AVERTISSEMENT
Ce document est le fruit d'un long travail approuvé par le jury de soutenance et mis à disposition de l'ensemble de la communauté universitaire élargie.
Il est soumis à la propriété intellectuelle de l'auteur. Ceci implique une obligation de citation et de référencement lors de l’utilisation de ce document.
D'autre part, toute contrefaçon, plagiat, reproduction illicite encourt une poursuite pénale.
Contact : [email protected]
LIENS
Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 122. 4 Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 335.2- L 335.10 http://www.cfcopies.com/V2/leg/leg_droi.php http://www.culture.gouv.fr/culture/infos-pratiques/droits/protection.htm Université de ffieÈe Centredes sciencesde I'environnenlent
Thèse de Doctorat de I'Université de Metz mentionSciences
présentéeet soutenuepubliquement le 24 Octobre l98A parAnnette LEXA-ROBIH
t
/
_ Plopriétéscholérétiques, antihépatotoxiques et diurétiques d'Eupatorlum cannabinum L.: approcheethnôpharmacologique
BIBLIOTHEOIJEUNIVERSITAIRE DE METZ Membresdu jury: M. J.M.Pelt, professeur (président du jury) |ilil ililililril lllil rilllil illlill llllllillll M. J. Atkinson,professeur (rapporteur) o22 420288 2 entin, maîtrede conférences(directeur de thèse) M. Larrey,docteur M. F. Mortier,professeur (rapporteur) M. G. Mazarjl docteur M. B. Capolaghi.docteur Maitre, de qui avez-vous appris le Tao? demanda Man Po à Mu Yu. De Itécriture de Ia lecture de I'éveil de I'attention du travail du son de I'inconnu du vide de I'infini sans commencement lui répondit-if.
Tchouang Tseur 3èIne siècte avant J.C.
À ur le profesesur if.li. Pelt, merci.
EIBI.IOTHËQUT UN I VhRS IIA,IRI
s/& wle À itacqusa Fleurentin, maitre de conférences à Ituniversité de Metz, Ie guide de ces travaux. Je n,ai cessé de louer sa disponibilité et son humeur égale en toutes circonstances
À Ur le profess€ur François llortl.er, professeur de pharmacognosie à Ia faculté de pharmacie de Nancy, la juste mesure entre compétence et sens de lthumour.
mercL. A Unê ll.e. Fuzell,er, naitre de conférences à la faculté de phamacie de Nancy, pour ntavoir fait gentinent et gracieusement bénéficier de ses compétences et de son sérieux,
A llr P.Irebr, maitre de recherche au C.N.R.S., pour l'aide et les conseils pratiques gui mta apportés,
A ClaLre Eoeffler, l,tarLe-Claire L,anbers, Donlnique Beaux, I.licbel itoyeua, Eassan Eaôi et Pierre-Yves lnrLs, pour la pierre que chacun a apportée à cet rfédif icerr,
À Àlaln Rolland, Ie coeur sur Ia main, une mention toute spéciale,
À Frédérl.o 9ol.c, pour aâ contrlbution informatique, avec toute mon anitié,
A it€an-Clauû€ Block, Paule Vasaeur, itean-FrançoLs Fenard, l{arcelle Grunfelder aLnsl que tout le personnel et tous mes collègues passés et présents ôu Centre des Sciences de I 'Environnenent, Pour tous leurs conseils , leur gentillesse, Pour tout ce çlue j'ai appris grâce à eux et qui ne se résume pas à une thèse, merci. A I{r Ie professeur Atkinson, professeur de pharnracotogie à la faculté des Sciences Pharmaceutiques de Nancy,
A ur uazars, docteur , directeur du centre dthistoire de la médecine à ltuniversité Louis Pasteur de Strasbourg, pour sa contribution ayurvédiquê,
A ur capolaghi, docteur en sciences pharmaceutiques et biologiste à I'hôpital Bel-Àir de Thionville, gui mta accueillie dans son laboratoire pour me permettre d'effectuer divers dosages,
A lltr Irarreyt docteur, chargé de recherche I.N.S.E.R.ll.,
pour avoir bien voulu accepter de juger cette thèse, rnerci, À ErLa Poitevin, A ldLchel LepetitdidLer,
à qui Je dois Ia contribution graphique à cet ouvrage. Recevez ici Ie témoignage de mon anritié fidèle et de mon adniration, j'ai toujours cru en vous, aujourd'hui je sais pourquoi. merci.
A Etl.enne Robin, docteur en médecine, praticien hospitalier, néphrologue et endocrinologue,
A ur Carrrnane docteur en médecine, praticien hospitalier, chef de service de médecine interne et de néphrologie au C.H.R. de Thionville,
A ltarc RobLn, docteur en Sciences Pharmaceutiques, pharmacologue, pour avoir airnablement accepté de me conseiller. La rencontre du milieu nédical et celui de Ia recherche est riche d'enseignements,
mercl.
â toue leg petits rongêurs gui ont été sacrifiés pour ce travail, mille excuses.... f, cbrl.àtopbe, j'ai puisé dans I'exemplaire oeuvre humanitaire çlue tu as accomplie loin d'ici, lâ force de mener ce travail à terme, Cette ascèse mta permis de découvrir gu'il existe sinon une raison de vivre et d'espérer, du moins une raison de trmieux- êtrerr. merci. A na rère, qui mta donné la plus belle Ieçon dt amour, de sagesse et de Joie de vivre.
A non pàre, I'esprit cartésien de la famille, je Ie remercie de m'avoir donné Ie gott de l'étude, De m'avoir permis de mener à bien mes années universitaires, Et d'avoir bien voulu mettre ses compétences orthographiques au senrice de la rédaction scientifigue.
A na fanLlle, merci. I i -:\'..\ I AOI.|UAIRE
PAGES
INTRODUETTON
1àre PARIIE 3 ErUDE BTBLTOGRAPEIOITE
À BTUDE BOTANTQUB
À'.1 ETUDE DU GENRE EUPATORII,II| L.
4.1.1 IÀ FAII{ILI,E DES ASTERÀCEAE
À. t-.1.1 TAXONOMTE A. r.. 1.2 DESCRIPTTONBOTANTQUE
4.1_.2 POSITTON SYSTEI{ATIQUE DU GENRE EUPATORII,II{L. I DÀNS IÀ FÀTIIILLE DES ASTERÀCEÀE
4.1.2.1 IÀ TRIBU DES EUPATORIEAE
4.L.2.2 IÀ TRTBU DES EUPATORIINEAE
A. ]..2.3 I,E GENREEUPATORIT'I{ L. L1
A. 1. 2.3.L POSTTIONSYSTEMATTQUE
4.1.2.3.2 CLE DE DETERMTNATIONDU GENREEUPATORII'I{ L.
4.2 ETUDE DE L,ESPECE E.cannabinum L. L4
4.2.1 CLE DE DETERITIINATIONDE L'ESPECE E.cannabinum L. L4
4.2.2 DTSTRIBUTION GEOGRÀPHIQUE 20
4.2.3 NOMSVERNACUTÀIRES 20
B T'TILI8ÀTION TRADITTONNEI,IJE 20
C CEII,IIE 25
C.1 TERPENOIDES 25 c. 1.1 IÀCTONES SESQUTTERPENTQUES C.1.2 TRITERPENESET STEROIDES C.1.3 DITERPENES C.1.4 II{ONOTERPENES C. 1.5 HUILE ESSENTIELLE
C.2 FIÀVONOIDES 33
C.3 DERIVES AIIIINES 35 C.3 1 ÀLCAI-,OIDES c.3 .2 AI{INO-ALCOOLS C.4 ÀCIDES-PHENOT,S 36
C.5 ACIDES-ALCOOLS 37
C.6 DERIVE DE BENZOFT'RANNE 37
C.7 DERIVES DE BENZOPYRANNE 38
C.8 SUCRES 38
D PEâruACOÎroGIB DE CERTAIITES STRUCTURES CtrII.IIQUBS PREAENTE8 DÀltg 1,8 cEl{RB Bupatorlun L. 39
D.l PTIARI{ACOI,OGIE DES FIÂVONOTDES 39
D. 2 PHARITIÀCOI,OGIE DES ÀCIDES-PHENOT,S 4L
D. 3 PHARMACOLOGIE DES ALCAIOIDES PYRROLIZIDTNIQUES 42
B CEIUTE ET PEARITACOIOGIE DE DIFFERENTES ESPECEE 43 DL GENRE EupatorLum L.
8.1 IÀCTONES SESQUTTERPENTQUES 43
8.2 FIÀVONOIDES 46
8.3 ALCAI,OIDES 46
8.4 HUILE ESSENTIELLE 50
8.5 POLYSACCHARIDES 50
F ETITDE PAARUACOIJoGIQUE DrE.cannabinum Ir. 5l_
,ène pARTTE pREpARÀTroN BT cÀRAcrERrgATroN 53 DEg EXTRAfT8 DeE.cannabl.num L.
A COIIPES nISTOLOGIQUES 54
B PREPARÀTION DB L'ENTRÀIÎ ÀQUEUX D,E.c!]nnab:Lr|gg I,. 56
B. 1 PROTOCOI,ED'EXÎRÀCTTON
8.2 IPTS UTILISES
C CARACTERISATION DE I,,EXTRAIT 59
C.1 }I,ATERIEL ET METHODES
C.l 1 PREPÀRÀTTONDES EXTRÀTTS
C.L.2 IDENTIFICATION DES EXTRÀITS EN C.C.M.
C.2 RESULTATS ET DISCUSSTON c.2. L IÂCTONES SESQUITERPENIQUES C.2.2. FI,AVONOTDESET ACTDES-PHENOLS c.2.3 ACTDES-ALCOOLS
C.2.4 ALCAIôIDES e.2.5 TENEUREN IONS Na+ etK+
D CONCLUSTON 68 tène peRTrE BTUDEptrARuAcoroorgun DE r.'ExrRÀrr AQI'EIIX D,Egcannab:Lnlrm L.
CONDITIONS D'EI..EVAGE ET D'EXPERTUENTATION DE8 ANTUAUX 69
A BÎUDB DE LÀ TOXICITE AIGUB DE L'EXTRAIT AQITEUX 7L Dr&Sgnnab:l1qgg L. CIIBZ LA 8OURIS
4.1 I.{ATERTELET METHODES
A.2 RESULTATS ET DTSCUSSTON
B PROPRIETE8 CEOLERBTIQUE8D'E.cannabLnun Ir. 74
8.1 ANALYSE BTBLTOGRAPET9UE
8.1.I- LE FLUX ACTDES BILIAIRES DEPENDANT
8.1.2 LE FLUX ACIDES BILIAIRES INDEPENDANT
8.1.3 LE FLUX EXTRÀHEPATOCYTAIRE
8.2 INFIJUEITCEDE IJ,EXTRAIT ÀQUEUXD,E.e|annablnlrn I.,. 80 SUR LE FIJUX BIIJIâIRE CHEU IE RÀT
8.2.1 MATERIEL ET METHODES
8.2.2 STATTSTTQUES
8.2.3 RESULTATS
8.2.4 ANALYSE DES RESULTATS
8.3 RECBERCBEDU SITE D'ACTION D'E.cannab:LEg4 L. 8UR LA FORIIATION DE LÀ BILE
8.3.1 INFLUBNCB DE L'EXTRAIT AQUEUXD'E.cannabitlu[ L. 90 gUR IrB TAUX D'ÀCIDBB BIIrIÀfRES DAltg L'l BIL,E
8.3.1.1 MATERIEL ET METHODES
8.3.1.2 STATTSTTQUES
8.3.1.3 RESULTATS 8.3.1.4 ANALYSEDES RESULTÀTS
8.3.2 TIÛPLUENCEDE rrrBxrRârr AeuBUx DrE.cannabLnun L. 95 gUR LA CI,ATRAIICE BIIJIATRB A IJ'ERTTHRITOIJ
8.3.2.1 MÀTERIEL ET I{ETHODES
8.3.2.2 EXPRESSIONDES RESULTATSET STATTSTIQUES 8.3.2.3 RESULTATS
8.3.3.4 ÀNALYSEDES RESULTATS
B.l. DISCUSSION 106 B. 4 . 1 ANALYSE COMPARÀTIVE
B. 4. 2 REIÀTION STRUCTURE/ACTMTE e PROPRIETE8 INTfBEPATOTOXIQUES D'E.cannabinum Ir. c.1 rltFrruEllcE DE rrrExrRArr D'E.eannabinum rJ. vrg-À-vrs 1i-6 DE Ir'EEPATTTE rNDItrrE PÀR r,E cclt rlf vrvo cEE,z LB RAr c. 1. t_ ANÀLYSE BIBLTOGRÀPHTQUE c.t.1.1 METABOLISMEDU CC14 c.1_.1.2 TilÎOXICATION EXPERTMENTÀLEAU CCt4 IN VM c. t . L.2.L ADMNISTRÀTIONDU TOXTQUE c. L. L.2.2 ANALYSESBIOCHIMTQUES c. 1. 1. 3 LES ÀNTTHEPÀTOIOXIQUES
C.1.1.3.1 LES MOLECULESDE SYNTHESE
C. 1. 1. 3.2 II{OLECULESD'ORIGTNE NÀTURELLE
C.L.2 INTLÛENCE D'UN PRETRATTEUENTET D'UN ].30 PC'8T-TRÀITEUENT DTEXTRârT ÀguEux DrE.cannablput[ L. Vrg-A-VIg DE I,'INIOXICÀTION EXPERTUENTALBÀU CClt CHEZ LE RAT
C.1.2.1 I,TÀTERTELET METHODES c.L.2.2 STÀTISTIQUES
C.I..2.3 RESULTÀTS
C.1.2.4 ANALYSEDES RESULTATS
C.2 UTSE AU POT!ÛITD'T'ITE ÎBCENIQUE D,EVAIJUÀTrON DE L4L IJ'EFFET INTINEPAIIOTOXTQUE D,E.CANNAbI.NUM IJ. clr;Aa LA SOURIA
C.2.1 ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE e.2.2 IIIFITITEDICEDE Ir'EXTRâIT A9UEUX D'E.cann!D!t!!4q L. L44 SIIR IrE TEltPg DE 8OUUEIL INDUIT PâR LE PENTOBARBfTAIT CAEU I'A SOURIS INTOXIQUEE AIt CCll
C.2.2.1 ITIATERIELET METHODES e.2.2.2 EXPRESSTONDES RESULTATSET STATTSTTQUES
C.2.2.3 RESULTATS ;
C.2.2.4 ANALYSEDES RESULTATS
C.2.3 IIÛFTJUEIICEDE IJ'EXTRAIT AQUBUX D,E.cElEabinrrm L. 148 VIA-â-VIS DE I'HEPÀTIÎE fNDUITE PAR LE CCtt C;E,BZLA AOURIS
C.2.3.1. MATERIEL ET METHODES e.2.3.2 EXPRESSTONDES RESULTATSET STATTSTTQUES e.2 .3 . 3 . RESULTATS
C.2.3.4 ANALYSEDES RESULTATS
C.3 âPPROCnB DU I|ECANISUE D'ÀCTfON DtE-.aannabinu[ L. PAR ]-55 DEg TECENIQUE8 EXPERII,IENTALES IN VITRO ET PAR LE TE8:[ D'INTOXICATION AU CCII CfrEZ LA SOUR,IS
C. 3. 1 ÀNALY8E BIBLIOGRAPHIQUE
C.3.1.1 MODELED'ETUDE SUR HEPATOCYTESISOLES DE RAT
C.3.L.2 ETUDE DU POWOIR ANTIRADICAIÀIRE D'UNE SUBSTANCE
C.3.2 ETUDE DB LA CYTOTOXICITE DE Ir'EXTRAIT 158 AQUEITXD'E.cannab:1nrrn L. SUR EEPATOCYTE8ISOtEg DE RAT
C.3.2.1 MATERIEL ET METHODES
C.3.2.2 EXPRESSIONDES RESULTATSET STATISTÏQUES
C.3.2.3 RESULTATS
C.3.3 ETITDE DE Ir'EFFET ANTIHEPA$OTOXIQUEDE Ir'EXTRAIT 161 AQUEUX D'E-.cannablnum L. VIS-A-VI8 D'UNE INÎOXICÀTION EXPERIITTENTALEÀU CClt gUR ÏEPATOCÏIE8 ISoLEg DE RIT
C.3.3.1 I{ATERIEL ET METHODES
C.3.3.2 EXPRESSIONDES RESULTÀTSET STATISTIQUES
C.3.3.3 RESULTATS
8.3.I RECAERCHBD'I'I[E ACTIVITE ÀNIIIJIPOPERONYDAN.:IEDE 165 ITTEXTRâIE AQUEUX D'E.cannabl.nun Ir. YI8-A-YI8 D'IINE INTOXTEATION EXPERIT,IENEALEÀU TERBUTYLHYDROPEROXYDE( tET-BOOE ) c.3.4.1 PROTOCOLE C.3.4.2 RESULTATS
C.3.5. RECtrERCBED'UNB ÀCTIVITE âITTIRADICâTJAIRE DB L67 L,BXTRAIT AQUEUX D,E.CANNAbI.NUMI,. IN VITRO c.3.5.1. PROTOCOLE
C.3.5.2 RESULTATS
C.3.6 RBCEERCHED'T'N INFLUENCE DE IJ'EUPATORIOPICRIITE 168 gItR IrE TE8T D'IIITOXICATION AU CCll enEZ Lâ SOURfg c.3.6.1 PROTOCOLE
C.3.6.2 RESULTATS
C.l. ÂlIAIrYgEg DEg REgULTÀlIg L7O c.5 DISCUSSTON L7L c.5.1 ETUDE COMPARjATTVEDES EXTRAITS AQUEUXVEGETAUX ET DES SUBSTANCES NATURELLES ANTIHEPATOTOXTQUESRETENUES DE IÀ LITTERATURE
C.5.2 ETUDE COMPARATTVEDE DIVERSES MOI,ECULESA,NTINECROTIQUES
C.5.3 APPROCHEDU MECANISMECYTOPROTECÎEUR DE L'EXTRAIT ÀQUEUX D'E.cannabinum L. VIS-A-VIS DU CCl
D PROPRIEÎE8 DIURETIQUES D'E.cannabinum L. 185
D.1 RAPPEL gUR LA PIIARITACOLOGIEDU REIN ET DEg DfURETI9UE8
D.1.1 TRÀNSFERTSDES PRTNCIPAUX PARAITIETRESURINAIRES
D.L.2 CONCENTRÀTIONET DILUÎION DES URINES
D.1.3 LES DTFFERENTSDTURETTQUES
D.1.4 LES DIFFERENTS MODELESEXPERIMENTÀUX
D.2 INFI.,UENCEDE IJ'EXTRAIT AQUEUXD'E.CANNAbiNUN IJ. EN ].93 ADttIlIISTRATrOlf CnRONIQUE 8UR IrA DIURESE ET IrE BILAII IONTQUB DE LTURTNE CnEZ tB RAT
D.2.1 MÀTERIEL ET METHODES
D.2.2 EXPRESSIONDES RESULTATSET STATISTIQUES
D.2.3 RESULTATS D.3 IltFIrUEtfCB DB IT,EXTRAIT AOUEUX D'E.cannabitlun L. 2O4 SI'R LA DIURESE AQUEUSE ET LA VrrEgSE DTBXCRETTON URrltArRE CEEZ IrE RÀr Blt SURCAARGE EYDRTQUE
D.3.1 IIIATERIEL ET METHODES
D.3.2 EXPRESSION DES RESULTATS ET STATISTIQUES
D.I ÀIIIIJTSB DEA RESULTATS ET DISCUSSION 2L4
D.4.1 MODELE CHRONIQUE
D.4.2 MODEI,EATGU
CONCITII8ION 226
TRAVÀUX CITE8 233 ERRATÀ
Par suite dtune erreur de numérotation, les 96, 1-28 et L'|2 ntexistent pas 'rnto lleh-tg bef ;rlof dDie) . r..1:1ii
' .l"r, - . Conplément à la reférence dtAvicenne en page 22 l Àvicenne( 98O?-LO37'), Canonis Libris, ârabicrrm nedicorum principis, 2(51 r per Fabiun paulinun Vtinensem , Venitiis, apud Juntas, 1608. n\f UTILISATIOND'EUPATORIUM ENMEDECINE SAVANTE AMBE (Avicenne,traduit en 1608) INTRODUCTIOlV I -1-
INTRODUCTIOTT
La phytothérapie traditionnelle gui connut un intérêt coegtant depuis Ia plus haute antiquité jusgu'au début du 20t'rue siècle, avait, des bases empiriques et un caractère sacré : la plante , outre sa beauté, ses couleurs et ses odeurs, était sacralisée de par sa morphologie (loi de sinrilitude), sa possible toxicité et ses dons curatifs. Sa désaffection provient, d'une part du développernent de Ia pensée rationnaliste et, des découvertes najeures de Ia chirnie de synthèse et de Ia chiniothérapie. Le reproche najeur gui lui fut alors adressé était Itabsence de fondement scientifique de son efficacité curative et le caractère inconstant des préparations. Àujourd'hui, Ia phytothérapie bénéficie d'un arme, l'ethnopharmacologie, dont Ia dénarche atliant Èravail sur le terrain et travail en laboratoire permet une approche scien- tifique des données ernpirigues. La première dérnarche de l,ethnopharmacologie est de sélectionner les espèces végétales en fonction de Ia tradi- tion culturelIe, de I'originatité botanique en insistant sur les plantes endéniques et de Ia connaissance phytochinigue noderne de ces espèces. EnEui.te des études chimiques et pharmacologiques sont entre- prlses en laboratoire de manière à confirmer ou infirrner Ia traditlon thérapeut,ique . Enfin, iI est possible de standardiser les préparations, élaborer des formes galéniques adéquates et effectuer des contrôIes à tous les stades.
Le but de ce travail était de rechercher les propriétés d'un extrait d'Eupatorium cannabinum L. rencontrées en médecine traditionnelle au moyen de techniques pharmacolo- giques expérinentales chez Itanimal. Ce travail srinscrit donc dans les finatités mêmesde I'ethno-pharmacologie gui, par son approche pluridisciplinaire, srintéresse, entre autres, à la fois aux indications thérapeutiques et aux technigues modernes dtexploration pharmacologigue.
Au travail sur Ie terrain stest substitué une recherche bibliographique visant, entre autres, à établir des conver- gences dtutilisation dans diverses pharmacopées tradition- nelles.
Quant au travail en laboratoire, le pari était délicat car iI avait été décidé de respect,er Ia posologie traditionnelle qui recommandait la prise de décocÈl-ons ou d,infusions de feuilles fraiches ou sèches. La recherche en phytothérapie fait relativernent peu état de travaux effectués avec des extraits végétaux totauxt iI stagit le plus souvent de fractions puriflées, enrichies en principes actifs au moyen de solvants organiques et bien sou- vent de nolécules végétales pures: -2-
Une analyse bibllographiçlue a permis de préciser les caractéristlques botaniques et cbiniques de I'espèce et de faire le point sur les indlcations théra;leutiques de cette plante très cornmuneen EuroPe. Une identification chirnique a été réa1isée : Ia finalité de ce travail n'était pas de fractionner I'extrait à I'aide de techniques sophistiguées rnais d'obtenir une carte dridentl.té cbinlque de l'extrait végétal. Des coupes histologiques de }a plante fraîche sont venues complèter l'étude botanique d'E.cannabinum L.
Ltactivité dtE.cannabinum L. a été explorée sur deux niveaux d'action, souvent associés en phytothérapie, Ie foie et le rein. * Au niveau bépatl.que, deux fonctions pharmacologigues ont été approfondiès : I'activité cholérétigue et 1'activité antihépatotoxigue. *. Lractivité cholérétique a été étudiée sur Ie nodèIe clas- sique dtétude de Ia cholérèse chez le rat par catéthérisme du caÀal cholédoque, Ia bite étant recueillie à intervalles réguliers. De nanière à préciser I'origine du flux biliaire stinulé par l'extrait végétal, deux protocoles ont été choisis I fa clearance à lrérythritol de manière à vérifier 1'origine hépatocytaire du flux biliaire, êt Ie ôosage ôes acLdes btllaires afin de rechercher une éventuelle stimulation du flux acides biliaires dépendant. ** Nous avons ensuite exploré le pouvolr ant,lbépatotoxl.que de Itextrait aqueux d'E.cannabinum L. sur un modèIe expérimental Ln vl.vo, chez le rat, reproduisant toutes les étapes de lrhépatite. Un toxique largement étudié et utilisé pour 1'éttde de I'hépatotoxicité et I'hépatoprotect,ion a été choisi : le térachlorure de carbone. Le nodèIe expérimental a ensuite été adapté à la eourLs de manière à mettre au point un test plus aisé à entreprendre et plus fiable pour le iecherche de produits antihépatotoxiques in vivo. .t lrrapproche du nécanLsme ûractLon antlbépatotoxLque de I,extràit végétal a été étudié au moyen de différentes techniques : Dans un but d'éthique et dtéconomie, Irutilisation d'hépatocytes leolés de rat était une méthode séduisante pour de larges rfscreeninçtstt. CeIIe-ci a été développée au laboratoire de manière à confirner les résultats obtenus -inv:Lvo. Le mêne modèIe utilisant un toxigue d'action plus spécifique de 1'étude des mécanismes de Ia lipoperoxydation, le terbu- tylhydroperoxyde, a permis de préciser le niveau d'action antihépatotoxigue de l'extrait. Le potentiel antiradicalaire de l'extrait a été testé sur un nodèIe sirnple utilisé au laboratoire, le test de I'inhibition du radical diphényl-picrylhydrazyl. -3-
Enfin une seule molécule contenue dans l'extrait aqueux d'E.cannabinum L. a été testée sur Ie rnodèle dtintoxication expérimentale c'}rez Ia souris car ce composé, Iteupatoriopicrine, est présent en guantité non négligeable et est caractérist,ique de Itespèce E.cannabinum L. . Beaucoup de plantes à tropisne hépatigue sont recommandées conme dturéttques et E.cannabinum en fait partie. Nous avons saisi Itoccasion d'explorer cette propriété souvent rencon- trée en phytothérapie et rarement étudiée expérimentalement. Un noôàIe drétuôe chronl.que par voie orale, cll'ez le rat, a été complété par 1'ut,ilisation d'un nodèIe aigu utilisant 1télimination d'une surcharge hypotonique.
Au cours de cette étude des propriétés pharmacologiques d'E.cannabinum L., nous avons recherché à confinner ou à in- firmer les indications traditionnelles et à comparer nos ré- sultats avec ceux rencontrés dans notre laboratoire et dans Ia littérature.
Ltoriginalité de notre démarche tient au respect de lrutilisation et de la posologie traditionnelles en utilisant un extrait aqueux total de la plante et à I'approche des mé- canismes dtaction responsables de ces propriéÈés pharnacolo- giques recherchées, tâche délicate s'il en est compte tenu du produit testé. Par ailleursr cê travail aura pernris de faire Ie point sur les travaux effectués sur les plantes à tropisme hépatorénal. ETUD E B IBLI OGRAPTTIQUE Etu?ebotaniq*
- -4-
À.BlruDE BOTANT9UE
A.I.BIIUDB DI' GENRE EUPIIT!8I'uI| L.
4.1.1.LÀ FAUIITITE DEg A8TERACEÀE (HEYWOODet coll , L9'17i CRONQUIST, 1981-t DEIÀNGHE et coll' 1-983)
A. 1. 1. 1. TÀXONOIIIE
Cette famille, unique représentant de I'ordre des Astérales' se distingue essentiellement par sa structure florale uni- former Sâ grande variété écologique, son caractère cosmopolite et lrirnportance et Ia plasticité de ses composés chimiques.
Les Àsteraceae comprennent L300 genres et environ 2O0OO espèces, généralenènt herbacées.Bien que très cosmopolites, el-Ies préièrent les régions tempérées, subtropicales et tropi- cales, particulièrement les régions boisées.
Ces nombreuses espèces se caractérisent notanment par une grande variété de molécules chiniques qui leur assurent é9a- Iement un système de défense efficace.
La prernière classification en 13 tribus est réalisée par genLham en 1-873,lequel s'inspire largement des travaux de Cassini, Dê Candolle et Lessing (tableau L).
Un siècle plus tard, Cronquist abandonne la tribu des Heleniae et crée celle des Liabeae.
Un nouvel arrangement biphytétigue est proposé par Carlguist en 1966. ce dernier distlngue deux sous-familles, les Chicorioideae et les Asteroideae, renfermant au total L2 tribus :
Soue-ftnille Cichorioiôeae : Mutiseae, Vernoniae, Arctotideae, Cichorieae, Eupatorieae.
Eous-famllle AsteroLôeae : Heliantheae, Astereae, Inuleae, Calenduleae, Senecioneae, Anthemideae.
Les deux groupes de Wagnitz (L976 dans Helmood et c91l ' L977) srinscrivént égalenent dans cette classification.Mals Ia tribu des Eupatorieaé, classée dans la sous-fanille des Asteroideae' passe ici dans Ie sous-groupe apparenté aux Cichorioideae: droupe 1 : Vernonieae, Liabeae, Carduceae, Echinopeae, Arctotideae -r-
TAB.I : CLASSIFfCATION DES ÀSTERACBAE sEf,,oN BENTAAU(Helmood et coII , L9'17, . (Appellations originales entre parenthèses)
lribu 1 : Vernonieae (Vernoniaceae)
rribu z : Eupatorieae (Eupatoriaceae)
Tribu 3 : Astereae (Asteroideae)
Tribu 4 : Inuleae (Inuloideae)
Tribu 5 : Heliantheae (Helianthoideae)
Tribu 6 : Helenieae (Helianthoideae)
Tribu ? : Anthemideae
Tribu 8 : senecioneae (Senecionideae)
TrLbu 9 : Calenduleae (Calendulaceael
Tribu 10 : Arctotideae
Tribu 11 : Cynareae (Cynaroideae)
Tribu L2 : Mutisieae (Mutisaceae)
TrLbu 13 : Cichoriae (Cichoriaceae) -6-
Groupe 2 : Heliantheae, Astereae, Inuleae, Calenduleae, Senecioneae, Anthernideae, Heliantheae, Eupatorieae.
Jeffreyren l-978, proposera une troisièrne sous-famille intermé- diaire, incluant Les Eupatorieae et les Senecioneae, mais en accord avec Heywood et, coll. (L977) , Ia classification des Asteraceae de Cronguist (1981) sera retenue.
Tribu 1: Lactuceae (Hieracium, Crepis, Lactuca, ilaxacum, Sonchus...). Cette tribu peut prendre Ie rang de la sous-famille des Cichorioideae (Liguliflorae) . L'autre sous-fanille des Asteroideae (Tubuliflorae) comprend le reste de la famille: Tribu 2 : Senecioneae (Senecio, Arnica, Tussilacro). Tribu 3 : Vernonieae (Vernonia).
Iribu | : Eupatorieae (Eupatorium, Aqeratum, Ékan:La, Stevia. .. ) . Trlbu 5: Cynareae (Centaurea, Cousinia, Arctium, Car!l:L]l!l, Carthamus, Cirsium, Echinops... ) . Tribu 6 : Inuleae (Inula, Antennaria, Helichrvsum, Leontopodiurn) .
Tribu 7 : Astereae (Àster, Bellis, Erigeron, Solidago... ) . trl.bu I : Anthemideae (Anthenis , Crysanthemum, EæM, Artenisia. . . ) TrLbu 9: Heliantheae (Ambrosia, Helianthus, Bidens,.@,, Dahlia, Rudbekia, lagetes, Xanthium) . rrLbu 10 : Calenduleae (Calendula.. . ) . ![rLbu 11 : MutLseae (Gerbera, Mutisia). TrLbu L2 : Arctotideae (Arctotis). rribu 13 : Liabeae (Liabum, Munnozia). -7 -
â. 1. 1.2 DBSCRTPTION BOTANIQUE
* Les fleurs de cette farnille, à symétrie radiale ou bilatérale, sont toutes regroupées en inflorescences. Généra- Iement hermaphrodites, petites, nombreuses et épigynes, elles se réunissent autour d'un réceptacle communsous forme de capitule, habituellenent pédonculé et entouré d'un involucre. La corolle se compose de 3 ou 4 ou 5 pétales soudés en un tube prolongé dtautant de lobes (fleurs tubulées) ou en un tube prolongé d'une languette ou ligule (fleurs ligulées). * Les feuilles, alternes, opposées ou basilaires, simples ou composées, sont, généralement dépourvues de ligules. * L'androcée renferme 4 à 5 étamines, à filets soudés au tube de Ia corolle et à anthères généralement soudées entre elles en un manchon à I'intérieur duguel passe un style. * Le gynécée conprend 2 carpelles soudés entre eux. L'ovaire est infère, uniloculaire. L'ovule est basal, anatrope. * Les fruits sont, des akènes surmontés généralement d'un calice persistant ou aigrette de soies. Les caractères conmuns des Asteraceae peuvent se résumer conme suit:
* Périanthe différencié en calice et corolle.
* Corolle à pétales soudés en tube ou en ligule.
* Fleurs épigynes, petites, nonbreuses et réunies en capitule.
*4à5étaninesà anthères généralement soudées entre elles autour du style.
* Carpelles soudés entre eux, renfermant un ovule infère, basal, anatrope. -8-
A. 1.2 PCrSrTrON 8Y8TBuÀTTQUEDIt GENRB EITPATORIIru L.DAIIS L,A FAIIILIJE DE8 ASTERACBÀE
À.1.2.!.1 IrA TRIEIT DEA EUPATORfEAECass.
La tribu fut décrite pour la première fois par Linné en L753. Ce groupe fut ensuite reconnu par Cassini en 1813 et Humbolt en 1818. Après la classification de Bentham en 1873 et les travaux de Robinson et Cronquist, sa position exacte dans Ia fanrille reste encore discutée. Cette tribu renferme 160 genres et environ 2O0o espèces, la plupart sud-anéricaines. Robinson et King la subdivisent en 19 groupes comprenant de nombreuses sous-tribus potentielles : 1 : Adenostemmatinae (sous-tribu)
2 Eupatoriinae (sous-tribu)
3 Disynaphia (groupe)
4 cyptis (groupe)
5 Acritopappus (groupe)
6 Piqueria (groupe)
7 Trichocoronis (groupe)
I Ayapana (groupe)
9 Alomiinae (sous-tribu)
1_0 Liatris (groupe)
11 Fleischrnania (groupe)
L2 Critonia (groupe)
13 Praxelis (groupe)
L4 Hebecllnun (groupe)
15: Neomicandea (groupe)
16: Mikania (groupe)
L7: Ageratina (groupe)
L8: Homeisteria (groupe)
I_9 : oaxacania (groupe) -9-
Les caractères qui différencient Ia tribu des Eupatorieae des autres tribus sont les suivants :
* Cette tribu est une des quelçlues Asteraceae à posséder des feuilles opposées.
* Les pétioles sont très étroitement ailés et marqués de sillons dans la partie supérieure.
* L'inflorescence est généralement un corymbe de capitules. * L'involucre est habituellement inbrigué, subinbriqué ou eximbriqué.
* Les fleurs sont toutes hermaphrodites. * Les corolles sont blanchâtres, rougeâtres, jarnais jaunâtres; EIIes sont en forme de tube ou d'entonnoir. * Le style possède le plus important des caractères distinctifs des Eupatorieae : sa base est pubescente et ce caractère ne se rencontre dans aucune autre tribu, mais ceci n'est pas considéré conme taxonomiguement fiable. * Les akènes sont prisrnatiçfues, à 5 côtés.
4.1.2.2.Lâ 8OU8-TRIBU DE8 EUPAÎORIINAE (Robinson et King dans Heln',roodet coll . rI977)
Ce groupe est principalernent limité à I'est de l,Àmérigue du Nord et de I'Amérique du Sud et n'a sans doute jamais atteint l'ouest de ces régions. Deux genres se sont dispèrsés naturel- lemenÈ: Eupatoriun L. qui a atteint I'Asl-e et I'Europe par ItAlaska et le genre Stonatanthus qui a donné naissance à 3 espèces africaines.
Les caractéristiques principales de cette tribu sont les suivantes :
* Bractées Lnvolucrales subimbriquées. * Style pubescent à sa base
Les Eupatoriinae renferment les genres mentionnés dans Ie tableau 2. -10-
TASLEÀU 2 3 IJES GENRES DE IJA SOUS-TRIBU DEg EUPÀTORIINAE
GEIIRES NOIIBRE DISTRIBUTION
Eupatorium L. 38 Est des USÀ,
Asie, Europe
Eupatoriodelphus K. & R. Est de
I'Amérigue du
Austroeupatorium K. & R. 1L Nord, Amérique
du Sud
Stonatanthes K.& R. 15 Brésil,Nord de
I'Argentine,
Hatchbachiella K.& R. Afrigue -11 -
4.1.2.3 IrE CENRE EUPATORIT'II TJ.
A. 1. 2.3.1 POSITTON SISTEUATToUE
Eupatorium L. est un groupe naturel dtespèces partageant les caractères de base d' Eupatorium cannabinum L. :
* Les sommités fleuries sont relativement pauvres en fleurs * Les fleurs renfermant, Ies akènes sont presçlue exclusivement glandulifères
* Absence de stomates au dos des lobes de Ia corolle
* Absence dtépaississernents annulaires dans les cellules du filet de I'anthère
* Présence de poils à la base du style * Les branches du style sont très papilleuses rt Absence de carpopodiurn distinct.
Le genre Eupatoriurn L. a été décrit pour la première fois en t-7OOpar Tournefort, puis repris par Linné dans Species Plantarum en L753. Dist,ribué dans res forêts tempérées de Uhémisphère nord, iI est originaire drArnérique âu Nord ori il est apparu au tertiaire. À la suite de variations climatigues, il a disparu de I'ouest de l'Amérique du Nord et srest étendu agx régions tempérées drAsie et drEurope, ainsi qurau- Mexique (figure 1) Le genre renferme environ 3i espèces.
4.1.2.3.2 CLE DE DETERUINATION DE GENRE EUPATORIUTI IJ.
Plusieurs clés de détermination ont été proposées par diffé- rents auteurs. Ainsi Tutin et coll . (L976) propose-nt: -I?-
lôÂ inrqnz,6W t FTGUREt.3CARTEDE TÀ REPÀRTITION UONDIÀI,E DT' GENRE EUPÀTORIUUL. (King et Robinson, 1970) -13-
r Plantes habituellement sans latex i au moins les fleurs intérieures non ligulées (sous-fanille des Asteroideae) . . Feuilles et bractées involucrales très rarement épineuses ; fleurs ligulées souvent présentes ; style jamais fin ni couvert de poils. ** Au moins quelques feuilles opposées
*** trig1'ettes de Poils nombreux 0 Fleurs jaunes, Iigule Présent : Àrnica
G Fleurs roses, ligule absent : EupatorLum.
Delanghe et coll. (1983), quant à eux , établissent la cIé suivante :
* Fleurs uniquement tubulées * Linbe foliaire présentant des dents terninées en pointes piquantes; tiges pariois épineuses; akènes le plus souvent surmontés d'arêtes *. Feuilles opposées, toujours présentes au moment de Ia floraison tr. Akènes surmontés d'une aigrette de soiesi capitules à 3 ou 6 fleurs rougeâtres ou rosées, disposées en corl.mbes denses : EuPatorLum ***t Akènes surmontés de 2 ou 4 ou 5 arêtes épineuses; Capitules généralement à plus de 6 fleurs jaunes, sàtitaires ou diposéeà en corymbe lâche : BLdens.
Enfin la clé de détermination proposée par Garnier (1-961) est décrite en ces termes : -14-
* Fleurs toutes groupées en.capitules, toutes munies d'une corolle colorée; fruit libre, insèré directement sur le réceptacle; anthères soudées ensemble et formant un tube autour du style
. Plantes sans latex; corolles toutes ou au moins celles du centre régulières et en tubes : Asteroideae .. Fruit surmonté d'une aigrette de soies ou de 2 ou 4 arêtes épineuses rtr gqiface du réceptacle sans paillettes ou écailles mais parfois des a1véoles à bords dentés
@ Feuitles opposées, divisées en 3 ou 5 segrments lancéolés; fleurs rosées en capitules très petits et très nombreux dans un même plan; plante éIevée: Eupatorium.
A.2 ETUDE DE IJ'ESPECE EUPATORIUI{ CANNABINTru L'
King et Robinson (l970)proposent une liste des espèces du genre Eupqtorium l, (tableau 3) et établissent les èaractéristiques du genre et de l'espèce type, E.cannabinum L- (figure 21.
A.2.1 CLE DE DETERUINATIONDE L'E8PECE E.cannabinum Ir.
Parmi toutes les espèces d'Egpêtor:lurn L., iI ntexiste qutune seule espèce européenne, représentée par E. cannabinum L. Les flores européennes signalent néamrnoins 2 espèces américaines introduites, E. adenophorum Spreng (Tutin et colI. L976 i Guinochet et ViInorin, L982) et E. rugosum Houtt. (De1anghe et coll, 1983) Deux variétés d'E. cannabinum L sont décrites , syriacum Jacq. (Boiss.) et corsicum Req. Leur clé de détermi- nation est Ia auivânte (Tutin et coll., L9'76i Delanghe et coll., 1983; Garnier, 1961, Meikle' 1985) : _ rr_
IIABLEÀU 3 3 ITISTE DES ESPECES DU GENRE EITPAl[ORIrru L. (King et Robinson, 1970,
E. alhumL. E. North America E. altissimumL. E. North America E. anomotumNash SE. United States E. benguetenseC. B. Rob. Philippine Is. E - camiguinense l\{err. PhilippineIs. E. cannabinumL, Europe, N. Africa, Asia minor, India includlng E. caucasicum Stev. E. corsicum Reg., E. punduohum lVall., E. sryiacum Jacq- E. capillifclium (Lam.) Small SE. United States,Cuba, Bahama Is, E- catense Elm. Philippine Is. E. chinense L. E. Asia including E. gblnii F. Schmidt er. Trautv., E. iaponlcum Thunb., E. sachalinenseFr., E. uallicâii DC. E. crneiloliumWilld,. E. United States E. lemtldii Codfrey SE. United States E- lormosanum Hoyata Fornrosa E- foduneiTwe.. E. Asia including E. stoechadoxnn }Iance E. lvterophgllum DC. China E. hyssoltiloltum L. E. United States E- bcheaefoliurn Greene SE. Unitcd Statc's E. leptophtlllunt DC. SE. United States,Cuba E-lindbyanumDC. SE. Asia,Philippine Is. E. mehnadenium Hance China E. mikanici fl I Im qp,ffi FIGURE 2 : CÀRÀCTERISTIQUES DU GENRE EIUEATORI'u}! L. : ESPECE TTPE E.cannabinun r,. (fig. 1 à 6) ET E.serotinum ltichx. (fig.7 à 9) D'APRES ring et, Robinson (1970) fig.l à 6 : B.cannabinum Ir. 1 : collet d'anthère, vue axiale, x1-35. 2 : extrémité dtanthère, xl-35. 3 : base du style, x68. 4 : surface de Ia branche du style, xL35. 5 et 6 : extrêmités d'une soie (aigrette du fruit), x135. t,ig.7 à 9 : E.serotinum llichx. ? : surface de Ia branche du style, xL35. I : base du style, x68. 9 : extrêmité d'un soie(aigrette du fruit),x135. -,18-, PLÀNTE ENTIERE FLEURIE (Haute-Marne, Àôut 1987) LA FEUILLE D'E.cannabinurn L. DETÀTL DE L'INFI.ORESCENCE DrE. cannabinum IJ. - 1l- * Tiges et pétioles pubescents et non glanduleux,. feuilles trifides ou pentafides ou simples; fleurs roses à pourpres ** Feuilles trl- ou pentapalrnitilobéesr plante élevée (de 100 à 175 cn), robustei tige sirnple, pêu rameuse; capitules de 2 à 5 mm de diamètre, nombreuxr ên corlnnbe large et dense, lnvolucre cylindrique; bractées externes plus courtes que les internes; akènes de 3 rnmde long, noirs; aigrette de soies nombreuses et plus longue çIue lrakènei 2n= 2Oi toute la France, Europe, Asier.Afrique du Nord : E. cannabinum (figures 2, 4a et 4b) *.* Plante naine ou peu éIevée (de 30 à B0 cn), assez grêIe; feuilles presçlue toujours toutes sinples; capitule en corlnnbe peu volurnineux; aigrette égalant au plus I'akène; étage inférieur et montagneux de la Corse, points humides: E.cannabl-num L. subesp. corsicun Req. **. Plante généralement moins robuste que Itespèce typique E.cannabinum L., division des feuil-Ies plus petites mais plus larges, souvent ovales à etliptigues, poinÈues, moins de 7 cm de long (souvent 3 cm), souvent plutôt densénent recouvertes de poils pubescents blancs conme les jeunes racines, coryrnbes plutôt petits, avec relativement peu de capitules, points humides, fleurs d,aott à octobre, rare à Chypre, âu Liban et en Palestine (Meikle, L985) : E.cannabinum L. var. svriacum (.Iacq.) BoLss. r Tiges ou pétioles pubescents et glanduleux; feuitles simples, rhombiques ou triangulaires, crénel.ées-dentées, sauf à la base; bractées externes de l,involucre égalant environ Ies internest peut atteindre 2 m. i capitules de 5 àLo mn de dianètre; akènes de 2 mrnde long, noirs; aigrettes de 5 à 10 soies i 2n= SIi parfois cultivée conme plante ornementale et naturalisée en quelques points hurnides de Itétage inférieur de Ia Corse : E.adenophorun Spreng. -Ig- C.9itu!. trucidoF. , t_\-. : l (\/l,f ^rI r \ \]êz ./ . t \ a.' at Eû9.èotÉ 0.' EuF.olE nl. Eu9rbis Flceô f 43., tll EoD.rêc f:è@o Di.ruoc rt) no@o ;. 'a.l oulÉ Y!fl!ÉlcEcoÈ :. P:a! tJ FIGURE 4a : [À FLEUR D'E.cannabinum L. (Le Maout et Decaisne, Lfô76, . B A, B, C : capitules avec involucres B : fleur plus ancienne que A et C (pottinisation) FIGURE 4b 3 I,A FI,EUR D,E.CANNAbiNUM I,. A DIFFERENTS STADES DE IÀ FLoRÀIsoN (Ivine and Cook, 1958) -20- À.2.2 DrSrRrBUTrON GEOGRAPHIQUE E.cannabinurn L. se rencontre dans toute ltEurope, principalement au nord et s'étend de Ia Finlande (63'N) à I'Asie (Hooker, L973) et l,Afrique du Nord (figure 3) .Cette plante est conmune en France, Suisse et Belgigue mais cependant rare dans la Creuse et, les Àrdennes. EIIe croit généralement dans les endroits hurnides, tels que les bois, les bords de ruisseaux, les marais et ce jusqu,à L7O0 n. d'altitude. La variété corsicum Req. ne se rencontre gurà ltét,age inférieur et montagneux de Ia Corse. La variété syriacum Jacq. (Boiss. ) se rencontre en quelgues points de la province de Gênes en ltalie (Pagani et Romussi, L9671. Du point de vue phytosociologique, eIIe se rencontre dans les Convolvulion sepii surtout, Phragrmitelia, MoIinietalia, Holschoent,alia, Alno-Uhnion, A1nion-Glutinosae (Guinochet et De Vihnorin, L982). 4.2.3 NOI{s VERNACUIJAIRES (Bonnier, L934 i Fournier, L948l; Maldaus,1933) Franaê: eupatoire à feuilles de chanvre, chanvrin, chanvre d'eau, eupatoire d'Avicenne, herbe de Sainte Cunégonde, origan des marais, pantagruelon (décrite par Rabelais). Allenagne: Wasserdost, Kuningundenkraut, Alpenkraut, Hanfwasserdost, Bolkenkruit, Klettenkraut. Eollande: Boelkenskruid, Leverkruid. Itall.e: eupatorio di Avicenna, canapa salvatica, canapa acquatica, erba Santa Bibiana ângleteme: waterhemp, thoroughwort, hemp-agrimony, water mandlin, sweet mandlin, filayra. Danenark: hanagtig, hjortetrôst. Pologne: sadziec, konopnica. Rusgie: poskonnik Sul,sse: hampfloks. llchàcoglovaqul.e: konopàc, sadec. Eongrl.e: vizikender. -2L- )r"î. baa FIG. 3 : CARTE DE I,À REPÀRTITION D,E. CANNAbI.NUM EN EUROPE (Ma1dausr 1933) (I t ilit ati^o n t ra?it innne lle - -2L B.UTIITISATION TRADITIONNELITE(Malingre, L97Li Fournier, L948,. Garnier et coll., 196L) * LrEupatoire était déjà citée dons les médecines savantes anciennes dt avant 1tàre cbrétLenne: t. à 1, époque romaine, l'Eupatoire de Pline correspond bien à Eupatorium cannabinum L. Elle doit dtailleurs son nom à Pliner êr hommageà Mithridate le Grand, roi des provinces pontiques de Lll à 63 avant J.C.,surnonmé Eupator (Eu=bon, Pater:père). Celui-ci fut le prernier à Itutiliser contre les maladies du foie. greque, Dioscoride Par conttêt ren néôecl.ne I'gprfo(gr6pr.OUdeI serait, êD i.it, agrimonia 6upàtoriâ- r,. *t en médecine arabe, Àvicenne, dans son Canon traduit en 160g (*) recommande l"Eupatoire contre les affections du foie et l,hydropisie. Une décoction de la racine dans du vin était utiliÈée conme vomitif, purgatif et diurétique. Avicenne Ia reeommandait aussi pour les plaies à guérison difficile, Ia ga1e, 1ê prurlt. Mais, selon lbn al Baythar, traduit par Leclerc (1877-f-883), IrEupatoire dtAvicenne et celle de Dioscoride et de Galien ne ferait qutune et serait Agrirnonia eupatoria. En fait une grande confusl-on règne quant à 1'utilisation de I'Eupatoire en médecine traditionnelle arabe. ** la médecl,ne ayunréôlque dont les enseignenents, datant du 1er et du 2eme siècles àprès J.c., sont réunis dans deux traités sanskrits, la Carakasamhitâ et la Susrutasamhitâ, ne mentionnent pas 1'utilisation de cette plante pourtant endénique en Inde (Mazard, communication personnelle). * A lrépoque nédiévale, elle semble peu enployée en France oû Iton note un emploi tout à fait particulier par les cerfs blessés qui la iechercheraient pour guérir leurs plaies. Cette utilisation est mentionnée également en Hollande ou Ia plante porte d'ailleurs Ie nom de Hirschklee. Ses appellations d'herbe de Sainte Cunégonde, irnpératrice d'ÀIlemagne morte en LO24 , KunLgundenkraut et Koninginnekruid, font référence à Ia grande confiance du peuplé germanique envers cette plante et les guérisons iurènt, dit-onf nornbreuses sur le tombeau de cette sainte. * Cette mêmeespèce va connaltre un regain d'intérêt aur ôLx- septlèue slàclc et dk-hultlène giècles avec Boerhaave en Hotlande et Tournefort en France. Le premier, en la dénommant Rusticorun panacear êD fait. le remède contre de nombreux maux et notarnrnenLcontre les maladies du foie et les plaies extérieures. Tous deux Ia recommandent contre les obstructions des viscères, les fièvres intermittentes, 1ê scorbut. (*) : Canonis libris, Arabicurn Medicorun principis, ?(5r., Veirise, traductl-on anon)rme des canons d'Avicenne en lat'in. -2:3-- En Hollande, Dodonaeus, en L644, affirme qu'elle purifie Ie sançt, chasse les fièvres intermittentes, s'emploie pour Iutter contre les maladies de foie, de Ia vésicule et du pancréas. Sous forme d'oenolé, eIIe est cicatrisante. * Eupatorium cannabinum est inscrite à la première édition de la pharmacopée française en 1818i ses feuilles, êt plus encore sa racine, sont cholagogues et laxatives. De nombreux médecins I'utilisent au ôix-neuviène siècIe. Cazin reconmande la racine, fraîche et récoltée au printemps, conme cholérétique, purgatif, contre Itoedème, I'hydropisie et Ia cachexie paludéenne. cêt auteur cite aussi ItactLon vernifuge d'une décoction dans du vin ou de Ia bière. Dorrrault (L875), dans son répertoire général de pharrnacie pratigue, mentionne Itutilisation dtE cannabinum à I'intérieur contre les obstructions. * En Allemagne, Thoms( dans Malingré, L97Ll en L929, cite ses propriétés diurét,iques, émétigues, antipyrétigues, vulnéraires et anti-inflammatoires. Les travaux de Chabrol et coll. (L934) confirment, sur I'aninal, les effets cholérétiques de nombreuses plantes appartenant à Ia famille des Asteraceae, dont notamment I'Eupatoire. Fournier, êD Lg1;a, consacre un article à ceÈte espèce dans son livre des plantes médicinales et vénéneuses de Francer êD reconmandant, son utilisation contre I'embarras gastrigue, Ie catarrhe vésical et, en usage externe, pour Ia cicatrisation des plaies. L'infusion ou la décoction de 30 à 6o I de feuilles ou de racines fraiches par litre dteau, la teinture mère, à raison de l-5 à 25 gouttes, ainsi gue 30 à 1-20g de suc de feuilles peuvent être utilisés avec succès. Leclerc (dans Fournier, Lg48) fui attribue, outre ses propriétés antihypercholestérolémiantes, antihypertensives et anticellulitiques, une efficacité dans les dermatoses dues à une déficience de Ia secrétion biliaire. 11 propose une décoction pendant L0 rninutes de 60 g de racines dans un litre d'eau, à raison de 2 à 3 tasses à jeun. Les feuilles peuvent être utilisées commediaphorétigues, diurétiques et cholérét,iques légers. Dans ce casr oD réalise unê ébullition de 2 à 3 minutes, suivie d'une infusion de 15 minutes, de 159 de feuilles sèches dans 2OOnI d'eau. En 1-983, Bézanger-Beauquesne nenÈionne une propriété originale: E.cannabinum renforcerait Ia résistance de I'organisme contre le virus de Ia grippe. r En Afrlque du Nord, t'utilisation dtE.cannabl-nun en nédecine traditionnelle est confuse car il sembleratt qu'elle ait été confondue avec Inula viscosa Ait. (Boulos, 1983t Beltakhdar, 1982). En effet, selon Renaudet Colin (1934), la plante, connue sous Ie nom de terhala sur les marchés (ou tubbaq), est en fait l.viscosa, très conmune, alors qu'E.cannabinum est relativement rare dans le Maghreb. -ZtF t En Inôe, oû se côtoient différents types de médecines traditionnelles, Chopra et coll. (1956, L969) citent les propriétés diurétiques, antiscorbutiques, diaphorétiques, émétiques d'E.cannabinum, ainsi que son emploi contre Ia jaunisse et pour Ia cicatrisation des plaies. Nadkarni (L922) Ia recommande aussi pour les maladies de foie et comme diurétigue. La médecine ayurvédique contemporaine n'utilise pourtant pas E.cannabinum mais uniquement I'espèce E.triplinerve comme hénrostatigue( Sarma, L969; BapaIaI Vaidya, L9821. . En nédeclne traditionnelle cyprl.ote, E.cannabinum L. var. syriacum Jacq. (Briss. ) est employée à forte dose, conne cholagogue, purgatif, émétigue et vermifuge; à faible dose comme tonique, apéritif, dépuratif, diurét,ique, sudorifiçfue, fébrifuge et ant,iscorbutigue. En usage externe, Ia plante est employée comme cicatrisant et résolutif (Arnold, 1985). * La néôecine traditionnelle du Venezuela accorde des vertus purgatives à Ia racine dtEupatoire( Veles Salas, L982'l Actuellernent, E.cannabinum L. n'est plus inscrite à Ia lOeme édition de la pharmacopée française et ne fait pas encore partie de Ia liste des plantes rnédicinales pouvant faire Itobjet d'une autorisation de mise sur le narché (Al{M) allégée (Bulletin officiel n"87-2o, Juin LgB7, texte 9585) Sur Ie marchér oD rencontre actuellement quelques préparations renfermant de I'Eupatoire comme par exemple Eupatoline (Arkopharrna) renferrnant 225 mg de plante par gélule. Chimic I -25- c. ETUDE CITTUTQUE C. l.TERPENOIDES C. 1. 1. LACTONE8 SE8QUITERPENI9UE8 Von Gizycki obtint en 1-95L-le premier principe amer de P,I,eupatoriopicrine(EUPP),à1'étatcristallisé La structure de I'EUPP, isolée des parties aériennes de Ia plante, fut élucidée par Dolejs et Herout (L962) qui obtin- rent, par hydrolyse alcaline, I'eupatolide (EUP). Drozdz et Bia1ek-Grygiel (L97L) isolèrent des parties aériennes de la plante, l'EUP à I'état cristallisé (figure 71. La structure de ITEUPP fut revisée en L972 par Drozdz et coII. (figure 6a). Ces derniers isolèrent 1'eucannabinolide à l'état amorphe, difficilenent séparable de I'EUPP (figure 6b). Bos et coII. (l-984) isolèrent Ia chromolaenide, I'eupasirnplicine , 4 autres germacranolides (figuer 6a et b) et un guaianolide, l'eupachifoline (figure 8). Woerdenbag et coll. (L986) isolèrent l'hyodorilactone E (figure 6a). Zdero et Bohlmann (1987) complétèrent I'étude des lactones des parties aériennes, isolant 6 germacranolides, ident,ifiés dans d'autres plantes, la 3-B-hydroxyEUPP, la 2O-deoxyEUPP, I'EUPP-L9-O-acétate, 2 dérivés deoxy (figure s) et la sachalinine (figure 10). Ces auteurs identifièrent 2 nouveaux germacranolides, L' EUPP-l-g-0-linoléonate (figure 11) et, Ie 8-B-acetoxy-2- hydroxycostunolide (figure L2l ,ainsi qu'un guaianolide, Ie 2-acetyl-A-Bl 4, S-dihydroxytigloyloxy I preeupatundine (figure 13). Geissmann et Atala (L97Ll étudièrent Ia distribution de I'EUPP dans Ia farnille des Asteraceae: ITEUPP se rencontre aussi dans certaines plantes appartenant toutes à Ia tribu des Heleniae : *Venegasia carpesioides D.c. *Eriophvlluur stachaedifoliurn Lag. var. arternisiaefoliun (Less. ) Macbr. 'tchaenactis douglasii (Hook. ) dont eIIe est Ie principal constituant. 'tChaneactis carpoqlinia cray. Dans E.cannabinum, elle est présente à raison de 0194* des parties aériennes sèches (Bloszyk et coll. , L9781. -26- IÀClONES R1 R2 R3 EUPP -H -cHaoH -cHsoH Composé L -H -cHg -cH2oH Composé 2 -cHs -cHg /o-oc'3 Composé 3 -H -cHg " Hyodorilactone E -cH2ococH3 -cH3oH FIG 6a 3 IrES LÀCTONESD'E.cannabinun L. -27- ll 4^,I Rl IÀCTONES Ra R2 Eucannabinolide -cH2oH -cH2oH Chromolaenide -cHr -cH2oH Eupasinplicine -cH2oH -cHg Conposé 4 -cHg -cHs FIG 6 b 3 LES LÀCTONESDrE.cannabinun L. (suite) FIG 7 3 EUPÀTOI,IDE -28- Ac.o 'M*u^ cHl FIG 7 3 EUPACEIFOLINB R1 R2 1_ -OH -H .H FIG 9 : DERIVES DEOXT DE L'EUPP (1 et z} -29- FIG 10 : gÀCIIÀIJININE FIG 11 3 EUPP 19-O-I.INOLEATE FIG 12 : 88 -ÀCETOXY-20(-HYDROXYCOSTUNOI,IDE -30- FTG 13 3 2-ACETNYI,-8-B-PREEI'PATI'NDTNE C. l..2.TRITERPENES ET STEROIDES L'acétate de dammaradiènyle (frgure 14) a été isolé d'E.cannabinum par Talapatra et coII. (L974) à partir de la plante entière séchée. C'est un triterpène rare qui ne se rencontre çlue dans deux autres espèces de Ia famille des Ast,eraceae : Inula helenium et olearia paniculata. EIIe représente O,Ol-8 de Ia matière sèche. FIG 1{ 3 ÀCETÀTE DE DÀIIUÀRÀDIENYI,E -3 1- Taraxastérol (figrure 20a) et stigrmastérol (figure 2ob) sont présents en très faibles quantités : 0rO0088 et 010005? des parties aériennes sèches (Talapatra gt coII. , L9741. Le taraxastérol se rencontre aussi dans d'autres Asteraceae : Cvnara scolvmus et Taraxacurn officinale. FIG 2Oa : TARÀXÀSTEROII FIG 2Ob s STIG!!.A8TEROI, C.1.3.DITERPENES Zdero et Bohlmann (1987) isolèrent un dérivé de clérodane, Ie cannaclérodanolide (figure 15) . FfG 15 s CN{NÀCITERODANOLIDE -32- c.1. a.uoNolrERPEltEg Zdero et Bohlmann (1987) isolent, de la racine, Ie Lo-acetoxynérylacétate (figure 16) . FIG 16 3 !.O-ACETOXYNERYI.,ÀCETÀTE C. 1. 