Univerzitet u Beogradu Biološki fakultet
mr Saša P. Marić
Evolucijska istorija kompleksa potočne pastrmke Salmo trutta L. 1758 na području Republike Srbije i značaj za ribarstvo
Doktorska disertacija
Beograd, 2005. Univerzitet u Beogradu Biološki fakultet
mr Saša P. Marić
Evolucijska istorija kompleksa potočne pastrmke Salmo trutta L. 1758 na području Republike Srbije i značaj za ribarstvo
Mentor: dr Predrag Simonović – vanredni profesor Biološki fakultet Univerzitet u Beogradu
Članovi komisije: dr Jelka Crnobrnja - Isailović – naučni saradnik Institut za biološka istraživanja «Siniša Stanković» Beograd dr Aleš Snoj – naučni saradnik Biotehnički fakultet Univerzitet u Ljubljani
Datum odbrane:
Doktorska disertacija
Beograd, 2005. III Zahvalnica
Zahvalnica
Zahvaljujem se svima koji su mi na bilo koji način olakšali rad na izradi disertacije i koji su svojim zalaganjem i nesebičnošću doprineli da ona ugleda svetlost dana.
Srdačno se zahvaljujem mentoru i članovima Komisije na korektnom i profesionalnom odnosu punom razumevanja. Zahvaljujem se mentoru Prof. dr Predragu Simonoviću, koji mi je, osim istina iz ove nauke, pokazao da se autoritet i poštovanje stiču jedino znanjem i korektnim odnosom prema kandidatu. Posebno se zahvaljujem za ukazano poverenje i neograničenu slobodu. Zahvaljujem se dr Alešu Snoju koji je rukovodio laboratorijskim radom i koji me je upoznao sa metodama molekularne genetike. Posebno mu se zahvaljujem na posvećenom vremenu, izuzetnom stpljenju, ukazanom poverenju, ustupljenoj literaturi, savetima, kao i odnosu za koji sigurno mogu reći da prevazilazi granice profesionalnog. Takođe se zahvaljujem dr Jelki Crnobrnji – Isailović koja mi je izašla u susret kada je to bilo neophodno, i u najkraćem roku pregledala disertaciju dajući veoma korisne sugestije.
Zahvaljujem se Nenadu Sekuliću iz Zavoda za zaštitu prirode Srbije na ustupljenom materijalu sa područja Kosova i Metohije, kao i kolegama Prof. dr Božidaru Ćurčiću, Prof. dr Predragu Simonoviću, Doc. dr Veri Nikolić, dr Ljiljani Tomović, Vladanu Bjedovu, Rastku Ajtiću, Nikoli Kolundžiću, Čedomiru Mijoviću i Žiki Milenkoviću, predsedniku Ribarskog područja «Južna Morava I» Leskovac, koji su mi na različite načine pomogli u prikupljanju analiziranog materijala.
Zahvaljujem se kolegama dr Simoni Sušnik, mr Andreju Raspetu, mr Tamari Jug, mr Brigiti Slavec, mr Poloni Frajman i Vidi Štuhec sa Biotehničkog fakulteta u Ljubljani koji su mi pomogli u prevazilaženju svih laboratorijskih problema i koji su svojom ljubaznošću i gostoprimstvom svakako doprineli da mi deo izrade teze koji se odvijao na Biotehnickom fakultetu u Ljubljani ostane u prelepom sećanju.
Zahvaljujem se kolegama Prof. dr Milošu Kaleziću, Doc. dr Ani Ivanović, dr Ljiljani Tomović i mr Imreu Krizmaniću na razumevanju i peuzimanju dela nastavnih i drugih obaveza za vreme izrade disertacije. Takođe se zahvaljujem mr Tamari Karan Žnidaršič na korisnim sugestijama vezanim za tehničku obradu teksta, a mr Biljani Stojković za pomoć pri tumačenju pojedinih rezultata.
Posebno bih se zahvalio svojim roditeljima, bratu i naravno supruzi Katarini, za pruženu podršku, moralnu potporu i sva odricanja koja su bila neminovna prilikom izrade disertacije. Najlepše vam hvala.
Saša Marić IV Izvod
Izvod
Za rasvetljavanje filogeografije populacija potočne pastrmke (Salmo trutta) na području Republike Srbije, sekvencioniran je 5' kraj kontrolnog regiona mtDNA u dužini od 561 bp i dobijene sekvence upoređene su sa poznatim sekvencama iz prethodnih istraživanja na drugim teritorijama. U analizu je uključena 101 jedinka poreklom iz gornjih tokova reka crnomorskog, egejskog i jadranskog sliva. Sekvencioniranjem je identifikovano petnaest haplotipova, od kojih se četrnaest smatra autohtonim i oni pripadaju dunavskoj i jadranskoj liniji, dok samo jedan haplotip (ATcs1), pronađen kod dve jedinke poreklom iz dve poribljavane reke, pripada atlantskoj liniji koja je komercijalizovana i najčešće korišćena za poribljavanje. Autohtoni haplotipovi odlikuju se izrazitom geografskom distribucijom: dunavski haplotipovi su strogo ograničeni na reke dunavskog sliva, dok jadranski haplotipovi dominiraju u rekama egejskog i jadranskog sliva; najveći deo ukupne molekularne varijanse (69%) pripisan je upravo razlikama između slivova. Filogenetskom rekonstrukcijom, koja je dopunjena sa šest novih haplotipova, po prvi put opisanih u ovom radu, podržano je stanovište o ancestralnoj poziciji dunavske linije unutar kompleksa potočne pastrmke, kao i naglašeno postojanje posebne farioides (Ad+) klade otkrivene unutar jadransko-mediteranske- marmoratus filogenetske grupe. Dobijeni rezultati potvrdili su naša očekivanja o postojanju visokog genetičkog diverziteta balkanskih populacija potočne pastrmke, što zahteva dalja istraživanja koja bi trebala da obuhvate pastrmske populacije iz celog regiona.
VI Sadržaj
Sadržaj
Zahvalnica...... III Izvod ...... IV Abstract...... V Sadržaj...... VI Skraćenice i simboli...... VIII
1. UVOD...... 1 1.1. Uvodne napomene ...... 1 1.2. Pregled lterature...... 3 1.2.1. Uopšteno o Salmonidama ...... 3 1.2.2. Karakteristike familije Salmonidae...... 4 1.2.3. Klasifikacija i filogenetski odnosi unutar familije Salmonidae...... 5 1.2.4. Salmo trutta (Linnaeus, 1758) - potočna pastrmka...... 12 1.2.5. Metode razlikovanja ribljih populacija ...... 21 1.2.5.1. Morfološke metode razlikovanja ribljih populacija...... 21 1.2.5.2. Genetičke metode razlikovanja ribljih populacija ...... 22 1.2.5.2.1. Alozimi ...... 23 1.2.5.2.2. Savremeni genetički markeri ...... 24 1.2.5.2.2.1. Ponavljajuća DNA ...... 25 1.2.5.2.2.1.1. Mikrosateliti...... 25 1.2.5.2.2.2. Mitohondrijalna DNA...... 27 1.2.5.2.2.2.1. Osobine mitohondrijalne DNA ...... 28 1.2.5.2.2.2.2. Mitohondrijska DNA kao genetski marker...... 31 1.2.5.2.2.2.3. Upotreba mtDNA za proučavanje vrsta i populacija salmonida...... 32 1.2.6. Ugroženost potočne pastrmke (Salmo trutta) u Evropi ...... 35 1.3. Ciljevi rada...... 38
2. MATERIAL I METODE...... 39 2.1. Materijal...... 39 2.1.1. Prikupljanje i čuvanje uzoraka...... 39 2.1.2. Raspored lokaliteta i brojnost analiziranih uzoraka...... 40 2.1.3. Hemikalije...... 42 2.1.3.1. Priprenljeni setovi hemikalija ...... 42 2.1.3.2. Enzimi...... 42 2.1.3.3. Početni oligonuklotidi (prajmeri)...... 43 2.1.3.4. Markeri...... 43 2.1.3.5. Puferi...... 43 2.1.4. Laboratorijska oprema ...... 43 2.2. Metode ...... 44 2.2.1. Izolacija DNA...... 44 2.2.1.1. Fenolna ekstrakcija...... 44 2.2.1.2. Wizard® Genomic DNA Purification Kit ...... 45 2.2.1.3. Jet quick tissue DNA spin kit/250 ...... 45 VII Sadržaj
2.2.2. Provera uspešnosti izolacije DNA ...... 45 2.2.3. Lančana reakcija polimeraze (PCR) ...... 46 2.2.4. Restrikciona analiza kontrolnog regiona mtDNA...... 48 2.2.5. Sekvencioniranje mitohondrijalne DNA...... 48 2.2.5.1. Izolacija fragmenata DNA iz agaroznog gela...... 48 2.2.5.2. Priprema reakcije za automatski sekvenator...... 49 2.2.5.3. Priprema DNA fragmenata za sekvencioniranje...... 50 2.2.5.4. Sekvencioniranje DNA fragmenata ...... 50 2.2.6. Programska analiza kontrolnog regiona mtDNA...... 51
3. REZULTATI...... 53 3.1. Analiza kontrolnog regiona mtDNA upotrebom RFLP tehnike...... 53 3.2. Analiza sekvencioniranja kontrolnog regiona mtDNA...... 54 3.2.1. Upoređivanje sekvenci kontrolnog regiona mtDNA pronađenih haplotipova na teritoriji Srbije sa već poznatim haplotipovima potočne pastrmke iz svih filogenetskih linija ...... 63
4. DISKUSIJA ...... 71 4.1. Analiza kontrolnog regiona mtDNA...... 72 4.2. Paleozoogeografska razmatranja, sa osvrtom na kolonizaciju Evrope potočnom pastrmkom ...... 81 4.3. Konzervacija genetičke raznovrsnosti populacija potočne pastrmke ...... 95 4.3.1. Specifičnosti konzervacije potočne pastrmke...... 95 4.3.2. Status ugroženosti potočne pastrmke u Evropi...... 97 4.3.3. Definisanje konzervacionih jedinica...... 98 4.3.4. Krajnja preporuka u konzervaciji potočne pastrmke ...... 99 4.3.5. Konzervacija diverziteta haplotipova u Srbiji i značaj za ribarstvo ...... 100
5. ZAKLJUČCI...... 107
6. SUMMARY...... 111
7. LITERATURA ...... 113
VIII Skraćenice i simboli
Skraćenice i simboli
A adenin ATP adenozin trifosfat bp bazni par C citozin ddNTP 2’, 3’ – dideoksinukleozid 5’–trifosfat DNA dezoksiribonukleinska kislina dNTP 2’ – deoksinukleozid 5’ – trifosfat EDTA etilen – diamino – tetraosirćetna kislina eng. engleski G guanin kbp hiljadu baznih parova mtDNA mitohondrijska DNA PCR polymerase chain reaction pH negativni logaritam koncentracije vodonikovih jona RFLP restriction fragment lenght polymorphism RNA ribonukleinska kislina rRNA ribozomalna RNA SDS sodium dodecyl sulphate T timin TAE rastvor Trisa, acetata u EDTA Taq DNA–polimeraza DNA – polimeraza, izolovana iz Thermus aquaticus TBE rastvor Trisa, borata u EDTA TEN rastvor Trisa, EDTA u NaCl Tris 2 – amino – 2 – (hidroksimetil) – 1, 3 – propandiol tRNA transportna RNA TSR template suppresion reagent Uvod
1. UVOD
1.1. UVODNE NAPOMENE
Povoljni prirodni uslovi omogućuju postojanje više hiljada vodotokova na teritoriji Srbije. Njihova ukupna dužina iznosi 65980 km ili prosečno 747 m/km2. U Srbiji ima samo 11 reka čija dužina iznosi preko 200 km, što znači da preovlađuju male i srednje reke dužine ispod 100 km (Gavrilović i Dukić, 2002). Reke Srbije otiču u tri mora, tako da se može reći da Srbija predstavlja hidrografski čvor Balkana. Najveća površina teritorije odvodnjava se prema Crnom (92,46%), a znatno manja površina ka Jadranskom (5,36%) i Egejskom moru (2,18%). Morski slivovi Srbije razlikuju se ne samo po veličini nego i hidrološki, što je uzrokovano specifičnim klimatskim prilikama, uslovima oticanja padavina i geološkim sastavom terena. Hidrološka raznovrsnost na području Srbije u pogledu broja, veličine, geografskog položaja i oticanja reka uslovila je i raznovrsnost živog sveta koji je vezan za vodena staništa. U planinskim vodama koje preovlađuju po broju u odnosu na ravničarske nalazimo idealne uslove za život pastrmskih vrsta riba. Prirodna nepovezanost morskih slivova i geotektonski događaji uslovili su da danas na području Srbije žive izolovane, lokalno specifične populacije potočne pastrmke (Salmo trutta). U poslednjih 20 godina mnogo je rađeno na utvrđivanju genetičkog identiteta populacija potočne pastrmke na području Evrope (Ferguson i Fleming, 1983; Krieg i Guyomard, 1985; Ferguson, 1989; Karakousis i Triantaphyllidis 1990; Phillips i Pleyte, 1991; Bernatchez i sar., 1992; Bernatchez, 1995; 2001; Giuffra i sar., 1994; 1996; Bernatchez i Osinov, 1995; Riffel i sar., 1995; Apostolidis i sar., 1996; 1996a; 1997; Garcia-Marin i sar., 1996; 1999; McKay i sar., 1996; Shed'ko i sar., 1996; Oleynik, 1997; Phillips i Oakley, 1997; Weiss i sar., 2000; 2001; Cortey i García-Marín, 2002; Cortey i sar., 2004). Na osnovu već poznatih rezultata, predpostavili smo da i populacije na području Srbije zbog duge izolovanosti i specifičnosti staništa predstavljaju posebne evolutivne grane. Snažan razvoj sportskog ribolova, kao i veoma zastupljen krivolov uz narušavanje prirodnih uslova staništa doveli su do značajnog smanjenja brojnosti populacija potočne pastrmke, a pojedine populacije su postale ugrožene sa stanovišta opstanka. Kao
1 Uvod posledica toga dolazi vrlo često do poribljavanja komercijalnim linijama koje su prilagođene ribnjačkom uzgoju. Najčešće se radi o linijama alohtonog porekla, koje se nakon ubacivanja u vodotokove nesmetano ukrštaju sa autohtonim populacijama, što može dovesti do ugrožavanja genetičke specifičnosti autohtone populacije. Unošenje alohtonih populacija može dovesti i do kompeticije u pogledu osnovnih životnih resursa što može rezultirati potiskivanjem autohtonih populacija iz njihovih prirodnih staništa. Pastrmke imaju izrazitu osobinu fenotipske plastičnosti, odnosno odgovora na promenu uslova staništa što često dovodi do nastanka specifičnih životnih formi, tako da se genetički različite jedinke fenotipski ne razlikuju i obratno (Bernatchez i sar., 1992). Fenotipski karakteri mogu biti indikativni (Marić i sar., 2004), ali nisu do kraja pouzdani za razlikovanje autohtonih od alohtonih populacija, pa je zbog toga neophodno koristiti precizne molekularno-genetičke metode. Na osnovu rezultata dobijenih uz pomoć ovih metoda može se sa velikom tačnošću utvrditi autohtonost populacija. Autohtone populacije su još uvek sačuvane u izvorišnim, nepristupačnim delovima vodotokova koji su vrlo često odvojeni prirodnim barijerama od nizvodnih delova tokova. Autohtone populacije su retke ali još uvek postoje, pa, zahvaljujući tome, u budućnosti mogu biti formirana autohtona matična jata (stvaranje matičnih jata je skupo, nije uvek praktično za održavanje i isplati se samo za jata zastupljena u ribolovno atraktivnim vodama i gde postoje dokazi da nije bilo introdukcije). Autohtono matično jato može se koristiti za repopulaciju na onim lokalitetima na kojima je pastrmka gotovo istrebljena, kao i na ribolovno atraktivnim vodama pod snažnim ribolovnim pritiskom. Kao marker za utvrđivanje genetičke varijabilnosti populacija potočne pastrmke u ovom radu koristili smo kontrolni region mitohondrijalne DNA, koji je, zbog svoje hipervarijabilnosti, dobar genetički marker. Zbog načina nasleđivanja, mtDNA se koristi za utvrđivanje filogenetskih odnosa između rodova, vrsta i nižih taksonomskih jedinica. Ovaj tip istraživanja spada u filogeografske studije pomoću kojih se može utvrditi geografski raspored evolutivnih linija, kao i geografski procesi koji su uticali na taj raspored, sa posebnim osvrtom na različitost, kako između srodnih vrsta, tako i unutar vrste (Avise, 1998; Hewitt, 2001).
2 Uvod
1.2. PREGLED LITERATURE
1.2.1. UOPŠTENO O SALMONIDAMA
Salmoniformes je relativno brojan red primitivnih Euteleostei koji obuhvata dva podreda: Osmeroidei i Salmonoidei (Johnson i Patterson, 1996). U okviru podreda Osmeroidei nalazi se porodica Osmeridae sa šest rodova. Vrste ove porodice uglavnom su ograničene na severne delove Atlantika i Pacifika. To su ribe male veličine sa adipoznim perajem. Žive u obalnim zonama odakle mnoge ulaze u reke gde se mreste. U nekim delovima areala dostižu veliku brojnost, tako da su i ekonomski važne ribe. Podred Salmonoidei uključuje anadromne i potamodromne grupe, koje veći deo životnog ciklusa provode u morima i čije migracije po spektakularnosti nalikuju migracijama jegulja. Zavičajno ponašanje ovih riba je veoma izraženo. Salmonidnim ribama pripadaju i grupe koje su isključivo slatkovodne (npr. Hucho, Salmothymus, Salvethymus). Kod salmonidnih riba iza dorzalnog peraja postoji dobro razvijeno adipozno peraje. Kod anadromnih salmonidnih riba primarna metamorfoza se događa tokom nizvodnih migracija. Sekundarna metamorfoza se odvija tokom uzvodnih migracija pred period mresta. Kod pripadnika roda Salmo i nekih drugih rodova dolazi do "regresivne metamorfoze", gubljenja morfoloških karakteristika nastalih sekundarnom metamorfozom tokom njihovih nizvodnih migracija posle reprodukcije. Kada naredni put ove ribe krenu da se mreste, kod njih se ponavlja ciklus morfoloških promena i njihovog gubljenja (Saunders i Schom, 1985). Salmonide imaju cirkumpolarno rasprostranjenje i karakteristične su za severnu Zemljinu hemisferu (Slika 1). Naseljavaju područja Severnog ledenog mora i severnog dela Atlantika i Pacifika, reke i mora Evrope, zapadne Azije i Severne Amerike (Lagler, 1977). Zbog njihovog komercijalnog značaja introdukovane su i u vode južne Amerike, Australije i Novog Zelanda (Wheeler, 1992).
Slika 1. Područje rasprostranjenja Salmonida (Maitland, 1995) – modifikovano.
3 Uvod
Na osnovu palentoloških dokaza utvrđena je pojava salmonidnih vrsta još početkom tercijara u eocenu, dok su krajem tercijara i početkom kvartara bile široko rasprostranjene (Mitrović i Pavlović, 1980). Među naučnicima postoje nesuglasice oko pradomovine salmonida. Neki smatraju da salmonide vode poreklo iz slatkih voda (Neave, 1958; Vladykov, 1963), ali ima i onih koji veruju da je more njihovo prvobitno stanište (Schmidt, 1947).
1.2.2. KARAKTERISTIKE FAMILIJE SALMONIDAE
Jedna od osnovnih zajedničkih karakteristika svih vrsta riba iz familije Salmonidae je postojanje masnog ili adipoznog peraja, koje se nalazi između leđnog i repnog peraja. Celo telo riba iz ove familije je, izuzev glave, prekriveno sitnim krljuštima. Bočna linija je jasno uočljiva. Leđno peraje je kratko. Dentalne, gornjevilične i međuvilične kosti salmonidnih vrsta riba su nazubljene, a od kostiju gornje vilice najsnažnije je nazubljen vomer. Kod salmonidnih vrsta on je različito nazubljen, pa oblik i nazubljenost vomera (kao i broj piloričnih nastavaka koji varira između 17 i 210) predstavlja važan taksonomski karakter, koji služi za identifikaciju riba iz ove familije. Kako su one izraziti predatori, želudac im je prilagođen varenju hrane životinjskog porekla - širok je i mišićav. Leđa i bokovi salmonidnih vrsta su prekriveni crnim i/ili crvenim pegama, a kod nekih vrsta i raznim tipovima pruga i šara. Sve salmonidne vrste obitavaju isključivo u hladnim, bistrim i nezagađenim potocima ili rekama brzog toka, koje su bogate rastvorenim kiseonikom (O2) ili u planinskim jezerima čije se temperature vode kreću oko 10oC i koje, ni u najtoplije doba godine, ne prelaze 18oC (maksimalno 20oC). To su sve tzv. reofilne vrste riba, vretenastog oblika tela, prilagođene životu u brzim rečnim tokovima. Sve vrste iz familije Salmonidae mreste se isključivo u slatkoj vodi, i to u izvorišnim delovima potoka ili reka u kojima obitavaju ili pak, u priobalnim delovima jezera, u kojima žive na peskovitom, šljunkovitom ili kamenitom dnu navedenih vodenih biotopa. Sazrevanje gonada riba iz ove familije nastupa u kasnim jesenjim danima, od novembra do januara - ređe od oktobra do februara - izuzev mladice (Hucho hucho), mekousne pastrmke (Salmothymus obtusirostris) i lipljana (Thymallus), koje se mreste u prolećnim mesecima (mart - april). Relativna plodnost (RF – predstavlja broj jaja na 1 kg
4 Uvod telesne težine) salmonidnih vrsta riba relativno je mala i kreće se od oko 1500 jaja - ikre (kod potočne pastrmke) do oko 12000 jaja (kod mladice) u odnosu na 1 kg telesne težine. Veličina riba iz familije Salmonidae je neujednačena. Dok vrste iz roda Salmo, Salvelinus i Salmothymus u potocima i manjim rečicama narastu otprilike do 30 ili 40 cm totalne dužine i između 0,30 kg i 1 kg mase tela (nekada i nešto više), one iz većih, dubljih reka ili jezera narastu znatno više, čak i preko 22 kg, a mladica i preko 50 kg (Aganović, 1979).
1.2.3. KLASIFIKACIJA I FILOGENETSKI ODNOSI UNUTAR FAMILIJE SALMONIDAE
Klasifikacija porodice Salmonidae je često menjana, tako da je vrlo teško dati precizan broj rodova u okviru podfamilije Salmoninae. Broj rodova, u zavisnosti od autora, kreće se između 5 i 10 (Nelsen, 1984). Prema klasifikaciji Starley-a i Smith-a (1993) broj rodova je 8, a prema najnovijoj klasifikaciji salmonida po ITISu (eng. Integrated Taxonomic Information Sistem, 30. 03. 2004.), broj rodova u okviru podfamilije Salmoninae je 7.
Superordo: Protacanthopterygii Ordo: Salmoniformes Familia: Salmonidae Subfamilia: Corregoninae (ozimice) Subfamilia: Thymalinae (lipljani) Subfamilia: Salmoninae Genus: Brachymystax, (lenok) Genus: Hucho, (mladica) Genus: Oncorhynchus, (pacifički lososi i pacifičke pastrmke) Genus: Parahucho Genus: Salmo, (atlantski losos i pastrmka) Genus: Salvelinus, (zlatovčice) Genus: Salvethymus
5 Uvod
Porodica Salmonidae obuhvata tri podporodice: Thymallinae, Coregoninae i Salmoninae (Shaposhnikova, 1975). Ovakva podela porodice Salmonidae na tri podporodice je opšte prihvaćena. Prema morfologiji rodovi podporodice Salmoninae su noviji i napredniji oblici u odnosu na rodove podporodica Thymallinae i Coregoninae, za koje se smatra da su evolutivno stariji (Stearley i Smith, 1993; Slika 2).
Slika 2. Prikaz odnosa među rodovima porodice Salmonidae na osnovu morfoloških istraživanja (Starley i Smith, 1993).
Mnogo veća neslaganja među autorima možemo sresti pri klasifikaciji rodova unutar podporodice Salmoninae. Autori se uglavnom slažu oko filogenetskog statusa najbolje proučenih rodova (Hucho, Salvelinus, Salmo, Oncorhynchus), za koje se smatra da predstavljaju naprednije salmonide. To se posebno odnosi na rodove Oncorhynchus i Salmo. Ostali rodovi: Brachymystax, Salmothymus, Acantholingua i Platysalmo, koji su slabije proučeni, smatraju se morfološki primitivnijim i njihovo filogenetsko mesto još uvek je potpuno nejasno (Stearley i Smith, 1993; Osinov, 1999; Phillips i Oakley, 1997).
6 Uvod
Slika 3.Prikaz četiri filogenetske hipoteze date na osnovu morfoloških analiza od strane različitih autora (za odnose između rodova Brachymystax, Hucho i Salvelinus) (1) Norden (1961), (2) Kendall i Behnke (1984), (3) Dorofeeva (1989) i (4) Stearley i Smith (1993).
(1) (2) Thymallus Thymallus
Brachymystax Brachymystax
Hucho Hucho
Salvleinus Salvelinus
Salmo Salmo Oncorhynchus Oncorhynchus
Thymullus (4) Thymallus (3) Brachymystax Brachymystax
Hucho Acantholingua
Parahucho Salmothymus
Salvelinus Hucho
Salmothymus Salvelinus
Salmo Salmo
Oncorhynchus Oncorhynchus
Prema prvoj hipotezi, Norden (1961) smatra da svaki od rodova ima monofiletsko poreklo (Slika 3-1). Kendall i Behnke (1984), prema drugoj hipotezi, smatraju da rodovi Brachymystax, Hucho i Salvelinus vode poreklo od zajedničke monofiletske grupe (Slika 3-2). Dorofeyeva (1989), prema trećoj hipotezi, smatra da rodovi Brachymystax, Hucho i Parahucho vode poreklo od jedne zajedničke monofiletske grupe, a Salvelinus od druge (Slika 3-3). Stearley i Smith (1993), prema četvrtoj hipotezi, smatraju da rodovi Hucho i Salvelinus vode poreklo od jedne monofiletske grupe, Salmothymus i Acantholingua od druge, a Brachymystax od treće (Slika 3-4). Intergenerički odnosi u podporodici Salmoninae znatno su izmenjeni nakon uvođenja molekularnih tehnika (Slika 4). Dobijanjem novih rezultata koji su bili različiti u odnosu na rezultate dobijene morfološkim analizama, bilo je neophodno izvršiti reklasifikaciju rodova u okviru podporodice. Dobijeni rezultati bili su pre svega značajni za utvrđivanje taksonomske pozicije “problematičnih” rodova (Brachymystax, Salmothymus, Acantholingua i Platysalmo).
7 Uvod
Predstavnici rodova Parahucho i Salvethymus (ITIS, 2004), na osnovu genetičkih istraživanja, svrstani su u rodove Hucho i Salvelinus (Phillips i Oakley, 1997). Oakley i Phillips (1999) su sekvencionirali gen hormona rasta (GH2C) i dobili rezultate na osnovu kojih je rod Brachymystax predstavljen kao izvedeniji predstavnik roda Hucho. Samim tim je odbačena hipoteza o rodu Brachymystax kao primitivnijem (arhaičnom) rodu podporodice Salmoninae. Sistematsko mesto roda Acantholingua je takođe izmenjeno nakon rezultata koje su dobili Phillips i sar., (2000), sekvencioniranjem gena hormona rasta (GH2C), gena na ribozomalnoj RNA (ITS1) i citohroma b na mitohondrijalnoj DNA. Na osnovu dobijenih rezultata, rod Acantholingua filogenetski je najbliži rodu Salmo.
Slika 4. Reklasifikacija rodova podfamilije Salmoninae bazirana na molekularnim podacima (mtDNA, GH2C i ITS1).
Thymallus Thymallus
Brachymystax Salmothymus
Acantholingua Hucho
Salmothymus Brachymystax
Hucho Salvelinus
Salvelinus Acantholingua
Salmo Salmo
Oncorhynchus Oncorhynchus
Sistematsko mesto roda Salmothymus takođe je bilo diskutabilno dok nisu urađene analize nuklearne DNA i sekvencioniranja kontrolnog regiona i citohroma b mitohondrijalne DNA (Slika 5). Na osnovu dobijenih rezultata, rod Salmothymus, isto kao i rod Acantholingua, filogenetski je najbliži rodu Salmo (Snoj i sar., 2002).
8 Uvod
Slika 5. Intergeneričko stablo porodice Salmonidae, urađeno na osnovu analiza nuklearne DNA i sekvencioniranja kontrolnog regiona i citohroma b mtDNA.
Coregonus lavaretus
Coregonus albula Thymallus thymallus
Thymallus arcticus
Salvelinus alpinus
Salvelinus fontinalis Brachymystax lenok
Salmo trutta Oncorhynchus keta Acantholingua ohridana Salmothymus Salmo Oncorhynchus mykiss obtusirostris salar
0.1
Rodovi Salmothymus, Acantholingua i Salmo čine posebnu grupu u okviru intergeneričkog stabla, što govori o njihovim srodničkim vezama. Dalja istraživanja išla su u pravcu utvrđivanja tačnog položaja roda Salmothymus i Acantholingua unutar grupe Salmo (Slika 6). Istraživanja su vršena ispitivanjem LDH- C1* i ITS1 gena nuklearne DNA i kontrolnog regiona mtDNA (Snoj i sar., 2002; Snoj, 2003). U analizama se kao veoma bitan pokazao LDH-C1* gen koji je sinapomorfna odlika rodova Salmothymus, Acantholingua i Salmo, što ga čini validnim genetičkim markerom za utvrđivanje filogenetskih odnosa ovih rodova.
9 Uvod
Slika 6. Filogenetski odnosi unutar grupe Salmo, dobijeni na osnovu sekvencioniranja LDH-C1* i ITS1 gena nuklearne DNA, kontrolnog regiona i citohroma b mtDNA. Da – dunavska, At – atlantska, Ma – marmoratus i Ad – jadranska linija.
Salvelinus fontinalis
Oncorhynchus mykiss
Salmo salar
Salmo obtusirostris 100 Acantholingua ohridana 100 Da
At 94 Salmo trutta/ marmoratus complex Ma 81 0.01 Ad
Na osnovu dobijenih rezultata (Snoj i sar., 2002; Snoj, 2003), autori su zaključili da unutar grupe Salmo postoje tri podgrupe: Salmo salar, Salmo trutta kompleks koji uključuje i Salmo marmoratus i treća podgrupa koju čine Acantholingua ohridana i Salmothymus obtusirostris. Autori takođe smatraju da su vrste iz treće podgrupe sestrinske i da predstavljaju evolutivni prelaz između Salmo salar i Salmo trutta kompleksa, pri čemu su znatno bliže kompleksu Salmo trutta. Autori su na osnovu dobijenih rezultata predložili reklasifikaciju roda Salmothymus kao zasebnog roda, i predlažu svrstavanje vrsta istog unutar roda Salmo. Sušnik i sar. (2004) na osnovu rezultata sekvencioniranja mtDNA zaključuju da vrste Salmo marmoratus i Salmo (Platysalmo) platycephalus ulaze u sastav filogenetskog kompleksa Salmo trutta (Slika 7).
10 Uvod
Slika 7. Filogenetski odnosi unutar grupe Salmo, sa posebnim akcentom na položaj vrste Salmo platycephalus, dobijeni na osnovu sekvencioniranja ITS1 gena nuklearne DNA, kontrolnog regiona i citohroma b mtDNA (Sušnik i sar., 2004). Ma – marmoratus, Me – mediteranska, Ad – jadranska, At – atlantska i Da – dunavska linija.
Utvrđivanje preciznih filogenetskih odnosa rodova i vrsta unutar porodice Salmonidae je veoma bitno zbog njihove zaštite, jer je poznato da su mnoge vrste iz ove porodice procenjene kao ugrožene (Crivelli, 1996). Veliki broj autora se slaže da postojeće nedoumice u vezi filogenije rodova i vrsta porodice Salmonidae mogu biti razrešene samo kombinovanjem rezultata morfoloških i molekularnih analiza (Delling, 2003; Bernatchez i sar., 1992).
11 Uvod
1.2.4. SALMO TRUTTA (LINNAEUS, 1758) – POTOČNA PASTRMKA
Pastrmka kao autohtona salmonidna vrsta naseljava vode Evroazije i severne Afrike. Rasprostranjena je na području od severne Norveške i severoistočnog dela Rusije na severu do planine Atlas u severnoj Africi na jugu, i od Islanda na zapadu do Aralskog mora na istoku (Behnke, 1986; Elliott, 1994). Tokom prošlog veka pastrmku su naselili u 24 zemlje izvan Evrope, i to u preostali deo Azije i Afrike, zatim u Australiju, Severnu i Južnu Ameriku (Laikre i sar., 1999). Kod ove vrste zubi su raspoređeni na vomeru, vilicama, jeziku i na nepcu (Povž i Sket, 1990). Zubi na vomeru su raspoređeni u dva reda i zadržavaju se tokom celog života. U gornjoj vilici postoje mnogobrojni zubi usmereni unazad. Ovi zubi služe samo za pridržavanje plena. Krljušti na telu su sitne, glava je bez krljušti. Branhiospina na prvom škržnom luku ima od 18 - 24. Piloričnih nastavaka ima od 40 - 100, prosečno 65,38 (Vuković i Ivanović, 1971). Diploidan broj hromozoma iznosi 84, mada je primećeno znatno variranje među intraspecijskim formama. Po bokovima, leđima, škržnim poklopcima i leđnom peraju nalaze se brojne tamne, crvene i/ili narandžaste pege (Povž i sar., 1996). Boja tela veoma varira i zavisi od osobina staništa. Dužina je obično oko 40 cm, težina do 800 gr. Potočna pastrmka naseljava hladne vode i to obično gornje tokove reka umereno kontinentalnog klimata, mada se može naći i u ravničarskim rekama borealne zone, kao i u jezerima sa čistom i hladnom vodom. Polni dimorfizam je izražen u doba mresta: ženke imaju zaobljen trbuh i crven nabubreli polni otvor, dok su mužjaci uskog trbuha i nemaju nabubreli polni otvor, ali se odlikuju veoma razvijenom donjom vilicom u obliku kuke. Mresti se krajem jeseni i početkom zime - od novembra do januara. RF ženke iznosi do 2000 jaja na kg telesne težine. Ikra se odlaže na kamenitom dnu sa brzim tokom vode. Prečnik jaja je veliki i iznosi 4.5 do 5 mm. Inkubacioni period traje, zavisno od temperature vode, od 60 do 90 dana. Larve izvaljene u januaru ili februaru imaju veliku žumančanu kesicu, koja im omogućuje ishranu, ali otežava kretanje. Aktivan život larvi, odnosno njihov izlazak iz skrovišta, nastaje sa trošenjem i smanjivanjem žumančane kesice na 1/3 njene veličine. U prirodnim plodištima mlađ ostaje do početka jeseni, kada naraste do 10 cm dužine. Ona se kasnije nizvodno seli u dublje i mirnije vode u potrazi za hranom. Polnu zrelost dostižu u 2 - 3 godini. U prvoj godini jedinke narastu 10 do 14 cm. Ove ribe imaju juvenilni kolorit, tzv. "mladalačko ruho", istaknuto sa desetak crnih
12 Uvod vertikalnih mrlja na bokovima tela. Sa porastom mlađi nestaju ova obeležja. Totalna dužina dvogodišnjih jedinki može dostići 20 do 25 cm, a težina 150 do 200 g (Jevtić, 1989). Rastu dosta sporo. U akumulacionom jezeru Lokvara (blizu Delnica), koje pripada dunavskom slivu, ulovljena je 1968. godine potočna pastrmka dužine 124 cm i težine od 25.5 kg, stara 15 ili 16 godina (Pažur, 1969). Potočna pastrmka se hrani različitim organizmima: ribama, larvama vodenih insekata, ikrom drugih riba, insektima koji lete nad površinom vode i padaju na vodu, račićima i drugim beskičmenjacima (Aganović, 1979).
Od uvođenja binomijalne nomenklature do danas, opisana je, na osnovu morfologije, 1931 vrsta evropskih salmonida. Ovako veliki broj vrsta javlja se kao posledica nedovoljnog poznavanja pravila nomenklature i morfologije riba, kao i primene različitih koncepata vrste. U poslednjih dvesta godina dato je 57 naučnih imena za potočnu pastrmku Salmo trutta sensu stricto (Kottelat, 1997). Pastrmka je izuzetno prilagodljiva različitim uslovima staništa spram kojih pokazuje visok nivo fenotipske plastičnosti. Zbog toga danas postoji veliki broj geografski specifičnih populacija, sa karakterističnim morfološkim odlikama, i to je glavni razlog zašto je za jednu vrstu dato toliko naučnih imena. Postoje tri različita ekološka oblika koje potočna pastrmka razvija u zavisnosti od uslova staništa: Salmo trutta forma fario – rečni oblik (Slike 10, 11, 12 i 13) Salmo trutta forma lacustris – jezerski oblik (Slika 8) Salmo trutta forma trutta – morski oblik (Slika 9)
Morski i jezerski oblik predstavljaju migratorne populacije, dok rečni oblik uvek naseljava rečno stanište u okviru koga može preduzimati manje ili veće migratorne pokrete. Morska forma živi i hrani se u moru, kada postane polno zrela migrira u reke na mrest, a nakon mresta mladi se vraćaju u more. Jezerska forma naseljava jezera, a na mrest, kao i morska forma, migrira u reke, ili pak u pliće delove jezera (Elliott, 1994). Migratorne i stalne populacije mogu istovremeno naseljavati neku reku i pojedine studije pokazuju da se mogu nesmetano ukrštati (Hindar i sar., 1991), mada mehanizam nasleđivanja migratornosti/stacionarnosti još uvek nije poznat.
13 Uvod
Na osnovu rezultata dobijenih sekvencioniranjem mtDNA utvrđeno je da različiti ekološki oblici nisu genetički uslovljeni, a samim tim ne moraju predstavljati monofiletske grupe (Ryman 1983; Bernatchez i sar., 1992; Cross i sar., 1992). Jezerska forma zbog uslova staništa može narasti i preko 20 kg, na bokovima tela dominiraju crne krupne tačke, crvene su vrlo retke ili ih uopšte nema.
Slika 8. Salmo trutta forma lacustris – jezerski oblik
Slika 9. Salmo trutta forma trutta – morski oblik
Morska forma je veoma slična atlantskom lososu. Po bokovima tela ima veliki broj crnih piknji nepravilnog oblika. Prvi o njoj je pisao Chiereghini (1818) i dao joj ime Salmo cenerinus, a posle njega Kolombatović (1890) koji ju je preimenovao u Trutta adriatica. Snoj i sar. (2002) su, na osnovu rezultata dobijenih sekvencioniranjem mtDNA, utvrdili da morska forma pripada atlantskoj liniji, pri čemu se smatra da su analizirani uzorci iz severnog Jadrana alohtonog (ribnjačkog) porekla.
