Tłumaczenie Patentu Europejskiego (19) Pl (11) Pl/Ep 3194566 Polska

RZECZPOSPOLITA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 3194566 POLSKA

(13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (51) Int.Cl. 04.08.2015 15744949.7 C12N 1/20 (2006.01)

(97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 27.03.2019 Europejski Biuletyn Patentowy 2019/13 Urząd Patentowy EP 3194566 B1 Rzeczypospolitej Polskiej

(54) Tytuł wynalazku: PRZECIWGRZYBICZE SZCZEPY PAENIBACILLUS, ZWIĄZKI TYPU FUZARYCYDYNY I ICH ZASTOSOWANIE

(30) Pierwszeństwo: 04.08.2014 EP 14179620

(43) Zgłoszenie ogłoszono:

26.07.2017 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2017/30

(45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:

30.09.2019 Wiadomości Urzędu Patentowego 2019/09

(73) Uprawniony z patentu:

BASF SE, Ludwigshafen am Rhein, DE

(72) Twórca(y) wynalazku:

ISABELLA SIEPE, Dossenheim, DE HEIKE BRÜSER, Speyer, DE KRISTIN KLAPPACH, Neustadt, DE KARL-HEINRICH SCHNEIDER, Kleinkarlbach, DE PETRA SPRÖTE, Mannheim, DE KERSTIN HAGE, Speyer, DE BIRGIT BLANZ, Limburgerhof, DE ECKHARD THINES, Mehlingen, DE

LUIS ANTELO, Hochspeyer, DE LOUIS PERGAUD SANDJO, Yaoundé, CM T3 TILL OPATZ, Oberursel, DE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Grażyna Wójcik SULIMA GRABOWSKA SIERZPUTOWSKA 3194566 BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SP.K. Skr. poczt. 6 00-956 Warszawa 10

PL/EP

Uwaga:

W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

SGS-16647/VAL EP 3 194 566 B1

Opis

Dziedzina wynalazku [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy nowych wyizolowanych szczepów bakteryjnych, któ- re należą do rodzaju Paenibacillus, pierwotnie wyizolowanych z gleby i wykazujących antagonistyczne działanie przeciwko szerokiemu zakresowi patogenów i zdolnych do wytwa- 5 rzania metabolitów przeciwdrobnoustrojowych. Niniejszy wynalazek dotyczy także kompozycji pestycydów drobnoustrojowych, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach. Niniejszy wynalazek dotyczy również sposobu zwalczania lub hamowania patogenów roślinnych lub zapobiegania zakażeniom patogenami roślinnymi przez zastosowanie takiej kompozycji. Niniejszy wynalazek dotyczy także nowych związków typu fuzarycydyny, które są meta- 10 bolitami wytwarzanymi przez szczepy według niniejszego wynalazku. Tło wynalazku [0002] W dziedzinie techniki zwalczania fitopatogennych grzybów oddziałujących na ro- śliny lub uprawy, dobrze znane jest stosowanie kompozycji związków czynnych zawiera- jących biopestycydy, na przykład wybrane spośród bakterii, takich jak bakterie tworzące 15 zarodniki, lub grzybów, które nie są szkodliwe dla roślin lub upraw, które mają być traktowane, a, które to biologiczne środki do zwalczania można dalej łączyć z klasycznymi chemicznymi antagonistami patogenów roślinnych. [0003] Biopestycydy zostały zdefiniowane jako postać pestycydów na bazie mikroorgani- zmów (bakterii, grzybów, wirusów, nicieni itp.) lub produktów naturalnych (związków lub 20 ekstraktów ze źródeł biologicznych) (Agencja Ochrony Środowiska USA: http://www.epa.gov/pesticides/biopesticides/). [0004] Biopestycydy są zazwyczaj wytwarzane przez hodowlę i zatężanie naturalnie wy- stępujących organizmów i/lub ich metabolitów, w tym bakterii i innych drobnoustrojów, grzybów, wirusów, nicieni, białek itp. Są one często uważane za ważne elementy progra- 25 mów zintegrowanego zarządzania szkodnikami (IPM) i poświęca się im wiele praktycznej uwagi jako substytutom syntetycznych chemicznych środków ochrony roślin (PPP). [0005] Biopestycydy dzieli się na dwie główne klasy, pestycydy drobnoustrojowe i biochemiczne: (1) Pestycydy drobnoustrojowe składają się z bakterii, grzybów lub wirusów (i często 30 zawierają metabolity wytwarzane przez te bakterie i grzyby). Jako pestycydy drobnoustrojowe są również klasyfikowane entomopatogeniczne nicienie, mimo że są wielo- komórkowe. (2) Pestycydy biochemiczne są naturalnie występującymi substancjami, które zwalcza- ją szkodniki lub dostarczają innych zastosowań w ochronie upraw, jak zdefiniowano 35 poniżej, ale są stosunkowo nietoksyczne dla ssaków. [0006] Wcześniej opisano kilka pestycydów drobnoustrojowych zawierających bakterie tworzące zarodniki, takie jak Bacillus subtilis, do zwalczania fitopatogennych grzybów, patrz np. WO 1998/050422; WO 2000/029426; WO 1998/50422 i WO 2000/58442. [0007] W WO 2009/0126473 ujawniono dopuszczalne w rolnictwie wodne kompozycje 40 zawierające bakteryjne lub grzybowe zarodniki zawarte w wodnym/organicznym rozpuszczalniku, i, które mogą ponadto zawierać środki do zwalczania owadów, pestycydy, fungicydy lub ich połączenia. Korzystnym gatunkiem są zarodniki bakterii z rodzaju Bacillus. [0008] W WO 2006/017361 ujawniono kompozycje do zwalczania patogenów roślinnych i zawierające co najmniej jedną korzystną bakterię, co najmniej jeden korzystny grzyb, co 45 najmniej jeden składnik odżywczy i co najmniej jeden związek, który przedłuża efektywny czas przydatności do użycia takiej kompozycji. Grupa korzystnych bakterii obejmuje m.in. bakterie Paenibacillus polymyxa i Paenibacillus durum. 2 [0009] EP-A-1 168 922 dotyczy kompozycji do wpływania na wzrost roślin i/lub nadawa- nia oporności na chorobę obejmujących co najmniej dwa wspomagające wzrost roślin szczepy Rhizobacteria i związek chitynowy, które to wspomniane szczepy są wybrane z rodzajów Bacillus, Paenibacillus, Brevibacillus, Virgibacillus, Alicyclobacillus i Aneurini- 5 bacillus. Jednak nie przedstawiono żadnych szczególnych szczepów Paenibacillus na po- parcie zastrzeganych połączeń. [0010] W WO 1999/059412 ujawniono szczep PKB1 Paenibacillus polymyxa (o nr dostę- pu w ATCC 202127) aktywny wobec kilku fitopatogennych grzybów. [0011] W WO 2006/016558 ujawniono szczepy BS-0048, BS-0074, BS-0277 Paenibacil- 10 lus sp. i szczep BS-0105 P. polymyxa, jak również fuzarycydynę A i fuzarycydynę B do ochrony roślin przed zakażeniami grzybami. Dalszy przeciwgrzybiczy szczep BRF-1 Pae- nibacillus został wyizolowany z ryzosfery soi (African J. Microbiol. Res. 4(24), 2692- 2698, 2010). [0012] W WO 2011/069227 ujawniono szczep JB05-01-1 P. polymyxa (o nr dostępu 15 ATCC w PTA-10436) mający silnie hamujący wpływ na patogenne bakterie, przeważnie przenoszone przez żywność ludzkie patogenne bakterie. [0013] Budi i in. (Appl Environ Microbiol, 1999, 65, 5148-5150) wyizolowali szczep B2 Paenibacillus sp. z mikoryzosfery Sorghum bicolor wykazujący antagonistyczne działanie wobec patogenów grzybowych przenoszonych przez glebę, takich jak Phytophthora para- 20 sitica. [0014] Szczep 11.D.3 Paenibacillus peoriae wyizolowany przez Delaporte, B. (Lab Cytol Veg, Paryż, Francja) i zdeponowany w otwartym zbiorze w Agricultural Research Service, USDA, U.S.A. pod numerem dostępu NRRL BD-62 (Int. J. Syst Bacteriol. 46(4), 988- 1003, 1996, zwany dalej również szczepem BD-62) z gleby w Cote d'lvoire wykazał ak- 25 tywność przeciwgrzybiczą przeciwko kilku fitopatogennym bakteriom i grzybom (J. Appl. Microbiol. 95, 1143-1151, 2003). NRRL jest skrótem od „Agricultural Research Service Culture Collection”, międzynarodowego organu depozytowego do celów deponowania szczepów mikroorganizmów w ramach TRAKTATU BUDAPESZTOWEGO W SPRA- WIE MIĘDZYNARODOWEGO UZNAWANIA DEPOZYTU MIKROORGANIZMÓW 30 DO CELÓW PROCEDURY PATENTOWEJ, o adresie National Center for Agricultural Utilization Research, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA. [0015] Aktywność przeciwdrobnoustrojowa wielu szczepów Paenibacillus, tj. szczepu P. peoriae przeciwko licznym bakteryjnym, grzybiczym i drożdżowym patogenom została 35 opisana gdzie indziej (Lett. Appl. Microbiol. 43, 541-547, 2006). [0016] Raza i in. (Brazilian Arch. Biol. Techol. 53, 1145-1154, 2010; Eur. J. Plant Pa- thol.125: 471-483, 2009) opisali wytwarzanie związku typu fuzarycydyny przez szczep SQR-21 Paenibacillus polymyxa skutecznego przeciwko Fusarium oxysporum. [0017] Fuzarycydyny stanowią grupę antybiotyków wyizolowanych z Paenibacillus spp., 40 które należą do klasy cyklicznych lipodepsypeptydów. Ich wspólne cechy strukturalne, które są zachowane w całej rodzinie, są następujące: pierścień makrocykliczny składający się z 6 reszt aminokwasowych, z których trzy to L-Thr, D-allo-Thr i D-Ala, a także ogon z kwasu 15-guanidyno-3-hydroksypentadekanowego przyłączony do N-końcowej reszty L- Thr wiązaniem amidowym (ChemMedChem 7, 871-882, 2012; J. Microbiol. Meth. 85, 45 175-182, 2011, Tabela 1 tu). Związki te są poddane cyklizacji przez mostek laktonowy pomiędzy N-końcową grupą hydroksylową L-Thr a C-końcową grupą karbonylową D-Ala. Pozycja reszt aminokwasowych w cyklu depsypeptydu jest zazwyczaj numerowana zaczy- nając od wyżej wymienionego L-Thr, który sam niesie również łańcuch GHPD, a kończąc na C-końcowym D-Ala. Nieograniczające przykłady fuzarycydyn wyizolowanych z Pae- 50 nibacillus są oznaczone jako LI-F03, LI-F04, LI-F05, LI-F07 i LI-F08 (J. Antibiotics 40(11), 1506-1514, 1987; Heterocycles 53(7), 1533-1549, 2000; Peptides 32, 1917-1923, 2011) i fuzarycydyny A (zwaną również LI-F04a), B (zwaną również LI-F04b), C (zwaną 3 również LI-F03a) i D (zwaną również LI-F03b) (J. Antibiotics 49 (2), 129-135, 1996; J. Antibiotics 50 (3), 220-228, 1997). Łańcuch aminokwasowy fuzarycydyny nie jest wytwarzany rybosomalnie, ale jest wytwarzany przez syntetazę peptydu nierybosomalnego. Wzo- ry strukturalne znanych fuzarycydyn przedstawiono w Tabeli 1 (Bio-technol Lett. 34, 5 1327-1334, 2012; tam Fig. 1). Związki oznaczone jako LI-F03a, LI-F03b aż do LI-F08a i LI-F08b są tu również określane jako fuzarycydyny LI-F03a, LI-F03b aż do LI-F08a i LI- F08b ze względu na ich strukturę w rodzinie fuzarycydyn (patrz Tabela 1).

Tabela 1: Struktury rodziny fuzarycydyn. Fuzarycydyna X2 X3 X5 A (LI-F04a) D-Val L-Val D-Asn B (LI-F04b) D-Val L-Val D-Gln C (LI-F03a) D-Val L-Tyr D-Asn D (LI-F03b) D-Val L-Tyr D-Gln LI-F05a D-Val L-Ile D-Asn LI-F05b D-Val L-Ile D-Gln LI-F06a D-allo-Ile L-Val D-Asn LI-F06b D-allo-Ile L-Val D-Gln LI-F07a D-Val L-Phe D-Asn LI-F07b D-Val L-Phe D-Gln LI-F08a D-Ile L-allo-Ile D-Asn LI-F08b D-Ile L-allo-Ile D-Gln

10 w którym strzałka określa pojedyncze wiązanie (amidowe) albo pomiędzy ugrupowaniem karbonylowym GHPD a grupą aminową L-Thr (L-treoniny) albo pomiędzy grupą karbonylową jednego aminokwasu a grupą aminową sąsiadującego aminokwasu, przy czym końcówka strzałki wskazuje przyłączenie do grupy aminowej wspomnianego aminokwasu L-Thr lub wspomnianego sąsiadującego aminokwasu; oraz 15 w którym pojedyncza linia (bez grotu strzałki) określa pojedyncze wiązanie (estrowe) między grupą karbonylową D-Ala (D-alaniny) a grupą hydroksylową L-Thr; i w którym GHPD oznacza kwas 15-guanidyno-3-hydroksypentadekanowy. [0018] Wśród wyizolowanych fuzarycydynowych antybiotyków, fuzarycydyna A wykazuje najbardziej obiecującą aktywność przeciwdrobnoustrojowa przeciwko wielu klinicznie 20 istotnym grzybom i bakteriom Gram-dodatnim, takim jak Staphylococcus aureus (zakres wartości MIC: 0,78-3,12 µg/ml) (ChemMedChem 7, 871-882, 2012). Opracowano syntezę analogów fuzarycydyny, które obejmują kwas 12-guanidynododekanowy (12-GDA) lub kwas 12-aminododekanowy (12-ADA) zamiast naturalnie występującego GHPD ale zastą- pienie GHPD przez 12-ADA doprowadziło do całkowitej utraty aktywności przeciwdrob- 25 noustrojowej, podczas gdy zastąpienie GHPD przez 12-GDA zachowało aktywność prze- ciwdrobnoustrojową (Tetrahedron Lett. 47, 8587-8590, 2006; ChemMedChem 7, 871-882, 2012). 4 [0019] Fuzarycydyny A, B, C i D są również opisywane do hamowania grzybów patogennych dla roślin, takich jak Fusarium oksysporum, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae i Penicillum thomii (J. Antibiotics 49(2), 129-135, 1996; J. Antibiotics 50(3), 220-228, 1997). Fuzarycydyny takie jak Li-F05, LI-F07 i LI-F08 wykazują pewną aktywność prze- 5 ciwgrzybiczą wobec różnych grzybów patogennych dla roślin, takich jak Fusarium monili- forme, F. oksysporum, F. roseum, Giberella fujkuroi, Helminthosporium sesamum i Peni- cillium expansum (J. Antibiotics 40(11), 1506-1514, 1987). Fuzarycydyny wykazują także aktywność przeciwbakteryjną wobec bakterii gram-dodatnich, w tym Staphylococcus aureus (J. Antibiotics 49, 129-135, 1996; J. Antibiotics 50, 220-228, 1997). Ponadto, fuzary- 10 cydyny wykazują aktywność przeciwgrzybiczą przeciwko Leptosphaeria maculans, który powoduje czarną zgniliznę korzeni rzepaku (Can. J. Microbiol. 48, 159-169, 2002). Co więcej, stwierdzono, że fuzarycydyny A i B i ich dwa pokrewne związki, w których D- allo-Thr wiąże się poprzez swoją grupę hydroksylową z dodatkową alaniną za pomocą mostka estrowego, wytwarzane przez pewne szczepy Paenibacillus wywołują reakcje 15 oporności w hodowanych komórkach pietruszki i hamują wzrost Fusarium oksysporum (WO 2006/016558; EP 1 788 074 A1). [0020] W WO 2007/086645 opisano syntetazę fuzarycydyny i kodujący ją gen jako wyizolowany ze szczepu E681Paenibacillus polymyxa, którego enzym bierze udział w syntezie fuzarycydyny A, B, C, D, LI-F03, LI-F04, LI-F05, LI-F07 i LI-F08. 20 [0021] Do chwili obecnej opublikowano genom kilku szczepów Paenibacillus polymyxa między innymi dla szczepu M-1 (nr dostępu w NCBI NC_017542; J. Bacteriol. 193 (29), 5862-63, 2011; BMC Microbiol. 13, 137, 2013), szczepu CR1 (nr dostępu w GenBank CP006941; Genome Announcements 2 (1), 1, 2014) i szczepu SC2 (nr dostępu w GenBank CP002213 i CP002214; nr dostępu w NCBI NC_014622; J. Bacteriol. 193 (1), 311-312, 25 2011), dla dalszych szczepów patrz tu, legenda na Figurze 12. Szczep M-1 P. polymyxa zdeponowano w China General Microbiological Culture Collection Center (CGMCC) pod nr dostępu CGMCC 7581. [0022] Montefusco i in. opisali w Int. J. Systematic Bacteriol. (43, 388-390, 1993) nowy gatunek bakterii z rodzaju Bacillus i zaproponowali jego nazwę Bacillus peoriae, która 30 może być odróżniona od innych szczepów Bacillus, jak na przykład Bacillus badius, B. coagulans, B. polymyxa i innych. Opisywano, że wspomniany nowy szczep Bacillus wytwarza zarodniki, jest gram-dodatni i wytwarza katalazę bez wytwarzania oksydazy. Pod- sumowano tu dalsze właściwości biochemiczne. Szczep, który można wyizolować z gleby lub materiałów stanowiących gnijące roślinny, oznaczono jako BD-57 i zdeponowano w 35 Rolniczym Ośrodku Badawczym, USDA, U.S.A. jako NRRL B-14750, a także w DSMZ (patrz poniżej) jako szczep DSM 8320. Na podstawie dalszej analizy biochemicznej i genetycznej, zmieniono nazwę wspomnianego szczepu na Paenibacillus peoriae (patrz Int. J. Systematic Bacteriol. 46, 988-1003, 1996). Nowsza ocenę odmienności Paenibacillus spp. w ryzosferze kukurydzy z użyciem metody PCR-DGGE opisano w J. Microbiol. Methods 40 54, 213-231, 2003. [0023] Biopestycydy do stosowania przeciwko chorobom upraw już ugruntowały swoje miejsce na różnych uprawach. Przykładowo biopestycydy już odgrywają ważną rolę w zwalczaniu chorób mączniaka rzekomego. Ich zalety obejmują: 0-dniowy odstęp przed zbiorami i możliwość stosowania przy umiarkowanym do ciężkiego obciążenia chorobą. 45 [0024] Obszarem, w którym nastąpił największy rozwój w dziedzinie biopestycydów jest obróbka nasion i modyfikacje gleby. Obróbka nasion biopestycydami jest np. stosowana do zwalczania patogenów grzybiczych przenoszonych przez glebę, które powodują zgnili- znę nasion, butwienie, gnicie korzeni i zarazy sadzonek. Można je również stosować do zwalczania wewnętrznych patogenów grzybowych przenoszonych przez nasiona, a także 50 patogenów grzybiczych, które znajdują się na powierzchni nasion. Wiele produktów bio- pestycydowych wykazuje również zdolność do stymulowania obrony roślin żywicielskich i 5 innych procesów fizjologicznych, które mogą sprawić, że traktowane rośliny będą bardziej odporne na różnorodne stresy biotyczne i abiotyczne. [0025] Jednak biopestycydy w pewnych warunkach mogą mieć również wady, takie jak wysoka specyficzność (wymagająca dokładnej identyfikacji szkodnika/patogenu i zasto- 5 sowania wielu produktów), mała szybkość działania (co czyni je nieodpowiednimi, gdy bezpośrednie zagrożenie dla upraw wynika z epidemii szkodników), zmienna skuteczność ze względu na wpływy różnych czynników biotycznych i abiotycznych (ponieważ biopestycydy są zazwyczaj organizmami żywymi, które działają zwalczając szkodniki/patogeny poprzez namnażanie się w docelowym owadzim szkodniku/patogenie) i wytworzenie 10 oporności. [0026] Zatem istnieje zapotrzebowanie na dalsze szczepy bakteryjne i dalsze metabolity przeciwdrobnoustrojowe, które antagonizują fitopatogenne mikroorganizmy, w szczegól- ności grzyby, które charakteryzują się szerokim spektrum aktywności przeciwko wszystkim klasom fitopatogennych grzybów. 15 Opis wynalazku [0027] Wspomniany problem został niespodziewanie rozwiązany przez dostarczenie nowych szczepów bakterii z rodzaju Paenibacillus, które charakteryzują się wyjątkowym profilem antagonistycznego działania wobec fitopatogennych grzybów, obejmujących również patogeny liści roślin, jak na przykład wybrane spośród Alternaria spp., Botrytis 20 cinerea, Phytophthora infestans i Sclerotinia sclerotiorum. Wspomniane szczepy bakteryjne zdeponowano w Międzynarodowym Urzędzie Depozytowym: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen i Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraße 7 B, 38124 Braunschweig, Niemcy (dalej DSMZ). [0028] Ponadto, całkowity bulion hodowlany, pożywka hodowlana i pozbawiony komórek 25 ekstrakt tych szczepów bakteryjnych wykazały aktywność hamującą co najmniej przeciwko Alternaria spp., Botrytis cinerea i Phytophthora infestans. Frakcjonowanie ekstraktów organicznych pod względem bioaktywności doprowadziło do wyizolowania dwóch nowych związków typu fuzarycydyny (związki 1A i 1B), których struktura została wyjaśnio- na za pomocą spektroskopii 1D- i 2D-NMR oraz spektrometrii mas. 30 [0029] Zatem niniejszy wynalazek dotyczy wyizolowanego mikroorganizmu, należącego do rodziny Paenibacillus, wykazującego co najmniej jedną z cech identyfikacyjnych jednego z następujących szczepów: 1) szczep Lu16774 Paenibacillus sp. zdeponowany w DSMZ pod numerem dostępu DSM 26969, 35 2) szczep Lu17007 Paenibacillus sp. zdeponowany w DSMZ pod numerem dostępu DSM 26970 i 3) szczep Lu17015 Paenibacillus sp. zdeponowany w DSMZ pod numerem dostępu DSM 26971. [0030] Jak tu stosowano, określenie szczep Paenibacillus sp. jest identyczny z określeniem 40 szczep Paenibacillus. [0031] Jak tu stosowano, określenie „izolat” odnosi się do czystej hodowli drobnoustrojów oddzielonej od jej naturalnego pochodzenia, taki izolat uzyskuje się przez hodowanie pojedynczej kolonii drobnoustrojów. Izolat to czysta hodowla pochodząca z heterogenicznej, dzikiej populacji mikroorganizmów. 45 [0032] Jak tu stosowano, „szczep” odnosi się do izolatu lub grupy izolatów wykazujących cechy fenotypowe, fizjologiczne, metaboliczne i/lub genotypowe należące do tej samej linii, w odróżnieniu od innych izolatów lub szczepów tego samego gatunku. [0033] Kolejna postać dotyczy całkowitego bulionu hodowlanego, supernatantu lub pozbawionego komórek ekstraktu lub frakcji lub co najmniej jednego metabolitu co najmniej 50 jednego spośród mikroorganizmów określonych powyżej, które korzystnie wykazują ak- tywność antagonistyczną wobec co najmniej jednego patogenu roślinnego. 6 [0034] Jak tu stosowano, „całkowity bulion hodowlany” odnosi się do ciekłej hodowli mikroorganizmu zawierającego komórki wegetatywne i/lub zarodniki przeprowadzone w za- wiesinę w pożywce hodowlanej i ewentualnie metabolity wytwarzane przez odpowiedni mikroorganizm. 5 [0035] Jak tu stosowano, „pożywka hodowlana”, odnosi się do pożywki, którą można uzy- skać przez hodowlę mikroorganizmu we wspomnianej pożywce, korzystnie płynnym bulionie i pozostającego, gdy komórki hodowane w pożywce są usuwane, np. supernatant pozostający, gdy komórki hodowane w ciekłym bulionie są usuwane przez wirowanie, fil- trację, sedymentację lub innymi sposobami dobrze znanymi w dziedzinie; zawierającego 10 np. metabolity wytwarzane przez odpowiedni mikroorganizm i wydzielane do pożywki hodowlanej. „Pożywkę hodowlaną” czasami nazywaną również „supernatantem” można uzyskać np. przez wirowanie w temperaturach około 2 do 30°C (korzystniej w temperaturach 4 do 20°C) przez około 10 do 60 min (korzystniej około 15 do 30 min) przy około 5000 do 20 000 x g (korzystniej około 15 000 x g). 15 [0036] Jak tu stosowano, „pozbawiony komórek ekstrakt” odnosi się do ekstraktu komórek wegetatywnych, zarodników i/lub całkowitego bulionu hodowlanego mikroorganizmu za- wierającego metabolity komórkowe wytwarzane przez odpowiedni mikroorganizm możli- wy do otrzymania sposobami niszczenia komórek znanymi w dziedzinie, takimi jak opartymi na rozpuszczalniku (np. rozpuszczalnikach organicznych, takich jak alkohole czasami 20 w połączeniu z odpowiednimi solami), oparte na temperaturze, z zastosowaniem sił ścina- jących, rozrywanie komórek za pomocą urządzenia ultradźwiękowego. Żądany ekstrakt można zatężyć konwencjonalnymi technikami zatężania, takimi jak suszenie, odparowanie, wirowanie lub podobne. Pewne etapy przemywania z zastosowaniem rozpuszczalników organicznych i/lub podłóż na bazie wody można również stosować na surowy ekstrakt, ko- 25 rzystnie przed użyciem. [0037] Jak tu stosowano, określenie „metabolit” odnosi się do dowolnego składnika, związku, substancji lub produktu ubocznego (w tym, ale nie wyłącznie, małocząsteczko- wych metabolitów wtórnych, poliketydów, produktów syntazy kwasów tłuszczowych, pep- tydów nierybosomalnych, peptydów rybosomalnych, białek i enzymów) wytwarzanego 30 przez mikroorganizm (taki jak grzyby i bakterie, w szczególności szczepy według wynalazku), który ma jakiekolwiek korzystne działanie tu opisane, takie jak aktywność pestycy- dowa lub poprawa wzrostu roślin, wydajność wykorzystania wody przez roślinę, zdrowie roślin, wygląd roślin, lub populacja pożytecznych mikroorganizmów w glebie wokół wy- stępującej tam aktywności roślinnej. 35 [0038] Jak tu stosowano, „izolat” odnosi się do czystej hodowli drobnoustrojów oddzielonej od jej naturalnego pochodzenia, taki izolat uzyskuje się przez hodowanie pojedynczej kolonii drobnoustrojów. Izolat to czysta hodowla pochodząca z heterogenicznej, dzikiej populacji mikroorganizmów. [0039] Jak tu stosowano, „szczep” odnosi się do izolatu lub grupy izolatów wykazujących 40 cechy fenotypowe i/lub genotypowe należące do tej samej linii, odmienne od cech innych izolatów lub szczepów tego samego gatunku. [0040] Kolejna postać dotyczy nowych związków o wzorze I

gdzie 45 R jest wybrany spośród kwasu 15-guanidyno-3-hydroksypentadekanowego (GHPD) i kwasu 12-guanidynododekanowego (12-GDA); X1 oznacza treoninę; X2 oznacza izoleucynę; X3 oznacza tyrozynę; 50 X4 oznacza treoninę; 7 X5 jest wybrany spośród glutaminy i asparaginy; X6 oznacza alaninę; i w którym strzałka określa pojedyncze wiązanie (amidowe) albo pomiędzy ugrupowaniem karbonylowym R a grupą aminową aminokwasu X1 albo pomiędzy grupą karbonylową 5 jednego aminokwasu a grupą aminową sąsiadującego aminokwasu, przy czym końcówka strzałki wskazuje przyłączenie do grupy aminowej wspomnianego aminokwasu X1 lub wspomnianego sąsiadującego aminokwasu; oraz w którym pojedyncza linia (bez grotu strzałki) określa pojedyncze wiązanie (estrowe) mię- dzy grupą karbonylową X6 a grupą hydroksylową X1; 10 i ich dopuszczalnych w rolnictwie soli oraz sposobów wytwarzania związków o wzorze I według wynalazku, które to sposoby obejmują hodowanie szczepów według wynalazku i wyizolowanie wspomnianych związków o wzorze I z całkowitego bulionu hodowlanego. [0041] Zgodnie z kolejną postacią, wynalazek dotyczy ponadto związków 1A i 1B o wzorze I, w którym R oznacza GHPD i w którym X5 oznacza asparaginę w przypadku związku 15 1A i X5 oznacza glutaminę w przypadku związku 1B:

[0042] Niniejszy wynalazek dotyczy ponadto kompozycji zawierających szczepy, całkowi- ty bulion hodowlany, pozbawiony komórek ekstrakt, pożywkę hodowlaną lub związki o wzorze I i ich sole według wynalazku, jak również ich zastosowania do zwalczania lub 20 hamowania patogenów roślinnych lub zapobiegania zakażeniu patogenami roślinnymi lub do ochrony materiału przed zniszczeniem przez szkodliwe mikroorganizmy oraz odpowiednich sposobów, które obejmują traktowanie patogenów, ich siedlisk lub materiałów lub roślin, które mają być chronione przed atakiem patogenu, lub gleby lub materiału roz- mnożeniowego skuteczną ilością kompozycji, szczepów, całego bulionu hodowlanego, po- 25 zbawionych komórek ekstraktów, pożywek hodowlanych lub związków o wzorze I i ich soli według wynalazku. [0043] Dalsze postaci wynalazku ujawniono w następującym szczegółowym opisie wynalazku, zastrzeżeniach i figurach. [0044] Wynalazek dotyczy szczepów mikroorganizmów: 30 1) szczep Lu16774 Paenibacillus sp. zdeponowany w DSMZ pod numerem dostępu DSM 26969, 2) szczep Lu17007 Paenibacillus sp. zdeponowany w DSMZ pod numerem dostępu DSM 26970 oraz 3) szczep Lu17015 Paenibacillus sp. zdeponowany w DSMZ pod numerem dostępu 35 DSM 26971. [0045] Szczepy Lu16774, Lu 17007 i Lu17015 zostały wyizolowane z próbek gleby z róż- nych lokalizacji w Europie, w tym z Niemiec i zdeponowane w ramach Traktatu Buda- peszteńskiego Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) pod wyżej wymienionymi numerami dostępu 20 lutego 2013, przez BASF SE, Niemcy. 40 [0046] Rodzaj Paenibacillus (dawniej prątki grupy 3 rRNA) scharakteryzowano fenoty- powo i fizjologicznie (Antonie van Leeuwenhoek 64, 253-260 (1993)) jako: ₋ komórki o pałeczkowatym kształcie o strukturze Gram-dodatniej, 8

