(Rubiaceae): Psychotria Goyazensis Müll. Arg. S T O

UFG UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS IQ INSTITUTO DE QUÍMICA

M A R C E L O

A U Contribuição do estudo fitoquímico de espécies de Psychotria L. G U (Rubiaceae): Psychotria goyazensis Müll. Arg. S T O

P E R E MARCELO AUGUSTO PEREIRA JANUÁRIO I a a R ORIENTADORA: PROF . Dr . LUCÍLIA KATO A a a CO-ORIENTAÇÃO: PROF Dr . CECÍLIA MARIA ALVES DE J OLIVEIRA A N U Á R I O DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

2015 GOIÂNIA- 2015 Universidade Federal de Goiás

Instituto de Química

Contribuição do estudo fitoquímico de espécies de Psychotria L. (Rubiaceae): Psychotria goyazensis Müll. Arg.

MARCELO AUGUSTO PEREIRA JANUÁRIO

Dissertação apresentada ao Instituto de Química da Universidade Federal de Goiás, como exigência parcial para a obtenção do título de Mestre em Química.

Orientadora: Profa. Dra. Lucília Kato. Co-orientadora: Profa. Dra. Cecília Maria Alves de Oliveira.

GOIÂNIA, 2015

À minha mãe Alexina, razão deste trabalho, pelo apoio ilimitado ao longo de toda minha vida. Te amo!

AGRADECIMENTOS

Nossa vida é feita de desafios, uns grandes, outros pequenos. Para mim, este trabalho foi um grande desafio, que trouxe momentos de desânimo, outros de euforia, e em todos eles, uma lição. É assim que chego ao fim desta etapa de vida, feliz por vencer mais uma vez e eternamente agradecido: À Deus, pela vida, saúde e forças diárias, o maior contribuinte para a concretização desta etapa. À Profa Dra. Lucília Kato, pela orientação e principalmente pela compreensão e humanidade nos momentos difíceis que surgiram ao longo deste trabalho. À Profa Dra. Cecília Maria Alves de Oliveira, pela visão, pela sinceridade, pela disponibilidade e paciência! Nos dois sabemos o quanto ela (a paciência) se fez necessária, não é Professora? Rsrs... À colega de laboratório Aline P. Moraes, que me acolheu logo que cheguei, quando não sabia nem mesmo o que era uma placa de CCD! Também pela presença constante ao meu lado, com paciência, explicando e auxiliando em tudo! Abraço, minha amiga! Se fosse descrever a imensa ajuda que você me deu ao longo destes dois anos, eu precisaria de muito mais espaço! À colega e grande amiga Geralda Lemes, pela paciência ao me ensinar a técnica de CLAE e pelas inúmeras dicas de coluna! Abraço grande, minha amiga! Aos colegas de laboratório e amigos queridos Vinícius G. Wakui e Raquel F. Naves, Celice Novaes, que também me ajudaram DEMAIS! Só Deus para recompensá-los! Aos irmãos em Cristo Dionari e Eliúde, pela calorosa recepção quando cheguei a esta cidade e pelos constantes auxílios ao longo desta jornada! Deus os abençoe e os recompense!

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 1 1.1. Família Rubiaceae. 1 1.2. A família Rubiaceae e substâncias bioativas 1 1.3. Alcaloides 2 1.4. Gênero Psychotria L. 4 1.5. Alcaloides de Psychotria L. 5 1.6. Descrição da espécie Psychotria goiazensis Mull. Arg. 10 2 OBJETIVOS 11 3 PARTE EXPERIMENTAL 13 3.1. Procedimentos gerais 14 3.2. Fracionamento fitoquímico de folhas, galhos e frutos de P. goyazensis. 15 3.2.1 1ª coleta, identificação e estudo das folhas. 15 3.2.2. Estudo dos frutos. 19 3.2.3. Estudo dos galhos. 21 3.2.4. 2ª Coleta das folhas. 22 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 24 4.1 Compostos isolados e/ou identificados nas folhas, galhos e frutos de P. 25 goiazenses. 4.2 Elucidação estrutural dos compostos isolados 26 4.2.1. Composto Pgfr 1 26 4.2.2. Composto Pgfr 2a 31 4.2.3. Composto Pgf 1 39 4.2.4. Mistura Pgf 7 (Identificação do harmano) 45 4.2.5. Composto Pgg 1 46 4.2.6. Mistura de compostos Pgf 2 48 4.2.7 Mistura de compostos Pgf 3 50 4.2.8. Mistura de compostos Pgf 5 51

5 Biossíntese de alcaloides de P goyazensis 52 6 CONCLUSÃO 55 7 REFERÊNCIAS 56 8 ANEXOS 68

8.1 TABELAS Tabela 1 Variedade de alcaloides isolados de Psychotria L. 6 Tabela 2 Dados espectroscópicos de 1H (ppm) e RMN 13C (via HSQC e HMBC) e 30 COSY para o composto Pgfr 1 e calicantina. Tabela 3 Dados espectroscópicos de 1H (ppm) e RMN 13C (via HSQC e HMBC) e 38 COSY para o composto Pgfr 2ª. Tabela 4 Dados espectroscópicos de 1H (ppm) e RMN 13C (via HSQC e HMBC) 44 para o composto Pgf 1 e ácido estrictosidínico. Tabela 5 Dados espectroscópicos de 1H (ppm) e RMN 13C (via HSQC e HMBC) 46 para Pgf 7 (identificação do harmano) e harmano. Tabela 6 Dados espectroscópicos de 1H (ppm) e RMN 13C (via HSQC e HMBC) e 48 para o composto Pgg 1 e isoescopoletina. Tabela 7 Tratamento cromatográfico da fração hexânica das folhas (1,5 g). 68 Tabela 8 Tratamento cromatográfico da fração diclorometânica das folhas (1,5 g). 69 Tabela 9 Tratamento cromatográfico das subfrações reunidas 53-74 (303,6 mg) 70 provenientes da fração diclorometância das folhas (1,5 g). Tabela 10 Tratamento cromatográfico da fração acetato de etila das folhas (1,95 g) 71 Tabela 11 Tratamento cromatográfico da fração n-butanólica das folhas (1,04 g). 72 Tabela 12 Massas e rendimentos obtidos na extração ácido-base do extrato etanólico 73 bruto dos frutos (8,3 g)

Tabela 13 Purificação da fração CHCl3 neutra dos frutos (161 mg) 73

Tabela 14 Purificação das frações reunidas acetato de etila básica (19 mg) e CHCl3 74 básica (13 mg) dos frutos. Tabela 15 Massas e rendimentos obtidos na extração ácido-base do extrato etanólico 74 bruto dos galhos (5,3 g)

Tabela 16 Purificação da fração CHCl3 ácida dos galhos (50 mg) 75 Tabela 17 Massas e rendimentos obtidos na extração ácido-base do extrato etanólico 75 bruto das folhas, 2ª Coleta. (15,3 g).

Tabela 18 Purificação da fração CHCl3 neutra das folhas, 2ª coleta (94,8 mg). 76

7.2 LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Metabólitos secundários bioativos isolados de espécies da família Rubiaceae. 2

Figura 2 Alcaloides naturais bioativos. 4

Figura 3 Cromatograma da injeção das subfrações reunidas na faixa de polaridade 17

CHCl3/MeOH 60-70% da fração acetato de etila.

Figura 4 Obtenção e fracionamento do extrato etanólico bruto das folhas. 18 Figura 5 Obtenção e fracionamento do extrato etanólico bruto dos frutos. 20 Figura 6 Obtenção e fracionamento do extrato etanólico bruto dos galhos 22 Figura 7 Obtenção e fracionamento do extrato etanólico bruto das folhas, 2ª coleta 23 Figura 8 Compostos isolados e/ou identificados em P. goyazensis. 26 Figura 9 Cone deblindagem dos elétrons π do anel aromático sobre os hidrogênios 28 metilênicos do anel da calicantina. Figura 10 Proposta de fragmentação para calicantina 29 Figura 11 Correlações de HMBC ( ) para Pgfr 2a. 32 Figura 12 Estruturas usadas como modelo para elucidação de Pgfr 2a. 33 Figura 13 Estruturas usadas como modelo para elucidação de Pgfr 2a. 33 Figura 14 Sobreposição da região expandida entre 7,0-6,0 ppm dos espectros de RMN de 34 1H da calicantina (A) e de Pgfr 2a (B). Figura 15 Sobreposição da região expandida entre 3,0-1,5 ppm dos espectros de RMN de 34 1H da calicantina (A) e de Pgfr 2a (B). Figura 16 Expansão da região entre 7,0-6,0 ppm do espectro de RMN de 1H de Pgfr 2a. 35 Figura 17 Simulação de espectro ABX em programa WINDNMR-Pro. para Pgfr 2a; 35

Constantes de acoplamento: JAB=5,8; JAX=0.8; JBX=6.1 Hz. Figura 18 Proposta de fragmentação para Pgfr 2a. 36 Figura 19 Correlações de HMBC ( ) para a unidade A de Pgf 1. 40

Figura 20 Correlações de HMBC ( ) para a unidade B de Pgf 1. 41 Figura 21 Correlações de HMBC ( ) que sustentam a conexão entre as unidades A, B 41 e C de Pgf 1. Figura 22 Configuração relativa do composto Pgf 1. Adaptado de NAVES, 2014. 41 Figura 23 Cromatograma da injeção da solução padrão de ácido estrictosidínico (0,01 43 mg/mL), com absorção máxima em 222,8 nm.

Figura 24 Cromatograma da co-injeção da solução padrão de ácido estrictosidínico com 43 a solução da subfração Fr 5 proveniente de FnBuOH, mostrando aumento da área e altura do pico correspondente a este composto, com absorção máxima em 222,7 nm. Figura 25 Biossíntese dos alcaloides ácido estictosidinico e harmano (Adaptado de 53 BRUNETON, 1991 & DEWICK, 2000). Figura 26 Biossíntese da calicantina (MAY & STOLTZ, 2006). 54

1 Figura 27 Espectro de RMN H (CD3OD, 500 MHz) para o composto Pgfr 1. 77 Figura 28 Expansão da região entre 7,3-6,0 ppm do espectro de RMN de 1H de Pgfr 1. 78 Figura 29 Expansão da região entre 3,0-1,3 ppm do espectro de RMN de 1H de Pgfr 1. 79 Figura 30 Mapa de correlações de HSQC de Pgfr 1. 80 Figura 31 Expansão da região entre 7,3-6,1 ppm do mapa de correlações de HSQC de 81 Pgfr 1. Figura 32 Expansão da região entre 5,6-4,0 ppm do mapa de correlações de HSQC de 82 Pgfr 1. Figura 33 Expansão da região entre 3,0-1,4 ppm do mapa de correlações de HSQC de 83 Pgfr 1. Figura 34 Mapa de correlações de HMBC de Pgfr 1. 84 Figura 34 Expansão da região entre 7,2-6,3 ppm do mapa de correlações de HMBC de 85 Pgfr 1. Figura 36 Expansão da região entre 5,3-4,4 ppm do mapa de correlações de HMBC de 88 Pgfr 1. Figura 37 Expansão da região entre 3,0-1,5 ppm do mapa de correlações de HMBC de 87 Pgfr 1. Figura 38 Mapa de correlações de COSY de Pgfr 1. 88 Figura 39 Expansão da região entre 7,1-6,3 ppm do mapa de correlações de COSY de 89 Pgfr 1. Figura 40 Expansão da região entre 3,0-1,5 ppm do mapa de correlações de COSY de 90 Pgfr 1. Figura 41 Espectro de massas de alta resolução ESI(+)FT-ICRMS de Pgfr 1. 91 1 Figura 42 Espectro de RMN H (CDCl3/CD3OD,500 MHz) para o composto Pgfr 2a. 92 Figura 43 Expansão da região entre 7,1-6,0 ppm do espectro de RMN de 1H de Pgfr 2a. 93 Figura 44 Expansão da região entre 3,0-1,4 ppm do espectro de RMN de 1H de Pgfr 2a. 94 Figura 45 Mapa de correlações de HSQC de Pgfr 2a. 95 Figura 46 Expansão da região entre 7,1-6,2 ppm do mapa de correlações de HSQC de 96 Pgfr 2a. Figura 47 Expansão da região entre 4,9-4,3 ppm do mapa de correlações de HSQC de 97 Pgfr 2a. Figura 48 Expansão da região entre 3,0-1,5 ppm do mapa de correlações de HSQC de 98 Pgfr 2a. Figura 49 Mapa de correlações de HMBC para Pgfr 2a. 99 Figura 50 Expansão da região entre 7,1-6,2 ppm do mapa de correlações de HMBC de 100 Pgfr 2a. Figura 51 Expansão da região entre 4,7-4,5 ppm do mapa de correlações de HMBC de 101 Pgfr 2a. Figura 52 Expansão da região entre 3,0-1,5 ppm do mapa de correlações de HMBC de Pgfr 2a. 102 Figura 53 Mapa de correlações de COSY de Pgfr 2a. 103 Figura 54 Expansão da região entre 7,0-6,0 ppm do mapa de correlações de COSY de 104 Pgfr 2a. Figura 55 Expansão da região entre 3,0-1,5 ppm do mapa de correlações de COSY de 105 Pgfr 2a. Figura 56 Espectro de massas de alta resolução ESI(+)FT-ICRMS de Pgfr 2a. 106 1 Figura 57 Espectro de RMN H (CD3OD, 500 MHz) para o composto Pgf 1. 107 Figura 58 Expansão da região entre 7,8-7,0 ppm do espectro de RMN de 1H de Pgf 1. 108 Figura 59 Expansão da região entre 5,9-5,2 ppm do espectro de RMN de 1H de Pgf 1. 109 Figura 60 Expansão da região entre 5,0-3,0 ppm do espectro de RMN de 1H de Pgf 1. 110 Figura 61 Expansão da região entre 2,7-2,0 ppm do espectro de RMN de 1H de Pgf 1. 111 Figura 62 Mapa de correlações de HSQC de Pgf 1. 112 Figura 63 Expansão da região entre 7,6-6,6 ppm do mapa de correlações de HSQC de Pgf 1. 113 Figura 64 Expansão da região entre 5,5-2,0 ppm do mapa de correlações de HSQC de 114 Pgf 1. Figura 65 Mapa de correlações de HMBC para Pgf 1. 115 Figura 66 Expansão da região entre 7,6-6,8 ppm do mapa de correlações de HMBC de 116 Pgf 1. Figura 67 Expansão da região entre 6,0-5,0 ppm do mapa de correlações de HMBC de 117 Pgf 1. Figura 68 Expansão da região entre 4,5-3,0 ppm do mapa de correlações de HMBC de 118 Pgf 1. Figura 69 Expansão da região entre 2,9-1,9 ppm do mapa de correlações de HMBC de 119 Pgf 1. 1 Figura 70 Espectro de RMN H (CDCl3- TMS, 500 MHz) para o composto Pgf 7. 120 Figura 71 Expansão da região entre 8,5-7,0 ppm do espectro de RMN de 1H de Pgf 7. 121 Figura 72 Expansão da região entre 3,5-2,5 ppm do espectro de RMN de 1H de Pgf 7. 122 Figura 73 Mapa de correlações de HSQC de Pgf 7. 123 Figura 74 Expansão da região entre 8,5-7,3 ppm do mapa de correlações de HSQC de 124 Pgf 7. Figura 75 Expansão da região entre 3,4-2,5 ppm do mapa de correlações de HSQC de 125 Pgf 7. Figura 76 Mapa de correlações de HMBC para Pgf 7. 126 Figura 77 Expansão da região entre 8,5-7,3 ppm do mapa de correlações de HMBC de 127 Pgf 7. Figura 78 Expansão da região entre 3,4-2,5 ppm do mapa de correlações de HMBC de 128 Pgf 7. 1 Figura 79 Espectro de RMN de H (CDCl3-TMS, 500 MHz) para o composto Pgg 1. 129 Figura 80 Expansão da região entre 7,6-6,0 ppm do espectro de RMN de 1H de Pgg1. 130 Figura 81 Expansão da região entre 4,5-3,5 ppm do espectro de RMN de 1H de Pgg 1. 131 Figura 82 Mapa de correlações de HSQC para Pgg 1. 132 Figura 83 Expansão da região entre 7,7-6,0 ppm do mapa de correlações de HSQC de 133 Pgg 1. Figura 84 Expansão da região entre 4,0-3,8 ppm do mapa de correlações de HSQC de 134 Pgg 1. Figura 85 Mapa de correlações de HMBC para Pgg 1. 135 Figura 86 Expansão da região entre 7,7-6,3 ppm do mapa de correlações de HMBC de 136 Pgg 1. Figura 87 Expansão da região entre 3,98-3,93 ppm do mapa de correlações de HMBC 137 de Pgg 1. 1 Figura 88 Espectro de RMN H (CDCl3/CD3OD,500 MHz) para Pgf 2. 138 Figura 89 Expansão da região entre 5,5-3,0 ppm espectro de RMN de 1H de Pgf 2. 139 Figura 90 Expansão da região entre 2,5-0,5 ppm espectro de RMN de 1H de Pgf 2. 139 13 Figura 91 Espectro de RMN C (CDCl3/CD3OD,125 MHz) para Pgf 2. 140 1 Figura 92 Espectro de RMN de H (CDCl3/CD3OD,500 MHz) para Pgf 3. 141 Figura 93 Expansão da região entre 5,5-3,0 ppm do espectro de RMN de 1H de Pgf 3. 142 Figura 94 Expansão da região entre 2,5-0,5 ppm do espectro de RMN de 1H de Pgf 3. 142 1 Figura 95 Espectro de RMN H (CDCl3-TMS, 500 MHz) de Pgf 5. 143 Figura 96 Espectro de massas ESI (+)MS/MS do íon m/z 347 (calicantina). 143 Figura 97 Espectro de massas ESI (+)MS/MS do íon m/z 363 (Pgfr 2a). 144

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

CC Cromatografia em Coluna CCD Cromatografia em camada delgada CCDA Cromatografia em camada delgada analítica CCDP Cromatografia em camada delgada preparativa COSY 1H-1H Correlation Spectroscopy d Dupleto dd Duplo dupleto ddd Duplo duplo dupleto HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence IV Infravermelho J Constante de Acoplamento lit. Literatura m Multipleto m/z Relação massa/carga p.f. Ponto de fusão ppm Parte por milhão RMN 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio 1 RMN 13C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13 s Simpleto sl Sinpleto largo t Tripleto td Triplo dupleto dt Duplo tripleto TMS Tetrametilsilano UV Ultravioleta δ Deslocamento químico. AchE Acetilcolinesterase BchE Butirylcolinesterase

MAO-A Monoaminooxidase

RESUMO

A família Rubiaceae Juss. é a quarta maior família das Angiospermas com cerca de 13000 espécies e 650 gêneros distribuídos pelas regiões tropicais ao redor do mundo. O gênero Psychotria L. é considerado o maior da família, compreendendo cerca de 2000 espécies. Os metabólitos secundários mais importantes no gênero são os alcaloides, representativos de mais de 60% de todos os compostos isolados e caracterizados estruturalmente até 2013. A esses compostos é atribuída grande variedade de atividades farmacológicas, como antifúngica, antiinflamatória, anticonvulsivante e inibidora das enzimas monoaminooxidases A e B, relacionadas a doenças como Mal de Parkinson. Psychotria goyazensis Müll Arg. é uma espécie da família Rubiaceae, gênero Psychotria L., comumente encontrada no Cerrado e Amazônia. O fracionamento fitoquímico dos extratos brutos das folhas, galhos e frutos de P. goyazensis resultou no isolamento de dois alcaloides conhecidos, o quinolínico calicantina (Pgfr 1) e o indolmonoterpênico ácido estrictosidínico (Pgf 1), além de possibilitar a identificação do alcaloide harmano (Pgf 7) e de outro alcaloide inédito, a hidroxi-calicantina (Pgfr 2a) em misturas. Por outro lado, foram identificados também em misturas os triterpenos ácido ursólico e oleanólico (Pgf 2) bem como os esteroides sitosterol e estigmasterol nas formas livre (Pgf 5) e glicosilada (Pgf 3). O estudo fitoquímico de Psychotria goyazensis permitiu ainda o isolamento de um composto fenólico, a cumarina isoescopoletina (Pgg 1) e apontou um aspecto interessante desta planta, uma vez que não existe na literatura relato do isolamento simultâneo dos dois tipos de alcaloide (indolmonoterpênico e quinolínico) de uma mesma espécie do gênero.

ABSTRACT

The Rubiaceae Juss. family is the fourth largest of angiosperms, with about 10,700 species and 640 genera distributed throughout the tropical regions around the world.The genus Psychotria L. is the largest of the family, comprising about 2000 species. The single most important secondary metabolites of genus are alkaloids, representing over 60% from isolated compounds and structurally characterized reported until 2013. To these compounds is attributed wide variety of pharmacological activities such as antifungal, anti-inflammatory, anticonvulsant and inhibitory monoaminooxidases enzymes A and B, related to diseases such as Parkinson's disease. Psychotria goyazensis Müll Arg. is a species of Rubiaceae family, genus Psychotria L., commonly found in brazilian midwestern. The fractionation of the crude extracts from leaves, twigs and fruits yielded two know alkaloids: calychantine (Pgfr 1) and strictosidinic acid (Pgf 1) and it led to identify the harmane (Pgf 7) and also, a novel quinoline alkaloid named hydroxy-calychantine (Pgfr 2a).The triterpenes ursolic and oleanolic acid (Pgf 2) and steroids sitosterol and stigmasterol free (Pgf 5) and glycosylated (Pgf 3) were identified in mixtures. Also, the phytochemical study of P. goyazensis allowed to the isolation of a phenolic compounds, the coumarin isoescopoletin (Pgg 1) and pointed out an interesting aspect of this plant, since there are no reports in literature on the simultaneous isolation of both types of alkaloid of the same species of the genus.

