Die Rolle der duralen Mastzellen im Maus Migräne-Modell

Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Biologie und Biotechnologie der Ruhr-Universität Bochum

Internationale Graduiertenschule Biowissenschaften Ruhr-Universität Bochum (Lehrstuhl für Tierphysiologie)

Vorgelegt von Elisabeth Dlugosch

Aus Recklinghausen

Bochum Oktober, 2017

Referent: Prof. Dr. Hermann Lübbert Korreferent: Prof. Dr. Stefan Herlitze

The role of dural mast cells in a murine migraine model

Dissertation to obtain the degree Doctor Rerum Naturalium (Dr. rer. nat.) at the Faculty of Biology und Biotechnology

Ruhr University Bochum

International Graduate School of Biosciences Ruhr University Bochum (Department of Animal Physiology)

Submitted by Elisabeth Dlugosch

From Recklinghausen

Bochum October 2017

First Supervisor: Prof. Dr. Hermann Lübbert Second Supervisor: Prof. Dr. Stefan Herlitze

Danksagung

Danksagung

Ich danke Herrn Prof. Dr. Hermann Lübbert für die Überlassung des Themas, die Bereitstellung des Arbeitsplatzes am Lehrstuhl für Tierphysiologie, sowie den fachlichen Rat.

Mein Dank gilt auch Herrn Prof. Dr. Stefan Herlitze für die Übernahme des Korreferats.

Des Weiteren möchte ich mich bei Herrn Dr. Frank Paris, Herrn Dr. Michael Andriske und Herrn Dr. Xinran Zhu für die wertvollen Tipps und fachliche Kritik bedanken.

Außerdem möchte ich mich noch bei Tanja Behning für den technischen Support bedanken, Manfred Ebbinghaus für seine Hilfe bei den Hypoxie-Kammern, Maria Josten für die Hilfe bei der Zellkultur und Katja Schmidtke für die Hilfe bei den PCRs.

Ein weiterer Dank geht an Frau Dr. Miriam Kremser und Herrn Dr. Daniel Segelcke für die hilfreichen Anregungen bei meiner Dissertation.

Ein großer Dank gilt auch allen Mitarbeitern und Studenten des Lehrstuhls für Tierphysiologie für die tolle Arbeitsatmosphäre und all die lustigen Gespräche, die wir über die Zeit geführt haben.

Ein besonderer Dank geht an alle ehemaligen und derzeitigen Doktoranden für die Unterstützung bei der Arbeit am Lehrstuhl über all die Jahre, aber auch vor allem für all die schönen Stunden, die wir außerhalb des Lehrstuhls miteinander verbracht haben.

Zuletzt möchte ich mich vom ganzen Herzen bei meiner Familie und meinen Freunden bedanken, die stets an mich geglaubt haben und mich immer unterstützt haben. Mein größter Dank gilt meinem Freund, der immer für mich da ist.

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Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

Abbildungs- und Tabellenverzeichnis VII

Abkürzungsverzeichnis X

Zusammenfassung XII

Abstract XV

1. Einleitung 1

1.1 Migräne 1

1.2 Mastzellen 2

1.3 Neurogene Inflammation der Dura mater 3

1.4 Modulation durch Serotonin und Histamin 6

1.5 Der 5-HT2B-Rezeptor in einem Maus-Migräne-Modell 8

1.6 Hypothetische Kaskade 10

1.7 Fragestellung der Arbeit 11

2. Material und Methoden 13

2.1 Material 13 2.1.1 Tiere 13 2.1.2 Farbstoffe 13 2.1.3 Kits 13 2.1.4 Chemikalien 14 2.1.5 Pharmakologische Substanzen 15 2.1.6 Verbrauchsmaterialien 15 2.1.7 Puffer und Lösungen 16 2.1.8 Primersequenzen 17 2.1.9 Antikörper 17 2.1.10 Programme 18 2.1.11 Geräte 18

2.2 Methoden 19 2.2.1 Hypoxie-Behandlung 19 2.2.2 In vivo Inkubation 19 Seite | IV

Inhaltsverzeichnis

2.2.3 Schädelkalotten-Präparation und Inkubation für die ex vivo Versuche 21 2.2.4 Blockierungsexperimente 24 2.2.5 Präparation der Dura mater und Mastzellfärbung 25 2.2.6 Histologische Auswertung 26 2.2.7 Statistik 29 2.2.8 Immunhistochemische Färbung mit einem CGRP-Antikörper und Avidin-FITC 29 2.2.9 Alcianblau-Safranin Färbung 30 2.2.10 Zellkultur 30 2.2.11 cDNA-Synthese 31 2.2.12 Single Cell-PCR 32

3. Ergebnisse 34

3.1 Charakterisierung muriner Mastzellen in der Dura mater 34

3.2 In vivo-Experimente 38 3.2.1 Auswirkung von operativen Eingriffen, Narkosedauer und Gewebefixierung auf die durale Mastzelldegranulation der CTMC in Mäusen 38 3.2.2 Etablierung des in vivo-Modells zur Untersuchung von Mastzelldegranulation in der Dura mater der Maus 41

3.3 Ex vivo - Halbschädel-Experimente 47 3.3.1 Etablierung des ex vivo-Modells mit verschiedenen Substanzen zur Untersuchung der duralen Mastzelldegranulation 47 3.3.2 Einfluss von Histamin auf die durale Mastzelldegranulation 50 3.3.3 Einfluss von Serotoninagonisten auf die durale Mastzelldegranulation 52 3.3.4 Einfluss von Serotoninantagonisten auf die mCPP- oder BW723C86-induzierte Mastzelldegranulation 56 3.3.5 Einfluss vom H1-Rezeptorantagonisten Cetirizin auf die mCPP-induzierte Mastzelldegranulation in der Dura mater der Maus 62 3.3.6 Einfluss des CGRP-Rezeptorantagonisten Olcegepant auf die durale Mastzelldegranulation 63

3.4 Single Cell-PCR mit murinen Mastzellen der Dura mater - Pilotversuch 64

4. Diskussion 71

4.1 Charakterisierung duraler Mastzellen der Maus 72

4.2 Durale Mastzelldegranulation in vivo 74 Seite | V

Inhaltsverzeichnis

4.2.1 Einfluss der Gewebefixierung, des operativen Eingriffs oder der Narkosedauer auf die durale Mastzelldegranulation 74 4.2.2 Mastzelldegranulation in vivo in der Dura mater der Maus durch C48/80 76

4.3 Durale Mastzelldegranulation in einem ex vivo - Halbschädel-Modell 77 4.3.1 Mastzelldegranulation durch C48/80 in dem ex vivo-Modell 77 4.3.2 Keine Induktion der duralen Mastzelldegranulation durch Histamin 78 4.3.3 mCPP- und BW723C86-induzierte Mastzelldegranulation in der Dura mater 80 4.3.4 Keine Inhibition der Mastzelldegranulation durch die Serotoninantagonisten RS127445 und Methysergid 82 4.3.5 Keine Inhibition der mCPP-induzierten Mastzelldegranulation durch Cetirizin 85 4.3.6 Einfluss des CGRP-Rezeptorantagonisten Olcegepant auf die durale Mastzelldegranulation 87

4.4 Expression verschiedener Rezeptoren auf duralen Mastzellen der Maus 89

4.5 Schlussfolgerung 92

Anhang 95

Literaturverzeichnis 101

Lebenslauf 114

Erklärung 116

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Abbildungs- und Tabellenverzeichnis

Abbildungs- und Tabellenverzeichnis

Abb. 1.1 Schematische Darstellung der hypothetischen Kaskade der Mastzelldegranulation in der neurogenen Inflammation 12 Abb. 2.1 Schädelkalotten-Präparation für die ex vivo Versuche 23 Abb. 2.2 Schematische Darstellung der Orientierung einer Dura mater auf dem Objektträger 25 Abb. 2.3 Prozedur der histologischen Aufnahmen 27 Abb. 2.4 Klassifizierung der Mastzelldegranulation 28 Abb. 3.1 Prozentualer Anteil der beiden Mastzelltypen in der murinen Dura mater 35 Abb. 3.2 Verschiedene Verteilungsmuster abhängig von der Anzahl der Mastzellen 36 Abb. 3.3 Lokalisation von Mastzellen in der murinen Dura mater 37 Abb. 3.4 Einfluss verschiedener Eingriffe auf die murine durale Mastzelldegranulation nach Normoxie-Behandlung 41 Abb. 3.5 Einfluss verschiedener Eingriffe auf die murine durale Mastzelldegranulation nach Hypoxie-Behandlung 42 Abb. 3.6 Bestätigung des C48/80 Effekts auf die murine Mastzelldegranulation des duralen Gewebes nach Hypoxie-Behandlung 43 Abb. 3.7 Einfluss von mCPP und C48/80 auf die in vivo Mastzelldegranulation in der murinen hypoxischen Dura mater mit größerer Stichprobenzahl 44 Abb. 3.8 Einfluss von mCPP und C48/80 auf die in vivo Mastzelldegranulation in der murinen normoxischen Dura mater 46 Abb. 3.9 Einfluss von mCPP und C48/80 auf die in vivo Mastzelldegranulation in der murinen hypoxischen Dura mater 47 Abb. 3.10 Etablierung des ex vivo-Modells zur Untersuchung der Mastzelldegranulation in der murinen Dura mater nach Normoxie-Behandlung 48 Abb. 3.11 Etablierung des ex vivo-Modells zur Untersuchung der Mastzelldegranulation in der murinen Dura mater nach Hypoxie-Behandlung 49 Abb. 3.12 Einfluss von verschiedenen Histamindosierungen auf die Degranulationsrate muriner duraler Mastzellen nach Hypoxie-Behandlung 51 Abb. 3.13 Einfluss von verschiedenen Histamindosierungen nach verlängerter Inkubationszeit auf murine durale Mastzellen nach Normoxie-Behandlung 52 Seite | VII

Abbildungs- und Tabellenverzeichnis

Abb. 3.14 Einfluss von mCPP auf die durale Mastzelldegranulation nach verlängerter Inkubation 53 Abb. 3.15 Mastzelldegranulation in der murinen Dura Mater bei verschiedenen

Dosierungen des partiellen 5-HT2B-Rezeptoragonisten mCPP nach Normoxie- Behandlung 54 Abb. 3.16 Mastzelldegranulation in der murinen Dura Mater bei verschiedenen

Dosierungen des partiellen 5-HT2B-Rezeptoragonisten mCPP nach Hypoxie- Behandlung 55

Abb. 3.17 Vergleich zwischen dem spezifischeren 5-HT2B-Rezeptoragonisten BW723C86 zu mCPP bezüglich der duralen murinen Mastzelldegranulation 56 Abb. 3.18 Blockierungsversuch der mCPP-induzierten Mastzelldegranulation in der

normoxischen murinen Dura mater mithilfe des 5-HT2B-Rezeptorantagonisten RS127445 57 Abb. 3.19 Blockierungsversuch der mCPP-induzierten Mastzelldegranulation in der

hypoxischen murinen Dura mater mithilfe des 5-HT2B-Rezeptorantagonisten RS127445 58 Abb. 3.20 Blockierungsversuch der mCPP- oder BW723C86-induzierten Mastzelldegranulation in der normoxischen murinen Dura mater mithilfe des 5-

HT2B-Rezeptorantagonisten RS127445 60 Abb. 3.21 Blockierungsversuch der mCPP-induzierten Mastzelldegranulation in der

normoxischen murinen Dura mater mithilfe des 5-HT1/2/7-Rezeptorantagonisten Methysergid 61 Abb. 3.22 Blockierungsversuch der mCPP-induzierten Mastzelldegranulation in der normoxischen murinen Dura mater mithilfe des inversen H1-Rezeptoragonisten Cetirizin 62 Abb. 3.23 Wirkung des CGRP-Rezeptorantagonisten Olcegepant auf die mCPP- Mastzelldegranulation in der murinen Dura mater 64

Abb. 3.24 Expression des 5-HT2A-Rezeptors auf duralen Mastzellen der Maus 65 Abb. 3.25 Expression des H1-Rezeptors auf duralen Mastzellen in der Maus 66

Abb. 3.26 Expression des H2- und 5-HT7-Rezeptors auf duralen Mastzellen der Maus 67 Abb. 3.27 Expression des D1- und D2-Rezeptors auf duralen Mastzellen der Maus 68 Abb. 3.28 Expression des M1- und M3-Rezeptors in duralen Mastzellen der Maus 69 Seite | VIII

Abbildungs- und Tabellenverzeichnis

Abb. 4.1 Mastzelldegranulationsraten nach verschiedenen Fixierungsmethoden 97 Abb. 4.2 Einfluss der Narkoselänge von Isofluran auf die Mastzelldegranulation in der murinen Dura mater 98 Abb. 4.3 Einfluss der Präparation ohne Injektion einer Substanz auf die murine durale Mastzelldegranulation im Vergleich zu nativen Tieren 99

Abb. 4.4 Single Cell-PCR vom 5-HT2C- und 5-HT2B- Rezeptor an duralen murinen Mastzellen 100

Tab. 2.1 Für die Histologie verwendete Farbstoffe 13 Tab. 2.2 Chemikalienliste 14 Tab. 2.3 Verwendete pharmakologische Substanzen 15 Tab. 2.4 Verbrauchsmaterial 15 Tab. 2.5 Hergestellte Puffer und Lösungen 16 Tab. 2.6 Primersequenzen für Single Cell PCR 17 Tab. 2.7 Verwendete Antikörper für die Immunhistochemische Färbung 17 Tab. 2.8 Software Programme 18 Tab. 2.9 Geräte 18 Tab. 2.10 Übersicht über verschiedenen Fixiermethoden 21 Tab. 2.11 Übersicht über die verschiedenen Behandlungen 21 Tab. 2.12 Übersicht der Inkubationsreihenfolge bei den Blockierungsversuchen 24 Tab. 2.13 cDNA-Synthese Komponenten Mix [1x] 32 Tab. 2.14 Komponenten des PCR-Ansatzes 32 Tab. 3.1 Übersicht über die Auswirkung verschiedener Parameter auf die durale Mastzelldegranulation 40 Tab. 4.1 Affinitäten von Histamin zu den vier verschiedenen Histaminrezeptoren 95 Tab. 4.2 Affinitäten von mCPP zu verschiedenen Rezeptoren 95 Tab. 4.3 Affinitäten von BW723C86 zu verschiedenen Rezeptoren 96 Tab. 4.4 Affinitäten von Methysergid zu verschiedenen Rezeptoren 96

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Abkürzungsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

A F

A.bidest Aqua bidestillata FA Formaldehyd ANOVA englisch: Analysis of variance FCS englisch: fetal calf serum AS Alcianblau-Safranin G ASICs Acid-sensing ion channels Avidin-FITC englisch: Fluorescein GFP englisch: green fluorescent protein Avidin D H

B HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1- BMMC bone marrow-derived mast cell piperazinyl)-ethansulfonsäure bp Basenpaar HPRT Hypoxanthin-Phosphoribosyl- BSA englisch: bovine serum albumin Transferase

C I cDNA englisch: coding DNA ICHD-2 englisch: International CGRP englisch: Calcitonin gene-related Classification of Headache peptide Disorders, Second Edition

CO2 Kohlenstoffdioxid IgE Immunglobulin E CTMC englisch: Connective Tissue Mast K Cell, englisch: Connective Tissue KG Körpergewicht Mast Cell L D L-NAME englisch: L-NG-Nitroarginine DM Dura mater methyl ester DMSO Dimethylsulfoxid dNTP Desoxyribonucleosidtriphosphat M

E M Molar MACS englisch: Magnetic cell sorting E.coli Escherichia coli MAD englisch: median absolute EDTA englisch: deviation Ethylenediaminetetraacetic acid MC englisch: mast cell Seite | X

Abkürzungsverzeichnis mCPP meta-Chlorphenylpiperazin PCR englisch: Polymerase Chain min Minuten Reaction MMA englisch: middle menigeal artery pKi englisch: negative logarithm of the MMC englisch: mucosal mast cell equilibrium dissociation constant

N PPE Plasmaproteinextravasation n.s. nicht signifikant R NMRI englisch: Naval Medical Research RT- ohne reverse Transkriptase

Institute S NO englisch: nitric oxide SIF englisch: Synthetic interstial fluid NOS Stickstoffmonoxidsynthase SP Substanz P O SSS Sinus sagittalis superior

O2 Sauerstoff ST Sinus transversus

P T

PB Phosphatpuffer TG trigeminales Ganglion PBCMC englisch: peripheral blood TNC trigeminaler Nucleus caudalis chord mast cells W PBS englisch: phosphate buffered saline WK Wasserkontrolle

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Zusammenfassung

Zusammenfassung

Migräne ist ein einseitiger, pulsierender Kopfschmerz, häufig begleitet von Photo- und Phonophobie, Übelkeit und Erbrechen. Patienten mit mehr als 15 Migränetagen pro Monat werden als Menschen mit chronischer Migräne eingestuft. Prophylaktische Medikamente sollen die Häufigkeit und Stärke der Migräneattacken reduzieren, haben aber häufig schwere Nebenwirkungen, so dass adäquate Therapien benötigt werden. Die Pathomechanismen, insbesondere diejenigen, die zu einem Fortschreiten bis hin zur chronischen Migräne führen, sind nach wie vor nicht vollständig verstanden. Migräne-artige Kopfschmerzen können bei Migränikern zum Beispiel durch Histamin oder den 5-HT2B/2C-Rezeptoragonist meta-Chlorphenylpiperazin (mCPP) ausgelöst werden. Dass Serotonin eine zentrale Rolle bei der Migräne-Pathophysiologie spielt, wurde auch durch die Wirkmechanismen des bei akuten Attacken eingesetzten Medikaments Sumatriptan

(Affinitäten zum 5-HT1B/1D-Rezeptor) und durch des früher verwendeten Prophylaktikums

Methysergid (Affinitäten zu 5-HT1/2/7-Rezeptoren) bestätigt. Im Tiermodell dient die neurogene Inflammation der Dura mater als Indikator für Migräne- ähnliche Prozesse. Dabei kommt es zu Prozessen, wie der Vasodilatation, Plasmaproteinextravasation (PPE) und Mastzelldegranulation, die durch das calcitonin gene-related peptide (CGRP) und Substanz P (SP) induziert werden. Diese Prozesse werden auch durch Serotonin und Histamin reguliert. Mithilfe des 5-HT2-Agonisten mCPP kann eine PPE in Meerschweinchen induziert werden. Im Gegensatz zu Meerschweinchen entwickelten Mäuse nach Gabe von mCPP zunächst keine PPE, konnten aber durch eine mehrwöchige Hypoxie-Behandlung (10 % O2) anfällig gemacht werden. Dieses Modell ermöglicht die Identifizierung der Ursachen für diese Sensitivierung. Diese Ursachen könnten auch im Menschen eine Voraussetzung für das Einsetzen einer Migräneattacke darstellen. Die in dem Tiermodell beobachtete Hypoxie-induzierte Sensitivierung war abhängig vom 5-HT2B-Rezeptor und Stickstoffmonoxid (NO). In der Literatur konnte gezeigt werden, dass NO die Ausschüttung von CGRP und SP induzieren konnte. Da die Applikation dieser Neuropeptide auch zur Aktivierung von Mastzellen führen kann, ist eine Beteiligung von Mastzellen in der neurogenen Inflammation denkbar. Inwieweit Mastzellen in diesem Migräne-Modell tatsächlich eine Rolle spielen und ob sie durch die Hypoxie- Behandlung sensitiviert werden und möglicherweise sogar ursächlich für die Sensitivierung

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Zusammenfassung bei der Induktion einer PPE in Mäusen sind, wurde in dieser Arbeit untersucht. Da in diesem Modell die Induktion der PPE durch den 5-HT2B-Rezeptor erfolgte, sollte überprüft werden, ob dies auch für Mastzelldegranulation in der Dura mater von Mäusen der Fall ist. Theoretisch triggert die Aktivierung des histaminergen H1-Rezeptors dieselbe Signalkaskade und könnte somit ebenfalls eine Mastzelldegranulation verursachen. Eine erste Charakterisierung der Mastzellen ergab, dass der Großteil der Mastzellen in der murinen Dura mater vom Bindegewebstyp (CTMC) war. Diese befanden sich häufig neben Blutgefäßen und Neuropeptid-haltigen Nervenfasern oder abseits im Bindegewebe. Die ersten funktionellen Untersuchungen der duralen Mastzelldegranulation wurden in vivo vorgenommen. Allerdings erwies sich das in vivo-Modell aufgrund hoher Streuung und fehlender Reproduzierbarkeit als nicht geeignet für diese Untersuchungen. Deswegen wurde parallel dazu ein pharmakologisches ex vivo-Modell der Dura mater von normoxischen und hypoxischen Mäusen mit anschließender histologischer Untersuchung von Avidin-FITC gefärbten Mastzellen etabliert. Bei den Halbschädelexperimenten wurden Mastzellen entweder mit Histamin oder den Serotoninagonisten mCPP oder BW723C86, welche eine hohe Affinität zum 5-HT2B-Rezeptor haben, stimuliert. Dabei degranulierten die Mastzellen nur nach Applikation von Serotoninagonisten, aber nicht nach der Zugabe von Histamin. Außerdem konnte kein Unterschied in der Reaktivität der Mastzellen von normoxischen oder hypoxischen Mäusen festgestellt werden, sodass angenommen werden kann, dass keine Sensitivierung der Mastzellen durch die Hypoxie-Behandlung stattgefunden hat. Trotz Induktion der Mastzelldegranulation durch mCPP oder BW723C86 konnte eine Beteiligung des 5-HT2B-Rezeptors an der Mastzelldegranulation durch den spezifischen 5-HT2B-Rezeptorantagonisten RS127445 ausgeschlossen werden. Aufgrund der hohen benötigten Konzentration von mCPP und BW723C86 wurde eine unspezifische Bindung an andere Serotoninrezeptoren vermutet. Durch die fehlende Inhibition der mCPP- induzierten Mastzelldegranulation durch den unspezifischeren Serotoninantagonisten Methysergid ist auch die Beteiligung weiterer Serotoninrezeptoren unwahrscheinlich. Inwieweit der H1-Rezeptor, zu dem mCPP ebenfalls relativ hohe Affinität besitzt, die Ursache für die mCPP-induzierte Mastzelldegranulation ist, konnte nicht abschließend geklärt werden, da der inverse Histaminagonist Cetirizin selbst Mastzelldegranulation induzierte. Darüber hinaus ist auch die Beteiligung von CGRP an der mCPP-induzierten

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Zusammenfassung

Mastzelldegranulation unwahrscheinlich, da der CGRP-Rezeptorantagonist Olcegepant diese nicht inhibieren konnte. Neben den pharmakologischen Experimenten wurden von einzelnen Mastzellen Single Cell-PCRs von verschiedenen Rezeptoren, zu denen mCPP auch Affinitäten besitzt, durchgeführt. Im Falle einer Lokalisation dieser Rezeptoren auf Mastzellen wäre eine

Aktivierung der Mastzelldegranulation möglich. Dabei konnte eine Expression des 5-HT2A- und H1-Rezeptors auf duralen Mastzellen nachgewiesen werden. Jedoch wurde die

Beteiligung des 5-HT2A-Rezeptors an der Mastzelldegranulation durch die pharmakologischen Experimente bereits ausgeschlossen. Eine Aussage über die Expression der anderen Rezeptoren, wie den dopaminergen und muskarinisch-cholinergen Rezeptoren, konnte aufgrund von methodischen Schwierigkeiten nicht beantwortet werden. In der vorliegenden Arbeit konnten Mastzellen durch Serotoninagonisten degranuliert werden, die auch andere Prozesse der neurogenen Inflammation induzieren. Jedoch wird aufgrund des fehlenden Hypoxie-Effekts und der fehlenden Beteiligung des 5-HT2B- Rezeptors der Beitrag von duralen Mastzellen an der mCPP-induzierten PPE und der Sensitivierung in Frage gestellt. Allerdings kann nicht ausgeschlossen werden, dass durch die Ausschüttung proinflammatorischer Substanzen aus Mastzellen und der damit verbundenen Sensitivierung von Nozizeptoren die Inflammation aufrechterhalten wird. Deswegen sollten weitere Experimente sich darauf konzentrieren den Beitrag von Mastzellen auf andere Prozesse der neurogenen Inflammation zu untersuchen, indem Mastzellen-Knockout Mäuse verwendet werden oder Mastzellen pharmakologisch stabilisiert werden. Dies könnte dazu beitragen ihre Rolle in der Migräne-Pathophysiologie besser einzuschätzen und zu verstehen.

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Abstract

Abstract

Migraine is a one-sided pulsating pain often accompanied by photo- and phonophobia, nausea and vomiting. Patients suffering more than 15 days per month of migraine are diagnosed with chronic migraine. Prophylactic medications reduce frequency and severity, but often cause severe adverse effects, making it necessary to find adequate cure. Although migraine has intensively been studied, the pathomechanism is still not fully understood.

Migraine-like headaches can be induced in migraineurs by histamine and the 5-HT2B/2C agonist meta-chlorophenylpiperazine (mCPP). An involvement of serotonin in migraine- related processes was confirmed by the effectivity of the drug sumatriptan (affinity to 5-

HT1B/1D receptors) in preventing acute migraine attacks and the prophylactic agent methysergide (affinity to the 5-HT1/2/7 receptors). In animal models, neurogenic inflammation in the dura mater serves as an indicator for migraine-like processes. It involves vasodilation, plasma protein extravasation (PPE) and mast cell degranulation triggered directly by calcitonin gene-related peptide (CGRP) and substance P (SP). These processes are modulated by serotonin and histamine. mCPP, for example, induces PPE in guinea pigs. In contrast to guinea pigs, mice do not develop PPE after mCPP application, but can be rendered susceptible by hypoxia treatment (10 % O2) for several weeks. Hypoxic mice may therefore allow the identification of mechanisms leading to susceptibility towards migraine-associated processes, which may also be relevant in humans. In the animal model, it was found that the sensitization is 5-HT2B receptor and nitric oxide (NO) dependent. In the literature, it could be shown that NO induces the release of CGRP and SP. Since the application of these neuropeptides also triggered mast cell degranulation, an involvement of mast cells in the neurogenic inflammation is hypothesized. Therefore, in this thesis I examined to what extent mast cells were involved in the chronic migraine model und if mast cells were sensitized by hypoxia treatment and therefore responsible for the sensitization of the PPE induction in mice. As the induction of

PPE was 5-HT2B receptor dependent an activation of mast cells by this receptor was investigated. The activation of the histamine H1 is expected to trigger the same signaling cascade, potentially resulting in the same effects. The intial characterization of murine mast cells in the dura mater revealed that the majority of resident mast cells are of the connective tissue type. They often occurred in the

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Abstract neighborhood of blood vessels, neuropeptide containing nerve fibers or were seen within the connective tissue. First functional examinations of mast cell degranulation were performed in a physiological environment in vivo, but these experiments lacked sufficient reproducibility and displayed massive scattering of results. Therefore, a pharmacological half skull ex vivo model with subsequent histological examinations of avidin-FITC stained mast cells in normoxic and hypoxic mice was established. In the half skull experiments mast cells were either stimulated with histamine or the serotonin agonists mCPP and

BW723C86, both with high affinities to the 5-HT2B receptor. Only the serotonin agonists, not histamine, induced massive mast cell degranulation. Additionally, no difference in the reaction of mast cells could be observed between normoxia or hypoxia treated mice, indicating a lack of sensitization of mast cells by hypoxia treatment. Although mast cell degranulation was induced by mCPP and BW723C86, the contribution of 5-HT2B receptors was excluded with the specific 5-HT2B receptor antagonist RS127445. Since high concentrations of mCPP and BW723C86 were needed to induce mast cell degranulation, an unspecific binding to other serotonergic receptors was assumed. However, inhibition by methysergide was not observed, rendering the involvement of other serotonin receptors unlikely. Another potential trigger of the mast cell degranulation was the H1 receptor, to which mCPP has relatively high affinity. The inverse histamine agonist cetirizine induced mast cell degranulation by itself, while histamine had no effect. This rendered an involvement of the H1 rather unlikely. Participation of CGRP, a key modulator of migraine, in the induction of mast cell degranulation is also unlikely since the CGRP receptor antagonist Olcegepant did not display an inhibiting effect. Apart from the pharmacological experiments a first attempt of Single Cell PCR of various receptors on dural mast cells was performed, since mCPP shows relatively high affinities to various other receptors in addition to serotonergic receptors. Expression of these receptor on mast cells would suggest a potential participation of these receptors in mast cell degranulation. The results revealed that the 5-HT2A and H1 receptor are expressed on mouse dural mast cells, but the involvement of 5-HT2A receptors in mast cell degranulation is unlikely, taking the results of the pharmacological experiments into consideration. Technical constraints did not allow to draw conclusions about the expression of other receptors on dural mast cells based on these early experiments.

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Abstract

The results of this thesis showed that mast cells can be degranulated by the same serotonin agonists that have been shown to induce processes of the neurogenic inflammation.

However, the absence of a hypoxia effect and since activation of the 5-HT2B was not confirmed, the contribution of dural mast cells to the mCPP induced PPE and the sensitization observed in the murine chronic migraine model must be questioned. Nonetheless, mast cells might maintain inflammation by releasing proinflammatory substances upon activation, leading to the sensitization of nociceptors. Further investigations should focus on the of proinflammatory substances released by mast cells and whether these substances might modulate or sensitize other aspects of neurogenic inflammation. This could be done by stabilizing mast cells pharmacologically or through the usage of mast cell knock out mice. These insights might help to understand the role of mast cells in neurogenic inflammation and their contribution to mechanisms underlying the pathophysiology of migraine.

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1.Einleitung

1. Einleitung

Mastzellen gehören zum Immunsystem und sind bekanntermaßen Verursacher von Allergiesymptomen (Peavy und Metcalfe 2008). Interessanterweise wird eine Beteiligung von Mastzellen an akuten Migräne-assoziierten Prozessen vermutet (Levy 2009). Zwei bekannte Modulatoren von Migräne-assoziierten Prozessen, wie der neurogenen Inflammation der Dura mater, sind Histamin und Serotonin(agonisten). Von großem

Interesse sind insbesondere der Serotoninrezeptor 5-HT2B und der Histaminrezeptor H1. Deswegen wurde in dieser Arbeit untersucht, ob eine Mastzelldegranulation in der murinen

Dura mater über die Aktivierung des 5-HT2B- oder H1-Rezeptors ausgelöst werden kann und ob andere Migräne-relevante Moleküle bei der Induktion involviert sind. Darüber hinaus wurde eine Beteiligung von Mastzellen an sensitivierenden Mechanismen untersucht, die möglicherweise auch zu wiederkehrenden Migräneattacken im Menschen führen könnten. Die Erkenntnisse über Mastzellen in der neurogenen Inflammation könnten zur Aufklärung der Mechanismen von Migräne beitragen.

1.1 Migräne

Migräne hat eine Prävalenz von ca. 15 % in der Weltbevölkerung und ist die dritthäufigste neurologische Erkrankung, die Betroffene im Alltag stark beeinträchtigt (Steiner et al. 2013). Migräne ohne Aura wird nach der International Classification of Headache Disorders, Second Edition (ICHD-2) definiert als ein pulsierender, einseitiger Kopfschmerz, der häufig mit Photo- und Phonophobie, sowie Übelkeit und Erbrechen einhergehen kann, in der Regel zwischen 4-72 Stunden andauert und dessen Symptome sich bei physischer Aktivität verschlimmern können (International Headache Society). Eine weitere Form von Migräne ist die Migräne mit Aura. Dabei handelt es sich um visuelle Beeinträchtigungen, die eine Attacke ankündigen können (Lipton et al. 2004). Allerdings sind Schätzungen zur Folge nur ca. 5 % der Frauen und ca. 2 % der Männer in der Gesamtpopulation von Migräne mit Aura betroffen (Lipton et al. 2002). Eine chronische Migräne wird diagnostiziert, wenn nach der ICHD-2-Klassifizierung die Symptome einer Migräne für drei aufeinanderfolgende Monate an mehr als 15 Tagen im Monat auftreten ohne, dass ein Medikamentenübergebrauch vorliegt, der für verschiedene Medikamente individuell definiert wird (International Headache Society). In der Regel liegt aber nach der Seite | 1

1.Einleitung

ICHD-2 ein Medikamentenübergebrauch dann vor, wenn die Medikamente über mindestens drei Monate länger als 10 Tage pro Monat eingenommen werden. Die Erhöhung der Kopfschmerz-Frequenz, wie bei chronischer Migräne, kann zu einem Übergebrauch an akuten Medikamenten führen, was wiederum Medikamenten-induzierten Kopfschmerz verursachen kann (Eross 2006). Um einen Medikamentenübergebrauch zu vermeiden, können prophylaktische Behandlungen angewendet werden, die aber aufgrund der zahlreichen Kontraindikation und Nebenwirkungen nicht für jeden geeignet sind (Parsekyan 2000). Ein Bedarf an nebenwirkungsarmen und effektiven Prophylaktika ist also gegeben. Eine genaue Aufklärung der Pathomechanismen, die bei chronischer Migräne eine Rolle spielen und diese von akuten episodischen Attacken unterscheiden, ist zu diesem Zweck absolut notwendig. Interessanterweise ist Migräne auch eine häufige Begleiterkrankung bei Mastozytose- Patienten, die eine erhöhte Anzahl von Mastzellen besitzen (Smith et al. 2011). Ein Zusammenhang zwischen Migräne und verschiedenen allergischen Erkrankungen, bei denen das Histamin aus Mastzellen für die Symptome ursächlich sind, wird in der Literatur diskutiert (Gazerani et al. 2003).

1.2 Mastzellen

Mastzellen wurden 1878 das erste Mal von Paul Ehrlich in seiner Dissertation beschrieben (Ehrlich 1878). Ihr Name entstand aufgrund ihrer „gemästeten“ Erscheinung. Heutzutage ist bekannt, dass diese Erscheinung nicht durch eine Aufnahme von Stoffen herrührt, sondern durch die Synthese und das Speichern von Proteoglykanen wie Heparin, Proteasen wie Tryptase und Chymase, biogenen Amine wie Serotonin und Histamin, Prostaglandine, Leukotriene, Zytokine und viele mehr (Riley 1953; Metcalfe et al. 1997; Aich et al. 2015). Jedoch existieren in Nagern zwei Typen von Mastzellen, die Bindegewebsmastzellen (englisch: „connective tissue mast cells“, CTMC) und die mukosalen Mastzellen (englisch: „mucosal mast cell“, MMC), die sich unter anderem in ihrem Protease- und Proteoglykangehalt unterscheiden (Metcalfe et al. 1997). Aufgrund der unterschiedlichen Färbeeigenschaften der Glykosaminoglykane können die zwei Mastzelltypen in Nagetieren mithilfe einer Alcianblau-Safranin (AS)-Färbung unterschieden werden. Dabei werden die

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1.Einleitung

Granulae der MMC durch das Alcianblau hellblau und CTMC durch das Safranin rot gefärbt (Enerbäck 1966; Gibson et al. 1987; Michaloudi et al. 2007). Mastzellen stammen von hämatopoetischen Vorläuferzellen aus dem Knochenmark ab (Kitamura et al. 1977) und differenzieren sich im Gewebe. Sie sind häufig zahlreich in Geweben lokalisiert, die mit der äußeren Umwelt in Kontakt kommen, wie zum Beispiel in der Haut (Benyon 1989), im Gastrointestinaltrakt, vor allem im Magen (Stanovnik et al. 1988), und in den Atemwegen (Riley 1959). Dort spielen sie als Teil des angeborenen Immunsystems eine wesentliche Rolle bei der Immunabwehr von Pathogenen (Echtenacher et al. 1996). Darüber hinaus sind sie bekanntermaßen für die Ausbildung von allergischen Symptomen bis hin zur Anaphylaxie verantwortlich (Peavy und Metcalfe 2008). Die Aktivierung von Mastzellen erfolgt bei einer Allergie erst nach einer Sensitivierung mit dem Antigen. Dies geschieht indem Antigen-spezifische Immunglobuline des Typs E (IgE) aus B-Zellen an den FcεRI-Rezeptor von Mastzellen binden. Erst beim Zweitkontakt mit dem Antigen werden Mastzellen aktiviert, in dem sich IgEs vernetzen (Metcalfe et al. 1997; Galli und Tsai 2012). Das ausgeschüttete Histamin aus aktivierten Mastzellen verursacht durch antidromische Stimulation von Peptid-haltigen Nervenendigungen allergische Symptome wie Schwellung und Rötung (Benyon 1989). Es gibt aber auch FcεRI-unabhängige Aktivierungswege, zum Beispiel durch das Corticotropin-releasing hormone (Theoharides et al. 1995) oder den Stem Cell Factor (Taylor et al. 1995). Eine Aktivierung von Mastzellen hat die Ausschüttung der biogenen Amine Serotonin und Histamin zur Folge (Ottosson und Edvinsson 1997; Manning et al. 2016). Beide Substanzen sind entscheidend für die Modulation Migräne-assoziierter Prozesse. Zusätzlich sind Mastzellen zahlreich in der Dura mater lokalisiert (Dimlich et al. 1991), die als schmerzsensitive Struktur im Schädel, eine zentrale Rolle in der Migräne-Pathophysiologie spielt.

