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ANNÉE 2016

THÈSE / UNIVERSITÉ DE RENNES 1 sous le sceau de l'Université Bretagne Loire

pour le grade de DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE RENNES 1 Mention : Biologie / écologie Ecole doctorale Vie-Agro-Santé

présentée par Yoann Navasse

Préparée à l’unité de recherche UMR IGEPP 1349 Institut de génétique, environnement et protection des plantes

Thèse soutenue à Agrocampus Spécialisation Ouest le 7 décembre2016 parasitaire chez les devant le jury composé de : Flavie VANLERBERGHE Aphidiinae : existe-t-il Directrice de recherche, INRA, CBGP / rapporteur Jean-Pierre SARTHOU des parasitoïdes de Maître de conférences, INRA, ENSAT / rapporteur Marlène GOUBAULT pucerons Maître de conférences, IRBI, Université François Rabelais / examinatrice généralistes ? Anne-Marie CORTESERO Professeure, Université de Rennes 1 / examinatrice Nicolas RIS Ingénieur de recherche, INRA/ examinateur Anne LE RALEC Professeure, Agrocampus Ouest / directrice de thèse Manuel PLANTEGENEST Professeur, Agrocampus Ouest / co-directeur de thèse 2 Sommaire

Introduction générale ...... 5

I. Le caractère généraliste ...... 5 I.. Qu’est-e u’ue espèce généraliste ? ...... 5 I.. L’eistee du aate galiste, u sujet otoves ...... 6 I.3. La spécialisation écologique ...... 8 I.. Ipotae et ôle du aate galiste/spialiste das l’effiait du sevie écosystémique de régulation ...... 11 I.4.1. Le service écosystémique de régulation ...... 11 I... Ipotae du aate galiste e vue d’ue lutte iologiue pa osevatio ...... 12 I... Dfii le aate galiste ou spialiste d’u pdateu ou paasitoïde ...... 14 II. Modles d’tude ...... 16 II.1. Les pucerons ...... 16 II.2. Les parasitoïdes Aphidiinae ...... 21 II.3. Spécialisation parasitaire chez les Aphidiinae ...... 24 II.4. Ves la ise e plae d’ue lutte iologiue pa osevatio, tats des oaissaes des communautés hôte-parasitoïde ...... 26

Objectifs de la thèse et méthodes utilisées ...... 30

I. Polatiue et aes d’tudes ...... 30 II. Mthodes ises e œuve ...... 32 II.1 Analyse des interactions pucerons-parasitoïdes dans les agrosystèmes et recherche de structuration génétique ...... 32 II.1.1 Échantillonnage de terrain ...... 32 II... Mthode d’hatilloage ...... 34 II.1.3. Les méthodes de détection du parasitisme ...... 35 II.1.4. Analyse de la structuration génétique par barcoding moléculaire : approche multilocus . 40 II.2 Expérimentations au laboratoire...... 41

Chapitre 1 : Les espèces de parasitoïdes généralistes à l'échelle d'un agroécosystème ...... 43

Objectifs ...... 43 A) Les espèces Aphidiinae et leurs traits généralistes ou spécialistes dans les agroécosystèmes ... 45

B) Copaaiso de deu thodes d’estiatio du paasitise et tude de la daiue d’eploitatio tepoelle des htes de espes galistes ...... 82 Conclusion et perspective ...... 97

Chapitre 2 : Analyse du caractère généraliste, spécialisation et spéciation écologiques chez Diaeretiella rapae...... 101

Synthèse des connaissances sur Diaeretiella rapae et ses interactions avec les pucerons ...... 101 Objectifs ...... 103 A) Daiue d’eploitatio tepoelle des htes pa ue espe supposée généraliste : Diaeretiella rapae ...... 105 B) Spécialisation écologique des Diaeretiella rapae en lien avec le caractère cultivés ou sauvages des plantes hébergeant les hôtes ...... 128 Conclusion et perspective ...... 149

Discussion générale et perspectives ...... 153

I. Avantages et inconvénients des deux méthodes utilisées pour la détection du parasitisme et pour l’estiatio des spetes d’htes des Aphidiiae ...... 153 II. Les espèces généralistes chez les Aphidiinae ...... 155 III. Comment se répartissent les espèces généralistes et spécialistes dans les agroécosystèmes et comment agissent les facteurs de spécialisation sur le caractère généraliste et spécialiste des Aphidiinae ? ...... 160 III.1. Répartition et distribution des espèces généralistes et spécialistes dans les différents habitats des agrosystèmes au cours du temps...... 162 III.2. Les facteurs de spécialisation écologique chez les Aphidiinae ...... 163 III.3. Le maintien du caractère généraliste chez les Aphidiinae ...... 166 IV. Conséquences agronomiques de la spécialisation parasitaire des Aphidiinae ...... 167

Références bibliographiques hors articles ...... 170 Annexe ...... 188

Introduction générale

Cette thèse est consacrée à la spialisatio paasitaie au sei d’u groupe d’isetes parasitoïdes les Aphidiinae (Hymenoptera : Braconidae). La uestio de l’eistee et du aintien du caractère généraliste dans les populations naturelles, présentes dans les agroécosystèmes, va être abordée dans ce travail. Nous avons cherché à observer, en conditions naturelles et à une échelle locale, les modes d’eploitatios des ressources par les Aphidiinae, ressources constituées par les différentes espèces de pucerons hôtes. Des pistes de recherche sur les facteurs de spécialisation écologique chez les parasitoïdes seront explorées, ainsi que leurs conséquences sur le service écosystémique rendu par ces organismes.

I. Le caractère généraliste

I.1. Qu’est-e u’ue espe galiste ?

La notion d’espe galiste et spécialiste est fortement utilisée dans les études portant sur la ophesio des aises d’volutio des espes, notamment à travers les mécanismes de spécialisation. Ce concept de spécialisation est etal das le doaie de l’écologie évolutive, de l'écologie comportementale et de l'écologie des communautés (Rieseberg, 2001 ; Kassen, 2002 ; Coyne et Orr, 2004 ; Bolnick et al., 2007 ; Loxdale et al., 2011). Central car les caractéristiques écologiques des espèces généralistes et spécialistes sont à la base de la répartition des espèces dans l’espae et de l’ogaisatio des seau tophiues (Devictor et al., 2008, 2010). En effet, la sélection naturelle induit des stratégies plus ou moins spécialisées chez les espèces, selon un compromis évolutif ete la apait d’ue espe à eploite u gadiet de essoue et la performance sur cette ressource (Levins, 1968). Les stratégies spécialistes devraient bénéficier d'environnements qui sont relativement homogènes dans l'espace et / ou le temps, alors que les stratégies généralistes devraient bénéficier d'environnements hétérogènes dans l'espace et / ou le temps (Kassen, 2002 ; Marvier et al., 2004 ; Ostergard et Ehrlen, 2005). Le fait est que la dégradation de l'habitat doit affecter négativement les spécialistes est prédit par la théorie de l'évolution de niche (qui sera développé ultérieurement). La manipulation de ce concept dans des études d'écologie nécessite de dfii piset e u’est une espèce généraliste. Ue aie d’aode e oept est d'établir les différences fonctionnelles entre une espèce généraliste et une espèce spécialiste. Les spécialistes auront une niche écologique étroite, tandis que les généralistes seront adaptées à un plus grand nombre de conditions et de

5 ressources environnementales. Les espèces spécialistes vont répondre de manière plus forte aux perturbations de leur environnement que les généralistes, et seront davantage sujettes à l'extinction (Evans et al., 2005 ; Wilson et al., 2008). De nombreuse études suggèrent que les espèces spécialistes sont en déclin dans le monde entier et ce dans différents groupes taxonomiques (papillons, Warren et al., 2001 ; carabes, Kotze et O'Hara, 2003 ; plantes, Rooney et al., 2004 ; bourdons, Goulson et al., 2005). Ceci est appuyé par la reconnaissance croissante que les espèces ne sont pas égales face au isue d’etitio lié aux changements globaux (Olden, 2006). La deuxième caractéristique fonctionnelle des spécialistes, comparées aux généralistes, est la performance das l’utilisatio de l'habitat ou des ressources alimentaires, qui est généralement plus élevée chez les spécialistes dans les conditions correspondant à leur niche écologique (Fox et Morrow, 1981 ; Futuyma, 2001 ; Devictor et al., 2010). Autrement dit, dans des conditions environnementales idéales, les espèces spécialistes présentent un avantage sur les espèces généralistes, alors que les stratégies généralistes sont avantageuses en cas de faible disponibilité des ressources ou dans un environnement instable (Pyke, 1977 ; Devictor et al., 2010). Certaines études laissent penser que la perte et la fragmentation des habitats, combinées aux changements globaux, entraîneront des bouleversements dans les communautés biologiques, notamment par une réduction du nombre d'espèces, et une domination des espèces généralistes (McKinney et Lockwood 1999, Warren et al., 2001). Le caractère généraliste des espèces semble donc être un avantage face aux perturbations environnementales, pour autant l'existence même de tels généralistes est sujette à discussion au sein de la communauté scientifique.

I.2. L’eistee du caractère généraliste, un sujet controversé

Dans leur article paru en 2011, Loxdale et collaborateurs, dfedet l’ide de l’ipoailit évolutive du caractère généraliste. Ces auteurs défendent l'idée ue l’volutio conduit nécessairement à la sélection du caractère spécialiste au sein des populations, possiblement induit par la spécialisation écologique (Schluter, 2001). Pour ces auteurs, les espèces apparemment généralistes occupent finalement des niches écologiques distinctes en développant des adaptations permettant leur occupation. Ce point de vue est contesté, en particulier par Dennis et al. (2011) qui soutiennent que les espèces généralistes existent réellement dans la nature. Ils ajoutent que le aate galiste ostitue ue assuae ote les isues d’etition des espèces, risques auxquels les spécialistes sont plus exposés. De plus, la limite, la distinction entre espèces généraliste et spécialiste constituent une réelle polatiue. La ihe ologiue d’ue espe tat opose de nombreuses dimensions (Hutchinson, 1957), une espèce peut par exemple être généraliste pour sa ressource alimentaire

6 mais spécialiste du point de vue de son habitat. Finalement, on peut avoir autant de traits généralistes que de dimensions de la niche écologique. La limite entre ces deux "états" est d’autat plus complexe à fixer que cette notion est relative, une espèce étant toujours plus ou moins généraliste relativement à une autre. En conditions naturelles, on observe plutôt des gradients de spécialisation, allant pour un me goupe d’espes d’u aate hpespécialisé à un fort degré de « généralisme », avec de nombreux états intermédiaires (Lapchin, 2002). Par exemple, McPeek distigue tois tpes d’espes galistes. Le peie tpe egoupe des espèces que l’o peut qualifier de « super-généralistes » capables d’te pefoates das l’esele des compartiments de la niche écologique occupée pa l’espe et d’te optitif ave des espes spécialistes. Le deuxième type fait appel à des espèces polymorphiques dans lesquelles se regroupent une diversité de populations ou d’idividus spialiss dans une dimension particulière de la ihe ologiue oup pa l’espe, oept foul pa ‘oughade et dfedu pa Bolnick (2003). Le troisième type, intermédiaire entre les deux premiers regroupe des individus performants dans la plupart des compartiments de la niche, mais en général moins compétitifs avec des espèces spécialistes. Une espèce à la base considérée comme généraliste peut voir la taille sa niche écologique se réduire par un évènement de spécialisation. Ce processus évolutif peut avoir lieu chez certaines populations en réponse aux caractéristiques de la communauté das lauelle ils s’isivet, à une zone géographique donnée ou aux changements globaux (Fox et Morrow, 1981 ; Thompson, 1994). La spécialisation peut être définie comme le opois volutif ete la apait d’ue espe à exploiter un gradient de ressource et la performance sur cette même ressource (Fox et Morrow, 1981 ; Barbault 2008). Malgré des études qui considèrent la spécialisation comme une impasse évolutive (Moran, 1988 ; Futuyma, 2001, d’autes tudes ot ot ue la spialisatio ’tait pas un état définitif et que toutes les trajectoires évolutives étaient possibles : généralistes - généralistes, généralistes - spécialistes, spécialistes - généralistes ou encore spécialistes - spécialistes (Thompson, 1994 ; Nosil, 2002).

I.3. La spécialisation écologique

Définition et concept La spécialisation écologique sulte d’ue divergence écologique (Schluter, 2001 ; Rundel et Nosil, 2005). Elle fait écho à la théorie des niches qui est défini par Hutchinson (1957) comme un hypervolume à « n » dimensions dont les axes sont constitués par les variables ou les ressources environnementales (Begon et al., 2006). La théorie de la niche écologique fait la synthèse de toutes les interactions entre une espèce et de son environnement (Hutchinson, 1957; Chesson, 2000). Par conséquent, ce concept combine les exigences écologiques de l'espèce et son rôle fonctionnel dans la communauté. La ihe ologiue d’ue espèce définit une capacité potentielle d’utilisation des ressources et de tolérance aux conditions environnementales, qui constitue sa « niche fondamentale », ’est-à-dire la place théorique qu'elle peut occuper das l’evioeet. Celle-ci est rarement totalement occupée puisu’à e iveau interviennent les interactions interspécifiques optitio, pdatio, paasitise, …. On définit alors pour chaque espèce une niche dite « réalisée » (Hutchinson, 1957 ; Begon et al., 2006 ; Keet, 2006). Cette distinction entre les deux échelles de niche découle du principe d’elusio optitive de Gause (1934), qui dit que deux espèces ne peuvent pas dans un écosystème se développer en exploitant parfaitement la même niche écologique (Futuyma, 2001). Le partitionnement de la ressource permet la séparation des niches écologiques et la diminution de la compétition entre les espèces (Chesson, 2000). Les espèces d'une même guilde doivent soit utiliser différentes formes de la ressource (Futuyma et Moreno, 1988 ; Ferry-Graham et al., 2002 ; Hardy et Otto, 2014), soit l'utiliser différemment dans le temps et dans l'espace pour survivre (Clavel, 2007) (Fig. 1).

Figure 1. Deux espèces avec exactement la même niche écologique e peuvet oeiste. L’volution mène soit à un déplacement de niche soit à une variation de largeur de niche conduisant à deux stratégies différentes : les espèces spécialistes et généralistes (Clavel ,2007).

En théorie, l’évolution tend à sélectionner les organismes qui présentent la meilleure fitness autrement dit la largeur de la niche d’une espèce devrait évoluer de façon à optimiser sa survie et son bilan énergétique entre acquisition et dépenses pour l’eploitatio d’ue essoue. Dans ce cas, la spécialisation écologique devrait intervenir quand elle permet une augmentation de la fitness des organismes (Futuyma, 2001). Cei est illust pa la thoie de l’optial foagig ui dfiit en fonction de la richesse énergétique, du temps de recherche et du temps de manipulation des ressources, l’évolution du régime alimentaire optimal d’un organisme (Pyke et al., 1977 ; Stephens et Krebs, 1986). Ce gain énergétique est primordial dans la compréhension des relations proie- prédateur et hôte-parasitoïde.

Les facteurs de spécialisation écologique Les conditions identifiées dans la majorité des modèles comme favorables à une spécialisation portent principalement sur les caractéristiques des ressources trophiques disponibles (Futuyma et Moreno, 1988 ; Thompson, 1994) et sur la nature des interactions qui existent au sein de la communauté biologique (; Hardy et Otto, 2014). Une ressource est un facteur de spécialisation notamment de par son abondance, sa fréquence au cours du temps, sa plus ou moins grande mobilité et les adaptations morphologiques et/ou physiologiques nécessaires à sa capture, sa consommation ou sa digestion (Thompson, 1994 ; Begon et al., 2006). Cette spécialisation écologique par la ressource a été très étudiée chez les insectes phytophages. Les compromis alimentaires sont au centre de la spéciation écologique chez les différents biotypes observés chez le puceron du pois Acyrthosiphon pisum (Peccoud et al., 2009), tout comme dans l’appaition de races d’hôtes chez la mouche de la pomme Rhagoletis pomonella (Feder et al., 1988 ; Filchak et al., 2000) ou encore chez la mouche Eurosta solidaginis (Craig et al., 1993) avec l’auisitio d’u ouvel hôte. Les interactions interspécifiques, plus particulièrement la compétition et la prédation jouent également un rôle important dans la spécialisation, de manière directe ou indirecte (Nosil et Crespi, 2006). Les compétiteurs tedet à faie flutue les iveau de essoue et aisi diiue l’as à la ressource. Les prédateurs augmentent le risque encouru lors de la recherche ou l’acquisition d’ue ressource. Il semble donc profitable pour une espèce soi de se spécialiser davantage sur une ressource pour augmenter son efficacité soi de déplacer ses exigences sur une autre ressource libre de compétiteurs ou limitant la prédation (Stephens et Krebs, 1986 ; Futuyma et Moreno, 1988 ; Ferry-Graham et al., 2002). De plus, la variation de l'environnement joue u ôle ipotat das l’évolution de la niche. La spécialisation est pensée comme une réponse évolutive à un environnement qui est stable dans l'espace et le temps, alors que les stratégies généralistes sont plus susceptibles d'être favorisées par

9 des environnements hétérogènes et perturbés (Kassen 2002). En d'autres termes, la probabilité de spécialisation est plus grande dans un environnement relativement stable que dans un environnement soumis à des changements (Scheiner, 2002). Les agroécosystèmes tels qu'ils existent dans l'agriculture des pays tempérés, en particulier française, sont principalement composés de deux types d’haitats, les habitats cultivés et les habitats semi-naturels, en proportions variables selon les contextes de production. Le milieu cultivé subissant de fortes perturbations due à l’alteae des cultures et aux pratiques culturales, comme le travail du sol ou l'usage de pesticides, (Rodriguez et Hawkins, 2000 ; Gurr et al., 2003) pourrait être propice au maintien du caractère généraliste chez les espèces qui y exploitent des ressources. Schématiquement, dans un tel environnement, le chevauchement des niches écologiques et la concurrence génèrent une force de sélection vers la spécialisation des espèces, mais l'instabilité de l'environnement et les variations dans la disponibilité des ressources permettent de promouvoir des stratégies généralistes.

De la spécialisation à la spéciation Pa le phoe de l’volutio, la spialisatio ologiue d’ue espe ou d’ue populatio peut conduire à une spéciation écologique (Schluter, 2001 ; Rundel et Nosil, 2005), qui peut avoir lieu dans tous les arrangements géographiques, allopatrie, parapatrie ou sympatrie (Matsubayashi et al., 2010). La spéciation est un processus évolutif qui induit les isolements reproductifs entre des individus appartenant à la base à la même espèce et ainsi entraîe l’appaitio d’ue ouvelle espèce (Ravigné, 2010). La spéciation écologique repose sur une divergence écologique initiale au sei de l’espe aestale - ’est-à-dire une adaptation à des environnements différents ou un hageet das l’utilisatio des essoues ou des haitats - qui entraîne l’talisseet de barrières aux flux des gènes entres les individus présentant des écologies contrastées et induit la foatio d’ue ouvelle espèce (Rundel et Nosil, 2005). La spéciation ne conduit pas obligatoirement et rapidement à des différences morphologiques entre les espèces. L’asee de différences morphologiques constitue des espèces qualifiées de cryptiques : morphologiquement semblables mais gtiueet diffetes Ma, . O peut l’epliue pa ue divegee trop récente entre les espèces pour que des différences morphologiques aient pu se mettre en place (Bickford et al., 2007) ou il peut exister une pression de sélection stabilisante pour maintenir certaines caractéristiques morphologiques dans des environnements spécifiques (Wake et al., 1983).

I.4. Importance et rôle du caractère généraliste/spécialiste dans l’effiait du service écosystémique de régulation

I.4.1. Le service écosystémique de régulation

Dans l'agriculture Européenne et particulièrement Française, l’agoologie est actuellement en plein développement. Cette science (Wezel et al., 2009) vient en appui du contexte réglementaire qui vise à liite l’utilisation des produits phytosanitaires, en France particulièrement via le plan Ecophyto iitialeet la e suite au Geelle de l’Evioeet dutio de % de l’usage des produits phytosanitaires, piloté par Miiste de l’agiultue, de l’agoalientaire et de la forêt) et constituant le plan national de la France dans le cadre de la directive Européenne 2009/128/CE. Pour aitei le iveau des edeets e diiuat l’utilisatio des pestiides, l’agoologie ise su la mobilisation des processus naturels pour réguler les bioagresseurs des cultures, dont les insectes ravageurs et les plantes adventices présents dans les parcelles cultivées (Tassin, 2011). Dans cette thèse, nous allons nous s’itesse plus patiulieet au sevie osstique de régulation des populatios d’isetes avageus, mobilisant les ennemis naturels de ces ravageurs (Power, 2010). Cette notion de service écosystémique a été définie par Daily (1997) et reprise lors du Millenium Ecosystem Assessment (2005). Les services écosystémiques ont été classés suivant quatre catégories : de support, d’appovisioeet, de gulatio et culturels. Les services de régulation concernent les bénéfices issus des processus écosystémiques régulant le cycle de l’eau, le climat ou le niveau des populations d'êtres vivants. Le contrôle biologique des ravageurs assuré par leurs ennemis naturels est un de ces services écosystémiques de régulation. L'objectif général est de renforcer ce contrôle biologique en mobilisant les différents types d'ennemis naturels. Cet objectif rejoint ceux de ce qu'on appelle plus classiquement la lutte biologique. On distingue trois stratégies de lutte biologique (Van Driesch et Reardon, R, 2004): - la lutte biologique par acclimatation qui consiste à introduire u auiliaie d’oigie eotiue das u ilieu olois pa u avageu, das le ut u’il s’ talisse de aie peaete et u’il assue ue gulatio duale des populatios du avageu. Celle-ci est le plus souvent utilisée quand le ravageur est lui-même non autochtone. Dans ce cas, l’auiliaie itoduit poviet e gal de la e aie d’oigie ue l’espe uisile. Les itodutios d’etoophages e Fae depuis le dut du e siècle ont été très nombreuses avec des résultats plus ou moins probants (Malausa et al., 2008). Pour limiter les risques d'effets non intentionnels de telles introductions, la réglementation récente mise en place en France (Décret n° 2012-140 du 31 janvier 2012).

- la lutte biologique inondative repose sur le principe de réaliser des lâchers massifs et pts d’auiliaies vivats atodes, aaies, isetes das la ultue ou das le sol afin de limiter les populations de ravageurs par prédation ou par parasitisme. Cela suppose l’eistee d’levages ou de productions de masse de ces organismes. Un des exemples les plus connus est l'utilisation des trichogrammes, Trichogramma brassicae, parasitoïdes oophages, pour lutter contre la pyrale du maïs Ostrinia nubilalis (Dicky et Byers, 1994 ; Smith, 1996 ; Wright et al., 2002). Dans cet exemple, la capacité du trichogramme à exploiter plusieurs espèces hôtes différentes est utilisée pour permettre une production économiquement viable, grâce à un hôte de substitution permettant l'élevage en masse de l'auxiliaire, différent de l'hôte cible. - la lutte biologique par conservation osiste e la aipulatio de l’evioeet dans le ut de favoise l’atio de gulatio des eeis atuels psets das les agosstes. Cette thode peut osiste e l’optiisatio des haitats favoisat l’istallatio des ennemis naturels en leur fournissant des ressources alimentaires ou des refuges qui se doivent d'être adaptés à ces espèces (Gurr et al., 2004 ; Heimpel et Jervis, 2005). Qu'en est-il du rôle de la spécialisation des ennemis naturels pour la lutte biologique par conservation ?

I.4.2. Importance du caractère généraliste en vue d’ue lutte iologiue pa conservation

Dans ce contexte, le aate galiste ou spialiste d’u ennemi naturel va grandement conditionner efficacité du service écosystémique rendu. L’effiait de la lutte biologique par conservation repose sur deux paramètres, la capacité de l’ennemi naturel à réguler efficacement les populations de ravageurs et la capacité des populations des ennemis naturels à se maintenir dans l’evioeet local (Thomas et al., 1992 ; Barbosa, 1998). Ces deux paramètres sont fortement iflues pa le deg de spialisatio de l’ennemi naturel. Plus celui-ci sera spécialisé sur le ravageur, plus il devrait être efficace (Straub et al., 2011). Cependant un niveau trop élevé de spécialisation peut être une contrainte forte, notamment par rapport au deuxième paramètre. En absence du ravageur cible (absence de la culture), l’eei atuel sans ressource ne peut se maintenir localement et la colonisation de la culture lors de l'apparition du ravageur au printemps suivant peut être ralentie et ainsi réduire l'efficacité de cet ennemi naturel malgré son fort degré de spécialisation (Holt et Lawton, 1993). Les ennemis naturels plus généralistes, qui pourront survivre e l’asee du avageu ile e eploitat d’autes essoues psetes das l’evioeet semblent être des cibles privilégiées pour développer des méthodes de lutte biologique par conservation (Devictor et al., 2010 ; Straub et al., 2011). Une autre façon pour ces espèces de se

12 maintenir en absence de ressource et notamment durant la période hivernale est de développer des statgies d’hiveatio comme la diapause ou la migration, qui peuvent dans certains cas coexister au sei d’ue e espe Lapet et al., 2010 ; Raymond et al., 2013). Les conditions de température hivernales représentent une contrainte environnementale forte notamment pour les organismes ectothermes comme les insectes et les organismes au sommet des chaînes trophiques doivent répondre à une baisse de la densité de ressources alimentaires (Danks, 2007 ; Bale et Hayward, 2010). Le passage de l’hive est u poessus d’ue ipotae uiale das le le écologique des organismes et potentiellement structurant pour les populations (Lampert et al., 2010). Le climat océanique qui se caractérise par un hiver doux, accentué par le réchauffement climatique contribue à limiter les phases de diapause chez les insectes, pouvant structurer les espèces. Par exemple, les conditions hivernales vont influencer chez les pucerons le mode de reproduction durant cette période (Simon et al., 1999 ; Delmotte et al., 2001 ; 2003). L'anholocyclie (voir ci-dessous) observée chez beaucoup d'espèces en climat océanique conduit au maintien d'une population active, susceptible d'être exploitée par des ennemis naturels. Fialeet, l’eei atuel "idéal" devrait être spécialisé sur le ravageur cible, tout en gardant un « degré de généralisme » peettat so aitie das l’evioeet loal, à proximité des parcelles agricoles à protéger. Plusieurs pistes peuvent être mobilisées pour mettre en place une lutte biologique par conservation reposant sur de tels ennemis naturels : - Instaurer de la compétition apparente, qui se définit comme une interaction indirecte entre deu espes pa l’itediaie d’u eemi naturel commun (Holt, 1977), c’est-à-dire que la psee d’ue espe donnée, par exemple un insecte phytophage, conduit à augmenter les iveau de populatios d’u eei ou à deux espèces, ce qui entraîne une diminution des niveaux de population de la deuxième espèce (Holt et Lawton, 1994 ; Van Veen et al., 2006). Il existe quelques exemples connus de compétition apparente, notamment chez les parasitoïdes (Bonsall et Hassell, 1997 ; Morris et al., 2004, Van Veen et al., 2006) ; il y a moins d'exemples documentés dans les relations proies-prédateurs, malgré un fort potentiel, puisque les prédateurs étant moins spécialisés, ils seront potentiellement capables de consommer un plus large éventail de proies (Van Veen et al., 2008). - Améliorer les conditios d’hiveation, puisque celles-ci peuvent conditionner grandement l’effiait du contrôle biologique, notamment pour la coïncidence temporelle de la epise d’ativit des ravageurs et de leurs ennemis naturels. Les activités hivernales des parasitoïdes ont une grande importance dans la suppression des populations printanières de pucerons (Plantegenest et al., 2001). L’itt du modèle hôte-parasitoïde est que la diapause de ce dernier peut avoir lieu avec son hôte. Le calage parfait des cycles biologiques peu avoir comme conséquence de réduire de décalage dans la epise d’ativit. Ceci est surtout théorique, car les systèmes pucerons-parasitoïdes en hiver ont

t ts peu tudis, e aiso des diffiults d’hatilloage et de la faile desit de pucerons et de parasitoïdes à cette période (Krespi, 1990 ; Krespi et al., 1997 ; Andrade et al., 2013 ; Neuville et al 2015). Plus généralement, une plus grande quantité d'habitats semi-naturels dans le paysage pourrait améliorer le contrôle des ravageurs par des parasitoïdes en leur fournissant proies ou hôtes alternatifs (Landis et al., 2000). De nombreuses études ont également démontré l'importance des habitats semi-naturels dans les agroécosystèmes pour fournir aux populations d'ennemis naturels des abris ou des ressources alimentaire (nectar, pollen ...) pour les stades adultes (Tscharntke et al, 2007; Ricci et al, 2011) et ainsi possiblement améliorer leur efficacité dans la lutte biologique (Rusch et al, 2012; Langer et Hance, 2004; Ahlmedi et al, 2011).

I.4.3. Dfii le aate galiste ou spialiste d’u prédateur ou parasitoïde

Pour tenter de gérer ces organismes prédateurs ou parasitoïdes à des fins de lutte biologique par conservation, il est donc primordial d'identifier précisément les interactions trophiques entre ces organismes et les insectes phytophages, autrement dit de déterminer « qui mange qui ? » ou « qui parasite qui ?». L'acquisition de ces connaissances est notamment l'objectif de l’tude des seau trophiques los d’tudes des communautés (Hall et Raffaelli, 1993 ; Woodward et al., 2005). L’ologie des ouauts a pou ut de dfii les elatios tophiues ete les espes de la communauté mais aussi de comprendre comment se répartissent les interactions entre espèce par l’estiatio du oe de lies existant entre le niveau trophique inférieur et supérieur (généraliste- spécialiste) (Bersier et al., 2002 ; Banasek-Richter et al., 2009). La définition du caractère généraliste d’u pdateu ou parasitoïde est complexe. Pour être en mesure de classer une espèce comme un spécialiste ou un généraliste, il faut tenir compte de nombreux aspects de leur biologie, de leur l'écologie et de leur phylogénie. Les relations proies - prédateurs sont difficilement identifiables, puisu’elles nécessitent des observations directes de consommation de la proie qui sont rarement possibles en conditions naturelles, notamment chez les insectes, ou des examens de résidus alimentaires (dans les fèces ou les contenus stomacaux). Depuis quelques années, le développement d’outils olulaies peet d’tudie dieteet à pati d’hatillos de teai la gae de ressources réellement consommée par un prédateur pa l’aalse des oteus stoaau, notamment utilisé pour étudier le régime alimentaire des carabes (Boreau de Roincé et al., 2012). Les interactions hôtes-parasitoïdes comparées aux relations proies-prédateurs sont a priori nettement plus accessibles. Il suffit de récolter directement des hôtes parasités qui restent pendant un certain temps sur les végétaux hôtes du phytophage, ou de maintenir en élevage des hôtes récoltés vivants jusu’à l’egee du paasitoïde ou de rechercher la présence d'un parasite

14 directement par dissection (Memmott et al., 1994 ; Valladares et al., 2001 ; Macfadyen et al., 2009). Ces méthodes ont toutefois des limites, dues au coût et à la difficulté de l'élevage de certaines espèces au laboratoire et à l'impossibilité d'identifier les parasitoïdes obtenus par dissection au stade larvaire. La gae d’hôtes d’u paasitoïde est galeet aessile pa ue thode olulaie permettant de détecter et d'identifier à l’itieu de l’hôte le paasitoïde gâe à des aueus génétiques spécifiques. Cette méthode a notamment été développée récemment chez les pucerons (Derocles et al., 2012). Pou Pouli et Mouillot , la gae d'hôtes des paasitoïdes est fotio du oe d’hôtes u’ils peuvet utilise et l'appaeteet de es hôtes. Helus et al. ot popos l'utilisatio d’ue thode asée sur la variabilité phylogénétique des espèces hôtes (PSV), qui a été montré comme une mesure intéressante pour la spécialisation des parasitoïdes de pucerons. Desneux et al., (2012) ont montré une spécialisation parasitaire chez Binodoxys communis en lien avec la phylogénie des hôtes. Toutefois, les informations sur la largeur des gammes d’hôtes eploites pa les paasitoïdes sot oteues à pati des osevatios dietes su le teai et à pati d’tudes réalisées en laboratoire avec des lignées de parasitoïdes. L’esele de ces données permet d’tali la gamme d’hôtes théoriquement exploités par une espèce. Mais celle-ci correspond aux hôtes petois su l’esele de son aire de répartition, sans prise e opte d’ue vaiailit géographique de la répartition des espèces hôtes et de la spécialisation locale des parasitoïdes. De plus, ces gammes d'hôtes ne donnent généralement aucune information quantitative sur la fréquence d'exploitation des différentes espèces (Shaw, 1994).

Afin d’tudie l’eistee d’espes galistes e oditios naturelles au sein des agroécosystèmes, nous nous sommes intéressés au modèle hôte – parasitoïde et plus particulièrement au modèle puceron – parasitoïde Aphidiinae. Nous allons nous attacher à définir les spetes d’htes els des Aphidiiae das u evioeet ie dliit et à observer la daiue d’eploitatio tepoelle des htes. Ce odle devait nous permettre de définir quels sont les facteurs qui jouent un rôle dans la spécialisation des espèces et d'étudier la répartition des espèces généralistes et spécialistes au sein des différents habitats offerts par les agroécosystèmes. Ceci doit contribuer à l'évaluation du service de régulation rendu par ces Aphidiinae et de la possibilité de renforcer le contrôle biologique des pucerons nuisibles aux cultures par ces parasitoïdes Aphidiinae.

II. Modèles d’tude

II.1. Les pucerons

Les pueos appatieet à l’ode des Heiptea. Ils possdet, oe tous les ees de l’ode, des pièces buccales de type piqueur-suceur qui leur permettent de se nourrir de la sève phloémienne des plantes. Les pucerons au sens strict appartiennent à la famille des Aphididae qui compte environ 4700 espèces au niveau mondial, dont 900 sont présentes en France (Nieto-Nafria et Mier-Durante, 1998 ; Blackman et Eastop, 2006). La grande diversité des pucerons est expliquée par une radiation évolutive parallèle à celle des Angiospermes et Gymnospermes au Crétacé (Von Dohlen et Moran 2000 ; Peccoud et al., 2010). Environ 60 % des espèces de plantes connues sont hôtes de pucerons en Europe (Dixon et al., 1987). Les pucerons présentent des cycles de développement caractérisés pa ue pathogse liue. Au ous de l’ae, de oeuses gatios parthénogénétiques alternent avec une génération sexuée (Fig. 2). La reproduction pathogtiue a lieu duat la plus gade patie de l’ae, du piteps à l’autoe. Les femelles diploïdes produisent des descendants femelles diploïdes, sans fécondation. Les colonies de pucerons ainsi formées correspondent à des colonies de clones puisque les descendants sont génétiquement identiques aux pucerons fondateurs des colonies, aux mutations près. Durant la phase parthénogénétique, la taille des colonies de pucerons augmente de façon extrêmement rapide du fait de l’eoîteet des gatios, due à la viviparité, les femelles donnant naissance à des larves après une embryogénèse interne. Une femelle est en âge de se reproduire en moins de 15 jours après quatre stades larvaires. Ce mode de reproduction explique en grande partie la nuisibilité de ces insectes (Dedryver et al., 2010). À l’autoe, les pueos poduiset des idividus seus âles et feelles ui vot s’aouple et poduie des œufs. Chez diveses espes de pucerons, le passage à la epodutio seue s’aopage d’ue alteae d’hôte, les gatios parthénogénétiques se développant sur des plantes herbacées tandis que les générations sexuées se développent sur des hôtes ligneux, ce sont des espèces dites dioéciques (10 % des espèces). À l’ivese, des espes dites ooiues ’effetuet pas e hageet d’hôte et le le de développement se déroule entièrement sur une plante herbacée ou sur une plante ligneuse. La phase de reproduction sexuée peut disparaître partiellement ou totalement au sein de certaines espèces ou populations, en lien avec les conditions climatiques hivernales ; dans ce cas on parle de pucerons anholocycliques, e oppositio à l’hololie ui est le ode aestal de epodution des pucerons. Les deux formes de reproduction, sexuée et asexuée, diffèrent en termes de bénéfices dans la dynamique évolutive des espèces (Simon et al., 1999 ; Delmotte et al., 2001 ; 2003). La

epodutio seue etaîe la podutio d'œufs diapausants qui constituent une forme de sistae à l’hive, et conduit à un brassage génétique régulier qui confère aux pucerons une apait d'adaptatio e as de petuatio de l’evioeet. La reproduction asexuée permet une production très importante de descendants. Cette stratégie est adaptée à un environnement à hivers doux, ce qui est souvent le cas en Bretagne où le climat océanique permet une reproduction parthénogénétique toute l'année, sans production de formes de résistance hivernale. Toutefois, le coût de cette stratégie de reproduction peut être élevé s'il survient un hiver rigoureux. De plus, la possibilité de réponse à un changement environnemental de la part de ces individus est limitée (Simon et al., 1999 ; Delmotte et al., 2001 ; 2003).

Hôte secondaire

Printemps Été

Larves

Reproduction asexuée

ou Œufs

Reproduction sexuée Hiver Automne

Hôte primaire

© Anne Le Ralec Figure 2 : Cycle biologique des pucerons. Le cycle complet fait alterner une génération sexuée avec « n » générations asexuées (Parthénogénèse cyclique), avec dans certains cas une alternance d'hôtes.

Les particularités de leur mode de reproduction confèrent aux pucerons une dynamique de population exponentielle au printemps. La dynamique théorique des populations des espèces de puceron peut être schématisée en 5 phases (Fig. 3) : - Phase d’istallatio et de oissae des oloies : à la sortie de l'hiver, les pucerons oloiset les plates hôtes et se ultipliet. Cette phase peut te pde d’u vol d’igatio ui oespod au passage de l’hôte piaie ves l’hôte seodaie espes hololiues dioéciques) (Hullé et al., 1999). (1) - Phase de forte croissance et de dissémination, période où le vol des pucerons est le plus important (Hullé et al., 1999 ; Turpeau-Ait Ighil et al., 2011). Les individus des colonies primaires devenues très importantes se disséminent à grande échelle. (2) - Le "mid-season crash" (Karley et al., 2004) qui correspond à une phase de chute brutale des effetifs de pueos au ilieu de l’t due à la ojugaiso de plusieus fateus : diiutio de la qualité nutritionnelle des plantes hôtes (senescence), émigration, pression des ennemies naturels (3) - Phase de réinstallation, en automne une nouvelle colonisation des plantes peut être observée, celle-i s’aopage d’u vol de etou ves l’hôte piaie espes hololiue dioéciques) (Hullé et al., 1999 ; Turpeau-Ait Ighil et al., 2011). (4) - Phase de maintien hivernal avec survie d'individus aux stades larvaires et adultes et ultipliatio e fotio des oditios liatiues e liat oaiue ou sous foe d'œufs diapausants, sans multiplication en climat continental. (5)

160 140 Elevé Elevé 120 100 80 60 Moyen

40 Bas 20 Niveau des populations 0

Au cours du temps

Figure 3 : Les 5 phases de la dynamique théorique des populations des espèces de pucerons au cours d’ue ae.

Les cycles iologiues et l’aodae des espèces de pucerons peuvent varier selon des paramètres de l’evioeet, tels ue la tepatue vaiatio liale latitudinale ; Llewellyn et al., 2003), la disponibilité et le stade phénologique de la plante hôte (Plantegenest, 1995). Au sei d’ue espe de puceron, ces variations peuvent ainsi avoi u ipat su la dogaphie, l’ologie et l’volutio des espèces (Halkett et al., 2006). De plus, la grande majorité des espèces de pucerons ont des spectres d'hôtes relativement étroits. Beaucoup se développent sur une ou un petit nombre d'espèces de plantes, généralement appartenant à la même famille botanique, si l'on ne considère pas l'alternance d'hôtes liée à la reproduction sexuée. Par exemple le puceron cendré du chou, Brevicoryne Brassicae, exploite uniquement des plantes appartenant à la famille des Brassicaceae. Au otaie, uelues espes sot apale d’eploite u gad oe de plates hôtes, oe Myzus persicae et Aphis fabae ue l’o a djà etouv su plusieus dizaies de plates appateat à plusieurs familles botaniques (Blackman et Eastop, 2006). Des études récentes ont révélé que la spécialisation à la plante hôte était plus grande qu'on ne le pensait. Chez plusieurs espèces, des races d'hôtes ont été mises en évidence (Peccoud et al., 2010). C'est le cas chez le puceron du pois Acyrthosiphon pisum, chez qui 12 races d'hôtes ou biotypes ont été identifiées sur différentes espèces de Fabacées (Peccoud et al., 2009 ; Peccoud et Simon, 2010), ainsi que chez Aphis gossypii où cinq races d'hôtes ont été identifiées sur des plantes de la famille des cucurbitacées, sur coton, et sur différentes solanacées (Carletto et al., 2009). Ces espèces de pucerons semblent donc fortement structurées par les plantes hôtes. L’esele des aatistiues iologiues des pueos psetes i-dessus contribuent à expliquer l'importance et la diversité des dégâts engendrés sur les cultures. Ils peuvent entraîner des pertes de rendement très importantes, allant par exemple jusqu'à 30 qtx/h sur blé. Les pucerons attauet ps d’ue espe vgtale sur quatre, qu'il s'agisse de végétaux ligneux ou non ligneux. Ils posent des problèmes sur de nombreuses plantes cultivées, en grandes cultures, sur les céréales, les fabacées, les brassicacées, mais aussi en maraîchage, par exemple sur laitue (Miller, 2005) et dans les vergers, avec des espèces de pucerons comme Dysaphis plantaginea et Aphis pomi sur pommiers. “u l’esele des espes oues, seule ue etaie evio, auait de el ipat ooiue sur les cultures (Dedryver et al., 2010). Les dégâts causés peuvent être de deux types, les dégâts directs : affaiblissement de la plante par la spoliation de sève élaborée, enroulement des feuilles ou podutio de galles dus à l'ijetio de salive, … et les dgâts idiets : tasissio de vius, développement d'un champignon saprophyte, la fumagine sur le miellat excrété par les pucerons … (Fig. 4). Cette forte nuisibilité a conduit à développer des moyens de lutte contre ces organismes, tout d'abord majoritairement chimiques, mais aussi biologiques, par la lutte biologique, plus espetueuse de l’evioeet.

