Evaluierung Überlappender Immunevasiver Funktionen Viraler

Generierung und Charakterisierung von Cytomegalovirus-Mutanten als Expressions- und Impfstoffplattformen für heterologe Virusproteine

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.

der Fakultät für Biologie an der Universität Duisburg-Essen

vorgelegt von

Meike Ute Rückborn

aus Duisburg

November 2020 Die der vorliegenden Arbeit zugrunde liegenden Experimente wurden, falls nicht anders geschildert, am Institut für Virologie der Universität Duisburg-Essen durchgeführt.

1. Gutachter: Herr Prof. Dr. Mirko Trilling 2. Gutachter: Frau Prof. Dr. Astrid Westendorf Vorsitzender des Prüfungsausschusses: Herr Prof. Dr. Ralf Küppers

Tag der mündlichen Prüfung: 09.02.2021

Diese Dissertation wird via DuEPublico, dem Dokumenten- und Publikationsserver der Universität Duisburg-Essen, zur Verfügung gestellt und liegt auch als Print-Version vor.

DOI: 10.17185/duepublico/74420 URN: urn:nbn:de:hbz:464-20210628-135635-1

Für meine Liebsten

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis I Abbildungsverzeichnis V Tabellenverzeichnis VI Abkürzungen VII 1 Einleitung 1 1.1 Das Cytomegalovirus 1 1.1.1 Epidemiologie und klinische Relevanz 1 1.1.2 Struktur und Genomorganisation 2 1.1.3 Infektion und Replikationszyklus 4 1.1.4 Tiermodelle in der HCMV-Forschung 6 1.1.5 Therapiemöglichkeiten, Resistenzen und Prävention 7 1.2 Das Hepatitis B Virus 9 1.2.1 Epidemiologie und Pathologie 9 1.2.2 Struktur und Genomorganisation 11 1.2.3 Infektion und Replikation 13 1.2.4 Tiermodelle in der HBV-Forschung 14 1.2.5 Therapiemöglichkeiten, Resistenzen und Prävention 16 1.3 Das Immunsystem 17 1.3.1 Die angeborene Immunantwort 17 1.3.1.1 Interferone 18 1.3.1.2 Interferone und die Jak-STAT-Signaltransduktion 19 1.3.2 Die adaptive Immunität – ein spezifisches Abwehrsystem des Wirts 22 1.4 Immunisierung 24 1.4.1 Vakzine 24 1.4.2 Virale Impfvektoren 26 1.4.3 CMV-basierte Impfvektoren 27 1.5 Das Ubiquitin-Proteasom-System 29 1.5.1 Die Cullin4A/B-Roc1-E3-Ubiquitin-Ligasen und DDB1 31 1.5.2 Regulation der Aktivität der CRLs durch NEDD8 33 1.6 Die virale Zweckentfremdung von Cul4-RING-Ub-Ligasen 34 1.6.1 Das DDB1-CRL-interagierende MCMV-Protein pM27 35 1.6.2 Cytomegalovirale pM27-ähnliche Proteine 37 1.6.2.1 HCMV – pUL145 und pUL27 37 1.6.2.2 RCMV – pR27 und pE27 39 1.6.3 Hepadnavirale pM27-Analoga: HBx und WHx 39 1.7 Inhibitoren der CRLs als antivirale Therapie 41 1.8 Zielsetzung 43

I Inhaltsverzeichnis

2 Material und Methoden 44 2.1 Materialien 44 2.1.1 Geräte 44 2.1.2 Verbrauchsmaterialien 46 2.1.3 Kits 47 2.1.4 Puffer und Lösungen 47 2.1.5 Zellkulturmedien und –zusätze 49 2.1.6 Antibiotika, Chemikalien und Enzyme 50 2.1.7 Antikörper 51 2.1.8 Plasmide 52 2.1.9 Primer 54 2.1.10 Bakterienstämme 54 2.1.11 Eukaryotische Zellen 55 2.1.12 Mausstämme 55 2.1.13 Viren 55 2.1.14 Computer- und Onlineprogramme 56 2.2. Methoden 57 2.2.1 Molekularbiologische Methoden 57 2.2.1.1 DNA-Präparation 57 2.2.1.2 Polymerasekettenreaktion 57 2.2.1.3 DNA-Restriktion 57 2.2.1.4 DNA-Agarosegel-Elektrophorese 58 2.2.1.5 DNA-Gelextraktion 58 2.2.1.6 DNA-Ligation 58 2.2.1.7 Southern Blot 59 2.2.1.8 Luziferase-Reporter-Assay 60 2.2.2 Proteinbiochemische Methoden 61 2.2.2.1 Herstellung von Zell-Lysaten 61 2.2.2.2 Bradford-Methode 61 2.2.2.3 Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 61 2.2.2.4 Western-Blot 62 2.2.3 Arbeiten mit prokaryontischen Zellen 62 2.2.3.1 Herstellung chemisch-kompetenter E. coli XL1 Blue und E. coli DH10B 62 2.2.3.2 Transformation chemisch-kompetenter E. coli XL1 Blue und E. coli DH10B 63 2.2.4 Arbeiten mit eukaryotischen Zellen 64 2.2.4.1 Kultivierung von humanen und murinen Zelllinien 64 2.2.4.2 Lagerung von Zellen in flüssigem Stickstoff 64 2.2.4.3 Präparation von primären Mausneugeborenenzellen 64 2.2.4.4 Transfektion 66 2.2.5 Virologische Methoden 66 2.2.5.1 Infektion von permissiven Mauszellen in vitro 66 2.2.5.2 Rekonstitution 67 2.2.5.3 Herstellung von MCMV-Stocks 67 2.2.5.4 Herstellung von konzentrierten MCMV-Stocks 68 2.2.5.5 Plaquetitration zur Bestimmung des MCMV-Titers 69 2.2.5.6 MCMV-Infektion von Mäusen 69 2.2.5.7 Organentnahme und Serumgewinnung aus der Maus 69

II Inhaltsverzeichnis

2.2.5.8 Hydrodynamische Injektion von HBV-Genomen in Mäuse 70 3 Ergebnisse 71 3.1 Der wiederhergestellte virale Mck-2 ORF hat keinen Effekt auf die beschriebenen ΔM27- Phänotypen von MCMV 71 3.1.1 Die Degradation von STAT2 bleibt in ΔM27-MCMV-infizierten Zellen aus 72 3.1.2 ΔM27-MCMV zeigt eine stark erhöhte IFNγ-Sensitivität in vitro 73 3.1.3 ΔM27-MCMV ist in C57BL/6-, BALB/c- und 129-Mäusen attenuiert 76 3.2 Herstellung von MCMV-Mutanten zur Durchführung von Transkomplementationsanalysen durch die heterologe Expression von pM27-artigen Proteinen 79 3.2.1 Klonierung der Insertionsplasmide 79 3.2.2 Insertion des Zielgens in das MCMV-Genom 80 3.2.3 Rekonstitution der genetisch veränderten MCMVs und Nachweis der Expression des HA- markierten Zielgens 82 3.3 Transkomplementationsanalyse pM27-ähnlicher Proteine 83 3.3.1 Charakterisierung von ΔM27-M27HA und ΔM27-EGFP 84 3.3.1.1 ΔM27-M27HA baut STAT2 ab und inhibiert die Aktivität des ISRE-Promotors 85 3.3.1.2 Die Reinsertion von M27HA verminderte die IFNγ-Sensitivität 88 3.3.2 Untersuchung der biologischen Eigenschaften der herpesviralen pM27-Homologa pUL27 und pR27 90 3.3.2.1 Charakterisierung von ΔM27-UL27HA 91 3.3.2.1.1 Die Expression von pUL27 beeinflusste weder die STAT2-Degradation noch die ISRE-Promotoraktivität 92 3.3.2.1.2. ΔM27-UL27HA repliziert schwächer als die Revertante in vitro 94 3.3.2.1.3 pUL27 beeinträchtigt die M27-vermittelte STAT2-Degradation von MCMV nicht 96 3.3.2.2 Untersuchung überlappender biologischer Funktionen von pR27 und pM27 im ΔM27-MCMV-Kontext 97 3.3.2.2.1 ΔM27-R27HA degradiert weder mSTAT2 noch inhibiert es die Aktivität des ISRE-Promotors 98 3.3.2.2.2 Die pR27HA-Expression verminderte die Replikation von ΔM27-MCMV 100 3.3.3 Transkomplementative Analyse der hepadnaviralen pM27-Analoga HBx und WHx 102 3.3.3.1 Untersuchung überlappender biologischer Funktionen von HBx und pM27 im MCMV-Kontext 102 3.3.3.1.1 In ΔM27-HBxHA-infizierten Zellen wurde weder mSTAT2 degradiert noch die Aktivität des ISRE-Promotors inhibiert 102 3.3.3.1.2 Die Expression von HBxHA vermindert die Replikation von ΔM27-MCMV und verstärkt die IFNγ-Sensitivität 104 3.3.3.1.3 HBx beeinträchtigt den pM27-vermittelten mSTAT2-Abbau nicht 107 3.3.3.2.1 In Gegenwart von ΔM27-WHxHA wurde weder mSTAT2 degradiert noch die Aktivität des ISRE-Promotors geschwächt 108 3.3.3.2.2 Die Expression von WHxHA verringert die Replikation von ΔM27-MCMV in An- und Abwesenheit von IFNγ 111 3.4 Charakterisierung von HBV-Antigen exprimierenden MCMV-Vektoren und Untersuchung des Schutzpotentials gegen HBV im hydrodynamischen Injektionsmodel in der Maus 114 3.4.1 Die prophylaktische Vakzinierung mit MCMV-HBx begünstigte die HBV-Antigen- Expression 114 3.4.2 Charakterisierung der MCMV-sHBsAg-Vakzinvektoren 117

III Inhaltsverzeichnis

3.4.3 Untersuchung des Schutzpotentials von sHBsAg-exprimierenden MCMV-Vektoren gegen HBV 119 3.4.3.1 Der MCMV-sHBsAg-Vakzinvektor induzierte anti-HBs IgG 120 3.4.3.2 Die prophylaktische Vakzinierung mit MCMV-sHBsAg-Impfvektoren senkt die HBV- Antigenämie 121 4 Diskussion 125 4.1 Die Mck-2 Mutation ist für die ΔM27-Phänotypen irrelevant 125 4.2 Die M27-kodierte Funktion ist sehr spezifisch 125 4.2.1 Die Reinsertion von M27HA unter Kontrolle des exogenen EF1-Promotors revertierte die ΔM27-Phänotypen 126 4.2.2 Die CMV-kodierten Sequenz-Homologa 127 4.2.2.1 Das UL27-Protein aus HCMV konnte die ΔM27-Phänotypen nicht revertieren 127 4.2.2.2 Das R27-Protein aus MuHV-2 konnte die pM27-Funktion nicht ersetzen 129 4.2.2.3 Die Proteine R27 (MuHV-2) und E27 (MuHV-8) scheinen sich hinsichtlich ihrer funktionellen Homologie mit pM27 voneinander zu unterscheiden 130 4.2.3 Die hepadnaviralen DDB1-interagierenden Proteine HBx und WHx sind keine Funktionshomologa von pM27 131 4.2.4 Das STAT2-degradierende Protein aus HCMV ist kein Sequenz-Homolog 134 4.2.5 Transkomplementationsanalysen zur Identifikation überlappender Funktionen 134 4.3 MCMV als prophylaktischer Vakzinvektor gegen HBV in der Maus 135 4.3.1 Die prophylaktische Vakzinierung mit MCMV-HBx verlängert die HBe-Antigenämie von HBV im HDI-Mausmodell 136 4.3.2 MCMV-Impfvektoren schützen vor HBV in der Maus 137 5 Zusammenfassung 140 5 Summary 142 Literaturverzeichnis 144 Danksagung 175 Erklärungen 177

IV Abbildungsverzeichnis

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Das Cytomegalievirus – Aufbau eines Viruspartikels ...... 3 Abb. 2: Das Hepatitis B Virus – Aufbau des Virions und seiner subviralen Partikel ...... 12 Abb. 3: Schematische Darstellung der Signaltransduktion von IFN Typ-I, -II und -III ...... 20 Abb. 4: Gegenwärtiges Funktionsmodel der immunevasiven Funktion von pM27...... 36 Abb. 5: MCMV mit intaktem Mck-2-Gen degradiert STAT2 pM27-abhängig...... 72 Abb. 6: ΔM27-MCMV weist eine erhöhte IFNγ-Sensitivität in primären MEFs auf...... 74 Abb. 7: ΔM27-MCMV weist im Vergleich zum wt-MCMV eine erhöhte IFNγ-Sensitivität in primären MNCs und immortalen CIMs auf...... 75 Abb. 8: Unabhängig von den Resistenz-bestimmenden Faktoren Ly49H und Ly49I sowie deren Mausstamm-spezifischen Unterschieden ist ΔM27-MCMV in vivo stark attenuiert...... 77 Abb. 9: Klonierung der Insertionsplasmide...... 80 Abb. 10: Schema der Insertion des Zielgens in das MCMV-Genom via BAC-Mutagenese...... 81 Abb. 11: Nachweis der Insertion der Genkassette ins MCMV-BAC-Konstrukt via Southern Blot...... 82 Abb. 12: Nachweis der Expression viral kodierter Proteine der neuen ΔM27-MCMV-Mutanten...... 83 Abb. 13: Die Reinsertion des Gens M27HA stellte den STAT2-Abbau wieder her...... 85 Abb. 14: Effektive Inhibition der STAT2-abhängigen ISRE-Promotoraktivität durch ΔM27-M27HA. .... 87 Abb. 15: Die Reinsertion von M27HA führte zu einer gesteigerten Resistenz gegenüber IFNγ...... 89 Abb. 16: Die Sequenzmotive, die in pM27 für die Bindung von DDB1 essenziell sind, sind auch in pM27-verwandten Proteinen aus Ratten- und humanem CMV konserviert...... 91 Abb. 17: ΔM27-UL27HA baut murines STAT2 nicht ab...... 92 Abb. 18: ΔM27-UL27HA hat keinen Einfluss auf die Aktivität des ISRE-Promotors...... 93 Abb. 19: Die pUL27-Expression verminderte die Replikation von ΔM27-MCMV...... 95 Abb. 20: Die Expression von pUL27HA wirkt sich nicht auf die pM27-vermittelte Degradation von STAT2 durch MCMV aus...... 97 Abb. 21: ΔM27-R27HA baut STAT2 in Maus-Zellen nicht ab...... 98 Abb. 22: ΔM27-R27HA hat keinen inhibitorischen Einfluss auf den ISRE-Promotor...... 99 Abb. 23: Die pR27HA-Expression vermindert die Replikation von ΔM27-MCMV...... 101 Abb. 24: Eine Infektion mit ΔM27-HBxHA hatte keinen Einfluss auf die STAT2-Level...... 103 Abb. 25: Die ISRE-Promotoraktivität wird durch ΔM27-MCMV-exprimiertes HBxHA verstärkt...... 104 Abb. 26: Die Expression von HBxHA wirkt sich negativ auf die Replikation von ΔM27-MCMV aus. ... 106 Abb. 27: Die Expression von HBxHA wirkt sich nicht negativ auf die pM27-vermittelte Degradation von mSTAT2 aus...... 108 Abb. 28: In Gegenwart von ΔM27-WHxHA findet keine mSTAT2-Degradation statt...... 109 Abb. 29: Die ISRE-Promotoraktivität wird durch ΔM27-MCMV exprimiertes WHxHA verstärkt...... 110 Abb. 30: Die Expression von WHx wirkt sich negativ auf die Replikation von ΔM27-MCMV aus...... 112 Abb. 31: Die prophylaktische Vakzinierung mit MCMV-HBxHA erhöhte die Titer des HBe-Antigens im Blut von C57BL/6-Mäusen...... 116 Abb. 32: Charakterisierung von ΔM27-MCMV-sHBsAg und MCMV-sHBsAg ...... 117 Abb. 33: Das M27-positive und das M27-negative MCMV-sHBsAgHA replizieren in vivo...... 119 Abb. 34: Die Immunisierung mit dem MCMV-sHBsAg-Vakzinvektor induzierte anti-HBs IgG...... 121 Abb. 35: Die prophylaktische Vakzinierung mit MCMV-sHBsAg-Impfvektoren vermindert die HBV- Antigenämie im HBV-Hydrodynamische-Injektion-Maus-Modell ...... 123

V Tabellenverzeichnis

Tabellenverzeichnis

Tab. 1: Geräte ...... 44 Tab. 2: Verbrauchsmaterialien ...... 46 Tab. 3: Kits ...... 47 Tab. 4: Puffer und Lösungen ...... 47 Tab. 5: Zellkulturmedien und -zusätze ...... 49 Tab. 6: Antibiotika, Chemikalien und Enzyme ...... 50 Tab. 7: Primäre und sekundäre Antikörper ...... 52 Tab. 8: Plasmide ...... 52 Tab. 9: Primer ...... 54 Tab. 10: Bakterienstämme ...... 54 Tab. 11: Zelllinien ...... 55 Tab. 12: Mausstämme ...... 55 Tab. 13: Viren ...... 56 Tab. 14: Zusammensetzung der Trenn- und Sammelgele eines SDS-Polyacrylamidgels ...... 62

VI Abkürzungen

Abkürzungen

AIDS Acquired immune deficiency syndrome ATP Adenosintriphosphat BAC Bacterial artificial chromosome Bp Basenpaare BPB β-Propeller B-Domäne cccDNA Covalently closed circular DNA CDS Coding sequence CMV Cytomegalovirus CPE Cytopathischer Effekt CRL Cullin-RING-E3-Ligase-Komplexe Cul Cullin DAMP Danger-associated molecular pattern DCAF DDB1-CUL4-assoziierten Faktor DHBV Duck hepatitis virus DNA Desoxyribonukleinsäure DDB1 DNA damage-binding protein 1 Ds Doppelstrang/ doppelsträngig E. coli Escherichia coli ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay et al. et alii (dt. und andere) FCS Fetal calf serum GCV Ganciclovir HBcAg HBV core antigen HBeAg HBV envelope antigen HBs HBV surface protein HBsAg HBV surface antigen HBV Hepatitis-B-Virus HBx HBV x-protein HCC Hepatozelluläres Karzinom

VII Abkürzungen

HCl Chlorwasserstoff HCMV Humanes Cytomegalovirus HECT Homologous to E6-AP C-terminus HEV Hepatitis-E-Virus HIV Humanes Immundefizienz-Virus HSPG Heparansulfatproteoglykane HSV Herpes-Simplex-Virus IFN Interferon IFNAR Typ-I-IFN-Rezeptor IFNGR Interferon-gamma-Rezeptor IFNLR1 IFN-λ-Rezeptor 1 Ig Immunglobulin IL-10R2 Interleukin-10-Rezeptor 2 IRF Interferon-regulierender Faktor ISG Interferon-stimulated gene ISGF Interferon-stimulated gene factor ISRE Interferon-stimulated response elements Jak Januskinase Kbp Kilobasenpaare kDa Kilo-Dalton KSHV Kaposi-Sarkom-Herpesvirus lHBsAg Long HBV surface antigen MCMV Murines (Maus) Cytomegalovirus MEF Mouse embryo fibroblast mHBsAg Middle HBV surface antigen MHC Major histocompatibility complex MNC Mouse newborn cell MOI Multiplicity of infection mRNA Messenger Ribonukleinsäure MuHV Murides Herpesvirus NAE NEDD8-aktivierendes Enzym

VIII Abkürzungen

NEDD8 Neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 8 OD Optische Dichte ORF Open reading frame PAMP Pathogen-associated molecular pattern pgRNA Prägenomische Ribonukleinsäure PIV Parainfluenzavirus rcDNA Relaxed circular DNA PFU Plaque forming units PRR Pattern recognition receptor RBR RING-between-RING RCMV Ratten-Cytomegalovirus RING Really interesting new gene Rpm Rotations per minute RT Raumtemperatur sHBsAg Short HBV surface antigen SARS Schweres Akutes Respiratorisches Syndrom SDS Natriumdodecylsulfat SIV Simian Immundefizenz-Virus SMC5/6 Structural maintenance of chromosomes 5/6 SNP Single nucleotide polymorphism SVP Subvirale Partikel STAT Signal transducer and activator of transcription Ub Ubiquitin UL Unique long UPS Ubiquitin-Proteasom-System US Unique short Tax.-ID Taxonomy identifier TRL Terminal repeat long TRS Terminal repeat short Tyk Tyrosinkinase

IX Abkürzungen

v/v Volume per volume WB Western-Blot WHO World Health Organization WHV Woodchuck hepatitis virus wt Wildtyp w/v Weight per volume

X Einleitung

1 Einleitung

1.1 Das Cytomegalovirus

Das humane Cytomegalovirus (HCMV, Humanes Herpesvirus-5, Tax.-ID: 10359) gehört zur Ordnung der Herpesviren (Herpesvirales) und ist Mitglied der β-Herpesvirus-Subfamilie. HCMV weist einen strengen Wirtstropismus, einen langsamen Replikationszyklus (72 h) sowie einen charakteristischen cytopathischer Effekt (CPE) auf. CMV-infizierte Nachbarzel- len bilden mikroskopisch erkennbare Synzytien. Die Vergrößerung des Zellkerns und Zellvolumens (Cytomegalie) ist typisch und war daher namensgebend (Weller et al., 1960). Im Jahre 1954 wurde zum ersten Mal das murine Cytomegalovirus (MCMV, MuHV-1, Tax.- ID: 10366) aus den Speicheldrüsen der Maus isoliert und in Zellkultur in murinen Zellen propagiert (Smith, 1954).

1.1.1 Epidemiologie und klinische Relevanz

HCMV ist ubiquitär verbreitet. Etwa 83% der globalen erwachsenen Bevölkerung sind mit HCMV infiziert (Zuhair et al., 2019). Die Seroprävalenz korreliert mit der Art und Weise der Kinderbetreuung, den Hygienestandards innerhalb der betrachteten Bevölkerungsgruppe sowie mit dem Lebensstil, Alter, Geschlecht und dem sozio-ökonomischen Status der einzelnen Individuen. Während die Seroprävalenz der erwachsenen Bevölkerung in Entwick- lungsländern nahezu 100% beträgt, ist die Inzidenz in den Industrieländern deutlich geringer. In Deutschland liegt die Seroprävalenz bei 56,7% (Lachmann et al., 2018). HCMV wird unter natürlichen Bedingungen häufig durch Schmierinfektionen transmittiert, d. h. durch den Kontakt von Schleimhäuten mit infektiösen Körperflüssigkeiten (z. B. Blut, Nasensekret, Speichel, Tränen, Urin, Genitalsekret oder Muttermilch) (Britt, 2007). Eine HCMV- Übertragung ist auch intrauterin über die Plazenta auf den Fötus und kongenital möglich (Cannon et al., 2010). Eine Übertragung kann ebenso durch Transplantationen mit einer HCMV-positiven Organspende erfolgen (Ramanan & Razonable, 2013). Nach erfolgter Infektion repliziert das Virus initial in den Epithelzellen in der Nähe der Eintrittsstelle und verteilt sich anschließend auf Organe und verschiedene Zelltypen. Die gesundheitlichen Folgen einer Primärinfektion hängen vom Immunstatus der infizierten Person ab. Bei adulten,

1 Einleitung

immunkompetenten Individuen kommt es in den allermeisten Fällen zu subklinischen Verläufen. In der akuten produktiven Phase können bei nur 5-20% der infizierten immunkompetenten Individuen unspezifische erkältungsähnliche Symptome beobachtet werden (Britt, 2007). Die Infektion kann durch das angeborene und das adaptive Immunsystem (s. 1.3) gemeinsam kontrolliert werden. In seltenen Fällen kommt es nach einer Primärinfektion zu einer infektiösen Mononukleose (Horwitz et al., 1986; Klemola & Kaariainen, 1965), welche in seltenen Fällen sogar tödlich verlaufen kann (Rafailidis et al., 2008). Bei immun- supprimierten oder -defizienten Individuen (z. B. bei Transplantations-empfängern oder AIDS-Patienten) kommt es ohne Behandlung häufig zu schwerwiegenden bis hin zu lebens- bedrohlichen Krankheitsverläufen mit Krankheitsbildern wie Hepatitis, Myokarditis, Pneu- monie, Retinitis, Enterokolitis, Meningitis oder Enzephalitis. HCMV ist weltweit das Pathogen mit den meisten fruchtschädigenden kongenitalen Infektionen (Buxmann et al., 2017). Die klinischen Anzeichen der kongenitalen HCMV-Infektion variiert von asymptoma- tischen Verläufen (ca. 85-90% [Manicklal et al., 2013]) bis hin zu Abort und postnatalem Tod (ca. 0,5% [Dollard et al., 2007; Manicklal et al., 2013]). Die Symptome zwischen den genannten Extremen reichen von mentaler und motorischer Retardation bis zu Verletzungen des Zentralen Nervensystems (Mikroenzephalitis), mit einer möglichen Beeinträchtigung des Innenohrs und der Retina, dem Knochenmark sowie der inneren Organe (Jones, 2013). Erfolgt die Primärinfektion der Mutter während der perikonzeptionellen Phase, ist die gesunde Kindsentwicklung am meisten gefährdet. Mit steigendem gestationalen Alter sinkt die Schwere der gesundheitlichen Folgen (Enders et al., 2011; Pass et al., 2006; Picone et al., 2013).

1.1.2 Struktur und Genomorganisation

Das behüllte CMV-Virion besitzt einen Durchmesser von bis zu 200 nm. Die Membranhülle enthält einige virale (Glyko-)Proteine, die für die Infektion essentiell sind (s. Gerna et al., 2019). Die DNA ist von einem ikosaedrischen Kapsid umgeben, welches einen Durchmesser von 100-110 nm besitzt. Zwischen dem Kapsid und der Virushülle befindet sich eine als Tegument bezeichnete Proteinmatrix. Wie alle Herpesviren besitzt CMV ein lineares, doppelsträngiges (ds) DNA-Genom, welches mit ca. 235 kbp das längste Genom der neun humanen Herpesvirus-Spezies und humanpathogener Viren im Allgemeinen darstellt

2 Einleitung

(Sijmons et al., 2014). Die komplette DNA-Sequenz des HCMV-Laborstamms AD169 wurde erstmals im Jahr 1990 veröffentlicht und war zum damaligen Zeitpunkt die größte zusam- menhängende Sequenz, die jemals generiert wurde (Chee et al., 1990; Bankier et al., 1991).

Abb. 1: Das Cytomegalievirus – Aufbau eines Viruspartikels Das Virus besitzt ein doppelsträngiges DNA-Genom, das von einem Nukleokapsid umgeben ist. Daran schließt sich eine Proteinmatrix an, die als Tegument bezeichnet wird. Den äußeren Abschluss bildet eine Membranhülle, die aus einer Doppellipidschicht besteht. In der Lipidhülle sind verschiedene virale Proteine eingelagert (Bild verändert nach CD Landsberg).

Die Architektur des HCMV-Genoms setzt sich aus zwei einzigartigen (engl. unique) Berei- chen zusammen: Einer längeren (engl. unique long, UL) und einer kürzeren (engl. unique short, US) Region. Diese werden beidseitig von einem Paar invertierter Wiederholungs- sequenzen (engl. inverted repeats) flankiert. Diese Bereiche werden als terminale/interne lange Wiederholungssequenz (engl. terminal/internal repeat long, TRL/IRL) oder terminale/interne kurze Wiederholungssequenz (engl. internal/terminal repeat short, IRS/TRS) bezeichnet. Diese beiden Sets an Wiederholungssequenzen weisen homologe Bereiche auf, die sich auf einige hundert Basenpaare erstrecken. Diese homologen Sequenzen werden a-, b- oder c-Sequenz genannt. Das HCMV-Genom besteht aus einer äquimolaren Mischung von vier genomischen Isomeren, die durch die Inversion der UL- und US-Regionen entstehen können (Murphy & Shenk, 2008). HCMV kodiert für mehr als 750 Translationsprodukte (Stern-Ginossar et al., 2012). Mithilfe einer in silico Studie wurden 528 neue putative offene Leserahmen (engl. open reading

3 Einleitung

frames, ORFs) beschrieben (Erhard et al., 2018). Die präzise Anzahl der HCMV-kodierten Translationsprodukte ist nicht bekannt und die Annotation des HCMV-Genoms wird sich vermutlich in der Zukunft ändern.

1.1.3 Infektion und Replikationszyklus

Ähnlich wie andere Herpesviren etabliert HCMV im Wirt eine lebenslang persistierende Infektion, welche zum Erfolg seiner Verbreitung beiträgt. Dabei durchläuft es zunächst eine aktive Replikation, bei der infektiöse Viruspartikel produziert werden. Der produktiven Replikation folgt ein Stadium der viralen Latenz. In dieser Phase findet keine oder nur eine limitierte Replikation in Abwesenheit nachweisbarer, infektiöser Virionen statt. Das Virus kann jedoch je nach Immunstatus des Wirts sporadisch reaktivieren und erneut replikative Zyklen durchlaufen (Reeves & Sinclair, 2008). HCMV weist in vitro ein sehr begrenztes Spektrum an Zelltypen/Zelllinien auf, in denen eine produktive Replikation möglich ist. In vivo hingegen repliziert es in vielen verschiedenen Zelltypen, wie z. B. in hematopoetischen Zellen, Fibroblasten, Endothelzellen, Epithelzellen und glatten Muskelzellen (Goodrum et al., 2002; Hahn et al., 1998; Maciejewski et al., 1992; Sinzger et al., 1995). Dieser breite Zelltropismus ermöglicht eine systemische Ausbreitung innerhalb des menschlichen Körpers sowie eine Übertragung auf andere menschliche Wirte, um je nach Immunstatus des Wirtes sporadisch produktive Reaktivierungszyklen zu durchlaufen. Der Replikationszyklus von CMV beginnt mit der Adsorption des Virions an eine permissive Zelle. Glykoproteine, die sich auf der Oberfläche der Virusmembran befinden, interagieren mit Wirtsrezeptoren, um eine Fusion oder Endozytose des Virions in die Zelle zu vermitteln (Isaacson et al., 2007). Die Fusion zwischen Virushülle und der Cytoplasma-Membran ermöglicht die Penetration des Nukleokapsids mitsamt des Teguments in die Zelle. Im Cytoplasma wird das Virus- Kapsid entlang der Mikrotubuli zum zellkernnahen Mikrotubuli-organisierenden Zentrum transportiert (Ogawa-Goto et al., 2003). Dort dissoziiert das Kapsid und die virale DNA wird über Zellkernporen in den Zellkern eingeschleust, wo die Transkription, die Genom- Replikation sowie die Enkapsidierung stattfinden. Parallel werden andere Tegument-Proteine des eingedrungenen Virions ins Cytoplasma entlassen und inhibieren die initialen Schritte des Immunsystems (Biolatti et al., 2018) und die virale Genexpression zu regulieren (Torres & Tang, 2014). Zudem regulieren viele Virus-kodierte Proteine Zell-Signalwege (Yurochko,

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2008) und den Zell-Metabolismus (Yu et al., 2011), um die virale Replikation und Immune- vasion voranzutreiben. Im Zellkern zirkularisiert die virale DNA und repliziert über den sogenannten rolling circle-Mechanismus (McVoy & Adler, 1994). Die Expression viraler Proteine findet in mindestens drei fein regulierten Ereigniskaskaden statt, in welchen verschiedene Aspekte des Replikationszyklus reguliert werden: immediate early (IE); early (E) und late (L) Antigene (Wathen & Stinski, 1982; Wathen et al., 1981). Diese Einteilung liegt zum einen dem zeitlichen Ablauf der Genexpression im viralen Replikationszyklus zugrunde. Zum anderen kann der Replikationszyklus mithilfe eines Proteinbiosynthese-Inhibitors (Cycloheximid) und eines Hemmstoffs der viralen DNA-Polymerase (Phosphonoessigsäure, PAA) in diese charakteristischen Phasen unterteilt werden. mRNA-Transkripte, deren Synthese nicht durch Cycloheximid gehemmt wird, sind IE-Gene. Diese erste, sehr frühe Phase beginnt direkt nachdem das Virus in die Zelle gelangt. Die Transkription der in dieser Phase exprimierten Gene wird durch zelluläre oder durch das Virion mitgebrachte, virale Transkriptionsfaktoren induziert und kann in Abwesenheit von de novo synthetisierten viralen Proteinen erfolgen (Chambers et al., 1999). Die Synthese von L-Proteinen ist erst nach der viralen DNA-Replikation möglich und kann mit PAA inhibiert werden. Nach der Transkripti- on und Translation transaktivieren die IE-Proteine die zweite Phase. Die Genprodukte der early-Gene (z. B. die pUL97-Kinase oder die pUL54-DNA-Polymerase) sind häufig Enzyme der viralen Replikationsmaschinerie. Anschließend erfolgt die dritte, späte Phase (engl. late; L). Es wird zwischen sog. „echten“ late-Genen und early/late-Genen (E/L) unterschieden. Die einen werden erst nach der Genom-Replikation exprimiert. Die anderen werden zwar schon vor der viralen Genom-Replikation exprimiert, aber erst nach dem Beginn der viralen Genom- Replikation hochreguliert. Die Expression „echter“ late-Gene ist von der viralen DNA- Replikation abhängig und erfolgt nicht oder signifikant reduziert in Anwesenheit von virostatischen Substanzen, die virale Genomreplikation verhindern (s. 1.1.5). In der L-Phase werden vor allem Strukturproteine gebildet, sowie Proteine, die für den Zusammenbau des Virions, als auch für den Austritt des Viruspartikels aus der Zelle benötigt werden (Landolfo et al., 2003). Neueren Untersuchungen zufolge scheint die Genexpression von HCMV jedoch einer komplexeren Regulation mit weiteren Transkriptionsphasen zu unterliegen (Stern- Ginossar et al., 2012; Weekes et al., 2014). Die Strukturproteine translozieren in den Nukleus und werden zu Kapsid-Vorläufern zusammengebaut. Die viralen Genome werden in die

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Vorläufer-Kapside eingeschleust. Nach der Anlagerung der ersten Tegument-Proteine gelangen die Kapside durch Ausknospung in den perinukleären Raum. Durch eine Fusion mit der äußeren Kernmembran gelangt der Virusvorläufer ins Cytoplasma, wo weitere Tegument- Proteine mit den Nukleokapsiden assoziieren. Diese Komplexe werden vom trans-Golgi- Netzwerk umstülpt und erhalten so ihre Hüllmembran inklusive viraler und zellulärer Membranproteine. Die Virionen werden in Golgi-Vesikeln zur Zellmembran transportiert und aus der infizierten Zelle ausgeschleust (Tandon & Mocarski, 2012). Bei der Replikation werden zudem zwei Arten nicht-infektiöser Partikel generiert: Die sog. non-infectious enveloped particles tragen kein Genom in sich und den dense bodies fehlt das Nukleokapsid (Irmiere & Gibson, 1983). Möglicherweise erfüllen diese Partikel eine biologische Funktion und sind nicht bloß ein Nebenprodukt der Virusreplikation.

1.1.4 Tiermodelle in der HCMV-Forschung

Die Ko-Evolution der Cytomegalieviren mit ihrer jeweiligen Wirtsspezies führte dazu, dass jede Säugetierspezies ihr eigenes einzigartig adaptiertes CMV besitzt. Daher weist CMV ein engstes Wirtsspektrum auf und HCMV kann nicht in Tiermodellen untersucht werden. Die evolutionäre Parallelentwicklung bestimmter Wirtsspezies prägte eine ebenso parallele Phylogenese der homologen CMVs (McGeoch et al., 1995). So weisen die Genome der CMVs von Primaten (Mensch, Schimpanse und Rhesus-Affe) eine größere Homologie untereinander auf als zu den CMV-Genomen von Nagetieren (Maus, Ratte und Meerschwein- chen) (Chee et al., 1990; Davison et al., 2003; Rivailler et al., 2006; Rawlinson et al., 1996; Vink et al., 2000; McGregor et al., 2004). Den engsten Verwandten des HCMV, welcher Primaten infiziert, stellt das CMV von Schimpansen dar (Davison et al., 2003; Hansen et al., 2003). Da es sich bei Schimpansen um eine geschützte Tierart handelt und die Haltung nicht nur aus ethischen, sondern auch aus finanziellen Gründen schwierig ist, hat sich dieses Tiermodell in der wissenschaftlichen Praxis nicht durchgesetzt. Das CMV aus Rhesus-Affen (RhCMV) hingegen spielt eine wichtige Rolle sowohl in der CMV-Vakzinforschung (Yue et al., 2008) als auch in Studien zur kongenitalen CMV-Infektion (Barry et al., 2006). Das Ratten CMV (RCMV)-Modell dient zur Untersuchung von CMV-assoziierten vaskulären Erkrankungen (Strelow et al., 2008). Ein RCMV-Stamm, welcher aus der Plazenta und dem Uterus einer Hausratte präpariert wurde (Loh et al., 2003) kann kongenital auf die Mausföten

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transmittiert werden (Loh et al., 2006). Trotz seines vielversprechenden Potentials wurde bis heute wenig über diesen einzigartigen RCMV-Stamm publiziert. Das Maus-CMV (MCMV-) Modell wurde am häufigsten verwendet und ist das bei weitem am besten erforschte CMV- Modell. Ein definiertes Genom und Proteom, die Verfügbarkeit zahlreicher Virus- und Mausmutanten und der unkomplizierte Umgang mit Mäusen als Versuchstiere machen MCMV zu einem optimalen Werkzeug zur Beantwortung von grundwissenschaftlichen Fragen, die sich nicht allein mithilfe der klinischen Forschung beantwortet ließen. Neben Einblicken in die Pathogenese der CMV-Infektion gestattete es ebenso die Identifikation zahlreicher immunevasiver Gene. Ein signifikanter Nachteil dieses CMV-Modells ist die Unfähigkeit von MCMV, die plazentale Barriere zu überwinden und Mausembryonen zu infizieren (Johnson, 1969). Ein gelegentlich verwendetes Kleintiermodel, bei dem eine Übertragung über die Plazenta erfolgt, ist das Meerschweinchen CMV (GPCMV) im Meer- schweinchen (Cavia porcellus) (Choi et al., 1978; Schleiss & McVoy, 2010).

1.1.5 Therapiemöglichkeiten, Resistenzen und Prävention

Zur Eindämmung einer HCMV-Infektion stehen verschiedene antivirale Medikamente zur Verfügung, welche die virale Replikation inhibieren (Virostatika). Ganciclovir (GCV) ist ein Guanosin-Analogon. Während der CMV-Replikation wird das Nukleosid-Analogon durch die virale pUL97-Kinase phosphoryliert und im Anschluss von zellulären Kinasen di- und triphosphoryliert. Der kompetitive Einbau in das virale dsDNA-Genom wird durch die Aktivität der CMV-kodierten pUL54-DNA-Polymerase vermittelt. GCV inhibiert die Enzymaktivität der pUL54-DNA-Polymerase. Resistenzen gegen GCV können durch UL97- und/oder UL54-Mutationen entstehen. Der weitaus größte Teil der GCV-Resistenzen (>90%) beruht auf UL97-Mutationen (Göhring et al., 2015), welche die Phosphorylierung von GCV verhindern, welche für die antivirale Wirkung von GCV essentiell ist, (Chou, 2008). In den übrigen Fällen sind UL54-Mutationen oder Mutationen in beiden Genen nachweisbar. Ein weiteres Medikament zur Behandlung von CMV-Erkrankungen ist Foscarnet. Das Pyrophos- phat-Analogon blockiert die entsprechende Bindestelle der viralen UL54-DNA-Polymerase und wirkt unabhängig von der pUL97-Aktivität. Resistenzen gegen dieses Virostatikum entstehen durch Mutationen im Gen der UL54-DNA-Polymerase. Bei Ganciclovir-induzierten UL54-Mutationen können Kreuzresistenzen auftreten. Das Cytosin-Analogon Cidofivir ist

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ebenso ein Inhibitor der CMV-kodierten UL54-DNA-Polymerase. Eine Phosphorylierung erfolgt ausschließlich durch zelluläre Enzyme und umgeht so die virale UL97-Kinase- Aktivität. (Kreuz-)Resistenzen entstehen durch UL54-Mutationen. Letermovir ist das neueste virostatische Präparat und wurde im Jahr 2018 in Deutschland zugelassen. Es inhibiert die Aktivität der CMV-kodierten UL56-Kinase. Die UL56-Kinase ist eine Komponente des viralen Terminase-Komplexes, der bei der CMV-Replikation die Spaltung konkatamerischer Virus-DNA in Einzel-Genome und deren Verpackung in Virus-Kapside vermittelt (Goldner et al., 2011). Durch seinen alternativen Wirkungsmechanismus konnte Letermovir bereits erfolgreich gegen multiresistente CMV-Infektionen eingesetzt werden (Bowman et al., 2017; Kaul et al., 2011). Jedoch wurden bereits Letermovir-Resistenzen in Patienten beobachtet (Cherrier et al., 2018). Neue virostatische Substanzen wie Maribavir befinden sich in der Entwicklung. Maribavir hemmt die pUL97-Kinase. Es reduziert die virale DNA-Synthese und unterbindet eine effiziente Virion-Morphogenese (Prichard et al., 2009). In einer Phase-III- Studie konnte kein signifikanter Vorteil für eine prophylaktische Behandlung mit Maribavir gezeigt werden (Marty et al., 2011). In einer aktuelleren Phase III-Studie konnte kürzlich gezeigt werden, dass Maribavir in höherer Dosierung ebenso gut wie Ganciclovir gegen CMV wirkt (Maertens et al., 2019). Bisher wurden keine Kreuzresistenzen mit Ganciclovir, Foscarnet oder Cidofovir beschrieben. Alternativen zu den Virostatika stellen die Behandlung mit CMV-spezifischen Hyper- Immunglobulinen (Nigro et al., 2017) und der Transfer CMV-spezifischer T-Zellen dar. Die Verabreichung von CMV-spezifischen Immunglobulinen, die aktuell in Form humaner Blut- produkte zur Verfügung stehen, bergen leider infektiologische Risiken. Monoklonale Anti- körper befinden sich zwar in der Entwicklung, sind jedoch nicht verfügbar. Eine andere Strategie stellt die Behandlung von CMV-Infektionen mittels T-Zell-Transfer dar. CMV-spezifische T-Zellen wurden bereits sowohl prophylaktisch als auch therapeutisch mit vielversprechenden Resultaten transferiert (Mackinnon et al., 2008; Walter et al., 1995). Dabei werden aus dem Blut eines CMV-positiven Lymphozyten-Spenders durch CMV- Antigen-Stimulation CMV-spezifische T-Zellen selektiert und expandiert. Diese Methode ist sehr zeitaufwändig und die Spender müssen eine gewisse HLA-Kompatibilität aufweisen. Ein Register CMV-positiver T-Zell-Spender steht in Deutschland zur Verfügung (Eiz-Vesper et al., 2013).

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In Anbetracht der klinischen Relevanz von HCMV wurde bereits vor zwei Jahrzehnten die Entwicklung eines HCMV-Impfstoffes höchst priorisiert. Eine zugelassene Schutzimpfung gegen HCMV ist trotz verschiedener signifikanter Versuche zum derzeitigen Zeitpunkt jedoch nicht verfügbar (Plotkin et al., 2020; Schleiss, 2016; Schleiss et al., 2017).

1.2 Das Hepatitis B Virus

Das Hepatitis B-Virus (HBV) gehört zu der Familie der Hepadnaviren (Hepadnaviridae) und zur Gattung der Orthohepadnaviren. HBV weist einen ausgeprägten Lebertropismus und eine extreme Wirtsspezifität auf. Auch wenn es keinen direkten cytopatischen Effekt besitzt (Guidotti et al., 1995), kann es sowohl eine akute als auch eine chronische Infektion der Leber hervorrufen und dabei eine Entzündung der Leber (Hepatitis) verursachen.

