Die Rolle Der Duralen Mastzellen Im Maus Migräne-Modell = the Role Of
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Die Rolle der duralen Mastzellen im Maus Migräne-Modell Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Biologie und Biotechnologie der Ruhr-Universität Bochum Internationale Graduiertenschule Biowissenschaften Ruhr-Universität Bochum (Lehrstuhl für Tierphysiologie) Vorgelegt von Elisabeth Dlugosch Aus Recklinghausen Bochum Oktober, 2017 Referent: Prof. Dr. Hermann Lübbert Korreferent: Prof. Dr. Stefan Herlitze The role of dural mast cells in a murine migraine model Dissertation to obtain the degree Doctor Rerum Naturalium (Dr. rer. nat.) at the Faculty of Biology und Biotechnology Ruhr University Bochum International Graduate School of Biosciences Ruhr University Bochum (Department of Animal Physiology) Submitted by Elisabeth Dlugosch From Recklinghausen Bochum October 2017 First Supervisor: Prof. Dr. Hermann Lübbert Second Supervisor: Prof. Dr. Stefan Herlitze Danksagung Danksagung Ich danke Herrn Prof. Dr. Hermann Lübbert für die Überlassung des Themas, die Bereitstellung des Arbeitsplatzes am Lehrstuhl für Tierphysiologie, sowie den fachlichen Rat. Mein Dank gilt auch Herrn Prof. Dr. Stefan Herlitze für die Übernahme des Korreferats. Des Weiteren möchte ich mich bei Herrn Dr. Frank Paris, Herrn Dr. Michael Andriske und Herrn Dr. Xinran Zhu für die wertvollen Tipps und fachliche Kritik bedanken. Außerdem möchte ich mich noch bei Tanja Behning für den technischen Support bedanken, Manfred Ebbinghaus für seine Hilfe bei den Hypoxie-Kammern, Maria Josten für die Hilfe bei der Zellkultur und Katja Schmidtke für die Hilfe bei den PCRs. Ein weiterer Dank geht an Frau Dr. Miriam Kremser und Herrn Dr. Daniel Segelcke für die hilfreichen Anregungen bei meiner Dissertation. Ein großer Dank gilt auch allen Mitarbeitern und Studenten des Lehrstuhls für Tierphysiologie für die tolle Arbeitsatmosphäre und all die lustigen Gespräche, die wir über die Zeit geführt haben. Ein besonderer Dank geht an alle ehemaligen und derzeitigen Doktoranden für die Unterstützung bei der Arbeit am Lehrstuhl über all die Jahre, aber auch vor allem für all die schönen Stunden, die wir außerhalb des Lehrstuhls miteinander verbracht haben. Zuletzt möchte ich mich vom ganzen Herzen bei meiner Familie und meinen Freunden bedanken, die stets an mich geglaubt haben und mich immer unterstützt haben. Mein größter Dank gilt meinem Freund, der immer für mich da ist. Seite | III Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Abbildungs- und Tabellenverzeichnis VII Abkürzungsverzeichnis X Zusammenfassung XII Abstract XV 1. Einleitung 1 1.1 Migräne 1 1.2 Mastzellen 2 1.3 Neurogene Inflammation der Dura mater 3 1.4 Modulation durch Serotonin und Histamin 6 1.5 Der 5-HT2B-Rezeptor in einem Maus-Migräne-Modell 8 1.6 Hypothetische Kaskade 10 1.7 Fragestellung der Arbeit 11 2. Material und Methoden 13 2.1 Material 13 2.1.1 Tiere 13 2.1.2 Farbstoffe 13 2.1.3 Kits 13 2.1.4 Chemikalien 14 2.1.5 Pharmakologische Substanzen 15 2.1.6 Verbrauchsmaterialien 15 2.1.7 Puffer und Lösungen 16 2.1.8 Primersequenzen 17 2.1.9 Antikörper 17 2.1.10 Programme 18 2.1.11 Geräte 18 2.2 Methoden 19 2.2.1 Hypoxie-Behandlung 