1.3 Neurogene Inflammation der Dura mater

Die neurogene Inflammation der Dura mater wurde als ein möglicher Erklärungsansatz für Migräne 1993 von Moskowitz vorgestellt (Moskowitz 1993). Die Dura mater wird von nicht-myelinisierten C-Fasern des ophthalmischen Astes des Nervus trigeminus innerviert und gehört somit zu den schmerzsensitiven Strukturen im Schädel (Fricke et al. 2001). Die

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Zellkörper dieser pseudounipolaren Neurone befinden sich im trigeminalen Ganglion (TG) und projizieren zentral zum trigeminalen Nucleus caudalis (TNC) (Noseda und Burstein 2013). Nozizeptive Signale werden für die Wahrnehmung von Schmerz anschließend in das thalamische Netzwerk verschaltet und zum Cortex weitergeleitet (Noseda und Burstein 2013). Die neurogene Inflammation der Dura mater ist vor allem gekennzeichnet durch eine Aktivierung der trigeminalen Afferenzen, die zur Nozizeption beitragen (Moskowitz 1993). Diese Aktivierung kann zum Beispiel durch eine elektrische Stimulation erfolgen, die dann weitere Prozesse auslöst, wie die Plasmaproteinextravasation (PPE) (Markowitz et al. 1987), bei der Plasmaproteine durch die erhöhte Permeabilität aus Blutgefäßen in das perivaskuläre Gewebe übergehen, und die Vasodilatation (Peitl et al. 1999), bei der sich muskularisierte Blutgefäße weitstellen. Dass die Aktivierung des trigeminalen Systems eine entscheidende Rolle bei Migräne spielt, zeigt die Tatsache, dass der 5-HT1B/1D- Rezeptoragonist Sumatriptan als akutes Migräne-Medikament eingesetzt wird. In der Vergangenheit wurde die Kopfschmerz-reduzierende Wirkung von Sumatriptan auf die ausgelöste Vasokonstriktion der Blutgefäße zurückgeführt (Caekebeke et al. 1992). Die

Lokalisation des 5-HT1B-Rezeptors auf der glatten Muskulatur von meningealen Arterien bestätigte diese Theorie (Longmore et al. 1997). Diese Vermutungen stammten von der vaskulären Hypothese ab, die vor der neuronalen Theorie als Ursache für Migräne vorgeschlagen wurde. Nach dieser Hypothese entsteht der Schmerz durch die Dilatation kranialer Blutgefäße, was heute zu großen Teilen als wiederlegt gilt (Goadsby 2009). Deswegen ist die Kopfschmerz-reduzierende Wirkung von Sumatriptan vermutlich eher durch die Inhibition der nozizeptiven Transmission der trigeminalen Nervenendigungen bedingt (Buzzi und Moskowitz 1990; Buzzi et al. 1991), was durch die Expression des 5-

HT1D-Rezeptors auf trigeminalen Afferenzen unterstützt wird (Longmore et al. 1997). Diese trigeminalen Afferenzen enthalten außerdem Neuropeptide wie das Calcitonin gene- related peptide (CGRP) und Substanz P (SP) (Fricke et al. 2001). Die Aktivierung trigeminaler Afferenzen und somit die Ausschüttung von CGRP (Strecker et al. 2002; Bellamy et al. 2006) und SP (Yonehara und Yoshimura 1999) kann durch Stickstoffmonoxid (NO) erfolgen. NO wirkt selbst dilatierend auf die Blutgefäße (Messlinger et al. 2000; Akerman et al. 2002) und erzeugte im Migräne-Patienten über NO- Donatoren, wie Nitroglyzerin, Migränekopfschmerz (Olesen 2008). Aber auch CGRP wird Seite | 4

1.Einleitung mit Migräne in Zusammenhang gebracht, da eine Infusion von CGRP im Migräniker Kopfschmerzen induzieren konnte (Lassen et al. 2002) und darüber hinaus festgestellt wurde, dass Migräniker während einer Attacke erhöhte CGRP-Plasmalevel aufwiesen (Goadsby et al. 1990). Zudem konnte in klinischen Studien bereits die Effektivität von CGRP-Rezeptorantagonisten, wie Olcegepant, bei der Behandlung von Kopfschmerzen gezeigt werden, was die Relevanz von CGRP in der Migräne-Pathophysiologie unterstreicht (Olesen et al. 2004). Außerdem konnte die Applikation von CGRP im Menschen (Lassen et al. 2008; Asghar et al. 2010) und im Tiermodell (Messlinger et al. 1995) zur Vasodilatation von meningealen Blutgefäßen, z. B. der Arteria meningea media (englisch: middle menigea artery, MMA) führen. Bei Ratten konnte die Vasodilatation durch Sumatriptan inhibiert werden (Shepherd et al. 1997; Wang et al. 2014). Dies weist darauf hin, dass CGRP sowohl für die Migräne-Pathophysiologie als auch für die neurogene Inflammation eine wichtige Rolle spielt. Das Neuropeptid SP hingegen spielt hauptsächlich für die Entstehung der PPE eine wichtige Rolle (Markowitz et al. 1987). Diese konnte bisher jedoch nur in einem einzigen Fall im Menschen nachgewiesen werden (Knotkova und Pappagallo 2007). Des Weiteren konnte eine Wirksamkeit von Antagonisten am NK1-Rezeptor, dem Rezeptor für SP, bei Migräne widerlegt werden (Goldstein et al. 1997). Die PPE wird jedoch als Marker für Migräne-assoziierte Prozesse gesehen, da die PPE einst zur Beurteilung der Effektivität von Sumatriptan diente, welches sowohl Kopfschmerzen als auch die PPE verhindern konnte (Buzzi und Moskowitz 1990; Johnson et al. 2003; Schuh-Hofer et al. 2003; Hunfeld et al. 2015). Beide Neuropeptide können neben der Induktion der PPE und Vasodilatation eine Degranulation von Mastzellen auslösen (Manning et al. 2016; Gaudenzio et al. 2016). Allerdings reagieren nicht beide Mastzelltypen (CTMC und MMC) gleichermaßen auf dieselben Stimuli (Metcalfe et al. 1997). MMC können, im Gegensatz zu den CTMC, nicht durch SP (Shanahan et al. 1985) und den Mastzelldegranulator Compound 48/80 (C48/80) (Enerbäck und Lundin 1974) stimuliert werden. SP spielt eine wichtige Rolle in der neurogenen Inflammation, weswegen die MMC in diesem Kontext deutlich weniger wichtig sind als die CTMC. Aus diesem Grund wurde C48/80 zur Induktion der Mastzelldegranulation für die Etablierung der Methode in der vorliegenden Arbeit genutzt werden.

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Eine Aktivierung von Mastzellen durch die beiden Neuropeptide kann erfolgen, weil diese häufig zahlreich neben Peptid-haltigen Nervenfasern in der Dura mater lokalisiert sind (Dimlich et al. 1991). Außerdem sind sie häufig in der Nähe von Blutgefäßen zu finden, was einen funktionellen Zusammenhang zwischen diesen Strukturen in der neurogenen Inflammation impliziert. Dass diese beiden Neuropeptide Mastzellen degranulieren lassen können, wird dadurch bekräftigt, dass CGRP-Rezeptoren auf duralen Mastzellen (Eftekhari et al. 2013) und NK1-Rezeptoren auf peritonealen Mastzellen (Okada et al. 1999) beschrieben wurden. Eine Aktivierung von Mastzellen und die daraus resultierende Degranulation kann wiederum zu einer Aktivierung von meningealen Nozizeptoren führen (Levy et al. 2007), was somit die Inflammation aufrechterhalten könnte. Levy et al. verwendeten in dieser Studie C48/80 zur Induktion einer Mastzelldegranulation. Diese Substanz wurde bereits in vielen verschiedenen Studien zur Degranulation von Mastzellen genutzt (Stanovnik et al. 1988; Gaudenzio et al. 2016; Chatterjea et al. 2012; Yao et al. 2014; Pedersen et al. 2015; Kilinc et al. 2016). So eine Aktivierung von Mastzellen führt zur Exozytose des Granula-Inhalts durch die Verschmelzung der Zellmembran mit der Granula-Membran (Röhlich et al. 1971) und somit zur Freisetzung der gespeicherten Stoffe, wie zum Beispiel Serotonin und Histamin (Ottosson und Edvinsson 1997; Manning et al. 2016). Beide Substanzen modulieren sowohl die Migräne-Pathophysiologie als auch die Prozesse der neurogenen Inflammation.

1.4 Modulation durch Serotonin und Histamin

Seit längerem wird die Rolle von Histamin in der Migräne-Pathophysiologie untersucht. Es konnte zum Beispiel festgestellt werden, dass Histamin bei intravenöser Gabe in Migränikern Migräne-ähnliche Kopfschmerzen auslösen kann, was durch den Histamin 1 (H1)-Rezeptor vermittelt wird (Krabbe und Olesen 1980). Dies ist im Einklang mit Ergebnissen einer Studie, bei der der Histamin-induzierte Kopfschmerz durch den H1- Rezeptorantagonisten Mepyramin akut verhindert werden konnte (Lassen et al. 1995). Einen Zusammenhang von Histamin und Migräne wurde zusätzlich durch Wirksamkeit einiger Antihistaminika als Prophylaktika bestätigt (Togha et al. 2008; Lewis et al. 2004) und darüber hinaus wurde bei Migräne-Patienten ein erhöhter Blutplasmaspiegel von Histamin während der Migräneattacke und in den Remissionsphasen gezeigt (Heatley et al.

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1982). Diese Erkenntnisse lassen eine Beteiligung von Histamin an der Migräne- Pathophysiologie vermuten. In der neurogenen Inflammation reguliert Histamin verschiedene Prozesse. Die Histaminrezeptoren H1 und H2 wurden in Endothelzellen und auf Glattmuskelzellen der humanen MMA nachgewiesen (Jansen-Olesen et al. 1997). Funktionell induzieren sowohl der H2-Rezeptor in der glatten Muskulatur als auch NO des endothelialen H1-Rezeptor eine Relaxation der Blutgefäße (Jansen-Olesen et al. 1997). Die durch den H2-Rezeptor vermittelte Vasodilatation wird vermutlich durch das ausgeschüttete Histamin aus Mastzellen ausgelöst (Powell und Brody 1976). Histamin kann neben der Vasodilatation auch eine gesteigerte Permeabilität von Blutgefäßen erzeugen (Ashina et al. 2015). Im Gegensatz dazu besitzt der H3-Rezeptor eine inhibierende regulatorische Funktion auf die neurogene Inflammation, da seine Aktivierung die Ausschüttung von SP (Ohkubo et al. 1995) und CGRP aus C-Fasern verhindert (Imamura et al. 1996). Aber auch Histaminrezeptoren auf Mastzellen beeinflussen die neurogene Inflammation. Die Expression einiger Histaminrezeptoren (H1, H2, H4) wurde bereits auf Mastzellen der humanen Haut gezeigt (Lippert et al. 2004). Der H4-Rezeptor ist für Chemotaxis zuständig (Hofstra et al. 2003). Die Rezeptoren H1 und H2 auf Mastzellen beeinflussen die weitere Ausschüttung von endogenem Histamin aus Mastzellen kompetitiv (Lippert et al. 2004), wobei der H2-Rezeptor eine inhibierende Wirkung auf die Ausschüttung besitzt (Hofstra et al. 2003). Diese Literaturdaten weisen somit nicht nur eine Beteiligung von Histamin und Histaminrezeptoren in der Modulation der neurogenen Inflammation hin, sondern auch auf eine Beteiligung von Mastzellen. Neben Histamin steht auch Serotonin im Fokus der Migräne-Forschung. Ähnlich wie bei Histamin konnte auch für Serotonin eine Veränderung des Blutplasmaspiegels in Migräne- Patienten beobachtet werden. Im Gegensatz zu Histamin stieg der Plasmaspiegel von Serotonin vor der Attacke jedoch leicht an und sank dann während der Attacke rapide ab

(Anthony et al. 1967). Außerdem wird der 5-HT1B/D-Rezeptoragonist Sumatriptan seit langer Zeit als akutes Migränetherapeutikum eingesetzt (Ferrari 1991). Aber auch Serotoninantagonisten wurden im klinischen Alltag zur prophylaktischen Behandlung von chronischer Migräne in der Vergangenheit verwendet. So wurde lange Zeit zur Prophylaxe der 5-HT1/2/7-Rezeptorantagonist Methysergid eingesetzt, welches aber mittlerweile aufgrund seiner starken Nebenwirkungen, wie zum Beispiel die Retroperitonealfibrose, Seite | 7

1.Einleitung nicht mehr für die Migräne-Therapie geeignet ist (Diamond 2007). Auf der anderen Seite konnte der 5-HT2B/2C-Rezeptoragonist meta-Chlorphenylpiperazin (mCPP) im Migräniker häufiger Kopfschmerzen im Vergleich zu gesunden Probanden induzieren (Brewerton et al. 1988; Leone et al. 2000).

In der neurogenen Inflammation kann die Aktivierung des Serotoninrezeptors 5-HT2B durch mCPP die Permeabilität von Blutgefäßen steigern und dadurch eine PPE in der Dura mater induzieren (Johnson et al. 2003; Hunfeld et al. 2015; Bonhaus et al. 1999b; Schmitz et al.

2015). Diese kann durch 5-HT2B-Rezeptorantagonisten wie BF-1 in Meerschweinchen (Schmitz et al. 2015) und Mäusen (Hunfeld et al. 2015), sowie durch LY202146 in Meerschweinchen (Johnson et al. 2003) und durch RS127445 in Ratten (Bonhaus et al.

1999b) inhibiert werden. Dies lässt darauf schließen, dass der 5-HT2B-Rezeptor in der neurogenen Inflammation eine zentrale Rolle spielt. Außerdem konnte die Expression des

5-HT2B-Rezeptors in der humanen Dura mater und MMA (Schmuck et al. 1996), auf humanen Endothelzellen, sowie in geringerer Ausprägung auch auf humanen

Glattmuskelzellen (Ullmer et al. 1995) nachgewiesen werden. Inwieweit der 5-HT2B- Rezeptor auch auf Endothelzellen von meningealen Blutgefäßen der Maus lokalisiert, ist nicht bekannt. Dieser Rezeptor steht aber im Fokus des chronischen Maus-Migräne- Modells des Lehrstuhls für Tierphysiologie, bei dem eine Sensitivierung von Mäusen gegenüber PPE-Triggern (mCPP) durch eine Hypoxie-Behandlung festgestellt werden konnte. Die Prozesse, die diese Sensitivierung verursachen, sind möglicherweise auch im Migräniker für eine erhöhte Anfälligkeit verantwortlich.

1.5 Der 5-HT2B-Rezeptor in einem Maus-Migräne-Modell

Die PPE wird als ein Indikator für eine akute Migräneattacke angesehen und deshalb häufig in Tiermodellen untersucht. In Meerschweinchen wird eine PPE durch die Aktivierung des

5-HT2B-Rezeptors bereits durch eine geringe Dosierung von mCPP induziert (Johnson et al. 2003; Schmitz et al. 2015). Da die Substanz im Menschen Migräne-artige Kopfschmerzen aus (Brewerton et al. 1988; Leone et al. 2000) auslöst und im Meerschweinchen Migräne- assoziierte Prozesse induziert, kann das Meerschweinchen, das für diesen Migräne-Trigger anfällig ist, als ein Modellorganismus für Migräne angesehen werden. Mäuse hingegen werden erst nach einer vierwöchigen Hypoxie-Behandlung (10 % Sauerstoff, 90 %

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Stickstoff) sensitiv gegenüber mCPP, was sogar weitere Wochen anhält (Hunfeld et al. 2015). Im Menschen konnte gezeigt werden, dass normobare Hypoxie auch bei Migränikern eine Migräne-Attacke auslösen kann (Schoonman et al.). Außerdem wurde in einer anderen Studie gezeigt, dass bei Bevölkerungen, die in höhergelegenen Regionen leben und somit chronischer Hypoxie ausgesetzt sind, im Gegensatz zu Bevölkerungen, die auf Meereshöhe leben, eine erhöhte Prävalenz von Kopfschmerzen und Migräne beobachtet werden kann (Jaillard et al. 1997). In dem Mausmodell für chronische Migräne kam es durch die Hypoxie-Behandlung zu physiologischen Veränderungen, welche dazu führten, dass Mäuse für Migräne-assoziierte Prozesse anfälliger wurden (Hunfeld et al. 2015). Welche Mechanismen zu Grunde liegen, konnte bisher nicht abschließend geklärt werden. Diese Mechanismen involvieren aber den

5-HT2B-Rezeptor und NO, da die PPE mit dem spezifischen 5-HT2B-Rezeptorantagonisten BF-1 (Schmitz et al. 2015) und mit dem unspezifischen Stickstoffmonoxidsynthase (NOS)- Inhibitor L-NG-Nitroarginine methyl ester (L-NAME) akut inhibiert wurde. Des Weiteren verhinderten die beiden Substanzen, bei täglicher Applikation während der vierwöchigen

Hypoxie, die Ausbildung der Sensitivität gegenüber dem 5-HT2B/2C-Agonisten mCPP

(Hunfeld et al. 2015). Ein weiterer Hinweis, dass die PPE durch den 5-HT2B-Rezeptor induziert wurde, lieferte der spezifischere 5-HT2B-Rezeptoragonist BW723C86, der im selben Modell ebenso eine PPE induzieren konnte. Außerdem wurde die Beteiligung des trigeminalen Systems in diesem Modell nachgewiesen, da auch das Migränemedikament Sumatriptan die akute Ausbildung einer PPE blockierte. Weitere Untersuchung am Lehrstuhl für Tierphysiologie haben im Rahmen einer Dissertation die Freisetzung von CGRP aus Nervenfasern analysiert. In dieser Arbeit konnte eine CGRP-Freisetzung sowohl bei normoxischen Tieren, also Tieren die bei normaler Raumluft gehalten wurden, als auch bei hypoxischen Tieren durch mCPP nachgewiesen werden (Haarmann 2016). Dies weist auf eine mögliche Beteiligung von CGRP in dem Modell hin. Allerdings war diese Freisetzung bei normoxischen und hypoxischen Tiere gleichermaßen induzierbar. Somit ließ dies nicht auf eine erleichterte Freisetzung von CGRP schließen, sodass dies als Ursache für die Sensitivierung durch die Hypoxie ausgeschlossen werden konnte. Da in diesem Modell bereits die PPE und die Freisetzung von CGRP intensiv untersucht wurden, sollte das Modell bezüglich Mastzellen weiter charakterisiert werden. Denn Mastzellen sind in diesem Modell von Interesse, da sie große Mengen an Histamin und Seite | 9

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Serotonin in ihren Granulae speichern (Riley 1953; Dimlich et al. 1991), die beide die neurogene Inflammation modulieren können. Außerdem können Histamin und Serotonin durch die Stimulation von CGRP und SP aus Mastzellen freigesetzt werden (Ottosson und Edvinsson 1997; Manning et al. 2016), welche ebenso Trigger der PPE und Vasodilatation und somit der neurogenen Inflammation sind. Aus diesem Grund wird seit einiger Zeit eine Beteiligung von Mastzellen an der neurogenen Inflammation vermutet (Levy 2009; Theoharides et al. 2005). Weitere Hinweise bekräftigen diese Hypothese. Zum Beispiel führte eine Aktivierung des trigeminalen Systems durch die elektrische Stimulation des TG zu einer Degranulation von duralen Mastzellen des CMTC-Typs in der Ratte (Dimitriadou et al. 1991). Diese konnte ebenso durch die Gabe eines NO-Donors induziert werden, was auf eine Rolle von NO bei der Aktivierung von Mastzellen hinweist (Pedersen et al. 2015). Eine Aktivierung von Mastzellen wiederum konnte durch die Ausschüttung von Histamin eine Vasodilatation (Akerman et al. 2002) und PPE (Ashina et al. 2015) induzieren. Das ausgeschüttete Histamin konnte aber auch, genau wie Serotonin, meningeale Nozizeptoren aktivieren (Levy et al. 2007) und diese sensitivieren (Zhang und Levy 2008). Dadurch könnten die Prozesse der neurogenen Inflammation aufrechterhalten werden. Diese Hypothese wird auch durch Aich et al. bekräftigt, die anhand verschiedener Literaturdaten vermuten, dass Mastzelldegranulation zu einer neuronalen Sensitivierung über die Aktivierung von Acid-sensing ion channels (ASICs) führt. Denn Mastzelldegranulation und CGRP-Freisetzung gehen mit einer Erniedrigung des pH-Wertes einher, was zur Aktivierung der ASICs führt (Aich et al. 2015). Somit wären Mastzellen als Grund für eine Sensitivierung durch die Hypoxie-Behandlung in dem chronischen Maus-Migräne-Modell des Lehrstuhls für Tierphysiologie denkbar.

1.6 Hypothetische Kaskade

Mit den aus der Literatur gesammelten Erkenntnissen kann die folgende hypothetische

Kaskade abgeleitet werden. Die Aktivierung des 5-HT2B- oder H1-Rezeptors führt zur Bildung von NO (Abb. 1.1, Punkt 1), da gezeigt werden konnte, dass L-NAME sowohl die PPE (Johnson et al. 2003; Hunfeld et al. 2015) als auch H1-Rezeptor-induzierte Vasodilatation inhibieren konnte (Akerman et al. 2002; Wong et al. 2004). NO wirkt dilatierend auf Blutgefäße (Messlinger et al. 2000) und aktiviert trigeminale Afferenzen

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1.Einleitung und induziert somit die Ausschüttung von CGRP (Strecker et al. 2002; Bellamy et al. 2006) und SP (Yonehara und Yoshimura 1999) (Abb. 1.1, Punkt 2&3). CGRP induziert dann die Vasodilatation (Messlinger et al. 1995) und SP die PPE (Markowitz et al. 1987; Phebus et al. 1997) (Abb. 1.1, Punkt 4). Sowohl CGRP als auch SP induzieren zusätzlich die Aktivierung der Mastzellen und somit die Ausschüttung der gespeicherten Substanzen aus den Mastzellen (Ottosson und Edvinsson 1997) (Abb. 1.1, Punkt 5&6). Histamin wiederum dilatiert Blutgefäße (Akerman et al. 2002; Powell und Brody 1976) (Abb. 1.1, Punkt 7). Histamin und auch Serotonin aktivieren dann meningeale Nozizeptoren (Levy et al. 2007) und sensitivieren diese (Zhang et al. 2007). Eine erneute Aktivierung der beiden Rezeptoren durch das ausgeschüttete Histamin und Serotonin wäre denkbar (Abb. 1.1, Punkt 8)

1.7 Fragestellung der Arbeit

Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der duralen Mastzellen bei der neurogenen Inflammation zu untersuchen. Dabei sollte insbesondere die Beteiligung von Mastzellen an sensitivierenden Mechanismen untersucht werden, die möglicherweise auch im Migräniker zu wiederkehrenden Attacken führen. Zu diesem Zweck wurde überprüft, ob die

Mastzelldegranulation in der Dura mater der Maus über eine Aktivierung des 5-HT2B- Rezeptors induziert wird, wie das für die PPE der Fall ist. Dieselbe Signalkaskade wird vermutlich auch durch den H1-Rezeptor getriggert (Kapitel 1.6), weswegen ebenso eine Beteiligung des H1-Rezeptors untersucht wurde. Bei der Induktion einer PPE durch die Hypoxie-Behandlung konnte im chronischen Maus-Migräne-Modell eine Sensitivierung beobachtet werden. Aus diesem Grund sollte überprüft werden, ob Mastzellen durch die Hypoxie-Behandlung sensitiviert werden und somit ursächlich für die beobachtete Sensitivierung sein könnten. Darüber hinaus wurden Hinweise auf eine Beteiligung anderer Migräne-assoziierter Moleküle, wie CGRP, an der Mastzelldegranulation gesammelt. Diese Untersuchungen tragen dazu bei die Mechanismen, die der Migräne-Pathophysiologie zu Grunde liegen, besser zu verstehen und weiter aufzuklären, um in Zukunft geeignetere Therapiemöglichkeiten für Migräne zu entwickeln.

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Abb. 1.1 Schematische Darstellung der hypothetischen Kaskade der Mastzelldegranulation in der neurogenen Inflammation

Ein möglicher Ausgangspunkt dieser Kaskade könnte die Aktivierung der NOS-gekoppelten Rezeptoren 5-HT2B oder H1 auf duralen Blutgefäßen sein (1). NO kann dilatierend auf Blutgefäße wirken und trigeminale Afferenzen reizen (2), was zur Ausschüttung von Mediatoren wie CGRP und SP führt (3). SP induziert dabei die PPE und CGRP die Vasodilatation (4). Beide Substanzen können auch Mastzellen aktivieren (5), was zur Ausschüttung des Granula-Inhaltes führt (6), welcher auch Histamin und Serotonin enthält. Histamin und Serotonin können wiederum trigeminale Afferenzen aktivieren und sensibilisieren. Histamin kann darüber hinaus über die Freisetzung von NO durch den H1-Rezeptor eine

Vasodilatation auslösen (7). Eine weitere Aktivierung des 5-HT2B-Rezeptors wäre denkbar (8). Für diese Abbildung wurden einige Vorlagen von Motifolio© verwendet.

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2.Material und Methoden

2. Material und Methoden 2.1 Material

2.1.1 Tiere

Die verwendeten Mäuse waren Weibchen des NMRI-Stammes (Naval Medical Research Institute), welche in der Regel zwischen 12-16 Wochen alt waren. Die Tiere wurden vom Lehrstuhl für Tierphysiologie selber gezüchtet und wurden entsprechend ihrer Anzahl in Typ II, III oder IV Käfigen mit Futter und Wasser ad libitum im 12 Stunden Tag/Nacht- Rhythmus gehalten. Die Temperatur betrug 21-22 °C mit einer Luftfeuchtigkeit von 50- 60 %. Die Haltung sowie die Versuche wurden in Übereinstimmung mit den aktuellen Richtlinien des Tierschutzgesetzes durchgeführt. Die in vivo Versuche fanden im Rahmen eines genehmigten Tierversuchsantrags statt. Für die immunhistochemische Färbung wurden Tie2-GFP-Mäuse verwendet, deren Endothelzellen unter der Kontrolle des Tie2- Promotors das grün fluoreszierende Protein (englisch: green fluorescent protein, GFP) exprimieren, sodass diese mithilfe der Fluoreszensmikroskopie sichtbar gemacht werden konnten (Motoike et al. 2000). Auch diese Mäuse stammten aus eigener Zucht und wurden unter denselben Bedingungen gehalten wie diese. 2.1.2 Farbstoffe Tab. 2.1 Für die Histologie verwendete Farbstoffe

Farbstoff Firma LOT Nummer Alcianblau Lösung (C.I.74240), 10 % Merck Millipore (DE) HX41681647 Fluorescein Avidin D (Avidin-FITC) Vectorlabs (US) W1124 Rhodamin Avidin D Vectorlabs (US) Z1018 Safranin O (C.I. 50240) Waldeck GmbH& CO. 1B-463 KG (DE)

2.1.3 Kits

Für die Synthese der coding DNA (cDNA) wurde das Revert Aid First Strand cDNA- Synthese Kit von Thermo Scientific (DE) nach Anleitung verwendet.

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2.Material und Methoden

2.1.4 Chemikalien

Tab. 2.2 Chemikalienliste

Chemikalie Firma

Atemkalk Intersorb Plus™ Intersurigcal GmbH (DE)

BSA Sigma-Aldrich (DE)

Calciumchlorid (techn.) VWR International GmbH (DE)

Confocal Matrix® Micro-Tech-Lab (AT)

Dispase BD Biosciences (DE)

DNA Ladder GeneRuler™ 50bp Thermo Fisher Scientific (US)

DNase I Roche Diagnostics (DE)

dNTP Mix Bioline (UK)

Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich (DE) (PBS) EDTA Sigma-Aldrich (DE)

Ethidiumbromid Carl Roth GmbH & CO. KG (DE)

Euparal Eindeckmedium Carl Roth GmbH & CO. KG (DE)

Fetales Kälberserum (FCS) Sigma-Aldrich (DE)

HEPES Applichem (DE)

Isofluran CP® CP-Pharma Handelsgesellschaft GmbH

Kollagenase Typ II CellSystems (DE)

Kollagenase Typ IV CellSystems (DE)

PCR Puffer (10x) mit MgCl2 Sigma-Aldrich (DE)

Roti®-ImmunoBlock Carl Roth GmbH & CO. KG (DE)

RPMI-1640 Medium mit L-Glutamin und Sigma-Aldrich (DE) Natriumbicarbonat Taq DNA Polymerase Sigma-Aldrich (DE)

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2.Material und Methoden

2.1.5 Pharmakologische Substanzen

Tab. 2.3 Verwendete pharmakologische Substanzen

Substanz Firma LOT Nummer BW723C86 hydrochlorid Tocris (UK) 3B/169121 Cetirizin dihydrochlorid Sigma Aldrich (DE) 642M4707V Compound 48/80 Enzo Life Sciences (DE) Altes Batch: 04021318 trihydrochlorid Neues Batch:12011430 Histamin dihydochlorid Sigma Aldrich (DE) BCBL7700V WXBC3017V mCPP hydrochlorid Tocris (UK) 8A/144969 Methysergid Maleat Tocris (UK) 2A/183237 Olcegepant Santa Cruz (DE) E0417 RS127745 hydrochlorid Sigma Aldrich (DE) 031M4630V

2.1.6 Verbrauchsmaterialien

Tab. 2.4 Verbrauchsmaterial

Verbrauchsmaterial Hersteller 30 µM MACS® Smart Strainer Miltenyi Biotech GmbH (DE) Objektträger Superfrost® Plus, Menzel-Gläser Thermo Fischer Scientific (DE) Stickstoff 5.0 Air Liquide (DE) TC-Platte 12 Well, Standard F Sarstedt AG & Co (DE) TC-Platte 24 Well, Standard F Sarstedt AG & Co (DE) TC-Schale 35, Standard Sarstedt AG & Co (DE)

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2.Material und Methoden

2.1.7 Puffer und Lösungen

Tab. 2.5 Hergestellte Puffer und Lösungen

0,01 M PBS, pH 7,3 0,01 M PB 0,14 M NaCl

0,2 M Phosphat Buffer (PB), pH 7,3 0,1 M NaH2PO4 monohydrat

0,1 M Na2HPO4 dihydrat In Aqua bidestillata (A.bidest) 4 % Formaldehyd (FA), pH 7,3 4 % FA 0,1 M PB 4 % Formaldehyd mit 0,1 M PBS, pH 7,3 4 % FA 0,1 M PBS Carnoy 60 % (v/v) Ethanol 30 % (v/v) Chloroform 10 % (v/v) Eisessig Kollagenaselösung Kollagenase TypII (Worthington) 200 U/ml in PBS 0,1 M

MACS Puffer, pH 7,2 1 x PBS 0,5 % (w/v) BSA 2 mM EDTA RMPI Medium RPMI 10 % (v/v) FCS 10 U/ml Penicillin 100 μg/ml Streptomycin 25 mM HEPES, pH 7,0-7,6 Synthetic interstial fluid (SIF) 107,7 mM NaCl 3,48 mM KCl

0,69 mM MgSO4

26,20 mM NaHCO3

1,67 mM NaH2PO4 x 2H2O 9,64 mM Na+-Gluconat 5,55 mM Glucose 7,6 mM Saccharose in A.bidest

Begasen mit CO2 für 10 min

1,53 mM CaCl2 x H2O pH-Wert 7,4 einstellen Verdauungsansatz 0,005 % (w/v) Kollagenase Typ II 0,005 % (w/v) Kollagenase Typ VI 1 U/ml Dispase 100 U/ml DNaseI

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2.Material und Methoden

2.1.8 Primersequenzen

Tab. 2.6 Primersequenzen für Single Cell PCR

Primer Sequenz Produkt Annealing- (bp) temperatur

ms5-HT2A fw CTGCTGGGTTTCCTTGTCAT 204 bp 58 °C ms5-HT2A fw TCTGGAGTTGAAGCGGCTAT

ms/hu5-HT2B fw ATTGTTTGTGATGCCGATTG 139 bp 56 °C

ms/hu5-HT2B rev GGAAATGGCACAGAGATGC ms5-HT2C fw CCATTGCTGATATGCTGGTG 224 bp 58 °C ms5-HT2C rev CTTAGTCCGCGAATTGAACC msH1 (Botta) fw CCTGATTGTAGGGGCAATCG 467 bp 58 °C msH1 (Botta) rev GCCGCACAGCCTTGTAGATC ms H2 fw AGGTAGATGGCAGGAGGAGA 187 bp 58 °C ms H2 rev TGATGGTTGGAAGGGTCTCC

hu/ms 5-HT7 fw TCTTCATCGCCATGGACGTC 181 bp 58 °C

hu/ms 5-HT7 rev GGAGGTAAGGTGATGGAGGC ms Drd1 fw TTTGGAGAGATGTGGCACCA 231 bp 56 °C ms Drd1 rev GCTTGCTTTCCACCTGTCTT ms Drd2 fw AGTGAACAGGCGGAGAATGG 293 bp 56 °C ms Drd2 rev TGCGGCTCATCGTCTTAAGG ms Chrm1 fw AAGCCACGTAACTAGTGGGC 401 bp 56 °C ms Chrm1 rev TGGAAGCCTGGGTGTTGTTT ms Chrm3 fw AAGGCACGAAACGGTCATCT 219 bp 56 °C ms Chrm3 rev GAGGATGGTGCTATGACCCG ms HPRT3 fw AGTTCTTTGCTGACCTGCTG 139 bp 58 °C ms HPRT3 rv CCACCAATAACTTTTATGTCCCC

2.1.9 Antikörper

Tab. 2.7 Verwendete Antikörper für die Immunhistochemische Färbung

Prim. AK Sek. AK Antigen CGRP IgG Für Spezies Ratte, Mensch Schaf Wirt Schaf Hase Klonalität polyklonal - Konjugat - Cy3 (rote Fluoreszenz) Hersteller Enzo Life Sciences GmbH (DE) Dianova GmbH (DE)

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2.Material und Methoden

2.1.10 Programme

Tab. 2.8 Software Programme

Software Hersteller Adobe Photoshop CS6, extended Adobe Systems Inc. (US) Diskus Carl H. Hilgers Technisches Büro (DE) ImageJ National Institute of Health (US) Microsoft Excel 2016 Microsoft Corporation (DE) Motiofolio Motiofolio Inc. OriginPro 2017G OriginLab (DE) Sigmaplot 12.5 Systat Software GmbH (DE)

2.1.11 Geräte Tab. 2.9 Geräte

Gerät Hersteller Axiopatch 200B Molecular Devices (US) Axioskop 2 Carl Zeiss (DE) Fluoreszenzfilter (grün) Carl Zeiss (DE) BP 470/40; BP (525/50) Fluoreszenzfilter (rot) Carl Zeiss (DE) BP 546/12; LP 590 Hypoxie-Kammer Fakultätsinterne Werkstatt RUB (DE) Inverses Fluoreszenz-Mikroskop DMI8 Leica Camera (DE) Isofluran-Verdampfer (8.260 A) Harvard Apparatus (US) Kamera KY-F75U JVCKENWOOD (DE) Micropipette Puller (Model: P-97) Sutter Instruments (US)

O2-sensor: FY9600-02 Ahlborn Meß- und Regelungstechnik GmbH Objektiv Fluar 10x Carl Zeiss (DE) Objektiv Fluar 20x Carl Zeiss (DE) Objektiv Plan Neofluar 2,5x Carl Zeiss (DE) Peristaltische Pumpe Minipuls®3 Gilson Inc. (US) Robo Cycler® Gradient 96 Thermocycler Stratagene (US)

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2.Material und Methoden

2.2 Methoden

2.2.1 Hypoxie-Behandlung

Die Hypoxie-Behandlung ist seit Jahren am Lehrstuhl für Tierphysiologie etabliert (Hunfeld et al. 2015) und wurde auch hier angewendet. Die Tiere wurden für vier Wochen in normobaren Kammern unter hypoxischen Bedingungen (90 % Stickstoff, 10 %

Sauerstoff) gehalten. Die Durchflussrate des O2/N2-Gasgemisches betrug 80-200 l/h. Zu jeder Zeit wurde mithilfe eines Sauerstoffsensors die Sauerstoffkonzentration gemessen, um sie konstant bei 10 % zu halten. Atemkalk auf dem Boden der Kammer regulierte den

CO2-Gehalt. Mit Kalziumchlorid gefüllte Säulen senkten die erhöhte Luftfeuchtigkeit in den Kammern auf 40-60 % Luftfeuchtigkeit. Die Kammer wurden alle zwei Tage geöffnet, um Atemkalk und Kalziumchlorid zu wechseln, sowie Futter und Wasser aufzufüllen. Wasser und Futter stand auch hier den Tieren ad libitum zur Verfügung. Wöchentlich wurden die Tiere in neue Käfige gesetzt. Die jeweiligen Normoxie-Tiere wurden unter gleichen Futterbedingungen als Kontrollgruppe außerhalb der Kammern gehalten.