14 Uvod
Na osnovu genetičkih analiza (RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), alozimski polimorfizam, sekvenciranje mtDNA) koje su rađene u poslednjih 20 godina, došlo se do zaključka da pastrmke određenog geografskog područja pokazuju značajne specifične sličnosti i na genetičkom nivou. Utvrđene genetičke sličnosti se povezuju isključivo sa geografskim područjima (basenima) i nemaju nikakve veze sa ekološkim formama (Guyomard i Krieg, 1983; Bernatchez i sar., 1992; Giuffra i sar., 1996; Largiader i Scholl, 1996; García-Marín i Pla, 1996; García-Marín i sar., 1999; Vollestad i Hindar, 1997; Berrebi i sar., 2000). Bernatchez i sar. (1992) su se bavili utvrđivanjem nukleotidnog redosleda unutar 640 bp dugog kontrolnog regiona mtDNA. U analizu su uključili sve tri ekološke forme (rečnu, jezersku i morsku), glavaticu (Salmo marmoratus), gardsku (Salmo carpio) i korzikansku pastrmku (Salmo macrostigma). U analizu su uključene, geografski posmatrano, ukupno 24 populacije pastrmki iz atlantskog, dunavskog, sredozemnog i jadranskog sliva. Cilj je bio da se na osnovu dobijenih rezultata utvrde filogenetski odnosi morfološki i geografski različitih populacija pastrmki u Evropi. Autori su utvrdili 21 polimorfno mesto i ukupno 12 haplotipova (haploidni genotip – genetička varijanta) koje su po obradi podataka razvrstali u pet filogenetskih grupa – linija, koje su se uglavnom poklapale sa specifičnim geografskim poreklom uzorka:
1. jadranska linija (Ad) (Slika 10) 2. sredozemna (mediteranska) linija (Me) (Slika 11) 3. dunavska linija (Da) (Slika 12) 4. atlantska linija (At) (Slika 13) 5. marmoratus linija (Ma) (Slika 14)
Populacije potočne pastrmke koje pripadaju istoj liniji poseduju neke zajedničke morfološke osobine. Karakteristike spoljašnjeg izgleda mediteranske i jadranske linije su veliki broj sitnih crvenih i crnih tačaka koje su nepravilno raspoređene po celom telu, kao i četiri široka tamna pojasa, koji kao obruči obavijaju telo i to jedan u nivou glave, dva u nivou trupa i jedan u nivou repa. Širina pojaseva je individualna (Odak, 2004).
15 Uvod
Slika 10. Jadranska linija potočne pastrmke
Slika 11. Sredozemska (mediteranska) linija potočne pastrmke
Dunavska linija ima krupnije crvene i crne tačke podjednako zastupljene i ravnomerno raspoređene po celom telu. Slika 12. Dunavska linija potočne pastrmke
Atlantska domestifikovana linija ima karakterističnu crnu pigmentaciju koja preovladava nad crvenom i nalazi se uglavnom na trupnom delu neposredno iza glave (Giuffra i sar., 1996).
16 Uvod
Slika 13. Atlantska linija potočne pastrmke
Marmoratus linija (glavatica), ima karakteristične mramorne šare po kojima je i dobila ime. Osnovna boja tela je maslinasto zelena ili braonkasta, a šare se nalaze na leđima i bokovima tela i nešto su tamnije od osnovne boje. Pojedini primerci mogu imati i četiri široka tamna pojasa. Slika 14. Marmoratus linija potočne pastrmke
Prema teoriji molekularnog sata, gde razlika u sekvenci nukleotida od 1% do 2% predstavlja milion godina (Smith, 1992; Bernatchez, 2001) smatra se da su se pre približno 10 miliona godina od zajedničkog pretka razdvojile dve vrste, losos (Salmo salar) i pastrmka (Salmo trutta). Bernatchez (2001) smatra da se razdvajanje pastrmskih filogenetskih linija od zajedničke predačke populacije dogodilo se u periodu od pre 0,5 do 2 miliona godina, što ukazuje da su veoma značajnu ulogu pri formiranju filogeografskih linija imale klimatske promene koje su se desile tokom pleistocenskih glacijacija (700 – 10 (14) hiljada godina). Poslednja velika pomeranja unutar linija desila su se po poslednjoj glacijaciji (pre oko 20000 – 14000 godina).
17 Uvod
Pošto je atlantski basen najduže bio izložen uticaju ledenog doba smatra se da je atlantska linija imala najskoriju demografsku ekspanziju koja se dogodila pre 26000 – 13000 godina, što se poklapa sa početkom kraja poslednje glacijacije (pre oko 18000 godina). Dunavska linija imala je stariju najznačajniju demografsku ekspanziju mnogo pre At linije, pošto na nju ledena doba nisu posebno uticala i to pre 300000 – 150000 godina, što se poklapa sa najznačajnjim interkonekcijama (Crno more, Kaspijsko i Aralsko jezero) i širenjem mora (pre oko 28000 godina). Vreme demografske ekspanzije unutar jadranske linije najverovatnije se desilo između At i Da linije, pre 77000 – 135000. Smatra se da ledeno doba nije imalo uticaja na mediteransku i marmoratus liniju (Bernatchez i sar., 1992; Bernatchez, 2001).
Slika 15. Geografska distribucija pet glavnih mtDNA evolutivnih linija potočne pastrmke u Evropi (Bernatchez, 2001).
- atlantska linija, - dunavska linija, - jadranska linija - mediteranska linija - marmoratus linija
18 Uvod
Pet filogenetskih linija koje je opisao Bernatchez i sar. (1992), grupa naučnika koja je udružena u konzorcijum «TROUTCONCERN» (Laikre i sar., 1999) objedinila je u tri grupe: • pastrmke mediteransko – jadranskog regiona • pastrmke crnomorskog, kaspijskog i aralskog basena • pastrmke atlantskog regiona
Mediteransko – jadranski region predstavlja oblast u kojoj Salmo trutta – complex pokazuje najveću fenotipsku raznolikost (Behnke, 1968). Nekoliko oblika potočne pastrmke sa promenljivim taksonomskim statusom, u zavisnosti od autora, karakteristično je upravo za ovaj region, a posebno za oblast Balkana i Turske (S. macrostigma, S. dentex, S peristericus, S. marmoratus, S. carpio, S. obtusirostris, S pelagonicus, S. farioides, S. macedonicus, S. lumi, S. letnica). Popisi navodnih vrsta ili podvrsta mogu se pronaći kod Behnke (1965; 1968); Banarescu i sar. (1971); Economidis i Banarescu (1991); Kottelat (1997); i Dorofeeva (1998). Genetičke studije zasnovane na jedarnoj i mitohondrijalnoj DNA pokazuju visok nivo genetičke raznovrsnosti (kvantitativno (npr. veliki broj različitih haplotipova), ali ne i kvaltativno (sa malim međusobnim razlikama)) između populacija potočne pastrmke ovog regiona. Kao rezultat genetičkih analiza utvrđena su samo dva jasno različita entiteta: mediteranske populacije potočne pastrmke (Salmo trutta) i glavatica (Salmo marmoratus). Primena novih molekularnih tehnika nije potvrdila taksonomski položaj populacija fenotipski karakterističnih za Balkansko poluostrvo, u sistemu klasifikacije zasnovanom na fenotipskim karakteristikama koje su pod uticajem kompleksa biogeografskih faktora (Karakousis i Triantaphyllidis, 1990; Apostolidis i sar., 1997). Patarnello i sar. (1994) su na osnovu sekvencioniranja delova mtDNA otkrili izuzetno nisku stopu genetičkih razlika kod populacija koje su fenotipski veoma različite (Salmo macrostigma, Salmo carpio i Salmo fibreni).
Crnomorski, kaspijski i aralski basen predstavljaju više od 50% ukupne teritorije koju naseljava potočna pastrmka u Evropi. Iako se radi o izuzetno velikoj teritoriji, broj genetički analiziranih populacija je svega desetak i to sa teritorije bivšeg Sovjetskog Saveza (Bernatchez i sar., 1992; Bernatchez i Osinov, 1995; Riffel i sar., 1995; Largiadèr i Scholl, 1995; Osinov i Bernatchez, 1996). Sekvencioniranjem mtDNA unutar ovog regiona pronađene su dve od pet filogenetskih linija: dunavska i atlantska. Dunavska
19 Uvod linija značajno preovlađuje, dok je svega nekoliko jedinki određeno kao pripadnici atlantske linije. Autori smatraju da nije moguće sa sigurnošću zaključiti da li je prisustvo atlantske linije posledica prirodne kolonizacije ili introdukcije (Osinov i Bernatchez, 1996). Na bazi morfoloških i ekoloških razlika, populacije crnomorskog, kaspijskog i aralskog basena bile su klasifikovane u posebne taksone (Berg, 1948). Populacije crnomorskog basena su prepoznate kao Salmo trutta labrax, kaspijskog basena kao Salmo trutta caspius, a populacije aralskog basena kao Salmo trutta oxianus. Posebna ekofenotipska forma iz jezera Sevan (kaspijski basen) prepoznata je kao posebna podvrsta Salmo trutta ischchan. Kombinacijom dobijenih rezultata analize alozima i mtDNA, Bernatchez i Osinov (1995) i Osinov i Bernatchez (1996), smatraju da se ne može dati podrška za predhodno iznetu taksonomsku originalnost. Iako je obrađeno vrlo malo uzoraka dunavske linije iz crnomorskog, kaspijskog i aralskog basena, utvrđen je visok nivo genetičke diferencijacije populacija (Bernatchez i Osinov, 1995; Osinov i Bernatchez, 1996).
Atlantska filogeografska linija naseljava reke atlantskog basena od Islanda i Norveške na severu do Iberijskog poluostrva i Atlas planine u Maroku na jugu, takođe naseljava reke sliva Baltičkog i Severnog mora. Na osnovu genetičkih rezultata došlo se do zaključaka da su populacije atlantske linije prilično homogene i da je nivo genetičke diferencijacije manji u odnosu na mediteranske i dunavske populacije. Utvrđene su značajne razlike na osnovu analize nuklearne i mtDNA između južnih iberijskih i severnih populacija (Moran i sar., 1995; Antunes i sar., 1999; Bouza i sar., 1999; García- Marín i sar., 1999; Weiss i sar., 2000). Utvrđene razlike smatraju se posledicom neistovremenog naseljavanja severnih delova atlantskog basena nakon poslednje glacijacije. Na bazi diskontinuiteta u učestalosti alela LDH-C1*(=LDH-5*)100 i *90 Ferguson i Fleming (1983) smatraju da su Velika Britanija i Irska rekolonizovane u postglacijalnom periodu sa dve «grupe» potočne pastrmke. Prva rekolonizaciona grupa nazvana je «ancestralna» i odlikovala se prisustvom LDH-C1*100 alela, dok je druga rekolonizaciona grupa nazvana «moderna» i odlikovala se prisustvom alela LDH-C*90. Hamilton i sar. (1989), na osnovu dopunskih analiza, proširuju hipotezu o dve nezavisne rekolonizacije na preostali deo severo-zapadne Evrope potočnom pastrmkom. Filogenija mtDNA haplotipova i njihov geografski raspored sugerišu da je postglacijalna rekolonizacija severo-zapadne Evrope bila znatno složenija; pretpostavlja se da je bilo
20 Uvod više od dve rekolonizacije, kako je prethodno predloženo (Hynes i sar., 1996; García- Marín i sar., 1999). Atlantska linija je pronađena i u dunavskom slivu, ali nema podataka da li se radi o prirodnom ili veštačkom procesu (Duftner i sar., 2003). Bernatchez i sar. (1992), smatraju da je moguće da se radi o prirodnoj kolonizaciji, koja se mogla desiti u periodu interglacijacija. Osim u dunavskom, atlantska linija je pronađena u mediteranskom basenu, što se smatralo posledicom čovekove aktivnosti (Poteaux i sar., 1998). Međutim, na Siciliji su nedavno pronađene autohtone populacije atlantske linije koje najverovatnije vode poreklo iz severne Afrike (usmeno saopštenje Aleš Snoj).
1.2.5. METODE RAZLIKOVANJA RIBLJIH POPULACIJA
Metode razlikovanja ribljih populacija podeljene su u dve osnovne grupe: 1. Morfološke metode 2. Genetičke metode
1.2.5.1. Morfološke metode razlikovanja ribljih populacija
Morfometrija i meristika su najčešće primenjivane morfološke metode. Ove metode se koriste pre svega zbog lake primene i ekonomskih razloga. Ako se odabere pravi set karaktera i ako se pravilno izvrše analize, dobijeni rezultati će biti bez sumnje validni. Morfometrija jeste oblast bioloških istraživanja u kojoj se kvantitativnim analizama opisuje forma (oblik i veličina) nekog morfološkog entiteta, bića ili pojedinačne karakteristike (Oxnard, 1978). Osnovu ovakvih analiza čini statistički pristup obradi geometrijskih informacija o istraživanom morfološkom objektu. Morfometrijske karakteristike koje se najčešće koriste u razmatranju veličine i oblika tela jesu rastojanja između anatomskih tačaka smeštenih na longitudinalnoj osi (opšte dužinske karakteristike), dorzo-ventralnoj osi (karakteristike visine) i osi koja povezuje levu i desnu stranu tela (karakteristike širine). U cilju što tačnijeg određenja oblika morfoloških struktura koriste se i takve karakteristike koje predstavljaju udaljenost između anatomskih tačaka postavljenih na neortogonalnim (kosim) osama, čiji su uglovi manji ili veći od pravog u odnosu na pomenute ose (Sttraus i Bookstein, 1982; Bookstein i sar., 1985). Morfološka istraživanja, kako ona koja se bave spoljašnjom morfologijom, tako i
21 Uvod osteološka, često su izvor podataka za analizu filogenetskih odnosa pojedinih vrsta riba (Klykanov, 1975; Shaposhnikova, 1975), bez obzira na nivo klasifikacije. Zadatak takvih istraživanja je utvrđivanje stanja karakteristika i njihove učestalosti u istraživanim taksonima. Time se utvrđuje status pojedinih stanja karakteristika u filogenetskom smislu, tj. jesu li stanja predačka (pleziomorfna) ili izvedena (apomorfna) (Hennig, 1966), a i rekonstruišu filogenetski odnosi na osnovu ocene stanja tih karakteristika. Merističke osobine imaju jednostavniju naslednu osnovu u odnosu na morfometrijske, pa su stoga lakše za analizu ribljih populacija. Meristički karakteri su diskretni ili brojivi i u merističkim analizama ribljih populacija najčešće se koriste karakteri kao što su: broj žbica (tvrdih i mekih) u perajima, broj krljušti u bočnoj liniji, broj piloričnih nastavaka, broj kičmenih pršljenova, broj branhiospina i dr. (Alegria - Hernandez, 1985)
1.2.5.2. Genetičke metode razlikovanja ribljih populacija
Kao rezultat brzog razvoja molekularne genetike u poslednjih 20 godina, danas imamo nekoliko laboratorijskih tehnika koje su upotrebljive za akumulaciju genetičkih podataka na populacijama potočne pastrmke, kao i za druge vrste. Upotrebu molekularnih metoda pratio je nastanak molekularne sistematike koja se bavi analizom strukture makromolekula, na osnovu dobijenih rezultata rekonstruiše evoluciju gena i organizama, a samim tim i objašnjava genetičku raznovrsnost (Moritz i Hillis, 1996). Genetička raznovrsnost populacija može se utvrditi korišćenjem molekularnih markera koji predstavljaju sekvencu na molekulu DNA ili proteinu koja se može lako detektovati i čije je nasleđivanje moguće pratiti (Ford-Lloyd, 1996). Polimorfizam na molekulu DNA javlja se kao posledica mutacija koje se manifestuju kao supstitucije, a ređe kao insercije ili delecije, ili pak grešaka prilikom replikacije. Izučavanje polimorfizma je omogućeno otkrićem DNA tehnika, na prvom mestu lančane reakcije polimeraze, a nakon toga primene restrikcionih endonukleaza koje seku molekul DNA na fragmente određene dužine (Ryman i Utter, 1987). Najčešće korišćene metode molekularne genetike u ispitivanju varijabilnosti ribljih populacija su alozimi i noviji genetički markeri kao što su ponavljajuće sekvence jedarne DNA – mikrosateliti i mitohondrijska DNA.
22 Uvod
Upotrebom različitih genetičkih markera, kako mitohondrijskih tako i jedarnih, selektivno neutralnih lokusa (mikrosatelita), kao i lokusa koji su pod uticajem selekcije (pojedini alozimi), možemo najlakše utvrditi genetičku strukturu populacije. Što više markera upotrebljavamo, dobijamo potpuniju sliku genetičkog polimorfizama (Berrebi i sar., 1999).
1.2.5.2.1. Alozimi
Do pred kraj prošloga veka široko primenjivana metoda za utvrđivanje genetičke raznovrsnosti u molekularnoj genetici bila je elektroforeza alelskih varijanti proteina (alozima) (Aebersold i sar., 1987; Utter i sar., 1987; Morizot i Schmidt, 1990; May, 1992). Upotreba alozima omogućava utvrđivanje alelskih varijanti, što se može iskoristiti za ocenjivanje genetičke varijabilnosti prirodnih populacija, praćenje protoka gena, rešavanje problema hibridizacije, kao i za utvrđivanje filogenetskih odnosa (Ferguson i Masson, 1981; Murphy i sar., 1996). Mada su danas razvijene mnoge savremenije tehnike, alozimska elektroforeza je još uvek cenjena i vrlo korisna metoda za utvrđivanje značajnog nivoa genetičke varijabilnosti na populacijama potočne pastrmke, pre svega zbog svoje niske cene u poređenju sa drugim savremenim molekularnim metodama i zbog relativno lake upotrebe(Ferguson, 1989). Posebna prednost je u tome što postoji veliki broj dostupnih podataka o alozimskoj varijabilnosti, što omogućava upoređivanje uzoraka iz populacija koje poseduju značajnu vremensku i prostornu udaljenost. Osim prednosti koje ima upotreba alozimskih markera, postoje i određene mane na koje ukazuju Gyllensten i Wilson (1987) i Billington i Hebert (1991). Smatra se da su alozimski markeri pod uticajem selekcije, da zbog degeneracije genetičkog koda ne pokazuju realni nivo polimorfizma, često se nalaze na vrlo malom kodirajućem delu genoma tako da ih je vrlo teško detektovati elektroforezom i različite genetičke varijante mogu imati istu mobilnost na gelu. Lewontin (1974), smatra da je elektroforezom moguće utvrditi samo trećinu svih aminokiselinskih supstitucija, koje u stvari predstavljaju refleksiju nukleotidnih supstitucija. Iz svega rečenog zaključuje se da na osnovu rezultata elektroforetske analize nije uvek pouzdano donositi zaključke o genotipskoj varijabilnosti. U današnje vreme ovoj metodi pripisuju još jednu veliku zamerku, a to je žrtvovanje životinja koje je neophodno da bi se došlo do veće količine tkiva koju ova metoda zahteva.
23 Uvod
U poslednjih 30 godina prošloga veka urađen je veliki broj alozimskih analiza na pastrmskim populacijama iz različitih geografskih područja Evrope. Prve analize su urađene na pastrmskim populacijama atlantskog područja, i utvrđen je nizak nivo genetičke varijabilnosti. Homogenost populacija ovog područja objašnjava se veoma dugim zadržavanjem leda u severnim delovima atlantskog basena za vreme poslednje glacijacije. Kao rezultat toga dolazi do znatnog sužavanja areala, migracija severnih populacija ka jugu i ujedinjenja sa tamošnjim populacijama (Allendorf i sar., 1976; Ryman i sar., 1979; Crozier i Ferguson, 1986; Hansen i sar., 1993). Slične alozimske analize rađene su na utvrđivanju dijagnostičkih alela između atlantskih i mediteranskih populacija, (Apostolidis i sar., 1996; García-Marín i sar., 1991) kao i na utvrđivanju genetičke varijabilnosti unutar mediteranskih pastrmskih populacija (Guyomard i Krieg, 1983). Osinov (1984; 1989) je radio alozimske analize između populacija crnomorskog i kaspijskog basena i uočio je određeni nivo genetičke varijabilnosti. Veći broj autora je pokušao da, na osnovu alozimskih analiza, tj utvrđivanja alelskih varijanti koje su karakteristične samo za ovu vrstu (Giuffra i sar., 1996), odredi sistematski status glavatice (Salmo marmoratus). Na osnovu dobijenih rezultata autori određuju glavaticu kao samostalnu, prvobitnu i u odnosu na potočnu pastrmku parapatričnu vrstu (Berrebi i sar., 2000).
1.2.5.2.2. Savremeni genetički markeri
Relativno skorašnji razvoj novih i visoko varijabilnih genetičkih markera kao što je materinski nasleđena mitohondrijalna DNA (Avise, 1994) i hipervarijabilni mini- i mikrosateliti (Estoup i Angers, 1998; Goldstein i Schlötterer, 1998), pružili su nova saznanja u ispitivanju varijabilnosti populacija potočne pastrmke, koja nisu bila dostupna primenom samo alozimskih tehnika.
24 Uvod
1.2.5.2.2.1. Ponavljajuća DNA
Ponavljajuću DNA nalazimo u dva oblika: • raspršena ponavljajuća DNA • tandemski ponavljajuća DNA Raspršenu ponavljajuću DNA delimo prema broju ponavljanja na: • duge rasute elemente (LINE) – koji su duži od 1000 baza • kratke rasute elemente (SINEs) – koji su kraći od 500 baza Tandemski ponavljajuća DNA je sinonim za satelite, kod kojih se ponovljivost tandemskih jedinica kreće između 103 i 107 ponavljanja po lokusu. Kada je broj ponavljanja tandemskih jedinica znatno manji (do 100 po lokusu), koristimo termine minisateliti i mikrosateliti.
1.2.5.2.2.1.1. Mikrosateliti
Mikrosateliti su otkriveni kod svih do sada proučavanih eukariota, kod kojih su ravnomerno raspoređeni po celom genomu, ali su uglavnom ograničeni na euhromatin. Pronađeni su kako u kodirajućim tako i u nekodirajućim regionima, manji broj ih se nalazi na telomernim i centromernim regijama (Tautz i sar., 1986; Tautz, 1993). Učestalost pojave mikrosatelita je najmanje jednom na svakih 10 kb. Pronađeni su takođe kod pojedinih eubakterija i prokariota, ali sa manjom učestalošću (Tautz, 1989). Mikrosateliti predstavljaju jednostavne nukleotidne nizove koji se sastoje iz ponovljenih osnovnih motiva, dugih od 1 – 6 baznih parova (bp), koji se unutar lokusa ponavljaju od 5 pa do preko 100 puta (Stallings i sar., 1991). Mikrosateliti kičmenjaka najčešće se javljaju kao di-, tri- , i tetranukleotidne replike, sastavljene iz svih mogućih kombinacija nukleotida u osnovnom motivu (Tautz, 1989). Najčešće ponavljajući motiv je CA, a posle njega AG, AAC, AAG i AAT (Glenn, 1995). Mikrosateliti sadrže veliki broj replika osnovnog motiva i veoma su podložni mutacijama (10-3 do 10-4 po lokusu u generaciji kod dinukleotidnih mikrosatelita) koje se javljaju zbog grešaka pri replikaciji DNA, što se izuzetno odražava u dužinskom polimorfizmu (Amos i sar., 1993). Stopa mutacija mikrosatelita razlikuje se između replika sa različitim osnovnim motivom, između različitih lokusa sa replikama istog motiva i između alela istog lokusa (Schlötterer, 1998). Stopa polimorfizma je uglavnom srazmerna broju replika osnovnog motiva. Kod
25 Uvod korišćenja mikrosatelita kao markera kod kojih razlikujemo alele na osnovu različitog broja ponavljanja osnovnog motiva može se javiti problem u neslaganju dužine mikrosatelitskih fragmenata i njihovog nukleotidnog redosleda. Angeres i sar. (1995) su analizirali nukleotidni redosled mikrosatelitnih alela jednoga lokusa kod dvanaest salmonidnih vrsta i zaključili su da pojedini mikrosatelitni aleli kod različitih vrsta mogu imati jednaku dužinu, ali različit nukleotidni redosled. Autori upozoravaju da se zaključci o evolutivnim odnosima ne mogu izvoditi isključivo na osnovu dužine mikrosatelitnih alela, jer različite mutacije vrlo lako mogu rezultirati jednakom konačnom dužinom alela. Za mikrosatelite se još uvek ne zna način nastanka, odnosno njihova evolucija, zbog čega se i ne mogu koristiti kao filogenetski markeri. Mikrosateliti su veoma informativni kao genetički markeri iz više razloga: zbog visoke stope genetičke varijabilnosti, jednostavnog kodominantnog mendelističkog nasleđivanja, sačuvanosti mikrosatelitskih lokusa među srodnim vrstama. Spadaju u grupu neutralnih genetičkih markera jer nisu podložni jakom selekcionom pritisku (Queller i sar., 1993; Dowling i sar., 1996; Goldstein i Pollock, 1997). Jednostavno se mogu izolovati iz materijala koji ne zahteva žrtvovanje životinja (krvi, dlake, slina, izmeta (Constable i sar., 1995), krljušti (Miller i Kapuscinski, 1996), i arheološkog materijala (Bruford i sar., 1998). Pri analizama možemo upotrebiti veliki broj lokusa, a jednostavna optimizacija lančane reakcije polimeraze omogućava amplifikaciju više različitih lokusa u jednoj reakciji (Jug, 2002). Zbog svih predhodno nabrojanih osobina mikrosateliti imaju veoma široku upotrebu. Koriste se za utvrđivanje genetičke varijabilnosti i populacione strukture u okviru mnogo kraćih geografskih udaljenosti nego što je to ranije bilo moguće (Estoup i sar., 1998). Koriste se pri utvrđivanju porekla i srodničkih odnosa između jedinki (Marshall i sar., 1998; Queller i sar., 1993; Hansen i sar., 1997; Fontaine i Dodson, 1999), koriste ih pri kartiranju gena (Weissenbach i sar., 1992; Hearne i sar., 1992), kao i pri proceni efektivne veličine populacije (Edwards i sar., 1992). Veoma značajnu ulogu mikrosateliti imaju pri analizama muzejskog materijala (krljušti), jer na taj način možemo dobiti podatke o genetičkoj strukturi populacije za dugi vremenski period (Nielsen i sar., 1997; 1999a; b; Miller i Kapuscinski, 1997; Tessier i Bernatchez, 1999). Mikrosatelitski markeri počinju intezivnije da se koriste u izučavanju salmonidnih populacija početkom devedesetih godina prošloga veka. Ovi markeri su se pokazali kao znatno uspešniji u odnosu na alozimske. Alozimski markeri se mogu koristiti za razlikovanje populacija između basena (dunavski, mediteranski, atlantski), dok se
26 Uvod mikrosateliti koriste za utvrđivanje mikrogeografskih diferencijacija između nedavno razdvojenih populacija. Brunner i sar. (1998) i Angers i sar. (1995) su preko mikrosatelitskih markera utvrdili visok nivo interpopulacione raznolikosti na izolovanim populacijama roda Salvelinus. Rezultati ovih ispitivanja se mogu iskoristiti za očuvanje biološke raznovrsnosti. Mikrosateliti se koriste za utvrđivanje stepena introdukcije neautohtonih populacija u neki vodotok, kao i za praćenje dinamike obnavljanja autohtonih populacija (Hansen i sar., 2000; Poteaux i sar., 1999). Estoup i sar. (1993) su preliminarno objavili pregled polimorfizama mikrosatelitskih lokusa kod geografski izolovanih populacija potočne pastrmke, a nešto kasnije pronađeni su i mikrosatelitski markeri za razlikovanje glavatice (Salmo marmoratus) od ostalih pastrmskih linija (Snoj i sar., 1997; Sušnik i sar., 1997).
1.2.5.2.2.2. Mitohondrijalna DNA
Mitohondrije su semiautonomne ćelijske organele koje su zbog posedovanja sopstvene DNA (mitohondrijalna DNA – mtDNA), sposobne za autonomnu replikaciju DNA, kao i za transkripciju i translaciju genetičke informacije u proteine. Mitohondrije su prisutne u svim ćelijama kičmenjaka osim u eritrocitima sisara. Sličnost između mtDNA i bakterijske DNA navodi na sumnju da su mitohondrije evolutivni potomci slobodno živećih bakterija koje su postale subcelularne organele. U procesu integracije u ćeliju izgubile su mnoge svoje gene ili su ovi prenešeni u jedarni genom. Današnja mitohondrijalna DNA predstavlja samo deo nekada znatno većeg genoma, čiji su geni gusto raspoređeni jedan uz drugi bez umetnutih introna, osim u kontrolnom regionu koji predstavlja jedinu regulatornu sekvencu unutar genoma mtDNA (Harison, 1989). Mitohondrijalna DNA je prvi put konstatovana kod abnormalnih fibroblasta pileta i u kinetoplastima tripanozoma. Biofizička istraživanja su pokazala da se mtDNA razlikuje od nukleusne po mnogim osobinama, pa i po baznom sastavu (Grozdanović- Radovanović, 2000). Ispitivanja mtDNA na različitim životinjskim taksonima pokazala su da postoje varijacije duž sekvence, kako u redosledu nukleotida, tako i u veličini gena (Harrison, 1989).
27 Uvod
1.2.5.2.2.2.1. Osobine mitohondrijalne DNA
Mitohondrijalna DNA predstavlja važan genetički marker koji se koristi za utvrđivanje genetičke strukture populacije, taksonomskih razmatranja, filogenetskih odnosa, ukrštanja, introgresije i praćenja procesa nastanka novih vrsta. Osnovne osobine mtDNA zbog kojih se i pokazala kao veoma dobar genetički marker su: jednostavna organizacija, materinsko nasleđivanje, odsustvo rekombinacija i srazmerno visoka stopa mutacija (Avise i sar., 1987; Avise, 1994). Mitohondrijska DNA kičmenjaka je zatvoreni kružni molekul, veličine između 14 – 26 kb (Billington i Herbert, 1991), a kod salmonida je utvrđena dužina od 16670 bp (Berg i Ferris, 1984). mtDNA predstavlja značajan deo genoma koji čini do 1% ukupne ćelijske mase DNA (Cables, 2001). Najveći deo mitohondrijskog genoma čine kodogene regije, sastavljene iz ukupno 37 gena, od kojih su dva za kodiranje ribozomalne RNA, 22 gena koji kodiraju tRNA i 13 gena za kodiranje polipeptida angažovanih u transportu elektrona i oksidativnoj fosforilaciji (Avise, 1994; Curole i Kocher, 1999). Na mtDNA kodiraju se sledeći proteini: citohrom b, tri podjedinice citohrom oksidaze, dve podjedinice ATP sintetaze i sedam podjedinica NADH dehidrogenaze (Gillham, 1994; Montoya i sar., 1983). Pri prevođenju specifičnog genskog koda u mitohondrijske proteine učestvuju molekuli rRNA i tRNA, kodirani sa mtDNA. Pored 37 gena na mtDNA nalazi se i kontrolna regija (eng. D-loop region) dužine oko 1000 bp sa sekvencama koje imaju ulogu u regulaciji replikacije i transkripcije. Procesi replikacije i translacije su potpuno autonomni u odnosu na iste procese u jedarnoj DNA (Borst i Grivell, 1981). Ako razmotrimo nukleotidni raspored mtDNA kod različitih kičmenjaka, možemo utvrditi da su organizacija i položaj gena veoma dobro očuvani tokom evolucije, kao da postoje razlike u genetskom kodu, što se može iskoristiti pri filogenetskim studijama (Curole i Kocher, 1999).
28 Uvod
Slika 16. Raspored gena na mtDNA, sa prikazom restrikcijskih mesta za pojedine endonukleaze kod atlantskog lososa (Salmo salar).
Molekuli mtDNA su prisutni sa oko 1000 kopija u somatskim ćelijama, zrele jajne ćelije poseduju oko milion a spermatozoidi oko 50 kopija. Mitohondrijska DNA se kod najvećeg broja životinja nasleđuje po materinskoj liniji, mada ima nekih primera biparentalnog nasleđivanja kod beskičmenjaka (Hoeh i sar., 1991). Kod materinskog nasleđivanja samo ženski deo populacije prenosi mtDNA na potomstvo, zbog toga što pri oplođenju jajne ćelije obično dolazi do razgradnje mitohondrija prispelih iz spermatozoida (Harrison, 1989). Zbog haploidnosti mitohondrijalnog genoma efektivna veličina populacije za mtDNA iznosi samo jednu četvrtinu jedarne DNA (Birky, 1983). Pošto se mtDNA jednostrano nasleđuje, između molekula obično ne dolazi do rekombinacija, kao što je slučaj sa jedarnom DNA, što znači da se mtDNA nepromenjena prenosi sa roditelja na potomstvo. Pojava kada potomstvo u svim svojim ćelijama ima isti haplotip mtDNA naziva se homoplazmija, međutim može se dogoditi da u jednom organizmu postoje različiti haplotipovi mtDNA, gde se ovakva pojava naziva heteroplazmija, vrlo je retka i prisutna samo u nekim generacijama (Avise, 2000). Heteroplazmija do sada nije zabeležena kod salmonida, ali kod nekih drugih vrsta riba jeste, i javlja se kao posledica biparentalnog nasleđivanja ili pak mutacionih promena na delu molekula mtDNA u organizmu (Lightowlers i sar., 1997).
29 Uvod
Mitohondrijsku DNA karakteriše vrlo visok stepen mutacija, što je veoma značajno pri njenoj upotrebi kao genetskog markera. Utvrđeno je da stepen supstitucija iznosi 5,7 x 10-8 za pojedinačno nukleotidno mesto za godinu dana, što znači da mtDNA akumulira 2 – 4% mutacija na milion godina (Brown i sar., 1982; Lewin, 2000). Smatra se da je uzrok visoke stope mutacija mtDNA njena intenzivnija dinamika i mogućnost replikacije za 5 – 10 puta brže u odnosu na jedarnu DNA, a samim tim je i stepen zamene nukleotida za 5 – 10 puta veći nego kod jedarne DNA (Brown i sar., 1979). Na visok stepen mutacija u mtDNA utiču sledeći razlozi: neefikasnost mehanizama popravke (Tomkinson i Linn, 1986; Lopez i sar., 1997), visoke koncentracije mutagenih materija - (superoksidni radikali, O 2), koji nastaju pri visokoj metaboličkoj aktivnosti mitohondrija (Li i Grauer, 1991; Lopez i sar., 1997), nepouzdanost procesa replikacije DNA (Li i Grauer, 1991), slabiji selekcioni pritisak u određenim regijama, koji zajedno sa klonalnom selekcijom vrlo brzo dovodi do fiksacije mutacija (Cann i sar., 1984). Između evolutivno udaljenih linija utvrđene su razlike u stepenu supstitucija istog gena. Kao najznačajniji razlog za različite stope mutacija su oštećenja DNA koja nastaju kao posledica sporednih produkata metabolizma (Martin, 1999). Na osnovu rezultata restrikcije i sekvenciranja mtDNA utvrđeno je da frekvencija mutacija nije ista duž celog genoma. Najnižu frekvenciju mutacija na genomu mtDNA imaju regije koje kodiraju rRNA molekule (Ferris i Berg, 1988). Kontrolna regija predstavlja najvarijabilniji deo mtDNA, koji zbog manjeg funkcionalnog pritiska poseduje najviše mutacija posebno na 3'- i 5'-kraju, a to su regije genoma koji nose zapise za tRNAPro i tRNAPhe. Najkonzervativniji deo kontrolne regije je centralni deo koji broji oko 300 bp i odgovoran je za početak replikacije, i ovaj deo poseduje veliki broj citozinskih i guaninskih baza (Shedlock i sar., 1992). U kontrolnoj regiji roda Salmo javljaju se uglavnom tačkaste mutacije u obliku supstitucija (tranzicije i transverzije), dok su insercije i delecije vrlo retke. Nesklad u relativnoj stopi evolucije između mtDNA i jedarne DNA je jasan dokaz da su genomi u različitim subćelijskim strukturama unutar organizama pod različitom kontrolom i pod različitim evolutivnim pritiskom, koji se razlikuje između taksona (Brown i sar., 1979).
30 Uvod
1.2.5.2.2.2.2. Mitohondrijska DNA kao genetski marker
Zbog svojih osobina pomenutih u predhodnom poglavlju mtDNA se koristi kao genetski marker pri filogenetskim studijama, zbog materinskog jednostranog nasleđivanja koristi se za rekonstrukciju evolutivnih događaja uključujući migracije, introdukcije i efekat «uskih grla» populacija. mtDNA se pokazala kao dobar marker za praćenje efikasnosti uvođenja novih linija u akvakulturu, kao i za praćenje delovanja uvedenih linija na autohtone populacije (Li i Grauer, 1991). Zahvaljujući mogućnosti izolaovanja mtDNA čak i iz fosilnog materijala, omogućeno nam je upoređivanje izumrlih populacija sa današnjim. U ovoj studiji koristili smo mtDNA kao marker pomoću koga je moguće pratiti intraspecijsku genetičku varijabilnost između geografski odvojenih populacija, odnosno populacija koje pripadaju istom ili različitim morskim slivovima. Iako je utvrđivanje odnosa među srodnim vrstama na osnovu mtDNA u velikom broju slučajeva u skladu sa morfološkim, alozimskim i drugim molekularnim metodama, povremeno dolazi do neslaganja dobijenih rezultata (Harrison, 1989). Giuffra i sar. (1996) su upoređivali rezultate dobijene upotrebom tri najčešće korišćena genetska markera: alozimi, mtDNA i mikrosateliti. Na osnovu rezultata interpopulacionog polimorfizma pastrmki za odgovarajući markerski sistem dobijena su filogenetska stabla koja su se međusobno razlikovala, pa je i ocena filogenetskih odnosa među populacijama pastrmki (morfološkim oblicima) različita. Kao razlozi zavisnosti rezultata od vrste molekularnih podataka navode se: različite evolutivne stope, različite stope homoplazije kod različitih markera, prisustvo introgresije među lokusima usled nepotpune reproduktivne izolacije populacija. Različiti načini nasleđivanja i evolucija mitohondrijskih i jedarnih gena, teoretski može dovesti do nesklada u rezultatima korišćenjem ova dva markerska sistema (Bernatchez i sar., 1992) Vrlo je malo studija u kojima su se uporedno pratile morfološke osobine i genetički polimorfizam. Bernatchez i sar. (1992) i Giuffra i sar. (1994) su pokušali utvrditi povezanost između haplotipova mtDNA i morfološki diferenciranih populacija pastrmki. Kao rezultat dobili su da su se morfološki veoma slične populacije raspoređivale u vrlo različite evolutivne linije. Patarnello i sar. (1994) su, tokom istraživanja, utvrdili da su relativno male razlike na nivou mtDNA povezane sa relativno velikim fenotipskim razlikama.