₋ słaba reakcja na wybarwienie Grama, często nawet wybarwienie ujemne, ₋ różnicowanie w endospory elipsoidalne, które wyraźnie pęcznieją w zarodni (komórka macierzysta), ₋ fakultatywny wzrost beztlenowy z silnym wzrostem przy braku powietrza niezależnie 5 od tego, czy jest obecny azotan, czy nie, ₋ fermentacja różnych cukrów, ₋ tworzenie kwasu i gazu z różnych cukrów, w tym glukozy, ₋ brak wytwarzania kwasu z adonitolu i sorbitolu, ₋ negatywny pod względem ureazy (z wyjątkiem P. validus), 10 ₋ negatywny pod względem dihydrolazy argininowej, ₋ brak wykorzystania cytrynianu, ₋ brak wzrostu w obecności 10% chlorku sodu, ₋ wydzielanie licznych zewnątrzkomórkowych enzymów hydrolitycznych rozkładają- cych DNA, białko, skrobię; i/lub 15 ₋ zawartość G + C w DNA od 40% do 54%. [0047] Rodzaj Paenibacillus (dawniej prątki grupy 3 rRNA) również scharakteryzowano za pomocą analizy 16S rDNA (Antonie van Leeuwenhoek 64, 253-260 (1993)) jako: ₋ mający specyficzną sekwencję 22 zasad w regionie zmiennym V5 16S rDNA (5' do 3'): TCGATACCCTTGGTGCCGAAGT (Antonie van Leeuwenhoek 64, 253-260 20 (1993), Patrz tabela 3); i/lub ₋ przez hybrydyzację izolowanego lub amplifikowanego przez PCR chromosomalnego DNA z sondą BG3 (5'-TCGATACCCTTGGTGCCGAAGT-3') (patrz Antonie van Leeuwenhoek 64, 253-260 (1993)). [0048] Zdeponowane szczepy Lu16774, Lu17007 i Lu17015 według wynalazku, jak ozna- 25 czono, należą do rodzaju Paenibacillus w oparciu o następujące obserwacje morfologiczne i fizjologiczne (patrz tu Przykład 2.3): ₋ komórki o pałeczkowatym kształcie ₋ zarodniki elipsoidalne ₋ pęczniejąca zarodnia 30 ₋ wzrost beztlenowy ₋ fermentacja różnych cukrów, w tym glukozy, arabinozy, ksylozy, mannitolu, fruktozy, rafinozy, trehalozy i glicerolu z wytworzeniem kwasu ₋ wytarzanie gazu z glukozy ₋ negatywny pod względem dihydrolazy argininowej 35 ₋ brak wykorzystania cytrynianu, ₋ brak wzrostu w obecności 5% chlorku sodu, ₋ wytwarzanie zewnątrzkomórkowych enzymów hydrolitycznych rozkładających skro- bię, żelatynę, kazeinę i eskulinę. [0049] Ponadto zdeponowane szczepy Lu16774, Lu17007 i Lu17015 według wynalazku 40 również określono jako należące do rodzaju Paenibacillus przez analizę 16S rDNA na podstawie obecności sekwencji o 22 zasadach w 16S rDNA (5' do 3') specyficznej dla Pa- enibacillus: 5'-TCGATACCCTTGGTGCCGAAGT-3' (patrz SEQ ID NO:1 (nukleotydy 840-861), SEQ ID NO:2 (840-861), SEQ ID NO:3 (844- 45 865) i SEQ ID NO:4 (840-861) tu, w wykazach sekwencji). [0050] Ponadto sekwencjonowanie całego 16S rDNA w porównaniu z 24 różnymi szczepami Paenibacillus doprowadziły do zgrupowania zdeponowanych szczepów Lu16774, Lu17007 i Lu17015 ze szczepami typu Paenibacillus brasiliensis, P. kribbensis, P. jamilae, P. peoriae i P. polymyxa, korzystniej z P. peoriae, w szczególności szczepem BD-62 50 Paenibacillus peoriae (patrz tu Fig. 1 i 2). Wiadomo, że P. polymyxa i P. peoriae mają wartości identyczności sekwencji 16S rDNA od 99,6 do 99,7% (J. Gen. Appl. Microbiol. 48, 281-285 (2002)). 9 [0051] ”Procent identyczności” lub „procent podobieństwa” pomiędzy dwiema sekwencjami nukleotydowymi oznacza procent identyczności reszt na całej długości uliniowionych sekwencji i jest określany przez porównanie dwóch optymalnie lokalnie uliniowionych sekwencji w oknie porównania zdefiniowanym przez długość lokalnego uliniowienia 5 między dwiema sekwencjami, tak jak na przykład identyczność obliczona (dla raczej po- dobnych sekwencji ) po ręcznym uliniowieniu za pomocą oprogramowania AE2 (Align- ment Editor 2). Lokalne uliniowienie między dwiema sekwencjami obejmuje tylko seg- menty każdej sekwencji które są uważane za wystarczająco podobne zgodnie z kryterium, które zależy od algorytmu zastosowanego do przeprowadzenia uliniowienie (np. AE2, 10 BLAST, struktura drugorzędowa cząsteczki rRNA lub podobne). Procent identyczności oblicza się przez określenie liczby pozycji, w których w obu sekwencjach występuje identyczny kwas nukleinowy, aby uzyskać liczbę dopasowanych pozycji, dzieląc liczbę dopasowanych pozycji przez całkowitą liczbę pozycji w oknie porównania i mnożąc wynik przez 100. 15 [0052] Aby określić procent identyczności sekwencji dla dwóch sekwencji kwasu nukleinowego (np. jednej z sekwencji nukleotydowych z Tabeli 1 i jej homologu), sekwencje poddaje się uliniowieniu w celu optymalnego porównania (np. przerwy można wprowadzić w sekwencji jednego kwasu nukleinowego dla optymalnego uliniowienia z innym kwasem nukleinowym). Następnie porównuje się zasady w odpowiednich pozycjach. Gdy pozycja 20 w jednej sekwencji jest zajęta przez zasadę taką jak w odpowiadającej pozycji w innej sekwencji, wówczas cząsteczki są identyczne w tej pozycji. Należy rozumieć, że w celu określenia identyczności sekwencji podczas porównywania sekwencji DNA z sekwencją RNA, nukleotyd tymidynowy jest równoważny nukleotydowi uracylu. [0053] W celu uliniowienia, dane sekwencji wprowadzono do oprogramowania AE2 25 (http://iubio.bio.indiana.edu/soft/molbio/unix/ae2.readme), uliniowiono ręcznie zgodnie ze strukturą drugorzędową powstałej cząsteczki rRNA i porównano z reprezentatywnymi sekwencjami genów 16S rRNA organizmów należących do Firmicutes (Nucl. Acids Res. 27, 171-173, 1999). Aby uzyskać wartości % identyczności dla wielu sekwencji, wszystkie sekwencje były uliniowione ze sobą (uliniowienie wielu sekwencji). Ponadto, aby uzyskać 30 wartości % identyczności między dwiema sekwencjami na dłuższym odcinku uliniowionych sekwencji w porównaniu z wielokrotnym uliniowieniem, przeprowadzono ręczne do- pasowanie sekwencji parami, jak opisano powyżej, stosując AE2 (uliniowienie sekwencji parami). [0054] Dalsze, znormalizowane, zautomatyzowane rybotypowanie wykonuje się przy uży- 35 ciu Qualicon RiboPrintersystem dla szczepów Lu16774, Lu17007 i Lu17015 Paenibacillus w porównaniu z P. peoriae BD-62 z użyciem enzymu restrykcyjnego EcoRI prowadziło do podobieństwa wszystkich trzech nowych szczepów do P. peoriae BD-62 między 0,24 a 0,5 (Przykład 2.2 i Fig. 12). [0055] Podsumowując, szczepy przypisano do następujących grup taksonomicznych. 40 [0056] Oba szczepy Lu16774 i Lu17007 Paenibacillus należą do gatunku Paenibacillus polymyxa. [0057] Zatem wynalazek dotyczy szczepów mikroorganizmów: 1) szczep Lu16774 Paenibacillus polymyxa zdeponowany w DSMZ pod numerem do- stępu DSM 26969, 45 2) szczep Lu17007 Paenibacillus polymyxa zdeponowany w DSMZ pod numerem do- stępu DSM 26970 i 3) szczep Lu17015 Paenibacillus sp. zdeponowany w DSMZ pod numerem dostępu DSM 26971. [0058] Zgodnie z wynikami przedstawionej tu analizy filogenetycznej (Fig. 12 do 22) i 50 niepublikowanymi wynikami profesora Borrissa z Niemiec proponuje się, że gatunki hete- rogeniczne Paenibacillus polymyxa wymagają nowej klasyfikacji taksonomicznej na dwa 10 podgatunki: 1) Paenibacillus polymyxa ssp. polymyxa i 2) Paenibacillus polymyxa ssp. plantarum; oraz 3) nowy gatunek Paenibacillus nov. spec. epiphyticus. [0059] Typ szczepu P. polymyxa DSM 36 razem ze szczepami SQR-21, CF05, CICC 10580, NRRL B-30509 i A18 P. polymyxa tworzą w każdym z dendrogramów największej 5 wiarygodności analizowanych dla pięciu konserwowanych genów metabolizmu podstawowego (ang. house keeping genes) (dnaN, gyrB, recA, recN i rpoA) oddzielny klaster (Fig. 17-21). [0060] Bardzo podobne wyniki uzyskano przez oznaczenie średniej identyczności amino- kwasów (AAI), która jest często stosowana do określania zależności filogenetycznych 10 między gatunkami bakterii. Metoda ta opiera się na obliczeniu średniej identyczności rdzenia genomu na poziomie aminokwasowym (Proc. Natl. Acad. USA 102, 2567-2572, 2005). Zgodnie z otrzymaną macierzą AAI na Fig. 22, P. polymyxa DSM 36 tworzy razem ze szczepem SQR-21 P. polymyxa subklastry, które różnią się od dwóch innych przedstawionych tu klastrów. 15 [0061] Szczepy Lu16674 i Lu17007 wraz ze szczepami M-1, 1-43, SC2 i Sb3-1 P. polymyxa tworzą drugi subklaster w każdym z dendrogramów o największej wiarygodności analizowanych dla pięciu konserwowanych genów metabolizmu podstawowego (dnaN, gyrB, recA, recN i rpoA) (Fig. 17-21). Zgodnie z macierzą AAI na Fig. 22 opartą na anali- zie genomu rdzenia, ten drugi klaster podrzędny jest potwierdzony przez jego reprezenta- 20 tywne szczepy Lu16674 i Lu17007 wraz ze szczepami M-1 i SC2 P. polymyxa. [0062] Różnica między tymi dwoma subklastrami nie jest tak znacząca, aby uzasadnić nowy gatunek, ale poziomy identyczności AAI między przedstawicielami obu klastrów wy- noszą około 97,5%, co uzasadnia klasyfikację do dwóch oddzielnych podgatunków [0063] Dlatego proponuje się wyznaczenie pierwszego subklastra zgodnie z typem P. 25 polymyxa szczepu DSM 36T Paenibacillus polymyxa ssp. polymyxa. Oprócz szczepu DSM 36, szczepy SQR-21, CF05, CICC 10580, NRRL B-30509 i A18 P. polymyxa będą należeć do podgatunku Paenibacillus polymyxa ssp. polymyxa. [0064] Ponadto proponuje się wyznaczenie drugiego subklastra jako nowego podgatunku Paenibacillus polymyxa ssp. plantarum. Oprócz szczepów Lu16674 i Lu17007, szczepy 30 M-1, 1-43, SC2 i Sb3-1 P. polymyxa należą do Paenibacillus polymyxa ssp. plantarum. [0065] Szczep Lu17015 wykazuje jedynie 94,9% identyczność (AAI) pomiędzy genami rdzenia genomu ze szczepem typu Paenibacillus polymyxa DSM36 = ATCC 842 (Fig. 22). Zatem, szczep Lu17015 nie mógł być przypisany do tego gatunku Paenibacillus polymyxa ani do żadnego innego znanego gatunku Paenibacillus. Podobne wartości stwierdzono dla 35 szczepów E681 (94,7%) i CR2 (94,9%). Między sobą te trzy szczepy mają co najmniej 98,1% identyczność (AAI). Zgodnie z definicją gatunku z Konstantinides i Tiedje (Proc Natl. Acad. Sci. USA. 102, 2567-2572, 2005), szczep Lu17015, a także szczepy E681 i CR2 mogą być przypisane do nowego gatunku. Tak więc zaproponowano tu nowy gatunek Paenibacillus spec. nov. epiphyticus. W konsekwencji, szczep Paenibacillus należy do 40 szczepu Lu17015 Paenibacillus epiphyticus. Proponuje się, aby wspomniany szczep był typem szczepu. Podobnie, dendrogramy oparte na porównaniu sekwencji pięciu genów metabolizmu podstawowego (Fig. 17-21) pokazują, że ten klaster jest odległy od wszystkich innych szczepów P. polymyxa. Proponuje się, że oprócz Lu17015, do Paenibacillus spec. nov. epiphyticus powinny należeć szczepy E681, CR2 TD94, DSM 365 i WLY78 P. 45 polymyxa. [0066] Zatem, wynalazek dotyczy szczepów mikroorganizmu 4) szczep Lu16774 Paenibacillus polymyxa ssp. plantarum zdeponowany w DSMZ pod numerem dostępu DSM 26969, 5) szczep Lu17007 Paenibacillus polymyxa ssp. plantarum zdeponowany w DSMZ 50 pod numerem dostępu DSM 26970 i 6) szczep Lu17015 Paenibacillus epiphyticus zdeponowany w DSMZ pod numerem dostępu DSM 26971. 11 [0067] Oprócz szczepów Lu16774, Lu17007 i Lu17015, niniejsze ujawnienie dotyczy dowolnego szczepu Paenibacillus, zarówno fizycznie pochodzącego z oryginalnego depozytu dowolnego ze szczepów Lu16774, Lu17007 i Lu17015 jak i niezależnie wyizolowanego, o ile zachowuje co najmniej jedną z cech identyfikujących zdeponowanych szczepów 5 Lu16774, Lu17007 i Lu17015 Paenibacillus. Takie szczepy Paenibacillus obejmują dowolne komórki potomne dowolnego ze szczepów Lu16774, Lu17007 i Lu17015, w tym mutanty tych szczepów. [0068] Określenie „mutant” odnosi się do mikroorganizmu otrzymanego przez bezpośred- nią selekcję mutanta, ale obejmuje także mikroorganizmy, które zostały dalej zmutowane 10 lub poddane innym manipulacjom (np. przez wprowadzenie plazmidu). Odpowiednio, postacie obejmują mutanty, warianty i lub pochodne odpowiedniego mikroorganizmu, za- równo naturalnie występujące, jak i sztucznie indukowane mutanty. Przykładowo, mutanty można indukować przez poddanie mikroorganizmu działaniu znanych mutagenów, takich jak promieniowanie rentgenowskie, promieniowanie UV lub N-metylo-nitrozoguanidyna, 15 stosując konwencjonalne metody. Po wspomnianym traktowaniu można przeprowadzić badanie przesiewowe pod kątem zmutowanych szczepów wykazujących pożądane cechy. [0069] Zmutowane szczepy można uzyskać dowolnymi metodami znanymi w dziedzinie, takimi jak bezpośrednia selekcja mutantów, mutageneza chemiczna lub manipulacja gene- tyczna (np. przez wprowadzenie plazmidu). Przykładowo, takie mutanty można uzyskać 20 przez zastosowanie znanego mutagenu, takiego jak promieniowanie rentgenowskie, promieniowanie UV lub N-metylo-nitrozoguanidyna. Po wspomnianym traktowaniu można przeprowadzić badanie przesiewowe pod kątem zmutowanych szczepów wykazujących pożądane cechy. [0070] Szczep Paenibacillus może być w szczególności szczepem, który zawiera sekwen- 25 cję DNA wykazującą co najmniej 99,6%, korzystnie co najmniej 99,8%, nawet korzystniej co najmniej 99,9%, a w szczególności 100,0% identyczność sekwencji nukleotydowej do dowolnej spośród sekwencji 16S rDNA szczepów Lu16774, Lu17007 i Lu17015, tj. z któ- rąkolwiek z sekwencji nukleotydowych przedstawionych w Wykazie sekwencji stanowią- cych SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 i SEQ ID NO:3. 30 [0071] Szczep Paenibacillus może być w szczególności szczepem, który zawiera sekwen- cję DNA wykazującą 100% identyczność sekwencji nukleotydowej do dowolnej spośród sekwencji 16S rDNA szczepów Lu16774, Lu17007 i Lu17015, tj. z którąkolwiek z sekwencji nukleotydowych przedstawionych w Wykazie sekwencji stanowiących SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 lub SEQ ID NO:3. 35 [0072] Szczep Paenibacillus może być szczepem, którego cała sekwencja 16S rDNA wykazuje po optymalnym uliniowieniu w obrębie okna uliniowionych sekwencji co najmniej 99,6% identyczność do co najmniej jednej spośród sekwencji SEQ ID NO:1 i SEQ ID NO:2 lub co najmniej 99,8% identyczność do SEQ ID NO:3; korzystnie co najmniej 99,8% identyczność do co najmniej jednej spośród sekwencji SEQ ID NO:1, SEQ ID:2 i 40 SEQ ID NO:3; korzystniej co najmniej 99,9% identyczność do co najmniej jednej spośród sekwencji SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 i SEQ ID NO:3; nawet korzystniej więcej niż 99,9% identyczność do co najmniej jednej spośród sekwencji SEQ ID NO:1, SEQ ID:2 i SEQ ID NO:3; w szczególności 100% identyczność do co najmniej jednej spośród sekwencji SEQ ID NO:1, SEQ ID:2 i SEQ ID NO:3. 45 [0073] Według dalszej postaci, szczep Paenibacillus według wynalazku jest wybrany z grupy obejmującej: a) szczep Lu16774 zdeponowany w DSMZ pod numerem dostępu DSM 26969; b) szczep Lu17007 zdeponowany w DSMZ pod numerem dostępu DSM 26970; szczep Lu17015 zdeponowany w DSMZ pod numerem dostępu DSM 26971.. 50 [0074] Szczep Paenibacillus może być szczepem, który zawiera sekwencję DNA dnaN wykazującą co najmniej 99,6% identyczność sekwencji nukleotydowej do sekwencji DNA 12 o SEQ ID NO:4 lub SEQ ID NO:9 lub, który zawiera sekwencję DNA wykazującą co najmniej 99,8% identyczność sekwencji nukleotydowej do sekwencji DNA o SEQ ID NO:14. [0075] Szczep Paenibacillus może być szczepem, którego cała sekwencja DNA dnaN wykazuje po optymalnym uliniowieniu w obrębie okna uliniowionych sekwencji co najmniej 5 99,6% identyczność do co najmniej jednej spośród sekwencji DNA o SEQ ID NO:4 i SEQ ID NO:9 lub co najmniej 99,8% identyczność do SEQ ID NO:14; korzystnie co najmniej 99,9% identyczność do SEQ ID NO: 14; w szczególności 100% identyczność do SEQ ID NO:14. [0076] Szczep Paenibacillus może być szczepem, który zawiera sekwencję DNA wykazu- 10 jącą co najmniej 99,8%, w szczególności 100,0% identyczność sekwencji nukleotydowej do dowolnej spośród sekwencji DNA dnaN szczepów Lu16774, Lu17007 i Lu17015, tj. do dowolnej z tych sekwencji DNA o SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:9 i SEQ ID NO:14. [0077] Szczep Paenibacillus może być szczepem, który zawiera sekwencję DNA gyrB wykazującą co najmniej 99,9% identyczność sekwencji nukleotydowej do sekwencji DNA 15 o SEQ ID NO:5 lub SEQ ID NO:10 lub która zawiera sekwencję DNA wykazującą co najmniej 99,2% identyczność sekwencji nukleotydowej do sekwencji DNA o SEQ ID NO:15. [0078] Szczep Paenibacillus może być szczepem, którego cała sekwencja DNA gyrB wykazuje po optymalnym uliniowieniu w obrębie okna uliniowionych sekwencji co najmniej 20 99,9% identyczność do co najmniej jednej spośród sekwencji DNA o SEQ ID NO:5 i SEQ ID NO:10 lub co najmniej 99,9% identyczność do SEQ ID NO:15; korzystnie co najmniej 99,9% identyczność do SEQ ID NO: 15; w szczególności 100% identyczność do SEQ ID NO:15. [0079] Szczep Paenibacillus może być szczepem, który zawiera sekwencję DNA wykazu- 25 jącą 100,0% identyczność sekwencji nukleotydowej do dowolnej spośród sekwencji DNA gyrB szczepów Lu16774, Lu17007 i Lu17015, tj. do dowolnej z tych sekwencji DNA o SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:10 i SEQ ID NO:15. [0080] Szczep Paenibacillus może być szczepem, który zawiera sekwencję DNA recF wykazującą co najmniej 99,2% identyczność sekwencji nukleotydowej do sekwencji DNA 30 o SEQ ID NO:6 lub SEQ ID NO:11 lub która zawiera sekwencję DNA wykazującą co najmniej 99,8% identyczność sekwencji nukleotydowej do sekwencji DNA o SEQ ID NO:16. [0081] Szczep Paenibacillus może być szczepem, którego cała sekwencje DNA recF wykazuje po optymalnym uliniowieniu w obrębie okna uliniowionych sekwencji co najmniej 35 99,2% identyczność do co najmniej jednej spośród sekwencji DNA o SEQ ID NO:6 i SEQ ID NO:11 lub co najmniej 99,8% identyczność do SEQ ID NO:16; korzystnie co najmniej 99,9% identyczność do SEQ ID NO: 16; w szczególności 100% identyczność do SEQ ID NO:16. [0082] Szczep Paenibacillus może być szczepem, który zawiera sekwencję DNA wykazu- 40 jącą co najmniej 99,8%, w szczególności 100,0% identyczność sekwencji nukleotydowej do dowolnej spośród sekwencji DNA recF szczepów Lu16774, Lu17007 i Lu17015, tj. do dowolnej z tych sekwencji DNA o SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:11 i SEQ ID NO:16. [0083] Szczep Paenibacillus może być szczepem, który zawiera sekwencję DNA recN wykazującą co najmniej 99,8% identyczność sekwencji nukleotydowej do sekwencji DNA 45 o SEQ ID NO:7 lub SEQ ID NO: 12 lub która zawiera sekwencję DNA wykazującą co najmniej 99,3% identyczność sekwencji nukleotydowej do sekwencji DNA o SEQ ID NO:17. [0084] Szczep Paenibacillus według wynalazku może być szczepem, którego cała sekwencja DNA recN wykazuje po optymalnym uliniowieniu w obrębie okna uliniowionych 50 sekwencji co najmniej 99,8% identyczność do co najmniej jednej spośród sekwencji DNA o SEQ ID NO:7 i SEQ ID NO: 12 lub co najmniej 99,3% identyczność do SEQ ID NO: 17; 13 korzystnie co najmniej 99,6% identyczność do SEQ ID NO: 17; w szczególności 100% identyczność do SEQ ID NO:17. [0085] Szczep Paenibacillus może być szczepem, który zawiera sekwencję DNA wykazu- jącą co najmniej 99,8%, w szczególności 100,0% identyczność sekwencji nukleotydowej 5 do dowolnej spośród sekwencji DNA recN szczepów Lu16774, Lu17007 i Lu17015, tj. do dowolnej z tych sekwencji DNA o SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:12 i SEQ ID NO:17. [0086] Szczep Paenibacillus może być szczepem, który zawiera sekwencję DNA rpoA wykazującą 100,0% identyczność sekwencji nukleotydowej do sekwencji DNA o SEQ ID NO:8 lub SEQ ID NO:13 lub która zawiera sekwencję DNA wykazującą co najmniej 10 99,8% identyczność sekwencji nukleotydowej do sekwencji DNA o SEQ ID NO:18. [0087] Szczep Paenibacillus może być szczepem, którego cała sekwencja DNA rpoA wykazuje po optymalnym uliniowieniu w obrębie okna uliniowionych sekwencji 100,0% identyczność do co najmniej jednej spośród sekwencji DNA o SEQ ID NO:8 i SEQ ID NO:13 lub co najmniej 99,8% identyczność do SEQ ID NO:18; korzystnie co najmniej 15 99,9% identyczność do SEQ ID NO:17; w szczególności 100% identyczność do SEQ ID NO:18. [0088] Szczep Paenibacillus może być szczepem, który zawiera sekwencję DNA wykazu- jącą 100,0% identyczność sekwencji nukleotydowej do dowolnej spośród sekwencji DNA rpoA szczepów Lu16774, Lu17007 i Lu17015, tj. do dowolnej z tych sekwencji DNA o 20 SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:13 i SEQ ID NO:18. [0089] Ujawniono wyizolowany mikroorganizm, należący do rodziny Paenibacillus, wy- kazujący co najmniej jedną z cech identyfikacyjnych jednego z następujących szczepów: 1) szczep Lu16774 Paenibacillus zdeponowany w DSMZ pod numerem dostępu DSM 26969, 25 2) szczep Lu17007 Paenibacillus zdeponowany w DSMZ pod numerem dostępu DSM 26970 lub 3) szczep Lu17015 Paenibacillus zdeponowany w DSMZ pod numerem dostępu DSM 26971. [0090] Kolejna postać dotyczy szczepu Paenibacillus, który jest wybrany z grupy obejmu- 30 jącej: 1) szczep Lu16774 zdeponowany w DSMZ pod numerem dostępu DSM 26969, 2) szczep Lu17007 zdeponowany w DSMZ pod numerem dostępu DSM 26970 i 3) szczep Lu17015 zdeponowany w DSMZ pod numerem dostępu DSM 26971, 4) szczepy mające co najmniej jedną z cech identyfikujących jednego ze wspomnia- 35 nych szczepów Lu16774, Lu17007 i Lu17015. [0091] Ujawniono wyizolowany mikroorganizm wybrany ze szczepów: 1) szczep Lu16774 Paenibacillus zdeponowany w DSMZ pod numerem dostępu DSM 26969, 2) szczep Lu17007 Paenibacillus zdeponowany w DSMZ pod numerem dostępu DSM 40 26970 i 3) szczep Lu17015 Paenibacillus zdeponowany w DSMZ pod numerem dostępu DSM 26971; wykazujący działania antagonistyczne przeciwko co najmniej jednemu patogenowi roślinnemu i zdolne do wytwarzania co najmniej jednego związku typu fuzarycydyny; lub zmutowany szczep tego gatunku wykazujący wspomnianą zdolność, tj. za- 45 chowujący wspomniane działanie antagonistyczne przeciwko co najmniej jednemu patogenowi roślinnemu i wykazujący wspomnianą zdolność do wytwarzania co najmniej jednego związku typu fuzarycydyny. [0092] Kolejna postać dotyczy mikroorganizmu wybranego spośród: 1) szczepu Lu16774 Paenibacillus zdeponowanego w DSMZ pod numerem dostępu 50 DSM 26969, 2) szczepu Lu17007 Paenibacillus zdeponowanego w DSMZ pod numerem dostępu DSM 26970, i 14 3) szczepu Lu17015 Paenibacillus zdeponowanego w DSMZ pod numerem dostępu DSM 26971; [0093] Cecha identyfikująca zdeponowanych szczepów Lu16774, Lu17007 i Lu17015 Pa- enibacillus jest taka, że są zdolne do wytwarzania co najmniej jednego związku o wzorze I, 5 korzystnie wybranego spośród związków 1A i 1B, w szczególności do wytwarzania związków 1A i 1B, które są metabolitami odpowiednich szczepów; i ich dopuszczalnych w rolnictwie soli. [0094] Zatem, według jednego aspektu wynalazku, szczepy Paenibacillus według wynalazku są zdolne do wytwarzania co najmniej jednego związku o wzorze I, korzystniej wy- 10 twarzania związków 1A lub 1B, w szczególności wytwarzania związków 1A i 1B; i jego dopuszczalnych w rolnictwie soli. [0095] Zatem, według jednego aspektu wynalazku, szczepy Paenibacillus według wynalazku są zdolne do wytwarzania co najmniej jednego związku o wzorze I, korzystniej wytwarzania związków 1A lub 1B, w szczególności wytwarzania związków 1A i 1B; i do- 15 puszczalnych w rolnictwie soli tych związków, w pożywce wzrostowej zawierającej co najmniej jedno źródło węgla i jedno źródło azotu, jak tu zdefiniowano. [0096] Zatem, według jednego aspektu wynalazku, szczepy Paenibacillus według wynalazku w pożywce wzrostowej zawierającej co najmniej jedno źródło węgla i jedno źródło azotu jak tu zdefiniowano wytwarzają co najmniej jeden związek o wzorze I, korzystniej 20 wytwarzają związki 1A lub 1B, w szczególności wytwarzają związki 1A i 1B; i jego dopuszczalne w rolnictwie sole. [0097] Inna postać wynalazku dotyczy wyizolowanego mikroorganizmu wybranego spo- śród 1) szczepu Lu16774 Paenibacillus zdeponowanego w DSMZ pod numerem dostępu 25 DSM 26969, 2) szczepu Lu17007 Paenibacillus zdeponowanego w DSMZ pod numerem dostępu DSM 26970 i 3) szczepu Lu17015 Paenibacillus zdeponowanego w DSMZ pod numerem dostępu DSM 26971; 30 wykazującego działania antagonistyczne przeciwko co najmniej jednemu patogenowi ro- ślinnemu i zdolne do wytwarzania co najmniej jednego związku typu fuzarycydyny o wzorze I, korzystnie wybranego spośród związków 1A i 1B, w szczególności do wytwarzania związków 1A i 1B; lub zmutowanego szczepu tego gatunku wykazującego wspomnianą zdolność, tj. zachowujący wspomniane działanie antagonistyczne przeciwko co najmniej 35 jednemu patogenowi roślinnemu i wykazujący wspomnianą zdolność do wytwarzania co najmniej jednego związku typu fuzarycydyny o wzorze I, korzystnie wybranego spośród związków 1A i 1B, w szczególności do wytwarzania związków 1A i 1B. [0098] Inna postać wynalazku dotyczy wyizolowanego mikroorganizmu wybranego spo- śród 40 1) szczepu Lu16774 Paenibacillus zdeponowanego w DSMZ pod numerem dostępu DSM 26969, 2) szczepu Lu17007 Paenibacillus zdeponowanego w DSMZ pod numerem dostępu DSM 26970 i 3) szczepu Lu17015 Paenibacillus zdeponowanego w DSMZ pod numerem dostępu 45 DSM 26971; wykazującego działania antagonistyczne przeciwko co najmniej jednemu patogenowi ro- ślinnemu i obecnego w pożywce wzrostowej zawierającej co najmniej jedno źródło węgla i jedno źródło azotu jak tu zdefiniowano, zdolnego do wytwarzania co najmniej jednego związku typu fuzarycydyny o wzorze I, korzystnie wybranego spośród związków 1A i 1B, 50 w szczególności do wytwarzania związków 1A i 1B; lub zmutowanego szczepu tego gatunku wykazującego wspomnianą zdolność, tj. zachowującego wspomniane działanie antagonistyczne przeciwko co najmniej jednemu patogenowi roślinnemu i wykazującego 15 wspomnianą zdolność do wytwarzania co najmniej jednego związku typu fuzarycydyny o wzorze I, korzystnie wybranego spośród związków 1A i 1B, w szczególności do wytwarzania związków 1A i 1B. [0099] Inna postać wynalazku dotyczy wyizolowanego mikroorganizmu wybranego spo- 5 śród 1) szczepu Lu16774 Paenibacillus zdeponowanego w DSMZ pod numerem dostępu DSM 26969, 2) szczepu Lu17007 Paenibacillus zdeponowanego w DSMZ pod numerem dostępu DSM 26970 i 10 3) szczepu Lu17015 Paenibacillus zdeponowanego w DSMZ pod numerem dostępu DSM 26971; wykazującego działania antagonistyczne przeciwko co najmniej jednemu patogenowi ro- ślinnemu, wytwarzającego co najmniej jeden związek typu fuzarycydyny o wzorze I, korzystnie wybrany spośród związków 1A i 1B, w szczególności wytwarzającego związki 1A 15 i 1B; lub zmutowanego szczepu tego gatunku wykazującego wspomnianą zdolność, tj. za- chowującego wspomniane działanie antagonistyczne przeciwko co najmniej jednemu patogenowi roślinnemu i wykazującego wspomnianą zdolność do wytwarzania co najmniej jednego związku typu fuzarycydyny o wzorze I, korzystnie wybranego spośród związków 1A i 1B, w szczególności do wytwarzania związków 1A i 1B. 20 [0100] Dalsza cecha identyfikująca zdeponowanych szczepów Lu16774, Lu17007 i Lu17015 Paenibacillus lub zmutowanego szczepu tego gatunku polega na tym, że są one zdolne do wytwarzania co najmniej jednego związku wybranego z grupy obejmującej fu- zarycydynę A, fuzarycydynę B, fuzarycydynę C, fuzarycydynę D, LI-F06a, LI-F06b i LI- F08b poza ich zdolnością do wytwarzania co najmniej jednego związku o wzorze I, ko- 25 rzystnie wybranego spośród związków 1A i 1B, w szczególności do wytwarzania związ- ków 1A i 1B. [0101] Zatem, zgodnie z dalszym aspektem wynalazku, szczepy Paenibacillus według wynalazku są zdolne do wytwarzania co najmniej jednej fuzarycydyny o wzorze I, korzystnie wybranej spośród związków 1A i 1B, w szczególności do wytwarzania związków 1A i 1B, 30 jak tu ujawniono i są zdolne do wytwarzania co najmniej jednego związku wybranego z grupy obejmującej fuzarycydynę A, fuzarycydynę B, fuzarycydynę C, fuzarycydynę D, LI- F06a, LI-F06b i LI-F08b. [0102] Zgodnie z dalszym aspektem wynalazku, szczepy Paenibacillus według wynalazku są zdolne do wytwarzania co najmniej jednej fuzarycydyny o wzorze I, korzystnie wybra- 35 nej spośród związków 1A i 1B, w szczególności do wytwarzania związków 1A i 1B, jak tu ujawniono i są zdolne do wytwarzania co najmniej trzech związków wybranych z grupy obejmującej fuzarycydynę A, fuzarycydynę B, fuzarycydynę C, fuzarycydynę D, LI-F06a, LI-F06b i LI-F08b. [0103] Zgodnie z dalszym aspektem wynalazku, szczepy Paenibacillus według wynalazku 40 są zdolne do wytwarzania co najmniej jednej fuzarycydyny o wzorze I, korzystnie wybranej spośród związków 1A i 1B, w szczególności do wytwarzania związków 1A i 1B, jak tu ujawniono i są zdolne do wytwarzania co najmniej pięciu związków wybranych z grupy obejmującej fuzarycydynę A, fuzarycydynę B, fuzarycydynę C, fuzarycydynę D, LI-F06a, LI-F06b i LI-F08b. 45 [0104] Zgodnie z dalszym aspektem wynalazku, szczepy Paenibacillus według wynalazku są zdolne do wytwarzania co najmniej jednej fuzarycydyny o wzorze I, korzystnie wybranej spośród związków 1A i 1B, w szczególności do wytwarzania związków 1A i 1B, jak tu ujawniono i są zdolne do wytwarzania fuzarycydyny A, fuzarycydyny B, fuzarycydyny C, fuzarycydyny D i LI-F08b. 50 [0105] Dalszą cechę identyfikującą zdeponowanych szczepów Paenibacillus stanowi ich aktywność przeciwgrzybicza. W szczególności, stwierdzono, że szczepy te są skuteczne przeciwko inwazji patogenów roślinnych, w tym Alternaria spp., Botrytis cinerea, Phy- 16 tophthora infestans i Sclerotinia sclerotiorum; w którym Alternaria spp. jest korzystnie wybrana spośród A. solani i A. alternata, w szczególności A. solani. [0106] Zatem, zgodnie z dalszym aspektem wynalazku, szczepy Paenibacillus według wynalazku wykazują aktywność przeciwgrzybiczą, szczególnie przeciwko patogenowi roślin- 5 nemu wybranemu z grupy obejmującej Alternaria spp., Botrytis cinerea, Phytophthora infestans i Sclerotinia sclerotiorum, przy czym Alternaria spp. jest korzystnie wybrana spo- śród A. solani i A. alternata, w szczególności A. solani. Bardziej szczegółowo, szczepy Paenibacillus według wynalazku wykazują aktywność przeciwgrzybiczą przeciwko co najmniej dwóm lub przeciwko wszystkim czterem wspomnianym patogenom. 10 [0107] Zgodnie z dalszym aspektem wynalazku, szczepy Paenibacillus według wynalazku wykazują aktywność przeciwgrzybiczą przeciwko patogenom roślinnym Alternaria solani, Botrytis cinerea, Phytophthora infestans i Sclerotinia sclerotiorum. [0108] Działanie antagonistyczne szczepów Paenibacillus przeciwko patogenom roślin- nym może być pokazane w testach konfrontacyjnych in vitro z użyciem pożądanych fito- 15 patogennych grzybów, takich jak Alternaria spp., Botrytis cinerea, Phytophthora infestans i Sclerotinia sclerotiorum, przy czym Alternaria spp. jest korzystnie wybrana spośród A. solani i A. alternata, w szczególności A. solani: [0109] Jako pożywkę wzrostową dla tych fitopatogennych grzybów stosuje się pożywkę ISP2 zawierającą na litr: 10 g ekstraktu słodowego (Sigma Aldrich, 70167); 4 g ekstraktu 20 drożdżowego Bacto (Becton Dickinson, 212750); 4 g monohydratu glukozy (Sigma Ald- rich, 16301); 20 g agaru (Becton Dickinson, 214510), pH około 7, woda podwójnie destylowana. Jako pożywkę wzrostową dla PHYTIN stosuje się pożywkę V8 zawierającą na litr: 200 ml soku warzywnego, 3 g węglanu wapnia (Merck Millipore, 1020660250); 30 g agaru (Becton Dickinson, 214510), pH 6,8, woda podwójnie destylowana. 25 [0110] Szczepy Paenibacillus zaszczepia się punktowo po jednej stronie płytki agarowej. Blok agarowy (ok. 0,3 cm2) zawiera jeden aktywnie rosnący patogen roślinny umieszczony w środku płytki. Po inkubacji przez 7-14 dni w około 25°C bada się wzrost patogenu ro- ślinnego, zwłaszcza pod kątem stref hamowania. Można ocenić następujące działania antagonistyczne: Antybiozę ocenia się przez ocenę średnicy strefy wolnej od grzybów (strefa 30 hamowania). Współzawodnictwo ocenia się przez porównanie średnicy wzrostu patogenu grzybowego na płytkach ze szczepami bakteryjnymi w porównaniu z płytkami kontrolnymi. Mykopasożytnictwo można udokumentować w przypadku, gdy bakterie przerastają patogen grzybiczy, a także mykopasożytuje patogeny. Można to wizualizować z użyciem mikroskopii. 35 [0111] Kolejna cecha identyfikująca zdeponowanych szczepów Paenibacillus Lu16774, Lu17007 i Lu17015 polega na tym, że są one zdolne do wytwarzania i wydzielania co najmniej jednego enzymu litycznego korzystnie wybranego spośród chitynazy, celulazy i amylazy (patrz Przykład 6), jeszcze korzystniej co najmniej chitynazy i celulazy; w szcze- gólności w pożywce wzrostowej zawierającej co najmniej jedno źródło węgla i jedno źró- 40 dło azotu jak tu zdefiniowano. [0112] Zatem, zgodnie z dalszym aspektem wynalazku, szczepy Paenibacillus według wynalazku są zdolne do wytwarzania i wydzielania co najmniej jeden enzymu litycznego, korzystnie wybranego spośród chitynazy, celulazy i amylazy, jeszcze korzystniej co najmniej chitynazy i celulazy; w szczególności w pożywce wzrostowej zawierającej co najmniej 45 jedno źródło węgla i jedno źródło azotu jak tu zdefiniowano. [0113] Bardziej szczegółowo, niniejszy wynalazek dotyczy zdeponowanych szczepów Lu16774, Lu17007 i Lu17015 i ujawnione są dowolne szczepy Paenibacillus wykazujące jedną lub większą liczbę cech identyfikujących zdeponowanego szczepu, przy czym cechy identyfikujące są wybrane z grupy obejmującej: 50 (a) aktywność przeciwgrzybiczą przeciwko patogenowi roślinnemu wybranemu z grupy obejmującej Alternaria spp., Botrytis cinerea, Phytophthora infestans i Sclerotinia 17 sclerotiorum, przy czym Alternaria spp. jest korzystnie wybrana spośród A. solani i A. alternata, w szczególności A. solani, jak tu ujawniono; (b) zdolność do wytwarzania co najmniej jednego związku typu fuzarycydyny o wzorze I, w szczególności związków 1A i/lub 1B, jak tu ujawniono; 5 (c) zdolność do wytwarzania co najmniej jednego związku wybranego z grupy obejmu- jącej fuzarycydyny A, B, C, D, LI-F06a, LI-F06b i LI-F08b, jak tu ujawniono; i (d) zdolność do wytwarzania i wydzielania co najmniej jednego enzymu litycznego wybranego z grupy obejmującej chitynazę, celulazę i amylazę, jak tu ujawniono. Korzystniej, wspomniany szczep Paenibacillus ma zdolności określane poprzez (b), (c) 10 i (d) w pożywce wzrostowej zawierającej co najmniej jedno źródło węgla i jedno źró- dło azotu jak tu zdefiniowano. [0114] W szczególności, szczepy Paenibacillus wykazują dwie lub większą liczbę cech identyfikujących zdeponowanego szczepu, gdzie szczepy o co najmniej cechach (a) i (b) są szczególnie korzystne. Przykładowo, zgodnie z korzystną postacią, szczepy według wyna- 15 lazku (a) wykazują aktywność przeciwgrzybiczą przeciwko patogenowi roślinnemu wybranemu z grupy obejmującej Alternaria spp., Botrytis cinerea, Phytophthora infestans i Sclerotinia sclerotiorum, przy czym Alternaria spp. jest korzystnie wybrana spośród A. solani i A. alternata, w szczególności A. solani oraz (b) są zdolne do wytwarzania co najmniej jednego związku o wzorze I, a szczególnie związku 1B. Zgodnie z dalszą korzystną 20 postacią, szczepy według wynalazku (a) wykazują aktywność przeciwgrzybiczą przeciwko trzem lub przeciwko wszystkim patogenom roślinnym wybranym z grupy obejmującej Al- ternaria spp., Botrytis cinerea, Phytophthora infestans i Sclerotinia sclerotiorum, przy czym Alternaria spp. jest korzystnie wybrana spośród A. solani i A. alternata, w szczegól- ności A. solani i (b) są zdolne do wytwarzania co najmniej jednego związku o wzorze I, 25 korzystniej wytwarzania związków 1A lub 1B, w szczególności do wytwarzania związków 1A i 1B. [0115] Zgodnie z postacią wynalazku, szczepy według wynalazku są dostarczane w postaci wyizolowanej lub zasadniczo oczyszczonej. [0116] Określenia „wyizolowany” lub „zasadniczo oczyszczony” będą oznaczać, że szcze- 30 py według wynalazku zostały usunięte ze środowiska naturalnego i zostały wyizolowane lub oddzielone i są wolne w co najmniej 60%, korzystnie są wolne w co najmniej 75% a korzystniej są wolne w co najmniej 90%, nawet korzystniej są wolne w co najmniej 95% i najkorzystniej są wolne w co najmniej 99% od innych składników, z którymi były naturalnie związane. Izolat uzyskany przez hodowanie pojedynczej kolonii drobnoustrojów jest 35 przykładem izolowanego szczepu według wynalazku. [0117] Szczepy według wynalazku można dostarczać w dowolnym stanie fizjologicznym, tak jak aktywne lub uśpione. Uśpione szczepy można dostarczać na przykład zamrożone, wysuszone lub liofilizowane lub częściowo wysuszone (procedury wytwarzania częściowo wysuszonych organizmów podano w WO 2008/002371) lub w postaci zarodników. 40 [0118] Zgodnie z postacią wynalazku, szczepy według wynalazku dostarcza się w postaci zarodników. [0119] Według dalszej postaci wynalazku, szczepy według wynalazku dostarcza się jako całkowity bulion hodowlany zawierający szczep według wynalazku. [0120] Hodowla jest korzystnie wyizolowaną lub zasadniczo oczyszczoną hodowlą. 45 [0121] „Wyizolowana hodowla” lub „zasadniczo oczyszczona hodowla” odnosi się do hodowli szczepów według wynalazku, która nie zawiera znaczących ilości innych materia- łów, które normalnie znajdują się w naturalnym środowisku, w którym szczep wzrasta i/lub z którego szczep normalnie można uzyskać. W konsekwencji taka „wyizolowana hodowla” lub „zasadniczo oczyszczona hodowla” jest wolna w co najmniej 60%, korzystnie 50 jest wolna w co najmniej 75%, a korzystniej jest wolna w co najmniej 90%, jeszcze korzystniej jest wolna w co najmniej 95%, a najkorzystniej jest wolna w co najmniej 99% od innych materiałów, które normalnie występują w naturalnym środowisku, w którym szczep 18 wzrasta i/lub z którego normalnie można uzyskać szczep. Taka „wyizolowana hodowla” lub „zasadniczo oczyszczona hodowla” zazwyczaj nie zawiera żadnego innego mikroorganizmu w ilościach wystarczających do zakłócania replikacji szczepu według wynalazku. Izolowane hodowle według wynalazku można jednak łączyć w celu wytworzenia miesza- 5 nej hodowli szczepów według wynalazku i dalszego biopestycydu, korzystnie pestycydu drobnoustrojowego. [0122] Wynalazek dotyczy sposobów fermentacyjnego wytwarzania przeciwpatogennych biopestycydów, jak tu opisano. [0123] Szczepy stosowane zgodnie z wynalazkiem można hodować w sposób ciągły lub 10 nieciągły w procesie okresowym lub w procesie okresowym z zasilaniem lub okresowym z powtarzanym zasilaniem. Przegląd znanych metod hodowli znajdzie się w podręczniku Chmiela (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) lub w podręczniku Storhasa (Bioreaktoren und periphere Einrich- tungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)). 15 [0124] Pożywka, która ma być użyta do hodowli mikroorganizmu musi spełniać wymaga- nia poszczególnych szczepów w odpowiedni sposób. Opisy pożywek hodowlanych dla różnych mikroorganizmów podano w podręczniku „Manual of Methods for General Bacte- riology” wydanym przez American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981). 20 [0125] Te pożywki, które można stosować zgodnie z wynalazkiem, ogólnie zawierają jedno lub większą liczbę źródeł węgla, źródeł azotu, soli nieorganicznych, witamin i/lub pierwiastków śladowych. Korzystnymi źródłami węgla są cukry, takie jak mono-, di- lub polisacharydy. Bardzo dobrymi źródłami węgla są na przykład glukoza, fruktoza, manno- za, galaktoza, ryboza, sorboza, rybuloza, laktoza, maltoza, sacharoza, rafinoza, skrobia lub 25 celuloza. Można również dodawać do pożywek cukry za pomocą złożonych związków, takich jak melasa lub inne produkty uboczne rafinacji cukru. Korzystne może być również dodanie mieszanin różnych źródeł węgla. Inne możliwe źródła węgla to oleje i tłuszcze, takie jak olej sojowy, olej słonecznikowy, olej arachidowy i olej kokosowy, kwasy tłusz- czowe, takie jak kwas palmitynowy, kwas stearynowy lub kwas linolowy, alkohole, takie 30 jak glicerol, metanol lub etanol i kwasy organiczne, takie jak kwas octowy lub kwas mle- kowy. Źródłami azotu są zazwyczaj organiczne lub nieorganiczne związki azotu lub mate- riały zawierające te związki. Przykłady źródeł azotu obejmują gaz amoniakalny lub sole amonowe, takie jak siarczan amonu, chlorek amonu, fosforan amonu, węglan amonu lub azotan amonu, azotany, mocznik, aminokwasy lub złożone źródła azotu, takie jak namok 35 kukurydziany ciekły, mąka sojowa, białko sojowe, ekstrakt drożdżowy, ekstrakt mięsny i inne. Źródła azotu można stosować oddzielnie lub w mieszaninie. Nieorganiczne związki soli, które mogą być obecne w pożywkach, obejmują sole chlorkowe, fosforanowe lub siarczanowe wapnia, magnezu, sodu, kobaltu, molibdenu, potasu, manganu, cynku, miedzi i żelaza. Jako źródła siarki można stosować nieorganiczne związki zawierające siarkę, na 40 przykład siarczany, siarczyny, ditioniny, tetrationiany, tiosiarczany, siarczki, ale także organiczne związki siarki, takie jak merkaptany i tiole. Jako źródła fosforu można stosować kwas fosforowy, diwodorofosforan potasu lub wodorofosforan dipotasu lub odpowiednie sole zawierające sód. Środki chelatujące można dodawać do pożywki, aby utrzymać jony metali w roztworze. Szczególnie odpowiednie środki chelatujące obejmują dihydroksyfe- 45 nole, takie jak katechol lub protokatechan, lub kwasy organiczne, takie jak kwas cytryno- wy. Pożywki fermentacyjne stosowane według wynalazku mogą również zawierać inne czynniki wzrostu, takie jak witaminy lub promotory wzrostu, które obejmują na przykład biotynę, ryboflawinę, tiaminę, kwas foliowy, kwas nikotynowy, pantotenian i pirydoksynę. Czynniki wzrostu i sole często pochodzą ze złożonych składników pożywek, takich jak 50 ekstrakt drożdżowy, melasa, namok kukurydziany ciekły i tym podobne. Ponadto do po- żywki można dodawać odpowiednie prekursory. Dokładny skład związków w pożywce jest silnie uzależniony od konkretnego doświadczenia i musi być ustalony indywidualnie 19 dla każdego konkretnego przypadku. Informacje na temat optymalizacji pożywki można znaleźć w podręczniku „Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach” (Wyd. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) s. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Pożywki do wzrostu można również uzyskać od dostawców komercyjnych, tak jak Standard 1 (Merck) 5 lub BHI (Brain heart infusion, DIFCO) itp. [0126] Korzystne pożywki wzrostowe, które można stosować według wynalazku, zawiera- ją jedno lub większą liczbę źródeł węgla wybranych spośród L-arabinozy, N-acetylo-D- glukozaminy, D-galaktozy, kwasu L-asparaginowego, D-trehalozy, D-mannozy, glicerolu, kwasu D-glukonowego, D-ksylozy, D-mannitolu, D-rybozy, D-fruktozy, α-D-glukozy, 10 maltozy, D-melibiozy, tymidyny, α-metylo-D-galaktozydu, α-D-laktozy, laktulozy, sacharozy, urydyny, kwasu α-hydroksyglutarowego-γ-laktonu, β-metylo-D-glukozydu, adonitolu, maltotriozy, 2-deoksyadenozyny, adenozyny, kwasu cytrynowego, kwasu mucynowe- go, D-celobiozy, inozyny, L-seryny, L-alanyloglicyny, kwasu D-galakturonowego, α- cyklodekstryny, β-cyklodekstryny, dekstryny, inuliny, pektyny, amigdaliny, gentiobiozy, 15 laktitolu, D-melezytozy, α-metylo-D-glukozydu, β-metylo-D-galaktozydu, β-metylo-D- ksylozydu, palatynozy, D-rafinozy, stachiozy, turanozy, kwasu γ-aminomasłowego, D- glukozaminy, kwasu D-mlekowego, L-lizyny, 3-hydroksy-2-butanonu; i jedno lub większą liczbę źródeł azotu wybranych spośród amoniaku, azotynu, azotanu, L-alaniny, L- asparaginy, kwasu L-asparaginowego, kwasu L-glutaminowego, L-glutaminy, glicyny, di- 20 merów aminokwasów: Ala-Asp, Ala-Gln, Ala-Glu, Ala-His, Gly-Gln, Gly-Glu, Gly-Met i Met-Ala; w szczególności azotanu. Pożywki te można uzupełnić solami nieorganicznymi i witaminami i/lub pierwiastkami śladowymi. Szczepy te są zdolne do wytwarzania związ- ków 1A i 1B w tych pożywkach wzrostowych. [0127] Wszystkie składniki pożywki sterylizuje się albo przez ogrzewanie (20 minut przy 25 2,0 barach i 121°C) albo przez sterylną filtrację. Składniki można sterylizować razem lub w razie potrzeby oddzielnie. Wszystkie składniki pożywki mogą być obecne na początku wzrostu lub ewentualnie mogą być dodawane w sposób ciągły lub wsadowy. [0128] Temperatura hodowli wynosi zwykle między 15°C a 36°C, korzystnie 25°C do 33°C i może być utrzymywana na stałym poziomie lub może być zmieniana podczas do- 30 świadczenia. Wartość pH pożywki powinna wynosić od 5 do 8,5, korzystnie około 7,0. Wartość pH do wzrostu można kontrolować podczas wzrostu przez dodanie zasadowych związków, takich jak wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu, amoniak lub woda amo- niakalna lub związków kwasowych, takich jak kwas fosforowy lub kwas siarkowy. Do kontrolowania pienienia mogą być stosowane środki przeciwpieniące, np. estry poligliko- 35 lowe kwasów tłuszczowych. Aby utrzymać stabilność plazmidów, można dodać do po- żywki odpowiednie substancje o selektywnym działaniu, np. antybiotyki. Mieszaniny ga- zowe stanowiące tlen lub zawierające tlen, np. powietrze z otoczenia są wprowadzane do hodowli w celu utrzymania warunków tlenowych. Temperatura hodowli wynosi zwykle od 20°C do 45°C. Hodowlę kontynuuje się aż do uzyskania maksimum pożądanego produktu. 40 Zwykle osiąga się to w ciągu 10 godzin do 160 godzin. [0129] W szczególności, szczepy według wynalazku można hodować w pożywce wybranej spośród różnych standardowych pożywek mikrobiologicznych, takich jak bulion Luria- Bertaniego (LB), bulion tryptikazo-sojowy (TSB), bulion z ekstraktu drożdżowe- go/ekstraktu słodowego/glukozy (YMG, ISP2) w 15°C do 36°C przez 18 do 360 godzin w 45 pożywce ciekłej lub w pożywce zestalonej na agarze w szalce Petriego. Może być konieczne napowietrzanie. Komórki bakteryjne (komórki wegetatywne i zarodniki) można przemywać i zatężać (np. przez odwirowanie w temperaturze około 15 do 30°C przez oko- ło 15 min przy 7000 x g). [0130] Wynalazek dotyczy także pożywki hodowlanej możliwej do uzyskania przez ho- 50 dowanie szczepów według wynalazku w pożywce i oddzielenie pożywki od bulionu hodowlanego (a zatem pozostaje, gdy komórki hodowane w pożywce są usuwane z całkowi- tego bulionu hodowlanego), np. supernatantu całkowitego bulionu hodowlanego, tj. cie- 20 kłego bulionu pozostałego, gdy komórki hodowane w bulionie i inne pozostałości usuwa się przez odwirowanie, filtrację, sedymentację lub innymi sposobami dobrze znanymi w dziedzinie. Supernatant można uzyskać np. przez wirowanie w temperaturach około 2 do 30°C (korzystniej w temperaturach 4 do 20°C) przez około 10 do 60 min (korzystniej oko- 5 ło 15 do 30 min) przy około 5000 do 20 000 x g (korzystniej około 15 000 x g). [0131] Taka pożywka hodowlana zawiera metabolity pestycydowe, które są wytwarzane przez hodowany szczep. [0132] Wynalazek dotyczy także pozbawionego komórek ekstraktu szczepów według wynalazku. Aby wytworzyć pozbawiony komórek ekstrakt, szczepy według wynalazku moż- 10 na hodować jak opisano powyżej. Komórki mogą być rozrywane również przez ultra- dźwięki o wysokiej częstotliwości, przez wysokie ciśnienie, np. w prasie Frencha dla ko- mórek, przez osmolizę, działanie detergentów, enzymów litycznych lub rozpuszczalników organicznych, za pomocą homogenizatorów lub przez połączenie kilku wymienionych metod. Ekstrakcję można prowadzić korzystnie rozpuszczalnikiem organicznym lub miesza- 15 niną rozpuszczalników, korzystniej alkoholem (np. metanolem, etanolem, n-propanolem, 2-propanolem lub podobnym), jeszcze korzystniej 2-propanolem (np. w stosunku 1:1 do objętości hodowli). Rozdzielanie fazowe może być wzmocnione przez dodanie soli, takich jak NaCl. Fazę organiczną można zebrać, a rozpuszczalnik lub mieszaninę rozpuszczalni- ków można usunąć przez konwencjonalną destylację i/lub suszenie, a następnie ponownie 20 przeprowadzić w zawiesinę w metanolu i sączyć. [0133] Taki ekstrakt zawiera metabolity pestycydowe, które są wytwarzane przez hodowany szczep. [0134] Metabolity pestycydowe, które są specyficzne dla szczepów według wynalazku, można odzyskać z takiej pożywki lub ekstraktu zgodnie z konwencjonalnymi metodami, w 25 szczególności, gdy szczepy według wynalazku hodowano jak opisano powyżej. [0135] Metodyka niniejszego wynalazku może ponadto obejmować etap odzyskiwania po- szczególnych metabolitów pestycydowych. [0136] Określenie „odzyskiwanie” obejmuje ekstrakcję, zbieranie, izolowanie lub oczyszczanie związku z pożywek hodowlanych lub pozbawionych komórek ekstraktów. Odzy- 30 skiwanie związku można przeprowadzić zgodnie z dowolną konwencjonalną metodyką izolowania lub oczyszczania znaną w dziedzinie, w tym, ale nie wyłącznie, obróbką kon- wencjonalną żywicą (np. żywicą anionowo lub kationowymienną, niejonową żywicą ad- sorpcyjną itp.), obróbką konwencjonalnym adsorbentem (np. aktywowanym węglem drzewnym, kwasem krzemowym, żelem krzemionkowym, celulozą, tlenkiem glinu itp.), 35 zmianą pH, ekstrakcją rozpuszczalnikiem (np. konwencjonalnym rozpuszczalnikiem, takim jak alkohol, octan etylu, heksan i tym podobne), destylacją, dializą, filtracją, zatęża- niem, krystalizacją, rekrystalizacją, regulacją pH, liofilizacją i tym podobnymi. Przykła- dowo metabolity można odzyskać z pożywek hodowlanych, najpierw usuwając mikroorganizmy. Pozostały bulion jest następnie przepuszczany przez lub nad żywicą kationowy- 40 mienną w celu usunięcia niepożądanych kationów, a następnie przez lub nad żywicą anio- nowymienną w celu usunięcia niepożądanych anionów nieorganicznych i kwasów organicznych. [0137] W całkowitym bulionie hodowlanym z nowych szczepów Paenibacillus stwierdzono kilka metabolitów. Zbadano szczegółowo i zidentyfikowano dziewięć metabolitów 45 (patrz Przykład 7, Fig. 1). Dwa z nich okazały się nowe (związek 1A i związek 1B). Stwierdzno, że związki 1A i 1B są wytwarzane przez wszystkie trzy szczepy Paenibacillus według wynalazku (patrz Tabela 17) ale żadnego z nich nie stwierdzono w całkowitym bulionie hodowlanym pokrewnego szczepu NRRL BD-62 Paenibacillus peoriae. [0138] Zatem niniejszy wynalazek dotyczy również związków o wzorze I

