata

215

66,0

45,0 36,0 29,0 24,0 20,1

14,2

1 2 3

FIGURA 2 – Eletroforese em gel de poliacrilamida (12,5%) na presença de SDS (2,0%) e β- mercaptoetanol (2,5%) do Extrato bruto de Piptadenia moniliformis Benth. e da 1ª Fração proteica não retida oriunda do extrato bruto de P. moniliformis quando submetido a cromatografia de troca iônica em matriz de DEAE –Celulose, revelada com nitrato de prata. Em cada poço foram aplicados 3 µgP de cada amostra. Raia 1 - MM = marcadores de massa molecular: α-lactoalbumina do leite bovino - 14,2 kDa, inibidor de tripsina da soja – 20,1 kDa, tripsinogênio do pâncreas bovino – 24,0 kDa, anidrase carbônica bovina 29,0 kDa, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de músculo de coelho 36,0 kDa, albumina do ovo – 45,0 kDa, albumina bovina – 66,0 kDa; Raia 2 – Extrato bruto; Raia 3 – 1ª Fração proteica não retida na matriz de DEAE-celulose.

216

0,7 Q3 0,6

0,5 Ac. Acético Tampão glicina 0,01 M, pH 9,0 0,4 0,05 M

0,3 Abs 280 nm 280 Abs 0,2

0,1 Q1 Q2 0 1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101 111 121 fração 3 ml

FIGURA 3 – Cromatografia de afinidade em matriz de Quitina. D1- 1ª Fração proteica não retida na matriz de DEAE (11,4 mgP) foi aplicada em matriz de quitina (10,2 cm x 1,5 cm), equilibrada com tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2. A fração proteica não retida foi eluída com o tampão de percolação da coluna e denominada Q1. A primeira fração proteica retida na matriz de quitina foi eluída com ácido acético 0,05 M e denominada Q2 e a segunda fração proteica retida na matriz de quitina foi eluída com tampão glicina 0,01 M, pH 9,0 e denominada Q3. Fluxo da fração proteica não retida: 30 mL/h, fluxo da fração retida: 45 ml/h. Frações: 3,0 mL/tubo.

217 A princípio, Q1 e Q2 embora tivessem apresentado picos de absorbância a 280 nm muito baixos, foram consideradas frações, uma vez que, em alguns casos, picos de absorbâncias baixos possuem quantidades consideráveis de proteínas. No entanto, após a dosagem de proteínas, pelo método de Bradford (1976), dos picos em questão, não foi verificado a presença de proteínas nem mesmo com a união dessas frações oriundas de mais três cromatografias. Por isso, não foi possível a determinação de atividade quitinásica dessas frações. Desse modo, a cromatografia de afinidade em matriz de quitina não se mostrou eficiente na separação das proteínas presentes na fração D1, já que só foi possível a retirada das proteínas aplicadas em uma única fração (Q3) com um aumento brusco de pH (de aproximadamente 3,0 para 9,0), o que mostrou forte interação dessas proteínas à matriz de quitina, tornando necessário testes com outras matrizes cromatográficas. Outro passo cromatográfico realizado para o fracionamento de D1 foi a utilização de uma matriz trocadora de cátions, a CM-sepharose (FIGURA 4), uma vez que essa fração proteica não ficou retida em DEAE-celulose que é uma matriz de características contrárias. Sendo assim, D1 (31,35 mgP) foi submetido à cromatografia de troca iônica em coluna de CM-sepharose, resultando na obtenção de frações proteicas não retidas (FNR-CM) eluídas com tampão de equilíbrio (acetato de sódio 50 mM, pH 5,2) e frações proteicas retidas (FR-CM), que foram eluídas com o tampão de equilíbrio acrescido de 0,2 M, 0,6 M e 1M de NaCl (FIGURA 4). O perfil cromatográfico apresentado na FIGURA 4 mostra a predominância de proteínas nas frações não retidas (FNR-CM), em detrimento às frações retidas, ou seja, nas condições experimentais testadas, a maioria das proteínas presentes em D1 não ficou adsorvida na matriz de CM-sepharose, levando a hipótese de que a maioria das proteínas parecia estar com carga líquida igual à zero. Quando realizada a determinação de atividade quitinásica para todas as frações, apenas a fração não retida apresentou tal atividade. Diante dos resultados, esse passo cromatográfico foi, portanto, descartado. O processo de purificação prosseguiu utilizando outra cromatografia de afinidade, a “affi-gel blue gel. Essa matriz é um gel de agarose covalentemente ligado a um corante “Cibacron®” azul F3GA que tem a característica de purificar uma grande variedade de proteínas, das mais variadas origens, pelo fato do corante azul funcionar como ligante iônico, hidrofóbico, aromático ou devido ao seu sítio de ligação estericamente ativo em várias aplicações.

218

0,4 1,2 FR-CM 0,35 FRN-CM 1 0,3 0,8 0,25 0,6 0,2 0,15 ] [ NaCl nm 280 Abs 0,4 0,1 0,2 0,05 0 0 1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101 111 121 Fração 6 ml

FIGURA 4 – Cromatografia de troca iônica em matriz de CM-Sepharose. D1 - 1ª Fração proteica não retida na matriz de DEAE (31,35 mgP) foi aplicada em matriz de CM – sepharose (16,5 cm x 2,1 cm), equilibrada com tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,2. A fração proteica não retida foi eluída com o tampão de percolação da coluna e denominada FNR-CM. As frações proteicas retidas foram eluídas com a adição de 0,2 M, 0,6 M e 1M de NaCl ao tampão de equilíbrio e denominadas de FR-CM. Fluxo: 30 mL/h; Frações: 6,0 mL/tubo.

219 Tem sido utilizada para a purificação de diversas proteínas bioativas (CHU; LIU; NG, 2003; XIA; NG, 2004; XIA; NG, 2005; WANG; NG, 2005; WANG; NG, 2006a,b; WANG; NG, 2007) e é indicada para a purificação de enzimas, incluindo quitinases (WANG et al. , 2009). Alíquotas de D1 (3,33 mgP) foram, então, submetidas à cromatografia de afinidade em matriz de “affi-gel blue gel” (FIGURA 5) e sua aplicação resultou em três frações não retidas à coluna: primeira, segunda e terceira fração não retida na matriz de “affi-gel blue gel” denominadas de A1, A2 e A3, respectivamente, obtidas pela percolação da coluna com o tampão de equilíbrio (tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2). O material retido foi eluído com o mesmo tampão acrescido de NaCl 0,5 M originando A4, fração retida na matriz de “affi-gel blue gel”. A adição de NaCl 1,5 M ao tampão de equilíbrio não foi capaz de retirar mais nenhuma fração proteica. Essa matriz foi eficiente na separação das proteínas não retidas na matriz de DEAE- celulose (D1), obtendo-se 4 picos cromatográficos pelo monitoramento da absorbância a 280 nm. Embora as três primeiras frações não tenham aparecido como picos isolados, foi possível sua separação e monitoramento de atividade biológica. Resultado esse, não conseguido nas duas tentativas (cromatografias anteriores) anteriores. As frações A1, A2, A3 e A4, provenientes da cromatografia de afinidade em matriz de “Affi-gel blue gel” foram avaliadas quanto a sua capacidade em hidrolisar quitina (TAELA 7). A1 concentrou a maior atividade específica para quitinase (15,04 ± 0,57 nKat/mgP), seguida de A4 (5,81 ± 0,20 nKat/mgP) e A2 (1,37 ± 0,24 nKat/mgP). Não foi detectada atividade quitinásica para a fração A3. A atividade apresentada por A1 foi de 13,41 vezes maior do que a encontrada para o extrato bruto de P. moniliformis e 4,02 vezes maior que a atividade de D1, mostrando que essa cromatografia foi capaz não só de separar as proteínas presentes em D1 como também de aumentar consideravelmente a purificação das proteínas com atividade quitinásica. Dessa forma, a matriz em questão tornou-se o terceiro passo no processo de purificação dessas proteínas. Entretanto, o rendimento de proteínas dessas etapas de purificação não foi muito animador, já que ocorreu grande perda de proteínas a cada passo cromatográfico, passando de um rendimento de 33,07 ± 1,22 mgP/gF presentes no extrato bruto para 0,059 ± 0,005 mgP/gF em A1.

220

2,5 A1 1,6 1,4 2 1,2

1,5 1 0,8

1

0,6 [ ]M NaCl nm 280 Abs A3 A2 0,4 0,5

A4 0,2 0 0 1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101 111 121 Fração 3 ml

FIGURA 5 – Cromatografia de afinidade em matriz de Affi-gel blue gel. D1 - 1ª Fração proteica não retida na matriz de DEAE (3,33 mgP) foi aplicada em matriz foi Affi-gel blue gel (12,5 cm x 1,7 cm), equilibrada com tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2. As frações proteicas não retidas foram eluídas com o tampão de percolação da coluna e denominadas A1 - 1ª Fração proteica não retida na matriz de Affi-gel blue gel, A2 - 2ª Fração proteica não retida na matriz de Affi-gel blue gel, A3 - 3ª Fração proteica não retida na matriz de Affi-gel blue gel. A fração proteica retida foi eluída com a adição de 0,4 M de NaCl ao tampão de equilíbrio e denominadas de A4 - 1ª fração proteica retida na Affi-gel blue gel . Fluxo das frações não retidas: 20 mL/h, fluxo da fração retida : 30 ml/h. Frações: 3,0 mL/tubo.

221

TABELA 7 – Determinação da atividade quitinásica das frações proteicas oriundas de D1 quando submetidas à cromatografia de afinidade em matriz de “Affi-ge Blue gel”.

FRAÇÕES PROTEICAS ATIVIDADE QUITINÁSICA nKat/mgP

A1 15,04 ± 0,57 A2 1,37 ± 0,24 A3 0,0 ± 0,0 A4 5,81 ± 0,20

Média ± desvio padrão de três análises, cada uma em triplicata.