Dégâts directs

Dégâts indirects

Figure 4 : Exemples de dégâts directs et indirects provoqués par les différentes espèces de pucerons. Pour les dégâts directs, de gauche à droite et de haut en bas : Aphis gossypii sur courgette, Dysaphis plantaginea sur pommier, Brevicoryne Brassicae sur colza et galle de Pemphigus spyrothecae sur peuplier. Les deux exemples de dégâts indirects sont de gauche à droite : Pea Enation Mosaic Virus (PEMV) transmis par Acyrthosiphon pisum sur pois et fumagines sur miellat de Takecallis arundicolens sur feuille de bambou

II.2. Les parasitoïdes Aphidiinae

Les paasitoïdes sot des ogaises dot les laves se dveloppet au dpes d’u seul hôte dont ils entraînent la mort (Godfray, 1994; Quicke, 1997). Ils représentent ainsi un mode de vie itediaie ete les pdateus et les paasites puisue l’hôte est sstatiueet tu et u’il existe une dépendance physiologique étroite entre le parasitoïde et son hôte. Les parasitoïdes de pucerons appartiennent à l’ode des Hymenoptera, et, pour une grande majorité, à la famille des Braconidae, sous-famille des Aphidiinae. Cette sous-famille comprend 60 genres et environ 400 espèces (Sanchis et al., 2001) dont au moins 120 sont répertoriées en France (Starý et al., 1977), mais l’itt pou le goupe fait que le nombres de taxons décrits est en constante augmentation (Starý et al., 2010 ; Petrovic et al., 2011). La systématique des Aphidiinae a fait l’ojet de plusieurs publications à la fois basée sur des caractères morphologiques (Gärdenfors, 1986 ; O’Donnell, 1989 ; Finlayson, 1990) et moléculaires (Smith et al., 1999 ; Kambhampati et al., 2000 ; Sanchis et al., 2000 ; Shi et Chen, 2005). Malgré de nombreuses études, la systématique du groupe est encore en constante évolution, notamment autour des genres primitifs Ephedrus ou Praon. Les Aphidiinae sont des endoparasitoïdes solitaires koinobiontes (Godfray et Shimada, 1999), ce qui signifie ue les stades iatues de es isetes se dveloppet à l’itieu de leu hôte e maintenant ce dernier vivant jusqu'à la fin du développement larvaire (Fig. 5) (Askew et Shaw, 1986). Accouplée ou vierge, la femelle va chercher à pondre dans un puceron. La majorité des espèces psetet ue pathogse ahotoue, les œufs o fods, donc haploïdes, donnant des âles, et les œufs fods, diploïdes, des femelles. En absence d'accouplement ou dans le cas d'une incompatibilité mâle / femelle, la descendance de la femelle sera donc entièrement composée de mâles. Une parthénogénèse thélytoque a été observée chez certaines espèces, par exemple au sein du genre Lysiphlebus (Belshaw et al., 1999 ; Belshaw et Quicke, 2003). La femelle parasitoïde pond u œuf das u pueo dot le stade peut alle du er stade larvaire à l'adulte aptère, en passant par les larves de stade 3 ou 4 avec fourreaux alaires. Après 2 à 3 jours, l’œuf éclot et la larve se développe aux dépens de son hôte en se nourrissant tout d'abord d’holphe. La pote est aopage d’ue ijetio de vei ui etaîe ue astatio parasitaire du puceron, par destruction des ovaires et lyse des embryons déjà formés (Digilo et al., 2000). Cette action du venin, associée à celles des sécrétions issues des tératocytes, cellules provenant de la séreuse embryonnaire, permet au parasitoïde de détourner le métabolisme de son hôte à son profit, et assure sa nutrition durant le développement larvaire (Falabella et al., 2000). Après trois stades larvaires, la larve consomme les organes vitaux du puceron entraînant sa mort, tisse un cocon de soie à l'intérieur de la cuticule du puceron, puis et se nymphose. Le puceron mort contenant la nymphe du parasitoïde est alors au stade momie, momie qui reste fixée au support

21 végétal par la soie du cocon (Fig. 6). Après la mue imaginale, l'adulte du parasitoïde en émerge, après avoir découpé un opercule à la surface de la momie (Fig. 6). Le cycle complet dure 15 jours à 20 °C. Dans la nature, les mâles émergent avant les femelles, ce qui diminue le temps entre deux générations (Minks et Harrewijn, 1988). L’aoupleet se fait apideet aps l’egee a il faut peu de temps pour que les adultes deviennent matures (Minks et Harrewijn, 1988), les femelles étant proovogéniques (Le Ralec, 1995). Avant de pouvoir pondre, les femelles doivent rechercher un hôte potentiel, les facteurs qui interviennent lors de cette recherche constituant une partie des mécanismes responsables de la specialisation parasitaire (Le Lann et al., 2008). Selon le schéma de Vinson (1976), un parasitoïde doit, pour réussir son développement, franchir successivement différentes étapes. Celles-ci peuvent être classées en deux catégories, la 1ère concerne la femelle adulte, qui doit localiser les hôtes pour y dpose ses œufs, on parle alors d'étapes pré-ovipositionnelles. Puis dans un deuxième temps, après la pote, la lave doit te apale de se dveloppe das le ops du pueo, il s’agit des tapes post-ovipositionnelles. Du fait du dveloppeet à l’itieu de l’hôte, les paasitoïdes entretiennent un lien étroit avec leur hôte. Ils doivent être capables de répondre aux défenses physiologiques des hôtes et d'y puiser les ressources nécessaires à leur développement. Chacune de ces étapes est source de spécialisation. Pour un parasitoïde généraliste, la capacité à exploiter un grand nombre d'espèces hôtes différentes implique de pouvoir localiser, infester et se développer avec succès sur u gad oe d’espes aat des aatéristiques morphologiques et physiologiques variées. Les étapes pré-ovipositioelles opeet la dtetio d’u hôte potetiel à log distae et la eoaissae d’u hôte à oute distae. À logue distae, les stimuli olfactifs produits par la plante semblent jouer un rôle très important dans la détection d’hôtes potetiels (Vet et Dicke, 1992). Les plantes libèrent en continu ou sous forme de patchs des substances olfactives qui pourraient orienter précocement les femelles en direction des hôtes. Cette attractivité des plantes hôtes a été montré chez plusieurs Aphidiinae, comme Diaeretiella rapae, attirée par les composés secondaires émis par les plantes de la famille des Brassicacées, saines (Vaughn et al., 1996 ; Bradburne et Mithen, 2000 ; Pope et al., 2008) ou attaquées par des aphides (Blande et al., 2007). Chez Aphidius ervi, c'est le complexe plante-pucerons qui attire les femelles à distance (Guerrieri et al., 1993 ; Du et al., 1998), grâce aux composés secondaires émis par la plante lors d’ue attaue de pueos. La dtetio des pueos hôtes su la plate pa les feelles Aphidiinae peut faire appel à différents stimuli, visuels (Michaud et Mackauer, 1994, 1995) ou chimiques, telle la perception odorante du miellat ou des phéromones d'alarme des pucerons (Hatano et al., 2008). La reconnaissance et l'acceptation finale des hôtes reposent également sur des stimuli chimiques, essentiellement gustatifs, externes au niveau cuticulaire par exemple

(Weinbrenner et Völkl, 2002 ; Muratori et al., 2006) ou internes, au niveau de l'hémolymphe des aphides, perçus via les récepteurs sensoriels de l'ovipositeur (Le Ralec et Rabasse, 1988). Dans ce processus de sélection de l'hôte, depuis la perception de la plante jusqu'à l'acceptation de l'hôte, la reconnaissance de l'hôte adéquat peut se faire plus ou moins précocement selon la spécialisation du parasitoïde. En effet, certaines études ont montré que les espèces spécialistes étaient capables de détecter un hôte adéquat à longue distance (Mackauer et al., 1996 ; Dicke, 2009). Cette reconnaissance précoce éviterait le coût associé à la manipulation de l'hôte pour une reconnaissance par contact ; les espèces plus généralistes ayant une probabilité plus grande que le puceron détecté soit exploitable, auraient un coût plus faible à cette manipulation. Le coût associé à la manipulation des hôtes provient en partie des comportements des espèces de pucerons en psee d’u paasitoïde. Il peut s'agi de la hute volotaie de la plate pa le pueo par exemple chez A. pisum ; Dion et al., 2011), de l’issio de stios oiulaie ou d'autes comportements comme des mouvements de pattes et d'antennes. La capacité de contournement ou d’viteet de es dfeses peut te u fateu de spialisatio. Après avoir détecté et reconnu un hôte potentiel, ce qui conduit à l'oviposition, viennent les étapes post- ovipositionnelles. Le développement dans le corps d'un hôte vivant implique de nombreuses contraintes fonctionnelles, notamment pour les ressources alimentaires qui sont limitées et pas obligatoirement accessibles directement. Le processus de régulation métabolique de l'hôte induisant la castration parasitaire permet chez les Aphidiidae d'assurer l'alimentation de la larve jusqu'à la nymphose (Pennacchio et Strand, 2006). Si cette régulation ne se fait pas complètement, le parasitoïde peut mourir avant la fin de son développement préimaginal (Le Ralec et al., 2011). De plus, la larve du parasitoïde doit être capable de contourner les mécanismes de défense immunitaire de l’hôte (Govind et al., 2008). Chez les Aphidiinae, cet aspect est encore mal connu, de même que les mécanismes immunitaires chez les pucerons hôtes (Poiré et Coustau, 2011). En revanche, le rôle de bactéries symbiotiques dans la protection des pucerons contre leurs parasitoïdes a fait l'objet de nombreuses recherches récentes (Ferrari et al., 2004 ; Oliver et al., 2010). Chacune des étapes de l'interaction parasitoïde – puceron recèle des facteurs de spécialisation, puisque pour être généraliste, une espèce devra posséder un ensemble d'adaptations lui permettant de contourner les différentes barrières chez plusieurs espèces de pucerons. Cela peut expliquer pouuoi u spialiste sea plus pefoat u’u galiste, e lie ave le deg d’adaptation des parasitoïdes aux caractéristiques morphologiques, comportementales et physiologiques des espèces de pucerons. La largeur du spete d’hôtes des Aphidiinae, qui correspond au nombre d'espèces de pucerons exploitées par une espèce, traduit donc ce degré de spécialisation parasitaire.

Figure 5 : Cycle biologique des parasitoïdes Aphidiinae

@ INRA Bernard Chaubet

Figure 6 : Moie d’Aphidius ervi et egee d’u paasitoïde II.3. Spécialisation parasitaire chez les Aphidiinae

Chez les Aphidiinae, il existe un continuum de spécialisation entre des espèces qui ne parasitent u’ue espe de pueo, tel Aphidius eadyi qui exploite uniquement le puceron du pois A. pisum

24 ou encore Aphidius microlophii connu seulement sur le puceron de l'ortie Microlophium carnosum. E oppositio, d’autes Aphidiiae paasitet plusieus dizaies d’espes de pueos (Kavallieratos et al 2004 ; Starý, 2006). C'est par exemple le cas de Diaeretiella rapae, l'espèce d'Aphidiinae la plus galiste au egad de la littatue, puisu’elle est etioe oe eploitat ue etaie d’espes de pueos su l’esele de son aire de répartition (Singh et Singh 2015). Il en est de même pour Lysiphlebus fabarum qui a été collecté sur 76 espèces de pucerons hôtes dans le monde (Kavallieratos et al., 2004 ; Starý, 2006). La figure 7, issue d'une large analyse bibliographique du spectre d'hôtes des Aphidiinae (Besson, 2013), illustre la répartition des espèces en fonction de la largeur de leur spectre d'hôtes théorique, c'est-à-dire celui obtenu en compilant tous les relevés d'une espèce de parasitoïde donnée sur les différents pucerons signalés dans la littérature, quels que soient les lieux, les dates et les fréquences de ces interactions.

70 58 60 50 40 32 30

parasitoïdes 20 12 12 9 7 5 Nombre d'espèces Nombre d'espèces de 10 4 1 1 2 3 1 3 1 2 1 2 1 1 1 2 2 1 1 2 1 1 1 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 20 21 22 23 24 27 28 35 37 40 56 58 62 76 77 90

104 Nombre d'espèces de pucerons hôtes

Figure 7 : Spectres d'hôtes théoriques des Aphidiinae, issus de la littérature, exprimés en nombre d’espes de paasitoïdes eploitants « x » espes de pueos diffetes su l’esele de leu aire de répartition (Besson, 2013).

On constate que les espèces spécialistes, attaquant une ou deux espèces aphidiennes dominent largement, avec 90 espèces sur les 171 répertoriées dans cette étude. 45 espèces ont un spectre d'hôtes qu'on peut qualifier d'intermédiaire. On peut citer par exemple Ephedrus cerasicola avec trois espèces exploitées ou Trioxys pallidus exploitant cinq espèces. Seules 36 espèces ont été répertoriées sur plus de 8 espèces de pucerons, telle Binodoxys centaurea qui exploite 10 espèces et très peu dépassent la vingtaine d'hôtes. De plus, à l’itieu d’ue gae d’hôtes de paasitoïdes, certains hôtes sont préférés et sont plus avantageux pour le développement des parasitoïdes (Storeck et al., 2000 ; Ode et al., 2006). Ils seront parasités plus fréquemment. Une des principales limites des spectres d'hôtes obtenus par ces compilations est qu'ils concernent l’esele de l'aie de patitio de haue paasitoïde. Or, des variations géographiques du spete d’hôtes ont été mises en évidence chez différentes espèces, comme par exemple chez

Diaeretiella rapae qui dans le sud de la France exploite couramment Rhopalosiphum padi sur céréales (Hopper et al., 1995), alors que l’o ne retrouve que très rarement cette espèce sur ce puceron en Bretagne (Rabasse et Dedryver, 1983 ; Krespi, 1990). Le aitie d’u oe duit de paasitoïdes galistes peut te epliu pa plusieus paramètres. Une stratégie généraliste pourrait être avantageuse en cas de faible disponibilité des ressources ou de l'instabilité de l'environnement (Levins, 1962 ; MacArthur et Pianka,1966 ; Futuyma et Moreno, 1988), comme nous l'avons vu plus haut. Dans les agroécosystèmes où la disponibilité et la nature des ressources varient considérablement dans l'espace et le temps, les espèces généralistes ayant un comportement plastiue das l’eploitatio de diffets hôtes devraient par conséquent avoir un meilleur rendement à l'échelle de la métapopulation. La plasticité comportementale et le manque de fidélité à un hôte semblent les principaux mécanismes permettant le maintien des phénotypes généralistes. Andrade et al. (2013) ont montré que le parasitoïde Aphidius rhopalosiphi pourrait parasitent soit R. padi et Sitobion avenae en hiver en fonction de leur disponibilité et n'a trouvé aucune spécialisation d'hôte au printemps. La nécessité de rester généraliste pendant l'hiver lorsque les hôtes sont rares est souligné par les auteurs comme le facteur entravant la spécialisation à l’hôte et permettant ainsi la persistance d'un phénotype généraliste. Les généralistes pourraient donc exploiter séquentiellement un ou quelques hôtes au ous d’ue ae, e fotio de l’aodae des ressources disponibles sans entrer dans des processus irréversibles d'adaptation locales (Raymond et al., 2015).

II.4. Ves la ise e plae d’ue lutte iologiue pa osevatio, états des connaissances des communautés hôte-parasitoïde

Dans un contexte actuel, où la diiutio de l’utilisatio des pestiides est ue poupatio majeure, l'une des voies explorées pour limiter les pertes de récolte dues aux bioagresseurs est l'utilisation des processus écologiques de régulation des populations. Il existe trois moyens de lutte biologique différents (méthodes détailler dans la partie I.4) Nous nous intéressons ici aux précédentes utilisations des parasitoïdes de pucerons comme moyen de lutte. Ils ont été utilisés en lutte biologique par acclimatation (Van Driesche et Reado, , où l’ojetif est d’itoduie das l’evioeet ue espe de paasitoïde veat d’u aute pas ou otiet, capable de réguler les populations du ravageur. Ce fut le cas pour Aphidius ervi introduit en Amérique du Nord en 1959 (Angalet et Fuester, 1977) et au Chili il y a environ 40 ans (Zuniga, 1990) pour lutter contre le puceron du pois (A. pisum). La lutte biologique inondative ou par augmentation, qui correspond à la multiplication des parasitoïdes en insectarium, par exemple par des entreprises comme Biobest ou Koppert, et la

26 réalisation de lâchers inondatifs, est très utilisée sous serre (Van Lenteren et al., 1997), par exemple ote les pueos des solaaes toates, auegies, … ou des faisies. En revanche les lâchers e plei hap ’ot pas eu l’effet esopt, car les parasitoïdes tendent à se disperser rapidement au-delà de la zone à protéger (Muratori et al., 2000). Enfin la dernière méthode, dite « par conservation », a pour but de favoriser et d’améliorer l’effiait des paasitoïdes Aphidiiae psets das l’evioeet e assuat le aitie des populations et en augmentant les effectifs, en leur fournissant des habitats et des ressources supplémentaires (Langer et Hance, 2004). La gestion des bords de culture pour favoriser la compétition apparente entre pucerons a permis dans certains cas de ralentir la croissance des populations de ravageurs (Langer et Hance, 2003 ; Levie et al., 2005), mais pas systématiquement (Frere et al., 2007). L’esele des espes des Aphidiinae étant toutes des parasitoïdes de pucerons, cette forte spialisatio su ette essoue est u avatage e vue d’ue lutte iologiue pa osevatio, puisque cela signifie que ces organismes doivent avoir une capacité importante de régulation de ces avageus. Ce fot deg de spialisatio ’ephe pas l’eistee d’espes capables d’eploite plusieurs dizaines d’hôtes (Kavallieratos et al., 2004 ; Starý, 2006). La période précédant le retour du ravageur dans la parcelle constitue u fateu dteiat das l’effiait de la lutte iologiue. L’effiait side das l’appaitio ts apide des Aphidiiae ds la oloisatio de la ultue pa le ravageur (Chang et Kareiva, 1999 ; Rauwald et Ives, 2001 ; Neuville et al., 2015). Afi d’alioe la capacité de régulation et le maintien des populations, la possible installation de compétition apparente induite par les parasitoïdes Aphidiinae serait un levier intéressant (Morris et al., 2004, Van Veen et al., 2006), sachant que cette interaction indirecte peut être induite avec un seul ennemi naturel commun (Bonsall et Hassell, 1998). Cette compétition apparente pourrait être envisagée avec des ressources présentes dans les habitats semi-naturels. Cela est conditionné par le passage des parasitoïdes généralistes du milieu cultivé vers les habitats semi-naturels et vice et versa.

Pour utiliser efficacement ces organismes en lutte biologique par conservation, il est important de bien connaître les interactions qui relient les espèces de pucerons aux espèces de parasitoïdes dans u evioeet do et au ous du teps. L’tude des seau d’iteatios plate-puceron- parasitoïde doit permettre de définir localement la lageu du spete d’hôtes des parasitoïdes, la daiue d’eploitation temporelle des hôtes et la répartition des espèces généralistes et spécialistes dans les différents habitats au cours du temps. Il est aussi très important de pouvoir définir le comportement hivernal des parasitoïdes. Sous nos latitudes où l’hive est doux, deux stratégies sont employées par les parasitoïdes Aphidiinae, la diapause sous forme de momies et l’eploitatio otiue des hôtes eoe psets (Andrade et al., 2013), de nombreuses espèces

27 aphidiennes étant anholocycliques dans l'Ouest de la France. Dans le cas de la diapause, la quantité de ressource disponible dans la période automnale conditionnera le nombre potentiel de momies diapausates foes et dteiea le iveau des populatios e sotie d’hive. En cas d'exploitation hivernale des hôtes, on peut espérer une activité de parasitisme plus précoce au printemps, dès la colonisation des parcelles par les pucerons.

Un premier travail conduit précédemment dans l'unité, dans le cadre de la thèse de Stéphane Derocles (2012), où il a étudié les communautés de pucerons et de parasitoïdes dans un agrosystème, conduit à reconsidérer le statut et la place des espèces parasites généralistes dans ces communautés. U outil olulaie peettat de dtete et d’idetifie les paasitoïdes à l’intérieur du puceron par barcoding a été développé (Derocles et al., 2012, a, b). Ceci a permis une première analyse sans a priori d'un réseau pucerons – parasitoïdes dans une zone réduite (zone atelier de Pleine Fougère), sur trois parcelles cultivées et leur environnement immédiat (bordures), durant une période de temps limitée (6 semaines). Il a mis en évidence un réseau trophique assez simplifié présentant très peu d’espes généralistes et surtout compartimenté en fonction du type d’haitats. Il semble avoi peu d’hages entre les compartiments cultivé et non cultivé, aussi bien e tees d’espes de pueos ue de paasitoïdes Vialatte et al., 2005, Derocles et al., 2014). De plus, lors de ce travail, la mise au point d'outil moléculaire a conduit à analyser la variabilité intraspécifique de certains des gènes utilisés pour distinguer les espèces entre elles. Les résultats ont ot u’il eistait ue stutuatio gtiue e fotio de l’hôte hez la plupat des espes supposées généralistes rencontrées dans cette étude, comme Diaeretiella rapae, Praon volucre, Ephedrus plagiator, Aphidius matricariae ou Lysiphlebus fabarum et qu'elles pourraient en fait être constituées de populations spécialisées selon l'hôte, voire d’espes ptiues. “eule l'espèce Aphidius ervi n'a pas montré une telle structuration (Derocles et al., 2016). Cette étude a été menée sur des populations ponctuelles ayant des hôtes et origines géographiques différentes (plusieurs régions et pays, Ouest et Est France, Chili et Belgique). Ces nouveaux outils moléculaires permettent la découverte de la biodiversité cryptique en révélant das de oeu goupes taooiues l’eistee d’espes ptiues des espèces morphologiquement semblables mais génétiquement différentes) (Hebert et al., 2004 ; Sha et al., 2007). Des stutuatios des populatios ot djà tait osev pou uelues espes d’Aphidiiae sur des critères biologiques et moléculaires comme Binodoxys communis (Desneux et al., 2009), Diaeretiella rapae (Antolin et al., 2006 ; Le Ralec et al., 2011) Lysiphlebus fabarum (Barahoei et al., 2011), et Ephedrus plagiator Toić et al., . L’eistee de stutuatio intraspécifiques, si elles correspondent effectivement à une spécialisation parasitaire, risquent de limiter fortement les possiilits d’échanges entre les ressources du compartiment cultivé et sauvage des

28 agroécosystèmes et ainsi de duie l’effiait théorique de la lutte biologique par conservation. L’eistee d’Aphidiiae galistes est donc fortement questionnée. Cette thèse doit apporter des éléments pour confirmer ou infirmer cette hypothèse, notamment à une échelle locale, correspondant à une potentielle échelle de gestion opérationnelle des ravageurs et de leurs ennemis naturels.

Afi d’avoi ue vue d’esele, peieet des mécanismes liés à l'utilisation des hôtes par les parasitoïdes de pucerons, en mettant l'accent sur les différences entre les espèces généralistes et spécialistes, et deuxièmement sur la difficulté de déterminer les causes et les conséquences du maintien du caractère généraliste chez les Aphidiinae, ces deux éléments de recherche ont été compilés et réunis dans une synthèse : Aphid parasitoid generalism: development, assessment and implications for biocontrol Publié en 2015, dans Journal of Pest Science, en collaboration avec une équipe Chilienne (Université de Talca). Cette synthèse est présentée en Annexe 1.

Objectifs de la thèse et méthodes utilisées

I. Polatiue et aes d’tudes

L’eistee de degs de spialisatio vaiales ete les espes d’Aphidiiae, les connaissances précédemment acquises sur les seau d’iteatios pueos – parasitoïdes, la structuration gtiue oseve au sei des espes les plus galistes et la suspiio d’espes ptiues chez certaines d'entre elles, ont conduit à poser la question centrale de cette thèse : Existe-t-il des parasitoïdes Aphidiinae généralistes ? Das ue optiue appliue, la uestio de l’eistee de vais galistes, apales d’eploite de multiples ressources est primordiale pour envisager par exemple une lutte biologique par conservation contre les pucerons reposant sur la gestion d'hôtes réservoirs. Pour apporter des lets de pose, ote tavail se divise e deu aes d’tudes : - le premier axe consiste à caractériser le degré de « généralisme » des Aphidiinae par la détermination du spete d’hôtes elleet eploits pa les espes psetes das u environnement donné et à rechercher des structurations génétiques intraspécifiques liées à ces hôtes - , le deuxième axe consiste à analyser les facteurs qui peuvent influencer la répartition des espèces à caractère généraliste ou spécialiste dans l'environnement et expliquer la spécialisation des Aphidiinae. Pour cela, dans un premier temps, nous avons réalisé un échantillonnage de terrain intensif sans a priori de l'ensemble des espèces de pucerons présentes dans un agroécosystème spatialement délimité, afin de détecter des espèces de parasitoïdes généralistes. Cela doit permettre de déterminer le spectre d’hôtes elleet eploits pa es espes localement, au cours du temps. Après avoir déterminé les espèces qui exploitent effectivement plusieurs hôtes, il s'agira ensuite de vérifier la structuration génétique de ces espèces par une approche de barcoding multilocus et de la confronter aux différents facteurs pouvant avoir un rôle das ette stutuatio, ’est-à-dire les caractéristiques écologiques des hôtes (hôtes abondants vs hôtes rares), de la plante (temps de psee/asee das l’evioeet, faille otaiue… ou du ilieu ultiv ou o.

Dans un deuxième temps, nous avons choisi une des espèces les plus généralistes, Diaeretiella rapae pour vérifier les hypothèses suivantes : D. rapae est constituée d'entités spécialisées n'exploitant qu'une partie du spectre théorique total et ces entités pourraient être des espèces cryptiques. Nous

30 avons testé ces hypothèses par deux approches, un échantillonnage de terrain orienté et des expérimentations biologiques en laboratoire. L'échantillonnage de terrain est centré sur une culture abritant l'hôte principal de D. rapae, B. brassicae et peet de teste l’hpothse d'ue daiue tepoelle d’eploitatio des hôtes séquentielle ou simultanée Des aalses gtiues peettot de vifie l’eistee d’ue structuration en fonction des hôtes exploités et le lien entre les caractéristiques écologiques des hôtes. Au laboratoire, nous avons analysé la spécialisation parasitaire de différentes souches ayant des hôtes et des oigies gogaphiues diffets. L’ojetif est de dteie les pefoaes des différentes souches su ue gae d’hôtes puis de teste leu itefodit, afi de dtete des espèces cryptiques.

À la suite de la présentation des diffetes thodes d’tudes utilises, le manuscrit s'organisera en deux chapitres : Chapitre 1: Les espèces de parasitoïdes généralistes à l'échelle d'un agroécosystème Chapitre 2) Analyse du caractère généraliste, spécialisation et spéciation écologiques chez Diaeretiella rapae

II. Méthodes mises e œuve

II.1 Analyse des interactions pucerons-parasitoïdes dans les agrosystèmes et recherche de structuration génétique

II.1.1 Échantillonnage de terrain

Afi d’tudie les iteatios pucerons-parasitoïdes en conditions naturelles, deux échantillonnages distincts, ayant pour objectif de détecter les situatios d’eploitatios de essoues multiples par une espèce Aphidiinae, et ce dans les habitats cultivés et semi-naturels, ont été conduits. Nous nous sommes focalisés sur la détermination le spete d’hôtes réel de l'ensemble des espèces d'Aphidiinae à une échelle locale, pour ensuite analyser la répartition des espèces généralistes et spécialistes dans les différents habitats et dans le temps. Le fait de se limiter spatialement, a permis de produire un effot d’hatilloage itese, pour être le plus exhaustif possible en termes de plantes, cultivées et sauvages, et de pucerons échantillonnés, apparemment sains comme parasités par les Aphidiinae. Un premier échantillonnage a été réalisé dans une zone géographique bien délimitée pouvant s’appaeter à une exploitation agricole, le domaine expérimental de l'INRA au Rheu (Fig. 8), à proximité de Rennes (35, France), durant une saison culturale, d’avil à ovembre 2014.

Bois Blé Maïs

Brassicaceae

0 300 m

Figure 8 : Pla de la zoe epietale de l’IN‘A du ‘heu, ave la divisio e seteurs et les 3 parcelles ciblées par secteur

La zone d’hatilloage est situe das ue gio oage (bocage dégradé) dans un contexte de polyculture élevage, conduit essentiellement en agriculture conventionnelle, iluat l’usage d’isetiides et autres produits phytosanitaires. Ce contexte paysagé explique la grande diversité de milieux qui compose la zoe d’hatilloage : parcelles cultivées (Poaceae, Brassicaceae, Fabaceae…, paelles aaîchères (chou), prairies, haies, friches et bois. La zone expérimentale a été divisée en trois secteurs avec dans chaque secteur trois parcelles ciblées : une parcelle de Brassicacées (2 Brassica napus et une Brassica oleracea), une parcelle de blé et une parcelle de maïs. Les autres cultures autour des parcelles ciblées sont des Fabaceae (Medicago sativa, Pisum sativum et Trifolium sp), de Brassicaceae (Raphanus sativus), des Poaceae (Hordeum vulgarea) et des Solanaceae (Solanum tuberosum) (Fig. 8). L'échantillonnage des colonies de pucerons et des momies d'Aphidiinae a été réalisé par secteur, un jour par semaine répété pendant 3 semaines par mois, d'avril à novembre 2014.

Un deuxième échantillonnage a été réalisé sur une zone géographique plus large mais orienté vers les parcelles de Brassicaceae cultivés : colza et choux, ainsi que leur environnement (Fig. 9). Le fait de cibler une culture permet de suivre la dynamique temporelle des populations des pucerons qui lui sont associés et celle de leurs parasitoïdes, en présence puis en absence de la ressource qu'ils constituent. Sur Brassicaceae c'est un ravageur important, le puceron cendré du chou, B. brassicae qui est ciblé. Ce ravageur est associé à un parasitoïde supposé très généraliste, D. rapae.

Rennes

Plélan-le- Grand

Figure 9 : Localisation des parcelles de Brassicaceae, colza en jaune et brocoli-navet en vert, échantillonnées en 2014 (cercles) et en 2015 (carrés).

L’hatilloage des pueos et des oies a été réalisé une fois par mois pour chaque parcelle et ce sur deux années consécutives sans interruptio d’avril 2014 à décembre 2015. On dispose donc de la daiue d’eploitatio des hôtes des populatios de D rapae, avant, pendant et après le pic d’aodae du avageu, e iluat la piode hiveale. Nous pourrons ainsi définir la stratégie d’eploitation mise en place par cette espèce, une exploitation simultanée de différents hôtes ou une eploitatio suetielle e fotio de l’aodae des hôtes et en particulier de celle du ravageur. Nous avons ciblé 14 parcelles de colza et une parcelle avec une succession de deux cultures brocoli - avet, d’avil à décembre 2014. Puis e , l’hatilloage a t alisé dans et autour de cinq parcelles de colza et une parcelle avec une succession de deux cultures brocoli - navet dans le même secteur (Fig. 9). Nous avos fait le hoi d’hatilloe u oe de paelles important la première année, pour optimiser les chances de couvrir exhaustivement la gamme d’hôtes exploitée par ce parasitoïde au cours du temps. Pour la deuxième année, nous avons réduit le nombre de parcelles ave oe ojetif d’avoi u effot d’hatilloage plus intense lors de la période hiveale. D’u poit de vue agooiue, et hatilloage doit peette d’estie l’ipotae des essoues psetes dans le compartiment non cultivé des agrosystèmes pour le aitie des populatios das l’evioeet loal et aisi assue ue gulatio iologiue contre le ravageur la plus efficace possible.

II.1.2. Mthode d’hatilloage

La méthode d'échantillonnage utilisée est la e pou les deu apages, il s’agit d’une recherche à vue des oloies de pueos et des oies d’Aphidiiae, calibré par le temps de prospection : 30 minutes dans chaque culture, et de 30 minutes à 2 heures dans les bords de champs, en fonction de la superficie, de la longueur, de la diversité et la hauteur de la végétation. Pour une parcelle ciblée, nous avons réalisé des prélèvements dans la culture cible, les habitats non cultivés adjacents comme les haies, les bois ... et les parcelles cultivés adjacents. Nous avons réalisé une trajectoire d'échantillonnage par parcelle cultivée, une pour tous les habitats linéaires non cultivés tels que les bords de route ou chemin (y compris les haies et les bandes enherbées) et une trajectoire par habitat non cultivé tels que les bois, le tout pour chaque jour d'échantillonnage (Fig. 10). De plus, nous avons également échantillonné les pucerons présents sur les plantes adventices dans les parcelles cultivés. Nous avons par la suite considéré ces prélèvements dans la catégorie des habitats semi-naturels. Les trajectoires restent les mêmes tout au long de la campagne d'échantillonnage. Nous avons recueilli un maximum de 5 échantillons de la même morpho-espèce de pucerons sur la même espèce de plante, dans le même habitat à la même date. Les pucerons de ces 5 échantillons ont été

34 regroupés en un, qui forme ce qui sera appelé au cours de cette thèse : « un prélèvement ». Les momies récoltées dans chaque prélèvement ont été isolées dans une boite de pétrie et placées en hae liatiue jusu’à l’egee des paasitoïdes.

Parcelle ciblée

Autre culture

Bord de route

Haie

Bois

Trajectoire

Point de prélèvement

Figure 10 : Schéma des parcelles ciblées lors des échantillonnages et exemple des habitats adjacents, y compris des exemples de trajectoire utilisés pour la recherche des colonies de pucerons et des momies et de point de prélèvement.

II.1.3. Les méthodes de détection du parasitisme

Après avoir placés les pucerons de chaque prélèvement dans un tube Eppendorf de 1,5 ml rempli d'éthanol 95 % et les avoir stockés à une température maximale de 20 °C, nous avons utilisé deux méthodes de détection du parasitisme.

II.1.3.1. La détection biologique

Dans un premier temps, nous avons utilisé une détection biologique du parasitisme par le prélèvement de momies associé à une identification morphologique des parasitoïdes ayant émergé des momies. Les pucerons récoltés et les plantes hébergeant les colonies de pucerons ont été identifiées au niveau de l’espe das la esue du possile, pour les plantes un classement au niveau de la famille a ensuite été retenu. L’idetifiatio des pucerons et des parasitoïdes, au minimum jusu’au gee, le plus souvent à l'espèce, peut être considérée comme particulièrement fiable, du fait des compétences présentes dans l’uipe e atie d’identification morphologique de ces deux taxons. En effet, le laboratoire gère historiquement un des pièges à succion du réseau Agraphid (surveillance des populations de pucerons par capture d'individus ailés, depuis 1978), le dernier en France, ce qui occasionne une activité quotidienne de tri et d'identification de très nombreuses espèces aphidiennes. De plus, les activités de recherche conduites sur les parasitoïdes Aphidiinae ont conduit à développer les compétences d'identification sur ce taxon, par des

35 formations dédiées auprès de spécialistes Européens de la systématique des Aphidiinae. Les personnes ayant déterminé les insectes dans le cadre de ce travail de thèse sont Bernard Chaubet (parasitoïdes) et Christelle Buchard (pucerons et parasitoïdes). Le site Encyclop'Aphid (https://www6.inra.fr/encyclopedie-pucerons) offre une vitrine de ces compétences en matière de biologie et d’idetifiatio des pucerons et de leurs ennemis naturels.

II.1.3.2. Détection moléculaire

Principe, méthode et intérêt Dans un deuxième temps, nous avons utilisé une méthode moléculaire de détection du parasitisme, l’appohe pa diagosti PC‘. Après la récolte des pucerons, une analyse moléculaire a été conduite sur les pucerons prélevés en 2014, grâce à des outils moléculaires développés par Derocles et al., (2012). Cette thode peet de dtete et d’idetifie les edopaasitoïdes de la sous-famille des Aphidiinae ds le stade œuf, h aps l’oviposition, à l’itieu des pueos. Pour réaliser l’etatio de l’ADN des pucerons, nous avons utilisés la méthode Hot Sodium Hydroxyde et Tris (HotShot) (Moteo‐Pauet et al., 2008). Nous avons conservé un maximum de 50 pucerons par prélèvement pour des questions de temps et de faisabilité. Les extractions sont réalisées de manière individuelle, mais nous avons choisi de regrouper ensuite 10 extraits ADN de puceos d’u e prélèvement pour faire les analyses par PCR. Avec cette méthode, les données quantitatives sont conservées, mais de façon partielle. L’ojetif ’tat pas de dfii u tau de paasitise pa espèce mais d’idetifier dans le temps et das l’espae si une espèce de puceron est parasitée. La détection du parasitisme d'un Aphidiinae se fait par PCR, qui consiste en une amplification en chaîne pa polisatio d’u faget d’ADN combinée à ue letophose su gel d’agaose, pou révéle l’aplifiatio des fragments d’ADN ils Fig. 1). Celle-i essite la ise au poit d’u jeu d’aoes spécifiques aux Aphidiinae (sans co-aplifie l’hôte. Derocles et al. (2012) ont mis au point un couple d'amorces dessinées sur le gène 16S, aplifiat uiueet l’ADN des Aphidiiae. Afi de s’affahi de l’tape de dosage de l’ADN et pou s’assue du o douleet de la PC‘, nous avons couplé les amorces spécifiques 16S à des amorces classiques, amplifiant la séquence du gène COI. De plus, la méthode moléculaire nous permet de cibler certaines espèces, en particulier gâe à des ouples d’aoes spifiues à haue espe. Dans cette thèse, nous avons plus particulièrement recherché trois espèces : D. rapae, A. ervi et A. matricariae (le design des amorces est évoqué ci-dessous). Nos aalses PC‘ tat alises su u lage de l’ADN de pueos d’u e elev oteat μL d’ADN de haue pueo, il tait essaie de vifie si ote pogae PC‘ peettait d’aplifie l’ADN du paasitoïde das u lage contenant un seul puceron parasité

36 avec potentiellement 9 pucerons non parasités. Pour réaliser ces tests, nous avons utilisé des élevages de pucerons et de parasitoïdes présents au laboratoire. Ces tests ont été réalisés aussi bien pour la détection globale du parasitise ue pou les aoes des espes iles, sauf elles d’A matricariae, e disposat pas d’levage de e paasitoïde au laoatoie. Nous avons testé la détection du parasitoïde avec trois couples puceron-parasitoïde : D. rapae / B. brassicae, D rapae / M. persicae et A. ervi / A pisum. Nous avons pris un puceron parasité depuis 72 h et 9 pucerons sains pou haue ouple. Le lage aals oteait μL de l’ADN etait des pueos sais, et μL de l’ADN du pueo paasit. L’epiee a t répétée 5 fois pour chaque couple et chaque amorce. Nous avons obtenu dans 93 % des cas la détection du parasitoïde ave l’aoe “ (sur les 15 tests, das seul as le paasitise ’a pas t dtet. Pou l’aoe D. rapae, le parasitoïde a été détect fois su et fois su pou l’aoe d’A. ervi. Ces tests valident la possibilité d'analyser l’ADN des pueos e lots de 10 sans risque de ne pas détecter le parasitisme.

Le piipe de la vlatio pa letophose su gel d’agaose est asé sur la présence / absence d’ue ade su la photo du gel pise sous ultaviolet Fig. 11). La psee d’ue ade est le sige ue le faget d’ADN il a t aplifi do ie pset das l’etait d’ADN. O peut utilise Double détection cette méthode en simplex (une bande attendue) ou Marqueur en multiplex (plusieurs bandes attendues). Dans ce de taille Simple Puits négatifs détection cas, pour déterminer quelles bandes appartiennent à quelles espèces, ayant connaissance de la taille du fragment amplifié, on utilise un marqueur de taille Figure 11 : eeple d’letophose su pour repérer les longueurs de bande (Fig. 11). gel d’agaose

Le desig d’aoces spécifiues L’aalse olulaie du paasitise à l’itieu du ops du puceron nécessite de détecter uiueet l’ADN d’u paasitoïde. C’est das ette optiue ue Deoles et al. (2012) ont mis au point u ouple d’aoes dessiné sur le gène 16S spécifique aux parasitoïdes Aphidiinae. Mais afin d’tudie le paasitise d’ue espe de paasitoïde en particulier avec cette méthode, nous avons esoi d’aoes spifiues à ette espe. Au ous de ette thèse, nous avons ciblée trois espèces, A. ervi, A. matricariae et D. rapae, pour lesquelles, il a fallu dessiner des amorces spifiues. U ouple d’aoes spifiues pou A. ervi avait déjà été dessiné par Traugott et al. (2008). Ces amorces ne sont pas strictement spécifiques, puisue l’espe Aphidius microlophii est détectée dans de nombreux cas. Pour ce qui est des espèces D. rapae et A. matricariae, aucune aoe spifiue ’eistait, ous e avos do dessies. Pour cela, 25 séquences du gène COI de

D. rapae, provenant de 4 pays différents (France, Canada, Iran, Suisse et Nouvelle-Zélande) ont été obtenues à partir des données de GenBank. Il en a été de même pour A. matricariae, avec 14 séquences du gène COI. Ces séquences ont ensuite été alignées à l’aide du logiiel BioEdit® vesio 5.0. Après avoir comparé ces séquences qui ne possédaient que de très faibles variations entre elles (4 ou 5 bases différentes sur les 658 paires de bases du gène), une séquence consensus par espèce a été créée afin de faciliter le dessin des amorces. Par la suite, 128 séquences consensus du gène COI appateat à d’autes espes d’itt suees du ge appateat à espes de pucerons et 58 séquences du gène appartenant à 58 espèces de parasitoïdes Aphidiinae) ont été récoltées sur GenBank afin de les comparer à la séquence consensus des deux espèces cibles. Pour les deux espèces, cinq amorces potentielles ont été dessinées avec 6 combinaisons possibles pour chacune des espèces. Afin de tester la spécifiit des ouples d’aoes et de s’assue de la oe dtetio d’u aiu de populatios, de nombreux tests ont été réalisés. Nous avons par la même occasion testée celle d’A. ervi veat de l’tude de Taugott et al. (2008). La méthode utilisée est une détection par PCR couplée à ue vlatio pa letophose su gel d’agaose. Nous avons créé ue plaue d’ADN « test » contenant une gamme d’ADN des espèces de pucerons, de parasitoïdes et de quelques hyperparasitoïdes susceptibles d’te econtrées das l’tude (Fig. 12.

Figure 12 : Détail de la plaque ADN « test » utilisé pour les tests sur les amorces spécifiques Dr et Am. En orange : A. ervi, en rose pâle : A. matricariae, en bleu : D rapae, avec entre parenthèse un numéro qui correspond à des hôtes de collecte différents. En gris : les autres espèces de parasitoïdes rencontrées, en vert : les espèces de pucerons échantillonnées et en rose clair : quelques hyperparasitoïdes.

Finalement, les couples suivant Dr1-F – Dr2-R amplifiant un fragment de 246 Pb (pour D. rapae) et Am1-F – Am4-R amplifiant un fragment de 397 Pb (pour A. matricariae) (Fig. 13) ont été retenus. Ces deux couples semblent d’aps les tests suffisamment généralistes pour détecter une grande diversité de populations de D. rapae et A. matricariae, mais suffisamment spécifiques pour ne détecter que leur espèce respective, sauf dans quelques as où l’o dtete des idividus d’Aphidius sonchi présents dans notre échantillonnage avec les amorces spécifiques à A. matricariae. Nos tests ont aussi validé les observations de Traugott et al. (2008) sur la non-spécificité stricte des amorces d’A. ervi, puisue l’o dtete des individus d’A. microlophii.

Dr1-F : ’-AGAATTACGGGTAGATTAATTGG-’

Dr2-‘ : ’-CCAACACCAGAATTTATTAAACCTCTTACT-’

Am1-F : ’-GGTCTGGAGTATTAGGTTTATC-’

Am4-‘ : ’-GGCTCCTATAATAGAAGAAATACCTGCC-’

Figure 13 : Séquences des amorces constituant les couples spécifiques à Diaeretiella rapae (Dr) et Aphidius matricariae (Am). F : Forward et R : Reverse.

La oiaiso des deu thodes d’aalse, moléculaire et le prélèvement de momies, permet d'augmenter la probabilité de détecter le parasitisme de manière globale et pour chaque espèce ile. L’aute itt est d’augete les haes de dtetio des veets aes. La oiaiso des deu thodes peet de opae l’efficacité de chacune dans la recherche du paasitise et aisi d’idetifie ue thode plus fiale ui peettait à l'avenir de s’affahi d’ue des deu thodes. Il a eu de oeu dats su l’effiait des diffetes thodes pour estimer le parasitisme, Agusti et al. (2005), Gariepy et al. (2005) et Jones et al. (2005) ne trouvaient pas de différences significatives entre les méthodes moléculaires, le prélèvement de momies et la dissetio. À l’ivese, d’autes études, comme celles de Tilmon et al. (2000) et Ashfaq et al. (2004) trouvaient une meilleure détection par les méthodes moléculaires. Gariepy et al. (2008) semblent avoir clos le débat en démontrant que les informations apportées par les méthodes moléculaires et conventionnelles sont les es, alg ue dtetio plus poe pa l’aalse moléculaire. Mais cette méthode est limitée puisque sa seule application est la détection ; pour réaliser des analyses phylogénétiques ou des études de génétiques des populations, l’tape de séquençage est indispensable.

II.1.4. Analyse de la structuration génétique par barcoding moléculaire : approche multilocus

Histoiueet, le aodig olulaie epose su l’utilisatio d’ue gio d’ADN uiue standardisé pour une identification fiable des espèces (Hebert et Gego, . La gio d’ADN utilisée chez les animaux est une portion du gène codant pour la cytochrome oxydase I (COI, Hebert et al., 2004). Cette portion est constituée de 658 paires de bases (pb). Les différences entre les espèces se situent au niveau des changements de paires de bases dans la séquence, la distance génétique entre deux espèces est fonction du nombre de paires de bases qui varient entre deux suees. L’utilisatio d’ue séquence unique est très discutée dans la littérature (Rubinoff, 2006 ; Valentini et al., 2009). Le ge COI poviet de l’ADN itohodial ui, de par son hérédité maternelle, reflète uniquement les trajectoires évolutives des femelles (Hurst et Jiggins, 2005), de plus ce gène est sujet à de nombreuses introgressions mitochondriales entre les organismes et leurs symbiotes (Rot et al., 2006 ; Linnen et Farrell, 2008). Aisi, l’utilisatio d’autes loi est eoade afi de pouvoi dtete les poles auss pa l’utilisatio du COI Fzal & LeBlois, 2008). L’utilisatio de plusieus ges peet de oie des lous veat de plusieus gios d’ADN, nucléaire, mitochondrial et ribosomique aat des vitesses d’volutios diffetes et ainsi d’observer plus précisément la structuration génétique. Dans cette thèse nous avons étudié sur la structuration génétique de populations locales, à l'échelle de l'agroécosystème étudié, de cinq espèces d'Aphidiinae identifiées comme généralistes : D. rapae, A. ervi, A. matricariae, E. plagiator et L. fabarum. La méthode utilisée est la suivante : nous avons sélectionné trois individus par relation plante-pueo paasit pa l’ue de es cinq espes. L’ADN de chaque individu est extrait par une méthode non destructive (Kit Qiagen DNeasy) qui permet aps l’aalse olulaie de evei à l’idetifiatio ophologiue (Derocles et al., 2016). Nous avos hoisi d’aalse la stutuatio gtiue gâe à tois aueus olulaies : le gène mitochondrial « COI », le gène ribosomal « 16S » et le gène nucléaire « LWRh ». Cela nécessite de passer une étape de séquençage afin de pouvoir analyser les différences génétiques entre les différentes séquences des individus. Nous avons sélectionné ces trois marqueurs, très utilisés en phylogénie, d’aps le tavail de Derocles et al. (2012). Ces trois marqueurs sont suffisants pour bien séparer les différentes espèces et pour étudier les structurations intraspécifiques. L'analyse des patterns de structuration pourra mettre en évidence des regroupements d'individus selon les hôtes, les plates ou les ilieu d'oigie et appote des lets de pose su la psee d’etits spécialisées localement chez les espèces d’Aphidiiae apparemment généralistes.

