Aspergillus Provenientes De Ambiente Hospitalar – Identificação Molecular E Determinação Dos Padrões De Susceptibilidade Aos Antifúngicos

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UNIVERSIDADE DE LISBOA

FACULDADE DE CIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA ANIMAL

Caracterização de isolados de Aspergillus provenientes de ambiente hospitalar – identificação molecular e determinação dos padrões de susceptibilidade aos antifúngicos

Mariana Rato da Conceição Monteiro Francisco

Mestrado Biologia Humana e Ambiente

Versão Final

Dissertação Orientada por: Doutora Raquel Filipa Pinheiro Sabino Professora Doutora Deodália Maria Antunes Dias

[2017]

Agradecimentos

A conclusão deste mestrado significa imenso para mim. Significa a conclusão desta etapa tão importante e a atribuição do grau de mestre, que não teria sido possível de alcançar sem a ajuda, colaboração, dedicação e carinho de inúmeras pessoas. Quero desta forma agradecer a todos os que contribuíram para que esta etapa fosse possível de alcançar e concluir.

Foi um privilégio enorme ter realizado a tese de mestrado no Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, no laboratório de Micologia.

Quero começar por agradecer à minha orientadora externa, a Doutora Raquel Sabino, por todo o apoio, paciência, dedicação, persistência, amizade, ajuda e confiança que teve para comigo. Muito obrigado por tudo e por todos os ensinamentos, conselhos e aprendizagens transmitidos!

Não poderia deixar de agradecer à Doutora Cristina Veríssimo, por toda a simpatia, ajuda, ensinamentos, amizade, conselhos e contributo na elaboração deste trabalho. À Doutora Helena Simões, por toda a ajuda, confiança, simpatia. Ao Doutor João Brandão por toda a simpatia e conhecimentos transmitidos. À Dona São, por toda a simpatia, apoio, gratidão e ajuda prestada. Muito obrigado por tudo o que fez por mim!

Quero também agradecer à Doutora Carla Viegas a colaboração, simpatia e ajuda na recolha das amostras ambientais e clinicas, tão essenciais para a elaboração deste trabalho de investigação.

Agradeço também à minha orientadora interna a Professora Doutora Deodália Dias, pelas horas despendidas em burocracias, pela simpatia, e por toda a ajuda e empenho no desenvolvimento do trabalho realizado.

Não poderia deixar de fazer um agradecimento muito especial a toda a minha família, que tiveram um papel importantíssimo, nomeadamente ao meu pai Armando, à minha mãe Edite, à minha irmã Raquel, ao meu tio António e à minha tia Luísa e ao meu namorado John e ao meu cunhado Rui por toda a paciência, motivação, confiança, carinho, união, ajuda e conselhos. Ao meu sobrinho João Maria por todo o carinho, alegria e distração.

Não podia deixar de agradecer a todos os meus amigos e colegas, nomeadamente à minha amiga Constança por todo o carinho e confiança e conselhos.

A todos e por tudo, Muito Obrigada!

Índice

AGRADECIMENTOS ______II LISTA DE TABELAS ______VI LISTA DE FIGURAS ______VIII LISTA DE ABREVIATURAS ______IX RESUMO ______X ABSTRAT ______XI 1. INTRODUÇÃO ______1 1. Género Aspergillus ______1 1.1. Morfologia ______2 1.2. Identificação de espécie do género Aspergillus ______2 1.3. Secções e espécies crípticas ______3 Aspergillus fumigatus ______3 Aspergillus fumigatus sensu stricto ______4 Porque é que Aspergillus fumigatus é bem-sucedido? ______4 2. Tratamento ______5 2.1. Antifúngicos utilizados ______5 2.1.1. Polienos ______5 Anfotericna B (AMB) ______5 2.1.2. Azóis/Triazois ______6 Itraconazol ______6 Voriconazol ______6 Posaconazol ______6 2.3.1 Equinocandinas ______7 2.2. A problemática da resistência aos antifúngico ______7 2.3. Mecanismos de resistência aos azóis em Aspergillus fumigatus ______7 2.4. Multirresistência ______8 3. Patologias associadas a infeção por Aspergillus spp ______8 3.1. Aspergilose bronco pulmonar alérgica (ABPA) ______9 3.2. Aspergiloma ______9 3.3. Aspergilose invasiva (AI) ______9 4. Infeções nosocomiais ______9 5. Objetivos da dissertação ______10 2. MATERIAL E MÉTODOS ______11 1. Amostras biológicas ______11 1.1. Colheita ______11 Amostras clínicas ______11 Amostras ambientais ______11 1.2. Processamento cultural ______12 1.3. Identificação molecular ______13 1.3.1. Procedimento ______13 Ø Extração de DNA ______13 Ø PCR (Polymerase Chain Reaction) para identificação das espécies de Aspergillus spp ___ 13 ITS (Internal transcribed spacer) ______13 Calmodulina ______14 β-tubulina ______14

III

Ø Gel de eletroforese ______15 Ø Purificação ______15 Ø Sequenciação ______15 ITS ______15 Calmodulina ______16 β-tubulina ______16 Ø PCR (Polymerase Chain Reaction) para otimização da amplificação do gene Cyp51A __ 17 Ø Especificidade do primer ______17 PCR (Polymerase Chain Reaction) em tempo real ______18 Ø Deteção Aspergillus fumigatus sensu stricto em amostras ambientais ______18 Ø Deteção de mutações de Aspergillus fumigatus que conferem resistência aos azóis por PCR tempo real ______19 2. Teste de susceptibilidade aos antifúngicos ______20 2.1. Meios de screening ______20 2.2. Microdiluições ______20 3. RESULTADOS ______22 Resultados culturais das amostras clínicas ______22 Resultados culturais das amostras ambientais ______22 Superfície ______22 Ar (líquido) ______23 Terra ______24 Determinação da susceptibilidade aos antifúngicos ______27 Determinação da suscetibilidade dos isolados provenientes de amostras clínicas ______27 Determinação da suscetibilidade dos isolados provenientes de amostras ambientais ______28 Otimização das condições de PCR do gene Cyp51A para deteção Aspergillus fumigatus sensu stricto em amostras ambientais ______32 Especificidade do primer ______33 PCR (Polymerase Chain Reaction) em tempo real ______34 Deteção Aspergillus fumigatus sensu stricto em amostras ambientais ______34 Deteção de mutações de Aspergillus fumigatus que conferem resistência aos azóis por PCR em tempo real ______34 4. DISCUSSÃO ______37 Caraterização de isolados de Aspergillus spp. ______37 Caraterização dos padrões de suscetibilidade aos antifúngicos dos isolados recolhidos ______39 Otimização das condições de PCR do gene Cyp51A ______40 Especificidade do primer ______40 PCR tempo real ______41 Deteção Aspergillus fumigatus sensu stricto em amostras ambientais ______41 Deteção de mutações de Aspergillus sp. que conferem resistências aos azóis por PCR em tempo real ______42 Conclusões finais e perspetivas futuras ______43 5. BIBLIOGRAFIA ______45 6. ANEXOS ______49 Anexo 1: meios de screening de resistência aos azóis (meios seletivos de crescimento de isolados resistentes) ______49 Anexo 2: procedimento microdiluições ______50 Anexo 3: produção cientifica associada a este estudo – publicações em poster ______53

Anexo 4: extras da tese – complemento da rotina de laboratório ______56

Lista de Tabelas

Tabela 1.1: Diferenças entre espécies crípticas de Aspergillus fumigatus sensu stricto ______4 Tabela 2.1: Valores de ciclo limite (Threshold) e Temperatura de Melting do controlo positio _____ 19 Tabela 2.2: Valores de Temperatura de Melting da amostra se wildtype para os diferentes loci cuja mutação confere resistência aos azóis ______20 Tabela 2.3: Valores de Temperatura de Melting da amostra se mutante para os diferentes loci cuja mutação confere resistência aos azóis ______20 Tabela 2.4: Diferenças entre os dois métodos de determinação da suscetibilidade aos antifúngicos ______21 Tabela 2.5: Valores do corte epidemiológicos do corte para a anfotericina B, voriconazol e posaconazol para as espécies de Aspergilus ______21 Tabela 3.1: Resultados culturais das amostras ambientais de superfície em meios de malte ______23 Tabela 3.2: Resultados culturais das amostras ambientais de ar (líquido) em meios de malte ______24 Tabela 3.3: Resultados culturais das amostras ambientais de terra em meios de malte ______24 Tabela 3.4: Identificação morfológica e molecular dos isolados de Aspergillus sp. encontrados nas amostras ambientais recolhidas ______25 Tabela 3.4 (continuação): Identificação morfológica e molecular dos isolados de Aspergillus sp. encontrados nas amostras ambientais recolhidas ______26 Tabela 3.4 (continuação): Identificação morfológica e molecular dos isolados de Aspergillus sp. encontrados nas amostras ambientais recolhidas ______27 Tabela 3.5: Resultados culturais das amostras clínicas em meios de screening de itraconazol e voriconazol ______27 Tabela 3.5(continuação): Resultados culturais das amostras clínicas em meios de screening de itraconazol e voriconazol ______28 Tabela 3.6: Suscetibilidade aos antifúngicos dos isolados de Aspergillus sp. (provenientes de ambiente hospitalar), determinada através de meio de screening agar e microdiluições ______29 Tabela 3.6 (continuação): Suscetibilidade aos antifúngicos dos isolados de Aspergillus sp. (provenientes de ambiente hospitalar), determinada através de meio de screening agar e microdiluições ______30 Tabela 3.6 (continuação): Suscetibilidade aos antifúngicos dos isolados de Aspergillus sp. (provenientes de ambiente hospitalar), determinada através de meio de screening agar e microdiluições ______31 Tabela 3.7: Suscetibilidade aos antifúngicos das diferentes secções de Aspergillus sp. recolhidos em ambiente hospitalar ______31 Tabela 3.7 (continuação): Suscetibilidade aos antifúngicos das diferentes secções de Aspergillus sp. recolhidos em ambiente hospitalar ______32 Tabela 3.8: Amostras de ar utilizadas para a realização do PCR em tempo real ______34 Tabela 3.9: Amostras utilizadas para deteção de mutações que conferem resistência aos azóis em Aspergillus fumigatus sensu stricto ______35 Tabela 3.10: Resultados das análises às mutações do cyp51A com as condições testadas ______36 Tabela 4.1: Diferenças entre os isolados entre os dois métodos (meios de screening e microdiluições) de caraterização dos padrões de suscetibilidade aos antifúngicos ______39 Tabela 4.2: Tabela comparativa dos resultados obtidos por métodos culturais e convencionais em algumas amostras de ar ______42 Tabela 6.1: Resultados da extração e identificação molecular de leveduras de amostras da rotina do laboratório de micologia do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge ______56

Tabela 6.1 (continuação): Resultados da extração e identificação molecular de leveduras de amostras da rotina do laboratório de micologia do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge ______57 Tabela 6.2: Resultados da extração e identificação molecular de desmatófitos de amostras da rotina do laboratório de micologia do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge ______57 Tabela 6.2 (continuação): Resultados da extração e identificação molecular de desmatófitos de amostras da rotina do laboratório de micologia do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge ______58

VII

Lista de Figuras

Figura 1.1: Representação esquemática da morfologia de um Aspergillus sp ______2 Figura 1.2: A Aspergillus fumigatus em placa de agar de Malte a 30ºC durante 7 dias; B conidióforos; C conídios. ______2 Figura 3.1: Gráfico representativo dos géneros fúngicos encontrados nas amostras clínicas analisadas ______22 Figura 3.2: Resultado do gel de eletroforese da 2ª tentativa de otimizar as condições de amplificação de PCR com o primer cyp51A ______32 Figura 3.3: Resultado do gel de eletroforese da 5ª tentativa de otimizar as condições de amplificação de PCR com o primer cyp51A ______32 Figura 3.4: Resultado do gel de eletroforese da 11ª tentativa de otimizar as condições de amplificação de PCR com o primer cyp51A ______33 Figura 3.5: Fotografia do gel de agarose resultante do PCR para testar a especificidade do primer Cyp51A ______33 Figura 3.6: Pesquisa de DNA de Aspergillus fumigatus sensu stricto diretamente em amostras de colheitas ambientais de ar em meio líquido por amplificação do gene Cyp51A através de PCR em tempo real com Sybergreen ______34 Figura 3.7: Temperatura de melting do locus onde ocorre mutaçãoo L989H (flurocromo verde) no gene CYP51A em Aspergillus fumigatus sensu strico ______35 Figura 3.8: Temperatura de melting do locus onde ocorre mutaçãoo TR34 (flurocromo amarelo) no gene CYP51A em Aspergillus fumigatus sensu strico ______35 Figura 3.9: Temperatura de melting do locus onde ocorre mutaçãoo T289A (flurocromo laranja) no gene CYP51A em Aspergillus fumigatus sensu strico ______36 Figura 3.10: Temperatura de melting do locus onde ocorre mutaçãoo Y121F (flurocromo vermelho) no gene CYP51A em Aspergillus fumigatus sensu strico ______36 Figura 6.1: Ilustração do procedimento de distribuição do solvente pelos eppendorf’s ______50 Figura 6.2: Excerto de artigo “Fungos e Ambiente Hospitalar: Preocupações relevantes e riscos para o doente” ______52 Figura 6.3: Poster apresentado no “Annual Meeting of International Society of Exposure Science” _ 53 Figura 6.4: Poster apresentado no “7th Advances against of Aspergilosis ______54 Figura 6.5: Ata do congresso no “Annual Meeting of International Society of Exposure Science” __ 55

VIII

Lista de Abreviaturas

ABPA aspergilose bronco pulmonar alérgica AI aspergilose invasiva ATCC American Type Culture Collection ATPase adenosinatrifosfatases BLAST Basic Local Alignment Search Tool CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute CMI Concentração mínima inibitória DMSO dimetilsulfóxido ESTSEL Escola Superior de Tecnologia de Lisboa EUCAST European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing g grama

H2O água HIV vírus da imunodeficiência humana INSA Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge ITS Intergenic Transcribed Spacer l litro max máximo MEA malte extrato de agar mg/ml miligrama/mililitro

MgCl2 cloreto de magnésio min mínimo mm milímetros MOPs Ácido 4-morfolinopropanosulfónico ou Ácido 3- (N-morfolinopropanosulfónico) N Número NaOH hidróxido de sódio NEQAS National External Quality Assessment Scheme nm nanómetro pb Número de pares de bases de resíduos de nucleótidos (base pairs) PBS Tampão fosfato salino (Phosphate Buffered Saline) PCR Polymerase Chain Reaction pH Potencial hidrogeniónico RPMI Roswell Park Memorial Institute medium Taq Thermus aquaticus TMO transplante de medula óssea ufc unidades formadoras de colónias µl microlitro

Resumo

Aspergillus sp. é um fungo potencialmente patogénico com elevada letalidade em doentes imunocomprometidos, nomeadamente transplantados e sob terapias imunossupressoras. Por se tratar de um fungo ambiental cosmopolita, a qualidade microbiológica do ambiente hospitalar que rodeia este tipo de doentes reveste-se de particular importância. Assim, este estudo teve como objetivo a deteção e caracterização de isolados de Aspergillus spp. em ambiente hospitalar. Para tal, foram analisadas 51 amostras ambientais (ar, superfície e substrato). O género fúngico mais frequentemente isolado foi Penicillium em 33% das amostras. Apesar de menos frequente, Aspergillus sp. foi isolado em 18% das amostras. O número de unidades formadoras de colónias variou entre 0 e 111 ufc/m3 no ar, 0 e 1000 ufc/m2 nas superfícies e 55 e 175 ufc/g na terra. Usando uma abordagem polifásica na identificação e apenas após aplicação de metodologias moleculares, verificou-se que 63% dos isolados eram espécies crípticas, sendo que a espécie críptica mais prevalente Aspergillus protuberus (27%), pertencente à secção de Aspergillus versicolor. Outro dos objetivos desta dissertação foi a caracterização dos padrões de susceptibilidade aos antifúngicos dos isolados de Aspergillus spp. recolhidos, para isso foram realizadas duas técnicas: meios screening (itraconazol e voriconazol) e microdiluições (anfotericina B, posaconazol e voriconazol). As metodologias mostraram elevada percentagem de concordância e apresentam-se como complementares. Não se detetaram resistências nos isolados pertencentes à secção Fumigati, enquanto os isolados da secção Versicolores foram aqueles que apresentaram valores mais elevados de concentrações mínimas inibitórias para diferentes antifúngicos. Através dos meios de screening foram ainda pesquisados isolados Aspergillus sp. resistentes aos azóis em exsudados nasais de trabalhadores de uma indústria corticeira. Foram detetados, em dois dos trabalhadores, três isolados de Aspergillus sp. com susceptibilidade reduzida ao itraconazol, dois deles pertencentes à secção Niger e um à secção Fumigati. A confirmação desta redução na susceptibilidade ao itraconazol não foi possível efetuar pelo método de referência. A otimização de um PCR específico usando o primer cyp51A permitiu desenvolver uma metodologia de PCR em tempo real com elevada sensibilidade e que permite a deteção rápida de Aspergillus fumigatus sensu stricto a partir de amostras ambientais críticas, nomeadamente ar colhido em ambiente hospitalar. Resultados preliminares obtidos para a deteção de mutações que conferem resistência aos azóis em Aspergillus fumigatus sensu stricto, por PCR efetuado diretamente na amostra, sugerem tratar-se de uma técnica com potencial no estudo destes settings. Como conclusão, a realização desta tese permitiu caracterizar detalhadamente os isolados de Aspergillus spp. no que respeita à sua deteção, identificação molecular e suscetibilidade aos antifúngicos. Os resultados obtidos permitiram estabelecer novos objetivos para desenvolvimentos futuros.

Palavras-chave: Antifúngicos; Aspergillus fumigatus; espécies crípticas; susceptibilidade.

Abstrat

Aspergillus sp. is a potentially pathogenic fungus with high lethality in immunocompromised patients, namely the transplanted and the ones subjected to immunosuppressive therapies. Since this is an environmental fungus with a cosmopolitan distribution, the microbiological quality of the hospital environment surrounding these patients is of particular importance. Thus, this study aimed to detect and characterize isolates of Aspergillus sp. collected from hospital environment. For this purpose, 51 environmental samples (air, surface and substrate) were analysed. The most frequent fungal genus found was Penicillium. in 33% of samples. Although less frequent, Aspergillus sp. was isolated in 18% of the samples. The number of colony-forming units ranged from 0 to 111 ufc/m3 in the air, 0 and 1000 ufc/ m2 on the surfaces and 55 and 175 ufc/g in the studied substrate. Using a poliphasic approach to species identification and only after applying molecular methods, it was possible to verify that 63% of the isolates collected were considered as cryptic species. Aspergillus protuberus (belonging to section Versicolores) was the most frequent cryptic species found (27%). Another objective of this dissertation was to characterization of the antifungal susceptibility patterns of the Aspergillus spp. isolates collected. Two techniques were used: screening media (itraconazole and voriconazole) and microdilutions (amphotericin B, posaconazole and voriconazole). The two methodologies showed high percentage of agreement and we may consider them as complementary. No resistance was detected in isolates belonging to the Fumigati complex, whereas isolates belonging to the Versicolores complex showed the highest values of minimum inhibitory concentrations for different antifungal agents. Through the screening-media methodology, we also investigated isolates of Aspergillus spp. collected in nasal exudates of workers from a cork industry. Three isolates of Aspergillus sp. (collected from two workers) presented reduced susceptibility to itraconazole. Two isolates belong to the Niger complex and one to the Fumigati complex. The confirmation of the reduced susceptibility of these isolates is not possible to perform by the reference method. The optimization of a PCR methodology using the cyp51A primer allowed the development of a high sensitivity real-time PCR methodology that allows rapid detection of Aspergillus fumigatus sensu strict from critical environmental samples. Preliminary results obtained for the detection of mutations that confer resistance to azoles in Aspergillus fumigatus sensu stricto by PCR done directly in the sample, suggest that this technique as potential in the study of these parameters. In conclusion, the elaboration of this thesis allowed the detection and characterization of the Aspergillus sp. isolates in regard to their. molecular identification and antifungal susceptibility. The results obtained allowed to establishment of new goals for future studies.

Key words: Antifungals; Aspergillus fumigatus; cryptic species; susceptibility.

1. Introdução

Os fungos são organismos pertencentes ao reino Fungi e caracterizam-se por serem eucariotas e heterotróficos. Na maioria dos casos desenvolvem filamentos ramificados e reproduzem-se tanto de forma sexuada como assexuada, produzindo esporos. [1] Caracterizam-se ainda por terem paredes celulares constituídas por quitina, β-glucano entre outros. Uma grande variedade de fatores tem contribuído para o aumento do número de pessoas em risco de desenvolvimento de infeções fúngicas, incluindo espécies que nunca tinham sido descritas como patogénicas humanas. Inserem-se nestes fatores, o envelhecimento da população, que é representada em grande parte por pacientes com doenças degenerativas e neoplásicas, pacientes que sofreram transplantes de órgãos sólidos e de células estaminais hematopoiéticas, e pacientes que realizaram terapia imunossupressora. [2]. Por outro lado, os progressos feitos no desenvolvimento e na melhoria das terapias contra as doenças humanas têm feito com que haja um aumento da sobrevivência de pacientes com doenças graves e de pacientes com deficiência do sistema imunitário. Como consequência de uma acumulação dos fatores de risco há um favorecimento da progressão de doenças infeciosas, tais como as infeções fúngicas invasivas. [3] Os fungos cosmopolitas potencialmente patogénicos mais frequentes são a Candida sp., o Aspergillus sp., o Pneumocystis sp. e o Cryptococcus sp. Estima-se que estas espécies de fungos causem pelo menos 1,4 milhões de mortes por ano em todo o mundo. As infeções causadas por Aspergillus sp. são as segundas infeções fúngicas invasivas mais frequentes (a seguir às causadas por Candida sp.) e são as infeções microbianas mais comuns em transplantes de células estaminais hematopoiéticas. [3,4]

1. Género Aspergillus

O género Aspergillus pertence ao filo Ascomycota, ao reino Fungi, à ordem Eurotiales e à família Thichonomacea. Os pertencentes ao género Aspergillus caracterizam-se por serem organismos filamentosos. Na fase anamórficas, ou seja, assexuadas, a reprodução é realizada através de esporos assexuais, chamados conídios. [1] Este género é considerado bastante diverso, sendo constituído por 344 espécies [5] tendo um grande impacto económico e também social. As espécies pertencentes a este género podem-se encontrar em todo o mundo e em diversos habitats. Muitas espécies de Aspergillus sp. são utilizadas na biotecnologia para a produção de vários metabolitos tais como antibióticos, ácidos orgânicos, enzimas, medicamentos, ou como fermentadores na indústria alimentar. [6] Contaminam comummente alimentos e algumas produzem micotoxinas. Raramente a inalação de conídios por indivíduos saudáveis (imunocompetentes) provoca algum efeito adverso, uma vez que os conídios são eliminados de forma relativamente eficaz pelos mecanismos de imunidade inata do ser humano. No entanto, algumas espécies são frequentemente descritas como patogénicas para humanos e animais, sendo responsáveis por um largo espectro de infeções fúngicas, nomeadamente: [1,2,5,6,7] − aspergilose bronco pulmonar alérgica (desenvolve-se essencialmente em indivíduos susceptíveis que estão frequentemente expostos a elevadas concentrações de conídios); − aspergiloma (crescimento de uma massa fúngica no interior das cavidades pulmonares resultantes de sequelas em pacientes com tuberculose prévia); − aspergilose invasiva (disseminação para diferentes órgãos, normalmente fatal em doentes imunocomprometidos).