2.2.2 In vivo Inkubation

Für eine Untersuchung unter möglichst physiologischen Bedingungen wurde die Mastzelldegranulation in der Dura mater zunächst nach der in vivo Inkubation von verschiedenen Substanzen analysiert. Um die Dosierung des Narkosemittels an das Körpergewicht anzupassen, wurden die Tiere für die in vivo Versuche zunächst gewogen. Anschließend wurden sie initial rein volatil mit 5 % Isofluran in Atemluft (0,75 l/m) in einer Kammer vorbetäubt. Nach Verlust des Stell-, Lid- und Zwischenzehenreflexes wurden die Tiere in Rückenlage gelegt und an den Extremitäten fixiert. Zur Erhaltung der notwendigen Allgemeinanästhesie für die Präparation der Vena jugularis externa und der Injektion der Substanzen wurden die Tiere in eine Narkosemaske gelegt (Isofluran 2-3 %, in 21 % O2), worunter die Tiere jederzeit spontan atmen konnten. Erst nach Fehlen des Zwischenzehenreflexes wurde die Vena jugularis externa mit einer kleinen feinen Schere freipräpariert. Die zu injizierenden Substanzen waren in Saline gelöst und wurden intravenös in die Vena jugularis externa appliziert. Die Inkubationszeit für die Substanzen betrug für diese Experimente 10 min. Danach wurden die narkotisierten Tiere durch zervikale Dislokation getötet und dekapitiert. Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wurden

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2.Material und Methoden zwei von diesem Ablauf abweichende Prozeduren durchgeführt. Zum einen wurden variierenden Narkosezeiten und zum anderen verschiedene Fixiermethoden getestet. Für den Versuch mit den verschiedenen Narkoselängen (Abb. 4.2) wurden die Tiere, wie oben beschrieben, in Narkose versetzt, verweilten entweder 5 oder 30 min in der Narkose, erhielten aber im Gegensatz zu der oben beschriebenen Prozedur keine Injektion. Nach Ablauf der Zeit wurden die Tiere, wie oben beschrieben, noch in Narkose mit einer zervikalen Dislokation getötet, dekapitiert und die Schädel, wie in Kapitel 2.2.3 näher erläutert, präpariert und mit 4 % FA immersionsfixiert.

Der Einfluss verschiedener Fixiermethoden auf die Mastzelldegranulation (Abb. 4.1) wurde wie folgt untersucht. Die Tiere der Gruppen, 4 % FA, 4 % FA in 0,01 M PBS und Carnoy, wurden sofort mit zervikaler Dislokation getötet, dekapitiert, die Schädel, wie unter 2.2.3 beschrieben, präpariert und mit dem jeweiligen Fixativ immersionsfixiert. Eine Narkose war daher nicht notwendig. Es wurden auch keine Injektionen durchgeführt Die Schädelkalotten wurden in formaldehydhaltigen Lösungen bei 4 °C über Nacht oder in Carnoy für drei Stunden inkubiert. Die formaldehydhaltigen Lösungen unterschieden sich dadurch, dass 4 % FA in 0,01 M PBS zusätzlich zu dem Phosphatpuffer noch Saline enthielt. Carnoy dagegen ist ein alkoholhaltiges Fixativ. Eine weitere Gruppe wurde, im Gegensatz zu den drei anderen Gruppen, nicht immersionsfixiert, sondern mithilfe einer Perfusion mit 4 % FA. Dies soll besonders Gewebeschonend und schnell-fixierend sein. Dazu wurden die Tiere, wie oben beschrieben mit Isofluran in Narkose gelegt. Die Mäuse wurden auf dem Rücken liegend in der Narkosemaske auf dem Perfusionstisch fixiert, sodass die Vorderextremitäten das Operationsfeld nicht verdecken konnten. Auch hier wurde der Zwischenzehenreflex überprüft. Anschließend wurde der Brustkorb eröffnet, das Herz freigelegt und eine Kanüle (23 G, 0,6 mm x 25 mm) in den linken Ventrikel eingeführt und mittels Klemme fixiert. Dann wurde der rechte Vorhof eröffnet, um das Abfließen des Blutes und des Fixativs zu garantieren. Mithilfe einer peristaltischen Pumpe wurde über die in den Ventrikel eingeführte Kanüle zunächst 0,01 M PBS (Raumtemperatur) durch den Körperkreislauf gepumpt. Nachdem das Blut herausgespült worden war, wurde das Gewebe mit 4 % FA, dass durch den Körperkreislauf geleitet wurde, fixiert. Im Anschluss wurden die Tiere

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2.Material und Methoden dekapitiert und der Schädel, wie unter 2.2.3 beschrieben, präpariert. Die Behandlung der einzelnen Gruppen für den Versuch sind in Tab. 2.10 zusammengefasst.

Tab. 2.10 Übersicht über verschiedenen Fixiermethoden

Gruppe Fixierung Tötung Narkose 4 % FA Immersionsfixierung Zervikale Dislokation Nein 4 % FA in 0,01 M PBS Immersionsfixierung Zervikale Dislokation Nein Perfusionsfixierung 4 % FA Perfusionsfixierung Durch Perfusion Ja Carnoy Immersionsfixierung Zervikale Dislokation Nein

Für alle weiteren Versuche gilt, dass die Gruppe „Nativ“ nur durch zervikale Dislokation getötet wurde und keine weiteren Behandlungen erfolgten. Tiere, der Gruppe „Schein-OP ohne Injektion“ wurden mit Isofluran in Narkose gelegt und die Vena jugularis externa freipräpariert ohne das eine Injektion erfolgte. Anschließend wurden die Tiere mit zervikaler Dislokation in Narkose getötet. Den Gruppen „Saline“, „C48/80“ und „mCPP“ wurde zusätzlich nach der Freipräparation der Vena jugularis externa entweder Saline, C48/80 oder mCPP intravenös appliziert und die Tiere dann noch in Narkose durch zervikale Dislokation getötet. Die Präparation erfolgte bei allen, wie unter 2.2.3 beschrieben, mit anschließender Immersionsfixierung mit 4 % FA. Die verschiedenen Behandlungen sind in Tab. 2.11 übersichtlich dargestellt.

Tab. 2.11 Übersicht über die verschiedenen Behandlungen Freipräparation Gruppe Narkose Injektion Tötung der V. jugularis Nativ x x x Zervikale Dislokation Ohne ✓ ✓ x Zervikale Dislokation in Narkose Injektion Saline ✓ ✓ Saline Zervikale Dislokation in Narkose mCPP ✓ ✓ mCPP Zervikale Dislokation in Narkose C48/80 ✓ ✓ C48/80 Zervikale Dislokation in Narkose

2.2.3 Schädelkalotten-Präparation und Inkubation für die ex vivo Versuche

Als Alternative zu den problematischen in vivo-Versuchen wurde die ex vivo-Methode etabliert. Dabei wurden die Substanzen nicht intravenös appliziert, sondern im Schädel

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2.Material und Methoden inkubiert wurden, sodass sich die Dura mater in einer Art Organbad befand. Für die Inkubation der verschiedenen Substanzen in der Schädelkalotte mit anhaftender Dura mater erfolgte die zervikale Dislokation und Dekapitation der Tiere mit anschließender Entfernung des Fells sowie der Haut des Schädels mit dem Skalpell. Mithilfe einer Schere wurde der Schädel, ausgehend vom Foramen magnum, durch laterale Schnitte nach rostral geöffnet und der untere Teil des Schädels samt unterem Gebiss vom Rest des Schädels getrennt Abb. 2.1A&B). Danach wurde ein Teil des Gaumendachs entfernt, um die Öffnung zu erweitern (Abb. 2.1C). Im Anschluss wurde das Gehirn unter Zuhilfenahme eines Spatels aus dem Schädel entfernt und somit die Dura mater freigelegt (Abb. 2.1D). Der Schädel wurde durch eine Abtrennung der vorderen Rostrums verkleinert, sodass dieser genau in eine 12-Well Platte passte, um den Schädel stabil in der Platte transportieren zu können (Abb. 2.1E). Die Substanzen wurden im synthetic interstitial fluid Puffer (SIF) gelöst, der dafür entwickelt wurde eine möglichst physiologische Umgebung zu schaffen (Bretag 1969). Es wurden 300 µl Lösung in die Schädelkalotte gegeben (Abb. 2.1F). Die Inkubation fand in einem Wärmeschrank bei 37 °C und 5 % CO2 in 12-Well-Platten statt und dauerte zunächst 10 min und wurde im weiteren Verlauf der Versuche aufgrund der bis dahin gesammelten Ergebnisse auf 20 min verlängert. Anschließend wurde die Lösung entnommen und das Gewebe über Nacht bei 4 °C mit 4 % FA fixiert.

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2.Material und Methoden

Abb. 2.1 Schädelkalotten-Präparation für die ex vivo Versuche

Nachdem das Fell und die Haut vom Schädel der Maus entfernt worden waren, wurden seitlich Schnitte vom Foramen magnum auf Höhe der Ohröffnungen vorgenommen (A, gestrichelte Linie). Der untere Teil des Schädels sowie der Unterkiefer wurden vom Rest des Schädels gelöst (umgedrehte Ansicht in (B)). Ein kleiner Teil des Gaumendaches wurde abgetrennt (C), damit das Gehirn mithilfe eines Spatels ohne Berührung der am Schädel anhaftenden Dura mater aus dem Schädel gehoben werden konnte (D). Zum Schluss wurde der vordere Teil des Rostrums abgeschnitten (E), damit der Schädel genau in 12-Well-Platten passte (F). Die gelösten Substanzen konnten anschließend im Schädel inkubiert werden. Seite | 23

2.Material und Methoden

2.2.4 Blockierungsexperimente

Zur Eingrenzung des Rezeptors, der die Mastzelldegranulation vermittelt, sollten spezifische Rezeptorantagonisten verwendet werden. Aus diesem Grund wurden zwei Inkubationen je 20 min durchgeführt. Als Kontrolle wurde das jeweilige Vehikel für Agonist und Antagonist verwendet, um zu überprüfen, ob das Vehikel einen Effekt auf Mastzellen ausübt. Dabei wurde in der ersten Inkubationsrunde das Vehikel des Antagonisten verwendet, in der zweiten Inkubationsrunde das Vehikel, in dem Antagonisten und Agonist gelöst waren. Für die Positivkontrolle wurde in der ersten Inkubationsrunde das Vehikel des Antagonisten verwendet und bei der zweiten Inkubation die mastzellstimulierende Substanz, wie zum Beispiel mCPP. Des Weiteren gab es eine Antagonistenkontrolle zum Ausschluss einer Wirkung des Antagonisten auf Mastzellen. Dazu wurde der Antagonist in beiden Runden alleine inkubiert. Bei abweichendem Vehikel des Agonisten, wurde in der zweiten Inkubationsrunde der Antagonist in dem Vehikelgemisch für Antagonist und Agonist inkubiert. Die Blockierungsgruppen wurden häufig in verschiedenen Konzentrationen ausgetestet. Dabei wurde zunächst nur der Antagonist in der ersten Runde inkubiert und in der zweiten Inkubationsrunde der Antagonist mit dem Agonisten zusammen. Der Ablauf der jeweiligen Gruppen ist in Tab. 2.12 noch einmal übersichtlich dargestellt.

Tab. 2.12 Übersicht der Inkubationsreihenfolge bei den Blockierungsversuchen

Gruppe 1. Inkubation 2. Inkubation Vehikel Vehikel Antagonist Vehikel Antagonist (ggf. + Vehikel Agonist) Positivkontrolle Vehikel Antagonist Agonist Antagonistenkontrolle Antagonist Antagonist Blockierungsgruppe Antagonist Antagonist + Agonist

Zur Abschätzung der benötigten Antagonistenkonzentrationen wurde der IC50-Wert mit der Cheng-Prusoff-Gleichung (Cheng und Prusoff 1973) ermittelt und verschiedene

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2.Material und Methoden

Konzentration zum Blockieren der Rezeptoren eingesetzt. Nach den Inkubationen wurden die Lösungen verworfen und die Dura mater, wie bereits oben beschrieben, fixiert.

2.2.5 Präparation der Dura mater und Mastzellfärbung

Um die Mastzellen in der Dura mater sichtbar zu machen und untersuchen zu können, musste diese zunächst entfernt werden. Dazu wurde die fixierte Dura mater im Schädel zunächst mit 0,01 M PBS gewaschen. Bevor die Dura mater vom Schädel abgezogen wurde, wurde der parietale Teil des Schädels abgetrennt. Anschließend wurde die Zirbeldrüse entfernt und die Dura mater von Lateral nach Rostral abgezogen. Die Dura mater wurde dann drei Mal für jeweils 5 min mit 0,01 M PBS in 24-Well-Platten gewaschen. Anschließend wurde sie free floating mit Avidin-FITC, einer spezifischen Mastzellfärbung, bei der das Avidin an das in CTMC enthaltene Heparin bindet (Bergstresser et al. 1984; Tharp et al. 1985), in einer Verdünnung von 1:500 in einer Dunkelkammer auf dem Schüttler für 1 Stunde inkubiert. Danach wurde die Dura mater, wie bereits oben beschrieben, gewaschen und auf einem Objektträger immer in derselben Orientierung aufgezogen. Die subdurale Seite der Dura mater lag dem Objektträger auf, sodass die epidurale Seite zum Eindeckgläschen orientiert war. Der kaudale Teil der Dura mater war zum oberen Rand des Objektträgers orientiert (Abb. 2.2).

Abb. 2.2 Schematische Darstellung der Orientierung einer Dura mater auf dem Objektträger

In A) ist die Dura mater mit dem abgetrennten kaudalen Teil (gestrichelte Linien) und dem abgetrennten Sinus transversus (ST) zum oberen Rand des Objektträgers orientiert. Die subdurale Seite wird dabei auf den Objektträger gelegt (B). SSS = Sinus sagittalis superior Seite | 25

2.Material und Methoden

Unter dem Mikroskop ist der kaudale Teil am unteren Ende des Objektträgers zu sehen, wie in der Abb. 3.2 in der Übersicht dargestellt. Mit Hilfe eines Skalpells wurde der Sinus transversus (ST) abgetrennt, da er durch seine Dicke das Eindecken erschwerte. Die Eindeckung der Probe erfolgte mit dem Eindeckmedium Confocal-Matrix®. Die Lagerung erfolgte im Kühlschrank bei 2-8 °C im Dunkeln.

2.2.6 Histologische Auswertung

Es wurden jeweils acht Bilder pro Durahälfte in einem definierten Bereich aufgenommen. Um diesen definierten Bereich zu erreichen, wurde der Bildausschnitt in der kleinsten Vergrößerung (Objektiv Plan Neofluar 2,5x) so positioniert, dass der untere Teil des Bildausschnittes mit dem kaudalen Teil der Dura mater abschloss, wo zuvor der ST abgetrennt wurde (Abb. 2.3A). Danach wurde zu einer höheren Vergrößerung gewechselt (Objektiv Fluar 10x) und der Bildausschnitt lateral das Sinus sagittalis superior (SSS) ausgerichtet (Abb. 2.3B, noch nicht lateral ausgerichtet). Es erfolgte eine Verschiebung des Bildes um 3 weitere Bildausschnitte in dieser Vergrößerung. Anschließend wurde auf eine noch höhere Vergrößerung (Objektiv Fluar 20x) gewechselt (Abb. 2.3C). Die genaue Vergrößerung der Aufnahmen setzt sich aus der Vergrößerung der Kamera (KY-F75U) und der Objektivvergrößerung zusammen. Die exakte Vergrößerung ist für die Aufnahmeserie jedoch nicht entscheidend, da alle Bilder unter denselben Bedingungen aufgenommen wurden, weil die Aufnahmen immer mit dem selben Mikroskop-Aufbau getätigt wurden. Die Prozedur diente ausschließlich dazu jeweils ähnliche Bereiche der Dura mater in die Auswertung mit einzubeziehen und dabei eine subjektive Auswahl zu vermeiden. Bei der letzten Vergrößerung erfolgte eine Aufnahmeserie, bei der vier Bilder in die rostrale Richtung gemacht wurden, eins in die mediale Richtung zum SSS hin und drei weitere Bilder Richtung kaudal, sodass ein Rechteck aus 2x4 Bildern entstand. Diese Prozedur wurde dann jeweils spiegelverkehrt auf der anderen Seite durchgeführt. Dabei überschnitten sich die Bildausschnitte nicht. Pro Bildausschnitt wurden mehrere Tiefenebenen aufgenommen, sodass alle Mastzellen scharf abgebildet wurden, da dies für die Auswertung der Aufnahmen notwendig war. Das Zusammenführen der einzelnen Bildaufnahmen (verschiedene Tiefenebenen) wurde mit Adobe Photoshop CS6 Extended durchgeführt.

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2.Material und Methoden

Abb. 2.3 Prozedur der histologischen Aufnahmen

Gezeigt ist die mit Avidin-FITC gefärbte Dura mater in verschieden Vergrößerungen. In der kleinsten Vergrößerung (hier mit Objektiv Plan Neofluar 2,5x aufgenommen) ist der Sinus sagittalis superior (SSS) mit den gestrichelten Linien gekennzeichnet (A). Das Kästchen stellt die Stelle der höheren Vergrößerung (hier mit Objektiv Fluar 10x aufgenommen) in B) dar. Die höchste Vergrößerung (hier mit Objektiv Fluar 20x aufgenommen) entspricht der Ausgangsvergrößerung (C). Seite | 27

2.Material und Methoden

Die Auszählung und Kategorisierung der Mastzellen wurde mit Hilfe von Image J und Microsoft Excel durchgeführt. Die Mastzellen wurden in zwei Kategorien eingeteilt. Eine Mastzelle galt als nicht degranuliert, wenn sie eine homogene helle Färbung mit Avidin- FITC aufwies und scharf umrandet war (Abb. 2.4A). Eine Mastzelle, die fünf oder mehr sichtbare Granulae-Inhalte außerhalb des Zellkörpers aufwies (Abb. 2.4B) oder die sogenannte „ghostly look“-Mastzellen (Abb. 2.4C), die eine Reduktion der Färbeintensität um mehr als 60 % zeigten, wurden als degranuliert definiert. Darauffolgend wurde der prozentuale Anteil von degranulierten Mastzellen in dem definierten Auswertungsbereich der Dura mater ermittelt.

A) B)

C)

Abb. 2.4 Klassifizierung der Mastzelldegranulation

Gezeigt sind unterschiedliche Stadien der Mastzelldegranulation mithilfe einer Avidin-FITC Färbung (1:500 in PBS), wie die nicht degranulierte Mastzelle (A), die degranulierte Mastzellen (B) und die „ghostly look“ Mastzelle, die vollständig degranuliert ist (C). Die Pfeile zeigen Granula-Inhalte außerhalb der Zelle (B).

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2.Material und Methoden

2.2.7 Statistik

Die Statistik wurde mit SigmaSTAT durchgeführt. Bei paarweisen Vergleichen wurde der Mann-Whitney-Test und bei multiplen Vergleichen der Kruskal-Wallis-Test durchgeführt. Als Post-hoc-Test wurde in den meisten Fällen der Dunn´s Test verwendet. Abweichungen sind in den Bildunterschriften vermerkt. Alle Prozentangaben werden aufgrund der Anwendung von nicht-parametrischen Tests als Median mit median absolute deviation (MAD) im Text wider gegeben. Der MAD wird wie folgt berechnet:

MAD= median(|풳풾 − median|)

2.2.8 Immunhistochemische Färbung mit einem CGRP-Antikörper und Avidin-FITC

Die immunhistochemische Färbung wurde durchgeführt, um die Lokalisation von Mastzellen zu Migräne-relevanten Strukturen, wie CGRP-positive Nervenfasern und Blutgefäßen, zu beschreiben. Dazu wurden Tie2-GFP-Mäuse verwendet, deren Endothelzellen GFP exprimieren, sodass Blutgefäße unter dem Fluoreszenz-Mikroskop sichtbar werden. Mit CGRP-Antikörpern wurden CGRP-positive Fasern immunhistochemisch gefärbt. Zusätzlich wurden die Mastzellen, wie bereits oben beschrieben, mit Avidin-FITC gefärbt und sichtbar gemacht. Für diese immunhistochemische Färbung wurde der Schädel wie im oberen Teil des Kapitels 2.2.3 beschrieben präpariert, die Dura mater freigelegt und anschließend sofort mit 4 % FA über Nacht bei 4 °C fixiert. Am nächsten Tag wurden die Schädel drei Mal mit 0,01 M PBS für 5 min bei Raumtemperatur gewaschen. Anschließend wurden diese für zwei Stunden und 30 min in 70 %igem Ethanol inkubiert. Danach wurden sie drei Mal gewaschen und dann vom Schädel abgezogen, wie im oberen Teil des Kapitels 2.2.5 beschrieben. Der Verdau mittels Kollagenaselösung wurde für 13 min in 24-Well-Platten durchgeführt. Dort wurden diese erneut drei Mal für 5 min gewaschen. Danach erfolgte das Blocken unspezifischer Bindestellen mit dem Roti® Immunoblock für 45 min bei Raumtemperatur. Im Anschluss wurde der Primär-Antikörper gegen CGRP in einer Verdünnung von 1:2000 über Nacht bei 4 °C auf dem Schüttler inkubiert. Am darauffolgenden Tag wurde zunächst der Primär-Antikörper mit dreimaligen Waschen für jeweils 5 min entfernt und anschließend für 45 min mit dem Sekundär-Antikörper (1:2000) und Rhodamin-Avidin (1:500) inkubiert. Zum Schluss wurde auch der nicht gebundene

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2.Material und Methoden

Teil der Antikörperlösung mit dreimaligem Waschen für 5 min von den Proben entfernt und die Proben mit Confocal-Matrix® eingedeckt.

2.2.9 Alcianblau-Safranin Färbung

Die Alcianblau-Safranin (AS) Färbung diente dazu die beiden Mastzelltypen, Bindegewebsmastzellen (CTMC) und die mukosalen Mastzellen (MMC) voneinander zu unterscheiden. Durch die unterschiedlichen Glykosaminoglykanen, die in den Granulae enthalten sind (Gibson et al. 1987), werden die beiden Typen unterschiedlich angefärbt. Diese Unterscheidung kann wichtig sein, da ihre Reaktivität auf Stimuli, wie C48/80 und SP, unterschiedlich ist (Metcalfe et al. 1997; Shanahan et al. 1985; Enerbäck et al. 1985). Die Vorbereitungen der Dura mater für die AS-Färbung, wie Präparation und Fixierung, entsprach dem oben beschriebenen Verfahren. Die mit 4 % FA fixierte Dura mater wurde für 5 min in der 10 %igen Alcianblau-Lösung gefärbt. Danach wurden die Proben mit 0,3 % Essigsäure für 5 min gewaschen und mit 0,1 % Safranin in 0,1 %iger Essigsäure für 45 min gegen gefärbt. Nach der Inkubation in einer aufsteigenden Alkoholreihe (70 %, 80 % und 98 % Ethanol) und zweimaliger Inkubation in Isopropanol wurden die Proben in Euparal eingedeckt. Von vier Tieren wurden jeweils 20 Bildausschnitte ausgewertet. Eine Mastzelle wurde als CTMC klassifiziert, wenn sie überwiegend rot gefärbten Granula-Inhalt aufwies und als MMC, wenn die Granulae überwiegend blau gefärbt waren (Abb. 3.1).

2.2.10 Zellkultur

Zur Bestimmung der Expression von verschiedenen Rezeptoren auf Mastzellen, sollte eine Single Cell-PCR von einzelnen Mastzellen durchgeführt werden. Dies sollte weitere Informationen darüber liefern, ob die Mastzelldegranulation möglicherweise direkt über den jeweiligen auf den Mastzellen exprimierten Rezeptor erfolgen kann oder, ob dies durch eine Signalkaskade von Rezeptoren, die auf anderen Strukturen exprimiert sind, vermittelt wird. Zur Vorbereitung wurde eine Zellkultur aus Dura mater-Gewebe von sechs bis neun Tage alten NMRI Mäusen angelegt. Zunächst wurden die Mäuse dekapitiert und die Dura mater mit einer Pinzette vom Schädel entfernt. Für eine Zellkultur wurden 5-6 Duren präpariert, in PBS auf einen Objektträger gelegt und mithilfe eines Skalpells zerkleinert. Die Suspension wurde dann enzymatisch mit der Kollagenaselösung für eine Stunde bei Seite | 30

2.Material und Methoden

37 °C verdaut. Die Lösung wurde dabei alle 10 min geschüttelt und gemischt. Anschließend wurde die Lösung für 10 min bei einer Temperatur 4 °C mit 300 g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und das entstandene Pellet in 5 ml kaltem MACS-Puffer gelöst. Anschließend wurde die Lösung erneut unter gleichen Bedingungen für 5 min zentrifugiert. Das hier entstandene Pellet wurde zunächst mit 1 ml MACS Puffer trituriert und anschließend mit weiteren 4 ml MACS Puffer aufgefüllt. Als nächstes wurde die Zellsuspension auf einen 30 µm Zellstrainer gegeben, um größere Gewebe- oder Zellakkumulate zurückzuhalten und die vereinzelten Zellen aufzufangen. Zum Schluss wurden 10 µl der Zellsuspension in die Neubauer-Zählkammer pipettiert, um die Anzahl der Zellen zu ermitteln. Es wurden 100.000 Zellen/cm2 ausgesät. Die gewonnenen Zellen wurden dann im Deckel einer 35 mm großen Kulturschalen, die mit 0,5 % Gelatine beschichtet wurde, ausgesät. Die Zellen wurden unter üblichen

Kulturbedingungen (37 °C, 5 % CO2) im RPMI Medium kultiviert. Das Medium wurde alle zwei Tage abgesaugt, die Zellen mit PBS gewaschen und neues Medium hinzugefügt. Um die Mastzellen in der gemischten Zellkultur zu identifizieren, wurden diese zunächst eine Stunde mit Avidin-FITC (1:500) in RPMI-Medium gefärbt. Diese konnten dann gezielt für die Single Cell-PCR verwendet werden. Dafür mussten Mikropipetten mit einem Durchmesser von ca. 3-5 µm mit dem Micropipette puller hergestellt werden. Diese wurden mit 5 µl RNase freiem Wasser befüllt und es wurde ein Überdruck von 40 mbar induziert. Die Mastzellen waren am Fluoreszenzmikroskop aufgrund ihrer spezifischen, grünen Färbung eindeutig identifizierbar. Mithilfe des Mikromanipulators wurde die Mikropipette an die Mastzellen herangeführt. Durch Unterdruck konnte der Inhalt der Zelle in die Pipette gesaugt werden. Um die Zellen in den cDNA-Ansatz zu überführen, wurde der Unterdruck aufgehoben. Es wurde nur jeweils eine Mastzelle aufgesaugt. Aus Zeitgründen und aufgrund ihrer Erfahrungen im Bereich Single Cell-PCR wurde diese Aufgabe von Frau M. Josten übernommen.

2.2.11 cDNA-Synthese

Die cDNA-Synthese wurde mit dem RevertAid First Strand cDNA Kit weitestgehend nach Herstelleranweisung durchgeführt. Die Komponenten und ihre Anteile sind in Tab. 2.13 zusammengefasst:

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2.Material und Methoden

Tab. 2.13 cDNA-Synthese Komponenten Mix [1x]

Komponente Volumen [µl] 5x Reaction Buffer 4 RiboLock RNase Inhibitor 1 Random Hexamer Primer 1 Reverse Transkriptase 1 10 mM dNTP Mix 2

H2O 6

Es ergab sich mit der Probe (5 µl) ein Gesamtvolumen von 20 µl für den cDNA- Syntheseansatz. Der Ansatz wurde dann in den RoboCycler®96 Gradient überführt. Dieser wurde für 10 min auf 25 °C erhitzt, dann für eine Stunde bei 42 °C inkubiert und anschließend für weitere 10 min bei 70 °C. Die Lagerung der Proben erfolgte bei -20 °C bis zur weiteren Verwendung. Die cDNA-Proben aus Dura mater Gewebe wurden freundlicherweise von Frau K. Osenberg zur Verfügung gestellt. Für die Dura mater- Proben sind Verunreinigungen durch genomische DNA durch einen DNase-Verdau ausgeschlossen.

2.2.12 Single Cell-PCR

Die Single Cell-PCR unterschied sich dahingehend von einer üblichen PCR, dass eine Probe nur aus der cDNA einer einzigen Zelle bestand. Die Komponenten des PCR- Ansatzes sind in Tab. 2.14 aufgelistet.

Tab. 2.14 Komponenten des PCR-Ansatzes

Komponente Volumen [µl] 10x Puffer 2 2 mM dNTP Mix 2 10 pmol/µl Forward Primer 1 10 pmol/µl Reverse Primer 1 5U/µl Taq-Polymerase 0,2 A.dest 8,8 cDNA 5

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2.Material und Methoden

Pro cDNA-Ansatz (20 µl) wurden drei Primerpaare getestet, je zwei verschiedene Primerpaare für Rezeptoren und eines für das housekeeping gene HPRT. Dies diente zur Kontrolle der cDNA-Synthese. Zur Kontrolle, ob Verunreinigungen durch genomische DNA bestande, wurden Proben ohne reverse Transkriptase (RT-) mitgeführt. Da jedoch aus einer Zelle nicht genügend Material für diese Kontrolle zur Verfügung stand, wurde jeweils der Inhalt einer anderen Mastzelle extra hierfür extrahiert. Statt der reversen Transkriptase wurde bei der cDNA-Synthese Wasser hinzugefügt. Eine weitere Kontrolle stellte die Wasserkontrolle dar, mittels der während der PCR überprüft wurde, ob Verunreinigungen im PCR-Ansatz vorhanden waren. Diese Probe enthielt statt der Taq-Polymerase Wasser im gleichen Volumen.

Das PCR-Programm begann mit einer fünfminütigen initialen Denaturierung bei 95 °C. Danach erfolgten 40 Zyklen mit jeweils einem Denaturierungsschritt bei 95 °C für 45 Sekunden, einem Annealing für 45 Sekunden, das je nach Primer bei 56 °C oder 58 °C durchgeführt wurde (Tab. 2.6), und dem Elongationsschritt bei 72 °C für 15 Sekunden. Die finale Elongation betrug 3 min. Danach wurden die Proben auf 6 °C runtergekühlt. Anschließend wurden die Proben mit einem 2 %igen Agarose-Gel, welchem 1 %iges Ethidiumbromid hinzugefügt wurde, elektrophoretisch aufgetrennt. Als Marker wurde der DNA Ladder GeneRuler™ 50 bp verwendet und die Bilder wurden mit dem Gel Doc™ XR Geldokumentationssystem aufgenommen. Bei einigen Gelbildern wurde das Bild mit einem Bildprogramm aufgrund von schwachen Banden aufgehellt und der Kontrast verstärkt. In den Abbildungsunterschriften ist vermerkt, welche Bildern dahingehend bearbeitet wurden.

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3.Ergebnisse

3. Ergebnisse

3.1 Charakterisierung muriner Mastzellen in der Dura mater

Zur Untersuchung der Migräne-Pathophysiologie im Tiermodell, auch in Bezug auf die Charakteristika von duralen Mastzellen, werden in der Literatur häufig Versuche in Ratten (Rattus norvegicus) beschrieben (Michaloudi et al. 2007; Dimlich et al. 1991; Dimitriadou et al. 1997; Boes und Levy 2012). Aus diesem Grund, sollte zunächst eine Charakterisierung der Lokalisation und des vorliegenden Mastzell-Typs in der murinen Dura mater durchgeführt werden. Die Häufigkeiten der beiden Typen variieren von Gewebe zu Gewebe (Irani et al. 1986). Die Bestimmung des prozentualen Anteils der Bindegewebsmastzellen, CTMC, ist von großem Interesse da nur sie auf C48/80 reagieren (Enerbäck und Lundin 1974), was in der vorliegenden Arbeit als Positivkontrolle zur Induktion von Mastzelldegranulation dient. Außerdem kann auch nur dieser Typ durch SP stimuliert werden (Shanahan et al. 1985), weswegen die Relevanz der MMC für die neurogene Inflammation gering ist. Aus diesem Grund wurde der prozentuale Anteil der beiden Mastzelltypen in der murinen Dura mater bestimmt. Mithilfe der AS-Färbung konnten die beiden Typen unterschieden werden, da CTMC durch Safranin rot und die MMC durch Alcianblau bläulich angefärbt werden. In Abb. 3.1A ist ein Beispiel beider Typen gezeigt. Für die Quantifizierung wurden insgesamt vier Dura mater-Proben ausgewertet. Dazu wurden die mehrheitlich rot gefärbten Mastzellen als CTMC definiert und die überwiegend blau gefärbten als MMC. Im Anschluss wurde der prozentuale Anteil pro Probe ermittelt, um festzustellen, welcher Typ Mastzelle überwiegend in der Dura mater der Maus zu finden ist. Für die gesamte Arbeit ist jeweils der Median mit dem MAD (Erklärung unter 2.2.7) angegeben. Wie aus Abb. 3.1B zu entnehmen ist, sind 66,4±7,7 % der Mastzellen aufgrund ihrer mehrheitlich roten Färbung den CTMC und 33,6±7,7 % dem MMC-Typ zuzuordnen. Da der Großteil der Mastzellen, dem CTMC-Typ entsprachen, konnte zur Visualisierung dieses Typus die deutlich einfacher anwendbare Avidin-FITC Färbung verwendet werden.

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3.Ergebnisse

A) B) *

100

80

60

40

Prozentualer Anteil [%] Anteil Prozentualer 20

0

MMC CTMC Abb. 3.1 Prozentualer Anteil der beiden Mastzelltypen in der murinen Dura mater

Gezeigt ist das Beispiel Bindegewebs-Mastzelle (englisch: „Connective Tissue“, CTMC) und einer mukosalen Mastzelle (englisch: „mucosal mast cell“, MMC), die mit der AS-Methode gefärbt wurden (A). Der prozentuale Anteil der beiden Mastzelltypen wurde in der murinen Dura mater ermittelt (B). Dabei wiesen die CTMC eine hauptsächlich rote und die MMC eine überwiegend blaue Färbung des Granula-Inhaltes auf. Die Werte von einzelnen Proben werden als Punkte und der Median als Linie dargestellt. Der Stern (*) stellt einen statistisch signifikanten Unterschied mit p < 0,05 dar. Statistik: Mann Whitney Test, Signifikanz: p = 0,029, n = 4.