31 Uvod
Pored svih pozitivnih osobina koje poseduje mtDNA kao genetički marker, postoje i neke negativne. Maternalno nasleđivanje mtDNA onemogućava korišćenje ovog markera pri razlikovanju hibrida u populacijama gde je eventualno došlo do introdukcije. U tim slučajevima se preporučuje korišćenje informativnijih markera preko kojih možemo pratiti i maternalno i paternalno nasleđivanje. Takođe, pri analizama vrlo srodnih jedinki, upotreba mtDNA kao genetičkog markera se ne preporučuje zbog njene premale varijabilnosti za tu vrstu studija. Kako se mtDNA nasleđuje kao jedan gen, treba biti posebno oprezan pri donošenju zaključaka na nivou čitave populacije, jer se evolucija pojedinačnog gena može razlikovati od evolutivnog proseka celog genoma. Upotreba isključivo mtDNA kao genetskog markera nosi sa sobom rizik od netačne rekonstrukcije filogenije (Zhang i Hewitt, 2003). Većina autora se slaže da je za utvrđivanje što tačnijih filogenetskih odnosa između taksona potrebno uključiti što više genetičkih sistema, i dobijene rezultate uporediti sa rezultatima morfoloških analiza.
1.2.5.2.2.2.3. Upotreba mtDNA za proučavanje vrsta i populacija salmonida
Tokom osamdesetih godina prošloga veka većina analiza mtDNA na salmonidama zasnivala se na utvrđivanju inter- i intraspecijskog polimorfizma korišćenjem restrikcionih endonukleaza (RFLP – tehnika). Berg i Ferris (1984) prvi su analizirali mitohondrijalni genom kod salmonida upotrebom restrikcionih enzima na četiri vrste iz porodice Salmonidae: pacifički losos (Oncorhynchus tchawitcha), dužičasta pastrmka (Oncorhynchus mykiss), potočna pastrmka (Salmo trutta) i potočna zlatovčica (Salvelinus fontinalis). Autori su procenili dužinu genoma mtDNA na 16670 bp, i utvrdili su filogenetske odnose za date vrste, pri čemu su zaključili da su pacifički losos i dužičasta pastrmka filogenetski bliže u odnosu na potočnu pastrmku. Autori su utvrdili da se intraspecijski polimorfizam mtDNA kod salmonida kreće od 0,1 do 2%, što je uočeno i kod većine drugih grupa kičmenjaka, dok su razlike između vrsta od 3 do 14%. Gyllesten i Wilson (1988) su radili slična istraživanja kao i Berg i Ferris (1984). U analizu su uključili populacije potočne pastrmke iz različitih geografskih područja, atlantskog lososa (Salmo salar), dve vrste iz roda Oncorhynchus (Oncorhynchus mykiss i
32 Uvod
Oncorhynchus clarki) i potočnu zlatovčicu. Restrikcionom analizom cele mtDNA utvrdili su bliske srodničke veze između populacija potočne pastrmke i atlantskog lososa na jednoj strani i vrsta roda Oncorhynchus na drugoj strani. Taylor i sar. (1999) su vršili ispitivanja na 47 populacija vrste Salvelinus confluentus, koristeći RFLP – tehniku, i konstatovali su veoma malu varijabilnost mtDNA, sa divergencijom od 1,2%. Brunner i sar. (1998) su, kao i njihovi prethodnici, upotrebili RFLP tehniku, na dva regiona mtDNA vrste Salvelinus alpinus iz 12 jezera alpske regije, i potvrdili su vrlo malu genetičku varijabilnost i nediferenciranost populacija. Malu varijabilnost su objasnili posledicom nedavne diferencijacije populacija iz jedne iste grupe, verovatno po završetku ledenog doba. Početkom devedesetih godina prošloga veka počinje se sa utvrđivanjem redosleda nukleotida (sekvencioniranjem) vezanim za posebne regione na mtDNA. Shedlock i sar. (1992) su uradili prva detaljnija istraživanja kontrolnog regiona kod salmonida. Sekvencionirali su ceo kontrolni region kod 6 vrsta iz roda Oncorhynchus, atlantskog lososa i arktičkog lipljana (Thymallus arcticus). Zaključili su da su delovi kontrolnog regiona koji su kod drugih kičmenjaka važili za konzervativne, takođe očuvani i kod salmonida, kao i da su različiti delovi kontrolnog regiona pod različitim selekcionim pritiskom. Bernatchez i sar. (1992) radili su na utvrđivanju nukleotidnog redosleda unutar 640 bp dugog kontrolnog regiona mtDNA (strana 15). U analizu su uključene geografski posmatrano ukupno 24 populacije pastrmki iz atlantskog, dunavskog, sredozemnog i jadranskog sliva. Na osnovu dobijenih rezultata autori su utvrđene haplotipove razvrstali u pet filogenetskih grupa - linija: sredozemna (mediteranska), jadranska, dunavska, atlantska i marmoratus linija. Autori zaključuju da, na osnovu dobijenih rezultata, pastrmka predstavlja jednu od najbolje genetički struktuiranih vrsta koju su proučavali. Giuffra i sar. (1994) su sekvencionirali 5'- deo kontrolnog regiona, fragment gena za citohrom b i gen za ATP-aznu podjedinicu VI, na populacijama pastrmki severnoitalijanskih voda. Analizirali su devet geografski različitih populacija potočne pastrmke, osam geografski različitih populacija glavatice i gardsku pastrmku. Na osnovu dobijenih rezultata potvrđuju pet filogenetskih grupa koje su utvrdili Bernatchez i sar. (1992). Apostolidis i sar. (1996a) bavili su se proučavanjem varijabilnosti istih delova mtDNA na 11 grčkih populacija potočne pastrmke, na atlantskoj i populaciji ohridske pastrmke. Sekvencioniranjem kontrolnog regiona pronađeno je 10 haplotipova sa
33 Uvod interpopulacionim polimorfizmom od 0,32% do 2,31%. Autori zaključuju da je interpopulacioni polimorfizam haplotipova kod pastrmki veoma visok. Phillips i sar. (2000) su se bavili utvrđivanjem sistematskog položaja vrste Acantholingua ohridana, između ostalog i sekvencioniranjem gena za citohrom b, dok su se istim problemima vezanim za vrstu Salmothymus obtusirostris bavili Snoj i sar. (2002), sekvencioniranjem kontrolnog regiona i citohroma b. Na osnovu dobijenih rezultata utvrđeno je da obe vrste poseduju specifične mtDNA haplotipove koji ne spadaju u prethodno pomenute linije. Weiss i sar. (2000), sekvencioniranjem 5' kraja kontrolnog regiona mtDNA na sedam portugalskih populacija potočne pastrmke, pronalaze pet novih haplotipova u okviru At linije, koji su se razlikovali od opšteg severnog At1 haplotipa za dva do tri mutaciona koraka. Na osnovu dobijenih rezultata predlažu re-evaluaciju postglacijalne rekolonizacije severne Evrope, za koju se, do objavljivanja ovih rezultata, smatralo da je rekolonizovana iz dva glavna glacijalna refugijuma (jugozapadnog atlantskog i ponto- kaspijskog). Weiss i sar. (2001) sekvencionirali su 5' kraj kontrolnog regiona mtDNA na 27 populacija potočne pastrmke u Austriji. Sve analizirane populacije pripadale su dunavskom slivu, mada je 44% analiziranih jedinki imalo haplotipove iz At linije. Pronalazak tako visokog procenta haplotipova At linije u dunavskom slivu otvorio je pitanje eventualne prirodne kolonizacije, mada je poznato da je u Austriji bilo poribljavanja upravo materijalom At linije. Suárez i sar. (2001) sekvencionirali su ceo kontrolni region mtDNA populacija potočne pastrmke Iberijskog poluostrva i severne Afrike. Na osnovu rezultata identifikuju četiri glavne grupe haplotipova na Iberijskom poluostrvu: atlantsku, Duero, mediteransku i andaluzijsku. Na osnovu opisane četiti iberijske grupe, povećavaju broj do tada poznatih pet glavnih evropskih mtDNA grupa na šest: 1. Atlantska grupa koja uključuje dva različita grozda - južno evropski i severno atlantski; 2. Endemična grupa ograničena na Duero basen Iberijskog poluostrva; 3. Jadransko – Andaluzijska grupa koja uključuje Jadransko – Jonske populacije u Mediteranu i Andaluzijske populacije na jugu Iberijskog poluostrva; 4. Mediteranska grupa koja je rasprostranjena od jugo-zapadnog basena Iberijskog poluostrva do Jonskog basena; 5. Dunavska grupa koja je rasprostranjena u basenu Crnog mora, Kaspijskog i Aralskog jezera; 6. marmoratus grupa ograničena na basen Jadranskog mora.
34 Uvod
Sušnik i sar. (2004), na osnovu rezultata sekvencioniranja kontrolnog regiona i citohroma b mtDNA, zaključuju da vrste Salmo marmoratus i Salmo (Platysalmo) platycephalus ulaze u sastav filogenetskog kompleksa Salmo trutta, s tim da Salmo marmoratus spada u liniju marmoratus, što je istakao i Bernatchez i sar. (1992), a Salmo platycephalus u jadransku liniju. Cortey i sar. (2004), sekvencioniranjem celog kontrolnog regiona mtDNA, opisuju filogenetske odnose populacija potočne pastrmke u mediteranskom basenu Iberijskog poluostrva sa osvrtom na istorijsku biogeografiju. U filogenetsku analizu uključuju svih pet glavnih mtDNA linija, i zaključuju da je dunavska linija najancestralnija. Nilsson i sar. (2001) utvrđuju, na osnovu polimorfizma mtDNA, dve glavne linije atlantskog lososa (Salmo salar) - severnoameričku i evropsku.
1.2.6. UGROŽENOST POTOČNE PASTRMKE (SALMO TRUTTA) U EVROPI
Potočna pastrmka predstavlja jednu od najbolje proučenih slatkovodnih vrsta riba. Dosadašnje analize pokazuju da je veliki deo intraspecijske varijabilnosti potočne pastrmke izgubljen, a da je preostali deo veoma ugrožen (Laikre i sar., 1999). Veliki broj populacija potočne pastrmke ugrožen je različitim tipovima ljudskih aktivnosti, koje mogu biti podeljene u tri opšte kategorije: degradacija staništa, ribolov i poribljavanje (Allendorf, 1988; Laikre i Ryman, 1996; Laikre i sar., 1999). Degradacija staništa može biti direktna i indirektna. Direktna degradacija podrazumeva fizičke promene staništa, na primer, podizanje hidroelektrana koje mogu sprečavati migracije pri mrestu, ili pak regulacija rečnog korita. Indirektna degradacija podrazumeva promenu hemijskih svojstava vode kroz razne vidove zagađenja (kisele kiše, ispuštanje hemijskih materija u vodotokove i dr.). Degradacija staništa takođe uključuje i promenu sastava ribljih zajednica (introdukcija egzotičnih ribljih vrsta ili istrebljenje postojećih vrsta sa kojima je potočna pastrmka prirodno koegzistirala). Ribolov, kako komercijalni tako i sportski, dovodi do smanjenja brojnosti, do opadanja intrapopulacionog genetičkog diverziteta, a samim tim i do opadanja vijabilnosti populacija. Poribljavanje materijalom iz veštačkog mresta ili prenošenje jedinki sa drugih lokaliteta sve je češća praksa upravljanja vodama. Do poribljavanja najčešće dolazi zbog smanjenja brojnosti autohtonih populacija, što je uglavnom rezultat prevelikog ribolovnog
35 Uvod opterećenja. Poribljavanje predstavlja naročito ozbiljnu pretnju otkako se posmatra kao blagotvoran način da se pomogne autohtonim populacijama, ali u stvarnosti veoma često dovodi do izumiranja lokalnih autohtonih genskih fondova (Ryman i Utter, 1987; Allendorf i Leary, 1988; Ferguson, 1989; Hindar i sar., 1991a; Waples, 1991; Taylor, 1991; Leary i sar., 1993; Hansen i Loeschcke, 1994; Ryman i sar., 1995; Allendorf i Waples, 1996). Glavni ugrožavajući faktori po populacije potočne pastrmske u Srbiji su: preveliko ribolovno opterećenje, degradacija staništa i poribljavanje. Najznačajniji ugrožavajući faktor predstavlja preveliko ribolovno opterećenje, koje uključuje ne samo legalan ribolov, već na prvom mestu krivolov. Glavni razlog izuzetno velikog ribolovnog pritiska je nedovoljno i neprofesionalno sprovođenje ribolovne kontrole do 2003 godine, kao i neprimenjivanje legislativno regulisanih zaštitnih mera u ribarstvu. Drugi po značaju ugrožavajući faktor predstavlja direktna degradacija staništa u vidu formiranja vodozahvata za potrebe elektroprivrede (Božica, Vrla, Vlasina), za vodosnabdevanje (Lopatnica, Mlava), za industrijska i rudarska postrojenja (Resava, sokobanjska Moravica, Lopatnica), kao i izgradnja fabrika flaširane vode (Vrla) – primeri su samo ilustracija i sigurno su daleko brojniji, ali i o tome nema sređenih i dostupnih podataka. Socio-ekonomski aspekti korišćenja vode ovih reka kao resursa su nepobitno važni, ali rešenje problema do kojih to korišćenje dovodi, pre svega problema po očuvanje autohtonog diverziteta pastrmke u Srbiji, i pored kako-tako zakonom propisane obaveze (Anonimno 1994; 2004) nije adekvatno u administrativno-upravljačkoj praksi sektora zaštite životne sredine i zaštite prirode. Indirektna degradacija staništa svodi se na eventualno zagađenje raznim vrstama hemikalija koje se koriste u poljoprivredi. Zbog sve manje naseljenosti brdsko-planinskih krajeva kao i ekstenzivne poljoprivrede, ovaj tip degradacije staništa ne predstavlja posebno značajan ugrožavajući faktor po pastrmske populacije. Treći po značaju faktor ugrožavanja populacija potočne pastrmke je poribljavanje. Ova aktivnost još uvek nije uzela previše maha, i do sada su poribljavane samo ribolovno atraktivne vode, koje trpe veliki ribolovni pritisak. Evidencije o izvršenim poribljavanjima na teritoriji Srbije uglavnom ne postoje, ali je poznato da je materijal za poribljavanje nabavljan širom bivše Jugoslavije, ne vodeći računa čak ni o poribljavanju materijalom koji pripada barem istom slivnom području, a kamoli o poribljavanju materijalom autohtonog porekla, poznate genetičke strukture. Postoje negativna iskustva
36 Uvod u drugim državama (Slovenija) gde se vršilo poribljavanje neautohtonim linijama. U Soču je unešena potočna pastrmka (za koju se smatra da nije autohtona za sliv pomenute reke) atlantske i dunavske linije, koja se nesmetano ukrštala sa marmoratus linijom dajući plodne hibride i preteći da vremenom može doći do potpunog uništenja genetičke originalnosti marmoratus linije. Degradacija staništa, ribolov i poribljavanje mogu biti okidač za tri glavna procesa koji dovode do smanjenja ili gubljenja intraspecijske raznolikosti, a to su: izumiranje lokalnih populacija, hibridizacija i gubitak genetičke varijabilnosti unutar populacije (Ryman i sar., 1995a; Laikre i Ryman, 1996). Ovi procesi se mogu odraziti na različite hijerarhijske nivoe intraspecijske genetičke raznolikosti, na primer, između alela unutar individue, između individua unutar populacije, između populacija unutar geografskog regiona. Genetička raznolikost na bilo kom hijerarhijskom nivou biće smanjena ako specifični aleli, genotipovi ili genski fondovi populacija prestanu da egzistiraju ili ako je njihov integritet ugrožen hibridizacijom. Značaj genetičke raznolikosti ogleda se u boljem prilagođavanju na sredinske promene. Izumiranje lokalnih populacija može rezultirati potpunim gubitkom pojedinih alela ili alelskih kombinacija. Degradacija staništa je glavni uzrok izumiranja lokalnih populacija. Preteran izlov i nepromišljeno poribljavanje takođe mogu dovesti do istih rezultata (Laikre i sar., 1999). Nepromišljeno poribljavanje dovešće, na prvom mestu, do introgresivne hibidizacije, a na drugom mestu i do kompeticije za osnovne životne resurse. Dve najosnovnije preporuke genetičke konzervacije svode se na maksimalno obraćanje pažnje ka očuvanju ekosistema i na utvrđivanje genetičke strukture populacije, kao i minimalne vijabilne veličine populacije. Možemo zaključiti da praktično vrlo malo znamo o ekonomskoj, ekološkoj i evolutivnoj vrednosti pojedinih gena i populacija. Stoga fokus genetičke konzervacije mora biti usmeren na ispitivanje genetičkog diverziteta između i unutar populacija unutar svake vrste (Frankel, 1970; 1974; Ryman i Ståhl, 1980; Utter, 1981; Meffe, 1986; Ryman, 1991).
37 Uvod
1.3. CILJEVI RADA
U okviru ovoga rada postavljeni su sledeći ciljevi:
¾ Utvrditi genetičku raznovrsnost populacija potočne pastrmke na teritoriji Republike Srbije, upotrebom molekularno genetičkih metoda.
¾ Pronađene genetičke varijante (haplotipove) uporediti sa već poznatim i razvrstati ih u postojeće filogeografske linije (Bernatchez, 1992).
¾ Na osnovu dobijenih rezultata i korišćenjem postojećih, rekonstruisati evolutivnu istoriju potočne pastrmke na teritoriji Republike Srbije.
¾ Utvrditi ugrožavajuce faktore i efekte njihovog delovanja na autohtone populacije
¾ Dati predlog mera zaštite autohtonih populacija.
38 Materijal i metode
2. MATERIJAL I METODE
2.1. MATERIJAL
2.1.1. PRIKUPLJANJE I ČUVANJE UZORAKA
Uzorci potočne pastrmke koji su analizirani u ovom radu sakupljeni su u periodu od juna 1997. do juna 2004. godine. Sakupljanje materijala je vršeno na 35 lokaliteta u okviru sva tri morska sliva (crnomorskog, egejskog i jadranskog) na teritoriji Republike Srbije. Najveći broj analiziranih jedinki prikupljen je elektroribolovom koji se obavljao uz pomoć elektroagregata marke Suzuki – Bosch, snage 2100W, izlazne struje 220V DC, frekvencije 40 Hz i jačine u zavisnosti od osobina vode, maksimalno 8.5 A. Manji broj analiziranih jedinki prikupljen je udičarskim alatom koji se koristi u rekreativnom ribolovu. Nakon izlova, jedinkama je odsečen deo analnog peraja (oko 0.5 cm2) koje ima mogućnost regeneracije, i sačuvan u 96% etanolu, a jedinke su vraćene nazad u vodu. Svaki uzorak je sačuvan u posebnoj epruveti sa obeleženim rednim brojem i nazivom lokaliteta. Delić uzorkovanog peraja dalje je korišćen za molekularne analize.
Slika 17. Način uzimanja uzoraka (odsecanje analnog peraja i odlaganje u etanol).
39 Materijal i metode
2.1.2. RASPORED LOKALITETA I BROJNOST ANALIZIRANIH UZORAKA
Tabela 1. Pregled analiziranih uzoraka po morskim slivovima, lokalitetima i vrsti molekularnih analiza mtDNA.
Lokaliteti N Analizirani broj uzoraka po lokalitetu Sliv Crnog mora Sekvencioniranje RFLP 1. Zmajevac 3 3 - 2. Gradac 3 3 - 3. Godljevača 6 2 4 4. Crni potok 7 2 5 5. Trudovačka reka 3 3 - 6. Bresnička reka 3 3 - 7. Brevina 3 3 - 8. Jošanica 3 3 - 9. Prolomska reka 3 3 - 10. Rečka 3 3 - 11. Vratna 2 2 - 12. Resava 6 2 4 13. Buk 7 2 5 14. Radovanjska reka 3 3 - 15. Golema reka 3 3 - 16. Studenačka reka 3 3 - 17. Dojkinačka reka 2 2 - 18. Rosomačka reka 3 3 - 19. Jerma 4 4 - 20. Vlasina 2 2 - 21. Džepska reka 1 1 - 22. Vrla 3 3 - 23. Jelašnička reka 3 3 - ∑ 79 61 18 Sliv Egejskog mora - 24. Dejanov potok 6 3 3 25. Lisina 2 2 - 26. Božica 8 2 6 27. Ljubata 2 2 - 28. Brankovačka reka 7 2 5 29. Tripušnica 5 5 - 30. Tisova reka 7 2 5 31. Čerenačka reka 7 2 5 ∑ 44 20 24 Sliv Jadranskog mora - 32. Prizrenska Bistrica 11 6 5 33. Pećka Bistrica 13 8 5 34. Bogska reka 3 3 - 35. Alagina reka 3 3 - ∑ 30 20 10 Ukupno 153 101 52
40 Materijal i metode
Slika 18. Prostorni raspored analiziranih lokaliteta na teritoriji Republike Srbije (broj i naziv lokaliteta iz tabele odgovara broju i položaju lokaliteta na karti).
Sliv Crnog mora Sliv Egejskog mora Sliv Jadranskog mora
41 Materijal i metode
2.1.3. HEMIKALIJE
agaroza FMC amonijum acetat Sigma borna kiselina Sigma EDTA Sigma etidijum bromid Sigma etanol 96% i 70% Merck fenol Fluka formamid Applied Biosystems hlorovodonična kiselina Merck izoamil-alkohol Merck - Alkaloid kalijum acetat Kemika kalijum hlorid Kemika sirćetna kiselina Merck- Alkaloid magnezijum sulfat Merck mineralno ulje Sigma natrijum acetat Merck - Alkaloid natrijum hlorid Merck Na-dodecil sulfat (SDS) Merck natrijum hidroksid Merck magnezijum hlorid Merck - Alkaloid Tris-baza GATC TSR Applied Biosystems voda za ćelijske kulture Sigma
2.1.3.1. Pripremljeni setovi hemikalija
DNA sequencing Kit, Big DyeTM Terminator Perkin Elmer Cycle Sequencing v2.0 Ready Reaction
Wizard® Genomic DNA Purification Kit Perkin Elmer Jet quik tissue DNA spin kit/250 Genomed
2.1.3.2. Enzimi
endonukleaze AluI Fermentas rekombinantna Taq DNA-polimeraza Fermentas proteinaza-K Life Technologies RNA-za Fermentas
42 Materijal i metode
2.1.3.3. Početni oligonukleotidi (prajmeri)
Tabela 2. Početni oligonukleotidi koji su korišćeni pri amplifikaciji celog kontrolnog regiona mtDNA (28Riba i cytR).
Oznaka Nukleotidni redosled Referenca 28Riba CACCCTTAACTCCCAAAGCTAAG Snoj i sar., 2000. cytR GTGTTATGCTTTAGTTAAGC Bernatchez i Danzmann, 1993.
2.1.3.4. Markeri
100 bp Fermentas sadrži fragmente DNA koji su dugi 80, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 i 1031 bp 1 kbp Fermentas sadrži fragmente DNA koji su dugi 250, 500, 700 bp, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 5, 6, 8 i 10 kbp
2.1.3.5. Puferi
amplifikacijski pufer 0,25% bromfenol plavo 0,25% ksilen cianol 30% glicerol 50 x pufer TAE 2 M tris acetat 0,1 M EDTA (pH 8,0) 10 x pufer TBE 0,5 M Tris baza 0,5 M borna kiselina 10 mM EDTA (pH 8,3) pufer TEN 1 M Tris-HCl 0,5 M EDTA 2 M NaCl
2.1.4. LABORATORIJSKA OPREMA
TM ABI PRISM 310 Perkin Elmer TM ABI PRISM 3100 Perkin Elmer automatske pipete (10-1000 µl) Gilson centrifuga 5417C Eppendorf vakumski koncentrator Eppendorf Gel Doc 1000 BioRad inkubator Tehtnica, Eppendorf kadice za elektroforezu Pharmacia mešalica (vortex) Retsch magnetna mešalica Tehtnica mikroprocesorski vodeni termostat MJ Research UV – transiluminator Camag
43 Materijal i metode
2.2. METODE
2.2.1. IZOLACIJA DNA
DNA je izolovana iz tkiva analnog peraja na tri različita načina. Bez obzira na koji je način vršena izolacija, prvo je odsečeni deo tkiva analnog peraja (oko 2mm2), opran destilovanom vodom od alkohola i nakon toga je prenet u posudicu (eppendorf) od 1,5 ml.
2.2.1.1. Fenolna ekstrakcija
Nakon pranja i prenošenja dela tkiva analnog peraja u posudicu od 1,5 ml, dodato je 200 µl TEN pufera, 7 µl 10% SDS i 5 µl proteinaze - K. Sadržaj posudice je promešan obrtanjem, nakon toga posudica je stavljena na inkubiranje preko noći na 37oC. Nakom inkubacije, dobijeni lizat je prečišćen fenolnom ekstrakcijom. Lizat (sadržaj bez skeletnih elemenata peraja) prenet je u novu posudicu od 1,5 ml i dodato je 300 µl fenola, hloroforma i izoamil alkohola (25:24:1). Sadržaj posudice je promešan i centrifugiran 5 min na 10000g. Posle centrifugiranja, u posudici je uočena gornja i donju frakcija. Gornja frakcija u kojoj je rastopljena DNA odpipetirana je u novu posudicu, vodeći računa da ne dođe do uzimanja dela belog taloga donje frakcije u kome se nalaze proteini. U sledećem koraku dodato je 300 µl hloroforma i izoamil alkohola (24:1), sadržaj je promešan i centrifugiran 5 min na 10000g. Po centrifugiranju, gornja frakcija je odpipetirana u novu posudicu, u koju je dodat 2,5 puta veći volumen 96% etanola ohlađenog na – 20oC, da bi došlo do obaranja genomske DNA. Sadržaj posudice je promešan obrtanjem iste nekoliko puta, dok nisu primećene bele niti DNA. Uzorak je stavljen da se inkubira 1h na – 20oC. Nakon ovog vremena izvršeno je centrifugiranje uzorka 10 min na 10000 g. Po centrifugiranju, iz posudice je odpipetiran supernatant i dobijeni talog DNA osušen je na vazduhu. DNA je rastopljena u 20 µl vode za ćelijske kulture (Sigma), i sačuvana u frižideru na + 4oC.
44 Materijal i metode
2.2.1.2. Wizard® Genomic DNA Purification Kit
Druga metoda izolacije DNA je izolacija uz pomoć specijalizovanog kita Wizard® Genomic DNA Purification Kit. Izolacija je urađena prateći uputstva proizvođača, koristeći protokol za izolaciju DNA iz mišjeg repa.
2.2.1.3. Jet quick tissue DNA spin kit/250
Treća metoda izolacije DNA je izolacija uz pomoć specijalizovanog kita firme Genomed, Jet quik tissue DNA spin kit/250. Izolacija je urađena prateći uputstva proizvođača, koristeći protokol za izolaciju DNA iz životinjskih tkiva.
2.2.2. PROVERA USPEŠNOSTI IZOLACIJE DNA
Provera uspešnosti izolacije DNA, kao i određivanje dužine PCR, RFLP produkata, te izolacija fragmenata DNA za sekvencioniranje, može se obaviti elektroforezom na agaroznom gelu, zahvaljujući tome što se molekuli DNA mogu kretati u električnom polju. Brzina kretanja zavisi od veličine fragmenta DNA, gustine medijuma i jačine struje. Provera izolacije DNA je izvršena na 1% agaroznom gelu. Agarozni gel je napravljen od agaroze i 0,5 x TBE pufera. Smeša agaroze i pufera zagrejana je u mikrotalasnoj pećnici do tačke ključanja, a nakon toga smeša je ohlađena u vodenom kupatilu na elektromagnetnoj mešalici. Dok se smeša hladila, u nju je dodato 0,5 µl etidijum bromida. Nakon hlađenja, gel je nasut u modele za elektroforezu i ostavljen oko 30 min da se stegne. Posle stezanja gela, modeli sa gelom preneti su u kadice za elektroforezu u kojima se nalazio 0,5 x TBE pufer. Pre nanošenja na gel, uzorku DNA (4 µl) dodat je amplifikacijski pufer (0,25% brom – fenol plavo, 0,25% ksilen cianol i 30% glicerol). Smeša DNA i pufera odpipetirana je u rupice na gelu. U 0,5 x TBE puferu, pri naponu od 120 V, elektroforeza je trajala oko 30 min. Za to vreme etidijum bromid se interkalirao između baza DNA i fluorescirao pri emitovanoj svetlosti talasne dužine 302 nm, što je omogućilo vizuelizaciju gelova po elektroforezi pomoću UV – transiluminatora.
45 Materijal i metode
Slika 19. Provera izolacije DNA na agaroznom gelu
DNA
Kada je utvrđeno da je koncentracija izolovane DNA dobra, napravljena je radna koncentracija tako što je osnovna razblažena 10 x dodavanjem Sigma vode. Dobijeno razblaženje (∼10 - 50 ng/µl) korišćeno je dalje za pripremu PCR reakcije.
2.2.3. LANČANA REAKCIJA POLIMERAZE (PCR)
Lančana reakcija sinteze DNA pomoću DNA polimeraze u in vitro uslovima je metoda za amplifikaciju nukleinskih kiselina. PCR (eng. Polymerase Chain Reaction) je otkrio Karl Mullis 1985 godine (Saiki i sar., 1988). Pomoću ove metode može se umnožiti željeni segment DNA u velikom broju kopija. Lančanom reakcijom polimeraze umnožen je kontrolni region (D-loop) mtDNA dužine oko 1100 bp. Reakcija je tekla u tri koraka na različitim temperaturama. U prvom koraku, pri visokoj temperaturi dolazi do denaturacije dvolančanog molekula uzoračke DNA. Snižavanjem temperature u drugom koraku, početni oligonukleotidi naležu uz komplementarna mesta na jednolančanom molekulu uzoračke DNA. U trećem koraku uz prisustvo enzima polimeraze sintetizuje se komplementarni lanac DNA između početnih oligonukleotida. Tabela 3. Sastav reakcijske smese zapremine od 20 µl:
10,8 µl vode (Sigma)
2 µl 10 x pufera PCR (Fermentas)
1,2 µl 2 mM smeše dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 1 µl 25 mM MgCl2 1 µl 10 pmol/µl početnog oligonukleotida (28Riba) 1 µl 10 pmol/µl početnog oligonukleotida (cytR) 1 µl Taq DNA – polimeraze 5 U/µl 2 µl uzoračke DNA ∑ 20 µl
46 Materijal i metode
Pripremljena PCR reakcija stavljena je u PCR mašinu MJ Research PTC - 100 (mikroprocesorsko vodeni termostat) na temperaturno - vremenski program 28RCYTR, koji počinje denaturacijskim korakom (5 min na 95oC) i završava se korakom sinteze komplementarnog lanca DNA (5 min na 72oC).
Tabela 4. Opis temperaturno vremenskog programa 28RCYTR
Ime programa Denaturacija Vezivanje početnih Sinteza komplementarnog Broj ciklusa oligonukleotida lanca 28RCYTR 95oC, 45 s 52oC, 45 s 72oC, 45 s 32
Nakon završetka PCR reakcije, izvršena je provera kvaliteta i dužine PCR produkata na 1,5% agaroznom gelu u 0,5 x TBE puferu. Dužina fragmenata je utvrđena koristeći markere od 100 bp ili 1kb. (Priprema gela je ista kao u poglavlju 2.2.2.).
Slika 20. Provera PCR produkta na agaroznom gelu
47 Materijal i metode
2.2.4. RESTRIKCIONA ANALIZA KONTROLNOG REGIONA MTDNA
(TEHNIKA RFLP – RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM)
U restrikcionoj analizi tretiran je PCR produkt endonukleazom Alu I, koja reže kontrolni region mtDNA na prepoznatljivoj sekvenci ag/ct, na fragmente karakteristične dužine za linije potočne pastrmke koji su očekivani na analiziranom području. U posudici od 0,5 ml pripremljena je restrikciona reakcija zapremine 20 µl koja sadrži: 5 µl PCR produkt 2 µl odgovarajućeg restrikcionog pufera 0,5 µl (5 U) endonukleaze 12,5 µl vode (Sigma) Napravljena reakcija je inkubirana 3h na temperaturi od 37oC. Po završenoj inkubaciji naneti su reakcija (uzorci) i marker (100 bp) na 1,5% agarozni gel u 0,5 x TBE puferu. Nakon toga otpočeta je elektroforeza 5 min na 80 V, a nakon toga još 10 min na 120 V. Rezultati restrikcije provereni su po elektroforezi pomoću UV – transiluminatora.
2.2.5. SEKVENCIONIRANJE MITOHONDRIJALNE DNA
Sekvencioniranje je metoda kojom se utvrđuje redosled nuleotida na fragmentu DNA određene dužine. Za sekvencioniranje i analizu fragmenata mtDNA TM upotrebljavani su automatski sekvenatori ABI PRISM 310 (sa jednom kapilarom) i TM ABI PRISM 3100 (sa 16 kapilara).
2.2.5.1. Izolacija fragmenata DNA iz agaroznog gela
Nakon elektroforeze PCR produkata na agaroznom gelu (Slika 20), odmah ispod fragmenata DNA skalpelom su izrezane rupice pravougaonog oblika, koje su napunjene 0.5 x TAE puferom. Nastavljena je elektroforeza ali na 200 V u trajanju od 2 x 1 min. Za to vreme DNA fragmenti su eluirali u pufer, koji je odpipetiran u posudice od 1,5 ml. Da bi DNA bila oborena, u posudice je dodat 6M NaCl i 96% etanol ohlađen na -20oC (8 µl 6M NaCl / 50 µl 0,5 x TAE i 2,5 x volumen etanola). Obaranje je trajalo preko noći na -20 oC ili 1h na -70 oC. Nakon obaranja (inkubacije) uzorci su centrifugirani 25 min na 20000 g, alkohol je odpipetiran i
48 Materijal i metode talog DNA osušen na vazduhu. Posle sušenja talog je rastopljen u 20 µl vode (Sigma). Svrha izolacije fragmenata DNA iz agaroznog gela je odstranjivanje ostataka početnih nukleotida i dNTP-a koji se nisu ugradili u PCR produkt, kao i drugih nečistoća. Uspešnost izolacije fragmenata iz agaroznog gela može se proveriti spektrofotometrijski ili na 1,5 % agaroznom gelu u 0,5 x TBE puferu. (Priprema gela je ista kao u poglavlju 2.2.2.).
Slika 21. Provera izolacije DNA fragmenata iz agaroznog gela
2.2.5.2. Priprema reakcije za automatski sekvenator
Sekvencijska reakcija je imala volumen od 15µl. U specijalne posudice prilagođene PCR mašini odpipetirano je od 3 – 6 µl prečišćenog PCR produkta iz agaroznog gela, 4,5 µl razblaženog rastvora BigDye, 0,3 µl početnog oligonukleotida i do 15 µl dosuta je voda (Sigma).
Tabela 5. Nukleotidni redosled početnih nukleotida korišćenih za sekvencioniranje segmenata kontrolnog regiona. Oznaka Nukleotidni redosled Referenca 28Riba CACCCTTAACTCCCAAAGCTAAG Snoj i sar., 2000. vHF-F TCCGTCTTTACCCACCAACT Snoj i sar., 2002. RCSB3-F AAGCCGGGCGTTCTCTTATATGC Snoj i sar., 2002.
49 Materijal i metode
Pripremljena sekvencijska reakcija stavljena je u PCR mašinu MJ Research PTC - 100 (mikroprocesorsko vodeni termostat) na temperaturno - vremenski program HEL2 koji počinje denaturacijskim korakom (5 min na 96oC). Tabela 6. Opis temperaturno vremenskog programa HEL2
Ime programa Denaturacija Vezivanje početnih Sinteza komplementarnog Broj ciklusa oligonukleotida lanca HEL2 95oC, 30 s 50oC, 15 s 60oC, 4 min 35
2.2.5.3. Priprema DNA fragmenata za sekvencioniranje
Produkt sekvencijske reakcije (15 µl) odpipetiran je u posudicu od 1,5 ml u kojoj je predhodno pomešan 2 µl Na – acetata (3 M, pH 4,6) i 50 µl 96% etanola ohlađenog na -20oC. Rastvor je dobro promešan na Vortexu i inkubiran na ledu 10 min. Nakon toga usledilo je centrifugiranje u trajanju od 25 min na 20800 g. Po centrifugiranju odpipetiran je supernatant, a talog koji se nalazio uz zid posudice prosušen je na vazduhu. Potom je talog rastvoren u 15 µl rastvora Template Suppression Reagent, dobro je sve promešano na Vortexu i nekoliko sekundi centrifugirano. Rastvorena DNA je denaturisana 3 min na 95oC, posle toga je rastvor ohlađen na ledu i prenet u posebne posudice za sekvencioniranje koje su stavljene u automatski sekvenator na utvrđivanje redosleda nukleotida.
2.2.5.4. Sekvencioniranje DNA fragmenata
Sekvencijska reakcija u kojoj se nalazi DNA čiji se nukleotidni raspored želi utvrditi na sekvenatoru, sadrži jedan početni oligonukleotid, smešu nukleotida koji sadrže i dideoksiribonukleozid – trifosfate (ddNTP) sa fluorescirajućom molekularnom grupom. Polimeraza takođe ulazi u sastav reakcije, i njena funkcija je da sintetizuje komplementarni lanac uzoračkoj DNA vezujući iza početnog obične nukleotide sve dok se ne ugradi prvi ddNTP. Jednolančani molekuli DNA koji sadže (ddNTP) na svome kraju, putuju kroz električno polje i raspoređuju se po dužini. Svetlost određene talasne dužine koju emituje laser pada na fluorescirajuće grupe molekula DNA i menja svoju prvobitnu talasnu dužinu, što beleži detektor. Pošto postoje četiri različite fluorescirajuće grupe za svaki od četiri molekula ddNTP, možemo na osnovu talasne dužine fluorescirajuće svetlosti utvrditi nukleotidni raspored uzoračke DNA.
50 Materijal i metode
2.2.6. PROGRAMSKA ANALIZA KONTROLNOG REGIONA MTDNA
Za utvrđivanje grešaka i polimorfnih mesta na 5`- kraju kontrolnog regiona mtDNA (561 bp) upotrebljen je program Chromas 2.23 ©Technelysium Pty. Ltd.. Upoređivanje dobijenih sekvenci sa sekvencama koje postoje u bazi podataka “GenBank” urađeno je u programu Clustal_X (Thompson i sar., 1997). Filogenetska stabla nacrtana su koristeći dve vrste metoda za obradu genetičkih podataka. “Neighbour-Joining” (NJ) spada u nediskretne metode (metode distanci) koje za oblikovanje filogenetskog stabla koriste matrice parnih distanci. Parne distance između pojedinih haplotipova izračunate su koristeći Kimura-2 parametarsku metodu. “Neighbour-Joining” (NJ) se drugačije naziva metoda pridruživanja suseda, koja za formiranje filogenetskog stabla koristi uzastopno pridruživanje operacionalno taksonomskih jedinica (suseda) u parove, tako da smanjuje ukupnu dužinu grana za svaki nivo grupisanja. Dužina grananja se utvrđuje po dodavanju pojedinih operacionalno taksonomskih jedinica. Metoda NJ korišćena je iz genetičkog programskog paketa MEGA3 (Kumar i sar., 2004) sa potporom formiranja čvorišta od 10000 bootstrap ponavljanja i programskog paketa PAUP (Swofford, 2000) sa 1000 bootstrap ponavljanja. “Maximum parsimony” (MP) – metoda najveće štedljivosti - spada u grupu diskretnih metoda (“Character State” metode) koje formiraju filogenetsko stablo ne uzimajući u obzir distance između polimorfnih mesta već ostale promene na sekvencama tipa supstitucija, insercija i delecija. Kod ove metode primenjen je heuristički princip sa TBR (Tree Branch Replications) zamenom grana kako bi se pronašao put do najkraćeg stabla. Drugim rečima, “Maximum parsimony” je karakter zasnovana metoda koja izvodi konačnu sliku filogenetskog stabla minimizacijom ukupnog broja evolutivnih koraka potrebnih za objašnjavanje dotičnog seta podataka. Ova metoda u prvoj fazi formira konsenzus stablo sa čvorištima koja se javljaju u najmanje 50% slučajeva (Majority Rule 50% Consensus Tree), a u drugoj fazi dodaje bootstrap vrednosti nakon 1000 ponavljanja. Metoda MP korišćena je iz programskog paketa PAUP (Swofford, 2000). Upotrebom statističkog “parsimony” kriterijuma u programu TCS 1.3 (Clement i sar., 2000) slikovito su prikazani, u obliku mreže, osnovni filogenetski odnosi analiziranih haplotipova.