1.2.1 Epidemiologie und Pathologie

Nach einer Schätzung der Weltgesundheitsorganisation (engl. World Health Organization, WHO) aus dem Jahr 2015 leben weltweit 257 Millionen Menschen mit einer chronischen HBV Infektion. Die geschätzte Anzahl der HBV-verursachten Tode lag bei 887.000 Men- schen, die an den Folgen einer HBV-Infektion, meistens an einer Zirrhose oder hepatozellulä- ren Karzinomen (engl. hepatocellular carcinoma, HCC), starben. Im Jahr 2016 waren nur 10,5% der geschätzten Gesamtzahl der Infizierten sich ihrer Infektion bewusst, während nur 16,7% der diagnostizierten HBV-Patienten sich in einer antiviralen Therapie befanden. Die HBV Prävalenz der adulten Bevölkerung ist in der westpazifischen (6,2%) und afrikanischen (6,1%) Region am höchsten (http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/hepatitis-b). In hoch-endemischen Regionen wird HBV größtenteils vertikal von der Mutter auf das Kind bei der Geburt (perinatal) oder horizontal bei Kontakt mit dem infizierten Blut eines infizierten Kindes auf ein uninfiziertes Kind übertragen. Transmissionen können auch durch die wiederholte Verwendung von Nadeln und Spritzen bei der medizinischen Versorgung oder intrave- nösem Drogenmissbrauch stattfinden. Infektionen passieren auch bei der Übertragung von infektiösen Körperflüssigkeiten durch ungeschützten Sexualverkehr und dem gemeinsamen Gebrauch kontaminierter Hygieneartikel. Eine Übertragung über Muttermilch, Lebensmittel, Wasser oder gelegentlichen Kontakt wie Umarmungen, Küssen oder beim Teilen von

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Nahrung oder Getränken mit infizierten Personen erfolgt nicht. Das HBV besitzt eine lange Inkubationszeit mit durchschnittlich 75 Tagen. Die ersten Symptome weisen ein breites Spektrum auf und treten erst nach 2-6 Monaten nach erfolgter Infektion auf. Bei ca. 65% der Erwachsenen verläuft die Infektion vollständig asymptomatisch. Bei einem Drittel kommt es zunächst zu einer grippalen Symptomatik wie Fieber, Abgeschlagenheit und Müdigkeit, aber auch Oberbauchschmerzen, Druckgefühl unter dem rechten Rippenbogen, Appetitlosigkeit bis hin zur Abneigung gegen Speisen, Schwindel und Erbrechen. Nach einigen Tagen tritt die klassische Gelbsucht (Ikterus) auf. Bei 1% der Erkrankten folgt ein akutes Leberversagen. Bei diesen Patienten besteht ein hohes Risiko, an der Hepatitis zu versterben. Im Regelfall klingt die Hepatitis nach 2-4 Wochen wieder ab. Bei mehr als 95% der Infizierten heilt die akute Hepatitis anschließend spontan aus und es kommt zu einer Immunkontrolle (Robert Koch- Institut, 2016). Bei der Ausbildung einer persistenten Infektion kann das Virus je nach Immunstatus des Patienten jedoch reaktivieren (Guner et al., 2011; Yotsuyanagi et al., 1998). Eine chronische HBV-Infektion liegt vor, wenn das HBs-Antigen länger als 6 Monate im Blut des Patienten nachweisbar ist (Cornberg et al., 2011). Die Entwicklung einer chronischen HBV-Infektion ist bei Kindern, die durch ihre Mutter oder während ihrer ersten fünf Lebens- jahre infiziert werden, sehr verbreitet (95%) (http://www.who.int/news-room/fact- sheets/detail/hepatitis-b). Hingegen kommt es nur bei 5-10% der erwachsenen Infizierten zu einer chronischen Hepatitis. Der chronische Krankheitsverlauf resultiert aus dem Unvermö- gen des Immunsystems, die Virusinfektion zu kontrollieren (Bertoletti & Ferrari, 2016). Die Heilung der HBV-Infektion ist definiert als die Abwesenheit von HBsAg und dem Nach- weis von HBs-Antikörpern im Blut. Diese sog. Anti-HBs-Serokonversion findet jährlich in etwa 0,2-1% aller chronisch infizierten Patienten spontan statt (Cornberg et al., 2011). Eine geringfügige HBV-Persistenz bleibt jedoch über Jahrzehnte hinweg bestehen (Rehermann et al., 1996). Die Infektion wird funktionell, aber nicht vollständig eliminiert. Trotz der Verfüg- barkeit von antiviralen Medikamenten ist bis heute kein Heilmittel gegen eine chronische HBV-Infektion verfügbar (s. 1.2.5). Ein Grund für die HBV-Persistenz in chronisch infizierten Patienten ist ein intrazelluläres Replikations-Intermediat, welches im Nukleus infizierter Hepatozyten in Form eines episoma- len, Plasmid-ähnlichen Moleküls verbleibt. Die persistente cccDNA (s.1.2.3) ermöglicht die Produktion weiterer Virus-Nachkommen (Nassal et al., 2015). Eine weitere Ursache der

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Persistenz besteht in der ineffektiven Immunantwort, die sich typischerweise durch die funktionelle Ermüdung und Depletion von zytotoxischen T-Zellen, dem Fehlen adäquater T- Helferzellen und der ausbleibenden Produktion von neutralisierenden Antikörpern auszeich- net (Ye et al., 2015; Bourton et al., 2018; Bertoletti & Ferrari, 2016). Aus der andauernden Virusreplikation und wiederkehrenden Immunantworten resultiert eine kontinuierliche Zerstö- rung der Leber, die letztlich zur Entwicklung einer Zirrhose und einem HCC beiträgt.

1.2.2 Struktur und Genomorganisation

HBV setzt sich aus drei verschiedenen Partikeltypen zusammen. Neben dem infektiösen Dane-Partikel (HB-Virionen) werden bei der HBV-Replikation filamentöse und sphärische subvirale Partikel (SVPs) produziert (Dane et al., 1970; Howard, 1986). Die SVPs sind nicht- infektiös und besitzen eine ausgeprägte Immunogenität (Ho et al., 2020). Das infektiöse HB- Virion besitzt einen Durchmesser von 42 nm. In die äußere Lipidmembran ist das integrale Oberflächenprotein HBsAg („s“ von engl. surface, Oberfläche) eingelagert. Dieses existiert in drei unterschiedlichen Isoformen: Als kleines (engl. small, sHBsAg), mittleres (engl. middle, mHBsAg) und als großes (engl. large, lHBsAg) HBsAg (Heermann et al., 1984). In der Virushülle befindet sich das ikosaedrische Nukleokapsid, welches sich aus Dimeren des HBcAg („c“ von engl. core, Kern) zusammensetzt (Zhou & Standring, 1992). Die SVPs bestehen nur aus Lipiden und dem Oberflächenprotein HBsAg. Das sphärische Partikel besteht hauptsächlich aus dem sHBsAg und weist einen Durchmesser von 22 nm auf. Das filamentöse Partikel enthält alle drei Formen des HBsAg und weist ebenfalls einen Durch- messer von 22 nm auf, wobei es jedoch in seiner Länge variiert (Gilbert et al., 2005; Heer- mann et al., 1984).

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Abb. 2: Das Hepatitis B Virus – Aufbau des Virions und seiner subviralen Partikel Links: Das infektiöse Dane-Partikel ist von einer Membranhülle umgeben, in welche die Oberflächenpro- teine IHBsAg, mHBsAg und sHBsAg eingelagert sind und die das Nukleokapsid umschließt. Das Kapsid enthält das virale Genom, an welches ein Komplex aus der viralen Polymerase und des terminalen Proteins assoziiert ist. Rechts: Subvirale Partikel, die entweder in filamentöser oder in sphärischer Form vorliegen können (Abb. verändert nach CD Landsberg).

Im Nukleokapsid befindet sich das zirkuläre und partiell doppelsträngige DNA-Genom (engl. relaxed circular DNA, rcDNA). Mit 3,2 kb stellt es eines der kleinsten Virusgenome autonom replizierender Viren dar (Tong & Revill, 2016). Es besteht aus einem vollständigen Minus- strang sowie einem verkürzten, komplementären Plusstrang (Landers et al., 1977; Summers et al., 1975). Nach der Infektion von Hepatozyten gelangt das Genom in den Zellkern und wird dort zu einer kovalent geschlossenen, zirkulären Form (engl. covalently closed circular DNA, cccDNA) vervollständigt. Die cccDNA persistiert im Zellkern und erschwert die Behandlung chronischer HBV-Infektionen, da die Beendigung der antiviralen Therapie zum Wiederauftre- ten von Virusnachkommen führen kann (Shih et al., 2016). Das HBV-Genom ist erstaunlich kompakt und enthält vier überlappende Gene. Durch die Verwendung verschiedener Transla- tionsstarts kodiert HBV für sieben verschiedene Proteine. Das C-Gen enthält eine präC- und C-Region, welche sowohl das Kapsid-Protein HBcAg als auch seine lösliche Form (HBeAg) kodieren. Das S-Gen konstituiert eine präS1, präS2- und S-Region, die für die drei Formen des HBs-Antigens (lHBsAg, mHBsAg und sHBsAg) kodieren. Das P- und das X-Gen kodieren die virale Polymerase bzw. das X-Protein (HBx) (Bartenschlager & Schaller, 1988; Heermann et al., 1984; Kwee et al., 1992; Ou et al., 1986; Seeger & Mason, 2000).

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1.2.3 Infektion und Replikation

Der Eintritt von HBV in die Hepatozyte erfolgt durch Endocytose und wird durch eine unspezifische Assoziation an Heparansulfatproteoglykane (HSPG) und die spezifische Bindung an den Gallensäure-Rezeptor NTCP initiiert (Leistner et al., 2008; Ni et al., 2014; Yan et al., 2012). Die Fusion des Virus mit der Zellmembran führt zur intrazellulären Freisetzung des Nukleokapsids ins Cytoplasma (Glebe & Urban, 2007). Nach dem Transport zum Zellkern dissoziieren die Kapsid-Proteine und die Virus-DNA transloziert durch die Kernporen in den Nukleus (Kann et al., 1997). Dort erfolgt zunächst die Vervollständigung und Reparatur des Genoms. Durch zelluläre Reparatur-Enzyme wird der Einzelstrangbereich des HBV-Genoms zu einem Doppelstrang vervollständigt (Köck & Schlicht, 1993). Die ccc- DNA liegt assoziiert mit Nukleosomen als Minichromosom vor (Bock et al., 1994). Ausge- hend von der cccDNA werden nun von der zellulären RNA-Polymerase II die mRNAs für die viralen Proteine und das RNA-Prägenom synthetisiert. Drei subgenomische RNAs (2,4 kbp, 2,1 kbp und 0,7 kbp) kodieren für die Oberflächenproteine und das X-Protein. Die superge- nomische RNA (3,5 kbp) ist länger als das eigentliche Genom und kodiert für die virale Polymerase, das HBcAg und HBeAg. Sie dient ebenfalls als Matrize für die Synthese des viralen DNA-Genoms (prägenomische RNA, pgRNA) (Cattaneo et al., 1984; Ganem & Varmus, 1987; Imazeki et al., 1987). Die RNA-Transkripte werden in das Cytoplasma entlassen und translatiert. Anschließend bindet die virale Polymerase die pgRNA und induziert die Verpackung der pgRNA zusammen mit der Polymerase in die bereits translatier- ten Kapsidproteine (Seeger et al., 1986). In diesen unreifen Nukleokapsiden findet die Umwandlung der prägenomischen RNA in das reife virale DNA-Genom statt. Durch die verschiedenen Enzymaktivitäten der viralen Polymerase erfolgt zunächst die reverse Tran- skription der pgRNA in einen komplementären (-)-DNA-Strang und anschließend die Degradation der pgRNA sowie die Synthese des (+)-DNA-Strangs (Lien et al., 1987; Summers & Mason, 1982). Die neu gebildeten Kapside können erneut deassemblieren und die Virus-DNA in den Zellkern entlassen, um die Expression viraler Transkripte zu erhöhen oder um als Matrize für die Synthese neuer cccDNA zu dienen (Tuttleman et al., 1986; Wu et al., 1990). Ein weiterer Weg führt die neuen Nukleokapside über das endoplasmatische Retiku- lum und den Golgi-Apparat zur Zellmembran. Dort erfolgt die Umhüllung des Nukleokapsids mit einer Lipidmembran, die die viralen Oberflächenproteine enthält (Huovila et al., 1992;

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Seeger & Mason, 2000). Durch Knospung gelangt das HB-Virion ohne lytischen Effekt von der Hepatozyte ins Blut (Blum et al., 1989). Die für eine HBV-Infektion charakteristische Schädigung der Hepatozyten wird durch protektive Immunantworten hervorgerufen. Dies ist der Preis, den der Wirt zur Kontrolle und angestrebten Eliminierung der Infektion mit einem intrazellulären Virus zahlen muss (Ferrari, 2015).

1.2.4 Tiermodelle in der HBV-Forschung

Die jahrzehntelange HBV-Forschung weist große Lücken im Verständnis der Mechanismen auf, die bei der Etablierung und Aufrechterhaltung der Infektion humaner Hepatozyten sowie der gleichzeitigen Interaktion mit dem Immunsystem von entscheidender Bedeutung sind. Dieser Makel beruht sowohl auf dem engen Wirtsspektrum als auch auf dem strengen Zelltropismus von HBV (Wettengel & Burwitz, 2020). Das Virus infiziert Menschen und große Affen (Seeger et al., 2015; Lichter et al., 1969; Maynard et al., 1972; Thornton et al., 2001; Warren et al., 1999). Im Folgenden werden einige Tiermodelle vorgestellt, in denen die HBV-Infektion und die induzierten Immunantworten erforscht werden können. Schimpansen (Pan troglodytes) sind HBV-permissiv und können eine akute oder chronische Infektion entwickeln (Barker et al., 1975; Wieland, 2015). Obwohl das Schimpansen-Modell die natürliche HBV-Infektion im Menschen präzise abbildet, ist die Verwendung von Schimpansen aus ethischen Gründen und aufgrund der hohen Haltungskosten nur in Ausnah- men (z. B. präklinischen Therapiestudien) praktikabel. Die Tupajas (Tupaia glis) sind die einzigen Nicht-Primaten, die ebenfalls experimentell für eine „natürliche“ HBV-Infektion permissiv sind. Aufgrund der sehr geringen Infektionseffizienz in vivo wird das Tupaja- Modell vorwiegend in vitro eingesetzt. Die Verwendung primärer Tupaja-Hepatozyten lieferte einen fundamentalen Beitrag zur Identifizierung des Zellrezeptors und anderer wichtiger Faktoren, die beim Andocken des HBV an die Wirtszelle beteiligt sind (Yan et al., 2012). Das Studium der natürlichen Infektion basiert größtenteils auf der Verwendung HBV- verwandter Viren wie das Enten-HBV (engl. duck hepatitis B virus, DHBV) und das Murmel- tier Hepatitis Virus (engl. woodchuck hepatitis virus, WHV). Das DHBV gehört nicht wie das humane Virus zu den Orthohepadnaviren, sondern zur Gattung der Avihepadnaviren, und weist lediglich 40% Homologie zu HBV auf. Diese Diskrepanz spiegelt sich auch in der

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Übertragbarkeit der DHBV-Forschungsergebnisse auf das humane Virus wider. Allerdings zeigt die initiale Entdeckung der cccDNA in infizierten Entenlebern, dass DHBV eine wichtige Rolle für das virologische Verständnis von HBV spielt (Mason et al., 1982; O'Connell et al., 1983). Das WHV ist enger mit dem HBV verwandt. WHV und HBV sind sich sowohl in ihrer Morphologie, also auch in ihrer Genomorganisation sehr ähnlich (Ko- dama et al., 1985; Tyler et al., 1981). WHV dient zur Untersuchung der Pathogenese und Immunologie der HBV-Infektion (Menne et al., 1998; Menne et al., 1997; Miller et al., 1990; Roggendorf et al., 2010). Daneben existieren Maus-Modelle zur Erforschung der HBV-Replikation. Die Maus (Mus musculus) ist das am besten charakterisierte Versuchskleintier und einfach in der Haltung und Handhabung, aber leider nicht HBV-permissiv. Um die Barriere des Wirtstro- pismus zu umgehen, wurden verschiedene HBV-Maus-Modelle entwickelt. Die HBV- transgenen Mäuse kodieren entweder nur bestimmte HBV-Antigene (Chisari et al., 1985; Milich et al., 1990; Kim et al., 1991) oder das vollständige HBV-Genom (Guidotti et al., 1995). Letztere produzieren in ihren Hepatozyten infektiöse HB-Virionen (Guidotti et al., 1995). Die Tiere sind den viralen Antigenen gegenüber immuntolerant. Da trotz HBV- Replikation in HBV-transgenen Mäusen keine Leberschäden beobachtet wurden, konnte gezeigt werden, dass das Virus allein nicht cytopathisch ist (Guidotti et al., 1995). Zudem kann die HBV-DNA in der Mausleber auch über virale Vektoren bereitgestellt werden. Mithilfe von Adenoviren (Ad-HBV) und Adeno-assoziierten Virusvektoren (AAV- HBV) können eine akute bzw. eine persistierende HBV-Infektion induziert werden (Sprinzl et al., 2001; Huang et al., 2012). Die Hydrodynamische Injektion (H. I.) von HBV-Genomen in Mäusen ist eine effiziente Methode zum Transfer genetischen Materials in die Leber. Dabei wird in die Schwanzvene ein großes Volumen einer Flüssigkeit injiziert. Die DNA, welche sich in der Lösung befindet, wird aufgrund des hohen intravenösen Drucks von den Hepatozyten aufgenommen und die Gene transient exprimiert. Diese Prozedur führt nach der Injektion zu einem kurzzeitigen, signifikanten Leberschaden. Daher müssen mögliche Interferenzen mit der murinen Zellfunk- tion und Genexpression berücksichtigt werden. Allerdings ermöglicht das Modell die Bereitstellung replikations-kompetenter HBV-Genome in der Leber immunkompetenter Mäuse (Yang et al., 2002). Die Virämie erreicht ihren Höhepunkt etwa nach einer Woche.

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HBV-spezifische Antikörper und CD8+ T-Zell-vermittelte Immunantworten führen zur Eliminierung von HBsAg und HBV-DNA im Serum. Mithilfe dieses Modells können Immunantworten, die während einer akuten Infektion stattfinden, erforscht werden. Zudem sind Ansätze verfügbar, mit denen sich eine chronische Infektion in Mäusen abbilden lässt (Preston et al., 2016). Im Gegensatz zu transgenen Mäusen können mit diesem System verschiedene HBV-Genotypen und Varianten in vivo in relativ kurzer Zeit analysiert werden. Hydrodynamik-basierte Maus-Modelle dienten bereits zur Evaluierung antiviraler Substanzen (McCaffrey et al., 2003) und zur Strategieentwicklung zur Eliminierung von cccDNA (Lin et al., 2014).

1.2.5 Therapiemöglichkeiten, Resistenzen und Prävention Bei der Behandlung einer chronischen, HBV-induzierten Hepatitis kommen entweder pegy- liertes Interferon (IFN) oder Nukleosid-Analoga (Lamivudine, Adefovir, Telbivudine, Entecavir und Tenofovir) zum Einsatz. Wie bei den meisten antiviralen Therapien besteht auch bei HBV die Gefahr der Resistenzbildung (Ahn & Ahn, 2018). Trotz der Verfügbarkeit von antiviralen Medikamenten ist bis heute ist kein Heilmittel gegen eine chronische HBV- Infektion verfügbar. Die Therapie kann zwar die Virus-Infektion bis unterhalb der Nachweis- grenze eindämmen, jedoch nicht vollständig eliminieren. In den allermeisten Fällen bedarf es einer lebenslangen Medikamenteneinnahme, welche auch die Progression vorhandener Leber- Erkrankungen verlangsamt (Alonso et al., 2017). Da in seltenen Fällen spontane, immunvermittelte Heilungen der chronischen Hepatitis B sowie die Eliminierung des Virus beobachtet wurden, könnte ein gegen HBV gerichteter therapeutischer Impfstoff als Paradebeispiel für andere chronische Viruserkrankungen dienen (Cornberg et al., 2011). Bei jenen Patienten, in denen eine spontane Heilung stattfand, scheint das Immunsystem „gelernt“ zu haben, das Virus zu kontrollieren. Eine therapeutische Impfung soll das Immunsystem des Patienten (re)aktivieren und damit eine Bekämpfung, Kontrolle und optimalerweise Eliminierung der Virusinfektion herbeiführen. Eine HBV-Infektion kann durch eine prophylaktische Schutzimpfung verhindert werden (Szmuness et al., 1980; Beasley et al., 1981). Prophylaktische Impfstoffe basieren meistens auf einer raschen Antikörper-vermittelten Neutralisierung eines eindringenden Pathogens. Zur Kontrolle und Eliminierung einer HBV-Infektion sind jedoch multi-spezifische und polyfunk-

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tionale T-Zell-Antworten erforderlich, die sich idealerweise gegen kontinuierlich exprimierte virale Antigene richten. Die Impfung schützt jedoch nur seronegative Personen vor einer Virusübertragung.

1.3 Das Immunsystem

Das Immunsystem ist ein evolutionär konserviertes Abwehrsystem des Wirtes. Das Immun- system kann in zwei Kompartimente unterteilt werden: Das angeborene/allgemeine Resistenz- system und das adaptive System. Beide Systeme interagieren kontinuierlich miteinander, um eine effektive Immunantwort zu generieren.

1.3.1 Die angeborene Immunantwort

Das angeborene Immunsystem besteht aus einer Reihe kontinuierlich funktionsfähiger, protektiver Komponenten und stellt somit immer die erste Verteidigungslinie gegen pathogene Einflüsse dar. Neben anatomischen Barrieren (z. B. eine intakte Haut oder die Schleimhäu- te des respiratorischen oder gastrointestinalen Traktes) weist das angeborene Immunsystem auch physiologische Barrieren (z. B. Fieber, Magensäure, Tränenflüssigkeit) auf. Neben diesen anatomischen und physiologischen Mechanismen beinhaltet das angeborene Abwehr- system Immunzellen (s. Gasteiger et al., 2017), die im Zuge von Infektionen, Gewebeverlet- zungen oder genotoxischen Stress aktiviert werden. Die angeborene Immunität kann solche Situationen durch keimbahnkodierte mustererkennende Rezeptoren (engl. pattern recognition receptor, PRR) wahrnehmen. Obwohl diese PRRs keine Spezifität gegenüber einem bestimmten Pathogen oder Antigen aufweisen, lösen sie eine rasche Immunreaktion gegen Antigene aus. PRRs kommen in subzellulären Kompartimenten wie den zellulären und endosomalen Membranen, dem Zytosol und auch in sekretierten extrazellulären Formen im Blut oder in interstitiellen Flüssigkeiten vor (Medzhitov & Janeway, 1997). Die PRRs erkennen konservierte pathogen-assoziierte molekulare Strukturen (engl. pathogen-associated molecular pattern, PAMP), die sich von den Selbstantigenen des Wirts unterscheiden (Janeway & Medzhitov, 2002) und “Gefahr“-assoziierte molekulare Muster (engl. danger-associated molecular patterns, [DAMPs]) des Wirtes, welche auf Änderungen in der Homöostase hindeuten (Matzinger, 1994). Die Erkennung von PAMPs führt u. a. zur Aktivierung des

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Komplementsystems, Opsonisierung, Aktivierung von Phagozyten und der Freisetzung von Zytokinen (Ricklin et al., 2010; Mevorach, 2000; Galli et al., 2011). Zytokine sind sowohl bei der Abwehr von bakteriellen und viralen Infektionen als auch in deren Pathogenese und Symptomatik involviert. Sie können autokrin (an Ort und Stelle), parakrin (in benachbarten Zellen) oder endokrin (in entfernten Zellen) wirken. Deshalb spielen sie eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Regulation von Immunzellen. Zytokine werden in verschiedene Klassen unterteilt: Chemokine, Interleukine, Lymphokine, Tumor-Nekrose-Faktor und Interferone (IFNs) (Zhang & An, 2007; Dinarello, 2007; Turner et al., 2014; O'Shea et al., 2002).

1.3.1.1 Interferone

Interferone (IFNs) wurden vor etwa 60 Jahren von Isaacs & Lindenmann in Oxford und parallel von Nagano & Kojima in Tokyo beschrieben (Isaacs & Lindenmann, 1957; Isaacs et al., 1957; Nagano et al., 1954; Nagano et al., 1966). Interferone wirken antiviral, antiprolife- rativ, apoptotisch und immunmodulatorisch (Fleischmann, 1988; Barber, 2000; Megger et al., 2017). Anhand ihrer molekularen Homologien sowie ihrer Rezeptoren können IFNs in drei verschiedene Typen unterteilt werden (Shulman et al., 1984; Kotenko et al., 2003; Sheppard et al., 2003). Zu der Multigenfamilie der Typ-I-IFNs zählen über 14 IFNα-Subtypen im Menschen und 10 IFNα-Subtypen in der Maus. Diese Subtypen weisen verschiedene biologische Funktionen auf (Cull et al., 2003; Gerlach et al., 2009; Gibbert & Dittmer, 2011; Lavoie et al., 2011; Matos et al., 2019). Ebenfalls zur Familie der Typ-I-IFNs zählen IFNβ, IFNε, IFNτ, IFNδ, IFNκ und IFNω (Hardy et al., 2004; Pestka et al., 2004). Die murine und die humane Genfamilie weisen große Analogien zueinander auf (Seif & De Maeyer-Guignard, 1986). Typ-I-IFNs werden nach der Erkennung von PAMPs durch PRRs in der infizierten Zelle sowie in benachbarten Zellen induziert und produziert (s. Asselin-Paturel & Trinchieri, 2005). Sie werden von den meisten Zelltypen sekretiert und ihr Rezeptorkomplex befindet sich auf allen kernhaltigen Zellen. Sie wirken direkt antiviral, hemmen die Zellproliferation und besitzen immunmodulatorische Eigenschaften (Paquette et al. 1998; Biron, 2001; Tough et al., 1996). Im Gegensatz dazu existiert nur ein einziges Typ-II-Interferon: IFNγ (Pestka et al., 1987). Dieses wird hauptsächlich von T-Zellen und NK-Zellen produziert. Obwohl dem IFNγ

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vorwiegend immunmodulatorische Funktionen zugeschrieben werden, konnten direkte antivirale Effekte von IFNγ gezeigt werden (Boehm et al., 1997; Le et al., 2008; Trilling et al., 2011; Trilling et al., 2009; Zimmermann & Trilling et al., 2005). Die drei eng verwandten humanen Typ-III-Interferone IFNλ1, IFNλ2 und IFNλ3 wurden als erstes identifiziert (Kotenko et al., 2003; Sheppard et al., 2003), gefolgt von der Entdeckung des entfernter verwandten IFNλ4 (Prokunina-Olsson et al., 2013). Mäuse exprimieren nur zwei funktionale Typ-III-IFNs: IFNλ2 und IFNλ3 (Lasfar et al., 2006). Die initiale Entde- ckung der Typ-III-IFN lag einer Sequenzanalyse zugrunde, bei der die Existenz einer neuen Rezeptoruntereinheit, dem IFN-λ-Rezeptor 1 (IFNLR1) geklärt wurde. Im Komplex mit dem Interleukin-10-Rezeptor 2 (IL-10R2) transmittiert IFNLR1 Signale dieser neuen IFN-Familie. Die Typ-III-Interferone werden während einer Virusinfektion von Epithelzellen, Keratinozy- ten und Hepatozyten sekretiert und stimulieren Epithelzellen, insbesondere des respiratorischen und gastrointestinalen Traktes (Sommereyns et al., 2008; Lazear et al., 2015).

1.3.1.2 Interferone und die Jak-STAT-Signaltransduktion

Typ-I-IFNs werden rasch nach der Stimulation von PRRs produziert (Sun et al., 2013). Dabei wird zunächst abhängig von einer Phosphorylierung des IFN-regulierenden Faktors 3 (IRF3) und der Aktivierung von NFκB (engl. nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells) eine initiale Welle aus IFNβ und IFNα4 produziert (Honda et al., 2006; Tamura et al., 2008; McNab et al., 2015). Diese initiale Typ-I-IFN-Welle induziert die Phosphorylie- rung von IRF7 und führt durch eine positive Rückkopplung wiederum zu einer erhöhten Freisetzung von Typ-I-IFNs. Diese produzierten Zytokine nutzen allesamt denselben Rezep- tor, den Typ-I-IFN Rezeptor (IFNAR). IFNAR setzt sich aus zwei membranständigen Untereinheiten zusammen: IFNAR1 und IFNAR2 (s. Abb. 3), wobei IFNAR2 für die hochaffine IFN-Bindung zuständig ist.

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Abb. 3: Schematische Darstellung der Signaltransduktion von IFN Typ-I, -II und -III Die Bindung der Interferone an spezifische Rezeptoren führt zur Phosphorylierung verschiedener Tyrosin- Kinasen. Diese aktivieren STAT-Moleküle, die daraufhin Homo- oder Heterodimere bilden, translozieren in den Zellkern. Dies führt zur Stimulation der Transkription verschiedener antiviraler Zielgene. Auch wenn STAT2-Homdimere nicht zu dem bisher beschriebenen Typ-I-IFN-Signalweg zählen, konnte bereits gezeigt werden, dass diese nach Stimulation mit IFNα gebildet werden (Blaszczyket et al., 2015). Eine detailliertere Beschreibung und Erklärung von Abkürzungen sind dem Text zu entnehmen (siehe Abschnitt 1.3.1.2). NPC: nuclear pore complex, OAS: Oligoadenylat-Synthetase, IDO: Indoleamine-2,3- oxigenase, INOS:Induzierbare NO-Synthase. Abb. verändert nach CD Landsberg (basierend auf Howe, 2017 und Trilling, 2013).

Nachdem Typ-I-Interferon gebunden hat, kommt es zu einer Konformationsänderung, Dimerisierung und Autophosphorylierung des Rezeptors, wodurch die assoziierten Tyrosin- kinasen aktiviert werden. IFNAR1 ist mit der Tyrosinkinase 2 (Tyk2) und IFNAR2 mit der Januskinase 1 (Jak1) assoziiert (Platanias, 2005; Marchetti et al., 2006). Diese Kinasen phosphorylieren nun intrazelluläre Tyrosinreste des Rezeptors, die daraufhin als Bindestelle für signal transducer and activator of transcription (STAT) 1 und STAT2 dienen. Letztere werden phosphoryliert und bilden mit IRF9 einen Komplex (auch Interferon-stimulierter Genfaktor 3 [ISGF3] genannt). ISGF3 transloziert in den Zellkern und bindet dort an spezifi-

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sche DNA-Elemente mit einer charakteristischen Konsensus-Sequenz. Diese Motive werden interferon-stimulated response elements (ISRE) genannt und induziert die Transkription von interferon-stimulated genes (ISGs) (s. Abb. 3). Darüber hinaus induzieren Typ-I-IFNs auch die Phosphorylierung und Dimerisierung von STAT3, STAT4, STAT5 und STAT6, was zur Aktivierung weiterer Signaltransduktionswege führt (s. Uddin et al., 2000; 1999; 1995). Für IFNβ wurde unabhängig von der IFNAR2 Untereinheit eine spezifische Ligation mit IFNAR1 gezeigt, durch welche Signale transduziert werden, die unabhängig vom Jak-STAT-Signalweg zur Modulation von Genen führen (de Weerd et al., 2013). Außerdem gibt es eine STAT1-unabhängige Signaltransduktion nach Stimulation mit IFNα, bei der es zu der Bildung von STAT2/IRF9-Komplexen kommt. Dieser Komplex induziert STAT2/IRF9-spezifische ISGs (Blaszczyk et al., 2015). Zusätzlich werden durch Typ-I-IFN auch STAT1-Homodimere gebildet, die dann als alpha-activated factor (AAF) bezeichnet werden (Decker et al., 1991). Das Typ-II-Interferon IFNγ bindet an einen Rezeptor, der aus den Untereinheiten IFNGR1 und IFNGR2 besteht. Diese sind mit den Tyrosinkinasen Jak1 und Jak2 verbunden. Im kanonischen Signalweg der IFNγ-Signaltransduktion werden STAT1-Monomere phosphoryliert und bilden anschließend Homodimere (s. Abb. 3). Das aktivierte Homodimer transloziert in den Zellkern und bindet dort an sogenannte gamma-activated sequences (GAS). Allerdings ist auch STAT2 in die IFNγ-Signaltransduktion involviert. IFNγ induziert wie Typ-I-IFN die Formierung eines ISFG3-Komplexes, wodurch zusätzlich eine ISGF3-abhängige ISG- Expression stattfindet (Le-Trilling et al., 2018; Matsumoto et al., 1999; Trilling et al., 2013; Zimmermann & Trilling et al., 2005). IFNγ induziert nicht nur die Transkription verschiedener Gene, sondern unterdrückt auch die Transkription zahlreicher Gene. Diese Gene werden IFN-repressed genes (IRepGs) genannt (Trilling et al., 2013; Megger et al., 2017). Die Signalkaskaden unterhalb des IFNλ-Rezeptorkomplexes sind denen, die als Antwort durch Typ-I-IFN aktiviert werden, sehr ähnlich (Kotenko, 2011). Die Signaltransduktion erfolgt vorwiegend über IFNLR (IL28Ra) oder IFNAR (IL10R2) und wird über den Jak- STAT-Signalweg weitergeleitet (s. Abb. 3). Die Bildung des ISGF3-Komplexes ist hoch spezifisch sowohl für die Typ-I als auch für Typ-III-IFN Signalübertragung. Obwohl Typ-I- und Typ-III-IFN die Expression sehr ähnlicher ISGs induzieren, variiert diese jedoch hinsichtlich ihrer Kinetik. Im Allgemeinen erreicht die Expressionskurve von ISGs als

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Antwort auf Typ-I-IFN ihren Höhepunkt früher und flacht schneller wieder ab. Hingegen zeigen die Expressionslevel von Typ-III-IFN stimulierten Genen ein vergleichsweise verspä- tetes und anhaltendes Induktionsmuster (Marcello et al., 2006; Bolen et al., 2014; Jilg et al., 2014). Die von Typ-I-IFN unterschiedliche biologische Funktion von IFNλ wird u. a. durch die vorwiegende Expression seiner Rezeptoren in Barriere bildenden Epithelzellen des respiratorischen und gastrointestinalen Traktes sowie an der Blut-Hirn-Schranke festlegt (Kotenko et al., 1997; Nagalakshmi et al., 2004; Zhou et al., 2007). IFNλ spielt in der antiviralen Abwehr eine nicht-redundante Rolle, die nicht durch Typ-I-IFN kompensiert werden kann (Ye et al., 2019). Einzelnukleotid-Polymorphismen (engl. Single Nucleotide Polymorphism, SNP) in den IFNλ- Genen im Menschen sind stark mit dem Verlauf von Virusinfektionen assoziiert (Freitas et al., 2020; Møhlenberg et al., 2019). Zudem besitzt IFNλ modulatorische Eigenschaften in Bezug auf das adaptive Immunsystem. Es ist sowohl an der Regulation von B-Zellen als auch von T-Zellen beteiligt (Egli et al., 2014).

1.3.2 Die adaptive Immunität – ein spezifisches Abwehrsystem des Wirts

Die adaptive Immunität wird durch das Zytokin-Milieu während der angeborenen Immunant- wort induziert. Im Gegensatz zum angeborenen Immunsystem benötigt die erworbene Immunität mehr Zeit, kann jedoch hochspezifisch Erreger eliminieren. Dabei kann ein immunologisches Gedächtnis ausgebildet werden, das den Organismus bei einer erneuten Infektion mit demselben Erreger schützt. Die zellvermittelte adaptive Immunantwort wird durch B-und T-Lymphozyten sowie Antigen-präsentierende Zellen (APC; z. B.: Dendritische Zellen (DC), Makrophagen, B-Zellen und Monozyten) ausgeführt. Im peripheren Gewebe nehmen unreife DCs Antigene von eingedrungenen Pathogenen auf und migrieren über die Lymphbahn in sekundäre lymphatische Organe (Milz und Lymphknoten), wo sie die prozes- sierten Peptidfragmente dort zirkulierenden naiven T-Lymphozyten präsentieren. Diese wandeln sich in Effektor-T-Zellen um und initiieren entweder die Zell-vermittelte Immunan- twort am Infektionsort oder verbleiben im lymphatischen Gewebe und leiten dort die humorale Immunabwehr durch Aktivierung der B-Lymphozyten ein. B-Zellen werden im Knochenmark gebildet. Dort durchlaufen sie einen Entwicklungsprozess, bei dem durch zufällige Mutationen und Neuanordnung von duzenden B-Zell-Rezeptor-

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Genen ein riesiges Repertoire an B-Zellen mit einer hohen Anzahl an möglichen Spezifitäten entsteht. Dieses initiale Repertoire muss frei von Auto-Reaktivitäten und in der Lage sein, auf jegliche fremdartigen Reize in dem Maße zu reagieren, dass zumindest eine Aktivierung von schwach kreuzreaktiven B-Zellklonen erfolgt. Die Aktivierung durch Antigen-Kontakt führt zu einer gerichteten Migration in die sekundären Lymphatischen Organe (MacLennan et al., 2003; MacLennan et al., 1997; Toellner, 2014). Die Affinität der B-Zell-Rezeptoren wird im Folgenden gesteigert durch klonale Expansion, somatische Hypermutationen der B-Zell- Rezeptor-Gene (Griffiths et al., 1984; Gearhart et al., 1981) gefolgt von einer Selektion der B-Zellen, die eine höhere Affinität als ihre Vorgänger und keine Kreuz-Aktivität mit Selbst- Antigenen aufweisen (Sabouri et al., 2014). Anschließend reifen die B-Zellen weiter zu Plasmazellen. Diese beginnen mit der Produktion von bestimmten Antikörpern, welche die höchste Affinität zu dem Antigen aufweisen. Von diesen B-Zellen werden Klone generiert, welche entweder ebenfalls Antikörper-produzierende Plasmazellen oder als B- Gedächtniszellen in den Lymphknoten zurückbleiben, um eine erneute Immunantwort gegen das Antigen zu induzieren. Dies geschieht beim primären Kontakt zu einem bestimmten Pathogen. Der Prozess der klonalen Selektion und Expansion dauert einige Tage und führt zur Produktion von IgM, dem ersten Antikörpertyp, der während einer primären Immunantwort gebildet wird. Im Laufe der Immunantwort fangen die Plasmazellen an, somatisch mutierte bzw. Antigen-spezifische IgG-Antikörper zu produzieren. Obwohl IgM zuerst produziert wird, ist IgG i. d. R. ein besserer neutralisierender Antikörper, bindet effektiver als IgM (Honjo et al., 2002) und vermittelt u. a. die Opsonisierung von eingedrungenen Pathogenen (s. Bournazos & Ravetch, 2017). Plasmazellen produzieren auch andere Klassen von Antikör- pern wie IgD, IgA und IgE. IgG ist jedoch der wichtigste Antikörper bei der Entwicklung von Impfstoffen. Trotz der limitierten Anzahl spezifischer B-und T-Lymphozyten entsteht durch klonale Selektion und somatische Rekombination ein riesiges Repertoire an Lymphozyten- Klonen mit hochspezifischen Antigenrezeptoren. Mithilfe der bei der primären Immunantwort gebildeten T- und B-Gedächtniszellen wird bei erneuter Pathogen-Exposition durch eine raschere Proliferation (klonale Expansion) eine rapidere und effektivere sekundäre Immun- antwort gegen das bekannte Antigen induziert. Diese sekundäre humorale Immunantwort besteht vorwiegend aus IgG-Antikörpern (Seifert & Küppers, 2016; Parkin & Cohen 2001)

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1.4 Immunisierung

Immunisierung bezeichnet das Herbeiführen eines Schutzes vor Erkrankungen mithilfe von Komponenten des (adaptiven) Immunsystems. Eine Immunisierung kann aktiv oder passiv herbeigeführt werden. Bei einer natürlichen Infektion oder Impfung entwickelt der Organis- mus bei Kontakt mit einem Erreger „aktiv“ Antikörper gegen Teile des Erregers (Antigene), die durch das Immunsystem erkannt werden. Dies führt bei erneutem Antigen-Kontakt zu einer Resistenz des immunisierten Individuums. Die langanhaltende bis lebenslängliche Immunität beruht auf der Spezifität klonaler T- und B-Zellen sowie der langen Lebensspanne zuvor gebildeter Gedächtniszellen. Bei erneutem Kontakt mit demselben Antigen expandieren die Immunzellen und bringen so die Infektion durch schnelle und gezielte Immunantworten zeitnah unter Kontrolle (Agrawal, 2019). Bei der passiven Immunisierung wird durch die Injektion vorbehandelter Antikörper oder Lymphozyten ein umgehender, vorübergehender Schutz vor Infektionskrankheiten erzielt (Cruz-Ramos & García-Foncillas, 2019; Pelegrin et al., 2015). Die Übertragung mütterlicher Antikörper auf den Fetus über die Plazenta oder auf den Säugling mit der Muttermilch sind natürliche Formen der passiven Immunisierung (Vojtek et al., 2018). Aufgrund ihrer schnellen Wirkung wird die passive Immunisierung zur Behandlung von Krankheiten eingesetzt, die nach erfolgter Infektion oder Exposition gegenüber Toxinen drohen. Zwar können Immunglobuline auch prophylaktisch eingesetzt werden (s. Keller & Stiehm, 2000; Zeitlin et al., 1999), doch bieten sie aufgrund ihrer Kurzlebigkeit im Körper keinen Langzeitschutz, wie er durch eine aktive Immunisierung erzielt werden kann (Hedegaard & Hedegaard, 2016).

1.4.1 Vakzine

Eine der größten Erfolgsgeschichten der Medizin zur Prävention und Kontrolle von (Infektions-)Krankheiten stellt der weit verbreitete Einsatz von Impfstoffen dar, welcher im Jahr 1978 zur vollständigen Ausrottung des humanen Pockenvirus führte. Durch Impfungen werden jährlich 2–3 Millionen Menschenleben gerettet und unzählige Erkrankungen abge- wendet (https://www.who.int/news-room/facts-in-pictures/detail/immunization). Gezielte und weltweite Impfmaßnahmen senkten die Inzidenzen von Polio, Masern und anderen Kinder- krankheiten in den vergangenen Jahrzehnten dramatisch (Plotkin, 2009; Younger et al., 2016).

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Traditionelle Impfstoffe (z. B. lebend-attenuierte oder inaktivierte Viren/Bakterien sowie deren Bestandteile) trugen größtenteils zum Erfolg im Kampf gegen verschiedenste Krank- heitserreger bei. Die Produktion von konventionellen Impfstoffen ist jedoch arbeits- sowie kostenintensiv und langwierig (Ulmer et al., 2006). Zudem sind hochvirulente Pathogene nur unter teuren Sicherheitsbedingungen propagierbar. Ebenso besteht die Gefahr, dass attenuierte Erreger in ihre pathogene Form revertieren können (Pons-Salort et al., 2016) und daher meistens nur vollständig immunkompetenten Individuen verabreicht werden können (Ada, 2005). Inaktivierte Impfstoffe können nicht replizieren und besitzen daher kaum pathologi- sche Effekte. Aufgrund ihrer geringeren Immunogenität müssen Untereinheiten-Impfstoffe entweder in hohen Dosierungen oder in Kombination mit Wirkstoffverstärkern, sog. Ad- juvanzien, verabreicht werden, um eine protektive Immunantwort auszulösen (Wagner & Hildt, 2019). Nahezu alle zugelassenen Impfstoffe rufen eine starke, langanhaltende Immun- antwort hervor, wie sie durch eine natürliche Infektion (z. B. Polio oder Gelbfieber) hervorgerufen werden würde. Bisher war es jedoch schwierig eine präventive Immunität gegenüber Erregern wie HIV, Tuberkulose oder Malaria zu generieren. Diese Pathogene induzieren keine protektive Immunantwort und/oder besitzen immunevasive Eigenschaften. Wiederholte Infektionen (z. B. mit Malaria) oder chronische Krankheitsverläufe wie Tuberkulose, AIDS oder Krebs sind die Folge. Eine Amplifikation der natürlichen Immunantworten mithilfe der konventionellen Impfstoffe konnte daher nur eine unzureichende oder gar keine Immunität gegen diese Erreger erzielen (Hawn et al., 2014; Picker et al., 2012; Stephenson et al., 2016; Cowman et al., 2016). Mithilfe der Erkenntnisse aus der Virologie und Immunologie wurden evolutionär konservierte, immunologische Schwachstellen der Pathogene identifiziert. Dies legte den Grundstein des neuen, rationalen Vakzin-Designs (Rodrigues et al., 2017). Die industrielle Revolution und Globalisierung führten weltweit zu einem radikalen, demo- graphischen Wandel. Das Ansteigen der Lebenserwartung, der Bevölkerungsdichte und der Reiseaktivität rund um den Globus liefert die Basis für das Auftauchen und die Verbreitung alter und neuer Pathogene, die das potentielle Risiko einer pandemischen Bedrohung in sich tragen. Die rasche Ausbreitung von gefährlichen Erregern wie HIV, SARS, Ebola, Zika in den vergangenen Jahrzehnten und die aktuelle Corona-Pandemie betonen die Ernsthaftigkeit dieser Bedrohung. Eine ebenso akute Gefahr stellt die fortschreitende Medikamenten- Resistenz von Viren dar (z. B. HIV, CMV, Hepatitis B und C) (Yeo et al., 2020; Heliövaara

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et al., 2019; Jia et al., 2018; Yamashita et al., 2020). Ihre enorme genetische Diversität, hohe Mutationsraten, genetische Rekombination und schnelle Replikation ermöglichen den Viren der Immunantwort des Wirtes und antiviralen Therapien zu entkommen und resistente Stämme zu bilden. Eine Verbreitung dieser Pathogene kann mithilfe von Impfstoffen unterbunden werden. Eine schnelle, effektive Entwicklung, eine hocheffiziente Produktion und globale Bereitstellung von Impfstoffen sind dazu unerlässlich. Nukleinsäure-basierte Impfstoffe (z. B. DNA und mRNA) können schnell entwickelt und ohne hohe Sicherheitsauf- lagen in großen Margen produziert werden. Ein weiterer Vakzin-Ansatz stellt die Verwen- dung von viralen Vektoren dar, welche im folgenden Abschnitt beschrieben werden.

