Arsenijevic J.Pdf

УНИВЕРЗИТЕТ У БЕОГРАДУ ФАРМАЦЕУТСКИ ФАКУЛТЕТ

Јелена С. Арсенијевић

Хемијска и фармаколошка карактеризација хербе самониклог и плантажно гајеног панонског тимијана, Thymus pannonicus All. (Lamiaceae)

Докторска дисертација

Београд, 2014.

UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF PHARMACY

Jelena S. Arsenijević

Chemical and pharmacological characterization of aerial parts of wild growing and cultivated Hungarian thyme, Thymus pannonicus All. (Lamiaceae)

Doctoral dissertation

Belgrade, 2014.

У овом раду испитан је хемијски састав и биолошка активност хербе самониклог и гајеног панонског тимијана, Thymus pannonicus All. (Lamiaceae), врсте која је до сада само делимично хемијски и фармаколошки испитана. Материјал је сакупљен на локалитетима на којима панонски тимијан самоникло расте у јужном Банату и на планинама у источној Србији. Варијације у саставу хербе самониклих биљака пореклом из јужног Баната испитане су у зависности од фенофазе у којој је извршено сакупљање. Уз примену различитих азотних и фосфорних ђубрива гајене су јединке пореклом са Вршачких планина. Садржај Cu, Fe, Mn, Zn и Cr одређен је применом атомске спектроскопије у ризосфери и херби самониклог панонског тимијана. Ради процене биорасположивости елемената у ризосфери, одређена је стварна и потенцијална киселост ризосфере. Садржај испитиваних елемената у херби зависио је од њихове биорасположивости у земљишту, а низак садржај Zn у херби и поред релативно високих концентрација у ризосфери указивао је на специфичну регулацију садржаја овог метала код Th. pannonicus . Методама атомске емисионе и апсорпционе спектроскопије одређен је садржај Cr, Co, Ni, Mo, Cu, Zn, Mn, Fe, Mg, Ca, K и Na у листу самониклог панонског тимијана. Kонцентрације испитиваних елемената биле су у физиолошким границама. Статичком хедспејс (ХС) екстракцијом издвојена је ХС фракција узорака листа самониклих биљака чији је састав анализиран GC и GC-MS методама. ХС фракције листа панонског тимијана богате монотерпенским угљоводоницима као главне компоненте садржавале су лимонен, мирцен, α- пинен и (E)-β-оцимен. У ХС фракцијама богатим кисеоничним монотерпенима најзаступљенији су били гераниал, нерал, 1,8-цинеол, као и 6-метил-5-хептен-2- он. Применом хемометријских метода, корелационом анализом и анализом главних компоненти, утврђена је корелација садржаја минерала, пре свих Zn, Mg и Mn, и испарљивих једињења листа, што се може довести у везу са биосинтезом испарљивих једињења. Садржај етарског уља (ЕУ) одређен је дестилацијом воденом паром у апаратури по Клевенџеру у херби самониклих и гајених биљака и износио је

0,03–1,43% ( V/m ). Састав ЕУ одређен је GC и GC-MS методама. Уља су била богата кисеоничним монотерпенима и кисеоничинм сесквитерпенима, а главне компоненте били су цитрал (гераниал и нерал), линалол, тимол, гермакрен D и (Е)-неролидол. Хроматографским техникама (хроматографијом на колони, хроматографијом на танком слоју, семипрепаративном HPLC ) из метанолног екстракта хербе самониклог панонског тимијана изоловано је четири једињења: апигенин 7-О-глукуронид ( 1), розмаринска киселина (РК) ( 2), 3-O-(2-кафенил)- розмаринска киселина ( 3) и 3-O-(метил-2-кафенил)-розмаринска киселина ( 4), док је из воденог екстракта изолован и идентификован лутеолин 7-О- диглукуронид ( 5). Структуре изолованих једињења утврђене су на основу анализе њихових UV , MS и/или 1H NMR спектара. Једињења 4 и 5 су по први пут изолована из биљака рода Thymus у овом раду. Поларни екстракти хербе израђени су екстракцијом 80%–ним метанолом, кључалом водом током 20 min и кључалом водом током 2 h. Добијени су суви водено-метанолни екстракти хербе самониклих и гајених биљака (ВМЕ), инфузи хербе самониклих биљака (5% m/V ) и суви деодорисани водени екстракт хербе самониклог панонског тимијана (ДВЕ), редом. Садржај укупних полифенола (СУП) у поларним екстрактима одређен је спектрофотометријски на бази Folin-Ciocalteu (FC ) реакције, а резултати су изражени у еквивалентима галне киселине (ГК). ВМЕ су садржавали 100,03– 215,37 mg ГК/g, инфузи 1122,25–1979,93 mg ГК/L, док је ДВЕ садржавао 205,00 mg ГК/g. HPLC анализом је у поларним екстрактима хербе утврђено присуство РК и њених деривата, као и флавоноида, пре свега глукуронида апигенина и лутеолина. HPLC методом у екстрактима је одређен садржај РК, хетерозида апигенина и хетерозида лутеолина. Главна компонента свих екстраката била је РК. Концентрацијe РК у ВМЕ износиле су 26,55–146,80 mg/g. Инфузи су садржавали 367,42–1199,47 mg/L РК, а ДВЕ 71,11 mg/g. Садржај хетерозида апигенина, изражен као апигенин, у ВМЕ хербе самониклих биљака, ВМЕ хербе гајених биљака, инфузима и ДВЕ био је: од количина у траговима до 8,53 mg/g, 4,86–15,33 mg/g, 23,41–93,29 mg/L и 1,28 mg/g, редом. ВМЕ самониклих биљака садржавали су 3,12–17,25 mg/g, а гајених 3,70–10,51 mg/g хетерозида лутеолина, изражених као лутеолин. Концентрације хетерозида

лутеолина у инфузима износиле су 109,62–259,61 mg/L, док је ДВЕ садржавао 4,09 mg/g. ХС екстракцијом и GC и GC -MS методом анализиране су испарљиве фракције инфуза у којима су се као главне компоненте, у зависности од узорка, налазили цитрал, линалол, 3-октанон и 1,8-цинеол. Антиоксидантна активност поларних екстраката испитана је in vitro применом два теста: укупна антиоксидантна активност (УАА) испитана је FRAP тестом, а антирадикалска активност DPPH тестом. ВМЕ и ДВЕ испољили су јаку

УАА (FRAP 2,53–5,33 mmol Fe/g) и анти-DPPH активност (IC 50 12,71–24,62 μg/mL). Антиоксидантни ефекат ВМЕ гајених биљака био је нешто нижи од ефекта ВМЕ самониклих биљака. УАА инфуза износила је 68,09–124,58 mmol Fe/L, а

неутрализација слободног DPPH радикала постигнута је са IC 50 1,32–2,96 μL/mL. Бујон микродилуционом методом испитана је антимикробна активност инфуза. Коришћени су стандардни сојеви четири Грам(+) и три Грам(–) бактерије и један сој гљивице Candida albicans . У испитиваном опсегу концентрација (31,25–500,00 μL/mL) сви инфузи су остварили антимикробни ефекат, а најбоља активност испољена је према гљивици C. albicans (МИК 31,25– 62,50 μL/mL). In vivo антиоксидантна активност ДВЕ испитана је на моделу оксидативног стреса код пацова индукованог угљентетрахлоридом. Примена ДВЕ у вишим испитиваним дозама (1,0–5,0 mL/kg TM) довела је до значајног смањења интензитета липидне пероксидације и одржавања физиолошких концентрација глутатиона. Могући механизам испољенe цитотоксичнe активности ДВЕ in vivo , испитане на моделу Ерлиховог асцитног тумора код миша, је прооксидантни ефекат екстракта у малигним ћелијама. Фенофаза у којој је извршено сакупљање хербе значајно је утицала на садржај и састав ЕУ. Садржај ЕУ био је већи пре и током, него након цветања биљака. Херба пореклом са Вршачких планина, чије је ЕУ садржавало цитрал као главни састојак, имала је већи садржај и мање варијабилан састав ЕУ од осталих узорака. Утицај фенофазе на састав и антиоксидантну активност ВМЕ био је мање изражен. Гајењем уз примену азотних и фосфорних ђубрива добијена је херба релативно уједначеног хемијског састава, а утицај различитог режима ђубрења није био изражен, што је резултовало и уједначеном антиоксидантном

активношћу ВМЕ. Херба гајених биљака и херба самониклих биљака пореклом са Вршачких планина нису се значајније разликовале. Основна разлика је била у садржају хетерозида апигенина, који је у ВМЕ гајених биљака био значајно већи него у ВМЕ хербе самониклих биљака. Као основни параметар специфичног квалитета хербе панонског тимијана, Thymi pannonici herba , могу се поставити садржај ЕУ (најмање 5,0 mL/кg) и садржај цитрала у ЕУ (најмање 70%).

Кључне речи : минерали, хедспејс, етарско уље, полифеноли, деодорисани водени екстракт, инфуз, сезонска варијабилност, антиоксидантна активност, антимикробна активност, цитотоксична активност

Научна област : Фармација Ужа научна област : Фармакогнозија УДК број :

Chemical and pharmacological characterization of aerial parts of wild growing and cultivated Hungarian thyme, Thymus pannonicus All. (Lamiaceae)

The chemical composition and the biological activity of aerial parts of wild growing as well as cultivated plants of Hungarian thyme, Thymus pannonicus All. (Lamiaceae), were investigated in this study. The investigated material was collected on several localities in southern Banat and on the mountains in eastern Serbia, and furthermore, seasonal variations in the composition of the herb from southern Banat were studied. Cultivation of plants of Mt. Vršačke planine origin was performed by fertilization with different nitrogen and phosphorus fertilizers. The Cu, Fe, Mn, Zn and Cr content in the rhizosphere and aerial parts of Hungarian thyme was determined by atomic spectroscopy (AS). Additionally, real and potential acidity of rhizosphere was measured in order to assesse the bioavailability of elements. The obtained concentrations of investigated elements in herb samples were influenced by their availablity in rhizosphere. While relatively high content of Zn was found in rhizosphere samples, aerial parts of Hungarian thyme contained low levels of this element, indicating that specific regulation mechansims of zinc's content are present in Hungarian thyme. The Cr, Co, Ni, Mo, Cu, Zn, Mn, Fe, Mg, Ca, K and Na content in the leaves of wild growing plants was determined by suitable AS methods. Measured concentrations were found to be within physiological ranges for upper plant parts. Static headspace (HS) extraction followed by GC and GC-MS analysis was used for the characterization of the leaf volatile fraction. HS fractions rich in monoterpene hydrocarbons contained limonene, myrcene, α-pinene and ( E)-β-ocimene as the main compounds, while geranial, neral, 1,8-cineole and 6-methyl-5-hepten-2-one were predominant in HS fractions rich in oxygenated monoterpenes. Chemometric analysis (Correlation analysis and Principal component analysis) revealed the existence of several correlations of metal content, especially Zn, Mg and Mn, with volatile compounds, which could be related to biosynthesis of volatiles. The content of essential oil (EO) in herb of wild growing and cultivated plants, determined by hydrodistillation in Clevenger apparatus, was 0.03–1.43% ( V/m ). The EO composition was investigated by GC and GC-MS. Dominant classes of compounds

were oxygenated mono- and sesquiterpenes. Depending on the sample, the main constituents of EOs were citral (geranial and neral), linalool, thymol, germacrene D and ( E)-nerolidol. By means of column chromatography, thin layer chromatography and semiprep-HPLC, four compounds were isolated from the methanol extract of aerial parts of Hungarian thyme: apigenin-7-O-glucuronide ( 1), rosmarinic acid (RA) ( 2), 3- O-(2-caffenyl)-rosmarinic acid ( 3) and 3-O-(methyl-2-caffenyl)-rosmarinic acid ( 4). From the water extract one compound was isolated: luteolin-7-O-diglucuronide ( 5). Structure elucidation of isolated compounds was performed by UV, MS and/or 1H NMR spectral analysis. Compounds 4 and 5 were isolated for the first time from plants of the genus Thymus in this work. Polar extracts of aerial parts of Hungarian thyme, i.e., dry hydromethanolic extracts of wild growing and cultivated plants (HME), infusions of wild growing plants (5% m/V) and dry deodorized water extract of plant growing wild (DWE), were obtained by extraction with 80% aqueous methanol, boiling water during 20 min and boiling water during 2 h, respectively. Total phenolics content in polar extracts was determined by spectrophotometric Folin-Ciocialteu method, and the results were expressed as gallic acid (GA) equivalents. HME and infusions contained 100.03–215.37 mg GA/g and 1122.25–1979.93 mg GA/L, respectively, while DWE contained 205.00 mg GA/g. The presence of RA and its derivatives, as well as the presence of flavonoids, with apigenin and luteolin glucuronides as the most abundant, was confirmed by HPLC analysis. The content of RA, apigenin heterosides and luteolin heterosides was determined by HPLC method. Concentrations of RA in HME and infusions were in the range 26.55–146.80 mg/g and 367.42–1199.47 mg/L, respectively. DWE contained 71.11 mg/g of RA. The content of apigenin heterosides, expressed as apigenin, in HME of wild growing plants, HME of cultivated plants, infusions and DWE was up to 8.53 mg/g, 4.86–15.33 mg/g, 23.41–93.29 mg/L and 1.28 mg/g, respectively. Concentrations of luteolin heterosides were in the range 3.12–17.25 mg/g and 3.70–10.51 mg/g, expressed as luteolin, for HME of wild growing and cultivated plants, respectively. The concentrations of luteolin heterosides in infusions ranged from 109.62 to 259.61 mg/L, while DWE contained 4.09 mg/g of these flavonoid compounds. Depending on the sample, volatile fracion of investigated infusions, analyzed by static HS extraction coupled with GC and

GC-MS analysis, contained citral, linalool, 3-octanone and 1,8-cineole as main constituents. Antioxidant capacity of polar extracts was tested in vitro by FRAP test for determination of total antioxidant activity (TAA) and DPPH test for assessing the free radical scavenging activity. HME and DWE exhibited strong TAA (FRAP 2.53–5.33 mmol Fe/g) and DPPH scavenging activity (SC 50 12.71–24.62 μg/mL). HME of cultivated plants had slightly weaker antioxidant properties than HME of wild growing plants. Infusions' TAA ranged from 68.09 to 124.58 mmol Fe/L, while DPPH scavenging effect was achieved at SC 50 1,32–2,96 μL/mL. Antimicrobial activity of infusions was assayed by broth microdilution method against standard strains of four Gram(+) and three Gram(-) bacteria and one strain of fungi Candida albicans . Antimicrobial activity was demonstrated to some extent for all infusions in the tested concentration range (31.25–500.00 μL/mL), while the strongest activity was exhibited against the strain of C. albicans (MIC 31.25–62.50 μL/mL). In vivo antioxidant activity of DWE was investigated in carbontetrachloride- induced oxidative stress in rats. Higher doses of DWE (5% m/V; 1,0–5,0 mL/kg b.w.) significantly reduced lipid peroxidation intensity and preserved reduced glutathione. Possible mechanism of exhibited in vivo cytotoxic activity of DWE, investigated in mice with imlpanted Ehrlich ascites carcinoma, could be related to the prooxidant activity of the extract in malignant cells. Phenological stage significantly influenced the content and the composition of EO of aerial parts of the wild growing plants Hungarian thyme. The content of EO was higher before and during flowering than after flowering period. The herb collected on Mt. Vršačke planine which contained EO rich in citral, had higher EO yields and less variable composition in comparison to other samples. The influence of the phenophase on the composition and antioxidant activity of HME was less pronounced. Influence of different type of fertilization during cultivation of Hungarian thyme was fairly insignificant, and relatively uniform herb samples in terms of composition and antioxidant activity of HME were obtained. Herb of the cultivated plants and the herb from the Mt. Vršačke planine did not differ significantly. The main difference was in the content of apigenin heterosides in HME: HMEs of cultivated plants had substantially higher content of these constituents than HMEs of wild growing plants.

The content of EO (min. 5 mL/kg) and the content of citral in the EO (min. 70%) could be set as the most significant quality requirements for the herb of Hungarian thyme, Thymi pannonici herba .

Keywords : minerals, headspace, phenolic compounds, essential oil, deodorized water extract, infusion, seasonal variation, antioxidant activity, antimicrobial activity, cytotoxic activity

Academic expertise : Pharmacy Major in : Pharmacognosy UDC Nº :

Садржај

I Увод ...... 1 1. Род Thymus L...... 2 2. Секундарни метаболити биљака рода Thymus L...... 3 2.1. Етарско уље ...... 4 2.2. Флавоноиди ...... 5 2.2.1. Флавоноидни агликони ...... 5 2.2.2. Флавоноидни хетерозиди ...... 9 2.2.3. Фенолкарбоксилне киселине ...... 12 3. Биолошка активност екстраката и секундарних метаболита биљака рода Thymus 17 4. Употреба биљака рода Thymus ...... 19 4.1. Традиционална лековита примена биљака рода Thymus ...... 20 4.2. Примена лековитих производа на бази биљака рода Thymus заснована на доказима . 21 4.3. Официналне дроге ...... 22 5. Thymus pannonicus All...... 23 5.1. Досадашња фармакогнозијска испитивања Th. pannonicus ...... 23 II Циљ рада ...... 27 III Материјал и методе ...... 30 1. Порекло материјала ...... 31 1.1. Материјал сакупљен на природном станишту ...... 31 1.2. Материјал добијен гајењем ...... 33 2. Испитивање киселости ризосфере и одређивање садржаја метала у ризосфери и биљном материјалу ...... 34 2.1. Порекло ризосфере и биљног материјала ...... 34 2.2. Испитивање киселости ризосфере ...... 34 2.3. Одређивање садржаја метала у ризосфери и биљном материјалу ...... 35 2.3.1. Хемикалије ...... 35 2.3.2. Микроталасна дигестија ...... 36 2.3.3. Атомска спектроскопија ...... 36 3. Анализа испарљивих састојака ...... 38 3.1. Порекло биљног материјала ...... 39 3.2. Хедспејс екстракција ...... 39 3.3. Изоловање и одређивање садржаја етарског уља ...... 40 3.4. Гасна хроматографија ( GC ) и гасна хроматографијa – масена спектрометрија ( GC-MS ) 40 3.4.1. Квалитативна и квантитативна анализа ...... 41 4. Изоловање и утврђивање структуре изолованих једињења ...... 41 4.1. Припрема екстраката ...... 41 4.2. Пречишћавање метанолног (В) екстракта ...... 42 4.2.1. Пречишћавање фракције В.10 ...... 42 4.2.2. Пречишћавање фракције В.11-12 ...... 43 4.3. Пречишћавање воденог (Г) екстракта ...... 43 4.4. Семипрепаративна високоефикасна течна хроматографија ...... 44 4.5. Идентификација изолованих једињења ...... 45 4.5.1. Високоефикасна течна хроматографија ( HPLC ) и хроматографија на танком слоју ( TLC ) ...... 45 4.5.2. Спектроскопска анализа ...... 46

4.5.3. Течна хроматографија – масена спектрометрија (LC-MS) ...... 47 4.5.4. Нуклеарна магнетна резонанца ( NMR ) ...... 48 5. Хемијска анализа и in vitro испитивање антиоксидантне и антимикробне активности поларних екстраката ...... 48 5.1. Биљни материјал и припрема екстраката...... 48 5.1.1. Припрема водено-метанолних екстраката ...... 48 5.1.2. Припрема инфуза ...... 50 5.1.3. Припрема деодорисаног воденог екстракта ...... 50 5.2. Анализа високоефикасном течном хроматографијом ( HPLC )...... 50 5.2.1. Квалитативна и семиквантитативна анализа ...... 50 5.2.2. Одређивање садржаја розмаринске киселине, хетерозида апигенина и хетерозида лутеолина ...... 51 5.3. Одређивање укупних полифенола ...... 51 5.4. Анализа хедспејс фракција инфуза ...... 52 5.5. Испитивање in vitro антиоксидантне активности...... 52 5.5.1. Испитивање укупне антиоксидантне активности (FRAP тест) ...... 52 5.5.2. Испитивање способности неутрализације слободних радикала (DPPH тест) .... 53 5.6. Испитивање антимикробне активности инфуза in vitro ...... 54 5.6.1. Стандардни сојеви микроорганизама и њихова култивација ...... 54 5.6.2. Бујон микродилуциони тест ...... 55 6. Испитивање in vivo антиоксидантне и цитотоксичне активности деодорисаног воденог екстракта (ДВЕ) ...... 56 6.1. Поступак испитивања антиоксидантне активности ДВЕ in vivo ...... 56 6.1.1. Експерименталне животиње ...... 56 6.1.2. Протокол огледа ...... 56 6.2. Поступак испитивања цитотоксичне активности ДВЕ in vivo за ћелије Ерлиховог асцитног тумора ...... 58 6.2.1. Експерименталне животиње ...... 58 6.1.2. Протокол огледа ...... 58 6.3. Биохемијска испитивања ...... 60 6.3.1. Одређивање садржаја укупних протеина у хомогенату јетре ...... 60 6.3.2. Одређивање активности ксантин оксидазе ( XOD ) ...... 60 6.3.3. Одређивање активности каталазе ( CAT ) ...... 61 6.3.4. Одређивање активности пероксидазе ( Px ) ...... 61 6.3.5. Одређивање активности глутатион пероксидазе (GSHPx ) ...... 61 6.3.6. Одређивање активности глутатион редуктазе ( GR ) ...... 62 6.3.7. Одређивање садржаја редукованог глутатиона ( GSH ) ...... 62 6.3.8. Одређивање интензитета липидне пероксидације ( LPx ) – TBA тест ...... 63 7. Статистичка обрада резултата и хемометријска анализа ...... 63 7.1. Основни статистички параметри ...... 63 7.2. Корелациона анализа ...... 64 7.2.1. Корелациона анализа садржаја метала у херби и ризосфери панонског тимијана ...... 64 7.2.2. Корелациона анализа садржаја метала и састава хедспејс фракција листа панонског тимијана ...... 64 7.2.3. Корелациона анализа садржаја полифенолних састојака и антиоксидантне активности поларних екстраката хербе панонског тимијана ...... 64 7.3. Анализа главних компоненти ( PCA )...... 65 7.3.1. PCA садржаја метала и састава хедспејс фракција листа панонског тимијана 65 7.3.2. PCA етарских уља хербе гајеног панонског тимијана ...... 66 7.4. Кластерска анализа ( CA ) ...... 66 7.4.1. Кластерска анализа узорака листа самониклог панонског тимијана ...... 66 7.4.2. Кластерска анализа етарских уља хербе самониклог панонског тимијана ...... 67

IV Резултати и дискусија ...... 68 А. Анализа самониклог панонског тимијана ...... 69 1. Анализа ризосфере самониклог панонског тимијана: киселост и садржај метала ...... 69 1.1. Испитивање киселости ризосфере ...... 70 1.2. Aнализа садржајa метала (Cu, Fe, Mn, Zn и Cr) у ризосфери ...... 71 2. Aнализа садржајa метала (Cu, Fe, Mn, Zn и Cr) у херби самониклог панонског тимијана . 73 3. Aнализа корелација садржаја метала у ризосфери и херби самониклог панонског тимијана ...... 75 4. Анализа садржајa метала (Cr, Co, Ni, Mo, Cu, Zn, Mn, Fe, Mg, Ca, K и Na) у листу самониклог панонског тимијана ...... 78 5. Анализа хедспејс фракција листа самониклог панонског тимијана ...... 80 6. Анализа корелација садржаја метала у листу и састава хедспејс фракција листа самониклог панонског тимијана – хемометријска анализа ...... 87 7. Анализа етарскoг уља хербе самониклог панонског тимијана ...... 98 7.1. Садржај етарског уља у херби самониклог панонског тимијана ...... 98 7.2. Квалитативна и квантитативна анализа етарских уља ...... 100 8. Идентификација изолованих једињења ...... 121 8.1. Идентификација једињења 1 ...... 121 8.2. Идентификација једињења 2 ...... 126 8.3. Идентификација једињења 3 ...... 130 8.4. Идентификација једињења 4 ...... 135 8.5. Идентификација једињења 5 ...... 140 9. Хемијска анализа и испитивање in vitro антиоксидантне активности водено-метанолних екстраката хербе самониклог панонског тимијана ...... 144 9.1. HPLC анализа водено-метанолних екстраката ...... 144 9.2. Анализа садржаја укупних полифенола у водено-метанолним екстрактима ...... 152 9.3. Испитивање in vitro антиоксидантне активности водено-метанолних екстраката .. 154 10. Хемијска анализа и испитивање in vitro антиоксидантне и антимикробне активности инфуза хербе самониклог панонског тимијана ...... 160 10.1. HPLC анализа инфуза ...... 160 10.2. Анализа садржаја укупних полифенола у инфузима ...... 164 10.3. Анализа хедспејс фракције инфуза ...... 165 10.4. Испитивање in vitro антиоксидантне активности инфуза ...... 169 10.5. Испитивање антимикробне активности инфуза ...... 172 11. Анализа варијабилности састава и активности хербе самониклог панонског тимијана178 Б. Анализа гајеног панонског тимијана ...... 185 1. Анализа етарскoг уља хербе гајеног панонског тимијана ...... 185 1.1. Анализа садржаја етарског уља хербе гајених биљака ...... 185 1.2. Квалитативна и квантитативна анализа етарског уља хербе гајених биљака ...... 187 2. Хемијска анализа и испитивање in vitro антиоксидантне активности водено-метанолних екстраката хербе самониклог панонског тимијана ...... 193 2.1. HPLC анализa водено-метанолних екстраката хербе гајених биљака ...... 193 2.2. Садржај укупних полифенола у водено-метанолним екстрактима хербе гајених биљака...... 199 2.3. Испитивање in vitro антиоксидантнe активности водено-метанолних екстраката хербе гајених биљака ...... 200 3. Поређење садржаја и састава етарског уља, састава и антиоксидантне активности водено-метанолних екстраката хербе самониклих и гајених биљака панонског тимијана202 4. Предлог монографије Thymi pannonici herba ...... 205 В. Анализа састава и активности деодорисаног воденог екстракта хербе панонског тимијана ...... 210

1. Хемијска анализа и испитивање in vitro антиоксидантне активности деодорисаног воденог екстраката хербе панонског тимијана ...... 210 1.1. HPLC анализa деодорисаног воденог екстракта ...... 210 1.2. Анализа садржаја укупних полифенола у деодорисаном воденом екстракту ...... 213 1.3. Испитивање in vitro антиоксидантне активности деодорисаног воденог екстракта 215 2. Испитивање in vivo антиоксидантне активности ДВЕ ...... 215 2.1. Анализа ефекта примене угљентетрахлорида на активност ензима, садржај редукованог глутатиона и интензитета липидне пероксидације ...... 220 2.2. Анализа ефекта примене ДВЕ на активност ензима, садржај глутатиона и интензитет липидне пероксидације ...... 221 2.3. Анализа ефекта примене ДВЕ на активност ензима, садржај глутатиона и интензитет липидне пероксидације код животиња третираних угљентетрахлоридом ...... 222 3. Испитивање in vivo цитотоксичне активности ДВЕ на туморске ћелије ...... 223 3.1. Анализа ефекта ДВЕ у зависности од примењене дозе ...... 223 3.2. Анализа ефекта ДВЕ на ћелије Ерлиховог асцитоног тумора ...... 225 3.2.1. Испитивање ефекта ДВЕ на инхибицију раста тумора ...... 225 3.2.2. Анализа антиоксидантне/прооксидантне активности ДВЕ: Активност антиоксидантних ензима, садржај редукованог глутатиона и интензитет липидне пероксидације ...... 228 V Закључци ...... 234 Литература ...... 242 Прилози ...... 260 Прилог 1. Резултати оптимизовања методе хедспејс екстракције ...... 261 Прилог 2. Резултати корелационе анализе садржаја метала и састава хедспејс фракција листа панонског тимијана ...... 266 Прилог 3. Резултати микроскопске анализе прашка хербе гајеног панонског тимијана ...... 287 Прилог 4. Резултати ТLC анализе хербе гајеног панонског тимијана ...... 290

I Увод 1. Род Thymus L.

Род Thymus L. припада трибусу Menthae , подфамилијe Nepetoidae фамилијe Lamiaceae ( Harley и сар., 2004 ). Врсте овог рода насељавају углавном сушна станишта Европе и Азије, северне Африке и северне Америке. Центар диверзитета овог рода налази се у појасу око Средоземног мора. Биљке рода Thymus изразито су полиморфне и имају изражену тенденцију ка хибридизацији, што овај род чини таксономски компликованим. Број врста овог рода је различит у зависности од приступа аутора, али се може сматрати да је тај број преко 200, што род Thymus , уз родове Salvia , Hyptis , Scutellaria , Stachys , Teucrium , Nepeta и Plecanthrus , сврстава међу осам најзначајнијих од укупно 220 родова фамилије Lamiaceae ( Morales, 1996 ; Morales, 1997 ). Thymus врсте су вишегодишње зељасте биљке или полужбунови. Стабљика је на пресеку округла или четвороугаона; усправна или пузећа која се завршава цвастима на врху, или пузећа која се завршава стерилном розетом листова, а цветни изданци се развијају само из пазушних, бочних пупољака. Стабљика и гране су покривене длакама – холотрихно (прекривене све четири стране стабла), алелотрихно (длакама су прекривене наспрамне стране, које се смењују по интернодијама), или гониотрихно (длаке се налазе само на ребрима) (Morales, 2002 ). Листови су наспрамно распоређени, унакрсно постављени; линеарни су, елиптични или округласти, обода целог или благо назубљеног. Индументум је врло варијабилан, листови могу бити голи или покривени длакама; често су трепљастог обода. Цветови су скупљени у пазуху горњих листова и формирају лоптасте или издужене цвасти. Чашица је звонаста или цеваста, двоусната, ждрело је затворено чекињастим длакама; горња усна je усправна са три зупца, a доњa са два зупца која су по ободу трeпљаста. Круница је двоусната: горња усна је равна, на врху незнатно усечена, а доња трорежњевита, средњи режањ је највећи. Прашника има четири. Стубић на врху са кратким крацима жига. Цветови су гинодиоични, хермафродитни и женски. Андродиочни цветови су ретки ( Диклић, 1974 ; Morales, 2002 ). У Флори Европе се у оквиру рода Thymus наводи 66 врста, сврстаних у осам секција: Mastichina , Micantes , Piperella , Pseudothymbra , Thymus , Teucrioides , Hyphodromi и Serpyllum (Jalas, 1971 ; Jalas, 1972 ).

У Флори СР Србије описана је 31 врста рода Thymus и 74 инфраспецијских таксона. Осим врста Th. comptus и Th. striatus , које припадају секцији Hyphodromi , све Thymus врсте наше флоре припадају секцији Serpyllum . Врста Th. vulgaris (Sect. Thymus ) је унесена у флору Србије и гаји се као зачинска и лековита биљка (Диклић, 1974 ). Народни називи за врсте рода Thymus у Србији су бабина душица, бакина душица, вресковина, врисак, душа, душица, мајкина душица, мајчина душица , материна душа, материнка, паприца, писмена трава, попонац, тамјаника, тимијан, труп, чубрић ( Симоновић, 1959 ).

2. Секундарни метаболити биљака рода Thymus L.

Најзначајнији и највише проучавани секундарни метаболити који се јављају код биљака рода Thymus су етарско уље и једињења полифенолне природе, флавоноиди и фенолкарбоксилне киселине ( Vila, 2002 ). За биљке подфамилије Nepetoidae , којој род Thymus припада, карактеристично је присуство етарског уља, фенолкарбоксилне киселине розмаринске киселине, значајнијих количина тритерпенских киселина (олеанолне и урсолне киселине), као и одсуство иридоида ( Cantino и Sanders, 1986 ; Janicsák и сар., 1999 ; Harley и сар., 2004 ; Janicsák и сар., 2006 ). Поред наведених једињења у врстама рода Thymus јављају се и деривати хидроксијасмона, нпр. 5'-хидроксијасмон 5'-О-β-глукозид ( Takeuchi и сар., 2004 ; Pereira и сар., 2013 ); хетерозиди једноставних фенола, нпр., 3-хидрокси-4- метоксифенетил-3-О-β-глукозид, еугенол О-β-глукозид, сирингин ( Kitajima и сар., 2004 ), арбутин ( Takeuchi и сар., 2004 ; Fecka и Turek, 2008 ); хина киселина (Nagy и сар., 2011 ); бифенилна једињења, нпр., 3,4,3',4'-тетрахидрокси-5,5'- диизопропил-2,2'-диметилбифенил ( Dapkevicius и сар., 2002 ; Haraguchi и сар., 1996 ; Nakatani и сар., 1989 ; Okazaki и сар., 2002 ); кисели полисахариди ( Chun и сар., 2001 ), као и ацетофенонски хетерозиди ( Wang и сар., 1999 ).

2.1. Етарско уље

Садржај и састав етарског уља биљака рода Thymus је доста проучаван. У 63 узорка хербе 17 различитих Thymus таксона пореклом из Македоније садржај етарског уља је износио од 0,10 до 2,30% ( V/m ), и зависио је од локалитета и године сакупљања материјала ( Кулевенова, 1996 ). Надземни делови Th. vulgaris L. и Th. zygis L. могу да садрже и до 2,5% ( V/m ) етарског уља ( Wichtl, 2008 ; Teuscher, 2008 ). Pluhár и сар. (2012a) су дестилацијом воденом паром хербе 20 узорака четири различите Thymus врсте ( Th. glabrescens Willd., Th. pannonicus All., Th. praecox Opiz и Th. pulegioides L.) изоловали 0,01–0,69% ( V/m ) етарског уља. У другим испитивањима врста овог рода такође су добијене количине етарског уља приближне количинама које су овде наведене. Садржај етарског уља у биљкама обично је највећи током периода цветања, али је за поједине биљке рода Thymus утврђено да се максимални приноси код исте биљке постижу у две фенофазе, током и након цветања ( Stahl-Biskup, 2002 ). У етарским уљима надземних делова биљака рода Thymus најчешће преовлађују монотерпенска једињења, обично у концентрацијама око 90%. Сесквитерпени ређе чине доминантну групу једињења у етарским уљима ( Stahl- Biskup, 2002 ). Монотерпенски феноли тимол и карвакрол су компоненте које се у значајним количинама јављају у највећем броју етарских уља Thymus таксона. У уљима може бити доминантан тимол или карвакрол, или могу бити заступљени у приближним количинама. Присуство тимола и карвакрола обично је праћено присуством монотерпенских угљоводоника p-цимена и γ-терпинена, који могу да представљају и доминантне компоненте уља. Таква уља се такође сматрају 'фенолним' због повезаности ових једињења у њиховој биосинтези. Осим у уљима биљака рода Thymus , тимол и карвакрол ретко представљају главне састојке етарских уљa других биљака (Stahl-Biskup, 2002 ). Етарска уља богата нефенолним монотерпенима су ређа. Од нефенолних монотерпена, као преовлађујућа једињења у етарским уљима биљака рода Thymus обично се јављају монотерпени са кисеоником у структури: линалол, борнеол, 1,8-цинеол, гераниол, α-терпинилацетат, α-терпинеол, геранилацетат, камфор, цитрал, линалилацетат, терпинен-4-ол. Од монотерпенских

угљоводоника у значајнијем проценту се могу наћи мирцен, α-пинен, камфен, феландрен ( Stahl-Biskup, 2002 ). Сесквитерпенска једињења су ретко доминантна у етарским уљима Thymus таксона. Најчешће су присутни ( Е)-кариофилен, гермакрен D, β- бисаболен, али ретко у количинама већим од 10% ( Stahl-Biskup, 2002 ; Figueiredo и сар., 2008 ). За врсте рода Тhymus карактеристичан је, поред морфолошког полиморфизма, и изразит хемијски полиморфизам у погледу састава етарског уља. Тако је, на пример, испитивањима састава етарског уља Th. vulgaris пореклом из Француске, утврђено постојање седам хемотипова ('хемијских раса') ( Keefover-Ring и сар., 2009 ). Поред тога, за биљке овог рода није неуобичајено да се у оквиру једне популације јављају индивидуе различитог састава етарског уља ( Stahl-Biskup, 2002 ).

2.2. Флавоноиди

У биљкама рода Thymus детектовано је присуство све четири основне класе флавоноида: флавона, флавонола, флаванона и дихидрофлавонола. Испитивања ове групе секундарних метаболита у роду Thymus била су усмерена у два правца: (1) проучавање спољашњих (површинских, липофилних) флавоноида који се налазе у облику агликона, и (2) проучавање унутрашњих (вакуоларних, хидрофилних) флавоноида, који се налазе у облику хетерозида.

2.2.1. Флавоноидни агликони Као слободни флавоноидни агликони у Thymus врстама јављају се супституисани флавони, флаванони, а ређе и флавоноли и дихидрофлавоноли. Посебно су значајни флавоноидни агликони локализовани на површини листова, у смеши са восковима и вишим терпенима. Ова једињења су најчешће флавони, деривати апигенина (5,7,3'-трихидроксифлавон) и лутеолина (5,7,3',4'- тетрахидроксифлавон) са додатним супституентима у прстену А у положају 6, или 6 и 8, или, ретко, 8. Хидроксилне групе у положајима 7, 3' и 4' могу, а не морају, бити метиловане, док је у положају 5 увек присутна слободна OH група.

Супституент у положају 6 може бити хидроксилна или метокси група, а у положају 8, метокси група ( Vila, 2002 ). Поред 8-метокси деривата, код биљака рода Thymus установљено је и присуство 8-C-p-хидроксибензил, као и 8-C-пренил флавоноида ( Merghem и сар., 1995 ). Флавоноидни агликони локализовани на површини листова представљају користан таксономски карактер у оквиру рода Thymus (Vila, 2002 ; Marin и сар., 2003 ; Мarin и сар., 2005 ; Horwath и сар., 2008 ; Šoštarić, 2012 ). Осим тога, агликони флавоноида испољавају значајну биолошку активност (спазмолитичку, антимикробну, цитотоксичну) ( Androutsopoulos и сар., 2010 ). У Табели 1. дат је преглед флавоноидних агликона изолованих и/или детектованих у екстрактима различитих Thymus таксона ( Vila, 2002 ; Ismaili и сар., 2001 ; Ismaili и сар., 2002 ; Dapkevicius и сар., 2002 ; Marin и сар., 2003 ; Ismaili и сар., 2004 ; Marin и сар., 2005 ; Koşar и сар., 2005 ; Kulišić и сар., 2006 ; Fecka и Turek, 2008 ; Horwath и сар., 2008 ; Boros и сар., 2010 ; Hossain и сар., 2010a ; Özgen и сар., 2011 ; Lee и сар., 2011 ; Miron и сар., 2011 ).

Табела 1. Флавоноидни агликони биљака рода Thymus

ФЛАВОНИ

а) б)

а) Деривати апигенина R6 R7 R8 R4’ Апигенин H H H H Акацетин H H H Me Генкванин H Me H H 5- Хидрокси -7,4' - диметоксифлавон ( 4' -метилгенкванин ) H Me H Me 8-Метоксигенкванин H Me OMe H Скутелареин OH H H H Сорбифолин ОH Me H H Ладанеин OH Me H Me Тимузин OH Me OMe H Пебрелин OH Me OMe Me Цирзимаритин ОМе Ме H H Ксантомикрол OMe Me OMe H Салвигенин OMe Me H Me Гарденин B OMe Me OMe Me Пектолинаригенин OMe H H Me б) Деривати лутеолина R6 R7 R8 R3’ R4’ Лутеолин H H H H H Лутеолин 7 -метилетар H Me H H H Диосметин H H H H Me Хризоериол H H H Me H Велутин (лутеолин 7,3’ -диме тилетар) H Me H Me H Пилоин (лутеолин 7,4’ -диметилетар) H Me H H Me Лутеолин 7,3',4' -триметилетар H Me H Me Me 6-Хидроксилутеолин OH H H H H 6-Хидроксилутеолин 7,3' -диметилетар OH Me H Me H 6-Хидроксилутеолин 7,4' -диметилетар OH Me H H Me 6-Хидроксил утеолин 7,3',4' -триметилетар OH Me H Me Me Тимонин OH Me OMe Me H Тимонин 4’ -метилетар OH Me OMe Me Me Цирзилиол OMe Me H H H Еупаторин OMe Me H H Me Цирзилинеол OMe Me H Me H 5-Дезметилсинензетин OMe Me H Me Me Сидеритофлавон OMe Me OMe H H 3' -Мет оксиксантомикрол (8 -метоксицирзилинеол) OMe Me OMe Me H 5-Дезметилнобилетин OMe Me OMe Me Me

Табела 1. Флавоноидни агликони биљака рода Thymus (наставак )

ФЛАВОНОЛИ

Деривати кверцетина R6 R7 R8 R3’ R4’ Кверцетин H H H H H Изорамнетин H H H Me H

ДИХИДРОФЛАВОНИ (ФЛАВАНОНИ) OR3'

а) OR4' б) OR4' R8 R8

R7O O R7O O

R6 R6

OH O OH O а) Деривати нарингенина R6 R7 R8 R4’ Нарингенин H H H H Сакуранетин H Me H H Изосакуранетин H H H Me Ксантомикрол флаванон OMe Me OMe H 8-Пренилнарингенин H H пренил H б) Деривати ериодиктола R6 R7 R8 R3’ R4’ Ериодиктиол H H H H H Хесперетин H H H H Me 3' -Метоксиксантомикрол флаванон ОМе Ме ОМе ОМе H

ДИХИДРОФЛАВОНОЛИ (ФЛАВАНОНОЛИ)

а) б)

а) Деривати аромадендрина R6 R7 R8 R3’ R4’ Аромадендрин (дихидрокемферол) H H H H H б) Деривати таксифолина R6 R7 R8 R3’ R4’ Таксифолин (дихидрокверцетин) H H H H H

2.2.2. Флавоноидни хетерозиди За разлику од обимно проучаваних површинских флавоноида, анализа гликозилованих флавоноидних једињења у екстрактима биљака рода Thymus је интензивнија тек у последње време. У Табели 2 дат је преглед хетерозида флавоноида који се јављају код биљака рода Thymus . У врстама рода Тhymus као најзаступљенији јављају се хетерозиди апигенина и лутеолина. Поред ових, као флавонски агликони јављају се и деривати 6-хидрокси апигенина (скутелареина) и 6-хидрокси лутеолина, као и диосметин (4’-метиллутеолин). Присуство флаванских гликозида, хетерозида нарингенина и ериодиктиола, је релативно често, док се хетерозиди флавонола ређе јављају ( Табелa 2 ) ( Vila, 2002 ; Pereira и Cardoso, 2013 ). Гликозидна веза се најчешће остварује преко хидроксилне групе у положају 7, али је забележено и присуство 5, 3’ и 4’ О-хетерозида. За поједине таксоне карактеристично је присуство ди-C-гликозида апигенина, виценина-2 (апигенин 6,8-ди-C-глукозид) ( Husain и Мarkham, 1981 ). Tomás-Barberán и сар. (1988) су установили да се код 22 Thymus таксона која су испитивали, као агликони флавоноидних хетерозида јављају 6-хидрокси флавони (пре свега 6- хидрокси–лутеолин), као и да је, у поређењу са другим испитиваним таксонима фамилије Lamiaceae и још пет других фамилија, код биљака рода Thymus чешћа појава 5-О-хетерозида. Поред тога, није утврђено присуство хетерозида 6-метокси или 8-хидрокси–флавона. Шећерни део молекула флавоноидних хетерозида биљака рода Thymus најчешће чини глукоза у β-D-пиранозном облику. Осим глукозе, као моносахаридне јединице јављају се и глукуронска киселина, ксилоза, алоза, а у оквиру дисахардних гликона, и рамноза и галактоза (Табелa 2 ).

Табела 2. Флавоноидни хетерозиди биљака рода Thymus

Једињење Таксон Референца

Th. collinus Bieb. Vila (2002) Th. marschallianus Willd. Vila (2002) Th. nummularius Bieb. Vila (2002) Th. serpyllum L. Vila (2002), Апигенин 7-О-глукозид Boros и сар. (2010)*, Kulišić и сар. (2006) Th. vulgaris L. Vila (2002), Hossain и сар. (2010a)*, Koşar и сар. (2005)*,

Једињење Таксон Референца

Kulišić и сар. (2006) Th. membranaceus Boiss. Tomás и сар. (1985) Th. piperella L. Vila (2002) Th. webbianus Rouy Blásquez и сар. (1994) Th. glabrescens Willd. Boros и сар. (2010)* Th. pannonicus All. Boros и сар. (2010)* Th. praecox Opiz Boros и сар. (2010)* Th. pulegioides L. Boros и сар. (2010)* Th. vulgaris L. Nagy и сар. (2011)* Апигенин 7-О-глукуронид Th. serpyllum L. Miron и сар. (2011)* Th. x citriodorus (Pers.) Schreb. Pereira и сар, (2013)* Th. vulgaris L. Wang и сар. (1998) Апигенин 7-О-рутинозид Hossain и сар. (2010a)* Апигенин 4'-О-p-кумароилглукозид Th. serpyllum L. Vila (2002) Th. antoninae Rouy & Coincy Husain и Мarkham (1981) Th. baeticus Boiss. ex Lacaita Husain и Мarkham (1981) Th. camphoratus Hoffmanns. et Link Husain и Мarkham (1981) Th. capitellatus Hoffmanns. et Link Husain и Мarkham (1981) Th. cephalotus L. Husain и Мarkham (1981) Th. cherlerioides Vis. Husain и Мarkham (1981) Th. dolopicus Form. Husain и Мarkham (1981) Th. hirtus Willd. Husain и Мarkham (1981) Th. hyemalis Lange Husain и Мarkham (1981) Апигенин 6,8-ди-C-глукозид Th. jajlae (Klok. et Schost) Starkov Husain и Мarkham (1981) (виценин-2) Th. leucotrichus Haláscy Husain и Мarkham (1981) Th. longiflorus Boiss. Husain и Мarkham (1981) Th. mastigophorus Lacaita Husain и Мarkham (1981) Th. membranaceus Boiss. Husain и Мarkham (1981), Tomás и сар. (1985) Th. villosus L. Husain и Мarkham (1981) Th. vulgaris L. Husain и Мarkham (1981) Th. zygis L. Husain и Мarkham (1981) Th. webbianus Rouy Blásquez и сар. (1994) Th. vulgaris L. Wang и сар. (1998) Скутелареин 7-О-глукопиранозид Th. mastichina L Gordo и сар. (2010) Скутелареин глукозилглукуронид Th. serpyllum L. Vila (2002) Скутелареин 7 -О- Th. serpyllum L. Vila (2002) глукозил(1 ‰4)рамнозид Th. collinus Bieb. Vila (2002) Th. marschallianus Willd. Vila (2002) Th. nummularius Bieb. Vila (2002) Th. serpyllum L. Vila (2002) Th. vulgaris L. Vila (2002), Fecka и Turek (2008), Wang и сар. (1998) Th. loscosii Willk. Vila (2002) Лутеолин 7-О-глукозид Th. membranaceus Boiss. Tomás и сар. (1985) Th. piperella L. Vila (2002) Th. moroderi Pau ex Mart ínez Vila (1987) Th. webbianus Rouy Blásquez и сар. (1994) Th. tosevii ssp. tosevii var. tosevii Velen. Кулеванова (1996) Th. tose vii ssp. tosevii var. longifrons Кулеванова (1996) Ronn. Th. tosevii ssp. tosevii var. degenii Ronn. Кулеванова (1996) Th. tosevii ssp. tosevii var. Кулеванова (1996) substriatus (Borb.) Matevski

Једињење Таксон Референца

Th. longidens var. lanicaulis Ronn. Кулеванова (1996) Th. macedonicus ssp. macedonicus Кулеванова (1996) (Deg. et Ur.) Ronn. Th. alsarensis Ronn. Кулеванова (1996) Тh. willdenowii Boiss Ismaili и сар. (2001) Тh. broussonettii Boiss Ismaili и сар. (2002) Th. satureioides Coss. Ismaili и сар. (2004) Лутеолин 7 -О-(6'' -ферулоил) -β- Th. sipyleus Boiss. subsp. sipyleus var. Özgen и сар. (2011) глукопиранозид sipyleus Th. membranaceus Boiss. Tomás и сар. (1985) Th. moroderi Pau ex Mart ínez Vila (1987) Th. vulgaris L. Dapkevicius и сар. (2002) Kobayashi и сар. (2003) Лутеолин 7-О-глукуронид Fecka и сар. (2008) Nagy и сар. (2011)* Th. serpyllum L. Fecka и сар. (2008)* Miron и сар. (2011)* Th. sipyleus Boiss. subsp. sipyleus var. Özgen и сар. (2011) sipyleus Лутеолин 7-α-О-глукуронид Th. x citriodorus (Pers.) Schreb. Pereira и сар. (2013)* Th. membranaceus Boiss. Tomás и сар. (1985) Лутеолин 7-О-ксилозид Th. moroderi Pau ex Mart ínez Vila (1987) Лутеолин ацетилглукозид Th. vulgaris L. Justesen (2000)* Th. vulgaris L. Vila (2002), Лутеолин 7-О-диглукозид Justesen (2000)* Th. serpyllum L. Vila (2002) Th. membranaceus Boiss. Tomás и сар. (1985) Th. vulgaris L. Fecka и Turek (2008)* Лутеолин 7-О-рутинозид Hossain и сар. (2010a)* Th. serpyllum L. Fecka и Turek (2008)* Лутеолин 7 -О-неохесперидозид Th. membranaceus Boiss. Tomás и сар. (1985) (вероникастрозид) Лутеолин 7 -О- [ксилозил(1 ‰2)глукозид) Th. membranaceus Boiss. Tomás и сар. (1985) (лутеолин 7-О-самбубиозид) Лутеолин галактоарабинозид Th. serpyllum L. Vila (2002) Тh. willdenowii Boiss Ismaili и сар. (2001) Тh. broussonettii Boiss Ismaili и сар. (2002) Лутеолин 3'-О-глукуронид Th. satureioides Coss. Ismaili и сар. (2004) Th. vulgaris L. Hossain и сар. (2010a)* Лутеолин 3'-О-алозид Th. moroderi Pau ex Mart ínez Vila (1987) Th. sipyleus Boiss. subsp. sipyleus var. Özgen и сар. (2011) Лутеолин 5-О-β-глукопиранозид sipyleus Th. x citriodorus (Pers.) Schreb. Pereira и сар. (2013)* Th. loscosii Willk. Vila (2002) 6-Хидроксилутеолин 7-О-глукозид Th. membranaceus Boiss. Tomás и сар. (1985) Th. mastichina L. Gordo и сар. (2012) Диосметин 7-О-глукуронид Th. serpyllum L. Vila (2002) Дихидрофлавони (флаванони) Тh. willdenowii Boiss Ismaili и сар. (2001) Тh. broussonettii Boiss Ismaili и сар. (2002) Th. satureioides Coss. Ismaili и сар. (2004) Ериодиктиол 7-O-глукозид Th. vulgaris L. Fecka и Turek (2008)* Nagi и сар. (2011)* Th. serpyllum L. Fecka и Turek (2008)* Th. serpyllum L. Мiron и сар. (2011)* Eриодиктиол 7-О- глукуронид Th. vulgaris L. Nagi и сар. (2011)* Ериодиктиол 7-О-рутинозид Th. vulgaris L. Wang и сар. (1998)

Једињење Таксон Референца

(Ериоцитрин) Th. serpyllum L. Fecka и Turek(2008)* Kulišić и сар. (2006)* Th. vulgaris L. Fecka и Turek (2008)* Нарингенин 7-О-глукозид Koşar и сар. (2005)* Нарингенин 7 -О-рутино зид Th. vulgaris L. Fecka и Turek (2008)* (нарирутин) Хесперидин (хесперетин 7-О- Th. vulgaris L. Wang и сар. (1998) рутинозид) Fecka и Turek (2008)* Флавоноли Кверцетин 3-О-хексозид Th. vulgaris L. Hossain и сар. (2010a)* Кверцетин 4'-О-глукозид Th. serpyllum L. Generalić-Mekinić и сар. (2014)* Th. glabrescens Willd. Boros и сар. (2010)* Th. pannonicus All. Boros и сар. (2010)* Th. praecox Opiz Boros и сар. (2010)* Рутин Th. pulegioides L. Boros и сар. (2010)* Th. serpyllum L. Boros и сар. (2010)* Th. vulgaris L. Hossain и сар. (2010a)* Изорамнетин 3-О-глукозид Th. vulgaris L. Hossain и сар. (2010a)* *, једињење је идентификовано применом метода течне хроматографије са UV или MS детекцијом упоређивањем са екстерним стандардом и/или тумачењем масеног спектра.

2.2.3. Фенолкарбоксилне киселине У Thymus врстама утврђено је присуство обе серије фенолкарбоксилних киселина, и деривата бензојеве и деривата кафене киселине ( Табела 3 ; Слика 1 ). Деривати кафене киселине су чешће заступљени од деривата бензојеве киселине и могу чинити и до 80% укупних полифенола биљака рода Thymus . Кафена киселина је релативно чест састојак, док је од њених једноставних деривата у мањем броју Thymus таксона утврђено присуство p-кумарне, ферулинске и синапинске киселине. Међутим, кафена киселина и њени једноставни деривати (метилестри, етилестри, метилетри, гликозиди) обично су присутни у ниским концентрацијама, а као преовлађујућа једињења јављају се депсидни (хлорогенска киселина, розмаринска киселина, кафеоилхина киселина) и олигомерни деривати кафене киселине. Деривати бензојеве киселине се ређе налазе у врстама овог рода. p- Хидроксибензојева, протокатехинска, гентизинска, ванилинска, гална, и сирингинска киселина су идентификоване у мањем броју таксона, обично у ниским концентрацијама. Основна компонента поларних екстраката већине испитаних Thymus таксона најчешће је розмаринска киселина, депсидно једињење, димер кафене киселине. Поред овог једињења, у биљакама рода Thymus јављају се и њени

деривати, глукозид и метилрозмаринат. У неким таксонима утврђено је и присуство тримера кафене киселине, као што су литосперминска киселина, салвианолинска киселина I, K и H (Pereira и Cardoso, 2013 ; Vila, 2002 ).

p-хидроксибензојева протокатехинска сирингинска гална киселина киселина киселина киселина

p-кумарна киселина кафена киселина ферулинска киселина

розмаринска киселина хлорогенска киселина HO

COOH OH HO COOH OH O COOH O COOH O O O OH HO O OH

HO HO литосперминска киселина салвианолинска киселина H

OH OH HO COOH OH O COOH O COOH HO O O OH HO O OH HO O салвианолинска киселина I HO салвианолинска киселина K HO COOH Слика 1. Неке фенолкарбоксилне киселине детектоване у биљкама рода Thymus

Табела 3. Фенолкарбоксилне киселине биљака рода Thymus

Једињење Таксон Референца

Деривати бензојеве киселине Th. carnosus Boiss. Vila (2002) Th. vulgaris L. Zgórka и Głowniak (2001)*, Kulišić и сар. (2006)*, p-Хидроксибензојева киселина Hossain и сар. (2010a)* Th. serpyllum L. Miron и сар. (2011)*, Generalić-Mekinić и сар. (2014)* Th. praecox Opiz subsp. caucasicus var. Turumtay и сар. (2014)* caucasicus p-Хидроксибензоил-хексозид Th. vulgaris L. Hossain и сар. (2010a)* Th. webbianus Rouy Blásquez и сар. (1994) Th. vulgaris L. Zgórka и Głowniak (2001)* Hossain и сар. (2010a)* Протокатехинска киселина Th. quinquecostatus var. japonica Hara Lee и сар. (2011) Th. praecox Opiz subsp. caucasicus var. Turumtay и сар. (2014)* caucasicus Тh. serpyllum L. Generalić-Mekinić и сар. (2014)* Гентизинска киселина Th. vulgaris L. Zgórka и Głowniak (2001)* Th. carnosus Boiss. Vila (2002) Th. vulgaris L. Zgórka и Głowniak (2001)*, Kivilompolo и сар. (2007)* Ванилинска киселина Hossain и сар. (2010a)* Th. serpyllum L. Miron и сар. (2011)* Th. praecox Opiz subsp. caucasicus var. Turumtay и сар. (2014)* caucasicus Th. webbianus Rouy Blásquez и сар. (1994) Th. vulgaris L. Shan и сар. (2005)* Гална киселина Hossain и сар. (2010a)* Th. praecox Opiz subsp. caucasicus var. Turumtay и сар. (2014)* caucasicus Th. serpyllum L Generalić-Mekinić и сар. (2014)* Th. carnosus Boiss. Vila (2002) Th. webbianus Rouy Blásquez и сар. (1994) Th. vulgaris L. Zgórka и Głowniak (2001)* Сирингинска киселина Kivilompolo и сар. (2007)* Hossain и сар. (2010a)* Th. serpyllum L. Miron и сар. (2011)* Th. praecox Opiz subsp. caucasicus var. Turumtay и сар. (2014)* caucasicus Деривати кафене киселине Th. carnosus Boiss. Vila (2002) Th. aestivus Reut. es Willk Vila (2002) Th. antoninae Rouy et Coincy Vila (2002) Th. baeticus Boiss. ex Lacaitae Vila (2002) Th. camphoratus Hoffmanns. et Link Vila (2002) Th. capitellatus Hoffmanns. et Link Vila (2002) Th. funkii Coss. Vila (2002) Th. glandulosus Lag. ex H. Del Villar Vila (2002) Кафена киселина Th. membranaceus Boiss. Vila (2002) Th. moroderi Pau ex Martínez Vila (2002) Th. orospedanus H. Del Villar Vila (2002) Th. vulgaris L. Vila (2002), Zgórka и Głowniak (2001)*, Shan и сар. (2005)*, Kulišić и сар. (2006)*, Kivilompolo и сар. (2007)*

Једињење Таксон Референца

Woydiło и сар. (2007)*, Fecka и Turek (2008)*, Hossain и сар. (2010a)* Th. wilkomii Ronn. Vila (2002) Th. bashkiriensis Klok. et Schost. Vila (2002) Th. albanus H. Braun Кулеванова (1996) Th. alsarensis Ronn. Кулеванова (1996) Th. balcanus Borb. Кулеванова (1996) Th. jankae var. jankae Celak Кулеванова (1996) Th. jankae var. pantotrichus Ronn. Кулеванова (1996) Th. jankae var. patentipilus Lyka Кулеванова (1996) Th. longidens var. dassareticus Ronn. Кулеванова (1996) Th. longidens var. lanicaulis Ronn. Кулеванова (1996) Th. macedonicus ssp. macedonicus (Deg. et Кулеванова (1996) Ur.) Ronn. Th. moesiacus var. moesiacus Velen. Кулеванова (1996) Th. tosevii ssp. tosevii ssp. substriatus (Borb.) Кулеванова (1996) Matevski Th. tosevii ssp. tosevii var. degenii Ronn. Kулеванова (1996) Th. tosevii ssp. tosevii var. longifrons Ronn. Kулеванова (1996) Th. tosevii ssp. tosevii var. tosevii Velen. Кулеванова (1996) Th. serpyllum L. Janiczák и сар. (1999)*, Fecka и Turek (2008)*, Boros и сар (2010)*, Miron и сар. (2011)* Тh. glabrescens Willd. Komes и сар. (2011)* Th. pannonicus All. Boros и сар (2010)* Th. praecox Opiz Boros и сар (2010)* Th. pulegioides L. Boros и сар (2010)* Th. quinquecostatus var. japonica Hara Lee и сар. (2011) Th. praecox Opiz subsp. caucasicus var. Turumtay и сар. (2014)* caucasicus Етилестар кафене киселине Th. serpyllum L. Miron и сар. (2011)* Th. vulgaris L. Hossain и сар. (2010a)*, Хексозид кафене киселине Nagy и сар. (2011)* Th. carnosus Boiss. Vila (2002) Th. webbianus Rouy Blásquez и сар. (1994) Th. vulgaris L. Zgórka и Głowniak (2001)* Shan и сар. (2005)* Hossain и сар. (2010a)* Th. serpyllum L. Kivilompolo и сар. (2007)*, Boros и сар (2010)*, p-Кумарна киселина Komes и сар. (2011)*, Miron и сар. (2011)*, Generalić-Mekinić и сар. (2014)* Тh. glabrescens Willd. Boros и сар (2010)* Th. pannonicus All. Boros и сар (2010)* Th. praecox Opiz Boros и сар (2010)* Th. pulegioides L. Boros и сар (2010)* Th. praecox Opiz subsp. caucasicus var. Turumtay и сар. (2014)* caucasicus Th. vulgaris L. Kivilompolo и сар. (2007)*, Woydiło и сар. (2007)*, Hossain и сар. (2010)* Ферулинска киселина Тh. glabrescens Willd. Boros и сар (2010)* Th. pannonicus All. Boros и сар (2010)* Th. praecox Opiz Boros и сар (2010)* Th. pulegioides L. Boros и сар (2010)*

Једињење Таксон Референца

Th. serpyllum L. Boros и сар (2010)*, Generalić-Mekinić и сар. (2014)* Th. praecox Opiz subsp. caucasicus var. Turumtay и сар. (2014)* caucasicus Th. webbianus Rouy Blásquez и сар. (1994) Th. vulgaris L. Hossain и сар. (2010a)* Th. serpyllum L. Boros и сар (2010)*, Miron и сар. (2011)*, Komes и сар. (2011)* Хлорогенска киселина Тh. glabrescens Willd. Boros и сар (2010)* Th. pannonicus All. Boros и сар (2010)* Th. praecox Opiz Boros и сар (2010)* Th. pulegioides L. Boros и сар (2010)* Th. praecox Opiz subsp. caucasicus var. Turumtay и сар. (2014)* caucasicus 4-Кафеоилхина киселина Th. serpyllum L. Miron и сар. (2011)* Th. webbianus Rouy Blásquez и сар. (1994) 3,5-Дикафеоилхина киселина Th. vulgaris L. Hossain и сар. (2010a)* Th. aestivus Reut. es Willk. Vila (2002) Th. antoninae Rouy et Coincy Vila (2002) Th. baeticus Boiss. ex Lacaitae Vila (2002) Th. camphoratus Hoffmanns. et Link Vila (2002) Th. capitellatus Hoffmanns. et Link Vila (2002) Th. glandulosus Lag. ex H. Del Villar Vila (2002) Th. membranaceus Boiss. Vila (2002) Th. moroderi Pau ex Martínez Vila (2002) Th. orospedanus H. Del Villar Vila (2002) Th. vulgaris L. Vila (2002) Zgórka и Głowniak (2001)*, Dapkevicius и сар. (2002), Kobayashi и сар. (2003), Koşar и сар. (2005)*, Shan и сар. (2005)*, Kivilompolo и сар. (2007)* Fecka и Turek (2008)*, Hossain и сар. (2010a)*, Damašius и сар. (2014)* Розмаринска киселина Th. wilkomii Ronn. Vila (2002) Th. bashkiriensis Klok. et Schost. Vila (2002) Th. alsarensis Ronn. Kулеванова (1996) Th. longidens var. lanicaulis Ronn. Kулеванова (1996) Th. macedonicus ssp. macedonicus (Deg. et Kулеванова (1996) Ur.) Ronn. Th. tosevii ssp. tos evii ssp. substriatus (Borb.) Kулеванова (1996) Matevski Th. tosevii ssp. tosevii var. degenii Ronn. Kулеванова (1996) Th. tosevii ssp. tosevii var. longifrons Ronn. Kулеванова (1996) Th. tosevii ssp. tosevii var. tosevii Velen. Kулеванова (1996) Th. sipyleus Boiss. subsp. sipyleus var. sipyleus Özgen и сар. (2011) Тh. willdenowii Boiss Ismaili и сар. (2001) Th. satureioides Coss. Ismaili и сар. (2004) Th. quinquecostatus var. japonica Hara Lee и сар. (2011) Th. serpyllum L. Janiczák и сар. (1999)*, Fecka и Turek (2008)*, Boros и сар (2010)* Miron и сар. (2011)*, Komes и сар. (2011)*, Generalić-Mekinić и сар. (2014)*

Једињење Таксон Референца

Тh. glabrescens Willd. Boros и сар (2010)* Th. pannonicus All. Boros и сар (2010)* Th. praecox Opiz Boros и сар (2010)* Th. pulegioides L. Boros и сар (2010)* Th. x citriodorus (Pers.) Schreb. Pereira и сар. (2013)* Глукозид розмаринске киселине Th. vulgaris L. Nagy и сар. (2011)* Метилрозмаринат Th. vulgaris L. Fecka и Turek (2008) Литосперминска киселина Th. serpyllum L. Fecka и Turek (2008) Литосперминска киселина B Th. vulgaris L. Damašius и сар. (2014)* Салвианолинска киселина H Th. vulgaris L. Dapkevicius и сар. (2002), (3 ′-O-(8 ′′ -Z-Кафеоил)- Nagy и сар. (2011)* розмаринска киселина) Th. x citriodorus (Pers.) Schreb. Pereira и сар. (2013)* Салвианолинска киселина I Th. vulgaris L. Nagy и сар. (2011)* Салвианолинска киселина K Th. vulgaris L. Nagy и сар. (2011)* *, једињење је идентификовано применом метода течне хроматографије са UV или MS детекцијом упоређивањем са екстерним стандардом и/или тумачењем масеног спектра.

