UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

MORFOANATOMIA E HISTOQUÍMICA COMPARATIVA ENTRE ALTERNANTHERA BRASILIANA (L.) KUNTZE E ALTERNANTHERA DENTATA (MOENCH) STUCHLIK; ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOLÓGICO DE ALTERNANTHERA BRASILIANA

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Danielle Fontana Pereira

Santa Maria, RS, Brasil 2007

MORFOANATOMIA E HISTOQUÍMICA COMPARATIVA ENTRE ALTERNANTHERA BRASILIANA (L.) KUNTZE E ALTERNANTHERA DENTATA (MOENCH) STUCHLIK; ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOLÓGICO DE ALTERNANTHERA BRASILIANA

por

Danielle Fontana Pereira

Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do Programa de Pós- Graduação em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração em Controle e Avaliação de Insumos e Produtos Farmacêuticos, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Orientador: Profª. Drª. Margareth Linde Athayde

Santa Maria, RS, Brasil 2007

Universidade Federal de Santa Maria Centro de Ciências da Saúde Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

A Comissão Examinadora, abaixo-assinado, aprova a Dissertação de Mestrado

MORFOANATOMIA E HISTOQUÍMICA COMPARATIVA ENTRE ALTERNANTHERA BRASILIANA (L.) KUNTZE E ALTERNANTHERA DENTATA (MOENCH) STUCHLIK; ESTUDO FITOQUÍMICO E

BIOLÓGICO DE ALTERNANTHERA BRASILIANA

elaborada por Danielle Fontana Pereira

como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

COMISSÃO ORGANIZADORA:

Margareth Linde Athayde, Profª. Drª. (Presidente/Orientadora)

Clarice Azevedo Machado, Profª. Drª. (PUCRS)

Melânia Palermo Manfron, Profª. Drª. (UFSM)

Santa Maria, 29 de janeiro de 2007

AGRADECIMENTOS

Primeiramente gostaria de agradecer a Deus, sem sua presença nada disso seria possível. Principalmente nos maiores obstáculos pude perceber que a fé me fez forte para superá-los. À Profª. Drª. Margareth Linde Athayde, meu agradecimento e admiração por ter proporcionado, desde o início de minha formação, uma atenção especial sendo muitas vezes mais que orientadora, se tornando uma amiga e, em diversas situações, representando uma segunda mãe, dando-me a força e estímulo necessário para que prosseguisse em busca do meu ideal. Ao Prof. Dr. Sydney Hartz Alves e à sua aluna, colega e amiga Patrícia Pozzatti, do laboratório de pesquisas micológicas da UFSM, pela realização dos testes acerca da atividade antimicrobiana dos extratos fracionados assim como pelo auxílio na interpretação dos resultados. A Maria Angélica Silveira Lima (setor de Ressonância Magnética do Departamento de Química da UFSM) por ter disponibilizado de seu tempo de modo a me repassar seus conhecimentos sobre interpretações de espectros, além da realização de análises de 13C RMN e 1H RMN de Alternanthera brasiliana. Ao chefe do Departamento de Morfologia Prof. Dr. Aron Ferreira da Silveira, por me despertar para o mundo das pesquisas e por ter acompanhado todos meus passos até o dia de minha titulação. Ao Departamento de Farmácia Industrial, principalmente ao Prof. Dr. Sérgio Dalmora, por se sensibilizar com meu acidente, dando-me todo o apoio necessário. Aos professores do curso de pós-graduação pelos conhecimentos compartilhados durante minha formação, disponibilidade e atenção, meus mais sinceros agradecimentos. Principalmente à coordenadora do curso Profª. Drª. Simone Cardoso, a qual pude compartilhar inúmeros momentos de descontração, juntamente com outros docentes do programa de pós-graduação estando entre eles o Prof. Dr. Ruy Beck. À todos que no dia 29 de abril de 2006, se mobilizaram acerca do meu acidente e que, das mais diversas formas, prestaram algum tipo de solidariedade, se estendendo pelos longos e tão sofridos meses de recuperação. Pelos inúmeros abraços, beijos, telefonemas, mensagens de incentivo. Nesta época pude perceber que, além de um grupo de pesquisadores, pertenço a um grupo de amigos. Pessoas que conviveram comigo e, igualmente a mim, fazem do Centro de Ciências da Saúde (CCS) sua segunda casa, ao pessoal dos laboratórios, da coordenação do curso, ao diretor do Centro e ao reitor Clovis Lima. Uma homenagem muito especial de agradecimento à técnica de laboratório Vera Pagliarin por ter me ajudando, reduzindo os danos em meu corpo. Serei eternamente grata a ti, meu carinho e admiração são imensuráveis. Ao, em breve, Drº. Gilberto Dolejal Zanetti pelo conhecimento botânico repassado, de fundamental importância para a realização deste trabalho além dos telefonemas de preocupação com minha recuperação, meu respeito por ti ultrapassa as barreiras do conhecimento e quero muito que esse laço de amizade perdure por todo nosso caminho. Concomitantemente, quero agradecer a Profª. Drª. Melânia Palermo Manfron que também participou ativamente neste trabalho e solidariamente, me levou até o Pronto Socorro tentando minimizar minhas dores, passando-me a força necessária para superar aquele momento. Ao meu “bixo”, aluno, colega e, principalmente, amigo Francisco Maikon pelos inúmeros gestos e palavras de carinho e preocupação. Aos colegas de pós-graduação pelo tempo que deixaram de realizar seus trabalhos para me dar alguns minutos de atenção. Aos bolsistas Mariane, Bruna, Ticiane, Clarice, Aline, mestrandos Leandro, Aline Bolzan, Maikon, Adiene, Janaína e Michel e ao já mestres Ricardo e Chana, que conviveram comigo no laboratório de fitoquímica tornando as inúmeras horas de trabalho momentos de descontração e demonstração de companheirismo, amizade e incentivo quando, por muitas vezes, todo o conhecimento e empenho pareciam lutar contra nossos ideais, fazendo com que mais uma vez as tradicionais frases surgissem: “Resultado negativo também é resultado!”, “Fala sério!”, “É mole?!” Muito obrigada a todos vocês. As minhas verdadeiras amigas com quem pude compartilhar, diariamente, os momentos de “despressurização”, Marcela (Alemoa), Gabriela, Silvinha, Fibele, vocês estarão para sempre no meu coração. Ao meu namorado Luis Henrique pelo amor e carinho, por entenderes quando não podia estar presente e por toda tua dedicação quando me tornei, temporariamente, dependente de tua ajuda. Te amo, Baby! Aos meus queridos pais, Érico e Nelise e a minha irmã Marcelle que mesmo distante fisicamente estava sempre presente em meu coração. Como no dia de minha formatura, torno a repetir: “vocês são a fórmula do meu sucesso”. Obrigada por darem apoio as minhas invenções, por me darem o chão quando o senti faltar, por me darem atenção e principalmente amor. Não poderia deixar de agradecer profundamente por se mostrarem uma verdadeira família, quando mesmo depois de crescida, tornei a depender de vocês e, independente do obstáculo, estavam em todos os momentos presentes nessa difícil etapa. Te amo pai! Te amo mãe! Te amo Mar!

Alguns homens vêem as coisas como elas são e perguntam: POR QUE? Nós sonhamos com as coisas como elas nunca foram e nos perguntamos: POR QUE NÃO?

Georges Bernard Shaw RESUMO

Dissertação de Mestrado

Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas Universidade Federal de Santa Maria, RS, Brasil

MORFOANATOMIA E HISTOQUÍMICA COMPARATIVA ENTRE ALTERNANTHERA BRASILIANA (L.) KUNTZE E ALTERNANTHERA DENTATA (MOENCH) STUCHLIK; ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOLÓGICO DE

ALTERNANTHERA BRASILIANA

AUTORA: DANIELLE FONTANA PEREIRA ORIENTADORA: PROFª. DRª. MARGARETH LINDE ATHAYDE Data e Local da Defesa: Santa Maria, 29 de janeiro de 2007.

A família Amaranthaceae compreende, aproximadamente 65 gêneros e 1000 espécies de herbáceas. O gênero Alternanthera está inserido nesta família e encontra-se amplamente distribuído pelo mundo. As espécies Alternanthera brasiliana (L.) Kuntze e Alternanthera dentata (Moench) Stuchlik são igualmente conhecidas por “penicilina”, sendo encontradas no Brasil, mais comumente nos estados de Santa Catarina e Rio Grande do Sul. O uso popular da espécie A. brasiliana destina-se ao tratamento de amigdalites, gripes e resfriados já para a espécie A. dentata foi referenciada em infecções, febre acompanhadas de dor de cabeça e também como antiséptico para sarnas e feridas. Este trabalho visa determinar parâmetros farmacognósticos de diferenciação entre as referidas espécies, uma vez que há discordância entre botânicos da existência da espécie dentata. As características macroscópicas que podem auxiliar na autenticação das espécies são contorno, cor, abundância de tricomas no limbo e a forma do pecíolo. As análises anatômicas permitiram a diferenciação através do tipo de estômatos encontrados (anfiestomático e hipostomático) além da ocorrência do colênquima, disposição do floema e a ausência de tricomas tectores na face adaxial de A. dentata. A presença da bainha vascular com anatomia de Kranz caracterizou o tipo C4 da família Amaranthacea. Adicionalmente, o trabalho descreve a identificação de β-sitosterol, estigmasterol e espinasterol oriundos da fração diclorometânica das folhas de A. brasiliana. As folhas de A. brasiliana para as análises farmacobotânica, fitoquímicas e atividades biológicas foram coletadas em dezembro de 2004 e março de 2005 nos municípios de Santa Cruz do Sul e Santa Maria, sendo identificadas pela bióloga Drª. Thaís do Canto Dorow (Dpto. Biologia, UFSM). As excicatas estão depositadas no Herbário do Departamento de Biologia da UFSM sob registro SMDB10038 e 10039, respectivamente. A espécie A. dentata utilizada no estudo morfo-anatômico foi coletada no município de Florianópolis, sendo identificada pelo pesquisador da EPAGRI-SC Antônio Amaury Silva Jr., e confirmada pelas biólogas da Universidade Federal de Pelotas Elen N. Garcia e Sílvia Rubin, tendo seu registro no herbário da instituição 03 (PEL-UFPEL) 04/07/06 e no Herbário da UFSM SMDB 10100. Quanto a atividade antimicrobiana, a melhor resposta obtida foi com a fração diclorometânica frente a alga Prototheca zopffi mas também foram encontrados CIM satisfatórios para as bactérias Gram-positivas S. aureus e B. subtillis e para o fungo S. cerevisiae. A maior atividade antioxidante foi encontrada na fração acetato de etila, a qual evidenciou um IC50=163, 01µg/mL. Não foi evidenciada correlação entre teores de polifenóis e atividade antioxidante.

Palavras-chave: Alternanthera brasiliana, Alternanthera dentata, morfoanatomia, histoquímica, fitoquímica, microbiologia, antioxidante e polifenóis. ABSTRACT

Máster Dissertation Post-Graduate Program in Pharmaceutical Science Federal University of Santa Maria, RS, Brazil

COMPARATIVE MORPHOANATOMY AND HISTOCHEMISTRY BETWEEN ALTERNANTHERA BRASILIANA (L.) KUNTZE AND ALTERNANTHERA DENTATA (MOENCH) STUCHLIK; PHYTOCHEMICAL AND BIOLOGICAL STUDY

OF ALTERNANTHERA BRASILIANA

AUTHOR: DANIELLE FONTANA PEREIRA ADVISER: PROFª. DRª. MARGARETH LINDE ATHAYDE Data e Local da Defesa: Santa Maria, 29 de janeiro de 2007.

The family Amaranthaceae consist of approximately 65 genus and 1000 species of herbaceous plants. The genus Alternanthera is in this family and can be found spread worldwide. The Alternanthera brasiliana (L.) Kuntze and Alternanthera dentata (Moench) Stuchlik species are known as “penicillin” and can be found in Brazil, commonly in Santa Catarina and Rio Grande do Sul. The popular usage of the A. brasiliana specie is for the treatment of tonsillitis, cold and the influenza and the A. dentata is used to treat infections, fever along with headache and is also used as antiseptical for the treatment of itches and wounds. This work aims at to stipulate pharmacognostics parameters of distinguishment between the two cited species because there is a disagreement among the botanics about the existence of the dentata species. The macroscopical characteristics that can help authenticate them are: the perimeter, color, the abundance of trichomas in the limb and the shape of the stalk. The anatomical analysis had allowed the distinction through the type of found stomata (anfiestomatic and hipostomatic), the existence of the collenchyma disposal of the phloem and the absence of trichomes in the adaxial surface of A. dentata. The presence of the Kranz sheath characterized the type C4 of the Amaranthaceae family. Additionally, this work describes the identification of β-sitosterol, stigmasterol and espinasterol isolated from dichloromethane fraction of A. brasiliana leaves. The A. brasiliana leaves used in the pharmacobotanic and phytochemistry analyses and in the biological activities were collected in December 2004 and March 2005 in Santa Cruz do Sul (RS) and Santa Maria (RS), the leaves were identified by the biologist Dr. Thaís do Canto Dorow (Dpt. of Biology, UFSM). The vouchers are deposited in the Department of Biology herbarium of UFSM respectively under the register numbers SMDB 10038 and 10039. The A. dentata specie used in the morpho- anatomic study was collected in Florianópolis (SC) and was identified by the researcher Antônio Amaury Silva Jr. of EPAGRI-SC and confirmed by Elen N. Garcia and Sílvia Rubin, both biologists of the Federal University of Pelotas. This specie used in the study is registered in the institution 03 herbarium (PEL-UFPEL) 04/07/06 and in the UFSM herbarium SMDB 10100. In relation to the antimicrobial activity the best result was obtained in the dichloromethane fraction with the Prototheca zopffi algae but it was also found satisfactory MIC for the Gram-positive S. aureus and B. subtillis bacteria and for the S. cerevisiae fungus. The biggest antioxidant activity was found in the acetate of ethyla fraction wich evidenced a IC50=163, 01ug/mL. The correlation between the polyphenol tenors and the antioxidant activity was not possible.

Key-words: Alternanthera brasiliana, Alternanthera dentata, morphoanatomy, histochemistry, phytochemical, microbiology, antioxidant and polyphenol.

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 – Procedimentos gerais para a obtenção de compostos biologicamente ativos ...... 24 FIGURA 2 – Estrutura química do ácido gálico (ácido fenólico derivado do ácido benzóico) ...... 29 FIGURA 3 – Estames de Alternanthera brasiliana ...... 34

FIGURA 4 – Aspecto geral das flores com brácteas de Alternanthera brasiliana . 36 FIGURA 5 – Aspecto geral das flores com brácteas de Alternanthera dentata ... 36 FIGURA 6 – Partição líquido-líquido e obtenção das frações orgânicas de Alternanthera brasiliana a partir de um fracionamento neutro do extrato bruto hidroalcoólico 70% ...... 44 FIGURA 7 – Aspecto geral dos ramos vegetativos de Alternanthera brasiliana (7a) e Alternanthera dentata (7b) ...... 52 FIGURA 8 – Aspecto macroscópico da folha fresca de Alternanthera brasiliana (fig. 8a) e Alternanthera dentata (fig. 8b). 1a.-lâmina foliar vista ventral; 1b.-lâmina foliar vista dorsal; 2a.-lâmina foliar vista dorsal; 2b.-lâmina foliar vista ventral ...... 54 FIGURA 9 – Margem da lâmina foliar de Alternanthera brasiliana (fig. 9a) e Alternanthera dentata (fig. 9b). Legenda: as setas indicam os tricomas presentes na margem foliar ...... 54 FIGURA 10 – Tricomas da face dorsal da folha fresca de Alternanthera brasiliana (fig. 10a) e Alternanthera dentata (fig. 10b) ...... 55 FIGURA 11 – Limbo de Alternanthera brasiliana (fig. 11a) e Alternanthera dentata (fig. 11b) evidenciando os tricomas tectores ...... 55 FIGURA 12 – Aspecto geral da seção transversal do pecíolo de Alternanthera brasiliana (fig. 12a) e Alternanthera dentata (fig. 12b) ...... 55 FIGURA 13 – Margem fimbriada, camptódroma, eucamptódroma de Alternanthera brasiliana (fig. 13a) e Alternanthera dentata (fig. 13b) em detalhe ...... 56 FIGURA 14 – Aureola pentagonal a irregular das faces ventrais dos limbos foliares de Alternanthera brasiliana (fig. 14a) e Alternanthera dentata (fig. 14b) ...... 56 FIGURA 15 – Seção transversal evidenciando o aspecto geral da região central do limbo da folha de Alternanthera brasiliana. Legenda: 1. epiderme adaxial; 2. epiderme abaxial; 3. Parênquima paliçadico; 4. Parênquima esponjoso; 5. Feixe vascular, 6. colênquima ...... 59 FIGURA 16 – Seção transversal evidenciando o aspecto geral da região central do limbo da folha de Alternanthera dentata. Legenda: 1. epiderme da região superior; 2. epiderme da região inferior; 3. Parênquima paliçádico; 4. Parênquima esponjoso; 5. Feixe vascular; 6. Colênquima ...... 60 FIGURA 17 – Seção transversal evidenciando o aspecto geral do feixe vascular central no limbo da folha de Alternanthera brasiliana (fig. 17a) e Alternanthera dentata (fig. 17b). Legenda: 1- Xilema; 2- Floema; 3- Parênquima ...... 60 FIGURA 18 – Seção transversal da região lateral do limbo da folha de Alternanthera brasiliana (fig. 18a) e Alternanthera dentata (fig. 18b) evidenciando feixe vascular secundário protegido por bainha vascular parenquimática. Legenda: 1. Bainha vascular parenquimática; 2. Xilema; 3. Floema ...... 61 FIGURA 19 – Seção transversal da região lateral do limbo da folha de Alternanthera brasiliana (fig. 19a) e Alternanthera dentata (fig. 19b) evidenciando detalhe de feixes vasculares laterais. Legenda: 1. idioblasto cristalífico; 2. feixe vascular; 3. Bainha vascular parenquimática ...... 61 FIGURA 20 – Seção transversal da região lateral do limbo da folha de Alternanthera brasiliana (fig. 20a) e Alternanthera dentata (fig. 20b) evidenciando mesofilo. Legenda: 1. Estômatos xerofíticos na epiderme da região abaxial e adaxial; 2. Parênquima paliçadico; 3. Parênquima esponjoso ...... 62 FIGURA 21 – Seção paradérmica da face abaxial do limbo de folhas de Alternanthera brasiliana (fig. 21a) e Alternanthera dentata (fig. 21b) evidenciando tricomas tectores. Legenda: 1a.- tricoma tector unisseriado com parede verugosa formado por 3células; 1b.- tricoma tector unisseriado com parede verugosa formado por 4 células; 2a.- tricoma tector unisseriado com parede verrugosa formado por 3 células ...... 62 FIGURA 22 – Seção paradérmica da face abaxial do limbo de folhas de Alternanthera brasiliana (fig. 22a) e Alternanthera dentata (fig. 22b) evidenciando células epidérmicas. Legenda: 1a. e 2a.- célula epidérmica com parede anticlinal sinuosa; 1b.e 2b.- estômatos diacíticos (predomina) ...... 63 FIGURA 23 – Seção paradérmica da face adaxial do limbo de folhas de Alternanthera brasiliana (fig. 23a) e Alternanthera dentata (fig. 23b) evidenciando células epidérmicas. Legenda: 1a.- células epidérmica com parede anticlinal reta e/ou levemente sinuosa; 2a.- células epidêmicas com parede anticlinal pouco sinuosa; 1b. e 2b.- estômato diacítico ...... 63 FIGURA 24 – Coloração por tinta da china evidenciando mucilagens – folhas de Alternanthera brasiliana (fig. 24a) e de Alternanthera dentata (fig. 24b) ...... 65 FIGURA 25 – Coloração por cloreto férrico evidenciando polifenóis em seção transversal da folha de Alternanthera brasiliana ...... 65 FIGURA 26 – Coloração por hidróxido de potássio 5% evidenciando flavonóides em seção transversal das folhas de Alternanthera brasiliana (fig. 26a) e Alternanthera dentata (fig. 26b) ...... 66 FIGURA 27 – Coloração do Sudan III evidenciando óleos voláteis em seção transversal das folhas de Alternanthera brasiliana (fig. 27a) e Alternanthera dentata (fig. 27b) ...... 66 FIGURA 28 – Coloração por reativo lugol evidenciando grãos de amido em seção transversal das folhas de Alternanthera brasiliana (fig. 28a) e Alternanthera dentata (fig. 28b) ...... 66 FIGURA 29 – Coloração por reativo de Dragendorff evidenciando alcalóides em seção transversal das folhas de Alternanthera brasiliana (fig. 29a) e Alternanthera dentata (fig. 29b) ...... 67 FIGURA 30 – Cromatograma das frações diclorometânicas de A. brasiliana

com observação sob luz visível. Sistema eluente: CH2Cl2: EtOH (9:1), revelador: anisaldeído-sulfúrico e aquecimento a 100ºC ..... 71 FIGURA 31 – Cromatograma das frações 4 a 10 da coluna 1 com observação sob luz visível. Sistema eluente: hexano:acetona (9:1)-migrado 4 vezes, revelador: anisaldeído-sulfúrico e aquecimento a 100ºC .. 72 FIGURA 32 – Cromatograma das frações 1 a 34 da coluna 2 com observação sob luz visível. Sistema eluente: hexano:acetona (9:1), revelador: anisaldeído-sulfúrico e aquecimento a 100ºC ...... 73 FIGURA 33 – Cromatograma das frações 1 a 34 da coluna 2 com observação sob luz ultravioleta. Sistema eluente: hexano:acetona (9:1), revelador: anisaldeído-sulfúrico e aquecimento a 100ºC ...... 73 FIGURA 34 – Cromatograma das frações 13 a 15 da coluna 2 com observação

sob luz visível. Sistema eluente: CH2Cl2-migrado 2 vezes, revelador: anisaldeído-sulfúrico e aquecimento a 100ºC ...... 74 FIGURA 35 – Cromatograma das frações 28 a 32 da coluna 3 com observação

sob luz visível. Sistema eluente: CH2Cl2, revelador: anisaldeído- sulfúrico e aquecimento a 100ºC ...... 75 FIGURA 36 – Isolamento de Ab1 a partir do fracionamento da fração diclorometânica de Alternanthera brasiliana sobre gel de sílica ...... 76 FIGURA 37 – Cromatograma bidimensional de Ab1 com observação sob luz ultravioleta. Sistema eluente: 1ª migração: hexano: AcoEt (1:1);

