Tesis Doctoral
El género Hypocrea Fr. (Hypocreales, Ascomycota) en la Argentina. Estudio de la variabilidad molecular de su estado anamórfico Trichoderma
Barrera, Viviana Andrea 2012
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Cita tipo APA: Barrera, Viviana Andrea. (2012). El género Hypocrea Fr. (Hypocreales, Ascomycota) en la Argentina. Estudio de la variabilidad molecular de su estado anamórfico Trichoderma. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.
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Universidad de Buenos Aires Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Departamento de Biodiversidad y Biología Experimental
—El género Hypocrea Fr. (Hypocreales, Ascomycota) en la Argentina. Estudio de la variabilidad molecular de su estado anamórfico Trichoderma“
Tesis presentada para optar por el título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área Biología.
Lic. Viviana Andrea Barrera
Directora: Dra. Romero, Andrea Irene Directora asistente: Dra. Gasoni, Amelia Laura Consejera de estudios: Dra. Lopez, Silvia Edith
Buenos Aires, 2012
—El género Hypocrea Fr. (Hypocreales, Ascomycota) en la Argentina. Estudio de la variabilidad molecular de su estado anamórfico Trichoderma“
En la presente tesis se informan los resultados de un estudio polifásico integral del género Hypocrea/Trichoderma de Argentina. El estudio se encaró desde varios puntos de vista: biodiversidad, morfología, filogenia, incluyendo el análisis de la variabilidad de cepas biocontroladoras de T. harzianum. Para mostrar los resultados de forma ordenada se ha organizado el texto en dos capítulos. El Capítulo I trata sobre la identificación de ejemplares coleccionados y depositados en herbarios nacionales e internacionales. En el Capítulo II se analiza una colección de cepas bicontroladoras nativas de T. harzianum para reconocer caracteres útiles para su aplicación en el campo del control biológico. Como consecuencia de este estudio se identificaron 38 especies de las cuales se incorporan 4 especies nuevas para la ciencia, 2 especies que se citan por primera vez para Sudamérica, 17 especies que se citan por primera vez para la Argentina y por primera vez se cita la relación teleomorfo-anamorfo para T. longibrachiatum. Se caracterizaron 25 cepas nativas biocontroladoras de T. harzianum, se observaron diferencias en cuanto a sus requerimientos nutricionales y alta similitud entre sus caracteres genéticos. Se encontraron 291 marcadores moleculares polimórficos de RAPD de los cuales 15 fueron específicos para 5 cepas y 58 marcadores moleculares polimórficos de UP-PCR de los cuales 5 resultaron específicos para una cepa.
Palabras claves: Hypocrea/Trichoderma, filogenia, tef1, requerimientos nutricionales, marcadores moleculares, RAPD, UP-PCR.
—Hypocrea Fr. (Hypocreales, Ascomycota) in Argentina. Studies on the molecular variability of its anamorphic state Trichoderma“
In this thesis we report the results of a comprehensive multi-phase study of the genus Hypocrea/Trichoderma in Argentina. The study was faced from several points of view: biodiversity, morphology and phylogeny, including analysis of the variability of biocontrol strains of T. harzianum. To display the results in an orderly way, the text is organized into two chapters. Chapter I deals with the identification of specimens collected and deposited in national and international herbaria. Chapter II discusses a collection of native biocontrol T. harzianum strains to recognize characters useful for application in the field of biological control. As a result of this study 38 species were identified of which are incorporated 4 new species to science. Two species are recorded for the first time for South America, 17 species recorded for the first time for Argentina and for the first time cited the teleomorph-anamorph relationship to T. longibrachiatum. Twenty five native biocontrol T. harzianum strains were characterized, showing differences in their nutritional requirements and high genetic similarity between their characters. We found 291 polymorphic RAPD molecular markers of which 15 were specific for 5 strains and 58 polymorphic molecular markers of UP-PCR of which 5 were specific for one strain.
Key words: Hypocrea/Trichoderma, phylogeny, tef1, nutritional requirements, molecular markers, RAPD, UP-PCR.
Agradecimientos
A la Dra. Andrea Romero por toda su dedicación y enseñanzas, así como su compañerismo y amistad.
A la Dra. Laura Gasoni por brindarme todo su apoyo para llevar adelante este doctorado y darme la oportunidad para desarrollar mis proyectos.
Al Dr. Leopoldo Iannone por su ayuda desinteresada, por el tiempo dedicados a las consultas y orientación en filogenias.
A la Dra. Carolina Martínez por la guía en el trabajo con los marcadores moleculares, su apoyo, compañerismo, amistad, por estar siempre.
A la Prof. Nanci López por estar siempre a mi lado dedicando mucho esfuerzo y alegría a las largas horas de trabajo.
Al Dr. Diego Sauka por la buena onda y su generosidad, por poder contar siempre y la lectura crítica.
Al Biól. Rodrigo Rojo por tantas horas de charlas, debates, intercambio de ideas, compañerismo al extremo.
Al Lic. Matías Zapiola por el soporte informático, toda la paciencia y sus agudas observaciones que siempre terminan en risas.
Al Ing. Guido Chiessa por toda la ayuda profesional sin olvidarse de las risas que nunca faltaron.
A la Lic. Mariana Capdet por el gran aporte de colecciones, por compartir horas de trabajo con paciencia y amistad.
A la Dra. Adriana Hladki por esos viajes de colección imperdibles por esa bella Tucumán, los llevaré siempre conmigo.
Al Dr. Ricardo Comerio por toda la buena onda, sabios consejos y compartir el entusiasmo por el microscopio.
A la Ing. Benintende por sus enseñanzas sobre el trabajo con bacterias y los buenos chistes.
Al Ing. Rubén Larossa por su tiempo brindado en la discusión de temas estadísticos.
A la Prof. Lorena Lafuente y la Lic. Estela Favret por todo el apoyo bibliográfico y ese lugar cálido y tranquilo en la biblioteca.
Al Dr. Roberto Lecuona y el staff del INTA por todo el apoyo brindado desde la institución.
A todos los compañeros de trabajo Carmiña, Martita, Pedro, Juan Carlos, Mónica, Gachy por el buen humor para sobrellevar las largas horas de trabajo.
Al PROPLAME-PRHIDEB-CONICET por todo su apoyo y a sus integrantes por brindar el espacio para el desarrollo académico.
A JICA por el soporte económico en el marco del proyecto y la oportunidad de realizar experiencias profesionales en Japón.
A mis hijos Vanina y Tomás que me han comprendido en todo momento, a mis padres, a mis hermanas Fabiana y Romina, Joaquín, Fabián, Coqui, Cynthia, Facundo, Eli, toda la familia y amigos por estar siempre y tenerme paciencia. A Daniel que me ha brindado cariño, apoyo, trabajo, paciencia, fuerza en todo momento.
ÈNDICE GENERAL
PORTADA
TITULO Y RESUMEN EN CASTELLANO
TITULO Y RESUMEN EN INGLES
AGRADECIMIENTOS
ÈNDICE GENERAL
CAPITULO I —Estudios taxonómicos del género Hypocrea/Trichoderma en Argentina“
Pág.
INTRODUCCIÌN 1-10
MATERIALES Y MÉTODOS 11-20
1- Muestras y sitios de muestreo 11
1.1. Colecciones 11
1.2. Muestras de suelo 12
1.3. Muestras de raíces 13
1.4. Especímenes estudiados de herbario. 13
1.5. Observaciones microscópicas 13
2- Aislamiento de las cepas 14
2.1. Fuentes de las cepas 14
2.2. Conservación de los aislamientos 16
2.3 Tasa de crecimiento 17
3- Estudio Filogenético 17
3.1. Extracción de ADN 17
3.2. Cuantificación del ADN extraído 18
3.3. Marcadores Genéticos 18
3.4. Electroforesis para evaluación de productos de amplificación 19
3.5 Secuenciación 19 3.6. Análisis filogenético 19
4. Ordenamiento y modalidad de las descripciones 20
RESULTADOS 21-80
1. Colecciones 21
2. Aislamiento de las cepas 21
3. Especies identificadas 21
4. Descripciones y discusión de las especies 22-80
Sección Longibrachiatum 22
H. longibrachiata / T. longibrachiatum 22
H. nothoandinensis 24
H. schweinitzii / T. citrinoviride 26
T. ghanense 29
T. parareesei 30
T. saturnisporum 31
Sección Trichoderma
Clado Rufa 33
H. atroviridis /T. atroviride 33
T. gamsii 34
T. aff. koningii 36
H. koningiopsis / T. koningiopsis 37
Trichoderma sp. nov. 1 39
T. ovalisporum 41
T. aff. stilbohypoxyli 43
Hypocrea sp. 1 44
Trichoderma sp. nov. 3 46 Clado Pachybasium A 47
T. asperellum 47
T. hamatum 48
Trichoderma sp. nov. 2 49
Sección Pachybasium B 50
Clado Chlorospora 50
H. cremea / 50
T. cremeum 51
H. sinuosa 52
T. sinuosum 53
Clado Lixii / Catoptron 54
H. catoptron / T. catoptron 54
H. lixii / T. harzianum 55
Clado Virens 59
H. virens / T. virens 59
Clado Ceramica 60
H. ceramica 60
Clado Lutea 61
H. melanomagna / T. melanomagnum 61
—Lone Lineages“ 62
H. eucorticioides 62
H. saccharina 63
T. spirale 65
Materiales de Herbario examinados 66
H. andinogelatinosa 66
H. aurantiistroma 67 H. jecorina 68
H. longipilosa 69
H. patella 70
H. peltata 70
H. pezizaeformis 71
Hypocrea sp. 2 72
H. virescentiflava 73
H. tenuiextensa 74
5. Estado actual de los tipos de Hypocrea/ Trichoderma de Spegazzini depositados en el LPS 74
Tabla 6. Estado actual de los tipos de Spegazzini depositados en el LPS
6. Ambientes naturales 75
7. Tasa de crecimiento 75
Tabla 7. Tasa de crecimiento
8. Análisis filogenético 77
DISCUSION / CONCLUSIONES 81-97
FIGURAS
Figura 5 Cladograma tef1
Figura 5a Cladograma Sección Trichoderma Grupo LKB
Figura 5b Cladograma Sección Trichoderma Grupo LVC
Figura 5c Cladograma Sección Pachybasium B parte I
Figura 5d Cladograma Sección Pachybasium B parte II
Figura 5e Cladograma Sección Longibrachiatum
Figura 6a Cladograma rpb2 parte I
Figura 6b Cladograma rpb2 parte II
TABLAS Tabla 1. Lista de aislamientos utilizados en el estudio filogenético
Tabla 2. Colecciones sobre sustratos leñosos
Tabla 3. Colecciones aisladas de muestras de suelos
Tabla 4. Lista de taxones reconocidos de acuerdo a Druzhinina & Kubicek (2005)
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 98-105
CAPITULO II —Estudios fenéticos y genéticos de cepas biocontroladoras de
Trichoderma harzianum de Argentina“
INTRODUCCION 1-10
MATERIALES Y MÉTODOS 11-22
I- Cepas biocontroladoras de Trichoderma spp. 11
i- Características de la colección de cepas biocontroladoras 11
ii- Cultivos monospóricos 12
II- Fenotipificación de las cepas según sus requerimientos nutricionales 12
i- Caracteres morfológicos de las estructuras conidiógenas 12
ii- Estudios de asimilación de fuentes de carbono y nitrógeno 12
iii- Actividad enzimática mediante el sistema API-ZYM 14
iv- Perfiles fisiológicos mediante el sistema BIOLOG 15
III- Análisis estadístico 17
i- Análisis de Componentes Principales 17
ii- Análisis de Coordenadas Principales 17
iii- Análisis de Procrustes Generalizado 17
iv- Análisis de Agrupamiento por método de distancia no ponderado 18
IV- Estudios de marcadores moleculares 19
i- Amplificación por RAPD y UP-PCR 19 ii- Evaluación de polimorfismos 20
iii- Búsqueda de marcadores SCAR 20
iv- Clonado de fragmentos de amplificación con vector linearizado 21
v- Técnica de —Southern blotting“ 21
RESULTADOS 23-39
I- Cepas biocontroladoras de Trichoderma spp. 23
II- Fenotipificación de las cepas según sus requerimientos nutricionales y genéticos
24
i- Grupos Fisiológicos 25
a- Análisis de agrupamientos de perfiles fisiológicos y genéticos
de cepas nativas 27
b- Análisis de agrupamientos de perfiles fisiológicos y genéticos
de cepas nativas y exóticas 30
c- Análisis de perfiles genéticos de marcadores moleculares 34
III- Estudios de marcadores moleculares 36
i- Selección de marcadores SCAR 36
ii- Comprobación de especificidad del marcador M6b 23 39
DISCUSION / CONCLUSIONES 40-45
ANEXOS
Tabla 2-II Lista de primers utilizados
Tabla 3-II Variables fisiológicas utilizadas en el análisis de marcadores moleculares
Lista de acrónimos utilizados
Medios de cultivo
REFERENCIAS BIBLIOGRÊFICAS 46-52
CONTRIBUCIONES Capítulo I Introducción
Introducción
El género Hypocrea fue sancionado por Fries en 1825 como el género tipo de la familia Hypocreaceae (Hypocreales, Ascomycetes), basado en Sphaeria rufa Pers.: Fr., que tiene ascosporas hialinas, actualmente H. rufa (Pers.: Fr.) Fr., especie tipo del género. En 1791 Tode propuso Sphaeria gelatinosa con ascosporas verdes, Link en 1833 propuso el género Creopus con el tipo S. gelatinosa Tode, aunque sin explicitar que estaba caracterizado por poseer ascosporas verdes. Fries (1849) propuso a H. gelatinosa basado en el tipo de S. gelatinosa pero explicitando la característica de poseer ascosporas verdes. En 1910 Seaver propone el género Chromocrea para agrupar a todas las especies de Hypocreaceae de esporas verdes basado en H. gelatinosa. Aunque varios autores aplicaron estos nombres, otros como Doi (1972) y Webster (1964) no los aceptaron. Chaverri et al. (2001a, b, 2003a) y Chaverri & Samuels (2003) confirmaron mediante análisis filogenético que estos géneros son congenéricos con Hypocrea. Desde fines del siglo 19 hacia el comienzo de siglo 20 más de 400 especies de Hypocrea Fr. fueron propuestas por investigadores que muestrearon diferentes sitios en Asia, Êfrica y América (Samuels et al., 2006b). El orden Hypocreales está constituído por las familias Bionectriaceae, Hypocreaceae, Nectriaceae, Clavicipitaceae y Niessliaceae, de las cuales las más importantes son las 3 primeras. De acuerdo con Samuels et al. (2006b) el orden está compuesto por mayoría de hongos micoparásitos y micosaprobios. La familia Hypocreaceae comprendía 12 géneros de acuerdo con Rossman et al. (1999). Entre ellos Aphysiostroma, Arachnocrea, Dialhypocrea, Protocrea, Pseudohypocrea y Sporophagomyces tienen ascosporas desarticuladas pero se diferencian de Hypocrea en la morfología de los estromas y anamorfos. Arachnocrea y Pseudohypocrea tienen ascosporas bicónicas. Podostroma tiene estromas estipitados. Hypocrea junto con Sarawakus (Hypocreaceae), Viridispora y algunas especies de Neonectria (Nectriaceae) son los únicos géneros con ascosporas verdes dentro del Orden Hypocreales (Chaverri & Samuels, 2003). Actualmente los géneros Podostroma y Protocrea se consideran congenéricos con Hypocrea por poseer caracteres basados en secuencias de ADN similares.
1 Capítulo I Introducción
Hypocrea se caracteriza por poseer ascomas periteciales inmersos en estromas con alta variabilidad morfológica, con ascosporas verdes o hialinas formadas en ascos típicamente cilíndricos de ápice romo a veces ligeramente engrosado con 8 ascosporas bicelulares mono o dimórficas, que se desarticulan a la madurez quedando ascos 16 esporados (Kullnig-Gradinger et al., 2002) y estado anamórfico Trichoderma. Chaverri & Samuels (2003) estudiaron las especies de Hypocrea de esporas verdes haciendo análisis filogenéticos con marcadores tef1 y rpb2 y comprobaron que este grupo no es monofilético no asignándole valor de categoría taxonómica, y se asocia con especies de esporas hialinas. En el mismo análisis aparecen varios grupos con soporte mayor al 50%, entre los cuales uno de ellos, al cual denominaron CHLOROSPORA, contiene especies de estromas amarillos pulvinados que son indistinguibles entre sí y requieren de las secuencias de los anamorfos para su identificación. A continuación se enumeran los caracteres de los estromas de Hypocrea utilizados para las descripciones de las especies detallando los estados posibles para cada carácter: 1- Color: blanco, amarillo, naranja, castaño, verdosos hasta negros. 2- Forma: pulvinados (más comunes), en algunos casos con subículo, efuso-reflejos y pedicelados (poco frecuentes) 3- Superficie del estroma: lisa, con protuberancias por las papilas de los peritecios, a tuberculadas. 4- Textura del estroma: en epidermis de textura angularis, en el interior del excípulo de textura angularis, epidermoidea o intricata. 5- Area ostiolar: los ostíolos pueden ser desde inconspicuos hasta evidentes por el color de las ascosporas o contrastar con el color del estroma. 6- Reacción con hidróxido de potasio (KOH): en algunos casos la epidermis o el excípulo reaccionan dando coloraciones en los tonos de naranja o castaño. 7- Reacción con ácido láctico: la epidermis y papilas periteciales reaccionan dando color verde en especies de la Sección Longibrachiatum. 8- Ascos: cilíndricos con el ápice levemente engrosado y el pie redondeado. 9- Ascosporas: bicelulares que se desarticulan a la madurez, se diferencian las partes separadas de las ascosporas como DISTAL que es la parte cercana al ápice y PROXIMAL, la parte cercana al pie del asco. Las partes se clasifican en monomórficas y dimórficas. Las ascosporas monomórficas suelen ser globosas a
2 Capítulo I Introducción
subglobosas. En el caso de las dimórficas la parte proximal suele ser globosa a subglobosa y la parte distal es elipsoidal. En cuanto a la ornamentación de las paredes suelen ser espinosas a verrucosas. En el grupo de H. citrina se agrupan las especies con estromas de hábito efuso- reflejo, predominando los colores amarillentos, con ascosporas hialinas, ornamentadas. Este grupo fue estudiado por Overton et al. (2006) quien estableció conexiones con los respectivos estados anamórficos del tipo Hypocreanum. Los caracteres de los teleomorfos más útiles para la identificación son utilizados en conjunto: color y forma del estroma, reacción al KOH y ácido láctico, características de las ascosporas (Jaklitsch, 2009).
Su estado anamórfico Trichoderma fue establecido por Persoon en 1794. Este último también es reconocido como el estado anamórfico de Sarawakus Lloyd y Podostroma P. Karst., pertenecientes al orden Hypocreales (Ascomycetes) (Rossman et al, 1999). Los hermanos Tulasne (1865) mostraron la primera evidencia sobre la conexión entre H. rufa y T. viride en sus famosas ilustraciones. A diferencia de su teleomorfo, las cuatro especies de Trichoderma descriptas por Persoon fueron reducidas a solo una por Bisby en 1939: Trichoderma viride. Dingley (1952, 1957) estableció el primer tratamiento taxonómico del género aislando los anamorfos a partir de ascosporas y haciendo la descripción de los holomorfos. Dingley siguió el sistema de Bisby por lo tanto sólo reconoció a T. viride como el estado anamórfico de las diez especies que describió. En su tesis Rifai (1969) estableció la base fundamental de la sistemática del estado anamórfico Trichoderma. Doi (1966, 1971) propuso una taxonomía infragenérica para Hypocrea basado en caracteres del teleomorfo y, en algunos casos, con caracteres del holomorfo. En 1984 Bissett en una revisión del género propuso a la Sección Longibrachiatum, posteriormente el mismo autor propuso una clasificación infragenérica del estado anamórfico Trichoderma, y clasificó a los grupos de acuerdo con el tipo de ramificación de los conidióforos Bissett (1991a). Numerosos trabajos entre los cuales merece ser destacados Chaverri & Samuels (2003), Samuels (1996, 2006), Samuels et al. (2006a, b) y Jaklitsch (2009), entre otros, ofrecen revisiones detalladas acerca de las consideraciones modernas de la taxonomía de Hypocrea/Trichoderma. A pesar de las exhaustivas descripciones morfológicas reportadas por numerosos investigadores como Doi estos caracteres no son
3 Capítulo I Introducción determinantes para la identificación de las especies según como lo explican Druzhinina et al. (2005) —debido a la homoplasia de los caracteres usados la identificación de los taxones es difícil aún para los expertos“. Aunque por estudios filogenéticos se observó que la Sección Pachybasium propuesta por Bissett (1991b) no es monofilética, los tipos de ramificaciones descriptos por este autor, se mantienen como referencia para describir la morfología de los conidióforos (Jaklitsch, 2009). En cuanto a los caracteres del estado anamórfico estos presentan mayor variabilidad: 1- Aspecto de la colonia en CMD o SNA: forma pústulas o matas, proyecciones estériles. 2- Aspecto de la colonia en APG: no forma pústulas, se forman anillos, se identifica el olor a coco, pigmentos difusibles. 3- Tipo de ramificación de los conidióforos, son variados, algunos se muestran en la Fig. 1. 4- Fiálides (células conidiógenas): en general son ampuliformes a lageniformes, rectas, a veces sinuosas o en forma de gancho. 5- Conidios: la mayoría son elipsoidales, hay 5 especies con conidios globosos a subglobosos (Jaklitsch et al., 2006). Las paredes de los conidios pueden ser lisas (más frecuentes) u ornamentadas con verrugas o proyecciones aladas (T. saturnisporum).
4 Capítulo I Introducción
Fig 1. Tipos de ramificaciones de los conidióforos del estado anamórfico Trichoderma (Bissett, 1991a).
Este método fue desarrollado por Samuels et al. (2006a) al estudiar el agregado de especies de T. koningii y sirve para diferenciar especies emparentadas. Se utiliza un rango de temperaturas amplias y dos medios de cultivo, APG para observar el crecimiento en condiciones óptimas con mayor conidiación, en cambio en SNA o CMD se observa la formación de pústulas como en la naturaleza. Pero según Jaklitsch (2009) a veces se observan variaciones según el tipo de medio de cultivo utilizado y aún pueden detectarse diferencias con los incubadores entre laboratorios. Por lo tanto, es necesario que los experimentos con tasa de crecimiento sean llevados a cabo bajo las mismas condiciones. Este autor afirma que es útil para separar especies del grupo de ascosporas verdes pero que se dificulta con las especies de la Sec. Trichoderma. La mayor parte de las especies de Hypocrea/ Trichoderma tienen temperaturas óptimas de crecimiento entre 25-30°C. Pocas son capaces de crecer a más de 35°C. En general crecen más rápido en APG que en SNA. Este carácter permite distinguir especies cercanamente emparentadas, y suele ser combinado con la producción de pigmentos difusibles al medio de cultivo.
5 Capítulo I Introducción
Conceptos de especie e identificación
Los conceptos de especies han sido revisados por Mayden (1997) quien los caracterizó como concepto morfológico de especies (—Morphological Species Concept“, MSC), el concepto biológico de especies (—Biological Species Concept“, BSC), el concepto filogenético de especies (—Phylogenetic Species Concept“, PSC) y el concepto evolutivo de especies (—Evolutionary Species Concept“, ESC). Avise & Wollenberg (1997) discuten que el ESC es el concepto puramente teórico aunque los otros tres tratan de reconocer especies evolutivas. De acuerdo con los autores mencionados acerca de los conceptos de reconocimiento de especies Taylor et al. (2000) propone que el acercamiento a una definición de especies en hongos se haga desde el PSC mediante el análisis de numerosos locus polimórficos. Es por ello que el proceso de identificación de las especies de Hypocrea/Trichoderma ha crecido considerablemente por el análisis de secuencias de distintos genes o secuencias neutras como por ej. ITS (Kullnig- Gradinger et al., 2002). Actualmente ha aumentado el número de marcadores genéticos como el factor de elongación de la transcripción (tef1), calmodulina (cal), actina (act), subunidad II de la RNA polimerasa (rpb2) (Samuels et al., 2009, Druzhinina et al., 2012). En la Fig. 2 se muestra la estructura del gen tef1.
Fig. 2. Esquema de la estructura del gen tef1 que codifica para el factor de elongación de la transcripción, las regiones con variabilidad específica se encuentran en el intrón mayor (—large intron“), el intrón pequeño (—small intron“, señalado con una flecha) y el exón mayor (—large exon“) (Druzhinina et al., 2005).
Las secuencias ITS no son aplicables para separar especies dentro de algunas secciones debido a que presentan copias parálogas (Lieckfeldt & Seifert, 2000). En el caso del intrón mayor de tef 1 (—large intron“) provee buena resolución de clados cercanamente emparentados pero no es preciso para resolver las filogenias de grupos alejados (Druzhinina et al., 2005). Los autores mencionados proponen que el mejor
6 Capítulo I Introducción acercamiento hacia la aplicación del concepto de Concordancia Genealógica de Reconocimiento de Especies (—Genealogical Concordance Phylogenetic Species Recognition“, GCPSR) es aplicando en simultáneo los marcadores tef1, rpb2, ech42 (gen de la endoquitinasa) e ITS, aunque admiten que es un procedimiento con un costo económico elevado. Taylor et al. (2000) proponen que el GCPSR es más sencillo de aplicar e interpretar que los BSC o MSC, de este modo se unifica el concepto de especies y menciona que una de las críticas es el inconveniente para diagnosticar especies evolutivas de reciente aparición ya que los loci de los distintos genes marcadores no se terminan de fijar en corto tiempo.
Chaverri & Samuels (2003) describieron 40 especies de Hypocrea/Trichoderma con ascosporas verdes en todo el mundo en una combinación de características fenotípicas y genotípicas, concluyeron que las especies de ascosporas verdes no constituyen un grupo monofilético. En la página web del ISTH (International Subcommission on Trichoderma and Hypocrea Taxonomy) http://www.isth.info hay enlistadas 104 especies reconocidas del 2004 al 2008 y 153 secuencias de haplotipos de ITS 1 and 2 en el —TrichOKEY Barcode“. Samuels et al. (2006b) en un estudio sobre Hypocreales del sudeste de Estados Unidos describieron 32 especies de Hypocrea/Trichoderma. Jaklitsch (2009) reconoció 75 especies de Hypocrea/Trichoderma en Europa y describió 19 con esporas verdes. En una publicación reciente Jaklitsch (2011) reportó 56 especies de Hypocrea/Trichoderma con esporas hialinas comparando las secuencias tef1 en un árbol filogenético con 135 especies, el cual sería el número actualizado de las especies conocidas en total. En Sudamérica las primeras citas de especies de Hypocrea fueron publicadas por Spegazzini (1883, 1887, 1899) quien reconoció 4 especies de Argentina, una de Paraguay y 3 de Brasil. Más tarde Doi (1975, 1976) recorrió Colombia, Perú, Brasil, Chile y Argentina donde realizó viajes de colección y además visitó herbarios buscando especímenes de Hypocreales. Describió 24 especies de Hypocrea de Sudamérica, principalmente de Colombia. Entre las especies descriptas para Argentina figuran H. sulphurella y H. schweinitzii. En Argentina los estudios sobre el estado anamórfico Trichoderma se iniciaron 30 años atrás (Godeas et al. 1977 a, b; Wright et al., 1988; Mitidieri, 1988; Lopez et al., 1990). Romero (1987) encontró estromas negros con ascosporas verdes en masa sobre tocones de Eucalyptus viminalis en Buenos Aires, los cuales fueron identificados como Hypocrea nigricans f. nigricans. Las especies:
7 Capítulo I Introducción
Trichoderma hamatum, T. harzianum, T. koningii, T. polysporum, T. saturnisporum y T. viride han sido reportadas en una checklist de Ascomycetes anamórficos hallados en bosques nativos de Argentina, en su mayoría provenientes de los Andes Patagónicos y en bosques de talares de la provincia de Buenos Aires (Allegrucci et al., 2009). Catania (2009) encontró H. nigricans f. nigricans, H. ceramica y H. gelatinosa sobre Podocarpus parlatorei a 1500-1700 m de altitud. Hay trabajos sobre aplicación de cepas de Trichoderma con importancia como agentes de control biológico (BCAs) en Argentina (McAllister et al. 1994, Cozzi and Gasoni 1995, Inbar et al. 1996, Perelló et al. 1997, entre otros). En todos los casos las identificaciones a especie fueron hechas describiendo caracteres morfológicos y basándose en las claves de Rifai (1969) y Bissett (1991 a, b). Druzhinina et al. (2005), mientras comprobaban el sistema de código de barras basado en secuencias de ITS-rDNA, utilizaron secuencias de cepas del estado anamórfico de suelos del Parque Nacional Iguazú, con este método identificaron: T. harzianum, T. longibrachiatum, H. jecorina y T. spirale. En una extensiva exploración realizada con aislamientos obtenidos de muestras de suelo de Colombia, México, Guatemala, Panamá, Ecuador, Perú y Brasil, Hoyos-Carvajal et al. (2009), fueron reconocidos 29 taxones basados en los análisis filogenéticos con secuencias de ITS- rDNA y tef1 junto con la caracterización fenotípica de sus actividades metabólicas. Otras especies de Hypocrea/ Trichoderma que han sido mencionadas para Sudamérica por análisis fenotípico y genotípico son T. turrialbense (Degenkolb et al., 2008), T. hamatum, T. evansii, T. paucisporum, T. lieckfeldtiae, H. chlorospora, H. stilbohypoxyli, T. stromaticum y H. flaviconidia de Ecuador, Puerto Rico, Perú, Costa Rica y Colombia (Samuels & Ismaiel, 2009).
Sustratos
La familia Hypocreaceae comprende especies xilófilas presentes en bosques templados a subtropicales. Las especies del género Hypocrea han sido halladas sobre sustratos leñosos y creciendo sobre otros hongos. El estado anamórfico Trichoderma ha sido aislado de numerosos sustratos, es conocido como habitante saprófito en suelo, sobre sustratos leñosos en descomposición, sobre otros hongos, endofítico y, en el caso de T. longibrachiatum y T. orientalis aislados de tejidos humanos no inmunocomprometidos (Druzhinina et al., 2008).
8 Capítulo I Introducción
Actualidad del status nomenclatural de los nombres de anamorfos y teleomorfos
Durante el último Congreso Internacional de Botánica realizado en Melbourne en julio 2011. Se establecieron pautas para establecer la nomenclatura de especies de hongos. Uno de los avances es que se agrega la palabra —fungi“ en el Código Internacional de Nomenclatura Botánica. Con respecto al nombre para hongos se propone establecer el principio de 1 HONGO = 1 NOMBRE, para lo cual se aplicará el principio de prioridad entre los nombres de los estados teleomórfico y anamórfico para elegir el nombre de un hongo, es decir que el nombre será el más antiguo. Ese cambio será efectivo a partir del 1º enero de 2013 y es propulsado por micólogos que trabajan con hongos en estado anámorfico (Hawksworth, 2011). El Código actual de Viena (McNeill et al., 2006) establece, en el artículo 59, que el nombre correcto es el del estado teleomórfico para el caso de los taxones fúngicos pleomórficos, una vez conocida la conexión entre teleo- y anamorfo. Este artículo ha generado muchos debates y en el caso de los investigadores dedicados al género Hypocrea/Trichoderma se promueve la prioridad hacia el uso del nombre Trichoderma basándose en su importancia económica. La Subcomisión Internacional de Taxonomía de Trichoderma e Hypocrea (—International Subcomission on Trichoderma and Hypocrea Taxonomy“ ISTH) es una subcomisión de la Comisión Internacional de Taxonomía de Hongos (—International Comission on the Taxonomy of Fungi“ ICTF) quienes están realizando una encuesta en el sitio www.isth.org entre los miembros de la subcomisión donde el nombre Trichoderma tiene 50 votos vs. Hypocrea con 20 votos. En esta tesis seguiremos el Código de Nomenclatura vigente (Viena 2006) y le daremos el nombre del teleomorfo o del holomorfo. O en el caso especial en que no se conozca el teleomorfo se usará el nombre del anamorfo. En el Capítulo II se tratará sobre el anamorfo T. harzianum Rifai.