222

O perfil eletroforético da primeira fração não retida na matriz de “affi-gel blue gel” (A1) (FIGURA 6) apresentou-se mais limpo em relação ao de D1 (FIGURA 2) com menor número de bandas proteicas na faixa de 97 a 40 kDa, onde foi visualizado apenas uma banda na altura de, aproximadamente, 80 kDa e outra na altura de 66,0 kDa. Abaixo de 40 kDa foi verificada a presença de bandas em torno dos marcadores moleculares de 31,0 e 21,4 kDa e uma banda proteica na altura do marcador de 14 kDa. Para uma fração proteica mais pura, ou seja, com maior número de quitinases em relação ao de outras proteínas, era necessário dar continuidade à purificação para a utilização da mesma na avaliação de atividades biológicas importantes, como atividades contra vetores de doenças e antimicrobianas. Dessa forma, foi escolhido outro passo cromatográfico, a matriz de CM-sepharose, para a tentativa de separação das proteínas presentes na fração proteica A1. Essa matriz foi novamente escolhida por se tratar de uma matriz com alta capacidade de ligação e devido sua estabilidade química e física elevada. Essa matriz não foi eficiente na separação das proteínas presentes em D1 nas condições anteriormente testadas, mas o perfil cromatográfico poderia ser melhorado se fosse utilizado a adição de 1 M de NaCl ao tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2 para a retirada do material que ficou retido na coluna. Dessa forma, talvez, ao invés de vários picos retidos indefinidos com baixa leitura a uma absorbância de 280 nm, seria possível a obtenção de um único pico, com absorbância maior mais bem definido. Foi pensando dessa forma que A1 (10 mgP) foi submetida à cromatografia de troca iônica em matriz de CM-sepharose (FIGURA 7) equilibrada com tampão acetato sódio 50 mM, pH 5,2. A fração proteica não retida foi eluída com o tampão de equilíbrio da coluna e denominada FNR-CM2. Para a retirada da fração proteica retida na matriz de CM-sepharose (FR-CM2) foi adicionado NaCl 1M ao tampão de equilíbrio como havia sido pensado. No entanto, essa tentativa não foi muito bem sucedida pelo fato dessa fração retida não apresentar proteínas quando dosadas pelo método de Bradford (1976), o que era de se esperar, após a análise do cromatograma, visto que aumentos de leitura à absorbância de 280 nm dessa fração foram quase inexistentes. O que leva a concluir que todas as proteínas presentes em A1 saíram na fração não retida na matriz, não sendo possível o aumento da purificação. Mais uma vez foi necessária a tentativa de outro passo cromatográfico. Dessa vez a matriz selecionada foi, novamente, a matriz de quitina.

223

116,0 97,4 66,0

45,0

31,0

21,4

14,0

1 2

FIGURA 6 – Eletroforese em gel de poliacrilamida (12,5%) na presença de SDS (2,0%) e β- mercaptoetanol (2,5%) da fração proteica oriunda de D1 quando submetida à cromatografia de afinidade em matriz de “Affi-gel blue gel”, revelada com nitrato de prata. Em cada poço foram aplicados 3 µgP de cada amostra. Raia 1 - MM = marcadores de massa molecular: lisozima - 14,0 kDa, inibidor de tripsina da soja – 21,4 kDa, anidrase carbônica – 31,0 kDa, ovalbumina – 45,0 kDa, albumina sérica bovina – 66,2 kDa, fosforilase B – 97,4, β- galactosidase – 116 kDa, miosina – 212 kDa; Raia 2 – 1ª Fração proteica não retida na matriz de “Affi-gel blue gel”.

224

0,16 1,2 FNR -CM2 0,14 1 0,12 0,8 0,1 0,08 0,6 0,06 [ [ M] NaCl nm Abs 280 0,4 0,04 0,2 0,02 FR-CM2 0 0 1 11 21 31 41 51 61 71 Fração 5 ml

FIGURA 7 – Cromatografia de troca iônica em matriz de CM-Sepharose. A1 - 1ª Fração proteica não retida na matriz de Affi-gel blue gel (10 mgP) foi aplicada em matriz de CM – sepharose (10,5 cm x 2,1 cm), equilibrada com tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,2. A fração proteica não retida foi eluída com o tampão de percolação da coluna e denominada FNR-CM2. A fração proteica retida foi eluída com a adição de 1M de NaCl ao tampão de equilíbrio e denominadas de FR-CM2. Fluxo: 30 mL/h; Frações: 5,0 mL/tubo.

225 Foi insistido na utilização dessa matriz por funcionar como afinidade para proteínas que se ligam a quitina ou mesmo para quitinases, tendo sido usada com sucesso para a purificação total, parcial ou verificação da capacidade de ligação dessas proteínas com a matriz (FREITAS, 2006; GIFONI, 2009). A1 (10 mgP) foi aplicado na cromatografia de afinidade em matriz de quitina (FIGURA 8) previamente equilibrada com tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2. O processo cromatográfico resultou em uma fração não retida, retirada com o tampão de equíbrio (FQ1) e uma fração retida retirada com tampão glicina 0,01 M pH 9,0 (FQ2). Tal fração apresentou-se como um pico bem definido característico de material de elevado grau de pureza. A utilização de ácido acético 0,05 M não foi capaz de promover a saída de nenhuma fração proteica. As frações FQ1 e FQ2 foram analisadas quanto à quantidade de proteínas por Bradford, rendimento, determinação de atividade quitinásica e quanto ao seu perfil eletroforético. Em relação ao rendimento proteico, FQ1 apresentou 0,02 mgP/gF ± 0,002 mostrando um rendimento muito baixo, posto que corresponde a apenas 0,06 % em relação ao conteúdo de proteínas presentes no extrato bruto. Além disso, seu rendimento proteico foi três vezes menor em relação à quantidade de proteínas presentes na fração A1, que já era baixo. FQ2 obteve um rendimento bem maior de proteínas, cerca de 13 vezes maior que FQ1, com 0,27 ± 0,01 mgP/gF. Esse valor representa 0,82% das proteínas presentes no extrato bruto, o que ainda é baixo, visto que não chega nem a 1 % do total de proteínas extraídas de sementes de P. moniliformis . Embora as frações tenham apresentado um baixo rendimento proteico, a determinação de atividade quitinásica das frações FQ1 e FQ2 foi realizada. O resultado apresentado na TABELA 8 aponta FQ1 como a fração de maior atividade quitinásica (5,56 ± 0,41 nKat/mgP) em relação a FQ2 (0,79 ± 0,04 nKat/mgP), no entanto o valor encontrado para essa fração é quase três vezes menor que a atividade quitinásica apresentada por A1. Esse resultado não foi favorável ao objetivo de aumentar a purificação de proteínas com atividade quitinásica, tendo em vista que ao invés de aumentar a atividade específica com a diminuição de proteínas, o que ocorreu foi um decréscimo na atividade. A eletroforese das frações proteicas oriundas da cromatografia de afinidade em matriz de quitina após a aplicação de A1 (FIGURA 9) mostra que o perfil das proteínas de FQ1 e FQ2 são diferentes, provando que essa matriz foi capaz de promover a separação das proteínas presentes em A1.

226

0,6 FQ2

0,5 Glicina 100 mM, pH 9,0 0,4 Ácido acético 0,3 50 mM

Abs 280 nm 280 Abs 0,2 FQ1 0,1

0 1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101 111 121 131 141 151 161 171 Fração 1,5 ml

FIGURA 8 – Cromatografia de afinidade em matriz de Quitina. A1- 1ª Fração proteica não retida na matriz de “Affi-gel blue gel” (10 mgP) foi aplicada em matriz de quitina (11,5 cm x 1,6 cm), equilibrada com tampão Acetato de sódio 50 mM, pH 5,2. A fração proteica não retida foi eluída com o tampão de percolação da coluna e denominada FQ1. A fração proteica retida na matriz de quitina foi eluída com tampão glicina 100 mM, pH 9,0 e denominada FQ2. Fluxo da fração proteica não retida: 30 mL/h, fluxo da fração proteica retida: 45 ml/h. Frações: 1,5 mL/tubo.

TABELA 8 – Determinação da atividade quitinásica das frações proteicas oriundas de A1 quando submetidas à cromatografia de afinidade em matriz de Quitina

FRAÇÕES PROTEICAS ATIVIDADE QUITINÁSICA nKat/mgP

FQ1 5,56 ± 0,41 FQ2 0,79 ± 0,04

Média ± desvio padrão de três análises, cada uma em triplicata

227

212,0 116,0 116,0 97,4 97,4 66,0 66,0 45,0 45,0

31,0

31,0

21,4

21,4

14,0 14,0

1 2 1 3

FIGURA 9 – Eletroforese em gel de poliacrilamida (12,5%) na presença de SDS (2,0%) e β- mercaptoetanol (2,5%) da fração proteica oriunda de A1 quando submetida à cromatografia de afinidade em matriz de quitina, revelada com nitrato de prata. Em cada poço foram aplicados 3 µgP de cada amostra. Raias 1 - MM = marcadores de massa molecular: lisozima - 14,0 kDa, inibidor de tripsina da soja – 21,4 kDa, anidrase carbônica – 31,0 kDa, ovalbumina – 45,0 kDa, albumina sérica bovina – 66,2 kDa, fosforilase B – 97,4, β-galactosidase – 116 kDa, miosina – 212 kDa; Raia 2 – Fração proteica não retida na matriz de quitina; Raia 3 – Fração proteica retida na matriz de quitina.