2ª migração: CHCl2: AcoEt (7:3), revelador: anisaldeído-sulfúrico e aquecimento a 100º C ...... 76 FIGURA 38 – Diferença estrutural entre os triterpenos estigmasterol, β-sitosterol e espinasterol ...... 77 13 FIGURA 39 – Espectro de C RMN de Ab1, em CDCl3 ...... 78 FIGURA 40 – Cromatograma das frações 1 a 6 da coluna 4 com observação

sob luz visível. Sistema eluente: CHCl3, revelador: anisaldeído- sulfúrico e aquecimento a 100ºC ...... 83 FIGURA 41 – Cromatograma das frações 6 a 11 e material de partida da

coluna 4 com observação sob luz visível. Sistema eluente: CHCl3 (migrado 3 vezes), revelador: anisaldeído-sulfúrico e aquecimento a 100ºC ...... 84 FIGURA 42 – Cromatograma das frações 1 a 30 da coluna 5 com observação

sob luz visível. Sistema eluente: CHCl3, revelador: anisaldeído- sulfúrico e aquecimento a 100ºC ...... 84 FIGURA 43 – Cromatograma das frações 1 a 30 da coluna 5 com observação

sob luz ultravioleta. Sistema eluente: CHCl3, revelador: anisaldeído-sulfúrico e aquecimento a 100ºC ...... 85 FIGURA 44 – Cromatograma da mistura Ab1 e frações 22 a 24 (Ab3) da coluna

5 com observação sob luz visível. Sistema eluente: CHCl3, revelador: anisaldeído-sulfúrico e aquecimento a 100ºC ...... 85 FIGURA 45 – Cromatograma da mistura Ab1e 22 a 24 (Ab3) da coluna 5 com

observação sob luz ultravioleta. Sistema eluente: CHCl3, revelador: anisaldeído-sulfúrico e aquecimento a 100ºC ...... 86 FIGURA 46 – Cromatograma das frações 49 a 52 (Ab4) e 12 a 14 (Ab2) da coluna 5 com observação sob luz visível. Sistema eluente:

CHCl3, revelador: anisaldeído-sulfúrico e aquecimento a 100ºC .. 86 FIGURA 47 – Cromatograma das frações 49 a 52 (Ab4) e 12 a 14 (Ab2) da coluna 5 com observação sob luz ultravioleta. Sistema eluente:

CHCl3, revelador: anisaldeído-sulfúrico e aquecimento a 100ºC .. 87 FIGURA 48 – Isolamento das substâncias Ab2, Ab3 e Ab4 a partir do fracionamento de extrato diclorometânico de Alternanthera brasiliana sobre gel de sílica ...... 88 FIGURA 49 – Percentual da atividade antioxidante do ácido ascórbico (padrão),

extrato bruto e das frações CH2Cl2, AcOEt e BuOH das folhas de Alternanthera brasiliana ...... 94 FIGURA 50 – Classificação quanto à capacidade antioxidante de alguns compostos fenólicos oriundos do metabolismo secundário vegetal ...... 97 FIGURA 51 – Curva de calibração do ácido pirogálico com suas concentrações versus absorbâncias e respectiva equação da reta e coeficiente de correlação ...... 99

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 – Riscos ao lactente pela contaminação da mãe, proveniente de fármacos presentes em plantas medicinais ...... 23 TABELA 2 – Diferenças morfológicas entre as espécies de Alternanthera ...... 35 TABELA 3 – Sistemas de solventes empregados na preparação da coluna 4 .... 46 TABELA 4 – Concentrações dos extratos utilizados nos ensaios microbiológicos .. 47 TABELA 5 – Cultivos padrões e fármacos utilizados no estudo ...... 48 TABELA 6 – Análise morfológica de Alternanthera brasiliana versus Alternanthera dentata ...... 53 TABELA 7 – Análise microscópica da folha de Alternanthera brasiliana ...... 57 TABELA 8 – Análise microscópica de Alternanthera dentata ...... 58 TABELA 9 – Análise histoquímica das folhas de Alternanthera brasiliana e de Alternanthera dentata ...... 64 TABELA 10 – Valores espectroscópicos de 13 C-RMN atribuídos a estigmasterol (Ab1.a), β-sitosterol (Ab1.b) e espinasterol (Ab1.c)da mistura e dos

compostos 1-3 tidos como referências (δc=ppm) ...... 79 TABELA 11 – Concentrações inibitórias mínimas (CIM), concentrações bactericidas mínimas (CBM) e concentrações fungicidas mínimas (CFM) obtidas para o extrato bruto e as frações diclorometânica, acetato de etila e butanólica frente as cepas testadas ...... 89 TABELA 12 – Atividade antioxidante do ácido ascórbico, extrato bruto e das frações diclorometânicas, acetato de etila e n-butanol de Alternanthera brasiliana ...... 92 TABELA 13 – Média das leituras, desvio padrão e coeficiente de variação percentual (CV%) obtidos para o ácido pirogálico, extrato bruto e frações diclorometânica, acetato de etila e n-butanol das folhas de Alternanthera brasiliana ...... 98 TABELA 14 – Total de conteúdo fenólico presente nas folhas de Alternanthera brasiliana ...... 99

LISTA DE SIGLAS, ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

Abs absorbância AcoEt acetato de etila AgNO3 nitrato de prata ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária BPFC Boas Práticas de Fabricação e Controle CBM concentração bactericida mínima CC cromatografia em coluna CCD cromatografia em camada delgada CCMP cromatografia em coluna de média pressão

CDCl3 clorofórmio deuterado CFM concentração fungicida mínima

CHCl3 clorofórmio

CH2Cl2 diclorometano CIM concentração inibitória mínima COSY Espectroscopia de Correlação CV% coeficiente de variação percentual DMSO dimetil sulfóxido EB extrato bruto EtOH etanol FDA Food and Drug Administration HETCOR Espectroscopia de Correlação Heteronuclear n-BuOH n-butanol MS Espectroscopia de massa OMS Organização Mundial da Saúde RDC Resolução de Diretoria Colegiada REBLAS Rede Brasileira de Laboratórios em Saúde 1H RMN RMN – ressonância magnética nuclear protônica 13C RMN ressonância magnética nuclear de carbono-13 SVS Secretaria de Vigilância Sanitária UFPel Universidade Federal de Pelotas UFSM Universidade Federal de Santa Maria UV ultravioleta δ deslocamento químico λ comprimento de onda

SUMÁRIO

RESUMO ...... 6 ABSTRACT ...... 7 LISTA DE FIGURAS ...... 8 LISTA DE TABELAS ...... 13 LISTA DE SIGLAS, ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ...... 15 1 INTRODUÇÃO ...... 19 2 OBJETIVOS ...... 21 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...... 22 3.1 Histórico sobre a importância de plantas para a humanidade ...... 22 3.2 Pesquisas com o gênero Alternanthera (Amaranthaceae) ...... 29 3.3 Usos empíricos na medicina popular: informações etnofarmacológicas .. 30 3.4 Informações etnofarmacológicas embasadas em ensaios de atividades .. 31 3.5 Metabólitos Secundários no Gênero Alternanthera ...... 32 3.6 Descrição das espécies Alternanthera brasiliana e Alternanthera dentata .. 34 3.7 Características morfo-anatômicas de folhas de espécies de alternantheras . 37 4 MATERIAIS E MÉTODOS ...... 39 4.1 Material vegetal ...... 39 4.2 Procedimentos gerais ...... 39 4.3 Equipamentos ...... 40 4.4 Solventes e reagentes ...... 41 4.5 Preparação do material vegetal ...... 42 4.5.1 Preparação do material vegetal para os estudos morfo anatômicos e histoquímicos (Alternanthera brasiliana x Alternanthera dentata) ...... 42 4.5.2 Preparação do material vegetal para os estudos fitoquímicos e farmacológicos em Alternanthera brasiliana ...... 43 4.5.2.1 Perfil cromatográfico ...... 45 4.5.2.2 Fracionamento preliminar do extrato diclorometânico ...... 45 4.6 Avaliação da atividade antimicrobiana ...... 46 4.6.1 Microorganismos ...... 47 4.7 Avaliação da atividade antioxidante das frações das folhas de Alternanthera brasiliana ...... 48 4.8 Doseamento de polifenóis das frações das folhas de Alternanthera brasiliana ...... 49 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 51 5.1 Introdução aos resultados e discussão referentes à parte I ...... 51 5.2 Análise morfo-histológica ...... 51 5.2.1 Análise morfológica ...... 52 5.2.2 Análises anatômicas das folhas – Alternanthera brasiliana e Alternanthera dentata ...... 56 5.2.3 Análise histoquímica ...... 63 5.3 Introdução aos resultados e discussões referentes a parte II ...... 70 5.4 Rendimento dos extratos das folhas de Alternanthera brasiliana ...... 71 5.4.1 Rendimento e perfil das frações diclorometânica, acetato de etila e n- butanol ...... 71 5.4.2 Perfis cromatográficos das frações das colunas 1, 2 e 3 ...... 72 5.5 Elucidação estrutural da substância Ab1 ...... 75 5.5.1 Perfis cromatográficos das frações das colunas 4 e 5 ...... 83 5.6 Avaliação da atividade antimicrobiana ...... 88 5.7 Avaliação da atividade antioxidante das frações das folhas de Alternanthera brasiliana ...... 92 5.8 Determinação da quantidade de polifenóis nas frações das folhas de Alternanthera brasiliana ...... 98 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 101 1 INTRODUÇÃO

A Organização Mundial da Saúde (OMS) considera que, no mundo, aproximadamente 80% da população depende principalmente da medicina tradicional para seus cuidados primários de saúde, bem como do uso de extratos de plantas ou de seus princípios ativos (AKELERE, 1992; 1984; FARNSWORTH et al., 1985). Uma imensidade de plantas vêm sendo utilizadas tradicionalmente com finalidade terapêutica sendo elas uma fonte importante de produtos biologicamente ativos, muitos dos quais se constituem em modelos para a síntese de um grande número de fármacos. Pesquisas com produtos encontrados na natureza revelam uma gama de estruturas, propriedades físico-químicas e biológicas (WALL e WANI, 1996). Geralmente, os efeitos medicinais ou tóxicos destas plantas estão relacionados aos metabólitos secundários. A este grupo de metabólitos pertencem substâncias como taninos, saponinas, lactonas, sesquiterpenos, alcalóides entre outros. A valorização destes produtos e a maior aceitação dos mesmos vêm estimulando a indústria farmacêutica a aumentar a produção de fitoterápicos e o investimento em produtos naturais (ZANETTI, 2002). No entanto, apenas uma pequena parte destas plantas já foram estudadas e tiveram suas ações farmacológicas comprovadas cientificamente (SOEJARTO, 1996), o que ocasiona um uso ainda muito restrito quando analisado em paralelo aos grandes benefícios que poderiam ocasionar. Assim, por mais que o Brasil tenha uma grande diversidade de plantas com alto potencial para o tratamento de diversas patologias e que existam pesquisadores dispostos a comprovar os efeitos farmacológicos das ervas medicinais, o número de espécies presentes na Farmacopéia Brasileira ou em outras publicações oficiais ainda é muito restrito. Para que os fitoterápicos ganhem expressão e se consolidem definitivamente no mercado farmacêutico é preciso, além das pesquisas interdisciplinares que visam retirar o uso dos produtos naturais apenas por critério empírico e conhecimento popular, o estabelecimento de normas de controle de qualidade conferindo ao fitoterápico a segurança de efeitos conforme são preconizados para os medicamentos sintéticos em geral (CECHINEL FILHO e YUNES, 1998). Na década de 90 foi desencadeado um processo de readequação do 20 mercado, firmando definitivamente a condição de medicamento aos fitoterápicos. Conforme Brito et al. (1996), as portarias SVS nº 06 de 1995 e subseqüentes, ilustram as providências tomadas nessa década, que se caracterizou pelo aumento na produção desses medicamentos e pelas medidas efetivas no controle de qualidade da produção em larga escala. Com isso, segundo Sonaglio et al. (1999), a fundamentação científica é o grande diferencial entre preparações utilizadas em medicina popular e fitoterápicos. A família Amaranthaceae compreende, aproximadamente, 65 gêneros e 1000 espécies de plantas herbáceas, anuais e perenes, arbustos e árvores, localizando- se em regiões tropicais, subtropicais e temperadas (SIQUIERA, 1994/1995). O gênero Alternanthera abrange uma grande diversidade de espécies, possuindo representantes amplamente distribuídos pelo mundo (SOUZA et al., 1998; SALVADOR et al., 2004). Suas espécies são usadas na medicina popular de seus países com diversos fins terapêuticos, incluindo o tratamento de infecções virais, como hepatite, herpes simples, febre hemorrágica e influenza, distúrbios gástricos, hepáticos, renais e do aparelho respiratório, além do uso como agente emoliente, antidiarréico, antiinflamatório, vermífugo, antimicrobiano e analgésico (LAGROTA et al., 1994; CALDERÓN et al., 1997; MACEDO et al., 1999; SOUZA et al., 1998). No Brasil ocorrem cerca de 30 espécies de Alternanthera (KISSMANN e GROTH, 1999), sendo que Alternanthera brasiliana (L.) Kuntze e Alternanthera dentata (Moench) Stuchlik compartilham a mesma sinonímia popular: penicilina, terramicina (LORENZI e MATOS, 2002; KISSMANN e GROTH, 1999). Devido à grande semelhança morfo-anatômica entre essas espécies, autores como Kissmann e Groth (1999) e Lorenzi e Matos (2002) citam as mesmas como espécie única, ou seja, A. brasiliana. A presente dissertação está dividida em duas partes. A primeira parte trata do estudo morfo-anatômico e histoquímico comparativo entre Alternanthera brasiliana e Alternanthera dentata, visando evidenciar elementos de diferenciação entre ambas. A segunda parte descreve os estudos relacionados à análise fitoquímica e atividades biológicas de Alternanthera brasiliana. 2 OBJETIVOS

Parte I − Estabelecer parâmetros de distinção para a identificação botânica das espécies Alternanthera brasiliana e Alternanthera dentata através de análises morfoanatômicas e histoquímicas de suas folhas.

Parte II − Isolar metabólitos secundários de Alternanthera brasiliana, principalmente os constituintes químicos de possível interesse farmacêutico. − Identificar quimicamente o(s) composto(s) isolado(s) − Realizar testes antimicrobianos com frações do extrato de Alternanthera brasiliana. − Determinar o potencial antioxidante do extrato bruto e frações de Alternanthera brasiliana. − Determinar o conteúdo de polifenóis totais no extrato bruto e frações de Alternanthera brasiliana. 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Histórico sobre a importância de plantas para a humanidade

O acúmulo de conhecimentos empíricos versando sobre plantas medicinais, que vem sendo transmitido desde as antigas civilizações até os dias de hoje, faz com que estas sejam amplamente utilizadas em medicina popular e, sendo o Brasil detentor de uma das floras mais ricas do mundo em matéria-prima para fitoterápicos, é indispensável o estabelecimento de bases científicas para o emprego destes vegetais na terapêutica (SIMÕES, 1984). Segundo Ferreira (2002) há alguns anos o Brasil já se encontra entre os dez maiores consumidores de medicamentos do mundo, entretanto a lei de patentes enfraqueceu substancialmente as perspectivas das indústrias químicas brasileiras. Sendo assim, o alto custo investido na promoção da saúde, somado a barreira imposta pelas grandes indústrias farmacêuticas, tornou quase nula a participação de indústrias químico-farmacêuticas brasileiras no campo de medicamentos patenteados. Isto impôs uma necessidade de diversificação fazendo com que o segmento de fitoterápicos se torne muito atraente, confirmando os valores citados por Leite et al. (2001) onde o mercado brasileiro, referente a plantas medicinais, tem movimentado recursos na ordem de 0,7 a 1,0 bilhão de dólares/ano. Estes valores são ainda mais expressivos quando se referem ao mercado europeu ou norte- americano os quais ostentam cifras, no ano de 2000, de 8,5 e 6,3 bilhões de dólares/ano respectivamente (SIMÕES e SCHENKEL, 2002). Conforme Grünwald (1996), o fitomedicamento deve ser visto como um elemento de ligação entre a medicina complementar de base tradicional e a medicina convencional, altamente científica. O uso popular serve como orientador das pesquisas e, depois de estabelecida esta relação, deve ser preconizado um rigoroso controle de qualidade desde o cultivo e manejo das plantas até a distribuição das drogas vegetais, assegurando, em grande parte, a qualidade do produto final. A etnobotânica e a etnofarmacologia entram neste contexto a fim de aumentar o consumo e a confiabilidade no medicamento de origem natural expandindo o conhecimento referente aos metabólitos secundários isolados e sintetizados (MONTELLANO, 1975; JÚNIOR e 23

VIZZOTTO, 1996; CECHINEL FILHO e YUNES, 1998) A ausência de estudos somados ao uso indiscriminado das plantas com propriedades farmacológicas podem acarretar graves conseqüências ao organismo humano. Ainda é comum a idéia de que produtos naturais são desprovidos de reações tóxicas ou efeitos adversos. Na tabela 1 é possível perceber o quanto determinados produtos do metabolismo secundário vegetal podem danificar ou alterar a fisiologia humana (VEIGA et al., 2005).

TABELA 1 – Riscos ao lactente pela contaminação da mãe, proveniente de fármacos presentes em plantas medicinais.

Composição do fármaco Efeito biológico Salicilatos Tendência à hemorragia Bases purínicas Taquicardia Antraquinonas Diarréia Lactonas sesquiterpênicas Desnutrição (por rejeição do leite devido ao gosto desagradável) Alcalóides pirrolizidínicos Hepatotoxicidade Alcalóides indólicos Vômito, diarréia, câimbras, obstrução nasal FONTE: VEIGA et al. (2005).

