Programa Fondecyt Informe Final Etapa 2013 Comisión Nacional De Investigacion Científica Y Tecnológica Version Oficial
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PROGRAMA FONDECYT INFORME FINAL ETAPA 2013 COMISIÓN NACIONAL DE INVESTIGACION CIENTÍFICA Y TECNOLÓGICA VERSION OFICIAL FECHA: 15/03/2014 Nº PROYECTO : 1110737 DURACIÓN : 3 años AÑO ETAPA : 2013 TÍTULO PROYECTO : EVOLUTIONARY RESPONSES OF SOUTHERN SOUTH AMERICAN RODENTS TO PRECIPITATION GRADIENTS AND BIOGEOGRAPHICAL HISTORY DISCIPLINA PRINCIPAL : GENETICA Y EVOLUCION GRUPO DE ESTUDIO : BIOLOGIA 1 INVESTIGADOR(A) RESPONSABLE : GUILLERMO D'ELIA VARGAS DIRECCIÓN : COMUNA : CIUDAD : Niebla REGIÓN : XIV REGION FONDO NACIONAL DE DESARROLLO CIENTIFICO Y TECNOLOGICO (FONDECYT) Moneda 1375, Santiago de Chile - casilla 297-V, Santiago 21 Telefono: 2435 4350 FAX 2365 4435 Email: [email protected] INFORME FINAL PROYECTO FONDECYT REGULAR OBJETIVOS Cumplimiento de los Objetivos planteados en la etapa final, o pendientes de cumplir. Recuerde que en esta sección debe referirse a objetivos desarrollados, NO listar actividades desarrolladas. Nº OBJETIVOS CUMPLIMIENTO FUNDAMENTO 1 1.- to estimate the capacity of concentrate urine in TOTAL selected South American rodent species inhabiting contrasting environment by urine osmolarity and renal measurements. 2 2.- to assess the expression profile of genes TOTAL Este fue el objetivo principal del proyecto, tanto related to water economy (e.g., renal aquaporines) por lo novedoso del mismo, como porque in rodent populations from contrasting constituyo el que implico mayor trabajo y el que environment. genero el volumen mayor de resultados. 3 3.- to evaluate if in genes related to water PARCIAL Aún se esta trabajando en pos de completar este economy (e.g., renal aquaporines) there are objetivo. Para ver si existen alelos exclusivos de alleles exclusive to populations from xeric areas, las áreas xéricas en los loci que presentan and, in case they exist, to evaluate if some of their sobre-expresión, primero hay que realizar el unique substitutions have been fixed by positive objetivo 2; una vez que se tiene la lista de genes selection. candidatos a posteriori lo que sigue es un trabajo bioinformático para recobrar los contigs y ver el patrón geográfico de variación de cada loci. La caracterización de los perfiles de expresión terminó hace poco, por lo que el tiempo no ha alcanzado para cumplir con este objetivo. Sin embargo, el trabajo esta encaminado. Dicho lo anterior, destaco que el presente es el menor de los objetivos del proyecto; constituye un objetivo secundario derivado de los resultados del objetivo 2. Cierro este comentario mencionando que el cumplimiento parcial del objetivo 3 no afecta significativamente la culminación del proyecto. 4 4.- to compare the geographic structure of TOTAL variables related to water economy (e.g., urine osmolarity, renal measurements, gene expression profiles) with the pattern shown by features (e.g., the mitochondrial DNA) neutral with respect to water economy. Otro(s) aspecto(s) que Ud. considere importante(s) en la evaluación del cumplimiento de objetivos planteados en la propuesta original o en las modificaciones autorizadas por los Consejos. Considero que las tareas de investigación enmarcadas en el proyecto se realizaron de forma satisfactoria. Los resultados obtenidos son, en buena medida, interesantes y novedosos. A lo largo estos tres años de investigación, que se hicieron muy cortos, se ha generado un cúmulo enorme de datos los que se continuaran publicando en el transcurso del presente año. Las perspectivas de investigación que se han abierto son múltiples y muy estimulantes, desde que se ha avanzado sustancialmente en la caracterización de los patrones espaciales de expresión génica de las dos especies de mamíferos más conspicuas del sur de América del Sur. Es así que en una propuesta de investigación que recientemente fue aprobada por FONDECYT planteamos expandir la línea de investigación aquí iniciada, aumentando el muestreo geográfico y evaluando que tan plásticas son las respuestas aquí caracterizadas. El futuro es promisorio; consideramos que en tres o cuatro años estaremos en condiciones de publicar manuscritos de alto impacto. RESULTADOS OBTENIDOS: Para cada uno de los objetivos específicos, describa o resuma los resultados. Relacione las publicaciones y /o manuscritos enviados a publicación con los objetivos específicos. En la sección Anexos incluya información adicional que considere pertinente para efectos de la evaluación. La extensión máxima de esta sección es de 5 páginas (letra tamaño 10, Arial o Verdana). El trabajo realizado durante la etapa 2013 fue intenso y variado, atacándose todos los frentes del proyecto, La mayor novedad de este año radica en que se avanzó significativamente en el análisis de expresión génica, algo que se inició durante el segundo año luego de solucionar problemas técnicos de laboratorio. La expresión génica se estudió a escala transcriptómica y a con el enfoque de genes candidatos a priori. Es así, que en este informe se enfatiza la parte de expresión génica, dado que constituye la parte fundamental del proyecto, la que a su vez puede considerarse como la parte más novedosa del mismo en el contexto de la investigación de corte organísmico que se desarrolla en Chile. Se considera que el objetivo general del proyecto “To contribute to the understanding of how adaptive and neutral divergence promote the differentiation of rodent populations in southern South American” se cumplió de buena manera. Objetivos específicos 1.