1. INTRODUÇÃO

1.1. Família Rubiaceae

Rubiaceae é a quarta maior família botânica dentre as angiospermas (VERGUTZ et al., 2010 apud DELPRETE, 2004 & CONSOLARO, 2008), estando presente em quase todo o globo, com cerca de 650 gêneros e 13000 espécies, ocupando o quarto lugar em diversidade (ROCHA SILVA & CHOZE, 2013). No Brasil essa família compreende cerca de 142 gêneros e 2182 espécies (BARBOSA et al.; 2014), apresentando grande variedade de hábitos, desde ervas, subarbustos até árvores e menos comumente, lianas. Os exemplares estão distribuídos nos mais diversos biomas como Amazônia, Mata Atlântica e Cerrado (BARBOSA, 2008). Existem cerca de 44 tribos estabelecidas; entretanto, devido à grande diversidade morfológica, há certa complexidade para o estudo filogenético (DELPRETE, ANDERSON &ALBERT, 2002). Não obstante, investigações recentes apoiadas em marcadores moleculares têm proposto a divisão da família em três subfamílias: Rubioideae, Cinchonoideae e Ixoroideae (ALEXANDRINO, MORES & Da CUNHA, 2011).

1.2. A família Rubiaceae e substâncias bioativas

Inúmeros são os exemplos de metabólitos secundários com atividades biológicas isoladas de Rubiaceae, por exemplo as saponinas triterpênicas chiococcasaponinas 1, 2 e 3, das raízes de Chiococca alba, que apresentaram atividade antinflamatória (BORGES et al., 2013), as antraquinonas 4 e 5, obtidas das raízes de Prismatomeris fragrans, que exibiram moderada atividade antifúngica, antituberculose e citotóxica (5) (KWANJAI, SOMDEJ & RUCHANEE, 2005). Os flavonóides (-)- epicatequin-3-O-β-glucopyranosídeo (6), e epi-catequina (7), isolados respectivamente, das folhas de Vangueria spinosa e Galianthe ramosa, exibiram atividade antibactericida (6) (CHATTERJEE, BHATTACHARJEE & CHANDRA, 2011) e antioxidante (7) (VASCONCELOS, 2009). Os iridóides asperulosídeo (8), escanderosídeo (9) e segunosídeo (10) apresentam efeito protetor contra danos nos rins, além de propriedades antiinflamatórias e imunomoduladoras de redução de ácido úrico (8 e 9) (HOU et al., 2014), além de propriedade antidiabética (10) (AJALA & COKER, 2012). Os derivados fenólicos 11 e 12 foram isolados dos galhos de Alibertia sessilis, e

1 apresentaram atividade antifúngica (SILVA et al., 2005). As estruturas dos compostos 1-10 estão relacionadas na Figura 1, abaixo. Os metabólitos secundários mais representativos da família Rubiaceae são os alcaloides, brevemente discutidos na seção 1.3.

O R1

R2 C(O)OR HO(O)C O HO R5 R3 HO O OH R4 O 1 R= arap-rhap-(apif)-apif R1 R2 R3 R4 R5

2 R= arap-rhap-xylp 4 OH CH3 OH OMe OMe 3 R= arap-rhap 5 OH CHO OH H H

R1 O COOH H R2 O H

HO O OH O O R3 O H H H2COOCH3C HOH2C OH OGLU OGLU 6 R1=OH, R2= H, R3= β-glucopyranose 8 9 7 R1= H, R2= OH, R3= H

OCH3 OCH3 H H3CO HO OCH3 OH

O OGLC HO GLU O O H3CO O O OCH3 O O O OH O

H CO OCH OH OH OH 3 3 O OH OH 10 11 12 Figura 1- Metabólitos secundários bioativos isolados de espécies da família Rubiaceae

1.3. Alcaloides

Os alcaloides são utilizados pela humanidade desde as civilizações pré- históricas, o que dificulta conhecer a origem correta da descoberta destes compostos. Existem relatos, por exemplo, de que os Sumérios há 4000 anos a.C. já utilizavam chás

2 e infusões enriquecidos dessas substâncias, dentre eles a papoula, de Papaver somniferum, de onde se extrai o ópio (MARTINEZ, ALMEIDA & PINTO, 2009). Existem registros de que as civilizações milenares americanas Inca, Asteca, Maya, Olmeca e Tolteca também já utilizavam drogas cujos princípios ativos eram alcaloides, como a quina, a ipecacuanha e a coca (ALMEIDA et al., 2009).

Alcaloide é um termo de difícil definicão, dada a grande diversidade estrutural, propriedades físico-químicas e ações farmacológicas destas substâncias; entretanto, em muitos textos, são definidos como compostos que possuem um ou mais átomos de nitrogênio pertencente(s) a um anel heterocíclico, apresentando intensa atividade biológica quando interagem com organismos vivos (MIURA, 2009 apud COSTA, 1994; ROBBERS et al., 1997; HENRIQUES et al., 2000; LIMA, 2008).

Não existe um sistema unificado para classificação destas substâncias, em grande parte devido à sua diversidade estrutural. SOUZA (2012) salienta que os principais critérios utilizados para classificar os alcaloides são biogênese, origem biológica, além de propriedades espectroscópicas e espectrométricas. Em relação à biogênese, a maioria destas substâncias são derivados de aminoácidos, sendo este fato usado como um dos principais critério de classificação. Assim, os chamados alcaloides tropânicos, derivados do núcleo de mesmo nome, são formados a partir dos aminoácidos ornitina e arginina (OLIVEIRA, 2008), enquanto os alcalóides pirrolizidínicos, derivados do núcleo pirrolizidínico, têm sua origem a partir dos aminoácidos L-valina , L-leucina, L-isoleucina e L-treonina (MARTINEZ, et al., 2013). Os alcaloides benzilisoquinolínicos, aporfínicos, proaporfínicos, protoberberínicos, protopínicos e naftafenantridíneos são biossintetizados a partir dos aminoácidos fenilalanina e tirosina, ao passo que os alcaloides indólicos originam-se a partir do aminoácido L-triptofano (OLIVEIRA, 2008). Por sua vez, os alcaloides quinolínicos podem originar-se de duas vias distintas: a partir do aminoácido L- triptofano ou pela via do ácido antranílico (SOUZA, 2012).

Os alcaloides são conhecidos por sua acentuada ação farmacológica. Alguns são venenos potentes, como é o caso da coniina (13), presente em Conium macalatun, substância responsável pela morte do filósofo Sócrates em 399 a. C. (CORREIA, 2001), a veratramina (14), presente em Veratrum californicum Durand, (KEELER & BINN, 1966; KEELER, 1968; 1973 &1989) e a estricnina (15), obtida a partir das

3 sementes de Strychnos nux-vomica (SCHMITT & ROSSATO, 2011 apud TILLEY et al., 2003). Outros exibem acentuados efeitos anestésicos, como os alcaloides do ópio, dentre eles a morfina (16) (RYAN & STEPHAN, 2001; KLOCKGETHER, 2002; NORN, 2005). Alguns destes compostos são altamente alucinógenos, como os alcaloides tropânicos da família Solanaceae, por exemplo a atropina (17), escopolamina (18) e hiosciamina (19), associados a práticas de bruxaria na Europa da Idade Média e Renascimento (MARTINEZ, ALMEIDA & PINTO, 2009).

OH H H H

HO N O HN H N H H O coniina (13) veratramina (14) estricnina (15)

O OH

O HOH2C N H O O HO O O morfina (16) atropina (17) escopolamina (18)

O hiosciamina (19) Figura 2-Alcaloides naturais bioativos.

1.4 O Gênero Psychotria L.

Psychotria L. é o maior gênero da família Rubiaceae, pertencendo à subfamília Rubioideae e tribo Psychotrieae, compreendendo cerca de 2000 espécies organizadas em três subgêneros (com base na morfologia e distribuição geográfica): Psychotria L. (espécies de distribuição pantropical que mostram similaridades morfológicas com espécies de Psychotria asiática L.); Heteropsychotria Steyerm (espécies que ocorrem na América e mostram grandes similaridades com o gênero Palicourea Neotropical) e

Tetramerae (Hiern) R. Petit (espécies que ocorrem na África e Madagascar) (KLEIN- JÚNIOR et al., 2014).

O gênero apresenta taxonomia complexa, sendo motivo de debate entre alguns autores seja pelo elevado número de espécies na tribo ou pela relativa falta de caracteres morfológicos disponíveis para definir os grupos (NEPOKROEFF et al., 1999), razões pelas quais têm sido estreitamente relacionado aos gêneros Palicourea e Cephaellis (TAYLOR, 1996) e por vezes aos gêneros Calycodendron e Calycosia (LIBOT et al., 1987). Portanto, apenas com a utilização de caracteres morfológicos não é possível estabelecer limites que definam claramente esses gêneros.

Estudos recentes têm apontado a quimiotaxonomia, área de estudos que auxilia na classificação levando em conta os constituintes químicos das espécies, como uma ferramenta útil no sentido de contribuir para uma classificação mais efetiva das mesmas, por meio da análise da rota biossíntética dos chamados marcadores taxonômicos (DA S. BOLZANI et al., 2001). De acordo com KLEIN-JÚNIOR e colaboradores (2014), os alcaloides são a principal classe de metabólitos secundários isolados de Psychotria L. e representavam , até 2013, cerca de 60% do total de compostos isolados e caracterizados estruturalmente de espécies do gênero.

1.5 Alcaloides de Psychotria L.

Os alcaloides de Psychotria L. estão divididos em dois grandes grupos. O primeiro engloba os alcaloides indolmonoterpênicos (Tabela 1, estruturas 20 a 35) e os alcaloides indólicos (Tabela 1, estruturas 36 a 41), representando a maioria das espécies de Psychotrias brasileiras, como é o caso de P. leiocarpa (LOPES et al., 2004), P. brachyceras (Do NASCIMENTO et al., 2007), P. stachyoides (PIMENTA et al., 2010), P. umbellata (BOTH et al., 2005; KERBER et al., 2014), P. myriantha (FARIAS, 2006), P. prunifolia (FARIA, 2009), Psychotria acuminata (BERGER et al., 2012), P. capitata (WAKUI, 2014) e P. sp (MORAES, 2013), dentre outras. No segundo grupo estão os alcaloides polindólicos e quinolínicos (Tabela 1, estruturas 42 a 53) isolados de espécies como P. beccarioides (HART et al., 1974), P. forsteriana (ROTH et al., 1986), P. oleoides (LIBOT et al, 1987), P. rostrata (LAJIS, MAHMUD &,TOIA, 1993 ; TAKAYAMA et al, 2004), P. lyciiflora (JANNIC et al., 1999), P. colorata (ELISABETSKY et al., 1995) e P. glomerulata (SOLIS et al., 1997). Nos últimos anos

apareceram relatos do isolamento de alcaloides de espécies de Psychotria L, cujas estruturas não se encaixam em nenhum dos grupos citados acima, como é o caso de P. calocaropa (ZHOUA et al., 2010), P. henryi (LIU et al., 2013; LIU et al., 2014) (Ver Tabela 1, estruturas 49 a 53). ALCALOIDE ESTRUTURA ESTRUTURA ATIVIDADE REFERÊNCIA

20 N-β-D- O P. leiocarpa Analgésica FRAGOSO, N glicopiranosilvin- H antioxidante 2007; O cosamida N MATSUURA & H OGLU OGLU FETT-NETO, 2013

21 braquicerina NH OGlc P. brachyceras Efeito Do

H H O antiinflamatório e NASCIMENTO, N H capacidade 2007 H HO capturadora de H COOMe oxigênio singleto

OGLC 22 lialosídeo N P. suterella Potencial inibidor PASSOS et al., de MAO-A 2013

N H

H3COOC

23 psicolatina NH P. umbellata Ansiolítica BOTH et al., antidepressiva 2005 ; N H H H KERBER et al., GlcO 2014 O H

OCOCH3

24 lagambosídeo N P. acuminata ------BERGUER et al., 2012 N H

CH2OH OGLC H

25 5α- CO2H P. acuminata ------BERGUER et carboxiestrictosidi NH GlcO al., 2012 na O N H H

H3CO2C O 26 bahienosida B H P. acuminata ------BERGUER et OGLC P. sp al., 2012 N H3CO2C H MORAES, 2013

N H O H

OGLC

27 miriantosina NH P. myriantha ------FARIA, 2010

N H OGLU HOOC O

Tabela 1 – Alcaloides de Psychotria L.

28 desoxicordifolina COOH P. sp Inibidora MORAES, 2013 N moderada da enzina AChE. N H H COO 3

Glu O O 29 3,4- NH P. umbellata ------KERBER et al., dehidroepoxipsico O 2014 N H H H

latina GlcO

O H

OCOCH3 30 N-4-1(R)2- OH P. umbellata ------KERBER et al., hidroxipropilpsico N 2014

latina N H H H

GlcO

O H

OCOCH3

31 N-4-1(S)2- OH P. umbellata ------KERBER et al., hidroxipropilpsico N 2014 latina N H H H

GlcO

O H

OCOCH3 32 angustina O P. lacinata Inibidora das PASSOS et al., N enzimas 2013 N N H BChE, MAO-A.

OCH3 33 valesiachotamina N P. lacinata Inibidora das PASSOS et al.,

lactona O enzimas 2013. N H H BChE, MAO-A. SACCONNAY

O et al., 2014 O

OCH 34 E- N 3 P. lacinata Inibidora das PASSOS et al., valesiachotamina enzimas 2013. O N H H BChE, MAO-A. O

OCH 35 Z- N 3 P. lacinata Inibidora das PASSOS et al., valesiachotamina enzimas 2013. O N H H BChE, MAO-A.

36 10-hidroxi-iso- H O N H P. prunifolia ------FARIA, 2010 deppeaninol H O H N H

O H H H 2 C

37 10-hidroxi- H O N P. prunifolia ------FARIA, 2010 antirhina N H H H

H O H

Tabela 1 – Continuação-Alcaloides de Psychotria L.

H 38 prunifoleina O P. prunifolia Potencial SACCONNAY N

H inibidor de et al., 2014

N H monoami- H noxidases e colinesterases H 39 14- O P. prunifolia Antileishmania KATO et al, N

oxoprunifoleina H 2012.

N H O H

CH 40 bufotenina N 3 P. capitata ------RAMOS, 2008; HO H3C MOREIRA, N H 2011

+ C H 3 41 N-óxido de H O P. capitata ------RAMOS, 2008; N - bufotenina O MOREIRA, C H 3 N 2011 H

42 psicotridina HN P. Citotóxica HART et al., beccarioides 1974 N

N H

H 43 quadrigemina A N P. forsteriana Citotóxica LI et al, 2013 N BERETZ, 1985

N N

N H

44 N P. oleoides Antiplaquetária BERETZ, 1985 isopsicotridina B NH N LIBOT et al.,

NH 1987

HN N N

N H

Tabela 1 – Continuação-Alcaloides de Psychotria L.

HN 45 H P. rostrata Antibiótica TAKAYAMA et (+) quimonantina al, 2004. N

N H H

HN 46 H P. lyciiflora Analgésica JANNIC et al., meso- 1999 N quimonantina

N H H H H N 47 hodgkinsina N P. colorata Analgésica VEROTTA et al., 1998.

HN H ELISABETSKY N et al., 1995

N H H 48 glomerulatina P. glomerulata ------SOLIS et al., N N 1997

N N

H 49 psicotriasina N P. calocarpa ------ZHOUA et al, 2010

N H 50 psicotripina P.pilifera ------LI et al., 2011 H

N N

N N H H 51 ------N H P. henryi ------LIU et al., 2013;

52 ------P. henryi ------LIU et al., 2013;

N N

Tabela 1 – Continuação-Alcaloides de Psychotria L.

H 53 psicohenina N H P. henryi ------LIU et al., 2014

N H Tabela 1 – Continuação-Alcaloides de Psychotria L.

1.6 Psychotria goyazensis Müll. Arg.

Psychotria goyazensis Müll. Arg. tem como sinonímia Psychotria sunbundulata var. megapontica Muell. Arg. in Mart., Psychotria sunbundulata var. minor Müll. Arg. in Mart., e Psychotria argoviensis Steyerm, apresentando-se na forma de subarbusto ou arbusto de 0,5-2,5 m de altura, pouco ramificada.

A espécie está amplamente distribuída no Equador, Colômbia, Venezuela, Guianas e no Brasil, onde ocorre nos estados do Amazonas, Pará, Mato Grosso, Tocantins e Goiás. A inflorescência ocorre entre os meses de maio e junho e entre novembro e janeiro, sendo que a frutificação ocorre entre os meses de janeiro a abril e de maio a julho (DELPRETE, 2010). Bioensaios anteriores com esta espécie assinalam atividade insenticida nos extratos do caule (TAVARES et al., 2013). Não há relatos na literatura de estudo fitoquímico desta espécie.

2 OBJETIVOS

Tendo em vista o grande potencial das plantas da família Rubiaceae para produzir substâncias bioativas, o estudo fitoquímico de Psychotria goyazensis visa:

 O isolamento dos componentes químicos de suas folhas, galhos e frutos e posterior elucidação dos mesmos por meio de técnicas espectroscópicas (Ressonância Magnética Nuclear uni e bidimensional (RMN 1D e 2D), Infravermelho (IV) e Espectrometria de Massas (EM).

3. PARTE EXPERIMENTAL

3.1 PROCEDIMENTOS GERAIS.

O material coletado foi seco em estufa de ventilação forçada e moído em moinho de facas. Para eliminação dos solventes utilizou-se evaporador rotativo modelo MA 120 da marca MARCONI®. As colunas cromatográficas (CC) foram realizadas utilizando sílica gel 60 (0,063 - 0,200 mm), sílica gel 60 (0,05-0,200 mm) ou sílica gel 60 (0,040-0,063 mm) pelo sistema flash, além de SEPHADEX LH-20, em colunas de vidro de diâmetro e altura que variavam de acordo com a massa dos extratos a ser cromatografada. O monitoramento das colunas cromatográficas foi feito através de cromatografia em camada delgada analítica (CCD), utilizando-se placas de alumínio (sílica gel 60 F254), ou placas de vidro, confeccionadas com camada de sílica gel 60 Pf254. Para a cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP) foram utilizadas placas em suporte de vidro de 0,75 mm de espessura. Os solventes utilizados nas separações cromatográficas apresentavam grau de pureza P.A ou foram destilados. Os agentes reveladores usados foram ultravioleta -UV- (254 e 365 nm), reagente de Dragendorff (para alcaloides e compostos nitrogenados - reação positiva: coloração laranja), reagente anisaldeído (para esteroides, terpenoides e açucares-reação positiva: coloração roxa) e solução de ácido sulfúrico/metanol (1:1 v/v), seguido de aquecimento (revelador universal). Em alguns casos foi empregada a técnica de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) no modo analítico, por meio de cromatógrafo Dionex®, modelo ICS 500 DC, SP,DP,EG,TC, acoplado a detector de arranjos de diodos (DAD) Ultimat 3000, coluna analítica Acclaim®120, C18, 5 µm (4,6 x100 mm), do Laboratório de Fisiologia Vegetal do Instituto de Ciências Biológicas I da Universidade Federal de Goiás. No modo preparativo utilizou-se cromatógrafo Shimadzu®, modelo LC8A, equipado com detector UV-Vis (SPD-M20A) e coluna Shim-pack PRESP-ODS (H) 5 µm, C-18, 250 X20 mm. As amostras foram injetadas manualmente, 20 µL (analítico) e 2 mL (preparativo). Os espectros de RMN uni e bidimensionais (1H, 13C, COSY, HSQC e HMBC) foram obtidos em espectrômetro Bruker (operando a 500 MHz para 1H e a 125 MHz para 13C), sendo que os deslocamentos químicos foram dados em ppm, utilizando-se o TMS como padrão de referência interna sempre que possível. A determinação do ponto de fusão dos compostos foi realizada no fusômetro Karl Kolb e os espectros de massas

14 foram obtidos no espectrômetro de massas LTQ FT Ultra (ThermoScientific, Bremen, Germany), pelo método de ESI em modo positivo, no Núcleo de Competências em Química do Petróleo (NCQP), Universidade Federal do Espírito Santo, Vitória.

3.2 Fracionamento fitoquímico de folhas, galhos e frutos de P. goyazensis. 3.2.1 Coleta, identificação e estudo das folhas.

A primeira coleta do material (folhas, galhos e frutos) ocorreu em fevereiro de 2011 no Santuário da vida silvestre, Fazenda Vagafogo, Pirenópolis/GO, sendo a sua identificação realizada pelo Prof. Dr. Piero Giuseppe Delprete, Institut de Recherche pour le Développement (IRD), Cayenne, Guiana Francesa (França). A exsicata está depositada no Herbário da Universidade Federal de Goiás, Unidade de Conservação PRPPG, Campus II, Goiânia, GO, sob o número de registro 5705. As folhas secas e moídas (138,57 g) foram submetidas à extração com álcool etílico 99,5% (600 mL) em temperatura ambiente por uma semana com troca diária de solvente, o qual foi eliminado ao final desse período por meio de evaporador rotativo, resultando numa massa de 34,8 g de extrato etanólico bruto (EEBFI). O material obtido foi solubilizado em metanol (MeOH)/H2O 1:1 e particionado consecutivamente com os solventes hexano (Hex) (400 mL), diclorometano (300 mL), acetato de etila (AcOEt) (250 mL) e n-butanol (n-BuOH) (150 ml), obtendo-se 11,7 g de fração hexânica (FrHexFI), 7,4 g de fração diclorometânica (FrDCMFI), 1,95 g de fração acetato de etila (FrAcOEtFI), 1,04 g de fração n-butanólica (n-BuOHFI) e 10,3 g de fração hidrometanólica (FrHMFI), totalizando 32,39 g e contabilizando 93,07% de EEBF (Figura 4). Parte de FrHexFI (1,5 g) foi submetida ao fracionamento em coluna cromatográfica clássica (CC) de sílica gel 60 Merkc (Tabela 7, Anexos), utilizando os eluentes Hex e CH2Cl2 em gradiente de polaridade iniciando-se em 100% do primeiro e finalizando-se em 100% do último, de onde se coletou 206 subfrações de volumes variáveis entre 5-15 mL aproximadamente, as quais foram reunidas de acordo com seus perfis cromatográficos em CCD. As subfrações reunidas 53-79 (Hex/CH2Cl2 10%-20%, 92 mg) forneceram, após evaporação do solvente, um sólido cristalino em forma de agulhas, que recebeu o código Pgf 5. Parte de FrDCMFI (1,5 g) também foi purificada em CC (Tabela 8, Anexos) utilizando os mesmos métodos descritos para no item anterior, utilizando-se misturas de

Hex, CH2Cl2 e MeOH, iniciando-se em 100% do primeiro até 100% do último. Foram coletadas 242 subfrações de volumes variáveis entre 5 e 15 mL, as quais foram comparadas em CCD analítica e posteriormente reunidas de acordo com os perfis cromatográficos apresentados. As subfrações 53-74 (Hex /CH2Cl2, 30% - 45%, 303,6 mg) foram submetidas a novo tratamento cromatográfico (CC, Sílica gel, sílica gel 60

Merkc, Tabela 9, Anexos), utilizando-se os eluentes Hex/CH2Cl2/MeOH em gradiente de polaridade, de onde se coletaram 129 frações, reunidas de acordo com a similaridade em CCD. As subfrações reunidas 46-51 (CH2Cl2/MeOH, 15%-25%, 28,7 mg) apresentaram-se puras e receberam o código Pgf 2. Um sólido branco em forma de placas precipitou-se das subfrações reunidas 86-90 (CH2Cl2/MeOH, 30%-45%, 16,8 mg) após evaporação do solvente e recebeu o código Pgf 3. FrAcOEtFI (1,95 g) foi purificada por meio de CC (Sílica gel, sílica gel 60

Merkc, Ø = 3,0 cm e h = 20 cm, solventes Hex/CHCl3/MeOH em gradiente de polaridade, iniciando-se em 100% do primeiro e finalizando-se em 100% do último, Tabela 10, Anexos). Foram coletadas 259 subfrações, de volumes entre 5-15 mL, reunidas de acordo com sua similaridade em CCD analítica.