A transformação de uma planta em medicamento deve visar à preservação da integridade química e farmacológica do vegetal, garantindo a constância de sua ação farmacológica e segurança de utilização, além de valorizar seu potencial terapêutico, requerendo assim, estudos prévios de modo a desenvolver metodologias analíticas e tecnológicas (MIGUEL e MIGUEL, 1999). Torna-se conveniente ressaltar o papel importante que a pesquisa tem desenvolvido com o objetivo de aumentar os conhecimentos pertinentes às plantas e aos insumos farmacêuticos oriundos de plantas quanto ao controle de qualidade, propriedade terapêutica e toxicológica, valorizando a interdisciplinaridade. Os fitoquímicos, por exemplo, conforme Sant’Anna (1996), não estão interessados somente em uma classe de constituintes de plantas, mas trabalham na obtenção de compostos biologicamente ativos. O mesmo acontece com outros profissionais, de forma que trabalhos interlaboratoriais são cada vez mais freqüentes, até pela complexidade intrínseca das várias etapas indispensáveis no desenvolvimento 24 tecnológico de um fitoterápico. A inter-relação entre os diferentes profissionais tornou-se mais que um princípio de trabalho, uma prioridade diante da multidimensionalidade do caminho entre a planta e a produção de medicamentos. Di Stasi et al. (1996) afirmam que estudos isolados perpetuam a falta de resultados e impedem, por conseqüência, o desenvolvimento de novos medicamentos. Constatam-se inúmeras plantas cujos estudos fitoquímicos e farmacológicos são potencialmente satisfatórios, contudo, a espécie em questão não possui sequer pesquisas agronômicas e ecológicas que se preocupem com reprodução vegetal ou extrativismo sustentável. No organograma a seguir estão representadas as etapas dos processos pelos quais a planta deve passar, desde a coleta até sua caracterização como fármaco, exemplificando a interdisciplinaridade requerida (CECHINEL FILHO e YUNES, 1998).

Planta

Testes Extrato Extratos Testes biológicos bruto semipuros biológicos

Procedimentos cromatográficosos

Elucidação -Frações Testes estrutural -Compostos puros biológicos

Modificação Síntese de estrutural análogos

Testes Relação Testes biológicos estrutura-atividade biológicos

FONTE: CECHINEL FILHO e YUNES (1998). FIGURA 1 – Procedimentos gerais para a obtenção de compostos biologicamente ativos.

Com a realização de todas as etapas descritas anteriormente, torna-se 25 possível aumentar o número de monografias nos códigos oficiais que privilegiem desde o cultivo, perpassando pelo manejo adequado, até chegar a determinação de doses clínicas representando assim a saída para a indústria nacional, além de se tornarem uma solução economicamente viável aos programas de saúde mantidos por governos, prefeituras e demais organizações. A portaria nº 6 da Secretaria de Vigilância Sanitária (SVS), de 31 de janeiro de 1995 (BRASIL, 1995), tornou-se um marco regulatório dos fitoterápicos brasileiros, pois foi a primeira norma moderna a regulamentar essa classe de medicamentos (MARQUES, 2003), sendo estabelecido duas etapas de 5 anos para que suas exigências fossem cumpridas, encerrando dia 30 de janeiro de 2005. Mais recentemente, em de 16 de março de 2004, foi editada pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) a resolução RDC nº48, visado a normatização do registro de medicamentos fitoterápicos. A resolução RDC nº48 determina que todos os testes referentes ao controle de qualidade de fitoterápicos deverão ser realizados em laboratórios credenciados pela Rede Brasileira de Laboratório em Saúde (Sistema REBLAS) ou por empresas que possuam certificado de Boas Práticas de Fabricação e Controle (BPFC), exigindo para a comercialização do produto acabado a realização de testes que garantam sua qualidade através de métodos analíticos que incluam perfis cromatográficos e resultados de prospecção fitoquímica, além de comprovação de segurança de uso, incluindo estudos de toxicidade pré-clínica. No dia 23 de junho de 2006, o Diário Oficial da União tornou pública a aprovação da Política Nacional de Plantas Medicinais, sob o decreto nº 5.813, tendo por objetivo geral “garantir à população brasileira o acesso seguro e o uso racional de plantas medicinais e fitoterápicos, promovendo o uso sustentável da biodiversidade, o desenvolvimento da cadeia produtiva e da indústria nacional”. Entretanto, por mais que existam resoluções, regulamentando o uso de produtos naturais no Brasil, ainda é grande o número de acidentes oriundos do uso incorreto destes produtos, da fraude e troca proposital de espécies e do comércio informal das mesmas (VEIGA et al., 2005). Por isso, torna-se cada vez maior a necessidade do estabelecimento de rígidas leis referentes a todas as etapas do processo de produção de fitoterápicos. O primeiro passo a ser tomado quando iniciada uma pesquisa de um produto de origem vegetal é o levantamento bibliográfico e cultural da espécie e, após esta etapa é necessário estabelecer critérios de identificação e, aliado a este controle de 26 qualidade da matéria prima de um fitoterápico, está a análise morfo-histológica a qual, através de padrões macroscópicos e microscópicos destaca as peculiaridades da espécie possibilitando a correta identificação botânica. O seu baixo custo e alto grau de reprodutibilidade fez com que estes testes passassem a ser obrigatórios no controle de qualidade botânico desde a década de 90, conforme rege a portaria 06/95 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, do Ministério da Saúde, e subseqüentes (BRITO et al. 1996). Além destas análises para a precisão na identificação da droga vegetal, pode-se fazer uso da histoquímica a qual refere-se ao tratamento de partes da planta fresca ou desidratada conforme Gattuso e Gattuso (1999) com reagentes específicos para determinar a presença de metabólitos secundários baseando-se nas colorações desenvolvidas e/ou precipitados através da formação de complexos insolúveis. As precipitações ocorrem pela formação de sais, por reações ácido/base, e as formações cromáticas pela obtenção de um complexo entre parte do reagente e o grupo químico específico. O estudo fitoquímico compreende as etapas de isolamento, elucidação estrutural e identificação dos constituintes mais importantes do vegetal, principalmente de substâncias originárias do metabolismo secundário, responsáveis ou não por uma ação biológica. Este estudo compreende um conjunto de técnicas espectrais como UV, IV, RMN 1H e 13C e MS aliado ao uso de técnicas sofisticadas de RMN (COSY, HETCOR, etc.). Estas técnicas permitem propor com segurança a estrutura molecular de substâncias naturais. Além disso, o uso de difração de raios- X, quando possível, possibilita avaliar a estereoquímica real destas substâncias (WHISTON, 1987). Esses conhecimentos conjuntamente com ensaios de atividade biológica permitem caracterizar as frações ou substâncias bioativas (CECHINEL FILHO e YUNES, 1998). Contudo, somente a qualidade da matéria-prima não garante a segurança e eficácia de um fitoterápico, é preciso verificar e comprovar a atividade biológica da planta assim como a dose terapêutica recomendada e seu potencial tóxico ao organismo. Segundo Farias (1999) a eficácia é comprovada por estudos pré-clínicos e clínicos e a segurança confirma-se após determinar a ausência de efeitos tóxicos e contaminantes. Conforme Hamburger e Hostettmann (1991), devem ser levados em consideração a simplicidade, rapidez, reprodutibilidade e o baixo custo dos testes biológicos, visto que o número de amostras a serem testadas geralmente é grande. Por exemplo, para a realização de testes de atividade antifúngica e antibacteriana as 27 principais metodologias preconizadas são: − Método da difusão em ágar (BAUER et al., 1966; LIMA et al., 1995). − Método da concentração inibitória mínima (MITSCHER et al., 1972; CECHINEL FILHO et al., 1996). A capacidade das bactérias em adquirir resistência aos fármacos utilizados como agentes terapêuticos é enorme (COHEN, 1992), sendo este problema crescente, o estímulo a pesquisas que visem o conhecimento de novos composto eficazes perante microorganismos já resistentes é fundamental. Inúmeros estudos têm sido desenvolvidos em diversos países objetivando a determinação de atividade antimicrobiana de extratos vegetais (FERESIN et al., 2001; KHAN et al., 2001; RAMESH et al., 2002). Estes extratos são reconhecidos por suas substâncias ativas, como é o caso dos compostos fenólicos, óleos essenciais e taninos (NASCIMENTO et al., 2000). Entretanto esses estudos devem ser realizados com plantas oriundas do local em que se pretende estimular o uso, pois uma pesquisa realizada por Cechinel Filho (1999) com a espécie Aleurites moluccana L. Willd, coletada no Brasil não apresentou atividade antimicrobiana, enquanto que a mesma espécie coletada e analisada no Havaí (EUA) mostrou-se portadora de atividade antiviral contra o vírus do HIV e também contra algumas bactérias. Isto sugere que o ambiente influencia na síntese de determinados compostos, podendo alterar a composição química da planta. Ahmad e Beg (2001) explicitam que a atividade antimicrobiana é decorrente da interferência das mais diferentes substâncias, causando a morte ou inibindo o crescimento dos microorganismos. Através do teste da concentração inibitória mínima e posterior repique da menor concentração efetiva ao combate do crescimento do microorganismo pode-se verificar se a planta tem ação bactericida ou bacteriostática. Além da atividade antimicrobiana, as plantas também podem se mostrar excelentes antioxidantes naturais. De acordo com Mensor et al. (2001), as substâncias antioxidantes presentes nos vegetais neutralizam a ação dos radicais livres e o consumo destas substâncias pode fortalecer o sistema imunológico, além de reduzir o risco de uma série de doenças como o desenvolvimento de cânceres pela ação silenciosa dos radicais livres, proporcionando ao paciente um grande benefício a sua saúde. A indústria de cosméticos também está bastante receptiva às 28 descobertas de compostos bioativos naturais, visto que a demanda da sociedade por produtos que previnam o envelhecimento é crescente. Dentre os compostos mais efetivos para esta ação estão os polifenóis, eles promovem a remoção ou inativação dos radicais livres formados durante a iniciação ou propagação do processo oxidativo, através da doação de átomos de hidrogênio a estas moléculas, interrompendo a reação em cadeia (SIRMIC e JAVANOVIC, 1994). Além de seqüestradores de radicais, os antioxidantes fenólicos também podem atuar como quelantes de metais (SHAHIDI, JANITHA e WANASUNDARA, 1992). Os polifenóis pertencem à categoria dos antioxidantes naturais e são os antioxidantes mais presentes em nossa dieta. Uma ampla variedade de alimentos e bebidas tem se mostrado valiosos veículos quanto ao efeito antioxidante e são, conseqüentemente, recomendados para inclusão na dieta promovendo um balanceamento na dose de antioxidantes benéficos para a saúde humana. Há algum tempo vem sendo associado ao consumo moderado de vinho, principalmente vinho tinto, a redução da mortalidade por doenças cardiovasculares (RENAUD e DE LORGERIL, 1992). Os compostos polifenólicos presentes no vinho têm alta capacidade antioxidante e a estes constituintes foi atribuída uma atividade protetora contra as patologias oriundas do efeito oxidativo. Os polifenóis são considerados redutores naturais do processo de trombose pela inibição da aglomeração de plaquetas, da peroxidação de lipídios e da oxidação de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) (CASTELLUCCIO et al., 1995; SOLEAS et al., 1997; KINSELLA et al., 1993). A busca pela indústria farmacêutica de novos compostos naturais bioativos é crescente, devido à demanda da sociedade por produtos que previnam o envelhecimento. Adicionalmente, para uso cosmético também é de fundamental importância a descoberta de fármacos capazes de combater, por exemplo, o desenvolvimento de cânceres pela ação silenciosa dos radicais livres, proporcionando ao paciente um grande benefício a sua saúde. Na seleção de antioxidantes são desejáveis as seguintes propriedades: eficácia em baixas concentrações (0,001 a 0,01%), ausência de efeitos indesejáveis na cor, odor, sabor do produto, compatibilidade e facilidade de incorporação ao produto, estabilidade nas condições de processo e armazenamento, além da inexistência de efeitos tóxicos (BAILEY, 1996). Conforme Ramalho e Jorge (2006), o tocoferol é um dos melhores 29 antioxidantes naturais devido a sua capacidade de doar seus hidrogênios fenólicos aos radicais lipídicos interrompendo a reação em cadeia. Ferguson e Harris (1999) descreveram os ácidos fenólicos como portadores de um anel benzênico, um grupamento carboxílico e um ou mais grupamentos hidroxila e/ou metoxila na molécula (fig. 2), que conferem propriedades antioxidantes. Segundo Nawar (1985), os produtos intermediários formados pela ação destes antioxidantes são relativamente estáveis, devido a ressonância do anel aromático apresentada por estas substâncias. Sendo assim, a pesquisa de plantas que possuam compostos fenólicos torna-se alvo de vários pesquisadores.

OH

OH COOH

OH FIGURA 2 – Estrutura química do ácido gálico (ácido fenólico derivado do ácido benzóico).

Um método simples e rápido de estimar o potencial antioxidante in vitro de uma amostra é pela aplicação do método fotocolorimétrico do DPPH, que se apresenta na forma de um radical livre relativamente estável que produz coloração violeta em etanol. Quando em contato com amostras portadoras de atividade antioxidante, a forma radicalar do DPPH sofre uma redução e a coloração violeta intensa diminui. A redução na concentração de DPPH é monitorada pelo decréscimo da absorbância em espectrofotômetro.

3.2 Pesquisas com o gênero Alternanthera (Amaranthaceae)

A família Amaranthaceae compreende várias espécies com atividade biológica (LAGROTA et al., 1994; SALVADOR et al., 2002) e elas são usadas na nutrição e medicina popular para o tratamento de diversas enfermidades (MACEDO et al., 1999; SOUZA et al., 1998; GORISTEIN, NUE e ARRUDA, 1991; SI-MAN et al. 1988; SIQUEIRA, 1987). 30

3.3 Usos empíricos na medicina popular: informações etnofarmacológicas

Grenand, Moretti e Jacquemin (1987) em um estudo realizado com as populações nativas e indígenas das Guianas verificaram que estes usam as folhas de A. brasiliana como adstringente e antidiarréico, ao passo que o macerado oriundo da planta inteira é usado contra prisão-de-ventre. Mors, Rizzini e Pereira (2000) relatam que a infusão das folhas de A. brasiliana pode ser considerada diurética, digestiva e depurativa, sendo empregada nas moléstias do fígado e da bexiga. Conforme Rodrigues e De Carvalho (2001) as flores de A. brasiliana, quando ingeridas na forma de infusão ou decocto são consideradas béquicas, devendo ser ingeridas de 3 a 4 xícaras deste chá por dia. Em relação à espécie A. dentata, não foram encontrados registros na literatura científica referentes ao seu uso popular e o mesmo ocorreu em relação a estudos fitoquímicos e/ou farmacológicos. Entretanto, Sens (2002) relatou, em sua dissertação de mestrado o uso popular de diversas plantas por uma tribo indígena de Santa Catarina. Dentre as plantas citadas, encontraram-se alguns dados de A. dentata, cuja transcrição integral encontra-se a seguir.

Alternanthera dentata (Moench) Scheygr. (AMARANTHACEAE) Pulle, Fl. Surinam, (Meded. K. Ver. Kol. Inst. Amst. xxx.) 39, 1932.

NOME: Erva-de-penicilina. INFORMANTE: Congó Patté. INDICAÇÕES: Infecções, febre com dor de cabeça, lavar sarna e feridas bravas. MODO DE PREPARO: P/ febre com dor de cabeça - 1 punhado de folhas e caule lavados em 1 litro de água, aquecer até ferver e retirar do fogo. MODO DE USAR: Beber chá quente ou frio. POSOLOGIA: 1 colher de sopa 3 vezes ao dia até melhorar. MODO DE PREPARO: P/ infecções -1 punhado de folhas lavadas em 1 litro de água, aquecer até ferver e retirar do fogo. MODO DE USAR: Beber chá quente ou frio. POSOLOGIA: 1 copo 3 vezes ao dia até melhorar. MODO DE PREPARO: P/ lavar sarna e feridas bravas - 10 punhados de folhas e caules em 5 litros de água, aquecer até ferver e retirar do fogo. MODO DE USAR: Banhos ou lavagens frios ou mornos. POSOLOGIA: Lavar a região afetada 5 vezes ao dia ate melhorar. COMPOSIÇÃO QUÍMICA E BIOATIVIDADE (ISI, espécie/gênero: 0/83): Alternanthera spp.: Extratos de cultura de callus, analgésico (MACEDO et al., 1999); saponinas triterpênicas (SANOKO et al., 1999); betaínas (BLUNDEN et al., 1999); antimalárico (MESA et al., 1998); extrato etanólico, diurético (CALDERON et al., 1997); extrato hepatoprotetor (LIN et al., 1994); extratos antivirais, 193 Herpes simplex (LAGROTA et al., 1994) e HIV 31

(ZHANG et al., 1988); flavonóide-C-glicosídeo (ZHOU et al., 1988). PATENTES (DERWENT-ISI, espécie/gênero: 0/4). Alternanthera spp.: As patentes referem-se a cosméticos para o cabelo, a um antifúngico e a um herbicida sintético eficiente contra o gênero. COMENTÁRIOS: Não há estudos sobre conteúdo químico ou atividades biológicas desta espécie. A literatura registra atividades analgésicas e antivirais para diversas espécies do gênero, o que pode estar relacionado aos usos tradicionais (p. 192).

3.4 Informações etnofarmacológicas embasadas em ensaios de atividades

Estudos farmacológicos tem confirmado que algumas plantas deste gênero, incluindo A. pungens, A. sessilis, A. tenella e A. brasiliana têm importantes atividades que justificam seu uso na medicina popular (RUIZ et al., 1991; QU, YANG e XIANG, 1993; GARCIA, CALDERÓN e FUENTES, 1995). A. brasiliana evidenciou, in vitro, uma pronunciada atividade contra o vírus do herpes simples, podendo esse efeito ser devido a diferentes mecanismos dependentes da ação da timidina quinase viral ou da DNA polimerase (LAGROTA et al., 1994). O extrato alcoólico de A. brasiliana produziu uma relação de analgesia dose- dependente, sendo sua resposta, muitas vezes mais potente que a dos fármacos utilizados como padrão (ácido acetilsalicílico, dipirona e indometacina), não apresentando interferência no efeito quanto à via de administração (oral ou intraperitonial). O mecanismo de ação, porém, não foi definido pelos autores (SOUZA et al., 1998). Estudos realizados, in vitro, com a A. brasiliana puderam comprovar que, principalmente os flavonóides canferol 3-O-rutinosídeo e canferol 3-O-robinobiosídeo inibiram de modo eficiente a proliferação de linfócitos humanos sendo duas vezes mais ativos que o extrato bruto (BROCHADO et al., 2003). Caetano et al. (2002) analisaram o extrato bruto de A. brasiliana quanto a sua atividade antimicrobiana frente a cepas de Staphylococcus aureus (ATCC 6538 e ATCC 9144) e S. aureus de isolados hospitalares (metilicina resistentes e não resistentes) e o extrato mostrou uma atividade bastante semelhante ao cloridrato de tetraciclina utilizado como padrão. Mazzini e Faria (2002) determinaram a atividade antifúngica do extrato etanólico de Alternanthera sp., o qual inibiu o crescimento de Rhizoctonia sp, Alternaria sp, Penicillium chrysogenum, Candida albicans e Aspergillus niger. A 32 metodologia utilizada não foi descrita. Extratos de Alternanthera spp. mostraram atividade antiviral, sendo que a espécie A. phyloxeroides apresentou, in vitro, inibição do HIV, além do vírus do herpes simples (CHANG et al., 1988). O extrato alcoólico de A. pungens, na concentração de 100 mg/kg, foi efetivo no aumento do volume urinário, aumentando também a eliminação de sódio, mostrando-se equivalente aos resultados obtidos com a furosemida (CALDERÓN, GARCÍA ASSEF e FUENTES, 1997). A. sessilis evidenciou efeito hepatoprotetor em modelo de hepatite aguda induzido por tetracloreto de carbono e paracetamol em camundongos e D(+)- galactosamina em ratos (LIN et al., 1994). A atividade antimicrobiana atribuída ao extrato de A. maritima está associada, principalmente, às bactérias Gram-positivas e a alguns fungos (leveduras e dermatófitos); os extratos etanólicos e hexânicos das partes aéreas da A. marítima mostraram alguma inibição contra bactérias Gram-negativas. Com o extrato bruto foi obtido apenas efeito fungistático, mas para os compostos isolados foi verificado o efeito fungicida, podendo ser usado como aditivo antimicrobiano natural em cosméticos ou na industria alimentícia ou, então auxiliar na síntese de novas drogas (SALVADOR et al., 2004). Alternanthera repens comprovou seu uso popular quanto ao seu efeito antidiarréico, porém ao avaliar a atividade antimicrobiana do extrato, através do método de difusão em ágar, não foram obtidos resultados positivos (ZAVALA et al., 1998). Em um estudo feito por Delaporte et al. (2005) com a espécie Alternanthera brasiliana pode-se constatar que o nitrogênio é o principal macronutriente constituinte da folha seguido do potássio e do cálcio. Nas cinzas totais das partes aéreas o cálcio foi detectado em maior concentração e, em relação aos micronutrientes, o manganês teve sua percentagem maior nas folhas, enquanto que nas cinzas o zinco foi mineral mais presente. Este estudo contribui no controle de qualidade da espécie além de fornecer suporte para seu uso na nutrição humana.