II.2 Expérimentations au laboratoire

Les expérimentations conduites au laboratoire demandent de maintenir des souches de parasitoïdes et de pucerons en conditions contrôlées, et donc de poduie les plates afi d’assue le développement des différentes espèces de pucerons. Toutes les colonies d'insectes ont été maintenues en chambres climatiques à 20 ± , ◦C, 60% ± 10% d'humidité relative, et une photopériode de L16 : D8. Ces conditions environnementales maintiennent les pucerons en phase de reproduction parthénogénétique continue pendant toute la période d’levage et d'epiee. Toutes les souches de pucerons et de parasitoïdes sont élevées dans des cages de Plexi-glass® de 20 dm3 (40cm x 20cm x 25cm) pour les parasitoïdes et 125 dm3 (50cm x 50cm x 50cm) pour les pucerons, comportant des ouvertures couvertes de tulle fin permettant l'aération sur toutes les faces latales. La podutio de plates s’est faite dans les mêmes conditions climatiques que pour les insectes, dans des pots individuels (6,5 cm x 6,5 cm x 6 cm) contenant du terreau horticole. Les plantes sont : - des brocolis (var. Marathon) pour lesquelles on plante un plant par pot ; les plants sont produits par un pépiniériste spécialisé (Thomas Plants, 22 Ploubazlanec) et conservés en chambre froide à 8°c - des plantules de blé (var. Premio) à raison de 15 à 20 graines par pot - des plantules de féverole (var. Irena), à raison de une graine par pot - des plantules de chénopode (Chenopodium album), seule plante non cultivée utilisée ; nous ’avios auue oaissae su la ussite de la podution de chénopode en conditions contrôlées. Cette espèce ayant un taux de germination très variable, le semis de graines oltes das l’evioeet atuel s’est fait e a, puis chaque plantule a été repiquée individuellement dans un pot. A partir de ces premières plantes, nous avons récolté les graines afin de constituer un stock permettant de pérenniser la production. Nous avons voulu quantifier la capacité et le succès parasitaire de différentes souches de Diaeretiella Souhes Htes rapae et relier les différences à l’hôte d’oigie ou à l’oigie gogaphiue. Pour cela, nous avons réalisé des expériences de peutatio d’hôtes (Fig. 14). La méthode est la suivante : nous avons constitué plusieus souhes d’ue e espe de paasitoïde veat soit d’hôtes différents soit du même hôte mais avec une origine géographique Figure 14 : Schéma du principe des expériences différente. Nous avons conduit cette étude sur de peutatio d’hôtes

41 quatre souches de Diaeretiella rapae ayant pour origine trois espèces de pucerons différentes, deux des souches ont un hôte commun mais elles ont une origine géographique différente. Puis, on sletioe ue gae d’hôtes potentiels sur lesquels les tests seront effectués. Il est difficile pour une espèce généraliste de tester l’esele des pueos hôtes connus dans la bibliographie. Dans notre cas, la gae d’hôtes testée est composée de 6 espèces de pucerons, sur quatre familles botaniques. Nous y avons inclus une espèce non hôte, afin de vérifier que les conditions d'expérience n'induisent pas un parasitisme non observé dans la nature. Les détails des souches de parasitoïdes et de la gae d’hôtes sletioe seot psets das l’atile : Ecological specialization in Diaeretiella rapae (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiinae) on aphid species from wild and cultivated plants. Dans la continuité, nous avons mené un test de compatibilité reproductive. Celui-ci doit permettre de vérifier si l’eistee d'une structuration génétique et d’ue possile spialisatio ologiue pourrait taduie la psee d’espes ptiues hez D. rapae. Des croisements entre individus venant des différentes souches ont été effectués. L’aalse du se-ratio est le paramètre qui permet d’idetifier les croisements incompatibles (Fig. 15). Du fait du caractère haplo-diploïde des Aphidiinae, une descendance exclusivement copose de âle sigifie u’il ’ a pas eu fodatio et donc qu'il existe une incompatibilité reproductive entre deux souches, à un niveau pré- ou post- accouplement.

Figure 15 : Schéma du principe des expériees d’itefodit ete les souhes

Chapitre 1 : Les espèces de parasitoïdes généralistes à l'échelle d'un agroécosystème

Objectifs

Das e hapite, ous ous soes oets su la ehehe d’espes d’Aphidiiae galistes à ue helle loale ave pou ojetif d’oseve les spetes d’hôtes elleet eploits e conditions naturelles dans un agrosyste ie dliit et au ous d’ue saiso ultuale. Nous avos hatillo des oloies de pueos et des oies d’Aphidiiae das les ilieu ultivs ue o ultivs ui oposet l’agoosste tudi, duat toute ue ae hois la piode hiveale. Cei doit ous peette d’estie la divesit des espes de pueos et des paasitoïdes Aphidiiae psete à l’helle loale, la patitio des espes das les diffets haitats au ous du teps et d’idetifie les hages potetiels d’espes de pueos et de paasitoïdes ete les deu tpes d’haitats ultivs et sei-atuels de l’agoosste au ous du temps. La partie A sera consacrée à la recherche des espèces généralistes, mais aussi aux facteurs qui peuvent influencer la patitio das l’agoosste des espes galistes et spialistes. L’itt de ette tude est de pouvoi opae le deg de « généralisme » observé pour chaque espe e fotio des essoues psetes à l’helle loale et su ue saiso culturale, avec les oaissaes thoiues des spetes d’hôtes appotes pa la littatue pou haue espe. D’u poit de vue thoiue, o s’atted à touve ue plus gade divesit d’espes de pueos et donc de parasitoïdes dans les habitats semi-naturels, du fait de la stabilité dans le temps de ces ilieu. À l’ivese, das les ilieu ultivs dit istales, o suppose ue l’o touvea plus d’espes galistes de paasitoïdes et das le e teps des effetifs de pueos ts importants mais sur une courte période (temps de présence de la culture). Les suspicions de plus en plus importantes de structuration génétique des populations chez les Aphidiinae généraliste, allant jusu'à l’eistee d’espes ptiues, ous oduiset à vérifier la structuration génétique des espes ue l’o idetifiea oe galistes et ui eploiteot des essoues das les deu tpes d’haitats ultivs et sei-naturels). Nous allons plus particulièrement nous intéresser à l’ipotae des aatéristiques écologiques des hôtes et des plantes dans les différents habitats su la patitio des espes galistes et spialistes, das le teps et l’espae, aisi ue su la spécialisation parasitaire intra- et interspécifique chez les Aphidiinae. On s'intéresse en particulier à l'abondance ou à la rareté des espèces hôtes et des plantes, à la fois en termes de densité et de

43 période de présence, ainsi qu'au type d'habitat, cultivé ou non cultivé, en sachant que ces trois aspects sont partiellement liés : dans le milieu cultivé, on s'attend à une faible diversité de pucerons mais en très forte abondance sur une période de temps limitée. Dans les milieux non cultivés, la diversité de pucerons sera plus importante, mais en abondance plus faible, du fait de la plus grande diversité de plantes et la stabilité des milieux non cultivés. Efi, l’aalse gtiue ee su les espes galistes devait peette de tahe su l’eistee et l'tedue d'ue stutuatio gtiue à l’helle loale hez les Aphidiinae généralistes. Ces tavau seot psets das le pojet d’atile : « Distribution of generalist and specialist parasitoid species (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiinae) on pest and non-pest aphids in an agroecosystem » (version à retravailler avant soumission).

La patie B s’itessea à la daiue d’eploitatio tepoelle des hôtes hez tois espes d’Aphidiiae, galistes aat u itt agooiue pa leus apaits ipotates à paasite une espèce considérée comme ravageu das l’agoosste et pa l’eploitatio de essoues dans les habitats semi-atuels. L’ojetif est de dteie si les paasitoïdes eploitet siultaet l’esele de leu gae d’hôte ou si au otaie ils eploitet suetielleet les hôtes. O peut ette plusieus hpothses das le deuie as, l’eploitatio peut se faie e fotio de l’aodae des hôtes, du tpe de ilieu e alteat ilieu o ultiv et ultivs e asee de la ultue… Das l’optiue d’ue ise e plae de lutte biologique par conservation ote les pueos pa les paasitoïdes, l’osevatio de situatios possiles de optitio appaete ostitueait ue peie voie das l’alioatio de l’effiait du otôle iologiue. Cette étude va aussi nous peette de opae deu thodes d’aalses du paasitise pa les Aphidiiae, l’hatilloage de teai des oies d’Aphidiiae et l’aalse olulaie pa détection du parasitoïde dans le corps du puceron vivant.

A) Les espèces Aphidiinae et leurs traits généralistes ou spécialistes dans les agroécosystèmes

Distribution of generalist and specialist parasitoid species (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiinae) among pest and non-pest aphids in an agroecosystem

Yoann Navasse, Stéphane A.P. Derocles, Christelle Buchard, Manuel Plantegenest, Anne Le Ralec

Abstract Level of trophic specialization is an important trait that influences the distribution of species in space and time and the topology of food webs. The degree of generalism has implications in the regulation of pest populations as this trait influences the efficiency of the control pest populations and the capacity to persist in the local environment when the pest is absent by exploiting alternative resources. However, the evolutionary ecology of generalism remains a controversial topic in ecology and factors influencing the degree of specialization are still under debate. Here, we studied aphid and parasitoids biodiversity as well as the structure of their interactions network in cultivated and semi-natural habitats. We assessed whether the type of habitat (crop vs non crop) determined the degree of host specialization in Aphidiinae parasitoids. We showed that specialist parasitoid species tended to exploit rare aphid species mainly in uncultivated areas. On the contrary, generalist parasitoid species tended to exploit abundant aphid species in environments with low plant diversity. Finally, while the five most generalist species seemed to contradict the general rule by exploiting hosts in both habitats, genetic analyses revealed a population differentiation according to the aphid host, the plant or both.

Key words: Cryptic species, Aphidiinae, DNA barcoding, agroecosystem, host-parasitoid community, food web, ecological network

Introduction

The degree of trophic specialization in species has been extensively studied because it strongly influences the spatial distribution of species and of the topology of food webs. However, the evolutionary ecology of the degree of trophic specialization remains highly debated. Loxdale et al, (2011) stated the evolution of generalism is very unlikely. These authors demonstrated that ecological specialization in populations tends to select specialist traits at the expense of generalist

45 traits (Rundel & Nosil, 2005). Dennis et al, (2011) rejected this view by stating that generalist species actually exist in nature. According to them, the generalism prevents the risk of extinction. Specialization results from a tradeoff between the ability of a species to exploit a range of resources and its performance in the exploitation of these resources (Wilson & Yoshimura, 1994; Devictor et al, 2010; Keet, 2006; Loxdale et al 2011). Ecological niches of specialized species are consequently restricted to a narrow range of environmental conditions and resources (Fox & Morrow, 1981; Futuyma, 2001; Begon et al, 2006). Specialist species develop physiological and behavioral adaptations precisely matching their preferred habitat and resource characteristics (Krasnov et al, 2004). Such adaptations are assumed to be selected for because they induce an increase in efficiency in using the optimal resource (Wilson & Yoshimura, 1994; Straub et al, 2011). Consequently, the performances of specialist species are generally higher those of generalist species under conditions corresponding to their ecological niche (Devictor et al, 2010). Generalist strategies are however advantageous in low availability of resources or in unstable environments (Pyke, 1977; Devictor et al, 2010). In disturbed ecosystems such agroecosystems, the process of specialization can be driven by two opposite forces. On the one hand, niche overlapping and interspecific competition generate a selection force towards the specialization of species (Ferry-Graham et al., 2002; Futuyma & Moreno, 1988). On the other hand, the instability of the environment and of the availability of resources promotes generalist strategies (Futuyma & Moreno 1988). We therefore expect to find generalist species in cultivated area in particular, because of the seasonally harvested annual crops leading to habitat instability (Rodriguez & Hawkins, 2000; Gurr et al, 2003; Tscharntke & Kruess 1999). Uncultivated habitats (e.g. field edges, hedges and woods) which are more stable and hosting a large diversity of plants and resources (Benton et al, 2003; Kruess, 2003) are expected to favor specialist. Regarding the ecosystem service of pest regulation, the generalism of natural enemies impacts the efficiency of crop pests biological control. Indeed, the level of generalism influences the capacity of the natural enemies to effectively control pest populations and to remain in the local environment in the absence of pests (Thomas et al, 1992; Barbosa, 1998). Despite the importance of this trait in the determination of the regulation service provided by pest natural enemies in agroecosystem, the actual range of resources used by many natural enemies is poorly known. Direct observations of trophic interactions are often difficult and the quantification resources consumption by individuals during their lifetime still more difficult (Memmott et al, 1994; Symondson 2002; Macfadyen et al, 2009). Indirect methods, such as feeding tests in the laboratory or molecular analysis of gut content (Valentini et al. 2009; Boreau de Roincé et al, 2012), provide only partial information on the species diet in nature. Host – parasitoid trophic interactions are easier to identify as emerging parasitoid can be identified from parasitised hosts collected on plants (Valladares et al, 2001). This allows to establish parasitoid host ranges and plant-host-parasitoid interactions. However, the interaction

46 networks that can be inferred from the examination of literature are generally qualitative likely leading to an overestimation of the usual host range of most parasitoid species (Derocles et al. 2014). On the contrary, the possible ecological role played by the rarely exploited resources in local environment remains poorly understood. In this study, we aimed at assessing the actual host range of aphid generalist parasitoids belonging to the sub-family Aphidiinae (Hymenoptera: Braconidae) in cultivated and uncultivated habitat at a farm scale. Agricultural landscapes in temperate areas could harbour a large diversity of aphid species, both on crop and non-crop plants, offering a large diversity of potential resources for generalist parasitoids. A large range of levels of specialization can be observed among the four hundred species belonging to Aphidiinae (Sanchis et al, 2001). While most parasitoid species are able to parasitize only one or two aphid species, some species seem able to parasitize several dozens of aphid species (Kavallieratos et al, 2004; Stary, 2006). However, recent studies revealed intraspecific host specialization (Antolin et al, 2006; Le Ralec et al, 2011), host based genetic structuration or even cryptic species, in some generalist Aphidiinae such as Aphidius matricariae, Diaeretiella rapae, Praon volucre (Derocles et al, 2016, Navasse et al submitted), Binodoxys communis (Desneux et al, 2009), Lysiphlebus fabarum (Barahoei et al, 2011) and Ephedrus plagiator Toić et al, . These convergent results question the existence of truly generalist Aphidiinae (i.e. species with populations able to successfully parasitize many different host species). Host specialization leading to speciation could occur in allopatric populations (e.g. in the genus Binodoxys, Desneux et al, 2009). However sympatric ecological specialization could also arise from the adaptation to ecological characteristics of aphid hosts (Le Ralec et al, 2010; Raymond et al, 2015; Gagic et al, 2016) or host plants such as their abundance, distribution and physiology (Desneux et al, 2012; Le Guigo et al, 2012a; Le Guigo et al, 2012b). Here, we studied the effects of ecological traits of aphids and plants on the distribution of generalist and specialist Aphidiinae species, particularly their abundance. A large sampling of aphid and Aphidiinae was conducted at the scale of an agroecosystem (corresponding to the size of a farm), during one year from spring to autumn. We examined the observed plant-aphid-parasitoid networks to test the hypothesis that generalist species are more present in the cultivated areas throughout the sampling period, while specialist species are more present in uncultivated areas. We also hypothesized that non-crop habitats harbor a greater diversity of aphids - parasitoids interactions than cultivated habitats. Then, we collected data on abundance and frequency of aphid and plant hosts to analyze their impact on the repartition of specialist and generalist species. Finally, we analyzed the genetic structure of the five most generalist species found in the agroecosystem studied to detect a possible trophic specialization at intraspecific level. The possible consequences of the

width of the range of hosts actually exploited by parasitoids and of the resulting structure of the tri- partite food webs on the ecosystem service of natural pest control they provide are discussed.

Materials and methods

Experimental site and sampling methods This study was carried out in the INRA experimental station of Le Rheu (Brittany, France) including 50 hectares of experimental fields, in an agricultural area of 9 km2 (UTM (zone 30U) X: 589341 Y: 5328111). This environment presents a large diversity of cultivated and uncultivated habitats. The experimental area was divided in 3 blocks; within each blocks, three plots were targeted: one plot including a field of Brassicacae crop (2 Brassica napus and 1 Brassica oleracea), one plot including a field of wheat and one plot a field of maize (Fig. 1). A plot was constituted of the cultivated field of the uncultivated habitats surrounding the field (e.g. hedgerows, herbaceous strips, woods, fallow) and of the adjacent fields. The adjacent sampled fields were sown with Fabaceae (Medicago sativa, Pisum sativum and Trifolium sp), Brassicaceae (Raphanus sativus), Poaceae (Hordeum vulgarae) and Solanaceae (Solanum tuberosum). Sampling of aphid colonies and Aphidiinae mummies was carried out one day by week during 3 weeks per month from April to November 2014, i.e. 24 sampling session by block. The sampling method consisted in a visual search during 30 minutes in each crop, and between 30 minutes to 2 hours in the field edges (according to the area, length, diversity and height of the vegetation; Fig. 1).

Bois Blé Maïs Wheat, maize Brassicaceae or rapeseed

Other crops

Edge field Hedgerows Wood Sampling trajectory Collection points 0 300 m a b Figure 1: (a) Experimental area, area division and field sampling (b) Example of sampling trajectory in crops and adjacent habitats. A collection point includes up to 5 colonies of aphid species sampled, on the same plant in the same habitat at the same date

A maximum of 5 samples of the same morpho species on the same plant, in the same habitat (cultivated and uncultivated) and at the same date was collected. A sample was constituted by one

48 colony of aphids on one plant. The 5 samples were then pooled to constitute a collection point. Aphids were counted and identified (Blackman & Eastop, 2006) in the laboratory. The plants harbouring aphid colonies were identified at least to the family level in the laboratory (Blamey & Grey-Wilson, 2003). Aphid mummies were plaed i a liati hae at ± . ◦C, % ± % relative humidity and a photoperiod of L16: D8 in a Petri dish. Emerging parasitoids and aphid species were identified in the laboratory (Stary, 1973; Gärdenfors, 1986; Blackman & Eastop 2000, 2006; Kavallieratos et al 2001; 2005; Tomanovic et al 2003; 2007).

Trophic network and host ranges For each parasitoid species, we identified the theoretical aphid host range based on Kavallieratos et al. (2004), Starý (2006) and Singh & Singh (2015). Next, the correlation between the width of the theoretical host range and the width of the host range observed during the sampling period in the sampled areas was tested using a nonparametric test, the Spearman correlation coefficient (Hervé 2014). This allowed us to assess in what extent the theoretical level of specialization inferred from literature can inform us about the actual level of specialization observed in the field. To analyze the repartition of the generalist and specialist parasitoid species in the agroecosystem, we classified Aphidiinae species in two categories (specialist vs generalist), although these traits in Aphidiinae are a continuum. The threshold between the two categories was set up from the observed host ranges (see below). Three quantitative plant-aphid-paasitoid food es ee uild usig the pakage ipatite Plote futio i ‘ R Core Team, 2013): a network of all interactions found in the agroecosystem, a network of interactions found in crops and a network of interactions from uncultivated habitats. We then analysed the structure of the networks based on the following network descriptors: qualitative connectance, weighted quantitative connectance, number of links per species, weighted quantitative linkage density, weighted quantitative generality, weighted quantitative vulnerability (Bersier et al. 2002), number of compartments (Compartments are sub-sets of the web which are not connected, through either higher or lower trophic level, to another compartment) and interaction eveess “hao’s eveess fo the e eties; see Aleht et al. 2007). The effects of the collection date and the type of habitats (cultivated vs uncultivated) on the overall presence of parasitism (all parasitoids species) in the collection points were analyzed with Generalized linear models (GLMs) assuming a binomial error (logit link) and an analysis of variance aova.gl futio. The post ho tests ee paiise opaisos ith the futio estio’ i the doB’ pakage Højsgaad, .

Factors influencing the repartition of generalist or specialist species We compared the presence duration (number of months) of species according to the generalist or specialist trait of species in the environment with the same method as described above (GLM). We analyzed the distribution of generalist or specialist species in the environment. For this, we compared the proportion of generalist and specialist species according to the seasons (spring, summer, autumn), the type of area (cultivated, uncultivated), the number of aphids per collection point and the abundance of aphid species (number of collection points with the same aphids species in sampling area), plant families and aphid-plant interactions. The number of aphids per collection point and the abundance of aphid species, plant families and interactions were split into qualitative classes and a GLM was built with all factors included (binomial error, logit link function). The anova.glm function was used to assess the significance of each tested variable. A MCA (Multiple correspondence analyses) with dudi.acm function in "ade4" package (Chessel et al, 2004) was realized to identify the factors (mentioned earlier) related to generalist or specialist trait. In addition, we used the Spearman correlation test to assess the correlation between the abundance of plant family and the species richness of plant and aphid in botanical family. All statistical analyzes were performed using the software R (R Core Team, 2013).

Genetic structure of the most generalist species We extracted individually the DNA from up to 3 adult parasitoids by plant-aphid association observed throughout the sampling season for the 5 parasitoid species with the largest range of host species observed in this study. The extraction was carried out with a Qiagen DNeasy kit non-destructive method (following Derocles et al. 2012). The DNA was amplified with 3 markers: Cytochrome c oxidase I (COI), 16S and Long wavelength Rhodopsin (LWRh; primers and amplicon lengths in Table 1). These markers are the most relevant in the study of Aphidiinae genetic structure (Derocles et al, 2016). PCR amplifications were carried out with 16 µL of reaction volume composed of 2 µL of DNA extract, 8.7 µL of H2O, 2.5 µL of buffer, 1 µL of MgCl2 at 25 mM, 0.5 µL of dNTP at 10 mM, 0.3 µL of each primers at 10 µM and 0.12 µL of GoTaq® (Promega).The PCR conditions were: 94°C for 180s; 40 cycles of 94°C for 30s, 56°C for 60s, 72°C for 90s; with the final cycles of 72°C for 600s.

Table 1: Primer pairs used to amplify parasitoids adult and search genetic structuration

Primer Gene amplified PCR product Sequences References

LCO1490 COI 5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3' Traugott et al., (2008) 620 bp HCO2198 COI 5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3' Traugott et al., (2008) 16S-F 16S ’-CGC CGT TTT ATC AAA AAC ATG T-’ Simon et al., (1994) 380 bp 16S-R 16S ’-TTA CGC TGT TAT CCC TAA-’ Khambhampati & Smith (1995) LWRhF LWRh ’-AAT TGC TAT TAY GAR CAN TGG GT-’ Mardulyn & Cameron (1998) 650 bp LWRhR LWRh ’-ATA TGG AGT CCA NGC CAT RAA CCA-’ Mardulyn & Cameron (1998)

PCR products (COI, 16S and LWRh) were purified and both strands sequenced (Sanger technology; Sanger et al, 1977). The sequences obtained were edited and aligned with BIOEDIT 7.2.5 (Hall, 1999) To detect a potential genetic structuration, ML trees were built for each gene separately and for all genes together using Mega v7. Support node was assessed by bootstrapping with 1000 pseudo- epliates. We used “eueeati Vaida et al, to oied seuees in the following order 16S, COI and LWRh. Cotesia flavipes (Hymenoptera: Microgastrinae) was used as outgroup as commonly used in Aphidiinae phylogenetic studies (Smith et al, 1999; Khambhampati et al, 2000). The sequences used were JQ396736 (COI), JQ396691 (16S), GI930421217 (LWRH) (GenBank).

Results

Sampling data and trophic networks We obtained 331 collection points, 140 of them contained mummies and 11 consisting only in mummies. We sampled around 65400 aphids belonging to 47 different taxa (species or genus). Some aphids could not be identified at the species level, in particular in the genera Aphis and Uroleucon. Aphids were sampled on 53 plant taxa (species or genus), belonging to 16 families. 1584 Aphidiinae emerged from the 2120 sampled mummies. We identified 29 species of Aphidiinae (Table 2); few individuals could not be identified at species level. The other mummies did not emerged or a hyperparasitoid emerged. Hyperparasitoids were not considered in this study. For 16 taxons of aphids, no mummy was detected.

Table 2: List of Aphidiinae species present in the agroecosystem with their theoretical host range (based on Kavallieratos et al. 2004, Stary 2006, and??) and their classification as generalist or specialist based on the literature or the observed interactions.

Number of Number of Theorical Realized Majority host (collection Generalist or specialist Generalist or specialist Parasitoids species collection Hosts not described in the literature Presence in the agroecosystem individual host range Host range points) species in the literature species in agrosystem points Adialytus salicaphis 2 36 2 2 / Chaitophorus leucomelas (2) Specialist Specialist June-July Aphidius absinthii 1 1 1 1 / Macrosiphoniella sp (1) Specialist Specialist June Aphidius avenae 16 50 6 4 Aphis fabae Sitobion avenae (12) Generalist Generalist April à July Aphidius eadyi 1 1 1 1 / Acyrthosiphon pisum (1) Specialist Specialist Avril Cavariella aegopodii, Microlophium April at June, September and Aphidius ervi 12 40 18 5 Acyrthosiphon pisum (8) Generalist Generalist carnosum and Hyperomyzus picricis October June, July, September and Aphidius funebris 15 36 3 3 / Uroleucon sp (10) Specialist Specialist October Aphidius matricariae 11 23 15 8 Hyperomyzus picricis and Uroleucon sp Myzus persicae (3) Generalist Generalist May at July and October Aphidius rhopalosiphii 3 5 2 2 / Sitobion avenae (2) Generalist Specialist Avril and May Aphidius rosae 1 1 1 1 / Macrosiphum funestum (1) Specialist Specialist June Aphidius salicis 2 22 4 2 / Cavariella aegopodii (1) Specialist Specialist June Aphis fabae, Cavariella pastinaceae Aphidius sonchi 6 92 3 6 Hyperomyzus picricis (2) Generalist Generalist Mai and June and Uroleucon sp Aphidius urticae 1 1 4 1 / Acyrthosiphon pisum (1) Generalist Specialist April Macrosiphoniella sp, Cavariella Binodoxys acalephae 5 20 2 4 Aphis sp (2) Specialist Generalist June - July aegopodii and Uroleucon sp Cavariella theobaldii and Hyadaphis Binodoxys angelicae 18 75 2 5 Aphis sp (7) Generalist Generalist May at July and September foeniculi Binodoxys centaurea 7 36 4 3 Aphis sp and Uromelan sp Uroleucon sp (4) Generalist Specialist June and July May, June, September and Diaeretiella rapae 19 320 21 5 / Brevicoryne brassicae (9) Generalist Generalist October Ephedrus nacheri 3 6 2 1 / Hayhurstia atriplicis (3) Specialist Specialist September and October Ephedrus niger 1 2 3 1 / Uroleucon sp (1) Specialist Specialist July Ephedrus plagiator 10 24 16 4 / Uroleucon sp (6) Generalist Generalist June, October and November Lysiphlebus confusus 1 5 3 1 / Aphis sp (1) Specialist Specialist June Brachycaudus cardui, Brachycaudus sp Lysiphlebus fabarum 23 696 5 6 Aphis sp (14) Generalist Generalist June, July and October and Metopolophium sp Lysiphlebus testraceïpes 1 19 1 1 Macrosiphum sp Macrosiphum sp (1) Specialist Specialist June Monoctonus crepidis 2 19 1 1 Uroleucon sp Uroleucon sp (2) Specialist Specialist June Praon barbatum 2 2 1 1 / Acyrthosiphon pisum (2) Specialist Specialist June and September Praon bicolor 1 7 0 1 Uroleucon sp Uroleucon sp (1) Specialist Specialist July Praon uroleucon 2 2 1 1 / Uroleucon sp (2) Specialist Specialist June and July Praon volucre 3 9 17 2 Uroleucon sp Uroleucon sp (2) Generalist Specialist June and July Praon yomenae 2 4 1 1 Uroleucon sp Uroleucon sp (2) Specialist Specialist June Trioxys auctus 1 1 1 1 Sitobion avenae Sitobion avenae (1) Specialist Specialist July

Among the 29 parasitoid species, 14 were found only on one host taxon (Fig. 2). The maximum number of observed host taxa for a parasitoid species was recorded for A. matricariae, with 8 host taxa (Table 2). The average host range was 2.59 + 2.04. We chose a threshold of at least 4 aphid taxons in parasitoid host ranges to classify a species as generalist. One third of all parasitoid species was found on 4 hosts or more (Fig. 2). The observed host range was significantly correlated with the theoretical one for the specialists (cor.test: r = 0.628, p = 0.006), but not for the generalist species (cor.test: r = 0.411, p = 0.184), the latter exploited only a part of the available host species belonging to their theoretical host range (Table 2). Over the 29 species of parasitoids, 12 should be classified as generalists with a threshold of four host species, regarding the theoretical host range, but only 8 of them truly parasitized species beyond this threshold (Table 2). For instance, Binodoxys acalephae considered as a specialist in the literature exploited 4 different aphid taxons (so considered as a generalist here) in the agroecosystem studied. Diaeretiella rapae considered as a generalist in the literature had 21 of its theoretical hosts present in agroecosystem, but parasitized only five of them. Moreover, all generalist species were always predominantly found on a single aphid host species, while other hosts were only marginally parasitised. Finally, many of the aphid-parasitoid interactions observed in the agroecosystem studied were not previously described in the literature (Table 2).

Number parasitoids of species 2

0 1 2 3 4 5 6 7 8 Number of exploited hosts

Figure 2: Distribution of parasitoids species according to the number of exploited host species.

The food web obtained from all the interactions observed between plants, aphids and parasitoids is presented in Fig. 3 (Table S 1).The trophic networks differed in the cultivated and uncultivated compartments of the agroecosystem (Table 3, Fig. S1 and S2). The species richness in each trophic level was also higher in this compartment. The density of the cultivated food web is considerably lower than those of the uncultivated food web (Figs 2, S1 and S2): we found many more aphid– parasitoid interactions in the uncultivated food web than in the cultivated food web (Table 3). The linkage density, vulnerability, generality and connectance were also higher for the uncultivated food web than for the cultivated food web (Table 3). As a direct consequence of these results, we found that the uncultivated food web was much more compartmentalized than the cultivated food web (8 compartments in uncultivated food web vs. 5 compartments in cultivated food web; Table 3; Figs 2, S1 and S2). Moreover, the two types of habitats appeared to be poorly connected. These two environments shared only 2 aphid taxons, B. brassicae and M. persicae, and 5 parasitoid species: A. ervi, A. matricariae, D.rapae, E. plagiator and L. fabarum (Fig. 3). Aphids shared were found on cultivated and uncultivated plants from the same family (Brassicaceae, Fabaceae and Poaceae).

Table 3. Network structure of complete agroecosystem, cultivated areas and uncultivated habitats.

Metrics Complete Cultivated network Uncultivated network network Number of collection points 331 54 277 Number of collection points with 140 39 101 mummies Number of plants species (botanical 16 12 (3) 42 (16) family) Number of aphids species 47 7 46 Number of parasitoids species 29 (9/20) 11 (6/5) 25 (8/17) (generalist/specialist) Qualitative Connectance 0,040 0,137 0,042 Quantitative Connectance 0,020 0,041 0,023 Links per species 1,209 0,897 1,151 Quantitative Linkage density 2,522 1,181 2,724 Number of compartments 8 5 8 Tri-partite Interaction evenness 0,369 0,189 3,730 Quantitative Generality 2,192 1,012 2,398 Quantitative Vulnerability 2,852 1,349 3,052

Figure 3. Quantitative food webs between plants, aphids and their parasitoids. The series of bars represent plant abundance (bottom), aphid abundance (middle) and parasitoid abundance (top). The width of edge links between plants, aphids and parasitoids illustrates the relative strength of each interaction. In yellow: plants, aphids and parasitoid found in crops; in black: plants, aphids and parasitoids found in uncultivated habitats; in dashed yellow lines: plants and aphid found in both habitats; parasitoid in yellow and framed in black were found in both habitats

Distribution of generalist and specialist parasitoid species in the agroecosystem The analysis of the global parasitism (all parasitoids species) on all collection points showed a sigifiat effet of the to studied fatos: the date oths GLM: Χ2 = 23,318, Df = 7, p = 0.002) ad the tpe of haitat GLM: Χ2 = 9.431, Df = 1, p = 0.002) (Fig. 4a). The abundance of collection points with mummies was the highest in April. We did not find any mummies in August. Moreover, there were a higher number of collection points with mummies in the first half of the sample period. The number of collection points with mummies was twofold in the cultivated area compared to the uncultivated one (Fig. 4b). In total, generalist species were more frequently detected with 116 cases of detection in 140 collection points but only 56 cases of detection for specialist species (in a collection point, up to 3 different parasitoid species can be found). The average time of presence in the environment differed for generalist and specialist species, 3.63 + 1.19 months on average for generalist species against 1.57 + 0.81 months for speialist speies GLM: Χ2 = 13.437, Df = 1, p < 0.001) (Table 2).

1 a 0,8 a a 0,7 0,8 0,6

0,6 ab 0,5 ab b b b 0,4 0,4 bc 0,3

Proportion parasitism of Proportion 0,2 c 0,2 parasitism of Proportion 0,1 d 0 0 April May June July Aug Sept Oct Nov Cultivated areas Uncultivated areas Sampling period Types of areas

Figure 4: Proportion of collection points with parasitism per sampling period (months) (a). Proportion of collection points with parasitism per types of areas (b). Statistical tests were GLM and pairwise comparisons with estio’ futio as post hoc tests. Significant differences are indicated with different letters (p < 0.05).

The proportion of generalist or specialist species was affected by 3 of the 6 variables tested (Fig. 5). The two first factors which affected significantly the proportion of generalist or specialists Aphidiinae speies ee the audae of aphid taos GLM: Χ2 = 19.987, Df = 3, p < 0.001) (Fig.5d) and the audae of plat fail GLM: Χ2 = 15.803, Df = 2, p < 0.001) (Fig.5e). The most common aphid taxons tended to be exploited by generalist species, while the rarest were exploited by specialist species. The most common botanical families in the agroecosystem appeared to be beneficial to specialists and vice versa for generalist species. The most common plant families were also the ones with the greater richness of plant species (cor.test: r = 0.827, p <0.001) and aphid taxons (cor.test: r = 0.923, p <0.001). The third variable having an effect on the proportion of generalist vs specialists Aphidiinae species was the type of habitat. In a less extend, the cultivated area hosting proportionately fewer specialist species than the uncultivated one (Fig. 5b) but this was not sigifiat GLM: Χ2 = 1.696, Df = 1, p = 0.193). The sampling period did not seem to have any effect o the distiutio of geealists ad speialists speies i tie GLM: Χ2 = 1.146, Df = 2, p = 0.584) (Fig. 5a), nor had the number of aphids (individuals) per collection points GLM: Χ2 = 3.813, Df = 3, p = . Fig. ad the audae of aphids speies o the sae plat GLM: Χ2 = 0.078, Df = 1, p = 0.780) (Fig. 5f).

Type of parasitoids species Type of parasitoids species Type of parasitoids species Generalist Specialist Generalist Specialist Generalist Specialist

Autumn >201

2:4 Cultivated 201 -

101

0:2

-100

Summer 51

2:0 - Type of areas of Type Season sampling Season

-2 4: Uncultivated -

< 51 <

Number of aphids per collection points collection per aphids of Number <-4 Spring 2 2 Value of GLM: X = 1,146, Df = 2, p = 0,564 Value of GLM: X = 1,696, Df = 1, p = 0,193 2 Value of GLM: X = 3,813, Df = 3, p = 0,432

Type of parasitoids species Type of parasitoids species Type of parasitoids species Generalist Specialist Standardized residuals Generalist Specialist Generalist Specialist

Very Very Common

Very common Very

Common

Common Moderately Moderately

Abundance of aphid species aphid of Abundance

Abondnace of botanical family plants of family botanical of Abondnace Uncommon Uncommon Uncommon 2 species plant a on sampling aphid of Abundance 2 2 Value of GLM: X = 19,987, Df = 3, p < 0,001 Value of GLM: X = 15,803, Df = 2, p < 0,001 Value of GLM: X = 0,078, Df = 1, p = 0,780

Figure 5: Analysis of the effect of different factors on the generalist / specialist parasitoid species. The data represented the sampling proportions with generalists or specialists parasitoids depending on different classes of factors. Statistical tests are realized in a binomial GLM coupled to an analysis by MCA. For MCA, we had many factors to make up classes, the classification method are described both in the title or axes and in the tables under the illustrations. 58

Genetic structure of populations of the most generalist parasitoid species The five most abundant generalist species in this study were A. ervi, A. matricariae, D. rapae, E. plagiator and L. fabarum (Fig. 2 and Table 2). They were also the only ones which parasitized aphids both in cultivated and in uncultivated habitats. The subsample in the analysis of the genetic structure of these five species is in table S2.The multilocus ML tree revealed that most of these generalist species had a substructure related to the aphid host or plant family (Fig. 6). In A. matricariae, the 11 samples were structured into three units: a clade including individuals emerging from B. brassicae in the cultivated area, a clade including individuals emerging from Aphis spp. in the uncultivated area and clade including individuals emerging from five different aphid taxons and from both habitats. In D. rapae, the eight samples were separated into two groups: individuals emerging from H. atriplicis differed genetically from the other D. rapae. In E. plagiator, the four samples were separated into four groups. The sixteen samples of L. fabarum were split into two groups. The first group was constituted of individuals emerging from S. avenae, Brachycaudus sp and species of Aphis collected on Fabaceae in the uncultivated area. Individuals clustered in the second group exploited species of Aphis on all plant families except Fabaceae and Metopolophium sp on Rosaceae. In A. ervi no structure emerged from the six samples found on the four different aphid hosts in cultivated and uncultivated environments.

Aphidius matricariae

Aphidius ervi

Diaeretiella rapae

Lysiphlebus fabarum

Ephedrus plagiator

Figure 6: ML tree of five parasitoid species from the multilocus analysis based on three genes. Bootstrap values are given for each branch. Scaling is expressed in the proportion of substituted bases per site. Name of specimens are constituted of sample name, aphid host, plant host and in bracket: number of individual and type of habitats (C: cultivated, NC: uncultivated). Am: Aphidius matricariae, Ae: Aphidius ervi, Dr: Diaeretiella rapae, Ep: Ephedrus plagiator, Lf: Lysiphlebus fabarum

Discussion

In this study, we collected a large sample of aphids and parasitoids during 10 months at a farm scale in order to assess the host range actually used by aphid parasitoids in a small time and spatial scale. We observed in parasitoid host range a gradient from monophagous species to species that parasitized up to eight different aphid hosts. Observed host ranges were significantly narrower than expected. The cultivated and the uncultivated parts of the studied agroecosystem differed in the proportion of generalist and specialist parasitoids they hosted. Specialist species were more abundant in uncultivated habitats than in the cultivated area. The most generalist species exploited hosts in both types of habitats. This proportion was affected by the abundance of the aphid taxons and by the plant families hosting aphids in the environment. Generalist species were present during a longer period than specialist ones. Finally, we found that the actual host range of species classified as generalist is probably narrower than described in the literature, as a genetic structuration related to aphid taxons, host plants or both was detected in most generalist species.

Realized parasitoid host ranges The diversity of aphid and parasitoid species found in the studied agroecosystem was very important, accounting for a third of all species described in nine European countries during 13 years by Kavallieratos et al. (2004). In our study, Aphidiinae appeared mainly monophagous. Few species parasitized more than three aphid taxons and the actual host range observed in the agroecosystem was often narrower than the theoretical one. Many available aphid hosts were not exploited by generalist species. This could reveal a local specialization. Previous studies have showed that the parasitoid host range may not be consistent across the entire area of distribution of a species (Stireman et al, 2006; Abrahamson & Blair, 2008; Henry et al, 2008). Indeed, all hosts belonging to the theoretical host range of a parasitoid are not equally preferred or suitable locally for the development of parasitoids (Storeck et al, 2000; Ode, 2006; Stilmant et al, 2008; Desneux et al, 2009; Le Ralec et al., 2011). This pattern of host exploitation we observed is consistent with a preference/performance hypothesis (Desneux et al., 2012), as we observed in most generalist species a host predominantly exploited. The only exception was A. matricariae where this pattern is more balanced. Ecological specialization is often driven by competition for resources (Futuyma & Moreno, 1988; Chesson, 2000; Hardy & Otto, 2014), following the Gause's theory of niche (Gause, 1934). Host specialization in generalist parasitoids could therefore limit the interspecific competition for aphid hosts exploited by more competitive specialist species (Straub et al, 2011). In this study, we also found previously undescribed interactions between aphid and parasitoid, for almost a half of the latter. It is appealing to attribute them to erroneous identifications (Gagic et al.,

2016). However, all specimens were carefully re-examined and we confirmed the correct identification of both aphids and parasitoids. The two reviews (Kavallieratos et al, 2004; Starý et al, 2006) used to determine parasitoid theoretical host ranges listed interactions between aphids and parasitoids in Central and Eastern Europe. It is however unlikely that so many interactions found in a well-studied agricultural context were previously undescribed. Moreover, such interaction was not found in studies focused on French fauna either (Stary et al, 1971, 1973, 1977). They should rather be considered as parasitoid errors in host selection process in the absence of a more suitable resource. In Aphidiinae, it is well-known that such behavior could lead to the production of few offspring (Le Ralec et al., 2011). Whether this result in the selection of populations able to parasitize new host species and then in enlargement of the species host spectrum remains to be demonstrate.

Role of cultivated and uncultivated habitats and factors involved in the proportion of generalist and specialist species of Aphidiinae In order to analysis the distribution of generalist and specialist Aphidiinae in the agroecosystem, we classified all encountered parasitoid species as generalist or specialist according to their realized host range. However, a more realistic scenario would rather consider a continuum of specialization. The threshold used to separate specialist from generalist was rather arbitrary (4 parasitised host species) underlying the difficulty to make such a binary classification. To analysis the effects of host traits on parasitoid specialization, other classification methods exist (see Gagic et al., 2016), but are not relevant in our study as they are design rather for meta-analysis and a larger diversity of species. The proportion of generalist and specialist natural enemies in an agricultural landscape varies depending on the type of habitats (Stilmant et al, 2008) and especially, the surface and isolation of habitats (Tscharntke & Kruess 1999; Tscharntke et al, 2005). We found more specialist species and more specific interactions involving a single aphid taxon and a single parasitoid species in the uncultivated habitats. Specialist species were especially found on rare species of aphids on the plant family with the greatest species richness and harbouring the highest aphid richness, including rare species. Specialist species appeared hence favored by uncultivated habitat stability and host scarcity. Plant and aphid richness were much higher in the uncultivated area which may explain why we find more specialist Aphidiinae in this habitat (Rodriguez & Hawkins, 2000; Kruess, 2003; Gurr et al, 2003) Stireman & Singer, 2003); because specialists parasitoids are most often associated with the hosts themselves specialists (Stireman & Singer 2003). This high richness of aphids and parasitoids may result from ecological speciation (Futuyma, 2008; Matsubayashi et al, 2010). These can lead to a high phytophagous specificity to a plant species or a plant family. Indeed, less than 10% of phytophagous organisms feed on plants belonging to more than three different families (Schoonhoven et al, 2005).

This high degree of specialization in aphids may cause the parasitic specialization in Aphidiinae by a host-plant associated differentiation (Stireman et al, 2006; Forbes et al, 2009; Feder et al, 2010). Generalist species exploited aphids in both cultivated and uncultivated habitats. The proportion of generalist species seemed positively influenced by the abundance of aphid taxons in the environment, rather by the aphid numbers in the colonies. The proportion of generalist was negatively affected by the abundance of plant families. The abundance of generalist species appear to be favored by plants homogeneity (i.e. low species richness). Low diversity of plants and aphids facilitate hosts searching by generalist species which are less efficient than specialist species in their searching behavior (Stilmant et al. 2008; Devictor et al, 2010). On the contrary, generalist species respond better than specialist species to habitat instability caused by crop rotation and seasonal flutuatios i esoues i ultivated aeas Wilso et al, ; Toaović et al, . This segregation of generalist and specialist parasitoid species by habitats, by aphid taxons or by plants reduces interspecific competition and facilitates species coexistence (Lei & Hanski, 1998; Von Zeipel et al, 2006; Elzinga et al, 2007; Klapwijk & Lewis, 2011). Moreover, the resources partitioning can also be temporal. Generalist species were present almost twice as long in the agroecosystem as the specialist species were, which could be related to their ability to parasitize several species of aphids. Resource partitioning in time and space allows the separation of ecological niches and reduces interspecific competition (Ferry-Graham et al, 2002; Futuyma & Moreno, 1988; Chesson, 2000; Hardy & Otto, 2014). Specialist species in cultivated area were present mainly in April and May before the massive arrival of generalist species and very little in autumn. In uncultivated area, the highly specialized species are mostly present before the summer crash of aphid populations (in June and July), when aphid richness is the most important, although some species such as Ephedrus nacheri were present in autumn. Generalist species, on the other hand, were present almost continuously in all type of habitats. Despite a longer time of study and a higher number of monitored aphid taxons, we did not find more parasitoid species sharing between the cultivated and uncultivated habitats than in the study of Derocles et al. (2014) performed only in spring. Especially, we did not observe any migration of parasitoids species from cultivated areas to uncultivated habitats, after crops harvesting. This supports the hypothesis that semi-natural habitats played a weak role of reservoir for parasitoids of pest aphids. We found only five species of parasitoids exploiting both pest aphids in cultivated area and non-pest aphids in uncultivated area. Such species constitute a choice target for conservation biological control. Indeed, they may persist in the environment in the absence of the target pests and thereby apply high pressure on pest aphids from the onset of crop colonization (Langer & Hance, 2004). Their

63 population could be increased by providing them alternative non-pest hosts. However, this results in an increase of pest regulation service only in the absence of intraspecific host specialization.

