UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS GENÉTICOS VEGETAIS

OSCAR ALFONSO LOAIZA LOAIZA

CARACTERIZAÇÃO DO COMPORTAMENTO FISIOLÓGICO DE SEMENTES DE Eugenia uniflora L. SUBMETIDAS À DESSECAÇÃO

FLORIANÓPOLIS

2020

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Oscar Alfonso Loaiza Loaiza

CARACTERIZAÇÃO DO COMPORTAMENTO FISIOLÓGICO DE SEMENTES DE Eugenia uniflora L. SUBMETIDAS À DESSECAÇÃO

Dissertação submetida ao Programa de Pós- Graduação em Recursos Genéticos Vegetais da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do Grau de Mestre em Ciências: Recursos Genéticos Vegetais. Orientadora: Prof.a Dr.a Neusa Steiner

Florianópolis 2020

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Oscar Alfonso Loaiza Loaiza Caracterização do comportamento fisiológico de sementes de Eugenia uniflora L. submetidas à dessecação

O presente trabalho em nível de mestrado foi avaliado e aprovado por banca examinadora composta pelos seguintes membros:

Prof. Valdir Marcos Stefenon Universidade Federal de Santa Catarina

Prof. Paulo Tamaso Mioto Universidade Federal de Santa Catarina

Prof. Marcos Vinícius Marques Pinheiro Universidade Federal de Santa Catarina

Certificamos que esta é a versão original e final do trabalho de conclusão que foi julgado adequado para obtenção do título de mestre em Ciências: Recursos Genéticos Vegetais

______Prof. Dr. Cláudio Roberto Fonseca Sousa Soares Coordenador do Programa

______Prof. Dra. Neusa Steiner Orientadora

Florianópolis, 20 de fevereiro de 2020

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Este trabalho é dedicado aos meus amados pais, aos meus irmãos, ao meu sobrinho, a minha avó (in memoriam), e a todas aquelas pessoas que acreditaram em mim e nas minhas capacidades brindando suas palavras de apoio.

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AGRADECIMENTOS

São muitas as pessoas que gostaria agradecer pelos suportes recebidos: Econômicos, acadêmicos, intelectuais, espirituais e ou emocionais. Tudo o tempo compartilhado comigo semeou uma semente no meu interior, algumas foram mais difícil de aprender a cuidar, algumas outras já germinaram e se encontram crescendo e se desenvolvendo. Mas com certeza, todos têm me deixado grandes lições de vida que me acompanharão até a senescência da minha existência. No primeiro local, quero agradecer a Deus pela oportunidade de viver dois anos maravilhosos de aprendizagens e erros valiosos que marcaram minha vida. E no segundo ponto, quero agradecer ao povo brasileiro por me acolher como um mais e me brindar oportunidades de crescimento pessoal e profissional ainda quando não estiveram no seu melhor momento. Espero poder lhes retornar todas essas oportunidades num futuro próximo. Quero agradecer aos meus pais, Clara e Alfonso, pela sua compreensão e apoio garantido na cada uma das minhas aventuras até hoje, obrigado pelo conforto na distância, o suporte econômico quando foi necessário, por me transmitir confiança a traves dos seus olhares e cada uma das suas palavras, por desejar sempre as melhores coisas para nós, pelos seus sacrifícios e esforços que espero retornar vocês. Graças aos meus irmãos: Johan, Fredy e Duban, por ficar sempre presentes na distância e apoiar moralmente as minhas lutas. Ao Thomas, meu amado sobrinho, porém, mais do que agradecer, preciso pedir seu perdão pela ausência, por me perder da sua infância estando longe dele, prometo não fazer de novo e lhe agradecer pessoalmente com companhia e tempo de qualidade. Obrigado também aos meus amigos por me enviarem boas energias desde os seus diferentes lugares desde o primeiro momento que contei para vocês meus planos e os meus sonos em terras brasileiras: Lizeth, Diana, Sebastian, Dona Mary e todos os membros do grupo dos cavalos VIP. Também merecem um agradecimento muito especial meus colegas do laboratório pelo auxílio, compreensão, apoio e risadas quando foram necessárias. Daniela Goeten e Danielle da Silva, vocês merecem um reconhecimento maior pela ajuda, apoio incondicional, entrega e autenticidade para comigo, são realmente duas pessoas muito valiosas. Quero agradecer à AGROSAVIA e todas as pessoas que laboraram comigo na minha instituição pelo tempo outorgado para ser empregar no mestrado, por todos os ensinos nos últimos anos e todos aqueles mais que virão no futuro. Obrigado aos meus chefes e exemplos de trabalho e dedicação: Clarita, Dr. Rafael, Dr. Silvio. Vocês sempre serão a referência do trabalho de um pesquisador comprometido, honesto e lutador. Dona Mariela merece um espaço nesta página pelo seu

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apoio e conversas sinceras nos nossos momentos de descanso e por sempre escutar com paciência e compreensão ao um amigo cansado. Aos meus colegas de moradia, especialmente ao Luan e o Junior pelo tempo, datas especiais e as lições de vida compartilhadas. Ao Junior pela sua sempre disposição de compartilhar desde um lanche ou a limpeza do apartamento até uma conversa sem final, e ao Luan pela confiança, as risadas e por ser o referente de disciplina, convicção, e paixão pelo trabalho. Obrigado a todo o povo colombiano residente em Florianópolis pela solidariedade e desejos de transformação do nosso país. Agradeço por me acolher. Obrigado a Universidade Federal de Santa Catarina, os funcionários e aos professores do programa pela sua sempre ótima disposição. Ao programa SAPSI de apoio psicológico da UFSC por ter me recebido de brazos abertos quando precisei dos seus serviços. Aos laboratórios e pessoal de LFDGV, LAVEG e Lameb pelo apoio nas diferentes atividades realizadas em cada um deles. Por último, e não menos importante, quero agradecer especialmente ao programa de fomento à pesquisa científica do Brasil, CAPES, pela bolsa concedida, e a minha Orientadora, Professora Neusa Steiner, pela paciência, pela oportunidade brindada e por me mostrar o melhor caminho a seguir.

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“Los locos dan festines, y los cuerdos son los invitados; Los locos viven inventando mundos, y los cuerdos viven en mundos inventados Los locos crean castillos, y los cuerdos los habitan; Los locos son mitad cielo y mitad tierra, los cuerdos son sólo tierra; Los locos crean la música, los cuerdos sólo la escuchan; Los locos son personajes, los cuerdos son actores; Los locos son la pintura, y los cuerdos sólo pintan; Los locos son poesía, y los cuerdos quienes redactan; Los locos viven en muchos mundos, y los cuerdos sólo viven en la tierra; Los locos nos sentimos libres, y los cuerdos… nos encierran”

(Andrea Montiel Rimoch, En favor de la locura, 1984)

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RESUMO

Brasil tem cerca de 3000 espécies do gênero Eugenia. Essas espécies apresentam baixo número de sementes por fruto, e são classificados como sensíveis à dessecação. A compreensão do comportamento das sementes durante o armazenamento é importante para a conservação das espécies nativas, no entanto, a maioria das sementes tropicais são sensíveis à dessecação o que dificulta a conservação ex situ pelos métodos tradicionais. A pitangueira (Eugenia uniflora L.), espécie nativa tropical da mata atlântica com importância ecológica e socioeconómica, possuem sementes sensíveis à dessecação e poucos esforços têm sido realizados para a conservação da espécie. Assim, este trabalho teve por objetivo avaliar a tolerância à dessecação das sementes de E. uniflora a partir de aspectos fisiológicos e bioquímicos, a fim de propor estratégias para armazenamento das sementes. Sementes de E. uniflora foram coletadas em duas populações em Florianópolis (27° 34’ 01.9” S e 48° 25’ 40.7” W), Santa Catarina – Brasil. O conteúdo inicial de água foi estimado e as sementes foram dessecadas em sílica gel a 27 °C até atingirem os seguintes conteúdos de água (CA): 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% e 5%. Para determinar a viabilidade das sementes foram avaliados: Ìndice de velocidade de germinação (IVG), e testes de tetrazólio e condutividade elétrica. Sementes com tegumento íntegro, o processo da dessecação levou 1327 horas até atingir 5% CA, enquanto, sementes com tegumento danificado levaram 216 horas. As sementes de E. uniflora perderam a viabilidade entre 40% e 30% CA. No entanto, o teste de tetrazólio demostrou 5% de sementes viáveis com 10% CA. Para o IVG foram observados valores de 1,72 e 0,90 para 50% e 40% CA, respectivamente e somente nestes tratamentos houve germinação superior a 50%. Os valores de condutividade elétrica não apresentaram diferença significativa entre tratamentos. O conteúdo de Espermedina (Spd) decresceu junto à redução do CA nas sementes, enquanto o conteúdo de Espermina (Spm) aumentou. Os nossos resultados sugerem papel importante da Spd na sinalização da germinação das sementes de E. uniflora, quando submetidas ao déficit hídrico durante a dessecação. Este trabalho provê importante informação para futuros estudos sobre o papel das poliaminas na conservação das sementes sensíveis à dessecação. No longo prazo, as poliaminas poderiam se tornar uma opção viável para induzir a tolerância à dessecação, e assim conseguir armazenar as sementes sensíveis para garantir mais uma estratégia de conservação ex situ.