51 Materijal i metode
Genetička varijabilnost utvrđena je korišćenjem analize molekularne varijanse (AMOVA testa) iz programskog paketa “ARLEQUIN” (Schneider i sar., 2000) na tri hijerarhijska nivoa: između slivova, između populacija unutar slivova i unitar populacija. Značajnost komponenti varijanse i Φ-statistike testirana je višestrukim permutacijama (1000×) originalnog seta podataka. Da bi se dobila šira filogenetska slika, haplotipovi pronađeni u Srbiji analizirani su skupa sa nekoliko već pronađenih haplotipova sa drugih teritorija iz različitih mtDNA linija.
52 Rezultati
3.1. ANALIZA KONTROLNOG REGIONA mtDNA UPOTREBOM TEHNIKE (Restriction Fragment Length Polimorphism)
Upotrebom RFLP tehnike odnosno restrikcionog enzima Alu I dobijeni su preliminarni rezultati zastupljenosti osnovnih mtDNA linija potočne pastrmke unutar sva tri sliva na teritoriji Srbije. Restrikcioni enzim Alu I rezao je kontrolni region mtDNA dužine oko 1100 bp na fragmente karakteristične dužine za dva različita restrikciona profila. Kontrolni region uzoraka iz crnomorskog sliva restrikcioni enzim Alu I je rezao na četiri mesta formirajući pet fragmenata dužine 464, 311, 252, 37 i 4 bp (Slika 22a), dok je uzorke iz egejskog i jadranskog sliva isti enzim rezao na tri mesta formirajući četiri fragmenta dužine 563, 464, 37 i 4 bp (Slika 22b). Fragmenti od 4 i 37 bp vrlo su kratki i ne mogu se uočiti na gelu.
Slika 22. Restrikcija kontrolnog regiona mtDNA sa endonukleazom Alu I . Uzorci sa lokaliteta crnomorskog sliva označeni su sledećim brojevima: 1. Resava, 2. Godljevača, 3. Buk, 4. Crni potok, 5. Brevina i 9. Gradac. Uzorak broj 6. Božica, pripada egejskom slivu, a uzorci 7. Pećka Bistrica i 8. Prizrenska Bistrica pripadaju jadranskom slivu. Poslednja kolona desno na obe slike predstavlja marker od 1 kbp. a) b)
53 Rezultati
3.2. ANALIZA SEKVENCIONIRANJA KONTROLNOG REGIONA mtDNA
Analiza sekvencioniranja kontrolnog regiona mtDNA urađena je na ukupno 101 uzorku iz sva tri sliva, pri čemu je iz crnomorskg sliva sekvencioniran 61 uzorak, a iz egejskog i jadranskog sliva po 20 uzoraka (Tabela 1). Sekvencioniranjem je utvrđen nukleotidni redosled kontrolnog regiona mtDNA u dužini od 561 bp, počevši od 5’ kraja do mesta “poli T” koje se nalazi oko polovine ukupne dužine kontrolnog regiona. Na osnovu dobijenih rezultata sekvencioniranja identifikovano je ukupno 18 polimorfnih mesta (Tabela 10) na osnovu kojih je u sva tri sliva pronađeno 15 različitih haplotipova koji pripadaju Da – dunavskoj (8 haplotipova), «južnoj» 1 (6 haplotipova) i At – atlantskoj filogenetskoj grupi (1 haplotip) (Tabela 9). Od 15 pronađenih haplotipova 6 je novih za nauku, i to 3 dunavska i 3 jadranska (dva iz egejskog i jedan iz jadranskog sliva). Haplotip Ad+Prz koji je pronađen u Prizrenskoj Bistrici kao autohtoni, zajedno sa naknadno analiziranim haplotipovima iz Rijeke Crnojevića Ad+RC i iz Neretve Ad+N formira potpuno novu, do sada nepoznatu liniju, kojoj je dodeljena oznaka Ad+ i ime farioides . Novo otkrivena linija je geografski ograničena na reke jadranskog sliva jugo- zapadnog Balkana. Pronađeni dunavski (Da) i «južni» jadransko – egejski (Ad i Ad+) haplotipovi pokazuju izrazitu geografsku pravilnost u distribuciji. Da haplotipovi bili su striktno ograničeni na dunavski sliv, dok su «južni» haplotipovi bili dominantni u jadransko – egejskom slivu, sa izuzetkom pet jedinki koje su bile pronađene u dunavskom slivu (4 jedinke su pronađene u Jermi i 1 u Vrli, i sve pripadaju haplotipu ADcs1). Genetička segmentacija primećena je i između «južnih» haplotipova. Prostorni raspored 5 od 6 pronađenih haplotipova bio je striktno povezan sa jadranskim ili egejskim slivom, samo je haplotip Ad+Prz bio ravnomerno raspoređen u oba sliva (Tabela 9). Radi kompletnije i preciznije slike o evolutivnoj istoriji 15 pronađenih haplotipova potočne pastrmke na teritoriji Srbije, analizirano je još 8 haplotipova, pre svega iz linija koje nisu autohtone za istraživano područje (At, Ma, Me – po dva haplotipa za svaku liniju), kao i dva Ad+ haplotipa (Crna Gora i Bosna i Hercegovina) (Tabela 13).
1 «Južna» grupa obuhvata haplotipove 1Ad i novo opisane 2Ad+ linije ( 1, 2 pronađeni su na analiziranom području), kao i haplotpove koji su naknadno uključeni u analizu iz Ma i Me linije.
54 Rezultati Tabela 9. Prikaz pronađenih haplotipova po lokalitetima i njihova frekvenca. Haplotipovi koji su obeleženi zvezdicom (*) pronađeni su po prvi put, dok haplotip obeležen znakom + pripada novo opisanoj Ad+ ( farioides ) liniji. z Dunavski sliv 1. Zmajevac 3 1 2 2. Gradac 3 1 1 1 3. Godljevača 2 2 4. Crni potok 2 2 5. Trudovačka reka 3 3 6. Bresnička reka 3 3 7. Brevina 3 3 8. Jošanica 3 3 9. Prolomska reka 3 3 10. Rečka 3 2 1 11. Vratna 2 2 2 12. Resava 2 1 1 13. Buk 2 2 14. Radovanjska reka 3 1 2 15. Golema reka 3 3 16. Studenačka reka 3 3 17. Dojkinačka reka 2 2 18. Rosomačka reka 3 2 1 19. Jerma 4 4 20. Vlasina 2 2 21. Džepska reka 1 1 22. Vrla 3 2 1 23. Jelašnička reka 3 3 Egejski sliv 24. Dejanov potok 3 1 2 25. Lisina 2 1 1 26. Božica 2 2 27. Ljubata 2 2 28. Brankovačka reka 2 1 1 29. Tripušnica 5 5 30. Tisova reka 2 2 31. Čerenačka reka 2 2 Jadranski sliv 32. Prizrenska Bistrica 6 6 33. Pećka Bistrica 8 4 4 34. Bogska reka 3 3 35. Alagina reka 3 3 36 5 5 2 1 1 3 2 8 10 4 4 7 11 2 z 35 5 5 2 1 1 3 2 8 10 4 4 7 11 2
55 Rezultati
Iz prethodne tabele može se videti da je sa 35 lokaliteta iz sva tri sliva identifikovano ukupno 15 haplotipova. Na 23 lokaliteta crnomorskog sliva pronađeno je 10 haplotipova od kojih je 8 autohtono za crnomorski sliv. Od tih 8, tri su nova za nauku: Da*Vl (Vlasina), Da*Dž (Džepska) i Da*Vr (Vrla)), pet je bilo već poznato od ranije Da1, Da2, Da-s6, Da23b i Da22, a dva pronađena haplotipa ADcs1 (jadranski) i At1 (atlantski) nisu autohtona za ovo slivno područje.
Slika 23. Brojčana i procentualna zastupljenost haplotipova crnomorskog sliva.
Brojčano i procentualno najzastupljeniji haplotip crnomorskog sliva je Da1, koji je identifikovan na 16 od 23 analizirana lokaliteta i predstavlja 59% zastupljenosti svih pronađenih dunavskih haplotipova. Posle Da1 haplotipa, sa po 8% u ukupnoj zastupljenosti učestvuju haplotipovi Da2 (pronađen na 4 lokaliteta), Da23b (pronađen na 3 lokaliteta) i ADcs1 (pronađen na 2 lokaliteta). Sa 5% zastupljen je haplotip Da-s6 (pronađen na 1 lokalitetu), sa po 3% haplotipovi Da23b i Da*Vl (pronađeni na po 1 lokalitetu). Sa po 2% zastupljeni su haplotipovi Da*Dž, Da22 i At1 (svaki je pronađen na posebnom lokalitetu).
56 Rezultati
U egejskom slivu, na 8 analiziranih lokaliteta pronađeno je 5 haplotipova od kojih su dva: Ad*Bož (sliv Božice) i Ad*Ti (Tisova i Čerenačka reka) nova za nauku, dok su haplotipovi ADcs1, Ad+Prz, At1poznati od ranije.
Slika 24. Brojčana i procentualna zastupljenost haplotipova egejskog sliva.
z Brojčano i procentualno najzastupljeniji haplotip egejskog sliva je Ad*Bož, koji je idetifikovan na 4 od 5 analiziranih lokaliteta u slivu reke Dragovištice i predstavlja 35% zastupljenosti svih haplotipova pronađenih na ovom slivnom području. U slivu iste reke sa 15% zastupljen je haplotip ADcs1 (pronađen na 3 lokaliteta) i haplotip At1 sa 5% (pronađen na 1 lokalitetu). U slivu reke Vardar koja pripada istom slivnom području obrađene su leve i desne pritoke. U levoj pritoci pronađen je haplotip Ad+Prz (pronađen na jednom lokalitetu - Pčinja), koji predstavlja 25% ukupne zastupljenosti haplotipova ovog sliva, a od desnih pritoka obrađena su dva lokaliteta (Tisova i Čerenačka reka) na kojima je pronađen haplotip Ad*Ti koji učestvuje sa 20% u ukupnoj zastupljenosti.
U jadranskom slivu na 4 analizirana lokaliteta pronađena su 3 haplotipa, od kojih je jedan novi za nauku Ad*Pe (Pećka Bistrica), a dva su već poznata od ranije Ad+Prz i ADcs11. Slika 25. Brojčana i procentualna zastupljenost haplotipova jadranskog sliva.
z
Brojčano i procentualno najzastupljeniji haplotip jadranskog sliva je ADcs11, koji je identifikovan na sva 3 obrađena lokaliteta u slivu Pećke Bistrice i zastupljen je sa 50%. Novi haplotip Ad*Pe koji je pronađen samo u Pećkoj Bistrici zastupljen je sa 20%, a
57 Rezultati haplotip Ad+Prz koji je pronađen u Prizrenskoj Bistrici sa 30% u ukupnom broju svih haplotipova na slivnom području.
Slika 26. Brojčana i procentualna zastupljenost svih pronađenih haplotipova na analiziranom području.
z Procentualne vrednosti zastupljenosti haplotipova u ukupnom uzorku uglavnom se slažu sa brojčanim vrednostima zbog broja analiziranih jedinki (101 jedinka). Po brojnosti, u ukupnom uzorku dominira haplotip Da1 (36 jedinki), a prate ga Ad+Prz (11 jedinki) i ADcs11 (10 jedinki), ADcs1 (8 jedinki), Ad*Bož (7 jedinki), dok su ostali haplotipovi zastupljeni sa pet i manje jedinki.
58 Rezultati
Slika 27. Sekvenca 5’ kraja kontrolnog regiona mtDNA (561bp), najbrojnijeg haplotipa Da1 na analiziranom području. Broj i zvezdica (*) iznad sekvence pokazuju varijabilna nukleotidna mesta između analiziranih haplotipova (pronađenih i naknadno uključenih) iz svih pet glavnih linija (Bernatchez i sar., 1992).
2 26 61 80 * * * * ACTTTTCAGC TATGTACAAT AACAAATGTT GTACCTTGCT AACCCAATGT TATACTACAT CTATGTATAA TATTACATAT 80
113 126 146 * * * TATGTATTTA CCCATATATA TAATATAGCA TG-TGAGTAG TACATCATAT GTATTATCAA CATTAGTGAA TTTAACCCCT 160
178 196 228 235 236 * * * ** CATACATCAG CACTAACTCA AGGTTTACAT AAAGCAAAAC ACGTGATAAT AACCAACTAA GTTGTCTTAA CCCGAGTAAT 240
243 262 263 * ** TGTTATATCA ATAAAACTCC AGCTAACACG GGCTCCGTCT TTACCCACCA ACTTTCAGCA TCAGTCCTGC TTAATGTAGT 320
387 389 390 * ** AAGAACCGAC CAACGATATA TCAGTAGGCA TACTCTTATT GATGGTCAGG GACAGATATC GTATTAGGTC GCATCTCGTG 400
403 * AATTATTCCT GGCATTTGGT TCCTATATCA AGGGCTATCC TTAAGAAACC ACCCCCTGAA AGCCGAATGT AAAGCATCTG 480
484 530 542 543 548 * * ** * GTTAATGGTG TCAATCTTAT TGCCCGTTAC CCACCAAGCC GGGCGTTCTC TTATATGCAT AACGTTCTCT TTTTTTTTTT 560
TT
59 Rezultati
Tabela 10. Polimorfna mesta na 5’ kraju kontrolnog regiona mtDNA za 15 haplotipova pronađenih na teritoriji Srbije. Polimorfna mesta analiziranih haplotipova predstavljena su u odnosu na haplotip At1, gde crtica ( - ) predstavlja ponovljeni nukleotid iz pvog reda, a kosa crta ( / ) deleciju.
At1 T T C T C G T A T G G C T T T G G C Da2 C A - - - - - G G - - T C - C A C T Da23b C A - - - A - G G - - T C - C A C T Da*Vl C A - - - - - G G - - T - - C A C T Da22 C A - - - - - T G - - T C - C A C T Da1 C A ------G - - T C - C A C T Da-s6 C G ------G - - T C - C A C T Da*Dž C A T - - - - - G - - T C - - - C - Da*Vr C A - - - - G - G - - T C - - - - - ADcs1 - C ------C - T C C - - - - ADcs11 - C - C - - - - - C - T C C - - - - Ad*Pe - C ------C A T C C - - - - Ad*Ti - C ------C - T C C - - C - Ad*Bož ------C - T C C - - - - Ad+Prz - C - - T - - - - T - T C C - - - -
Kod mutacija haplotipova pronađenih u Srbiji tranzicije su zabeležene u 12 slučajeva (polimorfna mesta obeležena crnom bojom), transverzije u 4 (polimorfna mesta obeležena crvenom bojom), a na 2 polimorfna mesta (obeležena plavom bojom), zbog specifičnih mutacija na obeleženim pozicijama, a karakterističnih za pojedine haplotipove, može se reći da postoji «kombinacija tranzicija i transverzija» za dato mesto. Haplotip Da- s6 ima tranziciju na poziciji broj 26, u odnosu na sve ostale dunavske haplotipove (A→G). Na istoj poziciji postoji transverzija između dunavskih i ostalih haplotipova (At i «južnih»). Na poziciji broj 235 postoji očigledna tranzicija između prva tri dunavska (Da2, Da23b i Da*Vl) i svih ostalih haplotipova (G→A), osim u slučaju haplotipa Da22 koji ima transverziju na toj poziciji u odnosu na sve druge haplotipove (Tabela 10). U Da liniji pronađena su tri nova haplotipa (Da*Vl, Da*Dž and Da*Vr), koji se karakterišu mutacionim događajima na sledećim pozicijama: Da*Vl 390 (T), haplotip Da*Dž 61 (T), 530 (T), 542 (G), i 548 (C), haplotip Da*Vr 228 (G), i 543 (G), dok su polimorfizmi na pozicijama 530, 542, i 548 isti kao i kod haplotipa Da*Dž. U Ad liniji prvi put su opisana tri haplotipa Ad*Bož, Ad*Pe i Ad*Ti koja se karakterišu mutacionim događajima na sledećim pozicijama: Ad*Bož 26 (T), Ad*Pe 387 (A) i Ad*Ti 543 (C) (Tabela 10).
60 Rezultati
Tabela 11. Procentualne vrednosti divergencija između parova haplotipova (ispod dijagonale), i broj polimorfnih mesta između njih na analiziranom fragmentu kontrolnog regiona mtDNA(iznad dijagonale).
z 1 1 1 1 2 5 6 10 10 11 11 9 10 11 0,18 2 2 2 3 6 7 11 11 12 12 10 11 12 0,18 0,35 2 2 3 6 7 9 11 12 12 10 11 12 0,18 0,35 0,35 1 2 5 6 10 10 11 11 9 10 11 0,18 0,35 0,35 0,18 1 4 5 9 9 10 10 8 9 10 0,35 0,53 0,53 0,35 0,18 5 6 9 9 10 10 8 9 10 0,88 1,05 1,05 0,88 0,70 0,88 3 7 7 8 8 6 7 8 1,05 1,23 1,23 1,05 0,88 1,05 0,53 6 6 7 7 7 6 7 1,76 1,94 1,59 1,76 1,59 1,59 1,23 1,05 5 6 6 6 4 6 1,76 1,94 1,94 1,76 1,59 1,59 1,23 1,05 0,88 1 1 1 1 2 1,94 2,12 2,12 1,94 1,76 1,76 1,41 1,23 1,05 0,18 2 2 2 3 1,94 2,12 2,12 1,94 1,76 1,76 1,41 1,23 1,05 0,18 0,35 2 2 3 1,59 1,76 1,76 1,59 1,41 1,41 1,05 1,23 1,05 0,18 0,35 0,35 2 3 1,76 1,94 1,94 1,76 1,59 1,59 1,23 1,05 0,70 0,18 0,35 0,35 0,35 3 z 1,94 2,12 2,12 1,94 1,76 1,76 1,41 1,23 1,05 0,35 0,53 0,53 0,53 0,53
Srodnički odnosi između pojedinih parova haplotipova određivani su upoređivanjem haplotipova putem dvoparametarskog Kimura modela sa odnosom tranzicije/transverzije = 2. Procentualne vrednosti distanci za haplotipove pronađene u
Srbiji kreću se od 0,18% do 2,12% (X= 1.2 SD = ±0.68 ). Što se tiče razlika u polimorfnim mestima, haplotipovi se među sobom razlikuju za od 1 do 12 supstitucija. Genetička divergencija unutar Da linije je znatno izraženija i za oko tri puta veća (0,6% od unutar grupne srednje genetičke distance) u poređenju sa divergencijom unutar «južne» grupe linija (Ad i Ad+).
Tabela 12. Rezultati AMOVA testa.
z φφφ Između slivova 2 165.779 2.80100 68.80 0.72965 ( φsc) Između populacija 32 93.851 0.92690 22.77 0.91565 ( φst) unutar slivova Unutar populacija 66 22.667 0.34343 8.43 0.68798 ( φct) 100 282.297 4.07133 100
Vrednosti Φ statistike AMOVA testa pokazuju da je genetička divergencija povezana sa geografskim rasporedom odnosno hidrološkim paternom (68.80% od ukupne varijabilnosti između slivova, Φ CT = 0.68798, p < 0.001). Rezultati ukazuju da je visok nivo populacione strukturiranosti (Φ ST = 0. 91565, p < 0.001) u ukupnom uzorku (sve
61 Rezultati lokalne populacije) posledica velike različitosti haplotipova između populacija unutar različitih slivova. Svaka lokalna populacija predstavljena je najčešće sa jednim ili retko sa dva ili tri haplotipa, što je rezultiralo visokim vrednostima za oba Φ ST i Φ SC statistička parametra (Φ SC = 0.72965, p < 0.001).
Utvrđivanje stepena srodnosti između pronađenih haplotipova na teritoriji Srbije predstavljeno je filogenetskim stablom koje je urađeno po metodi "Neighbour-Joining" (NJ), koja spada u metode distanci. Filogenetsko stablo napravljeno je i po metodi "Minimum evolution" (ME), ali se ono nije bitno razlikovalo od stabla napravljenog predhodnom (NJ) metodom.
Slika 28. Filogenetsko stablo haplotipova pronađenih na teritoriji Srbije, urađeno na osnovu sekvenci 5' kraja kontrolnog regiona mtDNA metodom "Neighbour-Joining" (NJ) u programu "MEGA 3". Brojevi uz čvorišta predstavljaju procentualne vrednosti ponavljanja grananja u 10000 ponavljanja. Kao "outgroup" uključene su dve vrste Salmo ohridanus i Salmo salar . Na osnovu dobijenog stabla evidentno je da su dunavski i «južni» (Ad i Ad+) egejski i jadranski haplotipovi monofiletske grupe, a da se između njih nalazi At1 haplotip koji pripada atlantskoj liniji.
62 Rezultati
3.2.1. UPOREĐIVANJE SEKVENCI KONTROLNOG REGIONA mtDNA PRONAĐENIH HAPLOTIPOVA NA TERITORIJI SRBIJE SA VEĆ POZNATIM HAPLOTIPOVIMA POTOČNE PASTRMKE IZ SVIH FILOGENETSKIH LINIJA
Da bi se dobila kompletnija slika filogenetskih odnosa, u dalju analizu, osim haplotipova pronađenih u Srbiji, uključeno je još osam haplotipova iz četiri filogenetske linije: atlantske, mediteranske, marmoratus i farioides (Ad+). Iz dunavske linije nisu uključeni dodatni haplotipovi jer je pronađen veliki broj različitih haplotipova na teritoriji Srbije. Iz atlantske linije analizirana su još dva haplotipa iz Austrije čije su sekvence za kontrolni region mtDNA preuzete iz Banke gena: At-11a (AY185 578) i At-10 (AY185 577). Iz farioides linije analizirana su još dva haplotipa čije sekvence nisu do sada objavljene u Banci gena (Ad+N – Neretva i Ad+RC-Rijeka Crnojevića; usmeno saopštenje Aleš Snoj). Iz mediteranske linije analizirana su dva haplotipa čije su sekvence zavedene u Banci gena: MEcs1 (AY 836350) i MEcs7 (AY 836356) (Španija). Iz marmoratus linije analizirana su dva haplotipa iz Slovenije: MAcs1 (AY 836365) i Ma-s2 čija cela sekvenca još nije objavljena (usmeno saopštenje Aleš Snoj). Kao "outgroup" analizirane su dve vrste čije su sekvence zavedene u Banci gena Salmo ohridanus (AY260 512) i Salmo salar (U12143).
63 Rezultati
Tabela 13. Polimorfna mesta na 5’ kraju kontrolnog regiona mtDNA za 15 pronađenih haplotipova na teritoriji Srbije (levo ravnanje), kojima je priključeno još 8 haplotipova iz atlantske, farioides , marmoratus i mediteranske linije (desno ravnanje). Polimorfna mesta analiziranih haplotipova predstavljena su u odnosu na haplotip At1, gde crtica ( - ) predstavlja ponovljeni nukleotid iz pvog reda a kosa crta ( / ) deleciju. Nomenklatura haplotipova data je po (Bernatchez, 2001), (Duftner i sar., 2003), (Cortey i sar., 2004) i (Razpet i sar., u štampi).
u Srbiji van Srbije At1 T T C T / C G T A T A T T G C G C T T A T G G C At11a - - - - / - - C ------At10 - - - - / - A ------Da2 C A - - / - - - - - G G - - - - T C - - C A C T Da23b C A - - / - A - - - G G - - - - T C - - C A C T Da*Vl C A - - / - - - - - G G - - - - T - - - C A C T Da22 C A - - / - - - - - T G - - - - T C - - C A C T Da1 C A - - / ------G - - - - T C - - C A C T Da-s6 C G - - / ------G - - - - T C - - C A C T Da*Dž C A T - / ------G - - - - T C - - - - C - Da*Vr C A - - / - - - - G - G - - - - T C ------ADcs1 - C - - / ------C - - T C C - - - - - ADcs11 - C - C / ------C - - T C C - - - - - Ad*Pe - C - - / ------C - A T C C - - - - - Ad*Ti - C - - / ------C - - T C C - - - C - Ad*Bož - - - - / ------C - - T C C - - - - - Ad+Prz - C - - / T ------T - - T C C - - - - - Ad+N - C - - / T ------C T - - T C C - - - - - Ad+RC - - - - / T ------T - - T C C - - - - - MAcs1 - C - - A ------A - - T C C - - - - - Ma-s2 - C - - A ------A T - T C C - - - - - MEcs1 - C - - / - A - C ------T C C - - - - - MEcs7 - C - - / - A - C ------T C C T - - - -
64 Rezultati
U prethodnoj tabeli upoređena su polimorfna mesta na 5’ kraju kontrolnog regiona mtDNA haplotipova pronađenih u Srbiji sa još osam haplotipova koji pripadaju atlantskoj, farioides , mediteranskoj i marmoratus liniji, a nisu pronađeni na analiziranom području. Iz tabele se može videti da haplotipovi svake linije poseduju nukleotidne sinapomorfizme na određenim pozicijama. Analizirani haplotipovi atlantske linije poseduju dva sinapomorfizma na pozicijama 389 (C) i 390 (T). Haplotipovi dunavske linije poseduju veći broj sinapomorfizama i to na pozicijama: 2 (C), 26 (A) sa izuzetkom Da-s6 koji poseduje tranziciju (A→G), pozicija 236 (G), pozicija 530 (C) sa izuzecima Da*Dž i Da*Vr koji poseduju tranziciju (C→T), pozicija 542 (A) sa izuzecima Da*Dž i Da*Vr koji poseduju tranziciju (A→G), pozicija 543 (C) sa izuzetkom Da*Vr koji poseduje transverziju (C→G) i pozicija 548 (T) sa izuzecima Da*Dž i Da*Vr koji poseduju tranziciju (T→C). Poslednja četiri polimorfizma kod haplotipa Da*Dž i Da*Vr zajednička su za najveći broj haplotipova koji pripadaju drugim linijama (At, Ad, Ad+ Ma i Me) (Tabela 13). Haplotipovi Ad i Ad+ linije poseduju takve sinapomorfizme da se mogu jasno razlikovati. Zajednički sinapomorfizam za najveći broj haplotipova obe grupe je prisustvo (C) na poziciji broj 26, a to su svi prikazani haplotipovi izuzev Ad*Bož i Ad+RC koji na istoj poziciji imaju tranziciju (C→T). Sinapomorfizam bitan za prvu grupu (Ad) je na poziciji 262 (C). U drugu grupu (Ad+) spadaju haplotipovi koji na poziciji 126 i 262 imaju (T), a to su Ad+Priz , Ad+N i Ad+RC. Haplotipovi linije marmoratus (Ma) poseduju sinapomorfizam koji se ogleda u prisustvu insercije na poziciji 113 (A) i prisustvu (A) na poziciji 262. Haplotipovi mediteranske (Me) linije poseduju sinapomorfizme na pozicijama 146 (A) i 196 (C). Haplotipovi iz Ad+ grupe, i iz Ma i Me linije pokazuju po dva interkladna sinapomorfizma po kojima se razlikuju, što ukazuje na sličnu dubinu divergencije ovih klada (Tabela 13).
65 Rezultati
Slika 29. Filogenetsko stablo haplotipova pronađenih na teritoriji Srbije uz dodatak 8 haplotipova iz atlantske, farioides , marmoratus i mediteranske linije, sa dva "outgroup" haplotipa Salmo ohridanus i Salmo salar , urađeno na osnovu sekvenci 5' kraja kontrolnog regiona mtDNA metodom "Neighbour-Joining" (NJ) u programu "MEGA 3". Brojevi uz čvorišta predstavljaju procentualne vrednosti ponavljanja grananja u 10000 ponavljanja.
Na osnovu dobijenog stabla evidentno je da su haplotipovi grupisani u već poznate linije (dunavsku, atlantsku, mediteransku, marmoratus i jadransku) i novu Ad+ (farioides ) liniju, pri čemu su haplotipovi Da i At linije posebno grupisani u odnosu na ostale «južno» – evropske haplotipove (Me, Ma, Ad i Ad+). U okviru Ad linije grupisani su sledeći haplotipovi: Ad*Bož, Ad*Pe, Ad*Ti, ADcs1 i Adcs11, dok Ad+ grupu čine tri haplotipa: Ad+Prz, Ad+N i Ad+RC.
66 Rezultati
Slika 30. Filogenetsko stablo haplotipova pronađenih na teritoriji Srbije uz dodatak 8 haplotipova iz atlantske, farioides , marmoratus i mediteranske linije, sa dva "outgroup" haplotipa Salmo ohridanus i Salmo salar . Stablo je urađeno u programu "PAUP 4" na osnovu sekvenci 5' kraja kontrolnog regiona mtDNA metodom "Maximum parsimony (MP) Majority role consensus 50%". Brojevi uz čvorišta predstavljaju procentualne vrednosti ("bootstrap") ponavljanja grananja u 1000 ponavljanja. Vrednosti iznad grana date su za "MP Majority role consensus 50%", prva vrednost ispod grana predstavlja MP "bootstrap" i druga vrednost ispod grana predstavlja NJ "bootstrap".
67 Rezultati
Stablo koje je dobijeno metodom "MP Majority rule consensus 50%", vrlo je slično stablima koja su dobijena korišćenjem metoda MP i NJ u programu "PAUP 4"‚ zato je upotrebljeno jedno stablo da se prikažu rezultati za sve tri metode. Dobijeno stablo, prema položaju haplotipova i rasporedu u filogenetske linije, veoma je slično stablu dobijenom u programu "MEGA 3" metodom "Neighbour-Joining" (NJ) (slika 29). Konsensus stablo takođe prikazuje jasno razdvajanje dve glavne klade (Da i At klada plus «južno» – evropska klada). Uključivanjem dva "outgroup" haplotipa Salmo ohridanus i Salmo salar omogućeno je utvrđivanje statističke značajnosti prvog grananja koje se pokazalo kao vrlo značajno. Unutrašnja topologija u okviru dve glavne grupe (Da i At plus «južno» – evropska) bila je podržana nešto nižim "bootstrap" vrednostima, što posebno važi za haplotip Ad*Bož, koji na ovom stablu zauzima ancestralni položaj u odnosu na ostale «južno» – evropske haplotipove, ali bez podrške za MP analizu i sa niskom "bootstrap"vrednošću za NJ analizu. Grupisanje u okviru «južno» – evropske grupe haplotipova u Ad, Ma i Me i dopunsku Ad+ grupu (Ad+Prz, Ad+N i Ad+RC) isto je kao i pri NJ analizi u programu "MEGA 3" (Slika, 29). Haplotipovi Da*Dž i Da*Vr zauzimaju na svim filogenetskim stablima bazalni položaj unutar Da linije, što je i statistički podržano.
68 Rezultati
Slika 31. Kladogram (mreža) hap lotipova pronađenih na lokalitetima sva tri sliva na teritoriji Srbije, uz dodatak haplotipova koji su naknadno uključeni u analizu (crveni krugovi iste veličine). Veličina krugova haplotipova pronađenih na teritoriji Srbije odgovara njihovoj frekvenci, a dvobojnost označava da je haplotip pronađen na dva slivna područja. Haplotipovi pronađeni u dunavskom slivu označeni su različitim nijansama zelene boje, u egejskom nijansama žute i u jadranskom različitim nijansama plave boje. Svaka linija koja učestvuje u povezivanju haplotipova predstavlja jedan mutacioni korak po algoritmu programa «TCS», a crni krugovi predstavljaju teoretski nedostajuće haplotipove.
69 Rezultati
Na osnovu kladograma (mreže) haplotipova (Slika 31) uočava se grupisanje haplotipova u odgovarajuće linije. Preko broja algoritamskih mutacionih koraka (spojnih linija) moguće je utvrditi tačan broj polimorfizama (mutacija) između haplotipova koji pripadaju istoj liniji. Na osnovu kladograma mogu se utvrditi genealoški odnosi između haplotipova. Posmatranjem kladograma u celini, centralnu poziciju zauzima haplotip Da*Vr koji je približno podjednako udaljen od Da (≥ 5 mutacionih koraka), At (≥ 5 mutacionih koraka)i «južne» klade (≥ 6 mutacionih koraka). Unutar Da klade centralnu poziciju zauzima haplotip Da1 koji se od hapotipova Da-s6, Da22 i Da2 razlikuje za jedan mutacioni korak, dok se od haplotipova Da23b i Da*Vl razlikuje za dva mutaciona koraka. Najudaljeniji haplotipovi u okviru Da linije su Da*Dž i Da*Vr koji se razlikuju od centralnog haplotipa za 4 odnosno 5 mutacionih koraka. Unutar linija koje pripadaju južnoj kladi (Ad, Ad+, Ma i Me) haplotip ADcs1 zauzima centralno mesto. Ostali Ad haplotipovi razlikuju se od centralnog ADcs1 haplotipa za jedan mutacioni korak, dok se haplotipovi iz Ma, Me i Ad+Prz linija razlikuju od centralnog za ≥2 mutaciona koraka.
Na osnovu rezultata dobijenih analizama isključivo na haplotipovima koji su pronađeni na teritoriji Srbije (Slike 22b i 28) nije se moglo uočiti jasno razdvajanje unutar jadranske linije. Međutim, dopunskim uključivanjem u filogenetsku analizu haplotipova Ad+N i Ad+RC, koji su sa haplotipom Ad+Prz formirali na filogenetskim stablima novu grupu, statistički visoko značajnu (Slika 29 i 30), kao i posebnu grupu na kladogramu haplotipova (Slika 31), omogućen je uvid u razdvajanje prvobitne Ad linije i novo otkrivene Ad+ ( farioides ) linije.
70 Diskusija
4. DISKUSIJA
Bernatchez i sar. (1992) smatraju da, bez obzira na izuzetno veliki broj rezultata koji su dobijeni u poslednjih 20 godina, za rasvetljavanje filogeografske strukture populacija potočne pastrmke još uvek nedostaju rezultati sa vrlo značajnih geografskih područja kao što su severna Afrika i istočna Evropa. Kottelat (1997) naglašava da je veliki problem u rešavanju taksonomije pastrmskih populacija Balkanskog poluostrva upravo nedostatak informacija sa područja republika bivše Jugoslavije. Poseban značaj u izučavanju balkanskih pastrmskih populacija je upravo u tome što se smatra da je Balkansko poluostrvo, pored Apeninskog i Iberijskog, bilo refugijalni centar, a samim tim i centar diverziteta za vreme glacijacija (Hewitt, 1996; 1999). U najbližoj okolini Srbije samo na teritoriji Austrije, Slovenije i Grčke utvrđena je genetička diferenciranost pastrmskh populacija (Duftner i sar., 2003; Snoj i sar., 2004; Apostolidis i sar., 1996; 1996a; 1997). Poslednjih godina sakupljan je materijal iz Bosne i Hercegovine, Hrvatske i Crne Gore, ali rezultati još nisu objavljeni. Ako se uporede rezultati istraživanja sa pomenutih teritorija, kao i rezultati koje je objavio Bernatchez (1992), sa rezultatima koji su dobijeni na teritoriji Srbije (101 jedinka/15 haplotipova), uočava se vrlo sličan diverzitet haplotipova. Bernatchez i sar. (1992) pronašli su, analizom 310 bp kontrolnog regiona mtDNA, 12 haplotipova na 154 analizirane jedinke iz 24 populacije zapadne Evrope. Duftner i sar. (2003) su na teritoriji Austrije opisali 16 haplotipova iz uzorka od 123 jedinke sa 20 lokaliteta (crnomorski sliv), analizom kompletnog kontrolnog regiona mtDNA, gde 7 haplotipova pripada atlantskoj liniji, čiju autohtonost na analiziranom području tek treba utvrditi. Apostolidis i sar. (1997) su za teritoriju Grčke opisali 10 haplotipova iz uzorka od 76 jedinki sa 12 lokaliteta (egejski, jonski i jadranski sliv), analizom kontrolnog regiona mtDNA u dužini od 310 bp. Snoj i sar. (2004) su na teritoriji Slovenije opisali 12 haplotipova iz uzorka od 364 jedinke sa 20 lokaliteta (crnomorski i jadranski sliv), analizom kontrolnog regiona mtDNA u dužini od 420 bp. Analizom celog kontrolnog regiona mtDNA i obradom većeg broja uzoraka sa lokaliteta na teritoriji Kosova i Metohije (razvođe slivova), verovatno bi genetički diverzitet pastrmskih populacija na teritoriji Srbije bio veći od prikazanog.
71 Diskusija
4.1. ANALIZA KONTROLNOG REGIONA mtDNA
Na osnovu rezultata RFLP tehnike, korišćenjem restrikcionog enzima Alu I dobijena je prva informacija o zastupljenosti mtDNA linija potočne pastrmke na analiziranom području. Upotrebom enzima Alu I dobijene su dve različite dužine fragmenata, koje su odgovarale haplotipovima Da i Ad linije. Da haplotipovi pronađeni su na analiziranim lokalitetima crnomorskog sliva, dok su Ad haplotipovi pronađeni na lokalitetima jadranskog i egejskog sliva. Ranija istraživanja su pokazala da su u egejskom slivu najzastupljeniji haplotipovi Ad linije (Apostolidis i sar., 1996a; 1997). Enzim Alu I ne može razdvojiti haplotipove Da i At, kao ni Ad i novo opisane Ad+ (farioides) linije, jer imaju potpuno ista restrikciona mesta.