Genetic structuration in generalist species of Aphidiinae Intraspecific host specialisation in generalist Aphidiinae species (Derocles et al, 2016) could limit the role of reservoir of uncultivated areas (De Conti et al, 2008). Our study revealed various levels of genetic differentiation between populations of generalist species at small spatial scale, ranging from the absence of any clearly identifiable structure to the possible existence of cryptic species. These structures were linked to the aphid taxons, host plant or both. Only one generalist species did not exhibited any identifiable genetic structure: A. ervi. This species exploits mainly aphids from Fabaceae crops including A. pisum (Toaović & Brajković, 2001; Kavallieratos et al, 2004) and could be considered as a true generalist in the cultivated area. However, A. ervi was not well represented in the uncultivated areas with only rare events of parasitism detected on non-pest aphids, as demonstrated in previous studies (Bilodeau et al, 2013; Derocles et al, 2016). A. matricariae and D. rapae were structured according to the aphid host. In both species, we observed several clades specific to a single aphid taxon and a clade gathering individuals collected on several pest aphids. Derocles et al, (2016) showed that A. matricariae consisted of several phylogenetic lineages (paraphyletic groups) based on the analysis of samples originating from various host and geographic areas. In D. rapae, recent studies based on biological experiment (reproductive incompatibility, Navasse et al. submitted) and molecular analyses (Derocles et al, 2016; Navasse et al, unpublished) showed that populations collected on the aphid H. atriplicis were genetically distinct from populations exploiting other aphid taxons. In L. fabarum, the structure found was related to the plant-of collection and we observed two clades exploiting two or three species of aphids in the uncultivated area but very few pest aphid taxons. Other studies have also demonstrated that L. fabarum consisted of several phylogenetic lineages and probably included cryptic species (Barahoei et al, ; Petović et al, ; Deoles et al, . Fiall E. plagiator exhibited a high intraspecific vaiailit liked to the eploited aphid host ad plat Kavallieatos et al, ; Toić et al, 2005; Derocles et al, 2012; Derocles et al, 2016). We had too few different trophic interactions between aphid and plants exploited by E. plagiator to conclude on factors inducing a population structure. The presence of hidden host specialization or cryptic species in generalist species can have profound implications on the topology of ecological networks (Wirta et al, 2014; Kaartinen et al, 2010). Intraspecific trophic specialization in generalist parasitoid either related to exploited aphid species or plant species could limit the potential role of reservoir of semi-natural habitats. Level and modality of

64 host specialization in generalist parasitoids should be addressed to assess the role of semi-natural habitats in the provision of pest regulation service.

Acknowledgements

The authors thank Bernard CHAUBET for technical assistance for identified aphids and parasitoids. This work was supported by the French Miiste de l’Eseigeet “upieu et de la ‘ehehe’ and was founded by the French Research National Agency (PEERLESS project, ANR-12-AGRO-0006).

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Table S 1: Tritrophic interactions observed in the agroecosystem studied. C: Interactions observed on crop plant (C); N: interactions observed on non-crop plants (N)

Parasitoid Host aphid Host plant Interactions on crops or non crops Adialytus salicaphis Chaitophorus leucomelas Populus deltoïdes N Chaitophorus sp Populus deltoïdes N Aphidius absinthii Macrosiphoniella sp Achillea millefolium N Aphidius avenae Acyrthosiphon pisum Pisum sativum C Aphis fabae Chenopodium sp N Metopolophium dirhodum Hordeum vulgare C Sitobion avenae Triticum aestivum C Zea mays C Aphidius eadyi Acyrthosiphon pisum Medicago sativa C Aphidius ervi Acyrthosiphon pisum Medicago sativa C Pisum sativum C Trifolium sp C Cavariella aegopodii Anthriscus sylvestris N Microlophium carnosum Urtica dioica N Myzus persicae Brassica rapa C Hyperomyzus picricis Picris hieracioides N Aphidius funebris Uroleucon sonchi Sonchus sp N Uroleucon sp Crepis sp N Picris hieracioides N Senecio sp N Sonchus sp N Uromelan sp Aster sp N Centaurea sp N Aphidius matricariae Aphis fabae Chenopodium sp N Aphis sp Matricaria sp N Brachycaudus helichrysi Matricaria sp N Brevicoryne brassicae Brassica napus C Brevicoryne brassicae Brassica rapa C Hyperomyzus picricis Picris hieracioides N Myzus cerasi Prunus avium N Myzus persicae Brassica rapa C Chenopodium sp N Uroleucon sp Achillea millefolium N Aphidius rhopalosiphii Metopolophium dirhodum Hordeum vulgare C Sitobion avenae Triticum aestivum C Uroleucon sp Crepis sp N Aphidius rosae Macrosiphum funestum Rubus fruticosus N Aphidius salicis Cavariella aegopodii Anthriscus sylvestris N Cavariella sp Heracleum sphondylium N Aphidius sonchi Aphis fabae Sonchus sp N Cavariella pastinaceae Cornus sanguinea N Hyperomyzus lactucae Sonchus sp N Hyperomyzus picricis Picris hieracioides N Hyperomyzus sp Sonchus sp N Uroleucon sp Sonchus sp N Aphidius urticae Acyrthosiphon pisum Medicago sativa C Binodoxys acalephae Aphis sp Rumex sp N Ulex europaeus N Cavariella aegopodii Anthriscus sylvestris N Macrosiphoniella sp Achillea millefolium N Uroleucon sp Sonchus sp N Binodoxys angelicae Aphis fabae Cirsium sp N Viburnum opulus N Aphis farinosa Salix caprea N Aphis sp Cirsium sp N Galium sp N Matricaria sp N Rubus fruticosus N Rumex sp N Vicia faba N Cavariella theobaldii Heracleum sphondylium N Pastinaca sativa N Hyadaphis foeniculi Pastinaca sativa N Binodoxys centaurea Aphis sp Solanum nigrum N Uroleucon sp Crepis sp N Senecio sp N 76

Uromelan sp Aster sp N Centaurea sp N Binodoxys sp Aphis fabae Cirsium sp N Aphis sp Sonchus sp N Uroleucon sp Crepis sp N Diaeretiella rapae Aphis fabae Chenopodium sp N Cirsium sp N Brevicoryne brassicae Barbarea vulgaris N Brassica napus N and C Brassica oleracea C Hayhurstia atriplicis Chenopodium sp N Myzus persicae Brassica oleracea C Chenopodium sp N Uroleucon sp Crepis sp N Ephedrus nakeri Hayhurstia atriplicis Chenopodium sp N Ephedrus niger Uroleucon sp Picris hieracioides N Ephedrus plagiator Aphis fabae Chenopodium sp N Aphis sp Capsella bursa-pastoris N Sitobion avenae Triticum aestivum C Uroleucon sp Picris hieracioides N Sonchus sp N Lysiphlebus confusus Aphis sp Salix caprea N Lysiphlebus fabarum Aphis fabae Cirsium sp N Heracleum sphondylium N Aphis sp Capsella bursa-pastoris N Cirsium sp N Cytisus scoparius N Heracleum sphondylium N Matricaria sp N Rubus fruticosus N Rumex sp N Sonchus sp N Ulex europaeus N Urtica dioica N Vicia faba N Vicia sp N Brachycaudus cardui Senecio sp N Brachycaudus sp Cirsium sp N Matricaria sp N Metopolophium sp Rubus fruticosus N Sitobion avenae Zea mays C Lysiphlebus testraceïpes Macrosiphum sp Salix caprea N Monoctonus crepidis Uroleucon sp Crepis sp N Praon barbatum Acyrthosiphon pisum Medicago sativa C Praon bicolor Uroleucon sp Picris hieracioides N Praon sp Aphis sp Rumex sp N Uroleucon sp Senecio sp N Praon uroleucon Uroleucon sp Crepis sp N Praon volucre Aphis sp Ulex europaeus N Uroleucon sp Crepis sp N Praon yomenae Uroleucon sp Achillea millefolium N Crepis sp N Trioxys auctus Sitobion avenae Zea mays C Trioxys sp Myzus cerasi Prunus avium N Uroleucon sp Crepis sp N No parasitised Amphorophora rubi Rubus fruticosus N Aphis cytisorum Cytisus scoparius N Aulacorthum solani Crepis sp N Sonchus sp N Betulaphis quadrituberculata Betula pendula N Callipterinella calliptera Betula pendula N Corylobium avellanae Corylus avellana N Elatobium abietinum Corylus avellana N Glyphina betulae Betula pendula N Hyperomyzus pallidus Lapsana communis N Macrosiphum euphorbiae Chenopodium sp N Brassica napus C Corylus avellana N Rubus fruticosus N Macrosiphoniella millefolii Achillea millefolium N Macrosiphum albifrons Lupinus sp N

Megoura viciae Vicia faba N Vicia sp N Rhopalosiphum padi Zea mays C Hordeum vulgare C Thelaxes dryophila Quercus petraea N Utamphorophora humboltii Cornus sanguinea N

Table S 2: List of the tritrophic relationships used in the ML tree.

Plant family of host Number of individual Name of Species Sampling period Type of areas Aphid host Plants plant sequenced population Aphidius ervi October Cultivated Acyrthosiphon pisum Fabaceae Medicago sativa 3 Ae1 Aphidius ervi April Cultivated Acyrthosiphon pisum Fabaceae Pisum sativum 3 Ae2 Aphidius ervi June Cultivated Acyrthosiphon pisum Fabaceae Trifolium sp 3 Ae3 Aphidius ervi June Uncultivated Hyperomyzus picricis Asteraceae Picris hieracioides 1 Ae4 Aphidius ervi September Uncultivated Cavariella aegopodii Asteraceae Anthriscus sylvestris 1 Ae5 Aphidius ervi June Cultivated Myzus persicae Brassicaceae Brassica rapa 1 Ae6 Aphidius matricariae June Uncultivated Uroleucon sp Asteraceae Achillea millefolium 3 Am1 Aphidius matricariae June Cultivated Myzus persicae Brassicaceae Brassica rapa 2 Am2 Aphidius matricariae June Uncultivated Hyperomyzus picricis Asteraceae Picris hieracioides 2 Am3 Aphidius matricariae June Uncultivated Aphis sp Asteraceae Matricaria sp 1 Am4 Aphidius matricariae June Uncultivated Myzus cerasi Rosaceae Prunus avium 1 Am5 Aphidius matricariae June Cultivated Brevicoryne brassicae Brassicaceae Brassica rapa 3 Am6 Aphidius matricariae July Cultivated Brevicoryne brassicae Brassicaceae Brassica napus 2 Am7 Aphidius matricariae June Uncultivated Brachycaudus helichrysi Asteraceae Matricaria sp 3 Am8 Aphidius matricariae September Cultivated Myzus persicae Brassicaceae Brassica oleracea 1 Am9 Aphidius matricariae June Uncultivated Aphis fabae Chenopodiaceae Chenopodium sp 1 Am10 Aphidius matricariae June Uncultivated Myzus persicae Chenopodiaceae Chenopodium sp 1 Am11 Diaeretiella rapae May Cultivated Brevicoryne brassicae Brassicaceae Brassica napus 3 Dr1 Diaeretiella rapae June Uncultivated Uroleucon sp Asteraceae Crepis sp 3 Dr2 Diaeretiella rapae June Cultivated Myzus persicae Brassicaceae Brassica oleracea 3 Dr3 Diaeretiella rapae June Uncultivated Brevicoryne brassicae Brassicaceae Barbarea vulgaris 3 Dr4 Diaeretiella rapae October Uncultivated Hayhurstia atriplicis Chenopodiaceae Chenopodium sp 3 Dr5 Diaeretiella rapae May Uncultivated Myzus persicae Chenopodiaceae Chenopodium sp 3 Dr6 Diaeretiella rapae June Uncultivated Aphis fabae Chenopodiaceae Chenopodium sp 1 Dr7 Diaeretiella rapae October Cultivated Brevicoryne brassicae Brassicaceae Brassica oleracea 3 Dr8 Ephedrus plagiator June Uncultivated Aphis fabae Chenopodiaceae Chenopodium sp 3 Ep1 Ephedrus plagiator May Uncultivated Uroleucon sp Asteraceae Picris hieracioides 3 Ep2 Ephedrus plagiator June Cultivated Sitobion avenae Poaceae Triticum aestivum 2 Ep3 Ephedrus plagiator October Uncultivated Aphis sp Brassicaceae Capsella bursa-pastoris 1 Ep4 Lysiphlebus fabarum July Uncultivated Aphis sp Fabaceae Ulex europaeus 3 Lf1 Lysiphlebus fabarum June Uncultivated Aphis sp Fabaceae Cytisus scoparius 3 Lf2 Lysiphlebus fabarum June Uncultivated Aphis sp Asteraceae Matricaria sp 3 Lf3 Lysiphlebus fabarum June Uncultivated Aphis sp Fabaceae Vicia sp 2 Lf4 Lysiphlebus fabarum June Uncultivated Brachycaudus sp Asteraceae Matricaria sp 3 Lf5 Lysiphlebus fabarum June Uncultivated Aphis sp Rosaceae Rubus fruticosus 3 Lf6 Lysiphlebus fabarum June Uncultivated Metopolophium sp Rosaceae Rubus fruticosus 1 Lf7 Lysiphlebus fabarum April Uncultivated Aphis sp Urticaceae Urtica dioica 3 Lf8 Lysiphlebus fabarum June Uncultivated Aphis sp Polygonaceae Rumex sp 3 Lf9 Lysiphlebus fabarum June Uncultivated Brachycaudus cardui Asteraceae Cirsium sp 3 Lf10 Lysiphlebus fabarum June Uncultivated Aphis sp Brassicaceae Capsella bursa-pastoris 3 Lf11 Lysiphlebus fabarum June Uncultivated Aphis fabae Asteraceae Cirsium sp 3 Lf12 Lysiphlebus fabarum June Uncultivated Brachycaudus sp Asteraceae Cirsium sp 3 Lf13 Lysiphlebus fabarum June Uncultivated Aphis sp Fabaceae Vicia faba 3 Lf14 Lysiphlebus fabarum June Uncultivated Aphis sp Asteraceae Sonchus sp 3 Lf15 Lysiphlebus fabarum July Cultivated Sitobion avenae Poaceae Zea mays 1 Lf16 79

Supplementary Figure 1. Quantitative food webs between plants, aphids and their parasitoids in uncultivated habitats. The series of bars represent plant abundance (bottom), aphid abundance (middle) and parasitoid abundance (top). The width of edge links between plants, aphids and parasitoids illustrates the relative strength of each interaction.

Supplementary Figure 2. Quantitative food webs between plants, aphids and their parasitoids in cultivated habitats. The series of bars represent plant abundance (bottom), aphid abundance (middle) and parasitoid abundance (top). The width of edge links between plants, aphids and parasitoids illustrates the relative strength of each interaction.

B) Copaaiso de deu thodes d’estiatio du paasitise et tude de la daiue d’eploitatio tepoelle des htes de espes galistes

Daiue d’eploitatio tepoelle des essoues pa tois espes d’Aphidiiae galistes et opaaiso de deu thodes d’estiatio du paasitise

Introduction

Nous avons vu dans la partie précédente que les espèces Aphidiinae généralistes sont peu nombreuses dans l'agroécosystème étudié et encore moins nombreuses à être présentes dans les deux types d'habitat, cultivé et non cultivé. De plus, une structuration génétique de leurs populations, en fonction des espèces de pucerons et de plantes dont elles sont issues, suggère une spécialisation intraspécifique. Afin d'approfondir la répartition du parasitisme des espèces les plus généralistes entre leurs différents hôtes, à la fois dans l'environnement et dans le temps, et d'en comprendre les déterminants, nous avons choisi trois espèces parmi les cinq identifiées dans le pojet d’atile pdet : Aphidius ervi, Aphidius matricariae et Diaeretiella rapae. Les deux autres espèces, Ephedrus plagiator et Lysiphlebus fabarum n'ont pas été retenues car la 1ère s'est avérée peu fréquente au cours de notre échantillonnage et nous avions trop d'informations incomplètes sur les hôtes de la seconde, du fait de difficultés d'identification, notamment pour les pucerons du genre Aphis et leurs plantes hôtes. Les trois espèces retenues présentent en outre un fort intérêt pour la régulation de pucerons ravageurs des cultures et leur structure génétique permet d'espérer une exploitation de plusieurs espèces hôtes différentes au sein d'un même agroécosystème, par au moins une entité sub- spécifique. A. ervi semble avoir un rôle agronomique majeur dans la limitation des populations du puceron du pois Acyrthosiphon pisum, ravageur des cultures de Fabacées (Van Emden & Harrington, 2007). Cette espèce ne présente aucune structuration génétique liée à l'hôte dans notre agroécosystème. Diaeretiella rapae est patiueet l’uiue paasitoïde piaie du pueo cendré du chou Brevicoryne brassicae, ravageur important des cultures de Brassicaceae (Alford et al, 2003 ; Blackma & Eastop, . Malg l’eistee potetielle d’ue espe ptiue spialise sur H. atriplicis, les idividus eploitat l’esele des autes hôtes selet foe u goupe homogène. Enfin A. matricariae, espèce la plus généraliste dans notre agrosystème, présente une stutuatio gtiue des populatios plus aue. Deu etits se spaet d’u goupe plus généraliste qui semble avoir comme hôte principale Myzus persicae. Ce puceron très polyphage est à l’oigie de oeu dgâts e agiultue su les Bassiaeae, “olaaeae… Feto et al, .

Dans le cadre du déploiement de stratégies de lutte biologique par conservation, le caractère galiste de l’espe est u ite piodial pou le aitie des populatios e asee des ravageurs (Holt et Lawton, 1993). Les ressources dans le milieu non cultivé possiblement exploitable pa es espes pouaiet joue u ôle de sevoi. Afi de aatise l’ipotae de es ressources, nous avons choisi de nous intéresser à la dynamique tepoelle d’eploitatio des hôtes pour ces trois espèces dans les milieux cultivés et non cultivés d'un agroécosystème de type grandes ultues, à l'helle d'ue eploitatio agiole. L’ojetif est de dfii si l’espe eploite simultanément des pueos das les deu ilieu, ou suetielleet, ’est-à-die u’elles exploiteraient en priorité les ravageurs de culture plus accessibles car présents en plus grand nombre dans le milieu cultivé, puis avec la raréfaction du ravageur elles pourraient exploiter des hôtes dans le ilieu o ultiv. Note hpothse est alos ue le hageet d’hôte est li à l’aodae des ressources. Les ravageurs sont généralement présents en grande quantité mais sur une courte période du fait que la plante cultivée est très abondante et présente sur de grande surface. Pou atteide et ojetif, ous utilisos l’hatilloage pset das le pojet d’atile précédent. Aux données biologiques, prélèvements de pucerons et de momies, déjà présentées, s'ajoutent des données obtenues grâce à des outils moléculaires permettant de détecter la présence du parasitoïde dans le corps du puceron (Derocles et al, 2014). La combinaison des deux méthodes vise à otei ue valuatio plus pise du spete d’hôtes effetif de ces trois espèces dans notre agroécosystème. En effet, la détermination des hôtes exploités, uniquement par la collecte de pucerons parasités au stade momie, tend à sous-estimer le niveau de parasitisme sur les différents hôtes, les individus parasités mais non encore momifiés, n'étant pas détectés et cela peut conduire à minorer, voir ignorer, les évènements de parasitisme les moins fréquents.

Matériel et méthodes

Echantillonnage Pou appel, l’hatilloage a t oduit d’avil à ovee , sur le domaine expérimental de la Motte, conduit en agriculture conventionnel (INRA, Centre de Rennes, Le Rheu 35, France), qui offre une grande diversité de milieux cultivés et non cultivés. La méthode était la suivante : prélèvement de pucerons et de momies à vue, e stadadisat l’hatilloage des diffets sites par le temps de prospection par milieu, soit 30 minutes pour une parcelle cultivée avec un prélèvement de cinq colonies maximum par interaction plante - puceron présente. Tous les individus d'une même colonie sont collectés. Pour les milieux non cultivés, le temps de prospection variait de 30 mn à 2 heures en fonction du linéaire, de la hauteur et de diversité de la végétation. Là encore, les colonies de pucerons sont récoltées en totalité, à raison de cinq colonies au maximum pour chaque

83 interaction plante-puceron pour chaque jour d'échantillonnage. Celui-ci a été réalisé en ciblant trois paelles ultives et leus odues su tois seteus diffets du doaie epietal de l’IN‘A- Le ‘heu f. Ojetifs de la thse et thodes utilises II.., ave tois jous d’hatilloage pa semaine (un par secteur) et trois semaines par mois. La détermination des individus des trois niveaux trophiques, plantes, pucerons et parasitoïdes issus des momies récoltées dans les colonies, s'est faite au niveau de l'espèce, dans la mesure du possible. Après détermination, les pucerons et les parasitoïdes ont été conservés dans de l'alcool à 96°. Les individus obtenus sur une même espèce de plante, sur un même site (une parcelle et ses bordures), à une même date constituent un prélèvement.

Détection moléculaire du parasitisme dans le corps des pucerons

Extactio de l’ADN La méthodologie utilisée a été développée par Derocles et al (2012). Au total, l'échantillonnage réalisé a conduit à la collecte d'environ 65400 pucerons. Pour des raisons de temps et de faisabilité, nous avons réalisé un sous-échantillon pour l'analyse moléculaire. Nous avons conservé au maximum 50 individus par prélèvement, en sélectionnant les pucerons de stade L4 et/ou adultes, susceptibles d'avoir été parasités aux stades larvaires précédents et donc de contenir une larve de parasitoïde de stade L2 ou L3, ce qui augmente la quantité d'ADN de parasitoïde présent dans le puceron et donc les haes d'etaie et ADN. Pou alise l’etatio de l’ADN des pueos, ous avos utilis la méthode "Hot Sodium Hydroxyde and Tris" (HotShot) (Montero-Pau et al., 2008). Les échantillons ainsi préparés sont alors directement utilisables pour réaliser les PCR (amplification en chaîne par polymérase). Une fois les extractions réalisées, nous avons choisi de regrouper 10 extraits ADN de pueos d’u e elev, e ui doe au aiu lots de pa elev. Cette thode constitue un compromis entre l'évaluation quantitative du parasitisme sur chaque espèce hôte et la faisabilité technique d'une détection strictement individuelle du parasitisme au sein des pucerons. Elle ne permet donc pas de calculer un taux de parasitisme, mais d'estimer la fréquence de ce parasitisme pour chaque espèce de puceron hôte récoltée.

Analyse par PCRs successives Ue peie PC‘ ultiple a t alise ave deu ojetifs, i s’assue du o douleet de l’etatio pa l’itediaie d’ue paie d’aoe uiveselle et ii dtete la psee d’u paasitoïde Aphidiiae à l’itieu du pueo pa ue paie d’aoes spifiues au espes de cette sous-famille.

Ue paie d’aoes gales du ge COI ge itohodial odat pou le tohrome oxydase est utilise oe toi positif de l’etatio de l’ADN, apale de dtete aussi ie l’ADN des pueos ue elui des paasitoïdes. Ce ouple d’aoes suffit do pou vifie ue l’etatio s’est oeteet doule. Le ouple d’aoes hoisi est le suivat : LCO1490 et HCO. Les fagets d’ADN aplifis pa es aoes esuet paies de ase : LCO1490 : ’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-’ Fole et al, et HCO : ’- TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-’ Fole et al, 94). Pou dtete la psee d’u paasitoïde Aphidiiae à l’itieu du ops de so hôte, ue paie d'aoes spifiues à e goupe, dessi su le ge odat pou l’A‘N iosoiue “ a t utilisée. Ces amorces permettent de détecter les parasitoïdes à l’itieu du ops de leu hôte ds 24h après l'oviposition avec un taux de détection de 100 % (Derocles et al, 2012 a et b), ce qui justifie la sélection des stades L4 et/ou adultes chez les pucerons à analyser. Le fragment amplifié par ces amorces mesure 210 paires de bases. Les séquences de ces amorces sont : 16S-F : ’-CGC CGT TTT ATC AAA AAC ATG T-’ “io et al, et “-‘spe ’-TCT AWA GGG TCT TCT CGT CT-’ Deoles et al, 2012). Le protocole de la PCR multiplex est le suivant : le programme retenu possède un volume final de 16

µL pa idividu, iluat . µL d’H2O ultra pure, 2.5 µL de tampon 5x, 1 µL de MgCl2 à 25 mM, 0.5 µL de dNTP à M dATP, dCTP, dGTP et dTTP, . µL d’aoe Foad à µM . µL d’aoe LCO1490 et 0.4 µL d’aoe “-F, . µL d’aoe ‘evese à µM . µL d’aoe HCO et . µL d’aoe “-‘spe, . µL de GoTa® Poega et µL d’etait d’ADN. Le pogae PC‘ comprend une dénaturation initiale de 3 mn à 94 °C suivie de 40 cycles de dénaturation de 30 secondes à 94 °C, une hybridation de 60 secondes à 56 °C puis une élongation de 90 secondes à 72 °C. Pou le deie le, le teps d’logatio tait de . Ue fois la PC‘ alise, µL de produits PCR ajouté à 4µL de tampon de charge ot t dposs su u gel d’agaose à . % contenant du SYBR® Safe et soumis à électrophorèse. Nos aalses PC‘ tat alises su u lage de l’ADN de pueos d’u e elev oteat µL d’ADN de haue pueo, il tait essaie de vifier si ce programme PCR peettait d’aplifie l’ADN du paasitoïde das u lage oteat u seul pueo paasit et pucerons non parasités (cf. Objectifs de la thèse et méthodes utilisées II.1.3). Une deuxième PCR a ensuite été réalisée pour déterminer si le parasitisme détecté provenait de l’ue ou l’aute de os espe iles, D. rapae, A. ervi et/ou A. matricariae. Des PCRs ont été alises e utilisat des ouples d’aoes spifiues de haue de es espes. “euls les échantillons où un parasitoïde a été détecté lors de la première PCR ont été analysés, ce qui a permis de réduire le nombre de lots à analyser. Les amorces que nous avons utilisées ont été dessinées sur le gène COI.

Pour le parasitoïde A. ervi, des amorces existantes ont été utilisées, celle-i peettat d’aplifie u fragment de 164 paires de bases : “: ’-GGTATATGATCTGGAGTATTAGGTC-’ et A: ’- CCACCAATTATAATAGGTATAACC-’ Taugott et al, . Auue aoe spifiue ’eistait pou les parasitoïdes D. rapae et A. matricariae, nous en avons donc dessiné (cf. Objectifs de la thèse et méthodes utilisées II.1.3). Cette étape a été présentée dans le chapitre introductif de la thèse. Pour D. rapae, le couple d'amorces suivant, Dr1-F - Dr2-R, amplifiant un fragment de 246 paires de bases a été utilisé : Dr1-F: ’-AGAATTACGGGTAGATTAATTGG-’ et Dr2-‘: ’- CCAACACCAGAATTTATTAAACCTCTTACT-’. Pour A. matricariae, le couple suivant, Am1-F – Am4-R, amplifiant un fragment de 397 paires de bases a été utilisé : Am1-F: ’-GGTCTGGAGTATTAGGTTTATC- ’ et Am4-‘: ’-GGCTCCTATAATAGAAGAAATACCTGCC-’ Le programme utilisé pour réaliser ces PCRs comprend un volume final de 16 µL par individu PCR iluat µL d’H2O ultra pure, 2.5 µL de tampon 5x, 1 µL de MgCl2 à 25 mM, 0.5 µL de dNTP à 10 mM (dATP, dCTP, dGTP et dTTP, . µL d’aoe Foad à µM, . µL d’aoe ‘evese à µM, . µL de GoTa® Poega et µL d’ADN de pueo. Le pogae PC‘ oped ue dénaturation initiale de 3 mn à 94 °C suivie de 40 cycles de dénaturation de 30 secondes à 94 °C, une hybridation de 60 secondes à 60 °C (56 °C pour D. rapae) puis une élongation de 90 secondes à 72 °C. Pou le deie le, le teps d’logatio est de . Ue fois la PC‘ alise, µL de poduits PCR ajouté à 4µL de tampon de charge ot t dposs su u gel d’agaose à . % oteat du SYBR® Safe et soumis à électrophorèse.

Analyse statistique Afin de réaliser les différentes analyses, nous avons choisi de regarder le parasitisme par point de prélèvement, ceux afin de ne pas pede l’ifoatio du oe de lots. C’est-à-die ue si l’o détecte un seul lot comme parasité par une espèce dans un point de prélèvement celui-ci aura le e poids ue si l’o dtete ette espe das les lots d’u aute poit de plveet. “eules des informations qualitatives ont ainsi été retenu. Les analyses ont pour but de comprendre quels sont les pucerons exploités dans quels milieux et à quelle période par les trois espèces de parasitoïdes étudiés. Nous cherchons à déterminer les facteurs qui influence la présence / absence des trois espèces cibles par point de prélèvement. Les facteurs considérés sont : la date (en mois), le type de milieu, la famille de plante et l'espèce de puceron. L'influence de ces quatre facteurs sur le parasitisme des trois espèces a été évaluée en utilisant un modèle linéaire généralisé (GLM) en supposant une erreur binomiale et une fonction de lien logit. Ensuite nous avons utilisé la méthode des contrastes comme test post hoc, celui-ci permet de réaliser des comparaisons par paires, pour ce faire on utilise la fonction 'esticon' du package 'Doby' (Højsgaard, 2004). Toutes les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du logiciel R (R Core Team, 2013).

Résultats

Données biologiques et moléculaires sur le parasitisme global Au total, 331 prélèvements ont été obtenus. Onze d'entre eux ne contenaient que des momies. Les quelques 65 400 pucerons récoltés appartiennent à 47 taxons, (espèces ou genres), sur 53 taxons botaniques (espèces, genres ou familles), 42 % des points de relevés présentent du parasitisme, sous forme de momies, ayant donné 1584 parasitoïdes adultes appartenant à 29 espèces ou genres. L’aalse olulaie du paasitise des pueos olts a pot su u total de pueos appartenant au plveets. Pai es plveets, uate ’ot pu te aalss los des PC‘s pole los de l’etatio. “u les plveets estats, se sot vls positifs à la dtetio olulaie de l’aoe “, soit % des plveents. Il y a donc une différence de près de 20 % dans la détection du parasitisme entre les deux méthodes, en faveur de la méthode moléculaire. Dans 39 cas, la détection moléculaire du parasitisme est négative bien qu'il y ait eu présence de momies dans le prélèvement. Une double détection es tobtenue dans 101 des 197 plveets positifs los de l’aalse olulaie. Au total, les deu thodes oies vlet que 236 prélèvements sur 331 contenant des pucerons parasités, soit 71 %.

Specte d’hôte observé pour trois espèces généralistes et comparaison des deux méthodes de détection Les trois espèces de parasitoïdes ciblées dans cette étude, D. rapae, A. ervi et A. matricariae sont détectés par la combinaison des deux méthodes dans 20 % des 331 prélèvements effectués. Le tableau 1 présente les effectifs de chacune des trois espèces, selon la méthode de détection, ainsi que les données concernant les pucerons et plantes hôtes où le parasitisme a été détecté. Le tableau 2 liste pour chaque espèce les hôtes potetiels psets das l’evioeet, et les hôtes effectivement exploités, en précisant le mode de détection. Ces deux tableaux montrent la otiutio de haue thode pou l’aalse du paasitise.

Tableau 1 : Parasitisme des trois espèces d'Aphidiinae, exprimé en nombre total de prélèvements

Aphidius ervi Aphidius matricariae Diaeretiella rapae Prélèvements avec parasitisme 22 19 28 - Méthode moléculaire 13 17 24 - Prélèvement de momies 12 11 19 - Commun 3 9 15 Hôtes potentiels / hôte exploités 18/8 15/14 21/9 Famille / espèce de plante 6/12 8/14 6/10 Parasitoïdes adultes issus des 40 23 320 momies

Tableau 2 : Statut des espèces de pucerons échantillonnées pour le parasitisme de trois espèces de parasitoïdes Aphidiinae, selon la méthode de détection. En vert, les hôtes potentiels où le parasitoïde est détecté avec les deux méthodes. En bleu, les hôtes potetiels où le paasitoïde est dtet pa l’ue des deu thodes. E oage, les hôtes o décrits dans la littérature où le parasitoïde est détecté par les deux méthodes. En rouge, les hôtes non décrits dans la littérature où le parasitoïde est détecté uniquement par la méthode moléculaire. En gris, les hôtes potentiels où le parasitoïde n'a jamais été détecté quelle que soit la méthode utilisée. Aphidius ervi Aphidius matricariae Diaeretiella rapae

Hôtes détectés Hôtes détectés Hôtes détectés Hôtes Hôtes Hôtes Pucerons échantillonnés potentiels Momies Moléculaire potentiels Momies Moléculaire potentiels Momies Moléculaire Aphis fabae x x x x x x x x Uroleucon sp x x x x x x x Brevicoryne brassicae x x x x x x Myzus persicae x x x x x x x x x x x x Hayhurstia atriplicis x x x x x Acyrthosiphon pisum x x x x x Aulacorthum solani x x x x Myzus cerasi x x x x x Rhopalosiphum padi x x x x x Brachycaudus helichrysi Aphis sp x x x x x x x x Sitobion avenae x x x x x x x x Brachycaudus sp x x x Macrosiphum euphorbiae x x x x Hyperomyzus picricis Cavariella aegopodii x x Corylobium avellanae x x x x x Hyperomyzus lactucae x x x x Metopolophium dirhodum x x Microlophium carnosum x x Aphis farinosa x x x Brachycaudus cardui x x Hyperomyzus sp x Hyadaphis foeniculi x Macrosiphoniella sp x Uroleucon sonchi Macrosiphum albifrons x Macrosiphum sp x

Les tois espes ’eploitet pas l’esele des hôtes potetiels psets das l'agosstème (Tableau 1 et 2). De plus, la fréquence du parasitisme sur les différents hôtes parasités est variable. Ainsi A. ervi a été détecté sur huit espèces ou genres différents (Tableau 3), majoritairement sur A. pisum avec huit prélèvements sur 22, sur le puceron des épis Sitobion avenae, dans 5 prélèvements et sur M. persicae dans deux prélèvements. Il n'a été détecté qu'une seule fois dans les autres espèces. Trois pucerons non décrits comme hôte Cavariella aegopodii, Hyperomyzus picricis et Uroleucon sp ont également été parasités par ce parasitoïde. A. matricariae a été détecté dans 14 espèces de pucerons hôtes différentes, le plus souvent à des fréquences faibles (Tableau 4). Son hôte le plus fréquent est M. persicae avec 4 prélèvements sur 19. Trois espèces de pucerons non décrits comme hôte H. picricis, C. avellanae et Hyperomyzus lactucae ont également été parasités par ce parasitoïde. D. rapae a été détecté sur neuf espèces de pucerons, majoritairement sur B. brassicae dans 12 prélèvements sur 28, puis sur M. persicae avec 6 prélèvements et Hayhurstia atriplicis, avec 3 prélèvements. Il a été détecté dans une seule espèce de puceron non décrite comme hôte, Corylobium avellanae, sur noisetier.

Daiue d’eploitatio des hôtes des 3 espèces de paasitoïdes dans le temps La dynamique des populations de pucerons, telle que reflétée par l'évolution du nombre de prélèvements effectués chaque mois, toutes espèces confondues, montre au printemps une forte augmentation des populations qui culminent en juin avant de diminuer et de disparaître au mois d'août. Cet effondrement est suivi d'une réapparition des pucerons à l'automne, à des niveaux beaucoup plus faibles qu'au printemps (Figs. 1, 2 et 3). La dynamique des hôtes potentiels des trois espèces de parasitoïdes suit le même pattern. Les parasitoïdes sont majoritairement détectés au printemps et très peu à l'automne. Aucune momie n'a été trouvée durant le mois d'août. Le seul facteur qui a un effet significatif sur le parasitisme d'A. ervi est le type de milieu (GLM: X2 = 6.2580, Df = 1, P = 0.01236), on retrouve cette espèce majoritairement dans le milieu cultivé. Les autres facteurs comme la date (GLM: X2 = 1.7749, Df = 7, P = 0.97125), la famille de plante (GLM: X2 = 6.9416, Df = 13, P = 0.90514) et le puceron hôte (GLM: X2 = 23.0617, Df = 46, P = 0.99812) n'ont pas d'effet significatif. La figue et le taleau psete la daiue de l’espe das le teps et elle de l’eploitatio des hôtes. Ce paasitoïde eploite des pueos das les ilieu ultivé tout au long de la piode d’tude, plus patiulieet A. pisum, S. avenae et M. persicae. On le retrouve sporadiquement dans le compartiment non cultivé des agrosystèmes surtout en juin, période où la divesit d’espes de pueo est la plus iportante. Pour A. matricariae, aucun facteur n'a d'effet significatif sur le parasitisme de cette espèce, que ce soit la date (GLM: X2 = 6.570, Df = 7, P = 0.4750), la famille de plante (GLM: X2 = 7.978, Df = 13, P = 0.8450), le type de milieu (GLM: X2 = 1.131, Df = 1, P = . ou l’espe de pueo hôte (GLM: X2

= 44.869, Df = 46, P = 0.5196).. Bien que l'analyse ne montre pas d'effet significatif de la date, cette espèce a été détectée essentiellement en juin (Fig.2). On la retrouve surtout dans le milieu non ultiv, et de faço plus ae et dispese su l’esele de la piode d’hatilloage das le milieu cultivé (Tableau 4). Les ressources exploitées dans milieu cultivé sont les pucerons des Poaceae et des Brassicaceae. Pou l’espe D. rapae, comme pour A. matricariae, aucun facteur n'a d'effet significatif sur le parasitisme de cette espèce,, que ce soit la date (GLM: X2 = 10.430, Df = 7, P = 0.1655), la famille de plante (GLM: X2 = 6.492, Df = 13, P = 0.9264), le type de milieu (GLM: X2 = 0.853, Df = 1, P = 0.3557) ou l’espe de pueo hôte (GLM: X2 = 37.042, Df = 46, P = 0.8243). ). Cette espèce exploite de mai à septembre les pucerons B. brassicae et M. persicae sur les Brassicaceae cultivées et sauvages (Fig.3, Tab. 5). Elle parasite les autres espèces de pucerons dans les habitats non cultivés, elle aussi surtout en juin. Toutefois, elle a également été prélevée plus tard, notamment sur Chenopodium sp, qui est pset su l’esele de la piode d’hatilloage dans le compartiment non cultivé et qui héberge trois espèces de pucerons (A. fabae, M persicae et H. atriplicis) parasités par D. rapae.

200 180 Figure 1: Dynamique des prélèvements effectués, avec des 160 hôtes potetiels d’A. ervi et d’A. ervi durant les mois

140 d’hatilloage e 2014. 120 100 Prélèvements 80 A. ervi 60

Nombreprélévementsde Hôtes potentiels 40

0 Avril Mai Juin Juillet Août Septembre Octobre Novembre

Mois d'échantillonnage Tableau 3 : Dynamique temporelle d'exploitation des hôtes par A. ervi durant les mois d’échantillonnages en 2014. Dans les différentes cases du tableau sont mentionnées la plante hôte et le nombre de prélèvements entre parenthèse (cellule à fond blanc : prélèvement dans une zone cultivée, à fond gris : prélèvement dans une zone non cultivée).

A. ervi 2014 Espèce de pucerons hôtes Avril Mai Juin Juillet Août Septembre Octobre Novembre Medicago sativa (1); Pisum sativum Medicago sativa Medicago sativa Acyrthosiphon pisum Medicago sativa (1) Trifolium sp (1) (1); Trifolium sp (2) (1) (1) Sitobion avenae Trifolium aestivum (2) Zea mays (3)

Myzus persicae Brassica rapa(1) Brassica rapa (1)

Aphis sp Gallium sp (1)

Aphis fabae Cirsium sp (1)

Cavariella aegopodii Anthriscus sylvestris (1)

Hyperomyzus picricis Picris hieracioides (1)

Microlophium carnosum Urtica dioica (1)

Uroleucon sp Senecio sp (1) Sonchus sp (1)

200 180 Figure 2: Dynamique des prélèvements effectués, avec 160 des hôtes potetiels d’A. matricariae et d’A.

140 matricariae durant les mois d’hatilloage e

120 2014. 100 Prélèvements 80 A. matricariae 60 Hôtes potentiels 40

Nombreprélévementsde 20

0 Avril Mai Juin Juillet Août Septembre Octobre Novembre Mois d'échantillonnage Tableau 4 : Dynamique temporelle d'exploitation des hôtes par A. matricariae durant les mois d’échantillonnages en 2014. Dans les différentes cases du tableau sont mentionnées la plante hôte et le nombre de prélèvements entre parenthèse (cellule à fond blanc : prélèvement dans une zone cultivée, à fond gris : prélèvement dans une zone non cultivée).

A. matricariae 2014 Espèce de pucerons Avril Mai Juin Juillet Août Septembre Octobre Novembre hôtes Brassica Brassica Myzus persicae Chenopodium sp (1) oleracea (2) rapa (1) Brevicoryne brassicae Brassica rapa (1) Brassica napus (1)

Metopolophium Hordeum dirhodum vulgare (1) Rhopalosiphum padi Zea mays (1)

Matricaria sp (1); Heracleum sphondylium (1); Cytisus Aphis sp scoparius (1) Aphis fabae Heracleum sphondylium (1); Chenopodium sp (1)

Brachycaudus Matricaria sp (1) helichrysi Brachycaudus sp Cirsium sp (1)

Corylobium avellanae Corylus avellana (1)

Hyperomyzus picricis Picris. hieracioides (1)

Myzus cerasi Prunus avium (1)

Uroleucon sp Achillea millefolium (1)

200 180 Figure 3: Dynamique des prélèvements effectués, avec 160 des hôtes potentiels de D. rapae et de D. rapae durant 140 les mois d’hatilloage en 2014. 120

100 Prélèvements 80 D. rapae 60 Hôtes potentiels 40 Nombreprélévementsde 20

0 Avril Mai Juin Juillet Août Septembre Octobre Novembre Mois d'échantillonnage

Tableau 5 : Dynamique temporelle d'exploitation des hôtes par D. rapae durant les mois d’échantillonnages en 2014. Dans les différentes cases du tableau sont mentionnées la plante hôte et le nombre de prélèvements entre parenthèse (cellule à fond blanc : prélèvement dans une zone cultivée, à fond gris : prélèvement dans une zone non cultivée).

D. rapae 2014 Espèce de pucerons hôtes Avril Mai Juin Juillet Août Septembre Octobre Novembre Brassica napus (2); Brassica napus (4); Brassica oleracea Brevicoryne brassicae Brassica rapa (1) Brassica oleracea (3) (1); Barbarea vulgaris (1) Brassica oleracea (1); Chenopodium Myzus persicae Brassica oleracea (3) Raphanus sativus (1) sp (1) Medicago Acyrthosiphon pisum sativa (1) Aphis sp Chenopodium sp (1)

Aphis fabae Cirsium sp (1); Chenopodium sp (1)

Corylobium avellanae Corylus avellana (1)

Hayhurstia atriplicis Chenopodium sp (2) Chenopodium sp (1)

Macrosiphum euphorbiae Rubus fruticosus (1)

Uroleucon sp Crepis sp (1)

Discussion

Dans cette étude, nous avons montré que les trois espèces de parasitoïde généralistes sont psetes patiueet tout au log de la piode d’hatilloage das le ilieu ultiv. Elles exploitent des ressources dans le milieu non cultivé uniquement durant une courte période qui oespod au pi d’aodae des pueos e tees d’effetif et sutout e tees de divesit spécifique. Ces généralistes, en particulier A. ervi et D. rapae, sot epedat loi d’eploite l’esele des essoues potetielles disponibles, telles qu'identifiées en considérant le spectre d'hôtes théorique obtenu à partir des données de la littérature. Seule A. matricariae exploite ici 14 des 15 hôtes de ce spectre théorique. De plus, D. rapae et A. ervi semblent avoir des hôtes préférentiels respectivement B. brassicae / M. persicae et A. pisum / S. avenae. Ces quatre espèces sont considérées comme des ravageurs des cultures. Du point de vue de la régulation des populations, cette préférence marquée, plus forte qu'attendue, peut se traduire par une meilleure efficacité. A. matricariae sele 'avoi pas d’hôte pfetiel, e s'il tait u peu plus fuet sur M. persicae, un de ses hôtes les plus courants (Giri et al., 1982 ; Desneux et al., 2006). Cette espèce diffère également des deux autres par une présence limitée dans le temps, durant le pic d’aodae des pueos e jui. Une seule année de suivi ne permet évidemment pas de généraliser les observations faites sur la dynamique spatio-temporelle d'exploitation des différentes espèces d'hôtes présentes dans l'environnement. La variabilité interannuelle de l'abondance et de la diversité spécifique des pucerons peut être forte, en fonction des conditions climatiques, mais aussi de l'assolement (Llewellyn et al., 2003 ; Halkett et al., 2006), les espèces et variétés cultivées et leur arrangement spatial évoluant au cours du temps, ce qui peut impacter les ressources en hôtes disponibles pour les parasitoïdes. Elle nous a cependant permis de démontrer qu'il était possible de déterminer le spectre d'hôtes effectif des espèces exploitées par les parasitoïdes sur une période et un contexte agronomique donnés, qualitativement, mais aussi quantitativement, même si cette approche quantitative n'a pas été que partiellement mise en œuve ii. E patiulie, ous avos pu estie l'intérêt d'une méthode de détection moléculaire des parasitoïdes en développement dans le corps des pucerons, par rapport à la méthode plus classique d'échantillonnage des pucerons parasités au stade momie. La méthode moléculaire utilisée a été mise au point par Derocles et al. (2012) et son intérêt a été démontré dans un premier travail d'analyse des communautés pucerons-parasitoïdes dans un agroécosystème de l'Ouest de la France (Derocles et al., 2014). Nous avons choisi dans cette étude de la modifier un peu pour réaliser une recherche orientée d'espèces ciblées pour leur caractère généraliste. Il ne s'agissait en effet pas ici de décrire sans a priori la structure de la communauté,

94 mais de déterminer de la façon la plus exhaustive possible, les hôtes effectivement utilisés par ces espèces, même rarement, dans un agrosystème bien délimité. Pour cela, nous avons utilisé des amorces spécifiques des trois espèces cibles. La méthode s'est révélée efficace et, combinée à la récolte de momies, elle a permis d'augmenter le nombre d'espèces hôtes potentielles détectées, effectivement utilisée dans le contexte agronomique étudié, pour chaque espèce de parasitoïde, alors que d'autres études n'avaient pas montré de différences statistiques entre les deux méthodes (Agusti et al., 2005 ; Gariepry et al., 2005 ; Jones et al., 2005). Cette étude a aussi conduit à identifier des relations hôte-parasitoïde non décrites dans la littérature. Lorsque la détection moléculaire ne s'accompagne pas de collecte d'individus au stade momie (cases rouges du tableau 2), on peut se demander si l’œuf ou la lave dtete auait ahev so dveloppeet jusu'au stade oie. La pote pa des feelles d'œufs das des hôtes iaduats a déjà été observée chez des Aphidiinae (Stary et al., 1989), ce phénomène étant appelé pseudoparasitisme ou parasitisme incomplet. Pour d'autres interactions non décrites, des momies ont été observées sur des hôtes nouveaux, (H. picricis pour A. matricariae ; H. picricis et C. aegopodii pour A. ervi). Cependant, l'exploitation régulière de ces nouvelles espèces par les deux parasitoïdes concernés doit être confirmée avant de les inclure dans leur spectre d'hôtes. En effet, ces évènements de parasitisme sont très ponctuels et pourraient découler de comportements d'oviposition aléatoires ou opportunistes de la part des femelles, durant leur phase de recherche d'hôtes. De la même façon, il est difficile d'estimer le rôle écologique joué par les hôtes déjà répertoriés dans la littérature, mais ayant été détectés très rarement, souvent une seule fois, dans notre échantillonnage, en particulier dans le milieu non cultivé. En effet, ces interactions sont principalement observées au mois de juin, à un moment où les hôtes préférentiels sont très abondants, mais elles sont beaucoup plus rares à l'automne, lorsque les populations de pucerons réapparaissent après ce qu'il est convenu d'appeler le "mid-season crash" (Karley et al., 2004), c'est- à-dire l'effondrement brutal des populations aphidiennes, probablement lié à la baisse de la qualité nutritionnelle des plantes et à la pression des ennemis naturels. L'exploitation simultanée de pucerons abondants dans le milieu cultivé et de pucerons plus rares dans le milieu non cultivé pourrait peut-être correspondre là aussi à des ovipositions opportunistes, par exemple lorsque les femelles parasitoïdes adultes fréquentent les habitats semi-naturels pour s'y nourrir de nectar (Wäckers, 2004 ; Heimpel & Jervis, 2005 ; Vattala et al., 2006). Cette hypothèse demande bien sûr à être vérifiée. Quoi qu'il en soit, il semble peu probable que ces hôtes constituent des réservoirs pour les parasitoïdes étudiés, en l'absence des pucerons des cultures, puisqu'ils ne semblent pas parasités à l'automne. La principale exception concerne le parasitisme de plusieurs espèces de pucerons sur chénopode par D. rapae. Nous y reviendrons dans le chapitre suivant.