Palavras-Chave: Tolerância à dessecação. Pitanga. Poliaminas. Anatomia de semente. Myrtaceae.

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ABSTRACT

Brazil has about 3000 species of gender Eugenia. These species are known for having few seeds in the fruit and not being desiccation tolerant. Seed behavior during storage is important for the conservation of native species. Most tropical seeds are desiccation sensitive and this is a bottleneck for the ex situ conservation of biodiversity by traditional methods. Pitangueira (Eugenia uniflora L.) is a tropical species native to the Brazilian Atlantic Forest with ecological and socioeconomically importance, which presents desiccation sensitive seeds and little effort has been made to conserve them. This work had the objective of evaluating the desiccation tolerance of E. uniflora seeds through physiological aspects and biochemical analysis, aiming to improve seed storage. Seeds of E. uniflora were collected in two natural populations in Florianópolis (27º 34’ 01.9’’ S and 48º 25’40.7’’ W), Santa Catarina – Brazil. The initial water content was calculated and for evaluation of desiccation tolerance, seeds were dried in silica gel at 27ºC until they reach a water content (WC) of 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% and 5%. Germination speed index (GSI), tetrazolium and electric conductivity test were performed to determine the seed viability. In seeds with intact tegument, desiccation process took 1327 hours until reach 5% of WC, while in seeds with damaged tegument it took 216 hours. E. uniflora seeds lose germination capacity between 40 and 30% WC, but the tetrazolium test demonstrated 5% of viability in seeds with 10% WC. GSI was different between 50 (1.72) and 40% (0.90) of WC and only in these treatments the germination was above 50%. The electric conductivity values did not present statistical differences between treatments. The endogenous content of Putrescine (PUT) also was not statistically different between treatments, but spermidine (SPD) content decreased together with reduction of seeds WC. However, spermine (SPM) content increased when seed’s WC reduced. Our results suggest that Spd is a key factor for regulating E. uniflora seed germination. While Spm could be associated with desiccation tolerance. This work may provide useful insights for further studies about the polyamines’ role in the Atlantic forest seeds desiccation and conservation. In the future, polyamines could become a viable option to induce desiccation tolerance, and thus be able to store sensitive seeds to ensure another ex situ conservation strategy.

Keywords: Desiccation Tolerance. Pitanga. Polyamines. Seed anatomy. Myrtaceae.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Características taxonômicas de E. uniflora...... 15

Figura 2 – Comportamento fisiológico dos tratamentos de dessecação em sementes de E. uniflora...... 27

Figura 3 – Características fisiológicas avaliadas em sementes de E. uniflora submetidas a dessecação ...... 29

Figura 4 – Reação ao teste de tetrazólium das sementes de E. uniflora submetidas à dessecação...... 31

Figura 5 – Conteúdo endógeno de Poliaminas (PAs) em sementes de E. uniflora dessecadas...... 32

Figura 6 – Curvas de dessecação de sementes de E. uniflora...... 34

Figura 7 – Sequência de dano mecânico no tegumento da semente dessecadas de E. uniflora...... 35

Figura 8 – Sementes de E. uniflora com o tegumento integro...... 36

Figura 9 – Características morfoanatômicas de sementes de E. uniflora...... 38

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ABA Ácido Abscísico ATO Azul de Toluidina CA Conteúdo de Água CBB Coomasie Brilliant Blue (Azul Brilhante de Coomasie) CCA Centro de Ciências Agrárias CE Condutividade Elétrica HPLC High Performance Liquid Chromatography (Cromatografia Liquida de Alta Eficiência) IVG Índice de Velocidade de Germinação LEAs Late Embryogenesis Abundant Proteins MF Massa Fresca MS Massa Seca PAS Periodic Acid Schiff (Ácido Periódico de Schiff) PAs Poliaminas PS Peso Seco PU Peso Úmido Put Putrescina SF Semente Fresca Spd Espermedina Spm Espermina TMG Tempo Médio de Germinação UFSC Universidade Federal de Santa Catarina

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA ...... 14 1.1. Eugenia uniflora L. (MYRTACEAE) ...... 14 1.2. SEMENTES SENSÍVEIS À DESSECAÇÃO ...... 17 1.3. POLIAMINAS (PAs) ...... 19 2. OBJETIVOS ...... 20 2.1 OBJETIVO GERAL ...... 20 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...... 20 3. MATERIAL E MÉTODOS ...... 21 3.1. MATERIAL VEGETAL ...... 21 3.2. BENEFICIAMENTO DO MATERIAL VEGETAL ...... 21 3.3. DETERMINAÇÃO DO CONTEÚDO DE ÁGUA E DESSECAÇÃO DAS SEMENTES ...... 21 3.4. TESTE DE GERMINAÇÃO ...... 23 3.5. EMBEBIÇÃO ...... 23 3.6. CONDUTIVIDADE ELÉTRICA ...... 23 3.7. ÍNDICE DE VELOCIDADE DE GERMINAÇÃO (IVG) ...... 23 3.8. TEMPO MÉDIO DE GERMINAÇÃO (TMG) ...... 24 3.9. TESTE DE REAÇÃO DE TETRAZÓLIO ...... 24 3.10. DESCRIÇÃO DA DESSECAÇÃO DAS SEMENTES ...... 24 3.11. MICROSCOPIA DE LUZ ...... 25 3.12. QUANTIFICAÇÃO DE POLIAMINAS ...... 25 3.13. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E ANÁLISES ESTATÍSTICAS...... 25 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 26 4.1. RESPOSTA FISIOLÓGICA DAS SEMENTES SUBMETIDAS À DESSECAÇÃO ...... 26 4.2. RELAÇÃO DAS POLIAMINAS COM A TOLERÂNCIA A DESSECAÇÃO EM SEMENTES DE E. uniflora...... 32 4.3. DANOS NO TEGUMENTO DURANTE A DESSECAÇÃO ...... 34 4.4 MUDANÇAS ANATÔMICAS NAS SEMENTES OCASSIONADAS PELA DESSECAÇÃO ...... 36 5. CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS FUTURAS ...... 40 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 42

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1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA

1.1. Eugenia uniflora L. (MYRTACEAE)

A família Myrtaceae se encontra representada com 23 gêneros no Brasil (Landrum & Kawasaki, 1997) sendo um dos grupos taxonômicos com maior distribuição no mundo. O gênero Eugenia possui cerca de 400 espécies, com aproximadamente uma terço das espécies compreendida nesta família, e no continente americano se pode encontrar do México a Argentina (Johnson & Briggs, 1984; Simões et al 2018, Stefanello et tal, 2011). O Brasil possui aproximadamente 297 espécies nativas de plantas do gênero Eugenia (“Flora do Brasil” 2018), sendo estas de grande importância pelas características que apresentam em termos das potencialidades do uso e aproveitamento na economia pelos usos farmacológicos baseados nas características nutricionais e agroindustriais (Sardi et al 2017). Além disso, a maioria das plantas são frutíferas, as que fornecem alimento para homens, animais e pássaros especialmente, o que representa uma importância ecológica significativa para os ecossistemas onde elas se encontram. Os frutos das espécies do gênero Eugenia são ricos em óleos essenciais e taninos (Lunardi et al 2001), minerais e compostos ativos como fenóis, carotenoides, antocianinas, açúcares, fibras e vitaminas (de Souza et al 2018). Estes compostos bioativos têm ganhado importância, por serem considerados agentes antioxidantes, anti-inflamatórios, antidiabéticos, antigenotóxicos, antimutagénicos, antihiperglicémicos, antinociceptivo e gastroprotetivo (Basting et al 2014, Dametto et al 2017, Li et al 2017). A Eugenia uniflora L. é conhecida popularmente como pitangueira, e também é chamada de pitanga, pitangueira-vermelha, pitanga-mulata, nangapiré, pitanguero, surinam- cherry e cayenne-cherry (Vignale, Jocholon, Cabrera 2018). E. uniflora é um arbusto denso 2 – 4 m que pôde-se encontrar como uma pequena árvore 6 – 9 m ramificada (Figuras 1A, 1B) e tem raízes profundas e abundantes (Vignale, Jocholon, Cabrera 2018; Bourscheid et al 2011). As folhas de E. uniflora são opostas, simples, de pecíolo curto, membranáceas, elípticas, as vezes são coriáceas, têm um aroma próprio e particular que emana quando as folhas são esmagadas e que diferença a espécie das outras mirtáceas, apresentam coloração verde intensa brilhante quando estão maduras e menor intensidade quando são folhas novas (Figura 1C) (Vignale, Jocholon, Cabrera 2018; Bourscheid et al 2011). Além, E. uniflora é uma espécie semidecídua (Figura 1B) (Bourscheid et al 2011) e semidecidual ou decidual em regiões com muito frio (Vignale, Jocholon, Cabrera 2018; Bourscheid et al 2011).