9 Capítulo I Introducción
Objetivos e Hipótesis
El objetivo general es realizar un estudio del género Hypocrea Fr. en la Argentina, tanto en su estado teleomórfico como en su estado anamórfico Trichoderma.
Los objetivos particulares son:
‹ Identificación de las especies. ‹ Obtener cepas en cultivo ‹ Analizar los caracteres morfológicos ‹ Estudiar caracteres moleculares ‹ Aplicar técnicas cladísticas para analizar las relaciones filogenéticas entre especies y/o grupos taxonómicos definidos.
Hipótesis H1: Existe amplia biodiversidad en el género Hypocrea en Argentina.
H2: Existen especies diferentes en la Argentina a las conocidas.
H3: Existen especies con distribución sudamericana.
H4: La filogenia de las especies argentinas refleja la filogenia del género.
10 Capítulo I Materiales y Métodos
Materiales y Métodos
1. MUESTRAS Y SITIOS DE MUESTREO
1.1 Colecciones Se coleccionaron estromas o pústulas anamórficas (cojines pulverulentos verdosos formados por conidióforos y conidios) sobre sustrato leñoso caído, en descomposición, en los sitios que se detallan a continuación: Buenos Aires: Lomas de Zamora, Llavallol: Reserva del Parque Fitotécnico Santa Catalina. Universidad de Lomas de Zamora. Hurlingham: Monte sin disturbar en predio del CNIA-INTA. Depto. Saladillo, Saladillo. Depto. San Pedro, San Pedro. Depto. La Plata, La Plata. Depto. Bahía Blanca, Bahía Blanca. Chubut: Depto. Futaleufú, Esquel. Depto. Cushamen, Epuyen. Entre Ríos: Depto. Colón: Parque Nacional El Palmar. Misiones: Depto. Iguazú: Parque Nacional Iguazú. Neuquén: Depto. Lacar, Parque Nacional Lanín. Depto. Aluminé, Abra Ancha. Tucumán: Depto. Yerba Buena: Parque Provincial Cerro San Javier, Parque Provincial La Florida, Parque Provincial Horco Molle. Depto. Chicligasta: Reserva Provincial Río Cochuna.
En los parques nacionales de Iguazú y El Palmar se realizaron muestreos estacionales durante 1 año y se repitió el muestreo de otoño en hojas caídas de las especies de palmeras nativas (para más detalles ver Capdet & Romero, 2010). Euterpe edulis Mart. (—palmito“, con distribución tropical Blombery & Rodd, 1982) es una especie candidata al —status“ vulnerable (Ministerio de Ecología de la Provincia de Misiones) y Butia yatay
11 Capítulo I Materiales y Métodos
(—yatay“, con distribución subtropical-templada Blombery & Rodd, 1982) es una especie en peligro (IUCN, 1997). Syagrus romanzoffiana (—Pindó“) de amplia distribución crece en regiones tropicales y subtropicales (Blombery & Rodd, op. cit.). Se coleccionaron partes leñosas caídas, descompuestas, por ej. vainas, pecíolos, espatas, raquis foliar y floral. El material fue secado al aire. Los especímenes fueron depositados en la colección fúngica BAFC (Holmgren et al., 1990).
1.2 Muestras de suelo
Se tomaron muestras de suelos no cultivados siguiendo rutas provinciales y nacionales en las siguientes localidades. Buenos Aires: Lomas de Zamora, Llavallol: Reserva del Parque Fitotécnico Santa Catalina. Universidad de Lomas de Zamora. Depto. San Pedro, San Pedro. Depto. La Plata, La Plata. Depto. Bahía Blanca, Bahía Blanca. Hurlingham: Monte sin disturbar en predio del CNIA-INTA. Ciudad Autónoma de Buenos Aires: Facultad de Agronomía (colección de Cap. II). Catamarca: Depto. Pomán, Rincón. Córdoba: Depto. Pres. Roque Sáenz Peña, Laboulaye, costado de la Ruta Provincial 4, en suelos sin disturbar. Depto. Gral San Martín, Villa María, al costado de la Ruta Provincial 9, en suelos sin disturbar. Depto. Pocho, Villa Dolores, al costado de la Ruta provincial 28, en suelos sin disturbar. Depto. Río Segundo, Oncativo, al costado de la Ruta provincial 9, en suelos sin disturbar. Corrientes: Depto. Santo Tomé, Gob. Virasoro, Las Marías. Entre Ríos: Parque Nacional El Palmar. Mendoza: Depto. Luján de Cuyo, Mendoza, EEA Mendoza, predios experimentales. Misiones: Parque Nacional Iguazú. San Luis: Depto La Capital, El Durazno al costado de la Ruta Provincial 18. Salta: Depto. Cerrillos, Cerrillos, EEA Salta, predios experimentales.
12 Capítulo I Materiales y Métodos
Santa Fe: Depto. San Cristóbal, Suardi, suelos no cultivados. Depto. San Cristóbal, Colonia Ana, suelos no cultivados. Tucumán: Parques Provinciales La Florida, Horco Molle, San Javier y Río Cochuna. Depto. Lules: Potrero de las Tablas. Depto. Juan B. Alberdi, J. B. Alberdi (Villa Alberdi): suelos cultivados con tabaco de la firma Nobleza Piccardo (colección de Cap. II). Las muestras se recogieron con cuchara previamente desinfectada con etanol al 70%, se tomaron aproximadamente 50-100 gr de suelo, las muestras fueron conservadas en bolsas con cierre hermético y se guardaron en refrigerador hasta su procesamiento (protocolo adaptado de Rossman et al., 1998).
1.3 Muestras de raíces
Se extrajo micelio de raíces de plantas de trigo (según se describe en pág. 16). Buenos Aires: Depto. Saladillo, Saladillo. Corrientes: Depto. Uruguay, Concepción del Uruguay. Santa Fe: Depto. Gral. López, Venado Tuerto.
1.4 Especímenes estudiados de herbarios
Se consultaron materiales adicionales solicitando en préstamo a herbarios nacionales (LPS, BAFC y LIL) e internacionales (NY, BPI y K). Las siglas de las respectivas instituciones se citan de acuerdo con Thiers (2012 http://sweetgum.nybg.org/ih/). En una tabla se resumirán los tipos de las especies por Spegazzini del LPS.
1.5 Observaciones microscópicas
Las observaciones se realizaron con microscopio estereoscópico Olympus SZX9. Todas las observaciones y mediciones de las estructuras microscópicas se realizaron con microscopio óptico (Olympus BX51) acoplado a cámara digital Cool Snap-Pro (Media
13 Capítulo I Materiales y Métodos
Cybernetics, EEUU) que utiliza el software Image-Pro Solution. Se tomaron notas de caracteres de los estromas como: forma, características de la superficie, modo de sujetarse al sustrato, observación de las aperturas ostiolares. El color de los estromas se comparó con las tablas de colores de Ridgway (1912). Se midieron los diámetros de los estromas y se observó la forma de disposición sobre el sustrato, si estaban aislados o agregados. Se hicieron cortes a mano alzada de los estromas con bisturí de hoja delgada u hoja de afeitar. Los cortes obtenidos se montaron en agua, solución de KOH 3% y ácido láctico 85-90% para la observación de reacciones de color. Para el estudio y mediciones de estructuras micromorfológicas bajo microscopio se montaron los cortes o preparados de ascos y ascosporas en KOH 3%. Se midieron largo y ancho de ascos y ascosporas. Se observó la presencia de ornamentaciones en la pared de las ascosporas así como el color de las mismas. El tejido excipular fue observado en algunos casos. Para las observaciones morfológicas los aislamientos obtenidos durante este estudio (detallado en el punto 2) fueron desarrollados en harina de maíz adicionada con dextrosa al 2% (CMD) y medio mínimo (SNA). Fueron incubados a 25 °C bajo luz blanca fluorescente con fotoperíodo de 12 h durante 72 a 96 h. Se tomaron en cuenta las siguientes características de las colonias: color de la colonia, presencia de olores característicos, observación de pigmentos difusibles y proyecciones estériles sobre la superficie de las pústulas. También tipo de crecimiento de la colonia y disposición de las células conidiógenas (fiálides). En las descripciones se mencionarán como fiálides. Se describirán como matas y pústulas las estructuras conidiógenas agrupadas en las colonias crecidas en SNA: las pústulas contienen conidióforos y conidios en estructuras con límites definidos, en cambio, las matas no tienen formas definidas y además contienen micelio vegetativo. Se seguirá el concepto de ramificación de Bissett (1991a) como se menciona a continuación: 1- Tipo Gliocladium 2- Tipo Pachybasium 3- Tipo Trichoderma (tomando como modelo el de T. asperellum) 4- Tipo Hypocreanum (no figura en la tabla) 5- Producción de sinanamorfos, son formas de conidióforos distintas que se producen en las pústulas, del tipo-Verticillium, ocurre en algunas especies.
14 Capítulo I Materiales y Métodos
Para la descripción de los caracteres microscópicos se montó una pequeña porción de una pústula en una gota de solución KOH al 3%. Se midieron ancho de la base y zona media y largo de las fiálides y ancho de la hifa portadora. El estudio de los conidios comprendió la observación del ancho y largo, color en masa y descripción de la ornamentación.
2. AISLAMIENTO DE LAS CEPAS
2.1. Las fuentes de los aislamientos fueron: a) sustrato leñoso: 1- pústulas anamórficas; 2- estroma; 3- ascosporas b) suelo: 1- no cultivados; 2- reservas; 3- cultivados (rizosférico y no rizosférico) c) raíces de trigo y soja
LOS MEDIOS MENCIONADOS SE ENCUENTRAN DETALLADOS EN ANEXO. Para las siguientes técnicas se siguió la metodología de Jaklitsch (2009, 2011).
a) 1- Pústulas anamórficas Se tomaron masas de esporas de las pústulas y se transfirieron a placas con agar papa glucosado (APG) suplementado con 50 U/ml de sulfato de penicilina y 100 U/ml de estreptomicina o ácido láctico al 50%. a) 2- Estroma Se colocaron estromas completos o parte de ellos sobre portaobjetos previamente esterilizados con alcohol y flameados. Cada portaobjetos fue adherido con una cinta adhesiva al interior de la tapa de una placa de petri invertida con APG con 50 µl de ácido láctico al 50%. Las placas fueron incubadas durante la noche a temperatura ambiente iluminadas con luz cálida. Al cabo de 24 horas se observó la aparición de micelio en la superficie del agar o sobre el estroma, se transfirieron las colonias a placas con APG. a) 3- Ascosporas Se realizaron cortes transversales y longitudinales a mano alzada de porciones de los estromas al nivel de los peritecios. Los cortes fueron colocados en microtubos con solución Tween al 20 % estéril, los tubos se agitaron con vortex y las suspensiones de
15 Capítulo I Materiales y Métodos ascosporas obtenidas fueron transferidas con micropipeta a portaobjetos cubiertos con una delgada película de APG (microcultivo) adicionada con antibióticos, como se detalló previamente. Una vez observada la germinación de las ascosporas bajo microscopio estereoscópico se transfirieron los ápices hifales a cajas de Petri con APG en una cámara de flujo laminar. Obteniendo así cultivos monospóricos.
Para aislamientos de muestras de suelo se siguió la metodología de Chaverri & Samuels (2003) y Atanasova et al. (2010). b) suelo: 1- no cultivados; 2- reservas; 3-cultivados (rizosférico y no rizosférico) Para suelos no cultivados, de reservas y cultivados no rizosféricos se procedió de la siguiente manera: Una porción de 10 gr de suelo se diluyó en 100 ml de agua estéril en un erlenmeyer de 250 ml y se agitó a 300 rpm durante 1 hora. La suspensión obtenida se diluyó 10 veces (100 Rl suspensión + 900 Rl de agua destilada estéril) y con esta dilución se realizaron diluciones seriadas hasta 10-5 mg/ml (dilución 1: 10-5). Se inocularon placas de APG, suplementadas con ácido láctico o soluciones de antibióticos, con 100 Rl de las diluciones 1:10-3 a 1:10-5, se homogeneizó sobre la superficie de la placa y se incubó a 25ºC en oscuridad durante 48 h. Al cabo del período se hicieron observaciones sobre las colonias desarrolladas y se aislaron aquellas con características similares al estado anamórfico Trichoderma. Posteriormente fueron seleccionadas las colonias con diferentes aspectos de cultivo. Suelo cultivado rizosférico: se pesaron 20g de raíces con tierra, se colocaron en erlenmeyer con 10 volúmenes de agua destilada estéril y se agitó durante 20 min a 220 rpm en agitador. La suspensión obtenida se filtró con gasa estéril. Con el sobrenadante obtenido se realizaron diluciones seriadas de 1:10-1 a 1:10-5, de las cuales se transfirieron 100 Rl a placas de Petri con medio selectivo para Trichoderma (TSM). Las placas fueron incubadas a 25ºC en oscuridad y se observaron a las 24 y 48 h. Se transfirieron los ápices hifales a placas con APG para seleccionar las colonias de Trichoderma sp.
c) Raíces de trigo y soja: las raíces fueron lavadas y desinfectadas superficialmente con solución 10% de hipoclorito de sodio (NaClO) durante 10 min. Se enjuagó con agua
16 Capítulo I Materiales y Métodos destilada estéril durante 1 min. Se secaron 10 h en flujo laminar sobre papel de filtro estéril (Waller et al., 1998). Una vez secas fueron transferidas a placas de Petri con APG y se incubaron como se detalló anteriormente.
2.2 Conservación de los aislamientos
Para la conservación a largo plazo de las cepas del estado anamórfico Trichoderma se realizaron suspensiones de conidios. Los cultivos incubados en placas de Petri durante 5 a 7 días en APG a 25 °C fueron inundados con solución estéril de glicerol al 20%. Se procedió a barrer la superficie de la colonia con un rastrillo estéril. Se recolectó el material resuspendido y se filtró en un dispositivo con fibra de vidrio previamente esterilizada. El filtrado se guardó en tubos de centrífuga de 15 ml. Se agregó solución de glicerol hasta alcanzar 5 a 7 ml. Los aislamientos se conservan a -80 °C (Nakasone et al., 2004). Para la conservación de los cultivos a corto plazo se prepararon tubos con medio APG en pico de flauta, refrigerados a 4-5 °C. Todas las cepas han sido depositadas en el cepario BAFC cult (Thiers, 2012), con duplicados en los laboratorios de Bioinsumos Fúngicos IMYZA y en la —U. S. National Fungus Collection“ (BPI).
2.3 Tasa de crecimiento
Para este estudio se utilizaron 114 cepas de 21 especies filogenéticas (excepto H. sinuosa que no entró en el análisis por ser incorporada más tarde). El micelio en activo crecimiento en CMD incubado a 25 °C con fotoperíodo de 12 h de luz blanca fluorescente fue transferido a placas de APG y SNA, ubicando el inóculo a 2 o 3 cm del extremo de la placa. Se prepararon 5 placas para cada medio y cada cepa, las placas fueron incubadas a 15, 20, 25, 30 y 35 °C en oscuridad durante 96 h según Chaverri & Samuels (2003) y Jaklitsch (2009). Se tomaron medidas del radio de la colonia cada 24 h. El experimento fue repetido 3 veces durante semanas consecutivas. Se calcularon intervalos de confianza con los datos obtenidos usando Infostat v. 2011p (Di Rienzo et al., 2011). Los resultados de los radios de crecimiento a 25 °C, 35 °C y 40 °C medidos a las 72 h se presentan en una tabla.
17 Capítulo I Materiales y Métodos
3. ESTUDIO FILOGENÉTICO
Las citas de los cebadores se indican en la Tabla 2 del Capítulo II. La metodología empleada para todos los procedimientos del 3.1 al 3.4 se llevaron a cabo de acuerdo con Samuels et al. (2011).
3.1 Extracción de ADN
A partir de las cepas obtenidas (Tabla 1), una porción de micelio fue transferido a placas de Petri de 60 mm conteniendo Caldo Papa Dextrosa (PDB). Los cultivos fueron incubados a 25 °C con 12 h luz blanca fluorescente durante 48-72 h. Luego de dicho período el micelio fue cosechado, secado con papel absorbente y transferido a un tubo de 1,5 ml. La extracción de ADN se realizó usando dos kits de extracción: ArchivePure DNA Tissue Kit (5Prime) y DNEAsy Qiagen kit siguiendo las instrucciones de los fabricantes con mínimas modificaciones en el caso del kit Archive: se agregaron 300 µl del Buffer de Lisis al micelio recolectado y los tubos fueron incubados 1 h a 65 °C, se adicionaron 1,5 µl de RNasa y posteriormente fueron incubados por 15 min a 65 °C. Se agregaron 300 µl de Solución de Precipitación de Proteínas y fueron centrifugados 3 min a 13000 rpm. El sobrenadante fue transferido a un microtubo limpio con 300 µl de isopropanol 100%. Se mezcló suavemente invirtiendo los tubos y se centrifugó 3 min a 13000 rpm. Se descartó el isopropanol. Se agregaron 300 µl de solución de etanol al 70%. Los ácidos nucleicos fueron rehidratados en 100 µl de buffer de hidratación.
3.2 Cuantificación del ADN extraído
Se sembraron en geles de agarosa al 1% (adicionado con bromuro de etidio) con 5 µl de cada muestra con 3 µl de buffer de carga, la corrida electroforética se realizó a 120 mV durante 15-20 min. Las bandas fueron observadas con transiluminador de UV. Se tomaron fotografías digitales con KODAK DC19 Capture o DSC Sony Cybershot 4.2Mp y equipo de adquisición de imágenes G-BOX (Syngene, USA).
18 Capítulo I Materiales y Métodos
La cuantificación se realizó por dos medios: 1- con el marcador de masa molecular (BIORAD), se sembraron 12,5 µl junto a los productos obtenidos. Se compararon la intensidad de las bandas amplificadas con las del marcador. 2- con espectrofotómetro (Nanodrop, Thermoscientific) aplicando 1 µl de producto (metodología de acuerdo a Samuels et al., 2011). .
3.3 Marcadores Genéticos
ITS (espaciadores internos transcriptos) (White et al., 1990) En un volumen de reacción de 50 Rl se agregaron 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM
KCl, 0,2 mM dNTPs, 0,2 RM primers ITS1 e ITS4, 3 mM MgCl2, 1 unidad TAQ polimerasa (Invitrogen life technologies, Brasil) y 10 a 100 ng de ADN. El programa de amplificación utilizado fue el siguiente: 1 ciclo de 1 min a 94ºC seguido de 30 ciclos de 15 s a 94 °C, 15 s a 58 °C y 15 s a 72 °C. tef1 (factor de elongación de la transcripción) En un volumen de reacción de 20 µl con buffer 1x Master Mix (New England
Biolabs), 1,25 mM MgCl2 y 50 a 100 ng/µl de ADN genómico. El programa de amplificación fue el siguiente: 1 ciclo de 1 min a 94 °C durante 1 min, 30 ciclos de 1 min a 94 °C, 1 min a 55 °C, 1 min a 72 °C con un paso final de elongación de 3 min a 72 °C. rpb2 (subunidad 2 de la polimerasa) En un volumen de reacción de 20 µl con buffer 1x Master Mix (New England
Biolabs), 1,25 mM MgCl2 y 50 a 100 ng/µl de ADN genómico. La amplificación tuvo dos pasos: 1- programa previo de ensayo (—touchdown“) de 14 ciclos de 2 min a 94 °C, 30 s a 65 ºC y 1 min a 72 ºC con decrecimiento de la temperatura de 1 ºC por ciclo 2- programa de amplificación con 30 ciclos de 30 s a 94 °C, 30 s a 50 °C, 1 min a 72 °C, con un paso final de elongación de 10 min a 72 °C.
19 Capítulo I Materiales y Métodos
3.4 Electroforesis para evaluación de productos de amplificación
Se utilizaron geles de agarosa al 1,5% para los productos de RAPDs y de 1,7% para los productos de UP-PCR. Los geles de 25 cm de longitud con peines cada 12 cm aproximadamente. Los productos fueron corridos durante 3 h a 130 V en buffer TAE 1x. Se cuantificaron con 10 µl de muestra y los productos restantes se conservaron a -20 °C para secuenciar en el caso de cuantificación satisfactoria.
3.5 Secuenciación
Los productos resultantes fueron purificados con el Wizard SV Gel and PCR Clean- Up System (Promega). La reacción de secuenciación se realizó con el kit BigDyeTM Terminator v 3.1 (Applied Biosystems) basado en el método de Sanger. Los productos de reacción fueron purificados por precipitación con etanol y corridos con el —Genetic Analyzer“ 3130xl en SIGYSA (Argentina). Para los productos de marcadores moleculares se enviaron a secuenciar a Macrogen (Corea) siguiendo las especificaciones de la empresa.
3.6 Análisis filogenético
Las secuencias obtenidas para los genes tef1 y rpb2 en esta tesis fueron alineadas junto a secuencias de referencia, de las bases GenBank y EMBL, usando el algoritmo Clustal W con el programa Bioedit v. 7.0.5.3 (Hall, 1999). Para los alineamientos se asignó una penalidad de 15 a la apertura de gaps y 6 para la elongación de los mismos. Las matrices generadas fueron las siguientes: para tef1 258 secuencias y 528 caracteres y para rpb2 163 secuencias y 549 caracteres. Para el análisis por parsimonia de las secuencias tef1 y rpb2 se empleó la estrategia de búsqueda heurística mediante Multiple TBR + TBR con 1000 secuencias de adición al azar, 10000 árboles fueron guardados en memoria para su bisección y reconexión utilizando el programa NONA (Goloboff, 1999) en Winclada (Nixon, 2002). El soporte de los nodos se calculó mediante 1000 réplicas de Bootstrap. Todos los caracteres fueron considerados con el mismo peso. El análisis filogenético usando Mr Bayes 3.1 (Ronquist &
20 Capítulo I Materiales y Métodos
Huelsenbeck, 2003) también fue desarrollado sobre la misma matriz de datos. El modelo evolutivo utilizado para el gen tef1 fue HKY + G (con gamma= 0.59128), establecido usando MEGA version 5 (Tamura et al., 2011) y para las secuencias rpb2 el modelo evolutivo fue K2 + G + I = 0,55, valor de G = 1,78. Se corrieron 4 cadenas por 2000000 generaciones (—mcmc ngen“=2000000, —samplefreq“=100) hasta una frecuencia de la desviación estándar inferior a 0,01. Los primeros 5000 árboles fueron descartados. Secuencias de T. hamatum, H. rufa, T. neokoningii y H. viridescens no fueron representadas en el árbol rpb2. Con las secuencias ITS se realizaron comparaciones con secuencias de los aislamientos de la colección estudiada en el Capítulo II, por lo tanto, no se realizaron análisis filogenéticos.
4. Ordenamiento y modalidad de las descripciones
Se presentará una tabla con la totalidad de las especies identificadas ordenadas siguiendo las relaciones filogenéticas. De la misma manera, se organizarán las descripciones por clados y dentro de cada uno, se seguirá el mismo criterio. En la presente tesis seguiremos el criterio de clasificación propuesto por Druzhinina et al. (2005) donde se clasifican a las especies de Hypocrea/Trichoderma en 3 Secciones y 13 Clados. Las especies que no se ubican en clados emparentados se los denomina —líneas únicas“.
21 Capítulo I Re
et al. et al. Hypocrea
Hypocrea longibrachiata
Estromas ´ Epidermis textura angularis Excípulo textura intricata Ascomas Ascos Ascosporas
Trichoderma longibrachiatum Colonias Células conidiógenas Fiálides
Conidios C
Butia yatay
I I
Syagrus romanzoffiana
et al. vs T. longibrachiatum
H orientalis T. longibrachiatum H. orientalis H. schweinitzii T longibrachiatum H orientalis T. longibrachiatum H orientalis H. schweinitzii Hypocrea nothoandinensis notho H. andinensis. ´ ´ ´ ´ Butia yatay
Estromas Epidermis textura epidermoidea Excípulo textura angularis intricata Ascomas Ascos Ascosporas
Trichoderma Colonias Conidióforos Células conidiógenas Fiálides Conidios C
´ ´ ´ ´ Butia yatay I I
H. nothoandinensis H. schweinitzii H. andinensis H. novaezelandiae H. orientalis H. pseudokoningii H. schweinitzii et al. H. nothoandinensis H. novaezelandiae
Hypocrea schweinitzii Sphaeria schweinitzii
Estromas Epidermis textura angularis epidermoidea, . Excípulo textura intricata Ascos Ascosporas
Trichoderma citrinoviride Colonias Conidióforos Hifas Fiálides
Conidios C
´ ´ ´ ´ Butia yatay I I I ´ ´ ´ ´ I ´ ´ ´ ´ I I I I I ´ ´ ´ ´ I I ´ ´ ´ ´ H. schweinitzii
T. longibrachiatum . et al. et al H. andinensis H. novaezelandiae H. orientalis H pseudokoningii et al tef rpb2 et al
H. schweinitzii H. andinensis H. novaezelandiae H. orientalis H. pseudokoningii c
H. ibicuyensis H. lenta H. schweinitzii H. ibicuyensis H. lenta
Trichoderma ghanense et al et al. C
Pinus et al et al. T. parceramosum T. atroviride T. ghanense T. parareesei T. longibrachiatum T. orientalis
Trichoderma parareesei et al
in vivo Colonias Conidióforos Fiálides Conidios
I I I Syagrus
romanzoffianum I Syagrus romanzoffianum I T. parareesei H. jecorina T. parareesei H. jecorina/T. reesei et al T. reesei T. parareesei tef1 rpb2 T. parareesei T. reesei. in vitro T. parareesei in vitro T. reesei Syagrus romazoffianum Trichoderma saturnisporum Colonias
Pústulas onidióforos Fiálides Conidios C
et al
Hypocrea atroviridis Trichoderma atroviride Pinus radiata Colonias Conidióforos Fiálides Conidios
Pinus radiata Butia yatay. I et al Trichoderma gamsii .
Colonias Conidióforos Fiálides Conidios
Colonias C
I et al et al. T. koningii tef1 rpb2
Trichoderma koningii
et al
EN T. virens T. longibrachiatum I I I T. koningii T. koningii tef1 rpb2 T. koningii
et al et al et al Fusarium graminearum Pyrenophora tritici-repentis T. koningii Hypocrea koningiopsis
Trichoderma koningiopsis Colonias Conidióforos Fiálides Conidios
I I I I I I Hypocrea sinuosa Hypocrea schweinitzii I I
SCO
et al. et al. H. koningiopsis T. koningiopsis H. schweinitzii H sinuosa et al. op. cit.
Trichoderma
Colonias Conidióforos
Fiálides Conidios Clamidosporas Eidamia C
I I Butia yatay Butia yatay Butia yatay Butia yatay Butia yatay I Butia yatay, Butia yatay Butia yatay
Butia yatay, I I Euterpe edulis Syagrus romanzoffiana
T. neokoningii T. gamsii sensu et al. T. neokoningii vs sensu et al. T. gamsii T. gamsii et al. T. gamsii T. neokoningii Butia yatay T. neokoningii
Trichoderma ovalisporum
Colonias Proyecciones estériles Conidióforos Fiálides Conidios
T. ovalisporum tef et al.
Malpighiaceae Malvaceae et al H. schweinitzii
Trichoderma stilbohypoxyli In Stud. Mycol.
Colonias Conidióforos Fiálides Conidios
´
EN I I Pseudotsuga mentziensii
sensu et al. tef1 rpb2 T. stilbohypoxyli T. stilbohypoxyli T. stilbohypoxyli Hypocrea Estromas
Epidermis textura epidermoidea Excípulo medular textura angularis textura angularis intricata Ascos Ascosporas Trichoderma
I I I
et al. tef1 T. petersenii T. petersenii T. petersenii et al. T. petersenii Trichoderma T.
petersenii T. petersenii H. petersenii Trichoderma
Colonias Conidióforos Fiálides Conidios
Penicillium
I I I I I I
Hypocrea tef1 rpb2 T. taiwanense et al. T. taiwanense T. taiwanense T. taiwanense et al. . T. taiwanense Trichoderma asperellum et al
C
I
et al. Trichoderma hamatum Verticillium hamatum
et al.
I
et al
Trichoderma Colonias en SNA Colonias en CMD Conidióforos Fiálides Conidios Clamidosporas
Butia yatay I I
I Syagrus romanzoffiana
et al tef1 et al op. cit T. ovalisporum T. koningii T. koningiopsis tef1 rpb2 Hypocrea nothoandinensis et al.
Hypocrea cremea
Estromas Epidermis textura globular intricata Ascos Ascosporas
T. cremeum Colonias Conidióforos Fiálides Conidios C
EN Butia yatay
vs T. cremeum H. catoptron H. surrotunda H. sinuosa H. chlorospora Hypocrea sinuosa Estromas Epidermis textura angularis Excípulo medular Ascos Ascosporas
Trichoderma sinuosum Colonias Conidióforos Fiálides Conidios C
Hypocrea sinuosa H. chlorospora H. sinuosa tef1 H. sinuosa H. chlorospora, H. costaricensis H. thelephoricola H. surrotunda H. cremea Hypocrea tef1 H. cremea H ´ ´ H. sinuosa Hypocrea catoptron
Estromas Epidermis textura angularis Excípulo medular textura intricata
Ascos Ascosporas
Trichoderma catoptron
Butia yatay Butia yatay
H. catoptron I H. catoptron
Hypocrea lixii Trichoderma harzianum Colonias Conidióforos Células condiógenas Fiálides Conidios C
I I I
I Eucalyptus viminalis Hypocrea nigricans I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
´ ´´ ´ ´´ I P. parlatorei P. parlatorei I I Podocarpus parlatorei, P. parlatorei I I Hypocrea gelatinosa
tef1 rpb2 et al. et al. Eucalyptus viminalis Podocarpus parlatorei T. harzianum et al. Celtis tala
Scutia buxifolia et al et al et al C Hypocrea virens Trichoderma virens Gliocladium virens Colonias Conidióforos Gliocladium Fiálides Conidios Clamidosporas
EN
I
et al. Hypocrea ceramica
Estromas Epidermis textura epidermoidea Excípulo textura celular textura intricata Ascomas Ascos Ascosporas
Trichoderma ceramicum
EN I I I
H. ceramica H. aureoviridis H. ceramica
C Hypocrea melanomagna
Trichoderma melanomagnum
I Hypocrea rufa I I Nothofagus cuninghamii Eucalyptus regnans I H. rufa
"Lone lineages" Hypocrea eucorticioides Stud. Mycol. et al. Hypocreanum et al
I I I Chromocrea
H. corticioides. et al H. eucorticioides H. corticioides H. corticioides
Hypocrea saccharina Estromas Excípulo medular textura celular textura intricata Ascos Ascosporas
H. saccharina
Trichoderma spirale
Colonias Conidióforos Células conidiógenas Fiálides Conidios C
I I I I I I I I et al. T. fertile. rpb2 tef1 T. fertile T. spirale 1) Hypocrea andinogelatinosa
Estromas Epidermis Ascomas Ascos Ascosporas
I P. parlatorei P. parlatorei H. gelatinosa
H. andinogelatinosa H. tuberosa H. andinogelatinosa. H. tuberosa H. tuberosa H. andinogelatinosa H. tuberosa H. andinogelatinosa H. tuberosa H. andinogelatinosa. Hypocrea aurantiistroma Stud. Mycol.
et al.
BUENOS I Populus Creopus
et al H. microcitrina vs H. aurantiistroma H. megalocitrina H. fulva H. aurantiistroma Hypocrea jecorina et al et al.