3.5 Metabólitos Secundários no Gênero Alternanthera

Estudos químicos com algumas espécies de Alternanthera relataram a 33 existência de betacianinas, betaínas, ecdisteróides, flavonóides, protoalcalóides, saponinas, esteróides e triterpenos (FERREIRA e DIAS, 2000; POMILIO et al., 1992; POMILIO et al., 1994; PATTERSON, XU e SALT, 1991; ZHOU, BLASKÓ e CORDELL, 1988; BANERJI et al., 1971). A partir de A. pungens foram isolados diferentes constituintes como alcalóides, esteróides, triterpenos, leucoantocianidinas, beta-espinasterol e uma saponina derivada do núcleo oleanano, com os açúcares glicose e ramnose. Recentemente o cloridrato de colina também foi descrito (CALDERÓN, GARCÍA ASSEF e FUENTES, 1997). Estudos fitoquímicos preliminares feitos com A. brasiliana indicaram a presença de terpenos, esteróides e compostos fenólicos. No extrato hexânico foi confirmada a presença de fitosterol e β-sitosterol; estes compostos, juntamente com outros grupamentos existentes nas frações mais polares, podem justificar a ação analgésica, com potência equivalente ao ácido acetilsalicílico e ao paracetamol, evidenciada com o extrato hidroalcoólico desta espécie (SANTOS et. al., 1995), Brochado et al. (2003), isolaram seis flavonóides da A. brasiliana: canferol 3- O-robinobiosideo-7-O-alfa-ramnopiranosideo, quercetina 3-O-robinobiosideo-7-O- alfa-L-ramnopiranosideo, quercetina 3-O-robinobiosideo, canferol 3-O- robinobiosideo, canferol 3-O-rutinosideo-7-O-alfa-L-ramnopiranosideo e canferol 3- O-rutinosideo. Estas estruturas foram elucidadas por Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio e de Carbono (1H RMN e 13C RMN, 1H-1H-COSY, APT, HETCOR) estando todos de acordo com a literatura. Em discordância com os estudos acima, Macedo et al. (1999), não encontraram em seus extratos de A. brasiliana alcalóides e compostos fenólicos (taninos, flavonóides, etc) em concentrações detectáveis. As reações positivas quanto a presença de diferentes esteróis ou triterpenos foram obtidas com anisaldeído e reagente de Lieberman-Burchard. Entretanto, foi confirmada por cromatografia em camada delgada (CCD) e cromatografia gasosa (CG) a presença de β-sitosterol que é o principal constituinte do fitosterol, o qual já tinha sido previamente detectado no extrato hidroalcoólico. A partir da A. marítima foram isolados os seguintes constituintes: esteróides (estigmasterol, beta-sitosterol, campesterol, espinasterol e U7-estigmasterol), ácidos orgânicos (ácido palmítico e vanílico) e estas estruturas foram confirmadas por comparação de espectros de RMN com os obtidos por Kojima et al. (1990) e 34

Chaurasia e Swichtl, (1987), além de análises em CG com uso de padrões. As saponinas U7estigmasterol-3-O-β-D-glucopiranosídeo, e espinasterol-3-O-α-D- glucopiranosídeo foram identificadas por análises espectroscópicas e comparação com dados publicados. Também foram relatados os flavonóides glicosídicos vitexina, isovitexina, isoramnetina-3-O-robinobiosideo e quercetina-3-O-rutinosídeo (SALVADOR et al., 2004). Mazzini e Faria (2002), após a obtenção de resultados positivos de atividade antifúngica para Alternanthera sp., conduziram um estudo químico com os extratos ativos e, através de coluna cromatográfica de sílica gel e posterior análise em cromatógrafo gasoso acoplado a espectômetro de massas detectaram a presença do 3,7,11,15-tetrametil-2-hexadecen-1-ol. Delaporte et al. (2001), assinalaram para a Alternanthera brasiliana uma variação na concentração de taninos entre 0,46% e 0,87% em relação a época de coleta.

3.6 Descrição das espécies Alternanthera brasiliana e Alternanthera dentata

O gênero Alternanthera compreende cerca de 170 espécies. O nome Alternanthera tem origem no latim e se refere aos estames e pseudoestaminódios que se alternam (alternus + antera), como mostrado na figura 3 (EDWIN e REITZ, 1967).

FONTE: EDWIN e REITZ (1967). FIGURA 3 – Estames de Alternanthera brasiliana. 35

São ervas com folhas opostas com inflorescência em espiga e flor hermafrodita com estames soldados na base formando um tubo baixo (EDWIN e REITZ, 1967). Alternanthera dentata (Moench) Stuchlik tem suas origens nas regiões tropicais do globo mais especificamente do leste da Índia ao Brasil, principalmente a região sul do Brasil. Possui nestas regiões alguns nomes comuns como trevo Indor, planta-do-Cálico ou Folha-Rubi, além de penicilina e/ou perpétua-dentata. Como sinonímia botânica foram encontrados os epípetos Gomphrena dentata, Telanthera dentata, Gomphrena brasiliensis e Mogiphanes brasiliensis (EDWIN e REITZ, 1967). A espécie congenérica Alternanthera brasiliana (L.) Kuntze é descrita por Edwin e Reitz (1967), embora existam autores que consideram as duas espécies como apenas uma. Coloração geralmente arroxeada das folhas e ramos e a presença de brácteas mais longas que as tépalas e com margens lacerado- denteadas, são as diferenças morfológicas mais citadas entre Alternanthera dentata e a espécie Alternanthera brasiliana típica (LORENZI e MATOS, 2002). A tabela 2 referencia diferenças descritas por Edwin e Reitz (1967), entre folhas e flores de A. brasiliana e A. dentata.

TABELA 2 – Diferenças morfológicas entre as espécies de Alternanthera.

Alternanthera dentata Alternanthera brasiliana Folhas Esverdeadas Variáveis Flores Com sépalas mais curtas Branco amarelentas com brácteas e que bractéolas. bracteóloas com metade do tamanho das flores Alvo pilosas

A Alternanthera brasiliana é uma planta nativa da América Tropical até o sul da Ilha de Santa Catarina, exclusiva de restingas litorâneas, xerófita e heliófita. Popularmente, essa erva é conhecida por penicilina, terramicina ou perpétua-do- mato (EDWIN e REITZ, 1967). As figuras 4 e 5 ilustram as flores e brácteas de A. brasiliana e A. dentata. 36

FONTE: EDWIN e REITZ (1967). FIGURA 4 – Aspecto geral das flores com brácteas de Alternanthera brasiliana.

FONTE: EDWIN e REITZ (1967). FIGURA 5 – Aspecto geral das flores com brácteas de Alternanthera dentata.

Até o presente momento não foi encontrado nenhum artigo ou trabalho de pesquisa que utilizasse ambas espécies concomitantemente como objeto de estudo visando determinar características de modo a estabelecer diferenças entre as mesmas com o intuito de corroborar no controle botânico de qualidade destas espécies, visto a utilização com fins medicinais. Entretanto, vários artigos foram encontrados a respeito de outras espécies do gênero Alternanthera, tratando dos 37 mais diversos assuntos. Dentre as espécies pode-se citar a A. repens (ZAVALA et al., 1998); A. philoxeroides (CHANG et al., 1988); A. marítima (SALVADOR et al., 2004); A. sessilis (LIN, YUN-HO e SHYH-JONG, 1994); A. pungens (CALDERÓN, GARCÍA ASSEF e FUENTES, 1997).

3.7 Características morfo-anatômicas de folhas de espécies de alternantheras

Delaporte et al. (2002) estudaram as características morfo-anatômicas das folhas de A. brasiliana e concluiram se tratar de uma planta com folhas simples, oval-lanceoladas, peninérveas, opostas cruzadas, membranáceas, pilosas e com diversos padrões de coloração, do verde ao púrpura. A análise anatômica revelou folhas anfiestomáticas, com tricomas tectores ornamentados, mesofilo dorsiventral e padrão de venação eucampitódroma. Foram observadas alterações na disposição e no tamanho dos feixes vasculares da nervura principal os quais são sempre do tipo colateral, com tecido esclerenquimático no pólo floemático. Outra espécie do gênero com descrição morfo-anatômica é Alternanthera tenella Colla. Kissmann e Groth (1999), comenta que esta planta daninha, Alternanthera tenella, popularmente conhecida como “apaga-fogo”, possui folhas simples, sésseis, opostas, com limbo oblongo-lanceolado de base atenuada e ápice agudo, margens inteiras e nervuras marcadas na face ventral e proeminente na dorsal. Ferreira et al. (2003), ao realizarem um estudo morfo-anatômico mais detalhado da Alternanthera tenella constataram que a espessura média a lâmina foliar é de 252,39µm, a epiderme é simples, sendo a face adaxial mais espessa que a da abaxial. Seu mesófilo foliar é dorsiventral; o parênquima paliçádico apresenta uma camada de células com espessura média de 65,33 µm, e a espessura média do parênquima lacunoso é de 92,54 µm. Suas folhas são anfiestomática, estando os estômatos, nas duas faces, dispostos no mesmo nível das demais células da epiderme. Tanto na face adaxial como na abaxial os estômatos são diacíticos, sendo os ostíolos da face adaxial de maior comprimento. Foi verificada a maior presença de estômatos na face abaxial das folhas. Tricomas glandulares multicelulares não ramificados foram observados em ambas faces das folhas e mostrou alto teor de cera epicuticular. A taxa de vascularização foliar média é de três feixes a cada 38

590µm de largura de lâmina foliar. Também foi verificada a presença de drusas entre os feixes vasculares. 4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Material vegetal

O material vegetal constituiu-se de folhas frescas de Alternanthera brasiliana, coletadas nos municípios de Santa Cruz do Sul-RS e Santa Maria-RS nos meses de junho de 2004 e março de 2005 e identificadas pela bióloga Drª. Thaís do Canto Dorow do Departamento de Biologia da Universidade Federal de Santa Maria. Submeteu-se ambas amostras a um macerado hidroalcoólico por uma semana de modo a obter um extrato bruto, realizou-se uma cromatografia em camada delgada e após a verificação de igual perfil cromatográfico para as duas coletas, optou-se em utilizar o material oriundo do município de Santa Cruz do Sul para os estudos fitoquímicos e biológicos, o qual foi desenvolvido com folhas secas e as folhas coletadas no município de Santa Maria destinaram-se ao estudo farmacobotânico, pelo fato de alguns testes necessitarem da utilização da planta fresca. As exsicatas encontram-se depositadas no Herbário do Departamento de Biologia da UFSM sob o registro SMDB 10038, para o material coletado em Santa Cruz do Sul e registro SMDB 10039, referente ao material coletado no município de Santa Maria. A espécie Alternanthera dentata utilizada no estudo morfo-anatômico foi coletada no município de Florianópolis-SC, identificada pelo pesquisador da EPAGRI-SC, Antônio Amaury Silva Júnior. Sua identificação foi confirmada pelas biólogas Elen Nunes Garcia e Sílvia Rubin da Universidade Federal de Pelotas, estando registrada na instituição por E. Nunes & S. Rubin, 03 (PEL-UFPeL) 04/07/06 e na Universidade Federal de Santa Maria sua exsicata foi depositada no herbário do Departamento de Biologia com o registro SMDB 10100. As espécies utilizadas no estudo farmacobotânico foram submetidas as mesmas condições ambientais como incidência solar, quantidade de água e substrato e, só após o desenvolvimento das mudas, iniciou-se os testes a cerca de suas características macroscópicas e microscopicas.

4.2 Procedimentos gerais

Os solventes e reagentes utilizados foram procedentes das marca Belga, 40

Quimex, Vetec ou Merck de grau p.a. e a água utilizada nos experimentos foi submetida a uma destilação prévia. Para as cromatografias analíticas em camada delgada (CCD) foram utilizadas cromatofolhas recobertas com gel de sílica GF254 Merck de espessura 0,2mm com suporte de alumínio 20x20cm. As análises por CCD foram realizadas em cuba saturada, com migração ascendente, sendo utilizadas diferentes proporções de misturas de solventes como eluente. A detecção das substâncias sobre CCD se deu pela visualização sob luz visível e ultravioleta (UV) em comprimentos de onda de 254 e 365 nm, seguida de aspersão da placa com o reagente cromogênico anisaldeído-sulfúrico, cuja composição está descrita a seguir e posterior aquecimento a 100ºC.

Anisaldeído sulfúrico ...... 0,5mL Ácido sulfúrico concentrado ...... 1,0mL Ácido acético glacial ...... 25,0mL Etanol ...... 25,0mL

Para as cromatografias em coluna (CC) foram utilizados gel de sílica 60 Merck com tamanhos de partículas 63-200µm. Para identificação das substâncias isoladas foram realizadas as seguintes técnicas espectrais: espectrometria de ressonância magnética nuclear de 1H e 13C (1H RMN e 13C RMN). Os espectros foram obtidos no Departamento de Química da UFSM.

4.3 Equipamentos

− Balança analítica OHAUS Voyager − Balança semi-analítica MARTE AS 5500C − Banho de ultrassom THORNTON Unique − Bomba de vácuo PRIMAR − Espectrômetro de RMN BRUCKER DPX. Para a obtenção dos espectros de RMN (RMN 1HÆ 400MHz e RMN 13CÆ 100MHz), as amostras foram solubilizadas em

CDCl3 41

− Estufa BIOMATIC − Evaporador rotatório BÜCHI R – 114, acoplado a um banho de água BÜCHI Waterbath B – 480 e a uma trompa de água − Lâmpada UV CHROMATOVUE − Lâmpada UV BOITTON − Microscópio ótico acoplado à câmera digital (Tron) − Microscópio Carl Zeiss − Micrótomo rotativo com navalha de aço inox com perfil D − Moinho de facas com tamis de malha 0,86µm − Capela de fluxo laminar horizontal − Estereomicroscópio binocular − Lâminas − Lamínulas

4.4 Solventes e reagentes

− Etanol absoluto p.a. − Hexano − Diclorometano − Clorofórmio − Clorofórmio deuterado

− Gel de sílica G60 F254 em cromatofolhas − Acetato de etila − n-butanol − Anisaldeído − Água destilada − Dibenzoil peróxido – ativador de historresina − Dimetil sulfóxido –DMSO − Historresina® − Resina básica − Resina acrílica autopolimerizante − Bálsamo sintético entellan® 42

4.5 Preparação do material vegetal

4.5.1 Preparação do material vegetal para os estudos morfo anatômicos e histoquímicos (Alternanthera brasiliana x Alternanthera dentata)

Porções de 2x2 mm foram retiradas da região mediana das lâminas foliares adultas (JOHANSEN, 1940). O material ficou imerso em álcool etílico 70% para fixação e conservação, e mantido sob refrigeração. Na análise do corte transversal, o material botânico foi desidratado em série etílica ascendente de 70 a 96ºGL – uma hora em cada álcool – e incluído em blocos de hidroxietilmetacrilato conforme Gerrits e Smidt (1983) e Ruetze e Schimitt (1986). Obteve-se cortes de 4µm em micrótomo rotativo. Cada corte foi levado à banho histológico, em temperatura ambiente, repassado para lâmina e corado com azul de toluidina 1% (GERLACH, 1977). Após a coloração fixou-se lamínula com bálsamo sintético entellan. As lâminas montadas tiveram registros efetuados por fotografias obtidas em microscópio com câmara digital (Tron), e as lâminas permanentes encontram-se registradas, sob número 111 para A. brasiliana e 112 para A. dentara, junto ao laminário do Departamento de Farmácia Industrial, CCS, UFSM (METCALFE e CHALK, 1950; CUTTER, 1987; ESAÚ, 1990). A análise morfológica da planta fresca e da droga foi efetuada através de observações a olho nu e com auxílio de estereomicroscópio binocular (FELLIPE e ALENCASTRO, 1966; HICKEY, 1974; ESAÚ, 1990). O estudo da epiderme abaxial e adaxial da folha foi obtido em lâminas temporárias, com cortes a mão livre de material fresco (OLIVEIRA e AKISUE, 1989). Na análise histoquímica montou-se lâminas semi-permanentes com secções transversais de folhas dos exemplares mantidos a fresco, tratando-se com reagentes indicativos de compostos específicos para óleos voláteis (Sudan III), alcalóides (Dragendorff), saponinas (Ácido sulfúrico), flavonóides (Hidróxido de potássio 5%), polifenóis (taninos) (Cloreto férrico), mucilagem (Tinta da china), antocianinas (vapores de ácido acético) e amido (Lugol), (COSTA, 1982; GATTUSO e GATTUSO, 1999). Todas as lâminas foram registradas através de fotografias obtidas em microscópio com câmara digital (Tron). 43

4.5.2 Preparação do material vegetal para os estudos fitoquímicos e farmacológicos em Alternanthera brasiliana

O material coletado foi quebrado manualmente e desidratado em temperatura ambiente. Depois de pulverizado em moinho de facas, com tamis de malha 0,86µm, a droga foi macerada a frio com etanol 70% com agitação diária, após o período de sete dias, o líquido extrativo foi filtrado e, em evaporador rotatório, eliminou-se o álcool e, a partir da fração aquosa, foi realizado o fracionamento com solventes de polaridade crescente. (diclorometano, acetato de etila e n-butanol, 3 x 200 mL para cada solvente). O preparo do material vegetal, extratos e fracionamentos, está esquematizado na figura 6. Paralelamente o mesmo procedimento descrito acima foi realizado com 100 g de droga pulverizada, sem fracionamento posterior, com a finalidade de obtenção de um extrato bruto (EB). 44

Coleta das folhas de Alternanthera brasiliana (472,335g)

Secagem das folhas à temperatura ambiente

Maceração a frio EtOH:H2O (70:30)

Extrato bruto hidroalcoólico

Evaporação do EtOH

Fração aquosa

Extrato

Fracionado CH2Cl2=11,80g diclorometânico Evaporação Fracionado em rotavapor acetato de etila AcoEt= 2,83g

Fracionado n-BuOH= 9,44g n-butanólico

FIGURA 6 – Partição líquido-líquido e obtenção das frações orgânicas de Alternanthera brasiliana a partir de um fracionamento neutro do extrato bruto hidroalcoólico 70%. 45

4.5.2.1 Perfil cromatográfico

De modo a avaliar o melhor extrato fracionado (diclorometânico, acetato de etila ou n-butanol) a ser trabalhado fez-se uma CCD em cromatofolhas de sílica gel

G 60 F254 e optou-se então por direcionar os estudos de isolamento de constituintes com a fração diclorometânica.

4.5.2.2 Fracionamento preliminar do extrato diclorometânico

Coluna 1 O fracionamento preliminar do extrato iniciou-se através de cromatografia em coluna do tipo “flash”. Para a execução desta coluna utilizou-se 3g de extrato diclorometânico e 150 g de sílica gel. Nesta técnica, o gel de sílica foi suspenso em hexano:acetona (9:1) e a suspensão foi transferida para uma coluna de vidro, a qual possui uma das extremidades afilada e munida de uma torneira. Após a transferência e compactação do adsorvente, a amostra foi ressuspensa em pequena quantidade de eluente e aplicada sobre a coluna de gel de sílica. Os constituintes do extrato foram eluídos através da coluna com o auxílio de uma bomba de vácuo acoplada à extremidade superior desta. As frações recolhidas possuíam volume variável, na dependência da sua coloração, não excedendo o volume de 200mL. Os resultados da separação foram monitorados por CCD utilizando-se anisaldeído-ácido sulfúrico como revelador, sendo que as frações foram reunidas conforme a semelhança de seus constituintes.