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Figura 1 – Características taxonômicas de E. uniflora.

A) Arbusto no campus Trindade da UFSC - Florianópolis, B) Arbusto com inflorescências no campus Trindade da UFSC - Florianópolis, C) Folhas e flor em estádio de antese, D) Frutos maduros (vermelhos) e imaturos (verdes e laranjas) de E. uniflora (maturação asincrônica), E) Frutos, F) Sementes frescas.

As flores são hermafroditas, podem ser solitárias ou fasciculadas, tem pedúnculos compridos 2 – 3 cm, possuem corolas brancas com quatro pétalas, livres, têm estambres numerosos e os ovários podem ter vários óvulos que dão origem até três sementes (Figura 1C) (Vignale, Jocholon, Cabrera 2018; Bourscheid et al 2011). O fruto é uma baga globosa deprimida nos pólos que tem como característica sete a dez sulcos marcados longitudinalmente, o epicarpo dos frutos é de cor vermelha e até quase preto quando maduros, porém, muda sua coloração durante o processo de desenvolvimento ou maturação passando do verde quando imaturos para o amarelo, alaranjado, vermelho e finalmente vermelho escuro (Vignale, Jocholon, Cabrera 2018; Bourscheid et al 2011). Possuem um sabor doce ácido e aroma forte e característico (Bourscheid et al 2011), e uma polpa de cor vermelha intensa que pode pintar ou corar (Vignale, Jocholon, Cabrera 2018). As sementes podem variar o tamanho são globosas e achatadas, o tegumento tem uma coloração verde clara e é bastante aderente ao embrião (Bourscheid et al 2011), e o número pode variar desde frutos que não possuem até frutos com uma, dois ou três sementes (Vignale, Jocholon, Cabrera 2018). E. uniflora apresenta variados utilidades nas áreas farmacológicas, ornamentais, perfumaria e cosméticos, alimentação, além do uso na agricultura como na recuperação de áreas degradadas e no pastoreio de abelhas (Bourscheid, 2011). As folhas possuem óleos essenciais que são usados para elaborar e comercializar cosméticos devido ao aroma e propriedades

CONFERE COM ORIGINAL, cópia extraída de documento original de acordo com o Art. 5º do Decreto nº 83.936/79 16 adstringentes (Amorimb et al, 2009), e o comércio dos frutos é feito principalmente após processamento devido à alta fragilidade e pericibilidade (Bourscheid, 2011), que na indústria podem ser aproveitados no consumo fresco em sucos, geleias e sorvetes (Denardin et al, 2015, Franzon et al 2018) Nas sementes tem sido descrito a presença de quercista e compostos derivados do ácido elágico, dentro outros (Oliveira et al, 2014). Também, se têm utilizado extratos das sementes de E. uniflora para enriquecer formulações alimentícias com compostos como monoterpenos e antioxidantes (Franzon et al, 2018; Oliveira et al, 2006). A Embrapa Clima Temperado tem desenvolvido pesquisas relacionadas à conservação e promoção do uso desta espécie, com estudos sobre a enxertia na propagação dela visando alternativas diferentes para conservação (Franzon et al 2013). Como estratégia de conservação da espécie, Crizel et al (2007) propuseram a produção de mudas por sementes das espécies frutíferas nativas do sul do Brasil, e entre estas a E. uniflora, uma das espécies do gênero Eugenia mais estudadas (de Souza et al 2018). No entanto, a grande maioria dos esforços de pesquisa realizados com E. uniflora estão restritos as áreas de alimentos e fármacos para estudar as propriedades químicas das diferentes estruturas como folhas e frutos principalmente. Surpreendentemente, em termos de conservação de sementes, poucos estudos estão sendo feitos para propagar e armazenar as sementes desta espécie, uma vez que tem ampla distribuição, em um ecossistema altamente antropizado. Mesmo com estas características, a semente foi classificada como sensível à dessecação a partir de 45% do conteúdo de água (Delgado & Barbedo.2007), o que inviabiliza armazenamento por métodos convencionais. Tanto para uso e conservação de uma espécie como E. uniflora com elevado potencial econômico, estudar o grau de tolerância à dessecação e o comportamento fisiológico das sementes é essencial considerando a representatividade desta espécie em um dos hotspots de biodiversidade, porque poderia servir como modelo para estudar a tolerância a dessecação no gênero Eugenia e, assim gerar dados para o manejo e conservação de E. uniflora e mais outras espécies do mesmo gênero no bioma da Mata Atlântica com base na sua fisiologia e metabolismo, visando gerar ferramentas para auxiliar programas de melhoramento genético e facilitar a conservação ex situ da espécie a través de bancos de germoplasma por apresentar sementes sensíveis à dessecação (Delgado & Barbedo.2007).

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1.2. SEMENTES SENSÍVEIS À DESSECAÇÃO

A semente é uma estrutura vegetal que protege e mantem o embrião para sobreviver durante a maduração e até o estabelecimento das plântulas que garantirão gerações futuras de novos indivíduos (Koornneef, 2002). Antigamente, os autores definiram três categorias ou tipo de sementes relacionadas às técnicas de armazenamento, como é o caso das que correspondem a ortodoxas, intermediárias e recalcitrantes (Roberts, 1973; Ellis et al, 1990), termos que atualmente estão em desuso no contexto científico porque agora são empregados os termos tolerante ou sensível à dessecação segundo o grau que é possível tolerar. Inicialmente, foram definidos dois tipos de sementes classificadas de acordo com a capacidade de conservar a viabilidade após desidratação (Ellis et al 1990; Barbedo & Filho, 1998). As sementes do tipo recalcitrante geralmente são sensíveis à dessecação, não sobrevivem ao armazenamento em condições secas nem toleram baixas temperaturas (<15 °C), são de maior tamanho, têm embrião pequeno e o processo de secagem nelas é divagar e sem repouso metabólico (Marques, 2018) sendo que as sementes tolerantes se comportam de forma contrária às sensíveis (Marques, 2018), e depois foram definidas as sementes intermediárias como aquelas que se comportam como ortodoxas, mas com menor tolerância à dessecação (Ellis et al, 1990; Barbedo & Filho, 1998). O processo de formação das sementes inicia com a divisão celular, e segue com a expansão celular, sínteses e acúmulo de reservas e matéria seca, finalizando com a etapa de dessecação, sendo que a última etapa só ocorre em sementes tolerantes à dessecação (Delmondez et al, 2004). Sementes sensíveis não passam pelos estágios finais de desidratação observado nas sementes tolerantes (Pammenter & Berjak 2014). Os mecanismos pelos quais as sementes perdem viabilidade durante a secagem e/ou armazenamento ainda não estão totalmente compreendidos (Delahaie et al. 2013), mas aparentemente espécies sensíveis não possuem, ou não realizam, os processos necessários para a aquisição da tolerância à dessecação (Berjak & Pammenter 2013). A alta atividade metabólica das sementes, bem como a ausência de “Late Embryogenesis Abundant Proteins – LEAs” são fatores preponderantes para a sensibilidade à dessecação (Farrant et al. 1997). Além disso, é provável que outros mecanismos de proteção sejam ineficientes ou ausentes, como proteção antioxidante, açúcares não redutores e proteínas heat shock (HSPs) (Berjak & Pammenter 2013; Delahaie et al. 2013). A taxa de desidratação de uma semente sensível é influenciada pelo seu tamanho, natureza de seu revestimento e estádio de desenvolvimento (Berjak & Pammenter 2008).