As patologias associadas a este género (nomeadamente Aspergillus fumigatus) afetam maioritariamente os pulmões, embora também possam ocorrer noutros órgãos. [8,9,10] No ponto 4 da introdução desta dissertação, serão descritas mais detalhadamente as patologias associadas a Aspergillus sp.

1.1. Morfologia

Figura 1.1: Representação esquemática da morfologia de um Aspergillus spp. [11]

A morfologia é uma parte importante na identificação de espécies, nomeadamente das espécies do género Aspergillus, sendo feita maioritariamente através da observação da tipologia da colónia (macro morfologia) e da morfologia dos conídios e conidióforos (micro morfologia). A cabeça aspergilar situa-se no topo de um conidióforo que se dilata na sua extremidade formando a vesícula. As células produtoras de esporos (fiálides) são suportadas diretamente pela vesícula ou por uma camada de células estéreis chamadas métula. As fiálides podem cobrir toda a vesícula ou apenas o seu topo, sendo a sua disposição uma característica essencial na identificação morfológica das diferentes espécies de Aspergillus spp. A partir da extremidade das fiálides, surgem os conídios cujas dimensões são variáveis consoante a espécie. Na base dos conidióforos, sustentados por uma célula basal, encontram-se as hifas (Figura 1.1). [1]

1.2. Identificação de espécies do género Aspergillus

Figura 1.1: Representação esquemática da morfologia de um Aspergillus spp. [2014, Valente, J.]

Figura 1.2: A Aspergillus fumigatus em placa de agar de Malte 30ºC durante 7 dias. B conidióforos. C conídios. [8]

A correta identificação de isolados de Aspergillus spp. é um fator bastante importante, sendo que as mais recentes descobertas, têm demonstrado que infelizmente, muitas estirpes continuam a ser identificadas de forma incorreta. Isto acontece, pois a sua identificação é feita através da observação de características fenotípicas (observação da morfologia das colónias e identificação microscópica), havendo espécies de Aspergillus spp. morfologicamente idênticas entre si, por vezes indistintas morfologicamente, mas ao serem analisadas a nível molecular verifica-se serem espécies diferentes (as denominadas espécies crípticas, todas pertencentes à mesma secção de espécies). Por outro lado, por vezes, as estirpes isoladas de tecidos humanos ou animais tendem a ter uma esporulação mais restrita e podem mostrar diferenças na micromorfologia, como os conidióforos serem mais ramificados, alongados ou os conídios variarem bastante em termos de tamanho e forma. Esta variação faz com que seja habitual a sua má identificação, levando a que fossem descritas "novas" espécies de Aspergillus spp. de origem clínica, onde se inclui o Aspergillus fumigatus. Através de vários estudos percebeu-se que através da biologia molecular e através da filogenia todas as espécies são sinónimas do Aspergillus fumigatus, tendo sido revista recentemente a taxonomia das espécies de Aspergillus fumigatus e afins, através de parâmetros moleculares, morfológicos e fisiológicos. [6,8,12]

1.3. Secções e espécies crípticas

Assim, de acordo com metodologias moleculares recentes verificou-se que o género Aspergillus é dividido em oito subgrupos que, por sua vez são, subdivididos em várias secções que incluem uma grande variedade de espécies estritamente relacionadas (crípticas). As seções clinicamente mais relevantes são Fumigati, Flavi, Terrei, Usti, Nigri e Nidulantes. A maior parte dos estudos utiliza a sequenciação da região Intergenic Transcribed Spacer (ITS) do DNA ribossomal que permite a identificação da espécie de Aspergillus spp. ao nível da secção. A sequenciação através de genes adicionais por vezes é necessária para ter uma melhor especiação, como é o caso da ß-tubulina e calmodulina que têm uma grande variabilidade interespecífica e são relativamente conservados entre espécies. [13] É através da sequenciação destes genes que é possível identificar espécies crípticas dentro das diferentes secções de Aspergillus spp. Estudos moleculares realizados revelaram que existem numerosas espécies crípticas nas diferentes seções do género Aspergillus [5,10]. Quando fazemos apenas a identificação morfológica ou através da sequenciação da região ITS, falamos apenas ao nível da secção, só poderemos designar a espécie identificada por sensu lato e apenas após sequenciação dos referidos genes podemos identificar a espécie como sensu stricto ou como uma das suas espécies crípticas. Por exemplo, Aspergillus fumigatus pertence ao subgénero Fumigati, secção Fumigati. Dentro desta secção, podemos encontrar a espécie Aspergillus fumigatus sensu stricto e as suas espécies crípticas (Aspergillus lentulus, Aspergillus udagawae, Aspergillus viridinutans, Aspergillus felis, Aspergillus fischeri, Aspergillus pseudofischeri, Aspergillus hiratsukae). É muito importante a correta identificação das espécies crípticas de Aspergillus spp., pois podem variar em algumas características clinicamente relevantes, nomeadamente a virulência e o perfil de resistência aos antifúngicos. [12]

Aspergillus fumigatus

Aspergillus fumigatus, descrito por Johann Baptist Georg Wolfgang Fresenius em 1863, trata-se de um fungo filamentoso cosmopolita. Este fungo desempenha um papel importante, na decomposição aeróbica de matérias orgânicas e na reciclagem do carbono e do azoto ambiental. O seu habitat natural é o solo, onde sobrevive e cresce alimentando-se de detritos orgânicos, tendo sido reportada a sua presença em vários substratos por todo o mundo. [8,9,10]

Não é considerado um dos fungos mais prevalentes do mundo, mas é um dos mais ubíquos, ou seja, têm a capacidade de estar presente em diversos habitats, tais como: na água, no solo, em alimentos, animais, plantas, em humanos e em detritos. Trata-se de uma espécie termo tolerante, capaz de crescer a temperaturas superiores a 55ºC, sobrevivendo a 70ºC. [1,8,9] Ao longo dos últimos anos o Aspergillus fumigatus têm vindo a emergir como fungo patogénico, provocando assim infeções invasivas graves e habitualmente fatais em pessoas imunocomprometidas em países desenvolvidos. [8,9] Os isolados de Aspergillus fumigatus típicos produzem colónias escuras azul esverdeado em placas de malte, podendo existir Aspergillus fumigatus menos pigmentados apresentando conídios brancos. [6,8,10] A cabeça aspergilar situa-se no topo de um conidióforo curto e de parede lisa e apresenta a forma de uma coluna de fiálides compactas. A partir da ponta das fiálides, surgem os conídios que são de pequenas dimensões (2-3mm). Apresentam vesículas (20-30 um diâmetro), normalmente férteis na metade superior. As fiálides são suportadas diretamente na vesícula (6-8 x 2-3 um). [1]

Aspergillus fumigatus sensu stricto

O Aspergillus fumigatus sensu lato é dividido em cinco outros grupos, onde se encontra o Aspergillus fumigatus sensu stricto. A sua morfologia varia um pouco, sendo que a largura das estrias dos conidióforos varia 3,5-10 µm, a maioria das cepas apresentam vesículas subclavadas (10-26 µm diâmetro). Em comparação, a maioria das vesículas são mais largas (22 µm), mais estreitas e todas as estirpes de Aspergillus fumigatus sensu stricto crescem a 50ºC, mas não a 10ºC em meio de malte. [10] As características fenotípicas permitem distinguir os Aspergillus spp. ao nível da secção, não sendo possível a identificação exata das espécies. O Aspergilus fumigatus sensu stricto em comparação como outros Aspergillus spp. Da secção Fumigati pode apresentar características morfológicas diferentes, estando descritas na Tabela 1.1. [14]

Tabela 1.1: Diferenças entre espécies crípticas de Aspergillus fumigatus e sensu stricto. [14] Aspegillus fumigatus sensu stricto Espécies crípticas Aspergillus fumigatus

Resistência – Triazóis raro redução da susceptibilidade

aveludado esbranquiçada Macroscopia verde – azulado pálido verde-azul vesículas: piriforme Microscopia vesículas: globosa, mais pequena 15 mm 22 mm max: > 55ºC max: 45ºC Crescimento min: 37ºC min: 10ºC

Porque é que Aspergillus fumigatus é bem-sucedido?

Em termos da distribuição global e de prevalência o Aspergillus fumigatus é sem dúvida um organismo evolutivamente bem-sucedido. Uma das razões para o sucesso da espécie é a capacidade de produzir inúmeros conídios por reprodução assexuada e pelo pequeno diâmetro dos conídios o que ajuda a dispersar e também permite a penetração profunda nos alvéolos do pulmão, um factor chave ligado à patogenicidade. [10] Um outro fator de virulência é a sua termotolerância, apresentando capacidade para crescer a temperaturas elevadas. A produção de gliotoxina [5] está também associada a um aumento da sua patogenicidade uma vez que esta enzima permite uma invasão da hifa fúngica no tecido pulmonar. Por último, as evidências apontam para a possibilidade de Aspergillus fumigatus ter a

4 capacidade se reproduzir sexuadamente, o que aumenta a sua variabilidade genética e, consequentemente, a sua adaptabilidade. [6,10]

2. Tratamento

2.1. Antifúngicos utilizados

Atualmente existem três principais famílias de antifúngicos utilizados na prática clínica de tratamento de infeções fúngicas invasivas. Os polienos (são representados pela anfotericina B e pela nistatina); os azóis (constituídos pelo itraconazol, fluconazol, voriconazol, posaconazol, ketoconazol e pelo miconazol); e as equinocandinas, são representadas pela caspofungina, a micafungina e pela anidulafungina. [3,4,15]. Ao longo dos últimos anos houve um incremento de novos antifúngicos, proporcionando aos médicos uma maior variedade nos tratamentos. O uso crescente de antifúngicos têm provocado uma pressão seletiva maior sobre as diferentes espécies/estirpes de fungos, levando ao aparecimento de resistências: as espécies/estirpes sensíveis vão sendo substituídas por estirpes resistentes, havendo assim uma modificação na epidemiologia das infeções fúngicas, levando a um desenvolvimento de resistências secundárias em várias espécies/estirpes. [4] A realização de testes de susceptibilidade a determinados antifúngicos, torna possível detetar mais precocemente resistências aos antifúngicos e desta forma torna-se mais fácil de determinar o melhor tratamento para um determinado fungo. [4]

2.1.1. Polienos

Os Polienos são uma classe de antifúngicos que é representada pela anfotericina B e pela nistatina. Estes são absorvidos e administrados via oral. Em infeções orais, da faringe ou periorais. A administração é feita de forma tópica, sendo também por vezes utilizada de forma intravenosa no tratamento de infeções fúngicas sistémicas. [15]

Anfotericina B (AMB)

A anfotericina B é considerada o antifúngico mais eficaz para o tratamento da aspergilose invasiva, apresentando uma atividade clínica útil à semelhança da caspofungina e dos azóis, no tratamento primário da aspergilose invasiva. Também é utilizada no tratamento de diversas outras infeções fúngicas. [15,16,17] Este antifúngico demonstra uma elevada atividade contra várias espécies de fungos. A maioria dos Aspergillus fumigatus são inibidos por concentrações de 0,03 a 1 mg/ml de anfotericina B, sendo que esta não produz efeitos em bactérias ou em vírus. [15]

Mecanismo de ação: A anfotericina B tem a capacidade de se ligar à membrana plasmática do fungo, a qual é constituída pelo ergoesterol necessário para manter a integridade desta mesma membrana. O ergosterol contribui para uma variedade de funções celulares, incluindo a fluidez e a integridade da membrana, bem como a função adequada de enzimas ligadas à membrana, tal como as proteínas associadas com o transporte de nutrientes e a síntese de quitina. [10] A anfotericina B cria canais pelos quais atravessam iões de potássio, resultando assim num aumento da permeabilidade aos catiões e na interrupção do gradiente de protões, inibindo assim as bombas de protões ATPase. Isto faz com haja um esgotamento das reservas energéticas celulares, o que resulta num aumento da fragilidade da membrana podendo causar danos oxidativos na mesma. [3,8,17]

Resistência: as resistências a esta classe de antifúngicos são extremamente raras no género Aspergillus. A maioria dos isolados de Aspergillus terreus são resistentes à anfotericina B, in vitro, não sendo claros os mecanismos da resistência intrínseca de Aspergillus terreus a este antifúngico. Foi recentemente observada a resistência à anfotericina B em Aspergilus fumigatus, mas é rara. [8,17]

2.1.2. Azóis / Triazois

Na prática médica, os azóis e mais especificamente os triazóis são os antifúngicos mais utilizados. Possuem um largo espectro de atividade in vitro, sendo agentes terapêuticos importantes para o tratamento sistémico e de prevenção de infeções fúngicas graves, incluindo a aspergilose. Os triazóis apresentam uma toxicidade geral, significativamente menor quando comparados com a anfotericina B. [3,7,16,15] A via de ergosterol é necessária para a biossíntese de um dos principais constituintes da membrana plasmática fúngica (ergosterol) e é o alvo para os azóis.

Itraconazol

Em contraste com a anfotericina B, o modo de ação do itraconazol é bem caracterizado. [8] O itraconazol atua contra um largo espectro de fungos (incluindo Aspergillus spp. [15]) que podem causar infeções superficiais e sistémicas, sendo eficaz em pacientes imunocomprometidos menos graves, pois são capazes de absorver itraconazol do trato gastrointestinal, tais como transplantados de órgãos, doentes com anemias e doentes HIV+, sendo também eficaz em pacientes nos quais o tratamento com anfotericina B falhou. [8,15]

Voriconazol

O voriconazol exerce uma ação antifúngica de largo espectro, sendo utilizado no tratamento de infeções graves e é considerado o antifúngico de eleição para o tratamento de aspergilose invasiva. [18] Vários estudos demonstram que a maioria das estirpes de Aspergillus spp. são totalmente suscetíveis ao voriconazol, embora a sua utilização tenha vindo a ser alterada desde que começou a ser utilizado na pratica clínica. [15,18]

Posaconazol

Este antifúngico possui uma atividade antifúngica de largo espectro in vitro contra o Aspergillus spp. (Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus terreus, Aspergillus nidulans, Aspergillus ustus). Encontra-se indicado para o tratamento de várias infeções fúngicas, entre as quais está a aspergilose invasiva, a quando da rejeição com o tratamento com a anfotericina B, sendo também é indicado para a profilaxia de infeções fúngicas invasivas. [15]

Mecanismo de ação dos triazóis referidos: interferem com a biossíntese do ergosterol que se encontra presente na membrana dos fungos, através da inibição da enzima do citocromo P-450 14alfa- desmetilase (codificada pelo gene cyp51A) que catalisa um passo essencial na biossíntese do ergoesterol: a conversão do lanosterol em ergoesterol, levando à acumulação intracelular de 14alfa- desmetilase e realizada pela alteração da função celular. A inibição do citocromo impede a síntese do ergosterol nas membranas dos fungos, alterando a fluidez da membrana, alterando a via de síntese e na

6 acumulação de fosfolipídeos e dos ácidos gordos insaturados dentro das células fúngicas. Trata-se de um mecanismo seletivo, não afetando as células hospedeiras. [7,15]

Resistências: O primeiro caso publicado de isolados de Aspergilllus fumigatus resistentes ao itraconazol apareceu em 1979. Apesar de ser incomum, a resistência aos azóis em Aspergillus fumigatus é cada vez mais importante. [8,17]

2.1.3 Equinocandinas

As equinocandinas, do qual é exemplo a caspofungina, pertencem a uma classe de antifúngicos recente, atuando através de um novo mecanismo que inibe um componente essencial na parede celular das células dos fungos, competindo com a síntese do glucano, que não se encontra presente nas células animais, razão pela qual esta classe de antifúngicos revelam um perfil excelente em termos de tolerância. [15]. As equinocandinas vieram resolver alguns dos problemas relacionados com terapias antifúngicas, em particular com azóis, dada a necessidade de ajustamento da dose administrada consoante a idade, a função renal e hepática. [15]

Mecanismo de ação: as equinocandinas inibem e bloqueiam a enzima que faz a biossíntese da parede celular fúngica, através da inibição da biossíntese do ß-glucano, componente essencial da parede celular de Aspergillus spp. Como o ß-D-glucano não está presente nas células dos mamíferos, a atividade da caspofungina revela-se especifica para fungos. [1,3,15]

2.2. A problemática da resistência aos antifúngicos

Tal como referido anteriormente, com a melhoria dos tratamentos de transplantes de órgãos, de medula óssea e de doentes HIV+, o número de pessoas em risco de desenvolver infeções fúngicas aumentou bastante. Ocorreu também um desenvolvimento das moléculas antifúngicas utilizadas, bem como o aparecimento de novos antifúngicos. Esta combinação de fatores levou a uma utilização mais ampla dos diferentes antifúngicos e a um aumento da sua aplicação, que por sua vez levou ao aumento da frequência de resistências aos antifúngicos. As resistências foram descritas em praticamente todos os antifúngicos e em várias espécies, incluindo na Candida spp. e no Aspergillus spp. [1,3] Nos últimos anos, têm sido observados novos padrões de resistência, incluindo o aparecimento de resistências simultâneas a diferentes classes de antifúngicos (resistências múltiplas), em diferentes espécies de Candida spp., ou resistências a diferentes moléculas antifúngicas pertencentes à mesma classe (Aspergillus spp. resistentes a vários azóis). [3] Embora a resistência aos azóis em Aspergillus spp. tenha sido documentada desde o final da década de 1990, esta era incomum. No entanto, nos últimos anos estes relatos têm aumentado, tendo vindo a tornar-se num problema de saúde pública, sendo detetadas resistências em isolados clínicos e ambientais de Aspergillus fumigatus principalmente na Europa, como na Holanda, Espanha, Bélgica, Dinamarca, Suécia e França. [7,19,20,21]

2.2.1. Mecanismos de resistência aos azóis em Aspergillus fumigatus

Os mecanismos responsáveis pela resistência aos azóis em Aspergillus fumigatus baseiam-se na alteração da afinidade da enzima 14-esterol-desmetilase para o antifúngico, levando à produção do ergosterol, mesmo na presença de antifúngico. [8]. Esta enzima 14-esterol desmetilase está codificada pelo gene cyp51A. Mutações nas posições G54, G138, G448 e M220 ou a inserção de repetições de 34 a 36 pb (mutação TR34) - em tandem- na região promotora deste gene, juntamente com uma

7 substituição L98H (TR34/L98H) no gene cyp51A tem sido observadas em isolados clínicos e ambientais de Aspergillus spp.com resistência aos azóis. [4] Mecanismo de resistência envolvendo estas mutações são detetadas por técnicas sofisticadas e dispendiosas, como o PCR ou PCR em tempo real com sondas específicas ou através da sequenciação de DNA. [7,17,19,22] Foram descritos dois modelos diferentes para o desenvolvimento de resistências aos azóis em Aspergillus fumigatus: − Exposição a azóis por profilaxia ou mesmo por tratamento com esta classe de antifúngicos durante um período prolongado, ocorrendo maioritariamente em contexto clínico. Sendo detetadas várias mutações no gene Cyp51A, neste contexto que conferem resistência aos azóis. − Exposição aos azóis agrícolas em isolados ambientais de Aspergillus spp. e a pressão seletiva causada por estes antifúngicos agrícolas leva a um aumento de isolados ambientais com menor suscetibilidade aos azóis. O rápido aparecimento de resistência aos triazois em isolados de Aspergillus fumigatus foi atribuída à exposição de fungos ambientais a inibidores 14- desmetilase, estes são comummente usados para controlar o crescimento de fungos em flores ornamentais e em plantas de colheita. [19] Uma substancial quantidade de resíduos de azóis podem persistir ativos nos solos e na água durante vários meses, bem como em frutas e vegetais, pois as moléculas que constituem os azóis são muito estáveis. [4,20] Pessoas mais suscetíveis poderão inalar os seus esporos e desenvolver infeção. Foi detetado um mecanismo de resistência novo (mutação TR34/L98H) nestes isolados ambientais e verificou-se que era comum a isolados obtidos de doentes com infeção por Aspergillus spp. resistentes aos azóis, e que não estiveram previamente expostos a esta classe de antifúngicos. Este facto veio comprovar o novo modelo de desenvolvimento de resistência proposto. [20] De facto, num estudo na Holanda foram identificados cinco triazois agrícolas com semelhanças moleculares com os triazois médicos sendo capazes de induzir o mecanismo de resistência TR34/L98H in vitro. [16,22]

2.2.2. Multirresistência

O fenómeno de resistência a múltiplos antifúngicos é caracterizado pela aquisição dupla de resistência a compostos químicos que são estruturalmente diferentes causando problemas em diversos tratamentos de infeções fúngicas. [23] É possível ocorrer resistência cruzada entre azóis, tendo sido demonstrada, in vitro e in vivo, a resistência cruzada entre o itraconazol e o posaconazol (estruturalmente semelhantes) sendo pouco provável ocorrer entre o itraconazol e o voriconazol (estruturalmente dissemelhantes). [17] Dada a emergência de resistências aos antifúngicos que se tem verificado nos últimos anos em Aspergillus spp., bem como o padrão de menor suscetibilidade que algumas espécies crípticas dentro da mesma secção apresentam, torna-se essencial efetuar a determinação da suscetibilidade aos antifúngicos. Deste modo, poder-se-á caracterizar o perfil de suscetibilidades/resistências de isolados clínicos e ambientais (quer para melhor adequabilidade da terapia quer por questões epidemiológicas).

