Inmunolocalización de citolisinas en la anémona de mar (Stichodactyla helianthus)

Katia Ojito Ramos María Cristina Pico Beltrán

Edición: Liset Ravelo Romero Corrección: Fernando Gutiérrez Ortega Diagramación: Roberto Suárez Yera Diseño de cubierta: Claudia María Larrea Marin

Katia Ojito Ramos y María Cristina Pico Beltrán, 2010 Editorial Feijóo, 2010

ISBN: 978-959-250-580-3

Editorial Samuel Feijóo, Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas, Carretera a Camajuaní, km 5 ½, Santa Clara, Villa Clara, Cuba. CP 54830

RESUMEN

Las sticholisinas I y II son dos proteínas citolíticas provenientes de la anémona de mar (Stichodactyla helianthus) que presentan un gran potencial biomédico. La ubicación de estas citolisinas dentro del tejido del animal sería un elemento de gran utilidad en el estudio de las funciones para las cuales este las emplea y facilitaría el proceso de aislamiento y purificación de las mismas. En este trabajo se obtuvieron anticuerpos policlonales anti-sticholisinas en conejos, los que se purificaron mediante intercambio iónico y cromatografía de afinidad, resultando esta última de bajo rendimiento para la matriz cromatográfica empleada. Se preparó un conjugado anti-IgG de conejo peroxidasa, a partir de anticuerpos anti- IgG de conejos obtenidos en carneros. Este conjugado se empleó en la localización inmunohistoquímica de las sticholisinas en el tejido de la anémona de mar, técnica que fue estandarizada para estos reactivos, permitiendo la localización de las sticholisinas en cnidocitos de tentáculos y boca de Stichodactyla helianthus.

ÍNDICE

INTRODUCCIÓN / 7

CAPÍTULO 1. CITOLISINAS EN ANÉMONAS DE MAR / 9

Características generales de las anémonas de mar / 9 Características morfológicas / 9 Histologías de las anémonas de mar / 12 Actividades biológicas descritas en anémonas de mar / 15 Stichodactyla helianthus /18 Stichodactyla helianthus como fuentes de compuestos bioactivos / 19 Citolisinas de anémonas de mar / 20 Significado biológico de las citolisinas en las anémonas de mar / 21 Citolisinas de Stichodactyla helianthus / 23 Potencial biomédico de las sticholisinas de Stichodactyla helianthus / 26

CAPÍTULO 2. OBTENCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-STICHOLISINAS I Y II EN CONEJO / 29

Generalidades en la producción de anticuerpos policlonales / 29 Preparación del inóculo (sticholisina I y II- adyuvante) / 31 Preparación de la mezcla sticholisina I y II- adyuvante de Freud / 31 Esquema de inmunización de conejos con el inóculo / 32 Purificación de los anticuerpos anti-sticholisina I y II obtenidos en conejos / 33 Obtención del suero / 34 Precipitación en sulfato de amonio (NH SO ) / 34 4 4 Cromatografía de intercambio iónico / 35 Cromatografía de inmunoafinidad / 36

CAPÍTULO 3. LOCALIZACIÓN INMUNOHISTOQUÍMICA EN LA ANÉMONA DE MAR STICHODACTYLA HELIANTHUS / 39

Técnicas enzimo-inmunohistoquímicas / 39 Antecedentes históricos / 39 Generalidades de la técnica / 41 Selección del procedimiento de procesamiento de los tejidos / 42 Selección de los procedimientos de tinción inmunohistoquímica / 44 La especificidad en las tinciones inmunohistoquímica / 46 Preparación del conjugado anti-IgG de conejo peroxidasa / 48 Obtención de anticuerpos anti-IgG de conejo / 49 Conjugación / 50 Colecta de la anémona Stichodactyla helianthus / 51 Inmunohistoquímica / 51 Procesamiento de las muestras. Fijación y embebimiento en parafina / 51 Tinción inmunoperoxidasa. Método indirecto / 52 Desparafinación y rehidratación / 53 Ensayos preliminares / 53 Eliminación de la reacción inespecífica del conjugado / 55 Efectos de la dilución y de las condiciones de incubación del anticuerpo primario / 58

CAPÍTULO 4. DISCUSIÓN GENERAL / 62 CONCLUSIONES / 67

RECOMENDACIONES / 68

BIBLIOGRAFÍA / 69

Introducción

Las citolisinas constituyen una gran familia de proteínas, presentes en bacterias, plantas y animales, que comparten una actividad común, la destrucción de células por rompimiento de la barrera de permeabilidad de sus membranas; estas toxinas, principalmente las provenientes de las anémonas de mar, han sido objeto de muchos estudios. El estudio del mecanismo de acción de estas proteínas tiene gran importancia puesto que puede ser utilizado como herramienta para conocer una gran variedad de procesos de membranas. La relevancia de estas toxinas formadoras de canales, no solo se limita a su estudio y caracterización sino que son consideradas modelos de aquellas que forman los canales propios de membranas naturales. Estas citolisinas, además pudieran ser utilizadas con fines terapéuticos si se consideran sus propiedades cardioestimulatorias, anticoagulantes y sus potencialidades como agentes antitumorales.1, 2

Las sticholisinas I y II (St I y II) son dos proteínas citolíticas provenientes de la anémona de mar Stichodactyla helianthus. Desde hace algunos años son objetos de estudio del grupo de Biomembrana de la Facultad de Biología de la Universidad de La Habana 3-15 y han sido evaluadas en la preparación de una inmunotoxina contra Giardia duodenalis. 16 Estas toxinas tienen gran potencial biomédico, son las proteínas que interactúan con proteínas canales de membrana, como las que actúan sobre canales de sodio, éstas se proponen para el tratamiento del dolor; otras, actúan sobre canales de potasio los cuales están implicados en la regulación de funciones celulares, tales como excitabilidad del músculo liso, y neuronas y proliferación celular. Obviamente el bloqueo de estos canales conduce a condiciones patofisiológicas, las sticholisinas de Stychodactyla helianthus se encuentran en la fase II con su propiedad de bloquear canales de potasio (Kv 1.1 y Kv 1.3), han demostrado ser eficaz en modelos animales de esclerosis múltiple y otras enfermedades autoinmunes, como son, diabetes tipo I, psoriasis y artritis reumatoide.17 Las St I y II interfieren con la unión de dendrotoxinas marcadas en la membrana de los sinaptosomas, y bloquea la corriente a través de los canales con varias subunidades KV1 y también la conductancia intermedia de los canales de potasio dependientes de calcio .18 entre otras investigaciones. 19-24

En todas estas investigaciones, las proteínas han sido aisladas a partir del extracto crudo del cuerpo integro del animal.

7 La ubicación de estas toxinas dentro del tejido del animal sería un elemento de gran utilidad en el estudio de las funciones para las cuales este las emplea y en la aplicación de estas toxinas, a la par que facilitaría el protocolo de aislamiento y purificación.

Una de las técnicas más utilizadas con el objetivo de detectar histológicamente antígenos, son las técnicas inmunohistoquímicas. Dada la disponibilidad y especificidad de anticuerpos como reactivos y la gran sensibilidad del método, constituyen procedimientos sencillos, rápidos y económicos.

Los objetivos del trabajo fueron obtener y purificar anticuerpos anti-sticholisinas en conejos, Localizar las sticholisinas en el cuerpo de la anemona de mar Stichodactyla helianthusis y estandarizar la técnica inmunohistoquímica para la localización de toxinas en anémonas de mar.

CAPÍTULO 1. Citolisinas en anémonas de mar

Anémonas de mar

8

Los cnidarios pertenecen a los invertebrados metazoarios inferiores y se caracterizan por ser el único filo que posee células urticantes denominadas cnidocistos. Los cnidocistos tienen importancia taxonómica, ecológica y zoogeográfica, ya que a través del estudio de estas células es posible conocer el status de una especie y si ésta se encuentra representada por clines. 25 Dentro de este grupo zoológico se encuentran las anémonas de mar.

Características morfológicas

La clase Anthozoa, a la cual pertenecen las anémonas de mar (Cuadro 1), son los miembros más avanzados de los cnidarios, y su estructura corporal es mucho más compleja que los pólipos simples de las hidras. 26

Dominio: Eukaryota - Whittaker & Margulis,1978

Reino: Animalia - Linnaeus, 1758 - animals

Subreino: Radiata - (Linnaeus, 1758) Cavalier-Smith, 1983

Infrarreino: Coelenterata - Leuckart, 1847

Phylum: Cnidaria - Hatschek, 1888 - Cnidarians

Subphylum: Anthozoa - (Ehrenberg, 1831) Cavalier-Smith, 1998 - Corals, Flower Animals

Clase: Anthozoa - Ehrenberg, 1831 - Corals, Flower Animals

Subclase: Zoantharia

Orden: Actiniaria - Sea Anemones

Familia: Stichodactylidae

Género: Stichodactyla - Brandt, 1835

Nombre específico: helianthus - (Ellis, 1768)

9 Nombre científico: Stichodactyla helianthus (Ellis, 1768)

Cuadro 1. Ubicación taxonómica de la anémona de mar Sticodactyla heialnthus.

El cuerpo de una anémona de mar tiene una forma más o menos cilíndrica y carece de esqueleto. Esta formado por una gruesa columna, en cuyo extremo aboral se destaca un disco pedal aplanado que le sirve para la fijación al sustrato (Figura 1).

En el extremo oral de la columna se estrecha ligeramente para formar el disco oral o perisoma en el cual se aprecian varios tentáculos huecos. En el centro del disco oral se observa una boca en forma de hendidura que presenta en ambos extremos un surco ciliado llamado sifonoglifo. Este facilita la circulación del agua hacia la cavidad gastrovascular. La función de la corriente de agua es mantener el esqueleto interno líquido o hidrostático contra el cual actúa el sistema muscular. Sigue a la boca una faringe aplanada que se prolonga unas 2/3 partes a lo largo de la columna y que contiene las mismas capas de células que la pared del cuerpo. 27

La cavidad gastrovascular de las anémonas de mar es más compleja que en el resto de los cnidarios, se halla dividida en cámaras por mesenterios longitudinales dispuestos radialmente: 6 cámaras situadas entre la faringe y la pared del cuerpo, que incrementan el área superficial para la secreción de enzimas digestivas y la absorción de nutrientes. 28 Por debajo de la faringe las cámaras se abren a una cavidad digestiva basal común. Los mesenterios están formados por una doble capa de gastrodermis con una lámina intermedia de mesoglea; llevan, además, un haz de músculos longitudinales. Estos mesenterios pueden ser completos e incompletos; los primeros unen la pared del cuerpo con la faringe; los incompletos solo unen la pared del cuerpo y dividen parcialmente la cavidad digestiva. 29 El borde libre de cada mesenterio es trilobulado y recibe el nombre de filamento mesentérico. 30

10

Figura 1. A, B, C. estructura de una anémona marina. A, Sección longitudinal. B, Sección transversal al nivel d ela faringe. C, Corte transversal del filamento mesentérico 30

11

Histología de las anémonas de mar

La pared corporal consta de tres capas fundamentales: la epidermis, externa, una interna integrada por células de revestimiento de la cavidad gastrovascular, gastrodermis, y entre ambas una tercera llamada mesoglea. 30, 31

Epidermis

La epidermis consta de cinco tipos principales de células.

- Células epiteliomusculares: Tienen forma cilíndrica, su base descansa en la mesoglea y se dilatan ligeramente en su extremo distal para formar la mayor parte de la superficie epidérmica. A diferencia del verdadero epitelio columnar, estas células poseen dos o más extensiones basales, cada una de las cuales contiene una miofibrilla contráctil. Dichas extensiones están orientadas en dirección paralela al eje del péndulo y los tentáculos del cuerpo; las extensiones sucesivas están conectadas entre sí. En conjunto, forman una capa cilíndrica longitudinal contráctil. - Cnidocitos: Están esparcidos por toda la epidermis, alojados o invaginados en las células epiteliomusculares y aun en la gastrodermis. Son particularmente más abundantes en la epidermis de los tentáculos, donde se agrupan y forman verrugas; también abundan en la región oral. Faltan o son escasos en las regiones aborales. Estas células son particulares de los cnidarios, contienen orgánulos evaginables llamados cnidos, en los que se encuentran las estructuras punzantes denominadas nematoditos. En el interior de las células está relleno de una cápsula que contiene un tubo enrollado, usualmente doblado; el extremo de la cápsula esta dirigido hacia fuera y está cubierta por una tapa u opérculo. Es probable que la base del cnidocito esté asociada, además, con una neurona terminal. Según parece, el mecanismo de descarga es un cambio en la permeabilidad de la pared de la cápsula bajo la influencia de factores mecánicos y químicos. La pared del nematodito al excitarse aumenta su grado de permeabilidad y, de ese modo, el agua circundante penetra abundantemente al nematodito, lo que incrementa la presión hidrostática interna y se produce la apretura del opérculo y el nematodito entero explota hacia fuera. La descarga tiene lugar por

12 impulsos nerviosos de neuronas asociadas y tal vez las conexiones neuronales sirven para producir el disparo simultáneo de gran número de nematoditos.

Un nematodito descargado, completamente libre o adherido a la base del cnidocito, consta de una cápsula y un tubo filiforme de longitud variable. Los nematoditos tienen diferentes tipos estructurales, y una especie puede tener varios de ellos, pero generalmente son penetrantes y capaces de inyectar toxinas. El filamento está abierto en la punta y suele estar dotado de espinas. Después de la descarga, el filamento está abierto en la punta y suele estar dotado de espinas. Después de la descarga, el filamento se abre paso en los tejidos de la presa y le inyecta una proteína tóxica de efecto paralizante. Las anémonas producen dos tipos de toxinas distinguibles, tanto desde el punto de vista bioquímico como farmacológico: las neurotoxinas y las citolisinas. 1 Otro tipo de cnidos es el espirocito, un organelo adhesivo. Estos presentan un filamento que tiene muchos túbulos delgados, que se solubilizan después de la descarga para formar un denso adhesivo que envuelve cualquier cosa que toca. Los espirocitos funcionan en la fijación al sustrato y la captura de las presas y sus cnidocitos ostentan varios anillos de microvellocidades, que probablemente funcionen como receptores que provocan la descarga y que sustituyen las estructuras filiares características de ciertos nematoditos. 29

Los nematoditos degeneran después que son descargados, el filamento urticante no puede invaginarse, por lo que estos cnidocitos son reemplazados por otros provenientes de las células intersticiales, lo que ocurre en un término de 48 horas. 31

- Células intersticiales: Se localizan por debajo de la superficie epidérmica incluida a modo de cuña entre las células epiteliomusculares. Son células pequeñas, redondas, con núcleos relativamente grandes. A veces tienen uno o dos nucleolos. Estas células pueden considerarse como células embrionarias no diferenciales, que persisten en el estado adulto. Las células intersticiales son los principales agentes en la reconstrucción de los tejidos, el crecimiento y la regeneración de las anémonas. Los cnidocitos descargados son reemplazados por estas células; también actúan como células germinales o formativas del animal, ya que dan origen a los óvulos y espermatozoides así como a cualquier tipo de células.

13 - Células glandulares: Son abundantes en el disco basal, en los tentáculos y en la región oral. Son células secretoras de mucus que sirven principalmente en la fijación. Poseen prolongaciones contráctiles parecidas a las observadas en las células epiteliomusculares. - Células sensoriales y nerviosas: Las células sensoriales son células alargadas u orientadas en posición normal a la superficie epidérmica; su base se une a un plexo nervioso que se extiende bajo la epidermis y la gastrodermis, junto a la mesoglea. 31 En la superficie epidérmica terminan en una esfera o en unas cerdas sensoriales, semejantes a flagelos. Estas células son muy abundantes en los tentáculos alrededor del hiposoma, prominencia cónica en cuyo vértice se abre la boca, donde se organizan en un anillo nervioso, que son las partes más sensitivas a los estímulos externos. Las células nerviosas son más o menos similares a las neuronas multipolares de otros animales, se encuentran en la base de la epidermis junto a la mesoglea y están orientadas paralelamente a esta y constituyen el plexo nervioso. En las medusas y los pólipos más diferenciados, las células nerviosas tienden a concentrarse en determinadas regiones, pero nunca llegan a formar un sistema nervioso central.