I
H. jecorina et al.
Hypocrea longipilosa Estromas Epidermis textura angularis textura angularis Ascos Ascosporas
Trichoderma longipile T. longipilis
I Allophyllus edulis Creopus gelatinosus
H. longipilosa Creopus gelatinosus Hypocrea gelatinosa H. ceramica H. thuemenelloides H. thuemenelloides H. tawa Corylus avellanae
Allophylus edulis Hypocrea patella Ann. Rep. N.Y. St. Mus. nat. Hist. patella
BUENOS I I
H. patella patella H. patella tropica patella H. patella tropica H. patella patella Hypocrea peltata
PA H. paraguayensis I Patagonula americana H. argentinensis
H. paraguayensis H. argentinensis H. peltata Trichoderma tef1 rpb2,
Hypocrea pezizaeformis Estromas Epidermis textura epidermoidea Excípulo textura celular textura intricata Ascos Ascosporas
H I Persea lingue H. atro-virens
H. fulvisata, H. fulvisata
Hypocrea
Estromas Excípulo textura angularis intricata Ascos Ascosporas
BUENOS I I
H. aureoviridis H. ceramica, H. strictipilosa H. gyrosa H. aureoviridis H. ceramica H. gyrosa H. strictipilosa Hypocrea virescentiflava
Trichoderma
I
H. sulfurella
H. sulphurella H. catoptron Hypocrea tenuiextensa Estroma Excípulo textura celular textura intricata
BUENOS I
HYPOCREA TRICHODERMA Hypocrea Trichoderma
F
F H. sinuosa
S T. longibrachiatum H. nothoandinensis H. schweinitzii T. ghanense T. parareesei T. saturnisporum H. atroviridis T. gamsii T. aff. koningii T. koningiopsis Trichoderma 1 T. ovalisporum T. stilboxypoxyli Hypocrea T. asperellum T. hamatum Trichoderma H. cremea H. sinuosa H. lixii H. virens T. spirale
tef1 rpb2 tef1
c T. viride. H. taiwanense H. petersenii , H. koningiopsis H. ovalisporum H. koningii T. asperellum T. hamatum / H. flaviconidia H. stilbohypoxyli T. neokoningii T. gamsii H. viridescens / H. vinosa H. rufa H. atroviridis
H. lixii H. lixii H. lixii T. spirale H. cremea H. sinuosa H. virens T. saturnisporum H. andinensis H. schweinitzii . T. longibrachiatum H. orientalis , T. parareesei y H. jecorina T. reesei T. ghanense rpb2 T. hamatum H. rufa, T. neokoningii H. viridescens tef1 tef1 H. lixii
tef1
Discusión/ Conclusiones
Discusión y Conclusiones
Durante el desarrollo del presente capítulo se han identificado los taxones aplicando los conceptos filogenético (PSC) y morfológico (MSC) de reconocimiento de especies de acuerdo con lo propuesto por Taylor et al. (2000). Los taxones de Hypocrea/Trichoderma presentan caracteres convergentes los cuales dificultan la identificación cuando se tienen en cuenta únicamente sólo un tipo de caracteres. Por otro lado, la taxonomía de este grupo es dependiente del estado anamórfico según lo indican varios estudiosos del grupo (Druzhinina & Kubicek, 2005; Jaklitsch, 2009; Samuels et al., 2012).
La caracterización morfológica realizada durante la presente tesis fue consistente en su mayor parte con la filogenia propuesta por Jaklitsch basada en las secuencias del gen tef1 (2009; 2011). Siguiendo la metodología propuesta por este autor logramos el agrupamiento de las cepas estudiadas con 22 especies conocidas. En algunos casos, las descripciones morfológicas no fueron consistentes con las características de las especies agrupadas sugiriendo que estos especímenes podrían corresponder a taxones no descriptos hasta el momento.
Biodiversidad
Como consecuencia de los presentes resultados se identificaron 38 especies totales del género Hypocrea/Trichoderma. Para la Argentina, se describen 36 de las cuales 4 son especies nuevas para la ciencia, 2 son nuevas citas para Sudamérica y 17 registros nuevos para el país. Las 2 restantes son de Brasil y Chile. Además de reconocer especies que no estaban descriptas se actualizó el —status“ nomenclatural de materiales depositados en herbarios nacionales.
Chaverri & Samuels (2003) identificaron 40 especies de Hypocrea de ascosporas verdes en todo el mundo. Por otro lado Samuels et al. (2006b) informaron para el sudeste de EEUU 32 especies de Hypocrea, de las cuales 8 tienen ascosporas verdes. En Europa se han informado 75 especies entre las cuales 19 corresponden a especies de esporas verdes (Jaklitsch, 2009). De las 36 especies identificadas en Argentina 11 corresponden a especies de ascosporas verdes. Teniendo en cuenta que Jaklitsch (2011) reconoció 135 especies en total en el género Hypocrea y, según
82 Capítulo I Discusión/ Conclusiones
Chaverri & Samuels (op. cit.), 40 de ellas son de esporas verdes la proporción entre las especies de ascosporas verdes y hialinas es del 29,6% a nivel mundial. Esta misma proporción se mantiene tanto en EEUU (25%), en Europa (25%) y en la Argentina (27%). Cabe destacar que los datos obtenidos en este trabajo, como resultado de la bioprospección, son más cercanos a los mundiales que los de EEUU y Europa, no habiendo sido explorado aún todo el territorio nacional.
Teniendo en cuenta las especies con esporas verdes y con esporas hialinas, Hoyos- Carvajal et al. (2009) reconocieron 29 taxones (estado anamórfico) aislados de muestras de suelo de 7 países de regiones tropicales sudamericanas. Doi (1975, 1976) describió 24 especies en sus viajes de colección por 5 países de Sudamérica. Al comparar estos datos con los obtenidos en los sitios de regiones templadas y subtropicales estudiados en la presente tesis se observa un mayor número de taxones en Argentina. Lo que indica que este género está bien representado en nuestro país, con una diversidad alta, de alrededor del 27% de las 135 especies reconocidas a nivel mundial.
Por lo tanto se acepta la hipótesis planteada acerca de la amplia diversidad de especies para el género Hypocrea/Trichoderma en Argentina.
Análisis filogenético
La distribución de las secciones Trichoderma, Pachybasium B y Longibrachiatum representada en el cladograma en base al rpb2 (Fig. 6) coincide con los resultados obtenidos por Jaklitsch (2011) con el gen tef1. En cambio, el agrupamiento obtenido por tef1 (Fig. 5) presentó discordancias entre las secciones Pachybasium B y Longibrachiatum que quedaron separadas. La topología del árbol elaborado con tef1 en la Sección Trichoderma se parece al obtenido por Jaklitsch et al. (2006) donde hace un análisis del Clado Rufa pero agregando especies del LKB de Samuels et al. (2006a). En la tabla 4 que contiene la clasificación de acuerdo con Druzhinina & Kubicek (2005) se señalan las subclasificaciones propuestas por estos autores. En nuestro árbol en esta sección también se visualizan los grupos LKB y LVC como señalaran Jaklitsch et al. (op. cit.). Por otro lado, las filogenias presentadas aquí se corresponden con el —XII Rufa Clade“ surgido del alineamiento obtenido por Druzhinina et al. (2005) con secuencias
83 Capítulo I Discusión/ Conclusiones
ITS 1 y 2 con el —Viride Clade“ mencionado por Jaklitsch et al. (2006), mostrando que tienen una distancia genética cercana. Aunque los subclados generados fueron consistentes con los observados con T. koningii y T. viride, ambas especies son consideradas como complejos de especies (Samuels et al., 2006a). Los aislamientos BAFC 169 y 170 se agruparon con alto soporte con Trichoderma PSA (como —especie filogenética no descripta“), coincidiendo con este taxón propuesto por Samuels et al. (2006a) también en base al marcador tef1. Este taxón se agrupó por fuera del LKB, coincidiendo con el agrupamiento obtenido por Samuels et al. (op. cit.). Con todo lo antedicho con respecto a los caracteres fenotípicos y las relaciones filogenéticas encontradas se concluye que se trata de una especie nueva y en la figura 5 se la indica como Trichoderma sp. nov. 2 (descripta en la pág. 50). Dentro del clado LKB se discuten a continuación los grupos que lo forman. Los aislamientos BAFC 212 a 215 comparten características morfológicas y de cultivo entre sí y que los ubica en el Clado Rufa (Druzhinina & Kubicek, 2005). De estas 4 colecciones la BAFC 215 es la única que también posee el estado teleomórfico. A pesar de esta similitud en sus caracteres en el análisis molecular con el marcador tef1 la colección BAFC 215 se separó uniéndose a una de las secuencias de referencia, H. petersenii (que pertenece taxonómicamente al clado Rufa). De la cual difiere en el estado anamórfico. Por lo cual esta colección queda en suspenso en cuanto a su identificación como Hypocrea sp. 1 (pág. 45). Las otras 3 colecciones (BAFC 212/13/14) están reunidas con buen soporte y con características suficientemente diferentes (pág. 47) como para proponerlas como una especie nueva, denominada por el momento Trichoderma sp. nov. 3. Con el marcador rpb2 el análisis no es comparable porque no se pudieron incluir todas las secuencias. El siguiente grupo de 32 aislamientos que comparten características morfológicas y de cultivos similares, (aunque forman subgrupos con las distintas secuencias de referencia) en conjunto, se los considera H. koningiopsis. La diversidad que muestran estos aislamientos coincide con la exhibida por Samuels et al. (2006a) quienes describieron la especie en base a numerosas colecciones provenientes de todos los continentes. Ambos marcadores moleculares apoyaron esta diversidad al menos en el análisis de parsimonia. El aislamiento BAFC 166 coincidió categóricamente en cuanto a sus caracteres conidiales y culturales con H. ovalisporum y esto se reflejó perfectamente en el análisis molecular agrupándose con la cepa de referencia. Cabe destacar que entre los 270
84 Capítulo I Discusión/ Conclusiones aislamientos totales esta especie estuvo presente con un solo aislamiento, este resultado es coincidente con el de Hoyos-Carvajal et al. (2009), quienes consiguieron 1 aislamiento de esta especie sobre un total de 183 obtenidos de muestras de suelo de 7 países de la región neotropical de América del Sur. Nuevamente el análisis en base a tef1 fue más resolutivo. El último grupo del LKB lo formaron 7 colecciones BAFC que no coincidieron morfológicamente (Jaklitsch et al., 2006), ni tampoco en la distribución geográfica (Samuels et al., 2006a) y molecularmente se acercaron a la secuencia de referencia T. koningii con los dos marcadores. Por estos motivos por el momento estos aislamientos son considerados afines a T. koningii pero posiblemente pertenezcan a una o a dos especie/s distinta/s. Los aislamientos BAFC 1 y 18 agrupados con T. asperellum y T. hamatum respectivamente formaron un grupo externo al LKB, en ambos casos hubo coincidencias fenotípicas y genotípicas que facilitaron las identificaciones de las respectivas colecciones BAFC. En el caso de BAFC 1 coincidiendo con ambos marcadores aunque con BAFC 18 no se pudo trabajar con este marcador. Las relaciones filogenéticas de estos taxones son coincidentes con los obtenidos con 3 marcadores por Samuels et al. (2006a) y Jaklitsch et al. (2006). Los aislamientos BAFC 203 a 206 se agruparon relativamente con H. stilbohypoxyli con el marcador tef1. Con este marcador quedó más cercanamente relacionado con el LVC, a diferencia de lo observado con el marcador rpb2 (BAFC 205/6/7), con el cual se relacionaron con el LKB. Esta misma discrepancia de la relación de este taxón con estos dos grandes grupos se ve reflejada en los análisis de Jaklitsch et al. (2006) y Samuels et al. (2006a), respectivamente. En el presente análisis la relación entre el LVC y el grupo H. stilbohypoxyli en base al tef1 es coincidente con la hallada por Jaklitsch et al. (op. cit.) en la cual se muestra externa al LVC. Con respecto a lo demostrado por Samuels et al. (op. cit.) se comportó de forma similar como un grupo externo al LKB aunque más relacionado con éste que con el LVC. Los aislamientos BAFC 203 a 206 se diferencian de T. stilbohypoxyli por caracteres culturales y fenotípicos (Ver Notas en descripción), por lo tanto, se los mantiene por el momento como una especie afín a este taxón. Siguiendo con la Sección Trichoderma el próximo gran grupo es el LVC, dentro del cual comenzamos a analizar un conjunto formado por 19 aislamientos argentinos.
85 Capítulo I Discusión/ Conclusiones
Estas colecciones BAFC si bien se relacionan con T. neokoningii con tef1 (en rpb2 no existe secuencia de referencia) y entre sí con ambos marcadores, no comparten con dicha especie caracteres morfológicos ni culturales ni tampoco los comparten con T. gamsii, que es otra especie afín. Pero como ya se mencionó en las Notas respectivas se trata de taxones diferentes. A su vez entre los aislamientos argentinos se visualizan los siguientes conjuntos. Si se tiene en cuenta que, originalmente, T. neokoningii se basó en un solo aislamiento (de Perú, Samuels et al., 2006a) se podría pensar que parte de los argentinos serían otras poblaciones de la misma especie (zona rayada de la Fig. 5b), en cambio, otro subconjunto unido a las diferencias fenotípicas ya mencionadas se hipotetizan como una Trichoderma sp. nov. El siguiente clado conformado por los aislamientos BAFC 10 a 16 coincidieron sin mayores inconvenientes en cuanto a sus caracteres conidiales y culturales con los relacionados con T. gamsii. El análisis filogenético con ambos marcadores tef1 y rpb2 apoyó estas similitudes al asociarse con la secuencias de referencia de GeneBank. La relación entre los clados Trichoderma sp. nov. 1/ T. neokoningii y T. gamsii es congruente con la exhibida por Jaklitsch et al. (2006) quienes propusieron estas dos especies. De confirmar nuestra hipótesis sobre Trichoderma sp. nov. 1, ésta integraría el grupo LVC dándole una mayor identidad al mismo y reforzando su presencia en América del Sur y extendiéndola hasta la Argentina. Lo que confirmaría lo postulado por Jaklitsch et al. (op. cit.) sobre la biogeografía del grupo LVC que es cosmopolita con presencia confirmada en Sudamérica. El grupo formado por los aislamientos BAFC 222 y 223 junto con H. viridescens y H. vinosa no pudo ser definido ya que los caracteres de los conidios no se corresponden con los resultados filogenéticos. Estos aislamientos permanecen sin identificar. Una situación similar ocurre con el aislamiento BAFC 216 por lo cual, continúa sin ubicación taxonómica. Los presentes resultados con respecto a H. viridescens, H. vinosa y H. rufa, es decir, su ausencia, son coherentes de acuerdo con Jaklitsch et al. (2006) ya que ellos incluyeron pocos registros de estas especies para Sudamérica, más aún, Samuels et al. (2006a) postulan que estas especies no se encuentran en el Hemisferio Sur. El último grupo de la Sec. Trichoderma formado por los aislamientos BAFC 7, 8 y 217 comprende el taxón T. atroviride y se corresponde en sus caracteres fenotípicos. Otros aislamientos que también se corresponden fenotípicamente con este taxón son los BAFC 2 al 6 pero no tuvieron soporte con tef1. Con rpb2 se re-agruparon BAFC 3, 4, 6
86 Capítulo I Discusión/ Conclusiones y 7 junto con las secuencias de referencia con alto soporte de todo el grupo. Esto requiere estudios más detallados de la Sec. Trichoderma, ya que cuando se analizó sólo esta sección, todos estos aislamientos BAFC se agruparon con T. atroviride. En cuanto a la relación de este grupo con respecto al LKB y al LVC se mantiene la misma que la mostrada en el estudio de Dodd et al. (2003) siendo externo a estos grupos. Los miembros de la Sección Pachybasium B aquí representados son especies con ascosporas verdes, excepto T. spirale del cual se desconoce el estado teleomórfico. En el agrupamiento las especies se asociaron a diferencia de lo mostrado por Chaverri & Samuels (2003) en el análisis bayesiano con tef1 en el cual estas especies se separaron en clados independientes. Con el marcador tef1 se agruparon 78 aislamientos en 3 subgrupos con las respectivas secuencias de referencia de H. lixii. En el grupo donde se encuentra la secuencia de referencia H. lixii CIB T23 de Colombia (Hoyos-Carvajal et al., 2009) se agruparon aislamientos de suelos y colecciones provenientes de todas las provincias muestreadas. La cepa CIB T23 está asociada a los linajes 2 y 4 de Europa y Camerún, respectivamente (Chaverri et al. 2003b). Por lo visto, los aislamientos argentinos presentan concordancia en cuanto a la heterogeneidad de ambientes y suelos. El segundo grupo de H. lixii contiene aislamientos de suelos cultivados y naturales (en menor medida), con excepción de pocas colecciones de Parque Nacional El Palmar. Entre los aislamientos de suelos se encuentran las cepas estudiadas en el Capítulo II y otros aislamientos de distintos cultivos con actividad como BCAs y está asociado con la cepa de referencia GJS 04-02 proveniente de EEUU. Esta cepa de referencia se agrupa en el Clado 8 citado por Branco Rocha (2011) que contiene un grupo heterogéneo de aislamientos provenientes de suelos y distintos sustratos y de distintos continentes. Probablemente en este grupo se encuentran aislamientos más especializados por su acción antagonista. El tercer grupo está compuesto por aislamientos provenientes de PN Iguazú de suelos y 2 colecciones de sustratos leñosos a excepción de BAFC 97 que proviene de suelos de Buenos Aires junto con la cepa de referencia H. lixii DIS 94D de Perú. En este caso la cepa de referencia Dis 94D coincide dentro del Clado 10 de la filogenia de Branco Rocha (2011) que es un grupo de aislamientos endófitos neotropicales [Sudamérica (Brasil) y Êfrica]. Este grupo presenta coincidencias por el origen ya que es totalmente sudamericano, pero presenta diferencias por el tipo de relación endofítica de los
87 Capítulo I Discusión/ Conclusiones aislamientos de Brasil. Los ejemplares argentinos crecen sobre sustratos leñosos y es posible que tengan un origen endofítico. Branco Rocha (op. cit.) corrobora los resultados obtenidos en el estudio filogenético mostrado por Druzhinina et al. (2010). En el presente análisis se concluye que todos los aislamientos de este clado pertenecen a H. lixii. Es interesante destacar que se dividieron en 3 subgrupos, cada uno con una secuencia de referencia. Esto apoya las opiniones de Chaverri et al. (2003a) y Druzhinina et al. (2010) sobre que este taxón es un complejo de especies. Druzhinina et al. (op. cit.) concluyeron que H. lixii/ T. harzianum conforman una matriz de especies filogenéticas y linajes relictuales, entre las especies mencionan a T. harzianum s.s., H. lixii s.s., T. inhamatum y proponen un nombre nuevo T. sp. —afroharzianum“. Entre los linajes relictuales figuran varias colecciones provenientes de Sudamérica. Aunque Branco Rocha (2011) no identificó las entidades taxonómicas propuestas por Druzhinina et al. (op. cit.), en nuestro estudio 2 de los grupos conformados se relacionan con los Clados informados por el primer autor. El análisis con el marcador rpb2 mostró mayor homogeneidad en el subgrupo 3, los subgrupos 1 y 2 se mostraron más dispersos, pero no tienen soporte en el análisis bayesiano, a diferencia del agrupamiento con tef1 donde los 3 subgrupos están bien soportados por ambos análisis. Según Druzhinina et al. (op. cit.) no habría especiación alopátrica en el grupo. Todo lo antedicho demuestra que el estudio filogenético de H. lixii/ T. harzianum requiere un análisis más detallado aumentando el número de secuencias provenientes de diversas regiones, de esta forma se podrían confirmar las entidades taxonómicas propuestas por estos autores mencionadas en el párrafo anterior. El clado conformado por los aislamientos BAFC 195 al 202 coincidieron sin mayores inconvenientes en cuanto a sus caracteres morfológicos y culturales con los relacionados con T. spirale. El análisis filogenético con ambos marcadores tef1 y rpb2 apoyó estas similitudes al asociarse con las secuencias de referencia de GeneBank. Se considera que este grupo corresponde a la especie T. spirale y ésta constituye la primera cita para nuestro país. El grupo de estromas amarillos con ascosporas verdes compuesto por las especies H. cremea y H. sinuosa resultó ser de difícil resolución. El aislamiento BAFC 9 fue obtenido a partir de ascosporas germinadas. Y si bien los caracteres morfológicos se corresponden con los del estado anamórfico de H. cremea, no se relacionó con ella en
88 Capítulo I Discusión/ Conclusiones la filogenia sino con H. chlorospora, la cual presenta conidióforos levemente sinuosos y de diámetro mayor, en cambio, en H. cremea los conidióforos son rectos como en el aislamiento BAFC 9. En otros análisis no mostrados el aislamiento argentino se ubicó con la secuencia de referencia H. cremea, por lo tanto, aunque no se haya relacionado en estos cladogramas se postula a esta especie por el BSC. Con la especie H. sinuosa sucede la misma situación, aunque en este caso se refuerza el concepto de la especie por la mayor cantidad de aislamientos estudiados y por los caracteres morfológicos como las proyecciones estériles sinuosas que sólo comparte con H. chlorospora y de la cual se diferencia por caracteres morfológicos y culturales. Los aislamientos argentinos coinciden con todos estos caracteres y, por lo tanto, se considera que ambas especies, H. cremea y H. sinuosa, se citan por primera vez para la Argentina. Los aislamientos BAFC 208 a 211 se agruparon con las secuencias de referencia de la especie T. virens. Se observó coincidencia en cuanto a la característica del conidióforo tipo-Gliocladium entre otros con alto soporte en el análisis filogenético con los marcadores tef1 y rpb2 con lo demostrado por Chaverri & Samuels (2003). Esta especie no ofreció dificultades para su identificación. La Sección Longibrachiatum, aunque presentó bajo soporte en el análisis filogenético, es considerada un grupo monofilético (Kuhls et al., 1997). El grupo quedó integrado por las especies habituales de esta sección coherente con los caracteres genotípicos y fenotípicos de los aislamientos reunidos en este clado. Los subclados son consistentes con las similitudes expuestas por Samuels et al. (1998) acerca del —schweinitzii complex“ compuesto por H. novaezelandiae, H. andinensis, H. pseudokoningii, T. parareesei y H. schweintizii. Samuels et al (2012). Los agrupamientos de las especies tienen similitud en el clado de T. longibrachiatum de acuerdo con Samuels et al. (op. cit.), H. schweinitzii se encuentra en un clado separado. La identificación taxonómica de los aislamientos BAFC 171 al 176 fue consistente con las características conidiales típicas de la especie T. saturnisporum, se obtuvo alto soporte con ambos marcadores de acuerdo con la descripción de Samuels et al. (2012). Esta especie ya fue citada para Argentina por varios autores de sitios silvestres y contaminados (Saparrat et al. 2002). Los aislamientos BAFC 163 a 165 se agruparon con H. andinensis, en este estudio consideramos que por características culturales así como el hábitat de esta especie no concuerda con las características de las especies descriptas por Samuels et al. (1998, 2012). Se observa un comportamiento similar con ambos marcadores aunque con
89 Capítulo I Discusión/ Conclusiones rpb2 la cepa BAFC 163 se agrupó con la secuencia de referencia de H. andinensis aunque sin soporte bayesiano. La hipótesis que se plantea de una especie nueva es apoyada por Samuels et al. (2012) y Druzhinina et al. (2012) quienes manifestaron que H. andinensis fue propuesta basada en un solo aislamiento y que al analizar el Clado Longibrachiatum nuevamente trabajaron con pocos aislamientos y encontraron que todos responden a líneas evolutivas independientes. Es por ello que postularon que probablemente se trata de un complejo de especies y que requieren el análisis de un número mayor de aislamientos provenientes de Sudamérica. Por todo lo mencionado se considera que las colecciones argentinas responden a una de esas líneas evolutivas integrada por el holomorfo y se postula como una especie nueva a la cual se denominó H. nothoandinensis, emparentada con H. andinensis. El conjunto de 15 aislamientos (BAFC 177 a 191) se agruparon con H. schweinitzii/ T. citrinoviride con alto soporte. Según Samuels et al. (2012) el teleomorfo de H. schweinitzii es común en América del Norte y Europa y el estado anamórfico es cosmopolita. La identificación de los estromas requirió la diferenciación de las especies más cercanas H. novae-zelandiae y T. pseudokoningii, que se diferencian por su distribución pantropical, además de otras diferencias morfológicas (ver tabla pág. 29). Debido a que los materiales argentinos presentan características típicas de H. schweinitzii y algunos aislamientos se obtuvieron a partir de la germinación de las ascosporas es que el Dr Samuels confirmó que se trata de H. schweinitzii (com. pers.). Lo cual coincide con Doi (1972) quien confirmó la presencia del teleomorfo (Ver en Notas de la especie). El concepto de especie de Doi está basado en el BSC del teleomorfo, pero como en algunos casos no se encuentra el estado anamórfico los autores posteriores no le otorgan validez a sus identificaciones (Jaklitsch, 2009). Las colecciones argentinas permiten confirmar las conclusiones de Doi (1972) acerca de esta especie. La explicación para esta distribución es que las colecciones provienen del Parque Nacional El Palmar y de Buenos Aires (H. lenta) que son sitios de clima templado. Existe una abundante colección de estromas con las características de esta especie de los cuales no se obtuvieron los estados anamórficos pero debido a que pertenecen a los mismos sitios de colección se decidió identificarlos aplicando el MSC. De esta forma se confirma la presencia del teleomorfo para América del Sur. El clado que contiene las especies T. longibrachiatum, los aislamientos BAFC 132 al 143 y la especie más cercana, H. orientalis presentó alto soporte con ambos marcadores y en los dos tipos de análisis. Es de sumo interés para esta especie el hecho
90 Capítulo I Discusión/ Conclusiones que se haya obtenido el estado teleomórfico de T. longibrachiatum durante el presente estudio, el cual era desconocido hasta el momento y ha sido denominado H. longibrachiata. Samuels et al. (2012) afirman que T. longibrachiatum es más común en ambientes tropicales que en clima templado aunque originalmente fue hallado en EEUU. Druzhinina et al. (2012) consideraron a esta especie como una —agamoespecie“ que habría perdido la capacidad para reproducirse sexualmente. Por lo tanto, esto demuestra que es probable que las diferencias biogeográficas de los estados teleomórfico y anamórfico sean menores a las informadas hasta el momento. Esta es la primera vez que se combina el holomorfo de esta especie. El clado compuesto por las especies T. parareesei y T. reesei con los aislamientos BAFC 167/8 presentó concordancia con los caracteres fenotípicos observados con ambos marcadores demostrado por Atanasova et al. (2010), Samuels et al. (2012). Los aislamientos argentinos se consideran como T. parareesei y se agruparon con alto soporte con las dos secuencias de referencia. Esta constituye la segunda cita de esta especie para Argentina y de la misma localidad del material tipo (PN Iguazú). El último taxón de la Sec. Longibrachiatum es T. ghanense con un aislamiento, BAFC 17, el cual se agrupó con alto soporte con ambos marcadores, hubo concordancia en los caracteres morfológicos y culturales estudiados aunque los conidios de este ejemplar son lisos y no tuberculados. Samuels et al. (2012) afirman que es posible que haya dos tipos de conidios para esta especie. De acuerdo con estos autores la especie tiene distribución cosmopolita. Un aspecto interesante es su baja frecuencia de aparición en los muestreos según Samuels et al. (2012). Hoyos-Carvajal et al. (2009) no lo encontraron en el estudio de las especies de Trichoderma neotropicales. Esta es la primera cita para nuestro país. De los 10 holotipos de Spegazzini estudiados se encontró que H. corticioides es una buena especie pero que debió ser renombrada por ser un homónimo y este proceso lo llevó a cabo Overton et al. (2006) y con el cual se coincide. Tres especies fueron sinonimizadas por Doi (1975), Chaverri & Samuels (2003) con quienes se coincide en esta tesis. El resto de los materiales o no se corresponden con el género o están en condiciones que no permiten tomar decisiones (Ver Tabla 5).
91 Capítulo I Discusión/ Conclusiones
Tasas de crecimiento
Los resultados de las tasas de crecimiento obtenidas para las 22 especies filogenéticas (Tabla 6) corresponden con las informadas por Chaverri & Samuels, (2003), Samuels et al. (2006a; 2012) y Jaklitsch (2006). A partir de los estudios antes citados, se ha podido determinar que la temperatura óptima de crecimiento en APG y SNA está comprendida en el rango de 25- 35°C (con excepciones a 20°C). Este carácter contribuye para tomar decisiones taxonómicas. Los datos obtenidos con respecto a las temperaturas óptimas durante estos estudios coinciden con los informados por los investigadores antes mencionados. En la Sección Longibrachiatum se encuentran agrupadas las especies con mayor tasa de crecimiento a 35°C, siendo T. longibrachiatum la especie que presenta la mayor tasa a 35°C y a 40°C. Tanto T. longibrachiatum como H. schweinitzii/T. citrinoviride y H. nothoandinensis/ T. nothoandinensis fueron halladas en un área abierta con alta exposición a la radiación solar en El Palmar (área cercana al Arroyo Los Loros) y podrían ser considerados casi termofílicos (Samuels et al., 2012) unido al hecho de que pueden crecer a 40°C in vitro. H. virens/ T. virens creció a 35°C en PDA y SNA más rápido que lo reportado por Chaverri & Samuels (2003) para esta especie descripta con crecimiento moderado. Los aislamientos mesofílicos corresponden a H. koningiopsis, H. ovalisporum and H. cremea, con las menores tasas de crecimiento. Los valores de tasa de crecimiento en PDA de T. parareesei demostraron ser similares a los informados por Atanasova et al. (2010), pero son claramente inferiores en SNA, aún menores a los de H. jecorina establecidos por los mismos autores.
Biogeografía/ Sustrato
Entre las especies cosmopolitas encontradas en este estudio figuran H. virens, H. lixii, H. cremea, H. sinuosa, T. spirale, T. longibrachiatum y H. koningiopsis (Chaverri & Samuels, 2003; Samuels et al., 2006b; 2012). De este grupo de especies T. virens fue aislada de suelos de Perú y Colombia (Hoyos-Carvajal et al., 2009). Aunque no está presente en Europa de acuerdo con Jaklitsch, (2009), se han obtenido aislamientos de abono en Polonia (Bˇaszczyk et al., 2011). El teleomorfo sólo es conocido de EEUU sobre sustratos leñosos (Chaverri &
92 Capítulo I Discusión/ Conclusiones
Samuels, op. cit.). Las colecciones sobre sustratos leñosos son novedosas para Argentina, porque hay cepas caracterizadas como antagonistas de hongos fitopatógenos aisladas de suelos (Consolo et al., 2012). H. cremea posee una sola colección del PN El Palmar. Esta especie fue descripta por primera vez de Nueva York (EEUU) y posteriormente fue hallada en Nueva Zelanda, por lo tanto, en este caso se amplía la distribución mundial de H. cremea. Trichoderma koningiopsis en el presente trabajo fue encontrada en la mayoría de los sitios muestreados, mayormente en regiones templadas y fue la segunda especie más frecuente. Aunque los autores antes mencionados consideran que es una especie cosmopolita, afirman que es más comúnmente hallada en regiones tropicales que en templadas. Hoyos-Carvajal et al. (2009) informaron la presencia de esta especie en suelos de Perú y Colombia. Los datos recopilados en Argentina indicarían que la distribución de la especie es independiente del tipo de ambiente. Además una de las colecciones es endofítica de raíces de plantas de trigo, Samuels et al. (2006a) informaron que fue aislada de vainas y troncos de Theobroma spp. y sugieren que puede ser efectiva para proteger al maíz de Fusarium verticillioides, entre otros, por lo tanto, se amplía la lista de hospedantes y se deberá comprobar la eficiencia de estos aislamientos como BCAs. Con respecto a H. lixii/ T. harzianum en este estudio se halló su estado anamórfico en sustratos leñosos y suelos de casi todas las regiones muestreadas. Hay numerosos investigadores que informan aislamientos de T. harzianum principalmente los que se dedican al control biológico y siempre aislados de suelos, por lo tanto, esta es la primera cita del estado anamórfico sobre sustratos leñosos en Argentina. El teleomorfo había sido hallado por investigadores trabajando con poblaciones saprófitas de hongos sobre sustratos leñosos (Catania, 2009, Gamundí & Romero, 1998). H. schweinitzii y H. koningii son consideradas con distribución restringida a América del Norte y Europa (Samuels et al., 2006a; 2012). Hay algunas consideraciones con respecto a la biogeografía de estas especies del Clado Rufa para tener en cuenta. Hay una importante colección de H. schweinitzii/ Trichoderma citrinoviride distribuídas en el PN El Palmar encontradas durante la época fría. Esta especie tiene distribución en América del Norte y Europa (Samuels et al. 1998, Jaklitsch 2011). Doi (1975) sinonimizó H. ibicuyensis Speg. y H. lenta (Tode) Berk. como H. schweinitzii. Estas especies fueron reportadas por Spegazzini (1912) en Entre Ríos y Buenos Aires.