228 O perfil de FQ1 é parecido com o perfil das proteínas presentes em A1, com exceção de algumas proteínas; uma na altura do marcador molecular de 66,0 kDa, algumas que estão abaixo de 31 kDa e umas que estão entre os marcadores de 21,4 e 14 kDa, que aparecem no perfil de FQ2 (indicados com setas pretas na FIGURA 9). Houve um aumento de bandas de proteínas próximas ao marcador de 45 kDa e uma maior concentração proteica na altura de 66,0 kDa na eletroforese da fração FQ1. A análise do cromatograma da FIGURA 8, do perfil de proteínas por eletroforese (FIGURA 9), do rendimento de proteínas e da determinação de atividade quitinásica (TABELA 8) das frações FQ1 e FQ2, leva a concluir que o pico cromatográfico referente à fração FQ2, embora tenha se apresentado de forma bem definido, que condiz com seu perfil eletroforético limpo, com poucas bandas proteicas, sua atividade quitinásica (0,79 ± 0,04 nKat/mgP) foi cerca de 19 vezes menor que a apresentada pela fração A1 (15,04 ± 0,57 nKat/mgP) do passo cromatográfico anterior. A capacidade de FQ1 em hidrolisar quitina também não foi mais eficiente que a de A1. Esses achados mostram que a utilização de A1 na cromatografia em matriz de quitina foi capaz, apenas, de separar suas proteínas em duas frações proteicas com baixo rendimento e sem aumentar a purificação das proteínas com atividade quitinásica. Isso inviabilizou o uso dessa matriz no prosseguimento da maior purificação de proteínas com atividade quitinásica. Em virtude do baixo rendimento proteico (0,059 ± 0,005 mgP/gF) da primeira fração não retida na matriz de “Affi-gel blue gel” (A1) e das tentativas não bem sucedidas de aumentar a purificação dessa fração (FIGURA 10), uma nova estratégia para aumentar a purificação de proteínas com atividade quitinásica foi proposta, visto que, alguns ensaios biológicos requerem uma grande quantidade de proteínas, o que tornaria difícil o acúmulo de A1 para a realização dos mesmos. Além do que, quanto mais pura a fração a ser utilizada, maior será o entendimento do seu modo de ação.

229

EXTRATO BRUTO

DEAE - celulose

a a a a 1a FNR 2 FNR 3 FNR 1 FR 2 FNR

D1 D2 D3 D4 D2 Fração com maior atividade quitinásica

Quitina CM - 1a FR “Affi-gel blue gel” s Q3 e Única fração p proteica h presente a r a a a o 1a FNR 2 FNR 3 FNR 1 FR

s A1 A2 A3 A4 Fração com maior 1a FNR a atividade FNR –CM 1 FR quitinásica, Atividade FR –CM porém com quitinásica ↓ Quantidade baixo Dificuldade no acúmulo de apenas nessa de proteínas rendimento material para ensaios biológicos fração

Quitina

CM -sepharose

FNR FR FQ1 FQ2 a 1 FNR Atividade FNR-CM2 quitinásica, maior, Única fração embora menor proteica que A1

presente Baixo rendimento.

FIGURA 10 - Esquema da tentativa de purificação de proteínas com atividade quitinásica presentes em sementes de Piptadenia moniliformis . F = Fração; N = Não e R = Retida.

230 5.9 Re-estruturação da Purificação de Proteínas com Atividade Quitinásica Presentes em Sementes de Piptadenia moniliformis Benth.

O rendimento das proteínas foi o fator crucial para uma reestruturação na purificação das proteínas com atividade quitinásica. Esse fato tornou-se mais acentuado após a necessidade de utilização de outro lote de sementes de P. moniliformis Benth. originaria dos depósitos de armazenamento do banco de sementes do Ibama, da floresta do Araripe (Crato, CE). A quantidade de proteínas extraídas com a utilização desse novo lote de sementes passou a ser de 10,21 ± 0,20 mgP/gF, o que representa perda superior a três vezes em relação à quantidade de proteínas das sementes usadas inicialmente (33,07 ± 1,22 mgP/gF). Esse achado pode ser justificado devido ao local e época de coletas distintos, bem como pelo maior tempo de armazenamento das sementes. Diante desse fato, tornou-se necessário aumentar a concentração de proteínas com atividade quitinásica antes da utilização dos passos cromatográficos. Assim sendo, o extrato bruto de P. moniliformis foi submetido ao fracionamento com sulfato de amônio sólido nas faixas de saturação de 0-30%, 30-70% e de 70-100%. Posteriormente, foi analisada a atividade específica de quitinase para cada fração e verificado que tal procedimento não foi capaz de atingir o objetivo almejado, pois nenhuma delas apresentou atividade específica superior a do extrato bruto, e sim bem inferiores (dados não mostrados). Ao invés de testar outras faixas de saturação com sulfato de amônio, para a precipitação de proteínas, foi usado o ácido tricloroacético (TCA) por sua rapidez, simplicidade e eficiência na purificação de diversas proteínas (FIELDING; RYALL, 1971; YEANG; YUSOF; ABDULLAH, 1995; BEZERRA, 2010) Alíquotas do extrato bruto foram precipitadas com solução aquosa de TCA 10%, para obter frações proteicas com concentração final de 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 e 3,0% de TCA e denominadas de F 0,5; F 1; F 1,5; F 2; F 2,5 e F 3, respectivamente. Posteriormente foram analisadas quanto à determinação de atividade quitinásica (TABELA 9) e quanto ao perfil de proteínas por eletroforese (FIGURA 11). Segundo a TABELA 9, a F 2 foi fração possuidora da maior atividade específica para quitinase (0,62 ± 0,01), sendo menor que a atual atividade encontrada para o extrato bruto (0,98 ± 0,03). Esse novo valor de atividade determinada para o extrato bruto apresentou uma redução de 13% em relação à atividade quitinásica encontrada para o primeiro lote de sementes utlilizados (1,13 ± 0,03). Isso se deve ao fato da redução de atividade total ter acompanhado a diminuição da quantidade total de proteínas extraídas das novas sementes.

231 TABELA 9 – Determinação da atividade quitinásica das frações proteicas oriundas do extrato bruto de Piptadenia moniliformis Benth. quando submetido à precipitação com ácido tricloroacético (TCA) em diferentes concentrações

AMOSTRAS ATIVIDADE QUITINÁSICA nKat/mgP

Extrato Bruto Dializado 0,98 ± 0,03 F 0,5 0,29 ± 0,01 F 1 0,44 ± 0,02 F 1,5 0,59 ± 0,01 F 2 0,62 ± 0,01 F 2,5 0,19 ± 0,0 F 3,0 0,0 ± 0,0

Média ± desvio padrão de três análises, cada uma em triplicata

232

116,0 97,4 66,0

45,0

31,0

21,4

14,0

1 2 3 4 5 6 7 8

FIGURA 11 - Eletroforese em gel de poliacrilamida (12,5%) na presença de SDS (2,0%) e β- mercaptoetanol (2,5%) revelada com nitrato de prata das frações proteicas obtidas do fracionamento com ácido tricloroacético (TCA). Em cada poço foram aplicados 1 µgP de cada amostra. Raia 1 - MM = marcadores de massa molecular: lisozima - 14,0 kDa, inibidor de tripsina da soja – 21,4/19,7 kDa (duplo), anidrase carbônica – 31,0 kDa, ovalbumina – 45,0 kDa, albumina sérica bovina – 66,2 kDa, fosforilase B – 97,4, β-galactosidase – 116 kDa, miosina – 212 kDa; Raia 2 – Extrato bruto; Raia 3 – Fração TCA 0,5%; Raia 4 – Fração TCA 1,0%; Raia 5 – Fração TCA 1,5%; Raia 6 – Fração TCA 2,0%; Raia 7 – Fração TCA 2,5%; Raia 8 – Fração TCA 3,0%.

233 A partir do aumento de inclusões de TCA concentrando 3 % houve uma perda total de atividade quitinásica, mostrando que níveis maiores que 2,5 % desse ácido, parecem estar causando desnaturação das proteínas de interesse levando a perda de sua função. O perfil da eletroforese da FIGURA 11 mostra que todas as frações precipitadas por TCA apresentaram perfis semelhantes, com exceção da F 1,5 que apresentou bandas acima da altura do marcador de massa molecular de 21,4 e nas proximidades do marcador de 30 kDa. Todas as frações apresentaram-se com menos bandas proteicas em relação ao extrato bruto. F 1,5 possui atividade específica (0,59 ± 0,01) próxima de F 2 (0,62 ± 0,01), embora mais baixa. Em seu perfil eletroforético, há presença de maior número de bandas de proteínas que F2. Além disso, F 2 apresentou um rendimento de 2,66 ± 0,06 mgP/gF, representando 26% das proteínas presentes no estrato bruto, sendo superior ao rendimento de D1 oriundo da primeira etapa de purificação do protocolo anterior. Isso tornou F 2 a fração escolhida para ser submetida aos procedimentos subseqüentes de purificação.

5.10 Cromatográfia de Troca Iônica de F 2 em Matriz de CM-sepharose

A fração proteica de sementes de P. moniliformis proveniente do fracionamento do extrato bruto com TCA, na concentração final de 2,0% (denominada de F 2), após diálise e liofilização, foi submetida à cromatografia de troca iônica em matriz de CM-sepharose com uma alíquota contendo 10 mg de proteína (FIGURA 12). A fração não adsorvida na matriz foi eluída com tampão acetato de sódio, 50 mM, pH 5,2 e denominada C1. A fração proteica adsorvida foi eluída com a adição de NaCl 0,25 M ao tampão de percolação da coluna e denominada de C2. As frações proteicas foram subseqüentemente dialisadas exaustivamente contra água destilada e submetidas aos ensaios para determinação da atividade quitinásica. A TABELA 10 mostra que C1 concentrou maior atividade específica para quitinase (2,10 ± 0,11), em torno de 90 % a mais que C2 (0,14 ± 0,03) e, apresentou atividade cerca de duas vezes maior que a encontrada para ao extrato bruto (0,98 ± 0,03). Esse resultado mostra que o aumento da purificação de proteínas com atividade quitinásica foi possível, no entanto para verificar se houve eficiência na separação das proteínas de F 2, uma eletroforese em gel de poliacrilamida com o extrato bruto e as frações proteicas foi realizada (FIGURA 13).