Mesoglea

Es una capa anhista, aunque puede contener células emigradas de la epidermis o de la gastrodermis. La mesoglea puede tener diferente espesor y consistencia; pero es, en las anémonas de mar, mucho más gruesa que la de los pólipos hidrozoarios, posee gran números de fibras y amebocitos errantes y a menudo está formada por tejido conectivo. 25

Esta capa facilita el intercambio de iones y el pasaje de agua hacia el exterior como también hacia la cavidad del cuerpo. 25

Gastrodermis

La histología de la gastrodermis o capa interna de la pared del cuerpo guarda cierta semejanza con la descrita para la epidermis. Sin embargo, las células que se corresponden con las epiteliomusculares reciben el nombre de musculonutritivas. Los dos tipos de células son morfológicamente análogas, pero las últimas suelen ser flageladas y sus prolongaciones basales contráctiles, se desarrollan al máximo en el hipostoma y las bases de los tentáculos, siendo mucho más delicadas que las correspondientes a la epidermis. Además, las fibras

14 contráctiles de la gastrodermis están orientadas en ángulo recto con el eje longitudinal del tallo corporal formando así una capa muscular circular. Intercaladas entre las células musculonutritivas se encuentran las células glandulares enzimáticas. Se trata de células en forma de cuña, flageladas, con sus extremidades puntiagudas dirigidas hacia la mesoglea. Estas células glandulares enzimáticas carecen de prolongaciones contráctiles basales. Las células restantes encontradas en la gastrodermis son idénticas a las encontradas en la epidermis. Las células secretoras de mucus abundan sobre todo alrededor de la boca; en esta zona se encuentran también, aunque en menor número, células nerviosas. La distribución de nematoditos en la gastrodermis es restringida. Se encuentran zooxantelas simbiontes en las células gastrodérmicas de muchas anémonas, sobre todo en los tentáculos y el disco oral. 28

Actividades biológicas descritas en anémonas de mar

Gran variedad de sustancias químicas (aminoácidos, proteínas, enzimas, sustancias fenólicas, 5-hidroxitriptamina y una iminopurina) han sido detectadas en anémonas de mar, y su actividad biológica ha sido evaluada en diferentes sistemas in vitro y también en ensayos in vivo. 32-37

Los primeros trabajos con sustancias biológicamente activas provenientes de cnidarios se iniciaron a comienzos del siglo XX, con Charles Richet y Paul Portier, quienes acuñaron el término “anafilaxia” en 1902 al estudiar las propiedades tóxicas de Physalia, “fragata portuguesa”. Más tarde, los mismos autores, utilizando un extracto de tentáculos de la anémona de mar (Anemonia sulfata) verificaron que cuando este era inyectado en perros, provocaba la muerte de los animales a los 4 o 5 días. El fenómeno de anafilaxia fue descubierto durante esos estudios, pues los perros que se recuperaban se tornaban hipersensibles a bajas dosis, muriendo en pocos minutos. 34 Un estudio más detallado de las toxinas de cnidarios empieza en la segunda mitad del siglo XX, a partir de 1958, con los trabajos de Lane y Dodge. Las toxinas de Physalia physalis han sido exhaustivamente estudiadas, siendo así que Hessinger (1986) mostró la presencia de una glicoproteína heterotrimérica de peso molecular de 240 kDa, como un único componente responsable de la acción cardiotóxica, hemolítica e inductora de síntesis de prostaglandinas. 38

15 La toxicidad de la mayoría de las especies de anémonas de mar varía desde lesiones urticantes dolorosas producidas por especies de Actinia sp., hasta eritema, edema y reacciones sistémicas que pueden provocar la muerte. Envenenamientos leves resultan en eritema localizado, edema, hemorragia pretraquial, y exquimosis. Envenenamientos severos resultan en hemorragia localizada, necrosis vesiculante, y ulceraciones de la piel. Infecciones secundarias son comunes después de la picadura de especies como Sagartia, Anemonia, Actinodendrom, Tritactis, y Actinia. Reacciones sistémicas son inusuales pero pueden incluir fiebre, debilidad, náuseas, vómitos y síncope. 38

Reacciones urticantes y daños dermatológicos tales como dermatitis vesiculopapular y prurito eritematoso han sido causados por Haloclava producta,39 algunas veces esos síntomas son acompañados de somnolencia, naúseas, vómitos y edema como en el caso de Anemonia viridis (antes Anemonia sulcata).39 Otra consecuencia menos común es el malfuncionamiento de algún órgano vital que puede conducir a la muerte del individuo, se han reportado casos de hígado40 y riñón41 afectados por contacto directo con el animal o de manera indirecta por consumo de mariscos contaminados con el veneno paralizante ya que las toxinas pueden entrar en la cadena alimenticia acumulándose en concentraciones que pueden ser letales.42, 43 La anémona Condylactis sp que habita los arrecifes y lagos del sur de Florida y el Caribe ha sido señalada como la más patogénica para el hombre. 44

Las toxinas urticantes parecen ser constituidas solamente por polipéptidos o proteínas. Las proteínas más estudiadas de este grupo son las que poseen peso molecular de 5 kDa, conocidas como proteínas formadoras de canales de sodio dependiente de voltaje; y las citolisinas con peso molecular entre 15 y 20 kDa, las que se conocen en un número mayor de 30 y han sido aisladas de más de 20 especies diferentes de anémonas de mar. 34 La estructura tridimensional de alrededor de cuatro de estas moléculas ha sido determinada por resonancia magnética nuclear (RMN). 35

En la familia Actiniidae varias especies están siendo estudiadas desde el punto de vista químico y farmacológico. De 1971 a 1982 las investigaciones en anémona de mar revelaron 22 toxinas, de éstas se destacaron tres péptidos neurotóxicos de peso molecular entre 2 a 3 kDa encontradas en Anemonia viridis, denominadas ATX I, II y III. Un péptido neurotóxico de 5 kDa ha sido aislado de la misma especie a partir de una extracto crudo adicionando solventes orgánicos (ácido acético-acetona) mostrando un 90-95 % de actividad paralizante ensayado sobre Carcinus maenas. 45

16 Aminas, como la dopamina, fueron detectadas por medio de cromatografía en capa fina, en la anémona de mar Metridium senile por Lenicque et al. en 1977. Mathias et al. (en 1960) detectaron histamina en A. viridis y Actinia equina, los autores sugieren que una alta concentración de esta amina encontrada en los tentáculos de estas especies puede estar asociada a los cnidocitos. Estudios cromatográficos con extractos de A. equina demostraron la presencia de histamina y noradrenalina.34

Estudios sobre la presencia de sustancias farmacológicamente activas de la anémona de mar Bunodosoma caissarum, han demostrado que esta especie posee grandes cantidades de una iminopurina denominada caisarona (Zelnik et al., 1986). Una de las actividades más interesantes de este producto natural es la producción de una fuerte estimulación de la actividad peristáltica en el intestino de los mamíferos, 37 además de producir alteraciones en el desarrollo embrionario de erizo de mar al evaluarse un extracto hidroalcohólico. 37

La presencia de dos fosfolipasas con actividad hemolítica y dos polipéptidos sinérgicos ha sido demostrada en el veneno de los nematocistos de Aiptasia pallida; una de ellas ha sido reconocida como una ß-fosfolipasa A2 y ha sido caracterizada. 33

Las citolisinas y hemolisinas son comunes en anémonas de mar. Varias toxinas con actividad hemolítica han sido aisladas de una variedad de anémonas: variolisina de Pseudactinia varia, parasitoxina de Parasicyonis actinostoloides, citolisina II de Stichodactyla helianthus,46 entre otras, además diferentes polipéptidos con actividad hemolítica se han secuenciado.47 La mayoría de las hemolisinas encontradas hasta hoy en cnidarios son proteínas, excepto algunos lípidos hemolíticos que han sido encontrados en hidrozoarios por Fusetani et al. en 1986.47

Actualmente, debido a la gran diversidad que se ha encontrado en las toxinas de anémonas de mar, como proteínas y péptidos citolíticos, éstas pueden ser clasificadas en cuatro grupos, basados en su estructura primaria y propiedades funcionales. El grupo I consiste en péptidos de 5-8 kDa, representados por los obtenidos de las anémonas de mar Tealia felina y Radianthus macrodactylus. Estos péptidos forman poros en las membranas que contienen fosfatidilcolina. El grupo II, que es el más numeroso, comprende proteínas básicas de 20 kDa, denominadas actinoporinas, aisladas de diferentes géneros de las familias Actiniidae y Stichodactylidae. Las más estudiadas han sido las equinatoxinas, sticholisinas y magnificalisinas de Actinia equina, Stichodactyla helianthus, y Heteractis magnifica, respectivamente. Éstas se asocian típicamente con membranas que contienen esfingomielina y crean poros cation-selectivos. La estructura cristal de equinatoxina II ha sido determinada con

17 una resolución de 1.9 Å. Forman el grupo III proteínas citolíticas letales de 30 a 40 kDa, como la fosfolipasa A2 de Aiptasia pallida (Fam. Aiptasiidae) y una citolisina similar de Urticina piscivora. La metridiolisina, una citolisina thiol-activada aislada de Metridium senile (Fam. Metridiidae), con una masa molecular de 80 kDa es la única representante del grupo IV. 47

Los roles biológicos de estas toxinas, basadas en su actividad formadora de poros, también pueden asociarse a captura y muerte de la presa, digestión, rechazo de depredadores y competición espacial intraespecífica.34

Stichodactyla helianthus

Las anémonas pertenecientes al género Stichodactyla son especimenes grandes, los cuales son muy conocidos por sus relaciones simbióticas con ciertos peces del género Amphirion (Pomacentridae) que viven entre los tentáculos de estas anémonas marinas. Después de la aclimatación etológica del pez a la anémona, el mucus que está en la superficie del pez eleva al parecer el estímulo umbral de descarga de los nematoditos, lo que le permite vivir en un hábitat que de otra manera sería mortal. La anémona le proporciona protección y algunos residuos de alimentos, en tanto que el pez la protege a su vez de algunos depredadores, se lleva el tejido necrótico y reduce, con sus movimientos de natación y ventilación, la putrefacción de la anémona por sedimentos de varias clases.49

Stichodactyla helianthus son pólipos solitarios, desprovistos de esqueleto y con mesenterios dispuestos en círculos hexamétricos (Figura 2). Poseen dos sifonoglifos. Esta anémona es típica de Las Antillas, muy común en las costas de Cuba, en Las Bahamas y Las tortugas. Su disco es de color verde y el peristoma generalmente amarillo; los tentáculos son numerosos, cortos y de color verdoso amarillento.31

Figura 2. Stichodactyla helianthus

18 Esta anémona, debido a sus propiedades toxicas, ha sido seleccionada por diferentes grupos de investigadores como material biológico interesante en la búsqueda de compuestos bioactivos.

Stichodactyla helianthus como fuente de compuestos bioactivos

La búsqueda de compuestos bioactivos en Stichodactyla helianthus se inicia con los trabajos de Delvin en 1974 50, quien aisló y purificó parcialmente una toxina con propiedades hemolíticas que resultó ser altamente tóxica a ratones. Más adelante, Berheiner y Avigad, en 1976, aislaron, mediante focalización isoeléctrica, una proteína de alto peso molecular, de carácter básico y altamente hemolítica. Posteriormente, otros laboratorios demostraron que dicha toxina forma un canal iónico no específico en bicapas lipídicas artificiales, que es un agregado de varios monómeros. Además, otros autores señalaron que en esta especie coexistían cuatro variantes de isotoxinas citolíticas de naturaleza proteica, entre ellas, la citolisina Sh C III resultó ser la de mayor potencia hemolítica. La secuencia aminoacídica de esta citolisina, fue determinada por Blumenthal y Kem en 1983 50, y posteriormente modificada por Álvarez et al. (1996), 9 quienes descubrieron el segmento que complementa la estructura primaria inicialmente propuesta, posiblemente implicado en su mecanismo de acción. Más tarde, Tejuca (1996)11 demostró la analogía de Sh CIII con St I.

Además de la presencia de proteínas altamente hemolíticas, en el extracto de Stichodactyla sp. se describió su capacidad de inhibir algunas proteasas. 51 Con posterioridad, al realizar el fraccionamiento cromatográfico del extracto del cuerpo total de Stichodactyla helianthus se comprobó la coexistencia de varios inhibidores de proteasas. Se trata de polipéptidos de carácter básico y de bajo peso molecular, de los cuales el más caracterizado hasta el presente, 52 Sh P I-I, es capaz de inhibir un variado grupo de proteasas con valores de Ki muy bajos. La significación biológica de los inhibidores de proteasas para esta y otras especies de anémonas aún no ha sido dilucidada. Sería importante delimitar si estos inhibidores están presentes en el veneno de los nematoditos, o si se localizan en regiones carentes de estos organelos. Es lógico pensar que, si la primera posibilidad fuese la certera, podrían representar un sistema de auto- protección del animal, para defenderse de las proteasas presentes en sus presas. Bajo esta hipótesis, también pudiera justificarse su importancia, considerando además que, si se “descargan” conjuntamente con las hemolisisnas, pudieran contribuir a la preservación de las

19 propiedades líticas de estas en el propio veneno frente a las potencialidades proteolíticas de la presa. También es posible suponer que los inhibidores de proteasas pudieran ser importantes como agentes reguladores en los mecanismos digestivos del animal evitando, por ejemplo, la autodigestión a través de sus propias enzimas líticas o de las de algas zooxantela que también establecen relaciones simbióticas con esta especie. Todas estas suposiciones pudieran ser consideraciones a tener en cuenta al estudiar la ecofisiología de esta especie.52

Citolisinas de anémonas de mar

Las citolisinas constituyen una gran familia de proteínas solubles en condiciones acuosas, pero que muestran gran capacidad para interactuar con las membranas lipídicas y formar poros por oligomerización. De este modo, los cambios conformacionales sobre las interacciones lipídicas son un ejemplo atractivo de dinámica proteica en respuesta a cambios ambientales, lo cual posibilita el entendimiento de mecanismos de otros importantes procesos como son el plegamiento y agregación de las proteínas.53

Estas proteínas están presentes en bacterias, animales y plantas, que comparten una actividad común: la destrucción de células dianas por rompimiento de la barrera de permeabilidad de sus membranas.54 La formación de poros funcionales en la membrana de células por este tipo de proteínas se conoce desde hace tiempo como una forma eficiente de mediar la lisis celular. Estas proteínas están presentes en gran cantidad de organismos, los cuales aprovechan su letalidad en la lucha contra competidores y depredadores. Muchas de estas citolisinas que han sido aisladas y caracterizadas a partir de estos organismos. 55- 60

Las citolisinas de anémona de mar son numerosas y son objeto de intensos estudios, que han evidenciado su gran similitud estructural. Se han aislado y caracterizado 39 polipéptidos citolíticos de 21 especies de anémonas, 11 entre las cuales se encuentran las sticholisinas I y II de Stichodactyla heliantus y equinotoxina II (Eqt II) de Actinia equina; estas toxinas han sido muy estudiadas, tanto sus características estructurales como su mecanismo de acción. En relación con su letalidad el mecanismo no es aún bien comprendido, pero se piensa que podría estar relacionado con los efectos cardiotóxicos que provocan. 61

20 Las citolisinas de anémonas de mar son nombradas actinoporinas; esta denominación propuesta por Kem (1988), tiene en cuenta el orden a que pertenecen las anémonas de mar (Actinaria) y la propiedad de estas proteínas de formar poros en las membranas. No obstante, se ha generalizado la denominación propuesta por Bernheimer, en 1987, que incluye el nombre de la especie de origen y la terminación lisina. Por ejemplo: carinolisina para el caso de la citolisina proveniente de Actibaria cari y sticholisinas para las provenientes de Stichodactyla heliantus. 11

Estas actinoporinas son generalmente clasificadas acorde al motivo estructural que provoca la formación del poro, así las α-actinoporinas, son aquellas que tienen motivos estructurales de α- hélices, y las β-actinoporinas, las que presentan barril o lámina β. 53

Significado biológico de las citolisinas en las anémonas de mar

La presencia de toxinas muy potentes en las anémonas de mar no es sorprendente si tenemos en cuenta que son animales sedentarios que necesitan armas altamente efectivas y de acción rápida, capaces de inmovilizar y matar presas y/o repeler posibles depredadores. En este sentido, parece razonable que estas citolisinas estén destinadas a inmovilizar y matar pequeñas presas, al respecto se ha demostrado que estas proteínas son altamente letales para crustáceos y peces.11 Por otra parte, estas proteínas pudieran colaborar en la digestión de las presas, que según se ha demostrado, en estos organismos es llevada a cabo por enzimas similares a la tripsina y quimotripsina. En concordancia con esta hipótesis está la conocida resistencia de la tembrosina de Anthopleura japonica a la degradación proteolítica. 62

En relación con la función de defensa de estas proteínas, Senic y Macek en 1990 encontraron evidencias de que, ante una estimulación mecánica moderada, Actiba cari expulsa un líquido que contiene grandes cantidades de citolisinas.63 Este comportamiento también fue demostrado en Actina equina. La toxina secretada pudiera tener una función de señal química para los depredadores.

Otra función que ha sido postulada para estas citolisinas es su participación en la diseminación de colonias de anémonas. En este caso se produce una competencia por el espacio a través de agresiones intraespecies. Las toxinas son secretadas una vez que se ha producido el contacto entre los tentáculos de las anémonas y esta agresión provoca el desplazamiento de

21 una anémona. 63 La participación de las citolisinas en este proceso está por investigar, sin embargo, se conoce que las anémonas de mar son resistentes a sus toxinas citolíticas, incluso si se les inyecta directamente la proteína. 34

De forma general; las anémonas que presentan neurotoxinas no secretan citolisinas y viceversas. No obstante, en algunas anémonas se presentan los dos tipos de toxinas, ellas son, C. gigantea64, P. actinostoloides 65 y Stichodactyla heliantus. 66 Este hecho permite inferir que posiblemente en los orígenes todas las anémonas poseían ambos tipos de toxinas, lo cual sería sin duda un arma más efectiva contra un amplio espectro filogenético de posibles presas y depredadores. No obstante, la posible existencia de ambas toxinas en todas las anémonas de mar ha sido postulada por Turk en 1991. 1

Por otro lado, hasta el presente, solo han sido aisladas directamente de los nematocitos las citolisinas de A. pallida y de M. senille, por lo tanto, no es posible asegurar que todas las citolisinas purificadas hasta el momento sean provenientes de estas estructuras. En trabajos realizados por Macek y Sencic y Macek, 63 se ha demostrado que la purificación de la equinotoxina y la caitoxina de fuentes distintas (tentáculos, cuerpo íntegro del animal o del exudado) originan preparados diferentes. Estos resultados permitieron a Turk 1 sugerir que algunas isoformas no se originan en los nematocitoss. No obstante, aquellas toxinas destinadas a la defensa o a la captura de presas deben ser secretadas por los nematocitos. En particular, la metridiolisina, la cual difiere significativamente de las restantes citolisinas de las anémonas de mar, pudiera estar destinada a ayudar en la digestión, en lugar de actuar propiamente como toxina. 34

La ubicación de estas toxinas dentro del tejido del animal sería un elemento de gran utilidad en el estudio de las funciones para las cuales el animal emplea estas proteínas y en la aplicación de estas toxinas, a la par que facilitaría el protocolo de aislamiento y purificación. Una de las técnicas más empleadas con el objetivo de detectar antígenos en tejidos son las técnicas inmunohistoquímicas, dada la disponibilidad y especificidad de los anticuerpos y la gran sensibilidad de estos métodos, que constituyen procedimientos sencillos, rápidos y económicos.