50 21 gdzie R jest wybrany spośród kwasu 15-guanidyno-3-hydroksypentadekanowego (GHPD) i kwasu 12-guanidynododekanowego (12-GDA); X1 oznacza treoninę; 5 X2 oznacza izoleucynę; X3 oznacza tyrozynę; X4 oznacza treoninę; X5 jest wybrany spośród glutaminy i asparaginy; X6 oznacza alaninę; oraz 10 w którym strzałka określa pojedyncze wiązanie (amidowe) albo pomiędzy ugrupowaniem karbonylowym R a grupą aminową aminokwasu X1 albo pomiędzy grupą karbonylową jednego aminokwasu a grupą aminową sąsiadującego aminokwasu, przy czym końcówka strzałki wskazuje przyłączenie do grupy aminowej wspomnianego sąsiadującego aminokwasu; oraz 15 w którym pojedyncza linia (bez grotu strzałki) określa pojedyncze wiązanie (estrowe) mię- dzy grupą karbonylową X6 a grupą hydroksylową X1; i ich dopuszczalnych w rolnictwie soli. [0139] Według dalszej postaci, X1 we wzorze I korzystnie oznacza L-treoninę. [0140] Według dalszej postaci, X2 we wzorze I korzystnie oznacza D-izoleucynę lub D- 20 allo-izoleucynę. [0141] Według dalszej postaci, X3 we wzorze I korzystnie oznacza L-tyrozynę. [0142] Według dalszej postaci, X4 we wzorze I korzystnie oznacza D-allo-treoninę. [0143] Według dalszej postaci, X5 we wzorze I korzystnie oznacza D-glutaminę lub D- asparaginę. 25 [0144] Według dalszej postaci, R we wzorze I korzystnie oznacza GHPD. [0145] Szkic wzoru I dla związków o wzorze I można również przedstawić następująco:

w którym X jest wybrany spośród -NH-(C=O)-CH2-CH(OH)-(CH2)12-NH-C(=NH)NH2 i -NH- 30 (C=O)-(CH2)11-NH-C(=NH)NH2; R1 oznacza 1-hydroksyetyl; R2 oznacza 1-metylopropyl (sec-butyl); R3 oznacza 4-hydroksybenzyl; R4 oznacza 1-hydroksyetyl; 35 R5 jest wybrany spośród karbamoiloetylu i karbamoilometylu; R6 oznacza metyl. [0146] Podobnie, korzystne postacie oparte na tym alternatywnym szkicu wzoru I są na- stępujące: R1 w tym wzorze I korzystnie oznacza (1S,2R)-1-hydroksyetyl. 40 R2 w tym wzorze I korzystnie oznacza (1R,2R)-1-metylopropyl lub (1R,2S)-1- metylopropyl. R3 w tym wzorze I korzystnie oznacza (S)-4-hydroksybenzyl. R4 w tym wzorze I korzystnie oznacza (1S,2R)-1-hydroksyetyl. 22 R5 w tym wzorze I korzystnie oznacza (R)-karbamoiloetyl i (R)-karbamoilometyl. X w tym wzorze I korzystnie oznacza -NH-(C=O)-CH2-CH(OH)-(CH2)12-NH- C(=NH)NH2. [0147] Według dalszej postaci, wynalazek dotyczy ponadto związków 1A i 1B, które mają 5 wzór I, w którym R oznacza GHPD i w którym X4 jest asparaginą w przypadku związku 1A i X4 jest glutaminą w przypadku związku 1B:

[0148] Pestycydowe metabolity ze szczepów według wynalazku są korzystnie wybrane ze związków o wzorze I, w którym R oznacza GHPD, w szczególności wybrane spośród 10 związków 1A i 1B, które można otrzymać przez ekstrakcję i wyizolowanie z hodowli, tj. całkowitego bulionu hodowlanego, szczepów według wynalazku. [0149] Ponadto związki typu fuzarycydyny o wzorze I, w tym związki, w których R oznacza GHTD, można zsyntetyzować analogicznie do sposobów znanych w dziedzinie (Bio- polymers 80(4), 541, 2005; J. Peptide Sci. 12S, 219, 2006; Tetrahedron Lett. 47(48), 8587- 15 90, 2006; Biopolymers 88(4), 568, 2007; ChemMedChem 7, 871-882, 2012). [0150] Wynalazek dotyczy także dopuszczalnych w rolnictwie soli, zwłaszcza soli addycyjnych z kwasami wspomnianych związków typu fuzarycydyny o wzorze I. Wspomniane sole można otrzymać konwencjonalnymi sposobami dobrze znanymi w dziedzinie, np. przez reakcję związków według wynalazku z odpowiednim kwasem z wytworzeniem soli 20 addycyjnej z kwasem. Anionami użytecznych soli addycyjnych z kwasami są przede wszystkim chlorek, bromek, fluorek, jodek, wodorosiarczan, metylosiarczan, siarczan, diwodorofosforan, wodorofosforan, azotan, wodorowęglan, węglan, heksafluorokrzemian, heksafluorofosforan, benzoesan, a także aniony kwasów C1-C4 alkanowych, korzystnie mrówczan, octan, propionian i maślan. 25 [0151] W związku z tym wynalazek dotyczy także całkowitego bulionu hodowlanego z mikroorganizmu zawierającego co najmniej jeden związek o wzorze I lub jego dopusz- czalną w rolnictwie sól, korzystnie wybranego spośród związków 1A i 1B lub jego dopuszczalnej w rolnictwie soli, w szczególności wspomniany całkowity bulion hodowlany zawiera związki 1A i 1B lub jego dopuszczalną w rolnictwie sól. 30 [0152] Według dalszej postaci, wynalazek dotyczy także całkowitego bulionu hodowlanego mikroorganizmu z rodziny Paenibacillus zawierającego co najmniej jeden związek o wzorze I lub jego dopuszczalną w rolnictwie sól, korzystnie wybrany spośród związków 1A i 1B lub jego dopuszczalnej w rolnictwie soli, w szczególności wspomniany całkowity bulion hodowlany zawiera związki 1A i 1B lub jego dopuszczalną w rolnictwie sól. 35 [0153] Według dalszej postaci, wynalazek dotyczy także całkowitego bulionu hodowlanego z co najmniej jednego szczepu Paenibacillus według wynalazku, jak zidentyfikowano i zdefiniowano powyżej, zawierającego co najmniej jeden związek o wzorze I lub jego do- puszczalną w rolnictwie sól, korzystnie wybranych spośród związków 1A i 1B lub jego dopuszczalnej w rolnictwie soli, w szczególności wspomniany całkowity bulion hodowla- 40 ny zawiera związki 1A i 1B lub jego dopuszczalną w rolnictwie sól. [0154] Wspomniane związki typu fuzarycydyny są wydzielane do pożywki hodowlanej odpowiedniego mikroorganizmu zdolnego do ich wytwarzania. 23 [0155] W konsekwencji, wynalazek dotyczy także pożywki hodowlanej i/lub pozbawionego komórek ekstraktu mikroorganizmu zawierającego co najmniej jeden związek o wzorze I lub jego dopuszczalną w rolnictwie sól, korzystnie wybrany spośród związków 1A i 1B lub jego dopuszczalnej w rolnictwie soli, w szczególności wspomniana pożywka hodowla- 5 na i/lub pozbawiony komórek ekstrakt zawiera związki 1A i 1B lub jego dopuszczalną w rolnictwie sól. [0156] Według dalszej postaci, wynalazek dotyczy także pożywki hodowlanej i/lub pozbawionego komórek ekstraktu mikroorganizmu z rodzaju Paenibacillus zawierającego co najmniej jeden związek o wzorze I lub jego dopuszczalną w rolnictwie sól, korzystnie wy- 10 brany spośród związków 1A i 1B lub jego dopuszczalnej w rolnictwie soli, w szczególno- ści wspomniana pożywka hodowlana i/lub pozbawiony komórek ekstrakt zawiera związki 1A i 1B lub jego dopuszczalną w rolnictwie sól. [0157] Według dalszej postaci, wynalazek dotyczy także pożywki hodowlanej i/lub pozbawionego komórek ekstraktu z co najmniej jednego szczepu Paenibacillus według wy- 15 nalazku jak zidentyfikowano i zdefiniowano powyżej, zawierającego co najmniej jeden związek o wzorze I lub jego dopuszczalną w rolnictwie sól, korzystnie wybranego spośród związków 1A i 1B lub jego dopuszczalnej w rolnictwie soli, w szczególności wspomniana pożywka hodowlana i/lub pozbawiony komórek ekstrakt zawiera związki 1A i 1B lub jego dopuszczalną w rolnictwie sól. 20 [0158] Wynalazek dotyczy ponadto kompozycji agrochemicznych zawierających środek pomocniczy, jak zdefiniowano poniżej i odpowiednio co najmniej jeden lub większą liczbę szczepów, całkowite buliony hodowlane, pozbawione komórek ekstrakty, pożywki hodowlane i związki o wzorze I, według wynalazku. [0159] Jak tu stosowano, „kompozycja” w odniesieniu do produktu (szczepu drobnoustro- 25 ju, środka lub preparatu) według niniejszego wynalazku odnosi się do połączenia składni- ków, przy czym „formułowanie” jest procesem stosowania wzoru, takiej jak przepis, dla połączenia składników, które należy dodać w celu utworzenia preparatu. Taka kompozycja jest również określana tu jako preparat. [0160] Odpowiednio szczepy, całkowite buliony hodowlane, pozbawione komórek eks- 30 trakty, pożywki hodowlane, związki o wzorze I i kompozycje według wynalazku, są odpowiednie jako środki przeciwgrzybicze lub fungicydy. [0161] Wyróżniają się one wyjątkową skutecznością przeciwko szerokiemu spektrum fitopatogennych grzybów, w tym grzybów przenoszonych przez glebę, które pochodzą przede wszystkim z klas Plasmodiophoromycetes, Peronosporomycetes (syn. Lęgniowce), Chytri- 35 diomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes i Deuteromycetes (syn. Grzyby niedoskonałe). Niektóre są skuteczne ogólnoustrojowo i mogą być stosowane w ochronie roślin jako fungicydy dolistne, fungicydy do zaprawiania nasion i fungicydy glebowe. Po- nadto są one odpowiednie do zwalczania szkodliwych grzybów, które między innymi wy- stępują w drewnie lub korzeniach roślin. 40 [0162] Odpowiednio, szczepy, całkowite buliony hodowlane, pozbawione komórek ekstrakty, pożywki hodowlane, związki o wzorze I i kompozycje według wynalazku, są szczególnie ważne w zwalczaniu wielu fitopatogennych grzybów na różnych roślinach uprawnych, takich jak zboża, np. pszenica, żyto, jęczmień, pszenżyto, owies lub ryż; burak, np. burak cukrowy lub burak pastewny; owoce, takie jak owoce ziarnkowe, owoce 45 pestkowe lub owoce miękkie, np. jabłka, gruszki, śliwki, brzoskwinie, migdały, wiśnie, truskawki, maliny, jeżyny lub agrest; rośliny strączkowe, takie jak soczewica, groch, lu- cerna lub soja; rośliny oleiste, takie jak rzepak, gorczyca, oliwki, słoneczniki, kokos, ziarna kakaowe, rośliny na olej rycynowy, palmy olejowe, orzechy ziemne lub soja; dyniowate, takie jak kabaczki, ogórki lub melony; rośliny włókniste, takie jak bawełna, len, konopie 50 lub juta; owoce cytrusowe, takie jak pomarańcze, cytryny, grejpfruty lub mandarynki; warzywa, takie jak szpinak, sałata, szparagi, kapusta, marchew, cebula, pomidory, ziemniaki, dyniowate lub papryka; rośliny laurowe, takie jak awokado, cynamon lub kamfora; rośliny 24 energetyczne i na surowce, takie jak kukurydza, soja, rzepak, trzcina cukrowa lub palma olejowa; kukurydza; tytoń; orzechy; kawa; herbata; banany; winorośle (winogrona stołowe i winogrona na sok winogronowy); chmiel; darń; słodki liść (zwany również Stewia); ro- śliny stanowiące źródło kauczuku naturalnego lub rośliny ozdobne i leśne, takie jak kwia- 5 ty, krzewy, drzewa szerokolistne lub wiecznie zielone, np. drzewa iglaste; oraz na materiale rozmnożeniowym roślin, takim jak nasiona i materiał uprawny tych roślin. [0163] Korzystnie, odpowiednio szczepy, całkowite buliony hodowlane, pozbawione ko- mórek ekstrakty, pożywki hodowlane, związki o wzorze I i kompozycje według wynalazku, stosuje się do zwalczania wielu grzybów na uprawach polowych, takich jak buraki cu- 10 krowe, tytoń, pszenica, żyto, jęczmień, owies, ryż, kukurydza, bawełna, soja, rzepak, rośli- ny strączkowe, słoneczniki, kawa lub trzcina cukrowa; owoce; winorośle; rośliny ozdobne; lub warzywa, takie jak ogórki, pomidory, fasole lub kabaczki. [0164] Określenie „materiał rozmnożeniowy roślin” należy rozumieć jako oznaczający wszystkie generatywne części rośliny, takie jak nasiona i wegetatywny materiał roślinny, 15 taki jak sadzonki i bulwy (np. ziemniaki), które można wykorzystać do namnażania rośli- ny. Obejmuje to nasiona, korzenie, owoce, bulwy, cebulki, kłącza, pędy, kiełki i inne czę- ści roślin, w tym sadzonki i młode rośliny, które mają być przeszczepione po kiełkowaniu lub po wzejściu z gleby. Te młode rośliny mogą być również chronione przed przesadze- niem przez całkowite lub częściowe traktowanie przez zanurzenie lub oblanie. 20 [0165] Korzystnie, traktowanie roślinnych materiałów rozmnożeniowych odpowiednio szczepami, całkowitymi bulionami hodowlanymi, pozbawionymi komórek ekstraktami, pożywkami hodowlanymi, związkami o wzorze I; i kompozycjami według wynalazku, stosuje się do zwalczania wielu grzybów na zbożach, takich jak pszenica, żyto, jęczmień i owies; ryż, kukurydza, bawełna i soja. 25 [0166] Określenie „rośliny uprawne” należy rozumieć jako obejmujące rośliny, które zo- stały zmodyfikowane przez hodowlę, mutagenezę lub inżynierię genetyczną, w tym, ale nie wyłącznie, rolnicze produkty biotechnologiczne na rynku lub w fazie rozwoju (por. http://cera-gmc.org/, patrz tam baza danych upraw GM). Genetycznie zmodyfikowane ro- śliny to rośliny, których materiał genetyczny został zmodyfikowany przez zastosowanie 30 technik rekombinacji DNA, które w naturalnych warunkach nie mogą być łatwo uzyskane przez krzyżowanie, mutacje lub naturalną rekombinację. Zazwyczaj jeden lub większa liczba genów zostało zintegrowanych z materiałem genetycznym rośliny zmodyfikowanej genetycznie w celu poprawy pewnych właściwości rośliny. Takie modyfikacje genetyczne obejmują również, ale nie wyłącznie, ukierunkowaną potranslacyjną modyfikację białka(- 35 ek), oligo- lub polipeptydów np. przez glikozylację lub addycje polimerowe, takie jak ugrupowania prenylowane, acetylowane lub farnezylowane lub ugrupowania PEG. [0167] Roślinom zmodyfikowanym przez hodowlę, mutagenezę lub inżynierię genetyczną, nadaje się np. tolerancję wobec zastosowań określonych klas herbicydów, takich jak herbicydy auksynowe, takie jak dikamba lub 2,4-D; herbicydy bielące, takie jak inhibitory diok- 40 sygenazy hydroksylofenylopirogronianowej (HPPD) lub inhibitory desaturazy fitoenu (PDS); inhibitory syntazy acetomleczanowej (ALS), takie jak sulfonylomoczniki lub imi- dazolinony; inhibitory syntazy enolopirogroniano-szikimowo-3-fosforanowej (EPSPS), takie jak glifosat; inhibitory syntetazy glutaminowej (GS), takie jak glufosynat; inhibitory oksydazy protoporfirynogenu-IX; inhibitory biosyntezy lipidów, takie jak inhibitory kar- 45 boksylazy acetylo-CoA (ACCaza); lub herbicydy oksynilowe (tj. bromoksynil lub joksy- nil) w wyniku konwencjonalnych metod hodowli lub inżynierii genetycznej. Ponadto ro- śliny stały się odporne na wiele klas herbicydów poprzez liczne modyfikacje genetyczne, takie jak oporność zarówno na glifosat i glufosynat, jak i na glifosat i herbicyd z innej klasy, takie jak inhibitory ALS, inhibitory HPPD, herbicydy auksynowe lub inhibitory ACCa- 50 zy. Te technologie dotyczące odporności na herbicydy są m.in. np. opisane w Pest Mana- gem. Sci. 61, 2005, 246; 61, 2005, 258; 61, 2005, 277; 61, 2005, 269; 61, 2005, 286; 64, 2008, 326; 64, 2008, 332; Weed Sci. 57, 2009, 108; Austral. J. Agricult. Res. 58, 2007, 25 708; Science 316, 2007, 1185; i cytowanych tam odnośnikach. Kilka roślin uprawnych uczyniono odpornymi na herbicydy konwencjonalnymi metodami hodowli (mutagenezy), np. rzepak letni Clearfield® (Canola, BASF SE, Niemcy) jest tolerancyjny na imidazoli- nony, np. imazamoks lub słoneczniki ExpressSun® (DuPont, USA) są tolerancyjne na sul- 5 fonylomoczniki, np. tribenuron. Metody inżynierii genetycznej zostały wykorzystane do uczynienia roślin uprawnych, takich jak soja, bawełna, kukurydza, buraki i rzepak, odpornymi na herbicydy, takie jak glifosat i glufosynat, z których niektóre są dostępne na rynku pod nazwami handlowymi RoundupReady® (glifosat, Monsanto, USA), Cultivance® (tolerancja na imidazolinon, BASF SE, Niemcy) i LibertyLink® (tolerancja na glufosynat, 10 Bayer CropScience, Niemcy). [0168] Ponadto objęte są również rośliny, które uzyskano wykorzystując techniki rekombinacji DNA zdolne do syntezy jednego lub większej liczby białek owadobójczych, zwłaszcza tych znanych z rodzaju bakteryjnego Bacillus, szczególnie z Bacillus thurin- giensis, takie jak δ-endotoksyny, np. CryIA(b), CryIA(c), CryIF, CryIF(a2), CryIIA(b), 15 CryIIIA, CryIIIB(b1) lub Cry9c; wegetatywne białka owadobójcze (VIP), np. VIP1, VIP2, VIP3 lub VIP3A; białka owadobójcze bakterii zasiedlających nicienie, np. Photorhabdus spp. lub Xenorhabdus spp.; toksyny wytwarzane przez zwierzęta, takie jak toksyny skor- pionów, toksyny pajęczaków, toksyny osy lub inne neurotoksyny specyficzne dla owadów; toksyny wytwarzane przez grzyby, takie jak toksyny Streptomycetes, lektyny roślinne, ta- 20 kie jak lektyny grochu lub jęczmienia; aglutyniny; inhibitory proteinazy, takie jak inhibitory trypsyny, inhibitory proteazy serynowej, inhibitory patatyny, cystatyny lub papainy; białka inaktywujące rybosomy (RIP), takie jak rycyna, RIP kukurydzy, abryna, luffina, sa- poryna lub bryodyna; enzymy metabolizmu steroidów, takie jak oksydaza 3- hydroksysteroidowa, transferaza ekdysteroido-IDP-glikozylowa, oksydazy cholesterolowe, 25 inhibitory ekdysonu lub reduktaza HMG-CoA; blokery kanałów jonowych, takie jak blokery kanałów sodowych lub wapniowych; esteraza hormonu juwenilnego; receptory hor- monów moczopędnych (receptory helikokininowe); syntaza stilbenu, syntaza bibenzylu, chitynazy lub glukanazy. W kontekście niniejszego wynalazku jako te owadobójcze białka lub toksyny należy rozumieć wprost także jako pre-toksyny, białka hybrydowe, skrócone 30 lub inaczej zmodyfikowane białka. Białka hybrydowe charakteryzują się nowym połącze- niem domen białkowych (patrz np. WO 02/015701). Ujawniono dalsze przykłady takich toksyn lub genetycznie zmodyfikowanych roślin zdolnych do syntezy takich toksyn, np. w EP-A 374 753, WO 93/007278, WO 95/34656, EP-A 427 529, EP-A 451 878, WO 03/18810 i WO 03/52073. Sposoby wytwarzania takich genetycznie zmodyfikowanych ro- 35 ślin są ogólnie znane specjalistom w dziedzinie i są opisane, np. w publikacjach wymienionych powyżej. Te białka owadobójcze zawarte w roślinach zmodyfikowanych genetycznie nadają roślinom wytwarzającym te białka tolerancję na szkodliwe szkodniki ze wszystkich grup taksonomicznych stawonogów, zwłaszcza chrząszczy (Coeloptera), dwu- skrzydłych owadów (Diptera) i ciem (Lepidoptera) i nicieni (Nematoda). Genetycznie 40 zmodyfikowane rośliny zdolne do syntezy jednego lub większej liczby białek owadobój- czych to np. opisane w publikacjach wymienionych powyżej, a niektóre z nich są dostępne w handlu, takie jak YieldGard® (odmiany kukurydzy wytwarzające toksynę Cry1Ab), YieldGard® Plus (odmiany kukurydzy produkujące toksyny Cry1Ab i Cry3Bb1), Star- link® (odmiany kukurydzy wytwarzające toksynę Cry9c), Herculex® RW (odmiany kuku- 45 rydzy wytwarzające Cry34Ab1, Cry35Ab1 i enzym fosfotrynina-N-acetylotransferazę [PAT]); NuCOTN® 33B (odmiany bawełny wytwarzające toksynę Cry1Ac), Bollgard® I (odmiany bawełny wytwarzające toksynę Cry1Ac), Bollgard® II (odmiany bawełny wy- twarzające toksyny Cry1Ac i Cry2Ab2); VIPCOT® (odmiany bawełny wytwarzające tok- synę VIP); NewLeaf® (odmiany ziemniaków wytwarzające toksynę Cry3A); Bt-Xtra®, 50 NatureGard®, KnockOut®, BiteGard®, Protecta®, Bt11 (np. Agrisure® CB) i Bt176 od Syngenta Seeds SAS, Francja, (odmiany kukurydzy wytwarzające toksynę Cry1Ab i enzym PAT), MIR604 od Syngenta Seeds SAS, Francja (odmiany kukurydzy wytwarzające 26 zmodyfikowaną wersję toksyny Cry3A, por. WO 03/018810), MON 863 z Monsanto Eu- rope SA, Belgia (odmiany kukurydzy wytwarzające toksynę Cry3Bb1), IPC 531 z Mon- santo Europe SA, Belgia (odmiany bawełny wytwarzające zmodyfikowaną wersję toksyny Cry1Ac) i 1507 z Pioneer Overseas Corporation, Belgia (odmiany kukurydzy wytwarzają- 5 ce toksyny Cry1F i enzymu PAT). [0169] Ponadto, objęte są również te rośliny, które uzyskano przez stosowanie technik rekombinacji DNA zdolne do syntezy jednego lub większej liczby białek w celu zwiększenia odporności lub tolerancji tych roślin na patogeny bakteryjne, wirusowe lub grzybicze. Przykładami takich białek są tak zwane „białka związane z patogenezą” (białka PR, patrz 10 np. EP-A 392 225), geny odporności na choroby roślin (np. odmiany ziemniaka, które wy- kazują ekspresję genów oporności działających przeciw Phytophthora infestans pochodzą- cego z meksykańskiego dzikiego ziemniaka Solanum bulbocastanum) lub lizozymu T4 (np. odmiany ziemniaka zdolne do syntezy tych białek o zwiększonej odporności na bakterie, takie jak Erwinia amylvora). Sposoby wytwarzania takich genetycznie zmodyfikowa- 15 nych roślin są ogólnie znane specjalistom w dziedzinie i są opisane, np. w publikacjach wymienionych powyżej. [0170] Ponadto objęte są również te rośliny, do, których wykorzystuje się techniki rekombinacji DNA odpowiednie do syntezy jednego lub większej liczby białek w celu zwiększe- nia produktywności (np. wytwarzanie biomasy, wydajność ziarna, zawartość skrobi, za- 20 wartość oleju lub zawartość białka), tolerancji na suszę, zasolenie lub inne czynniki śro- dowiskowe ograniczające wzrost lub tolerancję na szkodniki i patogeny grzybowe, bakteryjne lub wirusowe tych roślin. [0171] Ponadto objęte są również te rośliny, które dzięki zastosowaniu technik rekombinacji DNA zawierają zmodyfikowaną ilość substancji zawartych lub nowych substancji za- 25 wartych, w szczególności w celu poprawy żywienia ludzi lub zwierząt, np. w roślinach ole- istych wytwarzających prozdrowotne długołańcuchowe kwasy tłuszczowe omega-3 lub nienasycone kwasy tłuszczowe omega-9 (np. rzepak Nexera®, DOW Agro Sciences, Ka- nada). [0172] Ponadto objęte są również te rośliny, które dzięki zastosowaniu technik rekombina- 30 cji DNA zawierają zmodyfikowaną ilość substancji zawartych lub nowych substancji zawartych, w szczególności w celu poprawy wytwarzania surowców, np. ziemniaków, które wytwarzają zwiększone ilości amylopektyny (np. ziemniaki Amflora®, BASF SE, Niem- cy). [0173] Szczepy, odpowiednio całkowite buliony hodowlane, pozbawione komórek eks- 35 trakty, pożywki hodowlane, związki o wzorze I i kompozycje według wynalazku, są szczególnie odpowiednie do zwalczania następujących chorób roślin: Albugo spp. (biała rdza) na roślinach ozdobnych, warzywach (np. A. candida) i słoneczni- kach (np. A. tragopogonis); Alternaria spp. (plamistość liści Alternaria) na warzywach, rzepaku (A. brassicola lub Brassicae), burakach cukrowych (A. tenuis), owocach, ryżu, 40 soji, ziemniaków (np. A. solani lub A. alternata), pomidorach (np. A. solani lub A. alternata) i pszenicy; Aphanomyces spp. na burakach cukrowych i warzywach; Ascochyta spp. na zbożach i warzywach, np. A. tritici (antraknoza) na pszenicy i A. hordei na jęczmieniu; Bi- polaris i Drechslera spp. (teleomorfa: Cochliobolus spp.), np. południowa zaraza liści (D. maydis) lub północna zaraza liści (B. zeicola) na kukurydzy, np. plamistość liści (B. soro- 45 kiniana) na zbożach i np. B. oryzae na ryżu i darniach; Blumeria (wcześniej Erysiphe) graminis (mączniak prawdziwy) na zbożach (np. na pszenicy lub jęczmieniu); Botrytis cinerea (teleomorfa: Botryotinia fuckeliana: szara pleśń, szara zgnilizna) na owocach i jago- dach (np. truskawkach), warzywach (np. sałata, marchew, seler i kapusta), rzepaku, kwia- tach, winoroślach, roślinach leśnych i pszenicy; Bremia lactucae (mączniak rzekomy) na 50 sałacie; Ceratocystis (syn. Ophiostoma) spp. (gnicie lub więdnięcie, sinizna) na drzewach liściastych i wiecznie zielonych, np. C. ulmi (holenderska choroba wiązu) na wiązach; Cercospora spp. (plamistość liści powodowana przez Cercospora) na kukurydzy (np. szara 27 plamistość liści: C. zeae-maydis), ryżu, burakach cukrowych (np. C. beticola), trzcinie cukrowej, warzywach, kawie, soji (np. C. sojina lub C. kikuchii) i ryżu; Cladosporium spp. na pomidorach (np. C. fulvum: pleśń liści pomidora) i zbożach, np. C. herbarum (zgnilizna kłosów) na pszenicy; Claviceps purpurea (sporysz) na zbożach; Cochliobolus (anamorph: 5 Helminthosporium z Bipolaris) spp. (plamistość liści) na kukurydzy (C. carbonum), zboża (np. C. sativus, anamorph: B. sorokiniana) i ryżu (np. C. miyabeanus, anamorph: H. oryzae); Colletotrichum (teleomorfa: Glomerella) spp. (antraknoza) na bawełnie (np. C. gossypii), kukurydzy (np. C. graminicola: zgnilizna łodyg i antraknoza), owocach miękkich, ziemniakach (np. C. coccodes: więdnięcie), fasoli (np. C. lindemuthianum) i soji (np. C. 10 truncatum lub C. gloeosporioides); Corticium spp., np. C. sasakii (brunatnienie pochew li- ściowych) na ryżu; Corynespora cassiicola (plamistość liści) na soi i roślinach ozdobnych; Cycloconium spp., np. C. oleaginum na drzewach oliwnych; Cylindrocarpon spp. (np. rak drzew owocowych lub zamieranie młodych winorośli, teleomorfa: Nectria lub Neonectria spp.) na drzewach owocowych, winoroślach (np. C. liriodendri, teleomorfa: Neonectria li- 15 riodendri: choroba czarnych stóp ang. black foot disease) i roślinach ozdobnych; Dema- tophora (teleomorfa: Rosellinia) necatrix (zgnilizna korzeni i łodyg) na soi; Diaporthe spp., np. D. phaseolorum (zgorzel łodyg) na soi; Drechslera (syn. Helminthosporium, teleomorfa: Pyrenophora) spp. na kukurydzy, zbożach, takich jak jęczmień (np. D. teres, pla- mistość) i pszenica (np. D. tritici-repentis: plamy oparzeniowe liści), ryżu i darni; czyreń 20 (ang. esca) (zamieranie, udar (ang. apoplexy)) na winorośli, spowodowane przez Formiti- poria (syn. Phellinus) punctata, F. mediterranea, Phaeomoniella chlamydospora (wcze- śniej Phaeoacremonium chlamydosporum), Phaeoacremonium aleophilum i/lub Botry- osphaeria obtusa; Elsinoe spp. na owocach jabłkowatych (E. pyri), owocach miękkich (E. veneta: antraknoza) i winorośli (E. ampelina: antraknoza); Entyloma oryzae (śnieć liści 25 ang. leaf smut) na ryżu; Epicoccum spp. (czarna pleśń) na pszenicy; Erysiphe spp. (mącz- niak prawdziwy) na burakach cukrowych (E. betae), warzywach (np. E. pisi), takich jak dyniowate (np. E. cichoracearum), kapustne, rzepak oleisty (np. E. cruciferarum); Eutypa lata (rak powodowany przez Eutypa lub obumieranie, anamorfa: Cytosporina lata, syn. Li- bertella blepharis) na drzewach owocowych, winoroślach i drzewach ozdobnych; Exsero- 30 hilum (syn. Helminthosporium) spp. na kukurydzy (np. E. turcicum); Fusarium (teleomorfa: Gibberella) spp. (więdnięcie, zgnilizna korzeni lub łodyg) na różnych roślinach, takich jak F. graminearum lub F. culmorum (zgnilizna korzeni, parch lub zaraza kłosów) na zbo- żach (np. pszenicy lub jęczmieniu), F. oxysporum na pomidorach, F. solani (f. sp. glycines teraz syn. F. virguliforme) i F. tucumaniae i F. brasiliense każdy powoduje zespół nagłej 35 śmierci na soi i F. verticillioides na kukurydzy; Gaeumannomyces graminis (choroba pod- stawy źdźbła) na zbożach (np. pszenicy lub jęczmieniu) i kukurydzy; Gibberella spp. na zbożach (np. G. zeae) i ryżu (np. G. fujikuroi: choroba Bakanae); Glomerella cingulata na winorośli, owocach jabłkowatych i innych roślinach i G. gossypii na bawełnie; choroba typu grainstaining complex na ryżu; Guignardia bidwellii (czarna zgnilizna) na winoroślach; 40 Gymnosporangium spp. na roślinach różowatych i jałowcach, np. G. sabinae (rdza gru- szek) na gruszkach; Helminthosporium spp. (syn. Drechslera, teleomorfa: Cochliobolus) na kukurydzy, zbożach i ryżu; Hemileia spp., np. H. vastatrix (rdza liści kawy) na kawie; Isariopsis clavispora (syn. Cladosporium vitis) na winorośli; Macolina Phomolina (syn. phaseoli) (zgnilizna korzeni i łodyg) na soi i bawełnie; Microdochium (syn. Fusarium) 45 nivale (różowa pleśń śniegowa, ang. pink snow mold) na zbożach (np. pszenicy lub jęcz- mieniu); Microsphaera diffusa (mączniak prawdziwy) na soi; Monilinia spp., np. M. laxa, M. fructicola i M. fructigena (zaraza kwiatów i pędów, brązowa zgnilizna) na owocach pestkowych i innych roślinach różowatych; Mycosphaerella spp. na zbożach, bananach, owocach miękkich i orzeszkach ziemnych, takich jak np. M. graminicola (anamorfa: Sep- 50 toria tritici, septorioza paskowana liści) na pszenicy lub M. fijiensis (czarna choroba Siga- toka) na bananach; Peronospora spp. (mączniak rzekomy) na kapuście (np. P. brassicae), rzepaku oleistym (np. P. parasitica), cebuli (np. P. destructor), tytoniu (P. tabacina) i soji 28 (np. P. manshurica); Phakopsora pachyrhizi i P. meibomiae (rdza sojowa) na soi; Phia- lophora spp. np. na winorośli (np. P. tracheiphila i P. tetraspora) i soi (np. P. gregata: zgnilizna łodyg); Phoma lingam (zgnilizna korzeni i łodyg) na rzepaku i kapuście i P. betae (zgnilizna korzeni, plamistość liści i butwienie) na burakach cukrowych; Phomopsis 5 spp. na słonecznikach, winoroślach (np. P. viticola: nekroza kory winorośli, ang. can and leaf spot) i soi (np. zgnilizna łodyg: P. phaseoli, teleomorfa: Diaporthe phaseolorum); Physoderma maydis (brązowa plamistość) na kukurydzy; Phytophthora spp. (więdnięcie, korzenia, liści, owoców i korzenia przybyszowego) na różnych roślinach, takich jak papryka i dyniowate (np. P. capsici), soja (np. P. megasperma, syn. P. sojae), ziemniaki i pomi- 10 dory (np. P. infestans: zaraza późna) i drzewa liściaste (np. P. ramorum: nagłe obumarcie dębu); Plasmodiophora brassicae (kiła kapusty) na kapuście, rzepaku, rzodkiewce i innych roślinach; Plasmopara spp., np. P. viticola (mączniak rzekomy winorośli) na winorośli i P. halstedii na słonecznikach; Podosphaera spp. (mączniak prawdziwy) na roślinach różowa- tych, chmielu, owocach jabłkowatych i miękkich, np. P. leucotricha na jabłkach; Polymyxa 15 spp., np. na zbożach, takich jak jęczmień i pszenica (P. graminis) i buraki cukrowe (P. betae) i przenoszone w ten sposób choroby wirusowe; Pseudocercosporella herpotrichoides (łamliwość źdźbła zbóż/łamanie łodyg, teleomorfa: Tapesia yallundae) na zbożach, np. pszenica lub jęczmień; Pseudoperonospora (mączniak rzekomy) na różnych roślinach, np. P. cubensis na kabaczkach lub P. humili na chmielu; Pseudopezicula tracheiphila (fialofo- 20 roza, choroba „red fire” lub „rotbrenner”, anamorfa: Phialophora) na winorośli; Puccinia spp. (rdza) na różnych roślinach, np. P. triticina (rdza brunatna lub liści), P. striiformis (rdza paskowa lub żółta), P. hordei (rdza karłowata), P. graminis (rdza łodygowa lub czarna) lub P. recondita (rdza brunatna lub liści) na zbożach, takich jak np. pszenica, jęczmień lub żyto, P. kuehnii (rdza pomarańczowa) na trzcinie cukrowej i P. asparagi na szpara- 25 gach; Pyrenophora (anamorph: Drechslera) tritici-repentis (mozaikowata plami-stość li- ści) na pszenicy lub P. teres (plamistość siatkowa) na jęczmieniu; Pyricularia spp., np. P. oryzae (teleomorfa: Magnaporthe grisea, zaraza ryżu) na ryżu i P. grisea na darni i zbo- żach; Pythium spp. (zgorzel) na darni, ryżu, kukurydzy, pszenicy, bawełnie, rzepaku oleistym, słonecznikach, soi, burakach cukrowych, warzywach i innych roślinach (np. P. ulti- 30 mum lub P. aphanidermatum); Ramularia spp., np. R. collo-cygni (plamistość liści powodowana przez Ramularia, fizjologiczna plamistość liści) na jęczmieniu i R. beticola na burakach cukrowych; Rhizoctonia spp. na bawełnie, ryżu, ziemniakach, darni, kukurydzy, rzepaku, ziemniakach, burakach cukrowych, warzywach i różnych innych roślinach, np. R. solani (zgnilizna korzeni i łodyg) na soi, R. solani (brunatnienie pochew liściowych) na ry- 35 żu lub R. cerealis (wiosenna zaraza powodowana przez Rhizoctonia) na pszenicy lub jęczmieniu; Rhizopus stolonifer (czarna pleśń, miękka zgnilizna) na truskawkach, mar- chewce, kapuście, winorośli i pomidorach; Rhynchosporium secalis (mistość liści) na jęczmieniu, życie i pszenżycie; Sarocladium oryzae i S. attenuatum (zgnilizna pochew li- ściowych) na ryżu; Sclerotinia spp. (gnicie łodygi lub biała zgnilizna) na warzywach i 40 uprawach polowych, takich jak rzepak oleisty, słoneczniki (np. S. sclerotiorum) i soja (np. S. rolfsii lub S. sclerotiorum); Septoria spp. na różnych roślinach, np. S. glycines (brązowa plamistość) na soi, S. tritici (septorioza paskowana liści) na pszenicy i S. (syn. Stagonospo- ra) nodorum (plamistość powodowana przez Stagonospora) na zbożach; Uncinula (syn. Erysiphe) necator (mączniak prawdziwy, anamorfa: Oidium tuckeri) na winorośli; Seto- 45 spaeria spp. (zaraza liści) na kukurydzy (np. S. turcicum, syn. Helminthosporium turcicum) i darni; Sphacelotheca spp. (głownia pyląca) na kukurydzy, (np. S. reiliana: głownia guzowata), sorgo i trzcinie cukrowej; Sphaerotheca fuliginea (mączniak prawdziwy) na kabaczkach; Spongospora subterranea (parch prószysty) na ziemniakach i przenoszone w ten sposób choroby wirusowe; Stagonospora spp. na zbożach, np. S. nodorum (plamistość 50 powodowana przez Stagonospora, teleomorfa: Leptosphaeria [syn. Phaeosphaeria] nodorum) na pszenicy; Synchytrium endobioticum na ziemniakach (rak ziemniaka); Taphrina spp., np. T. deformans (kędzierzowatość liści) na brzoskwiniach i T. pruni (torbiel śliwek) 29 na śliwkach; Thielaviopsis spp. (czarna zgnilizna korzeni) na tytoniu, owocach jabłkowa- tych, warzywach, soi i bawełnie, np. T. basicola (syn. Chalara elegans); Tilletia spp. (śnieć pospolita lub śnieć cuchnąca) na zbożach, takich jak np. T. tritici (syn. T. caries, śnieć pszenicy) i T. controversa (śnieć karłowa) na pszenicy; Typhula incarnata (szara 5 pleśń śnieżna, ang. grey snow mold) na jęczmieniu lub pszenicy; Urocystis spp., np. U. oc- culta (głownia źdźbłowa) na życie; Uromyces spp. (rdza) na warzywach, takich jak fasola (np. U. appendiculatus, syn. U. phaseoli) i burakach cukrowych (np. U. betae); Ustilago spp. (głownia pyląca) na zbożach (np. U. nuda i U. avaenae), kukurydzy (np. U. maydis: głownia kukurydzy) i trzcinie cukrowej; Venturia spp. (parch) na jabłkach (np. V. inaequa- 10 lis) i gruszkach; i Verticillium spp. (więdnięcie liści i pędów) na różnych roślinach, takich jak drzewa owocowe i drzewa ozdobne, winorośle, owoce miękkie, warzywa i uprawy po- lowe, np. V. dahliae na truskawkach, rzepaku oleistym, ziemniakach i pomidorach. [0174] Odpowiednio, szczepy, całkowite buliony hodowlane, pozbawione komórek ekstrakty, pożywki hodowlane, związki o wzorze I i kompozycje według wynalazku, są rów- 15 nież odpowiednie do zwalczania szkodliwych patogenów, zwłaszcza grzybów, w ochronie przechowywanych produktów lub zbiorów i w ochronie materiałów. [0175] Określenie „ochrona materiałów” należy rozumieć jako oznaczający ochronę mate- riałów technicznych i nieożywionych, takich jak środki klejące, kleje, drewno, papier i kar- ton, tekstylia, skóra, dyspersje farb, tworzywa sztuczne, smary chłodzące, włókna lub tka- 20 niny, przeciwko inwazji i zniszczeniu przez szkodliwe mikroorganizmy, takie jak grzyby i bakterie. W odniesieniu do ochrony drewna i innych materiałów, szczególną uwagę zwraca się na następujące szkodliwe grzyby: Workowce takie jak Ophiostoma spp., Ceratocystis spp., Aureobasidium pullulans, Sclerophoma spp., Chaetomium spp., Humicola spp., Pe- triella spp., Trichurus spp.; Podstawczaki takie jak Coniophora spp., Coriolus spp., Glo- 25 eophyllum spp., Lentinus spp., Pleurotus spp., Poria spp., Serpula spp. i Tyromyces spp., Grzyby niedoskonałe takie jak Aspergillus spp., Cladosporium spp., Penicillium spp., Tri- chorma spp., Alternaria spp., Paecilomyces spp. i Sprzężniaki takie jak Mucor spp. i dodatkowo w ochronie przechowywanych produktów i zbiorów, godne uwagi są następujące grzyby drożdżowe: Candida spp. i Saccharomyces cerevisiae. 30 [0176] Sposób traktowania według wynalazku można również stosować w dziedzinie ochrony przechowywanych produktów lub zbiorów przed atakiem grzybów i mikroorgani- zmów. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem określenie „przechowywane produkty” oznacza naturalne substancje pochodzenia roślinnego lub zwierzęcego i ich przetworzone postacie, które zostały pobrane z naturalnego cyklu życia i dla których pożądana jest długotrwała 35 ochrona. Przechowywane produkty pochodzenia roślinnego, takie jak rośliny lub ich czę- ści, na przykład łodygi, liście, bulwy, nasiona, owoce lub ziarna, mogą być chronione w stanie świeżo zebranym lub w postaci przetworzonej, takiej jak wstępnie wysuszone, zwil- żone, rozdrobnione, zmielone, sprasowane lub wyprażone, który to proces jest również znany jako traktowanie po zbiorach. Definicja przechowywanych produktów obejmuje 40 również drewno, czy to w postaci surowego drewna, takiego jak drewno budowlane, słupy elektryczne i zapory, czy w postaci gotowych wyrobów, takich jak meble lub przedmioty wykonane z drewna. Przechowywane produkty pochodzenia zwierzęcego to wyprawiona skóra, skóra, futra, włosy i tym podobne. Połączenia według niniejszego wynalazku mogą zapobiegać niekorzystnym skutkom, takim jak rozkład, odbarwienie lub pleśń. Korzystnie 45 „przechowywane produkty” są rozumiane jako oznaczające naturalne substancje pochodzenia roślinnego i ich przetworzone postacie, korzystniej owoce i ich przetworzone postacie, takie jak owoce ziarnkowe, owoce pestkowe, owoce miękkie i owoce cytrusowe oraz ich przetworzone postacie. [0177] Odpowiednio, szczepy, całkowite buliony hodowlane, pozbawione komórek eks- 50 trakty, pożywki hodowlane, związki o wzorze I i kompozycje według wynalazku, można stosować do poprawy zdrowia rośliny. Wynalazek dotyczy również sposobu poprawy zdrowia roślin przez traktowanie rośliny, jej materiału rozmnożeniowego i/lub miejsca, w 30 którym roślina rośnie lub ma rosnąć, skuteczną ilością szczepów, całych bulionów hodowlanych, pozbawionych komórek ekstraktów, pożywek hodowlanych, związków o wzorze I i kompozycji. [0178] Określenie „zdrowie roślin” należy rozumieć jako oznaczające stan rośliny i/lub jej 5 produktów, który jest określony przez kilka wskaźników osobno lub w połączeniu ze sobą, takich jak wydajność (np. zwiększona biomasa i/lub zwiększona zawartość cennych skład- ników), wigor roślin (np. ulepszony wzrost roślin i/lub bardziej zielone liście („efekt zazie- lenienia”)), jakość (np. ulepszona zawartość lub skład niektórych składników) i tolerancja na stres abiotyczny i/lub biotyczny. Powyższe zidentyfikowane wskaźniki stanu zdrowia 10 rośliny mogą być wzajemnie zależne lub mogą wynikać z siebie nawzajem. [0179] Zdrowsze rośliny są pożądane, ponieważ skutkują między innymi lepszymi plona- mi i/lub lepszą jakością roślin lub upraw, a zwłaszcza lepszą jakością zebranych części ro- ślin. Zdrowsze rośliny są również odporniejsze na stres biotyczny i/lub abiotyczny. Duża odporność na stres biotyczny z kolei pozwala specjaliści na zmniejszenie ilości stosowa- 15 nych pestycydów i w konsekwencji spowolnienie rozwoju oporności na odpowiednie pestycydy. [0180] Należy podkreślić, że wyżej wspomniane wpływy odpowiednio szczepów, całkowi- tych bulionów hodowlanych, pozbawionych komórek ekstraktów, pożywek hodowlanych, związków o wzorze I i kompozycji według wynalazku, tj. poprawione zdrowie rośliny, są 20 również obecne, gdy roślina nie znajduje się pod wpływem stresu biotycznego, w szcze- gólności, gdy roślina nie znajduje się pod presją szkodników. [0181] Przykładowo, w przypadku zaprawiania nasion i zastosowań w glebie, oczywiste jest, że roślina cierpiąca na atak grzybów lub środków owadobójczych wykazuje zmniejszone kiełkowanie i wschody, co prowadzi do gorszych roślin lub zakładania upraw i ży- 25 wotności, a w konsekwencji do zmniejszonej wydajności w porównaniu z materiałem roz- mnożeniowym roślin, który został poddany leczniczemu lub profilaktycznemu traktowaniu przeciwko właściwemu szkodnikowi i który może rosnąć bez uszkodzeń spowodowanych przez czynnik stresu biotycznego. Jednakże, sposoby według wynalazku prowadzą do po- lepszonego zdrowia roślin, nawet przy braku jakiegokolwiek stresu biotycznego. Oznacza 30 to, że pozytywne działania odpowiednio szczepów, całkowitych bulionów hodowlanych, pozbawionych komórek ekstraktów, pożywek hodowlanych, związków o wzorze I i kompozycji według wynalazku, nie mogą być wyjaśnione tylko przez aktywność pestycydową odpowiednio szczepów, całkowitych bulionów hodowlanych, pozbawionych komórek eks- traktów, pożywek hodowlanych, związków o wzorze I i kompozycji według wynalazku, 35 ale opierają się na dalszych profilach aktywności. Zgodnie z powyższym, stosowanie odpowiednio szczepów, całkowitych bulionów hodowlanych, pozbawionych komórek eks- traktów, pożywek hodowlanych, związków o wzorze I i kompozycji według wynalazku według wynalazku, można również prowadzić przy braku presji szkodników. [0182] W równie korzystnej postaci, niniejszy wynalazek dotyczy sposobu poprawy zdro- 40 wia roślin wyhodowanych ze wspomnianego materiału rozmnożeniowego roślin, przy czym materiał rozmnożeniowy roślin jest traktowany skuteczną ilością co najmniej jednego spośród szczepów, całkowitych bulionów hodowlanych, pozbawionych komórek eks- traktów, pożywek hodowlanych, związków o wzorze I i kompozycji według wynalazku. [0183] Każdy wymieniony poniżej wskaźnik zdrowia roślin, który jest wybrany z grup 45 obejmującej wydajność, żywotność roślin, jakość i tolerancję rośliny na stres abiotyczny i/lub biotyczny, należy rozumieć jako korzystną postać niniejszego wynalazku, każdą za- równo osobno jak i korzystnie w połączeniu ze sobą. [0184] Zgodnie z niniejszym wynalazkiem „zwiększona wydajność” rośliny oznacza, że wydajność produktu z odpowiedniej rośliny jest zwiększona o mierzalną ilość ponad wy- 50 dajność tego samego produktu z rośliny wytworzonego w tych samych warunkach, ale bez stosowania odpowiednio szczepów, całkowitych bulionów hodowlanych, pozbawionych 31 komórek ekstraktów, pożywek hodowlanych, związków o wzorze I i kompozycji według wynalazku. [0185] Do zaprawiania nasion np. jako postacie do zaszczepiania i/lub stosowania dolist- nego, zwiększona wydajność może być scharakteryzowana, między innymi, przez następu- 5 jące ulepszone właściwości rośliny: zwiększona masa rośliny; i/lub zwiększona wysokość rośliny; i/lub zwiększona biomasa, taka jak większa całkowita świeża masa (FW); i/lub zwiększona liczba kwiatów na roślinę; i/lub większą wydajność ziarna i/lub owoców; i/lub więcej pędów lub pędów bocznych (gałęzi); i/lub większe liście; i/lub zwiększony wzrost pędów; i/lub zwiększona zawartość białka; i/lub zwiększona zawartość oleju; i/lub zwięk- 10 szona zawartość skrobi; i/lub zwiększona zawartość pigmentu; i/lub zwiększona zawartość chlorofilu (zawartość chlorofilu ma dodatnią korelację z szybkością fotosyntezy rośliny i odpowiednio, im wyższa zawartość chlorofilu, tym większa wydajność rośliny) i/lub zwiększona jakość rośliny. [0186] „Ziarno” i „owoc” należy rozumieć jako dowolny produkt roślinny, który jest dalej 15 wykorzystywany po zbiorze, np. owoce w odpowiednim znaczeniu, warzywa, orzechy, zboża, nasiona, drewno (np. w przypadku roślin leśnych), kwiaty (np. w przypadku roślin ogrodniczych, roślin ozdobnych) itp., czyli wszystko o wartości ekonomicznej wytwarzane przez roślinę. [0187] Według niniejszego wynalazku wydajność zwiększa się o co najmniej 4%. Na ogół 20 wzrost wydajności może być nawet większy, na przykład 5 do 10%, korzystniej o 10 do 20% lub nawet 20 do 30% [0188] Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, wydajność - jeśli mierzy się ją pod nieobec- ność presji szkodników - zwiększa się o co najmniej 2%. Ogólnie, wzrost wydajności mo- że być nawet większy, na przykład do 4% do 5% lub nawet więcej. 25 [0189] Innym wskaźnikiem stanu rośliny jest wigor roślin. Wigor rośliny przejawia się w kilku aspektach, takich jak ogólny wygląd. [0190] W przypadku zastosowań dolistnych ulepszona żywotność roślin może być charak- teryzowana między innymi przez następujące ulepszone właściwości rośliny: poprawa wi- talności rośliny; i/lub ulepszony wzrost roślin; i/lub ulepszony rozwój roślin; i/lub lepszy 30 wygląd; i/lub ulepszone utrzymanie rośliny w pionie (mniejszy zwrot roślin/wyleganie i/lub większa blaszka liściowa; i/lub większy rozmiar; i/lub zwiększona wysokość rośliny; i/lub zwiększony stopień krzewiastości; i/lub zwiększona liczba pędów; lub zwiększona liczba kwiatów na roślinę i/lub zwiększony wzrost pędów i/lub zwiększona aktywność fo- tosyntetyczna (np. oparta na zwiększonej przewodności szparkowej i/lub zwiększonym 35 współczynniku asymilacji CO2)); i/lub wcześniejsze kwitnienie; i/lub wcześniejsze owo- cowanie; i/lub wcześniejsza dojrzałość ziarna; i/lub mniej nieproduktywnych pędów; i/lub mniej martwych liści podstawowych; i/lub mniejszy potrzebny wkład (taki jak nawozy lub woda); i/lub bardziej zielone liście; i/lub całkowite dojrzewanie w skróconych okresach wegetacji; i/lub łatwiejsze zbiory; i/lub szybsze i bardziej jednolite dojrzewanie; i/lub dłuż- 40 szy okres trwałości; i/lub dłuższe wiechy; i/lub opóźnienie starzenia się; i/lub silniejsze i/lub bardziej wydajne pędy; i/lub lepsza zdolność do ekstrakcji składników; i/lub lepsza jakość nasion (do wysiewu w kolejnych sezonach do wytwarzania nasion); i/lub zmniejszone wytwarzanie etylenu i/lub hamowanie jego odbioru przez roślinę. [0191] Innym wskaźnikiem stanu rośliny jest „jakość” rośliny i/lub jej produktów. Zgodnie 45 z niniejszym wynalazkiem zwiększona jakość oznacza, że pewne cechy rośliny, takie jak zawartość lub skład pewnych składników, które są zwiększone lub ulepszone przez mie- rzalną lub zauważalną ilość w stosunku do tego samego czynnika rośliny wytwarzanego w tych samych warunkach, ale bez zastosowania odpowiednio szczepów, całkowitych bulio- nów hodowlanych, pozbawionych komórek ekstraktów, pożywek hodowlanych, związków 50 o wzorze I i kompozycji według wynalazku. Zwiększona jakość może być scharakteryzowana, między innymi, poprzez następujące ulepszone właściwości rośliny lub jej produktu: zwiększona zawartość składników odżywczych; i/lub zwiększona zawartość białka; i/lub 32 zwiększona zawartość oleju; i/lub zwiększona zawartość skrobi; i/lub zwiększona zawar- tość kwasów tłuszczowych; i/lub zwiększona zawartość metabolitu; i/lub zwiększona za- wartość karotenoidów; i/lub zwiększona zawartość cukru; i/lub zwiększona ilość niezbęd- nych aminokwasów; i/lub ulepszony skład odżywczy; i/lub ulepszony skład białkowy; 5 i/lub ulepszony skład kwasów tłuszczowych; i/lub ulepszony skład metabolitu; i/lub ulepszony skład karotenoidów; i/lub ulepszony skład cukru; i/lub ulepszony skład aminokwa- sów; i/lub ulepszony lub optymalny kolor owoców; i/lub ulepszony kolor liści; i/lub więk- sza zdolność do przechowywania; i/lub lepsza przetwarzalność zebranych produktów. [0192] Innym wskaźnikiem stanu rośliny jest jej tolerancja lub odporność na biotyczne 10 i/lub abiotyczne czynniki stresowe. Stres biotyczny i abiotyczny, zwłaszcza w dłuższym okresie, może mieć szkodliwy wpływ na rośliny. [0193] Stres biotyczny jest powodowany przez żywe organizmy, podczas gdy stres abiotyczny jest powodowany na przykład przez skrajne warunki środowiskowe. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem „zwiększona tolerancja lub odporność na biotyczne i/lub abiotycz- 15 ne czynniki stresowe” oznacza (1.), że pewne czynniki negatywne spowodowane przez stres biotyczny i/lub abiotyczny są zmniejszone w mierzalnej lub zauważalnej ilości w po- równaniu z roślinami narażonymi w tych samych warunkach, ale bez traktowania odpowiednio szczepami, całkowitymi bulionami hodowlanymi, pozbawionymi komórek ekstraktami, pożywkami hodowlanymi, związkami o wzorze I i kompozycjami według wyna- 20 lazku i (2.), że negatywne skutki nie są zmniejszone przez bezpośrednie działanie odpowiednio szczepów, całkowitych bulionów hodowlanych, pozbawionych komórek ekstrak- tów, pożywek hodowlanych, związków o wzorze I i kompozycji według wynalazku, na czynniki stresowe, np. przez ich działanie grzybobójcze lub owadobójcze, które bezpo- średnio niszczy mikroorganizmy lub szkodniki, ale raczej przez stymulację własnych reak- 25 cji obronnych roślin przeciwko wspomnianym czynnikom stresowym. [0194] Czynniki negatywne spowodowane stresem biotycznym, takie jak patogeny i szkodniki, są powszechnie znane i są powodowane przez żywe organizmy, takie jak współzawodniczące rośliny (na przykład chwasty), mikroorganizmy (takie jak fitopatogenne grzyby i/lub bakterie) i/lub wirusy. 