Coluna 2 Após analisar as frações obtidas com a coluna “flash”, foram escolhidas as frações 4, 5 e 6 para realizar uma nova separação. A separação dos constituintes foi realizada através de cromatografia em coluna (CC), seguindo-se a mesma técnica descrita no item 3.5.2.2, porém sem a utilização de pressão. As condições da coluna estão descritas a seguir. Coluna: 40g de sílica gel 60 Amostra: 199mg das frações 4, 5 e 6 da coluna 1 Eluente: hexano:acetona (9:1) Vazão: 15 a 20 gotas/minuto 46

Coluna 3 A fração resultante da reunião das alíquotas 13, 14 e 15 foi submetida a nova cromatografia em coluna nas condições detalhadas abaixo. Coluna: 20g de sílica gel 60 Amostra: 54,4mg das frações 13, 14 e 15 da coluna 2 Eluente: diclorometano Vazão: 15 a 20 gotas/minuto

Coluna 4 Com a finalidade de isolar mais compostos, foi realizada uma nova coluna “flash”, utilizando a mesma quantidade de amostra da fração diclorometânica e de sílica. Optou-se por um sistema gradiente nesta coluna, o qual está descrito na tabela 3.

TABELA 3 – Sistemas de solventes empregados na preparação da coluna 4.

Sistema eluente da fração diclorometânica Sub-frações Diclorometano 1-5 Hexano:acetona (9:1) 6-11

Coluna 5 Após a análise das frações obtidas, optou-se trabalhar, primeiramente, com a fração de nº 2, devido à mesma apresentar manchas características de terpenos além do seu rendimento ter sido bastante significativo. As condições da coluna estão descritas a seguir. Amostra: 111,9mg Eluente: Clorofórmio Vazão: 15 a 20 gotas/minuto

4.6 Avaliação da atividade antimicrobiana

Os testes para a avaliação da atividade antimicrobiana dos extratos fracionados de Alternanthera brasiliana foram realizados no Laboratório de Pesquisas Micológicas (LAPEMI) da UFSM, com a colaboração do Profº. Drº. 47

Sydney Hartz Alves. Para tanto, utilizou-se o método de microdiluição em caldo, baseado nos documentos M27-A2 para fungos leveduriformes (NCCLS, 2002) e M7- A4 para bactérias (NCCLS, 1997). Esta metodologia avalia a Concentração Inibitória Mínima (CIM), que é a mais baixa concentração da substância que inibe completamente o crescimento do microorganismo. A interpretação dos resultados é baseada na turvação ou não das cavidades. A turvação evidencia a ineficácia da amostra na concentração testada perante o microorganismo, enquanto que a limpidez indica a concentração inibitória mínima (CIM) da fração testada em relação ao microorganismo em questão. Na possibilidade de se estabelecer um CIM, é feito um repique dessa concentração objetivando a determinação da concentração bactericida mínima (CBM), quando se trata de bactérias e concentração fungicida mínima (CFM) quando o microorganismo em questão pertence a classe dos fungos ou algas. As concentrações das frações testadas estão descritas na tabela 4.

TABELA 4 – Concentrações dos extratos utilizados nos ensaios microbiológicos.

Atividade antibacteriana Atividade antifúngica (µg/mL) (µg/mL) 2500,0 1250,0 1250,0 625,00 625,00 312,50 312,50 156,25 156,25 78,125

4.6.1 Microorganismos

A tabela 5 apresenta os microorganismos utilizados para a determinação da atividade antimicrobiana além dos fármacos utilizados como controle frente a cada cepa testada. 48

TABELA 5 – Cultivos padrões e fármacos utilizados no estudo.

Microorganismo ATCC Controle µg/mL Escherichia coli ATCC 2792 Ampicilina 8,0 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Ceftriazone 16,0 Staphylococcus aureus ATCC 25293 Ampicilina 2,0 Bacillus subtilis ATCC 6633 Imipenem 0,06 Cândida albicans ATCC 44773 Fluconazol 16,0 Cândida glabrata Isolado clínico Fluconazol 32,0 Saccharomyces ATCC 28952 Fluconazol 2,0 cereviseae Prototheca zopfii Isolado clínico Anfotericina B 0,5

4.7 Avaliação da atividade antioxidante das frações das folhas de Alternanthera brasiliana

A preparação do material vegetal se deu conforme o item 3.5.2. Foram avaliados o extrato bruto, as frações diclorometânica, acetato de etila e n-butanol das folhas de Alternanthera brasiliana. Para avaliação da atividade antioxidante foi usado o método fotocolorimétrico do DPPH (1,1-difenil, 2-picrilidrazila) utilizando o método (CHOI et al., 2002). Para o ensaio foram preparadas soluções de 125; 62,5; 31,25; 15,6 e 7,8µg/mL de cada amostra em etanol. À 2,5mL das amostras adicionou-se 1mL da solução de DPPH 0,3mM em etanol. Após 30 minutos foram feitas as leituras das absorbâncias a 518nm, onde o radical DPPH apresenta máximo de absorção. Uma solução de DPPH (1mL, 0,3mM) em etanol (2,5mL) foi usada como controle negativo e uma preparação de ácido ascórbico foi utilizada como padrão (controle positivo) nas mesmas concentrações das frações. Etanol foi usado para zerar o espectrofotômetro (Shimadzu, UV-1021), tendo como branco as soluções testes de cada fração sem adição do DPPH visando minimizar a interferência de componentes dos extratos na leitura. As leituras foram efetuadas em triplicata, sendo determinados o desvio padrão e o coeficiente de variação percentual (CV%) para cada uma das concentrações. A porcentagem da inibição de cada fração analisada frente ao DPPH foi determinada pela seguinte equação: 49

⎡(Ab amostra − Ab branco) ⎤ %inibição = 100 − ⎢ ×100⎥ ⎣ Ab controle ⎦ onde: Ab amostra = absorbância da amostra; Ab branco = absorbância do branco; Ab controle = absorbância do controle.

4.8 Doseamento de polifenóis das frações das folhas de Alternanthera brasiliana

O doseamento de polifenóis foi realizado com as mesmas frações e extrato bruto utilizado para a realização do método do DPPH, com a finalidade de estabelecer uma possível correlação entre ambos, uma vez que os polifenóis possuem atividade antioxidante reconhecida (GOUPY et al., 1999; HOUR et al., 1999). Foram doseadas as frações diclorometânicas, acetato de etila, n-butanol e o extrato bruto das folhas de A. brasiliana. Para o doseamento dos polifenóis foi utilizado o método de Chandra e Mejia (2004) modificado, o qual usa Folin- Ciocalteau (reagente para fenóis) que permite a determinação indireta dos compostos fenólicos utilizando o ácido gálico como padrão de todos os fenóis. Nesta reação forma-se um complexo de cor azulada, que absorve radiação no comprimento de onda de 760 nm. O método não é específico, porque outros compostos podem ser reduzidos, como açúcares e ácido ascórbico (SINGLETON e ROSSI, 1965). Este método foi adaptado utilizando como padrão o ácido pirogálico no lugar do ácido gálico (F. Bras.IV). As concentrações de polifenóis das amostras foram determinadas por comparação com a curva de calibração elaborada com o ácido pirogálico. Para o ensaio foram preparadas soluções de 0,15mg/mL de cada amostra onde se utilizou 10mL etanol de modo a solubilizar as frações e após o volume total foi completado a 100 mL com água destilada. À 1mL das amostras foram adicionados 0,5mL do reagente de Folin-Ciocalteau, após 5minutos acrescentou-se 10mL de carbonato de sódio 20% e as leituras das absorbâncias foram realizadas após 10 minutos, em 730nm. Todas as amostras foram preparadas em triplicata. A 50 curva de calibração foi feita com ácido pirogálico nas concentrações de 0,005; 0,01; 0,015; 0,025 e 0,03mg/mL e suas leituras procedidas da mesma forma das amostras. Para zerar o espectrofotômetro (Shimadzu, UV 1021) foi utilizado água destilada. 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Introdução aos resultados e discussão referentes à parte I

Devido à crescente demanda mundial, as plantas utilizadas como medicinais necessitam cada vez mais de um estabelecimento de normas que venham a contribuir para o controle de qualidade, que garanta a identidade correta dos insumos bem como em todas as etapas do desenvolvimento para a utilização dos mesmos pela industria farmacêutica. Sendo assim, esta dissertação, em sua primeira parte, objetivou avaliar os aspectos botânicos existentes entre duas espécies de Alternanthera com uso medicinal popular comum, procurando definir diferenças consistentes, destacando aspectos de relevância para a padronização de matérias primas de A. brasiliana e A. dentata. Muitas vezes, as diferenças a olho nu de espécies do mesmo gênero não são suficientes para a correta identificação requerendo uma análise mais profunda das estruturas presentes no vegetal. O detalhamento deste estudo está descrito a seguir

5.2 Análise morfo-histológica

A primeira diferença detectada entre as duas espécies se refere a estrutura do caule principal que reflete basicamente o desenvolvimento destas plantas. Em Alternanthera brasiliana as folhas se distribuem ao longo de todo o caule principal com muitas gemas e nós que ocorrem ao longo deste caule, e por vezes se apresenta de forma decumbente. Em Alternanthera dentata as folhas se encontram concentradas no ápice do caule, assim como os nós dando origem a ramificações, o que lhes confere uma característica mais ereta com um caule principal. Outra diferença estabelecida foi a coloração das folhas onde a primeira espécie apresenta uma coloração mais avermelhada e a espécie Alternanthera dentata uma coloração mais esverdeada (fig. 21). Estas diferenças permaneceram mesmo quando ambas foram submetidas à mesma incidência solar e com o mesmo tipo de substrato. 52

Figura 7a Figura 7b FIGURA 7 – Aspecto geral dos ramos vegetativos de Alternanthera brasiliana (7a) e Alternanthera dentata (7b).

5.2.1 Análise morfológica

A tabela 6 apresenta os resultados da análise morfológica das folhas de Alternanthera brasiliana e Alternanthera dentata, seguida das figuras 8 a 14, correspondentes. Destaca-se a coloração, o contorno e a margem das folhas, bem como a abundância de tricomas na face dorsal e a forma do pecíolo em seção transversal como sendo características macroscópicas úteis na diferenciação entre estas duas espécies. 53

TABELA 6 – Análise morfológica de Alternanthera brasiliana versus Alternanthera dentata. Alternanthera dentata Alternanthera brasiliana Lâmina Foliar Contorno Oblongo com pouca Elíptico, oblongo-lanceolado pilosidade. com pilosidades alvas e em maior quantidade que na outra espécies Ápice Agudo (mais expressivo Agudo (mais tênue que em A. que em A. brasiliana). dentata). Base Simétrica, cuneata. Simétrica, cuneata. Margem Inteira com poucos Inteira com tricomas tectores tricomas tectores muito muito próximos e em número espaçados entre si. elevado. Subdivisão do limbo Inteiro e mais largo na Inteiro e mais delgado na região região mediana e mais mediana do que em A. dentata. longo em comprimento do que em A. brasiliana. Nervação Peninérvia. Peninérvia. Tamanho 7,0cm compr. x 4,0cm larg. 4,5cm compr. x 2,0 cm larg. Transparência com poucos tricomas com tricomas esbranquiçados esbranquiçados e do tipo viloso. evidentes pontos translúcidos irregulares. Consistência Membranácea. Membranácea. Pecíolo Aspecto Geral Achatado com 25-30mm Delgado com 10-15mm de de comprimento. comprimento. Inserção Marginal. Marginal. Secção transversal Côncavo-convexo. Circular, levemente canaletado. Filotaxia Oposta Oposta Venação Venação Pinada, camptódroma, Pinada, camptódroma, eucamptódroma. eucamptódroma. Última marginal Fimbriada. Fimbriada. Aoréola Pentagonal a irregular bem Pentagonal a irregular não demarcada. evidente ao estereomicroscópio. 54

FIGURA 8 – Aspecto macroscópico da folha fresca de Alternanthera brasiliana (fig. 8a) e Alternanthera dentata (fig. 8b). 1a.-lâmina foliar vista ventral; 1b.- lâmina foliar vista dorsal; 2a.-lâmina foliar vista dorsal; 2b.-lâmina foliar vista ventral.

FIGURA 9 – Margem da lâmina foliar de Alternanthera brasiliana (fig. 9a) e Alternanthera dentata (fig. 9b). Legenda: as setas indicam os tricomas presentes na margem foliar. 55

FIGURA 10 – Tricomas da face dorsal da folha fresca de Alternanthera brasiliana (fig. 10a) e Alternanthera dentata (fig. 10b).

FIGURA 11 – Limbo de Alternanthera brasiliana (fig. 11a) e Alternanthera dentata (fig. 11b) evidenciando os tricomas tectores.

FIGURA 12 – Aspecto geral da seção transversal do pecíolo de Alternanthera brasiliana (fig. 12a) e Alternanthera dentata (fig. 12b). 56

FIGURA 13 – Margem fimbriada, camptódroma, eucamptódroma de Alternanthera brasiliana (fig. 13a) e Alternanthera dentata (fig. 13b) em detalhe.

FIGURA 14 – Aureola pentagonal a irregular das faces ventrais dos limbos foliares de Alternanthera brasiliana (fig. 14a) e Alternanthera dentata (fig. 14b).

5.2.2 Análises anatômicas das folhas – Alternanthera brasiliana e Alternanthera dentata

As tabelas 7 e 8 referem-se as análises microscópicas de A. brasiliana e A. dentata, respectivamente. Os caracteres microscópicos da folha de A. dentata e A. brasiliana exibem características próximas como a epiderme uniestratificada com estômatos do tipo xerofítico, o mesofilo heterogêneo com idioblastos contendo drusas, e os feixes vasculares protegidos por uma bainha parenquimática característica de plantas do tipo C4. Contudo, pode-se averiguar que a cutícula em A. brasiliana é mais espessa que em A. dentata. Os estômatos são anfiestomáticos 57 para A. brasiliana, enquanto que A. dentata exibe estômatos hipostomáticos. O parênquima esponjoso em A. dentata mostra-se mais frouxo que em A. brasiliana que, por vezes, assume um menor número de camadas celulares neste parênquima. Os tricomas da face adaxial são muito numerosos em A. brasiliana e também ocorre, na região central das folhas, uma aresta de nervura convexa e também arqueada em A. dentata, porém em A. brasiliana a região central das folhas exibe uma aresta de nervura do tipo convexo. Na região central em A. brasiliana ocorre um colênquima junto a epiderme inferior, enquanto que em A. dentata o colênquima é subjacente à epiderme superior. O feixe vascular de A. dentata mostra células parenquimáticas junto ao floema o que não foi observado em A. brasiliana que exibe um floema compacto.

TABELA 7 – Análise microscópica da folha de Alternanthera brasiliana.

Cutícula: delgada sem formações epicuticulares, sendo mais espessa na região central do limbo. Células epidérmicas: camada simples de células Epiderme pavimentosas. A parede periclinal é maior que a (uniestratificada, parede anticlinal. A epiderme na região abaxial anfiestomática com apresenta células de, aproximadamente, a estômato do tipo metade do comprimento das células epidérmicas xerofítico) na região adaxial. Estômatos: xerofítico, anfiestomático. Tricomas tectores: esparsos, unisseriados composto por 3 a 4 células e com base simples. Parênquima paliçádico: composto por apenas 1 camada de células. Seção Parênquima esponjoso: composto por 2 a 3 Limbo transversal camadas de células; as de maior dimensão Mesofilo estão localizadas nas camadas próximas a (heterogêneo, paliçada. Também, próximo a paliçada ocorrem bifacial) idioblastos com acúmulo de oxalato de cálcio do tipo drusa. Ocorrem células justapostas, mas o espaço intercelular é irregular. Em todas as formações parenquimáticas não foram evidenciados canais ou células secretoras. Região de nervuras primárias: As nervuras de grande porte apresentam-se protegidas por uma bainha vascular composta de parênquima Sistema de feixe esponjoso. Abaixo da epiderme abaxial ocorre 2 vascular a 3 camadas de colênquima do tipo angular. Os feixes vasculares são do tipo colateral fechado e possuem formato côncavo-convexo. 58

(cont. Tabela 7) Região de nervuras secundárias e menores: A estrutura das nervuras secundárias e das que Seção Sistema de feixe Limbo possuem menor porte segue o mesmo padrão transversal vascular das nervuras primárias, porém a bainha vascular fica mais definida na estrutura como um todo. Parede celular: sinuosa ao centro e reta próximo as extremidades. Seção Estômatos: diacíticos (predominam), anisocíticos e paracíticos. paradérmica Tricomas tectores: são unisseriados com extremidades afiladas e parede (adaxial) verrugosa. Em geral apresentam 3 células, entretanto, também são encontrados tricomas com 2 células. Parede celular: sinuosa. Seção Estômatos: diacíticos (predominam), anisocítico e anomocítico. paradérmica Tricomas tectores: unisseriados com extremidades afiladas e parede verrugosa (abaxial) (predomina) e lisa. Células unidas por vilosidades. Os tricomas são formado por 3 células, mas também se encontra tricomas com 2 a 5 células.

TABELA 8 – Análise microscópica de Alternanthera dentata.

Cutícula: mais tênue que na espécie A. brasiliana e com um discreto espessamento na região central. Sem formações epicuticulares. Células epidérmicas: camada simples de células Epiderme pavimentosas. A parede periclinal geralmente (uniestratificada, apresenta-se com tamanho superior ao da parede anfiestomática com anticlinal. As células epidermicas na região abaxial estômato do tipo apresenta comprimento inferior ao das células da xerofítico) epiderme adaxial. Estômatos: xerofítico, hipostomático.

Seção Tricomas tectores: pouco numerosos, Limbo transversal unisseriados, composto por 2 células e uma base simples (unicelular). Parênquima paliçádico: composto por apenas uma camada de células. Parênquima esponjoso: composto por 3 a 4 Mesofilo camadas de células; as células próximas ao parênquima paliçadico possuem maior tamanho e, (heterogêneo, as próximas a epiderme abaxial, são menores. O bifacial) espaço intercelular é irregular e as células encontram-se mais distantes entre si do que em A. brasiliana. Ocorrem idioblastos com acúmulo de oxalato de cálcio do tipo drusa. 59

(cont. Tabela 8) Região de nervuras primárias: As nervuras de grande porte apresentam-se protegidas por uma bainha parenquimática. Logo abaixo da epiderme abaxial ocorre uma camada tênue de colênquima. Seção Sistema de feixe Os feixes vasculares são do tipo colateral. Limbo transversal vascular Região de nervuras secundárias e menores: A estrutura das nervuras secundárias e das que possuem menor porte segue o mesmo padrão das nervuras primárias, porém a bainha vascular parenquimática está bem delimitada. Seção Parede celular: sinuosa a reta. paradérmica Estômatos: diacíticos. (adaxial) Tricomas tectores: não foi encontrado tricoma em nenhuma seção paradérmica. Parede celular: sinuosa. Seção Estômatos: diacíticos (predominam), anisocítico e anomocítico. paradérmica Tricomas tectores: unisseriados com extremidades afiladas e parede verrugosa. (abaxial) Geralmente estes tricomas encontram-se compostos por 2 células, mas também são encontrados tricomas de 3 células.

As figuras 15 a 20 evidenciam diferentes estruturas das folhas de A. brasiliana e A. dentata em cortes transversais e as figuras 21 a 23 expõem as características evidenciadas em cortes paradérmicos nas folhas das referidas espécies.

FIGURA 15 – Seção transversal evidenciando o aspecto geral da região central do limbo da folha de Alternanthera brasiliana. Legenda: 1. epiderme adaxial; 2. epiderme abaxial; 3. Parênquima paliçadico; 4. Parênquima esponjoso; 5. Feixe vascular, 6. colênquima. 60

FIGURA 16 – Seção transversal evidenciando o aspecto geral da região central do limbo da folha de Alternanthera dentata. Legenda: 1. epiderme da região superior; 2. epiderme da região inferior; 3. Parênquima paliçádico; 4. Parênquima esponjoso; 5. Feixe vascular; 6. Colênquima.