22 Citolisinas de Stichodactyla helianthus

Las sticholysina I y II son toxinas formadoras de poros, pertenecientes a la familia de las actinoporinas, 14, 67, 68 y están compuestas por una cadena simple de polipéptidos de aproximadamente 175 residuos de aminoácidos 68 y como el resto de las proteínas de esta familia, no poseen cisteína en su estructura. 14, 68, 69

La purificación de las St I y II fue realizada por primera vez en la Facultad de Biología por el grupo de Chávez a partir del extracto crudo de la anémona. 11 Paz-Lago, en 1992, caracterizó molecularmente estas dos proteínas, cuyas propiedades más relevantes se resumen en la tabla 1.14

Tabla 1. Características moleculares de sticholisinas I y II

Característica Sticholisina I Sticholisina II

Peso Molecular (kDa) 20 20

Punto isoeléctrico >9.5 >9.5

Coeficiente de extinción molar 2.13 ± 0.37 1.87 ± 0.21 (1mg/mL, 1cm)

Espectro Ultravioleta (max nm) 279 279

Estructura secundaria por Alto % de Alto % de dicroísmo circular estructura β estructura β

Como se puede observar, St I y II muestran propiedades muy similares entre sí. Lo mismo ocurre con su estructura primaria, aunque sus secuencias amino terminales evidencian que, aunque existe una gran homología entre ellas, son entidades moleculares diferentes y pudieran constituir isoformas de una misma proteína.11 Las predicciones estructurales de St I y II indicaron que son polipéptidos hidrofílicos con un simple fragmento altamente hidrofóbico correspondiente al amino terminal probablemente involucrado como péptido líder en la interacción con la membrana. 70

23 Los análisis cinéticos de la filtración de su contenido acuoso en modelos de vesículas, revelaron una oligomerización de estas proteínas; tres de cuatro monómeros, están aparentemente involucrados en la permeabilización de la membrana. Experimentos realizados muestran que la St II, adopta una conformación en tetrámero en ausencias de membranas, estos experimentos posibilitaron la explicación de la actividad citolíticas de estas proteínas en términos de una tendencia intrínseca a la oligomerización 68, 53, 71.

La estructura tridimensional de la St II, descrita por estudios de cristalografía de rayos x, mostro que está compuesta de un núcleo con una estructura sadwich-β hidrofóbico rodeado en sitios opuestos por dos alfa hélices que comprenden los residuos de aminoácidos del 14-23 y 128- 135 69, 72. Estas α- hélices interactúan con el sadwich- β, predominantemente a través de interacciones hidrofóbicas y de van der Waals, pero también han sido observados puentes iónicos.69 Otro aspecto llamativo de esta proteína es la presencia de grupos expuestos de aminoácidos aromáticos de Tyr106, Trp110, Tyr111 y Trp114 (comenzando por el lazo comprendido entre las cadenas β6 y β7), y Tyr131, Tyr135, y Tyr136 de la α- helice2. Se conoce que estos residuos son de alta afinidad por la interfase membranar y de hecho, grupos análogos han sido observados en toxinas bacterianas formadoras de canales como son la α- hemosisna y aerolisina.71

Los modelos más aceptados asumen que el primer tercio de los residuos N- terminal, los que incluyen una de las alfa hélices, están directamente involucrados en la formación del poro, 72 uniéndose a la interfase membranar y ensamblando los cuatro monómeros, conduciendo al final a la formación del poro funcional, 69 Estas regiones contienen fragmentos antipáticos, bien conservados en todas las actinoporinas, esta es la única porción de esta molécula que puede cambiar de conformación sin perturbar la forma general de la proteína. 14, 71, 72, 47

Acorde con estos modelos, la región N- terminal puede estar involucrado inicialmente en la oligomerización mediante interacciones con la región C-terminal del monómero adyacente, así, el ensamblaje de los cuatro monómeros a la interfase de la membrana podría involucrar las interacciones proteínas-proteínas mediadas por residuos comprendidos dentro de los primeros 29 aminoácidos de la cadena. 69

Las sticholisinas son producidas en forma soluble, pero ellas se pueden unir a diferentes células y modelos de sistemas de membranas como son monocapas lipídicas, micelas y vesículas lipídicas. Los pasos de unión y formación de poros son muy dependientes de la naturaleza fisicoquímica de la membrana; de hecho grandes poblaciones de toxinas se unen

24 con gran afinidad a membranas con alto contenido de esfingomielina, 14, 67 sin embrago en membranas ricas en esfongolípidos la unión es relativamente baja y reversible. 14

La carga positiva de la colina es estabilizada por interacciones catiónicas entre el sistema rico en electrones de los anillos aromáticos de la Tyr111 y la Tyr135. Además, los grupos fosfatos interactúan con el grupo hidroxi fenólico de la Tyr 111 y la Tyr 136 y posiblemente podría ser un estabilizador fuerte por el sitio catiónico de la Arg51. De manera interesante, la comparación de las estructuras de la St II libre y del complejo St II- fosfatidilcolina reveló algunas modificaciones en el lazo entre la cadena β6 y β7. Sin embrago, las diferencias estructurales son mayormente debido a reajustes en los sitios de las cadenas para facilitar la unión de estas a la fosfatidilcolina. Las interacciones catiónicas entre los residuos aromáticos y la fosfatidilcolina han sido observadas también en estructuras cristalinas de staphylococos. 71

La presencia conjunta de esfingomielina y colesterol y de esfingomielina y fosfatidilcolina, 13 promueve la unión de estas sticholisinas y la formación de poros. Pequeñas cantidades de lípidos que favorecen una organización no lamelar también aumentan la eficiencia de la formación del poro. El poro funcional formado en membranas celulares o en modelos tiene un diámetro de 2.0 nm y es formado presumiblemente, por el extremo amino terminal de alfa hélices .67

Ambas sticholisinas presentan un mecanismo de lisis que transita por la formación de un poro en la membrana, originado por la agregación probable de entre 3 y 4 monómeros. Los iones divalentes muestran una acción selectiva sobre la actividad lítica de ambas citolisinas. El calcio y el manganeso potencian dicha actividad, en tanto el cobalto y el manganeso la inhiben.73 Ambas proteínas inducen la agregación plaquetaria en el plasma rico en plaquetas en el rango de concentraciones ensayadas (0,5 a 10 µg/mL). Para ambas citolisinas se obtienen porcentajes de agregación plaquetaria superiores al 90 % con menos del 50 % de lisis celular. La agregación plaquetaria se mantiene elevada aun cuando la lisis celular disminuye a menos del 20 %. El EDTA 2 mM/L y el verapamilo 100 mM/L inhiben significativamente la agregación inducida por StI, lo que evidencia que el calcio extracelular tiene una función importante en este proceso y probablemente esta citolisina tiene una función similar a la de un ionóforo de calcio. Con StII no se obtuvo inhibición significativa de la agregación en presencia de EDTA y verapamilo. La agregación inducida por ambas citolisinas no está

25 influida por el aumento del AMPc intracelular y es independiente de la formación de tromboxano A2 en la plaqueta .73

Potencial biomédico de las sticholisinas de Stichodactyla helianthus

Actualmente el potencial biomédico de productos naturales de origen marino es importante, ellos están siendo estudiados aplicando métodos in vivo con el propósito de acreditarlos en el campo preclínico y clínico, para el tratamiento del dolor, esclerosis múltiple y enfermedades cardiovasculares.

De las toxinas aisladas y caracterizadas las que tienen mayor potencial biomédico son las proteínas que interactúan con proteínas canales de membrana, como las que actúan sobre canales de sodio, éstas se proponen para el tratamiento del dolor; otras que actúan sobre canales de potasio los cuales están implicados en la regulación de funciones celulares tales como excitabilidad del músculo liso, y neuronas y proliferación celular. Obviamente el bloqueo de estos canales conduce a condiciones patofisiológicas, sin embargo un bloqueo específico puede resultar en un efecto terapéutico adecuado.

Para la producción de un medicamento a partir de una molécula proveniente de un organismo se dan cuatro fases de investigación: La fase I comprende el aislamiento de la molécula activa, el conocimiento de su estructura tridimensional y su actividad in vitro; en la fase II se incluyen las pruebas in vivo; la fase III corresponde a la experimentación preclínica en pacientes voluntarios y la fase IV es la producción farmacéutica del nuevo medicamento disponible al público.

Las sticholisinas de Stychodactyla helianthus se encuentran en la fase II con su propiedad de bloquear canales de potasio (Kv 1.1 y Kv 1.3) ha demostrado ser eficaz en modelos animales de esclerosis múltiple. La esclerosis múltiple es una enfermedad del sistema nervioso central de etiología inmunológica, y se caracteriza por parches diseminados de desmielinización del cerebro y el cordón espinal, lo que resulta en múltiples y diversos síntomas neurológicos. Recientemente, se ha propuesto que los canales Kv 1.3 serían cruciales en la patogénesis de la esclerosis múltiple y otras enfermedades autoinmunes. Se ha demostrado que la encefalomielitis autoinmune inducida en ratas puede ser revertida por las sticholisinas. De este modo la inhibición selectiva de Kv 1.3 podría representar una terapia adecuada para el tratamiento de enfermedades autoinmunes como la esclerosis múltiple, diabetes tipo I,

26 psoriasis y artritis reumatoide. Las propiedades farmacocinéticas de ShK aún no se conocen pero se proyectan a ser estudiadas pronto. 17

Las St I y II interfieren con la unión de dendrotoxinas marcadas en la membrana de los sinaptosomas, y bloquea la corriente a través de los canales con varias subunidades KV1 y también la conductancia intermedia de los canales de potasio dependientes de calcio .18

Se han realizado varios estudios donde se ha demostrado que péptidos aislados de Stichodactyla helianthus son bloqueadores de alta afinidad de canales de potasio tanto Kv1.1 como Kv1.3. 17, 54

Las células T memorias efectoras son importantes mediadores de enfermedades autoinmunes como la esclerosis múltiples, diabetes mellitus tipo I y artritis reumatoidea, ya que estas células se hacen muy reactivas diferenciándose de sus estado nativo, por su constante activación como consecuencia de la estimulación repetitiva por el auto antígeno, y contribuye de esta manera al daño tisular producto de la inflamación mediada por la migración rápida de citoquinas al tejido. Las terapias convencionales para disminuir este tipo de reacción inmunologíca comprometen la efectividad del sistema inmunológico en el estado de respuesta inmune aguda; volviendo totalmente vulnerable a estos pacientes antes cualquier invasión de gérmenes oportunistas.

Muchos estudios han mostrado que las células T memorias usan predominantemente los canales de potasio dependientes de calcio KCa3.1 durante la fase aguda de activación, ya las células T memorias efectoras emplean los canales de potasio Kv1.3 74, 19, 20, por lo que el empleo de bloqueadores específicos para estos canales serían potenciales farmacológicos.

Se ha comprobado que las St I y II son potentes inhibidores selectivos de estos canales; inhibiendo la proliferación y producción de interferón gamma solamente de las células T memorias efectoras, 19-24 las cuales pueden ser empleadas como posibles tratamientos para estas enfermedades.

En la actualidad se ha desarrollado una tecnología de moléculas híbridas, las cuales se obtienen mediante una conjugación de anticuerpos monoclonales y toxinas, para generar potenciales agentes para el tratamiento del cáncer y otras enfermedades. Frecuentemente se emplean como componentes tóxicos de estas inmunotoxinas, resinas y toxinas de plantas los cuales inhiben la síntesis de proteínas a nivel ribosomal, lo cual requiere la internalización de las mismas en la célula. Se han realizado investigaciones utilizando las porinas St I y II, las que

27 son activas a nivel de membrana celular, las cuales se han unido mediante puentes de disulfuro a anticuerpos monoclonales anti factor de crecimiento epidérmico, que solo exhiben la actividad hemolítica en células que expresan este tipo de receptor (receptor para factor de crecimiento epidérmico humano), 24 lo cual provee de alto nivel de especificidad para este tipo de terapia, haciéndola menos invasiva al organismo.

28

CAPÍTULO 2. Obtención y purificación de anticuerpos anti-sticholisina I y II en conejo

Generalidades en la producción de anticuerpos policlonales

La producción de anticuerpos es una práctica frecuente en los laboratorios docentes, de investigaciones biomédicas y en los centros de obtención de biopreparados. La diversa utilidad de estos reactivos justifica su producción y los estudios acerca de la potencialización y modelación de antígenos, de los mecanismos y regulación de la respuesta inmune y de la obtención de anticuerpos por diferentes procedimientos, como los biotecnológicos y de ingeniería genética y la inmunización in vitro.

El método convencional para obtener anticuerpos policlonales consiste en la inoculación del inmunógeno a animales inmunocompetentes. Este procedimiento se fundamenta en la respuesta de anticuerpos, la cual conlleva una serie compleja de mecanismos internos del animal, que el experimentador intenta manipular a través de la potenciación del inmunógeno, las dosis, el intervalo entre ellas, la vía y el modo de administrárselas.

Los anticuerpos policlonales son de naturaleza heterogénea y esto tiene gran importancia práctica. A diferencia de los anticuerpos monoclonales, son producidos por células plasmáticas provenientes de diferentes clones de células B, de ahí su carácter policlonal.75 La heterogenicidad de los antisueros policlonales se manifiesta en la naturaleza de los anticuerpos sintetizados. Estos anticuerpos están dirigidos contra sitios (epitópos) diferentes de la molécula de antígeno y reaccionan con distintos grados de afinidad en la medida en que ajusten con el epítopo, estos anticuerpos pertenecen a diferentes isotipos inmunoglobulínicos de la especie animal en que se producen.

29 El empleo de adyuvante se ha generalizado en la obtención de anticuerpos policlonales. El adyuvante es una sustancia o preparado que facilita inespecíficamente la respuesta inmune a un antígeno.76 Con su empleo se ahorra tiempo e inmunógeno y se obtiene un mayor nivel de anticuerpos específicos. Es usualmente administrado con el inmunógeno, pero puede darse antes o después de él. Generalmente todos los inmunógenos solubles y los conjugados proteína-hapteno son mezclados con adyuvantes.77 En el caso de inmunógenos celulares puede obviarse su empleo. Los adyuvantes que se emplearon para la obtención de los anticuerpos utilizados en este estudio fueron el adyuvante completo e incompleto de Freund (ACF/AIF) y alúmina

(Al(OH)3).

El AIF es una emulsión de agua en aceite de parafina con un estabilizador. El ACF contiene además micobacterias muertas, las que inducen formación de granulomas en el sitio de la inyección, los granulomas no son más que una acumulación compacta de macrófagos formada en el sitio de inoculación. Ambos adyuvantes, al ser mezclados con el antígeno en solución o suspensión acuosa rinden una emulsión muy espesa que al ser inyectada se deposita en el sitio de inoculación. El AIF, por carecer de micobacterias, es menos efectivo que el ACF. Estas emulsiones no pueden administrarse por vía intravenosa y son inaceptables para uso humano por su tendencia a desarrollar abscesos estériles y desórdenes autoinmunes. Se recomienda emplear el ACF solo una vez en la primera inoculación y continuar con el AIF. 77

El gel de hidroxilo de aluminio (alúmina) está formado aproximadamente por un 2 % de

Al(OH)3 en una forma gelatinosa muy hidratada que absorbe fuertemente los antígenos proteicos. Convenientemente diluidas, las preparaciones antigénicas con alúmina pueden administrarse por vía intravenosa sin provocar trombosis fatales. Por su baja toxicidad los adyuvantes de aluminio pueden emplearse en humanos.

30 Preparación del inóculo (sticholisina I y II- adyuvante)

La purificación de St I y II se realizó según el método descrito por Lanio y colaboradores en 1999.78

Preparación de la mezcla sticholisina I y II- adyuvante de Freud

Se tomaron dos volúmenes iguales de extracto de sticholisina y de adyuvante, y se mezclaron parte y parte, empleando el método de dos jeringuillas interconectadas por un tramo de manguera fina, llenándose un poco menos de la mitad de su volumen, una con el inmunógeno, en este caso el extracto de sticholisina, y la otra con el adyuvante. Primeramente se impulsó el inmunógeno dentro del aceite y viceversa, de manera que el fluido expulsado de una jeringuilla entre en la otra, repitiéndose hasta que se alcanzó la viscosidad adecuada.

Preparación de la mezcla sticholisina I y II- alúmina

Se mezclaron las soluciones de sticholisina I y II y el gel de Al(OH)3 en la proporción 70-100 µg de gel por cada microgramo del inmunógeno proteico. Se agitó la mezcla unos minutos y se incubó 1 hora a 37 °C.

