Identificação De Peptidases Expressas Pelas Espécies De Tripanossomatídeos Wallaceina Inconstans E Wallaceina Brevicula
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CURSO DE BIOMEDICINA ALAN RENIER JAMAL OCCHIONI MOLTER Identificação de Peptidases Expressas pelas Espécies de Tripanossomatídeos Wallaceina inconstans e Wallaceina brevicula IBMR– CAMPUS CATETE 2016 ALAN RENIER JAMAL OCCHIONI MOLTER Identificação de Peptidases Expressas pelas Espécies de Tripanossomatídeos Wallaceina inconstans e Wallaceina brevicula Monografia apresentada à coordenação do curso de Biomedicina, como cumprimento parcial das exigências para conclusão do curso de Bacharelado em Biomedicina do Instituto Brasileiro de Medicina e Reabilitação. Orientadores: Drª. Marta Helena Branquinha de Sá & Dr. André Luis Souza dos Santos Co-orientador: Doutorando Michel Gomes Chagas IBMR – CAMPUS CATETE 2016 IBMR – CAMPUS CATETE ALAN RENIER JAMAL OCCHIONI MOLTER Identificação de Peptidases Expressas pelas Espécies de Tripanossomatídeos Wallaceina inconstans e Wallaceina brevicula Monografia apresentada à coordenação do curso de Biomedicina, como cumprimento parcial das exigências para conclusão do curso de Bacharelado em Biomedicina do Instituto Brasileiro de Medicina e Reabilitação. Aprovada em___ de _________de _____. Conceito:_________ (_____________). Banca Examinadora _______________________________________ Profª. _______________________________________ Profº. _______________________________________ Profª. _______________________________________ ...A vitória é o resultado de uma cuidadosa experimentação e inteligente argumentação... Contra toda esta evidência, quase a única defesa restante para o cientista cético é a ignorância. (George R. Price, 1955) RESUMO As espécies do gênero Wallaceina são tripanossomatídeos flagelados monoxênicos isolados de hospedeiros invertebrados pertencentes à ordem Hemíptera, que apresentam ao longo do ciclo de vida as formas promastigota, endomastigota, coanomastigota, brochomastigota e opistomorfa (Kotysgov et al.,2004). Sabe-se muito pouco a respeito deste gênero e por isso o presente trabalho tem por objetivo investigar o perfil proliferativo e a possível presença de peptidases produzidas por Wallaceina inconstans e Wallaceina brevicula. Para se analisar o perfil proliferativo, as espécies foram cultivadas a 28ºC e 37ºC em meio Warren, e as células foram estimadas pela contagem em câmara de Neubauer. As células cultivadas a 28ºC atingiram o ápice da fase logarítmica em 48 horas. Entretanto, as células cultivadas a 37ºC não apresentaram proliferação relevante, observando-se uma morfologia típica de células mortas. Para se analisar o perfil de peptidases expressas pelas duas espécies, extratos celulares totais obtidos dos parasitos em diferentes tempos de cultivo foram utilizados em SDS-PAGE contendo gelatina incorporada ao gel como substrato. Após a corrida, os géis foram incubados em sistemas tampão com diferentes faixas de pH: 5,0, 7,0 e 9,0. Após a incubação observou-se que os géis incubados em pH 5,0 apresentaram cinco bandas de maior intensidade referentes ao tempo de 48 horas, representando o período de maior expressão de peptidases nas duas espécies. Observou-se ainda que nos valores de pH 7,0 e 9,0 as cinco bandas se apresentavam com menor intensidade, para ambas as espécies. Os géis das duas espécies incubados em pH 5,0 somados ao inibidor proteolítico E-64, demonstraram uma inibição na expressão de bandas, enquanto que os demais não apresentaram inibição proteolítica relevante. A inibição da expressão de bandas observadas na utilização do inibidor E-64 sugere uma possível presença de cisteína- proteases produzidas pelas duas espécies de tripanossomatídeos, e portanto, os resultados obtidos indicam uma adaptação destes dois tripanossomatídeos a mesma temperatura e pH encontrados no trato digestivo de insetos da ordem Hemíptera, 28ºC e pH 5,0, as quais são ideais para proliferação e atividade proteolítica observadas nas espécies estudadas. Palavras Chave: Wallaceina brevicula , Wallaceina inconstans, Peptidase, Inibidor proteolítico. ABSTRACT The species of the genus Wallaceina are trypanosomatid flagellated monoxenic isolated of invertebrate hosts belonging to the order Hemiptera, which feature throughout the life cycle the promastigote, endomastigote, choanomastigote, brochomastigote and opisthomorphs forms (Kotysgov et al., 2004). We know very little about this genre and so the present study aims to investigate the proliferative profile and the possible presence of peptidases produced by Wallaceina inconstans and Wallaceina brevicula. To analyze the proliferative profile, species were grown at 28 ° C and 37 ° C in Warren medium, and the cells were estimated by counting in a Neubauer chamber. Cells grown at 28°C reached the summit of the log phase in 48 hours. However, cells grown at 37°C showed no significant