Die Verwendung von Avidin-FITC bietet die Möglichkeit Mastzellen des CTMC-Typs spezifisch in der Dura mater anzufärben (Bergstresser et al. 1984), da das Protein Avidin an Heparin bindet (Tharp et al. 1985), dass in großen Mengen in den Granulae dieser Mastzellen vorhanden ist (Dimlich et al. 1991). Mithilfe des Fluorophores Fluorescein isothiocyanat (FITC), dass bei 495 nm angeregt wird und bei 515 nm emittiert, können Mastzellen so durch ihre grüne Fluoreszenz sichtbar gemacht werden. Da nur CTMC durch C48/80 und SP aktiviert werden können, waren diese hier für die Untersuchung der neurogenen Inflammation von großer Relevanz (Enerbäck et al. 1985; Shanahan et al. 1985 Metcalfe et al. 1997). Mithilfe dieser Methode konnte die Verteilung der CTMC in der murinen Dura mater beschrieben werden. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass je nach Anzahl der Mastzellen die Verteilung in der Dura mater variiert. Bei einer großen Anzahl von Mastzellen, wie in Abb. 3.2A, ist die Verteilung der Mastzellen recht homogen. Es ist sogar erkennbar, dass Mastzellen gefäßständig (*) oder entlang des SSS lokalisiert sind. Bei einer mittleren Anzahl von Mastzellen sind Bereich neben dem SSS zu erkennen, die weniger dicht besiedelt sind (Abb. 3.2B). Bei einer geringen Anzahl von Mastzellen breiten

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3.Ergebnisse sich diese Bereiche lateral aus. Dafür sind immer noch viele Mastzellen unmittelbar am SSS zu sehen. (Abb. 3.2C).

Abb. 3.2 Verschiedene Verteilungsmuster abhängig von der Anzahl der Mastzellen Gezeigt ist die Verteilung von duralen mit Avidin-FITC (1:500 ins PBS) gefärbten Mastzellen in Mäusen bei hoher Anzahl (A), mittlerer Anzahl (B) und geringer Anzahl (C). Avidin-FITC färbt das in CTMC gelagerte Heparin. Die Bilder wurden zur besseren Darstellung aufgehellt. * = Mastzellen entlang von Blutgefäßen, SSS = Sinus sagittalis superior. Seite | 36

3.Ergebnisse

Von Untersuchungen an Ratten ist bekannt, dass Mastzellen in der Dura mater häufig neben Blutgefäßen oder CGRP-positiven Nervenfasern lokalisiert sind. Die in Abb. 3.3 abgebildeten Endothelzellen der Blutgefäße zeigen eine grüne Fluoreszenz, da das Dura mater-Präparat von einer Tie2-GFP-Maus stammt, die das GFP unter der Kontrolle des Tie2-Promotors exprimiert, welches eine spezifische Transkription in Endothelzellen ermöglicht. Mastzellen (rot/orange fluoreszierend) sind häufig neben Blutgefäßen (*) zu sehen. CGRP-positive Nervenfasern (rot) ziehen durch das Gewebe und können teilweise parallel zu Blutgefäßen verlaufen. Häufig sind an diesen Stellen Mastzellen zu finden (Pfeil). Mastzellen können aber auch mitten im Gewebe lokalisiert sein, wo sie nicht in direktem Kontakt zu Blutgefäßen oder Nervenfasern stehen (#). Wie bei Ratten, scheinen die murinen Mastzellen ebenfalls neben Migräne-relevanten Strukturen lokalisiert zu sein, wo sie in Wechselwirkung mit diesen treten können.

Abb. 3.3 Lokalisation von Mastzellen in der murinen Dura mater

Gezeigt werden Mastzellen (rot/orange) in der murinen Dura mater von Tie2-GFP Mäusen, deren Blutgefäße grün fluoreszierend sind. Mastzellen können in der Nähe von Blutgefäßen lokalisiert sein (*) oder CGRP-positiven Fasern (rot), wie der Pfeil andeutet. Aber auch mitten im Gewebe finden sich Mastzellen (#). Der Anti-CGRP Antikörper war 1:2000, der Cy3-gekoppelte Zweitantikörper 1:2000 und Avidin-Rhodamin 1:500 verdünnt.

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3.Ergebnisse

3.2 In vivo-Experimente

3.2.1 Auswirkung von operativen Eingriffen, Narkosedauer und Gewebefixierung auf die durale Mastzelldegranulation der CTMC in Mäusen

Zur Etablierung der in vivo-Experimente für die Untersuchung von Mastzelldegranulation in der murinen Dura mater musste zunächst der Einfluss bestimmter Parameter auf die Degranulation überprüft werden., da aus der Literatur bekannt ist, dass Parameter wie Fixierung, Narkose und Eingriffe Einfluss auf Mastzelldegranulation haben können (Kiernan 1975; Lampe und Kiernan 1976; Jonge et al. 2004; Luo et al. 2015). Dazu wurde zunächst die Auswirkung der verschiedenen Fixierungen untersucht. Für die weiteren pharmakologischen Untersuchungen sollte die Fixierung eine möglichst geringe basale Degranulationsrate zeigen, damit der Einfluss verschiedener Substanzen untersucht werden konnte. Folgende Fixierungen wurden getestet: 4 % FA nach dem Standardprotokoll, 4 % mit 0,01 M PBS, Perfusionsfixierung mit 4 % FA und Carnoy- Fixierung. Ausgenommen von der Perfusionsfixierung wurden alle weiteren Gruppen nach der zervikalen Dislokation als Immersionsfixierung durchgeführt. Nur für die Perfusionsfixierung wurden die Tiere in Narkose gelegt, in der sie auch verstarben.

Die Ergebnisse sind im Vergleich zu den anderen Parametern in Tab. 3.1 zusammengefasst. Durch die Fixierung mit dem nach dem Standardprotokoll hergestellten 4 %igem FA degranulierten 44,3±14,6 % aller Mastzellen in dem Auswertebereich. Das modifizierte FA mit 0,01 M PBS führte zu einer Degranulationsrate von 30,2±13 % und die Perfusionsfixierung lediglich zu 18,8±7,1 % degranulierten Mastzellen. Die Carnoy- Fixierung hingegen verursachte eine massive Degranulation von 77,9±8,1 % (Tab. 3.1 und Anhang Abb. 4.1A). Die Perfusionsfixierung und die Carnoy-Fixierung unterschieden sich signifikant voneinander (Kruskal Wallis Test, p = 0,017, Post-Hoc-Test: Dunn’s Methode). Die Anzahl gezählter Mastzellen variierte im Median von 89±28 bis 120±48, jedoch unterschieden sich dabei die Gruppen statistisch nicht voneinander (Kruskal Wallis Test, p = 0,073). Da die Fixierung einen Einfluss auf die Mastzelldegranulation nahm, wurde als Kompromiss die 4 % FA-Immersionsfixierung für weitere Versuche gewählt, da sie zeitsparender war als die Perfusionsfixierung mit den geringsten basalen

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3.Ergebnisse

Degranulationswerten, aber eine geringere basale Degranulation als Carnoy aufwies. Aufgrund des hohen Aufwandes könnten mit der Perfusionsfixierung keine hohen Stichprobenzahlen verwendet werden, die aber aufgrund der großen Streuungen angestrebt werden sollten.

Neben dem Einfluss der Fixierung wurde auch der Einfluss der Inhalationsnarkose die durale Mastzelldegranulation überprüft, da aus der Literatur bereits bekannt ist (Luo et al. 2015), dass sich die Reaktion von Mastzellen insbesondere bei längerer Anwendung von Inhalationsnarkotika verändern kann. Zu diesem Zweck wurden die Mäuse entweder für 5 min oder für eine halbe Stunde mit 2-3 % Isofluran in Atemluft stabil in Narkose gehalten und wurden anschließend in Narkose mithilfe der zervikalen Dislokation getötet. Der Median von der 5 min Narkose-Gruppe entsprach mit 12,9±1,9 % einer basalen Degranulationsrate. Ebenso zeigte die 30 min-Gruppe eine basale und geringe Degranulationsrate von 15,1±2,4 % (Tab. 3.1, Anhang Abb. 4.2A). Die Streuung fiel in diesem Versuch vergleichsweise gering aus. Die Degranulationsraten der beiden Gruppen unterschieden sich statistisch nicht voneinander (Mann Whitney Test, p = 0,548). Für die Anzahl gezählter Mastzellen konnte mit 250±16 gezählten Mastzellen für 5 min Narkose und 195±36 gezählten Mastzellen für 30 min Narkose ebenso kein statistischer Unterschied zwischen den beiden Gruppen ermittelt werden (Mann Whitney Test, p = 0,548). Es konnten keinerlei Unterschiede in der basalen Degranulation abhängig der Narkosedauer festgestellt werden, sodass die Dauer auf 30 min festgelegt wurde, um Substanzen ausreichend lange inkubieren zu können, da eine Aktivierung von Mastzellen über eine Signalkaskade unter Umständen einige Zeit benötigt.

Um auszuschließen, dass bereits geringe Manipulationen, wie die Freipräparation der Vena jugularis externa (in Narkose) bereits zu einer massiven Degranulation duraler Mastzellen führt, wurden die narkotisierten Tiere entweder direkt durch zervikale Dislokation getötet und dekapitiert (Nativ-Gruppe) oder ihnen wurde in Narkose die Vena jugularis externa wie für eine intravenöse Injektion freipräpariert, um sie anschließend ebenfalls mittels zervikaler Dislokation zu töten und zu dekapitieren (Schein-OP ohne Injektion-Gruppe). Im Falle der „Nativ“-Gruppe zeigte sich bereits eine Degranulationsrate von 51,6±8,8 % (Tab. 3.1, Anhang Abb. 4.3A), was deutlich höher war als in vorigen Versuchen, wie zum

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3.Ergebnisse

Bespiel bei der 30 min Narkose-Gruppe (vergl. Tab. 3.1, Anhang Abb. 4.2A). Die Degranulationsrate in diesem Versuch erhöhte sich auf 68,2±10,1 %, wenn das Tier zuvor unter Narkose für eine Injektion präpariert wurde. Dies war jedoch nicht statistisch signifikant (Mann Whitney Test, p = 0,082). Die Anzahl gezählter Mastzellen unterschied sich statistisch nicht voneinander (Mann Whitney Test, p = 0,082). Es ergaben sich Mediane von 113±16 gezählten Mastzellen für die Nativ-Gruppe und 114±9 gezählte Mastzellen für die Schein-OP ohne Injektion-Gruppe. Die intravenöse Applikation der Substanzen über die Vena jugularis externa wurde gewählt, da dieselbe Applikationsroute auch bei den PPE-Versuchen im chronischen Maus-Migräne-Modell durchgeführt worden. Dabei kann die Manipulation am Tier nicht vermieden werden. Allerdings konnte kein Unterschied gegenüber der Nativ-Gruppe festgestellt werden, sodass für die nächsten Versuche diese Applikationsroute weiterverwendet werden konnte.

Tab. 3.1 Übersicht über die Auswirkung verschiedener Parameter auf die durale Mastzelldegranulation

Fixierung Narkosedauer Eingriff

4 %ige FA 44,3±14,6 % FA mit 5 min 12,9±1,9 % Nativ 51,6±8,8 % 30,2±13 % Degranulation 0,01 M PBS [%] Perfusions- 18,8±7,1 % Schein- fixierung 30 min 15,1±2,4 % OP ohne 68,2±10,1 % Carnoy 77,9±8,1 % Injektion Kruskal Wallis Test, p = 0,017, Post-Hoc-Test: Signifikanz Mann Whitney Test, Mann Whitney Test, Dunn’s Methode Behandlung p = 0,548 p = 0,082 Carnoy vs. Perfusionsfixierung 89±28 bis 120±48 195±36 & 250±16 113±16 und 114±9 Signifikanz Kruskal Wallis Test, Mann Whitney Test, Mann Whitney Test, Anzahl p = 0,073 p = 0,548 p = 0,082 Einfluss Ja Nein Nein

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3.Ergebnisse

3.2.2 Etablierung des in vivo-Modells zur Untersuchung von Mastzelldegranulation in der Dura mater der Maus

Um die durale Mastzelldegranulation in der Maus unter möglichst die physiologischen Bedingungen untersuchen zu können, wurden in vivo-Experimente durchgeführt. Dabei sollte C48/80 mit seiner mastzelldegranulierenden Eigenschaft Aufschluss über die Detektierbarkeit der Mastzelldegranulation unter diesen Experimentalbedingungen geben. Da in dem chronischen Maus-Migräne-Modell von Hunfeld et al. Mäuse erst nach Hypoxie-Behandlung anfällig für die Induktion einer PPE wurden (Hunfeld et al. 2015), sollte überprüft werden, ob auch Mastzellen nach einer Hypoxie-Behandlung sensitiviert sind.

A) B) 260 100 n.s. 240 n.s. 220 80 200 180 160 60 140 120 40 100 80 60 20

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Anzahl gezählter Mastzellen gezählter Anzahl Degranulation in Prozent in [%] Degranulation 20 0 0

Nativ Saline Nativ Saline

1 mg/kg KG C48/80 1 mg/kg KG C48/80 Schein-OP ohne Injektion Schein-OP ohne Injektion Abb. 3.4 Einfluss verschiedener Eingriffe auf die murine durale Mastzelldegranulation nach Normoxie- Behandlung

Gezeigt wird die Mastzelldegranulation in der murinen Dura mater in dem ausgewerteten Bereich (16 Bilder) mit oder ohne Eingriff. Die normoxischen Mäuse wurden entweder zunächst in Narkose gelegt und dann durch zervikale Dislokation getötet („Nativ“) oder die Vena jugularis wurde in Narkose freipräpariert und die Tiere wurden im Anschluss durch zervikale Dislokation getötet („Schein-OP ohne Injektion“) oder sie erhielten nach Freipräparation eine intravenöse Injektion mit Saline oder der mastzelldegranulierenden Substanz C48/80 in einer Dosis von 1 mg/kg KG angepasst an das Körpergewicht. Einzelwerte werden als Punkte und der Median als Linie dargestellt. Zu sehen ist sowohl die Mastzelldegranulation in Prozent (Kruskal Wallis Test, p = 0,443) (A) als auch die Gesamtzahl der gezählten Mastzellen im Auswertebereich jeder Probe (Kruskal Wallis Test, p = 0,246) (B). n = 6, außer Nativ: n = 7. n.s. = nicht signifikant.

Für die normoxischen Tiere (Abb. 3.4A) ergab sich für die Nativ-Gruppe mit 29,8±12,7 % eine ca. 20 %ig geringere Degranulationsrate als bei den Vorversuchen bei der Nativ- Seite | 41

3.Ergebnisse

Gruppe (Abb. 4.3A). Auch in diesem Versuch konnte mit zunehmender Manipulation ein leichter Anstieg der Degranulationsrate beobachtet werden. Bei der Gruppe Schein-OP ohne Injektion kam es zu einer Steigerung um ca. 11,5 % (41,3±15,5 %) im Vergleich zu der Nativ-Gruppe. Durch die Saline-Injektion (Vehikel für C48/80) erhöhte sich die Degranulationsrate auf 45±6,5 % und durch die Injektion von C48/80 in der Dosierung 1 mg/kg Körpergewicht (KG) auf 52,2±6,3 %. Trotz ansteigender Tendenz gab es keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen (Kruskal Wallis Test, p = 0,443). Die Mediane der Anzahl gezählter Mastzellen pro Gruppe lagen zwischen 85±7 und 157±29 gezählten Mastzellen (Abb. 3.4B) und unterschieden sich statistisch nicht signifikant voneinander (Kruskal Wallis Test, p = 0,246).

A) * B) 260 100 240 n.s. 220 80 200 180 160 60 140 120 40 100 80 60 20

40

Anzahl gezählter Mastzellen gezählter Anzahl Degranulation in Prozent in [%] Degranulation 20 0 0

Nativ Saline Nativ Saline

1 mg/kg KG C48/80 1 mg/kg KG C48/80 Schein-OP ohne Injektion Schein-OP ohne Injektion Abb. 3.5 Einfluss verschiedener Eingriffe auf die murine durale Mastzelldegranulation nach Hypoxie- Behandlung

Gezeigt wird die Mastzelldegranulation in der murinen Dura mater in dem ausgewerteten Bereich (12 Bilder) mit oder ohne Eingriff. Die hypoxischen Mäuse wurden entweder zunächst in Narkose gelegt und dann durch zervikale Dislokation getötet („Nativ“) oder die Vena jugularis wurde in Narkose freipräpariert und die Tiere wurden im Anschluss durch zervikale Dislokation getötet („Schein-OP ohne Injektion“) oder sie erhielten nach Freipräparation eine intravenöse Injektion mit Saline oder 1 mg/kg KG C48/80. Einzelwerte werden als Punkte und der Median als Linie dargestellt. Zu sehen ist sowohl die Mastzelldegranulation in Prozent (Kruskal Wallis Test, p = 0,033; Post-Hoc-Test Dunn’s Methode: Nativ vs. 1 mg/kg KG C48/80, p < 0,05) (A) als auch die Gesamtzahl der gezählten Mastzellen im Auswertebereich jeder Probe (Kruskal Wallis Test, p = 0,468) (B). n = 6, außer Nativ: n = 7. Der Stern (*) stellt einen statistisch signifikanten Unterschied mit p < 0,05 dar. n.s. = nicht signifikant.

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3.Ergebnisse

Bei den mit Hypoxie-behandelten Mäusen war ein ähnlich ansteigender Trend zu beobachten. Die Nativ-Gruppe hatte hier eine basale Degranulationsrate von 15,5±9,2 % (Abb. 3.5A). Mehr als dreifach so hoch waren die Degranulationsraten der Gruppen Schein-OP ohne Injektion mit 52,1±11 % und Saline mit 46,5±10 % und mehr als fünffach so hoch war die Degranulation bei der Gruppe 1 mg/kg KG C48/80 mit 78,8±9,3 %. Zwischen der Gruppe Nativ und 1 mg/kg KG C48/80 gab es einen signifikanten Unterschied (Kruskal Wallis Test, p = 0,033, Post-Hoc-Test: Dunn’s Methode). Die Anzahl gezählter Mastzellen war mit 72±13 bis 103±17 gezählten Mastzellen bei allen Gruppen recht ähnlich (Abb. 3.5). Es gab keinen signifikanten Unterschied (Kruskal Wallis Test, p = 0,468). Eine Induktion der duralen Mastzelldegranulation war somit nur für die Hypoxie-behandelte Mäuse möglich.

A) B) * 260 100 240 n.s. 220 80 200 180 160 60 140 120 40 100 80 60 20

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Anzahl gezählter Mastzellen gezählter Anzahl Degranulation in Prozent in [%] Degranulation 20 0 0

Nativ Saline Nativ Saline

1 mg/kg KG C48/80 1 mg/kg KG C48/80

Schein-OP ohne Injektion Schein-OP ohne Injektion Abb. 3.6 Bestätigung des C48/80 Effekts auf die murine Mastzelldegranulation des duralen Gewebes nach Hypoxie-Behandlung

Gezeigt wird die Mastzelldegranulation in der murinen Dura mater in dem ausgewerteten Bereich (16 Bilder) mit oder ohne Eingriff. Die hypoxischen Mäuse wurden entweder zunächst in Narkose gelegt und dann durch zervikale Dislokation getötet („Nativ“) oder die Vena jugularis wurde in Narkose freipräpariert und die Tiere wurden im Anschluss durch zervikale Dislokation getötet („Schein-OP ohne Injektion“) oder sie erhielten nach Freipräparation eine intravenöse Injektion mit Saline oder 1 mg/kg KG C48/80. Einzelwerte werden als Punkte und der Median als Linie dargestellt. Zu sehen ist sowohl die Mastzelldegranulation in Prozent (Kruskal Wallis Test, p = 0,023; Post-Hoc-Test Dunn’s Methode: Nativ vs. 1 mg/kg KG C48/80, p < 0,05) (A) als auch die Gesamtzahl der gezählten Mastzellen im Auswertebereich jeder Probe (Kruskal Wallis Test, p = 0,089) (B). n = 6, außer 1 mg/kg KG C48/80: n = 7. Der Stern (*) stellt einen statistisch signifikanten Unterschied mit p < 0,05 dar. n.s. = nicht signifikant. Seite | 43

3.Ergebnisse

Eine erneute Durchführung mit Hypoxie-behandelten Mäuse zeigte eine ähnliche Tendenz, aber andere Degranulationsraten. In diesem Fall waren die Streuungen deutlich kleiner. Eine basale Degranulationsrate von 10,6±1,8 % bis 12±7,3 % konnte hier für die Gruppen Nativ, Schein-OP ohne Injektion, sowie Saline erzielt werden (Abb. 3.6A). Nur 1 mg/kg KG C48/80 erzeugte in dem hypoxischen Gewebe eine dreifach so hohe Degranulationsrate mit 46,3±9,2 %. Dieses Ergebnis unterschied sich signifikant von der Gruppe Schein-OP ohne Injektion (Kruskal Wallis Test, p = 0,023). In diesem zweiten Versuch waren die ersten drei Gruppen deutlich geringer gestreut als die Gruppe 1 mg/kg KG C48/80. Die Mediane für Anzahl gezählter Mastzellen befanden sich zwischen 124±17 und 180±40 gezählten Mastzellen und waren statistisch nicht unterschiedlich (Kruskal Wallis Test, p = 0,089) (Abb. 3.6B).

A) *# B) 260 100 240 # 220 80 200 180 160 60 140 120 40 100 80 60 20

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Anzahl gezählter Mastzellen gezählter Anzahl Degranulation in Prozent in [%] Degranulation 20 0 0

Saline Saline

1 µg/kg KG mCPP 1 µg/kg KG mCPP 1 mg/kg KG C48/80 1 mg/kg KG C48/80 Abb. 3.7 Einfluss von mCPP und C48/80 auf die in vivo Mastzelldegranulation in der murinen hypoxischen Dura mater mit größerer Stichprobenzahl

Gezeigt wird die Mastzelldegranulation in der murinen Dura mater in dem ausgewerteten Bereich (8 Bilder) nach verschiedenen Injektionen. Den hypoxischen Mäusen wurde entweder Saline, 1 mg/kg KG mCPP oder 1 mg/kg KG C48/80 unter Narkose in die Vena jugularis injiziert. Einzelwerte werden als Punkte und der Median als Linie dargestellt. Zu sehen ist sowohl die Mastzelldegranulation in Prozent (Zwei-Wege ANOVA mit den zwei Faktoren Substanz und Tag, da der Versuch aufgrund der hohen Stichprobenzahl an zwei Tagen durchgeführt werden musste; Substanz (*), 1 mg/kg KG mCPP vs. 1 mg/kg KG C48/80, Saline vs. 1 mg/kg KG C48/80, p = 0,007; Tag (#), p ≤ 0,001) (A) als auch ist die Gesamtzahl der gezählten Mastzellen im Auswertebereich jeder Probe (Zwei-Wege ANOVA mit den zwei Faktoren Substanz und Tag; Substanz (*), p = 0,521; Tag (#), p = 0,046) (B). n = 14. Der Stern (*) stellt einen statistisch signifikanten Unterschied mit p < 0,05 und die Raute (#) mit p ≤ 0,001 dar.

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3.Ergebnisse

In den vorherigen Versuchen konnte eine durale Mastzelldegranulation durch die Positivkontrolle C48/80 bei den Hypoxie-behandelten Tieren beobachtet werden, sodass eine Untersuchung zur Beteiligung von Mastzellen an der neurogenen Inflammation unter diesen Bedingungen möglich ist. Da die PPE, als einer der Prozesse der neurogenen Inflammation, durch die Gabe von mCPP induzierbar war, sollte überprüft werden, ob auch eine Mastzellaktivierung durch denselben Signalweg erfolgt. Dazu wurde neben C48/80 auch mCPP mit einer Dosierung von 1 µg/kg KG in Hypoxie behandelten Tieren mit einer hohen Stichprobenzahl von n = 14 getestet. Dieselbe Dosierung von mCPP löste in hypoxischen Mäusen eine PPE aus (Hunfeld et al. 2015). Es wurden keine Normoxie- behandelten Tiere verwendet, da bisher keine Mastzelldegranulation in normoxischen Tieren durch C48/80 erzeugt werden konnte. Aus zeitlichen Gründen musste der Versuch über zwei Tage erfolgen. Für die Saline-Gruppe ergab sich hierbei ein Medianwert von 22,7±16,1 % (Abb. 3.7A). Ähnlich war das Ergebnis für die Gruppe 1 µg/kg KG mCPP mit 23,3±12,3 % Degranulationsrate. Demgegenüber war die Degranulationsrate in der Gruppe 1 mg/kg KG C48/80 mit 55,6±17,2 % um das Doppelte erhöht. Um eine Zwei-Wege ANOVA mit dieser kleinen Stichprobenzahl durchführen zu können, musste eine arcsin- Wurzel-Transformation durchgeführt werden, die eine Normalverteilung generiert. Dabei ergab sich sowohl ein signifikanter Unterschied für den Faktor Substanz (p = 0,007), also Saline versus C48/80 und mCPP versus C48/80 als auch für den Faktor Tag, also Tag 1 versus Tag 2 (p = <0,001). Für alle Substanzen konnte ein Unterschied zwischen den Tagen festgestellt werden. Bei der Anzahl der gezählten Mastzellen ergab sich ein Median von 104±17 für Saline, 76±7,5 für 1 µg/kg KG mCPP und 101±18 für 1 mg/kg KG C48/80, dabei ergab sich nur ein signifikanter Unterschied zwischen den Tagen (p = 0,046), aber nicht zwischen den Behandlungsgruppen (p = 0,521).

Da eine PPE in normoxischen Tieren mit mCPP in einer Dosierung von 1 mg/kg KG induziert werden konnte (Hunfeld 2016), wurde dieselbe Dosierung von mCPP in Normoxie- oder Hypoxie-behandelten Mäusen bezüglich der Induktion einer Mastzelldegranulation getestet. Die Applikation des Vehikels führte in den normoxischen Tieren zu einer Degranulationsrate von 20,6±4,5 %, welche nur geringfügig höher war als die Degranulation bei 1 mg/kg KG mCPP mit 27,8±2,8 % und 22,8±6,6 % für 1 mg/kg KG C48/80 (Abb. 3.8A). Es konnte kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den Seite | 45

3.Ergebnisse

Gruppen ermittelt werden (Kruskal Wallis Test, p = 0,165). Dies traf ebenso auf die Anzahl gezählter Mastzellen zu, die von 70±12 bis 86±24 gezählten Mastzellen variierte (Kruskal Wallis Test, p = 0,885) (Abb. 3.8B)

A) B) 260 100 n.s. 240 n.s. 220 80 200 180 160 60 140 120 40 100 80 60 20

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Anzahl gezählter Mastzellen gezählter Anzahl Degranulation in Prozent in [%] Degranulation 20 0 0

Saline Saline

1 mg/kg KG mCPP 1 mg/kg KG C48/80 1 mg/kg KG mCPP 1 mg/ml KG C48/80 Abb. 3.8 Einfluss von mCPP und C48/80 auf die in vivo Mastzelldegranulation in der murinen normoxischen Dura mater

Gezeigt wird die Mastzelldegranulation in der murinen Dura mater in dem ausgewerteten Bereich (8 Bilder) nach verschiedenen Injektionen. Den normoxischen Mäusen wurde entweder Saline, 1 mg/kg KG mCPP oder 1 mg/kg KG C48/80 unter Narkose in die Vena jugularis injiziert. Einzelwerte werden als Punkte und der Median als Linie dargestellt. Zu sehen ist sowohl die Mastzelldegranulation in Prozent (Kruskal Wallis Test, p = 0,165) (A) als auch die Gesamtzahl der gezählten Mastzellen im Auswertebereich jeder Probe (Kruskal Wallis Test, p = 0,885) (B). n = 8, außer 1 mg/kg KG mCPP: n = 9. n.s. = nicht signifikant.

Ähnlich sahen die Ergebnisse für die hypoxischen Tiere aus (Abb. 3.9A). Saline führte auch hier lediglich zur einer basalen Degranulation von 21±10,6 %, wohingegen 1 mg/kg KG mCPP bei den hypoxischen Mäusen eine höhere Degranulationsrate von 49,3±27,1 % erzeugte. Die Positivkontrolle 1 mg/kg KG C48/80 führte zu einer Degranulationsrate von 39,9±12,3 %. Diese Tendenzen waren jedoch nicht signifikant (Kruskal Wallis Test, p = 0,408). Auch die Anzahl gezählter Mastzellen unterschied sich statistisch nicht voneinander (Kruskal Wallis Test, p = 0,658). Die Mediane lagen zwischen 90±14 und 112±21 gezählten Mastzellen (Abb. 3.9B).

Insgesamt konnten die in vivo-Versuche nicht reproduziert werden und in einigen Versuchen zeigte sich eine hohe basale Degranulationsrate, dessen Ursache nicht ermittelt

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3.Ergebnisse werden konnte, weswegen die Untersuchung der duralen Mastzelldegranulation in einem ex vivo System fortgesetzt wurden.

A) B) 260 100 n.s. 240 n.s. 220 80 200 180 160 60 140 120 40 100 80 60 20

40

Anzahl gezählter Mastzellen gezählter Anzahl Degranulation in Prozent in [%] Degranulation 20 0 0

Saline Saline

1 mg/kg KG mCPP 1 mg/kg KG C48/80 1 mg/kg KG mCPP 1 mg/kg KG C48/80 Abb. 3.9 Einfluss von mCPP und C48/80 auf die in vivo Mastzelldegranulation in der murinen hypoxischen Dura mater

Gezeigt wird die Mastzelldegranulation in der murinen Dura mater in dem ausgewerteten Bereich (8 Bilder) nach verschiedenen Injektionen. Den hypoxischen Mäusen wurde entweder Saline, 1 mg/kg KG mCPP oder 1 mg/kg KG C48/80 unter Narkose in die Vena jugularis injiziert. Einzelwerte werden als Punkte und der Median als Linie dargestellt. Zu sehen ist sowohl die Mastzelldegranulation in Prozent (Kruskal Wallis Test, p = 0,408) (A) als auch die Gesamtzahl der gezählten Mastzellen im Auswertebereich jeder Probe (Kruskal Wallis Test, P = 0,658) (B). Saline: n = 7; 1 mg/kg KG mCPP: n = 9; 1 mg/kg KG C48/80: n = 6. n.s. = nicht signifikant.

3.3 Ex vivo - Halbschädel-Experimente

3.3.1 Etablierung des ex vivo-Modells mit verschiedenen Substanzen zur Untersuchung der duralen Mastzelldegranulation

Aufgrund der vielfältigen Probleme, wie hohe Basaldegranulation und fehlende Reproduzierbarkeit in den in vivo-Versuchen, wurden ergänzende ex vivo-Versuche im Halbschädelpräparat mit anhaftender Dura mater durchgeführt. Das Halbschädel-Modell wurde auch bereits von anderen Arbeitsgruppen für verschiedene Untersuchungen der Dura mater genutzt (Gupta et al. 2010; Baun et al. 2012). Für die vorliegende Arbeit wurde das ex vivo-Modell mit einer histologischen Auswertung nach einer Färbung von Mastzellen mit Avidin-FITC kombiniert. Dazu sollte zunächst überprüft werden, ob mit der Methode Mastzelldegranulation detektierbar ist, wofür die Positivkontrolle C48/80 verwendet wurde. Seite | 47

3.Ergebnisse

Darüber hinaus sollte überprüft werden, ob Mastzelldegranulation, über die hypothetische

Kaskade (Kapitel 1.6) mittels 5-HT2B-Rezeptor oder H1-Rezeptor induziert werden kann. Dafür wurden mCPP und Histamin verwendet. Mithilfe von mCPP (5 mM) konnte bereits in vivo eine Plasmaproteinextravasation (PPE) über den 5-HT2B-Rezeptor in Normoxie Mäusen induziert werden (Hunfeld 2016), sodass die in den hier durchgeführten Versuchen die gleiche Konzentration gewählt wurde. Für Histamin wurde eine möglichst hohe Konzentration gewählt.

A) B) ** 260 100 240 n.s. 220 80 200 180 160 60 140 120 40 100 80 60 20

40

Anzahl gezählter Mastzellen gezählter Anzahl Degranulation in Prozent in [%] Degranulation 20 0 0

SIF SIF

5 mM mCPP 5 mM mCPP 1,6 mM C48/80 1,6 mM C48/80 54 mM Histamin 54 mM Histamin

Abb. 3.10 Etablierung des ex vivo-Modells zur Untersuchung der Mastzelldegranulation in der murinen Dura mater nach Normoxie-Behandlung Gezeigt wird die Mastzelldegranulation in der normoxischen murinen Dura mater in dem ausgewerteten Bereich (8 Bilder) nach einer 10-minütigen Inkubation entweder mit SIF, 5 mM mCPP, 54 mM Histamin oder 1,6 mM C48/80 als Positivkontrolle. Einzelwerte werden als Punkte und der Median als Linie dargestellt. Zu sehen ist sowohl die Mastzelldegranulation in Prozent (Kruskal-Wallis Test, p = 0,006, Post-hoc-Test Dunn’s Methode: SIF vs. C48/80, p < 0,05) (A) als auch die Gesamtzahl der gezählten Mastzellen im Auswertebereich jeder Probe (Kruskal-Wallis Test, p = 0,374) (B). n = 5. n.s. = nicht signifikant. Die Sterne (**) stellen einen statistisch signifikanten Unterschied mit p < 0,01 dar.

Im Dura mater-Gewebe von normoxischen Mäusen führte die 10-minütige Inkubation von 1,6 mM C48/80 zu einer Degranulation von 86,7±1,9 %, welche signifikant im Vergleich zu dem Vehikel SIF mit 19,3±9,9 % (Kruskal-Wallis Test, p = 0,006, Post-hoc-Test: Dunn’s Methode) erhöht war (Abb. 3.10A). SIF wurde als Vehikel verwendet, da es aufgrund seiner Zusammensetzung eine möglichst physiologische Umgebung schafft. Ebenfalls zu sehen war, dass die beiden anderen Substanzen 5 mM mCPP und 54 mM

Seite | 48

3.Ergebnisse

Histamin geringere Degranulationsraten von 36,4±15,9 % und 37,4±7,0 % aufwiesen und sich somit nicht signifikant von der Vehikel-Gruppe SIF unterschieden. Die Anzahl gezählter Mastzellen, im Median 72±32 bis 102±29, unterschied sich hier bei den verschiedenen Behandlungsgruppen nicht (Kruskal-Wallis Test, p = 0,374) (Abb. 3.10B).

A) ** B) 260 100 240 n.s. 220 80 200 180 160 60 140 120 40 100 80 60 20

40

Anzahl gezählter Mastzellen gezählter Anzahl Degranulation in Prozent in [%] Degranulation 20 0 0

SIF SIF

5 mM mCPP 5 mM mCPP 1,6 mM C48/80 1,6 mM C48/80 54 mM Histamin 54 mM Histamin Abb. 3.11 Etablierung des ex vivo-Modells zur Untersuchung der Mastzelldegranulation in der murinen Dura mater nach Hypoxie-Behandlung Gezeigt wird die Mastzelldegranulation in der hypoxischen murinen Dura mater in Prozent in dem ausgewerteten Bereich (8 Bilder) nach einer 10-minütigen Inkubation entweder mit SIF, 5 mM mCPP, 54 mM Histamin oder 1,6 mM C48/80 als Positivkontrolle. Einzelwerte werden als Punkte und der Median als Linie dargestellt Zu sehen ist sowohl die Mastzelldegranulation in Prozent (Kruskal-Wallis Test, p = 0,004, Post-hoc-Test Dunn’s Methode: SIF vs. C48/80, p < 0,05) (A) als auch die Gesamtzahl der gezählten Mastzellen im Auswertebereich jeder Probe (Kruskal-Wallis Test, p = 0,051) (B). SIF: n = 3; 5 mM mCPP: n = 6; 54 mM Histamin und 1,6 mM C48/80: n = 5. Die Sterne (**) stellen einen statistisch signifikanten Unterschied mit p < 0,01 dar. n.s. = nicht signifikant.