93 Capítulo I Discusión/ Conclusiones
Hoyos-Carvajal et al. (2009) no aislaron el anamorfo en Colombia y las regiones adyacentes. Debido a que sólo fue hallado en el bosque de El Palmar es probable que tanto el teleomorfo como el anamorfo tengan distribución templada. El paisaje del PN El Palmar presenta características de bosques xéricos y pastizales. En conclusión la distribución del estado teleomórfico es de ambientes templados pero sin distinción entre Hemisferios Norte y Sur. Según lo discutido en el grupo de aislamientos aquí denominados como T. aff. koningii, una de las razones por las cuales no se definió la especie fue la distribución geográfica considerada restringida al Hemisferio Norte por Samuels et al. (2006a). Debido a que se observaron otras diferencias fenotípicas es probable que se trate de una especie nueva cercanamente emparentada a T. koningii que sufrió especiación alopátrica. Los aislamientos agrupados como T. aff. stilbohypoxyli han sido encontrados en suelo y sustrato leñoso, pero lo más relevante es el aislamiento endófito en Pseudotsuga menziensii. T. stilbohypoxyli ha sido descripta sobre ascomicetes lignícolas y como endofito en Theobroma spp. y en Fagus sylvatica. Con distribución conocida en América del Sur y Europa. Samuels et al. (2006a) postulan que T. stilbohypoxyli es una especie de distribución tropical pero que tiene una amplia diversidad genética y que probablemente sea un complejo que contenga más de una especie. Encontraron diferencias entre los aislamientos endofíticos de Theobroma spp. y Fagus sylvatica, lo cual lleva a pensar en diferencias alopátricas. De acuerdo con los datos de la presente tesis se apoya esta hipótesis y se amplía el rango de hábitats conocidos, probablemente, entre las colecciones argentinas haya especies nuevas afines a T. stilbohypoxyli. Los aislamientos identificados como T. gamsii fueron obtenidos de suelos, una de las muestras proviene de rizósfera de plantas de trigo sanas, probablemente tenga buen comportamiento como BCA aunque no ha sido informado hasta ahora. Se confirma que tiene distribución templada aunque Samuels et al. (op. cit.) opinan que es mayormente de clima templado del Hemisferio Norte, consideramos que es de clima templado pero sin distinción entre los hemisferios. T. longibrachiatum se considera cosmopolita aunque más frecuente en sitios tropicales que en templados (Samuels et al. 2012). Fue aislada de suelos y sustratos herbáceos; también es conocido como parásito en seres humanos (Ver en —Interacciones negativas“). Es interesante destacar que las colecciones del teleomorfo, encontrado por primera vez en este estudio, crecen sobre sustratos leñosos de sitio templado (PN El
94 Capítulo I Discusión/ Conclusiones
Palmar), así como los estados anamórficos que fueron aislados de suelos. Por lo tanto, como esta especie se consideró hasta el momento como una agamoespecie, el muestreo presente demostró que su distribución es más amplia de lo que se consideraba hasta el momento y que probablemente el teleomorfo H. longibrachiata tiene distribución restringida en el Hemisferio Sur en climas templados. En este estudio fue hallado un solo ejemplar de T. ovalisporum sobre pecíolo de Butia yatay en El Palmar en otoño, aunque la distribución conocida es tropical. Concuerda con Hoyos-Carvajal et al. (2009) quienes obtuvieron una única cepa entre 183 aislamientos de suelos de Brasil, Ecuador y Panamá. Holmes et al. (2004) estudiaron su comportamiento frente a los patógenos presentes en los sustratos leñosos de los cuales habían sido aislados como endofitos [Banisteriopsis caapi (Spruce ex Griseb.) C.V.Morton] y Theobroma grandiflorum (Willd. ex Spreng.) K. Schum. Llegaron a la conclusión que T. ovalisporum posee potencial biocontrolador. Debido a la falta de más aislamientos y que fue hallado sobre sustrato leñoso en clima templado es posible que la distribución sea un poco más amplia aunque se refuerza su presencia en Sudamérica. T. spirale es conocido como endofito pero también aislado de suelos y de distribución cosmopolita (Jaklitsch, 2009). Los aislamientos argentinos provienen de suelos de distintas localidades lo cual concuerda con las descripciones de la especie. Es interesante destacar que se lo ha encontrado en rizósfera de plantas sanas de trigo, este carácter concuerda con la relación endofítica y posiblemente posea potencial biocontrolador. Dentro del grupo de estromas amarillos y ascosporas verdes H. cremea, H. ceramica y H. catoptron fueron halladas en el PN El Palmar y H. sinuosa en Tucumán todas en estado teleomórfico sobre sustratos leñosos. H. cremea y H. ceramica hasta ahora se conocían de EEUU, H. catoptron no había sido informada en Sudamérica (Chaverri & Samuels, 2003). Para estas especies se confirma su distribución en climas templados y sobre sustratos leñosos. H. sinuosa es cosmopolita y se la encontró sobre sustratos leñosos y suelos (Jaklitsch, 2009), los materiales argentinos concuerdan con estas características. Tres taxones presentaron distribución estrictamente subtropical ya que sólo fueron encontrados en el PN Iguazú: Trichoderma sp. nov. 3, T. parareesei e Hypocrea sp. 1.
95 Capítulo I Discusión/ Conclusiones
En cuanto a los sustratos leñosos se han coleccionado mayor cantidad de especímenes en estado anamórfico que en estado teleomórfico. Se sabe que el estado teleomórfico crece sobre sustrato leñoso en cambio el anamorfo tiene amplia variedad de sustratos incluyendo el suelo (Chaverri & Samuels, 2003). Hyde et al. (2000) mencionan la presencia de H. tawa y H. rufa como especies relacionadas con palmeras, aunque no las describen completamente. Chaverri & Samuels (op. cit.) y Jaklitsch et al. (2006) no revisaron sus colecciones. En las colecciones argentinas se encontraron teleomorfos con aspecto de H. rufa pero no fueron identificados por la falta del estado anamórfico. Las especies H. saccharina, H. andinogelatinosa y H. jecorina estuvieron presentes en Tucumán solamente y sobre sustratos leñosos. H. saccharina es conocida de Cuba, H. jecorina tiene distribución pantropical y H. andinogelatinosa fue propuesta por Doi (1972) a partir de colecciones de Brasil y Colombia. Por lo tanto, estas especies coinciden en su distribución y sustratos con los conocidos. En los muestreos realizados en los Parques Nacionales (Iguazú, El Palmar) y en las Yungas se observó una distribución típica para cada estado. El estado anamórfico fue frecuentemente hallado en sitios húmedos y sombríos, a diferencia del teleomorfo que fue hallado en sitios bien iluminados y bajo radiación solar. Esto no concuerda con lo expresado por Jaklitsch (2009) sobre sus estudios de Hypocrea/ Trichoderma en Europa. El autor opina que los teleomorfos tienen mayor relación con la humedad del ambiente y que suelen aparecer debajo de las hojas y en cambio los anamorfos no presentan diferencias en su distribución. Probablemente estas diferencias se deban al tipo de vegetación y de suelos presentes en Argentina. Otro motivo podría ser la especiación alopátrica de acuerdo con las opiniones de Dodd et al., (2003) quien realizó un estudio evolutivo sobre H. atroviridis/ T. atroviride y explicó que —las evidencias apuntan a la existencia de genes independientes para las morfologías de los anamorfos y teleomorfos que evolucionaron a diferentes velocidades. Los genes de los teleomorfos aparecen más altamente conservados que los genes de los anamorfos. Los genes anamórficos también parecen ser más adaptables a las condiciones ambientales y esto explicaría porque algunos hongos están más ampliamente dispersos en su estado anamórfico mientras que la reproducción sexual está altamente limitada al lugar o al sustrato“.
96 Capítulo I Discusión/ Conclusiones
INTERACCIONES NEGATIVAS DE ESPECIES DEL ESTADO ANAMÌRFICO HYPOCREA/TRICHODERMA
Se argumenta acerca de la importancia de una correcta identificación de las especies del género en los casos de aplicaciones tecnológicas. Schuster & Schmoll (2010) alertan a los científicos sobre los efectos negativos que provocan algunas especies del género, se citan algunos ejemplos a continuación:
1) Interacciones con plantas Se mencionan los tricotecenos con potencial efecto sobre las plantas, ya que provocan clorosis y marchitamiento, estos son productos del metabolismo secundario que producen los géneros de hongos fitopatógenos pero también son sintetizados por el género Trichoderma (Berestetskiy, 2008).
2) Casos clínicos Existen especies del género que son capaces de crecer a altas temperaturas, con óptimos de alrededor de 37°C especialmente las de la Sección Longibrachiatum. Además tienen la capacidad de secretar enzimas extracelulares que degradan tejidos animales. Entre las especies informadas las más comunes son T. longibrachiatum y T. orientalis, dichas especies han sido reportadas a partir de tejidos infectados de pacientes inmunodeprimidos o sometidos a prácticas quirúrgicas. No se han encontrado características filogenéticas diferentes a las de los aislamientos ambientales (Druzhinina et al., 2008). Se hace difícil el tratamiento por la baja susceptibilidad a los antifúngicos conocidos y, por lo tanto, requiere el tratamiento combinado con diferentes drogas (Kratzer et al., 2006). Los autores advierten sobre la práctica común de aplicar microorganismos seleccionados con buena respuesta como BCAs pero sin conocimiento sobre su identidad, lo cual lleva al riesgo sanitario de los trabajadores y el medio ambiente, al liberar una gran cantidad de biomasa de microorganismos potencialmente dañinos.
3) Efectos sobre micorrizas Martínez et al. (2004) encontraron inhibición de la germinación de especies de micorrizas arbusculares por algunos aislamientos saprofíticos de Trichoderma pseudokoningii. Comprobaron que los exudados solubles y volátiles producidos por
97 Capítulo I Discusión/ Conclusiones cepas de T. pseudokoningii inhibieron la germinación de esporas de Gigaspora rosea y Glomus mosseae.
4) Efectos sobre hongos comestibles Se han identificado las especies T. pleurotum y T. pleuroticola que atacan a Pleurotus ostreatus (gírgolas) y T. aggressivum con dos formas especiales: europeae y aggressivum (Samuels et al. 2002). Estas especies han causado importantes pérdidas en las plantas de producción de hongos comestibles. Otras especies (T. harzianum, T. longibrachiatum, T. ghanense, T. asperellum, y T. atroviride) han sido reportadas como causantes de infecciones aunque de colonización menos agresiva (Schuster & Schmoll, (2010).
5) Producción de micotoxinas Se ha informado sobre la producción de micotoxinas como ácido 3- nitropropiónico y ocratoxina A por parte de T. reesei, que es utilizada en industria comestible, aunque de acuerdo con las condiciones de producción con máximos controles estos microorganismos son fácilmente controlables (Blumenthal, 2004).
Es por ello que la identificación de las especies del género Hypocrea/ Trichoderma es crucial para la selección de los aislamientos con mejor comportamiento como BCAs para ser aplicados en el ambiente.
98 Hypomyces aurantius Sphaerostilbella aureonitens Trichoderma PSA 1 Trichoderma PSA 2 Trichoderma 93 BAFC 170 sp. nov. 2 1 BAFC 169 0.1 Trichoderma sp. nov. 3 T. koningiopsis 69 BAFC 166 T. ovalisporum “Large Koningii Branch” T. ovalisporum LKB 1 T. koningii 100 BAFC 1 T. asperellum T. asperellum 95 1 99 BAFC 18 T. hamatum 1 98 1 T. hamatum 1 H. flaviconidia BAFC 203 63 BAFC 205 0.94 BAFC 206 BAFC 204 Sec. 70 H. stilbohypoxyli 0.95 Trichoderma sp. nov. 1 T T. gamsii “Large Viridescens Clade” 96 H. v iridescens/H. vinosa 0.97 LVC 99 BAFC 216 1 H. rufa T.viride/ 100 BAFC 3 BAFC 2 0.83 BAFC 4 BAFC 5 BAFC 7 Subclado 1 BAFC 8 100 BAFC 217 H. atroviridis/ 1 T. atroviride 1 T. atroviride T. atroviride 2 53 BAFC 6 CLADO 1 98 H. lixii 0.63 0.95 99 T. spirale 1 H. cremea 96 BAFC 9 H. cremea/ Subclado 2 94 1 H. chlorospora T. cremeum 0.99 100 H. sinuosa 1 1 H. sinuosa 2 Sec. BAFC 192 PB 94 BAFC 193 H. sinuosa/ 0.57 BAFC 194 T. sinuosum BAFC 209 BAFC 208 T. virens 2 T. virens 100 98 BAFC 210 1 BAFC 211 1 T. virens 1 BAFC 176 BAFC 175 BAFC 174 90 T. saturnisporum T. saturnisporum 0.99 BAFC 172 BAFC 173 BAFC 171 * BAFC 165 0.61 BAFC 163 H. nothoandinensis 92 BAFC 164 0.86 H. andinensis Sec. 0.54* CLADO 2 62 100 H. schweinitzii L 1 100 T. longibrachiatum 0.58 100 1 1 H. orientalis BAFC 167 T. parareesei 100 BAFC 168 1 T. parareesei 2 *1 96 T. parareesei 1 1 T. reesei T. ghanense BAFC 17 T. ghanense Figura 5. Árbol obtenido por análisis Bayesiano a partir de secuencias del gen tef 1 entre los intrones 4 y 5 y exón 6. Los valores de “bootstrap” del análisis de Parsimonia se muestran arriba de las líneas y los de BPP abajo ( los valores menores al 50% no se muestran). Sec. T = Sección Trichoderma; Sec. PB = Sección Pachybasium B; Sec. L= Sec. Longibrachiatum. Los nombres en rojo representan nodos colapsados por contener numerosos aislamientos; se amplían en los siguientes cladogramas denominados Figura 5a, 5b, etc. * Indica que la topología de esas ramas no fue la misma en el análisis de Parsimonia. Figura 5a: Ampliación del LKB dentro del Clado 1 (N° de BAFC PROVISORIOS)
Trichoderma PSA Trichoderma sp. nov. 2
96 H. petersenii 0.87 BAFC 215 Hypocrea sp. 1 95 BAFC 214 0.62 Trichoderma sp. nov. 3 98 98 BAFC 212 1 1 BAFC 213 H. taiwanense BAFC 48 BAFC 28 BAFC 47 BAFC 50 BAFC 46 BAFC 36 BAFC 37 BAFC 35 BAFC 44 BAFC 45 51 BAFC 43 0.59 BAFC 49 BAFC 38 BAFC 31 BAFC 40 BAFC 41 84 T. koningiopsis 1 H. koningiopsis/ T. koningiopsis 0.62 BAFC 39 84 BAFC 30 0.99 BAFC 26 BAFC 34 98 BAFC 32 1 BAFC 54 BAFC 53 BAFC 55 BAFC 27 91 BAFC 56 1 BAFC 57 “Large Koningii Branch” 69 BAFC 58 LKB 1 BAFC 51 BAFC 52 T. koningiopsis 2 BAFC 33 BAFC 29 96 BAFC 166 H. ovalisporum 1 H. ovalisporum BAFC 22 BAFC 19 BAFC 23 BAFC 20 0.1 BAFC 21 T.aff. koningii 99 BAFC 25 1 BAFC 24 T. koningii Figura 5b: Ampliación del LVC dentro del Clado 1. (BAFC N° PROVISORIOS).
BAFC 203 63 BAFC 205 100 T.aff. stilbohypoxyli 0.94 BAFC 206 100 1 BAFC 204 1 T. stilbohypoxyli BAFC 156 BAFC 155 BAFC 161 BAFC 152 BAFC 158 BAFC 153 57 BAFC 159 0.57 BAFC 162 BAFC 160 BAFC 157 Trichoderma sp. nov. 1 70 BAFC 151 97 BAFC 154 0.95 0.87 BAFC 148 BAFC 147 97 BAFC 146 1 BAFC 149 BAFC 150 T. neokoningii 0.74* BAFC 146 71 *1 BAFC 145 0.94 BAFC 12 65 BAFC 13 0.92 BAFC 11 T. gamsii BAFC 10 99 “Large Viridescens Clade” 96 1 BAFC 15 90 LVC 0.97 BAFC 16 0.92 T. gamsii 58 BAFC 14 0.62 BAFC 222 98 98 1 BAFC 223 1 H. viridescens H. vinosa 99 BAFC 216 1 H. rufa T.viride ref./
0.1 Figura 5c: Ampliación del T. atroviride clado colapsadoH. lixii del subclado 2, dentro del clado 1 (BAFC N° BAFC 82 BAFC 88 PROVISORIOS). BAFC 83 BAFC 69 BAFC 71 BAFC 89 BAFC 87 BAFC 90 BAFC 94 BAFC 96 BAFC 92 BAFC 84 BAFC 65 BAFC 64 BAFC 95 0.1 BAFC 60 BAFC 70 BAFC 91 BAFC 86 BAFC 85 BAFC 59 BAFC 63 97 BAFC 76 0.96 BAFC 67 BAFC 93 BAFC 77 H.lixi /T. harzianum BAFC 80 BAFC 81 BAFC 78 H. lixi 1 BAFC 74 BAFC 75 BAFC 110 BAFC 115 BAFC 124 BAFC 129 BAFC 128 BAFC 218 BAFC 113 BAFC 73 BAFC 72 BAFC 125 BAFC 121 98 BAFC 116 0.95 BAFC 219 BAFC 220 BAFC 117 BAFC 123 100 BAFC 119 BAFC 122 1 BAFC 221 BAFC 114 BAFC 112 BAFC 130 BAFC 118 BAFC 131 BAFC 127 BAFC 126 H. lixi 2 BAFC 111 BAFC 61 BAFC 107 Figura 5d. Continuación de la Figura 5c más el clado colapsadoT. spirale (BAFC N° PROVISORIOS).
H.lixii /T. harzianum
BAFC 127 BAFC 126 H. lixii 2 BAFC 111 BAFC 61 BAFC 107 BAFC 62 BAFC 108 BAFC 109 BAFC 103 BAFC 101 BAFC 102 BAFC 100 95 BAFC 98 1 BAFC 99 H. lixii 3 BAFC 104 BAFC 106 BAFC 105 BAFC 97
99 BAFC 197 1 BAFC 198 98 T. spirale BAFC 201 1 BAFC 202 T. spirale 96 BAFC 200 1 BAFC 199 BAFC 195 BAFC 196
H. cremea 100 1 94 H. sinuosa 0.57
0.1
T. virens Figura 5e: Ampliación de los clados colapsadosH. schweinitzii y T. longibrachiatum . * Topología diferente en el análisis de Parsimonia. (BAFC N° PROVISORIOS)
H. nothoandinensis
BAFC 178 BAFC 180 BAFC 177 BAFC 182 BAFC 184 * BAFC 186 0.54 BAFC 190 BAFC 187 BAFC 181 BAFC 188 H. schweinitzii/ BAFC 189 T. citrinoviride 100 BAFC 183 1 BAFC 185 H. schweinitzii/ T. citrinoviride BAFC 179 BAFC191 BAFC 138 BAFC 140 BAFC 142 BAFC 136 BAFC 137 BAFC 141 BAFC 143 H. longibrachiata/ T. longibrachiatum T. longibrachiatum 100 BAFC 135 1 BAFC 132 100 BAFC 139 1 BAFC 133 BAFC 134 H. orientalis
T. parareesei
0.1 T. reesei T. ghanense Figura 6: Arbol obtenido por Análisis de Máxima Parsimonia a partir de secuencias del gen rpb2. Los valores de “bootstrap” se muestran arriba de las líneas y los de BPP abajo (los valores menores al 50% no se muestran). (BAFC N° PROVISORIOS) Sphaerostilbella aureonitens Hypomyces aurantius 100 BAFC 1 T. asperellum T. asperellum Trichoderma 1 99 BAFC 169 Trichoderma PSA sp. nov. 2 90 0.97 BAFC 6 99 BAFC 4 H. atroviridis/ 0.97 58 BAFC 7 T. atroviride 99 BAFC 3 99 T. atroviride 4 T. atroviride 3 BAFC 149 99 BAFC 154 BAFC 161 Clado 1 99 99 99 99 BAFC 162 BAFC 157b 0.99 0.74 (BAFC 19) 99 99 BAFC 150 BAFC 158 99 BAFC 151 99 BAFC 159 BAFC 152 BAFC 153 99 BAFC 147 LVC BAFC 146 1 99 99 BAFC 148 1 99 100 BAFC 144 99 BAFC 145 BAFC 157 99 99 BAFC 156 Secc. 99 BAFC 160 T BAFC 16 BAFC 155 BAFC 15 99 T. gamsii R BAFC T. gamsii 1 99 10 I BAFC13 BAFC12 C H 99 BAFC 206 100 O 99 BAFC 205 T.aff. stilbohypoxyli BAFC 207 D T. stilbohypoxyli E BAFC 20 R 99 99 T. koningii 52 BAFC 25 M 99 BAFC 24 A BAFC 23 99 BAFC 22 LKB BAFC 166 0.99 T. ovalisporum BAFC 213 99 BAFC 215 99 99 80 BAFC 214 0.99 T. taiwanense 50 BAFC 29 T. koningiopsis 99 BAFC 39 99 67 BAFC 26 99 BAFC 51 71 BAFC 34 62 BAFC 48 H. koningiopsis/ BAFC 33 T. koningiopsis T. koningiopsis 62 99 BAFC 30 BAFC 31 BAFC 54 BAFC 53 99 BAFC 55 BAFC 57 BAFC 56 99 BAFC 195 BAFC 196 100 BAFC 198 Subclado 2a 0.97 BAFC 199 100 BAFC 197 T. spirale 0.99 T. spirale Secc. 99 BAFC 202 51 BAFC 201 PACHYBASIUM B BAFC 200 T. virens 3 100 T. virens 4 1 99 BAFC 208 T. virens 99 BAFC 210 BAFC 211 Subclado 2b1 65 100 H. sinuosa H. cremea/ 1 68 BAFC 9 T. cremeum 99 H. cremea * 99 BAFC 164 Clado 2 99 100 BAFC 165 H. nothoandinensis 1 99 BAFC 163 H. andinensis * H. orientalis 100 99 BAFC 133 1 BAFC 136 H. longibrachiata/ 1 99 BAFC 143 T. longibrachiatum Secc. BAFC 141 L BAFC 133b O 99 T. longibrachiatum N 0.90 100 BAFC 175 99 T. saturnisporum T. saturnisporum G 0.99 100 BAFC 173 I BAFC 171 B 99 99 Subclado 2b 100 T. reesei T. parareesei R 0.96 BAFC 167 1 T. parareesei A 99 100 BAFC 17 T. ghanense C 0.55 1 T. ghanense H 99 99 BAFC 182 I 0.97 BAFC 180 A 100 BAFC 178 H. schweinitzii T 1 99 BAFC 187 H. schweinitzii/ U 0.99 BAFC 177 M 99 BAFC 184 T. citrinoviride 100 BAFC 63 BAFC 188 99 1 BAFC 67 BAFC 189 H. lixii 5 BAFC 186 BAFC 107 Subclado 2b2 99 77 BAFC 62 99 BAFC 115 BAFC 109 99 99 BAFC 108 73 BAFC 59 99 BAFC 100 50 0.96 BAFC 102 99 BAFC 103 0.95 BAFC 82 99 H. lixii 4 H. lixii/ T. harzianum 99 BAFC 84 BAFC 96 99 99 BAFC 99 BAFC 102b 1 99 BAFC 81 Secc. 98 99 BAFC 77 PACHYBASIUM B 54 BAFC 91 BAFC 79 99 BAFC 78 BAFC 80 H. lixii 6 BAFC 97 90 99 BAFC 124 0.99 BAFC 111 Fig. 6b: Continuación del árbol 99 BAFC 224 BAFC 218 de MP con secuencias rpb2. BAFC 129 (N° de BAFC PROVISORIOS) BAFC 128 BAFC 112 A B
2 mmmm 2 mmmm
C D
f
10 µm 100 µm
Lámina 1. Hypocrea longibrachiata. A: Estromas sobre sustrato leñoso. B: Detalle: ostíolos oscuros. C: Ascos. D: Corte longitudinal del estroma, pared peritecial hialina (flecha), de “textura angularis”; ostíolos vistos en corte (flechas horizontales). A B
0,50,5 mmmm 1 mm C D
1 mmmm a E
1010 µmµm
F G
1100 1010 µmµm µmµm
Lámina 2. T. longibrachiatum. A: Pústulas sobre raquis foliar de Butia yatay. B: Detalle de pústula. C: Colonia en APG, a: reverso. D: Pústulas de cultivos en SNA. E-F: Conidióforos, fiálides y conidios. G: Conidios. A B
3 mmmm
C 200 µm
D
15 µm
15 µm
Lámina 3. Hypocrea nothoandinensis. Teleomorfo. A: Estromas sobre sustrato leñoso. B: Corte longitudinal a nivel de peritecio mostrando reacción verde en agua en la zona del ostíolo. C: Ascos. D: un asco. A B
C D
1 mmmm 1010 µmµm
E F
10 µm G 10 µm
5 µm
Lámina 4. Hypocrea nothoandinensis. Anamorfo. A: Colonia en APG. B: reverso. C: Detalle de pústulas en SNA. D-F: Conidióforos, fiálides y conidios. G: Conidios. A B
1 mm 0,50,5 mmmm
C D
cav. per. 100 µm
E 150 µm
F 10 µm 10 µm
G 10 µm
Lámina 5. H. schweinitzii. Teleomorfo. A: Estromas sobre sustrato leñoso. B: Detalle visualizando ostíolos. C: Corte longitudinal del estroma en floxina. D: Corte longitudinal a nivel de peritecio mostrando reacción verde en ac. láctico en la zona de ostíolos (flechas; cav. per. = cavidad peritecial; flecha señala pared peritecial). E: Perífisis del ostíolo en floxina (flecha). F-G: Ascos. A a b
B C
10 µm
1 mm
D E
10 µm
10 µm fiálides int.
Lámina 6. H. schweinitzii/T. citrinoviride. A: Colonia en APG, a: reverso, b en APG a 40°C difusión de pigmento amarillo. B-E: Colonias en CMD B: Pústulas. C-E: Conidióforos, fiálides y conidios. E: Fiálides intercalares (flechas). A B B
8 µm C
10 µm
c
6 µm
Lámina 7. T. ghanense. A: Colonia en APG. B: Células conidiógenas. C: Conidióforos. c: Conidios. A 1mm 0,5 mm B
C 1mm D b
c
E F
10 µm
10 µm
Lámina 8. T. parareesei. A: Pústulas in vivo. B: Detalle de pústulas. C: Colonia en APG, c: reverso, b Pústulas en SNA. D: Enfrentamiento entre cepas en APG (flechas señalan puntos de siembra). E: Conidios. F: Conidióforos, fiálides y conidios. A B
1 mm
C D
10µm 1 mmmm
F E 10µm 10µm
f
G H I
4 µm
4 µm 10µm
Lámina 9. Trichoderma saturnisporum. A: Colonia en APG. B-I Cultivo en SNA: B: Pústulas. C: Detalle de pústulas con proyecciones estériles (flechas). D: Proyección estéril en detalle. E: Ramas. F: Conidióforos. G: Células conidiógenas y conidios. H-I: Conidios. A B B B
a
1 mm
C
10µm
f D 10µm
Lámina 10. Hypocrea atroviridis / T. atroviride. A: Colonia en APG, a: reverso. B-D Cultivo en SNA. B: Matas. C: Conidióforos y células conidiógenas. D: Conidios. A B
10µm
1 mmmm
C D 10µm
10µm F E
f 15µm G
10µm 5µm
Lámina 11. Trichoderma gamsii. A: Pústulas in vitro en SNA. B, C, D, E: Conidióforos y fiálides. F: Fiálides percurrentes señaladas en contorno blanco. G: Conidios. A B
2mm
D C
10µm 1mm
E F
10µm
10µm
Lámina 12. T. aff. koningii. A. Colonia en APG. B-C: Detalle de pústulas. D-E: Conidióforos. F: Conidios. A B
2 mm
0,5 mm C D
1 mm
E F
10µm
10µm G H
15µm 5 µm
Lámina 13. T. koningiopsis. A: Pústulas in vivo. B: Colonia en APG. C-D: Pústulas in vitro. E-G: Conidióforos con fiálides. H: Conidios. A B 2 mm
C D 10 µm
0,5 mm E 20 µm
F G H
10 µm
10 µm 10 µm
Lámina 14. Trichoderma sp. nov. 1. A: Colonia en APG. B-C: Pústulas. D-E. Conidióforos. F-G: Conidios. H: clamidosporas. A B
1 mm
C 0,5 mm a
20 µm E F D 20 µm
10 µm
Lámina 15. T. ovalisporum. A: Colonia en APG, a reverso. B: Pústulas. C: Detalle de pústula. D- E: Conidióforos con fiálides. F: Conidios. A B
a
1 mm
C D
20 µm
20 µm
F E 10 µm
10 µm
Lámina 16. T. aff. stilbohypoxyli. A: Colonia en APG, a: reverso de la placa. B: Pústulas. C-E: Ramas conidiógenas. F: fiálides percurrentes. A B 1 mm 0,5 mm
C D E H
20 µm 10 µm 10 µm 10 µm
F G
f
1 mm
I 10 µm J
10 µm
Lámina 17. A-E: Hypocrea sp. Teleomorfo. A: Estromas sobre sustrato leñoso. B: Estromas con cirros blancos (flecha). C: Ascos. D: un asco. E: ascosporas. F-J: Trichoderma sp. nov. 3. Anamorfo. F: Colonia en APG, f reverso. G: Pústulas en SNA. H-J: Conidióforos y células conidiógenas. A B
a
0,5 mm
C D
20 µm 20 µm
E F
20 µm 10 µm
G H 10 µm
10 µm
Lámina 18. Trichoderma sp. nov. 2. A-B: cultivos en APG; C-E; G-H: cultivos en CMD. A: Colonia en APG; a: reverso. B: Pústulas. C: Hifas gruesas. D: Células conidiógenas (flecha señala 1 clamidospora terminal). E: Conidióforos en CMD. F: Conidióforos en SNA. G: Conidios. H: clamidosporas. A 1 mm B 20 µm
C
D
E 20 µm 1 mm
F F10 µm
Lámina 19. Hypocrea cremea/T. cremeum. A: Estroma. B: Ascos. C: Cultivo en APG. D: Pústulas. E: Conidióforos con 1-4 fiálides en verticilos. F: Ascosporas, una germinando (flecha). A B
2 mm 1 mm
C 50 µm D E
100 µm 20 µm
F G
f
20 µm 10 µm
Lámina 20. Hypocrea sinuosa. A: Estromas jóvenes. B: Estromas con cirros de ascosporas verdes. C: Corte longitudinal del estroma en agua, pared peritecial (flechas) castaña. D: Cte. long. en KOH 3% reacción positiva de la pared peritecial virando al color naranja (flecha). E: “Textura angularis” de la epidermis en cte. long. F: Ascos. G: Ascosporas. A B B
a
1 mm
C D f
20 µm 20 µm
F G
E F G f f f
20 µm 20 µm 10 µm
Lámina 21. H. sinuosa/T. sinuosum. A: Colonia en APG, a: reverso. B: Pústulas. C-G: Cultivo en SNA. C: Conidióforos. D-F: proyecciones fértiles terminando en 1 (D, F) o 2 fiálides (f) (flechas). G: Conidios. A 2 mm B
1 mm
C D
0,25 mm 100 µm
E F
10 µm
G
20 µm 10 µm
Lámina 22. Hypocrea catoptron. A-B: Estromas. C: Estroma con cirros de ascosporas oscuras. D: Cte. longitudinal del estroma, mostrando varios ascomas periteciales. E, G: Ascos. F: Excípulo “textura intricata” con células separadas. A D
a
2 mm
E B
2 mm
C 0,5 mm 10 µm F
Lámina 23. T. harzianum. A: Colonia en APG, a reverso. B-C: Pústulas en SNA. D: Pústulas in vivo. E: Conidióforos con fiálides. F: Conidios. A B
1 mm
C E 10 µm
10 µm F
20 µm D
10 µm
Lámina 24. T. virens. A: Colonia en APG. B: Pústulas. C-F: Colonia en SNA. C-D: Conidióforos con fiálides. E- F: Conidios. B A 2 mm 1 mm
C D
1 mm 20 µm
E F G f
20 µm
10 µm
10 µm
Lámina 25. Hypocrea ceramica. A: Estromas B: Estroma con cirros de ascosporas oscuras. C: Estromas. D: Excípulo “textura angularis”. E: ascosporas. F-G: Ascos. A B
2 mm 1 mm
E C F
100 µm
D 100 µm 10 µm 5 µm
G
Lámina 26. Hypocrea melanomagma. A: Estromas. B: Estroma. C-D: Corte longitudinal de estroma con ascomas (flecha). E: Asco. F: ascosporas ornamentadas. G: Corte de un ascoma peritecial. A B
2 mm 0,50,5 mmmm
C
100 µm
D E 10 µm 10 µm
Lámina 27. Hypocrea eucorticioides. A: Estroma efuso. B: Detalle ostíolos. C: Corte longitudinal de estroma con ascomas. E-F: Ascos con ascosporas monomórficas. A B
0,5 cm 2020 mmmm
D C
10 µm 1515 mmmm
E F
G
10 µm 5 µm 2 µm
Lámina 28. H. saccharina. A-F. A-C. Estroma (en C: ostíolos oscurecidos por presencia de ascosporas verdes). D: Ascos. E: ascosporas (note ornamentaciones). F: parte de un asco con ascosporas ornamentadas. G: ascospora con ornamentación en detalle. A B
a
1 mm
C 50 µm D
10 µm
E 10 µm F
f
10 µm
G H I
10 µm 10 µm
Lámina 29. Trichoderma spirale A: Colonia en APG; B-H: Colonia en SNA. A: Aspecto de la colonia; a: reverso de la placa. B: Pústulas. C: Ramas conidiógenas. D, F, H: Detalle de proyecciones estériles. E: Conidióforos y Células conidiógenas. G: Conidios. B C 10 µm A 1 mm
0,5 mm
D 1 mm E 10 µm
F G H
10 µm
1 mm
10 µm
Lámina 30. A-C: H. patella. A-B: Estroma. C: Ascos. D-E: H. andinogelatinosa. D: estromas. E: ascosporas. F-H: H. longipilosa. F: Estromas. G: Ascos. H: ascosporas. A B
2 cm 0,5 mm
C D 10 µm
50 µm
E
10 µm
Lámina 31. Hypocrea aurantiistroma. A: Aspecto general del estroma. B: Detalle: ascomas. C: ascoma peritecial. D: ascos-ascosporas. E: ascosporas, note ornamentación (flecha). A B 1 cm
1 cm C D
2 cm 1 mm
E 1 mm F
10 µm
Lámina 32. A-B: Estroma de H. jecorina. A: Aspecto general . B: Detalle de ostíolos. C-D: Estroma de H. tenuiextensa. C: Aspecto general. D: Detalle de ostíolos. E-F: H. virescentiflava. E: Estromas. F: Ascos con ascosporas ornamentadas. A
B C
10 µm
1 cm
D
2 cm
Lámina 33. H. peltat a . A-C: LPS 1724 holotipo de H. argentinensis Speg. A: sobre original. B: Estroma. C: Ascos. D: LPS 1718 holotipo de H. paraguayensis Speg. A B
2 mm 0,25 mm
C D
20 µm
E
F
Lámina 34. H. pezizaeformis Speg. (Holotipo LPS 1722, Brasil). A. Estromas. B. Estroma detalle de ostíolos. C. Sobre original. D. Ascos. D: notas del Dr. G.J. Samuels. F: sobre original de otra colección LPS 1723 de Chile; material no en buen estado, identificado por Spegazzini como H. atro-virens Montg. También revisado por Dr. Samuels. A B
2 mm 1 mm
C E
0,5 mm
D
10 µm
20 µm
Lámina 35. Hypocrea sp. 2. A: Estromas. B: Estroma con ascosporas en masa oscura sobre los ostíolos. C: Estroma con ascomas más maduros en el centro: ostíolos oscuros (flecha). D: Pared de “Textura angularis”. E: Ascos con ascosporas ornamentadas. Tabla 1. Lista de aislamientos nativos utilizados en el estudio filogenético con secuencias de referencia y grupos externos. Detalles de código, origen, N° Genebank y nombre de colección original (BAFC N° PROVISORIOS).