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A dessecação é o processo de perda de água nos tecidos das sementes (Berjak & Pammenter 2013). Ademais, Farrant et al. (1997) sugerem que os tecidos de uma mesma semente podem divergir quanto a tolerância à dessecação, uma vez que tecidos distintos apresentam características que indicam maior ou menor sensibilidade. Por isso, as plantas desenvolveram uma estratégia de resposta para que as sementes não percam a viabilidade, conhecida como a tolerância à dessecação. Esta tolerância pode ser entendida como a habilidade de sobreviver à remoção de todo, ou quase todo, conteúdo de água intracelular sem que ocorram danos irreversíveis, como por exemplo mudanças na estrutura das células, especialmente membrana celular e estresses oxidativos acumulativos (Leprince & Buintink 2010). A tolerância à dessecação pode ser influenciada por fatores tais como o estádio de desenvolvimento do embrião, conteúdo de umidade, tempo de armazenamento da semente e temperatura de secagem para algumas espécies (Farrant, 1997), e relacionadas também as taxas do metabolismo (Farrant et al, 1985) e ao número de vacúolos no interior da célula. Outro fator que influencia a viabilidade é a maneira como ocorre a desidratação (lenta ou rápida). A desidratação lenta faz com que as células fiquem em um estágio “intermediário” por mais tempo e, como são metabolicamente ativas, ocorre acúmulo de danos oxidativos relacionados ao metabolismo durante esse período (Berjak & Pammenter 2013). Portanto, a desidratação rápida (flash drying) é uma das estratégias empregadas para que a semente tolere teores de água mais baixos sem perder a viabilidade. As espécies tolerantes à dessecação dispõem de uma gama de processos e mecanismos capazes de beneficiar e proteger as células quanto às intempéries de estresses abióticos, como é o caso do estresse hídrico por dessecação. Dentre estes destaca-se alguns compostos bioquímicos de reserva das sementes, como é o caso dos açúcares oligossacarídeos específicos e as denominadas proteínas LEAs (Delmondez, 2004; Leprince & Buitinik 2010). Estas proteínas são compostos hidrofílicos termoestáveis que aportam a proteção osmótica com a vitrificação (Berjak & Pammenter 2008), um acúmulo de solutos compatíveis que não interferem com a estrutura nem com a função celular impedindo a formação de cristais de gelo (Hoekstra, 2001), e como consequência, a menor fluidez do citoplasma provoca o declínio da capacidade metabólica da célula, também limitando a migração de radicais livres e de espécies reativas de oxigênio (ROS) (Berjak & Pammenter 2013). A relativa estabilidade celular provida pela vitrificação é o mecanismo pelo qual sementes tolerantes à dessecação mantém a viabilidade com baixos teores de água (Berjak & Pammenter 2008). Entretanto, devido à

CONFERE COM ORIGINAL, cópia extraída de documento original de acordo com o Art. 5º do Decreto nº 83.936/79 19 complexidade do controle genético destas estratégias, os fatores relativos à aquisição da tolerância à dessecação ainda estão sendo elucidados (Berjak & Pammenter 2008).

1.3. POLIAMINAS (PAs)

As PAs são moléculas derivadas dos aminoácidos e possuem função regulatória em vários processos fisiológicos, como divisão celular, embriogênese, organogênese, crescimento do tubo polínico, alongamento e floração do caule, crescimento radicular, desenvolvimento de tubérculos, desenvolvimento dos frutos, senescência e na sinalização de resposta aos estresses (Tiburcio el tal 2014, Podwyszynska et al 2015). Além, estão envolvidas na adaptação ao estresse desempenhando funções na regulação osmótica, na estabilidade das membranas e na eliminação de radicais livres, atuando como antioxidantes (Liu et al 2016), não entanto, a função das PAs em plantas e sementes ainda não é muito bem conhecida (Podwyszynska et al, 2015). As PAs mais comuns e mais estudadas são três: Putrescina (Put), Espermedina (Spd) e Espermina (Spm), e os aminoácidos arginina e ornitina são os precursores da Put, a Spm é sintetizada a partir da Spd, e a Spd é sintetizada da Put. Porém, elas podem ser Inter convertidas entre si (Alcázar et al, 2010) e podem ocorrer de forma livre, conhecidas como as PAs solúveis, ou podem se ligar a macromoléculas (solúveis em ácido) (Urano et al, 2003). Nas plantas, as PAs são encontradas em tecidos de ativo crescimento pelo que são consideradas reguladores de crescimento (Kaur-Sawhney et al 2003) e nas sementes são produzidas no embrião atuando no seu desenvolvimento (Urano et al 2005). Também atuam na fase de maturação das sementes em resposta ao processo de tolerância a dessecação e elevada salinidade (Urano et al 2005), e contra estresses abióticos de temperatura, salinidade, seca, oxidativo e mecânico (Gupta et al 2013). Podem atuar como sinalizadoras de processos hormonais como a regulação do ácido abscísico (ABA) (Alcázar et al 2010). Estes estudos, indicam que as PAs podem desempenhar um papel importante com efeitos potenciais na utilização em sementes sensíveis a dessecação. Porém os estudos em sementes nativas sensíveis à dessecação ainda são incipientes, com a exceção do Laboratório de Fisiologia Vegetal da Universidade Federal de Santa Catarina que vem trabalhando visando entender a relação das PAs com a sensibilidade à dessecação em sementes de espécies nativas da família Myrtaceae. Neste sentido foram estudadas as características fisiológicas,

CONFERE COM ORIGINAL, cópia extraída de documento original de acordo com o Art. 5º do Decreto nº 83.936/79 20 bioquímicas e morfológicas das sementes de E. uniflora submetidas à dessecação e as relações existentes das PAs com estas características.

2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Estudar as caraterísticas morfofisiológicas das sementes de Eugenia uniflora quanto à tolerância à dessecação.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Estudar a viabilidade e o vigor das sementes de E. uniflora submetidas a dessecação;  Quantificar e qualificar o conteúdo endógeno de poliaminas em sementes de E. uniflora submetidas a dessecação;  Determinar os fatores que afetam a tolerância à dessecação em sementes de E. uniflora a partir do comportamento fisiológico relacionado ao vigor e viabilidade  Estudar e identificar as modificações de tecidos e células de sementes de E. uniflora submetidas à dessecação e sua relação com a tolerância à dessecação.

CONFERE COM ORIGINAL, cópia extraída de documento original de acordo com o Art. 5º do Decreto nº 83.936/79 21

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. MATERIAL VEGETAL

Em todos os experimentos foram utilizados frutos maduros de E. uniflora (Figura 1D) coletados ao acaso em aproximadamente 50 plantas em duas populações naturais no município de Florianópolis (27º 34’ 01.9’’ S, 48º 25’40.7’’ W), Santa Catarina, Brasil, entre os meses de janeiro e abril de 2019, sendo armazenados em sacolas de plástico na geladeira e após submetidos ao beneficiamento.

3.2. BENEFICIAMENTO DO MATERIAL VEGETAL

No início dos experimentos as sementes foram separadas da polpa do fruto mecanicamente com auxílio de multiprocessador e submetidas a dessecação de imediato. Não obstante, observou-se durante a dessecação que a grande maioria das sementes tinham danos mecânicos sob o tegumento ocasionados pelo multiprocessador que não eram perceptíveis ao olho humano quando as sementes estavam frescas. Pelo anterior, se decidiu iniciar novamente os experimentos e separar as sementes do fruto manualmente com auxílio de uma peneira sob água corrente para evitar danificar as sementes e, aquelas que foram evidenciadas com danos ou com presença de insetos e/ou danos associados com insetos foram descartadas. Além disso, com o propósito de padronizar as unidades experimentais para diminuir o erro experimental foi avaliado diâmetro na parte média das sementes pela grande variação de tamanhos de frutos e sementes encontrada nas populações. Aquelas sementes menores de 1,9 cm e maiores de 3,08 cm de diâmetro foram descartadas e não empregadas nos experimentos. Após beneficiamento, as sementes foram dessecadas, depois foram desinfestadas por imersão em solução de hipoclorito de Sódio (1%, v/v) durante 5 minutos e logo lavadas em água corrente para finalmente avaliar a germinação.

3.3. DETERMINAÇÃO DO CONTEÚDO DE ÁGUA E DESSECAÇÃO DAS SEMENTES

Para quantificar o conteúdo de água inicial das sementes de E. uniflora, quatro repetições de 10 sementes, escolhidas aleatoriamente, foram submetidas ao método da estufa a 105 ± 3 °C por 24 horas (Brasil, 2009). As sementes foram pesadas em balança de precisão

CONFERE COM ORIGINAL, cópia extraída de documento original de acordo com o Art. 5º do Decreto nº 83.936/79 22 antes e depois da secagem para obter o peso úmido (PU) e o peso seco (PS), respetivamente. Com os valores obtidos foi calculado o conteúdo de água nas sementes em massa úmida -1 (%H2O) e massa seca (g H2O g PS).

-1 MF: [(PU – PS)/PU]*100 = % H2O MS: [(PU – PS)/PS] = g H2O g PS (1) Onde: MF = Massa fresca; MS = Massa seca; PU = Peso úmido; PS = Peso seco

As sementes foram dessecadas em recipientes fechados na presença de sílica gel (granulometria de 1 – 4 mm) sob temperatura ambiente 27 °C até atingirem os conteúdos de água (CA) desejados para cada um dos tratamentos: 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% e 5%, o tratamento controle correspondeu à percentagem do conteúdo de água inicial, ou seja, de sementes frescas. Para isto, foi utilizado como referência o conteúdo de água determinado nas sementes frescas pelo método da estufa, seguindo metodologia de Hong & Ellis (1996). Após este processo, as sementes foram dispostas sobre tela 3 cm acima da sílica gel que foi trocada cada 24 horas, e para controlar e verificar o processo da dessecação as sementes foram pesadas em balança de precisão de hora em hora até as primeiras 24 horas 4 repetições de amostras compostas por 15 sementes cada para calcular a dessecação partindo do conteúdo de água inicial em massa fresca. Depois das primeiras 24 horas, as sementes foram pesadas cada 24 horas. Com os dados obtidos foi calculada a dessecação e construída a curva.