FIGURA 17 – Seção transversal evidenciando o aspecto geral do feixe vascular central no limbo da folha de Alternanthera brasiliana (fig. 17a) e Alternanthera dentata (fig. 17b). Legenda: 1- Xilema; 2- Floema; 3- Parênquima. 61

FIGURA 18 – Seção transversal da região lateral do limbo da folha de Alternanthera brasiliana (fig. 18a) e Alternanthera dentata (fig. 18b) evidenciando feixe vascular secundário protegido por bainha vascular parenquimática. Legenda: 1. Bainha vascular parenquimática; 2. Xilema; 3. Floema.

FIGURA 19 – Seção transversal da região lateral do limbo da folha de Alternanthera brasiliana (fig. 19a) e Alternanthera dentata (fig. 19b) evidenciando detalhe de feixes vasculares laterais. Legenda: 1. idioblasto cristalífico; 2. feixe vascular; 3. Bainha vascular parenquimática. 62

FIGURA 20 – Seção transversal da região lateral do limbo da folha de Alternanthera brasiliana (fig. 20a) e Alternanthera dentata (fig. 20b) evidenciando mesofilo. Legenda: 1. Estômatos xerofíticos na epiderme da região abaxial e adaxial; 2. Parênquima paliçadico; 3. Parênquima esponjoso.

FIGURA 21 – Seção paradérmica da face abaxial do limbo de folhas de Alternanthera brasiliana (fig. 21a) e Alternanthera dentata (fig. 21b) evidenciando tricomas tectores. Legenda: 1a.- tricoma tector unisseriado com parede verugosa formado por 3células; 1b.- tricoma tector unisseriado com parede verugosa formado por 4 células; 2a.- tricoma tector unisseriado com parede verrugosa formado por 3 células. 63

FIGURA 22 – Seção paradérmica da face abaxial do limbo de folhas de Alternanthera brasiliana (fig. 22a) e Alternanthera dentata (fig. 22b) evidenciando células epidérmicas. Legenda: 1a. e 2a.- célula epidérmica com parede anticlinal sinuosa; 1b.e 2b.- estômatos diacíticos (predomina).

FIGURA 23 – Seção paradérmica da face adaxial do limbo de folhas de Alternanthera brasiliana (fig. 23a) e Alternanthera dentata (fig. 23b) evidenciando células epidérmicas. Legenda: 1a.- células epidérmica com parede anticlinal reta e/ou levemente sinuosa; 2a.- células epidêmicas com parede anticlinal pouco sinuosa; 1b. e 2b.- estômato diacítico.

5.2.3 Análise histoquímica

A tabela 9 e as figuras 24 a 29, apresentam os resultados da análise histoquímica. Pode-se constatar que as mucilagens e alcalóides ocorrem em células com localização histológica diferenciada entre as duas espécies em questão. Flavonóides e óleos voláteis diferem basicamente nestas espécies pela intensidade 64 dos mesmos. Os grãos de amido se diferenciam nas espécies pelo tamanho que exibem e número que são encontrados, já as antocianinas diferenciam-se pela quantidade e localização tecidual. Os reagentes e corantes utilizados estão descritos nas figuras.

TABELA 9 – Análise histoquímica das folhas de Alternanthera brasiliana e de Alternanthera dentata.

Localização histoquímica Compostos analisados Alternanthera brasiliana Alternanthera dentata Mucilagens Junto ao parênquima, próximo ao Junto ao parênquima próximo a feixe vascular central. (fig. 37a) epiderme na face adaxial. (fig 37b) Polifenóis Epiderme e parênquima subjacente Ocorre uma predominância de a epiderme na face abaxial. (fig. 38) catequinas no parênquima esponjoso. * Flavonóides Epiderme na face adaxial e abaxial. Na epiderme na face adaxial em (fig. 39a) maior quantidade. (fig. 39b) Óleos voláteis Parênquima esponjoso, abaixo do Parênquima esponjoso. (fig. 40b) feixe vascular. (fig. 40a) Alcalóides Epiderme na face adaxial e junto ao Epiderme na face adaxial. (fig. parênquima, mais concentrado no 43) parênquima adjacente aos feixes vasculares. (fig. 42a) Grão de amido simples distribuídos Grãos dde amido simples, em Amido nas células parenquimáticasl. (fig. grande quantidade no 41a) parênquima esponjoso. (fig. 41b) Antocianinas Grande quantidade em Em grande quantidade no praticamente todas as regiões parênquima esponjoso. * anatômicas. *

* Fotografia não mostrada 65

FIGURA 24 – Coloração por tinta da china evidenciando mucilagens – folhas de Alternanthera brasiliana (fig. 24a) e de Alternanthera dentata (fig. 24b).

FIGURA 25 – Coloração por cloreto férrico evidenciando polifenóis em seção transversal da folha de Alternanthera brasiliana. 66

FIGURA 26 – Coloração por hidróxido de potássio 5% evidenciando flavonóides em seção transversal das folhas de Alternanthera brasiliana (fig. 26a) e Alternanthera dentata (fig. 26b).

FIGURA 27 – Coloração do Sudan III evidenciando óleos voláteis em seção transversal das folhas de Alternanthera brasiliana (fig. 27a) e Alternanthera dentata (fig. 27b).

FIGURA 28 – Coloração por reativo lugol evidenciando grãos de amido em seção transversal das folhas de Alternanthera brasiliana (fig. 28a) e Alternanthera dentata (fig. 28b). 67

FIGURA 29 – Coloração por reativo de Dragendorff evidenciando alcalóides em seção transversal das folhas de Alternanthera brasiliana (fig. 29a) e Alternanthera dentata (fig. 29b).

A instituição e normatização de registros de produtos fitoterápicos junto ao Sistema Nacional de Vigilância Sanitária, do Ministério da Saúde (SVMS-MS), prevê algumas determinações a fim de resgatar a necessidade de estudos de segurança, eficácia e qualidade prévios às plantas. Através da farmacobotânica, cujas técnicas são de baixo custo e de resultados imediatos (GATTUSO e GATTUSO, 1999), procurou-se estabelecer padrões morfo-anatômicos capazes de caracterizar as duas espécies de Alternanthera, uma vez que as mesmas apresentam diferenças sutis e inconspícuas, acarretando uma dificuldade e dúvidas quanto suas corretas identificações. A tênue diferença entre as espécies Alternanthera brasiliana e Alternanthera dentata fez com que as mesmas fossem consideradas por alguns autores como uma única espécie (LORENZI e MATOS, 2002), entretanto, em nossos estudos pode-se verificar aspectos morfológicos e anatômicos que auxiliam em uma diferenciação consistente para ambas as espécies. Morfologicamente, a venação de A. dentata e A. brasiliana são concordantes, mas a primeira espécie apresenta o limbo mais translúcido e a segunda possui o limbo mais opaco. Outra diferença bastante significante e de fácil percepção para diferenciar as espécies está na coloração desenvolvida por suas folhas, onde em A. dentata as folhas preservam o tom esverdeado na base e, gradualmente, tendem a uma tonalidade mais púpura enquanto que em A. brasiliana a coloração das folhas é uniformemente púpura em ambas as faces. Além da coloração mais fechada em A. 68 dentata, suas folhas e caules são mais robustos. Em relação ao contorno da lâmina foliar, em A. dentata foi determinado como sendo oblongo e tendo pouca pilosidade, enquanto que em A. brasiliana o limbo foi classificado como elíptico, oblongo- lanceolado apresentando pilosidades alvas e em maior quantidade. O pecíolo em A. dentata, em corte transversal apresentou formato côncavo-convexo e também é mais longo que em A. brasiliana o qual o mesmo toma formato circular levemente canaletado quando analisado em seção transversal. Na revisão da literatura, conforme Edwin e Reitz (1967) as folhas de Alternanthera dentata são mais esverdeadas e as flores possuem sépalas mais curtas que bractéolas além de serem alvo pilosas. Na mesma chave de identificação a espécie congenérica Alternanthera brasiliana é descrita como tendo folhas variáveis e flores branco amarelentas além das brácteas e bracteóles apresentarem metade do tamanho das flores. Lorenzi (2000), Kissmann e Groth (1999) e Lorenzi e Moreira (2001) declaram ser a coloração mais arroxeada das folhas e ramos e a presença de brácteas mais longas que as tépalas com as margens lancerado- denteadas as únicas diferenças entre as duas espécies. Anatomicamente, as folhas são anfiestomáticas para a espécie A. brasiliana (apresentam estômatos na face dorsal e ventral) enquanto que em A. dentata os estômatos se localizam somente na face abaxial da folha sendo, portanto, denominado de hipostomática. A classificação de anfiestomática está de acordo com o padrão de Amaranthaceae (METCLAFE e CHALK, 1950). Duarte e Debur (2004), descreveram para A. brasiliana estômatos anomocíticos e diacíticos, contudo, no presente estudo, foram encontrados, além dos dois tipos identificados pelos autores anteriores, estômatos paracíticos e anisocíticos, porém com menor ocorrência. Quando comparadas as duas espécies estudadas houve predominância de estômatos do tipo diacíticos em ambas as faces do limbo. Delaporte et al. (2002) referenciou para Alternanthera brasiliana a existência exclusiva de estômatos anomocíticos. Em estudo com a espécie Alternanthera tenella, Ferreira et al. (2003) identificaram estômatos do tipo diacíticos e Bona (1993) relatou a prevalência do tipo diacítico nas espécies Alternanthera aquatica e Alternanthera philoxeroides, entretando também foram encontrados estômatos anomocíticos nestas espécies. A forma dos tricomas segue um padrão determinado nas diversas espécies, o que determina valor taxonômico para este caráter (ESAÚ, 1977). Em Amaranthaceae o padrão dos tricomas é muito variado (METCALFE e CHALK, 69

1950). Os tricomas tectores encontrados na análise anatômica de A. brasiliana está de acordo com o que foi observado por Duarte e Debur (2004) e Delaporte et al. (2002) sendo unisseriado e composto por três células com extremidade afilada e junção das células por vilosidade. Também foram encontrados tricomas com o número de células variando de duas a cinco, mas em todos os casos há predominância de parede verrugosa. Em Alternanthera dentata, não foi verificada a existência de tricomas em seções paradérmicas adaxiais, estando presentes somente na face abaxial e portando as mesmas características de Alternanthera brasiliana sendo, majoritariamente composto por 2 células, mas por vezes com tricomas formados por 4 células. Bona (1993) mostrou existir para as espécies A. philoxeroides e A. aquática dois diferentes tipos de tricomas não glandulares. A. stellata, estudada por Metcalf e Chalk (1988) apresentou tricomas pluricelulares não glandulares com formações dendríticas. Ferreira et al. (2003) encontrou em Alternanthera tenella tricomas do tipo glandulares multicelulares não ramificados em ambas as faces da folha. Devido a essa ampla variedade de tipos de tricomas existentes entre as espécies de Alternanthera, conclui-se que este caráter pode ser útil na orientação para a identificação de espécie. Mesofilo dorsiventral (bifacial) é comum em Amaranthaceae (METCALFE e CHALK, 1950), sendo encontrado nas duas espécies analisadas. Os mesmos autores também descreveram as drusas como estruturas comuns em Alternanthera. Em A. tenella foi confirmada a presença de drusas entre os feixes vasculares (FERREIRA et al., 2003). Duarte e Debur (2004) confirmaram essas estruturas em A. brasiliana nas células idioblásticas e, igualmente a estes pesquisadores, as espécies estudadas apresentaram igual característica estando, entretanto, em maior quantidade em A. dentata. A localização dos idioblastos é bastante variada, havendo uma tendência a elas se situarem próximas aos vasos de médio e pequeno porte. Foram visualizadas estruturas com forma de cristais dentro das células idioblásticas de A. brasiliana e A. dentata. Às células idioblásticas pode-se atribuir diversas funções como balanço iônico impedindo a acumulação de oxalato tóxico, armazenamento de cálcio, proteção contra o ataque de herbívoros além de funcionarem como suporte mecânico (HARRY e BRUCE, 1980). A epiderme simples e o parênquima paliçádico formado por uma camada de células em A. brasiliana e A. dentata também foi verificado por Ferreira et al. (2003) para A. tenella. Da mesma forma em que houve concordância de resultados com o 70 tipo de células epidérmicas visualizados em seções paradérmicos realizados por Duarte e Debur (2004) e Delaporte et al. (2002) onde a face adaxial apresentou parede sinuosa a lisa e a face abaxial com parede ondeada. A aresta de nervura de A. brasiliana foi definida como convexa, entretanto Duarte e Debur (2004) encontraram uma nervura biconvexa mais proeminente na face abaxial, em A. dentata, com a análise de diversas seções transversais foi verificado além da aresta de nervura convexa a existência de arestas arqueadas. O colênquima angular de A. brasiliana assim como o número de camadas celulares encontrados na porção abaxial da folha entrou em concordância com os autores citados acima. O feixe vascular central é do tipo colateral fechado e se apresenta no formato côncavo-convexo em A. brasiliana, assim como em A. dentata não sendo verificada a variabilidade de disposições e quantidades citadas por Duarte e Debur (2004). As estruturas secundárias seguem o mesmo padrão do feixe central, porém com uma bainha parenquimática mais nítida caracterizando o tipo C4 desta família. Quanto às análises histoquímicas pode-se inferir a presença de alcalóides, amido, antocianidinas, flavonóides, mucilagens, polifenóis e óleos voláteis em ambas as espécies. Pelo fato destes resultados serem concordantes em A. brasiliana e A. dentata, o estudo histoquímico destas espécies não pode ser utilizado como critério de diferenciação. Algumas classes de compostos identificados por corantes e reagentes utilizados nas análises histoquímicas também já tiveram sua confirmação de existência no gênero através de estudos fitoquímicos como os alcalóides, esteróides e triterpenos identificados por Calderón, García Assef e Fuentes (1997) para a espécie A. pungens, os terpenos, esteróides (MACEDO et al., 1999; SANTOS et al., 1995) e compostos fenólicos citados por Santos et al. (1995) para a A. brasiliana assim como os flavonóides presentes na mesma espécie e identificados por Brochado et al. (2003).

5.3 Introdução aos resultados e discussões referentes a parte II

A segunda parte desta dissertação contemplou análises de caráter fitoquímico, as quais visaram a identificação de metábólitos secundários existentes em A. brasiliana e a aplicação de testes antimicrobianos e antioxidante além da determinação do teor de polifenóis presentes na referida espécie. Para o estudo fitoquímico fez-se uso de técnicas cromatográficas tradicionais como cromatografia em coluna e cromatografia em camada delgada. Técnicas por CLAE são bastantes práticas nesta linha de estudos, uma vez que trata-se de uma 71 metodologia bastante sensível e que permite acoplar outros métodos de análise agilizando a identificação dos constituintes entretanto, por mais que a CLAE seja uma técnica muito sensível, as análises cromatográficas empregadas também reproduzem resultados satisfatórios. Análises de 1H-RMN e 13C-RMN foram utilizadas de modo a possibilitar a identificação dos compostos isolados. Auxiliando esta investigação encontram-se relatos científicos os quais são fundamentais na identificação das substâncias. Os testes biológicos foram realizados in vitro empregando espectrofotômetro para leitura e posterior interpretação dos resultados.

5.4 Rendimento dos extratos das folhas de Alternanthera brasiliana

5.4.1 Rendimento e perfil das frações diclorometânica, acetato de etila e n-butanol.

A partir de 472,33g do pó das folhas secas de Alternanthera brasiliana, foram obtidos 11,80g de extrato seco da fração diclorometânica, correspondendo a um rendimento de 2,49%; 2,83 g da fração acetato de etila, representando 0,59% e 9,44g da fração butanólica o que equivale a 1,99% do total da droga em pó macerada. Todas as frações foram analisadas por cromatografia em camada delgada. A fração diclorometânica forneceu o maior rendimento e, partir dessa, foram isolados os compostos Ab1, Ab2, Ab3 e Ab4. A figura 30 representa o perfil cromatográfico de frações diclorometânicas de A. brasiliana, provenientes de 4 coletas realizadas no município de Santa Cruz do Sul.

FIGURA 30 – Cromatograma das frações diclorometânicas de A. brasiliana com

observação sob luz visível. Sistema eluente: CH2Cl2: EtOH (9:1), revelador: anisaldeído-sulfúrico e aquecimento a 100ºC. 72

5.4.2 Perfis cromatográficos das frações das colunas 1, 2 e 3

Coluna 1 Foram coletadas e analisadas cromatograficamente 22 frações. A figura 31 representa o perfil cromatográfico das frações 4 a 10, sendo escolhidas as de número 4, 5 e 6 para um novo fracionamento.

FIGURA 31 – Cromatograma das frações 4 a 10 da coluna 1 com observação sob luz visível. Sistema eluente: hexano:acetona (9:1)-migrado 4 vezes, revelador: anisaldeído-sulfúrico e aquecimento a 100ºC. 73

Coluna 2 As figuras 32 e 33 mostram o perfil cromatográfico das frações obtidas na coluna 2. Da esquerda para a direita, frações em ordem numérica crescente. A última coluna da direita representa o material de partida.

FIGURA 32 – Cromatograma das frações 1 a 34 da coluna 2 com observação sob luz visível. Sistema eluente: hexano:acetona (9:1), revelador: anisaldeído-sulfúrico e aquecimento a 100ºC.

FIGURA 33 – Cromatograma das frações 1 a 34 da coluna 2 com observação sob luz ultravioleta. Sistema eluente: hexano:acetona (9:1), revelador: anisaldeído-sulfúrico e aquecimento a 100ºC. 74

As frações 13, 14 e 15 foram juntadas devido suas semelhanças e seu perfil isolado é mostrado na figura 34.

FIGURA 34 – Cromatograma das frações 13 a 15 da coluna 2 com observação sob

luz visível. Sistema eluente: CH2Cl2-migrado 2 vezes, revelador: anisaldeído-sulfúrico e aquecimento a 100ºC.

Coluna 3 Após o fraciomento das alíquotas 13, 14 e 15, oriundas das colunas 2, obteve-se o seguinte perfil cromatográfico representado na figura 35 para as frações 28 a 32. 75

FIGURA 35 – Cromatograma das frações 28 a 32 da coluna 3 com observação sob

luz visível. Sistema eluente: CH2Cl2, revelador: anisaldeído-sulfúrico e aquecimento a 100ºC.

Esta substância foi submetida a análise por 1H RMN e 13C RMN para a elucidação estrutural do composto.

5.5 Elucidação estrutural da substância Ab1

Da fração diclorometânica do extrato hidro-etanólico das folhas da planta foram isolados 42mg de um composto cristalino branco, o qual se apresentou como uma única mancha (CCD), de coloração roxa após revelação com o reagente anisaldeído-sulfúrico e aquecimento a 100ºC. Uma representação esquemática das etapas do isolamento de Ab1 pode ser visualizado na figura 36. 76

Extrato CH2Cl2 de A. brasiliana 3,0g

Coluna 1- coluna flash Adsorvente: SiO2 Eluente: hexano:acetona (9:1)

Fração 4-6 da col. 3 (199mg)

Coluna 2- CC Adsorvente: SiO2 Eluente: hexano:acetona (9:1)

Fração 13-15 da col. 4 (54,4mg)

Coluna 3- CC

Adsorvente: SiO2 Eluente: CH2Cl2 Fração 28-32 da col. 3 (Ab1)

FIGURA 36 – Isolamento de Ab1 a partir do fracionamento da fração diclorometânica de Alternanthera brasiliana sobre gel de sílica.

O comportamento cromatográfico de Ab1 e a comparação por cromatografia em camada delgada com amostra autêntica de β-sitosterol sugeriu a presença desse esteróide em mistura. A confirmação foi realizada através de cromatografia em camada delgada bidimensional, onde foi verificada a existência do mesmo. (fig. 45).

FIGURA 37 – Cromatograma bidimensional de Ab1 com observação sob luz ultravioleta.

Sistema eluente: 1ª migração: hexano: AcoEt (1:1); 2ª migração: CHCl2: AcoEt (7:3), revelador: anisaldeído-sulfúrico e aquecimento a 100º C. 77

A figura 38 representa as estruturas químicas dos três compostos identificados através do espectro de 13C-RMN.