30 [0195] Czynniki negatywne spowodowane stresem abiotycznym są również dobrze znane i często można je zaobserwować jako zmniejszoną żywotność roślin (patrz powyżej), na przykład: mniejsza wydajność i/lub mniejszy wigor, dla obu skutków przykładami mogą być między innymi spalone liście, mniejsza liczba kwiatów, przedwczesne dojrzewanie, późniejsza 35 dojrzałość upraw, zmniejszona wartość odżywcza. [0196] Stres abiotyczny może być spowodowany na przykład przez: skrajne temperatury, takie jak ciepło lub zimno (stres cieplny/stres związany z zimnem); i/lub silne zmiany temperatury; i/lub temperatury nietypowe w danym sezonie; i/lub susza (stres spowodowany suszą); i/lub skrajna wilgotność; i/lub duże zasolenie (stres solny); i/lub promieniowanie 40 (na przykład przez zwiększone promieniowanie UV spowodowane malejącą warstwą ozo- nową); i/lub zwiększone poziomy ozonu (stres ozonowy); i/lub zanieczyszczenie organiczne (na przykład fitotoksycznymi ilościami pestycydów); i/lub zanieczyszczenia nieorganiczne (na przykład zanieczyszczeniami metalami ciężkimi). [0197] W wyniku czynników stresu biotycznego i/lub abiotycznego zmniejsza się ilość i 45 jakość roślin poddanych stresowi. W odniesieniu do jakości (jak zdefiniowano powyżej), rozwój reprodukcyjny jest zwykle poważnie dotknięty skutkami dla upraw, które są ważne dla owoców lub nasion. Synteza, gromadzenie i przechowywanie białek zależy głównie od temperatury; wzrost jest spowolniony przez prawie wszystkie rodzaje stresu; synteza poli- sacharydów, zarówno strukturalnych, jak i zapasowych, jest zmniejszona lub zmodyfiko- 50 wana: efekty te powodują spadek biomasy (wydajności) i zmiany wartości odżywczej produktu. 33 [0198] Jak wskazano powyżej, powyższe zidentyfikowane wskaźniki stanu zdrowia rośliny mogą być współzależne i mogą wynikać z siebie nawzajem. Przykładowo zwiększona od- porność na stres biotyczny i/lub abiotyczny może prowadzić do lepszego wigoru roślin, np. do lepszych i większych upraw, a tym samym do zwiększonej wydajności. Odwrotnie, 5 bardziej rozwinięty system korzeniowy może powodować zwiększoną odporność na stres biotyczny i/lub abiotyczny. Jednak te współzależności i interakcje nie są ani znane, ani w pełni zrozumiałe, dlatego różne wskaźniki są opisane oddzielnie. [0199] W jednej postaci odpowiednio szczepy, całkowite buliony hodowlane, pozbawione komórek ekstrakty, pożywki hodowlane, związki o wzorze I i kompozycje według wyna- 10 lazku, powodują zwiększoną wydajność rośliny lub jej produktu. W innej postaci odpowiednio szczepy, całkowite buliony hodowlane, pozbawione komórek ekstrakty, pożywki hodowlane, związki o wzorze I i kompozycje według wynalazku, powodują zwiększony wigor rośliny lub jej produktu. W innej postaci odpowiednio, szczepy, całkowite buliony hodowlane, pozbawione komórek ekstrakty, pożywki hodowlane, związki o wzorze I i 15 kompozycje według wynalazku, powodują zwiększoną jakość rośliny lub jej produktu. W jeszcze innej postaci odpowiednio szczepy, całkowite buliony hodowlane, pozbawione komórek ekstrakty, pożywki hodowlane, związki o wzorze I i kompozycje według wynalazku, powodują zwiększoną tolerancję i/lub odporność rośliny lub jej produktu na stres biotyczny. W jeszcze innej postać odpowiednio szczepy, całkowite buliony hodowlane, 20 pozbawione komórek ekstrakty, pożywki hodowlane, związki o wzorze I i kompozycje według wynalazku, powodują zwiększoną tolerancję i/lub oporność rośliny lub jej produktu na stres abiotyczny. [0200] Odpowiednio, szczepy, całkowite buliony hodowlane, pozbawione komórek ekstrakty, pożywki hodowlane, związki o wzorze I i kompozycje według wynalazku, stosuje 25 się jako takie lub w postaci kompozycji przez traktowanie grzybów lub roślin, materiałów do rozmnażania roślin, takich jak nasiona, gleba, powierzchnie, materiały lub pomieszczenia, które mają być chronione przed atakiem grzybów za pomocą grzybobójczo skutecznej ilości substancji czynnych. Nanoszenie może być przeprowadzone zarówno przed, jak i po zakażeniu roślin, materiałów rozmnożeniowych roślin, takich jak nasiona, gleba, po- 30 wierzchnie, materiały lub pomieszczenia przez grzyby. [0201] Określenie „skuteczna ilość” oznacza ilość, która jest wystarczająca do zwalczania szkodliwych grzybów na roślinach uprawnych lub do ochrony materiałów i która nie powoduje znacznego uszkodzenia traktowanych roślin. Taka ilość może zmieniać się w szerokim zakresie i zależy od różnych czynników, takich jak gatunki grzybów, które mają być 35 zwalczane, traktowana uprawiana roślina lub materiał, warunki klimatyczne i stosowanych, odpowiednio, szczepów, całkowitych bulionów hodowlanych, pozbawionych komó- rek ekstraktów, pożywek hodowlanych i związków o wzorze I lub jego soli według wynalazku. [0202] Materiały rozmnożeniowe roślin mogą być traktowane odpowiednio szczepami, 40 całkowitymi bulionami hodowlanymi, pozbawionymi komórek ekstraktami, pożywkami hodowlanymi, związkami o wzorze I i kompozycjami według wynalazku, profilaktycznie albo przed, albo przed sadzeniem albo przesadzaniem. [0203] Szczepy według wynalazku można formułować jako środki do zaszczepiania dla rośliny. Określenie „środek do zaszczepiania” oznacza kompozycję, która zawiera wyizo- 45 lowany szczep według wynalazku i ewentualnie nośnik, który może zawierać biologicznie dopuszczalną pożywkę. [0204] Takie środki do zaszczepiania i inne odpowiednie kompozycje można wytwarzać jako kompozycje zawierające oprócz składników czynnych co najmniej jeden środek pomocniczy (składnik obojętny) powszechnymi sposobami (patrz np. H.D. Burges: Formula- 50 tion of Microbial Biopesticides, Springer, 1998). [0205] Aby wytworzyć suchy preparat, komórki bakteryjne, korzystnie zarodniki można przeprowadzać w zawiesinę w odpowiednim suchym nośniku (np. glince). Aby wytworzyć 34 ciekły preparat, komórki, korzystnie zarodniki, można ponownie przeprowadzić w zawie- sinę w odpowiednim ciekłym nośniku (np. na bazie wody) do pożądanej gęstości zarodni- ków. Wartość gęstości zarodników jako liczbę zarodników na ml można określić przez określenie liczby jednostek tworzących kolonie (CFU) na podłożu agarowym np. agar z 5 dekstrozą ziemniaczaną po inkubacji przez kilka dni w temperaturach około 20 do około 30°C. [0206] Zgodnie z jedną postacią, poszczególne składniki kompozycji według wynalazku, takie jak części zestawu lub części mieszaniny dwuskładnikowej lub trójskładnikowej, mogą być mieszane przez samego użytkownika w zbiorniku opryskiwacza lub dowolnym 10 innym naczyniu stosowanym do zastosowań (np. bębny do zarabiania nasion, maszyny do granulowania nasion, opryskiwacz plecakowy) i jeśli to potrzebne można dodać dodatkowe środki pomocnicze. Kiedy żyjące mikroorganizmy, takie jak szczepy Paenibacillus według wynalazku, stanowią część takiego zestawu, należy uważać, aby wybór i ilości innych części zestawu (np. chemicznych środków pestycydowych) i dalszych środków po- 15 mocniczych nie miały wpływu na żywotność mikrobiologicznych pestycydów w kompozycji mieszanej przez użytkownika. Zwłaszcza w przypadku bakteriocydów i rozpuszczal- ników należy wziąć pod uwagę zgodność z odpowiednim pestycydem mikrobiologicznym. [0207] Szczepy, całkowite buliony hodowlane, pozbawione komórek ekstrakty, pożywki hodowlane i/lub związki o wzorze I według wynalazku można przekształcić w powszechne 20 rodzaje kompozycji agrochemicznych, np. roztwory, emulsje, zawiesiny, pyły, proszki, pasty, granulki, wytłoczki, kapsułki i ich mieszaniny. Przykładami typów kompozycji są zawiesiny (np. SC, OD, FS), koncentraty do emulgowania (np. EC), emulsje (np. EW, EO, ES, ME), kapsułki (np. CS, ZC), pasty, pastylki, zwilżalne proszki lub pyły (np. WP, SP, WS, DP, DS), wytłoczki (np. BR, TB, DT), granulki (np. WG, SG, GR, FG, GG, MG), ar- 25 tykuły owadobójcze (np. LN), a także preparaty żelowe do traktowania materiałów roz- mnażenowych roślin, takich jak nasiona (np. GF). Te i dalsze rodzaje kompozycji są zdefiniowane w „Catalogue of pesticide formulation types and international coding system”, Monografia techniczna nr 2, 6. wyd. maj 2008, CropLife International. [0208] Kompozycje wytwarza się w znany sposób, taki jak opisany przez Molleta i Gru- 30 bemanna, Formulation technology, Wiley VCH, Weinheim, 2001; lub, New developments in crop protection product formulation, Agrow Reports DS243, T&F Informa, Londyn, 2005. [0209] Odpowiednimi środkami pomocniczymi są rozpuszczalniki, ciekłe nośniki, stałe nośniki lub wypełniacze, środki powierzchniowo czynne, środki dyspergujące, emulgatory, 35 środki zwilżające, adiuwanty, solubilizatory, środki zwiększające penetrację, koloidy ochronne, środki adhezyjne, środki zagęszczające, środki utrzymujące wilgoć, repelenty, atraktanty, środki pobudzające odżywianie, kompatybilizatory, środki bakteriobójcze, środki do zamrażania, środki przeciwpieniące, środki barwiące, środki zwiększające klei- stość i środki wiążące. 40 [0210] Odpowiednimi rozpuszczalnikami i ciekłymi nośnikami są woda i rozpuszczalniki organiczne, takie jak frakcje oleju mineralnego o średniej do wysokiej temperaturze wrze- nia, np. nafta, olej napędowy; oleje pochodzenia roślinnego lub zwierzęcego; węglowodo- ry alifatyczne, cykliczne i aromatyczne, np. toluen, parafina, tetrahydronaftalen, alkilowa- ne naftaleny; alkohole, np. etanol, propanol, butanol, alkohol benzylowy, cykloheksanol; 45 glikole; DMSO; ketony, np. cykloheksanon; estry, np. mleczany, węglany, estry kwasów tłuszczowych, gamma-butyrolakton; kwasy tłuszczowe; fosfoniany; aminy; amidy, np. N- metylopirolidon, dimetyloamidy kwasów tłuszczowych; i ich mieszaniny. [0211] Odpowiednimi stałymi nośnikami lub wypełniaczami są ziemie mineralne, np. krzemiany, żele krzemionkowe, talk, kaoliny, wapień, wapno, kreda, gliny, dolomit, zie- 50 mia okrzemkowa, bentonit, siarczan wapnia, siarczan magnezu, tlenek magnezu; polisacharydy, np. celuloza, skrobia; nawozy, np. siarczan amonu, fosforan amonu, azotan amo- 35 nu, moczniki; produkty pochodzenia roślinnego, np. mączka zbożowa, mączka z kory drzewnej, mączka drzewna, mączka ze skorupki od orzecha i ich mieszaniny. [0212] Odpowiednimi środkami powierzchniowo czynnymi są związki powierzchniowo czynne, takie jak anionowe, kationowe, niejonowe i amfoteryczne środki powierzchniowo 5 czynne, polimery blokowe, polielektrolity i ich mieszaniny. Takie środki powierzchniowo czynne można stosować jako emulgatory, środek dyspergujący, środek zwiększający roz- puszczalność, środek zwilżający, środek zwiększający penetrację, koloid ochronny lub ad- iuwant. Przykłady środków powierzchniowo czynnych wymieniono w McCutcheon, tom 1: Emulsifiers & Detergents, McCutcheon's Directories, Glen Rock, USA, 2008 (Wydanie 10 międzynarodowe lub wydanie w Ameryce Północnej). [0213] Odpowiednimi anionowymi środkami powierzchniowo czynnymi są sole alkaliczne, ziem alkalicznych lub sole amonowe sulfonianów, siarczanów, fosforanów, karboksy- lanów i ich mieszanin. Przykładami sulfonianów są alkiloarylosulfoniany, difenylosulfo- niany, sulfoniany alfa-olefin, sulfoniany ligniny, sulfoniany kwasów tłuszczowych i ole- 15 jów, sulfoniany etoksylowanych alkilofenoli, sulfoniany alkoksylowanych arylofenoli, sulfoniany skondensowanych naftalenów, sulfoniany dodecylo- i tridecylobenzenów, sulfoniany naftalenów i alkilonaftalenów, sulfobursztyniany lub sulfoaminobursztyniany. Przy- kładami siarczanów są siarczany kwasów tłuszczowych i olejów, etoksylowanych alkilofenoli, alkoholi, etoksylowanych alkoholi lub estrów kwasów tłuszczowych. Przykładami 20 fosforanów są estry fosforanowe. Przykładami karboksylanów są karboksylany alkilu i etoksylany karboksylowanego alkoholu lub alkilofenolu. [0214] Odpowiednimi niejonowymi środkami powierzchniowo czynnymi są alkoksylany, N-podstawione amidy kwasów tłuszczowych, tlenki amin, estry, środki powierzchniowo czynne na bazie cukru, polimerowe środki powierzchniowo czynne i ich mieszaniny. Przy- 25 kładami alkoksylanów są związki, takie jak alkohole, alkilofenole, aminy, amidy, arylofe- nole, kwasy tłuszczowe lub estry kwasów tłuszczowych, które poddano alkoksylaowaniu 1 do 50 równoważnikami. Do alkoksylowania można stosować tlenek etylenu i/lub tlenek propylenu, korzystnie tlenek etylenu. Przykładami N-podstawionych amidów kwasów tłuszczowych są glukamidy kwasów tłuszczowych lub alkanoloamidy kwasów tłuszczo- 30 wych. Przykładami estrów są estry kwasów tłuszczowych, estry glicerolu lub monoglice- rydy. Przykładami środków powierzchniowo czynnych na bazie cukru są sorbitany, etok- sylowane sorbitany, estry sacharozy i glukozy lub alkilopoliglukozydy. Przykładami poli- merowych środków powierzchniowo czynnych są homo- lub kopolimery winylopirolido- nu, alkoholi winylowych lub octanu winylu. 35 [0215] Odpowiednimi kationowymi środkami powierzchniowo czynnymi są czwartorzę- dowe środki powierzchniowo czynne, na przykład czwartorzędowe związki amoniowe z jedną lub dwiema grupami hydrofobowymi lub sole długołańcuchowych amin pierwszo- rzędowych. Odpowiednimi amfoterycznymi środkami powierzchniowo czynnymi są alki- lobetainy i imidazoliny. Odpowiednimi polimerami blokowymi są polimery blokowe typu 40 A-B lub A-B-A zawierające bloki poli(tlenku etylenu) i poli(tlenku propylenu) lub typu A- B-C zawierające alkanol, poli(tlenek etylenu) i poli(tlenek propylenu). Odpowiednimi po- lielektrolitami są polikwasy lub polizasady. Przykładami polikwasów są sole alkaliczne kwasu poliakrylowego lub polimerów grzebieniowych. Przykładami polizasad są poliwi- nyloaminy lub polietylenoaminy. 45 [0216] Odpowiednimi adiuwantami są związki, które same mają znikomą lub nawet nie wykazują aktywności pestycydowej i które poprawiają biologiczne działanie wolnego od komórek ekstraktu, pożywki hodowlanej lub metabolitu w odniesieniu do celu. Przykła- dami są środki powierzchniowo czynne, oleje mineralne lub roślinne i inne środki pomocnicze. Dalsze przykłady są wymienione przez Knowles, Adjuvants and additives, Agrow 50 Reports DS256, T&F Informa UK, 2006, rozdział 5. 36 [0217] Odpowiednimi środkami zagęszczającymi są polisacharydy (np. guma ksantanowa, karboksymetyloceluloza), glinki nieorganiczne (organicznie modyfikowane lub niemody- fikowane), polikarboksylany i krzemiany. [0218] Odpowiednimi bakteriocydami są bronopol i pochodne izotiazolinonu, takie jak al- 5 kiloizotiazolinony i benzoizotiazolinony. Odpowiednimi środkami przeciw zamarzaniu są glikol etylenowy, glikol propylenowy, mocznik i gliceryna. Odpowiednimi środkami prze- ciwpieniącymi są silikony, długołańcuchowe alkohole i sole kwasów tłuszczowych. Od- powiednimi środkami barwiącymi (np. w kolorze czerwonym, niebieskim lub zielonym) są pigmenty o małej rozpuszczalności w wodzie i barwniki rozpuszczalne w wodzie. Przykła- 10 dami są nieorganiczne środki barwiące (np. tlenek żelaza, tlenek tytanu, heksacyjanożela- zian żelaza) i organiczne środki barwiące (np. alizaryno-, azo- i ftalocyjaninowe środki barwiące). Odpowiednimi środkami zwiększającymi kleistość lub środkami wiążącymi są poliwinylopirolidony, poli(octany winylu), poli(alkohole winylu), poliakrylany, woski biologiczne lub syntetyczne i etery celulozy. 15 [0219] Kiedy żywe mikroorganizmy, takie jak szczepy Paenibacillus według wynalazku w postaci komórek lub zarodników, stanowią część kompozycji, takie kompozycje można wytwarzać jako kompozycje zawierające oprócz składników czynnych co najmniej jeden środek pomocniczy (składnik obojętny) uzyskany powszechnymi sposobami (patrz np. H.D. Burges: Formulation of Microbial Biopesticides, Springer, 1998). Odpowiednimi 20 powszechnymi mi rodzajami takich kompozycji są zawiesiny, pyły, proszki, pasty, granulki, wytłoczki, kapsułki i ich mieszaniny. Przykładami rodzajów kompozycji są zawiesiny (np. SC, OD, FS), kapsułki (np. CS, ZC), pasty, pastylki, zwilżalne proszki lub pyły (np. WP, SP, WS, DP, DS), wytłoczki (np. BR, TB, DT), granulki (np. WG, SG, GR, FG, GG, MG), artykuły owadobójcze (np. LN), jak również preparaty żelowe do traktowania mate- 25 riałów do rozmnażania roślin, takich jak nasiona (np. GF). Należy wziąć tu pod uwagę, że każdy rodzaj preparatu lub wybór środka pomocniczego nie powinien wpływać na żywot- ność mikroorganizmu podczas przechowywania kompozycji i na koniec stosowania na glebę, roślinę lub materiał rozmnożeniowy roślin. Odpowiednie preparaty są wspomniane w np. WO 2008/002371, US 6955912, US 5422107. 30 [0220] Przykładami odpowiednich środków pomocniczych są te wymienione tu powyżej, przy czym należy zadbać o to, aby wybór i ilości takich środków pomocniczych nie miały wpływu na żywotność pestycydów drobnoustrojowych w kompozycji. Zwłaszcza w przypadku bakteriocydów i rozpuszczalników należy wziąć pod uwagę zgodność z odpowiednim mikroorganizmem odpowiedniego pestycydu drobnoustrojowego. Ponadto kompozy- 35 cje z pestycydami drobnoustrojowymi mogą ponadto zawierać stabilizatory lub składniki odżywcze i środki chroniące przed UV. Odpowiednimi stabilizatorami lub składnikami odżywczymi są np. alfa-tokoferol, trehaloza, glutaminian, sorbinian potasu, różne cukry, takie jak glukoza, sacharoza, laktoza i maltodekstryna (H.D. Burges: Formulation of Mi- crobial Biopesticides, Springer, 1998). Odpowiednimi środkami chroniącymi przed UV są 40 np. związki nieorganiczne, takie jak dwutlenek tytanu, tlenek cynku i pigmenty z tlenku żelaza lub związki organiczne, takie jak benzofenony, benzotriazole i fenylotriazyny. Oprócz środków pomocniczych wymienionych dla kompozycji zawierających związki I, kompozycje mogą tu ewentualnie zawierać 0,1 - 80% stabilizatorów lub składników od- żywczych i 0,1-10% środków chroniących przed UV. 45 [0221] Kompozycje agrochemiczne ogólnie zawierają od 0,01 do 95%, korzystnie od 0,1 do 90%, a zwłaszcza od 0,5 do 75% wagowych substancji czynnej. Substancje czynne stosuje się w czystości od 90% do 100%, korzystnie od 95% do 100% (zgodnie z widmem NMR). [0222] Przykłady rodzajów kompozycji i ich przygotowanie stanowią: 50 i) Rozpuszczalne w wodzie koncentraty (SL, LS) [0223] 10-60% wag. całkowitego bulionu hodowlanego, pozbawionego komórek ekstraktu, pożywki hodowlanej lub metabolitu według wynalazku i 5-15% wag. środka zwilżają- 37 cego (np. alkoksylanów alkoholu) rozpuszcza się w wodzie i/lub w rozpuszczalniku roz- puszczalnym w wodzie (np. alkohole) do 100% wag. Substancja czynna rozpuszcza się po rozcieńczeniu wodą. ii) Dyspergowalne koncentraty (DC) 5 [0224] 5-25% wag. całkowitego bulionu hodowlanego, pozbawionego komórek ekstraktu, pożywki hodowlanej lub metabolitu według wynalazku i 1-10% wag. środka dyspergują- cego (np. poliwinylopirolidonu) rozpuszcza się w rozpuszczalniku organicznym (np. cy- kloheksanonie) do 100% wag. Rozcieńczenie wodą daje dyspersję. iii) Koncentraty odpowiednie do emulgowania (EC) 10 [0225] 15-70% wagowych całkowitego bulionu hodowlanego, pozbawionego komórek ekstraktu, pożywki hodowlanej lub metabolitu według wynalazku i 5-10% wagowych emulgatorów (np. fodecylobenzenosulfonianu wapnia i etoksylanu oleju rycynowego) rozpuszcza się w nierozpuszczalnym w wodzie rozpuszczalniku organicznym (np. w węglo- wodorze aromatycznym ) do 100% wag. Rozcieńczenie wodą daje emulsję. 15 iv) Emulsje (EW, EO, ES) [0226] 5-40% wagowych całkowitego bulionu hodowlanego, pozbawionego komórek ekstraktu, pożywki hodowlanej lub metabolitu według wynalazku i 1-10 wag. emulgatorów (np. dodecylobenzenosulfonianu wapnia i etoksylanu oleju rycynowego) rozpuszcza się w 20-40% wag. nierozpuszczalnego w wodzie organicznego rozpuszczalnika (np. węglowo- 20 dorze aromatycznym). Tę mieszaninę wprowadza się do wody do 100% wag. za pomocą urządzenia emulgującego i przekształca w jednorodną emulsję. Rozcieńczenie wodą daje emulsję. v) Zawiesiny (SC, OD, FS) [0227] W mieszanym młynie kulowym 20-60% wagowych całkowitego bulionu hodowla- 25 nego, pozbawionego komórek ekstraktu, pożywki hodowlanej lub metabolitu według wynalazku rozdrabnia się z dodatkiem 2-10% wagowych środków dyspergujących i środków zwilżających (np. lignosulfonian sodu i etoksylan alkoholu ), 0,1-2% wag. środka zagęsz- czającego (np. guma ksantanowa) i wody do 100% wag., aby uzyskać dobre rozdrobniną zawiesinę substancji czynnej. Rozcieńczenie wodą daje stabilną zawiesinę substancji 30 czynnej. Do kompozycji typu FS dodaje się do 40% wagowych środka wiążącego (np. poli(alkoholu winylowego)). vi) Granulki dyspergowalne w wodzie i granulki rozpuszczalne w wodzie (WG, SG) [0228] 50-80% wag. całkowitego bulionu hodowlanego, pozbawionego komórek ekstraktu, pożywki hodowlanej lub metabolitu według wynalazku zmielono drobno z dodatkiem 35 środków dyspergujących i środków zwilżających (np. lignosulfonian sodu i etoksylan alkoholu) do 100% wag. i przygotowano jako dyspergowalne w wodzie lub rozpuszczalne w wodzie granulki za pomocą wyposażenia technicznego (np. wytłaczanie, wieża natrysko- wa, złoże fluidalne). Rozcieńczenie wodą daje stabilną dyspersję lub roztwór substancji czynnej. 40 vii) Proszki dyspergowalne w wodzie i proszki rozpuszczalne w wodzie (WP, SP, WS) [0229] 50-80% wag. całkowitego bulionu hodowlanego, pozbawionego komórek ekstraktu, pożywki hodowlanej lub metabolitu według wynalazku zmielono w młynie wirnikowo- stojanowym z dodatkiem 1-5% wag. środków dyspergujących (np. lignosulfonianu sodu), 1-3% wag. środków zwilżających (np. etoksylan alkoholu) i nośnikiem stałym (np. żel 45 krzemionkowy) do 100% wag. Rozcieńczenie wodą daje stabilną dyspersję lub roztwór substancji czynnej. viii) Żel (GW, GF) [0230] W mieszanym młynie kulowym 5-25% wagowych całkowitego bulionu hodowlanego, pozbawionego komórek ekstraktu, pożywki hodowlanej lub metabolitu według wy- 50 nalazku rozdrabnia się z dodatkiem 3-10% wagowych środków dyspergujących (np. lignosulfonianu sodu), 1-5% środka zagęszczającego (np. karboksymetyloceluloza) i wody do 38 100% wagowych, aby uzyskać drobną zawiesinę substancji czynnej. Rozcieńczenie wodą daje stabilną zawiesinę substancji czynnej. ix) Mikroemulsja (ME) [0231] 5-20% wag. całkowitego bulionu hodowlanego, pozbawionego komórek ekstraktu, 5 pożywki hodowlanej lub metabolitu według wynalazku dodaje się do 5-30% wag. mieszanki rozpuszczalników organicznych (np. dimetyloamidu kwasu tłuszczowego i cyklo- heksanonu), 10-25% wag. mieszanki środka powierzchniowo czynnego ( np. etoksylan alkoholu i etoksylan arylofenolu) i wody do 100%. Tę mieszaninę miesza się przez 1 h, aby spontanicznie wytworzyć termodynamicznie trwałą mikroemulsję. 10 x) Mikrokapsułki (CS) [0232] Faza olejowa zawierająca 5-50% wagowych całkowitego bulionu hodowlanego, pozbawionego komórek ekstraktu, pożywki hodowlanej lub metabolitu według wynalazku, 0-40% wagowych nierozpuszczalnego w wodzie rozpuszczalnika organicznego (np. wę- glowodoru aromatycznego), 2-15% wagowych monomerów akrylowych (np. metakrylanu 15 metylu, kwasu metakrylowego i di- lub triakrylanu) dysperguje się w wodnym roztworze koloidu ochronnego (np. poli(alkoholu winylowego)). Polimeryzacja rodnikowa zainicjo- wana przez inicjator rodnikowy powoduje tworzenie mikrokapsułek poli(met)akrylanowych. [0233] Alternatywnie, faza olejowa zawierająca 5-50% wagowych całkowitego bulionu 20 hodowlanego, pozbawionego komórek ekstraktu, pożywki hodowlanej lub metabolitu we- dług wynalazku, 0-40 wagowych nierozpuszczalnego w wodzie rozpuszczalnika organicznego (np. węglowodoru aromatycznego) i monomeru izocyjanianowego (np. 4,4'- diizocyjanianu diifenylometanu) dysperguje się w wodnym roztworze koloidu ochronnego (np. poli(alkoholu winylowym)). Dodatek poliaminy (np. heksametylenodiaminy) powodu- 25 je tworzenie mikrokapsułek polimocznikowych. Monomery wynoszą 1-10% wag. % wag. odnosi się do całkowitej kompozycji CS. xi) Proszki do rozpylania (DP, DS) [0234] 1-10% wagowych całkowitego bulionu hodowlanego, pozbawionego komórek ekstraktu, pożywki hodowlanej lub metabolitu według wynalazku zmielono i dokładnie zmie- 30 szano ze stałym nośnikiem (np. rozdrobnionym w znacznymi stopniu kaolinem) do 100% wag. xii) Granulaty (GR, FG) [0235] 0,5-30% wagowych całkowitego bulionu hodowlanego, pozbawionego komórek ekstraktu, pożywki hodowlanej lub metabolitu według wynalazku zmielono i połączono ze 35 stałym nośnikiem (np. krzemianem) do 100% wag. Granulację osiąga się przez wytłacza- nie, suszenie rozpyłowe lub złoże fluidalne. xiii) Ciecze o bardzo małej objętości (UL) [0236] 1-50% wagowych całkowitego bulionu hodowlanego, pozbawionego komórek ekstraktu, pożywki hodowlanej lub metabolitu według wynalazku rozpuszcza się w rozpusz- 40 czalniku organicznym (np. węglowodorze aromatycznym) do 100% wag. [0237] Kompozycje typu i) do xiii) mogą ewentualnie zawierać dalsze środki pomocnicze, takie jak 0,1-1% wag. bakteriocydów, 5-15% wag. środków przeciw zamarzaniu, 0,1-1% wag. środków przeciwpieniących i 0,1-1% wag. środków barwiących. [0238] Roztwory do zaprawiania nasion (LS), emulsje zawiesinowe (SE), płynne koncen- 45 traty (FS), proszki do obróbki na sucho (DS), proszki dyspergowalne w wodzie do obróbki zawiesinowej (WS), proszki rozpuszczalne w wodzie (SS), emulsje (ES), koncentraty do emulgowania (EC) i żele (GF) są zwykle stosowane w celu traktowania materiałów roz- mnożeniowych roślin, w szczególności nasion. [0239] Korzystne przykłady rodzajów preparatów do zaprawiania nasion lub stosowania na 50 glebę dla kompozycji przedmieszek są typu WS, LS, ES, FS, WG lub CS. [0240] Zazwyczaj preparat przedmieszkowy do stosowania do zaprawiania nasion zawiera 0,5 do 99,9 procent, zwłaszcza 1 do 95 procent pożądanych składników i 99,5 do 0,1 pro- 39 cent, zwłaszcza 99 do 5 procent, stałego lub ciekłego adiuwanta (w tym, na przykład rozpuszczalnik taki jak woda), w którym środki pomocnicze mogą stanowić środek powierzchniowo czynny w ilości od 0 do 50 procent, zwłaszcza od 0,5 do 40 procent, w prze- liczeniu na preparat przedmieszki. Podczas gdy dostępne w handlu produkty będą korzyst- 5 nie formułowane jako koncentraty (np. kompozycja (preparat) przedmieszkowy), użyt- kownik końcowy będzie zwykle stosował rozcieńczone preparaty (np. kompozycję mieszanki zbiornikowej). [0241] Sposoby zaprawiania nasion do nanoszenia lub traktowania odpowiednio szczepami, całkowitymi bulionami hodowlanymi, pozbawionymi komórek ekstraktami, pożyw- 10 kami hodowlanymi, związkami o wzorze I i kompozycjami według wynalazku materiału rozmnożeniowego roślin, zwłaszcza nasion, są znane w dziedzinie i obejmują metody na- kładania, powlekania, powlekania warstewką, granulowania i moczenia materiału rozmno- żeniowego. Takie sposoby mają również zastosowanie do połączeń według wynalazku. W korzystnej postaci nanoszenie lub traktowanie odpowiednio szczepami, całkowitymi bu- 15 lionami hodowlanymi, pozbawionymi komórek ekstraktami, pożywkami hodowlanymi, związkami o wzorze I i kompozycjami według wynalazku materiału rozmnożeniowego ro- ślin, następuje takim sposobem, że nie wpływa negatywnie na kiełkowanie. Zgodnie z tym, przykładami odpowiednich sposobów nanoszenia (lub traktowania) materiału rozmnoże- niowego roślin, takiego jak nasiona, jest zaprawianie nasion, powlekanie nasion lub granu- 20 lowanie nasion i tym podobne. [0242] Korzystne jest, aby materiałem rozmnożeniowym roślin było nasiono, fragment nasiona (tj. łodyga) lub cebulka. [0243] Chociaż uważa się, że niniejszy sposób może być zastosowany do nasion w dowolnym stanie fizjologicznym, korzystne jest, aby nasiona były w stanie wystarczająco trwa- 25 łym, aby nie uległy uszkodzeniu podczas procesu obróbki. Zwykle nasiona byłyby nasionami zebranymi z pola; usuniętymi z rośliny; i oddzielonymi od wszelkich kolb, łodyg, łu- ski zewnętrznej i otaczającej pulpy lub innego materiału roślinnego innego niż nasiona. Nasiona korzystnie byłyby również biologicznie stabilne w takim stopniu, że obróbka nie powodowałoby biologicznego uszkodzenia nasion. Uważa się, że obróbka może być zasto- 30 sowana do nasion w dowolnym czasie między zbiorem nasion i siewem nasion lub podczas procesu siewu (zastosowania ukierunkowane na nasiona). Nasiona można również przygo- tować przed lub po obróbce. [0244] Równomierne rozmieszczenie składników odpowiednio, w szczepach, całkowitych bulionach hodowlanych, pozbawionych komórek ekstraktach, pożywek hodowlanych, 35 związkach o wzorze I i kompozycjach według wynalazku, oraz ich przyleganie do nasion jest pożądane podczas obróbki materiału rozmnożeniowego. Obróbka może się różnić od cienkiej warstwy (opatrunku) preparatu zawierającego połączenie, na przykład mieszaniny składnika(-ów) czynnego(-ych), na materiale rozmnożeniowym rośliny, takim jak nasiona, gdzie rozpoznawalny jest pierwotny rozmiar i/lub kształt do stanu pośredniego (takiego jak 40 powłoka), a następnie do grubszej folii (takiej jak granulowanie z wieloma warstwami róż- nych materiałów (takich jak nośniki, na przykład glinki; różne preparaty, takie jak inne składniki czynne; polimery i środki barwiące), gdzie pierwotny kształt i/lub rozmiar nasion nie jest już rozpoznawalny. [0245] Aspekt niniejszego wynalazku obejmuje zastosowanie odpowiednio szczepów, cał- 45 kowitych bulionów hodowlanych, pozbawionych komórek ekstraktów, pożywek hodowlanych, związków o wzorze I i kompozycji według wynalazku, na materiał rozmnożeniowy roślin w sposób ukierunkowany, w tym umieszczanie składników w połączeniu na cały materiał rozmnożeniowy roślin lub tylko na ich częściach, w tym tylko na jednej stronie lub części pojedynczej strony. Specjalista w dziedzinie zrozumie te sposoby nakładania z 50 opisu dostarczonego w EP954213B1 i WO06/112700. [0246] Odpowiednio szczepy, całkowite buliony hodowlane, pozbawione komórek ekstrakty, pożywka hodowlana, związki o wzorze I i kompozycje według wynalazku, można 40 również stosować w postaci „pigułki” lub „granulat” lub odpowiedniego substratu i umieszczanie lub wysiewanie, potraktowanej pigułki lub substratu, obok materiału roz- mnożeniowego roślin. Takie techniki są znane w dziedzinie, w szczególności z EP1124414, WO07/67042 i WO 07/67044. Nanoszenie odpowiednio szczepów, całkowi- 5 tych bulionów hodowlanych, pozbawionych komórek ekstraktów, pożywek hodowlanych, związków o wzorze I i kompozycji tu opisanych na materiał rozmnożeniowy roślin obejmuje również ochronę materiału rozmnożeniowego roślin traktowanego połączeniem we- dług niniejszego wynalazku przez umieszczenie jednej lub większej liczby cząstek zawie- rających pestycyd obok nasion traktowanych pestycydami, przy czym ilość pestycydu jest 10 taka, że nasiona traktowane pestycydami i cząstki zawierające pestycyd zawierają razem skuteczną dawkę pestycydu, a dawka pestycydu zawarta w nasionach zaprawionych pestycydem jest mniejsza lub równa maksymalnej niefitotoksycznej dawce pestycydu. Takie techniki są znane w dziedzinie, w szczególności z WO2005/120226. [0247] Nanoszenie odpowiednio szczepów, całkowitych bulionów hodowlanych, pozba- 15 wionych komórek ekstraktów, pożywek hodowlanych, związków o wzorze I i kompozycji według wynalazku, na nasiona obejmuje również powłoki o kontrolowanym uwalnianiu na nasionach, w których składniki połączeń są włączone do materiałów, które z czasem uwal- niają składniki. Przykłady technologii zaprawiania nasion z kontrolowanym uwalnianiem są ogólnie znane w dziedzinie i obejmują folie polimerowe, woski lub inne powłoki na- 20 sion, przy czym składniki mogą być włączone do materiału do kontrolowanego uwalniania lub stosowane pomiędzy warstwami materiałów, lub obydwa. [0248] Nasiona można traktować przez nakładanie na nie odpowiednio szczepów, całkowi- tych bulionów hodowlanych, pozbawionych komórek ekstraktów, pożywek hodowlanych, związków o wzorze I i kompozycji według wynalazku, w dowolnej pożądanej kolejności 25 lub jednocześnie. [0249] Zaprawianie nasion zachodzi w przypadku nasion nie poddanych wysiewowi, a określenie „nasiona niewysiane” ma obejmować nasiona w dowolnym okresie między zbiorem nasion a wysiewem nasion do ziemi w celu wykiełkowania i wzrostu rośliny. Ob- róbka nasion niewysianych nie ma obejmować tych praktyk, w których składnik czynny 30 jest stosowany na glebę, ale obejmowałaby dowolną praktykę stosowania, która byłaby ukierunkowana na nasiona podczas procesu sadzenia. [0250] Korzystnie, obróbka zachodzi przed wysiewem nasion, tak, że wysiane nasiona zo- stały wstępnie potraktowane szczepami, całkowitymi bulionami hodowlanymi, pozbawionymi komórek ekstraktami, pożywkami hodowlanymi, związkami o wzorze I i odpowied- 35 nio kompozycjami według wynalazku. W szczególności korzystne jest powlekanie nasion lub granulowanie nasion. W wyniku obróbki składniki przylegają do nasion, a zatem są dostępne do zwalczania szkodników. [0251] Zaprawione nasiona można przechowywać, obchodzić się z nimi, wysiewać i uprawiać w taki sam sposób, jak z każdymi innymi nasionami zaprawionymi składnikiem 40 czynnym. [0252] W szczególności, niniejszy wynalazek dotyczy sposobu ochrony materiału rozmno- żeniowego roślin przed szkodnikami i/lub poprawy zdrowia roślin wyhodowanych ze wspomnianego materiału rozmnożeniowego roślin, przy czym gleba, w której materiał rozmnożeniowy roślin jest wysiewany, jest traktowana odpowiednio skuteczną ilością 45 szczepu, pozbawionego komórek ekstraktu, pożywki hodowlanej, metabolitu lub kompozycji według wynalazku. [0253] W szczególności, niniejszy wynalazek dotyczy sposobu ochrony materiału rozmno- żeniowego roślin przed szkodnikami, przy czym glebę, w której zasiewa się materiał roz- mnożeniowy roślin, traktuje się skuteczną ilością odpowiednio szczepu, pozbawionego 50 komórek ekstraktu, pożywki hodowlanej, metabolitu lub kompozycji według wynalazku. [0254] W szczególności, niniejszy wynalazek dotyczy sposobu ochrony roślinnego mate- riału rozmnożeniowego przed szkodliwymi grzybami, przy czym glebę, w której zasiewa 41 się materiał rozmnożeniowy roślin, traktuje się odpowiednio skuteczną ilością szczepu, pozbawionego komórek ekstraktu, pożywki hodowlanej, metabolitu lub kompozycji we- dług wynalazku. [0255] W szczególności, niniejszy wynalazek dotyczy sposobu ochrony materiału rozmno- 5 żeniowego roślin przed szkodnikami zwierzęcymi (owadami, roztoczami lub nicieniami), przy czym glebę, w której zasiewa się materiał rozmnożeniowy roślin, traktuje się odpowiednio skuteczną ilością szczepu, pozbawionego komórek ekstraktu, pożywki hodowlanej, metabolitu lub kompozycji według wynalazku. [0256] Użytkownik nakłada kompozycje według wynalazku zwykle z urządzenia z wstęp- 10 nie ustaloną dawką, opryskiwacza plecakowego, zbiornika opryskowego, płaszczyzny na- tryskowej lub systemu irygacyjnego. Zwykle kompozycję agrochemiczną przygotowuje się z wodą, buforem i/lub dalszymi środkami pomocniczymi do pożądanego stężenia użytko- wego i w ten sposób otrzymuje się gotową do użycia ciecz opryskową lub kompozycję agrochemiczną według wynalazku. Zwykle stosuje się 20 do 2000 litrów, korzystnie 50 do 15 400 litrów, gotowej do użycia cieczy do opryskiwania na hektar użytków rolnych. [0257] W odniesieniu do obróbki materiału rozmnożeniowego roślin, zwłaszcza nasion, ujawnione tu kompozycje dają, po dwu- do dziesięciokrotnym rozcieńczeniu, stężenia składników czynnych od 0,01 do 60% wagowych, korzystnie od 0,1 do 40%, w gotowych do użycia preparatach. Nanoszenie może być przeprowadzone przed lub podczas siewu. 20 Sposoby nakładania odpowiednio szczepu, pozbawionego komórek ekstraktu, pożywki hodowlanej, metabolitu lub kompozycji według wynalazku na materiał rozmnożeniowy ro- ślin, zwłaszcza nasiona, obejmują metody nakładania, powlekania, granulowania, opylania, namaczania i nanoszenia dobruzdowego na materiał rozmnożeniowy. Korzystnie, odpowiednio szczepy, całkowite buliony hodowlane, pozbawione komórek ekstrakty, pożywki 25 hodowlane, związki o wzorze I lub kompozycje według wynalazku nanosi się na materiał rozmnożeniowy roślin takim sposobem, aby kiełkowanie nie było indukowane, np. przez zaprawianie, granulowanie, powlekanie i opylanie nasion. [0258] Gdy szczepy według wynalazku stosuje się w ochronie roślin, w których szczepy stosuje się jako zabieg dolistny lub do gleby, dawki zwykle wynoszą od około 1 x 106 do 5 30 x 1015 (lub więcej) CFU/ha, korzystnie od około 1 x 107 do około 1 x 1013 CFU/ha, jeszcze korzystniej od 1 x 109 do 5 x 1012 CFU/ha. [0259] Gdy szczepy według wynalazku stosuje się do zaprawiania nasion, dawki nanoszenia w odniesieniu do materiału rozmnożeniowego roślin zwykle są w zakresie od około 1 x 101 do 1 x 1012 (lub więcej) CFU/nasiono, korzystnie od około 1 x 103 do około 1 x 1010 35 CFU/nasiono, a jeszcze korzystniej od około 1 x 103 do około 1 x 106 CFU/nasiono. Alter- natywnie, dawki nanoszenia w odniesieniu do materiału rozmnożeniowego roślin korzystnie wynoszą od około 1 x 107 do 1 x 1016 (lub więcej) CFU na 100 kg nasion, korzystniej 1 x 109 do około 1 x 1015 CFU na 100 kg nasion, jeszcze korzystniej od 1 x 1011 do około 1 x 1015 CFU na 100 kg nasion. 40 [0260] Gdy stosuje się pozbawione komórek ekstrakty, pożywki hodowlane i/lub związki o wzorze I, materiał stały (suchą masę) uważa się za składniki czynne, np. do uzyskania po wysuszeniu lub odparowaniu ośrodka ekstrakcyjnego lub ośrodka zawiesinowego w przypadku preparatów ciekłych. Przy stosowaniu w ochronie roślin, ilości stosowanych skład- ników czynnych wynoszą, w zależności od pożądanego efektu, od 0,001 do 2 kg na ha, ko- 45 rzystnie od 0,005 do 2 kg na ha, korzystniej od 0,05 do 0,9 kg na ha i w szczególności od 0,1 do 0,75 kg na ha. Do obróbki materiałów rozmnożeniowych roślin, takich jak nasiona, np. przez opylanie, powlekanie lub zraszanie nasion, ogólnie konieczne są ilości składni- ków czynnych od 0,1 do 1000 g, korzystnie od 1 do 1000 g, korzystniej od 1 do 100 g, a najkorzystniej od 5 do 100 g, na 100 kilogramów materiału rozmnożeniowego roślin (ko- 50 rzystnie nasion). Przy stosowaniu w ochronie materiałów lub przechowywanych produk- tów, ilość zastosowanych składników czynnych zależy od rodzaju obszaru, który poddaje się nakładaniu i pożądanego efektu. Ilości zwykle stosowane w ochronie materiałów wy- 42 noszą 0,001 g do 2 kg, korzystnie 0,005 g do 1 kg, składników czynnych na metr sześcien- ny traktowanego materiału. [0261] Zgodnie z jedną postacią, poszczególne składniki kompozycji według wynalazku, takie jak części zestawu lub części mieszaniny dwuskładnikowej lub trójskładnikowej, 5 mogą być mieszane przez samego użytkownika w zbiorniku opryskiwacza lub dowolnym innym naczyniu stosowanym do nanoszenia (np. bębnie do zarabiania nasion, maszynie do granulowania nasion, opryskiwaczu plecakowym) i jeśli to wskazane, mogą być dodane ewentualnie dodatkowe środki pomocnicze. [0262] Jeśli część takiego zestawu tworzą żywe mikroorganizmy, takie jak szczepy według 10 wynalazku, należy uważać, aby wybór i ilości składników (np. chemicznych środków pestycydowych) i dodatkowych środków pomocniczych nie miały wpływu na żywotność mi- kroorganizmów w kompozycji wymieszanej przez użytkownika. Zwłaszcza w przypadku bakteriocydów i rozpuszczalników należy wziąć pod uwagę zgodność z odpowiednimi mi- kroorganizmami. 15 [0263] Do szczepów można dodawać różne rodzaje olejów, środków zwilżających, adiu- wantów, nawozów lub mikroskładników odżywczych i innych pestycydów (np. herbicydy, insektycydy, fungicydy, regulatory wzrostu, środki zabezpieczające, biopestycydy), pozbawione komórek ekstrakty, pożywki hodowlane, metabolity, związki o wzorze I i kom- pozycję według wynalazku, odpowiednio jako przedmieszkę lub, jeśli to wskazane, nie 20 wcześniej niż bezpośrednio przed użyciem (mieszanka zbiornikowa). Środki te można zmieszać z kompozycjami według wynalazku w stosunku wagowym 1:100 do 100:1, korzystnie 1:10 do 10:1. Korzystnie kompozycja według wynalazku zawiera kolejny biopestycyd. Jeszcze korzystniej kompozycja według wynalazku zawiera oprócz środka pomocniczego i co najmniej jednego związku o wzorze I, pestycyd mikrobiologiczny. 25 [0264] Pestycyd jest na ogół chemicznym lub biologicznym środkiem (takim jak wirus, bakteria, środek przeciwdrobnoustrojowy lub dezynfekujący), który poprzez swój wpływ odstrasza, obezwładnia, zabija lub w inny sposób zniechęca szkodniki. Docelowe szkodniki mogą obejmować owady, patogeny roślinne, chwasty, mięczaki, ptaki, ssaki, ryby, nicienie (glisty) i mikroby, które niszczą własność, powodują uciążliwości, rozprzestrzeniają 30 choroby lub są nosicielami chorób. Określenie pestycydy obejmuje również regulatory wzrostu roślin, które zmieniają oczekiwany wzrost, kwitnienie lub tempo rozmnażania ro- ślin; defolianty powodujące opadanie liści lub innego listowia z rośliny, zazwyczaj w celu ułatwienia zbiorów; środki osuszające, które wspomagają wysuszenie żywych tkanek, takie jak niepożądane wierzchołki roślin; aktywatory roślin, które aktywują fizjologię roślin 35 dla obrony przed niektórymi szkodnikami; środki zabezpieczające, które zmniejszają nie- pożądane działanie chwastobójcze pestycydów na rośliny uprawne; oraz promotory wzrostu roślin, które wpływają na fizjologię roślin w celu zwiększenia wzrostu roślin, biomasy, wydajności lub dowolnego innego parametru jakościowego dających się zbierać dóbr ro- ślin uprawnych. 40 Przykłady [0265] Niniejszy wynalazek zostanie opisany bardziej szczegółowo za pomocą następują- cych przykładów. Następujące przykłady mają charakter poglądowy i nie mają na celu ograniczenia zakresu wynalazku. Przykład 1: Izolacja nowych szczepów bakteryjnych według wynalazku 45 [0266] Zebrano próbki gleby z różnych lokalizacji w Europie, w tym z Niemiec. Stosując powszechnie znane procedury izolacji drobnoustrojów do tych gleb, twórcy wynalazku uzyskali wiele bakterii, które następnie poddano konwencjonalnym technikom izolowania w celu dostarczenia czystych izolatów, jak tu opisano. Do wyizolowania każdego rodzaju bakterii postępowano zgodnie ze standardowymi tech- 50 nikami wzbogacania w drobnoustroje (C. A. Reddy, T. J. Beveridge, J. A. Breznak, G. A. Marzluf, T. M. Schmidt i L. R. Snyder (eds.). Methods for General and Molecular Micro- biology, Am. Soc. Microbiol., Washington, District of Columbia). 43 [0267] Następujące szczepy zostały wyizolowane i zdeponowane w ramach Traktatu Bu- dapeszteńskiego w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) 20 lutego 2013: a) Lu16774 zdeponowany w DSMZ o numerze depozytu DSM 26969 5 b) Lu17007 zdeponowany w DSMZ o numerze depozytu DSM 26970 c) Lu17015 zdeponowany w DSMZ o numerze depozytu DSM 26971. Przykład 2 - Charakterystyka nowych szczepów bakteryjnych Przykład 2.1: Sekwencjonowanie 16S-rDNA [0268] Sekwencje genu 16S rRNA Paenibacillus szczepy określono przez bezpośrednie 10 sekwencjonowanie 16S rDNA amplifikowanego z użyciem PCR w DSMZ, Braunschweig, Niemcy. [0269] Ekstrakcję genomowego DNA przeprowadzono z użyciem zestawu do oczyszczania DNA Gram-dodatnie MasterPure ™ z Epicenter Biotechnologies, zgodnie z instruk- cjami producenta. Amplifikację 16S rDNA z użyciem PCR i oczyszczanie produktu PCR 15 przeprowadzono jak opisano wcześniej (Int. J. Syst. Bacteriol. 46, 1088-1092, 1996). Oczyszczone produkty PCR sekwencjonowano z użyciem zestawu do sekwencjonowania BigDye® Terminator v1.1 (Applied Biosystems) zgodnie z protokołem producenta. Reak- cje z sekwencjonowania poddano elektroforezie z użyciem analizatora genetycznego 3500xL firmy Applied Biosystems. Wieloznaczności sekwencji mogą wynikać z istnienia 20 kilku cistronów kodujących 16S rRNA z różnymi sekwencjami w obrębie jednego genomu (J. Bacteriol. 178 (19), 5636-5643, 1996). [0270] Uzyskane dane sekwencji ze szczepów umieszczono w edytorze uliniowienia AE2 (http://iubio.bio.indiana.edu/soft/molbio/unix/ae2.readme), z uliniowieniem ręcznym zgodnie ze strukturą drugorzędową powstałej cząsteczki rRNA i porównano z reprezenta- 25 tywnymi sekwencjami genów 16S rRNA organizmów należących do Firmicutes (Nucl. Acids Res. 27, 171-173, 1999). Do porównania sekwencje 16S rRNA otrzymano z baz danych EMBL i RDP. [0271] Sekwencje 16S rDNA szczepów według wynalazku przedstawiono w wykazie sekwencji, jak wskazano w Tabeli 2. 30 Tabela 2: Wykaz sekwencji odniesienia do 16S rDNA ze szczepów Paenibacillus. Szczep SEQ ID NO Lu16774 1 Lu17007 2 Lu17015 3