- to estimate the capacity of concentrate urine in selected South American rodent species inhabiting contrasting environment by urine osmolarity and renal measurements. Los resultados, en línea con otros derivados de estudios previos (e.g., Bozinovic et al. J. Arid Environ. 75 (2011): 411-415), indican que los individuos de bosque producen orina menos concentrada que aquella producida por organismos de estepa. Esta diferencia, sin embargo, resulto significativa solo para la comparación de muestras de Abrothrix longipilis y no para las muestras de A. olivaceus (Figura 1). Los tamaños muestreales no son altos porque muchos individuos al ser procesados no presentaban orina suficiente para constituir una muestra analizable por el refractómetro usado. Aún así, los resultados son suficientes para ilustrar algo importante en el contexto del proyecto: los animales de la estepa, al igual que lo que pasa con otros sistemas análogos ya estudiados, concentran más la orina que los animales del bosque. Esto constituye la base que sustenta el centro del proyecto; i.e., es de interés investigar como se ajustan los perfiles de expresión génica en organismos de una misma especie que habitan ambientes contrastantes. Figura 1. Comparación de la concentración de orina de muestras de bosque y estepa de Abrothrix longipilis y A. olivaceus. En consonancia con hallazgos previos (revisados en Bozinovic y Gallardo Comp. Biochem. Physiol. 142C (2006): 163–172) se encontró que los animales de estepa tienen riñones significativamente más grandes que aquellos del bosque (Anexo A, Figura 2) Al mismo tiempo, la tendencia es inversa en relación a órganos del sistema digestivo. Existe una relación positiva y significativa entre el tamaño de algunos órganos del sistema digestivo y la precipitación anual acumulada; la misma relación se da con la productividad primaria neta (Anexo A, Figura 3). 2.- to assess the expression profile of genes related to water economy (e.g., renal aquaporines) in rodent populations from contrasting environment. El gran avance realizado durante este tercer año refiere a los análisis de expresión génica y la comparación de los niveles de expresión entre ambientes. De hecho, este objetivo es la pieza central de este proyecto, es la más novedosa y relevante del mismo: contrario a los otros objetivos, para este no existen datos previos, no solo para las especies focales, sino que para ningún mamífero de America del Sur. Estos análisis se basaron en extracciones de ARN de 41 y 79 especimenes de Abrothrix longipilis y A. olivaceus respectivamente (Anexo: A Tablas 1 y 2); estas extracciones se realizaron siguiendo el protocolo detallado en el Anexo B. tal cual estaba contemplado en el proyecto usando ejemplares de cuatro localidades de dos bandas latitudinales (sur y norte) y a su vez de ambientes contrastantes, dos de bosque y dos de estepa (Anexo A, Figura 1). La expresión génica se estudió con dos enfoques cuyos resultados principales se detallan a continuación. Genes candidatos a priori La elección de los genes candidatos se realizó en base a una exploración de la literatura referente a la economía del agua y en base a resultados preliminares (al momento de comenzar los análisis) de expresión a partir del enfoque transcriptómico. Para las dos especies focales se analizó mediante RT-qPCR (PCR cuantitativo) la expresión de dos genes candidatos: Aquaporina 2 (AQP2) y el miembro 1 de la Familia de transportadores de soluto 12 (SCL12a1). La expresión de los genes candidatos se cuantificó usando como referencia (expresión relativa) la expresión de cinco genes normalizadores (Succinato deshidrogenasa subunidad a, SDHa1; Hipoxantina fosforribosil 1, Hprt; Proteína Ribosomal L27, RPL27; Gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, GAPDH; Proteína Ribosomal L13, RPL13). Los genes normalizadores se usan para establecer el nivel basal de expresión génica y así determinar si alguno de los genes candidatos se sobre expresa (o sub expresa) en alguno de los ambientes de interés. La etapa de diseño de primers y optimización de reacciones de amplificación de los siete genes analizados llevó meses de trabajo dado que