234

0,3 C2 0,3 C1 0,25 0,25 C2 0,2 0,2 C1 0,15 0,15

[ [ ] M NaCl Abs 280 nm Abs 280 0,1 0,1

0,05 0,05

0 0 1 11 21 31 41 51 61 71 Fração 3 ml

FIGURA 12 – Cromatografia de troca iônica em matriz de CM-Sepharose. Fração TCA 2% (10 mgP) foi aplicada em matriz de CM – sepharose (7,5 cm x 2,2 cm), equilibrada com tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,2. A fração proteica não retida foi eluída com o tampão de percolação da coluna e denominada C1. A fração proteica retida foi eluída com a adição de 0,1 M de NaCl ao tampão de equilíbrio e denominada C2. Fluxo: 30 mL/h; Frações: 3,0 mL/tubo.

TABELA 10 – Determinação da atividade quitinásica das frações proteicas oriundas da fração TCA 2% quando submetida a uma cromatografia de troca iônica em matriz de CM- sepharose.

FRAÇÕES PROTEICAS ATIVIDADE QUITINÁSICA nKat/mgP

C1 2,10 ± 0,11 C2 0,14 ± 0,03

Média ± desvio padrão de três análises, cada uma em triplicata

235

66,0

45,0 36,0 29,0 24,0 20,1

14,2

1 2 3 4 5

FIGURA 13 - Eletroforese em gel de poliacrilamida (12,5%) na presença de SDS (2,0%) e β- mercaptoetanol (2,5%) e revelada com nitrato de prata das proteínas do extrato bruto de Piptadenia moniliformis Benth. e de suas frações proteicas obtidas do fracionamento com 2% de TCA seguido de cromatografia de troca iônica em matriz de CM-sepharose. Em cada poço foram aplicados 3 µgP de cada amostra. Raia 1 - MM = α-lactoalbumina do leite bovino - 14,2 kDa, inibidor de tripsina da soja – 20,1 kDa, tripsinogênio do pâncreas bovino – 24,0 kDa, anidrase carbônica bovina 29,0 kDa, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de músculo de coelho 36,0 kDa, albumina do ovo – 45,0 kDa, albumina bovina – 66,0 kDa; Raia 2 – Extrato bruto de P. moniliformis Benth; Raia 3 – Fração TCA 2%; Raia 4 – Fração proteica não retida na matriz de CM-sepharose (C1); Raia 5 – Fração proteica retida na matriz de CM- sepharose (C2).

236 A eletroforese mostra que houve separação das proteínas presentes em F 2, posto que C1 (raia 4) e C2 (raia 5) apresentaram perfil proteico diferente. C1 concentrou a maioria das proteínas de F 2, encontrando-se quase todas na região entre os marcadores moleculares de 45,0 e 20,1 kD, com exceção de uma banda proteica que apareceu acima do marcador de 45,0 kDa e outra na altura do marcador de 14 kDa. A faixa de concentração de proteínas em C1 é condizente com as massas moleculares de quitinases de plantas que geralmente apresentam massas moleculares variando de 25 – 45 kDa (SAHAI; MANOCHA 1993; WANG et al ., 2009). As bandas proteicas da fração C2 apareceram em menor número, sendo uma localizada acima do marcador de 66,0 kDa, duas abaixo de 20,1 kDa e uma banda abaixo de 14,0 kDa. Os perfis eletroforéticos apresentados por C1 e C2 estão de acordo com o resultado de determinação de atividade quitinásica dessas frações, onde C1 apresenta bandas de proteínas em alturas que correspondem às de quitinases de plantas com atividade quitinolítica maior que C2, que possui poucas bandas proteicas na altura de quitinases vegetais. Pelo exposto, a cromatografia de troca iônica em matriz de CM-sepharose foi eficiente não só em separar a F 2 em duas outras frações (C2 e C2) com também em aumentar a purificação de proteínas com atividade quitinásica. Essa matriz trocadora de cátions também foi utilizada com sucesso para a purificação de quitinase de leguminosa por Wang et al . (2009), mostrando sua eficiência. C1 possui 0,1 ± 0,02 mgP/gF que representa 0,98% das proteínas presentes no extrato bruto. Assim sendo, C1 foi a fração escolhida para dar continuidade ao processo de purificação.

5.11 Cromatográfia de Troca Iônica de C1 em Matriz de Resource Q Acoplada ao Sistema de FPLC

A fração proteica, denominada C1, proveniente de cromatografia de troca iônica em matriz de CM-sepharose foi aplicada à coluna de troca iônica em matriz de Resource Q acoplada ao sistema de FPLC (“Fast Protein Liquid Cromatography”) (FIGURA 14). Apenas duas frações proteicas foram observadas (as demais eram isentas de proteínas), a fração que não interagiu com a matriz foi retirada com o tampão de equilíbrio, acetato de sódio 0,05 M pH 5,2, e denominada de RQ1.

237

0,1 1,2 RQ1 0,09 0,08 1

0,07 0,8 0,06 0,05 0,6 0,04

[ ] M NaCl Abs 280 nm 280 Abs 0,4 0,03 RQ2

0,02 0,2 0,01 0 0 1 11 21 31 41 51 61 71 Fração 0,5 ml

FIGURA 14 – Cromatografia de troca iônica em matriz de Resource Q acoplada ao sistema de FPLC. C1 – Fração proteica não retida na matriz de CM-sepharose (2 mgP) foi aplicada em matriz de Resource Q (6,4 mm x 30 mm), equilibrada com tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,2. A fração proteica não retida foi eluída com o tampão de percolação da coluna e denominada RQ1. A fração proteica retida foi eluída com a adição de 0,1 M de NaCl ao tampão de equilíbrio e denominada de RQ2. Fluxo: 0,5 mL/min; Frações: 0,5 mL/tubo.

238 A fração que interagiu com a resource Q foi eluída após a adição de 0,1 M de NaCl ao tampão de equilíbrio e denominada RQ2. As frações proteicas obtidas foram dialisadas, liofilizadas e utilizadas no ensaio de determinação da atividade quitinásica, onde ambas apresentaram atividade específica para quitinase semelhantes (dados não mostrados). Esse achado apontou que poderiam se tratar de proteínas semelhantes. Para tanto, a eletroforese em gel de poliacrilamida dessas frações foi realizada (FIGURA 15). O perfil eletroforético de RQ1 e RQ2 foram iguais, mostrando que se tratavam da mesma fração proteica. A matriz de trocadora aniônica, Resource Q, não foi capaz de promover a separação das proteínas presentes em C1. Esse resultado foi um tanto inesperado dado o fato de essa matriz ter sido escolhida, justamente, devido a sua capacidade de promover a separação em alta resolução de biopolímeros, sendo bastante utilizado na purificação de proteínas, como no caso das proteínas putificadas por Sheehan; O’sullivan, 2004, Gifoni, 2009 e Bezerra, 2010). Diante da dificuldade na obtenção de uma única quitinase (FIGURA 16) e do insucesso de separação de C1 por uma cromatografia de alta resolução, aliado ao rendimento proteico considerável e à elevada atividade quitinásica, essa fração foi escolhida para a utilização em ensaios biológicos, usando modelos experimentais de importância econômica para o homem, plantas e animais. A fração proteica C1 será mencionada, a partir de agora, como Fração proteica de sementes P. moniliformis ( Pm FP), dada sua origem. Seu esquema de purificação encontra-se na FIGURA 16.

5.12 Detecção e Dosagem de Proteínas Bioativas na Fração Proteica de Sementes de Piptadenia moniliformis (Pm FP)

A fração proteica de sementes de P. miniliformis ( Pm FP) possui quitinases em sua composição, dada a elevada atividade quitinolítica apresentada. No entanto, o conhecimento de outras possíveis proteínas presentes na Pm FP é relevante para um melhor direcionamento quanto sua atuação nos diferentes modelos biológicos testados.

239

66,0

45,0 36,0 29,0 24,0 20,1

14,2

1 2 3

FIGURA 15 - Eletroforese em gel de poliacrilamida (12,5%) na presença de SDS (2,0%) e β- mercaptoetanol (2,5%) revelada com nitrato de prata das frações proteicas de C1 obtidas quando submetidas a uma cromatografia de troca iônica em matriz de Resource Q acoplada ao sistema de FPLC. Em cada poço foram aplicados 3 µgP de cada amostra. Raia 1 - MM = α- lactoalbumina do leite bovino - 14,2 kDa, inibidor de tripsina da soja – 20,1 kDa, tripsinogênio do pâncreas bovino – 24,0 kDa, anidrase carbônica bovina 29,0 kDa, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de músculo de coelho 36,0 kDa, albumina do ovo – 45,0 kDa, albumina bovina – 66,0 kDa; Raia 2 –Fração proteica não retida na matriz resource Q (RQ1) ; Raia 3 - Fração proteica retida na matriz resource Q (RQ2).

240

EXTRATO BRUTO

Fracionamento com TCA

0,5 % de 1,0 % de 1,5 % de 2,0 % de 2,5 % de 3,0 % de TCA TCA TCA TCA TCA TCA (F 0,5) (F 1) (F 1,5) (F 2) (F 2,5) (F 3) Fração de maior atividade quitinásica

CM- sepharose

FNR FR (C1) Pm FP (C2) Fração de maior atividade quitinásica

Resource Q

FNR FR

(RQ1) (RQ2)

Frações iguais

FIGURA 16 – Esquema de purificação da fração proteica de sementes de Piptadenia moniliformis com elevada atividade quitinásica.