Pou olue, l’aalse olulaie du paasitise ofote le ostat ue les espes osides comme galistes ’eploitet pas l’esele des essoues e hôtes potetiels psetes das un agrosystème. Les ressources des milieux non cultivés sont rarement exploitées en dehors de la piode d’aodae e jui et o peut s'iteoge su l'ipat de ces événements rares dans le maintien des espèces au niveau local. En termes d'efficacité de la régulation naturelle, il serait itessat d’eploe le opoteet des paasitoïdes duat la piode hiveale. L’effiait de la lutte étant conditionn pa l’aive siultae des paasitoïdes ave le avageu das la ultue aux printemps (Neuville et al 2015), le comportement et le maintien hivernal des populations dans l’evioeet loal sele te u dteiat ajeu.

Conclusion et perspective

L’aalse des iteatios plates – pucerons – parasitoïdes présentent dans un agroécosystème donné sur une période de temps assez longue (8 mois), nous a permis dans un premier temps de valide la psee et les piodes d’ativits des espes d’Aphidiiae galistes et d’ivetoie l’esele des espes d’Aphidiiae psetes das l’agoosste tudi. Nous avos ofi la prédominance des espèces spécialistes, en particulier dans les habitats semi-naturels. Malgré la mise à jour de 9 espèces généralistes (qui exploite au moins 4 hôtes différents) : Aphidius avenae, Aphidius sonchi, Binodoxys acalephae, Binodoxys angelicae, A. ervi, A. matricariae, D. rapae, E. plagiator et L. fabarum, seules ces 5 dernières exploitent des ressources dans les deux types d’haitats de l’agoosste. Cette aatistiue est fodaetale pou la ise e plae de compétition apparente et donc pour contribuer à une lutte biologique par conservation efficace mobilisant ces organismes. La méthode utilisée pour classer les espèces comme des généralistes ou des spécialistes peut paraître arbitraire, du fait du gradient de spécialisation existant chez les Aphidiinae, mais elle s'est révélée utile pour analyser les effets des caractéristiques des hôtes sur la spécialisation parasitaire. De plus, l’utilisatio d’ue thode d’hatilloage et d’ue aalse olulaie, sas a priori sur les hôtes, c'est-à-dire en ne ciblant pas seulement les espèces hôtes déjà répertoriées, nous a permis d’avoi l’iage la plus elle possile des spetes d’hôtes eploits. L’appot de la iologie olulaie ous a peis pou les tois espes iles d’ajoute potetielleet plusieus hôtes à la gamme théorique des espèces. Potentiellement car sans observation directe du parasitisme (momie plus émergence), on ne peut pas déterminer si ces évènements de parasitisme auraient abouti au dveloppeet oplet d’u paasitoïde et o peut suspete l’eistee de paasitise ioplet (Starý, 1989. L’avatage d’avoir combiné les deux méthodes est de montrer, dans trois cas sur six, que la détection moléculaire dans un hôte non encore décrit ne veut pas forcément dire pseudoparasitisme : le parasitisme de Hyperomyzus picricis par A. matricariae et A. ervi, et de Cavariella aegopodii également par A. ervi a été confirmé par des collectes de momies, ayant émergées. Dans les cas de pseudoparasitisme, on peut s'interroger sur les raisons conduisant une femelle à pondre dans un hôte pourtant incompatible avec le développement de sa progéniture. Plusieurs hypothèses peuvent être avancées, une simple erreur de la part de la femelle, un choix délibéré par aue d’autes essoues ou la aue d’ue apait aestale à paasite ette espe. Globalement, on peut se poser la uestio du ôle de es veets das l’otetio d’u ouvel hôte et plus généralement sur le maintien du caractère généraliste de certaines espèces. En effet, de

97 telles "erreurs" pourraient éventuellement permettre le développement d'une progéniture et conduire à l'élargissement du spectre d'hôte de l'espèce concernée. Il est pour l'instant difficile d'value l’apleu et la fuee de es iteatios, ais la piqure et/ou la ponte des parasitoïdes Aphidiiae s’aopagat le plus souvet d’ue injection de venin qui a comme effet la castration du puceron (Pennacchio et al., 1995 ; Digilio et al., 2000 ; Falabella et al., 2007) le pseudoparasitisme pourrait jouer un rôle dans la régulation des effectifs de pucerons. Les observations moléculaires du paasitise pa l’appohe diagosti pa PC‘ ous ot foteet liits das le oe d’espes de parasitoïdes ciblées, dans le nombre de pucerons analysés (12776 sur les 65400) et la manière de les analyser (qualitative). Une étude quantitative du parasitisme des espèces généralistes devra apporter des informations sur le poids des différents hôtes exploités, en particulier pour les veets aes, su la daiue des populatios d’Aphidiiae. De plus, pour presque chaque espèce généraliste, on distingue un hôte majoritairement exploité, ela est d’autat plus vai pou les espes les plus galistes eploitat des pueos das les deu haitats de l’agoosste. Plus galeet, os hpothses su la divesit et l’aodae des pueos et des espèces de parasitoïdes généralistes / spécialistes dans les diffets opatiets de l’agosste se vifiet. La divesit spifiue des pueos et des Aphidiinae spécialistes est plus importante dans les milieux non cultivés et inversement dans les ilieu ultivs. À l’ivese, la patitio des espes galistes e sele pas ifluee pa le tpe d’haitats ais plutôt pa l’aodae des espes de pueos oe de oloies das l’evioeet et des failles de plates. Plus une espèce de pucerons est abondante, plus elle est parasitée par des généralistes et plus une famille botanique est présente, plus les espèces de pucerons liés à cette famille seront parasitées par des spécialistes. Les spécialistes semblent avantagés dans l’eploitatio des oloies aes das les haitats sei-atuels. Cela peut s’epliue par une meilleure adaptation pour la localisation de ces ressources, ce qui limite alors la compétition interspécifique. Gagic et al. (2016) ont montré par une méta-analyse des interactions puceron- paasitoïdes ue plusieus aatistiues des espes de pueos, otaet l’aodae et la dispersion des individus dans les colonies, jouaient un rôle important dans la répartition des espèces d’Aphidiiae spialistes et généralistes.

La ehehe de stutuatio gtiue des populatios des espes d’Aphidiiae les plus galistes das l’agoosste tudi, ui eploitet des essoues das les diffets haitats, nous a révélé de multiples structurations suivant deux facteurs : la plate et l’hôte, aisi ue l’iteatio ete les deu. Pou E. plagiator, du fait du oe esteit d’iteatios aalses, o peut uiueet olue su l’eistee d’ue ts fote vaiailit gtiue hez ette espèce. Dans le cas de L. fabarum, la structuration observée montre deux groupes distincts structurés selon

98 les hôtes d'oigie, et sutout selo l’iteatio plate-pucerons, séparant les Aphis en fonction de la famille botanique. Chez D. rapae, les individus exploitant H. atriplicis forme un groupe à part des autres individus exploitant 8 espèces différentes (parasitisme détecté avec les deux méthodes). Pour A. matricariae, deux entités structurées chacune par un puceron hôte se distingue d'un groupe contenant 11 hôtes différents. Seule A. ervi ne présente pas de structuration génétique des populations Nous avos esuite osev la daiue d’eploitatio des hôtes das le teps pou es dernières espèces de parasitoïdes. Nos résultats montrent une présence importante de ces espèces das le ilieu ultiv et tout au log de la piode d’tude. À l’ivese, elles eploitet les essoues psetes das le opatiet o ultiv uasi elusiveet duat le pi d’aodae et de diversité spécifique, malgré la présence importante de ressources dans ce milieu aux autres périodes. Seule D. rapae selait pouvoi fiie d’u sevoi d’hôtes ostitu d’H atriplicis sur Chenopodium sp. Cette espèce de pucerons est la seule espèce des habitats semi-naturels à être paasit pa ue espe galiste duat la piode pdat l’hive. Fialeet, e sevoi peut en réalité ne pas en être un du fait de la structuration génétique que nous avons observée entre les individus exploitant cette espèce et ceux exploitant les autres hôtes. Das ette tude, pou avoi la daiue oplte de l’ativit des paasitoïdes, il ous aue des informations sur le comportement hivernal des parasitoïdes. Celui-ci est pourtant fondamental puisque comme le suggèrent dans leur étude Neuville et al. , l’effiait de la lutte iologiue side das la shoisatio de l’aive des paasitoïdes et du avageu das la paelle ultive au printemps (Andrade et al., 2013). L’ativit hiveale des paasitoïdes deva être prise en compte dans les prochaines études. Par exemple, l'activité hivernale d’Aphidius rhopalosiphii change en fonction de la situation géographique, ainsi que des variations climatiques. En Belgique, Legrand et al. (2004) ont montré que cette espèce présentait une stratégie de diapause prédominante, mais une étude réalisée par Andrade et al. (2013) a montré que cette espèce en Bretagne (France) est active en hiver. Les parasitoïdes qui sont actifs au cours de l'hiver, sans diapause, doivent également être adaptés à une baisse de la quantité de ressources (Danks, 2004 ; Danks, 2007) qui peut être un facteur du maintien du caractère généraliste. De plus, si une compétition apparente peut être favoise à ette piode, l’effiait de la lutte iologiue s’e touvea foteet augete

Afin de déterminer au mieux si les ressources des habitats semi-naturels peuvent jouer un rôle de réservoir pour les Aphidiinae, il oviet d’tudie plus piset le opoteet d’ue espèce qui présente des caatistiues avatageuses das ette optiue, ’est-à-dire suffisamment spécialiste du milieu cultivé pour avoir un impact significatif sur les populations de ravageurs, mais suffisamment généraliste pour exploiter des ressources variées en absence du ou des ravageurs et surtout présentant peu de structuration génétique des populations. De plus, afin de déterminer les facteurs influençant les structurations génétiques observées chez les espèces galistes, l’espe ile deva potetielleet pset des variations de structuration gtiue des populatios e fotio de la gogaphie, du ilieu, de la plate ou de l’hte Pou e faie, das le Chapite , ous allos ous oete su l’tude de Diaeretiella rapae et de ces interactions avec les pucerons, les plantes et son habitat.

100

Chapitre 2 : Analyse du caractère généraliste, spécialisation et spéciation écologiques chez Diaeretiella rapae.

Synthèse des connaissances sur Diaeretiella rapae et ses interactions avec les pucerons

Diaeretiella rapae (Fig. 16 est ou d’aps la littatue Figure 16 oe l’ue des espes d’Aphidiiae la plus galiste. Elle est apale d’eploite ps d’ue etaie d’espes de pueos diffetes su l’esele de so aie de répartition (Pike et al, 1999 ; Singh et Singh, 2015). Cette espèce est dite cosmopolite car on la retrouve sur tous les otiets hois l’Atatiue. “o itt agooiue, de par la largeur de son spectre et sa capacité à exploiter plusieurs pucerons ravageurs sur les différentes cultures notamment Brassicaceae et Poaceae, lui a valu d’te introduite dans plusieurs états des Etats-Unis (Tanogoshi et al., 1995 ; Pike et al., 1999) pour lutter contre Diuraphis noxia, le puceron russe du blé, espèce elle-même introduite accidentellement aux Etats-Unis en 1986 (Michaud. et Sloderbeck, 2005). Elle parasite de nombreux ravageurs comme le puceron de la moutarde (Lipaphis erysimi), le puceron cendré du chou (B. brassicae), le puceron vert du pêcher (Myzus persicae), le puceron russe du blé (Diuraphis noxia… Mais elle est galeet apale d’eploite des pueos des haitats sei-naturels comme Brachycaudus cardui ou Brachycaudus helichrysi sur des Asteraceae, Hayhurstia atriplicis sur des Chenopodiaceae, Myzus cerasi sur des Rosaceae. On retrouve cette espèce parasitant des pucerons sur plus de 35 familles botaniques (Singh et Singh, 2015). Mais ce fort degré de « généralisme » est disut puisu’il s’ave ue plusieus tudes suspetes l’eistee de spialisatio loale, voi l’eistee de structuration gtiue des populatios jusu’à l’eistee d’espes ptiues. D’ue aie gale, les tudes etes s’aodet pou die ue ette espe est fortement associée aux pucerons des Brassicaceae : B. brassicae, Lipaphis erysimi ou M. persicae (Blande, 2004). De plus, elle a été signalée comme l'ennemi naturel le plus efficace contre le puceron cendré du chou, B. brassicae (Wilson et Lambdin, 1987 ; Pike et al., 1999 ; Singh et Singh, 2015) qui semble être l’hôte piipal de ette espèce. De nombreuses études montrent une forte attirance de cette espèce

101 envers les Brassicaceae, elle semble attirée par les composés secondaires (glucosinolates et isothiocyanates) is pa les plates de la faille des Bassiaes à la suite d’attaues de pucerons (Read et al., 1970; Reed et al., 1995 ; Bradburne et Mithen, 2000 ; Blande et al., 2007 ; Pope et al., 2008). Mais elle ne semble pas attirée pa des plates ’aat pas sui d’attaue ‘eed et al, 1995), ni par le miellat de pucerons (Girling et al., 2006) ni par des pucerons seuls (Read et al., 1970). Cette capacité à détecter spécifiquement ces composés peut être un facteur de spécialisation potentiel pour cette espèce. D'autre part, ses capacités à parasiter des pucerons des céréales comme Rhopalosiphum padi et D. noxia varie en fonction de la situation géographique. Par exemple, dans le sud de la France, elle exploite couramment Rhopalosiphum padi sur céréales où D. noxia est présent (Hopper et al, 1995) alos ue l’o etouve ue ts aeent D. rapae sur R. padi en Bretagne, ce puceron y étant très fréquent sur céréales (Rabasse & Dedryver, 1983 ; Krespi, 1990), mais D. noxia étant absent. On est e esue de se deade si la ouaut d’hôtes ifluee la apait de paasitise de D. rapae sur les hôtes présents. À la vue de ces différentes observations sur le parasitisme de D. rapae sur les pucerons des céréales et eu des Bassiaeae, l’eistee de stutuatio des populatios de D. rapae en fonction de la plante a été étudiée. Bien que Baer et al. (2004) n'aient pas mis en évidence de structuration génétique liée à l'hôte sur la base de données moléculaires (ADN mitochondrial), d’autes tudes révèlent l’eistee de spialisatio loale comme Antolin et al (2006) qui ont conclu à l'existence probable de biotypes spécialisés sur la base de données biologiques de performance et de virulence entre des individus venant de B. brassicae et de Diuraphis noxia. Ces informations ont été corroborées par les travaux de Le Ralec et al. (2011), qui a montré que R. padi ’tait pas ou pesue pas parasité par des individus ayant B. brassicae et M. persicae oe pueo d’oigie. Il pourrait y avoir une structuration des populations entre celles venant des pucerons associées aux Poaceae et celles exploitant les pucerons des Brassicaceae. Malgré cette possible structuration en fonction de la plante cultivée, sa large gamme d'hôtes peut « a priori » être exploitée pour développer des stratégies de lutte biologique utilisant des hôtes relais dans les habitats semi-naturels. La mise en place d’ue optitio appaete ete le avageu et les autes essoues dispoiles pouait te ue solutio afi d’assue le aitie des populatios das l’evioeet loal. Chez ette espèce, les niveaux de populatio à la sotie de l’hive et l’aive siultae das la ultue du avageu et du paasitoïde ostituet des lets dteiats das l’effiait du otôle biologique (Neuville et al., 2015). Les ressources présentes dans les habitas semi-naturels pourraient jouer ce rôle de réservoir en absence du ravageur. Deux précédentes études de Něe et Starý, (1984) et Starý et González, (1991 ot tudi le ôle de sevoi potetiel d’ue espe, Hayhurstia atriplicis, pour D rapae. Ce puceron se développe uniquement sur les espèces de plante du genre

102 Chenopodium, plantes qui sont présentes dans les habitats semi-naturels et elles sont aussi connues pou te des adveties e ultue. “i à l’oigie ces auteurs ont envisagés que H. atriplicis ait un rôle de réservoir après avoir réalisé des expériences montrant la capacité des D. rapae venant de H. atriplicis a exploité B. brassicae, il sele aiteat ue e e soit pas le as du à l’eistee de structuration génétique forte chez D. rapae. Une étude de Derocles et al. (2016) a détecté une structuration génétique entre individus de D. rapae venant de B. brassicae ou H. atriplicis. Nous avons observé dans la partie précédente de cette thèse cette même structuration génétique pour des populations issues d'un site unique et récoltée la même année. Le rôle de réservoir joué par cette espèce de pucerons paraît alors peu probable.

Objectifs

L’esele des tudes potat su D. rapae pose plusieurs questions qui seront abordées dans ce Chapitre 2 en deux parties. Dans la partie A, nous allons chercher à identifier plus précisément le spete d’hôtes elleet eploit loaleet, ave l’ojetif de dfii si des essoues psetes dans les habitats semi-naturels hormis H. atriplicis peuvent jouer un rôle de réservoir pour cette espe. Cela essite de s’itesse au spete d’hôtes elleet eploit, de dfii la piode à lauelle les hôtes sot eploits et de s’assue de l’asee de stutuatio gtiue. L’tude menée dans le chapitre précédent nous a révélé pour D. rapae ue gae d’hôtes eploite ts liite e oe d’espes, ave ue eploitatio uasi otiue du avageu et ts peu d’iteatios ave les autes espes à l’helle d’u agosste. Afi d’eploe plus pisément les ressources effectivement exploitées et à quelle période de la saison, nous avons centré notre hatilloage su l’hôte ajoitaie B. brassicae (le ravageur) en ciblant uniquement des parcelles de Brassicaceae et leur environnement adjacent à ue helle gioale. L’ojetif tait d’oseve la daiue d’eploitatio tepoelle des hôtes pa D. rapae avant, pendant et après le pic d’aodae des populatios du avageu. L’eploitatio des diffets hôtes peut se faie de faço simultanée ou de façon séquentielle : soit D. rapae exploite ses différents hôtes en même temps soit elle les eploite les us aps les autes e fotio de leu aodae das l’evioeet. Afi de dfii la statgie d’eploitatio des hôtes, ous avos suivi la dynamique des populations de D.rapae, celle des populations du ravageur et celle des espèces de pucerons hôte et non-hôtes de D.rapae dans différents habitats autour des parcelles de brassicacées sur deux années consécutives, incluant la période hivernale. Efi, das ette patie, ous avos galeet ehehe l’eistee de structuration génétique des populations ayant comme origine des interactions plante-puceron diffetes afi de ofie ou o l’eistee d’ue ou plusieus espes pouvat jouer un rôle de sevoi, d’aode le ôle des plates et des hôtes das la stutuatio des populatios et de

103 ofie la stutuatio oseve à l’helle loale ete les populatios eploitat H. atriplicis et celles parasitant d'autres espèces de pucerons. Ces travaux seront présentés dans le projet d’atile : « Temporal dynamics of host exploitation by the generalist parasitoid Diaeretiella rapae (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiinae) in cultivated and semi-natural habitats » (soumission prochaine à Biological control). Dans la partie B, la question abordée aura pour objectif de déterminer si la structuration génétique entre les populations issues de H. atriplicis et celles des autres hôtes correspond bien à une spécialisation parasitaire ? Puis nous avons cherché à vérifier si cette structuration correspondait à des espèces distinctes cryptiques. Pour cela, nous avons testé les capacités de parasitisme et les pefoaes d’ue souhe de D. rapae ayant H. atriplicis oe hôte d’oigie ue ous avons opaes à elles de souhes aat oe pueos hôtes d’oigie B. brassicae et M. persicae. Puis, ous avos utilis u test d’itefodit ete les souhes pou aatise l'eistee d'espes distites. Ces tavau seot psets das l’article soumis à Bulletin of Entomological Research : « Ecological specialization in Diaeretiella rapae (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiinae) on aphid species from wild and cultivated plants ».

104 A) Daiue d’eploitatio temporelle des hôtes par une espèce supposée généraliste : Diaeretiella rapae

Temporal dynamics of host exploitation by the generalist parasitoid Diaeretiella rapae (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiinae) in cultivated and semi-natural habitats.

Yoann Navasse, Pauline Gardin, Christelle Buchard, Manuel Plantegenest, Stéphane A.P. Derocles, Anne Le Ralec

Abstract In agroecosystems, the degree of generalism of pest natural enemies has implications for the natural pest control. Theories predict that generalists would be able to exploit alternative host in uncultivated areas when the pest and the crop are absent. Although specialists would have better performance in the parasitism of the pest, they are expected to have more difficulties to find and exploitable suitable alternative hosts in semi natural habitats. To manage non-crops in conservation biological control, the impact of uncultivated environments on the presence and dynamics of pest natural enemies, generalist parasitoids in particular, needs to be determined in agroecosystems. We investigated the temporal dynamics of host exploitation by Diaeretiella rapae, known as one of the most generalist Aphidiinae, in cultivated and uncultivated compartments of agroecosystem. First, we collected colonies of living aphids and aphid mummies in Brassicaceae and in adjacent areas (cultivated and semi-natural). To detect more parasitism event, we used two approaches: laboratory rearing of mummies and molecular detection of parasitism within living aphids. In D. rapae, a trophic specialization is suspected or even cryptic species. We then studied the genetic structure of D. rapae populations with Maximum likelihood trees from plant - aphid interactions found in our sampling. We showed first that D. rapae did not exploit all potential resources available in its local environment. Diaeretiella rapae exploited mainly B. brassicae and parasitized rarely other hosts. Next, we detected a genetic structure of D. rapae population according to the aphid host: populations from the aphid Hayhurstia atriplicis formed a different clade in the ML tree. These results show the limited role of reservoir of uncultivated habitats and question their interest in conservation biological control.

Key words: generalist, specialist, uncultivated areas, agroecosystem, Brassicaceae, cryptic species, molecular analysis, COI, LWRh, 16S, host specialization

105 Introduction Specialist species are characterized by a narrow ecological niche, while generalists are suitable for a larger number of environmental conditions and resources (Fox & Morrow, 1981; Futuyma, 2001; Begon et al., 2006). Theory predicts that under the conditions corresponding to their ecological niche, the performance of specialists is generally higher than the performance of the generalists (Devictor et al., 2010). On the other hand, generalist species have an advantage when the availability of resources is low or fluctuating (Pike, 1977; Devictor et al., 2010). Consequently, the specialist or generalist trait of pest natural enemies has major implications in the management of pest populations. Because specialists are supposed to be more effective than generalists on the same resource (i.e. prey or host; Devictor et al., 2010; Straub et al., 2011), a specialist species is expected to have a greater impact on pest population. However, a high degree of specialization may result in a major drawback for specialist species: the risk of local extinction in the absence of the pest species, which they are specialized on (Holt and Lawton 1993). Generalist natural enemies by exploiting a wide range of resources are able to maintain their populations on non-pest when the pest is absent. The exploitation of resources in the semi-natural habitats could then potentially limit the extinction risk of populations of natural enemies in agroecosystems (Tscharntke et al., 2007; Ricci et al., 2011) and also enhance their effectiveness in biological control by supplying complementary food resources (e.g. nectar, pollen; Rusch et al., 2012; Langer & Hance, 2004; Ahlmedi et al., 2011). Among the 4 500 species of aphids known worldwide, 450 are found on cultivated plants (Blackman & Eastop, 2006), with one hundred having a real economic impact on the agricultural yield (Dedryver et al., 2010). The aphid natural enemies with the highest degree of specialization are the Aphidiinae parasitoids (Hymenoptera: Braconidae; Van Veen et al., 2008). Aphidiinae species are mainly specialists, but some species can parasitize several dozen of species (Kavallieratos et al., 2004; Stary, 2006). In spring, the success of pest regulation in annual crops is strongly conditioned by the early exploitation of the pest by the parasitoids when the pest starts to colonize the crop (Wissinger, 1997; Chang & Kareiva, 1999; Rauwald & Ives, 2001). Parasitoids able to exploit hosts in both cultivated and semi-natural habitats would constitute a major advantage in an applied point of view, because they would maintain their populations in local environment and then parasitize pests very early. While natural enemies of pest aphid are well known, few studies have focused on aphid-parasitoid interactions from wild plants and wild relatives of crop species in semi-natural habitats (Harvey & Wagenaar, 2006; Gols et al., 2008). Moreover, some studies have shown few exchanges between cultivated and uncultivated compartments for both aphid pests (Vialatte et al., 2005) and their parasitoids (Derocles et al., 2014). However, this latter work considered only parasitoid exchanges during spring. Resources in semi-natural habitats are more likely to be exploited during less favorable periods for pest aphids and could then have a fairly significant impact on population dynamics of

106 parasitoids. We hypothesize two situations in the exploitation of pest and non-pest by parasitoids. They could exploit simultaneously pests in crops and non-pests on uncultivated plants or they could use sequentially hosts, pests in the crop and then alternative hosts in semi-natural habitats when the crop is absent. Diaeretiella rapae (McIntosh) (Hymenoptera: Braconidae) is a good model to test the impact of uncultivated areas on the dynamics of parasitoid populations, as it is known as one of the most generalist Aphidiinae with a hundred host species recorded (see Singh & Singh, 2015). It is also described as one of the very few primary parasitoids of Brevicoryne brassicae (Wilson and Lambdin, 1987; Pike et al., 1999), an important pest of cultivated Brassicaceae (Blackman & Eastop, 2006). Few studies are devoted to the resources available in the uncultivated areas for D. rapae. Nemec & Stary (1984) and Stary & Gonzalez (1991) considered the wild plant Chenopodium sp as a possible reservoir of hosts for D. rapae. However, the question of whether D. rapae use hosts both in cultivated and uncultivated areas is complicated by evidences of host-associated genetic variability in this species (Vaughn & Antolin, 1998), leading to a suspicion of cryptic species. Studies with host-switching experiments revealed specialization in populations of D. rapae (Antolin et al., 2006; Le Ralec et al., 2011; Navasse et al., submitted). By a molecular phylogenetical approach, Derocles et al., (2016) have also shown genetic differentiation associated to host specialization between D. rapae individuals coming from aphids on Brassicaceae (B. brassicae and M. persicae) on one side and individuals from H. atriplicis on Chenopodium sp on the other side. The existence of cryptic species in D. rapae specialized on a narrow host range could then limit the ability to exploit hosts in both cultivated and uncultivated compartments. In this study, we aimed first to identify the host species of D. rapae throughout the year in an agroecosystem where the population levels of its main host B. brassicae fluctuate with rapeseed culture cycle. We followed populations of aphid and parasitoids in cultivated Brassicaceae and uncultivated environments next to the crops during two years, before, during and after the colonization of Brassicaceae by aphids. To detect even the rarest parasitism events, we coupled sampling of aphid mummies and molecular detection of D. rapae in living aphids (following Derocles et al 2012). Here our objective is not to quantify the parasitism rate of D.rapae in each host but rather to describe exhaustively the host species exploited by this parasitoid throughout the year and the frequency of the various parasitism events. Especially, we tried to determine if pest in the crop and non-pest in the non-crop are used simultaneously or sequentially by D. rapae. Next, to detect any host specialization, we assessed the genetic structure of D. rapae from different aphid species and in the different habitats with a molecular phylogeny based on fragments from cytochrome c oxidase I [COI], 16S and long wavelength rhodopsin [LWRh]. Overall, this study aims to determine if and when alternative host species present in uncultivated habitats of agroecosystems are exploited

107 by D. rapae, to conclude on the generalist trait of this presumed generalist and on its interest in conservation biological control against B. brassicae.

Materiel and methods

Experimental sites and field sampling The sampling was realized in plots of an agricultural area of 220 km2 located in South-West of Rennes (X: 48.083328 Y: -1.68333) (France) (Fig. 1). A plot was defined as follow: a field of Brassicaceae, the adjacent uncultivated habitats (e.g. hedgerow, woods) and the adjacent fields (others crops, mostly wheat, maize and rapeseed; Fig. 2). In 2014, the study was conducted in 15 plots: 14 field of rapeseed (crop present from April to July) and one field with a succession of two crops: cabbage from April to June and turnip from September to November. Once a month between April and December, samples of living aphids and mummies of Aphidiinae were collected from cultivated and uncultivated habitats of each plot. The sampling method was a visual search during 30 minutes in each crop, and 30 minutes to two hours in the field edges, according to the surface, and the diversity and cover of vegetation. We realized one sampling trajectory by cultivated plot, one trajectory for all uncultivated linear habitats (e.g. roadsides, hedgerows) and one trajectory by uncultivated habitats (e.g. wood) by sampling session (Fig. 2). The trajectories remain the same throughout the sampling campaign. We collected a maximum of 5 samples (all individuals in the aphid colony) of the same morphotype of aphid (determined to species-level in the laboratory) on the same plant species, in the same habitat at the same date. Aphids of these 5 samples were considered as a collection point. The aphids from each collection point were placed in a 1.5-mL Eppendorf tube filled with 95% ethanol and then stored at a maximum temperature of 20°C. Aphids were identified in the laboratory using a microscope and morphological criteria (Blackman & Eastop, 2000, 2006). The plants harbouring the aphid colonies were identified at least to the family level in laboratory (Blamey & Grey-Wilson, 2003). The aphid mummies ee plaed at a tepeatue of ± . ◦C, % ± % elative huidit ad a photoperiod of L16: D8 in a Petri dish waiting for emergence. Emerging parasitoid species from mummies were identified in laboratory to species level (Stary, 1973; Gärdenfors, 1986; Blackman and Eastop 2000, 2006; Kavallieratos et al 2001; 2005; Tomanovic et al 2003; 2007). In 2015, samples of living aphids and aphid mummies were collected with the same method described above from January to December (so the sampling period extended overall from April 2014 to December 2015) in 6 plots composed of cultivated Brassicaceae and their adjacent uncultivated environments: 5 field of rapeseed (from April to July) and one field with a succession of two crops cabbage (April to June) and turnip (September to November; Fig. 1).

108 Rennes

Plélan-le- Grand

Figure 1: Location of sampled plots of Brassicaceae. Legend: yellow: rapeseed, green: broccoli and turnip; rounds for sampling in 2014 squares for 2015

Cultivated Brassicaceae

Other crops

Roadside

Hedgerow

Woods

Sampling trajectory

Collection points

Figure 2: Example of a plot of cultivated Brassicaceae and adjacent semi-natural habitats with examples of sampling trajectory. A collection point included up to 5 colonies of aphid species sampled on the same plant in the same habitat at the same date.

Molecular detection of D. rapae within aphids For a more comprehensive view of hosts exploited by D. rapae, we conducted a molecular analysis on aphids collected in 2014. In 2014, we wanted to have a complete view of exploited host on a very important number of plots. In 2015, we focused on the truly exploited hosts by D. rapae in the agroecosystems in winter. A maximum of 50 adults or fourth instar larvae of aphid per collection point were selected for this analysis. We extracted individually the DNA of each aphid selected with a hot sodiu hdoide ad Tis ethod" method (HotShot; Montero-Pau, 2008). We then pooled the DNA extracted of ten aphids from the same species from a same collection point. We then had a maximum of five pools of DNA from ten aphids of the same species per collection point available for further molecular analysis.

109 After extraction, we used the procedure described by Derocles et al., (2012) as a first step to detect any parasitoids in each pool of aphid DNA. In this first step, a multiplex PCR was realized with two primer pairs. The first primer pair amplifies 658 bp of the mitochondrial cytochrome c oxydase I [COI] gene with the universal LCO1490 and HCO2198 primers to ensure the proper functioning of the etatio ad the PC‘ i tue positive otol’. The seod oe aplifies p of the rRNA gene 16S with the Aphidiinae-specific 16S-F and 16S-Rspe primers to detect the presence of Aphidiinae parasitoids inside the pools of aphids. Sequences of primers are presented in Table 1. When a parasitoid is detected in a pool of aphid DNA, a simplex PCR was performed in a second step to determine whether the parasitism detected is due or not to D. rapae. For this, we designed a primer pair [Dr-F - Dr-R] on 658 bp of COI to specifically detect D. rapae in the pools of aphid DNA (Table 1).

Table 1: Primers pairs used to detect D. rapae iside the aphids’ od ad to aplif adults D. rapae. Primer Gene amplified Sequences References LCO1490 COI 5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3' Folmer et al. (1994) HCO2198 COI 5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3' Folmer et al. (1994) 16S-F 16S ’-CGC CGT TTT ATC AAA AAC ATG T-’ Simon et al. (1994) 16S-R 16S ’-TTA CGC TGT TAT CCC TAA-’ Khambhampati & Smith (1995) 16S-Rspe 16S ’-TCT AWA GGG TCT TCT CGT CT-’ Derocles et al. (2012) LWRhF LWRh ’-AAT TGC TAT TAY GAR CAN TGG GT-’ Mardulyn & Cameron (1999) LWRhR LWRh ’-ATA TGG AGT CCA NGC CAT RAA CCA-’ Mardulyn & Cameron (1999) Dr-F COI ’-AGAATTACGGGTAGATTAATTGG-’ In this study Dr-R COI ’-CCAACACCAGAATTTATTAAACCTCTTACT-’ In this study

These primers were designed based on sequences of D. rapae from different countries and sequences from more than 50 other Aphidiinae species of different geographical origins. Sequences were downloaded from GenBank. These primers amplified a fragment of 246 bp and appeared from preliminary tests to detect a wide range of D. rapae populations, without amplifying non-target species. We tested our primers on a sample of 28 other Aphidiinae species (1 individual per species) from our sampling. Then we tested primers on samples from different populations of D. rapae, to be sure to detect all populations of this species. Each PCR amplifications was carried out with 16 µL of reaction volume composed of 2 µL of DNA extract, 8.7 µL of H2O, 2.5 µL of buffer (1X final concentration), 1 µL of MgCl2 at 25 mM, 0.5 µL of dNTP at 10 mM, 0.3 µL of each primer at 10 µM and 0.12 µL of GoTaq® (Promega). The PCR amplification conditions were identical for both multiplex and singleplex PCRs: 94°C for 180s; 40 cycles of 94°C for 30s, 56°C for 60s, 72°C for 90s; with the final cycles of 72°C for 600s. PCR products were visualized on 1.5 % agarose gels.

110 Genetic structuration of D. rapae populations The objective was to determine if D. rapae is structured genetically and to determine factors that structure this species For this, we extracted individually the DNA of adults D. rapae emerged from the collected mummies, up to 3 individuals by plant-aphid interaction. The extraction was carried out with a Qiagen DNeasy kit non-destructive method (as described by Derocles et al., 2012). The DNA was amplified with 3 markers: COI (620 bp) [LCO1490 - HCO2198], 16S (380 bp) [16S-F - 16S-R] and LWRh (650 bp) [LWRhF - LWRhR] (Table 1). These 3 markers were the most relevant in the study of the genetic structure in the Aphidiinae (Derocles et al., 2016). PCR conditions were the same as above. All PCR products were purified and both strands sequenced (Sanger technology; Sanger et al., 1997). The sequences obtained were edited and aligned with BIOEDIT 7.2.5 (Hall, 1999). Alignments were translated into amino acids using MEGA version 7 (Tamura et al., 2011) to detect frameshifts or stop odos idiatig pseudogees. Fo LW‘h, the ’ ito as eoved fo the aalses because of large divergences in sequence impeding sequences alignment (Derocles et al., 2012). To detect a potential genetic structuration, ML analyses were built for each gene separately and for all genes together with MEGA version 7. Node support was assessed by bootstrapping (1000 pseudo replicates). For all gees, e used “eueeati Vaida et al., 2011) to concatenate sequences. Cotesia flavipes (Hymenoptera: Microgastrinae) was added and used as out group (see Smith et al., 1999; Khambhampati et al., 2000; Derocles et al., 2016); the sequences used were JQ396736 (COI), JQ396691 (16S), GI930421217 (LWRH).

Statistical analysis All statistical analyses were performed using the software R (Team R, 2013). Data were analysed as presence / absence of D. rapae within the collection points. For 2014, data was constituted of D. rapae detection in collected mummies and living aphids with the molecular tool. For 2015 data was constituted of D. rapae detection in collected mummies. We tested, in 2014 and 2015 separately, the effect of the sampling date (months), the sampling area (cultivated vs uncultivated) and plant family - aphid species interactions on the presence or absence of parasitism by D. rapae in the collection points for each year. We included the plot as a random factor. To analyse the effects of these factors on absence or presence of parasitism, we used a Generalized Linear Model Mixed (GLMM) assuming a Bioial eo ad logit lik futio. The GLMMs ee the aalsed ith the aova’ futio. The post hoc tests were pairwise comparisons with the futio estio’ i the doB’ pakage (Højsgaard, 2004).

111 Results

Sampling data in 2014 and 2015 and contribution of molecular tool for sampling 2014 The majority of aphids sampled were identified at the species level. However, for genus containing highly polyphagous species, such as Aphis and Uroleucon, the absence of winged individuals in the colonies makes identification uncertain, even with the identification of the host plant. In the aphids sampled, we have a total of 57 different taxa consisting of 46 aphid species and 11 genera. Among the 57 taxa sampled during the two years, 22 are known in the literature (Singh & Singh 2015) as potential host for D. rapae (Table 2). The characteristics of the two sampling campaigns are presented in Table 3. Over the two years, adults of D. rapae have emerged from mummies on 61 collection points representing 14.2% of the collection points.

Table 2: List of the potential hosts of D. rapae collected in 2014 and 2015. Species with diagonal stripe were found only in 2014, species in bold were found only in 2015, the others were found in both years and the exploited hosts by D. rapae are in grey frames.

Potential host of D.rapae Acyrthosiphon pisum Brevicoryne brassicae Myzus cerasi Aphis craccivora Hayhurstia atriplicis Myzus persicae Aphis fabae Hyadaphis foeniculi Rhopalosiphum padi Aphis farinosa Lipaphis erysimi Sitobion avenae Aphis sp Macrosiphum euphorbiae Uroleucon sonchi Brachycaudus cardui Macrosiphum sp Uroleucon sp

Brachycaudus helichrysi Metopolophium dirhodum

Brachycaudus sp Microlophium carnosum

Table 3: Characteristic of the two sampling years Year 2014 2015 Number of plots 15 6 Number of collection points 236 186 Number of plant species 43 40 Number of aphid species 37 44 Total numbers of aphids collected 48711 22240 Number of collection points with mummies 90 47 Total number of mummies collected 1128 1124 Number of collection points with D. rapae 33 28 Total number of D. rapae collected 741 827

112 In 2014, the subsample used for molecular detection of the parasitism, with up to 5 pools of 10 aphids selected per collection point, represented 9215 individuals. Among the 236 collection points, parasitism by an Aphidiinae was detected in 141 cases, representing 59.7% of collection point, while mummies were found only in 38.1% of the collection points. Diaeretiella rapae was detected in 31 collection points by the sampling of living aphid and a molecular method to detect parasitism and in 33 collection points with mummies sampling. For 25 collection points we have detected D. rapae by both methods, 6 collection points only by molecular method and 8 collection points only by mummies sampling. In 2015, mummies were found in 25.3% of the collection points. Among the 186 collection points, parasitism by an Aphidiinae was detected in 47 cases and parasitism by D. rapae in 28 cases.

Host range by D. rapae in 2014 and 2015 In 2014, we found 19 potential hosts of D. rapae in the agrosystem (Table 2), but only six hosts were exploited: Brevicoryne brassicae and Myzus persicae in both cultivated and uncultivated habitats; Hayhurstia atriplicis, Aphis fabae, Microlophium carnosum and a previously undescribed host: Hyperomyzus lactucae in uncultivated habitats. In 2015, we collected 18 potential hosts of D. rapae, 16 were also found in 2014 (Table 2). In 2015, D. rapae exploited only four different hosts, three of them were also found in 2014: B. brassicae, M. persicae and H atriplicis. The host found only in 2015 was Sitobion avenae on Triticum aestivum in the cultivated area. In the both years, the main host species of D. rapae was B. brassicae, the majority of D. rapae was collected on this aphid species. In 2014, 716 D. rapae were collected on B. brassicae and only 25 adult parasitoids on other aphid species (on 10 collection points). In 2015 we collected 806 D. rapae on B. brassicae and 21 adult parasitoids on other aphid species (on 6 collection points; Table S 1).

Temporal dynamic of host exploitation by D. rapae in 2014 and 2015 Overall, the population dynamics of all aphid species showed two peaks: in June and October in 2014; between April and June and in September in 2015, the latter was very low (Fig. 3). In the two years, a collapse in aphid's populations has occurred in August, a phenomenon called mid-season crash (Karley et al., 2004). The dynamics of B. brassicae followed these general trends, except for its first peak, which was earlier in May 2014. All factors tested seemed to have an influence on the parasitism of D. rapae. The sampling area (cultivated vs uncultivated) had a significant effect on the number of collection points where D. rapae was detected in 2014 (GLMM; X2 = 81.211, Df = 1, P < 0.001) and in 2015 (GLMM; X2 = 38.962, Df = 1, P < 0.001). Diaeretiella rapae preferentially exploited aphids in cultivated environment. The sampling period had a significant effect on the number of collection points where D. rapae was detected in 2014 (GLMM; X2 = 40.364, Df = 6, P < 0.001) and in

113 2015 (GLMM; X2 = 16.466, Df = 8, P = 0.048). Diaeretiella rapae is mainly present between May and June. Finally, the plant family - aphid species interactions had a significant effect on the number of collection points where D. rapae was detected in 2014 (GLMM; X2 = 1474.01, Df = 11, P < 0.001) and in 2015. (GLMM; X2 = 120.7, Df = 4, P < 0.001) D. rapae exploited mainly B. brassicae on cultivated Brassicaceae. Table 4 shows the temporal dynamic of host exploitation by D. rapae. In spring, the dynamics of the D. rapae populations followed the dynamics of B. brassicae, exclusively on cultivated Brassicaceae. In July and August, in the absence of cultivated Brassicaceae, D. rapae was collected on B. brassicae on wild Brassicaceae (2014 and 2015), and also on Aphis fabae (2014) and H. atriplicis (2015) on Chenopodium sp. Other theoretical host species available were not exploited (e.g. Sitobion avenae, Uroleucon sp, Aphis sp; Fig. 3 and Table 4). In autumn 2015 (September to November), D. rapae was not found. In autumn 2014, we obtained D rapae from three collection points on B. brassicae, one on cultivated Brassicaceae (new seedling of Brassica napus), two on Sinapsis alba (nitrate-fixing intermediate crops), and one collection point on M. persicae on radish (nitrate-fixing intermediate crops). And we found D. rapae on four other collection points on two aphid species came from the uncultivated compartment, three on H. atriplicis on Chenopodium sp and one on Hyperomyzus lactucae on Crepis sp (Table 4). Finally, no mummies of Aphidiinae were found in winter.

114

Figure 3: Dynamics of aphids and D. rapae in the plots sampled. A) Detection of D. rapae by collection of aphid mummies and molecular detection of parasitism in living aphids in 2014. B) Detection of D. rapae by collected mummies only in 2015. To distinguish between potential host and non-host of D. rapae, we used the review of Singh and Singh (2015). The symbol represents the date of harvest of Brassicaceae.