3. Patologias associadas a infeção por Aspergillus spp.

De uma forma geral, as patologias provocadas por Aspergillus são três: a aspergilose broncopulmonar alérgica, o aspergiloma e a aspergilose invasiva. Em todas as patologias o órgão primariamente envolvido é o pulmão e o Aspergillus fumigatus é a espécie dominante. [1]

3.1. Aspergilose Bronco Pulmonar Alérgica (ABPA)

A aspergilose bronco pulmonar alérgica é o resultado da resposta à hipersensibilidade das vias aéreas à colonização por Aspergillus spp., ocorrendo frequentemente em pessoas com asma e fibrose cística. Esta doença é indolente, ou seja, não têm dor, mas é potencialmente progressiva. A fisiologia patológica desta doença é complexa, havendo inflamação de locais resultantes da remoção ineficaz dos esporos, que leva por sua vez a um aumento da produção de muco, hiper-reactividade das vias aéreas, bronquiectasia, tosse recorrente e pieira. Na maioria das vezes desenvolve-se uma reação alérgica brônquica (asma), após a inalação de esporos de Aspergillus spp. [1,24]

3.2. Aspergiloma

Esta é a mais familiar infeção localizada provocada por Aspergillus spp. Normalmente, os aspergilomas desenvolvem-se em paciente com os pulmões estruturalmente anormais, com cavidades já pré-existentes, por exemplo em antigas cavidades provocadas pela tuberculose. O aspergiloma representa uma forma não invasiva de aspergilose pulmonar, formando uma massa semelhante a uma bola, constituída por uma malha intrincada de hifas normalmente de Aspergillus spp.1,25]

3.3. Aspergilose invasiva (AI)

A Aspergilose Invasiva (AI) pode ser definida como uma infeção oportunista que se tornou numa das principais causas de preocupação devido às elevadas taxas de morbidade e mortalidade em pacientes com doenças malignas hematológicas, com uma taxa de mortalidade média de 50% em pacientes com leucemia. A AI é, de facto, uma das principais causas de morte em centros de tratamento da leucemia, transplantes de medula óssea (TMO) e em unidades de transplante de órgãos sólidos. Este mau prognóstico é, em parte, devido às dificuldades em obter um diagnóstico precoce resultando num atraso prejudicial no início do tratamento antifúngico adequado. Como se trata de uma infeção de rápida progressão (1 a 2 semanas desde o o início até à morte), os médicos por vezes iniciam empiricamente o tratamento ao paciente ao invés de esperar para que o diagnóstico seja estabelecido. O principal agente etiológico da AI é Aspergillus fumigatus (em 90% dos casos), não sendo, no entanto, o único agente patogénico dentro deste género. [8,12,19,26,27]

4. Infeções nosocomiais

As infeções fúngicas invasivas adquiridas em ambiente hospitalar, especialmente a aspergilose, têm vindo a tornar-se um problema crescente em pacientes imunocomprometidos. [28] A exposição a bio aerossóis contaminados é problemática, nomeadamente em ambientes hospitalar, onde sob condições de temperatura e humidade adequadas, poderá ocorrer aumento da esporulação e de conídios presentes no ar e superfícies. Vários estudos têm demonstrado que a percentagem mais elevada de infeções nosocomiais é causada por fungos. [28] Até há pouco tempo não existiam valores limite aceites em matéria de concentração de fungos no ar nos hospitais. [29] De acordo com alguns autores, os valores permitidos para a presença de fungos nas unidades de cuidados intensivos, não pode ser superior a 300 cfu/m3 no ar interior; nas salas de operações o número de cfu/m3 permitido é 0, enquanto que em salas de tratamento, o valor permitido é de 50 cfu/m3, e nas restantes unidades hospitalares o valor permitido é de 200 cfu/m3. [30] Em muitos dos casos de AI é difícil determinar onde foram adquiridos, se dentro ou fora das instalações hospitalares. [19] Patterson et al. [31] definiu que um caso de infeção nosocomial de AI ocorre mais de uma semana após a entrada no hospital, ou em menos de 2 semanas.

Admite-se que o ambiente hospitalar é a principal fonte de contaminação dos pacientes que acabam por desenvolver AI; e a eliminação dos esporos de Aspergillus spp. deste ambiente foi mostrado que é importante para a redução da incidência de AI adquirida em hospitais. [26] A deteção de Aspergillus fumigatus em unidades hospitalares com doentes de alto risco é uma importante forma de prevenção da AI nosocomial. De acordo com o guia da AIHA (American Industrial Hygiene Association), a presença confirmada de Stachybotrys chartarum, Aspergillus versicolor, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus e Fusarium moniliforme em ambiente hospitalar exige a toma de decisões que levem à implementação de medidas corretivas e preventivas. [30] Foram recentemente encontrados Aspergillus fumigatus na água de hospitais, sendo claro que é importante e que têm potenciais implicações para a prevenção de infeções. Também vários estudos relatam de que o ar dos hospitais se encontra contaminado com esporos de Aspergillus spp. [19]. Os pacientes poderão, pois, desenvolver infeção após inalação de esporos presentes nestes reservatórios. De acordo com alguns estudos, em 2009 demonstrou-se pela primeira vez que os pacientes com AI causada Aspergillus fumigatus resistente aos azóis possam ter adquirido esta estirpe no meio ambiente, tendo sido encontrados azóis no solo e em compostagem em locais envolventes aos hospitais. [19,20] A propagação de Aspergillus fumigatus resistentes a azóis por transmissão pessoa-a-pessoa é uma situação extremamente rara e só ocorre se aerossóis estiverem contaminados com conídios infetados. Isto apenas pode ocorrer em pacientes com aspergiloma, tendo uma cavidade na qual pode ocorrer a esporulação e os conídios poderem ser transmitidos através da tosse e da infeção se poder desenvolver através da re-inalação por um hospedeiro suscetível, embora este é extremamente raro. [16]

5. Objetivos da dissertação

Esta dissertação teve como principais objetivos a deteção e caracterização de isolados de Aspergillus spp. em ambiente hospitalar. A caracterização dos isolados encontrados foi realizada através de técnicas moleculares (nomeadamente sequenciação da região ITS -Internal transcribed spacer - e dos genes que codificam a β-tubulina e calmodulina)fim de proceder à identificação até ao nível da espécie. Efetuou-se ainda a caracterização dos padrões de susceptibilidade aos antifúngicos dos isolados recolhidos, através de duas técnicas diferentes e complementares: meios de screnning para deteção de isolados resistentes aos azóis e microdiluições em placa (método de referência CLSI). Pretendeu-se também com este trabalho desenvolver uma metodologia que permita de forma mais rápida e eficaz a deteção de Aspergillus fumigatus a partir de amostras ambientais críticas, nomeadamente ar colhido em ambiente hospitalar.

2. Material e Métodos

1. Amostras biológicas

1.1. Colheita

Foram recolhidas um total de 51 amostras ambientais e 105 amostras clínicas para pesquisa de Aspergillus spp. As amostras ambientais foram obtidas através de colheitas realizadas (ao longo de um dia, durante o mês de Março de 2016) num hospital da grande área de Lisboa. Estas colheitas ambientais inserem- se no âmbito de um estudo de vigilância em Aspergillus spp. que tem vindo a ser desenvolvido na Unidade de Referência de Infeções Parasitárias e Fúngicas do INSA. Neste estudo foram já efetuadas colheitas em ambiente hospitalar (no mesmo hospital) em anos prévios. As amostras clínicas foram obtidas em colheitas realizadas aos trabalhadores de uma indústria corticeira durante vários dias de Setembro e Outubro de 2015.

Amostras clinicas:

As amostras clínicas recolhidas foram exsudados nasais de trabalhadores da indústria corticeira. A seleção deste grupo de estudo prende-se com o facto de estes trabalhadores estarem expostos a concentrações elevadas de esporos, que advém do trabalho inerente à manipulação do sobreiro, cortiça e seus derivados. Por se tratar de um potencial grupo de risco para exposição a fungos, nomeadamente Aspergillus spp., realizou-se uma pesquisa da flora fúngica existente na cavidade nasal deste grupo de indivíduos.

Amostras de exsudados nasais: foram colhidas 105 amostras clínicas aos trabalhadores da indústria corticeira. As amostras clínicas recolhidas foram exsudados nasais, colhidos através de zaragatoas, que foram conservadas imersas em soro fisiológico num eppendorf a 4ºC.

Amostras de ambientais:

As amostras ambientais recolhidas foram: terra (n=2), ar (n=26) e superfícies (n=23) provenientes do hospital acima mencionado. Foram efetuadas colheitas em ambiente hospitalar, uma vez que este ambiente tem de estar o mais limpo possível e com baixas concentrações de esporos fúngicos, nomeadamente de Aspergillus spp., pois trata-se de um local onde se encontram internadas e circulam pessoas com o sistema imunitário debilitado e que estão, portanto, mais suscetíveis a desenvolver uma infeção grave. Como tal, foram realizadas recolhas ambientais na área do exterior e envolvente ao hospital (amostras de terra e de ar), tendo ainda sido também realizadas colheitas no interior do hospital (amostras de ar, terra e superfícies).

Amostras de terra: foram recolhidas 2 amostras de terra, uma das amostras foi terra de um jardim da área envolvente ao hospital (no exterior), sendo que a segunda foi uma amostra retirada de um vaso que se encontrava no corredor (no interior) do hospital analisado. A colheita foi realizada recolhendo 50g de terra de cada um dos locais já referidos para um saco de plástico estéril. As amostras foram refrigeradas no transporte para o laboratório.

Amostras de ar: foram recolhidas 26 amostras de ar utilizando dois métodos de colheita diferentes: usando um coletor de ar por impacto em meio líquido em meio sólido (Millipore Air Tester, Millipore) e um coletor de ar em meio líquido tipo Impinger (Coriolis, Bertin Tecnologies). De cada local foram colhidos 900L de ar, a 1 metro de altura do chão e a uma velocidade de 140L/min, diretamente para os meios associados a cada amostrador de ar. Utilizando o método de impacto em meio sólidos, as amostras de ar para cada local foram colhidas sempre para 2 placas: sabouraud com itraconazol (4 µg/ml) e outra com sabouraud com voriconazol (2 µg/ml), anteriormente preparadas como está descrito no Anexo 1. Foram colhidas 16 amostras, correspondendo 10 dos corredores, 2 das salas da unidade de transplante de medula óssea, 4 da hematologia, 6 das urgências, 4 dos arquivos, 2 das consultas e também a um 2 do exterior. Utilizando o amostrador coriolis, as amostras de ar foram recolhidas para um tudo estéril cónico contendo 10 ml de solução salina com tampão fosfato estéril e 0,05% Triton X-100. [2013, Viegas,C.] Foram recolhidas 7 amostras, correspondendo a 5 dos corredores, 1 das salas da unidade de transplante de medula óssea, 2 do serviço de hematologia, 2 das urgências, 1 do arquivo, 1 das consultas e também 1 do exterior (área envolvente). As amostras foram refrigeradas no transporte para o laboratório.

Amostras de superfície: foram recolhidas 23 amostras de superfície pelo método do molde quadrado por estria fina, de acordo com a norma ISO International Standard ISO 18593 (2004). Zaragatoas humedecidas em soro fisiológico foram passadas em estria nas superfícies a analisar de várias zonas interiores de um hospital da grande área de Lisboa. [32] foram recolhidas 23 amostras, correspondendo a 7 maçanetas, 3 paredes, 3 bancadas, 2 carrinhos de apoio, 2 mesas, 2 bancos, 1 janela e 3 painéis eletrónicos (máquina de senhas, botões de elevador). As amostras foram refrigeradas no transporte para o laboratório.

1.2. Processamento cultural

Amostras clínicas: as zaragatoas foram lavadas (por agitação em vortex) e 400µl do lavado plaqueados em 2 placas petri: uma contendo meios de sabouraud com itraconazol (4 µg/ml) e outra, meio de sabouraud com voriconazol (2 µg/ml), colocando-se a crescer em estufa a 37ºC durante 7 dias. Em estudo paralelo e complementar a decorrer na Escola Superior de Tecnologia de Lisboa (ESTSEL), as zaragatoas dos exsudados nasais dos mesmos trabalhadores foram inoculadas em placas de malte suplementado com cloranfenicol a 0,05%.

Amostras de terra: 40 g de cada amostra de terra recolhida foram estão diluídos em 40 ml de água destilada e agitou-se 30 min. Foram plaqueados 200µl do lavado através da técnica de espalhamento em 3 meios de cultura diferentes: meio de malte suplementado com clorofenicol 0,05%, meio de sabouraud com itraconazol (4 µg/ml) e meio de sabouraud com voriconazol (2 µg/ml). Foram colocadas a crescer na estufa a 37ºC durante 7 dias e efetuaram-se os cálculos necessários para os resultados obtidos serem apresentados em UFC (unidades formadoras de colónia) /g de terra. [32]

Amostras de superfície: os esfregaços (zaragatoas) das superfícies foram plaqueados por espalhamentos em 3 meios de cultura diferentes: meio de malte suplementado com clorofenicol a 0,05%, sabouraud com itraconazol (4 µg/ml) e com voriconazol (2 µg/ml) e foram posteriormente colocados na estufa a 37ºC durante 7 dias e efetuaram-se os cálculos necessários para os resultados obtidos serem apresentados em UFC/m2. [32]

As diferentes amostras recolhidas foram plaqueadas em vários meios de cultura: o meio de malte foi utilizado para crescimento e identificação de todos os isolados fúngicos presentes na amostra. Os meios de sabouraud suplementados com os antifúngicos itrazconazol e voriconazol (4 µg/ml e 2 µg/ml, respetivamente) foram utilizados para pesquisa de isolados potencialmente com os antifúngicos, uma vez que a concentração de antifúngico no meio de cultura é elevada e corresponde a um valor cujo crescimento de Aspergillus fumigatus indica estarmos perante um isolado potencialmente resistente. Ao fim dos 7 dias, foram identificados todas os isolados encontrados. Para tal, efetuou-se a sua caracterização macro e microscópia. Para a observação das características macroscópicas, foram verificados a cor da frente e reverso da colónia, a sua topografia, textura. Para a observação microscópica, foram efetuadas preparações microscópicas através duas técnicas diferentes: colocando uma pequena porção da colónia, dissociada com o auxilio de lanceta, numa lâmina com uma gosta de azul de lactonfenol e lamela e ainda através da técnica da fita-cola. Posteriormente, foi realizada a observação e identificação morfológica ao microscópio com ampliação de 400x. As placas com as culturas isoladas foram guardadas a 4ºC. Foram efetuadas em crio tubos, suspensões de esporos dos isolados de Aspergillus spp. Utilizou-se tampão PBST (PBS com 2% de Tween 80) e duas gotas de glicerol esterilizado para conservar estas as suspensões, que foram posteriormente guardadas a -80ºC. Todos os isolados de Aspergillus spp. foram analisados por biologia molecular, como referido no ponto 2, sendo o seu DNA inicialmente conservado a 4ºC (durante o processamento) e posteriormente congelado a -30ºC.

1.3. Identificação Molecular

A análise molecular foi realizada como metodologia complementar à identificação morfológica realizada e permitiu efetuar a identificação dos isolados até à espécie (dentro da secção). Esta análise é realizada através de várias etapas: extração de DNA, PCR de amplificação, gel de eletroforese, purificação e sequenciação, de seguida discriminadas em pormenor.

1.3.1. Procedimento:

Ø Extração de DNA

As extrações de DNA foram realizadas através da utilização de um kit de extração de DNA “High Pure PCR Template Preparation Kit” (Roche) de acordo com as instruções do fabricante (secção2.6 e 2.8) e disponíveis em: hhtps://cssportal.roche.com/LFR_PublicDocs/ras/11796828001_en_10.pdf. [11]

Ø PCR (Polymerase Chain Reaction) para identificação das espécies de Aspergillus spp.

Para identificação da secção de espécies a que pertencia cada isolado de Aspergillus spp. foi realizada uma reação de PCR que amplifica a região ITS (Internal transcribed spacer). Para identificação das diferentes espécies dentro de cada secção, amplificaram-se os genes que codificam a β-tubulina e a calmodulina. Foram utilizadas várias reações de PCR: ITS, β-tubulina e calmodulina. [33]

ITS (Internal transcribed spacer)

A reação de PCR foi realizada num volume de 25µl, contendo:

− PCR beads; (GE Healthcare) − 18µl de água; − 1,5µl primer ITS1 (5'–TCCGTAGGTGAACCTGCGG–3'); − 1,5µl primer ITS4 (5'–TCCTCCGCTTATTGATATGC–3'); − 4µl de DNA.

As condições de PCR foram as seguintes: Ø Desnaturação inicial a 95°C durante 4.5min; Ø 95°C durante 30s; Ø 50°C durante 45s; 40 ciclos Ø 72ºC durante 1min; Ø Extensão final de 72°C durante 3min.

Calmodulina

A reação de PCR foi realizada num volume de 25µl, contendo: − PCR beads; (GE Healthcare) − 17,5µl de água; − 1,75µl primer cmd5 (5'–CCGAGTACAAGGAGGCCTTC–3'); − 1,75µl primer cmd6 (5'–CCGATAGAGGTCATAACGTGG–3'); − 4µl de DNA.

As condições de PCR foram as seguintes: Ø Desnaturação inicial a 95°C durante 10min; Ø 95°C durante 30s; Ø 55°C durante 30s; 38 ciclos Ø 72°C durante 1min; Ø Extensão final de 72°C durante 7min.

β-tubulina

A reação de PCR foi realizada num volume de 25µl, contendo: − PCR beads; (GE Healthcare) − 18µl de água; − 1,5µl primer BT2a (5'–GGTAACCAAATCGGTGCTTGCTTTC–3'); − 1,5µl primer BT2b (5'–ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC–3'); − 4µl de DNA.

As condições de PCR foram as seguintes: Ø Desnaturação inicial a 94°C durante 5min; Ø 94°C durante 30s; Ø 55°C durante 45s; 32 ciclos Ø 72°C durante 2min; Ø Extensão final de 72°C durante 5min.

Ø Gel de Eletroforese

O gel de agarose foi preparado utilizando 90ml de solução tampão TBE 0,5x a pH 8.0 (44.5 mM Tris-base, 44.5 mM ácido bórico, 1.0 mM EDTA) e 1.80g de agarose. Adicionou-se 2.0µl de Gel Red (SYTO®, 60 Red Fluorescente Nucleic Acid Stain – 5 mM Solution in DMSO) após ligeiro arrefecimento da solução de agarose preparada anteriormente. Numa cama de gel, preparada com pentes de 15 ou 20 poços, verteu-se o gel preparado de e esperou-se 20 minutos de forma a solidificar. Colocou-se o gel numa tina de eletroforese, contendo a mesma solução tampão TBE 0,5x a pH 8.0 utilizada na preparação do gel. [11] A electroforese foi realizada a 120 V, durante 20 min, utilizando o equipamento BioRad: Power PC Basics. No primeiro poço pipetou-se 5µl, contendo 2µl de marcador DNA de 100pb (100-1200 pb) (Gene Ruller™, Fermentas, DNA Codder Mix, 0.5 µg/µL) mais 3µl de Loading Buffer (Azul de bromofenol – 2,6 –dibromo-4-[3-(3.5-dibromo-4-hidroxifenil)]). Nos poços seguintes pipetou-se 13µl, contendo 3µl de Loading Buffer mais 10µl de cada produto de PCR. [11] Após conclusão da eletroforese colocou-se o gel de agarose no transiluminador acoplado com uma câmara de vídeo Gel Doc (Gel ChemiDoc) e do programa informático Quantity One (Biorad) que possibilitou a visualização da fluorescência das bandas. Caso se visualizem as bandas, o processo de identificação molecular prossegue para purificação do amplificado e posterior sequenciação. Caso a banda não seja visível é necessário repetir o PCR de amplificação ou repetir a extração.

Ø Purificação

Os fragmentos amplificados por PCR resultantes foram purificados utilizando: − 1.6µl de ExoSAP-IT™ (GE™Healthcare); − 4µl de cada produto de PCR resultante. Este foi preparado na câmara de manipulação Pós-PCR (TradLabor SF). [11,33]

As condições de purificação foram as seguintes: − 37ºC durante 15min − 80ºC durante 15min.

Ø Sequenciação

Por se ter verificado que quando se obtêm sequências Forward com boa discriminação (homologia > 98% e coverage >98%) e sem “ruído de fundo”, a identificação do isolado não apresenta dúvidas, optou-se por fazer apenas a sequenciação da cadeia Forward, fazendo-se a sequenciação da cadeia Reverse e posterior sequência complemento apenas quando estas condições não se verificam. A sequenciação das cadeias de DNA foi realizada com o kit de 1.1 v BigDyeTerminator Cycle sequenciação (Applied Biosystems) no termociclador, nas seguintes condições: [33]

ITS [34]

A reação de amplificação para a sequenciação da cadeia Forward foi realizada num volume de 9µl, contendo: − 3µl de água; − 3µl tampão BigDye;

− 2µl primer ITS1 (5'–TCCGTAGGTGAACCTGCGG–3'); − 1µl de produto de PCR purificado.

A reação de amplificação para a sequenciação da cadeira Reverse foi realizada num volume de 9µl, contendo: − 3µl de água; − 3µl tampão BigDye; − 2µl primer ITS4 (5'–TCCTCCGCTTATTGATATGC–3'); − 1µl de produto de PCR purificado.

As condições de amplificação foram as seguintes: Ø Desnaturação inicial a 96°C durante 5s; Ø 96°C durante 10s; Ø 50°C durante 5s; 30 ciclos Ø 60°C durante 4min; Ø Extensão final de 72°C durante 5min.

Calmodulina [35]

A reação de amplificação para a sequenciação da cadeia Forward foi realizada num volume de 9µl, contendo: − 3µl de água; − 3µl tampão BigDye; − 2µl primer cmd5 (5'–CCGAGTACAAGGAGGCCTTC–3'); − 1µl de produto de PCR purificado. A reação de amplificação para a sequenciação da cadeia Reverse foi realizada num volume de 9µl, contendo: − 3µl de água; − 3µl tampão BigDye; − 2µl primer cmd6 (5'–CCGATAGAGGTCATAACGTGG–3'); − 1µl de produto de PCR purificado.

