TTHHÈÈSSEE En vue de l'obtention du DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSE Délivré par l’Université Toulouse III – Paul Sabatier Discipline ou spécialité : Biosciences Végétales Présentée et soutenue par Mohammed-Amine Madoui Le 12 mai 2009 Identification d'effecteurs du pouvoir pathogène et de voies métaboliques chez l'oomycète Aphanomyces euteiches par une approche génomique JURY Harald Keller (Rapporteur) – Directeur de Recherhce à l’UMR IPMSV, INRA/CNRS/UNSA, Sophia Antipolis Marc-Henri Lebrun (Rapporteur) – Directeur de Recheche à l’UMR 5240, CNRS/UCB/INSA/BCS, Lyon Hubert Schaller (Examinateur) - Chargé de Recherche à l'UPR 2357 CNRS / Université de Strasbourg Mathieu Arlat (Président du jury) – Professeur au LIPM, INRA/CNRS, Castanet-Tolosan Bernard Dumas (Directeur de thèse) – Chargé de Recherche à l’UMR 5546, CNRS/Université Paul Sabatier - Toulouse III Elodie Gaulin (Directrice de thèse) – Maître de Conférences à l’UMR 5546, CNRS/Université Paul Sabatier - Toulouse III Ecole doctorale : SEVAB, Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingénieries Unité de recherche : UMR 5546 CNRS - UPS, Surface Cellulaires et Signalisation chez les Végétaux Directeurs de Thèse : Bernard Dumas et Elodie Gaulin . 2 Remerciements Je remercie en premier lieu mes encadrants, Bernard Dumas et Elodie Gaulin pour m’avoir fait confiance pendant et à la suite de mon stage de master et pour m’avoir permis de réaliser mes travaux de thèse dans de très bonnes conditions. Je les remercie également pour leur encadrement de qualité qui m’a permis de me former à la démarche de la recherche scientifique ainsi qu’aux techniques de la biologie moléculaire. Merci à vous deux pour votre patience et votre dévouement. Je remercie ensuite mes deux aides précieuses, Catherine Mathé et Hélène San Clémente qui m’ont donné goût à la programmation. Elles m’ont largement aidé à me former et à mettre en pratique les notions de bioinformatique acquises de jours en jours. Un grand merci à vous deux pour vos enseignements. Un énorme merci à Justine Bertrand-Michel de la plate-forme de lipidomique de l’INSERM de Purpan. Merci pour l’investissement considérable qu’elle a apporté dans les travaux de biochimie des stérols d’Aphanomyces. Merci également à Hubert Schaller pour ses conseils avisés lors de mon comité de thèse et pour le suivi de mes travaux. Je tiens également à remercier spécialement Arnaud Bottin pour tous les repas passés ensemble à discuter d’Aphanomyces et à confronter nos hypothèses sur ce parasite. Je souhaite aussi remercier Christophe Jacquet, Marie-Thérèse Esquerré-Tugayé, Francis Carbonne et Claude Lafitte pour leur participation à mes travaux durant les diverses réunions d’équipe. Et puis que seraient ces trois années passées sans la présence des autres doctorants ? Merci à Valérie Jaulneau pour l’ambiance qu’elle a mis dans le laboratoire. Et merci aux autres doctorants : aux anciens comme Marc, Ilham, Joanne et Nasser ainsi qu’au nouveau, merci Mathieu pour ta bonne humeur. Un grand merci aux services communs de l’UMR 5546, à Jean-Luc, Catherine, Nicole et Michèle. Et enfin merci à toutes les personnes qui ne sont pas du laboratoire mais qui m’ont aidé ou ont participé à un moment donné à mes travaux, alors merci à Martina Rickauer du laboratoire SP2 de l’INP/ENSAT, à David Allouche et à Didier Laborie de la plateforme bioinformatique de l’INRA de Toulouse, à Gérald Salin et à Julien Sarry de la plateforme génomique de Toulouse. 3 4 Sommaire Résumé................................................................................................................................... 7 Abstract .................................................................................................................................. 9 Chapitre 1 : Introduction .......................................................................................................... 11 1 Les oomycètes : classification et importance.................................................................... 13 1.1 Caractéristiques et classification des oomycètes........................................................ 13 1.2 Des microorganismes parasites de plantes et d'animaux............................................ 15 2. Génomique des oomycètes............................................................................................... 17 2.1 Banques d’ESTs et génomes d’oomycètes................................................................. 17 2.2 Outils bioinformatiques dédiés à l’étude des oomycètes ........................................... 21 2.3 Effecteurs du pouvoir pathogène................................................................................ 23 3. Aphanomyces euteiches, un parasite des légumineuses ................................................... 