[0272] Wartości identyczności dla genu 16S rDNA w % obliczono przez porównanie par sekwencji w ramach uliniowienia porównywanych sekwencji. 35 [0273] Porównanie przeprowadzone tylko z dwiema sekwencjami opartymi na uliniowieniu par sekwencji oznaczono tu jako wartości binarne. Pozostałe wartości są oparte na wielokrotnym uliniowieniu sekwencji wszystkich sekwencji w ramach porównania. Większe wartości identyczności z porównań wieloskładnikowych wynikają z problemu, że dane sekwencji porównywanych sekwencji były różnej długości, co skutkowało krótszym ulinio- 40 wieniem. [0274] Procent (%) identyczności z porównań parami kompletnych sekwencji rDNA wśród trzech nowych szczepów Lu16774, Lu17007 i Lu17015 wynosił między 99,5 a 99,9% (Tabela 3, wartości binarne).

44 Tabela 3: Identyczności w% całego 16S rRNA sekwencji trzech nowych szczepów Paeni- bacillus (wartości binarne w nawiasach). Identyczności całego 16S rRNA sekwencje nowych szczepów Paenibacillus (%) Szczepy Lu16774 Lu17015 Lu17007 Lu16774 - Lu17015 99,7(99,5) - Lu17007 99,9 (99,8) 99,8 (99,5) -

[0275] Porównanie pełnej sekwencji 16S rRNA trzech nowych szczepów Lu16774, Lu17007 i Lu17015 z powiązanymi taksonami (patrz Fig. 9) ujawniło duży procent iden- tyczności z Paenibacillus peoriae (szczep typu DSM 8320) z 99,8%. Wartości binarne 5 identyczności dla uliniowień sekwencji par P. peoriae z nowymi szczepami były odpowiednio następujące: Lu16774: 99,5%, Lu17007: 99,5%; i Lu17015: 99,7%. [0276] Nie była możliwa końcowa ocena gatunków, do, których nowe szczepy Lu16774, Lu17015 i Lu17007 Paenibacillus należały w oparciu o dane sekwencji 16S rRNA. [0277] Sekwencjonowanie całego rDNA prowadziło do uzyskania 100,0% identyczności 10 Paenibacillus peoriae NRRL BD-62 do P. peoriae (szczep typu DSM 8320) potwierdzając wskazanie gatunku P. peoriae dla tego szczepu BD-62 (patrz Fig. 9). [0278] Bliskie pokrewieństwo wszystkich trzech nowych szczepów Lu16774, Lu17007 i Lu17015 Paenibacillus do P. peoriae potwierdzono przez porównanie z sekwencją 16S rRNA P. peoriae szczepu BD-62, co dało wartości identyczności 99,8% (patrz Fig. 9). 15 [0279] Do konstrukcji operacji na filogenetycznym dendrogramie w pakiecie ARB (Nucl. Acids Res. 35, 7188-7196, 2007) zostały użyte: w oparciu o wartości odległości ewolucyj- nych drzewo filogenetyczne zostało skonstruowane metodą sąsiedniego łączenia (Jukes, T. H. & Cantor C. R. (1969). Evolution of protein molecules. In Mammalian protein metabo- lism, str. 21-132. Edytowany przez H. N. Munro. Nowy York: Academic press) z użyciem 20 korekty Jukes i Cantor (Mol. Biol. Evol. 4, 406-425, 1987). Korzeń drzewa został określo- ny przez włączenie sekwencji genu 16S rRNA Cohnella thermotolerans do analizy. Pasek skali poniżej dendrogramu wskazuje 1 podstawienie nukleotydów na 100 nukleotydów. Wyniki podano na Figurze 10. [0280] Filogenetyczny dendrogram dla tych sekwencji (Fig. 10) przedstawia, że trzy nowe 25 szczepy Lu16774, Lu17007 i Lu17015 są najbardziej ze sobą spokrewnione, a ich najbliż- szym spokrewnionym znanym każdemu z nich był Paenibacillus peoriae szczep NRRL BD-62. Przykład 2.2: Analiza RiboPrint [0281] Standaryzowane, zautomatyzowane rybotypowanie odbywa się z użyciem Qualicon 30 RiboPrintersystem. System RiboPrinter łączy etapy przetwarzania molekularnego w rybo- typowaniu w autonomicznym, zautomatyzowanym urządzeniu. Procedura obejmuje lizę komórek, trawienie chromosomalnego DNA enzymem restrykcyjnym EcoRI, rozdział fragmentów przez elektroforezę, przeniesienie fragmentów DNA na membranę nylonową, hybrydyzację z sondą wygenerowaną z operonu rrnB z E. coli, detekcję chemiluminescen- 35 cyjną sondy do fragmentów zawierających sekwencje operonu rrn, detekcję obrazu i kom- puterową analizę wzorów RiboPrint (Food Technology 50(1), 77-81, 1996; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 5229-5233, 1995; Int. Journ. Syst. Bact. 44(3), 454-460, 1994). [0282] Rybotypowanie zostało wykonane przez DSMZ, Niemcy dla nowych szczepów Paenibacillus Lu16774, Lu17007 i Lu17015 w porównaniu ze szczepem BD-62 P. peoriae 40 z użyciem enzymu restrykcyjnego EcoRI. Uzyskane wzorce zostały porównane z użyciem oprogramowania systemu RiboPrinter, zintegrowanej biblioteki identyfikacyjnej DuPont oraz oprogramowania BioNumerics (Applied Maths, Belgia). 45 [0283] Podobieństwo wszystkich trzech nowych szczepów do BD-62 wynosiło między 0,24 a 0,5 (Fig. 11). Grupa trzech nowych szczepów składa się z dwóch grup, zawierają- cych pierwsza: Lu17015, podczas gdy druga grupa obejmuje szczepy Lu16774 i Lu17007. Żaden z nowych szczepów nie ma podobieństwa wiekszego niż 0,84 do żadnego szczepu 5 w bibliotece identyfikacyjnej DuPont, a zatem nie został zidentyfikowany automatycznie. [0284] Szczep BD-62 został zidentyfikowany jako Paenibacillus peoriae na podstawie wejścia DUP-13142 w bibliotece identyfikacyjnej DuPont (wejście na podstawie Paeniba- cillus peoriae DSM 8320). Przykład 2.3: Charakterystyka morfologiczna i fizjologiczna 10 [0285] Szczepy scharakteryzowano w DSMZ analogicznie do sposobów opisanych w Gor- don, R.E., Haynes, W.C. & Pang. C.H.-N. (1973): The Genus Bacillus, Agriculture Hand- book nr. 427. Washington DC: US Department of Agriculture. Wyniki podano w Tabeli 4.

Tabela 4: Charakterystyka danych Paenibacillus szczepów według wynalazku i porówna- 15 nie ze znanym szczepem NRRL BD-62 z Paenibacillus peoriae. Szczepy Paenibacillus Identyfikacja Lu16774 Lu17007 Lu17015 BD-62 Charakterystyka forma komórki pałeczkowaty pałeczkowaty pałeczkowaty pałeczkowaty kształt kształt kształt kształt szerokość [µm] 0,9-1,0 0,9-1,0 0,9-1,0 0,9-1,0 długość [µm] 3->5,0 3-5,0 3-5,0 2,5-5,0 elipsoidalne zarodniki + + + + spuchnięte sporangium + + + + Katalaza + + + + Oksydaza - - - - wzrost beztlenowy + + + + Reakcja VP + + + + pH w pożywce VP- 5.2 5.7 4.8 5.2 maksymalna temperatura dodatni wzrost w °C 40 40 40 40 ujemny wzrost w °C 50 50 50 50 Wzrost w: pożywce pH 5, 7 + + + + NaCl 2% + + + + NaCl 5% - - - - NaCl 7% - - - - Tworzenie kwasów z: D-Glukozy + + + + L-Arabinozy + + + + 46

D-ksylozy + + + + D-mannitolu + + + + D-fruktozy + + + + Rafinozy + + + + Trehalozy + + + - Glicerolu + + + + Gaz z glukozy + + + + Hydroliza skrobi + + + + żelatyny + + + + kazeiny + + + ? Tween 80 - - - - eskuliny + + + + Wykorzystanie cytrynianu n.g.* n.g. n.g. n.g. propionianu n.g. n.g. n.g. n.g.

N03 do N02 + + + + Reakcja indolowa - - - - Lecytynaza + + + - Dezaminaza - - - - fenyloalaninowa Dihydrolaza argininowa - - - - Lizozym + + + + * n.g. = bez wzrostu.

[0286] Analiza komórkowych kwasów tłuszczowych przeprowadzona w DSMZ spowo- dowała, że wszystkie szczepy wykazywały zwykły profil dla Paenibacillus spp. [0287] Wykorzystując dostępne dane genetyczne, fizjologiczne i biochemiczne, wykazano, 5 że szczepy Lu16774, Lu17007 i Lu17015 należą do rodzaju Paenibacillus. Ponieważ szczepy Lu16774, Lu17007 i Lu17015 oraz BD-62 wytwarzają gaz z glukozy, żaden z nich nie należy do Paenibacillus jamilae. [0288] Fenotypowe zróżnicowanie między Paenibacillus peoriae a Paenibacillus polymyxa jest przede wszystkim możliwe z użyciem charakterystyki tworzenia kwasu z niektó- 10 rych substratów (Int. J. Syst. Bacteriol. 43 (2), 388-390, 1993; W. J. Syst. Bacteriol. 46 (6), 988-1003, 1996). Żaden z nowych szczepów nie był całkowicie zgodny z jego cechami charakterystycznymi przedstawionymi w Tabeli 4 całkowicie dla żadnego z tych dwóch gatunków, ale w sumie z dostępnych danych genetycznych, fizjologicznych i biochemicz- nych, które najprawdopodobniej wskazują na gatunek Paenibacillus peoriae i P. polymyxa 15 lub przynajmniej na inny gatunek bardzo blisko spokrewniony z Paenibacillus peoriae i P. polymyxa. 47 [0289] Ze względu na mnogość dotychczas opisanych gatunków Paenibacillus nie można określić prawidłowych gatunków taksonomicznych trzech izolatów badanych na podstawie kryteriów fizjologicznych i morfologicznych z Tabeli 4 (Rainer Borriss, Uniwersytet Humboldta w Berlinie, wyniki niepublikowane). 5 [0290] Niemniej jednak nie było możliwe całkowite określenie gatunku w tym rodzaju. Stwierdzono, że najbardziej zbliżone gatunki i szczepy stanowi Paenibacillus peoriae BD- 62 na podstawie analizy 16S-rDNA (patrz np. Fig. 11). Przykład 2.4: Analiza filogenetyczna oparta na genach kodujących DnaN, GyrB, RecF, RecN i RpoA 10 [0291] Sekwencje nukleotydowe genów kodujących DnaN, GyrB, RecF, RecN i RpoA zo- stały wyekstrahowane z kompletnych sekwencji genomu lub z publicznych baz danych (Wykaz sekwencji jak przedstawiono w Tabeli 28). [0292] Tabele identyczności (Fig. 12 do 16) wytworzono z użyciem podejścia wszyscy przeciwko wszystkim, w którym każda sekwencja jest uliniowiona z każdą inną sekwen- 15 cją. Uliniowienie sekwencji przeprowadzono za pomocą programu Needle (EMBOSS pac- kage 6.6.0; Trends in Genetics 16 (6), 276-277). Stosowano standardowe parametry (tworzenie przerwy 10,0; wydłużenie przerwy 0,5). Wyniki identyczności są obliczane na podstawie uliniowień bez uwzględniania żadnych przerw. [0293] W przypadku drzew filogenetycznych (Fig. 17 do 21), wielokrotne uliniowienie se- 20 kwencji, które przeprowadzono z użyciem Clustal Omega (wersja 1.2.0; Molecular Sys- tems Biology 7: 539, doi:10.1038/msb.2011.75). Drzewa filogenetyczne oblicza się meto- dą maksymalnego prawdopodobieństwa za pomocą oprogramowania Dnaml (zaimplemen- towanego w pakiecie Phylip 3.696; Felsenstein 1981 http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html). Dendrogramy zostały ustanowione 25 z użyciem modelu odległości F84 przy zastosowaniu współczynnika przejścia - transwersji wynoszącego dwa (2). Drzewa są wykreślane z użyciem narzędzia Dendroscope (http://dendroscope.org/).

Tabela 28: Wykaz sekwencji odniesienia dla sekwencji DNA dnaN, gyrB, recF, recN i 30 rpoA ze szczepów Paenibacillus. Szczep Gen SEQ ID NO Lu16774 dnaN 4 Lu17007 dnaN 5 Lu17015 dnaN 6 Lu16774 gyrB 7 Lu17007 gyrB 8 Lu17015 gyrB 9 Lu16774 recF 10 Lu17007 recF 11 Lu17015 recF 12 Lu16774 recN 13 Lu17007 recN 14 Lu17015 recN 15 Lu16774 rpoA 16 Lu17007 rpoA 17 48

Lu17015 rpoA 18

Przykład 2.5: Porównanie genomu rdzenia i macierz AAI [0294] Porównania genomu można przeprowadzić z użyciem pakietu oprogramowania EDGAR uniwersytetu Gießen (BMC Bioinformatics 10, 154, 2009; 5 (https://edgar.computational.bio.unigiessen.de/cgi-bin/edgar.cgi). Określenie genomu rdzenia, dendrogramów filogenetycznych na podstawie kompletnych sekwencji genomu i wartości macierzy AAI przeprowadzono z użyciem pakietu oprogramowania EDGAR. Wyniki przedstawiono na Fig. 22. Przykład 3: Wzrost (fermentowalność) szczepów dla testów in vivo 10 [0295] Dla prób w szklarniach i polach szczepy Paenibacillus hodowano najpierw na płyt- kach ISP2 (gotowy do użycia agar z BD [USA], numer katalogowy 277010). Następnie kolby do wytrząsania z przegrodami zawierające płynną pożywkę ISP2 zaszczepiono ko- lonią z płytki agarowej i inkubowano przez 5-7 dni przy 150 obr/min i 25°C. W zależności od badania albo cały bulion hodowlany, albo zwirowany i przemyty H2O osad komórek 15 lub supernatant nałożono na rośliny. Możliwa była fermentacja w skali do 10 l. [0296] Szczepy Paenibacillus hodowano w ciekłej pożywce ISP2 (ekstrakt słodowy 10 g/l, ekstrakt drożdży Bacto 4 g/l, monohydrat glukozy 4 g/l) przez 6 dni w 22°C przy 150 obr/min. OD600nm wskazanie wzrostu bakterii mierzono w różnych punktach czasowych.

20 Tabela 5: Wzrost bakterii ze szczepów Paenibacillus w ciekłej pożywce ISP2. OD przy 600 nm szczep Paenibacillus 0 d 3 d 6 d Lu17007 0,011 3,110 3,050 BD-62 0,013 0,442 0,446

Przykład 4 - Test in vitro konfrontacji aktywności przeciwgrzybiczej [0297] Działanie antagonistyczne szczepów Paenibacillus przeciwko patogenom roślin- nym przedstawiono w teście konfrontacji in-vitro. Wykorzystywane są fitopatogenne grzy- 25 by Sclerotina sclerotiorum (SCLSCL), Botrytis cinerea (BOTRCI), Alternaria sp. (AL- TESP) i Phytophthora infestans (PHYTIN). [0298] Jako pożywkę wzrostową dla BOTRCI, ALTESP, SCLSCL, stosuje się pożywkę ISP2 zawierającą na litr: 10 g ekstraktu słodowego (Sigma Aldrich, 70167); 4 g ekstraktu drożdżowego Bacto (Becton Dickinson, 212750); 4 g monohydratu glukozy (Sigma Ald- 30 rich, 16301); 20 g agaru (Becton Dickinson, 214510), pH około 7, woda podwójnie destylowana. Jako pożywkę wzrostową dla PHYTIN stosuje się pożywkę V8 zawierającą na litr: 200 ml soku warzywnego, 3 g węglanu wapnia (Merck Millipore, 1020660250); 30 g agaru (Becton Dickinson, 214510), pH 6,8, woda podwójnie destylowana. [0299] Szczepy Paenibacillus zaszczepiono punktowo po jednej stronie płytki agarowej. 35 Blok agarowy (ok. 0,3 cm2) zawierający jeden aktywnie rosnący patogen roślinny umieszczono na środku płytki. Po inkubacji przez 7-14 dni w 25°C zbadano wzrost patogenu ro- ślinnego, zwłaszcza w strefach hamowania. [0300] Następnie płytki agarowe inkubuje się w °C przez około 7-14 dni przed oceną. An- tybiozę ocenia się przez ocenę średnicy strefy wolnej od grzybów (strefa hamowania). 40 Współzawodnictwo ocenia się przez porównanie średnicy wzrostu patogenu grzybowego na płytkach ze szczepami bakteryjnymi w porównaniu z płytkami kontrolnymi. Mykopa- sożytnictwo można udokumentować w przypadku, gdy bakterie przerastają patogen grzybiczy, a także pasożytują na patogenach. Można to wizualizować z użyciem mikroskopii. [0301] Nowe szczepy Paenibacillus wykazywały aktywność przeciwgrzybiczą wobec 45 wszystkich testowanych patogenów roślinnych. 49 Tabela 6: Wyniki testu konfrontacji in-vitro. Średnica strefy zahamowania [mm] szczep Paenibacillus PHYTIN BOTRCI ALTESP SCLSCL Lu16774 8 2 2 2 Lu17007 8 8 5 2 Lu17015 8 5 5 2 BD-62 2 5 0 0

Przykład 5 - Badania szklarniowe pod kątem aktywności przeciwko grzybom pato- gennym roślin 5 Przykład zastosowania 5.1: Działanie przeciwko późnej zarazie na pomidorach powodowanej przez Phytophthora infestans z nanoszeniem ochronnym [0302] W opisanej próbie szklarniowej stosowano dostępne w handlu młode sadzonki po- midorów („Goldene Königin”). Stosowano 2 powtórzenia (doniczki z 1 rośliną) na zabieg. Rośliny hodowano w dostępnym w handlu substracie (Universal, Floragard) w około 22°C 10 w szklarni. Wilgotność kontrolowano z użyciem specjalnego urządzenia (∼90% wilgotno- ści). Rośliny opryskano do spłynięcia surowym/całkowitym bulionem hodowlanym z 6- dniowych hodowli odpowiedniego szczepu Paenibacillus (w zależności od ustawienia) z użyciem komory natrysku. Warunki hodowli dla szczepów opisano w Przykładzie 3. Jeden dzień po zastosowaniu traktowane rośliny zaszczepiono zawiesiną sporangiów Phy- 15 tophthora infestans (PHYTIN). Po zaszczepieniu, próbne rośliny natychmiast przeniesiono do wilgotnej komory. Zakres ataku grzybów na liście oceniano wizualnie 5-7 dni po zaszczepieniu. Atak grzybów w nietraktowanej próbce kontrolnej wynosił między 80-100% i ustalono na 100% dla porównania.

20 Tabela 7: szczep Paenibacillus PHYTIN (% ataku grzybów) Lu17007 4 Lu16774 20 BD-62 53

Przykład zastosowania 5.2: Działanie przeciwko szarej pleśni na pieprzu powodowanej przez Botrytis cinerea z nanoszeniem ochronnym [0303] W opisanej próbie szklarniowej stosowano dostępne w handlu młode sadzonki pie- 25 przu („Neusiedler Ideal”). Zastosowano 2 powtórzenia (doniczki z 1 rośliną) na zabieg. Rośliny hodowano w dostępnym w handlu substracie (Universal, Floragard) w około 22°C w szklarni. Wilgotność kontrolowano z użyciem specjalnego urządzenia (∼90% wilgotno- ści). Rośliny opryskano do spłynięcia surowym bulionem hodowlanym z 6-dniowych hodowli odpowiednich szczepów Paenibacillus (w zależności od ustawienia) z użyciem ko- 30 mory natrysku. Warunki hodowli dla szczepów opisano w Przykładzie 3. Jeden dzień po zastosowaniu traktowane rośliny zaszczepiono zawiesiną zarodników Botrytis cinerea (BOTRCI). Po zaszczepieniu, próbne rośliny natychmiast przeniesiono do wilgotnej komory. Zakres ataku grzybów na liście oceniano wizualnie 5-7 dni po zaszczepieniu. Atak grzybów w nietraktowanej próbce kontrolnej wynosił między 80-100% i ustalono na 100% 35 dla porównania.