3. Биолошка активност екстраката и секундарних метаболита биљака рода Thymus

У различитим in vitro и in vivo испитивањима утврђена је пре свега антимикробна, антиоксидантна и спазмолитичка активност етарског уља и екстраката биљака различитих врста рода Thymus . Антимикробна активност производа на бази биљака рода Thymus у великој мери је последица присуства етарског уља. У многобројним испитивањима потврђена је осетљивост микроорганизама према 'фенолним' етарским уљима, при чему су за активност уља одговорни управо фенолни монотерпени тимол и карвакрол. Етарска уља биљака рода Thymus која не садрже феноле испољавају слабију антимикробну активност. Према дејству етарског уља Грам(+) бактерије су генерално осетљивије од Грам(–), а добра активност је утврђена и према већем броју гљивица (Zarzuelo и Crespo, 2002 ; Pina-Vaz и сар., 2004 ; De Martino и сар., 2009 ; Ruiz-Navajas и сар., 2012 ; Tekoriene и Ložienè, 2012 ). Етарска уља различитих врста рода Thymus испољила су активност према бактерији Helicobacter pylori , а да при том нису показала токсични ефекат према линији ћелија гастричне мукозе ( Dandlen и сар., 2011 ). Поред етарског уља, антимикробну активност показују и различити екстракти

биљака рода Thymus . Ефекат екстраката израђених мање поларним растварачима обично је јачи од ефекта поларнијих екстраката ( Unal и сар., 2008 ; Vardar-Unlü и сар., 2003 ). У поређењу са екстрактима других биљака, екстракти биљака рода Thymus испољавају значајнију антиоксидантну активност in vitro . Сматра се да су за овакву активност одговорна полифенолна једињења, фенолкарбоксилне киселине и флавоноиди ( Miura и Nakatani, 1989 ; Zheng и сар., 2001 ; Shan и сар., 2005 ; Hossain и сар., 2010б ). Запажено је да, осим од саставa неиспарљиве фракције, активност екстраката хербе тимијана зависи и од састава испарљивих једињења, састојака етарског уља. Тако је на пример, установљена јача антиоксидантна активност етанолних и ацетонских екстраката хербе фенолних хемотипова Th. pulegioides у поређењу са линалол и гераниал/гераниол/нерал хемотипом ( Ložienè и сар., 2007 ), а слично је уочено и код екстраката различитих хемотипова Th. vulgaris (Chizzola и сар., 2008 ). Добра антиоксидантна активност етарског уља тимијана са тимолом и/или карвакролом као доминантним састојцима утврђена је у различитим испитивањима. 'Нефенолна' етарска уља Thymus врста, са високим садржајем 1,8-цинеола, линалола, борнеола или терпинен-4-ола, такође испољавају извесну антиоксидантну активност, у појединим случајевима јачу од поредбених супстанци, али слабију у односу на етарска уља са високим садржајем фенола ( Miguel, 2010 ). Спазмолитички ефекат хербе Th. vulgaris приписује се флавоноидним једињењима, тимонину, цирзилинеолу и 8-метоксицирзилинеолу ( Van den Broucke и Lemly, 1983 ). У новијим испитивањима спазмолитичке активности, фракционисање и пречишћавање екстракта хербе тимијана (официналног у DAB 10*) резултовало је изоловањем лутеолина и лутеолин 7-О-глукозида као најактивних компоненти, при чему је установљено да розмаринска киселина и апигенин не доприносе значајно дејству екстракта ( Engelbretz и сар., 2012 ). Begrow и сар. (2010) су утврдили да се релаксантно и спазмолитично дејство екстракта на изоловане органе (трахеју и илеум пацова) остварује преко неколико механизама и да укупном ефекту доприносе и тимол и карвакрол. Осим екстраката Th. vulgaris , и екстракти биљака других Thymus врста ( Th.

* За припрему екстракта хербе тимијана коришћена је смеша NH 4OH, глицерола, етанола и воде, при односу дрога – растварач 1:10 ( Engelbertz и сар., 2012 ).

18 satureioides Coss., Th. webbianus Rouy, Th. leptophyllus Lange, Th. orospedanus H. Del Villar) испољавају спазмолитички ефекат, при чему је утврђено да су мање поларне фракције екстраката активније у поређењу са поларним фракцијама, као и да ефекту значајно доприносе метоксиловани флaвоноиди ( Zarzuelo и Crespo, 2002 ). Eкстракти и етарска уља биљака различитих Thymus врста су у различитим in vitro експериментима испољили и антиинфламаторну ( Vigo и сар., 2004; Ocaña и Reglero, 2012 ) и цитотоксичну активност ( Gordo и сар., 2012 ; Berdowska и сар., 2013 ; Nikolić и сар., 2014 ), као и инхибиторни ефекат на ензим ацетилхолинестеразу ( Mata и сар., 2007 ), док је in vivo испитивањима установљено хепатопротективно дејство етарског уља ( Jiménez и сар., 1993 ), као и антихипертензивни ( Mihailović-Stanojević и сар., 2013 ) и антиноцицептивни ефекат екстраката ( El Habazi и сар., 2006 ). Поред овога, примена екстракта хербе тимијана ( Th. vulgaris ) доводи до повећања мукоцилијарног клиренса, како in vitro (Begrow и сар., 2010 ), тако и in vivo (Wienkötter и сар., 2007 ).

4. Употреба биљака рода Thymus

Биљке рода Thymus користе се као лековите (херба, етарско уље) и зачинске (херба), у прехрамбеној, козметичкој и индустрији парфема (етарско уље) и као украсне ( Lawrence и Tucker, 2002 ; Figueiredo и сар., 2008 ). Сматра се да су се биљке рода Thymus у древном Египту користиле за израду парфемских масти и балзамовање, као и да су се биљке овог рода још у периоду пре нове ере користиле као зачинскe, али није утврђено која је тачно врста (или врсте) била у употреби. Први наводи о овим биљкама датирају из периода V-IV века п.н.е. у записима Хипократа, као и Плинијуса и Диоскорида из првог века нове ере ( Teuscher, 2008 ; Zarzuelo и Crespo, 2002 ). Од средњег века тимијан се гаји као баштенска зачинска и лековита биљка, а сматра се да је употреба етарског уља тимијана започета у XVI в. ( Lawrence и Tucker, 2002 ). Данас се на тржишту Европе углавном налази етарско уље добијено дестилацијом хербе Тh. zygis L. (шпански тимијан), док су свежа или сува херба

Th. vulgaris L. и Th. zygis L., подједнако заступљене. У честој употреби су и херба и етарско уље Th. serpyllum L., као и Th. mastichina L. Као главне компоненте етарских уља употребљаваних биљака Th. vulgaris , Th. zygis и Th. serpyllum налазе се тимол и карвакрол, а у уљу Th. mastichina 1,8-цинеол и линалол ( Lawrence и Tucker, 2002 ). Поред хербе и етарског уља наведених врста, у последње време све више су употреби херба и етарско уље Th. x citriodorus (Pers.) Schreb., мириса на лимун, који се користе у кулинарству и ароматерапији ( Lawrence и Tucker, 2002 ; Pereira и сар., 2013 ). У прехрамбеној индустрији се екстракти и/или етарско уље биљака рода Thymus користе као конзерванси, захваљујући антиоксидантној активности екстраката и антимикробној активности етарског уља ( Zarzuelo и Crespo, 2002 ; Sagdic и сар., 2009 ).

4.1. Традиционална лековита примена биљака рода Thymus

Инфуз и етарско уље биљака рода Thymus , најчешће Th. vulgaris , Th. serpyllum , Th. zygis , традиционално се користе споља код повреда, модрица, инфицираних улцера, апсцеса, различитих дерматитиса и код свраба. Такође, забележена је употреба код реуматских болова (ишијас, артритис, лумбаго), гихта и неуропатског бола, код којих се емулзија на бази екстракта ових биљака утрљава уз масажу на болно место. Поред тога, производи на бази биљака овог рода се користе код неких случајева алопеције јер се сматра да побољшавају прокрвљеност коже и делују антисебороично, а забележена је и спољашња примена код проблематичне коже са акнама. Сматра се да додатак хербе води за купање делује оснажујуће, али и седативно, умирујуће. Етарско уље ових биљака је током Првог светског рата коришћено као антисептик, а воде за испирање уста се користе код инфекција десни ( Zarzuelo и Crespo, 2002 ; Figueiredo и сар., 2008 ). Интерно се инфузи биљака рода Thymus користе, пре свега, код респираторних и гастроинтестиналних тегоба. Захваљујући експекторантном, спазмолитичном и антисептичном дејству примењују се за ублажавање кашља код грипа и прехладе, синузитиса, хроничног и акутног бронхитиса, као и код

надражајног кашља. Сматра се да инфуз повољно делује и код диспептичних тегоба, флатуленције, дијареје, гастритиса или чира на желуцу. Поред тога, интерно примењен инфуз се традиционално примењује као тоник, средство против несанице, анксиозности и депресије, код проблема у уринарном тракту и као еменагог. Етарско уље је коришћено за ерадикацију цревних паразита (Zarzuelo и Crespo, 2002 ; Figueiredo и сар., 2008 ). На подручју Србије мајчина душица ( Th. serpyllum L.) се користила за испирање усне дупље код појаве афти, као облога код грчења вилице или појаве лишаја на кожи, као и код тегоба у желуцу или мањка апетита ( Чајкановић, 1985 ). Према новијим подацима у Србији се инфуз мајчине душице ( Th. serpyllum L.) традиционално користи код гастроинтестиналних тегоба, а код упала зглобова се примењује споља у облику купки или инфуза. Такође се сматра 'леком за све болести' и превентивним средством ( Jarić и сар., 2007 ). На Пештерској висоравни се инфуз хербе Th. pulegioides L. користи код болова у стомаку, прехладе, кашља, повишене температуре, код блажих поремећаја нервног система, као и код свих осталих здравствених проблема ( Pieroni и сар., 2011 ). У Босни и Херцеговини се различите врсте рода Thymus (Th. comosus Heuffel ex Griseb, Th. longedentatus Ronn., Th. praecox Opiz, Th. pulegioides L.) примењују у облику инфуза код проблема са јетром, за умирење, за прочишћавање крви, код камена у бубрегу, код бронхитиса и астме, бола у грлу, код задаха из уста, дијареје, флатуленције, грчева у стомаку, код ноћног мокрења код деце, као роборанс, против несанице и мамурлука, а екстерно против несанице и за третман масне косе ( Šarić-Kundalić и сар., 2010 ; Šarić- Kundalić и сар., 2011 ).

4.2. Примена лековитих производа на бази биљака рода Thymus заснована на доказима

У савременој фитотерапији као традиционални биљни лекови, према Европској агенцији за лекове ( European Medicines Agency , EMA ), у употреби су производи на бази хербе ( Thymi herba , Th. vulgaris L., Тh. zygis L., Lamiacecae) и етарског уља тимијана ( Thymi aetheroleum , Th. vulgaris L., Тh. zygis L., Lamiaceae).

Инфуз, течни, меки и суви екстракти хербе, као и тинктура хербе, користе се per os као експекторанси код кашља повезаног са прехладом и споља код упала десни и слузнице усне дупље и грла ( EMA/HMPC/342332/2013). Етарско уље у облику течних препарата такође се примењује per os као експекторанс код прехладе. За ублажавање симптома прехладе примењују се и течни и получврсти облици за спољашњу употребу на кожи или као додаци води за купање ( EMA/HMPC/131901/2009 ). Комбиновани препарати на бази хербе тимијана и корена јагорчевине се у облику чврстих и течних препарата користе интерно као експекторанси (EMA/HMPC/130042/2010 Corr .) Према немачкој Комисији Е, херба тимијана, Thymi herba (Th. vulgaris L., Тh. zygis L., Lamiacecae), се примењује и код пруритуса у облику додатака води за купање, као и интерно за убалажавање симптома бронхитиса и великог кашља и код упала слузница горњег респираторног тракта. Поред ове дроге, Комисија Е наводи као дрогу и хербу мајчине душице, Serpylli herba (Th. serpyllum L., Lamiaceae), којa се примењује на сличан начин као Thymi herba (Blumenthal, 1998 ).

4.3. Официналне дроге

Биљке рода Thymus представљају биолошке изворе дрога и препарата дрога официналних у савременим фармакопејама. У Европској фармакопеји ( Ph. Eur. 7.0 ) официнални су: херба тимијана, Thymi herba (Th. vulgaris L., Тh. zygis L., Lamiacecae), етарско уље тимијана, Thymi aetheroleum (Th. vulgaris L., Тh. zygis L., Lamiaceae) и херба мајчине душице, Serpylli herba (Th. serpyllum L., Lamiaceae). Основни параметар специфичног квалитета хербе тимијaна и хербе мајчине душице је садржај етарског уља (најмање 12 mL/kg у херби тимијана и најмање 3 mL/kg у херби мајчине душице), а за хербу тимијана захтева се и да садржај фенолних монотерпена тимола и карвакрола у изолованом етарском уљу износи најмање 40%. За Thymi aetheroleum постављени су захтеви за садржај тимола (36,0–55,0%) и карвакрола (1,0–4,0%), као и захтеви за садржај β-мирцена (1,0–3,0%), γ-терпинена (5,0–10,0%), p-

цимена (15,0–28,0%), линалола (4,0–6,5%) и терпинен-4-ола (0,2–2,5%). У Петој југословенској фармакопеји ( Ph. Jug. V ) официнална је херба тимијана, Thymi herba (Th. vulgaris L., Тh. zygis L., Lamiacecae).

5. Thymus pannonicus All.

У овом раду испитана је врста Thymus pannonicus All. (Lamiaceae) (панонски тимијан, енг. Hungarian thyme , Euroasian thyme ). Биљке ове врсте карактеришу се одрвенелим стабљикама које доњим делом леже на земљи, а средњим и горњим делом се издижу. Цветне гране су мање-више усправне, а стерилни изданци усправни. Цео изданак је густо прекривен длакама; цветне гране покривене дугачким стршећим длакама. Листови су издужено или линеарно ланцетасти, са развијеном лисном дршком, са утиснутим жлездама, на лицу густо покривени мање-више стршећим дугачким длакама. Цваст је класолико издужена, ређе лоптаста, скраћена. Растe на осунчаним затрављеним површинама. Јавља се на подручју целе Европе, а у Србији се јавља subvar. griseus Ronn. спорадично, у источној и југоисточној Србији и Војводини ( Диклић, 1974 ). Према Флори Европе врста Thymus pannonicus All. (syn. Th. kosteleckyanus Opiz) укључује и Th. marschallianus Wild., таксон који се у Флори Србије третира као врста. У овом раду је прихваћена класификација дата у Флори Европе (Jalas, 1972 ).

5.1. Досадашња фармакогнозијска испитивања Th. pannonicus

Врста Th. pannonicus је до сада само делимично испитана. Највећи број испитивања односио се на садржај и састав етарског уља (Табела 4 ). Састојци поларних екстраката, флавноиди, фенолкарбоксилне киселине, ређе су испитивани. Подаци о биолошкој и фармаколошкој активности екстраката и секундарних метаболита ове биљке су спорадични.

Као доминантни састојци раније испитиваног етарског уља хербе панонског тимијана најчешће се јављају тимол и/или карвакрол. У погледу састојака етарског уља популације панонског тимијана са подручја Србије су прилично разноврсне. Као главне компоненте етарског уља идентификовани су α-пинен, гермакрен D, линaлол, ( Е)-кариофилен, цитрал (смеша гераниала, тј. trans -цитрала, и нерала, тј. cis -цитрала), мирцен, тимол и α-терпинилацетат. Преглед главних састојака до сада испитиваних етарских уља Th. pannonicus дат је у Табели 4 .

Табела 4. Преглед најзаступљенијих компоненти етарског уља Th. pannonicus

Порекло Састојци етарског уља Референца

α-пинен (19,90%), (Е)-β-оцимен (14,24%), ( Z)-β-оцимен (12,45%), камфор Србија Šoštarić, 2012 (7,58%) гермакрен D (36,91%), α-пинен (13,88%), мирцен (7,56%), ( Е)-β-фарнезен Србија Šoštarić, 2012 (6,96%), ( Е)-β-оцимен (5,61%)

Србија линалол (66,06%), β-бисаболен (7,76%), камфор (6,01%) Šoštarić, 2012

Србија (Е)-кариофилен (40,30%), лимонен (24,82%), ( Е)-β-оцимен (6,56%) Šoštarić, 2012

Србија гераниал (51,74%), нерал (34,05%), терпинен-4-ол (4,34%) Šoštarić, 2012

мирцен (25,85%), α-терпинеол (20,01%), ( Е)-γ-бисаболен, ( Е)-кариофилен Србија Šoštarić, 2012 (11,75%) гермакрен D (34,00%), бициклогермакрен (12,30%), ( Е)-β-оцимен (9,75%), Србија Šoštarić, 2012 1 мирцен (4,75%) гермакрен D (20,40%), (E)-кариофилен (14,57%), β-бурбонен (9,17%), Србија Šoštarić, 2012 1 кариофилен оксид (5,45%)

Србија гермакрен D (66,66%), α-пинен (11,29%) Šoštarić, 2012 1

тимол (40,9%), p-цимен (16,1%), тимолметилетар (10,2%), γ-терпинен (7,6%), Србија Pluhár и сар., 2012а карвакролметилетар (6,5%) тимол (42,8 -56,2%), p-цимен (3,4 -16,1%), γ-терпинен (2,6 -13,4%), Мађарска тимолметилетар (3,8-20,8%), карвакролметилетар (4,1-5,7%), β-бисаболен (2,3- Pluhár и сар., 2012а 8,5%), Мађарска тимол (24.6-67.5%) Pluhár и сар., 2010

Мађарска тимол (36.5-63.7%) , p-цимен (11.5-27.3%) Pluhár и сар., 2010

Мађарска тимол (28.4-63.7%), p-цимен (11.5-31.8%), γ-терпинен (9.7-20.9%) Pluhár и сар., 2010

Мађарска тимол (36.5%), p-цимен (27.3%), нерал (11.2%) Pluhár и сар., 2010

Мађарска тимол (38.5%), p-цимен (20.6%), γ-терпинен (12.0%), β-бисаболен (10.3%) Pluhár и сар., 2010

Мађарска тимол (41.9%), p-цимен (20.2%), изоборнеол (10.3%), α-терпинен (9.9%) Pluhár и сар., 2010

тимол (27.7%), линалилацетат (18.8%), γ-терпинен (18.6%), α-кубебен Мађарска Pluhár и сар., 2010 (13.9%)

Мађарска p-цимен (45.0%), гераниол (13.6%), линалилацетат (9.9%) Pluhár и сар., 2010

Порекло Састојци етарског уља Референца

Мађарска линалилацетат (36.2%), геранилацетат (20.2%) Pluhár и сар., 2010

Мађарска гермакрен D (43.4), ( Е)-кариофилен (15.0%) Pluhár и сар., 2010

Мађарска кариофилен оксид (45.2%), α-кубебен (15.7%), линалол (13.8%) Pluhár и сар., 2010

Мађарска гермакрен D (29.7%), (E)-кариофилен (22.0%), фарнезол (10.4%) Pluhár и сар., 2010

Кина тимол (32,9%), γ-терпинен (22,4%), карвакрол (8,0%), p-цимен (7,7%) Јia и сар., 2010 1

Maksimović и сар., Србија гераниал (41,42%), нерал (29,61%), терпинен-4-ол (4,34%) 2008

Мађарска тимол (25-41%), p-цимен (17-38%) Pluhár и сар., 2007

Словачка α-терпинилацетат (74,9-84,5%), лимонен (3,3-13,0%), α-терпинеол Stahl-Biskup, 2002 2

Словачка тимол (41,0-50,5%), p-цимен (16,7-25,5%), γ-терпинен (7,2-14,8%), гераниол Stahl-Biskup, 2002 2

Словачка линалол (70-72%) Stahl-Biskup, 2002 2

тимол (12,3-43,1%), p-цимен (6,5-36,7%), гераниол (1,3-29,6%), γ-терпинен (1,6- Словачка Stahl-Biskup, 2002 2 27,3%), тимолметилетар p-цимен (32,6-66,2%), тимол (11,7-29,9%), тимолметилетар (6,7-10,3%), γ- Словачка Stahl-Biskup, 2002 2 терпинен, гераниол α-терпинилацетат (31,33%), терпинен-4-ол (4,50%), карвакрол (3,21%), тимол Karuza-Stojaković и Србија (2,80%) сар., 1989 Karuza-Stojaković и Србија тимол (13,37%), p-цимен (9,15%), карвакрол (3,23%), терпинен-4-ол (3,14%) сар., 1989 1

Украјина тимол (29,0-59,3%), γ-терпинен, p-цимен Stahl-Biskup, 2002 1

Украјина карвакрол (39,1-61,4%), тимол, γ-терпинен, p-цимен Stahl-Biskup, 2002 1

Украјина тимол (26,4/19,7%), карвакрол (28,1/17,1%), γ-терпинен, p-цимен Stahl-Biskup, 2002 1

Украјина гераниол (33,7-70,2%), геранилацетат (5,4-11,6%), гераниал (1,7-10,1%) Stahl-Biskup, 2002 1

Украјина карвеол (65,8%), борнеол, α-терпинеол Stahl-Biskup, 2002 1

СССР гераниол (30,3%), лимонен (10,1%), α-пинен, α-терпинеол, β-кариофилен Stahl-Biskup, 2002 1

p-цимен (22,4%), тимол (20,0%), γ-терпинен (19,3%), β-бисаболен, Dembitski и сар., Казахстан тимолметилетар 1985 1 1, биљни материјал идентификован као Thymus marschallianus Willd.; 2, биљни материјал је идентификован као Thymus kosteleckyanus Opiz.

Од неиспарљивих састојака, у херби Th. pannonicus утврђено је присуство флавоноида: апигенина, лутеолина, скутелареина, кверцетина, дихидрокверцетина, ериодиктиола, нарингенина, хесперетина, апигенин 7-О- глукозида, лутеолин 7-О-глукозида и рутина, као и фенолкарбоксилних киселина: кафене, ферулинске, хлорогенске и розмаринске киселине ( Vila, 2002 ;

Boros и сар., 2010 ). Поред тога, детектован је већи број флавоноидних агликона присутних на површини листова (Šoštarić, 2012 ; Vila, 2002 ). Надземни делови панонског тимијана у јужном Банату традиционално се користе у облику инфуза код блажих респираторних и гастроинтестиналних тегоба, као и за ароматизацију домаћих џемова, колача. Јединке овог поднебља су карактеристичног мириса на лимун који потиче од цитрала, састојка етарског уља. Ово етарско уље испољило је инхибиторну активност на раст неколико сојева бактерија, а показана активност је, бар делимично, приписана цитралу (Maksimović и сар., 2008 ). Други подаци о овој врсти нису познати.

II Циљ рада За разлику од бројних других врста рода Thymus , хемијски састојци Th. pannonicus нису подробно изучавани и биолошка активност није научно потврђена, али се може претпоставити да херба панонског тимијана поседује лековита својства слично другим сродним врстама. Поред потенцијалне лековитости хербе, постоји могућност коришћења ове ароматичне биљке за добијање етарског уља. Раније је установљено да херба панонског тимијана са Вршачких планина садржи етарско уље богато цитралом, течношћу која има пријатну арому лимуна и која се користи за ароматизацију козметичких и прехрамбених производа, као и у индустрији парфема ( SciFinder, 2013а ). С обзиром на то да се врсте овог рода, пре свега Th. vulgaris , успешно гаје код нас, поставља се питање могућности плантажног гајења панонског тимијана ради добијања већих количина биљног материјала, а уз очување природних ресурса. Потенцијална производња етарског уља би као додатни производ имала велике количине воденог екстракта. Овакви, тзв., деодорисани водени екстракти се сматрају отпадним материјалом, али је за неке њихове фракције показано да садрже биљне састојке полифенолне природе са извесном фармаколошком активношћу (пре свега антиоксидантном), и да као такви могу представљати лековиту сировину, или се могу користити у прехрамбеној индустрији као конзерванси ( Dorman и сар., 2003 ).

С обзиром на забележену традиционалну лековиту примену до сада мало проучаване врсте Th. pannonicus All., а имајући у виду позната дејства и употребу сродних биљних врста, циљeви овог рада су: ° испитати хемијски састав хербе и фармаколошку активност поларних екстраката хербе биљака пореклом са природних станишта, ° испитати хемијски састав и фармаколошку активност деодорисаног воденог екстракта који се добија као споредни производ током изоловања етарског уља хербе, ° одабрати узорак самониклог панонског тимијана за увођење у систем плантажног гајења, ° утврдити варијабилност хемијског састава и биолошке активности хербе панонског тимијана гајеног у плантажним условима, и

° дефинисати дрогу и особине дроге чији је биолошки извор Th. pannonicus и поставити захтеве за идентификацију, општи и специфични квалитет дроге.

III Материјал и методе 1. Порекло материјала

У испитивањима у овом раду су коришћени надземни делови панонског тимијана, Thymus pannonicus All. (Lamiaceae). Биљни материјал је добијен сакупљањем узорака са природног станишта и од биљака гајених на огледној плантажи Института за проучавање лековитог биља “Др Јосиф Панчић” у Панчеву. Биљни материјал је идентификовао доц. др Иван Шоштарић (Катедра за ботанику, Универзитет у Београду – Пољопривредни факултет, Београд) у складу са Флором Европе ( Jalas, 1972 ). Хербарски примерци су депоновани у Хербаријуму Катедре за агроботанику, Универзитет у Београду – Пољопривредни факултет, Београд. У испитивањима су коришћени и узорци земљишта са локалитета где панонски тимијан самоникло расте.

1.1. Материјал сакупљен на природном станишту

Надземни делови панонског тимијана сакупљени су на локалитетима у јужном Банату (локалитети 1–11 ) и на планинама у источној Србији (локалитети 12 –15 ) током 2008., 2010. и 2011. ( Табела 5 ). Током 2008. су сакупљени надземни делови у цвету јединки панонског тимијана на локалитетима 1–8 и 12 –15 , као и узорци земљишта у зони корена одговарајућих јединки (ризосфера). Током периода цветања 2010. сакупљени су листови панонског тимијана са локалитета 5 и 8–11 . На сваком локалитету узоркован је лист са 3 јединке. У циљу праћења сезонских варијација прикупљени су збирни узорци хербе панонског тимијана пре, у току и након периода цветања 2011. са локалитета 5 и 8–11.

Табела 5. Материјал сакупљен на природним стаништима Th. pannonicus

Година узорковања и фенофаза Локалитет Координате 2008. 2010. 2011. током цветања током цветања Ф1 (пре цветања) Ф2 (током цветања) Ф3 (након цветања) N 45° 07' 37, 7'' 1 Вршачке планине – Дом Црвеног крста херба, земљиште - - - - E 21° 20' 31,9'' N 45° 07' 11,7'' 2 Вршачке планине – пут херба, земљиште - - - - E 21° 19' 47,1'' N 45° 07' 06,4'' 3 Вршачке планине – брдски пут херба, земљиште - - - - E 21° 19' 47,9'' N 45° 0 6' 59,1'' 4 Вршачке планине – капела херба, земљиште - - - - E 21° 19' 43,2'' N 45° 07' 18,5'' 5 Вршачке планине – Ђаков врх херба, земљиште лист херба херба херба E 21° 21' 10,0'' N 45° 06' 34,6'' 6 Вршачке планине – Село Месић херба, земљиште - - - - E 21° 24' 26,6'' N 45° 05' 36,3''

jужни Банат Банат jужни 7 Вршачке планине – поток Физош херба, земљиште - - - - E 21° 27' 36,2'' N 45° 05' 31,3'' 8 Вршачке планине – село Сочица херба, земљиште лист херба херба херба E 21° 27' 23,5'' N 45° 07' 12,0" 9 Вршачке планине – кула - лист херба херба херба E 21° 19' 12,0" N 45° 00' 10,8" 10 Девојачки бунар - лист херба херба херба E 20° 57' 03,6" N 44° 54' 10,8" 11 Гребенац - лист херба херба херба E 21° 13' 48,0" N 44° 10' 15,8'' 12 Планина Стол код Бора – ливада херба, земљиште - - херба - E 21° 07' 25,2'' N 44° 10' 33,7'' 13 Планина Стол код Бора – падина херба, земљиште - - - - E 22° 07' 50,0'' N 43° 35' 28,8'' 14 Планина Озрен херба, земљиште - - херба - E 21° 53' 15,8''

источна Србија Србија источна N 43° 4 3' 34,4'' 15 Планина Ртањ – село Врмџа херба, земљиште - - херба - E 21° 50' 45,6''

1.2. Материјал добијен гајењем

Семенски материјал панонског тимијана сакупљен је на локалитетима на Вршачким планинама (локалитети 5, 8 и 9) и засејан на огледној плантажи Института за проучавање лековитог биља “Др Јосиф Панчић”. Петнаест узорака хербе гајених јединки Th. pannonicus сабрано је током периода цветања 2012. године. Гајењем су добијене биљке чијим се макроскопским прегледом разликују две форме: биљке са изразито густим индументумом (биљке 'длакавог листа') и биљке са ређим индументумом (биљке 'глатког листа'). Током периода од једне године вршено је ђубрење биљака на начин приказан у Табели 6 . Као азотно ђубриво коришћено је минерално NPK ђубриво са односом азота, фосфора и калијума 9:3:3 или уреа (45% N), a фосфорно ђубриво је било састава N:P:K 6:15:13.

Табела 6. Узорци хербе гајеног Th. pannonicus и начин ђубрења биљака

Узорак Ђубриво Количина ђубрива Опис

Г01 - - биљке 'глатког листа' Г02 NPK 6:15:13 30 kg P/ha биљке 'глатког листа' Г03 NPK 6:15:13 60 kg P/ha биљке 'глатког листа' Г04 NPK 9:3:3 90 kg N/ha биљке 'глатког листа' Г05 NPK 9:3:3 180 kg N/ha биљке 'глатког листа' Г06 Уреа 180 kg N/ha биљке 'глатког листа' Г07 - - биљке 'длакавог листа' Г08 NPK 6:15:13 30 kg P/ha биљке 'длакавог листа' Г09 NPK 6:15:13 60 kg P/ha биљке 'длакавог листа' Г10 NPK 9:3:3 90 kg N/ha биљке 'длакавог листа' Г11 Уреа 90 kg N/ha биљке 'длакавог листа' Г12 Уреа 180 kg N/ha биљке 'длакавог листа' Г13 - - биљке 'глатког листа' Г14 - - биљке 'длакавог листа' Г15 - - биљке 'длакавог листа'

Херба биљака гајених уз примену ђубрива (Г02 –Г06 и Г08 –Г12 ) сакупљена је током прве вегетационе сезоне. У испитивањима су коришћене и хербе биљака које нису ђубрене, при чему су анализиране хербе биљака сабране у првој (Г01 и Г07 ) и трећој (Г13 и Г14 ) вегетационој сезони. Поред тога испитана је и хреба јединке гајене у заштићеном простору без примене ђубрива (пластеник) сабрана у трећој вегетационој сезони (Г15 ).

2. Испитивање киселости ризосфере и одређивање садржаја метала у ризосфери и биљном материјалу

2.1. Порекло ризосфере и биљног материјала

Узорци земљишта (ризосфере) за одређивањe киселости и анализу метала узорковани су са дубине од 5–15 cm, у зони корена, претходно сакупљеног надземног дела јединке панонског тимијана током цветања 2008. на Вршачким планинама на локалитетима 1–8, и на планинама у источној Србији на локалитетима 12 –15 (Табела 5 ). За одређивање садржаја метала узорци хербе су сакупљени током цветања 2008. на локалитетима 1–8 и 12 –15 , као и током периода цветања 2010. са локалитета 5 и 8–11 (Табела 5 ), где је из сваке популације узоркован лист са три јединке (а, б и в) које су биле удаљене најмање 30 m.

2.2. Испитивање киселости ризосфере

У поступку испитивања киселости узорака ризосфере одређена је стварна и потенцијална киселост. За одређивање стварне киселости, 10,00 g узорка ризосфере је суспендовано у 25 mL редестиловане воде и остављено да стоји уз повремено мешање. Након 30 min pH -метром ( PH240 , Radiometer ) је мерена киселост суспензије. Одређивање потенцијалне киселости ризосфере је спроведено на сличан начин, осим што је уместо у води, узорак суспендован у 1 M раствору калијум- хлорида.

2.3. Одређивање садржаја метала у ризосфери и биљном материјалу

Садржај метала у узорцима ризосфере и биљног материјала одређен је методама атомске емисионе и апсорпционе спектроскопије након микроталасне дигестије узорака. У Табели 7 дат је преглед анализираних узорака, одређиваних метала и примењених метода. Узорци ризосфере (0,5 g) су очишћени од органских материја (делови биљака и животиња, и др.), осушени на ваздуху, уситњени и хомогенизовани. Биљни материјал (0,8 g) је осушен на ваздуху, уситњен, хомогенизован и подвргнут елементној анализи ( Табела 7 ), с тим што су узорци листа из 2010. претходно били подвргнути хедспејс анализи ( Материјал и методе 3.2 и 3.4 ).

Табела 7. Метали одређивани у узорцима сакупљеним 2008. и 2010. и примењена метода одређивања

Узорковани Метода одређивања Локалитет/година материјал FAAS ETAAS ICP-OES 1/08 херба, ризосфера 2/08 херба, ризосфера 3/08 херба, ризосфера 4/08 херба, ризосфера 5/08 херба, ризосфера Cu 6/08 херба, ризосфера Fe Cr / 7/08 херба, ризосфера Mn 8/08 херба, ризосфера Zn 12/08 херба, ризосфера 13/08 херба, ризосфера 14/08 херба, ризосфера 15/08 херба, ризосфера

5/10 лист Na Cr 8/10 лист Cu K Ni 9/10 лист Zn Ca Mo Mn Mg 10/10 лист Co 11/10 лист Fe

2.3.1. Хемикалије За припрему свих раствора коришћена је редестилована вода, а сви остали реагенси (водоник-пероксид, 30% ( m/m ), азотна киселина, 65% ( m/m ) и калијум-хлорид) су били p.a. степена чистоће. Стандардни раствори соли метала Cr, Co, Ni, Mo, Cu, Zn, Mn, Fe, Mg, Ca, K и Na су припремљени разблаживањем комерцијално доступних основних раствора концентрације 1 g/L ( Merck,

Darmstadt, Немачка) разблаженом HNO 3 (2,0%, V/V ).

2.3.2. Микроталасна дигестија Узорци су разарани у микроталасном дигестору CEM MDS-2000 (Ražić и

сар., 2005 ). Сваком узорку (0,5–0,8 g) додато је 7 mL HNO 3, 65% ( m/m ), 2 mL H 2O2, 30% ( m/m ), и смеша је разарана у микроталасној пећници током 30 min. Након филтрирања, раствори добијени минерализацијом биљног материјала су допуњени редестилованом водом до 25 mL, а узорци добијени минерализацијом земљишта до 50 mL. Паралелно са сваком серијом узорака, који су минерализовани, иста

процедура је спроведена и за слепу пробу, која је припремана од 7 mL HNO 3, 65%

(m/m ), и 2 mL H 2O2, 30% ( m/m ).

2.3.3. Атомска спектроскопија Садржај метала одређен је одговарајућим методама атомске спектроскопије. Пламена спектрометрија ( Flame Atomic Absorption Spectrometry , FAAS ) је примењена за одређивање садржаја Cu, Fe, Zn и Mn мерењем на атомском апсорпционом спектрометру Perkin-Elmer 5000 на одговарајућим таласним дужинама ( Табела 8 ) применом лампи са одговарајућим шупљим катодома. Сигнал је мерен уз корекцију шума (деутеријумска лампа) при оптималној висини пламена ( A-Ac ). Индуктивно спрегнутом плазмом – оптичком емисионом спектрометријом ( Inductively Coupled Plasma – Optical Emission Spectrometry , ICP-OES ) одређен је садржај Na, K, Ca, Mg и Fe мерењима на одговарајућим таласним дужинама ( Табела 8 ) и при оперативним условима рада инструмента који су дати у Табели 9 .

Табела 8 . Таласне дужине на којима су вршена мерења λ [nm] Елемент FAAS ICP-OES ETAAS Na / 589,7 / K / 766,3 / Ca / 318,0 / Mg / 383,2 / Fe 248,3 240,3 / Cu 324,7 / / Zn 213,9 / / Mn 279,5 / / Cr / / 257,6 Ni / / 231,8 Mo / / 313.3 Co / / 240,7

Табела 9 . Оперативни услови рада у ICP-OES

Спектрометар Perkin-Elmer ICP/6500

Снага 1000 W Спољни проток аргона 15 L/min Средњи проток аргона 1,1 L/min Централни проток аргона 0,9 L/min Распршивач Perkin-Elmer (под правим углом) Брзина уношења узорка у плазму a 1,0 mL/min а контролисана перисталтичком пумпом

Садржај Cr, Ni, Mo и Co је одређен електротермалном атомском апсорпционом спектрометријом ( Electrothermal Atomic Absorption Spectrometry , ETAAS ) на апсорпционом спектрометру Perkin-Elmer 5000 са графитном пећницом HGA 400 и графитном киветом, мерењем на одговарајућим таласним дужинама (Табела 8 ) и применом температурних програма са оптималним температурама сушења, пиролизе, атомизације и чишћења одговарајућим за сваки појединачни елемент ( Табела 10 ); температура инјектовања је износила 20 °C, а при одређивању

Cr и Mo као модификатори су коришћени Mg(NO 3)2 и Pd+Mg(NO 3)2, редом. Тачност методе је проверена анализом стандардних референтих материјала, листа ( NIST SRM 1547 – Peach leaves ) и земљишта ( NIST SRM 2711 – Montana II Soil ). Добијене су задовољавајуће рикавери вредности (90,06–115,35%). Квантификација је извршена методом екстерне калибрације.

Табела 10 . Температурни програми примењени за одређивање садржаја a) Cr, б) Ni, в) Mo и г) Co ETAAS методом

Фаза Температура (°C) Време рампе (s)/време задржавања (s)

1 110 5/15 2 130 5/20 3 850 10/20 4 2300 0/3 5 2400 1/2

б)

Фаза Температура (°C) Време рампе (s)/време задржавања (s)

1 110 5/15 2 130 5/20 3 1100 10/20 4 2300 0/3 5 2400 1/2

в)

Фаза Температура (°C) Време рампе (s)/време задржавања (s)

1 130 10/15 2 200 10/15 3 1600 1/15 4 2300 0/5 5 2400 1/2

г)

Фаза Температура (°C) Време рампе (s)/време задржавања (s)

1 110 5/15 2 130 5/20 3 850 10/20 4 2400 0/3 5 2500 1/2

3. Анализа испарљивих састојака

Анализа испарљивих састојака панонског тимијана обухватала је испитивања испарљивих једињења издвојена из листа хедспејс екстракцијом и етарских уља изолованих из хербе дестилацијом воденом паром. Хемијски састав хедспејс фракција и етарских уља анализиран је гасном хроматографијом и гасном хроматографијом – масеном спектрометријом.

3.1. Порекло биљног материјала

Састав хедспејс фракција испитан је у узорцима листа панонског тимијана сакупљеним током периода цветања 2010. на локалитетима 5 и 8–11 у jужном Банату (Табела 5 ). Са сваког локалитета узоркован је лист са три јединке које су биле удаљене најмање 30 m. Садржај и састав етарског уља одређeн је у узорцима хербе панонског тимијана сакупљене у три различите фенофазе: пре (фаза Ф1), током (фаза Ф2) и после периода цветања (фаза Ф3) у јужном Банату (локалитети 5 и 8–11 ) током 2011., у узорцима хербе у цвету пореклом са планина у источној Србији (локалитети 12 , 14 и 15 ) прикупљених 2011. (Табела 5 ), као и у херби у цвету гајених биљака ( Г01 –Г15 ) сабраних 2012 (Табела 6).

3.2. Хедспејс екстракција

За статичку хедспејс (ХС) екстракцију коришћен је аутоматски хедспејс семплер Agilent G1888 Headspace Sampler спрегнут са гасним хроматографом Agilent 6890N . Листови (0,8 g) су уситњени и херметички затворени у хедспејс виале (20 mL). Оптимизовање методе је извршено на узорку цитралног хемотипа (сакупљеном на Вршачким планинама 2010. на локалитетима 5 и 8). Екстракција испарљивих састојака је вршена током 20, 30 и 60 min на температурама 60, 80, 90 и 100 °C. Оптимални резултати су добијени уравнотежавањем узорaка хербе на 90 °C током 30 min ( Прилог 1 ). Сви даљи експерименти извршени су под следећим условима: ° време инкубације узорка: 30 min; ° температура инкубације: 90 °C; ° температура петље: 100 °C; ° температура трансфер линије: 110 °C; ° мешање: благо; ° носећи гас: хелијум;

° време повећања притиска у виали: 0,08 min; ° притисак у виали: 15 psi; ° време пуњења петље: 0,5 min; ° време еквилибрације петље: 0,05 min; ° време инјектовања: 1,00 min.

3.3. Изоловање и одређивање садржаја етарског уља

30 g хербе је уситњено маказама и подвргнуто дестилацији воденом паром у апаратури по Клевенџеру током 2 сата. Добијена етарска уља су била бледо жуте боје и специфичне тежине мање од 1. Садржај етарског уља изражен је као запремина уља (mL) у 100 g биљног материјала (% V/m ). Након сушења безводним

Na 2SO 4, етарска уља су растварана у апсолутном етанолу (20 μL/mL) и анализирана гасном хроматографијом и гасном хроматографијом – масеном спектрометријом.

3.4. Гасна хроматографија ( GC ) и гасна хроматографијa – масена спектрометрија ( GC-MS )

За анализу састава хедспејс фракција и етарских уља коришћен је гасни хроматограф са пламено-јонизационим детектором Agilent 6890N спрегнут са масеним детектором Agilent 5975C . Раздвајање компоненти вршено је на капиларној колони HP-5MS (30 m x 0,25 mm, дебљина филма стационарне фазе 0,25 μm). Kao носећи гас коришћен је He, са протоком 1,0 mL/min. Температура колоне линеарно је програмирана 60–280 °C са променом од 3 °C/min. Температура split-splitless инјектора износила је 200 °C, а температура пламено-јонизационог детектора 300 °C. Температура трансфер линије масеног детектора била је 300 °C. Јонизација је вршена електронским ударом ( EI режим) при енергији од 70 еV. Запремина раствора етарских уља (20 μL/mL) од 1 μL инјектована је у split режиму 1:10, док су хедспејс екстракти инјектовани у запремини од 1 mL у split режиму 1:5.

3.4.1. Квалитативна и квантитативна анализа Идентификација испарљивих компоненти је вршена упоређивањем Ковачевих индекса, ретенционих времена и масених спектара једињења са одговарајућим подацима датим у базама података ( NIST/NBS , Wiley ) и/или литератури ( Adams, 2001 ). Ковачеви индекси (линеарни ретенциони индекси, RI )

одређени су у односу на хомологи низ n-алкана (C 9–C24 ) aнализираних под истим условима. Релативни удео компоненти у етарским уљима и хедспејс екстрактима одређен је методом нормализације интегрисаних површина пикова на хроматограмима добијеним са пламено-јонизационог детектора.

4. Изоловање и утврђивање структуре изолованих једињења

4.1. Припрема екстраката

Поступак изоловањa једињења извршен је из надземних делова панонског тимијана у цвету сакупљених на Вршачким планинама 2011. на локалитетима 5, 7 и 8. Биљни материјал (365,8 g) је уситњен и подвргнут сукцесивним екстракцијама растварачима растуће поларности: хексаном, дихлорметаном, метанолом и водом. Свака екстракција је вршена методом бимацерације (48 h + 24 h) уз повремено мућкање, при односу дрога-растварач 1:10. Након филтрирања екстракти су упарени до сува и добијено је 3,98 g хексанског (фракција А), 8,24 g дихлорметанског (фракција Б), 42,12 g метанолног (фракција В) и 37,30 g воденог (фракција Г) екстракта.

4.2. Пречишћавање метанолног (В) екстракта

40,0 g метанолне фракције ( В) је раздвојено хроматографијом на стубу силикагела под вакуумом, применом система растварача дихлорметан–метанол са променом поларности од 100:0 до 0:100, уз додатак воде у количини од 5% у односу на запремину метанола у мобилној фази. Сакупљено је 12 фракција од по 400 mL које су анализиране хроматографијом на танком слоју:

a) на силикагелу у систему растварача CH 2Cl 2–MeOH–H2O 70:30:0,3 ( V/V ); детекција зона је вршена посматрањем хроматограма у ултраљубичастој светлости пре и после дериватизације NP реагенсом (1,0% метанолни

раствор дифенилборилоксиетиламина), као и концентрованом H 2SO 4 уз загревање; б) на целулози, где је као мобилна фаза коришћена 30% сирћетна киселина; зоне су детектоване коришћењем NP реагенса. На основу сличности у саставу, поједине фракције су спојене и добијено је 7 фракција: В.1 , В.2 , В.3–4, В.5 , В.6–9, В.10 и В.11–12 .

4.2.1. Пречишћавање фракције В.10 2,0 g фракције В.10 је пречишћено применом екстракције на чврстој фази коришћењем реверзно-фазног кертриџа ( Isolute C18 cartridge ) масе 10 g. Фракција је растворена у малој количини метанола и допуњена водом до 100 mL. За солватацију кертриџа коришћено је 100 mL метанола, а за уравнотежавање 100 mL воде. Раствор фракције је наношен на чврсту фазу брзином од 3 mL/min. Елуирање је вршено смешом воде и метанола у односу 100:0, 80:20, 60:40, 40:60, 20:80 и 0:100 (V/V ). Сваки елуент је припремљен у количини од 30 mL. Сакупљено је 12 фракција од по 15 mL које су анализиране хроматографијом на танком слоју на исти начин као и фракција В (Материјал и методе 4.2 ). Фракције 4–7 ( В.10.4-7) су спојене и потом пречишћене хроматографијом на стубу силикагела. Као мобилна фаза коришћена је смеша дихлорметана, метанола и воде, растуће поларности, 95:5:0–0:100:5 ( V/V ). Фракције 67–71, елуиране смешом

CH 2Cl 2–MeOH–H2O 60:40:2, су спојене и из њих је препаративном хроматографијом на танком слоју целулозе (0,1 mm, Мerck, Немачка), коришћењем 30% ( V/V )

сирћетнe киселинe као мобилне фазе, изоловано једињење 1 (апигенин 7-О- глукуронид ).

4.2.2. Пречишћавање фракције В.11-12 Ради уклањања угљених хидрата, 4,05 g фракције В.11-12 је растворено у 60 mL етанола, 40% ( V/V ). Раствор је остављен 1 h на 4 °C, након чега је центрифугиран ( Tehtnika , Словенија) током 5 min на 2500 обртај/min. У супернатант који је одвојен декантовањем, додато је 20 mL воде и 1,5 g кожног праха. Смеша је мућкана 1 h при брзини од 120 обртај/min. Након таложења, танини су одвојени филтрирањем. Додатком 1 M HCl pH филтрата је подешен на 3,0. Смеша је допуњена водом до 100 mL, и потом пречишћена екстракцијом на чврстој фази. За екстракцију на чврстој фази коришћен је реверзно-фазни кертриџ ( Isolute C18 cartridge ) масе 10 g. Уравнотежавање кертриџа извршено је пропуштањем 100 mL метанола. Кертриџ је потом уравнотежен раствором 0,01 M HCl ( pH 2,0). Брзина наношења узорка и елуирања била је 3 mL/min. Елуирање је вршено смешом воде и метанола у односу 100:0, 80:20, 60:40, 40:60, 20:80 и 0:100 ( V/V ). Сваки елуент је припремљен у количини од 30 mL. Сакупљено је 12 фракција од по 15 mL које су анализиране хроматографијом на танком слоју на исти начин као и фракција В (Материјал и методе 4.2 ). Фракције 2–11 ( В.11-12.2-11 ) су спојене и подвргнуте семипрепаративној високоефикасној течној хроматографији, при чему је изоловано једињење 2 (розмаринска киселина ), једињење 3 (3-О-(2-кафенил)- розмаринска киселина ) и једињење 4 (3-О-(метил-2-кафенил)-розмаринска киселина ).

4.3. Пречишћавање воденог (Г) екстракта

10,85 g воденог екстракта ( Г) је растворено у 1400 mL етанола, 60% ( V/V ). Након стајања у фрижидеру на 4 °C током 1 h, смеша је центрифугирана (7 min, 2500 обртај/min) и настали талог је одвојен декантовањем. У супернатант је додато 20 g нерастворног поливинилпиролидона ( Kollidon CL , BASF , Немачка),

смеша је мућкана 1 h при брзини од 120 обртај/min, профилтрирана и филтрат упарен до сува. 3,54 g сувог остатка пречишћено је сукцесивном екстрацијом етилацетатом и метанолом, при чему су етилацетатни и метанолни раствори одбачени. Остатак је растворен у води и наношен на препаративне плоче танког слоја целулозе (0,1 mm, Мerck, Немачка). Хроматограми су развијани у 30% сирћетној киселини као мобилној фази. Зона Rf вредности 0,40 подвргнута је даљем пречишћавању семипрепаративном високоефикасном течном хроматографијом. Изоловано је једињење 5 (лутеолин 7-О-диглукуронид ).

4.4. Семипрепаративна високоефикасна течна хроматографија

За извођење семипрепаративне високоефикасне течне хроматографије (семипреп HPLC ) коришћен је Agilent 1100 течни хроматограф са мануалним инјектором и детектором са диодним низом при следећим условима: ° реверзно-фазна колона, Zorbax Eclipse XDB-C18 (250 x 9 mm; пречник честица 5 μm); ° запремина инјектованог узорка: 500 μL; ° температура: 25 °C; ° брзина протока: 3,3 mL/min; ° бинарна мобилна фаза са градијентном променом састава: мобилна фаза А – 0,1% раствор мравље киселине у води, мобилна фаза B – 10% мобилне фазе A, 90% ацетонитрил; ° таласне дужине: 210, 250, 320, 350 и 370 nm. За раздвајање и изоловање једињења 2, 3 и 4 примењен је систем са градијентним протоком: 0–7 min удео мобилне фазе B је износио 25%, након чега је линеарно растао до 30% у 15 min, до 40% у 22 min, потом до 50% у 27 min, и до 70% у 32 min, након чега је систем враћен на почетне услове у 35 min. Сакупљане су фракције на 13,44 min (једињење 2), 16,31 min (једињење 3) и 24,19 min (једињење 4). Пречишћавање једињења 5 је извршено применом семипреп HPLC методе уз описане услове, при чему је састав мобилне фазе мењан на следећи начин: почетни

удео мобилне фазе B је износио 10% и линеарно је повећаван до 20% у 5 min, 5–13 min је елуирано изократски, 13–18 min линеарно је повећан удео B фазе до 90%, након чега је систем током 2 min враћен на почетне услове. Сакупљана је фракција

на ретенционом времену Rt 9,80 min.

4.5. Идентификација изолованих једињења

4.5.1. Високоефикасна течна хроматографија ( HPLC ) и хроматографија на танком слоју ( TLC ) Анализа високоефикасном течном хроматографијом ( HPLC ) је урађена на Agilent 1100 течном хроматографу са мануалним инјектором и детектором са диодним низом, под следећим условима ( Pavlović, 2008 ): ° реверзно-фазна колона, Zorbax Eclipse XDB-C18 (250 x 4,6 mm; пречник честица 5 μm); ° запремина инјектованог узорка: 20 μL; ° температура: 25 °C; ° брзина протока: 0,8 mL/min; ° бинарна мобилна фаза са градијентом променом састава ( Табела 11 ): мобилна фаза А – 0,02% раствор фосфорне киселине у води, мобилна фаза B – 10% мобилне фазе A, 90% ацетонитрил; ° таласне дужине: 210, 250, 320, 350 и 370 nm.

Табела 11. Промена састава мобилне фазе коришћене у HPLC анализи

Време (min) Удео фазе B (%) 0 10 5 25 15 25 20 30 25 50 30 70 35 10 38 10

За хроматографију на танком слоју ( TLC ) коришћене су комерцијално

доступне плоче силикагела са флуоресцентним индикатором ( TLC Silica gel 60 F254 , Merck Darmstadt , Немачка, дебљина слоја 0,1 mm) и плоче са целулозом ( TLC

Cellulose F254 , Merck Darmstadt , Немачка, дебљина слоја 0,1 mm). Као мобилна фаза при развијању хроматограма на танком слоју силикагела коришћене су следеће смеше растварачa:

° EtOAc-HCOOH-AcOH-H2O, у односу 100:11:11:26 ( V/V ), и ° толуен-EtOAc-HCOOH, у односу 5:4:1 ( V/V ). Хроматограми на танком слоју целулозе развијани су са: ° дестилованом водом, ° 15% сирћетном киселином, и ° 30% сирћетном киселином. Хроматограми су посматрани на дневној и у ултраљубичастој светлости на 254 nm и 366 nm, пре и након прскања дифенилборилоксиетиламином ( NP -реагенс, Sigma Aldrich ). Као референтне супстанце током HPLC и TLC анализе коришћени су апигенин 7-О-глукозид ( Sigma Aldrich , Немачка), розмаринска киселина ( HWI Analytic GmbH , Немачка) и лутеолин 7-О-глукозид ( Carl Roth , Немачка).

4.5.2. Спектроскопска анализа За одређивање положаја слободних хидроксилних и фенолних група, као и положаја супституената у молекулима флавоноида и фенолкарбоксилних киселина користе се тзв. шифт (енг. shift ) реагенси. У реакцији са овим реагенсима долази до померања и/или промена у интензитету апсорпционих трака у односу на UV-VIS спектар једињења снимљен у метанолу (MeOH спектар) ( Mabry и сар., 1970 ). Припремљени су следећи реагенси:

° раствор AlCl 3: 5 g AlCl 3 је растворено у 100 mL метанола; ° раствор HCl: помешано је 50 mL концентроване HCl и 100 mL воде; ° NaOAc: NaOAc, анхидровани, прашак;

° H3BO 3: H 3BO 3, анхидрована, прашак; ° NaOMe: 2,5 g Na је растворено у 100 mL метанола уз хлађење и мешање. Спектри једињења снимљени су Evolution UV-VIS 300 спектрофотометром (Thermo Fisher ) према следећем поступку:

1. MeOH спектар: снимљен је спектар раствора једињења у метанолу (концентрације 0,1 mg/mL, запремина 1,5 mL);

2. а) AlCl 3 спектар: у кивету са метанолним раствором једињења додато је 4-5

капи раствора AlCl 3, смеша је промућкана и снимљен је спектар;

б) AlCl 3/HCl спектар: у кивету у којој снимљен AlCl 3 спектар додато је 3 капи раствора HCl, смеша је промућкана и снимљен је спектар; 3. NaOMe спектар: у кивету са метанолним раствором једињења додато је 3 капи раствора NaOMe, смеша је промућкана и снимљен је спектар одмах и након 5 min, због могуће декомпозиције спектра; 4. а) NaOAc спектар: у кивету са метанолним раствором једињења додат је NaOAc у вишку, тако да се добије засићени раствор, смеша је промућкана и снимљен је спектар; због могуће декомпозиције спектра, снимање је понављено након 5–10 min;

б) NaOAc/H 3BO 3 спектар: у кивету у којој је снимљен NaOAc спектар додат је

прашак H 3BO 3 у половини количине претходно додатог NaOAc, смеша је промућкана и снимљен је спектар.

4.5.3. Течна хроматографија – масена спектрометрија (LC–MS) За одређивање молекулске масе и масе фрагментних јона једињења 1, 2, 3, 4 и 5 коришћен је течно-масени хроматограф Agilent Technologies HPLC 1260 Infinity са аутоматским инјектором, детектором са диодним низом и квадрупол масеним детектором ( Single quad MS detector 6130). Раздвајање је вршено на Zorbax SB -C18 колони (4,6 х 250 mm; дијаметар честица 5 µm) на температури од 25 °C и при протоку мобилне фазе од 0,8 mL/min. Бинарна мобилна фаза састојала се из фазе А – 0,1% мравља киселина и фазе B – ацетонитрил. Промена састава мобилне фазе вршена је градијентно, на исти начин као и при HPLC анализи ( Табела 11 ). Хроматограми су снимани на 210, 320, 350 и 370 nm. Електроспреј јонизација под атмосферским притиском је вршена у негативном режиму при притиску 40 psi, температури 350 °C и протоку азота од 10 L/min. Сигнал депротонованог молекула једињења 1, 2, 3, 4 и 5 добијен је при фрагментацији од 125 V, а додатни фрагментни јони при напону од 250 V.

Метанолни раствор фракције В.10 (5 mg/mL) је коришћен за анализу једињења 1, 2, 3 и 4, док је једињење 5 растворено у води (0,1 mg/mL). Запремина инјектованог узорка износила је 5 µL.

4.5.4. Нуклеарна магнетна резонанца ( NMR ) Протонски NMR спектри ( 1H NMR ) снимљени су на Катедри за фармакогнозију и хемију природних производа Фармацеутског факултета Универзитета у Атини, Грчка ( Department of Pharmacognosy and Natural Products Chemistry , School of Pharmacy , University of Athens ). Снимање је вршено на апарату NMR Bruker DRX 400. Тетраметилсилан ( TMS ) је коришћен као интерни стандард. За растварање једињења 3 и 4 коришћен је деутерисани метанол. Хемијска померања у NMR спектру изражена су у δ јединицама (ppm), а константе спрезања ( J) у Hz.

5. Хемијска анализа и in vitro испитивање антиоксидантне и антимикробне активности поларних екстраката

5.1. Биљни материјал и припрема екстраката

За анализу хемијског састава и испитивање биолошке активности коришћени су: ° суви водено-метанолни екстракти хербе самониклог и плантажно гајеног панонског тимијана, ° инфузи херби прикупљених са природних станишта у Србији, и ° деодорисани водени екстракт хербе сакупљене на Вршачким планинама.

5.1.1. Припрема водено-метанолних екстраката За припрему водено-метанолних екстраката коришћена је: ° осушена херба панонског тимијана сакупљеног током 2011. (Табела 5 ):

- на локалитетима 5 и 8–11 у јужном Банату, у периоду пре (Ф1), током (Ф2) и након цветања (Ф3); - на локалитетима 12 , 14 и 15 на планинама источне Србије, током периода цветања (Ф2); ° осушена херба плантажно гајеног панонског тимијана сабраног 2012. током цветања (Табела 6). 1,00 g уситњене хербе је преливен са 20,0 mL 80% ( V/V ) метанолa. Екстракција је вршена уз помоћ ултразвука током 15 min и потом мацерацијом на собној температури током 24 h. Филтрати су упарени до сува. Приноси екстраката дати су Табели 12 .

Табела 12. Приноси водено-метанолних екстраката хербе Th. pannonicus: a) самониклих и б) гајених биљака

а)

Локалитет/година Фенофаза Принос (%)

5/11 Ф1 19,31 б) 8/11 Ф1 18,90 Узорак Принос (%) 9/11 Ф1 21,54 10/11 Ф1 27,42 Г01 15,35 11/11 Ф1 20,57 Г02 17,68 5/11 Ф2 18,13 Г03 18,78 8/11 Ф2 12,93 Г04 17,53 9/11 Ф2 14,04 Г05 17,30 10/11 Ф2 23,91 Г06 16,53 11/11 Ф2 19,84 Г07 16,36 12/11 Ф2 17,83 Г08 18,24 14/11 Ф2 20,46 Г09 16,43 15/11 Ф2 11,57 Г10 14,56 5/11 Ф3 18,52 Г11 15,86 8/11 Ф3 17,58 Г12 15,37 9/11 Ф3 22,13 Г13 15,28 10/11 Ф3 19,57 Г14 14,15 11/11 Ф3 9,93 Г15 16,32

Xsr 18,57 Xsr 16,38

Sd 4,32 Sd 1,33 Min 9,93 Min 14,15 Max 27,42 Max 18,78 Max/Min 2,76 Max/Min 1,33 Локалитет: 5, Вршачке планине – Ђаков врх; 8, Вршачке планине – село Сочица; 9, Вршачке планине – кула; 10, Девојачки бунар; 11, Гребенац; 12, планина Стол – ливада; 14, планина Озрен; 15, планина Ртањ – село Врмџа. Фенофаза: Ф1, пре цветања; Ф2, током цветања; Ф3, након цветања. Узорак: Г01–Г06, херба 'глатког листа' сабрана у првој сезони вегетације; Г07–Г12, херба 'длакавог листа' сабрана у првој сезони вегетације; Г13, херба 'глатког листа' сабрана у трећој сезони вегетације; Г14, херба 'длакавог листа' сабрана у трећој сезони вегетације; Г15, херба биљке гајене у заштићеном простору сабрана у трећој сезони вегетације.

Xsr , средња вредност; Sd, стандардна девијација; Min , најмања вредност; Max , највећа вредност; Max/Min , однос највеће и најмање вредности.

5.1.2. Припрема инфуза За припрему инфуза коришћена је осушена херба панонског тимијана сакупљена на локалитетима 5 и 8-11 у јужном Банату током цветања 2011. Припремљени су 5%-ни инфузи. Уситњена херба (1,25 g) је преливена са 25 mL кључале воде. Након 20 min инфузи су процеђени у одмерну тиквицу од 25 mL и допуњени водом.

5.1.3. Припрема деодорисаног воденог екстракта Деодорисани водени екстракт (ДВЕ) је добијен након дестилације воденом паром хербе панонског тимијана сакупљене на локалитету 5 током цветања 2010. Осушена и уситњена херба (60 g) је преливена са 1,2 L дестиловане воде и подвргнута дестилацији воденом паром у апаратури по Клевенџеру током 2 h. Након дестилације, преостала смеша хербе и воде је профилтрирана. Филтрат је уз благо загревање упарен до сува дајући 9,80 g ДВЕ.

5.2. Анализа високоефикасном течном хроматографијом ( HPLC )

Хемијска анализа водено-метанолних екстраката, инфуза и деодорисаног воденог екстракта извршена је високоефикасном течном хроматографијом ( HPLC ) на Agilent 1100 течном хроматографу са мануалним инјектором и детектором са диодним низом, под условима наведеним у поглављу Материјал и методе 4.5.1 . Водено-метанолни екстракти и ДВЕ су растворени у одговарајућим растварачима (80%-ни метанол ( V/V ) и вода) у концентрацији од 5 mg/mL. Инфузи су анализирани без разблаживања. Сви узорци су пре инјектовања филтрирани кроз мембрански филтeр 0,45 μм ( Econofilter , Agilent Technologies , Немачка).

5.2.1. Квалитативна и семиквантитативна анализа Идентификација компоненти екстраката вршена је упоређивањем њихових UV спектара и ретенционих времена са одговарајућим подацима добијеним анализом стандардних супстанци и изолованих једињења чија је структура претходно потврђена. Релативни квантитативни однос компоненти процењен је на

основу односа површине пика датог једињења и укупне површине хроматограма снимљеног на 350 nm.

5.2.2. Одређивање садржаја розмаринске киселине, хетерозида апигенина и хетерозида лутеолина Садржај розмаринске киселине одређен је екстерном калибрацијом коришћењем стандарда розмаринске киселине ( Rotichrom HPLC , Roth , Немачка) очитавањем површина на 320 nm. Раствори стандарда припремани су у метанолу у концентрацији 0,05–0,85 mg/mL и конструисана је калибрациона крива (y=32000·x–27,56; R 2=0,9993). Резултати су изражени као маса розмаринске киселине по граму (водено-метанолни екстракти и ДВЕ) или литру испитиваног екстракта (инфузи). Укупни садржај хетерозида апигенина изражен је преко агликона апигенина. Квантификација је извршена израчунавањем укупне површине пикова хетерозида на хроматограму снимљеном на 350 nm и прерачунавањем на основу калибрационе криве на mg апигенина по маси сувих екстраката (водено- метанолни екстракти и ДВЕ), односно запремини инфуза. Калибрациона крива (y=61304,21·x–68,58; R 2=0,9998) је конструисана коришћењем стандарда апигенина ( Sigma Aldrich , Немачка) у опсегу концентрација 0,005–0,2 mg/mL. На сличан начин је одређен укупни садржај хетерозида лутеолина који је изражен преко агликона лутеолина. За конструисање калибрационе криве (y=59410,82·x–51,34; R 2=0,9999) коришћен је стандард лутеолина ( Rotichrom HPLC , Roth , Немачка) у опсегу концентрација 0,005–0,02 mg/mL. Резултати су изражени у mg/g сувог екстракта (водено-метанолни екстракти и ДВЕ), односно у mg/L (инфузи).