Ein ähnliches Bild zeigte sich für die Proben der hypoxischen Tiere. Auch hier induzierte 1,6 mM C48/80 eine massive Mastzelldegranulation von 100 % im Auswertebereich, die sich signifikant von der Vehikel-Gruppe SIF mit 24,7±2,5 % (Kruskal-Wallis Test, p = 0,004, Post-hoc-Test: Dunn’s Methode) unterschied (Abb. 3.11A). Weiterhin war zu erkennen, dass 5 mM mCPP auch in diesem Versuch eine Degranulationsrate von 29,2±9,1 % auslöste, wohingegen das mit Histamin inkubierte Gewebe eine leicht erhöhte Mastzelldegranulation von 52,2±7,1 % zeigte, was sich aber nicht signifikant von der SIF- Gruppe unterschied. Bei der Anzahl der insgesamt gezählten Mastzellen war eine Tendenz im Median für eine geringere Anzahl bei der Gruppe C48/80 mit 39±26 gezählten

Seite | 49

3.Ergebnisse

Mastzellen zu erkennen. Im Vergleich zu den anderen Gruppen mit 93±46 bis 113±22 gezählten Mastzellen wurde jedoch kein statistisch signifikanter Unterschied ermittelt (Kruskal-Wallis Test, p = 0,051) (Abb. 3.11B).

Das ex vivo-Modell eignete sich zur Untersuchung der Mastzelldegranulation, da mit dem bekannten Mastzelldegranulator C48/80 eine massive Mastzelldegranulation beobachtet werden konnte. Allerdings zeigten sich unter diesen Bedingungen keine Unterschiede zwischen den Normoxie- oder Hypoxie-behandelten Tieren.

3.3.2 Einfluss von Histamin auf die durale Mastzelldegranulation

Da Histamin im Migräniker Kopfschmerzen induzieren kann (Krabbe und Olesen 1980) und der H1-Rezeptor durch seine Lokalisation auf Blutgefäßen (Jansen-Olesen et al. 1997) und seiner Fähigkeit zur Bildung von NO Lantoine 1998 #197}, ähnlich wie der 5-HT2B- Rezeptor, zu einer Aktivierung der trigeminalen Afferenzen und somit zur Ausschüttung von CGRP und SP führen könnte (s. Kapitel 1.6), sollte überprüft werden, ob durch Histamin eine Mastzelldegranulation ausgelöst werden kann. Bei der Histaminbehandlung der Dura mater von hypoxischen Tieren war in den Vorversuchen (Abb. 3.11) zumindest eine Tendenz zu einer erhöhten Mastzelldegranulation zu erkennen, weswegen verschiedene Dosierungen dieser Substanz zunächst am Gewebe hypoxischer Tiere getestet wurde. Histamin hat zu den vier Histaminrezeptoren sehr unterschiedliche Affinitäten, sodass ein großer Konzentrationsbereich gewählt wurde. Die geringsten Affinitäten zeigt Histamin gegenüber den H1- und H2- Rezeptoren (Tab. 4.1). Die Affinitäten gegenüber den H3- und H4- Rezeptoren liegen um das 1000-fache darüber. Das Vehikel SIF induzierte nach einer 10-minütigen Inkubation eine Degranulationsrate von 35,3±9,3 % (Abb. 3.12A). Ähnliche Ergebnisse lieferten die Histaminkonzentration 540 µM mit 39,3±11,8 % und 5,4 mM mit 40,6±23,5 %. Die höheren Dosierungen von 54 mM und 540 mM zeigten etwas geringere Degranulationsraten mit 13,5±7,1 % und 28,6±4,5 %. Es konnte kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen ermittelt werden (Kruskal-Wallis Test, p = 0,186). Bei der Anzahl gezählter Mastzellen ergaben sich Medianwerte von 64±11 bis 87±11, die sich ebenfalls nicht statistisch voneinander unterschieden (Kruskal-Wallis Test, p = 0,855). Eine 10-minütige Inkubation

Seite | 50

3.Ergebnisse von Histamin in verschiedenen Dosierungen reichte nicht aus, um eine Mastzelldegranulation zu induzieren.

A) B) 260 100 n.s. 240 n.s. 220 80 200 180 160 60 140 120 40 100 80 60 20

40

Anzahl gezählter Mastzellen gezählter Anzahl Degranulation in Prozent in [%] Degranulation 20 0 0

SIF SIF

54 mM Histamin 54 mM Histamin 540 µM Histamin5,4 mM Histamin 540 mM Histamin 540 µM Histamin5,4 mM Histamin 540 mM Histamin Abb. 3.12 Einfluss von verschiedenen Histamindosierungen auf die Degranulationsrate muriner duraler Mastzellen nach Hypoxie-Behandlung Gezeigt wird die Mastzelldegranulation in der hypoxischen murinen Dura mater in dem ausgewerteten Bereich (8 Bilder) nach einer 10-minütigen Inkubation entweder mit SIF, 540 µM, 5,4 mM, 54 mM oder 540 mM Histamin. Einzelwerte werden als Punkte und der Median als Linie dargestellt. Zu sehen ist sowohl die Mastzelldegranulation in Prozent (Kruskal-Wallis Test, p = 0,186) (A) als auch die Gesamtzahl der gezählten Mastzellen im Auswertebereich jeder Probe (Kruskal-Wallis Test, p = 0,855) (B). n = 5, außer für 540 mM Histamin: n = 4. n.s. = nicht signifikant.

Andere Prozesse der neurogenen Inflammation, wie zum Beispiel die PPE, traten erst nach knapp 20 min auf, sodass auch die Mastzelldegranulation möglicherweise eine längere Zeit benötigt. Aus diesem Grund wurde die Inkubationszeit von Histamin auf 20 min verlängert und zusätzlich weitere Konzentrationen ausgetestet. Alle Konzentrationen von Histamin (540 nM bis 54 mM) zeigten eine Degranulationsrate zwischen 19,3±11,7 und 35,4±6,3 % und unterschieden sich nicht von der Vehikelgruppe SIF mit 23,2±14,4 % (Kruskal-Wallis Test, p = 0,567) (Abb. 3.13A). Jedoch unterschied sich bei der verlängerten Inkubationszeit die Anzahl insgesamt gezählter Mastzellen. Hier zeigte sich zunächst eine steigende Tendenz, von der SIF-Gruppe mit 90±12 gezählten Mastzellen bis 156±17 gezählten Mastzellen in der 54 µM Histamin-Gruppe und dann wieder eine abnehmende Tendenz bis 88±25 gezählte Mastzellen für 54 mM Histamin (Abb. 3.13B).

Seite | 51

3.Ergebnisse

B) A) * 260 100 n.s. 240 220 80 200 180 160 60 140 120 40 100 80 60 20

40

Anzahl gezählter Mastzellen gezählter Anzahl Degranulation in Prozent in [%] Degranulation 20 0 0

SIF SIF

54 µM Histamin 54 µM Histamin 540 nM Histamin5,4 µM Histamin 540 µM Histamin5,4 mM Histamin54 mM Histamin 540 nM Histamin5,4 µM Histamin 540 µM Histamin5,4 mM Histamin54 mM Histamin Abb. 3.13 Einfluss von verschiedenen Histamindosierungen nach verlängerter Inkubationszeit auf murine durale Mastzellen nach Normoxie-Behandlung

Gezeigt wird die Mastzelldegranulation der normoxischen murinen Dura mater in dem ausgewerteten Bereich (8 Bilder) nach einer 20-minütigen Inkubation entweder mit SIF, 540 nM, 5,4 µM, 54 µM, 540 µM, 5,4 mM oder 54 mM Histamin. Einzelwerte werden als Punkte und der Median als Linie dargestellt. Zu sehen ist sowohl die Mastzelldegranulation in Prozent (Kruskal-Wallis Test, p = 0,567) (A) als auch die Gesamtzahl der gezählten Mastzellen im Auswertebereich jeder Probe (Kruskal-Wallis Test, p = 0,017, Post-Hoc-Test Dunn’s Methode: SIF vs. 540 µM Histamin, p < 0,05) (B). n = 5, außer für SIF: n = 4. Der Stern (*) stellt einen statistisch signifikanten Unterschied mit p < 0,05 dar. n.s. = nicht signifikant.

Dabei unterschieden sich die Gruppen 540 µM Histamin mit einem Median von 144±8 gezählten Mastzellen und SIF mit 90±12 signifikant voneinander, was vermutlich darauf zurückzuführen ist, dass die Streuung der Probe geringer war als bei den Proben mit geringeren Histamin-Konzentrationen (Kruskal-Wallis Test, p = 0,017, Post-Hoc-Test: Dunn’s Methode). Histamin konnte somit in keiner der getesteten Konzentrationen bei verlängerter Inkubationszeit eine Mastzelldegranulation in der murinen Dura mater induzieren, weswegen sich weitere Untersuchungen auf die Induktion von Mastzelldegranulation durch Serotoninagonisten konzentrieren sollten.

3.3.3 Einfluss von Serotoninagonisten auf die durale Mastzelldegranulation

Eine verlängerte Inkubationszeit sollte auch für mCPP ausgetestet werden. Dafür wurden die Zeiträume 20 min und 60 min ausgewählt. Nach einer Inkubation von 20 min ergab sich für die Vehikel-Gruppe SIF eine Degranulationsrate von 32,8±7,8 %, wohingegen mCPP

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3.Ergebnisse im selben Zeitraum eine mehr als doppelt so hohe Degranulationsrate von 72,3 ±3,4 % erzeugte (Abb. 3.14A). Ähnliche Ergebnisse waren für die Inkubationszeit von 60 min zu beobachten. Mit 24±14,2 % zeigte sich hier in der SIF-Gruppe eine übliche Degranulationsrate für das Vehikel. mCPP induzierte nach 60 min Inkubation eine hohe Degranulationsrate von 68,4±3,2 %. Dabei unterschieden sich jeweils die Vehikelgruppe und die Stimulationsgruppe innerhalb einer Inkubationszeit signifikant (Kruskal-Wallis Test, p = 0,002, Post-hoc-Test: Tukey Test). Die Anzahl gezählter Mastzellen variierte zwischen 99±18 und 151±11 Mastzellen im Median, unterschied sich dabei aber statistisch nicht (Kruskal-Wallis Test, p = 0,567) (Abb. 3.14B). Eine 20-minütige Inkubationszeit war somit ausreichend zur Induktion einer Mastzelldegranulation mit mCPP, weswegen weitere Experimente mit dieser Inkubationsdauer fortgeführt wurden.

A) ** ** B) ** 260 100 240 n.s. 220 80 200 180 160 60 140 120 40 100 80 60 20

40 Anzahl gezählter Mastzellen gezählter Anzahl Degranulation in Prozent in [%] Degranulation 20 0 0

SIF 20 min SIF 60 min SIF 20 min SIF 60 min

5 mM mCPP 20 min 5 mM mCPP 60 min 5 mM mCPP 20 min 5 mM mCPP 60 min Abb. 3.14 Einfluss von mCPP auf die durale Mastzelldegranulation nach verlängerter Inkubation Gezeigt wird die Mastzelldegranulation der normoxischen murinen Dura mater in dem ausgewerteten Bereich (8 Bilder) nach einer 20- und einer 60-minütigen Inkubation mit SIF oder 5 mM mCPP. Einzelwerte werden als Punkte und der Median als Linie dargestellt. Zu sehen ist sowohl die Mastzelldegranulation in Prozent (Kruskal-Wallis Test, p = 0,002, Post-hoc-Test Tukey Test: SIF 20 min vs. 5 mM mCPP 20 min, SIF 60 min vs. 5 mM mCPP 60 min, SIF 20 min vs. 5 mM mCPP 60 min, p < 0,05) (A) als auch die Gesamtzahl der gezählten Mastzellen im Auswertebereich jeder Probe (Kruskal-Wallis Test, p = 0,567) (B). n = 5. Die Sterne (**) stellen einen statistisch signifikanten Unterschied mit p < 0,01 dar. n.s. = nicht signifikant.

Da 5 mM mCPP eine signifikant erhöhte Mastzelldegranulation in der murinen Dura mater auslöste, sollte überprüft werden, ob Mastzellen durch die Hypoxie-Behandlung sensitiviert Seite | 53

3.Ergebnisse werden. Dazu wurden verschiedene Konzentrationen von mCPP (5 µM, 50 µM, 0,5 mM oder 5 mM) für 20 min inkubiert und sowohl am normoxischen als auch hypoxischen Gewebe getestet. Einzig die Konzentration von 5 mM mCPP induzierte eine erhöhte Mastzelldegranulationsrate von 75,7±10,7 %, wohingegen SIF und die anderen Konzentrationen von mCPP nur eine basale Mastzelldegranulation von 7,4±1,4 bis 30,1±12 % auslösten (Abb. 3.15A). Die durch die höchste mCPP-Konzentration (5 mM) induzierte Mastzelldegranulation war dabei statistisch signifikant erhöht im Vergleich zu SIF (Kruskal-Wallis Test, p = 0,015, Post-hoc-Test: Dunn´s Methode). In Abb. 3.15B ist die Anzahl gezählter Mastzellen dargestellt, die sich in dem Versuch mit 101±14 bis 154±35 gezählten Mastzellen bei den verschiedenen Gruppen statistisch nicht voneinander unterschied (Kruskal-Wallis Test, p = 0,264).

A) * B) 260 100 240 n.s. 220 80 200 180 160 60 140 120 40 100 80 60 20

40 Anzahl gezählter Mastzellen gezählter Anzahl Degranulation in Prozent in [%] Degranulation 20 0 0

SIF SIF

5 µM mCPP 5 µM mCPP 5 mM mCPP 50 µM mCPP 5 mM mCPP 50 µM mCPP 0,5 mM mCPP 0,5 mM mCPP Abb. 3.15 Mastzelldegranulation in der murinen Dura Mater bei verschiedenen Dosierungen des partiellen 5-HT2B-Rezeptoragonisten mCPP nach Normoxie-Behandlung

Gezeigt wird die Mastzelldegranulation der normoxischen murinen Dura mater in dem ausgewerteten Bereich (8 Bilder) nach einer 20-minütigen Inkubation mit SIF, 5 µM, 50 µM, 0,5 mM oder 5 mM mCPP. Einzelwerte werden als Punkte und der Median als Linie dargestellt. Zu sehen ist sowohl die Mastzelldegranulation in Prozent (Kruskal-Wallis Test, p = 0,015, Post-hoc-Test Dunn´s Methode: SIF vs. 5 mM mCPP, p < 0,05) (A) als auch die Gesamtzahl der gezählten Mastzellen im Auswertebereich jeder Probe (Kruskal-Wallis Test, p = 0,264) (B). n = 5, außer SIF n = 4. Der Stern (*) stellt einen statistisch signifikanten Unterschied mit p < 0,05 dar. n.s. = nicht signifikant.

Für die Hypoxie behandelten Tiere sahen die Degranulationsraten sehr ähnlich aus. Auch hier induzierte 5 mM mCPP eine starke Degranulation der Mastzellen (79,2±5,4 %), die signifikant höher war als SIF (Kruskal-Wallis Test, p = 0,014, Post-hoc-Test: Dunn´s

Seite | 54

3.Ergebnisse

Methode) (Abb. 3.16A). Die anderen mCPP-Konzentrationen, sowie SIF, führten zu geringeren basalen Degranulationsrate von 16,8±9,6 bis 26,7±6,3 % und waren damit vergleichbar mit den Werten im normoxischem Gewebe. Auch die Anzahl gezählter Mastzellen war mit 100±14 bis 152±38 gezählten Mastzellen sehr ähnlich und statistisch nicht signifikant (Kruskal-Wallis Test, p = 0,175) (Abb. 3.16B).

A) * B) 260 100 240 n.s. 220 80 200 180 160 60 140 120 40 100 80 60 20

40 Anzahl gezählter Mastzellen gezählter Anzahl Degranulation in Prozent in [%] Degranulation 20 0 0

SIF SIF

5 µM mCPP 5 µM mCPP 5 mM mCPP 50 µM mCPP 5 mM mCPP 50 µM mCPP 0,5 mM mCPP 0,5 mM mCPP Abb. 3.16 Mastzelldegranulation in der murinen Dura Mater bei verschiedenen Dosierungen des partiellen 5-HT2B-Rezeptoragonisten mCPP nach Hypoxie-Behandlung

Gezeigt wird die Mastzelldegranulation der hypoxischen murinen Dura mater in dem ausgewerteten Bereich (8 Bilder) nach einer 20-minütigen Inkubation mit SIF, 5 µM, 50 µM, 0,5 mM oder 5 mM mCPP. Einzelwerte werden als Punkte und der Median als Linie dargestellt. Zu sehen ist sowohl die Mastzelldegranulation in Prozent (Kruskal-Wallis Test, p = 0,014, Post-hoc-Test Dunn´s Methode, SIF vs. 5 mM mCPP, p < 0,05) (A) als auch die Gesamtzahl der gezählten Mastzellen im Auswertebereich jeder Probe (Kruskal-Wallis Test, p = 0,175) (B). n = 5. Der Stern (*) stellt einen statistisch signifikanten Unterschied mit p < 0,05 dar. n.s. = nicht signifikant.

Um zu überprüfen, ob die Mastzelldegranulation durch den 5-HT2B-Rezeptor vermittelt wurde, sollte zusätzlich zu mCPP der spezifischere 5-HT2B-Rezeptoragonist BW723C86 (Tab. 4.3) getestet werden. Da es keine Unterschiede zwischen Normoxie- und Hypoxie- Mäusen bezüglich der Mastzelldegranulation gab, wurde BW723C86 nur an Duren von normoxischen Mäusen untersucht. Um BW723C86 besser lösen zu können, wurde dem Vehikel SIF 0,5 % Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzugefügt. Das Vehikel führte ähnlich wie SIF alleine zu einer Mastzelldegranulation von 18,8±3 % (Abb. 3.17A). Im Vergleich dazu konnte mit 5 mM mCPP eine Steigerung der Mastzelldegranulation um das Vierfache (74,6±7,9 %) und mit 400 µM BW723C86 sogar um das Fünffache (91,5±0,7 %) erzeugt werden. Dabei waren die Degranulationsraten beider 5-HT2B-Rezeptoragonisten-Gruppen Seite | 55

3.Ergebnisse signifikant erhöht im Vergleich zu der Vehikel-Gruppe (Kruskal-Wallis Test, p ≤ 0,001, Post-hoc-Test: Dunnette´s Methode). Andere Konzentrationen von BW723C86 induzierten ausschließlich basale Degranulationsraten von 16,7±3,1 bis 22,9±4,1 %. Bei der Anzahl schwankte der Median zwischen 81±26 und 160±25 Mastzellen in den verschiedenen Gruppen (Abb. 3.17B). Es ergab sich dabei aber kein signifikanter Unterschied (Kruskal-

Wallis Test, p = 0,391). Eine Induktion der Mastzelldegranulation war also mit 5-HT2B- Rezeptoragonisten in jeweils einer Konzentration möglich.

B) A) *** 260 100 240 n.s. 220 80 200 180 160 60 140 120 40 100 80 60 20

40

Anzahl gezählter Mastzellen gezählter Anzahl Degranulation in Prozent in [%] Degranulation 20 0 0

5 mM mCPP 5 mM mCPP 4 µM BW723C86 4 µM BW723C86 0,5% DMSO in SIF 400 nM BW723C86 40 µM BW723C86400 µM BW723C86 0,5% DMSO in SIF 400 nM BW723C86 40 µM BW723C86400 µM BW723C86

Abb. 3.17 Vergleich zwischen dem spezifischeren 5-HT2B-Rezeptoragonisten BW723C86 zu mCPP bezüglich der duralen murinen Mastzelldegranulation Gezeigt wird die Mastzelldegranulation der normoxischen murinen Dura mater in dem ausgewerteten Bereich (8 Bilder) nach einer 20-minütigen Inkubation mit 0,5 % DMSO in SIF, 5 mM mCPP, 400 nM, 4 µM, 40 µM oder 400 µM BW723C86. Einzelwerte werden als Punkte und der Median als Linie dargestellt. Zu sehen ist sowohl die Mastzelldegranulation in Prozent (Kruskal-Wallis Test, p ≤ 0,001, Post-hoc-Test Dunnette´s Methode getestet gegen 0,5 % DMSO: 0,5 % DMSO vs. 5 mM mCPP, 0,5 % DMSO vs. 400 µM BW723C86, p < 0,05) (A) als auch ist die Gesamtzahl der gezählten Mastzellen im Auswertebereich jeder Probe (Kruskal-Wallis Test, p = 0,391) (B). n = 5. Die Sterne (***) stellen einen statistisch signifikanten Unterschied mit p ≤ 0,001 dar. n.s. = nicht signifikant.

3.3.4 Einfluss von Serotoninantagonisten auf die mCPP- oder BW723C86-induzierte Mastzelldegranulation

Um festzustellen, ob die mCPP-induzierte Mastzelldegranulation 5-HT2B-Rezeptor vermittelt war, sollte der spezifische 5-HT2B-Rezeptor-Rezeptorantagonist RS127445 (Bonhaus et al. 1999b) auf seine Fähigkeit die Mastzelldegranulation zu inhibieren getestet Seite | 56

3.Ergebnisse werden. Dies wurde sowohl an normoxischem als auch hypoxischem Gewebe getestet, um zu überprüfen, ob Unterschiede bei der Inhibition der Mastzelldegranulation zwischen den beiden Gruppen vorliegt. Da sich RS127445 besser mit DMSO lösen ließ, wurde hierfür das Vehikel SIF mit 0,5 % DMSO gewählt und für mCPP SIF alleine verwendet. Dabei erzeugte die Antagonistenkontrolle 100 µM RS127445 alleine bei dem Normoxie-Gewebe eine basale Degranulationsrate von 15,6±7,4 %, ebenso wie die beiden Vehikel SIF und

0,5 % DMSO in SIF mit 16,3±3,6 % und 12,8±2,8 % (Abb. 3.18A). Der 5-HT2B- Rezeptorantagonist RS127445 in Kombination mit mCPP induzierte mit 68,9±3,7 % eine ebenso hohe Degranulationsrate wie mCPP alleine mit 66±8,2 %. Mit dem Mann-Whitney Test konnte zwischen der 5 mM mCPP-Gruppe und seiner Vehikel-Gruppe (SIF ohne DMSO) ein statistisch signifikanter Unterschied festgestellt werden (p = 0,008).

A) B) ** *** 260 100 240 n.s. 220 80 200 180 160 60 140 120 40 100 80 60 20

40

Anzahl gezählter Mastzellen gezählter Anzahl Degranulation in Prozent in [%] Degranulation 20 0 0

SIF SIF

5 mM mCPP 5 mM mCPP

0,5% DMSO in SIF 0,5 % DMSO in SIF

100 µM RS127445 (mCPP) 100 µM RS127445 (mCPP) 100 µM RS127445 Kontrolle 100 µM RS127445 Kontrolle Abb. 3.18 Blockierungsversuch der mCPP-induzierten Mastzelldegranulation in der normoxischen murinen Dura mater mithilfe des 5-HT2B-Rezeptorantagonisten RS127445 Gezeigt wird die Mastzelldegranulation der normoxischen murinen Dura mater in Prozent in dem ausgewerteten Bereich (8 Bilder) nach einer 20-minütigen Inkubation mit den Vehikeln SIF oder 0,5 % DMSO in SIF (2x Inkubation), 5 mM mCPP, der Antagonistenkontrolle 100 µM RS127445 (2x Inkubation) oder der Blockierungsgruppe 100 µM RS127445 (zuerst Antagonist, dann Agonist und Antagonist). Einzelwerte werden als Punkte und der Median als Linie dargestellt. Zu sehen ist sowohl die Mastzelldegranulation in Prozent (Mann-Whitney, SIF vs. 5 mM mCPP, p = 0,008; Kruskal- Wallis Test, p = 0,008, Post-hoc-Test Dunnette´s Methode getestet gegen 0,5 % DMSO: Signifikanz: 0,5 % DMSO vs. 100 µM RS127445, (p < 0,01) (A) als auch ist die Gesamtzahl der gezählten Mastzellen im Auswertebereich jeder Probe (Mann-Whitney, p = 0,841, Kruskal-Wallis Test, p = 0,253) (B). n = 5. Die Sterne stellen einen statistisch signifikanten Unterschied mit p < 0,01 (**) oder mit p ≤ 0,001 (***) dar. n.s. = nicht signifikant. Seite | 57

3.Ergebnisse

Für RS127445 mit mCPP zeigte sich ebenfalls eine signifikante Erhöhung im Vergleich zu der Vehikelkontrolle mit 0,5 % DMSO (Kruskal-Wallis Test, p < 0,01, Post-hoc-Test: Dunnette´s Methode), während die Antagonistenkontrolle (100 µM RS127445 alleine) sich nicht von der Vehikelkontrolle unterschied. Die Anzahl der gezählten Mastzellen in den verschiedenen Gruppen zeigten Medianwerte von 80±4 bis 117±37 (Abb. 3.18B), die nicht signifikant unterschiedlich voneinander waren (Mann-Whitney: p = 0,841, Kruskal-Wallis Test: p = 0,253).

Ähnliche Ergebnisse lieferten die Versuche mit dem Gewebe hypoxischer Tiere (Abb. 3.19A). Basale Degranulationsraten waren auch hier für die SIF-Gruppe mit 11,5±1,8 % und die Antagonistenkontrolle 100 µM RS127445 mit 10,7±2,2 % zu beobachten.

A) B) ** *** 260 100 240 n.s. 220 80 200 180 160 60 140 120 40 100 80 60 20

40

Anzahl gezählter Mastzellen gezählter Anzahl Degranulation in Prozent in [%] Degranulation 20 0 0

SIF SIF

5 mM mCPP 5 mM mCPP

0,5 % DMSO in SIF 0,5 % DMSO in SIF

100 µM RS127445 (mCPP) 100 µM RS127445 (mCPP) 100 µM RS127445 Kontrolle 100 µM RS127445 Kontrolle Abb. 3.19 Blockierungsversuch der mCPP-induzierten Mastzelldegranulation in der hypoxischen murinen Dura mater mithilfe des 5-HT2B-Rezeptorantagonisten RS127445 Gezeigt wird die Mastzelldegranulation der hypoxischen murinen Dura mater in dem ausgewerteten Bereich (8 Bilder) nach einer 20-minütigen Inkubation mit den Vehikeln SIF oder 0,5 % DMSO in SIF (2x Inkubation), 5 mM mCPP, der Antagonistenkontrolle 100 µM RS127445 (2x Inkubation nur Antagonist) oder den Blockierungsgruppen 100 µM RS127445 (zuerst Antagonist, dann Agonist und Antagonist). Einzelwerte werden als Punkte und der Median als Linie dargestellt. Zu sehen ist sowohl die Mastzelldegranulation in Prozent (Mann-Whitney, SIF vs. 5 mM mCPP, p = 0,008; Kruskal-Wallis Test, p = 0,008, Post-hoc-Test Dunnette´s Methode getestet gegen 0,5 % DMSO: 0,5 % DMSO vs. 100 µM RS127445, p < 0,01) (A) als auch die Gesamtzahl der gezählten Mastzellen im Auswertebereich jeder Probe (Mann-Whitney, p = 0,548; Kruskal-Wallis Test, p = 0,445) (B). n = 5. Die Sterne stellen einen statistisch signifikanten Unterschied mit p < 0,01 (**) oder mit p ≤ 0,001 (***) dar. n.s. = nicht signifikant.

Seite | 58

3.Ergebnisse

Das Vehikel SIF mit 0,5 % DMSO wies eine leicht erhöhte Degranulationsrate von 20,7±11,1 % auf. Eine im Vergleich zu SIF siebenfache Erhöhung der Degranulationsrate zeigte 5 mM mCPP mit 72,5±7,5 %. Die Blockierungsgruppe 100 µM RS127445 mit mCPP induzierte sogar eine 10 % höhere Degranulationsrate (81,3±5,8 %). Der Mann- Whitney Test zeigte, dass 5 mM mCPP auch hier wieder signifikant höhere Degranulationsraten auslöste als das Vehikel SIF (p = 0,008), ähnlich wie bei den normoxischen Tieren. Bei den anderen Gruppen zeigte nur die Blockierungsgruppe 100 µM RS127445 mit mCPP eine signifikant höhere Degranulationsraten als die Vehikelgruppe 0,5 % DMSO in SIF (Kruskal-Wallis Test, p < 0,01, Post-hoc-Test: Dunnette´s Methode). Bei der Anzahl gezählter Mastzellen befanden sich die Mediane zwischen 81±1 und 135±41 gezählte Mastzellen ohne statistisch signifikanten Unterschieden zwischen den verschiedenen Behandlungsgruppen (Mann-Whitney: p = 0,548, Kruskal-Wallis Test: p = 0,445) (Abb. 3.19B)

Die verwendete Dosierung für RS127445 war geringfügig höher als der kalkulierte IC50- Wert (64 µM) und war somit möglicherweise nicht ausreichend, um die Mastzelldegranulation zu inhibieren. Deswegen wurde eine noch höhere Dosierung verwendet, um zu überprüfen, ob die Degranulation durch den 5-HT2B-Rezeptor vermittelt wird. Dazu wurde die dreifach höhere Dosierung von RS127445 eingesetzt. Zudem sollte die Wirksamkeit von RS127445 auf die Inhibition der BW723C86-induzierten Mastzelldegranulation überprüft werden, da BW723C86 ein spezifischerer Agonist für den

5-HT2B-Rezeptor ist. In diesem Fall wurden die Untersuchungen nur am Gewebe von normoxischen Tieren durchgeführt, da es im Vorversuch keinerlei Unterschiede in der Reaktion bei den Normoxie- und Hypoxie-Gruppen gab (Abb. 3.18, Abb. 3.19). Das Vehikel erzeugte auch hier wieder eine basale Degranulationsrate von 17±1 % und die Antagonistenkontrolle mit 7,4±1,4 % eine noch geringere Degranulationsrate (Abb. 3.20). Die mit 5 mM mCPP induzierte Mastzelldegranulation von 96,3±0,9 % war ähnlich hoch wie die Werte der beiden Blockierungsgruppen 100 µM RS127445 mit mCPP und 300 µM

RS127445 mit mCPP mit 89,9±3,5 % und 93,9±2,1 %. Der spezifischere 5-HT2B- Rezeptoragonist BW723C86 erzeugte ebenfalls eine hohe Degranulationsrate von 93,9±6,1 %. Die dazugehörige Blockierungsgruppe 100 µM RS127445 mit BW723C86 (91,5±3,9 %) unterschied sich kaum von der BW723C86-Gruppe. Statistisch konnte ein Seite | 59

3.Ergebnisse signifikanter Unterschied der Gruppen 5 mM mCPP, 100 µM RS127445 mit mCPP, 300 µM RS127445 mit mCPP, 400 µM BW723C86 und 100 µM RS127445 mit BW723C86 jeweils im Vergleich zu dem Vehikel SIF mit 0,5 % DMSO ermittelt werden (Kruskal-Wallis Test, p = <0,001, Post-hoc-Test: Dunnette´s Methode). Bei der Anzahl gezählter Mastzellen ergaben sich Mediane von 66±10 bis 135±14 gezählten Mastzellen in den verschiedenen Gruppen, die sich statistisch nicht voneinander unterschieden (Kruskal-Wallis Test, p = 0,111) (Abb. 3.20B). Abgesehen von der Vehikelgruppe und der Antagonistenkontrolle induzierten alle Behandlungsgruppen hohe Degranulationsraten, weswegen eine Beteiligung weiterer Serotoninrezeptoren mit einem anderen Serotoninantagonisten getestet werden sollte.

A) *** B) 260 100 240 n.s. 220 80 200 180 160 60 140 120 40 100 80 60 20

40

Anzahl gezählter Mastzellen gezählter Anzahl Degranulation in Prozent in [%] Degranulation 20 0 0

5 mM mCPP 5 mM mCPP

0,5% DMSO in SIF 400 µM BW723C86 0,5 % DMSO in SIF 400 µM BW723C86

100 µM RS127445300 µM (mCPP)RS127445 (mCPP) 100 µM RS127445300 µM (mCPP)RS127445 (mCPP) 300 µM RS127445 Kontrolle 300 µM RS127445 Kontrolle 100 µM RS127445 (BW723C86) 100 µM RS127445 (BW723C86) Abb. 3.20 Blockierungsversuch der mCPP- oder BW723C86-induzierten Mastzelldegranulation in der normoxischen murinen Dura mater mithilfe des 5-HT2B-Rezeptorantagonisten RS127445 Gezeigt wird die Mastzelldegranulation der normoxischen murinen Dura mater in dem ausgewerteten Bereich (8 Bilder) nach einer 20-minütigen Inkubation mit dem Vehikel 0,5 % DMSO in SIF (2x Inkubation), 5 mM mCPP, der Antagonistenkontrolle 300 µM RS127445 (2x Inkubation nur Antagonist) oder den Blockierungsgruppen 100 µM oder 300 µM RS127445 mit 5 mM mCPP, 400 µM BW723C86 und die dazugehörige Blockierungsgruppe 100 µM RS127445. Einzelwerte werden als Punkte und der Median als Linie dargestellt. Zu sehen ist sowohl die Mastzelldegranulation in Prozent (Kruskal-Wallis Test, p = <0,001, Post-hoc-Test Dunnette´s Methode getestet gegen 0,5 % DMSO: 0,5 % DMSO vs. 5 mM mCPP, 0,5 % DMSO vs. 100 µM RS127445 mit 5 mM mCPP; 0,5 % DMSO vs. 300 µM RS127445 mit 5 mM mCPP, 0,5 % DMSO vs. 400 µM BW723C86, 0,5 % DMSO vs. 100 µM RS127445 mit BW723C86, p < 0,05) (A) als auch die Gesamtzahl der gezählten Mastzellen im Auswertebereich jeder Probe (Kruskal-Wallis Test, p = 0,111) (B). n = 5. Die Sterne (***) stellen einen statistisch signifikanten Unterschied mit p ≤ 0,001 dar. n.s. = nicht signifikant.

Seite | 60

3.Ergebnisse

Mithilfe des unspezifischen Serotoninantagonist Methysergid sollte getestet werden, ob die Mastzelldegranulation durch einen anderen Serotoninrezeptor induziert wird. Sowohl SIF mit 11,8±5,7 % als auch die Antagonistenkontrolle 1 mM Methysergid mit 16,1±0,7 % induzierten eine basale Degranulationsrate (Abb. 3.21A). Die Degranulationsrate der mCPP-Gruppe lag bei 70,7±9,1 %. Die Gruppen, die zusätzlich 1 µM bis 1 mM Methysergid enthielten, zeigten Degranulationsrate von 73,4±5 % bis 77,1±7,3 %. Statistische Unterschiede wurden zwischen SIF und 5 mM mCPP und jeweils zwischen SIF und jeder Blockierungsgruppe mit mCPP festgestellt (Kruskal-Wallis Test, p = 0,001, Post- hoc-Test: Dunnette´s Methode). Bei der Anzahl der gezählten Mastzellen, im Median 46±22 bis 94±2, war statistisch kein Unterschied zwischen den einzelnen pharmakologischen Gruppen festzustellen (Kruskal-Wallis Test, p = 0,080 (Abb. 3.21B).