Sekvenciranjem dela kontrolnog regiona mtDNA dobijen je precizan pregled (koji restrikciona analiza nije mogla pružiti) pronađenih haplotipova na analiziranom području, koji je omogućio detekciju genetičkog diverziteta potočne pastrmke u okviru tri već poznate mtDNA linije (Da, Ad i At) kao i četvrte nove Ad+, koje naseljavaju gornje tokove reka određenih slivova na teritoriji Srbije. Haplotipovi Da, i «južnih» linija su generalno autohtoni za lokalitete crnomorskog odnosno jadranskog i egejskog sliva, dok je At haplotip alohtonog porekla za analizirano područje. Ako se uporede rezultati istraživanja iz crnomorskog sliva na teritoriji Srbije sa dobijenim rezultatima iz uzvodnog dela istog sliva (Slovenija i Austrija) uočava se da je diverzitet haplotipova veoma sličan. U crnomorskom slivu Srbije pronađeno je 8 haplotipova naspram 7 Da haplotipova iz Slovenije (Snoj i sar., 2004) i 8 Da haplotipova iz Austrije (od 5' kraja do poli T bloka kontrolnog regiona mtDNA) (Duftner i sar., 2003). Najučestaliji haplotip u okviru sva tri analizirana područja je Da1. Od zajedničkih haplotipova koji se sreću u Srbiji i u uzvodnim delovima crnomorskog sliva, osim haplotipa Da1 pronađeni su Da2, Da22, Da23b haplotipovi sa vrlo sličnim učestalostima u okviru analiziranih područja. Haplotipovi Da22 i Da23b su vrlo retki i svaki je, osim u Srbiji, pronađen na malom broju lokaliteta (Da22 u Sloveniji i u Austriji (na po 2 lokaliteta), Da23b u Austriji (1 lokalitet/1 primerak)). Haplotip Da22 je jedini u Da liniji koji na poziciji 235 poseduje transverziju G→T, dok haplotip Da23b poseduje tranziciju G→A na poziciji 146, što je karakteristika najvećeg broja mediteranskih i vrlo malog broja atlantskih haplotipova. Da23b haplotip pronađen je na tri lokaliteta u Istočnoj Srbiji
72 Diskusija
(Rečka, Vratna i Radovanjska reka - pritoka Timoka), a to su reke koje imaju neposrednu komunikaciju sa Dunavom. Isti haplotip pronađen je u Austriji na lokalitetu Lohnbach koji je takođe u neposrednoj vezi sa Dunavom. Od haplotipova koji su pronađeni nizvodno i istočnije (basen Crnog mora, Kaspijskog i Aralskog jezera), sa visokom učestalošću se takođe javlja haplotip Da1, nešto ređe Da2, i Da-s6 (jedini Da haplotip koji na poziciji 26 poseduje tranziciju A→G). Da-s6 haplotip je veoma redak i pripada posebnim ekofenotipskim formama iz jezera Sevan (Jermenija, sliv - Kaspijskog jezera), prepoznatim kao posebna vrsta Salmo ischchan. Behnke (1986) je dao hipotezu da se radi o pastrmci izvedenoj od primitivnog pretka svih ostalih populacija potočne pastrmke. Bernatchez i Osinov (1995) i Osinov i Bernatchez (1996) odbacuju pomenutu hipotezu na osnovu kombinovanih rezultata alozima i mitohondrijalnih markera i zaključuju da Salmo ischchan predstavlja morfološki i ekološki jedinstvenu formu pastrmki koja se razvila relativno skoro i pripada istoj evolutivnoj liniji kao i ostale pastrmke iz basena Crnog mora, Kaspijskog i Aralskog jezera. Pronalazak haplotipa Da-s6 na teritoriji Srbije u Studenačkoj reci (sliv Visočice i Nišave) predstavlja prvi nalaz ovog haplotipa van jezera Sevan, što daje potvrdu gore iznešenim tvrdnjama Bernatchez i Osinov (1995) i Osinov i Bernatchez (1996). Slika 32. Pastrmke kod kojih je pronađen haplotip Da-s6. Salmo ischchan - jezero Sevan (Jermenija)
Salmo trutta – Studenačka reka (Srbija)
73 Diskusija
Tri nova Da haplotipa (Da*Vl, Da*Dž, Da*Vr) pronađena su na razvođu crnomorskog – dunavskog sliva (Južna Morava) i egejskog (Dragovištica/Struma) sliva (Slika 1). Da*Vl je prvi dunavski haplotip koji na poziciji 390 poseduje tranziciju C→T, što je odlika haplotipova At linije i jednog do sada pronađenog haplotipa Ad linije (ADcs3) (Cortey i sar., 2004). Haplotip Da*Dž poseduje novo polimorfno mesto na poziciji 61 (tranzicija, C→T), dok haplotip Da*Vr poseduje novi polimorfizam na poziciji 228 (transverzija, G→T). Haplotipovi Da*Dž i Da*Vr se značajno odvajaju od ostale grupe Da haplotipova (Slika 31) zbog polimorfizama na pozicijama 530 (tranzicija, C→T), 542 (tranzicija, A→G), 543 (transverzija, C→G, važi samo za Da*Vr, dok Da*Dž ima C kao i ostali Da haplotipovi) i 548 (tranzicija, T→C) (Tabela 13). Oba haplotipa imaju na pozicijama 530, 542, 543 i 548 raspored baza karakterističan za pojedine haplotipove ostalih linija. Za pomenute pozicije postoje sinapomorfizmi između Da*Dž i Ad*Ti kao i između Da*Vr i najvećeg broja haplotipova svih ostalih linija (At, Ad, Ad+, Me i Ma). Prema filogenetskom položaju klada za haplotipove Da*Dž i Da*Vr, može se videti da je njihov položaj ancestralni u okviru Da linije (Slika 30) i istovremeno da su to Da haplotipovi koji su najbliži haplotipovima svih ostalih linija (Slika 30 i 31). Ovakav položaj pomenutih Da haplotipova podržava tvrdnju Cortey i sar. (2004) da, analizom celog kontrolnog regiona mtDNA, topološki Da haplotipovi zauzimaju ancestralni položaj u odnosu na ostale linije, što se slaže sa stanovištem Bernatchez i sar. (1992), Bianco (1990) i Durand i sar. (2003) da recentna slatkovodna fauna Evrope ima istočnjačko poreklo (Azija). Na lokalitetima Jerma (br. 19) i Vrla (br. 22) koji se nalaze na razvođu dunavskog i egejskog sliva, pronađen je haplotip ADcs1 koji je u Jermi jedini haplotip, a u Vrli je pronađen zajedno sa novim dunavskim haplotipom Da*Vr. Objašnjenje za prisustvo haplotipa ADcs1 u Jermi je njeno poribljavanje u gornjem delu toka kroz Bugarsku, kao i njenih desnih pritoka koje izviru takođe na teritoriji Bugarske (usmeno saopštenje Saša Panić, Pirot). Poribljavanje je izvršeno matičnim materijalom iz sliva Strume (egejski sliv) koji pripada Ad liniji. Upravo haplotip ADcs1 pronađen je u rekama sliva Dragovištice/Struma (Tabela 9), što ide u prilog pomenutom usmenom saopštenju. Prevođenje voda iz sliva Dragovištice u sliv Južne Morave za potrebe akumuliranja vode radi proizvodnje električne energije (Ocokoljić, 1987), smatra se uzrokom prisustva haplotipa ADcs1 u Vrli. Prevođenje vode sistemom cevi najverovatnije je omogućilo prenošenje oplođene ikre ili čak mlade ribe iz jednog slivnog područja u drugo. Iz svega navedenog, najverovatnije da je haplotip ADcs1 alohtonog porekla za oba lokaliteta.
74 Diskusija
Na lokalitetu Gradac (br. 2) pronađen je haplotip At linije (At1), koji je alohtonog porekla za deo crnomorskog sliva na teritoriji Srbije. Reka Gradac je više puta poribljavana jer trpi veliki ribolovni pritisak, a jedno od poribljavanja vršeno je i materijalom sa Vrela Bune gde se uzgajala potočna pastrmka At linije (usmeno saopštenje Sreten Đorđević). Materijal koji se koristi za poribljavanje vrlo često je alohtonog porekla i pripada komercijalnim linijama kao što je At, pre svega zbog prilagodljivosti ribnjačkom uzgoju. U uzvodnom delu sliva Dunava u zoogeografskoj kontakt zoni crnomorskog i atlantskog sliva pronađeni su haplotipovi At linije. Poznato je da je u vodama Austrije, Švajcarske i Nemačke bilo masovnog poribljavanja upravo materijalom At linije, ali pojedini autori smatraju da mogućnost post-glacijalne kolonizacije gornjih delova sliva Dunava u oblasti kontakt zone od strane At haplotipova ne može biti u potpunosti odbačena (Duftner i sar., 2003). Bernatchez i Osinov (1995) i Osinov i Bernatchez (1996) smatraju da populacije Da linije unutar basena Crnog mora i Kaspijskog i Aralskog jezera odlikuje prisutnost posebnih alela ili mtDNA genotipova, kao i visok nivo genetičke diferenciranosti što treba uzeti u obzir prilikom programa konzervacije. Rezultati dobijeni na pastrmskim populacijama crnomorskog sliva iz Slovenije, Austrije i Srbije u potpunosti podržavaju stavove pomenutih autora.
Apostolidis i sar. (1997) podelili su vode slivova Grčke u dve zone Južno – Jadransko Jonsku zonu i Ponto – Egejsku zonu. Analizirani deo jadranskog sliva (Beli Drim) na teritoriji Srbije pripada po pomenutoj podeli severnom delu Južno – Jadransko Jonske zone. Na ovom delu analizirane teritorije, od tri pronađena haplotipa Ad*Pe je novi, a dva su već od ranije poznata: ADcs11 i Ad+Prz (Slika 1; Tabela 10). Haplotip Ad*Pe je jedinstven po tranziciji (G→A) na 387 mestu, koja do sada nije bila opisana i pronađen je samo u Pećkoj Bistrici. Haplotip ADcs11 (Cortey i sar., 2004) ili AD-s7 po Bernatchez (2001), pronađen je u Pećkoj Bistrici ali i njenim pritokama (Tabela 10) i prvobitno je bio opisan od strane Apostolidis i sar. (1997) u slivu Jonskog mora kao ADs7r9. To je jedini haplotip koji na poziciji 80 poseduje tranziciju T→C. Haplotip Ad+Prz pronađen je u Mrtvici (pritoka Morače) (usmeno saopštenje Aleš Snoj), ali nije još zvanično objavljen. Na teritoriji Srbije pronađen je na dva lokaliteta u jadranskom (Prizrenska Bistrica; br. lok. 32/Beli Drim) i egejskom slivu (Tripušnica; br. lok. 29/Vardar). Haplotip Ad+Prz poseduje tranziciju C→T na poziciji 126 i 262 što je karakteristika samo još dva poznata haplotipa iz Ad linije, jedan je iz Neretve (Ad+N) a
75 Diskusija drugi je iz Rijeke Crnojevića (Ad+RC) (usmeno saopštenje Aleš Snoj). Haplotip AdN jedino poseduje C na poziciji 243, dok AdRC haplotip poseduje T na poziciji 26, i to su dva mesta po kojima se ovi haplotipovi razlikuju od Ad+Prz. Zbog specifičnih sinapomorfizama (pozicije 126 i 262), haplotipovi Ad+Prz, Ad+N i Ad+RC formiraju posebnu grupu sa visokom bootstrap potporom za sve tri urađene analize. Ova grupa je pozicionirana kao sestrinska u odnosu na ostale jadranske, mediteranske i marmoratus haplotipove (Slika 30), pa je zato i označena kao nova Ad+ linija. Pošto sva tri haplotipa naseljavaju reke u slivu južnog Jadrana, i jasno se grupišu kao i ostale linije sa visokim bootstrap vrednostima, možda možemo predpostaviti da se radi o Salmo fariodes (Karaman, 1937), za koju je opisano da naseljava pritoke srednjeg i južnog Jadrana (Krka, Neretva, Beli Drim, pritoke Ohridskog i Skadarskog jezera). Međutim, nalaz istog haplotipa u slivu Vardara (Tripušnica) izvan je areala u kome je opisan, što je najverovatnije posledica poribljavanja. U Ponto – Egejskoj zoni na teritoriji Srbije analizirali smo izvorišne delove reka u slivovima Vardara i Strume. Na analiziranim lokalitetima pronađeno je pet haplotipa, od kojih su dva nova (Ad*Ti i Ad*Bož), a tri su već bila poznata (ADcs1, Ad+Prz i At1) (Slika 1; Tabela 10). Na lokalitetima Tisova i Čerenačka reka (br. lok. 30 i 31/desne pritoka Vardara), pronađen je novi haplotip Ad*Ti koji se za samo jednu transverziju (G→C) na poziciji 543 razlikuje od haplotipa ADcs1. U okviru iste zone, samo u levoj pritoci Vardara (Tripušnica) ponađen je haplotip Ad+Prz koji je predhodno pomenut u jadranskom slivu. Prisustvo Ad+Prz haplotipa u Tripušnici najverovatnije je posledica poribljavanja koje je izvedeno 1978. godine putem mlađi koja je nabavljena u Konjicu (Neretva – jadranski sliv). Pošto je haplotip Ad+Prz pronađen u slivu Belog Drima i Skadarskog jezera, najverovatnije ga ima i u slivu Neretve, odakle je prenet u Tripušnicu, u kojoj do tada pastrmke nije bilo (usmeno saopštenje «Ribolovačko društvo Trgovište»). U slivu Strume identifikovan je ranije pomenuti haplotip ADcs1 (Cortey i sar., 2004) ili AD-s1 po Bernatchezu (2001), koji je već pronađen na više lokaliteta u okviru egejskog sliva u Grčkoj (Apostolidis i sar., 1997), ali i u slivovima Jadranskog, Jonskog i Sredozemnog mora, kao i Atlantskog okeana (Bernatchez, 2001). Za ADcs1 haplotip može se reći da je jedan od Ad haplotipa sa najširim rasprostranjenjem, što se može objasniti njegovom izuzetnom sposobnošću kolonizacije. U istom slivu pronađen je novi haplotip Ad*Bož koji na pozicijama 26 ima timin kao i haplotipovi ADcs16 i Ad+RC, ali se od prvog razlikuje po citozinu na poziciji 262, a od drugog po citozinu na poziciji 126 i
76 Diskusija
262. Pošto se u istom slivu nalaze haplotipovi ADcs1 i Ad*Bož, najverovatnije su oni naseljeni tokom dve nezavisne kolonizacije, pri čemu je haplotip Ad*Bož verovatno stariji, pre svega zbog njegove topologije na filogenetskom stablu (Slika 30). Prema neobjavljenim rezultatima najskorijih ispitivanja kraćih sekvenci (390 bp) kontrolnog regiona mtDNA uzoraka iz Rilske reke (sliv Strume) i Arde (sliv Marice), utvrđeno je prisustvo haplotipa koji do 390 bp odgovara haplotipu Ad*Bož. Ako ostatak sekvence bude identičan kao kod haplotipa Ad*Bož, ovaj haplotip biće karakterističan za egejski sliv. Međutim, ista sekvenca kao za Rilsku reku i Ardu pronađena je analizom uzoraka iz Krke (jadranski sliv), koja je verovatno različit haplotip od Ad*Bož, što će se, predpostavljamo, utvrditi budućim sekvencioniranjem još nedostajućih 170 bp do poli T bloka. Podudarnost između sekvenci egejskog i jadranskog sliva verovatno je posledica paralelizma (paralelne slučajne mutacije) na poziciji 26 (Tabela 10) po kojoj se ovaj haplotip i razlikuje od najrasprostranjenijeg haplotipa jadranske linije ADcs1 (usmeno saopštenje Aleš Snoj). Ad*Bož haplotip zauzima ancestralni položaj u odnosu na sve ostale haplotipove “južnih” – mediteranskih linija (Ad, Ad+ (farioides), Me, i Ma) (Slika 30). Haplotip Ad*Bož se razlikuje od haplotipova Me linije po četiri mutacije, od farioides i Ma haplotipova po tri, i od svih Ad haplotipova po dve mutacije, izuzev od ADcs1 od koga se razlikuje po samo jednoj mutaciji (Slika 31). Ancestralni položaj haplotipa Ad*Bož treba dokazati i rezultatima drugih DNA analza, ali i analizom drugih tipova kararaktera (morfološki), zbog nedetektabilno niskih “bootstraping” verovatnoća za NJ i MP analize, i zbog toga što postoje tri druga haplotipa (ADcs11, AD*Pe and Ad*Ti) koja su barem podjednako udaljena od Ma, Me i drugih Ad haplotipova po broju mutacija (Slika 31). Vrlo je teško dodeliti taksonomski status nekom od pronađenih egejskih haplotipova. Karaman (1924) je opisao samo jednu vrstu, Salmo macedonicus, u reci Treski (sliv Vardara), čije ime je kasnije primenjeno i na potočnu pastrmku iz reke Strume. Posebnu poteškoću pri rešavanju taksonomskih problema predstavlja postojanje dva haplotipa u slivu Strume (ADcs1 i Ad*Bož) koji se fenotipski razlikuju, što pravi dodatnu nomenklaturnu komplikaciju. U slivu Strume na lokalitetu Brankovačka reka (br. 28) pronađen je haplotip At linije (At1), isti kao i na lokalitetu Gradac u crnomorskom slivu. Haplotipovi At linije nisu autohtoni za egejski sliv i njihovo prisustvo u Brankovačkoj reci najverovatnije je posledica poribljavanja Dragovištice u delu toka kroz Bugarsku, mada se ne isključuju i
77 Diskusija poribljavanja u Srbiji o kojima nema ni pismenih ni usmenih dokaza, zbog loše organizovanog administrativno-ribarstvenog upravljanja. Rezultati istraživanja populacija potočne pastrmke na obrađenim lokalitetima egejskog i jadranskog sliva u potpunosti su u skladu sa dosadašnjim saznanjima da mediteransko – jadranska oblast predstavlja poseban region Evrope u kome Salmo trutta kompleks ispoljava najviši fenotipski diverzitet (Behnke 1968), što je praćeno takođe visokom genetičkom raznovrsnošću, koja je utvrđena studijama na jedarnoj i mitohondrijalnoj DNA (Laikre i sar., 1999). Najveći broj ranijih taksonomskih klasifikacija bio je zasnovan na fenotipskoj varijabilnosti, što je rezultiralo kompleksnom biogeografskom strukturom posebno populacija Balkanskog poluostrva, a što nije potvrđeno rezultatima dobijenim upotrebom savremenih molekularnih tehnika (Karakousis i Triantaphyllidis 1990, Apostolidis i sar., 1997). Generalno, može se reći da je očekivano velika varijabilnost linija potočne pastrmke Bernatchez (1992) između slivova na teritoriji Srbije (Tabela 12) praćena veoma značajnom međupopulacionom varijabilnošću unutar slivova, što je najverovatnije posledica skorašnje izolacije i lokalne diferencijacije unutar svake od linija.
Evropske populacije potočne pastrmke pokazuju biogeografska razgraničenja koja su poslužila pri definisanju rečnih basena i slivova kao diskretnih jedinica (Apostolidis i sar., 1997; Bernatchez i sar., 1992; Giuffra i sar., 1994). Pripadnost haplotipova pojedinim linijama (što je uglavnom praćeno i pripadnošću određenim rečnim basenima), može se uvideti preko filogenetskih stabala (Slika 29 i 30) urađenih različitim metodama (NJ, MP, Majority role consensus 50%), analizom haplotipova iz svih mtDNA linija (Bernatchez i sar., 1992). Rezultati koji se mogu izdvojiti kao posebno značajni su:
• diferenciranost haplotipova u linije • razdvajanje Da i At klade od klade ostalih «južnih» linija (Ad, Ad+ Ma i Me) • ancestralni položaj haplotipova Da*Dž i Da*Vr u Da kladi • formiranje posebne “farioides” (Ad+) grupe (linije), koja ima potpuno istu značajnost kao i grupe ostalih južno evropskih linija
78 Diskusija
U oba slučaja (Slika 29 i 30), dobijeni rezultati su posledica već pomenutih sinapomorfizama (Tabela 13). Međutim, striktna interpretacija filogenetskih stabala je da Da-At klada zauzima sestrinski položaj u odnosu na ostale «južno» evropske linije. Upotrebom pomenutih metoda do sada nije dobijena ovakva topologija stabla, ali može se reći da se ona slaže sa predloženim evolutivnim modelom Salmo trutta – kompleksa, po kome su najstarija filogeografska razdvajanja povezana sa alopatričkom fragmentacijom u gornjem i srednjem pleistocenu između tri glavna evropska basena: atlantskog (At linija), ponto – kaspijskog (Da linija) i mediteranskog (Ad, Ma i Me linija). Kasnija divergencija ili subsegmentacija u mediteranskom basenu dovela je do nastanka Ad, Ma i Me linija (Bernatchez i sar., 1992; Patarnello i sar., 1994; Snoj i sar., 2002), a rezultati ove studije promovišu još jednu liniju (farioides ili Ad+) unutar ovog basena. Pripadnost haplotipova određenim linjama kao i broj polimorfizama između njih može se utvrditi i preko kladograma (mreže) (Slika 31), s tim što utvrđivanje broja mutacija između haplotipova koji pripadaju različitim linijama preko broja algoritamskih mutacionih koraka nije potpuno precizno. Rezultati dobijeni na osnovu kladograma uglavnom se podudaraju sa rezultatima filogenetskih analiza (Slika 29 i 30). Jedina značajnija razlika je što su Da haplotipovi na mreži zauzeli ancestralni položaj u odnosu na sve ostale haplotipove, dok na filogenetskim stablima (Slika 29 i 30) nije moguće utvrditi koja je linija u okviru Salmo trutta kompleksa ancestralna. Da i At haplotipovi čine sestrinsku kladu u odnosu na kladu «južnih» haplotipova, s tim što je u okviru Da i At klade, At linija započela nešto kasniju diferencijaciju na haplotipove. U «južnoj» kladi sve linije (Ad, Ad+, Me i Ma) pokazuju sličnu starost (vreme diferencijacije), koje je pri dobijenoj rezoluciji stabla nešto između vremena diferencijacije Da i At haplotipova, što se podudara i sa tvrdnjom Bernatcheza (2001). Izrazita ancestralnost haplotipa Aa*Bož u okviru «južne» klade, kao što je već rečeno, tek mora biti ispitana. Cortey i sar. (2004) sekvencioniranjem celog kontrolnog regiona mtDNA i upotrebom istih filogenetskih analiza dobija takvu rezoluciju stabla pri kojoj Da linija zauzima izrazito bazalni položaj u odnosu na ostale linije, kao što je to slučaj i na našem kladogramu (Slika 31). Smatramo da bi i naša filogenetska stabla potvrdila ancestralniji položaj Da linije sekvencioniranjem celog kontrolnog regiona mtDNA analiziranih uzoraka. Na osnovu rezultata sekvencioniranja, osim detekcije haplotipova, utvrđena je i varijabilnost unutar 5' kraja nekodirajućeg kontrolnog regiona mtDNA. Unutar fragmenta kontrolnog regiona dužine 561 bp pronađeno je 18 polimorfnih mesta, što je u proseku jedno polimorfno mesto na svakih 31,2 nukleotida. Utvrđena varijabilnost unutar
79 Diskusija kontrolnog regiona mtDNA analiziranih uzoraka nešto je manja u odnosu na rezultate Bernatchez i sar. (1992), koji su analizom fragmenta dužine 310 bp pronašli 13 polimorfnih mesta, što je u proseku jedno polimorfno mesto na 23,8 nukleotida. Razlog za manju varijabilnost uzoraka koji su analizirani je neravnomeran raspored polimorfnih mesta. Najveći broj polimorfnih mesta se upravo nalazi u prvoj trećini 5' kraja kontrolnog regiona, dok se dalje prema sredini njihov broj smanjuje. Salmonide odlikuje približno jednaka varijabilnost kodogenih i nekodogenih regiona molekula mtDNA (Giuffra i sar., 1994), što je razlika u odnosu na ostale kičmenjake, kod kojih je varijabilnost kontrolnog regiona 5 do 15 puta veća od varijabilnosti u kodirajućim regionima (Aquadro i Greenberg, 1983). U kontrolnom regionu mtDNA najčešće se javljaju tačkaste mutacije, koje nastaju kao rezultat supstitucija, delecija ili insercija. Do pojave tačkastih mutacija najčešće dolazi usled pogrešnog sparivanja nukleotida prilikom replikacije, ili kao rezultat spontanih mutacija koje nisu vezane sa replikacijom, i koje nastaju najčešće zbog nukleotidne depurinizacije i/ili deaminacije (Alberts i sar., 1994). Pogrešno spareni nukleotidi mogu biti uklonjeni pomoću posebnog mehanizma koji vrši popravku na DNA, na taj način što prepoznaje i izrezuje pogrešno sparene nukleotide prilikom polimerizacije i ligacije novog lanca (Lewin, 2000). Mehanizmi za uklanjanje grešaka su efikasni ali nisu stoprocentno sigurni, tako da se neke mutacije mogu fiksirati i dalje prenositi na potomstvo, što dovodi do genetskih promena narednih generacija (Snoj, 1997). U kontrolnom regionu mtDNA kao najčešće greške pri sparivanju nukleotida javljaju se supstitucije, dok su delecije i insercije znatno ređe. Među supstitucijama, tranzicije su mnogo češće u odnosu na transverzije, a među tranzicijama dominiraju supstitucije C→T (Li i Grauer, 1991), što su i rezultati ovog rada pokazali (Tabela 10). Transverzije G↔C su vrlo retke među supstitucijama, i zbog toga imaju veoma veliki značaj pri utvrđivanju srodnosti između različitih sekvenci. Zbog težine nastanka takve supstitucije, najverovatnije da je većina takvih zamena posledica višestrukih supstitucija na istom mestu (npr.: G→A→C). Takav tip supstitucija javlja se i u rezultatima ovoga rada na tri polimorfna mesta (26, 262, 543). Prema dobijenim rezultatima, odnos tranzicija i transverzija je 14:7, a broj transverzija je nešto povećan zbog polimorfne pozicije (26) na kojoj se javljaju dve transverzije (Tabela 10). Bernatchez i sar. (1992) dobili su odnos tranzicija i transverzija (17:6) na 12
80 Diskusija haplotipova potočne pastrmke, dok je odnos tranzicija i transverzija na lipljanu identičan sa rezultatima ovoga rada - 14:7 (Sušnik, 2001). Za razliku od Salmonida, kod većine drugih kičmenjaka na intraspecijskom nivou preovlađuju tranzicije nad transverzijama (10 do 32 puta), kako u kodirajućim tako i u nekodirajućim regionima mtDNA (Moritz i sar., 1987). Snoj (1997) smatra, da što je stepen divergencije između dve nukleotidne sekvence manji, mogućnost da na određenom mestu dođe do više od jedne supstitucije gotovo je zanemarljiva i broj uočenih supstitucija između takve dve sekvence trebalo bi da koincidira sa stvarnim brojem supstitucija. U suprotnom slučaju, kada postoji velika razlika između sekvenci, uočeni broj razlika je manji od stvarnog, što je posledica višestrukih supstitucija na istom mestu.
4.2. PALEOZOOGEOGRAFSKA RAZMATRANJA, SA OSVRTOM NA KOLONIZACIJU EVROPE POTOČNOM PASTRMKOM
Da bi se dobio uvid u današnje rasprostranjenje i poreklo slatkovodnih riba Evrope, samim tim i potočne pastrmke, neophodno je izvršiti rekonstrukciju paleogeografskih događaja koji su imali veoma značajan uticaj na hidrografiju Evrope i Mediterana tokom srednjeg i donjeg miocena, pliocena i pleistocena. Tokom jure i krede Tetis je bio otvoreno ekvatorijalno more koje je razdvajalo Evroaziju i Afriku, i spajalo prvobitni Atlantik sa Indopacifičkim okeanom. Pomeranjem Evroazijske i Afričke ploče morski put između pomenutih okeana i Tetisa bio je redukovan ili prekinut, a kao rezultat toga, tokom gornjeg i srednjeg miocena, formirala su se dva glavna unutrašnja basena: Mediteran i Paratetis (Hsü i sar., 1977). Za vreme srednjeg miocena (pre 15 miliona godina) dolazi do orogeneze Alpskog, Dinarskog, Balkanskog i Pindskog planinskog masiva, što dovodi do formiranja izrazite barijere između Mediterana i Paratetisa. Kao rezultat formiranja ovakve barijere, dolazi do preusmeravanja velikog broja bivših centralno evropskih rečnih slivova u Paratetis, koji takođe prima slatku vodu sa šireg područja centralnog Palearktika. Višak vode koji se javljao u Paratetisu rezultirao je pozitivnim vodnim bilansom što je dovelo do prelivanja vode u susedna mora Mediterana preko transalpijske, panonske i transegejske veze (Slika
81 Diskusija
33). Analizom sedimenata dna na području današnjeg Crnog mora, a predačkog Paratetisa, navodi se da je u periodu 15 – 5 miliona godina Paratetis bio oligosalino (bočatno) ili čak slatkovodno «more». U istom periodu Mediteran je posedovao slanu vodu i funkcionisao je kao otvoreno more, usled postojanja široke veze sa Atlantskim okeanom (Hsü, 1978). Pored formiranja prirodnih barijera u vidu pomenutih planinskih masiva ipak je između Paratetisa i Mediterana postojala komunikacija do kraja miocena.
Slika 33. Rekonstrukcija geografije Mediterana i Paratetisa tokom srednjeg miocena. Moguće morske veze: A i B - veze Mediterana i Atlantika; C – Transalpijska brazda; D – Jadransko - Panonska veza; E – Transegejska veza; F – Paratetis Baltička veza; G - Paratetis Arktička veza (Hsü, 1978; modifikovano).
Najveći broj fosilnih ostataka riba iz srednjeg miocena pronađenih u Evropi predpostavlja se da potiče iz Sibira i istočne Azije (Banarescu, 1960; 1977). Smatra se da je kolonizacija Evrope izvršena preko mreže rečnih veza između basena Lene, Jeniseja i Oba sa Paratetisom, odakle je preko Tauranskih vrata omogućena kolonizacija istočne Evrope, a opadanje saliniteta u Paratetisu praćeno je daljom kolonizacijom ka zapadnoj Evropi i Engleskoj (Bianco, 1990).
82 Diskusija
Krajem miocena (6,1 do 5,1 miliona godina), u tzv. mesinskom periodu, desila su se dva veoma važna geološka događaja:
1. Značajno povećanje zapadno Antarktičke ledene mase, koje je praćeno opadanjem nivoa svetskog mora. 2. Približavanje afričke i evropske ploče, u kombinaciji sa opadanjem nivoa mora, rezultira izolacijom Mediterana od Atlantika.
Kao posledica navedenih događaja, Mediteran postaje evaporativni basen (McKenzie i Oberhansli, 1985; Cita i McKenzie, 1986), koji zbog izdizanja planinskih lanaca Alpskog, Dinarskog, Balkanskog i Pindskog masiva gubi vezu i sa Paratetisom (Slika 34). Od momenta izolacije Mediterana od Paratetisa svaki od basena prolazi kroz različitu istoriju koja je uglavnom izazvana različitim hidrološkim statusom. Isušivanje Mediterana poznato je kao «mesinska kriza saliniteta», koja je trajala oko milion godina (Slika 35).
Slika 34. Događaji koji su doveli do krize saliniteta: razdvajanje Mediterana od Atlantika i od Paratetisa (Hsü, 1978; modifikovano).
Za vreme mesinskog perioda Paratetis je bio bočatna ili slatkovodna sredina, čiji se nivo vode povećavao posebno u vlažnim periodima, što je uzrokovalo povremeno povezivanje evropskih rečnih sistema, a samim tim i mogućnost za širenje ili pak izolaciju slatkovodnih riba.
83 Diskusija
Slika 35. Mesinska kriza saliniteta, uzrok isušivanja Mediterana. (Hsü, 1978).
Krajem mesinskog perioda, slatka voda iz Paratetisa prodire u Mediteran koji je do tada bio suv, pri čemu se basen Paratetisa redukuje na mrežu jezera (panonski, dakijski, pontski i kaspijski basen), a voda koja je dospela u Mediteran ispunjava depresije, takođe formirajući mrežu jezera (Hsü i sar., 1977; Rögl i Steininger, 1983). Ovaj događaj poznat je kao «Lago Mare» faza Mediterana i Paratetisa (Slika 36). Mediteran je bio ispunjen slatkom vodom oko 100 000 godina, do pred sam početak pliocena, kada je došlo do otvaranja Gibraltarskog moreuza i ulaska slane vode iz Atlantika u Mediteran. Slika 36. Mesinska «Lago Mare» faza Mediterana i Paratetisa (Hsü, 1978; mod.).
Period «Lago Mare» nesumnjivo je odigrao veoma važnu ulogu u ranom prolasku primarno slatkovodne faune riba iz Paratetisa u Mediteran, kao i u disrtibuciji pomenute faune u peri-mediteranske rečne sisteme. Potvrdu ovakvom scenariju daju brojni fosilni ostaci koji potiču iz mesinskog perioda.
84 Diskusija
Morska voda koja iz Atlantika ulazi u Mediteran postepeno počinje da se preliva i u Paratetis, posebno u njegov zapadni deo (oblast današnjeg Crnog mora, Kaspijskog i Aralskog jezera), što dovodi do katastrofalnih posledica po specijalizovane zajednice slatkovodnih riba (Slika 37) (Bianco, 1990).
Slika 37. Ponovno uspostavljanje saliniteta (morskih uslova) u basenima Mediterana i Paratetisa. Crvene tačke predstavljaju hipotetičke prvobitne reke u kojima je mogla preživeti primarno slatkovodna fauna riba Paratetisa (Hsü, 1978; modifikovano).
Najstariji fosilni ostaci roda Salmo iz područja Paratetisa pronađeni su u Hrvatskoj u blizini Samobora (Samoborska Gora). Predpostavlja se da se radi o vrsti Salmo immigratus (Gorjanović – Kramberger, 1891) koja je zauzimala stratigrafsku poziciju donjeg Sarmata u okviru centralno-panonskog basena (Anđelković, 1989). Na osnovu ovog nalaza može se zaključiti da je rod Salmo naseljavao Paratetis još u srednjem miocenu, pre oko 13 miliona godina, a verovatno i ranije. Banarescu (1973) smatra da su predstavnici familije Salmonidae kolonizirali evropske prostore iz voda Sibira, što može biti vrlo verovatno pošto je Paratetis tokom srednjeg i donjeg miocena bio ispunjen bočatnom ili slatkom vodom i povezan sa istočno-sibirskim rekama (Jenisej, Lena i Ob) (Bianco, 1990). Kasnije širenje Salmonida iz Paratetisa omogućeno je ka severu preko veza sa Baltikom i ka zapadu preko veze sa Rajnom. Fosilni nalaz vrste Salmo immigratus u panonskom basenu Paratetisa iz srednjeg miocena može imati ključnu ulogu za razrešenje porekla roda Salmo u evropskim vodama. Najverovatnije da je Salmo immigratus bio predstavnik istočno-azijskih salmonida koji se naselio u Paratetisu. Kako je postojala miocenska veza Paratetisa i Baltika, verovatno je deo populacije Salmo immigratus koji je migrirao ka severu bio
85 Diskusija predački za atlantskog lososa (Salmo salar), dok je populacija koja je ostala u Paratetisu i njegovim pritokama bila predačka za evropske pastrmke. Nakon davanja predačke osnove za dve grupe roda Salmo (losos i pastrmka), Salmo immigratus izumire. Atlantski losos danas naseljava isključivo severna mora i obale istočnog Atlantika, i uopšte ga nema u današnjim basenima bivšeg Paratetisa (Crno more, Kaspijsko i Aralsko jezero), što ukazuje na nastanak lososa upravo u morima severne i zapadne Evrope. Činjenice da je Patatetis u Saramatskom katu bio ispunjen uglavnom bočatnom vodom koja po svojim osobinama jako nalikuje vodi današnjih severnih mora, kao i da su ga naseljavale ribe sa jako širokom ekološkom valencom u odnosu na salinitet (Anđelković, 1989), uz pojavu anadromije («zavičajno ponašanje») koja je karakteristična za lososa, mogu predstavljati dodatne argumente koji idu u prilog iznetoj hipotezi da je predak lososa (Salmo immigratus) živeo u Paratetisu odakle je migrirao ka severnim morima za koja predpostavljamo da su i bila mesto njegovog nastanka, nakon prekida veze preko basena Rone i/ili Rajne sa basenom Atlantika i njegovih priobalnih mora.
Najstariji fosilni ostaci potočne pastrmke pronađeni su na Kavkazu, datiraju sa početka pleistocena i procenjuje se da su stari oko 2 miliona godina (Osinov i Bernatchez, 1996), s tim što se smatra da je potočna pastrmka kao vrsta znatno starija. Pošto se radi o fosilnom nalazu iz basena bivšeg Paratetisa, može se predpostaviti da pastrmka vodi poreklo od Salmo immigratus kao jedine vrste roda Salmo koja je naseljavala Paratetis u doba srednjeg i donjeg miocena. Derzhavin (1934) i Vladimirov (1944; 1948) smatraju upravo populacije potočne pastrmke sa područja Kavkaza najprimitivnijim formama, od kojih su širenjem svoga areala nastale sve ostale populacije pastrmki koje naseljavaju južna mora. Antunes i sar. (2002) analizom geneologije gena za transferin dolaze do zaključka da najancestralnije populacije potočne pastrmke naseljavaju pritoke Crnog mora, Kaspijskog i Aralskog jezera. Cortey i sar. (2004) navode da korišćenjem filogenetskih metoda NJ i MP, haplotipovi dunavske linije zauzimaju ancestralni položaj u odnosu na haplotipove ostalih linija. Iz svega navedenog može se uvideti da postoje argumenti koji idu u prilog napred iznetoj hipotezi o poreklu evropskih pastrmki od pretka koji je naseljavao Paratetis i njegove pritoke u doba miocena. Tokom pliocena (5 - 1.8 miliona godina), Paratetis prolazi kroz fazu redukcije svoje veličine, prvo raspadom na manje pojedinačne međusobno povezane basene, da bi kasnije
86 Diskusija došlo do potpunog isčezavanja panonskog i dakijskog basena, čime se uspostavio današnji sliv Dunava (Hsü, 1978). Po završetku pliocena, od Paratetisa ostaju samo Crno more, Kaspijsko i Aralsko jezero (Rabrenović i sar., 2003), što vodi ka značajnoj izolaciji pastrmskih populacija Paratetisa. U drugoj polovini pliocena (3,1 miliona godina) desile su se značajne klimatske oscilacije. Globalno pan-okeansko postepeno opadanje temperature započelo je pre oko 2,4 miliona godina, što je nagoveštavalo veliko zahlađenje tokom pleistocena (Rage i Roček, 2003). Početkom pleistocena dolazi do formiranja ledenog pokrivača koji se povremeno širio (glacijacija) ili povlačio (interglacijacija). U poslednjih 0,9 miliona godina, glacijacije su se javljale u ciklusima od oko 100 000 godina (Roy i sar., 1996). Analizom genetičkih podataka životinjskih populacija Evrope i Severne Amerike, došlo se do zaključka da genetička diferencijacija današnjih populacija predstavlja, između ostalog, odraz uslova za vreme pleistocenskih glacijacija, kao i kolonizacija koje su pratile povlačenje ledenog pokrivača (Avise, 1992; Hewitt, 1996; Bernatchez i Wilson, 1998; Taberlet i sar., 1998). Slatkovodne i anadromne ribe predstavljaju važnu grupu organizama u zoogeografskim studijama, na osnovu kojih je sugerisano da postoji značajan glacijalni uticaj na geografsku distribuciju intraspecijskog genetičkog polimorfizma. Bernatchez (2001) smatra da svih pet mtDNA linija potočne pastrmke (Bernatchez, 1992) imaju monofiletsko poreklo, a da su se razvile nezavisno kao rezultat predačke alopatričke fragmentacije. Na osnovu širokog opsega divergencije (1 – 2% na milion godina), pretpostavlja se da je do razdvajanja linija od predačke populacije došlo u periodu između 0,5 i 2 miliona godina, što ukazuje da je formiranje glavnih filogeografskih grupa povezano sa klimatskim promenama, kao i promenama staništa, što se podudara sa pleistocenskim glacijacijama. Poseban akcenat je stavljen na klimatske promene u poslednjih 700 000 godina (Anderson i Borns, 1994) koje su verovatno imale značajan uticaj u izolaciji nekoliko velikih rečnih sistema (danas slivova različitih basena: Rona, Rajna i Dunav) (Villinger, 1986). Najstarije razdvajanje na linije potočne pastrmke povezano je sa alopatričkom fragmentacijom između tri glavna basena: atlantskog (At – linija), ponto – kaspijskog (Da – linija) i mediteranskog, s tim da je u mediteranskom basenu verovatno kasnije došlo do istovremenih fragmentacija koje su dovele do razdvajanja Me, Ma i Ad linije (Bernatchez, 2001).