5.3. Одређивање укупних полифенола

Садржај укупних полифенола (СУП) у екстрактима одређен је спектрофотометријском методом на основу реакције фенолних једињења са фосфомолибдоволфрамовом киселином, Фолин-Чокалтеу (FC, Folin-Ciocalteu )

реагенсом: у базној средини долази до оксидовања фенола до хинона и редукције молибдата и волфрамата до плаво обојених производа ( Velioglu и сар., 1998 ). Растворима испитиваних екстраката (100 μL) додато је 750 μL FC реагенса (разблаженог 10 пута), смеше су промућкане и након 5 min додато је 750 μL раствора натријум-карбоната (60 g/L). Након 90 min инкубације, мерена je апсорбанција на 725 nm у односу на слепу пробу (100 μL растварача коришћеног за растварање екстракта + 750 μL разблаженог FC реагенса + 750 μL раствора натријум-карбоната). Реакционе смеше су припремане у трипликату. Раствори стандарда галне киселине припремљени су у концентрацијама 10–100 μg/mL и подвргнути истом поступку као и екстракти. Конструисана је калибрациона крива: y=119,28·x–0,0016; R 2=0,9996. Садржај укупних полифенола у екстрактима израчунат је из калибрационе криве. Резултати су изражени у еквивалентима галне киселине (ГК) по маси (водено-метанолни екстракти и ДВЕ), односно запремини испитиваног екстракта (инфузи). Ради поређења, према датом поступку је одређена маса галне киселине еквивалентна јединици масе розмаринске киселине.

5.4. Анализа хедспејс фракција инфуза

У циљу идентификовања испарљивих компоненти које улазе у састав инфуза, испитан је састав њихових хедспејс фракција. Одмах након припреме, 4 mL инфуза пренесено је у хедспејс виалу и херметички затворено. Узорковање хедспејс фракција и њихова GC и GC-MS анализа вршена је према поступку датом у поглављима Материјал и методе 3.2 и 3.4 .

5.5. Испитивање in vitro антиоксидантне активности

5.5.1. Испитивање укупне антиоксидантне активности ( FRAP тест) Укупна антиоксидантна активност екстраката одређена FRAP је (Ferric Reducing Antioxidant Power ) тестом, којим се одређује способност аналита да

редукује јон Fe 3+ до Fe 2+ који са 2,4,6-трипиридил-s-триазином ( TPTZ ) даје плаво обојен комплекс. Интензитет настале боје мери се спектрофотометријски ( Szőllősi и Szőllősi, 2002 ). Растворима испитиваних екстраката (100 μL) додато је 3 mL FRAP реагенса. FRAP реагенс је припремљен мешањем ацетатног пуфера ( pH 3,6), TPTZ реагенса (10 mmol/L у 40 mmol/L HCl) и раствора гвожђе(III)-хлорида (20 mmol/L) у односу 10:1:1. Реакционе смеше су припремане у трипликату. Након инкубације од 30 min мерена је апсорбанција у односу на слепу пробу (100 μL растварача коришћеног за растварање екстракта + 3 mL FRAP реагенса). Припремљени су раствори стандарда гвожђе(II)-сулфата концентрације 200–1000 μmol/L и подвргнути истом поступку као и екстракти. Конструисана је калибрациона крива: y=0,0226·x–0,014, R 2=0,9994. Из једначине калибрационе криве израчуната је FRAP вредност која представља број молова Fe 2+ по јединици масе (водено-метанолни екстракти и ДВЕ), односно запремине екстракта (инфузи). Ради поређења, према датом поступку одређена је FRAP вредност розмаринске киселине и аскорбинске киселине.

5.5.2. Испитивање способности неутрализације слободних радикала ( DPPH тест) Способност екстраката да неутралишу слободне радикале испитана је према љубичасто обојеном 2,2-дифенил-1-пикрилхидразил радикалу ( 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl , DPPH ). Неутрализацијом DPPH радикала боја реакционе смеше се мења из љубичасте у жуту ( Cuendet и сар., 1997 ). Серија разблажења раствора екстракта (10–100 μL) допуњена је метанолом до 2,0 mL и додатo је 0,5 mL раствора DPPH (0,5 mmol/L у метанолу). На сличан начин припреман је контролни раствор (2,0 mL + 0,5 mL раствора DPPH ). Реакционе смеше су припремане у трипликату. Након 30 min стајања на мрачном месту мерена је апсорбанција (А) на 517 nm у односу на слепу пробу (метанол). Из добијених резултата конструисана је регресиона крива: probit(I) + 5 = k·log(c) + n, где је

I – инхбиција неутрализације DPPH радикала, I=(A контрола –Аекстракт )/A контрола ; c – концентрација екстракта;

53 k – нагиб криве; n – одсечак на y-оси.

Резултати су изражени као IC 50 , тј. концентрација екстракта, у јединицама масе (водено-метанолни екстракти и ДВЕ) или запремине (инфузи) по запремини, која је потребна за неутрализацију 50% DPPH радикала присутних у смеши, што се израчунава из регресионе криве за вредност probit(I)=0.

Ради поређења, према датом поступку одређене су IC 50 вредности розмаринске киселине и аскорбинске киселине.

5.6. Испитивање антимикробне активности инфуза in vitro

Испитивање антимикробне активности инфуза извршено је одређивањем минималне инхибиторне концентрације (МИК) бујон микродилуционим тестом. МИК је изражена као најмања запремина основног инфуза (5%, m/V ) која доводи до заустављања раста микроорганизама у 1 mL суспензије микроорганизама.

5.6.1. Стандардни сојеви микроорганизама и њихова култивација Антимикробна активност инфуза испитана је према стандардним сојевима микроорганизама из колекција ATCC (American Type Culture Collection ) и NCIMB (National Collection of Industrial, Food and Marine Bacteria ). Коришћено је 4 соја Грам(+) бактерија, 3 соја Грам(–) бактерија и један сој гљивица ( Табела 13 ).

Табела 13. Стандардни сојеви микроорганизама коришћени у испитивању антимикробне активности инфуза

Грам(+) бактерије 1 Staphylococcus aureus ATCC 25923 2 Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 3 Bacillus subtilis ATCC 6633 4 Enterococcus faecalis ATCC 29212

Грам(-) бактерије 1 Escherichia coli ATCC 10536 2 Klebsiella pneumoniae NCIMB 9111 3 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027

Гљивице 1 Candida albicans ATCC 10231

За испитивање су коришћене културе бактерија које су добијене тако што су прво пресејане у 10 mL Милер-Хинтон бујона и инкубиране на 37 °C током 24 h, а потом пресејане у 10 mL свежег бујона и инкубиране 18 h на 37 °C. На исти начин култивисана је гљивица Candida albicans осим што је, уместо Милер-Хинтон бујона, коришћен Сабуро бујон. Сабуро бујону додат је Tween 80, до финалне концентрације 0,5% (V/V ).

5.6.2. Бујон микродилуциони тест Бујон микродилуциони тест је изведен у микротитрационим плочама равног дна са 96 места. Коришћене су културе микроорганизама густине 5·10 5 /mL у одговарајућој подлози. Културама бактерија у Милер-Хинтон бујону је додат 2,3,5-трифенилтетразолијум хлорид (TTC ) (Candan и сар., 2003 ). За испитивање антимикробне активности припремљена су серијска разблажења инфуза хербе Th. pannonicus сакупљене током цветања на локалитетима у јужном Банату (локалитети 5 и 8–11 ) и на планинама у источној Србији (локалитети 12 , 14 и 15 ) у води. Припремљени су раствори инфуза концентрација 150–500 µL/mL (5 концентрација у дупликату). Добијени раствори су стерилисани бактериолошком филтрацијом кроз стерилни мембрански филтер величине пора 0,2 µm ( Minisart , Sartorius Stedim Biotech GmbH , Немачка). Свако место у микротитрационој плочи садржавало је 100 µL културе микроорганизама и 100 µL узорка. Као контрола коришћене су културе микроорганизама. Плоче су инкубиране у аеробној атмосфери на 37 °C током 24 h за испитивање антибактеријске, односно на 30 °C током 48 h ради испитивања антифунгалне активности. Раст микроорганизама очитаван је семиквантитативно. У присуству TTC -а раст бактерија је уочаван појавом ружичасте боје и талога, док је раст гљивице C. albicans праћен на основу замућења течне подлоге и/или појаве талога. Истим поступком испитана је и антимикробна активност стандарда розмаринске киселине ( Rotichrom HPLC , Roth , Немачка) у опсегу концентрација 2– 64 μg/mL.

6. Испитивање in vivo антиоксидантне и цитотоксичне активности деодорисаног воденог екстракта (ДВЕ)

In vivo екперименти су урађени у регистрованој фарми и лабораторији Самосталног одсека за биохемију Клиничког центра Војводине у Новом Саду. Руковање животињама и сви екпериментални поступци вршени су у складу са Законом о добробити животиња (Службени гласник РС, бр. 41/09) и Правилником о раду и коришћењу лабораторијских животиња који уређује Етичка комисија при Универзитету у Новом Саду.

6.1. Поступак испитивања антиоксидантне активности ДВЕ in vivo

6.1.1. Експерименталне животиње Испитивање in vivo антиоксидантне активности извршено је на лабораторијским пацовима соја Wistar на Самосталном одсеку за биохемију Клиничког центра Војводине у Новом Саду. Коришћене су животиње оба пола, 7–8 недеља старости, масе 200–250 g. Животиње су биле смештене у одговарајућим кавезним системима при режиму светло–тама 12 h:12 h, у условима контролисане температурe (25 °C) и влажности ваздуха (30–50%), уз слободан приступ води и стандардној храни за пацове ( PA са 20% протеина, Ветеринарски завод Суботица, Војовдина, Србија).

6.1.2. Протокол огледа Антиоксидантна активност ДВЕ испитана је на моделу оксидативног стреса

изазваног угљентетрахлоридом (CCl 4) код пацова. Процена ефекта извршена је упоређивањем вредности биохемијских параметара код животиња које су третиране воденим раствором ДВЕ и угљентетрахлоридом са вредностима параметара код животиња које су биле третиране само раствором ДВЕ или угљентетрахлоридом ( Ćebović, 2008 ). Водени раствор ДВЕ је припремљен растварањем 5,00 g екстракта у 100,0 mL водe.

Случајним избором животиње су подељене у групе. Свака група бројала је 6 јединки. Оглед је трајао 8 дана према алгоритму датом у Табели 14 . Током седам дана животињама је апликован екстракт (у дневној дози 0,1–5,0 mL/kg телесне масе (ТМ)) или физиолошки раствор (2,0 mL/kg TM). Седмог дана животињама је апликована једна доза угљентетрахлорида (2,0 mL/kg TM). Осмог дана животиње су жртвоване декапитацијом након примене анестетика (изофлуран, 1,5% у кисеонику, 10 min). Крв је узоркована из доње шупље вене. Маса јетре је измерена након одстрањивања жучне кесе. 1 g узорка хепатичног ткива је хомогенизован помоћу Potter-Elvehjem -овог сета у смеши раствора TRIS (трис -(хидроксиметил)- аминометан)-HCl и раствор сахарозе 1:3 (50 mM; 0,25M; pH 7,10) на температури од 4 °C. Добијени хомогенат је центрифугиран на 3000 обртај/min током 10 min. Узорци крви и јетре коришћени су за одређивање биохемијских параметара оксидативног стреса, тј. за одређивање активности ксантин оксидазе, каталазе, пероксидазе, глутатион пероксидазе, глутатион редуктазе, као и за одређивање садржаја глутатиона и интензитета липидне пероксидације.

Табела 14. Алгоритам испитивања антиоксидантне активности ДВЕ in vivo

Група животиња Контролна Нега тивна група контрола 1 2 3 4 5 6 Дан К 1 2 3 4 5 6 К CCL 4 CCL 4 CCL 4 CCL 4 CCL 4 CCL 4 CCL 4 физиолошки физиолошки ДВЕ ДВЕ раствор раствор 1 - 6 2,0 0,1 0,2 0,5 1,0 2,0 5,0 2,0 0,1 0,2 0,5 1,0 2,0 5,0 mL/kg mL/kg mL/kg mL/kg i.p. i.p. i.p. i.p. физиолошки физиолошк и ДВЕ ДВЕ раствор раствор 2,0 0,1 0,2 0,5 1,0 2,0 5,0 2,0 0,1 0,2 0,5 1,0 2,0 5,0 mL/kg mL/kg mL/kg mL/kg 7 i.p. i.p. i.p. i.p. CCL 4 CCL 4 2,0 2.0 mL/kg mL/kg

i.p. i.p. 8 жртвовање; узорковање ткива i.p. , интраперитонеално.

6.2. Поступак испитивања цитотоксичне активности ДВЕ in vivo за ћелије Ерлиховог асцитног тумора

6.2.1. Експерименталне животиње Испитивање in vivo цитотоксичне активности извршено је на лабораторијским мишевима соја Hann:NMRI (Hannover National Medical Institute ) у лабораторији Самосталног одсека за биохемију Клиничког центра Војводине у Новом Саду. Коришћене су животиње оба пола, 6–8 недеља старости, масе 25±2,5 g. Животиње су биле смештене у одговарајућим кавезним системима при режиму светло–тама 12 h:12 h и условима контролисане температурe (25 °C) и влажности

ваздуха (30–50%), уз слободан приступ води и стандардној храни за мишеве ( LM 2, Ветеринарски завод Суботица, Војводина, Србија).

6.1.2. Протокол огледа Цитотоксична активност ДВЕ испитана је на моделу Ерлиховог асцитног тумора (ЕАТ) код миша. Ефекат ДВЕ на туморске ћелије испитан је применом екстракта пре, истовремено и након имплементације тумора ( Ćebović, 2008 ). Водени раствор ДВЕ је припремљен растварањем екстракта у води у концентрацији 5,0% ( m/V ). Дозна зависност ефекта ДВЕ испитана је применом 6 доза раствора екстракта: 0,1; 0,2; 0,5; 1,0; 1,5 и 2,0 mL/kg TM (5–100 mg ДВЕ/kg ТМ), i.p. . Свака доза је испитана на групи од 6 животиња, а ефекат представља средњу вредност 6 одређивања броја (процента) оштећених туморских ћелија у асцитесу. Наставак огледа спроведен је применом дозе од 2,0 mL/kg TM. Случајним избором животиње су подељене у 5 група од по 6 јединки. Оглед је трајао 14 дана према алгоритму датом на Слици 2 .

Слика 2. Алгоритам испитивања цитотоксичне активности ДВЕ

ЕАТ, имплементација ћелија Ерлиховог асцитног тумора; i.p. , интраперитонеално; (у), узорковање.

Цитотоксична активност ДВЕ за ћелије ЕАТ процењена је у односу на животиње којима је даван физиолошки раствор (2,0 mL/kg, i.p. ) и животиње које су на биле третиране N-ацетилцистеином (2,0 mL/kg, i.p. ), као референтним антиоксидансом, на исти начин као и животиње третиране раствором ДВЕ. Ефекат примењеног третмана праћен је у узорцима асцитeса на два начина: (1) одређивањем запремине асцитеса, броја туморских ћелија и њихове вијабилности, и (2) одређивањем биохемијских параметара оксидативног стреса, како би се утврдило да ли се утицај ДВЕ на раст и развој тумора заснива на промени оксидантног статуса ћелија ЕАТ. Узорковани асцитес је разблажен Кребс-Рингеровим фосфатним пуфером (0 °C, pH 7,4) и центрифугиран најпре брзином од 4500 обртај/min на 4 °C, а потом 12000 обртај/min током 2,5 min, чиме је добијена густа ћелијска суспензија. Број ћелија у суспензији одређен је у Нојбауеровој комори. Вијабилност ћелија ЕАТ одређена је уз примену боје трипан плаво ( Trypan blue , 0,4% у Кребс-

Рингеровом фосфатном пуферу) у чијем присуству се ћелије оштећених мембрана боје плаво. Резултати су изражени као % оштећених у односу на укупан број ћелија.

6.3. Биохемијска испитивања

У узорцима хомогената јетре и асцитеса (тј. суспензије ћелија ЕАТ), одређена је активност ксантин оксидазе ( XOD ), каталазе ( CAT ), пероксидазе ( Px ), глутатион пероксидазе ( GSHPx ), глутатион редуктазе ( GR ), садржај глутатиона ( GSH ) и интензитет липидне пероксидације ( LPx ). Активност ензима одређена је као количина супстрата која изреагује у јединици времена, односно као количина продукта реакције која настаје у јединици времена. У узорцима хомогената јетре активност и садржај одређиваних параметара изражен је по mg протеина, а у узорцима асцитеса по mL ћелија ЕАТ (Ćebović, 2008 ).

6.3.1. Одређивање садржаја укупних протеина у хомогенату јетре Садржај протеина у узорцима хомогената јетре одређен је спектрофотометријски на основу биуретске раекције (Wood, 1989 ). Помешано је 20–50 μL узорка хомогената јетре са 3 mL биуретског реагенса

(CuSO 4·5H 2O – 0,15%; K,Na-тартарат – 0,6%; раствор KI у 0,85 mol/L NaOH – 0,1% и деоксихолат – 1,5%). Апсорбанција насталог производа мерена је након 30 min на 540 nm. Садржај протеина израчунат је на основу калибрационе криве стандарда албумина говеђег серума ( BSA , bovine serum albumine ) (5–50 mg/L).

6.3.2. Одређивање активности ксантин оксидазе ( XOD ) Активност ксантин оксидазе ( XOD ) одређена је спектрофотометријски на основу реакције оксидације ксантина до мокраћне киселине ( Bergmayer, 1970 ). На 20–50 μL узорка хомогената јетре или асцитеса додато је 3 mL смеше раствора EDTA и раствора ксантина (1 mol/L) у фосфатном пуферу pH 7,5. Након одређеног времена реакција је заустављена и реакциона смеша је центрифугирана на 3000 обртај/min у току 10 min. Мерена је апсорбанција супернатанта на 293 nm. Резултати су израчунати на основу специфичног апсорпционог коефицијента мокраћне киселине ( ε=1,2·10 4 L/mol·cm) изражени у nmol мокраћне киселине која

настаје током 1 min по 1 mg протеина хомогената јетре, односно у 1 mL запремине ћелија ЕАТ.

6.3.3. Одређивање активности каталазе ( CAT ) Активност каталазе ( CAT ) одређена је спектрофотометријски на основу

реакције разградње H 2O2. Продукти разградње, H 2O и O 2 не апсорбују у UV области 200–300 nm, услед чега долази до смањења апсорбанције ( Beers и Sizer, 1950 ). Узорак хомогената јетре или асцитеса (20–50 μL) помешан је са

3 mL смеше H 2O2 у фосфатном пуферу, припремљене мешањем 0,075 mL 30% H 2O2 са пуфером (0,05 mol/L; pH 7) до 50,0 mL. Реакција је заустављена након одређеног времена, а затим је реакциона смеша центрифугирана на 3000 обртај/min у току 10 min. Mерена је апсорбанција супернатанта на 240 nm. Резултати су изражени у nmol/min у 1 mg протеина хомогената јетре, односно у 1 mL ћелија ЕАТ (ε=4,36·10 4 L/mol·cm).

6.3.4. Одређивање активности пероксидазе ( Px ) Активност пероксидазе ( Px ) одређена је спектрофотометријски на основу реакције настајања обојеног тетрагвајакола из безбојног гвајакола

(о-метоксифенол) у присуству H 2O2 (Simon и сар., 1974 ). На 20–50 μL узорка хомогената јетре или асцитеса додато је 3 mL фосфатног пуфера (0,1 mol/L; pH 7), 50 μL раствора гвајакола (0,02 mol/L) и 40 μL раствора

H2O2 (0,14 mL H 2O2 у 100 ml H 2O). Реакција је заустављена након одређеног времена, па је реакциона смеша центрифугирана на 3000 обртај/min у току 10 min. Интензитет настале боје мерен је на 436 nm. Резултати су изражени у nmol/min у 1 mg протеина хомогената јетре, односно у 1 mL ћелија ЕАТ ( ε=2.3 ·10 4 L/mol ·cm).

6.3.5. Одређивање активности глутатион пероксидазе (GSHPx ) Активност глутатион пероксидазе ( GSHPx ) одређена је на основу реакције редукције кумолхидропероксида као супстрата у присуству GSH као кофактора. GSH у вишку реагује са Елмановим реагенсом дајући жуто обојени производ ( Beuthler и сар., 1983 ). Смеша узорка хомогената јетре или суспензије ћелија ЕАТ (20–50 μL) и 0,75 mL TRIS -HCl пуфера I (0,05 mol/L; pH 7,6) инкубирана је 10 min на 37 °C, а потом је

додато 0,1 mL раствора GSH (0,002 mol/L) и 0,1 mL метанолног раствора кумолхидропероксида (1:200) Добијена смеша је инкубирана 5 min на 37 °C.

Реакција је заустављена додатком 1 mL 20% CCl 3COOH . Након центрифугирања смеше (300 обртај/min, 10 min), 1 mL супернатанта помешан је са 2 mL TRIS -HCl пуфера II (0,4 mol/L; pH 8,9) и 0,1 mL Елмановог реагенса (0,02 g 5,5'-дитио-бис -(2- нитробензојеве киселине) у 5 mL TRIS -HCl пуфера II). Интензитет настале боје мерен је на 412 nm. Резултати су изражени у nmol/min у 1 mg протеина хомогената јетре, односно у 1 mL ћелија ЕАТ ( ε=1.36 ·10 4 L/mol ·cm).

6.3.6. Одређивање активности глутатион редуктазе ( GR ) Активност глутатион редуктазе ( GR ) одређена је на основу реакције редукције оксидованог глутатиона ( GSSR ) до GSH у присуству NADPH чиме долази до смањења апсорбанције реакционе смеше мерене на 340 nm ( Goldberg и Spooner, 1983 ). Реакциона смеша је припремљена од 20–50 μL узорка хомогената јетре или асцитеса, 0,2 mL 2%-ног раствора GSSG , 0,3 mL раствора NADPH (0,001 mol/L) и 2 mL фосфатног пуфера ( pH 7,6). Након заустављања реакције, смеша је центрифугирана (3000 обртај/min, 10 min), па је у супернатанту мерена апсорбанција на 340 nm. Резултати су изражени у nmol/min у 1 mg протеина хомогената јетре, односно у 1 mL ћелија ЕАТ ( ε=6,22 ·10 -3 L/mol ·cm).

6.3.7. Одређивање садржаја редукованог глутатиона (GSH ) Садржај редукованог глутатиона ( GSH ) одређен је спектрофотометријски на основу реакције GSH са Елмановим реагенсом (5,5'-дитио-бис -(2-нитробензојева киселина)). Тиолна група GSH редукује дисулфидну групу Елмановог реагенса при чему настаје жуто обојени тионитробензоат ( Beuthler, 1984 ). Реакциона смеша је припремљена од 1 mL узорка хомогената јетре или асцитеса и 2 mL 2%-ног раствора сулфосалицилне киселине (3000 обртај/min, 10 min). Након центрифугирања смеше, супернатант је помешан са Елмановим регенсом у односу 1:40. Интензитет настале боје мерен је на 412 nm. Резултати су изражени као nmol GSH у 1 mg протеина хомогената јетре, односно у 1 mL ћелија ЕАТ ( ε=1,36 ·10 4 L/mol ·cm).

6.3.8. Одређивање интензитета липидне пероксидације ( LPx ) – TBA тест Интензитет липидне пероксидације ( LPx ) одређен је спектрофотометријски на основу реакције тиобарбитурнe киселинe ( TBA ) са TBA -реактивним врстама (TBA-RS ), при чему настаје црвено обојени производ. TBA -реактивним врстама сматрају се карбонилни продукти пероксидације липида ћелијске мембране ( Beuge и Aust, 1978 ). 20–50 μL узорка хомогената јетре или асцитеса загревано је током 15 min у кључалом воденом купатилу са 3 mL Чинидле раствора, израђеног од 3,75 g TBA ,

15 g CCl 3COOH, 20,72 ml 37%-не HCl и 1-2 капи α-токоферола у 1 L раствора. Након центрифугуирања (3000 обртај/min, 10 min), апсорбанција је мерена на 535 nm. Садржај TBA-RS израчунат је на основу специфичног апсорпционог коефицијента производа који настаје у реакцији између малонилдиалдехида ( MDA ) и TBA (ε=1,56·10 5 L/mol·cm). Резултати су изражени као nmol MDA у 1 mg протеина хомогената јетре, односно у 1 mL ћелија ЕАТ.

7. Статистичка обрада резултата и хемометријска анализа

7.1. Основни статистички параметри

Средња вредност (Xsr ), стандардна девијација ( Sd), најмања и највећа вредност ( Min и Max ) у скуповима свих добијених резултата израчунати су коришћењем Microsoft Excel 2010 рачунарског програма. Утврђивање статистички значајних разлика између средњих вредности варијабли група података извршено је применом анализе варијансе ( ANOVA ) коришћењем рачунарског програма SPSS 11.0 ( SPSS Inc., Chicago, IL ).

7.2. Корелациона анализа

Корелационом анализом се испитује степен зависности између два низа нумеричких величина. У овом раду корелациона анализа је извршена израчунавњем Пирсоновог коефицијента линеарне зависности.

7.2.1. Корелациона анализа садржаја метала у херби и ризосфери панонског тимијана Корелациона анализа је извршена између вредности садржаја Cu, Fe, Mn, Zn и Cr у херби и ризосфери Th. pannonicus сакупљеним 2008. (локалитети 1–8 и 12 –15 ) (Табела 5 ). Пирсонови коефицијенти су израчунати за цео скуп података који се састојао од садржаја метала у херби и садржаја метала у ризосфери, коришћењем Microsoft Excel 2010 рачунарског програма.

7.2.2. Корелациона анализа садржаја метала и састава хедспејс фракција листа панонског тимијана Корелациона анализа између вредности садржаја Cr, Co, Ni, Mo, Cu, Zn, Mn, Fe, Mg, Ca, K и Na, и релативног садржаја испарљивих једињења у хедспејс фракцијама листа Th. pannonicus сакупљеног на локалитетима 5 и 8–11 2010. (Табела 5 ) извршена је са скупом података који се састојао од садржаја метала и процентног удела идентификованих компоненти у хедспејс (ХС) фракцијама. За израчунавање су коришћени рачунарски програми SPSS 11.0 ( SPSS Inc., Chicago, IL ) и Minitab 13.20 (Minitab Inc., State College, PA ).

7.2.3. Корелациона анализа садржаја полифенолних састојака и антиоксидантне активности поларних екстраката хербе панонског тимијана Корелациона анализа је извршена израчунавањем Пирсонових коефицијаната између вредности садржаја полифенолних састојака поларних екстраката (укупних полифенола, розмаринске киселине, хетерозида апигенина и хетерозида лутеолина) међусобом, као и између вредности садржаја полифенолних састојака и утврђених вредности параметара антиоксидантне активности

поларних екстраката ( FRAP вредност и IC 50 вредност). За израчунавање је коришћен рачунарски програм SPSS 11.0 ( SPSS Inc., Chicago, IL ).

7.3. Анализа главних компоненти ( PCA )

Анализа главних компоненти ( Prinicpal Component Analysis , PCA ) је мултиваријантна статистичка метода којa омогућава рад са великим бројем података, смањујући вишедимензионалност и сводећи на мањи број компоненти, од којих свака обухвата одређени број променљивих, са међусобним утицајем који се може дискутовати. Наиме, координате математичког простора, задатог на почетку, трансформишу се у нове координате, којима може да се опише највећи део варијабилности скупа података. Овако се добија простор са мање димензија лакши за интерпретацију и уочавање релација међу променљивама, а који суштински одговара почетном простору. Нове координате се називају главне компоненте (Principal Components , PC ) ( Ražić, 2011 ). PCA је извршена коришћењем рачунарских програма SPSS 11.0 ( SPSS Inc., Chicago, IL ) и Minitab 13.20 ( Minitab Inc., State College, PA ).

7.3.1. PCA садржаја метала и састава хедспејс фракција листа панонског тимијана PCA је урађена у циљу испитивања варијабилности и повезаности садржаја метала и релативног садржаја компонети хедспејс (ХС) фракција листа Th. pannonicus сакупљеног 2010. на локалитетима 5 и 8–11 . Рајан-Џојнеровим ( Ryan- Joiner ) тестом прво je испитана нормална дистрибуција података. Вредности које значајно одступају су, потом, одређене Грабсовим ( Grubbs ) тестом и у неколико случајева (Ca и Ni у узорку 8б, и Ni и Cr у узорку 8в) замењене средњим вредностима како не би реметиле даље моделовање. PCA je примењена на скупове података који су се састојали од: садржаја метала и релативног садржаја свих детектованих компоненти ХС фракција; садржаја метала и компоненти чији је релативни садржај био одређен у сваком узорку; садржаја метала и компоненти које су се у бар једном узорку налазиле у количини већој од 5%. Узета је у обзир и различита структура компоненти ХС

фракција, па су оне биле класификоване према врсти једињења (монотерпенски угљоводоници, кисеонични монотерпени, сесквитерпенски угљоводоници и кисеонични сесквитерпени). Према Кајзеровом ( Keiser ) критеријуму, постављено је да eigen (сопствена) вредност компоненте буде најмање 1. У случајевима када су се трансформацијом простора добиле главне компоненте са умереним оптерећењем променљивих, одн. како би се добила што једноставнија матрица за даљу евалуацију, вршена је Varimax ротација, што је олакшавало интерпретацију главних компоненти и односе променљивих.

7.3.2. PCA етарских уља хербе гајеног панонског тимијана PCA је урађена у циљу испитивања варијабилности састава етарског уља хербе гајеног Th. pannonicus сабраног 2012. (узорци хербе Г01 –Г15 ). Анализа је извршена на скупу вредности релативног садржаја компоненти етарских уља, чији је садржај бар у једном испитиваном узорку био ≥ 1%. Према Кајзеровом ( Keiser ) критеријуму, постављено је да eigen вредност компоненте буде најмање 1.

7.4. Кластерска анализа ( CA )

Кластерска анализа ( CA ) је мултиваријантна статистичка метода којом се добија слика (дендрограм) о груписању узорака на основу експериментално одређених променљивих величина. Груписање узорака је извршено хијерархијском кластерском анализом, применом Ward -овог метода и израчунавањем еуклидских растојања међу узорцима. CA је извршена коришћењем рачунарских програма SPSS 11.0 ( SPSS Inc., Chicago, IL ) и Minitab 13.20 ( Minitab Inc., State College, PA ).

7.4.1. Кластерска анализа узорака листа самониклог панонског тимијана Испитивање груписања узорака листа Th. pannonicus сакупљених 2010. на локалитетима 5 и 8–11 је извршено на основу: (1) скупа вредности садржаја компоненти у хедспејс фракцијама, (2) скупа вредности садржаја елемената и

вредности садржаја компоненти у хедспејс фракцијама, и (3) скупа вредности садржаја елемената и вредности садржаја одређене класе једињења (монотерпенски угљоводоници, кисеонични монотерпени, сесквитерпени) у хедспејс фракцијама.

7.4.2. Кластерска анализа етарских уља хербе самониклог панонског тимијана Груписање етарских уља хербе Th. pannonicus сакупљене 2011. на локалитетима у јужном Банату и на планинама у источној Србији (локалитети 5, 8- 12 , 14 и 15 ) испитано је на основу скупа података који се састојао од вредности садржаја свих детектованих компоненти етарских уља.

IV Резултати и дискусија

А. Анализа самониклог панонског тимијана

У циљу одабира узорка самониклог панонског тимијана за увођење у систем плантажног гајења ради добијања етарског уља или добијања других производа, извршено је испитивање хемијског састава и антиоксидантне и антимикробне активности самониклог панонског тимијана пореклом са различитих локалитета у Србији (Табела 5 ). Материјал сакупљен на локалитетима на којима панонски тимијан самоникло расте испитан је у погледу садржаја метала у ризосфери, херби и листу, састава хедспејс фракције листа, садржаја и састава етарског уља хербе, састава и in vitro антиоксидантне активности водено-метанолних екстраката хербе, као и хемијског састава, in vitro антиоксидантне активности и in vitro антимикробне активности инфуза хербе панонског тимијана. Узорци панонског тимијана за које је спроведеним анализама установљен повољнији састав и активност хербе, одабрани су за испитивање сезонске варијабилности састава и активности ради утврђивања оптималног периода сакупљања материјала. У том циљу испитане су варијације у саставу и садржају етарског уља, као и у саставу и антиоксидантној активности водено-метанолних екстраката хербе панонског тимијана сакупљене у три различите фенофазе (пре, током и након цветања) у јужном Банату.

1. Анализа ризосфере самониклог панонског тимијана: киселост и садржај метала

Састав и особине земљишта последица су састава основне стене, климе, топографије, вегетације и присуства других живих организама. Киселост земљишта, поред многих других фактора, има значајан утицај на биорасположивост елемената и њихову доступност биљкама. Равнотежни процеси преципитације и растварања, адсорпције и десорпције, комплексирања и дисоцијације метала, зависе од pH земљишта. Са опадањем pH повећава се

бирасположивост већине метала услед настајања растворних и покретљивих јона ( He и сар., 2005 ; Kabata и Kabata-Penidas, 2001 ). У узорцима ризосфере (земљишта узоркованог у зони корена) панонског тимијана одређена је киселост и садржај Cu, Fe, Mn, Zn и Cr.

1.1. Испитивање киселости ризосфере

Резултати испитивања киселости узорака ризосфере сакупљених 2008. са 12 локалитета, на Вршачким планинама (локалитети 1–8) и на планинама Стол (локалитети 12 и 13 ), Озрен (локалитет 14 ) и Ртањ (локалитет 15 ) у источној Србији, дати су у Табели 15 . Поред стварне, одређена је и потенцијална киселост која представља меру пуферског капацитета земљишта.

Табела 15 . Стварна ( pH (H 2O)) и потенцијална ( pH (KCl)) киселост ризосфере Th. pannonicus , основне стене и тип земљишта

Узорак a б Основна стена Тип земљишта pH (H 2O) pH (KCl) (локалитет / година) амигдалоидни и окцасти 1/08 – 5,24 4,09 гнајс амигдалоидни и окцасти 2/08 – 5,66 4,77 гнајс амигдалоидни и окцасти 3/08 – 6,09 4,87 гнајс амигдалоидни и окцасти 4/08 – 5,33 4,38 гнајс амигдалоидни и окцасти 5/08 – 6,71 6,00 гнајс барске и пролувијалне 6/08 – 6,18 5,41 суглине албитско-мусковитски 7/08 – 6,14 5,43 шкриљци албитско-мусковитски 8/08 – 6,19 5,15 шкриљци 12/08 кречњак вертисол (смоница) 5,91 4,93

13/08 кречњак калкомеланосол 7,13 6,47

14/08 кречњак – 7,37 6,80 флувисол 15/08 кречњак 7,62 7,12 (алувијални нанос) a Марковић и сар., 1984 .; б Подаци добијени из Института за земљиште, Теодора Драјзера 7, Београд. Локалитет: 1, Вршачке планине – Дом Црвеног крста; 2, Вршачке планине – пут; 3, Вршачке планине – брдски пут; 4, Вршачке планине – капела; 5, Вршачке планине – Ђаков врх; 6, Вршачке планине – село Месић; 7, Вршачке планине – поток Физош; 8, Вршачке планине – село Сочица; 12, планина Стол код Бора – ливада; 13, планина Стол код Бора – падина; 14, планина Озрен; 15, планина Ртањ – село Врмџа.

Узорци земљишта са планина у источној Србији, осим узорка са локалитета 12 (планина Стол – ливада), показали су слабо базну реакцију ( pH 7,13–7,62). Са друге стране, узорци ризосфере са Вршачких планина имали су pH вредност нижу од 7, при чему се могу уочити две групе узорака: узорци ризосфере са локалитета 1–4, веће киселости ( pH 5,24–6,09), и узорци ризосфере пореклом са локалитета 5–8, чија је стварна киселост нешто мања и износи 6,14–6,71.

Као основне стене локалитета на Вршачким планинама јављају се гнајс, глина или шкриљци, а узорци ризосфере са тих локалитета ( 1–8) имала су благо киселу реакцију. Са друге стране, узорци земљишта пореклом са локалитета у источној Србији (локалитети 12 –15 ), на којима је се као подлога јавља кречњак, показала су слабо базну реакцију и нижи пуферски капацитет. Изузетак представља узорак са локалитета 12 на планини Стол код Бора, који је показао благо киселу реакцију. Добијене вредности на локалитету 12 нису неочекиване с обзиром на то да је регион у околини Бора део Карпатско-балканског лука, масива стена који је налазиште наслага Cu, Au-Ag, Pb-Zn и Mo које се углавном налазе у облику оксидованих сумпорних једињења. Ископавање и обрада руда у оближњем

Рударско-топионичарском басену Бор доводи до настанка SO 2. И поред потрошње за производњу сумпорне киселине, овај гас у значајним количинама доспева у атмосферу. Благо кисела реакција ризосфере узорковане на

локалитету 12 може бити последица присуства SO 2 у атмосфери, као и задржавања киселих падавина због топографије терена ( Monthel и сар., 2002 ).

1.2. Aнализа садржајa метала (Cu, Fe, Mn, Zn и Cr) у ризосфери

Садржај Cu, Fe, Mn, Zn и Cr одређен у узорцима ризосфере узорковане 2008. на локалитетима на Вршачким планинама (локалитети 1–8) и на планинама Стол, Озрен и Ртањ (локалитети 12 –15 ) био је у распонима концентрација које се очекују за дати тип земљишта и стене које се налазе и у

његовој основи ( He и сар., 2005 ; Kabata-Pendias и Pendias, 2001 ). Резултати су приказани у Табели 16 . Садржај Fe био је уједначен на свим локалитетима (22,10–46,19 g/kg). У поређењу са литературним подацима, концентрације Mn биле су нешто повишене (изнад 776,95 mg/kg), при чему је наjвећи садржај одређен у узорцима земљишта пореклом са планина у источној Србији, посебно са локалитета 13 на планини Стол (4209,98 mg/kg) и 14 на планини Озрен (4901,27 mg/kg). Садржај Zn је у већини узорака такође био на горњој граници (62,27–214,02 mg/kg), док су концентрације Cu износиле 12,38–45,18 mg/kg. Као и у случају Mn, земљиште у нивоу ризосфере са планина у источној Србији (локалитети 12 –15 ) имало је веће количине Zn и Cu у односу на друге локалитете. Ниво Cr у узорцима земљишта варирао је у релативно уском опсегу (48,86–69,13 mg/kg).

Табела 16 . Садржај Cu, Fe, Mn, Zn и Cr у ризосфери Th. pannonicus

Узорак Cu Fe Mn Zn Cr (локалитет/година) mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg 1/08 22,97 35917 980,20 125,87 65,86 2/08 21,74 35226 832,87 120,92 56,99 3/08 29,53 33580 803,53 112,43 54,19 4/08 18,44 36318 776,95 129,99 54,53 5/08 13,67 29313 924,78 93,38 55,71 6/08 14,63 22102 1675,78 62,78 48,93 7/08 12,38 26560 927,37 63,29 48,86 8/08 14,58 32977 1401,88 62,27 63,94 12/08 32,42 30899 2238,66 100,86 58,31 13/08 45,18 46193 4209,98 160,57 54,22 14/08 34,17 38073 4901,27 134,06 65,55 15/08 28,62 27106 1754,74 214,02 69,13

Xsr 24,03 32855 1785,67 115,04 58,02

Sd 10,14 6305 1380,59 44,19 6,68 Min 12,38 22102 776,95 62,27 48,86 Max 45,18 46193 4901,27 214,02 69,13 Max/Min 3,65 2,09 6,31 3,44 1,41 Локалитет: 1, Вршачке планине – Дом Црвеног крста; 2, Вршачке планине – пут; 3, Вршачке планине – брдски пут; 4, Вршачке планине – капела; 5, Вршачке планине – Ђаков врх; 6, Вршачке планине – село Месић; 7, Вршачке планине – поток Физош; 8, Вршачке планине – село Сочица; 12, планина Стол код Бора – ливада; 13, планина Стол код Бора – падина; 14, планина Озрен; 15, планина Ртањ – село Врмџа.

Xsr , средња вредност; Sd, стандардна девијација; Min , најмања вредност; Max , највећа вредност; Max /Min , однос највеће и најмање вредности.

Локалитети 12 –15 на планинама у источној Србији налазе се у региону Карпатско-балканског лука ( Monthel и сар., 2002 ). Стога, виши садржај Cu, Zn и Mn у ризосфери панонског тимијана на овим локалитетима у односу на локалитете на Вршачким планинама (локалитети 1–8) није неочекиван, нарочито узимајући у обзир и већу киселост узорака земљишта вршачког порекла која омогућава растварање и спирање соли ових елемената. Што се тиче садржаја Cu и Zn, у узорцима ризосфере са Вршачких планина могу се разликовати 2 групе: узорци са локалитета 1–4 са вишим, и узорци са локалитета 5–8, са нешто нижим садржајем ових метала. Повишен садржај Cu и Zn у земљишту често је последица антропогеног утицаја ( He и сар., 2005 ). Hjortenkrans и сар. (2007) су, нпр., утврдили да је повишен садржај ових елемената поред путева последица ослобађања честица из аутомобилских гума и кочионих система, а како се локалитети 1–4 налазе близу асфалтног пута, повишен садржај Cu и Zn може бити у вези са током саобраћаја.

2. Aнализа садржајa метала (Cu, Fe, Mn, Zn и Cr) у херби самониклог панонског тимијана

Сматра се да је седамнаест елемената укључених у различите процесе примарног и секундарног метаболизма есенцијално за биљке: C, H, O, N, P, K, Ca, Mg, S, Fe, Mn, Zn, Cu, Ni, B, Mo и Cl ( Husted и сар., 2011 ). За Cr је познато да има значајну улогу у биљкама, али није потврђено да је есенцијалан ( Zayed и Terry, 2003 ). Према садржају, елементи су подељени на макро (>0,1% суве масе), микро (<0,1%) и елементе у траговима (концентрација у ppm) ( Hoenig, 2001 ). У узорцима хербе сакупљене 2008. на локалитетима на Вршачким планинама (локалитети 1–8) и на планинама у источној Србији (локалитети 12 –15 ) одређен је садржај Cu, Fe, Mn, Zn и Cr ( Табела 17 ). Поређењем узорака са различитих локалитета уочено је да су концентрације већине одређиваних метала биле више у узорцима хербе са локалитета 1–8 на Вршачким планинама, него у херби пореклом са локалитета 12 –15 на планинама у источној Србији. Садржај Fe и Мn нарочито је био варијабилан у зависности од локалитета.

За разлику од релативно уједначених концентрација Fe у узорцима ризoсфере, садржај овог елемента у узорцима хербе сакупљене на локалитетима у источној Србији (локалитети 12 –15 ) износио је до 267,00 mg/kg, док је у узорцима са појединих локалитета на Вршачким планинама (локалитети 6, 7 и 8) одређена и 5-6 пута већа концентрација Fe (262,97–1454,08 mg/kg). Количина Mn је у неколико узорака била на горњој граници, али у оквиру физиолошких концентрација за надземне делове биљака. Садржај овог елемента у херби панонског тимијана пореклом са планина у источној Србији (локалитети 12 –15 ) износио је 89,29–148,09 mg/kg, док је у узорцима са Вршачких планина (локалитети 1–8) био виши и износио је 164,87–278,25 mg/kg. Велике варијације у погледу садржаја Mn и раније су уочене код биљака рода Thymus (Mężyk и Więckowski, 1999 ).

Табела 17. Садржај Cu, Fe, Mn, Zn и Cr у херби Th. pannonicus

Узорак Cu Fe Mn Zn Cr (Локалитет/година mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg 1/08) 8,79 262,97 250,78 5,72 1,83 2/08 10,46 509,22 198,14 4,25 2,58 3/08 8,48 646,71 209,86 2,17 2,55 4/08 6,87 506,30 209,66 6,08 2,25 5/08 10,94 796,60 238,33 10,64 2,20 6/08 11,61 1454,07 278,25 4,78 3,51 7/08 7,75 1375,14 164,87 4,00 3,23 8/08 8,43 960,45 201,19 3,15 3,05 12/08 13,77 25,97 148,09 4,37 1,32 13/08 14,07 254,68 95,92 2,27 1,78 14/08 5,26 25,92 124,33 3,67 1,11 15/08 6,21 267,00 89,29 1,81 1,42

Xsr 9,39 590,42 184,06 4,41 2,23

Sd 2,83 478,61 60,35 2,38 0,78 Min 5,26 25,92 89,29 1,81 1,11 Max 14,07 1454,07 278,25 10,64 3,51 Max/Min 2,68 56,10 3,12 5,88 3,17 Резултати представљају средњу вредност три одређивања метала у узорку хербе са датог локалитета. Локалитет: 1, Вршачке планине – Дом Црвеног крста; 2, Вршачке планине – пут; 3, Вршачке планине – брдски пут; 4, Вршачке планине – капела; 5, Вршачке планине – Ђаков врх; 6, Вршачке планине – село Месић; 7, Вршачке планине – поток Физош; 8, Вршачке планине – село Сочица; 12, планина Стол код Бора – ливада; 13, планина Стол код Бора – падина; 14, планина Озрен; 15, планина Ртањ – село Врмџа.

Xsr , средња вредност; Sd, стандардна девијација; Min , најмања вредност; Max , највећа вредност; Max /Min , однос највеће и најмање вредности.

Сви испитивани узорци хербе из 2008. садржавали су Zn у нижим концентрацијама од очекиваних за надземне делове биљака (1,81–10,64 mg/kg) (Kabata-Pendias и Pendias, 2001 ). Раније је код појединих Thymus врста ( Th. serpyllum L., Th. pulegioides L.) установљено да су концентрације овог метала у узорцима хербе са различитих локалитета уједначене, чак и у случају већих варијација садржаја Zn у одговарајућим узорцима земљишта ( Mężyk и Więckowski, 1999 ; Remon и сар., 2005 ). Са друге стране, садржај Zn у херби Th. praecox Opiz, сакупљеној на различитим удаљеностима од рудника волфрама у Турској, варирао је у опсегу од 50 до чак 6780 mg/kg ( Güleryüz и сар., 2002 ), а високе концентрације Zn (173–186 mg/kg), више него у одговарајућим узорцима земљишта, одређене су и у херби Th. zygis L. (Illera и сар., 2001 ). Садржај Cu у херби биљака са Вршачких планина (локалитети 1–8) био je релативно уједначен и износио је 6,87–11,61 mg/kg. Насупрот томе, у узорцима са локалитета у источној Србији забележене су најниже концентрације, 5,26 mg/kg на планини Озрен (локалитет 14 ) и 6,21 mg/kg на Ртњу (локалитет 15 ), као и највише концентрације овог елемента, 13,77 mg/kg (локалитет 12 ) и 14,07 mg/kg (локалитет 13 ) на Столу код Бора. Садржај Cr био је у физиолошким границама (1,11–3,51 mg/kg). Као и у случају Fe, највише концентрације Cr су одређене у узорцима са локалитета 6, 7 и 8 на Вршачким планинама (3,05–3,51 mg/kg), док је херба сакупљена на планима у источној Србији садржавала мање количине овог елемента (1,11–1,78 mg/kg).

3. Aнализа корелација садржаја метала у ризосфери и херби самониклог панонског тимијана

У литератури се могу наћи различити подаци о минералном саставу надземних делова биљака рода Thymus (Chizzola и Michitsch, 2003 ; Garcia и сар., 2000 ; Mężyk и Więckowski, 1999; Panovska и сар., 1996), али је састав земљишта на коме су биљке расле ретко испитиван истовремено, па су односи између садржаја метала у земљишту и херби Thymus врста слабо познати ( Remon и сар.,

2005 ; Güleryüz и сар., 2002 ; Illera и сар., 2001 ). Популације тимол/ p-цимен хемотипа Th. pannonicus у Мађарској расту на земљиштима различитог састава и pH, при чему је установљено да је садржај тимола у етарском уљу хербе у корелацији са садржајем појединих метала у земљишту ( Pluhár и сар., 2007 ). Садржај Cu, Fe, Mn, Zn и Cr у узорцима хербе панонског тимијана испитиваних у овом раду разликовао се у зависности од локалитета. Ово је делимично последица различитог састава и киселости ризосфере, односно различите биорасположивости ових елемената. И поред нижих концентрација у ризосфери, услед киселијег земљишта и веће биорасположивости, у надземним деловима панонског тимијана пореклом са Вршачких планина (локалитети 1–8) одређен је виши садржај испитиваних елемената у поређењу са локалитетима на планинама у источној Србији (локалитети 12 –15 ). Алкално земљиште на локалитетима у источној Србији, са друге стране, имало је негативан утицај на биорасположивост метала. Даља повезаност између садржаја метала у ризосфери и херби панонског тимијана сакупљених 2008. на локалитетима 1–8 и 12 –15 испитана је корелационом анализом. Резултати су приказани у Табели 18 .

Табела 18. Корелациона матрица садржаја метала у херби и ризосфери Th. pannonicus

Херба Ризосфера Cu Fe Mn Zn Cr Cu Fe Mn Zn Fe 0,01 / / / / / / / / Mn 0,09 0,55 / / / / / / / Zn 0,14 0,17 0,58 * / / / / / / Херба Херба Cr 0,07 0,95 * 0,61 * 0,08 / / / / / Cu 0,25 -0,76 * -0,70 * -0,53 -0,72 * / / / / Fe 0,12 -0,63 * -0,38 -0,20 -0,47 0,68 * / / / Mn 0,09 -0,49 -0,63 * -0,34 -0,56 0,74 * 0,51 / / Zn -0,21 -0,71 * -0,65 * -0,34 -0,72 * 0,65 * 0,40 0,33 / Ризосфера Ризосфера Cr -0,44 -0,64 * -0,35 -0,20 -0,64 * 0,27 0,21 0,24 0,55 *Статистички значајне вредности Пирсоновог коефицијента за p=0,05 и N=12.

И поред високог садржаја Fe и, нарочито, Mn у ризосфери панонског тимијана са планина у источној Србији (локалитети 12 –15 ), у одговарајућим узорцима хербе садржај ових елемената био је прилично низак. Корелација садржаја Fe у херби и ризосфери, као и корелација садржаја Mn у херби и ризосфери је негативна и статистички значајна, посебно ако се узму у обзир

само локалитети 12 –15 . Са друге стране садржај Fe и Mn у херби је у благој међусобној позитивној корелацији. Код биљака које расту на растреситим земљиштима богатим калцијумом или на алкалним земљиштима, као што је на локалитетима 12 –15 , неретко долази до дефицијенције гвожђа због његове ниске биорасположивости. Дикотиледоне и неке монокотиледоне биљке, у циљу повећања апсорције Fe, врше ензимску редукцију Fe 3+ до Fe 2+ и ослобађају H + јон у ризосферу (тзв.,

2+ стратегија I). Под оваквим условима долази до редукције MnO 2 до Mn у ризосфери, чиме се повећава расположивост и апсорпција и овог елемента (Sayyari-Zahan и сар., 2009 ). Највише концентрације Cu одређене су у херби са планине Стол код Бора, у региону који је налазиште руда бакра, на локалитетима на којима су и у ризосфери измерене високе концентрације овог метала. Са друге стране, и поред високих концентрација у ризосфери, у херби са локалитета на планинама Озрен и Ртањ одређене су најниже концентрације Cu, што је бар делом у вези са његовом ниском биорасположивошћу у алкалној средини ризосфере. Према литературним подацима, вредности садржајa Zn у земљишту више од 200–300 mg/kg за последицу могу имати појаву токсичних ефеката код биљака, а садржај мањи од 10–20 mg/kg у надземним деловима биљака доводи до симптома дефицијенције ( Kabata и Kabata-Penidas, 2001 ). Међутим, иако је већина узорака ризосфере Th. pannonicus садржавала релативно високе концентрације цинка (до 214,02 mg/kg), у узорцима хербе одређене су ниске концентрације (1,81–10,64 mg/kg) (уз одсуство видљивих симптома дефицијенције Zn), што може указивати на специфичност механизама апсорпције и транслокације овог метала код панонског тимијана. Корелационом анализом утврђена је значајна повезаност садржаја Fe и Cr у испитиваној херби, са вредношћу Пирсоновог коефицијента 0,95. Овакав однос ова два елемента и раније је уочен код биљака, и у вези је са још увек неразјашњеним механизмом транслокације Cr кроз биљку, за који сматра да је повезан са способношћу биљке да акумулира Fe ( Zayed и Terry, 2003 ).

4. Анализа садржајa метала (Cr, Co, Ni, Mo, Cu, Zn, Mn, Fe, Mg, Ca, K и Na) у листу самониклог панонског тимијана

У узорцима листа три јединке панонског тимијана (а, б и в) са сваког од локалитета 5 и 8–11 у јужном Банату (сакупљеним 2010.), одређен је садржај Cr, Co, Ni, Mo, Cu, Zn, Mn, Fe, Mg, Ca, K и Na. Разултати су приказани у Табели 19 . Садржај одређених макро, микро и елемената у траговима у испитиваним узорцима листа панонског тимијана у складу је са физиолошким вредностима за надземне делове биљака датим у литератури ( Hänsch и Mendel, 2009 ; Kara, 2009 ; Kabata и Kabata-Penidas, 2001 ). Kонцентрације Cr, Cu, Mn и Fe (0,41–1,41; 7,04– 15,67; 20,54–219,09 и 89,50–749,91 mg/kg, редом) нису одступале од количина одређених у узорцима хербе из 2008. (Резултати и дискусија А.2 ). Са друге стране, у листу панонског тимијана сакупљеном 2010. одређена је значајно већа количина Zn (33,85–106,66 mg/kg) у поређењу са узорцима хербе из 2008. (1,22– 10,64 mg/kg), што, бар делимично, може бити у вези са тим да се Zn концентрише у листовима ( Kabata и Kabata-Penidas, 2001 ), а да је анализирани узорак из 2008. била херба. Садржај Ni (1,35–16,22 mg/kg) и Mo (0,06–1,25 mg/kg), као и макро елемената Mg (1,82–3,80 g/kg), Ca (7,89–26,58 g/kg), K (8,00–23,07 g/kg) и Na (2,53–114,01 mg/kg) био је у оквиру физиолошких вредности за ове елементе (Hänsch и Mendel, 2009 ; Kara, 2009 ). Садржај Co у свим узорцима листа панонског тимијана био је испод лимита квантификације. Ниске вредности кобалта, које нису неуобичајене за биљке ( Kabata и Kabata-Penidas, 2001 ), ипак нису биле очекиване, узимајући у обзир ранија испитивања. Pluhár и сар., 2007 су утврдили да се самоникли Th. pannonicus у Мађарској јавља на земљиштима са повишеним садржајем Co. Такође, с обзиром на то да је у испитивањима у овом раду у погледу садржаја елемената у листу анализиран и лист панонског тимијана цитралног хемотипа, претпостављено је да ће садржај Co бити у вези са садржајем цитрала, јер је приликом испитивања Cymbopogon citratus установљено да се удео цитрала у етарском уљу повећавао са додатком Co у подлогу у којој је биљка расла ( Aziz и Gad, 2011 ).

Табела 19. Садржај Cr, Ni, Mo, Cu, Zn, Mn, Fe, Mg, Ca, K и Na у листу самониклог Th. pannonicus

Узорак Cr Ni Mo Cu Zn Mn Fe Mg Ca K Na Локалитет/година mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg 5а/10 0,75 3,79 0,06 12,30 65,81 185,03 368,04 2639,12 10855,16 23066,93 114,01 5б/10 0,73 2,07 0,27 9,22 68,57 163,65 191,88 2426,98 10556,81 21113,15 112,66 5в/10 0,41 1,44 0,16 8,04 62,09 88,69 89,50 2103,63 7886,10 13191,36 2,53 8а/10 0,56 4,47 0,56 14,59 55,47 45,50 233,81 2772,53 11220,50 13456,72 9,34 8б/10 0,85 8,43 0,85 10,00 91,18 41,19 352,20 3802,95 26580,94 8006,06 10,97 8в/10 1,41 16,22 0,17 9,61 82,31 219,09 749,91 2684,52 10306,88 13323,39 14,72 9а/10 0,70 4,45 0,50 11,56 63,40 133,10 578,80 3229,64 12167,19 15109,84 55,10 9б/10 0,73 1,35 1,25 10,40 77,66 20,54 240,07 1820,34 11816,29 18883,08 10,42 9в/10 0,83 1,39 0,15 7,04 106,66 140,94 206,55 2466,23 8571,91 17923,58 6,20 10а/10 0,51 1,46 0,66 10,49 42,45 52,16 195,85 2589,24 11521,24 14683,31 17,78 10б/10 0,47 2,23 0,36 13,36 52,67 58,58 332,16 2336,95 10059,57 12815,60 8,40 10в/10 0,75 3,05 0,41 7,19 33,85 41,81 460,69 2424,42 9493,36 16082,06 17,44 11а/10 0,88 3,56 0,45 15,67 49,54 43,31 387,09 1827,05 10474,95 11192,43 24,28 11б/10 0,96 4,01 1,12 11,61 43,82 62,84 406,71 2553,33 11988,52 11128,71 14,67 11в/10 0,70 3,07 1,16 12,82 48,79 45,24 282,12 2667,73 11318,12 13132,94 14,98

Xsr 0,75 4,07 0,54 10,93 62,95 89,44 338,36 2556,31 11654,50 14873,94 28,90

Sd 0,24 3,83 0,39 2,56 19,85 62,35 168,00 497,12 4305,21 3984,23 36,35 Min 0,41 1,35 0,06 7,04 33,85 20,54 89,50 1820,34 7886,10 8006,06 2,53 Max 1,41 16,22 1,25 15,67 106,66 219,09 749,91 3802,95 26580,94 23066,93 114,01 Max/Min 3,43 12,02 22,64 2,22 3,15 10,67 8,38 2,09 3,37 2,88 45,01 Локалитет: 5, Вршачке планине - Ђаков врх; 8, Вршачке планине - Сочица; 9, Вршачке планине - кула; 10, Девојачки бунар; 11, Гребенац; а, б, в – са сваког локалитета одвојено су анализирани листови три јединке;

5. Анализа хедспејс фракција листа самониклог панонског тимијана

Хедспејс (ХС, енг. headspace ) фракција чврстог или течног матрикса представља гасну фазу која се налази у равнотежи са матриксом. Анализа такавог узорка је практично без интерференција које би потицале из матрикса. Главни параметар који утиче на састав ХС фракције је константа равнотеже аналита, у овом случају испарљивих биљних једињења, између матрикса (биљног материјала) и гасне фазе. Константа равнотеже зависи од напона паре једињења и коефицијента активности, на које се може утицати променама у температури и присуством јонски активних смеша ( Koning и сар., 2009 ). Приликом поступка ХС екстракције принос врло испарљивих једињења ( α- пинена, 1,8-цинеола) у добијеним ХС екстрактима обично је добар, што није случај и са једињењима више тачке кључања ( Bicchi и сар., 2000 ). У литератури постоји само неколико истраживања која се односе на анализу ХС фракција биљака рода Thymus , док састав испарљивих фракција панонског тимијана добијених ХС екстракцијом до сада није испитиван. Резултати анализе испарљивих састојака листа Th. pannonicus , изолованих ХС екстракцијом, сакупљеног 2010. године на локалитетима на Вршачким планинама 5 и 8–11 , приказани су у Табели 20 . У испарљивим фракцијама испитиваних узорака (ХС фракције) детектованe су укупно 82 компоненте, од чега је 69 идентификовано, чинећи 92,53–99,94% фракција. ХС фракције су садржавале 3,79–88,15% монотерпенских угљоводоника, 3,77–73,08% кисеоничних монотерпена, 1,53–5,20% сесквитерпенских угљоводоника, до 0,36% кисеоничних сесквитерпена и до 25,20% једињења осталих класа. У свим испитиваним узорцима најзаступљенија су била монотерпенска једињења (66,72–96,11%), при чему су у узорцима пореклом из Девојачког бунара (локалитет 10 ) и Гребенца (локалитет 11 ) били доминантни монотерпенски угљоводоници (74,97–88,15%), а у узорцима са Вршачких планина (локалитети 5, 8 и 9) најзаступљенија класа једињења били су кисеонични монотерпени (52,87–73,08%). ХС фракције панонског тимијана богате монотерпенским угљоводоницима као главне компоненте садржавале су лимонен (3,69–42,99%),

мирцен (11,07–39,54%), α-пинен (4,51–35,58%), ( E)-β-оцимен (4,71–23,56%) и камфен (до 15,81%). У ХС фракцијама богатим кисеоничним монотерпенима најзаступљенији су били гераниал (12,05–23,44%), нерал (11,46–22,10%) и 1,8- цинеол (2,92–12,52%), при чему је у овим фракцијама удео једињења осталих класа био значајан (13,15–25,20%), а међу њима издвојили су се са највећом количином 6-метил-5-хептен-2-он (8,85–16,01%) и 1-октен-3-ол (1,39–9,41%). Према профилима ХС фракција узорци листа сакупљени на локалитетима 5 и 8-11 се могу раздвојити на две групе које су се између осталог разликовале и по мирису: (1) узорци пореклом са Вршачких планина (локалитети 5, 8 и 9) и (2) узорци пореклом из Девојачког бунара (локалитет 10 ) и Гребенца (локалитет 11 ). ХС фракције узорака прве групе одликују се високим садржајем цитрала (смеше гераниала и нерала) дајући узорцима мирис на лимун, као и значајном количином 6-метил-5-хептен-2-она. Ова једињења нису детектована у узорцима друге групе, осим у узорку 10 в који је садржавао мале количине цитрала. Узорци друге групе имали су ХС фракције нешто оштријег мириса. Одликовале су се вишим садржајем мирцена који у ХС фракцијама прве групе није ни детектован. Даље се у оквиру друге групе узорака разликују узорци са ХС фракцијама богатим лимоненом ( 10 а, 10 в и донекле 11 б) и узорци богати α-пиненом и камфеном ( 10 б, 11 а и 11 в). Узорци прве групе потицали су од јединки које су се и морфолошки, према густини индументума, разликовале од јединки друге групе. Према Флори СР Србије прва група (локалитети 5, 8 и 9) одговара врсти Th. pannonicus All., док друга група (локалитети 10 и 11 ) одговара врсти Th. marshallianus Willd. (Диклић, 1974 ). Због особина испарљивих једињења и услова издвајања ХС фракције (температура и време излагања биљног материјала датој температури) извршена је оптимизација поступка ХС екстракције испарљивих једињења панонског тимијана. Поред тога, упоређени су састав добијених ХС фракција и етарског уља (ЕУ) добијеног дестилацијом воденом паром из истог биљног материјала ( Прилог 1 ).

Основна класа једињења у ЕУ панонског тимијана били су монотерпени са кисеоником у структури (84,29%). Монотерпенски изомерни алдехиди, гераниал и нерал, чинили су 36,35% и 26,83% ЕУ, редом. Од осталих компоненти, најзаступљенији су били нерилацетат, нерол и геранилацетат (Прилог 1 – Табела 1). У ХС фракцијама су кисеонични монотерпени такође били доминантни, али је њихов удео био мањи него у ЕУ (50,51–65,05%). На састав ХС фракција утицале су особине испарљивих једињења, односно услови изоловања фракције: температура (60, 80, 90 или 100 °C) и време инкубације узорка (20, 30 или 60 min). Гераниал и нерал су се слично понашали при промени услова (Прилог 1 – Слика 2 ). Виша температура и дуже време инкубације имали су негативни утицај на удео ових компоненти у фракцијама. Најмањи проценат површине пикова ова два једињења био је у узорцима добијеним инкубацијом на 100 °C током 60 min. Слично су се понашали и монотерпенски угљоводоници α-пинен и камфен (Прилог 1 – Слика 3 ), чији је релативни садржај био највиши у ХС фракцијама добијеним на температури од 60 °C. Са друге стране, ослобађање слабије испарљивих сесквитерпена захтевало је инкубацију на вишим температурама и било је без значајнијег утицаја времена инкубације на датој температури (Прилог 1 – Слика 5 ). Овакво понашање испарљивих састојака Th. pannonicus у складу је са физичко-хемијским особинама једињења (SciFinder, 2013б-з; De Coensel и сар., 2007 ; Chatzopoulou и Katsiotis, 2006 ). Међутим, упоређивањем састава ХС фракција и ЕУ, одговор неких једињења није у потуности очекиван. Ово је посебно уочљиво за 1,8-цинеол. Релативни садржај и одговор пламено јонизационог детектора за 1,8-цинеол у ХС фракцијама је неочекивано висок, посебно у поређењу са лакше испарљивим монотерпенским угљоводоницима, чији су температура кључања и енталпија испаравања мањи од одговарајућих параметара 1,8-цинеола. Боља растворљивост овог једињења у води у поређењу са монотерпенима током дестилације воденом паром може имати утицај на његов мањи принос у ЕУ (SciFinder, 2013е ). И у ранијим испитивањима других Thymus врста удео монотерпенских једињења у ХС фракцији хербе je био већи у поређењу са одговарајућим етарским уљем добијеног дестилацијом воденом паром. Доминантна фракција у

етарским уљима два узорка хербе Th. praecox ssp. polytrichus (syn. Th. balcanus ) из околине Сарајева били су сесквитерпени, односно кисеонични сесквитерпени (око 63% и око 40%, редом), док су одговарајуће ХС фракције у највећем проценту садржавале кисеоничне монотерпене (~65%). Код Th. praecox ssp. skorpilii (syn. Th. jankae ), Тh. aeropunctatus и Th. serpyllum , чији је састав етарских уља био међусобно различит, укупни монотерпени су чинили преко 50% одговарајућих ХС фракција ( Ćavar и сар., 2009 ; Vidic и сар., 2010 ). Иако је састав добијених ХС фракција различит од састава етарског уља, примењена метода је погодна за анализу мањих узорака материјала. Уз то, избегава се промена састава испарљиве фракције током дестилације воденом паром, а биљни материјал остаје практично интактан у погледу других неиспарљивих састојака.