Cepas nativas Nombre Códigos provisorios Procedencia Códigos de colección N° GeneBank tef1 Códigos USDA T. asperellum Samuels, Lieckf. & Nirenberg BAFC 1 Mendoza Tricho I GJS 08-101 H. atroviridis Dodd, Lieckf. & Samuels / BAFC 2 Entre Ríos EPOT09 35 T. atroviride P. Karst. BAFC 3 Buenos Aires SCOT0908 BAFC 4 Tucumán THM05M BAFC 5 Tucumán THMB01S BAFC 6 Buenos Aires SCOT0909 BAFC 7 Chubut SUR 174 BAFC 217 Buenos Aires BAFC cult 632M GJS 08-186 BAFC 8 Tucumán TLT11 01 H. cremea / T cremeum P. Chaverri & Samuels BAFC 9 Entre Ríos EPVER 27 T. gamsii Samuels & Druzhin. BAFC 10 Santa Fe Tricho D GJS 08-123 BAFC 11 Santa Fe Tricho E GJS 08-109 BAFC 12 Buenos Aires Tricho M GJS 08-130 BAFC 13 Santa Fe Tricho F GJS 08-112 BAFC 14 Entre Ríos Tricho B GJS 08-131 BAFC 15 Córdoba Co31A GJS 08-163 BAFC 16 Córdoba CVM31D GJS 08-153 T. ghanense Yoshim. Doi, J. Abe & Sugiy. BAFC 17 Entre Ríos T-020 GJS 08-114 T. hamatum (Bonord.) Bainier BAFC 18 Buenos Aires Tricho G GJS 08-100 T. aff. koningii BAFC 19 Entre Ríos EPOT09 40 BAFC 20 Entre Ríos EPOT09 14 BAFC 21 Entre Ríos EPOT09 64 BAFC 22 Entre Ríos EPVER 21 BAFC 23 Misiones M4 BAFC 24 Buenos Aires INTA5M BAFC 25 Buenos Aires INTAT3 H. koningiopsis Samuels / BAFC 26 Misiones MPINVE07 T. koningiopsis Samuels, C. Suarez & H.C. Evans BAFC 27 Entre Ríos EPOT09 63 BAFC 28 Entre Ríos EPOT09 23 BAFC 29 Entre Ríos EPVER 14 BAFC 30 Misiones MPINVE 10 (2) BAFC 31 Misiones MPINVE 06 BAFC 32 Entre Ríos EPOT09 27E BAFC 33 Entre Ríos EPVER 20 Tabla 1. Lista de aislamientos nativos utilizados en el estudio filogenético con secuencias de referencia y grupos externos. Detalles de código, origen, N° Genebank y nombre de colección original (BAFC N° PROVISORIOS).
H. koningiopsis Samuels / BAFC 34 Entre Ríos EPOT09 20 T. koningiopsis Samuels, C. Suarez & H.C. Evans BAFC 35 Entre Ríos EPVER 17 BAFC 36 Entre Ríos EPOT09 31 BAFC 37 Entre Ríos EPOT09 50 BAFC 38 Entre Ríos ESP4 BAFC 39 Entre Ríos ER82 BAFC 40 Misiones MPIN0910 bis BAFC 41 Tucumán TLF02S BAFC 42 Entre Ríos EPVER 17 BAFC 43 Entre Ríos ER81 GJS 08-187 BAFC 44 Tucumán THMB02S BAFC 45 Córdoba CL3213 GJS 08-152 BAFC 46 Córdoba CL322 prima BAFC 47 Córdoba CL3212 BAFC 48 Córdoba CL322 BAFC 49 Entre Ríos ER532 GJS 08-162 BAFC 50 Córdoba CL331 BAFC 51 San Luis SLED31A BAFC 52 San Luis SLED32A GJS 08-164 BAFC 53 Buenos Aires SCOT0902 BAFC 54 Buenos Aires SCOT0901 BAFC 55 Buenos Aires SCOT0903 BAFC 56 Entre Ríos ESP5 BAFC 57 Entre Ríos Tricho A GJS 08-107 BAFC 58 Entre Ríos Tricho C GJS 08-124 H. lixii Patouillard / T. harzianum Rifai BAFC 59 Entre Ríos EPOT09 18 BAFC 60 Entre Ríos EPOT09 27 BAFC 61 Entre Ríos EPOT09 10 BAFC 62 Entre Ríos EPOT09 07 BAFC 63 Misiones Pindó 10 BAFC 64 Misiones MPIN 09 04 BAFC 65 Misiones MPIN09 08 BAFC 66 Misiones MPIN09 06 BAFC 67 Misiones MPINVE 16 BAFC 68 Misiones MPINVE 08 BAFC 69 Entre Ríos EPVER 16 Tabla 1. Lista de aislamientos nativos utilizados en el estudio filogenético con secuencias de referencia y grupos externos. Detalles de código, origen, N° Genebank y nombre de colección original (BAFC N° PROVISORIOS).
H. lixii Patouillard / T. harzianum Rifai BAFC 70 Entre Ríos EPVER 22 BAFC 71 Entre Ríos EPVER 24 BAFC 72 Entre Ríos EPVER 28 BAFC 73 Entre Ríos EPVER 12 BAFC 74 Buenos Aires TVB6A GJS 08-172 BAFC 75 Buenos Aires TVB6B GJS 08-173 BAFC 76 Misiones MPIN09 10 BAFC 77 Salta SD Caro BAFC 78 Córdoba CVD92 GJS 08-181 BAFC 79 Córdoba CvD91 BAFC 80 Córdoba CvD93 BAFC 81 Buenos Aires T-003 GJS 08-128 BAFC 82 Misiones AR4803a BAFC 83 Entre Ríos ER231 BAFC 84 Misiones PNI1A GJS 08-183 BAFC 85 Córdoba CVM31A GJS 08-184 BAFC 86 Córdoba CVM31B GJS 08-177 BAFC 87 Entre Ríos ESP3 GJS 08-190 BAFC 88 Buenos Aires SCOT0905 BAFC 89 Misiones PNISOT0904 BAFC 90 Córdoba CVM32B GJS 08-182 BAFC 91 Córdoba CVM32C GJS 08-175 BAFC 92 Misiones PNI1C BAFC 93 BAFC 94 Misiones PNISOT0907 BAFC 95 Misiones PNISOT0908 BAFC 96 Corrientes Tricho H GJS 08-113 BAFC 97 Buenos Aires T1PF BAFC 98 Misiones AR005a BAFC 99 Misiones PNI1B BAFC 100 Misiones PNI122 BAFC 101 Misiones PNISOT0903 BAFC 102/102b Misiones AR004a BAFC 103 Misiones PNI331 BAFC 104 Misiones PNI1D GJS 08-189 BAFC 105 Misiones PNI222 GJS 08-154 Tabla 1. Lista de aislamientos nativos utilizados en el estudio filogenético con secuencias de referencia y grupos externos. Detalles de código, origen, N° Genebank y nombre de colección original (BAFC N° PROVISORIOS).
H. lixii Patouillard / T. harzianum Rifai BAFC 106 Misiones ESP2 GJS 08-180 BAFC 107 Buenos Aires SCOT0904 BAFC 108 Buenos Aires Tricho L GJS 08-121 BAFC 109 Buenos Aires Tricho K GJS 08-102 BAFC 110 Entre Ríos palm8 BAFC 111 Santa Fe SF122 BAFC 112 Buenos Aires T-019 GJS 08-103 BAFC 113 Tucumán THMB031 BAFC 114 Buenos Aires T39 BAFC 115 Entre Ríos EPOT0929 BAFC 116 Tucumán TLF03S BAFC 117 Tucumán TRC01S BAFC 118 Buenos Aires T-012 GJS 08-125 BAFC 119 Tucumán THMA03S BAFC 120 Salta LMcd15 BAFC 121 Tucumán TPT01S BAFC 122 Tucumán THMA01S BAFC 123 Tucumán TRC03S BAFC 124 Buenos Aires INTAS2 BAFC 125 Tucumán TLF04S BAFC 126 Buenos Aires T-017 GJS 08-105 BAFC 127 Buenos Aires T-001 GJS 08-117 BAFC 128 Buenos Aires T-002 GJS 08-120 BAFC 129 Buenos Aires T3PF BAFC 130 Buenos Aires T-005 GJS 08-106 BAFC 131 Córdoba CVD9321 GJS 08-161 BAFC 218 Buenos Aires T-009 GJS 08-110 BAFC 219 Tucumán TSJ01S BAFC 220 Tucumán TSJ02S BAFC 221 Salta LMcd5 BAFC 224 Tucumán T-022 H. longibrachiata / BAFC 132 Entre Ríos EPOT09 52 JN688269 T. longibrachiatum Rifai BAFC 133/133b Entre Ríos EPOT09 64E JN688272 BAFC 134 Entre Ríos EPOT09 52E JN688270 BAFC 135 Entre Ríos EPOT09 60 JN688271 BAFC 136 Misiones MPINVE15 JN688266 Tabla 1. Lista de aislamientos nativos utilizados en el estudio filogenético con secuencias de referencia y grupos externos. Detalles de código, origen, N° Genebank y nombre de colección original (BAFC N° PROVISORIOS).
H. longibrachiata / T. longibrachiatum Rifai BAFC 137 Misiones MPINVE 11 JN688268 BAFC 138 Misiones MPINVE 13 JN688267 BAFC 139 Entre Ríos ER432 GJS 08-119 BAFC 140 Santa Fe SF222 BAFC 141 Santa Fe SF521 BAFC 142 Entre Ríos ER431 BAFC 143 Entre Ríos ER431 GJS 08-104 Trichoderma sp. nov. 1 BAFC 144 Buenos Aires INTAT2 BAFC 145 * Misiones M6 * ampliación de T. neokoningii ? BAFC 146 * Misiones MPAL0902 BAFC 147 Entre Ríos Palm7 BAFC 148 Entre Ríos EPVER23 BAFC 149 * Misiones M5 BAFC 150 * Misiones M7 BAFC 151 Misiones M1 BAFC 152 Entre Ríos EPOT0916 BAFC 153 Entre Ríos EPOT0922 BAFC 154 Misiones M8 BAFC 155 Entre Ríos EPINV 10 BAFC 156 Entre Ríos EPVER 13 BAFC 157/157b Misiones M3 BAFC 158 Entre Ríos EPOT09 11 BAFC 159 Entre Ríos EPOT09 24 BAFC 160 Entre Ríos EPOT09 49 BAFC 161 Entre Ríos EPVER 25 BAFC 162 Entre Ríos EPOT09 34 H. nothoandinensis Barrera, Capdet & A.I. Romero BAFC 163 Entre Ríos EPOT09 68E BAFC 164 Entre Ríos EPOT09 37E BAFC 165 Misiones AR4805a T. ovalisporum Samuels & Schroers BAFC 166 Entre Ríos EPOT09 09 T. parareesei Jaklitsch, Druzhin. & Atanasova BAFC 167 Misiones MPINVE03 BAFC 168 Misiones MPINVE05 Trichoderma sp. nov. 2 BAFC 169 Entre Ríos EPOT0937 BAFC 170 Misiones M5c Tabla 1. Lista de aislamientos nativos utilizados en el estudio filogenético con secuencias de referencia y grupos externos. Detalles de código, origen, N° Genebank y nombre de colección original (BAFC N° PROVISORIOS).
T. saturnisporum Hammill. BAFC 171 Catamarca ET1025 BAFC 172 Catamarca ET1019 BAFC 173 Catamarca ET0722 BAFC 174 Catamarca ET0352 BAFC 175 Catamarca ET0541 BAFC 176 Catamarca ET0324 H. schweinitzii (Fr.) Saccardo / T. citrinoviride Bissett BAFC 177 Entre Ríos EPINV 15 BAFC 178 Entre Ríos EPINV 16 BAFC 179 Entre Ríos EPINV 19 BAFC 180 Entre Ríos EPINV 23 BAFC 181 Entre Ríos EPINV 08 BAFC 182 Entre Ríos EPINV 18 BAFC 183 Entre Ríos EPINV 21 BAFC 184 Entre Ríos EPINV 11 BAFC 185 Entre Ríos EPINV 12 BAFC 186 Entre Ríos EPINV 07 BAFC 187 Entre Ríos EPOT09 38 BAFC 188 Entre Ríos EPOT09 42E BAFC 189 Entre Ríos EPOT09 66E BAFC 190 Entre Ríos EPOT09 33 BAFC 191 Buenos Aires T8PF H. sinuosa / T. sinuosum P. Chaverri & Samuels BAFC 192 Tucumán TLF11 01 BAFC 193 Tucumán THM1104M BAFC 194 Tucumán THM1104 T. spirale Bissett BAFC 195 Santa Fe Raíces R2 BAFC 196 Córdoba CL3211 BAFC 197 Misiones PNI221 BAFC 198 Misiones PNISOT0906 BAFC 199 Misiones PNISOT0909 BAFC 200 Misiones PNISOT0905 BAFC 201 Misiones PNISOT0901 BAFC 202 Misiones PNISOT0902 T. aff. stilbohypoxyli BAFC 203 Misiones AR4819a BAFC 204 Entre Ríos ER332 GJS 08-122 BAFC 205 Entre Ríos ER32 BAFC 206 Entre Ríos ER331 GJS 08-129 Tabla 1. Lista de aislamientos nativos utilizados en el estudio filogenético con secuencias de referencia y grupos externos. Detalles de código, origen, N° Genebank y nombre de colección original (BAFC N° PROVISORIOS).
T. aff. stilbohypoxyli BAFC 207 Chubut SUR 146 H. virens / T. virens P. Chaverri, Samuels & E. L. Stewart BAFC 208 Entre Ríos EPOT09 40 E BAFC 209 Entre Ríos EPOT09 47 BAFC 210 Buenos Aires T4PF BAFC 211 Buenos Aires T6PF Trichoderma sp. nov. 3 BAFC 212 Entre Ríos MPIN09 09 BAFC 213 Entre Ríos MPIN09 03 BAFC 214 Misiones MPINVE 20 Sin identificar BAFC 215 Misiones AR4803 BAFC 216 Tucumán TSJ05S BAFC 222 Chubut SUR 146 BAFC 223 Tucumán TSJ02M
rojo = tef +rpb2
Cepas de referencia N° acceso GeneBank Especie Nombre Procedencia tef1 rpb2 H. andinensis Samuels & O. Petrini DAOM 220821 Colombia EU280042 GJS 09-62 Perú JN133559 T. asperellum Samuels, Lieckf. & Nirenberg GJS 02-64 Camerún EF186002 FJ150789 H. atroviridis Dodd, Lieckf. & Samuels 1 GJS 95-10 s/d AF348114 H. atroviridis 2 GJS 98-8 Francia DQ307545 H. atroviridis 3 CBS 119499 s/d FJ860518 H. atroviridis 4 DAOM 222144 Canadá FJ442754 H. cremea P. Chaverri & Samuels s/d EEUU AY737736 GJS 91-125 s/d AF545511 H. chlorospora Berk. & M. A. Curtis GJS 98-1 Costa Rica AY737737 H. flaviconidia Chaverri, Druzhin. & Samuels s/d Costa Rica DQ020001 T. gamsii Samuels & Druzhin. JB GS33 s/d DQ845425 GJS 04-09 EEUU JN133561 T. ghanense Yoshim. Doi, J. Abe & Sugiy. GJS 08-114 Argentina JN175606 JN175561 T. hamatum (Bonord.) Bainier GJS 04-203 Suiza EU883565 Tabla 1. Lista de aislamientos nativos utilizados en el estudio filogenético con secuencias de referencia y grupos externos. Detalles de código, origen, N° Genebank y nombre de colección original (BAFC N° PROVISORIOS).
H. jecorina Berk. & Broome / T. reesei E.G. Simmons GJS 88-6 Brasil GQ354362 GJS 04-115 Vietnam JN175553 H. koningii Oudem. CBS 457.96 Holanda AF456909 GJS 00-168 EEUU FJ442761 T. koningiopsis Samuels, C. Suarez & H.C. Evans 1 GJS 04-319 Perú FJ463270 T. koningiopsis 2 GJS 93-20 Cuba DQ284966 T. koningiopsis 3 GJS 04-199 Perú FJ442789 T. koningiopsis 4 GJS 97-273 Alemania FJ442795 H. lixii Patouillard/ T. harzianum Rifai 1 CIB T23 Colombia EU279989 H. lixii 2 GJS 04-02 EEUU FJ463401 H. lixii 3 DIS 94D Perú FJ463379 H. lixii 4 GJS 94-53 EEUU FJ442776 H. lixii 5 GJS 98-183 Austria FJ442777 H. lixii 6 GJS 04-212 Italia FJ442767 T. longibrachiatum Rifai GJS 04-31 Mexico DQ297069 GJS 07-21 Ghana JN175513 T. neokoningii Samuels & Soberanis GJS 04-216 Perú DQ841718 H. orientalis Samuels & O. Petrini CBS 243.63 Nueva Zelanda AY937421 GJS 10-230 Brasil JN175523 H. ovalisporum Samuels & Schroers Dis 70a Ecuador AY376037 FJ442742 T. parareesei Jaklitsch, Druzhin. & Atanasova 1 TUB F-1066 Mexico GQ354353 T. parareesei 2 TUB F-733 Argentina GQ354352 GJS 04-93 Vietnam JN175554 T. petersenii Samuels, Dodd & Schroers GJS 38-139 Francia DQ288998 GJS 04-164 EEUU FJ442783 Trichoderma PSA 1 GJS 99-191 Australia DQ307532 Trichoderma PSA 2 GJS 99-204 Nueva Zelanda DQ307531 Trichoderma PSA GJS 99-127 Australia FJ442702 GJS 99-86 Australia EU241497 H. rufa (Pers. : Fr.) Fr. / T. viride Pers. GJS 04-216 Perú DQ841718 Tabla 1. Lista de aislamientos nativos utilizados en el estudio filogenético con secuencias de referencia y grupos externos. Detalles de código, origen, N° Genebank y nombre de colección original (BAFC N° PROVISORIOS).
GJS 92-14 Nueva Zelanda DQ288988 T. saturnisporum Hammill. ATCC 28023 EEUU JN388897 GJS 99-17 Japón JN175525 H. schweinitzii (Fr.) Saccardo / T. citrinoviride Bissett DAOM 139758 Canadá EU338334 GJS 01-18 Rusia JN175542 H. sinuosa / T. sinuosum P. Chaverri & Samuels 1 PC 8 EEUU AY737743 H. sinuosa 2 CPK 2008 Europa FJ860698 H. stilbohypoxyli Samuels & Schroers CBS 992.97 Puerto Rico DQ109546 GJS 96-32 Puerto Rico EU241501 T. spirale Bissett CBS 120963 Turquía FJ463291 Dis 151E Costa Rica FJ442766 H. surrotunda P. Chaverri & Samuels GJS 88-73 USA AY737734 H. taiwanense / T. taiwanense Samuels & L.M. Wu 1 GJS 95-93 Taiwan DQ284973 H. taiwanense 2 GJS 95-93 Taiwan DQ284973 CPK 416 Singapur JN715608 H. vinosa Cooke GJS 99-183 Australia DQ841719 H. virens / T. virens P. Chaverri, Samuels & E.L. Stewart1 GJS 95-80 Holanda FJ463365 H. virens 2 GJS 06-114 Camerún FJ463364 GJS 01-287 Costa de Marfil EU341804 H. viridescens Jaklitsch & Samuels GJS 98-86 Mexico DQ307509 EU241497
Grupo externo ("outgroup") Hypomyces aurantius Plowr. ex Mussat GJS 74-69 Nueva Zelanda s/d FJ442744 Sphaerostilbella aureonitens (Tul. & C. Tul.) Seifert, Samuels & W. Gams GJS 74-87 Nueva Zelanda FJ467644 FJ442763 Tabla 2. Colecciones sobre sustratos leñosos. Clasificadas por estado teleomórfico y anamórfico.
Provincia Localidad Fecha Anamorfo Teleomorfo
Buenos Aires Saladillo * Abril 2007 1 Santa Catalina Abril 2010 19 Hurlingham (INTA) Mayo 2010 5 1
Chubut Epuyen Septiembre 2009 3
Esquel Septiembre 2009 5
Entre Ríos P.N. El Palmar Abril 2008 4 Agosto 2008 1 19 Febrero 2009 14 Abril 2009 43 35
Concepción del Uruguay* Mayo 2008 3
Misiones P.N. Iguazú Mayo 2008 4 Enero 2009 20 Abril 2009 5 Junio 2009 11 3 Abril 2011 5 8
Neuquén P.N. Lanín Mayo 2009 1
Abra Ancha Mayo 2009 1
Tucumán Horco Molle Mayo 2009 7 2 Abril 2011 4
San Javier Mayo 2009 4 1
La Florida Mayo 2009 3 Abril 2011 2
Río Cochuna Mayo 2009 2 2
Potrero de las Tablas Mayo 2009 1 Abril 2011 1
* muestras aisladas como endofitos de raíces
subtotales colecciones 161 79
N° total colecciones sustratos leñosos 240 Tabla 3. Colecciones aisladas de muestras de suelos. Clasificadas por tipo de suelo: cultivado, no cultivado y de reserva.
Provincia Localidad Fecha Cultivado No cultivado Reserva
Buenos Aires Bahía Blanca Mayo 2009 3 La Plata Abril 2009 1 8 Castelar Mayo 2010 5 San Pedro Junio 2009 2
Catamarca Catamarca Enero 2009 5
Córdoba Villa Dolores Junio 2008 5 Laboulaye Junio 2008 6 Oncativo Junio 2008 1 Villa María Junio 2008 6
Corrientes Las Marías Septiembre 2008 1
Entre Ríos P.N. El Palmar Abril 2008 8
Mendoza Mendoza Mayo 2008 2
Misiones P.N. Iguazú Mayo 2008 12 Junio 2009 9
San Luis El Durazno Junio 2008 2
Santa Fe Suardi Mayo 2008 3 Colonia Ana Mayo 2008 1
Tucumán San Javier Mayo 2009 5 Horco Molle Mayo 2009 6 Río Cochuna Mayo 2009 3 La Florida Mayo 2009 4 Potrero de las Tablas Mayo 2009 3
Cultivado No cultivado Reserva Subtotales de colecciones 6 48 47 Total de colecciones de suelos 101 Tabla 4. Lista de taxones reconocidos de acuerdo a Druzhinina Kubicek (2005), con una subclasificación de la Sección Trichoderma de acuerdo con Samuels et al. (2006) y Jaklitsch et al. (2006).
1 Sección Clado Anamorfo Teleomorfo Subclasificación Longibrachiatum T. longibrachiatum H. longibrachiata T. nothoandinensis H. nothoandinensis T. citrinoviride H. schweinitzii T. ghanense T. parareesei H. patella H. peltata H. jecorina T. saturnisporum Trichoderma Rufa T. ovalisporum LKB Trichoderma sp. nov. 3 LKB T. koningiopsis LKB T. aff koningii LKB T. aff stilboxypoxyli LKB T. gamsii LVC T. atroviride LVC Trichoderma sp. nov. 1 LVC H.rufa LVC T. viridescens LVC Pachybasium A T. asperellum T. hamatum Trichoderma sp. nov. 2 Pachybasium B Hypocreanum H. aurantiistroma* Tabla 4. Lista de taxones reconocidos de acuerdo a Druzhinina Kubicek (2005), con una subclasificación de la Sección Trichoderma de acuerdo con Samuels et al. (2006) y Jaklitsch et al. (2006).
H. eucorticioides Chlorospora T. cremeum H. cremea T. sinuosa H. sinuosa H. virescentiflava Lixii/catoptron H. catoptron T. harzianum H. lixii Virens T. virens Ceramica H. ceramica Lutea H. melanomagna "Lone lineages" 2 H. saccharina T. spirale H. andinogelatinosa H. pezizaeformis H. longipilosa H. tenuiextensa
* esta especie no fue agrupada en un clado por Overton et al . (2006)
1 Subclasificación basada en los grupos LKB "Large Koningii Branch" Samuels et al . (2006a) y LVC "Large Viridescens Clade" Jaklitsch et al . (2006).
2 Especies no clasificadas filogenéticamente (Druzhinina & Kubicek, 2005). Tabla 5. Estado actual de los tipos de Spegazzini depositados en el LPS
N° LPS nombre original año descripción nombre de acuerdo con Index Fungorum sinónimos referencia opinión de esta tesis y distribución
1725 Hypocrea puiggari 1881, Brasil no figura no tiene no tiene La estructura del estroma de este ejemplar no corresponde con el género Hypocrea
29420 H. platensis var. microsperma 1925, Córdoba Amplistroma xylarioides (Pat.) Huhndorf & Samuels Huhndorf et al. (2009) El material está en mal estado, H. xylarioides Doi (1975) no se pudieron observar los ascos y en los dibujos de Spegazzini no se observan los largos cuellos de los peritecios que caracterizan al género Amplistroma . Fue observado por Doi en 1975 y opinó que podía ser sinónimo deH. xylariorides Se requiere una nueva colección.
12724 Trichoderma cordobense 1925, Córdoba aceptado en el Index Fungorum Spegazzini (1926) El material no pudo ser observado porque está preservado en forma de cultivo seco. Los dibujos del sobre tienen parecido con conidióforos del tipo Hypocreanum o Gliocladium.
1724 H. argentinensis 1905, Jujuy H. peltata ( Jungh.) Berk Samuels & Ismaiel (2011) El aspecto del estroma en los dos materiales 1718 H. paraguayensis 1919, Paraguay H. peltata ( Jungh.) Berk Samuels & Ismaiel (2011) es similar y hay coincidencia con lo observado por los autores mencionados.
1720 H. ibicuyensis 1911, Entre Ríos H. schweinitzii (Fr.) Sacc. Doi (1975) Coincide con el concepto de Doi (1975), H. lenta por lo tanto, se confirma la especie. Tabla 5. Estado actual de los tipos de Spegazzini depositados en el LPS
N° LPS nombre original año descripción nombre de acuerdo con Index Fungorum sinónimos referencia opinión de esta tesis y distribución
1719 H. corticioides 1911, Entre Ríos H. eucorticioides Overton Overton et al . (2006) Hay acuerdo con el nuevo nombre propuesto por los autores debido a que se trataba de un sinónimo posterior a H. corticioides Berkeley & Broome (1873).
1726 H. virescentiflava Brasil, 1888 H. sulfurella Kalchbr. & Cooke Doi (1975) Se coincide con Chaverri & Samuels (2003) H. catoptron Chaverri & Samuels (2003)
1722 H. pezizaeformis Brasil, 1883 no figura H. fulvisata Este ejemplar fue revisado por GJ Samuels en 1994 y opinó que se trata de H. fulvisata las medidas de las ascosporas son menores opino que se trata de una especie válida y distinta.
