EULALIO GRACIA CORTÉS Ciudad Real, Septiembre De 20
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UNIVERSIDAD DE CASTILLA-LA MANCHA FACULTAD DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍAS QUÍMICAS DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA IMPREGNATION AND FUNCTIONALIZATION OF BIODEGRADABLE POLYMERS VIA CLICK CHEMISTRY IN SUPERCRITICAL CO2 Memoria que para optar al grado de Doctor en Ingeniería Química presenta: EULALIO GRACIA CORTÉS Directores: Dr. Antonio de Lucas Martínez Dr. Ignacio Gracia Fernández Composición del tribunal: Dr. Juan Francisco Rodriguez Romero Dra. Lourdes Calvo Garrido Dr. Louis Adriaenssens Profesores que han emitido informes favorable de la tesis: Dr. Renata Adami Dr. Giuseppe Caputo Ciudad Real, Septiembre de 2019 D. Antonio de Lucas Martínez y D. Ignacio Gracia Fernández, Catedráticos de Ingeniería Química de la Universidad de Castilla-La Mancha certifican que: Eulalio Gracia Cortés ha realizado bajo su dirección el trabajo titulado “Impregnation and functionalization of biodegradable polymers via click chemistry in supercritical CO2”, en el Departamento de Ingeniería Química de la Facultad de Ciencias y Tecnologías Químicas de la Universidad de Castilla-La Mancha. Considerando que dicho trabajo reúne los requisitos para ser presentado como Tesis Doctoral expresan su conformidad con dicha presentación. Ciudad Real, a de de 2019 D. Antonio de Lucas Martínez D. Ignacio Gracia Fernández TABLE OF CONTENTS RESUMEN 1 DESCRIPCIÓN DEL TRABAJO REALIZADO 9 A. Introducción 12 A.1. Evolución de los polímeros 12 A.2. Aplicaciones principales de los biopolímeros 14 A.2.1. Aplicaciones industriales 15 A.2.2. Aplicaciones en medicina 16 A.2.2.1. Liberación controlada 19 A.3. Ácido poliláctico (PLA) y uso en liberación controlada 24 A.4. Compuestos orgánicos con propiedades farmacológicas 26 A.4.1. Curcumina 26 A.4.2. Cumarina 28 A.5. Funcionalización de polímeros 29 A.5.1. Química click 31 A.6. Tecnología supercrítica 33 A.6.1. CO2 como fluido supercrítico 35 A.7. Objetivo del presente trabajo 36 A.8. Bibliografía 38 B. Materiales y métodos 48 B.1. Materiales 48 B.2. Instalaciones experimentales 51 B.2.1. Instalación de polimerización 51 B.2.2. Instalación de modificación de compuestos orgánicos 53 B.2.3. Instalación de reacción en medio supercrítico 53 B.2.4. Instalación de liberación in vitro 56 B.3. Procedimientos 57 B.3.1. Instalación de polimerización 57 B.3.2. Proceso de síntesis de 4-azidometil-7-metoxicumarina y 3- 57 azidometilcumarina. i B.3.3. Impregnación de principios activos 59 B.3.4. Instalación en medio supercrítico 60 B.3.5. Instalación de liberación in vitro 60 B.3.6. Elaboración de la disolución tampón 61 B.4. Bibliografía 62 C. Presentación de resultados 63 CHAPTER 1. Supercritical CO2 feasibility for the impregnation 67 and release of curcumin in PLGA 1.1. Introduction 70 1.2. Experimental 72 1.2.1. Materials 72 1.2.2. PLGA copolymerization set-up 73 1.2.3. Supercritial carbon dioxide impregnation set-up 73 1.2.4. Study of curcumin solubility 74 1.2.5. Impregnation of PLGA with curcumin using organic 74 solvents 1.2.6. Impregnation of PLGA using supercritical carbon dioxide 75 (scCO2) 1.2.7. In vitro release study 75 1.2.8. Characterization measurements 75 1.3. Results and discussion 77 1.3.1. Synthesis of PLGA 77 1.3.2. PLGA curcumin impregnation 79 1.3.3. Bulk impregnation of PLGA with curcumin 80 1.3.4. ScCO2 impregnation of PLGA with curcumin 83 1.3.5. In vitro release 87 1.4. Conclusions 91 1.5. Bibliography 93 ii CHAPTER 2. Functionalization and optimization of PLA with 97 coumarin via click chemistry in supercritical CO2 2.1. Introduction 100 2.2. Experimental 103 2.2.1. Materials 103 2.2.2. Synthesis of 4-azidomethyl-7-methoxycoumarin 103 2.2.3. Synthesis of click product at atmospheric pressure 104 2.2.4 Synthesis of click product at supercritical conditions 104 2.2.5. Characterization measurements 105 2.3.Results and discussion 105 2.4. Conclusions 113 2.5. Bibliography 114 CHAPTER 3. Feasibility of copper wire as heterogeneous 119 catalyst in click chemistry in scCO2 122 3.1. Introduction 3.2. Experimental 124 3.2.1. Materials 124 3.2.2. Synthesis of 4-azidomethyl-7-methoxycoumarin 124 3.2.3. Synthesis of click product in scCO2 124 3.2.4. Purification of click product 125 3.2.5. Cleaning process of copper wire catalyst 125 3.2.6. Characterization measurements 125 3.3. Results and discussion 126 3.4. Conclusions 147 3.5. Bibliography 149 CHAPTER 4. Application of click chemistry in scCO2 to PLA- 153 derived coumarin-release systems 4.1. Introduction 156 4.2. Experimental 158 4.2.1. Materials 158 4.2.2. Synthesis of of 3-(bromomethyl)coumarin 158 4.2.3. Synthesis of 3-azidomethyl coumarin 159 iii 4.2.4. Synthesis of click product in ScCO2 159 4.2.5. Characterization measurements 159 4.3. Results and discussion 160 4.3.1. Design of the PLA-coumarin adducts 160 4.3.2. 