Табела 20. Састав хедспејс фракција листова Th. pannonicus

Узорак (Локалитет/година) 5а/10 5б/10 5в/10 8а/10 8б/10 8в/10 9а/10 9б/10 9в/10 10а/10 10б/10 10в/10 11а/10 11б/10 11в/10 Компонента ХС фракције: КИЛ КИЕ % % % % % % % % % % % % % % % 1 Трициклен 921 931,0 ------0,35 1,25 - 0,37 0,52 0,15 2 α-Тујен 924 934,6 0,60 0,35 0,88 т. 0,18 0,89 0,18 0,35 0,25 0,82 - 1,22 1,51 0,83 0,55 3 α-Пинен 932 941,9 2,10 0,73 2,48 1,31 1,24 3,61 1,55 1,58 2,18 4,85 10,30 7,96 11,91 4,51 35,58 4 Камфен 946 958,9 0,78 - 3,22 0,19 0,15 3,82 т. 2,32 1,95 1,18 15,81 т. 11,24 6,71 7,08 5 Сабинен 969 980,7 0,69 0,26 0,30 0,25 т. 0,54 0,22 0,08 0,19 0,39 0,64 0,48 0,95 0,47 0,28 6 1-Октен-3-ол 974 985,5 4,34 2,03 3,59 1,39 7,18 4,31 4,18 9,41 5,78 2,45 - 1,78 - 2,22 1,94 7 β-Пинен 974 986,8 - - - 1,39 - - - - - 2,45 4,36 1,78 5,42 3,01 1,94 8 3-Октанон 979 993,1 ------т. - 2,81 т. 2,80 - 1,64 1,93 9 6-Метил-5-хептен-2-он 981 993,6 12,38 10,52 11,14 11,78 12,03 8,85 13,81 15,33 16,01 ------10 Мирцен 988 997,6 ------21,57 21,96 11,07 39,54 35,64 19,84 11 α-Феландрен 1002 1011,2 - - - - - 1,05 ------т. 12 α-Терпинен 1014 1022,8 0,55 0,33 0,55 т. 0,30 4,35 0,22 0,07 0,15 - т. - т. т. т. 13 p-Цимен 1020 1030,9 2,75 2,39 3,13 0,72 0,79 4,28 0,73 0,99 0,39 7,77 0,68 11,85 1,67 3,26 0,38 14 Лимонен 1024 1034,5 т. т. - - 0,18 - 2,13 т. 3,96 31,57 3,62 42,99 8,12 10,36 4,89 15 1,8-Цинеол 1026 1035,8 9,30 6,01 3,36 12,52 11,21 8,73 9,10 2,92 4,07 т. 11,30 т. 4,25 7,56 4,69 16 (Z)-β-Оцимен 1032 1039,8 ------т. - 2,06 2,53 1,84 17 н.и. 1049,6 - - т. - - т. т. 0,34 0,39 ------18 (E)-β-Оцимен 1044 1051,4 ------4,02 23,56 8,08 4,71 8,61 9,90 19 Бергамал 1051 1057,8 0,46 0,60 0,46 0,84 0,56 0,30 0,52 0,45 0,45 ------20 γ-Терпинен 1054 1063,5 1,27 0,86 1,23 0,35 0,66 6,21 0,65 0,48 0,47 т. т. 0,66 0,58 0,67 0,65 21 cis -Сабинен хидрат 1065 1072,8 5,98 3,42 5,51 0,21 0,85 3,88 1,92 1,11 2,65 0,15 0,12 0,19 0,90 1,02 0,16 22 cis -Линалол оксид 1067 1080,6 ------2,16 - 0,13 - 0,96 0,16 23 н.и. 1085,2 0,98 0,74 0,34 0,60 0,58 т. 0,59 0,68 0,78 - т. т. 0,18 т. т. 24 trans -Линалол оксид 1084 1093,7 ------0,40 1,31 0,13 - 0,19 0,35 0,24 25 Терпинолен 1086 1093,9 0,46 0,41 0,42 0,37 0,30 1,27 т. 0,22 - - т. 0,18 0,08 0,16 т. 26 Роузфуран 1091 1101,3 2,79 2,41 2,91 2,27 2,09 1,71 2,51 4,86 2,41 ------27 Линалол 1095 1103,9 ------11,99 1,52 2,45 1,75 4,91 2,44 28 1-Октен-3-ил-ацетат 1100 1114,4 ------0,34 - - - 29 Перилен 1102 1105,0 2,24 2,25 2,48 2,24 1,74 1,91 1,97 2,45 2,88 ------30 н.и. 1109,0 1,59 2,32 2,41 2,65 2,12 1,62 2,21 2,56 2,63 ------31 cis -Роузоксид 1106 1114,3 0,39 0,63 0,24 0,52 0,61 0,34 ------32 1,3,8-p-Ментатриен 1108 1125,5 ------0,07 0,15 - т. 0,03 33 дехидро-Сабинакетон 1117 1126,7 - - - - - 0,28 ------34 н.и. 1127,2 0,41 0,51 0,45 0,51 0,47 0,42 0,33 0,41 0,33 ------

Узорак (Локалитет/година) 5а/10 5б/10 5в/10 8а/10 8б/10 8в/10 9а/10 9б/10 9в/10 10а/10 10б/10 10в/10 11а/10 11б/10 11в/10 Компонента ХС фракције: КИЛ КИЕ % % % % % % % % % % % % % % % 35 α-Камфоленал 1122 1131,3 ------0,03 т. 0,09 36 н.и. 1133,6 ------0,40 0,16 0,10 т. 0,19 37 н.и. 1143,2 1,36 1,68 1,20 1,64 1,70 1,30 1,99 1,92 1,32 ------38 cis -p-Мента-2,8-диен-1-ол 1138 1144,8 - - - т. ------0,07 т. т. - 0,05 39 Камфор 1141 1148,6 0,49 0,47 0,85 0,47 0,38 0,78 - 0,97 0,76 т. 0,44 т. 0,83 0,61 1,62 40 trans -Хризантемал 1153,6 2,94 3,87 3,24 3,44 3,69 2,98 3,30 4,01 3,13 ------41 (Z)-Изоцитрал 1160 1167,6 1,23 1,59 1,07 1,38 1,37 0,47 1,39 1,37 1,21 ------42 Борнеол 1165 1170,7 - - 0,49 - - 0,53 ------т. - т. 43 Роузфуран епоксид 1173 1178,6 2,70 1,96 1,80 1,40 1,36 0,60 2,45 2,59 2,02 ------44 Терпинен-4-ол 1174 1181,9 - - т. - - 1,54 - - - - т. - т. - т. 45 (Е)-Изоцитрал 1177 1185,7 2,10 2,59 2,48 2,06 2,09 1,82 2,27 2,24 2,02 ------46 α-Терпинеол 1189 1197,1 - - - - - 0,15 ------т. - т. 47 н.и. 1199,8 0,90 1,67 1,09 1,12 0,89 0,53 0,55 0,39 0,44 - - т. - - - 48 н.и. 1211,7 0,17 т. 0,52 0,71 0,40 0,45 0,25 т. 0,37 ------49 н.и. 1214,2 т. ------т. - - - 0,08 50 cis -Сабинен хидрат ацетат 1219 1222,7 0,12 0,12 0,09 т. 0,13 0,11 0,14 0,15 0,13 ------51 Цитронелол 1223 1227,3 0,13 0,17 0,14 0,33 0,21 0,17 0,18 0,16 0,13 ------52 Нерол 1227 1234,2 0,65 1,41 0,53 1,02 1,63 1,79 1,42 0,86 0,75 - - т. - - - 53 Тимол метилетар 1232 1237,1 ------т. т. - 0,21 т. 54 Нерал 1235 1245,3 16,52 22,10 19,11 18,99 18,72 11,46 19,09 17,85 15,89 - - 0,23 - - - 55 Карвакрол метилетар 1241 1245,8 ------т. 0,28 т. т. т. 56 Гераниал 1264 1274,8 16,89 23,44 19,74 19,91 18,70 12,05 19,94 18,30 15,96 - - 0,49 - - - 57 3-Тујанол ацетат 1295 1300,6 0,36 0,38 - 1,06 0,63 0,17 - - 0,73 ------58 neoiso -Вербанол ацетат 1328 1334,7 - - - 0,11 т. - - - т. ------59 н.и. 1353,6 - т. 0,07 т. т. - - т. т. 0,07 0,09 т. 0,01 - 0,04 60 Нерилацетат 1359 1367,2 0,58 0,20 0,52 0,82 1,70 1,29 2,31 0,82 3,53 ------61 н.и. 1374,4 - т. т. 0,14 ------62 α-Копаен 1374 1379,1 0,12 т. 0,23 0,35 0,29 0,22 0,28 0,16 0,47 0,19 0,15 0,30 0,07 т. 0,09 63 Геранилацетат 1379 1386,5 0,52 0,06 т. т. т. 0,11 т. т. т. ------64 β-Бурбонен 1387 1388,3 1,70 0,81 0,99 3,59 1,85 2,14 1,40 1,22 2,10 1,92 0,84 2,14 0,61 0,88 0,40 65 β-Кубебен 1387 1392,8 т. - т. - - - - т. т. т. т. т. 0,14 0,24 0,13 66 (E)-Кариофилен 1417 1422,7 0,16 т. ------0,76 - т. 0,85 0,38 0,18 67 β-Иланген 1419 1422,7 т. - 0,08 0,41 0,11 0,12 0,08 0,06 0,15 т. 0,14 0,40 - - - 68 β-Копаен 1430 1432,6 0,07 т. 0,05 0,28 0,06 0,07 0,07 0,04 0,08 0,18 0,06 0,23 0,16 0,07 0,04 69 н.и. 1448,0 т. т. т. 0,10 т. т. т. т. т. - т. - т. - т. 70 α-Хумулен 1452 1457,5 ------0,02 - -

Узорак (Локалитет/година) 5а/10 5б/10 5в/10 8а/10 8б/10 8в/10 9а/10 9б/10 9в/10 10а/10 10б/10 10в/10 11а/10 11б/10 11в/10 Компонента ХС фракције: КИЛ КИЕ % % % % % % % % % % % % % % % 71 (E)-β-Фарнезен 1454 1458,6 - - - т. ------0,07 т. 0,15 72 allo -Аромадендрен 1458 1461,9 0,04 - - - - - т. т. - - 0,10 т. 0,12 0,18 т. 73 9-epi -(E)-Кариофилен 1464 1464,2 0,07 - - - - - т. т. - - 0,19 т. 0,20 0,35 0,44 74 γ-Муролен 1478 1479,7 т. - т. 0,05 - т. т. т. - - т. т. т. т. 0,04 75 Гермакрен D 1484 1484,7 0,12 - 0,06 0,33 т. 0,17 0,05 0,08 0,06 0,67 1,92 1,63 1,14 0,79 1,13 76 Бициклогермакрен 1500 1499,6 - - - т. ------0,30 - 0,15 0,28 0,22 77 β-Бисаболен 1505 1511,4 - 0,72 0,57 0,20 0,86 0,62 т. 0,23 0,43 ------78 γ-Кадинен 1513 1517,2 - - - т. ------т. - т. - 0,11 79 trans -Каламенен 1521 1526,4 ------т. т. 80 δ-Кадинен 1522 1526,4 - - т. т. т. т. - т. т. - т. - т. - 0,13 81 Кариофилен оксид 1582 1586,7 ------0,36 - - - - - 82 н.и. 1582,7 ------т. т. - 0,07 0,06 0,19 Идентификовано 94,58 93,07 93,91 92,53 93,84 95,68 94,06 93,71 93,73 99,93 99,51 99,84 99,64 99,94 99,50 Монотерпенски угљоводоници 9,20 5,31 12,20 4,57 3,79 26,01 5,69 6,08 9,54 74,97 82,24 86,44 88,15 77,29 83,13 Кисеонични монотерпени 65,93 73,08 64,55 68,75 67,11 52,87 67,99 60,64 58,66 15,61 13,57 3,77 7,96 15,63 9,45 Сесквитерпенски угљоводоници 2,27 1,53 1,97 5,20 3,17 3,34 1,88 1,79 3,29 3,73 3,70 4,70 3,53 3,16 3,05 Кисеонични сесквитерпени 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,36 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Остала једињења 17,17 13,15 15,18 14,01 19,77 13,46 18,50 25,20 22,24 5,26 0,00 4,92 0,00 3,86 3,87 Локалитет: 5, Вршачке планине – Ђаков врх; 8, Вршачке планине – Сочица; 9, Вршачке планине – кула; 10, Девојачки бунар; 11, Гребенац; а, б, в – са сваког локалитета одвојено су анализирани листови три јединке; %, релативни удео компоненте у ХС фракцији; КИЛ, литературни Ковачев индекс; KИЕ, експериментално одређен Ковачев идекс, израчунат као средња вредност индекса добијених за сваки узорак; н.и., неидентификована компонента; т., трагови; -, компонента није детектована.

6. Анализа корелација садржаја метала у листу и састава хедспејс фракција листа самониклог панонског тимијана – хемометријска анализа

Испитивањима у области биохемије и молекуларне биологије установљена је улога појединих хемијских елемената у биосинтези испарљивих биљних једињења. Двовалентни јони Mg 2+ , Ca 2+ , Mn 2+ , Fe 2+ , Zn 2+ и Cu 2+ делују инхибиторно на активност ензима еугенол синтазе 1 и изоеугенол синтазе 1 изолованих из петуније ( Petunia hybrida ) ( Koeduka и сар., 2006 ), док је присуство Fe 2+ као кофактора неопходно за синтезу 6-метил-5-хептен-2-она из ликопена (Vogel и сар., 2008 ). Пренил трансферазе и терпен синтазе, чијом активношћу настају терпенска једињења, такође захтевају присуство двовалентних металних јона као кофактора. Даље модификације терпенског молекула, реакцијама оксидације, дехидрогенације, редукције, изомеризације, такође се одигравају уз посредство ензима чији кофактори могу бити метали (Christianson, 2006 ; Тholl, 2006 ; Schwab и сар., 2008 ). Испарљиви састојци се из биљног материјала могу издвојити на различите начине: дестилацијом воденом паром, цеђењем, екстракцијом погодним растварачима или загревањем и њиховим ослобађањем у околну атмосферу (хедспејс екстракција). Веза између минералних материја и испарљиве фракције биљака углавном је посматрана кроз анализу етарског уља.

Са повећањем количине минералних материја (KCl, CaCl 2, MgCl 2) у подлози жалфије (Salvia officinalis L.), у етарском уљу повећевао се удео кисеоничних монотерпена, 1,8-цинеола, камфора, β-тујона и борнеола ( Tounekti и сар., 2010 ). Kanias и сар. (1998) су при испитивању садржаја елемената у траговима у херби и састава етарског уља различитих хемотипова Origanum vulgare L. установили негативну корелацију садржаја гвожђа, хрома и скандијума са садржајем карвакрола, а позитивну са садржајем тимола. Међутим, у другом истраживању, повезаност елементног састава хербе са варијабилношћу састава етарског уља Helichrysum italicum (Roth) G. Don. fil. ssp. italicum није била значајна ( Bianchini и сар., 2009 ) У поступку добијања етарског уља дестилацијом воденом паром могуће су промене у количини и саставу испарљиве фракције биљног материјала. Због релативно дугог загревања долази до губитка високо испарљивих једињења, а

могућа je и хидролитичкa и термолитичкa деградација једињења која се налазе у биљном материјалу. Сабинен хидрат и сабинен хидрат ацетат, на пример, се током дестилације воденом паром разграђују, па добијено етарско уље има мање количине ова два једињења, а веће количине продуката (терпинен-4-ола, γ- терпинена, α-терпинена и лимонена), у поређењу са садржајем у полазном биљном материјалу ( Richter и Schellenberg, 2007 ). Издвајањем испарљивих компоненти хедспејс екстракцијом, хемијске промене испарљивих једињења су незнатне, а остатак биљног материјала практично остаје непромењен у погледу садржаја и састава неиспарљивих једињења (или незнатно промењен услед загревања). Ово омогућава да се исти материјал подвргне даљим анализама, што је примењено у овом раду. У узорцима листа Th. pannonicus сакупљених 2010. на локалитетима 5 и 8– 11 у јужном Банату извршена је најпре анализа хедспејс фракције (Резултати и дискусија А.5 , Табела 20 ), а потом је у истим узорцима одређен садржај Cr, Co, Ni, Mo, Cu, Zn, Mn, Fe, Mg, Ca, K и Na ( Резултати и дискусија А.4 , Табела 19 ). Могућа веза садржаја елемената и биосинтезе испарљивих компоненти, као и груписање узорака на основу садржаја елемената и испарљивих компоненти, испитано је применом одговарајућих статистичких метода (корелациона анализа, анализа главних компоненти, кластерска анализа). Резултати корелационе анализе извршене на скупу података који се састојао од садржаја метала и састава ХС фракција дати су у прилогу (Прилог 2 – Табела 2 ). У Табели 21 приказан је део резултата који се односи на корелације између садржаја метала и састојака ХС фракција. Установљен je већи број статистички значајних корелација, од чега је око 10% (54) било између садржаја метала и релативног садржаја компоненти ХС фракција. Од анализираних метала, највећи број статистички значајних корелација установљен је између садржаја Zn и Mn са садржајем појединих састојака ХС фракција.

Табела 21. Корелациона матрица метала и компоненти хедспејс фракција

Метали : Cr Ni Mo Cu Zn Mn Fe Mg Ca K Na ХС компоненте: Трициклен -0,21 -0,04 0,09 0,43 -0,39 -0,30 -0,02 -0,22 0,08 -0,32 -0,23 α-Тујен 0,24 0,02 -0,10 -0,05 -0,44 -0,05 0,21 -0,45 -0,19 -0,12 -0,07 α-Пинен 0,01 0,08 0,38 0,33 -0,39 -0,32 -0,01 -0,11 0,10 -0,24 -0,21 Камфен -0,07 -0,02 0,09 0,52 * -0,28 -0,26 0,06 -0,41 -0,06 -0,39 -0,31 Сабинен 0,06 0,28 -0,38 0,46 -0,47 0,15 0,32 -0,44 -0,07 0,00 0,17 1-Октен-3-ол 0,22 -0,35 0,24 -0,46 0,72 * 0,10 -0,02 0,20 0,05 0,21 -0,06 β-Пинен 0,04 0,19 0,17 0,62 * -0,63 * -0,51 0,01 -0,37 0,13 -0,44 -0,28 3-Октанон 0,01 -0,03 0,36 -0,18 -0,66 * -0,39 -0,02 -0,01 0,18 -0,11 -0,21 6-Метил-5-хептен-3-он 0,00 -0,12 -0,24 -0,32 0,79 * 0,42 -0,11 0,22 -0,12 0,41 0,24 Мирцен 0,25 0,18 0,34 0,50 -0,63 * -0,46 0,04 -0,33 0,23 -0,44 -0,25 α-Феландрен 0,00 0,00 -0,26 -0,14 0,27 0,58 * 0,68 * 0,07 -0,06 -0,11 -0,11 α-Терпинен -0,03 -0,02 -0,35 -0,20 0,34 0,67 * 0,64 * 0,10 -0,13 -0,04 -0,01 p-Цимен -0,08 -0,11 -0,16 -0,44 -0,51 -0,05 0,17 -0,12 -0,15 0,10 -0,03 Лимонен -0,01 -0,08 0,06 -0,27 -0,60 * -0,35 0,05 -0,11 -0,03 -0,04 -0,19 1,8-Цинеол 0,02 0,54 * -0,10 0,47 0,26 0,24 0,29 0,53 * 0,24 -0,22 0,15 (Z)-β-Оцимен 0,52 * 0,37 0,49 0,47 -0,41 -0,31 0,08 -0,21 0,30 -0,41 -0,16 (E)-β-Оцимен -0,19 0,00 0,16 0,31 -0,51 -0,38 0,03 -0,19 0,01 -0,29 -0,27 Бергамал -0,11 0,09 -0,23 -0,12 0,58 * 0,31 -0,19 0,33 -0,05 0,29 0,29 γ-Терпинен 0,05 0,04 -0,32 -0,20 0,30 0,66 * 0,66 * 0,07 -0,13 -0,03 0,01 cis -Сабинен хидрат -0,09 -0,13 -0,63 * -0,33 0,39 0,77 * 0,00 -0,09 -0,41 0,49 0,51 * cis -Линалол оксид -0,15 -0,19 0,27 -0,01 -0,43 -0,24 -0,17 0,01 0,33 -0,13 -0,15 trans -Линалол оксид -0,09 -0,31 0,17 -0,10 -0,29 -0,22 -0,25 -0,05 0,15 -0,07 -0,20 Терпинолен -0,05 0,03 -0,34 -0,13 0,35 0,63 * 0,42 0,08 -0,12 0,06 0,15 Роузфуран -0,08 -0,23 -0,08 -0,28 0,65 * 0,28 -0,19 -0,02 -0,05 0,48 0,23 Линалол -0,14 -0,17 0,29 0,05 -0,55 * -0,33 -0,15 -0,06 0,30 -0,18 -0,19 1-Октен-3-ил-ацетат 0,09 0,06 -0,10 -0,40 -0,41 -0,21 0,20 -0,07 -0,25 0,08 -0,09 Перилен -0,08 -0,18 -0,35 -0,36 0,77 * 0,50 -0,17 0,12 -0,25 0,45 0,26 cis -Роузоксид -0,04 0,12 -0,28 -0,04 0,35 0,35 -0,08 0,44 -0,08 0,09 0,42 1,3,8-p-Ментатриен -0,10 0,01 -0,06 -0,24 -0,48 -0,29 0,17 -0,11 -0,25 -0,01 -0,17 дехидро-Сабинакетон 0,00 0,00 -0,26 -0,14 0,27 0,58 * 0,68 0,07 -0,06 -0,11 -0,11 α-Камфоленал 0,11 0,13 0,41 0,36 -0,25 -0,26 -0,06 -0,07 0,15 -0,20 -0,11 cis -p-Мента-2,8-диен-1-ол -0,34 -0,08 0,16 0,35 -0,24 -0,23 -0,06 -0,07 0,00 0,19 -0,20 Камфор 0,11 -0,17 0,32 0,18 0,19 -0,07 -0,20 -0,35 -0,10 -0,08 -0,22 (Z)-Изоцитрал -0,02 -0,04 -0,20 -0,23 0,66 * 0,34 -0,23 0,28 -0,04 0,42 0,40 Борнеол -0,37 -0,24 -0,39 -0,33 0,20 0,44 0,23 -0,12 -0,48 -0,16 -0,22 Роузфуран епоксид -0,01 -0,08 -0,23 -0,24 0,61 * 0,41 -0,18 0,11 -0,03 0,60 * 0,47 Терпиен-4-ол 0,00 0,00 -0,26 -0,14 0,27 0,58 * 0,68 0,07 -0,06 -0,11 -0,11 (E)-Изоцитрал -0,10 -0,11 -0,32 -0,33 0,70 * 0,49 -0,12 0,22 -0,17 0,40 0,35 α-Терпинеол 0,00 0,00 -0,26 -0,14 0,27 0,58 * 0,68 0,07 -0,06 -0,11 -0,11 cis -Сабинен хидрат ацетат 0,15 -0,25 -0,21 -0,45 0,81 * 0,54 * 0,08 0,23 -0,09 0,43 0,36 Цитронелол -0,12 0,16 -0,18 -0,06 0,56 * 0,29 -0,03 0,38 0,02 0,14 0,15 Нерол 0,08 0,07 -0,22 -0,24 0,70 * 0,55 * 0,32 0,51 * 0,06 0,11 0,26 Тимол метилетар 0,46 0,30 0,41 0,07 -0,27 -0,12 0,11 0,00 0,32 -0,26 -0,11 Нерал -0,09 -0,07 -0,27 -0,28 0,67 * 0,42 -0,17 0,27 -0,12 0,37 0,36 Карвакрол метилетар 0,09 0,06 -0,10 -0,40 0,41 -0,21 0,20 -0,07 -0,25 0,08 -0,09 Гераниал -0,10 -0,06 -0,28 -0,28 0,65 * 0,42 -0,17 0,26 -0,12 0,38 0,37 3-Тујанол ацетат 0,08 0,16 -0,23 0,01 0,51 0,15 -0,22 0,40 -0,13 0,08 0,07 neoiso -Вербанол ацетат -0,26 0,46 0,01 0,40 -0,10 -0,20 -0,17 0,12 0,14 -0,10 -0,15 Нерилацетат 0,21 -0,08 -0,24 -0,38 0,82 * 0,38 0,14 0,40 -0,21 0,08 -0,09 α-Копаен -0,17 -0,11 -0,29 -0,39 0,46 0,02 0,00 0,32 -0,41 -0,07 -0,41 Геранилaцетат 0,09 0,23 -0,42 0,10 0,11 0,58 * 0,16 0,05 0,05 0,59 * 0,70 * β-Буробонен -0,14 0,20 -0,25 -0,13 0,20 0,10 0,11 0,35 -0,05 0,05 -0,15 β-Кубебен 0,54 * 0,38 0,51 0,41 -0,40 -0,29 0,09 -0,17 0,33 -0,40 -0,16 (E)-Кариофилен 0,18 0,07 0,17 0,44 -0,46 -0,28 -0,07 -0,28 0,27 -0,23 -0,05 β-Иланген -0,20 0,21 -0,18 -0,15 -0,09 -0,21 0,09 0,13 -0,26 -0,10 -0,35

Метали : Cr Ni Mo Cu Zn Mn Fe Mg Ca K Na ХС компоненте: β-Копаен -0,13 0,34 -0,08 0,23 -0,45 -0,37 0,03 -0,02 0,02 -0,19 0,30 α-Хумулен 0,32 0,19 -0,07 0,51 * -0,19 -0,21 0,08 -0,41 -0,03 -0,26 -0,04 (E)-β-Фарнезен 0,14 0,15 0,38 0,41 -0,27 -0,27 -0,05 -0,20 0,14 -0,22 -0,11 allo -Аромадендрен 0,38 0,33 0,17 0,49 -0,38 -0,19 0,14 -0,27 0,20 -0,31 -0,06 9-epi -(E)-Кариофилен 0,28 0,29 0,49 0,50 -0,43 -0,29 0,03 -0,13 0,29 -0,33 -0,14 γ-Муролен -0,21 0,38 0,30 0,45 -0,21 -0,29 -0,20 0,14 0,22 -0,16 -0,19 Гермакрен D -0,09 0,10 0,13 0,31 -0,69 * -0,48 0,11 -0,29 -0,03 -0,30 -0,31 Бициклогермакрен 0,12 0,20 0,37 0,51 -0,43 -0,34 0,05 -0,19 0,20 -0,41 -0,24 β-Бисаболен 0,01 -0,39 -0,22 -0,50 0,70 * -0,33 -0,11 0,29 -0,41 -0,08 0,02 γ-Кадинен 0,00 0,07 0,44 0,21 -0,20 -0,20 -0,09 0,06 0,17 -0,12 -0,11 trans -Каламенен 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 δ-Кадинен 0,00 0,07 0,44 0,21 -0,20 -0,20 -0,09 0,06 0,17 -0,12 -0,11 Кариофилен оксид -0,34 -0,33 0,09 -0,05 -0,29 -0,17 -0,24 0,02 0,21 -0,01 -0,09 *Статистички значајне вредности Пирсоновог коефицијента за p=0,05 и N=15.

Резултати добијени корелационом анализом представљали су добар основ за анализу главних компоненти ( PCA ). Од скупова података који су анализирани, скуп вредности садржаја метала и релативног садржаја кисеоничних монотерена имао је главне компоненте ( PC ) у којима су метали имали високо оптерећење и били у позитивној или негативној корелацији са испарљивим једињењима листа панонског тимијана. Анализом eigen вредности матрице која се састојала од вредности садржаја метала и релативних садржаја кисеоничних монотерпена чији је садржај у бар једном узорку био најмање 5%, добијено је пет компоненти са eigen вредностима већим од 1. Са ових пет компоненти описано је 84,13% варијансе анализираног скупа података ( Табела 22 ).

Табела 22. Eigen вредности компоненти и проценат укупне варијансе скупа вредности садржаја метала и кисеоничних монотерпена описан главним компонентама

Компонента ( PC ) Eigen вредност Варијанса (%) Кумулативно (%)

1 4,69 31,27 31,27 2 3,14 20,94 52,21 3 1,90 12,67 64,88 4 1,53 10,19 75,07 5 1,36 9,06 84,13 6 0,72 4,80 88,93

Након Varimax ротације добијен је график простора ( Слика 3 ) у коме су у првој компоненти (PC 1) највеће оптерећење имали нерал, гераниал и Zn (0,905; 0,896 и 0,821 редом), а у другој (PC 2) Ni и 1,8-цинеол. У трећој компоненти ( PC 3) највеће оптерећење имали су негативно корелисани Mn и Mo, док су у четвртој компонети макроелементи K и Ca значајно доприносили варијабилности. Највеће оптерећење у петој компоненти имали су Fe и Cr у позитивној корелацији.

1.0 1,8-цинеол Ni Cu Mg .5 Fe нерал Ca гераниал Na Mn cis -сабинен хидрат PC 2 0.0 Zn Cr Mo K -.5

1.0 1.0 .5 .5 0.0 0.0 -.5 -.5 PC 1 PC 3 Слика 3. График оптерећења метала и кисеоничних монотерпена у прве три главне компоненте ( PC ) ротираног простора Пуним стрелицама је назначена позитивна, а испрекиданим стрелицама негативна корелација међу променљивама.

У првој главној компоненти овог скупа Zn, гераниал и нерал били су у значајној позитивној корелацији. Повезаност Zn и цитрала (смеше гераниала и нерала) уочена је и код врсте Cymbopogon flexuosus Steud. Watts. , где је фолијарна апликација Zn имала позитиван ефекат на повећање садржаја цитрала у етарском уљу ( Misra и Srivastava , 1991 ). Биосинтеза цитрала код Sweet Dany сорте босиљка ( Ocimum basilicum L.) подразумева конверзију геранил- пирoфосфата до гераниола активношћу гераниол синтазе ( geraniol synthase , GES ), и потом оксидацију гераниола до гераниала ( Iijima и сар., 2006 ). Оксидација се одиграва уз учешће гераниол дехидрогеназе ( geraniol dehydrogenase , GEDH ), ензима из групе цинамил-алкохол дехидрогеназа ( cinnamyl alcohol dehydrogenase , CAD ). Ова група ензима је део ензимске суперфамилије дехидрогеназа/редуктаза супстрата средњег ланца ( medium chain dehydrogenase/reductase , MDR ). MDR ензими се састоје од две субјединице, а свака субјединица као кофактор садржи два јона Zn ( Saito и сар., 2011 ). Узимајући у обзир да родови Thymus и Ocimum

припадају фамилији Lamiaceae, биосинтеза гераниала и нерала и код Th. pannonicus може имати сличан ток uz учешће Zn у реакцијама биосинтезе. Метали Ni и Mo су укључени у метаболизам азота ( Kabata и Kabata- Penidas, 2001 ), па њихово високо оптерећење у другој и трећој главној компоненти, редом, води ка претпоставци о повезаности метаболизма азота, испарљивих једињења и метала. На постојање такве везе наводе и прелиминарна испитивања утицаја монотерпена Th. serpyllum L. на нодулацију и раст детелине, биљке фиксатора азота ( Stewart и McKenna, 2001 ). Негативна корелација Mn и Mо по трећој главној компоненти у складу је са познатим антагонизмом ова два метала коме је узрок киселост земљишта. За разлику од већине метала, расположивост Mo у киселој средини значајно је смањена, док су

такви услови повољни за редукцију MnO 2 у земљишту до растворљивог и биорасположивог Mn 2+ (Kabata и Kabata-Penidas, 2001 ). Високо оптерећење манганом у трећој главној компоненти такође може указивати на његову повезаност са биосинтезом терпенских једињења. Изоловане монотерпен синтазe оригана, Origanum vulgare L. (Lamiaceae) у присуству Mn 2+ давале су смеше монотерпена, чији је састав одговарао испарљивој фракцији биљке ( Crocoll, 2011 ), па се и у случају Th. pannonicus присуство Mn може довести у везу са биосинтезом монотерпенских једињења. Даљом хемометријском анaлизом утврђено је још неколико корелација метала и испарљивих једињења панонског тимијана. Скуп вредности садржаја метала и једињења која су била одређена у сваком узорку: α-пинен, p-цимен, 1,8-цинеол, cis -сабинен хидрат и β-бурбонен, након Varimax ротације, дао је простор описан са шест главних компоненти eigen вредности веће од 1 ( Табела 23 ; Слика 4 ).

Табела 23. Eigen вредности компоненти и проценат укупне варијансе скупа вредности садржаја метала и једињења присутних у свим ХС фракцијама описан главним компонентама

Компонента ( PC ) Eigen вредност Варијанса (%) Кумулативно (%)

1 4,03 25,21 25,21 2 3,35 20,94 46,16 3 2,32 14,53 60,69 4 1,75 10,91 71,59 5 1,27 7,95 79,54 6 1,11 6,94 86,48

У првој главној компоненти ( PC 1) у математички ротираном простору највеће оптерећење имали су позитивно корелисани Ni и Cu; у другој (PC 2) cis - сабинен хидрат и Mn са високим позитивним, и Mo са високим негативним оптерећењем; у трећој главној компоненти ( PC 3) највеће оптерећење су имали 1,8-цинеол и Zn који су били у негативној корелацији са p-цименом; у четвртој компоненти доминантни су били β-бурбонен и Mg негативно корелисани са α- пиненом; у петој и шестој компоненти највеће оптерећење су имали K и Cr.

Mn 1.0 cis -сабинен хидрат

1,8-цинеол .5 Na K Zn Ni Mg Fe β-бурбонен PC 2 p-цимен 0.0 Cr α-пинен Cu

-.5 Ca

1.0 Mo 1.0 .5 .5 0.0 0.0 -.5 -.5 PC 1 PC 3 Слика 4. График оптерећења метала и једињења присутних у свим хедспејс фракцијама у прве три главне компоненте ( PC ) ротираног

простора

Пуним стрелицама је назначена позитивна, а испрекиданим стрелицама негативна корелација међу променљивама.

Антагонизам Mn и Mo у другој главној компоненти већ је уочен и PCA анализом метала и кисеоничних монотерпена, а могући узрок везе cis -сабинен хидрата и Mn може бити у биосинтетском путу овог монотерпена. Према

анализама ензимске активности сабинен хидрат синтазе изоловане из листа Majorana hortensis Moench. (Lamiaceae), конверзија супстрата геранилпирофосфата у цикличне алкохоле cis и trans -сабинен хидрат захтева присуство јона Mn 2+ или Mg 2+ (Hallachan и Croteau, 1988 ). Ова реакција је по типу слична превођењу геранилпирофосфата у гераниол, где је молекул воде донор OH групе. Ензим који врши ову конверзију, GES , код Sweet Dany сорте босиљка (Ocimum basilicum L.) као кофактор има јон Mn 2+ (Iijima и сар., 2004 ). Поред тога, према резултатима које је изнео Crocoll (2011 ) ензимска синтеза монотерпена код Origanum vulgare L. је Mn 2+ -завистан процес. Може се претпоставити да се слично одиграва и у листу панонског тимијана, узимајући у обзир сличности ензима фамилије Lamiaceae. За разлику од ензима као што је GES , чијом активношћу настаје једино гераниол, продукти терпен синтаза обично представљају смешу доминатног и неколико споредних једињења. Механизам биосинтезе сесквитерпенског угљоводоника β-бурбонена још увек није познат ( Dalton, 2011 ), нити су познати ензими укључени у његову синтезу. Crocoll (2011 ) je раније утврдио да је састав смеше сесквитерпена добијене активношћу изолованих синтаза оригана у присуству Mg 2+ одговарао сесквитерпенској фракцији биљке. Висок степен корелације садржаја β-бурбонена са садржајем Mg може указивати на постојање релативно кратког биосинтетског пута овог сесквитерпена, односно на постојање ензима чији је главни или једини производ каталитичког дејства ово једињење. Са Mg и β-бурбоненом негативно корелисан α-пинен, са друге стране, настаје као споредни производ већег броја монотерпен синтаза ( Wise и сар., 1998 ; Landmann и сар., 2007 ; Roeder и сар., 2007 ; Crocoll, 2011 ). Механизам биосинтезе 1,8-цинеола подразумева адицију воде на α- теринил катјон, настанак α-терпинеола, и потом циклизацију до 1,8-цинеола. Према досадашњим сазнањима, настанак овог једињења одиграва се активношћу 1,8-цинеол синтазе или α-терпинеол синтазе ( Fähnrich и сар., 2011 ). Ензимском катализом α-терпинеол синтазе изоловане из Th. caespititius Brot. није долазило до настанка 1,8-цинеола, или је настала количина била мања од нивоа детекције ( Lima и сар., 2013 ), па се, с обзиром на детектоване количине 1,8-цинеола и α-терпинеола у испитиваним ХС фракцијама, може претпоставити

да се код панонског тимијана синтеза овог једињења врши ензимом са активношћу 1,8-цинеол синтазе. Према доступној литератури, 1,8-цинеол синтазе су изоловане из више биљних врста ( Fähnrich и сар., 2014 ; Fähnrich и сар., 2012 ; Falara и сар., 2011 ; Roeder и сар., 2007 ; Shimada и сар., 2005 ; Chen и сар., 2003 ), укључујући и четири врсте фамилије Lamiaceae: Salvia officinalis L., S. fruticosa Mill., Rosmarinus officinalis L. и Lavandula x intermedia Emeric ex Loisel. ( Croteau и сар., 1994 ; Wise и сар., 1998 ; Kampranis и сар., 2007 ; Tan и Lin, 2004 ; Demissie и сар., 2012 ). Активност изолованих 1,8-цинеол синтаза in vitro захтева присуство двовалентних катјона, Mg 2+ или Mn 2+ , при чему је у неким случајевима повољнији утицај на ток реакције имао Mg 2+ (Roeder и сар., 2007 ), а у другим Mn 2+ (Croteau и сар., 1994 ; Chen и сар., 2003 ). Корелационом анализом у оквиру овог рада, утврђена је повезаност 1,8-цинеола са Mg ( Табела 21 ), што је у супротности са наведеним резултатима истраживања које спровео Crocoll (2011 ), где је профил монотерпенске фракције испарљивих једињења код O. vulgare постигнут уз присуство Mn 2+ . Са друге стране, за поједине терпен синтазе је утврђено да њихова активност зависи од Mg 2+ и Mn 2+ , и то тако да у зависности од присутног јона квалитативни састав смеше производа реакције није променљив, али квантитативни јесте ( Landmann и сар., 2007 ). PCA анализом садржаја метала и једињења присутних у свим ХС фракцијама панонског тимијана установљена је веза 1,8-цинеола са Zn, при чему се они налазе у негативној корелацији са p- цименом. Корелација Zn и кисeоничних терпена је уочена и код Helichrysum italicum ssp. italicum , али разлог овоме није утврђен ( Bianchini и сар., 2009 ). Поред тога, пут биосинтезе p-цимена и даље није до краја разјашњен. Сматрало се да ово једињење представља директан прекурсор монотерпенских фенола, тимола и карвакрола, али према резултатима Crocoll-a (2011 ), p-цимен настаје као споредни производ при синтези γ-терпинена услед прераног отпуштања супстрата из ензима и његове спонтане оксидације. γ-Терпинен, у чијој синтези учествује одговарајућа синтаза, се активношћу CYP 450 ензима оксидује до тимола и карвакрола. У узорцима панонског тимијана, утврђена је позитивна корелација γ-терпинена, Mg и Fe ( Табела 21 ). γ-Терпинен синтазе изоловане из Th. vulgaris , O. vulgare и Th. caespititius поред главног производа дају и смеше различитих монотерпена, углавном α-тујена, α-терпинена, мирцена, лимонeна,

α-терпинеола и др., при чему је максимална активност ензима in vitro постигнута или уз присуство Mg 2+ или уз присуство Mn 2+ (Alonso и Croteau, 1991 ; Crocoll, 2011 ; Lima и сар., 2013 ). Високи позитивни Пирсонови коефицијенти између γ- терпинена, α-терпинена, терпинолена, терпинен-4-ола и α-терпинеола код Th. pannonicus (Прилог 2 – Табела 2 ) могу указивати на заједнички пут настанка ових једињења преко ензима са активношћу Mg 2+ -зависне γ-терпинен синтазе, као и да је корелација са Fe у вези са присуством еквивалентне количине CYP ензима. Друга могућност која произилази из хемометријске анализе је да ова једињења настају као производи разлагања cis -сабинен хидрата in vivo који је примећен током развоја листа код неких врста ( Keszei и сар., 2010 ), а што може бити Fe-завистан процес. Однос између узорака листа панонског тимијана испитан је кластерском анализом састава ХС фракција, као и кластерском анализом садржаја метала у листу и састава ХС фракција. На основу састава ХС фракција испитивани узорци листа груписали су се у два кластера ( Слика 5 ): први су чинили узорци листа пореклом са Вршачких планина (локалитети 5, 8 и 9), који су у ХС фракцијама имали висок садржај цитрала, а други кластер су чинили узорци листа сакупљног у Девојачком бунару (локалитет 10 ) и Гребенцу (локалитет 11 ), са мирценом као главном компонентом, што је у складу са коментарима датим у поглављу Резултати и дискусија A.5 . Оваква подела узорака одговара Флори СР Србије ( Диклић, 1974 ), у којој се за разлику од Флоре Европе ( Jalas, 1972 ), Th. pannonicus (локалитети 5, 8 и 9) и Th. marschallianus (локалитети 10 и 11 ) не сматрају синонима, већ двема врстама. Са друге стране, испитивањима молекуларних маркера Sostaric и сар. (2012) нису установили диференцијацију ове две врсте.

Слика 5 . Груписање узорака листа Th. pannonicus на основу састава ХС фракција

Када су у кластерску анализу укључени и подаци о садржају метала у херби панонског тимијана испитиваној у овом раду, добијени су идентични дендрограми без обзира на то да ли су уврштена сва једињења ХС фракција, или само једињења из неке од класа (монотерпенски угљоводоници, кисеонични монотерпени, сесквитерпански угљоводоници, кисеонични сесквитерпени) (Слика 6 ). На дендрограму се уочавају две јасно одвојене гране, али овакво раздвајање узорака није у вези са географским пореклом узорака, као ни са таксономском поделом датој у Флори СР Србије, у којој су Th. pannonicus и Th. marschallianus дефинисани као одвојене врсте. Иако врло варијабилан, састав и садржај минералних материја је генетски контролисан ( Baxter и сар., 2012 ) и вероватно стабилнији од садржаја испарљивих компоненти, па је снажније утицао на груписање узорака листа панонског тимијана.

Слика 6 . Груписање узорака листа Th. pannonicus на основу састава ХС фракција (све идентификоване компоненте) и садржаја метала

7. Анализа етарскoг уља хербе самониклог панонског тимијана

Етарска уља (ЕУ) су изолована дестилацијом воденом паром из збирних узорака хербе панонског тимијана пореклом са природних станишта (локалитети 5, 8–11 , 12 , 14 и 15 ). Састав ЕУ је одређен гасном хроматогрaфијом и гасном хроматографијом – масеном спектрометријом.

7.1. Садржај етарског уља у херби самониклог панонског тимијана

Дестилацијом воденом паром хербе самониклог Th. pannonicus сакупљене 2011. добијено је 0,03–1,43% ( V/m ) етарског уља. (Слика 7 ). Најнижи садржај ЕУ одређен је у херби биљака са локалитета 12 , 14 и 15 на планинама у источној Србији које су биле у фази цветања (0,03–0,20 mL/100 g). Садржај ЕУ у херби сакупљеној у различитим фенофазама (пре, током и након цветања) у јужном Банату (локалитети 5 и 8–11 ) износио је 0,16–1,43

98 mL/100 g, при чему је највећи садржај ЕУ одређен у херби сакупљеној током цветања и износио је 0,33–1,43 mL/100 g, док је у периоду пре цветања и после цветања био 0,26–1,29 и 0,16–0,65 mL/100 g, редом.

1,60 1,43 1,40 1,29 1,20

1,00 0,94 Ф1 0,84 0,74 0,72 0,80 0,70 Ф2 0,65

0,60 0,53 0,53 0,49 Ф3 0,34 0,40 0,33 0,26 0,20 Принос ЕУ (mL/100 ПриносЕУ g) 0,16

0,20 0,10 0,03 0,00 5/11 8/11 9/11 10/11 11/11 12/11 14/11 15/11 Локалитет/година

Слика 7. Садржај етарског уља у херби самониклог Th. pannonicus сакупљеној у различитим фенофазама Локалитет: 5, Вршачке планине – Ђаков врх; 8, Вршачке планине – село Сочица; 9, Вршачке планине – кула; 10, Девојачки бунар; 11, Гребенац; 12, планина Стол код Бора – ливада; 14, планина Озрен; 15, планина Ртањ – село Врмџа. Фенофаза: Ф1, пре цветања; Ф2, током цветања; Ф3, након цветања.

У узорцима сакупљеним на локалитетима у јужном Банату у различитим фенофазама (локалитети 5 и 8–11 ), низак садржај ЕУ имала је херба сакупљена на локалитету 10 (Девојачки бунар) без обзира на фенофазу (0,16–0,33 mL/100 g), док је нешто виши садржај утврђен у херби са локалитета 11 (Гребенац) (0,34–0,74 mL/100 g). Херба сакупљена у различитим фенофазама на Вршачким планинама (локалитети 5, 8 и 9) у поређењу са узорцима сакупљеним и одговарајућим фенофазама на осталим локалитетима одликовала се вишим садржајем ЕУ који је износио 0,49–1,43 mL/100 g ЕУ. Слично резултатима добијеним у овом раду, и у испитивањима других аутора такође је забележена велика варијабилност у приносима етарског уља код ове биљне врсте (0,005–1,22%, V/m ) ( Pluhár и сар., 2007 ; Јia и сар., 2010 ). Одређени садржај ЕУ у херби панонског тимијана пореклом са Вршачких планина (локалитети 5, 8 и 9) у складу је са ранијим испитивањима хербе

панонског тимијана сакупљене на Вршачким планинама ( Živanović, 1974 ; Maksimović и сар., 2008 ).

7.2. Квалитативна и квантитативна анализа етарских уља

Резултати анализе хемијског састава ЕУ хербе самониклог Th. pannonicus сакупљене на Вршачким планинама на локалитетима 5, 8 и 9 приказани су у Табели 24 , пореклом са локалитета 10 (Девојачки бунар) и 11 (Гребенац) у Табели 25 , а са локалитета 12 (планина Стол код Бора), 14 (планина Озрен) и 15 (планина Ртањ) на планинама у источној Србији у Табели 26 . У анализираним ЕУ детектовано је укупно 343 једињења, од чега је 196 идентификовано чинећи 65,64–98,37% уља. Идентификована једињења су углавном терпени (монотерпенски угљоводоници, кисеонични монотерпени, сесквитерпенски угљоводоници, кисеонични монотерпени), а присутна су и једињења других класа као што су: виши алифатични угљоводоници, апокаротеноиди, фенилпропанска једињања или једињења која настају метаболизмом масних киселина. Једанаест од осамнаест испитиваних ЕУ хербе самониклог панонског тимијана као доминантну класу једињења садржавало је кисеоничне монотерпене (36,62–91,76%). Кисеонични сесквитерпени су били најзаступљенија класа у пет испитиваних уља (35,12–71,07%), а сесквитерпенски угљоводоници у два узорка (46,62% и 55,17%). Етарска уља хербе пореклом са Вршачких планина (локалитети 5, 8 и 9) била су међусобно сличног састава. Доминантна класа једињења у све три фенофазе били су кисеонични монотерпени који су чинили 81,10–91,76% ЕУ. Садржај монотерпенских угљоводоника био је до 1%, удео укупних сесквитерпена износио је 1,34–5,89%, док је садржај осталих класа једињења био 0,96–1,98% ( Табела 24 ). У свим ЕУ хербе пореклом са Вршачких планина, осим у ЕУ хербе сакупљене након цветања на локалитету 8 (Вршачке планине – село Сочица), најзаступљенија једињења били су монтерпенски изомерни алдехиди гераниал (24,28–42,74%) и нерал (19,99–31,88%). Уз висок садржај гераниала (21,04%) и

100

нерала (18,76%), у ЕУ хербе сакупљене након цветања на локалитету 8, у високом проценту јављају се гераниал диетилацетал (19,88%) и нерал диетилацетал (11,63%). Диетилацетали цитрала су се у значајном проценту налазили и у свим ЕУ хербе сакупљене у фази цветања на локалитетима 5, 8 и 9: нерал диетилацетал у количини 4,58–9,71%, а гераниал диетиацетал у количини 9,91–19,09%. Од кисеоничних монотерпена, поред гераниала и нерала, у свим ЕУ били су присутни и нерилацетат (2,26–5,76%) и нерол (1,77–4,34%), као и геранилацетат (0,66–5,13%) и гераниол (до 2,06%) Од сесквитерпена у ЕУ херби са локалитета 5, 8 и 9 у најзаступљенији су били β-бисаболен (0,34–2,28%) и ( Е)- неролидол (0,33–1,95%). Етарска уља хербе пореклом са Вршачких планина (локалитети 5, 8 и 9) одговарају раније описаном цитралном хемотипу који се карактерише високим уделом цитрала (смеше гераниала и нерала) ( Maksimović и сар., 2008 ). До сада, је постојање цитралног хемотипа панонског тимијана забележено само у Вршцу и околини, а с обзиром на садржај (0,49–1,43%, V/m ) и састав етарског уља (39,80– 74,62% цитрала), херба Th. pannonicus се може сматрати добрим извором цитрала. Садржај цитрала износио је 57,74–74,62% у ЕУ херби сакупљеним пре цветања, 44,26–65,51% током и 39,80–72,27% након периода цветања.

101

Табела 24. Састав етарских уља хербе Th. pannonicus сакупљене у различитим фенофазама на локалитетима 5, 8 и 9

Узорак (локалитет/година) и фенофаза 5/11 8/11 9/11 Ф1 Ф2 Ф3 Ф1 Ф2 Ф3 Ф1 Ф2 Ф3 Компоненте ЕУ КИЛ КИЕ % % % % % % % % % 1 α-Тујен 924 934,3 - т. ------2 α-Пинен 932 934,9 т. т. т. - - - т. - т. 3 Камфен 946 950,2 т. т. 0,04 т. - т. т. - т. 4 Сабинен 969 975,0 т. - т. ------5 1-Октен-3-он 972 978,3 ------т. 6 1-Октен-3-ол 974 978,4 0,34 0,35 0,67 0,40 0,38 0,38 0,44 0,43 0,52 7 3-Октанон 979 987,4 - - т. т. - - - - т. 8 6-Метил-5-хептен-2-он 981 988,3 0,87 0,44 0,70 0,85 0,40 0,49 1,23 0,34 0,50 9 Мирцен 988 991,8 - - т. - - т. - - - 10 3-Октанол 988 996,5 т. т. 0,24 т. - т. 0,09 - 0,42 11 2,4-(E,E)-Хептадиенал 1005 1012,1 - - 0,04 - - - - - т. 12 α-Терпинен 1014 1018,3 - - т. ------13 p-Цимен 1020 1025,7 т. т. 0,40 т. т. 0,11 0,32 т. т. 14 Лимонен 1024 1029,7 т. т. 0,09 т. - 0,10 0,29 - т. 15 1,8-Цинеол 1026 1032,6 0,09 0,08 0,49 0,15 т. 0,20 0,22 т. 0,11 16 Бергамал 1051 1053,7 т. т. 0,06 т. - т. т. - т. 17 γ-Терпинен 1054 1059,2 т. - 0,12 - - т. - - т. 18 cis -Сабинен хидрат 1065 1068,5 0,68 0,58 1,12 0,37 0,76 0,63 0,33 0,14 0,23 19 Терпинолен 1086 1089,8 - - 0,05 - - т. - - т. 20 Роузфуран 1091 1098,2 т. 0,06 0,16 - - 0,11 т. 0,07 0,16 21 Линалол 1095 1101,6 0,25 0,23 0,71 0,90 0,52 2,11 0,40 0,10 0,33 22 Перилен 1102 1102,6 т. 0,04 0,12 - - - т. 0,04 0,08 23 n-Нонанал 1100 1105,2 0,05 0,11 0,21 т. т. 0,17 0,09 0,05 0,16 24 cis -Роузоксид 1106 1112,2 - - 0,06 - - - т. - т. 25 p-Мент-2-en-1-ол ‡ 1118 1123,4 т. - 0,09 - - - т. - 0,02 26 trans -Роузоксид 1122 1128,2 - - т. - - - - - т. 27 α-Камфоленал 1122 1128,0 - - т. ------28 exo -Изоцитрал 1140 1145,7 0,22 0,19 0,32 0,20 0,17 0,17 0,19 0,31 0,26 29 Камфор 1141 1146,7 0,17 0,19 0,32 0,14 0,07 0,17 0,12 0,09 0,26 30 trans -Хризантемал 1153 1151,5 0,34 0,64 0,86 0,22 0,43 0,69 0,23 0,48 0,85 31 Цитронелал 1148 1153,7 0,12 т. 0,05 т. - - 0,13 т. 0,04

102

Узорак (локалитет/година) и фенофаза 5/11 8/11 9/11 Ф1 Ф2 Ф3 Ф1 Ф2 Ф3 Ф1 Ф2 Ф3 Компоненте ЕУ КИЛ КИЕ % % % % % % % % % 32 Неролоксид 1154 1155,4 т. - 0,10 - - 0,10 - - 0,09 33 (Z)-Изоцитрал 1160 1165,6 0,58 0,65 1,17 0,39 0,49 0,85 0,38 0,93 1,07 34 Борнеол 1165 1168,8 т. т. 0,38 0,21 - 0,24 - т. 0,10 35 Роузфуран епоксид 1173 1176,5 0,31 0,36 0,61 т. 0,23 0,53 0,15 0,31 0,44 36 Терпинен-4-ол 1174 1179,7 0,15 0,17 1,15 0,14 0,27 0,42 0,56 т. 0,19 37 (E)-Изоцитрал 1177 1184,2 0,92 1,06 1,77 0,64 0,95 1,34 0,71 1,39 1,69 38 α-Терпинеол 1186 1193,1 т. 0,14 0,23 т. 0,17 0,21 0,14 0,09 0,19 39 Метилсалицилат 1190 1196,5 т. т. т. - 0,09 т. - 0,14 - 40 n-Деканал 1201 1206,6 т. 0,06 0,14 т. - 0,11 т. т. 0,10 41 Вербенон 1204 1220,9 т. т. 0,05 т. - - т. т. 0,11 42 Цитронелол 1223 1225,3 т. т. т. 0,19 - - 0,14 0,10 0,02 43 Нерол 1227 1235,5 2,41 2,61 2,12 3,67 3,95 4,34 1,77 1,79 2,73 44 Нерал 1235 1251,5 31,88 21,70 30,78 24,56 19,99 18,76 29,37 28,51 30,34 45 Гераниол 1249 1260,8 1,05 0,13 0,25 2,06 0,38 0,13 1,94 0,07 0,28 46 Пиперитон 1249 1259,7 0,41 0,13 0,25 1,09 0,38 0,13 0,96 0,07 0,16 47 Гераниал 1264 1283,1 42,74 25,60 41,49 33,18 24,28 21,04 39,32 37,00 41,67 48 Нерилформат 1280 1285,4 0,13 0,09 - 0,35 0,22 - 0,10 0,09 - 49 Борнилацетат 1287 1288,8 ------т. - 50 Дихидроедулан I 1289 1293,0 т. - т. т. - - 0,06 - - 51 Тимол 1289 1296,6 - - т. - 0,86 - - - т. 52 3-Тујанол ацетат 1295 1302,5 - - 0,08 - - 0,22 - - 0,26 53 Карвакрол 1298 1305,8 - - т. ------54 Геранилформат 1298 1305,4 т. - - 0,30 - - 0,21 - - 55 Метилгеранат 1322 1325,9 - т. т. ------56 Цитронелилацетат 1350 1355,3 т. - 0,05 т. - - т. - 0,15 57 Етилнеролат 1351 1355,8 - 0,18 т. - т. 0,22 - т. - 58 Еугенол 1356 1361,1 т. - т. - т. - т. - т. 59 Нерилацетат 1359 1368,0 2,40 3,39 2,26 4,00 3,56 3,39 3,00 2,93 5,76 60 Геранска/неранска киселина ‡ 1355 1375,4 2,71 1,02 - 1,16 0,58 т. 1,05 0,73 - 61 α-Копаен 1374 1379,4 - 0,03 - - т. - - 0,03 62 Геранилацетат 1379 1386,9 3,02 0,79 4,17 6,44 0,66 1,39 5,13 0,74 1,61 63 β-Бурбонен 1387 1388,5 т. 0,24 т. - 0,48 0,45 т. 0,14 0,64 64 β-Елемен 1389 1395,2 т. т. - т. - т. т. - т.

103

Узорак (локалитет/година) и фенофаза 5/11 8/11 9/11 Ф1 Ф2 Ф3 Ф1 Ф2 Ф3 Ф1 Ф2 Ф3 Компоненте ЕУ КИЛ КИЕ % % % % % % % % % 65 Етилгеранат 1394 1398,0 т. 0,48 - - 0,39 0,68 - 0,10 - 66 Нерал диетилацетал н. 1422,5 0,30 9,71 0,21 0,30 9,49 11,63 0,18 4,58 - 67 β-Иланген 1419 1422,5 ------0,15 68 (E)-Кариофилен 1417 1423,0 0,05 - - - - - 0,07 - - 69 Геранска/неранска киселина ‡ 1374 1433,8 0,02 0,02 - т. - - - - - 70 β-Копаен 1430 1432,6 - т. 0,15 0,08 0,09 0,08 - - 0,18 71 Гераниал диетилацетал н. 1444,5 0,63 18,57 0,21 0,42 19,07 19,88 0,39 9,91 т. 72 Геранилацетон 1453 1455,6 т. т. 0,05 - - 0,09 - - т. 73 (E)-β-Фарнезен 1454 1458,7 - - - - 0,33 - - - - 74 allo -Аромадендрен 1458 1463,0 - т. - - - - 0,11 т. 0,16 75 9-epi -(E)-Кариофилен 1464 1464,7 - т. т. - - - 0,09 - 0,10 76 γ-Муролен 1478 1480,3 - - т. - - т. - - - 77 Гермакрен D 1484 1485,0 - - 0,21 - 0,80 0,26 - - 0,21 78 (E)-β-Јонон 1487 1488,9 т. - т. т. - т. т. - т. 79 (E)-5,6-Епокси-β-јонон 1488 1488,9 т. - т. т. - т. т. - т. 80 β-Бисаболен 1505 1511,1 0,59 0,44 0,46 2,28 1,17 0,63 0,35 0,48 0,34 81 γ-Кадинен 1513 1523,8 - - - - т. т. - - т. 82 Кубебол 1514 1518,8 ------т. 83 δ-Кадинен 1522 1526,1 т. т. т. т. - - - т. т. 84 1-nor -Бурбонанон 1561 1565,1 т. - 0,06 - - - - - т. 85 (E)-Неролидол 1561 1566,8 - - - 1,49 1,95 0,33 - - - 86 1,5-Епоксисалвиал-4(14)-ен 1564 1570,3 т. - т. т. - т. 0,08 - т. 87 Спатуленол 1577 1582,0 0,16 0,27 0,19 т. - 0,22 0,36 0,55 0,73 88 Кариофилен оксид 1582 1587,3 0,17 0,31 0,15 0,22 т. 0,57 0,35 т. 0,23 89 β-Копаен-4-α-ол 1590 1591,9 т. т. 0,04 т. - т. - т. 0,09 90 Салвиал-4(14)-ен-1-он 1594 1597,4 т. т. т. - - т. - - т. 91 β-Оплопенон 1607 1612,3 ------т. 92 Хумуленепоксид II 1608 1614,1 - - - т. - - - - - 93 β-Атлантол 1608 1615,1 - т. ------2-Метилен -6,8,8 -триметил - 94 трицикло[5,2,2,0 (1,6) ]ундекан-3-ол н. 1615,7 т. - 0,07 т. - - - - 0,13 95 nor -Копанон 1620 1626,2 - - т. - - - - - т. 96 Изоспатуленол 1641 1633,1 - - т. - - - 0,08 - 0,09

104

Узорак (локалитет/година) и фенофаза 5/11 8/11 9/11 Ф1 Ф2 Ф3 Ф1 Ф2 Ф3 Ф1 Ф2 Ф3 Компоненте ЕУ КИЛ КИЕ % % % % % % % % % 97 epi -α-Кадинол 1638 1643,7 ------0,09 98 epi -α-Муролол 1640 1645,9 т. - - т. - - т. - 0,05 99 α-Кадинол 1652 1658,3 0,16 0,13 т. 0,25 0,22 0,13 0,09 0,08 0,14 100 14-Хидрокси-9-epi -(E)-кариофилен 1668 1675,0 т. - т. - т. - - - - 101 Гермакра-4(15),5,10(14)-триен-1-α-ол 1685 1688,8 т. 0,12 0,26 0,13 0,27 0,21 т. 0,19 0,41 102 Изобициклогермакренал 1733 1743,6 - - т. - - т. - - т. 103 14-Окси-α-муролен 1767 1775,1 - - - - - т. - - т. 104 14-Хидрокси-α-муролен 1779 1780,0 т. - т. 0,11 - - - - т. 105 14-Хидрокси-δ-кадинен 1803 1806,1 т. - т. т. 0,22 - - - т. 106 Хексахидрофарнезилацетон 1845 1845,2 - - т. - - - - - т. 107 Платамбин 1867 1861,1 0,22 т. - 0,56 0,36 - 0,22 0,14 - 108 (E,E)-Гераниллиналол 2026 2028,4 - - - - 0,16 - - - - 109 γ-Палмитолактон 2106 2083,7 - - - - т. - - - - 110 Трикозан 2300 2273,3 - т. - - - т. - - - 111 Тетракозан 2400 2357,8 - 0,12 - - - т. - - - 112 Пентакозан 2500 2439,2 - 0,03 - т. - т. - т. - 113 Хексакозан 2600 2516,9 - т. - - - т. - т. - 114 Хептакозан 2700 2592,4 т. 0,09 - т. т. - т. т. - 115 Октакозан 2800 2664,8 - т. ------116 Нонанкозан 2900 2735,8 т. 0,08 - т. т. т. т. т. - 117 Хентриаконтан 3100 2873,5 - - - - - т. - - - Идентификовано 94,12 91,59 96,09 87,48 94,78 93,93 91,42 93,13 94,66 Монотерпенски угљоводоници т. т. 0,71 т. т. 0,22 0,61 т. т. Кисеонични монотерпени 91,51 88,87 91,76 81,10 87,86 89,71 87,12 90,59 89,31 Сесквитерпенски угљоводоници 0,64 0,69 0,85 2,36 2,87 1,42 0,62 0,62 1,81 Кисеонични сесквитерпени 0,71 0,81 0,79 2,76 3,02 1,46 1,17 0,96 1,95 Остала једињења 1,26 1,21 1,98 1,25 1,03 1,13 1,90 0,96 1,60 Локалитет: 5, Вршачке планине – Ђаков врх; 8, Вршачке планине – село Сочица; 9, Вршачке планине – кула. Фенофаза: Ф1, пре цветања; Ф2, током цветања; Ф3, након цветања. %, релативни удео компоненте у етарском уљу; КИЛ, литературни Ковачев индекс; КИЕ, експериментално одређен Ковачев индекс, израчунат као средња вредност индекса добијених за сваки узорак; ‡, тачан изомер није одређен; н., литературни Ковачев индекс није доступан; т, трагови; -, компонента није детектована.