1.4.2 Virale Impfvektoren

Vektoren sind Transportvehikel zur Übertragung eines Nukleinsäurestrangs in eine Empfän- gerzelle. Das Prinzip viraler Vektoren fand erstmals Erwähnung im Jahr 1972 (Jackson et al., 1972). Im Jahr 1982 folgte die Beschreibung des Vakzinia Virus als transienter Genexpressi- onsvektor (Macket et al., 1982; Panicali et al., 1982). Das erste rekombinante Virus zur Bereitstellung eines Vakzin-Antigens war ein rekombinantes Vakzinia Virus, das ein Antigen aus dem Hepatitis B Virus fremd exprimierte. Nach der Immunisierung von Schimpansen induzierte es protektive Immunantworten nach einer Stimulation mit Hepatitis B (Moss et al., 1984). Innerhalb der vergangenen Jahrzehnte wurden verschiedene virale Vektorentypen entwickelt, die sowohl in Tierversuchen als auch in klinischen Studien untersucht wurden (Ramezanpour et al., 2016; Rauch et al., 2018). Moderne virale Vakzinvektoren sind häufig Replikations- inkompetent oder attenuiert und weisen aufgrund einer geringen Zytotoxizität, Symptomatik und Genotoxizität sowie ihrer Zellspezifität und genetischen Stabilität eine hohe Biosicherheit auf. Da virale Vektoren sowohl eine humorale als auch eine zelluläre Immunität induzieren, stellen sie eine attraktive Alternative zu traditionellen Vakzinen dar. Die humorale Antwort bildet zwar neutralisierende Antikörper, die eine Infektion verhindern können, sie wirkt jedoch nur extrazellulär. Im Gegensatz dazu kann die zelluläre Immunität infizierte Zellen erkennen und eliminieren. Die Entwicklung viraler Vektoren stellt somit einen vielversprechenden Ansatz im Kampf gegen chronische Infektionen (z. B. Hepatitis, AIDS) sowie von Tumoren dar.

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Andererseits gibt es bei der Produktion und Anwendung virusbasierter Impfvektoren auch Einschränkungen. Bei der Propagierung der viralen Vektoren muss stets untersucht werden, ob die Kulturen frei von undefinierten, mutierten Pathogenen sind, da Viren während ihrer Replikation genetische Rekombinationen durchlaufen können (Condit et al., 2016). Kontami- nationen eines Impfstoffs durch andere Mikroorganismen müssen ebenfalls ausgeschlossen werden (Klug et al., 2016; Petricciani et al., 2014). Eine weitere Limitation stellt die präexis- tierende Immunität gegenüber dem Vektorvirus dar, welche zu einer verminderten Immuno- genität des Vektors führen kann (Belyakov et al., 2003; Li et al., 2012; Fausther-Bovendo & Kobinger, 2014). Zudem ist bei manchen virusbasierten Vektoren die Verpackungskapazität begrenzt (Ura et al., 2014). Beim Design multivalenter und multipathogener Impfstoffe, welche mehrere Antigene eines Pathogens oder verschiedener Pathogene bzw. unterschiedlichen Serotypen in Kombination bereitstellen, könnte die Kodierungskapazität des Vektors ein entscheidendes Kriterium darstellen (Lauer et al., 2017).

1.4.3 CMV-basierte Impfvektoren

Die Klonierung von CMV-Genomen als bacterial artificial chromosomes (BACs) in E- scherichia Coli ermöglichte die gentechnische Manipulation der viralen DNA (Messerle et al., 1997). Dies eröffnete neue Optionen zur effektiven Expression von exogenen Immunoge- nen sowie zur Modifikation großer Genombereiche (Karrer et al., 2004; Mohr et al., 2008). Für die Vakzin-Entwicklung ist ein wesentlicher Vorzug die starke Immunogenität der CMV- basierten Vektoren. In der ersten Woche nach der Infektion wird die MCMV-Replikation in den meisten Organen unter Kontrolle gebracht, während die spezifischen T-Zellen geprägt werden. Nach dem Eintreten einer Latenz, in der keine oder lediglich eine limitierte Virusrep- likation ohne detektierbare infektiöse Partikel stattfindet (Reddehase & Lemmermann, 2019), durchläuft CMV sporadisch Reaktivierungszyklen, was zu einer wiederholten Präsentation der viralen Antigene und Stimulation der spezifischen Gedächtniszellen führt. Eine atypische Akkumulation einer Vielzahl virusspezifischer CD8+-T-Zellen im Blut sowie in den peripheren Geweben sind das Resultat (Karrer et al., 2004; Klenerman & Oxenius, 2016; O'Hara et al., 2012). Dieses Phänomen wird als „Gedächtnis-Inflation“ (engl. memory inflation) bezeichnet, da die akkumulierenden CMV-spezifischen CD8+-T-Zellen sogar nach Erreichen der Latenzphase fortwährend expandieren, funktional bleiben und keine Anzeichen einer

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„Ermüdung“ (engl. exhaustion) zeigen (Holtappels et al., 2000; Podlech et al., 2000; Snyder et al., 2008; Klenerman, 2018). Da die induzierten Gedächtniszellen einen Effektor-ähnlichen Phänotyp aufweisen, weiter proliferieren und sich immer weiter zu hochentwickelten Phänotypen differenzieren, können sie bei erneutem Kontakt schnell die Infektion unter Kontrolle bringen (Sierro et al., 2005; Sallusto et al., 2004; Pardieck et al., 2014). Da nicht alle immundominanten CMV-Epitope inflationäre Immunantworten induzieren, ist es für das Vektordesign von elementarer Bedeutung herauszufinden, was die entscheidenden Faktoren sind. Wichtige Determinanten, die das Muster und die Stärke von T-Zellantworten bzw. das Auftreten einer Gedächtnis-Inflation beeinflussen, sind die Genexpression (Zeit- punkt sowie Lokalisation im CMV-Genom), die Avidität des Epitops sowie die Peptid- Prozessierung (Dekhtiarenko et al., 2013; Borkner et al., 2017; Čičin-Šain, 2019). Nicht nur die CMV-spezifischen CD8+-T-Zellen sind mit der Zeit in ihrer Frequenz erhöht. Im Serum des infizierten Wirts akkumulieren im Laufe der Infektion auch CMV-spezifische Antikörper. Während der Latenzphase einer HCMV-Infektion konnte ebenso eine inflationäre B-Zell- Antwort in Form eines graduellen Anstiegs der IgG-Level nachgewiesen werden (Vescovini et al., 2016). Auch in der Maus steigen die MCMV-spezifischen IgG-Level während der Latenz weiter an und persistieren noch lange Zeit nach der Infektion (Welten et al., 2016). Interessanterweise können CMV-basierte Vektoren, die ein Fremd-Antigen exprimieren, ebenfalls protektive Antikörper-Antworten induzieren, die spezifisch gegen das Fremd- Antigen gerichtet sind. Dies wurde für einen MCMV-Vektor gezeigt, der Tetanus-Toxin- Fragmente exprimiert (Tierney et al., 2012). CMV-Vakzinvektoren könnten daher möglich- erweise dazu benutzt werden, um neben expandierenden T-Zell-Antworten auch lebenslange humorale Immunität gegenüber Vektor- exprimierten Antigenen zu vermitteln. Im Gegensatz zu anderen Vakzinvektoren stellt eine präexistierende Immunität bei CMV- Vektoren keine Limitation dar. CMV kann seropositive Wirte infizieren, da es aufgrund seiner immunevasiven Eigenschaften vor der Erkennung durch bereits geprägte T-Zellen geschützt ist (Meyer-König et al., 1998; Boppana et al., 2001; Hansen et al., 2010). Während einige Studien zeigen, dass CMV-Vektoren trotz vorheriger CMV-Infektion eine protektive Immunität in experimentell vakzinierten Tieren bewirken (Hansen et al., 2018, Nejad et al., 2019), blieb in einer Studie mit Friend-Virus-Antigen-exprimierenden MCMV-Vektoren eine protektive Immunantwort in MCMV-präimmunen Mäusen aus (Bongard et al., 2019).

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Die größte Herausforderung beim Design von CMV-Vakzin-Kandidaten für den klinischen Gebrauch ist die Entwicklung nicht-pathogener Vektoren, welche in immun-inkompetenten und immunseneszenten Patienten angewendet werden können und das Risiko einer kongenitalen Infektion ausschließen. Parallel dürfen das immunogene und immunevasive Potenzial des CMV-basierten Vektors nur so weit eingeschränkt sein, dass sowohl robuste Immunantworten induziert als auch bereits seropositive Wirte infiziert werden können (Nejad et al., 2019; Snyder et al., 2011; Beswick et al., 2013). Die Sicherheit von CMV-Vektoren kann z. B. durch verschiedene gentechnische Modifikationen erreicht werden, die zur Attenuierung sowie einer effizienteren Kontrolle durch das Immunsystem führen (Čičin-Šain et al., 2007; Slavuljica et al., 2010; Tršan et al., 2017). Andererseits muss bei einem idealen CMV- basierten Vakzin-Kandidaten neben einer strengen Attenuierung in vivo eine effiziente Produktion durch das Erreichen hoher Titer in Zellkulturen möglich sein (Čičin-Šain et al., 2007). Mithilfe CMV-basierter Vektoren konnten bereits Impfstoffe gegen verschiedene infektiöse Krankheiten und Krebs entwickelt werden (Wilski et al., 2019). Rhesus-CMV-basierte Vakzine induzierten eine protektive Immunität gegenüber dem Simian-Immundefizienz-Virus (SIV), Ebola und Tuberkulose (Hansen et al., 2009; Tsuda et al., 2015; Hansen et al., 2018). Die klinische Translation der Forschungsergebnisse aus Tiermodellen wird den Vakzinologen dabei helfen, neue Formen von Immunantworten zu generieren und somit verbesserte Ansätze für die Entwicklung von Impfstoffen gegen bisher resistente Pathogene zu liefern. Jedoch sind bis heute keine der attenuierten HCMV-Stämme und Rekombinanten als Impfvektoren in der Klinik zugelassen.

1.5 Das Ubiquitin-Proteasom-System

Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) ist ein evolutionär konservierter Apparat, der als Hauptregulator der Proteostase in eukaryotischen Zellen dient (Leithe, 2016). Das UPS besteht aus Ubiquitin (Ub), ubiquitinierenden Enzymen und dem 26S-Proteasom. In einer synergistischen Enzymkaskade wird der Substrat-spezifische Ub-Transfer und letztlich die Proteolyse und Degradation eines Ziel-Proteins vermittelt (Varshavsky, 2017). Ub ist ein unter allen Eukaryoten hoch konserviertes Polypeptid bestehend aus 76 Aminosäuren (Goldstein et al., 1975, Goldknopf & Busch, 1977). Seine kovalente Bindung an ein Ziel-

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Protein (Ubiquitinierung) kann die Stabilität, die Lokalisation, die Aktivität und Interaktionen mit anderen Proteinen beeinflussen (Kwon et al., 2007; Hershko & Ciechanover, 1998). Das UPS nimmt u. a. Einfluss auf die Zellproliferation und -differenzierung, die Apoptose, die DNA-Replikation und -Reparatur, die Signaltransduktion und die Immunantwort (Imai et al., 2010; Neutzner et al., 2012; Abbas et al., 2017; Daulny et al., 2009; Qureshi et al., 2018; Zheng et al., 2019). Eine Dysfunktion des UPS kann die Entstehung von z. T. lebensbedrohli- chen Krankheiten zufolge haben (Brown & Kaganovich, 2016). Das UPS kann aber auch von Pathogenen zweckentfremdet und ausgebeutet werden, um z. B. Immunantworten zu umgehen (s. Abschnitt 1.6). Die Ub-vermittelte Degradation durch das 26S-Proteasom wurde in den späten 1970er und frühen 1980er Jahren entdeckt. Diese Arbeit wurde im Jahr 2004 mit dem Nobelpreis gewürdigt (Ciechanover et al., 2004). Die Ubiquitinierung ist ein komplexer dreistufiger Prozess, der durch Enzyme katalysiert wird. Das UPS weist eine hierarchische Häufigkeit der einzelnen Komponenten auf. So kodiert das humane Genom nur wenige Ub- aktivierende Enzyme (E1), etwa 40 Ub-konjugierende (E2) Enzyme und mehr als 600 verschiedene E3-Ub-Ligasen (Pelzer et al., 2007; Jin et al., 2007; Kwon et al., 2017). Im ersten Schritt der Ubiquitinierungs-Kaskade wird Ub in einer ATP-abhängigen Reaktion an einen Cystein-Rest des Ub-aktivierenden Enzyms (E1) gebunden (Ciechanover et al., 1981). Danach wird das aktivierte Ub auf eine Cystein-Seitenkette im katalytischen Zentrum des Ub- konjugierenden Enzyms E2 transferiert (Jin et al., 2007). Im dritten Schritt katalysieren E3- Ub-Ligasen die Übertragung von Ub auf das Zielprotein. Dabei wird das Ub kovalent meist an die ε-Aminogruppe eines Lysins des Substrates transferiert (Hershko et al., 1983). Die E3- Ub-Ligasen sind entscheidend für die hohe Substratspezifität im Ubiquitinierungs-Prozess und werden aufgrund ihrer Struktur- und Funktionsmerkmale in drei Klassen unterteilt: Die Homologous to E6-AP C-terminus (HECT), die Really interesting new gene und U-Box (RING und U-Box) und die RING-between-RING (RBR) E3-Ligasen-Familien (Berndsen & Wolberger 2014). Bei der Poly-Ubiquitinierung werden mehrere Ub-Moleküle aneinander ligiert. Die Verlänge- rung der Ub-Kette kann sowohl am N-Terminus als auch an den Lysin-Seitenketten (K6, K11, K27, K29, K33, K48 und K63) erfolgen. Die verschiedenen Ub-Konformationen kodieren für unterschiedliche Signale, welche das Schicksal des Ziel-Proteins festlegen. Der Ub-Kode ist aufgrund seiner Komplexität (noch) nicht vollständig entschlüsselt, wobei die Ubiquitinierung

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am K48 am häufigsten auftritt und das Zielprotein üblicherweise für den proteasomalen Abbau durch das 26S-Proteasom markiert (Hershko & Ciechanover, 1998; Kim et al., 2007; Pickart & Fushman, 2004). Das 26S-Proteasom setzt sich aus einem 20S-Komplex, welches das proteolytische Zentrum enthält, und zwei regulatorischen 19S-Komplexen zusammen. Die 19S-Untereinheiten sitzen an den beiden Enden der tonnenförmigen 20S-Untereinheit und sind für die Erkennung der K48-Ubiquitinierung sowie der ATP-abhängigen Entfaltung des Proteins verantwortlich. Anschließend wird das entfaltete Protein in die 20S-Untereinheit weitergeleitet und dort proteolytisch gespalten (Grice & Nathan, 2016). Ubiquitin wird hierbei selbst nicht abgebaut, sondern durch deubiquitinierende Enzyme von dem Substrat abgespalten und recycelt (Finley, 2009).

1.5.1 Die Cullin4A/B-Roc1-E3-Ubiquitin-Ligasen und DDB1

Die meisten E3-Ligasen gehören zur RING-Familie (Deshaies & Joazeiro 2009). Innerhalb dieser Familie bilden die Cullin-RING-E3-Ligase-Komplexe (CRLs) mit über 200 Mitglie- dern die größte Gruppe der E3-Ligasen (Petroski & Deshaies, 2005). Sie sind für 20% aller Ubiquitinierungen in der Zelle verantwortlich und in verschiedenste biologische Prozesse involviert (Soucy et al., 2009). Die Cullin-Familie ist evolutionär hoch konserviert. Säugetie- ren exprimieren sieben kanonische Cullin-Proteine, die modulare, multikomplexe CLRs (CRL1-7) bilden. Inmitten des CRL-Komplexes fungieren die Culline als eine zentrale Molekülplattform, an welche die weiteren Komponenten des CRL assoziiert sind. Der prototypische CRL besteht aus vier Komponenten: (I) Ein Cullin-Protein, das als Grundgerüst des CRLs dient, (II) ein RING-Finger-Protein, das an ein E2-Ub-konjugierendes Enzym bindet, (III) ein Substrat-Rezeptor, der das Ziel-Protein erkennt, und (IV) ein Adapter-Protein, das den Substrat-Rezeptor mit dem Cullin verbindet (Nguyen et al., 2017). Die Cul4-RING-Ligasen (CRL4) enthalten zwei paraloge Cullin-Proteine: Cullin 4A (Cul4A) und Cullin 4B (Cul4B). Im Vergleich zu Cul4A weist Cul4B einen verlängerten N-Terminus auf, der eine Kernlokalisationssequenz kodiert. Cul4A verbleibt größtenteils im Cytoplasma und reguliert die Ubiquitinierung von Substraten (Zhang et al., 2003), während ein geringer Anteil im Nukleus auf Kernproteine abzielt (Li et al., 2006a). Trotz einer Identität von 82% in ihrer genomischen Sequenz und ihren weitestgehend überlappenden Funktionen besitzt Cul4B

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einige Funktionen, die CulA nicht kompensieren bzw. übernehmen kann. So äußert sich eine Mutation von Cul4B beispielsweise in einer X-chromosomalen mentalen Retardierung (Zou et al., 2007). Als molekulares Grundgerüst verleihen die Cul4A/B dem CRL4 seine Struktur. Der bogenförmige, helikale N-Terminus des Cul4 interagiert mit der β-Propeller B-Domäne (BPB) des Adapter-Proteins DDB1 (engl. DNA damage-binding protein 1), während die katalytische Untereinheit des RING-Finger-Proteins Roc1 (engl. regulator of cullins 1) am C- Terminus bindet (Jackson & Xiong, 2009). Zusätzlich dient DDB1 als Brücke zwischen dem Cullin-Gerüst und der Substrat-erkennenden Untereinheit, dem sog. DDB1-CUL4- assoziierten Faktor (DCAF). DDB1 erkennt DCAFs anhand von konservierten WDxR (Bereiche, die innerhalb von WD40-Domänen lokalisiert sind) und/oder H-Box Motiven (Bergametti et al., 2002; Angers et al., 2006; Fischer et al., 2011; Li et al., 2010). Viele DDB1-Interaktionspartner besitzen WD40-Domänen (Xu & Min, 2011). Eine α-Helix, die N- terminal zu der WD40-Domäne lokalisiert ist, ist ebenfalls wichtig für die Interaktion mit DDB1 (Angers et al., 2006; Cassiday et al., 2015; Gérard et al., 2014; Li et al., 2010; Scrima et al., 2008). Allerdings gibt es auch DDB1-interagierende DCAFs, die keine WD40-Domäne aufweisen (Lee & Zhou, 2007; Li et al., 2006b). Die Architektur des DDB1-Cul4A/B-Roc1- Komplexes begünstigt die präzise Positionierung des Substrates zu dem (von Roc1 rekrutier- ten) E2-Enzym, sodass der Ub-Transfer auf das Ziel-Protein und der anschließende Abbau durch das Proteasom erfolgen können. Das DDB1-Protein wurde zunächst als eine Komponente des UV-DNA-Läsion-bindenden Komplexes beschrieben, welcher in die Nukleotid-Exzision-Reparatur-Maschinerie involviert ist (Duluan et al., 1995; Keeney et al., 1993). Später wurde DDB1 als wichtiges Adapter- Protein des Cul4A/B-CRL (Shiyanov et al., 1999) sowie seine Beteiligung an der Regulation zahlreicher fundamentaler Prozesse wie der Transkription, dem Zellzyklus, der Apoptose und der embryonalen Entwicklung beschrieben (s. Cang et al., 2006). DDB1 ist ein essentielles, von der Hefe Saccharomyces cerevisiae bis zum Menschen evolutionär konserviertes Protein (Milo et al., 2019). Eine gezielte Deletion von DDB1 in Mäusen ist bereits im embryonalen Stadium letal (Cang et al., 2006). Sogar in vitro führt eine Ablation von DDB1 zum Zelltod (Wakasugi et al., 2007). Kokristallisationsstudien des Cul4-DDB1-Komplexes zusammen mit endogenen Substratrezeptor-Proteinen oder mit viralen Proteinen, die diesen Komplex zweckentfremden, gaben Einblicke in dessen molekulare Struktur (Angers et al., 2006;

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Fischer et al., 2011; Li et al., 2010). Bis heute wurden einige Proteinstrukturen von DDB1 beschrieben. DDB1 ist ein Multi-Domänen-Protein (Li et al. 2006b). Die Verbindung zwischen den verschiedenen Domänen scheinen ein hohes Maß an Plastizität zu besitzen, welche es den beiden funktionalen Modulen von DDB1 erlaubt, sich in verschiedene Rich- tungen relativ zueinander zu orientieren. Dies ermöglicht wiederum die Anpassung und Ubiquitinierung von Substraten unterschiedlicher Formen und Größen. Zudem gestattet die flexible Struktur von DDB1 eine Rotation des Cul4 von bis zu 150° um den Substrat- Rezeptor. Die dadurch entstehende „Ubiquitinierungszone“ fördert die Erkennung zahlreicher Lysinreste der Substrate und unterstützt so deren Ubiquitinierung (Sun et al., 2020).

1.5.2 Regulation der Aktivität der CRLs durch NEDD8

Culline fungieren als molekulare Plattform für eine Subklasse an E3-Ub-Ligasen, die Cullin- RING-Ligasen (CRLs). Die Aktivität der CRLs wird durch streng kontrollierte Änderungen der Untereinheiten-Komposition der Komplexe und durch post-translationale Modifikationen der Culline erreicht. Einer der Regulatoren der CRL-Aktivität ist NEDD8 (Neural precursor cell Expressed Developmentally Down-regulated protein 8). Die kovalente Bindung von NEDD8 an die Cullin-Proteine innerhalb der CRLs aktiviert die Ub-Ligase-Aktivität des Holoenzyms (Chiba et al., 2004; Read et al., 2000; Podust et al., 2000). Die Neddylierung der Culline verläuft ähnlich wie der Ubiquitinierungs-Prozess. Nach einer initialen proteolyti- schen Prozessierung wird NEDD8 durch spezifische E1- und E2-Enzyme chemisch aktiviert. Das NEDD8 E1-aktivierende Enzym (NAE) initiiert die NEDD8-Transfer-Kaskade durch die chemische Aktivierung des Glycerin-haltigen C-Terminus von NEDD8. Das aktivierte NEDD8 wird auf eines der beiden NEDD8-spezifischen E2-konjugierenden Enzyme (UBC12 und UBE2F) transferiert. NEDD8-E3-Ligasen, die auch als Ub-E3-Ligasen fungieren, katalysieren den Transfer von NEDD8 vom E2-Enzym auf das Ziel-Protein (Enchev et al., 2015). Alle bis auf ein beschriebenes NEDD8-E3-Enzym gehören zur RING-Familie (Deshaies & Juazeiro, 2009). Durch die E3-Ligasen Roc1 oder Roc2 wird NEDD8 auf die Culline übertragen (Huang et al., 2009). Die mit der Neddylierung einhergehende Konforma- tionsänderung führt zu einer erhöhten Flexibilität der RING-Domäne von Roc1 und ermög- licht den Transfer von Ubiquitin auf das Zielprotein (Duda et al., 2008). NAE, das erste

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Enzym in der Neddylierungs-Kaskade, kann durch MLN4924 inhibiert werden (s.1.6) (Soucy et al., 2009).

1.6 Die virale Zweckentfremdung von Cul4-RING-Ub-Ligasen

Der obligatorisch intrazelluläre Parasitismus der Viren zeichnet sich durch eine enge Koevo- lution mit ihren Wirten aus (Tang et al., 2018). Diese führte bei den Wirten zur Entwicklung von antiviralen Abwehrmechanismen, um die Infektion möglichst effizient zu kontrollieren oder optimalerweise zu eliminieren. Der selektive Druck zellulärer Restriktionsfaktoren begünstigte wiederum die Entstehung von immunevasiven Mechanismen auf der Seite der Viren. Das UPS spielt bei diesem „evolutionären Wettrüsten“ eine entscheidende Rolle. Die Wirtszelle nutzt das UPS zur Degradation viraler Proteine (Zhao et al., 2018), um die Infektion einschränken, und zur Regulation der angeborenen (Zheng & Gao, 2019) und adaptiven Immunantwort (Sijts & Kloetzel; 2011). Allerdings wird dieselbe Maschinerie von vielen Viren zweckentfremdet, um ihre Reproduktion zu optimieren. Die Cul4-RING-Ub-Ligasen werden von verschiedenen Viren für ihre Zwecke ausgenutzt. DDB1 ist möglicherweise aufgrund seiner vielen strukturellen Merkmale ein häufiges Ziel viraler Ausbeutung. Das aus Paramyxoviren stammende SV5-V-Protein ahmt die Funktion von CRL4-Substrat-Rezeptoren nach und vermittelt so die Poly-Ubiquitinierung und Degra- dation von normalerweise stabilen STAT-Proteinen des IFN-Signalwegs (Horvath, 2004). SV5-V verankert sich mit DDB1, indem es seine N-terminale Helix in die Öffnung des BPA- BPC-Doppelpropellers von DDB1 einlagert (Li et al., 2006b). Die C-terminale Region des SV5-V liegt in einer globulären Struktur vor, die eine schüsselartige Vertiefung mit vielen konservierten hydrophobischen und unpolaren Seitenketten aufweist. Diese Oberflächen- region des Virusproteins ist essentiell für die Rekrutierung von STATs. Neben SV5-V, wurde auch für andere Viren die Manipulation des CRL4-Adaptors zur Degradation von restriktiven Wirtszellfaktoren beschrieben. Die Ausbeutung durch klinisch relevante Viren macht das UPS und die CRLs zu einem attraktiven Ziel für antivirale Therapien (s. 1.7).

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1.6.1 Das DDB1-CRL-interagierende MCMV-Protein pM27

Die essenzielle Bedeutung des Proteins pM27 für die MCMV-Replikation wurde mithilfe einer M27-Transposon-Insertionsmutante identifiziert, welche in vivo eine starke Attenuie- rung aufweist (Abenes et al., 2001; Lee et al., 2002; Zhan et al., 2000). Das etwa 79 kDa große Protein inhibiert die antivirale Wirkung von IFN. Durch die Zweckentfremdung des Ubiquitin-Proteasom-Systems vermittelt pM27 die Degradation von STAT2. Der Transkripti- onsfaktor STAT2 vermittelt die Signaltransduktion von IFN Typ-I und Typ-III und trägt ebenfalls zur Signalkaskade von IFNγ bei (Zimmermann & Trilling et al., 2005). Das pM27 rekrutiert STAT2 an das zelluläre DNA damage-binding protein 1 (DDB1), eine Komponente des CUL4A/B-Roc1-Ub-Ligase-Komplexes. Dies führt zur Ubiquitinierung von STAT2, welches infolgedessen durch das Proteasom abgebaut wird (Trilling et al., 2011). Die Inhibition des STAT2-abhängigen Jak-STAT-Signalwegs ermöglicht MCMV die Replikation in Anwesenheit von Typ-I und –II-IFNs (Trilling et al., 2011; Zimmermann & Trilling et al., 2005). Darüber hinaus inhibiert pM27 ebenfalls die Signaltransduktion von Typ-III-IFNs (Le- Trilling et al., 2018) (s. Abb. 4). Während die M27-Deletionsmutante (ΔM27-MCMV) in IFN-naiven Fibroblasten keinen deutlichen Phänotyp in vitro zeigt, führt eine Behandlung der Zellen mit IFNα zu einer verringerten Replikation. In Anwesenheit von IFNγ erfolgt nahezu keine Zunahme des Virustiters (Le-Trilling et al., 2018; Trilling et al., 2011; Zimmermann & Trilling et al., 2005). Die IFN-Suszeptibilität des ΔM27-MCMVs wird in vitro sowohl durch die pharmakologische Inhibierung der Janus-Kinase-Aktivität (z. B. durch Ruxolitinib) als auch durch die Abwesenheit von STAT2 vollständig aufgehoben (Le-Trilling et al., 2018).

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Abb. 4: Gegenwärtiges Funktionsmodel der immunevasiven Funktion von pM27. Das MCMV-kodierte Protein pM27 rekrutiert STAT2 zu dem DDB1-Cullin4-Ubiquitin-Ligase-Komplex und vermittelt so dessen (Poly-)Ubiquitinierung und anschließende proteasomale Degradation. Durch den Abbau von STAT2 wird die IFN-Signaltransduktion unterbrochen und die Induktion der IFN- stimulierten Genen verhindert. Abbildung verändert nach CD Landsberg basierend auf (Trilling et al., 2011).

In STAT2-defizienten Mäusen jedoch ist die Attenuierung des ΔM27-MCMVs zwar größten- teils aufgehoben, allerdings erlangt die M27-Deletionsmutante im Vergleich zum wt-MCMV nicht seine gesamte Replikationsfähigkeit zurück (Le-Trilling et al., 2018). Die ΔM27- Phänotypen lassen vermuten, dass pM27 neben der Degradation von STAT2 möglicherweise noch eine weitere Funktion besitzt. Diese STAT2-unabhängige Funktion ist für die MCMV- Replikation in vitro nicht essenziell und spielt eine untergeordnete, aber nicht vernachlässig- bare Rolle in vivo (Le-Trilling et al., 2018). Normalerweise besitzen Herpesviren wie MCMV eine hohe Speziesspezifität. Das MCMV- kodierte pM27 kann jedoch auch die Degradation von humanem STAT2 vermitteln (Trilling et al., 2011). Die Degradation von humanem STAT2 durch MCMV könnte anhand der Erkennung von konservierten Molekül-Domänen des STAT2-Proteins erfolgen.

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In Anbetracht des selektiven Drucks, den das Interferonsystem auf Viren ausübt, ist es nicht verwunderlich, dass auch andere Viren IFN-Antagonisten kodieren. Neben MCMV vermitteln auch Paramyxoviren (z. B. Zika, Dengue und Parainfuenzavirus-2 [PIV-2]) mithilfe des SV5- Proteins die proteasomale Degradation von STAT2 (Grant et al., 2016; Morrison et al., 2013, Parisien et al., 2001). PIV-2 und MCMV nutzen dazu denselben E3-Ub-Ligase-Komplex. Das SV5-Protein interagiert ebenfalls mit DDB1. An dieser Interaktion sind zwei Zink- Bindetaschen beteiligt, in denen ein CxCxxC Motiv lokalisiert ist, das auch in der Primärse- quenz des MCMV-kodierten M27-Proteins vorkommt (Li et al., 2006; Lin et al., 1998; Trilling et al., 2011). Die Interaktion zwischen pM27 und DDB1 wird durch eine Mutation dieses Motives signifikant beeinträchtigt (Trilling et al., 2011). Darüber hinaus ist das CxCxxC-Motiv in den Aminosäuresequenzen pM27-homologer Proteine anderer Cytomega- lieviren weitestgehend konserviert (Trilling et al., 2011). Im folgenden Abschnitt werden pM27-homologe Proteine aus HCMV und RCMV beschrieben.

1.6.2 Cytomegalovirale pM27-ähnliche Proteine

Das CMV der Maus kodiert das M27-Protein, welches durch die Interaktion mit DDB1 STAT2 an zelluläre E3-Ub-Ligase-Komplexe rekrutiert und somit die Ubiquitinierung und den proteasomalen Abbau von STAT2 vermittelt. Ein CxCxxC-Motiv, das auch in der Primärsequenz des DDB1-interagierenden SV5-Proteins von Paramyxoviren auftritt, ist dabei für die Interaktion zwischen pM27 und DDB1 essenziell (Trilling et al., 2011). Dieses Motiv ist auch in den Aminosäuresequenzen M27-homologer Proteinen aus CMVs anderer Spezies konserviert (Trilling et al., 2011). In diesem Abschnitt werden pM27-homologe Proteine aus HCMV und RCMV vorgestellt.

1.6.2.1 HCMV – pUL145 und pUL27

Der Antagonismus von STAT2 wurde in Anwesenheit von klinischen Stämmen und verschiedenen Laborstämmen des HCMVs beobachtet. Infektionsexperimente, in denen die Zellen entweder mit dem Proteasom-Inhibitor MG132 oder dem CRL-Inhibitor Pevonedis- tat/MLN4924 behandelt wurden, wiesen auf einen proteasomalen bzw. CRL-abhängigen Prozess hin, den HCMV für seine Zwecke nutzt (Le et al., 2008; Le-Trilling et al., 2016). Die Fähigkeit zur STAT2-Degradation hängt von dem Vorhandensein einer gewissen Genomregi-

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on ab. In Laborstämmen kommen durch den selektiven Druck der Zellkultur-Passagierung genomische Alterationen zustande. Die Untersuchung genetischer Varianten des HCMV- Laborstamms AD169, die sich hinsichtlich der Vollständigkeit ihrer Genome und ihrer Fähigkeit zur STAT2-Degradation unterschieden (Le et al., 2008), führte schlussendlich zur Identifikation des Gens, welches die STAT2-Degradation kodiert. Das ULb‘-Gen UL145 ist für die Induktion der STAT2-Degradation essenziell (Le-Trilling et al., 2020). Es kodiert für zwei pUL145-Isoformen, die sich bzgl. ihrer Länge und Expressionskinetik unterscheiden. Beide Isoformen rekrutieren zelluläre DDB1-enthaltende CRLs und fungieren als virale DCAFs. Bei pUL145 handelt es sich zwar um ein funktionelles Analog des MCMV-kodierten M27-Proteins, jedoch sind sie genetisch nicht miteinander verwandt. HCMV kodiert das pM27-homologe Protein pUL27. Die HCMV-induzierte STAT2-Degradation erfolgt jedoch (durch pUL145) selbst dann, wenn UL27 deletiert ist (Le et al., 2008). Daraus kann geschlussfolgert werden, dass pUL27 in Zellkultur nicht für den STAT2-Abbau essenziell ist. Eine Redundanz der Proteinfunktion in Bezug auf den STAT2-Abbau kann mithilfe der UL27-Deletionsmutante jedoch nicht ausgeschlossen werden. Ein rekombinantes Vakzinia- Virus, das pUL27 exprimiert, ist nicht in der Lage, humanes STAT2 abzubauen (Le et al., 2008). Obwohl die Expression des pUL27 an sich nicht ausreicht, um humanes STAT2 in vitro abzubauen, kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass möglicherweise ein unbekannter CMV-kodierter Kofaktor für einen pUL27-vermittelten STAT2-Abbau notwendig wäre. So konnte beispielsweise eine antagonisierende Verbindung zwischen der HCMV- kodierten Kinase pUL97 und dem pUL27 nachgewiesen werden (Bigley et al., 2015). ΔM27-MCMV ist in vivo stark attenuiert. In STAT2-defizienten Mäusen ist die Attenuierung der M27-Deletionsmutante im Vergleich zum wt-MCMV jedoch nicht vollständig aufgehoben (Le-Trilling et al., 2018). Es ist derzeit unklar, ob pM27 lediglich STAT2 degradiert oder ob es additive Effekte jenseits der STAT2-abhängigen IFN-Signaltransduktion besitzt. Hinweise einer potentiellen überlappenden Funktion liefert eine Interaktionsstudie von Reitsma und Kollegen, die pUL27 eine Interaktion mit DDB1 attestieren (Reitsma et al., 2011). Eine schwache Interaktion zwischen pUL27 und DDB1 wurde bereits in Ko-Immunpräzipitations- Studien von unserer Arbeitsgruppe bestätigt (Landsberg et al., 2018).

38 Einleitung

1.6.2.2 RCMV – pR27 und pE27

Neben dem murinen CMV-Modell dient auch das verwandte Ratten-CMV-Modell zur Erforschung der CMV-Infektion, der Pathogenese und zugrundeliegenden Mechanismen der Latenz und Reaktivierung von CMV (Simon et al., 2006; Reddehase et al., 2008; Krmpotic et al., 2003). Dabei werden im Wesentlichen zwei Laborstämme verwendet: Das England-Isolat (MuHV-8) und das Maastricht-Isolat (MuHV-2) (Beisser et al., 1998; Voigt et al., 2005). Beide wurden unabhängig aus der Wanderratte Rattus norvegicus isoliert (Bruggeman et al., 1982; Priscott et al., 1982). Beide RCMV-Stämme kodieren für pM27-homologe Proteine (pE27 bzw. pR27), in denen das CxCxxC-Motiv konserviert ist, welches im M27-Protein essenziell für die Interaktion mit DDB1 ist (Trilling et al., 2011). Unsere Arbeitsgruppe konnte für das MuHV-8-kodierte pE27 anhand von Ko-Immunopräzipitations-Experimenten eine Interaktion mit DDB1 nachweisen (Landsberg et al., 2018). Dem nah verwandten R27- Protein aus MuHV-2 wurde jedoch nur eine vergleichsweise schwache Interaktion mit DDB1 nachgewiesen (Landberg et al., 2018). Es ist nicht bekannt, ob pR27 bzw. pE27 oder ein anderes Protein den STAT2-Abbau in RCMV-infizierten Rattenfibroblasten vermittelt.

1.6.3 Hepadnavirale pM27-Analoga: HBx und WHx

Das von HBV-kodierte X Protein (HBx) ist etwa 17 kDa groß und zwischen den Säuger- Hepadnaviren konserviert (Sitterlin et al., 1997). HBx ist essenziell für den Start und die Aufrechterhaltung der HBV-Replikation in vitro (Lucifora et al., 2011) und in humanen Leber-transplantierten Maus-Chimären in vivo (Tsuge et al., 2010). Das HBx-Homolog aus dem Murmeltier (engl. woodchuck) Hepatitis Virus (WHV) WHx wird ebenfalls für die WHV-Replikation in Murmeltieren benötigt (Chen et al., 1993; Zoulim et al., 1994). Im Nukleus interagiert HBx mit der cccDNA (Belloni et al., 2009) und aktiviert die Transkripti- on (Lucifora & Protzer, 2012). Im Cytoplasma nimmt HBx Einfluss auf verschiedene zelluläre Signaltransduktionswege. Die Effizienzsteigerung der Virusreplikation wird durch die Manipulation von Faktoren erreicht, die eine Rolle bei der Apoptose, dem Metabolismus, der Proliferation und bei der Transkription spielen (Bouchard & Schneider, 2004; Benhenda et al., 2009; Casciano et al., 2012). Die Interaktion des X-Proteins mit DDB1 ist sowohl für die hepadnavirale Replikation in Murmeltieren (Sitterlin et al., 2000) als auch für die Replikation des HBV-Plasmids im HepG2-Replikationsmodel essentiell (Leupin et al., 2005;

39 Einleitung

Hodgson et al., 2012). Eine wichtige Funktion von HBx besteht darin verschiedene Abwehr- maßnahmen der Wirtszelle zu verhindern. So wirkt HBx der IFNα-induzierten Immunantwort durch die Hochregulierung von suppressor of cytokine signaling 3 (SOCS3) und protein phosphatase 2A (PP2A) (Tsunematsu et al., 2017) und einer Runterregulation des Typ-I-IFN Rezeptors entgegen (Cho et al., 2012). Bei HBx handelt es sich wie beim MCMV-kodierten pM27 um einen viralen DCAF- Rezeptor, der die zellulären DDB1-DCAF-anhängigen Signalwege für seine eigenen Zwecke manipuliert (Weitzman et al., 2004; Hollingworth & Grand, 2015). Auf diese Weise kann HBx in verschiedene zelluläre Prozesse eingreifen. HBx kann z. B. die zelluläre DNA- Reparatur-Maschinerie je nach Umgebungsfaktoren und Stadium des viralen Replikationszyk- lus entweder zu aktivieren oder zu inhibieren (Qadri et al., 1996; Königer et al., 2014). Einer früheren Studie zufolge inhibiert HBV mithilfe von HBx die Proteasom-Funktion, um die Degradation von viralen Proteinen zu unterbinden (Zhang et al., 2000). Neuere Untersuchun- gen hingegen zeigten, dass HBx mit dem DDB1-enthaltenden E3-Ub-Ligase-Komplex interagiert, um die Degradation des SMC5/6 (engl. structural maintenance of chromosomes 5 and 6)-Komplexes voranzutreiben (Decorsiere et al., 2016; Murphy et al., 2016). Normaler- weise würde SMC5/6 die Transkription der cccDNA inhibieren. Daher führt die Degradation von SMC5/6 zu einem Anstieg der viralen RNA-Synthese (Livingston et al., 2017). Für diese Funktion benötigt HBx die Ko-Lokalisation mit dem Faktor ND10 (Niu et al., 2017). In Kristallisationsstudien wurde ein H-Box-Motiv in den Primärsequenzen von HBx und WHx identifiziert, welches kritisch für die Interaktion mit DDB1 ist (Li et al., 2010). Die Interaktion wird nicht ausschließlich dem H-Box-Motiv zugeschrieben. Auch Bereiche außerhalb dieses Motivs könnten ein wichtiger Bestandteil der Interaktion mit DDB1 sein (Li et al., 2010). Da HBx über 100 zelluläre Proteine bindet (Wu et al., 2010) ist es wahrscheinlich, dass in Zukunft weitere HBV-Restriktionsfaktoren identifiziert werden, die über die Interaktion mit DDB1 und die Zweckentfremdung des CUL4A/B-Roc1-Ub-Ligase-Komplexes degradiert werden.

40 Einleitung

1.7 Inhibitoren der CRLs als antivirale Therapie

Die Manipulation und Ausbeutung des UPS ist unter Viren eine weit verbreitete Strategie und gewährleistet eine effiziente Replikation. Die Inhibierung dieses Zellsystems stellt daher ein attraktives Ziel für antivirale Therapien dar. Eine Vielzahl an Viren (wie HEV, KSHV, HIV, CMV) kann in Gegenwart von Hemmstoffen der Ubiquitin-Konjugation (z. B. PYR-41) oder von Proteasom-Hemmern (z. B. MG-132, Bortezomib) nicht replizieren (Karpe & Meng, 2012; Saji et al., 2011; Yu et al., 2009; Prösch et al., 2003; Kaspari et al., 2008; Turner et al., 2016). Da über 80% aller zellulären Proteine von einem funktionellen UPS abhängen (Yen et al., 2008), beeinträchtigen unspezifische Proteasom-Inhibitoren auch zelluläre Prozesse. Aufgrund schwerwiegender Nebenwirkungen werden diese Substanzen nicht als antivirale Medikamente verwendet. Eine spezifische Inhibition individueller Ub-Ligasen wie die Aktivität von definierten E3 Ub-Ligasen könnte diese Nebenwirkungen deutlich einschrän- ken. MLN4924 (Pevonedistat) ist ein spezifischer Inhibitor des NEDD8-aktivierenden Enzyms (NAE, s. Abschnitt 1.5.2), welcher bereits effektiv zur Behandlung von Krebs eingesetzt wird (Soucy et al., 2009). Darüber hinaus weist es jedoch auch eine starke antivirale Aktivität gegen verschiedene Viren auf (Le-Trilling et al., 2016; Sun et al., 2018). NEDD8 reguliert vorwiegend die Aktivität von CRL. Durch die Inhibition der NEDD8-Konjugati- onskaskade akkumulieren die CRL-Substrate (Soucy et al., 2010; Brownwell et al., 2010; Liao et al., 2011). Dies führt zu zellulärem Stress und induziert wiederum Prozesse wie die DNA-Reparatur-Antwort, Zellzyklus-Arrest, Apoptose, Autophagie und Seneszenz, welche im Zusammenspiel das Wachstum von Tumorzellen supprimieren (Jia et al., 2011; Lin et al., 2010; Milhollen et al., 2011; Peterson et al., 2009). Darüber hinaus beeinträchtigt die Inhibition der Cullin-Neddylierung ebenso die Funktion von viralen Proteinen, die mit den CRLs interagieren und zweckentfremden. So konnte gezeigt werden, dass MLN4924 in Zellkultur eine starke antivirale Wirkung gegen klinisch relevante Viren wie HIV, Influenza A Virus, das Kaposi-Sarkom-Herpesvirus (KHSV), Adenovirus-5, Herpes-Simplex-Virus (HSV)-1 und -2, HBV und HCMV aufweist (Nekorchuk et al., 2013; Le-Trilling et al., 2016; Sun et al., 2018, Chang et al., 2017; Sekiba et al., 2019a). Der antivirale Effekt gegen HSV-1 wirkte sogar gegen ein multidrugresistentes Isolat (Le-Trilling et al., 2016). Gegen HCMV wurde sogar in Gegenwart von nanomolar konzentriertem MLN4924 eine signifikante Inhibition der Virus-Replikation erreicht. Verglichen mit dem gängigen HCMV-Medikament

41 Einleitung

GCV zeigte MLN4924 bei jeder getesteten Konzentration einen stärkeren antiviralen Effekt (Le-Trilling et al., 2016). Die Toxizität von MLN4924 wurde hinreichend in vitro, in Tierversuchen und klinischen Studien (Phase I und II) untersucht (Nawrocki et al., 2012; Shah et al., 2016). Obwohl MLN4924 nur einen Teil aller UPS-regulierten Proteine hemmt, ist es dennoch nicht vollständig CRL-spezifisch. Durch eine zielgerichtete Inhibition von einzelnen Komponenten (z. B. E2- oder E3-Ub-Ligasen oder definierten CRLs) könnten die Nebeneffekte einer antiviralen Behandlung eventuell noch weiter verringert werden. Kürzlich wurde eine Substanz identifiziert, welche die Interaktion zwischen dem HBV-kodierten x-Protein und DDB1 unterbindet (Sekiba et al., 2019b). Durch die Auswertung vorhandener Strukturdaten von Komplexen aus zellulären CRLs und Virus-Proteinen könnten möglicherweise Inhibito- ren für andere Viren identifiziert werden (Li et al., 2006; Li et al., 2010; Schwefel et al., 2015; Schwefel et al., 2014). Daher ist ein tiefergehendes molekulares Verständnis der viralen CRL-ausbeutenden Proteine und CRL-Schnittstellen wichtig für die Entwicklung neuer antiviraler Substanzen.