19 2.2.2 In vivo Inkubation 19 Seite | IV Inhaltsverzeichnis 2.2.3 Schädelkalotten-Präparation und Inkubation für die ex vivo Versuche 21 2.2.4 Blockierungsexperimente 24 2.2.5 Präparation der Dura mater und Mastzellfärbung 25 2.2.6 Histologische Auswertung 26 2.2.7 Statistik 29 2.2.8 Immunhistochemische Färbung mit einem CGRP-Antikörper und Avidin-FITC 29 2.2.9 Alcianblau-Safranin Färbung 30 2.2.10 Zellkultur 30 2.2.11 cDNA-Synthese 31 2.2.12 Single Cell-PCR 32 3. Ergebnisse 34 3.1 Charakterisierung muriner Mastzellen in der Dura mater 34 3.2 In vivo-Experimente 38 3.2.1 Auswirkung von operativen Eingriffen, Narkosedauer und Gewebefixierung auf die durale Mastzelldegranulation der CTMC in Mäusen 38 3.2.2 Etablierung des in vivo-Modells zur Untersuchung von Mastzelldegranulation in der Dura mater der Maus 41 3.3 Ex vivo - Halbschädel-Experimente 47 3.3.1 Etablierung des ex vivo-Modells mit verschiedenen Substanzen zur Untersuchung der duralen Mastzelldegranulation 47 3.3.2 Einfluss von Histamin auf die durale Mastzelldegranulation 50 3.3.3 Einfluss von Serotoninagonisten auf die durale Mastzelldegranulation 52 3.3.4 Einfluss von Serotoninantagonisten auf die mCPP- oder BW723C86-induzierte Mastzelldegranulation 56 3.3.5 Einfluss vom H1-Rezeptorantagonisten Cetirizin auf die mCPP-induzierte Mastzelldegranulation in der Dura mater der Maus 62 3.3.6 Einfluss des CGRP-Rezeptorantagonisten Olcegepant auf die durale Mastzelldegranulation 63 3.4 Single Cell-PCR mit murinen Mastzellen der Dura mater - Pilotversuch 64 4. Diskussion 71 4.1 Charakterisierung duraler Mastzellen der Maus 72 4.2 Durale Mastzelldegranulation in vivo 74 Seite | V Inhaltsverzeichnis 4.2.1 Einfluss der Gewebefixierung, des operativen Eingriffs oder der Narkosedauer auf die durale Mastzelldegranulation 74 4.2.2 Mastzelldegranulation in vivo in der Dura mater der Maus durch C48/80 76 4.3 Durale Mastzelldegranulation in einem ex vivo - Halbschädel-Modell 77 4.3.1 Mastzelldegranulation durch C48/80 in dem ex vivo-Modell 77 4.3.2 Keine Induktion der duralen Mastzelldegranulation durch Histamin 78 4.3.3 mCPP- und BW723C86-induzierte Mastzelldegranulation in der Dura mater 80 4.3.4 Keine Inhibition der Mastzelldegranulation durch die Serotoninantagonisten RS127445 und Methysergid 82 4.3.5 Keine Inhibition der mCPP-induzierten Mastzelldegranulation durch Cetirizin 85 4.3.6 Einfluss des CGRP-Rezeptorantagonisten Olcegepant auf die durale Mastzelldegranulation 87 4.4 Expression verschiedener Rezeptoren auf duralen Mastzellen der Maus 89 4.5 Schlussfolgerung 92 Anhang 95 Literaturverzeichnis 101 Lebenslauf 114 Erklärung 116 Seite | VI Abbildungs- und Tabellenverzeichnis Abbildungs- und Tabellenverzeichnis Abb. 1.1 Schematische Darstellung der hypothetischen Kaskade der Mastzelldegranulation in der neurogenen Inflammation 12 Abb. 2.1 Schädelkalotten-Präparation für die ex vivo Versuche 23 Abb. 2.2 Schematische Darstellung der Orientierung einer Dura mater auf dem Objektträger 25 Abb. 2.3 Prozedur der histologischen Aufnahmen 27 Abb. 2.4 Klassifizierung der Mastzelldegranulation 28 Abb. 3.1 Prozentualer Anteil der beiden Mastzelltypen in der murinen Dura mater 35 Abb. 3.2 Verschiedene Verteilungsmuster abhängig von