105

За разлику од ЕУ узорака пореклом са Вршачких планина, у етарским уљима хербе сакупљене у свим фенофазама на друга два локалитета у јужном Банату, у Девојачком бунару (локалитет 10 ) и Гребенцу (локалитет 11 ), доминантна су била сесквитерпенска једињења (45,36–88,21%), осим у ЕУ хербе пореклом из Гребенца сакупљене током цветања, у коме су сесквитерпени (45,22%) и оксидовани монотерпени (46,92%) били заступљени у сличном проценту ( Табела 25 ). У ЕУ хербе пореклом из Девојачког бунара (локалитет 10 ) сакупљене пре цветања преовлађивали су кисеонични сесквитерпени са 41,87%, док су сесквитерпенски угљоводоници били заступљени са 3,48%. Најзаступљенија једињења у овом уљу били су спатуленол (18,29%), кариофиленоксид (8,61%) и хексадеканска киселина (8,23%). Од монотерпенских једињења, која су чинила 9,58% ЕУ, најзаступљенији је био α-пинен са 2,90%. У ЕУ хербе са локалитета 10 сабране у фази цветања преовлађивали су и даље кисеонични сесквитерпени (50,98%), а у значајној количини заступљени су и сесквитерпенски угљоводоници (26,65%). Након цветања однос ових класа једињења у ЕУ био је обрнут (25,80% кисеоничних сесквитерпена и 55,17% сесквитерпенских угљоводоника). У ЕУ хербе сакупљене у фази цветања доминантна једињења била су спатуленол (16,78%), epi -α-кадинол (14,38%), гермакрен D (8,11%), кариофилен оксид (6,64%) и ( Е)-кариофилен (6,55%). Монотерпенска једињења су била заступљена са 3,18%, а једињења осталих класа са 2,08%, од чега је 1,10% чинила хексадеканска киселина. Након цветања у ЕУ хербе са локалитета 10 преовлађивао је гермакрен D (31,87%), а у значајним количинама су се налазила и друга сесквитерпенска једињења: спатуленол (11,91%), бициклогермакрен (7,46%), гермакра- 4(15),5,10(14)-триен-1-α-ол (5,31%) и β-бурбонен (4,90%). У етарским уљима хербе пореклом из Гребенца (локалитет 11 ) сакупљене пре и после периода цветања доминантна класа једињења били су кисеонични сесквитерпени (53,18% и 71,07%, редом), док су у уљу хербе сабране за време цветања најзаступљенији били кисеонични монотерпени (46,92%). У ЕУ хербе сакупљене пре цветања најзаступљенија једињења били су кариофилен оксид (12,94%), спатуленол (11,99%), ( Е)-неролидол (8,35%) и α- кадинол (4,89%). Поред овога, уље је садржавало 9,55% монотерпенских

106

угљоводоника, од чега је 4,71% чинио α-пинен, затим 1,31% кисеоничних монотерпена и 3,82% једињења осталих класа. У ЕУ хербе сакупљене на локалитету 11 у фази након цветања преовлађивали су ( Е)-неролидол (20,33%), спатуленол (13,41%), α-кадинол (6,46%), гермакрен D (5,98%) и кариофилен оксид (5,52%). Монотерпенска једињења чинила су 3,40%, а једињења осталих класа 0,68% уља. Карактеристичан састојак ЕУ хербе из Гребенца (локалитет 11 ) сакупљене током цветања био је тимол (37,95%), који је у осталим узорцима углавном присутан у врло малој количини, а у неким чак није ни детектован. Сесквитерпенска једињења чинила су укупно 45,22% уља, а међу њима најзаступљнији били су гермакрен D (8,21%) и његов оксидовани дериват, гермакрен D-4-ол (7,77%).

107

Табела 25. Састав етарских уља хербе Th. pannonicus сакупљене у различитим фенофазама на локалитетима 10 и 11

Узорак (локалитет/година) и фенофаза 10/11 11/11 Ф1 Ф2 Ф3 Ф1 Ф2 Ф3 Компоненте ЕУ КИЛ КИЕ % % % % % % 1 α-Тујен 924 928,1 - - т. - 0,11 - 2 α-Пинен 932 935,1 2,90 0,29 0,54 4,71 0,14 0,15 3 Камфен 946 950,3 0,83 0,21 0,50 0,34 0,11 0,13 4 Сабинен 969 975,5 т. - 0,16 - т. - 5 1-Октен-3-ол 974 978,7 - 0,07 0,26 т. 0,73 0,20 6 β-Пинен 974 979,5 0,93 0,15 0,26 0,41 - - 7 3-Октанон 979 987,0 т. 0,03 0,12 - 0,07 т. 8 Мирцен 988 992,2 0,31 0,42 1,27 0,86 0,65 0,31 9 3-Октанол 988 996,5 т. т. т. - 0,07 0,10 10 α-Терпинен 1014 1011,5 - - т. - 0,16 - 11 p-Цимен 1020 1026,1 0,54 т. 0,15 0,72 1,63 0,19 12 Лимонен 1024 1030,2 1,00 0,53 1,33 2,51 0,26 0,29 13 1,8-Цинеол 1026 1033,1 0,36 0,15 0,46 0,41 0,61 0,18 14 (Z)-β-Оцимен 1032 1037,6 - - 0,29 - 0,08 т. 15 (E)-β-Оцимен 1044 1048,4 - 0,20 2,35 - 1,03 0,46 16 γ-Терпинен 1054 1059,8 - - 0,13 - 0,81 т. 17 cis -Сабинен хидрат 1065 1068,5 - т. 0,12 - 0,49 т. 18 n-Октанол 1063 1069,8 - - 0,04 - - т. 19 Терпинолен 1086 1090,5 - - т. - т. - 20 Роузфуран 1091 1097,8 - 0,05 - - - - 21 Линалол 1095 1102,2 0,83 0,79 1,96 0,39 0,81 0,64 22 n-Нонанал 1100 1105,5 - т. т. - 0,06 т. 23 p-Мент-2-ен-1-ол ‡ 1118 1123,6 - - т. - - - 24 3-Октанолацетат 1120 1124,4 - - - - 0,06 - 25 α-Камфоленал 1122 1128,2 0,42 - т. т. - т. 26 Камфор 1141 1147,1 1,47 0,20 0,52 0,51 0,11 0,36 27 (Z)-Изоцитрал 1160 1157,8 - - т. - - - 28 Борнеол 1165 1168,6 - - - - 1,73 т. 29 Терпинен-4-ол 1174 1179,4 - т. т. - 0,34 т. 30 α-Терпинеол 1186 1192,9 - т. 0,16 - 0,12 т. 31 Метилсалицилат 1190 1197,0 - - т. - 0,04 т.

108

Узорак (локалитет/година) и фенофаза 10/11 11/11 Ф1 Ф2 Ф3 Ф1 Ф2 Ф3 Компоненте ЕУ КИЛ КИЕ % % % % % % 32 cis -Дихидрокарвон 1191 1199,1 - - т. - - т. 33 γ-Терпинеол 1199 1199,9 - - - - 0,10 - 34 n-Деканал 1201 1206,5 - - т. - - т. 35 trans -Дихидрокарвон 1200 1206,8 - - - - т. т. 36 (E,E)-2,6-Диметил-3,5,7-октатриен-2-ол 1209 1209,6 - 0,18 0,17 - - т. 37 Вербенон 1204 1212,4 т. - т. - - т. 38 Тимол метилетар 1232 1236,6 - - т. - 2,14 т. 39 Нерал 1235 1242,3 - - т. - - т. 40 Карвон 1239 1246,5 т. - т. - - - 41 Карвакрол метилетар 1241 1246,3 т. - т. - 2,27 т. 42 Гераниол 1249 1255,6 - - т. - - - 43 Пиперитон 1249 1256,7 - - т. - - - 44 Гераниал 1264 1271,0 - - т. - - т. 45 n-Деканол 1266 1272,2 - - - - - 0,15 46 Нерилформат 1280 1283,8 т. - - - - - 47 Борнилацетат 1287 1287,7 - - т. - - т. 48 Дихидроедулан I 1289 1291,1 - - т. - т. - 49 Тимол 1289 1298,5 - - т. - 37,95 0,53 50 Карвакрол 1298 1307,0 - - т. - 0,18 - 51 α-Кубебен 1345 1353,2 - - - - 0,07 - 52 Тимол ацетат 1349 1357,2 - - - - 0,07 - 53 Еугенол 1356 1360,7 - - т. - т. - 54 α-Копаен 1374 1378,7 т. т. 0,33 т. 0,11 т. 55 β-Бурбонен 1387 1389,0 2,22 1,18 4,90 2,66 0,36 2,50 56 β-Кубебен 1387 1392,8 - 0,08 0,45 0,10 0,06 т. 57 β-Елемен 1389 1394,9 0,64 0,41 0,82 0,51 0,20 0,30 58 α-Гурјунен 1409 1409,1 - т. - - 0,04 - 59 β-Иланген 1419 1422,3 т. - - - - 0,63 60 (E)-Кариофилен 1417 1424,0 - 6,55 3,77 2,02 1,52 0,63 61 β-Копаен 1430 1432,4 т. 0,31 1,03 т. 0,19 0,44 62 α-trans -Бергамотен 1432 1437,9 - т. - - 0,08 - 63 Аромадендрен 1439 1443,9 т. т. т. т. 0,24 0,33 64 cis -Мурола-3,5-диен 1448 1449,3 - - 0,46 - 0,09 0,02

109

Узорак (локалитет/година) и фенофаза 10/11 11/11 Ф1 Ф2 Ф3 Ф1 Ф2 Ф3 Компоненте ЕУ КИЛ КИЕ % % % % % % 65 trans -Мурола-3,5-диен 1450 1454,1 - - - - 0,05 - 66 Геранилацетон 1453 1454,6 т. 0,16 - - - 0,20 67 α-Хумулен 1452 1457,2 - 0,41 0,45 - 0,08 0,18 68 (E)-β-Фарнезен 1454 1460,2 т. 1,35 1,19 1,75 1,95 0,66 69 allo -Аромадендрен 1458 1461,9 т. 1,11 - 0,95 0,34 0,34 70 9-epi -(E)-Кариофилен 1464 1464,4 0,63 0,60 - 1,36 1,10 0,40 71 cis -Мурола-4(14),5-диен 1465 1468,6 - т. т. - 0,06 т. 72 Даука-5,8-диен 1471 1469,5 - т. - - - т. 73 γ-Муролен 1478 1481,0 - т. - т. 0,48 т. 74 Гермакрен D 1484 1488,7 т. 8,11 31,87 - 8,21 5,98 75 (E)-β-Јонон 1487 1488,7 0,29 т. - - - т. 76 (E)-5,6-Епокси-β-јонон 1488 1489,1 0,29 - - - - - 77 β-Селинен 1489 1491,0 - - - - 0,14 т. 78 cis -β-Гвајен 1492 1493,9 - - - - 0,13 - 79 trans -Мурола-4(14),5-диен 1493 1498,3 - - - - 0,09 - 80 Бициклогермакрен 1500 1503,9 - 1,48 7,46 - 3,82 2,11 81 α-Муролен 1500 1503,2 - т. - т. 0,31 т. 82 Премнаспиродиен 1505 1507,8 - - - - 0,12 0,19 83 (E,E)-α-Фарнезен 1505 1511,7 - 0,37 0,79 - 3,33 т. 84 β-Бисаболен 1505 1512,1 - 0,77 - 4,10 1,29 1,03 85 Гермакрен A 1508 1516,7 - - 0,63 - - - 86 γ-Кадинен 1513 1518,8 - 2,85 0,22 0,54 0,68 0,35 87 Кубебол 1514 1520,2 т. - 0,18 0,24 - 0,26 88 endo -1-Бурбонанол 1518 1522,1 - - 0,08 - 0,20 0,36 89 trans -Каламенен 1521 1526,1 т. 1,06 - 0,78 - 1,03 90 δ-Кадинен 1522 1529,1 - - 0,81 - 2,44 т. 91 10-epi -Кубебол 1533 1535,7 - - т. - 0,05 т. 92 trans -Кадина-1,4-диен 1533 1537,0 - - - - 0,10 - 93 α-Кадинен 1537 1541,4 - т. т. т. 0,12 т. 94 1-nor -Бурбонанон 1561 1566,5 т. - т. - - 1,09 95 (E)-Неролидол 1561 1571,3 - - - 8,35 0,48 20,33 96 1,5-Епоксисалвиал-4(14)-ен 1564 1571,6 т. 0,66 0,94 - - - 97 Гермакрен D-4-ол 1574 1588,1 - - т. - 7,77 1,80

110

Узорак (локалитет/година) и фенофаза 10/11 11/11 Ф1 Ф2 Ф3 Ф1 Ф2 Ф3 Компоненте ЕУ КИЛ КИЕ % % % % % % 98 Спатуленол 1577 1588,5 18,29 16,78 11,91 11,99 0,73 13,41 99 Кариофилен оксид 1582 1591,9 8,61 6,64 т. 12,94 0,39 5,52 100 β-Копаен-4-α-ол 1590 1594,8 0,46 - 1,63 т. - т. 101 Виридифлорол 1592 1597,1 0,40 0,25 - 0,41 0,21 - 102 Салвиал-4(14)-ен-1-он 1594 1600,3 0,92 0,55 1,40 0,67 0,04 1,91 103 β-Оплопенон 1607 1615,1 - - - - 0,06 1,78 104 Хумулен епоксид II 1608 1614,4 0,60 0,74 - 1,31 - 0,57 105 β-Атлантол 1608 1615,2 - - - 0,92 0,06 - 106 2-Метилен-6,8,8-триметил-трицикло[5.2.2.0 (1,6) ]ундекан-3-ол н. 1618,5 2,25 0,45 0,97 - - 1,14 107 1,10-di-epi -Кубенол 1618 1621,0 - 1,93 0,14 1,13 0,15 1,28 108 nor -Копанон 1620 1628,8 0,48 т. 0,30 т. - 0,62 109 1-epi -Кубенол 1627 1632,8 - - - - 0,10 - 110 Кариофила-4(12),8(13)-диен-5-ол ‡ 1639 1643,8 - - 0,27 - - 0,69 111 Изоспатуленол 1641 1644,3 - - - - 0,13 - 112 epi -α-Кадинол 1638 1647,4 - 14,38 0,89 0,48 0,43 1,34 113 epi -α-Муролол 1640 1647,4 0,96 - 0,42 0,48 1,06 0,58 114 α-Муролол 1644 1652,1 - - - - 0,28 - 115 α-Кадинол 1652 1662,3 2,53 2,79 1,06 4,89 3,39 6,46 116 Интермедеол 1665 1667,3 - - - - 1,22 5,24 117 3-Оксо-β-јонон 1673 1674,5 - - 0,22 - - - 118 cis -Каламенен-10-ол 1660 1667,3 т. 0,23 - т. - - 119 14-Хидрокси-9-epi -(E)-кариофилен 1668 1677,4 т. 0,51 - 1,55 0,09 1,34 120 Кадален 1675 1679,2 - - - - - т. 121 α-Бисаболол 1685 1690,2 - 0,37 - - - - 122 Гермакра-4(15),5,10(14)-триен-1-α-ол 1685 1693,5 1,67 2,24 5,31 0,79 0,44 5,05 123 cis -14-nor -Мурол-5-ен-4-он 1688 1693,0 т. 0,42 - 1,21 - - 124 Шиобунол 1688 1695,9 - - - - 0,08 - 125 Оплопанон 1739 1743,1 0,88 т. - 1,79 0,05 - 126 Изобициклогермакренал 1733 1743,9 - т. т. - - т. 127 8-α-11-Елемодиол 1746 1752,5 0,86 - - - - - 128 Тетрадеканска киселина 1762 1766,4 0,88 - - - - - 129 14-Окси-α-муролен 1767 1775,3 0,82 - 0,30 - - 0,31 130 14-Хидрокси-α-муролен 1779 1782,1 - т. т. - - т.

111

Узорак (локалитет/година) и фенофаза 10/11 11/11 Ф1 Ф2 Ф3 Ф1 Ф2 Ф3 Компоненте ЕУ КИЛ КИЕ % % % % % % 131 14-Хидрокси-δ-кадинен 1803 1805,8 т. 0,67 т. - - т. 132 10-Оксо-изодауц-3-ен-15-ал н. 1842,1 - 1,38 т. 2,63 - т. 133 Хексахидрофарнезилацетон 1845 1846,2 1,00 0,42 т. - 0,11 т. 134 Платамбин 1867 1862,1 2,13 т. - 1,40 - - 135 n-Хексадеканол 1874 1881,5 - - т. - - - 136 Хексадеканска киселина 1959 1972,4 8,23 1,10 0,72 3,16 - - 137 (Z,E)-Гераниллиналол 1998 1998,9 - т. - 0,66 - - 138 (E,E)-Гераниллиналол 2026 2029,5 - т. т. - т. - 139 γ-Палмитолактон 2106 2098,4 - - т. - - - 140 Фитол 2111 2108,9 т. 0,30 т. - 0,12 т. 141 Докозан 2200 2185,4 - т. - - - - 142 Трикозан 2300 2273,5 - т. т. - - - 143 Тетракозан 2400 2357,6 - т. - - - - 144 Пентакозан 2500 2439,5 т. т. т. т. т. т. 145 Хексакозан 2600 2517,0 - т. - - - - 146 Хептакозан 2700 2593,0 т. т. т. т. т. - 147 Октакозан 2800 2664,9 - т. - - - - 148 Сквален 2847 2687,5 - т. т. - - 0,17 149 Нонакозан 2900 2736,5 т. т. т. т. т. т. 150 Триаконтан 3000 2804,0 - т. - - - - 151 Хентриаконтан 3100 2872,4 - т. т. - - - Идентификовано 65,64 82,90 92,69 82,65 98,37 92,29 Монотерпенски угљоводоници 6,50 1,80 6,98 9,55 4,98 1,54 Кисеонични монотерпени 3,08 1,38 3,39 1,31 46,92 1,86 Сесквитерпенски угљоводоници 3,48 26,65 55,17 14,78 27,80 17,14 Кисеонични сесквитерпени 41,87 50,98 25,80 53,18 17,42 71,07 Остала једињења 10,70 2,08 1,35 3,82 1,24 0,68 Локалитет: 10, Девојачки бунар; 11, Гребенац. Фенофаза: Ф1, пре цветања; Ф2, током цветања; Ф3, након цветања. %, релативни удео компоненте у етарском уљу; КИЛ, литературни Ковачев индекс; КИЕ, експериментално одређен Ковачев индекс, израчунат као средња вредност индекса добијених за сваки узорак; ‡, тачан изомер није одређен; н., литературни Ковачев индекс није доступан; т, трагови; -, компонента није детектована.

112

Састав етарских уља хербе панонског тимијана сабране током цветања на планинама Стол код Бора (локалитет 12 ), Ртањ (локалитет 14) и Озрен (локалитет 15 ) приказан je у Табели 26 . ЕУ хербе пореклом са Стола код Бора садржавало је нешто већу количину монотерпенских једињења (51,37%) у односу на сесквитерпенска (43,22%), док су сесквитерпенска једињења у ЕУ хербе пореклом са планина Ртањ (69.73%) и Озрен (75,56%) била заступљенија од монотерпенских (20,76% и 11,52%, редом). Садржај једињења осталих класа у овим узорцима износио је 3,47–4,01%. Најзаступљеније класе једињења у ЕУ хербе сакупљене на Столу код Бора (локалитет 12 ) били су кисеонични монотерпени (36,62%) и сесквитерпенски угљоводоници (25,81%). Монотерпенски алкохол линалол (24,72%) био је доминантно једињење, а од сесквитерпенских угљоводоника најзаступљенији били су ( Е)-кариофилен (8,60%) и гермакрен D (5,26%). У овом ЕУ у значајном проценту су се налазили и монотерпенски угљоводоници мирцен (6,09%) и лимонен (6,02%). ЕУ хербе прикупљене на планини Озрен (локалитет 14 ) садржавало је 69,73% сесквитерпенских једињења, од чега су 35,12% чинила једињења са кисеоником. Најзаступљенији је био гермакрен D (13,15%), а поред њега у значајним концентрацијама били су присутни и ( Е)-кариофилен (8,88%), кариофилен оксид (7,54%), елемол (5,84%) и α-кадинол (5,29%) од сесквитерпенских једињења, као и α-пинен (7,22%) од монотерпенских једињења. Сесквитерпенска једињења (75,56%) су била доминантна и у ЕУ хербе сабране током цветања на планини Ртањ (локалитет 15 ), при чему су већи део чинили угљоводоници (46,62%). Преовлађивао је гермакрен D (29,43%) док су се остале компоненте у ЕУ налазиле у мањим количинама: ( Е)-неролидол (6,49%), гермакра-4(15),5,10(14)-триен-1-α-ол (4,09%) и (Е)-кариофилен (3,52%).

113

Табела 26. Састав етарских уља хербе Th. pannonicus сакупљене током цветања на локалитетима 12 , 14 и 15

Узорак (локалитет/година) 12/11 14/11 15/11 Компоненте ЕУ КИЛ КИЕ % % % 1 α-Тујен 924 927,9 - т. - 2 α-Пинен 932 935,6 1,17 7,22 1,78 3 Камфен 946 950,3 0,61 0,91 0,69 4 Сабинен 969 974,9 0,27 0,29 0,12 5 1-Октен-3-он 972 978,2 0,65 - - 6 1-Октен-3-ол 974 978,5 0,65 0,38 0,24 7 β-Пинен 974 979,3 т. 0,76 0,36 8 3-Октанон 979 987,0 0,10 т. т. 9 Мирцен 988 993,0 6,09 0,88 2,48 10 3-Октанол 988 996,4 0,16 0,19 0,13 11 α-Терпинен 1014 1018,6 - т. - 12 p-Цимен 1020 1026,0 т. 1,08 0,22 13 Лимонен 1024 1031,1 6,02 2,22 2,08 14 β-Феландрен 1025 1033,1 т. - - 15 1,8-Цинеол 1026 1033,5 0,65 2,33 1,02 16 (Z)-β-Оцимен 1032 1041,0 0,12 0,17 0,86 17 (E)-β-Оцимен 1044 1048,3 0,31 2,02 - 18 γ-Терпинен 1054 1059,6 0,08 0,63 т. 19 cis -Сабинен хидрат 1065 1068,5 0,13 т. т. 20 Терпинолен 1086 1090,4 0,07 - - 21 Линалол 1095 1104,3 24,72 0,80 0,74 22 n-Нонанал 1100 1104,9 - - т. 23 Камфор 1141 1147,6 2,38 1,00 0,68 24 trans -Хризантемал 1153 1152,4 0,09 - - 25 Борнеол 1165 1168,5 0,22 т. - 26 Терпинен-4-ол 1174 1179,9 0,14 т. - 27 (E)-Изоцитрал 1177 1183,7 т. - - 28 α-Терпинеол 1186 1193,2 0,61 0,19 0,13 29 cis -Дихидрокарвон 1191 1199,9 0,07 - - 30 trans -Дихидрокарвон 1200 1207,0 0,08 - - 31 Нерол 1227 1231,1 0,84 - - 32 Тимол метилетар 1232 1236,4 0,12 т. - 33 Нерал 1235 1244,1 1,09 - - 34 Карвон 1239 1246,8 0,08 т. - 35 Гераниол 1249 1257,1 0,89 - - 36 Гераниал 1264 1274,1 1,65 - - 37 Борнилацетат 1287 1288,3 0,09 - - 38 Тимол 1289 1294,1 0,31 0,26 0,11 39 α-Кубебен 1345 1351,5 - - т. 40 Цитронелилацетат 1350 1354,0 - - т. 41 Еугенол 1356 1359,7 т. - - 42 Нерилацетат 1359 1366,4 1,63 - 0,23 43 α-Копаен 1374 1378,6 0,07 0,31 0,54 44 Геранилацетат 1379 1387,2 0,64 т. - 45 β-Бурбонен 1387 1390,5 0,64 1,74 2,82 46 β-Кубебен 1387 1412,5 - 0,43 0,26 47 β-Елемен 1389 1394,4 0,13 - 0,67 48 (E)-Кариофилен 1417 1425,2 8,60 8,88 3,52 49 β-Копаен 1430 1432,3 0,14 0,42 0,60 50 cis -Мурола-3,5-диен 1448 1448,5 - 0,19 т. 51 Геранилацетон 1453 1454,9 т. - - 52 α-Хумулен 1452 1457,2 1,62 1,01 0,30

114

Узорак (локалитет/година) 12/11 14/11 15/11 Компоненте ЕУ КИЛ КИЕ % % % 53 (E)-β-Фарнезен 1454 1459,9 т. 4,80 2,79 54 allo -Аромадендрен 1458 1463,2 0,22 т. - 55 9-epi -(E)-Кариофилен 1464 1464,4 0,25 - - 56 cis -Мурола-4(14),5-диен 1465 1467,5 0,06 т. 0,22 57 Даука-5,8-диен 1471 1469,9 - т. 0,17 58 γ-Муролен 1478 1484,0 0,09 0,35 т. 59 Гермакрен D 1484 1488,5 5,26 13,15 29,43 60 β-Селинен 1489 1491,3 т. т. 0,14 61 trans -Мурола-4(14),5-диен 1493 1498,1 - т. - 62 γ-Аморфен 1495 1498,0 - 0,21 0,42 63 Бициклогермакрен 1500 1500,6 2,59 0,32 0,11 64 α-Муролен 1500 1503,2 - т. т. 65 Премнаспиродиен 1505 1508,8 т. т. т. 66 β-Бисаболен 1505 1512,3 4,96 1,08 2,69 67 γ-Кадинен 1513 1517,5 0,38 0,44 0,37 68 Кубебол 1514 1517,8 - - т. 69 endo -1-Бурбонанол 1518 1521,0 т. - т. 70 trans -Каламенен 1521 1526,1 - 1,28 т. 71 β-Сесквифеландрен 1521 1527,2 0,40 - - 72 δ-Кадинен 1522 1526,8 0,40 т. 1,57 73 10-epi -Кубебол 1533 1534,8 0,08 - - 74 trans -Кадина-1,4-диен 1533 1535,2 - - т. 75 α-Кадинен 1537 1540,7 т. т. т. 76 Елемол 1548 1553,8 т. 5,84 2,95 77 Геранилбутаноат 1562 1563,7 0,06 - - 78 1-nor -Бурбонанон 1561 1565,9 - 0,20 - 79 (E)-Неролидол 1561 1568,8 2,16 - 6,49 80 1,5-Епоксисалвиал-4(14)-ен 1564 1570,8 - 0,43 0,37 81 Гермакрен D-4-ол 1574 1580,5 0,42 0,31 0,14 82 Спатуленол 1577 1583,4 1,02 0,64 0,35 83 Кариофилeн оксид 1582 1588,8 1,66 7,54 2,35 84 β-Копаен-4-α-ол 1590 1592,7 - 0,45 0,77 85 Виридифлорол 1592 1595,9 т. - - 86 Салвиал-4(14)-ен-1-он 1594 1598,1 0,06 0,81 1,21 87 Геранил(2-метилбутаноат) 1601 1603,9 0,13 - - 88 5-epi -7-epi -α-Еудезмол 1607 1609,3 - - 0,38 89 Хумуленепоксид II 1608 1612,7 0,14 0,43 - 90 β-Атлантол 1608 1614,0 0,31 - - 91 2-Метилен -6,8,8 -триметил -трицикло [5,2,2,0 (1,6) ]ундекан-3-ол н. 1615,9 0,09 0,61 0,85 92 1,10-di-epi -Кубенол 1618 1619,1 0,15 0,74 0,42 93 nor -Копанон 1620 1626,8 - - 0,36 94 γ-Еудезмол 1630 1635,9 - 1,00 0,64 95 Еремолигенол 1629 1639,8 - - 0,95 96 Кариофила-4(12),8(13)-диен-5-ол ‡ 1639 1638,7 0,11 0,35 - 97 Кариофила-4(12),8(13)-диен-5-ол ‡ 1639 1640,8 0,17 - - 98 Хинесол 1640 1643,4 - 0,30 - 99 Изоспатуленол 1641 1641,7 0,14 - - 100 epi -α-Кадинол 1638 1645,0 0,93 - 0,40 101 epi -α-Муролол 1640 1647,2 т. 0,31 0,44 102 β-Еудезмол 1649 1655,0 т. 2,09 1,44 103 α-Еудезмол 1652 1658,9 - - 1,94 104 α-Кадинол 1652 1659,4 0,43 5,29 1,41 105 cis -Каламенен-10-ол 1660 1668,5 - 0,44 т. 106 14-Хидрокси-9-epi -(E)-кариофилен 1668 1676,2 0,90 1,41 0,76 107 Гермакра-4(15),5,10(14)-триен-1-α-ол 1685 1692,1 0,60 2,69 4,09

115

Узорак (локалитет/година) 12/11 14/11 15/11 Компоненте ЕУ КИЛ КИЕ % % % 108 Шиобунол 1688 1697,1 2,33 1,83 - 109 2-(E),6-(Z)-Фарнезал 1713 1717,3 0,35 - - 110 2-(Z),6-(E)-Фарнезал 1715 1719,2 0,06 - - 111 2-(Z),6-(E)-Фарнезол 1722 1726,3 4,83 1,15 - 112 2-(E),6-(E)-Фарнезал 1740 1745,3 0,45 - - 113 Изобициклогермакренал 1733 1743,6 - - 0,12 114 Тетрадеканска киселина 1762 1763,7 0,11 - - 115 14-Окси-α-муролен 1767 1770,7 - 0,25 - 116 14-Хидрокси-α-муролен 1779 1782,8 - - т. 117 14-Хидрокси-δ-кадинен 1803 1804,1 - т. т. 118 10-Оксо-изодауц-3-ен-15-ал н. 1839,8 - - 0,12 119 Хексахидрофарнезилацетон 1845 1845,7 0,32 0,49 0,39 120 n-Хексадеканол 1874 1879,9 0,24 - - 121 Хексадеканска киселина 1959 1968,7 0,52 - 1,01 122 (Z,E)-Гераниллиналол 1998 1997,9 - - т. 123 n-Октадеканол 1077 2079,0 0,09 - - 124 γ-Палмитолактон 2106 2047,9 0,06 - т. 125 Фитол 2111 2110,6 - - т. 126 Докозан 2200 2185,7 0,21 0,22 т. 127 Трикозан 2300 2273,6 - 0,33 0,16 128 Тетракозан 2400 2357,9 - 0,44 0,20 129 Пентакозан 2500 2439,0 т. 0,52 0,29 130 Хексакозан 2600 2517,6 - 0,39 0,23 131 Хептакозан 2700 2592,8 0,07 0,30 0,26 132 Октакозан 2800 2665,7 - 0,22 0,18 133 Сквален 2847 2686,6 - - т. 134 Нонакозан 2900 2736,1 0,22 0,35 0,50 135 Триаконтан 3000 2804,5 - 0,19 0,17 136 Хентриаконтан 3100 2873,0 0,06 т. 0,19 Идентификовано 98,06 94,50 91,03 Монотерпенски угљоводоници 14,75 16,18 8,61 Кисеонични монотерпени 36,62 4,58 2,91 Сесквитерпенски угљоводоници 25,81 34,61 46,62 Кисеонични сесквитерпени 17,41 35,12 28,94 Остала једињења 3,47 4,01 3,95 Локалитет: 12, планина Стол код Бора - ливада; 14, планина Озрен; 15, планина Ртањ - село Врмџа. %, релативни удео компоненте у етарском уљу; КИЛ, литературни Ковачев индекс; КИЕ, експериментално одређен Ковачев индекс, израчунат као средња вредност индекса добијених за сваки узорак; ‡, тачан изомер није одређен; н., литературни Ковачев индекс није доступан; т, трагови; -, компонента није детектована.

На основу приказаних резултата може се закључити да су испитивана етарска уља хербе самониклог панонског тимијана имала различит састав у зависности од локалитета и фазе сакупљања хербе, што је у складу са литературним подацима о саставу етарског уља ове ( Табела 4 ) и других Thymus врста ( Stahl-Biskup, 2002 ). На основу садржаја компоненти ЕУ извршена је кластерска анализа. На добијеном дендрограму, приказаном на Слици 8 , уочавају се два кластера, А и Б.

116

Кластер А чине ЕУ хербе панонског тимијана цитралног хемотипа сакупљене у све три фенофазе на локалитетима на Вршачким планинама (локалитети 5, 8 и 9), подељена у две гране. Прву грану чине ЕУ хербе са локалитета 5 и 8 током цветања и ЕУ хербе са локалитета 8 након цветања, у којима је садржај цитрала износио 39,80–47,30%, а другу грану формирају ЕУ хербе са локалитета 9 сакупљене у све три фенофазе, ЕУ хербе сакупљене пре и након цветања на локалитету 5 и ЕУ хербе сакупљене пре цветања на локалитету 8 у којима је садржај цитрала био виши него у уљима прве гране и чинећи више од 50% уља (57,74–74,62%).

5 Ф2

8 Ф2

8 Ф3

5 Ф1 5 Ф3 А 9 Ф3

9 Ф1

9 Ф2

8 Ф1

10 Ф3

11 Ф1

10 Ф1 Б

10 Ф2

11 Ф3

12 11 Ф2 Слика 8. Кластерска анализа етарских уља хербе Th. pannonicus на основу релативног удела компоненти

У кластеру Б, кога чине ЕУ хербе сакупљене у све три фенофазе у Девојачком бунару (локалитет 10 ) и Гребенцу (локалитет 11 ), као и ЕУ хербе сакупљене на планинама источне Србије (локалитети 12 , 14 и 15 ), одвојиле су се четири гране: (1) етарска уља са гермакреном D као главном компонентом, добијена из херби сакупљених са локалитета 10 (Девојачки бунар) након цветања и са локалитета 14 (планина Озрен) и 15 (планина Ртањ), (2) етарска

117

уља богата кисеоничним сесквитерпенима, добијена из херби сакупљених пре и током цветања на локалитету 10 (Девојачки бунар) и пре и након цветања на локалитету 11 (Гребенац), (3) етарско уље хербе са локалитета 12 (планина Стол код Бора), чије је главна компонента линалол, и (4) етарско уље хербе сабране у фази цветања на локалитету 11 (Гребенац), чија је главна компонента тимол. На основу високог садржаја угљоводоничне сесквитерпенске фракције (34,61–55,17%) у ЕУ хербе сакупљене након периода цветања у Девојачком бунару (локалитет 10 ) и на планинама Озрен (локалитет 14 ) и Ртањ (локалитет 15 ), ова уља су се у кластеру Б одвојила у засебну грану (1). Најзаступљеније једињење у овим ЕУ био је гермакрен D (13,15–31,87%). Ово сесквитерпен je честа компонента етарских уља биљака рода Thymus , али је ретко заступљен у већим количинама ( Stahl-Biskup, 2002 ). Са друге стране, гермакрен D jе представљао главну компоненту у етарским уљима појединих популација Th. pannonicus из Мађарске и Србије (29,7-43,4%), као и популација Th. marschallianus из Србије (20,40–66,66%) ( Pluhár и сар., 2010 ; Šoštarić, 2012 ). Поред овог, у уљу хербе сакупљене након цветања на локалитету 10 и уљима херби пореклом са локалитета 14 и 15 у значајним количинама су били заступљени и други сесквитерпенски угљоводоници: ( Е)-кариофилен у сва три ЕУ (3,52–8,88%), бициклогермакрен у ЕУ са локалитета 10 након цветања (7,46%), β-бурбонен (1,74–4,90%), ( Е)-β-фарнезен у ЕУ хербе са локалитета 14 и 15 (4,80% и 2,79%, редом), као и β-бисаболен у ЕУ хербе са локалитета 15 (2,69%). Веће количине сесквитерпенских угљоводоника су биле присутне и у раније испитиваним ЕУ Th. marshallianus и Th. pannonicus из Србије, посебно бициклогермакрен и ( Е)- кариофилен, при чему је ( Е)-кариофилен у ЕУ једне популације Th. pannonicus представљао доминантно једињење чинећи 40,30% ЕУ ( Šoštarić, 2012 ). Поред угљоводоничних, у етарским уљима гране (1) у значајном проценту налазили су се и кисеонични сесквитерпени (25,80–35,15%): спатуленол (11,91% у ЕУ хербе сакупљене након цветања у Девојачком бунару), кариофилен оксид (7,54% у ЕУ хербе пореклом са планине Озрен), (Е)-неролидол (6,49% у ЕУ хербе пореклом са планине Ртањ), α-кадинол (5,29% у ЕУ хербе пореклом са планине Озрен) и гермакра-4(15),5,10(14)-триен-1-α-ол (5,31% у ЕУ хербе сакупљене након цветања у Девојачком бунару и 4,09% у ЕУ

118

хербе пореклом са планине Ртањ), који се јављају као доминантни и у етарским уљима херби гране (2). У оквиру гране (1), према нешто вишем садржају монотерпенских угљоводоника издваја се ЕУ хербе са локалитета 14 (планина Озрен), где је монотерпенски угљоводоник α-пинен представљао 7,22% ЕУ. У раније испитиваним ЕУ Th. pannonicus и Th. marschallianus из Србије садржај монотерпенских угљоводоника ((Е)-β-оцимена, лимонена и мирцена) био је већи у поређењу са уљима испитиваним у овом раду ( Šoštarić, 2012 ). Грана (2) кластера Б окупља четири етарска уља хербе панонског тимијана у којима су преовлађивала кисеонична сесквитерпенска једињења (41,87–71,08%): ЕУ хербе из Девојачког бунара пре и током цветања (локалитет 10 ) и хербе из Гребенца (локалитет 11 ) сакупљене пре и након цветања. ( Е)- Неролидол (8,35–20,33%) и спатуленол (16,78–18,29%) су били најзаступљенији у ЕУ хербе сабране пре и у фази цветања у Девојачком бунару (локалитет 10 ) и током и након цветања у Гребенцу (локалитету 11 ). У сва четири уља ове гране спатуленол (16,78–18,29%) и кариофилен оксид (5,52–12,94%) су се налазили у значајном проценту. Поред ових једињења, присутни су били сесквитерпенски алкохоли кадинанског и гермакранског скелета, α-кадинол (2,53–6,46%), epi -α- кадинол (14,38% у ЕУ хербе сабране током цветања на локалитету 10 ) и гермакра-4(15),5,10(14)-триен-1-α-ол (2,24–5,05%). Најзаступљенија једињења у овим уљима, неролидол и спатуленол се ретко налазе у ЕУ биљака рода Thymus у концентрацијама већим од 10% ( Stahl-Biskup, 2002 ). ( Е)-Неролидол се у већим количинама углавном налази у Thymus врстама северне Европе ( Stahl-Biskup, 2002 ; Raal и сар., 2004 ; Schmidt и сар., 2004 ), али и у ЕУ Тh. atticus из Грчке (Tzakou и Constantinidis, 2005 ) и Th. serpyllum из Србије и Марока ( Petrović и сар., 2014 ; Jamali и сар., 2012 ). Релативно високе концентрације спатуленола одређене су код Th. pulegioides пореклом из Мађарске ( Pluhár и сар., 2012б ) и Тh. parnassicus из Грчке ( Stahl-Biskup, 2002 ). У грану (3) кластера Б одвојило се етарско уље хербе са планине Стол (локалитет 12 ) које се карактерисало вишим садржајем линалола у поређењу са осталим узорцима (24,72%). Етарска уља са високим садржајем линалола (66-72%) су раније описана у случају хербе панонског тимијана из Словачке и са територије Србије (са различитог локалитета у односу на локалитете у овом раду) ( Stahl-Biskup, 2002 ; Šoštarić, 2012 ). Осим линалола, у ЕУ хербе са

119

локалитета 12 , ( Е)-кариофилен, гермакрен D, мирцен и лимонен налазили су се у значајнијим концентрацијама (5,26–8,60%) ( Табела 26 ). ( Е)-Кариофилен и лимонен, као и мирцен, били су заступљени у значајном проценту и у раније испитиваним етарским уљима хербе панонског тимијана сакупљене на просторно блиском подручју ( Šoštarić, 2012 ). Осим тога, у ЕУ хербе са локалитета 12 , гераниал и нерал су чинили 1,65% и 1,09%, редом. Ово је једино ЕУ, поред ЕУ хербе са локалитета на Вршачким планинама (локалитети 5, 8 и 9), у коме je утврђено присуство цитрала. На основу анализа састава етарског уља, највећи број раније испитиваних узорака хербе Th. pannonicus представља фенолне хемотипове ( Табела 4 ). Међутим, од испитиваних херби панонског тимијана са локалитета у Србији сакупљених 2011., само је етарско уље хербе из Гребенца (локалитет 11 ) у фази цветања садржавало 37,95% тимола, које се у кластерској анализи издвојило у засебну грану (4) у оквиру кластера Б. У фазама пре и након цветања у ЕУ хербе пореклом из Гребенца преовлађивала су кисеонична сесквитерпенска једињења, а садржај тимола у ЕУ након цветања износио је 0,53%, док његово присуству у ЕУ хербе сакупљене пре цветања није ни детектовано ( Табела 25 ). Са друге стране, према литературним подацима, ЕУ хербе сакупљене на истом локалитету 2008. било је богато сесквитерпенским угљоводоницима, пре свега гермакреном D и ( Е)-кариофиленом, а релативни удео фенолних и њима биосинтетски блиских једињења био је мањи од 2% ( Šoštarić, 2012 ). Овакве разлике могу бити последица различитих климатских прилика током 2008. и 2011., узорковања хербе у различитим фазама развоја биљке, постојањем интрапопулационих разлика, као и различитих метода анализе испарљивих једињења. Етарска уља панонског тимијана у којима преовлађује цитрал, линалол, гермакрен D или тимол, представљају уља већ познатих хемотипова ове биљке. Међутим, етарска уља богата кисеоничним сесквитерпенским једињењима, пре свега (Е)-неролидолом и спатуленолом, до сада се нису наводила као главни метаболити етарских уља Th. pannonicus . Као хемотип са доминантним кисеоничним сесквитерпенима идентификован раније је једино кариофилен оксид/ α-кубебен/линалол хемотип у Мађарској ( Pluhár и сар., 2010 ).

120

8. Идентификација изолованих једињења

Из метанолног екстракта хербе панонског тимијана изолована су и идентификована 4 једињења: апигенин 7-О-глукуронид ( 1), розмаринска киселина ( 2), 3-O-(2-кафенил)-розмаринска киселина ( 3) и 3-O-(метил-2- кафенил)-розмаринска киселина ( 4), док је из воденог екстракта изолован и идентификован лутеолин 7-О-диглукуронид ( 5).

8.1. Идентификација једињења 1 (апигенин 7-О-глукуронид)

Једињење 1 (5,3 mg) изоловано је у облику бледо-жутог прашка растворљивог у метанолу. HPLC и ТLC анализа једињења 1 HPLC анализом добијен је хроматограм на коме се једињење 1 јавља на

Rt 14,91 min и даје изглед UV спектра који одговара 7-О хетерозиду апигенина (Слика 9 ). На танком слоју силикагела и целулозе у UV светлости на 254 nm једињење 1 гаси флуоресценцију стационарне фазе. Након дериватизације NP реагенсом уочава се интензивно жута флуоресценција на 366 nm. У Табели 27

дате су Rf вредности једињења 1 у поређењу са стандардом S1 (апигенин 7-О- глукозид) у три хроматографска система. Једињење 1 и стандард S1 су показали различиту покретљивост. На танком слоју целулозе у води као мобилној фази стандард S1 се није покренуо са стартне линије што одговара особинама

моноглукозида. Са друге стране, Rf вредност једињења 1 је износила 0,67 што је карактеристично за глукурониде ( Markham, 1982 ).

121

DAD1 A, Sig=350,4 Ref=400,100 (JELENAA\2011ML~1\_ML10~1.SPE\_ML104~1.CC\_67-71~1\67-71-~1.D) mAU DAD1, 16.339 (590 mAU, - ) of 67-71-~1.D 16.343 mAU 250

500

400 200

300

200 150

100

0 100 200 225 250 275 300 325 350 375 nm

0 5 10 15 20 25 30 35 min

Слика 9. HPLC хроматограм и UV спектар једињења 1

Табела 27. Rf вредности једињења 1 и стандарда S1

Стационарна фаза Мобилна фаза Rf (1) Rf (S1 )

EtOAc-HCOOH-CH 3COOH-H2O 1 силикагел 0,59 0,67 100:11:11:26

CH 3COOH-H2O 2 целулоза 0,43 - 30:70

3 целулоза H2O 0,60 0,00

Спектроскопска анализа једињења 1 У UV спектру флавоноида растворених у метанолу јављају се две траке: трака I, на 300–350 nm, и трака II, на 240–285 nm. У присуству шифт реагенаса долази до промене у положају и изгледу траке I и/или до промена у изгледу траке II, које указују на структуру прстена B и прстена A, редом ( Markham, 1982 ).

Слика 10. Основна структура флавоноида

122

Резултати спектроскопске анализе једињења 1 раствореног у метанолу и

у присуству шифт реагенаса (AlCl 3, AlCl 3/HCl, NaOMe, NaOAc и NaOAc/H 3BO 3) представљени су у Табели 28 и на Слици 11 . У UV спектру једињења 1 у метанолу

уочавају се трака I, са λmax 330,00 nm, и трака II са λmax 269,00 nm, што одговара спектрима флавона и флавонола са супституентом у положају 3.

Табела 28. UV максимуми једињења 1 у метанолу и у присуству шифт реагенаса

λmax (nm) Померање λmax (nm) Спектар у присуству: Трака I Трака II траке I траке II MeOH 330 269

+ AlCl 3 343, 376 275, 296 +13

+ AlCl 3/HCl 339, 374 275, 296 +9 + NaOMe 389 273 +59 + NaOAc 387 267 +57 ~0

+ NaOAc/H 3BO 3 333 268 ~0

У присуству AlCl 3 дошло је до батохромног померања максимума траке I спектра једињења 1 услед грађења комплекса. Изглед спектра се није променио додатком HCl указујући на одсуство орто хидроксилних група. Четири изражене траке одговарају спектрима комплекса 5-ОH флавоноида са Аl 3+ јоном. У NaOMe спектру трака I је батохромно померена за 59 nm што је карактеристика флавоноида са слободном 4'-OH и/или 3-ОH групом. Интензитет спектра се није смањивао што је искључило могућност да је у молекулу једињења 1 присутна слободна 3-ОН група. Стабилност спектра указује и на одсуство дихидроксилних и трихидроксилних система осетљивих на присуство алкалија (6,7; 7,8; 3,4'; 5,6,7; 5,7,8; 3',4',5'). У делу спектра 320–335 nm изостала је појава додатног максимума што искључује постојање слободне хидроксилне групе у положају 7, односно указује на могућност везивања шећера у овом положају.

123

a) б)

в) г)

д) ђ)

Слика 11. UV спектри једињења 1 снимљени у метанолу и у присуству шифт реагенаса

а) у MeOH; б) у присуству AlCl 3; в) у присуству AlCl 3/HCl; г) у присуству NaOMe; д) у присуству NaOAc; ђ) у присуству

NaOAc/H 3BO 3

Максимум траке II у NaOAc спектру се у односу на МeOH спектар јавља на приближно истој таласној дужини (уз повећање интензитета траке) што одговара флавоноидима са супституисаном 7-OH групом. Како је интензитет спектра током времена остао непромењен, може се закључити да једињење 1 у својој структури нема дихидроксилни и трихидроксилни систем осетљив на

присуство база. Додатком H 3BO 3 положај апсорпционих максимума обе траке врло мало одступа од MeOH спектра, што указује на одсуство орто хидроксилних група у прстеновима A и B (Mabry и сар., 1970 ; Markham, 1982 ).

124

Изгледом и положајем максимума спектар једињења 1 одговара спектрима хетерозида апигенина са гликоном везаним у положају 7 ( Mabry и сар., 1982 ). LC-MS анализа

Једињење 1 се на LC-MS хроматограму фракције В.10 јавља на Rt 12,82 min. У масеном спектру једињења 1, јонизованог у негативном моду и фрагментисаном при 125 V, уочава се снажан сигнал депротонованог молекула ([M–H] –) на m/z 445,1. Фрагментацијом при 250 V интензитет сигнала депротонованог молекула је смањен, док се основни јон јавља на m/z 269,1 (Слика 12 ). Узимајући у обзир претходна разматрања, утврђено је да јон 269,1 потиче од агликона апигенина (Мr 270,24). Разлика у експериментално одређеној молекулској маси једињења 1 и апигенина износи 176 u, и указује на то да се као шећерна компонента у једињењу 1 налази хексауронска јединица

(Mr) (H O) (176= 194 -18 2 ), тј. глукуронска киселина ( Szilvássy и сар., 2013 ).

*MSD1 SPC, time=12.818 of D:\DATA\OBUKA\ML10-250.D ES-API, Neg, Scan, Frag: 250, "Neg ES"

100 Max: 13014 269.1

60 445.2

20 270.0 446.2 467.1 311.1 483.2

0 200 300 400 500 600 m/z Слика 12. Спектар масе једињења 1 добијен LC-MS методом при фрагментацији на 250 V

Експериментални подаци добијени анализом MS спектра једињења 1 одговарају литературним подацима за апигенин 7-О-глукуронид ( Justesen, 2000 ; Pereira и сар., 2013 ; Szilvássy и сар., 2013 ).

Једињење 1 идентификовано је као апигенин 7-О-глукуронид.

125

8.2. Идентификација једињења 2 (розмаринска киселина, α-[[(2 E)-3-(3,4-дихидроксифенил)-1-оксо-2- пропен-1-ил]окси]-3,4-дихидрокси-(αR)-бензенпропанска киселина)

Једињење 2 (12,1 mg) је изоловано као бледожута аморфна супстанца растворљива у метанолу. HPLC и TLC анализа једињења 2 На хроматограму добијеном високоефикасном течном хроматографијом

једињење 2 се јавља на Rt 18,68 min и показује UV спектар карактеристичан за деривате кафене киселине ( Sutherland, 1958 ; Dranik, 1966 ). Ретенционо време и UV спектар једињења 2 одговарају ретенционом времену и UV спектру стандарда S2 (розмаринска киселина) добијеним под истим експерименталним условима

(Rt 18,63 min) ( Слика 13 ). Једињење 2 је анализирано хроматографијом на танком слоју силикагела и целулозе у три различита система растварача уз коришћење стандарда S2 (Табела 29 ). Rf вредности једињења 1 и стандарда S2 биле су идентичне у сва три хроматографска система. Након развијања хроматограма једињење 2 и стандард S2 у UV светлости на 254 nm гасе флуоресценцију, а у UV светлости на 366 nm оба једињења показују жуто-зелену флуоресценцију, која се појачава након дериватизације NP реагенсом.

126

DAD1 A, Sig=350,4 Ref=400,100 (JELENAA\2011ML~1\_ML11-~1.SPE\_ML11-~1.2-1\2_100.D) mAU

(а) 18.687 DAD1, 18.685 (1820 mAU, - ) of 2_100.D 400 mAU 1750

350 1500

1250

300 1000

750 250 500

200 250

150 200 225 250 275 300 325 350 375 nm

100

0 5 10 15 20 25 30 35 min

DAD1 A, Sig=350,4 Ref=400,100 (1MILICA\STANDA~1\ROZMSTAN.D) mAU DAD1, 18.628 (2082 mAU,Apx) of ROZMSTAN.D (б) mAU 18.624 2000

400 1750

1500 350 1250

1000 300 750

250 500

250

200 0

200 225 250 275 300 325 350 375 nm

150

100

0 5 10 15 20 min

Слика 13. HPLC хроматограм и UV спектар једињења 2 (а) и стандарда S2 (б)

Табела 29. Rf вредности једињења 2 и стандарда S2

Стационарна фаза Мобилна фаза Rf (2) Rf (S2)

EtOAc-HCOOH-AcOH-H2O 1 силикагел 0,95 0,95 100:11:11:26 толуен-EtOAc-HCOOH 2 силикагел 0,49 0,49 5:4:1

127

CH 3COOH-H2O 3 целулоза 0,72 0,72 30:70

Спектроскопска анализа једињења 2 Анализирани су спектри једињења 2 у метанолу и у присуству шифт реагенаса ( Табела 30 ; Слика 14 ).

Табела 30. UV максимуми једињења 2 у метанолу и у присуству шифт реагенаса

Спектар у присуству: λmax (nm) Померање λmax (nm) MeOH 328, 290sh

+ AlCl 3 360 +32

+ AlCl 3/HCl 331, 291 ~0 + NaOMe 373 +45 + NaOAc 387 +59

+ NaOAC/H 3BO 3 333 +20

У UV спектру једињења 2 у метанолу уочава се апсорпциони максимум на

328 и плато на 290 nm, указујући на деривате кафене киселине који имају λmax 305–330 nm и још један превој или плато на таласној дужини 20–25 nm мањој од

λmax (Sutherland, 1958 ).

У присуству АlCl 3 долази до промене изгледа и батохромног померања спектра за 32 nm услед грађења комплекса са Al 3+ јоном. Награђени комплекс се разграђује у киселој средини, додатком HCl, и долази до регенерације спектра једињења 2, што указује на присуство орто хидроксилних група у молекулу. У присуству NaOMe долази до брзе декомпозиције спектра указујући на присуство кафеоил-групе у структури једињења 2 (Méndez и Lojo, 1969 ; Jurd, 1957 ). Апсорпциони максимум у NaOMe спектру је батохромно померен за 45 nm што одговара естрима кафене киселине, односно указује на то да једињење 2 у својој структури нема слободну карбоксилну групу која је у конјугацији са ароматичним системом ( Jurd, 1957 ; Dranik, 1966 ). У спектру снимљеном у присуству NaOAc, поред појаве максимума на

270 nm, долази до батохромног померања λmax за 59 nm. Додатком H 3BO 3, услед грађења комплекса са орто -дифенолним групама апсорпциони максимум се помера ка већим таласним дужинама за 20 nm. Овакве спектралне особине

128

одговарају естрима кафене киселине, док кафена киселина при овим условима даје хипсохромно померање апсорпционог максимума ( Dranik, 1966 ).

a) б)

в) г)

д) ђ)

Слика 14. UV спектри једињења 2 снимљени у метанолу и у присуству шифт реагенаса

а) у MeOH; б) у присуству AlCl 3; в) у присуству AlCl 3/HCl; г) у присуству NaOMe; д) у присуству NaOAc; ђ) у присуству

NaOAc/H 3BO 3

LC-MS анализа једињења 2 Једињење 2 се на LC-MS хроматограму фракције В.10 јавља на ретенционом времену Rt 14,63 min. У масеном спектру једињења 2 (Слика 15 ) налази се снажан сигнал депротонованог молекула ([M-H] –) на m/z 359,1. Фрагментацијом на 200 и 250 V интензивирају се јони m/z 197, m/z 179 и m/z

129

161, фрагментни јони карактеристични за розмаринску киселину (Mr 360,3) (Barros и сар., 2013 ; Hossain и сар., 2010а ).

*MSD1 SPC, time=14.626 of D:\DATA\OBUKA\ML10-250.D ES-API, Neg, Scan, Frag: 250, "Neg ES"

100 Max: 64576 161.1

60 197.1

40 359.1

20 179.0 162.1 381.2

0 200 300 400 500 m/z Слика 15. Спектар масе једињења 2 добијен LC-MS методом при фрагментацији на 250 V

Једињење 2 је идентификовано као розмаринска киселина.

8.3. Идентификација једињења 3 (3-O-(2-кафенил)-розмаринска киселина, 3 ′-O-(8 ″-Z-кафеоил)- розмаринска киселина, салвианолинска киселина H)

Једињење 3 (3,6 mg) је изоловано као смеђе-жута аморфна супстанца, растворљива у метанолу. HPLC и TLC анализа једињења 3 Ретенционо време једињења 3 у примењеној HPLC методи износи

Rt 22,83 min. Снимљени UV спектар одговара спектрима деривата кафене киселине. Апсорпциони максимум се налази на 324 nm, а превојна тачка на 290 nm ( Слика 16 ).

130

DAD1 A, Sig=350,4 Ref=400,100 (JELENAA\2011ML~1\_ML11-~1.SPE\_ML11-~1.2-1\3_100.D) mAU DAD1, 22.834 (1019 mAU, - ) of 3_100.D mAU 22.837

800 200

600

400 150

200

0 100 200 225 250 275 300 325 350 375 nm

0 5 10 15 20 25 30 35 min Слика 16. HPLC хроматограм и UV спектар једињења 3

Особине једињења 3 на танком слоју целулозе и силикагела испитане су

уз коришћење стандарда розмаринске киселине (стандард S2) ( Табела 31 ). Rf вредности једињења 3 и стандарда S2 се не подударају, док је изглед њихових зона на хроматограмима у видљивој и у UV светлости пре и након дериватизације NP реагенсом идентичан, с тим што једињење 3 показује флуоресценцију слабијег интензитета.

Табела 31. Rf вредности једињења 3 и стандарда S2

Стационарна фаза Мобилна фаза Rf(3) Rf(S2)

EtOAc-HCOOH-AcOH-H2O 1 силикагел 0,90 0,93 100:11:11:26 толуен-EtOAc-HCOOH 2 силикагел 0,38 0,46 5:4:1

CH 3COOH-H2O 3 целулоза 0,80 0,70 30:70

LC-MS анализа једињења 3

Једињење 3 се на хроматограму фракције В.10 јавља на Rt 17,38 min са јоном депротонованог молекула ([M–H] –) на m/z 537,2. Установљена молекулска маса једињења 3 одговара маси једињења насталог повезивањем остатка кафене

131

киселине са розмаринском киселином. Уочени фрагментни јон на m/z 493,2 се од депротонованог молекула разликује за 44 u што одговара губитку карбоксилне групе. Као потомци овог јона јављају се јони на m/z 313,2 и m/z 295,1 који настају одласком фрагмената који одговарају 2,3-дихидрокафеној киселини и 2,3-дихидро-2-хидрокси кафеној киселини, редом. Фрагментни јони на m/z 359,2, m/z 197,1, m/z 179,0 и m/z 161,1 одговарају јонима који потичу од розмаринске киселине ( Слика 17 ).

*MSD1 SPC, time=17.384 of D:\DATA\OBUKA\ML10-250.D ES-API, Neg, Scan, Frag: 250, "Neg ES"

100 Max: 27120 537.2

80 493.2 60 295.1 40 538.2

20 494.2 160.1 296.1 179.0 559.2 359.2 197.1 539.2 313.2 335.1

0 200 300 400 500 600 m/z Слика 17. Спектар масе једињења 3 добијен LC-MS методом при фрагментацији на 250 V

Експериментални подаци добијени LC-MS анализом једињења 3 одговарају подацима о молекулској маси и начину фрагментације тримера кафене киселине као што су литосперминска киселина или 3 ′-O-(8 ″-Z- кафеоил)- розмаринска киселина ( Barros и сар., 2013 ; Dapkevicius и сар., 2002 ; Pereira и сар., 2013 ). NMR анализа једињења 3 У 1H NMR спектру једињења 3 уочава се већи број сигнала ароматичних протона у области δ 6,5–7,3, као и сигнали алифатичних протона и сигнали олефинских протона који су у конјугацији са ароматичним системом ( Табела 32 ; Слика 18 ). Два дублета на δ 7,44–7,40 и δ 6,17–6,13, чије константе спрезања Ј износе 15,88 Hz, потичу од транс олефинских протона на положајима 7 и 8 централног молекула кафене киселине. Синглет на δ 7,16 потиче од олефинског протона на

132

положају 7'' остатка молекула кафене киселине везаног за розмаринску киселину.

Табела 32. 1H NMR подаци једињења 3 (400 MHz)

Протон δ (ppm) a Мултиплицитет б J (Hz) Број протона

2 6,98 - 6,97 д 2,00 1 5 6,89 - 6,87 д 8,32 1 6 7,11 - 7,09 дд 2,04; 8,24 1 7 7,44 - 7,40 д 15,88 1 8 6,17 - 6,13 д 15,88 1 2' 6,71 - 6,70 д 2,04 1 5' 6,64 - 6,62 д 8,08 1 6' 6,58 - 6,55 дд 2,06; 8,06 1 7'a 2,91 - 2,85 дд 9,62; 14,10 1 7'b 3,05 - 3,00 дд 3,40; 14,16 1 8' 5,03 - 4,99 дд 3,42; 9,55 1 2'' 7,24 - 7,23 д 2,08 1 5'' 6,71 - 6,69 д 8,28 1 6'' 7,04 - 7,02 дд 2,06; 8,30 1 7'' 7,16 с - 1 а Вредности хемијских померања δ једињења 3 раствореног у деутерисаном метанолу су одређена у односу на TMS . б д, дублет; дд, дублет дублета, с, синглет.

У области алифатичних протона уочавају се три сигнала. Два дублета дублета на δ 2,91–2,85 и 3,05–3,00 потичу од протона на положају 7' који се

спрежу међусобно ( Ј 14,10 Hz) и са протоном на положају 8' ( Ј7'а,8 9,62 Hz и

Ј7'b,8 3,40 Hz.). Сигнал протона H-8' се јавља као дублет дублета на δ 5,03–4,99. Дублети дублета ароматичних протона 6, 6'' и 6' јављају се на δ 7,11–7,09, δ 7,04–7,02 и δ 6,58–6,55, редом. Константе спрезања Ј износе око 8 Hz услед спрезања са протонима у орто , и око 2 Hz услед спрезања са протонима у мета положају. Сигнали протона у положајима 2, 2'и 2'', као и 5, 5' и 5'' јављају се као дублети са константама спрезања Ј ~2 Hz, односно J ~8 Hz. Поређењем са литературним подацима 1H NMR спектар једињења 3 одговара 3′-O-(8 ″-Z- кафеоил)-розмаринској киселини ( Dapkevicius и сар., 2002 ).

133

✕ ✕

Слика 18. 1H NMR спектар једињења 3

134

Експериментални подаци добијени анализом MS , UV , и 1H NMR спектара једињења 3 одговарају литературним подацима за једињење 3′-O-(8 ″-Z- кафеоил)-розмаринска киселина ( Dapkevicius и сар., 2002 ; Pereira и сар., 2013 ), односно 3-O-(2-кафенил)-розмаринској киселини.

Једињење 3 је идентификовано као 3-О-(2-кафенил)-розмаринска киселина.

8.4. Идентификација једињења 4 (3-O-(метил-2-кафенил)-розмаринска киселина, 3′-O-(8 ″-Z-метилкафеоил)-розмаринска киселина)

Једињење 4 (3,6 mg) је изоловано у облику смеђежуте аморфне супстанце, растворљиве у метанолу. HPLC и TLC анализа једињења 4 На хроматограму добијеном HPLC методом једињење 4 се јавља на

Rt 27,59 min. Снимљени UV спектар одговара спектрима деривата кафене

киселине, са λmax 326 nm и превојном тачком на 290 nm ( Слика 19 ). На танком слоју силикагела и целулозе једињење 4 гаси флуоресценцију стационарне фазе. Након дериватизације NP реагенсом флуоресцира жуто- зелено веома слабим интензитетом ( Табела 33 ).

135

DAD1 A, Sig=350,4 Ref=400,100 (JELENAA\2011ML~1\_ML11-~1.SPE\_ML11-~1.2-1\4_050_1.D) mAU DAD1, 27.599 (1433 mAU,Apx) of 4_050_1.D 350 mAU 27.593

1200

300 1000

800 250 600

400 200

200

0 150 200 225 250 275 300 325 350 375 nm

100

0 5 10 15 20 25 30 35 min

Слика 19. HPLC хроматограм и UV спектар једињења 4

Табела 33. Rf вредности једињења 4 и стандарда S2

Стационарна фаза Мобилна фаза Rf(4) Rf(S2)

толуен-EtOAc-HCOOH 1 силикагел 0,58 0,46 5:4:1

CH 3COOH-H2O 2 целулоза 0,88 0,70 30:70

LC -MS анализа једињења 4 Једињење 4 се на хроматограму добијеном LC-MS анализом фракције В.10

– јавља на Rt 26,38 min. Сигнал депротонованог молекула ([M–H] ) се јавља на m/z 551,2 ( Слика 20 ). Експериментално одређена молекулска маса једињења 4 се разликује од масе једињења 3 за 14 u, односно за једну метиленску групу. Појава фрагментног јона на m/z 353,0 одговара губитку фрагмента масе 198 u, што указује на то да се додатна метиленска група у односу на једињење 3 налази на централном или терминалном остатку кафене киселине, а не у оквиру остатка 2,3-дихидро-2-хидрокси кафене киселине. У MS спектру се такође уочавају јони на m/z 359,1, m/z 197,0, m/z 179,1 и m/z 161,0 који потичу од розмаринске киселине указујући на то да се метиленска група налази у терминалном остатку кафене киселине. Присуство јона на m/z 193,1, чија маса представља збир маса остатка кафене киселине (179 u) и метиленске групе,

136

потврђује претпоставку да је метиленска група везана за терминални остатак кафене киселине.

*MSD1 SPC, time=26.379 of D:\DATA\OBUKA\ML10-250.D ES-API, Neg, Scan, Frag: 250, "Neg ES"

100 393.1 Max: 13767 551.3 353.1

80 193.0 361.1 60 339.1

40 m/z

552.2 340 360 380 161.0

20 573.2 393.1 269.1 553.3 179.1 197.0 361.1 339.1 574.2

200 300 400 500 600 m/z

Слика 20. Спектар масе једињења 4 добијен LC-MS методом при фрагментацији на 250 V

Спектар масе једињења 4 добијен при фрагментацији на 250 V, указује на то да једињење 4 представља метил дериват једињења 3, са метил групом у терминалном остатку кафене киселине. NMR анализа једињења 4 У 1H NMR спектру једињења 4 уочава се већи број сигнала ароматичних протона у области δ 6,5–7,3, сигнали алифатичних протона и сигнали олефинских протона који су у конјугацији са ароматичним системом ( Табела 34 ; Слика 21 ). Олефински протони на положајима 7 и 8 централног молекула кафене киселине дају два дублета на δ 7,46–7,41 и δ 6,17–6,13 константе спрезања Ј ~16 Hz, указујући на транс конфигурацију двоструке везе. Сигнал олефинског протона на положају 7'' терминалног остатка кафене киселине ( δ 7,32) померен је парамагнетно у односу на сигнал који се јавља код једињења 3. У области алифатичних протона уочава се пет сигнала. На вредности хемијског померања δ 3,71 јавља се синглет три протона естарски или етарски везане метил групе. Дублет дублета који потиче од протона H-8' јавља се на δ 5,03–5,00. Сигнали протона 7' a и 7' b уочавају се као два дублета дублета на δ 2,88–2,82 и δ 3,05–3,01.