87 Diskusija
Razmatranjem pleistocenskih dešavanja i globalne geografske slike distribucije i genetičkog diverziteta za svaku od linija, moguće je izvesti zaključak o hipotetičkim centrima porekla za mtDNA linije potočne pastrmke. Reke u slivu atlantskog basena predstavljaju centar porekla At linije. Međutim, pošto je severni deo atlantskog basena bio pod jakim uticajem širenja ledene kape tokom pleistocenskih glacijacija, smatra se da je ancestralni centar porekla At linije bio više južno, verovatno u obalnim pritokama Iberijskog poluostrva ili čak severne Afrike (Bernatchez, 2001). Utvrđivanje centra porekla Da linije je prilično problematično zbog veoma brojnih interkonekcija, kao i povećanja i smanjenja nivoa Crnog mora, Kaspijskog i Aralskog jezera za vreme pleistocenskih glacijacija, koje ipak nisu imale toliko izrazit uticaj na gubitak staništa kao u slučaju At linije (Arkhipov i sar., 1995). Na osnovu kavkaskih fosilnih ostataka potočne pastrmke, smatra se da je ancestralna populacija od koje su nastale sve ostale populacije Da linije naseljavala pritoke Crnog mora (Bernatchez, 2001). Karakteristična slika geografske distribucije tri preostale linije (Me, Ma i Ad) značajno potkrepljuje realnost poznatih mediteranskih refugijuma: jugozapadni (iberijsko – mediteranski), centralni (jadransko – mediteranski) i istočni (balkansko – anadolijski) (Keith, 1998). Me linija je pretežno pronalažena u slivu reka zapadnog Mediterana, zbog čega se pretpostavlja da vodi poreklo upravo iz istog regiona. Ma linija je uglavnom ograničena na sliv reke Po, ali naseljava i reke jadranskog sliva Slovenije i Bosne i Hercegovine koje su mogle biti povezane za vreme faza maksimalnih interglacijacija (Bianco, 1990). Alozimske studije takođe su potvrdile severno jadransko poreklo Ma linije (Giffura i sar., 1996). Ad linija je predominantna u pritokama istočnog Mediterana u odnosu na Ma i Me liniju, što ukazuje da verovatno vodi porelo iz Balkansko – Anadolijskog refugijuma (Bernatchez, 2001), dok Ad+ linija najverovatnije vodi poreklo iz refugijuma jugozapadnog Balkana, gde je i danas rasprostranjena. Na osnovu alozimskih istraživanja utvrđeno je da je slika geografske distribucije linija povezana sa postglacijalnim geološkim događajima, pri čemu je predstavljen model rekolonizacije deglacijalnih područja severo-zapadne Evrope od tri preglacijalne linije (I, II i III). Za vreme povlačenja leda smatra se da je došlo do rekolonizacije uglavnom u graničnim područjima i to iz tri smera: 1. severo – zapadna migracija iz mediteransko – kaspijskog refugijuma (linija III), 2. migracija ka severu iz refugijuma atlantskog sliva (Iberijsko poluostrvo i južna Francuska - linija II) i 3. severno i istočno širenje iz refugijuma sa središtem u blizini Engleskog Kanala (Lamanš - linija I). Rekolonizacija deglacijalnih područja severo-zapadne Evrope iz četvrtog mediteranskog refugijuma,
88 Diskusija smatra se da nije vršena (linija IV) (García - Marín i sar., 1999), (Slika 38). Linije I, II i III odlikuju se različitim kombinacijama fiksiranih genotipova na lokusima LDH-C* i CK-A1, koji su danas prisutni u pastrmskim populacijama deglacijalnih područja, dok linija IV poseduje alel LDH - A2*100QL, koji odsustvuje kod populacija iz postglacijalno kolonizovanih regiona. Sadašnje populacije koje naseljavaju deglacijalna područja, smatra se da predstavljaju mešovite ili čiste potomke navedene tri migratorne grupe.
Slika 38. Distribucija predpostavljenih glavnih linija (I, II, III i IV) i pravci migracija populacija potočne pastrmke za vreme postglacijalne rekolonizacije za linije I, II i III. Isprekidana linija predstavlja granicu leda za vreme poslednje glacijacije (pre oko 13 000 godina), (García - Marín i sar., 1999 - modifikovano).
García - Marín i sar. (1999) i Bernatchez (2001) predlažu sličan model rekolonizacije koji se zasniva na brzom, istovremenom širenju populacija potočne pastrmke iz glacijalnih refugijuma, kao što je sugerisao i Hewitt (1999) za druge organizme. Do rekolonizacije bi došlo širenjem «prednjeg ruba» populacija migranata na veće distance koje bi ustanovile «kolonije» daleko ispred glavnog talasa populacije. Ovi migranti bi se naglo širili i zauzimali staništa pre ostalih, čime bi njihovi geni postali dominantni u genofondu novouspostavljene populacije. Ovakav tip rekolonizacije može dovesti do pojave velikog stepena homozigotnosti, kao i efekta «uskog grla» (eng. bottleneck) koji može usloviti gubitak genetičkog diverziteta (Nei i sar., 1975). Severno atlantski basen koji naseljava At linija potočne pastrmke odlikuje se malim genetičkim diverzitetom što bi se moglo objasniti ovakvom hipotezom o načinu rekolonizacije faune. Prema scenariju, populacije potočne pastrmke koje su već prisutne u refugijumu datog basena ili geografskog prostora, bile bi prve koje bi se proširile i zauzele dostupne ekološke niše,
89 Diskusija ostavljajući malu verovatnoću za osnivanje populacijama koje su preživele glacijacije u udaljenijim delovima refugijuma. Ovaj proces bi bio još izrazitiji ako bi vreme geografske izolacije (i/ili selekcije u različitim sredinama) bilo prilično značajno za akumulaciju genetičkih i ekoloških razlika (Bernatchez, 2001). Naseljavanjem novog područja populacijama sa «prednjeg ruba», populacije koje se nalaze iza njih vrlo malo mogu uticati na genetičku strukturu populacije na «pionirskom» području - u pitanju je jednostavno gustina populacije. Kao rezultat ovog načina rekolonizacije desilo bi se da populacije koje se nalaze «iza» populacija sa severne granice širenja (u centru ili na jugu refugijuma) neće biti u mogućnosti da brzo napreduju, što znači da se one moraju povlačiti na druga staništa ili opstati gde jesu. Pomenuti proces, uz fizičku izolaciju i biološke faktore, može biti «generator» procesa nastanka specifičnih genoma i podvrsta u južnim refugijumima (Hewitt, 1993).
Raspored kopna i mora kroz pleistocen postepeno se približava današnjem rasporedu. Međutim, u starijem pleistocenu ima velikih odstupanja od današnjeg izgleda obalskih linija. Takođe su velika odstupanja u odnosu na današnje stanje bila za vreme velikih zahlađenja (glacijacija), uključujući i ona u mlađem pleistocenu (virm), kada je usled povećanja kontinentalnih i planinskih lednika smanjena količina vode u okeanima i snižen nivo mora (Rabrenović i sar., 2003). Razmena primarno slatkovodne faune, a samim tim i pastrmskih populacija, između reka različitih oblasti, bila je verovatno omogućena opadanjem nivoa mora za vreme glacijacija (Bianco, 1990). Procene opadanja nivoa mora u Mediteranu su različite za određene faze glacijacija. Za vreme Virm glacijalne faze smatra se da je nivo Mediterana bio niži za maksimalno 130 m, dok je za vreme Mindel i Ris glacijalnih faza nivo mora bio za oko 200 m niži u odnosu na današnji nivo (Bianco, 1990; Pielou, 1979). Postoje mišljenja da opadanje nivoa mora u Mediteranu za oko 200 m pre oko 250 000 godina, za vreme Ris faze glacijacije (Brown i Gibson, 1983) uslovljava sužavanje Gibraltarskog moreuza na 1/5 današnje širine. Kao posledica ovih dešavanja dolazi do smanjenog dotoka vode u Mediteran iz Atlantika, što izaziva sekundarnu krizu saliniteta i pad nivoa vode u Mediteranu za oko 500 m, za šta je bilo potrebno oko 500 godina. Opadanjem nivoa vode u Mediteranu za 500 m može se objasniti prisustvo slatkovodnih riba na Rodosu koje su porekom iz Turske, kao i razmena slatkovodne riblje faune između severo – zapadne Afrike i Španije (Bianco, 1990). Ovom pojavom se može objasniti i izuzetna širina areala Ad i Me linije u
90 Diskusija
Mediteranu, koja se najverovatnije javlja kao posledica uspostavljanja veza između rečnih slivova različitih oblasti. Takođe treba pomenuti i rasprostranjenje At linije u Mediteranu koja je pronađena u istočnoj Španiji, na severo – zapadu Afrike i na Siciliji (usmeno saopštenje Aleš Snoj).
Slika 39. Narandžasta i crvena linija duž jadranske, jonske i egejske obale prikazuju sniženje mora od 100 m (Virm faza) i 200 m (Ris i Mindel faza), kao i posledice tih dešavanja u različitim regionima (1 – 7) (Bianco, 1990 – modifikovano).
U regionu 1 (Slika 39), kao posledica povlačenja nivoa mora, dolazi do značajnog proširenja reke Po, u regionu 2 dolazi do uspostavljanja veza između dalmatinskih reka, u regionu 3 dolazi do uspostavljanja transjadranske komunikacije (opadanjem nivoa mora od najmanje 160 m), u regionu 4 dolazi do uspostavljanja veza između albanskih reka (Drim ↔ Vjose), u regionu 5 dolazi do uspostavljanja veza između reka jonskog sliva (Taimis ↔ Aheron), u regionu 6 dolazi do uspostavljanja veza između reka sa suprotnih strana Patras - korintskog zaliva, i u regionu 7 dolazi do uspostavljanja slatkovodne veze između gornjeg dela Egejskog i Crnog mora. Osim brojnih rečnih veza koje su se uspostavile opadanjem nivoa mora za vreme glacijacija i koje su omogućile migriranje pastrmskih populacija, treba pomenuti i brojne međurečne veze, ledene ustave i slatkovodna jezera koje su uspostavljene u doba interglacijacija otapanjem ledenog pokrivača u zapadnom Sibiru i istočnoj Evropi. Kao posledica otapanja lednika dolazi do akumulacije i prelivanja vode iz jednog u drugi
91 Diskusija basen bivšeg Paratetisa (Aralsko → Kaspijsko jezero → Crno more), koji je preko Crnog mora komunicirao sa gornjim delom Egejskog mora. Ceo pomenuti sistem, uključujući i gornji deo Egejskog mora, najverovatnije je posle svake glacijacije – interglacijacije posedovao slatku ili bočatnu vodu (Slika 39), (Thunell i Williams, 1983). Kao potvrdu veze između ponto – kaspijskog i mediteranskog basena, imamo nalaz Da haplotipova, za koje se smatra da su autohtonog porekla u egejskom slivu Grčke (Apostolidis i sar., 1997), i Turske (Bernatchez, 2001). Takođe je postojala komunikacija između ponto – kaspijskog basena i basena Tigrisa i Eufrata (Persijski zaliv), što potvrđuje pronalazak dunavskog haplotipa Da25 (Sušnik i sar., 2005). Osim pomenutih veza između ponto – kaspijskog basena sa mediteranskim i basenom Indijskog okeana (Persijski zaliv), postojala je, za vreme različitih faza glacijacija, veza ponto – kaspijskog i atlantskog basena (Bernatchez, 2001). Veze Kaspijsko jezero – Baltik i Kaspijsko jezero – Arktik (Ekman, 1957), kao i veza između gornjeg Dunava i gornje Rajne (Balon, 1968; Englbrecht i sar., 2000) potvrđena je i prisustvom At haplotipova u slivu gornjeg Dunava, za koje se sumnja da su autohtonog porekla (Weiss i sar., 2001), kao i nalaz jedne populacije potočne pastrmke u pritoci gornje Volge (kaspijski basen), (Osinov i Bernatchez, 1996). Današnje filogeografske studije (Durand i sar., 1999; Nesbo i sar., 1999), kao i tradicionalne biogeografske studije (Banarescu, 1990) potvrđuju ponto – kaspijsko poreklo drugih slatkovodnih riba u atlantskom basenu koje su tu dospele za vreme pleistocenskih glacijalnih događaja. Kako su postojale pleistocenske veze između basena Crnog mora, Kaspijskog i Aralskog jezera sa Atlantikom na jednoj i sa Mediteranom i Indijskim okeanom na drugoj i trećoj strani, naša predpostavka da su populacije potočne pastrmke iz basena bivšeg Paratetisa ancestralne za sve ostale populacije koje naseljavaju severna i južna mora postaje realna. Realnost ove hipoteze ogleda se u postojanju haplotipova Da*Vr i Da*Dž koji su pronađeni u slivu Južne Morave (Dunav → Crno more), koji zauzimaju ancestralni položaj u okviru Da klade na filogenetskim stablima (Slika 29 i 30), kao i haplotipa Da24 koji je pronađen u reci Waldaist u Austriji (dunavski sliv), (Duftner i sar., 2003). Haplotipovi Da*Vr, Da*Dž i Da24 imaju poslednja četiri polimorfna mesta 530, 542, 543 i 548 do poly «T» regiona sinapomorfna sa haplotipovima iz Ad, Ad+ At, Ma i Ma linije. Kao posledica pomenutih sinapomorfizama, haplotipovi Da*Vr, Da*Dž zauzimaju centralni položaj na kladogramu – mreži (Slika 31), (posebno haplotip Da*Vr) u odnosu na sve haplotipove iz ostalih linija. Haplotip Da*Vr zauzima centralni položaj i po procentualnim vrednostima divergencije između haplotipova različitih linija (Tabela
92 Diskusija
11). Između haplotipa Da*Vr i najbližih haplotipova «južne» i At linije distance se kreću od 1,05 do 1,23%, dok je vrednost distanci između Da*Vr i Da haplotipova između 0,88 i 1,23%, izuzev haplotipa Da*Dž koji mu je najbliži i distanca između njih je 0,53%. Na osnovu iznetih činjenica može se zaključiti da haplotip Da*Vr (kao i njemu najbliži haplotipovi Da24 i Da*Dž) spadaju u grupu ancestralnih haplotipova ne samo za ostale Da haplotipove, već i za haplotipove ostalih linija. Unutar Da linije prikazana je duboka genetička divergencija, koja prema genetičkoj distanci skoro tri puta pravazilazi genetičku divergenciju između haplotipova Ad, Me i Ma linija. Duboka divergencija unutar Da linije (Tabela 11), kao i njena bazalna pozicija na filogenetskom stablu (Cortey i sar., 2004) i na kladogramu (mreži) haplotipova (Slika 31), sugerišu da Da populacije predstavljaju najstarije odvojenu liniju iz Salmo trutta kompleksa, a samim tim i ancestralnu za druge haplotipove (linije) unutar kompleksa. Haplotipovi koji su pronađeni u slivu Neretve i Skadarskog jezera (Ad+N i Ad+RC), a koji zajedno sa Ad+Prz formiraju jugo-zapadno balkansku farioides (Ad+) liniju, verovatno predstavljaju ostatke ancestralnog polimorfizma «južne» klade. Nakon prihvatanja stanovišta o postojanju pet glavnih evolutivnih linija (Da, At, Ad, Me i Ma) potočne pastrmke (Bernatchez i sar., 1992), sumnjalo se u mogućnost postojanja novih linija slične dubine divergencije, jer je smatrano da je distribuciono područje Salmo trutta kompleksa bar u pogledu pronalaska novih linija adekvatno istraženo (Bernatchez, 2001). Međutim, ispostavilo se da pojedini regioni nisu dovoljno istraženi, i da još uvek ne postoje podaci za pojedina područja u okviru prirodnog areala potočne pastrmke. Najnovija detaljna istraživanja populacija potočne pastrmke na Iberijskom poluostrvu otkrila su postojanje bitnih polimorfizama unutar At klade (Suárez i sar., 2001; Weiss i sar., 2000) na osnovu kojih je predloženo opisivanje nove evolutivne linije «Duero» (Suárez i sar., 2001; Cortey i Garcia-Marin, 2002). Pošto Balkansko poluostrvo, kao i Iberijsko, predstavlja «vruću tačku» biodiverziteta (Kryštufek i sar., 2004), veoma bitnu za post-glacijalnu evoluciju faune i kolonizaciju Evrope, a pri tome je slabo istraženo, pronalazak Salmo farioides (Ad+) linije u rekama jadranskog sliva jugo- zapadnog Balkana, s obzirom na sve okolnosti područja i nedostatka informacija, postaje sasvim realan. Dobijeni rezultati nukleotidnih divergencija na kontrolnom regionu mtDNA od 0,18% do 2,12% (Tabela 11), uglavnom se slažu sa ocenom Gyllestena i Wilsona (1988) da je intraspecijska nukleotidna divergencija mtDNA kod Salmonida između 0.1% i 2 %.
93 Diskusija
Primena molekularnog sata na kontrolni region mtDNA veoma je problematična zbog neprecizne kalibracije koja se po različitim autorima kreće od 0,5% do 2% na milion godina. Smith (1992) procenjuje stopu mutacija za mtDNA od 1% na milion godina za Salmonide. Ako bi se vrednosti distanci za haplotipove pronađene na teritoriji Srbije obračunale po mutacionoj stopi Smita od 1% na milion godina, dobile bi se vrednosti divergencije između 180 000 i 2,12 miliona godina, što korespondira sa geološkim epohama kraja pliocena i gotovo celog pleistocena. Iz ovoga proizilazi da su pleistocenske glacijacije odigrale veoma važnu ulogu u oblikovanju genetičkog diverziteta populacija potočne pastrmke. Međutim, treba pomenuti i procenu Apostolidis i sar. (1997) koji smatraju da se divergencija glavnih mtDNA linija desila od zajedničkog pretka u slično geološko vreme i to u doba mesinske periode i ranog pliocena, u periodu od pre 2,5 – 6 miliona godina. U ovom periodu desila su se dva veoma važna geološka događaja: 1. dolazi do izolacije Mediterana od Atlantika, kao i od basena Paratetisa (Slika 34), 2. krajem mesinskog perioda Mediteran i Paratetis bivaju redukovani na mrežu povezanih jezera poznatu pod nazivom «Lago Mare» faza (Slika 36), (Bianco, 1990). Pomenuti autori smatraju da je «Lago Mare» faza verovatno odigrala veoma važnu ulogu u izolaciji pastrmki Mediterana, kao inicijalnih panmiktičnih populacija koje su bile razdvojene u posebnim jezerima, iz kojih su se kasnije širile u peri-mediteranske rečne sisteme (Slika 37). Međutim, postoje mišljenja koja odbacuju hipotezu Apostolidis i sar. (1997) iz sledećeg razloga: pošto je u periodu krajem miocena i tokom prvog dela pliocena klima postala toplija i humidnija, u Mediteranu su vladali tropsko - subtropski uslovi (Rage, 1997), koji su verovatno sprečavali mediteransku ekspanziju salmonidnih riba sve do pojave zahlađenja krajem pliocena i u pleistocenu (pre oko 2,5 miliona godina) koje je zahvatilo i ovaj region (Cortey i sar., 2004), što i rezultati ovog rada u potpunosti podržavaju.
Tokom pleistocena javljaju se orogeni pokreti na severnom obodu Mediterana (Tirensko, Jonsko, Jadransko, Egejsko more, Makedonija, Trakija, Anadolija), što dovodi do rasedanja u oblasti Makedonije, Skadarskog basena i na južnom obodu panonskog basena (Stevanović, 1982). Pleistocenski orogeni pokreti, uz uticaj glacijalnih i interglacijalnih kolebanja nivoa mora, koja su praćena uspostavljanjem rečnih veza, imaju veoma značajan uticaj na rasprostranjenje i diverzitet pastrmskih populacija na području Balkanskog poluostrva. Jasno geografsko i filogenetsko razdvajanje Da haplotipova koji su pronađeni isključivo u crnomorskom slivu, od Ad i Ad+ haplotipova koji su kao
94 Diskusija autohtoni pronađeni u egejskom i jadranskom slivu (u zavisnosti od haplotipa) na teritoriji Srbije, uz analizu molekularnog sata i geološke istorije šireg područja Balkana, objašnjava razvoj pomenutih linija najverovatnije alopatričkom fragmentacijom za vreme Pleistocena. Veliki diverzitet pronađenih haplotipova u okviru linija na analiziranom području, korenspondira sa fizičkom izolacijom kao i biološkim faktorima koji su doprineli njihovom ograničenom rasprostranjenju.
4.3. KONZERVACIJA GENETIČKE RAZNOVRSNOSTI POPULACIJA POTOČNE PASTRMKE
4.3.1. SPECIFIČNOSTI KONZERVACIJE POTOČNE PASTRMKE
Potočna pastrmaka, zbog veoma važnog socio-ekonomskog značaja, koji se ogleda ne samo u ekološkoj vrednosti vrste već i u značaju za sportski i komercijalni ribolov, predstavlja veoma ugroženu vrstu sa gledišta gubitka intraspecijske genetičke varijabilnosti, najčešće kao posledice čovekovih aktivnosti (degradacija staništa, prekomeran izlov, poribljavanje), (Laikre i Ryman 1996).
Specifičnost konzervacije potočne pastrmke ogleda se u sledećem: ¾ Opsežnim genetičkim istraživanjima u poslednjih 20 godina na taksonu koji je poznat kao «potočna pastrmka» otkriven je veoma značajan nivo genetičke raznovrsnosti, koji se ogleda u postojanju više evolutivnih linija (Bernatchez, 1992), kao i daljoj genetičkoj diferencijaciji između lokalnih populacija unutar svake od linija. Veoma značajan deo genetičke varijabilnosti predstavljen je na među-populacionom nivou, i to je glavni razlog što se konzervacione mere, ribarstveno i konzervaciono upravljanje ovom vrstom, moraju fokusirati na lokalne populacije (Frankel, 1970; 1974; Ryman i Ståhl, 1980; Utter, 1981; Meffe, 1986; Ryman, 1991). ¾ Degradacija staništa dovodi do istrebljenja ili redukcije brojnosti lokalnih populacija, a samim tim i do gubitka značajnog intraspecijskog diverziteta. ¾ Najveći broj preostalih, pre svega ribolovno atraktivnih, populacija potočne pastrmke veoma su ugrožene zbog svoga ekonomskog značaja, pre svega zbog aktivnosti kao što su: prekomeran izlov i poribljavanje.
95 Diskusija
Ove aktivnosti se smatraju bezopasnim ili čak korisnim, ali su najčešće katastrofalne po genofond autohtonih populacija (Laikre i sar., 1999). Osnovni faktori ugroženosti populacija potočne pastrmke koji dovode do gubitka genetičke varijabilnosti obrazloženi su u poglavlju Uvod (1.2.6.), a mogu se videti i iz tabele 14. Tabela 14. Prikaz tri glavne kategorije aktivnosti koje ugrožavaju intraspecijsku varijabilnost potočne pastrmke, kao i njihov odnos sa tri glavna procesa koja dovode do gubitka genetičkog diverziteta (Laikre i sar., 1999). Aktivnost Izumiranje Hibridizacija Gubitak varijabilnosti unutar populacija Ribolov X X Poribljavanje X X X Degradacija X (X) X staništa
Aktivnosti koje utiču na degradaciju staništa kao i na prekomeran izlov, nesumljivo prouzrokuju i treći vid aktivnosti, a to je poribljavanje. Poribljavanje se uglavnom smatra glavnom ribarstvenom merom za povećavanje brojnosti pastrmskih populacija. Odgovarajuće izvedeno poribljavanje može biti razmatrano kao značajna mera pružanja «prve pomoći» populacijama koje su u neposrednoj opasnosti od izumiranja prouzrokovanog demografskim faktorima. Samo dva tipa poribljavanja mogu omogućiti dugoročna pozitivna rešenja: ¾ Poribljavanje iz konzervacionih razloga ¾ Poribljavanje radi ponovnog uspostavljanja populacije (reintrodukcija), s tim sto se mora imati u vidu da pomenuta poribljavanja mogu biti pozitivna samo uz utvrđivanje i otklanjanje faktora koji su doveli do redukovanja ili izumiranja populacije. U ostalim slučajevima (najčešće radi poboljšanja ribolova), poribljavanje predstavlja glavnu pretnju genetičkom integritetu populacije (Hindar i sar., 1991a). Riblja mlađ koja se koristi za poribljavanje najčešće je genetički različita od autohtonih populacija, i predstavlja uglavnom domestifikovane - ribnjačke populacije. Rezultati do kojih su došli Apostolidis i sar. (1996a, 1997) pokazuju da je poribljavanje reke Nestos (egejski sliv) neautohtonim materijalom iz reke Aheloos (Jonski sliv), radi poboljšanja sportskog ribolova, imalo veoma mali doprinos u poboljšanju ribolova. Preko mtDNA markera procenjeno je da je oko 75% autohtone populacije bilo zamenjeno poribljenom pastrmkom.
96 Diskusija
4.3.2. STATUS UGROŽENOSTI POTOČNE PASTRMKE U EVROPI
Značajan problem koji se javlja pri konzervaciji potočne pastrmke vezan je upravo za taksonomsku konfuziju unutar pomenutog taksona (pogledati Uvod 1. 2. 4). Glavni razlog pojave taksonomskih problema su nedoumice oko klasifikovanja različitih morfoloških i/ili genetičkih grupa, koje se prema nekim autorima smatraju vrstama, a prema drugim podvrstama ili specifičnim genetičkim formama unutar vrste (Laikre i sar., 1999). Međutim, taksonomska konfuzija ne sme imati presudan uticaj na određivanje konzervacionih mera i samog gazdovanja ovim taksonom. Efikasna konzervacija potočne pastrmke može se realizovati samo na jedan način, a to je posvećivanje pažnje genetičkim razlikama između populacija, bez obzira da li ove populacije nazivamo vrste, podvrste ili lokalne populacije. Eksperti «TROUTCONCERN» mreže složni su u stavu da se trenutna ugroženost potočne pastrmke ne shvata dovoljno ozbiljno, kao i da je sadašnji konzervacioni napor fokusiran samo na nivo vrste, ne uzimajući pri tome u obzir genetički diverzitet unutar vrste. U slučaju da se ovakav trend nastavi, veoma brzo će doći do gubitka dragocenih bioloških resursa u vidu lokalnih populacija potočne pastrmke, koje će izumirati neslućenom brzinom (Laikre i sar., 1999). Pored toga što trenutni klasifikacioni sistem ne uzima u obzir intraspecijsku genetičku strukturu, veoma veliki nedostak koji onemogućava konzervaciju ne samo potočne pastrmke već i ostalih vrsta riba, jeste što je generalno konzervacioni status do sada ustanovljen za relativno mali broj taksona riba. Upavo pomenuta dva nedostatka predstavljaju glavnu manu raznih lista ugroženih životinjskih vrsta (Ryman i sar., 1995a; Leidy i Moyle, 1998). Potočna pastrmka nije uvrštena na listu Bernske konvencije, kao ni na Crvenu Listu (IUCN) ugroženih životinjskih vrsta na internacionalnom nivou. Na Crvenoj Listi status ugroženih taksona dobili su: Salmo carpio, Salmo letnica, i Salmo platycephalus, dok su dva druga taksona Salmo marmoratus i Salmo dentex uvrštena u kategoriju vrsta sa nedovoljno podataka. Taksoni Salmo marmoratus i Salmo macrostigma uključeni su na listu «EU Habitat Directive» kao vrste od opšteg interesa koje zahtevaju primenu posebnih konzervacionih mera. Eksperti «TROUTCONCERN» mreže saglasni su da sadašnja Crvena Lista u najvećem broju slučajeva neadekvatno procenjuje ugroženost potočne pastrmke, iz razloga što se glavni ugrožavajući faktori ne uzimaju sa dovoljnom ozbiljnošću. Allendorf (1988) smatra da Crvena Lista ugroženih riba u velikoj meri reflektuje geografsku distribuciju ihtiologa, a ne ugroženih vrsta.
97 Diskusija
4.3.3. DEFINISANJE KONZERVACIONIH JEDINICA
Pri svakoj konzervacionoj aktivnosti postavlja se osnovno i krucijalno pitanje: Šta treba da bude predmet biološke konzervacije? Iz prethodno iznešenih stavova jasno je da konzervacija vrste predstavlja zastareli princip, i da svakako nije dovoljna jer ne uzima u obzir genetičku varijabilnost između i unutar populacija, koja takođe mora biti sačuvana (Frankel i Soulé 1981). U poslednjih 20 godina vođene su debate na temu utvrđivanja odgovarajuće jedinice za konzervaciju. Najveći broj autora složio se da konzervacioni napor treba usmeriti ka nivou evolutivnih linija unutar vrste (Ryder, 1986; Waples, 1991a; 1995; Moritz, 1994; 1995; 1999). Evolutivne linije unutar vrste nazvane su «Evolutionary Significant Units» ili ESU. Ovaj princip je prvo bio primenjen na pacifičkom lososu (Waples, 1991a), ali je sugerisano da je primenjiv za bilo koju vrstu (Ryder, 1986). Waples (1991a) definiše «Evolutionary Significant Units» kao populaciju ili grupu populacija koje su suštinski reproduktivno izolovane od drugih konspecijskih populacionih jedinica, i koje predstavljaju važnu komponentu evolutivnog nasleđa vrste. Evolutivno nasleđe vrste čini genetička varijabilnost kao produkt prošlih evolucionih događaja, koja predstavlja osnovu od koje će zavisiti buduća evolucija vrste. U pogledu nivoa minimalne značajnosti koja bi bila neophodna za dodeljivanje ESU ne postoji određeni standard (Nielsen, 1995), tako da odluka šta može biti smatrano kao biološki – evolutivno značajno mora biti rešavana od slučaja do slučaja (Waples, 1995). Metode za utvrđivanje ESU uključuju sakupljanje genetičkih i ekoloških podataka, kao i njihovu analizu fenetičkim i kladističkim tehnikama radi utvrđivanja hijerarhijskih genetičko – ekoloških odnosa između populacija (Waples, 1991a; 1995; Nielsen, 1995). Kada se odnosi između populacija utvrde, neophodno je doneti odluku o nivou na koji će biti fokusiran konzervacioni napor (Dodson i sar., 1998), a to je onaj nivo koji nosi značajnu komponentu evolutivnog nasleđa vrste. Rešavanje pitanja konzervacije od slučaja do slučaja, uvođenjem koncepta ESU, predstavlja pokušaj da konzervacija ignoriše filogenetski (pragmatični) koncept vrste (Cracraft, 1987), kako bi preskočila taksonomske diskusije. Trenutno u Evropi nije zauzet jasan stav oko definisanja ESU za potočnu pastrmku.
98 Diskusija
U velikom broju realnih situacija odluka o konzervacionom naporu neće biti zasnovana isključivo na biološkim aspektima, iako su oni primarnog značaja, jer izražavaju ugroženost ESU kao osnovne - najniže jedinice biološke raznovrsnosti. Ekonomski, socijalni i pravni aspekti su veoma značajni faktori u ovom procesu. U slučaju postojanja izrazitih socio-ekonomskih implikacija, biološki aspekt sam po sebi nije dovoljan za definisanje ESU. Koncept «Operational Conservation Units» (OCUs) uveden je da opiše jedinicu konzervacije koja bi bila rezultat interakcije između bioloških i socio-ekonomskih faktora (Dodson i sar., 1998). Biološki zahtevi su u velikoj meri ustanovljeni unutar ESU. Prema tome, OCU predstavlja konstitutivni činilac ESU i njegovu interakciju sa socio-ekonomskim pitanjima. Privremena operativna konzervaciona jedinica može biti definisana u slučaju kada je neophodno brzo izvršiti konzervacione aktivnosti, a još uvek ne postoji dovoljno bioloških podataka za opisivanje preciznih evolutivnih odnosa između populacija.
4.3.4. KRAJNJA PREPORUKA U KONZERVACIJI POTOČNE PASTRMKE
Potočna pastrmka predstavlja ekološki, ekonomski, estetski i naučno izuzetno vrednu riblju vrstu čiji nezadovoljavajući konzervacioni status u evropskim zemljama poziva na posvećivanje dodatne pažnje i preduzimanje konkretnih mera zaštite. Jedan od glavnih razloga neadekvatne zaštite i konzervacije ove vrste u Evropi je generalna neobaveštenost o aspektu biološkog diverziteta koji predstavlja genetička varijabilnost unutar vrste. Zaštita isključivo vrste nije dovoljna, već se mora obratiti pažnja na postojanje razlika na genetičkom nivou unutar i između lokalnih populacija, koje takođe moraju biti konzervirane. Opšti cilj konzervacije biološkog diverziteta na svim nivoima, od gena do ekosistema, ustanovljen je internacionalno i primenjuje se u svim državama (među kojima je i SCG) koje imaju ratifikovanu Konvenciju o Biološkom Diverzitetu (Rio de Janeiro 1992). Međutim, pomenute obaveze zaštite na genetičkom nivou u najvećem broju zemalja još nisu transformisane u adekvatne akcije. Prepoznavanje važnosti konzervacije genetičkog diverziteta je posebno važno za vrste kao što je potočna pastrmka, koje se karakterišu velikom genetičkom diferenciranošću lokalnih populacija. Gubitak lokalnih populacija potočne pastrmke može rezultirati u iskorenjivanju relativno velikog dela genetičke varijabilnosti unutar vrste (Laikre i sar., 1999).
99 Diskusija
4.3.5. KONZERVACIJA DIVERZITETA HAPLOTIPOVA U SRBIJI I ZNAČAJ ZA RIBARSTVO
Problem konzervacije fonda potočne pastrmke veoma je slojevit i stoga veoma složen, što se može zaključiti iz prethodno iznetih činjenica.
Tabela 15. Primeri glavnih aktuelnih pretnji po populacije potočne pastrmke u nekim zemljama Evrope (Laikre i sar., 1999). Država Degradacija staništa Ribolov Poribljavanje Puštanje Širenje domestifikovanih Regulacija bolesti Prekomeran Brane Zagađenje Lovokrađa i/ili ne reka i ribolov autohtonih parazita populacija Danska X X X X Estonija X X X X X Finska X X X Francuska X X X Nemačka X X Grčka X X X X X X Republika X X X X X Irska Norveška X X X X Portugal X X X X X Rusija X X X Španija X X X X Švedska X X X Švajcarska X X X X Velika X X X X X Britanija
U različitim zemljama Evrope, na osnovu molekularno-genetičkih studija, ukazano je na postojanje različitog broja glavnih evolutivnih linija (Bernatchez, 1992), kao i preostalih autohtonih populacija, što sugeriše da su pojedini prostori mogli sačuvati veći deo preostalog genetičkog diverziteta vrste. U zemljama Evope konzervacija genetičkog diverziteta potočne pastrmke veoma varira, pre svega iz razloga što su evolutivni faktori rezultirali u različitoj količini i strukturi genetičkog diverziteta vrste u pojedinim zemljama.
100 Diskusija
Ako iz tabele 15. uporedimo glavne ugrožavajuće faktore po evropske populacije potočne pastrmke, kao i populacije u Srbiji (pogledati Uvod), najviše sličnosti po vrsti i značaju ugrožavajućih aktivnosti naći ćemo između Grčke i Srbije. U Grčkoj najozbiljniju pretnju po populacije potočne pastrmke ima preveliko ribolovno opterećenje, koje uključuje i sve vidove krivolova (eksplozivna sredstva, otrovi i različite klopke). Uništenje staništa je drugi veoma značajan razlog ugroženosti, i obuhvata izgradnju brana, regulaciju tokova i izgradnju sistema kanala, kao i zagađenje poljoprivrednim i kućnim otpadnim produktima. Na trećem mestu nalazi se poribljavanje, mada, kao i u najvećem broju drugih zemalja, ne postoji sistematična informacija o stepenu poribljavanja kao i o njegovim efektima na autohtone populacije (Laikre i sar., 1999). Redosled i značajnost ugrožavajućih faktora na pastrmske populacije Grčke u potpunosti koincidira sa trenutnim stanjem ugroženosti populacija potočne pastrmke u Srbiji. Kada su nam poznati ugrožavajući faktori koji predstavljaju potencijalnu, ako ne i realnu opasnost da vremenom dođe do istrebljenja jedinstvenih pastrmskih populacija na teritoriji Srbije, neophodno je izvršiti uklanjanje negativnih (ugrožavajućih) aktivnosti, kao i administrativno upravljački odrediti konzervacionu jedinicu na koju će biti usmeren konzervacioni napor. Ratifikacijom Konvencije o Biološkom Diverzitetu naša zemlja se obavezala da će primenjivati konzervacione mere na svim nivoima, od gena do ekosistema, što se u potpunosti slaže sa dve glavne preporuke genetičke konzervacije:
1. sačuvati što je više moguće prirodnih ekosistema 2. utvrditi genetičku strukturu populacije
Rezultati ove teze započeli su identifikaciju genetičkog diverziteta pastrmskih populacija, predstavljenog sa 15 mtDNA haplotipova u okviru tri evolutivne linije (Bernatchez i sar., 1992), uzorkovanjem na 35 lokaliteta u okviru sva tri slivna područja Republike Srbije. Na osnovu dobijenih rezultata haplotip se može odrediti za konzervacionu jedinicu na koju će biti usmeren konzervacioni napor. Na osnovu saznanja dobijenih na terenu prilikom prikupljanja materijala može se reći da je ugroženost populacija potočne pastrmke izuzetno velika, i da je neophodna hitna primena konzervacionih mera u vidu dodeljivanja konzervacionih statusa, kako staništu, tako i haplotipovima. Posebna pažnja mora biti posvećena
101 Diskusija haplotipovima koji su pronađeni po prvi put u okviru areala vrste. Populacije novopronađenih haplotipova dunavskog sliva (Da*Vl, Da*Vr i Da*Dž) izuzetno su malobrojne. U izvorišnom delu reke Vlasine na uzorkovanih 100 m toka pronađene su samo dve ribe i obe su posedovale haplotip Da*Vl, dok je donji deo reke već poribljavan neautohtonom pastrmkom. U gornjem delu reke Vrle pronađen je haplotip Da*Vr koji već deli stanište sa introdukovanim haplotipom ADcs1, a samo stanište je ugroženo izgradnjom fabrike vode na obali reke. Haplotip Da*Dž pronađen je na 1 primerku u Džepskoj reci analizom oko 100 m toka. Novi haplotip jadranskog sliva Ad*Pe, kao i ostali koji su pronađeni u okviru istog slivnog područja (Ad+Prz i ADcs11), kao i dela egejskog sliva Ad*Ti (Lepenac sa pritokama), trenutno nisu pod našim uvidom zbog nemogućnosti pristupa pomenutom području. Novopronađeni haplotip Ad*Bož uzorkovan je u slivu Dragovištice i, u odnosu na ostale nove haplotipove, njegova brojnost je na zavidnom nivou. Međutim, i on je ugrožen poribljavanjem Dragovištice u donjem delu toka kroz Bugarsku materijalom At linije. Posebno je bitno pomenuti da je na lokalietima Vlasina, Vrla i Božica prisutna izrazita degradacija staništa, zbog formiranja akumulacionih jezera, dok se iz Ljubatske reke značajan deo vode prevodi u sliv Južne Morave. Takođe, izuzetno mala brojnost primećena je na ostalim uzorkovanim lokalitetima, izuzev lokaliteta gde je uzorkovan haplotip Da1. U Srbiji je do sada, na nacionalnom nivou, jedino populacijama potočne pastrmke u slivu Dragovištice bio dodeljen konzervacioni status na bazi IUCN kriterijuma. Još pre utvrđivanja novog mtDNA haplotipa (Ad*Bož), iz literaturnih podataka bilo je poznato da egejski sliv jugo-istočne Srbije naseljava vrsta Salmo macedonicus (Karaman, 1924). Ispitivanjima koja su obavili Marić i sar. (2004), utvrđena je i biomasa pastrmskih populacija sliva Dragovištice koja je iznosila 8,8 kg km-1, što je bilo za oko četiri puta manje u odnosu na biomasu populacija potočne pastrmke u reci Mlavi (istočna Srbija). Populacije potočne pastrmke u slivu Dragovištice zbog njihove taksonomske specifičnosti, kao i veoma malog areala na teritoriji Srbije koji naseljavaju, uz utvrđenu malu biomasu, dobile su operativni status Lower Risk (conservation dependent). Trenutno, ugroženost potočne pastrmke pokušava se legislativno regulisati određenim zaštitnim merama u ribarstvu, kao što su minimalna dozvoljena dužina ulova, period lovostaja u vreme mresta, strogo propisan režim ribolova u pogledu mogućnosti i količine ulovljenih pastrmki, broja ribolovnih dana tokom sezone, itd. Sve pobrojane
102 Diskusija mere su veoma dobre, ali one do sada nisu dale pozitivne rezultate u zaštiti, pre svega zbog njihovog nepotpunog sprovođenja.