As condições de sequenciação foram as seguintes: Ø Desnaturação inicial a 96°C durante 5s; Ø 96°C durante 10s; Ø 50°C durante 5s; 30 ciclos Ø 60°C durante 4min; Ø Extensão final de 72°C durante 5min.

β-tubulina

A sequenciação do gene que codifica a β-tubulina foi realizada utilizando um segundo par de primeres (Btub1 e Btub4), com as condições: A reação de amplificação para a sequenciação da cadeia Forward foi realizada num volume de 9µl, contendo: − 3µl de água;

− 3µl tampão BigDye; − 2µl primer btub1 (5'–AATTGGTGCCGCTTTCTGG–3'); − 1µl de produto de PCR purificado.

A reação de amplificação para a sequenciação da cadeia Reverse foi realizada num volume de 9µl, contendo: − 3µl de água; − 3µl tampão BigDye; − 2µl primer btub4 (5'–AGCGTCCATGGTACCAGG–3'); − 1µl de produto de PCR purificado.

As condições de sequenciação foram as seguintes: Ø Desnaturação inicial a 94°C durante 3min; Ø 96°C durante 10s; Ø 50°C durante 5s; 25 ciclos Ø 52°C durante 4min; Ø Extensão final de 60°C durante 5min.

As sequências de nucleótidos foram editadas usando o programa Chromas2 e alinhadas utilizando o programa CLUSTAL X2. As sequências obtidas foram comparadas com sequências depositadas nas bases de dados de GenBank, através do programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Os resultados foram aceites se as homologias e coverage com as outras sequências depositadas apresentarem um valor maior ou igual a 98%. [36] As sequências da região ITS foram usadas para identificar os isolados ao nível da secção de espécies, e as sequências dos genes que codificam a β-tubulina e a calmodulina foram utilizadas para identificar o isolado ao nível da espécie. [33]

Ø PCR (Polymerase Chain Reaction) para otimização da amplificação do gene Cyp51A

Com o objetivo de implementar uma metodologia que permitisse uma deteção rápida e eficiente de Aspergillus fumigatus a partir de amostras ambientais, desenvolveu-se técnica in house de PCR em tempo real. Os primers usados amplificam o gene cyp51A e são específicos para Aspergillus fumigatus sensu stricto. A otimização desta metodologia de deteção foi efetuada recorrendo a técnicas de PCR convencional (para otimização de condições de amplificação e estudo da especificidade do primer). Estão descritos nos resultados, os resultados obtidos até à otimização desta metodologia. Utilizou-se para tal, DNA de duas estirpes de referência de Aspergillus fumigatus sensu stricto: NEQAS 2646 (resistente ao itraconazol) e ATCC 204305 (sensível aos azóis). Pretendeu-se assim utilizar o gene cyp51A como marcador da presença de Aspergillus fumigatus. Após otimização, testou-se a especificidade do primer e aplicaram-se as condições definidas a uma metodologia de PCR tempo real.

Ø Especificidade do primer

Para testar a especificidade dos primers que amplificaram o gene cyp51A (cyp51AF e cyp51AR) realizou-se um PCR convencional com várias espécies de Aspergillus de referência: Aspergillus fumigatus sensu stricto ATCC 204305, Aspergillus fumigatus sensu stricto NEQAS 9648, Aspergillus fumigatus sensu stricto NEQAS 2070, Aspergillus fumigatus sensu stricto NEQAS 2646 (resistente ao

17 itraconazol), Aspergillus flavus sensu stricto ATCC 204304, Aspergillus nidulans NEQAS 2651, Aspergillus terreus NEQAS 2812 e Aspergillus niger NEQAS 1517. Como se pretendia amplificar apenas Aspergillus fumigatus sensu stricto, foram ainda testadas várias espécies pertencentes à secção Fumigati (espécies crípticas), usando isolados de referência do laboratório: Aspergillus lentulus (VA107), Aspergillus hiratsukae (HSMA 89). As condições de PCR utilizadas estão descritas nos resultados na 11ª tentativa da otimização e correspondem às condições definitivas após otimização.

PCR (Polymerase Chain Reaction) em tempo real

Ø Deteção Aspergillus fumigatus sensu stritco em amostras ambientais

A presença de Aspergillus fumigatus em ambiente hospitalar é relevante em termos clínicos, nomeadamente em unidades hospitalares onde existam doentes imunocomprometidos. Como tal, é de extrema importância fazer uma deteção rápida e precisa desta espécie em amostras colhidas em ambiente hospitalar. A deteção de Aspergillus fumigatus diretamente a partir das colheitas ambientais foi feita utilizando os primes que amplificam o gene cyp51A com as condições de PCR otimizadas no decorrer deste trabalho. As condições finais e otimizadas para a amplificação deste gene encontram-se descritas seguidamente, bem como todo o procedimento necessário para a observação dos resultados. A reação de PCR em tempo real foi realizada num volume de 19µl, contendo: − 10µl de água;

− 2,4µl MgCl2 − 0,5µl primer cyp51AF (5'–ATGGTGCCGATGCTATGG–3'); − 0,5µl primer cyp51 AR (5'–CTGT C-TCACTTGGATGTG–3'); − 0,5 µl SybrGreen; − 5µl de DNA*.

As condições de PCR foram as seguintes: Ø Desnaturação inicial a 95°C durante 5min; Ø 94°C durante 30s; Ø 54°C durante 45s; 36 ciclos Ø 72°C durante 2min; Ø Extensão final de 72°C durante 7min.

O PCR foi feito utilizando o Rotor-Gene Q (Qiagen, Heidelberg, Germany) e os resultados analisados utilizando o software do termociclador (Rotor-Gene 2.1.0.9). O valor de threshold aplicado baseia-se no sugerido pela bula do kit de PCR tempo real AsperGenius (PathoNostics, Maastricht, Países Baixos) [37]

* O DNA utilizado foi obtido fazendo extração diretamente a partir do 7 ml do líquido obtido nas amostras de ar recolhidas com o amostrador Coriolis. A extração foi efetuada de acordo com o descrito anteriormente.

Assim, as amostras utilizadas para a realização deste método foram 7 amostras de ar do ambiente hospitalar correspondendo a 4 corredores, da unidade de transplante de medula óssea, do serviço de hematologia, da enfermaria de hematologia, e da urgência, e a 2 salas, da urgência e do arquivo, e finalmente uma amostra do exterior.

Ø Detecção de mutações de Aspergillus fumigatus que conferem resistência aos azóis por PCR tempo real

A emergência de isolados resistentes aos azóis em ambiente hospitalar reveste-se de particular importância e motivo de preocupação. Com o intuito de detetar de forma direta a presença de Aspergillus fumigatus resistentes aos azóis em amostras ambientais, utilizou-se um kit de PCR em tempo real desenvolvido para pesquisa de mutações que conferem resistência aos azóis em Aspergillus fumigatus em produtos clínicos (sangue, soro, produtos respiratórios). Utilizou-se para tal o kit de PCR tempo real AsperGenius (PathoNostics, Maastricht, Países Baixos), [37] Este kit, utiliza um par de primers que amplificam o gene cyp51A (controlo), e de seguida, outros primers que irão amplificar regiões específicas dentro deste gene, sendo a sua amplificação detetada através de vários canais de fluorescência (amarelo, verde, laranja vermelho) (espetro de emissão 495 nm, 530 nm, 598 nm, e 645 nm, respectivamente). Por alteração da temperatura de melting destas regiões, poderão ser detetadas várias mutações que conferem resistência aos triazóis, entre as quais a TR34, L98H, Y121F, T289A. A reação de PCR em tempo real foi realizada num volume de 15µl, contendo: − 10µl resistance mastermix; − 2µl Taq polimerase; − 3µl de dilution buffer. − 10µl de DNA*

As condições de PCR foram as seguintes: Ø Desnaturação inicial a 95°C durante 2min; Ø 94°C durante 15s; Ø 58°C durante 60s; 45 ciclos Ø 95°C durante 2min; Ø 45ºC durante 90 s

O PCR em tempo real foi realizado segundo as instruções do fabricante e descritas por Chong et al. [37] e utilizando o Rotor-Gene Q (Qiagen, Heidelberg, Germany). A interpretação do resultado obtido foi efetuada com base na amplificação do gene Cyp51A e na temperatura de melting obtida para cada um dos quatro locus estudados, que correspondem a 4 hotspots para mutações que conferem resistência aos azóis. Para que um resultado seja validado, o nº de ciclos onde começa amplificação (Ct ) e a temperatura de melting (Tm) do controlo positivo terão de estar dentro da gama esperada (Tabela 2.1); para considerar a estirpe testada como sensível ou resistente, a temperatura de melting terá que coincidir com o que esta descrito na Tabela 2.2 e 2.3.

Tabela 2.1: Valores de ciclo limite (Threshold)e Temperatura de Melting do controlo positivo.

Mutação/ sonda Fluorocromo Canal de leitura Validação do Controlo Positivo L989H FAM verde Ct do CP = 29.0-33.0 Tm do CP = 65.0-68.0ºC TR34 JOE amarelo Ct do CP = 30.0-34.5 Tm do CP = 65.0-68.0ºC T289A ROX laranja Ct do CP = 29.0-33.5 Tm do CP = 66.0-69.0ºC Y121F Cy5 vermelho Ct do CP= 28.5-33.0 Tm do CP = 67.0-70.0ºC

Tabela 2.2: Valores de Temperatura de Melting da amostra se wildtype para os diferentes loci cuja mutação confere resistência aos azóis Mutação/ sonda Fluorocromo Canal de leitura Validação da amostra se wildtype

L989H FAM verde Temperatura melting= 60.0-63.0ºC TR34 JOE amarelo Temperatura melting = 63.5-65.5ºC

T289A ROX laranja Temperatura melting = 62.0-65.0ºC Y121F Cy5 vermelho Temperatura melting = 62.0-65.0ºC

Tabela 2.3: Valores de Temperatura de Melting da amostra se mutante para os diferentes loci cuja mutação confere resistência aos azóis Mutação/ sonda Fluorocromo Canal de leitura Validação da amostra se mutante L989H FAM verde Temperatura melting= 65.0-68.0ºC TR34 JOE amarelo Temperatura melting= 65.0-68.0ºC T289A ROX laranja Temperatura melting= 66.0-69.0ºC Y121F Cy5 vermelho Temperatura melting= 67.0-70.0ºC

* Foram testadas duas amostras a AA2 que corresponde a ar recolhido da sala das urgências e a amostra AA4 que corresponde a ar recolhido No corredor e elevador. O DNA utilizado foi obtido fazendo extração diretamente a partir de 7 ml do líquido obtido nas amostras de ar recolhidas com o amostrador Coriolis. A extração foi efetuada de acordo com o descrito anteriormente.

2. Teste de susceptibilidade aos antifúngicos

Para testar a susceptibilidade aos antifúngicos dos isolados de Aspergillus spp. detetados no decorrer deste trabalho, foram utilizados dois métodos distintos, a fim de se complementarem: utilização de meios de screening (placas de sabouraud agar suplementadas com itraconazol e voriconazol) e o método das microdiluições.

2.1. Meios de screening [38]

Foi utilizada a concentração de 4mg/l de itraconazol e 2mg/L de voriconazol dado serem os valores propostos pela norma EUCAST para a deteção de isolados de Aspergillus fumigatus potencialmente resistentes aos azóis. Os meios de srceening foram preparados como está descrito no Anexo 1. As estirpes foram colocadas a crescer em meio de malte durante 7 dias a 37ºC. Ao fim desses 7 dias o procedimento aplicado foi o descrito no Anexo 1.

2.2. Microdiluições

Os protocolos das microdiluições são atualmente o método de referência utilizado para testar a suscetibilidade aos antifúngicos normalmente por diluições padrão em meio liquido. [3,4] Existem dois métodos estandardizados, proveniente de subcomissões de teste de susceptibilidade aos antifúngicos, são eles a norma CLSI, Clinical Laboratory Standards Institute, e a norma EUCAST, European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing. [3,4] As diferenças entre estes dois métodos, encontram-se resumidas na Tabela 2.4.

Tabela 2.4: Diferenças entre os dois métodos de determinação da susceptibilidade aos antifúngicos. Método CLSI M38 A2 EUCAST Inóculo 0,4-5x104 cfu/ml 1-2,5x105 cfu/ml Standardização inóculo Espectofotómetro Hemacitómetro Meio de teste RPMI 1640 RPMI 1640 – 2% glucose

A determinação das suscetibilidades aos antifúngicos que foi efetuada no decorrer deste trabalho foi realizada com base na norma CLSI “Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi; Approved Standard M38 A2”. Foram realizadas um total de 69 determinações do padrão de susceptibilidade usando o método das microdiluições em placa com o intuito de caracterizar a susceptibilidade aos antifúngicos dos isolados de Aspergillus spp. (secções Nigri, Flavi, Circumdati, Nidulantes, Versicolores, Terrei, Fumigati, Usti, Cremei) e detetados e identificados nas amostras ambientais realizadas em Março de 2016 (n=17), e em 2012 e 2013 (n=52) obtidas em amostragens ao mesmo hospital, no decorrer de um projeto anterior do laboratório. [33] O procedimento utilizado para a realização das microdiluições encontra-se descrito no Anexo 2. Os resultados foram analisados através da observação da redução do crescimento in vitro, nos poços da microplaca que contêm diferentes concentrações de antifúngico, em comparação com o crescimento da estirpe no poço sem a presença do antifúngico (controlo positivo). O valor de concentração mínima inibitória (CMI) para cada estirpe foi registado após leitura efetuada às 48h de incubação das microplacas inoculadas. A CMI consiste na concentração mais baixa da substância antimicrobiana que produz a redução de crescimento visível de um microrganismo em agar ou em caldo no teste de susceptibilidade. No caso dos antifúngicos testados e para fungos filamentosos e de acordo com a norma CLSI, a CMI corresponde à concentração mais baixa de antifúngico que inibe completamente o crescimento da estirpe testada. Neste trabalho foram testadas as suscetibilidades para três antifúngicos diferentes (Voriconazol, Posaconazol e Anfotericina B). Não foi possível realizar o 4º antifúngico pretendido, o itraconazol, pois o existente perdeu a viabilidade e embora feito o pedido para aquisição de um novo lote, não chegou em tempo útil, não sendo possível no decorrer deste trabalho analisar a susceptibilidade ao itraconazol das estirpes colhidas. De acordo com a norma CLSI, não existem valores de CMI estabelecidos para as diferentes espécies de Aspergillus spp. a partir dos quais se considera uma estirpe resistente aos diferentes antifúngicos. Existem, no entanto, valores de corte epidemiológico propostos para cada espécie como podemos ver na Tabela 2.5.

Tabela 2.5: Valores de corte epidemiológicos para a anfotericina B, voriconazol e posaconazol para as espécies de Aspergillus spp.. [39] Espécies Anfotericina B (mg/l) Voriconazol (mg/l) Posaconazol (mg/l) Aspergillus niger 4 2 1 Aspergillus flavus 4 1 0,5 Aspergillus fumigatus 4 1 0,5 Aspergillus secção Circumdati 4 1 1

A interpretação dos resultados das microdiluições dos isolados testados foi feita com base na tabela 2.5. Em caso de se tratar de espécies pertencentes a outras secções, a interpretação foi baseada no valor de corte epidemiológico sugerido para Aspergillus niger.

3. Resultados

Resultados culturais das amostras clínicas

Os resultados culturais foram obtidos das amostras clínicas recolhidas a trabalhadores de uma indústria corticeira foram efetuados num trabalho paralelo a este estudo (efetuado na ESTSEL), e cuja publicação resultante se encontra em anexo. Observou-se que dos trabalhadores analisados, os géneros fúngicos mais frequentemente detetados na mucosa nasal foram Penicillium sp. (73.6%), seguido de Cladosporium sp. (9%), Chrysonilia sp. (2.9%) e Acremonium sp. (2.6%) (Figura 3.1). Com interesse para a dissertação aqui apresentada, efetuou-se, nas mesmas amostras, a pesquisa de isolados de Aspergillus sp. com resistência aos azóis e cujos resultados se apresentam no ponto 3 desta secção.

Figura 3.1: Gráfico representativo dos géneros fúngicos encontrados nas amostras clínicas analisadas. [40]

Com interesse para o prosseguimento deste estudo foram encontradas 3 amostras com isolados de Aspergillus spp. pertencentes à secção Nigri (2 isolados) e Fumigati (1 isolado).

Resultados culturais das amostras ambientais

Foram recolhidas 51 amostras ambientais: 2 amostras de terra, 26 amostras de ar e 23 amostras de superfície. Os resultados apresentados resultam da identificação e quantificação das colónias crescidas em meio de malte. A identificação foi efetuada com base nas características morfológicas (macro e micromorfologia)

Superfície

Os resultados culturais obtidos das 23 amostras ambientais de superfície recolhidas durante a visita a um hospital da grande área de Lisboa em Março de 2016 estão apresentados na Tabela 3.2, sendo que Rhizopus sp. e Penicillium sp. foram os géneros mais prevalentemente encontrados (cada um deles em 17% das amostras positivas), e detetados em 25% do total das amostras ambientais analisadas. Com interesse para este trabalho encontraram-se Aspergillus sp., todos eles detetados em zaragatoas efetuadas à parede de arquivo): na amostra AS19, que correspondeu aos Aspergillus sp. com os códigos HSMA 97, 98 e 104; na amostra AS20, que correspondeu ao Aspergillus sp. com o

22 código HSMA 102, e a amostra AS21 que correspondeu ao Aspergillus sp. com o código HSMA 93 e HSMA 107. Todos os isolados de Aspergillus foram posteriormente analisados por biologia molecular para determinar a espécie a que pertencem e foram caracterizados no que respeita ao seu padrão de susceptibilidade aos antifúngicos e os resultados encontram-se nas tabelas 3.5 e 3.6, respetivamente.

Tabela 3.1: Resultados culturais das amostras ambientais de superfície em meios de malte. Malte Código Descrição Origem (ufc/m2) AS1 carrinho apoio TMO - AS2 bancada TMO - AS3 superfície metálica TMO - AS4 mesa de madeira SH 160 Penicillium sp. AS5 puxador frigorifico SH 760 Penicillium sp. AS6 puxador de porta SH 10 Rhizopus sp. AS7 puxador microondas SH 10 micélio estéril AS8 banco de madeira SH - AS9 banco do chuveiro SH 10 Penicillium sp. AS10 carrinho de serviço EH - AS11 prateleira de madeira EH - AS12 microondas EH 30 Penicillium sp. AS13 pegas da cama EH - AS14 janela EH 10 Cladosporium sp. AS15 painel números elevador EL 10 Rhizopus sp. AS16 bancada U - painel de números do AS17 U 10 Rhizopus sp. multibanco AS18 maquina senhas SE - 1000 Aspergillus sp.; 10 fungos filamentosos não AS19 parede A Aspergillus sp. AS20 parede A 1000 Aspergillus versicolor (secção) 20 Aspergillus sp.; 10 Chaetomium sp. AS21 parede A 10 Aspergillus fumigatus (secção) AS22 rato computador A 10 micélio estéril

AS23 mesa A 10 Rhizopus sp. Nota: Não foi feita a identificação dos isolados de fungos filamentosos “não Aspergillus” pois o objectivo deste estudo foi só a identificação de Aspergillus sp. Legenda: TMO Transplante medula óssea; SH serviço hematologia; EH enfermaria hematologia; EL elevador; SE sala de espera; U urgência; A arquivo.

Ar (colhido para meio líquido)

Foram efetuadas 8 colheitas de ar, utilizando o coletor de ar para meio líquido: estas foram recolhidas durante a visita a um hospital da grande área de Lisboa em março de 2016. Os resultados culturais obtidos estão apresentados na Tabela 3.2, sendo que Penicillium sp. foi o género mais prevalente nestas amostras (em 50% das amostras positivas), e detetado em 7% das colheitas ambientais efetuadas.

Com interesse para este trabalho encontraram-se 2 isolados de Aspergillus sp., na amostra AA4 (ar do elevador e corredor da Urgência), que correspondeu ao Aspergillus sp. com o código HSMA 92 e a amostra AA5 (ar da sala de espera da urgência) que correspondeu ao Aspergillus sp. com o código HSMA 91, todos eles foram posteriormente analisados por biologia molecular para determinar a espécie a que pertencem e foram caracterizados no que respeita ao seu padrão de susceptibilidade aos antifúngicos e os resultados encontram-se nas tabelas 3.5 e 3.6, respetivamente.

Tabela 3.2: Resultados culturais das amostras ambientais de ar (líquido) em meios de malte. Malte Código Descrição Origem (ufc/m3) AA1 bancada TMO - AA2 corredor SH 111 Penicillium sp. AA3 corredor EH 45 Penicillium sp. 5 Aspergillus fumigatus (secção) AA4 elevador/corredor U 1 Penicillium sp. AA5 sala U 2 Aspergillus fumigatus (secção) AA6 sala SE - AA7 exterior E 53 Penicillium sp. AA8 sala A 1 Rhizopus sp. Legenda: TMO Transplante medula óssea; SH serviço hematologia; EH enfermaria hematologia; SE sala de espera; U urgência; A arquivo; E exterior.

Terra

Foram efetuadas duas colheitas de terra, os resultados culturais obtidos estão na Tabela 3.3. Com interesse para estes trabalhos encontraram-se isolados de Aspergillus sp., nas duas amostras T1 (Terra colhida no jardim no exterior do hospital), que correspondeu ao Aspergillus sp. com o código HSMA 101, HSMA 103 e HSMA 105 e a amostra T2 que correspondeu ao Aspergillus sp. com o código HSMA 90, HSMA 94, HSMA 95, HSMA 99, HSMA 108 todos eles foram posteriormente analisados por biologia molecular.

Tabela 3.3: Resultados culturais das amostras ambientais de terra em meio de malte. Malte Código Descrição Origem (ufc/g de terra) 20 Penicillium sp; 5 Fusarium sp.; 20 Aspergillus sp.; 10 T1 jardim E Scytalidium sp. T2 corredor SE 165 Aspergillus sp.; 10 Penicillium sp. Legenda: SE sala de espera; E exterior.

Para o seguimento deste trabalho, que teve como objetivo a caracterização de isolados ambientais de Aspergillus sp., foram recolhidos, durante este período de colheitas ambientais, três isolados de Aspergillus sp. provenientes das amostras clínicas, três isolados de Aspergillus sp. provenientes das amostras de ar, seis isolados de Aspergillus sp. provenientes das amostras de superfície e oito isolados de Aspergillus sp. provenientes das amostras de terra, que posteriormente foram analisados através de biologia molecular e utilizados para a determinação da susceptibilidade aos antifúngicos. Na Tabela 3.4. encontram-se listados todos os isolados de Aspergillus spp. recolhidos em amostras de ambiente hospitalar em todas as colheitas efetuadas no decorrer do estudo de vigilância em Aspergillus sp.