42 Einleitung

1.8 Zielsetzung

Ziel dieser Arbeit war die Evaluation möglicher überlappender biologischer Funktionen von DDB1-interagierenden viralen Proteinen (pM27, pUL27, pR27, HBx und WHx). Dazu sollten verschiedene MCMV-Mutanten, in denen M27 durch die CDS eines pM27-ähnlichen viralen Proteins ersetzt werden sollte, per BAC-Mutagenese konstruiert werden. Mithilfe der neu generierten Mutanten ΔM27-M27HA, ΔM27-UL27HA ΔM27-R27HA ΔM27-HBxHA ΔM27-WHxHA sollte analysiert werden, ob der Funktionsverlust von pM27 zumindest teilweise durch die heterologe Expression aufgehoben werden kann. Dazu sollte in Western- Blot-Analysen kontrolliert werden, ob in Abwesenheit von pM27 der STAT2-Abbau in MCMV-infizierten Zellen stattfindet. In M27-positiven MCMV-Mutanten sollte untersucht werden, ob die heterologe Expression eines fremden viralen Proteins den pM27-vermittelten STAT2-Abbau über DDB1 beeinflussen würde. Zudem sollte anhand von Wachstumskineti- ken in IFNγ-präinkubierten Zellen ermittelt werden, ob die heterologe Expression der pM27- ähnlichen Virusproteine die IFN-Empfindlichkeit von ΔM27-MCMV mildert. Die Durchfüh- rung von Luziferase-Assays mit IFNλ-stimulierten und infizierten Zellen sollte Aufschluss darüber geben, ob pM27-HA, pUL27-HA, pR27-HA, HBx-HA und WHxHA die Signaltrans- duktion von IFNλ die Aktivität des ISRE-Promotors beeinträchtigt. Darüber hinaus sollte das ΔM27-HBxHA als HBV-Vakzin im HBV-Mausmodell in Koopera- tion mit der Doktorandin Hongming Huang und Dr. Jia Liu am Institut für Infektiöse Krank- heiten am Union Hospital in Wuhan (P. R. China) untersucht werden. Für das Kooperationsprojekt sollten zusätzliche M27-positive und -negative MCMV-Vakzinvektoren konstruiert werden, welche die Kurzform des Oberflächenproteins des HBV (engl.: short hepatitis surface antigen, sHBsAg), exprimieren. Das Schutzpotential gegen HBV sollte anhand der Analyse der ELISA-Titer der Antigenämie von HBs und HBe erfolgen.

43 Einleitung

2 Material und Methoden

2.1 Materialien

2.1.1 Geräte

Im Folgenden sind die Geräte aufgeführt, die im Labor verwendet wurden.

Tab. 1: Geräte Gerät Hersteller -20°C Gefrierschrank Confort UG1211, Liebherr Medline, Liebherr KBS Kältetechnik -80°C Gefrierschrank Ultra Low Temperature Freezer, Sanyo Forma -86°C ULT Freezer, Thermo Scientific HeraFreeze, Heraeus Absaugvorrichtung Vacusafe, Integra 2-9336, Neolab KNF, Neuberger Blotting-Apparatur PerfectBlue™, Semi-Dry-Elektroblotter, Peqlab Cryo-Einfrierbehälter Coolcell FTS®, Biocision Eismaschine AF 80, Scotsman Elektrophorese-Kammern PerfectBlue™, horizontale Gelsysteme, Mini S und Mini L, Peqlab Elektroporationssystem Gene Pulser Xcell, Bio-Rad Entwicklermaschine Cawomat 2000 IR, Cawo Feinwaage R 160 P, Sartorius Research Fluoreszensmikroskop Type 11 090 137 002, Leica Geldokumentation GeneGenius Gel Imaging System, Syngene Science Imaging Advanced Fluorescence Imager, INTAS Science Imaging Gelelektrophoresekammern PerfectBlue™, vertikale Doppelsysteme, Twin S, L und ExW S, Peqlab Homogenisierer Dounce Tissue Grinders, Wheaton Hybridisierungsofen OV 3, Biometra Inkubatoren CB150 E3, Binder Incubat, Melag Max Q6000, Thermo Scientific Kühlschränke UK 1720, Liebherr

44 Material und Methoden

Lichtquelle für Fluoreszensmikroskop EL6000, Leica Magnetrührer MR Hei-Standard, Heidolph Mikroskop CKX41, Olympus Primo Vert, Zeiss Mikrowelle HF12M240, Siemens Multimode Reader Mithras2 LB 943, Berthold Technologies NanoDrop NanoDrop2000c, Thermo Scientific pH-Messgerät Lab 850, Schott Instruments Pipetten 8-5010, Neolab ErgoOne, Starlab Research, Eppendorf Pipettierhilfe Pipetboy 2, Integra Biosciences Pipetman, Gilson Pipetus®, Hirschmann Laborgeräte Reinstwasseranlage Milli Q, Millipore Spannungsquellen Mini Power Pack PS300T, Biometra Power Supply EV202, Peqlab Spektralphotometer BioPhotometer plus, Eppendorf Stickstofftank 1500 Series-190, MVE; MVE TEC 3000 Sterilbank HERAsafe, Thermo Electron Corporation Thermoblöcke Thermomixer Comfort, Eppendorf MBT 250, Kleinfeld Labortechnik ThermoStat plus, Eppendorf Thermocycler Professional TRIO, Biometra Ultrazentrifuge Optima™ L-80 XP Ultracentrifuge, Beckman Coulter Überkopfschüttler Heidolph Reax 2 UV-Transilluminator FLX-20M, MWG-Biotech Vortexer Vortexer™, Heathrow Scientific Vortex Genius 3, IKA Werke Waage EMB 1000-2, Kern 572, Kern Wasserbad Gesellschaft für Labortechnik Wiegeschüttler 3013, Gesellschaft für Labortechnik Duomax 1030, Heidolph Zentrifugen Centrifuge 5415D, Eppendorf; Centrifuge 5417R, Eppendorf; Centrifuge 5427R, Eppendorf; Centrifuge 5424, Eppendorf; Allegra® X-15R Centrifuge, Beckman Coulter; Avanti® J-26 XP, Beckman Coulter; Sigma 4- 16K

45 Material und Methoden

2.1.2 Verbrauchsmaterialien

Im Folgenden sind die Verbrauchsmaterialien aufgeführt, die im Labor verwendet wurden.

Tab. 2: Verbrauchsmaterialien

Name Hersteller

CDP-Star Substrat Roche Color Protein Standard Broad Range New England Biolabs Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche Cryo-Röhrchen Greiner Bio-One ECL Substrat GE-Healthcare Fuji medical X-Ray Film Fujifilm GelRed Biotium Gene Ruler DNA Ladder Mix Thermo Scientific Gene Pulser Küvette 0,2 cm Bio-Rad Hyperfilme ECL GE-Healthcare LumiNunc F96 MicroWell Platten Nunc Multiwell Platten Cellstar (6-wells #657160, 12-wells #665180) Greiner Bio-One Multiwell Platten Cellstar (24-wells #662160, 48-wells #677180) Greiner Bio-One Multiwell Platten Cellstar (96-wells # 353072) Greiner Bio-One Nitrozellulosemembran AmershamTM ProtranTM 0,45 µm GE-Healthcare Nylonmembran (positiv geladen) Roche Pipettenspitzen TipOne Starlab Protein G-Sepharose (PGS) GE-Healthcare Protein-Marker IV (Prestained) VWR Peqlab Reaktionsgefäße, 1,5 ml und 2 ml Safe Lock Eppendorf Reblot Plus Strong Solution (10x) Millipore RNA Loading Dye (2x) New England Biolabs Saran-Folie Sarogold Serologische Pipetten 5 ml, 10 ml, 25 ml Greiner Bio-One Serva DNA Stain Clear G Serva Superfix 25 Tetenal Triple Color Protein Standard III Serva Whatman 3MM Chr Papier Whatman Zellkulturflaschen Cellstar #690175, #658175, #660175 Greiner Bio-One Zellschaber M #99003 TTP Zentrifugenröhrchen (Falcontubes) 15 ml und 50 ml Greiner Bio-One

46 Material und Methoden

2.1.3 Kits

Im Folgenden sind die Kits aufgeführt, die im Labor verwendet wurden.

Tab. 3: Kits Kit Hersteller Beetle Juice PJK DIG-High Prime Roche ECL Plus Western Blotting Detection System Amersham KAPA Mouse Genotyping Kit KAPA Biosystems T4 DNA Ligase New England Biolabs NucleoBond® Xtra Midi Kit Macherey-Nagel NucleoSpin® Gel Extraktion Kit Macherey-Nagel QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Agilent Technologies Superfect Transfection Reagent Qiagen ZR BAC DNA Miniprep Zymo Research

2.1.4 Puffer und Lösungen

Im Folgenden sind die Zusammensetzungen/Rezepte der Puffer und Lösungen aufgeführt, die im Labor verwendet wurden.

Tab. 4: Puffer und Lösungen

Puffer/Lösung Zusammensetzung

Alkalische Phosphatase (AP)-Puffer 100 mM Tris/HCl, 100 mM NaCl, pH 9,5

Blocking Reagenz Blocking Reagenz Pulver, 10% (v/v) in Maleinsäurepuff- er

Blotting Puffer (Western-Blot) (10x) 480 mM TRIS, 280 mM Glycin, 20% (v/v) Methanol

Bradford-Lösung 8,5% Phosphorsäure, 4,75% (v/v) Ethanol, 100 mg/l Coomassie Blue G250 filtriert

Denaturierungspuffer (Southern Blot) 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl

HCl, 250 mM 20,8 ml 37%ige HCl, ddH2O ad 1 L

Lämmli-Elektrophoreselaufpuffer (10x) 250 mM Tris, 1,92 M Glycin, 1% (w/v) SDS

47 Material und Methoden

LB (Luria-Bertani)-Medium Das Pulver wurde nach Herstellerangeben eingewogen

und mit ddH2O aufgefüllt. Vor dem Gebrauch wurde das Medium 20 min bei 121°C autoklaviert und bei 4°C gelagert. Für die Herstellung fester Medien (LB-Agar- Platte) wurden 15 g Agar pro Liter hinzugegeben. Die Zugabe von Antibiotika erfolgte erst nach Abkühlen des Mediums auf ca. 50 °C

Luc-Lyse Puffer 25 mM TRIS, 2 mM DTT, 10% (v/v) Glycerol, 1% (v/v) Triton X-100

Maleinsäurepuffer 100 mM Maleinsäure, 150 mM NaCl, pH7,5

Methylzellulose-Medium 8,8 g Methylzellulose, 360 ml ddH2O, mit Rühr-fisch 20 min Autoklavieren bei 121°C und über Nacht bei 4°C rühren lassen. Vor Gebrauch 40 ml 10x MEM, 20 ml FCS, 5 ml Penicillin (104 U/ml)/Streptomycin (10 mg/ml),

5 ml L-Glutamin (0,2 M), 20 ml NaHCO3 (55g/l) hinzuzu- fügen

Neutralisationspuffer (Southern Blot) 0,5 M TRIS/HCl pH 7,5; 3 M NaCl

P1-Puffer 50 mM TRIS/HCl, pH 8,0; 10 mM EDTA, 100 μg/ml RNase A

P2-Puffer 200 mM NaOH, 1% (w/v) SDS

P3-Puffer 3 M Kaliumacetat, pH 5,5

PEI (100x) 100 mg/ml Polyethylenimin

Ponceau-Lösung 0,2% Ponceau S, 5% Essigsäure

RIPA-Puffer 50 mM TRIS/HCl, pH 7,5; 150 mM NaCl, 1% (v/v) NP- 40/IGEPAL, 0,1% (w/v) SDS, 1% (w/v) Na-Deoxycholat, 0,2 mM PMSF, 1 mM DTT, 1 μg/ml Leupeptin, 1 μg/ml Pepstatin

50 mM NaF, 0,1 mM Na3VO4

Saccharose-VSB-Kissen 15% (w/v) Saccharose, 50 mM TRIS /HCl, pH 7,8; 12 mM KCl, 5 mM EDTA

SDS-Probenpuffer (4x) 0,25 M TRIS/HCl pH 6,8; 25% (v/v) Glycerol 8% (w/v) SDS, 20% (v/v) β-Mercaptoethanol

48 Material und Methoden

SSC (20x) 0,3 M tri-Natriumcitratdihydrat, 3,0 M NaCl

Stringency Wash Buffer I 2x SSC, 0,1% (v/v) SDS

Stringency Wash Buffer II 0,5x SSC, 0,1% (v/v) SDS

Stripping-Lösung (Southern Blot) 0,2 M NaOH, 0,1% (v/v) SDS

TBE-Probenpuffer (6x) 10% (v/v) Glycerol, 6x TRIS-Borat-EDTA, 1 Spatelspitze Bromphenolblau

TBE-Puffer (10x) 890 mM TRIS, 890 mM Borsäure, 20 mM EDTA, pH 8,0

TBST (10x) 100 mM TRIS/HCl, pH 8,0; 1,5 M NaCl 0,5% (v/v) Tween20

VSB (Virus Standard Buffer)-Puffer 0,05 M TRIS, 12 mM KCl, 5 mM Na-EDTA, pH 7,8

2.1.5 Zellkulturmedien und –zusätze

Im Folgenden sind die verwendeten Zellkulturmedien und Zellkulturzusätze aufgelistet.

Tab. 5: Zellkulturmedien und -zusätze

Kulturmedium / -zusatz Hersteller Blasticidin (20 µg/ml, 1:2000) InvivoGen Ciprofloxacin Hydrochlorid MP Biomedicals Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco FBS Superior (Fetal bovine serum) Biochrom AG G418 (Geneticin) (250 µg/ml, 1:200) Roth Interferon α A (Maus) PBL Assay Science Interferon γ (Maus) PeproTech Interferon λ 2 (Maus) PeproTech Interferon α 2a (Mensch) PBL Assay Science Interferon γ (Mensch) PBL Assay Science Interferon λ 2 (Mensch) PeproTech L-Glutamin Gibco Modified Eagle Medium (MEM) Sigma Penicillin (10.000U/ml)/ Streptomycin (10.000 µg/ml) Gibco Phosphate buffered saline (PBS) Gibco Trypsin Gibco

49 Material und Methoden

2.1.6 Antibiotika, Chemikalien und Enzyme

Im Folgenden sind die verwendeten Antibiotika, Chemikalien und Enzyme aufgeführt.

Tab. 6: Antibiotika, Chemikalien und Enzyme Substanz Hersteller α-Digoxigenin-AP Antikörper Roche Acrylamid/Bisacrylamid (30%) Roth Agarose Biozyme Ammoniumperoxodisulfat (APS) Roth Ampicillin AppliChem BamHI New England Biolabs β-Mercaptoethanol Aldrich Borsäure Roth Bromphenolblau Roth Calciumchlorid Roth Chloramphenicol (CAM) Roth Calf-Intestine-Phosphatase New England Biolabs Coomassie Blue G250 Roth Dimethylsulfoxid (DMSO) Roth DIG Blocking Roche DIG EASY Hyb Roche Dithiothreitol (DTT) Roth DNA-Standard (GeneRuler™ DNA Ladder Mix) Thermo Scientific EcoRI New England Biolabs Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Roth Essigsäure (96%) Roth Ethanol Roth Glycin Roth Glycerol Roth HindIII New England Biolabs Isopropanol Roth Kaliumacetat Roth Kaliumchlorid Roth Kaliumhydroxid Merck Kanamycinsulfat Roth LB-Medium Roth LB-Agar Roth Leupeptin Roth Magnesiumchlorid Roth

50 Material und Methoden

Maleinsäure Roth Methanol JT Baker Methylcellulose (4000 CP) Sigma Natriumchlorid Roth Natriumchlorid-Natriumcitrat (SSC) Sigma Natrium-Deoxycholat Roth Natriumdodecylsulfat (SDS) Roth Natriumfluorid Roth Natriumhydrogencarbonat Roth Natriumhydroxid Roth Natriumorthovanadat AppliChem NEBufferTM (1.1, 2.1, 3.1, CutSmart®) New England Biolabs NheI New England Biolabs NP-40/IGEPAL Sigma Pepstatin Roth Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) Roth Phosphorsäure Roth Polyethylenimin (PEI) Sigma Ponceau Rot Roth RNase A AppiChem D(+)-Saccharose Roth Salzsäure (37%) Roth Tetramethylethylenediamine (TEMED) Roth tri-Natriumcitratdihydrat Sigma Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS) Roth Triton X-100 Roth Tween 20 Roth XbaI New England Biolabs XhoI New England Biolabs Zeomycin Invitrogen

2.1.7 Antikörper

In nachstehender Tabelle sind die primären und sekundären Antikörper aufgelistet, welche zum Nachweis von Proteinen bei der Western-Blot-Analyse verwendet wurden.

51 Material und Methoden

Tab. 7: Primäre und sekundäre Antikörper

Primär-Antikörper

Bezeichnung Spezies Hersteller Katalog-Nr. Verdünnung α-Aktin Maus α-GAPDH Kaninchen Abcam ab86139 1:3.000 α-HA Kaninchen Sigma H6908 1:5.000 α-HA Maus Sigma H3663 1:5.000

α-pp89 (CROMA101) Maus Hybridoma- 1:200 überstände α-mSTAT2 Kaninchen Sigma 3165 1:10.000 α-hSTAT2 Kaninchen Sigma 3165 1:10.000

Sekundär-Antikörper

Bezeichnung Kopplung Spezies Hersteller Katalog-Nr. Verdünnung

α-Maus POD Ziege Jackson Immuno- 115-035-062 1:10.000 Research

α-Kaninchen POD Ziege Sigma A6154 1:10.000

2.1.8 Plasmide

Im Folgenden sind Plasmide und deren Ursprung aufgelistet, die in dieser Arbeit zur Klonie- rung von rekombinanten MCMVs, zur Umklonierung von Genen in Expressionsplamide und bei Transfektionsexperimenten in eukaryotischen Zellen verwendet wurden.

Tab. 8: Plasmide

Plasmid Herkunft ______pCP20 Beschrieben in Baba et al. 2006 pFRT-Z Thermo Scientific pFRT-Z-hEF1 Thermo Scientific; Die Sequenz des humanen EF1- Promotors wurde von Dr. VTK Le-Trilling in die MCS eingebracht pFRT-Z-hEF1-M27(MCMV)-HA Kloniert von Dr. VTK Le-Trilling pFRT-Z-hEF1-UL27(HCMV)-HA Wurde in der vorliegenden Arbeit generiert pFRT-Z-hEF1-R27(RCMV)-HA Wurde in der vorliegenden Arbeit generiert pFRT-Z-hEF1-E27(RCMV)-HA Wurde in der vorliegenden Arbeit generiert pFRT-Z-hEF1-HBx(HBV)-HA Kloniert von Dr. VTK Le-Trilling

52 Material und Methoden

pFRT-Z-hEF1-WHx(WHV)-HA Kloniert von Dr. VTK Le-Trilling pFRT-Z-hEF1-Vpr(HIV1)-HA Wurde in der vorliegenden Arbeit generiert pFRT-Z-hEF1-Vpr(HIV2)-HA Wurde in der vorliegenden Arbeit generiert pFRT-Z-hEF1-Vpx(HIV2)-HA Wurde in der vorliegenden Arbeit generiert pFRT-Z-hEF1-sHBsAg(HBV)HA Wurde in der vorliegenden Arbeit generiert pIRES2-EGFP-Intron Fa. BD Biosciences Clontech Vektor; die Intron- Sequenz wurde in die NheI Schnittstelle vor der MCS von Dr. VTK Le-Trilling eingefügt pIRES2-EGFP-M27HA Kloniert von Dr. VTK Le-Trilling pIRES2-EGFP-UL27HA Kloniert von Dr. VTK Le-Trilling pIRES2-EGFP-R27HA Kloniert von Dr. CD Landsberg pIRES2-EGFP-E27HA Kloniert von Dr. CD Landsberg pISRE-Luc Agilent Life Science pcDNA-3xFlag-HIV2-Rod-Vpr Kloniert von Michael Emerman, Fred Hutchinson Cancer Research Center und zur Verfügung gestellt von Hanna-Mari Baldauf, Universitätsklinikum Frankfurt pcDNA-3xFlag-HIV2-Rod-Vpx Kloniert von Michael Emerman, Fred Hutchinson Cancer Research Center und zur Verfügung gestellt von Hanna-Mari Baldauf, Universitätsklinikum Frankfurt

53 Material und Methoden

2.1.9 Primer

Alle Primer wurden von der Firma MWG Biotech synthetisiert. In nachstehender Tabelle sind alle Primer aufgeführt, die in der vorliegenden Arbeit verwendet wurden.

Tab. 9: Primer

Oligonukleotid Sequenz (5‘ – 3‘)

MR-NheI-R27-fw tat gct agc tca cgt ccg ata acc ttc cag tct ctc gac

MR-R27-HA-HindIII-rev ata aag ctt agc gta atc tgg aac atc gta tgg gta atg gac tcc tgg tc

MR- NheI-E27- fw tat gct agc atg gat ctc aga gac cgc cag

MR-E27-HA-BamHI-rev ata cct agg agc gta atc tgg aac atc gta tgg gta tca agc gta atc tgg a

MR-NheI-HIV2-Vpr-fw tat gct agc atg agt gga taa tag aaa tct tga gag

MR-HIV2-Vpr-HA-BamHI-rev ata ctc gag tta agc gta atc tgg aac atc gta tgg gta tgg gta ttg cat gtt tct agg ggt cgg

MR-NheI-Vpx-fw tat gct agc atg aca gac ccc aga gag aca gta

MR-Vpx-HA-BamHI-rev ata gga tcc tta agc gta atc tgg aac atc gta tgg gta gac cag acc tgg agg ggg ag

MR-NheI-HIV1-Vpr-fw tat gct agc atg gaa caa gca cct gag gat

MR-HIV1-Vpr-HA-BamHI-rev ata gga tcc tca agc gta atc tgg aac atc gta tgg gta ggg tct act act gga tcc att tct tc

MR-NheI-sHBsAg-fw tat gct agc atg gag aac atc aca tca gga ttc c

MR-sHBsAg-HA-XhoI-rev ata ctc gag tta agc gta atc tgg aac atc gta tgg gta aat gta tac cca aag aca aaa gaa aat tgg

2.1.10 Bakterienstämme

Zur Klonierung und Vervielfältigung von DNA-Plasmiden und BACmiden (MCMV- Genomen) wurden folgende Bakterienstämme verwendet.

Tab. 10: Bakterienstämme

Bakterienstamm Genotyp

E. coli, Stamm XL1-Blue F´::Tn10 proA+B+ lacIq∆(lacZ)M15/recA1 endA1 gyrA96 (Nalr) thi hsdR17 - + (rK mK ) glnV44 relA1 lac

E. coli, Stamm DH10B F– mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) 80dlacZ∆M15∆lacX74 deoR recA1 endA1 araD139 ∆(ara, leu)7697 galU galKλ– rpsL nupG

54 Material und Methoden

2.1.11 Eukaryotische Zellen

In der vorliegenden Arbeit wurden folgende Zelllinien verwendet.

Tab. 11: Zelllinien

Name Zellart 293T Humane Nierenzellen CIM Immortalisierte Mausfibroblasten (BALB/c ) HeLa Humane Epithelzellen (Zervixkarzinom) HeLa pISRE-Luc, IFNλR1 Humane Epithelzellen (Zervixkarzinom) MEF Primäre Mausembryofibroblasten (BALB/c, C57BL/6) MNC Primäre Mausneugeborenenzellen (BALB/c, C57BL/6) NIH-3T3 Mausfibroblasten NIH-3T3#4 pISRE-Luc Mausfibroblasten NIH-3T3#4.39 pISRE-Luc, IFNλR1 Mausfibroblasten

2.1.12 Mausstämme

Für in vivo Experimente mit Mäusen wurden folgende Mausstämme verwendet.

Tab. 12: Mausstämme Mausstamm Züchter BALB/c Harlan (Envigo) C57BL/6 Charles River, Harlan (Envigo) 129S1/SvImJ bezogen aus eigener Zucht

2.1.13 Viren

Im Jahr 2011 wurde von Jordon et al. publiziert, dass die viralen Nachkommen, welche vom MCMV-BAC (pSM3fr) aus rekonstituiert wurden, aufgrund einer Mutation im MCK-2 Gen ein reduziertes Wachstum in der Mausspeicheldrüse aufweisen (Jordon et al., 2011). Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten MCMV wurden von einem MCMV-BAC rekonstituiert, in dem die Kodierungssequenz von MCK-2 repariert wurde. Im Folgenden sind alle Vieren aufgelistet, welche in dieser Arbeit verwendet wurden (s. Tab. 13).

55 Material und Methoden

Tab. 13: Viren

Murines CMV (MCMV) Herkunft wt-MCMV (pSM3fr) MCMV:M27HA (pSM3fr) Zimmermann & Trilling et al., 2005 ΔM27-MCMV (C3X:Mck-2rep) Kloniert von Dr. VTK Le-Trilling ΔM27-MCMV:hEF1-EGFP (C3X:Mck-2rep) Kloniert von Dr. VTK Le-Trilling ΔM27-MCMV:hEF1-M27HA (C3X:Mck-2rep) Kloniert von Dr. VTK Le-Trilling ΔM27-MCMV:hEF1-UL27HA (C3X:Mck-2rep) Wurde in der vorliegenden Arbeit generiert ΔM27-MCMV:hEF1-R27HA (C3X:Mck-2rep) Wurde in der vorliegenden Arbeit generiert ΔM27-MCMV:hEF1-HBxHA (C3X:Mck-2rep) Kloniert von Dr. VTK Le-Trilling ΔM27-MCMV:hEF1-WHxHA (C3X:Mck-2rep) Wurde in der vorliegenden Arbeit generiert ΔM27-MCMV:hEF1-sHBsAgHA (C3X:Mck-2rep) Wurde in der vorliegenden Arbeit generiert rep Δm157p-MCMV (C3X:Mck-2 ) Kloniert von Dr. VTK Le-Trilling. In dieser Deletionsmutante wurde nur jene Sequenz von m157 deletiert, welche nicht mit dem benachbarten ORF, m156, überlappt. Da- her wurde die Mutante mit „p“ (für partielle Deletion) gekennzeichnet. Δm157MCMV:hEF1-EGFP (C3X:Mck-2rep) Kloniert von Dr. VTK Le-Trilling Δm157-MCMV:hEF1-M27HA (C3X:Mck-2rep) Kloniert von Dr. VTK Le-Trilling Δm157-MCMV:hEF1-UL27HA (C3X:Mck-2rep) Wurde in der vorliegenden Arbeit generiert Δm157-MCMV:hEF1-HBxHA (C3X:Mck-2rep) Kloniert von Dr. VTK Le-Trilling Δm157-MCMV:hEF1-sHBsAgHA (C3X:Mck-2rep) Wurde in der vorliegenden Arbeit generiert

2.1.14 Computer- und Onlineprogramme

Im Labor wurde Nanodrop2000 zur Konzentrationsbestimmung von Plasmid- und BACmid- DNA-Präparationen genutzt. ClustalW, Geneious und Seaviewer wurden zur Sequenzanalyse und Alignments verwendet. Mithilfe von VectorNTI wurden Abbildungen von Vektoren generiert. GraphPad Prism (Version 6.04) diente zur graphischen Darstellung sowie der statistischen Auswertung von experimentellen Daten. Die Abbildungen wurden mit Microsoft Powerpoint, Adobe Acrobat DC und Adobe Illustrator CC 2017 generiert.

56 Material und Methoden

2.2. Methoden

2.2.1 Molekularbiologische Methoden

2.2.1.1 DNA-Präparation

Zur Vervielfältigung von DNA-Plasmiden wurden Übernachtkulturen (3 ml LB-Medium mit Selektionsmarker) mit E. coli inokuliert und bei 37°C und 150 rpm inkubiert. Die Bakterien wurden anschließend pelletiert (3 min; 4.487 g). Das Pellet wurde in 300 µl P1-Puffer resuspendiert und die Zellen lysiert. Nach Zugabe von 300 µl P2-Puffer und mehrmaligem Invertieren erfolgte eine max. 5-minütige Inkubation, bevor 300 µl P3-Puffer hinzugefügt und die Probe erneut mehrmals invertiert wurde. Nach einer 20-minütigen Zentrifugation (RT, 17.949 g) wurden die Überstände in ein neues Reaktionsgefäß überführt und auf 650 µl vorgekühltes Isopropanol (-20°C) gegeben. Die Proben wurden für 30 min bei -20°C inkubiert. Nach einer erneuten Zentrifugation (30 min, 4°C, 19.357 g) wurde die pelletierte DNA mit 600 µl Ethanol (70% [v/v]) gewaschen (10 min, 4°C, 19.357 g). Der Überstand wurde mithilfe einer Pipette abgenommen und das Pellet an der Luft getrocknet. Die DNA wurde in

30 µl ddH2O aufgenommen und die DNA-Konzentration bestimmt.

2.2.1.2 Polymerasekettenreaktion

Im Rahmen dieser Arbeit wurden zu unterschiedlichen Klonierungs- und Nachweiszwecken verschiedene PCR-Kits nach Angaben der Hersteller verwendet: Expand High Fidelity PCR System (Roche), DIG-High Prime (Roche), QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis (Agilent Technologies), KAPA Mouse Genotyping Kit (KAPA Biosystems).

2.2.1.3 DNA-Restriktion

Bei der Restriktionsspaltung von DNA-Molekülen (Plasmide, BACmide, PCR-Produkte) wurden kommerziell erhältliche Restriktionsenzyme und Restriktionspuffer verwendet. Eine DNA-Restriktion wurde durchgeführt, um resultierende DNA-Fragmente zu präparieren und in weiteren Reaktionsschritten mit anderen DNA-Molekülen zu verbinden (Ligation) oder um in einer anschließenden Gelelektrophorese die Größen der resultierenden DNA-Fragmente durch Vergleich mit einem Größenstandard zu verifizieren („Kontroll-Restriktion“). Beim präparativen Ansatz wurden 1-5 µg DNA und bei einer Kontroll-Restriktion 0,2-0,5 µg DNA

57 Material und Methoden

eingesetzt. Die Reaktionsansätze setzten sich aus 2 µl 10x Puffer, einem definierten Volumen wässriger DNA-Lösung und 0,5 µl Restriktionsenzym zusammen und wurde auf ein Gesamt- volumen von 20 µl mit destilliertem ddH2O aufgefüllt. Die Reaktion wurde bei 37°C für mehrere Stunden (bei anschließender Extraktion > 4 h oder über Nacht, bei Kontrollansätzen für ca. 2 h) inkubiert.

2.2.1.4 DNA-Agarosegel-Elektrophorese

Zur Auftrennung von DNA-Molekülen nach ihrer Fragmentgröße wurde eine Agarosegel- Elektrophorese durchgeführt. Die Konzentration des Agarosegels wurde der Größe der aufzutrennenden DNA-Fragmente angepasst. Für 100-1000 bp große DNA-Moleküle wurden 2%ige (w/v), für 1000-3000 bp 1%ige (w/v) und für (mehrere und/oder ähnlich große) DNA- Moleküle, die mehr als 1500 bp aufwiesen, 0,6%ige (w/v) Agarosegele verwendet. Zur Auftrennung von Restriktionsfragmenten eines BACmids wurde ein 0,5%iges (w/v) Agarose- gel hergestellt. Zur Herstellung des Agarosegels wurde die Agarose in eine TBE-Lösung gegeben und erhitzt. Vor dem Gießen des Gels wurde zur späteren Sichtbarkeit der DNA unter UV-Licht dem flüssigen Gel eine DNA-interkalierende Reagenz zugefügt. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte bei 120-140 V, 400 mA, 20-60 min (je nach Fragment- anzahl und -größe).

2.2.1.5 DNA-Gelextraktion

Zur Präparation von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen wurde das NucleoSpin® Gel Extraktion Kit nach Angaben des Herstellers (Macherey-Nagel) verwendet.

2.2.1.6 DNA-Ligation

Aus der Restriktion von DNA-Molekülen resultierende DNA-Fragmente mit zueinander passenden Überhängen wurden mithilfe einer Ligase-Reaktion miteinander verknüpft. In der vorliegenden Arbeit wurde dazu das T4 DNA-Ligase Kit der Firma New England Biolabs verwendet. Der Reaktionsansatz (Gesamtvolumen 10 µl) setzte sich wie folgt zusammen: 1 µl 10x Ligasepuffer, 1 µl T4-Ligase, 1 µl Insertionsplasmid, 7 µl PCR-Produkt/ oder DNA- Insert. Die Reaktion wurde entweder für 2 h bei RT oder über Nacht bei 16°C im Ther- moblock inkubiert. Zur Vervielfältigung der entstandenen DNA-Konstrukte wurden im Anschluss chemisch-kompetente Bakterien mit dem Ligationsprodukt transformiert.

58 Material und Methoden

2.2.1.7 Southern Blot

Neben der PCR-Analyse wurde das Southern Blot-Verfahren zum Nachweis der ins MCMV- Genom eingebrachten Gensequenz durchgeführt. Zunächst wurden 15 µl einer BAC-DNA- Präparation über Nacht bei 37°C mit HindIII nach Angaben des Herstellers fragmentiert. Am nächsten Morgen wurde ein 0,6%iges (w/v) Agarosegel mit 0,5x TBE-Puffer hergestellt. Vor dem Gießen des Gels wurden 5 µl Gelred Nucleid Acid Stain hinzugefügt. Als DNA-Standard wurden 0,5 µl des GeneRuler™ DNA Ladder Mix verwendet. Die Proben wurden mit 6x TBE-Laufpuffer auf ein Endvolumen von 20 µl gebracht und in die Geltaschen pipettiert. Die Gelelektrophorese (140 V, 400 mA über 90 min) erfolgte bis die Lauffront des blauen Probenpuffers ca. 1 cm vor der unteren Gelkante lag. Die DNA-Fragmente wurden mithilfe eines UV-Transilluminators detektiert. Im Anschluss wurde das Agarosegel 20-30 min in einer 250 mM HCl gewaschen. Es folgten drei Waschschritte mit H2O. Dann wurde das Gel mit SB-Denaturierungspuffer gewaschen und direkt im Anschluss 30 min im selbigen inkubiert. Der Puffer wurde verworfen und das Gel dreimal mit H2O gewaschen. Dann wurde das Gel mit SB-Neutralisationspuffer gewaschen. Anschließend wurde das Gel 30 min im

Neutralisationspuffer inkubiert. Abschließend wurde das Gel dreimal mit H2O gewaschen und bis zum Blotten in 20x SSC gelagert. Für das Blotten wurden Whatman-Papiere und Nylon- membran auf die Größe des Gels zugeschnitten. In die Blotting-Apparatur wurde ein ca. 2 cm hoher Stapel weicher Papierhandtücher gelegt und darauf 3 trockene Whatman-Papiere gestapelt. Darauf wurde ein mit 20x SSC befeuchtetes Whatman-Papier und obenauf die in zunächst mit ddH2O, dann ebenfalls mit 20xSSC angefeuchtete positiv-geladene Nylonmemb- ran positioniert. Das Agarosegel mit den der Größe nach aufgetrennten DNA-Fragmenten wurde blasenfrei auf die Membran aufgelegt. Auf das Agarosegel wurde noch ein weiteres befeuchtetes Whatman-Papier gelegt, auf welches abschließend eine Whatman-„Brücke“ gesetzt wurde, ein längliches Whatman-Papierstück, dessen Enden in einem Reservoir mit 20x SSC-Lösung eingetaucht vorlagen. Der Stapel (Blot) wurde abschließend beschwert. Der Blot erfolgte über Nacht. Am nächsten Tag wurden die übertragenen DNA-Moleküle durch UV-Bestrahlung (100%, 0,15J) kovalent mit der positiv-geladenen Nylonmembran verknüpft.

Die Membran wurde in eine gläserne Hybridisierungsröhre überführt und mehrmals mit H2O gewaschen. Dann wurde die Membran im Hybridisierungsofen in 20 ml DIG Easy Hyb- Lösung inkubiert (1h; 42°C). Die Hybridisierungslösung (DIG-markierte, doppelsträngige

59 Material und Methoden

DNA in DIG Easy Hyb-Lösung) wurde in siedendem Wasser denaturiert (10 min) und anschließend im Eisbad abgekühlt (5 min). Die Membran wurde dreimal mit H2O gewaschen und über Nacht (oder mind. 3h) bei 42°C mit der Hybridisierungslösung inkubiert. Am nächsten Tag wurde die Membran mit H2O gewaschen und zweimal mit Stringency Wash Buffer 1 bei RT gewaschen. Im Anschluss wurde die Membran mit Stringency Wash Buffer 2 gewaschen (30 min; 68°C). Dann wurde die Membran mit H2O gewaschen und in eine Schale überführt. Die Membran wurde kurz in Maleinsäurepuffer gewaschen. Als nächstes wurde die Membran mit DIG-Blocking-Lösung inkubiert (30 min, RT). Anschließend erfolgte eine Inkubation mit Anti-DIG-AP für mindestens 45 min bei RT. Danach wurde die Membran dreimal mit Maleinsäurepuffer gewaschen (jeweils 5 min). Dann wurde die Membran 1x in AP-Puffer gewaschen und anschließend zwischen Whatman-Papieren abgetrocknet. Die CDP-Star-Substratlösung (8-10x wiederverwendbar, wenn lichtgeschützt bei -20°C gelagert) wurde vorsichtig auf die Membran pipettiert und 2-5 min inkubiert. Die Membran wurde mit Whatman getrocknet, in Frischhaltefolie eingepackt und lichtgeschützt in einer Filmkassette kurz verwahrt. Die Detektion des Lichtes, welches bei der Umsetzung von CDP-Star durch die Anti-DIG-AP (alkalische Phosphatase) freigesetzt wird, erfolgte mithilfe von Röntgenfil- men.

2.2.1.8 Luziferase-Reporter-Assay

Zur Untersuchung des Effektes durch ΔM27-MCMV heterolog exprimierten viralen pM27- ähnlichen Proteinen (pM27HA, pUL27HA, pR27HA, HBxHA und WHxHA) auf die ISRE- Promotoraktivität wurden murine NIH3T3#4.39-Zellen (pISRE-Luc und IL28-R) mit den in dieser Arbeit konstruierten MCMV-Mutanten infiziert. Die Zellen wurden in 48-Loch-Platten ausgelegt und am folgenden Tag infiziert (MOI 5). Am nächsten Tag wurden die Zellen mit IFNα (200 U/ml) oder IFNλ (20 ng/ml) stimuliert, anschließend in 200 µl Luc-Lyse-Puffer lysiert und bei -20°C eingefroren. Zur Messung wurden die Platten aufgetaut und die Zellsus- pension für 2 min bei 600 g zentrifugiert. Anschließend wurden 50 μl Überstand in eine 96- Loch-Platte überführt (LumiNunc F96, Nunc) und gemessen (Mithras2 LB 943, Berthold Technologies).

60 Material und Methoden

2.2.2 Proteinbiochemische Methoden

2.2.2.1 Herstellung von Zell-Lysaten

Die Zellen wurden mit einem Zellschaber vom Boden einer Lochplatte abgelöst und zusammen mit dem Zellkulturüberstand in ein Reaktionsgefäß überführt und zentrifugiert (4°C, 6000 rpm, 1 min). Der Überstand wurde verworfen und das Pellet anschließend dreimal mit kaltem PBS gewaschen (4°C, 6000 rpm, 1 min). Für anschließende Western-Blot-Analysen wurden die Zellen in RIPA-Puffer lysiert. Bei anstehenden Luziferase-Assays wurden die Zellen in einem Luc-Lyse-Puffer lysiert. Nach Zugabe des Lyse-Puffers wurden die Zellen bei -20°C eingefroren.

2.2.2.2 Bradford-Methode

Zur Normalisierung der Proteinkonzentrationen verschiedener Lysatproben für eine Western- Blot-Analyse wurden die relativen Proteinmengen mithilfe der Bradford-Methode bestimmt. Die Lysatproben wurden schonend im Eisbad aufgetaut und die bei der Lyse entstandenen Zelltrümmer durch Zentrifugation (4°C, max. g, 20 min) gefällt. Anschließend wurde der Überstand in ein neues 1,5-ml-Reaktionsgefäß, in dem das Lysat von nun an bei -20°C gelagert wird, überführt. In einem weiteren Reaktionsgefäß wurden 995 µl einer Bradford- Lösung (RT) vorgelegt und 5 µl des zu untersuchenden Zell-Lysats hinzugegeben. Die Messung der Optischen Dichte (OD) erfolgte bei 595 nm. Als Blank dienten 5 µl des für die Lysat-Herstellung verwendeten Lyse-Puffers.

2.2.2.3 Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Die Auftrennung von Proteinen nach ihrer Molekülmasse erfolgte mittels SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Die Proteinproben wurden zunächst mit SDS-Probenpuffer versetzt, für 5 min bei 95°C denaturiert und anschließend auf das diskontinuierliche SDS- Polyacrylamid-Gel, welches aus Trenn- und Sammelgel (s. Tab. 14) besteht, aufgetragen. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte über Nacht bei 4°C (80 mA; 12 V).

61 Material und Methoden

Tab. 14: Zusammensetzung der Trenn- und Sammelgele eines SDS-Polyacrylamidgels

Komponente und Volumeneinheit Trenngel Sammelgel

8% 10% 12% 30% Polyacrylamid (PAA) [ml] 12,8 16 19,2 3 2 M Tris/HCl (pH 8,8) [ml] 10 10 10 - 0,5 M Tris/HCl (pH 6,8) [ml] - - - 2,4 20% (w/v) SDS [µl] 240 240 240 90 60% (w/v) Saccharose [ml] - - - 4,2 dH2O [ml] 24,4 21,2 18 8,4 TEMED [µl] 96 96 96 24 10% (w/v) APS [µl] 500 500 500 120

2.2.2.4 Western-Blot

Der Nachweis der Expression von Proteinen erfolgte via Western-Blot-Analyse. Nach der SDS-PAGE wurden die nach Größe aufgetrennten Proteine durch das Semidry-Blotverfahren auf eine Nitrozellulose-Membran transferiert. Der Blot setzte sich folgendermaßen zusammen: Anode, 3x 3mm-WhatmanPapier, Nitrozellulose-Membran, Gel, 3x 3mm-Whatman- Papier, Kathode. Nach dem Transfer (1:10 h, 14 V, 3000 mA) wurden die Proteine zur Kontrolle mit Ponceau-Rot reversibel angefärbt. Zum Blockieren der Membran wurde mind. 30 min in 5% (w/v) Milchpulver/TBST inkubiert. Die Inkubation mit dem primären Antikör- per erfolgte auf einem Wiegeschüttler (3013, GFL) für 1 h bei Raumtemperatur (RT) oder über Nacht bei 4°C, die Inkubation des sekundären, POD-gekoppelten Antikörpers erfolgte für 30 min bei RT. Die verwendeten Antikörper-Verdünnungen sind in Tab. 7 zusammengefasst. Im Anschluss wurde die Membran mind. dreimal mit TBST für je 10 min gewaschen. Unter Verwendung des „ECL Plus Western Blotting Detection Systems“ entstandene Licht- signal mit Filmen detektiert.

2.2.3 Arbeiten mit prokaryontischen Zellen

2.2.3.1 Herstellung chemisch-kompetenter E. coli XL1 Blue und E. coli DH10B

Um DNA-Moleküle durch die Zellmembranen von Bakterien zu schleusen, müssen diese zunächst einer chemischen Prozedur unterzogen werden. Zunächst wurden 3 ml LB-Medium aus einem Glycerolstock des Bakterienstamms angeimpft. Die Inkubation von E. coli XL1 Blue erfolgte bei 37°C über Nacht im Schüttler. Da E. coli DH10B zuvor bereits mit pCP20

62 Material und Methoden

und einem BACmid transformiert worden war, musste dem Kulturmedium 1:1000 Amp und 1:2000 CAM zur Aufrechterhaltung des Selektionsdrucks und Vorbeugung des Plasmidver- lustes hinzugefügt werden. Da der pCP20-Vektor für eine Rekombinase namens Flippase kodiert, welche bei 37°C aktiv ist, wurden die genetisch veränderten DH10B-Zellen bei 32°C über Nacht ebenfalls im Schüttler inkubiert. Am nächsten Morgen wurden 100 ml LB- Medium mit 1-2 ml der Vorkultur angeimpft. Bei E. coli DH10B erneut unter Zugabe von Antibiotikum. Die Kulturen wurden bei 37°C bzw. 32°C unter Schütteln inkubiert, bis eine optische Dichte (OD600) von 0,4-0,5 erreicht wurde. Diese wurde durch photometrische Messung der Bakteriensuspension ermittelt. Die nächsten Schritte erfolgten auf Eis und in temperierten Zentrifugen (4°C). Die Bakteriensuspension wurde in Falcons überführt und die Bakterien durch Zentrifugation pelletiert (10 min, 1200 g). Der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde in 50 ml einer MgCl2-Lösung (0,1 M) resuspendiert. Die Bakterien wurden erneut pelletiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 50 ml einer MgCl2- Lösung (0,05 M) resuspendiert. Wiederum wurden die Bakterien pelletiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 2 ml des Einfrierpuffers (0,05 M CaCl2/15% Glycerol [v/v]) resuspendiert und die Suspension 20 min im Eisbad stehen gelassen. Die Bakterien wurden aliquotiert und bis zur Verwendung bei -80°C gelagert.