1H-NMR spectroscopic analysis 163 4.3.3. Maldi-Tof analysis 165 4.4. Conclusions 168 4.5. Bibliography 169 CHAPTER 5. Drug release profile of click products in 173 comparison with impregantions carried out in scCO2 5.1. Introduction 176 5.2. Experimental 177 5.2.1. Materials 177 5.2.2. Synthesis of 4-azidomethyl-7-methoxycoumarin 178 5.2.3. Synthesis of 3-azidomethyl coumarin 178 5.2.4. Synthesis of click product in scCO2 178 5.2.5. Impregnation of coumarin in scCO2 178 5.2.6. Purification of click products 179 5.2.7. In vitro release study 179 5.2.8. Characterization measurements 179 5.3. Results and discussion 180 5.4. Conclusions 191 5.5. Bibliography 193 Conclusions and recommendations 197 Conclusions 199 Recommendations 201 203 List of publications and conferences 205 Publications 206 Conferences iv Annex I. Impregnation of curcumin into biodegradable support (poly-lactic-coglycolic acid, PLGA), to transfer its well known in 209 vitro effect to an in vivo prostate cancer model Annex II. Scientific articles published 233 v Resumen Resumen El desarrollo de nuestra sociedad ha conllevado el desarrollo de nuevos materiales que sean capaces de satisfacer nuestras necesidades. En este ámbito aparecen los polímeros biodegradables, materiales muy versátiles que ofrecen un amplio rango aplicaciones. Los beneficios tanto ambientales como sociales de estos polímeros han permitido su uso en distintas aplicaciones, entre las que destacan las del ámbito médico, donde se usan en ingeniería de tejidos biológicos como soporte físico, en vendajes o la que en la actualidad está incrementando su estudio en investigación, la liberación controlada. El uso de polímeros biodegradables para liberación controlada consiste en que un polímero actúa como soporte, el cual se combina con un principio activo de manera que éste se libera acorde a un modo prediseñado. Así se resuelven problemas actualmente existentes, como ciertas limitaciones para administración oral o intravenosa. Mediante los sistemas de liberación controlada (SLC) se consigue mejorar la biodisponibilidad eliminando así el riesgo de una degradación prematura, liberando más eficazmente los principios activos. Dentro de los polímeros biodegradables se ha elegido el uso del ácido poliláctico (PLA), el segundo polímero más comercializado en la actualidad, fundamentalmente por su biodegradabilidad y biocompatibilidad, destacando en aplicación biomédicas como la liberación controlada de fármacos. En cuanto a los compuestos orgánicos naturales con propiedades farmacéuticas estudiados en esta tesis doctoral se han seleccionado la curcumina y cumarina. La curcumina es conocida por sus propiedades antiinflamatorias, antioxidantes, antimicrobianas, anticancerígenas o en la 1 Resumen lucha contra el Alzheimer. Con respecto a la cumarina, este compuesto también exhibe propiedades antiinflamatorias, actividad anticoagulante, actividad antiviral en el tratamiento del VIH o en la lucha contra el cáncer de mama. La combinación entre polímeros y fármacos para su uso en liberación controlada es un tema con gran interés en la actualidad. En concreto, son reseñables las ventajas que aporta la impregnación en medio supercrítico utilizando CO2 como disolvente, ya que permite una distribución homogénea del principio activo en la estructura del polímero y que la liberación del mismo sea controlada conforme el polímero se degrada. En esta tesis doctoral se aborda el estudio de la viabilidad de la tecnología supercrítica para la mejora de la impregnación y liberación de curcumina en ácido poliláctico-co-glicólico (PLGA). Para ello se llevó a cabo un primer estudio comparativo de impregnación de curcumina en el polímero a presión atmosférica y en medio supercrítico, pudiendo así comparar el resultado obtenido en ambos medios. En este estudio se pudo comprobar que las impregnaciones llevadas a cabo en medio supercrítico doblaron prácticamente los rendimientos en comparación a las realizadas a presión atmosférica. La liberación del compuesto orgánico se llevó a cabo entre 9 y 12 días, dato que mejora sustancialmente los productos existentes. Una vez comprobada la viabilidad de la tecnología supercrítica en compuestos destinados a aplicaciones farmacéuticas el próximo objetivo en esta tesis doctoral fue el estudio de la unión del compuesto orgánico, como la cumarina, y polímero biodegradable (ácido poliláctico) mediante un enlace covalente; validando en este capítulo la química click como método 2 Resumen de funcionalización para llevar a cabo esta unión de compuestos. En este apartado se pudo comprobar que el CO2 como disolvente actúa positivamente en esta reacción, utilizando un catalizador en fase homogénea. Las condiciones de operación optimizadas permitieron obtener rendimientos de funcionalización superiores al 90%. El cambio del catalizador homogéneo por uno en fase heterogénea en la funcionalización mediante química click fue el siguiente apartado de estudio llevado a cabo en esta tesis doctoral. El empleo de hilos de cobre supone una ruta que permite obtener productos más puros mediante un proceso medioambientalmente más limpio. El proceso de purificación del producto final asociado supone un gran avance, ya que es posible su eliminación mediante una simple etapa de purificación.