Tabela 3.4: Identificação morfológica e molecular dos isolados de Aspergillus sp. encontrados nas amostras ambientais recolhidas. Identificação morfológica Código Descrição Origem Identificação molecular (secção/secção de espécies) HSMA1 quarto H Nigri Aspergillus tubingensis HSMA2 quarto ICU Nigri Aspergillus phoenicis HSMA3 sala H Nigri Aspergillus niger sensu stricto HSMA4 corredor H Nigri Aspergillus niger sensu stricto HSMA5 corredor ICU Flavi Aspergillus flavus sensu stricto HSMA6 janela ICU Flavi Aspergillus flavus sensu stricto HSMA7 superfície ICU Flavi Aspergillus persii HSMA8 superfície ICU Flavi Aspergillus flavus sensu stricto HSMA9 ar H Flavi Aspergillus flavus sensu stricto HSMA10 ar H Nidulantes Emericella nidulans HSMA11 ar ICU Aspergillus sp. Aspergillus persii HSMA12 ar H Circundati Aspergillus slerotium/ bridgeri HSMA14 ar H Circundati Aspergillus sclerotium HSMA15 ar H Versicolores Aspergillus sidowii HSMA18 ar H Aspergilli Aspergillus sclerotium / bridgeri HSMA19 ar ICU Terrei Aspergillus terreus sensu stricto HSMA20 ar ICU Circundati Aspergillus westerdijkiae HSMA21 ar H Circundati Aspergillus westerdijkiae HSMA22 ar H Circundati Aspergillus westerdijkiae HSMA23 superfície H Versicolores Aspergillus sydowii HSMA24 ar H Versicolores Aspergillus sydowii HSMA25 superfície H Versicolores Aspergillus versicolor/carneus HSMA27 ar H Versicolores Aspergillus venenatus HSMA29 ar H Nigri Aspergillus niger sensu stricto HSMA31 ar H Nigri Aspergillus tubingensis HSMA33 superfície H Nigri Aspergillus phoenicis HSMA34 ar H Fumigati Aspergillus fumigatus sensu stricto HSMA35 ar H Circundati Aspergillus ochraceus/ostianus/sepultus HSMA36 superfície ICU Flavi Aspergillus flavus sensu stricto HSMA37 ar H Nigri Aspergillus niger sensu stricto HSMA38 ar H Fumigati Aspergillus fumigatus sensu stricto HSMA39 ar H Usti Aspergillus minutos HSMA40 ar H Aspergillus sp. Aspergillus dimorphicus HSMA42 ar H Nigri Aspergillus tubingensis HSMA43 ar H Usti Aspergillus insuetus HSMA44 ar H Fumigati Aspergillus fumigatus sensu stricto HSMA45 superfície ICU Nigri Aspergillus tubingensis HSMA46 superfície ICU Nidulantes Emmericella nidulans HSMA47 ar H Usti Aspergillus minutos HSMA48 ar H Nidulantes Emmericella nidulans HSMA49 superfície H Usti Aspergillus minutos

Tabela 3.4 (continuação): Identificação morfológica e molecular dos isolados de Aspergillus sp. encontrados nas amostras ambientais recolhidas. Identificação morfológica Código Descrição Origem Identificação molecular (seção de espécies) HSMA50 ar H Versicolores Aspergillus sydowii HSMA51 ar H Versicolores Aspergillus protuberus HSMA52 ar H Versicolores Aspergillus creber HSMA53 ar H Versicolores Aspergillus protuberus HSMA54 superfície H Versicolores Aspergillus sydowii HSMA55 ar H Nidulantes Emericella quadrilátera HSMA56 ar H Flavi Aspergillus flavus sensu stricto HSMA57 ar H Flavi Aspergillus flavus sensu stricto HSMA58 ar H Flavi Aspergillus flavus sensu stricto HSMA59 superfície ICU Flavi Aspergillus flavus sensu stricto HSMA60 ar UTMO Versicolores Aspergillus protuberus HSMA61 ar H Versicolores Aspergillus protuberus HSMA62 superfície H Versicolores Aspergillus tenerensis HSMA64 ar UTMO Versicolores Aspergillus protuberus HSMA65 ar UTMO Fumigati Aspergillus fumigatus sensu stricto HSMA66 superfície ICU Fumigati Aspergillus fumigatus sensu stricto HSMA67 superfície H Fumigati Aspergillus fumigatus sensu stricto HSMA68 ar H Flavi Aspergillus flavus sensu stricto HSMA69 ar H Versicolores Aspergillus protuberus HSMA70 superfície H Terrei Aspergillus terreus sensu stricto HSMA71 ar UTMO Terrei Aspergillus terreus sensu stricto HSMA72 superfície ICU Terrei Aspergillus terreus sensu stricto HSMA74 superfície H Versicolores Aspergillus sydowii HSMA75 ar ICU Fumigati Aspergillus fumigatus sensu stricto HSMA76 ar H Versicolores Aspergillus protuberus HSMA77 ar H Nigri Aspergillus niger sensu stricto HSMA78 ar H Aspergilli Eurotium repens HSMA79 ar ICU Aspergilli Aspergillus ruber / Eurotium rubrum HSMA81 ar H Aspergilli Eurotium repens A. Pseudoglaucus HSMA82 ar H Versicolores Aspergillus tabacinus HSMA83 ar H Versicolores Aspergillus protuberus HSMA86 ar H Versicolores Aspergillus creber HSMA88 ar H Candidi Aspergillus sclerotium / bridgeri HSMA89 ar ICU Candidi Neosartorya hiratsukae HSMA90 terra SE Aspergillus sp. Aspergillus fumigatus sensu stricto HSMA91 ar U Aspergillus sp. Aspergillus fumigatus sensu stricto HSMA92 ar U Aspergillus sp. Aspergillus fumigatus sensu stricto HSMA93 superfície A Aspergillus sp. Aspergillus fumigatus sensu stricto HSMA94 terra SE Aspergillus sp. Aspergillus westerdijkiae HSMA95 terra SE Aspergillus sp. Aspergillus fumigatus sensu stricto HSMA97 superfície A Aspergillus sp. Aspergillus ustus

Na Tabela 3.4 é possível observar que foram encontradas 63% espécies crípticas, sendo que a espécie críptica mais prevalente foi com 27% o Aspergillus protuberus, espécie críptica da secção do Aspergillus versicolor.

Determinação da susceptibilidade aos antifúngicos

Foram realizados testes preliminares à suscetibilidade dos isolados de Aspergillus sp. obtidos usando para tal 2x214 meios de screening para os dois antifúngicos (itraconazol e voriconazol): 2x92 foram realizados a partir de estirpes já reisoladas (Aspergillus sp. isolados nas amostras ambientais) e 2x121 realizadas diretamente ao produto biológico obtido nas colheitas clínicas. Utilizando o método das microdiluições em placa (norma CLSI) foram realizados 92 ensaios para os três antifúngicos (voriconazol, anfotericina B e posaconazol), realizados aos isolados de Aspergillus sp. anteriormente identificados por biologia molecular, provenientes das colheitas ambientais (ambiente hospitalar) realizadas em 2012 e 2013 e depois em Março de 2016.

Determinação da susceptibilidade dos isolados provenientes de amostras clínicas

Os resultados apresentados resultam da identificação e quantificação das colónias crescidas em meio de screening. A identificação foi efetuada com base nas características morfológicas (macro e micromorfologia). O género Penicillium foi o mais prevalente, tendo crescido em 52% dos meios de screening inoculados.

Tabela 3.5: Resultados culturais das amostras clínicas em meios de screening de itraconazol e voriconazol. Screening agar com Itraconazol Screening agar com Voriconazol Código (ITZ 4 µg/ml) (VCZ 2µg/ml) (ufc/ml) (ufc/ml) C1 - 3 Phoma; 5 fungos filamentosos não Aspergillus C2 3 Penicillium sp. -

Tabela 3.5 (continuação): Resultados culturais das amostras clínicas em meios de screening de itraconazol e voriconazol. Screening agar com Itraconazol Screening agar com Voriconazol Código (ITZ 4 µg/ml) (VCZ 4 µg/ml) (ufc/ml) (ufc/ml) C3 8 Phoma; 83 Penicillium sp. 70 Phoma; 73 Penicillium sp. 3 fungos filamentosos não Aspergillus; 28 C4 15 Penicillium sp. Penicillium sp. 3 Paecilomyces ; 3 Trichoderma C5 35 Penicillium sp. 18 Penicillium sp. C6 5 Penicillium sp. 3 Penicillium sp. C7 3 Paecyllomyces; 5 Penicillium sp. 3 fungos filamentosos não Aspergillus C8 3 Trichoderma - C9 5 fungos filamentosos não Aspergillus - C10 - 3 não Aspergillus C11 - 3 Paecyllomyces; 3 Penicillium sp. C12 3 Aspergillus niger - C13 3 Penicillium sp. 3 Penicillium sp. C14 3 fungos filamentosos não Aspergillus 3 fungos filamentosos não Aspergillus C15 48 Penicillium sp. 40 Penicillium sp. C16 3 fungos filamentosos não Aspergillus - C17 - 3 Penicillium sp.; 3 Scopulariopsis C18 - 3 Penicillium sp. 3 Penicillium sp.; 3 Aspergillus C19 fumigatus - 3 Aspergillus niger C20 - 3 fungos filamentosos não Aspergillus C21 3 fungos filamentosos não Aspergillus - C22 3 fungos filamentosos não Aspergillus - C23 3 não Aspergillus; 3 Penicillium sp. 3 Penicillium sp. C24 3 fungos filamentosos não Aspergillus 10 Penicillium sp. Nota: Não foi feita a identificação dos isolados de fungos filamentosos “não Aspergillus” pois o objectivo deste estudo foi só a identificação de Aspergillus sp.

A confirmação da redução na susceptibilidade ao itraconazol dos isolados de Aspergillus sp. provenientes das amostras C12 e C19 não foi possível efetuar pelo método de referência.

Determinação da susceptibilidade dos isolados provenientes de amostras ambientais

Os resultados da determinação da susceptibilidade aos antifúngicos dos isolados de Aspergillus sp.provenientes de ambiente hospitalar encontram-se apresentados na Tabela 3.6. Relativamente à susceptibilidade usando meios de screening, observou-se que 50% dos isolados ambientais apresentaram susceptibilidade reduzida ao antifúngico itraconazol, 14% dos isolados apresentaram susceptibilidade reduzida ao voriconazol; os restantes isolados foram negativos para a resistência a estes azóis. Foi ainda observado que 13% dos isolados de ambiente hospitalar cresceram em ambos os meios de screening, o que mostra uma susceptibilidade reduzida quer ao itraconazol quer ao voriconazol. Relativamente à susceptibilidade usando o método de microdiluições foi possível obter uma correspondência de métodos apenas em relação ao antifúngico voriconazol, uma vez como foi já

28 explicado anteriormente não foi possível testar o método das microdiluições para o antifúngico itraconazol. Em comparação dos dois métodos para o antifúngico voriconazol observou-se que em 88% dos isolados o resultado coincidiu nos dois métodos, tenha sido este negativo ou positivo, havendo, portanto, uma discrepância entre métodos de 12%. Verificou-se que 11% dos isolados apresentavam susceptibilidade reduzida ao voriconazol, 12% ao posaconazol e 3% à anfotericina B.

Tabela 3.6: Susceptibilidade aos antifúngicos dos isolados de Aspergillus spp.(provenientes de ambiente hospitalar), determinada através de meios de screening agar e microdiluições Microdiluições - CMIs ScreeningAgar Código Identificação molecular (µg/mL) ITZ VCZ AMB VCZ PCZ HSMA1 Aspergillus tubingensis + - 1 0,25 1 HSMA2 Aspergillus phoenicis + - 1 0,25 1 HSMA3 Aspergillus niger sensu stricto + - 1 0,25 1 HSMA4 Aspergillus niger sensu stricto + - 1 0,5 1 HSMA5 Aspergillus flavus sensu stricto + +/- 2 0,5 0,5 HSMA6 Aspergillus flavus sensu stricto + +/- 2 0,5 1 HSMA7 Aspergillus persii - - 2 0,5 1 HSMA8 Aspergillus flavus sensu stricto + - 2 0,5 1 HSMA9 Aspergillus flavus sensu stricto - - 2 0,25 0,5 HSMA10 Aspergillus nidulans - - 2 0,25 0,5 HSMA11 Aspergillus persii + - 4 0,5 0,5 HSMA12 Aspergillus slerotium/ bridgeri + + 2 2 1 HSMA14 Aspergillus sclerotium + - 2 0,25 1 HSMA15 Aspergillus sidowii - - 2 1 2 HSMA18 Aspergillus sclerotium / bridgeri + + 4 2 1 HSMA19 Aspergillus terreus sensu stricto - - 2 0,5 0,25 HSMA20 Aspergillus westerdijkiae + - >8 0,25 1 HSMA21 Aspergillus westerdijkiae + - >8 0,25 1 HSMA22 Aspergillus westerdijkiae + - >8 0,25 1 HSMA23 Aspergillus sydowii + + 4 4 2 HSMA24 Aspergillus sydowii - - 4 0,5 2 HSMA25 Aspergillus versicolor/carneus - - 2 0,5 1 HSMA27 Aspergillus venenatus - - 2 0,5 1 HSMA29 Aspergillus niger sensu stricto + - 0,5 0,5 1 HSMA31 Aspergillus tubingensis + - 0,25 0,5 0,5 HSMA33 Aspergillus phoenicis + - 0,25 0,5 0,5 HSMA34 Aspergillus fumigatus sensu stricto - - 0,5 0,5 0,5 Aspergillus HSMA35 + - 2 0,25 0,5 ochraceus/ostianus/sepultus HSMA36 Aspergillus flavus sensu stricto - - 0,5 0,5 1 HSMA37 Aspergillus niger sensu stricto + - 0,5 0,25 1 HSMA38 Aspergillus fumigatus sensu stricto - - 0,5 0,5 0,5 HSMA39 Aspergillus minutus + + 2 4 2 HSMA40 Aspergillus dimorphicus + + 2 8 1 HSMA42 Aspergillus tubingensis + - 0,5 1 0,5 HSMA43 Aspergillus insuetus + + 2 4 4

Tabela 3.6 (continuação): Susceptibilidade aos antifúngicos dos isolados de Aspergillus spp. (provenientes de ambiente hospitalar), determinada através de meios de screening agar e microdiluições Microdiluições - CMIs ScreeningAgar Código Identificação molecular (µg/mL) ITZ VCZ AMB VCZ PCZ HSMA44 Aspergillus fumigatus sensu stricto - - 0,5 0,5 0,5 HSMA45 Aspergillus tubingensis + - 0,5 0,5 1 HSMA46 Aspergillus nidulans - - 0,5 0,125 0,5 HSMA47 Aspergillus minutos + + 0,5 2 2 HSMA51 Aspergillus protuberus + - 0,5 1 0,5 HSMA52 Aspergillus creber - - 0,0625 0,0625 0,125 HSMA53 Aspergillus protuberus - - 2 0,5 0,5 HSMA54 Aspergillus sydowii - - 1 2 0,5 HSMA55 Emericella quadrilátera + - 0,5 1 1 HSMA56 Aspergillus flavus sensu stricto - +/- 0,5 0,125 0,5 HSMA57 Aspergillus flavus sensu stricto - +/- 2 0,5 0,5 HSMA58 Aspergillus flavus sensu stricto + - 2 1 0,5 HSMA59 Aspergillus flavus sensu stricto - + 2 1 0,5 HSMA60 Aspergillus protuberus + - 2 2 0,5 HSMA61 Aspergillus protuberus + - 2 0,5 1 HSMA62 Aspergillus tenerensis - - 0,5 0,25 0,25 HSMA64 Aspergillus protuberus + - 0,5 1 0,5 HSMA65 Aspergillus fumigatus sensu stricto - - 0,5 0,0625 0,125 HSMA66 Aspergillus fumigatus sensu stricto - - 0,5 0,25 0,25 HSMA67 Aspergillus fumigatus sensu stricto + - 0,5 0,25 0,5 HSMA68 Aspergillus flavus sensu stricto - - 0,5 0,25 0,5 HSMA69 Aspergillus protuberus + + 0,5 0,5 0,5 HSMA70 Aspergillus terreus sensu stricto - - 1 1 1 HSMA71 Aspergillus terreus sensu stricto - - 0,5 0,5 0,5 HSMA72 Aspergillus terreus sensu stricto - - 2 0,5 0,5 HSMA74 Aspergillus sydowii - +/- 0,5 0,5 0,5 HSMA75 Aspergillus fumigatus sensu stricto - - 2 0,5 0,5 HSMA76 Aspergillus protuberus + - 2 0,5 0,5 HSMA77 Aspergillus niger sensu stricto + - 0,5 0,5 1 HSMA78 Aspergillus repens - - 0,5 0,5 0,5 Aspergillus ruber / Eurotium HSMA79 - - 0,25 0,25 0,25 rubrum Aspergillus repens/ A. HSMA81 - - 0,5 0,5 0,5 Pseudoglaucus HSMA82 Aspergillus tabacinus - - 0,5 0,25 0,5 HSMA83 Aspergillus protuberus + - 2 0,5 1 HSMA86 Aspergillus creber - - 0,25 0,5 HSMA88 Aspergillus sclerotium / bridgeri + + 0,25 2 1 HSMA89 Aspergillus hiratsukae - - 0,5 0,25 0,25 HSMA90 Aspergillus fumigatus sensu stricto - - 0,0312 0,0625 0,25 HSMA91 Aspergillus fumigatus sensu stricto - - 0,5 0,25 0,5 HSMA92 Aspergillus fumigatus sensu stricto - - 0,5 0,25 0,5

Na Tabela 3.7 é possível observar a distribuição das concentrações mínimas inibitórias (CMIs) (µg/mL) nas diferentes secções de Aspergillus sp. detetados em ambiente hospitalar. Foram testadas 10 secções diferentes, sendo a mais comum a secção Versicolores, representando 26% do total de isolados testados. A secção menos comum foi o Cremei, representando 1% do total. Como as secções Usti, Nidulantes, Terrei, Aspergilli e Cremei tinham pouca representatividade (quando comparados com as restantes secções), na Tabela 3.7 encontram-se agrupados. Para a anfotericina B, as secções Flavi e Nigri foram os que apresentaram uma maior média do valor de CMI (CMI=1); a secção Flavi apresenta, contudo, uma maior mediana (CMI=2). No entanto, é nas secções Versicolores e Circundati que se encontram isolados de Aspergillus sp. com maiores valores de CMI para a anfotericina B. Para voriconazol, todas as secções apresentaram valores de CMI relativamente baixos e semelhantes. No entanto, é na secção Versicolores no grupo que engloba as outras secções que se encontram isolados de Aspergillus sp. com maiores valores de CMI para o voriconazol (Cremei: CMI=8). Verificou-se exatamente a mesma distribuição para o posaconazol (Usti; CMI=4).

Tabela 3.7: Susceptibilidade aos antifúngicos das diferentes secções de espécies de Aspergillus sp. recolhidos em ambiente hospitalar. Secção Fumigati Flavi Nigri Versicolores Circumdati Outras secções nº isolados testados N=15 N=10 N=11 N=24 N=11 N=21 Antifúngico AMB AMB AMB AMB AMB AMB Mediana 0,5 2 1 0,5 0,5 0,5 Média Geométrica 0,7 1 1 0,76 0,84 0,81

Tabela 3.7 (continuação): Susceptibilidade aos antifúngicos das diferentes secções de espécies de Aspergillus sp. recolhidos em ambiente hospitalar. Secção Fumigati Flavi Nigri Versicolores Circumdati Outras secções Range 0,0312-2 0,5-2 0,25-1 0,0625-4 0,25-4 0,25-2 Antifúngico VRC VRC VRC VRC VRC VRC Mediana 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Média Geométrica 0,54 0,62 0,61 0,6 0,55 0,55 Range 0,0625-0,5 0,25-2 0,25-1 0,0625-4 0,25-2 0,125-8 Antifúngico PCZ PCZ PCZ PCZ PCZ PCZ Mediana 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Média Geométrica 0,6 0,7 0,7 0,64 0,63 0,64 Range 0,25-0,5 0,5-1 0,5-1 0,125-2 0,25-1 0,25-4 Legenda: AMB Anfotericina B; VCR Voriconazol; PCZ Posaconazol.

Otimização das condições de PCR do gene cyp51A para deteção Aspergillus fumigatus sensu sticto em amostras ambientais

As condições de PCR foram otimizadas no decorrer desta tese, tendo sido necessárias 11 tentativas para obter as condições ideais. O tamanho do fragmento que se pretende amplificar é de cerca de 1600 pares de bases. Para não tornar a tese demasiado exaustiva, exemplificam-se de seguida alguns dos resultados obtidos no decorrer do processo de otimização das condições de PCR. As condições de PCR foram as seguintes:

2ª tentativa

Desnaturação inicial a 95°C durante 5min; 94°C durante 30s; 60°C durante 45s; 40 ciclos 72°C durante 2min; Extensão final de 72°C durante 7min. 1 2 3

Figura 3.2: Resultado do gel de eletroforese, da 2ª tentativa de otimizar as condições de amplificação de PCR com o primer cyp51A. Legenda: 1 marcador molecular 100 bp; 2 Controlo positivo Aspergillus fumigatus sensu stricto NEQAS 2646 (resistente ao itraconazol); 3 Controlo positivo Aspergillus fumigatus sensu stricto ATCC204305 (sensível aos azóis). 5ª tentativa

Desnaturação inicial a 95°C durante 5min; 94°C durante 30s; 66°C durante 45s; 35 ciclos 72°C durante 2min; Extensão final de 72°C durante 7min.