A) *** B) 260 100 240 n.s. 220 80 200 180 160 60 140 120 40 100 80 60 20

40

Anzahl gezählter Mastzellen gezählter Anzahl Degranulation in Prozent in [%] Degranulation 20 0 0

SIF SIF

5 mM mCPP 5 mM mCPP

1 µM Methysergid (mCPP) 1 µM Methysergid (mCPP) 10 µM Methysergid (mCPP)1 mM Methysergid (mCPP) 10 µM Methysergid (mCPP)1 mM Methysergid (mCPP) 100 µM Methysergid (mCPP) 100 µM Methysergid (mCPP) 1 mM Methysergid (Kontrolle) 1 mM Methysergid (Kontrolle) Abb. 3.21 Blockierungsversuch der mCPP-induzierten Mastzelldegranulation in der normoxischen murinen Dura mater mithilfe des 5-HT1/2/7-Rezeptorantagonisten Methysergid Gezeigt wird die Mastzelldegranulation der normoxischen murinen Dura mater in dem ausgewerteten Bereich (8 Bilder) nach einer 20-minütigen Inkubation mit dem Vehikel 0,5 % DMSO in SIF (2x Inkubation), 5 mM mCPP, der Antagonistenkontrolle 1 mM Methysergid (2x Inkubation nur Antagonist) oder den Blockierungsgruppen 1 µM, 10 µM, 100 µM oder 1 mM Methysergid mit 5 mM mCPP. Einzelwerte werden als Punkte und der Median als Linie dargestellt. Zu sehen ist sowohl die Mastzelldegranulation in Prozent (Kruskal-Wallis Test, p = 0,001, Post-hoc-Test Dunnette´s Methode getestet gegen SIF: SIF vs. 5 mM mCPP, SIF vs. 1 µM Methysergid mit 5 mM mCPP; SIF vs. 10 µM Methysergid mit 5 mM mCPP, SIF vs. 100 µM Methysergid mit 5 mM mCPP, SIF vs. 1 mM Methysergid mit 5 mM mCPP, p < 0,05) (A) als auch die Gesamtzahl der gezählten Mastzellen im Auswertebereich jeder Probe (Kruskal-Wallis Test, p = 0,080) (B). n = 5. Die Sterne (***) stellen einen statistisch signifikanten Unterschied mit p ≤ 0,001 dar. n.s. = nicht signifikant. Seite | 61

3.Ergebnisse

3.3.5 Einfluss vom H1-Rezeptorantagonisten Cetirizin auf die mCPP-induzierte Mastzelldegranulation in der Dura mater der Maus

Der Serotoninagonist mCPP besitzt auch eine geringere Affinität (pKi 6,4) zu dem Histaminrezeptor H1 von Meerschweinchen (Tab. 4.2), sodass überprüft werden sollte, ob mCPP seine Wirkung unspezifisch über den H1-Rezeptor vermittelt, statt über einen Serotoninrezeptor. Dazu wurde der H1-Rezeptorantagonist Cetirizin verwendet.

A) *** B) 260 100 240 n.s. 220 80 200 180 160 60 140 120 40 100 80 60 20

40

Anzahl gezählter Mastzellen gezählter Anzahl Degranulation in Prozent in [%] Degranulation 20 0 0

SIF SIF

5 mM mCPP 5 mM mCPP

6 µM Cetirizin (mCPP) 6 µM Cetirizin (mCPP) 60 µM Cetirizin (mCPP)6 mM Cetirizin (mCPP) 60 µM Cetirizin (mCPP)6 mM Cetirizin (mCPP) 600 µM Cetirizin (mCPP) 600 µM Cetirizin (mCPP) 6 mM Cetirizin (Kontrolle) 6 mM Cetirizin (Kontrolle)

Abb. 3.22 Blockierungsversuch der mCPP-induzierten Mastzelldegranulation in der normoxischen murinen Dura mater mithilfe des inversen H1-Rezeptoragonisten Cetirizin

Gezeigt wird die Mastzelldegranulation der normoxischen murinen Dura mater in dem ausgewerteten Bereich (8 Bilder) nach einer 20-minütigen Inkubation mit dem Vehikel SIF (2x Inkubation), 5 mM mCPP, der Antagonistenkontrolle 6 mM Cetirizin (2x Inkubation nur Antagonist) oder den Blockierungsgruppen 6 µM, 60 µM, 600 µM oder 6 mM Cetirizin mit 5 mM mCPP. Einzelwerte werden als Punkte und der Median als Linie dargestellt. Zu sehen ist sowohl die Mastzelldegranulation in Prozent (Kruskal-Wallis Test, p ≤ 0,001, Post-hoc-Test Dunn´s Methode getestet gegen SIF: SIF vs. 6 mM Cetirizin, SIF vs. 600 µM Cetirizin mit 5 mM mCPP, SIF vs. 6 mM Cetirizin mit 5 mM mCPP, p < 0,05) (A) als auch die Gesamtzahl der gezählten Mastzellen im Auswertebereich jeder Probe (Kruskal-Wallis Test, p = 0,129) (B). n = 5, außer 6 µM Cetirizin mit 5 mM mCPP n = 4. Die Sterne (***) stellen einen statistisch signifikanten Unterschied mit p ≤ 0,001 dar. n.s. = nicht signifikant.

Eine basale Degranulationsrate lag nur für die Vehikel-Gruppe mit 12,9±2,5 % vor (Abb. 3.22A). Alle anderen pharmakologischen Behandlungen, also 5 mM mCPP, 6 mM Cetirizin (Antagonistenkontrolle) und alle Blockierungsgruppen von 6 µM bis 6 mM Cetirizin mit mCPP erzeugten eine Degranulationsraten von über 69 %. Die Positivkontrolle 5 mM mCPP induzierte hier eine Degranulationsrate von 75±1,9 %. Vergleichbar damit sind die Seite | 62

3.Ergebnisse

Gruppen mCPP mit 6 µM und mit 60 µM Cetirizin, die 78,6±2,4 % und 69,6±3 % degranulierte Mastzellen aufwiesen. Etwas höher waren die Degranulationsraten der Antagonistenkontrolle 6 mM Cetirizin mit 80,4 %, der Gruppe 600 µM Cetirizin mit mCPP mit 81,5±5,6 % und der Gruppe 6 mM Cetirizin mit mCPP mit 92,6±3 %. Es konnten signifikante Unterschiede jeweils zwischen SIF und der Antagonistenkontrolle 6 mM Cetirizin, 60 µM Cetirizin mit mCPP, 6 mM Cetirizin mit mCPP ermittelt werden (Kruskal- Wallis Test, p ≤ 0,001, Post-hoc-Test: Dunn´s Methode). Bei der Anzahl gezählter Mastzellen war kein signifikanter Unterschied zwischen den Behandlungsgruppen zu sehen (Kruskal-Wallis Test, p = 0,129). Der Median lag zwischen 51±8 und 131±18 gezählten Mastzellen (Abb. 3.22B).

3.3.6 Einfluss des CGRP-Rezeptorantagonisten Olcegepant auf die durale Mastzelldegranulation

Das Neuropeptid calcitonin gene-related peptide (CGRP) spielt in der Migräne Pathophysiologie eine zentrale Rolle (Olesen et al. 2004; Jansen-Olesen et al. 1997). Außerdem kann es eine Mastzelldegranulation induzieren (Ottosson und Edvinsson 1997). Eine Involvierung von CGRP könnte auf eine indirekte Aktivierung der Mastzellen hinweisen, da zunächst eine Aktivierung des trigeminalen Afferenzen nötig wäre (s. Kapitel 1.6). Dazu wurde der CGRP-Rezeptorantagonist Olcegepant getestet. Es wurde eine Konzentrationsreihe durchgeführt, bei der die Konzentration von 20 nM Olcegepant mit mCPP aufgrund eines methodischen Fehlers ausgeschlossen werden musste. Die Gruppen 0,5 % DMSO in SIF und 200 nM Olcegepant als Antagonistenkontrolle zeigten mit 6,1±1,3 % und 6,9±1,6 % eine geringe basale Degranulationsrate (Abb. 3.23). Die Positivkontrolle 5 mM mCPP induzierte eine Degranulationsrate von 83,9±2,8 %. Ähnlich hoch war die Degranulationsrate der Gruppe 0,2 nM Olcegepant mit mCPP (82,1±3,7 %). Die anderen Olcegepant-Gruppen zeigten etwas geringere Degranulationsraten mit 73,6±8,2 % für 2 nM Olcegepant mit mCPP und 75,7±4,3 % für 200 nM Olcegepant mit mCPP. Es konnte ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen jeweils 5 mM mCPP, 0,2 nM Olcegepant mit mCPP, 200 nM Olcegepant mit mCPP und dem Vehikel 0,5 % DMSO in SIF detektiert werden (Kruskal-Wallis Test, p = 0,001, Post-hoc-Test: Dunn´s Methode).

Seite | 63

3.Ergebnisse

Der Median der Anzahl gezählter Mastzellen lag für die verschiedenen Gruppen zwischen 54±12 und 80±10 gezählten Mastzellen, außer bei der Gruppe 200 nM Olcegepant, da hier 134±64 Mastzellen gezählt wurden (Abb. 3.23B). Dennoch unterscheiden sich die Gruppen statistisch nicht voneinander (Kruskal-Wallis Test, p = 0,738).

A) *** B) 260 100 240 n.s. 220 80 200 180 160 60 140 120 40 100 80 60 20

Degranulation in Prozent in [%] Degranulation 40 Anzahl gezählter Mastzellen gezählter Anzahl 20 0 0

0,5 % DMSO 5 mM mCPP 0,5 % DMSO 5 mM mCPP

2 nM Olcegepant (mCPP) 2 nM Olcegepant (mCPP) 0,2 nM Olcegepant (mCPP)200 nM Olcegepant (mCPP) 0,2 nM Olcegepant (mCPP)200 nM Olcegepant (mCPP) 200 nM Olcegepant (Kontrolle) 200 nM Olcegepant (Kontrolle)

Abb. 3.23 Wirkung des CGRP-Rezeptorantagonisten Olcegepant auf die mCPP-Mastzelldegranulation in der murinen Dura mater Gezeigt wird die Mastzelldegranulation der normoxischen murinen Dura mater in dem ausgewerteten Bereich (8 Bilder) nach einer 20-minütigen Inkubation mit dem Vehikel 0,5 % DMSO in SIF (2x Inkubation), 5 mM mCPP, der Antagonistenkontrolle 200 nM Olcegepant (2x Inkubation nur Antagonist) oder den Blockierungsgruppen 0,2 nM, 2 nM oder 200 nM Olcegepant mit 5 mM mCPP. Einzelwerte werden als Punkte und der Median als Linie dargestellt. Zu sehen ist sowohl die Mastzelldegranulation in Prozent (Kruskal-Wallis Test, p = 0,001, Post-hoc-Test Dunn´s Methode getestet gegen 0,5 % DMSO in SIF: 0,5 % DMSO in SIF vs. 5 mM mCPP, 0,5 % DMSO in SIF vs. 0,2 nM Olcegepant mit 5 mM mCPP und 0,5 % DMSO in SIF vs. 200 nM Olcegepant mit 5 mM mCPP, p < 0,05) (A) als auch die Gesamtzahl der gezählten Mastzellen im Auswertebereich jeder Probe (Kruskal-Wallis Test, p = 0,738) (B). n = 5. Die Sterne (***) stellen einen statistisch signifikanten Unterschied mit p ≤ 0,001 dar. n.s. = nicht signifikant.

3.4 Single Cell-PCR mit murinen Mastzellen der Dura mater - Pilotversuch

Die Aktivierung von Mastzellen kann direkt an der Mastzelle oder über eine Signalkaskade erfolgen, die verschiedene Moleküle wie NO, CGRP oder SP involvieren kann, wie sie in Kapitel 1.6 beschrieben ist. Die Expressionsdaten von relevanten Rezeptoren auf Mastzellen selbst könnten Hinweise darüber liefern, ob diese Rezeptor an einer direkten

Seite | 64

3.Ergebnisse

Aktivierung von Mastzellen beteiligt sein könnten. Aus diesem Grund wurde eine Single Cell-PCR mit cDNA von Mastzellen aus murinen Dura mater-Gewebe in einem Pilotversuch durchgeführt. Dazu wurden PCRs mit der cDNA von drei verschiedenen Mastzellen in separaten Ansätzen (MCx.x) und der cDNA von einer Dura mater (DM) durchgeführt. Des Weiteren wurden bei jeder PCR jeweils eine Wasserkontrolle, die statt der cDNA nur Wasser enthielt, eine RT- -Kontrolle von einer Mastzellprobe, die bei der cDNA-Synthese keine reverse Transkriptase enthielt und eine Referenzgen-Kontrolle mitgeführt. Für die letzte Kontrolle wurde das Referenzgen Hypoxanthin-Phosphoribosyl- Transferase (HPRT) verwendet.

A) 5-HT2A B) HPRT-Kontrolle

D R

M M M

W

D M M

W R

M

T

M

M T

C C

C

K - C

C

K C

-

3

3 3

3

3

3

. .

.

. .

.

1 3 4

1

3

4

250 bp 200 bp

200 bp 100 bp

Abb. 3.24 Expression des 5-HT2A-Rezeptors auf duralen Mastzellen der Maus

Dargestellt sind Abbildungen von Gelen nach elektrophoretischer Auftrennung der PCR-Amplifikate. Zu sehen ist die

Expression des 5-HT2A-Rezeptors in drei verschiedenen Mastzellen-Proben, sowie einer Dura mater-Probe und die dazugehörigen Wasser- und RT- -Kontrollen (A). HPRT diente hier als Referenzgen zur Kontrolle der cDNA-Synthese

(B). Die erwarteten Fragmentgrößen sind: 5-HT2A 204 bp (A), HPRT 139 bp (B). Marker: DNA Ladder GeneRuler™ 50 bp. DM = Dura mater-cDNA; WK = Wasserkontrolle (mit Wasser statt cDNA); RT-= ohne Reverse Transkriptase (bei der cDNA-Synthese); MC = Mastzellen-cDNA. Abb. 3.24A wurde zur besseren Sichtbarkeit der Banden leicht aufgehellt und der Kontrast wurde etwas verstärkt.

Da mCPP eine hohe Affinität zu den Serotoninrezeptoren der 5-HT2-Familie besitzt, waren diese von besonderem Interesse, sodass ihre Expression auf Mastzellen untersucht wurde.

Nachfolgend sind die Ergebnisse für den 5-HT2A-Rezeptor gezeigt. Für die Mastzellen (MC) MC 3.1, MC 3.3 und MC 3.4 sowie für die DM-Probe konnte eine Bande ungefähr auf der erwarteten Höhe von HPRT von 139 bp detektiert werden (Abb. 3.24B). Eine

Bande für den 5-HT2A-Rezeptor konnte gut sichtbar für die DM-Probe und schwächer für alle drei Mastzellen ungefähr auf der Höhe von 200 bp im Gel detektiert werden, was der erwarteten Fragmentgröße von 204 bp entspricht (Abb. 3.24A). In beiden Fällen konnten Seite | 65

3.Ergebnisse keine Banden in der Wasserkontrolle (WK) und Negativkontrolle für die reverse Transkriptase (RT-) detektiert werden, was auf eine spezifische Bande bei den zu testenden

Proben hinweist. Für den 5-HT2B- und 5-HT2C- Rezeptor wurden ebenso Single Cell-PCRs durchgeführt, die aber beide eine verunreinigte Wasserkontrolle aufwiesen (s. Anhang, Abb. 4.4) und aus diesem Grund nicht ausgewertet werden konnten. A) H1 B) HPRT-Kontrolle

D R

M M

W M M

D W M M

R

T

M

T

M

C

C C

K - C C C

K

-

9

3

3

3 9

3

.

. .

.

6

5

6

5

600 bp

500 bp 200 bp

100 bp

Abb. 3.25 Expression des H1-Rezeptors auf duralen Mastzellen in der Maus Dargestellt sind Abbildungen von Gelen nach elektrophoretischer Auftrennung der PCR-Amplifikate. Zu sehen ist die Expression des H1-Rezeptors in drei verschiedenen Mastzell-Proben, sowie einer Dura mater-Probe und die dazugehörigen Wasser- und RT--Kontrollen (A). HPRT diente hier als Referenzgen zur Kontrolle der cDNA-Synthese (B). Die erwarteten Fragmentgrößen sind: H1 467 bp (A), HPRT 139 bp (B). Marker: DNA Ladder GeneRuler™ 50 bp. DM = Dura mater-cDNA; WK = Wasserkontrolle (mit Wasser statt cDNA); RT-= ohne Reverse Transkriptase (bei der cDNA-Synthese); MC = Mastzellen-cDNA. Abb. 3.25A wurde zur besseren Sichtbarkeit der Banden leicht aufgehellt und der Kontrast wurde etwas verstärkt.

Dasselbe wurde auch für den Histaminrezeptor H1 durchgeführt. Für alle Mastzellen, also MC 3.5, MC 3.6 und MC 9, sowie für die DM-Probe konnte eine HPRT-Bande zwischen 100 bp und 200 bp detektiert werden, was im Einklang mit zu der erwarteten Fragmentgröße von 139 bp ist (Abb. 3.25B). Im Gegensatz zu den HPRT-Banden der Proben MC 3.6 und MC 9, die schwach zu sehen waren, war für die Probe MC 3.5 ein starke HPRT-Bande erkennbar. Für den H1-Rezeptor war eine deutliche Bande für die DM- Probe auf der Höhe von 500 bp zu sehen, was ungefähr der erwarteten Fragmentgröße von ca. 467 bp entspricht. Für die Probe MC 3.5 war eine sehr schwache Bande für den H1- Rezeptor zu sehen, was auf der Abbildung schwer zu erkennen ist, aber im Gel besser zu erkennen war (Abb. 3.25A). Diese Mastzell-Probe wies auch die stärkste HPRT-Bande auf (Abb. 3.25B). Die RT- und die WK waren unauffällig und zeigten keine Banden, weder für den H1-Rezeptor noch für HPRT.

Seite | 66

3.Ergebnisse

A) H2 B) 5-HT7

D

W M

D W M R

R M M

M M

M T

M T

C

C K

K C C

C C

-

-

5

5 1 1

1 1

.

. . .

. .

2

2 0

1

0 1

200 bp 200 bp

100 bp 100 bp

C) HPRT-Kontrolle

D

W M

R M M

M T

C

K

C C

-

5

1 1

.

. .

2

0 1

200 bp

100 bp

Abb. 3.26 Expression des H2- und 5-HT7-Rezeptors auf duralen Mastzellen der Maus

Dargestellt sind Abbildungen von Gelen nach elektrophoretischer Auftrennung der PCR-Amplifikate. Zu sehen ist die

Expression der H2- und des 5-HT7-Rezeptoren in drei verschiedenen Mastzell-Proben, sowie einer Dura mater-Probe und die dazugehörigen Wasser- und RT--Kontrolle (A, B). HPRT diente hier als Referenzgen zur Kontrolle der cDNA-

Synthese (C). Die erwarteten Fragmentgrößen sind: H2 187 bp (A), 5-HT7 181bp (B), HPRT 139 bp (C). Marker: DNA Ladder GeneRuler™ 50 bp. DM = Dura mater-cDNA; WK = Wasserkontrolle (mit Wasser statt cDNA); RT- = ohne Reverse Transkriptase (bei der cDNA-Synthese); MC = Mastzellen-cDNA

Weitere Rezeptoren von Interesse waren der Histaminrezeptor H2 und der

Serotoninrezeptor 5-HT7. Der 5-HT7 wurde untersucht, da mCPP eine Affinität zu diesem Rezeptor aufweist (Tab. 4.2) und dieser bei der Vasodilatation meningealer Blutgefäße eine Rolle spielt (Wang et al. 2014). Der H2-Rezeptor war von Interesse, weil Cimetidin ein H2-Rezeptorantagonist zumindest die Histamin-induzierte Mastzelldegranulation inhibieren konnte (Carlos et al. 2006). Aus diesem Grund wurde auch für diese Rezeptoren eine Single Cell-PCR durchgeführt. Für die DM- und die Mastzell-Proben MC 1.0 und MC 1.1, aber nicht für MC 5.2, wurde jeweils eine Bande für HPRT zwischen den Markerbanden 100 bp und 200 bp detektiert, was der erwarteten HPRT-Fragmentgröße von 139 bp entspricht (Abb. 3.26C). Für den H2-Rezeptor war überhaupt keine Bande in den Proben zu sehen, weder für die DM-Probe noch für die Mastzell-Proben, dafür aber Seite | 67

3.Ergebnisse

sogenannte „Primerwolken“ (Abb. 3.26A). Für den 5-HT7-Rezeptor waren zwei Banden auf der Höhe von ca. 200 bp und ca. 250 bp in der DM-Probe zu erkennen, aber nicht in den Mastzellproben (Abb. 3.26B). Keine der weiteren Probe zeigte eine Bande

Weitere interessante Kandidaten waren die Dopaminrezeptoren D1 und D2, da mCPP, wenn auch nur geringe, Affinitäten zu diesen Rezeptoren besitzt (Tab. 4.2). Sollten diese auf Mastzellen exprimiert sein, könnte die mCPP-induzierte Mastzelldegranulation möglicherweise über diese Rezeptoren vermittelt werden.

A) D1 B) D2

D R

M M M

W

D R

M M M

W

T

M

T

M

C C

C

K -

C C

- C

K

4

4 4

4 4

4

. .

.

. . .

3

1 2

3

1 2

250 bp 300 bp

200 bp 250 bp

C) HPRT-Kontrolle

D W

R M

M M

M T

K C

C - C

4 4

4

.

. .

1 2

3

200 bp

100 bp

Abb. 3.27 Expression des D1- und D2-Rezeptors auf duralen Mastzellen der Maus

Dargestellt sind Abbildungen von Gelen nach elektrophoretischer Auftrennung der PCR-Amplifikate. Zu sehen ist die Expression der D1- und des D2-Rezeptoren in drei verschiedenen Mastzell-Proben, sowie einer Dura mater-Probe und die dazugehörigen Wasser- und RT--Kontrolle (A, B). HPRT diente hier als Referenzgen zur Kontrolle der cDNA-Synthese (C). Die erwarteten Fragmentgrößen sind: D1 231 bp (A), D2 293 bp (B), HPRT 139 bp (C). Marker: DNA Ladder GeneRuler™ 50 bp. DM = Dura mater-cDNA; WK = Wasserkontrolle (mit Wasser statt cDNA); RT-= ohne Reverse Transkriptase (bei der cDNA-Synthese); MC = Mastzellen-cDNA. Abb. 3.27A wurde zur besseren Sichtbarkeit der Banden leicht aufgehellt und der Kontrast wurde etwas verstärkt.

Seite | 68

3.Ergebnisse

Das Ergebnis für diese Single Cell-PCRs lieferte nur eine sichtbare Bande für die DM- Probe auf der erwarteten HPRT-Fragmenthöhe von ca. 139 bp, nicht aber bei den MC- Proben (Abb. 3.27C). Für den D1-Rezeptor wurde eine Bande bei der DM-Probe zwischen der 200 bp und 250 bp Markerbande detektiert. Dies entspricht somit der ungefähr erwarteten Höhe von 231 bp. Schwache Banden waren auf dem Gel auch für die Proben MC 4.2 und MC 4.3, sowie bei RT- zu sehen, die hier nur sehr schwach sichtbar sind (Abb. 3.27A). Für den D2-Rezeptor konnte nur eine Bande für die DM-Probe auf Höhe der 200 bp bis 300 bp Markerbande detektiert werden (Abb. 3.27B). Die erwartete D2- Fragmentgröße ist 293 bp. Keine der Kontrollen oder der Mastzell-Proben zeigten eine Bande.

A) M1 B) M3

M

D

D

W M

R M W M

R M

M

M T M

C T

K C

C C

K C

-

C

-

4

4

4

4 4

4

.

.

.

. 6 .

.

5

4 4 5

6

500 bp 250 bp 400 bp 200 bp

C) HPRT-Kontrolle

M

D W M

R

M

M T

C

C

K

C

-

4

4

4

.

.

.

6

5

4

200 bp

100 bp

Abb. 3.28 Expression des M1- und M3-Rezeptors in duralen Mastzellen der Maus

Dargestellt sind Abbildungen von Gelen nach elektrophoretischer Auftrennung der PCR-Amplifikate. Zu sehen ist die Expression der M1- und des M3-Rezeptoren in drei verschiedenen Mastzell-Proben, sowie einer Dura mater-Probe und die dazugehörigen Wasser- und RT--Kontrolle (A, B). HPRT diente hier als Referenzgen zur Kontrolle der cDNA- Synthese (C). Die erwarteten Fragmentgrößen sind: M1 401 bp (A), M3 219 bp (B), HPRT 139 bp (C). Marker: DNA Ladder GeneRuler™ 50 bp. DM = Dura mater-cDNA; WK = Wasserkontrolle (mit Wasser statt cDNA); RT-= ohne Reverse Transkriptase (bei der cDNA-Synthese); MC = Mastzellen-cDNA.

Seite | 69

3.Ergebnisse

Auch für die muskarinisch-cholinergen Rezeptoren M1 und M3 wurden Single cell-PCRs durchgeführt, da mCPP auch zum M3-Rezeptor eine sehr geringe Affinität besitzt (Tab. 4.2). Der M1-Rezeptor wurde auch untersucht, da Acetylcholin in menschlichen Bronchien die Mastzelldegranulation vermutlich über den M1-Rezeptor inhibieren konnte, was aber nicht in der Trachea der Ratte der Fall war (Reinheimer et al. 2000). Genauso wie für die dopaminergen Rezeptoren konnte lediglich für die DM-Probe eine HPRT-Bande detektiert werden (Abb. 3.28C). Diese Bande entspricht auch der erwarteten HPRT-Fragmentgröße von 139 bp. Für den M1-Rezeptor konnte eine schwache Bande für die DM-Probe auf der Höhe der 400 bp bis 500 bp Markerbande detektiert werden, nicht aber für die Mastzellproben (Abb. 3.28A). Die erwartete Fragmentgröße ist hier 401 bp. Für den M3-Rezeptor war eine starke Bande für die DM-Probe ungefähr auf der Höhe der 250 bp Markerbande zu erkennen, sowie eine schwache Bande bei der Probe MC 4.6 (Abb. 3.28B). Das entspricht der erwarteten Markerbande von 219 bp. Keine der weiteren Proben, weder die RT-- noch WK-Proben zeigten Banden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in dem Pilotversuch eine Expression des 5-HT2A- und des H1-Rezeptor auf duralen Mastzellen der Maus festgestellt werden konnte. Für den

5-HT7-Rezeptor war nur eine Expression in der Dura mater aber nicht in Mastzellen detektierbar und für den H2-Rezeptor waren keine Banden zu sehen. Eine Expression der anderen Rezeptoren (D1, D2, M1 und M3) konnte aufgrund von methodischen Schwierigkeiten nur in der Dura mater festgestellt werden. Der ganze Versuch Bedarf weiterer Optimierung, um die Expression der verschiedenen Rezeptoren eindeutig auf Mastzellen nachweisen zu können.

Seite | 70

4.Diskussion

4. Diskussion Migräne gehört zu einer der häufigsten Erkrankungen weltweit (Steiner et al. 2013). Trotz intensiver Forschung sind die Mechanismen einer akuten Migräneattacke noch nicht vollständig bekannt. Ebenso wenig ist bekannt, was die immer wiederkehrenden Attacken bei chronischer Migräne begünstigt. Prophylaktische Behandlungen existieren zwar, sind aber aufgrund von Kontraindikationen und Nebenwirkungen nicht für jeden geeignet (Parsekyan 2000). Die Aufklärung der Pathomechanismen ist von großer Relevanz für die Entwickelung geeigneter Medikament, um den betroffenen Patienten zu helfen. Ein Erklärungsansatz für den Migräne-Pathomechanismus ist die sterile neurogene Inflammation der Dura mater (Moskowitz 1993). Eine Beteiligung von Mastzellen an der neurogenen Inflammation wird seit Längerem vermutet (Levy 2009; Theoharides et al. 2005), da die beteiligten Neuropeptide CGRP und SP nicht nur die für die neurogene Inflammation typische Vasodilatation und PPE auslösen können (Moskowitz 1993), sondern auch Mastzelldegranulation (Ottosson und Edvinsson 1997).

Mastzellen könnten ein Grund für die Sensitivierung gegenüber dem 5-HT2B/2C- Rezeptoragonisten mCPP sein, die in dem Maus-Migräne-Modell nach Hypoxie- Behandlung bei der Induktion einer PPE beobachtet werden konnte (Hunfeld et al. 2015). Aus diesem Grund sollte in dieser Arbeit überprüft werden, ob hypoxische Mäuse sensitiver bezüglich einer Aktivierung von Mastzellen reagieren. Die Mechanismen, die im Tiermodell ursächlich für die Sensitivierung sind, könnten auch im Menschen zur Anfälligkeit gegenüber Migräne-Attacken führen.

Es konnte gezeigt werden, dass die in dem Maus-Migräne-Modell induzierte PPE 5-HT2B- Rezeptor-abhängig ist (Hunfeld et al. 2015; Schmitz et al. 2015). Ob die Aktivierung des 5-

HT2B-Rezeptors ebenso eine Mastzelldegranulation verursacht, wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht. Da auch die Aktivierung des H1-Rezeptors durch Histamin zu Prozessen führt, die Anzeichen einer neurogenen Inflammation sein können, wie z. B. die Vasodilatation (Jansen-Olesen et al. 1997), wurde zusätzlich überprüft, ob Mastzelldegranulation auch durch den H1-Rezeptor induziert werden kann. Eine Aktivierung von Mastzellen wäre für die neurogene Inflammation von großer Relevanz, da das aus Mastzellen ausgeschüttete Histamin und Serotonin meningeale Nozizeptoren aktivieren und sensitivieren kann (Levy et al. 2007; Zhang et al. 2007). Dies könnte den

Seite | 71

4.Diskussion inflammatorischen Prozess durch die kontinuierliche Reizung der Nozizeptoren aufrechterhalten. Aus diesem Grund ist die Aufklärung der Beteiligung von Mastzellen an der neurogenen Inflammation von besonderem Interesse.

4.1 Charakterisierung duraler Mastzellen der Maus

Viele Untersuchungen der neurogenen Inflammation wurden an der Dura mater von Ratten durchgeführt. Um zu überprüfen, ob die dabei gewonnenen Erkenntnisse sich auch auf die Maus übertragen lassen, wurde im Rahmen dieser Arbeit zunächst eine Charakterisierung der duralen Mastzellen der Maus vorgenommen. Mastzellen können sich im Gewebe zu unterschiedlichen Typen differenzieren, den Bindegewebs-Mastzellen (CTMC) oder den mukosalen Mastzellen (MMC). Diese Unterscheidung ist relevant, da gezeigt wurde, dass nur CTMC durch C48/80 und SP stimuliert werden können (Stanovnik et al. 1988; Shanahan et al. 1985; Enerbäck und Löwhagen 1979). Sie können aufgrund ihres unterschiedlichen Granula-Inhaltes mithilfe der AS-Färbung unterschieden werden (Michaloudi et al. 2007). Zur Ermittlung des Verhältnisses von CTMC zu MMC wurde deswegen eine AS-Färbung durchgeführt. Insgesamt wurden nur ein Drittel als MMC klassifiziert und zwei Drittel als CTMC (Abb. 3.1). In der Dura mater der Ratte zeigte sich ein ähnliches Ergebnis. In einer Studie von Dimitradou et al. konnte ein Großteil der Mastzellen mithilfe einer immunhistochemischen Färbung mit Antikörpern gegen die Mastzellproteasen RMCPI und RMCPII als CTMC identifiziert werden (Dimitriadou et al. 1997). Dies bestätigten auch Michaloudi et al., die die altersabhängige Veränderung von Mastzellen in der Dura mater von Ratten mit der AS- Färbung untersuchten (Michaloudi et al. 2007). Da der Großteil der Mastzellen auch in der murinen Dura mater vom CTMC-Typ war, können diese durch C48/80 aktiviert und mit Avidin-FITC gefärbt werden. Letzteres färbt exklusiv die CTMC an, da das Avidin-FITC an das in Granulae gespeicherte Heparin bindet, welches in MMC nicht enthalten ist (Enerbäck et al. 1985). Durch den Fluoreszenzfarbstoff konnte die Lokalisation der Mastzellen in der Dura mater einfach sichtbar gemacht werden. Die Lokalisation war abhängig von der Anzahl der vorhandenen Mastzellen und die Verteilung bei großer Anzahl sehr homogen (Abb. 3.2). Mit sinkender Anzahl waren lateral vom Sinus sagittalis superior wenig Mastzellen zu finden. Schwankungen in der Anzahl der duralen Mastzellen sind bei weiblichen Nagern, wie zum Seite | 72

4.Diskussion

Beispiel Ratten, unter anderem zyklusbedingt (Boes und Levy 2012). Dies könnte auch eine mögliche Erklärung für die unterschiedlichen Anzahlen der duralen Mastzellen in NMRI- Mäusen sein, die ausgewählt wurden, da diese bereits für Untersuchungen im Rahmen des chronischen Maus-Migräne-Modells genutzt wurden (Hunfeld et al. 2015). Da im parietalen Teil der Dura mater stets viele Mastzellen lokalisiert waren, wurde dieser für die Auswertung ausgewählt, um eine Vergleichbarkeit zu gewährleisten. Die Mediane der insgesamt gezählten Mastzellen in jedem Experiment, außer einer Ausnahme (Abb. 3.13B), unterschieden sich statistisch nicht voneinander, sodass die Behandlungsgruppen miteinander verglichen werden konnten. Diese Ergebnisse sind in jeder Abbildung jeweils unter B) zu sehen. Durch die Auswahl eines bestimmten Auswertebereichs können allerdings keine Veränderungen in der Anzahl von Mastzellen oder in der Degranulationsrate in anderen Regionen detektiert werden. Jedoch sind bei intravenöser Injektion im in vivo-Modell und bei topischer Applikation der Substanzen in dem ex vivo- Modell Effekte in der gesamten Dura mater zu erwarten. Außerdem ermöglichte die Auswahl dieses Auswertebereichs stets eine Auswertung mit ausreichend großer Anzahl an Mastzellen, die zudem häufig neben relevanten Strukturen der neurogenen Inflammation, wie Blutgefäßen und Nervenfasern, lokalisiert waren (Abb. 3.3). Aber auch im Bindegewebe abseits von Nervenfasern und Blutgefäßen konnten Mastzellen gefunden werden. Ähnliche Beobachtungen wurden in der Dura mater der Ratte gemacht (Dimlich et al. 1991). Dimlich et al. beschrieben allerdings eine parallele lineare Anordnung von Mastzellen in der gesamten Dura mater. In der NMRI-Maus wurde jedoch eher ein homogenes Verteilungsmuster bei einer großen Anzahl von Mastzellen beobachtet (Abb. 3.2). Bei einer geringeren Anzahl waren auch Bereiche mit kaum Mastzellen zu sehen. Die geringe Abweichung der Verteilung, die für murine Mastzellen in der vorliegenden Arbeit beobachtet werden konnte, beruht möglicherweise auf Speziesunterschieden. Insgesamt zeigte jedoch die Charakterisierung der murinen Mastzellen in der Dura mater Parallelen zu den Erkenntnissen aus Ratten. Abgesehen von der variierenden Verteilung sind in beiden Fällen die duralen Mastzellen hauptsächlich vom CTMC-Typ und befinden sich häufig neben Blutgefäßen und Nervenfasern, aber auch frei im Bindegewebe. Diese Ähnlichkeiten ermöglichen Vergleiche zwischen den hier vorliegenden Daten und denen aus der Literatur.

Seite | 73

4.Diskussion

4.2 Durale Mastzelldegranulation in vivo

Nach der Charakterisierung der murinen Mastzellen in der Dura mater wurde die Rolle der Mastzellen in der neurogenen Inflammation in vivo untersucht. Dazu wurde zunächst der Einfluss verschiedener Parameter auf die Mastzelldegranulation überprüft, um das in vivo- Modell etablieren zu können.