As subfrações reunidas 212-259 (CHCl3/MeOH, 60-70%, 258,7 mg) mostraram em CCD a presença de um composto majoritário de alta polaridade, o qual foi analisado por comparação com padrão previamente isolado de Psychotria hoffmannseggiana (NAVES, 2014). Essa amostra foi analisada em CLAE no modo analítico, e a melhor condição encontrada para isolamento deste composto foi acetonitrila (ACN)/H2O, 20:80, fluxo 1 mL/min e varredura em λ = 237, 254, 280 e 344 nm, injeção de 20 µL de amostra por análise. Esse composto, que apresentou absorção máxima em λ=222,6 nm e tempo de retenção (tr) na faixa de 4-4,7 min foi posteriormente isolado em CLAE preparativo (ACN/H2O, 20:80, fluxo 10 mL/min, varredura em λ 237 e 254 nm, injeção de 2 mL de amostra por vez, 10 injeções consecutivas, Figura 3); apresentou tr de 19,52 min e foi codificado como Pgf 1 (196 mg).

mAU Ultravioleta Ch1:237nm

325 Ultravioleta Ch2:254nm /1 9 .5 2 1

300

275 /4 .7 5 7

250

225

200 /4 .7 5 7 3 175

150 /1 9 .5 1 7

125

100

0 /5 .3 9 3

/5 .3 9 5 /2 1 .7 9 2

/6 .5 4 1

/6 .1 7 0

/2 1 .8 2 6 /7 .8 8 2 25 /1 4 .9 4 2

1 /6 .5 4 3 4

/8 .8 9 0

/6 .1 6 4

/1 6 .0 8 9

/7 .4 4 6

/7 .8 9 1

/5 .9 0 0

/8 .8 8 9

/7 .4 6 2

/9 .6 6 7 /1 6 .0 9 3

/9 .7 1 4 2

/1 7 .5 3 2

/1 1 .6 0 5

/2 4 .7 8 2

/2 4 .7 9 6

/1 4 .3 3 6

/1 7 .4 8 3 /1 7 .5 8 4

/1 7 .1 0 8

/1 1 .3 5 8 /1 1 .5 6 6

/1 3 .3 0 0 /1 3 .4 1 7 /2 6 .4 7 3

/1 4 .2 8 3 /2 8 .3 8 8

/1 3 .8 4 2 /1 4 .7 8 3 /1 5 .0 3 3 /2 8 .1 5 8

/2 6 .3 9 1

/2 8 .3 3 1 /2 9 .5 1 8 0 /2 7 .7 7 5

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 min Figura 3 – Cromatograma das subfrações que eluíram na faixa de polaridade

CHCl3/MeOH 60-70% da coluna cromatográfica da fração AcOEt das folhas: isolamento de Pgf 1.

FrnBuOHFI (1,04 g) foi submetida a uma filtração em Sephadex LH 20 (Ø = 4 cm e h = 30 cm, Tabela 11, Anexos) utilizando-se consecutivamente misturas de CHCl3 em MeOH e MeOH em H2O até 50% de H2O. Foram coletadas 120 subfrações ao todo, com volumes entre 5 e 50 mL, às quais foram agrupadas de acordo com os perfis cromatográficos apresentados. As subfrações reunidas 36-94 (ver Tabela 12, anexos)

(CHCl3 /MeOH 40-75%, 36-94), foram analisadas em CCD juntamente com padrão de ácido estrictosidínico previamente isolado, o que possibilitou a identificação do mesmo.

Extrato etanólico

(EEBFI) ●Solubilizado em MeOH/H2O, 1:1 34,8 g ●Partição líquido-líquido com os Fração solventes hexano, CH2Cl2, AcOEt, N- hidrometanólica BuOH.

Fração Fração hexânica Fração acetato de Fração N-BuOH diclorometânica Resíduo (FrHexFI) etila (FrnBuOHFI) hidrometanólico (FrDCMFI) 11,7 g (FrAcOEtFI) 1,04g 10,3 g 7,4 g 1,95 g

Pgf 5 Subfrações na faixa de polaridade Subfrações na Identificação do 92 mg faixa de polaridade ácido CHCl3/MeOH 30-45% CHCl3/MeOH estrictosidínico. 60-70%

Pgf 2-28,7 mg Pgf 1 Pgf 3-16,8 mg 196,0 mg

Figura 4 - Obtenção e fracionamento do extrato etanólico bruto das folhas (1ª coleta).

3.2.2 Estudo dos frutos de P. goyazensis.

Os frutos secos (81,12 g) foram submetidos à extração com álcool etílico 99,5 % em temperatura ambiente de acordo com o mesmo procedimento utilizado para obtenção do extrato bruto etanólico das folhas. A evaporação do solvente resultou em uma massa de 8,3 g de extrato etanólico bruto (EEBFr).

O extrato EEBFr foi solubilizado em uma solução de AcOH/H2O 1:9 e deixado sob agitação em agitador magnético (70 rpm) por 24 horas. Após este período, o extrato ácido obtido foi filtrado e iniciou-se a partição de acordo com o esquema da Figura 5. As massas e rendimentos estão relacionados na Tabela 13, Anexos.

Extrato etanólico 8,3 g

Solução aquosa ácida I ● Filtração; ●Extração com CHCl3 (4 x 50 mL).

Fração CHCl3 Solução aquosa ácida ácida II 3,44 g

●Neutralização com NH4OH até PH 7.

Solução aquosa neutra I

● Extração com CHCl3 (4x 50 mL).

Solução aquosa neutra

Fração CHCl3 neutra II 161,1 mg ●Adição de NH4OH até PH 9,10. CC SiO2 flash, Tabela 13, anexos.

CHCl3/MeOH 20-25% Solução aquosa básica I calicantina (Pgfr 1) 12,4 mg

●Extração consecutiva com CHCl3, AcOEt e N-BuOH, 4x 50 mL cada.

Fração CHCl3 básica Fração AcOEt básica 19 mg Fração n-BuOH 13 mg básica CCDP junto com CHCl básica Reunida com 3 980 mg FrAcOEt básica (Tabela 14, Anexos) ácido devido à similaridade CHCl3/MeOH 10% Resíduo 4,04 g em CCD. estrictosidínico Pgfr 2a via CCD 2,2 mg

Figura 5 - Obtenção e fracionamento do extrato etanólico bruto dos frutos.

3.2.3 Estudo dos galhos P. goyazensis.

Os galhos, depois de secos e moídos (121,2 g), foram submetidos ao mesmo procedimento aplicado às folhas e frutos para obtenção do extrato bruto. A evaporação do solvente resultou em uma massa total de 5,3 g de extrato etanólico bruto (EEBG), que foi submetido à extração ácido-base, utilizando-se metodologia já descrita, resultando nas frações e subfrações relacionadas no esquema da Figura 6. As massas e rendimentos estão relacionadas na Tabela 15, Anexos.

Extrato etanólico 5,3 g

Solução aquosa ácida I ● Filtração; ●Extração com CHCl3 (4 x 50 mL).

Solução aquosa ácida Fração CHCl3 II ácida 2,3 g ●Neutralização com ●Extração com NH4OH até PH 7 CHCl3 (4 x 50 mL). CCDP (50 mg)

CHCl3/MeOH, 9,5: 0,5 cumarina (Pgg 1) 3,6 mg Solução aquosa neutra I ácido siríngico (Pgg 2) 3,3 mg

●Extração com CHCl3 (4 x 50 mL). Solução aquosa neutra II

Fração CHCl3 neutra ●Adição de NH4OH até PH 9,10. 23 mg

Não foram isolados Solução aquosa básica I ●Extração metabólitos consecutiva com CHCl3, AcOEt e N- Fração Fração BuOH, 4x 50 mL Fração n-BuOH cada. CHCl3 AcOEt básica básica básica 30 mg 452,5 mg 25,4 mg Não foram ácido Não foram isolados estrictosidínico Resíduo 2,12 g isolados metabólitos via CCD metabólitos

Figura 6 - Obtenção e fracionamento do extrato etanólico bruto dos galhos.

3.2.4 Estudo das folhas (2º Coleta) de P. goyazensis.

As folhas secas e moídas (90,8 g) forneceram 15,35 g de extrato (EEBFII), que foi submetido à mesma metodologia clássica de extração de alcaloides, de acordo com esquema abaixo. As massas e rendimentos estão relacionadas na Tabela 17, Anexos.

Extrato etanólico (EEBFII) 15,3 g ● Filtração; ●Extração com CHCl3 (4 x 50 mL).

Solução aquosa ácida I

●Extração com CHCl3 (4 x 50 mL).

Solução aquosa Fração CHCl3 ácida II ácida 2,85 g

●Neutralização com NH4OH até PH 7

Solução aquosa neutra I

●Extração com CHCl3 (4 x 50 mL). Solução aquosa neutra Fração CHCl3 neutra II

94,8 mg ●Adição de NH4OH CC (Tabela 18, Anexos) Até PH 9,10.

CHCl /MeOH, 10-20% 3 Solução aquosa básica I Mistura Pgf 7 (4,2 mg)

●Extração consecutiva com CHCl3, AcOEt e N-BuOH, 4x 50 mL cada.

Fração n-BuOH básica Fração CHCl3 básica Fração 678,9 mg 35,3 mg AcOEt CCDP básica ácido estrictosidínico via CCD CHCl3/MeOH, 9:1 30,4 mg Não foram isolados metabóltos. Resíduo 9,89 g

Figura 7- Obtenção e fracionamento do extrato etanólico bruto das folhas/ 2ª Coleta.

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Compostos isolados e/ou identificados nas folhas, galhos e frutos de P. goyazensis.

O estudo fitoquímico de P. goyazensis levou ao isolamento dos alcaloides ácido estrictosidínico (Pgf 1) e calicantina (Pgfr 1), e da cumarina escopoletina (Pgg 1), além de possibilitar a identificação em misturas dos triterpenos ácido ursólico e oleanólico (Pgf 2), dos esteroides sitosterol e estigmasterol na forma glicosilada (Pgf 3) e livre (Pgf 5) e dos alcaloides Pgfr 2a (na mistura Pgfr 2) e harmano (na mistura Pgf 7).

1' OH

H H N N 7' N N 2' 8a 7a' 6 5 6' 9 7 3' NH B 4 B 22 4 9 COOH a 9 4a 5' 3 4 4a' H 5 5 9' 4' A 3 A 3 N 14 H 15 12 6 6 H 7a 8a 2 8a 2 17 N N 7a N N O 7 H 7 H 19 18 GlcO 1 1 H calicantina (Pgfr 1) (Pgfr 2a) ácido estrictosidínico (Pgf 1)

6 5 9 5 7 N HO 10 10 3 6 3 2 13 N H3C H 7 12 O O O harmano (Pgf 7) (Pgg 1)

29 30 29

12 13 12 11 13 25 26 11 H COOH 25 26 18 H COOH 28 18 28 2 2 3 27 3 27 5 5 HO HO

ácido ursólico (Pgf 2) ácido oleanólico (Pgf 2) Figura 8 - Compostos isolados e/ou identificados nas folhas, galhos e frutos de P. goyazensis

22 22

19 23 19 23

18 18 H H OH OH

O 3 5 O 3 5 HO HO HO O 6 HO O 6 OH OH H H sitosterol glicosilado (Pgf 3) estigmasterol glicosilado (Pgf 3)

28 28 22 22 18 23 25 18 23 25

19 19 H H

8 8 H H H H 3 5 3 5 HO 6 HO 6 sitosterol (Pgf5) estigmasterol (Pgf 5) Figura 8 – Continuação- Compostos isolados e/ou identificados nas folhas, galhos e frutos de P. goyazensis.

4.2.1. Composto Pgfr 1

H N N

B 4 9 4a 5 A 3 6 7a 8a 2 N N 7 H

Massa molecular (g. mol-1) 346,4688 Quantidade isolada (mg); percentual do extrato bruto (%) 12,4; 0,15

Fórmula molecular C22H26N4 Aspecto Sólido amarelo

O composto Pgfr 1 (12,4 mg, p.f. 242-249ºC, lit. p.f. 245 ºC, ADJIBADE et al., 1992, p.f. 251-252 ºC VEROTTA et al., 1998 °C) foi isolado da fração clorofórmica neutra dos frutos como um sólido de coloração amarela solúvel em mistura de

CHCl3/MeOH, apresentando cor azul em luz UV (254 nm) e reação positiva para o

26 reagente Dragendorff. No espectro ESI (+) FT-ICR MS (Figura 41 – Anexos) identificou-se o íon m/z 347.22132 detectado no espectro como [M+H]+ e + correspondente à fórmula molecular [C22H26N4 + H ] (massa molecular calculada: m/z 347.22302, erro de 4,90 ppm). 1 O espectro de RMN de H (CD3OD, 500 MHz-TMS, Figura 27, Anexos) de Pgfr 1 mostra quatro sinais para hidrogênios aromáticos (Figura 23, Anexos) em δ 7, 08 (dd, J = 7,9 e 1,3 Hz, 1H, H-4), δ 6,56 (ddd, J = 7,9, 7,1 e 1,3 Hz, 1H, H-5), δ 6,82 (ddd, J = 7,9, 7,1 e 1,3 Hz, 1H, H-6) e δ 6,35 (dd, J = 7,9 e 1,3 Hz, 1H, H-7), cujos padrões de multiplicidade e constante de acoplamento são compatíveis com anel aromático orto-substituido (ADJBADE et al. 1992), os quais, pelo mapa de correlações de HSQC (Figuras 28 e 29/Anexos), encontram-se correlacionados aos carbonos em e δ 124,7 (C-4), δ 117,4 (C-5), δ 127,3 (C-6) e δ 112,2 (C- 7). Na região entre δ3,00-1,0 ppm foram identificados sinais de hidrogênios metilênicos em δ 2,95 (dd, J = 11,8 e 3,4 Hz,1H, H-2a) /δ 2,48 (dd, J = 13,1 e 11,8 Hz,1H, H-2b) e em δ 2,99 (dd, J = 13,1 e 5,2 Hz,1H, H-3b) /δ 1,57 (dd, 13,1 e 3,4, 1H, H-3a) (Figura 29 – Anexos) os quais aparecem no espectro de HSQC (Figuras 30 e 33 – Anexos) correlacionados aos carbonos sp3 em δ 46,8 e δ 29,2, sugerindo a presença de hidrogênios metilênicos ligados a heteroátomo. O hidrogênio metilênico H-3a mostrou deslocamento químico atípico em relação ao seu vizinho H-3b. Isso ocorre devido ao fenômeno de anisotropia magnética, causado pela movimentação dos elétrons π do anel aromático. Essa movimentação gera um campo magnético secundário oposto a B0 (campo magnético principal) no interior do anel e alinhado a B0 do lado externo deste, levando à formação de um cone de desblindagem de modo que hidrogênios situados no interior ou próximos a este cone estarão mais desblindados e irão precessar a frequências menores do que aqueles situados do lado externo do cone. Consequentemente, estes hidrogênios externos apresentarão menores descolamentos químicos. No caso da calicantina, o cone de desblindagem gerado pelos elétrons π do anel aromático (Figura 9) desblinda o hidrogênio equatorial H-3a (que está dentro do mesmo), justificando o menor descolamento químico deste em relação a seu vizinho H-3b.

Figura 9 – Efeito anisotrópico da nuvem de elétrons π do anel aromático sobre os hidrogênios metilênicos do anel da calicantina.

O mapa de contornos de HMBC (Figuras 34 a 37 – Anexos) mostrou correlações entre H-4/C-6/C-7a, H-7/C-5/C-4a confirmando o anel dissubstituído e ainda entre H- 4/C-9 e H-3/C-4a, comprovando a conexão entre as partes aromática e alifática. Por outro lado, o experimento COSY (Figuras 38 a 40 – Anexos) permitiu verificar correlações entre os hidrogênios aromáticos H-4/H-5/H-6 e H-7 e entre os hidrogênios metilênicos diastereotópicos H-2a/2b, H-3a/3b.

Os dados espectroscópicos e espectrométricos, além da comparação com dados da literatura (ADJIBADE et al., 1992; VEROTTA, 1998; Da ROSA, 2009) permitiram a identificação da estrutura Pgfr 1 como sendo o alcaloide calicantina (Tabela 2). O espectro de massas ESI (+)-MS/MS (Figura 96 – Anexos) de Pgfr 1 mostrou a presença dos íons m/z 316 e m/z 290, referentes à perda dos fragmentos CH5N e C3H7N obtidos, de acordo com o caso, pela migração de hidrogênio e pela quebra das ligações. A proposta de fragmentação está na Figura 10.

C H 3 H C H 3 C H H 3 N N H N N N N

.. + N N + H N : N + H N N H C H 3 H H C H 3 H C H 3 m/z 347

H 3 C N H 2

C H 3 H N N

N m/z 316

C H 3 H C H 3 H C H N N 3 N N H N N N H C H 2 H 3 C

H .. .. + H N H : N + H H N : N + C H H H H 3 N H H H C H 3 m/z 347 H H

C H 3 H N N

+ N H

H m/z 290 Figura 10 - Proposta de fragmentação da calicantina (Adaptado de NAKANO & MARTIN, 1976).

Tabela 2 - Dados espectroscópicos de 1H (ppm) e RMN 13C (via HSQC e HMBC) para o composto Pgfr 1 e calicantina* Posição Pgfr1 *calicantina 13 (a) (a) 13 (a) (a) C H; multiplicidade; HMBC COSY C H; multiplicidade; J (Hz) J (Hz) 2b 46,8 2,95; dd, 11,8 e 3,4, 1H C-9/ C-3 H-2/H-3/H-3’ 47,6 2,84; dd; 12,0 e 4,0 2a 2,48; dd, 13,1 e 11,8, 1H 2,42; ddd; 13,8 12 e 4,0 3a 29,2 1,57; dd, 13,1 e 3,4,1H C-9/C-4a H-3/H-2/H-2’ 31,7 1,45; dd; 13,8 e 2,5 3b 2,99; dd, 13,1 e 5,2, 1H C-4a ------4 124,7 7,08; dd; 7,9 e 1,3 1H C-9/C-6 / H-5 125,6 7,05; d; 7,8 C-7a 5 117,4 6,56; ddd; 7,9, 7,1 e 1,3, C-7 / C-4a H-4/H-6 117,8 6,50; t; 7,8 1H 6 127,3 6,82; ddd; 7 9, 7,1 e 1,3, C-4 / C-7a H-5/H7 128,0 6,78; t; 7,8 1H 7 112,2 6,35; dd; 7,9 e 1,3 1H C-5 / C-4a H-6 113,3 6,30; t; 7,8 3a 34,8 ------36,4 ------4a 122,3 ------121,2 ------7a 144,1 ------145,8 ------8a 71,9 4,91; s; 1H C-9 / C-7a 72,8 4,71; s # a N-CH3 NO 2,63; s; 3H C-2 / C-8 41,9 2,54; s a 1 13 # δ ppm ; * H e C (300 e 75 MHz, respectivamente, CD3OD, Da ROSA, 2009). NO: Correlação não observada.

Na família Rubiaceae, este alcaloide já foi isolado de Palicourea coriacea (NASCIMENTO, 2006) e Psychotria rostrata (VEROTTA et al., 1998), dentre outras. O composto apresenta atividade anticonvulsivante (CHEBIB et al., 2003), antibiótica (ZHANG et al., 2005) e a antifúngica (ZHANG et al., 2009).

4.2.2. Composto Pgfr 2a

1' OH

H N N 7' 2' 8a 7a' 6' 3' B 4 9 4a 5' 4a' 5 9' 4' A 3 6 8a 2 7a N N 7 H

Massa molecular (g. mol-1) 362,4682

Fórmula molecular C22H26N4O

O composto Pgfr 2a foi identificado na mistura Pgfr 2 (3,4 mg), a qual foi obtida das frações reunidas clorofórmica e acetato de etila básica dos frutos como um óleo marrom, apresentando coloração azul em UV (254 nm) e reação positiva para o regente Dragendorff. 1 O espectro de RMN de H da mistura (CDCl3/CD3OD, 500 MHz -TMS, Figura 42 – Anexos) mostrou sinais para o composto já isolado Pgfr 1, além de sinais para outros três hidrogênios aromáticos em δ 6,58 (1H, H-4’) e δ 6,42-6,38 (2H, H-6’ e H-5’) (Figuras 14 e Figura 43 – Anexos), sugerindo a presença de outro anel aromático monosubstituído na estrutura. Sinais para hidrogênios em δ 2,79 (ddd; J =11,6 e 3,5; 2H; H-2a/H-2’a) / δ 2,41 (ddd; J =13,3; 11,6 e 3,5; H-2b/H-2’b) e δ 2,98 (dt, J =13,3 e 5,6; 2H, H-3b/H-3’b) / δ 1,44 (dd, J =13,1 e 3,5, H-3a/H-3’a) (Figura 15) e (Figura 44 – Anexos) sugerem a presença na estrutura de dois conjuntos distintos de grupos metilênicos diastereotópicos (2a, 2’a/3b, 3’b). Por outro lado, foram observados sinais de grupos metílicos ligados a heteroátomo em δ 2,53 (s, 3H, H-1) e δ 2,49 (s, 3H, H-1’).