241 Sabe-se que a quitina, juntamente com β-1,3-glucano representam o maior componente estrutural da parede celular da maioria dos fungos patogênicos e há relatos que quitinases e glucanases de plantas possuem atividade antifúngica contra uma variedade desses fitopatógenos (BARTNICK-GARCIA, 1968; WESSELS; SIETSMA, 1981 SCHLUMBAUM et al ., 1986; LEAH et al. , 1991; ASAO et al. , 1997; TABEI et al. , 1998; YAMAMOTO et al. , 2000; ALCAZAR-FUOLI et al. , 2010), além de atividade inseticida (GOMES et al. , 1996). Algumas quitinases também apresentam atividade de lisozima sendo capaz de degradar peptídeoglicanos da parede celular de bactéria (BOLLER et al. , 1983; MAUCH; MAUCH- MANI; BOLLER, 1988; MAJEAU et al. , 1990; RADUTOIU et al . 2003; KAKU et al . 2006). Os inibidores de protease de plantas, entre suas várias funções, também participam da defesa vegetal contra o ataque de patógenos frente a vários micro-organismos patogênicos além dos fungos e dos insetos (FRANCO; MELO, 2000; CARLINI; GROSSI-DE-SÁ, 2002; KIM et al. , 2005; OLIVEIRA et al. , 2007; REVINA et al., 2010). Assim sendo, foram determinadas as atividades biológicas de proteínas já bem descritas na literatura frente aos modelos escolhidos (fungos, bactérias e insetos), dentre aquelas anteriormente encontradas no extrato bruto de sementes de P. moniliformis , como: atividade inibitória de tripsina e de quimiotripsina, atividade quitinásica, glucanásica e de protease (TABELA 11). Pm FP apresentou atividade inibitória de tripsina de 4.582,62 UI/mgP, que representa 25% de inibição na atividade da enzima tripsina padrão e atividade inibitória de quimiotripsina de 3.764,91 UI/mgP, representando apenas 19% de inibição em relação a atuação da enzima padrão. Embora os valores de atividade específica sejam elevados, o percentual de inibição enzimática foi baixo, quando comparados à atividade de outros inibidores, como, por exemplo, o inibidor de tripsina purificado de sementes de Poecilanthe parviflora (PPTI), que inibe a atividade catalítica da tripsina em 65% e, em menor extensão, também foi efetivo sobre a quimotripsina (> 40%) (GARCIA et al ., 2004), o PKTI-22, inibidor de tripsina purificado de Solanum tuberosum , foi capaz de inibir a tripsina em mais de 90 % (REVINA et al ., 2010) e o ApTKI, inibidor de sementes de Adenanthera pavonina que reduz a atividade da tripsina em 97% (MIGLIOLO et al ., 2010). Dessa forma, conclui-se que Pm FP possui baixa inibição para as enzimas tripsina e quimiotripsnia, e as atividades específicas elevadas podem ser justificadas pela baixa quantidade de proteína utilizada nos ensaios de determinação das atividades de tripsina e quimiotripsina.

242 TABELA 11 - Detecção e Dosagem de proteínas bioativas da fração proteica de sementes de Piptadenia moniliformis ( Pm FP)

Proteínas Bioativas Pm FP

Inibidor de tripsina % de Inibição 4.582,62 25 (UI/mgP)* Inibidor de quimotripsina % de Inibição 3.764,91 19 (UI/mgP)

Quitinase (nKat/mgP) § 2,10 ± 0,11

Glucanase (nKat/mgP) # ND

Protease (UA/mgP)** ND

Média ± desvio padrão de três análises, cada uma em triplicata. ND = Não Detectada. * UI/mgP, onde uma unidade de inibição é definida como o decréscimo em 0,01 na absorbância a 440 nm no ensaio de atividade inibitória sobre a quimotripsina segundo Erlanger et al . (1961). § nKat/mgP, onde 1 nKat representa 1 nmol de N-acetil-D-glucosamina liberado por segundo. # nKat/mgP, onde 1 nKat equivale a 1 nmol de glucose liberado por segundo. ** UA/mgP, onde uma unidade de atividade é definida como a quantidade de enzima que produz um aumento de 0,01 unidades de absorbância a 420 nm.

243 Não foi detectada atividade de β-1,3-glucanase e nem atividade proteolítica total em Pm FP, apenas atividade quitinásica (2,10 ± 0,11 nKat/mgP), como já mencionado anteriormente (TABELA 11). A unidade de atividade (U) quitinásica utilizada neste trabalho é o nKat, que representa 1 nmol de N-acetil-D-glucosamina liberado por segundo. Além dessa forma de expressar a unidade de atividade (U), existem outras como o µg de N-acetil-D- glucosamina liberado por minuto que é utilizada por muitos pesquisadores que trabalham com quitinase. Então, se a atividade específica de Pm FP for convertida para essa outra unidade, a mesma passará a ser de 27,4 ± 1,45 U/mgP, sendo catorze vezes maior que a de uma quitinase recombinante de trigo que apresentou atividade específica de 1,9 U/mgP (SINGH; KIRUBAKARAN; SAKTHIVEL, 2007) e seis vezes maior que a quitinase da cevada (4,2 U/mgP), purificada após clonagem e expressão (KIRUBAKARAN; SAKTHIVEL, 2007). Pode-se dizer que Pm FP possui uma elevada atividade quitinolítica, quando comparada a quitinase recombinante de cevada, justamente por se tratar de uma fração proteica e não de uma proteína pura “superexpressada”. Esse resultado sugere que a atividade biológica a ser apresentada por essa fração poderá ser, principalmente, pela presença das proteínas com atividade de quitinase, já que as outras atividades testadas não estavam presentes ou apresentaram-se em baixo percentual.

5.13 Ensaios Biológicos

Após a obtenção, determinação e apresentação das cracterísticas das proteínas presentes em Pm FP (FIGURA 16 e TABELA 11), partiu-se para a determinação das atividades biológicas dessa fração. A escolha dos modelos para os ensaios biológicos foi devido sua importância clínica e fitopatológica, bem como devido ao conhecimento de determinadas funções das proteínas presentes em Pm FP. Dessa forma, a fração proteica de P. moniliformis foi avaliada quanto à presença de atividade inibitória do crescimento de fungos leveduriformis (4 cepas) e de fungos fitopatogênicos (4 espécies), inibitória do crescimento bacteriano (4 cepas) e, ainda, atividade inibitória da eclosão de ovos e larvicida contra Ae. aegypti .

244 5. 13.1 Atividade Antifúngica – Fungos Leveduroformis e Filamentosos

5.13.1.1 Ensaio de Inbição do Crescimento de Leveduras em Meio Líquido

A Pm FP, em diferentes concentrações (500; 250; 125; 62,5; 31,25 e 15,62 µg/mL), foi testada quanto sua capacidade em inibir o crescimento das leveduras C. albicans , C. tropicalis , S. cerevisiae e P. anomala . A ovoalbumina (500 µg/ml) e o formol (0,04%) foram usados como controles negativo (permite o crescimento das leveduras) e positivo (impede o crescimento das leveduras), respectivamente (FIGURA 17). O resultado do ensaio de inibição do crescimento das leveduras C. albicans e P. anomala por Pm FP mostrou que não foi possível impedir o crescimento de ambas, em nenhuma das concentrações testadas, ao contrário, o crescimento foi favorecido em relação ao controle negativo testado (albumina). A C. albicans merece destaque na micologia médica devido a sua alta patogenicidade que leva a necessidade de encontrar novas substâncias com capacidade inibitória para ela, o que não é muito fácil, dado vários trabalhos citados na literatura com esse propósito que também não tiveram êxito como, por exemplo o realizado por Pretto (2005), Pelegrine et al. (2006), além do realizado com extrato bruto e as frações de Plinia glomerata , uma planta com potencial medicinal da mata atlântica brasileira, também não apresentou potencial inibitório para C. albincans , apenas para outros micro-organimos (SERAFIN et al. , 2007). Esse fato pode ser explicado considerando que a parede celular dos fungos age como barreira protetora, impedindo a entrada de extratos, frações ou compostos puros, ou estes não estão atuando em processos que resultem em inibição do curso de vida normal desse patógeno (SELITRENNIKOFF, 1992; SELITRENNIKOFF, 2001). Contrapondo-se a esse fato, C. albicans foi inibida por extratos aquosos de Momordica charantia , Schinus terebinthifolius e Schinus molle em uma triagem de agentes antifúngicos em plantas medicinais e alimentares (SCHMOURLO et al. , 2005). As curvas de crescimento da levedura C. tropicalis em todas as concentrações de Pm FP testadas, com exceção da maior concentração (500 µg/mL), foram menores que a do controle negativo albumina, sendo as concentração de 250 e 125 µg/mL capazes de promover redução de cerca de 50 e 30% no crescimento de C. tropiaclis , respectivamente. Esse resultado foi semelhante ao encontrado para a curva de crescimento de S. cerevisiae , diferindo apenas no percentual de redução da curva de crescimento para as concentrações de 250 e 125 µg/ml que foram um pouco inferiores, cerca de 40% para ambas as concentrações.