CA: MF – {[(Pi – Pn)/Pi]*100} = % H2O (2) Onde: CA = Conteúdo de Água MF = Conteúdo de Água inicial em massa fresca Pi = Peso inicial Pn = Peso control

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3.4. TESTE DE GERMINAÇÃO

Depois da dessecação e da desinfestação as sementes foram submetidas ao teste de germinação em papel germitest (Brasil, 2009). Foram utilizadas quatro repetições de 20 sementes. As sementes foram mantidas em câmara de germinação tipo BOD, com 25± 2°C, 80% de umidade relativa e fotoperíodo de 12 horas, sendo consideradas germinadas quando o comprimento da radícula foi de 3 mm e a contagem foi realizada diariamente durante 40 dias.

3.5. EMBEBIÇÃO

Para analisar a dinâmica de absorção de água das sementes foi feita uma curva inicial de embebição utilizando quatro repetições de 25 sementes as quais foram pesadas e colocadas para embeber em rolos de papel germitest saturados com água até 2,5 vezes o peso do papel seco, e mantendo em câmara BOD sob as condições descritas no ítem 3.4.. As amostras foram pesadas de 15 em 15 minutos durante as primeiras 4 horas, depois foram pesadas de uma em uma hora até as 12 horas, e em seguida a cada 6 horas até as 24 horas, e finalmente foram pesadas a cada 24 horas durante 10 dias até a germinação de 51% das sementes. Para a determinação do incremento de massa, se realizou a metodologia proposta por Justo et al. (2007) e Davide et al.(2011).

3.6. CONDUTIVIDADE ELÉTRICA

O teste de condutividade elétrica foi realizado com quatro repetições de 15 sementes cada. Elas foram pesadas e colocadas para embeber em copos plásticos contendo 50 ml de água deionizada e mantidos a 25°C, sendo avaliada a cada duas horas durante 12 horas a condutividade elétrica com o auxílio do condutivímetro Lutron CD-4303, e os valores foram expressos em μS.cm-1.g-1 (Mastriani 2019).

3.7. ÍNDICE DE VELOCIDADE DE GERMINAÇÃO (IVG)

O teste de germinação foi realizado com quatro repetições de 20 sementes cada. Diariamente foram realizadas revisões das sementes germinadas, considerando-se como germinadas aquelas com protrusão radicular. Os resultados foram expressos em porcentagem de sementes germinadas e calculou-se o IVG segundo Maguire (1962):

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IVG=G1/N1+G2/N2+...Gn/Nn (3)

Onde: G1, G2, Gn são o número de sementes germinadas e N1, N2, Nn o número de dias no teste.

3.8. TEMPO MÉDIO DE GERMINAÇÃO (TMG)

Foi calculado conforme Magalhães (2004), com base no número de sementes germinadas (G) em cada avaliação multiplicado pelo respectivo tempo, dividido o resultado pelo número total de sementes germinadas ao final do teste. Avaliação feita com quatro repetições de amostras de 20 sementes cada.

3.9. TESTE DE REAÇÃO DE TETRAZÓLIO

O teste de viabilidade das sementes foi realizado sob um total de 60 sementes por tratamento com quatro repetições de 15 sementes pré-umedecidas por 12 horas e abertas longitudinalmente depois da hidratação. Elas foram embebidas durante 2 horas a 25 °C em 2,3,5-trifeniltetrazólio a 0,05% e mantidas no ambiente escuro segundo Kaiser (2014). Posteriormente, elas foram classificadas em viáveis ou inviáveis de acordo com a coloração em áreas essenciais ao crescimento. A percentagem de viabilidade (PV) das sementes foi obtida pelo cálculo da razão PV = (número de sementes viáveis / número total de sementes) x 100.

3.10. DESCRIÇÃO DA DESSECAÇÃO DAS SEMENTES

Para este experimento foram aproveitados os dados obtidos na primeira curva de dessecação feita com as sementes que foram danificadas no multiprocessador e, eles foram comparados com os dados da curva feita com as sementes íntegras obtidas manualmente dos frutos. Se empregaram 4 repetições de 15 sementes cada para aquelas despolpadas mecanicamente e igual número de sementes e repetições para as despolpadas manualmente. Ambos experimentos foram dessecados conforme a metodologia descrita no ponto 3.3 até atingir 5% do CA.

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3.11. MICROSCOPIA DE LUZ

As análises histológicas dos embriões foram realizadas seguindo a metodologia (O`Brien et al. 1964) com modificações de Schmidt et al. (2009). As amostras foram desidratadas numa série crescente de soluções aquosas de etanol (30%, 50%, 70%, 90% e 100%, v/v) e em seguida infiltradas com historesina (Leica Historesin, Heidelberg, Germany). As amostras foram seccionadas (4 μm de espessura). Para a identificação das estruturas dos tecidos e células foram coradas com ATO (Azul de Toluidina) 0.5%, pH 3.0 (O`Brien et al. 1964) e dupla coloração com PAS (Periodic Acid Schiff) e CBB (Coomasie Brilliant Blue). As lâminas foram analisadas no microscópio Olympus BX 41 equipado com o software Image Q Capture Pro 5.1 (QImaging Corporation, Austin, TX, EUA).

3.12. QUANTIFICAÇÃO DE POLIAMINAS

As análises foram realizadas com três repetições de amostras de 300 mg de sementes maceradas in 1,6 ml de ácido perclórico (5%) para os tratamentos controle, 40%, 30%, 25%, 20% e 15% de CA. As Poliaminas livres foram extraídas, densiladas e identificadas pela fase inversa do HPLC, de acordo com Steiner et al (2007). O conteúdo de poliaminas foi determinado utilizando detector de fluorescência de 340 nm (excitação) e 510 nm (emissão), e os picos de área e tempos de retenção foram mensurados por comparação com modelos padrões de poliaminas: Putrescina (Put), Espermidina (Spd) e Espermina (Spm).

3.13. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E ANÁLISES ESTATÍSTICAS

Todos os experimentos foram feitos em delineamento inteiramente casualizado (DIC) e depois de coletados os dados das avaliações foram analisados com estatística descritiva, teste de normalidade (Shapiro–Wilk (p<0.05)), avaliados pelo teste de homocedasticidade (Barlett (p<0.05)), Análise de Variância e Teste de Tukey (p<0.05) quando foi necessário usando Software R® (versão 3.5.3, 2019).

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4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. RESPOSTA FISIOLÓGICA DAS SEMENTES SUBMETIDAS À DESSECAÇÃO

O teor de água das sementes frescas de Eugenia uniflora foi de 50,018%. Essa estimativa é semelhante aos valores reportados por Delgado & Barbedo (2007) e Comin et al. (2014), 55% e 50%, respectivamente. As sementes de E. uniflora apresentaram as três fases da curva de germinação definidas pelo modelo da curva trifásica e o processo germinativo descrito por Bewley et al (2013). De acordo com este modelo observou-se uma curta ou quase inexistente primeira fase que demorou 15 minutos e na qual as sementes embeberam pouca quantidade de água (77,33 mg) de acordo com a mudança no peso fresco nesse período de tempo. Este resultado se deve principalmente ao alto conteúdo inicial de água nas sementes de E. uniflora (50%). A segunda fase da germinação, foi caracterizada pela redução da quantidade de água embebida pela semente, demorou11 dias (264h), momento no qual iniciou a terceira fase, caracterizada pela protrusão da radícula., e a partir deste momento foi observado o aumento de massa fresca até observar que 100% das sementes germinaram no dia 20 (480h) (Figura 2A).

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Figura 2 – Comportamento fisiológico dos tratamentos de dessecação em sementes de E. uniflora.

A) Curva de embebição, B) Curva de dessecação e C) Dinâmica de germinação. As linhas verticais indicam desvio padrão. SF: Sementes frescas com 50% CA.