50 Tabela 8: szczep Paenibacillus BOTRCI (% ataku grzybów) Lu17007 2 Lu16774 16 Lu17015 20 BD-62 97

Przykład zastosowania 5.3: Działanie przeciwko wczesnej zarazie na pomidorze powodowanej przez Alternaria solani z nanoszeniem ochronnym 5 [0304] W opisanej próbie szklarniowej stosowano dostępne w handlu młode sadzonki po- midorów („Goldene Königin”). Zastosowano 2 powtórzenia (doniczki z 1 rośliną) na zabieg. Rośliny hodowano w dostępnym w handlu substracie (Universal, Floragard) w około 22°C w szklarni. Wilgotność kontrolowano z użyciem specjalnego urządzenia (∼90% wil- gotności). Rośliny opryskano do spłynięcia surowym/całkowitym bulionem hodowlanym z 10 6-dniowych hodowli odpowiednich szczepów Paenibacillus (w zależności od ustawienia) z użyciem komory natrysku. Warunki hodowli dla szczepów opisano w Przykładzie 3. Je- den dzień po zastosowaniu traktowane rośliny zaszczepiono zawiesiną zarodników Alter- naria solani (ALTESO). Po zaszczepieniu, testowane rośliny natychmiast przeniesiono do wilgotnej komory. Zakres ataku grzybów na liście oceniano wizualnie 5-7 dni po zaszcze- 15 pieniu. Atak grzybów w nietraktowanej próbce kontrolnej wynosił między 80-100% i ustalono na 100% dla porównania.

Tabela 9: szczep Paenibacillus ALTESO (% ataku grzybów) Lu17007 3 Lu17015 16 BD-62 96

20 Przykład zastosowania 5.4: Działanie przeciwko zarazie sojowej na soi spowodowanej przez Phakopsora pachyrhizi z nanoszeniem ochronnym [0305] W opisanej próbie szklarniowej stosowano dostępne w handlu młode sadzonki soi („Mentor”). Zastosowano 2 powtórzenia (doniczki z 1 rośliną) na zabieg. Rośliny hodowano w dostępnym w handlu substracie (Universal, Floragard) w około 22°C w szklarni. 25 Wilgotność kontrolowano z użyciem specjalnego urządzenia (∼90% wilgotności). Rośliny opryskano do spłynięcia surowym bulionem hodowlanym z 2-6 dniowej hodowli Paeniba- cillus spp. (w zależności od konfiguracji) z użyciem komory natrysku. Jeden dzień po na- noszeniu traktowane rośliny zaszczepiono zawiesiną zarodników Phakopsora pachyrhizi (PHAKPA). Po zaszczepieniu, próbne rośliny natychmiast przeniesiono do wilgotnej ko- 30 mory. Zakres ataku grzybów na liście oceniano wizualnie 5-7 dni po zaszczepieniu. Przykład zastosowania 5.5: Działanie przeciwko chorobie powodowanej przez Fusa- rium (ang. Fusarium Head Blight) na pszenicy, powodowanej przez Fusarium graminearum, z nanoszeniem ochronnym [0306] W opisanej próbie szklarniowej stosowano dostępne w handlu młode siewki psze- 35 nicy. Zastosowano 2 powtórzenia (doniczki z 1 rośliną) na zabieg. Rośliny hodowano w dostępnym w handlu substracie (Universal, Floragard) w około 22°C w szklarni. Wilgot- ność kontrolowano z użyciem specjalnego urządzenia (-90% wilgotność). Rośliny opryskano do spłynięcia surowym bulionem hodowlanym z 2-6 dniowymi hodowlami Paeni- bacillus spp. (w zależności od konfiguracji) z użyciem komory natrysku. Warunki hodowli 51 opisano w Przykładzie 3. Jeden dzień po zastosowaniu traktowane rośliny zaszczepiono zawiesiną zarodników Fusarium graminearum (GIBBZE). Po zaszczepieniu, próbne rośli- ny natychmiast przeniesiono do wilgotnej komory. Zakres ataku grzybów na liście oceniano wizualnie 5-7 dni po zaszczepieniu. 5 Przykład zastosowania 5.6: Działanie przeciwko plamistości liści na pszenicy powodowanej przez Septoria tritici z nanoszeniem ochronnym [0307] W opisanej próbie szklarniowej stosowano dostępne w handlu młode siewki pszenicy. Stosowano 2 powtórzenia (doniczki z 1 rośliną) na zabieg. Rośliny hodowano w do- stępnym w handlu substracie (Universal, Floragard) w około 22°C w szklarni. Wilgotność 10 kontrolowano z użyciem specjalnego urządzenia (-90% wilgotność). Rośliny opryskano do spłynięcia surowym bulionem hodowlanym z 2-6 dniowej hodowli Paenibacillus spp. (w zależności od konfiguracji) z użyciem komory natrysku. Warunki hodowli opisano w Przykładzie 3. Jeden dzień po zastosowaniu traktowane rośliny zaszczepiono zawiesiną za- rodników Septoria tritici (SEPTTR). Po zaszczepieniu, próbne rośliny natychmiast prze- 15 niesiono do wilgotnej komory. Zakres ataku grzybów na liście oceniano wizualnie 21-28 dni po zaszczepieniu. Przykład zastosowania 5.7: Działanie komórek Paenibacillus i supernatantu przeciwko różnym patogenom z nanoszeniem ochronnym [0308] Całkowity bulion hodowlany z 6-dniowych kultur Paenibacillus szczep Lu17007 20 otrzymano zgodnie z Przykładem zastosowania 3 i zastosowano jak w układzie doświad- czalnym z Przykładów zastosowania 5.1 do 5.3. Alternatywnie, taki cały bulion hodowlany przesączono przez filtr o wielkości porów 0,2 µm, aby uzyskać pożywkę hodowlaną i su- rową frakcję komórkową. Surową frakcję komórkową można następnie przemyć trzy razy pierwotnymi objętościami soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, aby uzyskać prze- 25 myte komórki. [0309] Próby szklarniowe przeprowadzono zgodnie z opisem w Przykładach zastosowania 5.1, 5.2 i 5.3 powyżej dla odpowiednich patogenów Phytophthora infestans, Botrytis cinerea i Alternaria solani. Zakres ataku grzybów na liście oceniano wizualnie 5-7 dni po zaszczepieniu. Atak grzybów w nietraktowanej próbce kontrolnej wynosił między 80-100% 30 i został ustalony na 100% dla porównania.

Tabela 10: % ataku grzybów przez Składnik hodowli Paenibacillus BOTRCI ALTESO PHYTIN Całkowity bulion hodowlany 0 2 7 Pożywka hodowlana 3 40 3 Surowa frakcja komórkowa 0 5 4 Przemyte komórki 1 10 1

Przykład 6 - Badania enzymatyczne 35 Przykład zastosowania 6.1: Chitynaza Oznaczenie chitynazy w stałej pożywce: [0310] 2 g/l NaNO3, 1g/l K2HPO4, 0,5 g/l MgSO4, 0,5 g/l KCl, 0.2 g/l peptonu, 15 g/l agaru, 10 g/l chityny z muszli kraba (Sigma-Aldrich C7170). [0311] Badaną stałą pożywkę autoklawuje się i napełnia nim 9 cm szalki Petriego. Szczepy 40 Paenibacillus zaszczepia się po środku płytek i inkubuje się przez dwa dni w 27°C. Na- stępnie szalki barwi się rozcieńczonym 1:3 roztworem Lugola (Carl Roth N052.2) przez 5 do 10 min. Roztwór Lugola wylewa się, a szalki fotografuje się i ocenia. Wzrost różnych szczepów wynosił nie więcej niż 5-10 mm. Niezabarwione strefy (korelujące z aktywno- 52 ścią chitynazy) wahały się od 0 mm (brak aktywności; „-” w Tabeli 11) do kilku cm („+” w Tabeli 11). Przykład zastosowania 6.2: Celulaza Oznaczenie celulazy w stałej pożywce: 5 [0312] 2 g/l NaNO3, 1g/l K2HPO4, 0.5 g/l MgSO4, 0.5 g/l KCl, 0.2 g/l peptonu, 15 g/l agaru, karboksymetylocelulozy, soli sodowej (Sigma-Aldrich 419273). [0313] Autoklawowaną pożywkę wylewa się na 9 cm szalki Petriego. Szczepy Paenibacil- lus zaszczepia się po środku szalek i inkubuje się przez dwa dni w 27°C. Po inkubacji szalki barwi się rozcieńczonym 1:3 roztworem Lugola (Carl Roth N052.2) przez 5 do 10 10 min. Roztwór Lugola wylewa się, a szalki fotografuje się. Przykład zastosowania 6.3: Amylaza Oznaczenie amylazy w stałej pożywce: [0314] 2 g/l NaNO3, 1g/l K2HPO4, 0.5 g/l MgSO4, 0.5 g/l KCl, 0.2 g/l peptonu, 15 g/l agaru, 10 g/l rozpuszczalnej skrobi (Merck 1.01252). 15 [0315] Autoklawowaną pożywkę wylewa się na 9 cm szalki Petriego. Szczepy Paenibacil- lus zaszczepia się po środku szalek i inkubuje się przez dwa dni w 27 °C. Po inkubacji szalki barwi się rozcieńczonym 1:3 roztworem Lugola (Carl Roth N052.2) przez 5 do 10 min. Roztwór Lugola wylewa się, a szalki fotografuje się.

20 Tabela 11: Aktywność chitynazy, celulazy i amylazy szczepów Paenibacillus. Szczep Chitynaza Celulaza Amylaza Lu16774 + + - Lu17007 ++ + + Lu17015 + + + BD-62 - - - -, brak aktywności; (+), mała aktywność; +, zwykła aktywność; ++, duża aktywność.

Przykład 7 - Metabolity typu fuzarycydyny otrzymane ze szczepów Paenibacillus Przykład 7.1: Hodowla izolatów bakteryjnych na dużą skalę i ekstrakcja metabolitów typu fuzarycydyny 25 a) Hodowla [0316] Szczepy Paenibacillus hodowano na płytkach agarowych zawierających pożywkę GYM (10 g/l glukozy, 4 g/l ekstraktu drożdżowego, 10 g/l ekstraktu słodowego; pH 5,5, dostosowane przed autoklawowaniem) i 20 g/l agaru. Hodowlę prowadzono przez 10 do 20 dni w temperaturze pokojowej. Do podtrzymywania agaru stosowano skosy z tą samą 30 pożywką i przechowywano w 4°C. [0317] Ciekłe hodowle na małą skalę (250 ml pożywki GYM w 500 ml kolbach) zaszczepiono 4-5 kawałkami dobrze rosnącej hodowli agarowej i hodowano w wytrząsarce orbi- talnej przy 120 obr/min w temperaturze pokojowej (20-23°C). [0318] Fermentacje na dużą skalę przeprowadzono w 20 l fermentorach z 15 l pożywką 35 GYM (nie użyto całkowitej pojemności fermentatorów z powodu tworzenia piany) za- szczepionej 250 ml dobrze hodowanej ciekłej hodowli i fermentację prowadzono w temperaturze pokojowej (20-23°C) z mieszaniem (120 obr/min) i napowietrzaniem (3 l/min) przez 5 do 8 dni. b) Prowadzenie ekstrakcji 40 [0319] Jedną równą objętość izopropanolu dodano do całego bulionu hodowlanego (nie przeprowadzono rozdziału biomasy od hodowli ciekłej). Po mieszaniu i inkubacji przez 2 do 16 godzin do mieszaniny dodano zwykłą sól kuchenną (chlorek sodu - 100 do 200 g/l), aż do widocznego rozdzielenia faz fazy organicznej i wodnej. 53 [0320] Fazę izopropanolową zatężono pod próżnią. Powstały ekstrakt, nadal zawierający dużą ilość soli, rozpuszczono w metanolu, odwirowano w celu lepszego wytrącenia pozo- stałości soli i fazę organiczną ponownie zatężono. Ten etap powtarzano, do momentu gdy nie pojawił się już osad soli. 5 c) Oczyszczanie i) Chromatografia na żelu krzemionkowym [0321] 30 gramów ekstraktu rozpuszczono w metanolu i związano z 50 g żelu krzemion- kowego (Merck, K60, mesh 70-230), wysuszono w 40°C i nałożono na 1 kg żelu krze- mionkowego (średnica kolumny 10 cm, wysokość około 30 cm). 10 [0322] Elucję przeprowadzono w czterech etapach w następujący sposób: Etap 1-4 l octanu etylu Etap 2-4 l octan etylu: metanol (3:1, obj./obj.) Etap 3-7 l octan etylu: metanol (1:1, obj./obj.) Etap 4- 4 l metanolu 15 [0323] Trzecią frakcję (związek pośredni 1), zawierającą związki czynne, wysuszono pod próżnią i rozpuszczono w 40% metanolu (MeOH) w 0,1% kwasie mrówkowym (FA) (stę- żenie: 100 mg/ml). Pozostałe frakcje odrzucono. ii) Frakcjonowanie z użyciem Chromabond HR-X [0324] 20 ml związku pośredniego 1 wprowadzono na uprzednio zrównoważony (z 40% 20 MeOH w 0,1% FA) wkład Chromabond HR-X (Macherey-Nagel, 1000 mg, ref. 730941). Wkład przemyto 100 ml 40% MeOH w 0,1% FA i eluowano 60 ml 70% MeOH w 0,1% FA. Ten związek pośredni 1-1 następnie wysuszono pod próżnią. iii) Preparatywna HPLC na kolumnie Sunfire C18 [0325] Związek pośredni 1-1 rozpuszczono w DMSO (stężenie: 200 mg/ml) i 300 µl 25 związku pośredniego 1-1 poddano chromatografii na kolumnie Sunfire C18 (19 x 250 mm, 5 µm, Waters) w następujący sposób: 16 min przy 10 ml/min, izokratyczny 70% 0,2 FA; 30% acetonitryl (ACN), 1 min przy 14 ml/min, gradient do 65% 0,2% FA; 35% ACN, 5 min przy 14 ml/min, izokratyczny 65% 0,2% FA; 35% ACN. 30 [0326] Możliwe było wykrycie pięciu frakcji. Wszystkie pięć otrzymanych frakcji wysuszono pod próżnią i rozpuszczono w DMSO (stężenie: 125 mg/ml). Dalsze oczyszczanie przeprowadzono stosując tę samą kolumnę i warunki izokratyczne (przepływ: 10,5 ml/min) dostosowane dla każdej frakcji (12,5 mg na cykl): Frakcja 1: 69% 0,2 FA; 31% ACN; wykryto dwa piki (1-1 i 1-2) 35 Frakcja 2: 69% 0,2 FA; 31% ACN; wykryto dwa piki (2-1 i 2-2) Frakcja 3: 69% 0,2 FA; 31% ACN; wykryto trzy piki (3-1, 3-2 i 3-3) Frakcja 4/5: 67% 0,2 FA; 33% ACN; wykryto jeden pik (4/5) Frakcja 6: 65% 0,2 FA; 35% ACN; wykryto dwa piki (6-1 i 6-2) [0327] Czystość i ilość następujących próbek była wystarczająca do analizy NMR i wyja- 40 śnienia struktury: piki 1-2, 2-1, 3-2, 4/5 i 6-1. Przykład 7.2: Wyjaśnienie struktury nowych związków 1A i 1B [0328] Z piku 2-1 frakcji 2, otrzymano mieszaninę związków 1A i 1B (stosunek około 3: 25 7) jako brązowy olej ([α]D = +20,9 (c = 0,6, DMSO-d6)). [0329] Wzór cząsteczkowy C47H78N10O12 głównego składnika, związku 1B, wywniosko- 45 wano z widma HR-ESI-MS, które dało pik przy m/z 975,5863 [M+H]+; ESI-MS: 975,6 (100%, [M+H]+), 488,4 (51%, [M+2H]2+). [0330] Poza tym mieszanina zawierała również jako składnik drugorzędny, lżejszy homo- log 1A, a różnica masy między obydwoma związkami wynosiła 14 amu. Obserwacja ta by- ła wspierana przez drugi pik obserwowany w widmie ESI-MS przy m/z 961,6. 50 [0331] Widma NMR (Tabela 12) obejmowały oprócz sygnałów wymiennych protonów między δ 6,83 a 8,58, rezonanse karbonylu w zakresie δ 166,0-174,5 i sygnały metynowe między δ 47,8 a δ 60,4 wskazujące na peptyd. 54 [0332] Kompleksowa analiza danych 1D i 2D-NMR związku 1B ujawniła obecność sze- ściu aminokwasów, w tym tyrozyny (Tyr), glutaminy (Gln), alaniny (Ala), dwóch treonin (Thr1 i Thr2) i izoleucyny (Ile). Ich sekwencja została znaleziona z użyciem dwóch lub trzech korelacji wiązań między amidowymi grupami funkcyjnymi. Zatem, widma COSY, 5 NOESY (Fig. 2) i HMBC (Fig. 3) przedstawiały korelacje z protonu-azotu Thr2 przy δ 8,58 z sygnałem protonu metinowego Thr2 przy δ 3,84 i karbonylu przy δ 166,7 z Tyr, podczas to samo powiązanie odnotowano między protonem-azotu z Tyr przy 8,52 a sygna- łem protonu metylenowego w Tyr przy δ 2,60 i karbonylem przy δ 170,4 z Ile. Ponadto, wodór metinowy z Ile przy δ 4,16 miał silną korelację z sygnałem karbonylowym z Ile 10 przy δ 170,4 i słabym kontaktem z sygnałem z Thr1 przy δ 168,6; sygnał protonu β-metiny przy δ 5,30 z Thr1 korelował z sygnałem karbonylowym przy δ 170,4 z Ala. Oprócz wyżej wymienionych korelacji, inne były wykazywane z N-protonu przy δ 7,27 z Ala dola protonu metinowego przy δ 4,20 z tego samego aminokwasu, podczas gdy ten drugi proton miał takie samo oddziaływanie z karbonylem jego grupy aminowej i z Gln. Poza tym ujawniono 15 krzyżowy pik z wymiennego protonu przy δ 8,20 z Gln do wodoru metinowego przy δ 3,87 z Gln i karbonylu z Thr2 przy δ 170,6; wyżej wymienione dane sugerowały strukturę cyklodepsypeptydową dla związku 1B. [0333] Ten cyklodepsypeptyd 1B zawierał końcowy guanidyno kwas β-hydroksy tłusz- czowy przyłączony do Thr1, ponieważ zaobserwowano kluczową korelację między sygna- 20 łem jego protonu α-metiny przy δ 4,39 a rezonansem karbonylu przy δ 171,9; dalej obser- wowano, kontaktowanie się HMBC od tego karbonylu przy δ 171,9 z protonami α- metylenowymi przy δ 2,35 i protonem β-metyinowym przy δ 3,77 jak również między protonami metylenowymi przy δ 3,03 a węglem guanidyny przy δ 157,2. Na podstawie frag- mentu jonu obserwowanego w widmie APCI-MS-MS macierzystego jonu [M + H]+ przy 25 m/z 256,2 wywnioskowano, że łańcuch boczny zawiera dwanaście grup metylenowych między grupą β-hydroksylową a grupą guanidynową. Podobnie widmo to dostarczyło informacji (Fig. 4b), które potwierdziły sekwencję połączeń aminokwasów i doprowadziły do wyjaśnienia struktury związku 1B jak pokazano na Fig. 1. [0334] Sygnały grupy CH2 przy 2,80, 2,52/36,3 w widmach 1D i 2D odpowiadały przy- 30 puszczalnie grupie β-CH2 asparaginy (Asn) w związku 1A. Wniosek ten potwierdzają opisane dane (Heterocycles 53, 1533-1549, 2000) w połączeniu z fragmentami uzyskanymi z macierzystego piku MS/MS przy m/z 961,6 (Fig. 4a). Podobnie te ostatnie analizy dostar- czyły informacji (Fig. 4a, 4b), które potwierdziły sekwencję połączeń aminokwasów w obu związkach i doprowadziły do wyjaśnienia struktury związków 1A i 1B jak pokazano na 35 Fig. 1. Przykład 7.3: Identyfikacja strukturalna związków 2A i 2B jako fuzarycydyn C i D [0335] Z piku 1-2 frakcji 1, otrzymano mieszaninę związków 2A i 2B (w stosunku około 1:1) w postaci brązowego oleju. Wzór cząsteczkowy cięższego składnika, związku 2B, zo- stał określony jako C46H76N10O12 na podstawie spektrometrii masowej o niskiej rozdziel- 40 czości. Analiza danych NMR (Tabela 13) pozwoliła zidentyfikować związek 2B jako fuza- rycydynę D. Lżejszy składnik mieszaniny, związek 2A, podobnie został identyfikowany jako fuzarycydyna C, w, której reszta Gln fuzarycydyny C jest zastąpiona przez Asn. [0336] Wzór fragmentacji w spektrometrii masowej jonów macierzystych m/z 961,6 i 947,6 odpowiednio dla związków 2B i 2A (Fig. 5a, 5b) potwierdził, że długość podstawio- 45 nego łańcucha bocznego kwasu tłuszczowego jest identyczna jak w związku 1B. Fuzary- cydyny C i D były wcześniej opisywane przez Kajimura i in. (J. Antibiot. 50, 220-228, 1997). Przykład 7.4: Identyfikacja strukturalna związku 3 jako LI-F08b [0337] Z piku 6-1 frakcji 6, wyizolowano związek 3 w postaci brązowego oleju a jego ni- 50 ska rozdzielczość przedstawiała pik przy m/z 925,6 [M + H]+ co w połączeniu z danymi NMR (Tabela 14) doprowadziło do wzoru cząsteczkowego C44H80N10O11. Związek 3 wy- kazywał podobne cechy w widmach NMR jak związek 1B i związek 2B (fuzarycydyna D) 55 z wyjątkiem obecności sygnałów aromatycznych (Tabela 14). Zaobserwowano zatem cha- rakterystyczne rezonanse peptydu, a mianowicie dziesięć sygnałów protonów przyłączo- nych do azotu między δ 6,89 a 8,49, osiem rezonansów karbonylu mieściło się w zakresie od δ 168,1 do 174,3 oraz sześć sygnałów N-metaminy zawarte między δ 48,0 a 59,5. 5 Szczegółowa analiza widm HMQC, COSY i TOCSY wykazała obecność sześciu amino- kwasów, w tym Gln, dwóch jednostek Thr, dwóch jednostek Ile i Ala. Ponadto widma te wykazały przesunięcia chemiczne związane z tym samym β-hydroksylowym kwasem tłuszczowym z końcową guanidyną jak w związkach 1A, 1B i fuzarycydynach C (2A) i D (2B). Pozycja tego łańcucha bocznego została określona na podstawie korelacji dalekiego 10 zasięgu w widmie HMBC między sygnałem protonowym N-metiny przy δ 4,44 z Thr1 i sygnał karbonylowy przy δ 172,1 z kwasu tłuszczowego. Sekwencja aminokwasowa zosta- ła wywnioskowana na podstawie oddziaływań NOESY i wzoru fragmentacji (Fig. 6). [0338] Połączenie danych NMR (Tabela 14) i spektrometrii mas doprowadziło do zidenty- fikowania metabolitu związku 3 jako LI-F08b, zwanego tu również fuzarycydyną LI-F08b, 15 opisaną po raz pierwszy przez Kuroda i in. (Heterocycles 53, 1533-1549, 2000). Przykład 7.5: Identyfikacja strukturalna związków 4A i 4B jako LI-F06a i LI-F06b oraz związków 5A i 5B odpowiednio jako fuzarycydyn A i B [0339] Z piku 4/5 frakcji 4/5, otrzymano mieszaninę dwóch dalszych metabolitów, związ- ków 4A i 4B (w stosunku około 1: 3), która dała dwa piki przy m/z 897,5 (4A) i 911,6 (4B) 20 w [0340] widmie ESI-MS, sugerujące dwa kolejne homologiczne cyklodepsypeptydy. Rezo- nanse wskazujące na peptydy zaobserwowano w ich widmach NMR (Tabela 15), jak rów- nież w widmach β-hydroksylowych kwasów tłuszczowych kończących się grupą guanidy- nową. Wzory fragmentacji obu jonów macierzystych znaleziono dla związków 4A i 4B 25 (Fig. 7a, 7b) pozwoliły określić sekwencję aminokwasów i zidentyfikować składniki mieszaniny odpowiednio jako LI-F06a (4A) i LI-F06b (4B). [0341] Otrzymaną z piku 3-2 frakcji 3, mieszaninę związków 5A i 5B (w stosunku około 1:3) analizowano w ten sam sposób. Widmo masowe ESI mieszaniny wykazało dwa piki przy m/z 883,6 (5A) i 897,5 (5B) i wzory fragmentacji tych jonów macierzystych (Fig. 8a, 30 8b) w połączeniu z danymi NMR (Tabela 16) pozwoliły zidentyfikować składniki jako fu- zarycydynę A (5A) i fuzarycydynę B (5B). Znaleziono dane dla 4A, 4B, 5A i 5B pasowały do wcześniej opisanych. (J. Antibiot. 50, 220-228, 1997; Heterocycles 53, 1533-1549, 2000).

1 13 35 Tabela 12. Dane H (DMSO-d6, 600 MHz) i C-NMR (DMSO-d6, 150 MHz) dla związ- ków 1A i 1B. Związki 1 Związek 1A Związek 1B

*Poz. δH δC Poz. δH δC Thr1 Thr1 NH 7,79 (br) - NH 8,18 (br s) - 1 - 168,6 1 - 168,6 2 4,46 (br d, 8,5) 56,4 2 4,39 (br d, 8,7) 56,9 3 5,30 (nakładające się) 70,2 3 5,30 (m) 70,2 4 1,13 (nakładające się) 16,6 4 1,13 (d, 6,4) 16,7 Ala Ala NH 7,22 (br) - NH 7,27 (br s) - 56

1 - nf* 1 - 170,4 2 4,13 (nakładające się) 47,7 2 4,20 (m) 47,8 3 1,11 (nakładające się) 17,8 3 1,17 (d, 7,1) 17,8 Asn Gln NH 8,33 (nakładające się) - NH 8,20 (br s) - 1 - 169,7 1 - 170,4 2 4,20 (1H, m) 50,6 2 3,87 (m) 53,2 3 2,52 (m), 2,80 (dd, 5,9, 15,1) 36,3 3 1,96 (m), 2,08 (m) 26,2 4 - 172,5 4 2,08 (m), 2,18 (m) 32,0 5 - - - - 174,3

NH2 6,99 (br s), 7,42 (br s) - NH2 6,83 (br s), 7,26(br - s) Związki 1 Związek 1A Związek 1B

*Poz. δH δC Poz. δH δC Thr2 Thr2 NH 8,50 (nakładające się) - NH 8,58 (br s) - 1 - 170,6 1 - 170,6 2 3,94 (m) 59,9 2 3,84 (m) 60,5 3 3,94 (m) 65,5 3 3,85 (m) 65,8 4 1,05 (br) 20,3 4 1,08 (nakładające 20,0 się) Tyr Tyr NH 8,48 (nakładające się) - NH 8,52 (br s) - 1 - nf 1 - 166,7 2 4,60 (m) 54,2 2 4,51 (m) 54,5 3 2,60 (nakładające się) 36,8 3 2,60 (m), 2,88 (m) 36,9 2,88 (nakładające się) 4 - 127,7 4 - 127,8 5 i 9 7,07 (d, 8,7) 130,2 5 i 9 7,06 (d, 8,5) 130,2 6 i 8 6,60 (nakładające się) 114,7 6 i 8 6,60 (d, 8,5) 114,7 7 - 155,9 7 - 155,9 Ile Ile NH 7,28 (br s) - NH 7,42 (br s) - 1 - nf 1 - 170,4 2 4,16 (nakładające się) 56,5 2 4,16 (br d, 8,5) 56,5 57

3 1,34 (nakładające się) 37,2 3 1,34 (m) 37,2 4 1,34 (nakładające się) 25,4 4 1,22 (m), 1,34 (m) 25,4 5 0,52 (nakładające się) 14,4 5 0,53 (nakładające 14,4 się) 6 0,59 (nakładające się) 11,4 6 0,61 (nakładające 11,4 się) *FA FA 1 - 171,9 1 - 171,9 2 2,35 (nakładające się) 43,1 2 2,35 (m) 43,3 3 3,77 (nakładające się) 67,5 3 3,77 (m) 67,5 4 1,34 (nakładające się) 36,8 4 1,34 (m) 36,9 5-12 1,19-1,30 (br s) 29,0- 5-12 1,19-1,30 (br s) 29,0- 29,2 29,2 13 1,25 (br s) 21,2 13 1,25 (br s) 21,2 14 1,43 (nakładające się) 28,7 14 1,43 (m) 28,5 15 3,03 (nakładające się) 40,6 15 3,03 (q, 6,6) 40,6 *Gu Gu NH nf - NH 8,40 (br s) - 16 - 157,2 16 - 157,2 * Poz. = pozycja; FA = kwas tłuszczowy; Gu = guanidyna; nf = nie znaleziono. Legenda dotyczy również tabel od 13 do 16. 1 13 Tabela 13. Dane dla H (DMSO-d6, 600 MHz) i C-NMR (DMSO-d6, 150 MHz) data of związków 2A i 2B. Związki 2 = fuzarycydyny C i D Związek 2A = fuzarycydyna C Związek 2B = fuzarycydyna D

Poz. δH δC Poz. δH δC Thr1 Thr1 NH 7,66 (d, 7,1) - NH 8,17 (br s) - 1 - 168,5 1 - 168,6 2 4,44 (br d, 8,9) 56,6 2 4,40 (br d, 8,9) 57,0 3 5,31 (m) 70,2 3 5,30 (m) 70,3 4 1,13 (nakładające się) 16,5 4 1,14 (nakładające się) 16,7 Ala Ala NH 7,21 (br) - NH 7,60 (br s) 1 - nf 1 - 170,6 2 4,12 (m) 47,7 2 4,19 (m) 47,8 3 1,12 (nakładające się) 17,8 3 1,17 (d, 7,2) 17,7 58

Asn Gln NH 8,26 (br) - NH 8,08 (br s) - 1 - 169,7 1 - 170,4 2 4,21 (m) 50,5 2 3,86 (m) 53,2 3 2,53 (nakładające się), 2,80 36,3 3 1,98 (m), 2,09 (m) 26,1 (dd, 6,3, 15,0) 4 - 172,6 4 2,10 (m), 2,18 (m) 31,9 5 - - 5 - 174,3

NH2 nf - NH2 6,84 (br s), - 7,28 (br s) Thr2 Thr2 NH 8,52 (nakładające się) - NH 8,47 (nakładające się) - 1 - 170,3 1 - 170,6 2 3,85 (m) 60,5 2 3,94 (m) 59,9 3 3,86 (m) 65,8 3 3,92 (m) 65,7 4 1,09 (d, 5,7) 19,9 4 1,05 (d, 5,8) 20,2 OH-3 4,96 (br d, 4,2) - OH-3 5,05 (d, 2,9) - Tyr Tyr NH 8,46 (nakładające się) - NH 8,52 (nakładające się) - 1 - nf 1 - 172,3 2 4,60 (m) 54,2 2 4,52 (m) 54,6 3 2,63 (nakładające się) 36,9 3 2,63 (m), 2,87 (m) 36,9 2,87 (nakładające się) 4 - 127,7 4 - 127,7 5 i 9 7,08 (nakładające się) 130,2 5 i 9 7,06 (d, 8,4) 130,2 6 i 8 6,60 (nakładające się) 114,7 6 i 8 6,60 (d, 8,4) 114,7 Związki 2 = fuzarycydyny C i D Związek 2A = fuzarycydyna C Związek 2B = fuzarycydyna D

Poz. δH δC Poz. δH δC 7 - 155,8 7 - 155,8 OH nf - OH 9,13 (br s) - Val Val NH 7,30 (nakładające się) - NH 7,42 (br s) - 1 - nf 1 - 170,3 2 4,12 (br s) 57,5 2 4,12 (br s) 57,5 3 1,59 (m) 30,9 3 1,59 (m) 31,0 59

4 0,56 (d, 6,4) 18,2 4 0,57 (d, 6,3) 18,3 5 0,35 (d, 6,5) 18,7 5 0,40 (d, 6,6) 18,7 FA FA 1 - nf 1 - 172,0 2 2,37 (nakładające się) 43,1 2 2,37 (m) 43,3 3 3,79 (nakładające się) 67,5 3 3,79 (m) 67,6 4 1,35 (nakładające się) 36,9 4 1,35 (m) 36,9 5 1,22 (nakładające się) 25,3 5 1,22 (br s) 25,3 6-12 1,20-1,27 (br s) 29,1- 6-12 1,20-1,27 (br s) 29,1- 29,2 29,2 13 1,26 (br s) 26,1 13 1,26 (br s) 26,1 14 1,44 (nakładające się) 28,5 14 1,44 (m) 28,7 15 3,07 (nakładające się) 40,7 15 3,07 (q, 6,7) 40,7 Gu Gu NH nf - NH 7,60 (br s) - 16 - 156,8 16 - 156,8 1 13 Tabela 14. Dane H (DMSO-d6, 600 MHz) i C-NMR (DMSO-d6, 150 MHz) dla związku 3 będącego LI-F08b. Związek 3 = LI-F08b

Pos. δH δC Thr1 NH 7,55 (br s) - 1 - 168,1 2 4,44 (br d, 8,4) 56,6 3 5,33 (m) 70,2 4 1,15 (d, 6,5) 16,7 Ala NH 7,53 (br s) - 1 - 170,6 2 4,05 (m) 48,0 3 1,22 (br s) 17,2 Związek 3 = LI-F08b

Poz. δH δC Gln NH 7,93 (br s) - 1 - 170,5 60

2 3,94 (m) 52,7 3 1,98 (m), 2,09 (m) 26,5 4 2,12 (m), 2,20 (m) 31,9 5 - 174,3

NH2 6,89 (br s), 7,32 (br s) - Thr2 NH 8,48 (br s) - 1 - 170,7 2 4,03 (m) 59,5 3 3,98 (m) 65,7 4 1,08 (d, 6,1) 19,8 Ile1 NH 8,49 (br s) - 1 - 172,5 2 4,15 (t, 7,6) 57,3 3 1,81 (m) 35,4 4 1,17 (m), 1,41 (m) 24,4 5 0,80 (t, 6,3) 10,6 6 0,81 (d, 7,2) 15,5 Ile2 NH 7,30 (br s) - 1 - 171,3 2 4,53 (m) 55,3 3 1,65 (m) 38,2 4 1,01 (m), 1,37 (m) 25,5 5 0,83 (t, 6,4) 11,4 6 0,70 (d, 7,4) 14,2 FA 1 - 172,1 2 2,37 (d, 5,7) 43,4 3 3,77 (m) 67,6 4 1,37 (m) 36,9 5-12 1,20-1,28 (br s) 29,0-29,2 13 1,25 (br s) 26,2 14 1,43 (m) 28,7 61

15 3,03 (q, 6,7) 40,6 Związek 3 = LI-F08b

Poz. δH δC Gu NH 8,37 (br s) - 16 - 157,2 1 13 Tabela 15. Dane H (DMSO-d6, 600 MHz) i C-NMR (DMSO-d6, 150 MHz) dla związ- ków 4A i 4B. Związki 4 = LI-F06a i LI-F06b Związek 4A = LI-F06a Związek 4B = LI-F06b

Poz. δH δC Poz. δH δC Thr1 Thr1 NH 8,31 (br) - NH 7,59 (br s) - 1 - 168,5 1 - 168,4 2 4,40 (m) 56,9 2 4,44 (m) 56,7 3 5,30 (m) 70,5 3 5,32 (m) 70,3 4 1,14 (m) 16,6 4 1,15 (m) 16,6 Ala Ala NH nf - NH 7,53 (br s) 1 - 170,6 1 - 170,7 2 3,97 (m) 47,9 2 4,07 (m) 48,0 3 1,15 (nakładające się) 17,3 3 1,21 (d, 7,3) 17,4 Asn Gln NH 8,06 (br) - NH 7,96 (br s) - 1 - 169,8 1 - 170,7 2 4,28 (m) 50,5 2 3,93 (m) 52,9 3 2,55 (m), 36,9 3 1,97 (m), 2,10 26,5 (m) 2,75 (dd, 6,7, 15,1) 4 - 172,6 4 2,12 (m), 2,21 32,0 (m) 5 - - 5 - 174,4