FIGURA 38 – Diferença estrutural entre os triterpenos estigmasterol, β-sitosterol e espinasterol. 78

13 FIGURA 39 – Espectro de C RMN de Ab1, em CDCl3.

Paralelamente, a substância Ab1 foi submetida à análise por Ressonância Magnética Nuclear (13C RMN e 1H RMN). A análise espectroscópica indicou tratar-se 79 de uma mistura de três triterpenos, entre os quais o β-sitosterol, já evidenciado inicialmente por cromatografia bidimensional. O isolamento de triterpenos esteroidais em mistura é freqüentemente relatado na literatura (OLEA e ROQUE, 1990; DE-EKNAMKUL e POTDUANG, 2003; GOULART et al., 1993). Na tabela 10 estão os valores obtidos e os relatados por algumas bibliografias para os três triterpenos identificados.

TABELA 10 – Valores espectroscópicos de 13 C-RMN atribuídos a estigmasterol (Ab1.a), β-sitosterol (Ab1.b) e espinasterol (Ab1.c)da mistura e dos

compostos 1-3 tidos como referências (δc=ppm). Estga 1 Ab1.a β-sitb 2 Ab1.b Espinac 3 Ab1.c C1 37,25 37,27 C1 37,25 37,17 C1 37,1 37,16 C2 31,64 31,65 C2 31,64 31,65 C2 31,4 31,44 C3 71,81 71,77 C3 71,81 71,77 C3 71,0 71,36 C4 42,29 42,30 C4 42,29 42,30 C4 38,0 37,99 C5 140,73 140,77 C5 140,73 140,77 C5 40,2 40,28 C6 121,72 121,66 C6 121,72 121,66 C6 29,6 29,66 C7 31,89 31,91 C7 31,89 31,91 C7 117,4 117,41 C8 31,89 31,91 C8 31,89 31,91 C8 139.5 139,58 C9 50,12 50,16 C9 50,12 50,16 C9 49,4 49,48 C10 36,40 36,50 C10 36,40 36,57 C10 34,2 34,21 C11 21,08 21,08 C11 21,08 21,08 C11 21,5 21,55 C12 39,68 39,68 C12 39,68 39,69 C12 39,4 39,48 C13 42,29 42,32 C13 42,29 42,22 C13 43,3 43,28 C14 56,87 56,78 C14 56,87 56,78 C14 55,1 55,12 C15 24,38 24,35 C15 24,30 24,29 C15 23,0 22,96 C16 28,24 28,22 C16 28,24 28,22 C16 28,5 28,75 C17 55,93 55,99 C17 56,05 56,09 C17 55,8 56,12 C18 11,87 11,96 C18 11,87 11,96 C18 12,0 12,03 C19 19,38 19,37 C19 19,38 19,37 C19 13,0 13,00 C20 40,50 40,43 C20 36,16 36,13 C20 40,8 39,79 C21 21,20 21,20 C21 19,03 19,04 C21 21,4 21,35 C22 138,40 138,27 C22 33,94 33,92 C22 138,7 138,12 C23 129,27 129,30 C23 33,12 26,27 C23 129,4 129,47 C24 51,23 51,23 C24 45,83 45,87 C24 51,2 51,23 C25 31,89 32,09 C25 26,03 28,87 C25 31,9 31,50 C26 19,0 21,26 C26 18,76 18,97 C26 21,1 21,04 C27 19,0 19,13 C27 19,81 19,78 C27 19,0 18,90 C28 25,42 25,36 C28 23,06 23,09 C28 25,4 25,36 C29 12,27 12,30 C29 11,99 11,84 C29 12,3 12,20

1 - Citado de estigmasterol (Goulart et al., 1993 CDCl3). 2 - Citado de β-sitosterol (Goulart et al, 1993, CDCl3). 3 - Citado de espinasterol (Kojima et al., 1990, CDCl3). 80

Um grande número de substâncias triterpênicas de ocorrência vegetal já é bem conhecido. Uma ampla diversidade quanto ao esqueleto e funcionalização predominantemente oxigenada, leva a mais de mil estruturas. Dentro dessa variedade existem alguns que ocorrem com maior freqüência. Estes apresentam apenas um grupo funcional no C-3 e são pentacíclicos ou tetracíclicos que contém no máximo uma e duas ligações duplas, respectivamente. Exemplos característicos são o lupeol, α-amirina, β-amirina, friedelina e o lanostadieno (OLEA e ROQUE, 1990). Os esteróides são substâncias relacionadas aos triterpenos, apresentando um esqueleto cíclico básico igual a dos triterpenos tetracíclicos do ciclopentanoperidrofenantreno (AKIHISA et al., 1986). O β-sitosterol e o estigmasterol são os esteróides majoritários geralmente presentes nas membranas celulares das plantas (KRAJEWSKY-BERTRAND, MILON e HARTMANN, 1992; SCHULER et al., 1991). Quando vários triterpenos do tipo mencionados estão presentes em um mesmo extrato vegetal, o fracionamento deste por técnicas cromatográficas convencionais dificilmente leva ao isolamento de substâncias puras. O que se obtém normalmente é uma mistura de triterpenos de difícil resolução. Estas situações podem ser enfrentadas de maneiras variadas dependendo do objetivo do estudo: se o interesse é isolar as substâncias, utilizando técnicas cromatográficas especiais (CLAE e CG de alta resolução, que envolvem custos, padrões e tempo) ou se o objetivo é meramente identificá-las, recorrendo a outros procedimentos, geralmente métodos físicos de análise para identificar triterpenos em mistura (OLEA e ROQUE, 1990; MAIA et al., 2000). Muitos trabalhos tratam da dificuldade em separar estes tipos de misturas esteroidais como β-sitosterol e estigmasterol, entretanto, mostram que é possível caracterizá-los mesmo não estando purificados (CARVALHO et al., 1998; BRUM et al., 1998; CONEGERO et al., 2003). Kojima et al. (1990) ao encontrarem dificuldade no isolamento, caracterizaram uma mistura de quatro esteróides através de dados de RMN. No espectro de 13C-RMN foram observados oito sinais bem desblindados na região de carbono sp2 (121,66, 129,30, 129,40, 138,12, 138,27, 140,77, 117,41 e 139,58 ppm) sugerindo a existência de, pelo menos, quatro ligações duplas. Segundo dados da literatura, sinais nos deslocamentos 121,66 e 140,77 ppm são característicos de esteróides com uma ligação dupla entre C-5 e C-6 (AHMAD et al., 81

1992; CHAURASIA e SWICHTL, 1987; DE-EKNAMKUL e POTDUANG, 2003; GOULART et al., 1993), sinais em 129,30 e 138,27 e 129,40 e 138,12 ppm são característicos de uma ligação dupla entre C-22 e C-23 na cadeia lateral de esteróides (DE-EKNAMKUL e POTDUANG, 2003; GOULART et al., 1993), enquanto os sinais em 117,41 e 139,58 ppm são característicos de ligação dupla entre C7 e C8 em triterpenos tetraciclicos do tipo esteroidal (KOJIMA et al., 1990). Os sinais que aparecem na região entre 10 e 80ppm correspondem aos carbonos do sistema tetracíclico da estrutura do metabólito (ZANETTI, 2002). Os sinais em 71,77 e 71,36 ppm são característicos de carbonos portadores de oxigênio (SILVERSTEIN e WEBSTER, 2000). Com a revisão bibliográfica acerca de possíveis compostos possuíntes destas características, constatou-se que é comum ocorrer o isolamento da mistura de β-sitosterol (24α-etil-colestan-5-eno-3β-ol) e estigmasterol (24α-etil-colestan-5,22-dieno-3β-ol) (CARVALHO et al., 1998; DE-EKNAMKUL e POTDUANG, 2003; GOULART et al., 1993; CONEGERO et al., 2003; CHAVES et al., 2004; BRUM et al., 1998; CARVALHO et al., 2001; PAULA et al., 1996). Estes compostos possuem uma mesma insaturação (∆5), portanto os sinais nos espectros de 13C-RMN irão coincidir e assim os sinais para C-5 e C-6 estarão mais intensos quando comparados com os outros dois sinais referentes a insaturação em ∆22 (que está presente somente em estigmasterol) (DE-EKNAMKUL e POTDUANG, 2003). Os compostos β-sitosterol e estigmasterol possuem as porções cíclicas idênticas, diferindo somente na cadeia lateral. Por este motivo, apesar da existência de uma ligação dupla a mais no estigmasterol (cadeia lateral) os compostos apresentam propriedades muito semelhantes a ponto de terem comportamentos cromatográficos idênticos mesmo em sílicas impregnadas com AgNO3, seja em CCD ou em cromatografia em coluna. Entretanto, os sinais em 117,41 e 139,58 ppm, de pequena intensidade quando comparados com os referentes à insaturação em ∆5, indicam a presença de insaturação em ∆7, que é característica de compostos do tipo espinasterol (∆7, 22). A presença do espinasterol na mistura Ab1 pode ser evidenciada pela existência adicional de sinais de pequena intensidade relativos à insaturação na cadeia lateral, entre C22 e C23 (138,12 e 129,47 ppm), que neste caso, não apresentaram o mesmo deslocamento químico evidenciado para o estigmasterol. Portanto, a dificuldade de separação desta mistura muitas vezes não justifica 82 o gasto de tempo e material na obtenção de substâncias puras, quando o objetivo for apenas registrar a composição química da mistura (MAIA et al., 2000). A análise dos espectros de 13C e 1H RMN fornece subsídios para a identificação da mistura de β-sitosterol, estigmasterol e espinasterol em Alternanthera brasiliana no presente estudo, sendo que as intensidades referentes aos sinais da insaturação em C5-C6 indicam o β- sitosterol como o componente majoritário, justificado pela baixa intensidade nos sinais da insaturação em C22 e C23, existentes somente no estigmasterol. Os dados relativos aos deslocamentos dos prótons olefínicos no espectro de 1H-RMN estão de acordo com os relatados na literatura para estas substâncias (SOUZA et al., 2001, DE-EKNAMKUL e POTDUANG, 2003). Dos ∆5-esteróides, os compostos β-sitosterol e estigmasterol são os mais abundantes em Amaranthaceae (PATTERSON et al., 1991). Entretanto, a estrutura ∆5 não é a mais abundante na família, pois de 19 espécies da referida família, em nove delas predominam os ∆5-esteróides enquanto que em dez espécies o tipo de esteróide prevalente é o ∆7-esteróide. No gênero Gomphrena, todas as 10 espécies estudadas evidenciaram a presença predominante de ∆5-esteróides (PATTERSON et al., 1991). Em investigações fitoquímicas preliminares realizadas em Alternanthera brasiliana por Souza et al. (1998) foi detectada a presença de terpenos, esteróides e compostos fenólicos, sendo o composto β-sitosterol o componente majoritário da fração hexânica. Estudos prévios realizados com o composto β-sitosterol demostraram que ele exerce um significativo efeito de analgesia (SANTOS et al., 1995), entretanto respostas superiores foram obtidas com os extratos da planta, o que remete a idéia de haver um sinergismo de ação com outros compostos presentes no extrato de modo a potencializar a resposta antinociceptiva (SOUZA et al., 1998). Outros ensaios farmacológicos foram realizados com estes esteróides: Galotta e Boaventura (2005) concluíram que o β-sitosterol foi inativo no teste de citotoxicidade realizado com a Artemia salina; já Mors, Rizzini e Pereira (2000) realizaram testes contra o veneno de cobra e destacaram para o β-sitosterol e estigmasterol uma proteção de 70% contra o veneno da cobra Bothrops jararaca. Segundo o mesmo autor, β-sitosterol e seu análogo estigmasterol já demostraram atividade anti- inflamatória, redutora de colesterol plasmático e no controle de tumores prostáticos. Dentre as importâncias fisiológicas dos esteróides está a capacidade de formar 83 complexos necessários para o organismo, como nos ácidos biliares e seus sais. Ainda, estes esteróides têm a capacidade de converter gorduras em ácidos graxos solúveis em água ou emulsificar estes compostos facilitando sua absorção intestinal e suas hidrólises, como para vitaminas lipossolúveis (HARTMANN, 1998).

5.5.1 Perfis cromatográficos das frações das colunas 4 e 5

Coluna 4 A coluna 4, igualmente a coluna 1, foi desenvolvida com a utilização de pressão. O perfil cromatográfico de suas frações está representado na figura 40.

FIGURA 40 – Cromatograma das frações 1 a 6 da coluna 4 com observação sob luz

visível. Sistema eluente: CHCl3, revelador: anisaldeído-sulfúrico e aquecimento a 100ºC. 84

FIGURA 41 – Cromatograma das frações 6 a 11 e material de partida da coluna 4

com observação sob luz visível. Sistema eluente: CHCl3 (migrado 3 vezes), revelador: anisaldeído-sulfúrico e aquecimento a 100ºC.

Coluna 5 A coluna 5 foi realizada com a amostra 2 oriunda da coluna 4 e seu perfil cromatográfico está apresentado na figura 42.

FIGURA 42 – Cromatograma das frações 1 a 30 da coluna 5 com observação sob

luz visível. Sistema eluente: CHCl3, revelador: anisaldeído-sulfúrico e aquecimento a 100ºC. 85

FIGURA 43 – Cromatograma das frações 1 a 30 da coluna 5 com observação sob

luz ultravioleta. Sistema eluente: CHCl3, revelador: anisaldeído-

sulfúrico e aquecimento a 100ºC.

As frações 22-24 (Ab3) foram juntadas devido suas semelhanças, seu rendimento foi de 1,7mg e o perfil cromatográfico isolado é mostrado nas figuras 44 e 45 juntamente com a mistura Ab1, que já teve seu processo de isolamento detalhado anteriormente.

FIGURA 44 – Cromatograma da mistura Ab1 e frações 22 a 24 (Ab3) da coluna 5

com observação sob luz visível. Sistema eluente: CHCl3, revelador: anisaldeído-sulfúrico e aquecimento a 100ºC. 86

FIGURA 45 – Cromatograma da mistura Ab1e 22 a 24 (Ab3) da coluna 5 com observação

sob luz ultravioleta. Sistema eluente: CHCl3, revelador: anisaldeído- sulfúrico e aquecimento a 100ºC.

As frações 12-14 também foram juntadas devido suas semelhanças, originando a substância codificada como Ab2; o mesmo ocorreu com as frações 49 a 52 originando Ab4 (fotografia não mostrada). Seus perfis cromatográficos isolados são mostrados nas figuras 46 e 47. O rendimento foi de 8,9mg para Ab2 e menos de 1mg para Ab4.

FIGURA 46 – Cromatograma das frações 49 a 52 (Ab4) e 12 a 14 (Ab2) da coluna 5

com observação sob luz visível. Sistema eluente: CHCl3, revelador: anisaldeído-sulfúrico e aquecimento a 100ºC. 87

FIGURA 47 – Cromatograma das frações 49 a 52 (Ab4) e 12 a 14 (Ab2) da coluna 5

com observação sob luz ultravioleta. Sistema eluente: CHCl3, revelador: anisaldeído-sulfúrico e aquecimento a 100ºC.

Não foi possível identificar por métodos espectroscópicos as substâncias Ab2, Ab3 e Ab4 mostradas nas figuras 44, 45, 46 e 47, devido as pequenas quantidades isoladas. Entretanto, encontram-se em processo de re-isolamento para a obtenção de maiores quantidades. O organograma da figura 48 representa as etapas realizadas para a separação desses compostos. 88

Extrato CH2Cl2 de A. brasiliana 3,0g

Coluna 4 – Coluna flash

Adsorvente: SiO2 Eluente: CH2Cl2; hexano:acetona (9:1)

Fração 2 da col. 4 (111,9mg)

Fração 12-14 Fração 22-24 Fração 49-52 (Ab2) (Ab3) (Ab4)

FIGURA 48 – Isolamento das substâncias Ab2, Ab3 e Ab4 a partir do fracionamento de extrato diclorometânico de Alternanthera brasiliana sobre gel de sílica.

5.6 Avaliação da atividade antimicrobiana

Atualmente é crescente o interesse por compostos antibacterianos de origem natural, uma vez que, grande parte dos microorganismos tende a desenvolver resistência aos antibióticos rotineiramente empregados na clínica e, assim, faz-se necessário essa busca constante por novos princípios ativos contra bactérias e fungos amplamente conhecidos. Este trabalho testou as frações diclorometânica, aceto de etila e n-butanol além do extrato bruto das folhas de Alternanthera brasiliana frente os seguintes microorganismos: Escherichia coli ATCC 2792, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 25293, Bacillus subtilis ATCC 6633, Candida albicans ATCC 44773, Candida glabrata (isolado clínico) Saccharomyces cerevisiae ATCC 28952 e Prototheca zopfii (isolado clínico). A avaliação da atividade antimicrobiana foi realizada pelo método da microdiluição em caldo, em microplaca de 96 poços, seguindo os documentos M27- A2 para fungos leveduriformes (NCCLS, 2002) e M7-A4 para bactérias (NCCLS, 1997). A tabela 11 mostra os resultados de atividade antimicrobiana para cada 89 fração e extrato bruto.

TABELA 11 – Concentrações inibitórias mínimas (CIM), concentrações bactericidas mínimas (CBM) e concentrações fungicidas mínimas (CFM) obtidas para o extrato bruto e as frações diclorometânica, acetato de etila e butanólica frente as cepas testadas.*

Ext. Ext. CH2Cl2 CH2Cl2 AcOet AcOet BuOH BuOH Controle Bruto Bruto (CIM) (CBM) (CIM) (CBM) (CIM) (CBM) (CIM) (CBM) Escherichia coli >2500 __ >2500 __ >2500 __ >2500 __ Amp 8,0 (ATCC 2792) Pseudomonas >2500 __ 1250 1250 >2500 __ >2500 __ Cef aeruginosa 16 (ATCC 27853) Staphylococcus 1250 1250 1250 >1250 1250 1250 >2500 __ Amp aureus 2,0 (ATCC 25293) Bacillus subtilis 2500 2500 1250 1250 2500 2500 2500 2500 Imi (ATCC 6633) 0,06

Ext. Ext. CH2Cl2 CH2Cl2 AcOet AcOet BuOH BuOH Controle Bruto Bruto (CIM) (CFM) (CIM) (CFM) (CIM) (CFM) (CIM) (CFM) Candida >1250 __ >1250 __ >1250 __ >1250 __ Flu albicans 16 (ATCC 44773) Candida >1250 __ >1250 __ >1250 __ >1250 __ Flu glabrata 32 Saccharomyces 625 625 625 >1250 625 1250 >1250 __ Flu cerevisae 2,0 (ATCC 28952) Prototheca >1250 __ 312,5 312,5 >1250 __ >1250 __ Anfo zopfii 0,5 * Valores referenciados em µg/mL. Amp.=ampicilina, Cef.=ceftriazone, Imi.=imipenem, Flu.= fluconazol, anfo.= anfotericina B