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Quanto aos tratamentos testados de dessecação, foi observado que a dessecação demorou 1327 horas (55 dias) até chegar a 5% do conteúdo de água (CA) (Figura 2B). Foram necessárias 96 horas (4 dias) para atingir 40% CA e 288 horas (12 dias) para alcançar 30% CA, tempos diferentes aos reportados por Comin (2014) que observou 14 horas (<1 dia) e 72 horas (3 dias) para alcançar até 41 e 31% CA, respectivamente, nesta mesma espécie, porém as sementes foram mantidas em estufa com temperatura média de 37 °C, evidenciando a influência da temperatura na velocidade da dessecação. A taxa de perda de água foi maior nas primeiras 24 horas de desidratação, tornando-se reduzida ao comparar com as taxas de dessecação de outras espécies do gênero Eugenia como E. brasiliensis, E. involucrata, E. pyriformis e E. astringens de acordo com estudos que estão sendo desenvolvidos no laboratório de Fisiologia Vegetal, Departamento de Botânica da Universidade Federal de Santa Catarina (Garcia, G., - dados não publicados). A partir dos tratamentos de dessecação, observou-se a redução gradual do potencial germinativo das sementes conjuntamente à redução do CA a partir de 40% CA (Figura 2B). Foi observado que 100% das sementes frescas e 93,75% das sementes dessecadas até 40% CA, germinaram, sendo observados valores semelhantes aos reportados por Delgado & Barbedo (2007) e Comin et al (2014). Foi observado 7,50%, 2,50% e 1,25% de germinação para as sementes dessecadas até 30%, 25% e 20% CA, respectivamente e aquelas dessecadas até 15%, 10% e 5% não germinaram. Os estudos realizados por Wielewicki (2006), Delgado et al (2006) reportam 31% CA como o valor crítico para a germinação de E. uniflora, enquanto Delgado & Barbedo (2007) reportou que as taxas letais estão entre 15% - 20% do CA, semelhantes as observadas no presente estudo. As variações anteriores podem acontecer pelas diferentes condições ambientais de dessecação. A temperatura e umidade relativa influenciam a velocidade da dessecação que determinada a taxa de desidratação e de metabolismo (Farrant, 1997; Berjak & Pammenter 2013), sendo afetada a viabilidade das sementes. A partir do conteúdo de água expresso em base seca, se observa a condição altamente recalcitrante da espécie, já que as sementes frescas (50%) apresentaram CA de 1,0025 g H2O -1 -1 -1 g dw, e CA de 0,8475 g H2O g dw e 0,7222 g H2O g dw para 40% e 30% em base úmida, respectivamente. Porém, apesar de apresentar uma perda de água semelhante de 50% para 40% e de 40% para 30%, é nesta última etapa que as sementes perdem 86,25% da viabilidade. A dinâmica da germinação foi semelhante para os tratamentos controle e 40% CA (Figura 2C), no entanto as sementes dessecadas até 40% demoraram o dobro do tempo que as sementes

CONFERE COM ORIGINAL, cópia extraída de documento original de acordo com o Art. 5º do Decreto nº 83.936/79 29 controle levaram para germinar. Isto é constatado pelos valores do IVG (Figura 3A), os quais foram diminuindo enquanto a dessecação foi maior. A tendência na diminuição dos valores do IVG é semelhante à reportada por Lamarca & Barbedo (2014) para E. uniflora. No entanto, a tendência dos valores do TMG é contrária à descrita pelos mesmos autores para E. uniflora, apesar dos dados não serem estatisticamente significativos.

Figura 3 – Características fisiológicas avaliadas em sementes de E. uniflora submetidas a dessecação

A) Índice de Velocidade de Germinação (IVG), B) Tempo Médio de Germinação (TMG), C) Condutividade Elétrica (C.E.) avaliada depois de 12 horas de hidratação e D) Dinâmica da C.E. durante as primeiras 12 horas de embebição de água das sementes. Nos gráficos A, B e C foi apresentada a curva da germinação (%), as linhas verticais indicam desvio padrão. Valores seguidos da mesma letra não apresentaram diferenças significativas de acordo o teste de Tukey (p < 0.05). SF: Sementes frescas com 50% CA.

As sementes frescas apresentaram maior IVG, menor TMG e homogeneidade do que aquelas dessecadas até 40%, as quais também mostraram maior IVG e menor TMG do que as dessecadas até 30% (Figura 3A-IVG, 3B-TMG), quando resultou uma queda brusca na viabilidade das sementes. No nosso estudo, conforme avança a dessecação, a média do TMG aumenta, porém, os desvios são maiores. Estes indicadores explicam com os nossos resultados, que a velocidade

CONFERE COM ORIGINAL, cópia extraída de documento original de acordo com o Art. 5º do Decreto nº 83.936/79 30 da germinação de E. uniflora é afetada negativamente pela dessecação, porém as sementes apresentam tempos diferentes e desuniformes de germinação, tempos que se fazem mais heterogêneos conforme a dessecação aumenta. Quando foi mensurada a resposta das sementes dessecadas à condutividade elétrica se achou que as sementes que não passaram pelo processo de dessecação, apresentaram menor liberação de eletrólitos, porém não foram diferentes significativamente das sementes dessecadas até 30% CA. Dessa forma observamos que sementes do controle, e com CA de 40%, 30% e 25% apresentaram comportamentos semelhantes em relação a condutividade elétrica. No entanto, os tratamentos com CA de 15% e 10% foram parecidos entre eles e tiveram uma perda maior de eletrólitos quando comparada aos demais tratamentos. Para os tratamentos de 5% e 20% CA, houve superioridade de condutividade elétrica, e as sementes dessecadas até 20% do CA apresentaram valores maiores na perca de eletrólitos, o que corrobora com o fato de que neste grau de dessecação (20%) as sementes têm o limiar de tolerância a dessecação. O fenômeno da maior lixiviação de eletrólitos nas sementes com menor CA, são indicativos de danos nas membranas e ou tegumento, o que pode resultar na perda da viabilidade dessas sementes (Figura 3C). Para a dinâmica da condutividade elétrica realizada nos diferentes tratamentos durante 12 horas de avaliação, foi possível observar mudança na tendência de liberação entre as 4 e as 8 horas, período no qual as sementes tentaram evitar a perca de eletrólitos, pois as curvas observadas tenderam a se manter horizontais, mas sofrem queda e novamente continuam a aumentar depois das 8 horas. Esta dinâmica não foi observada nas sementes dessecadas até 20% CA nas quais a quantidade de eletrólitos liberados aumentou a partir das 4 horas e a estabilização ocorreu após 8 horas de avaliação, apresentando a maior perda de eletrólitos (Figura 3D). A condutividade elétrica auxiliou à avaliação do vigor e viabilidade das sementes conduzidas nos diferentes tratamentos de dessecação, e quando estas apresentam taxas baixas de liberação de solutos eletrólitos, as membranas celulares permanecem estáveis e funcionais. Isto aconteceu com as sementes frescas de elevado vigor e qualidade fisiológica. No entanto, as sementes que apresentaram altas taxas de liberação de eletrólitos, aquelas mais dessecadas, indicando dificuldades para estabilizar e reparar os danos na membrana celular ocasionados pela perda de água. Estas sementes também perderam a viabilidade e o vigor, o que explica a baixa germinação ou ausência dela nas sementes dessecadas abaixo de 30% CA. Finalmente, as reações positivas das sementes ao tetrazólio (2,3,5- Triphenyltetrazolium chloride) foram semelhantes as reportadas por Kaiser et al (2014), ou

CONFERE COM ORIGINAL, cópia extraída de documento original de acordo com o Art. 5º do Decreto nº 83.936/79 31 seja, as sementes com maior CA reagiram com maior intensidade apresentando colorações mais fortes, ao comparar aquelas com menor CA. As sementes com 5% CA não reagiram ao tetrazólium (Figura 4) porém, se observaram duas grandes reduções na reação ao tetrazólio, a primeira quando as sementes atingiram 30% CA, corroborando com a queda na germinação das sementes, e a segunda quando as sementes atingiram 15% CA, ou seja, quando estas não germinaram, foi evidenciado novamente o limiar de potencial germinativo para E. uniflora com 20% CA. Contudo, as dessecações até 15% e 10% do CA apresentaram pouco grau de viabilidade nos tecidos dos embriões, evidenciando que apenas algumas regiões viáveis não são suficientes para a germinação, uma vez que estes tratamentos não germinaram. Além disso, as sementes que sofreram dessecação de 5% CA não reagiram ao teste de tetrazólio, e não apresentou grandes diferenças a dessecação de 10% CA. A diminuição na queda da viabilidade das sementes é semelhante à reportada por Lamarca & Barbedo (2014) para E. uniflora, E. brasiliensis e E. pyriformis. O anterior quer dizer que dessecação ocasiona danos metabólicos nas sementes impedindo a sua germinação. A água tem um papel importante nas reações metabólicas que tem lugar na semente para desencadear o processo germinativo porque a semente de E. uniflora tenta-se manter viável quando é dessecada segundo os resultados do teste de tetrazólio, mas ainda assim tem mais outros aspectos envolvidos no processo germinativo que precisam ser elucidados. Figura 4 – Reação ao teste de tetrazólium das sementes de E. uniflora submetidas à dessecação.

As linhas verticais indicam desvio padrão. SF: Sementes frescas com 50% CA.

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4.2. RELAÇÃO DAS POLIAMINAS COM A TOLERÂNCIA A DESSECAÇÃO EM SEMENTES DE E. uniflora

O conteúdo total das poliaminas (PAs) livres apresentou valores entre 0.073 e 0.123 µmol.g-1MF (Figura 5A) para os diferentes graus de dessecação avaliados, mostrando uma maior concentração em sementes frescas e uma tendência à diminuição juntamente com o conteúdo de água.

Figura 5 – Conteúdo endógeno de Poliaminas (PAs) em sementes de E. uniflora dessecadas.