O espectro bidimensional HSQC (Figuras 45 a 48 – Anexos) mostrou correlações entre os hidrogênios aromáticos e carbonos na faixa de δ 110-130 ppm (Tabela 3), deslocamentos típicos de carbonos sp2 de sistema aromático. O experimento mostra ainda (Figura 48 – Anexos), as correlações dos grupos metilênicos CH2 (2a/2’a),

CH2 (3b/3’b) e metílicos (H-1/1’) com os carbonos em δ 47,3 (C-2), δ 31,7 (C-3) e δ 42,5 (C-1/1’), respectivamente. Além disso, foram identificadas duas correlações (Figura 47 – Anexos) de hidrogênios em δ 4,66 e δ 4,54 e carbonos δ 72,3 e δ 72,6, respectivamente, sugerindo a presença de dois grupamentos metínicos distintos ligados a heteroátomo. O experimento de HMBC (Tabela 3, Figura 11 e Figuras 49 a 52-Anexos), mostrou correlações entre H-4/C-9, H-4/C-9’, H-8a/C-9/C-7 e H-8a’/ C-9’ que comprovam a união entre as unidades aromática e alifática, estabelecendo a presença das duas unidades quinolínicas. Por sua vez, a análise do experimento COSY (Figuras 54 e 55– Anexos) mostrou correlações entre os hidrogênios H- 4/ H-5/H-6 e H-7 para a unidade A, e H-4’/H-5’/H-6’, para a unidade B. Este experimento mostrou, ainda, correlação entre os hidrogênios metilênicos H-2a/2b e H-2’a/2’b e H-3a/H-3b e H- 3’a/H-3’b (Figura 55– Anexos).

1' O H

H N N 7' 23'’ 8a 7 a ' 6'

2'3’ 4 3a 4a 5' 4 a ' 5 4' 3

6 8a 2 7a N N 7 H

1 Figura 11 - Correlações de HMBC ( ) para Pgfr 2a.

A posição da substituição na unidade quinolínica B não pôde ser confirmada somente pelo deslocamento e pelo padrão de acoplamento dos hidrogênios H-4’/H- 5’/H-6’ e por este motivo, modelos estruturais reportados na literatura foram utilizados com o objetivo de atribuir corretamente a substituição. Na Figura 12 estão registrados os valores de deslocamento de 1H e 13C encontrados para as estruturas substituídas em

6’ e 4’, respectivamente; para a estrutura substituída em 7’, os dados de RMN estão na Figura 13.

6,42-6,45,m 116,8 H H 7' N 7' OH N 118,3 OH 6' 6' 138,6

5' 5' 6,42-6,45,m 117,9 116,8 4' 4' 6,42-6,45,m 118,3

1,2,3,4-tetrahydroquinolin-7-ol 1,2,3,4-tetrahydroquinolin-7-ol 1 13 RMN de H em CDCl3, 400MHz RMN de C em CDCl3, 400MHz NISHIYAMA et al., 2003 NISHIYAMA et al., 2003

6,65, d, 7,39 Hz H R N 7' 6' 7,08,t, 7,54 Hz Não foram encontrados dados de RMN de 13C 5' 6,72, d, 7,49 Hz 4'

R=C4H9 2-butyl-1,2,3,4-tetrahydro-5-quinolinol 1 RMN de H em DMSO-d6, 200 MHz FERRANTI et al., 1999.

OH OH H 7' N H 133,4 7' 142,3 7a' N 6' 6,42-6,38, m 7a' 6' 113,3 5' 6,42-6,38, m 4a' 5' 116,7 4a' 4' 4' 6,58,m 123,5

Pgfr 2a RMN de 1H emCDCl /CD OD, Pgfr 2a 3 3 13 500 MHz. RMN de C emCDCl3/CD3OD, 125 MHz. Figura 12- Estruturas usadas como modelo para elucidação de Pgfr 2a.

OH OH H 7' N H 8 7a' N 6' 6,42-6,38, m 7 6,49-6,39,m

5' 6,42-6,38, m 4a' 6 6,49-6,39,m 4' 5 6,58,m 6,49-6,39, m

Pgfr 2a 8-Hydroxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline RMN de 1H emCDCl /CD OD, 1 3 3 RMN de H em CDCl3, 400 MHz 500 MHz. NISHIYAMA et al., 2003. OH OH H 133,4 7' 142,3 N H 134,4 7' 145,5 7a' N 6' 113,3 7a' 6' 112,4 5' 116,7 4a' 5' 112,9 4a' 4' 4' 123,5 123,9

Pgfr 2a 8-Hydroxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline 13 13 RMN de C emCDCl3/CD3OD, RMN de C em CD3OD,100 MHz. 125 MHz. NISHIYAMA et al., 2003. Figura 13 - Estruturas usadas como modelo para elucidação de Pgfr 2a.

Os hidrogênios H-4’/H-5’ e H-6’ mostraram padrão de acoplamento de 2ª ordem (Figuras 14 a 17) de acordo com simulação feita por meio do uso do software WINDNMR (http://www.chem.wisc.edu/areas/reich/plt/windnmr.htm), sugerindo a presença de um sistema ABX para o anel B de Pgfr 2a. Os valores das constantes de acoplamento estão apresentados na Figura 17.

M-PGFFR45-53.011.ESP

L-PGF_FR4.012.ESP

0.15

0.07 A

0.06 0.10

6 . 3 7

6 . 3 6

7 . 0 9 6 . 3 9

0.05 6 . 3 6

7 . 1 0 7 . 0 8

6 . 5 7

6 . 8 3

Normalized Intensity

6 . 8 2 6 . 8 2

0.04 0.05

6 . 8 5 6 . 5 8

6 . 5 9

6 . 5 6

6 . 5 5

6 . 4 0 6 . 4 0

0.03 Normalized Intensity 0 0.99 0.97 0.94 0.98

0.02 6 . 3 1

7 . 0 0

7 . 0 1

6 . 3 1

6 . 7 9 6 . 5 8

6 . 5 9

7 . 0 0

6 . 5 7

6 . 5 8 6 . 2 9

7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 6.5 6.4 6.3 6.2 B

6 . 5 2

6 . 8 1 6 . 7 8

Chemical Shif t (ppm) 6 . 5 2

6 . 7 7 6 . 4 9

0.01 6 . 4 9

0 1.03 1.10 1.16 1.09 2.10 0.99

7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 6.5 6.4 6.3 6.2 6.1 Chemical Shif t (ppm) Figura 14 – Sobreposição da região expandida entre 7,0-6,0 ppm dos espectros de RMN de 1H da calicantina (A) e de Pgfr 2a (B).

Figura 15 – Sobreposição da região expandida entre 3,0-1,5 ppm dos espectros de RMN de 1H da calicantina (A) e de Pgfr 2a (B).

Figura 16 - Expansão da região entre 6,6-6,35 ppm do espectro de RMN de 1H de Pgfr 2a mostrando padrão de acoplamento ABX para os hidrogênios H-4’, H-5’ e H-6’.

Figura 17 - Simulação de espectro ABX em programa WINDNMR-Pro. para Pgfr 2a;

Constantes de acoplamento: JAB=5,8; JAX=0.8; JBX=6.1 Hz.

A análise mostrou maior similaridade entre os dados de RMN de 1H e 13C para as estruturas substituídas na posição 7’. Além disso, as correlações no espectro HMBC

35 dos hidrogênios H-5’/H-6’ com o carbono quaternário em δ 142,3 (C-7’) sugerem a substituição pela hidroxila na posição indicada.. No espectro ESI(+) MS (Figura 56 - Anexos) identificou-se o íon m/z 363,21805 + detectado como [M+H]+ e correspondente à fórmula molecular [C22H27N4O + H] (massa molecular calculada: m/z 363,21794 e com o erro de -0,3 ppm), confirmando a presença da hidroxila na estrutura. No espectro de ESI(+)-MS/MS do íon m/z 363,21 (Figura 97 – Anexos), foram observados os mesmos fragmentos presentes no espectro de fragmentação da calicantina, acrescidos de 16 (Figura 18).

O H C H 3 H C H 3 O H C H O H H 3 N N H N N N N

.. + N N + H N : N + H N N H C H 3 H H C H 3 H C H 3 m/z 363

H 3 C N H 2

C H 3 O H H N N

N m/z 332

C H 3 H O H C H 3 O H H C H N N 3 O H N N H N N N H C H 2 H 3 C

H .. .. + H N H : N + H H N : N + C H H H H 3 N H H H C H 3 H H m/z 363

C H 3 H O H N N

+ N H

H m/z 306

Figura 18- Proposta de fragmentação para o alcaloide Pgfr 2a

Tabela 3 - Dados espectroscópicos de 1H (ppm) e RMN 13C (via HSQC e HMBC), HMBC e COSY para Pgfr 2a. Posição δc δH; (ppm) multiplicidade; HMBC COSY J(Hz) 2a 47,3 2,79; dd; 11,6 e 3,5; 1H C-9/ C-3 H-2/H-3/H-3’ 2,41; ddd; 13,3; 11,6 e 3,5; 2b 1H 3a 31,4 1,44; dd; 13,1 e 3,5 1H C-9 H-3/H-2/H-2’ 2,98 dt, 13,3 e 5,6; 1H 3b 4 125,6 7,00; dd; 7,9 e 1,3 Hz, 1H. C-9/C-6 / H-5 C-7a 5 117,1 6,50; ddd; 7,9, 7,2 e 1,3 Hz, C-7 / C-4a H-4/H-6 1H 6 128,4 6,79; ddd; 7,9, 7,2 e 1,3 Hz, C-4 / C-7a H-5/H7 1H 7 113,6 6,29; dd; 7,9 e 1,3 Hz,1H C-5 / C-4a H-6 3a 35,6 ------4a 124,5 ------8a 72,6 4,54; s; 1H C-1a/ C-2 ---- 2’a 47,3 2,79; dd; 11,6 e 3,5; 1H C-9 H-2’/H-3’/H- 2,41; ddd; 13,3; 11,6 e 3,5; 3’ 2’b 1H 3’a 31,4 1,44; dd; 13,1 e 3,5 1H ------2,98 dt, 13,3 e 5,6; 1H C-9’ H-3’/H-2’/H- 3’b 2’

4’ 116,6 6,58; ABXm; JBX=6,1 Hz e C-6’ / H-5’ JAX=0.8 Hz; 1H C7a’/C-9’/ 5’ 116,7 6,40; ABXm; JAB=5,8 Hz; 2H C-7’ / C-4a’ H-4’/H-6’

6’ 113,3 6,40; ABXm; JAB=5,8 Hz; 2H C-4’ / C-7a’ H-5’/H-7’

7’ 142,3 ------3a’ 35,6 ------4a’ 123,3 ------7a’ 133,4 ------8a’ 72,3 4,66; s, 1H C-9’ / C-7a’ ------

N-CH3, 1 42,5 2,53; s; 3H C-2 / C-8 ------42,5 2,49; s;3H C-2’ / C-8a’ N-CH3, 1’

4.2.3. Composto Pgf 1

9 6 A 8 5 OH 11 NH 2 3 18 N H 19 6' H O H H 14 OH O 20 OH 15 21 H 1' HO 3' O C 16 HOOC 22 17 B ácido estrictosidínico. Massa molecular (g. mol-1) 518,2035 Quantidade isolada (mg) / percentual do extrato bruto (%) 196; 0,56 Massa das subfrações enriquecidas deste composto (g) / percentual do 1,16; 3,33 extrato bruto (%)

Fórmula molecular C26H34N2O9 Aspecto Sólido amarelo

O composto Pgf 1 (196,0 mg) (p.f. 237-240ºC, lit. p.f. 238-241ºC, HAMZAH et al., 1994) foi isolado da fração acetato de etila das folhas e identificado na fração n- BuOH das folhas, galhos e frutos de P. goyazensis, apresentando-se como um sólido amarelo amorfo solúvel em MeOH, com coloração azul escuro em UV (254 nm) e reação positiva para o reagente de Dragendorff. 1 A análise conjunta dos espectros de RMN de H e HSQC (CD3OD, 500 MHz – TMS, Figuras 57 e 64 - Anexos) revelou a presença das unidades tetrahidro-β- carbolínica (A), secologanina (B) e glicosídica (C) para Pgf 1 sendo a unidade tetrahidro-β-carbolina (A) identificada com base na presença de quatro sinais de hidrogênios aromáticos em δ 7,45 (dt, J = 8,1 e 0,9 Hz, 1H, H-9), δ 7,31 (dt, J = 8,1 e 0,9 Hz, 1H, H-12), 7,12 (ddd, J = 8,1, 7,1 e 0,9 Hz, 1 H, H-11) e δ 7,03 (ddd, J = 8,1, 7,1 e 0,9 Hz, 1H, H-10) (Figura 58 – Anexos), correlacionados aos carbonos em δ 119,5 (C-9), δ 111,1 (C-12), δ 122,1 (C-11) e δ 118,8 (C-10) (Figura 63 – Anexos) e dos dois grupos de hidrogênios metilênicos em δ 3,71 (dd, J = 5,2 e 2,0, 1H, H-5a)/δ 3,23 (d, J = 5,2, 1H, H-5b), e δ 3,08 (ddd, 7,8, 5,4 e 2,2 Hz, 1H, H-6a) / δ 3,07-2,98 (m, 1H, H-6b), correlacionados aos carbonos em δ 43,0, δ 19,6, respectivamente (Figura 64 - Anexos).

A unidade secologanina (B) foi identificada com base nos sinais de hidrogênios vinílicos em δ 5,32 (dt, J =17,44 e 1,3 Hz, 1H, H-18b) e δ 5,21(dt, J =10,6 e 1,3 Hz, 1H, H18a) (Figura 59 – Anexos) e na presença de um sinal de hidrogênio olefínico característico do anel secologanínico em δ 7,55 (s, 1H, H-17), correlacionados a carbonos com deslocamentos químicos característicos da unidade B (Tebela 4). Por outro lado, a unidade glicosídica com a configuração β (C) foi identificada pela presença de sinais característicos entre em δ 4,82 (d, J =7,9 Hz, 1H, H-1’) e dos demais observados na região entre δ 4,01- 3,00 ppm (Figura 60 – Anexos). Por meio da análise do mapa de correlações de HMBC (Tabela 4 e Figuras 66 a 69 - Anexos) foi possível observar correlações entre H-9/C- 7/C-11/C-13, H-12/C-8/C- 10, H-5a, b/C-3/C-6/C-7 e H-6, b/C-2/C-5/C-7 que ratificam a presença da unidade A em Pgf 1 (Figura 19). Do mesmo modo, correlações entre H-20/C-14/C-18/C-21 e H- 21/C-15/C-19/C-20 corroboram a presença da unidade B (Figura 20). A conexão entre as unidades A e B pode ser inferida pelas correlações observadas entre os hidrogênios diastereotópicos H-14b (δ 2,36, ddd, J = 13,3, 13,0 e 3,3 Hz, 1H) e H-14a (δ 2,11, ddd, J = 13,0, 12,3 e 4,5 Hz, 1H) e os carbonos C-2, C-3, C-15 e C-16 (H-14a/C-3/C-15 e H- 14b/C-2/C-3/C-16), ao passo que a conexão entre as unidades B e C foi estabelecida com base na correlação J3 existente entre H-1’/C-21 (Figura 21). A comparação dos dados espectroscópicos de Pgf 1 com os disponíveis na literatura (HAMZAH et al., 1994; NAVES, 2014) permitiram identificar este composto como o alcaloide ácido estrictosidínico (Tabela 4). A configuração relativa de Pgf 1 (Figura 22) foi estabelecida com base nas constantes de acoplamento entre H-3, H-14,

H-15, H-18, H-19, H-20 e H-21, relacionadas na sequência: JH3-H14b = 11,8 Hz (ax-ax),

JH3-H14a = 3,3 Hz (ax-eq), JH15-H14b = 4,5 Hz (ax-eq), JH19-18b = 10,7 Cis, JH19 -18a = 17,4 Trans,

JH20-21 = 9,1 Hz (ax-ax).

9 6 8 7 1 0 5

1 1 N H 1 3 2 3 N 1 2 H 1 4

Figura 19 - Correlações de HMBC ( ) para a unidade A de Pgf 1.

1 8

1 4 b H H

1 4 a H 2 0 1 5 2 1 H

O 1 6 H O O C 2 2 1 7

Figura 20 - Correlações de HMBC ( ) para a unidade B de Pgf 1.

9 6 8 A 5 O H 1 1 N H 2 3 1 8 N H 1 9 6 ' H O H H 1 4 O H O 2 0 O H 1 5 2 1 H 1 ' H O 3 '

O C 1 6 H O O C 2 2 1 7 B Figura 21 - Correlações de HMBC ( ) que sustentam a conexão entre as unidades A, B e C de Pgf 1.

9 6 11 8 7 5 H 13 NH N H H b 3 14 a H 18 H H H OHH O H 6' 15 19 4' H 21 O 22 20 2' O 1' HO H 3' HOOC 16 H H H

Figura 22 - Configuração relativa do composto Pgf 1. Adaptado de NAVES, 2014.

O ácido estrictosidínico foi isolado de diversas espécies de Rubiáceas, gênero Ophiorrhiza, como 0. filistipula, (ARBAIN et al,. 1993), O. communis e O. tomentosa (HAMZAH et al., 1994), mais tarde também nos gêneros Palicourea, a partir das raízes

41 de Palicourea couriacea (NASCIMENTO, 2006) e flores de Palicourea rígida (ROSA, 2009) e também de várias espécies de Psychotria L. (P. mirianta-FARIAS, 2006, P. barbiflora-OLIVEIRA, LEMOS & CONSERVA, 2013, e P. hoffmannseggiana- NAVES, 2014). O ácido estrictosidínico apresenta atividades analgésica e antipirética (REANMONGKOL et al., 2000), atividade quimiotática, que sugere atividade inflamatória aguda (SIMOES-PIRES et al, 2006), além de atividade sobre o Sistema Nervoso Central de ratos (FARIAS et al,2010; FARIAS et al, 2012), o que sugere que este alcaloide pode apresentar efeito promissor nesta região do cérebro. Este composto demonstrou ser o majoritário da espécie, tendo sido isolado em quantidades apreciáveis da fração acetato de etila das folhas, além de ter sido identificado em diversas outras frações trabalhadas. Este fato aponta uma tendência que algumas espécies de Psychotria L. vêm apresentando para biossíntese majoritária de alcaloides indolmonoterpênicos, como P. brachyceras (alcaloide braquicerina) e Psychotria hoffmannseggiana (também com o ácido estrictosidínico).

4.2.5.1. Identificação do ácido estrictosidínico nas frações N-butanólica das folhas (1ª e 2ª coletas) e nas frações N-butanólicas básicas dos galhos e frutos.

O ácido estrictosidínico foi detectado na fração butanólica das folhas (subfrações Fr 5, Fr 6 e Fr 7, ver Tabela 11 - Anexos) e nas frações butanólica básica dos galhos e frutos. A identificação foi feita por meio da co-injeção das amostras indicadas com solução preparada a partir do padrão previamente isolado, utilizando-se λ de absorção máxima (222-222,8 nm - Figura 23). Devido à semelhança entre os cromatogramas (o composto apresentou tempo de retenção sempre na faixa entre 4-5 min e absorção máxima em λ que variam entre 222-223 nm em todos eles), foi escolhido apenas um representativo do conjunto (Figura 24).

INJ PADRAO A M 60 40 #1 inj padrao Agua/MEOH 60:40 UV_VIS_1 Peak #1 100% at 4.16 min 400 60.0 mAU WVL:220 nm % 50% at 4.09 min: 999.80

1 -50% at 4.24 min: 999.94 222.8

50.0 Wvl Wvl = 223.0 300

40.0

196.9 200 30.0

20.0

100 10.0 273.0

SB1 SB2 0.0

min nm -50 -10.0 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.23 190 300 400 500 600 700 800 Tempo de retenção (min): 4,15 Área do pico (mAU. mim): 60,2138 Altura do pico (mAU): 350,4671

Figura 23 – Cromatograma da solução padrão de ácido estrictosidínico (0,01 mg/mL), com absorção máxima em 222,8 nm.

BUOH FR 5 E PADRAO #1 BUOH Fr 5 e padrao UV_VIS_1 Peak #1 100% at 4.82 min 500 60.0 mAU WVL:223 nm % 50% at 4.75 min: 998.93

-50% at 4.90 min: 999.80 1 222.7 50.0 400

40.0

300 199.8 30.0

200 20.0

272.9 100 10.0

0.0 SB1 SB2

min nm -50 -10.0 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.76 190 300 400 500 600 700 800 Tempo de retenção (min): 4,82 Área do pico (mAU. mim): 73.9675 Altura do pico (mAU): 434,7496 Figura 24 – Cromatograma da solução padrão de ácido estrictosidínico + fração n- BuOH dos frutos, mostrando aumento da área e altura do pico correspondente ao composto majoritário, com absorção máxima em 222,7 nm. Os cromatrogramas para as ineções das demais frações mostraram-se muito semelhante a este.