2.2.3.2 Transformation chemisch-kompetenter E. coli XL1 Blue und E. coli DH10B

Die Transformation von Bakterien dient zur Generierung einer hohen Kopienzahl des eingebrachten DNA-Moleküls (z. B. von Ligationsprodukten oder bereits klonierten DNA- Konstrukten [Re-Transformation]). Pro Transformationsansatz wurde ein 50 µl-Aliquot chemisch-kompetenter Bakterien schonend im Eisbad aufgetaut. Der Ligationsansatz bzw. 1 µl des zu retransformierenden Plasmids wurden zugegeben und durch Auf- und Abpipettie- ren durchmischt. Nach einer 30-minütigen Inkubation auf Eis erfolgte ein Hitzeschock (30- 60 s, 42°C). Anschließend wurde der Transformationsansatz für 3-5 min im Eisbad inkubiert. Nach der Zugabe von 1 ml LB-Medium ohne Antibiotikum wurden die transformierten Bakterien im Thermoblock bei 750 rpm geschüttelt. Die Inkubation von E. coli XL1 Blue erfolgte für 60 min bei 37°C, die Inkubation von E. coli DH10B (pCP20; MCMV-BAC) für 1,5 h bei 32°C. Die transformierten Bakterien wurden pelletiert (6500 rpm, 5 min, RT). Die Bakterien wurden in 100-200µl Restmedium resuspendiert. Die Bakteriensuspension wurde

63 Material und Methoden

auf antibiotikahaltigen LB-Agarplatten ausgestrichen. Bei E. coli XL1 Blue wurde nach der Transformation von pcDNA- und pFRT-Z-Vektoren Ampicillin (1:1000) und im Fall von pIRES-EGFP-Vektoren Kanamycin (1:1000) verwendet. Bei der BAC-Mutagenese wurden E. coli DH10B (pCP20; MCMV-BAC) mit pFRTZ-Vektoren transformiert. Hier wurde eine Selektion durch die Zugabe von CAM (1:2000) und Zeomycin (1:3000) sichergestellt.

2.2.4 Arbeiten mit eukaryotischen Zellen

2.2.4.1 Kultivierung von humanen und murinen Zelllinien

Alle zellbiologischen Arbeiten wurden zur Erhaltung der Sterilität unter einer Sterilbank durchgeführt. Die Zellen wurden bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Die Kultivierung der Zellen erfolgte in DMEM, welches mit 10% (v/v) hitze-inaktiviertem FCS (fetal calf serum) und 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin supplementiert wurde. Für die Passage von adhärenten Zellen wurde zunächst das Medium verworfen und die Zellen mit PBS (37°C) gespült. Anschließend wurden die Zellen durch Zugabe einer Trypsin-Lösung (0,625% [w/v] in PBS) und nach kurzer Inkubation (1-3 min) bei 37°C vom Boden des Kultivierungsgefäßes gelöst. Die abgelösten Zellen wurden in frischem Medium (37°C) resuspendiert und in gewünschter Verdünnung in ein neues Kultivierungsgefäß überführt.

2.2.4.2 Lagerung von Zellen in flüssigem Stickstoff

Die Cryo-Konservierung von Zellen erfolgte bei einer Konfluenz von ca. 70-80%. Dafür wurden die Zellen wie oben beschrieben zunächst mit PBS gewaschen und mit Trypsin abgelöst und anschließend in Medium aufgenommen. Die Zellen wurden bei 200 g für 1-2 min zentrifugiert und in je 1 ml Einfriermedium (50% [v/v] FCS, 40% [v/v] Medium und 10% [v/v] DMSO) pro Aliquot resuspendiert und in Cryo-Röhrchen überführt. Das Einfrieren der Zellen erfolgte in Cryo-Einfrierbehältern langsam (-1°C/min) über Nacht bei -80°C bevor sie in flüssigem Stickstoff gelagert wurden.

2.2.4.3 Präparation von primären Mausneugeborenenzellen

Traditionell werden die meisten MCMV-Experimente in primären Mausembryofibroblasten (MEF) durchgeführt. Die Herstellung von primären MEFs hat jedoch einige Nachteile. So muss das schwangere Muttertier für die Präparation der Embryonen getötet werden. Im Vergleich dazu hat die Verwendung von Mausneugeborenenzellen (engl.: mouse newborn

64 Material und Methoden

cells, kurz: MNC) einige Vorteile: Die Ausbeute an primären Fibroblasten pro neugeborener Maus ist höher als die Zellzahl der Fibroblasten, die aus einem Mausembryo gewonnen werden. Ein weiterer Vorteil der MNC liegt im Überleben des Muttertieres. In einer Publika- tion der Arbeitsgruppe wurde gezeigt, dass MNC alle aus MEF bekannten MCMV- Phänotypen vollständig rekapitulieren (Le-Trilling und Trilling, 2017). Die meisten Experi- mente dieser Arbeit wurden daher in MNCs durchgeführt. Zur Isolierung von Mausneugeborenenzellen wurden 1-2 Tage alte BALB/c- oder C57BL/6- Mäuse verwendet. Die Zellpräparation fand unter sterilen Bedingungen unter einer Sterilbank statt. Zunächst wurden die Mäuse in eine mit sterilem PBS gefüllte Vertiefung einer 6- Lochplatte gelegt. Der Kopf und die Extremitäten wurden abgetrennt und die inneren Organe des Abdomens entfernt. Das verbliebene Gewebe wurde in ein 2-ml-Reaktionsgefäß überführt und mit einer Schere sorgfältig zerkleinert. Je homogener die hergestellte Gewebesuspension, umso höhere Ausbeuten an MNCs konnte erzielt werden. Die Zellsuspension von 3-4 Mausneugeborenen wurde in 50-ml-Falcontube überführt und zweimal mit PBS gewaschen. Dazu wurde jeweils 20 ml PBS auf das Zellsuspension gegeben und anschließend zentrifugiert (5 min, 350 g, RT). Das gewaschene Homogenat wurde in 30 ml einer Trypsin-Lösung (2,5% Trypsin, 1:3 in sterilem PBS) für 30 min bei 37°C inkubiert. Nach der Zugabe von 5 ml einer 2,5%igen, unverdünnten Trypsin-Lösung sowie 100 µl einer DNaseI-Lösung (10 mg/ml) wurde das Homogenat für weitere 60 min bei 37°C stehen gelassen. Zum Abstoppen der Trypsin-Reaktion wurden 5 ml FCS hinzugegeben. Um das Trypsin vollstän- dig zu entfernen, wurde das Homogenat zentrifugiert (5 min, 350 g, RT) und der Überstand vorsichtig verworfen. Das Zellpellet wurde ausgiebig in 25 ml DMEM (10% [v/v] FCS) durch Pipettieren resuspendiert und anschließend erneut zentrifugiert (5 min, 350 g, RT). Nach dem Verwerfen des Überstands wurde das Zellpellet schließlich in 50 ml DMEM (10% [v/v] FCS, 1% [v/v] Pen/Strep, 2 mM Glutamin) resuspendiert. Zur Kultivierung und Expansion der isolierten Zellen wurde die Zellsuspension auf Zellkulturflaschen aufgeteilt (ein Mausneuge- borenes pro 175-cm2-Flasche). Nach einem Tag wurde das Zellkulturmedium gewechselt, um tote Zellen, Zelltrümmer oder Knochensplitter, die in den vorherigen Waschschritten nicht beseitigt wurden, zu entfernen. Die Zellen wurden unter einem Mikroskop beobachtet und bei

Erreichen der Konfluenz (P0) expandiert (1:5), um bei der nächsten Konfluenz (P1) eingefro-

65 Material und Methoden

ren und konserviert zu werden. Für Experimente wurden die Zellen aufgetaut und bis P3 expandiert.

2.2.4.4 Transfektion

Die Transfektion eukaryontischer Zellen erfolgte unter Verwendung des Superfect Transfec- tion Reagent (Qiagen) nach den Angaben des Herstellers oder mittels PEI (Polyethlenimin) nach dem folgenden Protokoll: Für 1,2x106 Zellen (6 well) wurden 50 µl serumfreies Medium mit 3 µg pro 1 µg DNA gemischt und 5 min bei RT inkubiert. 2 µg der zu transfizierenden DNA wurden in 50 µl serumfreies Medium aufgenommen und zu dem PEI-Mix pipettiert, durch Vortexen gemischt und 20 min bei RT inkubiert. Während dieser Inkubation wurden die Zellen mit PBS gewaschen und 2 ml Vollmedium auf die Zellen gegeben. Der Trans- fektionsmix wurde tropfenweise auf die Zellen gegeben und durch Schwenken gemischt. Die

Zellen wurden über Nacht inkubiert (5% CO2, 37°C). Abschließend wurde das Trans- fektionsmedium durch normales Kulturmedium ausgetauscht.

2.2.5 Virologische Methoden

2.2.5.1 Infektion von permissiven Mauszellen in vitro

Zu den MCMV-permissiven Mauszelllinien zählen u. a. primäre Mausembryofibroblasten (MEFs), Mausneugeborenenzellen (MNCs), NIH3T3 oder CIM (immortalisierte MEFs). Zur Infektion wurden MCMV-Stocks verwendet, die aus den Zellen und Zellkulturüberständen infizierter Zellen generiert worden waren. Das einzusetzende Volumen des MCMV-Stocks berechnet sich aus dem Quotienten des Produkts der Anzahl der zu infizierenden Zellen mit der gewünschten Infektionsdosis (MOI, engl.: multiplicity of infection) und dem Virustiter (ml-1). · V[Stock] = 𝑍𝑍𝑍𝑍𝑍𝑍𝑍𝑍𝑍𝑍𝑍𝑍ℎ𝑙𝑙 𝑀𝑀𝑀𝑀𝑀𝑀 Der vorhandene Zellkulturüberstand wurde verworfen𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉 𝑉𝑉und𝑉𝑉 eine Infektionslösung auf die Zellen pipettiert. Anschließend wurde zweimal bei 2000 rpm für 15 min bei RT zentrifugiert. Nach dem ersten Durchgang wurden die Platten um 180° gedreht. Die Zellen wurden anschließend bei 37°C in Kultur gehalten.

66 Material und Methoden

2.2.5.2 Rekonstitution

Für die Herstellung verschiedener MCMV-Mutanten wurde eine BAC-Mutagenese durchge- führt. Die daraus resultierenden Konstrukte wurden via PCR und Southern Blot verifiziert. Für die Rekonstitution von rekombinanten MCMVs aus MCMV-BACs wurden zunächst permissive Mausfibroblasten (z. B. CIM, MEF oder MNCs) in einer 12-Lochplatte ausgelegt, sodass sie am folgenden Tag eine Konfluenz von 50-80% aufwiesen. Zur Vorbereitung der Transfektion wurde pro Konstrukt 7,5 µl bzw. 15 µl einer BAC-DNA-Präparation eingesetzt. Die DNA-Lösung wurde mit 67,5 µl bzw. 60 µl purem DMEM (ohne Antibiotikum oder FCS) auf ein Gesamtvolumen von 75 µl aufgefüllt. Nach Zugabe von 7,5 µl Superfect Transfection Reagent (Qiagen) wurde der Transfektionsansatz kurz gevortext, angefugt und für 10 min bei RT inkubiert. Währenddessen wurde das vorhandene Medium von den zu transfizierenden Zellen abgesaugt und die Zellen mit 1 ml PBS gewaschen. Nach den 10 min wurden 400 µl DMEM (10% [v/v] FCS, 1% [v/v] Pen/Strep) zur Transfektionslösung zugegeben, durchgemischt und auf die Zellen gegeben. Die Zellen wurden 2-3 h bei 37°C stehen gelassen. Anschließend wurde der Überstand von den Zellen verworfen, die Zellen mit PBS gewaschen und 1 ml DMEM (10% [v/v] FCS, 1% [v/v] Pen/Strep) zugegeben. Die Zellen wurden weiterhin bei 37°C kultiviert und bei eintretender Konfluenz in größere Zellkulturgefäße überführt. In den nächsten Tagen/Wochen wurde durch ein Mikroskop beobachtet, ob ein zytopathischer Effekt durch MCMV-Replikation eintritt. Im Falle einer erfolgreichen MCMV-Rekonstitution wurden die Zellen so lange in Kultur gehalten, bis alle Zellen infiziert waren, um einen Gründer-Stock herzustellen, der einen möglichst hohen Titer aufweist.

2.2.5.3 Herstellung von MCMV-Stocks

Nach erfolgreicher MCMV-Rekonstitution oder zur Expansion des Virusvorrates erfolgte die Herstellung von MCMV-Stocks. Mithilfe eines Zellschabers wurden die auf dem Boden der Zellkulturflasche verbliebenen Zellen abgelöst und zusammen mit dem Zellkulturüberstand in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt. Die Zellen wurden bei 350 g für 3 min pelletiert. Der Überstand wurde in ein frisches Reaktionsgefäß überführt und das Zellpellet in 5 ml Zellkulturüberstand resuspendiert. Die Zellsuspension wurde in einen Homogenisierer überführt und der Glasstempel 20-mal auf und ab bewegt, wobei die Zellen aufgebrochen und

67 Material und Methoden

das MCMV aus den noch intakten Zellen freigesetzt wurde. Die Suspension wurde mit dem Überstand der ersten Zentrifugation vereint und bei 800 g erneut zentrifugiert. Das Zelltrüm- merpellet wurde verworfen. Der Überstand mit den MCMV-Virionen wurde in 2-ml- Reaktionsgefäßen portioniert (1-1,5 ml pro Tube) und bei -80°C gelagert.

2.2.5.4 Herstellung von konzentrierten MCMV-Stocks

Murine Zellen (CIM oder MNCs) wurden auf 20 Zellkulturflaschen (175 cm2) expandiert. Parallel wurde für jede Zellkulturflasche ein MCMV-Vorstock in einem 6 well angelegt. Vor dem infizierten der Zellen in den Stockflaschen wurde das Medium gewechselt. Wenn alle Zellen infiziert waren, wurden die Zellen mit einem Zellschaber abgelöst und zusammen mit dem Medium in sterile Zentrifugenbecher (250 ml) übertragen und 5 min bei 5000 g (10°C) zentrifugiert. Der Überstand wurde in sterile Zentrifugenbecher zur Verwahrung überführt und das Zellpellet in 5 ml des Überstandes resuspendiert. Nach dem Aufschluss der infizierten Zellen in einem Homogenisator wurden diese sowie der verwahrte Überstand bei 5000 g für 20 min (10°C) zentrifugiert. Der Viruspartikel enthaltende Überstand wurde in die sterilen Fugentubes überführt und 4 h bei 6000 g und 10°C zentrifugiert. Nach dem Fällen der Virionen wurde der Überstand verworfen und das Pellet in 15 ml frischem DMEM im Eisbad über Nacht im Kühlraum inkubiert. Am nächsten Tag wurde das Viruspellet resuspendiert, erneut homogenisiert und in einem sterilen Ultrazentrifugen-Röhrchen sehr langsam auf ein vorgelegtes Saccharose-Kissen (20 ml einer 15% Saccharose/VSB-Lösung) pipettiert, sodass sich die beiden Phasen nicht miteinander vermischten. Es folgten 70 min Zentrifugation bei 100.000 g und 10°C. Der Überstand wurde verworfen und das Viruspellet in 1 ml 15% Saccharose/VSB über Nacht im Kühlraum inkubiert. Am folgenden Tag wurde das Pellet im vorhanden Volumen resuspendiert und homogenisiert. Von der Virussuspension wurden 100 µl von 1:10 mit 15% Saccharose/VSB verdünnt, sodass eine doppelte Ausbeute an Virusstockvolumen generiert werden konnte. Die Virussuspension wurde in 20 µl-Aliquots bei -80°C eingefroren und gelagert.

68 Material und Methoden

2.2.5.5 Plaquetitration zur Bestimmung des MCMV-Titers

Vor der experimentellen Nutzung eines MCMV-Stocks wurde nach dem Einfrieren bei -80°C der Titer durch Plaquetitration bestimmt. Bei der Bestimmung von MCMV-Titern in Mausorganen wurde das bei -80°C gelagerte Organ zunächst mithilfe eines sterilen Spritzenstempels durch ein Zellsieb gerieben. Das homogenisierte Gewebe wurde mit 5 ml 3% FCS/PBS (5% für Leber) durch das Zellsieb gespült und in einem Zentrifugenröhrchen aufgefangen. Die Suspension wurde bei 4°C für 5 min bei 800 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde erneut bei 4°C für 5 min bei 800 rpm (Leber: 3000 rpm) zentrifugiert. Der daraus resultierende Überstand wurde wie weiter unten beschrieben für eine Plaquetitration verwendet. Am Vortag wurden in einer 48-Lochplatte MNCs ausgelegt. Diese wurden mit einer sequen- ziellen 1:10 Verdünnungsreihe der zu titrierenden Virussuspension infiziert. Nach 2 h wurde das Medium durch eine stark viskose Schicht aus Methylcellulose-Medium ersetzt, welche ausschließlich eine Zell-zu-Zell-Verbreitung initialer MCMV-Partikelerlaubt. Nach 3-4 Tagen konnte durch Zählen der resultierenden Plaques der Virustiter berechnet werden. Die Einheit der Viruskonzentration wird in plaque forming units (PFU)/ml angegeben.

2.2.5.6 MCMV-Infektion von Mäusen

Mäuse wurden mit MCMV (2x106 PFU pro Maus, Titerbestimmung mit Verstärkung durch Zentrifugation) intraperitoneal infiziert.

2.2.5.7 Organentnahme und Serumgewinnung aus der Maus

Nach der MCMV-Infektion wurden die Versuchstiere unter Einhaltung der Tierschutz- bestimmungen zum Zweck der Organentnahme durch Vergasen mit N2 getötet. Nach dem Töten wurden die Tiere in 70%iges Ethanol getaucht, um Verunreinigungen durch Haare und Kontaminationen vorzubeugen. Die benötigten Organe (Milz, Nieren, Leber, Lunge, Spei- cheldrüse) wurden entnommen, in Kryogefäße überführt und in flüssigem Stickstoff schock- gefroren. Zur Serumgewinnung wurde das Blut aus den Mäusen entnommen (Herzpunktion) und 10 min bei 1500 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein frisches Gefäß überführt und der Vorgang wiederholt. Das Serum und die Organe wurden bis zur experimentellen Auswertung bei -80°C gelagert.

69 Material und Methoden

2.2.5.8 Hydrodynamische Injektion von HBV-Genomen in Mäuse

Männlichen, 6-8 Wochen alten C57BL/6-Mäusen wurde innerhalb von 8 s das Volumen (0,1 ml/g Körpergewicht) einer DNA-Lösung in die Schwanzvene injiziert. Diese DNA-Lösung enthielt 10 µg des Plasmids pSM2, ein pUC19-Vektor basiertes Plasmid, welches für das HBV-Genom kodiert (freundlicherweise bereitgestellt von Dr. Hans Will, Heinrich-Pette- Institute, Hamburg, Germany). Nach der Verabreichung von pSM2 durch hydrodynamische Injektion findet eine Transfektion der Hepatozyten statt. Anschließend repliziert die HBV- DNA und HBV-Antigene werden exprimiert und sind im Blut der Tiere nachweisbar (s. Huang & Rückborn et al., 2020).

70 Ergebnisse

3 Ergebnisse

3.1 Der wiederhergestellte virale Mck-2 ORF hat keinen Effekt auf die beschriebenen ΔM27-Phänotypen von MCMV

Das CMV der Maus (MCMV) kodiert das M27-Protein, einen potenten Antagonisten der IFN-Signaltransduktion. Eine Deletion von M27 führt zu einer starken Attenuierung von MCMV. In Abwesenheit von pM27 wird STAT2 nicht degradiert und die MCMV-Infektion wird durch eine intakte IFN-Signalkaskade und der resultierenden Expression antiviraler IFN- stimulierter Gene beeinträchtigt. Früheren Arbeiten zur M27-Deletion fehlt eine gewisse Stringenz, um eine eindeutige Interpretation zuzulassen: Es wurden entweder Mutanten verwendet, die auf einer ungerichteten Insertion eines Transposons beruhten (Abenes et al., 2001) oder mittels des pSM3fr bacterial artificial chromosome (BAC) generiert wurden (Zimmermann & Trilling et al., 2005), von dem kürzlich bekannt wurde, dass es eine relevante Mutation enthält. So tragen sämtliche auf Grundlage des pSM3fr BAC erzeugten MCMVs eine Leserahmenmutation innerhalb des Gens Mck-2, welches für ein Chemokin- Homolog kodiert. Diese Mutation führt zu einer beeinträchtigten MCMV-Replikation in der Speicheldrüse. Die Korrektur dieser Mutation stellt die Replikationsfähigkeit wieder vollstän- dig her (Jordan et al. 2011). Die publizierten Phänotypen des ∆M27-MCMV könnten daher durch potenzielle Nebeneffek- te der Transposon-Insertion oder der ungewollten Doppelmutation beeinflusst worden sein. Aus diesem Grund wurden die ∆M27-Phänotypen mithilfe von MCMV-Mutanten mit repariertem Mck-2 ORF überprüft. Die folgenden Daten sind Teil einer kürzlich veröffentlich- ten Publikation (Le-Trilling et al., 2018). In der vorliegenden Arbeit wurden ausschließlich MCMV-Mutanten mit einem intakten Mck-2-ORF verwendet. Aus Gründen der Lesbarkeit wird im Folgenden darauf verzichtet, diesen Umstand jeweils explizit zu kennzeichnen. Darüber hinaus werden in den Abschnitten 3.2, 3.3 sowie 3.4 MCMV-Mutanten beschrieben, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit generiert bzw. charakterisiert wurden. Die MCMV- Mutanten exprimieren jeweils ein fremdes virales Protein, welches mit einem HA-Peptid markiert ist. Die heterologe Expression wird durch den konstitutiv aktiven zellulären EF1-

71 Ergebnisse

Promotor kontrolliert. Die Insertion der Genkassette fand entweder im M27-Lokus („ΔM27- MCMV“) oder im m157-Lokus („MCMV“) statt.

3.1.1 Die Degradation von STAT2 bleibt in ΔM27-MCMV-infizierten Zellen aus

MCMV inhibiert die IFN-induzierte Immunantwort des Wirts durch die Expression des immunevasiven Proteins pM27, welches den proteasomalen Abbau von mSTAT2 durch die Rekrutierung an den DDB1-Cul4A/B-RING-E3-Ubiquitinligasen vermittelt (Landsberg et al., 2018; Le-Trilling et al., 2016; Trilling et al., 2011). Um zu untersuchen, ob Mck-2-repariertes MCMV denselben Phänotyp aufweist, bzw. ∆M27-MCMV weiterhin keine Degradation von STAT2 vermittelt, wurden primäre Mausneugeborenenzellen (engl. mouse newborn cells, MNCs) entweder mit Medium behandelt (Negativkontrolle) oder mit M27HA-MCMV bzw. ∆M27-MCMV infiziert. Die Lysate der Zellen wurden per Western-Blot analysiert (s. Abb. 5).

Abb. 5: MCMV mit intaktem Mck-2-Gen degradiert STAT2 pM27-abhängig. Primäre MNCs wurden 24 h nach Behandlung mit Zellkulturmedium (uninfiziert) oder Infektion mit MCMV- M27HA bzw. ΔM27-MCMV (MOI 5) lysiert. Die Lysate wurden nach einer Normierung der Proteinmengen in einem Polyacrylamid SDS-Gel der Größe nach aufgetrennt. Die Proteine wurden mittels Western-Blot auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Die Detektion der Proteine erfolgte mit den Primärantikör- pern α-mSTAT2, α-HA, α-pp89 und α-Aktin.

72 Ergebnisse

Das zelluläre STAT2 wurde sowohl in uninfizierten Zellen als auch nach Infektion mit ∆M27- MCMV nachgewiesen. Die Expression des pM27 wurde durch einen HA-Antikörper gezeigt. Die MCMV-Infektion wurde mit einem Antikörper gegen das virale IE1-Protein (pp89; Keil et al., 1987) nachgewiesen. Das Haushaltsprotein β-Aktin wurde als Ladekontrolle detektiert. Der wiederhergestellte Mck-2 ORF besitzt keinen Einfluss auf die beschriebenen ΔM27- Phänotypen: In M27HA-MCMV infizierten Zellen wurde mSTAT2 degradiert, während die Infektion mit ∆M27-MCMV keinen Effekt zeigte.

3.1.2 ΔM27-MCMV zeigt eine stark erhöhte IFNγ-Sensitivität in vitro

Frühere Experimente mit dem aus pSM3fr-BAC generierten MCMVs zeigten, dass der Verlust der Kodierungskapazität von pM27 zu einer erhöhten Sensitivität von MCMV gegenüber IFNα und IFNγ in vitro führt (Zimmermann & Trilling et al., 2005; Trilling et al., 2011). Im folgenden Experiment mit Mck-2rep-MCMV konnte gezeigt werden, dass ∆M27- MCMV im Vergleich zu wt-MCMV eine erhöhte Sensitivität gegenüber IFNγ aufweist. Primäre Mausembryofibroblasten (engl. mouse embryo fibroblasts, MEFs) wurden mit IFNγ inkubiert und anschließend mit wt-MCMV bzw. ΔM27-MCMV infiziert. In Abb. 6 sind die Virustiter dargestellt, die zum Beginn des Experimentes sowie nach 3 Tagen vorlagen und mittels Plaque-Titration ermittelt wurden.

73 Ergebnisse

Abb. 6: ΔM27-MCMV weist eine erhöhte IFNγ-Sensitivität in primären MEFs auf. Primäre MEFs wurden mit wt-MCMV oder ΔM27-MCMV infiziert (MOI 0,1). Es wurden mit IFNγ präinkubierte (48 h, 500 U/ml) Zellen mit unbehandelten Zellen verglichen. Die zur Infektion angesetzten Virussuspensionen (0 d p. i.) und die infizierten Zellen samt Zellkulturüberstand (3 d p. i.) wurden bei - 80°C konserviert. Die Virustiter wurden per Plaque-Titration bestimmt. Die Balken im Diagramm stellen die Mittelwerte der ermittelten Virustiter dar. Die Fehlerbalken kennzeichnen die Standardabweichung. Zur statistischen Auswertung wurde ein ungepaarter T-Test durchgeführt. Die statistische Signifikanz wurde mit ** (p < 0,01) und „n.s.“ für nicht signifikant angegeben.

Die Behandlung der MEFs mit IFNγ hatte keinen signifikanten Effekt auf die Replikation des wt-MCMVs, das einen reparierten Mck-2-ORF kodiert. Bei vergleichbaren Ausgangstitern

(0 d p. i.) erhöhten sich die Virustiter innerhalb von 3 Tagen um 3,5 Log10-Stufen in unbehandelten Zellen bzw. um 3 Log10-Stufen in Anwesenheit von IFNγ. Der antivirale Effekt des IFNγ wirkte sich jedoch negativ auf die Replikation des ΔM27-MCMVs aus. Während der

Virustiter in IFN-unbehandelten MEFs innerhalb von 3 Tagen um 3 Log10-Stufen anstieg, sank in IFNγ-stimulierten MEFs der Titer von um etwa 1,5 Log10-Stufen. Die Titer von ΔM27-MCMV in Ab- und Anwesenheit von IFNγ unterschieden sich signifikant (p < 0,05) voneinander. Das Experiment zeigte, dass die beschriebene IFNγ-Sensitivität des ΔM27- MCMVs durch den wiederhergestellten Mck-2-ORF nicht beeinflusst wurde. Das gleiche Experiment wurde ebenfalls in MNCs (s. Abb. 7, A) und immortalisierten MEFs (CIMs) (s. Abb. 7, B) durchgeführt. Die Behandlung mit IFNγ hatte keinen signifikanten („n. s.“) Einfluss auf die Replikation des MCMV-Wildtyps. In IFN-unbehandelten MNCs stieg der Titer des wt-MCMVs innerhalb von 3 Tagen um 3,5 Log10-Stufen an. In IFNγ-

74 Ergebnisse

vorbehandelten MNCs stieg der Titer um 3 Log10-Stufen. Das ΔM27-MCMV hingegen zeigte eine hohe Empfindlichkeit gegenüber der IFNγ-Behandlung. Während der Titer des ΔM27-

MCMV in unbehandelten Zellen nach 3 d p. i. um 2,5 Log10-Stufen zunahm, sank der

Virustiter in Anwesenheit von IFNγ um 2 Log10-Stufen (s. Abb. 7, A). Der Unterschied von ca. 4 Log10-Stufen war signifikant (p < 0,05).

Abb. 7: ΔM27-MCMV weist im Vergleich zum wt-MCMV eine erhöhte IFNγ-Sensitivität in primären MNCs und immortalen CIMs auf. Primäre MNCs (A) und CIMs (B) wurden mit wt-MCMV oder ΔM27-MCMV infiziert (MOI 0,1). Es wurden mit IFNγ präinkubierte (48 h, 500 U/ml) Zellen mit unbehandelten Zellen verglichen. Die zur Infektion angesetzten Virussuspensionen (0 d p. i.) und die infizierten Zellen samt Zellkulturüberstand (3 d p. i.) wurden bei -80°C konserviert. Die Virustiter wurden via Plaque-Titration bestimmt. Die Balken im Diagramm stellen die Mittelwerte der ermittelten Virustiter dar. Die Fehlerbalken kennzeichnen die Standardabwei- chung. Zur statistischen Auswertung wurde ein ungepaarter T-Test durchgeführt. Die statistische Signifikanz wurde mit * (p<0,05), ** (p<0,01) und *** (p<0,001) angegeben.

In immortalisierten CIMs zeigte IFNγ hingegen eine signifikante antivirale Wirkung gegen das wt-MCMV (p < 0,01; s. Abb. 7, B). Der wt-Titer erhöhte sich in unbehandelten Zellen um

3,5 Log10-Stufen und in Anwesenheit von IFNγ um lediglich 2 Log10-Stufen. Die Replikation des wt-MCMV reduzierte sich durch die Behandlung mit IFNγ um 1,5 Log10-Stufen. Auch in CIMs zeigte das ∆M27-MCMV eine hohe Anfälligkeit gegenüber IFNγ. In unbehandelten Zellen erhöhte sich der Virustiter um 3 Log10-Stufen, während in IFNγ-stimulierten

CIMs der Virustiter um eine Log10-Stufe sank. Die Behandlung mit IFNγ beeinträchtigte das

Wachstum des ∆M27-MCMV um etwa 3,5 Log10-Stufen (p < 0,001; s. Abb. 7, B).

75 Ergebnisse

Zusammengefasst lässt sich sagen, dass der in der Literatur beschriebene Phänotyp von ∆M27-MCMV auch mit repariertem Mck-2-ORF in drei verschiedenen Zelllinien (MEF, MNC und CIM) in vitro beobachtet werden konnte.

3.1.3 ΔM27-MCMV ist in C57BL/6-, BALB/c- und 129-Mäusen attenuiert Mausstämme divergieren hinsichtlich ihrer Empfänglichkeit für eine MCMV-Infektion (Allan et al., 1984; Grundy et al., 1981). Ein Wirtsgen, durch das diese Prädisposition maßgeblich mitbestimmt wird, ist das Gen cmv1 (Scalzo et al., 1990), das für den NK-Zellrezeptor Ly49H kodiert (Daniels et al., 2001; Dokun et al., 2001 und Lee et al., 2001). In Mäusen interagiert das MCMV-kodierte Molekül pm157 mit Ly49H. Dies führt zu einer massiven Aktivierung von Natürlichen Killer (NK)-Zellen (Arase et al., 2002; Smith et al., 2002), welche daraufhin große Mengen an IFNγ freisetzen (Fodil et al., 2014). Da ΔM27-MCMV eine erhöhte Sensitivität gegenüber IFNγ in vitro aufweist (Zimmermann & Trilling et al., 2005; Trilling et al., 2011), wurden im Rahmen dieser Arbeit Ly49H-positive (C57BL/6) und Ly49H-negative (BALB/c) Mausstämme hinsichtlich ihrer Suszeptibilität für die Replikation von ∆M27- MCMV mit repariertem Mck-2-Gen miteinander verglichen (s. Abb. 8). Die Mäuse wurden mit 2x105 PFU von wt-MCMV oder ΔM27-MCMV i. p. infiziert. Nach 3, 7, 14 und 21 Tagen wurden Milz, Leber, Niere, Lunge und Speicheldrüse aus den Mäusen präpariert und die Virustiter der Organe durch Plaque-Titration bestimmt. Es wurde beobachtet, dass die Replikation des wt-MCMV nach 3 Tagen in der Milz, Leber, Niere und Lunge von Ly49H-positiven C57BL/6-Mäusen im Vergleich zu den Organen aus BALB/c-Mäusen stark reduziert ist (s. Abb. 8; vergleiche A, D, G und J mit B, E, H und K).

76 Ergebnisse

Abb. 8: Unabhängig von den Resistenz-bestimmenden Faktoren Ly49H und Ly49I sowie deren Mausstamm-spezifischen Unterschieden ist ΔM27-MCMV in vivo stark attenuiert. Bildlegende s. nächste Seite.

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C57BL/6, BALB/c, und 129 Mäuse wurden i. p. mit 2x105 PFU von wt-MCMV oder ΔM27-MCMV infiziert. Nach 3, 7, 14, und 21 Tagen p. i., wurden die angegebenen Organe präpariert und eingefroren. Anschlie- ßend wurden die Virustiter aus den hergestellten Homogenaten der Organe durch Plaque-Titration bestimmt. Die Titrationen erfolgten in Vierfachbestimmungen. Die Balken in den Diagrammen stellen das geometrische Mittel und die Punkte die einzelnen Messwerte der individuellen Mäuse (n = 3-5) dar. DL = Detektionslimit. (A) Virustiter in der Milz von C57BL/6-Mäusen. (B) Virustiter in der Milz von BALB/c- Mäusen. (C) Virustiter in der Milz von 129-Mäusen. (D) Virustiter in der Leber von C57BL/6-Mäusen. (E) Virustiter in der Leber von BALB/c-Mäusen. (F) Virustiter in der Leber von 129-Mäusen. (G) Virustiter in der Niere von C57BL/6-Mäusen. (H) Virustiter in der Niere von BALB/c-Mäusen. (I) Virustiter in der Niere von 129-Mäusen. (J) Virustiter in der Lunge von C57BL/6-Mäusen. (K) Virustiter in der Lunge von BALB/c- Mäusen. (L) Virustiter in der Lunge von 129-Mäusen. (M) Virustiter in der Speicheldrüse von C57BL/6- Mäusen. (N) Virustiter in der Speicheldrüse von BALB/c-Mäusen. (O) Virustiter in der Speicheldrüse von 129-Mäusen. Die Organentnahmen und die Organ-Titrationen wurden zusammen mit K. Wohlgemuth, B. Katschinski, L. Timmer, Dr. CD. Landsberg, F. Maaßen sowie Dr. VTK Le-Trilling und Prof. Dr. M. Trilling durchgeführt. Die Daten wurden publiziert (Le-Trilling et al., 2018).

Zu späteren Zeitpunkten konnten höhere Titer des wt-MCMV jedoch nicht nur in BALB/c- Mäusen, sondern auch in der Leber und der Speicheldrüse von C57BL/6-Mäusen ermittelt werden (s. Abb. 8; D und M). In der Leber erreichte der Titer einen Höhepunkt nach 14 Tagen mit etwa 1x104 PFU/g Organ (s. Abb. 8; D) und in der Speicheldrüse nach 21 Tagen mit 1x105 PFU/g (s. Abb. 8; M). Neben Ly49H interagiert pm157 auch mit dem inhibitorischen NK-Zellrezeptor Ly49I, der von Mäusen des Ly49H-negaitven 129-Stamms exprimiert wird (Arase et al., 2002). Zur Überprüfung einer potentiellen Relevanz des Ly49I-Rezeptors für die pM27-Wirkung wurden zusätzlich auch 129-Mäuse sowohl mit wt- als auch mit ∆M27-MCMV infiziert und die Organtiter zu den genannten Zeitpunkten bestimmt (s. Abb. 8; C, F, L, I und O). Für ∆M27-MCMV konnte in der frühen Replikationsphase (3 d p. i.) in allen drei Mausstäm- men niedrige Titer sowohl in der Milz als auch in der Leber bestimmt werden, die oberhalb des Detektionslimits lagen. In C57BL/6 erreichte die Mutante in der Milz 1,9x103 PFU/g und in der Leber 3x102 PFU/g. In BALB/c-Mäusen wurden in der Milz 1,4x103 PFU/g und in der Leber 6,7x103 PFU/g ermittelt. In Mäusen des 129-Stamms erreichte die Mutante in der Milz 1,2x103 PFU/g und in der Leber 6,7x103 PFU/g. In den Speicheldrüsen aller Mäuse lag der ∆M27-MCMV-Titer zu jedem Zeitpunkt unter der Nachweisgrenze (s. Abb. 8; M, N und O). Zusammengenommen zeigten diese Experimente, dass ∆M27-MCMV in allen drei Mausstämmen unabhängig von den beiden NK-Zell-Liganden Ly49H und Ly49I ein stark attenuiertes Wachstum in vivo aufweist.

78 Ergebnisse

3.2 Herstellung von MCMV-Mutanten zur Durchführung von Transkomplementationsanalysen durch die heterologe Ex- pression von pM27-artigen Proteinen

In der vorliegenden Arbeit sollte überprüft werden, ob pM27-artige Funktionen in anderen viralen Proteinen vorkommen. Da der Verlust von pM27 mehrere starke Phänotypen erzeugt, sollte überprüft werden, ob andere Proteine diese Effekte zumindest teilweise aufheben können. Diese gegenseitige Ersetzbarkeit wäre ein sehr starkes Indiz für überlappende biologische Funktionen. Zwei Klassen von Proteinen wurden diesbezüglich untersucht: (I) Zum damaligen Zeitpunkt uncharakterisierte Proteine aus anderen Cytomegaloviren, die Sequenzhomologien zu pM27 aufweisen und (II) Proteine, die wie pM27, bekanntlich mit DDB1 interagieren. Der Austausch erfolgte über BAC-Mutagenese. Dabei fand die genetische Manipulation des Virusgenoms in Bakterien statt, die ein BAC tragen, welches das gesamte MCMV-Genom (230 kb) beinhaltet. Bei dieser Klonierungsstrategie wurde zunächst ein Insertionsplasmid generiert, in welches die Sequenz des jeweiligen Zielgens kloniert wurde, das für ein potentiell pM27-ähnliches Protein kodiert. Über homologe Rekombination zwischen dem Insertionsplasmid (pFRT-Z-hEF1) und dem BAC wurden die Kodierungsse- quenzen (engl. coding sequence, CDS) der pM27-ähnlichen Proteine unter der Regulation des EF1-Promotors in den M27-Lokus des MCMV-Genoms eingebracht. Nach der Verifizierung wurden die MCMV-Mutanten durch Transfektion der BAC-DNA in permissiven Zellen rekonstituiert und validiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die MCMV-Mutanten ∆M27- UL27HA, ∆M27-R27HA, ∆M27-WHxHA und ∆M27-sHBsAgHA sowie die pM27-positiven Mutanten MCMV-UL27HA und MCMV-sHBsAgHA hergestellt. Im Folgenden wird diese Mutagenese ausführlich exemplarisch anhand der Mutante ∆M27-UL27HA beschrieben.

3.2.1 Klonierung der Insertionsplasmide

Zur Insertion der pM27-ähnlichen Gene in das MCMV-Genom mussten die jeweiligen CDS zunächst in das Insertionsplasmid pFRTZ-hEF1 kloniert werden. Nach der Amplifikation wurden die einzubringenden DNA-Sequenzen und die Zielvektoren mithilfe von Enzymen geschnitten und miteinander ligiert. Das Ligationsprodukt (s. Abb. 9, A) wurde im Anschluss

79 Ergebnisse

anhand von Restriktionsfragmentmustern (s. Abb. 9, B) sowie durch DNA-Sequenzierung verifiziert.

Abb. 9: Klonierung der Insertionsplasmide. (A) Schematische Darstellung des Insertionsplasmids pFRTZ-EF1-UL27HA mit den Flippase- Erkennungssequenzen (FRT1 bzw. FRT2, dargestellt als graue Boxen), dem Ampicillin-Resistenzgen (AmpR), dem Zeomycin-Resistenzgen (ZeoR), und den Restriktionsschnittstellen der Endonukleasen BamHI, und XbaI. (B) Agarose-Gelelektrophorese der Restriktionsfragmente (Spaltung mit NheI und XbaI) von Plasmiden (Minipräparationen) der Klone (1-4) von pFRT-Z-hEF1-UL27HA. Der DNA- Größenstandard wurde mit „S“ gekennzeichnet. Mittels Restriktionsanalyse korrekt getestete Klone wurden per DNA-Sequenzierung verifiziert (nicht gezeigt).

3.2.2 Insertion des Zielgens in das MCMV-Genom Nach der Klonierung des Zielgens in das Insertionsplasmid wurde die eigentliche BAC- Mutagenese in E. coli DH10B durchgeführt. Dazu wurde zunächst das Insertionsplasmid (s. Abb. 10, A) mit XbaI geschnitten. Nach der Restriktion wurde der Teil der DNA verworfen, der für das Ampicillin-Resistenzgen kodiert (s. Abb. 10, B). Nach der Religation des DNA- Fragments lag nur noch eine einzige FRT-Sequenz im Insertionsplasmid vor (s. Abb. 10, C). Für die eigentliche BAC-Mutagenese wurden E. coli DH10B verwendet. Diese trugen sowohl ein Plasmid, welches für das Rekombinase-Enzym Flippase kodiert, als auch ein ∆M27- MCMV-BAC. In dem Lokus des deletierten M27-Gens befand sich ebenfalls eine FRT- Sequenz (s. Abb. 10, D). Nach der Transformation der E. coli DH10B mit dem modifizierten

80 Ergebnisse

Insertionsplasmid fand eine Flippase-vermittelte homologe Rekombination zwischen der FRT-Sequenz des Plasmids und der im MCMV-Genom lokalisierten FRT-Sequenz statt (s. Abb. 10, C bzw. D). Nach der homologen Rekombination befand sich die Genkassette EF1- UL27HA-ZeoR im Erfolgsfall im MCMV-BAC (s. Abb. 10, E).

Abb. 10: Schema der Insertion des Zielgens in das MCMV-Genom via BAC-Mutagenese. Exemplarisch am Beispiel der Mutante ΔM27-UL27HA gezeigt. (A) Das Insertionsplasmid pFRTZ-hEF1- UL27HA mit AmpR: Ampicillin-Resistenzgen; FRT: Flippase-Erkennungssequenz (engl. flippase recognition target); EF1: Elongation factor-1; UL27HA: Zielgen; ZeoR: Zeomycin-Resistenzgen; XbaI: Restriktionsschnittstelle. (B) DNA-Fragment nach XbaI-Verdau ohne AmpR. (C) Das Religationsprodukt des Insertionsplasmids weist nur eine FRT-Sequenz auf. (D) Das ΔM27-MCMV-BAC trägt an der Position des ehemaligen M27-Lokus ebenfalls eine FRT-Sequenz und kodiert für eine Chloramphenicol- Resistenz (CamR). (E) Nach der Flippase-katalysierten Rekombination zwischen den FRT-Stellen des Insertionsplasmids und dem ΔM27-MCMV-BAC befindet sich die Genkassette EF1-UL27HA im MCMV- Genom.

81 Ergebnisse

Die resultierenden BAC-Klone wurden via Southern-Blot-Analyse untersucht. Der Nachweis der erfolgreichen Insertion erfolgte über eine Zeomycin-Sonde (s. Abb. 11, A). Ein Reblot mit einer M87-spezifischen Sonde diente als Ladekontrolle zum Nachweis der BAC-DNA (s. Abb. 11, B). Die Signalstärken, die die beiden Sonden zeigten, korrelierten miteinander. Die ZeoR-positiv getesteten BAC-Klone wurden für die Rekonstitution, dem nächsten Schritt bei der Herstellung der MCMV-Mutanten, verwendet.

Abb. 11: Nachweis der Insertion der Genkassette ins MCMV-BAC-Konstrukt via Southern Blot. (A) Der Nachweis der Insertion der Genkassette EF1-UL27HA-ZeoR erfolgte über die Hybridisierung einer DIG-markierten Zeomycin-Sonde. (B) Detektion des MCMV-kodierten Gens M87 (Ladekontrolle). Ein ΔM27-BAC („-“) diente als Negativkontrolle, ein ΔM27-EGFP-BAC („+“) als Positivkontrolle. Eine 1:1- Mischung aus beiden genannten Kontrollen („±“) wurde ebenfalls aufgetragen. M: DNA-Kontrolle. Die Pfeile markieren DNA-Fragmente, die mithilfe der jeweiligen Sonde detektiert werden konnten. Die DNA der Klone #1-13 des ΔM27-UL27HA-BAC wurden mit HindIII verdaut. Die DNA-Fragmente wurden in einem Agarosegel (0,5% [w/v]) der Größe nach aufgetrennt. Die DNA wurde über Nacht auf eine positivgeladene Nylonmembran transferiert.

3.2.3 Rekonstitution der genetisch veränderten MCMVs und Nachweis der Expression des HA-markierten Zielgens

Nach der Verifizierung der korrekt klonierten MCMV-BAC-Konstrukte (s. Abschnitt 3.2.2) wurden die MCMV-Mutanten rekonstituiert und die erfolgreiche Herstellung der MCMV- Mutanten durch die Expression der fremden Virusproteine dokumentiert. Dazu wurden primäre MNCs mit ΔM27-MCMV, ΔM27-EGFP, ΔM27-M27HA, ΔM27-UL27HA, ΔM27-

82 Ergebnisse

R27HA, ΔM27-HBxHA oder ΔM27-WHxHA infiziert. Die Proteine pM27 (79 kDa), pUL27 (70 kDa), pR27 (76 kDa) sowie HBx (17 kDa) und WHx (15 kDa) wurden mithilfe eines Western-Blots mittels eines Antikörpers gegen ein HA-Epitop-Tag nachgewiesen (s. Abb. 12). Die drei cytomegaloviralen Proteine pM27, pUL27 und pR27 (s. Abb. 12, A) sowie die hepadnaviralen Proteine HBx und WHx (s. Abb. 12, B) konnten in den Lysaten infizierter Zellen nachgewiesen werden.