Bons resultados antibacterianos foram evidenciados para as bactérias Gram- positivas S. aureus e B. subtillis. A fração diclorometânica apresentou as menores CIMs para ambas bactérias, sendo evidenciada a CBM frente a B. subtillis em 1250 µg/mL. O extrato bruto e a fração acetato de etila foram mais efetivas frente a S. 90 aureus apresentando CIM e CBM na concentração de 1250 µg/mL. Em relação a bactérias Gram-negativas, apenas a fração diclorometânica foi efetiva, apresentando CIM e CBM na concentração de 1250 µg/mL frente a P. aeruginosa. Os melhores resultados foram evidenciados frente ao fungo S. cerevisae, onde o extrato bruto foi efetivo como fungistático e fungicida na concentração de 625 µg/mL, seguido das frações acetato de etila (CIM=625 e CFM=1250µg/mL) e diclorometânica (CIM=625, CFM=1250µg/mL). A fração butanólica apresentou discreta atividade apenas frente ao B. subtillis (CIM=2500 µg/mL). Nenhuma das amostras testadas foi efetiva frente as espécies C. albicans e C. glabrata nas concentrações utilizadas no experimento. A fração diclorometânica foi a única que apresentou atividade algicida frente à P. zopfii, sendo efetiva na concentração de 312,5µg/mL. Caetano et al. (2002) testaram a atividade antimicrobiana do extrato hidroalcoólico bruto de A. brasiliana frente a cepas de S. aureus catalogadas (ATCC 6538 e 9144) e cepas provenientes de isolados hospitalares evidenciando resultados positivos, em uma concentração de 65000µg/mL de extrato, comparáveis com a atividade do cloridrato de tetraciclina (1000 µg/mL) utilizado como referência no ensaio. A metodologia empregada pelos autores acima foi a de difusão em ágar (discos e poços) a qual difere da metodologia utilizada no presente estudo (microdiluição em caldo). No presente estudo, o extrato bruto foi fracionado e idêntica atividade antibacteriana foi observada para a fração acetato de etila, sugerindo que os compostos ativos sejam majoritariamente extraídos por este solvente. Salvador et al. (2004) realizaram ensaios antibacterianos e antifúngicos pela técnica da difusão em ágar com os extratos da A. marítima; dentre os resultados positivos que obtiveram, Streptococcus e Trichophyton foram os microorganismos para os quais os extratos demonstraram atividade predominante. Contudo, para S. aureus (ATCC 25293), E. coli (26.1). P. aeruginosa (290D) e C. albicans (ATCC 1023) os extratos se mostraram ineficazes. Estes resultados diferem dos obtidos com a espécie brasiliana apena para S. aureus, uma vez que a espécie brasiliana também se mostrou pouco efetiva contra P. aeruginosa e ineficaz contra E. coli e C. albicans. Em A. caracasana, Canales-Martinez et al. (2005) não obtiveram resultados positivos com a fração acetato de etila frente a C. albicans. Neste estudo a atividade 91 antimicrobiana foi confirmada para S. aureus, S. epidermidis, B. subtilis, Sarcina lutea e uma espécie do Vibrio cholerae. Essas referências reforçam as evidências de ineficácia de espécies de Alternanthera frente a C. albicans. A conformidade integral de respostas obtidas por Salvador et al. (2004) com nossos estudos pôde ser realizada apenas frente ao microorganismo E. coli, contra o qual, tanto A. marítima quanto A. brasiliana se mostraram ineficazes. Os melhores resultados obtidos com ambas as espécies se referem às bactérias Gram-positivas, uma vez que as bactérias Gram-negativas são naturalmente mais resistentes aos agentes antimicrobianos por apresentarem uma parede celular muito mais complexa (RANG, DALE e RITTER, 2001). Salvador et al. (2004), no mesmo estudo antimicrobiano em A. marítima, realizaram um estudo fitoquímico, visando determinar a classe de compostos responsáveis por essa atividade biológica. Os esteróides, saponinas e flavonóides isolados mostraram uma atividade antimicrobiana considerável. A ação farmacológica dessas substâncias já havia sido confirmada por outros autores (YFF et al., 2002; PANIZZI et al., 2002; RAMESH et al., 2002; RAHUA et al., 2000; SATO et al., 2000; TERESCHUK, RIERA e ABDALA, 1997). Quanto à eficiência de A. caracasana (CANALES-MARTINEZ et al., 2005) e A. brasiliana frente a S. aureus e Bacillus subtilis, verifica-se que as duas espécies de Alternantheras são capazes de desempenhar resultados bacteriostáticos e/ou bactericidas perante estas cepas. Ensaios antimicrobianos empregando a técnica de discos por difusão em ágar também foram realizados por Zavala et al. (1998) em Alternanthera repens. A concentração teste utilizada foi a mesma empregada em nossos estudos (2500µg/mL), mas o autor obteve resultados negativos frente a todas as cepas testadas (Sarcina lutea ATCC 40322, Proteus vulgaris ATCC 6059, Staphylococcus aureus ATCC 6538P, Escherichia coli ETECS 1552 e Candida albicans). Sendo assim, os resultados encontrados por Zavala et al. (1998) encontram concordância de respostas ao se referir a E. coli e C. albicans, os quais os extratos não evidenciaram nenhuma resposta de combate a esses microorganismos. Os resultados apresentados permitem evidenciar para A. brasiliana uma boa atividade antibacteriana para a fração diclorometânica, principalmente contra bactérias Gram-positivas e a alga P. zopfii. As demais frações e o extrato bruto evidenciaram atividades menos pronunciadas, salientando-se a ineficácia de todas as frações testadas frente a E. coli e espécies de Cândida. 92

5.7 Avaliação da atividade antioxidante das frações das folhas de Alternanthera brasiliana

O método utilizado para estimar a capacidade antioxidante das folhas de A.brasiliana foi o de Choi et al. (2002), empregando-se como padrão o ácido ascórbico, uma vez que este possui atividade antioxidante comprovada. Foram testados o extrato bruto hidroetanólico das folhas e suas frações diclorometânica, acetato de etila e n-butanol. O comprimento de onda utilizado para o monitoramento do decréscimo da absorbância foi 518 nm. A tabela 12 mostra a média das leituras (em absorbâncias) do DPPH, após 30 minutos de contato com o ácido ascórbico (padrão) e com as amostras testadas. A partir dessas absorbâncias foi obtido o percentual de inibição, que corresponde à atividade antioxidante dos extratos. A análise de uniformidade dos dados foi efetuada através do cálculo de desvio padrão e do coeficiente de variação percentual.

TABELA 12 – Atividade antioxidante do ácido ascórbico, extrato bruto e das frações diclorometânicas, acetato de etila e n-butanol de Alternanthera brasiliana. Desvio Coeficiente de % de Concentrações Média padrão variação percentual inibição µg/mL (Abs) (±) (CV%) (IP%) Ácido ascórbico 7,8 0,463 0,0089 1,9 43,3 15,6 0,134 0,0023 1,7 83,6 31,25 0,018 0,001 5,5 97,1 62,5 0,014 0,001 7,1 98,3 125,0 0,014 0,001 7,1 98,3 250,0 0,014 0,001 7,1 98,3

CH2Cl2 7,8 0,682 0,022 3,2 27,52 15,6 0,741 0,016 2,1 21,25 31,25 0,678 0,019 2,8 27,94 62,5 0,644 0,015 2,3 31,56 125,0 0,583 0,009 1,5 38,04 250,0 0,564 0,08 14,1 40,06 93

(cont. Tabela 12) Desvio Coeficiente de % de Concentrações Média padrão variação percentual inibição µg/mL (Abs) (±) (CV%) (IP%) AcOEt 7,8 0,696 0,011 1,5 26,03 15,6 0,681 0,006 0,008 27,63 31,25 0,681 0,019 2,8 27,63 62,5 0,629 0,008 1,27 33,15 125,0 0,530 0,001 0,18 43,67 250,0 0,336 0,015 4,46 64,29 n-BuOH 7,8 0,699 0,02 2,8 25,71 15,6 0,697 0,009 1,3 25,92 31,25 0,673 0,013 1,9 28,48 62,5 0,687 0,03 4,3 26,99 125,0 0,668 0,04 5,9 29,01 250,0 0,628 0,013 2,0 33,26 Bruto 7,8 0,9051 0,002 0,2 4,15 15,6 0,9015 0,003 0,3 4,61 31,25 0,8958 0,004 0,4 5,66 62,5 0,8908 0,005 0,5 6,95 125,0 0,8743 0,004 0,5 10,50 250,0 0,8324 0,004 0,4 15,49

A representação gráfica das concentrações de cada amostra em relação à sua atividade antioxidante está representada na figura 49. 94

Atividade antioxidante (DPPH)

100 90 80 70 acetato de etila 60 Diclorometano 50 n-butanol 40 extrato bruto 30 Ác. ascórbico 20 Atividade antioxidante (%) antioxidante Atividade 10 0 7,81 15,6 31,25 62,5 125 250 concentrações (ug/mL)

FIGURA 49 – Percentual da atividade antioxidante do ácido ascórbico (padrão), extrato

bruto e das frações CH2Cl2, AcOEt e BuOH das folhas de Alternanthera brasiliana.

Apenas a fração acetato de etila apresentou atividade antioxidante moderada, IP%= 64,29%, na concentração de 250 µg/ml, quando comparada ao ácido ascórbico (IP%=98,3 % na concentração de 31,25µg/ml). As demais frações não apresentaram atividade antioxidante significativa e a relação dose-dependente não pode ser evidenciada.

Devido à baixa atividade antioxidante, o IC50 das frações diclorometânica, n- butanol e do extrato bruto não pode ser calculado. Para a construção das equações da reta da fração acetato de etila e do ácido ascórbico foram consideradas apenas as partes ascendentes das curvas, estando os valores onde se obteve um platô fora dos valores para obtenção da expressão y=ax+b (TSIMOGIANNIS e OREOPOULOU, 2005).

A fração acetato de etila apresentou um efeito antioxidante razoável (IC50= 163,01µg/mL, y =0,1597x+23,963, r = 0,998), enquanto o ácido ascórbico apresentou IC50= 19,55µg/mL (y= 2,1224x+36,239, r= 0,896), representando um IC50 cerca de 8 vezes superior ao da fração acetato de etila. 95

Depois da fração acetato de etila, a fração que apresentou maior capacidade antioxidante foi a diclorometânica, seguida da fração butanólica e do extrato bruto; entretanto a capacidade antioxidante dessas frações não foi suficientemente alta de modo a possibilitar o cálculo de seu IC50 pelo método dos mínimos quadrados. Sendo assim, os valores obtidos através da equação da reta seriam irreais e impossíveis de serem encontrados quando plotados no gráfico. Nenhumas das amostras testadas obteve valores comparáveis aos obtidos com o ácido ascórbico, uma vez que este já apresentou em sua segunda menor concentração uma porcentagem de inibição superior a 70% e nas amostras testadas a porcentagem de inibição mais alta para a maior concentração da fração acetato de etila alcançou 64,29 %. A menor atividade foi evidenciada no extrato bruto, atingindo um máximo de 15,49% de inibição na concentração de 250 µg/mL.

Os valores de IC50 e IP% são considerados bons quantificadores da eficiência antioxidante para compostos puros e extrato; servindo de parâmetros para indicar qual extrato é mais apropriado como material de partida para o isolamento de compostos com atividade antioxidante em estudos futuros. Entretanto, parece não haver um critério estabelecido para classificar a atividade em alta, boa, moderada, fraca ou insatisfatória em comparação com compostos de atividade antioxidante reconhecida. Existem inúmeros métodos rápidos, diretos e simples que permitem determinar a capacidade antioxidante, porém é possível que cada um deles reproduza diferentes e contraditórias respostas para a mesma amostra, o que torna a comparação entre eles impossível de ser realizada (ALONSO et al., 2002). Por este motivo, a comparação de atividades só é possível quando a amostra é submetida ao mesmo método de determinação. Shyamala et al. (2005), após determinar a atividade antioxidante da Alternanthera sessilis pelo método do DPPH, classificou-a como tendo uma ação moderada (menos que 60% de atividade em uma concentração de 50µg/mL e em torno de 70% para 100µg/mL); neste mesmo trabalho a Alternanthera sessilis obteve o valor mais baixo quanto a sua capacidade de redução quando comparada com Brassica oleracea, Coriandrum sativum e Spinacia oleracea. Os resultados obtidos no presente estudo foram cerca de duas vezes inferiores aos obtidos com a espécie A. sessilis, indicando para a espécie brasiliana uma fraca atividade antioxidante, manifestada apenas na fração acetato de etila. 96

A atividade antioxidante na fração acetato já era esperada, uma vez que os compostos fenólicos tendem a se concentrar em maior quantidade nessa fração, justificando as atividades insatisfatórias das outras frações. A literatura apresenta diversos trabalhos que relacionam alta atividade antioxidante à presença de compostos do tipo fenólico na fração acetato de etila (TUNG et al., 2006, TSENG et al., 1997, MENSOR et al., 2001). Por exemplo, Tseng et al. (1997) analisaram as frações de diferentes polaridades das flores de Hibiscus sabdariffa e constataram que a fração acetato de etila apresentava a maior porcentagem no índice de inibição. Este resultado também foi declarado por Mensor et al. (2001) quando obteve os melhores resultados com as frações acetato de etila para os testes feitos com diversas plantas empregando o mesmo método. Entretanto, em análises cromatográficas de todas as frações verificou-se a baixa concentração de compostos fenólicos em Alternanthera brasiliana. Adicionalmente, foi realizada uma cromatografia em camada delgada das frações juntamente com o ácido clorogênico e ácido caféico, fenóis estes que tem uma atividade antioxidante já conhecida (FILIP et al., 2001, SCHINELLA et al., 2000, ALONSO et al., 2002) e não foi observada a presença de nenhum destes compostos na planta. Os compostos fenólicos relatados para A. brasiliana até o momento, pertencem à classe dos flavonóides, sendo relatado o isolamento de seis flavonóides na espécie (BROCHADO et al., 2003), dois compostos com a aglicona quercetina e quatro derivados do canferol, todos altamente glicosilados. Diversos estudos descrevem as relações existentes entre as diversas estruturas e grau de glicosilação dos flavonóides, relacionando-os com a atividade antioxidante, verificada por diversos métodos (NANJO et al., 1996, TSIMOGIANNIS e OREOPOULOU, 2005). Zielinska, Gülden e Cordell (2003) verificaram que a quercetina é conhecida por ser um potente antioxidante e esta atividade é favorecida pela presença de grupos hidroxilas nas posições 3, 5, 7, 3’, 4’, que são importantes para essa atividade. Em estudo realizado por Tsimogiannis e Oreopoulou (2005), diversas agliconas foram classificadas quanto à atividade antioxidante, levando em consideração os resultados de IC50 obtidos pelo método do DPPH. Os resultados indicaram a seguinte ordem decrescente de atividade antioxidante: quercetina > fisetina > rutina > luteolina > taxifolina > eriodictiol > canferol (fig. 49). Adicionalmente, vários estudos demonstraram que, à medida que aumenta o grau 97 de glicosilação dos compostos, diminui a capacidade antioxidante (NANJO et al., 1996, TSIMOGIANNIS e OREOPOULOU, 2005; CHOI et al., 2002). Paralelamente, a presença das duas hidroxilas em posição orto no anel B, a presença da ligação dupla (∆2,3) no anel C e o grupo cetona em C4 desse anel, são importantes na efetividade da atividade antioxidante (NANJO et al., 1996; TSIMOGIANNIS e OREOPOULOU, 2005).

FIGURA 50 – Classificação quanto à capacidade antioxidante de alguns compostos fenólicos oriundos do metabolismo secundário vegetal.

Sob esta ótica, analisando as estruturas já identificadas na espécie, percebe- se que quatro dos flavonóides isolados possuem o esqueleto do canferol, o qual não apresenta a hidroxila da posição 3 do anel B, adicionalmente, todos possuem açúcares na posição 3 do anel C, além de dois flavonóides 3,7-glicosilados. Os dois flavonóides restantes possuem a quercetina como aglicona; entretanto, são também glicosilados na posição 3 do anel C. Essas particularidades estruturais podem justificar a baixa atividade antioxidante demonstrada pela espécie, uma vez que o sistema orto-hidroxila não está disponível em canferol, e o impedimento estérico proporcionado por açúcares nas estruturas dificulta a ligação do captador ao radical livre. 98

5.8 Determinação da quantidade de polifenóis nas frações das folhas de Alternanthera brasiliana

No presente estudo a metodologia aplicada foi a descrita por Chandra & Mejia (2004) a qual faz uso de Folin-Ciocalteau como reagente. As diluições das amostras e do ácido pirogálico foram feitas com água destilada, sendo assim, fez-se uso desta como branco, usado para calibrar o espectrofotômetro. A média das leituras (em absorbância) da curva padrão e das amostras, após contato durante 5 minutos com o reagente de Folin-Ciocalteau e mais 10 minutos com o carbonato de sódio 20%, está mostrada na tabela 13. A análise da uniformidade dos dados foi efetuada através do cálculo do desvio padrão e do coeficiente de variação percentual.

TABELA 13 – Média das leituras, desvio padrão e coeficiente de variação percentual (CV%) obtidos para o ácido pirogálico, extrato bruto e frações diclorometânica, acetato de etila e n-butanol das folhas de Alternanthera brasiliana. Coeficiente de Concentração Média Desvio Padrão variação (mg/mL) (Abs) (±) (CV%) ácido pirogálico 0,005 0,0826 0,0022 2,66 0,010 0,2211 0,0177 8,0 0,015 0,4622 0,0125 2,7 0,025 0,7408 0,0697 9,4 0,030 0,9498 0,0014 0,14 Extrato bruto 0,15 0,0749 0,0019 2,53

Fração CH2Cl2 0,15 0,1573 0,0076 4,83 Fração AcOEt 0,15 0,0559 0,0024 4,29 Fração n-BuOH 0,15 0,1984 0,0042 2,11 99

A representação gráfica da curva de calibração do ácido pirogálico é apresentada na figura 51.

Doseamento de Polifenóis

1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5

Abs 0,4 0,3 y = 34,443x - 0,0942 2 0,2 R = 0,9937 0,1 0 0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03 0,035 Concentrações

FIGURA 51 – Curva de calibração do ácido pirogálico com suas concentrações versus absorbâncias e respectiva equação da reta e coeficiente de correlação.

Os resultados do doseamento de polifenóis nas frações e no extrato bruto (mg/mL e mg/g de droga seca), obtido através da substituição dos valores de suas absorbâncias na equação da reta do ácido pirogálico, é mostrado na tabela 14.

TABELA 14 – Total de conteúdo fenólico presente nas folhas de Alternanthera brasiliana.

Percentagem de Frações mg/mLa mg/g FSb polifenóis Diclorometano 0,0073 ± 0,0002 48,6 4,86% Acetato de etila 0,0043 ± 0,00007 28,6 2,86% n-butanol 0,0085 ± 0,0001 56,6 5,66% Extrato bruto 0,0049 ± 0,0001 32,6 3,26% 100

Cada amostra foi analisada em triplicata. A media foi calculada e os resultados foram declarados em média±desvio padrão. Abreviações: FS, fração seca; aconcentração de compostos fenólicos expressos em miligramas equivalentes de pirogalol por mililitros de extrato aquoso; bconcentração de compostos fenólicos expressos em miligramas equivalentes de pirogalol por grama de fração seca (FS). A fração butanólica mostrou um maior teor de fenóis (0,0085mg/mL, 5,66%) enquanto que a fração acetato de etila apresentou a menor quantidade de conteúdo fenólico (0,0043mg/mL, 2,86%). O único artigo que descreve o doseamento de polifenóis na espécie A. sessilis é o de Shyamala e colaboradores (2005). Nesse artigo, o autor descreve o doseamento por Folin-Ciocalteau de um extrato etanólico na concentração de 0,2 mg/mL, relatando 25 mg de polifenóis por grama de extrato.. A comparação dos resultados do extrato bruto de A. brasiliana com os de Shyamala indicam um predomínio de polifenóis em A. brasiliana. Nesse mesmo artigo, os autores relatam correlação positiva entre conteúdo fenólico e atividade antioxidante, também determinada pelo método do DPPH. A maioria dos trabalhos que envolvem a determinação da atividade antioxidante e conteúdo total de polifenólicos relata a existência de correlação positiva entre capacidade antioxidante e conteúdo de fenólicos (ALONSO et al., 2002, SHYAMALA et al., 2005, CHANDRA e Mejia, 2004; TURKMEN, SARI e VELIOGLU, 2006). Entretanto, no presente estudo, os resultados obtidos não evidenciaram essa correlação, uma vez que para os maiores conteúdos de polifenóis, não foi verificada a maior atividade antioxidante; ao contrário, os resultados apresentaram-se em ordem inversa. Este fato pode ser atribuído à diferença na composição das frações, onde distintos compostos fenólicos podem apresentar desigualdade de respostas quanto à capacidade antioxidante. Adicionalmente, o método de Folin-Ciocalteu reflete a soma dos compostos fenólicos e não permite a diferenciação entre eles, do ponto de vista químico cada classe de fenólicos evidencia uma resposta específica para a atividade antioxidante. Por esta razão, pode ser que o total de polifenóis não corresponda à atividade antioxidante das substâncias fenólicas presentes no extrato. Adicionalmente, o conteúdo fenólico total baseados em certos padrões, como ácido gálico, epicatequina, epigalocatequina, pirogalol, catequina e quercetina, dentre outros, podem subestimar ou superestimar o valor total de conteúdo fenólico descrito para uma determinada espécie, levando a diferentes interpretações de resultados (CHANDRA e MEJIA, 2004; ALONSO et al., 2000).

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