Tabela 4 - Dados de RMN 1H e 13C (via HSQC e HMBC) do composto Pgf 1 e ácido estrictosidínico*. Posição Pgf 1 Ácido estrictosidínico* 13 a a 13 a a C δH ; multiplicidade; HMBC C δH ; multiplicidade; J (Hz) J (Hz) 2 130,1 ------128,9

3 51,1 4,41; d; 12,3; 1H C-2 / C-5 / C- 50,9 4,32; dd; 3,4 e 12,3 6/C-7/C14 5a 43,0 3,71; dd; 2,2 e 5,2; 1H C-3 / C-6 / 41,7 3,61; dd; 2,0 e 5,4 5b 3,23; d; 5,2; 1H 3,09; d; 5,4 6a 19, 6 3,08; ddd; 7,8; 5,4 e 2, 2,1H C-2 / C-5 / C-7 18,3 2,93; ddd; 2,0; 5,4 e 7,6 6b 3,07-2,98 m; 1 H 2,84-2,92; m 7 106,7 ------105,7 ---- 8 126,1 ------126,0 ----- 9 119,5 7,45; dt; 0,9 e 8,1; 1H C-7/C-11/ C- 117,6 7,34; ddd; 0,9, 1,1 e 8,0 13 10 118,8 7,03; ddd; 0,9; 7,1 e 8,1; 1H C-12 / C-8 119,1 6,9; ddd; 1,1; 7,1; 8,0 11 122,1 7,12; ddd; 0,9; 7,1 e 8,1; 1H C-12 / C-9/C- 122,0 7,02; ddd; 1,1; 7,1 e 8,0 13 12 111,1 7,31; dt; 0,9 e 8,1; 1H C-10 / C-8 110,9 7,21; ddd; 0,9, 1,1 e 8,0 13 136,3 ------136,6 ----- 14a 33,6 2,11; ddd; 4,5; 12,3 e 13,0; 1H C-3 / C-15 33,7 2,26; ddd; 3,4; 12,7 e 14b 2,36; ddd; 3,3; 13 e 13,0; 1H C-15 14,0 2,02; ddd; 4,3; 12,3 e 14,0 15 32,1 2,98; ddd; 4,8; 4,5 e 13,0; 1H C-14 / C-17 / 32,9 2,88; ddd; 4,3; 4,7 e C-21 / C-20 12,7 16 112,5 ------112,0 ---- 17 151,1 7,55; s, 1H C-15 / C-16 / 152,0 7,47; s C-19 / C-20 18a 117,4 5,21; dt; 1,3 e 10,6; 1H C-21 / C-22 117,7 5,21; ddd; 0,9, 1,6 e 18b 5,32; dt; 1,3 e 17,4; 1H 17,4 5,1; ddd; 0,9, 1,6 e 10,7 19 135,3 5,85; ddd; 7,6; 10,5 e 17,4; 1H C-20 / C-21 134,9 5,75; ddd; 8,0; 10,7 e 17,4 20 44,4 2,71; ddd; 4,8; 8,0 e 9,5; 1H C-14 / C-18 / 44,3 2,60; ddd; 4,7; 8,0 e 9,4 C-21 21 95,5 5,82; d; 9,1; 1H C-15 / C-19 / 95,1 5,72; d; 9,4 C-20 / C-1’ 22 174,1 ------174,5 ---- 1’ 99,1 4,82; d; 7,9; 1H C-21 / C-3’ 99,0 4,73; d; 7,8 2’ 70,5 3,22-3,21; dd; 7,9 e 9,2; 1H C-3’ / C-1’ 73,4 3,13; dd; 7,8 e 9,0 3’ 76,3 3,42-3,40; t; 9,1; 1H C-2’ / C-4’ / 76,8 3,33; t; 9,0 C-5’ 4’ 72,3 3,22-3,21; dd; 9,8 e 9,5; 1H C-3’ e C-6’ 70,2 3,15; dd; 9,0 e 9,6 5’ 77,1 3,42-3,40; ddd; 2,0; 6,8 e 9,6; 1H C-1’ / C-6’ 77,3 3,30; ddd; 2,2; 6,8 e 9,6 6’a 61,7 3,68; dd; 7,1 e 11,8; 1H C-4’ 61,7 3,58; dd; 6,8 e 11,8 6’b 4,02; dd; 2,2 e 11,8; 1H 3,91; dd; 2,2 e 11,8 a 1 13 δ em ppm; * H e C (500 e 125 MHz, respectivamente, CD3OD, NAVES, 2014).

4.2.4 - Mistura Pgf 7

6 5 9 7 N 10 3 13 N H 12 harmano Massa molecular (g. mol-1) 182,2213

Fórmula molecular C12H10N2

A mistura Pgf 7 foi obtida da fração clorofórmica neutra das folhas, segunda coleta. O alcaloide harmano foi identificado nesta mistura inicialmente por comparação com padrão previamente isolado em CCD. Para confirmar a presença deste alcaloide, os dados de RMN 1D e 2D foram 1 analisados. O espectro de RMN de H (CDCl3-TMS, Figura 70 - Anexos) apresentou seis sinais de hidrogênios aromáticos em δ 8,37 (d, J = 5,6 Hz, 1H, H-5), δ 7,84 (d, J = 5,6, Hz,1H, H-6), δ 8,13 (dt, J = 0,9 e 7,9 Hz, Hz, 1H, H-9), δ 7,31 (ddd, J = 2,4 Hz, 6,5 Hz e 7,9 Hz, 1 H, H-10) e 7,59-7,55 (m, H-11 e H-12, 2H) (Figura 71 - Anexos). O sinal δ 2,86 (3 H) foi atribuído ao grupo metílico presente na estrutura (Figura 72 – Anexos). O experimento HSQC (Figura 73 – Anexos) mostrou correlações dos hidrogênios aromáticos H-5/H-6/H-9/H-10/H-11/H-12 com os carbonos sp2 em δ 138,3,

δ 112,9, δ 121,1, δ 119,2, δ 127,3 e δ 111,1, e ainda a correlação de H-1(CH3) com o carbono em δ 19,8 (Figuras 74 e 75 – Anexos). O espectro bidimensional HMBC (Figura 76 – Anexos) mostrou correlações entre H-9/C-7/C/13, H-12/C-10/C-13, H-10/C-12, H-11/C-13, compatíveis com anel indólico, e ainda entre H-5/C-3/C-6/C-7 e H-6/C-2, caracterizando a unidade β- carbolínica (Figura 77 – Anexos). A posição da metila foi estabelecida com base nas correlações observadas entre os hidrogênios em δ 2,86 e os carbonos C-2 e C-3 (Figura 78 – Anexos). A análise em CCD com padrão previamente isolado, os dados espectroscópicos (Tabela 5) e a comparação com dados da literatura (NAVES, 2014) levaram à identificação do alcaloide harmano na mistura Pgf 7.

O alcaloide harmano ocorre com frequência em espécies da família Rubiaceae (MUKHTAR et al., 2012), sendo também muito comum em espécies da família Passifloraceae. Dentre as principais atividades biológicas conferidas a este composto destacam- se os efeitos mutagênico (FUNAYAMA et al., 1996), psicomimético e alucinógeno (GLENNON et al., 2000), analgésico (VEROTTA et al., 2002) e inibidor da enzina acetilcolinesterase (KHORANA et al, 2012).

Tabela 5 - Dados espectroscópicos de 1H (ppm) e RMN 13C (via HSQC e HMBC) para Pgf 7 e harmano* Pgf 7 *harmano 13 (a) (a) 13 (a) (a) Posição C δH; multiplicidade; HMBC C δH; J (Hz) multiplicidade; J (Hz) 2 134,8 ---- 134,7 --- 3 141,2 141,8 --- 5 138,3 8,37; d; 5,6 C-3 / C-6 / C-7 138,7 8,34; d; 5,2 6 112,9 7,84; d; 5,6 C-2 113,2 7,82; d; 5,2 7 127,9 ------128,6 ---- 8 122,2 ------122,1 ---- 9 121,1 8,13; dd; 0,9 e 7,9 C-7/C-13 121,9 8,11; ddd; 0,9 e 1,1 e 8,0 10 119,2 7,31; ddd; 2,4, 6,5 e C-12 120,4 7,29; ddd; 2,2 e 6,0 7,9 e 8,0 11 127,3 7,59-7,55; m ---- 128,5 7,51 - 7,58; m 12 111,1 7,59-7,55; m C-8/C-10/C-13 111,8 7,51 - 7,58; m 13 140,6 ------140,3 ----

CH3 19,8 2,86; s C-2 / C-3 20,4 2,83; s 1 13 * H e C (500 e 125 MHz, respectivamente; δ ppm; CDCl3); NAVES, 2014.

4.2.5 Composto Pgg 1 5 HO 10 3 6

H C 2 3 7 O O O Massa molecular (g. mol-1) 192, 16812

Fórmula molecular C10H8O4 Quantidade isolada/percentual do extrato bruto 3,6; 0,06

O composto Pgg 1 (3,6 mg) foi primeiramente identificado por meio de CCD com padrão previamente isolado de Psychotria hoffmannseggiana (NAVES, 2014). Foi obtido da fração clorofórmica ácida dos galhos e apresentou-se na forma de um óleo de coloração esverdeada solúvel em clorofórmio, com intensa coloração azul em UV (254 nm e 366 nm). 1 No espectro de RMN de H (CDCl3, 500 MHz, Figura 79 - Anexos) de Pgg 1 foram identificados dois dubletos em δ 7,61(d, J = 9,5, Hz, 1H, H-4) e δ 6,28 (d, J = 9,5, Hz, 1H, H-3, Figura 80 – Anexos) correspondentes à ligação dupla α, β insaturada, cujo valor da constante de acoplamento (9,5 Hz) é compatível com sinal de hidrogênios vicinais olefínicos de anel lactônico de cumarina (MURRAY, et al., 1982), enquanto em δ 6,93 (H-5) e δ 6,85 (H-8) foram observados dois singletos com integração para um hidrogênio cada um, atribuídos a hidrogênios do anel aromático tetrassubstituído. Um singleto em δ 3,98 (Figura 81 – Anexos) com integração para três hidrogênios e correlacionados ao carbono em δ 55,8 pelo mapa de correlações de HSQC (Figura 84 – Anexos), foi atribuído a um grupamento metoxila. O espectro de 13C (via HSQC e HMBC, Figuras 86 e 87 – Anexos e Tabela 6) de Pgg 1 mostrou a presença do esqueleto básico de cumarina com sinais característicos de carbono carbonílico em δ 161,6 (C-2) e dos carbonos sp2 em δ 143,1 e δ 113,3, correspondentes à ligação dupla α, β insaturada do anel lactônico. Foram identificados ainda sinais de carbonos quaternários em δ 149,4 (C-6), δ 150,1 (C-9), δ 111,7 (C-10) e δ 144,1 (C-7). O mapa de correlações de HMBC de Pgg 1 (Figura 86 – Anexos) revelou correlações entre H-3/C-2, H-4/C-2, H-8/H-5/C-6, H-4/H-5/C-9, H-5/C-4/C-9/C-10 e H-6/H-8/C-10, confirmando a presença e união dos dois anéis aromáticos. Foi verificada ainda uma correlação entre o grupamento metoxila e o carbono quaternário C-7. As demais correlações podem ser vistas na Tabela 6. A análise prévia em CCD, os dados espectroscópicos, e a comparação com dados da literatura levaram à identificação de Pgg 1 como a isoescopoletina, substância comum em espécies da família Rubiaceae.

Tabela 6 - Dados espectroscópicos de 1H (ppm) e RMN 13C (via HSQC e HMBC) para Pgg 1 e isoescopoletina*. Posição Pgg 1 *Isoescopoletina 13 (a) (a) 13 (a) (a) C δH; multiplicidade; HMBC C δH; multiplicidade; J (Hz) J (Hz) 2 161,6 ------161,1 ----- 3 113,1 6,28; d; 9,5 C-2 / C-10 113,3 6,27; d; 9,5 4 142,7 7,61; d; 9,5 C-2 / C-9 143,1 7,60; dd; 0,9 e 9,5 5 103,4 6,93; s C-4/C-9/C-10 103,1 6,92; d; 0,9 6 149,4 ------149,4 ----- 7 144,1 ------144,6 ----- 8 106,8 6,85; s C-6/C-7/C-9 107,3 6,85; s 9 150,1 ------150,7 ----- 10 117,4 ------111,7 -----

O-CH3 55,8 3,98; s C-7 56,1 3,96; s 1 13 a * H e C (500 e 125 MHz, respectivamente; δ ppm; CDCl3,); NAVES, 2014.

4.2.6. Mistura de Pgf 2.

29 30 29

12 13 12 11 13 25 26 11 H COOH 25 26 H COOH 18 28 18 28 2 2 27 3 3 27 5 5 HO HO

Proveniente de Fração diclorometânica das folhas Massa molecular (g. mol-1) 456,6803 Massa mistura (mg) / percentual do extrato bruto (%) 27,8; 0,08.

Fórmula molecular C30H4O3 Aspecto Sólido branco

Dados espectroscópicos de ácido ursólico

1 RMN H (CDCl3/CD3OD, 500 MHz, Figura 95 – Anexos): δ 0,98 (s; 3H, H-24), 0,82 (s; 3H, H-25), 0,93 (s; 3H, H-26), 0,87 (s; 3H, H-27), 1,10; s; 3H, H-28), 0,87 (d; 6,7; 3H, H-29), 0,92 (d; 5,9; 3H, H-30), 3,22 (dd; 11,9 e 4,3; 1 H, H-3), 2,19 (d; 11,3; 1H, H-18), 5.25(t; 3.5; 1H, H-12).

13 RMN C (CDCl3/CD3OD, Figura 96 – Anexos): δ 38,6 (C-1), 28,8 (C-2), 79,3 (C-3), 39,0 (C-4), 55,3 (C-5), 18,4 (C-6), 33,1 (C-7), 39,5 (C-8); 47,6 (C-9), 37,0 (C-10), 23,3 (C-11), 122,5 (C-12), 138,6 (C-13), 42,0 (C-14), 29,2 (C-15); 24,5 (C-16); 47,6 (C-17), 53,0 (C-18), 39,0 (C-19), 38,9 (C-20), 30,5 (C-21), 36,8 (C-22), 28,4 (C-23), 16,1 (C- 24), 15,3 (C-25), 17,0 (C-26), 23,5 (C-27), 180,9 (C-28), 17,1 (C-29), 21,0 (C-30).

Dados espectroscópicos de ácido oleanólico

1 RMN H (CDCl3/CD3OD, 500 MHz, Figura 95 – Anexos): δ 0,92 (s; 3H, H-24), 0,79 (s; 3H, H-25), 0,91 (s; 3H, H-26), 0,77 (s; 3H, H-27), 1,11; s; 3H, H-28), 0,87 (d; 6,7; 3H, H-29), 0,98 (d; 5,9; 3H, H-30), 3,22 (dd; 11,9 e 4,3; 1 H, H-3), 2,83 (2,83; dd;14.2 e 4,1; 1H, H-18), 5.25(t; 3.5; 1H, H-12).

13 RMN C (CDCl3/CD3OD, Figura 96 – Anexos): δ 38,6 (C-1), 28,8 (C-2), 78,3 (C-3), 39,0 (C-4), 55,3 (C-5), 18,4 (C-6), 33,1 (C-7), 39,5 (C-8); 47,6 (C-9), 37,0 (C-10), 23,3 (C-11), 122,5 (C-12), 144,1 (C-13), 42,0 (C-14), 29,2 (C-15); 24,5 (C-16); 47,6 (C-17), 53,0 (C-18), 39,0 (C-19), 38,9 (C-20), 30,5 (C-21), 36,8 (C-22), 28,4 (C-23), 16,1 (C- 24), 15,3 (C-25), 17,0 (C-26), 23,5 (C-27), 181,1 (C-28), 34,1 (C-29), 23,4 (C-30).

4.2.7 Mistura Pgf 3

19 23 22 19 23 18 H 18 OH H OH O 3 5 HO O 3 5 HO HO O 6 HO O 6 OH OH H H Sitosterol glicosilado Estigmasterol glicosilado Proveniente de Fração diclorometânica das folhas Massa molecular (g. mol-1) 576,8473/574,8314 Massa mistura (mg) / percentual do extrato bruto (%) 16,8; 0,05.

Fórmula molecular C35H60O6; C35H58O6 Aspecto Sólido branco/forma de placas

Dados espectroscópicos de sitosterol glicosilado

1 RMN H (CDCl3/CD3OD, 500 MHz - Figura 99 – Anexos): δ 0,65-1,10 (envelope de sinais de metilas; H-18, H-19, H21, H-26, H-27 e H-29), 3,57-3,65 (m, H-3), 5,3 (d; 5,1 Hz, H-6) e 3,15- 4,37(sinais de unidade glicosídica).

13 RMN C (CDCl3/CD3OD, 500 MHz –TMS, via HSQC e HMBC): δ 12,1 (C-29), 12,2 (C-18), 19,1 (C-21), 19,2 (C-27), 19,6 (C-19), 21,0 (C-26), 22,1 (C-11), 23,5 (C-28); 24,8 (C-15), 26,5 (C-23), 28,2 (C-16), 29,6 (C-25), 30,1 (C-2), 32,1 (C-7), 32,3 (C-8); 34,4 (C-22); 36,6 (C-20), 36,9 (C-10), 37,2 (C-1), 40,1 (C-12), 42,7 (C-13), 39,0 (C-4), 46,9 (C-24), 49,9 (C-9), 55,8 (C-17), 57,2 (C-14), 79,4 (C-3), 122,3 (C-6), 141,3 (C-5), 63,3 (C-6’), 71,1 (C-4’), 73,8 (C-2’), 76,8 (C-5’), 77,0 (C-3’), 102,8 (C-1’).

Dados espectroscópicos de estigmasterol glicosilado

1 RMN H (CDCl3/CD3OD, 500 MHz, Figura 99 – Anexos): δ 0,65-1,10 (envelope de sinais de metilas; H-18, H-19, H21, H-26, H-27 e H-29), 3,57-3,65 (m, H-3), 5,3 (d; 5,1 Hz, H-6), 5,14 (dd: 15,1 e 9,0 Hz, H-22), 5,01 (15,1 e 6,0 Hz, H-23), e 3,15- 4,37(sinais de unidade glicosídica).

13 RMN C (CDCl3/CD3OD, 500 MHz –TMS, via HSQC e HMBC): δ 12,1 (C-29), 12,2 (C-18), 19,1 (C-21), 19,2 (C-27), 19,6 (C-19), 21,0 (C-26), 22,1 (C-11), 23,5 (C-28); 24,8 (C-15), 26,5 (C-23), 28,2 (C-16), 29,6 (C-25), 30,1 (C-2), 32,1 (C-7), 32,3 (C-8); 34,4 (C-22); 36,6 (C-20), 36,9 (C-10), 37,2 (C-1), 40,1 (C-12), 42,7 (C-13), 39,0 (C-4), 46,9 (C-24), 49,9 (C-9), 55,8 (C-17), 57,2 (C-14), 79,4 (C-3), 122,3 (C-6), 130,1 (C-23), 138,3 (C-23), 141,2 (C-5), 63,3 (C-6’), 71,1 (C-4’), 73,8 (C-2’), 76,8 (C-5’), 77,0 (C- 3’), 102,8 (C-1’).

4.2.8. Mistura Pgf 5

28 28 22 22

18 18 25 23 25 23

19 19 H H

8 8 H H H H 3 5 3 5 HO 6 HO 6 sitosterol estigmasterol Proveniente de Fração hexânica das folhas Massa molecular (g. mol-1) 414,7067/412,6908 Massa mistura/ percentual do extrato bruto (%) 92,0/0,3

Fórmula molecular C29H50O; C29H48O Aspecto Sólido branco/forma de agulhas. Dados espectroscópicos de sitosterol

1 RMN H (CDCl3/CD3OD, 500 MHz, Figura101 – Anexos): δ 0,67-0,99 (envelope de sinais de metilas; H-18, H-19, H-21, H-26, H-27 e H-29), 3,53-3,57 (m, H-3), 5,3 (d; 5,1 Hz, H-6).

Dados espectroscópicos de estigmasterol

1 RMN H (CDCl3/CD3OD, 500 MHz -TMS): δ 0,67-0,99 (envelope de sinais de metilas; H-18, H-19, H-21, H-26, H-27 e H-29), 3,53-3,57 (m, H-3), 5,3 (d; 5,1 Hz, H-6), 5,16 (15,1 e 9,0 Hz, H-22) e 5,02 (15,1 e 6,0 Hz, H-23).

5 – Biossíntese dos alcaloides identificados em Psychotria goyazensis.

O ácido estrictosidínico e harmano pertencem à classe dos alcaloides indólicos, compostos derivados do núcleo de mesmo nome. Nas plantas, o núcleo indólico se forma a partir do aminoácido triptofano, que sofre descarboxilação por ação da enzima triptofano descarboxilase, originando a triptamina, precursor de quase todos os alcaloides indólicos conhecidos (BRUNETON, 1991).

Por outro lado, o ácido estrictosidimico pertence à classe dos alcaloides indolmonoterpênicos (uma subclasse dos indólicos), originados a partir do precursor estrictosidina (Figura 25), que por sua vez origina-se da consensação entre a triptamina e a secologanina (MANN et al., 1993), um aldeído monoterpênico proveniente da via do ácido mevalônico (Figura 25) (BRUNETON, 1991).

A calicantina é um tipo de alcaloide pirrolizidínico formado pela condensação entre duas unidades de N-metil triptamina, que envolve uma etapa de dimerização oxidativa a um intermediário hipotético (Figura 26). De acordo com MAY & STOLTZ (2006), este intermediário pode sofrer hidrólise para originar a calicantina (Figura 26).

OH OH

OH geraniol 10-hidroxigeraniol

OGlu H

O COOH HO NH2

H N H COOCH3 loganina L-triptofano

CHO NH2 OGLu + O N R H H3COOC H Triptamina (1) Formação de imina COOCH3 (2) Reação de secolognina Mannich

NH OGLu N R H H [O] N O H [O]

H3COOC N estrictosidina

N H harmano

NH OGLu

N O H H

HOOC ácido estrictosidínico

Figura 25 - Biossíntese dos alcaloides ácido estictosidinico e harmano (Adaptado de BRUNETON, 1991 & DEWICK, 2000).

COOH NH 2 NH2 HN -CO2 SAM N H N N L-triptofano H H Triptamina N-metil triptamina

[O]

HN N H

N N

hidrólise

H2N H3CHN

OHC CHO

NH2 NHCH3

Intermediário hipotético

H N N

N N H

calicantina

Figura 26 - Biossíntese da calicantina (MAY & STOLTZ, 2006).