Esquema de inmunización de conejos con el inóculo

Para seleccionar el animal de experimentación se deben tener en cuenta tres aspectos: la especie animal a que pertenece el inmunógeno, el volumen de suero que se necesita y la cantidad de antígeno de que se dispone. En la práctica, las inmunizaciones deben efectuarse en animales que estén lo más alejados posible en la evolución, a la especie animal al que pertenece el inmunógeno. 77

Un amplio número de especies de vertebrados se utilizan para la producción de antisueros. Los más empleados a nivel de laboratorio son conejos, ratas, ratones,

31 hámster y curieles.79 Una simple muestra de sangre de estos animales rinde aproximadamente 25 mL de suero en conejo y 1-2 mL en ratas, hámster y curieles. Cuando se requieren grandes volúmenes de suero, se emplean animales grandes como carnero, caballos; cerdos y asnos (Tabla 2).

Tabla 2. Animales de experimentación Cantidad Animal máxima de Comentarios suero (mL) Conejos 500 Con frecuencia la mejor elección para producir AcP, aun cuando el antígeno sea limitante. Ratones 2 Con frecuencia la mejor elección para producir AcM. Ratas 20 Buena elección para producción de AcM. Hamsters 20 Buena elección para AcP cuando el Ag es poco. Curieles 30 Difícil para desangrar. Pollos 50 Buenos para Ag altamente conservados de mamíferos

El más útil en los laboratorios es el conejo, por su tamaño y docilidad, son fáciles de mantener y manipular, pueden ser desangrados repetidamente y los anticuerpos que producen están bien caracterizados y son fáciles de purificar. Este animal en condiciones de vida y de manipulación correctas puede dar hasta 500 mL de suero durante el régimen de inmunización

En este trabajo se utilizaron cuatro conejos hembras de la línea Chinchilla, suministrados por el Centro Nacional de producción de animales, de seis meses de edad, cuyo peso aproximado era de 2 kg inmunizados dos con sticholisina I y dos con sticholisina II, utilizando adyuvantes diferentes con cada una de las sticholisinas; adyuvante completo de Freud (ACF/AIF) y alúmina.

Los conejos fueron inoculados por la vía subcutánea los días 0 y 30 con 100 µg de inóculo.

32 Purificación de los anticuerpos anti-sticholisina I y II obtenidos en conejos

Los anticuerpos pueden ser purificados a partir del suero sanguíneo, para ello se emplean métodos inespecíficos y métodos específicos.80 Con los métodos inespecíficos se obtiene una fracción enriquecida en IgG específica, entre ellos son muy utilizados en los laboratorios la precipitación con sales inorgánicas (sulfato de amonio y de sodio), polietilenglicol (PEG) ácido crapílico y otros; la cromatografía de intercambio iónico y la cromatografía de afinidad con proteína A (constituyente de la pared celular de Staphilococus aureus, la cual se une a la región Fc de la IgG de la mayoría de las especies de mamíferos, incluyendo tres subclases de la humana (menos IgG 3) y todas las subclases del ratón) o proteína G (constituyente de la pared celular de estreptococos del grupo C, se une a la región Fc de la mayoría de las IgG, la proteína G reacciona más fuertemente y con un rango más amplio de Ig de diferentes especies de mamíferos.). Con estas mismas técnicas se puede purificar IgG normal a partir de un suero o una mezcla de sueros normales.81

Con los métodos específicos se obtiene el anticuerpo de interés purificado libre de otros anticuerpos, ellos se basan en la absorción reversible de anticuerpos o de los contaminantes que lo acompañan. Con este fin, se emplea la cromatografía de afinidad con soporte de Sepharosa y los llamados inmunoabsorbentes constituidos por geles de proteínas polimerizadas con glutaraldehído. 81

El método de elección dependerá enteramente de los requisitos que debe tener el preparado final. En la práctica son aconsejables los métodos inespecíficos, en tanto que los específicos deben emplearse cuando se requieren preparados de anticuerpos de alto grado de pureza.

33 Obtención del suero

A los cuatro conejos inmunizados se les extrajo la sangre por el método de punción al ventrículo izquierdo. La sangre extraída se dejo coagular, para ello se mantuvo a 37 °C durante 1 hora y a 4 °C durante 4 horas, seguidamente se centrifugó a 2 500 rpm durante 10 min y se extrajo el sobrenadante, que se almacenó a – 20 °C.

Precipitación en sulfato de amonio (NH4SO4)

Con el objetivo de eliminar proteínas existentes en el suero que no eran de nuestro interés, se empleó como primer paso en la purificación de los anticuerpos, una

precipitación en NH4SO4. Este método se basa en el fenómeno de precipitación en salado, que se produce cuando las moléculas de agua que solvatan a la proteína en la solución, son eliminadas por la sal que se adiciona, de esta forma se incrementa la interacción proteína-proteína y esta precipita en su forma nativa.

Se tomó un volumen de suero y se diluyó en la misma cantidad de solución búfer fosfato (PBS); a continuación se colocó el suero diluido en agitador magnético y se le

fue añadiendo gota a gota un volumen igual de solución saturada de NH4SO4, al 50 % se dejó precipitar durante una hora, se centrifugó durante 15-20 min a 2 500 rpm, la fracción que precipita corresponde a la fracción gammaglobulínica del suero, que contiene fundamentalmente todas las clases de inmunoglobulinas y pequeñas cantidades de otras proteínas. El precipitado se resuspendió con NH4SO4 al 50 % de saturación y se centrifugó como antes. Finalmente, se restituyó la muestra con un volumen de PBS igual a la cuarta parte del volumen inicial de suero y se dializó en

PBS½ para eliminar el NH4SO4. A continuación se procedió a una cromatografía de intercambio iónico.

34 Cromatografía de intercambio iónico

A la fracción gammglobulínica obtenida por precipitación salina, se le realiz´p una cromatografía de intercambio iónico con el propósito de eliminar, entre otras, las β- lipoproteínas que pudieran unirse a las St y por tanto afectar la purificación de los anticuerpos. En este tipo de cromatografía la separación de las proteínas se basa en sus características de carga, lo que les permite interactuar reversiblemente con el intercambiador, bajo condiciones fijadas, por lo que la cantidad y distribución de las cargas, así como el tamaño molecular, desempeñan un papel importante. 82

La muestra fue aplicada a una columna preempacada Hi- Load Q- Sepharosa Fast Flow (Pharmacia, Suecia) equilibrada con PBS ½ a una velocidad de flujo de 1 mL/min en un sistema de baja presión con lectura de absorbancia a 280 nm. Se recuperó la fracción que no se unió a la matriz y que contenía la IgG de conejo. La matriz fue regenerada con PBS ½ que contenía NaCl 1 mol/L.

El resultado de esta cromatografía se muestra en la figura 3 (A, B, C, D), a diferencia del método general, la purificación de IgG se efectúa en una sola etapa, ya que en las condiciones de baja fuerza iónica y pH en que se realizó la técnica, quedan retenidas las otras proteínas del suero sanguíneo, mientras que las IgG eluyen y se obtienen en la primera fracción prácticamente pura.

Los anticuerpos fueron concentrados con PEG, y se les realizó lecturas absorbancia a 280 nm para determinar su concentración mediante el método espectrofotométrico,77 así como la cantidad de proteínas que contenían. Los resultados se muestran en la tabla 3, en la que se constata, que la mayor cantidad de IgG purificada se obtuvo a partir del suero del animal inmunizado con St I + alúmina y la menor a partir del suero del animal inmunizado con St II + ACF, lo cual a pesar de parecer una contradicción, resulta lógico teniendo en cuenta los volúmenes de suero purificados y los títulos de anticuerpos que presentó cada uno.

35

Figura 3 (A, B, C, D). Perfiles cromatográficos obtenidos en la purificación de los anticuerpos anti-St I y anti-St II mediante intercambio iónico

Tabla 3. Resultados de la cromatografía de intercambio iónico correspondiente a las fracciones γ- globulínica de los sueros anti-St. Vol. de Titulo de Vol. Suero Absorbancia Mg de suero anticuerpos c (mg/mL) Eluido hiperinmune (nm) IgG (mL) anti- St (mL) St I + ACF 15 1: 32 000 2,225 1,61 10 16,10 St I + alum 10 1: 256 000 1,509 1,09 40 43,60 St II + ACF 4 1: 64 000 0,792 0,57 28 15,96 St II + alum 7 1: 64 000 0,830 ,60 45 27,00

Cromatografía de inmunoafinidad

El último procedimiento empleado en la purificación de los anticuerpos fue la inmunoafinidad, este no es un método comúnmente empleado para aislar anticuerpos, por la complejidad de la técnica y sólo se utiliza para aplicaciones especiales de los anticuerpos, como el de nuestro trabajo.

36 Se empleó una matriz que contenía como ligando la sticholisina II. La matriz fue empacada en una columna de Amicon con doble adaptador de flujo y lavada con PBS y tampón glicina 0.1 mol/L pH 2.9. la muestra fue aplicada y seguidamente se lavó la columna exhaustivamente con PBS. Se utilizó el mismo sistema cromatográfico descrito para el intercambio con una velocidad de flujo de 0,5 mL/min.

Como la matriz de afinidad empleada presentaba como ligando la sticholisina II, sólo fueron sometidos a este procedimiento las fracciones de IgG purificadas en el intercambio iónico tanto anti-St II + ACF como anti-St II + alumina. La elución de los anticuerpos de la columna se efectuó con tampón glicina pH 2,9 para desfavorecer las interacciones St II-anticuerpos anti-St II, fracción que podemos ver en el perfil cromatográfico (figura 4) correspondiendo a los anticuerpos purificados la segunda fracción.

Figura 4. Perfiles cromatográficos obtenidos en la purificación de los anticuerpos anti-St II mediante la cromatografía de inmunoafinidad

Tanto al producto de interés como al primer pico obtenido en la cromatografía, se les determinó su concentración mediante el método espectrofotométrico, realizando una lectura de absorbancia a 280 nm. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 4 donde podemos apreciar que solo se obtuvo un 3,50 % y 6,37 % de los anticuerpos purificados anti-St II + ACF y anti-St II + alúmina, respectivamente. Estos bajos por cientos se pueden explicar por el bajo por ciento de St II inmovilizada en la matriz que fue de un 42 % o por la forma en que la proteína está ligada a la misma. 83

37

Tabla 4. Resultados de la cromatografía de inmunoafinidad correspondientes a los anticuerpos anti-St II (2da fracción) Prot. Suero Absorbancia Vol. eluido Prot. Eluida Aplicada C (mg/mL) % hiperinmune (nm) (mL) (mg) (mg) St II + ACF 15,96 0,191 0,14 4 0,56 3,50 St II + Alum 27,00 0,592 0,43 4 1,72 6,37

Torres, 83 quien propuso este método de inmunoafinidad, obtuvo bajos por cientos de recuperación de anticuerpos anti-St II, lo cual justificó por el bajo título del suero empleado (4000). En este trabajo se emplearon sueros de mayor título (64 000) y de la misma manera, se obtuvieron bajos por cientos de recuperación, sería conveniente revisar tanto el proceso de inmovilización como el de inmunoafinidad, aunque no se debe descartar la posibilidad de que anticuerpos con alta afinidad hayan quedado retenidos en la matriz y que se haga necesario una elución con un tampón de fuerza iónica mayor, como el tiosianato de sodio 2 molar, teniendo en cuenta el por ciento de proteína que se pierde como se muestra en la tabla 5.

Tabla 5. Análisis de los resultados obtenidos en la inmunoafinidad (ambas fracciones) Prot. Fracción 1 Fracción 2 total Tipo de Dife- Aplicada Prot. Prot. Prot. % suero % % % rencia (mg) eliuda eluida eluida St II + ACF 15,96 12,63 79,14 0,56 3,50 13,50 82,64 2,77 2,77 St II + alum 27,00 23,00 85,18 1,72 6,37 24,72 91,55 1,72 6,37

38 CAPÍTULO 3. Localización inmunohistoquímica de las citolisinas en la anemona de mar Stichodactyla helianthus

Técnicas enzimo-inmunohistoquímicas Antecedentes históricos

El principio, los anticuerpos pueden ser usados como reactivos histoquímicos si marcadores que no disminuyen su capacidad de reaccionar con antígenos específicos son unidos a ellos fue reconocido por Marrack en 1934. De los varios marcadores que se probaron, solo los colorantes fluorescentes cumplieron el requerimiento de sensibilidad, por lo que fueron los anticuerpos marcados con isotiocianato de fluoresceína los primeros que se utilizaron en 1941 por Coons y colaboradores para localizar antígenos neumocóccicos en tejidos infectados. 84

En la década de los cincuentas la aplicación de la inmunohistoquímica en la histopatología se incrementó notablemente por el mejoramiento de los métodos de conjugación y fijación de los tejidos, así como de los sistemas de lámparas y filtros para microscopio fluorescente. Quizás uno de los descubrimientos más significativos para la aplicación posterior de la técnica en otros campos, como la endocrinología y la neurobiología fue la localización in vitro de una molécula nativa, la hormona adrenocorticotrópica, en la pituitaria de cerdo, con el empleo de un conjugado fluorescente con anticuerpos levantados contra un antígeno parcialmente purificado por Marchall en 1951. 85 La localización de antígenos in vivo fue realizada cuatro años más tarde por Mellor y colaboradores en 1955, 85 ellos emplearon una técnica “indirecta” en la cual el antisuero de conejo contra un antígeno renal de rata fue inyectado en ratas y la presencia de la gammaglobulina fue detectada en secciones congeladas de riñón con el empleo de anticuerpos contra la gammaglobulina de conejo marcados con reactivo fluorescente.

En la década de los setentas el desarrollo de la histoquímica sirvió de base al desarrollo de una nueva metodología inmunológica, la enzimoinmunología. 86 Estas

39 técnicas utilizan anticuerpos marcados con enzimas para localizar los constituyentes presentes en los tejidos o en las células. Los principios básicos de estos procedimientos son los mismos que rigen las técnicas de inmunofluorescencia. 87

Estos métodos emplean dos procedimientos: directo e indirecto. 88 En el primero, el anticuerpo primario utilizado para detectar el antígeno está directamente acoplado a la enzima, y en el segundo método, el primer anticuerpo no está marcado, pero su fijación sobre el tejido se señala por medio de un segundo anticuerpo acoplado a la enzima, dirigido contra las inmunoglobulinas de la especie que ha proporcionado el primer anticuerpo. Este segundo método es el más utilizado porque emplea un solo tipo de conjugado, si no cambia la especie animal productora del primer anticuerpo. La utilización de sustratos de diferentes colores permite usar estos métodos para realizar una doble coloración con anticuerpos de distinta especificidad conjugados a dos enzimas diferentes. La enzima más comúnmente empleada para el marcado es la peroxidasa de rábano picante, que hasta la fecha posee gran popularidad y que ha dado nombre a las técnicas de “tinción inmunoperoxidasa”. Para la visualización de los preparados se emplea microscopia óptica común, no necesitándose de equipos accesorios, por lo que se reduce notablemente el costo de la investigación. Estos métodos además pueden ser aplicados a estudios en microscopía electrónica. La mayor desventaja de estos métodos con anticuerpos marcados reside en el proceso de conjugación, que nunca es completo. Frecuentemente, el remanente de anticuerpo libre, enzima libre o anticuerpo conjugado con peroxidasa inactivada reduce la sensibilidad del procedimiento por competencia con el anticuerpo marcado con peroxidasa activa y la adición de una tinción de fondo indeseable. 88, 89

Un hecho fundamental que impulsó el desarrollo y el perfeccionamiento de las técnicas inmunohistoquímicas fue la obtención de anticuerpos monoclonales por Milstein y Köhler en 1972, 90 esto dio un enorme ímpetu a la localización de antígenos específicos que no estaban disponibles en cantidades suficientes para levantar antisueros convencionales.

40 Las técnicas inmunohistoquímicas con anticuerpos marcados han sido ampliamente utilizadas en el diagnóstico de patologías. 88 Sin embargo, en los estudios moleculares han tenido ciertas limitaciones, por ejemplo, para localizar ARNm intracelular cuando las proteínas no son almacenadas dentro de las células y para localizar la molécula de ARNm intacta que no ha sido modificada por degradación proteolítica o por procesos post-traduccionales 88.