5.HITILE ESSENTIELLE Hendriks et. coII. (1985) identifièrent une huile essentielle (tableau 6) dans les feuilles (o'462 v/pl, les fleurs (0168? v/p) et les tiges (O,15* v/p).Le chromatogramme obtenu par chromatographie gazeuse a révé]é Ia présence de nombreux monoterpénes et àesguiterpènes ainsi que guelques dérivés de phénylpropane. -3 3- TAB.Ia : PRINCIPAUX CONSTITUANTS DE I,'HUTI,E E88ENTIEI,I,E DtE. cannabinum Ir. IIONOTERPENES CARBURES limonène, otet B pinène, UoIToTERPENTQUES ocimène, o( -terpinène, o(-terpinolène, camphène, p-nyrcène. DERIVES OXYGENES1-8-cinéol, linaIol, DroDroTREPENr9UEs o(-terpinéoI et acétate, acétate de néryle, acétate de bornyle. SESQUTTERPENES B-élémène, B-caryophyllène, D germacrène, B-bisabolène, o(- f arnésène, $-cardinène . DERIVES DE PEEITYI,PROPÀNE p-cimène, thpnol néthyléther, thymolhydroquinone diméthyléther. Une analyse plus fine a révéIé en fait les précédents constituants dans la fraction pentane de I'huile essentielle et les composés suivants (tableau 4b) dans Ia fraction éther (Hendriks et coll., L985) : Zdero et Bohlnann (L987) mettent aussi en évidence , dans les parties aériennes, de I'acétate de néryl et du germacrène D. e.2 . FLÀVONOIDE8 Oswiecimska et Sendra (1972) isolèrent, des parties aériennes sèchées, trois flavonoides dont deux souci forme glycosidigue (figure 17) : rutoside, hyperoside et quercetine à l'état de traces. Pagani et Romussi (L967) isolèrent de l'astragaline,des dérivés d'acide p-coumarigue, de l'acide feruligue, de I'isoquercétine et du kaempferol 3-rhamnoside dans la variété syriacum. La teneur en rutoside dépendrait de facteurs écologiques (Jerzmanowska dans Oswiecimska et Sendra, L9721. -34- TÀBIEÀII 4b: COUPOSES DE &A FRÀCTION PENTANE DE I,'EUII,E ESSENTIEI,I,E DtE.cannabinut (Bendrl.ks e!_@Lt. e 198s) cc Rt. Ctlmç"run6 !uw (M-H)- RrCOo R-O I (}r-l n-oclanal lln 127 ) 996 hcxyl acctate l.u tJl 59 3 I llr{l I n-nonanal t4l t{l { lrl85 hcptyl acetate t58 t57 59 5 I lrll rlecanal t56 t55 É I lr)6 uutyl ucetate r77 r7l 59 lllrt mcth)-lsalrùyl;rlc r5l l_sI l{ I l{tl linllvl ircctutc l9r, t95 59 9 l:r*' m()nol€11**ncucclJlc I rr(l te5 59 lll l:71) b()rnylJcclJlc l9r, te5 59 il I 1tl larcnrlulyl acctatc t96 rrs 5e t: l:n.5 Jl-tcrpenyl ucelutc 196 te5 59 t1 t:85 unrlccanll'.t t70 lô9 l-l t-1o2 3-hcrenyl ttglate' Ir,rl lli I 9' t: t.u7 m()n()lcrPdncacctale 196 le5 59 lô l-1rI nrlyl aeetutc lgtt te5 59 l7 brnzyl acct.rte I 5(l lJ9 59 In l -1-Sô gerunylacetate l9tl te5 59 I9 | .11: citroncllyI ucctute l9l'l t97 5e :tl llô: txrrnyI proplrnute Il0 f,}, 7J :l t-17| t h vm v l h y-r.lroqu rno ne dimct h ylet hcr l9{ :: lJ|l5 linaNl hulvratc(ts.J'.') ll.l s7 :-1 I{:l u-tcrpcnl I propionate : trf t_, lJ 1Jr.1 neryl propronate I l(l It t{5.r a phenvl hutrlratc'l : tl( x. I:? :ô I J{r.1 ihrnrt l hulrratc :l(l n7 I J.t 1: l.ltil ncrvl hutr r,rtc1 rrrr't) :$ l it|ô txrrnvl rs.rr.rlcralc :.rx lil! :,, li ltl rr-icrJxcnrI hutrfulc :-'r tt: .It l5.li ( rr--l-hctcn\| hcnt(rJtc :tH l:l l:irl ttrtrntlrllcrltc' l.ltr Iill .ll l55rt a phcnrl rs(rrJlcrJlct :r: l0l l.l: 155.1 lhrmrlrY)sùlctJlc :.u .{lll l.l!l .rJ I 555 ncrvl rsoralcrate l.it{ Ittl .i_t | !ô: geranrlrvrralctatc _ _rÀ lUl Jo trrrnr I trlllatcl :.lô tfg I h.ll a phcnrI trglrtc l.1l I tig r (J(l ls lô.17 lhtnrrl lr{l.rlË lr lu | ôiJ ncttl lrFlrtc l.ltr v, {tl \(\(lurlelp|jnc .rrcl.rlc :til ie .rl \crlttllcrl\nc J(ùtJlc :rùr ie {: l'il \(\q|lrl(rltnc JeclJlc :ô: )9 lr l7\rl tt'nrtlhlnu,tltc :r: l:t rJ t 7ôr s(\r{ullcrll(nc J(ciJlc :trl 5e ' l\o {1llç1çn11Jtlrn hr'l$ccn ttglrtcr .tttd Jnfril.tlc) cJn n\ ntrrjc trutrl thc \l('l nrats rç*-ttr.r 0H 0 Dérivés du flavonol 3 GLUCOSIDE ÀGIJYCONB R1 R2 Hyperoside quercetine -oH -galactose Rutoside* Quercetine -OH -glucose-Rhamnose Astragaline* Kaempférol -H -glucose KaempféroI 3-Rhamnoside KaenpféroI -H -rhamnoside FIc L7 I IJES FLAVONOIDES DrE.cannabinun l,(*) C.3 . DERIVES ÀIIIINES C.3.1.ÀLCALOIDES Deux alcaloides pyrrolizidiniques, souvent sous forme de N- oxydes dans Ia plante, ont été isolés des parties aériennes, par Pedersen (1-975): échinatine (figure 18a) et supinine (figrure 18b) . II y aurait, outre ces deux molécules, des isomères de ces dernières telles que la lycopsanine et l,intermédine (Hendriks et coII., 1983). Selon ces auteurs, les parties souterraines en renfermeraient égalernent. Hendriks et coll. (1987) isolérent en plus plusieurs esters de ces isomères : esters B-acéthyl, B-angeIyI/EigLyL, B-(iso) - valeryl. -36- La fraction alcaloidigue représente OrO3t de la matière sèche (Pedersen, le75) . 00É0H ttl -G- I -CH-CH3 I crtSA. crtS FIG 18a 3 ECNTNATINE , Ii ffi20-ù-i., ï-"'oH \--iV ,('\ FIG 18b 3 SUPININE C. 3 . 2 . À}IINO-ÀLCOOLS La présence de choline a été mise en évidence dans Ia variété svriacum (Pagani et Romussi, L967). C. '.ÀCIDES-PHENOIJS Acides cafeigues (figure 19a) , chlorogéniques (figure L9 b) et isochlorogénigues ont été isolés des parties aériennes sèches (Oswiecimska et Sendra, L9721. -37 - C[:g[gggn unn|lH FIG 19a 3 ACIDE CAFEIQUE FIG 19b : ÀCIDE CELOROGENIQUE c.5.ÀcrDEs-ÀtcooLs Les acides malique (62,5 lllig/kgl, citrique (2,5 mg/kg) et Iactique (L2,5 ng/}cgl ont été isolés par Bogaert et coll. (L972) des parties aériennes sèches. La variété syriacum renferme de ttacide ascorbigue (Pagani et Romussi, L967) -1 i C.6.DERIVE DE BENZ(rÉUNùTXB \__,-- L'euparine (figure 2L fut isolée des racines séchées (Jerzrnanowska, l-951) ï*' C ÈCu, FIG 21 : EUPÀRINE -38- C.7 DERIVES DE BENZOPY Zdero et Bohlmann (1-987) isolèrent, de Ia racine, Ie 3 -isobutyryloxy-6-hydroxytrémétone (figure 22al et le 3 -rnethacryloyloxy-6-hydroxytrémétone (figure 22b) . -H^C=COO 22a z cHr 22b -CaH7-COO rT.G 22 3 DERIVES DE BENPYRâNNE -/ c.8 SUCRES Pagani et Romussi (L967) identifièrent du glucose et du fructose dans les fleurs, des fructanes ainsi que du rutinose, du fructose, du rhamnose et du glucose dans les tiges et les racines. Enfin, 2 hétéroxylanes hydrosolubles furent isolés des parties aériennes (Vollmar et coII., 1986). ?ece rta inea dt r uc #f :;:;tn prétentet ?ana le genre Eupatorium L. -39- D. PIIARITACOI,OGIE DE CERTÀINE8 STRUCÎURES CEIUIQUES PRESENTES DANS LE GEIIRE EUPAIORIT'}T L. D. 1. PEARI,TACOLOGTEDEs FIJAVONOIDES Les flavonoides, produits en grande quantité par les plantes oÉ ils interviennent dans Ie processus de pollinisation et protègent des agressions extérieures (bactéries, charnpignons, herbivores), suscitent aussi, pâr leur inportance dans I'alimentation humaine et la médecine traditionnelle, de nombreux travaux de recherche. De faible toxicité (LO g/kg chez le rat) et non tératogènes (Périssoud et Testa, L986), ils possèdent cependant un pouvoir rnutagène sur les bactéries et les cellules de mammifères, rnais leur carcinogénicité est controversée, dépendant beaucoup de 1'espèce , de la structure moléculaire et des enzymes de la flore intestinale gui transforment des glycosides en aglycones carcinogènes (Mac Gregor, L986:, Hackett, L986).Ainsi la quercétine serait à la fois cytostatigue et mutagène : cytostatique en inhibant les enzymes de Ia glycolyser êD entrant en compétition avec I'ATP (Kyriakidys et coII., L986) et en inactivant in vitro le benzopyrène (Shah et Bhattacharya, 1986) et mutagène en étant capable de potentialiser Ia mutagénicité de Itacétaminofluorène chez les bactéries (Ogawa et coII.rl-985). Ils peuvent modifier la toxicité et la pharnacologie des xénobiotiques par leur pouvoir inhibiteur du système Paqn microsornal et intestinal (Vernet et Siess, L986). II y'àùrait cornpétition ou altération du site d'action du substrat de I'enzyme et ainsi inhibition et potentialisation d'un métabolite carcinogène (l{ood et coll., 1986). Bracke et coII. (L987) démontrèrent que Ia (+)-catéchine inhibait Ia prolifération de cellules tumorales in vitro en se liant à une glycoprotéine, la laminine, gouvernant 1'adhésion des cellules invasives aux tissus normaux (stade précoce dans la forrnation de métastases). Donneurs d'hydrogène, ils possèdent un pouvoir antioxydant, inhibant, Ia lipoperoxydation des acides gras polyinsaturés (Torel et coll., 1986) . Ilç,ont une grande affinité pour les métaux lourds (Cu2*, Zno-lcatalyseurs de nombreuses réactions biochimigues (Havsteen et coll., L983). Toutes ces propriétés expliguent leurs utilisations phar- macologiques: -40- * âIITI-IIÛFLAI{TIÀTOIRES ET AIITI-ALLERGTQUE8 : ils inhibenl Ia cycloxygénase et Ia lipoxygénase, empêchant Ie relargage dthistamine, Ia synthèse de prostaglandines et Itagrégation plaguettaire (Kinura et coll., L986i Rossi et coII., L986). IIs interviennent de Ia même nanière contre les venins de serpents et les pigtres d,insectes (Havsteen, L983). * ANcfoPROTEcTEURg : ils inhibent les enzymes protéolytigues, assurant une protection des tissus élastigues et conjonct,ifs (Jonadet et coII., 1986). Ils pourraient aussi agir conme antioxydants, inhibant, Ia lipoperoxydation des acides gras membranaires (Torel et coll., 1986) . * ÀNTIHEPÀTOTOXI9UES:Les travaux sur la sillrmarine ont conduit à la découverte de nouveaux flavonoides antihépa- totoxiques extraits de trois Asteraceae, Artemisia capit- laris, Eclipta alba et Wedelia calendulacea (I{agner, 1986). Wagner souligne le pouvoir antihépatotoxigue plus important des extraits totaux de flavonoides, comparativement aux rnolé- cules isolées. Ce dernier cite les bons résultats de la quercétine et de I'isorharnnétine vis-à-vis de 1'hépatotoxicité au tétrachlorure de carbone in vitro. fnversement, Périssoud et Test,a(L986), testant le pouvoir antihépatotoxique de quelgues flavonoides ne trouvent aucune efficacité avec Ia quercétine et Ia rutine. Récemment il a été démontré que les flavonoides surtout hydroxylés (à groupement 3-hydroxyl) conme Ia quercétine, la morine, la robinétine et la fisétine, sont actifs vis-à-vis de I'aflatoxine 8L, hépatocarcinogène et mutagène. Ils agi- raient par liaison avec les sites d'action des enzymes micro- somaux responsables de Ia biotransformation de 1'aflatoxine Bl- en métabolite actif, par liaison avec les phospholipides membranaires, avec Ie cyt,ochrome Paqo ou encore avec un méta- bolite (Bhattacharya et, Firozi, f.96gJ. La capacité à inhiber Ia stimulation de Ia chirnioluminescence du foie a été évaluée pour certains flavonoides et polyphénols : cette chimioluminescence est produite par la génération de radicaux libres à partir de toxiques hépatiques (tetrachlorure de carbone, ter-butylhydroperoxide), in vitro et in situ. Cette rnéthode, encore mal expliguée, est une mesure par compteur à scintillation du niveau des radicaux générés durant Ies processus oxydatifs. La (+) catéchine est le flavonoide Ie plus actif. La présence de groupes hydroxylés en C, C+r êst associée au pouvoir antioxydant. ?t Par contre, Ia éonjugaison dtun sucre dinrinue cette activité (rutine, hespéridine, kaempferol...). Cette inhibition de Ia chinioluminescence peut stexpliquer par Ie blocage des réactions dtoxydation en chaine par les polyphénols, formant un composé stable avec des radicaux libres. -4L- Bien gue Ia lipoperoxydation soit initiée dans des domaines cellulaires hydrophobes (Cytochrorne Paq6), cette réaction se propage en milieux hydrophiles, attei De plus Ia quercétine suscite actuellement des travaux sur sa dualité d'action inductrice de la tibération et inhibitrice de Itabsorption du calciun et de l'activité ca++-tlg++-RrPase par le réticulum sarcoplasmique (Kurebayashi, 1986) . D. 2 .PIIARII.ACOI,OGIE DES ACIDES-PHENOI,S Très conmuns dans le règne végétal, Ies dérivés de ltacide cinnamigue tels les acides caféique et chlorogénJ-que surtout, suscitent l'intérêt des pharmacologues car leur toxicité et leurs propriétés pharmacologiques sont mal connues. A doses non toxiçlues, ils sont antimutagènes ct:.ez les bactéries en piégeant les produits de dégradation électro- phites des mutagènes (Chan et co1l., 1986). Les acides férulique, caféique, chlorogénique et sutout ellagique inhibent la mutagénicité du métabolite carcinogène du benzo tal pyrène sur Salmonella tvphymurium (I{ood et col}., L982). In vivo, une diète d'acide chlorogénique a un effet préventif sur l'apparition de tumeurs induites chez Ie hamster (Mori et coll., 1986) outre leur pouvoir hydrocholérétique (Sharma et coll., L973) , ces acides-phénols ont un pouvoir antioxydant in vitro (Iwahashi et, coII., 1986) et in vivo c}l.ez le rat ori ils préviennent la lipoperoxydation (Kimura et coll., 1985). Enfin ils inhibent Ia synthèse des leukotriènes (Iwahashi et coll., 1986), I'activité de la DOPAdécarboxylase par siurilarité structurale avec les catécholamines (Escubedo et coII., 1986) et sont efficaces sur le virus de I'herpès in vitro (Kônig et coll., 1985). -42- D. 3. PIIARUACOLCTGIE DEg AI'CAITOIDES PYRROLIZIDINIQUES Une centaine d'alcaloides pyrrolizidinigues ont été isolés des végétaux dont 30 hépatotoxiques, surtout des diesters et esters cycliques contenant une base nécine, rétronécine et otonécine (Hirono, 1986). Certains provoquent en effet des nécroses hépatiques chez les animaux (Senecio, EgpëEor:Lum, Nardosmia, Erichtites parmi les Asteraceae, nais aussi des Boragineae et Léguminosae). Si leurs effets aigus sont connus, leur effets chroniques ne le sont pas. Souvent sous forme de N-oxydes, moins toxiques, ils sont réduits, après ingestion, en bases libres et rnétabolites toxigues (Kovack et coil. , LgTg).L'indicine N-oxyde, cytotoxique et antitumorale, a été testée commemolécule anticancéreuse (Suffness et Douros,L982). Récemment, if a été dérnontré gue seuls les alcaloides pyrrolizidiniques insaturés sont cytotoxiques in vitro. Cette cytotoxicité et donc 1'hépatotoxicité parait corrélée à une structure ester 1-,2-allylique (I{assel et coll. , L987). C/aimic et pharmaco log i"e ?e?ffirented edpècet ?ugenre Eupatorium L, -43- E. CEIUIE ET PIIARI'TACOLOGIE DE DIFFERENTES ESPECES DU GET{RE EI'PAITORIT'TI L. E. 1. r.,ÀCTONESSESQUITERPENTQUES Les lactones sesquiterpéniques ne senblent pas avoir de voie urétabolique spécifique à f intérieur de la plante mais leur accumulation n'est pas sans désavantage (Sutherland et Parks dans Woerdenbag, L986). Elles jouent le rôle de phytotoxines et protègent les plantes des insectes et des mammifères, le bétail tout particulièrement. Les premières études des lactones sesguiterpéniques de genre Eupatorium sont dues aux travaux de Kupchan et coII. (L967). Ces travaux furent ensuite repris par I'éguipe de Hladon : Hladon et coII. (1975a), H1adon et. coll. (l-975b) rHladon et Chodera (L975) et Hladon et colI. (L977r, dans le cadre d'une recherche de composés antitunoraux dtorigine naturelle- Kupchan et coll. (L967) lsolèrent, d'E.rotundifolium., une taôtone aè type guaianolide, cytotoxique sur le carcinome W256 chez Ie rat. L'extrait alcooligue d'E.semiserratum est aussi cytotoxique sur Ie carcinome KB du nasopharynx humain (Kupchan et coII., L965) ainsi que 1'extrait chlorofornigue d'E.cuneifolium (Kupchan et col1., 1968). Dobberstein et coll. (L977 ) démontrèrent aussi, c}rez Ia souris, l'activité cytot,oxique et antitumorale sur Ia leucémie lymphocytique P388 de 1'extrait alcooligue dtE.altissimum. Ltextrait éthanolique d'E.formosanum est également antitunoral sur Ie carcinorne W256, Ia leucémie P388 (Lee et coII. , L972, Lg't71, ce qui confirme son utilisation tradi- tionnelle comme anticancéreux (HaIl et coll. , L979). Lee et coll. (L972) isolèrent Ia rnolécule responsable de cette activité, I'eupatolide. Les espèces d'Eupatorium L. américaines contiennent toutes des laètones sesquiterpénigues de types guaianolide, genna- cranolide, héliangolide et eudesmanolide, à propriétés cyto- toxique et antitumorale. Le tableau 5 regroupe toutes les espèces contenant des lactones. Les lactones sesquiterpéniques provoçluent, chez Ithomme, des dermatoses de contact. Cependant aucune allergie n'a été rapportée avec E.cannabinurn. Le groupe O(-rnéthylène f-Iactone se Iie aux groupements sulfidryls des protéines cellulaires pour former des antigènes (Rodriguez et coII., L9761 -44- lr.u d ,q F .q o l@O o.t Ol r- \O F{ r- lolor f. f- o\ f. @ (n lF{ F{ o\ O\ r.l CÀ CÀ r{ H H l;- i i $ I i i EI F. ljhr jr jr $" =l jr ,ir jr I oldl -rl -rl é- ol -{ ;l -rl É I ol ol ol ol r.rl ol ol ol (, I lol ol ol l{ | ol ol ol o l+rll I l..t +rl I I I H I ol+rl +rl +rl o ol {Jl +{ +rl rl ot ot gl luq H l'-lt{ N N O O N O tr l> O t{ t{ Fl O t{ É loAl (u (l, É o d lao E t E: -n 15 O 'F{ lJ1Él o u IrU 15 O o| lbO.FtÉ rt lÊ-l'FlO f..{OoÇÉO . lg+J.d.r{É D o f-{td.Og{.'{ H H I tU P{O O O F{ Ê H I l{ ,$ É oo o o H I O OO t{O aÉ çO H Fl | +J OÉ rd.-t AÊ r( H I tU \ \ q{.r{ Ê-{ O.F{ ê. H I A{ O o tU F! U'.1 td É D z I A -'{oÉo P{t{ oq{ ùA ÊI E I o 5 o rQ 5 o â | l{.-t Oq-{ O O O Ct r H H I O-{ d É d A{ É I O O ..{ O -9{ ..{ tr\ rJ I É É O{É Oi O{5 OO O n .r{ .A 'lt H | O.-l O O O É-t É (, | > .Cl .Fl .Q .r{ O .F{ > ..{ I t{ F{ l{ rU F{ ul E,C H a , (t oÉ o Êl I o +, +JÉ .rJ .C OO o rf I o (d rdd .d d cto a | l.l 9{ ÊO llr 9. qd bt zo I a a aJ a u 50, .r{ r( I O O oo O O Od Fl I o I 6 loutul o F looo zH z lo o o r, € 1û ur o o f O Ul O O O ."{t +t .A (D O H E{ (, (, l.-16 .Ftlt rFl OrU O O .-{ f,l l-1 .-l Fl .r{ O Ë.r{ É E Fl -.1 É É lO-t O-'l G d-{ ltt llt O Fl lo H lB8 S8 Ë U8 U b E I H o l(ti t|t }{ rUrd d d td d f.d:;f .d,rl O Fi,-t É É .F{ :Fl H l-lc, Fl|lt +l t{d t{ h F{ .d : Fl f'O5 'O5 .r{ AA O O .O J )| l,qtî .cur É urùr trr Ul ,4 b' uf E{ lo D É I rt H I .Jù É F looo EI 2 | <5 tn u r{ H l(tott E{ o l'< H l(â o (,l oo t{ (a (,) x Ê fD D D g,) o D D o o I Ott rr E I t{..{ | 5l{ I frl q.{ . lo4.;l l,q l: O r ttt Fil Fl O fFldÈ1 trlAIO |2"{l Éa I Ef Êl El -{l tl El lÊl Él Êl Êl el 'il il l..ll -{l F] ..{l dl .'{l Ol .tJl o gl €l 81 8l .:l H f8l â Bl C' l'il 8l .el H El 8l Pl .:l H l,1l tdl ..!l q ol >J tdl F{l A ql ol 'r{l 'q F{ 6 lql .l | E lr'il Ê11 r'rt Êil Ê;l Êil Êil r';l -45- lo.qtr)r-o o\ .A sf s!ôl ICO O'l @ f. @ C- -l @ @CO lôf-o\o\or ol @ o. o\ol lrl CÀ rl F{ r{ Fl (À c{ F{d o l' r{ \ \ r{\ H l. . . \\ta\ H l-ll .. -{l F{l -{l . . . -ll rl EI l-{l -'ll -{l -{l -{l r{l -ll F{l -tl O È lol Frl ol Ol ol r{l F{l Fll Ol > ror or or ol ol ol ol ol ol--l â tt ot I ot ot ot td i, I | | +.rl.c o ;l Ël rl Ël +rl +rl +rl ol +J H tolItl otototÉ rJ IN UI N É Érd gl ll{ N O t{ C ..{ N É É-l H lO t'| rl O tll ,4 t{ É d5 tr IiÉOtÛEÉ o o d ÉM ItNF{ tdtÉFl .l I lÉ,4 ,4 Ft .c+J I too d "c oo loo t1oÉl Ël I I rd Él NO HI I I oo H t{É Él I I O ÉÉ O ''{ É ''{'r'l tx 8l Ir 'Ê{ É t{ o dl IH F{ .'{ O l| F.l IH A F{+J o l)l H O Ur or! O O-{ FTI Fl E ç F{'r{ Ê É,4 H -F{ rd o h-{ 'Fl ..a O H H t{ t{d O O . t{ t{d É z O d'.f P{q{ . O Opi z E UI d-{ AA . o o aa frl o ur uo oo o É (n Ul(t, (, H rd ttÊ O +, o(d(u çL AÉ O +, 9{ P1r BI o A .{J..{ O O \ o (l,5 oto o rl FI O OOr{ ÉÊ O rd EO ÉOÉ É .Ft.F{ 'F{ 2 Ff çOa ç r{ Fl .F{ F{ .F{ ..{ !0 o -'{ t{ > f{.C tJ z H .C -iOÉ OtU t{ t{ O.C OàÉ t{ û (, +) 5F{ rU q{-F{ O o ur+J a$a , o O t/l O l{ lrF{ +J d o o o o+J o É O 5>d OO rû o do dod o @ ttt .q O d g{q{ p{ H o H I t )a , 'r{ 5(l) AOU A 2 .ûutt (u6 (u't'|u (l, o d oo o .q E{ (, o o H oo o 2 ooo o ooo s o ..{ oo É € oooo G0 H F{ 6O -.{ .F{ O 6do€ Ét (, O .rf d F{ FIO ..{ ..1 .F{ Ul .Fl É F{.r{ O od F{ Fl F{O F{ É .tt O-{ Ê É"{ o o od o : t{ ttto d tUF{ É E É..{ É H (, ÉÉ É go d .! d-{ tU â rU d.d O oÉ t{ t{ kO t{ É .Êl:Fl O td rû o o oÉ o :F{ H FI t{ F{rU t, Ê r\t r\t rd .U d H A o .o5 J l{rd É É FÉ É H }| ur .cur o oa k k l.t.O tl D H urf'r O O O-{ O o Ur Ur Uù.O tri nl FT c z '44o 4'< o44'< E H (/1(/)) (/) o O{@(,)Câ o É (t DDt' DD dDDD b n H .F{ F) É û x gl o o A ot E{ É 1 P{ .F{ . 14 o ! ttt F] Ot{ d O .C É tn.qtoo oool Fl Él-a.e -F{ E!l ol O rdl Ol O -{l HI ô BI El ÊËfiHl El Ë' nl ot çl El :lEhËl Ël Êl rl 'fl| ..{l tUl o 'ilt Ël Elgl.?l $l Ël €l Êl Ft (, 14 .cl Ëlr\,1 o,B H 'r{l Ol Al ir Er ul È El Fl bl f;l Ël ill o H Ê;l Êil Êil ;| ;rfis ;| ;| J 'l -46- EIIes possèdent en outre une activité antinicrobienne. Selon Lee et coll. (L977) cette propriété serait due au noyau cyclopenténone. Calzada et coII. (L980), au contraire, imputent cette activité à Ia présence du groupe -méthylène- -lactone. Cependant Ie mécanisme reste une alkylation des centres nucléophiles à I'intérieur des micro- organismes. Les lactones sesguiterpéniques possèdent aussi une activité anti-inflammatoire et antihypertipidénique (HaII et coIl., L979, 1-98Oa, L980b ).EIIes agiraient comme inhibiteurs potentiels des enzymes lysosomiaux, de la phosphorylation oxydative et de la synthèse protéique. La fraction ct-rnéthylène t-Iactone joue là aussi le rôIe le plus important. Certains sesguiterpénoides eudesmanolides sont hépatoprotecteurs in vivo et in vitro sur des modèIes utilisant le CCl4 comme toxique (Handa et coll., L986). 8.2. FLÀVOIIOIDES De nombreux flavonoïdes ont été isolés des espèces d'Eupatorium (lableau 6). Cependant ceux-ci ne semblent pas posséder d'activité pharmacologique ni de structure originale (Hendriks et coll., l-983). Beaucoup contiennent de la rutine. La cytotoxicité d'E.semiserratum , mise en évidence par Kupchan et coII. (L965) et attribuée à I'eupatoriner uD flavonoide méthoxylé, n'a pas été confirmée par Dobberstein et coII. (L9771. L'activité est sans doute due aux lactones présentes dans Ia plante mais pas encore isolées. E. 3.ALCALOIDE8 Dans les Àsteraceae, les alcaloides ne se rencontrent que r:t;'ez les Senecioneae et à un degré moindre, ch.ez les Eupatorieae. 11 est intéressant de noter que tous les alcaloides isolés jusqu'ici dans Ie genre Eupatorium sont caractéristiques de ceux des Boraginaceae plut,ôt gue de ceux des Senecioneae, responsables de troubles hépatiques chez les animaux (Hegnauer, L977) z ce sont des esters en Cz d'acides néciques avec des bases nécine, rétronécine, héliotridine, supinidine, trachelantamidine ou isorétronecanol. Ces alcaloides se rencontrent essentiellenrent dans tes espèces américaines et notamment chez E.serotinum, espèce gui en contient te plus Le tableau 7 regroupe les espèces possédant des alcaloides. -47 - r{ r- Nr\ co @ f. C.\0 \o o\ cn or(n o| r{ rl r{ r{ F{ rd\\ ru Ê l.{..{ .l Êt .A .r{ t, O -.ll H t O É1 -rl EI .n +J Aa Ol A ^ F. .F{ o @É ol A1 t{Ol-tF{ â [r]^ O ]JÉ. +Jl (, .q(l,ol vv o +J r{ .q +J H o o rdo É É voAld gl X rt o'"{ .ç H Ff " ÉÉ o gl F{ .r{ d 9.. rd our a F Otd M j +J ..{ A OB =oo Éo r{lËl .À Él +, o gl oo Âl ck Êl ..-{O O O o+rt Ê É Ël d(lltt 'Fl O '.1 O F{ FI Ot{ \ .û d É OOO O: !r F{ z ktÉ O5O td +{ E O tt.-l Ê ttÉ t{ A o ql fl{ O +J .Fl .r{ -r{ +J Êl >ot +Jtr+J o ,4 H rl É-l l.{ O d O rû +J rl o oEo o @ \ \ \ f{t@ - É o H OF{ O O O t O O 'Fl à Éod 5()tt1t É d .{ a -'{ l.t -F{ tt I O .-{ .F{ | cl Êr -'l'O O p.O O F{ \ o Or+{ O . ..{ O O f- a H ${ P4É O O É ç{ \ FI o d E--l O€ :fi .U n cl = ÈO+J .'{.rf O d p{ | H o A6A OO5.C A F{ o OA1t{ Oruttt{ O z I k .'{l X o rt \ s(n O \F{(n \ O O F. oor 9{o5t o l{ É 4 É É-.{ O XÊ tr-r É O É .Fl r{ .r{.''l O É .C.-l l.t O ..{d >r +J Ê. F{F{ g .r{ -{ O l{ F{.F{ ,A O '.U.O t{ -rrttlrO AA -r{ É GO dbç{ O OU.' q.{ 'rtO d nt H ''{tttP{ +J ÉdOg. ..{k | lr É g{t{ Fl td ..{ l.td É P{O r J U+J O ç! +J+J.-t O O Ê sf t1 '.lOtU , 5UlO.d 'Fl> r (t .q.d}1 O t{tdtuâ1 E,ç m o ; D H É 2 a; (, H H ,{ .<'{.a É (9 o (,) trL'.{ tDo, tr H D Ot{ DDO É û !o H o 7i n frl dJ .F{ É' It F{ +t o -1 .Fl O |It r{B F) .r{ BÉIO Fl i- Ér dli EI HEI ,t ol at 1()1 È1 :l .51$l .5t .5t.51 8t Et 6l a EI Bt €til 'dt 'Ét E 'il ', (, Êl El Fl H F{l ttll . 5t 8t Èl A ttll Ol r{ '?l o ï {l H J 'il 'ilg Ê11 Ê11 r'll -48- f. o @ r-O o O\@ FJ -lo\ \ rl -{l a\ F{l F{l ol -{l r{l ol Ol -il I H ol al +Jl H rol ol EI +Jll^ C. ol +rl o 4 rll{ E F{oolr{F{ ru (, vt{ É ÉFlNvv o v(dt{ H .l H -nvo o DI 'I .F{ E h E J HI H ol 8l Êl Él o ooÉ sl tlÉ'Fl HI .r{ .'{ O ..{r{ H o +JÉ Ê O td.'{ +J 2 o !É d FI J OO 9{ ooi (, F{ 'dUt A O ,Ê Ut O.ri O E tt''{ E l>.Fl .r{ +J (V) \F{ \ -+ .qo rl I Orû O rd oo a t{ Éa É Ur Ot{ z O .'{ .Fl rd +ro .( \Â+JrÇt{ 6a o !0. o+J o o o +J ott FI o oo Ed U' oo o .F{ o H É (d.r{ .F{ td d +J\ H Fl .F{ OF{ t{ t{ k ..{ Orlr{ H +J O > td O td \O t{OO ê ..{ rt{ H Fl O o.q A1 E o o Q>t{ o 2 -{Ê 5+.| d çL .-t !| É +JO 2 FT O'.{ F{ O llt É Fl .F{ .F{ O O${ o a +J r{ tnFl o o o+, tl'-l g. H rdo \.d +J O 5 -.1É É tr 9.r+J I f. OX O ht{ ooo É a a6 0('|Êoo C'.-l tu F H Op{ I O 'r{ \ 9{ çLl t{ }1 a J Oç +JO Xrn \o o H s (l) É-'{ O É - .C I o\ H o oo .r{ l.t O É..1 O O F{ É r(t) 2 ÉÉ\ lr'd É rd+J É É rQ .'{OÉ .Fl ..{ .O o O +J É .'{ k ..{.F{ O k Fl É '.{ : F{ +JC -.{O t{ 5X t{l.l ÉO A ..1 -l .F{ .Fl.r{ O '15 O X.-t O O .r{ $.1 o+J o t{ +J F{ r{ O d +J rd t{ +J+, É Él{ ..{ O q{ Ê. ttt t(t tt, ÉÉ d orû .dru oÊi tU g{gi P.O H tt E O g{ O E g{9{ O O Uldp{ o tdg A O.U .'{td .F{O5 H aa -.{+J JA H Ê oo .C td O O O >}1 .crUO D t{ o Él o o 2 a t{ É H '4 tt 4 '{ '{o ( '< .Fl ro (, (â 'F{ CIl U) oo ul o +J H DX p D D'r{ D D ç tr É o (l) 2 o É o XT Et FI l{ Ê +J o '{ !l o u EU. É o Fl{o! tri 'l rua.c M E{ .Éo o t (, 'F{ o (.) t Él . = ,to Etj EI -F{l El 5l +rl ËI EI Irtl 'Éttl Ét frl 'ilEl +JI+J it Ët $t UI+J o sl .dl o H .gl Bl .ct É (, .cll l{ E El .31 *t ët Ët fil fl'< A '11 ol o 1l .l +, H Ê11 Èrl :lJ;l :l t'l| O -49- o C' nc|.u c.lof-\O @ Fl t-@r{ @co@\o cn @ oor@ o or ct\ or r{ Or r{r{o\ .{ F{ F{ * .5* - . -* É\\\\ a\aa\ .F{...F{.. F{l . rll e{l . F{l F{l .( -ll F{l F{l -'{ -ll -ll-ll É -|| -{l O Fll -ll Ol -{l Ol Ol -ll o ol ol .,{ ol ol ot ol ot ot ol .f{ ol ol A1 ()l ol t,,= kll'Flll | ol I lol +rl | +rl+rll = = (t +rl +Jl = Ei +Jl +Jl ol +rl ol ol+rl tol ol ol ol ol *rol N ÉO +ru N oul ,t1 H N OJ1 S Oj1 t{ }1 O O 1a O..{ l| .r{ O d..{ O !E O lrt{O dt{ E >g O t oot oo .u1' o ÉÉ 5É t{É È oo ulo to AT E{ E: tr{ iÉ o Ë .r{ 6 O 'r{ oç É o - É..r .d alH É o--r E +, o 'F{ ÉFld É ç tl '.{dO (tl 'r'l -r{ çUp{ F{ O t{ EtË t{ -.{ çl.o o E o Ë|fr +J ll*O O ,É .r{ d O 5()> O O 0 F{ É .A O>r-{ O O td O 'r{ llF{F{OOl.tllr+1 t{ Ëln t$\\rÉrd+J.r{ F{ O r(lf l.t t{ t| F{ .-l É."{ O .r{ É O +J'.1 t| Ê -{ ElÊ .r{ "{ br tltd O É o16 É ÉOEl +J 'r{ HtÉ (t '-lE!H d P{ É ) I "choo o+, -A o r- O4J É ,4 É."{ O ll' 'r{ O oo 4é d Î/)ul(,)o(â(ac,)(a(,)r,o ul DDDT'IDDDDDD4 D ) Ê1 o (tf dE.P jo x E S ,c ; o UFIÉOoPA (t Eil E:l H }l tll F{ É :t Z,.El El4il :,s Ëlsë .FllEI Elj;l:lillËlElfrl'dl elnE +rl gl !, .91 .91 Fl 8l I C' Fl El El Ël e sl at sl 8l Êl fl El 8l Fl 9l Hl f;l il 3 ol a .ol .ol .ol ul ul ul '1 u o El El I *il *il *il *il *il *il *il -il Êil *il Êr :l I -50- E. I.EUfIJE E8SENTIELLE Une huile essentielle a été isolée dtE.japonicum et E.rusosum et E.serotinun (Bohlnann &,LL. r t-984) . E.triplinerve a été particulièrement étudiée pour son huile essentielle analgésigue et sédative (Kokate et coll. ' LgTLl.Cette espèèe est également utilisée en médecine tradi- tionnelle commestimulant, tonique, diaphorétigue, hémostatigue, contre les pigûres de serpents et pour Ia guérison des plaies (Chopra et coII., 1956). B. 5. POITYSÀCCEARfDES Des polysaccharides anti-inflamnatoires se rencontrent dans Ies éxtraits aqueux d'E.perfoliatum et E.cannabinum (Wagner et coll., 1985; Vollmar et coll., 1986). Etu?epharmacologiq* A'8, ca.nnabinumL, I -51 - F. ETUDE PIIARIiACOITOGIQUED,EUPATORIUU CANNABTNITUL. A ce jour, aucune étude pharmacologique complète tentant de confirmer ou dtinfirmer I'utilisation tradiLionnelle d'E.cannabinum n,a été entreprise. rt faut cit,er les travaux de Mortier (Lg7z) sur res acides organiques alliphatiques de diverses plantes à réputation hépatorénale dont E.cannabinum. Par contre, I,activité cytotoxigue et ant,itumorale des ractones sesguiterpénigues d'E.cânnabinum a été rargement étudiée au cours de ces vingt dernières années. Récemnent I'extrait aqueux drE.cannabinum et plus particulièrenent Ia présence de polysaccharidès, a retenu I'attention d'un groupe de chercheurs pour ses propriétés immunostimulantes. F. 1. LACTONES SESQI'ITERPENTQUES Dans le cadre d'un programme de recherche de nouvelles molécu1es anticancéreuses, Hladon et coLl. (L975 a) étudièrent la cytotoxicité de deux lactones isolées d'E. cannabinum. Ces deux molécules, lreupatoriopicrine (EUpp) et I'eupatolider sê révéIaient actives in vitro sur culture de tissu humain (carcinome de nasopharynx KB, carcinorne cervicis uteri HeLa, ascites d,Erlish EAC). Leurs doses efficaces induisant 5oB d'inhibition de cçoissance cerlulaire (DEso) se situent entre 0,5 et L,3 ]E/ l-0o cellules/ nl de milieu, selon le type de cellules. LrEUpp perd son activité à pH 9,0 et en solution dans l,acétone. Par ra suite, 18 ractones sesquiterpéniques ont été testées in yitro (Hladon et coll., L9Z5 b) èt, sur tt molécules cyto- toxiquesr on distingue res germacranorides, parmi lesquerres ITEUPPet l'eupatolide 9fractones ont été retenues pour des tests in vivo chez ra sôuris (Ieucérnie exhudative L L21o , sarcome sa 1go, ascites d'Errish EAC (E4)) parmi lesquelres Uaratoride, exLraite de Jurinea alata (Asteraceae), et lrEUpp semblent, Ies plus actives (Hladon et coll.,L977l. Les recherches storientèrent alors vers les mécanismes dtaction de ces nolécules antitumorales. Hladon e.g coII. (L977) montraient que I'aratolide inhibait la synthèse des protéines et de L' ARN. -52- La cytotoxicité des lactones sesguiterpénigues nécessite la présence d'une double liaison exocyclique C1r-Cra, conjuguée à une lactone. La présence d'un groupe foffôtiôinel (époxyde, hydroxyl, chlorydrine, cét,one insaturée, O-acyl) adjacent à la lactone semble augmenter la réactivité de ce type de molécules avec les nucléophiles biologiques (Rodriguez et coII., L9761. Leur cytotoxicité est en effet, Iiée à la présence de groupes fonctionnels électrophiles. Les lactones se lient par une alkylation sélective de type MichaëI avec les groupements des protéines et enzymes cellulaires. Halt et coll. (1978) dénontrérent gue I'hélénaline, antitumorale, réduit I'activité glycolytique enzymatiguê, inhibe les enzymes de cycle de Krebs et la phosphorylation oxydative mitochondriale. La synthèse de I'ADN et I'activité enzymatique ADN polymérase sont bloquées (Lee et coll., L9771. Ces auteurs enregistrent aussi une diminution de Ia synthèse du cholestérol. HaIl et coll. (L979) étudièrent les propriétés anti- inflamrnatoires de 9 lactones sesguiterpéniques dont I'eupatolide et remarquèrent que Ia structure d-Iactone était nécessaire à ce type d'activité. Klirnek et colI. (L98l-) étudièrent I'EUPP sur un modèle in vitro permettant de stirnuler des lynphocytes humains à I'aide de Ia phytohénaglutinine, ce qui induit une transformation blastigue. Dans ces conditions , la présence dtEUPP entraîne une inhibition de Ia synthèse de I' ARN et de l'ADNrce gui laisse supposer Ia mise en oeuvre dtun mécanisme agissant au stade initial du cycle cellulaire. Baer et coII. (L983) démontrèrent que sur Ie même modèIe, I'EUPP dininue la consommation de glucose, la formation dtacide lactigue et inhibe Ia synthèse des enzymes du mé- tabolisrne glycolytique. Woerdenbag et coII. (1986) étudlèrent Ia cytotoxLcl-té des lactones d'E.cannabl,num sur un modèle in v*tr.o permettant de tester I'incapaclté des cellules de carcinome humains à se reproduire sur de courtes périodes de culture (4 jours). IIs montrent que la molécule entière est nécessaire pour une efficaclté optimale et gue Ia cytotoxicité est inversernent proportionnelle à l'hydrophilie , entrainant une meilleure pénétraÈion cellulaire. Ce modèle diffère de celui utilisé par I'éguipe de Hladon dont Ie nodèle consistait à tester Ia cytotoxicité des molécules sur des périodes d'incubation de quelgues heures. De plus I'EUPP, à Ia dose de 20 m9/k9, stavère cytostatigue in vivo chez Ia souris pour deux systènes de tumeurs solides transplant,ables: Ie fibrosarcome F1O26 et Ie carcinome intest'inal de Lewis (Woerdenbag et t. , 1987 a, L987 b) . Sutr ces modèIes I'EUPP, à dose cyto- statique en injections intrtveineuse(I.v. ) ou intrapéritonéale(I.P,), 'ù(frhit Ie taux de glutathion dans Ie t,issu hépatique ainsf 4pè {ans le tissu tunoral. En injection r.v. , cê taux est r*pt{lfment restauré contrairement à un injection I.P. La vçl,r l.P. est plus toxique que Ia voie I.V. et la dose de 40 q/*g en I.P. est léthale en moins de 24heures ( I{oerdenbag et coll., 1988). PREP'4RATIONel C,4RACTERISATIO Iv DES FXTNilTS D Eapato rium Canna.b inum L. -53- Avant dtentrependre toute étude pharmacologique, iI a été effectué une étude botanique complérnentaire de Ia systéuratique d'E.cannêbinum L., visant à identifier Ia plante au-moyen dà coupes histologiques. La préparation de I'extrait aqueux choisi pour l'étude pharmacorogique a été standardisée et une identification chinique de ses principaux composés a été effectuée en chromatographie sur couche mince. -54- A COUPES BrSTOI,OGrQUES La détermination systématique de I'espèce E.cannabinum L. été conplètée par une analyse histologigue microscopique permettant de rechercher Ia présence éventuelle de tissus de structures spéciaux. A.1 IilÀTERfEL, VEGETÀL La plante fraîche a été récoltée en juillet 1988 sur les bords de la Seille (Moselle). Tiges, feuilles et racines ont été aussitôt immergées dans de I'alcool à 60' pendant L2 heures. A.2 COI'PES HISTOT,OGTQUES Les coupes transversales sont colorées au moyen de Ia technique en double coloration au carmin azuré et au vert d'iode (Genevès, L9621. Les préparations sont ensuite passées successivement dans de I'alcool à 70", 96' et absolu, puis placées dans une résine type Baume du Canada et recouvertes d'une lamelle. Après sèchage et durcissement de la résine, les préparations peuvent être observées au microscope. Les coupes transversales de tige, feuille et racine sont réunies dans le figure 5. -55- fll. Pa. c. ep. p.tec.u. (x25)f (x78) . sc C. SêC. pa. c. col. p. tec.u. FIc. 5a : C.T. DE TIGE (X200) c. sc. col. 1. Pa.P. Pa.c P. tec. u fll. c-sc . Pl per.dic. fII. êP. Pa.SC. pâ.8. FIG. 5b 3 C.Î. DE FET'ILLE FIG. 5c : C.![. DE RACINE (x 78) (x 78) FIGT'RE 5 : COT'PES:[RÀ!I8\TER8ÀLES (C.T. } DE DIFFEREIMES PÀRTIES DrE.cannabinun L,.; ep: épider:ure; col.: collenchynet a.col.: assise collenchlmateuseipa.c. : parenchlme cortical i Pa.P. : parenchyne palissadique tpa : parenchlme i pâ.8.: parenchyme médullaire ipê. sc. : parenchyme scléreuxi sc. : sclérenchlme; c.sc. : cellules scléreuses; a.su.: assise subéreuse; f11.: faisceau libéro-Iigneux(structures secondaires) ; xy. : xylène; phl.: phloèrne; per.disc.: péricycle discontinu; c.sec.: canal secréteuri 1.: Iimbei n.c.: nervure centrale, p.tec.u.: poils tecteurs unisériés pluricellulaires; f.sc.: fibres de sclérenchyne. -56- B.PREPÀRATTONDE I,' EXTRÀIT AQUEUX D'@ L. Soucieux de respecter le mode d'enploi traditionnel de Ia plante et compte tenu de sa chimie ne comprenant pas de êonstituant,s majeurs non extractibles à I'eau' nous avons entrepris de réâIiser une préparation açlueuse par décoction et maéération et de Ia conserver par lyophylisation. B. 1 PROTOCOITBD'EXTRACTION Le protocole d'extraction choisi pour Ia préparation des lots utilisés au cours de 1'étude pharmacologigue est une décoction-rnacération décrite ci-dessous : 3Og de parties aériennes séchées incluant tiges, feuilles et fléurs lnhyto-fst, Strasbourg; Sanofi, Toulouse) sont mises en contact avec 300mI d'eau distillée bouillante. L'ensemble est porté à ébullition 5à Lo minutes sous réfrigérant à reflux. Cette décoction est suivie d'une macération à l'étuve pendant L2 heures à 44"C. Après filtration, Itextrait aqueux èst lyophilisé et conservé en flacons hermétiques contenant un deËsiccateur, à I'abri de Ia lumière et de I'hurnidité. Le rendement de I'extraction est d'environ l-28 en moyenne- Au moment de I'utilisation, Ie lyophilisat est dissous dans de I'eau distillée ou du NaCI à O,92. Une fabrication I'pilote'r industrielle (885) a été mise en oeuvre par Ie procédé de digestion à 8O'C, filtration, concentration sous vide puis séchage final en tarnbour chauffé à Ia vapeur. Les doses dtextrait aqueux testées au cours des études chromatographique, toxicologique et pharmacologigue sont toutes eiprinées en mg de plante sèche par kg de poids corporel ou par nI de suspension cellulaire. B.2.LOTS UTILISES Ltensernbte de I'étude pharmacologique rtoxicologique et chromatographique a été réalisé avec quatre lots différents,préparés selon Ie protocole décrit précédernrnent: a) 883 E 83 a été préparé au laboratoire selon Ie protocole décrit ci-dessus. Plusieurs extractions ont été réalisées sur un même lot de parties aériennes séchées récoltées industriellernent (Phyto-Est, Strasbourg) en été L982. -57 - Ce lot, de consistance légère, pulvérulente et de couleur brune, a fourni un rendement moyen de L2 + 38. 883 a été utitisé au cours de : I'étude du flux biliaire chez Ie rat I'effet antihépatotoxique chez Ie rat I'effet, diurétigue chronigue I'expérience 1 de 1'étude diurétigue en surcharge hydrigue hypotonique. B, E8l-3 et E8{-{ Ces lots ont été préparés par Ie laboratoire de galénique clin-Midy (Toulouse) avec un même lot de parties aériennes séchées réco1tées en été 1,984( Phyto-Est, Strasbourg). 884-3, d'un rendement de L58 ,était de consistance légère et pulvérulente et de couleur brun clair. 884-4 avait un rendement de 108, un aspect plus dense et une couleur brun foncé. 884-3 a été utilisé pour les études cytotoxique et antihépatotoxigue sur hépatocytes isolés. 884-4 a été utilisé pour : 1'étude antihépatotoxique chez la souris Ie test du radical diphény}-picrylhydrazyl Ie test de cytotoxicité sur hépatocytes isolés en suspension I'expérience 2 de I'étude diurétigue en surcharge hydrique hypotonique I'étude de la toxicité aiguë chez Ia souris. Ces deux lots ont fait 1'objet d'un étude chromatographigue sur couche mince pour Ia caractérisation chimigue de 1'extrait aqueux. c) B8s Le E85 est une fabrication pilote de I'usine c.P.E. (S.P.I.; Chateauneuf , Fr.) à partir d'un lot de 300 kg de plant,es entières séchées, réco1tées en été 1985( Phyto-Est, Strasbourg) . 885 avait un rendement de L2,82, uD aspect noyennement léger et une couleur brune. ce lot a été testé pour sa cytotoxicité ainsi ç[ue pour l'étude de son effet antihépatotoxique in vitro -58- D) 887 Le lot a été préparé à partlr des parties aériennes séchées récoltées en été L987 (PhYto-Est) f,87 avait un rendement de 9 r2|r UII aspect moyennement dense et une couleur brune. E 87 a été utilisé au cours de l'étude chromatographique. -19- C.CARACTERISATION DE L'EXTRÀIT De manière à établir une carte d'identité chirnique de l'extrait aqueux d'E.cannabinum, nous avons délibérément restreint cette étude à 4 composés choisis Pour Ia constance de leur présence dans les parties aériennes de Ia plante et leurs concentrations non négligeables (Drozdz et Bialek- Grygiet, L97L; Bloszyk et, coII., L978; oswiecimska et Sendra, L972; Bogaert et coll. , L9721. La caract,érisation des extraits aqueux 884-3 (solution 1), 884-4 (solution2) et E87 (solution 3) a été réalisée par chrornatographie sur couche mince (C.C.M.) pour les 5 classes chimigues suivantes: Iactones sesquiterpéniques, flavonoides, acides-phénols, acides-alcools et alcaloides. Par ailleurs, uD dosage des ions Na* et K* a été réalisé sur un extrait aqueux (884-4) à 250 mg de plante sèche/nl à I'aide d'un photomètre de flamme. Cette dose est du même ordre de grandeur que celles prescrites dans Ia posologie traditionnelle (2somg/kg de poids corporel). C. l..ltATERIEIr ET !'IETIIODES C. 1. l.PREPARÀTION DE8 EXTRAITS Pour effectuer les CCIIIdes lactones, des flavonoides, des aCides-phénols et des acides-alcools, Ies lyophilisats sont dissous dans de I'eau distillée de telle sorte que L mI de solution corresponde à O,L25g de plante sèche Lactones sesquiterpénlques (Drozdz et coII., L9721 z les solutions L, 2 et 3 ainsi préparées, sont mises en présence d' acétate de Pb à 1,08. Après défécation et centrifugation (SOOxg, 50 mn) relles sont épuisées par le chloroforme. Les extraits chloroformiques sont utilisés pour la CCM. Flavonoï,deg et asLdes-phénols (Nasr, L984) : Ies solutions sont utitisées telles quelles pour la CCM. Àcldes-alcools (Mortier, L9'721 z les solutions aqueuses de Iyophitisats sont additionnées d'HCI f.N jusqu'à pH 1-,5. puis épuisées par un mélange de butanol-acétate d'éthyf (Merck, Dàrmstadt, RFA). L'extrait butanoligue obtenu sera utilisé en ccM. -60- Alealoides | 49 de lyophilisat sont dissous dans 40 mI d'acide sulfurique 2N par agitation nagnétigue pendant t-5 minutes. Après centrifugation à 4ooo tàurs/rnn, r" curot est à nouveau repris de ra nême manière. L,ensembte est amené à pH l-0 avec de lthydroxide dtammonium 4N. Les alcaroides sont extraits après passage 3 fois en ampoure à décanter avec 4onr de chloroforme. Àprès évaporation sous vide jusgurà siccité, L' extrait arcaloidique est dissous dans 2ml de chloroforme (Rolland, com.pers. ) . C.1.2.TDENTIFICÀIION DEs EXTRâITS EN CCU Les CCM sont réalisées sur plaques prêtes à 1'emploi (Kieselgel G60, Merck, Oannstadt, nfal. Tous les solvants utilisés sont fournis par Merck (Darmstadt, RFA). * tactones sesqulterpéniques (Drozdz et col}., L972) z Dépôts z 2oyt de chacun des extraits chloroformigues des solutions L; 2 et 3. 20pI de EUPP (Département de pharmacologie, Académie de Médecine, Poznan, Pologne)à Or18 dans un méIange chloroforne-éthanol LtL v/v Solvant de nigration : chloroforme-acétone 3zLv/v. Révélat,eur : IGInO* l-? en solution aqueuse. * Flavonoi,des et acLôes-phénols (Nasr, L9B4) z Dépôts : 10yI des extraits aqueux L, Z et 3. 10 pI de standards (rutoside, hyperoside, quercétine, âcides caféique et chrorogénique) à o.Lt dans le méthanol. Solvants de nLgration : acétate d'éthyr- rnéthyrcétone-acide formique-eau (5:3:3: 1: L v/vl . Révélateur : réactif de Neu(ester B-aminoéthylique de l'acide borique à 1? dans Ie méthanol; Neu, tôstf. La plaque est pulvérisée puis observée sous U.V. à 365 nn. -6L- r Âciôes-alcools (Mortier, L972) z Dépôts-f : LO yI de chague extrait. Eolvant : toluène-formiate dtéthyle-acide formique 50:40:10 v/v. Révélateur : réactif de Schweppe (n butanol-glucose à 108 dans I'eau - aniline à L0? dans l'éthanol LOz2z2 v/v).La plague est pulvérisée puis chauffée L0 rninutes l-10"C jusqu'à 1'apparition de taches brunes. . alcaloiôes (Wagner et coll., l-984) : Dépots : l-0 et 20 p I des extraits alcaloidiques des lots 883 et E87t L0 pI d'urie solution de gramine (Serva, Heidelberg, RFA) à 18 dans le chloroforme, utilisée comme solution alcaloidigue témoin. Solvant : toluol- acétate d'éthyle- diéthylamine 722:L v/v. Révélateurs : réactif de Draggendorf constitué du mélange de 2 solutions A et B (A : Or85g de sous-nitrate basigue de bismuth dans 50 ml d'acide acétique à 25*i B: 8g d'iodure de potassium dans 20 mI d'eau distillée) filtrée au bout de 24 heures. Cette solution mère est diluée dans de I'acide acétigue à 108 au moment de I'emploi. C.1.3. DOgAcE DU POTASSIUI{ ET DU SODIUU DAlfg L,'EXTRAM AQUEUX DrE.caDnablDum Ir. Les teneurs en K+ et, en Na* d'une solution à 250 mg de plante sèche/ml (884-3) sont dosées à I'aide d'un photonètre de flamne à étalon interne de lithium (II, Italie). Les dosages ont été reproduits 4 fois. C.2.RE8ULTATS ET DISCUSSION C.2. 1. Lactones sesquiterpéniques : Une seule tache jaune pâte de Rf O,23 a été identifiée dans chacun des 3 extraits. Cette tache a la même coloration et le mêmeRf gue Ie standard EUPP. La surface et I'intensité de la coloration de Ia tache obtenue pour I'extrait 3 sont plus importantes. -6?- Ce spot, comparé au standard EUPP, laisse supposer Ia présence de Lo à LShg d'EUPP ce qui correspond à 0.68 au moins dans les parties aériennes séchées dtE.cannabinum. Drozdz et coll. (L972) identifièrent 3 lactones: EUPP, EUP et une lactone alors inconnue et obtenue non cristallisée. Dans notre expérimentation, seule I'EUPP a été identifiée. Cela peut s'expliquer par Ie mode de préparation de nos extraits car Drozdz et coll. utilisèrent les parties aériennes séchées et nous avons réalisé notre C.C.M. à partir d'un extrait aqueux des parties aériennes sèches. Or les lactones sont difficilement solubles dans I'eau. Par ailleurs, l'extrait chloroformigue du lyophilisat correspond à o,25 g/nI de parties aériennes sèches, celui des auteurs à Lg/mL. Enfin , ils employèrent des plaques de silice et de gypse i guant à nous , nous avons choisi des plagues Kieselgel prêtes à I'emploi. Toutes ces raisons expliquent çIu'une seule lactoner êD quan- tité importante dans I'extrait, ait été détectée dans nos conditions expérimentales. C.2.2. Flavonoïdes et acides-phénols : Les résuttats sont consignés dans Ie tableau 8 et à la figure 23. Les standards, rutoside, hyperoside et quercétine, apparaissent en couleur sombre sous U.v. et deviennent fluorescents, jaunes à jaune-orange après pulvérisation du réactif de Neu et observation sous U.V. Les standards, acides caféiques et acides chtorogénigues, présentent une fluorescence bleue intense sous U.V. En raison de la similarité de leur Rf et de leur coloration sous U.V. après pulvérisation du réactif de Neu, les conposés suivants ont été identifiés dans les 3 extraits L' 2 eE 3: rutoside, hyperoside, guercétine, acides caféique et chloro- génique. Outre ces 5 composés, il est à noter Ia présence de 3 taches supplémentaires dans les extraits 2 et 3 : Rf 0144, coloration fluorescente bleue sous U.V., verte sous U.V.après révéIation du réactif de Neu. Rf Or62, colorat,ion fluorescente bleue sous U.V. Rf O,32, coloration fluorescente bleue sous U.v., verte après pulvérisation du réactif de Neu. Si les deux prernières taches (Rf O,44 et 0162) sont à concen- trations très faibles donc sans intérêt pour la carte d'identité chirnique de Ia plante, Ia troisième (Rf 0,32) est irnportante de par sa surface et son intensité de coloration. ceite- ci laisse supposer gu'iI s'agit dtun acide-phénol . -63- !o H H 4 E H B x + H D ct zF o o Êl E oo É+roto o o o+J+JtDtn +Jtltt{uroÉ Ét{t{çÉ t{lrOÉF{A a Fl uoodrd oo rt H (t 0 Él 'rîOO A oo H C) É E 14 a tr E rd .z Ê ao EH OE{ (rÉH.{ ÉQ l{ loo Blo o oaaoa ,oJa)o Fl t{OOgO okoool{ HFT .QFlFl.Qr{ F{.clFlFlF{.q H B Ê.a.4Ê.q .aÉ.q.qaÉ tt{ oo oo aÊl mul mo H â.. H 8; àFl tsl Ell h.illnt eril Êr F:l "51 EIuHl t{\ -ê Of-sfo\t- ôlo\f-f-sfo\ Flx iil|rlCÀCÀtO cr(n|otoo\o\ TID \\\\ \\t\ C'E ooooo oooooo oo|DD (, t{: É It Eo H H EI tr â (, o o E{ o ) :e 1-o tt É ('l Èt .ooÉ brA ôt : oÈt t{ ..1 o.ooo F{ o F{q{Êtt O .c! d .rl .Fl o tr oooPrt +J d .F{ 'O O H oOOOt{ rU É oodgo t{ tr +J .Fl .Fl O g{ +J .( aooa x H hrû.uttq Êl -64- Rf Front 1O cE or99 o,94 g-(D - 12 o,67 C r- (D(D ID t--"\ f----. o r57 - (DOO (D - or39 b O a--, 5 o,32 , U , 12315678 FIGURE 23 s CnROU.ATOcRAl,tltE SUR COUCEE UINCE DEg FIJAVONOIDES ET DES ÀCIDES-PHENOIJS DE 3 EXTRAITS ÀgUEUX D'E.cannabinum L. lLr2r3l REVETJES SOUS U.V. ÀPREs PUT,VERTSATTON DE REACTTFS DE NEU. 1- : EXÎRÀIT AQUEUX 1 2 : EXTRAIT AQUEUX 2 3 : EXTRAIT ÀQUEUX 3 4 : QUERCETINE 5 : ÀCIDE CHLoRoGENIQUE 6 : ACIDE CAFEIQUE 7 : RUTOSIDE 8 : HYPEROSIDE -6r- L' acide chlorogénique, également présent dans Ia plante a été signalé par Wagner et coll.