137

Дублети дублета ароматичних протона 6, 6'' и 6' јављају се на δ 7,15–7,12, δ 7,09–7,07 и δ 6,57–6,55, редом. Константе спрезања Ј износе око 8 Hz услед спрезања са протонима у орто , и око 2 Hz услед спрезања са протонима у мета положају. Сигнали протона у положајима 2, 2'и 2'', као и 5, 5' и 5'' јављају се као дублети са константама спрезања Ј ~2 Hz, односно J ~8 Hz.

Табела 34. 1H NMR подаци једињења 4 (400 MHz)

Протон δ (ppm) a Мултиплицитет б J (Hz) Број протона

2 6,90–6,89 д 2,04 1 5 6,90–6,88 д 8,36 1 6 7,15–7,12 дд 1,98; 8,42 1 7 7,45–7,41 д 15,92 1 8 6,17–6,13 д 16,00 1 2' 6,70–6,69 д 2,0 1 5' 6,62–6,60 д 8,0 1 6' 6,57–6,55 дд 1,96; 8,10 1 7'a 2,88–2,82 дд 9,68; 14,26 1 7'b 3,05–3,01 дд 3,32; 14,26 1 8' 5,03–5,00 дд 3,32; 9,68 1 2'' 7,28–7,27 д 2,12 1 5'' 6,74–6,71 д 8,4 1 6'' 7,09–7,07 дд 2,22; 8,34 1 7'' 7,32 с - 1 *3''/4''/9'' 3,71 с - 3 а Вредности хемијских померања δ једињења 4 раствореног у деутерисаном метанолу су одређена у односу на TMS. б д, дублет; дд, дублет дублета, с, синглет; *, положај метил групе није одређен.

На основу добијених података може се закључити да једињење 4 представља метил дериват једињења 3 код кога се метил група налази у терминалном остатку кафене киселине: метилестар на C9'' или метилетар на положајима 3'' или 4''. На основу доступних примењених метода анализе положај метил групе није било могуће установити, па је једињење 4 идентификовано као 3-O-(метил-2-кафенил)-розмаринска киселина.

5' OH O COOH 6'

7 2'' 7'' 2 8' R3O O O OH 8 7' 2'

6'' COOR9 6 R3=CH3,R4=H, R9=H R4O HO R3=H, R4=CH3,R9=H 5'' 5 R3=H, R4=H, R9=CH3

138

✕ ✕

Слика 21. 1H NMR спектар једињења 4

139

8.5. Идентификација једињења 5 (лутеолин 7-О-диглукуронид)

Једињење 5 (19,0 mg) је изоловано у облику жутог прашка, слабо растворљивог у метанолу и растворљивог у води. HPLC и TLC анализа једињења 5 Једињење 5 се на хроматограму добијеном HPLC методом јавља на

Rt 9,02 min, a његов UV спектар одговара 7-О-супституисаним дериватима лутеолина ( Слика 22 ).

DAD1 A, Sig=350,4 Ref=400,100 (JELENAA\2011W~1\LUT9II.D) mAU

9.162 DAD1, 9.166 (1943 mAU,Apx) of LUT9II.D mAU 800

1750

700 1500

1250 600 1000

750 500

500

400 250

0 200 225 250 275 300 325 350 375 nm 300

200

100

0 5 10 15 20 25 30 35 min

Слика 22. Хроматограм и UV спектар једињења 5 добијени HPLC методом

Једињење 5, слично као и стандард S3 (лутеолин 7-О-глукозид) на танком слоју целулозе и силикагела гаси флуоресценцију стационарне фазе у UV светлости. Након дериватизације NP реагенсом флуоресцира жуто-наранџасто.

Са друге стране, Rf вредности стандарда S3 и једињења 5 у различитим хроматографским системима се не подударају ( Табела 35 ). На танком слоју целулозе након развијања хроматограма коришћењем воде као мобилне фазе, једињење 5 је, за разлику од стандарда S3 које се није покренуло са старта,

140

имало Rf вредност 0,81 што одговара особинама флавоноидних глукуронида (Markham, 1982 ).

Табела 35. Rf вредности једињења

Стационарна фаза

EtOAc 1 силикагел 100:11:11:26 CH 2 целулоза 15:75

3 целулоза H

Спектроскопска анализа једињења 5 Резултати спектроскопске анализе једињења реагенаса представљени су у Табели 36 у метанолу уочавају се трака I, са максимума на 256 nm и 268 nm, што одговара спектрима флавона и флавонола са супституентом у положају 3. Постојање два максимума у траци II карактеристично је за флавоноиде са

Табела 36. UV максимуми једињења шифт реагенаса

Спектар у присуству: Трак MeOH 345

+ AlCl 3 425

+ AlCl 3/HCl 353, 377 + NaOMe 410 + NaOAc 405

+ NaOAC/H 3BO 3 370

У присуству AlCl 3 трака I у спектру једињења 80 nm услед грађења комплекса. По додатку HCl изглед спектра се променио указујући на присуство хидроксилних група. Четири изражена екстремума у AlCl /HCl спектру одговарају спектрима комплекса 5 јоном, који су стабилни у киселој средини. 320–335 nm изостала је појава додатног максимума што одговара флавоноидима са супституисаном OH групом у положају 7.

в)

д)

Слика 23. UV спектри једињења 5 снимљени у метанолу и у присус реагенаса

а) у MeOH; б) у присуству AlCl 3; в) у присуству AlCl

NaOAc/H 3BO 3

У присуству NaOAc изостало је померања траке II што је карактеристика флавоноида са супституисаном OH груп слободном 7-OH групом и супституентима са кисеоником у положајима 6 или 8. Такође, у присуству NaOAc није дошло до декомпозиције спектра што указује да једињење у својој структури не садржи дихидроксилни или трихидроксил Спектроскопске карактеристике једињења шифт реагенаса одговарају хетерозидима лутеолина са шећерним делом везаним у положају 7 ( Mabry и сар., 1982 LC-MS анализа једињења 5 На хроматограму добијеном

Rt 8,64 min са сигналом депротонованог молекула Фрагментацијом депротонованог молекула што одговара хетерозиду лутеолина са две шећерне јединице. Појава m/z 351,1 указује на то да је шећерни део с глукуронске киселине, као и да је гликозидна веза остварена преко једне хидроксилне групе једињења 5 (Слика 24

*MSD1 SPC, time=8.641 of C:\CHEM32

100

40 285.1 285.1

20 286.1 286.1

200 300 m/z Слика 24. Спектар масе једињења при фрагментацији на 250 V

Једињење 5 је идентификовано као лутеолин 7 Од једињења изолованих у овом раду, у ранијим испитивањима само је розмаринска киселина (једињење присуство апигенин 7-О-глукуронида (једињење розмаринске киселине (једињење (Табеле 2 и 3). 3-O-(Метил-2-кафенил)-розмаринска киселина (једињење лутеолин 7-О-диглукуронид (једињење рода Thymus у овом раду.

9. Хемијска анализа и испитивање водено-метанолних екстраката хербе самониклог панонског тимијана

За разлику од добро и обимно проучаваних етарских уља и површинских флавоноида биљака рода Thymus , састојци поларних екстраката и даље нису довољно познати, а подаци о њиховим количинама су спорад доступни подаци о саставу поларних екстраката састав водено-метанолних екстраката биљака пореклом из Мађарске ( сар., 2010 ). Антиоксидантна активност екстраката ове врсте испитивана.

9.1. HPLC анализа водено-метанолних екстраката

У водено-метанолним екстрактима хербе панонског тимијана сакупљене 2011. на локалитетима и – у различитим фенофазама као и у екстрактима хербе сакупљене током цветања на локалитетима идентификовани су флавоноиди, пре свега хетерозиди апигенина и лутеолина, и Главна компонента свих испитиваних екстраката била је розмаринска киселина (једињење 2). Највећи удео овог једињења био је у водено екстрактима хербе сабране након периода цвета 3-O-(2-кафенил)-розмаринска киселина (једињење заступљенија у водено-метанолним екстрактима хербе панонског тимијана са Вршачких планина (локалитети 5, осталих локалитета (локалитети 10 розмаринска киселина (једињење 4) је детектованa само у екстрактима хербе пореклом са Вршачких планина. Од флавоноидних једињења, у свим испитиваним екстрактима су се у највећим количинама налазили 7-О-глукурониди апигенина и лут У испитиваним екстрактима су детектована и два једињења (

Rt 11,70 min) која према изгледу спектра и таласним дужинама апсорпционих максимума одговарају хетерозидима

Rt 9,65 min је LC-MS методом (Материјал и методе 4.5.3 глукуронид 6-хидрокси-лутеолина. Табела 37. Резултати HPLC анализе водено-метанолних екстраката хербе самониклог Th. pannonicus

Компонента екстракта: ) ) ) ) of of ) of ) of )

134 (315 mAU,Apx) mAU,Apx) (315 134 px) of GDJ180N1.D GDJ180N1.D of px)

- mAU, (244 DAD1,9.007 ) - mAU, (2057 DAD1,9.275 - mAU, (366 DAD1,9.581 - mAU, (415 DAD1,9.585 ) - mAU, (242 DAD1,10.021 (963 DAD1,11.075 - mAU, (3302 DAD1,11.163 ) - mAU, (603 DAD1,11.863 ) - mAU, (145 DAD1,14.771 ) - mAU, (389 DAD1,16.115 - mAU, (1083 DAD1,18.650 (635 DAD1,22.781 (509 DAD1,25.528 ) - mAU, (474 DAD1,27.634 ) - mAU, (426 DAD1,28.932 DDJ90N2.D of GDJ180N1.D of GDJ180N1.D 0706DB2.D GDJ180N1.D of GDJ180N1.D of mAU,Apx) I_DEVBUN.D of I_STOL.D of 1904SO1.D of GDJ180N1.D of 1907DB1.D of mAU,A GDJ180N1.D of mAU,Apx) GDJ180N1.D of DAD1,8. I_SOCICA.D of DEODOR2.D

-(2- R

О О ) ) ) ) ) 4 5 1 2 3 6- лутеолин лутеолин апигенин РК 3'-

-РК -РК -РК

дериват дериват 6- хетерозид хетерозид лутеолин

1 1 2 3 -(метил-2- -глукуонид* -глукуронид -глукуронид -диглукуронид О О О О О - - - - - (једињење (једињење min 28,90 апигенин 9,30 min min 9,30 катехина min 9,60 фенолкарбоксилна киселина min 9,65 хидроксилутеолин 7 min 10,05 хетерозид апигенина min 11,00 н.и. min 11,10 н.и. min 11,70 хетерозид флавона min 11,75 7 min 16,00 7 (једињење min 18,65 (једињење min 22,15 кафенил) (једињење min 25,55 н.и. min 27,50 3' кафенил) Фенофаза Локалитет/година min 8,15 апигенина min 9,00 7 (једињење 5/11 - + + + - + + - - + + +++ + ++ + - 8/11 + + ++ + - + + - - ++ + +++ + ++ + - 9/11 - + ++ + - + + - - ++ + ++++ + + + - Ф1 Ф1 10/11 - - + т. + - - + + ++ + +++ - - - - 11/11 + + + - + т. + + + ++ ++ +++ + - - - 5/11 - + ++ + - + + - - + + +++ ++ + + - 8/11 - + ++ + - + ++ - - + + ++++ +++ + + - 9/11 - + + + - + + - - + + +++ +++ + + - 10/11 - - + - + - - + + +++ ++ +++ + - - -

Ф2 Ф2 11/11 + + + - + + - + + +++ ++ +++ + + - - 12/11 - + ++ + + - - т. - ++ + ++++ + - - + 14/11 т. - ++ + + - - т. + ++ + +++ ++ - - + 15/11 - - + + - - - т. + ++ + ++++ + - - т. 5/11 - + ++ + - т. + - - + т. ++++ ++ + + - 8/11 + + ++ + т. + + - - + т. ++++ ++ + + - 9/11 - + ++ + т. т. + - - + - ++++ ++ + + - Ф3 Ф3 10/11 - - ++ + + - - + + + + ++++ - - - - 11/11 - - ++ + + - - + + + + ++++ + - - - *, Идентификација је извршена на основу података добијених LC-MS методом ( Материјал и методе 4.5.3 ). Локалитет: 5, Вршачке планине – Ђаков врх; 8, Вршачке планине – село Сочица; 9, Вршачке планине – кула; 10, Девојачки бунар; 11, Гребенац; 12, планина Стол код Бора – ливада; 14, планина Озрен; 15, планина Ртањ – село Врмџа. Фенофаза: Ф1, пре цветања; Ф2, током цветања; Ф3, након цветања. н.и., неидентификовано једињење. Садржај компоненти: –, компонента није детектована; т., <1%; +, 1–10%; ++ , 10– 20%; +++ , 20–40%; ++++ , >40%.

146

HPLC методом у водено-метанолним екстрактима одређен је садржај розмаринске киселине (РК), хетерозида апигенина и хетерозида лутеолина. Резултати одређивања садржаја РК у водено-метанолним екстрактима хербе самониклог Th. pannonicus сакупљене у различитим фенофазама дати су на Слици 25 .

160.00 146.80 140.00 123.93 120.59 120.00

100.00 93.38 Ф1 83.45 78.53 80.00 77.57 Ф2 68.05 57.97 58.14 57.22 Ф3 60.00 52.00 47.96 45.82 45.45 34.95

40.00 32.48 Садржај РК (mg/g) Садржај РК 26.55 20.00 0.00 5/11 8/11 9/11 10/11 11/11 12/11 14/11 15/11 Локалитет/година

Слика 25. Садржај розмаринске киселине (РК) у водено- метанолним екстрактима хербе Th. pannonicus сакупљене на природним стаништима у различитим фенофазама

Резултати су представљeни као средња вредност три одређивања ±Sd. Локалитет: 5, Вршачке планине – Ђаков врх; 8, Вршачке планине – село Сочица; 9, Вршачке планине – кула; 10, Девојачки бунар; 11, Гребенац; 12, планина Стол код Бора – ливада; 14, планина Озрен; 15, планина Ртањ – село Врмџа. Фенофаза: Ф1, пре цветања; Ф2, током цветања; Ф3, након цветања.

Водено-метанолни екстракти хербе самониклог панонског тимијана пореклом са локалитета у јужном Банату (локалитети 5, 8–11 ) сакупљене у различитим фенофазама садржавали су мању количину РК (26,55–93,38 mg /g) у односу на узорке пореклом са планина у источној Србији (локалитети 12 , 14 и 15 ) (120,59–146,80 mg/g). У погледу фенофазе, најниже концентрације РК су одређене у екстрактима хербе сакупљене током (26,55–78,53 mg/g), а највише у екстрактима хербе сакупљене након цветања (52,00–93,38 mg/g) на локалитетима у јужном Банату. Резултати одређивања садржаја укупних хетерозида апигенина у водено- метанолним екстрактима хербе самониклог Th. pannonicus сакупљене у различитим фенофазама представљени су на Слици 26 , а резултати одређивања садржаја укупних хетерозида лутеолина на Слици 27 .

147

Садржај укупних хетерозида апигенина у испитиваним водено- метанолним екстрактима износио је од количина у траговима до 8,53 mg/g, изражено као апигенин. Највише концентрације одређене су у екстрактима хербе сакупљене током цветања у Гребенцу (локалитет 11 ) (8,53 mg/g) и на планинима Озрен (локалитет 14 ) (8,39 mg/g) и Ртањ (локaлитет 15 ) (7,63 mg/g). Најмање количине су одређене у екстрактима хербе са Вршачких планина сакупљене на локалитетима 5 и 9 у све три фенофазе (од количина испод лимита квантификације до 1,54 mg/g).

9.00 8.53 8.39

8.00 7.63 7.00 6.00

4.95 Ф1 5.00 4.75 4.37 Ф2 4.00 (mg/g) Ф3

3.00 2.53 1.89 1.74 1.67 1.60 1.54

2.00 1.44 1.21 1.10 1.00 0.00 0.00 0.00

Садржајхетерозида апигенина 0.00 5/11 8/11 9/11 10/11 11/11 12/11 14/11 15/11 Локалитет/година

Слика 26. Садржај хетерозида апигенина, изражен као апигенин, у водено-метанолним екстрактима хербе Th. pannonicus сакупљене на природним стаништима у различитим фенофазама

Поређењем екстраката хербе сакупљене у различитим фенофазама на локалитетима у јужном Банату, изузев екстраката хербе са локалитета 8, садржај хетерозида апигенина био је виши у екстрактима хербе сакупљене током цветања (1,44–8,53 mg/g) него пре (1,10–4,37 mg/g) и после тог периода (од количина испод лимита квантификације до 1,74 mg/g). Водено-метанолни екстракти хербе сакупљене на природним стаништима садржавали су 3,12–17,25 mg/g хетерозида лутеолина, изражено

148

као лутеолин. Највеће количине одређене су у екстрактима хербе пореклом са локалитета 12 , 14 и 15 (планине у источној Србији) (15,27–17,25 mg/g). Екстракти хербе сакупљене пре и током цветања на локалитетима 5, 8 и 9 (Вршачке планине) садржавали су мању количину ових једињења (4,31–8,68 mg/g) него екстракти хербе сакупљене у истим фенофазама на локалитетима 10 (Девојачки бунар) и 11 (Гребенац) (10,18–14,18 mg/g). Концентрације хетерозида лутеолина у екстрактима хербе сакупљене након цветања на локалитетима у јужном Банату ( 5, 8–11 ) биле су релативно уједначене и износиле су 3,12–7,28 mg/g. У погледу фенофазе, варијације у садржају хетерозида лутеолина у екстрактима хербе са локалитета на Вршачким планинама ( 5, 8 и 9) биле су мање изражене него у екстрактима хербе пореклом са локалитета 10 и 11 у којима је садржај ових једињења био значајно виши у екстрактима хербе сакупљене пре и током цветања него након цветања. Поређењем моларних концентрација, уочава се да је садржај хетерозида лутеолина у сваком испитиваном екстракту био виши од садржаја хетерозида апигенина.

20.00 17.25 18.00 16.98

16.00 15.27 14.18 14.00 13.66

12.00 11.24 Ф1 10.18 10.00 8.68 Ф2 7.28 (mg/g) 8.00 Ф3 5.97 5.85 5.37 5.27 4.97 6.00 4.94 4.56 4.31

4.00 3.12 2.00

Садржајхетерозида лутеолина 0.00 5/11 8/11 9/11 10/11 11/11 12/11 14/11 15/11 Локалитет/година

Слика 27. Садржај хетерозида лутеолина, изражен као лутеолин, у водено-метанолним екстрактима хербе Th. pannonicus сакупљене на природним стаништима у различитим фенофазама

Резултати су представљeни као средња вредност три одређивања ±Sd. Локалитет: 5, Вршачке планине – Ђаков врх; 8, Вршачке планине – село Сочица; 9, Вршачке планине – кула; 10, Девојачки бунар; 11, Гребенац; 12, планина Стол код Бора – ливада; 14, планина Озрен; 15, планина Ртањ. Фенофаза: Ф1, пре цветања; Ф2, током цветања; Ф3, након цветања.

149

Састав испитиваних водено-метанолних екстраката панонског тимијана у складу је са постојећим подацима о саставу екстраката Thymus врста. У екстрактима су преовлађивала полифенолна једињења, пре свега фенолкарбоксилне киселине и деривати флавона. Од фенолкарбоксилних киселина (ФК) у водено-метанолним екстрактима испитиваним у овом раду детектована је розмаринска киселина (РК) и њени деривати. Друге ФК које се могу наћи у сродним врстама (кафена, ферулинска, хлорогенска, литосперминска) ( Pereira и Cardoso, 2013 ) нису идентификоване примењеним техникама. РК је била доминантна компонента свих испитиваних екстраката. Boros и сар. (2010) су испитивањем водено-метанолних екстраката панонског тимијана такође идентификовали РК као главну компоненту (948,51–1273,59 µg/g хербе), док је садржај кафене, хлорогенске и ферулинске киселине био 5 до 500 пута мањи. Рачунато на масу хербе, садржај РК у екстрактима панонског тимијана испитиваним у овом раду је износио 5,68–26,17 mg/g (0,57–2,62%), што је у опсегу концентрација који су утврђене и у Th. vulgaris (Pereira и Cardoso, 2013 ; Chizzola и сар., 2008 ). РК представља главну компоненту водено-алкохолних екстраката и других Thymus врста: Th. serpyllum , Th. praecox , Th. glabrescens , Th. pulegioides , Th. x citriodorus (Boros и сар., 2010 ; Fecka и Turek, 2008 ; Ložienè и сар., 2007 ; Pereira и сар., 2013 ). Са друге стране, у литератури постоје и подаци о саставу поларних екстраката Thymus врста код којих је РК присутна, али не представља главну компоненту. У екстрактима Th. serpyllum као доминантни састојци идентификовани су и литосперминска киселина или лутеолин 7-О- глукуронид ( Fecka и Turek, 2008 ). Поред РК, у екстрактима панонског тимијана испитиваним у овом раду у значајним количинама се налазио и њен дериват 3-O-(2-кафенил)-розмаринска киселина (салвианолинска киселина H, једињење 3). Ово једињење је први пут изоловано из Salvia cavaleriei H. Lév. (Zhang и Li, 1994 ), а потом и из Th. vulgaris од стране Dapkevicius и сар. (2002 ), који су утврдили и његову добру антирадикалску активност. Према доступној литератури, у роду Thymus 3-O-(2- кафенил)-РК је идентификована у екстрактима Th. vulgaris (Nagy и сар., 2011 ; Kozics и сар., 2013 ) и Th. x citriodorus (Pereira и сар., 2013 ). У испитиваним екстрактима Th. pannonicus утврђено је и присуство једињења 4, које по својој

150

структури представља 3''- или 4''-метил етар, или 9''-метил естар једињења 3. Метил естри једињења 3, клеродендранска киселина и ортосифска киселина D, су, за сада, изоловани из Clerodendranthus spicatus (Thunb.) C. Y. Wu (syn. Orthosiphon stamineus Benth.), Lamiaceae ( Zheng и сар., 2012 ; Sun и сар., 2014 ). Међутим, према доступној литератури, присуство структуре која би одговарала једињењу 4 овакве структуре до сада није утврђено у биљном царству. Од флавоноидних једињења у испитиваним екстрактима панонског тимијана доминантни су били хетерозиди лутеолина и апигенина. У свим екстрактима је садржај деривата лутеолина (3,12–17,25 mg/g екстракта, еквивалнетно 0,011–0,060 mM/g екстракта, односно 0,49–3,53 mg/g хербе) био већи од садржаја деривата апигенина (1,10–8,53 mg/g екстракта, еквивалентно 0,004–0,032 mM/g екстракта, односно 0,20–1,72 mg/g хербе), што је у складу са подацима о односима ових једињења код других Thymus врста ( Kulevanova и сар., 2001 ; Vila, 2002 ; Kozics и сар., 2013 ; Pereira и сар., 2013 ; Delgado и сар., 2014 ). Међу флавоноидима, најзаступљенији су били хетерозиди који у оквиру шећерног дела молекула имају остатак једног молекула глукуронске киселине, лутеолин 7-О-глукуронид и апигенин 7-О-глукуронид (једињење 1), док су остала једињења била заступљена у мањој мери. Лутеолин 7-О-глукуронид је раније идентификован и у водено-алкохолним екстрактима Th. membranaceus , Th. moroderi , Th. vulgaris , Th. serpyllum , Th. sipyleus , Th. x citriodorus (Tomás и сар., 1985 ; Vila, 1987 ; Justesen, 2000 ; Dapkevicius и сар., 2002 ; Nagy и сар., 2011 ; Fecka и Тurek, 2008 ; Miron и сар., 2011 ; Özgen и сар., 2011 ; Pereira и сар., 2013 ), док je присуство апигенин 7-О-глукуронида ређе утврђено, и то у Th. vulgaris , Th. serpyllum , Th. x citriodorus (Justesen, 2000 ; Nagy и сар., 2011 ; Miron и сар., 2011 ; Pereira и сар., 2013 ). Лутеолин 7-О-диглукуронид (једињење 5), према доступној литератури, до сада није изолован из Тhymus врста, али је развојем метода течне хроматографије са масеном спектрометријом у водено-етанолном екстракту Th. vulgaris утврђено присуство једињења која му одговарају по маси и фрагментацији ( Kozics и сар., 2013 ). У испитиваним водено-метанолним екстрактима детектована су два једињења која представљају хетерозиде 6 супституисаних флавона, 6-хидрокси- лутеолин глукуронид и неидентификовано једињење са ретенционим временом

Rt 11,70 min. Овакав тип једињења није неуобичајен за биљке рода Thymus , али су

151

досадашња испитивања углавном била усмерена ка липофилним (површинским) флавонима који се налазе у агликонском облику ( Vila, 2002 ; Marin и сар., 2003 ; Horwath и сар., 2008 ; Šoštarić, 2012 ). Према доступној литератури, присуство хетерозида 6-хидроксиапигенина (скутелареина) утврђено је само у Th. serpyllum и Th. mastichina , a хетерозида 6-хидрокси- лутеолина у Th. loscosii , Th. membranaceus и Th. mastichina (Vila, 2002 ; Gordo и сар., 2012 ). Флаванoни ериодиктиол, нарингенин и хесперетин, као и њихови хетерозиди, који се наводе као састојци екстраката различитих Thymus врста (Vila, 2002 ; Boros и сар, 2010 ; Fecka и Turek, 2008 ; Pereira и Cardoso, 2013 ), примењеним аналитичким методама нису идентификовани у испитиваним екстрактима панонског тимијана.

9.2. Анализа садржаја укупних полифенола у водено-метанолним екстрактима

Садржај укупних полифенола (СУП) у водено-метанолним екстрактима одређен спектрофотометријским поступком на основу реакције са FC реагенсом и изражен у еквивалентима галне киселине (ГК), износио је 100,03–215,37 mg ГК/g. Резултати су приказани на Слици 28 . Водено-метанолни екстракти херби сакупљених у јужном Банату (локалитети 5 и 8–11 ) пре и током цветања садржавали су нешто веће количине полифенола (172,06–215,37 и 171,75–213,50 mg ГК/g, редом) у односу на хербу сакупљену након цветања (100,03–188,47 mg ГК/g). У зависности од локалитета, просечан СУП био је већи у екстрактима хербе са локалитета на Вршачким планинама (локалитети 5, 8 и 9), и износио је 174,37–187,77 mg ГК/g, док је у екстрактима хербе пореклом из Девојачког бунара (локалитет 10 ) и Гребенца (локалитет 11 ) просечан СУП износио 163,45 и 162,84 mg ГК/g, редом. СУП у екстрактима хербе панонског тимијана пореклом са планина у источној Србији (локалитети 12 , 14 и 15 ) износио је 150,21–176,67 mg ГК/g. FC реакцијом одређена је маса ГК која одговара 1000 mg розмаринске киселине (РК) (722,56 mg ГК), на основу чега је израчунат удео РК у укупним

152

полифенолима испитиваних екстраката. Удео РК у укупним полифенолима водено-метанолних екстраката хербe из јужног Баната сакупљених пре (13,56– 29,49%) и током цветања (11,17–28,86%) био је у приближним опсезима, а након цветања удео се повећава (28,86–41.33%). У екстрактима хербе са планина Стол, Озрен и Ртањ, РК чини 51,11–60,04% укупних полифенола.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122232425262728293031323334353637383940 250

200 Ф1 Ф2 150 Ф3 РК (mg ГК/g)

100 СУП (mg ГК/g) СУП

0 5/11 8/11 9/11 10/11 11/11 12/11 14/11 15/11 Локалитет/година

Слика 28. Садржај укупних полифенола (СУП) и удео розмаринске киселине (РК) у укупним полифенолима у водено-метанолним екстрактима хербе Th. pannonicus сакупљене на природним стаништима у различитим фенофазама

Резултати су представљeни као средња вредност три одређивања ±Sd. Локалитет: 5, Вршачке планине – Ђаков врх; 8, Вршачке планине – село Сочица; 9, Вршачке планине – кула; 10, Девојачки бунар; 11, Гребенац; 12, планина Стол код Бора – ливада; 14, планина Озрен; 15, планина Ртањ. Фенофаза: Ф1, пре цветања; Ф2, током цветања; Ф3, након цветања. ГК, гална киселина.

У поређењу са доступним литературним подацима о садржају укупних полифенола (СУП) одређених на бази бојене реакције са FC реагенсом, испитивани водено-метанолни екстракти Th. pannonicus садржавали су количину полифенолних једињења која је у нивоу, или нешто већа него у већини водено-алкохолних и алкохолних екстраката других Thymus врста ( Delgado и сар., 2014 ; Roby и сар., 2013 ; Miron и сар., 2011 ; Armatu и сар., 2010 ; Rababah и сар., 2010 ; Ložienè и сар., 2007 ). Међутим, приметне су велике варијације у објављеним резултатима одређивања СУП. Најчешће испитивана херба Th. vulgaris садржи од само 0,58 mg ГК/100 g хербе, одређених у 80% метанолном

153

екстракту ( Wojdyło и сар., 2007 ), до значајно виших вредности: 4,52 g ГК/100 g хербе (Shan и сар., 2005 ) или 55 mg ГК/g 40%-ног метанолног екстракта (Spiridon и сар., 2011 ). Један од разлога оваквом распону разултата је утицај начина екстракције на принос екстракта и селективност екстракције полифенолних једињења. У претходним испитивањима ефикасности екстракције полифенола у зависности од примењеног растварача код различитих Thymus врста утврђено је да су смеше алкохола (метанола или етанола) и воде као екстрагенса давале бољи принос од концентрованог алкохола или воде појединачно, као и да не постоје значајне разлике у односу на примењени алкохол (метанол или етанол) ( Chizzola и сар. , 2008 ; Rababah и сар., 2010 ; Fecka и Turek , 2008 ). На основу ових података, може се сматрати да је применом 80%-ног метанола као растварача за екстракцију узорака хербе панонског тимијана принос екстракције полифенолних једињења квантитативан, и да рачунато на хербу СУП износи 9,93–47,45 mg ГК/g хербе (0,99–4,75%). У ранијем испитивању екстраката 92 биљке из различитих фамилија утврђен је широк опсег вредности СУП-а, 0,2–155,3 mg ГК/g осушеног биљног материјала, при чему је за већину лековитих биљака одређен умерен СУП од 9,1 до 23,1 mg ГК/g у биљном материјалу, укључујући и Th. vulgaris са 17,1 mg ГК/g (Kähkönen и сар., 1999 ). У поређењу са овим подацима, вредности СУП у херби панонског тимијана утврђене у овом раду се могу сматрати високим.

9.3. Испитивање in vitro антиоксидантне активности водено-метанолних екстраката

Антиоксидантни потенцијал водено-метанолних екстраката хербе панонског тимијана испитан је FRAP тестом, за одређивање укупне антиоксидантне активности, и DPPH тестом, за испитивање способности неутрализације слободних радикала. Резултати одређивања укупне антиоксидантне активности (УАА) водено- метанолних екстраката приказани су на Слици 29 .

154

УАА испитиваних водено-метанолних екстраката хербе Th. pannonicus пореклом са природних станишта износила је од 2,53 до 5,33 mmol Fe/g, при чему је FRAP вредност екстракaтa хербе сакупљене у јужном Банату (локалитети 5 и 8–11 ) била 2,53–5,33 mmol Fe/g, а екстраката хербе пореклом са планина у источној Србији (локалитети 12 , 14 и 15 ) 3,08–4,09 mmol Fe/g. Најјача активност екстраката хербе пореклом са локалитета 5 (Вршачке планине – Ђаков врх) и 11 (Гребенац) била је у случају хербе сакупљене пре цветања, са локалитета 9 (Вршачке планине - кула) у случају хербе сакупљене током, а са локалитета 8 и 10 у случају екстраката хербе сакупљене након периода цветања.

5 Ф1 Ф2 4 Ф3

3 РК (mmol Fe/g) (mmol Fe/g) 2 FRAP 1

0 5/11 8/11 9/11 10/11 11/11 12/11 14/11 15/11 Локалитет/година

Слика 29. Укупна антиоксидантна активност ( FRAP вредност) и удео розмаринске киселине (РК) у укупној антиоксидантној активности водено-метанолних екстраката хербе Th. pannonicus сакупљене на природним стаништима у различитим фенофазама

FRAP вредности испитиваних водено-метанолних екстраката (2,53–5,33 mmol Fe/g) билe су ниже од FRAP вредности стандарда аскорбинске киселине (7,41 mmol Fe/g) и стандарда розмаринске киселине (16,54 mmol Fe/g). Удео активности РК у УAA водено-метанолних екстраката хербе са локалитета 5 и 8–11 у јужном Банату износио је 11,26–43,27%, док је у екстрактима хербе сакупљене на планинама у источној Србији овај удео био преко 50%.

155

Резултати испитивања антирадикалске активности водено-метанолних

екстраката приказани су на Слици 30 . IC 50 вредности испитиваних екстраката хербе пореклом из јужног Баната износиле су 12,71–14,82 μg/mL за екстракте хербе сакупљене у периоду пре цветања, 12,92–16,08 μg/mL за екстракте хербе сакупљене током, и 14,24–23,68 μg/mL за екстракте хербе сакупљене након цветања. У овим екстрактима 8,79–35,30% антирадикалске активности било је последица присуства РК.

5/118/119/1110/1111/1112/1114/1115/11 25

20 Ф1 Ф2 15 Ф3 РК (μg/mL) (μg/mL) 10 50 IC 5

0 5/11 8/11 9/11 10/11 11/11 12/11 14/11 15/11 Локалитет/година

Слика 30. Анти-DPPH активност (IC 50 ) и удео розмаринске киселине (РК) у анти-DPPH активности водено-метанолних екстракaта хербе Th. pannonicus сакупљене на природним стаништима у различитим фенофазама

IC 50 вредности водено-метанолних екстраката хербе са планина у источној Србији износиле су 14,45–21,31 μg/mL, од чега је 46,31–65,91%

активности потицало од РК (IC 50 3,90 μg/mL).

У поређењу са стандардима аскорбинском киселином (IC 50 3,80 μg/mL) и

РК (IC 50 3,90 μg/mL), испитивани екстракти су испољили око 3–6 пута слабију

антирадикалску активност (IC 50 12,71–23,68 μg/mL).

Поларни екстракти биљака рода Thymus углавном испољавају снажну антиоксидантну активност. У већем броју испитивања кроз различите тестове

156

потврђена су редукциона и антирадикалска својства екстраката Th. vulgaris (Zheng и Wang., 2001 ; Shan и сар., 2005 ; Armatu и сар., 2010 ; Kozics и сар., 2013 ). Hossain и сар. (2010б ) су утврдили да је 80%-ни метанолни екстракт тимијана у поређењу са екстрактима других биљака фамилије Lamiaceae, рузмарином, ориганом, мајораном, жалфијом и босиљком, имао највећи садржај укупних полифенола и розмаринске киселине, као и највишу FRAP вредност. Са друге стране, постоје подаци и о слабијој активности екстраката појединих биљака рода Thymus , као и о варијацијама у активности екстраката биљака истог таксона. За инхибицију 50% DPPH радикала било је потребно 0,90–3,45 mg/mL метанолних екстраката хербе Th. mastichina из Шпаније ( Delgado и сар., 2014 ), док су екстракти хербе португалских биљака испољили значајно јачу

антирадикалску активност са IC 50 ~50 μg /mL ( Bentes и сар., 2009 ), која је и даље неколико пута слабијa од анти-DPPH активности екстраката Th. pannonicus добијених у оквиру овог рада. Антиоксидантна активност екстраката биљака рода Thymus доводи се у везу, пре свега, са присуством фенолкарбоксилних киселина и флавоноида, али и фенолa, тимолa и карвакролa, као и неких других мање поларних једињења, која се могу наћи у водено-алкохолним и алкохолним екстрактима ( Dapkevicius и сар., 2002 ; Ložienè и сар., 2007 ). У водено-метанолним екстрактима Th. pannonicus испитиваним у овом раду утврђено је присуство различитих полифенолних једињења. Високи редокс потенцијал ових једињења, који је последица присуства фенолне групе, омогућава да се она понашају као редукциони агенси и донори водоника (у

реакцијама са H 2O2, липидним пероксидима), као и директни "хватачи" слободних радикала. У реакцији са слободним радикалима, фенолно једињење се понаша као акцептор електрона. Услед делокализације примљеног електрона и резонантне стабилизације у ароматичном систему, спречавају су даље ланчане реакције слободних радикала. Фенолна једињења са орто -дихидроксилним групама имају способност комплексирања јона Fe 3+ и Cu 2+ , спречавајући реакције оксидације узроковане овим металима ( Miguel, 2010 ). Осим директног хемијског антиоксидантног деловања, полифеноли могу деловати на генетском и епигенетском нивоу, модулирајући експресију неких гена, a могу имати и утицај на активност ензима сигналних каскада ( Niki, 2010 ).

157

Антиоксидантна активност РК (једињење 2), која је доминантно једињење у испитиваним водено-метанолним екстрактима панонског тимијана, показана је у већем броју тестова. У поређењу са другим фенолкарбоксилним киселинама, кафеном, хлорогенском и ферулинском киселином, као и α- токоферолом и бутилхидрокситолуеном као референтним супстанцамa, испољила је најснажнију анти-DPPH активност ( Chen и Ho, 1997 ). Сматра се да се њено антиоксидантно деловање заснива на оксидацији орто -дихидроксилног система до хинона ( Fujimoto и Masuda, 2012 ). Испитивањем антиоксидантне активности полифенола жалфије (Salvia officinalis L.) установљена је изразита антиоксидантна активност РК и њених деривата (салвианолинских киселина K и I), која је била већа у поређењу са флавоноидним једињењима ( Lu и Foo, 2001 ). У испитивањима у овом раду, у поређењу са аскорбинском киселином (7,41 mmol Fe/g), за РК је одређена два пута већа FRAP вредност, док је анти-DPPH активност ова два једињења била приближна. За 3-О-(2-кафенил)-РК (салвинолинска киселина H, једињење 3) раније је утврђено да такође поседује антирадикалску активност, при чему је према DPPH радикалу испољила израженију способност неутрализације него према ABTS + радикалу (2,2'- азинобис-(3-етилбензотиазолин-6-сулфонат)) ( Dapkevicius и сар., 2002 ). За антиоксидантну активност флавоноида је значајно присуство 3'-OH групе у прстену B и α,β-незасићеног кетона у γ-пиронском прстену. Присуство додатне хидроксилне групе у прстену B има позитиван утицај на антиоксидантна својства, док се гликозилацијом флавоноидног молекула ефекат умањује у односу на агликон ( Miguel, 2010 ). Wang и сар. (1998) су утврдили да је анти-DPPH активност лутеолин 7-О-β-глукопиранозида већа од апигенинских хетерозида ( bis -глукозида и рутинозида). Слично, међу компонентама екстракта жалфије ( Salvia officinalis L.), антиоксидантна активност хетерозида лутеолина и његових деривата, међу којима посебно 6-хидроксилутеолин 7-О-глукозида и лутеолин 7-О-глукуронида, била је снажнија од активности хетерозида апигенина ( Lu и Foo, 2001 ). Kozics и сар. (2014) су закључили да је антирадикалски ефекат водено- етанолног екстракта Th. vulgaris последица присуства РК и других ФК (дихидрокафене, салвианолинске киселине К и I), и, у много мањој мери, хексозида и глукуронида лутеолина. При испитивању антиоксидaнатне

158

активности водено-етанолних екстраката Th. vulgaris , Chizzola и сар. (2008) су утврдили да је у FRAP и DPPH тесту 22–55% и 22–41% активности екстракта потицало од РК. У екстрактима панонског тимијана испитиваним у овом раду, удео РК у FRAP тесту износио је 11,26–64,75% укупне антиоксидантне активности екстраката, а допринос РК неутрализацији DPPH радикала износио је 8,79–65,91%. Највећи удео РК у антирадикалској и редукционој активности забележен је у екстрактима хербе сакупљене на локалитетима 12 , 14 и 15 на планинама у источној Србији, код којих је и садржај ове киселине био висок. У екстрактима хербе пореклом са Вршачких планина (локалитети 5, 8 и 9) се у значајном уделу јавља 3-О-(2-кафенил)-РК, па је допринос РК антиоксидантној активности мањи. Најмањи допринос РК антиоксидантној активности уочава се код екстраката хербе сакупљене у Девојачком бунару (локалитет 10 ) и Гребенцу (локалитет 11 ), код којих је удео хетерозида апигенина, лутеолина и 6-О-супституисаних флавоноида већи него у осталим екстрактима. Међутим, линеарна зависност укупне антиоксидантне и антирадикалске активности екстраката са садржајем укупних полифенола, розмаринске киселине, хетерозида лутеолина или садржајем хетерозида апигенина, није установљена. Иако често у корелацији (Rodríguez Vaquero и сар., 2010; Kukić и сар., 2006 ), антиоксидантни ефекат биљних екстраката не мора бити директно завистан од садржаја полифенолних једињења, што може бити у вези са саставом екстраката, присуством једињења других класа, присуством непознатих једињења, као и примењеним методама анализе и испитивања антиоксидантне активности. Испитивањем метанолних и водених екстраката биљака фамилије Lamiaceае, Stagos и сар. (2012) такође нису установили корелацију антиоксидантног ефекта са садржајем полифенолних једињења. У закључку, водено-метанолни екстракати Th. pannonicus одликовали су се високим садржајем укупних полифенола, са розмаринском киселином као главном компонентом. У значајним количинама присутни су и хетерозиди лутеолина и апигенина. Испољена јака антиоксидантна активност екстраката не може се приписати дејству неког од појединачних састојака, већ зависи од целокупног састава екстраката.

159

10. Хемијска анализа и испитивање in vitro антиоксидантне и антимикробне активности инфуза хербе самониклог панонског тимијана

Примена инфуза (биљних чајева) као освежавајућих и лековитих напитака је врло честа. Међутим, подаци о испитивању хемијског састава и активности инфуза у литератури су ретки. Оргaнолептичка и лековита својства инфуза зависе од састојака који се током припреме екстракцијом кључалом водом екстрахују из биљног материјала. У случају ароматичних биљака, као што су биљке рода Thymus , припремањем инфуза, поред екстракције растворљивих једињења, пре свега полифенола, у инфузе прелазе и мање поларни испарљиви састојци ( Tschiggerl и Bucar, 2012 ). Инфузи (5%, m/V ) хербе самониклог панонског тимијана сакупљене током периода цветања на локалитетима у јужном Банату (локалитети 5 и 8– 11 ) и на планинама у источној Србији (локалитети 12 , 14 и 15 ) испитани су у погледу хемијског састава, антиоксидантне и антимикробне активности.

10.1. HPLC анализа инфуза

HPLC анализом у испитиваним инфузима утврђено је присуство флавоноидa, хетерозида апигенина и лутеолина, и фенолкарбоксилних киселина, розмаринске киселинe и њених деривата (3-О-(2-кафенил)-РК и 3-О- (метил-2-кафенил)-РК). Резултати квалитативне и семиквантитативне HPLC анализе инфуза дати су у Tабели 38 . Као и у водено-метанолним екстрактима, главна компонента свих испитиваних инфуза била је РК (једињење 2). Поред РК, у инфузима хербе пореклом са Вршачких планина (локалитети 5, 8 и 9) као главна компонента јавља се и лутеолин 7-О-диглукуронид (једињење 5), а у значајним количинама присутна је 3-О-(2-кафенил)-РК (једињење 3). У инфузима хербе сакупљене на осталим локалитетима, у Девојачком бунару (локалитет 10 ), Гребенцу (локалитет 11 ), и на планинама у источној Србији (локалитети 12 , 14 и 15 ), поред РК, као доминатно једињење налазио се и лутеолин 7-О-глукуронид. Ови инфузи, посебно инфузи хербе са локалитета 12 (планина Стол - ливада),

160

Табела 38. Резултати HPLC анализе инфуза хербе самониклог Th. pannonicus

Компонента екстракта: ) ) ) ) of of ) of ) of )

J90N2.D J90N2.D

- mAU, (244 DAD1,9.007 ) - mAU, (2057 DAD1,9.275 - mAU, (366 DAD1,9.581 - mAU, (415 DAD1,9.585 ) - mAU, (242 DAD1,10.021 (963 DAD1,11.075 - mAU, (3302 DAD1,11.163 ) - mAU, (603 DAD1,11.863 ) - mAU, (145 DAD1,14.771 ) - mAU, (389 DAD1,16.115 - mAU, (1083 DAD1,18.650 (635 DAD1,22.781 (509 DAD1,25.528 ) - mAU, (474 DAD1,27.634 ) - mAU, (426 DAD1,28.932 DD of GDJ180N1.D of GDJ180N1.D 0706DB2.D GDJ180N1.D of GDJ180N1.D of mAU,Apx) I_DEVBUN.D of I_STOL.D of 1904SO1.D of GDJ180N1.D of 1907DB1.D of GDJ180N1.D of mAU,Apx) GDJ180N1.D of mAU,Apx) GDJ180N1.D of DAD1, 8.134 (315 mAU,Apx) mAU,Apx) (315 DAD1,8.134 I_SOCICA.D of DEODOR2.D

)

- - 1 - - О О О О -

) 4 -(2-

R флавона R

О О ) ) ) -

5 2 3 хетерозид хетерозид 7- лутеолин 7- апигенин РК 3'-

-РК -РК

дериват дериват 6- хетерозид хетерозид 7- лутеолин

дињење дињење 3 3 1 1 2 -(метил-2-кафенил)- О - 1,10 min 1,10 Локалитет/година Локалитет/година хетерпзид 6 хетерпзид min 11,75 глукуронид min 16,00 (једињење глукуронид min 18,65 (једињење min 22,15 кафенил) (једињење min 25,55 н.и. min 27,50 3' (је РК min 28,90 апигенин min 8,15 апигенина min 9,00 диглукуронид (једињење min 9,30 катехина min 9,60 фенолкарбоксилна киселина min 9,65 7 хидроксилутеолин глукуонид* min 10,05 апигенина min 11,00 н.и. 1 н.и. min 11,70 5/11 + ++ + + - + + - - + + +++ + + + - 8/11 + ++ + т. - + ++ - - + + +++ + + + - 9/11 + ++ + т. - + + - - + + +++ ++ + + - 10/11 - + + + + - - ++ - ++ ++ ++ т. т. - - 11/11 + + + + + + + ++ - ++ + +++ т. т. - - 12/11 - + + + + - - - ++ ++ + +++ т. т. - - 14/11 - + + + + - - - ++ ++ + +++ + т. - - 15/11 - - + + + - - + ++ ++ + +++ - т. - - *, Идентификација је извршена на основу података добијених LC-MS методом ( Материјал и методе 4.5.3 ). Локалитет: 5, Вршачке планине – Ђаков врх; 8, Вршачке планине – село Сочица; 9, Вршачке планине – кула; 10, Девојачки бунар; 11, Гребенац; 12, планина Стол код Бора – ливада; 14, планина Озрен; 15, планина Ртањ – село Врмџа. н.и., неидентификовано једињење. Садржај компоненти: –, компонента није детектована; т., <1%; +, 1–10%; ++ , 10–20%; +++ , 20–40%; ++++ , >40%.

161

14 (планина Озрен) и 15 (планина Ртањ – село Врмџа) у источној Србији, карактеришу се и вишим садржајем деривата 6-хидроксифлавона. Резултати одређивања садржаја РК у испитиваним инфузима дати су на Слици 31 , резултати одређивања садржаја хетерозида апигенина на Слици 32 , а резултати одређивања садржаја хетрозида лутеолина на Слици 33 .

1400

1200 1199.47 1086.63

1000 982.66

800 777.63

600 558.72 441.59 375.66 400 367.42 Садржај РК (mg/L) Садржај РК 200

0 5/11 8/11 9/11 10/11 11/11 12/11 14/11 15/11 Локалитет/година

Слика 31. Садржај розмаринске киселине (РК) у инфузима хербе самониклог Th. pannonicus

Садржај РК у инфузима хербе сакупљене током цветања на локалитетима 5, 8–12 , 14 и 15 износио је 367,42–1199,47 mg/L. Иако су водено-метанолни екстракти хербе пореклом са планина у источној Србији (локалитети 12 , 14 и 15 ) били најбогатији у погледу садржаја РК, количина ове фенолкарбоксилне киселине била је највећа у инфузима херби пореклом са Вршачких планина (локалитети 5, 8 и 9) (982,66–1199,47 mg/L). Најнижа концентрација РК нађена је у инфузу хербе сакупљене у Гребенцу (локалитет 11 ). Садржај хетерозида апигенина у инфузима хербе сакупљене на локалитетима 8, 9, 11 , 12 , 14 и 15 није значајније варирао и износио је 45,35– 63,93 mg/L. У инфузу хербе сакупљене на Ђаковом врху на Вршачким планинама (локалитет 5) одређен је најнижи (23,41 mg/L), а у инфузу хербе пореклом из Девојачког бунара (локалитет 10 ) највиши садржај ових једињења (93,29 mg/L).

162

Kao у водено-метанолним екстрактима хербе самониклог панонског тимијана, и у инфузима je садржај хетерозида лутеолина био већи од садржаја хетерозида апигенина и износио је 109,62–259,61 mg/L.

100 93.29 90 80

70 63.93 59.52

60 54.31 52.73 47.17 50 45.35

(mg/L) 40 30 23.41 20 10

Садржајхетерозида апигенина 0 5 8 9 10 11 12 14 15 Локалитет/година

Слика 32. Садржај хетерозида апигенина, изражен као апигенин, у инфузима хербе самониклог Th. pannonicus

300 250.61 250

200 188.77 169.20 163.00 154.96 138.09 150 137.30 109.62 (mg/L) 100

Садржајхетерозида лутеолина 0 5 8 9 10 11 12 14 15 Локалитет/година

Слика 33. Садржај хетерозида лутеолина, изражен као лутеолин, у инфузима хербе самониклог Th. pannonicus

163

У поређењу са саставом одговарајућих водено-метанолних екстраката (Табела 37 ) не уочавају се значајније разлике у међусобним односима компоненти, осим што је у инфузима удео РК и/или њених деривата мањи, а удео лутеолин 7-О-диглукуронида већи него у водено-метанолним екстрактима. Слично је установљено и испитивањима екстраката листа Lippia citriodora Humb. B. et Kwidely, где je садржај глукуронида лутеолина и/или апигенина био већи у воденим (декоктима и инфузима) него у етанолним екстрактима (Bilia и сар., 2008 ). Поред тога, у инфузима хербе сакупљене на планинама у источној Србији (локалитети 12 , 14 и 15 ) испитиваним у овом раду, релативни садржај хетерозида 6-О-супституисаних флавона већи је него у одговарајућим водено- метанолним екстрактима. Овакве разлике могу бити последица различите растворљивости компоненти у растварачима коришћеним за екстракцију.

10.2. Анализа садржаја укупних полифенола у инфузима

Резултати одређивања садржаја укупних полифенола (СУП) у инфузима хербе панонског тимијана на бази реакције са FC реагенсом изражени су у еквивалентима галне киселине (ГК) и приказани на Слици 34 .

2500

2000

1500

РК (mg ГК/L) 1000 СУП (mg СУП ГК/L)

500

0 5/11 8/11 9/11 10/11 11/11 12/11 14/11 15/11 Локалитет/година

Слика 34. Садржај укупних полифенола (СУП) и удео розмаринске киселине (РК) у укупним полифенолима у инфузима хербе самониклог Th. pannonicus

164

СУП у испитиваним инфузима износио je 1122,25–1979,93 mg ГК/L. Највеће количине одређене су у инфузима хербе са Вршачких планина (локалитети 5, 8 и 9) (1786,24–1979,93 mg ГК/L). Удео РК у укупним полифенолима испитиваних инфуза (17,99–43,96%) био је највећи у инфузима херби са Вршачких планина (локалитети 5, 8 и 9), а најмањи у инфузима херби са локалитета 10 (Девојачки бунар) и 11 (Гребенац). И у ранијим испитивањима установљен је висок садржај укупних полифенола у инфузима хербе биљака рода Thymus у поређењу са инфузима других биљака ( Komes и сар., 2011 ; Gião и сар., 2007 ; Mata и сар., 2007 ; Katalinic и сар., 2006 ). Као и у инфузима хербе панонског тимијана испитиваним у овом раду, главни састојак инфуза херби других Thymus врста била је розмаринска киселина (РК) ( Komes и сар., 2011 ; Fecka и Turek, 2008 ; Kulišić и сар., 2006 ).

10.3. Анализа хедспејс фракције инфуза

Количина и састав испарљиве фракције инфуза зависе од особина испарљивих једињења која се налазе у биљном материјалу ( Tschiggerl и Bucar, 2012 ; Carnat и сар., 2004 ; Carnat и сар., 1999 ). Напон паре компоненти и њихова растворљивост у води утицали су, како на састав инфуза и на успостављање равнотеже између хедспејс (ХС) фракција и течне фазе инфуза при примењеним условима ХС екстракције. Мања молекулска маса и присуство кисеоника у структури олакшавају екстракцију једињења из биљног материјала у инфуз, док је прелазак једињења из инфуза у ХС фракцију такође олакшан код једињења мање молекулске масе, али и мање поларности. Поред тога, растворљивост мање поларних једињења у инфузу зависи и од присуства других биљних метаболита, као што су нпр. сапонозиди који могу спречити испаравање и прелазак једињења у ХС фазу ( Tschiggerl и Bucar, 2012 ). Резултати анализе ХС фракција инфуза хербе Th. pannonicus сакупљене на локалитетима 5, 8–12 , 14 и 15 , приказани су у Табели 39 . На основу укупне површине хроматограма добијеног са пламено- јонизационог детектора може се закључити да су се највеће количине испарљивих компоненти налазиле у ХС фракцијама инфуза хербе сакупљене на

165

локалитетима 5 и 8, а најмање у ХС фракцији инфуза хербе са локалитета 15 , у којој је детектована само једна компонента. Највећи број компоненти (10) детектован је у фракцијама инфуза хербе сакупљене на локалитетима 5 (Вршачке планине – Ђаков врх) и 11 (Гребенац).

Табела 39. Састав хедспејс фракција инфуза хербе самониклог Th. pannonicus

Узорак (локалитет/година) 5/11 8/11 9/11 10/11 11/11 12/11 14/11 15/11 Компоненте: КИЛ КИЕ % % % % % % % % 1 α-Пинене 932 944,7 ------5,17 - 2 1-Октен-3-он 972 988,4 - - - - - 9,18 - - 3 1-Октен-3-ол 974 988,5 2,82 5,62 5,07 - 30,42 - 33,34 - 4 3-Октанон 979 996,8 14,92 17,17 10,45 40,27 - - - - 5 Мирцен 988 999,0 - - - - - 16,02 - - 6 α-Тeрпинен 1014 1023,7 3,20 4,61 2,79 - - - - - 7 1,8-Цинеол 1026 1037,5 7,02 12,74 5,17 38,09 25,51 13,43 32,33 100,00 8 γ-Терпинен 1054 1064,2 5,84 5,17 4,30 - - 4,17 - - 9 Роузфуран 1091 1102,2 2,56 т. 2,47 - - - - - 10 Линалол 1095 1105,6 - - - 11,35 10,43 49,08 15,62 - 11 Камфор 1141 1103,6 2,07 - - - - 8,13 5,29 - 12 trans -Хризантемал 1153 1154,3 4,42 5,39 2,33 - - - - - 13 Борнеол 1165 1172,1 - - - - 4,42 - - - 14 Терпинен-4-ол 1174 1182,0 - - - - 2,77 - - - 15 Нерал 1235 1245,0 28,10 25,57 31,91 - - - - - 16 Гераниал 1264 1274,6 29,05 23,72 35,50 - - - - - 17 Дихидроедулан I 1289 1291,7 - - - - 4,03 - - - 18 Тимол 1289 1298,3 - - - - 12,99 - - - 19 Гермакрен D 1484 1489,4 - - - 10,30 - - - - Идентификовано 100,00 100,00 100,00 100,00 90,56 100,00 91,76 100,00 Монотерпенски угљоводоници 9,04 9,79 7,10 - - 20,18 5,17 - Кисеонични монтерпени 73,22 67,42 77,39 49,44 56,11 70,63 53,25 100,00 Сесквитрепенски угљоводоници - - - 10,30 - - - - Кисеонични сесквитерпени ------Остале класе једињења 17,74 22,79 15,51 40,27 34,45 9,18 33,34 - Укупна површина хроматограма 230355 105440 210749 38007 89253 94878 67498 6906 Локалитет: 5, Вршачке планине – Ђаков врх; 8, Вршачке планине – село Сочица; 9, Вршачке планине – кула; 10, Девојачки бунар; 11, Гребенац; 12, планина Стол код Бора – ливада; 14, планина Озрен; 15, планина Ртањ – село Врмџа. %, релативни удео компоненте у етарском уљу; КИЛ, литературни Ковачев индекс; КИЕ, експериментално одређен Ковачев индекс, израчунат као средња вредност индекса добијених за сваки узорак; н.и., неидентификовано ; т, трагови; -, компонента није детектована.

У ХС фракцијама инфуза детектовано је укупно 22 једињења. Деветнаест идентификованих једињења представљала су 91,76–100,00% фракција. Доминантна класа једињења у свим испитиваним ХС фракцијама инфуза били су кисеонични монотерпени (49,44–100,00%), уз висок удео алифатичних

166

нетерпенских једињења (30,42-40,27%) у узорцима са локалитета 10 (Девојачки бунар), 11 (Гребенац) и 14 (планина Озрен). Гераниал (23,72–35,50%), нерал (25,57–31,91%) и 3-октанон (10,45–17,17%) били су главне компоненте ХС фракција инфуза хербе са локалитета на Вршачким планинама (локалитети 5, 8 и 9), а ХС фракција инфуза хербе са локалитета 8 (Сочица) садржавала је и висок удео 1,8-цинеола (12,74%). У ХС фракцији инфуза хербе пореклом из Девојачког бунара (локалитет 10 ) идентификовани су 3-октанон (40,27%), 1,8-цинеол (38,09%), линалол (11,35%) и гермакрен D (10,30%) као једино сесквитерпенско једињење детектовано у испитиваним ХС фракцијама. У ХС фракцијама инфуза хербе са локалитета 11 (Гребенац) и 14 (планина Озрен) најзаступљенија једињења била су 1-октен-3-ол (30,42–33,34%), 1,8-цинеол (25,51–32,33%), и линалол (10,43–15,62%). Тимол, једињење карактеристично за врсте рода Thymus , јавља се једино у ХС фракцији инфуза хербе пореклом из Гребенца (12,99%), чије је и етарско уље једино међу испитиваним садржавало значајније количине овог монотерпенског фенола. Главна компонента ХС фракције инфуза хербе са планине Стол (локалитет 12 ) био је линалол (49,08%). ХС фракцију инфуза хербе са локалитета 15 (планина Ртањ – село Врмџа) представљао је 1,8-цинеол, који је и једина компонента која је детектована у свим испитиваним узорцима (5,17–100,00%).

Количина компоненти у ХС фракцијама испитиваних у овом раду била је највећа код инфуза хербе сакупљене на Вршачким планинама (локалитети 5, 8 и 9), указујући на висок садржај испарљивих компоненти у инфузима, односно на добру растворљивост испарљивих једињења хербе у води. ХС фракције осталих испитиваних инфуза су садржавале мање количине једињења, што је у складу са садржајем и саставом етарских уља збирних узорака хербе ( Резултати и дискусија 7 ) која је коришћена и за припрему испитиваних инфуза. Етарска уља хербе из Гребенца (локалитет 11 ) и са планине Стол (локалитет 12 ) су као доминантне класе једињења садржавала кисеоничне монотерпене и сесквитерпенске угљоводонике што је резултовало умереном количином састојака у ХС фракцијама инфуза. Етарска уља херби чија је ХС фракција инфуза

167

садржавала најмање количине једињења (локалитети 10 , 14 и 15 ), као доминантне састојке садржавала су слабије растворна и мање испарљива сесквитерпенска једињења. Висок садржај цитрала (гераниала и нерала) у ХС фракцији инфуза хербе пореклом са Вршачких планина указује на висок садржај ових алдехида у инфузу. Њихова релативно добра растворљивост у води (1,7 g/L на 25 °C) (SciFinder, 2013б ; SciFinder, 2013в ) омогућава висок степен екстракције цитрала при припреми инфуза ( Carnat и сар., 1999 ). Линалол, за кога је ранијим испитивањима установљено да се припремом инфуза у великој мери екстрахује из биљног материјала ( Carnat и сар., 1999 ), није детектован у ХС фракцијама инфуза хербе пореклом са Вршачких планина, иако jе у малом проценту (0,1–0,5%) био присутан у одговарајућим етарским уљима. Са друге стране, иако је садржај овог једињења у етарским уљима хербе сакупљене у Девојачком бунару, Гребенцу и на планини Озрен (локалитети 10 , 11 и 14 ) такође био мањи од 1%, заступљеност линалола у одговарајућим ХС фракцијама инфуза била је значајна (10,43–15,62%). Овакви резултати могу бити у вези са различитим облицима у којима се линалол налази у биљном материјалу (слободан или гликозидно везан), као и чињенице да његово присуство у етарском уљу може бити последица хемијских реакција које се одигравају током дестилације воденом паром (нпр., хидролиза линалилацетата) (Ormeño и сар., 2011 ; Мastelić и сар., 2000 ; Lockwood, 2001 ). У ХС фракцијама инфуза хербе сакупљене на Вршачким планинама у значајнијем проценту јављају се 3-октанон, α-терпинен и γ-терпинен, који се у одговарајућим етарским уљима налазе у количинима у траговима (<0,01%). Поред наведених једињења, у значајно већим концентрацијама него у одговарајућим етарским уљима, у ХС фракцијама испитиваних инфуза, посебно инфуза хербе са локалитета 10 , 11 и 14 , јављају се 1-октен-3-ол и 1,8-цинеол. Испарљивост ових једињења је висока ( SciFinder, 2013и ; SciFinder, 2013е ), што резултује високим садржајем у ХС фракцијама, али исто тако може бити и узрок њиховог губитка током дестилације воденом паром и мањег садржаја у етарским уљима. 1,8-Цинеол, 3-октанон и 3-октанол су релативно хидрофилни (log P 2,506–2,795) (SciFinder, 2013е ; SciFinder, 2013ј ; SciFinder, 2013к ), што

168

омогућава њихову потпунију екстракцију током израде инфуза, што је у случају 1,8-цинеола потврђено и у ранијим испитивањима ( Tschiggerl и Bucar, 2010 ).

10.4. Испитивање in vitro антиоксидантне активности инфуза

Укупна антиоксидантна активност (УАА) инфуза хербе панонског тимијана испитана је FRAP тестом, а способност неутрализације слободних радикала DPPH тестом. Резултати одређивања FRAP вредности испитиваних инфуза приказани су на Слици 35 . УАА износила је 68,09–124,58 mmol Fe/L, при чему је 6–16% активности потицало од присутне РК ( FRAP вредност 16,54 mmol Fe/g).

140

120

100

80 РК (mmol Fe/L )

(mmol Fe/L) 60

40 FRAP

0 5/11 8/11 9/11 10/11 11/11 12/11 14/11 15/11 Локалитет/година

Слика 35. Укупна антиоксидантна активност ( FRAP вредност) и удео розмаринске киселине (РК) у укупној антиоксидантној активности инфуза хербе самониклог Th. pannonicus

Инфузи хербе самониклог панонског тимијана показали су и добру

антирадикалску активност (IC 50 1,32–2,96 μL/mL), при чему је 14,98–53,07% активности било последица присуства РК ( Слика 36 ).