31 3.1 La pourriture racinaire précoce du pois...................................................................... 31 3.2 Biologie d’A. euteiches.............................................................................................. 35 3.3 Variabilité du pouvoir pathogène............................................................................... 41 4 Objectifs de la thèse .......................................................................................................... 43 Chapitre 2 : AphanoDB: une ressource génomique pour Aphanomyces ................................. 47 Introduction .......................................................................................................................... 49 Article 1 : AphanoDB : a genomic ressource for Aphanomyces pathogens...……...............51 Conclusion............................................................................................................................ 59 Chapitre 3 : Identification d’effecteurs et de voies métaboliques chez Aphanomyces euteiches .................................................................................................................................................. 61 Introduction .......................................................................................................................... 63 Article 2 : Transcriptome of Aphanomyces euteiches : New Oomycete Putative Pathogenicity Factors and Metabolic Pathways………………………………………………65 Conclusion............................................................................................................................ 77 Chapitre 4 : Synthèse de sterols chez A. euteiches................................................................... 79 Introduction aux stérols........................................................................................................ 81 Structure chimique et nomenclature des stérols............................................................... 81 Diversité des stérols chez les organismes vivants............................................................ 83 Fonctions biologiques des stérols..................................................................................... 85 Voies de synthèse de stérols............................................................................................. 89 Article 3 : Sterol metabolism in the oomycete Aphanomyces euteiches, a legume root pathogen…………………………………………………………………………………....91 Conclusion.......................................................................................................................... 107 Chapitre 5 : Discussion ........................................................................................................ ..109 1. Génomique d’A. euteiches.......................................................................................... ....111 2. Identification de gènes d’interêt chez A. euteiches ....................................................... .112 3. Synthèse des stérols par A. euteiches ......................................................................... ....113 3.1 Une nouvelle voie de synthèse identifiée................................................................. 113 3.2 Voie des stérols et molécules anti-oomycètes.......................................................... 115 4. Conclusion...................................................................................................................... 116 Références .............................................................................................................................. 117 5 6 Résumé Les oomycètes sont des microorganismes eucaryotes responsables de maladies dévastatrices chez les plantes cultivées. La pourriture racinaire causée par l’oomycète Aphanomyces euteiches est à l'origine de dommages importants sur les cultures de légumineuses. Afin d’identifier les effecteurs du pouvoir pathogène et de mieux connaitre le métabolisme d'A. euteiches, une analyse globale du transcriptome a été réalisée. L’analyse bioinformatique de 20 000 ADNc issus de la souche ATCC201684 a conduit à la mise en place d’une base de données accessible en ligne, AphanoDB, sur laquelle les ESTs assemblées et annotées ont été déposées. L’exploitation d’AphanoDB a permis l’identification de nouveaux effecteurs putatifs du pouvoir pathogène et de voies métaboliques originales comme celle des stérols. L'étude de ce métabolisme a été approfondie par une approche biochimique. Contrairement à d'autre oomycètes comme Phytophthora, incapables de synthétiser des stérols, A. euteiches possède tous les gènes nécessaires à leur synthèse. L’analyse biochimique des stérols d’A. euteiches a montré que le fucostérol correspond au stérol majoritaire. L’inhibition