1721 H. platensis La Plata, 1899 no figura La muestra contiene 2 estromas inmaduros, no se observaron ascos ni ascosporas no se puede verificar la identificación de esta especie. Tabla 5. Estado actual de los tipos de Spegazzini depositados en el LPS Tabla 6. Tasa de crecimiento Medida del radio de la colonia (en mm) medidos a las 72 h
APG SNA Sección Clado Especie 25°C 35°C 25°C 35°C Longibrachiatum T. longibrachiatum 60-65 60-65 22-35 20-56 H. nothoandinensis 45-62 60-64 25-58 31-72 H. schweinitzii 50-62 62-66 6-38 14-21 T. ghanense 59-64 63-64 38-48 33-45 T. parareesei 61-65 62-64 16-26 20-23 T. saturnisporum 54-67 57-67 15-40 21-52 Trichoderma Rufa H. atroviridis 51-65 1-3 16-37 0-3 T. gamsii 38-58 0 25-44 0 T. aff. koningii 53-63 42-63 15-50 15-39 T. koningiopsis 45-64 0 25-42 0 Trichoderma sp. nov. 1 50-65 9-17 15-37 0-6 T. ovalisporum 53-60 13-19 19-40 6-10 T. stilboxypoxyli 31-67 0 7-45 0 Hypocrea sp. nov. 53-60 41-52 24-56 16-43 Pachybasium A T. asperellum 48-50 11-15 37-43 8-11 T. hamatum 52-60 0 35-36 0 Trichoderma sp. nov. 2 47-62 0-3 30-36 0-1 Pachybasium B Chlorospora H. cremea 44-54 0-1 16-45 0-2 H. sinuosa s/d s/d s/d s/d Lixii/catoptron H. lixii 45-60 15-52 19-52 10-27 Virens H. virens 60-63 31-60 15-36 11-20 "Lone lineages" T. spirale 39-62 13-52 23-45 6-15 Capítulo I f rencias
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106 Capítulo II Introducción
Características del estado anamórfico Trichoderma
El estado anamórfico Trichoderma Pers. se desarrolla saprofíticamente y tiene capacidad para vivir en distintos tipos de sustratos. Algunas especies son micoparásitos y tienen la capacidad de degradar compuestos celulares de otros hongos del suelo. Weindling (1932) publicó por primera vez acerca del comportamiento parasítico de una cepa de T. lignorum (actualmente T. virens) sobre otros hongos. A partir de entonces, a través de numerosas publicaciones, se describieron los diversos mecanismos involucrados en el antagonismo ejercido por cepas del estado anamórfico Trichoderma. Con los últimos avances en relación con la secuenciación del genoma de H. atroviridis/ T. atroviride y H. virens/ T. virens su comparación con los correspondientes a animales y plantas se ha elaborado la hipótesis que las especies del estado anamórfico Trichoderma han evolucionado a partir de la micotrofía, es decir, creciendo como saprófíto sobre estructuras fúngicas (ascocarpos y basidiocarpos), y micoparasitismo hacia una combinación de ambos frente a una oportunidad ambiental (Druzhinina et al., 2011).
Productos del metabolismo secundario en el estado anamórfico Trichoderma de interés en el control biológico de emfermedades causadas por hongos fitopatógenos
En la actualidad es bien conocido que existen cepas de Trichoderma spp. con capacidad de producir numerosos metabolitos secundarios (MS) como las enzimas extracelulares para competir por los recursos en el suelo o colonizar las raíces de las plantas sin dañar los tejidos vegetales, degradando las paredes celulares de otros hongos. Esta capacidad es aprovechada por los investigadores para controlar la presencia de hongos fitopatógenos en el suelo. Se conocen más de 100 compuestos producidos por especies del estado anamórfico Trichoderma, entre los cuales se incluyen sustancias no polares de bajo peso molecular como pironas, terpenoides, esteroides y policétidos (Sivasithamparam & Ghisalberti, 1998). Es conocido el efecto de algunas cepas en la promoción del crecimiento de las plantas, aunque, en la búsqueda del efecto biocontrolador se observó que hay participación de varios de los mecanismos descriptos que pueden actuar en simultáneo (Howell, 2003). Kubicek et al. (2001) aislaron y secuenciaron un grupo de enzimas degradadoras de la pared celular (CWDEs —Cell Wall Degrading Enzymes“) producidas por cepas de T. harzianum, con funciones hidrolíticas sobre la pared celular de otros microorganismos
1 Capítulo II Introducción fúngicos. Estas enzimas se reconocieron como quitinasas, celulasas, glucanasas y proteasas (Ait-Lahsen et al., 2001 y de la Cruz & Llobell, 1999). Otros MS de interés son los antibióticos que fueron descubiertos por Weindling en 1934, quien extrajo un compuesto con acción tóxica sobre Rhizoctonia solani y Sclerotinia americana, al cual lo denominó gliotoxina porque en ese momento el microorganismo que lo producía se conocía como Gliocladium virens (actualmente Trichoderma virens). Posteriormente Howell & Stipanovic (1983) aislaron un nuevo compuesto antibiótico al que denominaron gliovirina con efecto contra Pythium ultimum y Phytophthora spp. aunque sin efecto sobre R. solani, entre otros. Dentro de la especie T. virens se reconocieron dos grupos en base a la producción de antibióticos, el grupo ”P‘ produce gliovirina y ácido heptelídico pero no gliotoxina ni dimetilgliotoxina. Por el contrario, el grupo ”Q‘ produce gliotoxina y dimetilgliotoxina pero no las del grupo ”P‘. Las cepas de ambos grupos producen otros antibióticos como viridina y fitotoxina viridiol. (Howell et al., 1993) Otra característica importante es la capacidad que tienen ciertas cepas de Trichoderma spp. para producir un grupo de péptidos anfipáticos, no-ribosomales ricos en ácido - aminoisobutírico, no proteinogénicos, formados por 5 a 20 residuos de aminoácidos, terminados en un grupo alcohol. Estos compuestos se conocen como peptaiboles y tienen actividad antibiótica contra hongos y bacterias. En los últimos años el estudio de la proteómica en combinación con los análisis filogenéticos permitió desarrollar la quimiotaxonomía del grupo (Degenkolb et al., 2008). Se encontró además que las cepas de Trichoderma spp. son más resistentes que la mayoría de los hongos a compuestos tóxicos como fungicidas químicos y a compuestos antimicrobianos producidos por microorganismos del suelo y plantas. El motivo de esta resistencia tiene relación con la presencia de transportadores ABC, permeasas ATP- dependientes, que permiten el pasaje de sustancias evitando así la acumulación de toxinas en el interior de las células (Harman et al., 2004).
Estudios genómicos en Trichoderma spp.
En la última década se conformó un consorcio de grupos de trabajo de distintos países europeos con el fin de conducir la secuenciación del genoma. Esta misión fue encabezada por el —U.S. Department of Energy Joint Genome Institute“ con el fin de obtener la secuencia
2 Capítulo II Introducción completa del genoma de T. reesei, posteriormente se amplió a los genomas de T. atroviride y T. virens. Parte de los resultados se pueden consultar en el sitio web http://genome.jgi-psf.org. Con el estudio de los genomas de las 3 especies antes mencionadas se conoció que los genes que codifican para los MS, aparecen en grupos (—clusters“). Estos genes no se expresan bajo las condiciones estándar de laboratorio y deben ser estimulados como ocurre en el caso de los sideróforos (compuestos quelantes del hierro), los cuales son sintetizados en respuesta a una disminución en las concentraciones de hierro (Mukherjee et al., 2012).
Aplicaciones de las enzimas en la industria
Entre las especies de mayor interés por poseer gran capacidad de producción de celulasas y hemicelulasas se encuentra T. reesei (anamorfo de H. jecorina). Estas enzimas son aplicadas en la degradación de compuestos complejos a azúcares simples, los que son de gran utilidad en la industria del papel (Buchert et. al, 1998). Martínez et al. (2008) publicaron resultados parciales de las investigaciones realizadas en el estudio del genoma de T. reesei. Al contrario de lo esperado hallaron que dicha especie contiene un menor número de genes de celulasas y hemicelulasas en comparación con otros hongos con capacidad de degradar paredes celulares de las plantas. Actualmente son de vital interés las investigaciones dirigidas a la búsqueda de biocombustibles. Como consecuencia, surgió una disciplina denominada Biorefinería que busca métodos para convertir biopolímeros, como la celulosa, en azúcares simples para producir biocombustibles empleando microorganismos. Para incrementar el volumen de producción de las sustancias de interés los microorganismos deben ser mejorados para alcanzar la escala industrial. Es por ello que las enzimas producidas por T. reesei son intensamente analizadas con el fin de lograr un mayor rendimiento de producción a dicha escala [Ej. GC 626 amilasa ácida estable, STARGEN™ 002 mezcla de amilasas optimizada para hidrolizar almidón granular y FERMGEN™ proteasa ácida fúngica, estos productos son derivados de una cepa de T. reesei modificada genéticamente de la empresa GENENCOR (Danisco)] (Mathew et al., 2008).
Interacciones con plantas
La explotación de la capacidad biocontroladora del estado anamórfico Trichoderma llevó al desarrollo de fórmulas para ser aplicadas como reemplazo de fungicidas químicos y
3 Capítulo II Introducción disminuir la contaminación de suelos. Las formulaciones (Rhodes & Jones, 1993) están compuestas por altas concentraciones de conidios y biomasa en el orden de 106 a 108 cfu/g suelo ó 107 a 108 cfu/g semillas, solos o combinados con otros microorganismos (Paikray & Malik, patente 20120015806, 2012). Es por ello que actualmente existen en el mercado más de 20 productos en base a formulaciones sólidas de T. harzianum, T. virens, T. viride, T. koningii y T. parceramosum (Ej. Rootshield, Trichodex, TrichoFlow, TrichoNativa, entre otros) con fórmulas provenientes de EEUU, Francia, Bélgica, Dinamarca, Israel, etc. (Cumagun, 2012). (Se denomina formulaciones a los procesos o mecanismos que dirven para mantener a los microorganismos viables por un largo período de tiempo (18 meses) sin modificar sus características). En la Argentina, hay un solo producto registrado en el Listado de Fertilizantes (hasta mayo 2012, SENASA) denominado —Plant Shield HC“ registrado como fertilizante biológico, en formulado sólido, compuesto por la cepa T. harzianum T-22 (EEUU). Se están llevando a cabo investigaciones relacionadas con el estudio de los fenómenos de ISR ejercidos por cepas de Trichoderma en plantas. Por ejemplo, se ha observado que las plantas en contacto con la cepa de T. virens denominada G-6 inducen la producción de fitoalexinas fungitóxicas en algodón. Por otra parte, T. asperellum T-203 provocó la producción de compuestos antifúngicos en hojas al ser aplicado en raíces de zapallo. También se han encontrado compuestos homólogos a genes de avirulencia (Avr) que actuarían como elicitores induciendo respuestas hipersensibles en cultivares de plantas con el correspondiente gen de resistencia. Entre las interacciones negativas con plantas se menciona un terpenoide producido por T. brevicompactum, llamado tricodermina, que es altamente fungitóxico y fitotóxico (Harman et al., 2004). La inserción de genes de Trichoderma en plantas comenzó con el gen de la endoquitinasa ech42 de T. harzianum en plantas de tabaco y tomate, que mostraron alta tolerancia o resistencia completa a los hongos patógenos Alternaria alternata, A. solani, Botrytis cinerea y Rhizoctonia solani (Hermosa et al., 2012).
Identificación de las especies en base a caracteres fisiológicos
Los esfuerzos para lograr una identificación precisa y la necesidad de conocer los mecanismos involucrados en el control biológico guiaron las investigaciones hacia estudios intensivos de sus sistemas enzimáticos. Una de las primeras investigaciones en este campo fue publicada por Stasz et al. (1989) quien realizó un análisis fenético de un grupo de isoenzimas
4 Capítulo II Introducción con el cual lograron establecer relaciones filogenéticas entre T. harzianum, T. koningii, T. viride y T. hamatum. Por otra parte, un estudio extensivo sobre la utilización de distintas fuentes de C y N se puede realizar por medio del sistema BIOLOG (Classen et al., 2006). Este sistema ha sido diseñado para la identificación de numerosas especies fúngicas y bacterianas por medio de la estimación de la actividad mitocondrial con 95 fuentes de C. Con los datos obtenidos se elabora un perfil metabólico de la cepa en cuestión y se compara con los perfiles registrados para cada especie en las bases de datos propias del sistema. Para el estudio de hongos se utilizan microplacas FF con 95 fuentes de carbono distintas adicionadas con violeta de iodonitrotetrazolio. Este compuesto, adherido al sustrato, vira al color rojo en presencia del
CO2 liberado por la respiración celular del microorganismo sembrado en las cúpulas de la microplaca. Esta técnica permite la caracterización de aislamientos sobre la base del perfil de asimilación de las distintas fuentes de C. Kubicek et al. (2003) al analizar los perfiles metabólicos obtenidos en microplacas FF de BIOLOG y combinando las secuencias de ITS 1 y 2 identificaron 11 especies y encontraron que el agrupamiento obtenido no se corresponde entre los caracteres mencionados para con las especies de T. harzianum, lo que indica que este es un grupo con alta diversidad metabólica. El sistema BIOLOG también sirve para analizar patrones de utilización de fuentes de C generando perfiles fenotípicos de modos de nutrición. Druzhinina et al. (2006) compararon el comportamiento nutricional de cepas de H. jecorina salvajes y mutantes para la producción de celulasas utilizando microplacas BIOLOG FF. Para ello estudiaron la estimación de la biomasa micelial con la lectura a 750 nm, y generaron un gradiente de fuentes presentes en los pocillos con capacidad creciente de producir biomasa, quedando el pocillo correspondiente al control negativo en el medio del gradiente. Lo que demostró que, aún sin fuente carbonada, las cepas de T. reesei pudieron crecer y desarrollar biomasa.
Identificación de las especies en base a caracteres moleculares
1a. Secuenciación de los Espaciadores Internos Transcriptos del ADN ribosomal (rDNA-ITS) El estudio de las secuencias rDNA-ITS (—Internal Transcribed Spacers“) para la identificación de especies comenzó a ser aplicado por Kullnig et al. (2002), quienes amplificaron los ITS 1 y 2 y la subunidad 5.8S del DNA ribosomal y compararon las secuencias obtenidas con aquellas depositadas en las bases de datos internacionales como el EMBL-EBI (European Bioinformatics Institute). Actualmente se encuentra disponible una
5 Capítulo II Introducción clave on-line denominada —Trichokey“ basada en secuencias de rDNA ITS, tef1 y rpb2 que permite identificar las especies de los distintos estados anamórficos htpp://www.isth.info/index.php.
1b. Aplicación de la tecnología de marcadores moleculares en la utilización de Trichoderma como ACB
Los marcadores moleculares detectan variación en la secuencia de ADN entre genotipos. La base molecular de todos los marcadores de ADN son las mutaciones de punto (polimorfismos de un nucleótido o SNP: —Single Nucleotide Polymorphism“), inserciones, deleciones o inversiones de fragmentos de ADN que diferencian los genomas individuales de todos los miembros de una especie. Estos polimorfismos del ADN sobrevivieron a la selección durante la evolución de las especies al no afectar negativamente la supervivencia y reproducción. La herencia mendeliana, la neutralidad fenotípica y la disponibilidad ilimitada hacen de los marcadores de ADN importantes herramientas para el análisis genómico (Avise, 1994). En la actualidad, se tiende a clasificar a los marcadores moleculares en tres grandes categorías o clases (Andersen & Lübberstedt, 2003; Gupta & Rustgi, 2004): a) marcadores de ADN al azar (RDM: —random DNA markers“) los cuales son fenotípicamente neutros y derivados de cualquier región del genoma (se desconoce la secuencia, pueden provenir de regiones transcriptas o no transcriptas); b) marcadores derivados de regiones transcriptas del genoma tanto de clones de cADN, secuencias expresadas (ESTs “Expressed Sequence Tags“) o genes específicos (GTMs: —gene targeted markers“) y c) marcadores funcionales (FMs: —functional markers“) los cuales están causalmente relacionados con la variación fenotípica observada. Como parte de la caracterización molecular de cepas de interés en el estado anamórfico Trichoderma, se han aplicado las técnicas de marcadores moleculares al azar con el fin de obtener polimorfismos útiles para monitorear la colonización y supervivencia de las cepas aplicadas en ensayos de control biológico. Las técnicas más comúnmente utilizadas para obtener este tipo de marcadores moleculares para los BCAs son: RAPD (—Random Amplified Polymorphic DNA“) por Abbassi et al. (1999), UP-PCR (PCR con cebadores universales —Universal Primed PCR“) por Bulat et al. (1998), T-RFLP (—Terminal Restriction Fragment Lenght Polymorphism“) por Cordier & Alabouvette (2009) y AFLP
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(—Amplification Fragment Lenght Polymorphism“) por Larralde-Corona et al. (2008), entre otros. La técnica de RAPD es la versión comúnmente más usada de un grupo de técnicas desarrolladas simultáneamente, llamadas colectivamente MAAP (—Multiple Arbitrary Amplicon Profiling“) (Caetano-Annollés, 1994), las cuales involucran el uso de un iniciador de secuencia —arbitraria“ en una reacción de PCR, resultando en la amplificación de productos discretos de ADN. Cada producto deriva de una región del genoma que contiene dos segmentos cortos de secuencia complementaria a la del iniciador, ubicados en cadenas opuestas y suficientemente cerca (0,5 a 3 kb) para permitir la amplificación. Usando iniciadores cortos y bajas temperaturas de hibridación (—annealing“) se asegura que varios sitios distribuídos al azar en el genoma generen productos de amplificación (Figura 1).
Figura 1. Generación de fragmentos mediante la amplificación por RAPD. (Hopp & Martínez, 2005). Los bloques anaranjados indican el iniciador de RAPD que hibrida al azar en distintos sitios del cromosoma permitiendo la amplificación de fragmentos (indicados en color naranja). A la derecha se representa el esquema resultante de una electroforesis en gel de los productos obtenidos (1-5) para el ejemplo.
En la técnica de RAPD los productos de amplificación se separan en geles de agarosa en presencia de bromuro de etidio y se visualizan mediante luz UV (Williams et al., 1991). Los polimorfismos se detectan como presencia o ausencia de bandas y son resultado principalmente de diferencias de secuencias en uno o ambos sitios de pegado del iniciador.
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Estas técnicas son muy atractivas ya que no requieren de sondas para hibridar fragmentos ni de secuencias conocidas para diseñar los iniciadores. Se destacan por su simplicidad y fácil implementación en un laboratorio, ya que demandan poco equipamiento. El análisis por RAPD requiere poca cantidad de ADN (15-25 ng), es un ensayo no radiactivo, se realiza en pocas horas, pudiéndose analizar varias muestras. Sin embargo, es absolutamente crítico mantener estrictas condiciones de reacción para poder reproducir perfiles de amplificación consistentes (Caetano-Annollés, 1994) La técnica de UP-PCR permite amplificar regiones del genoma al azar generando perfiles de bandas polimórficas pero con mayor repetitibilidad y tiempos de reacción más cortos que RAPD. Lo que caracteriza a UP-PCR es que tiene la ventaja de utilizar cebadores universales de 17 a 21 pb, y por lo tanto, requieren temperaturas de hibridación mayores además de poseer una alta capacidad de generar polimorfismos (Cumagun et al., 2000). En la práctica, las principales limitantes de estos marcadores son la baja reproducibilidad de la técnica y que son marcadores dominantes (los heterocigotas no se pueden distinguir de los homocigotas). Además, presentan la desventaja de la comigración de bandas de tamaño similar, pero pueden no corresponder al mismo locus y/o alelo; dificultando el análisis en ciertos estudios poblacionales debido a los supuestos que se deben asumir.
1c. Marcadores SCAR (Regiones Amplificadas de Secuencias Caracterizadas)
Los SCARs (—Sequence Characterized Amplified Regions“) derivan en general, de marcadores RAPD individuales (Paran & Michelmore, 1993) pero también pueden derivar de marcadores de tipo AFLP (Nicod & Largiadèr, 2003). Las bandas de RAPD (o AFLP) de interés son clonadas, se determinan las secuencias nucleotídicas terminales y éstas son usadas para diseñar iniciadores para la amplificación específica del fragmento deseado (Figura 2).
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Figura 2. Pasos necesarios para la generación de un marcador SCAR a partir de un fragmento obtenido por RAPD (Hopp & Martínez, 2005). A la izquierda se esquematiza el gel del cual se aísla el fragmento de interés (por ejemplo, de un perfil de RAPD). A la derecha se representa el esquema resultante de la electroforesis en gel del SCAR obtenido sobre los mismos genotipos (calles 1 y 2).
Esta metodología aplicada a fragmentos de RAPD es muy ventajosa ya que permite realizar la amplificación por PCR en condiciones más rigurosas y reproducibles (Paran & Michelmore, 1993). El método UP-PCR se utiliza como alternativa al método de RAPD para generar marcadores SCAR en el género ya que se ha demostrado mayor confiabilidad en los polimorfismos de bandas (Lübeck et al., 1999). Las ventajas de los métodos basados en PCR sitio-específica son la rapidez y simplicidad en la obtención de los datos y la información generada, como así también la reproducibilidad y la posibilidad de transferencia a otros laboratorios. Según las características de su diseño, pueden llegar a ser codominantes (Konieczny & Ausubel, 1993). Son ampliamente utilizados en los programas de mejoramiento asistido por marcadores (MAS) y en mapeo físico de genomas. La desventaja más importante es que la cobertura del genoma está muy restringida, limitada a una única secuencia. Esta técnica ha sido aplicada por investigadores en el área de control biológico en T. atroviride y se ha logrado obtener secuencias amplificadas del ADN genómico a partir de una secuencia específica obtenida del individuo (Hermosa et al., 2001). Los polimorfismos deben ser seleccionados de acuerdo a la repetitibilidad de su presencia y la especificidad por la cepa de interés.
En la Argentina el estudio del estado anamórfico Trichoderma para el control de enfermedades de las plantas se inició hacia fines de la década del 80 (Wright et al., 1988;
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Mitidieri, 1988) y si bien continúa aumentando la cantidad de investigadores dedicados al desarrollo de herramientas de control biológico con cepas de Trichoderma spp. (Escande et al., 1994; Menéndez & Godeas, 1995) dichos trabajos se desarrollan con un enfoque agronómico (Gasoni et al. 2001) sin tener en cuenta muchas veces la identificación unívoca de la cepa empleada. Hasta ese momento se conocían algunas especies del estado anamórfico Trichoderma presentes en nuestro país, aunque se estudiaban principalmente aquellas con aplicación como ACBs efectivos contra patógenos de suelo: T. harzianum, T. koningii, T. asperellum, T. atroviride, etc. (Durman et al. 1999, Perelló et al., 2003; Mónaco et al., 2004), en algunos casos sin llegar a identificar la especie (Escande et al., 2002; Vargas Gil et al., 2008). Mediante el estudio taxonómico desarrollado en la presente tesis (presentado en el capítulo anterior) se amplía el conocimiento de especies presentes en suelos naturales y agronómicos de nuestro país.
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Objetivos e Hipótesis
El objetivo general es caracterizar las cepas argentinas de Trichoderma harzianum biocontroladoras en cuanto a su variabilidad mediante perfiles fisiológicos y moleculares.
Los objetivos particulares son:
‹ Determinar la variabilidad de los perfiles fisiológicos de las cepas biocontroladoras de T. harzianum.
‹ Determinar la variabilidad genética con los marcadores moleculares RAPD y UP-PCR de cepas biocontroladoras nativas y exóticas de T. harzianum.
‹ Estudiar la factibilidad del desarrollo de un marcador SCAR para cepas de T. harzianum biocontroladoras nativas.
Hipótesis
H1. Las cepas biocontroladoras de T. harzianum nativas pueden ser caracterizadas y diferenciadas en cuanto a requerimientos nutricionales mediante el estudio de perfiles fisiológicos.
H2. Existe relación entre los caracteres fenotípicos y genéticos estudiados.
H3. Las cepas de T. harzianum nativas y exóticas pueden ser diferenciadas genéticamente mediante el empleo de técnicas de marcadores moleculares.
11 Capítulo II Materiales y Métodos
I- CEPAS BIOCONTROLADORAS DE TRICHODERMA SPP. i) Características de la colección de cepas biocontroladoras
Se trabajó con una colección de 26 cepas nativas de Trichoderma spp. seleccionadas como ACBs. Estas cepas fueron aisladas de suelos con cultivos hortícolas en el período 1997-1999, excepto en el caso de las cepas T-022 y T-023, que fueron aisladas de rizósfera de plantas de tabaco sanas, rodeadas de plantas con síntomas de fusariosis, en el año 2000. Se agregaron 20 cepas de referencia exóticas, previamente identificadas: 18 como T. harzianum Rifai, una como T. viride Pers. y una como T. atroviride P. Karst.
Selección mediante enfrentamiento en cultivos duales Las cepas nativas aisladas de distintos suelos de cultivo fueron enfrentadas con los patógenos fúngicos: Rhizoctonia solani G.J. Khün, denominada R-81, perteneciente al subgrupo AG-4 HGI, aislada de soja y Fusarium oxysporum f. lycopersici (Sacc.) W. C. Snyder & H. N. Hansen, aislado de tomate, de acuerdo con la metodología empleada por Albert et al. (2011). Para los estudios posteriores se seleccionaron aquellas cepas que presentaron un porcentaje de inhibición (% I) superior al 40%.
Identificación de las cepas El proceso de identificación se realizó en el capítulo I. Las identificaciones de las cepas de referencia fueron confirmadas con el mismo procedimiento.
Conservación de las cepas Las cepas están depositadas en la colección de Insumos Fúngicos IMYZA-INTA. Son mantenidas a -20 °C en medio sólido Butler (1973), además de los otros medios mencionados en el capítulo I.
12 Capítulo II Materiales y Métodos ii) Cultivos monospóricos
Con el fin de obtener cultivos de las cepas identificadas con la máxima pureza genética posible la colección fue transferida a APG a 25 °C en oscuridad durante 10 días hasta obtener una masa abundante de esporas. Se recolectaron conidios volcando solución estéril de Tween 80 al 0,2% sobre la superficie de la colonia. Con una micropipeta se colectaron 50 µl de la suspensión de conidios y se diluyó 1:10 en microtubos, se agitó en vortex y se rastrilló sobre una placa de agar agua al 2%. Se incubaron las placas durante 20 a 24 horas. Los ápices hifales emergidos al cabo de la incubación fueron transferidos a APG e incubados a 25 °C en oscuridad. Los cultivos monospóricos de cada cepa fueron seleccionados y guardados para su conservación a largo plazo.
II- FENOTIPIFICACIÌN DE LAS CEPAS SEGN SUS REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES i) Caracteres morfológicos de las estructuras conidiógenas
Se tomaron medidas de diámetro mayor y menor de los conidios y fiálides y de las hifas portadoras de las células conidiógenas en cultivos crecidos en APG a 25 ºC en oscuridad durante 7 días. Se elaboró una matriz binaria con los datos clasificados por categorías. ii) Estudios de asimilación de fuentes de carbono y nitrógeno
Para estudiar el comportamiento de los aislamientos con distintas fuentes de carbono y nitrógeno se siguió la metodología propuesta por Grondona et al. (1997). En tubos de ensayo se dispensaron 10 ml de medio líquido Lynch B suplementado con 1% de las distintas fuentes de carbono (ver ANEXO MEDIOS DE CULTIVO). Las fuentes utilizadas fueron las siguientes (entre paréntesis se muestran las siglas con que se codificaron los medios): -Glucosa (LBGL) -Acido láctico (LBAL)
13 Capítulo II Materiales y Métodos
-Etanol (LBE) -Oxalato amónico (LBOA) -Acido cítrico (LBAC) -Tartrato amónico (LBTA)
Para los ensayos con fuentes de nitrógeno se preparó otro grupo de tubos conteniendo medio líquido Lynch A suplementado con las siguientes fuentes: -Creatina (LACR) -Oxalato amónico (LAOA) -Nitrito sódico (LANS) -Glicina (LAGY) -Urea (LAU) . Todos los medios de cultivo fueron esterilizados en autoclave a 121 °C durante 20 min, excepto los medios con etanol y urea. Estos fueron esterilizados por filtración empleando un filtro Millipore 45 Sm y luego agregados a los tubos con el medio Lynch A ó B estéril, bajo una cámara de flujo laminar. Previo a la siembra de los aislamientos en cada tubo los medios fueron adicionados con 0,05 g/l púrpura de bromocresol y se ajustó el pH a 4,5. Este compuesto es un indicador de pH que vira al amarillo a pH 5,2 y al púrpura a pH 6,8. En cada tubo se sembraron dos discos de cultivos monospóricos de aislamientos de cepas nativas y exóticas (provenientes de España) de T. harzianum de 0,5 cm diámetro crecidos en agar agua al 2%. Los tubos fueron incubados en oscuridad a 24 °C (±1 ºC) durante 14 días en forma estática. Al final de dicho período se evaluó el desarrollo del micelio, esporulación y alcalinización del medio de cultivo. Los datos se computaron como 0 = reacción nula y 1 = reacción positiva. El experimento fue repetido 3 veces en semanas consecutivas. Para el análisis de los datos se construyó una matriz de datos binarios. Se analizaron 3 caracteres: esporulación (ESP), producción de biomasa (CRE) y alcalinización del medio de cultivo (ALC), con 11 estados para cada carácter, que se correspondieron con los 11 medios enriquecidos con distintas fuentes de carbono y nitrógeno, por lo tanto, se trabajó sobre una matriz de 33 variables totales.
14 Capítulo II Materiales y Métodos
iii) Actividad enzimática mediante el sistema API®-ZYM
Se analizó la producción de enzimas mediante el sistema API®-ZYM (bioMérieux, Francia). Es un método semicuantitativo para testear actividades enzimáticas. Con un formato en galería con 20 cúpulas (contiene un blanco) que permite investigar 19 actividades enzimáticas en simultáneo (Figura 3).
Figura 3. Tiras reactivas de API ® utilizadas para identificación (en este caso se trata de la reacción API 20E para identificación de bacterias). Se muestran los pocillos en cada tira. La tira de arriba no muestra reacción, en cambio, en la tira de abajo se observa reacción positiva.
Las actividades enzimáticas ensayadas fueron las siguientes:
1- Control 11- Fosfatasa ácida 2- Fosfatasa alcalina 12- Naftol-A-S-BI-fosfohidrolasa 3- Esterasa 13- X-Galactosidasa 4- Esterasa lipasa 14- ß-Galactosidasa 5- Lipasa 15- ß-Glucuronidasa 6- Leucina arilamidasa 16- X-Glucosidasa 7- Valina arilamidasa 17- ß-Glucosidasa 8- Cistina arilamidasa 18- N-acetil-ß-Glucosaminidasa 9- Tripsina 19- X-Manosidasa 10- X-Quimotripsina 20- X-Fucosidasa
15 Capítulo II Materiales y Métodos
Las galerías fueron inoculadas con suspensiones de cultivos de las cepas nativas de Trichoderma spp. crecidos en medio GYM (Mugnai et al., 1989) e incubadas durante 9 días en oscuridad a 24 °C. Al cabo de dicho período fueron reveladas bajo una campana de extracción, siguiendo el protocolo del fabricante. Se anotaron los cambios de color de los pocillos en una escala desde 0 hasta 5, siendo 0 un efecto negativo y 5 el máximo efecto de color. El cambio de color denota la cantidad de enzima producida y se cuantifica con un valor del 1 al 5 como sigue:
5 nmoles 1 10 nmoles 2 20 nmoles 3 30 nmoles 4 ≥ 40 nmoles 5
El experimento se repitió 2 veces en semanas consecutivas. Con la información obtenida se construyó una matriz de datos binarios con 0 para expresar ausencia y 1 para presencia. iv) Perfiles fisiológicos mediante el sistema BIOLOG
El sistema BIOLOG es un método de identificación de especies de hongos y bacterias analizando asimilación de carbono y actividad mitocondrial. Está compuesto por microplacas que contienen 95 pocillos con distintas fuentes de carbono y un control. Junto con las fuentes carbonadas se encuentra un colorante redox como el violeta de iodonitrotetrazolio (INT) en las microplacas BIOLOG FF (que están diseñadas para identificar hongos) (Figura 4). Durante la oxidación del succinato, en el ciclo del ácido cítrico, el INT se reduce a una forma de color rojo, el formazán, con un pico de absorbancia en 490 nm. Esta es una reacción irreversible y se puede cuantificar la producción de formazán en cada pocillo, siendo una medida indirecta de la utilización de la fuente de carbono presente.
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Figura 4. Microplacas BIOLOG FF mostrando distintos tipos de reacciones positivas. El pocillo de la esquina izquierda arriba es el control negativo (nótese que en la placa de la izquierda dio reacción positiva).