115 Table 4: Temporal dynamics of host exploitation by D. rapae in 2014 (A) and in 2015 (B). The boxes mentioned the host plant (white for cultivated area, grey for uncultivated area and hatched for nitrate-fixing intermediate crops) and the number of collection points

A 2014 Hosts aphids April May June July August September October November December species Brassica napus Brassica napus (6) Sysimbrium. Brassica napus (2) Sinapsis B. brassicae (14) / Brassica officinale (1) alba (1) oleracea (2) Barbarea vulgarea (1) Sinapsis alba (1) Brassica M. persicae Chenopodium sp (1) Raphanus sativus (1) oleracea (2) Aphis sp Chenopodium sp (1)

H. atriplicis Chenopodium sp (2) Chenopodium sp (1)

H. lactucae Crepis sp (1)

M. carnosum Urtica dioica (1)

B 2015 Hosts aphids January September to April May June July August species to March December Brassica napus (7) / Brassica B. brassicae Brassica napus (8) Brassica oleracea (1) napus (5) Barbarea vulgarea (1) M. persicae Brassica oleracea (1)

H. atriplicis Chenopodium sp (2) Chenopodium sp (1)

S. avenae Triticum aestivum (2)

116 Genetic structure The 15 samples corresponding to 15 plant - aphid interactions exploited by D. rapae during the two sampling years showed overall little genetic differentiation (Fig. 4). However, two samples of D. rapae collected on H. atriplicis on Chenopodium sp in 2014 and 2015 formed a separate clade from others aphid species.

Figure 4: Maximum likelihood tree obtained by a multigene analysis with 3 fragments: COI, 16S and LWRh. Dr: Diaeretiella rapae, in bracket: number of individuals per population, followed by aphid host, plant species and year of sample. Bootstraps values are given for each branch. Scaling is expressed in the proportion of substituted bases per site.

117 Discussion

The aphid parasitoid D. rapae is known to parasitize a hundred of aphid species (Stary, 2006; Pike et al., 1999; Singh & Singh, 2015), but its host range may vary according to the geographical area. In this study, we showed that D. rapae did not use all the resources (i.e. aphid host) available in its local environment. On the twenty-two potential host species sampled over the two years, only seven were parasitized. We did observe neither a sequential nor a simultaneous exploitation of the various host species. In the studied agroecosystem, D. rapae appeared to be a specialized parasitoid exploiting B. brassicae throughout the year on cultivated and wild Brassicaceae, rather than a generalist parasitoid. Even in the absence of this pest, the exploitation of abundant alternative aphid hosts was scarce and very punctual. Alternative hosts were found in uncultivated areas, especially on Chenopodiaceae: H. atriplicis, A. fabae and M. persicae. However, molecular analysis of D.rapae collected on H. atriplicis revealed a high genetic divergence with other D. rapae, probably indicating a specialized cryptic species (as suspected by Navasse et al. submitted). Combining molecular detection of parasitism with mummies sampling allowed detecting more parasitism events. As the molecular detection allows detecting parasitism at almost every development stages before mummification (Gariepy et al. 2008; Derocles et al. 2012), it enhanced the probability to detect rare events of parasitism. Molecular detection has however a limit: the detection of parasitoid eggs or larvae that would not be able to fully achieve their development, a phenomenon called pseudoparasitism (Jones et al., 1986; Hegazi & Khafagi, 2000) or incomplete parasitism (Stary et al., 1989). For example in this study, we detected D. rapae in Hyperomyzus lactucae, an aphid species, which is not part of D.rapae theoretical host spectrum and could than revealed such case. Consequently, rare parasitism events detected only with the molecular approach must be considered carefully. Alternatively, the detection of D. rapae within H. lactucae may be the result of a molecular detection of an unexpected parasitoid. However from our preliminary tests, the species specific primers developed to detect D. rapae did not bind on non-target parasitoid species. In the studied area, B. brassicae was by far the most parasitized aphid by D. rapae despite the presence of several other potential hosts. Other studies showed that D. rapae is attracted by isothiocyanates, volatile organic compounds produced in Brassica plants (Bradburne and Mithen 2000) or by secondary compounds emitted by Brassicaceae after pest attacks (Pope et al., 2008; Blande et al., 2007). In an environment where Brassicaceae are abundant, this could lead to the specialization of D. rapae populations on aphids attacking Brassicaceae. However, colonies of B. brassicae on wild Brassicaceae were not systematically parasitized by D. rapae unlike cultivated Brassicaceae (Le Guigo et al., 2012a & b). To study the impact of wild Brassicaceae on maintaining population of D. rapae, a more targeted sampling of these wild Brassicaceae would clarify their

118 potential role of reservoir for B. brassicae and D. rapae. In our sampling, B. brassicae was found only on four species of Brassicaceae: Lepidium campestre, Capsella bursa-pastoris, Sysimbrium officinale and Barbarea vulgarea; D. rapae was detected only on the two latter. The ecological traits of aphids are involved in the specialization of their predators and parasitoids (Le Ralec et al., 2010; Raymond et al., 2015; Gagic et al., 2016). But these traits are dependent on the distribution of host plants, themselves influenced by the type of habitat (Kruess and Tscharntke, 1994; Vialatte et al., 2005). Cultivated areas are composed of few plant species in high abundance during a limited period (Rodriguez & Hawkins, 2000; Gurr et al., 2003), leading to aphid outbreaks. We found D. rapae almost exclusively on B. brassicae in cultivated Brassicaceae between April and June, when B. brassicae is an abundant resource. Conversely, uncultivated areas are composed of a wide variety of plants and aphids, but in very low abundance because of the reduced surface in agroecosystems (Benton et al., 2003). After July, B. brassicae populations collapsed and despite a great quantity of alternative hosts available in uncultivated habitats, we did not observe a shift of D. rapae from B. brassicae to these other resources. We observed only very few parasitism events on other aphid species, both in cultivated and uncultivated environments. The role of alternative aphid species exploited by D. rapae (H. atriplicis, M. carnosum, H. lactucae, S. avenae and A. fabae) as a parasitoid reservoir seems unlikely because these aphids were rarely parasitized, except M. persicae (considered as a pest, Blackman & Eastop 2000). Moreover, these species were exploited by D. rapae almost exclusively in spring and not in autumn or winter. The observed specialization of D. rapae questions the role of semi-natural habitats as sources of alternative hosts. Chenopodium sp was in previous studies considered as a reservoir of D. rapae by hosting the aphid H. atriplicis (Nemec and Stary, 1984; Stary and Gonzales, 1991). Our results showed as well that D. rapae parasitized this aphid on Chenopodium sp in autumn. Hayhurstia atriplicis is even the most parasitized aphid by D. rapae in uncultivated areas. However, the molecular phylogeny confirmed the existence of a genetic differentiation between D. rapae from H. atriplicis and D. rapae from other aphid species (Derocles et al., 2016). This was confirmed in laboratory experiments (Navasse et al., submitted) showing a reproductive isolation between a strain of D. rapae collected on H. atriplicis and several strains collected on B. brassicae and M. persicae. The parasitoid specialization on this aphid could be related to its specific traits. Hayhurstia atriplicis is present in low abundance, only on Chenopodium sp and during a short period of time (August to November; Blackman & Eastop, 2006). In addition, H. atriplicis has a particular behavior compared to the other hosts of D. rapae because this aphid induces galls on leaves. However, this could also be advantageous because being able to exploit a scatted and sparse resource limits the competition with more generalist species (Gagic et al., 2016).

119 All together, these results challenges the fact that D. rapae is a generalist species. Moreover, based on the present results and previous studies (Derocles et al 2016; Navasse et al submitted), H. atriplicis cannot be considered as a potential reservoir of D. rapae. Our study showed that in absence of cultivated Brassicacae, D. rapae rather exploits its main hosts (B. brassicae and M. persicae to a less extent) on wild Brassicaceae or on Brassicaceae nitrate-fixing intermediate crops as Synapsis alba and Raphanus sativus, rather than alternative aphid species. These plants could be leveraged to reinforce the maintenance of D. rapae in the environment between two successive crops of Brassicaceae. The establishment of nitrate-fixing intermediate crops is a regulatory requirement in France to limit nitrogen leaching between two crops. Other plants can also be hosts of the polyphagous M. persicae (Fenton et al., 1998). This aphid species could also be a reservoir for D. rapae in cultivated and uncultivated habitats (Le Guigo et al., 2012a). However we find M. persicae in our sampling almost exclusively on cultivated Brassicaceae (as B. brassicae) and nitrate fixing intermediate crops. Despite acting as a reservoir for D. rapae, there is a risk that these intermediate crops act as a reservoir for pests as well. In conclusion, only the wild Brassicaceae and Brassicaceae nitrate-fixing intermediate crops seems to be able play the role of reservoir of B. brassicae and M. persicae for D. rapae in the absence of cultivated Brassicaceae. Parasitoid community structure during winter is important to consider because it influences the early biological control of pests in spring (Andrade et al., 2013). A parasitoid species may have either a diapause strategy (i.e. diapausing mummies, Krespi, 1990; Colinet et al., 2010; Andrade et al., 2013) or an active winter strategy (Hance et al., 2007; Colinet et al., 2010) depending on local climatic conditions and hosts availability. In the studied agroecosystem, the mild winter conditions and the presence of potential host in the environment allow both strategies (Andrade et al., 2013; Colinet et al., 2010). Our data did not allow to clearly establish whether D. rapae is present or not in the agroecosystem during winter, although the presence of diapausing mummies of D. rapae on B. brassicae in uncultivated areas has been shown previously (Geiger et al., 2005). Our study shows that the presumed generalist parasitoid D. rapae exploits the resource as a specialist species in agroecosystems. Antolin et al., (2006) mentioned D. rapae as a serial specialist, because this parasitoid attacked hosts according to their availability: either by a parasitism mainly on cabbages aphids or a parasitism mainly on wheat aphids according to the seasons and the geographical areas. In addition, we confirmed that D. rapae is constituted of specialized populations or even cryptic species as demonstrated in other generalists (Tomić et al., 2005; Desneux et al., 2009; Barahoei et al., 2011; Derocles et al., 2016). To date, uncultivated areas seem therefore not to act as a reservoir of resources for D. rapae, confirming the scarcity of exchanges between cultivated and uncultivated compartments (Derocles et al., 2014). Alternatively, the parasitoid reservoir in

120 uncultivated areas would be constituted by the pest aphid itself and could result in an effective but risky biological control.

Acknowledgements

The authors thank Bernard CHAUBET for technical assistance for identified aphids and parasitoids. This ok as suppoted the Feh Miiste de l’Eseigeet “upieu et de la ‘ehehe’ and was founded by the French Research National Agency (PEERLESS project, ANR-12-AGRO-0006).

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127 B) Spécialisation écologique des Diaeretiella rapae en lien avec le caractère cultivés ou sauvages des plantes hébergeant les hôtes

Ecological specialization in Diaeretiella rapae (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiinae) on aphid species from wild and cultivated plants

Yoann Navassea,b, Stéphane A.P. Deroclesa,b, Manuel Plantegenesta,b, Anne Le Raleca,b a INRA-Agrocampus Ouest- Université de Renne 1, UMR1349 IGEPP, 65 rue de Saint-Brieuc, CS 84215, 35 042 Rennes Cedex, France b Université Bretagne Loire, Rennes, France

Abstract We investigated the ecological specialization and the ability to use resources in cultivated and uncultivated areas in Diaeretiella rapae, an aphid parasitoid known as generalist. Previous studies showed a genetic differentiation in D. rapae according to the host species. If this genetic differentiation is associated with a limited host range, this would reduce the ability to exploit the diversity of resources, particularly in uncultivated areas, and to control pest aphids, since a population specialized on a non-pest species would be unable to parasitize pest species. In this study, we used four strains of the parasitoid D. rapae: three strains reared on pest aphids (developing on cultivated Brassicaceae) and one strain reared on a non-pest aphid (developing on uncultivated Chenopodiaceae). With host-switching experiments, we tested the host suitability of each strain with pest and non-pest aphids and the ability of crossbreeding between strains. The strain reared on non-pest aphids was the most generalist, while the strains reared on pest aphids parasitized exclusively pest species. Moreover, a reproductive isolation was detected between strains from uncultivated plant and from cultivated plant. Diaeretiella rapae showed here at least an ecological specialization or even a complex of cryptic species related to the plant or to the type of environment (cultivated vs uncultivated). The role of uncultivated resources as a reservoir of D. rapae appears to be severely limited and their efficiency in conservation biological control must be questioned.

Key words: host range, host switching, generalist, specialist, reproductive isolation, non-cultivated areas, agroecosystem, Brevicoryne brassicae, Hayhurstia atriplicis

128 Introduction

Agroecosystems are composed of a mosaic of habitats at landscape scale (Evans et al, 2011; Pocock et al, 2012; Evans et al, 2013) shared between cultivated and uncultivated compartments (Woodward & Bohan, 2013; Derocles et al, 2014). Cultivated areas mainly include seasonally harvested annual crops, leading to habitat instability (Rodriguez & Hawkins, 2000; Gurr et al, 2003). At the opposite, uncultivated habitats (e.g. field edges, hedges and woods) are more stable and hosting a large diversity of plants (Benton et al, 2003). The different characteristics of these two compartments influence the structure and distribution of communities they host in time and space as well as the interactions between organisms (Thompson, 1994; Begon et al, 2006). The exploitation of resources at the different trophic levels depends on the degree of trophic specialization of species (Chaplin-Kramer et al, 2011). Generalist predators or parasitoids species can use a diversity of resources in the mosaic of crops and non-crop habitats, while specialist species are able to exploit only few patches of resources, more or less distant in this mosaic (Tscharntke et al, 2007). Cultivated habitats constitute abundant but temporary resources for phytophagous insects and their associated natural enemies while uncultivated habitats could act as refuges for these organisms as they are more stable environments. These habitats provide alternative prey for predators or hosts for parasitoids (Ahlmedi et al, 2011; Rusch et al, 2012). Many studies have demonstrated the importance of semi-natural habitats and their alternative resources in agroecosystems in determining the abundance of pest natural enemies (Ricci et al, 2009; Ricci et al, 2011), diversity (Tscharntke et al, 2007) and their efficiency for biological control (Langer & Hance, 2004). The ability to use alternative resources depends on the degree of generalism of the various species involved. Specialist species are more dependent on the availability of a particular prey or host than generalist species are. Consequently, specialists may exploit resources in only one type of habitat (cultivated or uncultivated; Gagic et al, 2016). Though specialist species are considered as more efficient to limit crop pests, they are prone to local extinction when their main food disappears (Pyke, 1977; Holt et Lawton, 1993; Devictor et al, 2010). For conservation biological control, species able to parasitize at least a few host species would be more efficient than highly specialized ones, as they are able to use resources in non-crop areas. This could ensure population conservation during the absence of crop and increase parasitism pressure when pest colonizes the crop. The sub-family Aphidiinae (Hymenoptera: Braconidae) included of about four hundred species of aphid parasitoids (Godfray & Shimada, 1999; Sanchis et al, 2001). Most of them parasitize only one or two species of aphids. Some species seem however able to parasitize more than dozen species of aphids, like Aphidius ervi, Aphidius matricariae, Diaeretiella rapae, Ephedrus plagiator, Lysiphlebus fabarum or Praon volucre (Starý, 2006). These generalist species can be suitable candidates to

129 regulate pest aphids by conservation biological control as they are theoretically able to exploit both pest and non-pest species. However, recent works question the actual host range of generalist Aphidiinae. Several studies revealed the existence of cryptic species (i.e. morphologically indistinguishable but genetically different species that are unable of crossbreeding) in species previously known as generalist: Aphidius matricariae (Derocles et al., 2016), Binodoxys communis (Desneux et al, 2009) Lysiphlebus fabarum (Barahoei et al, 2011) or Ephedrus plagiator (Tomić et al, 2005). Others work revealed the existence of genetically differentiated populations exploiting different host species, suggesting intraspecific host specialization. Derocles et al. (2016) identified such a genetic structuration in generalist species, like Diaeretiella rapae and Praon volucre. In parasitoid species, specialization reduces the number of exploited hosts and can potentially lead to speciation (Ravigné, 2010). In this study, we assessed in what extent one of the most generalist Aphidiinae species, Diaeretiella rapae (recorded as parasitizing nearly 100 aphid species; Singh & Singh, 2015) is actually generalist by testing its ability to parasitize various aphid species. We selected pest and non-pest aphids, from cultivated and wild plants to determine if this parasitoid could be a suitable candidate for conservation biological control strategies. Diaeretiella rapae main host is the cabbage aphid Brevicoryne brassicae (Hemiptera: Aphididae), a pest of many Brassicaceae crops (Něec & Starý, 1984; Wilson & Lambdin, 1987; Pike et al, 1999). It has recently been demonstrated that the efficiency of D. rapae to control B. brassicae depends on a quasi-synchronicity between the aphid colonization of the plant and the parasitoid arrival (Neuville et al, 2015). The ability of D. rapae to develop on non-pest species in semi-natural habitats next to the fields could then improve its efficiency to control B. brassicae by promoting its early presence in Brassica crops. Plants hosting alternative aphid host suitable for D. rapae (Le Guigo et al. 2012a) can be found in uncultivated areas. For instance, plants of the genus Chenopodium shelter tree potential hosts of D. rapae: Hayhurstia atriplicis, Aphis fabae and Myzus persicae (Starý, 2006). These plants are found both in fields and edges, throughout the year, and they could act as host reservoirs for D. rapae during the absence of B. brassicae (Starý & González, 1991). However, Derocles et al, (2016) showed a genetic differentiation between parasitoids developing on B. brassicae or M. persicae and those parasitising H. atriplicis. In this study, we tested the hypothesis that the uncultivated plants of the genus Chenopodium hosting the aphids Hayhurstia atriplicis, Aphis fabae or Myzus persicae could act as reservoirs for the parasitoid D. rapae. This is possible only if there is neither host specialization nor reproductive isolation between individuals developing on Brassica and Chenopodium aphids. For this purpose, we constituted four strains of D. rapae coming from three different host species and we compared their performances on six aphid host species by host switching experiments. We also tested crossbreeding

130 between parasitoid strains from different host species but coming from the same geographical area, and compared it to crossbreeding between individuals coming from the same host species but from different geographical areas.

Material and Methods

Parasitoids Four strains of the parasitoid D. rapae were established from parasitized aphids belonging to its main host species (Něe & Starý, 1984), collected in two geographic areas, western France and Portugal. Three of them originated from broccoli fields, two from the cabbage aphid Brevicoryne brassicae, one of each locality and one on the green peach aphid Myzus persicae, in western France. The last strain was isolated from the aphid Hayhurstia atriplicis collected on Chenopodium album, in a semi- natural habitat (an herbaceous bank next to a cultivated field) in western France. The sampling locations are given in Table 1. For the three French strains, the maximum distance between the sites of collection was about one hundred km. In the laboratory, each D. rapae strain was reared on the aphid species and plant of collection.

Aphids Aphid strains used for parasitoid rearing and in the experiments were established from field collected individuals or were part of laboratory collection of clones. Details are given in Table 2. Aphids were all maintained on their plant species of collection. Six aphid species were used in the experiments, three ones on which the parasitoid D. rapae was collected in the field, B. brassicae, M. persicae and H. atriplicis and three other species, Aphis fabae, Sitobion avenae and Acyrthosiphon pisum. Aphis fabae and S. avenae are part of the theoretical host range of D. rapae while A. pisum is not (except few records in South America, Singh & Singh, 2015). Brevicoryne brassicae, H. atriplicis, S. avenae and A. pisum are specialist aphids, respectively on Brassicacae, Chenopodiaceae, Poacae and Fabacae. Myzus persicae and A. fabae are more generalist species (Blackman & Eastop, 2006). For these two last species, individuals were collected from plants where another D. rapae host could be found, in order to test the hypothesis that the parasitoid could use different host species on the same plant species. M. persicae as B. brassicae were collected on Brassicaceae and A. fabae as H. atriplicis on Chenopodiaceae (Table 2). For S. avenae and A. pisum, three clones of each species were used, as intraspecific variability in host suitability for aphidiinae parasitoids is known for both species (Le Ralec, unpublished data; Simon et al, 1999; Peccoud et al, 2009,). As this variability is partially due to symbiotic bacteria (Hamiltonella defensa) in A. pisum (Dion et al, 2011), we chose three aposymbiotic clones. This was not necessary

131 with B. brassicae populations in western France because they are composed of very few genotypes (Le Guigo et al, 2012b) and no protective symbiotic bacteria against parasitoids have ever been found in this species (Henry et al, 2015).

Insects rearing Aphids and parasitoids were reared under laboratory conditions, at a temperature of ± . ◦C, 60% ± 10% relative humidity and a L16: D8 photoperiod in separate climatic chambers. Brevicoryne brassicae and M. persicae were reared separately on broccoli plants (Brassica oleracea var. italica cv Marathon). The three clones of S. avenae were reared separately on wheat (Triticum aestivum cv Boston) and the three clones of A. pisum on alfalfa plants (Medicago sativa). Both H. atriplicis and A. fabae were reared on goosefoot plants (Chenopodium album) obtained from seeds collected in the field.

Host suitability assessment The ability of each D. rapae strains to parasitize the six aphid species was evaluated. The non-host species, A. pisum, was tested to ensure parasitism events did not result from experimental non- choice conditions, whatever the aphid species tested. Newly emerged females of each of the four parasitoid strains were kept with honey and water for 24 to 48 h, and then isolated with a single male of the same strain for 24 h. Mated females had no contact with an aphid prior to the test. Each parasitoid female was tested only once. For each aphid species and clone, ten third instar nymphs were placed on a young plant of the species they had been reared on. After infestation, plants were isolated in a Cellophane® bag (29 cm x 15 cm) for 1 h to allow aphids settlement. They were then exposed to a single D. rapae female for 24 h. The female was then removed and the aphids were kept in climatic chambers for 20 days. For each aphid species, clone and parasitoid strain, ten replicates were carried out. After 10 days, mummified aphids were counted. Experiments were carried out in two distinct sessions (with a time lapse of 10 days). The number, sex-ratio (number of females / total number of individuals) and development time of the parasitoids emerged from the mummies were recorded.

Reproductive compability To assess reproductive compatibility between strains of D. rapae, originating from various hosts, we performed crosses between the four parasitoid strains. Because Aphidiinae are haplo-diploid, the absence of females in the progeny indicates reproductive incompatibility, as a 100% male progeny reflects the absence of oocyte fertilization. We used this feature to detect possible reproductive isolation between the strains. To avoid previous mating, mummies were maintained isolated until

132 emergence. Males and females were kept isolated for 24 h after emergence and supplied with water and honey, and then couples were randomly formed. Ten females from each strain were allowed to mate with ten males of the four possible strains. Five of them were proposed to oviposit on aphids belonging to the species of female rearing and five of them on aphids belonging to the species of male rearing. Each mated couple was used only once. We used the same experimental design as above (host suitability experiment) to obtain progeny and check the sex ratio in proportion of female. The number of mummies, the number and the sex of emerged adults were recorded.

Statistical analysis The influence of the aphid species (aphid of collection (rearing) or not), the strain of D. rapae and the session on the parasitism rate was assessed by using a Generalized Linear Model assuming a Binomial error and a logit link function. Pairwise comparisons between each pair strain-aphid were performed ith the futio estio’ usig the doB’ pakage Højsgaad, . The effect of the aphid species of the female and the male in each crossbreeding on parasitism rate was tested by the same method. The effects of host species (aphid of collection (rearing) or not), strains of D. rapae and sessions on the development time were tested using an analysis of vaiae folloed Tuke’s tests. Finally, the effects of host species (aphid of collection (rearing) or not) and strains of D. rapae on the sex-atio i oth epeiets ANOVA folloed Tuke’s tests. To esue the aua of our model, we checked normality of the distribution of residuals. Analysis was carried out under R version 3.1.1 (R Development Core team, 2013).

Results

Host suitability assessment The four strains differed in the range of aphid species they can parasitize and in the parasitism rates obtained on these species (Fig. 1). No mummy was obtained on S. avenae and A. pisum; these two species were removed from the statistical analysis. Parasitoid strains (GLM: X2 = 14.162, Df = 3, P = 0.0026), aphid species (GLM: X2 = 284.571, Df = 3, P < 0.001) and their interactions (GLM: X2 = 248.991, Df = 9, P < 0.001) influenced significantly the parasitism rate. The higher parasitism rates were obtained on the rearing host of each strain (GLM: X2 = 247.6, Df = 1, P < 0.001). Session effect was not significant (GLM: X2 = 0.307, Df = 1, P = 0.58) for the parasitism rate. Overall, mummies were produced on only four aphid species and the number of aphid species giving at least one mummy varied from two to four according to the parasitoid strain (Fig. 1). Brevicoryne brassicae and M. persicae were parasitized by all strains. Hayhurstia atriplicis was parasitized by two strains and A. fabae by one strain. The D. rapae strain reared on H. atriplicis produced offsprings on four aphid

133 species. The three other strains successfully parasitized only B. brassicae and M. persicae, although a unique mummy was obtained from the Portuguese strain on H. atriplicis. The strain reared on H. atriplicis produced significantly less progeny than the three other strains reared on B. brassicae and M. persicae (Fig.2). The development time between egg laying to adult emergence differed significantly according to the parasitoid strains (anova: Df = 3, F = 27.85, P < 0.001), aphid species (anova: Df = 3, F = 10.51, P < 0.001) and the interaction between these factors (anova: Df = 4, F = 3.39, P = 0.009) (Fig. 1). The strain reared on H. atriplicis required one or two more days to complete its development compared to the strains reared on M. persicae and B. brassicae (Fig. 1). Finally, for all strains, the sex-ratio of the progeny ranged from 0.7 to 1 (Fig. 1) and nor the aphid species (anova: Df = 3, F = 0.95, P = 0.42) neither the strains (anova: Df = 3, F = 2.14, P = 0.1) had a significant effect.

Reproductive compatibility The overall sex ratio of the progeny was about 0,8 of females, except for crosses involving individuals reared on H. atriplicis mated with a partner from another strain. In this case, only males were obtained (Fig. 3). The parasitism rates of the four D. rapae strains on the different aphid species observed in this experiment were similar to those obtained in the previous experiment (host suitability assessment) (Fig. 3). For all crossbreedings, the parasitism rate was significantly higher on the rearing host of the female (GLM: X2 = 209.71, Df = 1, P < 0.001; Fig. 3). Mummies were produced on H. atriplicis only when the female belonged to the H. atriplicis strain.

Discussion

The aphid parasitoid D. rapae is known to parasitize a hundred of aphid species (Pike et al, 1999; Starý, 2006; Singh & Singh, 2015). However, previous studies have shown local variations of its host range (Le Ralec et al, 2011). In the present study, we investigated the level of host specialization of four populations reared from three aphid species and two geographical origins. A higher degree of specialization was observed in the three D. rapae strains collected on the aphid species attacking crop (B. brassicae from two different areas and M. persicae), whereas the D. rapae strain coming from the non-pest aphid H. atriplicis, was able to parasitize a wider range of host species. Moreover, this strain appeared reproductively isolated from the three others. These results suggest the existence of specialized cryptic species in this presumed generalist parasitoid. The role of H. atriplicis in maintaining D.rapae populations when pest aphids are absent is therefore questionable. The four strains of D. rapae studied here differed in their host range but also in the number of offspring produced on each suitable aphid species. First, the three strains coming from B. brassicae

134 and from M. persicae parasitized only these two host species, regardless of their geographical origin. Next, the strain from H. atriplicis parasitized four of the six aphid species tested. In addition to its host of origin, the strain from H. atriplicis successfully developed on B. brassicae, M. persicae and A. fabae, this latter aphid species collected on Chenopodium album as well as H. atriplicis. Brevicoryne brassicae and M. persicae are very common aphids in European agroecosystems (Blackman & Eastop, 2000), and constitute an abundant resource during a short period of time for D. rapae on cultivated Brassicaceae (e.g. oil seed rape, cabbage, turnip) but also on uncultivated plant species. On the contrary, H. atriplicis is a scarce resource for a parasitoid, being present during three months only (August to October), on wild Chenopodiaceae (Blackman & Eastop, 2000), and in small abundance in agroecosystem. We can hypothesise that it represents a high risk for a parasitoid species to specialize on scarce resource. However, the ability to parasitize other aphid species on the same host plant, like A. fabae or M. persicae, but also aphid species exploiting plants of other families (e.g. B. brassicae and M. persicae on Brassicaceae), could limit the risk of specialization. The parasitic success of the most generalist strain (from H. atriplicis) was lower than the parasitic success of the more specialized strains, on the shared hosts B. brassicae and M. persicae. This reduction in parasitism efficacy is expected as a result of a trade-off between the ability to exploit numerous hosts and parasitism efficacy (Devictor et al, 2010; Le Ralec et al, 2010; Gagic et al, 2016). The grain aphid S. avenae was never parasitized, in spite of this species was supposed to belong to the host range of D. rapae (Pike et al, 1999, Singh & Singh 2015). Such an unsuitability of theoretical D. rapae hosts had already been observed for other cereal aphids (Antolin et al, 2006; Le Ralec et al, 2011). Unfortunately, we did not find any D. rapae individuals from cereal aphids. Less surprisingly, no progeny was obtained on the pea aphid A. pisum, used as a non-host control in this study, even in the experimental non-choice conditions. The highest parasitic success was always obtained on the host of collection, which was also the rearing host. This is not surprising as strains collected on a given host are expected to be adapted to this host. This variation in performances also indicates some degree of host specialization of the populations in the field (Henry et al, 2008). Differences in performance might also result from parasitoid strains have been continuously maintained on their host of collection since the sampling. The rearing on a single species of aphid host has been showed to affect positively the parasitoid success (Vafaie et al, 2013), enhances host recognition (Wickremasinghe & VanEmden, 1992; Storeck et al, 2000) and induces preference in host choice (VanEmden et al, 1996). The observed differences in the set of hosts successfully parasitized by the four D. rapae strains are consistent with the observations of Derocles et al, (2016). Indeed, using molecular phylogenetic analysis, the authors showed a clear genetic differentiation between populations of D. rapae collected on B. brassicae and M. persicae and populations sampled on H. atriplicis from the same

135 geographical area. Our results suggest that this molecular variation between D. rapae populations from different aphid species actually reflects host specialization. In addition, the strains from B.brassicae and M. persicae appeared reproductively incompatible with the strain from H. atriplicis. While distant populations from France coming from B. brassicae or M. persicae and Portugal coming from B. brassicae were able to successfully interbreed, the French population reared on H. atriplicis did not produced female offspring when the mating occurred with another strain. Our data reveals a clear congruence between genetic differentiations, host specialization and reproductive isolation in the populations of the generalist parasitoid D. rapae include in this study, suggesting the existence of cryptic species in D. rapae. Such cryptic species or specialized biotypes are known in other Aphidiinae. In several studies, morphometric analysis revealed specialized biotypes (Toić et al, 2005; Žikić et al, 2009; Barahoei et al, 2011; Toaović et al, 2014). However, in our case, a morphological re-examination of D. rapae individuals based on the main morphological characters usually used to identify Aphidiinae (maxillary palps, number of antennal segments, size, shape and i igs ad the ateolateal aea of the petiole; Kavallieatos et al, ; Toaović et al, ; Kavallieatos et al, ; Toaović et al, did ot allo to evidee a diffeetiatio between strains. Derocles et al, (2016) did not conclude in favor of the existence of two different species in D.rapae on the sole basis of molecular variations. Indeed, the analytical approach they applied based on a combination of maximum likelihood trees and the species delimitation method called Bayesian Poisson tree processes model (bPTP; Zhang et al, 2013) did not separated the two genetic entities (D. rapae populations from H. atriplicis on one side and populations from other species on the other) into distinct species. However, our complementary findings showing that morphologically indistinguishable (based on our morphological reexamination) host-specialized strains are reproductively isolated strongly claim in favor of the existence of at least two cryptic species in D. rapae. Desneux et al, (2009) with comparable results described a new species, Binodoxys koreanus, from two populations previously identified as Binodoxys communis. Consequently, our results suggest the need to consider the description of new species in D. rapae. The evolutionary process leading to reproductive isolation of individuals from the same ancestral species and resulting in two species (Ravigné, 2010) involves physical or biological reproductive barriers. In the case of B. communis and B. koreanus (Desneux et al, 2009), the two species originated from distant countries and their recent divergence could be explained by geographical isolation. In the present study, the incompatible strains were collected in the same geographical area. Sympatric speciation, i.e. the eegee of e speies ithout geogaphial isolatio Futua, ; Wile & Lieea, 2011) could result from a micro-habitat differentiation inducing a reduction in gene flow between specialized populations.

136 Because most aphid species are specialized on a few host plant species or families (Ferrari et al, 2008), we hypothesise that parasitoid specialization could be primarily driven by habitat choice (Le Ralec et al, 2010). Indeed, secondary compounds emitted by plants during the attack of aphids attract various Aphidiinae parasitoids (Guerrieri et al, 1993; Funk et al, 2002; Figueroa et al, 2004; Toneatto et al, 2010) and thus affects the host selection behavior of the parasitoid (Rehman & Powell 2010). Similarly, D. rapae is attracted by secondary compounds emitted by Brassicaceae after pest attacks (Blande et al, 2007; Pope et al, 2008). We hypothesise that the secondary compounds emitted by Chenopodiaceae infested by aphids are different. These differences in compounds potentially lead to the specialization of a part of the populations for the recognition of these compounds. According to our results, the presumed generalist species D. rapae could then comprise at least two biotypes or even distinct species, one specialized in the exploitation of aphid species attacking Brassicaceae and one specialized on aphid species of Chenopodiaceae. The synonymy of the species name D. rapae with names referring to Chenopodiaceae, like Diaeretiella chenopodii or Diaeretiella chenopodiaphidis (Singh & Singh 2015) should therefore be re-examined. Theoretical host range of D. rapae includes almost one hundred host species and similar cases of specialization in this parasitoid has been shown for other aphid hosts (see Antolin et al, 2006; Le Ralec et al, 2011). The potential number of specialized sub taxa or cryptic species could then be greater. This study was based on only four populations with a probably low genetic diversity due to the low number of individuals used to constitute the strains. To fully elucidate the taxonomic status of D. rapae, we need to conduct host switching and crossbreeding experiments on a larger number of populations originating from a wider range of hosts and countries. Finally, according to this study, the role of H. atriplicis as reservoir for D. rapae poposed Něe et Starý, (1984) and Starý et González, (1991) is questionable. Our results showed an asymmetry in host range between specialist strains coming from B. brassicae and M. persicae and a more generalist strain from H. atriplicis, the formers being unable to develop on H. atriplicis, a situation not tested by Starý et González (1991). This confirms the scarcity of the parasitoid exchanges between cultivated and uncultivated compartments (Derocles et al., 2014). Promoting non-pest aphids on non-crop plants as a parasitoid reservoir may not be a suitable way to enhance natural pest control by D. rapae in conservation biological control. Wild plant species belonging to the Brassicaceae in the vicinity of the field are more likely to be the actual reservoir of the corresponding D. rapae sub taxa, as they harbor the pest aphid species B. brassicae or M. persicae (Le Guigo et al, 2012a; Le Guigo et al, 2012b). However, wild Brassicaceae in uncultivated compartment of agroecosystems could also act as reservoir of pests.

137 Our study is consistent with several recent studies in demonstrating that aphidiinae species considered as generalists are more likely constituted of specialized entities or even cryptic species as it seems to be the case in D. rapae. This has to be fully considered in ecological studies on interaction networks between plants, aphids and parasitoids to avoid misinterpretations of resource sharing (Gagic et al, 2016) and the structure of ecological networks (Derocles et al. 2015). Moreover, the importance of aphid traits in the evolution of host-specificity in Aphidiinae is often underlined (Raymond et al 2015). Nevertheless, the plant taxa supporting the aphid hosts could also be a key factor driving parasitoid specialization.

Acknowledgements The authors thank Bernard CHAUBET for technical assistance for constituted and maintained insects eaig. This ok as suppoted the Feh Miiste de l’Eseigeet “upieu et de la ‘ehehe’ ad as fouded the Feh ‘eseah Natioal Agency (PEERLESS project, ANR-12- AGRO-0006).

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144 Table 1: Diaeretiella rapae strains included in this study: name of strains, collection host and plant, collection location, collection year and number of males and females for starting breeding. Dr/Mp: Diaeretiella rapae from M. persicae, Dr/Bb (Fr): Diaeretiella rapae from Brevicoryne brassicae (France), Dr/Bb (Por): Diaeretiella rapae from Brevicoryne brassicae (Portugal), Dr/Ha: Diaeretiella rapae from Hayhurstia atriplicis

Name of Sampling Sampling Number of individuals Aphid Host Plant strains location year for start breeding ♀ ♂ Dr/Mp Myzus Brassica oleraceae Western France 2009 10 5 persicae var. italica Dr/Bb(Fr) Brevicoryne Brassica oleraceae Western France 2013 4 5 brassicae var. italica Dr/Bb(Por) Brevicoryne Brassica oleraceae Portugal 2013 2 1 brassicae var. italica Dr/Ha Hayhurstia Chenopodium album Western France 2013 6 3 atriplicis

Table 2: Aphid species included in this study: species name based on morphological identification, collection plant, collection location and collection year. Species (clone) Plant Sampling Sampling Myzus persicae Brassica oleraceae var. italica Westernlocation France 2006year Brevicoryne brassicae Brassica oleraceae var. italica Western France 2006 Aphis fabae Chenopodium album Western France 2013 Hayhurstia atriplicis Chenopodium album Western France 2009 Sitobion avenae (SaR1) Triticum aestivum Western France 1990 Sitobion avenae (SaFima5) Triticum aestivum Western France 1990 Sitobion avenae (SaLec14) Triticum aestivum North France 1993 Acythosiphon pisum (pLL01-VF) Medicago sativa France 1987 Acythosiphon pisum (P123) Pisum sativum France 1999 Acythosiphon pisum (JML06) Medicago lupulina Germany 2006

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Figure 1: Total number of mummies produced per aphid species by the various strains of D. rapae (a). Average number of mummies per female with standard deviation, the sex ratio is expressed in female ratio and the mean development time in days with standard deviation for each pair of parasitoid strains and aphid species (b). Dr/Mp: Diaeretiella rapae from Myzus persicae, Dr/Bb(Fr): Diaeretiella rapae from Brevicoryne brassicae (France), Dr/Bb(Por): Diaeretiella rapae from Brevicoryne brassicae (Portugal) Dr/Ha: Diaeretiella rapae from Hayhurstia atriplicis. Statistical test is a GLM for parasitism rate and anova for development time with respectively pairwise comparisons with estio’ ad Tuke’s tests as post ho tests. Results of the three clones of A. pisum and S. avenae were pooled as no mummies were obtained. Significant differences are indicated with different letters (p < 0.05) and with asterisks (***: p < 0.001).

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Figure 2: Total number of adult female and male offsprings as well as unemerged mummies produced per aphid species by the various strains of D. rapae. Statistical test is a GLM with pairwise opaisos ith estio’ post ho test. Different letters show significant differences (p < 0.05).

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Figure 3: Average numbers of mummies produced (with standard deviation) (a) and offspring sex ratio (in female ratio) (b) for each aphid species tested and for all types of crossbreeding. Dr/Mp : Diaeretiella rapae from M. persicae, Dr/Bb : D. rapae from B. brassicae, Dr/Bb (Por) : D. rapae from B. brassicae (Portugal) Dr/Ha : D. rapae from H. atriplicis. Statistical test is a GLM for parasitism rate with pairwise comparisons with estio’ post hoc test and for analysis sex-ratio, we used anova with Tuke’s tests; different letters indicate significant differences (p < 0.05).

148 Conclusion et perspective

L’tude ile su Diaeretiella rapae nous révèle que cette espèce ne se comporte pas du tout comme un généraliste. Cette espèce se comporte comme un spécialiste des pucerons des Bassiaeae. “o spete d’hôte est ts liit ême à une échelle régionale, seules sept espèces étant exploitées sur les 22 hôtes potentiels présents. Nos résultats ne montrent ni une exploitation simultanée ni une exploitation séquentielle des hôtes par D. rapae. Les pucerons sur Brassicaceae B. brassicae et M. persicae sont exploités très majoritairement, tout au long de la période de présence de D. rapae et quasi exclusivement dans le milieu cultivé. Les autres hôtes hormis H. atriplicis sont exploités avant la disparition estivale des pucerons. Cette tude ous a peis d’ajoute tois hôtes suppletaies au spete d’hôtes idetifi das le hapite . Ces hôtes suppletaies et notamment M. carnosum sur Ortie et Hyperomyzus lactucae sur Crepis sp ot seuleet fait l’ojet d’ue dtetio olulaie ui e peet de etifie ue l’veet de paasitise auait aouti à l’egee d’u adulte, paasitise ioplet ; “taý, 1989). En revanche, le parasitisme de S. avenae sur céréales ayant était détecté par les deux méthodes peut être incorporé au spectre réel de ette espe das os agoosstes. Mais, d’ue aie gale, les veets de parasitisme sur les pucerons autres que ceux sur Brassicaceae sont très rares et ponctuels malgré une disponibilité importante de ressources. L'attraction par les. composés secondaires émis par les plantes de cette famille à la suite d’attaues de pucerons (Pope et al., 2008) est vraisemblablement un facteur primordial de spécialisation, car il permet l'orientation directe du parasitoïde vers des plantes abritant une ressource abondante. Ce phoe peut s’appaete à la théorie de « l’optial foagig » (Pyke et al., 1977 ; Stephens et Krebs, 1986), qui introduit la notion de coût et de bénéfice. Dans notre cas le coût correspond au temps de rechehe et le fie est li à l’effiait du paasitise. Cela sigifie pou D. rapae, ue, e l’asee de dtetio des oposs is pa les Bassiaeae, au out d’u etai teps de recherche, il est plus intéressant pour la femelle parasitoïde de parasiter un autre hôte. Cela se vérifie puisque les événements de parasitisme sur les plantes autres que les Brassicaceae se poduiset uad le stade phologiue des Bassiaeae ultivs ’est plus favoale au pueos entraînant une baisse des effectifs. Nous avons trouvé D. rapae das l’evioeet toute l’ae sauf e hive, alg u effot d’hatilloage ts ipotat su ette piode e . L’ativit hiveale de D. rapae sous nos latitudes ’est pas eoe oue. Duat ette piode, nous avons pu échantillonner quelques espèces de pucerons, montrant bien que les conditions climatiques hivernales clémentes permettent l’ahololie hez etaies espes oe M. persicae.

149 Les seules plantes qui semblaient pouvoir jouer un rôle de résevoi d’hôte pou D. rapae étaient celle appartenant au genre Chenopodium qui héberge 3 espèces hôtes potentiels : M. persicae, A. fabae et H. atriplicis. Ce deie est l’hôte le plus paasit pa D. rapae dans les milieux non cultivés et il est présent ue tadiveet das l’evioeet ete août et ovee. Ces deu aatistiues fot de ette espe u potetiel sevoi d’hôte itessat pou D rapae. Mais les analyses moléculaires ont confirmées une nouvelle fois la structuration génétique observée à l’helle loale ete les idividus eploitat H. atriplicis et les individus exploitant les autres espèces de pucerons et ce lors des deux années. De plus, l'tude au laoatoie peet de valide l’hpothse de l’eistee d’espes ptiues chez D. rapae. Tous les critères semblent réunis pou olue à l’eistee de deu espes cryptiques, un isolement reproductif, une structuration génétique, des performances différentes apaits de paasitise et lageu de gae d’hôtes diffetes) et des caractéristiques morphologiques identiques. Cette expérimentation au laboratoire nous a permis de relier la structuration génétique observée en conditions naturelles à la spécialisation parasitaire. Cependant os sultats potat su la gae d’hôtes exploitée au laboratoire et celle observée en conditions naturelles sont contradictoire. Au laoatoie, l’etit eploitat H. atriplicis paraît plus généraliste ue l’etit issue des pucerons des Brassicaceae, alors qu'en conditions naturelles, on observe l’ivese. O peut ette l’hpothse u’e oditios de o-choix, la souche exploitant à la base H. atriplicis a gardé une capacité à exploiter plusieurs hôtes. Dans le cas des autres souches venant de B. brassicae ou M. persicae sur Brassicaceae et maintenues en élevage sur ces mêmes hôtes, les oditios d’levage su u seul hôte peuvet avoi etaî ue pete de la apait à paasite Aphis fabae et S. avenae, qui le sont mais de façon très rare et ponctuelle en condition naturelle. Rappelons aussi que la base génétique initiale de ces souches d'élevage, fondées avec un nombre restreint d'individus, est étroite. Le fateu ui ous peet d’epliue la stutuatio gtiue des populatios oseve das l’agosste tudi hez D. rapae est l’hte, puisque les autres espèces de pucerons présentes sur chénopode, M. persicae et A. fabae sot paasites pa l’etit la plus galiste. De plus, H. atriplicis a un comportement particulier car il est premièrement présent tardivement (août- ovee das l’evioeet, su ue plate poutat psete toute l’ae. Deuieet, ce puceron forme sur la plante des galles par enroulement des feuilles (Fig. 17)), ce qui oblige le parasitoïde à percer en plus de la momie, la feuille pour pouvoir émerger. Ces galles pourraient ostitue ue foe de sistae à l’hive ou à la pdatio, pou le pueo ais aussi pou le paasitoïde, losue la feuille est eoule la oie ’tat plus aessile et potge du foid. Troisièmement, ce puceron produit des petites colonies sur des chénopodes ayant poussé sur sol nu

150 osevatio teai, à l’ivese des oloies plus ipotates et plus egoupes fo pa B. brassicae sur colza (Fig. 18).

Figure 17 : Galle formé par Hatriplici. atriplicis sur Chenopodium sp, egee d’u adulte de

Diaeretiella rapae et trous de sortie laissés par les parasitoïdes.