Abb. 12: Nachweis der Expression viral kodierter Proteine der neuen ΔM27-MCMV-Mutanten. Primäre MNCs wurden mit Zellkulturmedium (uninfiziert), ΔM27-MCMV, ΔM27-EGFP, ΔM27-M27HA, ΔM27-UL27HA, ΔM27-R27HA, ΔM27-HBxHA oder ΔM27-WHxHA infiziert (MOI 5). Die Zellen wurden nach 24 h lysiert. Die HA-markierten Proteine pM27 (79 kDa, aus MCMV), pUL27 (70 kDa, aus HCMV), pR27 (76 kDa, Ratten-CMV, Maastricht-Isolat) sowie HBx (17 kDa, HBV) und WHx (15 kDa, Murmeltier- Hepatitisvirus) wurden per Western-Blot mithilfe eines anti-HA-Antikörpers nachgewiesen. Gezeigt sind eine (A) kürzere sowie eine (B) längere Exposition.

3.3 Transkomplementationsanalyse pM27-ähnlicher Proteine

Der MCMV-kodierte Interferonantagonist pM27 interagiert mit DDB1, einer Komponente verschiedener Cullin-RING-Ligase (CRL)-Komplexe, und vermittelt die Ubiquitinierung von mSTAT2, die letztendlich zur proteasomalen Degradation von mSTAT2 führt (Landsberg et al., 2018; Le-Trilling et al., 2016; Trilling et al., 2011). In ∆M27-MCMV-infizierten Zellen

83 Ergebnisse

wird kein mSTAT2 degradiert (Le-Trilling et al., 2018; Zimmermann & Trilling et al., 2005; Trilling et al., 2011). Dies führt zu einer erhöhten IFN-Empfindlichkeit von MCMV in vitro und einer Attenuierung in vivo (Le-Trilling et al. 2018; Trilling et al., 2011; Zimmermann & Trilling et al., 2005; Abenes et al., 2001). Im Laufe der Evolution haben Viren zahlreiche immunevasive Mechanismen entwickelt. Viele Viren nutzen DDB1 und/oder CRLs als modulare Plattformen zum proteasomalen Abbau von wirtskodierten Restriktionsfaktoren (Le-Trilling et al., 2020; Becker et al., 2019; Landsberg et al., 2018). Im Folgenden werden Experimente mit MCMV-Mutanten geschildert, bei denen M27 durch die CDS eines pM27- ähnlichen Proteins ausgetauscht wurde. Dabei handelte es sich entweder um pM27-homologe Proteine aus β-Herpesviren, die eine Sequenzhomologie zu pM27 aufweisen oder um pM27- analoge, hepadnavirale Proteine, die bekanntlich mit DDB1 interagieren. Mithilfe der heterologen Expression durch ∆M27-MCMV wurde untersucht, ob die pM27-ähnlichen Proteine die pM27-Funktionen (teilweise) komplementieren und die beschriebenen ∆M27- spezifischen Phänotypen abschwächen oder sogar aufheben können.

3.3.1 Charakterisierung von ΔM27-M27HA und ΔM27-EGFP

In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob eine fehlende pM27-Funktion in MCMV durch ähnliche Proteine bzw. durch Proteine mit ähnlicher Funktion ersetzt werden kann. Dabei wurde die Genexpression nicht durch endogene Promotoren reguliert, sondern durch den konstitutiv aktiven EF1-Promotor. Um die grundsätzliche Machbarkeit des Ansatzes zu testen, wurde das Gen M27 als Positivkontrolle reinseriert. Zudem wurde zusätzlich eine Negativkontrollmutante in die Studie einbezogen, die im Gegensatz zu allen anderen Mutan- ten nicht für ein zusätzliches virales Protein, sondern für das grün fluoreszierende Protein (GFP, engl. green fluorescent protein) kodiert. Bei EGFP handelt es sich um eine im Sinne der molekularbiologischen Anwendung verbesserte (engl. enhanced) Version. Durch EGFP ist offensichtlich keine Komplementation der pM27-Funktionen zu erwarten. Mögliche Effekte der Insertion der Genkassette „EF1-EGFP“ wurden untersucht, um auszuschließen, dass durch die vorgenommene Transgeninsertion replikative Nachteile entstehen (z. B. durch die veränderte Genomgröße, das Vorhandensein des fremden Promotors oder die starke Expression eines Fremdgens).

84 Ergebnisse

3.3.1.1 ΔM27-M27HA baut STAT2 ab und inhibiert die Aktivität des ISRE-Promotors Von den beiden MCMV-Mutanten ∆M27-M27HA und M27HA-MCMV wird das M27- Protein mit einem HA-Tag exprimiert. Auf genomischer Ebene unterscheiden sich die beiden MCMVs jedoch bezüglich der Regulation der Expression von M27HA, die in der Revertante durch den konstitutiv aktiven zellulären Promotor EF1 induziert wird und in M27HA-MCMV durch den intrinsischen MCMV-Promotor. Da pM27 den IFN-Signalweg durch den Abbau von mSTAT2 inhibiert, wurden zunächst die STAT2-Proteinmengen und die Expressionsstär- ke von pM27 nach Infektion mit ∆M27-M27HA bzw. M27HA-MCMV per Western-Blot miteinander verglichen (s. Abb. 13). In Gegenwart von M27HA-MCMV und ∆M27-M27HA wurde mSTAT2 vollständig degradiert, während sich weder das ΔM27-MCMV noch das ΔM27-EGFP negativ auf die STAT2-Proteinmenge auswirkten (s. Abb. 13). Die Expression des pM27HA war beim ΔM27-M27HA stärker ausgeprägt als beim M27HA-MCMV.

Abb. 13: Die Reinsertion des Gens M27HA stellte den STAT2-Abbau wieder her. Primäre MNCs wurden mit M27HA-MCMV, ΔM27-MCMV, ΔM27-M27HA bzw. ΔM27-EGFP infiziert (MOI 5) oder mit Medium behandelt. Nach 48 h wurden die Zellen lysiert und die angegebenen Proteine sukzessive per Western-Blot nachgewiesen. Es wurden normalisierte Lysate verwendet.

85 Ergebnisse

In einem weiteren Experiment wurde untersucht, ob die STAT2-Degradation durch das ΔM27-M27HA ausreicht, um die STAT2-abhängige IFNλ-Signaltransduktion und damit die Aktivität des interferon-stimulated response element (ISRE)-Promotors zu unterdrücken. Dazu wurden transfizierte Zellklone (NIH3T3-ISRELuc-IFNλR) verwendet, die ein mIFNλR- Expressionsplasmid und einen pISRE-Luc-Reporter in sich tragen. Der mIFNλR-Rezeptor vermittelt die IFNλ-Responsivität, die Fibroblasten sonst nicht haben. Mithilfe des Reporter- Plasmids kann die IFN-Signaltransduktion über Luziferase-Assays quantifiziert werden (Le- Trilling et al., 2018). Die Zellen wurden mit M27HA-MCMV, ΔM27-MCMV, ΔM27- M27HA bzw. ΔM27-EGFP infiziert und anschließend mit IFNλ stimuliert, um den Typ-III- IFN-Signalweg zu aktivieren und die Aktivität des ISRE-Promotors und somit die Expression des Enzyms Luziferase zu induzieren. Die Lichtemission, die nach Substratzugabe durch die Luziferase-Aktivität verursacht wurde, gibt indirekt Aufschluss über die Enzymaktivität der Luziferase. Die Enzymaktivität steht wiederum in direkter Relation zur Luziferase- Expression, welche in den Zellen über den IFNλ-responsiven ISRE-Promotor reguliert wird. Die Luziferaseaktivität ist also ein Surrogat-Marker für die Effektivität der IFN-induzierten ISRE-Promotoraktivität. Die Daten sind in Abb. 14 graphisch dargestellt (s. Abb. 14, A+B). Nach Infektion mit M27HA-MCMV und ΔM27-M27HA wurden geringere (p < 0,001) Luziferase-Aktivitäten gemessen als nach Infektion mit ΔM27-MCMV oder ΔM27-EGFP (s. Abb. 14, A). Dies wurde sowohl in unstimulierten (weiße Balken) als auch in mit IFNλ- stimulierten Zellen (graue Balken) beobachtet. Die induzierte Luziferase-Aktivität war beim M27HA-MCMV (Faktor 3,2) höher als beim ΔM27-M27HA (Faktor 2,3). Somit inhibierte das ΔM27-M27HA die Aktivität des ISRE-Promotors stärker als M27HA-MCMV. Die beiden Kontrollen ΔM27-MCMV und ΔM27-EGFP unterschieden sich in den absoluten Werten der Luziferase-Aktivitäten signifikant (p < 0,001) voneinander, während die x-fach induzierte Luziferase-Aktivität der beiden MCMV-Mutanten nahezu identisch (Faktor 5,6 bzw. 5,4) war (s. Abb. 14, B).

86 Ergebnisse

Abb. 14: Effektive Inhibition der STAT2-abhängigen ISRE-Promotoraktivität durch ΔM27-M27HA. NIH3T3-ISRELuc-IFNλR-Zellen wurden mit verschiedenen MCMVs (M27HA-MCMV, ΔM27-MCMV, ΔM27- M27HA bzw. ΔM27-EGFP) infiziert (MOI 5). Nach 24 h wurden die Zellen mit mIFNλ2 (20 ng/ml) für 6 h stimuliert und Lysate hergestellt, um die Luziferase-Aktivität zu bestimmen. In (A) geben die Balken den Mittelwert der drei einzeln gemessenen Luziferase-Aktivitäten an. Die weißen Balken zeigen die Luziferase-Aktivität in unbehandelten, die grauen Balken in mit IFNλ-stimulierten Zellen. In einem einseitigen ANOVA-Test wurden signifikante Unterschiede ([***]: p<0,001) zwischen den Messwerten berechnet. In (B) ist die induzierte Luziferase-Aktivität gezeigt (Quotient aus Wert nach IFN-Stimulation und dem Wert aus unbehandelten Zellen).

Das Experiment zeigt, dass die Reinsertion von M27HA (kontrolliert von einem EF1- Promotor) die STAT2-abhängige IFNλ-Inhibition durch MCMV in den Wirtszellen wieder- herstellt.

87 Ergebnisse

3.3.1.2 Die Reinsertion von M27HA verminderte die IFNγ-Sensitivität

In vorherigen Experimenten wurde gezeigt, dass die Reinsertion von M27HA (unter der Kontrolle des EF1-Promotors) in ΔM27-MCMV sowohl zur Wiederherstellung der STAT2- Degradation und als auch zur Unterdrückung der STAT2-inhibierten IFN-Signaltransduktion führt. Im Folgenden wurde überprüft, ob sich die Insertion der EF1-M27HA-Genkassette auch auf das Replikationsverhalten des ΔM27-MCMV auswirkt. Es wurde ermittelt, welche Virustiter im Vergleich zum M27HA-MCMV, ∆M27-MCMV bzw. ΔM27-EGFP durch das ΔM27-M27HA in vitro erreicht werden. Dazu wurden primäre MNCs mit IFNγ inkubiert und anschließend mit MCMV-M27HA, ∆M27-M27HA, ∆M27-MCMV bzw. ∆M27-EGFP infiziert. Die Virustiter wurden durch Titration der Suspension aus Zellkulturüberstände und Zellen mittels Plaque-Titration ermittelt (s. Abb. 15, A und B). Die Anfangstiter der Viren waren vergleichbar, der Input lag zwischen 4,7-10,7x103 PFU/ml. In unbehandelten Zellen wichen die Titer von MCMV-M27HA und der ∆M27-M27HA-Mutante im Verlauf ihrer jeweiligen Replikation nicht signifikant voneinander ab (s. Abb. 15, A und C).

88 Ergebnisse

Abb. 15: Die Reinsertion von M27HA führte zu einer gesteigerten Resistenz gegenüber IFNγ. (A) Unbehandelte oder (B) IFNγ-präinkubierte (48 h, 100 U/ml) primäre MNCs wurden mit verschiedenen MCMV-Mutanten (M27HA-MCMV, ΔM27-M27HA, ΔM27-MCMV bzw. ΔM27-EGFP) infiziert (MOI 0,01). Nach 1, 2 bzw. 3 Tagen wurden die Zellen mitsamt Zellkulturüberstand bei -80°C eingefroren und zu einem späteren Zeitpunkt die Virustiter durch Plaque-Titration ermittelt. (C) Die Signifikanz der Differenzen zwischen den Virustitern wurde mit einem ungepaarten T-Test analysiert („n. s.“: nicht signifikant; [*]: p<0,05 [**]: p<0,01 [***]: p<0,001).

Die Titer beider Mutanten wiesen nach 3 Tagen ein Wachstum von etwa 3,5 Log10-Stufen auf. In unbehandelten Zellen replizierten ∆M27-MCMV und ∆M27-EGFP um mindestens eine

Log10-Stufe schlechter als die beiden M27-positiven MCMVs. Die Titer von ∆M27-MCMV

89 Ergebnisse

bzw. ∆M27-EGFP unterschieden sich bei 3 d p. i. zur ∆M27-M27HA-Mutante höchstsignifi- kant (T-Test: p<0,001). In Abwesenheit von IFNγ hob die Reinsertion von M27HA den Phänotyp von ∆M27-MCMV also vollständig auf. Die Behandlung mit IFNγ zeigte eine antivirale Wirkung gegenüber allen MCMVs. Der Titer von MCMV-M27HA stieg bis 3 d p. i. um ca. 3 Log10-Stufen, während der Titer der ∆M27-M27HA-Mutante um etwa 2 Log10- Stufen zunahm (T-Test: p < 0,001). Der antivirale Effekt von IFNγ war somit beim ∆M27-

M27HA um 1 Log10-Stufe größer. Die pM27-defizienten MCMV-Mutanten zeigten im Vergleich zur Revertante eine größere IFNγ-Sensitivität (T-Test: p<0,01 [3 d p. i.]). Der

∆M27-MCMV-Titer wurde durch die IFNγ-Behandlung um 3 Log10-Stufen und der Titer des

Kontrollvirus ∆M27-EGFP um 2 Log10-Stufen vermindert (s. Abb. 15, B). Das Experiment zur Überprüfung der IFNγ-Sensitivität zeigt, dass das ∆M27-M27HA einerseits zwar eine signifikant höhere IFN-Empfindlichkeit als M27HA-MCMV aufweist, andererseits jedoch eine signifikant höhere IFN-Resistenz verglichen zu den beiden Kontrollen ∆M27-MCMV und ∆M27-EGFP vorliegt. Somit konnte gezeigt werden, dass sich das ∆M27-M27HA als Positivkontrolle bewährt hat. Die MCMV-Mutante ∆M27-M27HA vermittelte den Abbau von mSTAT2 (s. 3.3.1.1., Abb. 13). Es konnte mithilfe eines Luziferase-Assays in IFNλ-responsiven Zellen festgestellt werden, dass das ∆M27-M27HA ebenfalls in der Lage ist, die ISRE-Promotor-Aktivität zu inhibieren (s. 3.3.1.1, Abb. 14). Im Hinblick auf die Replikation in vitro zeigte sich im Vergleich zum M27HA-MCMV kein Wachstumsdefizit. Gegenüber dem IFNγ erwies sich das ∆M27-M27HA als wesentlich resistenter als die beiden MCMV-Mutanten ∆M27-MCMV und ∆M27-EGFP (s. Abschnitt 3.3.1.2, Abb. 15).

3.3.2 Untersuchung der biologischen Eigenschaften der herpesviralen pM27- Homologa pUL27 und pR27

Bei der Untersuchung der Interaktion zwischen DDB1 und pM27 aus MCMV wurden anhand von Punktmutationsstudien in der Aminosäuresequenz von pM27 Motive entdeckt, die für die Interaktion zwischen pM27 und DDB1 essenziell sind (Trilling et al., 2011). Diese Amino- säuren sind auch in pM27-ähnlichen Proteinen anderer Cytomegaloviren wie HCMV und

90 Ergebnisse

Ratten-CMV (RCMV) konserviert (s. Abb. 16). In der vorliegenden Arbeit wurden ΔM27- MCMV-Mutanten generiert, welche die CDS der pM27-Homologa pUL27 aus HCMV und des pR27 aus Ratten-CMV (RCMV) unter der Kontrolle des EF1-Promotors exprimieren. In den folgenden Abschnitten werden die Experimente zur transkomplementativen Analyse dieser Proteine beschrieben.

Abb. 16: Die Sequenzmotive, die in pM27 für die Bindung von DDB1 essenziell sind, sind auch in pM27-verwandten Proteinen aus Ratten- und humanem CMV konserviert. Vergleich der Aminosäuresequenzen (303-333 und 358-375 [pM27]) der pM27-homologen Proteine pE27 und pR27 aus den Ratten-CMV-Stämmen England (Murines Herpesvirus-8, MuHV-8) sowie Maastricht (Murines Herpesvirus-2, MuHV-2) und dem HCMV-kodierten pUL27. In HCMV sind das letzte C und das L nicht konserviert (Trilling et al., 2011).

3.3.2.1 Charakterisierung von ΔM27-UL27HA

Das Protein pUL27 stammt aus dem humanen Cytomegalovirus, einem Mitglied der β- Herpesvirusfamilie. HCMV ist wie MCMV ebenfalls in der Lage STAT2 zu degradieren. Die HCMV-induzierte STAT2-Degradation erfolgt jedoch selbst dann, wenn das UL27 deletiert wurde (Le et al., 2008). Daraus kann geschlussfolgert werden, dass pUL27 in Zellkultur nicht für den STAT2-Abbau essentiell ist. Eine Redundanz der Proteinfunktion in Bezug auf den STAT2-Abbau konnte mithilfe eines rekombinanten Vakzinia-Virus (VV), das pUL27 exprimiert, ausgeschlossen werden (Le et al., 2008). Zudem findet keine Interaktion zwischen dem VV-exprimierten pUL27 und DDB1 statt (Trilling et al., 2011). Allerdings wäre es möglich, dass pUL27 die IFN-Signaltransduktion STAT2-unabhängig beeinflusst. ΔM27- MCMV ist in vivo stark attenuiert. Jedoch zeigten Experimente in STAT2-defizienten Mäusen, dass die Replikationsfähigkeit in Abwesenheit von STAT2 nicht vollständig wiederhergestellt ist (Le-Trilling et al., 2018). Es ist derzeit nicht klar, ob pM27 neben der Degradation von STAT2 additive Effekte auf STAT2-unabhängige Wirtsrestriktionsfaktoren besitzt. Daher wurde mithilfe der ΔM27-UL27-Mutante in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob der pM27-Funktionsverlust durch die Expression von pUL27 vermindert werden kann.

91 Ergebnisse

3.3.2.1.1 Die Expression von pUL27 beeinflusste weder die STAT2-Degradation noch die ISRE-Promotoraktivität

Um eine Funktion von pUL27 in Bezug auf den Abbau von murinem STAT2 zu untersuchen, wurden primäre MNCs mit M27HA-MCMV, ΔM27-MCMV, ΔM27-UL27HA und ΔM27- EGFP infiziert oder mit Medium behandelt. Die Zelllysate wurden anschließend mittels Western-Blots auf das Vorhandensein von mSTAT2-Protein in den infizierten Zellen analysiert (s. Abb. 17).

Abb. 17: ΔM27-UL27HA baut murines STAT2 nicht ab. Primäre MNCs wurden mit M27HA-MCMV, ΔM27-MCMV, ΔM27-UL27HA bzw. ΔM27-EGFP infiziert (MOI 5) oder mit Medium behandelt (uninfiziert). Nach 24 h wurden die Zellen lysiert und die angegebenen Proteine sukzessive via Western-Blot nachgewiesen. Es wurden normalisierte Lysate verwendet.

Nach Infektion mit ΔM27-UL27HA wurde mSTAT2 nicht abgebaut. Die Intensität der Proteinbande war mit dem der ∆M27-MCMV- bzw. ∆M27-EGFP-infizierten Zellen vergleichbar. Mittels eines α-HA-Antikörpers wurde die Expression von pM27HA (M27HA- MCMV) und pUL27HA (ΔM27-UL27HA) nachgewiesen. Die Detektion der Banden des IE1/pp89-Proteins zeigte eine im Vergleich zu den anderen MCMVs stärkere Proteinexpres- sion für ΔM27-UL27HA. Hingegen war für das M27HA-MCMV nur eine schwache pp89-

92 Ergebnisse

Bande zu erkennen. Die Normalisierung der Proteinmengen in den Lysaten ist anhand der Detektion des Haushaltgens β-Aktin nachzuvollziehen (s. Abb. 17). Mithilfe eines Luziferase-Assays wurde untersucht, ob ΔM27-UL27HA die Aktivität des ISRE-Promotors schwächen kann. Die in Abb. 18 (A und B) gezeigten Daten der Kontrollvi- ren stimmen mit denen in Abb. 14 überein, da es sich um dasselbe Experiment handelt. Es wurden im Folgenden die Daten für die hier betrachtete Mutante hinzugefügt.

Abb. 18: ΔM27-UL27HA hat keinen Einfluss auf die Aktivität des ISRE-Promotors. NIH3T3-ISRELuc-IFNλR-Zellen wurden mit M27HA-MCMV, ΔM27-MCMV, ΔM27-M27HA, ΔM27- UL27HA bzw. ΔM27-EGFP infiziert (MOI 5). Nach 24 h wurden die Zellen mit mIFNλ2 (20 ng/ml) für 6 h stimuliert und Lysate zur Quantifizierung der Luziferase-Aktivität hergestellt. In (A) geben die Balken den Mittelwert der drei einzeln gemessenen Luziferase-Aktivitäten an. Die weißen Balken zeigen die Luziferase-Aktivität in unbehandelten, die grauen Balken in mit IFNλ-stimulierten Zellen. Mit einem T- Test wurden signifikante Unterschiede ([***]: p < 0,001) zwischen den Messwerten berechnet. In (B) ist die induzierte Luziferase-Aktivität gezeigt (Quotient aus Wert nach IFN-Stimulation und dem Wert aus unbehandelten Zellen).

In Gegenwart von ΔM27-UL27HA wurde eine höchst signifikant höhere (p < 0,001) Luzi- ferase-Aktivität gemessen als mit M27HA-MCMV bzw. ΔM27-M27HA (s. Abb. 18, A). ΔM27-UL27HA konnte die Aktivität des ISRE-Promotors und die damit verbundene Induktion der Luziferase-Expression nicht inhibieren. Die Messwerte wiesen zwar eine breite Streuung auf, jedoch lagen die Mittelwerte der Kontrollen ΔM27-MCMV und ΔM27-EGFP innerhalb der ermittelten Standardabweichung von ΔM27-UL27HA (s. Abb. 18, A). Die Vergleichbarkeit von ΔM27-UL27HA und ΔM27-MCMV bzw. ΔM27-EGFP spiegelte sich

93 Ergebnisse

auch in der induzierten Luziferase-Aktivität wider (s. Abb. 18, B). Zusammengefasst lässt sich sagen, dass das HCMV-Homolog pUL27 im Kontext des ∆M27-MCMV den Verlust des MCMV-kodierten Proteins M27 nicht kompensieren kann.

3.3.2.1.2. ΔM27-UL27HA repliziert schwächer als die Revertante in vitro

Die EF1-Promotor-regulierte Expression des HCMV-kodierten pUL27 durch ΔM27-MCMV vermittelte weder die Degradation von STAT2 noch beeinträchtigte sie die IFN- Induzierbarkeit des ISRE-Promotors (s. 3.3.2.1.1). In Wachstumsexperimenten wurde nun untersucht, ob die Expression von pUL27 die IFNγ-Empfindlichkeit von ∆M27-MCMV mindern kann. Dazu wurden primäre MNCs mit ∆M27-UL27HA und parallel mit M27HA- MCMV, ∆M27-M27HA, ∆M27-MCMV bzw. ∆M27-EGFP infiziert. Die Virustiter wurden durch Titration der Suspension aus Zellkulturüberstände und Zellen mittels Plaque-Titration ermittelt (s. Abb. 19, A und B). Die für M27HA-MCMV, ∆M27-M27HA, ∆M27 bzw. ∆M27- EGFP dargestellten Wachstumskurven stimmen mit den Daten aus Abb. 15 überein, da sie aus demselben Experiment stammen. Im Diagramm aus Abb. 15 wurden die Titer für ∆M27- UL27HA eingefügt und in diesem Abschnitt beschrieben. ∆M27-UL27HA wies bereits in unbehandelten Zellen ein Wachstumsdefizit gegenüber allen anderen MCMVs auf (s. Abb. 18, A). Bei 3 d p. i. unterlag sein Titer höchstsignifikant (p < 0,001) dem Titer von M27HA-

MCMV und ∆M27-M27HA um 3 sowie von ∆M27-MCMV um 2 Log10-Stufen (p < 0,01).

Das ∆M27-EGFP übertraf den Titer der ∆M27-UL27HA-Mutante um 1 Log10-Stufe (n. s.).

Das antivirale IFNγ schwächte die Replikation von ∆M27-UL27HA um 3 Log10-Stufen.

Damit ist es vergleichbar IFN-empfindlich wie ∆M27-MCMV (3 Log10-Stufen) und das

Kontrollvirus ∆M27-EGFP (2 Log10-Stufen). Der Titer von ∆M27-M27HA büßte nur 1 Log10 in Anwesenheit von IFNγ ein. Diese Beobachtungen führen zu der Schlussfolgerung, dass pUL27 die biologischen pM27- Funktionen im ∆M27-MCMVunter den getesteten Bedingungen nicht komplementieren kann.

94 Ergebnisse

Abb. 19: Die pUL27-Expression verminderte die Replikation von ΔM27-MCMV. (A) Unbehandelte oder (B) IFNγ-präinkubierte (48 h, 100 U/ml) primäre MNCs wurden mit verschiedenen MCMV-Mutanten (M27HA-MCMV, ΔM27-M27HA, ΔM27-MCMV, ΔM27-EGFP bzw. ΔM27-UL27HA) infiziert (MOI 0,01). Nach 1, 2 bzw. 3 d p. i. wurden die Zellen mitsamt Zellkulturüberstand bei -80°C eingefroren und zu einem späteren Zeitpunkt die Virustiter durch Plaque-Titration bestimmt. (C) Die Signifikanz der Differenzen zwischen den Virustitern wurde mit einem T-Test analysiert („n. s.“: nicht signifikant; [*]: p<0,05 [**]: p<0,01 [***]: p<0,001).

95 Ergebnisse

3.3.2.1.3 pUL27 beeinträchtigt die M27-vermittelte STAT2-Degradation von MCMV nicht Es ist bekannt, dass pUL27 mit DDB1 interagiert (Reitsma et al., 2011). Unsere Arbeitsgrup- pe konnte ebenfalls eine schwache Interaktion zwischen pUL27 und DDB1 nachweisen (Landsberg et al., 2018). Das HCMV-kodierte pUL27 weist zu pM27 eine Sequenzhomologie auf. Das CxCxxC- und auch das LP-Motiv, welche für pM27 essenziell für eine Interaktion mit DDB1 sind (Trilling et al., 2011), weichen um eine Aminosäure in der UL27-Sequenz ab. Daher wurde im folgenden Experiment überprüft, ob eine heterologe pUL27HA-Expression in M27-positiven MCMV-Mutanten um die DDB1-Interaktion konkurriert und einen Effekt auf die pM27-vermittelte Degradation von mSTAT2 hätte. Zur Beantwortung dieser Frage- stellung wurde zunächst per BAC-Mutagenese die CDS von pUL27HA in den Lokus von m157 in das MCMV-Genom kloniert. Auch in dem generierten MCMV-UL27HA wird die Expression des heterologen Proteins durch den konstitutiv aktiven EF1-Promotor induziert. Im nächsten Schritt wurden primäre MNCs entweder mit M27HA-MCMV, ΔM27-MCMV, MCMV, MCMV-UL27HA oder MCMV-EGFP infiziert oder mit Medium behandelt (uninfiziert). Per Western-Blot wurden mSTAT2, pM27HA bzw. pUL27HA, IE1/pp89 und β-Aktin sukzessive nachgewiesen (s. Abb. 20).

96 Ergebnisse

Abb. 20: Die Expression von pUL27HA wirkt sich nicht auf die pM27-vermittelte Degradation von STAT2 durch MCMV aus. Primäre MNCs wurden mit Zellkulturmedium (uninfiziert) behandelt oder mit M27HA-MCMV, ΔM27- MCMV, MCMV, MCMV-UL27HA bzw. MCMV-EGFP infiziert (MOI 5). Nach 24 h wurden die Zellen lysiert und die oben angegebenen Proteine sukzessive via Western-Blot nachgewiesen.

Das Experiment zeigte, dass pUL27HA unter der Regulation des EF1-Promotors im Kontext der MCMV-UL27HA-Mutante die pM27-vermittelte Degradation von mSTAT2 nicht beeinflusst. In den Lysaten aller mit M27-positiven MCMV infizierten Zellen fand ein mSTAT2-Abbau statt. Lediglich in Abwesenheit von M27 (∆M27-MCMV) war mSTAT2 in dem Lysat MCMV-infizierter Zellen detektierbar.

3.3.2.2 Untersuchung überlappender biologischer Funktionen von pR27 und pM27 im ΔM27-MCMV-Kontext

Das pR27 aus RCMV (MuHV-2) enthält ebenfalls das konservierte CxCxxC-Motiv, welches bei pM27 essenziell für seine Interaktion mit DDB1 und somit für die mSTAT2- Ubiquitinierung und proteasomale Degradation ist (Trilling et al., 2011). Es ist nicht bekannt, ob pR27 den STAT2-Abbau in RCMV-infizierten Ratten-Fibroblasten vermittelt. Jedoch konnte unsere Arbeitsgruppe eine schwache Interaktion zwischen DDB1 und pR27 in Transfektionsexperimenten nachweisen (Landsberg et al., 2018). Daher wurde pR27 ebenfalls auf pM27-komplementative Eigenschaften mithilfe der generierten Mutante ∆M27-R27HA untersucht.

97 Ergebnisse

3.3.2.2.1 ΔM27-R27HA degradiert weder mSTAT2 noch inhibiert es die Aktivität des ISRE-Promotors

Um zu untersuchen, ob ∆M27-R27HA in der Lage ist, murines STAT2 zu degradieren, wurden primäre MNCs entweder mit Medium behandelt (uninfiziert) oder mit M27HA- MCMV, ∆M27-MCMV, ∆M27-R27HA, bzw. ∆M27-EGFP) infiziert. Im Anschluss wurden die Lysate mittels Western-Blot auf das Vorhandensein von mSTAT2-Protein untersucht (s. Abb. 21). nach Infektion mit ∆M27-R27HA fand keine mSTAT2-Degradation statt. Ein Abbau von mSTAT2 wurde nur in M27HA-MCMV infizierten MNCs beobachtet. Mit einem α-HA-Antikörper wurde in M27HA-MCMV infizierten Zellen pM27HA nachgewiesen. Im Lysat mit ∆M27-R27HA wurden mehrere Proteinbanden mit HA-Markierung detektiert (s. Abb. 21). Bei der obersten Bande mit der stärksten Intensität handelt es sich höchstwahr- scheinlich um das full-length pR27HA. Die Banden von geringerer Molekülmasse könnten Peptidfragmente des pR27HA sein. Mithilfe der Western-Blot-Analyse konnte gezeigt werden, dass eine Expression des RCMV-kodierten pR27 durch ΔM27-MCMV keinen STAT2-Abbau verursacht.

Abb. 21: ΔM27-R27HA baut STAT2 in Maus-Zellen nicht ab. Primäre MNCs wurden entweder mit Zellkulturmedium behandelt (unifiziert) oder mit M27HA-MCMV, ΔM27-MCMV, ΔM27-R27HA bzw. ΔM27-EGFP infiziert (MOI 5). Nach 24 h p. i. wurden die Zellen lysiert und die angegebenen Proteine sukzessive via Western-Blot nachgewiesen.

98 Ergebnisse

Im nächsten Schritt wurde mithilfe eines Luziferase-Assays untersucht, ob pR27 die Aktivität des ISRE-Promotors schwächen kann. Die in Abb. 14 (A und B) gezeigten Daten der Kontrollviren (M27HA-MCMV, ΔM27-MCMV, ΔM27-M27HA bzw. ΔM27-EGFP) stimmen mit denen in Abb. 22 überein, da es sich um dasselbe Experiment handelte. Es wurden im Folgenden die Daten für die hier betrachtete Mutante hinzugefügt. Die MCMV- Mutante ΔM27-R27HA konnte die Aktivität des ISRE-Promotors nicht herunter regulieren. Die induzierte Luziferase-Aktivität erreichte vergleichbare Werte wie bei ΔM27-MCMV und ΔM27-EGFP und unterschied sich höchstsignifikant von der Luziferase-Aktivität in Gegen- wart von M27HA-MCMV (p < 0,001) und ΔM27-M27HA (p < 0,001) (s. Abb. 22, A). Der relative Wert der x-fach induzierten Luziferase-Aktivität lag für ΔM27-R27HA mit einem Faktor von 5,0 nur geringfügig unter dem für ΔM27-MCMV (Faktor 5,6) und ΔM27-EGFP (Faktor 5,4) (s. Abb. 22, B).

Abb. 22: ΔM27-R27HA hat keinen inhibitorischen Einfluss auf den ISRE-Promotor. NIH3T3-ISRELuc-IFNλR-Zellen wurden mit M27HA-MCMV, ΔM27-MCMV, ΔM27-M27HA, ΔM27- EGFP bzw. ΔM27-UL27HA infiziert (MOI 5). Nach 24 h p. i. wurden die Zellen mit mIFNλ2 (20 ng/ml) für 6 h stimuliert und Lysate zur Messung der Luziferase-Aktivität hergestellt. (A) Die Balken geben den Mittelwert der drei einzeln gemessenen Luziferase-Aktivitäten an. Die weißen Balken zeigen die Luziferase-Aktivität in unbehandelten, die grauen Balken in mit IFNλ-stimulierten Zellen. Mit einem T- Test wurden signifikante Unterschiede ([***]: p < 0,001) zwischen den Messwerten berechnet. (B) Induzierte Luziferase-Aktivität: Quotient aus Wert nach IFN-Stimulation und dem Wert aus unbehandelten Zellen.

99 Ergebnisse

Aus den hier dargestellten Ergebnissen zu pR27 im ΔM27-MCMV-Kontext lässt sich schlussfolgern, dass das pM27-Homolog aus dem RCMV-Maastricht die biologischen Effekte des Verlustes der M27-Kodierugskapazität in Bezug auf die IFNλ-Inhibition nicht revertiert.

3.3.2.2.2 Die pR27HA-Expression verminderte die Replikation von ΔM27-MCMV

Die Expression von pR27 mildert den ∆M27-MCMV-Phänotyp weder im Hinblick die Unfähigkeit des STAT2-Abbaus noch in Bezug auf die Inhibition der IFNλ-induzierten Signalkaskade (s. 3.3.2.2.1). Als nächstes wurde untersucht, ob die Expression von pR27 den Replikationszyklus von ∆M27-MCMV in An- und Abwesenheit von IFNγ beeinflusst. Dazu wurden primäre MNCs mit ∆M27-R27HA, MCMV-M27HA, ∆M27-M27HA, ∆M27-MCMV bzw. ∆M27-EGFP infiziert. Die im Infektionsverlauf erreichten Titer wurden via Plaque- Titration ermittelt (s. Abb. 23). Die in Abb. 15 für M27HA-MCMV, ∆M27-M27HA, ∆M27- MCMV bzw. ∆M27-EGFP dargestellten Daten stammen aus demselben Experiment. Daher sind die Werte der hier dargestellten Titer identisch und werden lediglich mit den Titern von ∆M27-R27HA in Relation gesetzt. In unbehandelten MNCs wies ∆M27-R27HA ein signifikant geringeres Wachstum im Vergleich zu den anderen MCMVs auf (s. Abb. 23, A und C). Der Titer des ∆M27-UL27HA unterlag bei 3 d p. i. dem MCMV-M27HA und dem ∆M27-

M27HA jeweils um 3 Log10-Stufen (p < 0,001), dem ∆M27-MCMV 2 Log10-Stufen

(p < 0,01) und dem ∆M27-EGFP um 1 Log10-Stufe (n. s.). Die Behandlung der Zellen mit IFNγ führte bei allen MCMVs zu einem verminderten Wachstum. Durch IFNγ wurde die

Replikation des ∆M27-R27HA um etwa 3 Log10-Stufen vermindert. Somit wies das Virus die vergleichsweise höchste Empfindlichkeit gegenüber IFNγ auf. Die Ergebnisse der Wachstumsstudie von ∆M27-R27HA lassen darauf schließen, dass das RCMV (MuHV-2)-kodierte pR27 den Verlust des pM27 im Hinblick auf die Antagonisierung von IFNγ nicht komplementieren kann.

100 Ergebnisse

Abb. 23: Die pR27HA-Expression vermindert die Replikation von ΔM27-MCMV. (A) Unbehandelte oder (B) IFNγ-präinkubierte (48 h, 100 U/ml) primäre MNCs wurden mit verschiedenen MCMV-Mutanten (M27HA-MCMV, ΔM27-M27HA, ΔM27-MCMV, ΔM27-EGFP bzw. ΔM27-R27HA) infiziert (MOI 0,01). Nach 1, 2 bzw. 3 d p. i. wurden die Zellen mitsamt Zellkulturüberstand bei -80°C eingefroren und zu einem späteren Zeitpunkt die Virustiter durch Plaque-Titration bestimmt. (C) Die Signifikanz der Differenzen zwischen den Virustitern wurde mit einem T-Test analysiert („n. s.“: nicht signifikant; [*]: p<0,05 [**]: p<0,01 [***]: p<0,001).

101 Ergebnisse

3.3.3 Transkomplementative Analyse der hepadnaviralen pM27-Analoga HBx und WHx

Die Proteine HBx aus HBV und WHx aus WHV gehören wie das MCMV-kodierte pM27 zu den DDB1-bindenden Proteinen. Im Folgenden wurde mithilfe der beiden neuen MCMV- Mutanten ΔM27-HBxHA und ΔM27-WHxHA untersucht, ob die Expression der hepadnaviralen Proteine den Verlust der M27-Kodierungskapazität und die damit verbundenen ∆M27- MCMV-Phänotypen abschwächen.

3.3.3.1 Untersuchung überlappender biologischer Funktionen von HBx und pM27 im MCMV-Kontext HBx interagiert mit verschiedenen zellulären Proteinen und erfüllt verschiedene Aufgaben zur Gewährleistung der HBV-Replikation (s. 1.2.3). Der am besten beschriebene Interaktions- partner ist DDB1 (Lee et al., 1995; Sitterlin et al., 1997). Diese Interaktion ist in allen HBx- Proteinen von allen Säugetier-Hepadnaviren und somit auch im Murmeltier Hepatitis Virus (WHV) X-Protein konserviert (Sitterlin et al., 1997). Die Bindung zwischen HBx und DDB1 ist für die Replikation von HBV essentiell (Hodgson et al., 2012; Leupin et al., 2005). Da das MCMV-kodierte pM27 ebenfalls mit DDB1 interagiert, wurde im Folgenden untersucht, ob die HBx-Expression Einfluss auf die ΔM27-Phänotypen ausübt.

3.3.3.1.1 In ΔM27-HBxHA-infizierten Zellen wurde weder mSTAT2 degradiert noch die Aktivität des ISRE-Promotors inhibiert

Zunächst wurde untersucht, ob ΔM27-HBxHA Einfluss auf die mSTAT2-Levels infizierter Zellen nimmt. Dazu wurden primäre MNCs entweder mit Medium behandelt (uninfiziert) oder mit dieser Mutante sowie mit M27HA-MCMV, ∆M27-MCMV, ∆M27-M27HA und ∆M27-EGFP infiziert. Die Zelllysate wurden per Western-Blot auf das Vorhandensein des mSTAT2-Proteins untersucht (s. Abb. 24). Nach Infektion mit ∆M27-HBxHA wurde mSTAT2 nicht degradiert. Eine Degradation von mSTAT2 wurde nur in den Lysaten der mit M27HA-MCMV-infizierten MNCs festgestellt. Darüber hinaus wurde die Expression von pM27HA und HBxHA mit einem HA-Antikörper detektiert. Der Nachweis des Proteins pp89 zeigte in Gegenwart des ∆M27-HBxHA sowohl eine stärkere Ausprägung des Signals als

102 Ergebnisse

auch eine weitere Proteinbande, die in den Lysaten der anderen MCMV-infizierten Zellen nur schwach zu erkennen war. Alle anderen Lysate, in denen MCMV-infizierte MNCs vorlagen, wiesen einheitliche Signalstärken auf.

Abb. 24: Eine Infektion mit ΔM27-HBxHA hatte keinen Einfluss auf die STAT2-Level. Primäre MNCs wurden entweder mit Zellkulturmedium behandelt (unifiziert) oder mit M27HA-MCMV, ΔM27-MCMV, ΔM27-HBxHA bzw. ΔM27-EGFP infiziert (MOI 5). Nach 24 h p. i. wurden die Zellen lysiert und die angegebenen Proteine sukzessive via Western-Blot nachgewiesen. Es wurden normalisierte Lysate verwendet.

Ein weiterer Phänotyp von ∆M27-MCMV ist, dass die Mutante im Gegensatz zu M27- positivem MCMV die Promotoraktivität von ISRE nicht inhibieren kann (vgl. Abb. 14 und Le-Trilling et al., 2018). Im Folgenden wurde mithilfe eines Luziferase-Assays untersucht, ob die heterologe Expression von HBxHA mindernde Auswirkungen auf den ISRE-Promotor im ∆M27-MCMV-Kontext hat. Die in Abb. 14 (A und B) gezeigten Daten der Kontrollviren (M27HA-MCMV, ΔM27-MCMV, ΔM27-M27HA bzw. ΔM27-EGFP) stimmen mit denen in Abb. 25 überein, da es sich um dasselbe Experiment handelte. Es wurden im Folgenden die Daten für ΔM27-HBxHA hinzugefügt. Das ΔM27-HBxHA inhibierte die Aktivität des ISRE- Promotors nicht. Im Gegenteil: Die Infektion mit ∆M27-HBxHA erhöhte die Luziferase- Aktivität per se. Sowohl mit als auch ohne IFNλ-Behandlung wurden im Vergleich zu allen anderen MCMV-Mutanten signifikant höhere Luziferase-Aktivitäten gemessen (p < 0,001, s. Abb. 25, A). Bei der induzierten Luziferase-Aktivität liegt ΔM27-HBxHA (Faktor 3,8) liegt

103 Ergebnisse

zwischen M27HA-MCMV und ΔM27-M27HA und den beiden anderen M27-negativen MCMV-Mutanten (ΔM27-MCMV und ΔM27-EGFP) (s. Abb. 25, B).

Abb. 25: Die ISRE-Promotoraktivität wird durch ΔM27-MCMV-exprimiertes HBxHA verstärkt. NIH3T3-ISRELuc-IFNλR-Zellen wurden mit M27HA-MCMV, ΔM27-MCMV, ΔM27-M27HA, ΔM27-EGFP bzw. ΔM27-HBxHA infiziert (MOI 5). Nach 24 h p. i. wurden die Zellen mit mIFNλ2 (20 ng/ml) für 6 h stimuliert und Lysate zur Messung der Luziferase-Aktivität hergestellt. (A) Die Balken geben den Mittelwert der drei einzeln gemessenen Luziferase-Aktivitäten an. Die weißen Balken zeigen die Luziferase-Aktivität in unbehandelten Zellen, die grauen Balken in mit IFNλ-stimulierten Zellen. Mit einem T-Test wurden signifikante Unterschiede ([***]: p < 0,001) zwischen den Messwerten berechnet. (B) Induzierte Luziferase-Aktivität: Quotient aus Wert nach IFN-Stimulation und dem Wert aus unbehandelten Zellen.

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass eine Infektion mit ΔM27-HBxHA die Aktivität des ISRE-Promotors in NIH3T3-ISRELuc-IFNλR-Zellen zu erhöhen scheint. Dies wurde mit und ohne IFNλ-Stimulation beobachtet.

3.3.3.1.2 Die Expression von HBxHA vermindert die Replikation von ΔM27-MCMV und verstärkt die IFNγ-Sensitivität

Die Expression von HBx mildert den ∆M27-MCMV-Phänotyp weder im Hinblick auf den Abbau von mSTAT2 noch in Bezug auf die Inhibierung der IFNλ-induzierten Signalkaskade (s. Abschnitt 3.3.3.1.1). Wie sich die Expression von HBxHA auf die Replikation an sich sowie auf die IFNγ-Sensitivität von ∆M27-MCMV auswirkt, wurde im nächsten Experiment

104 Ergebnisse

untersucht. Dazu wurden parallel unbehandelte primäre MNCs und mit IFNγ präinkubierte Zellen mit dieser Mutante sowie zum Vergleich mit M27HA-MCMV, ∆M27-MCMV, ∆M27- MCMV-M27HA und ∆M27-EGFP infiziert, um die Titer während des Infektionsverlaufes zu ermitteln. Die Daten sind in Abb. 26 dargestellt. In IFN-unbehandelten MNCs unterlag die Mutante ∆M27-HBxHA bei 3 d p. i. dem MCMV-

M27HA und dem ∆M27-M27HA um 2 Log10-Stufen (p < 0,001; s. Abb. 26, A und C), dem

∆M27-MCMV um eine (p < 0,01) und dem ∆M27-EGFP um etwa eine halbe Log10-Stufe (n. s.). In IFNγ-behandelten Zellen, in denen bereits ein antiviraler Zustand induziert worden war, wirkte sich die Genexpression des HBx-Proteins ebenfalls negativ auf die Replikation von ∆M27-MCMV aus. Die Empfindlichkeit gegenüber IFNγ (Vergleich der erreichten Titer in unbehandelten Zellen zum Titer in IFNγ-präinkubierten Zellen) war bei ∆M27-HBxHA signifikant (p < 0,001) stärker ausgeprägt als beim parentalen ∆M27-MCMV und dem ∆M27- EGFP. Das antivirale Zytokin senkte in Gegenwart des HBxHA die virale Replikation um etwa 2,5-Log10-Stufen. Hingegen nahm bei ∆M27-MCMV der Titer um etwa 2-Log10-Stufen ab.