169

3,5

2,5

(μL/mL) 1,5 РК (μL/mL ) 50 IC 1

0,5

0 5/11 8/11 9/11 10/11 11/11 12/11 14/11 15/11 Локалитет/година

Слика 36. Анти-DPPH активност (IC 50 ) и удео розмаринске киселине у анти-DPPH активности инфуза хербе самониклог Th. pannonicus

У зависности од примењеног теста, најјачу антиоксидантну активност међу инфузима испитиваним у овом раду испољили су инфузи хербе сакупљене на Вршачким планинама (локалитети 5, 8 и 9), код којих је и садржај РК био највећи, као и инфуз хербе пореклом из Девојачког бунара (локалитет 10 ). Овај инфуз се карактерисао умереним садржајeм РК и вишим садржајем флавоноидних хетерозида, посебно апигенина, што, ако се узму у обзир разматрања дата у поглављу Резултати и дискусија 9.3 , не објашњава испољену активност. Релативно добра антиоксидантна активности инфуза хербе пореклом са планине Озрен (локалитет 14 ) може се довести у везу са релативно високим садржајем РК и највишим одређеним садржајем хетерозида лутеолина међу испитиваним инфузима. Међутим, инфузи хербе сакупљене у Гребенцу (локалитет 11 ) и на планини Ртањ (локалитет 15 ) деловали су снажније у односу на најслабије активан инфуз хербе са планине Стол (локалитет 12 ), иако су садржавали ниже количине РК и флавоноидних хетерозида. У ранијим испитивањима утврђена је висока антиоксидантна активност инфуза хербе биљака рода Thymus у поређењу са инфузима других биљака и углавном се приписује полифенолним састојцима екстраката ( Komes и сар.,

170

2011 ; Gião и сар., 2007 ; Mata и сар., 2007 ; Katalinic и сар., 2006 ; Kulišić и сар., 2006 ; Triantaphyllou и сар., 2001 ). Корелационом анализом садржаја полифенолних састојака и испољене in vitro антиоксидантне активности инфуза испитиваних у овом раду установљена је линеарна зависност само између садржаја укупних полифенола (СУП) и укупне антиоксидантне активности (УАА) (израчуната вредност Пирсоновог коефицијента: 0,98). Корелација између садржаја РК, хетерозида лутеолина или хетерозида апигенина са антиоксидaнтном активношћу није утврђена. Такође, удео РК, за коју се сматра да доприноси антиоксидантном ефекту више него флавоноидна једињења ( Kozics и сар., 2013 ), у УАА био је само 6,04–15,92%. Преостали део редукционе способности инфуза последица је присуства других састојака. Раније је запажено да се антиоксидантна активност поларних екстраката Thymus врста разликује у зависности од хемотипа одређеног на основу састава етарског уља ( Ložienè и сар., 2007 ; Chizzola и сар., 2008 ). Осим тога, у различитим испитивањима утврђена је добра антиоксидантна активност већине једињења одређених у ХС фракцијама испитиваних инфуза. Фенолни монотерепен тимол, детектован у ХС фракцији инфуза хербе пореклом из Гребенца (локалитет 11 ), као и монотерпенски угљоводоници α-терпинен и γ-терпинен, детектовани у ХС фракцијама инфуза хербе сакупљане на Вршачким планинама (локалитети 5, 8 и 9), били су међу најактивнијим терпенским једињењима у погледу инхибиције липидне пероксидације ( Ruberto и Barrata, 2000 ). Са друге стране, у истим тестовима, као и у анти-DPPH тесту (Mishra и сар., 2013 ), гераниал и нерал (цитрал), главне компоненте ХС фракција инфуза хербе са Вршачких планина, нису испољили значајнији антиоксидантни ефекат, што је у складу са резултатима испитивања у овом раду, где је утврђено да антиоксидантном ефекту инфуза хербе са Вршачких планина у највећој мери допринела РК, односно допринос осталих једињења био је мање значајан. ХС фракција инфуза хербе сакупљене на Столу код Бора (локалитет 12 ) у највећем проценту садржавала је линалол за који је утврђено да поседује прооксидантна својства ( Ruberto и Barrata, 2000), као и да практично не неутрализује DPPH радикал ( Mishra и сар., 2013 ), што може објаснити најслабију антиоксидантну активност овог инфуза међу испитиваним у овом раду. Ruberto и Barrata (2000)

171

су такође утврдили слабу антиоксидантну активност 1,8-цинеола, који је детектован у ХС фракцијама свих испитиваних инфуза. Уз то, ово једињење само у већим концентрацијама доводи до неутрализације DPPH радикала ( Mishra и сар., 2013 ), а слаба антиоксидантна активност појединих етарских уља Thymus врста доводи се у везу са високим садржајем 1,8-цинеола ( Miguel и сар., 2007 ). У ХС фракцији инфуза хербе прикупљене на планинини Ртањ (локалитет 15 ) 1,8- цинеол представља једину детектовану компоненту, што се може повезати са релативно слабом антиоксидантном активношћу овог инфуза у поређењу са осталим испитиваним инфузима.

10.5. Испитивање антимикробне активности инфуза

Резултати испитивања антимикробне активности 5%-них инфуза хербе панонског тимијана микродилуционом методом, према 4 соја Грам(+) и 3 соја Грам(–) бактерија, као и једном соју гљивице Candida albicans дати су у Табели 40 .

Табела 40. Антимикробна активност инфуза хербе самониклог Th. pannonicus

5923 Микроорганизам aureus Staphylococcus ATCC 2 epidermidis Staphylococcus ATCC 12228 subtilis Bacillus ATCC 6633 faecalis Enterococcus ATCC 29212 coli Escherichia ATCC 10536 pneumoniae Klebsiella 9111 NCIMB aeruginosa Pseudomonas ATCC 9027 albicans Candida ATCC 10231

Локалитет/година МИК (µL/mL) 5/11 125,00 125,00 125,00 125,00 125,00 125,00 250,00 31,25 8/11 >500,00 250,00 250,00 250,00 125,00 125,00 250,00 62,50 9/11 125,00 125,00 125,00 125,00 125,00 125,00 125,00 62,50 10/11 125,00 250,00 250,00 125,00 125,00 250,00 250,00 31,25 11/11 62,50 125,00 125,00 125,00 125,00 125,00 250,00 31,25 12/11 62,50 62,50 250,00 125,00 250,00 125,00 250,00 62,50 14/11 500,00 250,00 250,00 125,00 250,00 250,00 250,00 62,50 15/11 >500,00 >500,00 500,00 >500,00 >500,00 >500,00 >500,00 31,25 МИК, минимална инхибиторна концентрација.

У испитиваном опсегу концентрација, сви инфузи су довели до заустављања раста свих микроорганизама, осим инфуза хербе из села Сочица на

172

Вршачким планинама (локалитет 8), који није испољио ефекат према соју Staphylococcus aureus , и инфуза хербе пореклом са планине Ртањ (локалитет 15 ), који је показао активност једино према соју C. albicans и Грам(+) бактерији Bacillus subtilis . Инхибиција раста Грам(+) бактерија постигнута је концентрацијама инфуза од 62,50–500 µL/mL, а Грам(–) 125–250 µL/mL ( Слика 37 ). Ако се изузме најслабије активан инфуз хербе пореклом са планине Ртањ (локалитет 15 ), заустављање раста 5 од 7 испитиваних сојева бактерија: Bacillus subtilis , Enterococcus faecalis , Escherichia coli , Klebsiella pneumoniae и Pseudomonas aeruginosa , постигнуто је са концентрацијама инфуза 125–250 μL/mL. Бактериостатски ефекат према соју S. aureus , у зависности од инфуза, постигнут је са 62,50–500,00 μL/mL, при чему инфузи хербе сакупљене на локалитетима 8 и 15 нису показали активност. Раст соја Staphylococcus epidermidis инхибиран је у присуству 62,50–250,00 μL/mL инфуза. Сви испитивани инфузи испољили су најјачу антимикробну активност према гљивици C. albicans (МИК 31,25–62,50 μL/mL).

S. aureus 5 S. epidermidis B. subtilis 4 E. faecalis E.coli 3

Фреквенца K. pneumoniae P. aeruginosa 2 C. albicans

0 31.25 62.50 125.00 250.00 500.00 >500.00 MIK (μL/mL)

Слика 37. Број инфуза (фреквенца) којим је одређеном МИК постигнуто заустављање раста соја микроорганизма

Осетљивост Грам(+) и Грам(–) бактерија према већини инфуза испитиваних у овом раду била је подједнака ( Слика 38 ). Инфуз хербе пореклом из Гребенца (локалитет 11 ) остварио је најснажнији ефекат према тестираним сојевима микроорганизама, осим према соју P. aeruginosa , према коме је инфуз пореклом са Вршачких планина – кула (локалитет 9) испољио јачу активност.

173

Испитивањем антимикробне активности стандарда РК (опсег концентрација 2–64 μg/mL) није уочена инхибиција раста испитиваних сојева микроорганизама, што је у складу са литературним подацима о слабој антимикробној активности РК ( Moreno и сар., 2006 ; Klančnik и сар. 2010 ).

30 Грам(+) 25 Грам(-) 20 Фреквенца 15

0 31.25 62.50 125.00 250.00 500.00 >500.00 MIK (μL/mL)

Слика 38. Број инфуза (фреквенца) којим је одређеном МИК постигнуто заустављање раста сојева Грам(+) и сојева Грам(–) бактерија Број инфуза тестираних према Грам(+), односно Грам(–) бактеријама нормиран је на 100.

У ранијим испитивањима установљено је да различити секунадарни метаболити биљака, полифеноли, састојци етарског уља, неиспарљива терпенска једињења, алкалоиди, и др., могу доприносити антимикробном ефекту биљних екстраката ( Cowan, 1999 ). Rodríguez Vaquero и сар. (2010) су закључили да су за бактерицидни и бактериостатски ефекат инфуза неколико биљка које су испитивали одговорна полифенолна једињења, јер је након уклањања полифенолне фракције антимикробни ефекат изостао. Са друге стране, иако богат полифенолним једињењима и са високим антиоксидантним потенцијалом, инфуз Moltkia petrea (Tratt.) Griseb. није деловао инхибиторно према микроорганизмима ( Zovko Končić и сар., 2010 ), а инфуз Teucrium arduini L. је био активан само према соју S. aureus (Šamec и сар., 2010 ). Испитивањем метанолних и водених екстраката биљака фамилије Lamiaceае, Stagos и сар. (2012) такође нису установили корелацију антибактеријског ефекта са садржајем полифенолних једињења, а суви остатак инфуза хербе Th. fallax Fisch

174 et Mey., и поред добре антиоксидантне активности, испољио је слаб антибактеријски ефекат ( Unal и сар., 2008 ). Механизам антимикробног дејства флавоноидних једињења није до краја разјашњен, али је њихова активност показана у већем броју испитивања. Подаци о доброј антимикробној активности углавном се односе на флавоноле, флаваноле, флаваноноле и изофлавоне. Сматра се да ова једињења делују тако што доводе до нарушавања структуре ћелијске мембране микроорганизама, инхибирају синтезу ћелијског зида и ћелијске мембране, инхибирају синтезу нуклеинских киселина, или ремете производњу енергије ( Cushnie и Lamb, 2011 ). Међу неколико секундарних метаболита изолованих из Cynara cardunculus L., лутеолин је испољио је најјачу антимикробну активност (MИК 50– 100 μg/mL) према свим тестираним сојевима бактерија ( Salmonella typhimurim , Еsherichia coli , Bacillus subtilis , Staphylococcus epidermidis и Staphylococcus aureus ), док је апигенин показао умерени ефекат (MИК 100–150 μg/mL). Инхибиција раста бактерија 7-О-глукозидима апигенина и лутеолина постигнута је при једнаким концентрацијама ових хетерозида (МИК 100–150 μg/mL), осим у случају соја B. subtilis који је био осетљивији према хетерозиду апигенина. Неколико испитиваних сојева гљивица (родова Aspergillus , Penicillium , Trichoderma , Fusarium и Alternaria ) такође је било осетљивије на дејство лутеолина и подједнако осетљиво на апигенин и лутеолин 7-О-глукозиде, али је према једном соју апигенин 7-О-глукозид био активнији ( Kukić и сар., 2008 ). Са друге стране, у неким испитивањима је установљена већа осетљивост бактерија према апигенину или његовим хетерозидима у поређењу са одговарајућим дериватима лутеолина ( Sato и сар., 2000 ; Basile и сар., 1999 ). Уочена је и мања активност хетерозида флавоноида у поређењу са одговарајућим агликонима што се објашњава слабијом интеракцијом хидрофилнијих хетерозида са липофилном мембраном микроорганизма ( Wu и сар., 2013 ). Инфузи хербе панонског тимијана пореклом са локалитета 5 и 9 на Вршачким планинама испољили су међусобно сличан антимикробни ефекат (Табела 40 ; Слика 39 ). Према квалитативном саставу и испољеној антиоксидантној активности њима сличан инфуз хербе са локалитета 8 испољио је нешто слабију антимикробну активност. Овај инфуз се карактерисао средњим СУП, средњим садржајем деривата лутеолина, нешто вишим садржајем

175

хетерозида апигенина и нижим садржајем РК у поређењу са инфузима хербе сакупљене на локалитетима 5 и 9, што донекле објашњава разлике у оствареном ефекту. На антимикробни ефекат инфуза, осим идентификованих полифенолних једињења, могућ је и утицај других састојака екстракта. Ložiene и сар. (2007) су утврдили извесно смањење антибактеријског дејства поларних екстраката хербе Th. pulegioides L. након дестилације хербе воденом паром (тј., након деодоризације) у поређењу са екстрактима недеодорисане хербе, што су објаснили губитком испарљивих састојака, па тако разлике у саставу испарљивих фракција могу имати утицај на испољени антимикробни ефекат.

6 Инфуз 5/11 Инфуз 8/11 5 Инфуз 9/11 Инфуз 10/11 4 Инфуз 11/11

Фреквенца 3 Инфуз 12/11 Инфуз 14/11 2 Инфуз 15/11

0 31.25 62.50 125.00 250.00 500.00 >500.00 МИК ( μL/mL)

Слика 39. Број сојева (фреквенца) чији је раст инхибиран инфузом одређене МИК

У ХС фракцији инфуза хербе са локалитета 5 и 9 одређен је виши садржај цитрала и нижи садржај 1,8-цинеола и 3-октанона у поређењу са ХС фракцијом инфуза хербе са локалитета 8. Значајна антимикробна активност цитрала (смеше гераниала и нерала) утврђена је према различитим сојевима микроорганизама. У поређењу са још 20 терпенских једињења састојака етарских уља, уочен је релативно широк спектар дејства цитрала, као и значајна антибактеријска активност, укључујући и активност према сојевима S. aureus , B. subtilis , E. faecalis , E. coli , K. pneumoniae и P. aeruginosa , док је активност 1,8- цинеола била знатно слабија ( Dorman и Deans, 2003 ). Поред тога, значајна антимикробна активност утврђена је и за етарска уља Th. pannonicus , Cymbopogon citratus (DC.) Stapf, Backhousia citriodora F. Mueller, која у високом

176

проценту садрже цитрал ( Maksimović и сар., 2008 ; Bergonzelli и сар., 2003 ; Hayes и Marković, 2002). Поређењем активности цитрала и етарског уља Backhousia citriodora закључено је да је активност етарског уља према тестираним сојевима микроорганизама, S. aureus , E. coli , K. pneumoniae , C. albicans и A. niger последица присуства цитрала, што је посебно било изражено према соју P. aeruginosa (Bergonzelli и сар., 2003 ). За тимол, монотерпенски фенол, установљено је да поседује антимикробну активност јачу од других једињења која се јављају као састојци етарских уља према широком спектру микроорганизама, укључујући S. aureus , B. subtilis , Е. faecalis , E. coli , K. pneumoniae , P. aeruginosa , C. albicans , као и још неке изазиваче респираторних инфекција ( H. influenzae , Streptococcus pneumoniae , Branhamella catarrhalis ) ( Dorman и Deans, 2003 ; Kalemba и Kunicka, 2003 ). Сматра се да ово једињење доводи до разградње липополисахарида у ћелијском зиду бактерија, а потом и до делимичне деструкције ћелијске мембране ( Kalemba и Kunicka, 2003 ). Израженој антимикробној активности инфуза хербе панонског тимијана пореклом из Гребенца (локалитет 11 ) допринео је и тимол, који је и детектован у ХС фракцији овог инфуза. Слично важи и за линалол и активност инфуза хербе сакупљене на Столу код Бора (локалитет 12 ), с обзиром на значајан антимикробни ефекат овог монотерпенског алкохола и његов висок удео у ХС фракцији инфуза ( Dorman и Deans, 2003 ; Kalemba и Kunicka, 2003 ). Поређењем хемијског састава овог инфуза са саставом инфуза хербе пореклом из Девојачког бунара (локалитет 10 ), уочава се сличан квалитативни састав њихових ХС фракција, као и да је СУП и садржај хетерозида лутеолина и апигенина мањи, а садржај РК нешто већи у инфузу хербе сакупљене на планини Стол код Бора (локалитет 12 ). Поред тога, инфуз хербе сакупљене на Столу испољио је и слабију антиоксидантну активност. Међутим, на основу резултата испитивања антимикробне активности може се закључити да је овај инфуз испољио јачи антибактеријски ефекат. Мање концентрације овог инфуза биле су потребне за инхибирање раста сојева S. aureus , S. epidermidis и K. pneumoniae , док је једино сој E. coli био осетљивији према инфузу хербе сакупљене у Девојачком бунару. Могуће је да су разлике у антибактеријском ефекту ових инфуза последица присуства испарљивих једињења, с обзиром на то да је у ХС инфуза хербе сакупљене у Девојачком

177

бунару удео линалола мањи, а удео слабије активног 1,8-цинеола већи него у ХС фракцији инфуза хербе сабране на планини Стол. Уз то је и укупна количина испарљивих састојака мања у ХС фракцији инфуза хербе из Девојачког бунара. Може се претпоставити да су испарљиви састојци утицали и на активност инфуза хербе сакупљене на планини Озрен (локалитет 14 ), али и да је удео испарљивих једињења у, иначе слабој, антимикробној активности инфуза хербе пореклом са Ртња (локалитет 15 ) релативно мали, ако се узме у обзир да је у ХС фракцији овог инфуза нађена само мала количина 1,8-цинеола.

11. Анализа варијабилности састава и активности хербе самониклог панонског тимијана

У херби Th. pannonicus сакупљенoj током периода цветања 2011. на локалитетима у јужном Банату (локалитети 5 и 8–11 ) у поређењу са хербом сакупљеном у истој фази развоја биљака на планинама у источној Србији, Столу код Бора, Озрену и Ртњу (локалитети 12 , 14 и 15 ) утврђен је виши садржај етарског уља. Садржај розмаринске киселине, хетерозида лутеолина и хетерозида апигенина у водено-метанолним екстрактима хербе сакупљене у јужном Банату био је мањи, док у погледу садржаја укупних полифенола и испољенe антиоксидантнe активности водено-метанолних екстраката није било значајнијих разлика између екстраката хербе пореклом из јужног Баната и са планина у источној Србији. Поред тога, инфузи хербе пореклом из јужног Баната испољили су нешто јачу антиоксидантну активност (изузимајући инфуз хербе сабране у Гребенцу, на локалитету 11 ), а остварили су и јачи антимикробни ефекат од инфуза хербе сакупљене на планинама у источној Србији.

178

11.1. Анaлиза варијабилности састава и активности хербе панонског тимијана пореклом из јужног Баната у зависности од фенофазе и локалитета

Узимајући у обзир да је на подручју јужног Баната забележена употреба хербе панонског тимијана као лековите, као и за припрему освежавајућег чајног напитка и за ароматизацију домаћих кондиторских производа ( Maksimović и сар., 2008 ), херба пореклом из овог региона додатно је испитана у овом раду. У циљу дефинисања оптималног периода сакупљања извршена je анализа хербе Th. pannonicus сакупљене 2011. на локалитетима у јужном Банату (локалитети 5 и 8–11 ) у различитим фенофазама (пре, током и након цветања). Праћен је садржај и састав етарског уља, садржај поларних конституената у водено- метанолним екстрактима (садржај укупних полифенола, розмаринске киселине, хетерозида апигенина и хетерозида лутеолина), као и антиоксидантна активност водено-метанолних екстраката. Фенофаза у којој је вршено сакупљање хербе на локалитетима јужном Банату (локалитети 5 и 8–11 ) утицала је значајно на садржај и састав етарског уља (ЕУ), док су варијације у саставу и активности поларних екстраката хербе биле мање изражене. Према подацима из 1970. и 1971., херба Th. pannonicus са Вршачких планина је у фази пре цветања имала већи садржај ЕУ (0,90–1,03%, V/m ) него у фази пуног цветања (0,56–0,86%, V/m ), при чему се подаци не односе на исту годину сакупљања ( Živanović, 1974 ). Дестилацијом хербе из истог региона сакупљене 2005. у фази цветања добијено је 0,45% ( V/m ) ЕУ ( Maksimović и сар., 2008 ). Према разултатима испитивања у овом раду, садржај ЕУ у херби панонског тимијана, у свакој од фенофаза у којој је извршено сакупљање материјала, био је већи у узорцима цитралног хемотипа са Вршачких планина (локалитети 5, 8 и 9) у односу на узорке сакупљене у Девојачком бунару (локалитет 10 ) и Гребенцу (локалитет 11 ) ( Слика 7 ). Највећи садржај ЕУ је одређен у херби сакупљеној током периода цветања на локалитету 9 (Вршачке планине - кула) (1,43%, V/m ) и у херби сакупљеној пре цветања на локалитету 5 (Вршачке планине – Ђаков врх) (1,29%, V/m ). У зависности од локалитета уочене

179

су варијације у садржају ЕУ код хербе сакупљене пре цветања (0,49–1,29%) и током цветања (0,70–1,43%). Након периода цветања садржај ЕУ у херби пореклом са Вршачких планина био је мањи него у фазама пре и након цветања и није значајније варирао у зависности од локалитета (0,53–0,65%). Садржај ЕУ у узорцима сабраним на остала два локалитета у јужном Банату, у Девојачком бунару (локалитет 10 ) и Гребенцу (локалитет 11 ), пре и током цветања не зависи од фенофазе, а након периода цветања, као и код хербе пореклом са Вршачких планина, садржај ЕУ опада. У поређењу са ЕУ хербе са локалитета 10 и 11 , састав ЕУ цитралног хемотипа хербе пореклом са Вршачких планина (локалитети 5, 8 и 9) био је мање варијабилан, како у зависности од локалитета, тако и у зависности од фазе развоја биљака у којој је извршено прикупљање материјала. Доминантна група састојака увек су били кисеонични монотерпени, са гераниалом и нералом (цитралом) као најзначајнијим компонентама уља. Садржај гераниала у ЕУ хербе са различитих локалитета мења се током развоја биљака на сличан начин као и садржај нерала ( Слика 40 ). Током периода цветања садржај гераниала и нерала нижи је него у периоду пре цветања, а у фази након цветања количина ових једињења је приближна количинама утврђеним пре цветања, при чему је садржај гераниала и нерала обрнуто пропорционалан садржају одговарајућих диетилацетала. Изузетак представља узорак са локалитета 8, где садржај гераниала и нерала опада током развоја, а садржај диетилацетала расте. Разлог овоме могу бити другачији еколошки услови на локалитету 8 који су утицали на развој биљака. Смањење садржаја гераниала и нерала (цитрала) у фази током цветања у односу на биљке у вегетативној фази уочено је и код етарског уља листа Lippia cirtriodora H.B.K. (syn. Aloysia triphylla (L'Her.) Britton) ( Argyropoulou и сар., 2007 ; Vogel и сар., 1999 ).

180

50.00 50.00

40.00 40.00 5 30.00 30.00 5 8 8 (%) 20.00 20.00 9 9 10.00 10.00

Садржај гераниала Садржај у ЕУ 0.00 0.00 Садржај Садржај нерала у ЕУ (%) Ф1 Ф2 Ф3 Ф1 Ф2 Ф3 Фаза развоја биљака Фаза развоја биљака

20.00 20.00 16.00 16.00 5 5 12.00 12.00 8

8 (%) 8.00 8.00 Садржај Садржај

Садржај Садржај 9 у ЕУ(%) 9 4.00 4.00 0.00 0.00 нералдиетилацетала у ЕУ гераниалдиетилацетала Ф1 Ф2 Ф3 Ф1 Ф2 Ф3 Фаза развоја биљака Фаза развоја биљaкa

Слика 40. Садржај гераниала, нерала, герниал диетилацетала и нерал диетилацетала у етарским уљима (ЕУ) хербе сабране у различитим фенофазама на Вршачким планинама Локалитет: 5, Вршачке планине – Ђаков врх; 8, Вршачке планине – село Сочица; 9, Вршачке планине – кула; фенофаза: Ф1, пре цветања; Ф2, током цветања; Ф3, након цветања.

У ЕУ хербе сакупљене у Девојачком бунару (локалитет 10 ), код којих су у све три фенофазе била доминантна сесквитерпенска једињења, садржај угљоводоничних сесквитерпена се повећава током развоја биљке, док садржај кисеоничне фракције флуктуира. Запажа се да се концентрација сесквитерпенског угљоводоника гермакрена D повећава са каснијом фенофазом: од количина у траговима у ЕУ хербе сабране пре цветања, преко 8,11% током цветања, до 31,87% у ЕУ хербе сабране након цветања. Слично се уочава и у случају сесквитерпенског угљоводоника бициклогемакрена. Од кисеоничних сесквитерпена, спатуленол је био заступљен у значајном проценту у ЕУ хербе сакупљене на локалитету 10 у све три фенофазе. Концентрација спатуленола смањивала се са каснијом фазом сакупљања (18,29% – пре цветања, 16,78% – током цветања и 11,91% након цветања), слично као и концентрација кариофилен оксида (8,61% – пре цветања, 6,64% – током цветања, и у количинама у траговима у фази након цветања). Флуктуацији садржаја кисеоничних сесквитерпена значајно је допринела висока концентрација epi -α-кадинола у ЕУ хербе сакупљене током цветања (14,38%),

181

док је у ЕУ херби у друге две фазе био заступљен у малом проценту (мање од 1%). Варијације у саставу ЕУ у зависности од фенофазе биле су посебно изражене у случају хербе из Гребенца (локалитет 11 ), у коме су пре цветања преовлађивала кисеонична сесквитерпенска једињења, током цветања кисеонични монотерпен тимол, а након цветања у ЕУ су поново доминирали кисеонични сесквитерпени. Према литературним подацима, ЕУ Thymus врста богата фенолним једињењима, тимолом и карвакролом, током целог развојног циклуса као главне компоненте садрже тимол и/или карвакрол и биосинтетски блиска једињења, γ-терпинен и p-цимен ( Hudaib и сар., 2002 ; Jordan и сар., 2006 ). Са друге стране, код појединих биљака нађено је да се удео доминантне класе једињења значајно мења у зависности од фазе развоја биљке ( Lakušić и сар., 2013 ), као и у случају хербе панонског тимијана са локалитета 11 . Етарско уље хербе Satureja subspicata прикупљене током лета у околини Коњица садржавало је скоро 60% тимола и карвакрола, док је укупни садржај ових једињења у ЕУ хербе сабране у јесен износио 0,4% ( Ćavar и сар., 2012 ). У ранијим испитивањима састава водено-метанолних екстраката неколико Thymus врста, укључујући и Th. pannonicus , Boros и сар. (2010) су уочили зависност садржаја розмаринске киселине (РК) од локалитета. И код водено-метанолних естраката панонског тимијана испитиваних у овом раду садржај РК је варирао у зависности од локалитета, и нижи је (у све три фазе) у екстрактима хербе пореклом из Девојачког бунара (локалитет 10 ) и Гребенца (локалитет 11 ) него у екстрактима хербе сакупљене на локалитетима на Вршачким планинама ( 5, 8 и 9). У зависности од фазе сакупљања биљног материјала, садржај РК се различито мења, флуктуира (локалитети 5, 9 и 10 ) или расте тако да је највиши садржај забележен у фази након цветања (локалитети 8 и 11 ). Са друге стране, промене у садржају ЕУ на локалитету, осим локалитета 5, су супротне: у херби са локалитета 9 и 10 флуктуира обрнутим трендом у односу на садржај РК, а код хербе са локалитета 8 и 11 опада са фенофазом ( Слика 41 ).

182

а) б)

100.00 1.60 90.00 1.40 80.00 1.20 70.00 5 5 1.00 60.00 8 8 50.00 9 0.80 9 10 10 40.00 0.60 30.00 11 11 Садржај(mg/g) РК 0.40

20.00 g) Садржај ЕУ(mL/100 0.20 10.00 0.00 0.00 Ф1 Ф2 Ф3 Ф1 Ф2 Ф3 Локалитет Локалитет Слика 41. Садржај розмаринске киселине (РК) у водено-метанолним екстрактима (а) и садржај етарског уља (ЕУ) (б) хербе Th. pannonicus сакупљане у различитим фенофазама на локалитетима у јужном Банату Локалитет: 5, Вршачке планине – Ђаков врх; 8, Вршачке планине – село Сочица; 9, Вршачке планине – кула; 10, Девојачки бунар; 11, Гребенац. Фенофаза: Ф1, пре цветања; Ф2, током цветања; Ф3, након цветања.

Садржај хетерозида лутеолина био је уједначен у испитиваним водено- метанолним екстрактима хербе пореклом са локалитета на Вршачким планинама ( 5, 8 и 9) и није значајно варирао у зависности од фазе сакупљања хербе (3,12–8,68 mg/g). Значајно виши садржај ових једињења одређен је у екстрактима хербе пореклом из Девојачког бунара (локалитет 10 ) и Гребенца (локалитет 11 ) него у екстрактима хербе са Вршачких планина (локалитети 5, 8 и 9) сакупљене у истој фази развоја биљака (10,18–14,18 mg/g), осим код екстраката хербе сакупљене након периода цветања, код којих је садржај хетерозида лутеолина био уједначен на свим локалитетима. Садржај ових једињења у есктрактима хербе сабране на локалитетима 10 и 11 након цветања био је значајно нижи него у одговарајућим екстрактима хербе сабране пре и током цветања (4,97–5,85 mg/g). Садржај хетерозида апигенина у водено-метанолним екстрактима значајно је виши у екстракатима хербе сабране у Девојачком бунару (локалитет 10 ) и Гребенцу (локалитет 11 ) него у екстрактима хербе пореклом са Вршачких планина (локалитети 5, 8 и 9) у свим фенофазама. У водено-метанолним екстрактима хербе пореклом са Вршачких планина садржај ових једињења био је уједначен како у односу на локалитет, тако и у односу на фазу сакупљања биљног материјала. Фаза у којој је извршено сакупљање хербе није значајно утицала ни на антиоксидантну активност водено-метанолних екстраката. За екстракте хербе пореклом са Вршачких планина (локалитети 5, 8 и 9) укупна антиоксидантна

183

активност ( FRAP вредност) била је нешто виша код екстраката хербе сакупљене након цветања, али је антирадикалска активност ових екстраката најслабија у поређењу са екстрактима хербе са ових локалитета сабране пре и током цветања. Екстракти хербе сакупљене у различитима фенофазама у Девојачком бунару и Гребенцу (локалитети 10 и 11 ) нису испољили разлике у погледу укупне антиоксидантне активности, а антирадикалска активност била je нешто израженија код екстраката хербе сабране пре и током него након периода цветања. Како је садржај етарског уља херби сакупљених у јужном Банату био већи пре и током цветања, а варијације у саставу и антиоксидантној активности водено-метанолних екстраката херби нису биле значајније, то се као оптималан период сакупљања хербе панонског тимијана може сматрати период пре или током цветања биљака.

С обзиром на то да је у узорцима хербе панонског тимијана са Вршачких планина (локалитети 5, 8 и 9) имали виши садржај етарског уља богатог цитралом, били мање варијабилног састава и јаче активности инфуза у поређењу са осталим узорцима, то су јединке пореклом са ових локалитета одабране за плантажно гајење.

184

Б. Анализа гајеног панонског тимијана

Примена органских и минералних ђубрива може да утиче на принос масе лековитих биљака и њихов хемијски састав. Међутим, подаци добијени научним истраживањима на овом пољу и даље се спорадично срећу, а производња се углавном заснива на искуству произвођача ( Németh и сар., 2012 ). Поред тога, примена неког ђубрива зависи и од типа земљишта и његове плодности (Baranauskienè и сар., 2003 ). Прихрањивање младих биљака тимијана, Th. vulgaris , у Србији се обично изводи азотним ђубривима пред друго окопавање (20-30 kg/ha азота), а старији засади се прихрањују два до три пута: први пут у пролеће, пре првог окопавања, други пут после жетве, а трећи пут обично у јесен, комбинованим NPK ђубривом (Кишгеци и Адамовић, 1994 ). На основу резултата анализе хербе самониклог панонског тимијана са различитих локалитета у Србији, за плантажно гајење одабране су биљке пореклом са Вршачких планина, због већег садржаја етарског уља богатог цитралом, мање варијабилног састава и испољене биолошке активности инфуза. У циљу утврђивање варијабилности хемијског састава и биолошке активности панонског тимијана гајеног у плантажним условима, у овом раду је испитан утицај примене азотних и фосфорних ђубрива на принос и састав етарског уља, као и на састав и антиоксидантну активност екстраката хербе Th. pannonicus . Испитано је 15 узорака хербе панонског тимијана гајеног у различитим условима ( Табела 6).

1. Анализа етарскoг уља хербе гајеног панонског тимијана

1.1. Анализа садржаја етарског уља хербе гајених биљака

Резултати одређивања садржаја етарског уља (ЕУ) у херби гајеног панонског тимијана приказани су на слици Слици 42 .

185

Садржај ЕУ у херби гајеног панонског тимијана износио је 0,32–1,20 mL/100 g, при чему се могу раздвојити две групе узорака, Г01 –Г06 (херба биљака 'глатког листа' сабраних у првој сезони вегетације), са нижим (0,32–0,75 mL/100 g), и Г07 –Г12 (херба биљака 'длакавог листа' сабраних у првој сезони вегетације), са вишим садржајем ЕУ (0,62–1,05 mL/100 g). Највиши садржај ЕУ од 1,20 mL/100 g одређен је у узорку гајеном у заштићеном простору без додатака ђубрива (узорак Г15 ).

1.40

1.20 1.20 1.05

1.00 0.91 0.89 0.82 0.80 0.81

0.80 0.75 0.69 0.62

0.60 0.53 0.43 0.37 0.34

0.40 0.32

Садржај ЕУ (mL/100Садржај ЕУ g) 0.20

0.00 Г01 Г02 Г03 Г04 Г05 Г06 Г07 Г08 Г09 Г10 Г11 Г12 Г13 Г14 Г15 Узорак

Слика 42. Садржај етарског уља (ЕУ) у херби гајеног Th. pannonicus

Узорак: Г01–Г06, херба 'глатког листа' сабрана у првој сезони вегетације; Г07–Г12, херба 'длакавог листа' сабрана у првој сезони вегетације; Г13, херба 'глатког листа' сабрана у трећој сезони вегетације; Г14, херба 'длакавог листа' сабрана у трећој сезони вегетације; Г15, херба биљке гајене у заштићеном простору сабрана у трећој сезони вегетације.

Поређењем садржаја ЕУ унутар групе херби 'глатког листа' ( Г01 –Г06 и Г13 ), као и унутар групе херби 'длакавог листа' ( Г07 –Г12 и Г14 ) уочава се да је садржај ЕУ нижи код узорака добијених од биљака које нису ђубрене ( Г01 и Г07 ), као и да је садржај ЕУ у херби неђубрених биљака у трећој вегетационој сезони (Г13 и Г14 ) у нивоу садржаја у херби ђубрених биљака у првој . Највиши садржај ЕУ одређен је у узорку хербе Г15 која потиче од јединке која није ђубрена, али се одликује густим индументумом и расла је у простору заштићеном од спољашњих утицаја (пластеник). Ако се изузме овај узорак, највиши принос ЕУ имао је узорак Г08 , тј., херба јединке 'длакавог листа' која је ђубрена фосфорним ђубривом (P 30 kg/ha).

186

Предност у одабиру форме Th. pannonicus која би била погодна за плантажно гајење ради добијања етарског уља, имале би биљке 'длакавог листа'. Због гушћег индументума губитак ЕУ испаравањем је мањи, па је код хербе ових биљака садржај ЕУ виши.

1.2. Квалитативна и квантитативна анализа етарског уља хербе гајених биљака

У ранијим испитивањима, Németh и сар. (2012) установили су да примена различитих доза калијума уз константну дозу фосфора и азота у ђубриву има различит утицај на састав етарског уља две врсте нане, Mentha x piperita L. и Mentha spicata var. crispata (Bentls.) Mansf. Применом различитих азотних ђубрива при гајењу тимијана, Th. vulgaris , дошло je до повећања приноса хербе и до благог повећања садржаја етарског уља, али су промене у саставу етарског уља, као и неких других састојака (витамина C, сахаразе, нитрата, укупног азота, калијума, фосфора, и макроелемената и микроелемената: Ca, Mg, Cu, Fe, Mn и Zn) биле занемарљиве ( Baranauskienè и сар., 2003 ). Слично је уочено и при примени различитих ђубрива са променљивим односом азота и фосфора ( Omidbaigi и Arjmandi, 2002 ). У овом раду састав ЕУ изолованих из различитих узорака хербе гајеног Th. pannonicus анализиран је гасном хроматографијом и гасном хроматографијом – масеном спектрометријом. Резултати су приказани у Табели 41 . Доминантна класа једињења у свим ЕУ били су кисеонични монотерпени (85,11–94,70%). У погледу квалитативног састава и главних састојака испитивана ЕУ гајеног панонског тимијана међусобно су била слична. Као главне компоненете у свим уљима, осим у уљу хербе Г08 , идентификовани су гераниал (39,24– 46,24%) и нерал (29,92–35,62%), Најзаступљенија компонента ЕУ хербе Г08 био је геранилацетат (30,34%), који је у осталим ЕУ био присутан у нижим концентрацијaма (1,05–7,24%). Садржај цитрала (смеше гераниала и нерала) износио је 69,83–81,96%, изузимајући уље хербе Г08 у коме је удео ове смеше био 51,90%. Однос гераниала и нерала у свим испитиваним ЕУ био је око 4:3.

187

Табела 41. Састав етарских уља узорака хербе гајеног Th. pannonicus

Узорак Г01 Г02 Г03 Г04 Г05 Г06 ГО7 ГО8 ГО9 Г10 Г11 Г12 Г13 Г14 Г15 Компоненте ЕУ: КИЛ КИЕ % % % % % % % % % % % % % % % 1 α-Пинен 932 935,1 0,08 0,15 0,08 т. 0,09 0,14 т. т. т. т. т. т. 0,09 т. 0,04 2 Камфен 946 950,3 0,08 0,13 0,13 т. 0,09 0,12 т. т. т. т. т. т. 0,06 т. 0,06 3 1-Октен-3-ол 974 979,1 0,51 0,67 0,44 0,39 0,47 0,65 0,17 0,43 0,47 0,20 0,37 0,44 0,62 0,47 0,72 4 6-Метил-5-хептен-2-он 981 988,2 0,73 1,05 0,91 0,65 0,72 0,97 0,78 0,87 0,97 0,65 1,19 1,11 0,97 1,11 0,92 5 Мирцен 988 992,1 0,07 0,09 0,16 0,11 0,05 0,08 0,32 0,19 0,05 0,15 0,13 т. 0,05 0,04 0,07 6 3-Октанол 988 997,9 т. 0,05 т. т. т. 0,05 т. т. т. т. 0,11 т. 0,05 0,04 0,04 7 α-Терпинен 1014 1018,6 т. т. 0,13 т. т. т. т. т. т. т. т. т. т. т. т. 8 p-Цимен 1020 1026,1 0,15 0,19 0,08 т. 0,13 0,20 т. т. т. т. т. т. 0,10 т. т. 9 Лимонен 1024 1030,2 0,93 1,32 0,22 0,74 0,84 1,39 т. 0,20 т. т. 0,26 т. 0,92 т. т. 10 1,8-Цинеол 1026 1033,1 0,35 0,51 0,15 0,24 0,39 0,53 0,15 0,21 0,27 0,15 0,26 0,36 0,38 0,43 0,16 11 (E)-β-Oцимен 1044 1047,9 - т. - т. т. т. т. 0,09 0,17 0,10 т. 0,25 т. 0,29 0,05 12 Бергамал 1051 1054,0 т. т. т. т. т. т. т. т. 0,05 т. т. т. т. 0,05 т. 13 γ-Терпинен 1054 1059,5 0,16 0,23 0,32 0,13 0,14 0,22 0,07 т. 0,04 т. 0,10 т. 0,16 0,05 0,09 14 cis -Сабинен хидрат 1065 1069,1 0,66 0,48 3,28 0,43 0,47 0,46 0,64 0,15 0,46 0,38 0,52 0,43 0,46 0,44 0,79 15 cis -Линалол оксид 1067 1074,0 т. т. т. - т. т. т. 0,04 т. т. т. т. т. т. т. 16 trans -Линалол оксид 1084 1090,3 ------0,04 ------17 Терпинолен 1086 1090,4 т. т. 0,08 т. т. т. т. - т. т. т. т. т. т. т. 18 Роузфуран 1091 1098,7 0,32 0,38 0,45 0,31 0,28 0,41 0,37 0,30 0,44 0,30 0,44 0,44 0,44 0,45 0,43 19 Линалол 1095 1101,9 0,34 0,38 0,73 0,30 0,36 0,40 0,24 1,13 0,25 0,20 0,53 0,26 0,62 0,30 0,45 20 Перилен 1102 1102,8 т. т. т. т. т. т. 0,05 т. 0,05 0,05 т. 0,06 т. т. т. 21 n-Нонанал 1100 1105,5 т. т. 0,07 0,04 0,04 0,05 0,06 0,06 0,07 т. 0,05 0,07 т. 0,10 0,06 22 exo -Изоцитрал 1140 1146,3 0,42 0,43 0,37 0,22 0,45 0,43 0,41 0,26 0,39 0,41 0,44 0,36 0,38 0,29 0,41 23 Камфор 1141 1147,1 0,02 т. 0,61 0,16 - - - 0,08 0,07 0,07 т. 0,18 - 0,29 0,07 24 trans -Хризантемал 1153 1152,3 0,99 1,12 0,79 0,73 0,95 1,03 0,53 0,66 0,73 0,42 0,71 0,66 0,82 0,66 0,33 25 Цитронелал 1148 1154,1 0,07 0,07 0,10 т. 0,08 0,08 0,09 0,07 0,08 0,06 0,09 0,08 0,08 0,08 0,10 26 Нерол оксид 1154 1155,9 0,03 0,06 т. т. 0,03 т. 0,03 0,02 т. 0,02 т. т. т. т. т. 27 (Z)-Изоцитрал 1160 1166,8 1,27 1,28 1,17 1,13 1,28 1,33 1,19 0,85 1,26 1,19 1,24 1,39 1,23 1,36 1,33 28 Борнеол 1165 1169,5 0,79 0,92 0,30 0,77 0,89 0,84 0,08 0,05 0,06 т. 0,21 0,06 0,49 0,03 0,40 29 δ-Терпинеол 1162 1170,2 ------т. т. т. - т. - 0,03 - 30 Роузфуран епоксид 1173 1177,5 0,74 0,73 0,97 0,69 0,69 0,81 0,80 0,64 0,99 0,85 0,92 0,98 0,87 0,99 0,70 31 Терпинен-4-ол 1174 1180,4 0,26 0,42 1,35 0,22 0,25 0,21 0,32 0,08 0,15 0,18 0,21 0,16 0,24 0,16 0,30 32 (E)-Изоцитрал 1177 1185,5 1,78 1,84 1,73 1,76 1,88 1,90 1,89 1,32 1,83 1,85 1,85 2,08 1,80 1,99 1,95

188

Узорак Г01 Г02 Г03 Г04 Г05 Г06 ГО7 ГО8 ГО9 Г10 Г11 Г12 Г13 Г14 Г15 Компоненте ЕУ: КИЛ КИЕ % % % % % % % % % % % % % % % 33 α-Терпинеол 1186 1193,8 0,12 0,18 0,24 0,16 0,15 0,15 0,12 0,14 0,11 0,12 0,17 0,14 0,17 0,14 0,11 34 Метилсалицилат 1190 1197,7 0,14 0,30 0,23 0,20 0,24 0,24 0,11 0,03 0,20 т. 0,07 0,11 0,22 0,11 0,12 35 n-Деканал 1201 1206,7 т. т. т. т. т. т. т. т. т. т. т. т. т. т. 0,04 36 Вербенон 1204 1221,1 0,03 0,06 0,03 т. 0,05 0,05 т. 0,06 0,07 0,07 0,06 0,06 0,05 0,07 0,03 37 β-циклоцитрал 1207 1222,5 0,02 0,02 0,03 т. 0,02 0,02 т. т. т. т. т. 0,02 0,03 т. т. 38 Цитронелол 1223 1225,7 0,05 0,08 0,09 т. 0,09 0,08 0,07 0,06 0,07 0,08 0,05 0,07 0,08 0,07 0,05 39 Нерол 1227 1239,7 2,85 2,98 3,58 2,84 2,57 2,58 2,28 1,50 1,85 1,72 3,48 1,67 3,02 1,46 2,13 40 Нерал 1235 1255,1 32,71 32,48 30,57 29,92 32,42 32,55 33,11 22,73 33,06 33,36 30,58 34,31 31,79 35,62 32,88 41 Пиперитон 1249 1261,9 0,09 0,10 0,15 0,10 0,13 0,12 0,14 т. 0,21 0,16 0,22 0,25 0,11 0,17 0,09 42 Гераниол 1249 1265,9 0,39 0,42 0,87 0,65 0,54 0,49 0,50 1,80 0,86 0,95 0,78 0,70 0,62 0,45 0,70 43 Гераниал 1235 1286,5 43,69 42,29 39,97 40,16 43,82 42,48 44,62 29,18 43,10 45,70 39,24 44,52 41,46 46,34 42,76 44 Борнилацетат 1289 1292,5 т. 0,03 0,06 т. 0,02 0,02 - - - - - т. т. - - 45 Дихидроедулан I 1289 1293,8 0,02 0,03 т. т. 0,02 0,03 т. т. - т. т. т. т. - - 46 3-Тујанол ацетат 1295 1303,5 0,10 0,11 т. т. 0,10 0,09 - 0,03 0,05 т. т. 0,07 0,06 0,08 - 47 Метилгеранат 1322 1327,0 0,12 0,11 0,06 0,13 0,11 0,11 0,06 т. 0,04 т. т. 0,05 0,08 0,05 т. 48 Цитронелилацетат 1350 1355,5 0,05 т. т. т. 0,05 0,05 т. 0,08 т. т. т. т. т. т. т. 49 Етилнеролат 1351 1360,4 т. т. т. т. т. т. 0,09 - т. 0,08 т. т. т. - - 50 Еугенол 1356 1361,2 0,06 т. т. т. т. т. т. - т. т. т. т. т. т. т. 51 Нерилацетат 1359 1368,3 1,86 1,84 2,26 1,65 1,89 1,78 0,89 2,10 1,03 0,83 3,06 1,25 2,22 1,16 1,24 52 α-Копаен 1373 1379,4 т. т. 0,06 т. т. т. 0,08 т. 0,09 0,05 0,05 0,05 0,06 т. 0,04 53 Геранилацетат 1379 1388,5 2,03 1,65 1,25 2,54 2,74 2,40 2,83 30,34 3,27 3,37 4,92 1,54 1,97 1,05 7,24 54 β-Бурбонен 1387 1389,1 0,11 0,16 0,27 0,44 0,16 0,16 0,21 - 0,13 т. т. 0,39 0,19 0,21 - 55 β-Елемен 1389 1395,7 - т. 0,06 т. т. - 0,06 - 0,07 0,07 0,06 0,06 0,06 0,04 0,04 56 (E)-Кариофилен 1417 1424,0 т. т. т. т. т. т. т. 0,06 0,05 т. 0,38 0,11 т. т. 0,07 57 β-Копаен 1430 1432,9 0,06 т. 0,06 0,12 т. т. 0,10 0,04 0,09 0,08 0,10 0,08 0,06 0,04 т. 58 Гераниал диетилацетал н. 1442,5 - - 0,07 т. т. - т. - 0,04 т. - - т. - - 59 Геранилацетон 1453 1454,3 т. т. т. т. 0,05 т. т. т. т. т. т. т. т. т. т. 60 allo -Аромадендрен 1458 1462,0 0,07 0,06 т. 0,18 0,05 0,05 т. 0,06 т. т. 0,08 т. 0,07 т. - 61 9-epi -(E)-Кариофилен 1464 1464,5 0,04 0,05 т. 0,16 т. т. т. т. т. т. 0,06 т. 0,06 т. - 62 γ-Муролен 1478 1480,8 т. т. т. т. т. - т. т. т. т. 0,06 т. т. т. т. 63 Гермакрен D 1484 1485,9 0,80 0,68 1,63 3,66 0,55 0,69 1,92 1,47 2,62 2,17 2,02 1,97 1,88 0,85 1,31 64 (E)-β-Јонон 1487 1488,6 0,07 0,05 т. т. 0,06 0,06 0,07 т. т. 0,07 0,07 т. т. т. т. 65 α-Зингиберен 1493 1496,9 - т. - т. - - - т. - - 0,06 - - - - 66 Бициклогермакрен 1500 1499,9 0,12 0,14 т. 0,50 0,11 0,10 т. 0,08 - - 0,12 т. 0,15 - т.

189

Узорак Г01 Г02 Г03 Г04 Г05 Г06 ГО7 ГО8 ГО9 Г10 Г11 Г12 Г13 Г14 Г15 Компоненте ЕУ: КИЛ КИЕ % % % % % % % % % % % % % % % 67 (E,E)-α-Фарнезен 1505 1511,4 т. т. т. т. т. т. 0,39 т. т. т. 0,94 т. т. т. т. 68 β-Бисаболен 1505 1511,5 0,60 0,62 0,55 2,91 0,49 0,59 0,60 0,33 0,84 0,72 0,88 0,84 1,40 0,31 0,44 69 γ-Кадинен 1522 1526,5 т. т. т. 0,13 т. т. 0,10 т. 0,32 0,07 0,13 0,05 0,08 т. 0,08 70 (E)-Неролидол 1561 1565,9 ------т. - 0,13 - - - - 71 Гермакрен D-4-ол 1574 1579,2 т. т. т. т. т. т. т. 0,02 - - т. т. 0,03 т. т. 72 Спатуленол 1577 1581,7 0,59 0,58 0,13 1,01 0,63 0,56 0,07 0,14 т. т. 0,23 т. 0,48 т. 0,05 73 Кариофилен оксид 1582 1587,0 0,11 т. 0,10 т. т. т. 0,06 0,06 0,06 т. 0,20 0,05 0,05 0,04 0,05 74 β-Копаен-4-α-ол 1590 1592,1 т. т. 0,06 т. т. т. 0,07 0,04 0,08 0,09 0,05 0,07 0,06 0,05 т. 75 β-Атлантол 1608 1611,3 0,09 0,09 0,07 0,18 0,11 0,09 0,06 т. т. - 0,07 т. 0,09 - - 76 Изоспатуленол 1641 1641,7 0,07 0,07 т. 0,16 0,08 0,07 т. т. т. - т. т. 0,08 т. т. 77 epi -α-Кадинол 1638 1644,3 т. т. 0,03 т. т. т. т. 0,01 0,03 - т. 0,02 0,02 т. т. 78 epi -α-Муролол 1640 1645,5 т. т. 0,03 т. т. т. т. 0,02 0,03 - т. 0,03 0,03 т. т. 79 α-Кадинол 1652 1657,8 0,04 0,03 0,07 0,11 0,03 0,02 0,14 0,06 0,06 0,08 0,06 0,05 0,07 0,07 0,03 80 Гермакра-4(15),5,10(14)-триен-1-α-ол 1685 1689,7 0,19 0,19 0,36 0,48 0,22 0,21 0,36 0,17 0,30 0,33 0,20 0,22 0,31 0,22 0,12 81 2,6-(Z,E)-Фарнезол 1722 1723,4 т. т. - т. т. - 0,07 0,03 0,06 0,08 т. т. т. т. т. 82 14-Хидрокси-α-муролен 1779 1780,0 т. т. т. т. т. т. 0,06 т. 0,04 0,06 т. т. т. т. т. 83 14-Хидрокси-δ-кадинен 1803 1804,6 т. т. 0,06 т. т. т. 0,08 0,04 0,07 0,10 т. 0,05 т. 0,04 т. 84 Хексахидрофарнезилацетон 1845 1845,4 т. т. т. 0,11 т. т. 0,05 т. т. т. т. 0,05 т. т. т. 85 (E,E)-Гераниллиналол 2026 2044,5 т. т. т. т. т. т. 0,06 т. т. т. т. т. т. т. т. Укупно идентификовано 98,04 97,92 97,61 97,51 98,05 98,15 97,63 98,42 97,76 97,63 98,24 98,23 97,94 98,29 99,08 Монотерпенски угљоводоници 1,49 2,10 1,20 0,98 1,34 2,15 0,43 0,48 0,32 0,30 0,49 0,32 1,39 0,38 0,30 Кисеонични монотерпени 92,15 90,98 91,24 85,11 92,69 91,40 91,46 93,93 90,74 92,50 89,99 92,11 89,46 94,14 94,70 Сесквитерпенски угљоводоници 1,79 1,71 2,62 8,11 1,35 1,60 3,48 2,05 4,21 3,16 4,94 3,55 4,03 1,46 1,97 Кисеонични сесквитерпени 1,09 0,97 0,90 1,93 1,07 0,96 0,96 0,59 0,73 0,74 0,95 0,48 1,22 0,43 0,25 Остала једињења 1,52 2,15 1,65 1,39 1,60 2,04 1,30 1,38 1,76 0,93 1,87 1,78 1,85 1,88 1,86 Узорак: Г01–Г06, херба биљака 'глатког листа' сабрана у првој вегетационој сезони; Г07–Г12, херба биљака 'длакавог листа' сабрана у првој вегетационој сезони; Г13, херба биљке 'глатког листа' сабрана у трећој вегетационој сезони; Г14, херба биљке 'длакавог листа' сабрана у трећој вегетационој сезони; Г15, херба биљке гајене у заштићеном простору. %, релативни удео компоненте у етарском уљу; КИЛ, литературни Ковачев индекс; КИЕ, експериментално одређен Ковачев индекс, израчунат као средња вредност индекса добијених за сваки узорак; н., литературни Ковачев индекс није доступан; т, трагови; -, компонента није детектована.

190

Изузимајући узорак Г08 , састав испитиваних ЕУ панонског тимијана гајеног на огледној плантажи под различитим режимом ђубрења није значајније варирао, али извесне мање разлике постоје. Анализом главних компоненти (PCA ) етарских уља на основу садржаја састојака добијен је редуковани простор одређен са пет главних компоненти ( PC ), одговорних за 94,71% варијансе (Табела 42 ).

Табела 42. Eigen вредности компоненти скупа података садржаја састојака етарских уља узорака хербе гајеног Th. pannonicus

Компонента ( PC ) Eigen вредност Варијанса (%) Кумулативно (%)

1 6.303 37.07 37.07 2 3.910 23.00 60.07 3 2.554 15.02 75.10 4 2.134 12.55 87.65 5 1.201 7.07 94.71

Највеће оптерећење у првој главној компоненти (PC 1) имали су позитивно корелисани нерал, гераниал, ( Е)-изоцитрал и ( Z)-изоцитрал и са њима у негативој корелацији геранилацетат, гераниол и линалол, чиме је ЕУ хербе Г08 раздвојен од осталих EУ (Слике 43 и 44 ). ЕУ овог узорка одликовало се пре свега вишим садржајем геранилацетата (30,34%) и гераниола (1,80%), али и линалола (1,13%) у поређењу са ЕУ осталих узорака. У другој главној компоненти (PC 2) високе вредности оптерећења имали су нерол, лимонен, trans -хризантемал, спатуленол и нерилацетат. На основу вишег садржаја наведених састојака по овој PC раздвојила су се ЕУ узорака хербе 'глатког листа' ( Г01 , Г02 , Г04 –Г06 и Г13 ) од узорака ЕУ хербе 'длакавог листа' (Г07 , Г09 , Г10 , Г12 , Г14 и Г15 ). Изузетак представља узорак хербе 'длакавог листа' Г11 који се због вишег садржаја састојака који су имали високо оптерећење у PC 2 налази ближе узорцима ЕУ 'глатког листа' ( Слика 44 ). Од узорака ЕУ 'глатког листа' се према вишем садржају cis -сабинен хидрата и терпинен-4-ола, који су имали високо оптерећење у PC 3, одвојило ЕУ хербе Г03 . У четвртој и петој главној компоненти , гермакрен D и 6-метил-5-хептен-2-он допринели су варијабилности ЕУ узорака хербе гајеног панонског тимијана.

191

Слика 43. График оптерећења састојака етарских уља у прве три главне компоненте ( PC ) простора

Састојци: k4, 6-метил-5-хептен-2-он; k9, лимонен; k15, cis -сабинен хидрат; k22; линалол; k31, trans -хризантемал; k34, (Z)-изоцитрал; k38, терпинен-4-ол; k39, ( E)-изоцитрал; k48, нерол; k49, нерал; k51, гераниол; k52, гераниал; k63, нерилацетат; k67, геранилацетат; k80, гермакрен D; k86, β-бисаболен; k93, спатуленол.

Слика 44. График узорака етарских уља у простору дефинисаном анализом главних компоненти

192

За етарска уља која се користе због високог садржаја цитрала (смеша гераниала и нерала) сматра се да садржај алкохола нерола и гераниола треба да буде што мањи ( Sodré и сар., 2012 ). Како су се ЕУ хербе 'глатког листа' ( Г01 –Г06 и Г13 ) одликовала нешто нижим садржајем цитрала (73,84±2,82%) и вишим садржајем појединих других једињења, укључујући и нерол, узорци хербе 'длакавог листа' ( Г07 , Г09 , Г10 , Г12 и Г14 ), са изузетком узорака Г08 и Г11, могу се сматрати квалитетнијим у погледу састава етарског уља (садржај цитрала 77,95±1,32%). Узорак хербе Г08 (херба јединке 'длакавог листа' која је ђубрена фосфорним ђубривом, 30 kg/ha) је слично осталим узорцима 'длакавог листа' имао висок садржај ЕУ, али је састав овог ЕУ био специфичан, карактеришући се високим садржајем геранилацетата и нешто вишим садржајем гераниола у поређењу са свим осталим узорцима. У ранијим испитивањима, гајењем матичњака, Melissa officinalis L. (Lamiaceae), у плантажним условима, садржај гераниола у етарском уљу се повећавао са повећaњем примењене количине стајског ђубрива, али, не и са применом минералног NPK ђубрива ( Sodré и сар., 2012 ). ЕУ хербе узорка Г11 , хербе биљке 'длакавог листа' ђубрене уреом, N 90 kg/ha, од осталих ЕУ хербе 'длакавог листа' се разликовало по нешто већој количини нерола и нерилацетата, по чему је овај узорак био сличнији узорцима ЕУ хербе 'глатког листа'.

2. Хемијска анализа и испитивање in vitro антиоксидантне активности водено-метанолних екстраката хербе самониклог панонског тимијана

2.1. HPLC анализa водено-метанолних екстраката хербе гајених биљака

HPLC анализом водено-метанолних екстраката хербе гајеног панонског тимијана идентификована су једињења која припадају класама фенолкарбоксилних киселина и флавоноида.

193

Главна компонента свих испитиваних екстраката била је розмаринска киселина (РК) (једињење 2). Поред РК у свим екстрактима утврђено је и присуство 3-O-(2-кафенил)-розмаринске киселине (једињење 3), као и 3-O- (метил-2-кафенил)-розмаринске киселине (једињење 4). Од флавоноидних једињења, у испитиваним екстрактима установљено је присуство хетерозида апигенина и хетерозида лутeолина, при чему је удео апигенинских хетерозида био већи. Као доминантно флавоноидно једињење у екстрактима се јавља апигенин 7-О-глукуронид, осим у екстракту узорка хербе Г07 (херба биљке 'длакавог листа' у првој сезони вегетације која није ђубрена), код кога је лутеолин 7-О-глукуронид заступљенији. Присуство лутеолин 7-О- диглукуронида (једињење 5) утврђено је једино у екстракту хербе Г01 (херба биљке 'глатког листа' у првој сезони вегетације која није ђубрена). Поред флавоноидних хетерозида, у већини екстраката детектована је и мања количина агликона апигенина ( Г01 , Г02 , Г06 , Г08 –Г12 и Г14 ) ( Табела 43 ).

194

Табела 43. Резултати HPLC анализе водено-метанолних екстраката хербе гајеног Th. pannonicus

Компонента екстракта: ) ) ) ) of of ) of ) of )

- mAU, (244 DAD1,9.007 ) - mAU, (2057 DAD1,9.275 - mAU, (366 DAD1,9.581 - mAU, (415 DAD1,9.585 ) - mAU, (242 DAD1,10.021 (963 DAD1,11.075 - mAU, (3302 DAD1,11.163 ) - mAU, (603 DAD1,11.863 ) - mAU, (145 DAD1,14.771 ) - mAU, (389 DAD1,16.115 - mAU, (1083 DAD1,18.650 (635 DAD1,22.781 (509 DAD1,25.528 ) - mAU, (474 DAD1,27.634 ) - mAU, (426 DAD1,28.932 DDJ90N2.D of of GDJ180N1.D of GDJ180N1.D 0706DB2.D GDJ180N1.D of GDJ180N1.D of mAU,Apx) I_DEVBUN.D of I_STOL.D of 1904SO1.D of GDJ180N1.D of 1907DB1.D of GDJ180N1.D of mAU,Apx) GDJ180N1.D of mAU,Apx) GDJ180N1.D of DAD1, 8.134 (315 mAU,Apx) mAU,Apx) (315 DAD1,8.134 I_SOCICA.D of DEODOR2.D

)

- - 1 - - О О О О -

) 4 -(2-

R-флавона

О О ) ) ) -

5 2 3 хетерозид хетерозид 7- лутеолин 7- апигенин РК 3'-

ење ење

-РК -РК

дериват дериват 6- хетерозид хетерозид 7- лутеолин

0 min 0 3 3 1 1 2 -(метил-2-кафенил)- О - 11,75 min min 11,75 глукуронид min 16,00 (једињење глукуронид min 18,65 (једињење min 22,15 кафенил) (једињење min 25,55 н.и. min 27,50 3' (једињ РК min 28,90 апигенин Узорак min 8,15 апигенина min 9,00 диглукуронид (једињење min 9,30 катехина min 9,60 фенолкарбоксилна киселина min 9,65 7 хидроксилутеолин глукуонид* min 10,05 апигенина min 11,00 н.и. 11,1 н.и. min 11,70 6 хетерозид Г01 - + + + - + + - т. + ++ +++ ++ + + + Г02 - + + + - + + - т. + ++ +++ ++ + + + Г03 - + + + - + + - т. + + +++ ++ + + - Г04 - + + + - + + - - + ++ +++ ++ + + - Г05 - + + + - + + - - + + ++++ ++ + + - Г06 - + + + - + + - - + ++ +++ +++ ++ + + Г07 - + + + - + + - - ++ + +++ ++ + + - Г08 - + + + - + + - - + ++ +++ ++ + + + Г09 + + ++ + - + + - т. + ++ +++ ++ + + + Г10 + + + + - + + - + + ++ +++ ++ + + + Г11 - + + + - + + - + + ++ +++ ++ + + + Г12 + + + + - + + - + + ++ +++ ++ + + + Г13 + + ++ + - + + - т. + + +++ ++ + + - Г14 - + + + - + + - + + ++ +++ ++ + + т. Г15 + + ++ + - + + - т. + + +++ +++ + + - *, идентификација је извршена на основу података добијених LC-MS методом ( Материјал и методе 4.5.3 ); н.и., неидентификовано једињење. Узорак: Г01–Г06, херба 'глатког листа' сабрана у првој сезони вегетације; Г07–Г12, херба 'длакавог листа' сабрана у првој сезони вегетације; Г13, херба 'глатког листа' сабрана у трећој сезони вегетације; Г14, херба 'длакавог листа' сабрана у трећој сезони вегетације; Г15, херба биљке гајене у заштићеном простору сабрана у трећој сезони вегетације. Садржај компоненти: –, компонента није детектована; т., <1%; +, 1–10%; ++ , 10–20%; +++ , 20–40%; ++++ , >40%.

195

Резултати одређивања садржаја розмаринске киселине (РК) у водено- метанолним екстрактима хербе гајених биљака панонског тимијана HPLC методом приказани су на Слици 45 , резултати одређивања садржаја хетерозида апигенина на Слици 46 , а резултати одређивања садржаја хетерозида лутеолина на Слици 47 . Екстракти хербе гајеног панонског тимијана садржавали су 56,41–103,70 mg/g РК, при чему је највиши садржај одређен у екстракту узорка Г08 (103,7 mg/g). Најниже концентрације одређене су у екстрактима хербе Г14 (56,41 mg/g), Г06 (60,23 mg/g) и Г12 (61,73 mg/g). Изузимајући наведене узорке варијације у садржају РК у осталим узорцима нису биле изражене (73,19–89,32 mg/g).