6 CONCLUSÃO

O estudo fitoquímico de P. goyazensis conduziu ao isolamento de dois alcaloides (calicantina e ácido estrictosidínico), uma cumarina (isoescopoletina) e um derivado do ácido benzoico (ácido siríngico), além de possibilitar a identificação, em misturas, de outros dois alcaloides (hidroxi-calicantina e harmano), sendo a hidroxi-calicantina um composto inédito. Os triterpenos ácido ursólico e oleanólico e esteróides sitosterol e estigmasterol (nas formas glicosilada e livre) também foram identificados em misturas. O estudo mostrou ainda que o alcaloide indolmonoterpênico ácido estrictosidínico é o constituinte majoritário da espécie, semelhantemente em P.mirianta e P. hoffmannseggiana, esta última recentemente estudada em nosso grupo de pesquisa. Por outro lado, a identificação de alcaloides quinolínicos em P. goyazensis aponta um aspecto interessante da espécie, uma vez que não existe na literatura relatos sobre a ocorrência simultânea dos dois tipos de alcaloides (indolmonoterpênico e quinolínico) em uma mesma espécie do gênero.

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8 ANEXOS 8.1 TABELAS

Tabela 7 – Tratamento cromatográfico da fração hexânica das folhas (1,5 g).

Eluente Volume Subfrações Subfrações Massa (mg) Rendimento (%) (mL) reunidas Hex 100% 100 1-10 1-18 106.8 Hex: AcOEt 5% 50 15-18 19-35 56,9 Hex: AcOEt 10% 50 19-23 36-44 48,2 Hex: AcOEt 15% 100 24-39 46-52 69,2 Hex: AcOEt 20% 100 40-52 53-79 92,3 6,15 Hex: AcOEt 40% 100 53-66 80-91 110,4 Hex: AcOEt 50% 100 67-79 92-110 163,9 Hex: AcOEt 60% 100 80-89 111- 134 89,6 Hex: AcOEt 70% 100 90-115 135-166 100,8 Hex: AcOEt 80% 100 116-130 167-206 230,7 Hex: AcOEt 90% 131-144 AcOEt 100% 200 145-206 TOTAL 1,068 70,6

Tabela 8 – Tratamento cromatográfico da fração diclorometânica das folhas (1,5 g). Eluente Volume Subfrações Subfrações Massa (mg) Rendimento (mL) reunidas (%) Hex: 100% 100 - 1-10 7,3 0,48

Hex:CH2Cl2 5% 50 - 11-14 2 0,13

Hex:CH2Cl2 10% 50 - 15-27 8,2 0,55

Hex:CH2Cl2 15% 50 - 28-34 6,1 0,4

Hex:CH2Cl2 20% 50 - 35-52 12,6 0,84

Hex: CH2Cl2 30% 50 - 53-74 303,6 20,2

Hex:CH2Cl2 40% 50 - 75-83 145,3 9,68

Hex:CH2Cl2 50% 100 1-4 84-103 122 8,13

Hex:CH2Cl2 60% 100 5-8 104-116 65,4 4,36

Hex:CH2Cl2 65% 50 9-11 117-147 75,4 5,02

Hex:CH2Cl2 75% 50 12-14 148-174 70,3 4,68

Hex:CH2Cl2 85% 50 15-17 175-196 23,2 1,54

Hex:CH2Cl2 90% 50 18-20 197-199 2,5 0,16

Hex:CH2Cl2 95% 50 21-29 200-213 8 0,53

CH2Cl2 100% 100 30-48 214-242 130,9 8,72

CH2Cl2:MeOH 5% 100 49-53

CH2Cl2:MeOH 10% 50 54-62

CH2Cl2:MeOH 15% 50 63-83

CH2Cl :MeOH 20% 100 84-124

CH2Cl2:MeOH 30% 100 125-148

CH2Cl2:MeOH 40% 100 149-175

CH2Cl2:MeOH 50% 50 176-198

CH2Cl2:MeOH 60% 50 199-213

CH2Cl2:MeOH 70% 50 214-240

CH2Cl2:MeOH 100% 100 241-242* TOTAL 982,5 65,5

Tabela 9 – Tratamento cromatográfico das subfrações reunidas 53-74 (303,6 mg), provenientes da Fração diclorometânica das folhas. Eluente Volume Subfrações Subfrações Massa (mg) Rendimento (mL) reunidas (%) Hex 100% 50 - 1-45 32 10-54

Hex:CH2Cl2 10% 50 - 46-51 28,7 9,4

Hex:CH2Cl2 20% 50 - 53-57 75,1 24,73

Hex:CH2Cl2 30% 50 - 58-85 29,3 9,65

Hex:CH2Cl2 40% 50 - 86-90 16,8 5,53

Hex:CH2Cl2 50% 50 - 91-95 35,9 11,82 Hex:CH2Cl2 60% 100 1-12 97-99 14,9 4,9

Hex:CH2Cl2 80% 100 13-24 100-129 20,1 6,62

CH2Cl2 100% 100 25-40

CH2Cl2:MeOH 5% 50 41-79

CH2Cl2:MeOH 10% 50 80-91

CH2Cl2:MeOH 20% 50 92-111

CH2Cl2:MeOH 30% 50 112-129 TOTAL 252,8 83,26

Tabela 10-Tratamento cromatográfico da fração acetato de etila das folhas (1,95 g). Eluente Volume Subfrações Subfrações Massa (mg) Rendimento (mL) reunidas (%) Hex: 100% 100 - 3-6 20,8 1,06

Hex : CHCl3 5% 50 - 7-22 26,1 1,33

Hex : CHCl3 10% 50 - 23-40 12,1 0,62

Hex : CHCl3 20% 50 - 41-51 14 0,71

Hex : CHCl3 30% 50 - 52-61 9,8 0,5

Hex : CHCl3 40% 50 - 62-68 17,2 0,88 Hex : CHCl3 50% 100 1-10 69-85 6,3 0,32

CHCl3 100% 100 11-21 86-112 16,3 0,83

CHCl3 : MeOH 5% 100 22-30 113-121 3,5 0,18

CHCl3 : MeOH 10% 100 31-56 121-133 10,4 0,53

CHCl3 : MeOH 15% 50 57-62 134-152 12,5 0,64

CHCl3 : MeOH 20% 50 62-68 152-171 15,2 0,78

CHCl3 : MeOH 25% 200 69-95 172-192 44,3 2,3

CHCl3 : MeOH 30% 200 96-132 193-211 30,5 1,5

CHCl3 : MeOH 35% 50 133-143 212-259 258,7 13,3

CHCl3 : MeOH 40% 50 144-157

CHCl3 : MeOH 50% 50 158-164

CHCl3 : MeOH 60% 50 165-173

CHCl3 : MeOH 70% 50 174-188

CHCl3 : MeOH 80% 100 189-200

CHCl3 : MeOH 40% 100 201-211

CHCl3 : MeOH 50% 100 212-225

CHCl3 : MeOH 60% 100 226-236 MeOH 100 % 200 236-259 TOTAL 497,7 25,52

Tabela 11-Tratamento cromatográfico da fração n-butanólica das folhas (1,04g). Eluente Volume Subfrações Subfrações Massa (mg) Rendimento Código (mL) reunidas (%)

CHCl3 : MeOH 1% 100 1-11 1-11 11,1 1 Fr1

CHCl3 : MeOH 5% 100 5-19 12-15 13,6 1,3 Fr2

CHCl3 : MeOH 10% 50 20-24 16-34 5,4 0,52 Fr3

CHCl3 : MeOH 20% 100 25-35 35-41 47 4,5 Fr4 CHCl3 : MeOH 30% 150 36-73 42-58 420 40,38 Fr 5

CHCl3 : MeOH 40% 100 74-90 59-66 188 18,07 Fr 6

CHCl3 : MeOH 50% 50 91-94 67-78 66,3 6,3 Fr 7

CHCl3 : MeOH 60% 100 95-102 79-96 47,9 4,6 Fr8

CHCl3 : MeOH 70% 100 103-117 97-103 10,3 0,99 Fr9

CHCl3 : MeOH 80% 100 118-120 104-120 13,5 1,3 Fr10 MeOH 100% 100 122* 56,4 5,4

MeOH : H20 20% 100 123* 22,9 2,2

MeOH : H20 50% 100 124* 69,7 6,7 TOTAL 972,1 93,5

Tabela 12- Massas e rendimentos obtidos na extração ácido-base do extrato etanólico bruto dos frutos (EEBFr, 8,3 g), de P. goyazensis.

Frações obtidas Massa (mg) Rendimento (%)

CHCl3 ácida (FrCAFr) 3440 74,78

CHCl3 neutra (FrCNFr) 161 3,5

CHCl3 básica (FrCBFr) 19 0,4 AcOEt básica (FrAcOEtBFr) 13 0,3 n-BuOH básica (Frn-BuOHBFr) 980 21,3 Resíduo 4040 48,6 TOTAL 7673 92,4

Tabela 13 - Purificação da fração clorofórmica neutra (FrCNFr, 161 mg) dos frutos de P. goyazensis. Eluente Volume Subfrações Subfrações Massa Rendimento (mL) reunidas (mg) (%)

CHCl3 100% 50 -

CHCl3:MeOH 1% 50 1-7 1-14 3,3 2,04

CHCl3:MeOH 5% 50 8-13 15-20 2,5 1,55

CHCl3:MeOH 8% 50 14-19 21-22 4,6 2,9

CHCl3:MeOH 10% 50 20-22 23-26 2,8 1,7

CHCl3:MeOH 15% 50 23-29 27-31 5,7 3,5

CHCl3:MeOH 20% 50 30-40 32-34 9,5 5,9

CHCl3:MeOH 25% 50 40-43 35-40 8,8 5,5

CHCl3:MeOH 35% 50 44-46 41-44 5,5 3,4

CHCl3:MeOH 40% 50 47-51 45-48 6,3 3,9

CHCl3:MeOH 50% 50 52-53 49-53 5,4 3,35 MeOH 100% 100 54 54 83,06 51,5 TOTAL 137,4 85,4 (*) Subfração de 100 mL

Tabela 14- Purificação da fração AcOEt básica (Fr

AcOEtBFr, 19 mg) e CHCl3 básica (13 mg) -Total (32 mg) - dos frutos de P. goyazensis. Subfração Massa Rendimento (%) (mg) 1 2,3 7,1 2 4,7 14,6 3 2,9 9 4 3,4 10,6 5 0,8 2,5

Tabela 15 - Massas e rendimentos obtidos na extração ácido-base do extrato etanólico bruto dos galhos (EEBG, 5,3 g) de P goyazensis.

Frações obtidas Massa (mg) Rendimento (%)

CHCl3 ácida (FrCAG) 2300 43,3

CHCl3 neutra (FrCNG) 21,6 0,4

CHCl3 básica (FrCBG) 25,4 0,48

Acoet básica (FrAcoetBG) 25,0 0,48

n-BUOH básica (Frn-BUOHBG) 452,5 8,5

Resíduo 1997 37,6

TOTAL 4821,5 90,9

Tabela 16-Purificação da fração clorofórmica ácida dos galhos (FrCAG, 50,0 mg) dos galhos de P. goyazensis. Subfração Massa (mg) Rendimento (%)

1 4,7 21,7

2 3,3 0,06

3 3,6 0,06

4 11,4 52,7

TOTAL 20,8 96,1

Tabela 17- Massas e rendimentos obtidos na extração ácido-base do extrato etanólico bruto das folhas, 2 coleta (15,3 g). Frações obtidas Massa (mg) Rendimento (%)

CHCl3 ácida (FrCAFr) 2850 18,6

CHCl3 neutra (FrCNFr) 94,8 0,62

CHCl3 básica (FrCBFr) 35,3 0,23

AcOEt básica (FrAcOEtBFr) 30,4 0,20

n-BuOH básica (Frn-BuOHBFr) 678,9 4,41

Resíduo 9890 64,64

TOTAL 13,57 88,70

Tabela 18 - Purificação da fração clorofórmica neutra (94,8 mg) das folhas, 2 coleta. Eluente Volume Subfrações Subfrações Massa Rendimento (mL) reunidas (mg) (%)

CHCl3 100% 50 -

CHCl3:MEOH 1% 50 1-10 1-6 3,8 4,0

CHCl3:MEOH 5% 50 11-15 7-18 4,3 4,5

CHCl3:MEOH 8% 50 16-23 19-23 4,6 4,8

CHCl3:MEOH 10% 50 24-30 24-31 4,2 4,4

CHCl3:MEOH 15% 50 31-37 32-39 6,7 7,0

CHCl3:MEOH 20% 50 38-44 40-51 10,1 10,6

CHCl3:MEOH 25% 50 45-49 52-68 15,5 16,3

CHCl3:MEOH 35% 50 50-59

CHCl3:MEOH 40% 50 60-63

CHCl3:MEOH 50% 50 64-67 MEOH 100% 100 68 TOTAL 46,35 48,9

8.2 ESPECTROS

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Acquisition Time (sec) 5 .4 5 2 6 C o m m e n t m-pgffr45-43 Monique/Marcelo 1,0 mg meod D a te 22 Jun 2012 10:30:40 D a te S ta m p 22 Jun 2012 10:30:40 F ile N a m e C:\USERS\MAMAPOL\DESKTOP\VáRIAS AMOSTRAS\M-PGFFR45-53\11\FID Frequency (MHz) 5 0 0 .1 3 N u c le u s 1H Number of Transients 16 O r ig in s p e c t Original Points Count 32768 O w n e r n m rs u Points Count 32768 Pulse Sequence z g c p p r Receiver Gain 2 5 6 .0 0 SW(cyclical) (Hz) 6 0 0 9 .6 2 S o lv e n t METHANOL-d4 Spectrum Offset (Hz) 2 4 6 0 .4 0 3 1 Spectrum Type STANDARD Sweep Width (Hz) 6 0 0 9 .4 3 Temperature (degree C) 2 5 .0 0 0

VerticalScaleFactor = M-PGFFR45-53.011.ESP

1 M eth an ol 2 . 6 4

0.20

0.15 Absolute Intensity

0.10

6 . 3 7

6 . 3 6

7 . 0 9

6 . 8 3

7 . 1 0

6 . 5 7 6 . 8 2

0.05 1 . 5 8

2 . 9 8

1 . 5 6

1 . 5 9

1 . 6 0

2 . 5 1

3 . 0 0

2 . 4 9

2 . 4 8 2 . 9 5

1.00 0.89 0.87 0.90 0.73 2.43 0.78 0.92

11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 -1 Chemical Shift (ppm) 1 Figura 27 - Espectro de RMN de H (500 MHz, CD3OD-TMS) de Pgfr 1.

H N N

4 B 3a 4a 5 A 3 6 7a 8a 2 N N 7 H

Figura 28 - Expansão da região entre 7,3-6,0 ppm do espectro de RMN de 1H de Pgfr 1.

Jax-eq = 3,4 Hz

Jax-eq = 5,2 Hz Jax-ax = 13,1 Hz

Jax-eq = 11,8 Hz

Figura 29 - Expansão da região entre 3,0-1,3 ppm do espectro de RMN de 1H de Pgfr 1.

This report was created by ACD/NMR Processor Academic Edition. For more information go to www.acdlabs.com/nmrproc/ Acquisition Time (sec) (0.3408, 0.0057) C o m m e n t 5 mm TBI 1H/13C/D-BB Z-GRD Z8624/14 D a te 24 Jun 2014 10:35:00 F ile N a m e C:\USERS\MARCELO\DESKTOP\M-PGFFR45-53\201\SER Frequency (MHz) (500.13, 125.77) N u c le u s (1 H , 1 3 C ) Number of Transients 24 O r ig in s p e c t Original Points Count (2048, 215) O w n e r n m rs u Points Count (2048, 1024) Pulse Sequence hsqcedetgpsisp2.3 S o lv e n t M e O D Spectrum Type HSQC Sweep Width (Hz) (6006.68, 37557.27) Temperature (degree C) 2 5 .1 6 0 T itle m-pgffr45-53

M-PGFFR45-53.201.ESP

-20

100

120

140 F1 Chemical Shift (ppm)

160

180

200

220

240

260

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 -1 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 30- Mapa de correlações de HSQC de Pgfr 1.

H N N

4 3 a 4 a H-4 H-7 5 H-6 H-5 3 6 7 a 8 a 2 N N 7 H

C-7 C-4 C-6 C-5 C-4 C-6

Figura 31– Expansão da região entre 7,3- 6,1 ppm do mapa de correlações de HSQC de Pgfr 1.

H N N

4 3 a 4 a 5 3 6 7 a 8 a 2 N N 7 H

64 4.92, 71.48, 0.1

72 H-8a/C-8a 80

88 F1 Chemical Shift (ppm)

5.6 5.5 5.4 5.3 5.2 5.1 5.0 4.9 4.8 4.7 4.6 4.5 4.4 4.3 4.2 4.1 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 32– Expansão da região entre 5,6- 4,0 ppm do mapa de correlações de HSQC de Pgfr 1.

H N N

4 3 a 4 a 5 3 6 H-3a 7 a 8 a 2 N N H-2b H H-2a H-3b 7

2.97, 28.38, -0.02 24 C-3 C-3 32 1.58, 29, -0.02

2.99, 46.48, -0.04 2.53, 46.49, -0.07 40

C-2 C-2 48

56 F1 Chemical Shift (ppm)

3.0 2.9 2.8 2.7 2.6 2.5 2.4 2.3 2.2 2.1 2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 33– Expansão da região entre 3,0-1,4 ppm do mapa de correlações de HSQC para Pgfr 1.

This report was created by ACD/NMR Processor Academic Edition. For more information go to www.acdlabs.com/nmrproc/ Acquisition Time (sec) (0.1704, 0.0068) C o m m e n t 5 mm TBI 1H/13C/D-BB Z-GRD Z8624/14 D a te 24 Jun 2014 10:35:00 F ile N a m e C:\Users\Marcelo\Desktop\m-pgffr45-53\300\ser Frequency (MHz) (500.13, 125.77) N u c le u s (1 H , 1 3 C ) Number of Transients 124 O r ig in s p e c t Original Points Count (1024, 256) O w n e r n m rs u Points Count (1024, 1024) Pulse Sequence hmbcgplpndqf S o lv e n t M e O D Spectrum Type HMBC Sweep Width (Hz) (6003.75, 37557.27) Temperature (degree C) 2 5 .1 6 0 T itle H M B C G P

M-PGFFR45-53.300.ESP

-40

-20

100

120 F1 Chemical Shift (ppm)

140

160

180

200

220

240

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 -1 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 34 - Mapa de correlações de HMBC de Pgfr 1.

H N N

4 3 a 4 a 5 3 6 H-4 7 a 8 a 2 H-7 H-6 N N 7 H H-5

C-3a 50 H-4

C-7 6.58, 112.45, 0.15, 0 6.85, 124.52, 0.16, 0 100 6.58, 122.25, 0.21, 0 6.38, 122.26, 0.25, 0 7.11, 127.19, 0.35, 0 C-5 C-4 C-4 C-6 7.11, 143.87, 0.48, 0 C- 4a

C-7a 6.59, 124.59, 0.06, 0 F1 Chemical Shift (ppm) C-7a 150 6.85, 143.85, 0.19, 0

7.15 7.10 7.05 7.00 6.95 6.90 6.85 6.80 6.75 6.70 6.65 6.60 6.55 6.50 6.45 6.40 6.35 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 35– Expansão da região entre 7,2-6,3 ppm do mapa de correlações de HMBC para Pgfr 1.

H N N

4 3 a 4 a 5 3

6 7 a 8 a 2 H-8a N N 7 H H-4 1

C-3a 50 4.92, 34.31, 0.03

100

4.92, 143.35, 0.03

C-7a 150 F1 Chemical Shift (ppm)

5.3 5.2 5.1 5.0 4.9 4.8 4.7 4.6 4.5 4.4 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 36 – Expansão da região entre 5,3-4,4 ppm do mapa de correlações de HMBC para Pgfr 1.

H N N

4 3 a 4 a 5 3 6 7 a 8 a 2 N N 7 H N-CH3 1 H-3a H-2a H-3b H-2b

C-3 2.98, 46.34, 0.05, 0 C-2 H-4 2.24, 25.54, 0.19, 0 50 C-3a 1.58, 35.03, 0.07, 0 2.65, 46.35, 0.68, 0 2.65, 44.59, 0.07, 0

2.65, 72.03, 0.7, 0 C-1 100

2.32, 174.56, 0.07, 0 150

2.24, 180.3, 0.11, 0 1.96, 178.6, 0.54, 0 F1 Chemical Shift (ppm)

2.37, 174.11, 0.12, 0

3.0 2.9 2.8 2.7 2.6 2.5 2.4 2.3 2.2 2.1 2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 37 - Expansão da região entre 3,0-1,5 ppm do mapa de contornos de HMBC de Pgfr 1.

This report was created by ACD/NMR Processor Academic Edition. For more information go to www.acdlabs.com/nmrproc/ Acquisition Time (sec) (0.3408, 0.0426) C o m m e n t 5 mm TBI 1H/13C/D-BB Z-GRD Z8624/14 D a te 23 Jun 2014 12:36:00 F ile N a m e C:\Users\Marcelo\Desktop\m-pgffr45-43\100\ser Frequency (MHz) (500.13, 500.13) N u c le u s (1 H , 1 H ) Number of Transients 64 O r ig in s p e c t Original Points Count (2048, 256) O w n e r n m rs u Points Count (2048, 1024) Pulse Sequence c o s y g p q f S o lv e n t M e O D Spectrum Type COSY Sweep Width (Hz) (6006.68, 6003.75) Temperature (degree C) 2 5 .0 0 0 T itle m-pgffr45-43 Monique/Marcelo 1,0 mg meod

M-PGFFR45-43.100.ESP

-1

6 F1 Chemical Shift (ppm)

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 -1 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 38 – Mapa de correlações de COSY para Pgfr 1.