NH2 nf - NH2 6,88 (br s), - 7,33 (br s) Thr2 Thr2 NH 8,54 (br) NH 8,48 (br) - 1 - 170,4 1 - 170,6 62

2 3,91 (m) 60,5 2 4,02 (m) 59,7 3 3,92 (m) 65,6 3 3,99 (m) 65,7 4 1,09 (d, 6,4) 19,6 4 1,08 (d, 6,4) 19,8 Val Val NH 7,28 (m) - NH 7,39 (m) - 1 - nf 1 - 171,0 2 4,40 (nakładające się) 57,3 2 4,39 (m) 57,0 3 1,83 (nakładające się) 32,0 3 1,83 (m) 31,6 4 0,75 (d, 6,6) 18,1 4 0,74 (d, 6,6) 18,4 5 0,84 (nakładające się) 19,3 5 0,80 (nakładające 19,2 się) Ile Ile NH 7,31 (nakładające się) - NH 7,23 (nakładające - się) 1 - nf 1 - 171,2 2 4,51 (nakładające się) 55,5 2 4,51 (1H, m) 55,6 3 1,65 (nakładające się) 38,1 3 1,65 (m) 38,1 4 1,02 (m), 1,36 (m) 25,4 4 1,02 (m), 1,36 25,5 (m) 5 0,82 (nakładające się) 15,6 5 0,82 (nakładające 15,6 się) 6 0,72 (nakładające się) 14,4 6 0,71 (nakładające 14,3 się) FA FA 1 - 172,1 1 - 172,2 2 2,44 (dd) 43,1 2 2,37 (m) 43,4 3 3,81 (m) 67,7 3 3,78 (m) 67,7 4 1,37 (nakładające się) 36,9 4 1,37 (m) 36,9 5-12 1,22-1,24 (br s) 29,1-29,2 5 1,22-1,24 (br 29,1-29,2 s) 13 1,25 (br s) 26,4 13 1,25 (br s) 26,2 14 1,43 (m) 28,5 14 1,43 (m) 28,5 15 3,03 (q, 6,7) 40,7 15 3,03 (q, 6,7) 40,7 Gu Gu NH nf - NH 8,34 (br s) - 16 - 157,2 16 - 157,2

1 13 Tabela 16. Dane H (DMSO-d6, 600 MHz) i C-NMR (DMSO-d6, 150 MHz) dla związ- ków 5A i 5B. Związki 5 = fuzarycydyny A i B, LI-F04a i LI-F04b Związek 5A = fuzarycydyna A Związek 5B = fuzarycydyna B

Poz. δH δC Poz. δH δC Thr1 Thr1 NH 7,66 (br) - NH 8,30 (d, 8,0) - 1 - 168,5 1 - 168,4 2 4,46 (m) 56,6 2 4,40 (br d, 8,5) 57,0 3 5,32 (m) 70,4 3 5,31 (m) 70,3 4 1,16 (nakładające 16,3 4 1,15 (d, 5,7) 16,6 się) Ala Ala NH 7,26 (br) - NH 7,53 (br s) - 1 - 170,6 1 - 170,6 2 4,00 (m) 47,8 2 4,10 (m) 47,9 3 1,15 (nakładające 17,4 3 1,20 (d, 7,2) 17,5 się) Asn Gln NH 8,10 (br) - NH 8,53 (d, 4,3) - 1 - 169,8 1 - 170,6 2 4,28 (q, 6,6) 50,5 2 3,92 (m) 52,9 3 2,53 (m), 2,76 (dd, 36,7 3 1,98 (m), 2,09 (m) 26,4 6,6, 15,0) 4 - 172,5 4 2,10 (m), 2,20 (m) 31,9 5 - - 5 - 174,3

NH2 nf - NH2 6,86 (br s), 7,30 (br s) - Thr2 Thr2 NH 8,54 (br s) - NH 8,46 (d, 6,9) - 1 - nf 1 - 170,5 2 3,91 (m) 60,4 2 4,02 (m) 59,7 3 3,91 (m) 65,6 3 3,99 (m) 65,5 4 1,09 (d, 5,6) 19,6 4 1,07 (d, 6,0) 19,9 Val Val NH nf - NH 7,29 (br s) - 1 - nf 1 - 171,2 2 4,40 (m) 57,1 2 4,40 (m) 57,1 64

3 1,82 (m) 31,4 3 1,82 (m) 31,5 4 nf nf 4 0,76 (d, 6,6) 18,4 5 0,82 (d, 6,0) 19,1 5 0,81 (d, 6,2) 19,1 Val Val NH 8,41 (br s) - NH 8,37 (d, 7,6) - 1 - 172,1 1 - 173,1 2 4,13 (m) 58,3 2 4,23 (m) 57,8 3 2,02 (m) 29,7 3 1,99 (m) 30,2 4 0,86 (d, 6,7) 18,2 4 0,86 (d, 6,7) 18,2 5 0,84 (7,0) 19,3 5 0,84 (7,0) 19,3 FA FA 1 - 172,1 1 - 172,0 2 2,37 (br d, 5,8) 43,4 2 2,34 (dd, 7,0, 13,5), 43,4 2,44 (dd, 4,9, 13,5) 3 3,80 (m) 67,6 3 3,80 (m) 67,6 4 1,37 (m) 36,9 4 1,37 (m) 36,8 5-12 1,22-1,25 (br s) 26,2-29,2 5-12 1,22-1,25 (br s) 26,2- 29,2 13 1,25 (br s) 26,2 13 1,25 (br s) 26,2 14 1,43 (m) 28,7 14 1,43 (m) 28,5 15 3,03 (q, 6,7) 40,6 15 3,03 (q, 6,7) 40,6 Gu Gu NH nf - NH 8,47 (br s) - 16 - 157,2 16 - 157,2

[0342] Nie przeprowadzono doświadczeń hydrolizy w celu określenia konfiguracji stano- wiących aminokwasów. Przykład 8 - Metabolity wytwarzane przez szczepy Paenibacillus 5 Przykład 8.1: Wytwarzanie metabolitów przez szczepy Paenibacillus [0343] Obecność fuzarycydyny ogólnie, a zwłaszcza znanych fuzarycydyn A, B, C, D, LI- F06a, LI-F06b i LI-F08b, jak również nowych związków typu fuzarycydyn, 1A i 1B zosta- ła określona dla szczepów Paenibacillus postępując zgodnie z etapami proceduralnymi opisanymi w przykładzie 7.1 powyżej. 10 Tabela 17: Wytwarzanie metabolitów typu fuzarycydyny przez szczepy Paenibacillus. Szczepy Związek/fuzarycydyna 1A 1B 2A 2B 3 4A 4B 5A 5B C D LI-F08b LI-F06a LI-F06b A B Lu16774 + ++ ++ ++ ++ - - ++ ++ 65

Lu17007 + ++ ++ ++ ++ + ++ ++ ++ Lu17015 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ BD-62 ------Legenda: -, związek niewykrywalny; +, związek wykrywalny; ++, związek wykrywalny w większych ilościach w porównaniu ze skalą +.

[0344] Całkowity bulion hodowlany wszystkich nowych szczepów Paenibacillus: Lu16774, Lu17007 i Lu17015 zawierał co najmniej jeden metabolit typu fuzarycydyny zidentyfikowany w Przykładzie 7 (Tabela 17). Żaden z tych metabolitów typu fuzarycydyny 5 nie został wykryty w całym bulionie hodowlanym z P. peoriae szczepu BD-62. [0345] Całkowity bulion hodowlany nowych szczepów Paenibacillus Lu16774, Lu17007 i Lu17015 wszystkie zawierały co najmniej jeden metabolit typu fuzarycydyny 1A i 1B. Po- nadto, Całkowity bulion hodowlany nowych szczepów Paenibacillus Lu16774, Lu17007 i Lu17015 wszystkie zawierały fuzarycydyny A, B, C i D jak również LI-F08b. Dodatkowo, 10 całkowity bulion hodowlany nowych szczepów Paenibacillus Lu17007 i Lu17015 zawie- rał fuzarycydyny LI-F06a i LI-F06b. [0346] Związki 1A i 1B nie zostały wykryte w całkowitym bulionie hodowlanym blisko spokrewnionego P. peoriae szczepu BD-62. Fuzarycydyny A, B, C i D, LI-F06a, LI-F06b i LI-F08b również nie znajdowały się w całkowitym bulionie hodowlanym z P. peoriae 15 szczepu BD-62. Przykład 9: Aktywność metabolitów szczepów Paenibacillus przeciwko różnym patogenom grzybowym [0347] Związki 1A i 1B, fuzarycydyna A, B i D, które otrzymano, zastosowano w następu- jących doświadczeniach. 20 [0348] Oznaczenia wzrostu grzybów przeprowadzono w 96-studzienkowych płytkach z zawiesiną zarodników patogenu Botrytis cinerea (BOTRCI, w YBA [10 g peptonu Bacto (Becton Dickinson 211677), 10 g ekstraktu drożdżowego (Becton Dickinson 212750), 20 g octanu sodu, z uzupełnieniem do 1000 ml wody dwukrotnie destylowanej] lub Alternaria solani (ALTESO, w YBG [10 g Bacto peptone (Becton Dickinson 211677), 10 g ekstraktu 25 drożdżowego (Becton Dickinson 212750), 20 g gliceryny 99%, z uzupełnieniem do 1000 ml wody dwukrotnie destylowanej]). Fuzarycydyny i związki 1A i 1B rozpuszczono i roz- cieńczono w DMSO. Różne stężenia w zakresie od 60 µM do tak niskiego jak 0,3 µM pi- petowano do płytki mikrotitracyjnej. Dodano wodną zawiesinę o 104 zarodnikach/ml. Płyt- ki inkubowano w około 18°C. Wzrost grzybów określono przez pomiar gęstości optycznej 30 przy 600 nm w czytniku mikropłytek 3 i 7 dni po zaszczepieniu zarodników i porównano z nietraktowaną kontrolą (DMSO). Po czym określono IC50 (stężenie [µM] odpowiedniego metabolitu wymaganego do 50% zahamowania wzrostu grzybów). [0349] W szczególności związki 1A i 1B wykazały największą skuteczność przeciwgrzy- biczą z IC50 wartości 0,4-0,6 µM (Tab. 18). 35 Tabela 18. Wartości IC50 hamowanie wzrostu przeciwgrzybiczego przez metabolity Pae- nibacillus Patogen (dzień oceny) Związek/Fuzarycydynę 1A 1B 2B 5A 5B Fus. D Fus. A Fus. B Hamowanie wzrostu grzybów (IC50 [µM]) ALTESO (3 d) 0,6 0,6 1,1 1,3 1,1 66

ALTESO (7 d) 0,5 0,4 0,6 0,7 0,6 BOTRCI (7 d) 0,3 0,4 0,5 0,5 0,6 „-” oznacza, że zahamowanie wzrostu w badanym zakresie stężeń nie wystarcza do okre- ślenia IC50.

[0350] Ponadto przeprowadzono próby w szklarni ze związkami 1A i 1B, jak opisano w Przykładach zastosowania 5.1 do 5.5 powyżej dla odpowiednich patogenów Botrytis cinerea (BOTRCI), Alternaria solani (ALTESO), Phytophthora infestans (PHYTIN), Phakop- 5 sora pachyrhizi (PHAKPA) i Fusarium graminearum (GIBBZE). Zakres ataku grzybów na liście oceniano wizualnie 5-7 dni po zaszczepieniu. [0351] Szczególnie związki 1A i 1B były skuteczne w zwalczaniu ważnych chorób grzybiczych na roślinach uprawnych już przy poziomach dawek tak niskich jak 7,2 ppm i wyka- zywały większą skuteczność przeciwgrzybiczą niż fuzarycydyna A, B i D (Tabele 19 do 10 21). Tabela 19. Określono skuteczność przeciwgrzybiczą metabolitów in planta. % skuteczności (% ataku grzybów) Badany metabolit Stęż. BOTRCI ALTESO PHYTIN PHAKPA GIBBZE Bez traktowania - 0 (100) 0 (100) 0 (100) 0 (100) 0 (100) Związek 1A 360 ppm 99 100 95 49 Związek 1A 36 ppm 97 74 Związek 1B 360 ppm 100 100 97 Związek 1B 36 ppm 97

Tabela 20. Skuteczność metabolitów przeciwko zarazie na pomidorach spowodowanej przez Phytophthora infestans z nanoszeniem ochronnym. Badany metabolit Stęż. % skuteczności (% ataku grzybów) Bez traktowania - 0 (100) Fuzarycydyna A 7,2 ppm 15 Fuzarycydyna B 7,2 ppm 4 Fuzarycydyna D 7,2 ppm 0 Związek 1B 7,2 ppm 44 15 Tabela 21. Skuteczność metabolitów przeciwko zarazie na pszenicy spowodowanej przez Fusarium graminearum z nanoszeniem ochronnym. Badany metabolit Stęż. % skuteczności (% ataku grzybów) Bez traktowania - 0 (100) Fuzarycydynę A 360 ppm 31 Fuzarycydynę B 360 ppm 0 Związek 1A 360 ppm 49

67 Tabela 22. Skuteczność metabolitów przeciwko zarazie na pszenicy spowodowanej przez Septoria tritici z aplikacją ochronną. Septoria tritici z nanoszeniem ochronnym. Badany metabolit Stęż. % skuteczności (% ataku grzybów) Bez traktowania - 0 (100) Fuzarycydyna D 360 ppm 50 Związek 1B 360 ppm 80

Przykład 10: Porównanie aktywności Paenibacillus polymyxa nov. ssp. plantarum 5 szczepów Lu16674 i Lu17007 według wynalazku z Paenibacillus polymyxa nov. ssp. plantarum M-1 przeciwko różnym patogenom w próbach w szklarniach [0352] Całkowity bulion hodowlany z 6-dniowych kultur szczepów Paenibacillus Lu17007, Lu16674 i M1 otrzymano zgodnie z Przykładem zastosowania 3 i zastosowano jak w doświadczalnym układzie z Przykładu zastosowania 5.1 do 5.5. Próby w szklarni 10 przeprowadzono zgodnie z opisem w Przykładach zastosowania 5.1 do 5.5 powyżej dla odpowiednich patogenów. Zakres ataku grzybów na liście oceniano wizualnie 5-7 dni po zaszczepieniu. [0353] W szczególności, szczepy Paenibacillus Lu16774 i Lu17007 były skuteczne w zwalczaniu ważnych chorób grzybowych na roślinach uprawnych nawet przy dużych 15 współczynnikach rozcieńczenia i wykazywały większą skuteczność przeciwgrzybiczą niż blisko spokrewniony szczep M-1 (Tabele 22 do 27). Tabela 22. Szczep Paeniba- Współczynnik rozcieńczenia całko- % skuteczności wobec cillus witego bulionu hodowlanego BOTRCI (% ataku grzybów) Bez traktowania 0 (100) Lu16674 1:10 95 M-1 1:10 86 Lu16674 1:50 76 Lu17007 1:50 98 M-1 1:50 51

Tabela 23. Szczep Paeniba- Współczynnik rozcieńczenia całko- % skuteczności wobec cillus witego bulionu hodowlanego BOTRCI (% ataku grzybów) Bez traktowania 0 (100) Lu17007 nierozcieńczony 92 M-1 nierozcieńczony 87 Lu17007 1:10 84 M-1 1:10 53 Lu17007 1:50 63 M-1 1:50 32

68 Tabela 24. Szczep Paeniba- Współczynnik rozcieńczenia całko- % skuteczności wobec ALTE- cillus witego bulionu hodowlanego SO (% ataku grzybów) Bez traktowania 0 (100) Lu16674 1:10 77 M-1 1:10 41

Tabela 25. Szczep Paeniba- Współczynnik rozcieńczenia całko- % skuteczności wobec PHY- cillus witego bulionu hodowlanego TIN (% ataku grzybów) Bez traktowania 0 (100) Lu17007 1:10 83 M-1 1:10 42 Lu 16674 1:50 13 Lu17007 1:50 30 M-1 1:50 0

5 Tabela 26. Szczep Paeniba- Współczynnik rozcieńczenia całko- % skuteczności wobec PHA- cillus witego bulionu hodowlanego KPA (% ataku grzybów) Bez traktowania 0 (100) Lu17007 nierozcieńczony 94 M-1 Nierozcieńczony 87

Tabela 27. Szczep Paeniba- Współczynnik rozcieńczenia całko- % skuteczności wobec cillus witego bulionu hodowlanego GIBBZE (% ataku grzybów) Bez traktowania 0 (100) Lu17007 nierozcieńczony 70 M-1 nierozcieńczony 31 Lu16674 1:50 52 Lu17007 1:50 33 M-1 1:50 24

[0354] Cytowane tu dokumenty są włączone przez odniesienie. 10 Krótki opis figur: [0355] Figura 1. Związki 1A, 1B, 2A, 2B, 3, 4A, 4B, 5A i 5B. Figura 2. Kluczowe korelacje NOESY i COSY związku 1B. Figura 3. Korelacja HMBC związku 1B. 15 Figura 4. Wzory fragmentacji a) związku 1A i b) związku 1B. 69 Figura 5. Wzory fragmentacji a) związku 2A (fuzarycydyna C) i b) związku 2B (fuzarycydyna D). Figura 6. Wzór fragmentacji związku 3 (LI-F08b). Figura 7. Wzory fragmentacji a) związku 4A (LI-F06a) and b) związku 4B (LI-F06b). 5 Figura 8. Wzory fragmentacji a) związku 5A (fuzarycydyna A) i b) związku 5B (fuzarycydyna B). Figura 9 przedstawia procent identyczności pełnej sekwencji 16S rDNA szczepów Paeni- bacillus według wynalazku do spokrewnionych taksonów po wielokrotnym uliniowieniu sekwencji . 10 Legenda: * Numery szczepów: 1 = Paenibacillus szczep Lu16774; 2 = Paenibacillus szczep Lu17015; 3 = Paenibacillus szczep Lu17007; 4 = Paenibacillus peoriae NRRL BD-62; 5 = Paenibacillus anaericanus MH21; 6 = Paenibacillus brasiliensis PB172; 7 = Paenibacillus campinasensis 324; 8 = Paenibacillus chibensis JCM 9905; 9 = Paenibacil- lus glucanolyticus DSM 5162; 10 = Paenibacillus hunanensis FeL05; 11 = Paenibacillus 15 jamilae CECT 5266; 12 = Paenibacillus kribbensis AM49; 13 = Paenibacillus lactis MB 1871; 14 = Paenibacillus lautus JCM 9073; 15 = Paenibacillus macerans IAM 12467; 16 = Paenibacillus massiliensis 2301065; 17 = Paenibacillus pabuli HSCC 492; 18 = Paeni- bacillus peoriae DSM 8320 (BD-57); 19 = Paenibacillus pini S22; 20 = Paenibacillus polymyxa IAM 13419; 21 = Paenibacillus purispatii ES_MS17; 22 = Paenibacillus sedi- 20 minis GT-H3; 23 = Paenibacillus terrae AM141; 24 = Paenibacillus terrigena A35; 25 = Paenibacillus timonensis 2301032; 26 = Paenibacillus turicensis MOL722; 27 = Paeniba- cillus uliginis N3/975; 28 = Cohnella thermotolerans CCUG 47242. Szczepy 6 do 28 są szczepami typu dla odpowiednich gatunków. Podobieństwa nowych szczepów z Paenibacillus peoriae (NRRL BD-62 and DSM 8320) 25 zostały oznaczone wytłuszczoną czcionką. Figura 10 przedstawia filogenetyczny dendrogram obliczony na podstawie % identycz- ność sekwencji 16S-rDNA szczepów Paenibacillus według wynalazku z innymi taksonami (Fig. 9). Korzeń drzewa został określony przez włączenie do analizy sekwencji genu 16S rRNA z Cohnella thermotolerans. Pasek skali poniżej dendrogramu wskazuje podstawie- 30 nie 1 nukleotydu na 100 nukleotydów. Figura 11 przedstawia wzór RiboPrint uzyskany z próbek szczepów Paenibacillus według wynalazku w porównaniu z próbką blisko spokrewnionych P. peoriae szczepu BD-62 z użyciem Ribo-Printer Microbial Characterization System i wynikający z niego filogenetyczny dendrogram. 35 Figura 12 przedstawia procent identyczności sekwencji DNA genu dnaN ze szczepów Pa- enibacillus według wynalazku do spokrewnionych szczepów Paenibacillus po wielokrotnym uliniowieniu sekwencji . Legenda: * Numery szczepów: 1 = Paenibacillus szczep Lu16774; 2 = Paenibacillus szczep Lu17007; 3 = Paenibacillus szczep Lu17015; 4 = P. peoriae DSM 8320T = KCTC 40 3763T (nr dostępu w GenBank AGFX00000000; J. Bacteriol. 194, 1237-1238, 2012); 5 = P. polymyxa 1-43 (nr dostępu w GenBank ASRZ01000000; nr depozytu GCMCC 4965; CN 102352332 B); 6 = P. polymyxa A18 (nr dostępu w GenBank JWJJ00000000.1; NCBI Projekt ID 225496); 7 = P. polymyxa ATCC 842T = DSM 36T = KCTC 3858T (nr dostępu w GenBank AFOX00000000; J. Bacteriol. 193(18), 5026-5027, 2011); 8 = P. polymyxa 45 CF05 (nr dostępu w GenBank CP009909; Genome Announc 3(2):e00198-15. Doi:10.1128/genomeA.00198-15); 9 = P. polymyxa CICC 10580 (nr dostępu w GenBank JNCB00000000; Genome Announc. 2(4):e00854-14. doi:10.1128/genomeA.00854-14); 10 = P. polymyxa DSM 365 (nr dostępu w GenBank JMIQ00000000; J. Biotechnol. 195, 72- 73, 2015); 11 = P. polymyxa E681 (nr dostępu w GenBank CP000154; GenomeNet Ref 50 Seq NC_014483.2; J. Bacteriol. 192(22), 6103-6104, 2010); 12 = P. polymyxa M-1 (nr do- stępu w GenBank HE577054.1; GenomeNet Ref Seq NC_017542.1); 13 = P. polymyxa NRRL B-30509 (nr dostępu w GenBank JTHO00000000; Genome Announc. 2015 ma- 70 rzec-kwiecień; 3(2): e00372-15); 14 = P. polymyxa SC2 (nr dostępu w GenBank CP002213; J. Bacteriol. 193 (1), 311-312, 2011); 15 = P. polymyxa SQR-21 (nr dostępu w GenBank CP006872; GenomeNet Ref Seq NZ_CP006872.1; Genome Announc. 2014 marzec-kwiecień; 2(2): e00281-14); 16 = P. polymyxa Sb3-1 (nr dostępu w GenBank 5 CP010268; Genome Announc. 2015 marzec-kwiecień; 3(2): e00052-15); 17 = P. polymyxa TD94 (nr dostępu w GenBank ASSA00000000); 17 = P. polymyxa WLY78 (nr dostępu w GenBank ALJV00000000); P. terrae HPL-003 (nr dostępu w GenBank CP003107; NCBI Ref Seq NC_016641.1); P. polymyxa CR1 (nr dostępu w GenBank CP006941; Genome Announc. 2014 styczeń-luty; 2(1): e01218-13). 10 Figura 13 przedstawia procentową identyczność sekwencji DNA całego genu gyrB szcze- pów Paenibacillus według wynalazku do pokrewnych szczepów Paenibacillus po wielokrotnym uliniowieniu sekwencji . Numery szczepów zostały opisane w legendzie do Fig. 12. Figura 14 przedstawia procentową identyczność sekwencji DNA całego genu recF szcze- 15 pów Paenibacillus według wynalazku do pokrewnych szczepów Paenibacillus po wielokrotnym uliniowieniu sekwencji. Numery szczepów zostały opisane w legendzie do Fig. 12. Figura 15 przedstawia procentową identyczność sekwencji DNA całego genu recN szcze- pów Paenibacillus według wynalazku do pokrewnych szczepów Paenibacillus po wielo- 20 krotnym uliniowieniu sekwencji. Numery szczepów zostały opisane w legendzie do Fig. 12. Figura 16 przedstawia procentową identyczność sekwencji DNA całego genu rpoA szcze- pów Paenibacillus według wynalazku do pokrewnych szczepów Paenibacillus po wielokrotnym uliniowieniu wielu sekwencji. Numery szczepów zostały opisane w legendzie do 25 Fig. 12. Figura 17 przedstawia dendogram o największej wiarygodności na podstawie sekwencji całego genu dnaN szczepów z kompleksu P. polymyxa. Pokazana skala 0,1 odpowiada 1% wymianom nukleotydów. Figura 18 przedstawia dendogram o największej wiarygodności na podstawie sekwencji 30 całego genu gyrB szczepów z kompleksu P. polymyxa. Pokazana skala 0,1 odpowiada 1% wymianom nukleotydów. Figura 19 przedstawia dendogram o największej wiarygodności na podstawie sekwencji całego genu recF szczepów z kompleksu P. polymyxa. Pokazana skala 0,1 odpowiada 1% wymianom nukleotydów. 35 Figura 20 przedstawia dendogram o największej wiarygodności na podstawie sekwencji całego genu recN szczepów z kompleksu P. polymyxa. Pokazana skala 0,1 odpowiada 1% wymianom nukleotydów. Figura 21 przedstawia dendogram o największej wiarygodności na podstawie sekwencji całego genu rpoA szczepów z kompleksu P. polymyxa. Pokazana skala 0,1 odpowiada 1% 40 wymianom nukleotydów. Figura 22 przedstawia macierz indeksu aminokwasowego (AAI) reprezentatywnych ge- nomów kompleksu P. polymyxa wykonaną zgodnie z Przykładem 2.5. Numery szczepów zostały opisane w legendzie do Fig. 12. WYKAZ SEKWENCJI 45 [0356] <110> BASF SE <120> Szczepy Paenibacillus <130> 0000077456 <160> 3 50 <170> BiSSAP 1.2 <210> 1 <211> 1539 71 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <220> <221> źródło 5 <222> 1..1539 <223> /organizm="Paenibacillus polymyxa spp. plantarum” /uwaga="całkowity 16S rDNA szczepu Lu16774” /mol_type="inny DNA" <220> 10 <221> niepewne <222> 37,58,60,65,82,87,89,204,263,645,1020,1264,1457 <400> 1

15 <210> 2 <211> 1545 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. 72 <220> <221> źródło <222> 1..1545 <223> /organizm="Paenibacillus polymyxa ssp. plantarum” 5 /uwaga="całkowity 16S rDNA szczepu Lu17007” /mol_type="inny DNA" <220> <221> niepewne <222> 58,60,65,82,87,645,1020 10 <400> 2

<210> 3 15 <211> 1547 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <220> <221> źródło 73 <222> 1..1547 <223> /organizm="Paenibacillus epiphyticus” /uwaga="całkowity 16S rDNA szczepu Lu17015” /mol_type="inny DNA" 5 <220> <221> niepewne <222> 68,87,1024 <400> 3

<210> 4 <211> 1143 <212> DNA 15 <213> Paenibacillus sp. <220> <221> źródło <222> 1..1143 <223> /organizm="Paenibacillus polymyxa spp. plantarum” 20 /uwaga="dnaN szczepu Lu16774” 74 /mol_type="DNA" <400> 4

5 <210> 5 <211> 1980 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. 10 <220> <221> źródło <222> 1..1980 <223> /organizm="Paenibacillus polymyxa spp. plantarum” /uwaga="gyrB szczepu Lu16774” 15 /mol_type="DNA" 75 <400> 5

5 <210> 6 <211> 1116 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <220> 10 <221> źródło 76 <222> 1..1116 <223> /organizm="Paenibacillus polymyxa spp. plantarum” /uwaga="recF szczepu Lu16774” /mol_type="DNA" 5 <400> 6

<210> 7 10 <211> 1719 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <220> <221> źródło 15 <222> 1..1719 <223> /organizm="Paenibacillus polymyxa spp. plantarum” /uwaga="recN szczepu Lu16774” /mol_type="DNA" 77 <400> 7

5 <210> 8 <211> 945 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <220> 10 <221> źródło <222> 1..945 <223> /organizm="Paenibacillus polymyxa spp. plantarum” /uwaga="rpoA szczepu Lu16774” /mol_type="DNA" 78 <400> 8

5 <210> 9 <211> 1143 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <220> 10 <221> źródło <222> 1..1143 <223> /organizm="Paenibacillus polymyxa spp. plantarum” /uwaga="dnaN szczepu Lu17007” /mol_type="DNA" 79 <400> 9

5 <210> 10 <211> 1980 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <220> 10 <221> źródło <222> 1..1980 <223> /organizm="Paenibacillus polymyxa spp. plantarum” /uwaga="gyrB szczepu Lu17007” /mol_type="DNA" 80 <400> 10

5 <210> 11 <211> 1116 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <220> 10 <221> źródło 81 <222> 1..1116 <223> /organizm="Paenibacillus polymyxa spp. plantarum” /uwaga="recF szczepu Lu17007” /mol_type="DNA" 5 <400> 11

<210> 12 10 <211> 1719 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <220> <221> źródło 15 <222> 1..1719 <223> /organizm="Paenibacillus polymyxa spp. plantarum” /uwaga="recN szczepu Lu17007” /mol_type="DNA" 82 <400> 12

5 <210> 13 <211> 945 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <220> 10 <221> źródło <222> 1..945 <223> /organizm="Paenibacillus polymyxa spp. plantarum” /uwaga="rpoA szczepu Lu17007” /mol_type="DNA" 83 <400> 13

5 <210> 14 <211> 1143 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <220> 10 <221> źródło <222> 1..1143 <223> /organizm="Paenibacillus epiphyticus” /uwaga="dnaN szczepu Lu17015” /mol_type="DNA" 84 <400> 14

<210> 15 <211> 1980 5 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <220> <221> źródło <222> 1..1980 10 <223> /organizm="Paenibacillus epiphyticus” /uwaga="gyrB szczepu Lu17015” /mol_type="DNA" 85 <400> 15

5 <210> 16 <211> 1116 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <220> 10 <221> źródło 86 <222> 1..1116 <223> /organizm="Paenibacillus epiphyticus” /uwaga="recF szczepu Lu17015” /mol_type="DNA" 5 <400> 16

<210> 17 10 <211> 1719 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <220> <221> źródło 15 <222> 1..1719 <223> /organizm="Paenibacillus epiphyticus” /uwaga="recN szczepu Lu17015” /mol_type="DNA" 87 <400> 17

5 <210> 18 <211> 945 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <220> 10 <221> źródło <222> 1..945 <223> /organizm="Paenibacillus epiphyticus” /uwaga="rpoA szczepu Lu17015” /mol_type="DNA" 88 <400> 18

Zastrzeżenia patentowe

1. Szczep Paenibacillus, który jest wybrany z grupy obejmującej: 5 a) szczep Lu16774 zdeponowany w DSMZ pod numerem dostępu DSM 26969; b) szczep Lu17007 zdeponowany w DSMZ pod numerem dostępu DSM 26970; oraz c) szczep Lu17015 zdeponowany w DSMZ pod numerem dostępu DSM 26971. 2. Szczep Paenibacillus według zastrzeżenia 1, który to szczep Paenibacillus wykazuje 10 aktywność przeciwgrzybiczą przeciwko co najmniej dwóm z patogenów roślinnych wybranych z grupy obejmującej Alternaria spp., Botrytis cinerea, Phytophthora infestans i Sclerotinia sclerotiorum. 3. Szczep Paenibacillus według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 2, który to szczep Pa- enibacillus wytwarza co najmniej jeden spośród następujących związków:

15 w pożywce wzrostowej zawierającej co najmniej jedno źródło węgla i jedno źródło azotu. 89

4. Szczep Paenibacillus według zastrzeżenia 3, który to szczep Paenibacillus jest dodatkowo zdolny do wytwarzania co najmniej trzech związków wybranych z grupy obej- mującej fuzarycydynę A, fuzarycydynę B, fuzarycydynę C, fuzarycydynę D, LI-F06a, LI-F06b i LI-F08b. 5 5. Szczep Paenibacillus według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 2, który to szczep Pa- enibacillus zawiera co najmniej jeden spośród następujących związków:

6. Szczep Paenibacillus według zastrzeżenia 5, który to szczep Paenibacillus dodatkowo zawiera co najmniej trzy związki wybrane z grupy obejmującej fuzarycydynę A, fuza- 10 rycydynę B, fuzarycydynę C, fuzarycydynę D, LI-F06a, LI-F06b i LI-F08b. 7. Zasadniczo oczyszczona hodowla szczepu Paenibacillus jak zdefiniowano w dowolnym z zastrzeżeń 1 do 6. 8. Całkowity bulion hodowlany lub pozbawiony komórek ekstrakt szczepu Paenibacillus jak zdefiniowano w którymkolwiek z zastrzeżeń 1 do 6, zawierający co najmniej jeden 15 związek o wzorze I lub jego dopuszczalną w rolnictwie sól jak zdefiniowano w za- strzeżeniach 9 i 10. 9. Związek o wzorze I

w którym 20 R jest wybrany spośród kwasu 15-guanidyno-3-hydroksypentadekanowego i kwasu 12-guanidynododekanowego; X1 oznacza treoninę; X2 oznacza izoleucynę; X3 oznacza tyrozynę; 25 X4 oznacza treoninę; X5 jest wybrany spośród glutaminy i asparaginy; X6 oznacza alaninę; i w którym strzałka określa pojedyncze wiązanie amidowe albo pomiędzy ugrupowaniem karbonylowym R a grupą aminową aminokwasu X1 albo pomiędzy grupą karbo- 30 nylową jednego aminokwasu a grupą aminową sąsiadującego aminokwasu, przy czym końcówka strzałki wskazuje przyłączenie do grupy aminowej wspomnianego aminokwasu X1 lub wspomnianego sąsiadującego aminokwasu; i w którym pojedyncza linia bez grotu strzałki określa pojedyncze wiązanie estrowe między grupą karbonylową X6 a grupą hydroksylową X1; 35 lub jego dopuszczalna w rolnictwie sól. 10. Związek według zastrzeżenia 9 wybrany spośród związków 1A i 1B: 90

lub jego dopuszczalna w rolnictwie sól. 11. Sposób wytwarzania związku lub jego soli jak zdefiniowano w dowolnym z zastrze- żeń 9 do 10, który to sposób obejmuje hodowanie szczepu Paenibacillus jak zdefinio- 5 wano w którymkolwiek z zastrzeżeń 1 do 6 i odzyskiwanie wspomnianego związku lub jego soli z całkowitego bulionu hodowlanego. 12. Kompozycja zawierająca a) szczep Paenibacillus jak zdefiniowano w którymkolwiek z zastrzeżeń 1 do 6; lub b) zasadniczo oczyszczoną hodowlę jak zdefiniowano w zastrzeżeniu 7; lub 10 c) całkowity bulion hodowlany lub pozbawiony komórek ekstrakt jak zdefiniowano w zastrzeżeniu 8; lub d) związek o wzorze I lub jego sól jak zdefiniowano w którymkolwiek z zastrzeżeń 9 do 10; i środek pomocniczy. 15 13. Kompozycja według zastrzeżenia 12, zawierająca dodatkowo pestycyd. 14. Kompozycja według zastrzeżenia 13, w której pestycyd jest dodatkowym biopestycy- dem. 15. Materiał rozmnożeniowy roślin mający powłokę zawierającą kompozycję jak zdefiniowano w dowolnym z zastrzeżeń 12 do 14. 20 16. Zastosowanie kompozycji jak zdefiniowano w którymkolwiek z zastrzeżeń 12 do 14 do zwalczania lub tłumienia patogenów roślinnych lub zapobiegania zakażeniu patogenami roślinnymi lub do ochrony materiału przed inwazją i zniszczeniem przez szkodliwe mikroorganizmy. 17. Sposób zwalczania, tłumienia patogenów roślinnych lub zapobiegania zakażeniu pato- 25 genami roślinnymi, w którym patogeny roślinne, ich siedlisko lub rośliny, które mają być chronione przed atakiem patogenu roślinnego, lub gleba lub materiał rozmnoże- niowy traktuje się skuteczną ilością kompozycji jak zdefiniowano w którymkolwiek z zastrzeżeń 12 do 14. 18. Zastosowanie według zastrzeżenia 16 lub sposób według zastrzeżenia 17, w którym 30 patogeny roślinne i/lub szkodliwe mikroorganizmy są wybrane spośród szkodliwych grzybów. 91

100

101

102

103

104

105

106

107

108

109

110

111

112

113

114