Figure 18 : colonies de B. brassicae sur colza

On considère les deux entités comme morphologiquement semblables sur la base des caractères communément utilisés : le nombre de palpes maxillaires, le nombre de segments antennaires, la taille, la forme et la nervure des ailes et la région antérolatérale du pétiole (Kavallieratos et al., 2001, ; Toaović et al., 2003, 2007). Des analyses supplémentaires pourraient être menées pour séparer morphologiquement les deux groupes en utilisant la morphométrie. Cette méthode a été utilisée dans différents groupes. En particulier, les analyses morphométriques des ailes sont utilisés pour identifier des espèces cryptiques, par exemple chez le mâle de Euglossa viridissima et Euglossa dilemme (Hymenoptera: Apidae) (Quezada-Euan et al., . Chez les Aphidiiae, l’aalse morphométriques des nervations alaires est un élément important dans l'identification des espèces (Toaović et al., 2014). Dans notre cas, deux éléments qui seraient intéressants à comparer entre les deu etits sot la foe des adiules ui pouaiet vaie du fait ue l’etit spialise su H. atriplicis doit percer la feuille de chénopode. Ensuite, l’aalse du atio taille du ops / taille des ailes ou de la forme du thorax (volume des muscles alaires) pourrait être faite. Le temps de ehehe de la essoue tat plus log et essitat plus de dplaeet pou l’etit spialiste du fait des colonies moins nombreuse et plus éparse pourrait concorder avec des aptitudes de vol supérieur. Les compétences de taxonomistes sont maintenant nécessaires pour juger du bien-fondé

151 de oe ue ouvelle espe, vetuelleet pa des os d’espes utilisés historiquement et considérés aujourd'hui comme synonyme de Diaeretiella rapae, tels Diaeretiella chenopodii (Förster, 1867) ou Diaeretiella chenopodiaphidis (Ashmead, 1889) (Singh et Singh, 2015). Nos deu apages d’hatilloage ’ot pas peis d’aode la uestio de la spialisatio possible entre les populations exploitant les pucerons sur céréales et celles exploitant les pucerons des Bassiaeae. Nos apages d’hatilloages ous ot peis de olte uiueet si momies de D. rapae sur S. avenae. Ces six individus ne présentaient pas de structuration génétique avec ceux provenant de B. brassicae et M. persicae. Cependant lors de nos expériences menées au laboratoire aucune des quatre souches de D. rapae ’a paasit S. avenae. Afin de pouvoir appréhender cette possible spécialisation entre les deux familles de plantes cultivées, un échantillonnage dans le sud de la France pourrait être effectué avec pour objectif de récolter des momies de D. rapae provenant des différentes espèces de pucerons, dont D. noxia et R. padi, mais aussi B. brassicae et M. persicae pour les analyser par barcoding et ainsi les comparer avec les populatios de l’Ouest de la Fae. Cette aalse pouait te oie ave la ostitutios de souches issues du “ud et de l’Ouest de la Fae pou opae leu pefoae su ue gae d’hôtes lagies et alise des tests de opatiilit epodutive oe e ue ous avos fait pou idetifie la psee d’espes ptiues ete les populatios eploitant H. atriplicis et celles venant des pucerons sur Brassicaceae. Finalement, das l’optiue de la ise e plae d’ue lutte iologiue pa osevatio ote B. brassicae par D. rapae, les seuls sevois d’hôtes ui selet petiets pou D. rapae sont les pucerons des Brassicaceae eux-mêmes sur les Brassicaceae sauvages ou les cultures intermédiaires piège à nitrates (CIPAN). Le cas de M. persicae est à approfondir, ce puceron étant connu pour être très polyphage, même si dans nos échantillonnages nous l’avos touv pesue elusiveet su Brassicaceae. La détection de sa présence en hiver sur Brassicaceae laisse penser que cette espèce pouait joue e ôle de sevoi. L'istallatio das l’evioeet de Bassiaeae e asee des cultures pourrait permettre d'héberger B. brassicae et D. rapae. Nous avons pu voir dans l’hatilloage de teai ue les CIPAN de type Brassicaceae, notamment la moutarde (Synapsis alba) pouvaient héberger ce puceron en automne. Un échantillonnage ciblé sur cet objectif dans une gio alie où les CIPAN sot ts utilises peetta d’estie l’ipat el de ette patiue sur les populations de D. rapae ais aussi su elle du avageu, il e s’agit pas de e u sevoi de ravageur entraînant des dégâts plus importants.

152 Discussion générale et perspectives

Cette thèse consacrée à la spécialisation parasitaire chez les Aphidiinae a montré une nette pdoiae du aate spialiste au sei de e goupe, à ue helle d’tude ue l’o peut considérer comme locale. Quelques espèces présentent malgré tous des situatios d’eploitatio de ultiples hôtes. Cepedat, l’o a ot au sei de es espes l’eistee de stutuatio génétique des populations. De plus, nous avons observé une compartimentation importante, aussi ie des essoues, les pueos, ue des espes d’Aphidiiae entre les habitats composant les agoosstes tudis. Efi, l’eploitatio des essoues das les haitats sei-naturels par les parasitoïdes exploitants des ravageurs des cultures s'avère très rare, limitant ainsi les perspectives d’ue alioatio du otôle iologiue eged pa les Aphidiiae su les pueos avageus, par une gestion dirigée de ces milieux.

I. Avantages et inconvénients des deux méthodes utilisées pour la détection du parasitisme et pou l’estiatio des spetes d’htes des Aphidiinae

Note thode d’hatilloage avait pou ut d’te la plus ehaustive possile das les espes de pucerons échantillonnées, afin de pouvoir obtenir ue vue d’esele oplte des spetes d’hôtes aliss pa les Aphidiiae au sei d’u agoosste ie dliit et au ous d’ue saison culturale. Cette méthode, lourde au détriment de la quantification, nous a permis de détecter les cas de parasitisme les plus rares et notamment dans les habitats non cultivés. La méthode d’hatilloage à vue, uiueet alie pa le teps de ehehe psete uelues ioviets, oe elui d’etaîe u dsuilie das le oe de plveets effetués ete les deu tpes d’haitats, les haitats sei-naturels se retrouvant sur-échantillonner. Mais, au contraire des études réalisées avec a priori sur les hôtes ou les plantes à échantillonner, nous avons oteu à haue apage d’hatilloage, une vue exhaustive nous semble-t-il, de l’esele des ressources disponibles et exploitées par les Aphidiinae dans les différents habitats de l’agoosste il. Cei ous a peis de ous affahi de l’eistee des vaiatios géographiques des spectes d’hôtes oues pou etaies espes, otaet D. rapae (Hopper et al., 1995 ; Atoli et al., . Le aue de oaissae des spetes d’hôtes loau peut das le cas des études avec a priori entraîner la non-eploatio d’ue patie de la essource potetielleet eploitale pa ue espe d’Aphidiiae. L'échantillonnage des pucerons identifiés comme parasités sur le terrain (momies) a été combiné à une approche moléculaire permettant la détection d'un Aphidiinae au sein d'un hôte vivant, ciblant

153 trois espèces généralistes : A. ervi, A. matricariae et D.rapae. L’utilisatio de l’appohe olulaie pa diagosti PC‘ ous a peis d’avoi ue ifoatio plus oplte su les hôtes eploits pa es tois espes das l’agosste tudi. Cette thode ous vle u spete d’hôtes plus lage comparé aux informations obtenues par le prélèvement des momies. Mais, même si la détection du paasitise pa la thode d’hatilloage des oies est ois pise, plus logue et nécessitant des optees spifiues pou l’idetifiatio des Aphidiiae, elle este idispesale. Le pole ajeu de l’appohe olulaie se pose losue l’o dtete le paasitise d’u hôte pa ue espe d’Aphidiiae pou lauelle l’hôte ’est pas petoié dans son spectre théorique. Dans ce cas la suspicion de parasitisme incomplet (Starý, 1989) peut être forte. L’osevatio diete du paasitise d’ue espe de pueo pa u Aphidiiae peet de s’assue ue l’hôte paasit oduit ie à l’egee de l’adulte. Les hpothses peettat d’epliue la présence de ces situations et leurs conséquences ont été discuté dans la conclusion du Chapitre 1. Cette approche moléculaire appliquée à de nombreuses espèces cibles est complexe à mettre en place. Si en théorie le multiplexage des amorces spécifiques aux espèces est possible (Harper et al., 2005 ; Traugott et al., , ous ’avos pas pu l'utilise, pou seuleet espes iles. Les longueurs des fragments amplifiés pour deux espèces étaient trop proches pour se distinguer sur gel d’agaose. Nous avos dû alise deu PC‘ pou u jeu de aoes ui ostitue le problème majeur de cette méthode, l’tude d’ue ouaut ts divesifie semble moins envisageable (Wiens et al., 2011).

Les outils olulaies utiliss duat ette thse ’ot pas peis d’aalse l’esele des individus récoltés lors des échantillonnages puisque sur plus de 100 000 pucerons récoltés, environ 23 000 ont été analysés de façon partielle, du fait du regroupement en lots. De plus, sur les presque paasitoïdes adultes olts, ois de ot t sues. L’utilisatio des ouvelles technologies de séquençage notamment le séquençage haut-débit, comme le pyroséquençage (Taberlet et al., 2007) ou le séquençage par synthèse aussi appelé « séquençage illumina » aurait l’itt de pouvoi aalse ue uatit de does plus ipotate et plus apideet, ais ave un coût financier bien plus important. Avec ces méthodes, on peut envisager de regrouper l’itgalit des pueos d’ue oloie, d’ue e espe, d’u e haitat…, e fotio des ojetifs, et aisi de dteie la liste des espes de haue iveau tophiue d’ue ouaut et d'identifier qui interagit avec qui ou qui exploite qui, mais aussi de quantifier la part relative de chaque espèce dans la communauté (Valentini et al., 2009b ; Caporaso et al., 2012). Das os tudes, l’aalse du paasitise a t effetue su des lots de pueos appotat des informations essentiellement qualitatives. Ue alioatio ipotate seait d’aalse idividuelleet les pueos pou ehehe la psee d’u paasitoïde, afi d’otei u tau

154 de paasitise pa espe. Ave l'appohe hoisie, u’il ait u pueo paasit ou di das haue lot, l’ifoatio oteue est la psee de paasitise et o la uatit de pueos paasits. Ce paate est ipotat, otaet pou les veets de paasitise d’espes de pueos par un Aphidiinae, que nous avons qualifié de rares. Prenons le cas du parasitisme de D. rapae sur Aphis fabae. Cette interaction a été détectée seulement deux fois. Mais si dans ces deux interactions, su les pueos aalss idividuelleet, ou plus sot paasits, l’ipotae de ette interaction dans le maitie des populatios à l’helle loale peut te toute aute ue si le parasitisme ne concerne qu'un individu. L'interprétation de cette interaction par rapport au comportement des parasitoïdes peut également être différente, entre la réelle exploitation d'une ressource disponible par une ou plusieurs femelles et une "erreur" d'oviposition, une ponte opportuniste, dans un unique puceron. Les différentes études menées durant cette thèse peuvent être améliorées en particulier sur la quantification des inteatios, ais la oiaiso des deu thodes ous a peis d’otei les ifoatios essetielles à ette thse ui sot les spetes d’hôtes aliss pa les diffetes espes Aphidiiae à l’helle d’u agosste duat ue saiso ultuale.

II. Les espèces généralistes chez les Aphidiinae

L’esele des tudes oduites duat ette thse devait peette de pode à la uestio : existe-t-il des parasitoïdes de pucerons généralistes ? Nous avos idetifi au sei d’u agroécosystème bien déliit et duat ue saiso ultuale, espes d’Aphidiiae ui avaiet à disposition dans cet environnement près de 60 espèces de pucerons différentes. Les espèces d’Aphidiiae psetes se sot vles te ajoitaieet des spialistes. Mais euf espèces parasitaient quatre espèces de pucerons ou plus, dans cet environnement spatialement délimité, correspondant à une exploitation agricole, et ce, sur une saison culturale. Cependant, ces espèces généralistes n'exploitent qu'une partie très limitée de leu spete d’hôtes thoiue dispoile, évalué par les espèces d'Aphididae présentes dans l'environnement étudié et ayant été répertoriées das la littatue oe hôte du paasitoïde osid. L’espe la plus galiste idetifie das notre étude, A. matricariae, parasite 14 espèces de pucerons différentes sur les 15 hôtes potentiels présents sur une saison culturale, soit 87 % du spectre théorique, mais cette proportion est beaucoup plus faible pour les autres espèces. La différence entre le spete d’hôtes el osev et le spete thoiue à l’helle loale, est do duit pou les espes galistes. “i l’o opae le spete d’hôte osev ave le spete thoiue gloal, su l’esele de l’aie de patitio d’ue

155 espèce (Besson, 2013), l'écart est évidemment encore plus grand ; dans le cas de A. matricariae, il epsete % du spete d’hôtes global (Fig. 19). Nous avons comparé les spectres réels et théoriques pour les 5 espèces les plus généralistes ayant exploitées des ressources dans les habitats cultivés et semi-atuels das l’agoosste tudi.

70 58 Aphidius ervi 60 Aphidius matricariae 50 Diaeretiella rapae 40 Ephedrus plagiator 32 Lysiphlebus fabarum 30 parasitoïdes parasitoïdes 20 12 12 9 7 Nombre d'espèces Nombre d'espèces de 5 10 2 3 4 3 2 2 2 2 2 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 18 20 21 22 23 24 27 28 35 37 40 56 58 62 76 77 90 104 Nombre d'espèces de pucerons hôtes Figure 19 : Spectres d'hôtes théoriques des Aphidiinae, issus de la littérature, exprimée en nombre d’espes de paasitoïdes eploitats « x » espèces de pucerons diffetes su l’esele de leu aire de répartition (Besson, 2013. L’helle du oe d’hôtes ’est pas otiue. Chaue espe identifiée comme généraliste dans notre étude, et présente dans les deux milieux, est représentée par une couleur différente, le ele etoue le oe d’hôtes thoiue oplet, le tait e pointillé correspond au spectre théorique observé dans les agroécosystèmes étudiés durant cette thse et le tait plei oespod au spete d’hôte alis à l’helle loale.

Le spectre d’hôte osev pou l’ae oee, doit te ofi pa des osevatios su plusieurs années, afin de prendre en compte les variations annuelles des populations de pucerons et d'éventuels effets climatiques ou agronomiques (assolements par exemple). Nous avons pu en faire l’epiee duat ote tude potat su D. rapae, effectuée durant deux années, puisque la deuie ae d’hatilloage ous a peis d’ajoute u hôte suppletaie, le pueo des épis S. avenae, à la gae d’hôte eploits l’ae pdete. Les populatios de ette espe de pueo taiet ts aes das l’agoosste tudi e . De plus, La divesit et l’aodae des espes de paasitoïdes peuvet aussi vaie d’ue ae à l’aute. Pa eeple, Praon volucre, connu pour être un Aphidiinae généraliste (spectre théorique composé de 77 hôtes), présent en France et fréquent dans le bassin de Rennes (Derocles et al., 2014) est quasiment absent das l’agoosste tudi. Nous l’avos plev uiueet su des 17 hôtes potentiels psets à l’helle loale, et ave des effetifs ts duits, de seuleet idividus.

156 De plus, la fréquence du parasitisme des espèces classées ici comme généralistes sur leurs différents hôtes n'est pas équilibrée. La plupart exploitent localement une espèce hôte majoritairement. Ces osevatios ot t faites hez d'autes espes d’Aphidiiae galistes. Storeck et al., (2000) ont aisi ot ue pfee d’hôte hez Aphidius colemani envers Myzus persicae en sur Brassicaceae en Chine. D'après nos résultats, cet hôte préférentiel est le plus souvent une espèce de puceron considérée comme un ravageur ou une espèce très polyphage. Les interactions avec les autres espèces de pucerons sont ponctuelles et limitées. Ces Aphidiinae ne peuvent donc pas être considérées comme des « super généraliste » dans notre agroécosystème (McPeek, 1996). Ils pourraient plutôt être classées comme des généralistes opportunistes, en accord avec la pensée de Loxdale et al., (2011) puisque pour ces auteurs, « les espèces apparemment généralistes occupent finalement des niches écologiques distinctes en développant des adaptations permettant leur occupation. Ces espèces peuvent cependant être opportunistes pour certaines dimensions de leurs niches écologiques, mais montrent toujours des préférences alimentaires ». Das ote tude, afi d’aalse la patitio des espes galistes et spialistes, ous avos choisi de catégoriser les espèces en deux groupes, les généralistes qui exploitent quatre espèces ou plus et les spécialistes qui exploitent moins de quatre espèces. Nous aurions pu choisir une approche elative, ’est-à-dire par comparaison entre espèces, méthode utilisée par Gagic et al. (2016), approche qui semble pertinente du fait du continuum de spécialisation existant chez les Aphidiinae. Une autre approche est utilisée qui prend en compte la diversité taxonomique ou phylogénétique des hôtes d’u paasitoïde P“V Helus et al., , e paate fotioe oe ue estimation de la spécialisation taxonomique (Straub et al., 2011). Cependant ces deux approches ne ous auaiet pas peis d’aalse pa os thodes statistiues la patitio des espes galistes et spialistes. Das ote tude, d’aps la distiutio des spetes d’hôtes das l’agosste tudi, le seuil de espes eploites peettait de lasse % des espes oe généralistes (9 sur 29). Avec ce seuil de 4 espèces exploitées, sur les 174 espèces répertoriées pour définir la distribution du spectre d’hôtes des Aphidiinae (Besson, 2013), 70 espèces, soit 40%, seraient classées en tant que généralistes. Finalement, on obtient quasiment un même ratio d’espes galistes ave e seuil e se asat su les spetes thoiues ou su eu osevs à une échelle locale.

Cependant, les aalses olulaies ees su les i espes d’Aphidiiae les plus galistes ui eploitet des hôtes das les diffets haitats, ous vle pou uate d’ete elles l’eistee d’ue stutuatio gtiue des populations. Les structurations génétiques observées localement sont relativement importantes, avec, pour chaque espèce, deux ou trois groupes différents, ce qui est comparable aux structurations observées dans des populations étudiées à une échelle nationale,

157 voir continentale (Derocles et al., 2016). Il convient ensuite de vérifier si la structuration génétique observée correspond bien à une spécialisation parasitaire, ce qui conduirait à revoir le statut généraliste de ces espèces. Néanmoins, pour D. rapae et A. matricariae, parmi les entités formées, il ’ a pas d’uilie das le oe d’hôtes eploits. O oseve ue etit ui sele plus généraliste que les autres. Finalement, une seule espèce ne présente pas de structuration génétique des populations dans notre étude, A. ervi, ce qui tendrait à confirmer que cette espèce est bien généraliste. Toutefois, des études conduites en 2016 en marge de cette thèse, montrent que si l'on considère un contexte agronomique différent, offrant une gamme de pucerons également différente, la situation apparaît plus complexe (voir Encadré : spécialisation parasitaire chez Aphidius ervi).

L’tude appofodie ee su D. rapae, nous a permis de faire le lien entre la structuration génétique observée sur deux années entre les individus récoltés sur H. atriplicis et les autres et la spialisatio paasitaie. L’tude de peutatio d’hôtes ee ave u oe de souhes et su ue gae d’hôte etes esteits, a vl ue spialisatio ologiue ete des souches ayant B. brassicae et M. persicae comme hôtes d'origine et une souche provenant de H. atriplicis. Cette spialisatio ologiue, oie à l’eistee d’ue stutuatio gtiue et assoie à la ofiatio de l’asee de flu de ges ete les deu etits pa l’eistee d’u isoleet epoduteu, ofie les suspiios de l’eistee d’espes ptiues hez D. rapae (Derocles et al., 2016). À la vue de ces résultats, il serait souhaitable de discuter avec des taxonomiques de la pertinence de la révision de cette espèce.

158 Encadré : Spécialisation parasitaire chez Aphidius ervi

Aphidius ervi Le as d’ fait figue d’eeptio das l’eistee de stutuatio des populatios, ais des tavau ets es das l’uipe tedet à remettre en cause cette affirmation (Postic, 2016). Dans un contexte agronomique différent, la lutte biologique inondative contre les pucerons du faisie, des populatios d’Aphidius ervi exploitant ces ressources présentent apparaissent génétiquement différentes des populations analysées dans les

études précédentes. L’aalse pa aiu de vraisemblance basée sur trois gènes séquencés (COI, LWRh et 16S) montre cette structuration (Figure). Les idividus poveat d’hatilloages réalisés lors de précédentes études (Code Aerv et Ae) (Derocles et al, 2016 et les individus analysés dans le projet d’atile du hapite de ette thse, forment un groupe distinct. Les individus échantillonnés sur des pucerons du fraisier forment eux plusieurs groupes, en fotio de l’espe de puceron hôte : le premier regroupe les individus provenant de Rhodobium porosum (E12 et E13 ; E1, E2, E3 et E4) et le deuxième regroupe les individus issus de Macrosiphum euphorbiae et d’Acyrthosiphon malvae. De plus, los de ette tude, des idividus de l’espe de parasitoïdes Aphidius microlophii ont été ajoutés à l’aalse. Pou appel, ces deux espèces du genre Aphidius sont très semblables morphologiquement mais aussi génétiquement (Toaović et al., 2003 ; Traugott et al., 2008). On remarque que les populations qui exploitent les pucerons des fraisiers sont génétiquement plus proches des A. microlophii que des autres A. ervi. Le statut taxonomique de ces deux espèces pourrait être à revoir. commercialisés Individus

Figure : Arbre d'Aphidius ervi (E, Ae . et Aerv) et Aphidius microlophii (Amicro) calculé par maximum de vraisemblance avec les séquences

de trois fragments de gènes (16S, COI, LWRh). Les valeurs de bootstrap sont indiquées pour chaque branche

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III. Comment se répartissent les espèces généralistes et spécialistes dans les agroécosystèmes et comment agissent les facteurs de spécialisation sur le caractère généraliste et spécialiste des Aphidiinae ?

Nous avons montré que la spécialisation parasitaire était bien présente chez les Aphidiinae, avec de nombreuses espèces monophages et des espèces qui présentent de la spécialisation intraspécifique, qui pourrait s'inscrire dans un processus évolutif inéluctable de spécialisation des espèces (Futuyma, 2001). Cepedat, etaies etits sot apales d’eploite plusieus hôtes, On peut donc se demander quels sont les facteurs ou éléments responsables du maintien du caractère généraliste. Si on essaye de déterminer ces facteurs chez les Aphidiinae, les plus pertinents à étudier nous ont paru être le tpe d’haitat, l’hôte et la plante, de par leurs caractéristiques biologiques et écologiques. Nous avons vu en introduction que la spécialisation porte principalement sur les caractéristiques des ressources trophiques disponibles (Thompson, 1994 ; Begon et al., 2006) et sur la nature des interactions qui existent au sein de la communauté biologique (Hardy et Otto, 2014). Ces deu paates seot foteet iflues pa le tpe d’haitats. D’ue aie gale, la spialisatio ifluee la patitio des espes das l’evioeet et joue u ôle ipotat dans la structuration des populations des espèces généralistes (Devictor et al., 2010). Nous avions peu de connaissance sur les caractéristiques de ces facteurs pouvant agir sur la spécialisation et la répartition des espèces Aphidiinae à une échelle locale. Il semble que la spécialisation parasitaire résulte d’ue quation multifactorielle (Fig. 20). Les résultats que nous avons obtenus tendent à montrer que les habitats de par leur diversité botanique et leurs caractéristiques intrinsèques stailit das le teps vot sletioe les espes de pueos u’ils peuvent accueillir, ce qui constitue un premier filtre pour la diversité des parasitoïdes présents dans ces différents habitats. Les interactions plante–puceron et les hôtes en eux-mêmes constituent un deuxième filtre pour les espèces de parasitoïdes, puisu’u hôte patiulie e poua te eploit ue pa etaies espes de parasitoïdes. La composition des communautés de parasitoïdes dans les différents habitats dépend bien des hôtes présents, eux-mêmes dépendants de la diversité des espèces de plantes, qui sera plus ou moins importante e fotio de l’haitat Fig. ). De plus, la capacité à exploiter un hôte par un paasitoïde ’est pas déterminée uniquement par la psee de l’hôte das l’evioeet mais aussi par son abondance et par la difficulté pour le parasitoïde à franchir les différentes étapes pré- et post-ovipositionnelles (Vinson, 1976).

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Répartition de la communauté de parasitoïdes dans l’environnement et spécialisation parasitaire chez les Aphidiinae Variabilité / spécialisation intraspécifique D)

Hôtes

Plantes A)

Milieu cultivé Milieu non cultivé

Agroécosystème

Figure 20 : “ha de l’ifluee des diffets fateus tudis su la patitio de la omunauté de paasitoïdes das l’evioeet. A Les haitats ui oposet les agoosstes se distinguent en deux catégories, les milieux cultivés et non cultivés qui sont souvent adjacents B) les aatistiues de l’haitat vot ifluee la psente des plantes en termes de diversité et d’aodae. C Cette divesit et l’aodae des plates va dfii la opositio des espes de pueos ais aussi leus aodaes das les diffets haitats. D la divesit et l’aodae des hôtes va avoir un impact sur la répartition des espèces généralistes et spécialistes et sur la specialisation intra et interspécifique observé dans les différents milieux.

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III.1. Répartition et distribution des espèces généralistes et spécialistes dans les différents habitats des agrosystèmes au cours du temps.

D’ue aie gale, le type de milieux, cultivé ou non cultivé, de par les différences dans la supefiie u'ils oupet et la divesit de plates et de pueos u’ils heget, ifluee la répartition des espèces généralistes et spécialistes dans un agroécosystème (Tscharntke et Kruess, 1999 ; Tscharntke et al., . L’haitat détermine les espèces de plantes et de pucerons présentes, et plus globalement la répartition des ressources pour les phytophages et leurs ennemis naturels (Dixon, 2000). Nous avons clairement montré que les habitats semi-naturels présentent une diversité de failles de plate et ue divesit fauistiue, e oe d’espes de pueos et de parasitoïdes, bien plus élevée que dans le milieu cultivé, ce qui est conforme à l'idée générale que la richesse spécifique dans ces milieux est plus élevée (Kruess, 2003 ; Stireman et Singer, 2003). Cette richesse spécifique en termes de plantes et de pucerons peut être à l'origine du nombre plus ipotat d’espes d’Aphidiiae spialistes das les haitats sei-naturels. Nous avons montré dans le Chapitre 1 que la rareté des pucerons et la stabilité des zones non cultivées semblent être les facteurs responsables de la spécialisation des espes à l’helle loale. Les spécialistes auraient un avantage à exploiter ces espèces rares car elles sont potentiellement difficilement détectables par les généralistes, moins bien adaptés à la localisation de chacune d'entre elles (Stilmant et al., 2008 ; Devictor et al., 2010), ce qui conduit à diminuer la compétition interspécifique. E e ui oee la patitio des espes galistes, le tpe d’haitats e sele pas avoi d’ifluee, puisue l’o etouve autat d’espes galistes das les deu tpes d’haitats. Cependant, certaines espèces généralistes semblent inféodées à un seul milieu, comme A. avenae (milieu cultivé) ou Binodoxys angelicae (habitats semi-naturels). La répartition des espèces généralistes semble dépendre de la forte abondance des espèces de pucerons, en termes de nombre de colonies das l’evioeet. Le caractère généraliste des espèces d’Aphidiiae semble être favorisé par l'homogénéité des plantes (faible richesse en espèces), ce qui concorde bien avec les caractéristiques du milieu cultivé, des peuplements monospécifiques, mais sur une période de temps limité. En plus de cette présence plus importante des espèces spécialistes dans les habitats semi-naturels, nous avons observé un temps de présence très court de ces espes das l’evioeet, ie ue ous aos touv des spialistes su l’esele de la saiso ultuale. Cetais spialistes oe A. microlophii, su otie, sot plus poes puisu’o les etouve uiueet e sotie d’hive. La majorité est observée durant la période où les ressources en hôtes sont les plus abondantes et divesifies, ’est-à-die la piode pdat l’effodeet des populatios de pueos e t. Mais il y a aussi des spécialistes tardifs, comme Ephedrus nacheri sur chénopode, présent dans

162

l’evioeet uiueet e autoe. Cette patitio au ous du teps des spialistes pourrait réduire la concurrence interspécifique et faciliter la coexistence entre les espèces de parasitoïdes (Lei & Hanski, 1998 ; Von Zeipel et al., 2006 ; Elzinga et al., 2007 ; Klapwijk & Lewis, 2011), par le partitionnement de la ressource (séparation des niches écologiques) (Ferry-Graham et al., ; Futua & Moeo, ; Chesso, . À l’ivese, les espes galistes sot présetes plus logteps, et das les deu tpes d’haitats. De plus, nous avons montré que les échanges entre les deux compartiments des agrosystèmes sont très limités aussi bien en termes de pucerons que de parasitoïdes, et ce tout au long de la période étudiée. Cela confirme donc les premiers résultats de Derocles et al. (2014) qui ont observé une telle compartimentation sur une période de temps de quelques semaines au printemps. Cette forte compartimentation des ressources et des parasitoïdes pourraient constituer un premier facteur de spécialisation.

III.2. Les facteurs de spécialisation écologique chez les Aphidiinae

Nous avons vu das l’itodutio gale ue la spialisatio ologiue doule d’u partitionnement de la ressource conditionné par deux principaux facteurs, les ressources présentes dans notre cas la diversité des hôtes, et les interactions inter- et intraspécifiques (Gause, 1934 ; Hutchinson, 1957). Les ressources alimentaires sont un facteur important de spécialisation (Futuyma et Moreno, 1988 ; Thompson, 1994 ; Begon et al., 2006). La spécialisation des phytophages, considérés comme le goupe d’ogaises le plus ihe e espèces (Bernays, 2003), a été très étudiée. Cette forte diversité résulte de phénomènes de spéciation écologique (Futuyma, 2008 ; Matsubayashi et al., 2010). Celle- ci a entraîné une forte spécificité des phytophages à une plante ou à une famille botanique de plantes en particulier. On estime que moins de 10 % des insectes ravageurs se nourrissent sur des plantes appartenant au plus à trois familles différentes (Schoonhoven et al., 2005). Les pucerons ’happet pas à ette gle. Le fot deg de spialisatio hez les pueos pouait te à l’oigie de la spialisatio paasitaie hez les Aphidiiae, pa u pocessus appelé spécialisation en cascade ou radiation séquentielle (Stireman et al., 2006 ; Forbes et al., 2009 ; Feder et al., 2010). De plus, les parasitoïdes spécialistes sont le plus souvent associés à des hôtes eux-mêmes spécialistes (Stireman et Singer, 2003), ce qui peut expliquer la grande proportion d'interactions entre une espe de paasitoïde et ue espe de pueos, oseve à l’helle loale. Des situations de spéciation sympatrique séquentielle ont déjà été montrées chez plusieurs hyménoptères parasitoïdes, comme Diachasma alloeum (Ichneumonoidea: Braconidae) qui a subi une radiation suite à la foatio de aes d’hôtes hez so hôte Rhagoletis pomonella (Feder et al, 2010). Chez les

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Aphidiinae, Desneux et al, (2012) met en relation la diversité des espèces du genre Binodoxys à la phylogénie des hôtes. Le rôle majeur joué par les caractéristiques écologiques des hôtes à une échelle locale dans la spécialisation parasitaire a été démontré dans cette thèse notamment au niveau intraspécifique. Les patterns de structuration observés chez D. rapae et A. matricariae semblent directement conditionnés par les caractéristiques écologiques des hôtes. Pour D. rapae, dans la structuration observée entre les populations exploitant H. atriplicis et les autres populations exploitant majoritairement B. brassicae, les caractéristiques écologiques des deux hôtes sont très différentes et semble influencer la spécialisation parasitaire. Les paramètres écologiques qui différent entre ces deu hôtes sot l’aodae et la patitio das l’evioeet aisi ue des aatistiues comportementales. Brevicoryne Brassicae présente de nombreuses colonies avec des effectifs très importants, alors que Hayhurstia atriplicis présente des petites colonies éparses avec un comportement spécifique (induction de pseudo-galles) et une période de présence dans l’evioeet ts esteite. Pa ote, La stutuatio gtiue des populatios oseve chez A matricariae est plus supeate, a o oseve l’ivese, les deu entités les plus spécialisées, le sont sur deux pucerons présentant des colonies plutôt importantes et agrégées, B. brassicae et Aphis sp. L’espe de pueos ’est pas la seule oposate de la essoue pouvat etaie ue spécialisation au niveau inter- et intraspécifique. Les plantes et leurs interactions avec les pucerons constituent également un facteur de specialisation parasitaire. Les plantes étant à la base des réseaux trophiques, elles influencent de par leurs caractéristiques morphologiques, physiologiques, physiques ou chimiques, les effectifs et la répartition des populations de phytophages (Le Guigo, 2012a et b). Cette gulatio est le sultat d’u effet appel « Bottom up » (régulation par le bas, rétroactions des ressources sur leurs consommateurs). Celui-ci conduit à réguler les populations de phytophages en réduisant leurs performances (Hairston et al, 1960). Toutefois, les défenses des plantes peuvent également attirer les ennemis naturels en émettant des composés volatiles lorsque celles-ci sont attaquées par des phytophages (Pope et al., 2008). Ces composés constituent un élément de spécialisation permettant une détection plus rapide des hôtes. Das ette thse, ous avos ot ue l’ifluee des iteatios plate-puceron pourrait être à l'origine de structuration intraspécifique observée chez L. fabarum. Selon la famille botanique des plantes sur lesquelles se développent les pucerons du genre Aphis, ils seront parasités pa l’ue des deu etits oseves. La diffeiatio se fait entre la famille des Fabaceae et les autres. Afin de définir plus précisément le rôle des plantes dans la structuration des populations et leur influence sur la spécialisation écologique d'A. fabarum, une identification de toutes les plantes hôtes à l’espe, aisi ue de tous les pueos du gee Aphis, aurait été nécessaire. Barahoei et al.

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ot ot e Ia l’eistee de i iotpes hez L. fabarum associés aux hôtes, trois biotypes sur trois espèces du genre Aphis (A. craccivora, A. fabae, A. gossypii) et deux autres sur des hôtes différents. Il semble que les espèces du genre Aphis ont un rôle important dans la structuration des populations de cette espèce quel que soit la zone géographique considérée. Les interactions interspécifiques. Ave les plates et les hôtes, o s’itesse à l’effet « Bottom up » qui correspond à la rétroaction des ressources sur leurs consommateurs. À l’ivese, l’effet « Top Down » suppose une régulation des ressources par leurs consommateurs (Hairston et al., 1960). Les paasitoïdes Aphidiiae ot essetielleet u tpe d’eei atuel : les hyperparasitoïdes (ou parasitoïdes secondaires). Ce sont des organismes qui attaquent des parasitoïdes primaires au sein des pucerons Figure 21 hôtes encore vivants ou déjà momifiés et qui vont se nourrir au cours de leur développement de la larve du parasitoïde primaire (Sullivan, 1987) (Fig. 21). Par contrainte technique, e iveau ’a pas t tudi duat ette thse. Nous ’avos en effet aucun outil actuellement permettant de relier l'espe d’hpepaasitoïde à l'espe de paasitoïde piaie. Le seul lie ue l’o peut dteie est elui ete les pueos idetifiatio de la oie et les hpepaasitoïdes. Le dveloppeet d’outils olulaies peettat de eostituer la haîe tophiue seait ue avae osidale pou dfii l’ipat des hpepaasitoïdes su la spécialisation parasitaire des Aphidiinae. En effet, les ennemis naturels peuvent exercer par pression de parasitisme, une sélection sur les populations de parasitoïdes (Rosenheim et al., 1995 ; Rosenheim et al., 1999). Ces organismes relativement abondants ont un impact non négligeable sur la dynamique des populations de parasitoïdes et sur la structure des communautés (Rand et al., 2012 ; Traugott et al., 2008). Au même titre que les parasitoïdes primaires peuvent induire des interactions indirectes entre les pucerons, les hyperparasitoïdes peuvent en générer entre les parasitoïdes primaires (Morris et al., 2001). La spécialisation parasitaire que nous avons observée hez les Aphidiiae pouait ts ie peette d’happe au hpepaasitoïdes, goupe ui semble présenter un degré de spécialisation moins important que celui observé chez les Aphidiinae, d’aps ue tude de Mülle et al. . L’auisitio d’ue ouvelle essoue ou u hageet de ressource par un Aphidiinae le rendra plus difficilement détectable par les hyperparasitoïdes du fait du caractère moins spécialisé de ces organismes. De plus, hormis les interactions trophiques, un aute tpe d’iteatio est ipotat à pede e compte, la compétition pour la ressource. Les parasitoïdes Aphidiinae ne sont pas les seuls organismes qui parasitent ou consomment les pucerons. Leurs principaux compétiteurs sont soit des prédateurs généralistes comme les carabes, ou aphidiphages comme les coccinelles, les chrysopes,

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ou d’autes paasitoïdes oe eu appateat à la faille des Apheliidae et au gee Aphelinus dot ue tetaie d’espes est dite e Fae Mihel, . Les tudes de la compétition avec les autres parasitoïdes Aphidiinae ou Aphelinidae ont montré que pour certaines espèces d’Aphidiiae, les feelles sot apales de disiie u hôte sai d’u hôte djà paasit soit pa un congénère de son espèce (superparasitise ou pa u idividu d’ue aute espe (multiparasitisme) (Van Alphen et Visser, 1990). Ce comportement discriminatoire des hôtes déjà parasités semble être adaptatif, en raison de la concurrence pour les hôtes communs entre les espèces de parasitoïdes (Van Baaren et al., 1994). La compétition entre ces espèces pour la ressource peut les pousser à être de plus en plus performants donc spécialisés dans la détection précoce des hôtes das l’evioeet, puisu’il est foteet poale ue la peie espèce qui aura pondu sera celle qui exploitera la ressource avec succès.

III.3. Le maintien du caractère généraliste chez les Aphidiinae

La uestio du aitie du aate galiste hez les Aphidiiae est piodiale das l’optiue de la mise en plae d’ue lutte iologiue pa osevatio. Ue des thodes evisages pou améliorer son efficacité consiste à instaurer des situations de compétitions apparentes. Ces iteatios idietes sot oditioes pa l’eploitatio de ultiple hôtes pa un parasitoïde das les deu tpes d’haitats des agoosstes Le aitie du aate galiste hez les Aphidiinae semble lié aux habitats cultivés. Théoriquement, les stratégies généralistes sont avantageuses en cas de faible disponibilité des ressources et de l'instabilité de l'environnement (MacArthur et Pianka, 1966 ; Futuyma et Moreno, 1988). L'avantage adaptatif conféré par la possibilité d'utiliser une grande diversité de ressources est particulièrement important dans les environnements perturbés tels que les agroécosystèmes dans lesquels la disponibilité des ressources varie considérablement dans l'espace et le temps (Rodriguez et Hawkins, 2000 ; Gurr et al., 2003 ; Kruess, 2003 ; Toaović et al., 2009. Das l’agoosste tudi, la daiue d’eploitatio tepoelle des hôtes pa les espes galistes ote ue eploitatio uasi otiue d’avil à novembre du ravageur dans les habitats cultivés et non cultivés. Les autres ressources exploitées le sont de façon sporadique et rare. Elles ont lieu essentiellement durant la période précédant l’effodeet estival des populatios de pueos Kale et al., ui oode galeet ave la chute des populations de ravageurs des cultures. Cette particularité peut être interprétée comme du mutualisme apparent (Holt, 1977 ; Holt & Kolter, 1987 ; Holt & Lawton, 1994), le ravageur présent e gade uatit peet au autes espes d’te ois paasites pa les paasitoïdes généralistes mais cela peut fonctionner uniquement sur la période où la culture est présente. Pour les périodes où le ravageur est plus rare, notamment en automne, malgré la présence de ressources

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dans le milieu non cultivé celles-ci sont pas ou très peu eploites. La uestio ue l’o peut se pose est de savoir dans quelle mesure ces événements rares observés avant l'effondrement des populations au mois d'août traduisent participent au maintien du caractère généraliste ? Ces événements rares ont lieu au moment où les populations présentes dans le milieu cultivé disparaissent brutalement avec la maturité puis la récolte de la plante. Le caractère généraliste des espes d’Aphidiiae peut alos te vu oe ue pose à ette dispaitio utale d’ue ressource auparavant très abondante. Ue aute piode de l’ae pouait ifluee le aitie du aate galiste hez les Aphidiiae, et galeet l’effiait du otôle iologiue, l’hive. La piode hiveale se caractérise par une baisse importante des ressources en hôtes pour les parasitoïdes, voir une disparition totale pour les pucerons à reproduction sexuée. Le caractère généraliste constitue un avantage sélectif pendant l'hiver lorsque les hôtes sont rares. Cette période peut être considérée comme un facteur entravant la spécialisation sur un hôte et permettant ainsi la persistance d'un phénotype généraliste (Andrade et al., 2013). Ceci est valable lorsque les parasitoïdes sont actifs en hiver. Une telle stratégie hivernale est connue pou les paasitoïdes Aphidiiae das l’Ouest de la Fae où l’hive est dou Adade et al., . Malg u effot d’hatilloage ipotat los de l’hive , ous ’avos pas dtet la psee des paasitoïdes Aphidiiae das les agrosystèmes étudiés. Pour autant, Andrade et al., (2013) ont récolté de nombreuses momies diapausates d’Aphidius rhopalosiphi sur les pucerons des céréales en Bretagne. Afin de pouvoir définir la stratégie hivernale des espèces généralistes, une recherche plus ciblée sur les ou les cultures ou les plantes des habitats semi-atuels suseptiles d’hege des hôtes potetielleet exploités par ces espèces durant cette période devra être conduite.

IV. Conséquences agronomiques de la spécialisation parasitaire des Aphidiinae

À l’helle loale, ous avos is e videe ue fote spialisatio paasitaie hez les Aphidiiae, l’eistee de stutuatio gtiue des populatios pou les uelues espes les plus généralistes, une compartimentation importante des ressources entre les habitats composant l'agroécosystème étudié et une exploitation très limitée des ressources dans les habitats semi- atuels pa les paasitoïdes des avageus des ultues. L’esele de es osevatios ous laisset pese ue l’eistee de compétition apparente avec les ressources des habitats semi- naturels est très improbable. Le rôle de réservoir des ressources du milieu non cultivés pour les espes d’Aphidiiae galistes sele uasi ieistat. Bie u’ue espe oe A. ervi

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exploite des espèces dans le milieu cultivé, telle que A. pisum (ravageur) et des espèces comme Hyperomyzus picricis ou Cavariella aegopodii dans les habitats semi-atuels, l’istauatio de compétition apparente ne semble pas envisageable. Ces événements de parasitisme dans les habitats semi-atuels pa les espes galistes eploitat u avageu sot d’ue aie gale aes et potuels, ais sutout ils ’ot pas lieu juste avat ou pedat la piode hivernale, cruciale pour un maintien de l'auxiliaire dans l'environnement immédiat des cultures. La seule possibilité serait que les pucerons parasités lors de ces rares évènements entrent en diapause directement dès le mois de juin, ce qui paraît peu probable. Une des explications possibles de ces événements rares à cette période est la recherche de ressources alimentaires pour les parasitoïdes adultes. La récolte de la plante cultivée entraîne une disparition des ressources alimentaires (nectar, polle, iellat… pou les paasitoïdes adultes, e qui pourrait les conduire vers les habitats semi- naturels en quête de nourriture. La ressource en nectar semble être une donnée importante à pede e opte das l’effiait du paasitise Jaot et al., ; Varennes et al., 2015). Tout en cherchant de la ouitue, la dtetio d’hôtes potetiels ui ’auait pas eu lieu das le ilieu cultivé entrainerait ces évènements de parasitismes. Les parasitoïdes généralistes ayant un intérêt agronomique exploitent finalement très rarement les hôtes dans les milieux non cultivés. Le rôle de réservoir pour les parasitoïdes généralistes serait essentiellement assurer par le ravageur lui-e, ui doit lui aussi s’adapte à l’istailit du ilieu cultivé et aux conditions hivernales. Les espèces de parasitoïdes galistes suivet das l’espae et das le teps les hageets de opatiet du avageu u’elles eploitet. Nous l'avos montré chez D. rapae qui dans notre étude a suivi les déplacements de son hôte principal, le puceron cendré du chou B brassicae, qui est passé successivement des parcelles cultivées (avril à juin) aux opatiets o ultivs juillet à août et de ouveau das les paelles à l’autoe. Les observations de parasitisme en automne se sont faites sur des cultures intermédiaires de Sinapsis alba aussi appelées CIPAN (culture intermédiaire piège à nitrates). Dans ce cas, les milieux non cultivés ne doivent plus être envisagés uniquement comme réservoir de ressources mais bien comme ue zoe d’hiveatio Gu et al., ; Geiger et al., 2005) à optimiser en favorisant les parents sauvages des plantes cultivés. Fialeet ote helle d’tude est peut-être trop restreinte pour identifier les véritables réservoirs de parasitoïdes. La colonisation de parcelles cultivées au printemps n'est peut-être pas uniquement le fait des populations locales. On sait notamment par les captures du piège à succion, qui cible principalement les pucerons, mais permet de récupérer tout ce qui se trouve dans l'atmosphère à une hauteur de 12 mètres, que la capacité de vol des parasitoïdes est importante. On peut émettre l’hpothse de vols de igatio à logue distae p- et post- hives. Afi d’tudie ette hypothèse, une l’aalse des taits d’histoie de vie des diffetes espes doit te ee en

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s’itessat au atio taille / logueu des ailes, la lageu de pootu po des usles alaies ou eoe le atio logueu / lageu des ailes. L’esele de es taits pouaiet taduie de la apait de vol des espes d’Aphidiiae. La apacité de vol et de dispersion des parasitoïdes par le vol diet ou pa le taspot d’œufs psets das les pueos ails pouait joue u ôle important dans la structure des communautés (Mouquet et al., 2003 ; Derocles et al., 2014 b), mais surtout dans la recolonisation des parcelles cultivées et le calage de la dynamique des populations des pucerons et de leurs parasitoïdes.