H N N

4 3 a 4 a 5 3

6 H-4 H-6 H-5 H-7 a a 7 8 2 N N 7 H

5.5

6.83, 6.34, 0.01 6.36, 6.55, 0 6.0 7.09, 6.57, 0.02 6.83, 6.57, 0.01 6.56, 6.83, 0.01 6.36, 6.83, 0.03 6.5 H-5 H-7 H-7 7.0 H-5 7.09, 6.83, 0 H-5 H-6 6.83, 7.09, 0.01 6.56, 7.1, 0.02 H-6 7.5 H-4 H-4 H-6 8.0 F1 Chemical Shift (ppm)

7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 6.5 6.4 6.3 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 39 – Expansão da região entre 7,1-6,3 ppm do mapa de correlações de COSY para Pgfr 1.

H N N

4 3 a 4 a 5 3

6 7 a 8 a 2 N N 7 H H-3a

1 H-2a H-3b H-2b

2.98, 1.56, 0.01 2.51, 1.56, 0 1.57, 1.56, 0.03 H-3b 1 H-3a H-3a 1.57, 2.49, 0.01 2 H-2b H-2b

2.98, 2.53, 0.01 H-2a H-2a 3 2.51, 2.97, 0.01 1.56, 2.97, 0.01

4 F1 Chemical Shift (ppm)

3.0 2.5 2.0 1.5 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 40 - Expansão da região entre 3,0-1,5 ppm do mapa de correlações de COSY para Pgfr 1.

Intens. x107 1.2 347.22132

1.0

0.8

0.6

0.4 348.22470 0.2

343.15232 349.26951 344.58944 350.52786 351.41401 0.0 343 344 345 346 347 348 349 350 351 m/z Amostra 1_pos_000002.d: +MS

Figura 41 – Espectro de massas de alta resolução ESI (+) FT-ICR MS de Pgfr 1.

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Acquisition Time (sec) 3 .2 7 6 8 C o m m e n t l-pgf_fr4 Marcelol_PN2 1,1mg CdCl3/MeOD D a te 30 Jun 2012 19:49:36 D a te S ta m p 30 Jun 2012 19:49:36 F ile N a m e C:\USERS\MARCELO\DESKTOP\L-PGF_FR4\12\FID Frequency (MHz) 5 0 0 .1 3 N u c le u s 1H Number of Transients 16 O r ig in s p e c t Original Points Count 32768 O w n e r n m rs u Points Count 32768 Pulse Sequence z g c p p r Receiver Gain 1 8 1 .0 0 SW(cyclical) (Hz) 1 0 0 0 0 .0 0 S o lv e n t CHLOROFORM-d Spectrum Offset (Hz) 2 3 1 5 .6 8 4 8 Spectrum Type STANDARD Sweep Width (Hz) 9 9 9 9 .7 0 Temperature (degree C) 2 5 .1 6 0

0.115 VerticalScaleFactor = L-PGF_FR4.012.ESP 1

0.110

0.105

0.100

0.095

0.090

0.085

0.080

0.075

0.070

0.065

0.060

0.055

0.050 Absolute Intensity

0.045

0.040

0.035

0.030

0.025

0.020

0.015

0.010

0.005

0.63 0.56 0.57 0.58 1.06 0.51 1.11 1.41 1.81 1.86 1.68 2.00

14 12 10 8 6 4 2 0 -2 -4 Chemical Shift (ppm)

1 Figura 42 – Espectro de RMN de H (CDCl3/CD3OD, 500 MHz) de Pgfr 2a.

OH 1' H 7' N N 3' 8a 7a' 6' 2' 4 3a 4a 5' 4a' 5 4' 3 6 8a 2 7a N N 7 H 1

O H 1 '

H 7 ' N N 3 ' 8 a 7 a ' 6 ' 2 ' 4 3 a 5 ' 4 a 4 a ' 5 4 ' 3

6 8 a 2 7 a N N 7 H

Figura 43 – Expansão da região entre 7,1-7,0 ppm do espectro de RMN de 1H de Pgfr 2a.

O H 1 '

H 7 ' N N 3 ' 8 a 7 a ' 6 ' 2 ' 4 3 a 5 ' 4 a 4 a ' 5 4 ' 3 6 8 a 2 7 a N N 7 H

Figura 44 – Expansão da região entre 3,0-1,4 ppm do espectro de RMN de 1H de Pgfr 2a.

This report was created by ACD/NMR Processor Academic Edition. For more information go to www.acdlabs.com/nmrproc/ Acquisition Time (sec) (0.2048, 0.0064) C o m m e n t 5 mm TBI 1H/13C/D-BB Z-GRD Z8624/14 D a te 04 Jul 2014 11:48:00 F ile N a m e C:\Users\Marcelo\Desktop\l-pgf_fr4\201\ser Frequency (MHz) (500.13, 125.77) N u c le u s (1 H , 1 3 C ) Number of Transients 20 O r ig in s p e c t Original Points Count (2048, 240) O w n e r n m rs u Points Count (2048, 1024) Pulse Sequence hsqcedetgpsisp2.3 S o lv e n t C D C l3 Spectrum Type HSQC Sweep Width (Hz) (9995.12, 37557.27) Temperature (degree C) 2 5 .1 6 0 T itle l-p g f_ fr4

A u to P h a s e Ambiguous Phase

L-PGF_FR4.201.ESP

-20

100

120

140 F1 Chemical Shift (ppm)

160

180

200

220

240

14 12 10 8 6 4 2 0 -2 -4 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 45 – Mapa de correlações de HSQC de Pgfr 2a.

O H 1 '

H 7 ' N N 3 ' 8 a 7 a ' 6 '

2 ' 4 3 a 5 ' 4 a 4 a ' 5 4 ' H-5’/6’ 3 6 8 a 2 H-4 H-6 H-5 H-7 7 a N N H-4’ H 7

100 6.5, 117.01, -0.02 6.3, 113.39, -0.05 6.58, 117.02, -0.04 C-7 C-6’ C-4 C-6 C-4’ 6.39, 113.39, -0.04 120 C-5 6.39, 117.01, -0.03

C-5’ F1 Chemical Shift (ppm) 6.79, 128.51, -0.04 140

7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 6.5 6.4 6.3 6.2 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 46 – Expansão da região entre 7,1-6,2 ppm do mapa de correlações de HSQC de Pgfr 2a.

H 7' N 8a' N 7a' 6' 2' 3a 4a 5' 4a' 5 4' 3 6 8a 2 7a N N 7 H

64 4.67, 72.41, -0.02 4.55, 72.16, -0.02

72 H-8a’/C-8a’ H-8a/C-8a 80

88 F1 Chemical Shift (ppm)

4.90 4.85 4.80 4.75 4.70 4.65 4.60 4.55 4.50 4.45 4.40 4.35 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 47 – Expansão da região entre 4,9-4,3 ppm do mapa de correlações de HSQC de Pgfr 2a.

H 7' N 8a' N 7a' 6' 2' 3a 4a 5' 4a' 5 4' N-CH3 N-CH3’ 3 6 8a 2 7a N N H-3a/3’a 7 H

H-3b/3’b H-2a/2’a H-2b/2’b 1

20 2.98, 31.72, 0.02 1.43, 31.72, 0.03 30 C-3/C-3’ C-1/C-1’ 2.51, 42.26, -0.04 C-3/C-3’ 40 C-2/C-2’ C-2/C-2’ 50 2.8, 47.52, 0.02 2.42, 47.51, 0.02

60 F1 Chemical Shift (ppm) 70

3.0 2.5 2.0 1.5 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 48– Expansão da região entre 3,0-1,5 ppm do mapa de correlações de HSQC para Pgfr 2a.

This report was created by ACD/NMR Processor Academic Edition. For more information go to www.acdlabs.com/nmrproc/ Acquisition Time (sec) (0.2048, 0.0068) C o m m e n t 5 mm TBI 1H/13C/D-BB Z-GRD Z8624/14 D a te 04 Jul 2014 11:48:00 F ile N a m e C:\Users\Marcelo\Desktop\l-pgf_fr4\300\ser Frequency (MHz) (500.13, 125.77) N u c le u s (1 H , 1 3 C ) Number of Transients 76 O r ig in s p e c t Original Points Count (2048, 256) O w n e r n m rs u Points Count (2048, 1024) Pulse Sequence hmbcgplpndqf S o lv e n t C D C l3 Spectrum Type HMBC Sweep Width (Hz) (9995.12, 37557.27) Temperature (degree C) 2 5 .1 6 0 T itle H M B C G P

L-PGF_FR4.300.ESP

-40

-20

100

120 F1 Chemical Shift (ppm)

140

160

180

200

220

14 12 10 8 6 4 2 0 -2 -4 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 49 – Mapa de correlações de HMBC para Pgfr 2a.

H 7' N 8a' N 7a' 6' 2' 3a 4a 5' 4a' 5 4' 3 6 H-5’/6’ 8a 2 7a N N H-4 7 H H-7 H-6 1 H-4’ H-5

C-3a C-3a’ 50 7, 35.22, 0.04 6.57, 35.68, 0.04

6.39, 115.89, 0.04 6.57, 112.22, 0.08 100 C-6’ 6.39, 123.68, 0.07 7, 127.81, 0.11 6.78, 124.6, 0.04 6.58, 133.77, 0.04 C-7 C-5’ C-5 7, 144.77, 0.1 C-4 C-4a C-4a’ C-6 C-7a’ C-7a’ C-4a’ C-7a C-7’ C-7’ C-7a 150 F1 Chemical Shift (ppm) 6.78, 145.22, 0.06 6.57, 141.56, 0.02 6.39, 142.02, 0.11

7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 6.5 6.4 6.3 6.2 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 50 – Expansão da regiaõ entre 7,1-6,2 ppm do mapa de correlações de HMBC de Pgfr 2a.

100

H 7' N 8a' N 7a' 6' 2' 3a 4a 5' 4a' 5 4' 3 6 8a 2 7a N N 7 H

0 4.55, 35.67, 0.05 4.63, 47.27, 0.02, 0 H-8a/C-3a 50 H-8a’/C-2’

100 H-8a/C-7a 150 4.56, 145.23, 0.04 F1 Chemical Shift (ppm)

4.70 4.65 4.60 4.55 4.50 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 51 – Expansão da região entre 4,7-4,5 ppm do mapa de correlações de HMBC para Pgfr 2a.

101

H 7' N 8a' N 7a' 6' 2' 3a 4a 5' 4a' 5 4' 3 6 8a 2 N-CH3 N-CH3’ 7a N N 7 H H-3a/3’a H-3b/3’b H-2a/2’a H-2b/2’b 1

0 2.98, 34.95, 0.02 1.43, 35.67, 0.04 C-2 C-2’ C-3a/3a’ C-3a/3a’ 50 2.53, 47.26, 0.25 2.49, 47.26, 0.28

2.49, 73.24, 0.17 100 C-8a C-8a’

150 F1 Chemical Shift (ppm)

3.0 2.5 2.0 1.5 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 52- Expansão da região entre 3,0-1,5 ppm do mapa de correlações de HMBC de Pgfr 2a.

102

This report was created by ACD/NMR Processor Academic Edition. For more information go to www.acdlabs.com/nmrproc/ Acquisition Time (sec) (0.2048, 0.0256) C o m m e n t 5 mm TBI 1H/13C/D-BB Z-GRD Z8624/14 D a te 04 Jul 2014 11:48:00 F ile N a m e C:\Users\Marcelo\Desktop\l-pgf_fr4\100\ser Frequency (MHz) (500.13, 500.13) N u c le u s (1 H , 1 H ) Number of Transients 24 O r ig in s p e c t Original Points Count (2048, 256) O w n e r n m rs u Points Count (2048, 1024) Pulse Sequence c o s y g p q f S o lv e n t C D C l3 Spectrum Type COSY Sweep Width (Hz) (9995.12, 9990.23) Temperature (degree C) 2 5 .1 6 0 T itle l-pgf_fr4 Marcelol_PN2 1,1mg CdCl3/MeOD

L-PGF_FR4.100.ESP

-5

-4

-3

-2

-1

6 F1 Chemical Shift (ppm) 7

14 12 10 8 6 4 2 0 -2 -4 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 53 – Mapa de correlações de COSY para Pgfr 2a.

103

H 7' N 8a' N 7a' 6' 2' 3a 4a 5' 4a' 5 4' 3 6 8a 2 H-5’/6’ 7a N N H-4 7 H H-6 1 H-4’ H-5 H-7

5.0

5.5

6.79, 6.26, 0 H-5’ 6.58, 6.33, 0 6.0 7.01, 6.49, 0 6.79, 6.49, 0 H-7 6.58, 6.49, 0 6.39, 6.49, 0.01

H-5 H-5 6.5

6.39, 6.63, 0 H-6 7.0 H-6 6.5, 6.79, 0 6.3, 6.79, 0 6.5, 6.99, 0 H-4

7.5 F1 Chemical Shift (ppm)

7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 6.5 6.4 6.3 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 54 -Expansão da região entre 7,0-6,0 ppm do mapa de correlações de COSY de Pgfr 2a.

104

H 7' N 8a' N 7a' 6' 2' 3a 4a 5' 4a' 5 4' 3 6 8a 2 7a N N H-3b/3’b H-2a/2’a H-2b/2’b 7 H H-3a/3’a 1

-2 H-3a/3’a H-3a/3’a H-2b/2’b 0 2.98, 1.41, 0 2.4, 1.41, 0 H-2b/2’b 2.98, 2.38, 0 2.78, 2.38, 0 1.43, 2.38, 0 2.41, 2.75, 0 2 H-2b/3’a

2.78, 2.98, 0 2.4, 2.98, 0 1.43, 2.89, 0 4 H-2a/2’a H-3b/3’b H-2a/2’a H-2b/2’b F1 Chemical Shift (ppm) 6

3.0 2.5 2.0 1.5 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 55 – Expansão da região entre 3,0-1,5 ppm do mapa de correlações de COSY para Pgfr 2a.

105

Intens. x108 363.21805 OH 1.50 H 7' N 8a' N 7a' 6' 1.25 2' 3a 4a 5' 4a' 5 4' 1.00 3 6 8a 2 7a N N 7 0.75 H H 1

0.50

0.25 413.26639

431.14018 465.10117 499.06225 0.00 250 300 350 400 450 500 550 m/z Biscalicantina_Marcelo_Pos_msms_691_000001.d: +MS2(qCID 690.67865) Figura 56 - Espectro de massas de alta resolução ESI (+) FT-ICR MS de Pgfr 2a.

106

This report was created by ACD/NMR Processor Academic Edition. For more information go to www.acdlabs.com/nmrproc/ 16/01/2015 15:11:21

Acquisition Time (sec) 5 .0 4 6 3 C o m m e n t l-hfr12-5 meod 5,2mg Marcelo D a te 10 Oct 2013 15:29:04 D a te S ta m p 10 Oct 2013 15:29:04 F ile N a m e F:\L-HFR12-5\11\FID Frequency (MHz) 5 0 0 .1 3 N u c le u s 1H Number of Transients 16 O r ig in s p e c t Original Points Count 32768 O w n e r n m rs u Points Count 32768 Pulse Sequence z g c p p r Receiver Gain 1 4 4 .0 0 SW(cyclical) (Hz) 6 4 9 3 .5 1 S o lv e n t METHANOL-d4 Spectrum Offset (Hz) 2 4 4 1 .4 5 6 1 Spectrum Type STANDARD Sweep Width (Hz) 6 4 9 3 .3 1 Temperature (degree C) 2 5 .1 6 0

L-HFR12-5.011.espVerticalScaleFactor = 0.40 1

0.35

0.30

0.25

0.20 Absolute Intensity

0.15 7 . 5 5

0.10

3 . 4 3

3 . 4 1

3 . 2 3

3 . 2 4

3 . 2 7

5 . 8 3

7 . 3 0

5 . 8 1

3 . 6 9

7 . 0 3

7 . 1 3

3 . 7 0 3 . 0 0

0.05 3 . 2 1

5 . 3 3 2 . 9 9

5 . 2 2

5 . 2 0

5 . 3 0 4 . 0 3

2 . 9 8

5 . 8 6

7 . 0 2

2 . 3 7

2 . 7 1

4 . 4 4 4 . 4 1

2 . 7 0

3 . 7 1

2 . 1 1

5 . 8 7

5 . 8 9

4 . 8 2 4 . 8 3

11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 -1 Chemical Shift (ppm) 1 Figura 57 – Espectro de RMN de H (CD3OD, 500 MHz) de Pgf 1.

107

9 6 8 A 5 O H 1 1 N H 2 3 1 8 N H 1 9 6 ' H O H H 1 4 O H O 2 0 O H 1 5 2 1 H 1 ' H O 3 ' O C 1 6 H O O C 2 2 1 7 B

Figura 58 – Expansão da região entre 7,8-7,0 ppm do espectro de RMN de 1H de Pgf 1.

108

9 6 8 A 5 O H 1 1 N H 2 3 1 8 N H 1 9 6 ' H O H H 1 4 O H O 2 0 O H 1 5 2 1 H 1 ' H O 3 ' O C 1 6 H O O C 2 2 1 7 B

Figura 59 – Expansão da região entre 5,9-5,2 ppm do espectro de RMN de 1H de Pgf 1.

109

9 6 8 A 5 O H 1 1 N H 2 3 1 8 N H 1 9 6 ' H O H H 1 4 O H O 2 0 O H 1 5 2 1 H 1 ' H O 3 ' O C 1 6 H O O C 2 2 1 7 B

Figura 60 – Expansão da região entre 5,0-3,0 ppm do espectro de RMN de 1H de Pgf 1.

110

9 6 8 A 5 O H 1 1 N H 2 3 1 8 N H 1 9 6 ' H O H H 1 4 O H O 2 0 O H 1 5 2 1 H 1 ' H O 3 ' O C 1 6 H O O C 2 2 1 7 B

Figura 61 – Expansão da região entre 2,7-2,0 ppm do espectro de RMN de 1H de Pgf 1.

111

This report was created by ACD/NMR Processor Academic Edition. For more information go to www.acdlabs.com/nmrproc/ Acquisition Time (sec) (0.2925, 0.0068) C o m m e n t 5 mm TBI 1H/13C/D-BB Z-GRD Z8624/0014 D a te 01 Nov 2013 08:12:00 F ile N a m e F:\C-HFR11AE\200\SER Frequency (MHz) (500.13, 125.77) N u c le u s (1 H , 1 3 C ) Number of Transients 40 O r ig in s p e c t Original Points Count (2048, 256) O w n e r n m rs u Points Count (2048, 1024) Pulse Sequence hsqcedetgpsisp2.3 S o lv e n t M e O D Spectrum Type HSQC Sweep Width (Hz) (6999.38, 37557.27) Temperature (degree C) 2 5 .2 6 0 T itle c-hfr11ae meod 7mg Marcelo

C-HFR11AE.200.esp

-60

-40

-20

100 F1 Chemical Shift (ppm)

120

140

160

180

200

220

11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 -1 -2 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 62 – Mapa de correlações de HSQC para Pgf 1.

112

9 6 8 A 5 O H 1 1 N H 2 3 1 8 N H 1 9 6 ' H O H H 1 4 O H O 2 0 O H H-17 1 5 2 1 H 1 ' H O 3 ' O C 1 6 H-12 H O O C H-10 1 7 H-9 2 2 H-11 B

7.32, 110.95, 0.22 100 7.45, 117.26, 0.25 7.04, 119.15, 0.41 C-12 C-11 C-9 C-10 120 7.13, 121.68, 0.36 7.56, 151.67, 0.37 140

C-17 160 F1 Chemical Shift (ppm)

8.1 8.0 7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 63 – Expansão da região entre 7,6-6,6 ppm do mapa de correlações de HSQC de Pgf 1.

113

9 6 8 A 5 O H 1 1 N H 2 3 1 8 N H 1 9 6 ' H O H H 1 4 O H O 2 0 O H 1 5 2 1 H 1 ' H O 3 ' O C 1 6 H O O C H-2’/4’/5b 2 2 1 7 H-3’/5’

H-19/H-21 B H-2’/4’ H-18b H-18a H-6’a/5a H-1’ H-6’b H-6a/6b/15 H-3 H-20 H-14a H-14b

H-1’

C-6 3, 18.46, -0.1 3, 33.21, 0.14 0 2.11, 33.2, -0.12 4.42, 50.65, 0.14 3.31, 46.63, 0.38 C-20 C-5 C-15 C-14 50 C-3 C-6’ C-4’ 2.71, 43.27, 0.11 C-21 3.6, 56.69, -0.2 C-1’ C-5’ C-2’ C-18 3.41, 76.81, 0.32 100

5.83, 94.92, 0.15 4.83, 99.61, 0.14

C-19 5.21, 117.04, -0.11 150 F1 Chemical Shift (ppm)

5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 64– Expansão da região entre 5,5 e 2,0 ppm do mapa de contornos de HSQC de Pgf 1.

114

This report was created by ACD/NMR Processor Academic Edition. For more information go to www.acdlabs.com/nmrproc/ Acquisition Time (sec) (0.2925, 0.0068) C o m m e n t 5 mm TBI 1H/13C/D-BB Z-GRD Z8624/0014 D a te 01 Nov 2013 01:18:00 F ile N a m e F:\C-HFR11AE\300\SER Frequency (MHz) (500.13, 125.77) N u c le u s (1 H , 1 3 C ) Number of Transients 80 O r ig in s p e c t Original Points Count (2048, 256) O w n e r n m rs u Points Count (2048, 1024) Pulse Sequence hmbcgplpndqf S o lv e n t M e O D Spectrum Type HMBC Sweep Width (Hz) (6999.38, 37557.27) Temperature (degree C) 2 5 .1 6 0 T itle c-hfr11ae meod 7mg Marcelo

C-HFR11AE.300.esp

-40

-20

100

120 F1 Chemical Shift (ppm)

140

160

180

200

220

240

11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 -1 -2 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 65– Mapa de contornos de HMBC para Pgf 1.

115

9 6 8 A 5 O H 1 1 N H 2 3 1 8 N H 1 9 6 ' H O H H 1 4 O H H-17 O 2 0 O H 1 5 2 1 H-12 H 1 ' H O 3 ' H-9 H-10 O C 1 6 H-11 H O O C 2 2 1 7 B C-15

C-20 50

C-21 C-7 C-12 100 C-11 C-10 C-12 C-12 C-10 C-16 C-8 C-8 C-8 C-8 C-13 C-13 C-13 150

C-22 F1 Chemical Shift (ppm)

7.60 7.55 7.50 7.45 7.40 7.35 7.30 7.25 7.20 7.15 7.10 7.05 7.00 6.95 6.90 6.85 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 66– Expansão da região entre 7,6-6,85 ppm do mapa de correlações de HMBC para Pgf 1.