105 Ergebnisse

Abb. 26: Die Expression von HBxHA wirkt sich negativ auf die Replikation von ΔM27-MCMV aus. (A) Unbehandelte oder (B) IFNγ-präinkubierte (48 h, 100 U/ml) primäre MNCs wurden mit verschiedenen MCMV-Mutanten (M27HA-MCMV, ΔM27-M27HA, ΔM27-MCMV, ΔM27-EGFP bzw. ΔM27-HBxHA) infiziert (MOI 0,01). Nach 1, 2 bzw. 3 d p. i. wurden die Zellen mitsamt Zellkulturüberstand bei -80°C eingefroren und zu einem späteren Zeitpunkt die Virustiter durch Plaque-Titration bestimmt. (C) Die Signifikanz der Differenzen zwischen den Virustitern wurde mit einem T-Test analysiert („n. s.“: nicht signifikant; [*]: p < 0,05 [**]: p < 0,01 [***]: p < 0,001).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich die Expression von HBxHA negativ auf die Replikation von ΔM27-MCMV auswirkt und die Empfindlichkeit gegenüber IFNγ verstärkt.

106 Ergebnisse

3.3.3.1.3 HBx beeinträchtigt den pM27-vermittelten mSTAT2-Abbau nicht

Es ist bekannt, dass das HBV-kodierte Protein HBx mit DDB1 interagiert (Lee et al., 1995; Sitterlin et al., 1997) und den proteasomalen Abbau des zellulären Smc5/6 vermittelt (Murphy et al., 2016). Da das MCMV-kodierte pM27 das zelluläre mSTAT2 über denselben Mecha- nismus abbaut, wurde im Folgenden überprüft, ob die heterologe Expression von HBxHA in M27-positiven MCMV-Mutanten um die DDB1-Interaktion konkurriert und einen negativen Effekt auf die pM27-vermittelte Degradation von STAT2 hat. Dazu wurde zunächst per BAC- Mutagenese die CDS von HBxHA in den Lokus von m157 in das MCMV-Genom kloniert. Da bei der Mutagenese dasselbe Insertionsplasmid verwendet wurde wie bei der Klonierung des M27-negativen BAC-Konstruktes, wird auch in dem generierten MCMV-HBxHA die Expression des heterologen Proteins durch den konstitutiv aktiven EF1-Promotor reguliert. Im nächsten Schritt wurde untersucht, ob sich die mSTAT2-Proteinmengen in MCMV-HBxHA- und M27HA-MCMV-infizierten Zellen voneinander unterscheiden. Primäre MNCs wurden entweder mit Zellkulturmedium behandelt (uninfiziert) oder mit M27HA-MCMV, ΔM27- MCMV, MCMV, MCMV-HBxHA bzw. MCMV-EGFP infiziert. Die Zelllysate wurden per Western-Blot auf das Vorhandensein von mSTAT2, pM27HA bzw. HBxHA, IE1/pp89 sowie β-Aktin analysiert (s. Abb. 27).

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Abb. 27: Die Expression von HBxHA wirkt sich nicht negativ auf die pM27-vermittelte Degradation von mSTAT2 aus. Primäre MNCs wurden mit Zellkulturmedium behandelt (uninfiziert) oder mit M27HA-MCMV, ΔM27- MCMV, MCMV, MCMV-HBxHA sowie MCMV-EGFP infiziert (MOI 5). Nach 24 h wurden die Zellen lysiert und die angegebenen Proteine sukzessive per Western-Blot nachgewiesen. Es wurden normalisierte Lysate verwendet. Die Titer der verschiedenen MCMV-Stocks waren vor Versuchsbeginn parallel in einer Plaque-Titration angeglichen worden.

Da mSTAT2 ausschließlich in uninfizierten Zellen nachgewiesen werden konnte, kann geschlussfolgert werden, dass HBx keinen nachweislichen negativen Einfluss auf die pM27- vermittelte Degradation von mSTAT2 nimmt.

3.3.3.2 Untersuchungen zur Fähigkeit von WHx pM27 zu transkomplementieren

Bei dem vom WHV stammenden Protein WHx handelt es sich um ein Homolog des HBx (aus HBV). Beide Proteine interagieren mit DDB1 (Bergametti et al., 2002; Landsberg et al., 2018). Im Gegensatz zu HBx ist für WHx bisher kein Zielprotein beschreiben worden, das durch die Interaktion mit dem DDB1-CUL4-ROC1-E3-Ligase-Komplex abgebaut wird.

3.3.3.2.1 In Gegenwart von ΔM27-WHxHA wurde weder mSTAT2 degradiert noch die Aktivität des ISRE-Promotors geschwächt Es wurde untersucht, ob in Gegenwart von ∆M27-WHxHA eine Degradation von mSTAT2 stattfindet. Dazu wurden primäre MNCs mit dieser Mutante sowie mit M27HA-MCMV,

108 Ergebnisse

∆M27-MCMV, ∆M27-M27HA und ∆M27-EGFP infiziert und die Zelllysate anschließend per Western-Blot auf das Vorhandensein von mSTAT2-Protein untersucht (s. Abb. 28). Durch ∆M27-WHxHA wurde keine mSTAT2-Degradation vermittelt. Ein mSTAT2-Abbau wurde nur in Gegenwart von M27HA-MCMV festgestellt. Mit einem α-HA-Antikörper wurden die beiden Proteine pM27HA bzw. WHxHA detektiert. Beim Nachweis des Proteins IE1/pp89 wurde in Gegenwart von ∆M27-WHxHA und ∆M27-EGFP jeweils eine zweite, kleinere Signalbande detektiert. Eine schwächere Ausprägung des pp89-Signals wurde im Lysat mit M27HA-MCMV beobachtet. Die Detektion von β-Aktin veranschaulichte die gelungene Normalisierung der Proteinmengen der Lysatproben. Es konnte gezeigt werden, dass das ebenfalls mit DDB1-interagierende WHx-Protein den Funktionsverlust des pM27 im Hinblick auf den mSTAT2-Abbau nicht komplementieren kann.

Abb. 28: In Gegenwart von ΔM27-WHxHA findet keine mSTAT2-Degradation statt. Primäre MNCs wurden entweder mit Zellkulturmedium behandelt (unifiziert) oder mit M27HA-MCMV, ΔM27-MCMV, ΔM27-WHxHA bzw. ΔM27-EGFP infiziert (MOI 5). Nach 24 h p. i. wurden die Zellen lysiert und die angegebenen Proteine per Western-Blot nachgewiesen. Es wurden normalisierte Lysate verwendet.

Als nächstes wurde untersucht, wie sich die Expression von WHxHA auf die IFNλ-abhängige ISRE-Promotoraktivität auswirkt. Die in Abb. 14 (A und B) gezeigten Daten der Kontrollvi- ren (M27HA-MCMV, ΔM27-MCMV, ΔM27-M27HA bzw. ΔM27-EGFP) stimmen mit den

109 Ergebnisse

hier abgebildeten Werten überein, da es sich um dasselbe Experiment handelt. Es wurden im Folgenden die Daten für ∆M27-WHxHA hinzugefügt.

Abb. 29: Die ISRE-Promotoraktivität wird durch ΔM27-MCMV exprimiertes WHxHA verstärkt. NIH3T3-ISRELuc-IFNλR-Zellen wurden mit M27HA-MCMV, ΔM27-MCMV, ΔM27-M27HA, ΔM27-EGFP bzw. ΔM27-WHxHA infiziert (MOI 5). Nach 24 h p. i. wurden die Zellen mit mIFNλ2 (20 ng/ml) für 6 h stimuliert und Lysate zur Quantifizierung der Luziferase-Aktivität hergestellt. Dabei wurde jede Bedingung in drei Replikaten gemessen. (A) Mittelwert der drei einzeln gemessenen Luziferase-Aktivitäten. Die weißen Balken zeigen die Luziferase-Aktivität in IFN-unbehandelten, die grauen Balken in mit IFNλ- stimulierten Zellen. In einem T-Test wurden signifikante Unterschiede ([*]: p<0,05; [**]: p<0,01; [***]: p<0,001) zwischen den Messwerten berechnet. (B) Induzierte Luziferase-Aktivität: Quotient aus Wert nach IFN-Stimulation und dem Wert aus unbehandelten Zellen.

Vergleichbar mit dem vorher beschriebenen HBV-Protein HBxHA schien bei der WHxHA- exprimierenden MCMV-Mutante die Luziferase-Aktivität sowohl in IFN-unstimulierten als auch in mit IFNλ-behandelten Zellen per se erhöht zu sein. Die in unstimulierten Zellen ermittelten absoluten Werte waren im Vergleich zu denen, die in Gegenwart der anderen MCMV-Mutanten gemessen wurden, signifikant höher. Zwischen ΔM27-WHxHA und ΔM27-EGFP lag die Signifikanz bei p < 0,05, zwischen ΔM27-WHxHA und ΔM27-MCMV bei p < 0,01 und zwischen ΔM27-WHxHA und M27HA-MCMV bzw. ΔM27-M27HA bei p < 0,001 (s. Abb. 29, A). Der absolute Wert der Luziferase-Aktivität in IFNλ-stimulierten Zellen war im Vergleich zu den Werten, die in Gegenwart der anderen MCMV-Mutanten gemessen wurden, ebenfalls signifikant höher (p-Werte s. Abb. 29, B). Bei der relativen

110 Ergebnisse

Induktion der Luziferase-Aktivität lag der Faktor für das WHx-exprimierende ΔM27-MCMV ebenfalls zwischen den M27-positiven und M27-negativen MCMVs (s. Abb. 29, B). Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass eine Infektion mit ΔM27-WHxHA die Aktivität des ISRE-Promotors in NIH3T3-ISRELuc-IFNλR-Zellen zu erhöhen scheint. Die intermediä- ren relativen Werte schließen eine schwache Antagonisierung der Promotor-Aktivität durch WHx jedoch nicht aus.

3.3.3.2.2 Die Expression von WHxHA verringert die Replikation von ΔM27-MCMV in An- und Abwesenheit von IFNγ

Nachdem sich herausgestellt hatte, dass das WHV-kodierte DDB1-bindende WHx den pM27- Verlust weder im Hinblick auf die mSTAT2-Degradation noch auf die Inhibition der Aktivität des ISRE-Promotors komplementiert, wurde die Replikationsfähigkeit der MCMV-Mutante

∆M27-WHxHA untersucht. Dabei sollte ermittelt werden, wie sich die Expression von WHxHA auf die Replikation von ∆M27-MCMV an sich sowie auf dessen IFNγ-Sensitivität auswirkt. Die Daten sind in Abb. 30 (A und B) dargestellt. In unbehandelten MNCs wies ∆M27-WHxHA ein geringeres Wachstum im Vergleich zu den anderen getesteten MCMV auf (s. Abb. 30, A). Der Titer des ∆M27-WHxHA unterlag bei 3 d p. i. dem MCMV-M27HA und dem ∆M27-M27HA jeweils um 2 Log10-Stufen (p < 0,001), dem ∆M27-MCMV um 1

Log10-Stufen (p < 0,01) und dem ∆M27-EGFP um 0,5 Log10-Stufen (n. s.) (s. Abb. 30, A und C). Die Behandlung der Zellen mit IFNγ führte bei allen MCMVs zu einem verminderten Wachstum. Die Replikation des ∆M27-WHxHA war im Vergleich zu den unbehandelten

Zellen bei 3 d p. i. um etwa 3 Log10-Stufen geringer. Somit wies das Virus die vergleichsweise höchste Empfindlichkeit gegenüber IFNγ auf.

111 Ergebnisse

Abb. 30: Die Expression von WHx wirkt sich negativ auf die Replikation von ΔM27-MCMV aus. (A) Unbehandelte oder (B) IFNγ-präinkubierte (48 h, 100 U/ml) primäre MNCs wurden mit verschiedenen MCMV-Mutanten (M27HA-MCMV, ΔM27-M27HA, ΔM27-MCMV, ΔM27-EGFP bzw. ΔM27-WHxHA) infiziert (MOI 0,01). Nach 1, 2 bzw. 3 d p. i. wurden die Zellen mitsamt Zellkulturüberstand bei -80°C eingefroren und zu einem späteren Zeitpunkt die Virustiter durch Plaque-Titration bestimmt. (C) Die Signifikanz der Differenzen zwischen den Virustitern wurde mit einem T-Test analysiert („n. s.“: nicht signifikant; [*]: p<0,05 [**]: p<0,01 [***]: p<0,001).

112 Ergebnisse

Die Ergebnisse der Wachstumsstudie von ∆M27-WHxHA lassen darauf schließen, dass das WHV-kodierte WHx den Verlust des pM27 im Hinblick auf die Antagonisierung von IFNγ nicht komplementieren und somit den Phänotyp des ∆M27-MCMV nicht revertieren kann.

Zusammengefasst konnte keines der viralen Proteine die Funktion von pM27 unter den getesteten Bedingungen komplementieren. Obwohl viele Viren DDB1 zweckentfremden, um ihre Replikationseffizienz zu steigern, scheint jedes Protein ein (wirts-) spezifisches Substrat zu erkennen.

113 Ergebnisse

3.4 Charakterisierung von HBV-Antigen exprimierenden MCMV-Vektoren und Untersuchung des Schutzpotentials gegen HBV im hydrodynamischen Injektionsmodel in der Maus

In der vorliegenden Arbeit wurden M27-positive und -negative MCMV-Mutanten per BAC- Mutagenese generiert, die HBV-Proteine exprimieren und in geeigneten Mausmodellen bezüglich ihrer Eigenschaft als Vakzinvektor untersucht werden sollten. Mäuse sind nicht HBV-permissiv (Dandri & Petersen, 2017). Als etabliertes Modell wird daher die hydrodynamische Injektion (H. I.) durchgeführt, bei der Plasmide appliziert werden, die das HBV- Genom enthalten (Yang et al., 2002). Die verschiedenen Phänotypen der Deletion von M27 wurden bereits ausführlich beschrieben (s. 3.1). Die Unterschiedlichkeit der Immunogenität der beiden MCMV-Vakzinvektoren wurde im HBV-Mausmodell in Zusammenarbeit mit Prof. Dr. Jia Liu und Dr. Huang Hongming vom Institut für Infektiöse Krankheiten des Union Hospitals in Wuhan (P. R. China) untersucht.

3.4.1 Die prophylaktische Vakzinierung mit MCMV-HBx begünstigte die HBV- Antigen-Expression

Per BAC-Mutagenese wurden MCMV-Mutanten generiert, die HBV-Proteine exprimieren. Als erstes HBV-Antigen wurde HBx untersucht. Um den Einfluss einer Attenuierung des MCMV-Vektors auf die HBx-spezifische Immunantwort zu analysieren, wurde die HBx- Kodierungssequenz sowohl in ein M27-defizientes (ΔM27-HBxHA) als auch in ein m157- defizientes MCMV-Genom (MCMV-HBxHA) inseriert. Der Verlust von pM27 führt zu einer starken Attenuierung in vivo (Le-Trilling et al., 2018), während pm157 für die Replikation entbehrlich ist (Bubic et al., 2004). Die Mutanten MCMV-HBx und ΔM27-HBx sollten auf ihr Schutzpotenzial als Vakzinvektoren gegen HBV im hydrodynamischen Injektionsmodel in der Maus untersucht werden. Dabei sollte erforscht werden, ob durch eine prophylaktische Vakzinierung mit Antigen-exprimierenden MCMV-Impfvektoren die HBV-Antigenämie vermindert werden kann, welche durch eine H. I. von HBV-Genom kodierenden Plasmiden induziert wird. Zunächst wurden die Vakzin-Eigenschaften der MCMV-Mutante MCMV- HBx untersucht. Eine schematische Darstellung des experimentellen Ablaufs ist in Abb. 31 (A) dargestellt. Bei der ersten Impfung (oder Prime-Impfung) wurde C57BL/6-Mäusen

114 Ergebnisse

entweder PBS, MCMV oder MCMV-HBx intraperitoneal. injiziert. Nach drei Wochen wurde die Injektion wiederholt (Boost-Impfung), um die induzierte Immunantwort zu steigern. Den Mäusen wurde nach 1, 4, 7, 14, 17, 20 und 23 Tagen Blut entnommen, um die relative Konzentration bestimmter HBV-Antigene per ELISA zu ermitteln. Dabei wurden die Titer des HBV-kodierten HBs-Antigens (HBsAg, engl. HBV surface antigen) und HBe-Antigens (HBeAg, engl. HBV envelope antigen) quantifiziert. Beim HBsAg handelt es sich um den ersten immunologischen Marker, der nach einer HBV-Infektion nachweisbar ist. Dahingegen gibt das HBeAg indirekten Aufschluss über die Replikationsrate von HBV. Die ermittelte HBV-Antigenämie der einzelnen Versuchstiere zu den definierten Zeitpunkten sind in der Einheit Optische Dichte (OD) angegeben und in Abb. 31 dargestellt. Die HBsAg- Konzentration war sowohl in den PBS-injizierten als auch in den mit MCMV oder MCMV- HBx vakzinierten Mäusen zwischen 1 und 7 d p. H. I. relativ konstant. Der OD-Wert lag zu diesem Zeitpunkt in allen Gruppen zwischen 3,1-3,7 und unterschied sich nicht signifikant. Im H. I.-Modell sind die viralen Antigene innerhalb weniger Tage nicht mehr im Blut nachzuweisen, was höchstwahrscheinlich durch die Bildung von antiviralen Antikörpern durch das Immunsystem der Maus verursacht wird (Yang et al., 2002). Nach 14 d p. H. I. wurde in allen drei Gruppen ein Mittelwert von 0,02 ermittelt. Die Werte änderten sich zu den darauffolgenden gemessenen Zeitpunkten kaum noch und flachten seicht ab bis alle drei Versuchsgruppen an den Tagen 20 und 23 noch eine OD von 0,01 aufwiesen (s. Abb. 31, B). Insgesamt zeigte die Infektion mit MCMV per se keinen Einfluss auf den Verlauf der HBs- Antigenämie. Die prophylaktische Vakzinierung mit dem MCMV-HBx-Impfvektor verur- sachte keine signifikanten Unterschiede bezüglich der HBs-Antigenämie. Hingegen konnten stimulierende Auswirkungen der prophylaktischen Vakzinierung mit MCMV-HBx im Hinblick auf die HBeAg-Konzentrationen zu späteren Zeitpunkten festgestellt werden. Im Gegensatz zu Mäusen, die mit PBS oder MCMV behandelt worden waren, sank der HBe-Titer nach 20 bzw. 23 Tagen kaum ab und unterschied sich signifikant von den beiden Kontrollgruppen (p < 0,05; s. Abb. 31, C). Das Pilotexperiment der Kooperation zeigte also, dass eine prophylaktische Vakzinierung mit MCMV-HBx zu einer erhöhten HBeAg-Konzentration nach 17, 20 und 23 d p. H. I. führt und sich HBx als Antigen im MCMV-Vakzinvektor nicht eignet, um Mäuse vor HBV zu schüt- zen.

115 Ergebnisse

Abb. 31: Die prophylaktische Vakzinierung mit MCMV-HBxHA erhöhte die Titer des HBe-Antigens im Blut von C57BL/6-Mäusen. (A) Schematische Darstellung des Versuchsablaufs der prophylaktischen Vakzinierung mit MCMV (PBS, MCMV bzw. MCMV-HBx; Impfdosis: 2x105 PFU) gegen HBV im hydrodynamischen Injektionsmodel in der Maus. Die Antigenkonzentration von HBsAg sowie (B) sowie HBeAg an 1, 4, 7, 14, 17, 20 bzw. 23 d nach der hydrodynamischen Injektion von HBV-Genomen. Die individuellen Antigentiter der Mäuse sind als Symbole (schwarzer Kreis: PBS; dunkelgraues Quadrat: MCMV; hellgraues Karo: MCMV-HBxHA) dargestellt. Die horizontalen Striche zeigen das geometrische Mittel an. In einem einseitigen ANOVA-Test116 wurden signifikante Unterschiede ([*]: p<0,05) zwischen den Messwerten berechnet.

Ergebnisse

3.4.2 Charakterisierung der MCMV-sHBsAg-Vakzinvektoren Die vorhergehenden Experimente legten die Schlussfolgerung nahe, dass ein MCMV- exprimiertes HBx-Antigen nicht für eine Vakzinierung im H. I.-Modell geeignet ist. Deshalb wurden andere MCMV-Vektoren generiert, die das verkürzte HBV-Oberflächenprotein (engl. short HBV surface antigen, sHBsAg) exprimieren. Die Antigenexpression und die Replikati- onseigenschaften in vitro und in vivo wurden für die beiden Mutanten ΔM27-sHBsAg und MCMV-sHBsAg untersucht. Die Expression des HBV-Antigens sHBsAg wurde für beide MCMV-Vektoren mithilfe eines Western-Blots in infizierten CIM 24 h p. i. nachgewiesen (s. Abb. 32, A).

Abb. 32: Charakterisierung von ΔM27-MCMV-sHBsAg und MCMV-sHBsAg (A) Die Expression des HBV-Antigens sHBsAg wurde für beide MCMV-Vektoren per Western-Blot nachgewiesen. CIM-Zellen wurden entweder mit MCMV, MCMV-sHBsAg, ΔM27-MCMV oder mit ΔM27- MCMV-sHBsAg infiziert (MOI 3) oder mit Medium behandelt (uninfiziert). Nach 24 h p. i. wurden Lysate hergestellt. Die Proteine sHBsAg, pp89 und β-Aktin wurden sequenziell nachgewiesen. (B) Primäre MNCs wurden entweder mit MCMV oder ΔM27-MCMV, MCMV-sHBsAg oder ΔM27-MCMV-sHBsAg infiziert (MOI 0,05). Als Kontrolle für die Auswirkungen der Insertion einer Genkassette wurde parallel die Replikation von Mutanten untersucht, welche im selben Lokus EGFP anstelle von sHBsAg exprimieren. Die Virussuspension, welche zur Infektion verwendet wurde (Input), sowie die Zellkulturüberstände mitsamt den Zellen wurden 1, 2 und 3 d p. i. bei -80°C eingefroren und die Viruskonzentration durch Plaque-Titration ermittelt. Diese Daten sind publiziert (Huang & Rückborn et al., 2020).

Als nächstes wurde die Replikation der neuen MCMV-Vektoren in vitro analysiert, um zu überprüfen, wie sich die heterologe Expression des sHBs-Antigens auf die Wachstumskinetik

117 Ergebnisse

von MCMV auswirkt. Dazu wurden primäre MNCs entweder mit MCMV (Δm157p-MCMV), ΔM27-MCMV, MCMV-sHBsAg oder ΔM27-MCMV-sHBsAg infiziert. Als Kontrolle für die Auswirkungen der Insertion einer Genkassette („EF1-sHBsAg-ZeoR“) wurde parallel die Replikation von MCMV-Mutanten untersucht, welche im selben Lokus EGFP anstelle des sHBsAg exprimieren. Bei MCMV-sHBsAg wirkte sich der Expression von sHBsAg nicht negativ auf die Virusreplikation aus. Im Vergleich zum parentalen MCMV wies es nach 2 und 3 d p. i. keinen signifikanten Unterschied im Virustiter auf. Die Wachstumskinetiken von ΔM27, ΔM27-sHBsAg und ΔM27-EGFP wichen kaum voneinander ab (s. Abb. 32, B). In dem M27-negativen MCMV scheint die Expression daher keinen direkten Einfluss auf die Replikation zu nehmen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die EF1-regulierte Expression von sHBsAg weder in M27-positiven noch in M27-negativen MCMV-Vakzinvektoren signifikante Effekte auf die Replikation im Vergleich zu den parentalen MCMVs in vitro aufwies. Nachdem gezeigt wurde, dass die Vakzinvektoren in MNCs replizieren, wurden ebenfalls Studien zur Replikation in vivo durchgeführt. C57BL/6-Mäuse wurden entweder mit MCMV, MCMV-sHBsAg oder mit dem ΔM27-sHBsAg infiziert. Die Versuchstiere wurden jeweils nach 21 d zwecks Organentnahme im Versuch getötet und die Virustiter in der Leber und der Speicheldrüse mittels Plaque-Titration bestimmt. Die ermittelten Daten sind in Abb. 33 sowohl als geometrischer Mittelwert als auch die individuellen MCMV-Titer jedes Versuchs- tieres zusammenfassend graphisch dargestellt. In der Leber waren die Titer der sHBsAg- exprimierenden MCMV-Vektoren signifikant geringer im Vergleich zum Titer des parentalen MCMVs ([MCMV-sHBsAg]: p < 0,05 und [ΔM27-sHBsAg]: p < 0,01; s. Abb. 33, A). In der Speicheldrüse waren die Organtiter von MCMV ebenfalls im Vergleich zu den Titern von MCMV-sHBsAg und ΔM27-sHBsAg nach 21 Tagen signifikant höher (p < 0,05; s. Abb. 33, B). Zusammenfassend lässt sich über die in vivo Replikation der Vakzinvektoren sagen, dass die Virusreplikation des MCMV-sHBsAg im Vergleich zum MCMV in C57BL/6-Mäusen sowohl in der Leber als auch in der Speicheldrüse vermindert war. Die Titer des ΔM27- sHBsAg lagen in der Leber und in der Speicheldrüse unterhalb des Detektionslimits. Jedoch konnte eine Replikation nach 3 d p. i. in der Milz nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).

118 Ergebnisse

Abb. 33: Das M27-positive und das M27-negative MCMV-sHBsAgHA replizieren in vivo. Die Virustiter im Infektionsverlauf von MCMV, MCMV-sHBsAg und ΔM27-sHBsAg in der (A) Leber und (B) Speicheldrüse von C57BL/6-Mäusen. Es wurde entweder mit dem Kontroll-Vektor MCMV, MCMV-sHBsAg oder mit ΔM27-MCMV-sHBsAg infiziert (2x105 PFU). Die infizierten Tiere wurden nach 21 d p. i. zwecks Organentnahme im Versuch getötet. Die Viruslast wurde durch Plaque-Titration (Dreifachbestimmung) ermittelt. Die Balken in den Graphen zeigen den geometrischen Mittelwert an, der aus den individuellen Organtitern berechnet wurde. Die Daten wurden mithilfe eines einseitigen ANOVA-Tests auf signifikante Unterschiede untersucht und mit einem (*) für p < 0,05 und mit einem (**) für p < 0,01 markiert. DL = Detektionslimit.

3.4.3 Untersuchung des Schutzpotentials von sHBsAg-exprimierenden MCMV- Vektoren gegen HBV Es wurde gezeigt, dass MCMV in der Lage ist, sHBsAg zu exprimieren und sowohl in vitro als auch in vivo repliziert (s. 3.4.2). Dabei ist besonders hervorzuheben, dass der ΔM27- sHBsAg-Vektor eine starke Attenuierung in vivo aufweist. Für den klinischen Einsatz eines HCMV-Vakzinvektors im Menschen müsste ebenfalls eine Attenuierung erreicht werden, da

119 Ergebnisse

seine Biosicherheit besonders in immungeschwächten Individuen gewährleistet sein muss. Unserer Arbeitsgruppe ist es gelungen pUL145 aus HCMV als funktionelles pM27-Homolog zu identifizieren, welches ebenfalls STAT2 über die Zweckentfremdung von DDB1 und CRLs abbaut (Le-Trilling et al., 2020). Möglicherweise könnte dieses Wissen zur Entwick- lung von HCMV-basierten Impfvektoren beitragen. Im Folgenden wurde die Eignung der sHBsAg-exprimierenden MCMV-Mutanten als potentielle Vakzinvektoren überprüft. In weiteren Studien sollte nun untersucht werden, ob eine Impfung mit MCMV-sHBsAg und ΔM27-sHBsAg in C57BL/6-Mäusen zu einer verminderten HBV-Antigenämie führt.

3.4.3.1 Der MCMV-sHBsAg-Vakzinvektor induzierte anti-HBs IgG Im Folgenden wurde untersucht, ob durch die Vakzinierung mit MCMV-sHBsAg oder ΔM27-sHBsAg eine gerichtete Antikörperproduktion in C57BL/6-Mäusen gegen das HBsAg von HBV induziert wird. Dazu wurden C57BL/6-Mäuse mit PBS, MCMV, MCMV-sHBsAg oder ΔM27-sHBsAg infiziert. Nach 3, 4, 6, 9 bzw. 15 Wochen wurde den Mäusen nach dem schmerzfreien Tod per Herzpunktion Blut entnommen und die Anti-HBs-Titer ermittelt. In Abb. 34 sind die ermittelten Anti-HBs-Titer für die jeweilige Immunisierung zu den erwähn- ten Zeitpunkten dargestellt. Die Immunisierung mit MCMV-sHBsAg führte schon nach 3 Wochen zur nachweislichen Produktion von IgG-Antikörpern gegen das HBs-Antigen. Hingegen wurde nach der Immunisierung mit dem attenuierten ΔM27-sHBsAg keine Anti- HBs-Titer in den Mausseren gemessen. Auch zu den nachfolgenden Zeitpunkten führte allein die Vakzinierung mit MCMV-sHBsAg zur Induktion von Anti-HBs in den Versuchstieren. Der im Laufe der Versuchszeit stetig ansteigende Anti-HBs-Titer wird durch einen Ausreißer (mit 434,65 IU/l) nach 6 Wochen unterbrochen, der den Mittelwert der Gruppe um 50 IU/l erhöht.

120 Ergebnisse

Abb. 34: Die Immunisierung mit dem MCMV-sHBsAg-Vakzinvektor induzierte anti-HBs IgG. Mäusen des C57BL/6-Stamms wurden entweder PBS (Negativkontrolle), MCMV, ein IFN- antagonisierender (MCMV-sHBsAg) oder ein IFN-empfindlicher Vakzinvektor (ΔM27-MCMV-sHBsAg) injiziert (2x105 PFU pro Maus). Nach 3, 4, 6, 9 bzw. 15 Wochen wurde den Mäusen nach dem Tod über Herzpunktion Blut entnommen und das Serum bis zur Messung der anti-HBs Titer bei -20°C gelagert. Die im Diagramm dargestellten Balken zeigen den geometrischen Mittelwert der Messpunkte.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass mithilfe des MCMV-Impfvektors MCMV-sHBsAg eine humorale Antwort gegen das HBsAg im Blut von C57BL/6-Mäusen ab drei Wochen messbar war. Hingegen konnten keine Antikörper nach der Immunisierung mit ΔM27- sHBsAg im Blut festgestellt werden.

3.4.3.2 Die prophylaktische Vakzinierung mit MCMV-sHBsAg-Impfvektoren senkt die HBV-Antigenämie

Nachdem gezeigt werden konnte, dass MCMV-sHBsAg in C57BL/6-Mäusen eine gegen das HBsAg gerichtete humorale Immunantwort auslöst (s. 3.4.3.1), sollte im nächsten Schritt untersucht werden, ob eine prophylaktische Vakzinierung mit den Impfvektoren einen schützenden Effekt gegen HBV im H. I.-Modell in der Maus aufweist. C57BL/6-Mäusen wurde zunächst zwei Mal im Abstand von drei Wochen entweder PBS, MCMV, MCMV-sHBsAg oder ΔM27-sHBsAg injiziert. Nach 6 Wochen wurde die H.I. eines replikationsfähigen HBV-Genoms an den immunisierten Versuchstieren durchgeführt. Nach

121 Ergebnisse

1, 4, 7 bzw. 9 Tagen erfolgte eine Blutentnahme, um anhand des ELISA-Titers [OD] die HBs- und HBe-Antigenämie zu ermitteln. Eine Übersicht des experimentellen Ablaufs sowie die zusammengefassten Daten zweier unabhängiger Experimente sind in Abb. 35 (A-C) dargestellt. Die HBsAg-Titer nahmen sowohl nach der prophylaktischen Vakzinierung mit MCMV-sHBsAg als auch mit ΔM27-sHBsAg im Vergleich zu PBS- und MCMV- behandelten Mäusen früher und stärker ab (s. Abb. 35, B). Dabei senkte MCMV-sHBsAg die Antigenämie früher als ΔM27-MCMV-sHBsAg. Bereits nach 1 d p. H. I. konnte ein signifikanter Unterschied (p < 0,05) zwischen der PBS-behandelten und der MCMV-sHBsAg- Impfgruppe (OD 2,69) festgestellt werden (s. Abb. 35, B). Zwar erreichte die Gruppe, welche mit dem ΔM27-sHBsAg vakziniert worden war, eine OD von 2,55, jedoch konnte - möglich- erweise aufgrund einer zu geringen Stichprobengröße - keine Signifikanz festgestellt werden. Die MCMV-Kontrollgruppe unterschied sich nicht von der PBS-behandelten Gruppe. Nach 4 d p. H. I. lag bei allen Gruppen eine vergleichbare HBs-Antigenämie vor. Jedoch lagen in der MCMV-sHBsAg-Gruppe drei Individuen weit unter der mittleren OD. Nach 7 Tagen waren signifikante Unterschiede (p < 0,001) zwischen den Kontrollgruppen und den Vakzin- Gruppen zu beobachten. Während in den Kontrollgruppen noch immer eine OD von 3 vorlag, war der HBs-Titer in Anwesenheit von MCMV-sHBsAg und ΔM27-sHBsAg schon auf 0,3 abgesunken (s. Abb. 35, B). Nach 9 Tagen waren die HBs-Titer in allen Versuchsgruppen weiter abgefallen. Die MCMV-sHBsAg-Gruppe wies einen höchst signifikant (p < 0,001) geringeren HBsAg-Titer auf im Vergleich zu den beiden Kontrollgruppen. ΔM27-sHBsAg senkte den HBsAg-Titer ebenfalls signifikant besser als die PBS- (p < 0,05) und die MCMV- Gruppe (p < 0,01) (s. Abb. 35, B).

122 Ergebnisse

Abb. 35: Die prophylaktische Vakzinierung mit MCMV-sHBsAg-Impfvektoren vermindert die HBV- Antigenämie im HBV-Hydrodynamische-Injektion-Maus-Modell (A) Versuchsablauf der prophylaktischen Vakzinierung mit PBS, MCMV, MCMV-sHBsAg und ΔM27- sHBsAg (2x105 PFU) gegen HBV im H.I.-Modell in der Maus. Die Antigenkonzentration (bzw. ELISA- OD) von (B) HBsAg und (C) HBeAg an 1, 4, 7, bzw. 9 d H. I. Die individuellen Antigentiter sind als123 Symbole (schwarzer Kreis: PBS; dunkelgraues Quadrat: MCMV; hellgraues Karo: MCMV-sHBsAg; dunkelgraues Dreieck: ΔM27-sHBsAg) dargestellt. Die horizontalen Striche zeigen das geometrische

Ergebnisse

Die HBeAg-Titer sanken ab 7 d p. H. I. durch die prophylaktische Vakzinierung mit MCMV- sHBsAg und ΔM27-sHBsAg im Vergleich zu den beiden Kontrollgruppen ebenfalls stärker. Zuvor (1-4 d p. H. I.) lag kein signifikanter Unterschied zwischen der PBS-, der MCMV-, der MCMV-sHBsAg- oder der ΔM27-MCMV-sHBsAg-Impfgruppe vor. Erst nach 7 Tagen waren signifikante Unterschiede zwischen MCMV-sHBsAg und den Kontrollgruppen (PBS [p < 0,001] und MCMV [p < 0,05]) messbar (s. Abb. 35, C). Bei 9 d p. H. I. blieb die HBe- Antigenämie in den Kontrollgruppen weiterhin konstant, während sich in den Vakzinvektor- behandelten Mäusen die HBeAg-Titer weiter verringerten. Der HBeAg-Titer der MCMV- sHBsAg-Gruppe unterlag dem der beiden Kontrollgruppen höchst signifikant (p < 0,001). Die Vakzinierung mit ΔM27-sHBsAg führte im Vergleich zu den beiden Kontrollgruppen ebenfalls zu einer vergleichsweise höchst signifikanten Abnahme der HBeAg-Titer (p < 0,001) (s. Abb. 35, C). Abschließend ist festzuhalten, dass die prophylaktische Vakzinierung mit den getesteten MCMV-Vektoren MCMV-sHBsAg und ΔM27-sHBsAg sowohl die HBs- als auch die HBe- Antigenämie von HBV im Hydrodynamischen-Injektions-Mausmodell reduzierten.

124 Diskussion

4 Diskussion

4.1 Die Mck-2 Mutation ist für die ΔM27-Phänotypen irrelevant

Die bisher beschriebenen Phänotypen des ΔM27-MCMVs beruhten auf Untersuchungen von Mutanten, in denen entweder aufgrund einer ungerichteten Transposon-Insertion der M27- ORF nicht vollständig bzw. nicht ausschließlich deletiert wurde (Abenes et al., 2001) oder in denen unbeabsichtigt ein mutierter Mck-2-ORF vorlag (Jordan et al. 2011). Da in der vorliegenden Arbeit Mck-2-reparierte MCMV-Mutanten generiert und für transkomplementative Analysen verwendet werden sollten, musste zunächst überprüft werden, ob die Wieder- herstellung des viralen Mck-2-Gens die Phänotypen M27-defizienter MCMVs per se beeinflusst. In verschiedenen Experimenten wurde hier jedoch gezeigt, dass ΔM27-MCMV (I) die Fähigkeit verloren hat den Abbau von STAT2 zu vermitteln (s. 3.1.1), (II) entspre- chend in verschiedenen Zelllinien (MEF, CIM und MNC) eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber IFNγ (s. 3.1.2) und (III) eine starke Attenuierung in C57BL/6-, BALB/c- sowie 129-Mäusen aufweist (s. 3.1.3). Da das hier untersuchte, Mck-2-reparierte ΔM27-MCMV einen den bisher veröffentlichten Daten entsprechende Phänotypen aufwies, konnten die Mck- 2-reparierten MCMV-Mutanten für transkomplementative Analysen der pM27-Funktion in der vorliegenden Arbeit verwendet werden.

4.2 Die M27-kodierte Funktion ist sehr spezifisch

Das MCMV-kodierte Protein M27 interagiert mit DDB1 und zweckentfremdet DDB1-CRL- Komplexe zur Inhibition der IFN-induzierten antiviralen Immunantwort. Mit der Expression von pM27 inhibiert MCMV die IFN-Signalkaskade durch die Eliminierung von STAT2. Die pM27-vermittelte Rekrutierung von STAT2 an DDB1, einer Komponente der Cul4A/B-Ub- Ligase-Komplexe, führt zur Ubiquitinierung und proteasomalen Degradation von STAT2 (Trilling et al., 2011; Le-Trilling et al., 2016). Da ΔM27-MCMV mehrere starke Phänotypen besitzt und vorliegende Maus-Daten auf zusätzliche pM27-Funktionen hindeuten, wurde in

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Diskussion

der vorliegenden Arbeit durch heterologe Expression überprüft, ob andere viruskodierte Proteine diese Effekte zumindest teilweise aufheben können (Zimmermann & Trilling et al., 2005; Le-Trilling et al., 2018). Diese gegenseitige Ersetzbarkeit wäre ein sehr starkes Indiz für überlappende biologische Funktionen. Zwei Klassen von Proteinen wurden diesbezüglich untersucht: (I) Proteine aus anderen Cytomegaloviren, die Proteinsequenzhomologien zu pM27 aufweisen (pUL27 und R27) und (II) Proteine, die wie pM27, bekanntlich mit DDB1 interagieren (HBx und WHx).

4.2.1 Die Reinsertion von M27HA unter Kontrolle des exogenen EF1-Promotors revertierte die ΔM27-Phänotypen

Bei der transkomplementativen Analyse zur Evaluierung von überlappenden biologischen Funktionen DDB1-interagierender viraler Proteine diente ΔM27-M27HA als Positiv- Kontrolle. Mithilfe dieser Mutante wurden die Auswirkungen der eingebrachten Genkassette auf die Virus-Replikation und der Effekt der Regulation der Genexpression durch den exogenen, konstitutiv-aktiven EF1-Promotor untersucht. In Gegenwart von ΔM27-M27HA wurde STAT2 degradiert (s. 3.3.1.1, Abb. 13). Ebenso konnte ΔM27-M27HA die IFNλ- induzierte, STAT2-abhängige Aktivität des ISRE-Promotors inhibieren (s. 3.3.1.1, Abb. 14). Die Reinsertion des M27-Gens verminderte die Empfindlichkeit von ΔM27-MCMV gegen- über IFNγ in vitro signifikant (s. 3.3.1.2, Abb. 15, B und C). Eine vollständige Replikations- fähigkeit konnte jedoch nicht erreicht werden. Der Titer des ΔM27-M27HA unterlag dem Titer des M27HA-MCMV nach 3 Tagen höchstsignifikant (p < 0,001). Die Insertion der Genkassette hatte auf die Replikation keinen Einfluss, da ΔM27-M27HA in unbehandelten MNCs ein M27HA-MCMV-ähnliches Wachstum aufwies (s. 3.3.1.2, Abb. 15, A). Die pM27- Regulation durch den artifiziellen EF1-Promotor führte im Vergleich zur MCMV-endogenen Expressionskontrolle möglicherweise zu einer veränderten pM27-Expressionskinetik und - levels. Erste Experimente zeigten, dass ΔM27-M27HA eine frühere und stärkere Expression von pM27HA als M27HA-MCMV aufweisen könnte (Daten nicht gezeigt). Eine frühe, EF1- Promotor-bedingte Überexpression von pM27HA könnte sich in Gegenwart von IFNγ negativ auf das Wachstum von ΔM27-M27HA ausgewirkt haben. Zwar fanden sowohl eine effektive Degradation von STAT2 (s. 3.3.1.1, Abb. 13) als auch eine effektive Inhibition der ISRE- Promotor-Aktivität statt (s. 3.3.1.1, Abb. 14). Jedoch könnte die ungerichtete Überexpression

126 Diskussion

von pM27HA zufolge haben, dass die antiviralen Effekte von IFNγ nicht effektiv durch ΔM27-M27HA kontrolliert wurden. Somit konnte mithilfe der ΔM27-M27HA-Mutante gezeigt werden, dass eine transkomplementative Analyse und Identifikation von pM27-komplementierenden viralen Proteinen möglich ist, da M27HA unter der Kontrolle des EF1-Promotors den Funktionsverlust des deletierten M27 komplementieren konnte.

4.2.2 Die CMV-kodierten Sequenz-Homologa

Für das MCMV-kodierte pM27 ist ein CxCxxC-Motiv für eine effiziente Ko-Präzipitation von DDB1 entscheidend. Diese Aminosäuresequenz ist zwischen den meisten pM27- homologen Proteinen anderer Cytomegaloviren konserviert (Trilling et al., 2011). Mithilfe der im Rahmen dieser Arbeit neu generierten MCMV-Mutanten ΔM27-UL27HA und ΔM27- R27HA wurde untersucht, ob die heterologe Expression der pM27-homologen Proteine aus HCMV und dem nahe verwandten Ratten-CMV die starken ΔM27-Phänotypen zumindest teilweise aufhebt. Dies wäre ein Indiz für überlappende biologische Funktionen der cytomegaloviralen Homologa.