proliferation, observing a typical morphology of dead cells. To analyze the peptidase profile expressed by two kinds, total cell extracts obtained from parasites at different cultivation times were used in SDS-PAGE containing gelatin incorporated into the gel as substrate. After the run, the gels were incubated in buffer systems with different pH values: 5,0, 7,0 and 9,0. When analyzing the data, it was observed that the gels incubated at pH 5.0 showed five bands of greater intensity related to the time of 48 hours, representing a period of increased expression of peptidases in the two species. It was also observed that at pH 7,0 and 9,0 five bands performed with lower intensity for both species. The gels of the two species incubated at pH 5,0 added to proteolytic inhibitor E-64 showed an inhibition in the expression of bands, while others showed no relevant proteolytic inhibition. Inhibition of the expression of bands observed in the use of the E-64 inhibitor suggests a possible presence of cysteine proteases produced by two species of trypanosomes, and therefore, the results indicate an adaptation of these two trypanosomatids to the same pH and temperature found in the digestive tract of Hemiptera order of insects, 28°C and pH 5,0,which are ideal for proliferation and proteolytic activity observed in the studied species. Key words: Wallaceina brevicula , Wallaceina inconstans, Peptidase, Proteolytic inhibitor. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1. Representação da diversidade de hospedeiros e distribuição dos tripanossomatídeos entre eles..........................................................................................13 Figura 2. Principais estruturas e organelas encontradas em um modelo de tripanossomatídeo............................................................................................................14 Figura 3. As formas mais comumente encontradas dos tripanossomatídeos.................15 Figura 4. Fotografia dos insetos vetores Calocoris sexguttatus e Nabis brevis.............16 Figura 5. Coloraçao com Giensa de Wallaceina spp em cultura....................................16 Figura 6. Curva de proliferação de W.inconstans e W.brevicula a 28 ºC.......................27 Figura 7. Curva de proliferação de W.incontans e W.brevicula a 37 ºC........................28 Figura 8. Comparação das curvas de proliferação nas duas temperaturas estudadas.....29 Figura 9. SDS-PAGE com incubação em diferentes faixas de pH................................30 Figura 10. SDS-PAGE de extratos celulares totais das duas espécies incubados em pH 5,0 ,somados à DTT e inibidores de diferentes classes de peptidases...........................31 Figura 11. SDS-PAGE de extratos celulares totais incubados em pH 5,0 e DTT, com e sem a adição do inibidor proteolítico E-64....................................................................31 LISTA DE ABREVIATURAS AIDS - Acquired immunodeficiency syndrome BHI - Brain heart infusion DNA – Ácido desoxirribonucléico DTT – Dithiothreitol EGTA - Ethylenedioxy-bis-(Ethylenenitrilo)-Tetraacetic Acid EDTA - Ethylenediaminetetraacetic acid GP63 – Glicoproteína 63 HIV- Human immunodeficiency virus HIV-1 - Human immunodeficiency virus do tipo 1 HAART - Highly active antiretroviral therapy KDNA - Ácido desoxirribonucléico do cinetoplasto kDa – Kilodalton PMSF - Phenylmethanesulfonyl fluoride SFB – Soro fetal bovino SDS-PAGE - Polyacrylamide gel electrophoresis with sodium dodecyl sulfate SIRS – Síndrome da resposta inflamatória sistêmica TCD4 - Cluster of differentiation 4 Wi – Wallaceina inconstans Wb – Wallaceina brevicula Sumário 1- INTRODUÇÃO.........................................................................................................12 1.1.A Familia Trypanosomatidae.............................................................................12 1.2.Wallaceina spp....................................................................................................16 1.3.Enzimas Proteolíticas.........................................................................................19 1.4.Inibidores Proteoliticos.......................................................................................20 2 – JUSTIFICATIVA.....................................................................................................23 3 – OBJETIVO...............................................................................................................24 3.1. Objetivo Geral..................................................................................................24 3.2. Objetivos Especficos........................................................................................24 4 – METODOLOGIA.....................................................................................................25 4.1.Micro-organismo e Condicóes de Cultivo.........................................................25