Generalidades de la técnica

Los métodos inmunohistoquímicos pueden ser aplicados para la detección de virus, bacterias, hongos y protozoos, entre otros microorganismos, tanto para el diagnóstico como con propósitos investigativos. 91 Pueden aplicarse en secciones de tejidos congelados o embebidos en parafina, siendo los últimos los que ofrecen mayores posibilidades de conservación. 88 Estas técnicas han sido muy utilizadas para la detección de antígenos que constituyen marcadores tumorales como las glucoproteínas asociadas al carcinoma de Shope92 y el antígeno carcinoembrionario.93 Además, se han empleado para la detección de antígenos de virus animales y humanos, entre los que se encuentran, herpesvirus bovino tipo 5,94 citomegalovirus 95-97, papillovirus,98 virus de la estomatitis vesicular 99 y virus de la fiebre del Valle del Rift,100 retrovirus.101

Además de disponibilidad de un primer anticuerpo potente y específico, un gran número de factores influyen sobre el resultado final de un procedimiento de tinción inmunohistoquímica, como son: la preservación de la antigenicidad y morfología del tejido, las condiciones de su fijación, los procedimientos de tinción inmunohistoquímica y la tinción de fondo. Resulta claro que la probabilidad de que un estudio inmunohistoquímico sea exitoso se incrementará considerablemente con el conocimiento del papel de cada uno de estos factores. Sin embargo, ya que la tinción en cada procedimiento inmunohistoquímico es el resultado de un complicado conjunto de interrelaciones entre estos factores, la contribución exacta de cada factor individual no puede estar determinada. Por ejemplo, la aplicabilidad de diferentes fijaciones del tejido para el mantenimiento de su morfología no puede estar determinada

41 independientemente de su compromiso con la conservación de la inmunorreactividad de sus antígenos. Al mismo tiempo, el nivel de detección de la inmunorreactividad estará determinado por la especificidad y potencia del primer antisuero, ambas también dependientes de la sensibilidad del procedimiento inmunohistoquímico utilizado.87, 88

Selección del procedimiento de procesamiento de los tejidos

La localización de los antígenos se efectúa en improntas, suspensiones de células o cortes de tejido. Con respecto a la selección del procedimiento de procesamiento de tejido la atención debe enfocarse hacia la preservación de la inmunorreactividad y de la estructura del tejido. Sin embargo, casi cualquier forma de procesamiento de tejido (fijación e impregnación) cambiara la inmunorreactividad de los antígenos, mientras que en los tejidos no fijados o medianamente fijados la impregnación, así como los procedimientos largos de tinción, tienden a dañar la morfología. Por tanto, será necesario establecer un compromiso, cuyo resultado final dependerá grandemente del objetivo del estudio inmunohistoquímico.85, 88

La congelación del tejido en nitrógeno líquido, seguida por el seccionamiento sobre un criostato, usualmente ofrece la mejor preservación de la inmunorreactividad y es por tanto muy adecuada para antígenos que pierden su inmunoreactividad muy fácilmente, o para antígenos que son difíciles de fijar.88, 89 En tales secciones, sin embrago, las membranas celulares están usualmente aún intactas y consecuentemente impiden la penetración de los anticuerpos. El uso de un detergente, como Tritón X-100, que es generalmente adicionado al primer antisuero a una concentración de 0,1-2 % permite una mejor penetración de los anticuerpos. Una ventaja adicional del uso del detergente es la disminución de la tinción de fondo, debido a la adherencia no específica de los anticuerpos al tejido. Debe tenerse en cuenta que el uso de Tritón X-100 durante las incubaciones con el antisuero para mejorar su penetración, puede resultar -en secciones no fijadas- en una apreciable pérdida de la estructura del tejido.88

42 En la localización de péptidos por microscopía de luz ha dado buenos resultados, con respecto al mantenimiento de su inmunorreactividad y de la morfología del tejido, el uso de fijadores tamponados basados en formalina con o sin ácido pícrico, o glutaraldehído. La duración de la fijación, sin embargo, también parece ser una variable importante.89

Tanto en estudios de microscopía electrónica, como de luz, se puede impregnar el tejido fijado, previo a su seccionamiento y tinción inmunohistoquímica (tinción post- impregnación) o seccionar el material no impregnado con el empleo de un vibrátomo o criostato y usar estas secciones en un procedimiento de tinción inmunohistoquímica (tinción-pre-impregnación). La impregnación del tejido en parafina o epon usualmente resulta en una disminución de la inmunorreactividad. Por ejemplo, la tinción post- impregnación en microscopía electrónica resulta en una extracción de membranas y consecuentemente en una pérdida considerable de detalles estructurales ya que el

tetróxido de osmio (OsO4) generalmente no puede ser usado como fijador. Además, los largos tiempo de incubación con el primer antisuero, requeridos frecuentemente en este procedimiento, dan como resultado un nivel elevado de tinción no específica. Consecuentemente, un método de tinción inmunohistoquímica post-impregnación no debe ser generalmente la primera elección cuando se necesita una buena preservación de detalles estructurales. Una alternativa es el empleo de la técnica de tinción pre-

impregnación, mediante la cual el material puede ser fijado en OsO4 después de la tinción inmunohistoquímica, pero previo a la impregnación. El uso de este método de tinción pre-impregnación, hace posible que debido a la reacción vigorosa de la mezcla

de peróxido de hidrógeno (H2O2)- diaminobencidina (DAB), la DAB que se deposita se disperse sobre otras estructuras membranales, lo que resulta en una localización falsa del antígeno.85, 89

Se obtienen buenos resultados con los fijadores deshidratados como, por ejemplo, el etanol y la acetona. Sin embrago, hay riesgo de alteración de los tejidos después de su rehidratación, incluyendo la pérdida de ciertos antígenos por solubilización. Por tanto, es preferible la fijación con el p-formaldehido, que estabiliza las proteínas de los tejidos

43 por enlaces covalentes, esta debe hacerse cuidadosamente para evitar una fijación demasiado prolongada, que impedirá la penetración posterior de los conjugados.89

En general la calidad de la fijación es un factor importante en la determinación de los resultados de la reacción inmunoperoxidasa. Los factores relacionados en la fijación de los tejidos que pueden afectar adversamente los resultados de la reacción incluyen la fijación tardía, la fijación inadecuada, una pobre penetración de los fijadores en el tejido y la sobrefijación. Una demora en la fijación puede causar que la superficie del bloque del tejido se seque, lo cual podría producir una reacción inespecífica, falsos positivos o falsos negativos. La pobre penetración del fijador en el tejido puede ser el resultado de uno o más de los siguientes errores: gran tamaño relativo del bloque del tejido, la presencia de una cápsula de tejido elástico o fibras gruesas, la lenta penetración del fijador y un insuficiente período de tiempo permitido para la fijación. Una sobrefijación causa una pérdida exponencial de antígenos celulares,102

Los procedimientos inmunohistoquímicos son muy efectivos, sobre todo si tenemos en cuenta que se puede aplicar en material procesado por métodos convencionales de inclusión y corte en parafina, y que no requieren de cortes frescos.102

Selección de los procedimientos de tinción inmunohistoquímica

En principio todos los conjugados anticuerpo-enzima, preparados según los procedimientos: acoplamiento de enzima a los anticuerpos por medio de glutaraldehído, acoplamiento de peroxidasa por medio del peryodato de sodio, acoplamiento de enzimas a los anticuerpos por medio de la p-benzoquinona, dan buenos resultados. Estos conjugados en general se utilizan sin purificación posterior. Esta purificación es fastidiosa y no siempre mejora los conjugados, puesto que a veces se nota una disminución de la actividad del anticuerpo o de la enzima.88

Las enzimas utilizadas son aquellas para las que existen sustratos específicos asociados a cromógenos, que son productos insolubles y coloreados, disponibles

44 comercialmente. Estos son principalmente: la peroxidasa, la fosfatasa alcalina y la glucosa oxidasa. La α-galactosidasa no se utiliza porque su peso molecular es muy elevado, lo que implica dificultades de penetración de los conjugados en el tejido.89

En el relevado de la peroxidasa se utilizan cromógenos oxidables por el agua oxigenada en presencia de peroxidasa. Estos son: la DAB que da un precipitado color café, el aminoetilcarbazol que da un precipitado rojo-café y el 4-cloronaftol, que da un precipitado azul. La DAB es la más comúnmente utilizada en la microscopia óptica y electrónica, debido a que su precipitado es denso a los electrones.102 La glucosa oxidasa reacciona con la glucosa para dar ácido glucurónico y agua oxigenada que puede ser revelada por la peroxidasa en presencia de los cromógenos específicos citados previamente. También se puede utilizar una sal de tetrazolio que en un momento de la reacción de la glucosa oxidasa con la D-glucosa, se reduce y da precipitado azul que se intensifica al añadir metosulfato de fenacina. La fosfatasa alcalina se revela utilizando un derivado del naftol y del ácido fosfórico, que después de la hidrólisis por la enzima produce β-naftol. Este último reacciona con una sal de diazonio para dar un compuesto insoluble rojo o azul.88

Varios procedimientos inmunohistoquímicos, tanto inmunoquímicos, como no inmunoquímicos, están disponibles para visualizar anticuerpos que se han unido a secciones del tejidos. Los procedimientos de tinción indirecta son considerados más sensibles que los directos. La mayoría de los especialistas aceptan que dentro de los procedimientos indirectos el de la peroxidasa-antiperoxidasa es la técnica más sensible,102 seguida por los conjugados de peroxidasa y el conjugado fluorescente, en este orden.86 Los métodos indirectos tienen la ventaja, ya mencionada, que el mismo procedimiento puede ser usado en combinación con diferentes primeros antisueros. Aunque las técnicas fluorescentes exhiben la ventaja de una resolución mayor al nivel de la microscopía de luz, la tinción inmunohistoquímica de peroxidasa en la localización de péptidos es más ampliamente utilizada debido a la estabilidad del producto de la reacción DAB. Una ventaja adicional de la tinción inmunoperoxidasa es que el mismo

45 material puede ser usado con relativa facilidad tanto en microscopía de luz como electrónica.88

La especificidad en las tinciones inmunohistoquímicas

Para hablar de la especificidad en la inmunohistoquímica se deben considerar los factores que influyen sobre el resultado final de un procedimiento de tinción inmunohistoquímica, que como hemos analizado anteriormente, se resumen en la preservación de la antigenicidad, preservación de la morfología del tejido, los procedimientos de fijación, el seccionamiento del tejido, los procedimientos de tinción, la tinción de fondo, y la potencia y especificidad del primer antisuero. Sin embargo, como ya se expresó, una de las dificultades principales en cada estudio inmunohistoquímico es que en la mayoría de los casos la contribución de cada factor no puede ser determinada. Por tanto, para obtener algún conocimiento de, por ejemplo, la posible pérdida de determinantes antigénicos durante la fijación del tejido o de la especificidad inmunológica del primer antisuero, la selección de los experimentos de control, así como también la secuencia en la cual son conducidos los experimentos, son muy importantes.87

Dos criterios de especificidad se manejan en las técnicas inmunohistoquímicas: especificidad del método y especificidad de los anticuerpos.85, 103- 105

La especificidad del método es la ausencia de tinción por otros mecanismos diferentes a la interacción inmunoquímica entre los primeros anticuerpos y el tejido. Para evidenciarlas deberán establecerse una serie de ensayos preliminares con el empleo de un suero control o anticuerpo blanco.

La especificidad del método por la forma en que se determina, no permite distinguir si los primeros anticuerpos reaccionaron: (i) solo con el antígeno de interés o (ii) con el antígeno de interés y otros componentes del tejido, bien porque compartan epítopos con el antígeno que intentamos localizar o porque a esos anticuerpos los acompañen

46 anticuerpos contaminantes que reconocen otros componentes antigénicos del tejido. Estos anticuerpos pueden haber sido inducidos por impurezas en el antígeno inyectado. Para definir esta situación se utiliza el criterio especificidad de los anticuerpos.

La especificidad de los anticuerpos es la ausencia de tinción entre los primeros anticuerpos con otros componentes del tejido que no sean el antígeno de interés, es decir, los primeros anticuerpos solo reaccionan con la molécula que va a ser localizada en el tejido bajo estudio.106

El primer paso de la especificidad de los anticuerpos es determinar con qué componente del tejido reaccionan los primeros anticuerpos. Una reacción inmunohistoquímica positiva con el anticuerpo purificado por inmunoafinidad o la no tinción con antisuero después de ser absorbidos quizás provea información de los anticuerpos con respecto a la tinción, pero no sobre la naturaleza de los componentes inmunorreactivos del tejido. Por tanto, para probar la especificidad de los anticuerpos en inmunohistoquímica son necesarios otros ensayos que permitan identificar los componentes del tejido con los que reaccionan los anticuerpos. Estos ensayos deben reunir una de estas dos condiciones: - determinar las habilidades del primer anticuerpo para acoplarse a un número de antígenos conocidos que se suponen están presentes en el tejido. - determinar directamente qué componentes del tejido bajo estudio están realmente acoplados con el primer anticuerpo.

No es sorprendente que en los ensayos de especificidad de anticuerpos los componentes del tejido sean separados por una electroforesis SDS. Pero al mismo tiempo, esto significa que estos ensayos están limitados por la resolución de este tipo de electroforesis. Por ejemplo dos antígenos de tejido con aproximadamente igual masa molecular serán reconocidos como uno solo. Con respecto a esto resulta más conveniente el procedimiento basado en una electroforesis bidimensional para separar los antígenos del tejido.85

47

Una segunda posibilidad para probar la validez del ensayo de especificidad de anticuerpos involucra la incubación de los anticuerpos purificados con tejido que carece del antígeno que va a ser localizado. Esto podría lograrse con un mutante deficiente del antígeno o cuando es posible remover ese componente específicamente del tejido bajo estudio, pero ambos están solo disponibles para un número muy limitado de sistemas.107

Preparación del conjugado anti-IgG de conejo peroxidasa

El objetivo de la conjugación es unir la enzima con el anticuerpo o el antígeno de tal forma que cada uno retenga la cantidad máxima de su reactividad. En el caso de la conjugación de la peroxidasa de rábano picante por el método del periodato, la oxidación de la enzima rinde peroxidasa-aldehído sin pérdida significativa de la actividad enzimática. El peroxidasa-aldehído forma bases de Schiff con los grupos α o ε-amino disponibles de la molécula IgG con una elevada eficiencia. Estas bases de Schiff son luego estabilizadas con el borhidruro de sodio.77

Se recomienda la filtración de los conjugados a través de una columna de Sephadex G- 100 o G-200 para la separación de los anticuerpos no marcados que podrían competir con los conjugados por los antígenos, interfiriendo en los inmunoensayos.77

Las actividades inmunológicas y enzimáticas de la preparación deben ser evaluadas. La titulación combina ambas actividades y con frecuencia el título se expresa por la mayor dilución del conjugado con densidad óptica igual a la unidad.

El conjugado se conserva mezclando con igual volumen de glicerol (para evitar su congelación) a 120 °C en alícuotas convenientes, con BSA y timerosal o azida sódica al 0,01 %. Puede añadírsele un inhibidor de proteasas. La no congelación del conjugado durante su conservación permite tomar cada vez la cantidad requerida sin desechar el

48 resto. El preparado puede mantenerse activo al menos dos años y por lo general mucho más tiempo.

En el caso de la peroxidasa su sustrato es el H2O2 y uno de los cromógenos más empleados es el ortofenilendiamina (OPD) a pH 5, el tiempo óptimo de incubación es aquel al cual se obtiene la mayor diferencia de color entre muestras positivas y

negativas. Al cabo de este tiempo la reacción puede ser frenada con H2SO4 12,5 % en el caso de la peroxidasa, se debe esperar unos 5 min para que se estabilice la coloración antes de proceder a la lectura.

Obtención de anticuerpos anti- IgG de conejo

A un conejo de la raza Chinchilla, de ocho meses de edad, con peso aproximado de 2,5 Kg, sin inmunizar, se le extrajeron 30 mL de sangre; el sangrado se realizó por la arteria central de la oreja. Del suero obtenido se purificó la IgG utilizando como primer

paso la precipitación en NH4SO4 al 50 % de saturación, seguida de una cromatografía de intercambio iónico, procedimientos descritos anteriormente. Se determinó su concentración mediante el método espectrofotométrico. El resultado del intercambio iónico mostró un perfil cromatográfico característico, similar a los ya mostrados, la fracción colectada tuvo 1,45 mg/mL de concentración.

Con vistas a la obtención de anticuerpos anti-IgG de conejo se procedió a la inmunización de un carnero con la IgG purificada. Se realizaron tres inmunizaciones, vía subcutánea, los días 3, 30 y 90. Se emplearon dosis de IgG de conejo de 1 mg con CFA, 1 mg con IFA y 0,5 mg con IFA, respectivamente. A los 14 días después de la tercera inoculación, se procedió al sangrado del carnero, se extrajeron 600 mL de sangre por la arteria aorta del animal y se procedió a la obtención del suero al que se le realizó una inmunodifusión doble (IDD) con el objetivo de realizar una titulación previa de los anticuerpos obtenidos sin purificar, para lo cual se utilizó como antígeno la misma IgG de conejo inoculada, obteniéndose el título 1/8.

49 Posteriormente el suero obtenido se precipitó en NH4SO4 saturado al 50 % y con el objetivo de obtener la IgG lo más purificada posible, la fracción globulínica obtenida fue sometida a una cromatografía de afinidad con proteína G como ligando. La matriz de Sepharosa- proteína G (Pharmacia, Suecia) fue empacada en una columna de Amicon con doble adaptador de flujo, lavada con PBS hasta la obtención de una línea base, la muestra fue aplicada y la columna se lavó exhaustivamente con PBS. El material de interés unido a la columna fue eluído con un tampón glicina pH 2,9 para desfavorecer las interacciones proteínas G-IgG de carnero. Se empleó el sistema cromatográfico descrito para el resto de las cromatografías a una velocidad de flujo de 1 mL/min. En la figura 5 podemos observar el perfil cromatográfico de esta purificación, correspondiendo a la IgG purificada la segunda fracción, a la cual inmediatamente después de la elución se le restableció el pH a 7 con hidróxido de sodio (NaOH) y se concentró en PEG.

A la fracción obtenida se le leyó la absorbancia a 280 nm y se determinó su concentración por el método espectrofotométrico correspondiente a 4.86 mg/mL. A estos anticuerpos purificados se les realizó una IDD obteniéndose un titulo 1/32.

Figura 5. Perfil cromatográfico obtenido en la purificación de los anticuerpos anti-lgG de conejo mediante afinidad en proteínas G

Conjugación Para la conjugación se siguió el protocolo utilizado por el laboratorio de arbovirus, del Departamento de Virología del Instituto de Medicina Tropical, Pedro Kouri 108

50

A 8 mg de peroxidasa (Sigma, U.S.A) en 1 mL de agua destilada se le añadió 0,2 mL de solución fresca de periodato de sodio 0.01 mol/L (21 mg/mL), suavemente y agitando la mezcla durante 20 min a la temperatura del cuarto. Esta se dializó toda la noche contra un exceso de tampón acetato de sodio 1 mol/L pH 4,4 a 4 °C. Posteriormente se le adicionó 20 µL de tampón bicarbonato de sodio 0,2 mol/L a pH 9,5 y 1 mL de IgG (10 mg/mL) previamente dializada la noche anterior contra tampón carbonato-bicarbonato 0,01 mol/L pH 9,5, se agitó la mezcla suavemente por 2 horas a la temperatura del cuarto. Seguidamente se le agregó 0,01 mL de borohidruro de sodio (4 mg/mL) recién preparado y se mantuvo en agitación 2 horas a 4 °C.