1 2 3

Figura 3.3: Resultado do gel de eletroforese, da 5ª tentativa de otimizar as condições de amplificação de PCR com o primer cyp51A. Legenda: 1 marcador molecular 100 bp; 2 Controlo positivo Aspergillus fumigatus sensu stricto NEQAS 2646 (resistente ao itraconazol); e 3 Controlo positivo Aspergillus fumigatus sensu stricto ATCC204305 (sensível aos azóis). 32

Condições finais – 11ª tentativa

Desnaturação inicial a 95°C durante 5min; 94°C durante 30s; 64°C durante 45s; 36 ciclos 72°C durante 2min; Extensão final de 72°C durante 7min. 1 2 3

Figura 3.4: Resultado do gel de eletroforese, da 11ª tentativa de otimizar as condições de amplificação de PCR com o primer cyp51A. Legenda: 1 marcador molecular 100 bp; 2 Controlo positivo Aspergillus fumigatus sensu stricto NEQAS 2646 (resistente ao itraconazol); e 3 Controlo positivo Aspergillus fumigatus sensu stricto ATCC204305 (sensível aos azóis).

Especificidade do primer

Foi realizado um PCR convencional onde se aplicaram as condições de PCR otimizadas em que se testou a especificidade do primer cyp51A. Foram utilizadas várias espécies de Aspergillus, como: Aspergillus fumigatus sensu stricto, Aspergilllus lentulus, Aspergillus nidulans sensu stricto, Aspergillus niger, Aspergillus flavus sensu stricto, Aspergillus terreus sensu stricto e Aspergillus hiratsukae. A figura 3.4 mostra os resultados obtidos: foi obtida amplificação do fragmento pretendido (1600 pares de bases) apenas em Aspergillus fumigatus sensu stricto (poços 1 a 4). Espécies pertencentes à secção Fumigati (espécies crípticas de Aspergillus fumigatus) não amplificaram (poços 5 e 6), assim como espécies pertencentes a outras secções do género Aspergillus (poços 7-10), pelo que se verificou a grande especificidade deste primer para Aspergillus fumigatus sensu stricto.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Figura 3.5: Fotografia do gel de agarose resultante do PCR para testar a especificidade do primer Cyp51A. Legenda: M marcador 100 pb; 1 Aspergillus fumigatus NEQAS 2646; 2 Aspergillus fumigatus NEQAS 9648; 3 Aspergillus fumigatus ATCC 204305; 4 Aspergillus fumigatus NEQAS 2070; 5 Aspergillus lentulus VA107; 6 Aspergillus hiratsukae (HSMA 89); 7 Aspergillus nidulans NEQAS 2651; 8 Apergillus niger NEQAS 1517; 9 Aspergillus flavus ATCC 204304; 10 Aspergillus terreus VA49R1.

PCR (Polymerase Chain Reaction) tempo real

Deteção Aspergillus fumigatus sensu stricto em amostras ambientais

As amostras utilizadas para a realização do PCR em tempo real foram amostras de ar obtidas através do coletor de ar em meio líquido. Estas amostras foram utilizadas para a pesquisa e deteção de Aspergillus fumigatus sensu stricto que não possam ter sido detetados através dos métodos culturais. As amostras utilizadas estão descritas na Tabela 3.8. Os resultados obtidos podem ser observados na Figura 3.6. Verificou-se que além do controlo positivo, em duas das amostras analisadas (ar da urgência e ar exterior) ocorreu amplificação de DNA de Aspergillus fumigatus sensu stricto.

Tabela 3.8: Amostras de ar utilizadas param a realização do PCR em tempo real. Legenda: TMO transplante medula óssea; EH enfermaria hematologia; U urgência; EL elevador; CE consultas externas; E exterior. Código Descrição Origem Cor CP controlo positvo - CN controlo negativo - AA1 corredor TMO AA2 urgência U AA3 corredor EH AA4 elevador/corredor EL AA5 sala CE AA6 sala SE AA7 exterior E

Figura 3.6: Pesquisa de DNA de Aspergillus fumigatus sensu stricto diretamente em amostras de colheitas ambientais de ar em meio líquido por amplificação do gene Cyp51A através de PCR tempo real com Sybergreen.

Deteção de mutações de Aspergillus fumigatus que conferem resistência aos azóis por PCR tempo real

As amostras utilizadas estão descritas na Tabela 3.9. Estas amostras foram utilizadas para a deteção de mutações no gene Cyp51A e que conferem resistência aos azóis em Aspergillus fumigatus sensu stricto. Os resultados obtidos podem ser observados na Figura 3.7, 3.8, 3.9, 3.10 e Tabela 3.10.

Tabela 3.9: Amostras utilizadas para a deteção de mutações que conferem resistência aos azóis em Aspergillus fumigatus sensu stricto. Código Descrição Origem Cor Page 2 of 3 CP controlo positvo - CN controlo negativo - AA2 urgência U Sample Page Page 1 AA4 elevador/corredor EL Temp. Threshold 0° HSMA 91 Aspergillus fumigatus sensu stricto - Threshold 0.98637

Melt data for Melt A.Green

Figura 3.7: Temperatura de melting do locus onde ocorre a mutação L989H (fluorocromo verde) no gene Cyp 51A em No. Colour Name GenotypeAspergillus Peak fumigatus 1 Peak 2 sensu stricto. 1 CPLegenda: dF/dT derivative 66.5 of 78.5 fluorescence over temperature

2 CN 3 29 62.5 4 36 5 HSMA91 62.0 80.5

Bin Name Temperature Sample No. Sample Name Peak

(Continued on next page)...

Figura 3.8: Temperatura de melting do locus onde ocorre a mutação TR34 (fluorocromo amarelo) no gene Cyp 51A em Aspergillus fumigatus sensu stricto. Legenda: dF/dT derivative of fluorescence over temperature

mhtml:file://F:\RESISTENCIAS 20 4 2016\melt green.mht 08-11-2016

Figura 3.9: Temperatura de melting do locus onde ocorre a mutação T289A (flurocromo laranja) no gene CYP51A em Aspergillus fumigatus sensu stricto. Legenda: dF/Dt derivative of fluorescence over temperature

Figura 3.10: Temperatura de melting do locus onde ocorre a mutação Y121F (flurocromo vermelho) no gene CYP51A em Aspergillus fumigatus sensu stricto. Legenda: dF/Dt derivative of fluorescence over temperature

Tabela 3.10: Resultados da análise às mutações do cyp51A com as condições testadas. Amostras Mutação Cor CP AA2 AA4 HSMA91 Cyp51A Ct Tm Ct Tm Ct Tm Ct Tm L989H verde 32,63 66,5 - - 39,23 62,5 24,15 62,0 TR34 amarelo 32,00 66,3 - - - - 21,05 64,0 T289A laranja 30,90 67,0 36,75 63,3 36,24 63,2 20,36 63,2 Y121F vermelho 30,73 67,3 38,83 63,5 36,25 61,0 20,70 63,5 Resultado Resistente - - Sensível

Após validação dos controlos e análise dos resultados, verificou-se que o isolado HSMA91 não apresenta mutações nos loci pesquisados. Na amostra AA2 não foi possível concluir se existiria a mutação TR34 nem L989H e não apresenta as mutações T289A e Y121F. A amostra AA4 também não apresenta as mutações L989H, T289A e Y121F; não foi possível concluir se existiria a mutação TR34, uma vez que o loci correspondente não amplificou.

4. Discussão

Caracterização de isolados de Aspergillus spp.

Este trabalho teve como objetivo principal detetar e caracterizar Aspergillus spp. em ambiente hospitalar. Foram caracterizados (a nível molecular e a nível da sua suscetibilidade) todos os isolados de Aspergillus spp. provenientes de amostras ambientais, mas também de alguns isolados clínicos. Das 121 amostras clínicas apenas 24 apresentaram crescimento nos meios de screening (Tabela 3.5 dos resultados). Quer nos meios de malte (generalistas) quer nos meios suplementados com antifúngico, foi possível observar uma prevalência do isolamento de Penicillium sp. em relação a outras espécies, crescendo nos meios de screening tanto em meio de itraconazol como em voriconazol. Vários estudos ambientais efetuados na indústria corticeira mostram uma prevalência do género Penicillium [40], sendo a espécie Penicillium glabrum o agente da infeção respiratória suberose (doença respiratória dos trabalhadores da cortiça). Não existem quaisquer limites relativamente aos padrões de suscetibilidade do género Penicillium, pelo que a obtenção de crescimento em meios suplementados com as concentrações definidas de itraconazol e voriconazol não dá qualquer indicação sobre a suscetibilidade e resistência dos isolados. Das 27 amostras clínicas positivas, apenas 2 revelaram a presença de Aspergillus sp., sendo que uma das amostras tinha 2 espécies diferentes de Aspergillus sp. (amostra C19). Verificou-se o crescimento, no mesmo trabalhador, de Aspergillus fumigatus e Aspergillus niger resistentes ao itraconazol, não tendo estas espécies crescido no meio de screening suplementado com voriconazol. Só existiu mais um trabalhador (amostra C12) onde foi encontrada a presença de Aspergillus niger também este resistente apenas ao itraconazol. Além deste estudo, não está descrito qualquer outro trabalho que utilize os meios de screening para a deteção de isolados de Aspergillus sp. resistentes aos azóis neste tipo de setting. Esta abordagem permite, de uma forma rápida, fazer uma avaliação de alguns riscos inerentes à exposição ocupacional de Aspergillus spp. Das 51 amostras ambientais efetuadas, verificou-se que o género fúngico mais prevalente foi Penicillium, encontrado em 33% das amostras. Este género foi detetado nas colheitas de ar, superfícies e substrato (terra). Também o género Rhizopus foi encontrado com alguma frequência, neste caso mais frequentemente associado às superfícies. Nas amostras de ar, os géneros mais frequentemente encontrados foram o Penicillium sp. e o Rhizopus sp. Já nas amostras de substrato (terra), os géneros fúngicos mais frequentes foram Penicillium sp. e Aspergillus sp. Em alguns estudos [41] sobre a qualidade microbiológica e epidemiologia de fungos em ambiente hospitalar tem-se verificado também que o Penicillium é o género fúngico mais frequentemente isolado no ar. No ar, a concentração de fungos variou entre 0 (unidade transplante medula óssea e consultas externas) e 111 ufc/m3 (corredor do serviço de hematologia). De acordo com alguns autores [30], o valor limite sugerido de concentrações de fungos no ar é de 0 ufc/m3 em sala de operações, 50 ufc/m3 em salas de tratamento e de 200 ufc/m3 nas restantes unidades hospitalares. Assim, de acordo com o proposto, todas as unidades analisadas tinham valores dentro do proposto. Os valores obtidos no ar do corredor do Serviço de hematologia, apesar de considerarem dentro do limite, deverão ser tomados em consideração uma vez que as portas das salas de internamento/ tratamento desta unidade estão abertas para este corredor. No estudo efetuado, a concentração de fungos filamentosos nas superfícies variou entre 0 e 1000 ufc/m2. Apesar de não existirem quaisquer valores-limite definidos para as superfícies, 1000 ufc Aspergillus spp./m2 (em duas mostras de superfície) parece ser um valor muito elevado, representando uma elevada concentração de fungos. Os Aspergillus spp. isolados nestes casos foram Aspergillus ustus e Aspergillus tennesseensis da amostra AS19, correspondendo às estirpes HSMA 97, HSMA 98

37 e HSMA 104 e Aspergillus protuberus a amostra AS20 que corresponde à estirpe HSMA 102. Estas espécies têm sido descritas como causadoras de infeção [42,43]. Quanto às amostras de substrato (terra), a concentração de fungos variou entre 55 e 175 ufc/g. De relevo, encontraram-se isolados de Aspergillus sp. Após identificação molecular verificou-se que se tratavam das espécies Aspergillus fumigatus sensu stricto, Aspergillus tabacinus, Aspergillus westerdijkiae e Aspergillus minutus. Mortensen et al. [44], no entanto, verificou a existência de Aspergillus fumigatus em 78% das amostras de solo recolhidas no seu estudo, algumas delas no exterior de hospitais. No entanto outras espécies pertencentes a outras seções do género Aspergillus foram também isoladas. Verificou ainda que vários dos isolados obtidos apresentavam resistência aos azóis. Em 3 das 23 amostras de superfície foram encontrados isolados de Aspergillus sp. numa das amostras, foram detetadas 3 espécies diferentes de Aspergillus sp. Nos resultados apresentados na Tabela 3.1 é possível verificar 2 espécies que cresceram em meio de malte, que ao fazer apenas a cultura da amostra em meio de screening não iriam ser detetadas, isto permitiu detetar o aparecimento dos isolados HSMA 92 e HSMA 107 que não foram detetados nos meios de screening, por não apresentar resistência ao itraconazol nem ao voriconazol, mesmo depois de repetido o método e confirmado pelas microdiluições. O mesmo se sucedeu com o isolado HSMA 102, que não foi detetado nos primeiros meios de screening (cultura direta), mas após a obtenção de cultura em meio de malte e reisolamento em meios de screening verificou-se suscetibilidade reduzida ao itraconazol (crescimento positivo nestes meios), continuando a não apresentar crescimento no meio suplementado com voriconazol, tendo este padrão sido confirmado pelo método das microdiluições. Em 3 (2 amostras de ar em meio liquido e 1 amostra de ar em meio sólido) das 26 amostras de ar foram encontrados isolados de Aspergillus sp. Nos resultados apresentados na Tabela 3.2 é possível verificar 2 espécies que cresceram em meio de malte, que ao fazer apenas a cultura da amostra em meio de screening não iriam ser detetados, isto permitiu detetar o aparecimento do isolado HSMA 91 e HSMA 92, que não foi detetado nos primeiros meios de screening (cultura direta), mas após novo reisolamento em meios de screening não se verificou a suscetibilidade. O isolado HSMA 106 foi recolhido das amostras de ar diretamente em meio de screening itraconazol, apresentando resistência (cultura direta), apresentando novamente resistência ao itraconazol em meio de screening e crescimento duvido para o voriconazol, isto não foi confirmado pelas microdiluições. Da mesma forma, nos resultados apresentados na Tabela 3.3 é possível detetar o aparecimento de dois isolados de Aspergillus sp. que cresceram em meio de malte em amostras de terra, isto permitiu detetar o aparecimento dos isolados HSMA 90, HSMA 94, HSMA 95, HSMA 99 e HSMA 101 que não foram detetados nos meios de screening, por não apresentar resistência ao itraconazol nem ao voriconazol, mesmo depois de repetido o método e confirmado pelas microdiluições. O mesmo se sucedeu com os isolados HSMA 103 e HSMA 105, que não foram detetados nos primeiros meios de screening (cultura direta) mas após a obtenção de cultura em meio de malte e reisolamento em meios de screening verificou-se susceptilidade reduzida em ambos os antifúngicos, itraconazol e voriconazol, o que foi confirmado pelas microdiluições. Pode-se concluir que foi então importante o crescimento das amostras ambientais em meio de malte a fim de detetar a presença de Aspergillus sp. que poderiam não crescer em meio de screening, por não apresentarem resistências. Para avaliação da exposição a Aspergillus sp., é importante utilizar em paralelo um meio generalista e meios de screening. Foi realizada uma identificação morfológica a todos os isolados encontrados nas amostras clinicas e ambientais, esta identificação foi posteriormente verificada e validada por métodos moleculares. A identificação com base na sequenciação de regiões específicas do genoma permitiu efetuar uma identificação mais precisa pois a identificação morfológica apresenta algumas limitações ao nível da especificidade, em alguns casos fica apenas pela identificação ao nível da secção. A identificação

38 molecular, por sua vez, permite identificar os isolados até ao nível da espécie uma vez que as regiões sequenciadas têm uma grande variabilidade intraespecífica, apresentando, no entanto, pouca variabilidade interespecífica. A utilização de primers específicos permitiu a obtenção de bons resultados. Os primers ITS não têm um elevado poder discriminatório para determinados géneros fúngicos, pelo que é recomendada a sequenciação dos genes que codificam a β- tubulina e a calmodulina. A amplificação do gene da β-tubulina leva por vezes ao aparecimento de bandas inespecifícas, originando resultados pouco conclusivos uma vez que as sequências não são as ideais. Por sua vez a utilização dos primers que amplificam o gene da calmodulina (cmd5 e cmd6) permitem uma melhor discriminação das espécies de Aspergillus spp., conseguindo determinar inclusive espécies crípticas. Os 17 Aspergillus sp. identificados, exibiram um grau de homologia de 99% e 100% e foram identificados utilizando, consoante os casos, os três conjuntos de primers referidos anteriormente. Esta análise foi também realizada por outros autores. [35,45] Assim fica comprovada a eficácia e a necessidade da utilização desta metodologia na correta deteção e identificação de espécies. A utilização de uma abordagem polifásica (identificação morfológica e molecular), permitiu atingir um dos objetivos propostos para este estudo, caracterizando os isolados de Aspergillus sp. detetados em ambiente hospitalar. A utilização da biologia molecular para a correta identificação dos isolados de Aspergillus sp. foi vantajosa, pois permitiu que as identificações morfológicas que ficaram pelo nível do género fossem possíveis até ao nível da espécie reconhecendo e identificando espécies crípticas, que de outra forma não teriam sido identificadas. No global, e no decorrer de todo o estudo de vigilância de Aspergillus sp. em ambiente hospitalar, foram detetados 63% de espécies crípticas. As infeções causadas por espécies crípticas de Aspergillus sp. parecem ser menos frequentes que as infeções causadas por isolados de Aspergillus sensu stricto. No entanto, a eventual alta prevalência de espécies crípticas em ambiente hospitalar pode mudar o normal perfil de susceptibilidade aos antifúngicos, e um elevado número de estirpes resistentes presentes neste tipo de ambiente representa um perigo potencial, especialmente para doentes imunocomprometidos. [46]

Caracterização dos padrões de suscetibilidade aos antifúngicos dos isolados recolhidos

Foram recolhidos um total de 172 amostras clínicas e ambientais, destas 121 foram amostras clinicas e 51 amostras ambientais. A caracterização dos padrões de susceptibilidade aos antifúngicos dos isolados recolhidos foi realizada através de dois métodos diferentes, mas complementares, como será discutido posteriormente (meios de screnning e por microdiluições). Os dois métodos referidos complementam-se. Na Tabela 4.1 é possível observar algumas das diferenças que caracterizam os dois métodos.

Tabela 4.1: Diferenças entre os dois métodos (meios de screening e microdiluições) de caracterização dos padrões de susceptibilidade aos antifúngicos. Meios de Screening Microdiluições Preparação 2-3 horas 24 horas Incubação 7 dias 48 horas Pouco preciso – não há Muito preciso – parâmetros definidos (CLSI) parâmetros Análise de A susceptibilidade é analisada de acordo com A suscetibilidade não é analisada resultados valores de corte epidemiológico dependentes da de acordo com a secção de secção de espécies espécies

Na preparação dos métodos, os meios de screening foram mais vantajosos pois a sua preparação foi simples e rápida como já foi descrito anteriormente sendo que nas microdiluições foi mais demorado e trabalhoso. Relativamente ao crescimento das colónias os meios de screening requereram um período mínimo de 7 dias de incubação e as microdiluições requereram um período de 48h de incubação, embora tenha existido espécies que necessitaram de mais um pouco. Foi mais fácil caracterizar nos meios de screening os Aspergillus sp. resistentes e os não resistentes, mas foi difícil caracterizar os crescimentos considerados duvidosos, pois não se consegui definir bem se se tratavam de isolados resistentes ou não. Nas microdiluições segue-se a norma CLSI que está regulamentada, sendo a análise de resultados feita através deste método, sendo mais preciso e fácil. De uma forma geral, o método de eleição foram as microdiluições; os meios de screening apresentam vantagens em relação ao anterior pois são mais rápidos e menos dispendioso, podendo ser utilizado para uma primeira abordagem, na compreensão do padrão de susceptibilidade, mas o método das microdiluições apresenta-se como um método preciso para confirmação de resistências. Como podemos observar na Tabela 3.6 dos resultados existiram 9 casos de discrepância entre os valores dos meios de screening e das microdiluições. Os resultados dos meios de screening nestes casos não foram conclusivos, sendo difícil caracterizar como “positivo” ou “negativo” para o crescimento. Em todos os outros casos os valores coincidiram. De acordo com o método dos meios de screening, verificou-se que 54% dos isolados apresentavam suscetibilidade reduzida ao itraconazol (CMI≥4) e 14% ao voriconazol (CMI≥2). De acordo com a metodologia das microdiluições, 11% dos isolados apresentam resistência ao voriconazol, 12% ao posaconazol e 3% à anfotericina B. Dos isolados testados, 13% apresentava resistência a mais de um antifúngico. Para confirmar os resultados da obtidos pelo meio de screening em relação ao itraconazol, seria essencial proceder à determinação das CMIs através do método das microdiluições. Tal não foi possível fazer no decorrer deste trabalho, sendo esta lacuna uma limitação deste estudo. Apesar da grande preocupação da comunidade científica no que respeita à resistência aos azóis em Aspergillus fumigatus [47,48], os isolados analisados no decorrer deste estudo não apresentaram susceptibilidade reduzida a esta classe de antifúngicos. É nas secções Versicolores e Circundati que se encontram isolados de Aspergillus com maiores valores de CMI para a anfotericina B. A maior resistência da secção Circundati a anfotericina B foi previamente reportada por sabino et al 2016. [49]. No que respeita ao voriconazol, verifica-se que nas secções Versicolores e Cremei apresentam isolados com CMIs muito elevadas (4 e 8, respetivamente). Tal foi também observado por Espinel-Ingroff et al. [49]. Quanto ao posaconazol, é também na secção Versicolores e Usti que as CMIs se mostram mais elevadas, nomeadamente em Aspergillus insuetus e Aspergillus minutos. [50,51,52]

Otimização das condições de PCR do gene cyp51A

Foram otimizadas as condições de PCR pela realização de um PCR convencional para o gene cyp51A, para isso foi necessário proceder a algumas alterações das condições de PCR tais como diminuir a temperatura de anneling e diminuir o número de ciclos. Foram necessárias 11 tentativas, para se chegar às condições ótimas e assim se chegar a uma amplificação satisfatória, com a obtenção de um único fragmento de cerca de 1600 pares de bases.