245

Candida albicans Saccharomyces cerevisiae

1,6 1 0,9 1,4 0,8 1,2 0,7 1 0,6 0,8 0,5

600nm 0,4

630nm 0,6 A 0,3 A 0,4 0,2 0,2 0,1 0 0 -0,1 0 8 16 24 32 40 48 -0,2 0 8 16 24 32 40 48 Tempo (h) Tempo (h)

Candida tropicalis Pichia anomala 1,2 1,2 1 1 0,8 0,8 0,6 0,6 600nm 600nm 0,4 0,4 A A 0,2 0,2

0 0 0 8 16 24 32 40 48 0 8 16 24 32 40 48 -0,2 -0,2 Tempo (h) Tempo (h)

FIGURA 17 - Curvas de crescimento de quatro leveduras crescidas em caldo BHI ( Brain Heart Infusion ), pH 5, 0, contendo diferentes concentrações da fração proteica de P. moniliformis ( Pm -FP). Pm -FP 500 µg/mL; Pm -FP 250 µg/mL; Pm -FP 125 µg/mL; Pm -FP 62,5 µg/mL ; Pm -FP 31,25 µg/mL; Pm -FP 15,62 µg/mL; Formol 0,4%; (controle positivo) e Ovoalbumina 500 µg/mL (controle negativo). Os valores do Coeficiente de variação para cada ponto foram ≤ 10 %.

246

Entre os fungos unicelulares, as leveduras do gênero Candida representam a maior causa de infecções fúngicas nos seres humanos, particularmente a C. albicans e C. tropicalis que são responsáveis por 46% dos casos de infecção, tendo se tornado maior causa de mortalidade entre pacientes imunodeprimidos (CARLISLE; GUCALP; WIERNIK, 1993; GEORGOPAPADAKOU; TKACZ, 1995; RUY, 2007). O aumento da incidência de infecções e da resistência a antifúngicos comercialmente utilizados para esses patógenos impulsionaram pesquisas na busca de melhores alternativas de combate e o uso de extratos e proteínas de vegetais são fortes candidatos (ANAISSIE et al. , 1989; GHANNOUM e RICE, 1999; LOGUERCIO et al ., 2005). Portanto, Pm FP, tendo sido capaz de proporcionar redução no crescimento de C. tropicalis pode vir a ser usada, após pesquisas mais refinadas, como uma dessas alternativas para ajudar no combate a esse patógeno.

5.13.1.2 Ensaio de Inbição do Crescimento de fungos filamentosos em Meio Líquido

A atividade inibitória do crescimento de fungos filmentosos foi testada com concentrações decrescentes (500; 250; 125; 62,5 e 31,25 µg/ml) da Pm FP frente aos fungos Aspergillus niger , Penicillium herguei , Fusarium solani e Rhizoctonia solani . Foram usados como controles negativo, a ovoalbumina (500 µg/mL) e positivo, o peróxido de hidrogênio 10 mM, como pode ser visto na FIGURA 18. Os fungos citados foram escolhidos como modelo de estudo por se tratarem de fitopatógenos causadores de perdas consideráveis em culturas importantes como a do milho (Fusarium , Aspergillus e Penicillium ), a da soja ( Fusarium , Aspergillus e Penicillium e Rhizoctonia ) e a do feijão-de-corda ( R. solani ) (FERNANDES, 2005a; SARTORATO, 2010; PATOLOGIA DE SEMENTES, 2011) O resultado da FIGURA 18 mostra que os fungo A. niger , F. solani , R. solani e P. herguei , não tiveram seu crescimento inibido por nenhuma concentração de Pm FP testada, tendo sido estimulado o crescimento desse último fungo quando comparado ao controle negativo ovoalbumina.

247

Aspergillus niger Fusarium solani 2,5 2 2 1,5 1,5 1 1 630nm 630nm A 0,5 0,5 A 0 0 0 12 24 36 48 60 72 0 12 24 36 48 60 72 -0,5 -0,5 Tempo (h) Tempo (h)

Penicillium herguei Rhizoctonia solani

0,8 1,2 0,7 1 0,6 0,5 0,8 0,4 0,6

630nm 0,3 630nm

A 0,4

0,2 A 0,1 0,2 0 0 -0,1 0 12 24 36 48 60 72 0 12 24 36 48 60 72 -0,2 Tempo (h) Tempo (h)

FIGURA 18- Curvas de crescimento de quatro fungos crescidos em caldo YPD ( Yeast Potato Dextrose ), contendo diferentes concentrações da fração proteica de Piptadenia moniliformis (Pm -FP). Pm -FP 500 µg/mL; Pm -FP 250 µg/mL ; Pm -FP 125 µg/mL; Pm -FP 62,5 µg/mL; Pm -FP 31,25 µg/mL; Tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 5,2; Peróxido de Hidrogênio 10 mM (controle positivo); Ovoalbumina 500 µg/mL (controle negativo). Os valores do Coeficiente de variação para cada ponto foram ≤ 10 %.

248 A ausência de atividade antifúngica da fração proteica de P. moniliformis ( Pm FP) não foi esperada, dada à presença de forte atividade quitinásica que é reconhecidamente capaz de degradar parede celular de fungos, uma vez que a quitina é o maior componente estrutural de parede de fungos fitopatogênicos (KUDAN; PICHYANGKURA, 2009). Além disso, o extrato bruto dessa espécie é ativo contra o fungo A. niger , como pode ser visto na TABELA 5. No entanto, nem toda quitinase é ativa contra todos os fungos e algumas quitinases de plantas e de bacterias são desprovidas de atividade antifúngica (KAWASE et al. , 2006). Ademais, a amostra testada neste trabalho não se tratava de uma quitinase pura, e sim de uma mistura de proteínas contendo quitinases, o que poderia atrapalhar, de alguma forma, a atuação das quitinases não prejudicando o ciclo de vida dos fungos testados. Verburg e Huynh (1991) purificaram uma quitinase de Arabidopsis thaliana e verificaram sua capacidade em inibir o crescimento do fungo T. reesei , no entanto o crescimento dos fungos A. solani , F. oxysporum , S. sclerotiorum , G. Graminis e P. megasperma , não foi inibido por essa quitinase. Resultado similar foi encontrado por Broekhaert et al. (1988) onde quitinases de tabaco e de trigo foram ativas contra a germinação de esporos e contra o crescimento de hifas dos fungos Trichoderma hamatum e Phycomyces blakesleeanus , mas não do Botrytis cinerea . Em 2007, Ho e Ng purificaram duas proteínas tipo quitinases de banana que apresentavam potencial antifúngico diferente para Fusarium oxyporum e nenhuma delas era ativa contra Mycosphaerella arachidicola , indicando a especificidade de ação antifúngica. As quitinases, segundo Wang et al. (2009), parecem ter seu próprio epectro antifúngico cracterístico, atuando apenas em determinadas espécies. Um estudo realizado por Yan et al . (2008) sugere que esse fato pode estar correlacionado com a microestrutura de superfície e a proporção de quitina presente na parede celular de cada fungo. Essa especificidade de atuação pode contribuir para o desenvolvimeto do controle biológico de fungos patogênicos de espécies particulares. Assim sendo, Pm FP pode apresentar propriedades antifúngicas a espécies ainda não testadas, por isso é importante verificar a atuação da Pm FP frente a outros fungos patogênicos no intuito de determinar seu espectro de ação.

249 5. 13. 2 Atividade Antibacteriana

5.13.2.1 Ensaio de Inibição do Crescimento de Bactérias em Meio Líquido

A FIGURA 19 mostra as curvas de crescimento das espécies Gram-positivas B. subtilis e S. aureus , e das Gram-negativas E. aerogenes e S. choleraesuis , na presença de Pm FP (500; 250; 125; 62,5 e 31,25 µg/mL), de Ovoalbumina (500 µg/mL), como controle negativo e de formol 0,4%, como controle positivo. As curvas de crescimento da bacteria B. subtilis foram menores na presença de Pm FP, em todas as concentrações, quando comparado com aquela contendo ovoalbumina, até mesmo na menor concentração testada (31,25 µg/mL), a qual foi capaz de causar redução em torno de 60% do crescimento dessa cepa Gram-positiva em relação ao controle negativo. O mesmo resultado não foi obtido para a outra bactéria Gram-positiva, a S. aureus , posto que Pm FP, apenas nas mais baixas concentrações, foi capaz de causar leve diminuição na curva de crescimento quando comparadas ao controle ovoalbumina. Basile et al . (2000) afirmaram que na utilização de plantas para a avaliação de atividade antimicrobiana existe um perfil de seletividade maior entre as bactérias Gram-positivas. Entretanto esse fenômeno também é observado na outra classe bacteriana (SCHAECHTER et al. , 2002). Em relação às espécies Gram-negativas, Pm FP não apresentou efeito significativo sobre a E. aerogenes em nenhuma das concentrações testadas, mas sobre a S. choleraesuis, Pm FP, apenas na menor concentração (31,25 µg/mL), causou uma redução na curva de crescimento de cerca de 2 vezes em relação ao crescimento da mesma cepa na presença de ovoalbumina. Na realidade, o que parece acontecer é a estimulação do crescimento das bactérias na presença de Pm FP e, quanto mais baixa a concentração, menor é a curva de crescimento, daí a redução no crescimento de S. choleraesuis e de S. aureus citados anteriormente. A estrutura das células bacterianas Gram-negativas tem sido associada à resistência a diversos antimicrobianos, pois possuem uma membrana externa que não só dificultam a entrada desses agentes como não permite que concentrações suficientes penetrem para causar inativação da célula e, ainda, quando penetram, as bactérias possuem mecanismos especializados (bombas de efluxos) para expulsar substâncias estranhas para fora da célula.

250

Bacillus subtilis Enterobacter aerogenes

0,7 0,25 0,6 0,2 0,5 0,4 0,15 0,3 0,1 280nm A 280nm 0,2 A 0,05 0,1 0 0 0 4 8 12 16 20 24 -0,1 0 4 8 12 16 20 24 -0,05 Tempo (h) Tempo (h)

Staphylococcus aureus Salmonella choleraesuis

0,35 0,3

0,3 0,25 0,25 0,2 0,2 0,15 0,15 280nm 280nm 0,1 A 0,1 A 0,05 0,05 0 0 0 4 8 12 16 20 24 0 4 8 12 16 20 24 -0,05 -0,05 Tempo (h) Tempo (h)

FIGURA 19 - Curvas de crescimento de quatro espécies de bactérias (2 Gram + e 2 Gram -) crescidos em caldo nutritivo (Peptona e Extrato de levedura) contendo diferentes concentrações da fração proteica de P. moniliformis ( Pm -FP). Pm -FP 500 µg/mL; Pm -FP 250 µg/mL; Pm -FP 125 µg/mL; Pm -FP 62,5 µg/mL; Pm -FP 31,25 µg/mL; Formol 0,4% (controle positivo); Ovoalbumina 500 µg/mL (controle negativo). Os valores do Coeficiente de variação para cada ponto foram ≤ 10 %.