El sistema fue diseñado para identificar los aislamientos inoculados por el perfil de utilización de las fuentes carbonadas. En este trabajo, los perfiles de asimilación se utilizaron para la identificación y caracterización de acuerdo a la cantidad de biomasa producida. Las cepas de Trichoderma spp. argentinas y españolas crecidas en AEM al 2% fueron incubadas hasta obtener una suspensión de conidios con una densidad de 75% absorbancia a 590 nm. Esta suspensión fue transferida a un tubo conteniendo fluído de inoculación BIOLOG FF. Se sembraron 100 Sl de la suspensión en cada pocillo de las microplacas BIOLOG FF. Las cuales fueron incubadas a 25 °C en oscuridad durante 24 œ 96 h. Se midieron las absorbancias en los pocillos de las microplacas con el lector BIOLOG a 490 y 750 nm cada 24 h. Se construyó una matriz con los datos de absorbancia obtenidos a 750 nm, que es una medida de la densidad de biomasa producida por el microorganismo dentro de cada pocillo. Las 95 fuentes de la microplaca BIOLOG FF fueron reducidas a 36 basándose en la clasificación hecha por Druzhinina et al. (2006), quienes consideraron una clasificación de las fuentes basándose en la densidad de biomasa producida (—mycelial density“), con las lecturas a 750 nm de absorbancia (A750). De este modo se seleccionaron las 36 fuentes que generan mayor densidad de micelio, hasta un mínimo de 0,5 (valor seleccionado en el laboratorio).
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III- ANÊLISIS ESTADÈSTICO
Para evaluar todos los datos analizados se aplicaron técnicas multivariadas de reducción de dimensión siguiendo la metodología propuesta por Bruno & Balzarini (2010). Todos los análisis estadísticos aquí mencionados fueron desarrollados con el programa Infostat v. 2011p. (Di Rienzo et al., 2011). i) Análisis de Componentes Principales (ACP)
Para evaluar el comportamiento de las cepas en cuanto a las variables fenotípicas (asimilación de C y N, actividad enzimática y perfiles de asimilación con microplacas BIOLOG) se analizaron los datos por ACP. Se construyó una matriz de datos con las cepas como observaciones y los caracteres muestreados como variables. Los datos fueron previamente estandarizados. Se graficó mediante biplot con las 2 componentes principales que explican la mayor variabilidad. Se guardaron las dos primeras componentes principales. ii) Análisis de Coordenadas Principales (AcoorP)
Para analizar los datos de marcadores moleculares se calculó una matriz de distancias Euclídeas con previa estandarización de los datos binarios (presencia 1 y ausencia 0 de las bandas). La matriz de distancias se calculó con el índice de Similitud de Dice transformado ½ (1-Sij) . Se guardaron las dos primeras coordenadas principales. iii) Análisis de Procrustes Generalizado (PG)
Para ordenar en un único espacio la información brindada por los marcadores fenotípicos y genotípicos se extrajeron los ejes de los análisis multivariados ACP y ACoorP, respectivamente. El estudio de consenso del ordenamiento de los dos conjuntos de datos con el método de Procrustes Generalizado. En este análisis se tomaron las dos primeras componentes principales del ACP y las dos primeras coordenadas principales del ACoorP y se las consideró como dos grupos. Se graficó un biplot con los ejes de la descomposición de
18 Capítulo II Materiales y Métodos la matriz de consenso. Los valores de las sumas de cuadrado por grupos de marcadores se muestran en tablas. iv) Análisis de Agrupamiento por Método de Distancia no Ponderado (UPGMA)
Esta matriz de datos se analizó por agrupamiento por distancias con el método de distancia (UPGMA) calculado en NTSYSpc v.2.2 (F.J. Rohlf, Numerical Taxonomy System, Version 2.2, Exeter Software). Se construyó un dendrograma aplicando el Coeficiente de Similitud de Jaccard (Jaccard, 1901) para calcular la medida de similitud de distancias. Como soporte del análisis de agrupamiento se calculó el Coeficiente de Correlación Cofenética (CCC). Este coeficiente se utiliza para testear la bondad de ajuste del agrupamiento de un set de datos. Para calcularlo se genera una matriz simétrica a la matriz original con valores de similitud o disimilitud llamada matriz "cofenética". Se plotean los elementos de ambas matrices ignorando los de la diagonal. Para saber si los datos son independientes unos de otros se realizó una comparación de matrices con el test de Mantel. Se computaron el coeficiente de correlación producto-momento —r“ y el estadístico —Z“ del test de Mantel. La interpretación de los estadísticos es la siguiente (Smouse et al., 1986): 0,9 ≤ r ajuste óptimo 0,8 ≤ r < 0,9 buen ajuste 0,7 ≤ r < 0,8 ajuste malo r < 0,7 ajuste pésimo
El test de Mantel es un estadístico para evaluar la correlación entre dos matrices bajo la hipótesis que las matrices no están correlacionadas. Si las matrices muestran semejanza el Z debe ser un número mayor o igual al obsevado, si el valor p es menor al nivel de significancia entonces se rechaza Ho (Hipótesis nula) y se postula que las matrices no tienen correspondencia (Balzarini et al., 2008).
19 Capítulo II Materiales y Métodos
IV- ESTUDIOS DE MARCADORES MOLECULARES
Se realizó la extracción del ADN de las 43 cepas con el DNEAsy Qiagen kit según como se detalló en el capítulo I. i) Amplificación por RAPD (—Random Amplified Polymorphic DNA“) y UP-PCR (—Universal-Primed PCR“)
Se amplificó ADN genómico de las 43 cepas de Trichoderma seleccionadas en el laboratorio de Bioinsumos Fúngicos aplicando las técnicas de RAPD y UP-PCR según como se detalla a continuación. Para la técnica de RAPD se utilizaron 112 cebadores al azar de las series OP-A, OP-B, OP-F, OP-G, OP-I, OP-J, OP-K, OP-AA, OP-AC Operon Technologies (EEUU) (para consultar las secuencias consultar en la página http://www.operon.com) y 10 reacciones de UP-PCR con cebadores solos o combinados (Tabla 2). Las reacciones de amplificación fueron las siguientes:
UP-PCR. En un volumen de reacción de 20 Sl con 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 4 mM MgCl2, 0,4 mM dNTPs, 40 ng/Sl cebadores, 1U/Sl Taq polimerasa (Invitrogen Life Technologies, Brasil) y 1 a 10 ng de DNA genómico fue amplificado: 1 ciclo de 3 min a 94 ºC, 30 ciclos de 50 s a 94 °C, 70 s a 55 °C y 1 min a 72 °C. RAPD. En un volumen de reacción de 25 Sl se agregaron 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 10 mM KCl, 3 mM MgCl2, 0,1 mM dNTPs, 0,6 ng/Sl cebadores, 0,08 U/Sl AmpliTaq Stoffel fragment Perkin Elmer y 1 a 10 ng de DNA genómico. Con el siguiente programa de amplificación: 1 ciclo de 3 min a 94 ºC seguido de 40 ciclos de 1 min a 94 °C, 1 min a 34 °C y 2 min a 72 °C. Los productos resultantes fueron separados por electroforesis en gel de agarosa al 1,5% (para productos RAPD) y al 1,7% (para productos UP-PCR) en buffer TAE 1x a 130 mV, durante 2 h 30 min y fueron teñidos por inmersión en solución 0,5 mg/ml de bromuro de etidio.
20 Capítulo II Materiales y Métodos
Todas las reacciones de marcadores moleculares se hicieron por triplicado. ii) Evaluación de polimorfismos
Se tomaron fotografías digitales de los geles con los perfiles de bandas amplificadas por las técnicas de marcadores moleculares. Se evaluaron los polimorfismos de cada reacción con las herramientas de interpretación de imágenes del sistema —GeneTools Analysis Software“ (SynGene, EEUU). Las bandas se visualizaron como picos, se limpiaron los picos generados por el buffer de corrida. Se calibraron los marcadores de peso molecular y se guardaron las lecturas en planillas de cálculo para su posterior análisis. Se generaron tablas con los datos de pesos moleculares de las bandas presentes, se ordenaron las bandas por su peso molecular para todas las cepas estudiadas. Los datos de bandas ordenados se transformaron en tablas de datos binarios con presencia (1) y ausencia (0) de la banda en cuestión. Los perfiles de bandas fueron agrupados en un dendrograma con el algoritmo de agrupamiento UPGMA (—Unweighted pair-group method, arithmetic average“) Sneath & Sokal (1973), que se construyó con el programa NTSYSpc 2.2 (F.J. Rohlf, Numerical Taxonomy System, Version 2.2, Exeter Software). La matriz de datos de ingreso (—input“) fue conformada por 40 OTUs (—Operational Taxonomic Units“) con 474 variables. Cada OTU representó a las cepas de T. harzianum incluída la cepa de referencia y cada variable representada por un marcador molecular obtenido por RAPD y UP-PCR. Se generó una matriz de 40 x 40 calculada con el Coeficiente de Similitud de Jaccard (Jaccard, op. cit.). iii) Búsqueda de marcadores SCAR (—Sequence Characterised Amplified Region“)
Para llevar a cabo la búsqueda de marcadores SCAR de las cepas de interés se amplificaron los ADN genómicos de 5 cepas de la colección, las cuales presentaban mayor interés como ACB. La búsqueda de polimorfismos neutros se realizó aplicando las técnicas de RAPD y UP-PCR.
21 Capítulo II Materiales y Métodos
Las bandas polimórficas seleccionadas se cortaron a partir del gel de agarosa y se purificaron los fragmentos de interés con el sistema de purificación de productos de PCR —Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System“ (Promega, EEUU). iv) Clonado de fragmentos de amplificación con vector linearizado
La porción del gel de agarosa conteniendo las bandas polimórficas seleccionadas fue cortada de manera individual con un bisturí y se transfirieron a microtubo para purificar con el Wizard®SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega), según el protocolo del fabricante. Los productos purificados fueron ligados a vector linearizado mediante el sistema pGEM®- T (Promega), siguiendo el protocolo del fabricante pero a mayor relación inserto/vector que la indicada. Se transformaron 50 µl de células competentes químicas de Escherichia coli DH5X. Se incubaron 30 min en hielo y posteriormente se colocaron a 42 °C durante 1 min 30 s, nuevamente en hielo durante 2 min, se agregaron 0,2 ml de LB y se incubó en agitación a 37 °C durante 16 h (±1 h). Se plaquearon 200 µl de la mezcla de ligación en placas con LB-ampicilina adicionadas con IPTG y X-gal. Se observaron las colonias desarrolladas y se inocularon las colonias blancas tomando una colonia azul como control positivo en tubos con caldo LB- ampicilina. Se transfirió 1 ml de cada cultivo a microtubos, se concentraron las células y se realizó la extracción de plásmidos utilizando el sistema QIAprep® Spin Miniprep kit (QIAGEN). Se realizó la digestión con EcoRI y se separaron los fragmentos en gel de agarosa al 1% a 80-100 V para verificar la presencia de los insertos. Las colonias con inserto se conservaron a -20 °C en solución de glicerol 10 %. Los insertos clonados fueron secuenciados con los cebadores T7 y SP6 del vector plasmídico. Se reconstruyeron las secuencias resultantes mediante solapamiento de las secuencias provenientes de ambos cebadores con el software MEGA 5.0 (Tamura et al. 2011).
22 Capítulo II Materiales y Métodos v) Técnica de —Southern blotting“
Para comprobar la especificidad de los marcadores con la cepa de origen se realizó una prueba con la metodología de —Southern Blotting“ (Sambrook & Russell, 2001). En primer lugar se amplificó un grupo de moldes de cepas de T. harzianum nativas, con mayor similitud de perfiles genéticos, junto con la cepa de interés (cepa de origen del marcador). Las bandas amplificadas fueron separadas en gel de agarosa de acuerdo al procedimiento habitual. El gel de agarosa transferido a una membrana de nylon (Amersham Hybond N+, General Electric) siguiendo el método de transferencia alcalina con NAOH 0,4 N (Sambrook & Russell, op. cit.). La membrana obtenida se secó a 80 ºC y los productos de la amplificación se unieron covalentemente a la membrana mediante irradiación con luz UV (0,12 J/cm2). La membrana obtenida se hibridizó usando como sonda el marcador M6b 23, previamente amplificado y purificado con el sistema PCR product Purification kit Qiagen (QIAGEN) siguiendo las instrucciones del fabricante. La sonda se marcó radioactivamente con ¹×P-g dCTP mediante el método de iniciado al azar (—random primer“) de Feinberg & Vogelstein (1983; 1984) empleando el kit comercial Prime-a-Gene Labeling System (Promega) y siguiendo las instrucciones del proveedor. Para las reacciones de prehibridación e hibridación se utilizó una solución de ácido polianetolsulfónico (PAES 0,2%, SSC 5X, SDS 0,02% y lauril-sarcosina 0,01%), colocando la membrana en tubos de vidrio con tapa plástica siliconada. Los tubos se incubaron en un horno a 65 ºC, con agitación durante toda la noche. Los lavados posteriores a la hibridación se realizaron en la botella según el siguiente esquema básico:
Primer lavado 100 ml SSC 2x SDS 0,5% 65 ºC 20 min Segundo lavado 100 ml SSC 1x SDS 0,5% 65 ºC 10 min Tercer lavado 100 ml SSC 0,5x SDS 0,1% 65 ºC 30 min Cuarto lavado 100 ml SSC 0,5x SDS 0,5% 65 ºC 20 min Quinto lavado 100 ml SSC 0,1x SDS 0,5% 65 ºC 15 min
Este esquema de lavados se modificó levemente de acuerdo con la señal radioactiva registrada y el tipo de sonda empleada. La membrana tratada se expuso a una placa autorradiográfica (Kodak X-OMAT AR5) con intensificador a -70 ºC durante 1 h.
23 Capítulo II Resulta
I- CEPAS BIOCONTROLADORAS DE TRICHODERMA SPP.
En la Tabla 1 se muestran los datos correspondientes a las 25 cepas nativas de T. harzianum Rifai y una de T. ghanense Yoshim. Doi, J. Abe & Sugiy., identificadas mediante la metodología empleada en el Capítulo I de esta tesis. Asimismo se indican el nombre de colección de la cepa, la localidad de donde fue aislada, la identificación taxonómica, el cultivo de donde provenía (en el caso que corresponde) y los porcentajes de inhibición contra R. solani J. G. Kühn. Se agrega la clasificación en subgrupos (Ver en Grupos Fisiológicos). Se incluyeron en los análisis cepas de referencia exóticas del anamorfo T. harzianum aisladas de suelos cultivados y con buen comportamiento como BCAs provenientes de España, India, Colombia y Reino Unido.
Tabla 1. Datos de origen, especie identificada y cultivo asociado de las cepas nativas y exóticas utilizadas en este estudio. # cepa localidad identificación cultivo* % I** laboratorio GF T-001 Bs As T. harzianum Capsicum anuum 62 IMYZA-BF 1 T-002 Bs As T. harzianum Lactuca sativa 63 IMYZA-BF 1 T-003 Bs As T. harzianum Solanum melongena 60 IMYZA-BF 2a T-004 Bs As T. harzianum Lycopersicon esculentum 53 IMYZA-BF 2a T-005 Bs As T. harzianum Lycopersicon esculentum 48 IMYZA-BF 2a T-006 Bs As T. harzianum Lycopersicon esculentum 56 IMYZA-BF 1 T-007 Bs As T. harzianum Lycopersicon esculentum 61 IMYZA-BF 1 T-008 Bs As T. harzianum Lycopersicon esculentum 48 IMYZA-BF 1 T-009 Bs As T. harzianum Lycopersicon esculentum 59,5 IMYZA-BF 1 T-010 Bs As T. harzianum Lycopersicon esculentum 43 IMYZA-BF 2a T-011 Bs As T. harzianum Lactuca sativa 53 IMYZA-BF 1 T-012 Bs As T. harzianum Lactuca sativa 61 IMYZA-BF 1 T-013 Bs As T. harzianum Lactuca sativa 51 IMYZA-BF 2a T-014 Bs As T. harzianum Lactuca sativa 62,5 IMYZA-BF 1 T-015 Bs As T. harzianum Lactuca sativa 54 IMYZA-BF 1 T-016 Bs As T. harzianum Solanum melongena 53 IMYZA-BF 2a T-017 Bs As T. harzianum 65 IMYZA-BF 1 T-018 Bs As T. harzianum Lycopersicon esculentum 57 IMYZA-BF 2a T-019 Bs As T. harzianum Lycopersicon esculentum 51 IMYZA-BF 2a Entre s/d T-020 Ríos T. ghanense Pinus sp. 48 IMYZA-BF T-021 Bs As T. harzianum Lycopersicon esculentum 64 IMYZA-BF 2a T-022 Tucumán T. harzianum Nicotiana tabacum 45,5 IMYZA-BF 2b T-023 Tucumán T. harzianum Nicotiana tabacum 68 IMYZA-BF 2b T-025 España T. harzianum suelo cultivado 55 CIALE-GFB 2b T-026 España T. harzianum suelo cultivado 54 CIALE-GFB 2b T-027 España T. harzianum suelo cultivado 79 CIALE-GFB 2b
4 Capítulo II Resulta
T-028 España T. harzianum suelo cultivado 48 CIALE-GFB 2b T-029 España T. harzianum suelo cultivado 65 CIALE-GFB 2b T-030 India T. harzianum suelo s/d IMI 293162 2b T-031 Colombia T. harzianum suelo s/d IMI 296235 2b Reino 2b T-032 Unido T. harzianum suelo s/d IMI 298372 Reino 2b T-033 Unido T. harzianum suelo s/d IMI 298373 Reino 2b T-034 Unido T. harzianum suelo s/d IMI 298374 T-035 India T. harzianum Beta vulgaris s/d IMI 304056 2b Lycopersicon 2b T-036 India T. harzianum esculentum s/d IMI 304057 T-037 T. harzianum suelo cultivado s/d CIALE-GFB 3 T-038 Bs As T. harzianum suelo cultivado s/d IMYZA-BF 3 T-039 Bs As T. harzianum suelo cultivado s/d IMYZA-BF 3 T-040 Bs As T. harzianum suelo cultivado s/d IMYZA-BF 3 TA Irlanda s/d CBS del N T. harzianum compost s/d CBS 693.94 TH Reino 3 CBS Unido T. harzianum suelo s/d CBS 226.95 TV s/d CBS Holanda T. harzianum madera s/d CBS 189.79
* Las cepas fueron aisladas de suelo excepto T-001 aislada sobre esclerocios de Sclerotium rolfsii. ** Según la metodología de Albert et al. (2011) confrontando con la cepa Rhizoctonia solani AG4 HGI denominada R81, de la colección de Bioinsumos Fúngicos de IMYZA. # GF se refiere a —Grupos Fisiológicos“ determinados por el análisis de asimilación de fuentes de carbono y nitrógeno.
II- FENOTIPIFICACIÌN DE LAS CEPAS SEGN SUS REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES Y ATRIBUTOS GENÉTICOS
Con los datos obtenidos por las distintas técnicas mencionadas se construyeron matrices de datos provenientes de distintas fuentes: i) datos morfológicos: se utilizó la tasa de largo sobre ancho de conidios (L/W). ii)- Asimilación de fuentes de C y N: se estudiaron 33 variables. iii)- Actividad enzimática API-ZYM: se estudiaron 19 enzimas del test. iv)- Fuentes en microplacas BIOLOG: se seleccionaron 36 fuentes de acuerdo con la clasificación propuesta por Druzhinina et al. (2006). v)- Marcadores moleculares de RAPD y UP-PCR: se analizaron 163 marcadores moleculares.
5 Capítulo II Resulta
‹ Para cada set de datos provenientes de los análisis arriba enlistados ii, iii y v se elaboraron matrices binarias en función de presencia (1) o ausencia (0) del estado de los caracteres estudiados. ‹ Con los datos provenientes del estudio con el método iv se elaboró una matriz de datos contínuos de valores de absorbancia a 750 nm. ‹ Para los análisis multivariados se unieron los datos provenientes de las distintas matrices en una matriz única. i) Grupos Fisiológicos (GF) El análisis de agrupamiento por UPGMA con las cepas de la Tabla 1 de cada uno de los marcadores estudiados (datos no mostrados) permitió obtener un agrupamiento en torno a las variables de asimilación de fuentes de carbono y nitrógeno. Este análisis involucró a todas las cepas de la colección de Trichoderma harzianum biocontroladoras que figuran en la Tabla 1. El dendrograma obtenido por UPGMA con los marcadores mencionados se muestra en la Figura 5. Se observa que la mayoría de las cepas se reunieron en 3 grupos principales. Los cuales fueron numerados como 1, 2 (subdividido en 2a y 2b) y 3, los cuales se corresponden con los números presentes en la columna GF de la Tabla 1. El Coeficiente de Correlación Cofenética del agrupamiento dio un valor de r = 0,83595 y el test-t de Mantel, t = 16,5559 (p = 0,0020), y por lo tanto, la prueba de bondad de ajuste de este conjunto de datos resultó significativa para el agrupamiento obtenido por UPGMA. En la Figura 6 se muestra la correlación positiva entre las dos matrices cofenéticas.
6 Capítulo II Resulta
C y N 40 cepas de Trichoderma harzianum T-001 T-002 T-007 T-009 T-014 T-006 1 T-017 T-015 T-011 T-012 T-008 T-003 T-013 T-018 T-019 2a T-021 T-004 T-005 T-010 T-016 T-022 T-027 T-028 T-031 T-023 T-026 T-024 2b T-030 T-025 T-029 T-032 T-036 T-033 T-035 T-034 TH T-037 T-040 T-038 3 T-039 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 Jaccard Coefficient
Figura 5. Dendrogama UPGMA con datos binarios de crecimiento, esporulación y alcalinización de fuentes de C y N en medio líquido estático por cepas argentinas y exóticas de T. harzianum. Referencias: 1, 2a, 2b y 3 corresponden a los GF mencionados en la Tabla 1. Las flechas señalan los nodos de cada grupo. TH corresponde a la cepa de referencia CBS 226.95.
0.12
0.08
Y Label 0.05
0.01
-0.02 -0.08 -0.04 0.01 0.05 0.10 X Label
Figura 6. Gráfico de correlación de datos de marcadores moleculares con 33 marcadores de esporulación, biomasa y alcalinización de medios con distintas fuentes de C y N de cepas argentinas y exóticas de Trichoderma harzianum. r=0,83595 (=estadístico Z de Mantel normalizado), Mantel t- test: t= 16,5559 (p= 0,0020).
7 Capítulo II Resulta
a) Análisis de agrupamientos de perfiles fisiológicos y genéticos de cepas nativas.
En la Figura 7 se muestra un gráfico biplot del análisis de los caracteres API®- ZYM, asimilación de fuentes de carbono y nitrógeno y perfiles de asimilación en microplacas BIOLOG de las cepas nativas. En el biplot se observa que las cepas nativas se separan a lo largo de la componente principal 1 (CP1), que representa un gradiente de alcalinización con las fuentes de N en el extremo negativo. En el extremo positivo las variables que más aportan son: la alcalinización de los medios carbonados y la utilización de fuentes de carbono como aminoácidos, ácidos orgánicos y azúcares. En la intersección de la CP1 y componente principal 2 (CP2) se destaca la contribución de las variables crecimiento y esporulación en fuentes de C. En la CP2 las variables que más contribuyen son los aminóacidos y ácidos orgánicos en el extremo positivo y en el extremo opuesto se destacan los azúcares. Se observa que la mayoría de las cepas del GF 1 se dispersaron a lo largo de la CP1. Las cepas del GF 2a se dispersaron a lo largo de la CP2 pero hacia el lado negativo de la CP1. En estos cuadrantes contribuye la variable alcalinización en medios nitrogenados. El GF 2b está representado por la cepa T-023, que se ubicó en el I cuadrante con preferencia por aminoácidos y ácidos orgánicos y con esporulación en fuentes nitrogenadas.
8 Capítulo II Resulta
C comp
11,00 T16T-016 ALC N ALC C
C simp T23T-023 6,25 T21T-021
T19T-019 1,50 T-010T10 T-006 T15T-015 T-009 T11T-011 CP CP 2 (13,7%) T22T-022 T4T-004 T6 T2T-002 T9 T17T-017 T13T-013 T12T-012 T7T-007 T14T-014 -3,25 T18T-018
T1T-001
-8,00 -11,00 -6,25 -1,50 3,25 8,00 CP 1 (17,8%)
Figura 7. Gráfico biplot obtenido a partir de ACP. Se ordenan las 18 cepas nativas con datos de asimilación de fuentes de C y N, BIOLOG y API-ZYM (se indican en color los grupos fisiológicos según la Tabla 1). A la derecha arriba se esquematizan los dos ejes principales con las variables que más contribuyen a cada uno. ALC N= alcalinización en medios nitrogenados, ALC C= alcalinización en medios carbonados, C comp = sustratos orgánicos complejos, C simp = sustratos orgánicos complejos.
Para el estudio de ordenamiento de los datos de marcadores moleculares se realizó un Análisis de Coordenadas Principales. Este análisis rindió 2 coordenadas principales que explican el 90% de la variabilidad total con los GF 1 y GF 2b agrupados, el GF 2a se dispersó con respecto a los demás (Figura 8).
9 Capítulo II Resulta
ACoorP de datos genéticos de T. harzianum nativas SC(ARM)=0,628-Distancia: (Dice (sqrt(1-S))) 0,29 ClusterGF 2a 2a
0,19
0,08 CP(11,4%) 2
ClusterGF 1 1 1 ClusterGF 2a 2a -0,02 ClusterGF 2b 2b
ClusterGF 2a 2a
-0,12 -0,09 0,13 0,34 0,56 0,78 CP 1 (78,7%)
Figura 8. Arbol de recorrido mínimo (ARM) de los grupos fisiológicos, identificados como GF 1, GF 2a y GF 2b con datos de marcadores moleculares de cepas nativas.
En la Tabla 2 se muestran los valores de consenso para los grupos 1 y 2 que resultan del análisis del ACP de datos fenotípicos y el ACoorP de los marcadores moleculares.
Tabla 2. Sumas de cuadrado por grupo elaborado por análisis de PG de cepas T. harzianum nativas. Grupo1: marcadores fisiológicos; Grupo 2: marcadores moleculares.
Consenso Residuo Total Prop Cons Grupo1 0,770 0,230 1,000 0,770 Grupo2 0,770 0,230 1,000 0,770 Total 1,539 0,461 2,000 0,770
En la Figura 9 se grafica el ordenamiento de los dos grupos de datos por medio de un biplot. El consenso obtenido entre los grupos fisiológico y genético fue alto (77%). No se observa una separación o agrupamiento diferencial de las cepas. La mayor parte permanece agrupada a excepción de las cepas T-021, T-023 y T-016 se alejan del grupo principal.
30 Capítulo II Resulta
Configuración de consenso datos fenéticos y genéticos de T. harzianum nativas
0,21 T-001th1 T-018th18
0,12 T-013th13 T-022th22
th4T-004
T-002
CP(17,5%) 2 0,03 th2 th19 T-014th14 T-019 T-016th16 T-016th6 T-012th12 Tth15-015 T-021th21 T-017th17 th10 -0,06 T-010 T-007th7 th9 T-009 T-011th11 T-023th23
-0,15 -0,30 -0,02 0,26 0,54 0,82 CP 1 (82,5%)
Figura 9. Gráfico biplot obtenido a partir de análisis PG. Se ordenan las 18 cepas nativas en un plano conformado por los dos primeros ejes del análisis PG. Se calculó la distancia genética del índice de similitud de Dice mediante la transformación de raíz cuadrada de (1-S) con 163 marcadores moleculares y la distancia Euclídea para los marcadores fisiológicos (se indican en rojo las cepas con % Inhibición >60% sobre R. solani).
b) Análisis de agrupamientos por perfiles fisiológicos y genéticos de las cepas nativas y exóticas.
El ordenamiento de los datos fisiológicos mediante ACP generó el agrupamiento de los grupos fisiológicos 2a y 2b hacia el extremo negativo de la CP1. En cambio, el grupo fisiológico 1 se dispersó sobre el extremo positivo de la CP1. En este caso, la CP1 está explicada por las variables azúcares y alcoholes hacia el extremo positivo y los aminoácidos y ácidos orgánicos hacia el extremo negativo, la CP2 presenta un componente de esporulación y alcalinización en medios carbonados en el extremo positivo y esporulación y alcalinización de fuentes nitrogenadas en el extremo opuesto (Figura 10).
31 Capítulo II Resulta
esp C 16,00
T-027 C compl C simp
alc N 9,50
T-023 T-026 T-029 T-025 T-007 T-029 T-025 3,00 T-009 T-009 T-015 T-015 T-010 T-011 T-010T-006 T-011 CP 2 (14,2%) CP (14,2%) 2 T-014 T-014 T-006 T-022 T-012 T-016 T-019 T-028T-028 T-002 T-016 T-019 T-002 T-021 T-021 T-004 T-017 -3,50 T-004 T-013 T-001
T-018
-10,00 -20,00 -12,50 -5,00 2,50 10,00 CP 1 (19,5%) Figura 10. Gráfico biplot obtenido a partir de ACP. Se ordenan las 18 cepas nativas con datos de asimilación de C y N, BIOLOG y API-ZYM (se indican en color los grupos fisiológicos según la Tabla 1). A la derecha arriba se esquematizan los dos ejes principales con las variables que más contribuyen a cada uno. ALC N= alcalinización en medios nitrogenados, ALC C= alcalinización en medios carbonados, C comp = sustratos orgánicos complejos, C simp = sustratos orgánicos simples.
El análisis de los datos moleculares con Coordenadas Principales (Figura 11) muestra que los grupos fisiológicos 1, 2a y 2b se encuentran bastante cercanos, pero el grupo 2 b es el que presenta mayores diferencias. El grupo fisiológico 2a muestra dos subgrupos que están conectados entre sí.
3 Capítulo II Resulta
ACoorP de datos genéticos de T. harzianum nativas y exóticas
SC(ARM)=1,167-Distancia: (Dice (sqrt(1-S))) 0,50 ClusterGF 2a 2a
0,27
ClusterGF 2b 2b ClusterGF 2b 2b 0,04 ClusterGF 2a ClusterGF 2b 2b ClusterGF 1 1 2a ClusterGF 2b CP CP 2 (15,9%) ClusterGF 1 1 2b ClusterGF 2b 2b
-0,19 ClusterGF 2b 2b
ClusterGF 2b 2b
-0,42 -0,20 0,00 0,19 0,39 0,58 CP 1 (46,0%)
Figura 11. Arbol de recorrido mínimo (ARM) del ordenamiento de 23 cepas sobre el plano conformado por las dos primeras coordenadas principales.
El ordenamiento de los datos provenientes de marcadores fisiológicos (C y N, y BIOLOG) y moleculares por el método de PG fue del 61% (Tabla 3). Sobre un total de 23 cepas de T. harzianum provenientes de la Argentina y de España analizados con los datos de las 21 variables de asimilación de C y N, y las 25 fuentes seleccionadas de microplacas BIOLOG FF. Junto con 136 marcadores moleculares de RAPD y de UP- PCR. Con el fin de comparar el comportamiento de las cepas nativas con respecto a las cepas españolas de referencia. Para el análisis se utilizaron las dos componentes principales del ACP de datos fisiológicos y las dos primeras coordenadas principales del Análisis de Correspondencias de los datos de marcadores moleculares con la matriz de similitud calculada a partir de la transformación (1-S)½ del índice de similitud de Dice. Se graficó un biplot para mostrar el ordenamiento de los dos conjuntos de datos que se muestra en la Figura 12 con el ordenamiento de los grupos de cepas en el plano conformado por los dos primeros ejes del análisis de PG.
33 Capítulo II Resulta
Tabla 3. Sumas de cuadrado por grupo elaborado por análisis de PG de cepas T. harzianum argentinas y españolas. Grupo1: datos C y N, BIOLOG; Grupo: 2 marcadores moleculares de RAPD y UP-PCR.
Consenso Residuo Total Prop Cons Grupo1 0,612 0,388 1,000 0,612 Grupo2 0,612 0,388 1,000 0,612 Total 1,224 0,776 2,000 0,612
PG cyn, biolog y mm T. harzianum arg y esp 2 grupos 0,22 T-016 th16 T-029T29
T28T-028
0,14
CP(20,7%) 2
0,06 T27T-027
T26T-026 th21T-021 T25T-025 th23 -0,01 T-023 th22T-022 T-017th17 T-010 th15 th14T-014 th10 T-015 th19T-019 th13T-013 th18 th9 T-018 th11T-011 T-009 T-004 th4 th2 th12 T-012 th6 th7T-007 th1 T-002 T-001 T-006
-0,09 -0,20 0,01 0,23 0,44 0,66 CP 1 (61,4%)
Figura 12. Gráfico de Biplot de análisis PG con datos de 2 grupos de cepas argentinas y españolas de T. harzianum.