(L984) avec des Rf de 0150 à O,75 après migration dans Ie solvant acétate d'éthyle-acide formique-acide acétique glacial-eau lOO:L1:1-1227 v/v. La tache de Rf 0.62 pourrait correspondre à I'acide chlorogénique. C.2.3. Àcides-alcools : Les résultats sont condensés dans le tableau 9 L'acide malique a été identifié dans les extraits 1, 2 et 3. Ltacide succinique est également présent dans l'extrait 3 et, à un degré moindre, dans ltextrait 2. Mortier (L9721, dans les mêmes conditions, avait identlfié dans E.cannabinun, Ies acides lactique, glycoligue, fumarique, succiniquercitrique et Itacide 0-C[- dihydroxyméthylacryligue. Dans notre cas, seuls les acides malique et succinigue ont été identifiés. Là encore, le procédé d'extraction (en milieu agueux) peut être incriminé et les lyophilisats présentent des concentrations faibles en certains acides-alcools. -66- TAB 9 S CHROITTATOGRÀPEIE sUR COUCITE UTNCE DE8 ACIDES- AITCOOLS DE8 EXÎRÀIT8 A(E8t-3), B(B8t-t' , C(887) D'E.cannabLnum L.3 Rf BT COI,oRâTION ÀCIDEg-ALCO Acide citrigue 0, Lo brun Acide fumarique 0r48 Acide glycolique O,24 Acide lactique o ,4L Acide rnaligue 0r06 Acide succinique Ot44 Extrait I or4L Extrait 2 O,4L O,44 Extrait 3 o,4L o,44 e.2.1 Àlcaloides Le chromatogramme obtenu est représenté à Ia figure 24. Un alcaloide est présent dans ltextrait agueux d'883 et d'887 (Rf OrLl). Une analyse seni-quantitative, par comparaison avec Ie dépôt de grarnine (RfOr2Dl, Iaisse supposer que Itextrait cont,ient 0,25* dtalcaloides. Cette teneur est du même ordre que celle trouvée par Pedersen (1975) : Or3t de Ia matière sèche. Ce dernier avait isolé deux alcaloi.des; ici un seul est apparu en CCM nais sa technique d'extraction était différente de Ia nôtre. -6t- Rf I 0,2 a 0,1 a ^ FTGURE 21 : CHROIIIATOGRâI{I{ESUR COUCHE I,iINCE DE I,A FRâCTION ALCÀLOIDIQUE DE L'EXTRÀIT AQUEUXD'B.cannabi4trm ÀPRES PULVERISATION DE REACTIF DE DRAGGEIIDORF' 1: fraction alcaloidique de Itextrait agueux 883 2z grarnine 18 3 : fraction alcaloidique de Itextrait aqueux 887 -68- C.2.5 Teneur en Long Nat et tr* Les réeultats sont exprimés en milliequivalents par Iitre d'extrait aqueux à 25ô mg/mL, par I de plante sèche puis, pour une doJe posologigue donnée de SOorng/kg de poids éorporelr êD rnitliequivalents par L009 de poidç corpgrel de manière à rendre compte de ltapport en ions Na- et K- d' une adninistration de I'extrait chez I'animal. CONCENTRA![TON Naf K+ nEql/I 65!2,6 Lo, 7to, 3 nEq,/g de ante sèche o 126!0 rOL or43torol- yït/l-oov L2 r97+O r5I 2,L+O,06 D. CONCLUSION Cette étude chimigue succincte de 3 extraits agueux d'E.cannabinurn[ 1 (884-3), 2 (884-4), 3 (887) ], permet de dresser une carte d'identité chinique de la plante . En effet, divers composés ont été retrouvés dans chacun des 3 extraits en proportion constante: Iactone sesquiterpénigue (EUPP), flavônoides (rutoside, hyperoside, quercétine), àciaei-phéno1s (acides caféique et chlorogénique), acide- alcool lacide maligue) et alcaloide (non identifié). La présence dtacide isochlorogénigue a été suspectée-dans les 3 èxtraits . Parmi les acideè-alcools, I'acide succinigue a été identifié dans les extraits 2 et 3. Les dosages de Na+ et K* ont révélé une ç[uanlité faible de ces deux-ions dans une concentration dtextrait éguivalent à une posologie de 50O ng/kg. Les 3 extraits ont été obtenus à partir de plants récoltés sur des tl.eux dlfférents et sur plusieurs années mais Ie pro- tocOle dtextraction reste le mêrne. Nous pouvons conclure à la présence constante , dans I'extrait aqueux d'E.cann?binurn ôbtenu par décoction et macération, des composés chimiques suivants, révélés Par c.C.M.: Lactone sêsqulterpénlque : eupatoriopicrine. Flavonoïdes : rutoside, hypéroside, quercétine. lcid€s-pbénols : acides caféique et chlorogénique. âcl.des-alcools : acide rnalique. Alcaloïde : non identifié. ETUDEPruCOLOGIQUE DE L'FXTRAITAQUEUX f)'Eupato rium Cannabinum L, 69- De manière à confirmer Ia prescription de Ia médecine traditionnelle, recommandant I'usage d'E.cannabinum L. essentiellement pour lutter contre les maladies du foie, Itexpérimentation pharmacologique stest orientée vers ltétude des propriétés cholérétiques puis antihépatotoxigues de Itextrait aqueux. Les propriétés diurétigues de la plante ont ensuite été examinées. Àvant toute étude pharmacologique, iI était indispensable de standardiser 1,élevage et les conditions d'expérimentations des aninaux utilisés puis de s'assurer de 1'absence de toxicité de t'extrait végétal étudié. CONDITIONS D'ELEVAGE BT D'EXPERIIIENTATION DEg AISIIIAUX Ires ratg 3 Des rats nâIes oFA (Iffa-Credo, L'Arbresle, Fr. ) , d'un poids moyen de 250 à 35O g au moment des tests sont répartis au haèard dans des cages standards en macrolon par groupe de l-O dans une animalerie oir Ie cycle nuitrzjour est de LZH/L2H, 1â Iunière s'éteignant à 21 heures pour s'allumer à t heures. La température est maintenue à 2L+L"c. IIs sont nourris et abreuvés ad libiturn. Les cholérèses sont réa1isées entre 9 heures et L7 heures. Les tests d'intoxication sont tous effectués à partir de L4 heures. Les souris 3 Des souris Swiss mâles sont conditionnées pendant 15 jours avant les expérimentations au cycle jourr/nuit L2H/L2H, Ia lumière s,allumant à L heure et s'éteignant à 13 heures. ElIe sont réparties au hasard par groupes de 5 en cages standards en macrolon ou elles ont accès à Ia nourriture et à lteau ad libiturn. La température de l'animalerie est maintenue à 2111'C. Tous les tests sont réalisés au début de Ia phase de nuit (L4 heures). La toxicité est réalisée sur des souris de I'éIevage Janvier (Le Genest, Fr. ) gui avaient 11- semaines au moment du test. Les tests d'induction du sonmeil barbiturigue ont été réalisés avec des souris provenant de Itélevage Césal (MontmédyrFr.) qui avaient I à 9 semaines au moment des tests Les test d'intoxication au ccl, ont été effectués sur des souris provenant de I'éIevage lanvier (Le Genest, Fr.) qui avaient 1-3 à L4 semaines au moment des tests. La composition des croquettes utilisées pour Italimentation des rats et des souris est détailIée au tableau 10. -70- Eau... Matlêres minérales. Matières grasses. Matières azotées (n X tot X 6,25).... Cellulose brute. Extractif non azoté. Matière sèche. Energie cal. ltlétabolisable./kg. IIINERAUX(crammes/kg) Calc ium. 15 Phosphore. 9r5 Potassium. 7 Sodium. 5 Magnésium. 2 OLIGO ELEMENTS M X (Milligrammes/kg) Manganèse. I4o zinc-. . 48 16 Cuivre. l'4 Cobalt. 4 Iode...... :.. 43() Fer... ncfues HqfrlES (Grammes/kg) Arginine. 13' I Lysine. 15 4'5 Méthionine. Cyst ine . 4 Tryp tophane 2,'l GlycolIe. 16,9 fsoleuc ine. ll Leucine. 16,4 1o'4 Phénylalanine.... 9'4 thréonine. lo,4 VaI ine. ç Histidine. I Îy ros ine . INES vI'[AMINiS (MiIIigrammes'/kg) 6,7 B 1... . 4'4 B 2... . 2'9 B 6... o'o2 B 12.. - lO Acide Pantothénique 50 Niacine Biotine. o,5 )l Acide folique.. Vitarnine E..... 30 (),6 Vitamine K..... Acide ascorblque. Choline. ... i...... t300 TABTTEAU 10 ! COI{POSITTON CnTUIQUE DES CRO9UETTE8 U25 POUR RATS ET SOURIS DEs IÀBORâTOIRES EXTRA-LABO (PROVTNS) Etu?etoæirologique - 7L- A ETUDE DE LA IOXfCITE AfGUE DE IJ'EXTRAIT AQUEUX D'E.cannabinum L. CEEZ IrA SOURI8 Avant toute étude pharmacologique, il était, indispensable de stassurer de Itabsence de toxicité de I'extrait aqueux qui allait être testé sur divers modèIes pharmacologiques in vivo et, in vitro. Pour ce faire, le modèIe de la toxicité aiguë chez la souris avec un suivi durant L4 jours de divers para- mètres symptomatologiques a été choisi. 4.1 I.IATERIEL ET UETHODE8 Les animaux utilisés sont des souris Swiss (Janvier, Lê Genest, Fr. ) mâIes et femelles de 11 sernaines, répartis en Iots de 5. L'extrait aqueux d'E.cannabinum testé est Ie lot 514L-4, dissous dans NaCl O,9Z et injecté par voie intra-péritonéale aux doses de 50O et 2000 mg/kg sous un volume de lOmlr/kg. Ies Iots rrplaceborr reçoivent NaCI O,92. Les animaux sont surveillés pendant les 4 premières heures qui suivent I'injection puis tous les jours pendant L4 jours. La symptonatologie étudiée comporte les paramètres suivants : *comportement: activité, démarche, convulsions, trenblements. *aspect extérieur : état nutritionnel, fourrure, peau' yeux, oreilles, dents, muçtrueuses. *fonctions : respiration, digestion, selles, urines, système cardio-vasculaire. *mortalité. *poids. A.2 REgUIJTeTg ET DISCUSSION Les souris nrâIes (3 sur 5) et femelles (5 sur 5) ayant reçu I'extrait aqueux à 2000 mg/kg présentent, pendant les 4 premières hèures, des flancs rentrés et une activité réduite. Leurs urines sont plus colorées que celles des t,émoins. -72- ou .oooo .oo h{, u t{'O o +J()Ulc) +JOOO ÉÉoh ÉÉ0rt{ O O-{ 5 O OF{ 5 N l{$i O l{rt{ o D +Jt +lg Êl ooÉ ooÉ D OOtdo OOtuo ol É É'tto É Édo A Ct.rl ÉH d..{ Él| -{ H q}O -{ k 0}O H rH t pr-l ${ 5 Qd H â tJ) F. çll -l H r lil X F{ Fl r{OlN r(V) 14 +l cî +r +l +l rl $+l trt(\\o .+l t.o \\t OFI C\t F{ ôl Ën sfsf@ (fr('|(') ('l g8Hg rli 4 HÉ \o r- F{ lO Cî Or{f' Ën ôl rt (v) +t+lo H6 +r +l +l lO f- g^ sr\o@ \\+l \t c\t o\ o o\O1" (') (\ C1 Ëi (flsfc') -O =E Ë: Hj (')f-@ oo\o \\ F{ Bgt F{NCî O c'r +t +l +l +t +l +l e.:l sf\o\0 ôtNCO Hnl \\ \\\ :rl ocotft GI CÀ T. o:t ('t ôt nl .-. I! (')('lc') -Hl Eql e3l rorolrl tr)|ftrr Ëo I Ur ut tt' X tnx D x\ X\ o \U' \ln UrÉ tnÊ z F É o o o H oo oo H oo oo p n îil É n(\l o E 'âlEI 'ËlEI â(, ..{lflEl 'Fll nt .al !l F{ dl tûl - o. El Él Gl D FI FI  îF{ f,fl.l .l E É À Ffl f'fl :|;l gl o  o Er o o o É (ttt o = h 73- Le suivi du poids est présenté au tableau l-l- : une prise de poids régutière est observée durant les L4 jours de I'expérience dans tous les lots mâIes et femelles (placebo, extrait agueux 500 eE 2000 mgrzkg) . Aucune mortalité n'a été enregistrée. Outre Ie phénomène tenporaire et localisé au niveau péritonéal observé chez la najorité des animaux ayant reçu I'extrait à 20OO mg/kg, aucune nodification des autres para- mètres n'a été constatée. L'extrait aqueux dtE.cannabinum ne présente donc pas de toxicité particulière et de mortalité jusgu'à la dose de 2000 nrg/kg. À.3.Dr8CU88rON ET CONCLUSTON Le nodèIe d'etude de la toxicité aiguë chez la souris a perrnis de ne constater aucune toxicité de I'extrait açlueux d'E.cannabinum jusgu'à Ia dose de 2000 mg/kg. Lt étude a été menée égalernent avec les lots 884-3 et 885 gui n'ont montré aucune toxicité jusqu'à LO g/kg si ce n'est une démarche imprécise et une fermeture des paupières chez les souris tràitées à Lo g/kq pendant 2 jours (Arvis, conmunication personnelle) . Propriétéd c/ao lérétiq uer A'8. ca.nnabinumL. I -74- 8.1.Àl[ÀIrTgE BIBLIOGRAPHIQUE (BOYER, 1980, 1983t ERITINGER 1982a' 1982bt CORBIC, 1986t OKOLICSAIIYIT 1986) La recherche d'une hypercholérèse provoquée par l'administration de 1'extrait aqueux d'E.cannabinum constitue la première étape dans Itétude pharmacologique de cette plante à tropl-sme hépatorénal La bile, formée dans les hépatocytes, est déversée dans les canalicules biliaires formés par Ia membrane plasmigue canaliculaire des hépatocytes. EIIe est collectée ensuite dans un réseau de canaux biliaires où elle subit des modifications : en effet, Ies cellules épithéfiales de ces canaux secrètent et réabsorbent des substances organigues. La bile est enfin déversée dans le cholédoque, où elle est Ia résultante de deux flux (FIG.2s) : * Ie flux hépatocytaire constitué d'une fraction acides bitiaires dépendante (FABD) et d'une fraction acides biliaires indépendante (FABI). * Ie flux extra hépatocytaire, formé au niveau des canaux biliaires. E](T9A H5 PATOCYTAIRE FLI-t:< F LU:( !_Elèl!c'1_Ir$E I{IPI,TOCYTA ] R,E 'c ,..: c i,ies i- I i_:es acices bil iaire,-; i nr:épen,l,tn t-s dénend,:nts SCHEUA DES DIFFERENTE8 FRACTIONS CONSTIIIUANT Lâ BIIrE -75- Ainsi Ia bile est formée de 3 fractions : 8.1.1 I.,E FLUX ACIDES BII,IAIRES DEPET{DAIrI (TÀBD' Il représente 30 à 60 I du flux biliaire total. Les acides biliaires, synthétisés dans le foie à partir du chotestéroI, sont excrétés dans Ia bile, conjugués à Ia taurine et la glycine. Au niveau hépatocytaire, ils régulent Ie rnétabolisme fipidique et assurent Ie transport des lipides dans Ia bile. II est ainsi admis gue leur secrétion hépatique est le facteur déterminant dans la formation de Ia bile (Erlinger, 1_e82b). Déversés ensuite dans les intestins, ils assument des fonctions de solubilisation en particulier des tipides ainsi que des fonctions de transport et de régulation grâce à leur propriété érnulsionnante.Réabsorbés à ce niveau, ils regagnent ensuite Ie systèrne porte. Leur biosynthèse est régulée par homéostasie (Danielsson et Sjovall, )-975).Le recyclage constitue la circulation entérohépatique. Un récepteur spécifique des acides biliaires a été mis en évidence à Ia partie externe de Ia membrane plasmique des hépatocytes (Càrey, Lg82i Von Dippe, L986). Cette translocation est, sous ]a Çépendance d'un transport couplé à la ponpe à sodium \ta+-x+-ÀTPase dépendante. êette pompe, excrétant les ions N?*, crée un gradiènt éIectrochimigue- favorisant l'entrée des Na+ couplés aux acides biliaires (Erlinger, L982b) - Les acides biliaires, couplés à la lécithine et au cholestérol, forment des vésicules gui, transformées en micelles, migrent vers la membrane canaliculaire, par l'intermédiaire du complexe de Golgi (Carey, L9821. L'excrétion des acides biliaires et, Ie gradient osmotique ainsi formé, crée une force osmotique favorisant Ie passage de I'eau et des électrolytes au travers de Ia membrane canaliculaire : c'est Ie FABD. Lradministration de certains sels biliaires exogènes augrmentent Ie FABD : acides cholique, déhydrocholique, déoxycholique, ursocholigue et ursodéoxycholique. Les formes non conjuguées de ces acides biliaires sont plus cholérétiques que les formes conjuguées. La figure 25 schématise Ia forrnation hépatocytaire de Ia bile. II existe une relation Iinéaire entre flux biliaire et acides biliaires chez tous les Vertébrés (Boyer et Bloorner, L9741. - 76-- Plasma I ./& I Bile acid Na. r")={:;: ââ Pla3ma tr'IGURE 25 : REPRESENTATION GRAPHIQUE DE IJÀ FORITTATION EEPATOCyTÀIRE DE LA BILE (Okolicsanyi gt c.g.u., 1986) un g-radient La pompe à sodium Na+-K+-ATPase (A) -en créant EieJtià?ttinique,- i..ràrise r;àttted â'iott= r'la+1n1couplés aux acides bitiaire's, secrétés dans Ia lumière du canalicule(c) après transport au travers de Ia cellule. Les bicarbonates jàuent un rôIe irnportant dans Ia fonnation du FÀBI (D) . f,= flux extrahépatocytaire. -77 - Le dosage des acides biliaires dans Ia bile renseigne sur Itorigine de I'hypercholérèse: une augmentation du flux bitiaire corréIée à une augrmentation des acides biliaires révèIe une stimulation du FABD. 8.1.2. LE FLUX ACIDE8 BILIAIRE8 INDEPENDÀI{Î (FABI) (Corbic' le86) It représente 30 à 608 du flux biliaire total. L'origine de ce flux leste encore hypothétigue. Le rôle de Ia pornpe à sodium, située probablement sur Ia mernbrane sinusoidale et intercellulaire, Dê suffit pas actuellement à expliguer 1'origine du FABI. It a été dénontré que Ie transport des bicarbonates au travers de Ia mernbrane canaliculaire pourrait jouer un rôle important dans Ie FABI (Mathisen et Raeder,1983). Le FABI, stimulé par certains acides biliaires conme les acides ursodéoxycholigue, 7-céto-Iithocholique et nor-chénodéoxycholique est corréIé à une augrmentation des bicarbonates dans Ia bile. Certains anions organiques tels que les salycilates mais aussi Ies acides aminés ou des substances conjuguées aux anions (Graff, L983) peuvent être aussi responsables d'une stinulation du FABI : du fait de la lirnitation de leur passage à travers les jonctions intercellulaires, ils pourraient avoir un pouvoir osmotique Enfin Ithypothèse d'une action directe des acides biliaires, secrétés sôus forme anionigue et capables d' aug'menter Ie débit d'eau par un mécanisne osmotiÇtrUê, est actuellement envisagée. Ce rnécânisme, étudié dans Ie cas des nor-acides biliaires, très cholérétiques ct:rez les rongeurs (Kirkpatrik et coll., 1988) et appelé rrchole-hepatic shuntrr s'expliguerait ainsi (Palmer et côff . in Corbic, 1"986) : après avoir pris un proton à I'acide carbonique (Iibérant un anion bicarbonate), It acide biliaire serait iéabsorbé par les voies biliaires du fait d'un gradient de concentration entre les voies biliaires et les plexus sanguins adjacents; il y aurait transfert du pouvoir osnotique de l'acide biliaire au bicarbonate et I'acide biliaire n'apparait pas dans Ia bilei Ie retour de I'acide biliaire à I'hêpatocyte expliquerait son pouvoir cholérétique élevé du fait du grand nombre de cycles ainsi possibles. La figure 26 schématise Ia fornation du FABI. L'analyse de la relation linéaire entre flux (x) et acides biliaiies (V) montre que I'extrapolation de la ligne de régression àu O de l'âbscisse, intercepte I'ordonnée positive: crèst te FABI (Erlinger, 1982). I1 a été suggéré une relation curvilinéaire à faibte concentration en acides biliaires (Blitzer et Boyer, L9821. -78- Song ( Espoce de Drsse ) Voieporocellulorre K'l Not N'o" CO2+ l1t6^H'+HCOs-, \/ Joncfronserree No* No'Anions oulrescof ions (onrons ) FIG 26 3 REPRESENTATION DES I'TECÀNISUES (CONNUS OU EYPOTIIETIQITES) DE TRÀI{SPORT D'IONS I!,IPLIQUES DA!{S Ir'EIÀBORATION DE I,A FRACTION INDEPENDÀITTE DES ACIDES BII,IAIRES DE I,A SECRETTON Brr,rArRE (CORBTC, 1986) ces ions doivent établir (direct,ement ou non) un gradient osmotique capable d'entraîner la sécrétion dreau des sinusoides vers les canalicules. Le qradient ôe soôium transmembranaire dû à lractivité de Ia Na*-r*IarPase maintient le potent'iel ôe menbrane et sert de source drénergie à des Çransports secondairement actifs tels que 1réchange Na?7tt- ou Ie co- transport de sodiurn et de certains ions. Des anions commele bicarbonate ou certains ions organlgues pourraient être secrétés dans Ia bile par diffusion le long drun gradient électrochinique. La voie paracellulaire est partiellenent perméable aux électrolytes (davantage aux cations qu'aux anions) et permet Ie passage d,ions qui diffusent Ie long drun gradient éIectrochinique ou qui accompagnent un mouvement dreau (appelé, en anglais, rrsolvant dragtr). B.1.3 LE FIJUX EXTRAIIEPATOCYTAIRE Il représente environ 30* du flux biliaire tot,al. Eau et solutés peuvent circuler dans les espaces int,ercellulaires vers Ies canaliculesr êD traversant les complexes de jonction (Blitzer et Boyer, L982; Boyer, 1983). -79- Ces mécanismes d'excrétion et de sécrétion au niveau des canaux biliaires sont réguIés par des hormones : secrétine et gastrine stimulent la sécrétion en particulier des bicarbonates et d'eau (Boyer et Bloomer, L974; Barnhart et Combes' l97ar. La somàtostatine agit inversement en diminuant I'excrétion des bicarbonates (Lewis et, coll., L982; Ricci et Fevery, 1-981i René et coII., 1983). La clairance biliaire à l'érythritol permet d'estimer 1'origine du flux biliaire: en effet, une augrmentation conjointe du flux biliaire et de Ia clairance indique que I'augrmentation du flux biliaire est dtorigine hépatocytaire. Inversement, si la clairance n'augrmente Pês, I'hypercholérèse fait intervenir des mécanismes extrahépatocyta j-res. _ Nous avons donc recherché, dans un premier tenps, l'action cholérétigue d'E.cannabinum . La cholérèse a été étudiée par la technique du cathétérisme du canal cholédogue chez le rat. Une étude dose/effet et effeL/temps a été entreprise. Dans un deuxièrne temps, nous avons cherché à préciser le site draction de I'extrait aqueux d'E.cannabinum sur Ia formation de Ia bile. Pour ce faire nous avons dosé les acides biliaires dans la bile par réaction enzlrmatiç[ue, de façon à apporter des précisions guant à l'origine de ce flux biliaire stimulé (FABD ou FÀBI).Puis.]a technique de Ia mesure de la clairance à I'érythritol rac a été utilisée pour déterminer I'origine hépatocytaire ou extrahépatocytaire du flux biliaire. Propriétét cho [érétQ rcd A'8. cannabirutmL. I 8;2. INFI,I'ENCE D,@!!num I,. snR LE Frrltx BrrJrÀrRE""llfl -80- 8.2 IIIFLUENCB DB LTEXTRAIT A9UEUX DrE-@ L. gUR IrE FLITX BIIJIAIRE CHBZ I,E RAT La détermination de la cholérèse, par cathétérisme du canal cholédoque chez le rat anesthésié, est, une technigue couramment utilisée mais elle nécessite un contrôle rigoureux de certains paramètres pour obtenir une bonne reproductibilité. * Ira température : EIIe rnodifie Ie volume de bile excrétée (Bar ' L962). Entre 32 et 40'C, Ies variations sont réversibles nais au-deIà, il apparait des attérations irréversibles (Brauer et coll, L954). De plus, 1'anesthésie au pentobarbital induit une hypothermie. L'animal est donc réchauffé (Iarnpe LOO W, table chauffante) et des sondes thermiques rectales et abdominales permettent de naintenir Ia tenpérature à 38 t 0r5"C. * Lrl.nterruptl.on de la circulation entérohépathi$re 3 Le cathétérisme du canal cholédogue induit une baisse de la teneur en acides biliaires circulants. Pour compenser cette perte, une solution de taurocholate de sodiun dans NaCI O.9* ést perfusée par voie I.v. à o,2 à 7,5 IVrnôIes/min/Loog, yL/nin (corbic et co1l., Lg82l. * Le flux bilialre basal 3 Avant toute administration de produit à tester, Ie flux biliaire basal est déterminé sur 3O minutes, Ie rat étant son propre témoin. Sur 85 rats mâIes Sprague Dawley de 25O à 48o g, Ie flux biliaire moyen est de 7,7 t L,L2 ng/min/ L009. 8.2. 1.!{.ATERIEL ET UETHODE Des rats rnâIes Sprague Dawley (If fa credo, L'Arbresle, Fr. ) , pesant 3o0g à 4OO g, nourris ad libiturn avec une alinentation standard (Extralabo, Provins, FE. ) , sont rnis à jeun 18 heures avant I'expérimentation. IIs sont anesthésiés par injection intrapéritonéale de pentobarbital (Nembutal, Abbot) à la dose de 60 mg/kg de poids corporel et reçoivent si nécessaire L/3 de cette dose en cours d'expérience. La ternpérature abdominale, maintenue à 38 t o,5"C grâce à des tables dtopération chauffantes, est contrôlée par une sonde thermique (Technoderm, Forbach, Fr. ) . -81 - Le rat , placé en décubitus dorsal, est t,rachéotornisé avec un cathéter noZ (Biotrol, Paris) et une veine jugrulaire est cathétérisée (n" t ) . Après laparotonie médiane, le canal cholédogue est cathétérisé (no L). Une solution de taurocholate de sodirin (Signa) est perfusé par Ia veine jugulaire, à débit constant (O.2 môLe/mn/1-0og)dans NaCI O,9Zî 7 -5 l/nn).à I'aide drune pompe à perfusion (Microperpex' LKB). La bile, recueillie toutes les 1"0 minutes dans des tubes de 0r4 mI, préalablement pesés, est nesurée par gravirnétrie- Après obtention d'un flux biliaire régulier pendant 30 minutes, 5 lots de 5 rats reçoivent un ext,rait aqueux d'E.cannabinum à 62,5, L25, 25O, 500' L000 mg/Rg. Un lot de référence de 6 rats reçoit l-0 nglkg de déhydrocholate de sodium (D.H.C.: Dycholiurn, Théraplix S.A- ' Paris). Un lot rrplacebort de 9 rats reçoit du NaCI O,92. Toutes les injections sont effectuées par Ia veine jugulaire à 0.3 n1/100 g. B.2.2.8TAÎIgTrgUEg Toutes les 3O minutes après ltinjection de l'extrait aqueux, de DHC ou de NaCI OrgZ, lâ variation du flux biliaire basal (Z FB), pour chague animal, est calculée comme suit: - (FB FB5.=61),/ FB basal Les résultats sont aussi exprimés en pourcentages de flux biliaire cumulés, pour les lots E.cannabinum et DHC, et corrigés par rapport au 1ot rrplaceborr. Les Z FB pour chaque animal et par pêriodes de 30 minutes, sont soustraits de la moyenne du *FB du groupe placebo puis cumulés par périodes de 3O rninutes. Les différences des valeurs moyennes' sur 30 ninutes, entre les flux bitiaires de base et les flux biliaires après administration des produits testés, sont comparés aux rrtrr différences moyennes du lot rrplacebott par le test de rrFrr Student, après analyse de variance par Ie test de Snedecor. 8.2 .3 . REBULIIIT8 L'effet d'une injection unique de I'extrait açlueux drE.cannabinum eàt montrée sur les figures 27 et 28 ainsi qutaux tableaux L2, 13 et 1,4. -82- B.calnatrl.nun 2so tf/kg 0 I 7 11 10 br I o C' Gl I É tÉ â o E.cannabinum 1000 mg/kg t{ .r{ rt .r{ I Fl .r{ I  x 7 â F{ lt{ 0 I +l 00 tz0 mrr DEc Lo mg/Rg 12 10 - l-- --T:{-- --1.- +0 t20 mn lnjection FIGURE 27 3 COITRBES TYPIQITEE DE VÀRIÀTION DU FITIIX BILIÀIRE OB.IIENUES CHEZ I,E RAT APRES ÀDIIINISTRATION DE DEC Elr D',rcg!!@ r,- _93- .r ** +* cî *lOF{ \OOit@@F{ 'l' dP +l +l +l +l +l r' +l * *+ (, |rlOF{sfîîcî .r* i H -I(V)nmNCl C' ôto(\c\c! r{ o |flFIO A .r ooo *+ C'rt ** ooo z rÛ\oo{.CÀôl r{F{F{o\N VI VI VI o +l OÈ9{ o +t+l+l+læ+l cî \O O Ol \f oil +, lrtcoo\oNt') o n ôtôrNNC\l (, *** tr A *.r* ;J ct E *.r+('l CÀF{I.@mf' +) o b oil sf (') cî ôl UI rt x +l o +t+l+l+ln+l +J b @sf@o * ** .rtr)@c{to Fl F- c{ (\ (\ ôl * É +l .1. b (\ +t +l +l +l .r+* o x rQn('|(h {. FI sf\\ .{ Ê ttr (') Cî ('l (\ lYl |f|rlO F. C' E *lll ooo d FI C) *.r*  FI {.*** ooo *\o+sf@ Él Or@t\ VI VI VI É \(\\sl- cî Cî P{ 9{ g{ 8* +t +l +l +l E{o o Oo\+l f'r{ Zr o \\\o Oo C) Cl1Orr{@ (, çl r{F{\Oll F{ ** -+, DC' F{ *.r** .{ rt É .r*** z F{F{*f. +J Él tti \\Cor(t\ a ÊH ra (YtF{rO o o F{O +J 8E Ur o +t +l +l AO E ul coor+l o+l ÉEl Cî ' r{ r{ ûa tU $\OF{ôl o É\ EI r{r{*O.t.r** rd .r*** .cl ÉFl .:l .t3*orlo* cil nl (\ to -Al itl or x 2 F:I sf sf a Él o sfm(') r{ 9âl |n tr) +r +r +l +l q{ H ÉII N co@mo+l 3l (ft a É51 Fi F{6\f'F{ tU É ?Jl r{t{FlF{tfl X .|.* +J É;l D + .1. .1. H Êl .r*.r*or o EO D (\\oorôl P{ cl o| \\\\ôl P{ x 14 ul ('tôlNN rd dPD N +l I{ FI E{ Fl +t +l +l +l \o ZD tnf-NGl l{ Êr ol H r- tu  â rlôsfOl 9{ H F{ -H xE{ o HH H É14 r{ C\l .F{ Ê. Êa sr(\o +J XH ul \\\\Qn (t HX (\('r1o o H N o+l+l q4 ro +l+l+llJl-t .r{ Eâ f-F{@ti É \t-OtO Ê Hz| F{ f' l' F{ Fl ttt Éo lllll HH tn ÉE{ H( @\o('l +J trsl o r{O Ê Él gt Or{ttôt o x!0 FI Ft Fl É tr tl (, +l +l +l +l +l o Érr oc'r ('\or0o\ u KH É \\\t E - 9. GrNtrt\o\o .. Él llll +J .{: o ('l Gl x +J dP It (t D g +J A H o H É H rl H z gl É .( É o H É o .{ È o q É E{ H 33 o gl H É aae .oH û oo q{ x tr XooctNul q{ D . tral|oodGl Ê o É È. z it+++++ o -85- E{ H ."{ r{ o É E o * El tn (\I * p x * *.r 2 +lr * H b sr* T É Flo o o t- oo o EI çl \f UI cl oo d oit VIVI É O. O. p tn !0 (Y) * !0 +lr H o rl É o D o r{. i, . d !+ Fl oo É \o +J tr û z Ël b o o oo ra Fl +J HÉ E{É b +l * .{A É C\t .l o H3 o r* É o o o .{ E{ UI c- t{ Él5l .lJ >3 .r{l É E .ol (Yl o \I o êDo gl 6 Éil +t { 5 2q itl sf.l (t Htr 'll o \{ ).D ul æ +J OH Fll (\| @ l{ EÉ o .{ 9'r 6> À \o P{ H td UX x r- t{ dtr D oil ÉrÉ H I H 2 D +lr (d HFI ol sf P{ (, Êa A ul N F{ o Êo t+ DA E{ F{ o OF| H AÉ É cî +) z H ((t Él Êa X o o  H \f .r{ HA (H T +l HO ul ci| É ÊiH Ur AO N o XH ro ôl o I Eâ +J Flo o É sl c) tr o H Êl É d laC' o H ÊrÉ a lr Otf tt H HAz| n ÉE +, ÉH o x oOo .É{ D crÈur +J É d C' 20 +, Or{Êl UI : Htr ÉtE{O o Ç ÂÉ o Fl HOH o qie.É É tr .CAD o  >ÉE t{ H É9 .o Ê frl O ll{ n aÉ ${ É r{E{ E{ dPAH o -86- rl qtÉ gl Êr É H É H È H gl x D É Fl p ê n o H H É H Ê É E a - -:-:ilJ dP o\,- l]***.-- '''--oâ 's \r.- _\_+_+_;__r>a \ \ \a____È_f-___x*j ,[Et{Pg ( }trNurEs ) DE FIGURE 28 3 FLUX BII,IÀIRE CHEZ I,E RÀT EXPRII{E EN I'IOYE}INE PÀRRAPPoRTtrUFLUXBASAIJETPoURCEAQUEI,oT 62,5 mg/kg : --F L25 mg/kg : +-t 25o ng/kg : - 500 ngrlkg : -- LOoo ng/kg :*-* DHC 10 mg/kg !o-c Placebo : -*+ -B?,- Le DHC 10 mglkg induit une forte mais fugace hypercholérèse durant les iO prernières minutes. ElIe dirninue rapidement pour atteindre une èholérèse non significative par rapport au groupe ffplacebort, au bout de 9O minutes (tableau L2 et figure 281 . Le lot rplaceborr présente une baisse discrète mais régulière de la sécréiion nitiâire durant toute I'expérinentation, Pour atteindre -72 à l-50 minutes (tableau 13). Le flux biliaire est augrnenté de manière significative après une injection de ltextrait agueux dtE.cannabinum à L25, 25O, 50O et L000 mg/kg. II atteint un maximum 6O rninutes après (1-98) à 25O mg/kg et lrhypercholérèse persiste 150 ninutes. A 62,5 mg/kg par contre, Ia èholérèse dirninue progressivement tout au long de l'expérience. La figure 29 et le tableau L4 représente les pourcentages moyens cumulés sur 15o rninutes du flux biliaire corrigé par rapport au lot rrplaceborr. Ce pourcentage permet d'estimer plus distinctement Itactivité différentes dosés testées. L'effet maxinal est obtenu"noierètique-aul avàc I'extrait aqueux à 25O mg/kg (+ 872) puis, Pat ordre décroissant, 500 rngrzkg F74zr, L0o0 mlg/kg (+472' ' DHc (+47*) et L25 mg/Rg (+38?) . La dose de 62,5 mg/kg est inefficace(-218) . B 2. I AIIALY8E DEg RE8ULTAT8 Nous avons entrepris une étude des relations effeE/temps et effet/doses des iropriétés cholérétiques de l'extrait aqueux d'E . cannabinum. t Relatl.on effet / tenps Nous avons démontré Ithypercholérèse persistante sur 1-50 ninutes d,une injection- â'extrait aç[ueux dtE.cannabinum c.}rez ie rat (BB t d'aûgrrnentation du flux 1-50ninutes après injection de 250 ngrzkg). Le produit de référence, Ie DHC, qui est un sel biliaire, entiaîne, guant à lui, une stimulation de 47t à fO ng/kg. II est intéressant de remarçluer ' commeYamahara e'E coll. (1983, L985b) cornparant te pttC 10 nglkg à différents extraits .i'egetàux choiérétiques que les extraits agissent de manière rnoàérée mais persistante dans le ternps alors que Ie DHC pro- voque une hypercholérèse forte mais fugace. t Relation ef fet ,/ dose ( f igure 291 -88- *** É É o É tr F É H É *IFJF H rl H tr tt tF*+ px *tF É Fl D A Êl É D pE C' z o H H É H 125 250 1000 10 É É F E.cannabinum DHC A dp DosBs mg/kg FIGURE 29 : FLUX BIIIAIRE CITEZ LE RÀT EXPRIITE EN t DE VARIA:IION CInIUI,ES sUR 150 IIIITUBII ET CORRIGES PâR RAPPORT AU LOI ItPLÀeBBO?r lDnËg ADI{INISTRÀTION D'E.cannabinum Différences statistiquement significatives par rapport au Iot trplaceborr : lF p<0, 05 * * pso, 01 ** *PSo'001- -89- It existe une corrélation entre Ia concentration de 1'extrait aqueux et Ie pourcentage de variation cumulé du flux biliaire cohparé au lot rrplaceborr : 25O mg/kg de plante sèche constitue Ia concentration Ia plus efficace. De part et d'autre (125 et 5OO urgrlkg) le pouvoir cholérétigue persiste mais avec une plus faible intensité. De surcroit, lorsque lton dirninue Ia dose (6215 !!lg/kgl, oD diminue 1'activite cholérétigue. Par contre, iorsque-Ir6n augmente la dose, 1'effet persiste mais de manière moindre (1000 n/kgl. Propriétéa c la o lérét iq uea AE. cannabinumL. I L" SIIR LÀ 8.3 RECEERCEEDU SITE D'ACTIoN D'Egç.anngD.inum FOR}IATION DE I,À BII,E -90- 8.3.1 INFI,UBNCE DE IJ,EXTRAIT AQUEUX DTE.CANNAbiNUN 1.,. 8UR LE IIAUX D'ACIDES BILfAIRB8 DÀNg LA BILE 8.3.1.1 IiiATERIEI, ET I{ETEODES Le protocole expérimental utilisé est- le même que celui précé- demrnent décrit pour I'étude de la cholérèse. Les acides biliaires sont dosés dans Ia bile' PréIevée par période de 1O minutes, 30 rninutes avant et 6O minutes après iradroinistration des produits testés: un groupe de 5 rats reçoit t'extrait agueux d'E.cannabinum 500 mg/kg et un groupe ttplaceborr de 3 rats reçoit NaCl O,92. Le dosage est effectué par Ia néthode enzlrmatigue.utilisant Ia 3- -déshydrogènase décrite par Berthelot et coll (L97O) et rnodifiée par Corbic et coll. (L982). Le principe repose sur une déshydrogénation de I'hydroxyde 3-(' des acide3 Uifiaires par la 3{(-deshydrogènase en présence de NAD+. Le NÀD libére eét mesuré par spectrophotométrie à 340 nm' ôn-q,t"tttifie les acides biliairés à 1'exception des-acides biliaires 3-0(conjugués qui ne représentent que 58 des acides biliaires totaux (Samuel et Eik-Nes, L968). Les réactifs sont-utilisés dans Ia séquence suivante : * L00 rrl de 3-O(déshydrogènase L.2 Unité/ml (Worthington giàcnehicat Corporation H.,1., USA) dans un tampon Tris O'03 M et HCI O,O3 M' PH 7,2. * Loo lr"I d'hydrazine L M (Merck, Darmstadt, Àlf ')' I * 5o;rl de NAD 4.9 ml't (Merck) . * e OOJII de pyrophosphate de sodiurn Or L M (Merck) . de taurocholate de sodium * 2 til (Microcaps Drummond) de bite ou (siûma) . Le rrblanc dosagerr est réalisé avec 900 I de pyroPhosPhate de sodium et Z;rf de bile. 30 à 45 minutes aPrès, or lit Ia D.O. dans les microcuves de L rnl (Ratiolab) à 340 nn et à 25'C avec un spectrophotomètre double faisceau (Uvikon 81O, Kontron). Le pyrophosphate inactive les enzymes présents dans la bile et naintient Ie pH entre 9r1 et 10'3 car' en mileu plus acide, la réaction est réversible. Une gammed'étalonnage est établie à partir d'une solution de taurôcholate de sodium à 10, 2O, 30 et 40 nM. -9I- 8.3.1.2 STATTSTIQUES Les moyennes du flux biliaire et des concentrations en acides biliaires sont exprimées par périodes de 30 minutes. La régression linéaire, par ajustement au modèle y=ax+b est analysée par le test rrFn de Snedecor. 8.3.1.3 RESI'LTATs Lrinfluence d,E.cannabinum sur le flux biliaire et Ia sécrétion dtacides biliaires est présentée au tableau 15 et à la figure 30. Bien que le flux biliaire (V) augmente en parallèIe avec Ia concentration en acides biliaires (x) (respectivement 1-98 et 88), la relation linéaire Y= 3,6 x+ 7,8 n'est pas significative. Dans Ie groupe trplaceborf , Ia baisse significative, durant les 3O premiéres-rninttes, est due à I'interruption de Ia perfusion de taurocholate de sodium pendant I'injection de NaCl O,92. Dans le groupe traité par E.cannabinum, cette baisse est compensée par Itaugrmentation du flux biliaire (effet eho- ferétique)] de plué la secrétion d'acides biliaires est aussi augrmentée (envilon 1O*) mais pas de façon significative- 8.3. 1.1 ACIDE8 BIIrIÀfREg 11 y a absence de corrélation entre Ie flux biliaire et le taux d'aèides biliaires dans la bile. CommeI'origine du flux biliaire stimulé par E.cannabinum est hépatocytaire, I'extrait doit stimuler Ie FABI. Dans la littérature, le flux biliaire basal chez Ie rat est compris entre 3 et t-5 rng/nn/L}Og (Erlinger, 1982). Au cours de 1'éLude des propriétés cholérétiques menées sur 785 rats mâles Sprague Dawley de 250 à 480 g, Ie flux biliaire moyen est de 7,7 t L,Lz mg/min/IOOg. L'extrapolation tinéaire de Ia relat,ion flux/acides biliaires à lrordonnée indique I'existence d'une secrétion hépatocytairg en Itabsence d,une excrétion dtacides biliaires. Le flux biliaire est maintenu mêne si Ie taux d'acides bitiaires est extrêmement diminué (Erlinger, 19821. -92- x tr &l D ol 14 Fl E{ É H + E b ** H x I rod x b oo Êl Ê oo ê C' \O l- f. C. o ${st \1\oo VI VI z u'l \\\ ôl P{ çL o (\ H ooo Oll Fl o\oo E{ ln F{ (\ Fl  FI +l +r +l +1 +t +l É Fil \0 o\ oil @o\F- +r +r +l sf Ct sf \t\ FI(y)ôl H \ \o(.tc! @Of- 3 o (vl (rl (\it H âl C-@æ cî cr ôt +J z Él H Fll +J T itl o a ul o É +J Fil a o Él rl Ê .* tn ** C' o a FI c É É I ^oG b 'à-lat E H É H  6 H Ê trH x p .nÂTl É 4 Fl o RAT2 *nrr5 + nAT3 2 oBAT4 o -rta-atl 2OO 4OO 600 ÀCIDES BIIJIAIRES nnôles/m\/LOOg FIGI,RE 30 3 REIÀTION ENTRE LE FI,UX BILIÀIRE ET I,ES ACIDES BII,TÀTRES ÀPRES ÀDUINISTRÀTION D'E.CANNAbiNUTN -94- Le FÀBI calculé (6,4 mg/kg/Logl, gui représente 74* du FAB totat, est supérieur à celui rencontré dans Ia littérature (environ 60* èhez les lagomorphes et les rongeurs) (Klaasen et Watkin I Lg84).Ceci suggère gue Ie FABI puisse être stimulé. Dans les mêmes conditions expérinentales, deux plantes cholé- rétiques de Ia pharmacopée traditionnelle yeménite ont présenté deux hodes d'action différents d'E.cannabinum (Lanhers et coll., L986) : Ànisotes trisulcus augmente Ia sécrétion d'acides biliaires de 2OZ et stinule le FABD puisque }e FABI calculé par extra- polation à I'ordonnée représente 57t du FAB total, valeur èonforme à Ia littérature. De plus une relation linéaire entre Ie flux biliaire et la secrétion d'acides biliaires a été démontrées. Crepis ruepellii dirninue Ia sécrétion d'acides biliaires de -262 et stimule Ie FABI. Cet extrait végétal renferme vraisemblablement des composés entrant en compétition avec les acides biliaires. Cet exemple montre que Ia sécrétion de bite stimulée par un extrait végétal peut avoir des origines différentes. Nombreuses substances rnédicarnenteuses ou toxiques cholérétigues stimulent }e FABI. Cette cholérèse n'est d'ailleurs pas corréIée avee I'LndUction enzynatique microsomale. Ainsi, lâ cholérèse indulte par Ie phénobarbital est due à une stirnulation du FABI et Ia sécrétion endogène des acides bi- Iiaires est dininuée. ce phénornène s'explique par une rnodification de I tactivité enzyrnatique de glucuronoconjugaison- Les acides biliaires conjugués sont moins efficacernent réabsorbés au niveau des intestins et des reins et Ia perte urinaire des acides biliaires glucuronoconjugués est ainsi aucrmentée. Un mécanisme secondaire évoguant ta part,icipation de lrénzyme Na+-K+-ÀTPase dans I'augrmentation du FABI est aussi envisâgé : une nodification du micro-environnement Iipidique de la membrane plasrnique et de sa microviscosité (par le phénobarbital par exemple) affecte sensiblement cette enzyme (okuda et coll., 1988). Le mécanisme détoxlfiant de Ia glucuronoconjugaison intervient pour une part lnrportante dans 1'élimination de nombreuses rnolécules drorlglne végéÈaLe. La stimulation du FABI par lrextrait aqueui dtE.cànnabinum pourrait supporter ainsi cette hypothèse sàns pour autant oublier le pouvoir osmotigue Çe cèitains cations et anions organiques éIirninés dans Ia bile à Ia faveur d'un gradient éIectrochinique. -9r- 8.3.2 INFLUENCE DE L,EXTRAIT AQUEUXD,E-@ L. 8UR IrA CL,AIRÀIICE BIIJfÀIRE A L'ERYTERITOIT Cette technigue pernet d'estimer le fl$]r-biliaire canaliculaire d'origine héf,atoèytaire. L'érythritot uL4c et Ie mannitol 3H sont actuellement les rnolécules les plus utilisées : elles pénètrent dans les canalicules par un transport actif au travers des hépatocytes et ne sont ni excrétées ni réabsorbées. L'érythritol est un tétrose rapidement réabsorbé par les hépatocytes grâce à Ia perméabilité de leurs membranes sinusoidales séparant tes milieux sanguin et hépatocytaire. L'équilibre des concentrations, dans ces deux milieux est rapidement atteint (Forker, L982) . La clairance biliaire est égale au produit de flux biliaire (F) par le rapport des concentrations biliaires (B) et plasmatigues (P):C:FX(B/P, Lorsque I'augrmentation de Ia cholérèse est dtorigine ca- naliculaire, if y a une augTmentation proportionnelle du flux et de Ia clairance. Par contre, si I'hypercholérèse met en jeu des mécanismes extrahépatocytaires au niveau des canaux biliaires, lâ clairance n'augrmente pas. Certains auteurs ont montré que I'érythritot pouvait, malgré tout, diffuser au niveau des cellules épithéliales des canaux biliaires (Barnhart et Combes, Lg78; uottinger et Preisig, 198Ot f,ewie et-coll., L9821î René et coll., L983). Cependant ectto rôcn{t,ton cct f,alble et l'érythritol demeure à l'heure actuelle, la seule tubsttncÉ flable pour déterminer 1'origine d' une hypercholérèse. B. 3 .2 . 1 I,IATERIEL EII UETnODES Le protocole expérirnental est sensiblernent Ie même que celui du flux biliaire. La bile est collectée à partir de t = O, toutes les 10 minutes. À t = 20 minutes, un groupe de 3 rats, dont les pédicules rénaux ont été préalablement ]fgaturés, reçoit une injection unLque de 4 ci (0,2 rnt) de t*Uc érythritol (Radiochemical centre, Amersham, G.B.) dans la veine jugulaire. A t = 7o minutes, Ies animaux reçoivent l'extrait aqueux d'E.cannabinum 4OO rng/kg dans Ia veine jugulaire. 150 I de sang, préIevés par Itartère carotide préalablement cathétérisée (n' 3), sont collectés dans des tubes héparinés et préalablenent pesés, à t : 10, 35, 40, 65, 75, 85, 95 minutes. -97,- Des échantillons de 0105 rnl de sang sont placés dans des flacons de verre avec 0r5 nl de soluène 350 (Packard) /isopropanol (Merck) LzL v/v pendant une nuit. O,5m1 d'eau oxygénée à 3ot sont ajoutés et laissés 3o minutes à 40'C. Après refroidissement, 15 ml d'Instagel (Packardl/HCL O'5N 9zL v/v sont ajoutés et Ia radioactivité est mesurée dans un spectrophotomètre à scintitlation Iiguide gui détermine les désintégrations par ninute (Minibetta L2LL, LKB). Les échantillons de bile sont traités de la même manière, excepté I'addition d'eau oxygénée qui est remplacée par une exposition d'une heure à Ia lumière du jour et de 6 heures à I 'obscurité. Deux mesures sont effectuées, de façon à pallier les in- terférences biologiques et chirniques du sang et de Ia bile produisant un affaibtissement lumineux. Une correction du guenching est déterminée par Ia méthode du standard externe: on mesure Ia radioactivité d'un échantillon renfermant du 14c étalonné à 98300 dprn et celle de ce même échantillon lorsqu'on 4j9ute un rayonnement connu provenant d'une source externe de zaoP.a. Une ganme de l-O échantillons, renfermant les différentes substances biologigues (sang et bile) et chimiques (soluène 35O, isopropanol, HtO>, Instagel et HCt) est réalisée et on détennine Ie déplacérnént du spectre dçç irnpulsions (ipm) de '*C comptage de Ia source externe et dU sur les deux canaux. La couibe de quenching (affaiblissement du comptage) établie en fonction de I'efficacité de comptage (E) et du rapport de standardisation externe permet Ie calcul des dpn : dpm=ipm/E Les gammes réalisées à partir du sang et de la bile sont présentées dans les tableaux L6a, 1-6b, L7a, 17b et les courbes de guenching correspondantes dans les figures 3La, 31b' 32a et 32b (Fleurentin, L983) . 8.3.2.2 EXPRESSIONDBA il88ttÛTATS ET slATrsTrQUEs La clairance à 1'érythritol est calculée en divisant Ie taux de radioactivité excrétée dans Ia bile par unité de tempsr Pâr Ia radioactivité dans le sang. Les résultats sont exprimés à I'aide des paramètres suivants : Ies moyennes du flux biliaire en mg/mn/Loog exprimées par périodes de 1o minutes. re rapport 14c bite/rac sang. la clairance en rng/nn/Loog exprimée par périodes de 10 minutes. -98- TâBLEAU 15a 3 GAI,IUE DE DETERIITNATIoDI DU QUENCETDIGDAI{S LE gâNc (Fleurentin, 1983) ,tc l.l POS. SANG SOLUENI HzozINSTÆEI HCl c TFF S RATIC. No ISOPROP ETÀLON HESURE IÀPFORT 'LACOt ml ml ml rnl ml dPm CPM } g7 I 15 98 300 i8s 882 ,37 I, 57O 2 13,5 1r 5 98 300 81 403 82,81 L,162 3 ol, 13,5 1r5 98 300 80 798 82,2o l, l20 4 I 13, 5 lr5 98 300 80 507 81,9O L,O92 5 or5 or5 13,5 lr5 98 300 77 2-t7 78,6L o,932 6 o,025 or5 or5 13,5 1r5 9e 300 78 974 80,34 1, ol9 7 O,05 or3 or5 13,5 1r5 98 300 78 284 79,64 o,965 I O,05 or5 or5 13, 5 1r 5 98 300 79 369 80,7 4 1, ol6 9 orl or5 o,5 13,5 rr5 98 300 78'178 80,l4 l,OOl IO or2 or5 or5 13, 5 rr5 98 300 78 054 79,4I o,9'14 TABLEÀU 15b : D.P.l.l. DE LÀ GÀI,û,IE ÀPRES 9UENCIIfNG DÀNg IJE SÀNG (F1eurentLn, 1983 ) FOs TIilE cPËl cFnlI DP}II DPITIT RATTO RZ CLi{Z ci I= 00t 00600 85986.3 . I 99483.7 .l 1.563 .4 .00 9Cll?-,t 002 00600 8r456.7 .l 98469.6 .t l.l5é .l .00 6léJ7.. 003 00600 80s70.2 . r 9Ar68.8 .l 1.108 .f .00 8{:ô1.t 001 00600 80392.0 . I 98273.6 .l 1.085 .{ .00 8J72C.i 005 00600 7707?.8 . I 98931.6 ! .9?0 .t .00 | 1tJ06.5 00600600 79039.r . I 98540.8 .t 1.004 .t .00 9r?62.: 007 0c600 78r0t.3 .t 98083.0 .2 .965 .t .00 t | 52ô2.2 008 00é00 79289.5 .t 98691.9 .l 1.019 .4 .00 ç5it2.5 009 00600 78953.| . r 98425.9 . | 1.005 .1 .00 | 00132.0 01000600 78021.8 .l 9S156.1 .2 .960 .l .00 t07rr ?.2 -99- TÀBLEÀU 16a : GAttl,tE DE DETERT{II{ÀTION DU QITEDICEINGDANS LÀ BILE (Fleurentin, 1983) I4 Itl POS BILE SOLU rso,Hzo2 INSTA HCl c c No ENE ,ROP GEL ETALON UESUREEFF t RÀTIO iIÂCOl ml ml ml ml ml ml DPM CPM 1 R.APPORT I l5 98 3CO85 716 87.2O L,567 2 Q12 I5 or2 98 300 84 740 96,2L I,417 3 o,025 or2 or 5 13,5 1r5 98 30C 79 L49 8o,52 o,986 4 o,o25 o,L7 ),34 or5 13, rr 5 9e 300 78 356 79,7L o,962 5 O,05 or2 or 5 13, rr 5 98 300 79 006 8o, 37 o,985 6 O,05 o, 17 )r 34 or 5 13, rr5 98 3co 78 313 79,67 o,966 7 O,05 o12 or 5 15 o12 98 300 81 545 82,96 1,144 I O,05 o rLT ) ,34 or3 13; 1r 5 98 300 79 269 80,64 l, ol5 9 orl or2 or 5 13, 1r 5 98 300 78 869 8o,23 o,983 IO orl o,l7 ), 34 or 5 13, lr 5 9e 300 78 690 80, 05 o,965 TABI,EAU 16b 3 D.P.III. DE IÀ GAIIUE APRES 9UENCETNG DAIIS LA BILE (Fleurentin, 1983 ) POS IIIIE cP]fi cFnl z DPTIIDPIII1 RATItl RZ CU{Z cPll5 00r 00600 8ié09.2 . I 9S3t3.7 .t 1.353 .r .00 89784.5 002 00é00 84703.9 . I i8276.7 .t l.lt5 .t .00 92016.2 003 00600 7i079.7 . I 98287.9 .8 .98ô .t .00 t3r006.9 00r 00600 78234.9 : I i7q37.7 1.9 .96s .r .00 | 2981I .9 005 00é00 7916,1.3 .l i87â8.9 .2 .9Sl .r .00 | 32326. 5 006 00600 784t2.2 .l ?8235.9 .2 .971 .f .00 r 29?61. 0 .l l.l3é .r .00 86420.4 007 00600 8t60r.3 .l 9S525.9 - 008 00é00 79177.9 .l 9821i.9 .l 1.008 .t .00 I 10021.7 009 00600 7S788.3 . I 9781i.2 .t .996 .t .00 t29618.0 0t0 00600 78420.8 . I 98r/0.8 .6 .964 .a .00 t2r509.1 -1OO- lsoIoPE l. ulNoouI EFFZ I *l 87.00+ I I. I 86.00+ I I I 85.00r I I I 8{ .00+ I t I 93.00+ r. t0 lr* lr 82.00+ *rl Ir0 I* I-r 81.00+ . lf I* lf 80.00+ a* I I 0r l.l 7?.001 lr t0 t I------r------+------+------r------+------r------t.000 t.t00 1.20c t.3ù0 1.100 t.sô0 RAI'PORT DË ETAF{8I'ÀROISATIONEXTçni*-: FTGI'RE 31 s COITRBEDE QUENCEINC^Pa,N8LE 8ÀNG (METHODE DU STAI.IDÀRDEXTERNE : SOURCEDE zzoRa) (FEURENTTN, 1983) -10L- IS0I0PE I, gtNDou I EFFI t :rf 87.00+ I I I I r! 86.00+ I t I 85.00f 81.00+ I I I t 83.00+ I I I 82.00+ 81.00r :| l0* I 0**,r tl 80.00+0 It IO I !*---r------+------+------+------+------+------t.000 t.t00 t.200 t.300 1.100 1.500 RAPPORTDE STANDAFDISATIONEXTERNE FIGURE 32 s coURBE DE QUENCHING^^DjINSIJÀ BILE (METHODE DU STANDARDEXTERNE : SOURCEDE zzoRa) (FLEURENTTN, L983) p l, .l: r 5. ,. '" -102- Les moyennes sont comparées aux contrôIes respectifs par Ie test ntr de Student. La régression linéaire, ajustée sur Ie rnodè}e y= ax+ b est analysée par Ie test rFn de Snedecor et le test rrtrr de Student. 8.3.2.3 RESULTATE Les résultats sont consignés dans Ie tableau 18 et à Ia figure 33. a) Ltadninistration d'E.cannabinuni provoque une hypercholérèse significative pendant les 60 minutes qui suivent I'injection, atteignant une augmentation maximale de L4Z, L0 minutes après. Ces résultats confirment les expérimentations précédentes bien que lthypercholérèse soit, dans ce cas, rnoins intense et plus rapide. b) LraugrmentaÈlon du rapport LaC Ait.1 14C sang est importante dès lee 10 premières.qrinutes après f injection: cela proylent de Ia diminution du r+c sanguin et de I'augrmentation du'*c dans la bile. Lors des préIèvements suivants, le rapport B/S ' après avoir à attelnt un maximum40 minutes après inje diminue nouveau r Çion,'C progressivernç4t en fonction de Ia diminution du dans Ia bile car Ie r*c dans le sang se ctabilise de plus en plus. c) La clairance augmente durant les 50 minutes après injection avec un maxLnum à 4o rninutes. La figure 33 représente I'ensemble des mesures effectuées sur Ies 3 rats. Ira iégression linéaire calculée à partir de 26 polnts détinls par Ie flux biliaire x1 et la clairancg yi donne ûne drqlte de type y = 1'63 x - 3,'lo,^avec un coefficient de corrêIâtLon de ni O,Ag. Cette drolte est slgnificative à p 8.3. t. | â'ltAl,I8E DEg RESULTAT8 Ia régression linéaire s[gnificative entre flux biliaire et c,lairance à 1'érythitol ^*c suggère gue Ia cholérèse est dforiglne hépatocytaire. Aburada et coll. (1980), dans leur étude des prôprietés cholérétiques des iridoides, avaient aussi dérnontré l'origine hépatocytaire du flux stinulé. _103- Él @ F{ Ol H ol FI (\il C' â r0 o o rl E{ +l +l +l X sr \o n H (1 \o ê F{ @ r{ o z E o Ur \r \o H x sil r- E{ ur r{ o oit â â o H |ô +l +l +l o C' @ o o H C) tr (\ à ul d H @ r{ x Él  ol \o n o F{ !0 nt F o F{ o fl !t É F:I +l +l +l tr Itl tf) (vl lo r{ cl o (Yl o\ 9l T co r{ F{ (, HI F{ l ê À o E @ (rI \o H 2 o @ o o É H o o o o H ('t +l +l +l (, or o\ (vl H FT 0 @ EI 'tlf; ô o F{ |l o F{ I @ FI \o û Or u A o o !t É o FI Gl Él N +l +l +l o o r- (tt x Fr o d r\ Ë tr hl n Ë or F{ o É D Ê{ .{ ol (, .{ !t N n Fl o\ o (vl ('l E{ o o o Ê Gl F{ +l +l I co ôt +l È N ôl (v) â ot r{ r{ r{ EI É o F{ @ H H r\ r{ lo É rt. H o o r{ É 9r H Éro +l +l +l gl 2o ôt $ sf o F{ FI Cî N (rv D @ F{ Or rl H : É H o r{br br Fl HC' H C' Éo Hlo C' C' tr H"l FI É tr\ ËtF H e 'l' eÉ É XE H gl p\ (I (' e é rl sls ç!t É F{ H F.È çl Fl o É- * trll t tll2 . tll3 ul o i o r{ +/ ç É H É H ,{ H lf H gl x Es Fl Y=lr 64X-3 t7o r=0 r 83 P cLÀIRItltcE 1009 flrhn/ FIGURE 33 3 REIÀTION ENTRE I,E FLUX BILIÀIRE ET LA CIJÀIRÀÀICEÀ L'ERYTHRITOIT APRES ÀD!