A) conteúdo endógeno de Poliaminas livres totais (µmol g-1 MF) em sementes de E. uniflora, B) Putrescina (Put), C) Espermidina (Spd), e D) Espermina (Spm). Em todos os gráficos foi incluído os valores de germinação em um segundo eixo Y. As barras verticais indicam desvio padrão. Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente pelo teste de Tukey (p < 0.05). SF: Sementes frescas com 50% CA.

A principal queda no conteúdo total de PAs livres foi evidenciada no intervalo entre 40% - 30% CA, precisamente no intervalo que é perdida 86,25% da viabilidade das sementes. Porém, as diferenças estatísticas achadas entre os diferentes tratamentos não foram significativas quando é analisado o conteúdo total de PAs livres. Conteúdo de Put (Figura 5B), estava em menor proporção do que Spd (Figura 5C) e Spm (Figura 5D) em todos os tratamentos

CONFERE COM ORIGINAL, cópia extraída de documento original de acordo com o Art. 5º do Decreto nº 83.936/79 33 permanecendo em níveis semelhantes uma vez que não apresentaram diferenças estatísticas apesar de ter uma tendência à queda. Nas sementes frescas a quantidade de Spd (0.061 µmol.g- 1MF) é duas vezes maior que os valores da Spm (0.039 µmol./g-1MF) e três vezes maior do que os conteúdos de Put (0,0228 µmol.g-1MF). Mas conforme avançou a dessecação a relação entre Spm e Spd se inverteu. Spm aumentou até 0.053 µmol.g-1MF e Spd diminui até 0.021 µmol.g- 1MF quando as sementes atingiram 15% CA, dessecação onde não apresentaram germinação nenhuma. Nas sementes de E. uniflora com 5% CA, Spm tem o dobro dos valores da Spd. Adicionalmente, Spd apresentou diferença estatística significativa nos valores encontrados entre 40% e 30% CA na semente, 0.0631 µmol.g-1MF e 0.0348 µmol.g-1MF respetivamente, evidenciando a queda em quase a metade e continuando com a diminuição da concentração deste composto conforme avança a dessecação. No entanto, Spm apresentou uma tendência contrária, aumentando sua concentração conforme a dessecação avançou, porém sem diferenças estatísticas significativas entre os diferentes tratamentos. Mas, os valores de Spm com 15% CA foram ainda superiores do que com 50% CA. As poliaminas são moléculas sinalizadoras do estresse, o que explica desde o metabolismo a diminuição gradual no conteúdo total de PAs livres e de Spd, pois a Spd está regularmente envolvida com a minimização dos danos causados por estresses abióticos (Liu et al, 2016). Isto evidencia a influência da Spd na germinação, sob condições de déficit hídrico, porque quando ela é perdida a germinação é afetada negativamente. Além disso, na falta de Spd e concentrações baixas de Put, os valores de Spm tendem-se acrescentar. Alcázar et al (2011), acharam na rota de biossínteses uma canalização metabólica da Put à Spm induzida pela dessecação ou estresse hídrico em plantas de Arabidopsis e Craterostigma plantagineum. Esta rota metabólica curiosamente não gera acumulação de Spm, se não a redução progressiva das reservas de Spd, pois no processo participam Espermedina sintase (SPDS1) e Espermina sintase (SPMS), demonstrando envolvimento da Spd nas reações metabólicas que acontecem para tolerar à dessecação. Isso, pode explicar a diminuição progressiva da Spd e o acúmulo da Spm durante a dessecação das sementes de E. uniflora observadas em este trabalho. Além disso, é importante mencionar que as poliaminas podem apresentar interconversões entre elas (Alcázar et al, 2010), explicando assim, porque as diferenças das PAs livres totais não foram significativas (Figura 5A). Seriam necessários estudos mais específicos para relacionar o metabolismo destas moléculas em condições de dessecação com atividade de enzimas antioxidantes para compreender melhor a natureza dos danos metabólicos. Atualmente, são poucos os estudos feitos com poliaminas e dessecação de sementes e quase inexistentes em

CONFERE COM ORIGINAL, cópia extraída de documento original de acordo com o Art. 5º do Decreto nº 83.936/79 34 sementes sensíveis à dessecação. Os dados das variáveis fisiológicas demonstram que as sementes de E. uniflora conseguiram germinar até 40% CA, tentam se manter viáveis e vigorosas frente à dessecação entre 40% e 20% CA, mas morrem quando atingem valores inferiores ao 20% do CA.

4.3. DANOS NO TEGUMENTO DURANTE A DESSECAÇÃO

Este item foi feito com os dados obtidos durante a primeira fase dos experimentos quando as sementes foram separadas dos frutos usando o multiprocessador, e os dados foram comparados com os dados obtidos das sementes que foram processadas manualmente. A partir das curvas feitas com esta informação, foi observado que o processo de dessecação ocorre rapidamente quando o tegumento da semente é danificado (Figura 6).

Figura 6 – Curvas de dessecação de sementes de E. uniflora.

A) Sementes com tegumento danificado (dano mecânico ou físico) com teor de água inicial de 58% e B) com o tegumento integro (Sem danos) com teor de água inicial de 50,08%. As linhas verticais indicam desvio padrão.

O tegumento pode-se quebrar por dano mecânico (Kigel, 1995) ou por pequenos danos de insetos durante o processo de desenvolvimento da semente. No presente estudo isto foi evidenciado durante o processo de dessecação, quando algumas sementes sofreram redução de água muito mais rápido do que outras. Quando foram examinadas as sementes de dessecação rápida, foram observadas pequenas perfurações no tegumento realizadas por insetos ou durante o processo do beneficiamento mecânico, sendo estas imperceptíveis ao olho humano, porém aquelas que apresentaram o tegumento intacto demoraram muito mais tempo para dessecar.

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Dessa forma, realizou-se um experimento adicional para avaliar as observações registradas, onde os resultados do estudo sugerem que o rompimento do tegumento é um dano mecânico que permite a ocorrência da dessecação em maiores taxas. Além disso, durante a dessecação pela redução do volume do embrião, este se separa do tegumento à medida que o grau de dessecação aumenta, e a partir desta separação física entre tegumento e embrião, o tegumento não tem sustentação ao embrião e por ser um tecido delgado, este rompe-se acelerando o processo de perda de água de todos os tecidos da semente. A sequência de ruptura do tegumento foi observada a partir do estabelecimento de uma sequência visual da modificação no formato do tegumento durante o processo da dessecação (Figura 7). Algumas sementes evidenciam pequenos danos mecânicos como lesões feitas por insetos. Porém, a ruptura do tegumento acontece em qualquer momento da dessecação, sendo o momento no qual a semente começa a perder água muito mais rápido. Isto explica por que as sementes danificadas conseguiram chegar até 5% CA em 144 horas (6 dias), ou seja, 49 dias mais rápido do que as sementes integras (Figura 6).

Figura 7 – Sequência de dano mecânico no tegumento da semente dessecadas de E. uniflora.

A) Semente sem dessecação B) semente com 25% CA e com tegumento fraco que inicia seu rompimento pela perda de apoio causada pela diminuição do volumem do embrião C) semente com 25% CA com tegumento quebrado, D) semente com 25% CA com tegumento que apresenta danos mecânicos E) Tegumento de semente de E. uniflora quebrado, F) danos ocasionados por insetos durante o desenvolvimento da semente, sendo evidenciados durante dessecação. As sementes que apresentaram danos mecânicos foram descartadas e não foram utilizadas nos experimentos. Bar. 100 µm

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.No caso das sementes com tegumento íntegro, o embrião também perde o volume, mas de alguma maneira o tegumento consegue-se manter íntegro e funciona como barreira entre o embrião e o ambiente externo para evitar a perda de água (Figura 8).

Figura 8 – Sementes de E. uniflora com o tegumento integro

A) Semente sem dessecação e tegumento integro, B) semente com 25% CA com o tegumento integro, C) Semente com 10% CA com o tegumento integro. Bar. 100 µm

4.4 MUDANÇAS ANATÔMICAS NAS SEMENTES OCASSIONADAS PELA DESSECAÇÃO

Segundo Barroso (2002), A morfologia do embrião do gênero Eugenia é globoso, conferruminado, ou seja, é indiferenciado, não sendo possível diferenciar a estrutura do eixo radícula-hipocótilo e cotilédones (Figuras 9A). No presente trabalho, foi possível observar uma linha divisória dos cotilédones no embrião de E. uniflora (Figura 9B) após dessecação inicial (sementes dessecadas até 25% CA). No entanto, quando o embrião está hidratado isto não é visível. Andrade & Ferreira (2000) e Lucas et al. (2005), afirmam que não há diferenciação entre o eixo embrionário e os cotilédones, mas Justo et al (2007) acharam o eixo embrionário diferenciado em sementes maturas de Eugenia pyriformis. Porém, Ferreira (2010) observou diferenciação do eixo hipocótilo-radícula e dois cotilédones com linha de soldadura visível em sementes verdes e maturas para E. uniflora, E. cerasiflora e E.involucrata. Conhecer e diferenciar as estruturas dos eixos do embrião é importante no estudo das sementes, especialmente para este trabalho de pesquisa que procura gerar informações e ferramentas de utilidade para a conservação de E. uniflora. Isto, porque depois de conhecer que o limiar crítico de tolerância a dessecação desta espécie é muito alto (40% - 30% CA) e não permite armazenar as sementes, então devem-se procurar outro tipo de estratégias de conservação como a