Se observa la separación entre la cepa T-025 y otro grupo formado por T-016, T- 028, T-029. La cepa de España T-027 se encuentra separada del resto, mientras que la cepa T-026 (del mismo origen) se muestra más vinculada a las cepas nativas, las cuales se presentan como un grupo muy cercano. Debido a que el análisis donde se incorporaron los marcadores moleculares no permitió observar el comportamiento de las cepas nativas, se trabajó con el set de datos de marcadores fisiológicos de las cepas nativas y españolas para lograr una mejor separación de las mismas en el gráfico. En el análisis de PG con los conjuntos de datos de asimilación de fuentes de carbono y nitrógeno y preferencias nutricionales en microplacas BIOLOG de cepas argentinas y españolas se obtuvo 78% de consenso en el ordenamiento de ambos grupos Tabla 4 (no se muestra el gráfico biplot).
34 Capítulo II Resulta
Tabla 4. Sumas de cuadrado por grupo elaborado por análisis de PG de cepas T. harzianum argentinas y españolas. Grupo1: datos C y N; Grupo 2: BIOLOG
Consenso Residuo Total Prop Cons Grupo1 0,786 0,214 1,000 0,786 Grupo2 0,786 0,214 1,000 0,786 Total 1,573 0,427 2,000 0,786
c) Análisis de perfiles genéticos de marcadores moleculares
Como resultado de la amplificación del ADN genómico de toda la colección de cepas biocontroladoras, incluídas las exóticas se obtuvieron 473 marcadores polimórficos en total. De los cuales 311 fueron amplificados con la técnica UP-PCR y 162 con la técnica de RAPD. El dendrograma generado por el agrupamiento por UPGMA se muestra en la Figura 13. Se observa que las cepas nativas se agruparon con un 85-90% de similitud según el Coeficiente de Similitud de Jaccard. Las cepas restantes, que no se agruparon entre sí, incluyen a todas las exóticas y a algunas nativas como T-003 y T-016. Las matrices mostraron correlación positiva que se observa en la Figura 14.
35 Capítulo II Resulta
Marcadores Moleculares RAPds y UP-PCR de cepas de Trichoderma harzianum 311 marcadores uppcr y 162 de rapids T-001 T-006 T-004 T-007 T-008 T-005 T-011 T-015 T-017 T-019 T-009 T-014 T-013 T-012 T-002 T-022 T-018 T-038 T-039 T-010 T-021 T-023 T-026 T-025 T-035 T-027 T-030 T-036 T-040 T-031 T-032 T-033 T-034 T-037 T-003 T-029 T-016 T-028 TH T-020 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 Jaccard Coefficient Figura 13. Dendrograma UPGMA calculado con el Coeficiente de Similitud de Jaccard con matriz de datos binarios construída en base a los polimorfismos encontrados con 311 marcadores de UP-PCR y 162 de RAPD. Las cepas señaladas con el recuadro verde corresponden al 80% similitud y las recuadradas en rojo corresponden al 95%. La cepa T. ghanense T-020 corresponde al grupo externo (—outgroup“).
Gráfico de correlación de marcadores rapids y up Trichoderma harzianum 0.06
0.03
Y Label 0.01
-0.02
-0.04 -0.05 -0.02 0.00 0.03 0.06 X Label Figura 14. Gráfico de correlación de datos de marcadores moleculares con 311 marcadores de UP-PCR y 162 de RAPD para el set de cepas de Trichoderma harzianum. r=0,99708 (=estadístico Z de Mantel normalizado), Mantel t-test: t= 7,7753 p= 0,0020.
36 Capítulo II Resulta
III- ESTUDIOS DE MARCADORES MOLECULARES
i) Selección de marcadores SCAR
Los resultados de la búsqueda de marcadores polimórficos realizado sobre 5 cepas indicó que las dos técnicas de marcadores moleculares utilizadas rindieron polimorfismos para las cepas T. harzianum T-001, T-002 y T-023. Sólo los marcadores de T-023 resultaron estables y repetibles. RAPD. Con la técnica de RAPD se amplificaron las cepas de referencia con 128 cebadores, de los cuales 48 rindieron polimorfismos, se obtuvieron 291 marcadores, de los cuales 15 fueron específicos para T-023, 6 para T-002, 3 para T-001 y 2 para T- 022 (Figura 15).
Figura 15. Perfil de bandas obtenidos con RAPD, cebadores OP-B3, OP-K7 y OP-I20. Las calles 1 a 5 corresponden a las cepas: T-001, T-002, T-022, T-023 y T-024; las calles de los extremos corresponden a los marcadores de peso molecular 1 kb DNA ladder (Invitrogen). Las bandas polimórficas se señalan con flechas.
UP-PCR. Con las 46 reacciones de amplificación se obtuvieron 312 marcadores, de los cuales 58 rindieron polimorfismos, entre ellos sólo 5 fueron específicos para T-023 (Figura 16).
37 Capítulo II Resulta
Figura 16. Perfil de bandas obtenidos con UP-PCR, cebadores L45 y AA2M2, L45 y L15/A19, L45 y AS15inv. Las calles 1 a 5 corresponden con las cepas: T-001, T-002, T-022, T-023 y T-024; las calles de los extremos corresponden a los marcadores de peso molecular 1 kb DNA ladder (Invitrogen). Las bandas polimórficas se señalan con flechas.
De cada técnica utilizada se seleccionaron dos marcadores SCAR, uno de cada técnica. El marcador obtenido con los cebadores L45/AS15inv, de UP-PCR, está caracterizado por un peso de alrededor de 1000 pb, se obtuvieron 4 clones positivos y la secuencia dió similitud con exones del gen quitinasa de T. atroviride (Figura 17). El marcador obtenido con el cebador K12 dió un fragmento de alrededor de 800 pb, al cual se lo llamó K12 23 (Figura 18), se obtuvieron 2 clones positivos con el fragmento insertado y en la comparación con secuencias de referencia pertenecientes a T. harzianum presentó alta similitud.
38 Capítulo II Resulta
B
Figura 17. Electroforesis de agarosa con perfiles de amplificación. 1: T-001, 2: T-002, 22: T-022, 23: T- 023, 24: T-024. Perfiles de bandas amplificadas por UP-PCR con cebadores combinados L45/AS15inv, la flecha señala el marcador seleccionado M6b 23, PM: 100 bp DNA ladder (Invitrogen).
1 2 22 23 24 PM
Figura 18. Electroforesis de agarosa con perfiles de amplificación. 1: T-001, 2: T-002, 22: T-022, 23: T- 023, 24: T-024. Perfiles de bandas amplificadas por RAPD con cebador OPK-012, la flecha señala el marcador K12 23, PM: 1 kb DNA ladder (Invitrogen).
En la Tabla 5 se resumen las características de los marcadores seleccionados obtenidos por ambas técnicas.
39 Capítulo II Resulta
Tabla 5. Marcadores moleculares específicos de T. harzianum T-023, obtenidos con las técnicas de RAPD y UP-PCR.
Marcador M6b 23 K12 23 Técnica UP-PCR RAPD Cebadores L45/AS15inv OPK012 Tamaño fragmento (pb) 1000 800 Cantidad de clones 4 2 exones quitinasa T. Homología en BLAST atroviride tef Trichoderma sp.
ii) Comprobación de especificidad del marcador M6b 23 con la cepa de T. harzianum T-023.
En el experimento de —Southern Blotting“ el marcador M6b 23 resultó inespecífico para la cepa T. harzianum T-023. La sonda hibridó con todas las cepas de T. harzianum de la colección, por lo tanto, no se observó la especificidad del marcador con la cepa de origen por lo que no se continuó con las etapas posteriores de síntesis de los cebadores SCAR (Figura 19).
1 2 6 7 17 23 33 35 40 a PM A B
Figura 19. Imágenes de procedimiento de técnica de Southern blotting con productos de amplificación por UP-PCR para verificar especificidad del marcador M6b 23. A: fotografía de membrana Hybond N+ con productos RAPD con cebador OPK012, 1: T-001, 2: T-002, 6: T-006, 7: T-017, 17: T-017, 23: T-023, 33. T-033, 35: T-035, 40: T-040, TH: T. harzianum CBS 226.95, M6b1: clon Nº 1, M6b11: clon Nº 11, PM: 1 kb DNA ladder (Invitrogen); B: fotografía de membrana Hybond con hibridación de sonda marcada, 1: T-001, 2: T-002, 6: T-006, 7: T-017, 17: T-017, 23: T-023, 33. T-033, 35: T-035, 40: T-040, a: M6b11, PM: 1 kb DNA ladder (Invitrogen).
40 Capítulo II Discusión/ Conclusiones
Discusión/ Conclusiones
En el desarrollo del presente capítulo se ha llevado a cabo el estudio de una colección de cepas de Trichoderma harzianum con capacidad biocontroladora, mediante la integración de atributos morfológicos, fisiológicos, bioquímicos y moleculares. Se hicieron comparaciones dentro del grupo y entre las cepas nativas y exóticas. Este capítulo consta de dos partes: en la primera se lleva a cabo la caracterización de las cepas con el estudio de los atributos mencionados en el párrafo anterior con el fin de generar agrupamientos de las cepas de la colección. En la segunda parte se realiza la búsqueda de caracteres moleculares específicos de dichas cepas. De acuerdo con Nagy et al. (2007) la integración de los atributos antes mencionados pueden servir para establecer grupos dentro del complejo T. harzianum que determinen diferentes niveles de actividad biológica contra los hongos fitopatógenos.
Análisis de atributos fenotípicos
Las cepas nativas y exóticas se agruparon en 3 grupos fisiológicos en base a los caracteres de asimilación de fuentes de C y N. El mapeo del carácter: Porcentaje de Inhibición contra el fitopatógeno R. solani AG-4 HGI demostró que las cepas biocontroladoras se agruparon en forma independiente para este carácter, con respuestas variables en un rango de 43 a 68 % de Inhibición de R. solani AG-4 HG I (Tabla 1). Estos valores suelen ser variables dentro de la especie T. harzianum como en otras testeadas frente a R. solani y a Fusarium oxysporum (Soares de Melo & Faull, 2000; Rini & Sulochana, 2007). El análisis multivariado de estos caracteres permitió identificar a las variables alcalinización del medio nitrogenado y esporulación en medios carbonados como las responsables de la formación de los grupos fisiológicos mencionados. Steyaert et al. (2010a) observaron que los cultivos de Trichoderma atroviride, T. hamatum y T. pleuroticola modifican el pH del medio según el tipo de fuente de N. Si la fuente de N es primaria tienden a acidificar el medio, en cambio con las fuentes de N secundarias o primarias limitantes tienden a alcalinizar el medio. Con las cepas argentinas se observó que en el GF 2a en su mayoría se agruparon por la variable alcalinización del medio, pero, aún entre cepas de la misma especie, las respuestas son variables. Se conoce que
41 Capítulo II Discusión/ Conclusiones tanto el pH como las tasas de C/N son los principales factores que influyen en la esporulación del anamorfo Trichoderma (Steyaert et al., 2010b). La variable esporulación fue secundaria para la diferenciación de los grupos. El GF 1 se separó por la esporulación en fuentes de C de las cepas del GF 2a y de la única representante del GF 2b (T-023). A su vez, los aislamientos también se separaron por su capacidad para esporular en presencia de medio nitrogenado, de acuerdo con la segunda componente (Fig. 3). El oxalato de amonio utilizado como fuente de N separó a la cepa T-001 del resto, por la falta de producción de biomasa y, cuando este compuesto fue utilizado como fuente de carbono, no crecieron las cepas T-004, T-010, T-013, T-016, T-018, T- 019, T-020 y T-021. Estos resultados no se corresponden con los informados por Consolo et al. (2012), quienes trabajaron con 33 cepas de Trichoderma spp. biocontroladoras, de las cuales 20 son T. harzianum, y sólo 3 cepas fueron capaces de crecer en presencia de oxalato de amonio. La cepa T-001 fue aislada de esclerocios de Sclerotium rolfsii Sacc., parasitando tejidos de pimiento y sus preferencias nutricionales abren la discusión hacia otros temas relacionados como la producción de enzimas específicas. En otros taxones fúngicos como Aspergillus oryzae (Ahlb.) Cohn el oxalato de amonio es utilizado por una cepa celulolítica y pectinolítica como fuente de nitrógeno para estimular la producción de poligalacturonasa (Adeleke et al., 2012). Consolo et al. (2012) observaron escaso crecimiento y esporulación de cepas de Trichoderma spp. al ensayar el crecimiento con distintas fuentes nitrogenadas. Estos autores demostraron que el pH del medio se incrementa con la incorporación de sales de amonio, glicina o urea y que, bajo estas condiciones, se acelera la autólisis de las células fúngicas y se liberan compuestos amonificados. Aún permanece sin respuesta la pregunta si existen condiciones óptimas especie- específicas para incrementar la esporulación. Se ha demostrado que la fuente de carbono primaria es determinante de la esporulación en condiciones de luz y de oscuridad en cepas de T. viride y de T. atroviride (Chovanec et al., 2001; Friedl et al., 2008). Es posible que las cepas biocontroladoras de T. harzianum puedan ser separadas en torno a las variables de asimilación de fuentes de carbono y nitrógeno. En vista de estos resultados a través de estas dos variables se podrían incrementar las separaciones entre los grupos fisiológicos. Con los resultados mencionados se acepta la Hipótesis que plantea que las cepas biocontroladoras de T. harzianum nativas pueden ser diferenciadas por sus características fenotípicas.
42 Capítulo II Discusión/ Conclusiones
Si bien hubo un alto consenso en el ordenamiento de los conjuntos de datos fenotípicos y genéticos y la mayoría de las cepas nativas se mostraron agrupadas, algunas quedaron separadas y el mapeo del Porcentaje de Inhibición no permitió explicar las diferencias en torno a este carácter (Fig. 5). Es importante destacar que en este análisis los datos de morfología no son suficientes para distinguir al conjunto de cepas dentro de la especie en la colección. Este hecho se explica por lo publicado por Chaverri et al. (2003) quienes encontraron superposición de los rangos de caracteres morfológicos en T. harzianum y comentaron que esto se debe a una variación contínua de los rasgos morfológicos dentro de la especie. Los mismos autores afirman que no encontraron caracteres fenotípicos diagnósticos que se correlacionen con los linajes filogenéticos obtenidos en su estudio. Esta falta de diferencias en la distribución de las cepas podría deberse a una alta similitud en los caracteres genéticos analizados que estarían influenciando en el agrupamiento. Aunque el ordenamiento de las variables fue más ajustado entre las cepas nativas con 77% de consenso, que con nativas y exóticas analizadas en conjunto (consenso 61%). Estos valores de consenso altos obtenidos para las cepas nativas y exóticas demostraron que existe una relación ajustada entre los caracteres fenotípicos y genotípicos estudiados. Por lo tanto, estos resultados contribuyen a aceptar la Hipótesis 2. Cuando se incorporaron al análisis las cepas exóticas se observaron los mismos agrupamientos aunque se reforzaron los caracteres. El grupo 1 fue separado por el consumo de fuentes carbonadas simples de los grupos 2a y 2b que tuvieron preferencias por los azúcares complejos. Los grupos 2a y 2b se separaron entre sí por la alcalinización en fuentes nitrogenadas y esporulación en fuentes carbonadas, respectivamente. Las discrepancias entre los caracteres de las cepas nativas y las exóticas pueden haber sucedido por condiciones ambientales o ecológicas particulares. Estos datos concuerdan con los presentados por Sharma et al. (2009). Buyer et al. (2001) denominan muestreo puntual (—single time-point“) a las lecturas de las distintas fuentes en las microplacas BIOLOG en un momento definido. Estos muestreos puntuales son indicativos de la heterotrofia de la población fúngica. En este caso los grupos 1 y 2a demostraron ser menos heterotróficos, en tanto que, el grupo 2b presentó mayor diversidad en el comportamiento con respecto a las preferencias nutricionales.
43 Capítulo II Discusión/ Conclusiones
Dentro del grupo de aislamientos exóticos se observa que si bien presentan diferencias en los perfiles genéticos, al incorporarse las variables fisiológicas el consenso entre los grupos de datos fisiológicos y genéticos es alto. Probablemente las diferencias en el GF 2b puedan ser explicadas por las características del origen geográfico. De las lecturas de las microplacas BIOLOG se encontró que las cepas T-022 y T-023 (no se muestran los datos) mostraron menor crecimiento en presencia de lactosa que el resto de las cepas, lo cual coincide con lo informado por Hoyos-Carvajal et al. (2009). Estos autores encontraron correspondencia con 3 grupos de T. harzianum que clasificaron en los grupos A, B y C de acuerdo con el consumo de lactosa, siendo el grupo B el que menos consume esta fuente y los aislamientos que se analizaron en este trabajo provenían de cultivo de tabaco. En el caso de las cepas nativas aquí estudiadas consumieron menos lactosa que el resto y provienen de suelos de tabaco, por lo tanto, se considera que probablemente se encuentren dentro del grupo B. El agrupamiento por medidas del carácter similitud de los marcadores genéticos demostró que las cepas de T. harzianum nativas tienen alta similitud. Los grupos 1 y 2a mantuvieron una distancia genética menor (95%). Con esto se demuestra que estos grupos están cercanamente relacionados en cuanto a sus caracteres fenotípicos y genotípicos (Fig. 9). Si bien es importante destacar que las cepas nativas T-016 y T-003 mostraron patrones de bandas diferentes a las del resto, ambas cepas son las únicas obtenidas de suelos con cultivo de Solanum melongena L. (berenjena) y tienen bajo consumo de lactosa y N-acetil-D-glucosamina, lo cual los ubica dentro del grupo B anteriormente mencionado. De acuerdo con Hoyos-Carvajal et al. (2009) los aislamientos de cada grupo estarían asociados entre sí por ciertas características del hábitat como sustrato, tipo de suelo y condiciones climáticas. Los agrupamientos de cepas en base a caracteres ambientales está tomando importancia dentro de T. harzianum, se deberían hacer más comparaciones con las cepas estudiadas por Hoyos-Carvajal et al. (op. cit.), Branco Rocha (2011) y generar consenso entre los distintos grupos conformados para confirmar su robustez. Las cepas exóticas presentan mayor variabilidad genética. Las cepas T-032/34 del Reino Unido se utilizaron como referencia y se agruparon con un coeficiente menor al 0,5. El agrupamiento por marcadores moleculares fue el mismo que el obtenido por Grondona et al. (1997) al estudiar los atributos fisiológicos, bioquímicos y morfológicos
44 Capítulo II Discusión/ Conclusiones de las mismas cepas. En el caso de T-020 queda como grupo externo, por ser de una especie distinta del resto (T. ghanense). En base a lo anteriormente mencionado se acepta la Hipótesis 3 en la cual se plantea que las cepas nativas y exóticas pueden ser diferenciadas por sus caracteres genéticos. En conclusión la colección de cepas BCAs de T. harzianum nativas tienen baja variabilidad genética según los marcadores neutros obtenidos por RAPD y UP-PCR y las cepas nativas mostraron mayor similitud genética entre ellas y se diferenciaron con respecto a las exóticas. Todas estas condiciones y factores serán tenidos en cuenta para la elaboración de formulaciones con las cepas pertenecientes al GF 1, las cuales presentan alta capacidad biocontroladora.
Análisis de polimorfismos obtenidos
En este estudio, con 46 reacciones de amplificación con 8 cebadores UP-PCR se obtuvieron 58 marcadores polimórficos. A diferencia de estos resultados Consolo et al. (2012) obtuvieron 4 a 8 polimorfismos amplificando con 4 cebadores UP-PCR, con 33 cepas de distintas especies del estado anamórfico Trichoderma. Es importante destacar que en el presente trabajo la cantidad de marcadores polimórficos obtenidos es superior porque se utilizaron mayor cantidad de cepas (43) y los cebadores fueron combinados de manera tal de obtener 46 reacciones. Los resultados obtenidos por el empleo de la técnica de RAPD con 128 cebadores rindieron 48 polimorfismos, es decir, que la relación de polimorfismos con esta técnica fue superada por la de UP-PCR. En cuanto a la especificidad de los polimorfismos de marcadores se encontró que 15 fueron específicos para 5 cepas con la reacción de RAPD, en tanto que con la técnica de UP-PCR 5 resultaron específicos para la cepa T-023. La técnica UP-PCR rindió mayor número de polimorfismos, sin embargo, si bien la de RAPD es más costosa, consume más tiempo y requiere mayor número de repeticiones que la de UP-PCR, rindió mayor número de polimorfismos específicos para mayor número de cepas. Hermosa et al. (2001) encontraron 3 marcadores polimórficos cuando amplificaron 16 cepas con 30 cebadores RAPD. La relación obtenida en este estudio fue 3 veces superior a la obtenida por los autores antes mencionados. La técnica
45 Capítulo II Discusión/ Conclusiones
UP-PCR fue más eficiente que RAPD con respecto al número de polimorfismos aunque fue a la inversa en el número de polimorfismos específicos y la relación con el número de cepas. De los polimorfismos encontrados se seleccionaron dos SCAR provenientes de de la cepa T. harzianum T-023 y obtenidos con cada técnica, a los cuales se los denominó M6b 23 y K12 23. Estos SCAR fueron analizados para reconocer su especificidad por la cepa T-023. Se obtuvieron 20 marcadores que podrían ser aplicados en la síntesis de marcadores SCAR, uno de ellos es posiblemente específico de la especie T. harzianum aunque no de una cepa en particular. En el análisis por —Southern blotting“ las sondas generadas a partir de las secuencias SCAR hibridaron con todas las cepas de T. harzianum de la colección. Se obtuvo así un marcador no específico para la cepa T-023, por lo que no se pudieron sintetizar los cebadores SCAR específicos para el polimorfismo a nivel de cepa. Probablemente se trate de un marcador para la especie T. harzianum. Esto concuerda con Hermosa et al. (2001) quienes encontraron un SCAR específico a nivel de especie para T. atroviride, resultado analizado y confirmado posteriormente por Cordier et al. (2007). La caracterización de las cepas de T. harzianum obtenida en este estudio permitirá elaborar formulaciones más eficientes, en proceso de registro, que incluyen las cepas argentinas.
46 M dios de cultivo
APG (Agar Papa Glucosado) OXOID
MEA (Agar Malta) OXOID (=AEM)
CMD (Corn Meal Agar adicionado con dextrosa) Harina de maíz 30 g Agar OXOID 20 g Agua destilada 1000 ml Dextrosa 2%
SNA (Spezieller Nährstoffarmer Agar) KH2PO4 1 g KNO3 1 g MgSO4.7H2O 0,5 g KCl 0,5 g Glucosa 0,2 g Sacarosa 0,2 g Agar OXOID 20 g Agua destilada 1000 ml
Medio Butler Suelo 96 g Salvado de trigo 4 g Se esteriliza a 120 ºC durante 1 h, 2 días consecutivos
Medios Lynch LYNCH A (para fuentes de Nitrógeno) Sacarosa 10 g KH2PO4 1 g KCl 0,5 g MgSO4.7H2O 0,2 g CaCl2.2H2O 0,1 g púrpura de bromocresol 0,05 g/l agua destilada 1000 ml
Fuentes de N: 0,2% V Creatina (LACR) 2 g V Oxalato amónico (LAAO) 2 g V Nitrito sódico (LANI) 2 g V Glicina (LAGLY) 2 ml V Urea (LAU) 2 ml
LYNCH B (para fuentes de Carbono) NH4H2PO4 1 g KCl 0,2 g MgSO4.7H2O 0,2 g Sol. de Cu 0,5% 1 ml Sol. de Zn 1% 1 ml púrpura de bromocresol 0,05 g/l agua destilada 1000 ml
Fuentes de C: 1% V Glucosa (LBGL) 10 g V Etanol (LBE)* 10 g V Acido láctico (LBAL) 10 g V Oxalato amónico (LBAO) 10 g V Tartrato amónico (LBTA) 10 g V Acido cítrico (LBAC) 10 g
Medio GYM (Glucose Yeast Medium) Glucosa 10 g NH4H2PO4 1 g KCl 0,2 g MgSO4.7H2O 0,2 g Extracto levadura 5 g Solución de Zn 1% 1 ml Solución de Cu 0,5% 1 ml Agua destilada 1000 ml
TSM (¨Trichoderma Selective Medium¨ Medio Selectivo para Trichoderma) Elad et al. (1981) MgSO4.7H2O 0,2 g KH2PO4 0,9 g NH4NO3 1 g KCl 0,15 g Rosa Bengala 0,15 g Glucosa 3 g Agar 20 g Agua destilada 950 ml
Posteriormente al ciclo de autoclavado a 121 ºC 15 min Se adicionan al medio basal enfriado
Cloranfenicol 6,25 g/ml Solución streptomicina 1%
TAE Buffer Tris base 242 g Acido Acético Glacial 57,1 ml 0,5M EDTA (pH 8,0) 100 ml
Tabla 2-II. Lista de primers utilizados
nombre sequencia reacción referencia L45 5‘-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3´ UP-PCR Bulat et al ., 1998
AA2M2 5‘-CTG CGA CCC AGA GCG G-3´ UP-PCR Lübeck et al. , 1998
L15/AS19 5‘-GAG GGT GGC GGC TAG-3´ UP-PCR Lübeck et al ., 1998
AS15inv 5‘-CAT TGC TGG CGA ATC GG-3´ UP-PCR Lübeck et al ., 1998
3*2 5‘-TAA GGG CGG TGC CAG T-3´ UP-PCR Bulat & Mironenko, 1992
L21 5‘-GGA TCC GAG GGT GGC GGT TCT-3´ UP-PCR Lübeck et al ., 1998
AS4 5‘-TGT GGG CGC TCG ACA C-3´ UP-PCR Lübeck et al ., 1998
AS15 5‘-GGC TAA GCG GTC GTT AC-3´ UP-PCR Bulat et al ., 1994
Ef728M 5´-CAT YGA GAA GTT CGA GAA GG-3´ tef1 Samuels et al ., 2011
Ef2 5´-GGA RGT ACC AGT SAT CAT GTT-3´ tef2 Samuels et al ., 2011
ITS1 5´-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3´ ITS White et al ., 1990
ITS4 5´-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3´ ITS White et al ., 1990
RPB-F2 5´-GAA GCG TCT GGA TYT SGC-3´ rpb2 Samuels et al ., 2011
RPB-R2 5´-GGG GAA AGG RAT GAT ACT-3´ rpb3 Samuels et al ., 2011
RPB-450R 5´-TCC ATR CCT CTG TTG ATC AT-3´ rpb4 Samuels et al ., 2011
RPB-432F 5´-ATG ATC AAC AGA GGY ATG GA-3´ rpb5 Samuels et al ., 2011 Tabla 3-II. Variables fisiológicas utilizadas en el análisis de marcadores moleculares.
METODO
BIOLOG C y N API®-ZYM N-acetil-D-Glucosamina CRELBGL Fosfatasa alcalina Adonitol CRELBE Esterasa C1 Amigdalina CRELBAC Esterasa lipasa C8 L-Arabinosa CRELBAL Lipasa C14 D-Arabitol CRELBOA Leucina arilamidasa Arbutina CRELBTA Valina arilamidasa D-Celobiosa ESPLBGL Cistina arilamidasa Dextrina ESPLBE Tripsina i-Eritritol ESPLBAC '-Quimotripsina D-Fructosa ESPLBAL Fosfatasa acida D-Galactosa ESPLBOA Naftol-A-S-BI-fosfohidrolasa Gentobiosa ESPLBTA '-Galactosidasa D-Glucosamina ALCLBGL +-Galactosidasa '-D-Glucosa ALCLBE +-Glucuronidasa Glicerol ALCLBAC '-Glucosidasa Glucógeno ALCLBAL +-Glucosidasa Acido 2-ceto-D-Glucónico ALCLBOA N-acetil-+-Glucosaminidasa '-D-Lactosa ALCLBTA '-Manosidasa Maltosa CRELACR '-Fucosidasa Maltotriosa CRELAOA D-Manitol CRELANS D-Manosa CRELAGY D-Melibiosa CRELAU +-Metil-D-Glucósido ESPLACR D-Ribosa ESPLAOA Salicina ESPLANS D-Sorbitol ESPLAGY D-Trehalosa ESPLAU Xilitol ALCLACR D-Xilosa ALCLAOA Acido 2-Amino Butírico ALCLANS L-Alanina ALCLAGY L-Alanil-Glicina ALCLAU Acido L-Glutámico L-Prolina Acido L-Piroglutámico Tabla 3-II. Variables fisiológicas utilizadas en el análisis de marcadores moleculares. Lista de acrónimos utilizados
ACB Agente de Control Biológico ISR —Induced Sistemic Resistance“ Resistencia Sistémica Inducida ITS Internal Transcribed Spacers —Espaciadores internos transcriptos LKB —Large Koningii Branch“ Rama Koningii mayor (Samuels et al., 2006) LVC —Large Viridescens Clade“ Clado Viridescens mayor (Jaklitsch et al., 2006) L/W relación largo/ancho MS metabolitos secundarios PCR —Polymerase Chain Reaction“ Reacción en cadena de la polimerasa RAPD —Random Amplified Polimorphic DNA“ Amplificación al azar de ADN polimórfico rpb2 subunidad 2 de la RNA polimerasa SCAR —Sequence Characterized Amplified Region“ Región amplificada caracterizada por secuencia tef1 —Transcription Elongation Factor“ Factor de transcripción de la elongación UP-PCR —Universal-Primed PCR“ PCR con cebadores universales APG agar papa glucosado MEA —Malt Extract Agar“ extracto agar malta (=AEM) SNA medio mínimo para cultivo de hongos CMD —Corn Meal Dextrose“ harina de maíz adicionado con dextrosa PDB —Potato Dextrose Broth“ caldo papa adicionado con dextrosa TSM —Trichoderma Selective Media“ medio de cultivo selectivo para aislamientos de Trichoderma spp. ACP Análisis de Componentes Principales ACoorP Análisis de Coordenadas Principales PG Procrustes Generalizado UPGMA —Unweighted pair-group method, arithmetic average“ Método no ponderado de grupos apareados con media aritmética. BIOLOG Sistema de asimilación de fuentes carbonadas por microplacas Capítulo II Referencias
ferencias
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53 Contribuciones
Esta es la primera vez que se hace un estudio polifásico integral del taxón Hypocrea/Trichoderma encarando el estudio de la biodiversidad, la morfología, la filogenia e incluyendo el estudio de la variabilidad de cepas biocontroladoras de T. harzianum.
Se realiza por primera vez un análisis filogenético con un importante número de aislamientos en relación con los resultados publicados por los autores dedicados a la taxonomía del grupo.
Contribuciones
Se identificaron 36 especies del género Hypocrea/Trichoderma presentes en la Argentina.
Se encontraron 4 especies distintas a las conocidas, con lo cual se incorporan especies nuevas para la ciencia.
Dos especies se citan por primera vez para Sudamérica.
17 especies se citan por primera vez para la Argentina.
Se cita por primera vez la relación teleomorfo-anamorfo para T. longibrachiatum.
Con respecto a la biodiversidad del género en los sitios muestreados de Argentina se identificaron alrededor del 27% de las especies conocidas mundialmente.
El estudio de los aislamientos de T. harzianum deberá ser profundizado y ampliado con aislamientos sudamericanos para demostrar la existencia de las entidades taxonómicas discutidas.
Con los resultados de esta tesis se concuerda con la conformación del grupo LVC y que es cosmopolita. Más aún con la hipótesis de Trichoderma sp. 1 daríamos una mayor identidad al mismo, reforzando su presencia en América del Sur. Confirmando lo postulado por Jaklitsch et al. (op. cit.) acerca de la biogeografía del grupo LVC con presencia confirmada en Sudamérica.
En cuanto al sistema de clasificación acepto el de Druzhinina & Kubicek (2005), excepto que reemplazaría el Clado Rufa por los Clados LKB y LVC.
Se actualizaron los nombres de las especies propuestas por Spegazzini.
Se ha determinado que las variables que más permiten diferenciar a las cepas T. harzianum BCAs es la asimilación de las fuentes de carbono y nitrógeno.
Se desarrolló la tecnología para la búsqueda de marcadores SCAR que permitirá hacer un seguimiento de los microorganismos utilizados como BCAs.
La identificación y caracterización de las cepas de T. harzianum BCAs confirman la alta variabilidad intraespecífica observada en los caracteres genéticos.