{INISTRÀTION DrE.cannabinun 500 ng/kg CHEZ tE RAT -r05- Tanayama et Kanai (L9771, étudlant les propriétés hypercholérétigues des polyoxybenzènes d,origine naturelle, concluaient aussi à I'origine hépatocytaire du flux biliaire stimulé, acides biliaires dépendants. Le rapport B/S est toujours supérieur à 1 : ceci peut s'expliquer par la perméabilité canaliculaire de I'érythritol (Barnhart et Combes, L978; René et coll., L983; Ricci et Fevery, 1981; Corbic, 1986). Cependant, tous ces auteurs s'accordent à penser que cette perméabilité est faible et ne remet pas en cause la fiabitité de cette clairance. -106- B.t DrSCUggroN L'extrait aqueux d'E.cannabinum est cholérétique chez le rat, selon un relation effet/dose et effet/tenps : L'effet, maximal à la dose de 250 mg/kg, n'est pas très intense rnais se prolonge dans Ie temps contrairement au DHC, sel biliaire choisi comme cholérétique de référence. L'extrait aqueux stimule Ia fraction hépatocytaire du flux biliaire, acide biliaire indépendant. Il a paru intéressant, de comparer des résultats obtenus avec E.cannabinum et les résultats obtenus avec d'autres plantes étudiées au laboratoire. Une étude comparative des effets cholérétigues de molécules et d'extraits végétaux rencontrés dans la littérature a ensuite été entreprise de manière à mieux situer l'extrait drE.cannaÈinum parmi les autre plantes à pouvoir cholérétigue une aDDroche des relations structure,/activité. B. 1 . 1 Àl{ALYgE COI'IPARATM al Avec les plantes étuôlées au laboratoire Cette étude comparative, représentée au tableau L9, porte exclusivement sur Ie pouvoir cholérétigue de différents extraits végétaux étudiés au laboratoire selon le même protocole. iqus ces extrclts ont présentés une activité cholérétique *tûlllftertive. Les plantes suivantes ont été conparées avec E.cannabLnum : Rosnarinus officinalis L., Lamiaceae (Hoefler et coII., L987) Carlina acaulis, Asteraceae (Tabary, 1-986) Laserpitum latifolium L., Apiaceae (Davrainville et coII., Le88) Crepis ruepellii Sch. Bip., Asteraceae (Lanhers et col}., L983) Anisotes trisulcus (Forssk. )Nees.,Acanthaceae (Lanhers et coII, 1983). E.cannabinum et R.officinalis sont, dê loin, Ies plantes possédant le plus fort pouvoir cholérétique (88,48 et 8f-t). A pouvoirs cholérétiques égaux, Iâ dose d'E.cannabinum est 8 fois moins importante que celle de R.officinalis. Le procédé d'extraction de R.officinalls est une nacération alcoolique à froid alors que pour E. cannabinum, ctest une décoction suivie dtune macération aqueuse. -10?- o 2^ oz F{ H- {. {. |rto E{ ** oo ËË Éo .1. {. * .1. Ê{ uf sfonooo oo HË zd ttt\ HY CÔrttoto('t@ VIVI @@cî (Ytlotf) O. P{ (,HËo EH DÉ ** ÉD * Ê(, r! ..+ D-! AP oa dpo +, Râ = =H FI' z +J o o EN H o 6Ë H +J C' , 6Ë fr rrt Fl OF{Fl o HH \oo .q x 'jFlAAÉÉ o s idorûrdtt'td o EË o oÉoo,4,Ê (d rû +J +) F{ Eg H .c 'o 'o ç! z +, gB .{ .o E {Jo Àg o r{ lo t Ëg td +J l{ âË Êr o Hz EI 9{ (, çt{ E*3 Êt ru ob l{ r( oooooo H"Ë H\ toonnNo t{ H ttr ôTONCÀco (d aË NA ôl F{ cî P{ É o F. o +J rt, ËË o o tl o Â É T{ H Éo .Fl Êl oo É E.? (, ..{OOO Ur t{oouloo .rl FT 'OUOOF{À o fitOçÉFlr| .r{ .F{ .Fl É Q. .r{ +J EË H uooa, Ê H ouldrÛoo o Ê '.{OHl{ll-{T{ E HE FI +JÉ o (ro E{ ha , tI,o ET g 'n 91 r, UI EË +) t\t +J Ei o "Ë o o t) 3â É o E .ot{ H lH (t{ EË a o Ê{ A flflgflHfl -108- si c.ruepellii et A.trisulcus sont moins cholérétiques qu'E.cannabinumr pâr contre À.trisulcus stimule Ie FÀBDen augTmentant, conjointement au flux bitiaire, I'excrétion des acides biliaires de 2oZ, cela ayant pour conséguence une potentialité lithogénigue .Par contre c-fuepelfii stinrule le FABI mais diminue Ie FABD sans doute par la présence de com- posés chimigues entrant en compétition avec les acides bi- liaires (Lanhers et coll., 1985). b, alrec les extraits végétaux étudlés ôans Ia littérature Cette étude comparative porte sur différents extraits végétaux étudiés, selon un protocole sensiblernent identigue à celui utilisé au laboratoire chez le rat. Les plantes suivantes ont été conparées avec E.cannabinurn : 'tCaryophvllus sp., caryopyllaceae (Yamahara g.@Lt., L983) *4lngiber sp., Zingiberaceae (Yanahara et coll., 1-985d) *gaussureae lapa, Asteraceae (Yanahara et coll., 1985b) *Menta arvensis L., Labieae (Yanahara et coll., 1985a) 'tCynara scolymus L. , Asteraceae (Lietti , L9771 Faute de données précises sur Ia quantité de tout,es les plantes sèches utilisées par les différents auteurs, iI a paru préférable de s'exprimer en mg d'extrait végétal obtenu après évaporation du solvant dtextracblon/ kg de poids corporel. Àinsi, E.cannabinum 25o mg/kg correspond à 30rng d'extrait, aqueux/kg. Les résultats, présentés dans le tableau 20, ont été exprinés en pourcentages d'augrmentation cumulés sur l-50 minutes après I'injection: ils ont été obtenus par mesures graphigues des courbes des lots traités et des lots [placeborr, d'après les figures présentées dans les publications Nous ntavons retenu de la littérature que les résultats obtenus dans des conditions opératoires les plus proches des nôtres. Néammoins les résultats de l'équipe de Yamahara ont été obtenus par injection intraduodénale des extraits, ceux de Lietti par injection intrapéritonéale; quant aux nôtres ils sont Ie résultat d'une injection intra-veineuse. De plus, aucun des auteurs n'a pallié l'interruption du cycle entérohépathigue par addition d'acides biliaires. Les cholérèses obtenues par 1'équipe de Yanahara sont très importantes mais le rnatériel végétal utilisé I'est aussi: Zingiber (gingembte), à 500 Ing d'extrait acétonique/kg, provoçfue 25Ot d'augTmentation corrigés par rapport au ]ot rfplaceborr et cumulés sur 150 minutes. Cette doee correspond en fait à L4,759 de racines/kg . En conséquence de guoi Ia concentration en principes actifs injectés à 1'animal est sans conmune mesure avec I'utilisation traditionnelle de ces plantes -r0g- ofia HC' BI E{ uf û .4 F{ D Fl E{ fv â FT f-Ou.ltflc)nNsr\g E to @nrtN\or{f'f'tfl E{ OE ôln(.tsfFl E{ DÉ H ÉD rl ÀË (,  t{ dp @ 2 .{ z o o H po E{ C' a 2 IU FI â F{O H Fl ooooq\ H x ÉÉÉÊç-{ û 'oaooaodq x s iû+rru+J+Jtlt+r,ÉÉ l) o o.oo.o.oo'o+ra-ù-ooo.aE É E{ H dtdd.dÉ+J o H 2 (la ,{ H È >Êr o oo|D o HH HT ÉÈ É4 HÉ xo H F (,tr z FT oo tob HH ra 2U FI\ ooooooooo E{bi cî 00000000 Ës tnlr)n|oonno EO nÉ c)N KA É Êt4 É HÉ A OFx H trl tlv o UI UI H rt o o o tr É É E É o| E{ E É É o H P o o o o Êl o .r{ O Ul 'Fl .Fl H t{H t{ û FI .oÉl{o .o .rl H 5.O rr tU .FI od IU a É o (t{o o FT otd q.{ u o F'(, H Ot{ o o û .r{ .F{ .Fl FI +J +J +J É H H t{ l{ H rd tU IU o g 9. Ê 9{ Ë) I A{ aa o CI (nl N Fl  5l cl u F{l utl D .r{l 'dl  r{l E .ql t{l Èl xl É H g8l 6l tr H arl .Jl 8l  fiil ttl >t rdl Èl E{ ::l =l htu"dl rdl :t .;l .dl .l tl 3 r,il xrl È ol (nl Àa -110- De plus les extraits aqueux (Zingiber, S.radix) sont inefficaces arors que tous res extraits chotérétiques sont réalisés à partir de sorvants organiques (acétonef éthanot, néthanol) : E.cannabinun est la seule plante dont lrextrait aqueux soit cholérétigue. Par ailleurs, Yamahara et coll. (1983, 1995b, L985c, 1985d) remarquent Ie même type de relation effet/temps sur 150 minutes que celui observé avec E.cannabinum : les extraits végétaux ont un effet identigue en cinétique (effet chorérétique pèndant au moins 1-50 minutes) mais plus irnportant en intensit,é. Ces auteurs observent avec re DHC Loo mg/kg, soit 10 fois la dose choisie dans notre étude, une efficacité forte (2OO S) mais brève : ce cholérétigue de référence provoçfue un pic de cholérèse à 30 minutes et son action srannule au bout de 90 minutes. Lièvre et Guillot (L985) renarquent aussi cette relat,ion effet/tenps obtenue pour chrysanterrum americanum, spéciatité pharmaceutigue à propriété cholérétigue (bénéficiant drune A.M.l{. ) . Bien que les travaux de Ia littérature sélectionnés soient difficilement comparables (solvants drextraction, doses injectées, voies d'injection) r'extrait aqueux d' E.cannabinum est intéressant à plusieurs titres: * II agit en respect de l,indication thérapeutique traditionnelle c'est-à-dire par utirisation d'une décoction- rnacération de Ia plante entière séchée en rnilieu aqueux. * La dose la plus efficace r 25O mg/kg est très faible comparativement aux extraits végétaux étudiés dans Ia litté- rature. Cette dose correspond à Ia dose reconmandée par Leclerc (dans Fournier, L948) : un décocté de L59 de feuilles sèches /2OOnL d,eau, en prise quotidienne, éguivaut à 25O mg/kq pour un adulte de 60 kg. * rl exerce une activité nette et durable (prus de 150 minutes à 25o mg/kgl. 8.1.2 RELATION STRUCTURE/ACTMTE a) conparaison blbllographique De nombreux composés chiniques drorigine végét,ale sont cholérétiques: iridoides (Takeda et Àburada, t-991; Takeda et coll., 198Oi Tanayama et Kanai, 1977) , composés phénoliques et coumariniques (Takeda et, Aburada, t-g8L; Fontaine et coll., 1968; Yamahara et coll., 1983), terpènes monocycliques (Yamahara et coII., 1985a, 1985b et 1985d), acides-phénols (Lietti, L97L; Sharma et coII., L973; presiozi, 196L). -111- On rencontre aussi des lactones sesguiterpéniques (Yamahara et coll., 1985b) et des alcaloides (Danielak et colI., L9731. Par ailleurs le mécanisme d'action de certains composés a été étudié: Ies composés phénoligues, coumariniques et les iridoides seraient excrétés dans les canaux biliaires sous foçme de glucuronides, conme des anions organiques, couplés à Na+ et CI=, par transiort actif des hépatoéyteJ vers leé canalicules biliaires et Iteau serait alors passivement excrétée. fI y aurait compétition avec les acides bitiaires et Ie gradient osmotique ainsi créé entralnerait une auçlmentation du FABf (Takeda et Àburada, 1-981; Àburada et coII., lgg0). Une étude comparative du pouvoir cholérétique de différentes molécules d'origine végétale, relevé dans la littérature,est synthétisée dans les tableaux 2La, 21b et 2Lc. II apparaît dans ces tableaux que lractivité cholérétigue est presçlue toujours liée à Ia présence d'un groupenent rnéthoxy (-OCH?) ou acetoxy (-COCH") sur le noyau phénol des dérivés phénoliques (acides-phénolÉ et dérivés d'acide cinnamique), des coumarines et des al-caloides. Néammoins ceci n'est pas une règle car I'acide L-4 dicaffeyl- guinique, Ia cynarine extraite de Cynara scolyrnus, D'â pas de radical méthoxy et exerce cependant un fort pouvoir cholérétigue. 11 en est de même des monoterpènes cycligues, menthol et terpinéol, ainsi que du costunolide. S.gFnnab1nun pourralt exercer son activité cholérétique par L'j.ntermédiaire de ses lactones sesquiterpéniques riches en groupements acétoxy et partiell.eurent eolubles dans lreau. Ses acides-phénols peuvent être aussi !.npllqués, bien ç[ue sans groupement OCH. et COCH.rmais solubles dans Ireau. Enfin, son huile essentielle possèèle des monoterpènes cycliques susceptibles d'être aussi actifs. Cependant leur concentration faible dans l'extrait aqueux ne permet pas de retenir cette dernière hypothèse. b)conparaLson avec les spécialités pharmaceutLques cbolé- rétlques Un recensement des plantes à réputation cholérétiques (Bézanger-Beauquesne, l-986; Paris et Moyse, L97L)fait apparaitre une majorité de Labieae et d'Àsteraceae. Dans les spécialités pharrnaceutiques à visée cholérétique, renfermant presque toujours plusieurs plantes, les plus citées sont les suivantes: -112- ('l F{ F@ Ét or ol H Fl Fl ts A ..û -{'|J n F{l td e, ol t{ o rjl a H lÂ= É +rl ===4 !e ol'+J H tr tdo É t{d r\t 6 H .qo É ur J1 É .Û FI E{ Ê Él l] p ol Fl ZH É: oE{ z Hpl E{É + FI oFr z ÉÉ H o (9 EI H o É o ,J OEC' cl idtElll ql !t ooo Êr Ê tll D ol H H Itld E{ iËEtll FI ct oll Ê Ê I FT Ê o Èl aî (, Ët(.l ô| iÉtÉE(,o!É dl É ooootc) BI ttlto lr I p (, Êr ('tmiÉ Ê rl EtttiÉo o É Otouol - rtoo tl : N tr É o FT J rl tt !r{ trl o É NO E{ ..ÉJ ott .,{O (,dJl roxott toAO{.r{ Crttt{rr}{ ..{ IJ fit 4, à-l o FfF{,ÊOt{O 9l rûH.OÊ É toÙ|iûÈ tr FIe{F{ o frf Hdd.td.lt..{ç È É .'{ .d ..{ .'{ É {, o FfOOOOTûrd t AtI'ît.d.d _113_ I ome{ I @t\co I gr or ol H r{ c! F{ r{ Ë iH t\ ûr F! rol ç- iê| . .-,1 o 1$ -||.{ld F F{l È r{ td :o olkolr{ o olOolU= ====1.'{l.q H É +rl +J {rl 4 trl Ol-o+, t{ Ol È H É Él t{t('0, tlt FT oÉ t{ É Éogd .It D tDcct€ .4 E{ |It rû ,q q, rû 14 Brd(,lJl É z d (t E{ x H H z D H ol (, AH H OH É HÊI + + o Hû O f'l ÉFl o o l0 C' trH or H Fl FI É H É o (,t o FI rl 6n p H C' N u!ÉtEotto o o Êl û oororool I É tltrl o \ crt x CJ .n (vl / 6À E('rtEEttt o ^ çl cr!Étruooo C) É ocrotro o totl I Êl I H H tr o @ t tt .,{ rl oÊ 'F{ N rti' ..{ tt D aÉr É FI É oÉXÉF{ ; gl EO..{O o É +roaor{ 2 oaurdo H E{ Êtt-.tooa rl -A -l É t{ .'{ tt F. ait tlF{ttttl'd3F{ - lO , É >r | 'O F{ E IJ r0 !'t t{ É ,É O rr T{ O a N H ftt o d | É | (t É Fl É m.r{ lt{ O sn ..{ Fl () {, qt o g p ÉÊùrr{ F4 k - C' Ortt O O O A O O 5 o o C' iÉ tt t 'tt O d tt O t{ H ur I s ..{ É .rl .,{ ..{ k -l :.{ o ttl É ç G' (r*{ O O O A O O u tll H ..1 - rûO n' d n, O d ltl ...t O a ttl I aà I CD G' G' - .J ia tl I tl ta C' t{ :E C\a lf Ct- oz C)l -r14- t{ GoF{ til ! ût cl co io Gt n lnln or or or ol æ c, cl Fl Ê{ Fl r{ Or or or FI .{ el .t' Éat (t 6€ -tl (' o(l f{ Éh Ël jl t ha ol ôl ril 4 0ll I ul r-tl-t f-il -l ,{ É4 ll ('l Dl x! Ël -^l +J+, UI qJI o +J(t, J1 rl (D (l o (l(' Gt6 r{ l{ t1k O NE o .lt (l.6 O F{O ..{ E ÊÊ F J1 AX É d ct.t' Ê d .cd fil Ê ÉÉ H uE{ cl d (lût É u '{ >. E o Ê rl E z D D Êl or É H à E{ É9l + +l FT EI 2 rt H o c, (,Èl H É o a ot qt tl tc) trÉl ro cl I H e.l E{ t FT tc) É !c to FI ll É o EI (, dl ,Yr ql 'r oc, oo t Él e- É tl tr * C.' o Fl* * o oÉ vo o o Fl F{ FT É C.'{ HÉ c 6 o0 È O ..1 +J 9. - .à FI E{' l.t €.o F{ o ..{ ort o +tÉ o F{ ÉF{ , o É-l t TJ XA E{o IU ç OQ ..{ !t O ?l Eh oa É.o a A hEI ul {J qlO fE Fl ç.O EI o Er+J n a OÈl o DI t- f, rà ùl () ,E, I .A Ei !0 ga FT tlor, É Êl tFro H (, H H>'É, Ê >| É.cd Êl (, tr  +r 'rJ o o to EO à pÉ o c' lD E FI 3., E o ; t0 N qt H Èr F n e à = tr H o Ér H û Êl 9. 4 É (, C' Ê FT Ér É Êr Ê a É É Él tr É E{ -115- Pneumus boldus= Boldo (Mominiaceae) Cvnara scolymus L.= Artichaut (Asteraceae) Mentha pipera L.= Menthe (Labieae) Rosnarinus officinalis L.= Romarin (Labieae) Combretum micranthum G.Don.= Kinkileba (Conbretaceae) Taraxacum officinalis L.= Pissenlit (Asteraceae) Curcuma xanthorrhiza Roxb.= Curcuma (Zingiberaceae) Rhamnus frangula L.= Séné (Leguninoseae) Pour toutes ces plantes commepour E.cannabinum, iI serait vain de vouloir réduire 1'activité cholérétique à une molécule même si celle-ci est particulièrement active. Suivant Ie mode dtextraction et 1e solvant utilisés, Ies molécules présentes seront variables en quantité et en guatité(hydroJ-yse...). Une molécule inactive à l'état naturel dans Ia plante peut très bien devenir active à }a suite de réactions chimigues provoçluées par Ia chaleur (ébulfition)ou le solvant. Enfin tractivite ênotérétique peut être due à différentes composés chimiques et un effet de synergie n'est pas exclu. P rop r iétédant ihépato.toæ iq LLeo A'8, cannabinumL' Prop riété,t anti/eépato toæiq ue"t A'8. cannabinum L. C.1. INFLI'ENCE D,E.cannabinum L. VIS-À-VIS DE I,'EEPÀTITE IIIDI'ITE PAR I.E CCI, IN VIVO C.EEZ LE RÀT -115- C.1 IIIFLUEI{CE DE L'EXTRAII ,AQUEUXD'E.cannabinun L. Vf8-A- VIS DB L'HEPÀTITE INDUITE PAR LE CClt CHEZ IJE RAT C. 1. 1 âNALYSE BfBITIOCRAPEIQUE De nombreuses substances sont capables dtinduire une hépatotoxicité, reproduisant Ia pathologie rencontrée lors de 1'hépatite chroniçlue, Ie cirrhose biliaire ou I'alcoolisme. Ces composés chimiques responsables de la toxicité expéri- mentale se rangent en trois catégories (Kaplowitz et coll., L986) : * Les éIectrophites dont les métabolites produits par oxy- dation au niveau du cytochrome Pr"n, sê lient aux sites nucléophiles (acétaminophène, brôfrôbenzène) * Les radicaux libres, à un électron célibataire, produits par réaction dtoxydoréduction au niveau du cytochrong PaSO ét qui sont responsables des processus de lipoperoxydation (tPO) et de liaisons covalentes avec des acides glras insa- turés [tétrachlorure de carbone (CcI4) r halothane]. * Les radicaux oxygénés : certains composés chimigues (paraguat, doxorubicine, nitrofurantoine) ont une structure pérrnettant I'acceptation d'un éIectron célibataire formant àinsi un radical librei ce dernier réagit avec I'oxygène pour former un anion superoxyde( O2-l et Ie composé initiat est régénéré. Les métabolites de I'oxygène sont responéables de processus toxiques de lipoperoxydation. C.1.1.1 l,tBTÀBOIrISt'tEDU CCll Le CCl1 est un toxigue cÊpable d'induire in vivo, de manièrè reproductible, des léslons hépatigues rencontrées en clinique humaine: stéatose, fibrose, cirrhose. Largement utilisé in vitro sur hépatocytes, il a permis d'affiner I'étude des processus biochimiques de I'hépatotoxicité ainsi que d'étudier I'action de substances qui présentent une hépatoprotection. L'hépatite induite au ccln peut schérnatiquement se décomposer en 3 grandes étapes nême si cette coupure est artificielle car les réactions s'enchainent. Lepage et coll. (1988) utilisent aussi un découpage sirnilaire popour différencier les trois phases de I'action du CC14. La nécrose n'est pas spécifigue du CCI4. 't bioactivation du CCI, en radicaux libres * Iipoperoxydation autôcatalytique et Iiaisons covalentes -11?- * cytolyse al EiootLvation du ccl{ Le CClo atteint rapidement les cellules hépatigues. II agit précocément et réversiblement sur I'intégrité de la mem- brane plasmique, du fait de sa liposolubilité. Dans les minutes qui suivent I'exposition au CClo- L rng/n1 il y a une dininution de Ia consonmation d'oxygène (obserrrable même avec O,25 ng/nl), une fuite enzymatigue des transaminases et de la lactate deshydrogénase, une fuite de potassium et ce jusgu'à L0 à 30 minutes après l'intoxication, puis ces effets tendent à se stabiliser (Berger et coll., 1986). Cet effet est observé in vitro et in vivo ori I'atteinte directe devient irréversible à partir de 2 mM per os (Berger, 1987). L'impact direct du CCln sur Ia membrane plasrnigue n'est pas dû à une activation-locale en radicaux actifs CCI"' (Lepage et coll., 1988). La bioactivation du CClo se déroule au niveau du réticulum endoplasmique (Sipes et,-col1., L977'). Elle consiste en une réduction de Ia molécule au niveau du système enzymatigue transporteur d'éIectrons, Ie cytochrome Pasn réduc- tase/cytochrome Pacn, grâce à un électron'pËovenant du NADPH.Le transfert-d'éIectrons du cytochrome P4qo âu CC14 conduit à Ia formation d'un interrnédiaire réactifl lç radi- cal trichlorornéthyl ccl3' , de deni-vie estirnée à LO-+ secondes. cc14 + cyt paso(re++) ccl3' + cyt paso(re 3+) - (Rosen et Paumgartner, L982) La présence de ce radical a été effectivement identifiée (Tornasiet coll., 1980). Outre la lipoperoxydation (LPO) qu'il va engendrer, Ie radical cCll' pourra réagir différernnent : interaction avec des protéinés, nucléotides (Slater, L978) ou avec Ie cholesterol (Anzari, L982'1, deuxième réaction en carbanion CCl.- pouvant aboutir au :CCl" (Hines, L9541, conversion en CO.ë1- hydroxylé en acide carËoxyligue ou déchloriné pour donner COZ; (Connors e.t'co.L!.., 1986) . Cc,rtaLnee eubstances sont capables d'inhiber Ia biotrans- formation du ccl. en diminuant I'activité du systène enzyrnatique cytochrome Paco. La diète protéique augrmente la résistance au CCI4- en alt,éiant Ia synthèse du P.UO (Korsrud et coII., L9761. -I1B- b, Ll.poperoxydation autoaatalytique et liaisons covalentes (Recknagel et coll., 1e82) * r,ipopero:rydation 3 Si Ie radical CClq' correspond à 1'activation nétabolique initiale, Ia path6génie du CCla ne peut être réduite à ce seul nétabolite. 11 doit, être éonsidéré comme le point de départ de voies métaboliques aboutissant à des désordres cellulaires divers. Ltimportance de la participation de chacun de ces nétabolites à I'hépatotoxicité du CClo reste incertaine (Reynolds et coll., L984). Normalement pfis en charge par des systèmes endogènes tels que Ia superoxyde dimutase, le glutathion ou la vitanine E, lorsque ceux-ci sont dépassés, les radicaux libres vont interagir avec des produits variés, êt notamment avec les lipides. Le CCl.'peut se lier à I'oxygène pour former un radical trichlôrornéthylpéroxy (Packer, L978) : CCI3'+OZ+ CC13OO' Ce radical va réagir avec les acides gras polyinsaturés (ÀcPf) membranaires (LH) déclenchant Ia phase d'initiation de la LPO: + CC13OO' LH \ CC13OOH + L' ou ccl; + LH Le radical L réagit avec I'oxygène moléculaire, formant un radical d'hydroperoxyde dtAGPI : L'+ O^.,- \ LOO' I,oO' peut arracher un hydrogène à un AGPI voisin (phase de propagation) . LOO' + L'H IÉOH + Lt' (Pryort L9761 Les hydroxyperoxydes dtAGPI finissent par réagir entre eux, formant un produit non radicalaire. '+ L L,' I.L' II existe bien str d'autres voies métaboliçlues au cours de ce processus de lipoperoxydation. Cet aperçu rend compte de Ia diversité des réactions nétaboliçlues du CCIO. Les radicaux libres ainsi forméE se retrouvent non seulenent au niveau du foie mais aussi dans dtautres organes: reins, coeur, intestins, testicules, et à un degré noindre dans le sang et Ie cerveau (Ahmadet coll., l9g7). -LL9- * Liaisons covalentes 3 Les métabolites du CCI se lient conme des agents alkylants entes aux sftes nucléo- Plir"q des protéines, aux ripides membranaLres, artérant I'iTtégrité des membranes. nn se liant à ITADN, if" deviennent carcinogènes(Lévy et Brabec, 1994) . C'est en se liant aux groupements thiols de Ia cystéine du glutathion çlue ce tripeptide endogène joue son rôle de détoxifiant, et protège de la néciose induite par le CCI4 (De Ferreyra et coll., i.996). La relation ent,re Ia toxicité des xénobiotigues polyhalogénés (CCI4...), la LpO et Ie fer, ét par voie de conséquence ra porphyrie, est actuellement étuâiée. En effet, il a été observé, c};,ez les animaux exposés à ces toxiques, une porphyrie inputée à la réaction drun néta- bolite avec la partie sulfydryl de Iruroporphyrinogène décarboxylase (Goel et coII., 1988). Trois à cinq heures après intoxication, lorque les processus de Ia LpO se sont enclenchés, iI y a une élévation d' un des produits finaux de Ia f,pO, Ia malonaldehyde (MAD) et du glutathion oxydé (GSSG). L'érévation précoce de la MADobservée par certains auteurs serait obtenue dans des conditions bien partl-eulières (aninaux à jeun ou prétraltés au phénolaluitarl 1 Lepage et col1., L988). r,es aubstanees capables d'inactiver cette étape de ripo- peroxydation sont crassées en trois principarés catégôries: t Les ant,Lraôicalaires, capables de piéger les radicaux f -Les antllLpoperoxyôants, ayant la capacité d'interrompre I'auto-oxydatlon initiée par les lipoperoxydes dans res ripides lnsaturés. De plus ils ont ra-capaèité d,inhiber ra cycloxygénase contrairement aux antiradicalaires cl Cytolyse Cette étape finale, non spécifique au CCIr, Vâ conduire à ra destruction de la membrane prasrnique dé ra cerlule hépatique. Les radicaux ribres, de demi-vie brève, vont être respon- sables de la destruction du réticurun endoplasmique (nel. Les hydroxyperoxydes dtAcpr peuvent se décomposer en com- posés variés; leur derni-vie plus longue entràînera des phénomènes lésionnels prus tardifs et plus éloignés du RE. -120- Parmi les produits finaux de la LPO, Ia nalonaldéhyde joue un rôle majeur en dirninuant Ia fluidité membranaire, modi- fiant ainsi les interactions entre les diverses protéines. êIape Iré membranaire et des réactions enzymatiques. Les hydroxyalcènes, autres dérivés de Ia LPO, sont peut- être plus toxiques en se liant étroiternent aux protéines plasmatiques. IIs inhibent Ia division cellulaire par action sur Ia tubuline et les fuseaux mitotigues (Dianzani, L982) et inhibent aussi Ia synthèse protéique. LealtératLon de la ponpe à sodlum, pâr flux de ca** dans le cytosol, est souvent considérée comme I,événement crucial conduisant à une atteinte irréversible (Popper, L982î Younes et coll. , L984 i Agarhral, 1-984a, l-984b). Le calcium est réparti en un pool dynamique dans les mitochondries et Ie réticulum endoplasmique, êD un pool faiblement échangeable dans le noyau et en un pool de calcium insoluble non échangeable dans les mitochondries. La concentration du calcium dans lthépatocyte est 3 à 4 fois plus faible gue dans Ie rnilieu extracellulaire. I1 senble que les thiols, principalement Ie glutathion réduit (cSH) dans les cellules hépatiques, protège I'homéostasie calcique du réticulurn endoplasrnigue en protégeant les grggpes thiols de I'oxydation cruciale pour I'activité Ca---ATPase(orrenius et coll., L983) . Le caractère irréversible de cette altération été discuté par Mac Donald et coll. (1986) ainsi gue Lamb et coll., (L984). Ces derniers défendent I'hypothèse de Ia dégradation des phospholipides et I'incapacité à générer de nouveaux phospholipides comme étape cruciale conduisant à Ia nécrose. Selon Faris et Reed (L985), Ia réponse,çhinique induisant la mort n'est p$f une augrmentation du Ca-- résultant dtun flux de Ca--. La najorité des auteurs staccorflçnt cependant pour attribuer un rôIe crucial au Ca-- dans cette étape et Ie schérna de Younes et Siegers (L984) peut être retenu: ccl4 .LI LPO I {/ ÀÎTEINTE CELLUIÀIRE PRIMÀIRE REVERSIBI,E I V AUGMENTATIONDE I PERMEABILITE AU Ca++ I V ATTEINTE CELLUIÀIRE IRREVERSIBLE I v MORT CELLUIÀIRE -121- D'ailleurs I'importance des ions ca** a été démontrée dans Ie processus de régénération hépatocellulaire : la caÈécolamines, via des récepteurs gui utilisent les ions Cai* conrme messagers et ont besoin d'une certaine concentration en-ca** intracellulaire (Tsukanoto et Kojo, 1.987). Ces auteurs ont ainsi démontré qu'après hépatectomie partielle, le blocage des canaux calcigues par Ie vérapamil ou Ia nifédipine se traduisait par un baisse du taux d'ADN dans les cellules hépatigues en régénération; I'entrée de calcium dans 1'hépatocyte serait un événement essentiel de Ia régénération cellulaire. Le rôIe de Ia calmoduline dans les derniers stades de l'intoxication au CClo (nécrose) ainsi gue dans les processus de régénérafion suscitent I'intérêt de certains auteurs (Tsukamoto et Kojo, L987 i De Ferreyra et coll., L986, Fernandez et coII., l-986): cette protéine cytosolique est capable de former un complexe calciqtfç susceptible dtagir avec un grand nombre d'enzyrnes cat--dépendants et de Ies activer. rI a été recenment proposé divers mécanismes invoqués dans Itimpact du CCI.-: sur la membrane plasmique et Ie RE (Lepage et coll., 1988) l-) L'effet ûlrect ûu CCln décrlt au C.1.1.â. IL est insufflsant à lul seul pôur déclencher la nécrose. 2l L'effet dt à I'activation nétabolique du CCl4 au niveau du RE entralnant des anomalies de fonctions membranaires. 3) Les produits de Ia LPO , êr diffusant,inhibent certaines enzfrmes, dininuent la f luidité mernbranaire et agissent, sur Ies microtubules et les rnicrofilaments. 4l La perturbation de Ithoméostasie calcigue. 5) Ltaction du CClo sur Ia phospholipase Ar-Ca++- dépendante, Iocaliéée dans le RE et Ia membrane plasmique, fortement liée à Ia fluidité membranaire (Glende et coII., 1986). Vingt-quatre heures après I'intoxication, Iâ fuite enzymatigue et Ia LPO sont les plus éIevées in vivo, c'est pourquoi les dosages sont faits à cette période. Les substances capables de s'opposer à Ia nécrose cellu- laire sont intéressantes d'un point de vue thérapeutique car elles peuvent être utilisées après intoxication chinigue ou virale. - 1"22- effet direct sur la membrane NA?IHgyt Paso reouctase _ t cc14 -) ccrj -+Iiaisons covalentes RE réversibles avec protéines et Iipides membranaires. AGPT-P I I lipoperoxydation I AGPI+ C:f{CL: P' *02 POOI AGPI-P \ 1 *par accumulation de TG stéatose *par destruction du RE AGPT-E>I z7 *par inhibition de Ia I synthèse des phospholipides {/P ootrI \ libération nécrose *par destruction de Ia de nalonaldheyôe membrane plasmique (mécanismemal connu : altération de Ia pompe à calciurn?) FIGURE 3t : EFFEî DU CCI{ gUR LA CELIJULE RE : réticulun endoplrfnique; Àcpl : aciôes gras poly- insaturés, p : phosphofipidé de la nenbrane, p. : raaicat ribre des phospholipides, poo': radicar liËre peroxyde, POOH: peroxyde. -L23- Outre le glutathion, détoxifiant endogène, capable de s'opposer aux effets tardifs du CCIa, certains composés s'opposent à ra nécrose cellulaire ën stinulant re taux de nes ou phospholipides ou en diminuant leurs dégladations; certaines substances ant,inécrotiques, fàvorisant en outre la régénération hépatique, sont des inhibiteurs de Ia carmoduline et suscitent un intérêt tout particurier (De Ferreyra et coll., 1996i Fernandez et coll., 1986). La figure 34 résume, de manière synthétiÇtruer les mécanisnes d'action du cC14 sur 1a cellule hépatigue in vivo. c. 1. 1.2 INIOXrCÀTrON EXPERTUENTATJEAIt CClt rtMvo Pour étudier I'effet antihépatotoxique de lrextrait aqueux dtE.cannabingm, nous avons choisi, dans un premier temps, le modèle d'intoxication in vivo au CCl, chez le rat en nous efforçant d'induire une hépatite mïninale et reproductible, cornpatibte avec notre objectif gui est de proposer un traitement phytothérapigue. Lrextrâit aqueux d'E.cannabinum a été testé en traitement protecteur et curatif et a été comparé à un hépatoproteéteur de référence, la silymarine. Les dosages des transaminasesrde la bilirubine, des protéines plasmatigues et des triglycérides hépatiques ont permis diestimer Ie degré d'intoxication et drhépatoprotection. c.1. L.2.L ADUTNTSTRATIONDU TOXIQITE outre Ueffet direct du cclo sur ra ra nembrane plasmique, la LPO et les prenières innÏUitions enz)rmatigues apparaissent dès les J,5 premières minutes (Recknagel et coll., L983; Matsubara et co1l., l9g3). Une administration unique de CCI4 à dose suffisante entraîne dès ra première heure, ûne accurnuration de graisse dans re cornprexe de Golgi et le RE (Recknagel et choéhal, 1966; Périssoud, L981) . Dès Ia sixième heure, il y a apparition de gouttelettes ripidiques et hypertrophle des hépatocytes far gonfrement du RE. A plus forte dose, Ie CCIa conduitr ên L2 à 24 heures, à Ia nécrose, stade irréversible pouvant entrainer la mort de I tanimal. L24 La dose de CCI4, ch'ez }e rat, a été choisie en fonction de I'objectif a atteindre, c'est-à-dire une hépatite réversible. Des ections intrapéritonéales de O'01 a ml/kg ont été retenues *0101 à 1 ml/kg (Moore, 1983) tor25 mL/kg (Mac Donald, 1.986) 'tor l nlr/kg (Traiger et Bruckner, L976; Lindstrom et Ànders, L977',) t'Lrz ml/kg (Brabec et coll., L982i Fernandez et coII., 1986i De Ferreyra et coll., l-986) *5m1/kg (De Ferreyra et colI., L9771 Lors de la mise au point préalable du protocole, nous avons retenu la dose de O,3 m1-/kg, Ia plus faible dose présentant une augrnentation significative du taux de transaminases (Fleurentin, l-983). C.1. L.2.2 AIIALï8ES BfOCIIIUIQUES Nous avons sélectionné les paramètres biochirniques classiques reflétant I'atteinte hépatigue: Ie degré de cytolyse est estimé par le dosage des transaminases plasma- tiques, l'activité épuratrice du foie par Ie dosage de Ia UiliruUine plasmatigue totale, 1â synthèse protéique par Ie dosage des protéines plasmatiques totales. a) Doaage ôes transaninases plasnatiques Les transaminases catalysent le transport d'un groupement q-aminé dtun amino-acide sur un acide o(-cétonigue récepteur. L' aspartate amino transférase (ASAT) à localisation intracytoplasrnique et mitochondriale et I'alanine amino transférase (AIÂT) intracytoplasmique catalysent les réactions suivantes : ASAT Acide aspartique acide oxaloacétique + acide a(-cétoglutarique t + acide glutamique AIÀT Alanine -7 \ acide PYruvique + acide o{-cétoglutarique + acide glutarnigue -r25- La biotransformation du CCl, va être responsable de l'apparition de la nécrose ôetlutaire. Celle-ci se traduit par une fuite des ASAT et des AIÀT hors des hépat s, ce L'augrmentation du taux absolu des ÀSAT, également présentes dans les cellules myocardiques, musculaires, rénales et pancréatiques, sera plus éIevéegue celui des ALAT; mais ltélévation du taux de ces dernières sera plus spécifigue d'une atteinte hépatigue. Le taux d'AIÀT dans Ie sang circulant augrmente dès les 30 prenières minutes (Fracasso et coIl.rL980) et atteint un naximum L2 à 48 heures après I'intoxication (Teschke et, coll., 1983) . Le dosage, réatisé sur Ie plasma, s'effectue par une uréthode de cinétigue enzymatigue (Wrobleski et colI., L956) . b, Dosage de Ia bilirubine plasmatique La bilirubine est captée, conjuguée puis excrétée par les hépatocytes. Ltaltération des fonctions épuratrices des hépatocytes se traduit par une augmentation du t,aux de bil irubine plasmatigue. La néthode colorimétrique de Jendrassik et coll. (1938) a été retenue pour doser la bitirubine totale. Le taux physiologigue de Ia bilirubine plasmatique, pour 53 rats, varie de 0rB à L,8 ng/ml( Fleurentin, 1983). De façon à observer une augmentation significative de la bitirubine après intoxication, Ies animaux ont été mis à jeun aussitôt après t'injection du CCl4 (Fleurentin, 1983). c) Doaagê des protéines plasnat,içluee Le foie synthétise 1'albunine, composant majeur des protéines plasnatlques. Dès 30 à 60 rninutes après intoxica- tion, l'incorporation dtacides aminés marqués dans les protéines eet diminué (Slater, L978) et, dès la deuxiènre heure, Itexcrétion des protéines est ralentie (Fracasso et colI., 198O). Nous avons utilisé Ia classigue méthode du biuret (I{eichselbaum, 1946} . Le taux physlologique moyen des protéines plasmatiques, sur 77 rats, est de 63 + 6 g/L. -L26- Nous avons choisi dteffectuer Ie dosage 48 heures après intoxication, car Ia diminution du taux de protéines est eurentin, L983 d) Dosage des trl.glycéridee plasmatiques ([c) Les triglycérides, réserve énergétique de I'organisme, sont synthétisés essentiellernent au niveau du foie ori ils sont aussi catabolisés en acides grasr êu cours de la lipolyse. Une atteinte hépatigue peut entrainer une perturbation du métabolisme lipidique, gui évolue en dégénérescence graisseuse avec accurnulation des triglycérides dans les hépatocytes. Ce phénomène, appelé stéatose, précède dans Ia najorité des cas la nécrose. L'intensité de Ia stéatose est détectée ar Ie dosage des TG hépatiques. L'intoxication au CCI^ atteint les nitochondries et inhibe, dès la prernière heure,' la B-oxydat,ion des acides çtras : ces derniers stirnulent Ia synthèse des TG hépatiques dont le taux atteint un maximun 24 à 48 heures après (Klaasen et coII. , L969; Gravela et coll., L9791. La stéatose induite par Ie CCIa est aussi due à Ia dirninution des VLDL et à Ia perturbatiôn de Ia synthèse protéigue ainsi gu'à L' altéra- tion des coenzymes irnpliqués dans Ia régulation des réactions enzymatiques. La stéatose diminue dès 72 heures et les altérations sont réversibles. Le jetne est indispensable pour obtenir une stéatose suf f isante (Perissoud, 1981; Siegers e.Eco.Lt. , L9821 . Après préIèvernents sanguins pour les divers dosages plasmatlques, les rats Eont Ênogthésiés à I'éther qui ne perturbe pas I'accumutatlon des TG hépatiques (Cagen et Klaasen, L979, Périssôuûf 1981). Le dosage des TG s'effectue, après extracÈion des fragments hépatiques et saponification pour libéer Ie glycérol,par une méthode enzymatique (Schettler et Nussel, L9751. Les valeurs des TG hépatigues chez le rat sain, relevées dans la littérature sont les suivantesi * 11 + 3,5 mg/g de foie frais (Perissoud, 1981). * 7,oB + 1,6 9 mg/g de foie frais (Butler' 1961). * 9,23! or27 ng/g de foie frais (Beaux, 1984). -tzl- c. 1. 1.3 LEg ANTIHBPATOTOXIoUES C.1.1.3.1 Les nolécu1es ôe syntbèse Les modèles d'intoxication expérimentaler êu CCla notam- ment, ont pernis de rechercher et d'étudier des ôomposés capables se s'opposer à la biotransformation des toxiques. Leurs rnodes d'action sont divers : * Inhibiteurs ôu Cytocbrome prrn : cystarnine, diphényl-2-2 valérate de diéthylarnino-z-étËil (sKF s25Lr, chlorenphénicoI r Àntilipoperoxyôants, antiraôLcalaires, conposéa anti- oxygène : phénolthiazine, -tocophéroI, gallate de propyle, N-N- diphényl para phénylène dianine, chloramphénicolr pro- méthazine I ÀntlnécrotLques : propyl thiouracile, sKF 525 A, cycloheximide, diéthyldithiocarbamate, orotate d'amino-4- inidazide carboxamide- 5 (AICA), iniprarnine, trifluopérazine, cystarnine, cystéine * un mode de protection peut être acguis par stimulation de la synthèse ou par prévention de Ia baisse du glutathion hépatique comme avec Ia N-acetyl-cystéine (Ioannides et coll., l-983; Corcoran et Wong, 1986 ) ou avec la cimétidine (Pederson et coII. dans Corcoran et Wong,1986). C.1. 1.3.2 ltolécules drorlgl.ne naturelle Parmi les principes actifs de plantes antihépatotoxiques ayant fait l'objet de travaux pharmacologigues intéressants, Ia sylinarine et Ie (+)-cyanidanol-3t (+)- catéchine I bénéficient d'une littérature abondante : ces deux molécules sont devenues des spécialités pharnaceutigues utilisées dans Ie traitement des hépatites virales et de I'a1coolisne. Ia sillmarine, extrait de Silvbum marianum Gaertn. est un flavolignan constitué dtun rnélange de trois isomères structuraux, la silybine, la silydianine et Ia silychriEtine. Elle protège in vivo de I'0(-amanitine, de la phalloidine, de la galactosamine, du cCla et du thioacétamide. Ctest un st,abilisateur meriibranaire et un inhibiteur de la lipoperoxydation, inhibant Ia formation d'agents peroxydants dans les mitochondries et, Ies microsomes hépatiques. En outre, la silymarine induit Ia formation de glutathion hépatigue (Valenzuela et coll., 1e8s). -tzg- Le cyanidanol est un flavonoi.de, rencontré dans de nombreuses espèces végétales, capable d'inhiber Ia on du çtrutatnr-on lipoperoxydation. fI stest montré hépatoprotecteur sur des modèIes animaux utilisant le paracétamol, Iê ccld ou Ia galactosamine conme toxiques. C'est un antioxydant qui inhibe les effets cytolytiques des radicaux libres générés par les systènes enzlmatiques mitochondriaux et ôytosoliques lors d'intoxications hépatigues (Hackett et coll. , L984, Périssoud, 1981) II a été utilisé avec succès comme Ia sylimarine en clinique humaine contre les effets de Italcoolisme (Morgan, L986). II est actuellement retiré du commerce. La rnédecine traditionnelle orientale, bien étudiée, a fourni la najorité des autres espèces végétales mentionnée ces dernières années dans Ia littérature (Hikino ' 1984î Handa, l-986; I{agner, L980) . Les nécanismes d'action de ces nolécules antihépato- toxiques, à structures chinigues variées, restent mal connùs et souvent hypothétiques. 11 ne semble Pas y avoir d'unité dans la relation structure/activité. Wagner (t-980) fait remarquer çlue Ia grande rnajorité de ces molécules sont des dérivés du phénol ou du phénylpropane. r30 - C.L.2 INFLUENCE D'UN PRETRAITEIIENT ET D'UN POSTRÀITEUENT Drltll EXTRAIT ÀQI'EI'X D'8. cannabinum L. VIS-A-VI8 DE IJ'IITTOXICATION EXPERII{ENTAIJE ÀU CC!. C.F,BZ IrE RAT C. 1.2 . 1 I,IATERIEIT ET UETEODES Les rats pesant de 250 à 300 g, nourris et abreuvés ad libitun, reçoivent une injection I.P. de CClo à 6Z (Rectapur, Prolabo, Fr. ) dans l'huile dtolive (F. H. O., Marseille, Fr. )sous un volume de smlr/kg. Deux hépatoprotecteurs de référence ont été choisis : * Ie nébulisat de Silybum marianum Gaertn. ou chardon-marie (Expansion aromatique française, Ivry/Seine, Fr. ) . * le principe actif pur des graines de S.marianum, la sillnnarine (Roger Bellon, Neuilly/Seine, Fr. ) , représentant lOt des graines séchées. PrétraLtement I.P. : E.cannabingn (25O, 50O, 1-000, mg/kg), S.marianum (1000 mglkg) et Ia silymarine (l-0O mg/Rgl sont injectés en f .P. sous un volume de 2nJ./kg dans NaCl O,92, trente minutes avant Ie CCI.. * PrétraLtenent per os: E.cannabinum (500, 10OO llog,/kg) est adrninistré sous un volume de znl/kg dans NaCl Or98 par gavage à I'aide d'une sonde gastrigue, 90 rninutes avant 1e ccl4. * Pogt-traitenent I.P. : E.cannabinum 1-000ng/kg est injecté sous un volume de 2 mL/kg dans NaCI Orgtrtrente minutes après Ie CCln. Dans tous les traitements, uD groupe trplaceborr intoxiqué reçoit un volume équivalent de NaCl, êt un groupe de contrôle non intoxiqué reçoit I'huile d'olive sous un volume de snl/kg Les animaux sont ensuite rnis à la diète et, 24 heures après Itintoxication, ils sont anesthésiés legèrement avec une injection intramusculaire de 100 mgrlkg de Kétarnlne (Kétalar, Parke-Davis, Fr. ) de façon à recueillir 150 lltl de sang du sinus rétro-orbital dans des tubes en plasti'que de 1,5 ml prélalablernent héparinés (Héparine Fournier) Le plasma ast obtenu par centrifugation (3000x9; 5mn) et les dosage de I'activité enzymatique des AIÂT, dê la bilirubine, des protéines sont effectués à I'aide des kits de dosages suivants : kit GPT opt. ref 16L071, kit, protéines totales ref L2428I, kit bilirubine ref L249L9 (BoerhingêÊt Darmsdadt, RFA. ). -111- Les lectures se font avec un spectrophotomètre automatique à double faisceau (Uvikon 81-o, Kontron, RFA- ), à 25"C et à 34O nm pour les GPT, 578 nm pour la bilirubine et 576 nm pour ].es protêlnes. . DosaçIê ôes trlglycériôes plasmatiques : la méthode a été mise au point dans notre laboratoire par Beaux (l-985). Après prétraitement avec ltextrait aqueux d'E.cannabinum à 5Oo mg/kg, intoxication au CCI, et dosage des AIÀT -oeuxpfasmâtiâU"=, Ies rats sont anësthésiés au diéthyloxyde. échàntillons de tissus hépatiç[ues (50 à 10omg) sont préIevés du lobe latéral gauche: un à la-périphérie, ltautre au centre du lobe. Ils sont ensuite lavés avec NaCI or98 à ooC, séchés sur papier filtre, pesés et stockés à -2O'C en tubes de verre. Le dosage des TG est déterrniné par extraction et saponification pour Iibérer Ia partie glycérol des TG. Les fipiaes extraits des échantillons avec un mélange chloro- folme-néthanol (223 v/vl pendant 8 heures au minimum. Les échantillons sont enlevés et Ie solvant d'extraction est potasse évaporé à 7O'C au bain-marie. On ?joute 0r5 ml de alcôotigue 0r5 N aux résidus lipidiques secs gui sonÈ lncubés-3O minutes à 7O'C. Un rnl de sulfate de magnésium Orl,5 M est ajouté dans chaque tube. Après méIange les tubes sont centrifugés (3000x9; LO mn, 20'C). Les TG sont déterminés dais 1è surnàgeant par Ie kit de dosage des tri- glycérides ref L25o32 dans lru. v. à 365nrn (BoehringêÎ, Darmsdadt, RFA). e.L.2.2 SÎATrSTIQUES Une transfornation logarithmigue est appliquée aux valeurs des ALAT plasrnatiques (Heath, L9671- Ap1ès analyse de variance, Iê test xtrt de Student est ut,ilisé pour comparer Ies noyennes. Les AIÀT sont exprimées el unités internâtionales (1JI/L de plasma, Ia bilirubine et les protéines en rrrg/i et les fc nepatiques en mg/g de -foie irais. L,es pouicentages de protection sont calculés selon Ia formule suivante, où les valeurs moyennes des ALAT des animaux intoxigués sont retranchées des valeurs moyennes rencontrées chez les animaux sains (2O UT/LI z ( t (AlÂTtraités-20) - (AlÀTplacebo-20) l71alÀTpracebo-20) I )xl-oo -r32- C.1.2.3 RE8ULTAT8 al Influence ô'un traitement préventif drextraLt aqueux drB.cannabinum L. Les résultats sont présentés dans les tableaux 22 à 24 et à la figure 36. Une injection de cct4 0r3 mLlkg induit, 24 heures après injection I.P., une âugrmentation significative des ALAT plasnratiques par rapport au groupe de contrôIe(huile d'olive). * le prét,raLtement, I.P. (tab. 22) avec I'extrait aqueux d'E.cannabinum à 25O, 5oo, I-OOOmg/kg induit une diminution significative des ALAT plasmatiques (resp. 7L, 82 et 738). Un effet identigue est obtenu avec le nébulisat de S.marianurn à LOoo mg/kg (7LZ') ainsi gu'avec la sylimarine à 1o0 nglkg (77*r. II n'y a pas de différence significative entre les 3 doses d'E.cannabinum et entre E.cannabinum, S.marianum 1-OOOmg/kg et Ia silymarine lOO mgrzkg. L'extrait açlueux d'E.cannabinum (250 et ]-000 ng/kglainsi que Ia silymarine n'ont pas empêché I'augrmentation des taux de bilirubine et de protéines plasmatLgues. L'extrait aqueux dtE.cannabinun à 500 mg/kg n'a pas ernpêché I'accumulation de TG hépatigues (tab. 231. . Le prétra{taoeat oral de l'extrait aqueux d'E.cannabinum (5OO et lO00nrg/kg) est inefficace sur Ia fuite des ALAT (tab. 24'). b) Influence d'un post-traitenenÈ de I,€xt,ral.t aqueua drB.cannabLnum Ir. (tableau 25 I L'extraLt aqueux d'E.cannabinum, adninistré 3o rninutes après Ie CC14 à LOOOmg/kg, dininue le taux des AIÀT plasnatiquesl Par contre, S.marianum à 10oo ng/kg ne présente pas dteffet curatif. C.2.{ Àt{ALfgB DEg RESUITTÀT8 L'extrait aqueux dtE.cannabinurn inhibe Ia fuite des trans- aminases lorsqu'il est administré en l.P.chez le rat 30 minutes avant Ie CCI'. Les doses de 25O, 500 et 1000 ng/kg sont efficaces sans gu'il soit possible de rnettre en évidence une relation dose/ effet. -I33- H rl F{ !g nrl H EI Ur oo (, oo (\ sf cî +l +l +1 +t +l .** Fl fr F{ \otrl * o ro cfl F{ ('t \o rf) n lr)rO +J d (, +J o o o o D FT {J d z \o o H \ (r) E CÀ \(V) z tr F{IY)O \ ivt{o o H - r.û H .0 \(1 r I \cî o b i cî | ôl ôtl (.llôrl .cl H P o\ (') c! f- Or o d tr E \\ o C' ôl r{d (\o tU H E{ vv E vv oX P.. H H 2 2 A +) H H gl sf @o o\ o EI sil\ ôl \{' t ôt\ @^ F{ H D \(r) rlJ) \(\ rS É H Ç r(\ tl z n N F{l Gllcrl C\I c{l a É H (tl Fl t- f- (t rl @ \\ F' H o F{ r{ Fl rl +J tr vv t{ o o FI çt{ H É'À çL D :.t lru d z ^ t{ H ldF A ^Cî tl ('I @* o\ o.t|r) o* co O(n @ t{ cl (! f-{. ( o* m o\* \O Or* r{ or (Yl (d o ol f-ôl I @ F{CO I OF{|fl I OF{@ | o (\ (f'c 9{ GI x ro FIF- n C\I f- sf D ôl ôl I I c\t c! tr) | |r)n o\ | o.|('| F{ N\o@\0 nôt F{ \O -f c! \o r- I I o F. d æv nv (\v (\v n o H E r{ Fl r{ sf F{ oil .r{ E{ o +J 2 H X .d H Ê ED o T É H É oo ro ro H b lo F{ r{ F{ r{ H o o-HË â H z H z a H o z Ê +J D Â É . o À }| tn É É ra o E H lo o o o o a C' a ttl to o o o o E 2 ôt n o o F{ H H E D o F{ r{ É Fl E{ +J z E (, +J Él o : 7l EI ul .\| tl o o ô| 'dl 'ËlEI É o EI .rl É D rtl o o FI h o É n .ct EI 'il| IU t{ H o o É .o É ol o o o ç{ tr nt (, It tU Fl T{ É H Fl ..{ H cl P{ ;| g. I| g{ ;l o o _134_ a oFI H â x Fl D É FT E{ H H EI .l rt F oil d H N ro VI É o \o lr) 9.t tr F{ +l +l +l N sf a ttr (\ !t b \r sf : F{ É o\ r{ F.l C' (, (, E{ +J H É +Jo H o 2@ 4J .{H >l' .r r(o| o H ôl G' sf o oÉl F{ C\ ôl to .q Êf .{ I I I o H- H (r) ro (vl o DO DEI r{ (\ d z !t HÉ E{c| Ê EÈ o \r \o ôl @ (\ oE{ 14s +J (rl.{ o É F{ Eld 5 ru .rllElà ÂE{ +J t{ rilE x o Elr p P{ ifl Fr .( 9{ (Ip Ért tU .lol ÉH l{ EIH AZ rfl tÉ h crÉ tû F. 9À g{ zrlFIH o Êt .o .r{ HH +J HO (t HH o 14Ê ÊlH lH HC' H)| É ÊlÉ Ut A(' H Ur o 2Ê FX DH o\ o {J o É cl rf) o 8B É E o (, a 2 tt H .Fl D +J É o F. z Êl +J H F] trt H +J at D l/l ('| E{ o c| - o H frl É D . È1 o o É E o o .ot{ H E{ É FI H E{ U q{ z ${ aE{ â o É Él o A o - t-35- @ H E{ dp dp It u) sr z (vl (rI HE{ 2,â o o|d rt E ÈN ûnÉH oo EO HH tft F{ op \o^ (\ r- >o r.{ f. \O lr{ H r{o\ r{l H tl rl -f ÉE{ p F{ ôl Fl Or ÉÉ (fl (') trr- E{ @ (rt o É sf sf f. \O ÉlFtÉ F. 14 f-lfl F{ F{ .rll n|E{ gts x É1.{ D 1flr É Tl" - Hlx H rp â êÉ rd E{ Él E* E HÉ É Ëc g Hlt HO o ôtN ôt ôil .( z r{ F{ ÉÇ HFI É !t N D r( EI H H '51çl fl rt 2 il m odl  EH Ér çl E{ H Fl cl H odl '{:l â s E{ AHI Ëfl -136- n o F{ o (,H H tr) tn VI C'O E +l +l 9{ F o ro * DE{ cr Ot .{: H e.P |n zn oz HH = Htr +J i!D a)û +, HH UI XÉ o OH +J zHtr À ('rNr- HH t o br o !û(fl$ = o E !t tl o Hr ON n Ol E{ Fr o AÉ z rl Oil Étt trH A D Ê H (\ FX-H;a rl sf \f \f +J H EI r(Y) o tr l' ôtl (\ cî tl tl N CO I EEn f. a F{ {lt .'{ sËË +J O H .Êl o F{ 9{ ^ AA P{ n3ÈH \oo o@ rd D (r) *o \f\il @00 t{ EI \o \o F{m sf(Y) ll H Ç o.ttor\ ôl colôrl (DF-fsf t{  N c'lI F{l sf ôil tf N \o tô \o r0 (It É o (vl mf-NF vv A{ d @ (\ ôl F{ fiEI (\ vv rl o X p +, ËËn r! o fi oo oo oo EËr!r Fl Fl r{ r{ F{d OE E É HEI IÀ Ut c, :'l ZA 0l H rll D"{ {J tl ttl Ul qÉ F| rtl Hra Eil a\ g ol 8g , ttE E urê N +J IU EÉIRt'l +, È..{l Él o H Él o o E{nâl gl z 'Ël EI É o E Él .Fl Ê tll T odl o ctl t{ o rtl H .q cl 'il| tlt t{ E{ oÉl 6 Ê .o H o rul >r (+{ ;| (, ol q{ à â Fl ol H 9{ frfl â;1 o _13?