La purificación se realizó mediante una precipitación en NH4SO4 al 50 % de saturación, se reconstituyó el precipitado y se dializó toda la noche a 4 °C. Para culminar se le añadió albumina al 1 % y glicerol a igual volumen que el conjugado, se dispersó el alícuotas y se almacenó a -20 °C.

Colecta de la anémona Stichodactyla helianthus

La colecta de los animales se realizó en Jaimanitas, Ciudad de La Habana, en horas de la mañana, en un área de 100 m2 a 2 m de profundidad. Se trabajó con extremo cuidado para evitar el estrés de los animales.

Inmunohistoquímica Procesamiento de las muestras. Fijación y embebimiento en parafina

La fijación se realizó in situ para evitar la trasportación y manipulación de las anémonas vivas. Para ello se utilizó una solución de p-formaldehído al 4 % que contenía 0,1 mol/L de cacodilato de sodio en la que se mantuvieron durante 2 horas. A continuación y teniendo en cuenta que las anémonas son animales de simetría radial, con vistas a lograr cortes representativos de toda su morfología, se les realizaron incisiones paralelas a la boca previo a su inclusión en parafina. A la pieza obtenida se le

51 realizaron dos cortes, seccionándose en tres fragmentos, uno de ellos contenía la boca, la cavidad gástrica y las gónadas, en los dos restantes se hallaban mesenterio, tentáculos y pie.

Estos fragmentos fueron tratados en el procesador de tejido histokinette SAKUTA modelo VRV- 23. El tiempo de procesamiento total fue de 11 horas, 1 hora para cada uno de los siguientes pasos: etanol al 70 %, etanol al 80 %, etanol al 95 % (dos pases), etanol absoluto (dos pases) y parafina (tres pase). Posteriormente, se realizó la inclusión en bloques de parafina, los que se cortaron en secciones de 5 µm con un micrótomo horizontal Reichert, en la medida en que fueron realizados los ensayos. Los cortes se adhirieron sobre láminas histológicas con una solución albúmina-glicerina a partes iguales. Inmediatamente se pusieron en la estufa 30 min a 60 °C y posteriormente se procedió a la inmunotinción.

Tinción inmunoperoxidasa. Método indirecto

Se emplearon como anticuerpo primario los anticuerpos anti-St I obtenidos por inmunización con alúmina, teniendo en cuenta su elevado título y su calidad, la gran similitud estructural entre St I y St II permitó utilizar estos anticuerpos para detectar inmunohistoquímicamente las dos proteínas en el tejido del animal.

Como anticuerpo secundario el conjugado anti-IgG de conejo-peroxidasa, ambos a la dilución 1/500. Las diluciones se realizaron en PBS que contenía, en el caso del conjugado, suero de ratón al 2 %. Todas las incubaciones se realizaron en cámara húmeda.

52 Desparafinación y rehidratación

Antes de la tinción, los cortes de tejidos fijados a lámina fueron sometidos a los procesos de desparafinación y rehidratación. Para ello se realizaron inmersiones de las láminas en xilol, seguido de tres inmersiones en etanol absoluto, durante 3 min cada vez, y finalmente se lavaron tres veces con PBS, durante 10 min cada lavado.

Ensayos preliminares

Estos ensayos se realizaron para evaluar la presencia de peroxidasa endógena en el tejido de la anémona y las reactividades del anticuerpo primario, del conjugado y del revelador (H2O2 + DAB). Para ellos se preparó un juego de siete láminas que se sometió al protocolo que se presenta en la tabla 6.

Tabla 6. Diseño de los ensayos preliminares para la detección inmunohistoquímica de sticholisinas Ensayos Etapas a b c d e f 1. Bloqueo de peroxidasa endógena 9 - 9 9 9 - 2. Anticuerpo primario anti-St I 9 9 - - 9 - Anti-St - - 9 - - - IgG normal PBS - - - 9 - -

3. Conjugado anti-conejo peroxidasa 9 9 9 9 - - 4. Revelador DAB 9 9 9 9 9 9

El protocolo utilizado incluyó pasos los siguientes: primero, el bloqueo de la peroxidasa endógena, con 20 µL de peróxido de hidrógeno al 30 % en 200 mL de metanol. Las láminas se incubaron 15 min a la temperatura del cuarto y se lavaron con PBS durante 10 min. Como segundo paso, las láminas se incubaron con el anticuerpo primario: anti- St, a una dilución de 1/500 en PBS, IgG de conejo normal (no específica) o PBS

53 durante toda la noche a 4 °C. al día siguiente las láminas fueron lavadas dos veces con PBS y se eliminó el exceso del mismo. El tercer paso consistió en cubrir las láminas con el conjugado anti-conejo-peroxidasa durante 1 hora a la temperatura del cuarto y posteriormente se lavaron tres veces con PBS. Se realizó como cuarto proceder el revelado con solución de 5 mg de DAB, en 10 mL de tris- HCl 0.1 mol/L, pH 7.6 y 10 µL de peróxido de hidrogeno al 30 % (SIGMA). La reacción se detuvo antes de los 7 min con agua corriente. Las placas fueron deshidratadas con dos pases tanto en etanol al 95 % como en etanol absoluto. Se aclararon en xilol y se montaron con Bálsamo de Canadá, para ser observadas posteriormente al microscopio óptico de campo claro (OLIMPUS BH-2).

El criterio de positividad fue la presencia de una coloración pardo dorada, característica de la reacción de la DBA con la peroxidasa de rábano picante.87- 89

Los ensayos a y b mostraron una tinción positiva, observándose una coloración más intensa en gránulos de células ubicadas en los tentáculos y la boca del animal, además, se observo una coloración parduzca en todo el fondo de las preparaciones. En el ensayo c se observó un resultado positivo, lo que sugirió que el conjugado o la IgG de conejo reaccionaban con el tejido de la anémona, teniendo en cuenta que en este ensayo se utilizó como anticuerpo primario IgG no específica (Figura 6). Para determinar que la reacción era por el conjugado y no por la IgG normal de conejo se realizó el control con PBS (ensayo d) en el que también se apreció reacción positiva, quedando confirmada la reacción del conjugado con el tejido de la anémona. Esta tinción se caracterizó por una coloración de fondo en toda la preparación. El ensayo e presento una tinción negativa lo que evidenció que la mezcla peróxido de hidrógeno + DAB no reacciona con ningún otro elemento de la técnica, en particular con el anticuerpo primario, que no fuera con el conjugado de peroxidasa. Tampoco se observó reacción en el ensayo f, evidenciándose la no presencia de peroxidasa endógena en el tejido.

54 El aporte de este resultado desde el punto de vista experimental, es que se pudo prescindir del paso inicial de incubación con el bloqueador de peroxidasa endógena, ahorrando así recursos y tiempo. Desde otro punto de vista resulta interesante no encontrar en estos organismos una proteína tan generalizada en el resto de los animales, aunque aún sería necesaria la realización de otro tipo de estudio bioquímico para categorizar la no presencia de esta molécula en estos animales.

Figura 6. Localización inmunohistoquímica de sticholisinas mediante tinción inmunoperoxidasa indirecta. Vista de un corte trasversal de la boca de la anémona Stichodactyla helianthus sometido a la inmunotinción correspondiente al ensayo preliminar d. Se aprecia una coloración positiva lo que indica una reacción del conjugado con el tejido animal. (10X)

Eliminación de la reacción inespecífica del conjugado

Con el objetivo de eliminar la tinción de fondo provocada por la reacción del conjugado con el tejido de la anémona, se procedió a realizar los experimentos de bloqueo.

Se sometieron indistintamente un grupo de catorce láminas a dos bloqueadores: suero de ternera fetal al 1 % y suero de carnero normal (no inmunizado) al 1 % ambos en

55 PBS. Se utilizo además el detergente Tritón X-100 al 1 % en el que se diluyó el anticuerpo primario. Las combinaciones utilizadas se muestran en la tabla 7.

Tabla 7. Diseño de los ensayos para eliminar la reacción del conjugado con el tejido de anémona en la detección inmunohistoquímica de sticholisinas Ensayos I II III IV V VI VII Etapas Anti-St IgG Anti-St IgG Anti-St IgG Anti-St IgG Anti-St IgG Anti-St IgG Anti-St IgG

Bloqueo con suero de ternera 9 9 9 9 fetal (STF) al 1 % Bloqueo con suero de carnero 9 9 9 9 normal (SCN) al 1 % Empleo del detergente Tritón 9 9 9 9 X-100 al 1 %

Todos los bloqueos se realizaron durante 30 min a la temperatura del cuarto, previo a la adición del anticuerpo primario diluido en Tritón X-100 y sin lavados intermedios, el anticuerpo primario se incubó toda la noche a 4 °C. En cada ensayo se introdujeron controles en los que se sustituyó el anticuerpo anti-St por IgG de conejo no específica (tabla 7). Al día siguiente, todas las láminas fueron lavadas y se revelaron con la mezcla sustrato+ cromógeno.

Los resultados de este experimento se muestran en la tabla 8. Los anticuerpos y proteínas presentes en el STF y el SCN podrían interferir las interacciones entre los componentes del conjugado y del tejido del animal4. El Tritón X-100, además de una mejor penetración de los anticuerpos al tejido, disminuye las tinciones de fondo debido a la adherencia no específica de anticuerpos y otras proteínas al tejido bajo estudio.88

56 Tabla 8. Resultados de los ensayos para eliminar la reacción inespecífica del conjugado con el tejido de la anémona en la detección inmunohistoquímica de sticholisinas Ensayos Etapas I II III IV V VI VII Resultados Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva con tenue tenue muy tenue moderada intensa moderada anticuerpos intensa anti-St I Resultados Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa con IgG no específica

El ensayo III fue el que proporcionó una tinción óptima (Figura 7 A, B), determinado esto por la reacción heterogénea en la distribución, tanto dentro de una sola célula, entre grupos de células, así como el resto del tejido, siendo esta uno de los elementos más importantes en la calidad de una respuesta positiva.87, 88

A B

Figura 7. Localización inmunohistoquímica de sticholisinas mediante tinción inmunoperoxidasa indirecta. Vista correspondiente al ensayo III. A, tentáculo. B, boca. Se aprecia una tinción granular positiva, en células epidérmicas y gastrodérmicas de los tentáculos y la boca. (10X)

Los controles negativos demostraron la fiabilidad del experimento dando una tinción negativa (figura 8).

57

Figura 8. Localización inmunohistoquímica de sticholisinas mediante tinción inmunoperoxidasa indirecta. Vista correspondiente al control negativo del ensayo III. (10X)

Como se puede observar en estas figuras la positividad se apreció por la coloración pardo-dorado característica de la reacción de la DBA con la peroxidada,87- 89 en forma granular de células epidérmicas y gastrodérmicas de los tentáculos y la boca. Basándonos en la descripción histológica de de la Torre 31 y Barnes y Ruppert,30 se puede concluir que estas células son cnidocitos.

Efectos de la dilución y de las condiciones de incubación del anticuerpo primario

Una vez disminuida la tinción de fondo se investigaron otras diluciones del primer anticuerpo, además de la ya utilizada, bajo diferentes condiciones de tiempo y temperatura de incubación.

Se diseñaron doce ensayos en los que se aplicó un primer bloqueo con la solución de STF durante 30 min a la temperatura del cuarto y un segundo bloqueo, sin lavados intermedios, con la solución de SCN otros 30 min a la temperatura del cuarto. Posteriormente, las láminas se dividieron en cuatro grupos de a tres y fueron incubadas con diferentes diluciones (1/500, 1/1000, 1/2000, 1/4000) del anticuerpo anti-St diluido en Tritón X-100 al 1% en PBS. Las láminas de cada grupo fueron incubadas en tres

58 formas diferentes: (a) 30 min a 37 °C, (b) 60 min a la temperatura del cuarto y (c) durante toda la noche a 4 °C. En cada grupo de ensayo se procesaron controles negativos con IgG no específica. Finalmente, las láminas se incubaron con el conjugado, se revelaron con DAB, montaron y observaron al microscopio.

Los resultados de este experimento se muestran en la tabla 9, donde se puede apreciar la potencia del anticuerpo, observándose reacción hasta 1/4000 que equivale a una concentración de 0,27 µg/mL, apreciándose con esta dilución muy baja tinción de fondo (Figura 9). En cuanto a la temperatura y el tiempo de incubación no se observan diferencias significativas en los resultados (Figura 10 A, B, C).

Tabla 9. Efecto de la dilución de anticuerpos, de la temperatura y del tiempo de incubación en la detección inmunohistoquímica de sticholisinas

Temperatura y tiempo de incubación (°C y min) Dilución Resultados

1/500 Positiva muy intensa

1/1000 Positiva intensa 30 min a 37 °C 1/2000 Positiva intensa

1/4000 Positiva moderada

1/500 Positiva muy intensa

1/1000 Positiva intensa 60 min a la temperatura del cuarto 1/2000 Positiva intensa

1/4000 Positiva moderada

1/500 Positiva muy intensa

1/1000 Positiva intensa Toda la noche a 4 °C 1/2000 Positiva moderada

1/4000 Positiva tenue

59

Figura 9. Localización inmunohistoquímica de sticholisinas mediante tinción inmunoperoxidasa indirecta. Vista de la boca de la anémona Stichodactyla helianthus correspondiente al ensayo donde se empleó 1/4000 como dilución del anticuerpo primario, 30 min a 37 °C. Se aprecia una tinción positiva granular, en células epidérmicas y gastrodérmicas. (10X)

A B C

Figura 10. Localización inmunohistoquímica de sticholisinas mediante tinción inmunoperoxidasa indirecta. Vista correspondiente al resultado del efecto de la temperatura y del tiempo de incubación en la detección inmunohistoquímica de la St. A, 30 min a 37 °C. B, 1 hora a la temperatura del cuarto. C, toda la noche a 4 °C. Se aprecia una coloración positiva en células epidérmicas y gastrodérmicas de tentáculos (C) y boca (A, B) no observándose grandes diferencias entre las tinciones de los tres ensayos. (10X)

Los ensayos realizados permitieron estandarizar la tinción inmunohistoquímica de sticholisinas en los cortes histológicos de la anémona de mar Stichodactyla helianthus,

60 estableciendo los parámetros adecuados para obtener nitidez en las preparaciones y resultados positivos y negativos bien definidos.

61

CAPÍTULO 4. Discusión general

Las técnicas inmuhistoquímicas han constituido y constituyen una metodología de amplia utilización que permite, con el empleo de anticuerpos específicos, la identificación de tipos y estadios de diferenciación celular85 y la localización de moléculas o estructuras particulares en un tejido. 88, 90 Los anticuerpos constituyen el componente fundamental en una técnica inmunohistoquímica y su calidad determina en gran medida el éxito del ensayo.

La disponibilidad de anticuerpos policlonales que fueron producidos en conejo contra sticholisina I y II, nos permitió emprender la tarea de localizar estas citolisinas en el cuerpo de la anémona Stichodactyla helianthus, de donde fueron extraídas mediante un procedimiento de purificación a partir de un extracto total.70 Lo primero que se hizo fue evaluar si tales anticuerpos tenían la calidad requerida para un estudio inmunohistoquímico. Esta calidad está relacionada con la especificidad y potencia de los mismos. La especificidad significa que los anticuerpos fueran lo suficientemente selectivos para no reaccionar con otros componentes de la anémona. De esta forma, la tinción positiva correspondería exclusivamente a la identificación de la sticholisina en el tejido.

En el enfrentamiento de los anticuerpos anti-St I y II al extracto total y a las sticholisinas purificadas en una técnica de inmunotrasferencia se pudo constatar que ningún otro componente del extracto, que no fueran las St I y II, fue capaz de reaccionar con esos anticuerpos (resultados no mostrados), lo que significa que son específicos y que es posible su empleo para localizar las citolisinas en el cuerpo de la anémona.

Es importante reflexionar acerca de que si queremos localizar las citolisinas en el cuerpo de la anémona sin un conocimiento previo de su ubicación en el tejido, tenemos que estar seguros de que los anticuerpos no reaccionen con otras estructuras del animal. Este criterio no puede ser establecido con las técnica inmunohistoquímica en sí

62 misma, pues no existe un control que permita definirlo, ya que la reacción de posibles contaminantes con otros constituyentes del tejido de la anémona es también una reacción específica. La especificidad de los anticuerpos es el criterio al que nos hemos referido y evaluamos a través del enfrentamiento de los anticuerpos anti sticholisinas con el extracto total y las sticholisinas mediante la técnica de inmunotransferencia. No obstante, existe un procedimiento para evaluar la especificidad del método inmunoquímico y es su absorción con el antígeno para ser enfrentado, una vez absorbido el antisuero, con el tejido bajo estudio. El resultado negativo al enfrentar los anticuerpos absorbidos con el tejido que contiene las sticholisinas nos permitiría confirmar la especificidad del método, el inconveniente de este procedimiento es que se debe disponer de un antígeno altamente purificado en cantidad suficiente, esto es a menudo imposible para antígenos aislados de material biológico. Sin embrago, aun cuando una preparación antigénica suficientemente pura estuviera disponible, el ensayo de preabsorción solo muestra que componentes inmunorreactivos del tejido y este componente, comparten determinantes antigénicos.88, 90 Una alternativa para evaluar la especificidad de los anticuerpos que se utilizarán en el estudio inmunohistoquímico, es emplear un suero normal de la misma especie en la que se produjo el anticuerpo. La reacción negativa de este suero control significa que no existe otros componentes en el suero, como los anticuerpos naturales, capaces de reaccionar con el tejido bajo estudio.85 Esto reafirmaría que la tinción inmunohistoquímica positiva solo es debida a la reacción de los anticuerpos específicos con el antígeno que se desea localizar.