der Anzahl der Mastzellen 36 Abb. 3.3 Lokalisation von Mastzellen in der murinen Dura mater 37 Abb. 3.4 Einfluss verschiedener Eingriffe auf die murine durale Mastzelldegranulation nach Normoxie-Behandlung 41 Abb. 3.5 Einfluss verschiedener Eingriffe auf die murine durale Mastzelldegranulation nach Hypoxie-Behandlung 42 Abb. 3.6 Bestätigung des C48/80 Effekts auf die murine Mastzelldegranulation des duralen Gewebes nach Hypoxie-Behandlung 43 Abb. 3.7 Einfluss von mCPP und C48/80 auf die in vivo Mastzelldegranulation in der murinen hypoxischen Dura mater mit größerer Stichprobenzahl 44 Abb. 3.8 Einfluss von mCPP und C48/80 auf die in vivo Mastzelldegranulation in der murinen normoxischen Dura mater 46 Abb. 3.9 Einfluss von mCPP und C48/80 auf die in vivo Mastzelldegranulation in der murinen hypoxischen Dura mater 47 Abb. 3.10 Etablierung des ex vivo-Modells zur Untersuchung der Mastzelldegranulation in der murinen Dura mater nach Normoxie-Behandlung 48 Abb. 3.11 Etablierung des ex vivo-Modells zur Untersuchung der Mastzelldegranulation in der murinen Dura mater nach Hypoxie-Behandlung 49 Abb. 3.12 Einfluss von verschiedenen Histamindosierungen auf die Degranulationsrate muriner duraler Mastzellen nach Hypoxie-Behandlung 51 Abb. 3.13 Einfluss von verschiedenen Histamindosierungen nach verlängerter Inkubationszeit auf murine durale Mastzellen nach Normoxie-Behandlung 52 Seite | VII Abbildungs- und Tabellenverzeichnis Abb. 3.14 Einfluss von mCPP auf die durale Mastzelldegranulation nach verlängerter Inkubation 53 Abb. 3.15 Mastzelldegranulation in der murinen Dura Mater bei verschiedenen Dosierungen des partiellen 5-HT2B-Rezeptoragonisten mCPP nach Normoxie- Behandlung 54 Abb. 3.16 Mastzelldegranulation in der murinen Dura Mater bei verschiedenen Dosierungen des partiellen 5-HT2B-Rezeptoragonisten mCPP nach Hypoxie- Behandlung 55 Abb. 3.17 Vergleich zwischen dem spezifischeren 5-HT2B-Rezeptoragonisten BW723C86 zu mCPP bezüglich der duralen murinen Mastzelldegranulation 56 Abb. 3.18 Blockierungsversuch der mCPP-induzierten Mastzelldegranulation in der normoxischen murinen Dura mater mithilfe des 5-HT2B-Rezeptorantagonisten RS127445 57 Abb. 3.19 Blockierungsversuch der mCPP-induzierten Mastzelldegranulation in der hypoxischen murinen Dura mater mithilfe des 5-HT2B-Rezeptorantagonisten RS127445 58 Abb. 3.20 Blockierungsversuch der mCPP- oder BW723C86-induzierten Mastzelldegranulation in der normoxischen murinen Dura mater mithilfe des 5- HT2B-Rezeptorantagonisten RS127445 60 Abb. 3.21 Blockierungsversuch der mCPP-induzierten Mastzelldegranulation in der normoxischen murinen Dura mater mithilfe des 5-HT1/2/7-Rezeptorantagonisten Methysergid 61 Abb. 3.22 Blockierungsversuch der mCPP-induzierten Mastzelldegranulation in der normoxischen murinen Dura mater mithilfe des inversen H1-Rezeptoragonisten Cetirizin 62 Abb. 3.23 Wirkung des CGRP-Rezeptorantagonisten Olcegepant auf die mCPP- Mastzelldegranulation in der murinen Dura mater 64 Abb. 3.24 Expression des 5-HT2A-Rezeptors auf duralen Mastzellen der Maus 65 Abb. 3.25 Expression des H1-Rezeptors auf duralen Mastzellen in der Maus 66 Abb. 3.26 Expression des H2- und 5-HT7-Rezeptors auf duralen Mastzellen der Maus 67 Abb. 3.27 Expression