- oz H H É (., ** {.* ** !|| ^^ N *.r co sf ^ f- sf F{ l'- r{ ^ôlôl ^lOr{ o\ll E{ C-(vl('| F{ sf (\ a H c{ll lo\r- É a lolsf *JF ** # Post-traitenent r* 100 I .l DosEs Dig/Rg FIGURE 36 ! ÀCTMTE AIITIEEPATOTOXIQITE DrE.cannabinun, DE E.narianum EI' DE LA SILYUARIIIB, ÀDUINfgTREg 30 UINIttrEg AVÀllT ET 30 !|MUTES ÀPRES IN|IOXICÀIIION AU CC14' gUR IrE TAITX D',ALÀT PLÀSUATIQUES CEEZ IrE RAT Différences statistiqueuent significatives par rapport au lot rplacebotr : * ps0r05 * * n5o,or *Jr * Pso,ooL _13g_ Les pourcentages de protectlon obtenus sont du même ordre de grandeur que ceux obtenus avec la silyrnarine à la dose équivalente à la même teneur en son principe actif, la silymarine. Par contre, ni E.cannabinum ni Ia silyrnarine nront protégé l'animal de I'augmentaton de la bilirubine plasmatique ni de la baisse de Ia synthèse protéique. De plus E.cannabinum ne s'est pas opposée à I'accumulation de triglycérides hépatiques. Administré 30 minutes après re toxJ-gue, l,extrait aqueux à 1-oo0 mg/kg est protecteur vis-à-vis de Ia fuite des ArÀT mais res protections obtenues dans les rnêmesconditions, avec S.marianum 1000 mg/kg et avec la silynarine à lOO mg/kgr Dê sont pas significatives Administré par voie orare 90 rninutes avant re toxique, l'extrait aqueux est inefficace. cette inactivité èst sans doute due à une mauvaise absorption du produit ou à une dégradation enzymatigue digestive. Le mêne probrème a été rencontré au laboratoire au cours de rrétude drune plante à activité psychotropê, E.californica. Lreffet était perdu par la voie orale, mais persistait par voie rectale-. Une arnélioration de I,effet par voie oràte était obtenue avec I'utilisation d'un excipJ-ent approprié (Rottand, L9g8) . Les doses efficaces sont du mêmeordre que cerles retenues dans la posorogie traditionnelle et cerres étudiées pour leur actions cholérétiques : * Leclerc dans Fournier (1948)recomrnande15g de feuirres sèches pour 2Oornrd'eau soit 2somg/kg pour un adulte de 60 kg. * r'étude des propriétés chorérétigues étudiées au chapitre précédent a révéIé une efficacité maximale à 250 mg/k9, l'efficacite persistant à 5OOet 1OOOmg/kg La dose de sirynrarine a été choisie dans ra tittérature. Elle protège totarement Ia souris d,une intoxication à ra phalloidine et à r'o(-amanitine rorsqu'elre est injectée en I.V., suggérant, un effet sur la membraneplasrnique : Ia phalroidine réagit avec res microfiraments de rtactine et l'd-amanltine inhibe 1, ÀRN polymérase B dans Ie noyau (tfagner, L980). Adninistrée 16 heures avant Ie CCl,, le slllmarine stinure le grutathion hépatique (varenzûera et col1., 1985). rr a été démontré qu'erle stirnulait ra synthèse protéique et Ia régénération cellulaire en cas drintoxication à la galactosamine (wagner, 1980). Nous ntavons pas retrouvé cet effet protecteur en prétraitement I.p. Ceci est à rappro- cher des travaux de Willians et priestly (L973) qui n'observèrent aucune activité de Ia silyrnarine 1OOrng/kg per os vis-à-vis d'une intoxication au cCln L mL/kg per os. _L40_ Il est très fréquent qu'un même produit se révèIe actif ou inactif selon Ie protocole ernployé (dose, toxigue utilisé, temps et voie d'injection). CeIa a conduit certains auteurs à renettre en cause la validité des résultats d'autres auteurs mais iI faut plutôt rechercher Ia cause dans Ie protocole expérimental. Ctest d'ailleurs en confrontant résultats positifs et négatifs que Iton approche du mécanisme dtaction d'un produit. Àinsi notre voie d'injection (I.P.) et Ie toxigue que nous avons utilisé (CCIÂ) sont différents de ceux enployés dans la plupart des trariaux de I'équipe de !ùagner (Vogel , L977). Ceci peut expliquer la protection obtenue seulement sur Ia fuite enzlmaLique. Par éontre, I'absence d'efficacité 3o minutes après est corréIée avec la littérature : Ia silyrnarine n'est active guten administration prophylact,ique jusqu'à L0 rninutes après Itadministration du toxique. En effet, ctest un stabilisateur rnembranaire appelé aussi cytoprotecteur (Va1enzuela et coll., L985)ainsi q'un antilipoperoxydant et sa présence est indispensable au moment de f injection du toxique. P ropr iétéda n t i /aép a toto æ tq t rc,t A'8. cannabinttm L. - C.2. I,TISE ÀU POINT D'IINE :TECENIQUE D'EVÀI'I'ÀTION DE L'EFFET ÀIûTIEEPÀTOTOXIQIIE DtE. capnabinum IJ. IN VIVO CEEZ IÀ SOURIS -141- c.2.1 ÀNAITYSE BIBTTIOGRÀPnIQUE l,e modèle dtintoxication expérimentale au CC14 chez Ie rat, bien qu'ayant fourni des résultats intéressan€s, reste un test lourd à entreprendre et relativement coûteux. I1 a paru judicieux de rechercher dans la littérature un autre modèIe expérimental in vivo plus facile à mettre en oeuvre et moins cotteux. Le modèIe utilisant la souris a retenu notre attention bien qu'elle soit assez peu utilisée in vivo pour 1'étude des phénornènes dthépatotoxicitérà tort pourtant car cet aninal présente deux avantages : * Elle est très sensible aux toxiçIues hépatiques et répond à de très faibles doses. Ceci explique d'ailleurs son utilisation dans les tests de carcinogénèse car son foie est atteint de manière privilégiée et les résultats sont reproductibles (Newbrene, L9821 * Moins cotteuse gue Ie rat, elle permet d'effectuer un plus grand nombre de tests Relativement peu de publications font référence à son utilisation pour Ia recherche de substances hépatoprotectrices vis-à-vis du CCI,. EIle a pourtant été utilisée avec succès pour l'étude dés propriétés hépatoprotectrices de la sylimarine (Vogel, L977'r. Les doses de ccl. utilisées en injection intrapéritonéale, pour obtenir des-intoxications suffisantes, sont très variables : *o,o1 nl/kg en I.P. (Tien Tung, L9771 *or15 nL/kg en I.P. (vogel, L977, *or5 à r- nl/kg en I.P. (Miranda et coII., L983) +tm}/kçtr €fl, I.P; tt+iÏ+iams et ,#}r +97tI *o,o37 nl/kg P.o. (Hikino @Lt. r L9791 *s nl/kg en I.P. (Fraga et coll. ,L9871. Selon Berger et coII. (1987), lsplrzkg sont suffisants pour induire une libération enzymatiqùe. Nous avons dtabord tenté dtadapter à Ia souris Ie rnodèIe utilisé chez le rat par Vogel pour tester la sillmarine (L977) car Ie test avait été développé et optinisé au laboratoire. Le test consiste à estimer le pouvoir antihépatotoxique d'une substance par la réduction du temps de sonnreil induit par un barbiturique chez l'aninal préalablenent intoxiqué au CCIÂ. Les barbituriques exercent un effet dépresseur général sur Ie systène nerveux central. Certains d'entre eux comme l'hexobarbital ou le pentobarbital sont nétabolisés par te système hépatique NADPH-cytochrome PaSO réductase-cytochrome PaSO (figure 3s) . -L42- PB = PENTOBARBITAL PB + CYT. P 45o (re#) I I tlxArro* DUPB suR LE P 450 T cYT. P 45o- PB (r'e#) FLAVOPROTETNE IIADP I I nnpurrE \ I REDUcrroNDU P 45o 1/ rl + l' NADPH FLAVOPROTEINT cYT. P 45o - PB (re#) H+ OXYDEE I CYTOP 45O REDUCTASE I aIxATIoND'.*YGENE I o2*--'. + \ orr cYT. P 450 -PB (Fe#) I I ^ oxYDATIoNDU PB {r CYT. P 450 PB-OH (Fe++l FIGT'RE 35 s ROI,E DU CyIOCEROIIE Pr E^ DÀNS LE IIETABOLISIiE PENTOBARBITAIJ (PB, D,ÀPRE8lidhor et colI. (19?e) -143- Leur lipophilicité favorise leur affinité pour les zones hydrophobes des protéines-eÈ du cytochrone Pn (Tateoka et t. , L9871. Chez les animaux prétraités au-ëëIr,a8 du fait de la dégradation du cytochrome Pa"n hépatique, Ie temps de d sommeil induit par le pentobarbitâI-est aucrmenté.augurenté. Si l'animal est prétraité avec un antihépatotoxigue (conme la sillnnarine par exemple) capable d'inhiber Ia biotransformation du CCla, Ie teurps de sommeil sera dirninué par rapport aux animaux intoxiqués. Vogel développa ce test chez le rat en injectant la silymarine par voie I.V. et 1'hexobarbital par voie orale. Mavier et coll. (L983) utilisent aussi Ie rat et choisissent I'hexobarbital en injection I.P. Dans un premier temps, nous avons adapté le test optimisé et standardisé au laboratoire par Rolland (L984) en intoxiquant auparavant les souris au CC14. En effet Ie pentobarbital est préféré par la plupart'des auteurs (Rolland, 1988). Après avoir déterrniné Ia dose de CCI. à une dose suffisante pour augnenter significativernent Ie ternps de sonmeLl lndult par Ie pentobarbital, Itextrait aqueux dtE.cannablnun a été testé aux doses dont I'efficacité était significative dans l'étude des effets cholérétigue et antihépatotoxique chez le rat. Puis nous avons donc entrepris de développer Ie modèle dtintoxication expérimentale au CClo chez la souris dans Ie même esprit que celui précédemment choisi chez le rat au chapitre c.L.2 de manière à pouvoir comparer aisément les résultats. Le seul dosage des transaminases plasmatiques a été retenu pour estiner Ithépatoprotection. Àprès avoir recherché la dose de CClo nécessaire et suffisante pour induire une intoxication'du même ordre de grandeur çlue celle obtenue chez le rat, Itextrait agueux d'E.cannabinum a été testé en prétraitenent et en post-traitement. La silynarine a été utilisée conme antihépatotoxique de référence. tM- e.2.2 INFLUENCE DE IrrBXTnÀIT AQUEUXDrEggaEE@ L. gUR I.I'INDUCTION DU TEUPS DE SOIIMEII.. BARBITURI9UE C.F,BZI'A gOURIg rtrToxrQUEE AU CCl{ C.2.2.1 IiATERIEL BT UETHODE8 Les souris nourries et abreuvées ad libiturn, reçoivent les injections par voie I.P. sous un volume de Or1-nl/109. :tLe CCla- (Prolabo Rectapur, Fr.) est dissous dans l'huile dtolive (F.H.O. , Marseille, Fr. ) *Ltextrait agueux dtE.cannabinum (883) est dissous dans NaCI O r9Z *Le pentobarbital (Nernbutal@, Abbot, ) est injecté à Ia dose de 40 lrnrg/kg; à cette dose, lê pentobarbital induit un sommeil voisin de 30 minutes. Le mesure du ternps de sommeil est I'intervalle de temps entre le début du sommeil et Ie réveil. Le début du sonmeil correspond au moment orf les souris acceptent Ia position en décubitus dorsal. Le Èemps de réveil étant estirné au moment où I'animal quitte cette position après trois tentatives de remise en position initiale. a) choix de Ia dose de CCl" et du délai entre IrLntoxleatl.on et lrinjection ôu pentobarbLtal Des solutions de CCI4 à Or25 et 0,5* sont injectées à des temps différents: 24'heures, 60 et 30 rninutes avant f injection du pentobarbital. Un lot de contrôIe reçoit I'huile d'olive sous Ie mêmevolume. b)recbercbe drune Lnf,luenae dc !.rextrett aqueur deE.cannabl.nun aur tc teqla tte comell inôult par Ie pentobarbital ohet les soutl.g Lntoxtquées au cclo Le CCta est lnJecté à la dose de 0,252 et I'extrait aqueux est teËté aux doses de 0, 25O, 500 et 1000 mg/kg 60 minutes avant Ie CCI,. Le pentobarbital est injecté 60 minutes après. Un loË de contrôle reçoit I'huile d'olive sous le même volume. C.2.2.2. EXPRESSION DEg RESUIJTATB ET STATISTIQUBS Les moyennes et erreurs standards (8.S.) des temps de sommeil obtenus pour chacun des lots sont exprimés en secondes. r45 _ Les pourcentages d'augrmentation du temps de sommeil par rapport au lot de contrôle non intoxiqué ont aussi été représentés. Les valeurs ont été conparées d'abord iance puis à l'aide dtun test non paramétrigue de Mann-Whitney-I{ilcoxon. C.2.2.3 RESUITTATS Tous les résultats sont représentés sur Ie tableau 26. al choix de la ôose et du ôéIai drlnjection Les doses de OrL25, O,25 et 0,5 Z, injectées 24 heures, 30 ou 6O minutes avant Ie pentobarbitat, ont été testées. *Les souris ayant reçu Ie CClo 24 heures avant le pentobarbital ne se sont réveitlées que 24 heures plus tard. *Chez les souris ayant reçu les doses de O,25 et 0158 30 minutes avant le pentobarbital, 1ê temps de sonmeil a été augrmenté d'environ 30* *Injecté 6O rninutes avant, Ie ccla à o,25 et 0158 augrmente respectivement de 4L et 7oZ le terips de sornmeil. b) Lnfluence de lrextrait aqueux dtB.cannabinum L'extrait aqueux a été injecté 60 minutes avant le CCln à o,25*. Aucune différence st,atistiquemenÈ significative n'a été constatée entrc les lots traltés avec E.cannabinum 25O, 500 et lOOo rmlE/kget Le lot intoxigué. C.2.2.I AIIALYSE DE8 RESULTATS La dose de CCI. injectée 60 rninutes avant Ie pentobarbital augimente de manière significative Ie temps de sonuneil induit par Ie barbiturigue. Injecté 24 heures avant, le ccla produit des altérations hépatiques maximales et Ie cytôchrome Po",.' est incapable de cataboliser Ie pentobarbital-Èlont Iteffet se prolonge. I1 faut remarquer que plueleure tests effectués aux mêmes doses de CCI, (et nrêrneà O,L25+) n'ont pu être menés à bien car les animâux ne se réveillaient gue plusieurs heures après I'injection du barbiturique. Néanmoins I'extrait aqueux a été testé et aucune protection vis-à-vis du ccla nta été constatée aux doses antihépato- toxiques chez Ie-rat. -L46- dp dp dP dp o(\toc{ \o lf) $ c{ H D È u ol H rd H Êl t! -l x 9{ o -a H Qa oo Fl F{ Fl o o |rl +J Ë HO ro\o@ Nto1r n$@ro\o o OY f-FF{ dF('| o\F{Osfsf UI Ëtt f{NFl N rt c\t NOlFlsfsf .o tt ?l oo +r +t +l +t +t +l +t +t +l +t +l 4J A. f.@\O sf\oo @OO\O-f ..{ XFr sf@sI \otn@ c0\oc{or@ IU Ë8 Êl +l (VlF.f. rlOro\ l. CO l- sf rl t{ E{É r{dF{ Fl Fl rl rl (\ (\l N ôl +J Ë? a x +J Hs D o EH .(| r''l H- Hg ÉH o AZ l{ .É p sH É 9à nlr)n nlr)n ntrlrt|orr o flaâl o -=ta =tH .r{ T +J ilg r{ rd (, o C' .F{ Fls dp dp dP dP dP o\P q{ E ndp |n |r)lnnn .F.l ôt rft Ntrl ôt N ôl f.il o \\\\ É ;tÉ I ooo ooo ooooo Ul Àg o +l HË z É Eln o o ÉtD H É =ol H2 o ::H r{: O u 2É OH ()' 5D HH .r{ ËE{ XC' +J =H OD u =Ê HO .Fl *.û zzA +, -É HHH tU r\H +, àA ooE o Prr ÀH HHO tr o -Êl ÉeCl É É o Hll o o É (.1 \o o $Ér .oh Ës tti Ul Ut (H XA1A1 q{ E ààè FIEIE 6 Ë ooo o rooo uÉ ô!tr}o o ; E{ F{ a N 2 Él '{ H ul D T Él 'Fll  E F{ Er FI frl H .Al Ë H r-l Fl FlOntl tr o o oÉrÉl  â É É ÉHÉI H H E{ Ê{ HUdI E z 2 û o o 3S'll F. o o U A f'fl _L47 _ Le nornbre d'animaux par lot est trop faible (10 aninaux auraient été nécessaires) mais n'ont été présentés que les tests où tous les animaux se sont réveillés en un temps par lot, n'ont pas été représentés car une partie des animaux nettait plusieurs heures à se réveiller, rendant impossible tout calcul. Devant cette grande irrégularité de réaction à Itintoxication au CClo c};.ezla souris, nous avons décidé de ne pas poursuivre ce test. Malgré tout, nous pouvons supposer que t'extrait aqueux dtE.cannabinum ntayant pas apporté de protect,ion, son action ne doit pas se situer au niveau de Ia biotransformation de CCl4 car il n'a pas empêché Ia dégradation du système enzlimatigue cytochrome Pasgr. reflétée par I'augrmentation du temps de sommeil au penEoDarD].Ear -r48- C.2.3 INFLUENCE DE Ir'EXTRÀIT ÀQUEUX DrE.cannabinum vlg-â- VIg DE IJ'IIIIIOXICATION EXPERIUENTAI,E AU eclt CHEZ r,A gOURrS C.2.3.1 IIATERIEIT BT UETHODES Des souris mâIes Swiss (CésaI, Montmédy, Fr.) de 13 à L5 semaines, pesant environ 3Og, nourries et abreuvées ad libiturn, sont choisies pour les expérimentations.Elles reçoivent Ie CCI4 (Rectapur, Prolabo, Fr. ) dissous dans Ithuile dtolive riierge (F.H.O., Mafseille, Fr.) sous un volume de L0 nl/kg. La sylimarine (Roger Bellon, Neuilly/Seine, Fr. ), choisie conme hépatoprotecteur de référence et I'extrait agueux d' E.cannabinum (lot 84-4) ont été dissous dans NaCl O,9Z (1O ml/kg) .Un lot rrplacebo" reçoit' pour chague test, Ie NaCI O,9Z (10 mlrzkg). Toutes les injections ont été faites par voie intrapéri- tonéale. Après intoxication, les animaux sont rnis à jeun- Les dosages enzymatiques des AI,AT plasmatiques (BoehringêT, Darmsdadt, RFA) sont effectués 24 heures après intoxication au CClr.Pour ce faire, Ies animaux sont préalablement anesthésiés à Ia Kétamine LoO mg/kE par voie lntranusculaire (Kéta1ar, Parke-Davis, Fr.).Le sang est nrélevé dana le El.nus veLneux rétro-orbital à I'aide de inlcroCaplllalres (MLcrocaps Assistent, RFA) et des volumes d'envl.ron or5 ml sont recueillis dans des tubes de plastique préalablement héparinés (Héparine Fournier) . al Choix de la dose Quatre lots de souris reçoivent respectivement' O,O2, O,O4, Or07t et OrOgt de CCI4 sous un volume de 10 nt/kg.Un lot rrplacebort reçoit I'huile d'olive sous Ie mêmevolume. b) Influence de lrextrait aqueux drB.cannabinun Ir.eD prétraltenent L'extrait agueux est administré 30 minutes avant Ie CCI. (0,078) aux doses de 62,5, L25, 25O, 5O0 et 1000 mg/Rg. La sylinarine est testée dans les mêmes conditions aux doses de 25, 50 et f.OO mg/kg -L49- c) Influence ôe lrextrait aqueux deE.cannabinun L.en post- Lrextrait agueux à LOOO mg/kg est administré 30 minutes après Ie CCln (0,078). c.2.3.2 EXPRESSTONDEs RESULTATSET STATrSTrQUES Après transformation logarithnique, les valeurs des ALAT sônt exprimées et analysées exactement comme dans Ie chapitre C.L.2.2. Les taux des ALAT sont exprimés en UI/ml de sérum. Après vérification de Ithomogénéité des variances' une analyse de variance suivie dtun test trtx de Student sont effeétués pour comparer les lots témoins intoxiqués avec Ies lots traités. Les pourcentages de protection sont calculés selon la formùIe suivante, où les valeurs moyennes dtAIÀT des souris intoxiguées sont retranchées de la valeur moyenne rencontrée chez les souris saines (2L UT/LI z - ( t (AlÀTtraités-2L) (AlÀTptacebo-2Ll l/ [AlÀTplacebo-21] ]xLo0 e.2.3.3 RESULTÀÎ8 a) ChoLx de Ia ôose t Les résultats sont réunis dans Ie tableau 27. -15O- TÀBITEAU 2? s INTIJUENCE DE DIVERSBS COI{CENTRATION8 EN CC14 ÀDUINISTREES EN I.P. SUR LE TAUX D'AITAT 24 HEURES APRES' CEEZ LA SOURIS DOSE DB CClr ITO}IBRE D'A!II!,TÀUX ALAT Vr/L 24E 0 (solvant) 2L 2L(L6-271 o,o2z 54 (42-69 ) *** o,o4z 76(45-L28) *** 0, 07t 183(L57-213)*** 0,088 487 (403-586) *** Différence statistiquement significative par rapport au lot de contrôIe (solvant) : *** p Toutes les doses de ccta éIèvent significativement le taux d'AIÀT plasrnatiques c.t:eàIa souris. Mais Ia dose de o 'o2Z est insuffisante pour provoquer une éIévation conséquente du taux d'ÀIÀT et Ia dose de OrO88 provoque une éIévation importante. De rnanière à harmoniser les résultats avec ceux obtenus chez le rat, Ia dose de 0,O7* sera retenue pour les expérimentations suivantes car les taux d'ÀLAT sont du même ordre de grandeur que ceux obtenus chez Ie rat avec une dose à 6* de CC14 10 ng,/kg. bt Influence ôrun prétraltenent et drun post-traLtement ôrB. cannabLnum Les résultats sont présentés aux tableaux 28 et 29 et à la figure 37. Les taux des transaminases plasmatiques sont analysés, après une analyse de variance, à I'aide du test de Student. Un prétraiternent à l'extrait aqueux d'@b:!gg 30 minutes avant Ie CCI. est significativement protecteur aux doses de 5o0 (70 t) ét 1000 mg/Rg (6s t).Les doses inférieures (62,5, L25 et 250 mg/Rgl sont inefficaces (resp. 51t,56t et 21t). La sillnnarine injectée à 25, 50 et 100 rngr/kg diminue Ie fuite des AIÀT et Ia dose de 100 nglkg est Ia plus efficace (86t). -151- ÊtlFI .r{l nl dp dp dp dp dp dp dp dp EI F{ tO Fl o sf tO r{ \O tr)roôl F. @ sfsl@ tJl Ël o o VI ;l 9{ À T. dË +) {J ?8 UI o 6É {J 11n =E 5t El * * a*** o .la O * ^* .a HC' Fl* ôt * (\ ^O * o Xo o@\o \o^ rft (\oo\a o @toôr oit (V| (\ @ I ('|N\o C' HH F{ôt I lor I ro cQrl I CO rl I ltr) sfl or I ôrlcol È rg t lOt.o F('I n o\ FltocnlO ('l\ov F{ vf\ vôl vv +J Or ôt ro \o o Ë* @Flc,.t îrt \o ot \o \Oo\OF{ F{ r{tf} r{ cî FIO\rl$ ËÉ @@r{ a orl rû +, l{ Ër o 91 9.. Ei o H 3g t{ td Ê,'É P{ HEI o x Hrr t,  +) Es - sfOOO lro oo nlrltno t\, c{ F{ Fl Fl oil Fl r{ F{ o Ei !0 zH Hn .( q{ 2Z 5 l'l o É â,Ê Ui FÉ FF o +J Ul É ;Ë x n o Ê bl | ô!|no lo lo I looo o E \o N tfl o o ôrtrlo a dôl |'| o F{ tt 9x .{ +J Ëa o Êl z +J H |d +J o ; o o N lEl'âl É o I .Fl É E o lo ('l o H o  ,q t.a Êl .q IU k H o to El o É {, É o l() rûl o o (t{ tr |It tU tû lt{ .{ Irtt Ol .A E{ 9. lÉ'il 9{ çlr UI o -152- pû @ dP FI (v) rt EI Ho É âl F. Ël H rtl Él ;l à rt F{ C' C' p É n ôl \0 F ËH lF{ H r-l 8s It lflF{ H ln É r{ lO ïs É r{@ Ëâ ËH t''9:r a{ -Fa o-É E:r x Ëo D Ëx g ÈY E.{ H 2H o R .{ d EH F rÉ â 2 D À tt E Hra (, o\ o 2 lo H 8R o It F{ lf zF : o .\| 'âlEI D O r\tl É .a El E oÊl rl odl gl (t ol d! F{ rl E 9.Hl -r53- E.cannabinum t] Silrmarlne I PRSTRâITEUENT POST-TRAITEIIENT z - o trl*lrl H *** E{ C' FT Él I j**rF 9. Ho dP *tÉ * 1000 62,5 250 500 1000 DosEs mg/kg FIGURE 37 : ACTMTE ÀNTIHEPATOTOXIQUEDrE.cannabinun E:[ DE LA SILïllARIltE, ADI,IINI8TRE8 30 IiINUTES AVAIIT ET 30 UIltttTES APRES fNTOXICATTON ÀU CCl{r sUR LE TAITX D'ÀIJAT PIJÀSUÀTIQUE8 CEEZ IÀ 8OURI8 Différences statist,iguement significatives par rapport au lot rrplaceborr : lF p Le post-traitement à I'extrait aqueux d'E.cannabinum 1000 mg/kg 3o minutes après n'est pas significativement pro- tecteur vis-à-vis de la fuite des ALAT induite par le CC14. C.2.3.I âTIALTSE DE8 RESUIJTATS L'extrait aqueux d'E.cannabinum inhibe Ia fuite des trans- aninases lorsgutil est adnrinistré en r.P. e'}rez Ia souris 30 minutes avant le CCI,. L'extrait aqueux est efficace à 500 et L000 mg/Rg. Ces doses sont les mêmes que celles utilisées pour induire une dirninution de la fuite des ALAT chez Ie rat et correspondent, donc avec les doses employées dans Ia posologie traditionnelle (chapitre C.L.3) . Les pourcentages de protection obtenus sont du même ordre de giandeur que ceux obtenus avec ta silymarine à la dose de fOO mgrlkg. Lorsque I'extrait aqueux est adrninistré 3O minutes après Ie toxique, les protections obtenues avec E.cann?binun à 10oo lrlrg/kg chez Ia souris sont faibles et non significatives, càntrairement aux tests pratiqués chez Ie rat qui ont révété une protection significative dans ces conditions. Prop riétêd an tib épato toæ iq uet AE. cannabirutmL. - C.3. ÀPPROCEE DU }IODE D,ÀCTION D'E.canDabinrrm I.. PÀR DEs TECEIIIQUES EXPERII|EIIIIÀLES IN VrTRO -L55- e.3.1 ÀNALrgEBIBI.,IOGRAPHIQUE C.3.1.1 l,lodàle drétude sur hépatocytes isolés de rat Le modèle d'étude de I'hépatotoxicité in vitro sur hépatocytes fralchement isolés de rat a été développé au Iaboratoire pour les raisons suivantes : * l'étude pharmacologique sur animal, bien gue souvent indispensable car prenant en compte l'ensemble de Itorganisme face à une substance testée, reste touJours discutable d'un point de vue éthigue * parmi tous les modèIes d'études de I'hépatotoxicité in vitro (foie perfusé, tranche de foie, culture d'hépatocytes en lignée, culture prirnaire dthépatocytes, culture mixte d'hépatocytes, suspension dthépatocytes), le rnodèIe utilisant des suspensions dthépatocytes isolés présente des avantages certains : pas de flux sanguins, de perturbations hormonales ou nerveuses, nombre important de cellules, cott moindre de la manipulation, exploration de nombreux paramètres biologiques. al feahnique drLsolement ôes hépatocytes La néthode de dissociation des hépatocytes fait appel à Ia collagénase perfusée in situ, méthode développée par Berry et, Phillips (l-969). L'enzyme lyse les liaisons inter- cellulaires en respectant f intégrité de la membrane plasnique. La technique fut optirnisée notamment par Seglen (L9761 et Berry (L974t L9761. La technigue a été developpée au laboratoire par Àrvis (1985). Ce dernier a obtenu une bonne viabilité cellulaire (>86t ) et des nesures d'activités enzymatiques intracellulaires fiables, répétables, avec de faibles écarts types. bl Choix du toxlqur utlllsé * le CCII a d'abord été choisi car étant le plus souvent rencontrè dans Ia littérature et permettant la conparaison avec I'étude in vivo. Dissous soit dans Ie dinéthyf- sulfoxyde (DMSO), soit dans l'éthanol (Kiso et coII., 1983a)à des doses de l'ordre de 2 à 10 mM, il entraine une fuite enzymatique sans provoçluer de chute dranatique de Ia viabilité cellulaire (Àguiar, 1985; Périssoud, 1981). L56 - * le ter-butyl hydroperoxyde (t-BOOH) produit une LpO importante, une fuite enzymatiguê, une alkylation des macromolécures, une artération des l,homéostasie carcique et des artérations morphotogiques et structurales comme l'apparition de rrbullesrr à Ia surface mernbranaire.Il apparaît que des inhibit,eurs spécifigues de Ia LpO n'ont pas d'effet sur le relargage enzymatigue traduisant Ia nécrose cellulaire ni sur les altérations morphologigues. Sur de courtes périodes dtincubationrla LpO nrest pas primordiale dans Ia toxicité du t-BOOH mais lrélévâtion du taux de MÀD, un des produits finaux de la LpO, est suffisante pour apprécier Lractivité antllipoperoxydante d'une subst,ance t,estée. In vitro sur hépatocytes isolés de rat, Ie t-BOOH est métabolisé par la glutathion réductase, produisant ainsi une oxydation du glutathion réduit. puis une oxydation des nucléotides pyridiniçIues( via Ia glutathion réductase) conduit à une altération de Ithoméostasie calcique des mitochondriçs et du réticvulum endoplasnique. La concentration en cat' cytosolique augrmente et la ceIIuIe forme des rrbullesrr à la surface de la membraneplasrnique (Rush et coll., L9g5; Rush et coll., r.e86). cl analyses bioahlnlgues Trois marqueurs enzymatiques de I'atteinte hépatique ont été choisis : * mesure ôe lractivité de Ia lactate ôéehydrogénase (LDE), 100t cytoplasmique, pâE Ia rnéthode optimisée (Weissnaar et coII., Lg7s)mettant en jeu Ia réaction suivante : pyruvate + NÀDH + H+ --> L-lactate + NAD* t nsaur€ deg activités de lralanine-amino-transférase (ÀLAT) et de lraspartate-anino-trangférase (A8AT) dont les principes sont décrits au chapitre 8.2.L.2.2. . le doeage ôe la nalonaldéhyde (t{AD, a ét,é choisi afin d'estimer ltinpact du toxique et de lrextrait aqueux sur Ie processus LPO.La production de DîADlors de Ia LpO provient de l'atteinte des phospholipides (Nielhaus et Samuelson, 1e68). Ltappréciation de Ia LPO in vitro par cette technique de dosage de Ia lr[,ADn'est que partiel (moins grande précision que par chromatographie HPLC, sensibilité moindre aux faibles concentrations, métabolisation de la DIADau niveau nitochondrial), cependant cette technique continue à être largement utilisée. L57 - La méthode, décrite par Slater et Sawyer (1969) et développée au laboratoire par Joyeux (L986), sê déroule en 2 étapes : action de I'acide trichloracét,igue de manière à bloquer la réaction de LPO puis action du réactif, I'acide thiobarbiturigue, qui réagit avec la ltAD en donnant une coloration rouge orangé. C.3.1.2 Etude du pouvol.r antiradl.calaire ôrune substance 11 existe un test sirnple et rapide pour rechercher Ie pouvoir antiradicalaire d,un composé : Ie test drinhibition du radical diphenyl- picryIhydrazyl décrit pour Ia première fois par Deby- et êqlll frôzoj Ce test consiste à mettre en présence la substance dont on recherche le potentiel antiradicalaire avec une solution de diphényt-picrylhydrazyl (DPPH)r uh radical libre stable à température ordinaire. Ce dernier présente une intense coloration violette d'absorption maximale à 5L7 nm. Le réappariement d,électrons cêtibataires entraîne une décoloration de la solution.La diminution de Ia densité optique (DO) rend compte du pouvoir de tlpiégeur de radicaux librestt. La technique a été développée au laboratoire par Joyeux (communication personnelle) -'l5g- C.3.2 ETUDE DE I.A CYTOTOXICITE DE IJ'BXTRâIT âQUEUX DrE.cannabinum IJ. sI'R HEPATOCTTES ISOIrE8 DE RÀT C. 3 .2 . 1 IIATERIEL ET IIETHODES a, Àninaux : rats mâIes de 2oo à 35o g nourris et abreuvés ad libitum. bl l,latériel Collagénase grade II (BoerhingêT, Darmsdat, RFA; Sigrrna, Saint-Louis, USA), milieu rninimum de Eagle MEM (Flow Lab., Asnières, Fr. ) , solution saline de Hanks (Eurobio) , héparine 5000 UI (Fournier, Fr. ) , dinéthylsulfoxyde (Prolabo, Fr.), kit LDH opt.ref 543039 (Boerhinger), kit GPT opt.ref 161071 (Boerhinger), kit GoT opt.ref 158178 (Boehringer), spectrophotomètre Uvikon 8L0 (Kontron, RFA). c) Ertrait aqueux : Ie lot 883-3 a été testé aux doses de O,25, 2,5 et 25 ng/ml de suspension d'hépatocytes, Ie lot 885 aux doses de L,25, 2,5O et 5 ngrzutlet le lot 885-4 aux doses de l- et 5 nglnl. Le lyophilisat est dissous dans Ie nilieu rninirnal de Eagle utilisé pour les suspensions d'hépatocytes. cl tecbnlque deLsolement ôes hépatocytes AprÈB anesthésie au pentobarbital sodigue 60 mg/kg (Clin-t{ldy, Toulouse, Fr. ) et inJection d'héparine 1 mg/kg en I.P., I'abdomen de I'animal est incisé, le veine porte catéthérisée (Cathlon 4, Critikon) et la veine cave inférieure est sectionnée sous les veines rénales.Le foie est perfusé par une solution saline de Hanks (sans car*, ug+* lsans rouge de phénol; pH 7,4, 37"C) , gazée par"a-ns un néIange 95* O)/ 5t CO, sous un débit de 30 rnl/rnn. La veine cave supérieure esË catéthérisée après ouverture de Ia cage thoracique et la veine cave inférieure est clanpée au-dessus des veines rénales.Après 5 à 10 minutes de cette perfusion, Ie foie est perfusé par une solution saline de Hanks (sans ca**rsàns Mg**lsans rouge phénol) contenant du CaCI, 5nM et de la collagénase OrO58, avec reciÉculation pendant 1.5 à 2o minutes à un débit de L5 nL/nrn.Après excision du foie et transfert dans une -L59- boîte de Pétri, Iâ capsule de Gilson est retiré et les hépatocytes dispersés délicatement.La suspension est filtrée sur soie de 68 m et centrifugée 3 fois à 509 pendant 2mn. A chague opération, Ie surnageant est jeté et les culots remis en suspension dans du MEMde Eagle.La viabilité cellulaire est mesurée au moyen du test d'exclusion du bleu Trypan (Flow Lab. ) . La concentration Çe Ia suspension d'hépatocytes est ajustée à LxLOo cellules/ml de mitieu (chapitre C.3.4 sur 1'activité antilipoperoxydante) ou 2xl-oo (activité antihépatotoxique) après comptage à Ia cellul-e de Malassez. Les suspensions cellulaires sont maintenues en survie dans Ie nitieu rninimum de Eagle. Les hépatocytes en suspension sont répartis en fractions aliquotes de 2mI dans des erlenmeyers de 25 11, recouverts de Parafilm, naintenus à 37'C en bain- marie sous agitation (60 oscillations/mnl et gazés individuellement par un mélange 952 02/52 COZ d) ôétermlnations biochinlques ASAT, ALAT et LDH relarguées dans Ies milieux d'incubation sont dosées à I'aide des kits de dosage. C.3.2.2 BXPRESSIONDEg REBULTAT8ET SIATISTIQUE8 Moyennes et écart-types sont exprimés en milli-unités internationales( nU.I. ) de LDH, AIÀT et AsÀT par mI de suspension d'hépatocytes. Après avoir testé I'homogénéité de variance à I'aide du test de Cochran, Ies comparaisons statistiques sont effectuées par analyse de variance puis par Ie test rrtrl de Student. C.3.2.3 REgULl[ÀTg Les résultats sont réunis dans Ie tableau 22. SeuI Ie lot 5141-34 à Ia dose de 25 ngrlnl augmente Ia fuite enzymatique des ÀIÀT, ASAT et LDH après une heure dtincubation. Aux doses inférieures (O,25 à 5 mg/nl), aucune cytotoxicité nta été constatée -16O- E xH H E{ o H * E{ .r * â l{ H o ê o o E * o H o 'l' rt +l * VI o \0@ @ f- -f F. Fl sf (f, F- Oil O 9. a É F{$ sflfl $!O sfGt\on sfF{N H +l +l +r +l +t +1 +t +t +r +l +t +r +l o N-f !Ûsf @o.| F.trlF.to |rl O'r f- E ËHsf ul ro \o \oæ Osfmn F{ O\ f- E{ (\ F{ .-l sf ôl C- r. ro \o to Cil r{ F{ }{y x F{ Ëg Fl +J o UI nE{ o o EE t +J EIH o * eA cl * =@ * o c\l @ 00 |flFI .q ËÉ r{ r{ r{ rO F{ F{ cî('ltÛsil o\|r)|rl o o 'aâ;o{r +t +l +l +l +t +l +r +t +t +l +r +t +l IU if {N F{O roo \grJ@æ r{ @ lf) @o \o \o @f. |r)lOsfsil @\o\o F{ ({ flË H oD H +J H t{ Ëlx(ll-- * o el Fl s 'l' 9{ ilD >{ .T È âl 9l N |! :l Fl (ÀFl "{ -:l Ê. (\ ôt co (n t{ El-j F1 (\FI('l(vl (\ F{ f! L- t{ tç -rl +t +l +t +l +t +l H eF o\u) tvl o Oc') +t +t +t +l +l +t +l IU ÊÉ r{N rf sI \o tfl C! O F{ F{Osf -$l H ôt 9{ F{ (vl sf C.3.3 INFTJUENCEDE I.,,EXTRAIT ÀQUEUXD,E.eannabinlrD I.. VIS- l-VI8 D'IrltE INIOXICATION AU CCI| D'EEPAToCYIE8 ISOLE8 DE RAT C.3.3.1 IIATERIEIT ET UETHODE8 a, Àninaux Rats mâles pesant de 200 à 350 g nourris et abreuvés ad Iibitum. b, IifatérLel et méthoôes sont décrits au chapitre C.3.2-L étudiant lréventuel effet cytotoxigue de ltextrait aç[ueux d'8. cannabinum. La technique consiste à utiliser des suspensions drhépatocytes de rat. Les marqueurs hépatigues choisis pour estimer I'hépatoprotection de 1'extrait agueux au travérs de la fuite enzymatique sont les suivants : lactate déshydrogénase (LDH), alanine-amino-transférase (ALAT) et aspartate-amino-transférase (ASAT). Les dosages enzymatiques èont effectués 6O minutes après incubation. cl er(trait açIueux Le lyophilisat. 884-3 est dissous extemporanément dans Ie MEM de Eagle et ajouté au milieu de suspension sous un volume de 20 I apportant Ia concentration finale voulue exprimée en mg de plante sèche/nl de suspension d'hépatocytes. Les âoses de o, 25, 2r5o et 25 ng/ml sont ajoutées simulta- nément au CCln. ô, toxLque Le cCI4 (Prolabo) 2mMest solubilisé dans Ie DMSO5* v/v c.3.3.2 EXPnBgElOr 'ûE nffiffiilË ffi s![tltr!gu!8 Leg taux des ASÀT, ALAT et LDH sont exprinés en mU-T-/mL.x lob cellules.Les taux de MAD sont exprimés en mrnôles/L0" cellules. Les pourcentages de protection par rapport aux lots rrplaceborr intoxigués sont calculés selon la formule suivante, où les valeurs moyennes des ALAT des lots intoxiqués sont retranchées des valeurd moyennes des AIÀT des lots traités : ( t (AIÀTtraités-AlATcontrôle) - (AlÂTplacebo- AlÀTcontrôIe) l rzIAlÀTplacebo-AfÂTcontrôIe] ] xlOO -L62- Après avoir testé I'homogénéité des variances par le test de Cochran, Ies lots térnoins intoxiqués sont comparés aux Iots traités par une analyse de variance et un test rrtrr de Student. C.3.3.3 RE8UITTAT8 Les résultats sont présentés dans Ie tableau 30 et à Ia figure 38. Lorsque I'extrait de plante est ajouté sinultanément au CCla 2 ml{, Ia dose de O,25 mg/ml n'empêche pas la fuite enzfmatique des AIÀT, ÀSAT et L,DH.Par contre, Ia dose de 2,5 mg/mL dinrinue significativement la fuite de ces 3 enzynes par rapport au témoin intoxiqué. A Ia dose de 25 ngTrnf , ITextrail agueux augrmente significativement la fuite des ÀIÀT et des LDH, en présence de CCI4. -163- dp dp \o N |o to ! + H E{ 'l' H to @'1. It @F{ -fN F. o\tf (YlFIO @F{ l.ïll  +r +l +l rtt +l F|n +lo+r (\sfN -; F{ lT li m\o lF.f-m I eâ io Nrt NIOF{ ll.mF la EN o \o Fld f- Fl F{ - !t l'* ll âld dp Elo .r{l dP \o @ z o H (,El FT oFl É tr DoSEs nglul tr'rGuRE 38 : ecrrvtTE ÀI{TTBEPATOTOXTQUED'I'N A,JOUT DrE.cannabinum EIltULTÀlIEltENT A UNE INTOXICATION AU CCI1 gUR I'À rUITE D,ÀTÀT,D,ÀSÀT ET DE I,DH PENDAT{T30 UINUTES DANS l,ts I{ODETE EEPÀTOCYTESISOI.ES DE RAT Différence statistiquement significat,ive par rapport au Iot rrplacebotr : ** p C.3.' RBCEERCEE D'T'ITE ÀCIIIVITE ÀNTIIJIPOPEROXYDANTE DE LIBX1[R11IT ÀeItEItX D,Esennab:lnrrm L. IN VITRO VIS-À-VI8 D'ItltE IIITOXICAITION EXPBRIIIENTALE ÀU TERBUTYIJHTDROPEROXYDE (t-BooB) C.3.1.1 PROTOCOLE L,a technigue drl.golement des hépatocytes ut'ilisée et la préparatiôn de lrextraiÈ aqueux (E84-4) sont décrits au chapitre C.3.2.2. Lrextrait aqueux d'E.cannabinum (884-4) est ajouté sirnultanérnent au t-BOOHaux doses de 0,L25, O,25O, 0r50O et lnglml. Le t-BOOE (Sigrna) o,2mM est solubilisé dans Ie DMSO O.54v/v. Leg détermlnatLons btochiniques du taur d'ÀgAT et de I,DE relargués dans Ie nilieu sont dosées conme aux chapitres e.3.2 et C.3.3. pour lo dosage de Ia ttAD 2 rnl d'acide trichloracétique (prolabo) à rot sont ajoutés à 1 ml de suspensions drhépatoôytes et laissés L0 ninutes à tenpérature- àrnnfànte.Âpres centrifugation (50oxg; 5 rnin), 2 ml d'acide thiobarbttirrtgue à 18 sônt ajoutés à 2 nI de eurnageant et laissés au bain-marie à 1OO"è pendant 10 rninutes. Après refroldissement dans la glace, Iâ lecture se fait au spectrophotonètre à 535 nm. C.3.1.2 RE8ULTAT8 Les résultats sont consignés dans Ie tableau 31. Ltextrait aqueux aux doses de O, tlS, O,259r.Or50Oet 1 rng/rnlr.ajouté sfnultanérnent au t-BOOH O, 2 nM dirninue légérement mais non slgnlficatl-venent Le taux de lr[,ADet Ia fuite des LDH et des ASAT. -L66- .{ (\ tr)ôl o Ét Flc.ltoFlNôl ÊlE t (\ DEI o +r +l +l +l +l o}{ o +l (\l F{ lrO ôl @ (, F{ $tflnn\il 81,.TIEÉ a >rÉ o {JNzÉl o pHcl Fl É a rosfF{Not@ HO Fl OOilrtNôlF{ EHF Fl \\t\\t ZHÉ o oooooo .(DO (, E{F|!0 +t +r +l +l +l +l ÉH to \Of.\Ofî mFl o r{F-n(.|ôl\O Fl t\tti\ BÉH oôtôINNN oÊl o D o E{tD d D rQ OH !l nEo o 2 HH D- û na ('tc')mmmc/l àn to cl OE H z\ ox o ÉÊ 2P HÉ UtU'E ÉH E E:.-l D ttr E F.D lo0 Fl\ ZA Nn o H dN|n E ..oz Jd d* H Gl E{ Ërl (rtÉ ,l E{ Ncl DZ -..{l Én E{ onl 2 dp tdl ËË E |ot ÉN gl It T -o Él âA H o o rrtl É'l H nol H Ol ol ul!Êrl â EO E{ oEr+ -L67 - e.3.5 RECEERCtrED'II![E ACTMTE AITTIRADICAITAIRE DE II'EXIRIII ÀQUEIIX DrE.cannabipum Ir. C.3.5.1 PROIOCOIrE Dosage des antioxydants totaux par le diphenyl- picrylhydrazyl(DPPH) : , tlre DPPE(Sigrma,St Louis, U.S.A.) est dissous dans le néthanol de telle manière que ra lecture de cette sorution au spectrophotonètre à 517 nm ait une densité optique de Or5 ce qui correspond environ à une solution à 2ng/LOO nrt. rlrrertrait aqueux (lot E84-4) est testé à 0,125 et O,2SO mg/nL d'eau distillée. Un extrait aqueux de plante antihépatotoxique étudiée au taboratoire, RoÈmarinus officinalis, aux mêmesdoses, est présenté commeténoin po- sitif car présentant une activité antiradicalaire. Un ex- trait de Poa species (Granrinées) est choisi comme témoin négatif car cette espèce nta présenté aucune propriété pharmacologigue et toxicologique particulière au cours des différentes expérimentations réalisées dans notre laboratoire. Enfinr uD dosage de contrôle est effectué sur de I'eau distillée (blanc témoin). *Un nl et derni de cette solution drextrait végétal est ajoutée à 3 rnl de solution de DppH et l'ensenbre est raissé 5 minutes en contact. Quatre mI de toluène (prolabo, Fr. ) sont ajoutés. Après une forte agitation, la solution est centrifugée à 500xg pendant 3 ninutes et la densité optique du surnageant est mesurée à 5l-7nm. La lecture se fait à I'aide dtun spectrophotomètre Uvikon 8lO (Kontron, RFA). Les résultats sont exprimés en I d'extinction de la DO par rapport au blanc témoin. e.3.5.2 RE8ULTAT8 Doses 0, 25O mg/n\ O,L25 nglml E.cannablnun 16t 9t Poa sp. st 2* Rosmarinus . of f icinal is 84t 6st Aucune activité antiradicalaire de lrextrait açlueux à 0r125 et O,25O ng/ml n,a été nrise en évidence par le test du DPPH. Ltextrait de Poa sp. reste sans effet et la plante testée, R.officinalis, présente une forte activité. - 168 - C.3.6 RECNERCEE D'T'NB TNFTJUENCEDE T,EI'PATORIOPICRINE (EUPP' VI8-VI8 DE rr'TNTOXICATTON AU ccl{ cEEz LA souRrs 11 nous a paru intéressant de rechercher une éventuelle actlvité antihépatotoxique de ItEUPP pour plusieurs raisons rtcette molécule est en concentration non négligeable dans la plante (18 des parties aériennes sèches) *elle a déjà été retenue conme faisant partie des molécules pouvant éventuellement participer à I'effet cholérétique de l'extrait aqueux *eIle possède un pouvolr pharmacologique important puisqu'elle est cytostatique et antitumorale. La dose antitumorale utilisée chez la souris in vivo est de 20 ng/kg (Woerdenbaget coll-., L987a, 1987b et 1988). Une étude du solvant a été réalisée et I'éthanol à lot dans NaCI 0r98 est actuellenent préféré à tout autre (Woerdenbag, comm.pers. ) . Le ehotx du nodèIe d'intoxLcation expérinentale chez la sourLs pour teEter l-tgUPP se Justlfie par la faible variabLlité de Itintoxication reflétée par les taux d'AIÂT plasnatiques, contrairement à celle constatée chez le rat. D'autre part, ce test nous est apparu facile à mettre en oeuvre et peu cotteux. La dose d'EUPP choisie pour rechercher un effet antihépato- toxique a été determinée à partir de la littérature et de la caractérisation de ltextrait aqueux d'E.cannabinum en CCM : environ Lt de Ia plante sèche. La dose antlhépato- toxlque (et cholérétique) de 500 mgrlkg de poids corporel contLent ainsi 5 ng d'EUPP/kg. C.3.6.1 PROTOCOITE Iê protocole est exactement celul décrit au chapJ.tre C.2.3 1. *DanE un premier temps, l'lnoculté du solvant a été testée Eur des lots de 3 sourLs recevant de I'éthanol à 10t dans le Nacl 0,9*, 30 nLnutes avant le CCI4 à o,o7t (0r1n1/109 dans 1'huile d'olive) *AprèE avoir dissous I'EUPP dans l'éthanol à 97", Ia solution saline physlologigue est aJoutée de nanière à inJecter aux animaux, en I.P. sous Orlnl/109, la dose de 5 ng/kg 30 ninutes avant le CCln. iI \' la Ë U Eltro n D rt) Ét2 t, tt Ftt tr8F H È1 o HËÊtdtdF É FJ Fl urlDo ETI'O H D o âotsl ooË T é 5 tQtrI H o z t o )f" É N ((l trl rdztrl o rt El rtDri aa rt rrf ror' Ê, OJ A,H9' H û !JÊ' 55 z op ooo }{ o PO PrP F rt P \o cl H. F tsdpP E n ots oo z É dpo dp dP o o dp DH â €g o I aà rt i3z 0r ÈE P. rq 5 9H F. ËF Ft) trË g,o HÉ rf ol{ ooo ooo o EË o o oo oo ts xE tr {{ {{ t Ê, Yu Ft dP T; Fl Hcl D' Ft U 6 gB o Ft (r(r)l, É.;|' rt PPts aE EB ooo tt o F É hl EF o .:z.HË o E Fl 5 EZ rt !, ËE Fl z Ot H P E Dl ÊÊ CI : x sE Ë{- * Drt.r * * oo U 9r l^ ËH o HÉ o HPN u F@o\ EI o NNP E P o(rCÀ {o t ôN ^ Ël ^ ^^N ^^P È@ul cl u PPÈ È\ol o t, -ltol tlN H z NÈts (r(r{ a É ll1o FUIY NNV P{ F H È{ z È@ ** N r.il ** l o ** ** FI x *rl Ho :È* D. É H zo ) 'L69 - Un lot de contrôle recevait ltéthanol à 10* sous Ie même volurne 30 ninutes avant Ithuile dtolive Un lot rrplacebotr recevalt le eolvant 30 nlnutes avant le cc14 oro7t. Cette expérience a été menée sur des lots de 10 souris. C.3.6.2 RE8ULrATB Les résultats sont exprinés et analysés statistiquenent commeau chapitre C.2.3.2 lors de la mise au point de ce test. Les résultats sont présentés au tableau 32. Aucune toxicité éventuelle ni aucune potentialisation de Ithépatotoxicité du CClo- n'ont été constatées avec l'éthanol à 10t. Aucune protection n'a été obtenue avec I'EUPP smg/kg lorsque celle-ci était injectée 30 minutes avant le CCI.. -uo C.I AIIAIJTSE DEg REST'LTATs Sur hépatocytes isolés de ratrseule Ia dose de 25 nrg/nt de suspension cellulaire stest révélée cytotoxique en pro\roquant une fuite enzlmatique d' AIÂT, ASAT et LDH. Cette dose correspond à une solution saturée en lyophilisat et la force ionique exercée par cette solution est sans doute à I'origine d,un effet, de plasnolyse des cellules baignant dans un milieu fortement hypertonigue. Les résultats obtenus sur hépatocytes isolés de rat vis-à- vis du CCIa sont, venus confirmer les résultats in vivo: à doses non éytotoxiques, l,extrait aqueux ajouté sinul- tanément et 30 minutes avant le CClo dirninue Ia fuite des 3 marqueurs enzymatiques AIÂT, ASAT e€ LDH. Les doses gui se sont révélées efficaces sont L.ZS et 5 ngrlnl. . Les recherches d'une actlvité protectrice vis-à-vis du t-BOOH, par mesure de la l[,AD (reflet de la LPO) et drune activité antiradicalaire par Ie test du DPPHse sont révélées négatives aux doses de 0,25 à 1 nrgrlnt. Cependant les doses choisies dans les z derniers essais étaient peut-être insuffisantes puisque Ia dose de OrZS mglnl était inefficace sur Ia fuite enzlmatique induite par le CCI'. Cependant Ie choix de ces doses a été détenriné à partlr-de résultats obtenus sur un extrait végétal efficace à ces doses. Cela vient conforter les résultats obtenus sur Itensemble des autres tests, à savoir un effet cytoprotecteur aux stades terminaux de l,intoxication conduisant à la nécrose, et une absence d'activité sur la LPO. L'EUPP, à la dose contenue dans ltextrait aqueux nta présenté aucune activité antihépatoprotectrice vl-s-à-vls de l'intoxication au CCI. chez Ia souris. Nous ntavons pas jugé utile d,augmenter la concentratLon au rLsque d'apprôcher àes doses cyt6statigues, tri de la dininuer car dans ce cas Ia dose serait inférieure à celle contenue dans I'extrait aqueux qui présente des proprlétés antlhépatotoxiques. Cette expérience aura permis drélininer Ia possibilité dtune action antihépatotoxique deE lactones sesquiterpénlques d,E.cannabinum et de srassurer de l'absence de toxicité hépatique de cette molécule en quantlté non négligeable dans la plante. En effet, ai I'EUPP n'a pas dininué le taux d,AIÀT plasnatlçlues chez la souris Lntoxiquée, elle ne lta pas augnnenté. I{ordenbag et coll. (1988) ayant constaté une baisse du glutathion hépatique à Ia dose de 20 mg/kg, l'éventuallté d'u1 effet potentialisateur.du CCI4 pouvait mêmeêtre envisagée. Or iI nten est rien. -1?1- e.5 DISCUSSION Ltétude du potentiel hépatoprotecteur de l,extrait aqueux dtE.cannabinum a été dtabord recherché in vivo sur un mo- dèIe utilisant un toxique hépatique, le CC14, ch'ez le rongeur.Les résultats encourageants nous ont, alors conduit à adopter le même principe expérimental in vitro sur hépatocytes isolés de rat. Les test in vivo, bien que pré- sentant ltavantage de prendre en considération l,ensemble de ltorganisme et de stapprocher d'une pathologie humaine (I'hépatite, la cirrhose, la stéatose) ont deux inconvénients d'ordre pratigue : * ils sont coûteux car ils utilisent beaucoup d'animaux.II est indispensable d'avoir à chaque test un tot de témoins intoxiqués car I'intensité de l'intoxication au CC14 est très variable d'une expérience à I'autre pour des râisons gui nous sont inconnues mais qui pourraient être de nature chronobiologique. * un test nécessite 3 jours et ne peut se faire que sur un petit nombre d'animaux compte tenu des impératifs d'organisation expérinentale (respect des tenps d'injection, de préIèvernent, de dosage enzlzmatique). Hikino (1984) recommande de développer, pour toutes ces raisons, le modèIe in vitro sur culture primaire d'hépatocytes de rat. La technique permet un screening large de nonbreuses subst,ances naturelles et d'extraits végétaux à potentiallté hépatotoxigue.Il demeure néannoins qu'une cellule isolée de son organe et de son organisme réagit différernment d'une cellule baignant dans son envLronnement physiologigue.Cette réserrre est dtautant plus Lmportante que Ie produit testé est un extrait aqueux de plante renfermant une grande guantité de rnolécules.Le sang circulantrla fixation de certaines molécules aux protéines, la dégradation ou Ie rnétabolisne rapide de certaines substances, les phénomènes hormonaux locaux et cérébraux, les relations subt,iles entre divers organes (foie- intestins.. . ) ne sont pas prises en considération in vitro. Par ailleursr un toxique aura un devenir différent selon gu'il sera injecté à un organisme entier (injections I.P., I.M., I.V. et per os) ou gu'il sera rnis directement en contact avec une cellule isolée. Les tests in vivo chez le rat ont été reprodults chez la sourls.Les essais chez la souris présentent lravantage d'être réalisés à un noindre cotti d,autre part, l,élevage et les nanipulations sont plus aisés. Ces essais peuvent être effectués sur un plus grand nombre d,animaux par lot. Le seul désagrérnent réside dans Ia faible quantité de sang disponlble ne pennettant pas de nombreux dosages. 173- contrairement.à Hiking- (1994) nous avons pu apprécier la faible variation de rriritoxiôation au ccr, et'ia trèÀ bonne reproductibilité des résultats. pour toutËs ,ii"àrr", ce test in yivo parait fortement reconmandé pour"", ra iààùerches de principes antihépatotoxigues d'origine naturelre. Nous avons rapideurent lirnité nos estimations de la pro- tection in vivo vis-à-vis du lg*iqug aux seures Ar,Ai, plus sensibles que res ASAT. Leur étévàtion reflèt" piâcessus de cytolyse ou de nécrose mais égarenent une augrmeirtation"" de la pernéabilité rnembranaire 1nérissoud, 19g1i. pàur res recherches d'activité antihépatotoxiques âe subâtances naturelles, tous les auteurs sraccord-ent drairleurs sur I'utllisation de ce dosage prioritaire. r.es autres dosages (bilirubing, protéines, tryglycérides) n'ayant pas révélé de protection-particuliere-6nt etè abandonnés par ra suitè. pour les test in vitro, rÀs-g I3rqueurs enzlmatigues ArÀT, ASAT et LDH ont ete choisis. rl est admis que ra fuite de ces enzlmles est régulée par la perrréabirité membranaire et par reur localisati6n nais leurs poids moréculaires ne sont pas corrélés avec leurs relargages : ArÀT (tloooo) et LDH (14oooo) sont prus faci- rement libérées que les ASAT (gsood) (Manabe et èoll., Le87' . C.5.1 ETUDE COIIPâRATIVEDEg EXTRAITS VEGETIT'XET DBA SUBgIAllCBg NâTUREITLE8ÀIITIHEPÀTOIOXIQIIE8 RETEIÛUESDÀl{s LA I,TTTERITURE ces 5 dernières années, la recherche de substances naturelles à activité antlhépatotoxique s'est fortenent développég et plusieurs éçripes de cliercheurs en ont fait rggt spécialité. Les travàux encourageants effectués sur la silymarine et le cyanidanor-3 depuié 10 ans ont suscrté ces travaux. clegt ainsi que tréquipe Japonaise de Kiso et Hikino -a_adopté res curtuies pririaiier-à-rhép"tocytes de rat pour réaliser un screenlng lalge-1994, parrni les itantês de la phar:macopéeorientare (Hikino, yang ei corl., 19gz). Deux tabreaux ont été représentés pour rranalyse biblio- graphique : les tableaux 33 (a,brc) représentênt les plantes et res principes actifs anltnelatotoxiqu"-r-r"" tableaux 34 (?,b,9) reprennent, pour tês principes'"ôtit= et les extraits végétaux testés, Ies remarques intéressantes faitès par les auteurs. t'analyse de ces tabreaux appelre dlvers commentaires. 