Za potpunu zaštitu pastrmskih populacija neophodno je primeniti sledeće preporuke: 1. Utvrđivanje stanja populacije 2. Utvrđivanje i otklanjanje ugrožavajućih faktora koji su doveli do smanjenja brojnosti populacije 3. Utvrđivanje genetičke strukture populacije 4. U slučaju pronalaska novih genetičkih varijanti izvršiti dodelu konzervacionog statusa populaciji i staništu
Na osnovu dobijenih rezultata svi lokaliteti na kojima su pronađeni novi haplotipovi, kao i lokaliteti na kojima su pronađeni vrlo retki haplotipovi (Tabela 9), trebalo bi da dobiju poseban konzervacioni status kao stanište (određenu kategoriju i stepen zaštite), uz dodelu konzervacionog statusa na nacionalnom nivou haplotipovima koji su na datim lokalitetima pronađeni. Iako potočna pastrmka nije uvrštena na Crvenu Listu (IUCN) ugroženih životinja na internacionalnom nivou, pojedine države su joj dodelile status ugroženih vrsta na nacionalnom nivou (Grčka - Endangered, Španija – Vulnerable i Švedska - Lower risk, near threatened). Pošto su ugrožavajući faktori u Grčkoj i kod nas vrlo slični, logično bi bilo da i mi sledimo primer Grčke i da bar našim jedinstvenim populacijama (teritorija uže Srbije) dodelimo istu kategoriju ugroženosti. Pri dodeljivanju nacionalnog konzervacionog statusa moramo uzeti u obzir i ribolovnu atraktivnost pomenutih voda, kao i njihov potencijalni socio-ekonomski značaj. Vodama koje nisu posebno ribolovno atraktivne u izvorišnim delovima (Vrla, Vlasina i Džepska), a koje predstavljaju staništa jedinstvenih genetičkih formi (Da*Vr, Da*Vl i Da*Dž), treba kao staništu dodeliti I stepen zaštite (od izvorišta u dužini od 4 km), a haplotipovima status ugroženosti (Endangered). Reke u slivu Dragovištice u kojima je pronađen haplotip Ad*Bož (Lisina, Božica, Ljubata i Brankovačka reka (potencijalno)) koje su ribolovno atraktivne, a samim tim mogu imati i ekonomski značaj, moraju dobiti specijalni režim zaštite koji bi omogućio očuvanje genetičke jedinstvenosti pastrmskih populacija, kao i održivi ribolov kao jedan od izvora prihoda lokalnoj zajednici. Pastrmske populacije koje naseljavaju
103 Diskusija pomenute reke sliva Dragovištice dobile bi konzervacioni status Lower risk, near threatened. Izvorišni delovi navedenih reka u dužini od 4 km morali bi dobiti kao stanište I stepen zaštite, dok bi ostali deo toka pomenutih reka do ušća u Dragovišticu, kao i sama Dragovištica, bio pod II stepenom zaštite. Dodela navedenog konzervacionog statusa uz primenu strogih mera kontrole i upravljanja (lov po pravilu “uhvati-i-pusti” uz mogućnost nošenja jedne ribe preko 40 cm) obezbedio bi stalnost korišćenja, posebno ukoliko bi se adekvatnim poribljavanjem kroz neki period restaurirala genetička struktura populacije približna originalnoj. Perspektive haplotipa Ad*Bož u pogledu opstanka biće vrlo optimistične, naročito ako se obistine sumnje da je areal ovog haplotipa vezan i za ostale reke egejskog sliva, što će pokazati rezultati budućih istraživanja (Diskusija str. 79). Rekreativni («sportski») ribolov, koji se u velikom delu areala pastrmke smatra najelitnijim vidom rekreativnog ribolova, upražnjava se intenzivno. Intenzitet ribolova (a kod nas se pod ovim mora obuhvatiti i krivolov) je veliki, jer je cena takvog ribolova znatna i donosi upravljačima ili vlasnicima ribolovnih voda na kojima se vrši velike prihode u svetu, a ponegde i kod nas. Ovaj ribarstveno – komercijalni pritisak je pod uslovima kada nije bilo moguće zaokruženo odrediti i sprovoditi adekvatne konzervacione mere u većem delu areala pastrmke, a posebno kod nas i u bližem okruženju, snažan ugrožavajući faktor po pastrmski (geno)fond. Kao posledica velikog ribolovnog pritiska, najčešće se pribegava poribljavanju kao meri upravljanja pastrmskim fondom, što je uglavnom kontraproduktivno po originalnost pastrmskih populacija. Kod nas se poribljavanje najčešće vršilo i vrši onim materijalom koji je u datom trenutku dostupan, bez obzira na činjenicu koliko je odgovarajući, bez skoro bilo kakvih ograničenja i kontrole. Za područje stare SFRJ (izuzev Slovenije), a posebno za Srbiju, ne postoji precizno vođena evidencija o poribljavanju pastrmskih reka, osim u nekoliko pojedinačnih slučajeva. Zna se da je materijal za poribljavanje nabavljan iz mrestilišta u Ivanjici, Konjicu, Vrelu Bune i Blagaju, kao i iz Slovenije i sa Ohrida, i da su poribljavanja vršena širom Srbije. Srećom po pastrmski fond kod nas, ta poribljavanja su uglavnom vršena na ribolovno atraktivnim vodama: Mlavi, Krupaji, Gradcu, Moravici, Drini i ponegde drugde, ali su još preostale vode (koje su bile u fokusu uzorkovanja ove teze) koje su i / ili ribolovno neatraktivne, i / ili fizičkim preprekama odvojene od delova, obično nizvodnih, koji su ribolovno atraktivni svojom lakom dostupnošću ili veličinom pastrmke u njima (Marić, 2002). Prepoznavanje genetičkog identiteta
104 Diskusija pastrmki omogućava uspostavljanje sistema konzervacije uključenog u mere održivog ribolovnog korišćenja pastrmskog fonda i po obimu te aktivnosti, i po dubini implementacije. Ovakav vid ribarstvenog korišćenja pastrmskog fonda biće od značaja tek kada budemo imali s jedne strane potrebne parametre (stanje populacije, ribolovno opterećenje, genetičku strukturu), a sa druge uređen sistem proizvodnje autohtonog materijala za poribljavanje, u slučajevima kada je ova mera neophodna. Da bi se proizvodnja autohtonog materijala za poribljavanje mogla realizovati, za početak je neophodno ustanoviti referentnu laboratoriju koja bi se bavila utvrđivanjem genetičke strukture populacija, na osnovu koje bi se za specifične i ugrožene populacije formiralo matično jato koje bi služilo za dobijanje materijala za poribljavanje. Pošto je formiranje referentne laboratorije neophodan uslov za proveru genetičke strukture populacije, a samim tim i za konzervaciju retkih i ugroženih (autohtonih) populacija, cela procedura morala bi biti i zakonski regulisana. Ako se u ovom smislu u dogledno vreme ne promeni zakonska regulativa, i ne omogući utvrđivanje genetičke strukture populacija, najbolje bi bilo ne vršiti poribljavanja genetički neproverenim materijalom, već posebnu pažnju obratiti na zaštitu ugroženih populacija uz strogu zakonsku primenu zaštitnih mera u ribarstvu, ili pak, ako je neophodno, zabraniti izlov, pa u krajnjem slučaju i ribolov u periodu neophodnom za oporavak populacije. Kako oba aspekta konzervacionih i ribarstvenih aktivnosti zaslužuju najveću pažnju, u sadašnjim uslovima, u kojima se ribarstvo kao privredna delatnost kod nas nalazi (a u okviru nje i rekreativni ribolov), zahtevaju korenite promene i u zakonskom smislu i u pogledu dosledne implementacije u budućoj ribarstvenoj i konzervacionoj praksi. Sa zakonske strane, potreba za harmonizacijom naših ribolovnih propisa i konzervacione prakse sa istima u zemljama EU doprineće uvođenju pravila primerenijih vremenu i stanju u oblasti koja bi se time regulisala, dok bi, sa ribarstvene strane, uređenje celog sistema višestruko povećalo produktivnost pastrmskog ribolova i omogućilo upravljačima pastrmskih ribolovnih voda obavljanje delatnosti koja bi po profitabilnosti bila približna onoj u zemljama u kojima je to odgovarajuće regulisano. Time bi se jasno pomogli interesi nadležnih državnih organa iz oblasti zaštite životne sredine i ribarstva s jedne strane (kao propisivača, kontrolora i implementatora zakona) i najrazličitijeg opsega ribarstvenih subjekata kao upravljača pastrmskih ribolovnih voda, što otvara i put ka odgovoru na pitanje subjekata koji bi trebalo da se oko ove teme (i drugih, šire
105 Diskusija posmatrano) angažuju. Pri tome, uzimajući u obzir broj pastrmskih voda i ribolovni prtisak, sasvim je izvesno da bi se konzervacione aktivnosti vezane za pastrmski fond u Srbiji odvijale niskim intenzitetom, ali obavezno konstantno, što bi trebalo da bude finansijski održiva aktivnost u sklopu ribarstveno-finansijskog obima, dok bi ribarstvene aktivnosti, pre svega one vezane za zaštitu ribljeg fonda u ribarstvu, trebalo da budu višestruko intenzivirane u praksi. Ovo je pre svega značajno stoga sto bi pozitivne efekte ovako uređene održive ribarstvene i konzervacione prakse osetili stanovnici ruralnih, trenutno slabo razvijenih i raznovrsnošću delatnosti ograničenih područja Srbije i što bi, u sklopu ostalih vidova konzervaciono zavisnih aktivnosti, to moglo predstavljati zamajac njihovom održivom privrednom razvoju u celini.
106 Zaključci
5. ZAKLJUČCI
Na osnovu rezultata ove studije utvrđeno je postojanje tri glavne filogeografske grupe potočne pastrmke na teritoriji Srbije: dunavske (Da), «južne» (Ad; Ad+) i atlantske (At). U okviru sve tri grupe identifikovano je, na osnovu 18 polimorfnih mesta, ukupno 15 haplotipova, od kojih je šest po prvi put opisano untar areala vrste. Od šest novo opisanih haplotipova, tri su iz dunavske linije i pronađena su u slivu Južne Morave (Da*Vl (Vlasina), Da*Vr (Vrla) i Da*Dž (Džepska reka)), dok su dva od preostala tri koja pripadaju Ad liniji, pronađena u egejskom slivu (Ad*Bož (sliv Dragovištice) i Ad*Ti (sliv Lepenca), a jedan je pronađen u jadranskom slivu Ad*Pe (Pećka Bistrica).
Rekonstrukcijom filogenije NJ i MP metodama dobijena je vrlo slična topologija stabla, pri kojoj haplotipovi pokazuju pripadnost filogenetskim linijama potočne pastrmke. «Majority role consensus 50% tree» otkriva jasno razdvajanje sa visokom potporom na dve glavne klade (Da i At klada + «južna klada» (Ad, Ad+, Ma i Me)). U «južnoj» kladi haplotip Ad*Bož zauzima ancestralnu poziciju (Slika 30), ali zbog niskih “bootstraping” verovatnoća za NJ i MP analize njegovu ancestralnost tek treba dokazati rezultatima drugih DNA analiza, ali i analiziranjem drugih tipova kararaktera (morfoloških). U «južnoj» kladi, pored Ad haplotipova (ADcs1, ADcs11, Ad*Pe i Ad*Ti) koji nisu jasno grupisani u kladu, javljaju se dve već poznate podgrupe (mediteranska i marmoratus) i treća, dopunska, koja je prvi put identifikovana (Ad+). Članovi Me, Ma i Ad+ klade karakterišu se istim brojem intra- kladnih sinapomorfizama (pozicije 113 i 262 za Ma, 146 i 196 za Me, 126 i 262 za Ad+; Tabela 13) što sugeriše isti nivo divergencije ovih klada. Novu (Ad+) kladu čine haplotipovi Ad+Prz, Ad+N i Ad+RC, i ona je statistički poduprta istim nivoom verovatnoće kao i već ustanovljene podgrupe (klade Me i Ma). Haplotip Ad+Prz pronađen je u Prizrenskoj Bistrici, Mrtvici i Tripušnici (u koju je, kako pretpostavljamo, introdukovan iz Neretve), Ad+N je pronađen u Neretvi, a Ad+RC u Rijeci Crnojevića. Geografska distribucija pomenutih haplotipova vezana je za reke jadranskog sliva jugo-zapadnog Balkana i
107 Zaključci poklapa se sa distribucijom vrste Salmo farioides (Karaman, 1937), što i navodi na zaključak da Ad+ klada ustvari predstavlja Salmo farioides.
Unutar Da klade uočen je veliki nivo genetičke divergencije (Tabela 11). Ovaj podatak, kao i sinapomorfne pozicije (Tabela 13) najbazalnijih haplotipova Da klade (Da*Vr i Da*Dž) (Slika 30) i haplotipova iz svih ostalih linija, ide u prilog stavu da dunavske populacije predstavljaju najstariju fragmentiranu liniju Salmo trutta kompleksa. Ancestralna pozicija Da linije prikazana je i sekvencioniranjem celog kontrolnog regiona mtDNA (Cortey i sar., 2004; Templeton, 2004). Ovakvi rezultati navode na zaključak da je potočna pastrmka, najverovatnije, poreklom iz Paratetisa, odakle se, preko pleistocenskih veza, širila iz basena Crnog mora, Kaspijskog i Aralskog jezera prema Atlantiku na jednoj i Mediteranu na drugoj strani. Prilog ovoj hipotezi predstavlja pronalazak ekstremno divergentnih haplotipova kao što su Da*Vr i Da*Dž, koji zauzimaju intermedijarni položaj na mreži (Slika 31) između Da, At i «južne grupe» (Ad, Ad+, Ma i Me) haplotipova, što je posebno karakteristično za haplotip Da*Vr, čija se centralna pozicija može uočiti i preko vrednosti genetičkih distanci između pomenutih grupa. Sve navedeno dodatno potvrđuje dugo postojanje i ancestralno poreklo Da linije u evoluciji potočne pastrmke.
Na analiziranom području, u zavisnosti od sliva, bilo je očekivano prisustvo autohtonih haplotipova dunavske i Ad linije. Međutim, analizom je utvrđeno i prisustvo haplotipa At1 koji pripada atlantskoj liniji. Nalaz pomenutog haplotipa na dva lokaliteta, Gradac i Brankovačka reka, posledica je poribljavanja, jer se radi o haplotipu atlantske linije koji preovladava u ribnjačkoj proizvodnji mlađi potočne pastrmke. Takođe, bitno je pomenuti i nalaz haplotipa Ad linije ADcs1 na dva lokaliteta unutar dunavskog sliva (Jerma i Vrla), za koga smatramo da je na ove lokalitete dospeo antropogenom aktivnošću iz sliva Dragovištice (Jerma – poribljavanje, Vrla – ispumpavanje vode u sliv Južne Morave). Između egejskog i jadranskog sliva utvrđena je jasna genetička raspodela haplotipova, koju jedino narušava haplotip Ad+Prz pronađen u Tripušnici (egejski sliv), koji je u ovaj sliv dospeo kao posledica poribljavanja materijalom iz sliva Neretve.
108 Zaključci
Visok nivo genetičkog diverziteta koji je otkriven opisivanjem nekoliko novih polimorfizama unutar različitih linija potočne pastrmke, izrazita divergencija unutar dunavskih populacija na teritoriji Srbije, kao i pretpostavka postojanja evolutivno zasebne linije (Ad+; Salmo farioides) u jadranskom slivu, sugerišu da bi u narednom periodu trebalo preduzeti opsežne analize pastrmskih populacija na preostalom delu Balkana (Crna Gora, Makedonija, Albanija, Bosna i Hercegovina, Bugarska). Pošto analizirani prostor Srbije predstavlja samo mali deo Balkanskog poluostrva, za očekivati je da je genetički polimorfizam potočne pastrmke unutar celog regiona znatno veći.
Ova studija je pokazala da autohtone populacije još uvek postoje u Srbiji, barem u izvorišnim delovima reka. Ova informacija je od posebne važnosti za pravilno gazdovanje u cilju održanja autohtonog genetičkog diverziteta potočne pastrmke u Srbiji. Gazdovanje mora prepoznati biološku realnost postojanja genetičkog diverziteta i pronaći odgovarajuće strategije na bazi ove realnosti za efikasnu konzervaciju genetičke varijabilnosti (Ryman, 1991).
Pošto su novo pronađeni haplotipovi na teritoriji Srbije malobrojni i pod stalnom su pretnjom ugrožavajućih aktivnosti, neophodno im je, na nacionalnom nivou, dodeliti odgovarajuće konzervacione statuse. Novopronađenim haplotipovima (Da*Vr, Da*Vl i Da*Dž) u vodama koje nisu ribolovno atraktivne, u izvorišnim delovima (Vrla, Vlasina, Džepska), predložena je dodela statusa ugroženosti (Endangered), dok onima koji se nalaze u ribolovno atraktivnim vodama (reke sliva Dragovištice) u kojima je pronađen haplotip Ad*Bož predlaže se dodela konzervacionog statusa Lower risk, near threatened, koji bi trebao da zadovolji očuvanje genetičke jedinstvenosti, sa jedne strane, a sa druge održivi ribolov. Takođe, neophodno je dodeliti staništima na kojima su pronađeni novi haplotipovi, a to su gornji tokovi reka (Vrla, Vlasina, Džepska i reke sliva Dragovištice), odgovarajuću kategoriju i I stepen zaštite u prva 4 km toka.
109 Zaključci
Oba aspekta konzervacionih i ribarstvenih aktivnosti na populacijama potočne pastrmke zahtevaju vrlo brze i korenite promene, kako u zakonskom smislu, tako i u doslednoj primeni u budućoj konzervacionoj i ribarstvenoj praksi.
110 Summary
6. SUMMARY
Upon results of this study, the occurrence of three main phylogeographic groups of the brown trout was confirmed at the territory of Serbia: Danube (Da), “southern” (Ad; Ad+) and Atlantic (At). Within all groups, 15 haplotypes based on 18 polymorphic places were identified; six of them were recorded for the first time. Three new haplotypes belong to Danube group and were found in Južna Morava drainage (Da*Vl (Vlasina), Da*Vr (Vrla) i Da*Dž (Džepska River)), while within three others, belonging to Ad group, two were found in Aegean Sea basin (Ad*Bož (Dragovištica River drainage) and Ad*Ti (Lepenac River drainage); one was found in Adriatic Sea basin Ad*Pe (Pećka Bistrica River). Phylogeny reconstruction based on NJ and MP showed very similar tree topology. «50% Majority role consensus tree» revealed clear division of three main clades with high support level (Da and At clade + «southern clade» (Ad, Ad+, Ma and Me). Haplotype Ad*Bož have the ancestral position in the «southern» clade (Fig 30), but because of the low “bootstrapping” probabilities for NJ i MP analyses, this ancestral state should be additionaly proved with other DNA analyses and analyses of morphologic characters. Within «southern» clade, in addition to Ad haplotypes (ADcs1, ADcs11, Ad*Pe i Ad*Ti) that were not apparently grouped together, the presence of two well known subdivisions was confirmed (Mediterranean and marmoratus); the third additional subdivision Ad+ was identified for the first time. The members of the Me, Ma i Ad+ clades are characterized with the same numbers of intra-clade synapomorphies (positions 113 and 262 for Ma, 146 and 196 for Me, 126 and 262 for Ad+; Table 13); this suggest the same level of divergence of these clades. The new clade (Ad+) includes haplotypes Ad+Prz, Ad+N and Ad+RC, and has the same level of support as other (previously known) subdivisions (clades Me and Ma). Haplotype Ad+Prz was found in Prizrenska Bistrica River, Mrtvica River and Tripušnica River (we think that this haplotype was introduced from the Neretva River into Tripušnica River); Ad+N was found in Neretva River and Ad+RC in Rijeka Crnojevića River. Geographic distribution of those haplotypes is connected with the rivers of the Adriatic basin of the south-western Balkan peninsula and corresponds with the distribution of Salmo farioides (Karaman, 1937); this suggests that Ad+ clade represents Salmo farioides, and could belong to the new line within the “southern” group. Strong genetic divergence was found within the Da clade, that was based on the genetic distances (Table 11). Strong divergence, synapomorphic positions (Table 13) of the most basal haplotypes belonging to Da clade (Da*Vr and Da*Dž) (Fig 30), as well as position of the haplotypes of all other lineages, suggest that Danube populations represent the oldest fragmental line of Salmo trutta complex. Ancestral position of Da line was also shown by sequencing of the whole mtDNA control region (Cortey at al., 2004; Templeton, 2004). These results suggest that brown trout originated from the Parathetis and spred from the
111 Summary
Paratethis through the Pleistocene connections from the Black See basin, Caspian and Aral lakes toward the Atlantic Ocean and Mediterranean See. Extremely divergent haplotypes like Da*Vr and Da*Dž have intermediate positions in the network (Fig 31) between Da, At and «southern group» (Ad, Ad+, Ma i Me) of haplotypes. That specially accounts for the Da*Vr haplotype, that holds central position judging from its genetic distances to the rest of haplotypes. All these facts confirm the long term presence and ancestral origin of Da lineage in evolution of the brown trout. In spite of expectation that only wild haplotypes of Ad and Da lineages occur in Serbia, the analyses confirmed presence of haplotype At1 which belongs to Atlantic line. The finding of this haplotype in two localities, Gradac River and Brankovačka River, is a fisheries-related impact that predomintes in hatcheries’ production of brown trout fry for stocking. The occurrence of haplotype ADcs1 of the Ad lineage in two localities in the Danube River basin (Jerma and Vrla Rivers) could be a consequence of sotcking and transfer of water from the Dragovistica River drainage, respectively. The clear genetic dispersion of haplotypes was recorded between basins of Aegean and Adriatic Seas. It was disturbed only by Ad+Prz haplotype, which occured in Tripusnica River (Aegean Sea basin) after the stocking from the Neretva River drainage. Since the territory of Serbia represents only the small part of the Balkan Peninsula, the higher lever of genetic polymorphism of the brown trout from the whole region of the Balkans (Montenegro, Macedonia, Albania, Bosnia and Herzegovina, Bulgaria) could be expected, considering the recorded high level of genetic diversity, finding of new polymorphic places within different lines of the brown trout, strong divergence within Danube populations in the territory of Serbia, as well as suspected presence of evolutionary divergent line (Ad+; Salmo farioides) in the Adriatic basin. This study showed that aboriginal, i.e., populations still exist in Serbia, at least in spring sections of streams and rivers. This is very important for the conservation of autochthonous genetic diversity of the brown trout in Serbia. The efficient conservation of existing genetic variability, i.e., diversity, is to be taken into account in the strategy of fisheries management (Ryman, 1991). Since the new haplotypes are not very frequent in Serbia and are under the constant threat, proper conservation status in national legislation is needed. The conservation status of three new haplotypes from Da group (Da*Vr, Da*Vl and Da*Dž) in the headwaters of Vrla, Vlasina and Džepska Rivers should be set as EN, whereas for AD*Bož haplotype it should be set as LRnt in particular waters of the Dragovistica River drainage where some brown trout, attractive for fishing, occur. That would enable both maintenance of existing genetic uniqueness and sustainable fisheries utilization. However, the first four kilometers of each of those rivers should be assigned in the highest protection category. Both conservational and fisheries practice concerning the brown trout are in strong and urgent necessity for changes in legislation, as well as in consistent and harmonized application.
112 Literatura
7. LITERATURA
Aebersold, P. B., Winans, G. A., Teel, D. J., Milner, G. B., Utter, F. M. 1987. Manual for starch gel electrophoresis: a method for the detection of genetic variation. NOAA Technical Report NMFS 61, U.S. Department of Commerce, National Oceanic and Atmospheric Administration, National Marine Fisheries Service, U.S.A.
Aganović, M. 1979. Salmonidne vrste riba i njihov izgoj. IGKRO "Svijetlost", Sarajevo.
Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Watson, J. D. 1994. DNA repair. V: Molecular biology of the cell. New York, Gerland Publishing, pp. 242-251.
Alegria Hernandez V. 1985. A contribution to the study of heterogeneity of the Adriatic sardine (Sardina pilchardus Walb.) population. Acta Adriatica, 26: 109-122.
Allendorf, F. W. 1988. Conservation biology of fishes. Conservation Biology, 2: 145-148.
Allendorf, F. W., Leary, R. F. 1988. Conservation and distribution of genetic variation in a polytypic species, the cutthroat trout. Conservation Biology, 2: 170-184.
Allendorf, F. W., Ryman, N., Stennek, A., Stähl, G. 1976. Genetic variation in Scandinavian brown trout (Salmo trutta L.): evidence of distinct sympatric populations. Hereditas, 83: 73-82.
Allendorf, F. W., Waples, R. S. 1996. Conservation and Genetics of Salmonid Fishes. In: Avise, J. C. & Hamrick, J. L. (eds.) Conservation Genetics. Case Stories from Nature, Chapman & Hall, New York, pp. 238-280.
Amos, B., Schlöterer, C., Tautz, D. 1993. Social structure of pilot whales revealed by analytical DNA profiling. Science, 260: 670-672.
Anderson, B. G., Borns, H. W. Jr. 1994. The Ice Age world. Scandinavian Univ. Press, Oslo, Norway.
Anđelković, S. J. 1989. Tercijarne ribe Jugoslavije stratigrafsko – paleontološko paleoekološka studija. Paleontologica Jugoslavica. Jugoslovenska Akademija Znanosti i Umjetnosti Zagreb, 38: 1-121.
Angeres, B., Bernatchez, L., Angers, A., Desgroseillers, L. 1995. Specific microsatellite loci for brook charr reveal strong population subdivision on a micrographic scale. Journal of Fish Biology, 47 (Suppl. A): 177-185.
Anonimni autori. 1994. «Zakon o ribarstvu». Službeni glasnik Republike Srbije, 35, pp. 2342-2346.
Anonimni autori. 2004. «Zakon o zaštiti životne sredine». Službeni glasnik Republike Srbije, 135, pp. 29-43.
113 Literatura
Antunes, A., Alexandrino, P., Ferrand, N. 1999. Genetic characterization of Portuguese brown trout (Salmo trutta L.) and comparison with other European populations. Ecology of Freshwater Fish, 8: 194-200.
Antunes, A., Templeton, R. A., Guyomard, R., Alexandrino, P. 2002. The role of Nuclear Genes in Intraspecific Evolutionary Inference: Geneology of the transferin Gene in the Brown Trout. Molecular Biology and Evolution, 19 (8): 1272-1287.
Apostolidis, A., Karakousis, Y., Triantaphyllidis, C. 1996. Genetic divergence and phylogenetic relationships among Salmo trutta L. (brown trout) populations from Greece and other European countries. Heredity, 76: 551-560.
Apostolidis, A., Karakousis, Y., Triantaphyllidis, C. 1996a. Genetic differentiation and phylogenetic relationships among Greek Salmo trutta L. (brown trout) populations as revealed by RFLP analysis of PCR amplified mitochondrial DNA segments. Heredity, 77: 608-618.
Apostolidis, A. P., Triantaphyllidis, C., Kouvatsi, A., Economidis, P.S. 1997. Mitochondrial DNA sequence variation and phylogeography among Salmo trutta L (Greek brown trout) populations. Molecular Ecology, 6:531-542.
Aquadro, C. F., Greenberg, B. D. 1983. Human mitochondrial DNA variation and evolution: analysis of nucleotide sequences from seven individuals. Genetics, 103: 287-312.
Arkhipov, S. A., Ehlers, J., Johnson R. G., Wright H. E. Jr. 1995. Glacial drainages towards the Mediterranean during middle and late Pleistocene. Boreas, 24: 196- 206.
Avise, J. C. 1992. Molecular population structure and the biogeographic history of a regional fauna: a case history with lessons for conservation biology. Oikos, 63: 62-76.
Avise, J. C. 1994. Molecular tools. V: Molecular markers, natural history and evolution. Chapman & Hall, New York, pp. 44 - 91.
Avise, J. C. 1998. The history of phylogeography: a personal reflection. Molecular Ecology, 7: 371-379.
Avise, J. C. 2000. Phylogeography. The history and Formation of Species. Harvard University Press, Cambridge, MA.
Avise, J. C., Arnold, J., Ball, R. M., Bermingham, E., Lamb, T., Neigel J. E. Reeb, C. A. Saunders, R. C. 1987. Intraspecific phylogeography: The mitochondrial DNA and bridge between population genetics and systematics. Annual Review of Ecology and Systematics, 18: 489-522.
Balon, K. E. 1968. Notes to origin and evolution of trouts and salmons with special reference to the Danubian trouts. Acta Societatis Zoologicae Bohemoslovacae, 32 (1): 1-21.
114 Literatura
Banarescu, P. 1960. Einige Fragen zur Herkunft und Verbreitung der Süsswasserfishfauna der europäisch – mediterranen Unterregion. Archiv fuer Hydrobiologie, 57: 16-134.
Banarescu, P. 1973. Origin and affinities of the freshwater fish fauna of Europe. Ichthyologia, Beograd 5: 1-8.
Banarescu, P. 1977. Position zoogéographique de l'ichthyo – faune d'eau douce d'Asie occidentale. Cybium, 2: 35-55.
Banarescu, P. 1990. Zoogeography of freshwater: general distribution and dispersal of freshwater animals. Aula Verlag ed. Wiesbaden, 1: 1-511.
Banarescu, P., Blanc, M., Gaudet, J. L., Mureau, J. C. 1971. European inland water fish, multilingual catalogue. Fish News Books, London, pp. 170.
Behnke, R. J. 1965. A systematic study of the family Salmonidae with special reference to the genus Salmo. Ph.D. thesis, University of Berkley, California, U.S.A., pp. 273.
Behnke, R. J. 1968. A new subgenus and species of trout, Salmo (Platysalmo) platycephalus from south central Turkey, with comments on the classification of the subfamily Salmonidae. Mitteilungen Hamburgisches Zoologisches Museum und Institut, 66: 1-15.
Behnke, R. J. 1986. Brown trout. Trout, 27: 42-47.
Berg, L. S. 1948. Freshwater fishes of the USSR and adjacent countries. Zoological Institute Akademy Nauk Moscow USSR 1(27), volume 1. In Russian, English translation, 1962: Office of Technical Services, Department of Commerce, Washington, DC.
Berg, W. J., Ferris, S. D. 1984. Restriction endonuclease analysis of salmonid mitochondrial DNA. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 41: 1041-1047.
Bernatchez, L. 1995. A role for molecular systematics in defining significant evolutionary units. In Nielsen, J.L. and Powers, D.A. (eds.). Evolution and the aquatic ecosystem: defining unique units in population conservation. American Fisheries Society Symposium 17, American Fisheries Society, Bethesda, Maryland, USA, pp. 114-132.
Bernatchez, L. 2001. The evolutionary history of brown trout (Salmo trutta L.) interred from phylogenetic, nested clade, and mismatch analyses of mitochondrial DNA variation. Evolution, 55 (2): 351-379.
Bernatchez, L., Danzmann, R. G. 1993. Congrugence in control - region sequence and restriction – site variation in mitochondrial DNA of brook charr (Salvelinus fontinalis Mitchill). Molecular Biology and Evolution, 10: 1002-1014.
115 Literatura
Bernatchez, L., Guyomard, R., Bonhomme, F. 1992. DNA sequence variation of the mitochondrial control region among geographically and morphologically remote European brown trout Salmo trutta populations. Molecular Ecology, 1: 161-173.
Bernatchez, L., Osinov, A. G. 1995. Genetic diversity of trout (genus Salmo) from its most eastern native range based on mitochondrial DNA and nuclear gene variation. Molecular Ecology, 4: 285-297.
Bernatchez, L., Wilson, C. C. 1998. Comparative phylogeography of Nearctic and Palearctic fishes. Molecular Ecology, 7: 431-452.
Berrebi, P., Povž, M., Jesenšek, D., Cattaneo – Berrebi, G., Crivelli, A. J. 2000. The genetic diversity of native, stocked, and hybrid populations of marble trout in Soča river, Slovenia. Heredity, 85 (3): 277-287.
Bianco, P. G. 1990. Potential role of paleohistory of the Mediterranean and Parathetys basins on the early dispersal of Euro-Mediterranean freshwater fishes. Ichthyological Exploration of Freshwaters, 1: 167-184.
Billington, B., Herbert, P. D. N. 1991. Mitochondrial DNA diversity in fishes and its implications for introductions. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 48: 80-94.
Birky, C. W. 1983. Relaxed cellular controls and organelle heredity. Science, 222: 468- 475.
Bookstein, F. L., Chernoff, B. L., Humphries, J. M., Smith, G. R., Strauss, E. R. 1985. Morphometrics in evolutionary biology. The Academy of Natural Sciences of Philadelphia, Special Publication, 15 pp. 277.
Borst, P., Grivell, L. A. 1981. Small is beautiful-porterait of a mitochondrial genome. Nature, 290: 443-444.
Bouza, C., Arias, J., Castro, J., Sánchez, L., Martínez, P. 1999. Genetic structure of brown trout, Salmo trutta L., at the southern limit of the distribution range of the anadromous form. Molecular Ecology, 8: 1991-2002.
Brown, W. M., George, M., Wilson, A. C. 1979. Rapid evolution of animal mitochondrial DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 76: 1967-1971.
Brown, J. H., Gibson, A. C. 1983. Biogeography. Mosby, St Louis, Toronto & London, 643 pp.
Brown, W. M., Prager, E. M., Wang, A., Wilson, A. C. 1982. Mitochondrial DNA sequences of primates: tempo and mode of evolution. Journal of Molecular Evolution, 18: 225-239.
Bruford, M. W., Ciofi, C., Funk, S. M. 1998. Characteristics of Microsatellites. U: Molecular Tools for Screening Biodiversity. Chapman & Hall, New York, pp. 202-205.
116 Literatura
Brunner, P. C., Douglas, M. R., Bernatchez, L. 1998. Microsatellite and mitochondrial DNA assessment of population structure and stocking effects in Arctic charr Salvelinus alpinus (Teleostei: Salmonidae) from central Alpine lakes. Molecular Ecology, 7: 209-223.
Cables, L. 2001. Mitochondria. Horsepower. http://homepages.ihug.co.nz/~lcables/mitochondria.htm
Cann, R. L., Brown, W. M., Wilson, A. C. 1984. Polymorphic sites and the mechanisms of evolution in human mitochondrial DNA. Genetics, 106: 479-499.
Chiereghini, A. S. 1818. Descrizoine de’testacei e de’pesci she abitano le lagune e golfo Vento: pp 128.
Cita, M. B., McKenzie, J. A. 1986. The terminal Miocene event. International Geological Correlation Programme, Messinian Project, 96: 123-143.
Clement, M. Posada, D. Crandall, K. 2000. TCS: A computer program to estimate gene genealogies. Molecular Ecology, 9(10): 1657-1660
Constable, J. J., Packer, C., Collins, D. A., Pusey, A. E. 1995. Nuclear DNA from primate dung. Nature, pp. 373-393.
Cortey M., García-Marín J. L. 2002. Evidence for phylogeographically informative seqence variation in the mitochondral control region of Atlantic brown trout. Journal of Fish Biology, 60: 1058-1063.
Cortey, M., Pla, C., García-Marín, J. L. 2004. Historical biogeography of Mediterranean trout. Molecular Fhylogenetics and Evolution, 33: 831-844.
Cracraft, J. 1987. Species concept and the analogy of evolution. Biology and Phylosophy, 3: 329-346.
Crivelli, A. J. 1996. The freshwater fish endemic to the northern Mediterranean region. Le Sambuc, Arles, France.
Cross, T. F., Mills, C. P. R., Courcy Williams, M. 1992. An intensive study of allozyme variation in freshwater resident and anadromous trout, Salmo trutta L., in Western Ireland. Journal of Fish Biology, 40: 25-32.
Crozier, W. W., Ferguson, A. 1986. Electrophoretic examination of the population structure of brown trout, Salmo trutta L., from the Lough Neagh catchment, Northern Irland. Journal of Fish Biology, 28: 459-477.
Curole J. P., Kocher, T. D. 1999. Mitogenomics: digging deeper with complete mitochondrial genomes. TREE, 14: 394-398.
Delling, B. 2003. Species diversity and phylogeny of Salmo with emphasis on southern trouts (Teleostei, Salmonidae). Department of Zoology, Stockholm University: pp. 142.
117 Literatura
Derzhavin, A. N. 1934. Freshwater fishes from the south coast of the caspian. Transactions Azerb. Otd. Zakavkaz. Filiala AN SSR, 7: 91-126.
Dodson, J. J., Gibson, R. J., Cunjak, R. A., Friedland, K. D., Garcia de Leaniz, C., Gross, M. R., Newburym, R., Nielsen, J. L., Power, M. E., Roy, S. 1998. Elements in the development of conservation plans for Atlantic salmon (Salmo salar). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 55: 312-323.