En conclusion, le travail réalisé au cours de cette thèse démontre que, pour appréhender précisément la capacité des Aphidiinae à réguler efficacement les populations de pucerons ravageurs à l’helle loale, et vetuelleet te apale de la efoe, ue oaissae appofodie de la systématique des espèces, de la structuration génétique des populations des espèces généralistes et de la diversité des espèces de plantes, de pucerons et de parasitoïdes présentes dans les différents habitats de l'agroécosystème est nécessaire.

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Annexe

188 J Pest Sci DOI 10.1007/s10340-015-0687-6

REVIEW

Aphid parasitoid generalism: development, assessment, and implications for biocontrol

Lucie Raymond2 • Manuel Plantegenest3 • Vesna Gagic4 • Yoann Navasse3 • Blas Lavandero1

Received: 3 March 2015 / Revised: 3 August 2015 / Accepted: 7 August 2015 Ó Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2015

Abstract Host specialization in aphid parasitoids is parasitoids, focusing on the differences between generalist important both from a theoretical and an applied point of and specialist species. Second, this work describes the view. It arises from various ecological mechanisms difficulty to determine the host range of generalist para- involving their interactions with aphids, host plants, and sitoid species. Our review points out some observational endosymbiotic bacteria, as well as with potential com- artifacts, as is the existence of cryptic species or spa- petitors and enemies. From an applied point of view, host tiotemporal variability in host acceptance, which may lead specialization in aphid parasitoids has a great importance to misinterpretations about host specialization and result in as it determines the biological control they provide through pest management failures. Regarding biological control their capacity to switch between different hosts, to persist services, moderately generalized species that could use in the agrosystem in the absence of the pest, and to regulate various host species to sustain their populations may ensure pest outbreaks in a rapidly changing system. It also con- the long-term control, whereas specialist species would ditions the risk of undesirable effects on non-target species provide higher parasitism rates. At the community level, in the case of introduction or augmentation of populations the co-occurrence of specialist and generalist parasitoids of parasitoids. Biocontrol literature that looks at the ben- may maximize biological control services both in terms of efits of generalist and specialists natural enemies is mainly efficiency and in terms of stability in space and time. focused on differences between different guilds of natural enemies and does not consider the differences in host Keywords Aphid parasitoids Á Biological control Á Host specialization within a single guild. This review synthe- specialization Á Polyphagy sizes the mechanisms related to host-use by aphid

Key message Communicated by N. Desneux. • Biocontrol literature is mainly focused on differences & Lucie Raymond between different guilds of natural enemies and does [email protected] not consider the differences in host specialization & Blas Lavandero within a single guild. [email protected] • This review synthesizes the mechanisms related to 1 Instituto de Ciencias Biolo´gicas, Universidad de Talca, Talca, host-use by aphid parasitoids, focusing on differences Chile between generalists and specialists. 2 Millennium Nucleus Centre in Molecular Ecology and • Moderately generalized species could use various host Evolutionary Applications in Agroecosystems (CEM), Talca, species and may ensure the long-term control, but Chile specialist species would provide higher parasitism rates. 3 Agrocampus Ouest, UMR 1349 IGEPP, 35042 Rennes, • Co-occurrence of specialist and generalist parasitoids France may maximize efﬁciency and stability of biological 4 CSIRO, GPO Box 2583, Brisbane, QLD 4001, Australia control.

123 J Pest Sci

Introduction biological control by inoculation or conservation, the issue of food specialization in aphid parasitoids has a great The study of specialization has been extensively addressed importance. In general, parasitoids are frequently used in by evolutionary biologists as it shapes evolutionary pro- biological control because of the commonly held belief that cesses and global biodiversity patterns. However, as it they are rather host-specific, when compared to the typical conditions the ecological interactions between species, it is predators used in biological control (Godfray 1994). For also a key concept to study the ecosystem from a functional biological control, not only does this mean that released point of view, and to understand the factors that determine parasitoids will be most efficient at attacking a target pest the provision of ecosystem services. species, but it also reduces the possibility of environmental Specialization can be related to various resources or harm through spill-over of rapidly growing parasitoid environmental conditions. Hutchinson (1957) defined the populations from crops into adjacent natural habitats, as it ecological niche as an n-dimensional hypervolume, with is observed for generalist predators (Rand et al. 2006). axes corresponding to n environmental and/or resource However, aphid parasitoids are seldom specific to the point variables. Along each of these, populations display a wide of attacking only one host species, and there are many or narrow tolerance or pattern of utilization, corresponding species that have a large range of hosts (e.g., Mackauer and to varying degrees of specialization. There are thus various Stary´ 1967; Rakhshani et al. 2012; Barahoei et al. 2013, types of specialization depending on which particular axis 2014). As an example, Aphidius ervi (Haliday) has been of the ecological niche is considered (e.g., temperature, collected in 20 different aphid species, many of which have host range). Considering an ecosystem service such as different phylogenic origins. Another good example is biological control, the degree of specialization regarding Binodoxys communis (Gahan) that attacks several closely food resource also called ‘‘polyphagy’’ is particularly related aphid species in China; however, studies in labo- important as it affects the consumption of pests by their ratory have shown that it can use species with which they potential natural enemies. The host/prey range and the have no co-evolutionary history (see Desneux et al. 2009, capacity of natural enemies to switch between different 2012 for more detail). Moreover, parasitoid host range may preys or hosts, may be related to their host-use efficiency not be consistent across an entire species, as different races (Straub et al. 2011), thereby affecting their biocontrol can be specific to different host species (Antolin et al. potential. To be able to classify a species as a specialist, an 2006; Stireman et al. 2006; Abrahamson and Blair 2008; intermediate generalist/specialist or a generalist, one must Henry et al. 2008). Furthermore, within the parasitoid’s take into account many different aspects of their biology, host range, not all hosts are equally preferred and/or ecology, and phylogeny. To Poulin and Mouillot (2003), profitable to the development of parasitoids, what can host range is a function of the number of hosts that it can induce variations in host-use patterns (Storeck et al. 2000; use and the relatedness of these hosts. Expanding on this Ode 2006; Desneux et al. 2009; Zepeda-Paulo et al. 2013). issue Helmus et al. (2007) proposed the use of phylogenetic Therefore, the difference between potential and realized species variability (PSV), which has been shown to be a hosts may be substantial. more meaningful metric for specialization of aphid para- How effective a non-specialist aphid parasitoid is in sitoids (Desneux et al. 2012). However, the information is biocontrol depends on its genotype, its potential ‘‘gener- never complete and one has to assume that most of the alism’’ (i.e., its ability to oviposit and develop on different studied ranges have been performed with lineages of par- hosts) and on the balance between its preferences for the asitoids and hosts reared in laboratory versus the sum of target pest versus alternative hosts (possibly including non- ‘‘ecotypes’’ that exist in the natural conditions which fur- pest species). It is not clear how genetic compared to ther complicate the matter. contribute to biocontrol effectiveness; however, there is Parasitoid wasps (Hymenoptera: mainly Aphidiinae) are evidence of interactions between particular genotypes and known to play an important role in the biological control of the outcome on the interaction of aphid bacterial aphids. They have been used as introduced biocontrol endosymbionts (Vorburger 2013). Potentially, this inter- agents in classical biological control programs (Re- action could limit host-use, and therefore the parasitoid’s maudiere and Stary´ 1994; Fabre and Rabasse 1987; host breadth. The preference of different genotypes from Blommers 1994; Brewer et al. 2005) as well as released for several populations of the specialist parasitoid Aphelinus augmentation biological control in greenhouses (Fernań- mali (Haldeman) for different genotypes of its host Erio- dez and Nentwig 1997; Takada 1998). Aphid parasitoids soma lanigerum (Hausmann) was found to be stronger in are also considered for conservation biological control as sites under warming conditions in Chile (Lavandero and their action can be enhanced through habitat management Tylianakis 2013). The narrowing of host-genotype-niche (Frere et al. 2007; Langer and Hance, 2004). Whether for breadth by the parasitoids could reduce resilience of the

123 J Pest Sci network to changes in host genetic structure or invasion by in host-use in aphid parasitoids, focusing on the differ- novel host genotypes and inhibit biological control under a ences between generalist and specialist species, their climate change scenario. Moreover, if a certain genotype or characteristics and the conditions for their maintenance in race of a parasitoid is too specialized and cannot use the ecosystem and (ii) to discuss the potential contribution alternative hosts when the target pest is unavailable, it may of specialist and generalist parasitoids to biological con- be slow to colonize the crop when the pest appears (Holt trol of aphids. and Lawton 1994). In the case of non-specialist parasitoids, the presence of alternative hosts may increase the parasitism risk on the pest through the mechanism of ‘‘apparent Why might parasitoids specialize? competition’’ (Holt 1977). However, the presence of alternative hosts may also decrease the predation risk on Various ecological hypotheses account for specialization in the pest, if the alternative host is preferred or highly aphid parasitoids. They are mainly related to the presence resistant to the parasitoid (Kaser and Heimpel 2015). of competitors and enemies in the environment, and to the Landscape management measures for the improvement of aphid traits and the tight relationship between parasitoids conservation biological control generally assume that a and their hosts. greater amount of semi-natural habitat in the landscape enhances pest control by parasitoids by providing them Competition and niche partitioning alternative preys or hosts (Landis et al. 2000) and consequently increasing their abundance such as the apparent Competition plays an important role in the specialization competition potential. However, cultivated and unculti- processes. Gause’s principle of competitive exclusion vated landscape compartments do not necessarily share the imposes a limit to the similarity in resource exploitation for same species or populations, both in terms of aphids sympatric species. Following this principle, the competi- (Vialatte et al. 2005) and parasitoids (Derocles et al. 2014), tion between parasitoid species for the potential hosts and a larger parasitoid population in the semi-natural should lead to niche differentiation (Price 1980; Futuyma habitat does not necessarily support a more efficient bio- and Moreno 1988). The resources may be partitioned logical control in the adjacent crops. It seems then according to different modalities: parasitoids may spe- important to assess the level of generalism of parasitoids cialize on a particular host range, but resource partitioning that attack pest aphids and evaluate the host range, as well in space or in time can also occur. In fragmented land- as the potential of apparent competition mediated by these scapes, spatial segregation between parasitoids species that species. This may contribute to the determination of their use the same host species (i.e., potential competitors) is efficiency as biological control agents and to design rele- commonly observed (Lei and Hanski 1998; Elzinga et al. vant management measures aimed at improving their 2007; Klapwijk and Lewis 2011). Local adaptation pro- action. cesses in spatially segregated populations may ultimately Biocontrol literature that looks at the benefits of gen- lead to a smaller host range and a higher degree of spe- eralist and specialist natural enemies is mainly focused on cialization on particular hosts. differences between different natural enemy guilds (e.g., Apart from the presence of competitors and mechanisms carabids vs. parasitoids) and poorly considers the differ- related to niche partitioning, the host itself plays an ences in host specialization within a single guild. Within important role in the specialization processes. Host phy- the aphid parasitoids, there is an abundant literature on logeny imposes high constraints in parasitoid host ranges specialization processes (e.g., Poulin and Mouillot 2003; and network structure (Cagnolo et al. 2011; Desneux et al. Helmus et al. 2007; Desneux et al. 2012), but the infor- 2012). The physiological-efficiency hypothesis (Dethier mation regarding the conditions for generalism and the 1954) states that species have evolved host specificity in characteristics of the generalist species are scarce (e.g., adapting physiologically to the food quality of their hosts. Storeck et al. 2000; Blande et al. 2004). Descriptive Parasitoids are able to manipulate the host’s physiology studies regarding the parasitism of aphid species on dif- and biochemistry (Quicke 1997). In aphid parasitoids, ferent plant hosts in different regions are not enough, as some adaptations to efficiently exploit the host’s resources there are no complete populational and community level and metabolism products have been described. For information to understand these descriptions further. The instance, A. ervi is able to alter Acyrthosiphon pisum sole presence, with all the sampling biases included, does (Harris) reproduction and to reorient the aphid’s metabolic not assure trustworthy information on the true host range investment in reproduction toward its own nutrition (Dig- of a parasitoid, as we will argue further. The objective of ilio et al. 2000; Falabella et al. 2007; Le Ralec et al. 2011). this review is thus (i) to synthesize the behavioral, eco- Developing in a living host such as koinobiont aphid par- logical, and evolutionary mechanisms related to variation asitoids do (as opposed to idiobiont parasitoids), also

123 J Pest Sci imposes constrains of the immune defenses of the host changes in aphid immune system, or in the aphid behavior (Govind 2008). In various groups of parasitoids, mecha- (Łukasik et al. 2013). Vorburger (2013) argues that nisms to counter the host’s immune system have been endosymbionts influence co-evolutionary dynamics by described including the injection of virus-like particles by (i) increasing the heritable variation for resistance to par- parasitoid species of Braconidae (e.g., Biosteres longi- asitoids in host populations, (ii) increasing the genetic caudatus, Cotesia congregata) (Strand and Pech 1995; specificity of host–parasitoid interactions, and (iii) induc- Labrosse et al. 2003), the formation of tissues that avoid ing costs of resistance in aphid populations. However, to rigid encapsulation by the hemocytes or the development date, there are few aphid model systems (mainly A. pisum of structures avoiding asphyxiation in the Tachinid fly, and Aphis fabae), where endosymbionts’ functions and Gonia capitata and a species of the Aphelinid wasps, dynamics have been studied in relation to parasitoid Eretmocerus mundus (Gerling et al. 1990; Godfray 1994). resistance, in order to test properly these hypotheses. Parasitoid venom has been studied as another important The role of the natural enemies of parasitoids is another factor to face the host’s immune system in several egg factor to consider regarding host-specialization processes. parasitoids, but as well in aphid parasitoids (e.g., A. The enemy-free space hypothesis has been proposed for ervi)(Pennacchio et al. 1995; Digilio et al. 2000; Moreau herbivores species and states that these species have and Guillot 2005; Pennacchio and Strand 2006; Fang et al. evolved host specificity via specialized ways of using their 2010; Asgari and Rivers 2010). In aphids, the immune host plants as a refuge or defense against carnivores system seems to be weak, and the information regarding (Bernays 1988; Bernays and Graham 1988). For parasitoids immune reactions to parasitoid attacks is scarce. Although as for herbivores, different hosts may provide different through chemical and behavioral mechanisms some aphid physical and chemical supports to avoid detection from species have reduced the potential number of parasitoids enemies and to limit their attacks. Little is known about the that can exploit them (e.g., behavioral kicking in A. pisum effect of hyper-parasitoids (or secondary parasitoids) spe- and U. leonardi (Desneux et al. 2009)) or by sequestration cies that attack parasitoids of aphids in modulating primary of secondary plant metabolites such as in A. nerii (Malcolm parasitoid host range. However, it is probable that the high 1989). It is thus likely that adaptations to counter aphid mortality in aphid parasitoids resulting from secondary defense mechanisms shape the host range and the level of parasitoids acts as a strong selection agent potentially specialization. Learning the involved cues for selecting increasing their host specificity (Singer and Stireman high fitness host species seems then crucial, and therefore, 2005). Indeed, primary parasitoids may specialize on hosts host fidelity is an important feature of parasitoids behavior that provide refuge or defense against secondary para- (Henry et al. 2008). sitoids. The latter has never been studied in the context of parasitoid specificity. Interactions with organisms at higher and lower trophic levels Fitness trade-offs

In addition to niche partitioning and physiological adap- There are certain advantages in being specialist with both tation to their hosts, interactions with other organisms such physiological and behavioral adaptations to their host as endosymbionts, secondary parasitoids, or predators may characteristics (Brown 1984; Gaston et al. 1997; Krasnov promote host specialization in aphid parasitoids. et al. 2004), specialization toward a host or a group of hosts Secondary bacterial aphid endosymbionts interfering is assumed to be accompanied by an increase in relative with the success of development of the parasitoids are a fitness by parasitizing these hosts. The trade-off hypothesis potential cause of adaptation and specialization in aphid suggests a cost of this specialization in terms of the ability parasitoids (Oliver et al. 2005; Moran et al. 2008; Desneux to parasitize alternative hosts. Consequently, the parasitism et al. 2009; Andrade et al. 2013). Famous examples are fitness of specialists is expected to be higher than those of Hamiltonella defensa (Moran) (Oliver et al. 2003; Ferrari generalists under the conditions corresponding to their et al. 2004; Oliver et al. 2005) and Regiella insecticola ecological niche (Devictor et al. 2010). In aphid para- (Moran) (Vorburger et al. 2010) which are known to sitoids, Straub et al. (2011) evidenced trade-off between increase the level of resistance to parasitoids of several host-range breadth and host-use efficiency. The neural aphid species. Although the ability of endosymbionts to constraint hypothesis reinforces the trade-off hypothesis decrease the susceptibility of aphids to parasitoids is now stating that the limited information processing ability of well established, the involved mechanisms are multiple and insects will restrict their ability to make efficient decisions remain unclear. Depending on the considered endosym- in recognition and acceptance of potential hosts (Bernays biont and aphid species, resistance could be due to toxins and Graham 1988; Bernays and Wcislo 1994). In this way, encoded by the bacteria (Degnan and Moran 2008)or parasitoids with a large host range would be less successful

123 J Pest Sci than specialists in selecting a good quality host in a given negatively specialist than generalist species (Colles et al. time interval. This implies that generalism would be 2009; Devictor et al. 2010). associated with inefficient or poor decision making and Plasticity and lack of host fidelity are key mechanisms would be evolutionary penalized by reduced fitness from allowing the maintenance of generalist phenotypes. choosing poor quality food, an increased risk of predation, Andrade et al. (2013) showed that Aphidius rhopalosiphi or squandered time for oviposition (Singer 2012). For (Stephani Perez) could parasitize either Rhopalosiphum example, it has been observed that generalist parasitoid padi (L.) and Sitobion avenae (Fabricius) in winter Praon volucre does not rapidly discriminate an unsuitable depending on their availability and found no host special- host, which could result in lower host-use efficiency, when ization in the spring. The necessity to remain generalist compared to a relatively more specialist parasitoid such as during winter when hosts are scarce is pointed by the A. ervi (Stilmant et al. 2008; Zepeda-Paulo et al. 2013). In authors as the factor impeding host specialization and thus this context, what could explain the maintenance of gen- allowing the persistence of a generalist phenotype. How- eralist parasitoids in ecosystems and what are the mecha- ever, in A. ervi, a habitat generalist and a moderate host nisms allowing the persistence of these phenotypes? specialist, increased parasitism efficiency occurs after developing on a single host during two to three generations (Henry et al. 2008). Moreover, host fidelity can change Why might parasitoids be generalist? within a single generation (Henry et al. 2005; Andrade et al. 2013), but sex-biased behavioral mechanisms have Although numerous ecological mechanisms promote spe- been suggested to prevent reproductive isolation in para- cialization resulting in natural selection being generally sitoids exploiting different habitats (e.g., in A. ervi, females expected to lead to host specialization, many parasitoids of are monogamous with polygamous males; this increases aphids are able to develop on various host species. The male competition and the dispersal of males, leading to an degree of specialization or generalism, in terms of host important gene flow between populations despite female range, is variable (Fig. 1), from ‘‘specialized species’’ host fidelity) (Zepeda et al. 2015). Generalists might thus (such as A. mali that attacks only the aphid E. lanigerum)to sequentially exploit one or a few host species along the ‘‘oligophagous species’’ (parasitizing a limited number of year, depending on the current relative amount of available host species such as Aphidius avenae (Haliday), which was resources without entering a local adaptation processes. described attacking eight evolutionary distantly related The versatility associated to a lack of genetic differentia- aphid species including mainly cereal aphids) up to tion between populations using different hosts allows ‘‘polyphagous species’’ (with a broader host range such as keeping the ability to use different host species when the Praon volucre (Haliday) that can develop and have been resource is scarce. found in the field developing from more than 40 aphid Heritable host fidelity through imprinting (i.e., the species belonging to more than 20 genera (Krespi et al. acquisition of behavioral responses to olfactory stimuli 1997; Stary´ 1973;Ho¨ller 1990; Kavallieratos et al. 2004)). encountered during adult emergence, Van Emden et al. What are the characteristics of these generalist species, and 2008) can hasten race formation and host specialization. how generalism (the capacity to use two or more host However, cases of parasitoids exhibiting host fidelity and species) can be maintained when mechanisms and natural imprinting without any formation of host-races in moder- selection are assumed to lead to specialization and differ- ately generalized species have been documented (Zepeda- entiation between populations and species? Paulo et al. 2013). Imprinting should thus be considered as If the trade-off hypothesis suggests that specialists have a reversible way of specializing. It may allow generalist an advantage under the conditions corresponding to their parasitoids to specialize on the more abundant host in given ecological niche, it also implies that a generalist strategy environmental and spatiotemporal conditions. However, as might be advantageous in case of low resource availability generalists are little effective in perceiving and selecting or of environmental instability (Levins 1962; MacArthur hosts, imprinting may be poorly efficient and errors in host and Pianka 1966; Futuyma and Moreno 1988). The adap- choice may occur. When a new host becomes more tive advantage conferred by the ability to use a wide abundant in the system, errors in host choice should diversity of resources is particularly important in disturbed become more frequent and quickly amplified by imprinting environments such as agro-ecosystems in which resource which should promote quick switching from a host to availability and nature vary greatly over space and time. In another. Host range by itself does not satisfactorily explain these changing environments, generalist species able to differences in learning rate of parasitoids (Steidle and Van exhibit more plastic behaviors should consequently per- Loon 2003; Bleeker et al. 2006), and further experiments form better at the metapopulation scale. Accordingly, are needed to evaluate the occurrence of imprinting and its current environmental changes would affect more efficiency in generalist and specialist parasitoids.

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example, non-specialist aphid parasitoids are shown as 50 40 follows: successfully parasitize host (sub)species that have 40 lower behavioral defense against attack (Mackauer and 30 Vo¨lkl 1993; Desneux et al. 2009), that are not ant attended 30 (Vo¨lkl 1992), have an innate expectancy of a clumped 20 aphid distribution (Van Steenis et al. 1996), and leave Frequency Frequency 20 patches with few aphids more rapidly than when aphids are 10 10 abundant (Sheehan and Shelton 1989; Van Steenis et al. 1996). However, we are not aware of any published 0 0 experiment that explicitly tested primary parasitoid gen- 0 5 10 20 30 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 SR PSV eralist vs. specialist host-use depending on traits of different aphid species and where trait-specific effects can be Fig. 1 Frequency distribution of the number of aphid species in the distinguished from species-specific effects. In addition to parasitoid host range (SR) and phylogenic species variability (PSV) in aphid, the host plant (e.g., secondary plant metabolite) and the host range. The histogram was made using data on 75 parasitoid and 142 aphid species from Kavallieratos et al. (2004). We can habitat characteristics (e.g., phenology and disturbance) observe that distribution of host specificity is right skewed in both might determine aphid-primary parasitoid interactions cases (many specialized species), and that when number of species either directly or indirectly through their effects on aphids, (SR) is used as a measure of host specificity, the parasitoid host range predators, and secondary parasitoids (Fuentes-Contreras distribution contains intermediately specialized species, but when host relatedness is taken into account in the measure of parasitoid host et al. 1996; Tylianakis et al. 2007; Bukovinszky et al. 2008; specificity (PSV), the distribution is bimodal Petermann et al. 2010; Laliberte´ and Tylianakis 2010; Gagic et al. 2011; Sanders and van Veen 2011; Gagic et al. 2012). Aphid traits and parasitoid generalist vs. specialist host-use Are generalists actually generalists? According to optimal foraging theory (Pyke et al. 1977), parasitoids should select their host so to maximize the Although some generalist parasitoid species can use aphid balance between the fitness gain resulting from host hosts that are common in different parts of the world exploitation and successful development of their offspring irrespectively of the time of the year, the interactions and energy costs from locating and handling the host observed in natura in a given place and at a given time can (Henri and Van Veen 2011). Whether a parasitoid will be more restricted than described in the literature. These maximize its host-use efficiency by exploiting the most differences between fundamental and realized range of abundant host or a host with certain traits affecting its interactions may result from the spatiotemporal variability vulnerability to parasitoid attack depends on parasitoid in host preference and in host availability patterns (Gagic fitness gains/costs from exploiting a particular host. Spe- et al. 2012). Indeed, some interactions are specific to par- cialization to one host species often provides advantage to ticular geographical areas or to particular time periods and specialists in terms of higher host-use efficiency compared might not be found in other spatiotemporal contexts (De- to generalists (Straub et al. 2011), but may result in trade- rocles et al. 2014). Moreover, studies dealing with para- offs in the parasitoid’s ability to use other hosts due to sitoid host range generally do not distinguish rare from physiological, behavioral, and ecological barriers (Gross frequent interactions, what makes it difficult to distinguish 1993; Mackauer and Vo¨lkl 1993; Pennacchio and Strand species that actually use a broad host range, from species 2006; Desneux et al. 2009; Elias et al. 2013). with a strong preference for a particular host but being able Some aphid traits related to resource characteristics to occasionally use alternative hosts. (such as low aggregation in aphid colonies, weak honey- The case of A. ervi is a good illustration of the difficulty dew presence in colonies, ant-attendance and absence of to establish the host range of a generalist parasitoid species concealment) and related to host spatial niche (i.e., host- from the literature. About twenty aphid species are plant alteration, host-plant specificity, habitat specializa- described as potential hosts of A. ervi, including S. avenae, tion, or geographic distribution) may be more or less Metopolophium dirhodum (Walker), and R. padi (Stary´ associated to hosts’ exploitation by specialist or generalist 1973;Ho¨ller 1990; Krespi 1990; Kavallieratos et al. 2004). parasitoids (unpublished data). In experimental settings, a However, in a no-choice laboratory experiment, Stilmant few parasitoid choice experiments mainly conducted with a et al. (2008) evidenced that only S. avenae was success- single or a few parasitoid species have shown differences fully parasitized by A. ervi, whereas in a field survey, in parasitoid preferences for aphids with certain traits. For Derocles et al. (2014) found that both S. avenae and M.

123 J Pest Sci dirhodum were parasitized by A. ervi but did not find any parasitoid species should therefore always be associated to interaction with R. padi. This highlights the need to take spatial, temporal, and environmental data. into account host preferences and their spatiotemporal variability when defining the host range of parasitoid Population structure and taxonomic uncertainty species. Differences in host preferences can be accompanied by Host preference break in the gene flow between populations. Genetic differentiation may arise from the use of different hosts and Even if some parasitoid species can successfully develop from the adaptation of the parasitoids on these hosts with or on a broad host range, all the potential hosts are not without geographic separation between populations with equally preferred and some parasitoid species display contrasting host ranges. Ultimately, genetic differentiation strong host preference (Chau and Mackauer 2001;Ode may lead to the formation of distinct species. In some 2006; Desneux et al. 2009).Accordingtothepreference- species, such as Diaeretiella rapae or A. ervi, gene flow is performance hypothesis (Jaenike 1978), host preference in maintained between populations diverging in their ability parasitoids tends to correlate with fitness gained from the to use different hosts and prevents the complete divergence host (Driessen and Hemerik 1992; Chau and Mackauer between host-specialized populations (Vaughn and Antolin 2001). Host preference is mediated by cues emitted by the 1998; Baer et al. 2004; Bilodeau et al. 2013; Zepeda-Paulo aphid host plant (Storeck et al. 2000;Ode2006), by the et al. 2015). On the other hand, in some species such as P. aphid itself (Chau and Mackauer 2001), or by the pres- volucre or Ephedrus plagiator (Nees), considerable genetic ence of endosymbiotic bacteria inside the host (Andrade divergences have been evidenced by molecular techniques et al. 2013)andmayvarywithinaparasitoid species in suggesting the occurrence of unrecognized sibling species, space and time. Some populations from different geo- probably exhibiting differences in host range (Derocles graphical areas may thus exhibit different host prefer- et al. 2012). The existence of such cryptic species com- ences as it was shown for A. ervi (Pungerl 1984), plexes (i.e., species morphologically similar but phyloge- Lysiphlebus testaceipes (Cresson) (Stary´ et al. 1988), or netically separated) raises questions about the limit Diaeretiella rapae (M’Intosh) (Antolin et al. 2006). The between intra-specific genetic structuring and speciation, level of generalism and host preferences exhibited within and about the taxonomic uncertainty that exists within the aspeciesmayalsovaryintimeinrelationtotheamount parasitoid group. The taxonomic identification based on of available resource. A. rhopalosiphi, which is known to morphological criteria is challenging and led to some be generalist exhibits host preference regarding aphid mistakes. The problems of synonymies between species species in a choice situation (i.e., situation with a large (Berenbaum 2009), and the probable existence of numer- amount of resources) (Wickremasinghe and Van Emden ous cryptic species (Sha et al. 2007; Smith et al. 2008; 1992). By contrast, in winter season (i.e., situation with Derocles et al. 2012) result in misinterpretations about host scarce resources), the host preference is not expressed specialization, which may drive to insect pest management anymore and A. rhopalosiphi parasitizes indistinctly S. failures. The use of DNA markers is the safest way to avenae or R. padi (Andrade et al. 2013). In addition to resolve taxonomic uncertainties. As it is argued by San- host preference, there may be a preference with respect to drock et al. (2011) for L. fabarum species group, mor- the plant on which the host develops, sometimes called phological characters used for delineation of described ‘‘habitat preference.’’ A. rhopalosiphi attacks several species may be phylogenetically non-conservative and may aphid species but exclusively on cultivated and wild be irrelevant to reflect geographical or host-associated Poaceae (Stary´ 1973), whereas A. ervi can be found on differentiation. It repeatedly evidenced that generalist several herbaceous plants such as Poaceae or Fabaceae, species often comprise specialized cryptic species. For but does not parasitize all aphid species available on these example in Costa Rica, barcoding of 171 parasitic plants (Stilmant et al. 2008). hymenopterous morpho-species gave an extra 142 species The consideration of host and habitat preference and in which 90 % showed a high level of host specificity their variability in space and time may let one think that within the limits of the sampling effort of the study per- actual host specialization could be underestimated in par- formed by Smith et al. (2008). asitoids. However, considering the problem in another way, Resolving taxonomic uncertainties and assessing the various mechanisms of host-learning and imprinting could effective level of generalism and interaction between par- tend to indicate host specialization, which in fact is only asitoids and their hosts in a particular spatiotemporal transient. This could, in particular, provides an explanation context has a major importance for improving ecosystem to the apparent lability of host preferences in space and services providing. Indeed, host specialization conditions time. To make sense, the status of host specialization of a the possibility of apparent competition between pests and

123 J Pest Sci alternative host species as well as the risk of spill-over into By a modeling approach, Kaser and Heimpel (2015) con- the natural habitats for the released species. sidered the effect of apparent competition on biological control over a huge number of generations and found that apparent competition can have important benefits for Specialization and biological control increasing biological control efficacy, even at low levels of non-target impact. They also showed that the potential for A main goal in conservation biological control should be to apparent competition is strongly linked to the parasitoid conserve natural enemy species, avoiding new introduc- searching efficiency, in addition to its specialization level tions (sensus Ehler 1998). Understanding how parasitoids and its relative preference for the alternative host. As host exploit their hosts and the complementary or negative preference in generalist species seems to be less marked interactions with other species, therefore, is crucial to use in situation of scarce resources (Andrade et al. 2013), the the full potential of a natural enemies assemblage of spe- use of alternative hosts and the potential for apparent cies. Therefore, not only direct, but also indirect interac- competition may increase in these periods and have a long- tions must be considered. term effect on aphid populations. To validate this hypothesis, effect of apparent competition mediated by parasitoids Apparent competition should be studied over several seasons. Apparent competition can also occur at higher trophic The term ‘apparent competition’ describes the situation in levels and impact the primary parasitoids and their effi- which two species share a common natural enemy and the ciency for biological control. Apparent competition medi- presence of one species negatively impacts the dynamics of ated by secondary parasitoids has been evidenced in the other by increasing the predation risk (Holt 1977). several systems (Van Nouhuys and Hanski 2000; Morris More specifically, in conservation biological control, the et al. 2001). Lower host specialization in secondary para- presence of alternative hosts and preys in uncultivated sitoids species may explain the high level of apparent habitats could result in an increased predation and para- competition mediated by these species (Morris et al. 2001); sitism pressure on pests (Landis et al. 2000; Langer and however, host specialization in the fourth trophic level has Hance 2004; Van Veen et al. 2008). However, the inci- been poorly investigated. Interactions between primary and dence of apparent competition between crop aphids medi- secondary parasitoids have probably dramatic incidence on ated by shared parasitoids seems to be limited (Frere et al. the efficiency of biological control, and taking into account 2007), and weaker than apparent competition mediated by the higher trophic levels in investigating ecosystem ser- generalist predators (Van Veen et al. 2008; Alhmedi et al. vices is necessary to understand the interactions and the 2011). According to Alhmedi et al. (2011), the effect of factors affecting the provision of these services. apparent competition mediated by parasitoids may be restricted to asymmetric relationship between a dominant Parasitoid assemblages and biological control and a rare host species, what may limit the efficiency of an alternative host to avoid pest outbreaks. The lack of evi- Suppressive landscapes that promote natural enemy dence for a strong effect of apparent competition mediated assemblages that are more resilient to perturbation will by parasitoids may be due to an under-consideration of the increase the control rate success of one or many pest spe- long-term effect. Indeed, apparent competition may be cies, achieving more efficiently the overall goal of pest short-term or long-term (Holt and Kotler 1987; Morris suppression. Possibly in these landscapes, the chances of et al. 2001). The former is a result of a numerical response negative effects of invasive species could as well be buf- within a generation due to predator aggregation in patches fered (Gunderson 2000; Juliano et al. 2010). In natural of high prey density, and the latter involves a reproductive enemies assemblages, it has long been thought that more response of a natural enemy to an increase in prey density, specialist species have less undesirable effects and are and acts over a number of generations. Studies dealing with more efficient in finding prey. Generalist species, on the potential for apparent competition in aphid parasitoids other hand, may enhance the risk of negative non-desired generally consider a short temporal scale such as the effects on other organisms through apparent competition growing season (Traugott et al. 2008; Alhmedi et al. 2011; (Bonsall and Hassell 1998; Muller et al. 1999) or spill-over Derocles et al. 2014). There are nevertheless some evi- effects (Rand et al. 2006). However, as agro-ecosystems dences for important effect of long-term apparent compe- rarely are hosting a unique pest species and are inherently tition in other parasitoids groups (Bonsall and Hassell highly disturbed, specialist species would not be optimal 1997; Morris et al. 2004), and for temporal variation of the for providing biological control service as they are not able potential for apparent competition in aphid-parasitoids to switch between different pest species or to withstand low complexes (Langer and Hance 2004; Alhmedi et al. 2011). abundance or the absence of a given host subsequent to

123 J Pest Sci environmental or management derived perturbations. increasing parasitoid redundancy (Fig. 2). That means that Moderate specialists may balance plasticity and specificity the co-occurrence of generalist and specialist species in the even if the value of generalist and specialist parasitoids for parasitoid community would be necessary to provide a biological control cannot be generalized to any system and biological control service both highly efficient and stable in would greatly depend on the potential pest and non-pest space and time. This co-occurrence may be achieved at the hosts in a considered area. A. ervi is considered a habitat landscape scale and be beneficial for the biological control generalist exhibiting host-use plasticity with no apparent of the different annual crops in the landscape mosaic each fitness cost (Zepeda-Paulo et al. 2013). However, at the year. It would be interesting to test this hypothesis in the same time, it is specific enough not to attack a large range case of parasitoids of crop aphids which are living in of non-targeted species, develops host fidelity and can systems dominated by annual crops which are even more recognize an unsuitable host. In Chile, where it has been disturbed and time-varying than cultivated forests. Maybe introduced, it is an important natural enemy of cereal and in this kind of cropping-system, the role of the generalist legume aphids, with high parasitism rates in landscapes species, enhanced by the complementarity between dif- dominated by various crop systems with recurrent agri- ferent types of habitats in the landscape, would be more cultural disturbance (Zepeda-Paulo et al. 2013). important that in forest ecosystems. Another way to consider the problem is trying to find the Finally, to address the issue of parasitoid specialization characteristics of both specialists and generalists at the and biological control, it is important to consider the type community level rather than in a single species. In a recent of biological control we are dealing with. For classical study, Peralta et al. (2014) have evidenced that both biological control that aims at controlling an invasive pest functional complementarity and functional redundancy or to maintain it at a very low population level without were crucial to the provision of biological control service at producing undesirable effects on the natural assemblages, a large spatial and temporal scales. Functional complemen- moderate specialist may be a good option, as it would tarity (i.e., host-resource partitioning among parasitoid control the target pest and be able to maintain populations species) is mainly supported by the specialist species, in the target agro-ecosystem over the long term. For whereas functional redundancy (i.e., resource overlap) is inoculation biological control, specialist species would be more associated with generalist species. In parasitoids of the best option as the issue of resilience to perturbations Lepidoptera in temperate native and plantation forests, has a low importance as the periodicity of the releases is Peralta et al. (2014) found that at the community level, the mechanism to maintain populations during the required functional complementarity was strongly associated with part of the season. For conservation biological control,a increased overall parasitism rates on hosts, and that the mix of generalist and specialist species could be more spatial variability of parasitism rates decreased with relevant. Indeed, when observed over larger spatiotemporal

Fig. 2 Conceptual diagram showing the characteristics of specialist and generalist parasitoids at the individual level and at the community level, and their implications regarding ecosystem services and disservices

123 J Pest Sci scales, the combined effect of complementary species probably excel at diminishing non-target effects. However, should be larger than the effect of a single moderate spe- their ability to deal with low pest densities or to have a broad cialist species, as a single species is not likely to be equally host-use is less studied. Then, moderate generalism could be abundant on the aphid host in different habitats and a desirable trait offering a good compromise in terms of throughout the season. Moreover, if one considers that resilience to host-use and ‘‘species security.’’ As it has been rearing and threats to local natural enemy assemblages do shown by Derocles et al. (2014), aphid parasitoids in agri- not represent issues, as organisms are neither reared nor cultural landscape comprise several specialist species and new organism are introduced under this scheme. probable host-races in some species, which could turn out to be a disadvantage from a biological control program view point, unless it involves continuous rearing and liberation of Conclusion such agents. A challenge for the future will be to measure host range taking all the points raised above in consideration As described in this review, ecological, genetics and to choose moderately generalized species. These moderate behavioral mechanisms allow the maintenance of gener- generalists could benefit from various aphid species in order alist phenotypes in the aphid parasitoid species, despite the to sustain populations and ensure the maintenance of advantages of specialization. Generalism may provide ecosystem services, without negatively affecting native non- benefits to the individuals and populations, in a changing crop aphid populations. At the community level, the co-oc- environment such as agricultural landscapes; however, currence of specialist and generalist parasitoids may provide under more stable conditions selection may favor greater a benefit to biological control both in terms of efficiency and degrees of specialization. This may be particularly true in of stability in space and time. parasitoids of aphids that maintain intimate relationships with their hosts and are involved in co-evolutionary processes with their aphid hosts, their host plants, and Authors contribution endosymbiotic bacteria. However, even if specialization is the dominant process at the evolutionary timescale, we All authors contributed through the writing process of this cannot ignore that the degree of specialization or general- review. ism greatly varies between species in a given time and place. Although this is not a stable state from an evolu- Acknowledgments The authors would like to thank the helpful tionary point of view, the existence of generalist pheno- comments from all reviewers with which this review was greatly improved. For funding, the authors would like to thank project types in parasitoid species has a great importance from an APHIDWEB 611810 Structure, strength and invasibility of aphid applied point of view because it may influence ecological food webs-Marie Curie Actions—International Research Staff interactions as well as ecosystem services. Exchange Scheme (IRSES) and Fondecyt Grant 1110341 to BL for Another important aspect to consider is the observa- financial support and travel grants to MP and LR. LR was supported by Millennium Nucleus Center ICM NC120027. tional artifacts in the determination of a host-specialization status of a parasitoid species. While some cases of true Compliance with ethical standards generalism seem to occur in nature, the development of genetic tools has revealed numerous cases of genetically Conflict of interest The authors declare that they have no conflict of interest. differentiated host-races or even cryptic species. A study of the genetics of the most common species of Aphidiinae Research Involving Human Participants and/or Animals and parasitoids remains to be carried out, including the com- Informed Consent Not applicable to the described work. munity, population, and at the individual level. It could deeply modify our vision of parasitoid host specialization by revealing many cryptic species, providing evidence that true generalists are a rare and transient state in aphid par- References asitoids or quite the contrary considering the great amount of aphid species that interact in agricultural settings. Abrahamson WG, Blair CA (2008) Sequential radiation through host- race formation: herbivore diversity leads to diversity in natural Once resolved the problem of the determination of the enemies. In: Tilmon KJ (ed) Specialization, speciation and host range, the question of the optimal degree of general- radiation: the evolutionary biology of herbivorous insects. ism for efficient ecosystem services should be assessed. University of California Press, Berkeley The screening of biological control agents usually includes Alhmedi A, Haubruge E, D’Hoedt S, Francis F (2011) Quantitative food webs of herbivore and related beneficial community in non- a suite of specialist species. 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All in-text references underlined in blue are linked to publications on ResearchGate, letting you access and read them immediately. Résumé Les parasitoïdes de pucerons Aphidiinae (Hymenoptera : Braconidae) comprennent des espèces qui présentent un gradient de spialisatio allat d’espes oophages à des espèces capables de parasiter plusieurs dizaines d’espes hôtes. Le caractère galiste ou spialiste d’u ennemi naturel va conditionner son effiait à gule les populatios d’u ravageur, mais également sa capacité à pouvoir exploiter d’autes essoues dans les habitats semi-naturels, et assurer ainsi son maintien dans l’evioeet e l'absence du ravageur. L’ojetif peie de e tavail est de dfii s’il eiste des espèces généralistes au sein des Aphidiinae, dans un contexte agronomique spatialement et temporellement délimité. Dans un deuxième temps, il s'agit d’étudier les facteurs qui peuvent influencer la spécialisation parasitaire à l’helle ite et intraspécifique. Les fateus ils sot l’hôte, la plate, de pa leus aatistiues ologiues oe l’aodae et la fréquence, et le type d'habitat, cultivé ou non cultivé Nous avons étudié au sei d’u agosste et au ous d’ue saiso de vgtatio les seau tophiues plates- pucerons-parasitoïdes dans le milieu cultivé et dans les habitats semi-naturels. Nous avons cherché à identifier des situatios d’eploitatio d’hôtes ultiples das les deu opatiets de l’agosste et à dfii les fateus pouvat ifluee la patitio des espes galistes et spialistes das le teps et l’espae. Puis ous avos tudi le parasitisme en conditions naturelles et contrôlées d’une espèce en particulier, Diaeretiella rapae pour déterminer son degré de spécialisation parasitaire et la daiue d’eploitatio des hôtes sur les plantes cultivées et sauvages. Enfin, l’eistee de stutuatio génétique des populations, voire d’espes ptiues, a été recherchée chez les espèces les plus généralistes, grâce à une approche moléculaire de type barcoding. Nos sultats vlet u’il ’ a pas à popeet parlé de vrai généraliste parmi les Aphidiinae présents dans l'agroécosystème étudié. Les espèces supposées généralistes ayant un possible intérêt agronomique ont en réalité des spetes d’hôtes limités, elles ne parasitent que rarement et très ponctuellement des ressources dans les habitats semi- naturels. La plupart présentent des structurations génétiques de leurs populations (hormis A. ervi) e fotio de l’hôte, de la plate ou de l’iteatio des deu. Des espèces cryptiques ont été détectées chez D rapae. La conséquence de cette spécialisation parasitaire et des structurations génétiques intraspécifiques est un rôle probablement très faible des habitats semi-naturels comme réservoirs d'Aphidiinae, leur gestion n'étant alors pas un levier pour la mise en place d'une lutte biologique par conservation.

Mots clés : agroécosystème, communauté pucerons-paasitoïdes, aodig, spete d’hôte, espèce cryptique, habitats semi naturels

Abstract Aphid parasitoids of the sub-family Aphidiinae (Hymenoptera: Braconidae) include species with a gradient of specialization from monophagous to polyphagous species, able to parasitize several dozen of host species. Generalist or specialist trait for a natural enemy will determine its effectiveness in regulating pest populations, but also its ability to exploit other resources in semi-natural habitats and then to ensure its maintenance in the environment in the absence of pests. The first objective of this work is to determine if there are real generalists species within Aphidiinae in a peculiar agroecosystem over the time and in different habitats. Secondly, we studied the factors that may influence the parasitic specialization at inter- and intraspecific level. Targeted factors are the host, the plant, regarding their ecological characteristics, such as abundance and frequency, and the type of habitat, cultivated or uncultivated We studied the trophic network between plant-aphid-parasitoid in cultivated areas and in semi-natural habitats in an agroecosystem and during a growing season. We sought to identify situations of multiple exploitation of different host in the two compartments of agroecosystem and to identify factors influencing the distribution of generalists and specialists species in time and space. Then, we studied the parasitism of a particular species Diaeretiella rapae in natural and controlled conditions to determine its degree of parasitic specialization and its temporal dynamic of host exploitation on cultivated and wild plants. Finally, the existence of genetic structure of populations, even cryptic species, was investigated in the most generalist species, with a molecular barcoding method. Our results reveal that there is no true generalist species among Aphidiinae present in the studied agroecosystem. The supposed generalist species actually have limited host ranges, they parasite rarely and very timely resources of semi-natural habitats. Most of them show a genetic structuration of their populations (except A. ervi) depending on the host, the plant or the interaction of both. Cryptic species were detected in D rapae. The consequence of this parasitic specialization and intraspecific genetic structuring is probably a very low role of host reservoir played by the semi-natural habitats for Aphidiinae species, their management then not being a lever for the implementation of conservation biological control.

Key-words: agroecosystem, aphid-parasitoid community, barcoding, host range, cryptic species, semi natural habitats