1) r,a riste des plantes antihépatotoxiques laisse qpparaltre une grande variété âe farnirr-es et la naJorité des espèces étudiées n,appartient pas à la prràrn;a"pé" européenne. ceci tient sans doute âu fait qùe de teiles recherches ne sont pas entreprises en Europe. -t74- o îd rd f. sf .Qor ô \f \f .q r- @ sil æ t{.f. dC- tO @@ cî @ o\ 6 (n æocî 0r co ool @ ol r{ Or F{ ôICÀFICOF{OO\ Fl c{ or F{ r rl Or{ o\ Érf rl . \ Ol \rl r(l H F{l \ . l- Fl \ . ot$ t H F{l . F{l f- . rll . rll . EI Ol -{l O F{l O 6t . -tl -tl . -{l -{l -{l =l jl F{l 9. (,1 - ot ol t{l il 3 813 I 618l=l 8lËl Ël ol ol ol il â +Jl Ol F{ lr{ .O0l lOl lOl ",Ol ol dg or td 3l d --O +,1 .Ël. Pg"lËlulËl"l"lo rl Ël +Jl ;iH O ol t{ l| A ol +rl olol É ol o Xrl .cl OOO Ê{{J ool o (, oo F{ vtr (t o ÊÊÉ OOÉ Êtt'd E ÉÉ o F{ .Fl .-l hH É O bt..{ tn É É'-l O'rr É 6 UI ru d .F{ G,t1d O5'-lt1ol1dÉ UI XÊ1 .F{ .F{ 6sl = M B'-l E '-l'd )1:-l:-l:-l:-! .Q É .F{ .Fl a ru H o t * *-f; E v t x E .15 x H o ^ o tU I tU o É o o oo o I IU o o rd rU AIU @ o d IU oo t{ H o O^ ,É oo oo .d o +J rd td (, +J .r{ do Ê r{ 'r{ ao o -{ od tU -{ F{ o'< o^ .r{ H tlto o oo o tU Év D OtU É oo g ,É t{ o| Oa O Ut grd P{.{ É rul H rrt o d A{ +J ov , F{l X lr= rû 5l| rul .Fl br dl EI o Ov U 3 U>r +rl !El o .cl al H .ClO^ v= (I,1 .u ul F? 9l 'il|^ o .F{ Ol {J (, o!l vol o E{ tn..ll O = tr Ël vol ot d .r{l .{ EF{l l4 v td ol q{l dlolo +rl o F. -r{ tUl v O -F{l ull .,{l Hl t{l O ol ru H 'F{ Ël ol tr Él o N Él F:l .ql '.ll E -..{l dl 5l t{ FI Ët il |Iil rul r! o H otbtÉto 0l Él F.. +Jl (d Fl Ël tÉ z Ël utl lul u El t{ .{ F .Fll Htfl rul ol o 5l o HilIol EI iI :| .ql Al xl Nl dl € o ,ûl gl 0l 'El Flff Ê. .91 'dl I ol El .91.9 ol o HH ,dlbl Êl S fll O-t fiF 'Él ^el8l Htiti ol.c zz El*l .elË 8l HOI U ol o EÉ ()l ul ol >l +, l{l Ët st -ll O ÉÉ 11lÉl +Jl F{l il Esl fl tl.-ll t{l ..{l ,4 F{l +Jl .lJ ËA EI g|ul41d. gle F. olNl ' n(r| dt tr gÉ É n .( E{ -L76- f. t'. 1r) n:il sfO o lo @ @@ coorF c^ : cÀo or ôorro o\FI@ d I.Q\ F{ F{F{O FI(h CÀF{ r Q\ r r{ r r re{ .\.Ê{l .. .r{l . rll-tl . =l irir Ël jljl : !t H -{l Ol-{l ol Fl H Ol Ol-ll 8l Ëldl 818l=l (, Ë ulul o F. +'l Ël *.,l*.,l8l 8l ol +rl+rl ol ol I D â Ïdol +rl ol ol d +rl Ét r, ool O r{ tdd0l o dF{ F{ Ott d ht{ o H ! -{ tr{ -t ÉO É 55t{ H É 5 rrt rrt d .AÉ tU Ei Ei O gl É.'{ # .r{ .g Ur X .Ft."{ tr H .r{Od O .F{.û tU MM Ut * gl MO tB 't5 d I OE o M H Ao o ; H Otu d tr rdO o o| oo O H O tll^ d X rdk o .F{ OO .a É .qd t{ oE{ 'SB o E{ fler Ét El ,a É o5t ÉÉ 5l al 9r F. 'Ê 'il| 'il a E s'il|^'s ÊI EI olo-5 ol ol vdl H +'rdr ._tl ol E{ '31Ë10'll,$ 'd 'ÉlHl - -r{lËl ..filgl e or$rl{|.-tl r{dttldr +,r * o st gtEl Fl H E{ Êlds f;la Él EHIH (, ;l e,El!lsl*'l  rl 3lËl FlsrËl s Fl or'''rFHIË o ^Êl'dlEl"l !0 o El8lÊl rl bl 8l Ël .l .l H H 'Él'Ël:lËl A E{ ilHqË|d el ËlËl:.gl H -rl ol tdl ol--ll (, z 2 É H A $|sl!|âËlslEIHË âl !lglElsl Ê F. E{ H o H H gn È ao E H H Do o o ('l oaoo GI ,ttrÉ X tt .Fl tt O tr p .F{ F{ .F{ +J i: .( F{OFI'O H H oÉooo fl E â ÊrrtÉÉttt tl 0 o (tE('rrt\ p , ,É+J+JXA É tt rroaod C' oÉ,q,Éo o E{ +l +, {J +J +J +) H .?l .F{ .F{ ..1 .-l .Fl t\t |Ittrt|I'fit|t' â l{ lrlrlrt{H E{x +Jx 4Jxxxxx +J +J +J +J H o ooooo o - L1T(- H o o I h lrl o o H g È o E{ H I l. , o o .o.qO'F{ bldl+r tJO t{ Ë Ë É gd ,o F{ É g 1..h'.Ë l'Ë, O tFFl Ê q .r{ fit o N ttoE tqo o Êl F{ H o laho I d dl$ É \ UI -Fl Fl F lFl..lÉ ld ..{l Ê 5'O l.t ..{ F{ F{O H O Ol d\ {J O ao o .oÉ (, g O..{l > d.-l 5 Ocl> C' l'8, l-H .. tC, 2 o .{ Fll..t U É u {J .Fl H É lHg.9 l3g () t Ol 5 O tU"{ o d o+J o Ê H lo.q I Ut Fl+JlUl O O F Ê (ndo É^o F. E| l,<Ê+r loÉ t{ -{ t{l É."{ ..{ .r{ t\t ..{ dp É H I oÉ l._to ) o' tr OF{ o o o OU IU ,o +J UI o oa(J J-l H ttl F{ ul ott d t< {J F{ AA t{ J1 E F{.Fl O o 9. OO H t\ D X-{ g .o o 5 Ê-{ a out ..O r rll o g{ F: o| +J o +J (t{ a H (t o.o+, () .F{ o tt u+J\ È .F{ oo x a +J{JOO +J UI ooÉul.O .O.lJ o {t +r..1+J > (, +J H x {J.r{ t0 .odo lO E{ ,É O > >t(t +J É o UtrQ :rllOÉ +JÉ .r{ .o ..{ t\t ,tI, o F{ O o (, rt +J O I Ul.Ft O IJÊ E{ o O +r..1t .It É o o É-(, o Fl 5 >o ()+r o{J or ttdu ..1 hO i! 5 o oul 'F{ gl tttû C Or F{O t{5 o *,>r > O'O Fl o +JX5 .F{ rlJ H l[r ttt , ,Fi ,o O d.-l +, lJ É oott EI A\ oÉ oq H d'.1 Fl>ÉUlO o .Fl d l|'.{ H +Jo +J.-l Ol t{ +J c,q.l .'{ O l| (d t{ o oÊ i a (d li (U tU E{ rtoÊÉ o ÉÉ {o +JÉ o o 5() 5 9{'O q{ (l) ttÉ o bt 2 É O'.{ O.Fl ttt ! xrûul É un o tt.o o E .'l I doEl rl o .o oo c) OOÉ.,{É É 5 p{O .( F'tJ -a ..{ t{ >td d +J tD do +J 4J +J o t{ É O'O.'{ a o .O+JF{É H É X t'll o o 5do -{É O OFI U)4J.O E| -t +t O tû ,{ o É IU tJt É..1 -{ c{ O +J..{l O rU {J o oq-{o o t,Ég{O H É ..{ É Ol +J É o l{ F{ç{ O É d 5 d rl o o+r.q o It o Él o coo E IU o +J o.o \ >F{É t{>É() 'Fl li dFl 9 't Ll oÉd H o..{ ol d O O{E 9{ u o t{ É E{ +J C > EIF{ +J aÉ tt rû ol É a otoo a .c:0 +r .Fl t; Fl (, .O t{.-ll (t É C O-l o >l t o O çl.Fl O A o o t{+J O É -l O.Él Ut o O t{ q-{ o É tr .r{l o o É odÈ Ê {JO >r+J Ol o tDÉ o J }'l +r -t .rl Ë Ul Ul.Fl s (tf i ÊÉ l(t, F{ 'Fl +J o tÉ Ê ooooru o O.O5 +, .r{ .l F{ o >t5 | .o Él o É OFI h tdF{ a t F{15 tt Ê {, (/)l o X tr'.1 o h .,{l - o ,a d Fll tt tt-{l tt'.| .-oxulo r{ .r{ Ol..{ 'O D EO O 6 o+J t{ t{ +J Ull Fl o 'O o É or, 'Fl t{ÉÉ d >t o ot o $5.C O d o (r{ Ol Xçl do o ItOtU >t o o t€l o d F{ tt F4 o lO rU o+J o o >.F{ c à 'r{ tt ol F{ U'tU ru+rl+J o o .Fl l,i g ^Ë È O O'.{ o ,c{Jo C' F{l O u ot o +J ooo 5 0{r > tlt {J U| t{ F{ >lFl o oooÉ o {JO -- flr Ol.F{l O F{'F{ o o +rl.cl u O rr, O Ut.'l Od>'d qtt, -{ O n'O'O +, O h O"{ EÉ t{ O nt ,||, U| O{>r> -l o o .q É ."{ 16 bF{t| | Ê-.{ d t1 d dl..l | +, {J o 5|.-t O ()rJ u .rl hq{ H o o +J.r{ Fi {J tû HS o a O+J+J l{I o +J t{l t{ É . O hX"{ o t{.O O ol o x .o +Jl ct .uçt o h l{ E O.-l É EË F{OO> Ur Fl rd t{ (t o El 4l > d O{O+J Èt! |It tûMd-{ n t (rl l) É =rl +J 2 ul(d rJ .O t{ +J C' HE F{ .oo td l{ H oo t{ I Ul F{ o H o o F{ û N o F{ H oo N Fl o.c N o N +JO o .É >t Ê o H ool o H o>l É +J ."{l el E o ru >l 'gl P{l +J o o .o Êl |It I q.{ É'-ll .og. 5l ,4 o Ë. .r{ o Ê Èl .o H Êr Ul ('I o Ë I k F{ o o o Fl g tn Ê (It É a| o t{ o |! (, o H H OF{ It Ito .Fl o g H q >t C' 5'O .rlrt H g. à h oç: d Ê tlt +, | '"{ >r o o O. El. rUcQ F{ C) t\t |It _t?g_ E{ Fl o H É d XH Ul ut lrtr ÊFl x riol FIE E.H É F{F{ÉnF{\ t{ HX \UT Ê FtÉ \ rO É Ut tU (,0 urAl \ El\ U| Nx \ É P. HE{ E\ U' \UI É \ UI Ul Ê UrE -|Uut E ('r r/l H o o@ o oÉ F{ (vl O0 tÔto N {ôl .{ CO E E{ 9l o HE il F{ ,o dt El u ÉH o o o HT rd o H.{ o {J .Fl É NH (t{ C' z.E{ q.{ HH o ç1.  Ha{ o o Éi E{ u d (r^HC' E É x En o. ] o a I! +J o Og +) ul à É o âËH .r{ É rJ o Ê !n Ë tU UI g o 8x o .o UI É o .Fl gEftE ûf; rt t{ a x HÉ o {H4a +JO EO Eo o+J oh o o uo o+J {r!+, utd dOtd oÊ l{ol{ 6.O ltE oo E o5 d o5 (fl r -l tt F{ -{ tF o6 .Fl .Fl r{ NE N NFI É ÈHËo.o o o.o ..o ,c6 .c ,cd O'.{ (r.i{ O O.'{ oo ËËfi 9.À +JÉ 6F o Ol.'{ Ol Ol..{ >ro ÊE )l-l >l )l.t Og{ rGÉ -.ll t{ .r{l .-ll t{ oo IE >to >t >to $a HO t lgr t lt t t lÀt t C' UI É9 A Él> À ÉlA A AÉl>,Êl A È Cl .-ll4 U .-llO O O.-ll .ÉO U .oo .qd ^ EI FII EI t-l E E Er .31 ...:l .. .?l .. o H t{l t{l Hl .. t{h D ol ool o ol o|t'l .F{ |It (, p{ I Ël-.r É.Ël B..$lËl .F{rg :11 Ë 8l É x .. ElUl ..{ Cl ..{ dlÊl t{l O Ul +, (ll .AA D ..{l Fl F{.'ll F{ td.-ll .. ll *, l|l 'O F{l HO o x +rl ol o +rl o Âl+rl Hl .o ol o 5l È Ç1. A l.q É | ÉOl I O..ll O .Al d6l Fl (rlH O EllÉl (l Ell d -{l Fll É El d . El -t El oo !l{ DË 81fl to ÉËlËl f;Êl f; 3lÊl I el à $ âfi| +JÊ fi É-9lgl '.51 'ul ' ul F{H rlO , Elul , 8l fl el to ÊtH +, ol Ol +, ol +r Ol ol "+J Cl +, ol 5l rril +, ctl ()(, ûH .'{ Ol.q .'{ Ol .F{ gl Ol .'l ttll .r{.r{lT{l {Jl .F{.Fll c{â tU Fll..il tlt F{l ltt OIF{ d F{l tll El Êl tll (l -{l ..o t{ .Cl Ul H Jt l.t'r'l.Cl k -{l k Ol lrtl .'rl t{ Ol rt E! ''{ H Ë81.51Ë81 fiEl8l fiÈl ËËlbl dl ËEl AO H o utot o ut o Htot o Àt o dtot 14 (l,Bl oÈ -18O- 2) Les principes actifs appartiennent à des classes chiniques variées mais certaines d'entre elles sont nieux représentées : lignanes, terpénoides (di-, tri- et sesqui- terpénoides) glycosides, flavonoides et polyphénols. 3) La teneur en principes actifs pourrait dépendre du lieu et de Ia saison de récolte. 4) I1 a pu être dérnontré que certains principes actifs n'étaient pas actifs par eux-mêmes mais nécessitaient une nétabolisation in vivo en aglycones, pêr hydrolyse. 5) Pour beaucoup de ces principes actifs, la recherche s'est linitée à I'activité anticytotoxique par dosage des AfÀT. Cependant guelques-uns ont fait 1'objet dtune étude plus approfondie, permettant de corréler I'activité anti- cytotoxique à d'autres propriétés : * le thymolrl' eugénol et Ie menthol ont une activité corrèIée à un effet stabilisateur membranaire. La désoxlpodophyllotoxine est anticytotoxique et inhibe Ia mitose et Ia synthèse protéique; elle agit en injection simultanée au toxigue mais pas 3 heures après. * la (+)-catéchine agit à divers stades de Ia biotransformation du cCla puisqutelle est antilipoperoxydante et pôssède un effet stabilisateur membranaire. * Ia siLlmarine est anticytotoxiçlue, stimule la synthèse des protéines et du glutathion hépatigue et possède les propiiétés de stabilisateur membranaire.L'activité anti- cytotoxique des acides caféique, chlorogénique in vitro a été retrouvée in vivo. * r.es doses exprinrées en mg ou g de plantes sèches, utilisées in vlvo et in vitro sont toujours très importantes (3 à 5 g/ kg in vivo et de 1 à 883 g/nl in vitro). Les doses d'extraits aqueux dtE.cannabinum utilisées pour obtenir un effet anticytotoxique sont sans conmune mesure : or250 à Lg/kg in vivo et de 1à s ngrlnl in vitro. D'ailleurs les auteurs ne mentionnent aucune étude toxicologigue si ce n'est Kiso gE coII. (1984) remarquant une auçtmentation de Ia fuite des AIÀT chez les hépatocytes sains exposés à Ia diméthylesculétine lnglnl et la quercétine de 0r1 à 1 ngrlnl. Les phénols exacerbent la toxiclté du CCIa en augrmentant te fuite des AIÀT, AIÀT et tDH à hautes coôcentrations mais sont stabilisateurs membranaires aux doses gui dimLnuent Ia fuite enzlmatique (Manabeet coll., 1987). * les ajouts des principes actifs et des extraits végétaux sont touJours sinultanés au toxLque. * tous les [screeningstt portant sur cultures prinaires d'hépatocytes ont été entrepris avec Ie CCI. et Ia galactosamine. or iI est fréquent de consta€er que de _191_ nombreux produits anticytotoxigues vis-à-vis du CClo sont inactifs vis-à-vis de Ia galactosamine ou inversement. La galactosamine est un toxique provoç[uant des lésions hépatotoxiques proches des hépatites virales humaines comprenant des effets cytotoxiques liés à la déplétion en nucléotides uridiniques et une participation à des phénomènesinmunologiques (Schiessel et coll., 1984). Sa spécificité d'açtion différente du CCIa explique les différences de réaction d'un mêmeprodùit, d'autant plus que celui-ci agit aux stades précoces et spécifiques de cc14, le stade de la nécrose étant plus général. C.5.2 ETUDB COI'IPÀRATM DES DMRgEg UOLECULE8 DE 8TI{TBE8E A PROPRTETES ÀI{TTNECROTI9UES Le tableau 35 regroupe les molécules de synthèse à propriété antinécrotique sélectionnées dans Ia littérature selon 3 critères : * Ies recherches sont récentes et se poursuivent actuellement. 't les molécules sont utilisées en ctinigue humaine. * ce sont des antinécrotiques trvraisr c'est-à-dire qu'ils sont inefficaces sur Ia biotransformation du toxique et Ia LPO. Peu de mécanisrnes dtaction sont vraiment connus.II ressort néamrnoins 2 principaux types d'action : *inhibition de Ia phospholipase membranaire et protection de Ia dégradation des phospholipides membranaires et de I thoméostasie calcique. *stimulation de Ia synthèse protéique, de Ia régénération hépatigue. C.5.3 ÀPPROCHEDU l'lECAlIISltE CTTOPROTECTEURDE L'EXTRÀIT AQUEUX D'E.capnabl.num L VI8-A-VI8 DU CCll L'extrait végétal agirait au stade ultine du processus toxique, Iê nécrose. II n'empêche pas Ia bioactivation du CC14 ni la LPo consécutive. It a été démontré que I'EUPP, Iactone sesquiterpénique en concentration importante dans Ia plante (lt des parties aériennes sèches) ne présentait pas d'activité antihépato- toxique à la dose rencontrée dans Itextrait aqueux. -].'B2- \o fî \o sf Co\or- @@ I co o|@@ o\o\ lto (t'l FICÀO\ F{ r{ \o lco F{ colo \(l.\ (À lr{ ,.ir - - f- r{l . r{ r{1 .. l- F{l Ol Fll -{l . l. 3 Ëljl . Ël Ol F{lgl F{l ot ul'ol l_tl 2 ul El.J vl Rl vl l tl 1l lËl o H alll -rl Ol+Jlo ol lol H H F{l Olor ul E{ EI Ël ËtËl Ol d F{ l*rl (, Fl s Olt{d +rl lol É >N O lX-l \ ot I â o o o+J tJl o rû o o I o t{d O Ol t{ ç lr o lg o a t{ÉFt l{oo h to o H o OdtU o oo.Q otn H É Ê{ ÉX Urh O tn lo . gl ,1 h5 O O"{ O l'.{ o H o ooo t{ O ttt F] .r{ lr.1 H tr cô Afr.H oo= O 1.. z lo É: (, ô lg H +J o+J a - oÉ oo É Et l3 .r{ tU OO tU .r{ lUt E{ ut.q rd t{ +J +J lÉ H tt, ''{ Ê.r{ O .I, +J +rt o '.{tUO O ÊÊ !a oÊÉ -f Ér{+Jlt{ .oo 1.9 E O'-l 5 O td--{ Cç{ ,ÉÉ o lu D .o\ .cl{ o(d oo Ê l.F{ o| EtÉd O{.4 O 5 É,o +r ttt l, H oo OEÉU+ O t{ .Fl +rd lÈ E{ .4É O O..{ 'O+ ''{ p{ td ur lo \ OO tEi ood +JtI' H oË I F{ O .r{ 9{ El É() tû +J llt C' rt +, UIEIO HO o |I' lo H O..t O oorûoo .oo o ,.{ o lE z tn9{5 O d'O F{ Et{ Fl d o lul H 2 ,O'.1 t| F{..{ É l{ .o5 Fl O l"{ H o +JF{ É P{ Crl| U'O UI l.t lF{ z H O O"{ O.-1.. QCt .o.c É \tO lO É E{ l{.c Fi-l O 9{ t{ r(t Fl +J lO (, Êg.t{ (o o 5+J \ood o E lo o É o|\' E!.C tto o rûA O.'{ lF{ H .o Q Ê.r{ .O Ff ,|UFl O Ird O rt A Ê,c ,d O X mF{ r '0) p|.. lr O É O 9{O r{OOO5 .5 d (n 16O l_{O H H 'Fl +J .d+J 5 Ul O E -{'.{ alH D - 6t,lÉo t{ O{ tt'O AA Fl É tt lo.a H o :r{OdÉ d o..t t{ tt 5 t{..{ O.'{ O l'15.-l C., H O d d'-l P{Ul-{ O ..1 .n t 4J ..{ +J Ei I q{ .( lr ÉF{ O FIZ .o aa +, o ut l+J .oÉo5 +J6Ut.ûOO +J +J td h'.{ lÉ d H (,e +, O O{lt O ,OO'4l.t OOO.- >.Q-{ lO-{ o H o.,{ .o o ÉH s'd l| oo .r{.-l O I É E I rJ6 E O O O{Od d Q+JOO pq.{ o lo+J EI EC' O C.r{ ttt O Fl Ét\tt\, O..l O l*J O E{ Od+ g{ '.{+J t{ O 5 o rd ()+J d lJ F{ l'r{ - E (! +'-l F{ rd ul o oF{ O >..t td o É d lrd o }| H tUF{ 5dOÉ,O-t ,O d ${.q -F{ (tt\ lt{ O o o tD(J drlthÀ.CO ,a q{ 9{ .cl Fr l+J o t{'O I O O t{ 5 O+J O +JOOO +J|+J H ..ld o o Fi u'o É É Éoco d o o to |\' o o od F{.o.c o > c >tP'-l .q O Fl O l-l{l +JO(lP. d'ç .,{ Ul O A A 9{F: ol+r o t! d 9{'-l OO'F{ E.. l O o 5+J lo o E Fl .r{ F{ (tF{O(llj t\t .-l ç \o'"{ ct ttÉ lE É E+JFt O (t-{ OF{ tU F{EOIF{ À..1 O ld d D d o o.c FI ,|[JFl l{ ..{OO +) É l€-t (, À ÉÊ +J +J .O +Jo+J Ul O ooo I H r+{ O ç1.O +JÉ\o+'EÉ É('|doo .c k+r to+, É Éaûo É ttt E o.0, O O OF{ O O'.{ l'O g .,{ tt o.c o,c u o 5 ul F{ Ul'F{ t ld (o{, r! lo o |'.1Ê lt .Q orH 5 É.o J$t Xrt. g{ E t{ 1..{..{ ..{ O p...1 .Fl (O.Fl tt.r{ I{ E.F{ O UlFl El.'{ $ l-t > : +J -{ +, .É P{+r O Fl .F{ +J +J O {J l..l .O Êddc É El O F{'.{ .It +JOÉtUO r Éo l+Jl{ UI (t OF{ Ct .'{ O dÂft-r ul rû.F{ F{ t' É 'It.{ t (rl l" D I É o I tl E É I È .F{ tl gl N I IU I r{ o I tl E{ l{ I tl o .o I UI Êo lo lo I o t(t oÉ lÉ l+J I H ll'r{ I O'.1 É l+J oFl tÉ ç lS l" It l.o a6 l..l O l"{ lÉ C' tÉ F{ I{ l'O'.{ lF{ l'Fl E l|(t T{ gt l+J .c rl lx .Fl.Fl lo +J 1.9 ld lo It{ El l>t'O I Irt l+J.-l to E lÊ 16 _183_ La recherche dtune éventuelle activité antihépatotoxique de I'EUPP se justifiait au regard de ses propriétés pharrracologiques importantes. ElIe sont pourtant contradictoires car allant à Itencontre dtune éventuelle activité antinécrotique : elle est cytostatigue et antitumorale en se liant spécifiquement avec des groupements eléctrophiles des protéines, enzymes, nucléotidesi elle est inhibitrice de Ia synthèse protéique, réduit le taux de glutathion hépatigue à dose antitumorale. Néanrmoins cette recherche aura permi de constater qutà Ia teneur contenue dans Ia plante et dans l,extrait aqueux, I'EUPP n'exacerbait pas la toxicité hépatique du au CCI,. Par ailleurs, iI a été dérnontré que I'eupatolide était anti-inflammatoire et, si cet,te propriété est corrélée avec une activité inhibitrice des phospholipases Ar, une participation à I'activité antinécrotique ne ëloit pas être exclue. Sa cornposition chirnique fait apparaitre d'autres composés susceptibles de posséder une activité ant,ihépatotoxique : * diterpènes dérivés de clérodane. * triterpènes (acétate de damrnaradiényte). * flavonordes comrneIe rutoside, I,hyperoside, la quercétine, I'asÈragaline, l'acide p-coumarique, Itacide ferulique, I'isoquercétine et Ie kaempférol-3-rhamnoside. Certains sont susceptibles d'inhiber Ie cytochrome P456 (Vernet et Siess, 1986), de posséder un pouvoir an- tilipoperoxydant (Torelt et coII., L986) ou antiradicalaire vis-à-vis du DPPH (héspéridine> kaernpférol quercetine (Pincemail et coll., L985). IIs peuvent posséder des propriétés anti-inflammatoires et antiallergigues et une activité sur Ia phospholipase A, (PnZ) n,est pas exclue. * acides-phénols commeles acides caféiçlue, chlorogénigue et isochlorogénique. La litt.érature rapporte leurs activités antiliporeroxydante (Kirnura et coll., 1985) et anti-inflanmatoire (Koshihara et coII., 1984, Twahashi et col1., 1985). * polysaccharides anti-inflammatoires (Volhnar et coll., 1e86). * choline utilisée depuis longternps conme antinécrotique dans Ie traitement de I'alcoolisme. Ctest un agent Iipotrope donneur de groupements -CH1 qui intervient au niveau de Ia synthèse des phospholipides, cornmela bétaine commercialisée aussi pour les mêmesusages. Ainsi certaines nolécules présentes dans Itextrait sont potentiellement capables d'agir sur Ia LPO conme les acides-phénols et les flavonoides, soit sur Ia nécrose cellulaire commecertaines lactones, Ies polysaccharides, Ies flavonoides ou Ia choline. En effet, une propriété anti-inflammatoire peut très bien être envisagée conme une -184- inhibition des PIÀr localisée sur le réticulun endoplas- rnique et Ia menbrafiê ptasnique et contrôlant la production des icosanoides. Or un effet précoce du CClo, sur les PLA2 est actuellement envisagé (Lepage et coll? |'L988, Glende ét col1., 1986). L'activation des PlAr-car?-dépendante, pâr augrmentation du flux calcique, activé la dégradation des phopholipides et engendre une perte dtintégrité de la menbrane. Ce phénomène est connu pour être responsable des dommagescellulaires causés par Itischémie, Itoedème cérébral, 1ê choc toxique et Ia dégranulation dee éosinophiles. Cette notion d'effet précoce explique beaucoup de résultats jusgu'alors obscurs : tous les inhibiteurs du cytochrome Paqo et de LPO sont inactifs sur les effets précoces du cCI; par exemple. II parait alors fort plausible çlue certains principes actifs de Itextrait aqueux d'E.cannabinun puissent intervenir sur les effets précoces du CcIa : ceci se défend dtautant mieux qu'un antinécrotigue agit âu niveau de la membrane plasrnique conme stabilisateur membranaire ou conme inhibiteur des PIÀ, et que plusieurs composés contenus dans la plante possèderâient ces propriéÈés. P-priétét ?iurétiquer A'8, ca.nnabinumL. -185- En médecine traditionnelre, cholérétigues et diurétiques sont souvent associés. Outre Ireffet solvant dt à Itingestion d'une infusion ou drune décoction, Iteffet diurétique des plantes a souvent été inputé aux dérivés xanthigues ou aux sels de potassium en quantité non négligeable. En fait, si les premiers sont effectivement diurétiques, ils ont été abandonnés depuis tongtenps du fait de reur toxicité; guant aux seconds, Ieur hypothétigue effet est pourtant sans fondement d'un point de vue strictenrent physiologique. La bibliographie concernant les diurétigues d'origine naturerre est pauvre voire inexistante si ce n'est quelgues rares pubrications faisant sirnplement le constat d,un effet diurétique de te1 ou t,el extrait végétat sans recherche du principes actifs incriminés et de son mécanisme draction. Citons pour exemple Juniperus communis et Rosmarinus officinalis (Giachetti et coll., i.ggi-), ononis spinosa (Rebue1ta et coll., 1.981-),Viola odorata (Rebuelta et coll., L983b) , Sambucus ebulus (Petkov et Markovska, Lggt ) , Sambucus nigra (Rebuelta et coII., 1.983a). SeuI lreffet diurétigue fortement narqué de 1'extrait butanorique de cynara scorvmus a pu être attribué au mélange d, acides-alcools et d'acide hydroxlrméthylacryligue (Mortier, L9721. Le rapprochement chimiotaxinomigue de E.cannabinun avec d'autres Asteraceae à réputation cholérét,ique et diurétique, tels gue Ia chicorée, I'artichaut, le pissenlit, la piloseille et Ia grande bardane, nous a conduit à chercher si I'extrait agueux d'E.cannabinurn avait aussi un effet diurétique, bien que cette propriété soit secondaire et moins citée que son usage dans les maladies du foie. Lrutilisation de Ia plante corune diurétigue est mentionné par Àvicenne en arabe ancienne. Cette propriété se retrouve nentionnée à plusieurs titres dans l-a pharmacopée traditionnelle française : la racine était enployée pour lutter contre 1toedème, I'hydropisie et 1'hypertension , une décoction suivie d'une infusion de L5 g de feuilles fraiches dans 2O0 rnl d'eau était recommandéepar Leclerc commediurétigue (Fournier (1949). Les médecines traditionnelles indienne (Chopra, L9S6î Nadkarni, L9271, cypriote( Àrnold, 1985) et allemande( Thorns dans Malingré, L97L, citent aussi cette propriété. D.1 RÀPPEL 8UR LA pItARItACOI{rcIE DU REIN ET DE8 DIURETIQUBS (Schwartz et coll. dans Giroud et coll., L978, Le rein possède une fonction drexcrétion comportant drabord Ia filtration glonérulaire, puis des modifications du filtrat par différents processus tubulaires. Cette fonction est évaluée par Ia clairance çIui correspond à Ia quantité de plasma épuré par le rein en un temps donné. 186 - D.1.1 TRÀN8FERT DEg PRIIICIPAUX PARAITiEIRE8 ITRINAIREB Les glomérules laissent passer un simple filtrat plasmatique mais I'urine définitive est toute différente tant en volume qu'en composit,ion. Le tableau 36 regroupê, pour les principaux paramètres urinaires dont le glomérule assure Ia filtration totale, la concentration plasrnatique (qui est donc la même dans Ie filtrat glornérulaire) et les pourcentages réabsorbés dans les tubules et excrétés dans les urines. TIBLEAU 36 : teneur ôes principaux constLtuants urinaires dans le plasma et les urLnes chez lrhomme (draprès fright, 19731 Constituant, Concentration tercrétés t réabsorbés plasnat,l.que dans les dans les (s/Ll urines tubules Glucose I I 99 HCO3- L15 0r03 99 r7 Na* 3r3 t 99 K+ o,L7 715 92,5 cI- 3r6 1r5 98r5 Phosphate(en P) 0, 03 23,5 76 rs ca*f 0, L0 L12 98r8 Urée 0r3 58r8 4Lt2 HSO4-(en S) o r02 79,4 20,6 r 8o6lun : 65t du sodium filtré sont réabsorbés au niveau du tube proximal par un transfert actif, 25* sont réabsorbés dans Ie segrnent large de la branche ascendante de lranse de HenIé par un transport passif; 10t sont réabsorbés dans Ie tube distal et le tube collecteur par un transfert actif régulé entre autre par Iraldostérone. . Potagstur : la plus grande partie est réabsorbée au niveau du tube proxinral et accessoirement au niveau de ltanse de Henlét il existe une secrétion active dans Ia partie terminale du tube distal et la partie initiale du tube collecteur; cette secrétion est drautant plus grande que I'apport potassique et sodigue est grand et quril existe une hypersecrétion d t aldostérone. rB7- t ltagnesium : 3O* du magnésium de I'organisme sont élininés dans les urines; 8o* soit filtrés par Ie glomérute et les 2oZ restants sont liés à lralbumine qui ne franchit pas Ia barrière rénale et reste dans la plasna; 15 à 30t sont réabsorbés dans Ie tube proximal, 6Ot dans Ia branche ascendante de I'anse de Henlé et 2 à 5* dans Ie tube distal; Ie reste est excrété dans les urines (Bellorin-Font et coII', l.e84). . Urée : Ia réabsorbtion est variable , environ 40* en cas de d'apport hydrique, environ 8Ot en cas de restriction hy- drique. r CalcLnm : 55t du calciun filtré sont réabsorbés dans Ie tube proximal, 252 par ]a branche ascendante de I'anse de HenIé et 9t tà sont- activement dans te tube distal et le tube collecteur; seulement 18 du calcium filtré est excrété dans les urines. * Acide urique : 988 de 1tacide urique sont réabsorbés au niveau du tube proximal puis 8t de la quantite filtrée sont sécrétées. . Pbosphore : 9ot du phosphore filtré sont réabsorbés par le tube proximal. t lre glucose est réabsorbé activement au niveau du tube proximalî c.}:ez 1' individu sain, iI n'y a pas de glucosurie' . L,es acldeg aninés et les protéineg sont presçlue totalement réabsorbés au niveau du tube proxinal. L',albumine par exernple n'est pas excrétée dans les urines. D.1.2 CONCENIRATION ET DILUTION DEg URINE8 Le nraintien d,une pression osnotigue normale dans les Iiquides extraceltùIaires est nécéssaire à la sunrie de fiôig.tti"." . Ce rnaintien assuré par-(hormone le rein, es! sgus Ia àepéf,a"ttce de systèmes hormonaux anti-diurétiqu9 et alàostérone). eûand la concentration en subEtances osrnotiques urines est i"=ràf"fité'exfrrirnée en mosrnôles par.kg d'eau) des èùpérieure à du plasma, les-urines sont hypertoniques' euànd eIIe est"ètt" inférieirre, les urines sont hypotoniques. ôuana elle est égale, les urines sont isotoniques. Lteau éIirninée dans les urines est formée de deux com- posantes: . Ireau llée qui contient des substances osmotiques-à une concentration-identique au plasma (mesurée par la clearance osmolaire Co=o.).. ;-î;;"-itUlË"'goi ne contient pas de.subEtances osmotiques (mesurée par Ià clearance de I'eau libre cHzo)' libre Quand les urines- sont hypotoniçlues,-hypertoniques, Itexcrétion d'eau I'excrétion ;;i- ;";iùi.r., quana ef fè-s sont d'eat libre est négative. -188- Crest au niveau du tube proximal que 7OA de lteau filtrée sont réabsorbés passivement, proportionnellenent aux substances osmot]ques. Dilutiôn et concentration se produisent en aval- de ce tube. Au niveau de l'anse de Henlé èst créé un gradient osmotique cortico-papillaire grâce à un système de contre courant. Si V est le volume urinaire par unité de temps, Uosm et Sosm Itosmolarité en mosrn/I de lturine et du sérum : V = Co=mr CH2o = (Uo=* x v)/ So=* * CHzo Enfin, il existe deux mécanismes de régfulat,ion bornonale : f,e prâmier assurant la réabsorption d'eau au niveau du tube conlourné distat et des canaux collecteurs : c'est lthormone à"liaiùrétigue (ADH), secrétée par 1'hypophyse. t'lljection d'une solutfon Éypertonique (NaCI, saccharose' Na2S04) stimule I'ADH par la mise en jeu d'osmorécepteurs. - i'ingestion de-boisson abondante induit une polyurie. par intriÉition de Ia sécrétion d'ADH secondaire à I'hypotonie du plasna. Le second assqre Ia modulation de I'excrétion sodique en fonction des besoins hydroélectrolytiques de 1'organisme : crest I,aldostérone, hôrmone corticosurrénalienne dont la synthèse est réguléà par le système rénine-angiotensine slinul.é par la iolénlè. L'aldôstérone agir au niveau-du tube contournè Alst,a1 en favorisant 1'éclrange d'ions Na+ du liquide tubulaLre contre aés ions x+ e€ H+. D.1.3 IJESDIFFERENTS DIURETIQUES (Irnbs et coll., 1986) Un diurétique est une substance qui augrmente Ie volume des urines. Lrèau et I'éthanol sont diurétigues nais ils ne modifient pas Ia nat,riurèse. En fait les médicaments diurétique; sont des natriurétigugs ou.plus généralement des salidiuiétiques. La plupart deE diurétiques n'agissent que sur un segrment fimitê du néphron. Ils sont prescrits avant tout dans deux situations : l,oedème et lthypertension artérieIle. La figure 39 représente les sites d'action des principaux aiuré€iques donl la classificatlon est présentée au tableau 37. D.1.1 IrEg DIFFERENÎ8 UODEL,ESEXPERII'IENTAUX Il existe divers nodèIes d'étude des diurétiques chez Ie rat in VivO mais tous se déroulent sur quelques heuresr ên nodèles aigus : Le composé testé peut être dissous dans de lteau distillée' adminiËtré per os sous 20 à 2sm[/kg (Àndreani et coIl. ' L98'7î Rebuelta et-coll., 1991, Rebuelta e! co!L., 1983a et 1983b, Miragoli et rerrini, L986) ou dans une solution saline -189- o o o o o T{ rl, o t{ x .a J ol r! ol+r lo o HI .o ol o UI 0l+r o É t{O o EtU 5.O o Flo Otl UI Ê.o n.Fl d o o aa NO .o a Ê F{É H UI +J u o o o o o,o o \u o É o .Fl l{ F{ . O,O É É IU 6 É,4 O .-t t{ â ,o lJ d .O.-l .F{ aua +J+ Ê a -.r{ F{ tU o tt 5.-l t{ ult o t{ ul o ÉF{Ctq{ o .F{ .Fl F{ C' h\ É o,o É o dA1 Ê ÊO.û Ê o+ o +Jh o .-{ A1 O o OF{J4 rd a O P{O +J O ^ l.-l +rctll o + DZ tt odl{ É tU 9'rO t{ E t{ O OF{ r\t =É 'Fl t{ ''{ |lt l{ ho t rd o o o.Q z D O"{ +, Otd o +r.co ul o o P{ È,O tU NSFl o ,-Gl l.l r{ É .l.t'O tt .o h > t{'.{ o ttr d É '.1 U O O 5 Ê'.1 É ,4ÊA*1 t' g.Fl O o Odt{ o 5..t tn o l{fit o' AÉ-l o O r{'O É ttt{ rd rU o o+, 0 > É o od ÉuÉ o..{ +J Fl o É O-l o .o oo o ('.q o OCrtt t d .r{ .q t g t{O ot 6 9-l OÉrJP{ t{OOg. .o PA > +J ç1. a É+r U.| a {J +, ^lO UI 5'.1 ll +J Êtt ntl{ (, o H OOO t t{ Eio o O'.{ o\ .o +roÉ , ÊUl OF{ t ..O Ul F{ o r!l O QFI F{ HO o É >,,O..t^l o É.-l ,O ^l É F{O t{OVl o td ,O.F{ +J o.c H h+ 4J OF{ l|+ o ,o É+ E .'{ +) 'F{ )u6 'r{ ..{ trt t t\t tlt o r+{ nt .u oFi (d I kt{Z o +J O l{..{ Z  $x-Àz Â-{ .F{>5t{ 5 É O O\ .F{ t O t{\ .r{ lU o+J\ +J r-l +l .F{ F{ F{ F{ F{ | Ê F{ 9{+rl +J EÉ rJl +J .F{ H.C dF{ Ê .Fl > tU r{ É ÉrU É O-{ O (t"{ 65()()(J t'.q Éu ru .r{ O .r{dO tU F{ l+{ o e o É É à o }{ rJ o o () É UtF{ tlt tlt ,q, o o l{ , +J .oP o .o tt ."{ tr +J 'F{ É UI o o Ê +, tr o o k nt o IU h .r{ .Fl Ê Ê a o g. l{ t) q{ ttt UI +J o o .o +J É +J o , t .d o o É o rt co (t o (t +J o l{É o É +J!tlt ,4 C' É o () o ttrÉ Ê É F{O |U En o t{ o o oo E UI6d -19O- - TUBE PBOX I ruBE DrSrALl L-F- SITEI {} srrE 4 - 65 ,r, SITE 3 Ne'excrétê 20 à 400 mM/24h Prncipaux sites d'action des diurétiques sur le néphron' - les segmentsde tube timitêsen traitsépais sont imperméablesà I'eau: par le - les pourcen{sdonnent la valeur approchée du pourcentage d7 sodiym filtré glomérutequiestréabsor#parlesegmentindiguëparl.accolade; parois A . S4uatlontavorable à la ccncentration des urines : la perméabilitê à I'eau des l'eau du rube collecteur par l'hormone antidiurétnue HAD) permet le trcnsport de le gra- iÂesuraotepar r1u)d vers !'interstitium de la medulla, hypertonique.suivant dient osmotique ; B : Situation favorable à ta ditution des urines : en l'absence d'hormone antidiurétique, par la l'eau tibre (mesurabtepar CH2O) constituéelors de ta rêabsorptiondu ClNa Wbe branche ascendantede t'anse'de Henté ne peut être réabsorbéeau niveau du collecteur. ALDO : principat lieu d'action de l'aldostérone' 8UR I.'E FIGURE 39 : PRINCIPÀUX SITES D'âCTION DEg DIT'REIIQUE8 NEPHRON(Inbs gÈ,cgl-L. e 1986) 191 - normale sous 40 nl/kg (Kau et coII.,L987l. Il peut être adurinistré par voie i.p. 20 rninutes après une solution hypotonique à 0,458(5o rnl/kg) en I.P. (Petkov et co1l., 1981). Le produit peut être injecté par voie sous-cutanée et I'animal réçoit 10ô mlrzkg d'eau distillée æ,8 os (Guiol et coll., 1-984). L'urine excrétée durant les 4 à I heures suivantes est ensuite collectée.et les principaux paramètres urinaires sont nesurés (Na+ et K-). Lranimal peut subir une cathétérisation des uretères puis être placé en cage à mét,abolisme et recevoir Ie produit t'esté par voie I.V. (Harnnarlundet Paalzow, 1985). Pour étudier Iteffet diurétique de l'extrait aqueux d'E.cannabinum, nous avons utilisé deux modèIes in vivo, c.}:ez Ie rat : t un nodèIe chronique, par ingestion orale quotidienne d'extrait agueux d'E.cannabinum, à dose thérapeutique traditionnelle et active sur les précédents tests (cholérèse, hépatoprotection). Ce rnodèle est Ie plus proche de trttitisation traditionnelle. L'expérimentation, menée sur au moins guinze jours, comprend, outre Ia mesure du volume urinaiie quotidien, un bilan ionigue urinaire à Ia fin du traitement. * Un nodèIe algru r Pâr mesure de I'élimination d'une surcharge hypotonique. Ltextrait aqueux d'@nabinum est adninistrée â dose-unique dans une surcharge hypotonigue. Cette technique est enrployée par Kau et coll. (1987) chez Ie rat maie Ia éolution hypotonique et, le produit testé sont adninistrés par voie orale et les différents paramètres urinaires sont suivis pendant 6 heures. EIIe est utilisée auEel par Petkov et ttalkoska (t.ggl) pour I'étude d'extrait vôgûtatx, mais Ie prodult tccté est adninistré préalablement .n I.P. et l,anlnel. rGçolt ensuite Ia surcharge hypotonigue en I.P. Nous avons choisi Ia voie intrapéritonéale pour des raisons pratiques de néthodologie et par conséquent avoir une asslnilation rapide du produit testé : Ies gavages L.er os demandent un celtain tenps et if fallait pouvoir suivre Ia cinétique du volume urinaire excrété . Dans ces conditions, lradministration f.P. est toujours choisie pour ùettre en évldence un effet pharmacologique. Ltextrait a été dissous dLrectement dans Ia surcharge de manière à éviter une nouvelle manipulation de 1'animal f,,e furogénLôe a été choisi conme diurétique de référence afin de comparer I,intensité de I'action dtE.cEnnabinurn à celle d'un produit de synthèse. C'est un diurétique de I'anse de HenIé inhibant Ia réabsorbtion de NaCl dans la branche ascendante de ltanse de Henlé.-i"'U"+ En fait les ions CI- sont réabsorbés consécutivement é[-i"-ptésence dtions Kf est indispensable dans Ia lurnièrg du tubç, mettant ainsi en jeu un syètèure de cotransport Na+-2cl--Kr. ce transport existe aussi dans les érythrocytes, Ie côIon, Ia trachée, Ia cornée , Ies ascites dtfirlish et les cellules tumorales. II - !,o2 - est tié à la protéine de Tharnm-Horsfall, glycoprotéine rénale épithéliale située dans la membrane cellulaire de Ia branche ascendante de ltanse de Henlé, possédant des sites de fixation pour les ions Na*, r+ àt cr- (Graven et coll., 1984). Dans Ia tunrière du tube, le furosémide bloquç cg cotranspoçt, inhibant par voie de conséquence Ia pompe Na--Kt-ATPase, K- et Cl- étant, passivement distribuée de chaque côté de la cellule (Greger et Schlatter, 1983). nn adninistration chronique à forte dose, il diminue le taux de !tg++ dans le plasrna eÈ les os, 19 taux de K- dans le -reSteplasma, Ies muscles du sguelette mais la concentration en K* stable dans le myoCarde oÉ seule une augmentation de ca*t apparait (Borgrevink et coll. ' L9871. La dose choisie ici correspond à celle utilisée par Andreani et coII. (Lg87) chez le raL pour induire une salidiurèse. Une solution de nLtrate de potassl.un a été testée de nanière à vérifier un éventuel effet diurétique *ea s'eIE de potassium (couvent sous f,orme de nitrates) contenus dane de nombreuses ptrantes comme Cynara scolymus, une autre Asteraceae aux propriétée proches d' E. cannabinum. Le volume urinaire est suivi durant 24 heures après injection de la surcharge et les paranètres biotogigues et sériques les plus-x+ importanùs sont mesurés: débit, et concentration en Na+' et ci- et clairance osmolaire. 101 - D.2 IIÛFITUENCEDE Ir'BXTRAIT AQUEUX D'E'SSnnab:1ntrn L. BN lDl,lINrSTRl'rION CERONIQUE SUR IJA DTURE8E ET LE BILâlt IOIIIQUE DE Ir'URIIIE CEEZ LE RAT D.2.1 IIATERIEIT Ef UETHODES Des rats mâles Sprague Dawley (Iffa Credo, LtArbresle, Fr. ) d'un poids de 250 à 300 9, sont répartis en cage à métabo- lisme-pernettant Ie recueil séparé des urines et des fèces. L'extrait agueux d'E.cannabinurn L. (5O0 lrag/kgl est incorporé à la ration alimentaire journalière de 209 (Extra Labo, Provins, Fr. ) . Les témoins reçoivent de l' eau distillée dans les mêmes conditions. Les animaux sont abreuvés ad libitun. Sur les urines filtrées, recueillies toutes les 24 heures, Ie pH (pHrnètre protatest 653) et les volumes urinaires (volumètrie) sont mesurés. Après centrifugation (300xg; Srnn), le fittçat çst cgngelf-en tùues plastiguès. Les concentrations en Na*, Kt, Cl-' ca--, urée et créatinine sont déterminées en fin d'expérience' par un.quto-analyseur (Technikon, sMA 6). La concentration en Ug** est mesurée par spectrophotornétrie de flamme (Perkin- E1mer, 3058) r Erpérlence 1 t Les volumes, pH et concentrations urinaires d'un lot de 5 rats traités et d'un lot de 4 rats témoins sont suivl-s pendant 23 Jours. r Bxpérlênce 2 3 les volumes et les pH urinaires d'un lot de 5 rats traités et d'un lot de 5 rats térnoins sont suivis pendant 2O Jours. D.2.2 EXPRESSIONDEg RESULTATS Les moyennes journalières des flux uri4airçs (n1/1o0gl,des pH, de-s conceirtrations urinaifç= en Na+, Kt, cI-, Mg'-, urée, ôréatinine (mnrôrrzloog) et ca+r ( môrrz loog) des lots traités sont comparées aux moyennes des lots ténoins par un test non paramétrique, compte tenu des fluctuations journalières, Ie test des signes (c.8.À., L978). Sur les figuresrles moyennes et les erreurs standards sont représentés. D.2.3 RE8UITTATS * Erpérlenee 1 3 Les résultats sont réunis dans les tableaux 37,38 et 39 et les figures 40 à 48. -t94- .la r{ dp * o dp û d o It + rt VI to + g{ El dP ra F- F{ i. lrl\o lO sf br o \o(rl â z É r{ F{ rt o D F{ ôl o C) H o +t +l É C' E{ l? olo +t +l ut ul É lJ1 (tt sf (vl .Fl H rl N|rl o É É N (\ ôl 7 sf lO o É É o .r{ d n H {. rl A dp * +J EI r{ dp UI EI dp (Y) ro o rt + Cî +J (, E + a Êt Êl EI o Él F{ Fl n { rnF sf l- o X N @ {cî o D É dFl IU E D r{ (\ D br o +l +l 9{ ol o 1" sf F. +t +l A o cî 0 n(vl d !t @ôl +J E{ E{ Fl ôit cî o HÉ (rl|r) Fl ÂÉ Fl Ê É u HH tU NÉ FI {. E É dp + +, rs| H tr) dp t{ ÉtE GI É D o rtbl b â ST C) !0 OF{ \r sf o Ê lo D oo oo o F, +t +l +t +l 9l \fsf co@ Ftl d T{l âl N oor co@ Fll Fll Fil À x It H H !0 (\il Fl !û sf D É Ê cr H D oo oo ÉE .( o z t, +t +l +1+l E{ Êl H ôt (Vl o\o\ H û It .(E ('\or @o Êl F? D Fl E{ XN EI EE A r!l OC' HH DÊ otH HÉ zzaE, EID C- tO ('l oil o r É r{O oo tr D o +r +l +t +l ËË 12 ôl F. @o H H F @@ @@ H â Er F x o HD Ê E gt- sf lo zC' IX H D 2e tl Él Fll Èl  2 EI Êl H .Fll aa .ql il odl o rdl .c|Cl nÉl Co otrl oÊt dt o|l'l () ctl |!()1 D E rd ol n F{ rl F{ .l  . 9.t{l o{F{ E E rl E{ r{ (\l E H .{ Ê; p; E{ â x x H Fl FT -L9(- !0 Ê D o l" rt Fl ^lo E{ oo ÉoOi oe ut 2 .r{ vl * O trl. Ë *{.{.*dp*dp dpdpdPdp{dPd ul* bt (Yf(sff.Or(Y)co o (\il (s| F{ (.l Cî sf 6 z ++++l++ t^ o +J H UI B': H o É +J H f;Ë É o É ul .c| EI; o FI * o 'ElÉ o tU dP E ôt(ro Fl , o\o(\t P{ Ëls E{ rl dF{c{NOr E Tl t\rlf)lo(rl n OOOrlftt +J Èl It F{rQ o â +l +l +lOsil ;|a rt É nF{(h+l+l oH N rt OOnr-rfo!+l a t nf-n@OlFf' tu a \itt\\t xff H OOOnF{r{Fl +J br l{ o o o tl{ il Ê âi rtt flË t{ o k H IU ÉE È E: Ol É =H H ta€ o É o ÀÉ H T .F{ Ho Ë {J C' e o Ee â ."{ ttH o q.{ âÊ{ !t .Fl FIH H l.FlO =6 E{ @nn É * C)F{\ON@ Ut ER â ttrQQlCll .r{ F- E{ ooo1Û\\ o n o rQO H n +l +l +l F{ +J E8 o FT OF-@+l+l('l É tr (, dôlt\+lF{n o àg o d rtlrtsf|J}OOil+l Ê C' t{ rrt\(tt o À OOOltîlF{F{ , !lc El .Fl ËB +J D o rl .r{ rJ Êtz (t AA +, ^UIOO o : ooooo OUIOF{F{F{ o or a A O F{ (O (O (o Qta o (r| H IQFI()ÊÊEÉ o É E (O É É È- E .F{O E D H É â É Éo o v v v .F{F{ t{: E É t{ H v v +JrQ .o É v + + o dE q{ FI â *r *tn *. 'g 'fl:- q{ É É + L .F{ E{ C. Z M U E O A O- o -L97- Placebo: - E. cannabinum SOOngr/kgt- ;r - o o k , o É !t ô! à a u C' I \ I C' \ d I Itl FI \T a 3. Êr É \'L{ \ H tl .( ! \ za 2. H lt trÉ I Êl E D t. É P o olOrS20 TEI{PS( Jours ) FIGURE 40 3 INII,UENCE D,UN TRÀITEI,TENT ÀQUEUX D,E.CANNAbiNUM 5OO mg/lrg/z4 heures PENDÀIIT 21 atOURS SUR LE VOLUI'IE URINÀIRE CEEZ LE RÀT( EXP.1 ) Fl É H  A8 Ë fl Ê, IIEUPS( jours ) FIGURE 41 3 INFI,UENCE D,UN TRAITEI'IENT D,E.CANNAbiNUM 5OO mg/kg/24heures PENDH{T 21 JOURS SI'R LE pE IIRINAIRE CHEZ LE RAT( EXP.I I -r98- Placebo E.cannabinun 50089/kg o o l. a o â tt GI b C' C' d o o .or{ E @ Ël + rt à q6 lL { LJl &l -il lr 1 7 o oâ { H \ Ét â E{ oir BT zC' o C' or.- 3ro15?o TE!{PS(JourE I FIGURE 12 3 INFTUENCE D'I'N TRAITEITIENT ÀQUET'X D'E.CANNAbiNUM 5OO mg/k:g/z4 heures PENDAIIT 21 atottRs 8UR LE TAttx DE SoDIUl,l URINAIRE C.EEZtE RAT( EXP.1 ) o o h = o É T 6| ùr o o d o o .(,?l E E + !4 à 9l à o H E{ â 9rE o2 c, TEUP8( Jours ) FIGT'RE 13 3 INT.I,UENCED't'N ITRÀITEUEIIÛTD,E.CADNAbiNUM 5OO mg/kg/24heures PENDÀITT21 iIOURS SUR LE TAUX DE POTASSIUU URINÀIRE CHEZ LE RAT( EXP.I ) -L99- o o t{ a o EI rt c| Ul C' o d 0l o .oA E { EI lr \_ + / o 6 x 1V llI{ v Êr a // T z o H E{ t T 2 â â (,Êr z o rl lrtttll lrll o 6 lo ?o o TEUPa( Jours I FIGURE I/I 3 INFLUENCE D,T'I{ TRÀITEUE}TT ÀgUEUX D,E.caNNAbiNUM 5OO mg/t.g/24 beures PE!ûDÀNT21 iIoURs SUR IrE TAUX DE liAGNEsrItU URINAIRE CHBZ I,E RAT( EXP.I } o o 1{ a o â !t N tD 0 o d \ro o o F{ Eor E I d c, q6 v 9l Eof o H H .( Éor H à fd U 7 o o TEI{P8( Jours ) FIGURE 15 3 INFI,UENCE D'UN TRAITEIIENT DIE.CANNAbiNUN 5OO ng/kg/24heures PENDÀNT 21 itOURg 8UR IrE TAUX DE Cf,LORURES URINâIRE CHEZ LE RAT( EXP.1 ' Placebo 3 - E. cannabinum 500n9/lrg: - - -2OO- o o l{ ,o É t' (\| à C' C' |'l o o FI io a a + *n (, z H n o H H É É Ha Êr' C) z û10tS2O (,o rEuPs( jours I Placebo: - E.cannabl.nun 500ng/kg3 - - FIGURE I5 3 INFIJUENCE D'I'N TRAITE!'TENT ÀQUEI'X D'&.ggEg@ 5OO rrg/}lg/z1 beures PENDAI|T 21 itOURS 8UR LE rAIrX DE CAITCIUU URINAIRE CEEU LE RIT( EXP.I I -26L- o o t{ , o â rt N trl o 0 d o o flT d Hr (O /\ É tt Ér Él Ê p z FT t z o H E 4 É E{z (,Êl z o O TEI{PB( Jours ) FIGURE 47 3 II{TTUENCE D'UN TRÀITEUENT AQUEUX D'E'CANNAbiNUM 5OO mg/kg/z4 beures PENDÀNT 21 aIOURS 8UR LE TAUX D'I'R8E Cr;EZ LE RAT( EXP.I I o o H a o E It |\| Ur o I d o Iï1 o2 r{ I .O LtI\ E \ t- l Êl \ à I H À \ ù H I \ H 14 lr \ Él û1 rll () à FT Ao H H Ft H À Êr() o n o C) TEltPg ( Jours ) FIGURE 48 3 INFTJI'ENCE D,UN TRAITETTENf D,EI-EaENAbiNUN 5OO mg/kg/24heures PENDÀNT 21 itOURg sUR f,'E TÀUX DE CREATINME cfrEz LE RAT( EXP.1 ' Placeboi - E.cannabLnun soong/kg:- - 202 - Ltextrait aqueux d'E.cannabLnum induit une diurèse significative moyenne de 3Lt sur L4 jours. Au-de1à (2L iours) 1'èffet diurétique disparaÎt. {,es yariations,Se concentrations ùrlnairès en Na+' K*, c1-, Dtg*t, urée et créatinine sont corrélées aux variations de la diurèse sur L4 jours et les différences sont toujours significatives entre Lots traités et lots térnoins. SeuI I'ion Ca-- ne présente pas de variation significative (-3'48) sur L4 jours. De plus, diurèsè et concentrations ionigues suivent des fluctuations cycliques hebdomadaires. * Expérience 2 : I'extrait d'E.cannabinum induit une diurèse significative sur 20 jours (figure 49, tableau 371- Dans les deux expériences, le pH ne présente pas de variations entre lots témoins et lots traités (tableau 38, figures 41 et 50). -203- o r{o , o â !t (r| br o C' il F{ â H É H zÉ H Êp x D É Êl TEtlPg( jours , FTGURE 19 3 INFI,UENCE D'UN TRAITE!,IEITTÀQUEUX D'E.CANNAbiNUM 5OO mg/kg/z4 beures PENDAT{T21 JOUR8 8UR LE VOITII!'IEURINÀIRE qHEZ tE RAT( BXP.2 ) Placebo: E.cannabinun SOOng/kg H Ê H z H É D EI A IEUPS( Jours ) FIGURE 50 : INFI.UENCE D,UN TRAITEUENT D,E.CANNAbiNTTN 5OO Bg/kg/2{heures PENDA}IT 21 itOURS 8UR IrE pII URINÀIRE C.HEZLE RÀT( EXP.2 ) _204_ D.3 MFITUENCE DB IT,EXTRAIT AQIIEUX D'EgESEBID@ L. 8UR I.A DrURESE AQUEUSB ET IrÀ VrTESEE DTEXCRETION URTNATRE CEEZ LE RAT BN SLRCEARGE IIyDRTQUE Afin de confirmer I'activité de I'extrait aqueux d'E.cannabinum à 5OO mg/kg/zA heures pendant L4 jours, nous avons utilisé ta méthode consistant à adninistrer aux rats, placés en cage à métabolisure, une surcharge hydrique hypotonique dans laquelle sont dissous Itextrait ou le furosénride L0 ng/kg ou la solution de KNo. Lr75 neq,/I (01087 nF.q// Kg). Cette dose a été choisie en fonétion du taux de KNO" côntenu dans un extrait de plante diurétique étudiée au Iab6ratoire (Beaux, communication personnelle) . D. 3. l..IIATBRIEL ET I,TETHODES Des rats mâles Sprague-Dawley (Iffa Credo, L'Arbresle, Fr. ) de 310 à 4OO g sont répartis en cages à urétabolisme. Après une période d,adaptation oû ils sont nourris et abreuvés ad libiturn, ils sont mis au jetne total durant les 24 heures de Itexpérience. A t=O, Ia surcharge hydrigue hypotonique de NaCI 01458 est administrée aux rats sous un volume de 5 mtr/l00 g de poids corporel par voie I.P. Les produits testés sont dissous dans la surcharge : BXPERIEIICE TEUoIN NaCI 0r{5t TRAITES N=1-0 [= 10(E.cannabinum 5OO mg/kg, E83) 2 N=5 !if= 10 (E.cannabinum 500 mglkg, 884-4) N=10 lif= 10 (Furosénide 10 nglkg) N=5 N= 5 (KNOa L','75 rnEq,/I) Les volumes urinaires cumulés sont relevés toutes les heures pendant I heures puis 24 heures après ltinjection. Dans les expériences 2 et 4, un préIèvement sanguin est effectué 24 heures après I'injection par Ie sinus veineux sous anesthésie }égère à la Kétamine 100 mglkg (Ketalar, Parke Davis, Fr.) par voie I.M. _2Or_ I Dosage lonl.que sur leg url'nee et les sérums: Sodiurn et potassium sont dosés simultanément à ltaide dtun photonrètre de flamme (I1, Italie) en utilisant__u3 étalon interne de tithium. Une solution à 1-0Omfiq de Na- et de l-O0 mgq de K+ (50 I) dans Ia solution de lithiun 15 mEq (qsp 10 nI) sert d'étalon. Les chlorures sont dosés par une méthode volumétrigue rÀr"oiitétrique en présenôe de diphényl- carbazone utilisé comme révélateur. une gammeétalon NaCl 50, L00, 200 rnrnô}/L est- préparée- Le dosage en burette a lieu conme suit: ETAI,ON URINE ilIée 0r9 ml Or9 nl ffi orlml étafon orl mI acide nitrique uée 4 gouttes 4 gou iphénylcarbazone 1O gout, 16 90u (Or5 mI dans I'éthanol) Après virage de I'indicateur au violet, lê calcul de la càncentratlon en chlorure en mrnô1/1 se fait conme suit: (nl de nitrate mercurique/ mL de I'étalon NaCI)rz L00 Le pH est mesuré à l'aide d'un pHnètre (Schott-Gerate, RFA). Ltoenolarité est mesurée à Itaide dtun osmonètre (Biolyon,Fr. ) . D.3.2 EXPRE88IONDEg RE8UITtrATSE[ STATISTIQIIE8 Tous les réeultats sont exprimés en moyennes et erreurs standards. . Lcg vqlunes urLnaireg cumulés des loÇs traltés, exprimés en sont comparés, après contrôle de nI/106$ de poids corporel, rrtrl f;hm"geneite des valiances, aux lots térnoLns par Ie test' de Etudent. r ta3 vlÈegaes drélinlnatl.on sont évaluées par détermination graphique du ternps d'étimination de 50t et 10ot de Ia éurétraige hydrique hypotonique (1850 et T8100). 