Dorofeeva, E. A. 1989. The basic principles of classification and phylogeny of the salmonid fishes (Salmoniformes, Salmonoidei, Salmonidae). Biology and Phylogeny of Fishes, (Korovina, V. M., ed.). St. Petersburg: Proceedings of Zoologikal Institute, USSR Academy of Sciences (in Russian), pp. 5-16.
Dorofeeva, E. D. 1998. Systematics and distribution history of European Salmonid fishes of the genus Salmo. Journal of Ichthyology, 38: 419-429.
Dowling, T. E., Moritz, C., Palmer, J. D., Riesberg, L. H. 1996. Nucleic AcidsIII: Analysis of fragments and restriction sites. V. Molecular systematics. Sunderland, Sinauer, pp. 249-320.
Duftner, N., Weiss, S., Medgyesy, N., Sturmbauer, C. 2003. Enhanced phylogeographic information about Austrian brown trout populations derived from complete mitochondrial control region secuences. Journal of Fish Biology, 62: 427-435.
Durand, J. D., Bianco, P. G., Laroche, J., Gilles, A. 2003. Insight into the origin of endemic Mediterranean ichthyofauna: Phylogeography of Chondrostoma Genus (Teleostei: Cyprinidae). The Journal of Heredity, 94: 315-328.
Durand, J. J., Persat, H., Bouvet, Y. 1999. Phylogeography and postglacial dispersion of the chub (Leuciscus cephalus) in Europe. Molecular Ecology., 8: 989-998.
Economidis, P. S., Banarescu, P. M. 1991. The distribution and origins of freshwater fishes in the Balkan peninsula, especially in Greece. Internationale revue der gesamten hydrobiologie, 76: 257-283.
Edwards, A., Hammond, H. A., Jin, L., Caskey, C. T., Chakraborty, R. 1992. Genetic variation at five trimeric and tetrameric tandem repeat loci in four human population groups. Genomics, 12: 241-253.
Ekman, S. 1957. Zoogeography of the sea. Sidgwic & Jackson, London, pp. 417.
Elliott, J. M. 1994. Quantitative ecology and the brown trout. Oxford Series in Ecology and Evolution, Oxford University Press, Oxford, Great Britain, 286 pp.
Englbrecht, C. C., Freyhof, J., Nolte, A., Rassmann, K., Schliewen, U., Tautz, D. 2000. Phylogeography of the bullhead Cottus gobio (Pisces: Teleostei: Cottidae) suggests a pre-Pleistocene origin of the major central European populations. Molecular Ecology, 9: 709-722.
118 Literatura
Estoup, A., Angers, B. 1998. Microsatellites and minisatellites for molecular ecology: Theoretical and empirical considerations. In Carvalho, G.R. (ed.). Advances in Molecular Ecology. IOS Press, Amsterdam, pp. 55-86.
Estoup, A., Presa, P., Krieg, F., Vaiman, D., Guyomard, R. 1993. (CT)n and (GT)n microsatellite: a new class of genetic markers for Salmo trutta L. (brown trout). Heredity, 71: 488-496.
Estoup, A., Rousset, F., Michalakis, Y., Cornuet, J.-M., Adriamanga, M., Guyomard, R. 1998. Comparative analysis of microsatellite and allozyme markers: a case study investigating microgeographic differentiation in brown trout (Salmo trutta). Molecular Ecology, 7: 339-353.
Ferguson, A. 1989. Genetic differences among brown trout, Salmo trutta L., stocks and their importance for the conservation and menagment of the species. Freshwater Biology, 21: 35 - 46.
Ferguson, A., Fleming, C. C. 1983. Evolutionary and taxonomic significance of protein variation in the brown trout (Salmo trutta L.) and other salmonid fishes. In Protein Polymorphism: Adaptive and Taxonomic Significance, Vol. 24 (Oxvord, G. S. & Rollinson, D., eds) London: Academic Press, pp. 84-99.
Ferguson, A., Mason F. M. 1981. Allozyme evidence for reproductively isolated sympatric populations of brown trout Salmo trutta L. in Lough Melvin, Ireland. Journal of Fish Biology, 18: 629-642.
Ferris, S. D., Berg, W. J. 1988. The utility of mitochondrial DNA in fish genetics and fishery managment. V: Population genetics and fishery management. Seattle, Washington press, pp. 277-299.
Fontaine, P. M., Dodson, J. J. 1999. An analysis of the distribution of juvenile Atlantic salmon (Salmo salar) in nature as a function of relatedness using microsatellites. Molecular Ecology, 8: 189-198.
Ford-Lloyd, G. 1996. Measuring genetic variation using molecular markers. University of Brimingham, Kevin Painting, IPGRI, Rome.
Frankel, O. H. 1970. Sir William Macleay memorial lecture 1970. Variation - the essence of life. Proceedings of the Linneana Society of New South Wales 95: 158-169.
Frankel, O. H. 1974. Genetic conservation: our evolutionary responsibility. Genetics, 78: 53-65.
Frankel, O. H., Soulé, M. E. 1981. Conservation and evolution. Cambridge University Press, Cambridge, pp. 327.
Garcia-Marin, J. L., Jorde, P. E., Ryman, N., Utter, F., Pla, C. 1991. Management implications of genetic differentiation between native and hatchery populations of brown trout (Salmo trutta) in Spain. Aquaculture, 95: 235-249.
119 Literatura
Garcia-Marin, J. L., Pla C. 1996. Origins and relationships of native populations of brown trout (Salmo trutta) in Spain. Heredity, 76: 313-323.
Garcia-Marin, J. L., Utter, F. M., Pla, C. 1999. Postglacial colonization of brown trout in Europe based on distribution of allozyme variants. Heredity, 82: 46-56.
Gavrilović, LJ., Dukić, D. 2002. Reke Srbije. Zavod za uđžbenike i nastavna sredstva. Beograd.
Gillham, W. N. 1994. Organelle genome organization and gene content. V: Organelle genes and genomes. New York, Oxford University Press: 50-91.
Giuffra, E., Bernatchez, L., Guyomard, R. 1994. Mitochondrial control region and protein coding genes sequence variation among phenotypic forms of brown trout Salmo trutta from Northern Italy. Molecular Ecology, 3: 161-172.
Giuffra, E., Guyomard, R., Forneris, G. 1996. Phylogenetic relationships and introgression patterns between incipient parapatric species of Italian brown trout (Salmo trutta L. complex). Molecular Ecology, 5: 207-220.
Glenn, T. C. 1995. Microsatellite manual, Version 6, Unpubished manuscript, FTP: onyx.si.edu/protocols/msatmanV#rtf
Goldstein, D. B., Pollock, D. D. 1997. Launching microsatellites: A review of mutation processes and methods of phylogenetic inference. The Journal of Heredity, 88: 335-342.
Goldstein, D. B., Schlötterer, C. 1998. Microsatellites. Evolution and Applications. Oxford University Press, Oxford, pp. 352.
Gorjanović – Kramberger, D. 1891. Paleoihtioložki pilozi III. Rad Jugoslovenske Akademije Znanosti i Umjetnosti, Zagreb, 106: 59-129.
Grozdanović - Radovanović, J. 2000. Citologija. Zavod za udžbenike i nastavna sredstva, Beograd.
Guyomard, R., Krieg, F. 1983. Electrophoretic variation in six populations of brown trout (Salmo trutta L.). Canadian Journal of Genetics and Cytology, 25: 403-413.
Gyllensten, U., Wilson, A. C. 1988. Mitochondrial DNA of salmonids. V: Population genetics and fishery management. Seattle, Washington press, pp. 301-317.
Hamilton, K. E., Ferguson, A., Taggart, J. B., Tomasson, T., Walker, A., Fahy, E. 1989. Post-glacial colonization of brown trout, Salmo trutta L.: Ldh-5 as a phylogeographical marker locus. Journal of Fish Biology, 35: 651-664.
Hansen, M. M., Loeschcke, V. 1994. Effects of releasing hatchery-reared brown trout to wild trout populations. In Loeschcke, V., Tomiuk, J. & Jain, S. K. (eds.). Conservation Genetics. Birkhäuser Verlag, Basel. pp. 273-289
120 Literatura
Hansen, M. M., Loeschcke, V., Rasmussen, G., Simonsen, V. 1993. Genetic differentiation among Danish brown trout (Salmo trutta) populations. Hereditas, 118: 177-185.
Hansen, M. M., Nielsen, E. E., Mensberg, K.-L.D. 1997. The problem of sampling families rather than populations: Relatedness among individuals in samples of juvenile brown trout (Salmo trutta L.). Molecular Ecology, 6: 469-474.
Hansen, M. M., Ruzzante, D. E., Nielsen, E. E., Mensberg, K-L. D. 2000. Microsatellite and mitochondrial DNA polymorphism reveals life – history dependent interbreeding between hatchery and wild brown trout (Salmo trutta L.) Molecular Ecology., 9: 583-594.
Harrison, R. G. 1989. Animal mitochondrial DNA as a genetic marker in population and evotutionary biology. Trends in Ecology and Evolution, 4: 6-11.
Hearne, C. M., Ghosh, S., Todd, J. A. 1992. Microsatellites for linkage of genetic analysis of genetic traits. Trends in Genetics, 8: 288-294.
Hennig, W. 1966. Phylogenetic systematics. Univ. Illinois Pres, Urbana, pp. 263.
Hewitt, G. M. 1993. Post - glacial distribution and species substructure: lessons from pollen, insects and hybrid zones. In: Evolutionary Patterns and Processes, 97-123. Linnean Society Symposium Series 14. Lees, D. R. & Edwards, D. (Eds.). Academic Press, London.
Hewitt, G. M. 1996. Some genetic consequences of ice ages, and their role in divergence and speciation. Biological Journal of Linnean Society, 58: 274-276.
Hewitt, G. M. 1999. Post-glacial re-colonization of European biota. Biological Journal of Linnean Society, 68: 87-112.
Hewitt, G. M. 2001. Speciation, hybrid zones and phylogeography – or seeing genes in space and time. Molecular Ecology, 10: 537-549.
Hindar, K., Jonsson, B., Ryman, N., Ståhl, G. 1991. Genetic relationships among landlocked, resident, and anadromous brown trout, Salmo trutta L. Heredity, 66: 83-91.
Hindar, K., Ryman, N., Utter, F. M. 1991a. Genetic effects of cultured fish on natural fish populations. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Science, 48: 945-957.
Hoeh, W.R., Blakley, K. H., Brown, W. M. 1991. Heteroplasmy suggests limited biparental inheritance of Mytilis mitochondrial DNA. Science, 251: 1488-1490.
Hsü, K. 1978. When the Black sea was drained. Scientific American, 238: 52-63.
Hsü, K., Montadert, L., Bernouilli. D., Cita, M. B., Erikson, A., Garrison, R. E., Kidd, R. B., Melieres, F., Müller, C., Wright, R. 1977. History of the Mediterranean salinity crisis. Nature, 267: 399-403.
121 Literatura
Hynes, R. A., Ferguson, A., McCann, M. A. 1996. Variation in mitochondrial DNA and post-glacial colonisation of north-west Europe by brown trout (Salmo trutta L.). Journal of Fish Biology, 48: 4-67.
ITIS, 2004. Integrated taxonomic information system. Smithsonian Institution, Washington D. C. www.itis.usda.gov
Jevtić, J. 1989. Ribarstvo. Praktikum. Naučna knjiga, Beograd.
Johnson, G. D. C., & Patterson, C. 1996. Relationshipses of lower euteleostean fishes. In: Interrelations of Fishes. Stiassny , M. L. J., L. R. Parenti, G. D. Johnson (eds.). Academic Press, San Diego pp. 251-332.
Jug, T. 2002. Genetska raznolikost soške postrvi (Salmo marmoratus) v Sloveniji. Magistarsko delo, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani.
Karakousis, Y., Triantaphyllidis, C. 1990. Genetic structure and differentiation among Greek brown trout (Salmo trutta L.) populations. Heredity, 64: 297-304.
Karaman, S. 1924. Pisces Macedoniae. Derzeit am institut Z. Erforschung und Beksampfung D. Malaria, Trogir (Dalmatien) Split.
Karaman, S. 1937. Beitrag zur Kenntnis der Süsswasserfische Jugoslaviens. Glasnik Skopskog naučnog društva, 18: 131-139.
Keith, P. 1998. Evolution des peuplements ichtyologiques de France et stratégies de conservation. Ph. D. diss., Université de Rennes I, France.
Kendall, A. W., Behnke, R. J. 1984. Salmonidae: developments and relationships. In Ontogeny and Systematics of Fishes (Moser, H. G., ed.) American Society of Ichthiologysts and Herpetologists Spetial Publikation, 1: 142-149.
Klykanov, V. A. 1975. Systematic interrelations of the smelts of genera Osmerus Hypomesus of family Osmeridae. Ichthyologia, 7 (I): 31-40.
Kolombatović, G. 1890. Notizie ittiologiche. Glasnik prirodnjačkog društva, Zagreb.
Kottelat, M. 1997. European freshwater fishes. An heuristic checklist of the freshwater fishes of Europe (exclusive of former USSR), with an introduction for non- systematists and comments on nomenclature and conservation. Biologia, Section Zoology 52 Suppl. 5: 1-271.
Krieg, F., Guyomard, R. 1985. Population genetics of French brown trout (Salmo trutta L.): large geographical differentiation of wild populations and high similarity of domesticated stocks. Génétique, Sélection et Evolution, 17: 225-242.
Kryštufek B., Reed J. M. 2004. Pattern andProcess in Balakn Biodiversity - an Overview, in:. Griffiths H.I., Kryštufek B., Reed J.M. (Ed), Balkan Biodiversity, Pattern and Process in the European Hotspot, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp. 203-217.
122 Literatura
Kumar, S. Tamura, K. Nei, M. 2004. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment. Briefings in Bioinformatics, 5: 2 150-164.
Lagler, K. F. 1977. Freshwater fishery biology. Dubuque, WM. C. Brown Company Publishers, pp.19-35.
Laikre, L., Antunes, A., Apostolidis, A., Berrebi, P., Duguid, A., Ferguson, A., Garcia – Marin, J. L., Guyomard, R., Hansen, M. M., Hindar, K., Koljonen, M. – L., Largiader, C., Martinez, P., Nielsen, E. E., Palm, S., Ruzzante, D. E., Ryman, N., Trianthaphyllidis, C. 1999. Conservation genetic management of brown trout (Salmo trutta) in Europe. Report by the concerted action on identification, management and exploitation of genetic resources in the brown trout (Salmo trutta), "TROUTCONCERT"; EU FAIR CT97-3882. Silkeborg, Danmarks fiskeriundersrgelser: pp. 91.
Laikre, L., Ryman, N. 1996. Effects on intraspecific biodiversity from harvesting and enhancing natural populations. Ambio, 25: 504-509.
Largiadèr, C. R., Scholl, A. 1996. Genetic introgression between native and introduced brown trout (Salmo trutta L.) populations in The Rhône River Basin. Molecular Ecology, 5: 417-426.
Leary, R. F., Allendorf, F. W., Forbes, S. H. 1993. Conservation genetics and bull trout in the Columbia and Klamath River drainages. Conservation Biology, 7: 856-865.
Leidy, R. A., Moyle, P. B. 1998. Conservation status of the world's fish fauna: an overview. In Fiedler, P.L. and Kareiva, P.M. (eds.). Conservation Biology for the coming decade. Second edition. Chapman & Hall, International Thomson Publishing, USA, pp. 187-227.
Lewin, B. 2000. Genus VII. Oxsfod University Press, University of Oxsfod, Oxsfod, United Kindom.
Lewontin, R. C. 1974. The genetic basis of evolutionary change. Columbia University Press, New York.
Li, W. H., Grauer, D. 1991. Fundamentals of Molecular Evolution. Sinauer Associates, Sunderland, MA.
Lightowlers, R. N., Chinnera, P. F., Turnbull, D. M., Howell, N. 1997. Mammalian mitochondrial genetics: heredity, heteroplasmy and disease. Trends in genetics, 13: 450-455.
Lopez, J. V., Culver, M., Stephens, J. C., Johnson, W. E., O'Brien, S. J. 1997. Rates of nuclear and cytoplasmic mitochondrial DNA sequence divergence in mammals. Molecular Biology and Evolution., 14: 277-286.
Maitland, P. S. 1995. The conservation of freshwater fish: past and present experience. Biological Conservation, 72: 259-270.
123 Literatura
Marić, S. 2002. Morfološka varijabilnost pastrmki (subfamilia Salmoninae) – značaj za biološku konzervaciju. Magistarski rad, Biološki fakultet, Univerziteta u Beogradu.
Marić, S., Hegediš, A., Nikolić, V., Simonović, P. 2004. Conservation status of two eastern Balkan endemic fish species in Serbia and a proposal for their protection. Acta Zoologica Bulgarica 56 (2): 213-222.
Marshall, T. C., Slate, J., Kruuk, L. B., Pemberton, J. B. 1998. Statistical confidence for likelihood-based paternity inference in natural populations. Molecular Ecology, 7: 639-655.
Martin, A. P. 1999. Substitution rates of organelle and nuclear genes in sharks: implicating metabolic rate. Molecular Biology and Evolution., 16: 996-1002.
May, B. 1992. Starch gel electrophoresis of allozymes. In Hoelzel, A.R. (ed.). Molecular Genetic Analysis of Populations. A Practical Approach. IRL Press, Oxford, pp. 1- 27.
McKay, S. J., Devlin, R. H., Smith, M. J. 1996. Phylogeny of Pacific salmon and trout based on growth hormone type-2 and mitohondrial NADH dehydrogenase subunit 3 DNA sequences. Canadian Journal of Fisheries and Aqatic Sciences, 53: 1156- 1176.
McKenzie, J. A., Oberhansli, H. 1985. Paleoceanography expressions of the Messinian salinity crisis, p. 99 – 123. In Hsü, K., Weissert, H. J. (eds), South Atlantic Paleoceanography. Cambridge University Press, Cambridge.
Meffe, G. K. 1986. Conservation genetics and the management of endangered fishes. Fisheries, 11: 14-23.
Miller, L. M., Kapuscinski, A. R. 1996. Microsatellite DNA Markers Reveal New Levels of Genetic Variatio in Northen Pike. Transactions of the American Fisheries Society, 125: 971-977.
Miller, L. M., Kapuscinski, A. R. 1997. Historical analysis of genetic variation reveals low effective population size in a northern pike (Esox lucius) population. Genetics, 147: 1249-1258.
Mitrović, J., Pavlović, M. 1980. Paleozoogeorafija. Rudarsko geološki fakultet – OOUR Grupa za regionalnu geologiju i paleontologiju. Beograd.
Montoya, J., Gaines, G. L., Attardi, G. 1983. The pattern of transcription of the human mitochondrial rRNA genes reveals two overlapping transcription units. Cell, 34: 151-159.
Morán, P., Pendás, A. M., García-Vásquez, E., Izquierdo, J. I., Lobon-Cervia, J. 1995. Estimates of gene flow among neighbouring populations of brown trout. Journal of Fish Biology, 46: 93-602.
124 Literatura
Moritz, C. 1994. Applications of mitochondrial DNA analysis in the conservation: a critical review. Molecular Ecology, 3: 401-411.
Moritz, C. 1995. Uses of molecular phylogenies for conservation. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences, 349: 113-118.
Moritz, C. 1999. Conservation units and translocations: strategies for conserving evolutionary processes. Hereditas, 130: 217-228.
Moritz, C., Dowling, T. E., Brown, W. M. (1987). Evolution of animal mitochondrial DNA: relevance for population biology and systematics. Annual Review of Ecology and Systematics, 18: 269-292.
Moritz, C., Hillis, D. M. 1996. Molecular Systematics: Context and Controversis. V: Molecular systematics. Sunderland, Sinauer, pp. 1-13.
Morizot, D. C., Schmidt, M. E. 1990. Starch gel electrophoresis and histochemical visualization of proteins. In Whitmore, D.H. (ed.). Electrophoretic and Isoelectric Focusing Techniques in Fishery Management. CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor, pp. 23-80.
Murphy, R. W., Sites, J. W., Buth, D. G., Haufler, C. H. 1996. Proteins: Isozyme electrophoresis. V: Molecular systematics. Sunderland, Sinauer, pp. 51-120.
Neave, F. 1958. The origin and speciation of Oncorhynchus. Transaction of the Royal Society of Canada, Series 3, 52, (5): 25-49.
Nei, M., Maruyama, T., Chakraborty, R. 1975. The bottleneck effect and genetic variability in populations. Evolution, 29: 1-10.
Nelsen, J. S. 1984. Fishes of the world. Wiley, New York.
Nesbo, C. L., Fossheim, T., Vollestad, L. A., Jakobsen, K. S. 1999. Genetic divergence and phylogeographic relationships among European perch (Perca fluviatilis) populations reflect glacial refugia and postglcial colonization. Molecular Ecology, 8: 1387-1404.
Nielsen, E. E., Hansen, M. M., Loeschcke, V. 1997. Analysis of microsatellite DNA from old scale samples of Atlantic salmon: A comparison of genetic composition over sixty years. Molecular Ecology, 6: 487-492.
Nielsen, E. E., Hansen, M. M., Loeschcke, V. 1999a. Genetic variation in time and space: Microsatellite analysis of extinct and extant populations of Atlantic salmon. Evolution, 53: 261-268.
Nielsen, E. E., Hansen, M. M., Loeschcke, V. 1999b. Analysis of DNA from old scale samples: Technical aspects, applications and perspectives for conservation. Hereditas, 130: 265-276.
125 Literatura
Nielsen, J. L. (ed.). 1995. Evolution and the aquatic ecosystem: defining unique units in population conservation. American Fisheries Society Symposium 17, pp. 435.
Nilsson, J., Gross, R., Asplund, T., Dove, O., Jansson, H., Kelloniemi, J., Kohlmann, K., Löytynoja, A., Nielsen, E. E., Paaver, T., Primmer, C. R. Titov, S., Vasemägi, A., Veselov, A., Öst, T., Lumme, J. 2001. Matrilinear phylogeography of atlantic salmon (Salmo salar L.) in Europe and postglacial colonization of Baltic sea area. Molecular Ecology, 10: 89-102.
Norden, C. R. 1961. Comparative osteology of representative salmonide fish with particular reference to the grayling (Thymallus arcticus) and phylogeny. Journal of the Fisheries Research Board of Canada, 18: 679-791.
Oakley, T. H., Phillips, R. B. 1999. Phylogeny of salmonine fishes based on growth hormone inrons: Atlantic (Salmo) and Pacific (Oncorhynchus) salmon are not sister taxa. Molecular Phylogenetics and Evolution, 11: 381-393.
Ocokoljić, M. 1987. Visinsko zoniraje voda u slivu Velike Morave i neki aspekti njihove zaštite. Posebna izdanja Srpskog geografskog društva. Sveska 64, Beograd.
Odak, T. 2004. Molekularno – biološka obilježja endemske mekousn pastrve (Salmothymus obtusirostris salontiana). Magistarski rad, Agronomski fakultet, Sveučilišta u Zagrebu.
Oleynik, A. G. 1997 Molecular phylogeny of salmonid fishes: concordance of results from nuclear and mitohondrial DNA analyses. Genetika, 33: 229-234 (in Russian).
Osinov, A. 1984. Zoogeographical origins of brown trout , Salmo trutta (Salmonidae): data from biochemical genetic markers. Journal of Ichtyology., 24: 10-23.
Osinov, A. 1989. Brown trout (Salmo trutta L., Salmonidae) in basins of the Black and Caspian Seas: A population genetic analysis. Genetika, 24: 1523-1534.
Osinov, A. G. 1999. Salmonid fishes of the genera Salmo, Parasalmo, and Oncorhynchus: genetic divergence, phylogeny, and classification. Journal of Ichtyology, 39: 571-578.
Osinov, A., Bernatchez, L. 1996. Atlantic and Danubean phylogenetic groupings of brown trout (Salmo trutta L.) complex: genetic divergence, evolution, and conservation. Journal of Ichthyology, 36: 762-786.
Oxnard, C. E. 1978. One biologist’s view of morphometrics. Annual Review of Ecology and Systematics, 9: 219-241.
Patarnello, T., Bargelloni, L., Caldara, F., Colombo, L. 1994. Cytohrome b and 16 rRNA sequence variation in the Salmo trutta (Salmonidae, Teleostei) species coplex. Molecular Phylogenetics and Evolution, 3: 69-74.
Pažur, K. 1969. Divovske pastrve u jezeru Lokvare. Ribarstvo Jugoslavije, God. XXIV, 2, Zagreb.
126 Literatura
Phillips, R. B., Matsuoka, M. P., Konon, I., Reed, K. M. 2000. Phylogenetic analysis of mitochondrial and nuclear sequences supports inclusion of Acantholingua ochridana in the genus Salmo. Copeia, 2: 546-550.
Phillips, R. B., Oakley, T. H. 1997. Phylogenetics relationships among the Salmoninae based on nuklear and mitochondrial DNA sequences. In Molecular Systemaatics of Fishes (Kocher, T. D. & Stepien, C. A.; eds), Academic Prees, San Diego pp. 145-162.
Phillips, R. B., Plate, K. A. 1991. Nuklear DNA and salmonid phylogenetics. Journal of Fish Biology, 39 (Suppl. A): 259-275.
Pielou, E. C. 1979. Biogeography. Wiley, New York, pp. 351.
Poteaux, C., Beaudou, D., Berrebi, P. 1998. Temporal variations of genetic introgression in stocked brown trout populations. Journal of Fish Biology 53: 701-713.
Poteaux, C., Bonhomme, F., Berrebi, P. 1999. Microsatellite polymorphism and genetic impact of restocking in Mediterranean brown trout (Salmo trutta L.). Heredity, 82: 645-653.
Povž, M., Jesenšek, D., Berrebi, P., Crivelli, A. J. 1996. Soška postrv Salmo trutta marmoratus, Cuvier 1817, v porečju Soče v Sloveniji. Arles, Tour du Valat, pp. 65.
Povž, M., Sket, B. 1990. Naše sladkovodne ribe. Mladinska knjiga, Ljubljana, pp 85-86.
Queller, D. C., Strassmann, J. E., Hughes, C. R. 1993. Microsatellites and kinship. Trends in Ecology and Evolution., 8: 258-288.
Rabrenović, D., Knežević, S., Rundić, Lj. 2003. Istorijska geologija. Rudarsko – Geološki fakultet Univerziteta u Beogradu, Beograd.
Rage, J. C. 1997. Palaeobiological and palaeogeographical background of the European herpetofauna. In: Atlas of Amphibians and Reptiles in Europe. Gasc, J. - P., Cabela, A., Crnobrnja - Isailović, J., Dolmen, D., Grossenbacher, K., Haffner, P., Lescure, J., Martens, H., Martinez Rica, J. P., Maurin, H., Oliveira, M. E., Sofianidou, T. S., Veith, M. & Zuiderwijk, A. (Eds.). Paris: Societas Europaea Herpetologica and Museum National d'Histoire Naturelle, pp. 23-27.
Rage, J. C., Roček, Z. 2003. Evolution of Anuran assemblages in the Tertiary and Quaternary of Europe, in the context of palaeoclimate and palaeogeography. Amphibia-Reptilia, 24: 133-167.
Riffel, M., Storch, V., Schreiber, A. 1995. Allozyme variability of brown trout (Salmo trutta L.) populations across the Rhenanian-Danubian watershed in southwest Germany. Heredity, 74: 241-249.
127 Literatura
Rögl, F., Steininger, F. F. 1983. Vom Zerfall der Tethys zu Mediterran und Paratethys. Die neogene Paläogeographie und Palinspastik der zirkum - mediterranen Raumes. Annalen des Naturhistorischen Museum Wien A 85, 135-163.
Roy, K., Valentine, J. W., Jablonski, D., Kidwell, S. M. 1996. Scales of climatic variability and time averaging in Pleistocene biotas: implications for ecology and evolution. Trends in Ecology and Evolution, 11: 458-453.
Ryder, O. A. 1986. Species conservation and systematics: the dilemma of subspecies. Trends in Ecology and Evolution, 1: 9-10.
Ryman, N. 1983. Patterns of distribution of biochemical genetic variation in salmonids: differences between species. Aquaculture, 33: 1-21.
Ryman, N. 1991. Conservation genetics considerations in fishery management. Journal of Fish Biology, 39 (Supplement A): 211 - 224.
Ryman, N., Allendorf, F. W., Stähl, G. 1979. Reproductive isolation with little genetic divergence in sympatric populations of brown trout (Salmo trutta). Genetics, 92: 247-262.
Ryman, N., Jorde, P. E., Laikre, L. 1995. Supportive breeding and variance effective population size. Conservation Biology, 9: 1619-1628.
Ryman, N., Ståhl, G. 1980. Genetic changes in hatchery stocks of brown trout (Salmo trutta). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 37: 82-87.
Ryman, N., Utter, F. (eds.). 1987. Population Genetics and Fishery Management. Washington Sea Grant Publications/University of Washington Press, Seattle and London, pp. 420.
Ryman, N., Utter, F., Laikre, L. 1995a. Protection of intraspecific biodiversity of exploited fishes. Reviews in Fish Biology and Fisheries, 5: 417-446.
Saiki, R., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K. B., Horn, G. T., Erlich, H. A., Arnheim, N. 1988. Enzymatic amplification of b – globin genomic sequences and restriction site analysa for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 4: 1350-1354.
Saunders, R. L., Schom, C. B. 1985. Importance of the variation in the life history parameters of atlantic salmon (Salmo salar). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciencis, 42: 625-618.
Schlötterer, C. 1998. Genome evolution: Are microsatellites really simple sequences?. Current Biology, 8: 132-134
Schmidt, D. Y. 1947. Migrations of Fishes. USSR Academy of Sciences, Leningrad.
Schneider, S. Roessli, D. Excoffier, L. 2000. Arlequin: A software for population genetics data analysis. Ver 2.000. Genetics and Biometry Lab, Dept. of Anthropology, University of Geneva.
128 Literatura
Shaposhnikova, G. Ch. 1975. Systematic relation of some representatives of the family Salmonidae. - Ichthyologia, Vol. 7, No. 1, 61-70.
Shed'ko, S. V., Ginatulina, L. K., Parpura, I. Z., Ermolenko, A. V. 1996. Evolutionary and taxonomic relationships among Far-Eastern salmonid fishes inferred from mitichondrial DNA divergence. Journal of Fish Biology, 49: 815-829.
Shedlock, A. M., Parker, J. D., Crispin, D. A., pietsch, T. W., Burmer, G. C. 1992. Evolution of the salmonid mitochondrial control region. Molecular Phylogenetics and Evolution, 1: 179-192.
Smith, S. R. 1992. Introgression in fishes: significance for paleontology, cladistics, and evolutionary rates. Systematic Biology, 41: 41-57.
Snoj, A. 1997. Molekularno biološka karakterizacija soške postrvi (Salmo marmoratus, Cuvier 1817). Doktorska disertacija, Biotehniška fakulteta, Univerza v Ljubljani.
Snoj, A. 2003. Molecular phylogeny of «arhaic trouts» and their taxonomic classification. 3rd congress of the genetics society of Slovenija, Bled. Zbornik sažetaka, pp. 73- 74.
Snoj, A. 2004. Filogenetska struktura postrvi (Salmo trutta L.) v Sloveniji. Ribič, Glasilo Slovenskog ribištva. Ribiška sveza Slovenije, 10: 239-243.
Snoj, A., Jug, T., Melkič,. E., Sušnik, S., Pohar, J., Dovč,. P., Budihna, N. 2000. Mitochondrial and mirosatellite DNA analysis of marble trout in Slovenia. Journal of Fish Biology (Quaderni ETP), 29: 5-11.
Snoj, A., Melkič,. E., Sušnik, S., Muhamedagić, S., Dovč, P. 2002. DNA phylogeny supports revised classification of Salmothymus obtusirostris. Biological Journal of the Linnean Society, 77: 399-411.
Snoj, A., Pohar, J., Dovč, P. 1997. The first microsatellite DNA marker for marble trout, BFRO001. Journal of Animal Science, 75: 1983.
Stalling, R. L., Ford, A. F., Nelson, D., Torney, D. C., Hildebrand, C. E., Moyzis, R. K. 1991. Evolution and distribution of (GT)n repetitive sequences in Mammalian genomes. Genomics, 10: 807-815.
Stearley, R. F., Smith, G. R. 1993. Phylogeny of the Pacific trouts and salmons (Oncorhynchus) and genera of the family Salmonidae. Transactions of the American Fisheries Society, 122: 122 - 133.
Stevanović, M. P. 1982. Istorijska geologija. Rudarsko – Geološki fakultet Univerziteta u Beogradu, Beograd.
Strauss, R. E., Bookstein F. L. 1982. The truss: body form reconstructions in morphometrics. Systematic Zoology, 31: 113-135.
129 Literatura
Suárez J., Bautista J. M., Almodóvar A., Machordom A. 2001. Evolution of mitochondrial control region in Palaeartic brown trout (Salmo trutta) populations: the biogeographical role of the Iberian Peninsula. Heredity, 87: 198-206.
Sušnik, S. 2001. Polimorfizem kromosomske in mitohondrijske DNA lipana (Thymallus thymallus) in filogenetski odnosi med njegovimi geografsko ločenimi populacijami. Doktorska disertacija, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani.
Sušnik, S., Schöffman, J., Snoj, A. 2004. Phylogenetic position of Salmo (Platisalmo) platicephalus Behnke 1968 from south – central Turkey, evidenced by genetic data. Journal of Fish Biology, 64: 947-960.
Sušnik, S., Schöffman, J., Weiss, S. 2005. Genetic verification of native brown trout fom the Persian Gulf (Catak Cay River, Tigris basin). Journal of Fish Biology, 66: 1-6.
Sušnik, S., Snoj, A., Pohar, J., Dovč, P. 1997 The microsatellite marker (BFRO 002) characteristic for different geographically remote brown trout, Salmo trutta L., population. Animal Genetics, 28, 5: 372.
Swofford, D. L. 2000. PAUP*, b-VERSION 4.0. Sunderland, MA: Sinauer.
Taberlet, P., Fumagalli, L., Wust - Saucy, A. - G., Cosson, J. - F. 1998. Comparative phylogeography and postglacial colonization routes in Europe. Molecular Ecology, 7: 453-464.
Tautz, D. 1989. Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers. Nucleic Acid Research, 17: 6463-6471.
Tautz, D. 1993. Notes on the definition and nomenclature of tandemly repetitive DNA sequences. V: DNA fingerprinting: State of the science. Basel, Birkhäuser Verlag, pp. 21-28.
Tautz, D., Trick, M., Dover, G. A. 1986. Cryptic simplicicity in DNA is a major source of genetic variation. Nature, 322: 652-656.
Taylor, E. B. 1991. A review of local adaptation in Salmonidae, with particular reference to Pacific and Atlantic salmon. Aquaculture, 98: 185-207.
Taylor, E. B., Pollard, S., Louie, D. 1999. Mitochondrial DNA variation in bull trout (Salvelinus confluentus) from northwestern North America: implications for zoogeography and conservation. Molecular Ecology, 8: 1155-1170.
Templeton, A. R. 2004. Using haplotype trees for phylogeographic and species inference in fish populations. Environmental Biology of Fishes, 69: 7-20.
Tessier, N., Bernatchez, L. 1999. Stability of population structure and genetic diversity across generations assessed by microsatellites among sympatric populations of landlocked Atlantic salmon (Salmo salar L.). Molecular Ecology, 8: 169-179.
130 Literatura
Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. 1997. The Clustal_X windows interface: flexibile strategies for multiple sequence aligment aided by quality analysis tools. Nucleic Acid Research, 25, 24: 4876-4882.
Thunell, R. C., Williams, D. F. 1983. Paleotemperature and paleosalinity history of the eastern Mediterranean during the Late Quaternary. Palaeogeography, Palaeoclimatology, Palaeoecology, 44: 23-39. Tomkinson, A. E., Linn, S. 1986. Purification and properties of a strand specific endonuclease from mouse cell mitochondria. Nucleic Acid Research, 14: 9579- 9593.
Utter, F. M. 1981. Biological criteria for definition of species and distinct intraspecific populations and salmonids under the U.S. Endangered Species Act of 1973. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 38: 1626-1635.
Utter, F., Aebersold, P., Winans, G. 1987. Interpreting genetic variation detected by electrophoresis. In Ryman, N. and Utter, F. (eds.) Population Genetics and Fishery Management. Washington Sea Grant Program/University of Washington Press, Seattle, USA.
Villinger, E. 1986. Untersuchungen zur Flussgeschichte von Aare-Donau/Alpenrhein und zur Entwicklung des Malm-Karts in Su¨dwestdeutschland. Germany.
Vladimirov, V. I. 1944. Brook from of Sevan trout: Salmo ischchan Kessler morpha alabalach nova. Izv Akademy Nauk Arm. SSR, 3: 61-72.
Vladimirov, V. I. 1948. Brook trout in Armenia and its relationship to other representatives of the Salmo genus. Transactions sevan Gigrobiology Stantsii., 10: 87-178. Vladykov, V. D. 1963. A review of salmonid genera and their broad geographical distribution. Transaction of the Royal Society of Canada, Series IV, Section III, 1: 459-504.
Vollestad, L. A., Hindar, K. 1997. Developmental stability and environmental stress in Salmo salar (Atlantic salmon). Heredity, 78: 215-222.
Vuković, T., Ivanović, B. 1971. Slatkovodne ribe Jugoslavije. Zemaljski muzej BIH, Sarajevo.
Waples, R. S. 1991. Genetic interactions between hatchery and wild salmonids - lessons from the Pacific Northwest. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 48 (Suppl. 1): 124-133.
Waples, R. S. 1991a. Pacific salmon, Oncorhynchus spp., and the definition of "species" under the Endangered species Act. US National Marien Fisheries Service, Marine Fisheries Review, 53: 11-22.
Waples, R. S. 1995. Evolutionary significant units and the conservation of biological diversity under the endangered species act. American Fisheries Society Symposium, 17: 8-27.
131 Literatura
Weiss, S., Antunes, A., Schlötterer, C., Alexandrino, P. 2000. Mitochondrial haplotype diversity among Portuguese brown trout Salmo trutta L. populations: relevance to the post-Pleistocene recolonization of northern Europe. Molecular Ecology, 9: 691-698.
Weiss, S., Schlötterer, C., Waidbacher, H., Jungwirth, M. 2001. Haplotype (mtDNA) diversity of brown trout Salmo trutta in tributaries of the Austrian Danube: massive introgresion of Atlantic basin fish – by man or nature. Molecular Ecology, 10: 1241-1246.
Weissenbach, J., Gypapy, G., Dib, C., Vignal, A., Morissette, J., Millasseau, P., Vaysseix, G., Lathrop, M. 1992. A second-generation linkage map of the human genome. Nature, 359: 794-801.
Wheeler, A. 1992. Freshwater fishes of Britain and Europe. Rainbow Books, London, pp. 54-55.
Zhang, D.-X., Hewitt, G. M. 2003. Nuclear DNA analyses in genetic studies of populations: practice, problems and prospects. Molecular Ecology, 12: 563-584.
132