CONFERE COM ORIGINAL, cópia extraída de documento original de acordo com o Art. 5º do Decreto nº 83.936/79 37 criopreservação de embriões por exemplo, porém como foi discutido anteriormente, não é fácil determinar e diferenciar as estruturas do embrião em sementes do gênero Eugenia. A análise histoquímica indicou que a semente está composta por um tegumento conformado por quatro camadas de células (Figura 9C). A camada mais externa corresponde ao parênquima e os três internos ao esclerênquima, composto principalmente por células macroesclereídas, com um dos tecidos do esclerênquima bastante lignificado. Os tecidos mais externos são os primeiros que ocorrem rompimento quando a semente é dessecada, provavelmente devido a estrutura esponjosa do tecido e a baixa lignificação, além de ser delgado e membranoso, duas características que marcam a diferença com tegumentos de outras espécies do gênero Eugenia (Rizzini, 1970). Próximo à protoderme embrionária foram observados idioblastos no contorno do embrião (Figura 9E-F). Em embriões de E. brasiliensis e E. pyriformis foram observados idioblastos com compostos fenólicos (Ferreira 2017) e em outras espécies de Eugenia, estruturas semelhantes a estas foram denominadas cavidades secretoras (Van Wyk & Botha, 1984), sendo também observada estas cavidades que secretam compostos fenólicos em E. uniflora, E. cerasiflora e E. involucrata como estratégia dissuasiva para evitar a herbivoria, sendo maior a densidade destas cavidades nas sementes de E. uniflora (Ferreira, 2010).

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Figura 9 – Características morfoanatômicas de sementes de E. uniflora.

A) Semente germinada, se observa o tegumento fino ainda ligado ao embrião B) Semente de E. uniflora dessecada até 25% CA não germinada, com o tegumento separado do embrião, e a seta indicando união entre cotilédones. C)

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Tecidos do embrião e do tegumento de semente fresca não dessecada; D) Tegumento evidenciando as diferentes camadas celulares com seta sinalizando grãos de polissacarídeos neutros dentro das células E) Células dos cotilédones com abundante presença de polissacarídeos neutros e uma cavidade secretora que poderia ser um idioblasto; F) Células embrionárias e cavidades secretoras que poderiam ser idioblastos; G) Células embrionárias sem dessecação (sementes frescas); H) Células embrionárias dessecadas até 30% CA; I) Células embrionárias dessecadas até 20% CA, com seta indicando danos celulares (extravasamento). C, E, G, H, I: Dupla coloração Azul Brilhante de Coomassie (CBB) e Ácido periódico de Schiff (PAS); D, F: Azul de toluidina; Abreviaturas: ez: embrião. ep: epidermes. t: tegumento. es: esclerênquima. pe: parênquima esponjoso. pr; protoderme. Bars: A- B: 100 µm; C, D, F: 40 µm; E, G, H, I: 10 µm.

Nas análises histoquímica, foi observada a presença de polissacarídeos neutros (amido), com maiores reservas nas células das sementes de E. uniflora e a ausência de compostos ou corpos proteicos (Figura 9G, 9H, 9I). Mello (2008) reportou que o amido representava perto do 64% da matéria seca das sementes de E. uniflora. Observou-se redução no tamanho das células durante o processo de dessecação e grãos de amido espalhados dentro no citoplasma das células em tecidos hidratados, mas à medida que ocorreu a dessecação, o espaço livre da célula diminuiu concomitante à concentração das reservas (Figura 9G, 9H, 9I). Ao final da dessecação foi observada a ruptura da membrana celular com extravasamento do conteúdo celular. Este resultado evidencia o dano ocasionado pela dessecação não somente no tegumento, mas também nas sementes dessecadas em níveis inferiores a 20% CA. Na literatura ainda não se acharam estudos deste tipo que visem aportar explicações com ferramentas histoquímicas ao entendimento das mudanças anatômicas ou nos tecidos das sementes provocados pela dessecação, salvo alguns trabalhos que estão sendo desenvolvidos pelo laboratório de fisiologia vegetal no departamento de Botânica da Universidade Federal de Santa Catarina, Brasil. Eles têm trabalhado com espécies nativas da mata atlântica como Trichocline catharinensis, Garcinia gardneriana e algumas espécies da família mirtácea como Acca sellowiana, Campomanesia xanthocarpa, Campomanesia littoralis, Campomanesia reitziana entre outras do gênero Eugenia (Dados não publicados); tentando aportar explicações com sucesso sob a relação das poliaminas com a tolerância a dessecação e os efeitos da dessecação em variáveis metabólicas, fisiológicas e anatômicas. Mais ainda é preciso gerar mais informação que permita discutir com maior profundidade as implicações da relação poliaminas – tolerância à dessecação sob a conservação das espécies sensíveis a dessecação.

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5. CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS FUTURAS

As sementes de E. uniflora são altamente sensíveis à dessecação e apresentaram o limiar crítico de perda da viabilidade entre 40% e 30% do conteúdo de água (0,847 – 0,722 -1 gH2O/gMS ). Além disso, a dinâmica da dessecação é lenta, influenciada pelo alto teor de água inicial e regulada principalmente pela barreira morfoanatômica conferida pelo tegumento. Após a ruptura do tegumento por danos mecânicos, a dessecação da semente torna-se acelerada. Os danos decorrentes da dessecação são evidenciados após 96 horas e são do tipo mecânico e metabólico, e a viabilidade das sementes de E. uniflora é perdida devido aos danos em diferentes estruturas e tecidos, principalmente no tegumento, que ao se romper o processo de dessecação se acelera e o tegumento deixa de cumprir a função de barreira entre a semente e o ambiente. A dessecação gera desestruturação celular da semente ocasionando lixiviação de compostos nos espaços intercelulares. Dada sua alta sensibilidade à dessecação, as sementes de E. uniflora não podem ser armazenadas em bancos de germoplasma sob sistema convencional de baixa temperatura. Pelo anterior, é preciso continuar procurando novas estratégias de conservação ex situ para espécies sensíveis à dessecação para garantir duplicatas de segurança dos recursos genéticos armazenados através da complementariedade das estratégias existentes de forma eficiente e eficaz. E. uniflora precisa de altos teores de água para germinar. Nas florestas sob cenários de déficit hídrico facilitados pelas mudanças climáticas, a espécie corre risco de diminuir o número dos seus indivíduos e suas populações no futuro próximo, devido ao fato de precisar altos teores de água para germinar. Ainda, durante as colheitas dos frutos e trabalho de campo, foi observado que a floração coincide com as épocas de chuva, sendo a água o principal estímulo e insumo para floração e frutificação de E. uniflora. Além disto, as paisagens de ocorrência da espécie estão sendo fragmentados pela antropização e grande número das sementes que as árvores conseguem produzir são afetadas pelos insetos, mais dois fatos que dificultam a regeneração natural da E. uniflora e evidenciam a necessidade de trabalhar na conservação e administração dos recursos fitogenéticos desde a fisiologia vegetal para entender melhor o funcionamento e interações dos mesmos. Os teores endógenos de PAs evidenciaram a redução das reservas destes compostos conforme a dessecação avançou nas sementes, Spd diminui conforme aumentou Spm se acrescenta e isso ocorreu de forma gradual. O conteúdo de Put permaneceu praticamente

CONFERE COM ORIGINAL, cópia extraída de documento original de acordo com o Art. 5º do Decreto nº 83.936/79 41 inalterado durante todo o processo de dessecação. Não há registros na literatura sobre poliaminas em especial sobre Spm durante a dessecação de sementes. A desidratação lenta faz que as células fiquem em estágios de desidratação intermediários por mais tempo e, como são metabolicamente ativas, ocorre um acúmulo de danos oxidativos relacionados ao metabolismo acontecido nesse período. É necessário analisar a atividade das enzimas antioxidantes para auxiliar no entendimento dos danos oxidativos acontecidos e a sua relação com as PAs. O padrão do comportamento fisiológico das sementes de E. uniflora sob condições de dessecação e as mudanças graduais e sucessivas nos conteúdos de poliaminas apresentadas neste estudo e a relação com a germinação, vigor e viabilidade de sementes de E. uniflora, evidenciam a necessidade do estudo do potencial das poliaminas durante a indução da tolerância à dessecação. Uma vez induzida a tolerância à dessecação, o armazenamento a longo prazo torna-se uma opção viável visando à conservação de sementes sensíveis à dessecação garantindo mais uma alternativa nas estratégias de conservação ex situ.

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6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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CONFERE COM ORIGINAL, cópia extraída de documento original de acordo com o Art. 5º do Decreto nº 83.936/79