251 Além disso, possuem um espaço periplasmático, onde podem ser encontradas enzimas degradantes que inativam alguns antibióticos, como os beta-lactâmicos, proteases, nucleases e outros (TAVARES, 1999; SCHAECHTER et al. , 2002; VAN BAMBEKE; MICHOT; TULKENS, 2003). Isso, pode explicar, pelo menos em parte, a dificuldade em encontrar novos agentes antimicrobianos e a resistência das bactérias a esses compostos. Em consonância com esse fato, um estudo realizado por Kumar et al. (2006), usando extratos de várias plantas medicinas, concluiu que, no geral, as substâncias antibacterianas de plantas parecem inibir mais as bactérias Gram-positivas do que as Gram-negativas. De uma maneira geral, Pm FP, não apresentou atividade antibacteriana potente frente às cepas testadas, apenas proporcionou uma leve redução na curva de crescimento da bactéria B. subtilis em relação ao controle negativo, ovoalbumina. No entanto, esse é um resultado positivo que dever ser investigado mais detalhadamente, posto que ainda são poucas as proteínas em relação a outros compostos, com atividade antibacteriana descritas na literatura até o momento (NINGAPPA et al. , 2010). E, diante da capacidade de adaptação e resistência desses micro-organismos ainda existe a necessidade da busca constante por agentes com propriedades antibacterianas.

5.13. 3 Atividade Inseticida

O modelo biológico escolhido para o ensaio de atividade inseticida foi o mosquito Ae. aegypti por ser o principal vetor da dengue, doença que atinge o maior número de indivíduos por ano, sendo responsável por inúmeras mortes em todo mundo. A primeira estratégia de controle dessa doença é o combate ao seu vetor devido à ausência de vacinas eficientes (WHO, 2009; JANSEN; BEEBE, 2010).

5.13.3.1 Ensaio de Determinação da Atividade Inibitória da Eclosão dos Ovos de Aedes aegypti

O efeito de Pm FP em diferentes concentrações (1; 0,5; 0,250; 0,225; 0,200 e 0,175

252

mgP/ml) e dos controles negativos: albumina sérica bovina (BSA) (1 mgP/mL) e água destilada sobre a eclosão dos ovos e sobrevivência de larvas em 1º estádio de Ae. aegypti estão apresentados na TABELA 12. A fração proteica de P. moniliformis , nas concentrações de 1, 0,5 e 0,250 mgP/mL, impediu completamente a eclosão dos ovos de Ae. aegypti , mostrando-se tóxica, uma vez que a casca do ovo é uma estrutura impermeável e rígida que protege o embrião, desempenhando um papel importante na sobrevivência do mosquito transmissor da dengue e da febre amarela. A A rigidez característica dos ovos de A. aegypti deve-se à presença de um material semelhante à quitina em sua composição (BECKEL, 1958; MOREIRA et al ., 2007). Há outros relatos que sugerem que quitina é um componente da casca do ovo em outros insetos (BECKEL, 1958; HARWOOD, 1958; POWELL; HOLLANDER; FUCHS, 1986; WILSON; CRYAN, 1997; MOREIRA et al ., 2007; MANSUR et al ., 2010). Esses dados podem justificar a atuação de Pm FP, pelo fato dessa fração ser rica em proteínas com atividade quitinolítica, capaz de degradar a quitina presente na casca desses ovos e inviabilizá-los. A concentração de 0,225 mgP/mL de Pm FP, apresentou baixo percentual de eclosão dos ovos (11,66 ± 2,9) e mortalidade de cerca 33% entre as poucas larvas que eclodiram (TABELA 12). As larvas que se mantiveram vivas apresentaram escurecimentos em toda a sua estrutura, com ênfase no tórax, nos segmentos abdominais, incluindo o intestino médio e os túbulos de malpighi (FUGURA 20). Além disso, as brânquias anais das larvas tratadas com Pm FP (FIGURA 20, 3b) encontraram-se extremamente amareladas, diferentemente do controle BSA (FIGURA 20, 3a). Pm FP causou alteração na morfologia das larvas provavelmente pela ação das quitinases, uma vez que o escurecimento das larvas é devido à sobreposição de cutícula dos segmentos abdominais que pode ser causado por uma alteração na síntese e/ou na reabsorção de quitina (SALVADOR, 2002; CAVALHEIRO, 2010). Além disso, proteína bruta de B. thuringiensis contendo quitinases foi tóxica para larvas de Ae. aegypti , causando alto percentual de mortalidade (THAMTHIANKUL et al. , 2001). Quantidades menores de Pm FP (0,200 e 0,175 mgP/mL) permitiram maiores percentuais de eclosão de ovos do inseto em estudo (58,3 ± 5,8; 96,66 ± 2,9, respectivamente), mas ainda assim, foram capazes de causar mortalidade nas larvas do mosquito da dengue (TABELA 12).

253 TABELA 12 – Efeito da fração proteica de Piptadenia moniliformis ( Pm FP) sobre a eclosão dos ovos e sobrevivência de larvas em 1º estádio de Aedes aegypti após 7 dias de exposição

Número Número de Número de Número de Amostras % Eclosão % Mortalidade* de ovos eclosões larvas vivas larvas mortas

BSA (1 mgP/mL) 20 20 ± 0 100 ± 0 20 ± 0 0 0

Pm FP (1 mgP/mL) 20 0 0 ± 0 - - -

Pm FP (0,500 mgP/mL) 20 0 0 ± 0 - - -

Pm FP (0,250 mgP/mL) 20 0 0 ± 0 - - -

Pm FP (0,225mgP/mL) 20 2,33 ± 0,6 11,66 ± 2,9 1,66 ± 1,5 0,66 ± 1,1 33,33 ± 5,7

Pm FP (0,200mgP/mL) 20 11,76 ± 1,1 58,3 ± 5,8 9 ± 1,7 2,67 ± 0,6 23,31 ± 6,9

Pm FP (0,175mgP/mL) 20 19,33 ± 0,6 96,66 ± 2,9 17 ± 1,0 2,33 ± 0,6 12,10 ± 3,2

Água destilada 20 20 ± 0 100 ± 0 20 ± 0 0 0

Média ± desvio padrão de três análises, cada uma em triplicata * Média do número de larvas mortas/ número de eclosões x 100;

254 TX

AB

1a CA SR 1b

BA 2a 2a

2b

3a 3a 3b

TM

4.1b

TM

4a 4a IM 4b

FIGURA 20 – Fotomicrografia (50 x) das larvas de Aedes aegypti tradadas com BSA (1 mgP/mL) (a) e com Pm FP (0,225 mgP/mL) (b). 1 – CA: Cabeça, TX: Tórax e AB: Abdômen; 2 – SR: Sifão respiratório e BA: Brânquias anais (75 x); 3 – Detalhes das Brânquias anais; 4 – IM: Intestino Médio e TM: Túbulos de Malpighi; 4.1 – Detalhes do IM e TM.

255 As alterações de escurecimento apresentadas pelas larvas tratadas com Pm FP (0,250 mgP/mL) não estavam presentes nas larvas tratadas com essa fração na concentração de 0,175 mgP/mL (não mostrado). O que sugere uma atuação dose-dependente. Poucos estudos que buscam alternativas de controle contra A. Aegypti testam a toxicidade de compostos de planta sobre a eclosão de ovos quando comparados aos estudos que utilizam larvas de terceiro estádio. O que não torna menos importante, posto que são os ovos são o principal meio de dispersão do inseto, já que são capazes de resistir a longos períodos de dessecação (450 dias), permitindo seu transporte a grandes distâncias e tornando- se um sério obstáculo para sua erradicação (TELES, 2009). Nesse contexo, o resultado apresentado neste trabaho, onde uma fração proteica de P. moniliformis (de 1 a 0,250 mgP/mL) é capaz de causar inibição de eclosão de 100% nos ovos causando alterações em sua estrutura, torna-se de elevada importância. Resultado semelhante também foi encontado por Ramos et al. (2006), onde frações proteicas do látex da planta Calotropis procera foram capazes de inibir 100% a eclosão de ovos de Ae. Aegypti , só que em concentrações bem mais elevadas (10, 50 e 100 mgP/mL). Broadbent e Pree (1984) relataram que quando ovos de Ae. Agypti são expostos a altas concentrações de compostos, maior quantidade é capaz de penetrar na casca afetando a embriogênese. Outros estudos, usando metabólitos secundários de plantas, também investigaram o percentual de eclosão dos ovos como o de Govindarajan e Karuppannan (2011), que testaram vários extratos de folhas de Eclipta alba contra ovos de Ae. Aegypti . Aqueles autores encontraram que o extrato metanólico apresentou atividade ovicida mais efetiva, sem eclosão de nenhuma larva (100% de mortalidade) na concentração de 300 ppm.