Especificidade do primer

Foi realizado um PCR convencional onde se aplicaram as condições de PCR otimizadas, sendo testada a especificidade do primer cyp51A com DNA de diferentes espécies de Aspergillus spp. Foi possível observar que apenas as primeiras 4 amostras amplificaram, correspondendo a DNA de

Aspergillus fumigatus sensu stricto. As amostras seguintes não obtiveram amplificação, sendo elas DNA de Aspergilllus lentulus, Aspergillus nidulans sensu stricto, Aspergillus niger sensu stricto, Aspergillus flavus sensu stricto, Aspergillus terreus sensu stricto e Aspergillus hiratsukae. Os resultados obtidos e observados na Figura 3.5 dos resultados foram os esperados uma vez que se pretendia desenvolver uma metodologia com a utilização de primer e condições especificas para Aspergillus fumigatus sensu stricto, tendo o primer cyp51A amplificado apenas esta espécie. Uma das amostras testadas neste PCR foi o DNA de Aspergillus lentulus (amostra número 5 da Figura 3.5 dos resultados), sendo este uma espécie críptica para o Aspergillus fumigatus. Aspergillus lentulus e Aspergillus hiratsukae não amplificaram, comprovando assim a especificidade do primer cyp51A: específico para Aspergillus fumigatus sensu stricto, não amplificando DNA de espécies muito semelhantes as suas espécies crípticas. Estes resultados coincidem com diversos estudos que referem as semelhanças entre o Aspergillus fumigatus e o Aspergillus lentulus e com a Aspergillus. [35,45,53]

PCR tempo real

Deteção Aspergillus fumigatus sensu stricto em amostras ambientais

Além da identificação por sequenciação dos isolados obtidos através dos métodos culturais, também foi aplicada a técnica de PCR em tempo real para detetar a presença de Aspergillus fumigatus sensu stricto em amostras ambientais de ar, recolhidas pelo coletor de ar em meio líquido. Este PCR em tempo real foi realizado utilizando o flurocromo sybergreen que se intercalou nas moléculas de DNA, mostrando curvas de amplificação nas amostras de ar que possuíssem a presença de Aspergillus fumigatus sensu stricto. Foi realizado este teste nestas amostras de forma a testar a aplicabilidade deste primer específico na deteção da presença de Aspergillus fumigatus sensu stricto que de uma outra forma poderiam não ser detetados, por diversas razões que serão discutidas mais adiante nesta secção. Os resultados obtidos estão descritos na Figura 3.6 dos resultados, sendo possível observar que apenas a amostra AA2 e a amostra AA7 amplificaram. A partir amostra AA2 (ar da urgência) obteve-se, por cultura, o isolado HSMA 91 que corresponde a Aspergillus fumigatus sensu stricto: detetado e identificado por métodos culturais e convencionais, identificação confirmada por métodos moleculares e novamente confirmada desta vez por este método de PCR em tempo real. Na amostra AA7 (ar do exterior do hospital) não foi possível detetar a presença do Aspergillus fumigatus sensu stricto através da cultura em meios de screening nem em meio de malte. Várias explicações podem ser enunciadas, nomeadamente a de que a concentração de Aspergillus sp. pode ser menor nesta amostra e o seu crescimento pode ser inibido por outras espécies existentes no ambiente (amostra) em maior concentração ou com uma taxa de crescimentos mais rápida. Este resultado reforçou a tese de que esta metodologia permite detetar presença de Aspergillus fumigatus sensu stricto que de uma outra forma mais convencional não poderia ter sido detetada. Por outro lado, o resultado obtido pode também dever-se também ao facto da amostra AA7 ser de apenas de 300L de ar enquanto a amostra AA2 foi de 900L de ar; as diferenças de volumes de ambas as amostras devem-se à fraca autonomia do aparelho de recolha, o que fez como que a última amostra colhida no dia (a do ar exterior) não tivesse um volume tão grande. De facto, o uso deste método de deteção de DNA de Aspergillus fumigatus sensu stricto diretamente a partir da amostra traz diversas vantagens: a vantagem mais relevante é de que em cerca de 3h obtemos um resultado positivo ou negativo para a presença de Aspergillus fumigatus sensu stricto numa dada amostra, sendo perfeito para fazer a deteção desta espécie em amostras ambientais hospitalares por exemplo de controlo ambiental. De outra forma o tempo de espera é bastante mais demorado, sendo necessário o isolamento da amostra em meio de malte, a sua incubação mínima de 5- 7 dias, posterior identificação morfológica e por biologia molecular, demorando cerca de 8-10 dias até

41 se obter uma resposta. A elevada sensibilidade e especificidade desta metodologia são outras das vantagens que se poderão enunciar. Este método foi utilizado como complemento ao estudo e à pesquisa de isolados de Aspergillus spp., resultando num ótimo complemento pois permite uma deteção rápida e específica, principalmente no tipo de setting estudado (ambiente hospitalar). Contudo, existem desvantagens na aplicação desta metodologia, nomeadamente em relação ao custo muito elevado desta técnica. A deteção de DNA da secção Fumigati a partir de amostras ambientais tem vindo a ser efetuada para estudar ambientes de outros settings. [54]

Deteção de mutações de Aspergillus fumigatus que conferem resistência aos azóis por PCR tempo real

Os resultados preliminares obtidos para a deteção de mutações que conferem resistência aos azóis Aspergillus fumigatus sensu stricto, por PCR em tempo real e efetuado diretamente a partir da amostra, sugerem tratar-se de uma técnica com potencial no estudo deste tipo de ambientes. A sua relevância será tanto maior quanto maior a percentagem de isolados descrita como resistente, uma vez que em determinadas zonas geográficas a existência de estirpes resistentes é um problema emergente e de preocupação crescente. Foram utilizados DNAs de 2 amostras ambientais de ar, recolhidas pelo coletor de ar em meio líquido e DNA de uma estirpe já conhecida, como controlo. A partir amostra AA2 (ar da urgência) obteve-se, por cultura em meio de malte, o isolado HSMA 91 e a partir da amostra AA4 (ar do elevador/corredor) obteve-se, por cultura em meio de malte, o isolado HSMA 92. Estas foram as duas únicas amostras ambientais de ar do interior do hospital que apresentaram crescimento de Aspergillus fumigatus sensu stricto, tendo-se, portanto, prosseguido para a deteção das mutações através do kit já mencionado. Foi também utilizada o DNA da estirpe HSMA 91 como controlo do resultado obtido diretamente a partir da amostra. Os resultados obtidos podem ser observados na Tabela 3.10 dos resultados, sendo que se comprovou que a estirpe HSMA 91 é uma estirpe sensível aos azóis, tendo amplificado em todos os locus, mas as temperaturas de melting de cada um deles corresponder às temperaturas de melting esperadas para estirpes selvagens mutantes (controlos). A amostra AA2 não amplificou em 2 locus, enquanto a amostra AA4 não amplificou apenas num locus. Assim sendo, apenas se pode concluir que a amostra AA2 não apresenta as mutações T289A e Y121F, e a amostra AA4 não apresenta as mutações L989H, T289A e Y121F. Na Tabela 4.2 também foi possível comparar as várias metodologias aplicadas às amostras de ar.

Tabela 4.2: Tabela comparativa dos resultados obtidos por métodos culturais e convencionais em algumas amostras de ar. Amostras AA2 AA4 AA7 HSMA 91 Cultura malte + + - * Diretamente da amostra - - - * Meios de Estirpe obtida por cultura da screening * * * - amostra Microdiluições * * * S PCR de deteção de Aspergillus fumigatus sensu + - + +a stricto

sensível ao PCR de deteção de resistências ( 2 x (3locus) azóis locus) Legenda: + positivo; - negativo; x não foi realizado; *não aplicável; S sensível aos antifúngicos testados; a para confirmação de identificação

Analisando a Tabela 4.2 é possível verificar que o PCR detetou DNA de Aspergillus fumigatus sensu stricto na amostra AA2 e confirmar a identificação por obtenção de amplificação do DNA extraído de HSMA 91 (isolado obtido através da cultura da amostra AA2). Foi possível caracterizar a estirpe como sensível aos azóis (selvagem pelo menos para as 4 mutações testadas); o mesmo método aplicado diretamente à amostra não foi conclusivo, pois não amplificaram todos os locus (amplificaram 3 dos 4 locus). Como a estirpe HSMA 91 obtida em cultura pura e a extração de DNA foi realizada a partir daí, havendo uma maior quantidade de DNA disponível a testar. Por outro lado, na amostra AA2 a concentração de DNA de Aspergillus fumigatus poderia ser bastante inferior e a a amostra poderia estar mais contaminada, levando à inibição parcial da amplificação. Foi possível verificar que a amostra ambiental de ar AA2, teve crescimento de Aspergillus fumigatus em meio de malte, sendo o seu crescimento negativo em meios de screening suplementados com os azóis itraconazol e voriconazol, quer quando se realizou cultura da amostra de ar quer da estirpe resultante da cultura (HSMA 91). Também valores de CMIs de HSMA91 obtidos através das microdiluições correspondem a “sensível” para os antifúngicos testados, nomeadamente para os azóis (voriconazol e posaconazol), corroborando os resultados dos meios de screening. Em relação à amostra ambiental de ar AA4, esta apresentou crescimento de Aspergillus fumigatus em meio de malte. Não se obteve crescimento em meios de screening suplementados com os azóis itraconazol e voriconazol, quer quando se realizou cultura da amostra de ar quer da estirpe resultante da cultura (HSMA 92). Relativamente ao PCR em tempo real para deteção de Aspergillus fumigatus sensu stricto, houve uma amplificação muito tardia que foi considerada negativa, mas, no entanto, após análise dos resultados culturais, talvez se devesse ter considerado como positiva. Quanto às microdiluições, verificou-se que os valores de CMI obtidos para a estirpe HSMA 92 se encontram abaixo dos valores de cutoff, pelo que a estirpe foi considerada como sensível aos antifúngicos testados, corroborando os resultados dos meios de screening. Relativamente ao PCR em tempo real para deteção de resistências, foi apenas foi verificada a inexistência de mutações para 2 dos 4 locus. As razões para a falha na amplificação de dois dos locus serão possivelmente as mesmas que as apontadas anteriormente. Por último, na Tabela 4.2 encontra-se referida a amostra AA7 (amostra ambiental de ar exterior ao hospital): obteve-se amplificação de DNA de Aspergillus fumigatus sensu stricto por PCR em tempo real, não tendo sido, contudo, detetada a presença desta espécie em meio de malte, nem em meios de screening. Uma vez que a deteção molecular foi positiva para Aspergillus fumigatus sensu stricto, também dever-se-ia ter efetuado a deteção das resistências aos azóis. A justificação para não ter sido realizado o PCR em tempo real de deteção de resistências aos azóis prendeu-se com o facto de a utilização do kit ter sido a título experimental, sendo este como já referido anteriormente bastante caro. Foi assim dada prioridade à análise das amostras de ar do interior do hospital. De acordo com o nosso conhecimento, foi a primeira vez que se aplicou este kit para a pesquisa de DNA de Aspergillus fumigatus senso stricto em amostras ambientais. De acordo com o meu conhecimento, não foram até agora publicados trabalhos utilizando este kit para a deteção de isolados resistentes em colheitas de ar, recolhidas em ambiente hospitalar.

Conclusões finais e perspetivas futuras

A realização desta tese permitiu caracterizar detalhadamente isolados de Aspergillus spp. no que respeita à sua identificação molecular e suscetibilidade aos antifúngicos. Verificou-se a existência, nas diferentes amostras recolhidas no ambiente hospitalar estudado, de elevada percentagem de espécies crípticas pertencentes a diferentes secções de Aspergillus spp. Seria importante alargar este estudo a outros hospitais de outras regiões do país para efetuar um estudo mais detalhado da epidemiologia molecular e padrões de susceptibilidade de todos os isolados de Aspergillus spp. recolhidos. Neste

43 estudo, a utilização de abordagens polifásicas quer na identificação quer na determinação da suscetibilidade permitiu realizar testes mais precisos. A complementaridade das técnicas efetuadas permitiu aumentar a sensibilidade e especificidade das metodologias usadas. A otimização de uma reação de PCR para deteção de DNA de Aspergillus fumigatus sensu stricto diretamente a partir da amostra foi uma mais valia deste estudo e um contributo importante para a realização de estudos que permitam avaliar a presença de fungos potencialmente patogénicos no ar, principalmente em unidades hospitalares de doenças de risco. Num estudo subsequente a este, seria essencial determinar a sensibilidade desta técnica e, posteriormente, desenvolver esta metodologia de forma a transformar o método qualitativo (presença/ ausência de DNA de Aspergillus fumigatus sensu stricto) num método quantitativo. Os resultados preliminares do PCR para deteção de resistências diretamente a partir da amostra também sugerem tratar-se de uma abordagem de interessante aplicação, em caso de estudo de ambientes com suspeita da presença de Aspergillus fumigatus resistente. No entanto, e como perspetiva futura, seria importante desenvolver uma técnica in-house (como foi feito no decorrer deste estudo para a deteção do DNA de Aspergillus fumigatus sensu stricto na amostra) mas para a deteção de mutações que conferem resistência, desta forma, poder-se-ia evitar os elevados custos por amostra que são obtidos quando se usa o kit comercial.

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Anexos

Anexo 1 Meios Screening de resistência aos Azóis (meios seletivos de crescimento de isolados resistentes)

Ø Preparação do meio de meio de sabouraud sem cloranfenicol

Um meio esterilizado composto por 60 ml de água destilada e 7,5g de agar é colocado no banho a 100ºC até derreter por completo. Depois de derreter retirar o meio do banho e esperar que arrefeça um pouco. Pesa-se 0.2g de Itraconazol em 500µl de DMSO. Pesa-se 0.1g de Voriconazol em 500µl de DMSO. Adicionam-se depois 400µl de antifúngico aos 500 ml de meio de Sabouraud, de forma a obter concentrações de 4 µg/µL e 2 µg/µL, respectivamente. Homogeniza-se e distribui-se pelas placas de Petri. Espera-se que as placas arrefeçam e o meio solidifique e guardam-se a 4ºC.

Ø Preparação da estirpe

Adicionar 2 ml de PBS à placa de Petri. Com uma zaragatoa raspar bem a superfície da colónia. Com uma pipeta Pasteur retirar a suspensão resultante e colocar num tubo de vidro (tubo 1). Levar ao vortex e deixar repousar. Num novo tubo de vidro (tubo 2) adicionar 5 ml de soro fisiológico e adicionar 2 ou 3 gotas do tubo 1. Levar novamente ao vortex e colocar o tubo 2 no espectrofotometrometro e ler 80% a 82% de transmitância a 530 nm.

Ø Inoculação da estirpe

Embebe-se a zaragatoa na suspensão da estirpe preparada anteriormente; escorre escorre-se o excesso na parede do tubo. Faz-se de seguida a inoculação da estirpe através da técnica do riscado em estrias finas em diferentes sentidos.

Anexo 2 Procedimento microdiluições

Para a realização das microdiluições foi necessário utilizar o meio de RPMI.

Ø Preparação meio de RPMI

A preparação do meio de RPMI, foi feito através do seguinte procedimento: Pesou-se 10,4g de RPMI 1640 (Lonza Whittaker), pesou-se 34,53g MOPs (Sigma-Aldrish); Depois das pesagens realizadas, adicionou-se a um frasco rolhado de 1l, 900ml de H20 destilada, dissolvendo- se as amostras. Ao mesmo tempo acerta-se o pH com NaOH, pretendendo-se obter um pH igual a 7.

Por fim perfaz-se o volume total de 1l com H20 destilada. Conserva-se a 4ºC. Para cada antifúngico, foram marcados 10 tubos falcon e 10 eppendorf, com o nome de cada antifúngico a data e numerados de 1 a 10 (número de diluições). Distribuiu-se o solvente pelos eppendorf’s como podemos observar na Figura 6.1. Nos antifúngicos, anfotericina B, voriconazol e posaconazol, o solvente é DMSO. Conservar a 4ºC. Distribuir 9,9 ml de RPMI pelos tubos falcon e conservar a 4ºC.

Ø Pesagem dos antifúngicos:

Voriconazol/Posaconazol

Na balança de precisão pesar 19,2 mg de voriconazol/posaconazol para o eppendorf. Adicionar 1,5 ml DMSO. Diluir 1:8, num novo eppendorf (stock final) colocar 700 µl DMSO e de seguida adicionar 100µl do eppendorf anterior.

Cálculos realizados: !"#$ !" !"#$%& = 100% ! !"#!$#%&'çã! !"#$% : 12800!"/!" = 12,8!"/ ! !"#$%& !"#!" : 1500!" = 1,5!" ! ! ! = ↔ 12,8 = ↔ ! = 19,2!" ! 1,5

Anfotericina B

Na balança de precisão pesar 4,8 mg de anfotericina B para o eppendorf stock. Adicionar 1,5 ml DMSO na anfotericina B ao pó pesado.

Cálculos realizados: !"#$ !" !"#$!" = 100% ! !"#!$#%&'çã! !"#$% : 3200!"/!" = 3,2!"/ ! !"#$%& !"#$% : 1500!" = 1,5!" ! ! ! = ↔ 3,2 = ↔ ! = 4,8!" ! 1,5

Ø Preparação das Estirpes:

O Tubo que corresponde à solução stock preparada anteriormente para cada antifúngico. Pipetar para 10 tubos diferentes contendo DMSO, de acordo com o esquema descrito na Figura 6.1. Levar ao vortex. Pipetar 100µl da solução antifúngica preparada em cada eppendorf para um tubo falcon contendo RPMI.

Figura 6.1: ilustração do procedimento de distribuição do solvente pelos eppendorf’s.

Microplacas

Em cada linha da microplaca marcar o código da estirpe a analisar e em cada coluna numerar de 1 a 10, bem como o controlo positivo (c+) e o controlo negativo (c-). Em cada linha pipetar 100µl de antifúngico já preparado nos tubos falcon (nas diferentes concentrações: Poço 1 – mais concentrado; Poço 10 – menos concentrado). Para os outros dois poços (11 e 12) pipetam-se 100µl de RPMI sem antifúngico. As microplacas com antifúngicos poderão ser conservadas a -80ºC por 6 meses.

Ø Preparação do inóculo

Numa fase inicial prepara-se uma levedura (Candida parapsilosis – ATCC 22019) e um fungo filamentoso (Aspergillus flavus – ATCC 204304) de referência para controlo das concentrações dos antifúngicos preparados. Após validar os resultados obtidos, cujas MICs terão de corresponder aos valores esperados e referidos na norma CLSI, preparam-se todas as outras estirpes a testar, incluindo sempre, em cada ensaio, estirpes de referência. Assim, sempre que se realiza a inoculação das estirpes é inoculada uma linha em cada antifúngico do Aspergillus flavus ATCC 204304 que desta forma como estirpe de referência para o teste de suscetibilidade aos antifúngicos. O procedimento para preparação de inóculo é diferente caso se trate de um fungo leveduriforme ou filamentoso:

Fungo Leveduriforme: num tubo1 adicionar 5 ml de soro fisiológico. Com uma ansa retirar pouco da colónia e dissolver no soro fisiológico (tubo1). Colocar o tubo1 no espectrofotometrometro e ler 90% de transmitância a 530 nm. Num tubo pipetar 2,940 ml de RPMI e adicional 60µl da suspensão

50 anteriormente preparada no tubo1. Vortex. Num novo tubo (tubo2) pipetar 9,5 ml de RPMI e adicionar 500µl do tubo1. É o inóculo preparado no tubo 2 que será então adicionado à microplaca.

Fungo Filamentoso: adicionar 2 ml de PBS à placa de Petri. Com uma zaragatoa raspar bem a superfície da colónia. Com uma pipeta Pasteur retirar a suspensão de esporos resultante e colocar num tubo de vidro (tubo 1). Levar ao vortex e deixar repousar 5 minutos para que as estruturas maiores (hifas e agregados de esporos) se depositem. Num novo tubo de vidro (tubo 2) adicionar 5 ml de soro fisiológico e adicionar 2 ou 3 gotas do sobrenadante do tubo 1.Levar de novo ao vortex e colocar o tubo 2 no espectofotometro e ler 80% a 82% de transmitância a 530 nm. Num tubo (2) pipetar 4410 ml de RPMI e adicionar 90µl da suspensão anteriormente preparada no tubo 1. É o inóculo preparado no tubo 2 que será então adicionado à microplaca.

De seguida, procede-se à inoculação das microplacas já previamente preparadas com os antifúngicos. Para tal, pipetar 100µl da estirpe em cada poço (1 a 10) no controlo positivo pipetar 100µl do tubo2. No controlo negativo pipetar 100µl de RPMI. Colocar as microplacas na estufa a 37ºC durante 48h.

Confirmação da concentração do inóculo:

Fungo leveduriforme: num novo tubo (tubo3) pipetar 1900µl de RPMI e adicionar 100µl do tubo2. Pipetar 500µl do tubo3 para uma placa de sabouraud e espalhar bem com um espalhador a suspensão. Colocar na estufa a 37ºC durante 48h. Fazer a contagem das unidades formadoras de colónias após as 48h.

Fungo Filamentoso: num novo tubo (tubo2) pipetar 1800µl de RPMI e adicionar 20µl do tubo1. Pipetar 100µl do tubo2 para uma placa de sabouraud e com o espalhar bem com um espalhador a suspensão. Colocar na estufa a 37ºC durante 48h. Fazer a contagem das unidades formadoras de colónias após as 48h.

A leitura das microplacas é feita ao fim de 48h conforme está descrito e recomendado pelo método CLSI. A MIC é definida como pela visualização da menor concentração de antifúngico, que causa a inibição completa do crescimento. Para validar o resultado, a concentração de inóculo obtida (através da contagem das unidades formadoras de colónias) terá de coincidir com a concentração esperada e os valores de MIC obtidos com a estirpe de referência terão de coincidir com a gama de valores indicados na norma CLSI.

Anexo 3 Produção científica associada a este estudo – publicações em artigo

O artigo com o título “Fungos e Ambiente Hospitalar: Preocupações Relevantes e Riscos para o Doente” do qual sou co-autora foi publicado na revista “Infecção e Sepsis” na edicção de Janeiro de 2017.

Figura 6.2: Excerto de artigo “Fungos e Ambiente Hospitalar: Preocupações relevantes e riscos para o doente”.

Produção científica associada a este estudo – publicações em poster

O poster com o título “New approach to study the real exposure to fungi in cork industry: nasal swabs mycobiota investigation coupled with screening on fungal resistance to azoles” que sou autora foi apresentado no “Annual Meeting of International Society of Exposure Science” durante 9 e 13 de outubro de 2016 em Utrecht, na Holanda.