206 - I lr€a coDaentrations (mmôlr/I) , les débitg (mnôrz1) ioniques et lea pE urinaires sont analysés, après vérification de Ithomogénéité des variancês, pâr le test rrtrr. . La clal.ranee est calculée comme suit Uosm= osmolarité des urines en mosrn/ml Sosm= osmolarité du sérum en mosm/ml V= volume urinaire en nlrzl0Og C: concentration osmolaire urinaire en mosmr/ml D= débit osmolaire urinaire en nosn/1009 D(o-2rh)=[ v(o-8h].Uosm(0-8h) l+[ v(8-24h) .Uosm(8-24h) ] c(0-2rb)= D(o-24h)/ v(0-24h) Clairance osmolaire= v(o-24h). I uosm(0-24h) / Sosm(0-24h) ] D.3.3 RESULTATS al Volumeg urinaLres (tableau 40) 3 t Btp.1 et 2 (figures 5r- et 52) : l'extrait aqueux d'E.cannabinum (lot 8.83) à 500 mg/kg présente un effet diurétique dans I'expérience L, de 5 heures à I heures après l'injection de Ia surcharge hydrique hypotonique (3081 et 24 heures après (22*). Dans I'expérience 2, Itextrait d'E.cannabinum (E 84-4) est significativement diurétigue de 4 heures à I heures après (50*) t Exp.3 (figure 53): Ie furosérnide à la dose de l-0 mg/kg montre un effet diurétique significativement inportant les I premières heures (2192 2 heures après f injection de Ia surcharge, 3ot I heures après). . Exp.l (figure 54): Ie KNo. à Lr'15 mEq,/l ne modifie pas Ie volume urinaire par rapport-au placebo. bl TcûIls dlrô1'lil,iillû*ûl {r [e .uùutretgrc ùytrlque (tableau 40 et figures 56tr Ét 5Ëb) La vitesse d'élfunination de 50* de Ia surcharge hydrique hy- potonlque est maxinale avec Ie furosérnide (75t par rapport au groupe rrplaceborr) et encore importante avec E.cannabinum (27* dans I'expérience 1 et 46t dans I'expérience 2). La vitesse d'éIinrination de 100t de la surcharge est presçlue aussi inrportante avec Ie furosémide (75t par rapport au groupe rrplaceborr) qu'avec Itextrait aqueux d'E.cannabinun dans I'expérience 1 (71t). Par contre L'extrait est noins efficace dans I'expérience 2 (+3221. c)Paranètres biologtques urLnaLres (tableau 4L à 44, figures 56 et 57): -2O7- E^ lr) tflsf o *i (fl\O t r I i$ ur I o FtO OO | . - o o I t{-l Ëà d +t +l +r+r I VI rn cî \osf I +1+l Ê lil t t Of- Fl I frur sf lf) IO|o * É | rt" FI I É H * il É * *l z (sl H mL l ^* +) Ê rQ rQ I . - EâD Fl O | -l-l +r +l +r+r I +J Ëg FI @N Fl@ | +l+l o i \ {(Yl o .Et r | D :l;i N-r sf n I . - +J rJ I l** o .qo I o tU ËlË I a I ÉÉ ÉÉ I +J 2 ÊÊ o irH FI o c, I oo oo .F.FI EE H o I mo o(') sfsf I OO E{ Fl | .c.c ,ÉÊ ÊÊ | c,lO J û :l::oo sù('t I .c.C |\, (.|ôt F{ I rfsf z -* +J H | . t{ aiuoDH H o É 9. H Ê ËÀ: I |tt ËzH Él t{ sotr ÉÉ cÉ | o ÉÉ t{ È cr I K) u) on 55 I EE rU - Ul | $ril OFI o('l I |oo 9{ :l:, ,É,4 | + co Ë8" E Fl I .C.É ,É.É H \o(. No I Ét o EI:: .r{ +J (t l-- o X I .Fl ED q{ û ."t EËEIE loo oo I Fl F{F{ tt É TH tn flË .i .F{ 2â sf | o À I st I +J EË @ Ê FI o I I Ê EÉ bl o )1 â I tt ttr .r{ Es E tnl +J û o .r{ o tl +J o |tt ia gl , +J F{l o Ë 3Ë ll o E{ olto z 'ËlEI dlF. o H .r{lr É T o OEI I O.t o E g .a{, | .a .ot{ E{ o c)oul l(')o q{ H c) .OO l.O m A tU Àdt{ lAdO lH â x XF{ j IXF{A EËH l*EflFI À flfrfAÊ{ lff AX o -208- + E * so + 2É Dd r!l lo cro o É HP o EG0 rl vl E@ (\r lo\o lno Ê âÉr ilrrl\\ HÉ * -A sn Er{ l*t l-* F{ co+r l+l +r l+r +1 o ôl l-l o\ ltô -l oc0 o I +l-1.\li\ saH o Fl f{ O ln \O l('l @ DÉ +J Ê.D Fl C' c-o' E rQ l,-* l-- HEI â +J ê ul o @ l,.l o H +) û * li I H or l\o co lo to âi'i É \l\\lri ry{,tÉ 2 c\r(v! lf')c\ l{@ o nl H .q ûtl H É ni +r l+r+r l+r+r o C|lt.f D Ct\ ln -l ltr) tr| o Fll +l-l-\lrr rrt N F{ rll ql *x O\lr0 INS l@O otÊl z (vt rf - * È .lEl o l,n l- FilO H +J àt"t Er tl o Flp â xslol E{ ll EHI{ *l a ErÉZ û I |tt IrI|O H oil{ El zC' +) o *â\\l-.1\ l,'*I , H C' (\sf l\o{ lo|n o E.}|"98 9{ Hqltr +r+r l*,*, lJ*' 9. ÉH (vt @ lc.l -l | to tU AIDH + \tl..l+l l.l H OID d r{o lrq\o lolo xHo| l{ BIz|H E ô'|," (t . OÊl oHn O'. }| l" l-- o E{OTI 22 tl HO x tl +J -H HD |\t EE{ ÉA o E{É gl- tl -d HÉ rôo loo lutnn rH tx F{ .rt ââ É HE 2â (, l..* | tn à ETI tl o Iro r(f st I +J o ç o àlol o HH Eltl É Otl o t âe s lgl tt DD rololu ."1 rlO +, Êl o Zct âÉtol l- lË HO .r{lttln +J tlt ..4 o€ lo'É lo\ +, Jl É ln'O l.Q -l o dH oE loo lo cQ o|rt loo lo ('| o â ttro ldh l|I'o o D2 Êl É.{ Éo I oo EH Ë,,i HO ÉE{ E FA Fg 'Or E{ ': q{o ND H l..: 11 Étf ÀlftlÀ l+{ E{O â xlxlx .'{ Vl o Fr Êl lFr lFr OO. -2O9- E |n ËË o o ËB to \0 @ (V|or lot VI s{. (r) (Yl sf A{ f. +l +l +l + +l \o ôl \f o ËË I Fl nlo o f- t (, ('ror @ (vl -f +J F|ËËH +J Ë: d o o o rG| o * +J (.lôl sf (\ @ôl (OF{ sf(Vl ('r t\ n(V) o E +r +l +r +l +r +l .a Êls \O o CÀ OT @ro f- o H o Êls É lO F. @(rl ro@ |rt ro lrt ro|r) sil sf H t g{ z.( H ;lË É +J êoE! D o Fl !D ) Eo |rt ËËgH @m F{ ôt E{ +J SEË @sf ('l sf cî tr) H â o E{-}| +t +l sil +l +l +l Ê{ ro r- \o @ @ P{ H + +l IU EnT (\o N l. o l{ Ë to\O \o î1 !n H Ë IU Ê r$Ë o ËË' x +, HD IU û o gt- .Fl tx rJt o o 1lolr) q{ r{ d Ê ËË 2e U' Él .r{ t'| o A1 $ :Ë Ul Ut E É )1 o É gË o Ur o o a a tr) tt o tt .Fl Fll H +, Ës É o o f6t 'ËlEI rt n +J .r{ f. (t -a odl oFl rJ .a Él q{, F{ o oÉl oo sg E{ () (tl oo c1 o z rû ol ('H tU o o D-à H 1a É 5to - É'il g{ r+l tl. a, o =H E h =H H ît fî !r .o âD H ç{ ËÉ p; A T{ FO â x x .r{ GO Él Él FI o -2to- * Ëâ * .r * f- \O O,il O |on F{ F{ F{ Fld Fl r{ lflF.lO ooo oo oo oo + ooo !4 +r +l +t +l +t +1 F(\ 1.l (n |flf. VI VI VI + nF{ oor @o Ê9{Ê d ËE .1. z OFl |{d OF{ * {. .t3 * .. * Ëg b {. o + * +l C' * * ËH d * *Êl sf ôl lo rf) OFI +J x19 o roN ôt oit (Yl s a ïÊi o o =iÉ d +l +l +1+t +t +l +J #Èl (O I ôlo F@ O\ .{ F{ o@ orro sI r- =(, (, N($| sil c{ r'{ xÉ e fll o VD (rl .ct =a o o Èlo Fl o {. Irt GO * r-{ ËË FI * cî ôt ortrl P{ É r- Fl Fl F{(Vl .É H (vl É +l +r +1 +r +t +J z +l cî O\{ î.| @ o H + @Or o@ \o lo Ê Y OF{ ôl F{ Fl F{ D u t0 a ilsE{ +J âl' H l{ c * * o g {3 * P{ ê .* * a Fl o\N cî l. |I, itii ôl c!N cî $ l{ Fl +l +t +l +l +l h ËË + +l l. nf- rlo (t d Co ç'{ F{ \O -f l- P{ to ôt ôl fî Fl rl à o âË .Fl E{ +J x (, D o Hil ûâ tt{ FH no oo tntft âz F{ F{ É oÉ cn nË .F{ !r 3É o blt o A1 Àg +) Ul ut ç Ê 11 o E o Ul o o E , Ëâ trl tt o tt .Fl É FI atJ , É o É o .Fl EË ."{ o n +, .. n .F+ l. (t OtU oFl o\ tJ nÊ !.o .Q.{ o sË oË oo o E{ O rrt oo Om o z ruo dH |I,o CI E Àa AZ É - Êtrr 9.ll{ 9.X o EH FT k H (! (v) sf .o H q{ À A A (t{ Ef .r{ â x x x H Êr Êl frl o -. Ztt - EE ro \1.l àD lO F{ Or{ DOI rH oo oo +to aû { â ** +t +l +t +l @+l E{H tn@ |oco rfl Êr El OF{ O c\l o\ + r{ HH rt F{ Fl F{ r{ âo z Hgl EÉ ÊrI| oct osi Ul siD o N D!0 o fî \o Fl (vl (Vl lJ'l Êl f- cî o f. f. oit N +l Êt Êl o \o +l osl o +t +l +r +1 NFI F. F{ F. f. rno N\O r{ (O I ôt (\t tO F{ (\ É F{ sf I*F t@r- ÉÉY rt rt (\ (vl (\ 1') N ('t@ (v) 9'lz^fiiE +t +l +t +l +l rFl + ôtN r-O f- +l oÊl rt ro ôt F{ c'l (\N D z Nc'l \f\f (\@ E{ (\ 2n .oHl' X HH HD HZ É14 HO Ft- too oo nn ÉH XH F{ ;{ Fl û oz E. E{ z H -n â DE tn rtl J1 o H ul bt EÊ É A1 (, zû o ut HD o a tro n È o tt F{ FI F|GI É *Eno EI o 'Ël d lo F H odl oFl o\ !tO ÂÉl Â.o .Q Fl a ocl oo o 2 H o|Ul oo Oc'r DO 2 (t ol rU t{ do ÉH H F{ .l AA AZ EH T Ê Êrl 9.ll{ Élt E H oit (Yl { trÊ H .{: O p; À È E{@ â x x x H Ê1 FI frl -2t2- Ur o o Fl ?l É H H z,{ H pÊ f'l t tr oFl Placebo e' I E.cannalrinum Soong/kg o- TEttPg ( beures ) tr|IcItRE 51 3 IIIFIJI'ENCE DrE.cannabinun 50O ngrlkg sUR IrE VOLITME LRINATRE CEEZ LE RÀT EN SURCHARGEIIYDRIQUE UyPOTONIQUE( EXP.I ) Ul ,1 A É Êl É H ,âÉ H É p Fr tp' { ..{rTI É I o ,/ lrI+ It praeebo.--< i.cannabinun soong/kg o-{ fEI.lPs ( heuros , TIGURE 51 : IIIFI,UENCE D,I'N TRÀITEI.|ENT D,E.CANNAb1NUM 5OO NglKg auR LE VOLITUE URINAIRE CrEZ IrE RâT EN SURCEARGEEIDRIgUE URINAIRE( EXP.2 } -2L3- Huit heures aprés injection de la surcharge, 1â solution de KNo" (L,75 nEq) ne mod{fie.pas les concentratlons êt les déblts urinaires en Na', K- et CI- par rapport au groupe rrplaceborr. I€ furoséuride 10 nrg/kg augrmente Ie débit en ions Na+ et cl- mais n'en urodifie pas leurs concentrations urinaires. Par conÈre Ia concentration en ions Kf dans les urines est dininuée alors que son débit n'est pas modifié. L'extrait Aqueqx d'E.cannabinum 50O rnglkg augrmente.les débits en ions tla*, K+ et Cl- et les concentrations en Naî et c1-. Les rapports tta+7x+ ntaugrmentent significativement que I heures après Itinjection de Ia surcharge, pour Itextrait aqueux et pour Ie furosémide. dt Paranàtres biologlques sériques (tableau 45) : Les dosages ntont pas été effectués dans les expériences 3 (furoçémiÇe) et 4 (KNoe). Aucune des concentrations sériques en Na?, K' et cI- nta été nodifiée 24 heures après la surcharge hydrigue dans Itexpérience 2 (E.cannabinum). e) pB url.naLres (tableau 46) : Aucun traitement (E.cannabinun, furosémide et KNO.,) n'a mo- difié Ie pH urinaire I heures après Ia surcharge hidrigue. f) Clairance ognolaLre (tableau 471z I heures après I'injection de Ia surcharge, lê débit osmo- laire est augrmenté dans les urines nais Ia concentration ne varie pas. Vingt-quatre heures après ItinJection, aucun des paramètres ntest rnodifié (débit, concentration, clairance osmolaire et clairance de Iteau libre). -zL4- @ lo F{O - t* o +t +t H sf Fl H + d \0æ â - (vt (çl H z.E oo|ED 2ao- oo rl ch' ooE{ EÈ $to É}{ EI +t +l Ê I o't ôl trE Fl A Fl o|l roD C' F{ c'{ o| o o 9lE d Éllo rQ .rll t âl' E ro ôl EIIH o Élt, H oo ril Êl p ':l o +l +r f; H ôl H p- À H t{D EOI H ooHzl HE{ -o EF| O}| OC- $rf gE F{O oil 1'l DH oo oo Ê|D EI or { +r +l +l +1 HH N NF. ôl(V| aÉ I Fl Ctl @r0 o EI r! (o o@ r.F tl 5l'EIH .r{l (9 H É âtËEttr H EiIC' â rilÉ 2 rID H .l É o tr OF{ Or{ tflFl Ftl O C\t F{ F{ Or{ r@ oË EIg. oo oo oo Ne. EI +t +l +r +l +r +l l'É o @tr| (tl Fl trlN H I f. F{ (dltr oo DE{ H sÉ G' @@ @@ O\(^ HË r( glË| HH XEI EO OE û px E{Hzâ Ëg H=l ÉH tr)o oo ËH âz F{ F{ F{ E{D oÉ H uÀ ÉEl ûù E{ P tr2A tn rpl A1 oE Ut o É U' E 11 C'G| o zo o Ur n- to Ê DX o tt FI EI F{ FI F.E â za o H 'âlel d lrl z ."{ F .oo odl oÉ o\ H .qÉl !{, .Q F{ toE{ oH oo o ÇD o (tl oo 0er É |tr ol (tH do DO E F{ ol Âa Éo g{Fll Êll{ E H à4, É E (rI E{ F{ { gl a .{i H p; È A E{ â X x x E{ Êl Êl FI -2L6- ol H rl @1. oo d o +t +l o ÉH o tt oll- E{o N ôt Nr. o -Ël EI I C' o tfl\O VI uÉ çt - l.{ r- @@ {3 HÉ sf\ .r =H rQ HÉ F{ Ep +l :. ÉE t +l I .{' I I I I i/ Placebo rÈ_. Furoséml.ôe 10 mgflcg r--o - -l-I llllll I 2 468 24 FIGuRE53sI!ÛPI|I'BNCEDE.trI'Ro8Et|IDBl.otlg/r.g8g1lPvoLU}|EEXP'3 URMAIRE CriIEZLE RÀT EN SITRCEARGEIyDRIQUE AYPOTONIQUE( ST'R I,E VOI,UI{E FIGURE 5I S IT{FIJUENCE D'I'N.TRAITEUENT DE KNO3 URII{AIRE URINAIRE CREZ IJE RAT EN 8URCEARGE EIDRIQUE ( EXP.I , -218- o z o o c H o E{ a> a E.cannabinun 5OOngrlkg( EXP.1 t: [-1 E.cannabinum 5oO D9lk9( ENP.2 ,: EII! Furosémide 10 mg/Rg( ExP.3 t: liiiiiiiiil ffiog( ExP.t l: I âo H É. Éso 55b 3 TE 100 - H . ct D t{ ! ! ê t - dP ! t c c C o FIGURES 55a ET 55b 3 INFLUENCE D'UN TRÀIAEUENI D',&glE!0.rbinlln' DB FUROSEITIDE ET DE KNOa SIIR IrB TEltPg D'EIJIIIII{ÀTION URINÀIRE DE sot ( 5sa , ET DE l-OOt ( 55b , DE r,À suRcnARGE trvDRTQUE IIYPOTOII"I9UE CHEZ L,E RAT _ng_ Placsbo t-r E.caunabinuu 500 Dgr/kg( EXP.2 I @ Eurosénlde 10 Dg,/kg( ExP.3 , lttdtn INos( ErP.a ' r br G' tr C' o rl C' Fl o \ 0.4 o o rl o .O r-l É (o EI + Eo. zrt *r F It Ë o., ol o| H H â n o o H H o'r H Ér H H tr tr H FT ê Ol FIGURE 57A FIGURE 57b bl C' c, 05 cl o o d o.4 Ê A I d o'3 H D cf o.2 Ho H H HOJ FT cl FIGURE 57C TIGURE 57d FIGURES 57 arbrcrd : INFLUENCE D'Itll TRIITEUENT D'E.cannabinum 5Oo lûg,/kg( EXP.I ET ExP.z l, DE FURo8EIIIDE ( EXp.3 I EI bg KnO.( EXP.I ) gUR 1,ES DEBITS URINAIRE9 DB Na+iriâ-il i*i-tTi il-!i-T- tr" , Er suRr,; RÀppoRrya+7r+(szd ) 2l aEuRES ÀPRES SURCnARGE HyDRIQUE EYI'IOTONIgUE CF;EZ LE RAT -t2t- Elao€bo' E.cannabLnun soo Dg,/hg( BxP.2 ) I!! Furoeénlde 10 nE,/kg( ExP.3 ) gt rt.Io3(rrlor( ExP.a It I ttr b o o C' C' d d \o o o o o FI À (o .o â EO e + rl t z EI E It DC o| ol H â zH o o H H H O.1 E{o H H gl tr Eo oF FIGI'RE 56a FIGT'RE 56b br o C' rl o o .oF{ ta I F{ C) *x H crD ù' H z ào H :{ Htr Ho FIGT'RE 56c FTGT'RE56ô FIGURES 56 arbrcrd 3 INFLUENeE DrIn{ TRATTE}|EIÛIDtE.cannabinum 5oo nglkg( ExP.l ET ExP.2 | t DE FURoSEUIDE ( EXP.3 l.ET DE KNOI( EXP./| , gUR IIES DEBIT8 ITRINAIRE9 DE ra+isea l, rt+t 56b l,ôi-t s6c , Br suRLE RAppoRrut'/r+(s6d ) 8 EEURES ÀPRES SUCEARGERyDRTQUE EYPOTONTQUECHEZ tE Rlr ?2L - D. | ÀltÀLygEg DEg RE8UITTAT8 ET DISCUSSIOIû D. t.1 ttoDELE CERONTQUE L'activité diurét,ique de I'extrait, aqueux d'E.cannabinum a été étudiée en traitement chronique par injection orale sur L4 et 21 jours et en traitement aigu par injection I.P. sinultanément à une surcharge hydrique hypotonique. Ingéré quotidiennement à Ia dose de 5oO m9/k9, I'extrait aqueux (lot E 83) est diurétique pendant L4 jours . Au-delà, iI y a un phénornène de régulation bien connu en néphrologie, l'hy1govolémie entraînant au bout de guelques semaines de traiLement diurétique une baisse de filtration gloméru1aire, expliquant que le tot traité urine à nouveau comme le lot rrplaceborr. Les principaux paramètres urinaires augmentant conjointement, nous pouvons conclure à une diurèse sans modification pro: fgnde de bilan ionique .L'analyse de l-a teneur en ions Na- et K+ a révélé des quaritités faibi-es (respectivement 13 Eq et 2 Eq par 1o0g de poids corporel et par jour).La prise normale de Na+ ch'ez Ie rat Sprague-Dawley est 63 Eqtlg/iour et le surplus est excrété (Brensilver e.tco.L!. r 1984) .La teneur ionigue de I,extrait aqueux ingéré quotidiennernent n'expl,ique dons pu= I'augrpentation de I'excrétion sodique et potassique. Seul I'ion ca++ nta pas présenté une augrmentation de débit urinaire. Le pH urinaire n'a pas été nodifié. L'absence d'hypercalciurie chez les traités (-3r48 par rapport au loL rplaceborr) stexplique par une réabsorption dans Ia partie distale du néphron Normalemènt natriurèse et calciurèse évoluent conjointement (Bagtin et Prinseau, 1986). Tout se passe commesi I'extrait aquéux agissait cornme.un diurétique thiazidigtre qui dininue Iâ réabs6rption du Na* à ce niveâu,.dans Ie Jegnànt cortical de dilution, la réabsorptioh du cat+ n'étant pas modifiée ou étanÈ augrmentée. Àinsi, avec Ie chlorothiazide et I,hydrochlorothiazider êtr début de traitement, Ia natriurèse augrmente et la calciurie ne stélève que peu ou pas. Àprès quèlques jours, une hypocalciurie apparait sauf si une Cornpénsation sodée permet de rnalntenir la natriurèse à un niveau éIevé (Baglin et Prinseau, 1986). Le schéma suivant résume cette action des thiazidiques: -222- GaUV I thiazicles I _ _ ---cl l{--- Évotunon de la natnurèse Na U V.) et de la calaune Ea U V I lors de l'admtntstrat,crn dethnzdes(Baglin et prinseau, 1996) Les conséquences d'une hypocalciurie sont mal connues et pa- raissent àn tout cas dtirnportance secondaire lors des traite- ments thiazidiqtres. Une rninéralisation osseuse peut aPpa- raltre à Iâ lôngue. En fait iI n'y a presque Janais drhémoconcentration sauf en cas de traitement conconmitant à Ia vitamine D ou d'hyperthyroidisrne. Par contre, cet aspect des thiazidiques a conduit à leur utilisation dans Ia préven- tion des lithiases calciques, maladies fonctionnelles faisant intervenir Ie volume et Ie pH urinaire, Iâ calciurie, I'oxalurie et I'existence de facteurs inhibant le cris- tallisation (métaux à I'état de traces, pyrophosphate) ou solubilisant I'oxalate de calciun (citraterion nagnésiun) (Danielson, 1985). En outre les thiazidiques dirninueraientr- i'oxalurle et augrmenteraient Ia nagnésurie ainsi que Ie Zn-- urinaire. Bien str evant d'utiliser un thiazidigue dans Ie traitement des litblases calcigues urinaires, il irnporte de rechercher une anûalie métabolique duç.à une alimentation particulière (eau rii rôi=son riche en ca**, produits raitiersl apport sodé excessif) ou à une hyperuricurie Ainsi I'extrait aqueuxr êD agissant dans Ie sens des diuré- tiques thiazidiques aurait I'avantage de posséder un effet bénéfique sur les lithiases calciques urinaires. Les diurétiques thiazidiçlues possèdent un effet secondaire bien connu qui est I'hyperuricémie. Ici, Lô diurèse provoquée par I'extrait végétal n'a pas modifié Ie débit urigue puisque Ia concentration dturée augrmenteavec le volume urinaire. -223- Enfin, il ntest, pas sans intérèt de noter qr1'it senrble exis- ter une relation entre Ia rétention du calcium rénal et une activité antihypertensive (Massry, 1984) ' ce modèle chronique utitisé ici n'est pas habituellement en- proye dans rrèau.ià des diurétiques de synthèse ou d'origine iratûrelle, sans doute à cause de la contrainte matérielle quril repiésente, ceci excluant une comparaison intéressante à"""-rà Ëiuriogràphie. L'extrait açfueux d'E.cannaPingn peut étt"-coirparé aux extraits d'Anisotes_ trisulcus et yé- àà-poiiôàri"""pà"â."L ayt"tt-t"ri"a, deux plantes {e Ia pharmac-opée nen ititniasigue et.diurétique, obtenus dans I'éthanol et etuaiés selon ce protocole ;;;-ii"i.ti"Liott en même iii""ià"tin, 1983) ! ces 2 extraits, administrés Èemps a t-oo rngrlkg chacun, ont augrrnentéle flux urinaire de A6*--="i fa jo'û'rs et.gnt provogué-aussi une 1é9ère baisse de i;èfiri"ati6n àu Ca++ ai-nsi qu'une augrmentation du pH uri- naire. L'effet diurétigue obtenu est du nême ordre de grandeur que celui obtânu avec E.can{rAbinum. Malheureusement, i;-;;;F=iti""-énimique de ces exfts n'est.pas. connue mais if est intéressant dà constater gue leur utilisation traditionnelle a été confirmée expérimentalement non seulement commediurétiques mais èommeantilithiasiques' D.I.2 IdODELEAIGU Dans Ie rnodèIe utilisant I'lnjection I.P. de I'extrait simul- tanément à une surcharge hydrigue hypotoniguet Ia-diurèse a été stimulée. I1 apparâtt iue le IoL- 884-4 agi! plus rapide- ment que Ie lot E ilg sur ltétirnination de 50t de Ia surcharge r.i= fréti*ination totale est plus rapide avec E-83 qu'avec 884-4. Cependant ce n'est pas iorcément une variation de Ia Eàtpàtitiôn cnimigue de I'êxtrait qui est en cause mal-s les aniiraux eux-mêmes car les expériences ntont pas été nenées avec un mêmetôt a'animaux. Or des variations """:ointementilnf6rtantes de Ia vitesse d'élirnination de Ia surcharge hyPo- toirique ont été observées tout au long de t'année dans les lots'rrplaceborr constitués d, animaux provenant pourtant du même éievage, dê même âge et de même poids (Beaux' communica- tion personnelle). D'autres caractéristiques de l'effet diurétique drE.cannabinum peuvent être dégagées de I'analyse des résultats : 1)t'effet salidiurétique est inportant commeen ténoigne itàog.""Çation signiffcative deè concentrations urinaires en Na+ et K1 à 8 heures. 2,tLreffet satidiurétigue est persistant commeIe montre Iiélévation encore inËçrtante-bien que non significative des débits urinaires en Nâ*, Kî et CI- à 24 heures, valeurs redevenues normales al0rs dans Ie lot traité au furosémide. Le furosémide à 10 ng/kg présente une diurèse très élevée les àe,t* premières heurel-puis se stabillse par la suite. Lraction de ce produit de synthèse est rapide, Lnportante et brève. -224- Par contre si les débits urinaires en Na* et Cl- se sont élevés 8 heures après Ia surcharge, Ie débit, urinaire en K* a baissé alors que ce diurétique de I'anse possède normalement Itinconvénient d'êt,re hypokaliérniant z 2L9* d'augrmentation du débit en K* avec I'extrâit aqueux contre une dirninution de 88S pour le tot traité au furosérnide. D'ailleurs Ie débit en Na- I heures après Itadministrat,ion de la surcharge a augnnenté moins gue dans le lot traité avec ltextrait de plante proportionnellement au placebo z 374* dtaugmentation àu débil eir tla+ pour I'extrait contre LTLZ pour 1é furosémide. Cependant le fait que les expériences ntaient pas été faites au même moment donc avec les même animaux rend Ie commentaire délicat. A titre conparatif, les travaux d'Andreani et coll. (1987) peuvent être cités : chez le rat en surcharge aç[ueuse per os (25 nJ-/kgl, Ie furosémide 10 mg/kçt inauit urie augm;GTTon trè=' iiiôrtante du débit, en Na* (+758t) et rnoindre en K- (26821 3 heures après injection mais ces débits reviennent aux valeurs normales conme la diurèse dtailleurs, 6 heures après. Les travaux de Nakamura et coll. (L988) sur le rat laissent aussi apparaître une très forte natriurèse pendant une à deux heures après une injection I.v. de furosénide LO mg/kg. Ces auteurs comparent I'effet du furosémide à celui d'un diurétique thia- zidique(trichlorothiazide) et constatent dâns les mêmes conditions une natriurèse moins forte mais plus persistante dans le temps. Enfin, ils comparent les résultat,s obtenus avec diverses espèces et rernarguent gu'iI existe de grandes différences d'une espèce à I'autre; f intensité de Ia natriu- rèse sous furosémide diminue dans I'ordre suivant : chiencsouris Enfin, si Ie débit osmolaire dans les urines 8 heures après Ia surclrargç a augrmenté consécutivement à ltaugmentation des ions Nat, Kt et CI- dans Ie lot traité avec Ia plante, Ia clearance osmolaire et la clearance de lteau libre ntont pas été rnodifiées 24 heures après I'injection de Ia surcharge Ainsi 1textrait aqueux d'E.cannabinun se révèle être un diu- rétique intéressant : son pouvoir salidiurétique (natriuré- tique, chlorurétique et kaliurétique) I'emporte même sur son pouvoir d'élirnination aqueuse; 1'effet sans être aussi puis- sant que celui du furosémide nten est pas moins persistant et s'apparente à Ia famille des diurétigues Çhiazidiç[ues de par Ia baisse de l'élirnination urinaire du Ca--, favorable en cas de lithiase calcique. II importe enfin de remarquer qu'aucune toxicité ni perte de poids n'a été observée chez les animaux dans les deux nrodèIes. L'utilisation traditionnelle se voit Ià encore confirmée par des modèIes expérimentaux, Ie nodèle aigu, bien qu'artificiel se voyant conforté par le modèle chronique, plus proche de la posologie reconmandée. Quant à vouloir rechercher Ie ou les principes actifs, la tâche serait ardue du fait de I'absence de bibliographie suf- fisanment riche. Les acides-alcools, I'acide hydroxyméthylacryligue obtenu par hydrolyse de 1'eupatoriopicrine par exenple pourraient participer à I'effet diurétique (Mortier, L972) nais if ne faut pas oublier Ia présence des acides-phénols et des autres lactoneg sesquiterpénigues car ceux-ci participent vraisemblablement au pouvoir cholérétique de l'extrait et cholérèse et diurèse semblent être souvent associées en phytothérapie, dtautant que nombreuses Asteraceae des régions tempérées possèdent ces deux propriétés associées. Enfin Itextrait aqueux renferme vraisemblablement de nombreux sucres qui seraient susceptibles de posséder un pouvoir osmotique mais ils n'expliquent pas le fort pouvoir salidiurétique observé. CONCLUSrcTV -226- CONCI,USION L., qui Cette approche ethnopharmacologique .dtE.canlabinFn, â àotrtir*"r ôu infirmei éxpérinentalement les consistait- le données de Ia tradition thérapeutique- traditionnelle dans àornnaine hépato-rénal, stest âéroulée en trois temps : 1l Lrétude bibliographique a permis de rendre compte d'une d'"iiri=âtiôn âe Ia dans Ia médecine savante !l,a1te en "orrrrârgenceancienie et dans la médecine traâitionnelle en Europe et et itra., oÉ cettà ptante est endérniqge._.Son usage constant ù"à"ir" pour tulter contre les nâladies de foie et ses ainrétiques mentionnées suffisamnent pour gue plôËiiét-eÀ ?olt Son i;"^" ait choi=i a.'s'Y intéresser au cours de not're étude' désuétùae au vingtièrne siècle nais cette plante ù="f" tomba en par connait ,ttt t"f.in d'intérêt depuis une vingtaine d'années Ie biais de Ia découverte, danè ses parties aériennes, dê lactones ="=q"iaàrpénigues, cytostatiques et antitumorales comme de nonbreuseè esfèces d-'Eupatorium anéricaines' * outre une teneur non négligeable en lactones ="rq"ii"ipàniq""s, 1a plaite renferme de nombreux terpènes (triterpènes Ët =Leroiâes, diterpènes, monoterpènes, huile èssentiè1te), des flavonoides, des alcaloides des acides-alcools, des il;;;ii;ieÉlq";r,-àà= acides-phénols, àerives de berizopyranne et de benzufuranne et des sucres' t Cette plante ne renferme pa9 de- composés chiniques.poten- tiellenent toxiçies-nrais pfùtat pharmâcologiquement inté- ressants. I,a détemination ôu noôe.ôe préparatl,on de l,extrait tt tradi- v6gélai a etlé-aussi été établie en fonction de I'usage par décoction-nccératlon. L'établissement tionnel ont de ce nsde"rssg-1-ài"* a; ,ilffitatfLott ct 6a oècrgtÛtlrtùlou ottnlque produit ' tàrmf s ae ltrntltùlser le testé sur Lt extrait açlueux d'E.cannabinum.révèIe en chromatggraphie. couchesmincesunelactonffiiterpénique(9upatoriopicrine), acides- des ftavono1àé=-ïi"lôtia", hypérosiaê,quèrcétine), -des èàieiqo" àt êirroroséniquel,_.9nacide-alcool ;;e";r;- i;aiâ;; ce procédé i;;ïà;-ràiiq"àl et un alcaloide non idéntifié. dridentieicatiân est bien évidemnent grossier mais il Présente de détecter rapidement, à rnoindre frais et donc dans Itavantage les un but de stànàardisation-de quatité et de quantité, les plus sdrenent présents dans I'extrait' "à.pà"e"-crriniques -227- 3l Lrétuôe pbarmacologique a pu alors être entreprise, après constation de i'absenee àe-tortc-lté atguë chez la gourLg. Lee propriétég hépatotroPes de I'extrait açlueux drE.canirab-inurn ont éLé confirrnées au cours de I'étude de ses eteets ctrôferetiques et antihépatotoxigues. * Propriétés stimulantea du flux bl'liaire ** Lrextrait aqueux drE.cannabinum en injection intraveineuse stimule le flux biliaire c}rez Ie rat- *** Lreffet est fonction de ta dose : Itactivité est uraximale à la dose de 250 mg de plante sèche/kg. A dose moindre, l'extrait pÀrà rapidement éon eifet; à dose plus élevée, I'extrait reste ènorereLigue mais avec une efficacité moindre. *** La dose de 25O mg/Rg est du même ordre que celle-recom- mandée dans Ia posolô-gié traditionnelle lorsgue Ia plante est prescrite en déôoction ou en infusion. .** Lreffet est fonction du temps : son pouvoir ct-rolérétigue reste modéré mais persistant dans Ie ternps à la différence du sel biliaire utifiêe conme référence et dont I'effet est bref mais intense. Néanmoins, l'extrait aqueux à 250 mg/kg est plus cholérétique sur 150 minutes que Ie DHC à 10 nglkg' ** T-e flux biliaire stimulé est d'origJ.ne hépatocytaire corlme lra démontré la relation linéaire entre le flux biliaire et Ia clairance à ftàrythritol. L'extrait aqueux stimule la fraction indépendante des acides biliaires. .* Ltétude comparative avec les extraits totaux de plantes étudlées au laËoratoire révèle Ie fort pouvoir cholérétigue drE ggnngblnU6 pour une dose posologique faible. Par àonËËEËlË-onaveè les extraits-végétàui etuaies dans Ia rittéra- turé, une remarque identique conéernant Ia dose peut être faite. ** Lrapproche de Ia relatlon structure/activité laisse supposer que Itêltrait doit son effet cholérétique à Ia présence dracides-phénols et de lactones sesquiterpènes riches en groupements acetoxy-. . Proprlétés antibépatotoxLques .. Un prétraitement de l'extrait ?Çlueux inJecté el I.y' aux doses âe 5OO à 1OOOnrg/kg est antihépatotoxique ch9? Ie rat sur un modèle expérimental- dthépatite induite.paf . le tétrachlorure de carbone(CêIo) conme le dèrnontre la dininution de la fuite des transaminaËes plasmatigues(AtÀT) . *** trflninistré en pos-traitement 30 minutes après, I'extrait garde encore son activité. -228- *** Ce pouvoir est du même ordre que celui obtenu avec un hépatoprotecteur dtorigine naturelle choisi comme référence, Ia sillmarine extraite de Silybum marianum Gaertn- *** Les doses actives sont du même ordre que celles de Ia posologie traditionnelle. ** Les propriétés antihépatotoxiques de I'extrait ont ensuite été étudiées in vivo chez la souris. *** |i[eqs avons, dans un prenier temps, cherché à nettre au point un test de mesure du temps de sommeil barbiturique c}:ez la souris intoxiquée au CCla, dê manière à rendre compte de l'éventuelle action antihépàtotoxique de I'extrait aqueux, visualisé par un diminution du temps de somneil, mais des problèrnes néthodologiques sont apparus. *** Le mêne modèle dtintoxication expérimentale au CCI4-Ia que celui étudié chez Ie rat a été adapté avec succès chez souris et il a été obtenu une meilleure reproductibilité des résultats sur la fuite des AIÀT. *** Lrextrait aqueux est antihépatotoxique vis-à-vis du CCI4 lorguril est injecté ch.ez Ia souris en I.V. 3O nrinutes avanË le toxique. *** Ltefficacite d'un post-traitenrent 30 minutes après chez le rat nta pas été retrouvé chez la souris. ..* Itextrait est également efficace chez la souris aux doses de 5OO à 1OOOng/kg. Au-dessous, I'extrait perd son activité. Il nta pas été rnis en évidence de relation dose/effet. ** Ltapproche du mécanisme d'action antihépatotoxique de l'extrâit aqueux a été réalisée sur un modèle in vitro d'hépatocytes isolées de rat. i** Les résultats obtenus in vivo chez Ie rat et la souris intoxiqués au CCI ont été reproduits sur ce modèle pour lequel les doJes de 1,25=à 5 mglml dé suspension hépatocytaire sont efficaces. rô* [vEs un toxigue plus spécifique des processus de lipope- roxydation, Ie térbutylhydroperoxyde, il-a pu être dénontré lriircapacité de l'extiait à bloquer Ia lipoperoxydation par le dosage de Ia malonaldéhyde. Ltextrait ntintenrient pas au niveau de la lipoperoxYdation. *r* trq moyen d'un test sirnple, il a pu être démontré lrinefficâcité de I'extrait à inhiber le radical diphenyl- picrylhydrazyl comparativement à un extrait de Rqsmarinus ôg.iêinâtis àctif étudié au laboratoire. L'extrait n'a pas de pouvoir antiradicalaire. -229- rr* Il paraissait, séduisant dtapprocher Ie mécanisne dtaction au travérs d'un seul principe actif contenu dans la plante. Pourtant lrexpérience prouve, notanment pour les plantes rdoucesr, ctesl-à-dire sans principe actif toxique en quantité importante, que ltactivité pharmacologique rencontrée avec un trtôtuntr se pèrd très souvent après fractionnement. L'eupatoriopicrine a été choisie pour plusieurs raisons 3 son orig-inalité dans Ie règne végétal puisqu'elle ne se rencontre que dans quelques Àsteiaceae, sâ quant,ité importante.dans Ia ftante et-dans I'extrait et son aCtivité pharmacologiqtre déjà èprouvée (antitumorale). L'EUPP a été testée à Ia dose contenue dàns 5OO rig de plante sèche/kg, soit 5 ng d'EUPP/kg, sur le test de l,trepatite induite au CClo chlez Ia souris : aucune efficacité dè ce composé n'a été ôbservée à cette dose. Nous ntavons pas recherché d'activité des divers autres composés car aucun paimi eux ne présentait véritablement Ç'griginalité. La Iittéràture était déjà prolixe guant à I'activité antihépatotoxigue de certains d'entre eux, Ies flavonoides et les acides-phénols Par exemPle. .. L, approche des mécanismes dtaction qui gouvernent les propriétès antihépatotoxiques d'E.cann?binum nous ont conduit à ireèiser Ie site â'action de cet extrait végétal : iI 99it -aux Ëtades ult,ines et non spécifiquee de la biotransformation du toxique conduisant à la nécroJe cetlulaire. Cette activité antiriécrotigue pourrait être irnputée à un effet inhibiteur des phospholipaies À, menbranaires ou à un effet stabilisateur inernfianaiie : plfisieurs composés contenus dans la plante comme les flavonoides et les polyèaccharides sont potentiellement anti-inflammatoires. rrr Une étude bibliographique comparative des propriétés anti- hépatotoxiques d' eitrâitJ végétaux et de substances naturelles a perrnis dè constater un fois de plus que la dose dtE.cannabinum efficace est faible. . Proprlétés ôiurétlques .* Le nodèIe chronique où I'extrait était adrninistré quoti- diennenent pg,f-os, à 5OO ng/kg a permis de constater un effet àiurétique Gns perturbati-oné profondes du bitan ionique si ce n'est urie rétention de calcium : cette caractéristique gui possède des avantages certains (action bénéfique suf-les lithiases calciqueé1a permis de rapprocher I'effet diurétique de Irextrait de-celui ôbsenré avec les diurétiques thiazidiques. .* L'étude du modèle aigu utilisant I'éIlrnination d'une sur- charge hydrique hypotoniçIue a condult à attribuer à l'extrait végéÉatr-adnfnistrè a la dose de 500 nglkgr.des propriétés saiiaiuiétiques importantes. L'effet diurétlque, sans être aussi puissànt, esL ptus persistant dans Ie temps que le furosérnide, produit de synthèse choisi comne référence. .* La présence d, acides-alcools, dt acides-phénolsr-. areupatoriopicrine peuvent expliquer cet effet diurétigue mais -230- I'hlpothèse d'une contribution dee EeIs de po!9s?i9n eontenus aanâ- Ies plantes réputées diurétiqtres a été éItninée. Le choix de Ia voie dtlnjection de I'extrait s'est posé tout au long de cette étude. II ett sans doute été-préférable d'utiliser Ia voie pg--€,r en respect de 1'utilisation tradi- tionnelle. Mais cetEe voie n'est pas touJours facile à utiliser cornpte tenu du stress et des blessures que P99t provoçluer d'une sonde gastrique dans Itoesophage de lraâninistration rrscreeningrl Itanimal et du temps qtre néceésite Ce gavaEe. Un pharmacologique esL plus aisé à entreprendre par-voie I.P.ou i.V. par aitfeurs I'êxtrapolation de 1'appareil digestif de Iranimal à lthomme est aélicat et I'absence d'activité de Itextrait per os chez I'animal ne doit pas pernettre de conclure a une aUsence dtefficacité par Ia mêmevoie chez Irhomme. II eût été néammoins intéressant de tester ce type de voie. Ce travail aura permis ôe confirmer et drap-proober les mé- canLgues dractl.on géuvernant les propriétéa bépatotropes et_ dlurétiques, rencoitrées dane ta thérapeutlque tradltlonnelle, dtun extrait aqueux total CrE.aannabi4umr-Ell noyen 6e ieàUnfques pUafracotogiques noderneg Ln vl.vo et in vLtro 3 t lrertraLt est cholérétLque et, en ce seDsr Joue le rôIe deun bon ôraLneur hépatique. l,tintérêt du pouvoir cholérétique des extraits végétatx a-déjà été longuement débattu. II ne faut pas perdre de vue que notre étude vient en marge de Ia jeu ih"rm""ologie étassigue mettant en des réactions nolécules- iites d,acéion. Nous avons utilisé icl des techniques clas- siqges de pharmacologie pour tester un totun renfer"mant de nom- bréuEes moLécules. Dans ces conditions, il parait vain de voul.oir expliquer le mode d'action au risqug d9-se perdre dans des hypotfrêseJ hasardeuses. Ce pouvolr.chotérétique reste cepenâânt intéressant ear faisant partie' commetouE-les diirrétiçres, IaxatLfs, sudorifigues et purgatifs de Ia phyto- thérapiè, des rrdépuratifsrr ou trd1'aineursrr assurant une éltnination des toxines de I'organisme. Ainsl un cholérétique assure-t-it un dralnage hépatlgue in- téressant en cas dè surcharge nédlcamenteuse par exenplg' Nous pouvons donc évaluer le pouvoir cholérétique d'E.cannabinum, êD Ler:ne d'épuration héPatique. . ll est antlhépatototlque eD Lntenrenant eur lee événenents conCutgant à la-néoroge cellulaire et oette proprlété pourrait rontorccr I'arseDal thérapeutlque tane lee affeatlong népatfquea et dang lralcoôllené. Cette propriété vLent d'une de la F;a stajouter à la précédent9 pour Justlfler l'emplol- aâns les petiles pathologies hépatiEres tout.conme Ie iiante une iis-enfit, la troido ou llartichàut, naie ouvre aussi perpective nouvelle de recherche. -23L- t tf €st salLdLurétique, sans perturber l'égutlibre LonLque, et gon actLon rappelle celle des dl.urét,iquee tbiazl'diguee. Il peut être utilisé en traitement chronique sans inconvénients. Là encore l,intérê d'un diurétique trdouxtr est discutable. Les diurétiques chirniçlues sont utilisés en nédecine contre I'oedème et trhypertension. L'ernploi d' extraits végétaux diurétigues se justifie en termes de draineurs de I'organisme pour des traite- rnents de fond, I'urine comme Ia bile entrainant avec eux maints composés dont une mauvaise élirnination aboutit' à des intoxications. L'étude des indications traditionnelles de la plante a révé}é une autre convergence dtutilisation traditionnelle qui pourrait être explorée : ce sont les vertus cicatrisantes dtE.cannabinum vantégg^depuis Ia médecine savante arabe par Avicenne jusqu'au 19=*= siècle. Les indicationS thérapeutigues tant dans Ia médecine savante (grecque, arabo-persane, indienne, européenne) que tiaditionnelle sont en fait bien souvent une médecine préven- tive oÉ les remèdes essentiels consistent en dépuratifs et fortifiants, Ia notion d'état d'encrassement et de pureté étant constante Les rrdraineursrr de l,organisme' souvent prescrits en cures saisonnières au printemps et à Itautomne et qui connaissent un regain d'intérêt parmi les phytothérapeutes ont à la fois une valeur préthérapeutigue en préparant en quelque sorte Ie traiternent étiologique et post-thérapeutique. Ce travail qui s'inscrit dans les perspectives de I'ethnopharmacologie aura donc permis de confirmer les données de la tladition càr E.cannabl.nun sregt nontrée phamacologique- ncnt actLve aux doges et aur préparatLons (décoctlonrinfusion) utillséee par la posologle traditLonnelle. En guise de conclusion, iI était irrésistiblement plaisant de citér un morceau choisi d'un des maitres de ta phytothérapie en France au début de ce siècle : rt(... ) Ies feuilles peuvent être avantageusement employées pous préparer des infusions qui, douées de propriétés âiureLigues, diaphorétiques et très légèreurent cholérétiques, méritent de figurer parmi les médicaments auxquels on donne Ie nom de dépuratifs : j'ai eu maintes fois I'occasion dtentretenir mes lecteurs de ce genre de drogue dont Ie vocabte, si élastigue, ne signifie pas grand'chose aux yeux du nrofanum vulgus, té palladiunr de la santé, le moyen-Ig plus str de renédier àux vices su sançt, d'assurer le bon équilibre de ItorganLsme en le débarrassant des impuretés, des humeurs peccàntes qui enconbrent et en gênent Ie fonctionnement norrotal: â vouloir les proscrire on risquerait de porter atteinte à des traditions séculaires et d'entrainer les malades à recourir aux drogues parfois nocives, souvent inutiles, toujours- dispendiéuseE dont certains bienfaiteurs de l'humanité leur prônent les merrreilleux effets à la quatrième page des journaux -232- En leur prescrivant I'infusion de feuilles d'Eupatoire-qui agit à Ia foii en activant la secrétion biliaire , êD favorisant la diurèse, êD provoquant de }égères sudations, on peut être assuré drabold de leur faire respecter le sage précepte primum non nocere, ensuite de ne pas les entrainer dans de folles aepenses, enfin de leur fournir un breuvage qui répond à Ia coirception, si ancrée dans leur esprit, des bienfait's de Ia médicâtion dépurative. Cette infusion s'obtient en faisant bouillir 2 ou 3 minutes, puis laissant infuser un quart d'heure dans 2OO gr. d'eau 5 gr. de feuilles d'Eupatoire. -Le liguide résultant de cette opération n'a rien de bien plaisant : pour le rendre plus potable on peut ajouter, après ébullition r uD simple d,une agiéabte saveur, tel que Itintrouvable anis vert ou le fenouil. Mais un moyen plus sûr, qui n'exige qu'un peu dtimagination et de diplonatie, est de raconter aux malades quel iut le glorieux passé de la ptante dont on les engage à âbsorber ltapozème : je ne sache pas qutil existe de patient assez irréduétiblenent attaché aux principes démocratiques pour bouder devant un remède qui fit les délices d'un monarque aussi puissant gue MITHRIDATEEUPAIOR, roi du Pont.rr E.ITECITERC, 19'16. TRAVAUXCITES -233- TRâVÀUX CTTEA AEURADAI.I., TAKEDA 8., 8ANURAI II. ADô IIARIDJAU., 1980' Pharrracological studies on gardenia fruit 5: mechanism of inhibitory effect of genipin on gastric secretion and its facilitory effect, on bile secretion in rats, J.Pharm.Dyn.' 3' 423-433. ADUET T., CÀltARIlgA it. aDd LÀGIINâ if .C.1 L9A7, Hepatoprotective activity of polyphenolic compounds from Cvnara scolymus against Cct4 toxicity in isolated rat hepatocytes, J . Nat. Prod. ,- 50 ( 4 ) , 6L2-6L7 . ADUET T., CllLARâ$A J., HERNANDEZ:t.8. and L,AGITIIAif.C. t L987t Action of an artichoke extract against cCl4 induced hepatotoxicity in rats, Acta Pharm.Jugosl- i 37, 183-1-87. AGARIIAI A.K. anô I|EHENDALBts.!f,., 198'l(a), CCta induced àlterations in ca++ homeostasis in chlordeconë and phenobarbital pretreated aninals, Life Sci. , 34-, 1-41--1-48. AGâRIAIr A.K. anô UEEENDAITEE.l{..; 19Sl(br, Exceççive hepatotoxicity accumulation of intracellular Ca-- in chlordecone pôtentiated cc14 toxicity, Toxicol., -S., L7-24. AcUIAR X., 1985, Utilisation des hépatocytes fraichement isolés pour l'éùudedes séries médicanenteuses, Thèse Sci., Univ. Nancy, Fr. ÀEltAD F.F., COWllt D.L. anô SIIN 4.I., L987, Detection of free radicals formation in various tissues after acute CC14 administration in gerbil, Life Sci. , L, 2469-2475- AIIDREÀDII À., RAI|BAITDI 1.1., ltAgCELIrÀNI G. and RIIGARITI P. tLgS? , Synthesis and diuretic activity of inidazol2,l-blthiazole acetohydrazone, Eur.J.Med.Chem. , !,2, L9-22- AllZÀRI G.À.8.1 ttOgIrEN!t. anô RBI-NOLD88.8.r 1982; Evidence for@covalentbindingofccl?derivedfromCC14to cholésterol of rat liver, Biochem.Pharnacol. ' 31(21); 3509- 3510. ÀRt[OIrD N. , 1985, Contribution à la connaisance ethnobotanique et rnédicinale de la flore de Chypre, Thèse Pharm., Univ. René Descartes, Paris, L349-L351. ARVIS P.1., 1985, Etude de Iteffet hépatoprotecteur dtextrait végétaux sur hépatocytes isolés de rat, D.E.A. Toxicol., Univ. Metz, Ft., 48PP. EAER N., CElilIEIr it., GNO{IKOW8KIit. altô trf.IllAR D.r 1983, The effect of sesquiterpene lactones, eupatoriopicrin and hydraxyisonobilin, on the glycolytic netabolisn of human flmphoèytes, Intern.J.Clin.Pharnacol.Therap.Toxicol., 2L(Ll, 4L-46. -234- EAcIrfN â. et PRfNSEÀUXû., 1986, Calcium et diurétigues, La Revue du Praticien, 36.(55), 3263-3269. BÀPAIJÀIIVAIDYA, 1982, Some controversial drugs in indian medecine, Varanasi, Chaukhambha Orientalia, t_gl_-192. BAR N., L962, Contribution à lrétude de la fonction biliaire en hlpothennie (recherche sur le rat), Thèse Sci., Univ. Lille, Fr., 129pp. BARNEARDit.L. and COIIBES. 8., LgZg, Erythritot and mannitol clearance with taurocholate and secretin-induced choleresis, Àn.J.Physiol., 234-, 8L46-8L56. BEÀUX D., 1981, Evaluation drun modèle expérinental d'hépatotoxicité chez le rat par Ie dosage des triglycérides hépatiques et de Ia glutarnate-pyruvate-transaminase -erique, D. E.À. Toxicol. Univ . ltetz, Fr. , 65pp. BELI/AXtrDAR at., EONDA G. and MIKLI W. , L982, Herb drugs and herbalists in the Magrhib, Ed.Inetitute for the study of Ianguages and culture of Asia and Africa, Tokyo, 81. BELI{,RIN-FOI{'|[ 8.1 WEf8INGER J. and UARTfIIEZ V.p. , tggl, Effects of diuretics on magnesium metabolism, In pUSCHETT J.B. : Diuretics Chemistry, Phannacology and Clinical Application, Procceedings of the First International Conferencee on Diuretics, L984, Miani Beach, Florida, U.S.A., Ed. : Elsevier Sc.zublishing.Inc., 174-t-Bt-. BERCER ll. and SOZERI T., L987, Rapid halogenated hydrocarbons toxicity in isolated hepatocytes is nediated by solvent effect,s, Toxicology, 45, 319-330. BERCERl[.L., BEATT 8., COttBEgB. anô EBTABROOf, R.[., 1986, CClo-induced toxicity in isolated hepatocytes : the impôrtance of direct solvant inJury, Hepatology, 6(1) , 36-45. BERRY ll.N., L976, The development of techniques for the preparation of hepatic parenchlnral cell suspension-a history and rationale, ID TAGER J.Ir{., SOLING H.D. and WILLIÀIr{SON : Use of isolated rat liver cells and kidney tubules in netabolic studies, Ed : North Holland publishing Courpâtry, Amsterdam, 131-138 EERRI N.ll., L971, High yietd preparation of morphollogically int,act isolated parenchyrmal cells fron rat liver, Dans FLEISCHER S. and PACKER L. ! Methodes Enzynology Biomernbranes , 32., 625-632. BERRI N.ll. and PEILITIP8 t{.if ., 1969, High yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells, J.CeIl.Biôl.; l-, 506- 520. BEZÀIIGER-BEAUQUE8IIEIr. , PfNKAg U. and fOnK U. , 1983, Les plantes dans Ia thérapeutique moderne, Ed. : Maloine, paris, zLO. _ 235._ BEATTACEARYAR.K. and FIROZI P.F., 1988, Effect of plant flaVonoids on microsomes catalyzed reactions of aflatoxine 81 teading to activation and DNA adduct formation, Cancer lett.i 39-, 85-91. BITO8CIK E. r GEPPERT B. anô DROZDUB. , L978, Quantitative deternrination of sesquiterpene lactones in plant material by IR spectroscopy, Planta Med., 34-, 79-86. BOECtrER1., itÀKUPovIC it. , BoEI,I!IA!IN F., KING R.tl. anô ROBINSON8., 1986, Further heliangolides and guaianolides fron E.altissirnum. Phytochemistry, 25(71 , L669-L672. BocÀERTit., L973, Contribution à I'étude de I'acide hydroxymethylacryligue et de divers acides organiques associés dans ltartichaut, Thèse pharm., Univ. Paris, 229pp. BOGAERTJ.P., UORTIER tr.r DELAVEAU P.r atOUANf if .l{. et PELT if .!1. , t9?2, fntérèt des détérminations par voie enzynratique de certains acides alcools dans les drogues végétales, Bull. Soc. Pharm. , Nancy, 24-, 1t--16. ffiruffi û. r ûEilt-tl A. , trfNG R. and ROBIllSoN E. r 1980, Neue gâuJanolide aus Eupatorium rotundifolium, Phytochenistry, L9-, L233-L234. BOBLIIAI{Ntr., ZDEROC.r KING R.ld. anû ROBINSOII8., 1981, Further germacranolides from Eupatorium serotinum, Planta Med., l-, 76-77. BOIINIER G., 1931, Flore cornplète de France , Suisse et Belgigue, Ed. : Orlhac, Paris, 64-65. BORGREVINKP.C.l BOITTENI. and {IYNGE P. t L987 r Tissue electrolytes induced by high doses of diuretics in raÈs, Pharmacol.Toxicol. , -@., 77-8O. BOg Rr EENDRIK8 8., BRUIIIs 8.P., SCBRIPSEIIA J., KLOOSTERUAN if . and SIPtlA G., 1981, The presence of some sesguiterpene Iactones in E.cannabinum L, Farm.Tijdschr.Belgl., 6L, 398. BOULCT8L,., 1983, Medicinal plants of North Africa, Ed. : Reference Publications Inc., Algona, U.S.A., 64. BOÏBR if.L., 1980, New concepts of mechanisn of hepatocyte bile formation, Physiol.Rev. , 60(21, 303-326. EOIER if .û.r 1983, Tight jonctions in notmal and cholestatic Iiver: Does the paracellular pathway have functinnal significance?, Hepathol., 3, 6L4-6L7 . EOïER J.Ir. and BIOOI.IERit.R., L971, Canalicular bile,çecretion in man. Studies utilizing the biliary clearance of '*c nannitol, J.Clin.Invest., 54, 773-78L. 236 - BRIBBC tl.if ., OltENg if .B. , KENEL, tl., SOASCEER D. atrd CORIIISE 8.8., 1982, Modification of methanol potentiation of cC14 toxicity in rats by chloremphenicol and salicylate, Drug- Chem.Toxicol., 5(2'l , L43-L54. BRACXE td.E., CâSTROIIOVO V., VAII CAII\/EIIBERGE R.l'l.Ir., COUPUIIT P., VAKAERT Ir., PÀIEIJ STROJUY ift.l FOIDART if .!1. anô IIAREEIT ll.tf. , L987, The anti-invasive flavonoid (+)-catechin binds to Ianinin and abrogates the effect of larninin on ceII morphology and adhesion, Exp.CeII.Res., L73, l-93-205. BRAUERR.[., ITEONGG.F. and BOITITOÏÀYR.if., 1954, Mechanisrn of bile secretion. Effect of perfusion pressure and temperature on bile flow and bile secretion pressure, Am.J.Physiol., L77, 103-112. BRENSrI,\fERJ.Iil., DAIIIEL'8 P.H., IrAFÀVOttRG.8.r IIAL8EPIIIC D.ll., IroRCtr if .À.r PONTE tl.L. and CORÎEIrL S., 1985, Effects of variation in dietary sodium intake on sodium excretion in mature rats, Kidney Internat., 27-, 497-502. BRETEAU lt., BOURfN U. Ênô BfZIERE N. t L978, Pharmacologie des diurétiques, Diurétiques, 28(51), 397L-3983. BRfDcEg il.l., 198!, The use of hepatocytes in toxicological investigatLons, TesÈl.ng for toxicology, L25-1-43. BUÎLER [.]1., lLALrFg â.u., EORNTNGl{.G. anô BRODIE B.B.; 1961, The direct determination of liver triglycerides, J.Lip.Res., 2(Ll, 95-96. CâGEN 8.2. and NIÀÀ888N C.D. t t9?9, Hepatotoxicity of CCl4 in developing rats, Toxicol.Appl.Pharmacol., .S,, 347-354. ellr8lltÀ .it.r 1980, Relation ship between glycolysis and proliferation of L1210 cells in vitro of a new pharmacological effector RÀ-233, Biochem.Pharmacol., 29-, 2690. CIREI tl.C. t L982, The enterohepatic circulation, In ARIAS I.l{., POPPERH., SCHÀCHTERD. and SHAFRITZ D.A.s The liver, biology and pathobiology, Ed. : Raven Press, New-York, 429- 455. CEIBROIT E.r CEARONNAR., llAXIllIN li.r IAITU n. et PORIN it., 1931, L'actLon cholérétique des Composées1 C.R.Soc.Biol., 1O8, 11OO-1102. Cf,AIùtER8 4.X., CUITVBNORC.C.if . ald SllITE L.f., 1965' Characterisation of pyrrolizlidine alkaloids, J.Chronatog., 20, 270-277. CEltt R.f .ll., SAlt R.E.C. anô STIH E.E.r 1986, Mechanism of inhibition of N-rnethyl-N'-nitro-N-nitroguanidine l-nduced mutagenesis by phenolic compounds, Cancer Lett. r 31' 27-34. 