116

9 6 8 A 5 O H 1 1 N H 2 3 1 8 N H 1 9 6 ' H O H H 1 4 O H O 2 0 O H 1 5 2 1 H 1 ' H O 3 ' H-19/H-21 O C 1 6 H O O C H-18b H-18a 2 2 1 7 H-1’ B

C-15 C-15

50 C-20 C-20 C-3’ C-5’ 100 C-1’ C-21

C-21

150 F1 Chemical Shift (ppm) C-17

6.0 5.5 5.0 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 67 – Expansão da região entre 6,0-5,0 ppm do mapa de correlações de HMBC para Pgf 1.

117

9 6 8 A 5 O H 1 1 N H 2 3 1 8 N H 1 9 6 ' H O H H 1 4 O H O 2 0 O H 1 5 2 1 H 1 ' H O 3 ' O C 1 6 H O O C H-3’/5’ 1 7 H-6’a/5a H-2’/4’/5b 2 2 H-6’b B H-3 H-6a/6b/15

C-6 C-14 C-6 C-14 C-20 C-3 C-3 C-3 50 C-5’ C-2’ C-6’ C-5’ C-4’ C-5’ C-4’ C-1’ C-7 C-21 C-1’ 100 C-7 C-7 C-7 C-2 C-16 C-8 C-19 150 C-2

C-17 F1 Chemical Shift (ppm)

200

C-22 4.5 4.0 3.5 3.0

F2 Chemical Shift (ppm) Figura 68 - Expansão da região entre 4,5-30 ppm do mapa de correlações de HMBC de Pgf 1.

118

9 6 8 A 5 O H 1 1 N H 2 3 1 8 N H 1 9 6 ' H O H H 1 4 O H O 2 0 O H 1 5 2 1 H 1 ' H O 3 ' O C 1 6 H-14a H-20 H O O C H-14b 2 2 1 7 B

C-15 C-15 C-20 C-3 50

C-21 100 C-18 C-16 C-2 C-19

150 F1 Chemical Shift (ppm)

2.9 2.8 2.7 2.6 2.5 2.4 2.3 2.2 2.1 2.0 1.9 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 69 – Expansão da região entre 2,9-1,9 ppm do mapa de correlações de HMBC para Pgf 1.

119

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Acquisition Time (sec) 3 .2 7 6 8 C o m m e n t m_hm_1 Monique/Marcelo 1,1mg cdcl3 D a te 11 Nov 2014 17:35:28 D a te S ta m p 11 Nov 2014 17:35:28 F ile N a m e C:\USERS\MAMAPOL\DESKTOP\M_HM_1\1\FID Frequency (MHz) 5 0 0 .1 3 N u c le u s 1H Number of Transients 16 O r ig in s p e c t Original Points Count 32768 O w n e r n m rs u Points Count 32768 Pulse Sequence z g 3 0 Receiver Gain 2 2 8 .0 0 SW(cyclical) (Hz) 1 0 0 0 0 .0 0 S o lv e n t CHLOROFORM-d Spectrum Offset (Hz) 3 6 3 5 .4 8 7 5 Spectrum Type STANDARD Sweep Width (Hz) 9 9 9 9 .7 0 Temperature (degree C) 2 5 .1 6 0

0.095 M_HM_1.001.ESPVerticalScaleFactor = 1

0.090

0.085

0.080

0.075

0.070

0.065

0.060

0.055

0.050

0.045

Absolute0.040 Intensity

0.035

0.030

0.025

0.020

0.015

0.010

0.005

1.97 1.44 0.95 1.44 0.96 2.88 0.99 0.02 1.09 1.59 0.47 7.52 0.74

16 14 12 10 8 6 4 2 0 -2 Chemical Shift (ppm)

Figura 70 – Espectro de RMN de 1H (CDCl3-TMS, 500 MHz) de Pgf 7.

120

6 5 9 7 N 10 3 13 N 12 H

Figura 71 – Expansão da região entre 8,5-7,0 ppm do espectro de RMN de 1H de Pgf 7.

121

M_HM_1.001.ESP 0.11

0.10 6 5 0.09 9 7 N 10 0.08 3 0.07 13 N 12 H 0.06

0.05

0.04 Normalized Intensity

0.03

0.02

0.01

0 6.00

3.5 3.4 3.3 3.2 3.1 3.0 2.9 2.8 2.7 2.6 2.5 Chemical Shif t (ppm) Figura 72 – Expansão da região entre 3,5-2,5 ppm do espectro de RMN de 1H de Pgf 7.

122

This report was created by ACD/NMR Processor Academic Edition. For more information go to www.acdlabs.com/nmrproc/ Acquisition Time (sec) (0.2048, 0.0064) C o m m e n t 5 mm TBI 1H/13C/D-BB Z-GRD Z8624/14 D a te 21 Nov 2014 09:21:00 F ile N a m e C:\USERS\MAMAPOL\DESKTOP\M_HM_1\200\SER Frequency (MHz) (500.13, 125.77) N u c le u s (1 H , 1 3 C ) Number of Transients 48 O r ig in s p e c t Original Points Count (2048, 241) O w n e r n m rs u Points Count (2048, 1024) Pulse Sequence hsqcetgpsi_MOD S o lv e n t C D C l3 Spectrum Type HSQC Sweep Width (Hz) (9995.12, 37557.27) Temperature (degree C) 2 4 .8 6 0 T itle m _ h m _ 1

M_HM_1.200.ESP

-40

-20

100

120 F1 Chemical Shift (ppm)

140

160

180

200

220

240

16 14 12 10 8 6 4 2 0 -2 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 73 – Mapa de correlações de HSQC de Pgf 7.

123

6 5 9 7 N 10 3 H-11/12 13 N 12 H H-5 H-9 H-6 H-10

100 7.84, 112.95, 0.07 7.56, 111.83, 0.04 C-12

8.13, 122.05, 0.05 7.31, 120.72, 0.03 C-6 7.56, 128.93, 0.03 120 C-9 C-10

8.37, 138.66, 0.07 F1 Chemical Shift (ppm) C-11 C-5

8.5 8.4 8.3 8.2 8.1 8.0 7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 74 – Expansão da região entre 8,5-7,3 ppm do mapa de correlações de HSQC para Pgf 7.

124

6 5 9 7 N 10 3 13 N 12 H

-20

2.85, 20.06, 0.01

20 CH3

40 F1 Chemical Shift (ppm)

3.4 3.3 3.2 3.1 3.0 2.9 2.8 2.7 2.6 2.5 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 75 – Expansão da região entre 3,4-2,5 ppm do mapa de correlação de HSQC para Pgf 7.

125

This report was created by ACD/NMR Processor Academic Edition. For more information go to www.acdlabs.com/nmrproc/ Acquisition Time (sec) (0.1024, 0.0068) C o m m e n t 5 mm TBI 1H/13C/D-BB Z-GRD Z8624/14 D a te 21 Nov 2014 05:25:00 F ile N a m e C:\USERS\MAMAPOL\DESKTOP\M_HM_1\300\SER Frequency (MHz) (500.13, 125.77) N u c le u s (1 H , 1 3 C ) Number of Transients 96 O r ig in s p e c t Original Points Count (1024, 256) O w n e r n m rs u Points Count (1024, 1024) Pulse Sequence hmbcgplpndqf S o lv e n t C D C l3 Spectrum Type HMBC Sweep Width (Hz) (9990.23, 37557.27) Temperature (degree C) 2 5 .1 6 0 T itle m _ h m _ 1

M_HM_1.300 2.ESP

-40

-20

100

120 F1 Chemical Shift (ppm)

140

160

180

200

220

240

16 14 12 10 8 6 4 2 0 -2 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 76 – Mapa de correlações de HMBC para Pgf 7.

126

6 5 9 7 N 10 H-11/12 H-9 3 H-5 H-6 H-10 13 N 12 H

100 C-6 C-12

C-9 120 C-7 C-11 C-8 C-2 C-13 C-13

C-13 140 F1 Chemical Shift (ppm)

8.5 8.4 8.3 8.2 8.1 8.0 7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 77– Expansão da região entre 8,5-7,3 ppm do mapa de correlações de HMBC de Pgf 7.

127

6 5 9 7 N 10 CH3 3 13 N 12 H

100

120 2.85, 134.54, 0.28 2.85, 141.51, 0.87 C-2 C-3 140 F1 Chemical Shift (ppm)

3.6 3.5 3.4 3.3 3.2 3.1 3.0 2.9 2.8 2.7 2.6 2.5 2.4 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 78 – Expansão da região entre 3,5-2,4 ppm do mapa de correlações de HMBC de Pgf 7.

128

This report was created by ACD/NMR Processor Academic Edition. For more information go to www.acdlabs.com/nmrproc/ 16/01/2015 21:43:25

Acquisition Time (sec) 4 .7 5 3 5 C o m m e n t m-cac1\Marcelo_PN2 2mg cdcl3 D a te 18 Jul 2014 10:40:00 D a te S ta m p 18 Jul 2014 10:40:00 F ile N a m e F:\M-CAC1\11\FID Frequency (MHz) 5 0 0 .1 3 N u c le u s 1H Number of Transients 1 O r ig in s p e c t Original Points Count 32768 O w n e r n m rs u Points Count 32768 Pulse Sequence z g 3 0 Receiver Gain 1 8 1 .0 0 SW(cyclical) (Hz) 6 8 9 3 .3 8 S o lv e n t CHLOROFORM-d Spectrum Offset (Hz) 2 4 8 5 .5 9 0 8 Spectrum Type STANDARD Sweep Width (Hz) 6 8 9 3 .1 7 Temperature (degree C) 2 5 .1 6 0

VerticalScaleFactor =

L-RPHAC164-74-7.011.esp1 TMS

0.40

0.35

0.30

0.25

0.20 3 . 9 6 Absolute Intensity

0.15

0.10

6 . 9 2 6 . 8 5

0.05

6 . 2 8

6 . 2 7

7 . 5 9 7 . 6 1

12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 -1 -2 Chemical Shift (ppm) 1 Figura 79 – Espectro de RMN de H (CDCl3-TMS, 500 MHz) de Pgg 1.

129

L-RPHAC164-74-7.011.esp CH3 5 O 3 0.20 6 2 7 9 HO O O

0.15

0.10 Normalized Intensity H-5 H-8

H-3

6 . 9 2 6 . 8 5

0.05 H-4

6 . 2 8

6 . 2 7

7 . 5 9 7 . 6 1

7.5 7.0 6.5 Chemical Shif t (ppm) Figura 80 – Expansão da região entre 7,6-6,0 ppm do espectro de RMN de 1H de Pgg 1.

130

L-RPHAC164-74-7.011.esp

O-CH3 CH3

0.20 3 . 9 6 5 O 3 6 2 7 9 0.15 HO O O

0.10 Normalized Intensity

0.05

4.5 4.0 3.5 Chemical Shif t (ppm) Figura 81 – Expansão da região entre 4,5-3,5 ppm do espectro de RMN de 1H de Pgg 1.

131

This report was created by ACD/NMR Processor Academic Edition. For more information go to www.acdlabs.com/nmrproc/ Acquisition Time (sec) (0.3408, 0.0068) C o m m e n t 5 mm TBI 1H/13C/D-BB Z-GRD Z8624/14 D a te 18 Jul 2014 10:40:00 F ile N a m e C:\USERS\MAMAPOL\DESKTOP\ARQUIVOS DIVERSOS\M-CAC1\200\SER Frequency (MHz) (500.13, 125.77) N u c le u s (1 H , 1 3 C ) Number of Transients 30 O r ig in s p e c t Original Points Count (2048, 256) O w n e r n m rs u Points Count (2048, 1024) Pulse Sequence hsqcetgpsi_MOD S o lv e n t C D C l3 Spectrum Type HSQC Sweep Width (Hz) (6006.68, 37557.27) Temperature (degree C) 2 5 .3 6 0 T itle sensibilidade m-cac1 Marcelo 1mg cdcl3

A u to P h a s e Ambiguous Phase

M-CAC1.200.ESP

-40

-20

100

120 F1 Chemical Shift (ppm)

140

160

180

200

220

240

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 82 – Mapa de correlação de HSQC para Pgg 1.

132

CH3 5 O 3 6 2 H-5 H-8 7 9 HO O O H-4 H-3

6.93, 103.09, 0.02 6.85, 106.79, 0.02 100 C-3 C-5 C-8 120 6.28, 113.62, 0

C-4 140

7.6, 143.21, 0 F1 Chemical Shift (ppm) 160

7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 6.5 6.4 6.3 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 83 – Expansão da região entre 7,7-6,0 ppm do mapa de correlação de HSQC de Pgg 1.

133

CH3 5 O 3 OCH3 6 2 7 9 HO O O

48 3.96, 56.17, 0.05

72 F1 Chemical Shift (ppm)

4.00 3.95 3.90 3.85 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 84 – Expansão da região entre 4,0-3,8 ppm do mapa de correlação de HSQC para Pgg 1.

134

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M-CAC1.300.esp

-40

-20

100

120 F1 Chemical Shift (ppm)

140

160

180

200

220

240

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 85 – Mapa de correlações de HMBC de Pgg 1.

135

CH3 5 O 3 6 H-5 H-8 2 H-4 7 9 H-3 HO O O H-4

100 C-10 C-10

120

C-9 C-7 140 C-9 C-4 C-6 C-9 C-2

C-2 C-6 160 F1 Chemical Shift (ppm)

7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 6.5 6.4 6.3 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 86 – Expansão da região entre 7,7-6,3 ppm do mapa de correlações de HMBC para Pgg 1.

136

CH3 5 O 3 6 2 7 9 HO O O

120

128

136 OCH3/C-7 3.96, 144.66, 0.18

144 F1 Chemical Shift (ppm)

3.985 3.980 3.975 3.970 3.965 3.960 3.955 3.950 3.945 3.940 3.935 F2 Chemical Shift (ppm) Figura 87 – Expansão da região entre 3,98-3,93 do mapa de correlações de HMBC de Pgg 1.

137

138

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Acquisition Time (sec) 2 .6 2 1 4 C o m m e n t C-PGF2/CDCL3/MEOD 20 Mg Marcelo D a te 28 Mar 2014 12:55:44 D a te S ta m p 28 Mar2014 12:55:44 F ile N a m e C:\USERS/MAMAPOL/DESKTOP/ ARQUIVOS DIVERSOS\C-PGF2\11\1\fid Frequency (MHz) 5 0 0 .1 3 N u c le u s 1H Number of Transients 32 O r ig in s p e c t Original Points Count 32768 O w n e r Administrator Points Count 32768 Pulse Sequence z g 3 0 Receiver Gain 5 0 .8 0 SW(cyclical) (Hz) 1 2 5 0 0 .0 0 S o lv e n t METHANOL-d4 Spectrum Offset (Hz) 3 0 9 9 .5 2 4 4 Spectrum Type STANDARD Sweep Width (Hz) 1 2 4 9 9 .6 2 Temperature (degree C) 3 3 .6 6 0

C-AIF11.001.ESPVerticalScaleFactor = 1

0.45

0.40

0.35

0.30

0.25 Absolute Intensity

0.20

0.15 5 . 2 4

0.10

3 . 2 0

3 . 1 8

3 . 2 1

5 . 2 4 5 . 2 7

0.05

2 . 8 2 2 . 8 4

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 -2 -4 -6 Chemical Shift (ppm)

1 Figura 88 – Espectro de RMN de H (CDCl3/CD3OD, 500 MHz) de Pgf 2.

138

Figura 89 – Expansão da região entre 5,5-3,0 ppm do espectro de RMN de 1H de Pgf 2.

0.40 C-AIF11.001.ESP

0.35

0.30

0.25

0.20

0.15 Normalized Intensity

0.10

0.05

2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 Chemical Shif t (ppm)

Figura 90 – Expansão da região entre 2,5-0,5 ppm do espectro de RMN de 1H de Pgf 2.

139

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Acquisition Time (sec) 0 .5 5 0 5 C o m m e n t 5 mm BBO BB-1H/D Z-GRD Z8007/0124 D a te 10 Mar 2014 17:35:12 D a te S ta m p 10 Mar 2014 17:35:12 F ile N a m e C:\ USERES/MAMAPOL\DESKTOP\ARQUIVOS DIVERSOS\C-PGF2\2\fid Frequency (MHz) 1 2 5 .7 6 N u c le u s 13C Number of Transients 21017 O r ig in s p e c t Original Points Count 16384 O w n e r Administrator Points Count 16384 Pulse Sequence z g p g 3 0 Receiver Gain 7 2 4 .0 0 SW(cyclical) (Hz) 2 9 7 6 1 .9 0 S o lv e n t METHANOL-d4 Spectrum Offset (Hz) 1 2 6 0 9 .6 4 1 6 Spectrum Type STANDARD Sweep Width (Hz) 2 9 7 6 0 .0 9 Temperature (degree C) 2 5 .1 6 0

C-AIF11.002.ESPVerticalScaleFactor =

1 4 8 . 9 1 1.00

0.95 4 9 . 0 8

0.90

0.85

7 7 . 3 1 7 7 . 8 2

0.80

0.75 4 8 . 7 4

0.70

0.65 3 8 . 9 2

0.60

0.55 5 5 . 5 4

0.50

1 5 . 7 6

4 9 . 2 6 Absolute Intensity

0.45

4 8 . 5 8 5 3 . 1 1

0.40 4 8 . 0 6

0.35 3 7 . 1 5 1 3 8 . 4 5

0.30

3 9 . 7 2

1 2 5 . 6 8 1 8 0 . 9 4

0.25 2 8 . 2 1

2 3 . 4 9

1 7 . 0 6 3 0 . 8 4

0.20

7 8 . 9 4

1 5 . 5 7

1 4 4 . 1 2

2 1 . 2 6 1 2 5 . 8 4

0.15 4 7 . 8 9

3 3 . 3 0

1 8 1 . 1 2 1 2 2 . 4 6

0.10 1 5 . 3 9

0.05

220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 -20 Chemical Shift (ppm) 13 Figura 91 – Espectro de RMN de C (CDCl3/CD3OD, 125 MHz) de Pgf 2.

140

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Acquisition Time (sec) 3 .2 7 6 8 C o m m e n t l_FDM_86_90 Marcelo 5,1mg cdcl3/MeOD D a te 21 Mar 2014 14:38:08 D a te S ta m p 21 Mar 2014 14:38:08 F ile N a m e C:\USERS\MAMAPOL\DOCUMENTS\ESPECTROS E AMOSTRAS\L_FDM_86_90\1\FID Frequency (MHz) 5 0 0 .1 3 N u c le u s 1H Number of Transients 32 O r ig in s p e c t Original Points Count 32768 O w n e r n m rs u Points Count 32768 Pulse Sequence z g 3 0 Receiver Gain 3 2 .0 0 SW(cyclical) (Hz) 1 0 0 0 0 .0 0 S o lv e n t CHLOROFORM-d Spectrum Offset (Hz) 2 1 6 6 .3 1 6 2 Spectrum Type STANDARD Sweep Width (Hz) 9 9 9 9 .7 0 Temperature (degree C) 2 5 .1 6 0

L_FDM_86_90.001.espVerticalScaleFactor = 0.018 1

0.017

0.016

0.015

0.014

0.013

0.012

0.011

0.010

0.009 Absolute Intensity 0.008

0.007

0.006

0.005

0.004

0.003

0.002

0.001

14 12 10 8 6 4 2 0 -2 -4 -6 Chemical Shift (ppm) 1 Figura 92 – Espectro de RMN de H (CDCl3/CD3OD-TMS, 500 MHz) de Pgf 3.

141

L_FDM_86_90.001.esp

0.015

0.010

3 . 3 5 Normalized Intensity

0.005 4 . 3 6

4 . 3 8

3 . 3 4

3 . 3 7

3 . 1 8

3 . 8 2

3 . 8 1

3 . 6 9

3 . 7 0

3 . 2 0

5 . 3 3

3 . 8 4

3 . 1 6

3 . 6 7

3 . 2 5

3 . 6 8

3 . 5 7

5 . 1 0

3 . 3 9

5 . 0 2

5 . 0 0

5 . 1 5

4 . 9 9

4 . 9 7 5 . 1 4

0 1.00 0.57 0.57 1.01 1.12 1.11 1.06 1.36 1.15

5.0 4.5 4.0 3.5 Chemical Shif t (ppm) Figura 93 – Expansão da região entre 5,5-3,0 ppm do espectro de RMN de 1H de Pgf 3.

0.015 L_FDM_86_90.001.esp 0 . 7 8 0.014

0.013

0.012 0 . 6 9

0.011

0.010 0 . 7 7

0.009 0 . 6 7 0 . 8 2

0.008 1 . 0 0

0.007

0.006

0 . 9 1 Normalized Intensity

0.005 0 . 9 0 1 . 2 4

0.004

0.003

0.002 2 . 3 7

2 . 2 4

2 . 3 6

2 . 4 0

2 . 4 0 2 . 2 7 0.001 2 . 2 2

0 0.97 0.93 3.20

2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 Chemical Shif t (ppm)

Figura 94 – Expansão da região entre 2,5-0,5 ppm do espectro de RMN de 1H de Pgf 3.

142

L-FHEX113_116-29-30.001 PROCS.ESP 0.11

0.10 0.09 0.08

0.07

0.06

0.05

0.04 Normalized Intensity

0.03

0.02

0.01

0 0.98 0.64 0.63 0.08 0.89 7.88 7.29 0.03

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 -0.5 Chemical Shif t (ppm) 1 Figura 95 – Espectro de RMN de H (CDCl3/CD3OD-TMS, 500 MHz) de Pgf 5.

Figura 96– Espectro de massas ESI(+)-MS/MS do íon m/z 347 (calicantina).

143

Figura 97– Espectro de massas ESI(+)-MS/MS do íon m/z 363 (Pgfr 2a).

144