New approach to study the real exposure to fungi in cork industry: nasal swabs mycobiota investigation coupled with screening on fungal resistance to azoles Carla Viegas1, Anália Clérigo2, Cátia Pacífico1, Tiago Faria1, Raquel Sabino3, Mariana Francisco3, Cristina Veríssimo3, Susana Viegas1,4 1 Environment and Health RG - Lisbon School of Health Technology/Institute Polytechnic of Lisbon, Lisbon, Portugal 2 Centro de Estudos Espirométrico - Lisbon School of Health Technology/Institute Polytechnic of Lisbon, Lisbon, Portugal 3 Mycology Laboratory, National Institute of Health Dr. Ricardo Jorge, Lisbon, Lisbon 1649-016, Portugal 4 Centro de Investigação e Estudos em Saúde Pública, Escola Nacional de Saúde Pública, ENSP, Universidade Nova de Lisboa, Lisbon, Portugal

For further information please contact: [email protected]

Introduction Results The permanent contact with cork may lead to constant Fungal contamination was evident in 267 from the 305 exposure to fungi, raising awareness as a potential occupational samples collected (87.5%). hazard in the cork industry [1]. From 267 contaminated samples, 109 presented countless The presence of fungi belonging to the Penicillium glabrum units of Chrysonilia sytophila (40.8%) besides other fungal complex has been associated with the development of isolates. respiratory diseases such as suberosis, one of the most In Figure 2 is possible to observe that the most prevalent prevalent diseases among workers from cork industries, genus found was Penicillium sp. (73.6%), followed by besides occupational asthma [2,3]. Azoles are used as pesticides Cladosporium sp. (9%), Chrysonilia sp. (2.9%) and but also the first line therapy in the treatment of Aspergillus Acremonium sp. (2.6%). infections; azole-resistance as been described as to have also an environmental source and is considered an emerging public

health problem.

Aim of Study The aim of this work was to characterize fungal distribution and to evaluate the presence of azole-resistant Aspergillus isolates in nose swab samples from the cork industry workers. Methods Nose swab samples were collected from 305 workers of two cork industries. The introduction of the swab for biological

collection was done along the septum to 2.5 cm from the

external orifice (up to "feel " a slight resistance ) and rotated several times before removing it . Figure 2 – Most prevalent genus found

From the 305 samples collected 161 belong to workers from the cork yard.

Penicillium sp., Cladosporium sp., Acremonium sp. and A.

Figure 1 – Nose swab samples niger complex were the most commonly found species in Samples were plated onto malt extract agar (MEA) media (for workers from the cork yard. morphological identification of the present mycobiota) and also Itraconazole resistant isolates of the Aspergillus genus were onto azole-resistant screening media of Itraconazol and found in nose samples from two workers of the cork yard, Voriconazol (to detect resistant Aspergillus isolates). Plates belonging to the Nigri and Fumigati sections. were incubated at 27ºC during 5 to 7 days.

Conclusions This approach allowed knowing the real contact with fungi of the cork industry workers. Additionally, it was possible to obtain detailed data regarding the fungal mycobiota in order to allow a more accurate risk assessment. Ongoing studies in this setting are being performed aiming to assess possible health implications related to fungal exposure and to identify some of the measures that can be in place to reduce work environmental contamination and workers exposure. References [1] Serra R, Peterson S, Venâncio A. Multilocus sequence identification of Penicillium species in cork bark during plank preparation for the manufacture of stoppers. Res Mycrobiol 2008;159:178-86. doi: 10.1016/j.resmic.2007.12.009 [2] Basílio M, Gaspar R, Pereira C, Romão M. Penicillium glabrum cork colonising isolates-preliminar analysis of their genomic similarity. Rev Iberoam Micol 2006;23:151-4. PMID: 17196021 [3]Pimentel JC, Avila R. Respiratory disease in cork workers (“suberosis”). Thorax 1973;28:409-23. doi: 10.1136/ thx.28.4.409

Figura 6.3: Poster apresentado no “Annual Meeting of International Society of Exposure Science”.

O poster com o título “Aspergillus nosocomial infections - Do cryptic species found in hospital environment matter?” que sou autora foi apresentado no “7th Advances against Aspergilosis” durante 3 e 5 de março de 2016 em Manchester, no Reino Unido.

Aspergillus nosocomial infec9ons Do cryp9c species found in hospital environment ma@er?

Raquel Sabino1, Carla Viegas2, Cris5na Veríssimo1, Francisco M1,3, Carlos Mar5ns4, Karl V. Clemons5,6, David A. Stevens5,6

1 Na5onal Ins5tute of Health Dr. Ricardo Jorge – URSZ- Infec5ous Diseases Department, Lisbon, Portugal 2 Contacts: Scien5fic Area of Environmental Health, Lisbon School of Health Technology, Polytechnic Ins5tute of Lisbon, Portugal [email protected] 3 Faculty of Sciences, University of Lisbon, Portugal [email protected] 3 North Lisbon Hospital Centre, EPE, Lisbon, Portugal Phone number: (00351)217519247 4 California Ins5tute for Medical Research, San Jose, CA, United States Mycology laboratory – Infec5ous Diseases Department Na5onal Health Ins5tute Dr. Ricardo Jorge, Av. Padre Cruz, 5 Department of Medicine, Division of Infec5ous Diseases and Geographic Medicine, Stanford University, Stanford, CA, United States 1649-016 Lisboa, Portugal Abstract Purpose: Aspergillus is a major threat causing nosocomial infec5ons in immunocompromised pa5ents. Advances in molecular methods allowed species iden5fica5on through sequencing of specific genes, allowing high discrimina5on amongst isolates. Different Aspergillus species have different suscep5bili5es to an5fungals and several cryp5c species have been described as less suscep5ble to specific an5fungals. Therefore, we addressed the possible influence of hospital environmental isolates in the overall situa5on of Aspergillus an5fungal resistance. Methods: During one year, 101 air and 99 surface samples were collected from the environment of a Portuguese Central Hospital of Lisbon. Aspergillus isolates were iden5fied morphologically and by molecular methods. Genomic DNA was prepared from each isolate and the sequenced to achieve the correct species iden5fica5on. Determina5on of the an5fungal suscep5bility of selected isolates was performed by microdilu5on (CLSI M38-A2). The an5fungal agents studied were deoxycholate amphotericin B, itraconazole, voriconazole, and posaconazole. Results: From the 200 samples collected, 75 isolates of Aspergillus were isolated and iden5fied to sec5on by ITS sequence; cryp5c species were iden5fied by β-tubulin and calmodulin sequencing. Ten different sec5ons within the Aspergillus genus were iden5fied: Versicolores (N=20), Nigri (N=11), Flavi (N=10), Circumda5 (N=10), Fumiga5 (N=8), Us5 (N=4), Terrei (N=4), Nidulantes (N=4), Aspergilli (N=3) and Cremei (N=1). From these, 25 different Aspergillus species were iden5fied by β-tubulin and calmodulin sequencing, and a high percentage of cryp5c species (not sensu stricto) was found (59%). Sec5ons Us5, Versicolores and Circumda5 harbored the highest propor5on of cryp5c species [100% (4/4), 95% (19/20) and 90% (9/10), respec5vely]. From the 75 isolates, 22 were tested for their an5fungal suscep5bility. Of the 8 Fumiga5 isolates, there was 1 cryp5c species. The Circumda5, Versicolores and Nigri complexes contained isolates of cryp5c species with reduced suscep5bility to some of the an5fungals used in clinical therapeu5cs. In the Circumda5 complex, 3/5 isolates had MIC to amphotericin B >8µg/ml and 1/5 MIC >8µg/ml to itraconazole; 1/6 isolates from Versicolores complex had MIC to itraconazole >8 µg/ml; all 4 isolates from Nigri complex had MIC to itraconazole= 4 µg/ml. Conclusion: Since Aspergillus infec5ons are mainly nosocomial, the knowledge of the molecular epidemiology and determina5on of the suscep5bility profile of environmental isolates, may allow preven5ve or correc5ve measures to be taken.

Table 1. Aspergillus species and number of isolates collected in hospital environment Introduc9on Aspergillus Aspergillus Number of Aspergillus Aspergillus Number of Invasive aspergillosis is an important cause of mortality in subjects undergoing hematopoie5c stem cell transplants sec9on species isolates sec9on species isolates and is also an important cause of opportunis5c respiratory and disseminated infec5ons in other types of Versicolores A. versicolor A. terreus sensu immunocompromised pa5ents (1). In a propor5on of cases, it is suspected that Invasive aspergillosis is acquired (N=20) sensu stricto 1 Terrei (N=4) stricto 4 during hospitaliza5on, by airborne transmission from an environmental source of contamina5on (2–4). Molecular Nidulantes Emmericella methods allowed the iden5fica5on of new Aspergillus species that are morphologically similar but dis5nct at the A. protuberus 8 (N=4) nidulans 3 Emmericella molecular level (cryp5c species), and may show lower suscep5bility to an5fungal agents. Because of the high A. sidowii 6 quadrilatera 1 mortality rate associated with invasive aspergillosis in vulnerable pa5ents, it is essen5al to minimize the risks A. tabacinus 1 Us5 (N=4) A. minutus 3 associated to environmental exposure. A. tenneensis 1 A. insuetus 1 Circumda5 A. ochraceus A. venenatus 1 (N=10) sensu stricto 1 A. creber 2 A. sclero5um 4 Objec9ves Fumiga5 A. fumigatus (N=8) sensu stricto 7 A. westerdjikae 3 Our primary aim was to determine the an5fungal suscep5bility of Aspergillus collected from the environment of Neosartorya hospital wards of a Portuguese Central hospital housing pa5ents at higher risk to develop invasive fungal hiratsukae 1 A. persii 2 infec5ons. A. flavus sensu Aspergilli Flavi (N=10) stricto 10 (N=3) Euro5um repens 2 A. niger sensu Euro5um Nigri (N=11) stricto 5 rubrum 1 Methods Cremei During a one-year period, a total of 101 air samples and 99 surface samples were collected a Portuguese Central A. phoenicis 2 (N=1) A. dimorphicus 1 Hospital. Aspergillus isolates were plated for growth as single colonies on malt extract agar with chloramphenicol A. tubigensis 4 to check the colony purity. These isolates were iden5fied on the basis of morphology and through the use of molecular tools. Genomic DNA was prepared from each isolate and the sequencing of the Internal Transcribed Ø For all the isolates that grew in the azole screening media, the minimal inhibitory concentra5on (MIC) Spacers (ITS) regions was used to determine the species complex; β-tubulin and calmodulin sequencing was done will be determined using the microdilu5on method in order to confirm the previous results. So far, the MIC to achieve the correct species iden5fica5on. The isolates were screened for azole resistance using media was determined in 22 hospital environmental Aspergillus isolates (Table 2). supplemented with itraconazole (4µg/ml) (ICZ-agar) and voriconazole (2µg/ml) (VCZ-agar) (Fig.1) . Table 2. Minimal inhibitory concentration (MIC) was determined to 22 hospital environmental Aspergillus isolates Determina5on of the an5fungal suscep5bility of selected isolates was performed by microdilu5on (CLSI M38-A2) MIC MIC MIC MIC (Fig.2). The an5fungal agents studied were deoxycholate amphotericin B, itraconazole, voriconazole, and Identification Source Ward Species AMB ICZ VCZ PCZ code posaconazole. (µg/mL) (µg/mL) (µg/mL) (µg/mL) 12 - 227 air Hematology A. sidowii 2 4 1 2 12 - 235 surface Hematology A. sidowii 4 >8 4 2 12 - 236 air Hematology A. sidowii 4 4 0.5 2 12 - 237 surface Hematology A. versicolor sensu stricto 2 4 0.5 1 12 - 239 air Hematology A. venenatus 2 4 0.5 1 Growth control Growth control 12 - 213 air Hematology A. tubigensis 1 4 ≤0.25 1 12 - 214 surface ICU A. phoenicis 1 4 ≤0.25 1 12 - 215 air Hematology A. niger sensu stricto 1 4 ≤0.25 1 12 - 216 air Hematology A. niger sensu stricto 1 4 0.5 1 2 2 0.5 1 ICZ-agar VCZ-agar ICZ-agar ICZ-agar 12 - 219 surface ICU A. persii 12 - 223 air ICU A. persii 4 4 0.5 0.5 12 - 224 air Hematology A. slero5um 2 4 0.5 1 12 - 226 air Hematology A. sclero5um 2 4 ≤0.25 1 a b 12 - 230 air Hematology A. sclero5um 4 8 0.5 1 12 - 232 air ICU A. westerdjikae >8 4 ≤0.25 1 Fig. 1. Azole resistant screening media: (a) A. tubigensis isolate resistant to itraconazole (b) A. sclerotium Fig. 2. Determination of the antifungal susceptibility by microdilution (CLSI isolate resistant to itraconazole and voriconazole M38-A2) 12 - 233 air Hematology A. westerdjikae >8 4 ≤0.25 1 12 - 234 air Hematology A. westerdjikae >8 4 ≤0.25 1 12 - 217 air ICU A. flavus sensu stricto 2 2 0.5 0.5 12 - 218 surface ICU A. flavus sensu stricto 2 2 0.5 1 12 - 220 surface ICU A. flavus sensu stricto 2 2 0.5 1 Results 12 - 221 air Hematology A. flavus sensu stricto 2 2 ≤0.25 0.5 12 - 222 air Hematology Emmericella nidulans 2 2 ≤0.25 0.5

Ø Among the 75 Aspergillus isolates anayzed, 10 different sec9ons within the genus Aspergillus were iden5fied: Ø From the tested isolates, complexes Circunda0, Versicolores and Nigri showed isolates – namely cryp9c Versicolores (N=20), Nigri (N=11), Flavi (N=10), Circumda5 (N=10), Fumiga5 (N=8), Us5 (N=4), Terrei (N=4), species- with reduced suscep5bility to some of the an5fungals used in clinical therapeu5cs Nidulantes (N=4), Aspergilli (N=3) and Cremei ; 25 different species of Aspergillus were iden5fied by β-tubulin and calmodulin sequencing, and a high percentage of cryp5c species (i.e., not sensu stricto) was found (59%) Ø Several isolates presented resistance to more than one an5fungal substance, namely A. sidowii, a (N=1)(Table 1). cryp5c species from the Versicolores sec5on (highlited in yellow in Table 2); and A. persii, A. sclero0um and A. westerdjikae, cryp5c species belonging to the Circumda5 sec5on (highlited in blue in Table 2). Ø Sec5ons Us5, Versicolores and Circumda5 harbored the highest propor5on of cryp5c species [100% (4/4), 95% (19/20) and 90% (9/10), respec5vely]. Sec5ons Flavi and Terrei were comprised of only sensu stricto isolates Discussion and Conclusions (Table 1). Ø Aspergillus is frequently isolated from hospital environment and a high percentage of cryp5c species may be present Ø Un5l now, 61 Aspergillus isolates were screened in agar containing azoles. From those, 16 (26%) grew in ICZ- agar, 10 (16%) grew in VCZ- agar and 15 (25%)in both media. The isolates belonging to Fumiga5 sec5on Ø Although aspergillosis caused by cryp5c species remain less frequent than infec5ons caused by “sensu (N=5) and to Nidulantes sec5on (N=3) tested so far did not grew in any resistant screening media. All isolates stricto” isolates, the eventual high prevalence of cryp5c species in hospital environment may change the belonging to Nigri sec5on (N=11) grew in ICZ-agar but not in VCZ-agar and the ones belonging to the Us5 “regular” an5fungal suscep5bility profile, increasing the number of resistant strains, which implies a sec5on (N=4) grew in both. poten5al danger, especially in wards with immunocompromised pa5ents. Ø The molecular study of Aspergillus epidemiology (including the iden5fica5on of cryp5c species) and determina5on of the suscep5bility profile of environmental isolates may contribute to the preven5on (1) Marr K.A., Carter R.A., Boeckh M., et al. Invasive aspergillosis in allogeneic stem cell transplant recipients: changes in epidemiology and risk factors. Blood 2002;100:4358-66 (2) Haiduven D . Nosocomial aspergillosis and building construc5on . Med Mycol 2009; 47 ( suppl 1 ): S210 – S216 . (3)Hajjeh RA , Warnock DW . Counterpoint: invasive aspergillosis and the environment—rethinking our approach to preven5on . Clin Infect Dis 2001 ; 33 : 1549 – 1552 . and control of nosocomial aspergillosis. (4)Vonberg RP , Gastmeier P . Nosocomial aspergillosis in outbreak setngs . J Hosp Infect 2006 ; 63 : 246 – 254 .

Figura 6.4: Poster apresentado no “7th Advances against Aspergilosis”.

Foi apresentado também nas atas do congresso como pode ser observado na Figura 6.5.

Figura 6.5: Ata do congresso no “7th Advances against Aspergilosis”.

Anexo 4 Extras da tese – complemento da rotina de laboratório

Resultados: extração e sequenciação leveduras provenientes de amostras clínicas

Foi identificada a espécie, através de biologia molecular, de 35 isolados de leveduras provenientes de amostras clínicas da rotina do laboratório e colhidas durante o ano de 2015. Todas as espécies extraídas e identificadas foram conservadas a 4ºC. Foi feita a extração e a identificação por biologia molecular a 35 isolados, tendo sido conservadas 26 amostras. Foram identificadas 25 Candida albicans, 1 Candida pulchecherrima, 1 Candida tropicalis, 1 Candida parapsilosis, 2 Candida glabrata, 1 Cryptococcus neoformans e 1 Geotrchum bryndzae. Os produtos biológicos analisados foram 5 amostras de unha, 14 exsudados vaginais, 5 estirpe, 5 amostras de lavado bronca alveolar, 4 amostras de hemoculturas, 1amostra de uretral e 1 amostra de exsudado profundo.

Tabela 6.1: Resultados da extração e identificação molecular de leveduras de amostras da rotina do laboratório de micologia do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge. Produto Identificação Identificação Homologia Coverage Código biológico morfológica molecular (%) (%) L1 Unha Candida albicans Candida albicans 99 99 L2 vaginal Candida albicans Candida albicans 100 100 L3 estirpe Candida tropicalis Candida tropicalis 100 100 L4 vaginal Candida albicans Candida albicans 89 99 L5 vaginal Candida albicans Candida albicans 99 69 L6 Estirpe Candida albicans Candida albicans 100 97/96 Candida Chrysoperlae/Pulch L8 Unha 99 99 pulchecherrima erima L9 Unha Candida albicans 98 67 Hemocultur L11 Candida albicans Candida albicans 99 100 a L12 vaginal Candida albicans Candida albicans 100 100 L13 estirpe Candida albicans Candida albicans 100 69 L14 vaginal Candida albicans Candida albicans 98 67 L15 LBA Candida albicans Candida albicans 100 100 L16 LBA Candida albicans Candida albicans 100 100 L17 vaginal Candida albicans Candida albicans 99 100 L18 vaginal Candida albicans Candida albicans 100 99 L19 vaginal Candida glabrata Candida glabrata 100 96 L20 vaginal Candida albicans Candida albicans 100 100 L21 vaginal Candida albicans Candida albicans 100 100 vaginal Candida albicans + L22 Candida albicans 96 44 Candida glabrata L23 vaginal Candida albicans Candida albicans 99 99

Tabela 6.1 (continuação): Resultados da extração e identificação molecular de leveduras de amostras da rotina do laboratório de micologia do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge. Produto Identificação Identificação Homologia Coverage Código biológico morfológica molecular (%) (%) L24 Vaginal Candida albicans Candida albicans 99 100 L25 Unha Candida parapsilosis Candida albicans 98 99 L26 unha Candida albicans Candida albicans 100 100 Geothichum L27 estirpe Geotrichum spp. 100 100 bryndzae Cryptococcus Cryptococcus L28 estirpe 98 99 neoformans neoformans L29 vaginal Candida albicans Candida albicans 100 100 Candida L30 estirpe Candida parapsilosis 100 100 parapsilosis L31 estirpe Candida glabrata Candida glabrata 100 100 L32 LBA Candida albicans Candida albicans 100 100 L34 unha Candida albicans Candida albicans 100 99 L35 estirpe Candida albicans Candida albicans 99 100

Resultados: extração e sequenciação dermatófitos

Foram identificadas através de biologia molecular 18 espécies de dermatófitos, provenientes de amostras clínicas da rotina do laboratório durante o ano de 2015 e 2016. Através das características morfológicas, foram identificadas 44 isolados de Trichophyton rubrum, 5 Trichophyton saudanense, 10 Trichophyton tonsurans, 2 Trichophyton violaceum, 10 Trichophyton interdigitle, 9 Trichophyton mentagrophytus, 2 Trichophyton verrucosum, 2 Trichophyton gypseum, 12 Microsporum audovini, 6 Microsporum canis. Os produtos biológicos analisados foram 56 amostras de unha, 28 amostras de pele, 20 amostras de cabelo/couro cabeludo e 3 amostras de estirpe. Foi também realizada a extração de DNA de cada uma. Todas as espécies extraídas e identificadas foram conservadas a 4ºC. Foi feita a extração a 102 amostras e foram identificadas por biologia molecular 18 amostras.

Tabela 6.2: Resultados da extração e identificação molecular de dermatófitos de amostras da rotina do laboratório de micologia do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge. Produto Identificação Identificação Homologia Coverage Código biológico morfológica molecular (%) (%) Trichophyton Trichophyton D6 pele 99 99 mentagrophytes interdigitale Trichophyton Trichophyton D8 pele 99 99 mentagrophytes interdigitale Trichophyton Trichophyton D22 unha 99 100 interdigitale interdigitale Trichophyton Trichophyton D25 pele 99 99 mentagrophytes interdigitale Trichophyton Trichophyton D28 unha 99 100 interdigitale interdigitale

Tabela 6.2 (continuação): Resultados da extração e identificação molecular de dermatófitos de amostras da rotina do laboratório de micologia do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge. Produto Identificação Identificação Homologia Coverage Código biológico morfológica molecular (%) (%) pele Trichophyton Trichophyton D30 99 100 pescoço interdigitale interdigitale Trichophyton D34 estirpe Trichophyton rubrum 100 99 rubrum Trichophyton Trichophyton D37 pele 99 99 interdigitale interdigitale Trichophyton Trichophyton D38 cc 99 99 mentagrophytes interdigitale Trichophyton D41 pele Trichophyton rubrum 99 97 rubrum Trichophyton D43 unha Trichophyton rubrum 99 100 rubrum Trichophyton D45 unha Trichophyton rubrum 99 97 rubrum Trichophyton D46 pele Trichophyton rubrum 99 99 rubrum Trichophyton D47 unha Trichophyton rubrum 99 99 rubrum Trichophyton D50 unha Trichophyton rubrum 100 97 rubrum Trichophyton D51 unha Trichophyton rubrum 99 98 rubrum Trichophyton Trichophyton D57 pele 99 100 intendigitle interdigitale Trichophyton Trichophyton D69 pele 99 100 mentagrophytes interdigitale