4.2.1 Einfluss der Gewebefixierung, des operativen Eingriffs oder der Narkosedauer auf die durale Mastzelldegranulation

Zunächst wurde der Einfluss verschiedener Fixative und Fixiermethoden getestet, da es in der Literatur Hinweise darauf gibt, dass durch die Fixierung Mastzellen degranulieren können. Insbesondere Carnoy löste bei dermalen Mastzellen eine verstärkte Mastzelldegranulation aus (Lampe und Kiernan 1976). Auch im Rahmen der in dieser Arbeit durchgeführten Versuche bestätigte sich, dass Carnoy als Fixativ ungeeignet ist, da es eine massive Mastzelldegranulation auslöste, was eine pharmakologische Untersuchung unmöglich machte (Abb. 4.1). Die Perfusionsfixierung erzielte zwar die besten Ergebnisse, da diese Gruppe die geringste basale Degranulation aufwies, jedoch war diese Methode sehr zeitintensiv und erlaubte somit keine Durchführung von Versuchen mit großer Stichprobenzahl. Dies wäre jedoch aufgrund der großen Streuungen im in vivo-Modell notwendig. Da die übliche 4 %ige FA-Lösung eine geringere basale Degranulation als Carnoy aufwies und eine höhere Stichprobenzahl als mit Perfusionsfixierung erzielt werden konnten, wurde diese Fixierung für die weiteren Versuche verwendet. Durch diese Versuche konnte gezeigt werden, dass die Fixierungsart einen Einfluss auf die Mastzelldegranulation hat. Weitere Parameter wie die Narkosedauer und der Einfluss des operativen Eingriffs wurden ebenfalls untersucht. Für die in vivo-Untersuchungen war es notwendig die Mäuse in Narkose zu versetzen, da eine intravenöse Injektion in die Vena jugularis externa erfolgen sollte, analog zu der Prozedur für die PPE-Versuche (Hunfeld et al. 2015), und diese dafür freipräpariert werden musste. Die hier angewandte Narkose wurde mit dem Inhalationsanästhetikum Isofluran eingeleitet und aufrechterhalten. Es ist jedoch bereits bekannt, dass andere Inhalationsanästhetika, wie z. B. das Sevofluran, die Mastzelldegranulation in Teilen inhibieren kann (Luo et al. 2015). Somit konnte nicht ausgeschlossen werden, dass auch Isofluran einen Effekt auf Mastzellen haben könnte. Folglich wurde überprüft, ob die Seite | 74

4.Diskussion

Narkoselänge einen Einfluss auf die Mastzelldegranulation hat. Eine ausreichende Inkubationsdauer für die zu untersuchenden Substanzen sollte gewährleistet werden, da die Induktion einer Signalkaskade längeren Zeitraum benötigen könnte, ähnlich wie bei der PPE (~17 min) (Hunfeld et al. 2015). Eine Inhibition der Mastzelldegranulation durch das Narkotikum, wie bei Luo et al. (Luo et al. 2015) konnte in dieser Arbeit mit Isofluran nicht beobachtet werden (Abb. 4.2). In diesem Experiment war die basale Degranulationsrate im Vergleich zu anderen in vivo-Experimenten für beide Gruppen eher gering (vergl. Abb. 4.3). Schwankungen der basalen Degranulationsraten waren im Verlauf der Experimente jedoch immer wieder zu beobachten und nicht auf die Narkoselänge zurückzuführen. Die genauen Gründe konnten nicht festgestellt werden, aber eine mögliche Ursache dafür könnte Stress sein. Es konnte gezeigt werden, dass der Stress bei Ratten, der durch Immobilisation in einer Röhre herbeigeführt wurde, zur Mastzelldegranulation in der Haut oder Dura mater führte und, dass Stress bereits durch die simple Handhabung der Tiere auftreten konnte (Theoharides et al. 1995; Singh et al. 1999). In der vorliegenden Arbeit könnte Stress bei dem Einsetzen der Tiere in die Plexiglaskammer zur Einleitung der Narkose entstanden sein, der dann zur verstärkten Mastzelldegranulation führte. Um die Untersuchungen zu den Auswirkungen der Versuchsdurchführung auf die Mastzelldegranulation abzuschließen, wurde zudem der Einfluss des operativen Eingriffs auf die Mastzelldegranulation untersucht. Laut Literatur führte die Manipulation am Darm bei der Operation des Abdomens der Maus zur Mastzelldegranulation in diesem Gewebe (Jonge et al. 2004). Ebenso konnten Verletzungen in der Haut von Ratten eine Mastzelldegranulation induzieren (Kiernan 1975). In der vorliegenden Arbeit wurde bei den Tieren die Vena juglaris externa für eine intravenöse Injektion unter Narkose freipräpariert. Aus diesem Grund wurde der Einfluss dieses Eingriffs auf die durale Mastzelldegranulation untersucht. Zunächst schien dies keinen Unterschied zu machen (Tab. 3.1, Anhang Abb. 4.3), da sowohl die Tiere, die mittels zervikaler Dislokation (Nativ) getötet wurden, als auch die Tiere, bei denen zusätzlich eine Schein-OP ohne Injektion durchgeführt wurde, hohe Degranulationsraten in der Dura mater aufwiesen. Jedoch konnten im weiteren Verlauf Unterschiede zwischen den verschiedenen Manipulationen detektiert werden (Abb. 3.5). Dies war aber über die Versuche nicht konstant (Abb. 3.6), weswegen nicht von einem Einfluss des operativen Eingriffs auf die durale Mastzelldegranulation ausgegangen werden kann. Dies könnte daran liegen, dass im Seite | 75

4.Diskussion

Vergleich zur Literatur (Kiernan 1975; Jonge et al. 2004) die Manipulation nicht am zu untersuchendem Gewebe, der Dura mater, stattfand. Aus diesem Grund wurde diese Methode der Injektion weiter fortgeführt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in den hier durchgeführten Vorversuchen lediglich die Fixierungsart einen Einfluss auf die Mastzelldegranulation hatte. Andere Parameter, wie Narkoselänge und OP, beeinflussten die Degranulation nicht maßgeblich. Auffällig war jedoch, dass die basale Degranulation selbst bei keiner bis geringer Manipulation am Tier stark schwankte (vergl. Abb. 4.2 und Abb. 4.3).

4.2.2 Mastzelldegranulation in vivo in der Dura mater der Maus durch C48/80

Nach abschließender Untersuchung des Einflusses verschiedener Parameter auf die Mastzelldegranulation wurden verschiedene Substanzen im in vivo-Model getestet. Dabei wurde ebenso überprüft, ob unterschiedlich starke Reaktionen der Mastzellen in normoxischen oder hypoxischen Tieren hervorgerufen wurden. Als Positivkontrolle zur Etablierung dieses in vivo-Modells wurde C48/80, ein bekannter Mastzelldegranulator, getestet. Dieser konnte bereits in anderen Arbeitsgruppen erfolgreich eine Mastzelldegranulation auslösen (Gaudenzio et al. 2016; Chatterjea et al. 2012; Yao et al. 2014; Pedersen et al. 2015; Kilinc et al. 2016). In der vorliegenden Arbeit konnte durch C48/80 eine signifikant höhere Mastzelldegranulation bei den hypoxischen Tieren induziert werden (Abb. 3.5). Aufgrund der hohen Streuung wurde dieser Versuch wiederholt und dabei konnte C48/80-Effekt reproduziert werden (Abb. 3.6). Somit eignete sich der ausgewählte Auswertebereich zur Untersuchung der duralen Mastzelldegranulation. Nach Etablierung des in vivo-Modells sollte der Effekt von mCPP untersucht werden, welches im Menschen mit persönlicher oder familiärer Prädisposition für Migräne migräneartige Symptome auslösen konnte (Brewerton et al. 1988). Im Tiermodell induzierte mCPP Prozesse wie die PPE, die mit Migräne assoziiert werden (Johnson et al. 2003; Hunfeld et al. 2015; Schmitz et al. 2015). Ob die Applikation von mCPP auch zur Mastzelldegranulation führt, ist in der Literatur nicht beschrieben und wurde daher hier untersucht. Die Konzentration von 1 µg/kg KG mCPP, die bei hypoxischen Mäusen eine PPE induzieren konnte (Hunfeld et al. 2015), führte nicht zur Mastzelldegranulation in der Dura mater (Abb. 3.7). Selbst eine Erhöhung der mCPP-Dosierung auf 1 mg/kg KG erzielte bei normoxischen und hypoxischen Tieren keinerlei Mastzelldegranulation (Abb. Seite | 76

4.Diskussion

3.8, Abb. 3.9). Die Induktion der Mastzelldegranulation durch C48/80 war nicht beständig. So konnte C48/80 in dem an zwei Tagen durchgeführten Experiment in vivo nur an einem der beiden Tage einen signifikanten Unterschied bei der Mastzelldegranulation erzeugen (Abb. 3.7), wie durch die Zwei-Wege ANOVA gezeigt werden konnte. Allerdings konnte der C48/80-Effekt in den anderen Versuchen nicht reproduziert werden (Abb. 3.8, Abb. 3.9) Somit war eine zuverlässige Untersuchung der Mastzelldegranulation in diesem Modell nicht mehr möglich. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich die Untersuchungen der duralen Mastzelldegranulation in der Maus in vivo als ungeeignet erwiesen haben. Zum einen wurden Schwankungen der basalen Degranulationsrate festgestellt. Die Ursache dafür konnte nicht abschließend festgestellt werden. Zum anderen war der C48/80-Effekt nicht reproduzierbar. Somit wurden parallel erste Untersuchungen in einem ex vivo-Modell (Halbschädelpräparat) vorgenommen, bei dem Fehlerquellen wie Schwierigkeiten bei der Narkose und Stressinduktion beim Tier vermieden werden konnten.

4.3 Durale Mastzelldegranulation in einem ex vivo - Halbschädel-Modell

4.3.1 Mastzelldegranulation durch C48/80 in dem ex vivo-Modell

Die ex vivo-Untersuchungen wurden im Halbschädel mit anhaftender Dura mater durchgeführt. Die Substanzapplikation erfolgte im umgedrehten Schädel topisch auf die Dura mater, ähnlich einem Organbad. In den ersten Versuchen zeigte sich in den Positivkontrollen mit C48/80 bereits nach 10 min Inkubation eine starke Degranulationsrate. Dies konnte sowohl im Gewebe von normoxischen als auch hypoxischen Tieren beobachtet werden (Abb. 3.10, Abb. 3.11). Die Ergebnisse sind vergleichbar mit der topischen Applikation von C48/80 auf die Dura mater von Ratten, bei dem sich ebenso nach 10 min eine verstärkte Degranulation zeigte (Pedersen et al. 2015; Kilinc et al. 2016). Allerdings wurden in diesen Versuchen deutlich geringere Konzentrationen verwendet, die zu einer stark verringerten Mastzelldegranulation führten (Pedersen et al. 2015). Da in der vorliegenden Arbeit eine massive Mastzelldegranulation in dem ausgewählten Bereich der Dura mater nach der Applikation des Mastzelldegranulators C48/80 zuverlässig detektierbar war, eignete sich das ex vivo- Mausmodell zur Untersuchung duraler Mastzellen.

Seite | 77

4.Diskussion

4.3.2 Keine Induktion der duralen Mastzelldegranulation durch Histamin

Neben C48/80 wurden auch Auslöser von migräneartigen Kopfschmerzen, wie zum Beispiel Histamin (Krabbe und Olesen 1980), auf ihre Fähigkeit Mastzelldegranulation auszulösen, getestet. Von Histamin ist bekannt, dass die Kopfschmerzen über die Aktivierung des H1-Rezeptors erfolgt (Krabbe und Olesen 1980). In der vorliegenden Arbeit konnte Histamin trotz hoher Konzentrationen weder in Duren von Normoxie- noch Hypoxie-behandelten Tieren eine signifikant gesteigerte Mastzelldegranulation nach 10- minütiger Inkubation induzieren (Abb. 3.10, Abb. 3.11). Allerdings war eine ansteigende Tendenz bei hypoxischen Tieren zu sehen, weswegen weitere Konzentrationen von Histamin an den Duren hypoxischer Tiere getestet wurden. Da eine Aktivierung H1- Rezeptors durch die in Kapitel 1.6 beschriebene Signalkaskade zur Mastzelldegranulation führen könnte und Histamin eine geringe Affinität zu diesem Rezeptor in Ratten aufweist (pKi 4,4; Anhang Tab. 4.1), wurden hohe Konzentrationen von Histamin verwendet. In der vorliegenden Arbeit induzierte Histamin im Konzentrationsbereich von 540 µM bis 540 mM nach 10 min Inkubation keine signifikant erhöhte Mastzelldegranulation bei hypoxischen Tieren (Abb. 3.12). In der Literatur wurde beschrieben, dass Histamin vor allem in mit Toxocara canis infizierten Ratten eine Mastzelldegranulation durch einen indirekten Effekt über den H2-Rezeptor anderer Immunzellen induzierte. Diese modulierten durch ihre Aktivierung die Mastzelldegranulation mit Hilfe von löslichen Faktoren des Immunsystems und NO (Carlos et al. 2006). In den genannten Versuchen konnte eine Mastzelldegranulation durch die Applikation von 32 mM Histamin ausgelöst werden. Im Gegensatz zu der durch die Infektion hervorgerufenen Entzündung ist die neurogene Inflammation jedoch steril, was die Unterschiede in der Reaktivität von Mastzellen auf Histamin erklären könnte. Da andere Prozesse der neurogenen Inflammation, wie zum Beispiel die PPE, nach ca. 17- minütiger Inkubation der applizierten Substanzen nachgewiesen wurden (Johnson et al. 2003; Hunfeld et al. 2015), sollte überprüft werden, ob eine Mastzelldegranulation nach 20 min Inkubation mit Histamin detektierbar werden kann. Da eine Beteiligung der anderen Histaminrezeptoren an der Mastzelldegranulation nicht ausgeschlossen werden konnte, wurde wegen der deutlich höheren Affinität von Histamin zu den anderen Histaminrezeptoren (H3: pKi 7,7 und H4: pKi 7,2) ein möglichst großer

Seite | 78

4.Diskussion

Konzentrationsbereich ausgewählt (Tab. 4.1, Anhang). Allerdings konnte keiner der Konzentrationen (540 nM bis 54 mM) selbst nach 20-minütiger Inkubation eine erhöhte Mastzelldegranulation im Gewebe von normoxischen Tieren induzieren. Auf Versuche mit Hypoxie-Behandlung wurde in diesem Fall verzichtet, da diese wesentlich aufwendiger waren und zuvor durchgeführte Experimente keinerlei Hinweise lieferten, dass das Gewebe von hypoxischen Tieren sensitiver auf Histamin reagiert. Dux et al. verwendeten Histamin zur Induktion von Vasodilatation meningealer Blutgefäße in der Ratte, in dem sie Histamin topisch auf die Dura mater applizierten (Dux et al. 2002). Sodass davon ausgegangen werden kann, dass Histamin zwar Prozesse der neurogenen Inflammation, wie die Vasodilatation beeinflussen, jedoch nicht die Mastzelldegranulation. In dem hier durchgeführten Versuch mit 20-minütiger Inkubation von Histamin konnten jedoch unterschiedliche Medianwerte für die Anzahl gezählter Mastzellen für eine Behandlungsgruppe festgestellt werden (Abb. 3.13). Die genaue Ursache dafür ist nicht bekannt. Es konnte aber gezeigt werden, dass eine Aktivierung des H4-Rezeptors durch Histamin zur Chemotaxis von Mastzellen führt (Hofstra et al. 2003). Somit könnten weitere Mastzellen möglicherweise aus anderen Teilen des Gewebes eingewandert sein. Allerdings wurde Histamin topisch auf die gesamte Dura mater appliziert, weswegen diese Möglichkeit wenig plausibel erscheint. Eine weitere Erklärung wäre die vollständige Degranulation von Mastzellen. In diesem Fall könnten Mastzellen nicht mehr durch die Färbung sichtbar gemacht werden, da das Heparin nach der Ausschüttung diffundiert. In der Regel waren „ghostly look“ Mastzellen allerdings gut zu erkennen. Demzufolge sind die geringen Anzahlen bei den Gruppen mit hohen Konzentrationen wahrscheinlich kein Hinweis auf vermehrte Mastzelldegranulation durch eine erhöhte Anzahl von nicht mehr sichtbaren, vollständig degranulierten Mastzellen. Dies wird durch die Tatsache bekräftigt, dass die Anzahlen in diesen Gruppen im Median vergleichbar mit der Anzahl der SIF- Gruppe sind. Eine derartige Abweichung der Anzahl gezählter Mastzellen zwischen verschiedenen Behandlungsgruppen konnte nur in diesem Versuch beobachtet werden und lässt eher auf zufällige zyklusbedingte Schwankungen schließen (Boes und Levy 2012). Demnach kann eine Beteiligung von Histamin an der duralen Mastzelldegranulation in diesem Mausmodell nach der Lage dieser Daten ausgeschlossen werden. Dennoch spielt Histamin eine wichtige Rolle bei der Regulation der neurogenen Inflammation, wie zum Beispiel bei der Vasodilatation (Jansen-Olesen et al. 1997), die vermutlich durch das aus Seite | 79

4.Diskussion

Mastzellen ausgeschüttete Histamin verursacht wird (Powell und Brody 1976). Darüber induziert Histamin migräneartig Kopfschmerzen im Migräniker, was auf eine Beteiligung von Histamin an der Migräne-Pathophysiologie hindeutet (Krabbe und Olesen 1980). Es ist jedoch nicht auszuschließen, dass Histamin im Mensch zur Degranulation von duralen Mastzellen führt, da verschiedene Spezies unterschiedlich auf Histamin reagieren. Zum Beispiel sind Mäuse eher insensitiv gegenüber Histamin (Mayer und Brousseau 1946). Da Histamin keine Mastzelldegranulation induzierte, wurde der Fokus auf die Induktion der Mastzelldegranulation durch Serotoninagonisten gelegt.

4.3.3 mCPP- und BW723C86-induzierte Mastzelldegranulation in der Dura mater

Der 5-HT2B/2C-Rezeptoragonist mCPP kann bekanntermaßen eine PPE in Meerschweinchen (Johnson et al. 2003) und in Mäusen nach Hypoxie-Behandlung (Hunfeld et al. 2015) auslösen. Dieser Prozess wird über den 5-HT2B-Rezeptor vermittelt. Aus diesem Grund sollte überprüft werden, ob mCPP auch die durale Mastzelldegranulation von Mäusen in dem ex vivo-Modell induzieren kann. Eine Inkubation von 10 min war für die Induktion einer Mastzelldegranulation durch mCPP nicht ausreichend (Abb. 3.10, Abb. 3.11), sodass die Inkubationszeit auf 20 und 60 min verlängert wurde. Bereits nach 20 min induzierte mCPP eine Degranulation von Mastzellen, die nach 60 min vergleichbar war (Abb. 3.14). Laut Literatur können erste Degranulationszeichen bei einer direkten Aktivierung von Mastzellen, wie durch SP oder C48/80, bereits nach wenigen Minuten, spätestens aber nach 10 min beobachtet werden (Gaudenzio et al. 2016). In diesen Versuchen wurden Mastzellen aus menschlichem Nabelschnurblut (PBCMC) kultiviert. Die Notwendigkeit einer 20-minütige Inkubation könnte somit auf eine indirekte Aktivierung der Mastzellen durch eine von mCPP ausgelöste Signalkaskade hinweisen. Eine Möglichkeit dies zu untersuchen, wäre die Untersuchung einer reinen Zellkultur mit Mastzellen mithilfe des N- acetyl-β-D-hexosaminidase Assay. Dabei wird das Substrat 4-nitrophenyl-N-acetyl-b-D- glucosaminid durch das aus Mastzellen ausgeschüttete Enzym N-acetyl-β-D- hexosaminidase gespalten und somit photometrisch messerbar. Dieses Substrat wurde bereits in der Literatur zur Untersuchung von Mastzelldegranulation verwendet (Shibata und Yagi 1996; Schwartz et al. 1979; Pugh und Walker 1961). Der Nachweis einer Substanz-induzierten Mastzelldegranulation mittels Assays würde auf eine direkte Aktivierung hinweisen, da der Rezeptor direkt auf der Mastzelle lokalisiert sein müsste, um Seite | 80

4.Diskussion eine Mastzelldegranulation zu verursachen. Die Etablierung einer reinen Zellkultur ist jedoch schwierig und war daher aus Zeitgründen bisher nicht möglich. Da sowohl die PPE als auch die Mastzelldegranulation durch mCPP induziert werden konnten, stellte sich die Frage, welcher der beiden Prozesse zuerst erfolgt. In der vorliegenden Arbeit wurden aufgrund der langen Auswertung dieser Versuche keine Zeiträume zwischen 10 und 20 min getestet, sodass keine Aussage darüber möglich war, ob die PPE oder die Mastzelldegranulation zuerst induziert werden. Allerdings gibt es in der Literatur Hinweise darauf, dass Mastzellen keine Rolle bei der Induktion einer PPE in Ratten spielen (Markowitz et al. 1989). In dem chronischen Maus-Migräne-Modell konnte bei der Induktion der PPE eine Sensitivierung durch die Hypoxie-Behandlung beobachtet werden (Hunfeld et al. 2015). Deshalb sollte unabhängig von der möglichen Reihenfolge der Prozesse geklärt werden, ob Mastzellen durch die Hypoxie-Behandlung sensitiver gegenüber mCPP werden. Um dies zu überprüfen, wurden verschiedene Konzentrationen von mCPP am Gewebe von normoxischen und hypoxischen Tieren getestet. Dabei führte in beiden Fällen nur die höchste Konzentration von 5 mM mCPP zu einer verstärkten Mastzelldegranulation (Abb. 3.15, Abb. 3.16), sodass eine Sensitivierung der Mastzellen durch Hypoxie ausgeschlossen werden konnte. Dies ist konform mit Literaturdaten, bei den Mastzellen aus Nabelschnurblut keine veränderte Reaktivität auf den Mastzelldegranulator A23187 nach Hypoxie zeigten (Gulliksson et al. 2010). Da in der vorliegenden Arbeit mCPP in normoxischem und hypoxischem Dura mater-Gewebe gleichermaßen eine Mastzelldegranulation induzierte, wurde viele weitere Versuch mit normoxischem Gewebe durchgeführt. Die Induktion der duralen Mastzelldegranulation durch mCPP deutete auf eine Beteiligung des 5-HT2B-Rezeptors hin.

Die Substanz mCPP besitzt neben einer erhöhten Affinität zum 5-HT2B-Rezeptor (pKi: 7,6)

(Wainscott et al. 1993) auch Affinitäten zum 5-HT2A- (pKi: 6,4-6,9) (Bonhaus et al. 1995;

Owens et al. 1997) und 5-HT2C-Rezeptor (pKi: 6,9) (Bonhaus et al. 1995). In Untersuchungen anderer Migräne-relevanter Prozesse der neurogenen Inflammation konnte festgestellt werden, dass neben mCPP auch der spezifischerer 5-HT2B-Rezeptoragonist BW723C86, sowohl im Meerschweinchen-Modell als auch im Mausmodell für chronische Migräne eine PPE induzieren konnte (Hunfeld et al. 2015; Schmitz et al. 2015). Der spezifische 5-HT2B-Rezeptorantagonist BF-1 konnte die Ausbildung der mCPP- und Seite | 81

4.Diskussion

BW723C86-induzierte PPE in beiden Modellen inhibieren. Dies lässt darauf schließen, dass die mCPP-induzierte PPE über den 5-HT2B-Rezeptor vermittelt wird. Ob die

Mastzelldegranulation im ex vivo-Modell ebenso durch die Aktivierung des 5-HT2B-

Rezeptors induziert wurde, wurde ebenso mithilfe des spezifischeren 5-HT2B- Rezeptoragonisten BW723C86 getestet. Die Affinitätsdaten von BW723C86 sind in Tab. 4.3 im Anhang zu finden. Ähnlich wie mCPP konnte nur die höchste Dosierung von BW723C86 (400 µM) eine signifikant verstärkte Mastzelldegranulation auszulösen (Abb. 3.17). Dabei waren die 400 µM BW723C86 sogar tendenziell effektiver in der Induktion der Mastzelldegranulation als 5 mM mCPP. Dieselbe Konzentration von BW723C86 konnte ebenso im ex vivo-Halbschädelmodell eine Freisetzung von CGRP aus Nervenfasen induzieren (Haarmann 2016). Da BW723C86 in der vorliegenden Arbeit die durale Mastzelldegranulation induzieren konnte, deutete dies zunächst auf eine Beteiligung des 5-

HT2B-Rezeptors hin.

4.3.4 Keine Inhibition der Mastzelldegranulation durch die Serotoninantagonisten RS127445 und Methysergid

Zur Bestätigung der Beteiligung des 5-HT2B-Rezeptors an der duralen

Mastzelldegranulation wurde der spezifische 5-HT2B-Rezeptorantagonist RS127445 getestet, der am humanen 5-HT2B-Rezeptor mit hoher Affinität bindet (pKi: 9,5) (Bonhaus et al. 1999b). Affinitätsdaten zu Rezeptoren von Nagern sind nicht bekannt. RS127445 wurde sowohl bei normoxischen als auch hypoxischen Tieren verwendet. Der Antagonist zeigte bei einer Konzentration von 100 µM in beiden Fällen keine Inhibition der mCPP- induzierten Mastzelldegranulation (Abb. 3.18, Abb. 3.19). Dieselbe Konzentration von RS127445 war jedoch effektiv bei der Inhibition der mCPP- und BW-induzierten CGRP- Freisetzung im Halbschädelmodell (Haarmann 2016). Die verwendete Konzentration des Antagonisten war nur geringfügig höher als der mit der Cheng-Prusoff-Gleichung berechnete IC50-Wert (64 µM), die mCPP-Konzentration dafür aber vergleichsweise hoch. Aus diesem Grund wurde in normoxischen Tieren eine weitere, höhere Konzentration von RS127445 (300 µM) getestet. Mit der höheren Konzentration konnte ebenso keine Inhibition der mCPP-, sowie der BW723C86-induzierten Mastzelldegranulation mit angepasster RS127445-Konzentration festgestellt werden (Abb. 3.20). Noch höhere

Seite | 82

4.Diskussion

Konzentrationen von RS127445 konnten aufgrund der begrenzten Löslichkeit nicht ausgetestet werden, da die Endkonzentration von DMSO, in dem RS127445 gelöst werden musste, 0,5 % nicht überschreiten sollte. Diese Konzentration von DMSO zeigte keine Wirkung auf die Mastzelldegranulation (Abb. 3.20). Es wurde auf eine möglichst niedrige Konzentration von DMSO geachtet, um Effekte von DMSO auf Mastzellen, wie in der Literatur beschrieben (Swanston et al. 1982), zu vermeiden. Im Gegensatz zu der CGRP- Freisetzung konnten die hier verwendeten Konzentrationen von RS127445 die mCPP- und BW723C86-induzierte Mastzelldegranulation nicht inhibieren, was eine Beteiligung des 5-

HT2B-Rezeptors an der Degranulation duraler Mastzellen ausschließt. Da aber die mCPP- induzierte PPE durch die Gabe von RS127445 inhibiert werden kann (Bonhaus et al. 1999a), deutet dies daraufhin, dass die Induktion dieser beiden Prozesse trotz Verwendung des gleichen Stimulus über unabhängige Wege erfolgt.

Da der 5-HT2B-Rezeptor nicht an der Mastzelldegranulation beteiligt war, wurde überprüft, ob die Mastzelldegranulation durch andere Serotoninrezeptoren induziert wurde. Die benötigte Konzentration von mCPP zur Induktion der Mastzelldegranulation war höher als vom pKi-Wert zu erwarten wäre, sodass eine unspezifische Bindung von mCPP an andere

Serotoninrezeptoren, wie zum Beispiel einige 5-HT1-Rezeptoren sowie dem 5-HT6- und 5-

HT7-Rezeptor nicht ausgeschlossen werden konnte (Tab. 4.2, Anhang). Bisher gibt es keine

Hinweise in der Literatur darauf, dass der 5-HT6-Rezeptor relevant für die Migräne- Pathophysiologie sein könnte (Hamel 1999). Im Gegensatz dazu, wurde gezeigt, dass die

Inhibition des 5-HT7-Rezeptors in der Dura mater von Ratten zu einem verringerten

Blutfluss in der Arteria meningea media führt, was auf eine Beteiligung des 5-HT7- Rezeptors bei der duralen Vasodilatation schließen lässt (Wang et al. 2014). Außerdem konnten Antagonisten des 5-HT7-Rezeptors die Ausschüttung von CGRP durch elektrische Stimulation des TG inhibieren (Wang et al. 2010). Dies könnten Hinweise darauf sein, dass der 5-HT7-Rezeptor im Zusammenhang mit Migräne steht, da er an Prozessen der neurogenen Inflammation beteiligt ist, die als ein Erklärungsansatz für die Migräne-

Pathophysiologie dient. Für die 5-HT1-Rezeptoren besteht ein klarer Zusammenhang zu

Migräne, da zum Bespiel das klassisch verwendete Medikament Sumatriptan ein 5-HT1B/1D- Rezeptoragonist ist. Dieses wird als Therapeutikum zur Behandlung von Migräne eingesetzt und kann den Kopfschmerz bei akuten Migräne-Attacken reduzieren (Ferrari 1991). Außerdem wurde gezeigt, dass Sumatriptan neben der Reduktion des Seite | 83

4.Diskussion

Kopfschmerzes die CGRP-induzierter Vasodilatation der Arteria meningea media im Menschen verhinderte (Asghar et al. 2010). Auch im Tiermodell zeigte sich Sumatriptan effektiv, da es sowohl die PPE (Johnson et al. 2003; Schuh-Hofer et al. 2003; Hunfeld et al. 2015) als auch die Vasodilatation (Shepherd et al. 1997; Wang et al. 2014) inhibieren konnte, was auf eine Wirksamkeit bei der Inhibition der neurogenen Inflammation hindeutet. Lediglich für den 5-HT1A-Rezeptor konnte bisher kein Zusammenhang zur

Migräne festgestellt werden (Hamel 1999). Zum 5-HT1A-Rezeptor besitzt mCPP nur eine geringe Affinität (Tab. 4.2). Um eine Beteiligung der genannten Rezeptoren an der mCPP-induzierten Mastzelldegranulation zu überprüfen, wurde der unspezifische Serotoninantagonist

Methysergid eingesetzt, welcher Affinitäten zu den 5-HT1/2/7-Rezeptoren besitzt (Tab. 4.4). Methysergid wurde in der Vergangenheit als effektives Prophylaktikum bei Migräne eingesetzt, kann allerdings aufgrund von schweren Nebenwirkungen, wie der retroperitonealen Fibrose, nicht mehr zur dauerhaften Anwendung bei chronischer Migräne verwendet werden (Diamond 2007). Im Tiermodell zeigte sich ebenso eine Effektivität von Methysergid auf die Prozesse der neurogenen Inflammation. Es konnte in der Dura mater sowohl die durch elektrische Stimulation induzierte PPE in Ratten (Saito et al. 1988) als auch die durch mCPP-induzierte PPE in Meerschweinchen (Johnson et al. 2003) inhibieren. In dieser Arbeit zeigte Methysergid in keiner Konzentration einen inhibierenden Einfluss auf die mCPP-induzierte Mastzelldegranulation (Abb. 3.21). Andere Arbeitsgruppen hingegen setzten Methysergid zur Inhibition von Endotoxämie-induzierter Mastzellegranulation im Mesenterium von Ratten ein (Walther et al. 2002). Die Wirkung wurde vermutlich über eine Bindung am 5-HT2A-Rezeptor vermittelt, da auch der 5-HT2A- Rezeptorantagonist Ketanserin erfolgreich die Mastzelldegranulation inhibieren konnte. Diese Diskrepanz könnte auf die Verwendung unterschiedlicher Stimuli beruhen, da Walther et al. Lipopolysaccharide von E.coli zur Stimulation verwendeten (Walther et al. 2002) und in dieser Arbeit mCPP zur Induktion der Mastzelldegranulation genutzt wurde. Eine andere Möglichkeit könnten Speziesunterschiede sein, da hier Mäuse und nicht wie bei Walther et al. Ratten verwendet wurden. Da in dieser Arbeit keiner der Methysergid-Konzentrationen eine inhibitorische Wirkung auf die Mastzelldegranulation zeigte, war eine Beteiligung von Serotoninrezeptoren unwahrscheinlich. mCPP besitzt aber auch geringere Affinitäten zu nicht-serotonergen Seite | 84

4.Diskussion

Rezeptoren, wie zum Beispiel dem H1-Rezeptor, der wie in Kapitel 1.6 beschrieben, dieselbe Signalkaskade aktivieren kann wie der 5-HT2B-Rezeptor (Tab. 4.2). Seine Aktivierung durch Histamin wurde bereits ausgeschlossen.

4.3.5 Keine Inhibition der mCPP-induzierten Mastzelldegranulation durch Cetirizin

Der inverse H1-Rezeptoragonist Cetirizin ist ein bekanntes Antihistaminikum, was zur Linderung bei Allergiesymptomen eingesetzt wird. Da mCPP einen pKi-Wert von 6,4 an dem H1-Rezeptor von Meerschweinchen besitzt (Owens et al. 1997), sollte eine mögliche Beteiligung dieses Rezeptors untersucht werden. Die Affinität von mCPP zu diesem Rezeptor ist sogar deutlich höher als die von Histamin selbst (pKi 4,4; vergl. Tab. 4.2 und Tab. 4.1). Der H1-Rezeptor ist NOS-gekoppelt (Lassen et al. 1995) und eine NO- vermittelte Ausschüttung von CGRP in der Dura mater (Strecker et al. 2002) und von SP aus primären afferenten Neuronen im Fußspann (Yonehara und Yoshimura 1999) konnte bereits nachgewiesen werden. Sowohl CGRP als auch SP können eine Mastzelldegranulation induzieren (Ottosson und Edvinsson 1997). Somit könnte eine Aktivierung des H1-Rezeptors zur Degranulation duraler Mastzellen führen. Aus diesem Grund wurde Cetirizin eingesetzt, um zu überprüfen, ob die mCPP-induzierte Mastzelldegranulation durch die Aktivierung des H1-Rezeptors vermittelt wird. Cetirizin konnte in dieser Arbeit jedoch bei keiner Konzentration die mCPP-induzierte Mastzelldegranulation inhibieren (Abb. 3.22). Insgesamt wiesen die Gruppen, die höhere Konzentration von Cetirizin enthielten tendenziell eine verstärkte Mastzelldegranulation auf. Signifikante Unterschiede im Vergleich zu dem Vehikel SIF wurden nur für einige Gruppen festgestellt (6 mM Cetirizin, 600 µM Cetirizin + mCPP und 6 mM Cetirizin + mCPP), sodass nicht signifikante Unterschiede eine Inhibition implizieren könnten. Allerdings waren diese Unterschiede im Vergleich zu den anderen Gruppen so gering, dass nicht von einer Inhibition durch Cetirizin ausgegangen werden kann. Dies wird auch dadurch bestätigt, dass selbst mCPP trotz hoher Degranulationsrate keinen statistisch signifikanten Unterschied zu SIF aufwies. Für die Statistik wurde ein multipler Vergleich (Kruskal-Wallis-Test) durchgeführt, bei dem die 6 Gruppen jeweils mit SIF verglichen wurden. Daher ist es wahrscheinlich, dass der α-Wert durch die Bonferroni-Korrektur für multiple Vergleiche so gering war, dass diese Unterschiede als nicht signifikant eingestuft wurden. Seite | 85

4.Diskussion

Auffällig bei diesem Experiment war die Tatsache, dass Cetirizin (6 mM) alleine bereits eine starke Mastzelldegranulation vergleichbar mit den anderen Gruppen induzierte (Abb. 3.22). In der Literatur wurde die Wirkung von Antihistaminika auf Mastzellen bereits in diversen Studien untersucht, welche unterschiedliche Ergebnisse lieferten. In einer Studie am Menschen zeigte Cetirizin eine Wirkung auf die Allergiesymptome Rötung und Quaddelbildung in der Haut, aber nicht auf die Ausschüttung von Mediatoren, die unter anderem auch in Mastzellen enthalten sind (Nielsen et al. 2001). Andere Studien zeigten, dass Cetirizin im Menschen einen eher stabilisierenden oder inhibierenden Effekt auf die Ausschüttung von Mediatoren hatte (Albrecht et al. 2007; Okayama et al. 1994). Okayama et al. konnten aber auch zeigen, dass einige Antihistaminika wie Terfenadin konzentrationsabhängig die Ausschüttung inhibieren oder fördern können (Okayama et al. 1994). In derselben Studie wurde Cetirizin in einer Konzentration von 100 µM verwendet, welche dabei eine inhibierende Wirkung auf die Ausschüttung von Histamin und Prostaglandin D2 zeigte. In der vorliegenden Arbeit sind die höchsten Konzentrationen von Cetirizin deutlich höher (6 mM) als die in der Literatur verwendeten. Es besteht also die Möglichkeit, dass sich auch Cetirizin ab einer bestimmten Konzentration fördernd auf die Mastzelldegranulation auswirkt. Bisher gibt es keine Daten zu der Wirkung hoher Konzentration von Cetirizin auf die murine Mastzelldegranulation. In der vorliegenden Arbeit induzierte Cetirizin sehr eindeutig die Mastzelldegranulation in der Dura mater der Maus. Neben möglichen konzentrationsabhängigen Wirkungsweisen von Antihistaminika können auch Speziesunterschiede die Reaktion auf Antihistaminika beeinflussen. So ist von Mäusen bekannt, dass sie gegenüber Histamin wenig sensitiv sind, da eine Anaphylaxie erst bei einer Applikation von hohen Histamin-Konzentrationen auftritt (Mayer und Brousseau 1946). Darüber hinaus konnte in derselben Studie gezeigt werden, dass Antihistaminika bei Mäusen im Gegensatz zu anderen Spezies nicht protektiv sind, sondern sich fördernd auf die Ausbildung einer Anaphylaxie auswirken (Mayer und Brousseau 1946). Die Untersuchung der Beteiligung des H1-Rezeptors ist durch die Tatsache, viele H1- Rezeptorantagonisten Antihistaminika mit mastzellstabilisierende Eigenschaften sind (Levi-Schaffer und Eliashar 2009), erschwert. Ein Beispiel ist Ketotifen (Kimura et al. 1999).