El otro aspecto que debimos resolver fue la selección de los anticuerpos que utilizaríamos en el estudio inmunohistoquímico, dado que disponíamos de anticuerpo contra las dos sticholisinas. ¿Deberíamos trabajar con los dos anticuerpos separadamente y emplear una tinción bicolor, con una mezcla de los dos anticuerpos o con un solo tipo de anticuerpo? El estudio de reactividad cruzada de ambos antisueros 78, evidenció la elevada similitud antigénica de la St I y II, como corresponde a isoformas de una misma proteína.10 El por ciento de reactividad cruzada de ambos antisueros con la sticholisina heteróloga a todas las diluciones y con los dos

63 adyuvantes utilizados (Freud y alúmina) fue siempre mayor del 85 % (resultados no mostrados) lo que sugirió una reactividad cruzada verdadera, es decir que ambas proteínas comparten, todos sus epítopos.75, 76 Por todo esto decidimos emplear un solo tipo de anticuerpo para identificar las dos isoformas de St I y II y seleccionamos los anticuerpos anti-St I obtenidos con alúmina atendiendo a su mayor disponibilidad. Esto nos permitió, además, utilizar el método indirecto de tinción que permite amplificar la interaccion antígeno- anticuerpo primario.77

Para la inmunohistoquímica se empleó el método indirecto, que permite amplificar la interacción antígeno-anticuerpo primario*. Se utilizaron dos anticuerpos: el anti-St obtenido en conejo y el anti-IgG de conejo obtenido en carnero. La capacidad de alguno de estos dos anticuerpos de generar reacciones inespecíficas con el tejido bajo estudio podría conducir a positividades falsas o a una tinción de fondo que podría afectar la resolución de la tinción inmunohistoquímica. Los ensayos preliminares que llevamos a cabo tuvieron como objetivos detectar cualquier tipo de reactividad que no fuera la de los anticuerpos anti-St con las sticholisinas, para proceder a su eliminación y garantizar la especificidad del método inmunohistoquímico.85

Uno de los resultados más interesantes de nuestro trabajo es que si bien la IgG normal de conejo no generó reacción positiva por sí misma al ser enfrentada al tejido de la anémona; sí la generó la IgG del carnero que se conjugó con la peroxidasa. Estas reacciones que acostumbramos a llamar “inespecíficas”, constituyen uno de los obstáculos más importantes a resolver en los ensayos inmunoquímicos. Sus causas son diversas y complejas, así como las formas de eliminarlas.88, 90 El conjugado u otros anticuerpos pueden unirse electrostáticamente a proteínas básicas en la selección del tejido (interacción proteína-proteína). Tal unión no específica parece ser difícil de eliminar y puede incluso ser facilitada durante la preparación de los anticuerpos marcados. Sterbernger, desde 1979, planteó que al menos parte de esta reactividad no específica puede ser prevenida por pre incubación del tejido con suero pre inmune del animal que sirvió como fuente del segundo anticuerpo,85 por lo que en nuestro caso, decidimos emplear el suero de ternera fetal y el suero normal de carnero como

64 bloqueadores y el Tritón X-100 como diluyente del primer anticuerpo, lo que permite una mejor penetración de los anticuerpos y disminución de la tinción de fondo debido a la adherencia no específica de anticuerpos al tejido, en siete combinaciones diferentes. Tanto el SNC como el Tritón X-10 ya habían sido utilizados en otras tinciones inmunohistoquímicas con el mismo fin.85 Los mejores resultados se obtuvieron con el empleo de los bloqueadores y el detergente, lográndose una disminución de la tinción de fondo y, por consiguiente, resultados positivos contrastantes, siendo esto uno de los elementos más importantes en la calidad de una respuesta inmunohistoquímica.88, 90 (Figura 7)

En relación con la potencia de los anticuerpos, pudimos comprobar su calidad al obtener tinciones francamente positivas con una dilución 1/4000. Esto puede estar relacionado, no solo con la concentración de anticuerpos de la preparación, sino con su avidez, a la que contribuye la afinidad de los anticuerpos individuales que, por haberse levantado contra un antígeno timo dependiente, sufrieron un proceso de maduración en estos órganos de respuesta.109

La tinción inmunohistoquímica nos permitió identificar las sticholisinas en los tentáculos y la boca de la anémona Stichodactyla helianthus, apreciándose una coloración pardo- dorado granular, característica de la reacción de la DAB con la peroxidasa, tanto en células epidérmicas como gastrodérmicas. Basándonos en la descripción histológica de de la Torre 31 y Barnes y Ruppert 30 se pudo concluir que estas células eran cnidocitos, lo cual resulta comprensible teniendo en cuenta que es en este tipo de célula, característica de los cnidarios; donde se almacenan las toxinas de estos animales. Además, estas células se encuentran esparcidas por toda la epidermis y gastrodermis de los tentáculos y región oral, donde se agrupan y forman verrugas, y fue en estas zonas donde nuestros ensayos mostraron tinción positiva (Figura 7 y 9) y faltan o son escasas en las regiones aborales, donde no se apreció positividad en ningún experimento.

65 La presencia de estas toxinas potentes en estas regiones, no es sorprendente si consideramos que las anémonas son animales sedentarios que necesitan armas altamente efectivas y de acción rápida capaz de movilizar y matar presas y/o repeler los posibles depredadores. Aquellas toxinas destinadas a la defensa y captura de presas deben ser secretadas por nematocitos por su eficiente mecanismo de descarga, que consiste en un cambio en la permeabilidad de la pared de la cápsula bajo influencia de factores mecánicos y químicos.30 En este sentido, parece razonable que estas citolisinas estén destinadas a inmovilizar y matar pequeñas presas; al respecto se ha demostrado que estas proteínas son altamente letales para crustáceos y peces.33 Por otra parte estas proteínas pudieran colaborar en la digestión de las presas, que según se ha demostrado, en estos organismos es llevada a cabo por enzimas similares a la tripsina y quimotripsina 110.

En relación con la función de defensa de estas proteínas, Senic y Mancek 111 encontraron evidencias de que ante una estimulación mecánica moderada, Actina cari expulsa un líquido que contiene grandes cantidades de citolisinas. La toxina secretada puede tener una función de señal química para los depredadores, demás, debe ser una proteína constitutiva, garantizando una reserva permanente de la misma. En cuanto a nuestro caso, a pesar de ser los cnidocitos mas abundantes en la epidermis,30, 31 en todos nuestros ensayos se apreciaron mayor número de células teñidas en la gastrodermis.

Otra función que ha sido postulada para estas citolisinas, es su participación en la diseminación de las colonias de anémonas. En este caso se produce una competencia por el espacio a través de agresiones intraespecies. Las toxinas son secretadas una vez que se ha producido el contacto entre los tentáculos de las anémonas y esta agresión provoca el desplazamiento de una de las anémonas.63

66

CONCLUSIONES

1. Se logró la purificación de los anticuerpos anti-sticholisina I y II resultando la tecnología de inmovilización de la sticholisina II en la matriz cromatográfica empleada, un método de bajo rendimiento y eficiencia.

2. Se localizaron las sticholisinas en cnidocitos de tentáculos y boca de la anémona de mar (Stichodactyla helianthus).

3. Se estandarizó la técnica inmunohistoquímica para la localización de sticholisinas en Stichodactyla helianthus.

67

RECOMENDACIONES

1. Revisar las condiciones de aplicación y elución de la columna de inmunoafinidad teniendo en cuenta que un 42 % de eficiencia de acoplamiento no justifica tan bajos por cientos de purificación.

2. Mejorar el método de colecta de las anémonas con el propósito de disminuir la pérdida de toxinas por el estrés provocado.

3. Continuar el estudio inmunohistoquímico con mayor número de muestras, incluyendo anémonas de otras localidades.

68

Bibliografía

1- Turk, T. (1991). Cytoloytis toxins from sea anemone. J. Toxicon 10(33): 223-262. 2- Díaz, A., Tejuca, M., Álvarez, C., Lanio, M. E. (1992). Efecto anticoagulante del extracto total y algunas fracciones aisladas de la anemona de mar Stichodactyla helianthus. Rev. Iberoamer. Hemostasia, 5:8-11. 3- Lanio, M.E., Gómez, T., Álvarez, C., Pasos, F., Tejuca, M. (1990). Molecular and functional characteristic of a phospholipase A 2 from Stochodactula helianthus. Libros de resúmenes, IV congreso Panamericano de Bioquímica, Sao Paolo, Brasil. 4- Álvarez, C., Gómez, T., Tejuca, M., Lanio, M.E., Rubtov, A. (1991). Interaction of a polypeptide fraction obtained from the anemone Stichodactyla helianthus with membranes preparation of sarcoplasmic reticulum, Vestnik Moskova, Ser 16, Biologia 45:70-72. 5- Álvarez, C., Lanio, M.E., Pasos, F., Gómez, T., Tejuca, M. (1992). Interaccion de una fracción de naturaleza polipeptidica aislada de la anemona de mar Stichodactyla helianthus con las membranas biológicas. Biología 6: 149-150. 6- Álvarez, C., Tejuca, M., Morera, V., Besada, V., Pasos, F., Veitía, R., Luzardo, M.C., Acebedo, A.M., Padron, G., Lanio, M.E. (1994). Some characteristic of sticholisin: a novel cytolysin from S.helianthus. Advences in Modern Bioyachnology 2(1): 135- 137. 7- Morera, V., Gómez, J., Besada, V., Estrada, R., Pons, T., Lanio, M.E., Gómez, T., Álvarez, C., Pasos, F., Tejuca, M. (1994). Primary structure analysis of hemolytic polypeptide sticholysin isoled from a sea anemone. Advances’ in modern biotechnology 2(1): 135-138. 8- Tejuca, M., Álvarez, C., Lanio, M.E., Pasos, F. (1994). Mecanismo hemolítico de una citolisina purificada de Stichodactyla helianthus. Memorias del Congreso de Ciencias del Mar. Habana. Cuba.

69 9- Álvarez, C., Tejuca, M., Morera, V., Besada, V., Pasos, F., Lanio, M.E., Padron, G. (1996). Novel primary structure of sticholysin and its interaction with membranes. Toxicon 34(3): 301-305. 10- Tejuca, M., Luzardo, M.C., Álvarez, C., Veitía, R., Pasos, F., Lanio, M.E. (1996). Influencia del ph sobre el mecanismo hemolítico de una citolisina de la anemona d emar Stichodactyla hemianthus. Biología 10: 125-128. 11- Tejuca, M. (1996). Mecanismo de lisis de sticholisina I, una citolisina de la anemona de mar Stichodactyla helianthus. Tesis de Doctorado en Ciencias Biológicas. Facultad de Biologia, Universidad de la Habana. 12- Álvarez, C., Lanio, M.E., Tejuca, M., Martínez, D., Pasos, F., Campos, A.M., Encinas, M.V., Pertinhez, T., Schreier, S., lissi, E. A. (1998). The role of ionic strength on the enhacement of hemolytic activity of sticholysin I, a cytolisin from Stochidactyla helianthus. Toxicon 36(1): 165.

13- Álvarez C., Dalla M., Potrich C., Bernhart I., Tejuca M., Martinez D., Pazos F., Lanio ME., Menestrina G. (2001). Effects of Lipid Composition on Membrane Permeabilization by Sticholysin I and II, Two Cytolysins of the Sea Anemone Stichodactyla helianthus. Biophysical Journal. 80 (6): 2761-2774.

14- Álvarez C, Mancheño JM, Martínez D, Tejuca M, Pazos F, Lanio ME. (2009) Sticholysins, two pore-forming toxins produced by the Caribbean Sea anemone Stichodactyla helianthus: Their interaction with membranes. Toxicon. 2009 Mar 4 [Epub ahead of print].

15- Castañeda O, Harvey AL. (2009). Discovery and characterization of cnidarians peptide toxin that affect neuronal potassium ion channels. Toxicon. 2009 Mar 5.

16- Tejuca, M., Anderluh, G., Macek, P., Marcet, R., Torres, D., Serracet, J., Álvarez, C., Lanio, M.E., Dalla, M., Menestrina, G. (1999). Antiparacite activity of sea- anemone cytolisin on Giardia duodenalis abd specific targeting with anti- giardis antibodie. Parasitol 29(3): 489-98. 17- Yan L, Herrington J, Goldberg E, Dulski PM, Bugianesi RM, Slaughter RS, Banerjee P, Brochu RM, Priest BT, Kaczorowski GJ, Rudy B, Garcia ML. (2005).

70 Stichodactyla helianthus peptide, a pharmacological tool for studying Kv3.2 channels. Mol Pharmacol. 67(5):1513-21. 18- Castañeda O, Harvey AL. (2009) Discovery and Characterization of Cnidarian Peptide Toxins that Affect Neuronal Potassium Ion Channels. Toxicon. [Epub ahead of print] 19- Hu L, Pennington M, Jiang Q, Whartenby KA, Calabresi PA. (2007). Characterization of the functional properties of the voltage-gated potassium channel Kv1.3 in human CD4+ T lymphocytes. J Immunol. 179(7):4563-70. 20- Beeton, Ch., Pennington, M.W., Wulff, H., Singh, S., Nugent, D., Crossley, G., Khaytin, I., Calabresi, P.A., Chen, Ch.Y., Gutman, G.A., and Chandy, K.G. (2005). Targeting Effector Memory T Cells with a Selective Peptide Inhibitor of Kv1.3 Channels for Therapy of Autoimmune Diseases. Molecular Pharmacology DOI: 10.1124/mol.104.008193 21- Wulff H, Knaus HG, Pennington M, Chandy KG. (2004). K+ channel expression during B cell differentiation: implications for immunomodulation and autoimmunity. Immunol. 173(2):776-86. 22- Yan L, Herrington J, Goldberg E, Dulski PM, Bugianesi RM, Slaughter RS, Banerjee P, Brochu RM, Priest BT, Kaczorowski GJ, Rudy B, Garcia ML. (2005). Stichodactyla helianthus peptide, a pharmacological tool for studying Kv3.2 channels. Mol Pharmacol. 67(5):1513-21. 23- Wulff H, Calabresi PA, Allie R, Yun S, Pennington M, Beeton C, Chandy KG. (2003). The voltage-gated Kv1.3 K(+) channel in effector memory T cells as new target for MS. J Clin Invest.111(11):1703-13. 24- Ávila AD, Calderón CF, Pérez RM, Pons C, Pereda CM, Ortiz AR. (2007). Construction of an immunotoxin by linking a monoclonal antibody against the human epidermal growth factor receptor and a hemolytic toxin. Biol Res. 40(2):173-83. 25- Zamponi, M.O., Acuña, E.H. (1994). La variedad de los cnidocitos y su importancia en la determinación de clines. Physis. Buenos Aires, secc. A, 49 (116-117): 7- 18. 26- Gould, J.L and Keeton, W.T. (1996). Biological Science, 6th ed. W. W. Norton and Company: 646-47. 27- Solomon, E.P., Berg, R.L., Martin, W.P, Ville, C (1993). Biology, 3th ed. sauders College Publishing; Florida: 604-07.

71 28- Purves, W.K., Orian, G.H and Heller, H.C. (1995). Life: the science of biology, 4th ed. Sinaver associate, inc, W.H and Freeman and Company: 583- 87. 29- Campell, N.A. (1992) Biology. 3th ed. University of California, Riverside: 604. 30- Barnes, R.D and Ruppert, E.E. (1996). Zoología de los invertebrados. 5th ed. McGraw- Hill Interamaricana, México: 1114. 31- De la Torre, S. (1989). Zoologia de invertebrados inferiores. Editorial Pueblo y Educacion. La Habana. 32- Harris, M. (1990). "Harris’s final response." In Thomas N. Headland, Kenneth L. Pike and Marvin Harris (eds.), Emics and etics: The insider/outsider debate, 202-16. Frontiers of Anthropology, 7. 33 Grotendorst, G. Hessinger, D. (2000). Enzymatic characterization of the major phospolipase A2 component of sea anemone (Aiptasia pallida) nematocyst venom. Toxicon, Jul; 38 (7): 931-43. 34 Norton, R. (1991). Structure and structure-function relationships of sea anemone proteins that interact with the sodium channel. Toxicon, 29(9): 1051-1084.

35 Teng, C.M.; Lee, L.G.; Lee, C.Y. y Ferlan, I. (1988). Platelet aggregation induced by equinatoxin. Thromb. Res., 52: 401-411.

36 Cooper, R.A.; J.C. Freitas; F. Porreca; C.M. Eisenhour; R. Lukas & R.J. Huxtable. (1995). The sea anemone purine, caissarone: adenosine receptor antagonism. Toxicon, 33 (8): 1025-1031.

37 Preuss, J.M. (2000). Marine envenomations and toxidromes. Topics in Emergency Medicine, Jun 22 (2): 44-73.

38 Freudenthal, A.R. y Barbagallo, J.S. (2002). Ghost anemone dermatitis. J. Am. Acad. Dermatol., Nov; 47 (5): 722-6

39 García, P.J.; Schein, R.M.H. y Burnett, J.W. (1994). Fulminant hepatic failure from a sea anemone sting. Ann. Int. Med., 120 (8): 665-666.