237, - cEoPRA R.N., cHoPRl r.c. anô llARll,A8.s., 1969, supprement to glossary of indian nedicinal plants, Ed. : Councii-of scientific and rndustriar Reséach, ilew Dehri, rnde, 29, 119pp. c.xoPRAR.N., ltAYÀn S.re. anô cEoPRA r.c., 1956, Glossary of indian nredicinal prants, Ed. : councir ôr scientific ana industrial research, New-Delhi, 1L2-113. CONDIOR8f,.D., TEItnU,AltR.G., GAITIUIlt.D. anô ltABOltR.P., 1986, The formation of a nover free radical netabolite from ècr, i; the perfused rat liver and in vivo, J.Bior.chem. , 26L(1o); 4542-4548. coRBrc u., 1986, Que reste-t-il de la fraction indépendante des acides biliaires dans Ia secrétion biliaire?, Gastroenterol.Clin.Biol., 1O, 74L-743. coRcoRAll c.E. and wot{G8.K., 1996, Rore of glutathione in prevention of acetaminophen-induced hepatotôxicity by N- acetyl-L-cysteine in vivo : studies with N-acetyllo-éyEteine in mice, J.Pharmacol.Exp.Ther. , 239(L,r, 54-61. cRoriIQUrBTÀ., 1981, AD integrated system of classiftcation of frowering plants, Ed.corumbia univeisity press, New-york, 1020-1028. c-E-l. t L978, statistigue appliguée à L,exproitation des mesures, Ed. Masson, paris, 412pp. DÀNIEITANR., POPOltgKl E. ant BORKOWgtr8., 1923, The preparation of veget,able products containing isofraxidin, silibin and Glaucium alkaloids and evaruati6n of their choleretic actions, pol.J.pharmacol.pharm., 25., 27L-2g3. Dlr{rBLSoN Bo. @., 1985, Renal stones-current viewpoints on etiology and managenent, Scand.J.Urol.Nephro1., Là, 1-5. DANrErrSSoNE.anô girovÀLrr it., Lgzs, Bile acid metaborism, Anal.Rev.Biochem., 44, 233-253. DAvRârlwrrrLE tr. , FLEURE!ÛIINit. r ltoRTrER it., rouilog c. et PELT ir.lt., 1988, Recherche dtune activité hépatorénale drextraits de Laserpitium latifolium L. chez le raL, pl. Méd. Phytothér., 23 (41, 323-33i. DE FERRETRI,8.C.2 ERENACCEIA.g. anô eAgTROit.A., 1996, rncreased grutathion(csH) content in rivers of contror and carbon tetrachloride poisoned rats treated with the anticalnodulin drug trifluoroperazine (TFp), Res.Con.Chem.Pathol.Pharmacol., 53 (3), 399-402. DE FBRRBTRI8.C.2 DE FENO8O.lt. anô ClgIROg it.À.; 1993, Tryptophan potentiation of the rate cystein preventive effects in carbon tetrachlride-induceÈ necroéis, Res.Com.Chem.Pathol.Pharmacol.,40(3), 515-519. -238- DE FERREYRÀE.C. 1 D8 rENOS O.M. ' BER!ûACeEI4.8.1 CISERO C.R. aDA CAgTo if.À., L9?7, Treatement of CCl4-induced liver necrosis nith chemical compounds, Toxicôl. Appl. Pharnacol., E, 5t_3-521. DEBI C., I|AGOTTBÀUXG. and BACQ 2.8., 1970, Relat,ion entre acides gras essentiels et totaux des antioxydants tissulaires clrez la souris, C.R.Soc.BioI., 162(2') , 2675-268L. DBITAIICEEit.E. rDEIrVOSALLE 1,. ,DIwIGIIEAUD it., LIIIEINON iI. 6t VAN DBN BBRGHENC., 1983, Nouvel.le flore de Ia Belgique, du Luxembourg, du Nord de la France et des régions voisines, Ed.: Patrimoine du jardin botanique national de Belgique, Meix,6O3-6L5. DIÀLIr(, 8., VeN AAELEN ll., KISO y. and EIRO8EI E. , L987 , Antihepatotoxic actions of Cochlospermum tinctorium rhizomes, J.Etnopharmacol., 2O-, 239-243. DIlltZlNf tt.U., L9A2, Biochernical effects of sature and insatured aldehydes, In IÎAC BRIEN D.C. and SLATER T.F.: Free radical, lipid peroxidation and cancer, Ed. : Academic Press fnc., Londres, L29-L58. DOBBBRSTEINR.[., TfN-nA ]1.O., trOHGf,.8.8.1 CRAIIE F.À. atrd FÀRN8IORTI N.R., L977, Flavonoids constltuents from E.altissinun L, J.Pharm.Sci. , æ.(4r, 600-602. DOIrEitg L. anô BEROITTV. t L962, OD terpene 165: Constitution of eupatoriopicrin germacranolide from E.cannabinum L, Coll.Czechoslov. Chen.Commun., 2,3_,2654-266L. DORVIULT, 1875, L'officine ou répértoire général de pharrnacie pratique, 480, Ed : inconnu. DROZDE B. abC EIILBI-ORIGIEL G., L97L, Sesquiterpene Iactonesr5: Composit,ion of the lactone fraction of leaves and inflorescence of E.cannabinum L, Dissert.Phatm.Pharmacol., 23(5) , 537-540. DROtDt 8., CRtEtRCSTtr 8., gAllEK 8., EOr,ItE ll., EEROIII V. and 8ORll t., lt?f, Orr terpenee 21.5r Sesquiterpenic lactones fron E.cannabl.num L. Revision of the structure of eupatoriopicrin, Coll.Czechoslov.Chem.Commun., 37, 1546-1554. BRITINGER8., 1982(a), BiIe flow, In ARIAS I.M., POPPERM., SCHACHTERD. and SHÀFRITZ D.A.: The liver biology and pathobiology, Ed. : Raven Press, New-York, 407-427. BRLINGER 8., 1982 (bl , Biliary physlology and disease, ID ÀRIAS I.M., FRENKELM. and WIISON B.H.P.! The liver annual 2, Ed. Excerpta Medica, Àrnsterdam, 305-330. E8CIIBEDOR., CÀITARAit. and ÀDZBT T., 1986, Action of caffeic acid in rat and vas deferens, I.R.C.s.Med.Sci. , L4-, 1196- LL97i _239_ Flnyg ll.w. and REED D.if., 1985, Mechanism of chemical induced toxicity. 2. Role of extracellular calcium, Toxicol.Àppl.Phannacol., 79' 296-306. FBRIIAIIDEZ G.r VILI/ARRUEITli.e., DE FERRETRAE.C., DE FEltOg O.tl. aDs CA8TROif .A.1 1986, Imipramine prevention of CCI4 induced liver necrosis at late states of the intoxication process, J.Àppl.Toxicol., 6(6), 413-418. FERRIRC,G., I{ARTINO V., BORRÀfOG. anô COUSSIOit.D.r L987' 5, - - 7,3' ,4' - tetrahydroxy 6 methoxyflavone from E.subhastaturn, Phytochemistry, 26(11), 3092-3093. FLEIIRENIIN at., 1983, Répertoire des pharrnacopées traditionnelles du Yénen et étude pharmacologique de deux espèces à propriétés hépatorénales: Crepis ruepellii et Anisotes trisulcus, Thèse Pharm., Univ. Metz, 689pp. FONIAINE L., GRÀliIDll., llOI|HO D., CEABERTJ. and BO8CEETTI E.t 1968, Activité chlolérétique et spasmolytique, pharmacologie générale de la néthyl 4 ornbelliférone, Therapie, 23-, 5L-62. FORKERE.L., BICKLIN T. and SORlfgONH. t L982, The clearance of mannitol and erythritol in rat bile, Proc.Soc.Exp.Biol.Med., L26., 115-119. trOURIIIER P., 1918, Lê livre des plantes rnédicinales et vénéneuses de Francer2, Ed.Lechevalier, Paris' 130-L33. trRâCA$$Oll.E., ITEONER. tnô BERI[I T., 1980, Biochemical changes in isolated perfused liver from rats intoxicated with CCl4 or fed with steatogenous diet, Pharrnacol-Res.Comm., L2(41, 295-305. FRAGAC.G., I|ARTIN O.V.8.1 FERRAROG.8., COUSSIOit.P. aDû BOVBRf8 O., L987, Flavonoids as antioxydants evaluated by in vitro and in situ liver cheniluninescencê, Biochem.Pharmacol., 36 (5) | 7L2-72o. GÀRNIER G. ' BEZANGER-BEAUQUEBNEI'. et DEVRAITXG., 1961t Ressources médicinales de la flore française, Ed. Vigot Frères , L_ L326-L328. GEISSUANNT.À. and ÀTAL,â 8., L97L, Distribution ôf eupatoriopicrin in Conpositae, Phytochernistry, -L10, LO75-LO77 . GIACEETTI D., FRÀTIGLIoNI P.anô TADDEI !., 1981, Activita diuretica delI'oIio essentiale di Rosmarinus officinalis L. e di flgnlperus L. Esperienze nel ratto. Àtti del Congresso tlationate aelIa Soêieta Italiana di Pharmacognoaia, Messina, Lavori delt'Institutodi Pharmacognosia dell'Universita di Messina, suppl. 13, 77-85. OLEIIDE 8.4., CEOITIPARAI|BIL,if .R. and PU$APENDRAIIK., 1986, Àctivation af phospholipase A, by carbon tetrachloride in isolated rat hepatocytes, Bioéhem. Pharmacol., 35(19) ' 3301- 3307. -24O- GOEI.Ill.R., SEARIiA!1.4. anô 8TEOE 8.if .p 1988, Induction of Iipid peroxydation by hexachlorohexane, dieldrin, TCCD, carbone tetrachloride and hexachlorobenzène in rats , Environ.Contam.Toxicol., 40, 225-262. coNzALEU â.G., BÀRRERAJ.8., YÀIIE8 FERIIÀIIDEBA.C.Y., ROSA 8. F.E. and DOIIINGIIEZX.4., 1985, Eudesmane sesquiterpene fron Eupatoriurn cruadrangulare, Phytocheuristry, 24 (8r, 1847-1848. GRIFF it., 1983, Canalicular bile salt dependant bile formation : concepts and clues from electrolytes transport in rat, An.J.Physiol., 244, G233-G246. GRÀVELA 8., ÀIrBÀltO E. r DIANUâNf M.U., PCTITIG. and SLATER T.tr., L9?9, Effect of CC14 on isolated rat hePatocytes: inhibition of protein and Iipoprotein secretion, Biochem.J., L78, 509-5L2. GREGERR. and SCBLÀTTER8., 1983, Cellular mechanism of the action of loop diuretics on the thick ascending linb of Henle's loop, Klin.Wochenschr. , il., LOL9-LO27. GREVENJ., trôLLING 8., BRONEWSKI-sCEWÀRAER8.V., itU![KER U., ISEFFGENB. anô NfLIUg n. t L984, Evidence for a role of the Tamm-Horsfall protein in the tubular action of furosenide- like loop diuretic, ID PUSCHETTJ.B. : Diuretics Chenistry, Pharmacology and Clinical Application, Procceedings of the First International Conferencee on Diuretics, 1984, Miami Beach, Florida, U.s.A., Ed : Elsevier Sc.Publishing.Inc., 203-2L4. GUIEOURT C. et PÛâffiËllt O.1 tttl, llistoLre naturelle des drogues simples, 3, Ed. : Librairie VatLères J.B. et fils, Paris, 62-68. CÙII|OCEET ll. et DE VIITLI|ORIN R. , L982, Flore de France' 4 ' Ed. : C.N.R.S., Paris, 1393. GUIOIT C., UONIA8IRUC J.Ir. and lrtOI{TAgTRItCP.r 1981, Naloxone reduces diuretics responses induced by water alcohol or congenital lack of vasopressin in rats, Br.J.Pharmacol., 81, 085-O90. EACKBÎr â.1d., 1986, The rnetabolism of flavonoids conpounds in mammals, ID CODYSV., MIDDLETONE. and HÀRBORNEJ.B.: Plant flavonoids in biotogy and nedecine, Ed. : Àlan R. Liss Inc., New-York, L77-L91. EACXETT l.ll.r SEAï I.C. and GRIF3ITE8 lr.l., 1981, The prevention by (+)-cyanidanol-3 of hepatitiE induced changes in the disposition of irnipranine in the rat, Biochem. Pharmacol. , 3-3.(14), 2L79-2L84. EAITITI.8., IrEE K.H. and BIGEBÀIrIry 8.4. , L978, Antitunor agents, 27: Effects of helenalin on anaerobic and aerobic nretabolism of Erlisch ascites cells, J.Pharm.Sci., 67 (4, , 552-554. -24L- EALI.r I.E.r LBE K.8., STARNE8 C.O. atlû IIURAOKA O., 198Oa, Antihyperlipidemic activity of activity of sesquiterpene lactones and related compounds, J.Pharm.Sci., 69(6), 694-697- EAITITl.tt., tEE K.8., STÀRltEg e.O., 8U!'IIDA I.R., fU R.Ï.1 IADDELI, T.G., COCARAN J.19. and GEREAR:I K.G. , L979, Antiinflammatory activity of sesquiterpene lactones and related compounds,J.pharm.Sci., 68(5), 537-542. EALTL. I.[., 8TÀRllE8 E.D.; IIEE K.H. and WAI)DEITITT.G.r 1980bt Mode of action of sesquiterpene lactones as antiinflamnatory agents, J.Pharm.Sci., 69(5), 537-543. EÀl,lltARIrItlIDll. and PAALZOWL.K., 1985, Acute tolerance development to the diuretic effect of furosemide in the rat' Biopharm.Drug Dispos., 6, 9-2L. EANDÀ 8.8., SEARII,AA. and CEAKKÈBOR|II tr.K., 1986, Natural products and plant as liver protecting drugs, Fitotherapia' 57 (5) , 307-3s1. EIV8TEBN D., 1983, Flavonoids, a class of natural products of htgh pharmacotogical poteney, Blochetn.phamacol., U(71, 1141-1148. EEATE D.F. t L967, Normal or log-normal: Appropriate distributions, Nature, Æ, 1-L59-11-60. EEGNAUERR. r L9?7, The chemistry of the Compositae, ID HEYWOODV.H., HÀRBORNEJ.B. and TTRNERB.L.: The biology and chemistry of the Compositae, L, Ed. : Àcademic Press Inc., Londres, 283-335. BEIÛDRIXS8., BAIrRâlI\tgII{G W., AUIZING B.if . tnd BRUIN8 A.P.t 1987, Investigation into the presence of pyrrolizidine alkaioids in E.cannabinum by means of positive and negative ion chemical ioizat,ions cc-l'[s, Planta Med.,5-x(5), 395-408. EENDRIKS E.r BOg R. and BRITINS 4.P.1 1985, Analysis of the essential oil of E.cannabinun by combined gas chromatography- mass spectrometry using electron inpact and negative ion chemical ionization, P1anta Med., , 54L-542. BBtfDRIKg 8., I|AITINGRE tlE.ld. anô ELElttA E.l!., 19||3t plzrrolizidine alkaloids, flavonoids and volatile conpounds in the genus Eupatorium, Pharm.Vf,eekb.Scient.Ed., 5 | 28L-285. BERZ W. and KUIÀIITEIAVEIT P. , 1982, Sesquiterpene lactones of Eupatorium scrabidium, Phyt,ochenistry, 2L(10), 2475-2479 - EERU f. and SEAR!|A R.P.. L9?6, Sesquiterpene lactones of E.hyssopifolium, a germacranolide with an unusual lipid ester side chain, J.Org.Chem., 41(6) ' 1015-1020. BERZ f . r DE GROOTE R. r IIURARI R. and trItlilAR N. r L979, Sesquiterpene lactones of E.serotinun, J.Or9.Chen. , 44(15), 2784-2788. -242- IBRU f ., GOVINDAN8.V. and KIIIIiARN., 1981, Sesguiterpene lactones and other constituents of E.lancifoliurn and E.semiserratum, Phytochenistry, Æ-(61, L343-L347. EERZ f., KlLyÀt{ÀRAttAll P.8., RÀllAKRfgIMAll G. and BITOI'NÎ if .F.1 L977, Sesquiteperne lactones of E.perfoliatum L, J.Org.Chem., 42(L31, 2264-227L. IERZ f., trULlilfBfÀVEL P.r SUBRAU,ANIAII P.g.t CULVENOR C.C.if . anô EDGAR it.A., 1981, Alkaloids of Conoclinum coelestrinum (t) D.C., E.compositifoliurn Watt. and E.altissimun L. isàtation of cristalline intermedine from @, Experientia, 37-, 683. EERZ W., KItllAR N. aDd BITOUNIif.F., 1980r A thiol derivative ester side chain in a sesquiterpene lactone from E.mikanioides. Absolute configuration of deacetyleupaserrin and its congeners, J.Org.Chem. , 45(3), 488-493. SERZ f ., UURâRI R. and GOVIIÛDAII8.V. t L979, Sesquiterpene Iactones of E.anomalum and E.mohrii, Phytochernistry, L8-, L337-L34L. trEïfOOD V.H. and EARBONEit.B.; L9??, AD overture to the Compositae, fn HEYV0OODV.H.' HÀRBORNEJ:8. and TURNERB-L-: The biology and chemistry of the Compositae, L, Ed.: Academic Press Inc., Londres, I-I7. EINMO, 1987. ETKINO E. r KISO Y. r AIiAGAYA 8. and OGIEARI l. t 1981a, Antihepatotoxic actions of papyriogenins and papyriosides, t,riterpenoids of Tetrapanax papyriferun' J. Pharmacol., L2-, 23L-235. IItrINO 8., 1981, Antihepatotoxic principles in oriental nredicinal plants. Natural products and drug development, In ÀIfred Benson Symposium 2O, Ed.: Krosgaard-Larsen P., Brogger Christensen S. and Kofod H., Munksgaard, Copenhagen, 374-389. 8If,INO H., rISO N. , EÀllADA I. r SBIOIRI 1., AII!u'IA n. t ITOKAWA f,., XIUCtrI F. anô SÀttf,Àll U.7 198ta, Antihepatotoxic actions of gingerols and dl.arylheptanoids, J.Etnophar:macol.' U., 31- 39. BIf,INO f,., trIgO I. r llll€llA 8. and OGIEARI I., 1981a, Antlhepatotoxic actlons of papyriogenins and papyriosides, trLterpenoids of Tetrapanax papyriferum leaves, J.Etnopharmacol. , L2-, 23L-235. IIKINO E. , KISO r., IrATlltO T. , ÏO8EIDÀ T. anô ONITDA1., 1985b, Antihepatotoxicity of tannins, J.Ethnopharnacol., L4, L9-29. EIf,INO 8., NISO Y., PÀGU8trI E. anô IKETÀ Y. t t 198ab Antihepatotoxic actions of Iignoids from Schizandra chinensis, Planta Med., 50(3), 2L3-2L8. *243- IItrINO t., KISO T. r IAGNER E. aad FIEBIG ll., 1981c, Àntihepatotoxic action of flavolignans from S.marianum fruits, Planta Med., 3(50), 248-250. EIKINO 8., OB8AWAT., KISO Y. aDô OgEItlA Y. , L981, Analgesic and antihepatotoxic actions of dianosides, triterpenoid saponins oi Dianthus superbus var. longicalycinus herbs, Plant Med., 5-9., 353-355. EIKINO 8., SUGÀI T., EASEIUOrO I., !ÎERA8AKI 8. âtld HININO I., Lg|g, Liver protective principles of Thuiopsis dolobrata Ieaves, Planta Med. , fi., 156-t-63. EIIIE$ J., PEEK R.1,. tnd DAKEB8.D.1 1951r The kinetic of the base catalized deuterium exchange of chloroform in aquaeous solution, J.Ann.Chem.Soc., ft., 827-829. BIRONO I., 1986, Carcinogenicity of plant constituents: pyrrolizidine alkaloids, flavonoids and brackenfern, In CODYS ?:, STDDLEToN E. and IIARBoRNEJ.B.: Plant flavomoids in biàfogy and medecine, Ed. : Alan R. Liss Inc., New-York, 45- 53. EITADONB. and CHODERI4., L9751 Sesquiterpene lactonesr17. Cytotoxic and pharmacologicat activity, Archiv.Inmunol.Therap.Experiment., 4-, 857-865. ELADON 8., BOBKIEWICZ T. anô DROZDZ B. , L9??, Sesqul-terpene Iactones, L9. Prelirninary studies on the mode of action. Inhibition ôf synthesis of tumor cell protein and RNA, Archiv. Imnunol.Therap.Experiment., 25., 243-25L. IILADON E. r DROZDZ 8., GRABÀRCZyK8., BOBKIErICZ T. aDd OL8ZBW8KI J., tgZS(ai, Sesquiterpene lactones, -UL. Cytotoxic activity of eupatolide and eupatoriopocrine on human and animal uralignant cells in tissue culture iJ!-llitror PoI.J.Pharmacol.Pharm., 27, 429-438 - ELADON 8., DROZDZ8., EOLUB ll. and BOBKIEïIC,Z T., 1975(bl ' Sesquiterpene lactones, -L6. In vltro studies on cytotoxic prop-ertie3 of sesquiterpene lactones ln tissue culture of humân and malignamnt cells, Archiv.Immunol. ' Therap.Experiment. , 4-, 845-855. BOEFLBR C. r FITBURENIIINit., UORrIER F., PEL?f if '!l' atlô GUILLEIIAIN it., 198?, Comparative choleretic and hepatoprotective properties of young sprouts and total plant exlracLs of Rosmarinus officinalis in rats, J.Ethnopharmacol., L9, 133-143. EootrER if .D. t Lg?3r The flora of India, f, Ed. s Jayyed press, BaIIinaran, Delhi, 243-244. trOTftNGER 8. anô PREISfC R., 1980, DuaI inhlbitory effect of sornatostatin on canalicular and ductular bile salt- independent bile formation, Gastroenterol., 79, 1109., _2M_ EOIIIRD R.B. r CHRISTENSENÀ.f,., GXBB8 F.A. and PEBCE Ir.A., L967, The enzlmatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver, J.CeIl..BioL., 36., 675-684. IUB8 J.L., SCEIIIDII ll., GIESEI|-CROUBEE.]1., l[EIrgCE 1,t., 1986, Pharnacologie des diurétiques, Lâ Revue du Praticien, 36(55), 3223-3236. IOÀIINIDE8 C., IIAITITD.8., IIIIIJDERD.8., STEELTEC.ll., SPICKETT lI., DELAFORGElt anô PÀRKE D.V., 1983, A comparison of the protective effects of N-acetyl-cysteine and S- carboxylmethylcysteine against paracetanol-induced hepatotoxicity, Toxicol., 28-, 313-32L. MIIIE Y. anô COON1.R., 1956, A textbook oftheoretical botany, Ed. : LongrmansS.and Mac Lean R.C., Londres, Z, L958. IIâEA8EI 1., IIEGIORT., UORTSIIITA [. anô trIDO R. , 1996, Inhibition by chlorogenic acid of haematin-catalised retinoic acid 5, 6-epoxidation, Biochem.J., 239, 64L-646. itAtrUPOVIC at., SItlI [., BOEIJIAIIII E. and KING R.ll. , L98? , Further sesquiterpene lactones from E.altissinum, Planta Med.rL , L-2O. itElfDRlSSIK Ir. and GROF P., 1938, Vereinfachte Photouretrische Methoden zur Bestimmung des Blutbilirubins, Biochen.Z., 297, 81-89. iIERZUANOW8KÀ2., 1951, Euparin, the constituent of E.cannabinum and some derivatives, Polska Akad.UnieJ., Prace Kom.Farm. , Dissert. Pharm. , J, 165-182. {'ONADBTll., llEttlllEn tl.T., tsILIrIB F.r BA8TIDE if .P. et I,iAI.I|AISON af.Ir., 1986, Flavonoides extraits de Ribes nigrurn L. et d'Alchernilla vulqaris L, J.Pharmacol. , L7(L, | 2L-27. aIOIEUN ll., 1986, Etude d'extrait végétaux sur la malonaldehyde et le glutathion après intoxication d'hépatocytes isolés de rat, D.E.A. Toxicol., Univ. Metz, Fr., 44pp. KIPIroWITZ N., Al l!.X., SIllON F.R. and 8ÎOLZ 4., 1986, Effects of phenolic constituents from the Mulberry tree on arachidonate metabolism in rat platelets, Ann.Int.Dled., 104 (6) , 826-839. XIU 8.T.1 KEDDIE if .R. aDd ANDnEfg D., 1981, A method for gcreening diuretic agents in the rat, J.Pharmacol.Meth., 11, 67-75. trlu 8.T.; EOWE8.B., LI ir.T.I.1 slllÎtr L.E.' TEDDIB ir.R.2 BARIrOWif.,if., GILE8 R.B. and GOITDBERCll.E. t L987, ICI L47-798 : À novel diuretic agent htith B-adrenoreceptor blocking activity, J.Pharmacol.Exp.Therap., 242 (3r, 245 - g. trIllURA ï., OKITDA8., NOtdItRAtf ., FUKAI tf . and ARICEI t 1986, Effects oi phenolic constituents from the Mulberry tree on arachidonatè metabolism in rat platelets, J.Nat.Prod., 49(41, 639-644. trIUURÀ I., OKUDA.[.r OKUDA T., IATÀNO !f.r ÀGATA I. and ARICEI g., 1981, studies on the activities of the tannins and reiated compounds from medlcinal plants.and drugsrT. Effect ofleaves of Arternisia species and caffeic and chlorogenic àéià-"" fipiâ-néEabofism injury in rats fed peroxidized oil, Chem.Pharm.BulI., 33(5), 2028-2034. f,ING R.ll. et ROBINSON E. t Lg7O, Eupatoriun, a composite genus of arcto-tertiary ditribution, Taxon, L9-, 769-744' f,IRKPÀTRrK8.R.B., BREEN td.D., EAGEY L.R., EOFIIANNA.T. and TEPtrIry f.R., 198ô, Effect of side effect lenght on bile acid conjugation : Glucuronidation, sulfation and CoEnzyme À forfraÉion of Nor-bile acids and their natural Crn homologs by humans and rat liver ffactions, Hepatology, 8(2I; 353-357. trI8O y., TOXIIIN and HIKINO 8., 1983, Assay nethod_foT antihepâtotoxic activity using carbon tetrachloride induced èit"i"i,icity in primary cultuied hepatocytes, Planta Med., E-, 222-225. KIEO Y., TOKf,IN tl.and IIKINO tr., 1983, Antihepatotoxic principies of Atractylodes rhyzomes, J.Nat.Prod., L5, 65L- 654. gAKAIIOTO trI8O y., TOKHIN tl., EItrINO H., EATTORI ld. r T. and NÂllBÀ rf., 1981, Mechanism of antihepatotoxic activity of ciy"yrthizinrri Effect on free radical generation and tipoperoxidation, Planta Med., , 298-302' fIÀAgEN C.D. aDô WATKIN J.B.r 1981, Mechanisurs fo bile -ôrmation, hepatic uptake and biliary excretion Phannacol.Rev., 36(L) , 2-44- XLAASSENC.D., LEONE R. anô BERrt T., 1969t Comparison of the biochernical aiterations elicited in liver from rats treated with CCl,, CCll L-L-2 trichloroethane andl-l trichlorôrnethaté, Biochem.Pharmacol., 18, 2OL9-2O27. trIrIldEK D., CBI|IEIT it. and BAER 1., 1981, The ef fect of =à=q,tit"ti"." Iactones on the syntlresi9 of nucleic acid in culdure ol hurnan lymphocytes stirnulated by phytohenaglutininel ÂrcnLv. Inmunol . Therap. Experinent. , 22, 195-203. y. KODAKANDITA8.K.Y., SINE 8., TEATUR R.8., EUSAIN A._' trIsO ant EIKIN9 8., 19à5, Antihepatotoxic principles of Phyllanthus niruri herbs, J.Etnopharnracol', j-, 4L-44' XOKAIIE C.K., RAO R.E. and VARUA K.C.V., tg?L, Pharrracological studiee on the essential oil of E.triplinerve vahl, The Flavour IndustrY, March, L77-L8O. -246- KONIC B.anô DU$TUANNJ.[., 1985, The caffeoylics as a ne!Ù fanrily of natural antiviral compounds' Naturwissenschaften, 72,659-661. roRaRUD G.O., KUIPER-GK)ODI{AIIT., IIASSEITAGERE., CRICE E.C. and liAC LÀUGEAII if.U. t L976, Effect of dietary protein level on carbon tetrachloride induced liver damage in rats, Toxicol.Appl.Pharmacol., 37, L-Lz. KOSEIEARâ ï., NEICET T., I|URUTA 8., LAO 4., FUJII|OTO Ï. anô TATgItlto R.8. , L984, Biochim.Biophys.Àcta, 7Æ-, 92-97. fOVACf if.B., AtlEg l{.}l.r PCIIVISC., I|OERTBITG.G.r HâEN R. aDd CREAGÀNE.T. t tg7g, Toxicity and pharmacokinetics of a pyrrolizidine alkaloids indicine N-oxyde in humans, Canc.Res., 3|9-, 4540-4544. ruPcEAtt 8.1{., trBUINGWAI it.C. , CASSADÏ ir.td. r trlloI. it.R. r llAc PEAIIT A.T. and SIll 4., L967, The isolation and structural elucidation of eupatorin acetate' a novel gpaianolide tumor inhibitor from E.Lotundifolium, J.Amer.chem.Soc. , A9(21 ' 465- 466. KUPCEAN8.t1., KtfOX at.R. and UDAYAI|IIRÎEY ll.at.r 1965, Tunor inhibitors, 8: Eupatorin, neht cytotoxic flavone from E.semiserraturn, J.Pharm.Sci., 54 (61, 929-930. XUPCEAII 8.!1., SIGE'J C.tl., EEUINGWAYR.if ., XIIOX if .R. atrd UDA!ÀUUR[EM.$.1 1968, Tumor inhibitors, 33. Cytotoxic flavones from Eupatoriun species, Tetrahedron, 25, 1603-1615. KUPCEAII8.!1., IIGEL C.f,., KNOX if .R. and UDAYâIIURIEI 1t.8.1 1968, Tumors inhibitors, 36. Eupatin and eupatoretin, two cytoioxic flavonols from E.seniserratum' J.Org.Chen. | 34(5, ' 1460-1461. XUREBAIA$BI l{, aDd OGAWAY. r 1986r Characterisation of it"t""t"d Ca++ efflux by quercetin from the sarcoplasmic reticulum in frog skinned skeletal muscles fibres, J.Muscl.Res.CeIl Motil., 7, 142-150. IIRIAXIDIS g.l.l., 8OTIROUDIS T.G. and EVAI|GEI€EOUIOB4.8.1 19g6, Interaction of flavonoids with rabbit muscle phosphorylase kinase, Biochin.Biophys.Acta, 9L, L2L-L29' IÂl,tE R.G. , llAC CUB 8.8., TÀII.OR D.R. atrô litAC CUFfIf ll.l. ; 19glr The role of phospholipid rnetabolisn in bromobenzene and injury, loxicol.AppI.Phar:macol., CCIô-51O-52O. dependant hepâtocytes 75, t*ËGng !1.C., BERT$ND I., FLEUREITTIN.t. r IEBR P. anô PELI t:,ii., 1986, influence of Ànisotes trisrllcuç and CrePis ruèpellii extracts on bile site formation in the rat, Arzneim.Forsch ./Drug.Res., 5(1)' 826-829. LE l,lAOUr €t DECAISIIE. , L8?6, Traité général de botgnigue à"stiiptive ei ânarytique. i:a. : Did6t Frères et cre, Paris, L54. -247- ITECLERCIJ., 18?7-1883, Traité des simples, Eds.: Imprimerie Nationale, Paris ,lp6l , L-2. LECLERC8., L973, Précis de phytothérapie, Ed. Masson et Cie, Paris, L2. IrEE tr.X., EUlltG E.C.r HIIAïG 8.8. and FURUtrlfll 8., L972, Antitunror agentsr2. Eupatolide, a neht cytotoxic principle of E. formosanum Hay, J.Pharm.Sci., 6L(4r, 629-63L. IrEE K.8., KIUURA T., OKÀI|OTOll. anô COWHBRDC.tl., L976, The structure and stereochernistry of eupahyssopin' a ne$t ant,itumor germacranolide from E.hvssopifolium, Tetrahedron Letters , t4-, 1-051-1054. LEE K.Er KfUURA ![., IARITNA ll.r lLAC PIIAIIT À.lf.t OltÀtt K.D. and EUAIIG 8.G., L97?, Structure and stereochemistry of eupaformosanin, a nehr antileukemic and antisarcoma germacranolide from E.formosanum, Phytochenistry, L! , L068- 1070. ITBPAGER.N.r CHEE$EIIAIIK.H., OgllAlt N.and SITATERT.F., L9f|8, Lipid peroxidation in purified plasma menbrane fractions ofrat, Iiver in relation to the hepatotoxicity of Cc14, CeIl. Biochem. and Function, 6., 87-99. LBVY G. and BRABECU.it., 198{, Binding of CCta- nretabolites to rat hepatic mitochondrial DNA, Toxicol. Lett ., 22., 229-234 - LEIIS !1.8., BAKERÀ.L. anô MOOBA1.R., 1982, Effest of somatostatin on determination of bile flow in unanesthetized dogs, Ànn.Surg., L95., 97-103. ITIBBERC.9., 1985, Treatenent of alcoolic liver injury, Int.J.CIin.Pharm.Res., 5(6), 369-380. ITIETTI À. r Lg7?, Choleretic and cholesterol lowering properties of two Artichoke extract, Fitoterapia, 48., 153- 158. ûIg9R! A. ct GUILLOT B. r 1985, Défense et illustration du drainage. fntérèt de Chrysantellurn, Extrait des Cahiers de Biothérapie, 87, Travail commun des Laboratoires IPHYMT/Santane et du CEIA. ITIUD3TROII T.D. and AltDERg U.W. t L9?7 r Effect of cycloheximide and actinomycine D on CCI4 hepatotoxicity, lfoxLcol.Àppl.Pharmacol., 4-2, L67-L73. LIU tr.T. and LEBCA P. t L982, Phatmacological properties of dibenzo arc cyclooctene derivatives isolated from Fructus schizandrae chinensis.!: interaction with rat liver cytoCnrome Poq6 and inhibition of xenobiotic metabolism and mutagenicityr'-ëhen. Biol.Interact. , 39 , 307-314. I,OCOCXR.4., BEIL if .L. anô DITSKOTCHR.f., 1966, Alkaloids constituents of E. serotinum. Lloydia, 29(31, 2OL-2O5. -248- tlAC DoNALD if .R.; GAtÙDoLFfA.at. an6 SIPEB I.G. I 1986t Amelioration of ccl^ induced hepatic necrosis by post toxicant treatement-with cystamine, Toxicology, 39, 136-148. ttAC GRE@R if .tf.1 1986, Genetic toxicology of the dietary flavonoids, In CODYSV., MIDDLETONE. and HÀRBORNEJ.B.: Plant flavonoids in biology and medecine, Ed. : Alan R. Liss Inc., New-York, 33-43. liALDlUg c., 1933e Lehrbuch der biologischen Heilnittel, Ed. Thieme verlag, Leipzig, L310-1314. IIALINGRE Th.tt. , Lg7!.t Eupatoriun cannabinum L., een oud geneeskruid met nieuwe perspectiven, Pharm.Weekb-, LO6, 738- 744. tlANÀBE A.r NAKAYAIIA 8. and SAKAI|OTOK., L987, Effects of essentials oils on erythrocytes and hepatocytes from rats and dipalmitoyl phosphatidilcholine-Iiposomes, Japan J. Pharmacol . , &-, 77 -84 . IiASSRI 8.G., L981, Effect of diuretic on calcium metabolism, In PUSCHETTJ.B. : Diuretics Chemistry, Phamacology and Clinical Application, Procceedings of the First International Conferenceê on Diuretics, 1984, Miami Beach, Florida, U.S.À. ' Ed. t Elsevier sci.Publishing.Inc., 182-184. II,ATEISEN O. and RâBDER U., 1983, Role of sodium bicarbonate and plasma osrnolality in biliary secret'ion, Scan.J.Gastroenterol., 18, 825-832. U,AISUBARAT.1 GLENDB8.4., rALIJER J.R.L,. anô IrOfRBl tr., 1983, CCI, induced hepatotoxicity in rats: evidence for difference susêeptibilities of rat llver lobes, Japan J.Phatmacol.' 313-, 453-,t/85. rlYIER P., PREAUX A.!1., DEITCHIERit.C.1 BEAUeEANTlil. et DEItllEÀItX D.K, 1983, Comparaison des effets de la cinétidine et de Ia ranitidine in vivo et in vitro sur le système enzlmatlque microsomal hépatigue chez le rat, Gastroenterol.Clin.BioI., Z, 244-250. llBItrLE R.D., 1985, Flora of Cyprusr 2, Ed. : The Bentham- Moxon Trusu, Royal Botanic Gardens, 866-867 - HETIALITI A.Dl. anô EKIJUBÀ 8.e., 1981, Methoxylated flavonols and flavonones from Eupatorium cannabinum L, Planta Med. , E-, 403-405. UIRAGOITI C. anô FBRRINI R, L9e2, Effect of lbopanine on diuresis in conscious rats in nornal and experinentally altereted conditions, Arzneim.Fosch./Dtug ReE.' l1[(1)' 2à, 3t8-322. _249_ UIRANDA C.L., EENDERSONlil.C., SCEUfTZ J.l. and BIttrIrBR D.R., 1983, Protective role of dietary butylated hydroxyanisole against chemical-induced acute liver damage in mice, Toxicol. Appl. Pharmacol., 69-, 73-80. IIOORE L., 198t, Enhanced hepatotoxicity and inhibition of liver endoplasrnic reticulum calcium Punp by CClo in rats fed a thianine deficient diet, Life Sci., 32., 74L-745. IIORGAII ll. Y., 1986, Hepatoprotective agents in alcoholic I iver disease, Acta. Med. Scand. , suPpl .Æ-, 225-233 . ItoRI E., TÀIIAKA r., 8Er!,tâ E. r KUNTyASU T. and TAtrASEI tl- , 1986, Inhibitory effect of chlorogenic acid on rnethylazoxymethàno1 acetate-induced carcinogenicity in large intestine and liver hamsters, Canc.Lett., 30, 49-54- uoRTfER F., L972, Dê f intérèt thérapeutique de certains acides organiques aliphatiques, constituants de diverses drogues à réputation hépathorénales et en particulier de Cvnara scolymus, Thése Pharm., Univ. Nancy, Fr., 2oopp. NADKÈRIII [.]t. , L927, The indian materia medica, Ed. : Nadkarni r.u. rBombay, 346 NAKÀI|URAll., gEIttIZU T.r I|IYATA K. anô trAWABATAT., 1988t Diuretic effects of a novel uricosuric antihypertensive S- 8666 in rats, mice, monkeys and dogs : Comparison with furosemide and trichloromethiazide, Drug Dev.Res., L2-, 4L-51-. NA8R e., 1981, D.E.A. de Chinie Appliguée, Univ. Sci., Strasbourg, FE., 3. NÀgR C., 1987, Etude chfunlque de substances originales du Çinkgo blloba L. (glnkgoacées) dérivés ffavàniques(hétérosides- esters) et quinoléiques carboxyliques essais pharmacologiques prélininaires, Thèse Sci. Univ. Louis Pasteur. NEU R., L957, Naturwissenschaften, 4-, 181-182. NETBERNE P.l{., 1986, AEeesment of the hepatotoxic and carcinogenicity potentlale of ohemicals, In FILLASTRE J.P. : Hepatotoxlclty of drugs, Ed : Iæs éditions INSERIII' Rrbllcat,lon de L'UnLverslté de Rouen, , 75-L25- flEEAUg f,.G. and SAlrtUEIrgON8., 1968, Formation of malonaldehyde from phospholipids arachidonate during microsomal lipoperoxidation, Env.J.Biochêrl. ; 6, 126-130. NIE8C NIEACAUITZO. and SCtrldERgBAIrP., 1968, Ûber chole l{irkstoffe aus Artemisia arbroratum L, Arzneim.Forsch., -!9., 1330-1336. OGArA 8., EIRAyâI{A lr ., TOKUDAl.t., XIRAI K. end FUtrItI 8., 1986, The effect of quercetine, a mutagenicity-enhancing agent on the netabolism of 2 acetylaminofluorene, Mut.Res., L62, 179-186. -250- OEIIIEEI I.K., lll8fiIllâ À. and OKUDAK., L982t Irnmunofluorescence of Phenobarbital inducible cytochrome PaSO in the hepatic lobu1e of normal and phenobarbital treated rats, Hepatology, 2(61 ' 849-855. OfOITICgAttTI Ir. , LIRU88I tr., STRAZZIBOSCOltl., it[lll.lOlrQ U., ORLÀ}IDOR. I NASSUATOG., IIIURâCAlt. and CREPAL,DI C.L., 1986, The effect of drugs on bile flow and comPosition- An overview, Drugs, .4., 430-448. oKItDA E. , SORRENTTNOD., ÀtPrNr G. , TlvAroNr N. , itoltEg td.rf.l[.2 itAlIE ll., IIANG C.L. anô BERK P.D., 1988, BiIe acid secretion of pool size during phenobarbital induced hypercholeresis, Proc. Soc. Exp. BioI. Med., L87 | 2O2-2O8. ORnEGO E. , CARI'IICEÀEû F.if . I PIILLIPS ll.J.1 KALAN'|[ E. and trEÀNNA it. ' Lg?6, Protection by propylthiouracil against tetrachloride-induced liver damage, Gastroenterol., L., 82L- 826. ORRBNIUS 8., SARâE A.ir., BEIJLOI,IOG., IIBOR f,.' JOltES D.P. tnô gllITE ll., 1983, Relation of calcium conpartinentation in the hepatocyte- a critical role of glutathionef In Larson A. et coll. : Functions of Glutathione : biochemical, physiotogical, toxicological and clinical aspect' Ed. : Raven Press, New-York, 26L-269. OArIECIU8KA tl. and 8EIûDRAJ., L972, Eupatorium cannabinum L. , part 1: Search for biologically active fraction, Dissert.pharm.Pharmacol., 24 (51, 475-483. PACKBRJ.8., 8LÀTER T.F. and IILSON R.Ir., 1978, Reaction of the carbon tetrachloride related free radical CCl30' with amino acids : pulse radiolysis evidence, Life Sci., 4-, 26L7- 2620. PAGANI F.anô ROttuggf G.r L96?, Sui constituenti dell'Eupatorium cannabinum L. var. svriacum (Jacq. ) , II Farmaco, Ed.Pr., 22(L21 , 77L-785. PAPPA! N.if ., TISECARVERit.Ir. anû BBCKER8., 198a1 Effect of cycloheximide on increased aspartate aminotransferase in CCln hepatotoxicity, Ann. CIin. Lab. Sci., 1'1.(1), 40-46- PIRIS R.R. onô ltOygE f,., Lg?Lt Matière médicale, 3, Ed. : Masson et cle, Paris, 37o. PEDER8ENE. r 19?5, Echinatine and supinine: pyrrollzidine alkaloids from E.cannabinum, Phytochernistry, &, 2087-2088. pERISSOUD D., 1981, Mise au point dtune néthode biologique par la séIection de molécules hépatoÈropes du groupe des ilavonoides, Ph.D Univ. Lausanne, Suisse, 234pp- 25L - PBRIASOUDD. anô IEIBEL, I., 1980, Protective effect of (+)- cyanidanol-3 in acute liver injury galactosamine or carbone tandrachloride in the rat, Naunlnn.Schrniedeberg's Arch. Pharmacol. , 3L2., 2A5-29t PERI8SOUD D. €t IEBTA 8., 1986, Inhibiting or potentiating effects or flavonoids on CClo induced toxicity in isolated rat hepatocyt,es, Arzneim.Forsch./Drug Res. , 36(2'l ' L249-L253. PETKOV V. et IIARKOVSKÈV. , 1981 t L'effet diurétique de Sambucus ebulus L, Pl.Med.Phytothêr., 15(3) ' L72-L82. PINCEIiAIL J., DEBÏ C. r IrION y., BRAQUETP., EAIIS P., DRIBU tr. and GOUTIER R., 1985, Role of flavonoids in lipoperoxidation and radical reactions, 7th Ungarian Bioflavonoids Slnnposium, 16-18 Fby, Szeged, Hongrie. POPPER f. r L9A21 Hepatocellular degeneretion and death, In ARIAS I.M., POPPERH., SCHÀCHTERD. and SHAFRITZ D.A.: The Iiver biology and pathobiology, Ed. : Raven Press, New- Yorkr 2L3-24L. PRYOR[.4. , L976, Free Radicals in Biology, Ed. : Pryor W.A., New-York. Qttlitllto L., llâLAllCiO F. tnô RIO8 T., 1970, The structure of eupalin and eupatolin. Taro nesr flavonol rhamnosides isolated from Eupatoriun ligustrun D.C, Tetrehedron, 26, 285L-2859. REBUEITTAU., 8AN ROl,tAlfL. and G.-SERRAIIIIrIOS U.r 1981, Etude de Ireffet diurétique de différentes pérparations de 1'Ononis spinosa L, PI.l,téd.Phytothêr., l!(2r, 99-1.08. IBBUEITTÀ tl., VM8 if .ld., 8Àll ROltAlI Ir. and G.-gERRltffI'LOB ltl.t 1983a, Etude de I'effet, diurétique de différentes préparations de feuilles de Sambucus nigra L, Plant.Medic.Phytothêr., lJ(31, 173-181. REBITELTA tt. r VM8 J.ll. , SAll ROllAlI IJ., C-SERRA!|IÛIro8 lt. t 1983b, Etude de I'effet diurétique de différentes préparations des feuilles de Viola odorata L, Plant.Medic.Phytothér. , L7 (41 , 2L5-22L. RECINIOEL R.O. anô GEOBEAITB.N. r 1966, Lipoperoxidation as a vector in CCI4 hepatotoxicity, Lab.Invest., !-5., 132-148. nIeXNIOEIT R.O., eL,EilDE B.À., WALITERif .R.L. anû IOïREY K. t 1982r Lipid peroxydation: biochemistry, measurement and signl.flcànce in liver ceII injury, ID PIaa G.L. and Hewitt lil.R.: Toxicology of the llver, Ed. : Raven Press, New-York, 23t-235. IENAUD B.P.it. aDô coIrIN G.8. t 1931, Glossaire de }a natière nédicale marocaine, Ed. : Librairie orLentaliste Paul Geuthner, Paris, 184-185. -252- REIIE E., DÀIIZINGERR.F. anû EOFUAIINÀ.F., 1983, Pharmacologic effect of somatostatin on bile formation in the dog. Enhanced ductular reabsorption as a najor mechanism of anticholeresis' Gastroenterol., 84-, L2O-L29. RET-ISOLD$8.9., TREINEN R.if .r FARRISE H.E. and UOSLBN li.![., 1981, Metabolisrn of CCl4 to exhaled, excreted and bound nretabolites, Biochem.Phârmacol. , 33(2Ll , 3363-3374- REYIIOLDB8.8.1 TREINEN R.J., FARRISE H.E. and IIOBITBNtd.![.t 1981, Metabolisn of cCI4 to exhaled, excreted and bound netabolites, Biochem. Phârmacol., 33 (2L1, 3363-337 4. nfCCI G.L.and FEvERy J., 1981, Cholestatic act'ion of somatostatin in the rat: Effect on the different fractions of bile secretion, Gastroenterol., 81, 552-562 ROBINION E. and KING R.l{. t Lg|?, Eupatoriae-systernatic revieïr, In HEYWOODV.H., HÀRBORNEJ.B. and TURNERB.L. : The biologi and chemistry of the Cornpositae, L, Ed. : Academic Press Inc., Londres, 437-483. RODRIGUBZE.t TOWERSG.[.N. and I'IITCEEITLJ.C. t L9?6, Biological activities of sesquiterpene lactones' Phytochemistry, L5-, L573-1580. ROLIIÀIID A. , 1981, Standardisation des dif férents paramètres influents sur Ie ternps de sonmeil induit, par Ie pentobarbital sodique ç;};.ezla souris Swiss, D.E.À Toxicol-, Univ. N[e|'z, FE., 49pp. ROLT,ANDA. r 1988, Contribution à I'étude botanique et pharmacologique d'Escholtzia californlca Cham, Thèse Sci., Univ. Metz, Fr., 425PP. RO8EN G.t{. and RÀUCK}IANB.if., L982t CCLL induced lipidperoxydation: a spin trapping study, Toxicol.Lett., .1i0., 337 -344 . RO88I lt, RICKLE$ L.F. and IALPIN W.4., 1986, The crystal and molecular structure of quercetin, a biologically active and naturally occuring flavonoids, Bioorg.Chem., L4, 55-59. RUAB G.L., CtCtRgKIir.R., RIPPLE M.G., SOWII{8KI it., BUGITEStrIP. aDô EEfIlrf W.R., 1985, Organic hydroperoxides-induced lipid peroxidation and cell death in isolated hepatocytes' Toxicol.AppI.Pharmacol., 78, 473-483. RITAEG.L., IODIS L.A. and AITBERTBD.r 1986, Proteclig. of rat hepatocytès from ter-buthyl hydroperoxide-induced injury by catechol, Toxicol.AppI.Pharmacol., 84, 607-616. 8âtrAI K., YÀI{AlfE T., 8ÀIÎOE Y., INÀWA C. anô NISEIATA t[., 1987, Efiect of water extracts of crude drugs in decreasing blood ethanol concentrations in rats, Chem.Pharm.BuIl., 35(11) , 4s97-4604. -251- EllfitEÎr L.![. anô EfK-NEg K.8., 1968, Metabolism of steroid homones, In Greenberg D.M., Ed. : Academic Press, New-York, 2, L69-22O. SAnfiA (P.V.).1 1969r Dravyaguna Vijnana, Varanasi, Chowkhamba vidyabhanan, 2, 2eme édition, 7ot-7o3 (en Hindi). SCEETTITERG. and NU88EL E., L975' Arbeitsmed.Sozialmed. Praventivmed., -U., 25. 4sc"I"i.tt SCBIEA8EITC.r FITRTEOVEc. âDd KEPPLEn D., 198{, uptake during the transition from reversible to irreversible liver induced by D-Galactosamine in vivo, Hepatology' 4 (5) , 855-861. $ef,[ÀRTZ it., IltBg if .L. anô BLOCE R. t L978, Diurétiques, Itl ÇIROUD J.P., MATHEG. et MEYNIEL G.: Pharmacologie clinigue' L, Ed. : Expansion Scientifique Française, Paris'561-583. SEGIJBIIP.O. , Lg?6, Preparation of isolated rat liver cells, In Methods in cell biology, L3-, 4' 29-83. $EAE G.ll. and BEATTACITARIAR.K.r 1986, Modulation by plant flavonoids and related phenolics of microsomê, catalyzed adduct between benzo- -pyrene and DNA, Chem.BioI.Interact., 59-, 1-15. SEARIiA R.C., GUPTÀ 8.K. anô ARORAR.B. t L973' Structure activity relationship of some organic hydroxyacids with referenôe to their choleretic activity, Ind.J.Exp.BioI., 11, 572-573. SIEGER8 C.P.r PÀULI V., KORD G. and yOItt{Eg ll., 1986, Hepatoprotection by nralolitate against CCl4-alcohol-induced liver fibrosis, Agents and Action, U.F/61; 600-603. SIBGER$ C.P., VOLPBITl.l.r SCHEEITG. and ÏOIrllEB ll. t L982t Effect of dithiocarb and catechin aganist CClo-alcohol- induced fibrosis, Agents and actions, L2(51 ' 143-748- SIPE8 I.G., f,IRgHNA G. and GILLBTTE J.R. t L977, Bioctivation of ccla and bromotrichloromethane role of cytochrome P450, Life sôi. , 29, 1541- 1548. SLATER T.F. t L978, Biochemical studies of liver lnjury, ID SIÀTER T.F.: Biochenical mechanisms of liver injury, Ed. : Academic Press Inc., Londres, L-44. SLATER T.F. anô SAITER 8.C., 19?1, The stinulation effects of CCI4 on peroxidative reactions in rat liver fractions in vitio, Biochem.J., L23, 815-821. l[trFlt!$$ tl. anô DOURO$rit. , L982, Current status of the NCI plant and animal product program, J.Nat.Prod., 45(1) ' L-L4. ToDATANDLAg.t(.V., SINB 8., TEAKURR.8., HU8ÀIN A.r KrgO y. and EIKINO 8., 1985, Antihepatotoxic principles of Phvllanthus niruri herbs, J.Etnopharmacol.' L4, 4L-44. -Æ4- profil TI|gâRy A.ll., 1986, Utilisation traditionnelle et Phar:m., univ. ;Ë;;;iôglq"é-àâ èuirrtt" acaulis L, rhèse Nancy, FE., 61PP. in 2- TRAIGER G.ir.aDô BRUCTNERir.V. t Lg?6, The participation butanol inaucâa potentiation of CC14 hepatotoxicity, J.Phar:uracol.Exp.Ther.' L96(21' 74I-745' TAKAEA8HI T., ICEIUURA T. anô lilURAE T., L979, Hiyodorilactone D, E, F, new cytotoxic sesguiterpene-lactones from i.=âôn"iir,"n=" Makino, chen.Pharm.BulI., 27, 2539-2543. of TAKEDA 8. and ABURADAl,t. , LggL, The choleretic mechanism coumarin compounds and pirenolic compounds, J'Pharm'Dyn.' !-, 724-734. ÎÀKEDA 8.r yuAS f,., ENDO T- anô ABURâDA ll. , 1980 t Pharmacological studies on iridoid comPounds. 2- Relation ship between structures and choleretic action of iridoids compounds, J. Pharm.dyn. , ?, 485-492. 8.K., BILARD.8. anô TAITAPArRAB', L974 TAITAPÀTRA mass ôârràt"aienyt âcetate and taraxasterol from E'caqn?binum ;;;r;6fràùri". srudy of dammaradienyl acerare and its dèrivatives, Àus.J.Chem. , t-, LL37-LL42' TATIAïÀ!|Ag. and KAI{AI Y. , Lg77, Studleg on increase bile iornration produced by polyoxybenzenes in rat, Jap.J.Pharmacol. 1 27, 7L-78. yat(AltoTo E*!?!Otrt I., aluuRÀ tf ., WATANABEK., I. and Eo poiântiation of barbiturate-induced substituted I.f,. rLgg1, in derivatives .i-Ënà""uàiuitar,arnobarbital and thiopentar mice, Chem.Pharm.BulI., 35(21' 778-794' and ITESCBKER., VIBKE W. and Gotfil3ll}lsl{ L., 1983, C9lA-levels serum activities of, lLver Cngfres following acute cÇI4 intoxication, Toxicol.L,ett., L'l, 175-180' CEBN- TIEN tfIING P..1 ffi*fi|0c tr., KENG-TAO.Ir.' LING-YIN C.' EUA c. am oliil*t t:; Ls7;, Protect,ive action of Schizandrin g-ô"-ù"piùf" inJ,try in mice, Chinese Med.J., 3 (3) ' L73-180' SPin lfottlSl A. ÀLBAÏD E., LOTT K'A'f,' and SLITER t.F., 19801 t using trapping of free radical Products of CCI, activation pul!ê radiolYsis and high energy radiatiôn exposure' F.E.B.s. I€tt., 122' 3O3-306. îonEL it., CIITLIRD il.anô CIITITARDP., 1986r_ AntiOXyd"lÏ ààtivity' ot ftavonoids and reactivity with peroxyradical, PhytochenistrY, 25.(21, 383-385 rguxâiloTo I., Kqto g., 198?, Effect of_calcium channel blockers and trifluoroperazine on rat liver regeneration, European J. Pharmacol., L44, L59-L62' -255- TITTIN C. r EEIIIOOD V.II., BURGE8 N.À., l'tOORED.l{., VALENTINE D.8., trALTERg 8.11. anô IIEBB D.E. , L976, Flora Europea, 1[, Ed.: Carnbridge University Press, Cambridge, 103-L09. YAITEIIZUEL,AÀ.r ITAGO8e. and SCEUIDT K., 1985r Silymarin protection against hepatic lipid peroxidation induced by acute ethanol in the rat, Biochem.Pharmacol., 34(L21 , 2209- 22L2. \fEIrEg 8ÀLAg F.r 1982, Plantes médicinales de Venezuela, Ed : VELES BOZA F., fnstituto de capacitacion agricola, Caracas, 153, 144pp. VERIIET À. and 8f888 M.H., 1986, Comparison of the effect of various flavonoids on ethoxycoumarin deethylase activity of rat intestinal and hepatic microsomes, Fd.Chem.Toxic., 24(81 ' 857-861_. VOGEL G., L977, Natural substances wlÈh effect on the liver, In WAGNERH.and WOLFF P.: New nâturtl products and plant drugs with pharmacological, blol,ogleal and therapeutical activity, Ed. : Springer Vcrlag, Berlin, 265-247. VOLIJiAR À.1 SCEABFERl. and ïÀGNER 8., 1986, Immunologicalty active polysaccharldes of E.cannabinum and E.perfoliatum, Phytocheni.stry, 25(21 , 337-38L. VOX DIPPE P. r AIIAI{TEAIIARYAIIAII U., DRâIN P. aDd LEVI D., 1986t Purl-fication and reconstitution of the bile acid transport systen from hepatocytes sinusoidal plasma membrane' Biochern. Biophys . Acta , W-, 352-360 . rlO|tER 8., 1980, Plant constituents with antihepatotoxic activity, In BEAL J.R.and REINHARDE.: Natural products as rnedicinal agents, Ed. : Hyppokrates Verlag, Stuttgart, 2L7- 242. ttot[BR 8., BLADT 8. anô ZGAINSKI E.!1., 1981, Plant drug analysis, Ed. Springer Verlag, Berlin, RFA' 182. fAGltER E.r GEIER 8., KISO II. and RAO G., 19852 Coumestans as the nain active principle of the drug Eclipta alba and lledelia calendulacea, Planta Med. ' , 77-79 ïâGNER V.8., PROX8CEÀ. , RIE8S-DIAURER I., VOITIJIAR1., ODENTEAITg. , SIUPPNER E. , {IURCIC K., ITETURDAll. aDd trAlfG T.N. r 19852 Immunstirnulierend wirkende polysaccharide (heteroglykane) aus hoheren pflanzen, Arzneim.Forsch.Drug Res., -3$.(11), 7, 1069-1075. trÀROI D.r ADVENIER C., BTEVENONP. and BOISSIER if.R., t979, Hlpnotiques, In GIROUD J.P.' MÀTHEG. et IIEYNIEL G. : pnàrmracdlogie cllnique : Base de Ia thérapeutique. rEd 3 Expansion scientifigue française, Paris, f, 1607. lâ888L G., EIr-I|ENSnAWI B., SAEED 4., llAtrnÀN G. anô IIBRZÀBâN r.r 198?, screening of selected plants for pyrrolizidine alkaloids and antitumor activity, Pharmazie, 42(HlO), 7O9- -256- WEICEBELEAÇUT.B. r 1946, Amer.J.CIin.Path., L6-, 40- fBIggEAâR D. et soll. t l975r Med.WeIt. ' 26' 387. WIIrIrIN,lg D.E. and PRIE$TIT! B.G. t L973, Evaluation of prophylactic effieacy of silymarine in CCln-induced hepatotoxicity, Res.Com.Chem.Pathol., 6(1) r L85-194. WOERDBITBAGE.it., 1986, Eupatorium cannabinum L., a revielil enphasizing the sesquiterpene lactones and their biological activity, Pharm.l{eekb.Scient.Ed., 9., 245-25L. woERDEIIBAC E.J. , LEI,ISTRÀ W. , ltAllDRIKg tI., IÎALINGRE !rh.ll. and IONING8 â.1.T., 198?a, Investigation of the antitumor action of eupatoriopicrine against the Lewis lung tumor, Planta Med. , 53(4'), 3L8-322. IOERDEIIBÀG E.if .1 IIILINGRE Tb.U., LEUSÎRA f . and KONIG8 W.T., 1988, Reduced levels og gtutathione in liver tumour tissue of mouse after administration of eupatoriopicrine, Phytotherapy Res.,2(21 ,80-84. WOBRDBNBAGE.it., llÀITfNGRE Th.l,t., LBI|8TRA tr. and trONfNGg f.![., 198?b, Cytostatic activity of eupatoriopicrine in fibrosarôoma bearing mice, Phytother.Res. ' L(21' 76-79. ToERDENBÀG8.J., ltEritER c., IIIILDER N.[., DE VRII| l-f.tr.r EE!ûDRIK8 B. and Ii|AITINGRETh.ll.r 1986' Evalultler ef the iA vitro cytotoxicity of some sesquiterPcile hctones on a hrman ftrng caicinoma ce1t line using thé fàct green dye exclusl-on assay, Planta Med.' 2, 112-1.14. wooD 1.r., BuAllG tl.I., cm$o R.L.r NBmilnx E.L. I IrEER R.8.1 ItcI 8., itERINtr D.ll. cDô coNlIEl It.H. , t9e2, Inhibition of the mutagenicity of bay-region dioL epoxides-of Polyphenolic aronàtlc hyârocarbôns by naturally occuring plant phenols : exeeptLonnàI activity of ellagic acid, Proc.Natl.Acad.sci.usA, 79, 5513-5517- IOOD A.f,., SUITA 8.8., CEAIIG R.Ir., EUAIIG 1d.1. ald COI{IIET 1.8., 1986, Effects of flavonoids on the nretabolisn of xenobiotics, In CODYSV., MIDDLETONE. and HARBORNEJ.B.: Plant flavonoids in biolàgy and medecine, Ed. : ÀIan R. Liss Inc., New-York, L95-2LO. tRIGBl 8., 19?3, Physiologie appliquée à Ia nédecine, 12ème éditlon, 2Zl, Ed. : Flammàrion tlédeclne-Sciences, Paris, 6O6pp. IROBLE8KI F. anô ITADIIEI.8., 19561 Serun glutanic pyruvic transaminase in cardiac and hepatic disease, Proc.Soc.Exp.Biol.Med., 9L, 569. IÀllAEARl it. r KII.|URA H., KOBAYÀ8HI l't. r OKNTOTOT. , 8IWADA T. t trUJItIIrRA n. an| CIIEAKA T. ' 1985 (c) , Cholagogic action and characteristics of -terpineol - -O glucopyranoside, a new monoterpenoid glucoside, chern.Pharm.Bull., 33 (4r, L669-L675. - 257i - IAulElRl ir., roBAyAgHI ll., UIKI tr., trOZUKl tl., SllADl !!. anô FUitfUURl 8., 1985(br, Cholagogic and antiulcer effect of SausSureae radix and its active components, Chem.Pharn.Bull., 3:I(3), I-28s-1288. YAITIAEARIif ., trOBÀYAgBI tl., gAItrI l. r 8AWÀDA T.anC trItitIUURA 8., 19s3, Biologicatly active principles of crude drugs, phâr:nacoiogical-evaluâtion of cholagogtue substances in clove and its properties, J.Pharm.DYn., -É,, 28I-296. yAl.lA[ÀRA it., IIIKI tr., CHISÀKA T., gÀWADAT. r FULIIII'RA 8., TOItIttATgu T. , ttlKllto N. anû NoaARâ !f ., 1985 (al , Cholagogic effect of ginger and its active constituents, J.Etnopharmacol., -UL, 2L7-225. lÀllAEARl it., IIOKI f,., 8AWtrDAT., FUJIIiURI E. anô trOltf8l T., 1985(d,, Biologically active principles of crude drugs. Chofàgôôic suUétance-s in Menthae herba, Shoyakugaku Zasshi, 39(1), 93-98. YAI|C L.L., IEN f .T, trIgO y. atld EItrINO Ë. , L987, Àntihepatotoxic actions of Formosan plant drugs, J. Etnopharmacol., L9, 1O3-110. IOItltEg U. and SIEGER8 C,P., 1981p Interelation between lipid peroxydation and other hepatotoxic events, Biochem.Pharmacol., 33 (13) ' 2001-2003. IOItltBg U., AITBRECHTU. and SIEGER8 e.P.r 1983, Interrelation between lipid peroxidation and lysosomial enzlme relèase- in the presence of CCl4, cumene hydroperoxyde or i,hioacetanide, Res.éomm.Chem.Pathol.Pharmacol., æ(13), 2001-2003. UDEROC. trd BoELùtAtfN F. I 198?, Eupatoriopicrin 19-O Iinoleate and other constituents fron E.cannabinut, Planta Med. , !, L69-Ll2 '