Seite | 86

4.Diskussion

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass durch Cetirizin selbst, genau wie mCPP, eine Mastzelldegranulation induzierte, somit kann eine Beteiligung des H1-Rezeptors weder ausgeschlossen noch bestätigt. H1-Rezeptor Knockout-Mäuse (Zlomuzica et al. 2009) könnten dazu beitragen die Beteiligung des Rezeptors an der duralen Mastzelldegranulation zu klären. Eine Beteiligung des H1-Rezeptors bleibt aber unwahrscheinlich, da Histamin selbst in hohen Dosen keine Mastzelldegranulation induzieren konnte (Abb. 3.12, Abb. 3.13). Der Mechanismus, über den diese Mastzelldegranulation induziert wurde, konnte somit nicht abschließend ermittelt werden. Unabhängig davon wurden Hinweise gesammelt, die Auskunft darüber geben sollten, ob die Mastzelldegranulation durch eine direkte oder indirekte Aktivierung der Mastzellen induziert wurde. Dazu wurde der CGRP- Rezeptorantagonist Olcegepant verwendet, da Mastzellen in der neurogenen Inflammation unter anderem durch CGRP aktiviert werden können (Ottosson und Edvinsson 1997), was eine indirekte Aktivierung der Mastzellen über eine Signalkaskade implizieren würde.

4.3.6 Einfluss des CGRP-Rezeptorantagonisten Olcegepant auf die durale Mastzelldegranulation

Für CGRP wird eine bedeutende Rolle in der Migräne-Pathophysiologie vermutet, da sich CGRP-Rezeptorantagonisten wie Olcegepant in klinischen Studien als effektive Behandlung von Kopfschmerzen herausstellten (Olesen et al. 2004). Für Olcegepant ist am CGRP-Rezeptor von Ratten ein pKi-Wert von 8,4 (Bell 2014) und ein pKi-Wert von 11 am humanen Rezeptor beschrieben worden (Joshi et al. 2014). Außerdem konnte CGRP in Tiermodellen die Vasodilatation meningealer Gefäße induzieren (Messlinger et al. 1995) und löste bei duralen Mastzellen eine Degranulation aus (Ottosson und Edvinsson 1997), was auch die Wichtigkeit von CGRP in der neurogenen Inflammation untermauert. Dass die Gabe von mCPP, und auch BW723C86, in einem ex vivo-Halbschädelmodell in einer Ausschüttung von CGRP aus Nervenfasern resultierte, wurde bereits in einer Dissertation des Lehrstuhls für Tierphysiologie gezeigt (Haarmann 2016). Dort wurden durch dieselben Konzentrationen der beiden Substanzen (5 mM mCPP und 400 µM BW723C86) signifikante CGRP-Ausschüttungen in der Dura mater von Mäusen induziert.

Die Freisetzung von CGRP durch die beiden Substanzen konnte durch den 5-HT2B- Rezeptorantagonisten RS127445 inhibiert werden (Haarmann 2016), was darauf hindeutet,

Seite | 87

4.Diskussion dass die CGRP-Freisetzung im Gegensatz zu der Mastzelldegranulation über die

Aktivierung des 5-HT2B-Rezeptors vermittelt wird. In der vorliegenden Arbeit konnte keine Inhibition der mCPP-induzierten Mastzelldegranulation durch Olcegepant (unabhängig von der Konzentration) beobachtet werden. Bei einer Konzentration (2 nM) konnte kein signifikanter Unterschied zu der Vehikelgruppe ermittelt werden (Abb. 3.23). Da diese Gruppe allerdings keine deutliche Reduktion der Mastzelldegranulationsrate im Vergleich zu mCPP oder den anderen mCPP- haltigen Gruppen zeigte, ist dies eher auf den multiplen Vergleich in der Statistik wie bei Cetirizin zurückzuführen. Daraus ließ sich schließen, dass die mCPP-induzierte Mastzelldegranulation nicht CGRP involvierte. Dies wird von Daten einer ähnlichen Studie in einem Ratten ex vivo-Modell unterstützt, in dem die mit dem NO-Donor Glycerintrinitrat-induzierte Mastzelldegranulation ebenfalls nicht mit Olcegepant inhibiert werden konnte (Pedersen et al. 2015). Diese Ergebnisse stellen eine Induktion der Mastzelldegranulation durch CGRP in Frage. Eine Beteiligung von CGRP an der mCPP- induzierten Mastzelldegranulation hätte auf eine indirekte Aktivierung der Mastzellen durch eine Signalkaskade hinweisen können. Eine fehlende Beteiligung von CGRP spricht jedoch nicht zwangsläufig für eine direkte Aktivierung von Mastzellen, da diese auch durch SP aktiviert werden können (Ottosson und Edvinsson 1997). Diese Möglichkeit ist in dieser Arbeit nicht untersucht worden, da Antagonisten des NK1-Rezeptors, dessen Ligand SP ist, keine Wirksamkeit in einem ex vivo-Modell bei der Inhibition der Mastzelldegranulation zeigten (Pedersen et al. 2015) und sie klinisch aufgrund ihrer fehlenden Wirksamkeit bei Migräne-Kopfschmerzen irrelevant sind (Goldstein et al. 1997). Studien, die eine degranulierende Wirkung von SP auf Mastzellen zeigten, verwendeten mikromolare Konzentrationen von exogenem SP (Ottosson und Edvinsson 1997; Weidner et al. 2000). Geringe Konzentrationen im pikomolaren Bereich waren für die Induktion einer Mastzelldegranulation, zumindest bei peritonealen Mastzellen, nicht effektiv (Janiszewski et al. 1994). Tausk und Undem entdeckten, dass endogenes SP in der humanen Haut nicht zur Mastzelldegranulation führte und zweifelten an, dass diese hohen verwendeten Konzentrationen von exogenem SP physiologisch bei einer Stimulation von Nerven erreicht werden können (Tausk und Undem 1995). Somit konnte in dieser Arbeit eine Beteiligung von CGRP an der mCPP-induzierte Mastzelldegranulation in der murinen Dura mater ausgeschlossen werden. Jedoch konnte Seite | 88

4.Diskussion nicht abschließend geklärt werden, ob die Mastzelldegranulation durch eine direkte Aktivierung an der Zelle selbst verursacht wurde oder ob diese über eine Signalkaskade erfolgte. Für einen indirekten Effekt spräche der Zeitverlauf der Mastzelldegranulation, da diese erst nach 20 min auftrat (vergl. Abb. 3.10 und Abb. 3.14) und bei einer direkten Aktivierung in einer Zellkultur, zum Bespiel durch C48/80 oder exogenem SP, bereits nach 10 min erste Degranulationszeichen beobachtet werden konnten (Gaudenzio et al. 2016). Aufgrund der vorliegenden Datenlage dieser Arbeit ist es jedoch nicht mögliche eine direkte Aktivierung der duralen Mastzellen auszuschließen. Die mCPP-induzierte Aktivierung von Mastzellen könnte also an den Zellen selbst über andere Rezeptoren als die oben erwähnten Rezeptoren erfolgen und könnte unabhängig von Mediatoren sein. mCPP und BW723C86 besitzen neben Affinitäten für die serotonergen Rezeptoren und dem histaminergen H1-Rezeptor auch geringe Affinitäten zu den Dopaminrezeptoren D1 und D2 und mCPP darüber hinaus auch zu den muskarinisch-cholinergen Rezeptoren M2 und M3. Mit Hilfe einer Single Cell-PCR sollte in einem Pilotversuch ermittelt werden, ob die oben genannten Rezeptoren auf duralen Mastzellen der Maus exprimiert werden.

4.4 Expression verschiedener Rezeptoren auf duralen Mastzellen der Maus

Um festzustellen, welche Rezeptoren auf den duralen Mastzellen der Maus exprimiert werden, wurde in einem ersten Pilotversuch eine Single Cell-PCR von duralen Mastzellen durchgeführt. Mithilfe der Avidin-FITC Färbung wurden einzelne Mastzellen in der gemischten Zellkultur aus Dura mater-Gewebe identifiziert und die Expression der verschiedenen Rezeptoren auf diesen Zellen untersucht. In dieser Arbeit konnten sowohl mCPP als auch BW723C86 Mastzellen aktivieren. BW723C86 besitzt zu fast allen Rezeptoren, an die auch mCPP bindet, Affinitäten (vergl. Tab. 4.2 und Tab. 4.3). Diese unterscheiden sich allerdings in vielen Fällen im pKi-Wert.

In der Literatur ist die Expression des 5-HT1A-, 5-HT1B-,5-HT1D-, 5-HT2A-, 5-HT6- und 5-

HT7- und im geringeren Maße 5-HT2B-Rezeptors auf murinen Mastzellen aus dem Knochenmark (englisch: bone marrow-derived mast cells, BMMC) beschrieben (Kushnir- Sukhov et al. 2006). In der vorliegenden Arbeit konnte in diesem ersten Versuch festgestellt werden, dass der 5-HT2A-Rezeptor sowohl in der Dura mater und als auch auf duralen Mastzellen exprimiert wird (Abb. 3.24). Dies trifft ebenso auf den H1-Rezeptor zu (Abb. 3.25). Allerdings konnte bei den Mastzellen nur bei einer Mastzell-Probe eine Seite | 89

4.Diskussion schwache Bande für den H1-Rezeptor detektiert werden. Diese Mastzelle wies die stärkste HPRT-Bande auf. Die schwachen HPRT-Banden bei den anderen Mastzellen könnten ein Hinweis darauf sein, dass zu wenig Material aus den Zellen extrahiert worden ist und somit zu wenig cDNA synthetisiert werden konnte. Somit könnte die Bande für den H1-Rezeptor in diesen beiden Proben unter der Detektionsgrenze liegen. Da bereits auf menschlichen Mastzellen eine Expression dieses Rezeptors nachgewiesen wurde (Lippert et al. 2004), ist eine Expression des Rezeptors auch auf duralen Mastzellen wahrscheinlich. Eine

Beteiligung des 5-HT2A-Rezeptors und des H1-Rezeptors an der mCPP-induzierten

Mastzelldegranulation konnte nur im Fall des 5-HT2A-Rezeptors durch die pharmakologischen Experimente ausgeschlossen werden (Abb. 3.21). Inwieweit der H1- Rezeptor in der mCPP-induzierten Mastzelldegranulation eine Rolle spielt, konnte nicht abschließend geklärt werden, da Cetirizin selbst eine Mastzelldegranulation auslöste (Abb. 3.22). Die Beteiligung des Rezeptors ist aber unwahrscheinlich, da selbst hohe Konzentrationen von Histamin ineffektiv bei der Induktion der duralen Mastzelldegranulation waren.

Eine Expression der anderen 5-HT2-Rezeptoren, 5-HT2B und 5-HT2C, auf duralen Mastzellen konnte aufgrund von Verunreinigungen, vermutlich durch die Primer, nicht abschließend geklärt werden (Anhang, Abb. 4.4). Eine Wiederholung mit neuen Primern wäre daher notwendig. Den pharmakologischen Experimenten zufolge ist aber auch ihre Beteiligung unwahrscheinlich, da weder RS127445 noch Methysergid die Mastzelldegranulation inhibieren konnten.

Des Weiteren wurde die Expression des 5-HT7-Rezeptors auf Mastzellen untersucht. Der 5-

HT7-Rezeptor spielt bei der Vasodilatation der neurogenen Inflammation eine Rolle (Wang et al. 2014) und wird bei Ratten auf der Arteria meningea media vermutet (Terrón und

Martínez-García 2007). In dieser Arbeit konnte zwar eine Expression des 5-HT7-Rezeptors in der Dura mater, aber nicht in Mastzellen selbst nachgewiesen werden (Abb. 3.26) im Gegensatz zu Kushnir-Sukhov et al. die eine Expression auf BMMC feststellten (Kushnir- Sukhov et al. 2006). Diese Diskrepanz könnte aufgrund der Untersuchung unterschiedlicher Mastzelltypen herrühren, da BMMC Charakteristika von MMC aufweisen (Yamada et al.

2003) und hier CTMC untersucht wurden. Die Beteiligung des 5-HT7-Rezeptors ist aber ebenso, wie die Beteiligung anderer Serotoninrezeptoren, als Ursache für die Mastzelldegranulation unwahrscheinlich. Seite | 90

4.Diskussion

Der H2-Rezeptor wurde untersucht, da der inverse H2-Rezeptoragonist Cimetidin die Histamin-induzierte Mastzelldegranulation in immunsensitivierten Tieren inhibieren konnte (Carlos et al. 2006) und der Rezeptor auf Mastzellen der menschlichen Haut exprimiert wird (Lippert et al. 2004). Auf Mastzellen in der Lunge von Ratten konnte er jedoch nicht nachgewiesen werden (Rising und Lewis 1982). Eine Lokalisation des H2-Rezeptors auf meningealen Blutgefäßen wird aufgrund von funktionellen Untersuchung in der Dura mater von Ratten vermutet, da durch topische Applikation von Cimetidin die Histamin- induzierte Vasodilatation inhibiert werden konnte (Dux et al. 2002). In vorliegenden Arbeit konnte eine Expression des H2-Rezeptors weder in der Probe von Dura mater-Gewebe noch auf Mastzellen festgestellt werden, obwohl eine Expression von HPRT für die meisten der Proben vorhanden war (Abb. 3.26). Da hier keine Positivkontrolle zur Verfügung stand, kann nicht ausgeschlossen werden, dass die Primer für den H2-Rezeptor ungeeignet waren. Da der H2-Rezeptor im Magen lokalisiert ist (Diaz et al. 1994), könnte die cDNA vom Magen in weiteren Versuchen als Positivkontrolle dienen. Allerdings gibt es keinerlei Hinweise darauf, dass mCPP oder BW723C86 Affinitäten zum H2-Rezeptor aufweisen, weshalb dieser Rezeptor höchstwahrscheinlich keine Rolle bei der mCPP- oder BW723C86-induzierten Mastzelldegranulation spielt. Da mCPP auch Affinitäten zu nicht-serotonergen und nicht-histaminergen Rezeptoren wie dopaminerge Rezeptoren und muskarinisch-cholinerge Rezeptoren aufweist (Tab. 4.2), wurde überprüft, ob diese auf Mastzellen lokalisiert sind. Muskarinische Rezeptoren werden auf peritonealen Mastzellen von Ratten vermutet, da eine Freisetzung von Histamin durch Acetylcholin ausgelöst und mit Atropin inhibiert werden konnte (Masini et al. 1983), welches aber durch IgE vermittelt zu sein scheint (Masini et al. 1985). In den Proben mit dem Dura mater-Gewebe konnte eine Expression sowohl der Dopaminrezeptoren D1 und D2, als auch der cholinerg-muskarinischen Rezeptoren M1 und M2 nachgewiesen werden (Abb. 3.27, Abb. 3.28). In den Mastzellproben konnten keine HPRT-Banden detektiert werden. Dies lässt darauf schließen, dass nicht genügend Material aus den Mastzellen für die cDNA-Synthese gewonnen wurde. Da aber Banden für den D1- Rezeptor und eine Bande für den M3-Rezeptor (Abb. 3.27, Abb. 3.28) detektiert wurden und die Primer nicht Intron-umspannend generiert werden konnten, kann eine Amplifikation von genomischer DNA bei den Mastzellproben nicht ausgeschlossen werden. Diese wurden im Gegensatz zu der Dura mater-Probe nicht DNase verdaut. Somit Seite | 91

4.Diskussion ist keinerlei Aussage über die Expression dieser Rezeptoren auf duralen Mastzellen möglich. Um eine Expression auf Mastzellen auszuschließen, müsste dieser Versuch mit neuen Primern und genügend cDNA wiederholt werden. Sollte jedoch eine Expression dieser Rezeptoren auf Mastzellen bestätigt werden, könnte die pharmakologische Auswirkung auf Mastzellen mit Antagonisten überprüft werden. Aufgrund der geringen Affinität von mCPP zu den dopaminergen und muskarinisch-cholinergen Rezeptoren ist dies jedoch unwahrscheinlich (Tab. 4.2). Des Weiteren ist für die Substanz BW723C86 keine Affinität für die muskarinisch-cholinergen Rezeptoren beschrieben, welche aber in pharmakologischen Experimenten eine Mastzelldegranulation induzieren konnte (Abb. 3.17). Somit ist eine Relevanz dieser Rezeptoren in der duralen Mastzelldegranulation fraglich. Jedoch sind zumindest die Dopaminrezeptoren D1 und D2 für die neurogene Inflammation relevant, da diese auf duralen Blutgefäßen lokalisiert sind und sie den Blutfluss in Meningen beeinflussen (Cavallotti et al. 2004).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass nur der 5-HT2A- und der H1-Rezeptor zuverlässig auf duralen Mastzellen detektiert wurden und die Expression des 5-HT7-Rezeptors ausgeschlossen werden konnte. Eine Aussage über die Expression anderer Rezeptoren ist aufgrund methodischer Schwierigkeiten in diesem Pilotversuch nicht möglich. Aus diesem Grund müsste die Methode weiter optimiert werden. Jedoch wurde eine Beteiligung dieser Rezeptoren an der duralen Mastzelldegranulation in der neurogenen Inflammation zum Teil durch die eigenen pharmakologischen Experimente ausgeschlossen oder dies ist aufgrund von Affinitäts- und Literaturdaten unwahrscheinlich.

4.5 Schlussfolgerung

Eine Beteiligung von Mastzellen an der neurogenen Inflammation der Dura mater, die als ein Erklärungsansatz für die Migränepathophysiologie etabliert ist, wurde seit jeher aufgrund ihrer Nähe zu Blutgefäßen und Nervenfasern und ihrer Rolle in der Inflammation vermutet. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass sich in der Dura mater der Maus zahlreiche Mastzellen vom CTMC-Typ befanden, die in der Nähe von Migräne-relevanten Strukturen wie Blutgefäßen und Nervenfasern lokalisiert waren. Ihre Untersuchung im in vivo-Modell war aufgrund von Komplikationen und mangelnder Reproduzierbarkeit nicht möglich. Dafür erwies sich das ex vivo-Modell als geeignet für die Untersuchung duraler Mastzellen und ihrer Rolle in der neurogenen Inflammation. Die Mastzellen konnten zwar nicht durch Seite | 92

4.Diskussion

Histamin aber durch mCPP, sowie durch BW723C86, nach längerer Inkubation aktiviert werden. Die Rezeptoren, die diesen Effekt vermittelten, konnten nicht identifiziert werden. Aufgrund der Affinitätsprofile von mCPP und BW723C86 erschien eine Aktivierung über die 5-HT2-Rezeptoren, sowie andere Serotoninrezeptoren oder den Histamin H1-Rezeptor am wahrscheinlichsten. Die Beteiligung des 5-HT2B-Rezeptors an der Aktivierung von Mastzellen konnte jedoch weitestgehend ausgeschlossen werden, da RS127445 weder die mCPP- noch die BW723C86-induzierte Degranulation inhibieren konnte. Unwahrscheinlich ist auch die Beteiligung anderer Serotoninrezeptoren, da auch Methysergid ineffektiv bei der Inhibition der mCPP-induzierten Mastzelldegranulation war. Inwieweit der H1-Rezeptor eine Rolle dabei spielte, konnte nicht abschließend geklärt werden, da Cetirizin selbst Mastzelldegranulation induzierte. Jedoch scheint eine Beteiligung des H1-Rezeptors unwahrscheinlich, da Histamin selbst in hohen Konzentrationen keine Mastzelldegranulation induzieren konnte. Der CGRP- Rezeptorantagonist Olcegepant konnte ebenso die mCPP-induzierte Mastzelldegranulation nicht verhindern, was nicht auf eine Beteiligung von CGRP hinweist. Dies hätte Hinwiese auf eine indirekte Aktivierung über eine Signalkaskade liefern können. Auch SP hätte Hinweise auf eine indirekte Aktivierung von Mastzellen über eine Signalkaskade liefern können. Dies wurde in der vorliegenden Arbeit jedoch nicht getestet, da eine Beteiligung von endogenem SP an der Mastzelldegranulation aufgrund der Literaturdaten unwahrscheinlich erscheint. Eine indirekte Aktivierung der Mastzellen ist aber aufgrund der benötigten längeren Inkubationszeit der Agonisten zur Induktion einer Mastzelldegranulation über einen unbekannten Mechanismus immer noch denkbar. Somit konnte die Frage einer direkten oder indirekten Aktivierung der Mastzellen nicht abschließend beantwortet werden. Im Gegensatz zu der Mastzelldegranulation waren die PPE und die CGRP-Freisetzung aus

Nervenfasen 5-HT2B-Rezeptor abhängig (Johnson et al. 2003; Hunfeld et al. 2015; Haarmann 2016). Deswegen kann davon ausgegangen werden, dass diese Prozesse unabhängig von der Mastzelldegranulation sind. Darüber hinaus konnte auch keine Sensitivierung von Mastzellen durch Hypoxie beobachtet werden. Der fehlende Hypoxie- Effekt auf Mastzellen spricht somit auch gegen eine relevante Beteiligung von Mastzellen an der mCPP-induzierten PPE und an der beobachteten Sensitivierung in dem chronischen Maus-Migräne-Modell (Hunfeld et al. 2015). Jedoch kann eine Aufrechterhaltung der Seite | 93

4.Diskussion

Inflammation durch die Ausschüttung proinflammatorischer Substanzen aus einer aktivierten Mastzellen nicht ausgeschlossen werden, da diese zu einer Sensitivierung anderer Strukturen, wie zum Beispiel Nozizeptoren führen können (Levy et al. 2007). Um die Rolle von Mastzellen in der neurogenen Inflammation genauer aufzuklären, müsste der Einfluss von Mastzellen auf andere Prozesse der neurogenen Inflammation näher untersucht werden. Dazu könnten die Untersuchungen in Mastzell-Knockout-Mäusen durchgeführt werden oder Mastzellen pharmakologisch stabilisiert werden. Dies würde insbesondere zur Aufklärung der Mechanismen beitragen, die möglicherweise wiederkehrende Migräneattacken begünstigen. Diese Erkenntnisse könnten somit in Zukunft Patienten mit chronischer Migräne helfen, da geeignetere Therapien entwickelt werden können.

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Anhang

Anhang

Tab. 4.1 Affinitäten von Histamin zu den vier verschiedenen Histaminrezeptoren

Rezeptor H1 H2 H3 H4 pKi 4,4 3,8 7,7 7,1 7,2 7,4 Ki (nM) 40000 163000 20 79 70 42 Spezies Ratte Ratte Ratte Maus Ratte Maus (Ligneau (Tran et (Beukers et (Chen et al. Quelle et al. (Liu et al. 2001) al. 1978) al. 1997) 2003) 2000)

Tab. 4.2 Affinitäten von mCPP zu verschiedenen Rezeptoren

Rezeptor pKi/pKd Ki (nM) Spezies Quelle

5-HT1A 6,6 251 Ratte (Owens et al. 1997)

5-HT1B 6,4 338 Ratte (Schoeffter und Hoyer 1989)

5-HT1D 5,8 1584 Ratte (Schoeffter und Hoyer 1989)

5-HT2A 6,4-6,9 398-110 Ratte (Bonhaus et al. 1995; Owens et al. 1997) 5-HT2B 7,6 26 Ratte (Wainscott et al. 1993)

5-HT2C 6,9-7,2 125-59 Ratte (Bonhaus et al. 1995; Rothman et al. 2000) 5-HT3 8 10 Ratte (Milburn und Peroutka 1989)

5-HT6 5,6 2300 Ratte (Monsma et al. 1993)

5-HT7 6,6 256 Ratte (Shen et al. 1993) H1 6,4 449 Meerschweinchen (Owens et al. 1997) D1 < 6 >1000 Ratte (Martin et al. 1989) D2 < 6 >1000 Ratte (Martin et al. 1989) M2/M3 5,3 4700 Ratte (Owens et al. 1997)

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Tab. 4.3 Affinitäten von BW723C86 zu verschiedenen Rezeptoren

Rezeptor pKi/pEC50[IA]* Ki (nM) Spezies Quelle

5-HT1A <5,9 >1258 Ratte (Baxter 1996)

5-HT1B -

5-HT1D -

5-HT2A 6,6 251 Ratte (Baxter 1996)

5-HT2B 7,6*-7,9* 25-12 Ratte (Baxter 1996)

5-HT2C 6,9 125 Ratte (Kennett et al. 1997)

5-HT3 6,5 316 Ratte (Baxter 1996)

5-HT6 -

5-HT7 <6* >1000 Ratte (Kennett et al. 1997) H1 <5* >10000 Ratte (Kennett et al. 1997) D1 <5 >10000 Ratte (Kennett et al. 1997) D2 <5 >10000 Ratte (Kennett et al. 1997) M2/M3 -

Tab. 4.4 Affinitäten von Methysergid zu verschiedenen Rezeptoren

Rezeptor pKi Ki (nM) Spezies Quelle

5-HT1A 7,6 25 Ratte (Peroutka 1986)

5-HT1B 6,3 520 Ratte (Peroutka 1986)

5-HT1D 7 100 Ratte (Herrick-Davis und Titeler 1988) 5-HT2A 8,4 3,98 Ratte (Kovács et al. 2003)

5-HT2B 8,2 6,28 Ratte (Wainscott et al. 1993)

5-HT2C 9,3 0,5 Ratte (Herrick-Davis et al. 1997)

5-HT6 7,9 12,58 Maus (Plassat et al. 1993)

5-HT7 7,9 12,5 Ratte (Shen et al. 1993) H1 4,5 33000 Ratte (Tran et al. 1978) D1 - D2 - M2/M3 -

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Anhang

A) * B) 260 100 240 n.s. 220 80 200 180 160 60 140 120 40 100 80 60 20

40

Degranulation in Prozent in [%] Degranulation Anzahl gezählter Mastzellen gezählter Anzahl 20 0 0

4 % FA Carnoy 4 % FA Carnoy

4 % FA mit 0,01 M PBS 4 % FA mit 0,01 M PBS Perfusionfixierung 4 % FA Perfusionfixierung 4 % FA Abb. 4.1 Mastzelldegranulationsraten nach verschiedenen Fixierungsmethoden

Gezeigt wird die Mastzelldegranulation in der murinen Dura mater in dem ausgewerteten Bereich (8 Bilder) nach verschiedenen Fixierungsmethoden. Die Gruppen 4 % FA mit 0,1 M PB, 4 % FA mit 0,01 M PBS und Carnoy wurden immersionsfixiert, während eine Gruppe mit 4 % FA perfundiert wurde. Einzelwerte werden als Punkte und der Median als Linie dargestellt. Zu sehen ist sowohl die Mastzelldegranulation in Prozent (Kruskal Wallis Test, p = 0,017; Post-Hoc- Test Dunn’s Methode: Perfusionsfixierung 4 % FA vs. Carnoy, p < 0,05) (A) als auch die Gesamtzahl der gezählten Mastzellen im Auswertebereich jeder Probe (Kruskal Wallis Test, p = 0,073) (B). n = 5. n.s. = nicht signifikant.

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Anhang

A) B) 350 100 n.s. n.s. 300 80 250

60 200

150 40 100 20

Anzahl gezählter Mastzellen gezählter Anzahl 50 Degranulation in Prozent in [%] Degranulation

0 0

5 min Isofluran Narkose 5 min Isofluran Narkose 30 min Isofluran Narkose 30 min Isofluran Narkose Abb. 4.2 Einfluss der Narkoselänge von Isofluran auf die Mastzelldegranulation in der murinen Dura mater

Gezeigt wird die Mastzelldegranulation in der murinen Dura mater in dem ausgewerteten Bereich (12 Bilder) nach verschieden langanhaltenden Narkosen. Die Mäuse wurden vor der zervikalen Dislokation und Fixierung für entweder 5 min oder 30 min unter ca. 3 % Isofluran-Narkose gehalten. Einzelwerte werden als Punkte und der Median als Linie dargestellt. Zu sehen ist sowohl die Mastzelldegranulation in Prozent (Mann Whitney Test, p = 0,548) (A) als auch die Gesamtzahl der gezählten Mastzellen im Auswertebereich jeder Probe (Mann Whitney Test, p = 0,548) (B). n = 5. n.s. = nicht signifikant.

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Anhang

A) B) 260 100 n.s. 240 n.s. 220 80 200 180 160 60 140 120 40 100 80 60 20

40

Anzahl gezählter Mastzellen gezählter Anzahl Degranulation in Prozent in [%] Degranulation 20 0 0

Nativ Nativ

Schein-OP ohne Injektion Schein-OP ohne Injektion Abb. 4.3 Einfluss der Präparation ohne Injektion einer Substanz auf die murine durale Mastzelldegranulation im Vergleich zu nativen Tieren

Gezeigt wird die Mastzelldegranulation in der murinen Dura mater in dem ausgewerteten Bereich (12 Bilder) mit oder ohne Eingriff. Die Mäuse wurden entweder zunächst in Narkose gelegt und dann durch zervikale Dislokation getötet („Nativ“) oder die Vena jugularis wurde in Narkose freipräpariert und die Tiere wurden im Anschluss durch zervikale Dislokation getötet („Schein-OP ohne Injektion“). Einzelwerte werden als Punkte und der Median als Linie dargestellt. Zu sehen ist sowohl die Mastzelldegranulation in Prozent (Mann Whitney Test, p = 0,082) (A) als auch die Gesamtzahl der gezählten Mastzellen im Auswertebereich jeder Probe (Mann Whitney Test, p = 0,082) (B). Nativ n = 5, Schein-OP Ohne Injektion n = 6. n.s. = nicht signifikant.

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Anhang

A) 5-HT2C B) 5-HT2B

R

D M M

D R M

M M W

W M

T

T M

M

C C C

C -

C C K

K -

3 3

3

3 3 9

.

. .

.

.

1 4

3

5 6

250 bp 200 bp

200 bp 100 bp

Abb. 4.4 Single Cell-PCR vom 5-HT2C- und 5-HT2B- Rezeptor an duralen murinen Mastzellen

Dargestellt sind Gelbilder nach der Elektrophorese, die die Expression des 5-HT2B- und des 5-HT2C-Rezeptors von drei verschiedenen Mastzellen cDNA Proben, sowie einer Dura mater cDNA Probe und die dazugehörigen Kontrollen Wasserkontrolle und RT- ohne Reverse Transkriptase zeigen (A, B). Die dazugehörigen HPRT-Kontrollen sind den Abb.

3.24 (5-HT2B) und Abb. 3.25 (5-HT2C) zu entnehmen. Die erwarteten Fragmentgrößen: 5-HT2C 224 bp (A), 5-HT2B 139 bp (B). Marker: DNA Ladder GeneRuler™ 50bp. DM = Dura mater cDNA; WK = Wasserkontrolle (mit Wasser statt cDNA); RT-= ohne Reverse Transkriptase (bei der cDNA-Synthese); MC = Mastzellen cDNA. Abb. 4.4B wurde zur besseren Sichtbarkeit der schwachen Banden erhellt und der Kontrast wurde verstärkt.

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Literaturverzeichnis

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Lebenslauf

Lebenslauf

Elisabeth Dlugosch

STUDIUM

Seit 01/2014 Promotion, Ruhr-Universität Bochum, Lehrstuhl für Tierphysiologie

10/2011-09/2013 Master of Science Biologie, Ruhr-Universität Bochum, Lehrstuhl für Tierphysiologie Masterarbeit: Untersuchung der Expression vaskulärer Wachstumsfaktoren von Mäusen nach Hypoxie-Behandlung

10/2008-09/2011 Bachelor of Science Biologie, Ruhr-Universität Bochum, Lehrstuhl für Allgemeine Zoologie und Neurobiologie

Bachelorarbeit: Kontrolle der 5-HT7 Rezeptor Signalkaskade mit der lichtaktivierbaren PAC

EHRENAMT

Seit 04/2015 Biotechnologische Studenteninitiative (btS) 03/2016-05/2017 Erster Vorstand der Geschäftsstelle Bochum Seit 07/2016 Organisation des GMP-Workshops an der RUB

Seit 04/2015 Kommissionsmitglied der Tierschutzkommission Bochum

KONGRESSTEILNAHMEN (mit Posterpräsentation)

09/2016 European Headache and Migraine Trust International Congress 2016 in Glasgow, Schottland Influence of migraine-related substances on mast cell degranulation in a migraine mouse model Elisabeth Dlugosch, Prof. Dr. Hermann Lübbert

05/2015 International Headache Congress 2015 in Valencia, Spanien Examinations of mast cells in the dura mater in a migraine mouse model Elisabeth Dlugosch, Prof. Dr. Hermann Lübbert

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Lebenslauf

PUBLIKATION

 Hunfeld, Anika; Segelcke, Daniel; Bäcker, Ingo; Mecheri, Badreddine; Hemmer, Kathrin; Dlugosch, Elisabeth; Andriske, Michael; Paris, Frank; Zhu, Xinran, Lübbert, Hermann Hypoxia facilitates neurogenic dural plasma protein extravasation in mice: a novel animal model for migraine pathophysiology Scientific Reports 5, Article number: 17845 (2015) doi:10.1038/srep17845  Dlugosch, Elisabeth und Lübbert, Hermann Involvement of mast cells in the neurogenic inflammation Manuskript

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Erklärung

Erklärung

Ich versichere an Eides statt, dass ich die eingereichte Dissertation selbstständig und ohne unzulässige fremde Hilfe verfasst, andere als die in ihr angegebene Literatur nicht benutzt und dass ich alle ganz oder annähernd übernommenen Textstellen sowie verwendete Grafiken und Tabellen kenntlich gemacht habe. Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen nur die originalen Daten enthalten oder eine eindeutige Dokumentation von Art und Umfang der inhaltsverändernden Bildbearbeitung vorliegt. Außerdem versichere ich, dass es sich bei der von mir vorgelegten Dissertation (elektronische und gedruckte Version) um völlig übereinstimmende Exemplare handelt und die Dissertation in dieser oder ähnlicher Form noch nicht anderweitig als Promotionsleistung vorgelegt und bewertet wurde.

Es wurden keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel verwendet.

Die Dissertation wurde gemäß der Promotionsordnung und der Betreuungsvereinbarung angefertigt.

Bochum, den

Unterschrift

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