72 40 Mizuno, M.; Nishikawa, K.; Yuzawa, Y.; Kanie, T., Mori, H.; Araki, Y.; Hotta, N. y Matsuo, S. (2000). Acute renal failure after a sea anemone sting. Am. J. Kidney Dis., Aug; 36 (2): E10.

41 Montebruno, Z. y Maso, D. (1993). Intoxicación por consumo de mariscos contaminados con veneno paralizante en XII Región, Chile: estudio anatomopatológico. Rev. Med. Chile, 121 (1): 94-7, ene.

42 Mebs, D. 1998. Occurrence and sequestration of toxins in food chains. Toxicon, Nov. 36 (11): 1519-22.

43 Schwartz, S. y Meinking, T. (1997). Venomous marine animals of Florida: morphology, behavior, health hazards. J. Fla. Med. Assoc. Oct; 84 (7): 433-40.

44 Sánchez, J.; Bruhn, A.; Aneiros, A.; Wachter, E. y Béress, L. (1996). A simple biochemical method in the search for bioactive polypeptides in a sea anemone (Anemonia sulcata). Toxicon, 34 (11/12): 1361-1366.

45 Kem, W.R. (1988) Sea anemone toxin: estructure and action. En: The biology of the nematocysts. New York, Academic Press: 375.

46 Anderluh, G. and Maček, P. (2002) Dissecting the Actinoporin Pore-Forming Mechanism. Structure 11(11):1312-13.

47 Dunn, D. (1981). The clownfish sea anemone: Stichodactylidae (Coelenterata: Actinaria) and other sea anemone symbiotic with promacetind fished. Trans. Amer. Phil. Soc. 71: 1-115. 48 Mebs, D (1994). Anemone fish symbiosis: vulnerability and resistence of fish to the toxin of sea anemone. Toxicon, 32(9): 1059-68. 49 Castañeda, O. (1995). Caracterización de dos toxinas facilitadoras de la trasmisión colinérgica obtenidas a partir de Stichodactyla helianthus. Tesis de Doctorado en Ciencias Biológicas. Facultad de Biología. Universidad de La Habana. 50 Mebs, D. and Gebauer, E. (1980). Isolation of proteinase inhibitory, toxic and heomityc polypeptides from a sea anemone, Stochactis sp. Toxicon 18(1): 97-106.

73 51 Delfin, J., Diaz, J., Anthuch, W., Rodriguez, R., Gonzalez, Y., Morera, V., Martinez, I., Larionova, N., Padron, G., Chavez, M. (1996). Purification, characterization and immovilization of proteinase inhibitors from S. helianthus. Toxicon, 34(3):301.

52 Alegre-Cebollada, J., Martínez, Á., Gavilanes, J., and Goormaghtigh, E. (2007). Infrared Spectroscopy Study on the Conformational Changes Leading to Pore Formation of the Toxin Sticholysin II. Biophysical Journal 93(9, 1): 3191-3201.

53 Bernheimer, A.W. and Rudy, B. (1986). Interaction between membranes and cytolitic peptides. Biochim Biophys Act 864:123. 54 Honda, I., Ni, Y., Miwatoni, T., Adachi, T., Kim, J. (1992). The termoestable derect hemolysin of Vibrio parahemolyticus is a pore- forming toxic. Can Microbiol 28 (11): 1175 55 Causi, S., Monte, R., Ropele, M., Misserger, C., Not, T., Quadrifolio, F., Menestrina, D. (1993).pore forming and hemolytic proprieties of the Gardenerella veginalis citolisin. Mol Microbiol 9 (6): 1143. 56 Frey, J., Bosse, J., Chang, Y.F., Cullen, J.M., Fenwick, B., Gerlach, G.F., Gygi, D., Haesebrouck, F., Inzanse, I.I., Jansen, R. (1993). Actinobasillus pleuropneumoniae RTX- toxins: uniform desingnation of haemolisin cytolisin pleurotoxin and their genes. J Gen Microbiol 139(8): 1723. 57 Hung, C.C., Wu, S.H., Chiou, S.H. (1993). Sequence characterization of cardiotoxin from Taiwan cobra: isolation of a new isoform. Biochem Mol Biol Lnt 31(6): 1031. 58 Acevedo, A.M. (1994). Efecto de la fuerza ionica sobre la actividad hemolitica de una sticholisina de la anemone de mar Stichodactyla helianthus. Tesis de Diploma. Facultad de Biologia, Universidad de La Habana. 59 Ter-Hurne, A.A., Muir, S., vanHouten, M., van der Zeijst, B.A., Gaastra, W., Kuster, J.G. (1994). Characterization of three putative Serpulina hiodisenteriae hemolysin. Microbial Pathog 16 (4):269. 60 Bunc, M., Drevensek, G., Budihna, M., Suput, D. (1999). Effect of equinatoxin II from Actina equine on isolated rat heart: the role of direct cardiotoxic effect in equinatoxin II lethality. Toxicon 37(1): 109.

74 61 Galletis, P. and Norton, R.S. (1990). Biochemical and farmacological studies of the mechanism of action of tenebrosin- C, a cardiac stimulatory and haemolytic protein from the sea anemone, Actina tenebrosa. Toxicon, 28(6): 695- 706. 62 Brace, R.C. (1990). Aggression in a sea anemone: a model of early non-self recognition. Endeavaer, New Series, 14: 159. 63 Bernheimer, A.W., Avigad, L.S. and Lai, C.Y. (1982). Purification and proprieties of a toxin from the sea anemone Condilactis gigantean. Arch. Biochem. Biophys, 214: 840. 64 Ishikawa, Y., onodera, K., Takeuchi, A. (1989). Purification and effect of the neurotoxin from the sea anemone, Parasicyonis actinostoloides.J. Neurochem., 33(1):69-73. 65 Kem, W. R., Dunn, B.M., Parten, B., Price, D. (1985). The unconventional amino acid sequence, oh the major neurotoxin polypeptide of the sea anemone Stichodactyla helianthus. Toxicon, 23(4): 580.

66 Valcarcel, C.A., Dalla, M., Potrich, C., Bernhart, I., Tejuca, M., Martinez, D., Pazos, F., Lanio, M.E, Menestrina, G. (2001). Effects of lipid composition on membrane permeabilization by sticholysin I and II, two cytolysins of the sea anemone Stichodactyla helianthus. Biophys J. Jun; 80(6):2761-74.

67 de los Ríos, V., Mancheño, J.M., Martínez, A., Alfonso, C., Rivas, G., Oñaderra, M., and Gavilanes, J.G. (1999) Sticholysin II, a cytolysin from the sea anemone Stichodactyla helianthus, is a monomer-tetramer associating protein. Febs Letters. V(455): 27-30

68 Alegre-Cebollada; J., Lacadena, V., Oñaderra, M., Mancheño, J.M., Gavilanes, J.G., and Martínez, Á. (2004). Phenotypic selection and characterization of randomly produced non-haemolytic mutants of the toxic sea anemone protein sticholysin II. Febs Letters V (575):14-18.

69 Lanio, M.E., Álvarez, C., Morera, V., Pazos, E., Tejuca, M., Martinez, D., Menestrina, G., Campos, A.M., Lissi, E. (2000). Some estructural characteristics of sticholysin I and II, cytolisin from the sea anemone Stichodactyla helianthus and their implication for the interaction with membrans. Toxicon 38(4): 491-92.

75 70 Mancheño, J.M., Martín, J., Martínez, M., Gavilanes, J.G., and Hermoso, J.A. (2003). Crystal and Electron Microscopy Structures of Sticholysin II Actinoporin Reveal Insights into the Mechanism of Membrane Pore Formation. Webmar Structure. 11(11):1319-28

71 Martín-Benito J, Gavilanes F, de Los Ríos V, Mancheño JM, Fernández JJ, Gavilanes JG. (2000). Two-dimensional crystallization on lipid monolayers and three-dimensional structure of sticholysin II, a cytolysin from the sea anemone Stichodactyla helianthus. Biophys J. 78(6):3186-94.

72 Díaz, A., Brito, A., Tejuca, M., Álvarez, C., Lanio, M.E., Almagro, D. y Estrada, M. (1999). Efecto agregante plaquetario de 2 citolisinas: Sti y Stii purificadas de la anémona marina Stichodactyla Helianthus. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter. 15(3):182-89.

73 Pennington, M.W., Beeton, C., Galea, C.A., Smith, B.J., Chi V., Monaghan, K.P., Garcia, A., Rangaraju, S., Giuffrida? A., Plank, D., Crossley, G., Nugent, D., Khaytin, I., Lefievre, Y., Peshenko, I., Dixon, C., Chauhan, S., Orzel, A., Inoue, T., Hu, X., Moore, R.V., Norton, R.S., Chandy, K.G. (2007). Engineering a stable and selective peptide blocker of the Kv1.3 channel in T lymphocytes. Mol Pharmacol. [Epub ahead of print]. 74 Abbas, A.K., Lichtman A.H. (2007). Basic immunology. Function and Disorders of the Immune System. Second edition. Saunders Philadelphia. Pp 675-715 75 Wise, D.J. and Carter, G.R. (2002). Immunology a comprehensive review. Iowa State University Press. 76 Pico, M.C., Giraldino, I.G., Otero, A. (1997). Inmunología experimental. Editorial felix Varela. La Habana. 77 Pico, M.E., del Monte, A., Calvo, L., Torres, Y., Felicó, E., Otero, A. (2000). Inmunogenicidad y especificidad antigénica de las sticholisinas I y II de la anemona de mar Stichodactyla helianthus. Revista Biología. 14(2):156- 159 78 Rangel, L.; Perera, G.; Lassala, A.; Zarco, L.A. (1999) Desarrollo de un método de radioinmunoanálisis para ensayo cortisol, utilizando anticuerpos obtenidos y

76 purificados de la yema de huevo de gallinas inmunizadas. Red de Revista Científicas de America Latina y el Caribe, Vet. Mex., 30(4): 289- 295. 79 Subramanian, G. (2004). Antibodies: Production and purification. Vol 1. Spring Street, New York. 80 Bemeex, L.G. and Freitag, R. (2002). Separation and purification of biochemicals. In Encyclopedia of Physical science and Technology, Third edition. Academic press. 14(2): 651- 673. 81 Boschetti, E. (2002). Antibody separation by hydrofobic charge induction chromatography. Trends in Biothechnology, 20(8), 333-37. 82 Torres, Y. (1999). Obtención de anticuerpos contra Sticholisina I y II: dos citolisinas de la anemone d emar stochodactyla helianthus. Trabajo de Diploma. Facultad de Biologia. Universidad de la Habana.

83 Coindre, J.M. (2003) Immunohistochemistry in the diagnosis of soft tissue tumors. Histopathology, 43(1): 1-16.

84 Cuello, A.C. (1983). Immunochemistry. IBRO Handbook Series: Methods in the neurosciences. Vol 3. General Editor: A,D Smith, New York. Chaper 1: 1-46. 85 Sterberger, L.A. (1979). Immunocytochemestry. Ed 2. John Wiley and Sons, New York.

86 Kaczmarek E, Górna A, Majewski P. (2004). Techniques of image analysis for quantitative immunohistochemistry. Annales Academiae Medicae Bialostocensis 49(1):155- 158.

87 Duerr, J. S.(2006). Immunohistochemistry. Edited by Oliver Hobert. Worm Methods editor, Victor Ambros. http://www.wormbook.org. 88 Taylor, C.R., Cote, R.J. (1994). Immunomicroscopy: A diagnosis Tool for the Surgical Pathologist, 2nd ed. WB. Saunders Co., Philadelphia. 89 Corominas, J.M. (1992). Historia, concepto y utilidad de las tecnicas inmunohistoquímica. En: Cursos de técnicas inmunohistoquímica. Barcelona: Menanni Diagnotics: 2-30. 90 Bacchi, C.E., Grow, A.m., Bacchi M.M. (1994). Detection of infection disease agents in tissue by immunocytochemestry. Braz. J. Med. Biol. Res. 27(12): 2803-20.

77 91 Kyogashima, M., Inove, M., Isono, I., Nakayama, I. Seto, A. (1994). Monoclonal antibody E6G6 recognizes glycolipids as a differentiation antigen in Shope carcinoma cells. Cancer. Lett. 81(2): 221-228. 92 Godfraind, C., Langreth, S.G., Cardellichio, C.B., Knobler, R., Coutelier, J. P., Dubois, M., Holmes, K. V. (1995). Tissue and cellular distribution of an adhesion molecule in the carcinoembryonic antigen family that serves as a receptor for mouse hepatitis virus. Lab. Invest. 73(5): 615- 27. 93 DÓffay, J.M., ely, R.W., Baldwin, C. A., Whitenack, D. L., Stair, E. J., and Collins, J., K. (1995). Diabnostic of encephalitic bovine herpesvirus type 5(BHV- 5) infection in cattle: virus isolation and immunohistochemical detection of antigen in formalin- fixed bovine brain tissues. J. vet. Diagn. Invest. 7: 247- 251. 94 Oda, Y., Katsuda, S., Okada, Y., Okawahara, E., Ooi, A., Kawashima, A., Nakanishi, I. (1994). Detection of human cytomegalovirus, Epstein- Barr virus, and herpes simplex virus in diffuse interstitial prieumonia by polymerase chain reaction and immunohistochemestry. Am. J. Clin. Pathol. 102(4): 495- 502. 95 Solans, E.P., Garrity, E.R., Mc Cabe, M., Martinez, R. and Husain, A. N. (1995). Early diagnosis of cytomegalovirus pneumonitis in lung transplant patients. Arch. Pathol. Lab. Med. 119(1): 33-35. 96 Henin, D., Gervanz, E., Seilhean, D. (1995). Pathologic anatomy of cytomegalovirus encephalomyelitis. J. Neuroradiol. 22(3): 180-83. 97 Waggonar, S.e., Anderson, S. M., Luce, M. C., Herbst, A.L. (1995). Human papillomavirus detection and p53 expression in clear cell adenocarcinoma of the vagine and cervix. Obstet. Gynecol. 49(2): 230. 98 Huneycutt, B. S., Plakhov, I. V., Shusterman, Z., Bartido, S. M., Reiss, C.S., Aoki, C. (1994). Distribution of vesicular stomatitis virus protein in the brain of BALB/c mice following intranasal inoculation: An immunohistochemical analysin. Brain. Res. 28; 635(1-2): 81- 95. 99 Lerdthusnee, K., Romoser, W. S., Faran, M. E., Dohm, D. I. (1995). Rift valley fever virus in the cardia of culex pipiens: An immunocytochemical and ultraestructural study. Am. J. Trop. Med. Hyg. 53(4): 331-337.

78 100 Takase-Yoden, S. and Watanabe, R. (2001). Distribution of ecotropic retrovirus receptor protein in rat brains detected by immunohistochemistry. Journal of General Virology, 82: 1815–1820.

101 Zhang, Z., Andrews, G. A., Chard- Bergstrom, C., Minocha, H. C., Kapil, S. (1997). Application of Immunohistochemistry and In Situ Hybridization for Detection of Bovine Coronavirus in Paraffin-Embedded, Formalin-Fixed Intestines. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY. 35(11): 2964–2965.

102 Montes-Moreno, S., Roncador, G., Maestre, L., Martinez, N., Sanchez-Verde, L., Camacho, F.I., Cannata, J., Martinez- Torrecuadrada, J.L., Shen, Y., Chan, W.C., and Piris, M.A. (2008). Gcet1 (centerin), a highly restricted marker for a subset of germinal center-derived lymphomas. Blood 111, 351-358.

103 Nam-Cha, S.H., Roncador, G., Sanchez-Verde, L., Montes- Moreno, S., Acevedo, A., Domínguez-Franjo, P., Piris, M.A. (2008). PD-1, a follicular T-cell marker useful for recognizing nodular lymphocyte-predominant Hodgkin lymphoma. Am J Surg Pathol 32(8): 1252-1257.

104 Díaz-Alderete, A., Doval, A., Camacho, F., Verde, L., Sabin, P., Arranz-Sáez, R., Bellas, C., Corbacho, C., Gil, J., Perez- Martín, M., Ruiz-Marcellán, M., Gonzalez, L., Montalbán, C., Piris, M.A., Menarguez, J. (2008). Frequency of BCL2 and BCL6 translocations in follicular lymphoma: Relation with histological and clinical features. Leukemia Lymphoma 49(1): 95-101.

105 Vaccaro, C. A., Carrozzo, J. E., Mocetti, E., Berho, M., Valdemoros, P., Mullen, E., Oviedo, M., Redal, M. A. (2007). Expresión inmunohistoquímica e inestabilidad microsatelital en el síndrome de Lynch. MEDICINA (Buenos Aires); 67(3): 274-278.

106 Betensky, R. A., Nutt, C. L., Batchelor, T. T., Louis, D. N. (2005). Statistical Considerations for Immunohistochemistry Panel Development after Gene Expression Profiling of Human Cancers. Journal of Molecular Diagnostics, 7(2):276- 282.

79 107 Departamento de Virologia, Instituto de Medicina Tropical Pedro Kouri. (2007). Diagnóstico de Laboratorio. Curso teórico practico dengue y dengue hemorrágico. Los retos para su control. Laboratorio de Arbovirus.

108 Gearhart, P. J. (1993). Somatic mutation and affinity maduration. In: Paul, W. E.: Fundamental immunology. 3ed. Raven Press, new York: 865- 85.

109 Van Praet, M. (1982). Amylase and tripsin and chimotrypsin- like protease from Actina equine, their role in the nutrition of the sea anemone. Comp. Biochem. Physiol., 72a: 523.

110 Sencic, L., Macek, P. (1990). New method for isolation of venom from the sea anemone Actina cari. Purification and characterization of cytolytic toxin. Comparative Biochemestry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 97(4): 687- 693.

80