A concentração capaz de inibir 50% de eclosão dos ovos de Ae. aegypti (CI 50 ) apresentada por Pm FP foi de 204,418 ± 2,19117 µgP/mL, superior à encontrada por Prajapati -1 et al . (2005) para óleos essenciais de Curcuma longa (CI 50 90,7 µg.mL ) e Ocimun basilicum -1 (CI 50 173,9 µg.mL ). No entanto, as substâncias ativas apresentadas nos trabalhos acima citados e na maioria dos trabalhos relatados na literatura, não são de natureza proteica o que torna difícil a comparação. Desse modo, o resultado apresentado fica ainda mais interessante, posto que novos compostos ativos contra o veículo de dispersão do mosquito da dengue estão sendo revelados. No intuito de verificar possíveis alterações nos ovos de Ae. aegypti , foi realizado, novamente, o ensaio de atividade inibitória sobre a eclosão dos ovos usando Pm FP na maior concentração capaz de causar 100% de inibição de eclosão (1 mgP/mL, TABELA 12). Após

256 um período de sete dias, os ovos foram retirados e visualisados em estereomicroscópio Tecnival® (FIGURA 21). Através das observações no microscópio, pôde-se constatar alterações na morfologia dos ovos, já que a casca apresentou aspecto quebradiço e transparente, em algumas regiões, sendo possível a passagem da luz do microscópio através dele, sugestivo de fragilidade. Isso pode ter levado ao comprometimento embrionário. Esse resultado é semelhante ao achado de Jarial (2001), onde extratos de alho causaram fissuras na superfície dos ovos impedindo a eclosão das larvas. Existem trabalhos mostrando que a quitina está presente em duas principais estruturas extracelulares de insetos: cutícula, sintetizada por células epiteliais e a membrana peritrófica, sintetizada pelas células de revestimento intestinal, desempenhando um importante papel no reforço da estrutura do exoesqueleto e protegendo os insetos contra os estresses ambientais e micróbios patogênicos (NEVILLE; PARRY; WOODHEAD-GALLOWAY, 1976; TIMMERMANN; BRIEGEL, 1999; IBRAHIM et al. , 2000; ZHU et al. , 2002; DIAS FILHO et al. , 2002; ZIMOCH; MERZENDORF, 2002; ARAKANE et al. , 2004; ARAKANE et al. , 2005; KRAMER; MUTHUKRISHNAN, 2005; KATO et al. , 2006). Essas estruturas contendo quitina tem se tornado objeto de muitos estudos como alvo seguro de controle de insetos devido sua ausência nos vertebrados (KRAMER; MUTHUKRISHNAN, 2005). Assim sendo, Pm FP pode desempenhar um importante papel no controle da disseminação desse inseto, tornando-se relevante um estudo mais aprofundado.

257

AAA BBB

CCC

FIGURA 21 – Fotomicrografia (50 x) dos ovos de Aedes aegypti tratados com Pm FP (1 mgP/mL). (A) ; tratados com BSA (1mg/mL) (B) ; Detelhe da alteração dos ovos tratados com Pm FP (C) .

258 6. CONCLUSÃO DO CAPÍTULO

As dez espécies vegetais da Caatinga apresentam vários compostos bioativos nos extratos brutos de suas sementes originados do metabolismo primário (proteínas bioativas) e do metabolismo secundário (metabólitos secundários), além de, algumas delas, apresentarem atividades biológicas importantes frente a larvas de terceiro estádio de Ae. aegypti , fungos fitopatogêncos e bactérias patogênicas para seres humanos, tornando-as promissoras fontes de compostos antimicrobianos e inseticidas que podem ser aproveitados biotecnologicamente para o controle natural de doenças de plantas e pelas indústrias farmacêuticas. As espécies que se destacaram como possuidoras de um bom perfil bioativo foram: C. bracteosa , D. megacarpa , E. contortisiliquum , P. moniliformis e S. rugosa , por terem apresentado atividades frente a modelos biológicos de importância para o homem e/ou para as plantas que podem estar associados aos compostos biativos por elas apresentados. Dentre as espécies promissoras, foi isolada a fração proteica de P. moniliformis (Pm FP) contendo elevada atividade quitinásica que foi capaz de causar uma leve redução no crescimento das leveduras S. cerevisiae e C. tropicalis , bem como na bactéria B. subtilis .

Pm FP foi capaz de inibir a eclosão de ovos de Ae. aegypti com CI 50 de 204, 42 ± 2,19 µgP/ml, alterando a estrutura dos ovos por causar fissuras, além de causar modificações na morfologia das larvas de primeiro estádio como o escurecimento em vários de seus segmentos.

259 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Um dos propósitos desse trabalho foi o conhecimento a respeito das potencialidades de espécies vegetais nativas da caatinga, objetivando a agregação de valor a cada espécie, no intuito de viabilizar o uso racional e sustentável das mesmas, além do objetivo de contribuir para a descoberta de novas moléculas bioativas contra micro-organismos patogênicos para o homem e para as plantas, novas fontes de proteínas, outros nutrientes e alimentos. As metas do trabalho foram atingidas após a investigação da presença de metabólitos secundários e proteínas na busca de substâncias bioativas presente nas sementes das dez espécies, bem como com a determinação da composição dos vários nutrientes e antinutrientes nesses grãos de leguminosas não convencionais estudadas. Já que, o presente estudo proporcionou a comprovação de que estas espécies apresentam uma gama de compostos bioativos possíveis de serem isolados e aproveitados para o combate a vetores causadores de doenças humanas, biotecnologicamente para o controle natural de doenças de plantas e pelas indústrias farmacêuticas, além da comprovação de que a composição nutricional dessas sementes são possível de serem utiliadas para a alimentação humana e/ou animal. Através desse trabalho vários caminhos foram abertos para diversas outras pesquisas como: isolamento de qualquer um dos compostos bioativos detectados nas sementes estudadas; investigação da ação desses compostos in vitro ou em modelos biológicos para futuras utilizações agrícolas ou em indústrias farmacêuticas; estudos mais detalhados em torno de cada nutriente determinado; investigação de nutrientes (vitaminas, por exemplo) e antinutrientes não pesquisados; Isolamento de qualquer constituinte de interesse (fibras, lipídios) para uma melhor análise e futura utilização pela indústria de alimentos, entre outras. A necessidade de mais estudos em torno das sementes de leguminosas analisadas torna-se evidente após a investigação da qualidade protéica da farinha das sementes da espécie Piptadenia moniliformis Benth., apontada como mais promissora segundo o índice de qualidade nutricional (IQN), que mostrou através das analises in vitro que embora seu perfil de nutrientes seja bom, com elevada quantidade de proteínas e boa composição de aminoácidos, quando analisadas in vivo não foi capaz de promover crescimento e desenvolvimentos dos animais experimentais. Nem mesmo após tratamentos os térmicos realizados. Quando um novo estudo foi conduzido com a retirada de outro potente fator antinutricional, os α-galactosídeos, das farinhas de P. moniliformis , constatou-se uma leve melhora nos parâmetros nutricionais avaliados. Isso comprova que estudos mais detalhados 260 com as sementes podem levar a descoberta do real fator que prejudica o aproveitamento dos nutrientes desses grãos, processá-los de forma correta e torná-los possíveis de serem utilizados como alimento no futuro. Além disso, ensaios mais conclusivos podem ser feitos para o aproveitamento de Pm FP na diminuição da disperção dos ovos do mosquito da dengue, pelo dano que essa fração protéica é capaz de causar na estrutura dos ovos e ainda prejuízo causados nas larvas que deles eclodem. Assim sendo, a presente pesquisa não só atingiu aos seus objetivos como contribuiu para o aumento de objetos de pesquisa através da grande quantidade de conhecimentos gerados.

261 262 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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327

328 8. ANEXOS

8.1 Fonte da Figura 2

LETRA / ESPÉCIE FONTE A / Erythrina velutina LORENZI, 2002. B / Caesalpinia ferrea http://www.atelierdobonsai.com.br/forum/viewtopic.php ?t=11646&sid=61343b5bd21e44d64bd58fbe7796cc15

C / Hymenaea courbaril LORENZI, 2002. D / Lonchocarpus sericeus Chris Baasch : http://www.tropicsphere.com/main/forums/viewtopic.php ?f=2&t=9474&p=75535 E / Enterolobium contortisiliquum F / Piptadenia moniliformis LORENZI, 2002. G / Parkia platycephala H / Caesalpinia Bracteosa http://www.brasilcidadao.org.br/museu/ma_flora_05.php I / Dioclea megacarpa http://plants.usda.gov/java/largeImage?imageID=dime7_ 001_ahp.tif J / Senna rugosa Arquivo Pessoal

329 8.2 Fonte da Figura 3

LETRA / ESPÉCIE FONTE 1 Vagem de Caesalpinia ferrea 2 Vagens de Caesalpinia Bracteosa Arquivo Pessoal 3 (a) Vagens de Dioclea megacarpa 3 (b) Sementes de Dioclea http://grainecreation.com/zye_bourik_dioclea_meg megacarpa acarpa.aspx 4 Senna rugosa 5 (a) Vagens de Enterolobium Arquivo pessoal contortisiliquum 5 (b) Sementes de Enterolobium http://www.arvores.brasil.nom.br/new/tamboril/ind contortisiliquum ex.htm 6 (a) Sementes de Parkia platycephla LORENZI, 2002. 6 (b) Vagens de Parkia platycephla 7 (a)1 Vagens de Lonchocarpus Arquivo pessoal sericeus 7 (a)2 Vagens de Lonchocarpus sericeus 7 (b) Sementes de Lonchocarpus sericeus LORENZI, 2002. 8 (a) Vagens de Erythrina velutina 8 (b) Sementes de Erythrina velutina 9 (a) Hymenaea courbaril LORENZI, 2002. /www.clubedasemente.org.br/jatoba.html 9 (b) Hymenaea courbaril LORENZI, 2002. 10 (a)1 Sementes de Piptadenia Arquivo pessoal moniliformis 10 (a)2 sementes de Piptadenia moniliformis LORENZI, 2002. 10 (b) Vagens Piptadenia moniliformis

330 8.3 Artigo publicado

331