4.2.2.1 Das UL27-Protein aus HCMV konnte die ΔM27-Phänotypen nicht revertieren

In Gegenwart des ΔM27-UL27HA wurde keine Degradation von mSTAT2 beobachtet (s. 3.3.2.1.1, Abb. 17). Obwohl Herpesviren extrem speziesspezifisch sind, kann das MCMV- kodierte pM27 wirtsspeziesübergreifend auch die Degradation von humanem STAT2 vermitteln (Trilling et al., 2011). Vermutlich erkennt es das humane STAT2 anhand von konservierten Sequenzen. Auch wenn das pUL27 nicht für die STAT2-Degradation durch HCMV verantwortlich ist (Le-Trilling et al., 2020; Le et al., 2008), wurde eine schwache Interaktion zwischen pUL27 und DDB1 von unserer Arbeitsgruppe und anderen nachgewiesen (Landsberg et al., Reitsma et al., 2011). In einer Interaktionsstudie unserer Arbeitsgruppe konnte keine Interaktion zwischen pUL27 und STAT2 festgestellt werden (Landsberg et al., 2018). Konsistent mit diesen Befunden wurde hier in einem weiteren Experiment gezeigt, dass pUL27 keinen Einfluss auf die IFNλ-induzierte, STAT2-abhängige Aktivität des ISRE- Promotors besitzt. In dem Luziferase-Assay unterlag ΔM27-UL27HA dem M27HA-MCMV und dem ΔM27-M27HA höchstsignifikant (p < 0,001; s. 3.3.2.1.1, Abb. 18, A). In Gegenwart

127 Diskussion

von ΔM27-UL27HA wurde eine ähnliche Aktivität des ISRE-Promotors ermittelt wie für ΔM27-MCMV und ΔM27-EGFP. In Infektionsexperimenten mit ΔM27-MCMV in STAT2-defizienten Mäusen konnte die Replikationsfähigkeit von ΔM27-MCMV nicht vollständig wiederhergestellt werden. Dies ist ein starkes Indiz für (eine) zusätzliche, bisher unbekannte und STAT2-unabhängige Funkti- on/en von pM27. Diese STAT2-unabhängige Funktion könnte auch im homologen, HCMV- kodierten pUL27 kodiert sein. Da pM27 auch die IFNγ-abhängige Signalkaskade inhibiert, wurde die virale Replikation von ΔM27-UL27HA in IFNγ-behandelten und in unstimulierten Zellen untersucht. Die heterologe Expression von pUL27HA wirkte sich nachteilig auf die ΔM27-MCMV-Replikation in Zellkultur aus und verminderte nicht den antiviralen Effekt von IFNγ auf das virale Wachstum (s. 3.3.2.1.2, Abb. 19, A und B). Das UL27-Protein konnte die M27-kodierten Funktionen unter den hier getesteten Bedingungen nicht komplementieren. Mithilfe einer MCMV-Mutante, die sowohl pM27 als auch pUL27HA exprimiert, wurde untersucht, ob pUL27 die pM27-vermittelte STAT2-Degradation beeinflusst. Da STAT2 in den MCMV-UL27HA-infizierten Zellen nach 24 h per Western-Blot nicht nachweisbar war (s. 3.3.2.1.3, Abb. 20), kann ein starker, kompetitiver Effekt von pUL27HA auf die pM27- vermittelte STAT2-Degradation ausgeschlossen werden. Dieses Ergebnis ist kongruent zu den Transfektionsexperimenten unserer Arbeitsgruppe, in denen pUL27 im Vergleich zu pM27 wenn überhaupt äußerst schwach mit DDB1 interagiert (Landsberg et al., 2018). Im CxCxxC- Motiv, welches in pM27 für die Interaktion mit DDB1 essentiell ist, liegt bei pUL27 auch eine Mutation des dritten Cysteins zu einem Glycin vor. Dies könnte ein Grund für die stark beeinträchtigte Interaktion darstellen. Allerdings wurde dem UL27-Protein eine Funktion zugeschrieben, die für die proteasomale Degradation von TIP60 notwendig und ausreichend ist (Reitsma et al., 2011). In ihrer Interaktionsstudie identifizierten Reitsma und Kollegen u. a. auch UBR5 als Interaktionspartner von pUL27. Bei UBR5 handelt es sich um eine E3- Ubiquitin-Ligase. Das E6-Onkogen des Humanen Papillomavirus (HPV) zweckentfremdet UBR5 zur Destabilisierung von TIP60 (Subbaiah et al., 2016). In einer Interaktionsstudie konnte unsere Arbeitsgruppe für die herpesviralen Proteine pM27, pE27 (MuHV-8) und pR27 (MuHV-2) auch eine Interaktion mit UBR5 nachweisen. Der Fakt der evolutionären Konser- vierung der Interaktion mit UBR5 durch verschiedene Herpesviren attestiert der Interaktion einen Selektionsvorteil für die Virus-Replikation in vivo (Landsberg et al. 2018).

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Um eine überlappende, STAT2-unabhängige Funktion von pUL27 und pM27 zu identifizieren, könnte man in weiterführenden Experimenten nach Übereinstimmungen im Interaktom von UBR5 in pUL27HA- bzw. pM27HA-transfizierten Zellen suchen. Dies könnte ggf. zur Identifizierung von zellulären Restriktionsfaktoren führen, die sowohl durch pM27 als auch durch pUL27 über die E3-Ub-Ligase UBR5 destabilisiert werden. Auch wenn es Hinweise gibt, dass pUL27 aus HCMV ebenfalls wie pM27 aus MCMV das UPS der Wirtszelle zweckentfremdet, konnte hier keine funktionelle Homologie zwischen den beiden Proteinen gefunden werden. Die Homologie der beiden cytomegaloviralen Proteine beschränkt sich auf die Lokalisation innerhalb des CMV-Genoms sowie auf eine gewisse Proteinsequenzhomologie.

4.2.2.2 Das R27-Protein aus MuHV-2 konnte die pM27-Funktion nicht ersetzen

In der vorliegenden Arbeit wurde mithilfe der heterologen Expression von pR27HA durch ΔM27-MCMV überprüft, ob pR27 die starken Phänotypen der M27-Deletionsmutante zumindest teilweise abschwächen und somit Anhaltspunkte zu überlappenden biologischen Funktionen der homologen Proteine liefern kann. Das ΔM27-R27HA vermittelte keine Degradation von STAT2 (s. 3.3.2.2.1, Abb. 21). Ob dennoch eine Interaktion zwischen dem murinen STAT2 und pR27 stattfindet, die Einfluss auf die STAT2-abhängige IFNλ-Signaltransduktion nimmt, wurde mithilfe eines weiteren Experiments untersucht. Dabei wurde in einem Luziferase-Assay die Aktivität des ISRE- Promotors in ΔM27-R27HA-infizierten Zellen mit derjenigen verglichen, die in ΔM27- MCMV- bzw. ΔM27-M27HA-infizierten Zellen ermittelt wurde. Die in ΔM27-R27HA- infizierten Zellen gemessenen Werte unterschieden sich nicht signifikant von denen in ΔM27- MCMV- und ΔM27-EGFP-infizierten Zellen. Die Mutante unterlag jedoch den beiden M27- positiven MCMVs (M27HA-MCMV und ΔM27-M27HA) signifikant (s. 3.3.2.2.1, Abb. 22). Zudem wurde für ΔM27-R27HA ein im Vergleich zum ΔM27-MCMV vermindertes Wachs- tum (in unbehandelten Zellen) beobachtet (s. 3.3.2.2.2, Abb. 23, A). Eine Abschwächung der Sensitivität gegenüber IFNγ durch die Expression von pR27HA blieb ebenfalls aus (s. 3.3.2.2.2, Abb. 23, B). Eine Komplementation der pM27-Funktionen wurde unter den getesteten Bedingungen für das RCMV-kodierte Sequenz-Homolog pR27 demnach also nicht festgestellt. Die hier

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durchgeführte vergleichende Analyse der beiden CMV-kodierten Homologe legte weitere Unterschiede offen. Im Gegensatz zu pM27 wurde für pR27HA im Western-Blot neben einer stark ausgeprägten Proteinbande zusätzlich vier kleinere Signale detektiert (s. 3.3.2.2.1, Abb. 21). Da für pM27HA nur eine Bande detektiert wurde, könnten die verschiedenen Protein-Banden ein Indiz für mehrere pR27-Isoformen sein, die eine andere bzw. mehrere Funktionen besitzen. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass pR27HA aufgrund eines fehlenden stabilisierenden Faktors, der durch RCMV kodiert wird, seine Proteinfunktion unter den getesteten Bedingungen nicht voll entfalten konnte. Da es sich bei der Maus nicht um den natürlichen Wirt von RCMV handelt, wäre es möglich, dass die Prozessierung von pR27HA in murinen Zellen nicht optimal verläuft. Dies könnte experimentell durch die parallele Infektion von Maus- und Ratten-Fibroblasten mit ΔM27-R27HA überprüft werden. Der anschließende Nachweis der Proteinbanden per Western-Blot könnte Aufschluss über mögliche speziesspezifische Barrieren der Proteinsynthese liefern. Neben der hier gezeigten funktionellen Verschiedenheit der beiden CMV-homologen Proteine pR27 und pM27 wurde zudem durch eine Interaktionsstudie unserer Arbeitsgruppe deutlich, in der pR27HA im Vergleich zu pM27 lediglich eine schwache Interaktion mit DDB1 aufwies (Landsberg et al., 2018). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine Komplementation der pM27-Funktion durch pR27 in der vorliegenden Arbeit nicht nachgewiesen wurde. Daraus lässt sich schließen, dass die beiden Proteine pM27 und pR27 sehr wahrscheinlich unterschiedliche biologische Funktionen besitzen.

4.2.2.3 Die Proteine R27 (MuHV-2) und E27 (MuHV-8) scheinen sich hinsichtlich ihrer funktionellen Homologie mit pM27 voneinander zu unterscheiden

In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass pR27 aus MuHV-2 die pM27-Funktion in ΔM27-MCMV nicht komplementieren und die ΔM27-Phänotypen nicht abschwächen kann. In Interaktionsstudien unserer Arbeitsgruppe wurde die Bindungsstärke der cytomegaloviralen Proteine pM27, pR27 (aus RCMV-Maastricht) und pE27 (aus RCMV-England) miteinander verglichen. Während das pR27 nur eine schwache Interaktion mit DDB1 aufwies, wurde für pE27:DDB1 eine ähnlich starke Bindung nachgewiesen wie für pM27:DDB1. Erste experimentelle Befunde deuten darauf hin, dass pM27 und pE27 funktionelle Analoga sind

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(unveröffentlichte Daten). Ob pE27 die pM27-Funktionen in einer M27-defizienten MCMV- Mutante komplementieren würde, konnte aus zeitlichen Gründen in der experimentellen Phase der vorliegenden Arbeit leider nicht geklärt werden. Ein für die BAC-Mutagenese benötigtes Insertionsplasmid wurde jedoch bereits erfolgreich kloniert.

4.2.3 Die hepadnaviralen DDB1-interagierenden Proteine HBx und WHx sind keine Funktionshomologa von pM27

Die beiden Proteine HBx (HBV) und sein Murmeltier-Hepadnavirus-Homolog WHx (WHV) interagieren mit DDB1 (Li et al., 2010). Die Interaktion des X-Proteins mit DDB1 ist sowohl für die Replikation von HBV (Leupin et al., 2005; Hodgson et al., 2012) als auch von WHV (Sitterlin et al., 2000) essenziell. HBx nutzt diese Interaktion, um den proteasomalen Abbau von Smc5/6 zu induzieren (Murphy et al., 2016). Für WHx ist bisher kein Substrat beschrieben worden. Mithilfe des Inhibitors MLN4924 kann sowohl die Replikation von MCMV als auch von HBV in Zellkultur gehemmt werden (Le-Trilling et al., 2016; Sekiba et al., 2018). Beide Viren sind daher stark von aktiven CRLs abhängig. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob die Expression der hepadnaviralen Proteine HBx und WHx die starken Phänotypen von ΔM27-MCMV abschwächen können. Dies würde auf ähnliche biologische Funktionen hindeuten. In Gegenwart von ΔM27-HBxHA bzw. ΔM27-WHxHA wurde STAT2 nicht degradiert (s. 3.3.3.1.1, Abb. 24 und 3.3.3.2.1, Abb. 28), d. h. der pM27-Funktionverlust konnte durch die Expression der beiden hepadnaviralen Proteine hinsichtlich des STAT2-Abbaus nicht kompensiert werden. IFNλ induziert die Aktivierung des ISRE-Promotors über eine STAT2-abhängige Signal- kaskade. Da die M27-Deletionsmutante im Gegensatz zum wt-MCMV diesen Signalweg nicht blockieren kann, wurde mithilfe der beiden MCMV-Mutanten ΔM27-HBxHA bzw. ΔM27-WHxHA untersucht, ob die heterologe Expression der beiden Proteine die ISRE- Promotor-Aktivität und den vorgeschalteten Jak-STAT-Signalweg beeinflusst. Nach der Infektion mit ΔM27-HBxHA- bzw. ΔM27-WHxHA wurde sowohl in unbehandelten als auch in IFNλ-stimulierten Zellen signifikant höhere ISRE-Promotor-Aktivitäten im Vergleich zu ΔM27-MCMV-infizierten Zellen ermittelt (s. 3.3.3.1.1, Abb. 25 [A] und 3.3.3.2.1, Abb. 29 [A]). Allerdings war die relative Luziferase-Aktivität nach der Infektion mit ΔM27-HBxHA

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bzw. ΔM27-WHxHA geringer als bei ΔM27-MCMV, jedoch höher als bei den STAT2- degradierenden Mutanten M27HA-MCMV und ΔM27-M27HA (s. 3.3.3.1.1, Abb. 25 [B] und 3.3.3.2.1, Abb. 29[B]). Aus diesen Daten lässt sich schließen, dass es wahrscheinlich keine überlappende Funktion zwischen HBx, WHx und pM27 hinsichtlich der Inhibition der IFNλ- Signaltransduktion gibt. Die signifikant höhere ISRE-Aktivität in Gegenwart von HBx (und WHx), die hier beobachtet wurde, lässt auf eine steigende Wirkung von HBx auf die IFN- Signaltransduktion schließen. Die hier gemachten Beobachtungen könnten mit den Ergebnis- sen von Yang und Kollegen in Relation stehen, die in Hepatoma-Zellen nach der Transfektion von mit einem HBx-exprimierenden Lentivirus und anschließender Behandlung mit IFNα eine signifikant erhöhte Expression der antiviralen Gene IFNAR1, IFNAR2, IFN-stimulierter Genfaktor 3 (ISGF3) sowie der Doppelstrang-RNA aktivierten Proteinkinase und Ribonukle- ase L (RNase L) ermittelten (Yang et al., 2017). Darüber hinaus aktiviert die Expression von HBx die Phosphorylierung von STAT1 und etabliert so einen antiviralen Zustand in hepato- zellulären Karzinomzellen (Park et al., 2009). Möglicherweise wirken HBx und WHx wie PAMPs oder tragen zur Inaktivierung eines negativen Feedback-Inhibitors bei. Ob ΔM27- HBxHA- bzw. ΔM27-WHxHA ebenfalls die Expression der Komponenten der Jak-STAT- Signalweiterleitung in Mauszellen steigern, könnte in weiterführenden Experimenten untersucht werden. Dazu könnte mithilfe eines Western-Blots und einer Real-Time-PCR untersucht werden, ob die in ΔM27-HBxHA- bzw. ΔM27-WHxHA-infizierten Zellen vorliegenden Proteinmengen (z. B. von IFNAR1, ISGF3, RNase L) bzw. die Anzahl der Transkripte im Vergleich zu denen in ΔM27-MCMV-infizierten Zellen erhöht sind. Alles in allem konnte in der vorliegenden Arbeit durch die Untersuchung der ISRE-Aktivität nach Infektion mit ΔM27-HBxHA- bzw. ΔM27-WHxHA gezeigt werden, dass HBx und WHx die pM27-Funktion nicht kompensieren, sondern sogar einen gegenteiligen Effekt auf die IFNλ-Signaltransduktion aufweisen, indem sie die ISRE-Aktivität per se verstärken. Daher ist es nicht möglicherweise überraschend, dass die Expression der beiden Proteine HBx und WHx sich jeweils negativ auf die Replikation von ΔM27-MCMV auswirkte (s. 3.3.3.1.2 Abb. 26 [A] bzw. 3.3.3.2.2 Abb. 30 [A]) und darüber hinaus die Empfindlichkeit der M27- Deletionsmutante gegenüber IFNγ verstärkte (s. 3.3.3.1.2 Abb. 26 [B] bzw. 3.3.3.2.2 Abb. 30 [B]). Diese Ergebnisse könnten damit erklärt werden, dass die Expression von HBx zu einer erhöhten Aktivierung von STAT1 führt (Park et al., 2009). Das phosphorylierte STAT1

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aktiviert sowohl die durch ISRE- als auch die durch IFNγ-aktivierte Sequenzen (GAS)- vermittelte Transkription von antiviralen ISGs. Daher würde eine durch HBx bzw. WHx bedingte Aktivierung von STAT1 zu einem stärkeren antiviralen Effekt der IFNγ-Stimulation führen. Dies könnte den vorliegenden Phänotyp der beiden Mutanten erklären. Zudem führt eine MCMV-Infektion per se zur Induktion von IFNγ sowie einer verlängerten STAT1- Phosphorylierung (Trilling et al., 2014). Unsere Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass die Kodierungskapazität von M27 dabei keine Rolle spielt (Trilling et al., 2014). Mithilfe einer MCMV-Mutante, welche sowohl pM27 als auch HBxHA exprimiert, konnte gezeigt werden, dass die HBxHA-Expression keinen Einfluss auf die pM27-vermittelte Degradation von STAT2 hat (s. 3.3.3.1.3, Abb. 27). Da es sich bei beiden Proteinen um DBB1-Interaktionspartner handelt, wäre eine mögliche Kompetition um die DDB1- Bindestelle sehr plausibel gewesen. Allerdings fiel die häufig publizierte Interaktion zwischen HBx und DDB1 in den Interaktionsstudien unserer Arbeitsgruppe im Vergleich zur pM27:DDB1-Interaktion relativ schwach aus (Landsberg et al., 2018). Daher ist es möglich, dass die starke Affinität von pM27 zu DDB1 diejenige zwischen HBx und DDB1 in ΔM27- HBxHA-infizierten Zellen übertrifft und dazu führt, dass zwar HBxHA in hohem Maße exprimiert wird, pM27 jedoch durch seine höhere Affinität so dominant ist, dass es HBx das DDB1 einfach entzieht. Ob in MCMV-HBx-infizierten Zellen neben der STAT2-Abbau vermittelnden pM27:DDB1-Interaktion auch eine Interaktion zwischen HBx und DDB1 stattfindet, könnte per Western-Blot untersucht werden. Nur wenn eine Interaktion mit DDB1 stattfindet, kann HBX die Degradation bekannter Restriktionsfaktoren wie SMC6, STIM1, ZEB2 und PSME4 vermitteln (Minor et al., 2020). Alles in allem konnte gezeigt werden, dass die Expression der hepadnaviralen Proteine HBx und WHx keine abschwächende Wirkung, sondern sogar verstärkende Effekte auf die ΔM27- Phänotypen besitzt. Eine funktionelle Homologie wurde daher in der vorliegenden Arbeit nicht festgestellt. Die DDB1-interagierenden Proteine HBx, WHx und pM27 dienen ihren Viren zwar allesamt zur Ausbeutung des UPS und zur Steigerung der Virusreplikation, doch die jeweils adressierten Restriktionsfaktoren scheinen sich voneinander zu unterscheiden.

133 Diskussion

4.2.4 Das STAT2-degradierende Protein aus HCMV ist kein Sequenz-Homolog

Kürzlich ist es unserer Arbeitsgruppe gelungen, das Gen zu identifizieren, welches für die HCMV-vermittelte STAT2-Degradation verantwortlich ist: UL145 (Le-Trilling & Becker et al., 2020). Das UL145-Gen kodiert für zwei Proteinformen, die aufgrund ihrer unterschiedlichen Längen als „pUL145s“ und „pUL145l“ (von engl. short [s] bzw. long [l] variant) bezeichnet werden. Beide Isoformen rekrutieren DDB1-enthaltende Ub-Ligasen, um die proteasomale Degradation von STAT2 zu induzieren. Eine Sequenzanalyse von pUL145 offenbarte ein virales (v)DCAF-ähnliches Bindungsmotiv, welches die DDB1- Interaktionsoberfläche von zellulären Substrat-Rezeptoren DDB1-enthaltender Ubiquitin- Ligasen nachahmt. DCAF-Proteine bilden eine Familie von Substrat-Rezeptoren für DDB1/Ub-Ligase-Komplexe und bestimmen die Substraterkennung (Lee & Zhou, 2007). Das Bindungsmotiv zeigte Übereinstimmungen zum H-Box Motiv, welches bereits für andere viruskodierte DDB1-bindende DCAFs beschrieben wurde, u. a. HBx aus HBV (Li et al., 2010). Durch Mutationsanalysen wurde die Relevanz des DCAF-ähnlichen DDB1- Bindungsmotivs für die Protein-Funktion von pUL145 bestätigt (Le-Trilling et al., 2020). Aufgrund der funktionellen Relevanz der H-Box für pUL145 wurde in dem MCMV-kodierten pM27 und seinen Homologen (pUL27, pR27 und pE27) nach einem ähnlichen Motiv gesucht und gefunden, jedoch ist die Relevanz dieses Motivs für die pM27-kodierte Proteinfunktion bislang ungeklärt (Becker, 2020). Demnach wäre HBx möglicherweise ein Funktionsanalogon zu pM27, da die Proteine wahrscheinlich beide über ein H-Box-Motiv mit DDB1 interagieren.

4.2.5 Transkomplementationsanalysen zur Identifikation überlappender Funk- tionen

MCMV kodiert kein pUL145-Homolog und das HCMV-kodierte pUL27 interagiert wiederum nur schwach mit DDB1 und ist für die STAT2-Degradation entbehrlich (Landsberg et al., 2018, Le et al., 2008). Diese beiden Beispiele zeigen deutlich, dass aufgrund der Nomenklatur und gewisser Sequenzhomologien von Genen allein keine direkten Schlüsse über die Protein- Funktion CMV-homologer Proteine gezogen werden können. Das pR27 aus dem RCMV Maastricht-Stamm zeigt unter den hier getesteten Bedingungen keine Komplementation von pM27.

134 Diskussion

Weitere Studien zu überlappenden Proteinfunktionen viraler Proteine könnten zur Identifizie- rung bisher unbekannter viraler DCAFs beitragen. Die in der vorliegenden Arbeit in vitro durchgeführten Experimente der Proteine pUL27, pR27, HBx und WHx deuteten zwar auf keine überlappenden Funktionen mit dem MCMV-kodierten pM27 hin, jedoch kann ein komplementierender Effekt in vivo aufgrund fehlender Daten nicht ausgeschlossen werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden bereits Insertionsplasmide kloniert, um eine Transkomplementationsanalyse mit den DDB1-interagierenden, HIV-1 und HIV-2 -kodierten Proteinen Vpr und Vpx durchzuführen. Aus zeitlichen Gründen konnte die Klonierung der MCMV-Mutanten (ΔM27-Vpr1, ΔM27-Vpr2 und ΔM27-Vpx) jedoch leider nicht fertigge- stellt werden. Kürzlich wurde das bereits zugelassene Medikament Nitazoxanid (NTZ) als Inhibitor der HBx:DDB1-Interaktion identifiziert (Sekiba et al., 2019). In primären humanen Hepatozyten, die natürlich mit HBV infiziert worden waren, wurden in Gegenwart von NTZ die Protein- mengen von SMC5/6 signifikant wiederhergestellt und die HBV-Transkription von der cccDNA unterdrückt (Sekiba et al., 2019). Diese zielgerichtete Inhibierung einer Protein- Interaktion zwischen einer viralen und einer zellulären Komponente stellt nicht nur einen Fortschritt zur Entwicklung eines therapeutischen Agens zur funktionellen Heilung der Hepatitis B dar. Andere DDB1-interagierende Proteine könnten möglicherweise ebenfalls durch NTZ an ihrer Interaktion mit DDB1 gehindert werden. Neue Strukturdaten aus Ko- Kristallisationsstudien können ein tieferes molekulares Verständnis der Protein-Interaktion liefern und so als Grundlage für die Entwicklung zielgerichteter antiviraler Therapien dienen.

4.3 MCMV als prophylaktischer Vakzinvektor gegen HBV in der Maus

Mithilfe CMV-basierter Vakzinvektoren konnten bereits Impfstoffe gegen verschiedene infektiöse Krankheiten und Krebs entwickelt werden (Wilski et al., 2019). Die klinische Translation der Forschungsergebnisse aus Tiermodellen ermöglicht die Optimierung neuer Formen von Immunantworten und liefert somit verbesserte Ansätze zur Entwicklung von Impfstoffen gegen bisher resistente Pathogene. CMV-Vakzinvektoren induzieren eine atypische, weit über die Latenzphase hinaus stattfindende Akkumulation hochspezifischer

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CD8+ T-Zellen (Klenerman, 2018). Allerdings sind bis heute keine der HCMV- Rekombinanten oder attenuierten Stämme als Impfvektoren in der Klinik zugelassen. Tiermodelle bieten eine gute Möglichkeit, mehr über die Wirkungsweisen und Risiken von CMV-Vektoren als Impfstoffe zu lernen. In der vorliegenden Arbeit wurden virulente (Δm157p-MCMV, kurz „MCMV“) und attenuierte (ΔM27-MCMV) HBV-Antigen (HBx und sHBsAg) exprimierende Vakzinvektoren konstruiert und auf ihr protektives Potential untersucht.

4.3.1 Die prophylaktische Vakzinierung mit MCMV-HBx verlängert die HBe- Antigenämie von HBV im HDI-Mausmodell

In einem prophylaktischen Vakzin-Experiment mit MCMV-HBx wurde nach anschließender H. I. eines replikationsfähigen HBV-Genoms die ELISA-Titer der HBV-Antigene HBsAg und HBeAg im Blut von Mäusen ermittelt. Im Vergleich zu den Kontrollgruppen, die entweder mit PBS oder MCMV vakziniert wurden, wurde nach der Impfung mit MCMV- HBx eine länger anhaltende HBe-Antigenämie festgestellt. Der Unterschied zwischen MCMV und MCMV-HBs war dabei signifikant (p < 0,05) (s. 3.4.1). In einer natürlichen Infektion gibt der HBeAg-Titer indirekt Aufschluss über die Replikationsrate von HBV (https://www.rki.de/DE/Content/Infekt/EpidBull/Merkblaetter/Ratgeber_HepatitisB.html). Die vorzeitige Expression von HBx durch MCMV begünstigte möglicherwiese die HBV- Genexpression und virale Replikation in den Hepatozyten. Die heterologe Expression von HBx durch MCMV würde demnach die HBV-Infektion fördern und die Maus nicht im Sinne eines Impfstoffes schützen. Ob HBx per se kein geeignetes Antigen zum Schutz gegen HBV im HDI-Modell in der Maus ist, könnte durch ein weiteres Experiment untersucht werden. Im HBV hydrodynamischen Injektionsmodell verschwinden die HBV-Antigene nach 7 Tagen aus dem Blut der Maus parallel zum Auftauchen antiviraler Antikörper (Yang et al., 2002). Die HBV-Transkripte und DNA sind nach 15 Tagen nach dem Auftauchen antiviraler CD8+ T-Zellen nicht mehr in der Leber nachweisbar (Yang et al., 2002). In Experimenten mit immunschwachen Maus-Stämmen, welche keine funktionellen B-Zellen, T-Zellen oder Natürliche Killerzellen besitzen (sog. Nod/SCID-Mäuse), persistiert die HBV-Genexpression und DNA-Replikation hingegen noch nach 81 Tagen (Yang et al., 2002). Der Ausgang der H. I. von HBV hängt also von der Immunantwort des Wirtes ab. Die prophylaktische Impfung

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mit MCMV-HBx induzierte keine signifikant schnellere Abnahme der HBV-Antigenämie und verlängerte die Präsenz von HBeAg im Blut. Der attenuierte Vakzinvektor ΔM27-HBx könnte aufgrund des fehlenden Interferonantagonisten hinsichtlich der induzierten Immunan- twort vom MCMV-HBx unterscheiden. In Abwesenheit des IFN-Antagonisten pM27 könnte sich möglicherweise eine stärkere Immunantwort bilden, die zu einem effizienteren Immun- gedächtnis führen könnte. Wie die transkomplementativen Analysen in der vorliegenden Arbeit gezeigt haben, wurde die Attenuierung von ΔM27-MCMV selbst dann nicht aufgeb- hoben, als pM27-analoge und -homologe Proteine heterolog exprimiert wurden. Diese Eigenschaft macht ΔM27-MCMV zu einem sicheren Vakzinvektor in der Maus.

4.3.2 MCMV-Impfvektoren schützen vor HBV in der Maus

Das HBx ist ein intrazelluläres Protein (Hoare et al., 2001). Die infizierte Zelle präsentiert auf ihrer Oberfläche Peptidfragmente des intrazellulären Proteoms. Auf diese Weise können Immunzellen virale Antigene erkennen, die infizierte Zelle eliminieren und somit die Infektion eindämmen (Croft et al., 2019). Jedoch sind Antikörper, die HBx erkennen, nicht in der Lage, das Virion vor dem Zelleintritt zu erkennen, da HBx kein Struktur- bzw. Oberflä- chenprotein des Hepatitis B-Virions darstellt. Viele Impfstoffe beinhalten daher Oberflächen- proteine des Erregers, gegen die von B-Zellen Antikörper gebildet werden können. Wenn ein funktionsrelevanter Teil des Virusproteins von dem Antikörper gebunden wird, kann das Virion durch den Antikörper bereits vor dem Zelleintritt neutralisiert werden. Das Oberflä- chenprotein „HBsAg“ aus HBV ist sehr immunogen. Daher beruht der weltweit verwendete Impfstoff, der Menschen vor einer HBV-Infektion schützt, auf dem HBsAg. Aus diesem Grund wurden in der vorliegenden Arbeit zusätzlich MCMV-Vektoren generiert, die das kurze Oberflächenprotein von HBV (sHBsAg) exprimieren: MCMV-sHBsAg und ΔM27- sHBsAg (s. 3.4.2, Abb. 32, A). Die beiden sHBsAg-exprimierenden Impfvektoren konnten problemlos in vitro vermehrt werden (s. 3.4.2, Abb. 32, B). Das ΔM27-sHBsAg wies im Gegensatz zum MCMV-sHBsAg in vivo eine starke Attenuierung auf (s. 3.4.2, Abb. 33, A bzw. B). Eine Replikation des ΔM27-sHBsAg konnte 3 Tage nach der Vakzinierung jedoch in der Milz festgestellt werden (Daten nicht gezeigt). Nach der Sicherstellung der Antigenexpression und der Replikationsfähigkeit der Vakzinvek- toren wurden in Mäusen induzierbare Immunantworten untersucht. In einem Vakzinierungs-

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experiment wurde das Anti-HBsAg IgG detektiert, welches innerhalb von 15 Wochen in dem Blut der behandelten Mäuse vorlag. Die Impfung mit ΔM27-sHBsAg führte zu keinen detektierbaren Anti-HBsAg IgG Titern. Allerdings induzierte das stärker replizierende MCMV-sHBsAg die Bildung spezifischer Antikörper. Der Anti-HBsAg IgG-Titer stieg dabei über den gemessenen Zeitraum stetig an (s. 3.4.3.1, Abb. 34). Die MCMV-Vektor-induzierte Produktion von Antikörpern gegen ein Fremd-Antigen wurde auch für die heterologe Expression von Tetanus-Toxin-Fragmenten in der Maus beobachtet (Tierney et al., 2012). Zudem steigen die MCMV-spezifischen IgG-Level stetig nach einer MCMV-Infektion auch während der Latenzphase weiter an und bleiben lange Zeit erhalten (Welten et al., 2016). Das virulente MCMV-sHBsAg und das attenuierte ΔM27-sHBsAg unterscheiden sich offensichtlich in ihrer Immunogenität bzgl. fremder Antigene. Vermutlich reichte die sHBsAg- Genexpression durch das attenuierte ΔM27-sHBsAg nicht aus, um eine humorale Antwort gegen HBsAg in den vakzinierten Mäusen hervorzurufen. Die hier beobachteten Auswirkun- gen der M27-Defizienz auf die humorale Antwort gegen fremde Antigene könnte das rationale Design von CMV-basierten Vakzinen beeinflussen, falls diese eine Antikörper- Produktion induzieren sollen. Des Weiteren wurde in einem prophylaktischen Ansatz untersucht, ob die Vakzinierung mit MCMV-sHBsAg oder ΔM27-sHBsAg zu einer verringerten HBV-Antigenämie im HBV hydrodynamischen Injektionsmodell in der Maus führt (s. 3.4.3.2). Sowohl das MCMV- sHBsAg als auch das ΔM27-sHBsAg senkten die HBV-Antigenämie (HBs- und HBe- Antigenämie) nach 7 bzw. 9 Tagen nach H.I. signifikant im Vergleich zu den Kontrollen PBS und MCMV (s. 3.4.3.2, Abb. 35, B und C). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sowohl das virulente MCMV-sHBsAg als auch das attenuierte ΔM27-sHBsAg erfolgreich die HBV- Antigenämie herunter reguliert. Klinischen und experimentellen Befunden zufolge können Patienten mit einer chronischen HBV-Infektion durchaus die HBV-Replikation und die Progression der Leberschädigung kontrollieren, auch wenn diese keine antivirale Behandlung erhalten. Das Ausmaß und die Qualität der Immunantwort haben einen großen Einfluss auf den Krankheitsverlauf bei einer chronischen HBV-Infektion. Bei chronischen Patienten, die die HBV-Replikation und die Schädigungen der Leber kontrollieren können, wurde im Vergleich zu Patienten mit starker HBV-Replikation und fortschreitender Leberschädigung ein höherer Anteil an HBsAg- und

138 Diskussion

HBcAg-spezifischen zytotoxischen T-Zellen nachgewiesen (Maini et al., 2000). Mithilfe des in der vorliegenden Arbeit verwendeten HBV-Mausmodells könnte in einem weiteren Experiment das Schutzpotential eines MCMV-Impfvektors untersucht werden, der das HBV- Antigen HBcAg exprimiert. Zudem sind Ansätze des hydrodynamischen Injektionsmodells verfügbar, mit denen sich eine chronische HBV-Infektion in Mäusen abbilden lässt (Preston et al., 2016). Unsere Kooperationspartner Dr. H. Huang und Dr. J. Liu nutzten eines dieser chronischen HBV-Mausmodelle und konnten zeigen, dass die in der vorliegenden Arbeit generierten Impfvektoren nicht nur prophylaktisch, sondern auch therapeutisch gegen HBV in der Maus wirken (Huang & Rückborn et al., 2020). Da CMV in der Lage ist, ungewöhnliche und inflationäre T-Zell-Antworten zu generieren, wäre ein Erfolg in der Therapie der chronischen Hepatitis B durch einen HBV-Antigen- exprimierenden HCMV-Vakzinvektor denkbar. T-Zell-Antworten scheinen eine essentielle Rolle bei der Elimination einer HBV-Infektion zu spielen. Während HBV-spezifische T-Zell- Antworten schon längst in Patienten auftreten, deren Immunsystem die HBV-Infektion nach der akuten Phase unter Kontrolle bringt, sind die HBV-spezifischen T-Zellen chronisch infizierter Patienten nicht ausreichend und funktionell beeinträchtigt (Protzer et al., 2012). T- Zellen eliminieren HBV-infizierte Zellen durch ihre zytotoxische Aktivität, aber kontrollieren die HBV-Genexpression und-Replikation auch auf eine nicht-zytolytische Weise (Guidotti et al., 2002). Aufgrund von Bedenken bzgl. der Biosicherheit von HCMV-basierten Impfvekto- ren in immunkompromittierten Patienten sind bis heute jedoch keine der attenuierten HCMV- Stämme und -Rekombinanten als Impfvektoren in der Klinik zugelassen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl der virulente MCMV-sHBs als auch der attenuierte ΔM27-sHBs-Vektor in der Lage sind, Mäuse vor HBV im Hydrodynamischen Injektions- modell zu schützen. Möglicherweise wäre eine HCMV-Mutante, welcher der ORF des pM27- analogen STAT2-Antagonisten pUL145 fehlt (Le-Trilling et al., 2020), ein interessanter Kandidat für lebend-attenuierte Vakzin-Plattformen im Menschen.

139 Zusammenfassung

5 Zusammenfassung

Viren haben im Laufe der Evolution mannigfaltige Immunevasionsmechanismen entwickelt, um den Restriktionsfaktoren des Wirtes entgegenzuwirken. Um eine effiziente Replikation zu ermöglichen, kodieren viele Viren für Adapter-Proteine, die das zelluläre DNA damage- binding Protein 1 (DDB1) und assoziierte Cullin-RING-Ligase-Komplexe ausnutzen und für die proteasomale Degradation von antiviralen Restriktionsfaktoren zweckentfremden. Ziel dieser Arbeit war es, die biologischen Funktionen von verschiedenen, viralen DDB1- interagierenden Proteinen zu untersuchen. Mittels Transkomplementationsanalyse wurde studiert, ob ein wichtiges DDB1-interagierendes Protein durch die heterologe Expression sequenzhomologer oder funktionell analoger Proteine aus anderen Viren ersetzt werden kann. Im Mittelpunkt der Studie stand die Deletionsmutante des murinen Cytomegalovirus (MCMV), welche aufgrund des Funktionsverlustes des DDB1-interagierenden Proteins M27 nicht mehr in der Lage ist, die Interferon (IFN)-induzierte Immunantwort zu inhibieren und deshalb sehr stark attenuiert ist. Zunächst wurden per BAC-Mutagenese virale Fremdgene, die für (I) sequenzhomologe, cytomegalovirale Proteine (pUL27 [HHV-5] und pR27 [MuHV-2]) und (II) bekannte DDB1-interagierende Virusproteine (HBx [HBV] und WHx [WHV]) kodieren, in das MCMV-Genom eingebracht. Mithilfe der Mutanten ΔM27-M27HA, ΔM27- UL27HA, ΔM27-R27HA, ΔM27-HBxHA und ΔM27-WHxHA wurde analysiert, ob der ΔM27-Phänotyp zumindest teilweise durch diese heterologe Expression kompensiert wird. Keines der fremd exprimierten viralen Proteine minderte die Phänotypen von ΔM27-MCMV. Ausschließlich die Reinsertion von M27 stellte die Degradation von STAT2, die Inhibition der IFN-induzierten Signaltransduktion und die relative Unempfindlichkeit gegenüber IFNγ wieder her. Zusätzlich beeinträchtigte die heterologe Expression von pUL27HA, pR27HA, HBxHA und WHxHA die Replikationseffizienz von ΔM27-MCMV. Die Infektion mit ΔM27-HBxHA und ΔM27-WHxHA führte sogar zu einer vergleichsweise höheren Aktivität des ISRE-Promotors. Die Studie legt nahe, dass pM27 ein hochspezialisiertes Protein ist, dessen Funktion weder durch die Sequenz-Homologe pUL27 bzw. pR27 noch durch die hepadnaviralen DDB1-interagierenden Proteine HBx und WHx komplementiert werden. Die M27-Deletionsmutante ist stark attenuiert. Anhand der Transkomplementationsanalyse wurde deutlich, dass dieser Zustand sehr stabil ist, selbst bei Expression fremder, homologer oder

140 Zusammenfassung

analoger Virusproteine. Daher scheint ΔM27-MCMV ein geeigneter Vakzinvektor in der Maus zu sein. In der vorliegenden Arbeit wurden außerdem M27-positive und M27-defiziente MCMV-Vektoren generiert, welche das immunogene HBsAg von HBV exprimieren. Es konnte gezeigt werden, dass eine prophylaktische Vakzinierung sowohl mit MCMV-HBsAg als auch mit ΔM27-HBsAg im hydrodynamischen Injektionsmodell in der Maus vor HBV schützt. Die Vakzinierung mit MCMV-HBx zeigte hingegen keinen schützenden Effekt gegen HBV.

141 Summary

5 Summary

During evolution, viruses have developed multiple immune evasion mechanisms to counteract the host's restriction factors. To enable efficient replication, many viruses encode adapter proteins that exploit cellular DNA damage-binding protein 1 (DDB1) and associated cullin- RING ligase complexes and alienate them for proteasomal degradation of antiviral restriction factors. The aim of this work was to investigate the biological functions of different viral DDB1-interacting proteins. By means of transcomplementation analysis, we studied whether an important DDB1-interacting protein can be replaced by the heterologous expression of sequence homologous or functionally analogous proteins from other viruses. The study focused on the deletion mutant of the murine cytomegalovirus (MCMV), which is no longer able to inhibit the interferon (IFN)-induced immune response due to the loss of function of the DDB1-interacting protein M27 and is therefore highly attenuated. First, foreign viral genes coding for (I) sequence-homologous cytomegaloviral proteins (pUL27 [HHV-5] and pR27 [MuHV-2]) and (II) known DDB1-interacting viral proteins (HBx [HBV] and WHx [WHV]) were introduced into the MCMV genome by BAC mutagenesis. Using the mutants ΔM27- M27HA, ΔM27-UL27HA, ΔM27-R27HA, ΔM27-HBxHA and ΔM27-WHxHA, it was analysed whether the ΔM27 phenotype is at least partially compensated by this heterologous expression. None of the foreign expressed viral proteins reduced the phenotypes of ΔM27- MCMV. Only the reinsertion of M27 restored the degradation of STAT2, the inhibition of IFN-induced signal transduction and the relative insensitivity to IFNγ. Additionally, heterologous expression of pUL27HA, pR27HA, HBxHA and WHxHA impaired the replication efficiency of ΔM27-MCMV. Infection with ΔM27-HBxHA and ΔM27-WHxHA even led to a comparatively higher activity of the ISRE promoter. The study suggests that pM27 is a highly specialized protein whose function is not complemented by the sequence homologues pUL27 or pR27 or by the hepadnaviral DDB1-interacting proteins HBx and WHx. The M27-deletion mutant is highly attenuated. Transcomplementation analysis showed that this state is very stable, even when foreign, homologous, or analogous viral proteins are expressed. Therefore ΔM27-MCMV seems to be a suitable vaccine vector in the mouse. In the present work, M27- positive and M27-deficient MCMV vectors were generated, which express the immunogenic HBsAg of HBV. It could be shown that prophylactic vaccination with both MCMV-HBsAg

142 Summary

and ΔM27-HBsAg protects against HBV in the HBV hydrodynamic injection model in the mouse. However, vaccination with MCMV-HBx did not show a protective effect against HBV.

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174 Danksagung

Danksagung

Ich bedanke mich bei Herrn Prof. Dr. Trilling, der mir die Möglichkeit gab, an diesem Promotionsprojekt in seiner Arbeitsgruppe zu arbeiten. Vielen Dank für die Forschungsreisen nach Wuhan und Shanghai. Ein besonderer Höhepunkt meines (Doktoranden-)Lebens ist und bleibt der dreimonatige Forschungsaufenthalt in Wuhan. Danke, dass ich mein Projekt auf die MCMV-Vakzinvektoren ausweiten durfte. Auch mein Vortrag auf dem Mini-Herpesvirus- Workshop in der Berliner Charité über unser geglücktes HBV-Vakzin wird mir noch lange in Erinnerung bleiben. Herzlichen Dank für die stets offene Tür und offene Ohr. Dr. Khanh Le-Trilling möchte ich insbesondere für die Unterstützung bei der Generierung der MCMV-Mutanten danken. Ich durfte sehr viel von ihr lernen. Bei den Mausversuchen wurde ich von einigen Mitgliedern der Arbeitsgruppe unterstützt. Daher gilt mein Dank unseren Biologisch-technischen Assistenten Kerstin Wohlgemuth und Benjamin Katschinski sowie meinen Kolleginnen Dr. Christine Landsberg, Fabienne Maaßen und Lejla Timmer. Ohne Kerstin wären die Mausversuche so nicht möglich gewesen. Zudem geht mein Dank an Prof. Dr. Dongliang Yang, Dr. Jia Liu und Dr. Hongming Huang von dem Department of Infectious Diseases des Union Hospitals in Wuhan (China). Auch sie haben die Forschungszeit in Wuhan ermöglicht, gestaltet und für mich auch persönlich zu einer unvergesslichen Zeit werden lassen. Danke Jia und Hongming für eure harte Arbeit, eure hohe Motivation und eure Menschlichkeit. Am Ende wurde aus einem Projekt, das einige anfangs belächelten, ein Paper gemacht. Mein besonderer Dank gilt außerdem Dr. Tanja Becker, Mareike Eilbrecht, Sebastian Howe, Andreja Jagnjic, Benny Katschinski, Dr. Christine Landsberg, Fabienne Maaßen, Kevin Pattberg, Lydia Rink, Lejla Timmer, Kerstin Wohlgemuth. Einige von euch sind wie ich nicht mehr am Institut und gehen neue Wege. Ich werde unsere gemeinsame Zeit, die wir zusammen im Labor, bei Kaffee und Kuchen oder beim gemeinsamen AG Kochen hatten, nie vergessen.

175 Lebenslauf

Der Lebenslauf ist in der Online-Version aus Gründen des Datenschutzes nicht enthalten.

176 Erklärungen

Erklärungen

Erklärung: Hiermit erkläre ich, gem. § 6 Abs. 2, Nr. 7 der Promotionsordnung der Math.-Nat.- Fachbereiche zur Erlangung des Dr. rer. nat., dass ich das Arbeitsgebiet, dem das Thema „Generierung und Charakterisierung von Cytomegalovirusmutanten als Expressions- und Impfstoffplattformen für heterologe Virusproteine“ zuzuordnen ist, in Forschung und Lehre vertrete und den Antrag von Meike Ute Rückborn befürworte.

Essen, den ______Prof. Dr. Mirko Trilling

Erklärung: Hiermit erkläre ich, gem. § 7 Abs. (2) d) + f) der Promotionsordnung der Fakultät für Biologie zur Erlangung des Dr. rer. nat., dass ich die vorliegende Dissertation selbständig verfasst und mich keiner anderen als der angegebenen Hilfsmittel bedient, bei der Abfassung der Dissertation nur die angegebenen Hilfsmittel benutzt und alle wörtlich oder inhaltlich übernommenen Stellen als solche gekennzeichnet habe.

Essen, den ______Meike Ute Rückborn

Erklärung: Hiermit erkläre ich, gem. § 7 Abs. (2) e) + g) der Promotionsordnung der Fakultät für Biologie zur Erlangung des Dr. rer. nat., dass ich keine anderen Promotionen bzw. Promoti- onsversuche in der Vergangenheit durchgeführt habe und dass diese Arbeit von keiner anderen Fakultät/Fachbereich abgelehnt worden ist.

Essen, den ______Meike Ute Rückborn

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