120.00 103.70 100.00 89.52 85.56 85.32 80.99 80.03 78.89 78.32 77.35 74.03 74.02 80.00 73.19 61.73 60.23 60.00 56.41

40.00

Садржај РК (mg/g) Садржај РК 20.00

0.00 Г01 Г02 Г03 Г04 Г05 Г06 Г07 Г08 Г09 Г10 Г11 Г12 Г13 Г14 Г15 Узорак

Слика 45. Садржај розмаринске киселине (РК) у водено- метанолним екстрактима хербе гајеног Th. pannonicus

Садржај розмаринске киселине (РК) у испитиваним водено-метанолним екстрактима хербе панонског тимијана сабране у првој вегетационој сезони био је нешто виши у екстрактима хербе 'глатког листа' (60,23–89,52 mg/g) него у екстрактима хербе 'длакавог листа' изузимајући узорак Г08 (61,73–80,03 mg/g). У погледу садржаја РК, ђубрење примењеним азотним и фосфорним ђубривима није довело до видљивих разлика међу узорцима, осим што је

196

ђубрење уреом (N 180 kg/ha) за последицу имало негативан утицај на садржај РК и у оквиру узорака хербе 'глатког листа' ( Г06 ) и у оквиру узорака хербе 'длакавог листа' ( Г12 ). Највиши садржај РК одређен је у екстракту хербе Г08 , узорка хербе 'длакавог листа' код кога је утврђен и висок садржај ЕУ и његов специфичан састав, а који је ђубрен фосфорним ђубривом, P 30 kg/ha. Садржај хетерозида апигенина у водено-метанолним екстрактима хербе гајеног панонског тимијана износио је 4,86–15,33 mg/g, изражено као апигенин. Екстракти хербе 'глатког листа' ( Г01 –Г06 и Г13 ) садржавали су веће количине ових метаболита (11,47–15,33 mg/g) које су мање варирале у поређењу са екстрактима хербе 'длакавог листа' ( Г07 –Г12 , Г14 и Г15 ) (4,86–13,58 mg/g). Највећи садржај хетерозида апигенина унутар група узорака 'глатког листа' и 'длакавог листа' одређен је у екстрактима хербе узорака Г06 и Г12 , односно у екстрактима херби биљака које су ђубрене уреом, N 180 kg/ha.

18.00

16.00 15.33 14.54 13.87 13.56 13.58 13.52

14.00 12.86 11.87 11.47

12.00 10.93 10.34 10.00 8.00

8.00 6.93 (mg/g) 6.05

6.00 4.86 4.00 2.00

Садржајхетерозида апигенина 0.00 Г01 Г02 Г03 Г04 Г05 Г06 Г07 Г08 Г09 Г10 Г11 Г12 Г13 Г14 Г15 Узорак

Слика 46. Садржај хетерозида апигенина, изражен као апигенин, у водено-метанолним екстрактима хербе гајеног Th. pannonicus

Резултати су представљeни као средња вредност три одређивања ±Sd. Узорак: Г01–Г06, херба 'глатког листа' сабрана у првој сезони вегетације; Г07–Г12, херба 'длакавог листа' сабрана у првој сезони вегетације; Г13, херба 'глатког листа' сабрана у трећој сезони вегетације; Г14, херба 'длакавог листа' сабрана у трећој сезони вегетације; Г15, херба биљке гајене у заштићеном простору сабрана у трећој сезони вегетације.

Садржај хетерозида лутеолина у водено-метанолним екстрактима хербе гајеног панонског тимијана износио је 3,70–10,51 mg/g, изражено као лутеолин, и то у екстрактима хербе 'глатког листа' ( Г01 –Г06 и Г13 ) 4,37–8,80 mg/g, док је у екстрактима хербе 'длакавог листа' ( Г07 –Г12 и Г14 ) износио 6,70–10,51 mg/g.

197

Најнижи садржај одређен је у екстракту хербе јединке 'длакавог листа' гајене у заштићеном простору без примене ђубрива Г15 (3,70 mg/g).

12.00 10.51 10.00 8.80 8.29 8.28 7.58 7.45

8.00 7.31 6.99 6.81 6.70 6.00 6.03 4.78 4.41 4.37 (mg/g)

4.00 3.70

2.00

Садржајхетерозида лутеолина 0.00 Г01 Г02 Г03 Г04 Г05 Г06 Г07 Г08 Г09 Г10 Г11 Г12 Г13 Г14 Г15 Узорак

Слика 47. Садржај хетерозида лутеолина, изражен као лутеолин, у водено-метанолним екстрактима хербе гајеног Th. pannonicus

Рачунато на моларне концентрације, садржај хетерозида апигенина у сваком испитиваном водено-метанолном екстракту хербе гајеног панонског тимијана био је већи од садржаја хетерозида лутеолина, осим у екстракту хербе јединке 'длакавог листа' која није ђубрена ( Г07 ). Екстракти узорака херби Г08 (херба јединке 'длакавог листа' која је ђубрена фосфорним ђубривом, P 30 kg/ha) и Г11 (хербе биљке 'длакавог листа' ђубрене уреом, N 90 kg/ha) садржавали су приближне количине хетерозида апигенина и хетерозида лутеолина. Поред тога, уочено је да, ако се изузму екстракти узорака хербе 'длакавог листа' Г07 и Г15 , могу се разликовати две групе екстраката: (1) екстракти хербе 'глатког листа' ( Г01 –Г06 и Г13 ) и (2) екстракти хербе 'длакавог листа' ( Г08 –Г12 , Г14 ). Прва група екстраката садржавала је нешто већу количину хетерозида апигенина у поређењу са другом, при чему је и њихов садржај мање варирао, а друга група екстраката се карактерисала стабилнијим и вишим садржајем хетерозида лутеолина у поређењу са првом групом.

198

2.2. Садржај укупних полифенола у водено-метанолним екстрактима хербе гајених биљака

На основу реакције са FC реагенсом у водено-метанолним екстрактима хербе гајеног панонског тимијана одређен је садржај укупних полифенола (СУП), а резултати су изражени у еквивалентима галне киселине (ГК) ( Слика 48 ). Испитивани екстракти хербе гајеног панонског тимијана садржавали су 119,73–179,88 mg ГК/g, при чему је СУП у екстракатима хербе 'глатког листа' (Г01 –Г06 и Г13 ) износио 138,86–179,88 mg ГК/g, а у екстрактима хербе 'длакавог листа' ( Г07 –Г12 и Г14 ) 119,73–140,31 mg ГК/g. Екстракт хербе биљке 'длакавог листа' гајене у пластенику ( Г15 ) садржавао је 159,95 mg ГК/g.

200.00 РК (mg ГК/g) СУП-РК 180.00 160.00 140.00 120.00 100.00 80.00

СУП (mgСУП ГК/g) 60.00 40.00 20.00 0.00 Г01 Г02 Г03 Г04 Г05 Г06 Г07 Г08 Г09 Г10 Г11 Г12 Г13 Г14 Г15 Узорак

Слика 48. Садржај укупних полифенола (СУП) и удео розмаринске киселине (РК) у укупним полифенолима у водено-метанолним екстрактима хербе гајеног Th. pannonicus

У екстрактима гајеног панонског тимијана 31,34–53,73% укупних полифенола чини РК, при чему је највећи удео РК у укупним полифенолима одређен у екстракту хербе Г08 (херба јединке 'длакавог листа' ђубрене фосфорним ђубривом, P 30 kg/ha).

199

Укупни садржај полифенолних једињења био је већи у екстрактима узорака хербе 'глатког листа' него у екстрактима хербе 'длакавог листа', а утицај примене различитих ђубрива није био уочљив.

2.3. Испитивање in vitro антиоксидантнe активности водено–метанолних екстраката хербе гајених биљака

Антиоксидантна активност водено-метанолних екстраката хербе гајеног панонског тимијана испитана је одређивањем FRAP вредности екстраката, која представља меру укупне антиоксидантне активности (УАА) ( Слика 49 ) и

одређивањем инхибиторне концентрације (IC 50 ) екстраката према DPPH радикалу ( Слика 50 ).

6.00 РК (mmol Fe/g) FRAP-FRAP(РК) 5.00

4.00

3.00 (mmol Fe/g) (mmol 2.00 FRAP 1.00

0.00 Г01 Г02 Г03 Г04 Г05 Г06 Г07 Г08 Г09 Г10 Г11 Г12 Г13 Г14 Г15 Узорак

Слика 49. Укупна антиоксидантна активност ( FRAP вредност) и удео розмаринске киселине (РК) у укупној антиоксидантној активности водено-метанолних екстраката хербе гајеног Th. pannonicus

УАА водено-метанолних екстраката хербе гајеног панонског тимијана била je мања од активности аскорбинске киселине ( FRAP вредност 7,41 mmol Fe/g) и износила је 2,88–4,89 mmol Fe/g, при чему је 19,09–51,16% активности

200

било последица антиоксидантне активности РК ( FRAP вредност 16,54 mmol Fe/g). FRAP вредност узорака хербе 'глатког листа' ( Г01 –Г06 и Г13 ) износила је 3,22–4,38 mmol Fe/g, а узорака хербе 'длакавог листа' ( Г07 –Г12 , Г14 и Г15 ) 2,88– 4,89 mmol Fe/g. Антирадикалска активност водено-метанолних екстраката хербе гaјених биљака била је више него 4 пута слабија од активности аскорбинске киселине

(IC 50 3,80 μg/mL). IC 50 екстраката износила је 16,20–24,62 μg/mL, a активности је

допринела присутна РК са 25,65–54,80% (IC 50 3,90 μg/mL). За неутрализацију 50% DPPH радикала било је потребно

18,35–24,40 μg/mL екстраката хербе 'глатког листа' ( Г01 –Г06 и Г13 ), док је IC 50 екстраката хербе 'длакавог листа' ( Г07 –Г12 , Г14 и Г15 ) износила 16,20–24,62 μg/mL. Водено-метанолни екстракти хербе гајеног панонског тимијана испољили су уједначену антиоксидантну активност, како у погледу способности редукције Fe 3+ јона, тако и погледу способности неутрализације DPPH радикала.

30.00 РК (μg/g) DPPH-РК 25.00

20.00

15.00 (μg/g) 50

IC 10.00

5.00

0.00 Г01 Г02 Г03 Г04 Г05 Г06 Г07 Г08 Г09 Г10 Г11 Г12 Г13 Г14 Г15 Узорак

Слика 50. Анти-DPPH активност (IC 50 ) и удео розмаринске киселине (РК) у анти-DPPH активности водено-метанолних екстраката хербе гајеног Th. pannonicus

201

Применом различитих азотних и фосфорних ђубрива при испитивању услова гајења Th. pannonicus у овом раду добијена је херба релативно уједначеног хемијског састава (осим узорака Г08 и Г11 ), што је резултовало и уједначеном антиоксидантном активношћу водено-метанолних екстраката. На основу мањих разлика у хемијском саставу и in vitro антиоксидантној активности екстраката хербе гајеног панонског тимијана могу се разликовати групе узорака које се и морфолошки благо разликују: (1) херба 'глатког листа' која се одликује нижим садржајем ЕУ и вишим СУП и РК, и (2) херба 'длакавог листа' са вишим садржајем ЕУ и нижим СУП и РК. Етарска уља свих узорака одликовала су се високим садржајем гераниала и нерала (цитрала). Предност у одабиру форме Th. pannonicus која би била погодна за плантажно гајење ради добијања етарског уља, имају биљке 'длакавог листа'. Због гушћег индументума губитак ЕУ испаравањем је мањи, па је код хербе ових биљака одређен виши садржај ЕУ. Поред тога, може се сматрати и да је састав ЕУ хербе 'длакавог листа' повољнији, због нешто вишег садржаја цитрала. Узорак хербе Г08 , хербе јединке 'длакавог листа' која је ђубрена фосфорним ђубривом, P 30 kg/ha, одликовао се највишим садржајем ЕУ и РК у поређењу са осталим узорцима. Поред тога, ЕУ ове хербе било је специфичног састава, карактеришући се високим садржајем геранилацетата и нижим садржајем цитрала у поређењу са осталим узорцима.

3. Поређење садржаја и састава етарског уља, састава и антиоксидантне активности водено-метанолних екстраката хербе самониклих и гајених биљака панонског тимијана

Испитивана херба гајеног панонског тимијана добијена је од семена биљака пореклом са Вршачких планина (локалитети 5, 8 и 9). Између резултата анализе хербе самониклог панонског тимијана сакупљене 2011. на Вршачким планинама и хербе гајених биљака сабране 2012. на огледној плантажи

202

Института за проучавање лековитог биља 'Др Јосиф Панчић' уочавају се извесне сличности и разлике. Садржај етарског уља у херби самониклих и херби гајених биљака опада према следећем редоследу: херба самониклих биљака сакупљена током цветања (7,0–14,3 mL/kg) > херба самониклих биљака сакупљена пре цветања (4,9–12,9 mL/kg) ≥ херба гајених биљака 'длакавог листа' (6,2–10,5 mL/kg) > херба самониклих биљака сакупљена након цветања (5,3–6,5 mL/kg) ≥ херба гајених биљака 'глатког листа' (3,2–7,5 ml/kg). Према захтевима Европске фармакопеје ( Ph. Eur. 7.0 ), најмањи садржај етарског уља за дрогу Thymi herba (Thymus vulgaris , Th. zygis , Lamiaceae) износи 12 mL/kg, при чему дрогу представљају листови и цветови одвојени од стабљика. Дрога Serpylli herba која, слично испитиваној херби гајеног Th. pannonicus , представља надземне делове Th. serpyllum у цвету, треба да садржи најмање 3 mL/kg етарског уља (Ph. Eur. 7.0 ). Садржај ЕУ у херби како самониклог тако и гајеног Th. pannonicus одговара овим захтевима, при чему би се као погоднији могли сматрати узорци хербе самониклих биљака сакупљени пре и током цветања, као и херба гајених биљака 'длакавог листа'. Херба гајених биљака ‘длакавог листа’ одликовала се и уједначеним вредностима садржаја без обзира на режим ђубрења, за разлику од хербе самониклих биљака чији је садржај ЕУ значајније варирао у зависности од локалитета. Различити услови средине на природном станишту, као и услови вештачког гајења, могу значајно да утичу на састав етарског уља. Испитивањем етарских уља пет различитих хемотипова самониклог и гајеног Th. pulegioides L., установљено је да се могу разликовати два типа биљака: (1) биљке код којих се при промени услова средине не мења састав етарског уља, и (2) биљке код којих се при промени услова средине састав етарског уља мења (Ložienè и Venskutonis, 2005 ). Испитивана ЕУ хербе гајеног панонског тимијана, изузев узорка хербе Г08 , нису испољила значајније разлике у саставу у односу на ЕУ хербе самониклих биљака пореклом са Вршачких планина (локалитети 5, 8 и 9) сакупљене у периоду пре цветања, док се у односу на ЕУ хербе сакупљене током периода цветања разликују по нижем садржају диетилацетала нерала и гераниала.

203

Садржај укупних полифенолних једињења (СУП) у водено-метанолним екстрактима хербе гајеног панонског тимијана мањи је од СУП екстраката хербе самониклих биљака. Гајењем на огледној плантажи утицај спољашњих фактора је био мање изражен, а како синтеза полифенола код биљака представља један од адаптационих одговора на стрес ( Hossain и сар., 2010б ), већи садржај ових једињења у екстрактима хербе самониклих биљака може бити последица раста у природним условима. У погледу садржаја розмаринске киселине (РК), водено-метанолни екстракти хербе гајених биљака били су богатији у односу на екстракте хербе самониклих биљака пореклом са Вршачких планина (локалитети 5, 8 и 9) (на то указује и виши удео РК у укупним полифенолима екстраката гајених биљака), али су концентрације РК биле ниже у односу на екстракте хербе сакупљене на планинима у источној Србији (локалитети 12 , 14 и 15 ). Добијене вредности садржаја РК у водено-метанолним екстрактима гајених (5,64–10,37%, што одговара 0,89–1,89% рачунато на хербу) и самониклих биљака (4,55–9,34%, што одговара 0,81–1,80% рачунато на хербу) су приближне међусобно и одговара захтевима Европске фармакопеје ( Ph. Eur. 7.0 ) зa садржај РК у сувом екстракту листа матичњака (најмање 2%) и листу матичњака (најмање 1%). Међутим, ове вредности се не могу сматрати високим у поређењу са појединим другим врстама фамилије Lamiaceae, где је, на пример, садржај РК у херби Prunella vulgaris (одређен у водено-алкохолном екстракту) био просечно 6,1% ( Lamaison и сар., 1999 ). Слично екстрактима хербе биљака пореклом са Вршачких планина, и у екстрактима хербе гајених биљака били су присутни деривати РК, 3-O-(2- кафенил)-РК (једињење 3) и мања количина 3-O-(метил-2-кафенил)-РК (једињење 4). Најупечатљивија разлика између екстраката гајених и самониклих биљака била је у садржају флавонидних једињења. Док је садржај хетерозида лутеолина био приближан у обе групе, садржај хетерозида апигенина значајно је већи у екстрактима гајених биљака. Разлика потиче углавном од већег садржаја апигенин 7-О-глукуронида у екстрактима хербе гајених биљака. Поред хетерозида, у већини екстраката хербе гајених биљака присутна је и мала количина агликона апигенина који у водено-метанолним екстрактима хербе

204

самониклих биљака пореклом са Вршачких планина није детектован. Раније су Markham и сар. (1988) установили да однос количина глукуронида лутеолина и глукуронида апигенина код једне врсте маховина зависи од интензитета UV зрачења, где се при интензивнијем зрачењу синтеза флавоноида усмерава ка глукуронидима лутеолина који испољавају јача антиоксидантна својства. Међутим, литературни подаци о могућим факторима који би могли утицати на детектоване разлике у количини хетерозида апигенина код самониклог и гајеног панонског тимијана нису доступни. Разлике у укупној антиоксидантној активности водено-метанолних екстраката хербе гајених и самониклих биљака пореклом са Вршачких планина нису биле значајне. Међутим, антирадикалска активност екстраката хербе гајених биљака била је нешто нижа, што може бити у вези са нижим садржајем укупних полифенола.

4. Предлог монографије Thymi pannonici herba

На основу резултата испитивања у овом раду, утврђено је да херба панонског тимијана садржи полифенолна једињења и етарско уље, као и да испољава добру антиоксидантну активност и антимикробну активност, што указује на њену потенцијалну примену као биљне дроге у савременој фитотерапији, слично другим биљним дрогама чији су биолошки извор врсте рода Thymus (Thymi herba , Serpylli herba ). С обзиром на то да је употреба цитрала и природних производа који га садрже широка, ова дрога би могла представљати и потенцијални извор етарског уља и цитрала. У циљу дефинисања квалитета дроге која би се употрeбљавала, дат је предлог монографије хербе панонског тимијана ( Thymi pannonici herba ). Монографија обухвата дефиницију и особине дроге, поступке за идентификацију, и захтеве за општи и специфични квалитет дроге. Како је хемијски састав хербе биљака са природних станишта испитиваних у овом раду био релативно варијабилан, монографија је формирана

205

на основу резултата добијених анализом хербе гајених биљака. Ово не искључује могућност да се као биолошки извор дроге користи и самоникли Th. pannonicus . Параметри општег и специфичног квалитета одређени су одговарајућим физичко-хемијским методама у узорцима хербе гајеног панонског тимијана Г01 –Г15 . Као захтев за квалитет постављена је минимална или максимална вредност интервала поверања средње вредности датог параметра, за ниво вероватноће p=0,05.

206

Херба панонског тимијана Thymi pannonici herba

ДЕФИНИЦИЈА:

Цели или резани осушени надземни делови панонског

тимијана у цвету, Thymus pannonicus All. (Lamiaceae). Садржај :

- етарско уље: најмање 5,0 mL/kg; - цитрал (збир гераниала и нерала): најмање 70% у

етарском уљу.

ОСОБИНЕ:

Херба панонског тимијана има јак, ароматичан мирис, који

подсећа на мирис лимуна.

ИДЕНТИФИКАЦИЈА:

A. Стабљика панонског тимијана је четвроугаона, у доњем Макроскопски изглед делу одрвенела, обрасла стршећим длакама. Листови су утврђен је органолептичким наспрамни, са кратком дршком, линерано ланцетасти до прегледом узорака хербе. јајасти, 8–12 mm дужине и 3–5 mm ширине, са обе стране обрасли длакама. Цветови су скупљени у цвасти у пазуху горњих листова. Чашица је двоусната, ждрела покривеног длакама. Круница је двоусната, ружичасте до светлосмеђе боје кад је сува. B. Уситни се до прашка. Прашак је сивкастозелене боје, мириса на лимун. Епидермис се састоји од ћелија чији су За микроскопску анализу прашка хербе гајеног антиклинални зидови изувијани. Стоме су диацитног панонског тимијана типа. Пелтатне жлездане длаке су релативно крупне; суспендоваог у општем капитатне длаке су ређе. Нежлездане длаке су реактиву коришћен је микроскоп Olympus BX 41 . многобројне; брадавичасте су површине, вишећелијске, Фотографије су дате у са појединим колабираним ћелијама, као и двоћелијске и Прилогу 3.

једноћелијске. Прашак садржи и делове папилозног

епидермиса.

207

C. Хроматографија на танком слоју. Испитивани раствор . У 1,0 g спрашене дроге дода се 5

mL метиленхлорида, мућка 3 min и филтрира преко 2 g натријум-сулфата, безводног. Филтрат се користи као Фотографија хроматограма дата је у испитивани раствор. Прилогу 4. Поредбени раствор . Раствори се 25 µL цитрала у 25 mL ксилена. Стационарна фаза : плоче са танким слојем силикагела и флуорецентним индикатором. Мобилна фаза : етилацетат – хексан 10:90 ( V/V ). Апликација : одвојено се, у виду трака, нанесе по 20 µL испитиваног и поредбеног раствора. Развијање : у дужини од 15 cm. Детекција : испрска се раствором анисалдехида и загрева 10 min на 100–105 °C; посматра се на дневној светлости. Резултат : на хроматограмима поредбеног и испитиваног раствора на граници између доње и средње трећине уочавају се две сивкасто-љубичасте до плавичасто-љубичасте зоне (цитрал); на хроматограму испитиваног раствора уочавају се и друге зоне.

ИСПИТИВАЊА

Стране примесе: највише 2%. Губитак сушењем одређен Губитак сушењем: највише 4% одређено на резану дрогу. је на 1 g резане хербе поступком сушења у Укупни пепео: највише 11% одређено на резану дрогу. ексикатору током 24 h Пепео нерастворљив у HCl: највише 1,2% одређено на изнад дехидратационог средства (сумпорна резану дрогу. киселина, концентрована). ОДРЕЂИВАЊЕ Укупни пепео и пепео Етарско уље . Одређује се дестилацијом воденом паром нерастворљив у HCl током 2 h у апаратури по Клевеџеру. Користи се 30,00 g одређени су поступком датим у Ph. Eur. 7.0 . резане дроге, балон за дестилацију од 1000 mL и 400 mL коришћењем 1 g резане воде. Дестилација се изводи брзином од 2–3 mL/min, без хербе.

208

ксилена у бочној градуисаној цеви. Цитрал . Одређује се гасном хроматографијом, поступком нормализације површине хроматограма. Услови анализе дати су у поглављу Материјал и методе 3.4 .

209

В. Анализа састава и активности деодорисаног воденог

екстракта хербе панонског тимијана

Потенцијална производња етарског уља хербе панонског тимијана би као додатни производ имала велике количине воденог екстракта. Овакви, тзв., деодорисани, водени екстракти се сматрају отпадним материјалом, али је за неке њихове фракције показано да садрже биљне састојке полифенолне природе са извесном фармаколошком активношћу (пре свега антиоксидантном), и да као такви могу представљати потенцијалну лековиту сировину, или се могу користити као адитиви у прехрамбеној индустрији ( Sánchez-Vioque и сар., 2013 ; Dorman и сар., 2003 ). Деодорисани водени екстракт (ДВЕ) испитиван у овом раду добијен је као споредни производ изоловања етарског уља дестилацијом воденом паром из хербе панонског тимијана пореклом са локалитета Вршачке планине – Ђаков врх (локалитет 5).

1. Хемијска анализа и испитивање in vitro антиоксидантне активности деодорисаног воденог екстраката хербе панонског тимијана

1.1. HPLC анализa деодорисаног воденог екстракта

HPLC анализом деодорисаног воденог екстракта (ДВЕ) хербе панонског тимијана утврђено је присуство фенолкарбоксилних киселина и флавоноида (Табела 44 ). Главна компонента екстракта била је розмаринска киселина (РК), а у високом уделу био је присутан и лутеолин 7-О-диглукуронид (једињење 5). Поред ових једињења, детектоване су и мање количине других хетерозида лутеолина, пре свега лутеолин 7-О-глукуронида, потом хетерозиди апигенина,

210

са апигенин 7-О-глукуронидом као најзаступљенијим, као и деривати РК, 3-O-(2- кафенил)-РК (једињење 3) и 3-O-(метил-2-кафенил)-РК (једињење 4). Резултати одређивања садржаја РК, хетерозида апигенина и хетерозида лутеолина у ДВЕ HPLC методом приказани су у Табели 45 . Одређене концентрације РК, хетерозида апигенина и хетерозида лутеолина биле су приближне концентрацијама ових једињења у водено-метанолним екстрактима хербе пореклом са Вршачких планина.

211

Табела 44. Резултати HPLC анализе деодорисаног воденог екстракта хербе Th. pannonicus (ДВЕ)

Компонента екстракта: ) ) ) ) of of ) of ) of )

ICA.D ICA.D

- mAU, (244 DAD1,9.007 ) - mAU, (2057 DAD1,9.275 - mAU, (366 DAD1,9.581 - mAU, (415 DAD1,9.585 ) - mAU, (242 DAD1,10.021 (963 DAD1,11.075 - mAU, (3302 DAD1,11.163 ) - mAU, (603 DAD1,11.863 ) - mAU, (145 DAD1,14.771 ) - mAU, (389 DAD1,16.115 - mAU, (1083 DAD1,18.650 (635 DAD1,22.781 (509 DAD1,25.528 ) - mAU, (474 DAD1,27.634 ) - mAU, (426 DAD1,28.932 DDJ90N2.D of of GDJ180N1.D of GDJ180N1.D 0706DB2.D GDJ180N1.D of GDJ180N1.D of mAU,Apx) I_DEVBUN.D of I_STOL.D of 1904SO1.D of GDJ180N1.D of 1907DB1.D of GDJ180N1.D of mAU,Apx) GDJ180N1.D of mAU,Apx) GDJ180N1.D of DAD1, 8.134 (315 mAU,Apx) mAU,Apx) (315 DAD1,8.134 I_SOC of DEODOR2.D

)

- - 1 - - О О О О -

) 4 -(2-

О ) ) ) -оR флавона -оR

5 2 3 хетерозид хетерозид 7- лутеолин 7- апигенин РК 3'-

-РК -РК

дериват дериват 6- хетерозид хетерозид 7- лутеолин

n n 3 3 1 1 2 -(метил-2-кафенил)- О - 11,75 min min 11,75 глукуронид min 16,00 (једињење глукуронид min 18,65 (једињење mi 22,15 кафенил) (једињење min 25,55 н.и. min 27,50 3' (једињење РК min 28,90 апигенин min 8,15 апигенина min 9,00 диглукуронид (једињење min 9,30 катехина min 9,60 фенолкарбоксилна киселина min 9,65 7 хидроксилутеолин глукуонид* min 10,05 апигенина min 11,00 н.и. min 11,10 н.и. min 11,70 6 хетерозид ДВЕ т. ++ - + - + + - + + + ++++ + - + - *, идентификација је извршена на основу података добијених LC-MS методом ( Материјал и методе 4.5.3 ). н.и., неидентификовано једињење. Садржај компоненти: –, компонента није детектована; т., <1%; +, 1–10%; ++ , 10–20%; +++ , 20–40%; ++++ , >40%.

Табела 45. Садржај розмаринске киселине, хетерозида апигенина и хетерозида лутеолина у деодорисаном воденом есктракту хербе Th. pannonicus (ДВЕ)

Састојци ДВЕ Садржај (mg/g)

Розмаринска киселина 71,11 Хетерозиди апигенина 1,28 Хетерозида лутеолина 4,09

212

1.2. Анализа садржаја укупних полифенола у деодорисаном воденом екстракту

Садржај укупних полифенола у ДВЕ, одређен на бази реакције са FC реагенсом и изражен у еквивалентима галне киселине (ГК), износио је 205,00 mg ГК/g. Око 25% укупних полифенола чинила је РК (1000 mg РК еквивалентно је 722,56 mg ГК).

Састав водених екстраката који настају као споредни производи изоловања етарског уља дестилацијом воденом паром, тј. деодорисаних водених екстраката, зависи од физичких и хемијских процеса који се одигравају у присуству воде на повишеној темепратури, пре свега растварања у води растворних састојака биљака, хидролизе и термалне деградације нестабилних једињења. Показано је да након дестилације воденом паром у биљном материјалу заостаје мала количина полифенола ( Chizzola и сар., 2008 ; Ložiene и сар., 2007 ). Ова једињења су релативно добро растворна у води и ефикасно се екстрахују. Услед слабе селективности воде као растварача истовремено се добијају високи приноси екстраката ( Handa, 2008 ; Cazzola и сар., 2011 ). Деодорисани водени екстракт Th. pannonicus био је богат полифенолним једињењима (205,00 mg ГК/g, што је еквивалентно 3,36% ГК у полазном биљном материјалу). На сличан начин добијен деодорисани водени екстракт тимијана, Th. vulgaris , и других биљака фамилије Lamiaceae садржавали су 1,4-2,6 пута мање количине фенолних једињења ( Dorman и сар., 2003 ; Dorman и сар., 2004 ). Садржај укупних полифенола у ДВЕ приближан је вредностима одређеним у водено-метанолним екстрактима хербе самониклих биљака сакупљене пре и током периода цветања на локалитетима на Вршачким планинама (локалитети 5, 8 и 9) (171,75–215,37 mg ГК/g), а виши је од садржаја ових једињења у екстрактима хербе гајених биљака (119,73–179,88 mg ГК/g). Према међусобном односу састојака, састав ДВЕ сличан је саставу инфуза хербе пореклом са Вршачких планина испитиваних у овом раду ( Табела 38 ), што је у складу са пореклом биљног материјала и примењеним растварачем за екстракцију, који је у оба случаја вода.

213

На хроматограму ДВЕ добијеном HPLC анализом као најзаступљенија једињења јављају се РК (једињење 2) и лутеолин 7-О-диглукуронид (једињење 5) ( Табела 44 ). Услед добре растворљивости у води ( SciFinder, 2012л ), РК се раствара током изоловања етарског уља дестилацијом воденом паром. Садржај РК у ДВЕ (71,11 mg/g) у опсегу је концентрација овог једињења одређених у водено-метанолним екстрактим хербе самониклих биљака пореклом са Вршачких планина (локалитети 5, 8 и 9) (45,45–93,38 mg/g) и у водено- метанолним екстрактима хербе гајених биљака (56,41–103,70 mg/g), али је нижи од садржаја РК у водено-метанолним екстрактима хербе панонског тимијана сакупљене на планинама Стол, Озрен и Ртањ (локалитети 12 , 14 и 15 ) (120,59– 146,80 mg/g). Слично као и у водено-метанолним екстрактима и инфузима хербе самониклог панонског тимијана испитиваних у овом раду, и у ДВЕ je садржај хетерозида лутеолина (4,09 mg/g) био већи од садржаја хетерозида апигенина (1,28 mg/g). Садржај хетерозида апигенина био је приближан садржају одређеном у водено-метанолним екстрактима хербе пореклом са Вршачких планина (локалитети 5, 8 и 9), нешто нижи од садржаја у екстрактима хербе сакупљене у Девојачком бунару (локалитет 10 ) и Гребенцу (локалитет 11 ) пре и током цветања и на локалитима у источној Србији (локалитети 12 , 14 и 15 ), и значајно нижи него у водено-метанолним екстрактима хербе гајеног панонског тимијана. Концентрација хетерозида лутеолина приближна је концентрацијама ових једињења одређеним у водено-метанолним екстрактима хербе самониклих биљака пореклом са Вршачких планина (локалитети 5, 8 и 9), екстрактима хербе пореклом из Девојачког бунара (локалитет 10 ) и Гребенца (локалитет 11 ) сабране након периода цветања, као и екстрактима гајеног панонског тимијана (изузимајући узорaк Г07 ), а нижа је од концентрација у водено-метанолним екстрактима хербе пореклом из Девојачког бунара и Гребенца сабране пре и током цветања, као и у екстрактима хербе сакупљене на планинама у источној Србији (локалитети 12 , 14 и 15 ). За разлику од водено-метанолних екстраката, а слично инфузима хербе самониклих биљака, удео лутеолин 7-О-диглукуронида у укупним хетерозидима лутеолина био већи је од удела лутеолин 7-О-глукуронида, што може бити у

214

вези са растворљивошћу ових једињења у примењеним екстрагенсима. Иако је припрема ДВЕ подразумевала кључање у води током 2 h, а затим и упаравање уз загревање, диглукуронид лутеолина није био подложан разградњи.

1.3. Испитивање in vitro антиоксидантне активности деодорисаног воденог екстракта

In vitro антиоксидантна активност ДВЕ панонског тимијана испитана је FRAP и DPPH тестом. Укупна антиоксидантна активност екстракта, изражена FRAP вредношћу, износила је 4,09 mmol Fe/g, при чему је допринос РК ( FRAP 16,54 mmol Fe/g) укупној активности био 28,73%. Добијена вредност указује на снажна антиоксидантна својства ДВЕ, али ипак слабија од аскорбинске киселине као стандарда ( FRAP 7,41 mmol Fe/g). Способност неутрализације DPPH радикала испитиваним екстрактом

износила је IC 50 19,89 μg/mL и била је слабија у поређењу са аскорбинском

киселином (IC 50 3,80 μg/mL). Присутна РК била је одговорна за 36,26% антирадикалске активности екстракта.

Висок садржај полифенолних једињења, услед присуства РК и њених деривата, као и присуства флавоноидних једињења, имао је утицај на испољену добру in vitro антиоксидантну активност ДВЕ панонског тимијана. У поређењу са водено-метанолним екстрактима хербе самониклих биљака ( Резултати и дискусија А.9.3 ), ДВЕ се није значајно разликовао у погледу укупне антиоксидантне и анти-DPPH активности.

2. Испитивање in vivo антиоксидантне активности ДВЕ

Примењеним in vitro тестовима, у којима су се компоненте екстракта понашале као 'хватачи' слободних радикала или као редукциони агенси, утврђен је директaн (хемијски) антиоксидантни ефекат ДВЕ. У живим

215

организмима механизам антиоксидантног дејства неке супстанце може укључивати и стимулисање активности постојећих ћелијских механизама (Matés, 2000 ), а ефекат зависи и од фармакокинетичких процеса које се одигравају у организму. Стога је у овом раду испитана in vivo антиоксидантна активност ДВЕ на моделу оксидативног стреса код пацова индукованог

угљентетрахлоридом (CCL 4).

Механизам токсичног дејства CCl 4 обухвата већи број процеса који се

• • одигравају у ћелијама. Активацијом цитохрома p450 настају CCl 3 и CCl 3-ОО радикали који се ковалентно везују за ћелијске макромолекуле (нуклеинске кислеине, липиде, протеине). Реакцијом са остацима незасићених масних киселина у молекулима липида долази до настанка липидних пероксида и започињања процеса липидне пероксидације, који за последицу имају нарушавање интегритета ћелијске мембране и мембрана ћелијских органела. Поред овога, карбонилни производи деградације масних киселина лако реагују

са ћелијским ензимима доводећи до инхибиције њихове активности. CCL 4 делује и на молекуларном нивоу, пре свега активирајући TNF -α (Weber и сар., 2003 ).

Ефекат CCl 4 на јетру огледа се у ослобађању микрозомалних ензима и билирубина и њиховим повишеним вредностима у серуму, потом смањеном синтезом протеина, смањеном секрецијом VLDL честица, повећаном количином продуката липидне пероксидације, као и смањењем активности антиоксидантних ензима (ксантин оксидазе, каталазе, пероксидазе, глутатион редуктазе) и количине редукованог глутатиона ( Weber и сар., 2003 ; Cabré и сар.,

2000 ). Стога антиоксиданти агенси могу умање токсични ефекат CCl 4. У овом раду у хомогенату јетре пацова третираних угљентетрахлоридом и раствором ДВЕ (5%, m/V ; 0,1–5,0 mL/kg ТМ) одређена је активност ензима који учествују у регулацији редокс потенцијала ћелија (ксантин оксидазе ( XOD ), каталазе ( CAT ), пероксидазе ( Px ), глутатион пероксидазе ( GSHPx ) и глутатион редуктазе ( GR )), као и садржаја редукованог глутатиона ( GSH ) и интензитета липидне пероксидације ( LPx ). Резултати су приказани на Сликама 51–57 .

216

5,0

2,0

1,0 ДВЕДВЕ 0,5 ДВЕДВЕ + CCl4CCl 4 Контрола 0,2 без третмана

Доза ДВЕ (ml/kg ДВЕ Доза TM) 0,1 Контрола CCl 4

контрола CCl 4 контрола без третмана

2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 XOD (nmol/mg/min)

Слика 51. Утицај примене деодорисаног воденог екстракта (ДВЕ) на активност ксантин оксидазе ( XOD )

ДВЕ, животиње третиране раствором ДВЕ (5% m/V ; 0,1–5,0 mL/kg); ДВЕ+CCl 4, животињe третиранe угљентетрахлоридом (2,0 mL/kg) и раствором ДВЕ (5% m/V ; 0,1–5,0 mL/kg); K, нетретиране животиње;

K CCl 4, животиње третиране угљентетрахлоридом (2,0 mL/kg).

** 5,0

** 2,0 ДВЕ 1,0 * ДВЕ + CCl 4 ДВЕ 0,5 Контрола * безДВЕ третмана + CCl4 * 0,2 Контрола CCl 4

Доза ДВЕ (ml/kgДВЕ Доза TM) * 0,1

контрола CCl 4 * контрола без третмана

15,00 10,00 5,00 0,00 5,00 10,00 15,00 CAT (nmol/mg/min)

Слика 52. Утицај примене деодорисаног воденог екстракта (ДВЕ) на активност каталазе (CAT )

ДВЕ, животиње третиране раствором ДВЕ (5%, m/V ; 0,1–5,0 mL/kg); ДВЕ+CCl 4, животињe третиранe угљентетрахлоридом (2,0 mL/kg) и раствором ДВЕ (5% m/V ; 0,1–5,0 mL/kg); К, нетретиране животиње;

К CCl 4, животиње третиране угљентетрахлоридом (2,0 mL/kg). *, статистички значајна разлика у односу на нетретиране животиње (К) за ниво вероватноће p=0,05; **,

статистички значајна разлика у односу на животиње третиране угљентетрахлоридом (К CCl 4) за ниво вероватноће p=0,05.

217

** 5,0

** 2,0 ** ДВЕ 1,0 * ДВЕ + CCl 4 ДВЕ 0,5 Контрол а * без ДВЕтретмана + CCl4 0,2 Контрола CCl 4 *

Доза ДВЕ (ml/kgДВЕ Доза TM) 0,1 *

контрола CCl 4 * контрола без третмана

15,00 10,00 5,00 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 Px (nmol/mg/min)

Слика 53. Утицај примене деодорисаног воденог екстракта (ДВЕ) на активност пероксидазе ( Px )

К CCl 4, животиње третиране угљентетрахлоридом (2,0 mL/kg). *, статистички значајна разлика у односу на нетретиране животиње (К) за ниво вероватноће p=0,05; **, статистички значајна разлика у односу на животиње третиране угљентетрахлоридом (К) за ниво вероватноће p=0,05.

** 5,0 * ** 2,0 * ** 1,0 ДВЕ ДВЕДВЕ + CCl 4 0,5 * КонтролаДВЕ + CCl4 без третмана 0,2 * Контрола CCl 4

Доза ДВЕ (ml/kgДВЕ Доза TM) * 0,1

контрола CCl 4 контрола без третмана

35,00 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 5,00 10,00 15,00 GSHPx (nmol/mg/min)

Слика 54. Утицај примене деодорисаног воденог екстракта (ДВЕ) на активност глутатион пероксидазе ( GSHPx )

218

** 5,0

** 2,0 ДВЕ ** 1,0 ДВЕ + CCl 4 ДВЕ 0,5 Контрола * без ДВЕтретмана + CCl4 ** 0,2 Контрола CCl 4 *

Доза ДВЕ (ml/kgДВЕ Доза TM) 0,1 *

контрола CCl 4 * контрола без третмана

8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 GR (nmol/mg/min)

Слика 55. Утицај примене деодорисаног воденог екстракта (ДВЕ) на активност глутатион редуктазе ( GR )

** 5,0

** 2,0 ** ДВЕ 1,0 * ДВЕ + CCl 4 ДВЕ ** 0,5 Контрола * без ДВЕтретмана + CCl4 0,2 Контрола CCl 4 *

Доза ДВЕ (ml/kgДВЕ Доза TM) 0,1 *

контрола CCl 4 * контрола без третмана

6,00 4,00 2,00 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 GSH (nmol/mg)

Слика 56. Утицај примене деодорисаног воденог екстракта (ДВЕ) на садржај редукованог глутатиона ( GSH )

219

** 5,0

** 2,0 ДВЕ ** 1,0 * ДВЕ + CCl 4 ** ДВЕ 0,5 Контрола * безДВЕ третмана + CCl4 0,2 * Конт рола CCl 4

Доза ДВЕ (ml/kgДВЕ Доза TM) 0,1 *

контрола CCl 4 * контрола без третмана

12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 2,00 4,00 6,00 LPx (nmol МДА/mg)

Слика 57. Утицај примене деодорисаног воденог екстракта (ДВЕ) на интензитет липидне пероксидације ( LPx )

2.1. Анализа ефекта примене угљентетрахлорида на активност ензима, садржај редукованог глутатиона и интензитета липидне пероксидације

У метаболичком путу разградње пурина, XOD катализује реакцију оксидације ксантина или хипоксантина при чему настају мокраћна киселина и

• супероксидни анјон, О2̄, који доприноси оксидативном оштећењу ћелија. У овом раду, у поређењу са нетретираним животињама, активност XOD није била значајно промењена код животиња третираних угљентетрахлоридом (1,93 nmol/mg ·min и 1,89 nmol/mg ·min, редом), што је уочено и у неким ранијим испитивањима ( Ćebović и caр., 2006 ) ( Слика 51 ). За разлику од XOD , ензими CAT и Px делују као антиоксиданси катализујући реакције редукције пероксида (водоник-пероксида и органских пероксида). Третирањем животиња угљентетрахлоридом дошло је до значајног смањења активности ових ензима ( CAT 3,32 nmol/mg ·min; Px 4,92 nmol/mg ·min) у

220

поређењу са нетретираним животињама ( CAT 9,56 nmol/mg ·min; Px 10,80 nmol/mg ·min) ( Слика 52 и 53 ). У условима оксидативног стреса изазваног третирањем животиња угљентетрахлоридом активност ензимског система GR и GSHPx , који је укључен у регулацију садржаја GSH , била је значајно промењена. Сматра се да је улога GSH као антиоксиданса врло значајна у угљентатрахлоридом индукованом оштећењу јетре, када GSH реагује са слободним радикалима који настају

• • биотрансформацијом CCl 4 (CCl 3 , CCl 3-ОО ) и процесом липидне пероксидације. Испитивањима у овом раду, садржај GSH код животиња третираних угљентетрахлоридом (0,73 nmol/mg) био је значајно нижи у поређењу са

нетретираним животињама (4,97 nmol/mg). Ефекат CCl 4 посебно је био изражен према GSHPx , који катализује реакцију редукције органских хидропероксида уз утрошак GSH (Слика 54–56 ).

У складу са познатим механизмом дејства CCl 4, интензитет липидне пероксидације ( LPx ), процењен на основу садржаја малонилдиалдехида (МДА), био је значајно већи код третираних него код нетретираних животиња ( Слика 57 ).

2.2. Анализа ефекта примене ДВЕ на активност ензима, садржај глутатиона и интензитет липидне пероксидације

Ефекат примене различитих доза ДВЕ (5% m/V ; 0,1–5,0 mL/kg) на активност испитиваних ензима, садржај GSH и интензитет LPx није био статистички значајан у поређењу са нетретираним животињама ( Слика 51–57 ). У вишим дозама (2,0–5,0 mL/kg) уочава се благо повећање активности Px и GSHPx , што може указивати на прооксидантни ефекат ДВЕ.

221

2.3. Анализа ефекта примене ДВЕ на активност ензима, садржај глутатиона и интензитет липидне пероксидације код животиња третираних угљентетрахлоридом

Раствор ДВЕ (5%, m/V ) примењен у 6 различитих доза (0,1–5,0 mL/kg) код животиња третираних угљентетрахлоридом дозно-зависно је утицао на повећање активности ензима CAT (Слика 52 ) и Px (Слика 53 ), повећање садржаја GSH (Слика 56 ) и на смањење интензитета липидне пероксидације ( Слика 57 ) у поређењу са животињама третираних само угљентетрахлоридом. Примена ДВЕ у вишим дозама довела је до статистички значајног ублажавања ефеката примене угљентетрахлорида, а вредности наведених биохемијских параметара нису се статистички разликовале од вредности одређених код нетретираних животиња.

HPLC анализом утврђено je да је главни састојак ДВЕ била РК за коју је у ранијим испитивањима установљено да, осим у хемијским тестовима, испољава антиоксидантни ефекат и у испитивањима на ћелијским линијама. Поред директног хемијског дејства као антиоксиданса, РК je утицала на стабилност ћелијске мембране спречавајући ланчану реакцију липидне пероксидације (Pérez-Fons и сар., 2010 ). Осим тога, in vivo испитивањем на моделу липополисахаридом индукованог оштећења јетре код миша, утврђено је да је хепатопротективни ефекат РК највероватније последица њених антиоксидантних особина ( Osakabe и сар., 2002 ). У ранијим in vivo испитивањима на моделима оштећења јетре изазваних угљентетрахлоридом установљен је и протективни ефекат лутеолина или његових деривата ( Qiusheng и сар., 2004 ; Domitrović и сар., 2008 ), али је садржај ових једињења релативно мали у поређењу са садржајем РК у испитиваном ДВЕ панонског тимијана. Испитивањима у овом раду примена ДВЕ код животиња третираних угљентетрахлоридом довела је до значајног смањења интезитета липидне пероксидације, а у већим дозама и до одржавања физиолошких количина редукованог глутатиона. На основу добијених резултата испољени хепатопротективни ефекат ДВЕ може се довести у везу са његовим антиоксидантним својствима.

222

3. Испитивање in vivo цитотоксичне активности ДВЕ на туморске ћелије

Испитивањима in vitro и in vivo установљена је добра антиоксидантна активност ДВЕ. Хемијском анализом утврђено је да доминантне састојке екстракта представљају полифенолна једињења. Као основно својство полифенола обично се наводи њихов антиоксидантни потенцијал, али у зависности од услова, они се могу понашати и као прооксиданси. Поред тога, за многа полифенолна једињења утврђено је да могу деловати инхибиторно на настанак и/или развој тумора ( Havsteen, 2000 ; Quideau и сар., 2011 ; Link и сар., 2010 ; Paluszak и сар., 2010 ). Цитотоксични ефекат ДВЕ испитан је на моделу Ерлиховог тумора дојке код миша, при чему је праћен утицај ДВЕ на раст тумора, као и оксидо- редукциони статус туморских ћелија како би се проценио антиоксидантни или прооксидантни ефекат ДВЕ.

3.1. Анализа ефекта ДВЕ у зависности од примењене дозе

Раствор ДВЕ (5%, m/V) примењен пре ('пре-третман'), истовремено ('третман') и након ('пост-третман') имплементације Ерлиховог асцитног тумора (ЕАТ) у 6 различитих доза (0,1; 0,2; 0,5; 1,0; 1,5 и 2,0 mL/kg) дозно- зависно је инхибирао раст тумора. Резултати испитивања зависности ефекта, тј., вијабилности ћелија ЕАТ у асцитној течности, од дозе ДВЕ приказани су на Слици 58 .

223

Слика 58. Зависност броја оштећених ћелија од примењене дозе деодорисаног воденог екстракта (ДВЕ ) код мужјака (а) и женки (б)

*, статистички значајна разлика у односу на контролну (нетретирану) групу за ниво вероватноће p=0,05.

Применом виших доза (1,0; 1,5 и 2,0 mL/kg ТМ) број оштећених (апоптотичних и/или некротичних) ћелија био је статистички значајно виши у поређењу са контролном нетретираном групом. Такође, уочено је да је ефекат био најизразитији код група које су испитиваним екстрактом третиране пре имплементације ћелија ЕАТ (група 'пре-третман'), а најслабији ефекат установљен је код група животиња које су третиране раствором ДВЕ седам дана након имплементације ЕАТ (група 'пост-третман').

224

Поред тога, уочена је разлика у ефекту оствареном код животиња различитих полова, где је ефекат био израженији код женки него код мужјака. Примена раствора ДВЕ у највишој дози од 2,0 mL/kg TM резултовала је и најизраженијим ефектом, при чему је проценат оштећених ћелија код животиња групе 'пре-третман' износио чак 92,7% код мужјака и 98,4% код женки. Стога су остали параметри који указују на цитотоксичну активност процењивани на основу ефекта оствареног применом ове дозе. Такође, узета је у обзир разлика између ефеката остварених код мужјака и ефеката остварених код женки.

3.2. Анализа ефекта ДВЕ на ћелије Ерлиховог асцитоног тумора

3.2.1. Испитивање ефекта ДВЕ на инхибицију раста тумора Способност раствора ДВЕ (5%, m/V), примењеног у дози од 2,0 mL/kg TM, да инхибира раст тумора процењена је на основу промена у запремини асцитне течности, броја туморских ћелија у асцитној течности и њиховој вијабилности. На Слици 59 приказани су резултати мерења запремине асцитне течности. Смањење запремине асцитеса ЕАТ (96–98%) било је статистички значајно код животиња оба пола третираних раствором ДВЕ пре имплементације ћелија ЕАТ. Смањење је установљено и код животиња оба пола групе 'третман', али је ефикасност испитиваног екстракта била нешто мања. У групи 'пост-третман' ефекат је испољен само код женки, код којих је и у осталим огледним групама применом ДВЕ остварен нешто бољи ефекат него код мужјака.

225

Слика 59. Утицај примене деодорисаног воденог екстракта (ДВЕ) (5%, m/V ; 2 mL/kg ТМ) и N-ацетил-L-цистеина (Ac-Cys) на запремину асцитне течности ДВЕ/мужјаци, мужјаци третирани раствором ДВЕ; ДВЕ/женке, женке третирани раствором ДВЕ; Ac-Cys/мужјаци, мужјаци третирани Ac-Cys-ом; Ac-Cys/женке, женке третиране Ac-Cys-ом; K, контролна (нетретирана) група; *, статистички значајна разлика у односу на контролну групу (К) за ниво вероватноће p=0,05.

Са друге стране, применом N-ацетил-L-цистеина, као стандардног антиоксиданса, статистички значајна инхибиција повећања асцитне течности забележена је само код групе која је третирана овом супстанцом пре имплементације ЕАТ ('пре-третман'), а применом након имплементације ћелија ЕАТ ('пост-третман') код женки чак је дошло и до значајнијег повећања запремине асцитеса. Резултати одређивања броја туморских ћелија приказани су на Слици 60 . У поређењу са контролном групом, број туморских ћелија присутних у асцитној течности био је значајно мањи код свих група огледних животиња ('пре- третман', 'третман' и 'пост-третман') третираних раствором ДВЕ. Израженији ефекат установљен је код женки, па је број ћелија ЕАТ износио 1500/mm 3 код групе 'пре-третман', 9000 /mm 3 код групе 'третман' и 39000 /mm 3 код животиња групе 'пост-третман', у односу на 120000/mm 3 за контролну групу. Код животиња оба пола ефекат је био слабији уколико је раствор екстракта био примењен садам након имплементације ЕАТ ('пост-третман').

226

Применом N-ацетил-L-цистеина број туморских ћелија присутних у асцитној течности мужјака био је благо смањен, док је код женки дошло чак и до повећања броја ћелија.

Слика 60. Утицај примене деодорисаног воденог екстракта (ДВЕ) (5%, m/V ; 2 mL/kg ТМ) и N-ацетил-L-цистеина (Ac-Cys) на број туморских ћелија у асцитној течности

ДВЕ/мужјаци, мужјаци третирани раствором ДВЕ; ДВЕ/женке, женке третирани раствором ДВЕ; Ac-Cys/мужјаци, мужјаци третирани Ac-Cys-ом; Ac-Cys/женке, женке третиране Ac-Cys- ом; K, контролна (нетретирана) група; *, статистички значајна разлика у односу на контролну групу (К) за ниво вероватноће p=0,05.

Утицај примене раствора ДВЕ на вијабилност туморских ћелија, односно на број оштећених (апоптотичних и/или некротичних) ћелија приказан је на Слици 61 . Применом ДВЕ број оштећених ћелија у асцитној течности значајно је био већи у поређењу са контролном групом. Израженији ефекат био је постигнут код женки него код мужијака, и код групе 'пре-третман' у поређењу са групама огледних животиња 'третман' и 'пост-третман'. Број оштећених ћелија није се статистички значајно разликовао код животиња третираних раствором N-ацетил-L-цистеина у поређењу са контролном групом.

227

Слика 61. Утицај примене деодорисаног воденог екстракта (ДВЕ) (5%, m/V ; 2 mL/kg ТМ) и N-ацетил-L-цистеина (Ac-Cys) на вијабилност туморских ћелија у асцитној течности

На основу добијених резултата може се закључити да се применом ДВЕ пре настанка туморске промене остварује значајнији ефекат него уколико се примењује истовремено са имплементацијом туморских ћелија. Такође, ефекат ДВЕ може бити варијабилан код женки у зависности од њиховог хормонског статуса.

3.2.2. Анализа антиоксидантне/прооксидантне активности ДВЕ: Активност антиоксидантних ензима, садржај редукованог глутатиона и интензитет липидне пероксидације Резултати одређивања активности антиоксидантних ензима укључених у регулацију оксидо-редукционог статуса ћелије, ксантин оксидазе ( XOD ), каталазе ( CAT ), пероксидазе ( Px ), глутатион пероксидазе ( GSHPx ) и глутатион редуктазе ( GR ), приказани су у Табели 46 . Резултати одређивања садржаја глутатиона и интензитета липидне пероксидације дати у Табели 47 . У поређењу са активношћу ензима утврђеном за контролну групу, утицај примене ДВЕ на активност испитиваних ензима био је израженији код група

228

животиња код којих је примена испитиваног екстракта започета пре или истовремено са имплементацијом ћелија ЕАТ ('пре-третман' и 'третман') него код групе животиња код које је примена започета седам дана након имплементације ћелија ЕАТ ('пост-третман'). Активност XOD у ћелијама Ерлиховог тумора била је статистички већа код група животиња 'пре-третман' и 'третман', док повећање активности код животиња оба пола групе 'пост-третман' није било статистички значајно. Ефекат ДВЕ на активност CAT није био статистички значајан ни код једне групе огледних животиња. Активност Px била је значајно повећана код животиња група 'пре-третман' и 'третман', док је код животиња третираних екстрактом након имплементације ћелија ЕАТ ефекат изостао.

Табела 46. Утицај примене ДВЕ (5%, m/V ; 2 mL/kg ТМ) на активност ензима XOD , CAT , Px , GR и GSHPx у ћелијама Ерлиховог асцитног тумора (ЕАТ)

Група Активност ензимa (µmol/mL ·min) у ћелијама ЕАТ

Мужјаци XOD CAT Px GR GSHPx Контролна група 0,123±0,011 0,445±0,012 0,279±0,001 1,38±0,01 0,772±0,009 'пре-третман' 3,22±0,14 * 0,458±0,029 0,922±0,11 * 3,45±0,21 * 4,82±0,36 * 'третман' 1,56±0,18 * 0,311±0,021 0,627±0,065 2,78±0,17 5,11±0,34 'пост-третман' 0,538±0,120 0,284±0,100 0,302±0,078 2,07±0,26 3,67±0,25 Женке Контролна група 0,152±0,013 0,512±0,023 0,328±0,001 2,24±0,05 0,783±0,011 'пре-третман' 4,15±0,15 ** 0,247±0,11 ** 0,912±0,13 ** 3,78±0,34 3,87±0,64 ** 'третман' 1,69±0,17 ** 0,287±0,120 0,547±0,078 2,92±0,18 3,12±0,57 'пост-третман' 0,684±0,130 0,413±0,069 0,327±0,091 2,07±0,31 2,08±0,34 * Вредности су изражене каo средња вредност, Xsr , ±Sd одређена код 6 животиња за ниво вероватноће p=0,05. , статистички значајна разлика у односу на контролну групу мужјака за ниво вероватноће p=0,05; ** , статистички значајна разлика у односу на контролну групу женки за ниво вероватноће p=0,05.

Активност ензимског система GR и GSHPx , који је укључен у регулацију садржаја GSH , била је значајно већа код третираних група животиња, при чему је ефекат примене ДВЕ био израженији према активности GSHPx (око 6 пута у односу на контролну групу). Утицај ДВЕ на активност GSHPx био је мање изражен код женки него код мужјака. Одређени садржај GSH у складу је утицајем примене ДВЕ на GR и GSHPx . Интензитет липидне пероксидације ( LPx ) у ћелијама ЕАТ процењен је на основу садржаја малонилдиалдехида (МДА). У поређењу са контролном групом, у туморским ћелијама животиња групе 'пре-третман' садржај МДА био је

229

статистички значајно већи. Међутим, значајне разлике у садржају МДА у ћелијама животиња група 'третман' и 'пост-третман' у поређењу са контролном групом нису уочене. Разлог овоме може бити извесно смањење садржаја МДА услед смањене вијабилности ћелија ЕАТ код животиња ових група.

Табела 47. Утицај примене ДВЕ (5%, m/V ; 2 mL/kg ТМ) на садржај редукованог глутатиона ( GSH ) и интензитет липидне пероксидације ( LPx ) у ћелијама Ерлиховог асцитног туморa

Група Садржај GSH Интензитет LPx Мужјаци (nmol/mg) (nmol МДА/mg) Контролна група 1,50±0,02 0,029±0,001 'пре-третман' 0,312±0,11 * 0,91±0,11 * 'третман' 0,587±0,12 * 0,078±0,053 'пост-третман' 0,945±0,11 * 0,074±0,061 Женке Контролна група 1,63±0,01 0,031±0,001 'пре-третман' 0,248±0,12 * 0,24±0,09 ** 'третман' 0,694±0,09 * 0,064±0,037 'пост-третман' 1,26±0,05 0,040±0,012

Вредности су изражене каo средња вредност, Xsr ,±Sd одређена код 6 животиња за ниво вероватноће p=0,05. *, статистички значајна разлика у односу на контролну групу мужјака за ниво вероватноће p=0,05; ** , статистички значајна разлика у односу на контролну групу женки за ниво вероватноће p=0,05.

Ерлихов асцитини тумор (ЕАТ) је врло инвазиван аденокарцином погодан за лабораторијска испитивања. Након интраперитонеалне имплементације ћелија ЕАТ, долази до брзог раста броја туморских ћелија и повећања запремине асцитне течности, што се доводи у везу са повећањем пропустљивости перитонеалних крвних судова. Како асцитна течност представља директан извор хранљивих материја за туморске ћелије, повећање њеног волумена је значајно и за раст самог тумора (Ozaslan и сар., 2011 ). Малигно трансформисане ћелије, се између осталог, карактеришу промењеним енергетским метаболизмом који им омогућава да опстану у условима сталног раста и деоба. Поред тога, ове ћелије се одликују смањеном апоптозом и повећаном некрозом (уз ослобађање проинфламаторних супстанци), а развиле су и механизме избегавања ћелијама имунског система (Hanahan и Weinberg, 2011 ). У оваквим условима, оксидо-редукциони статус

230

малигних ћелија је промењен, а њихова отпорност према оксидативном стресу повећана у односу на здраве ћелије. Агенси богати полифенолним једињењима могу испољити оксидантни или прооксидантни ефекат у зависности од особина једињења и примењене дозе, па је ефекат таквог агенса према туморским ћелијама теже предвидив ( Trachotham и сар., 2009 ). У испитивањима у овом раду, примена деодорисаног воденог екстракта хербе панонског тимијана (ДВЕ) код животиња са имплементираним ЕАТ резултовала дозно-зависним смањењем броја туморских ћелија, запремине асцитеса, и вијабилности туморских ћелија. Ефекат примене био је осетнији код женки, што се може објаснити естроген-зависном природом ћелија ЕАТ. Поред тога, смањење броја ћелија, запремине асцитеса и вијабилности ћелија било је израженије код група животиња које су биле третиране испитиваним ДВЕ пре имплементације тумора, него код група код којих је третман започет истовремено са или седам дана након имплементације, указујући на хемопревентивни ефекат ДВЕ. За разлику од уочљивог ефекта испољеног применом ДВЕ, примена N-ацетил-L-цистеина, као стандардног антиоксиданса, није имала значајнији утицај на раст тумора. У туморским ћелијама животиња контролне (нетретиране) групе активност ензима XOD и интензитет LPx били су ниски, што указује на то да су механизме продукције оксиданаса у малигним ћелијама супримирани. Код животиња третираних испитиваним ДВЕ (5%, m/V ; 2 mL/kg ТМ) вредности ових параметара биле су значајно повишене. Овакав ефекат може бити последица изложености малигних ћелија оксидативном стресу изазваним применом ДВЕ, односно његовом прооксидантном активношћу. Активност ензимског система укљученог у регенерацију GSH било је значајно повишено. Изразито повећана активност GSHPx , као и благо повећање активности GR и смањење нивоа GSH , у односу на контролну групу, указују на то да су се туморске ћелије третираних животиња налазиле у стању оксидативног стреса, односно да је за антитуморски ефекат ДВЕ одговорно његово прооксидантно дејство (Ćebović и сар., 2008 ). За РК, која представља доминантно једињење у испитиваном екстракту, поред антиоксидантног, утврђено је да остварује прооксидантни, као и низ других биолошких ефеката ( Petersen, 2013 ; Muñoz-Muñoz и сар., 2013 ). Сматра се да ово једињење потенцијално може имати употребу као састојак функционалне

231

хране ( Fernández-Ginés и сар., 2005 ), и као хемопревентивни агенс у борби против рака ( Link et al., 2010 ). Цитотоксична активност розмаринске киселине in vitro утврђена је у већем броју испитивања. У истраживању Stanojković и сар. (2013) РК је у MTT тесту испољила цитотоксични ефекат према неколико туморских ћелијских линија, али не и према линији здравих ћелија MRC 5. Berdowska и сар. (2013) су испитивали активност водених екстраката неколико Lamiaceae врста ( Mentha piperita , Majorana hortensis , Th. vulgaris и Th. serpyllum ) и њихових полифенолних састојака. РК и њен дериват литосперминска киселина, као и лутеолин 7-О- глукуронид, испољили су снажнију активност у поређењу са осталим испитиваним супстанцама састојцима екстраката (лутеолин 7-О-рутинозид, кафен киселина, ериодиктиол 7-О-рутинози и арбутин). Водени екстракти Th. vulgaris и Th. serpyllum , који су садржавали 15,1% и 19,3% РК, редом, довели су до смањења вијабилности 50% адријамицин-резистентних MCF -7 канцерских ћелија у концентрацијама од 407 mg/L и 399 mg/L, редом. Ефекат екстраката које су испитивали аутори био је израженији од ефеката појединачних једињења које је екстракт садржавао, што може бити последица синергистичких и адитивних, као и антагноистичких ефеката, како познатих и идентификованих, тако и непознатих, састојака екстраката. In vivo цитотоксични ефекат екстраката биљака Prunella vulgaris (Feng и сар., 2010 ) и Perilla frutescens (Osakabe и сар., 2004 ) такође је био обајшњен присуством РК и њених деривата. Поред тога, Karmokar и сар. (2012) су установили да је хроничнa p.o. примена РК успорила развој аденома код миша. Механизам цитотоксичног дејства РК и даље није у потпуности расветљен. Анализом резултата in vitro испитивања Berdowska и сар. (2013) су претпоставили да механизам дејства РК, слично резултатима добијеним у овом раду, може бити последица прооксидантног ефекта услед присуства хидроксилних радикала који настају у реакцији грађења хелата прелазних метала са РК. Поред тога, претпоставља се да механизам цитотоксичне активност РК може укључивати и интеракцију РК са ћелијским протеинима чиме ти протеини постају нефункционални ( Berdowska и сар., 2013) , утицај на експресију тумор-супресорских гена p53 и p21 ( Stanojković и сар., 2013 ), или

232

хиперметилацију ДНК тумор-супресорских гена, јер је утврђено да РК снажно инхибра ДНК метилтрансферазу ( Paluszczak и сар., 2010 ). Резултати добијени у овом раду указују да механизам цитотоксичног дејства ДВЕ укључује изазивање оксидативног стреса у туморским ћелијама, али није установљено да ли је РК директно одговорна за овај ефекат. Поред РК, у екстракту је, од идентификованих једињења, био најзаступљенији лутеолин 7-О- диглукуронид. Иако је антитуморско дејство лутеолина потврђено у већем броју испитивања ( Seelinger и сар., 2008 ), допринос хетерозида лутеолина укупном цитотоксичном ефекту ДВЕ вероватно није значајан, јер је садржај ових једињења у испитиваном екстракту релативно низак.

233

V Закључци

234

° Испитивањем садржаја метала у херби и ризосфери панонског тимијана уочена је зависност садржаја испитиваних елемената (Cu, Fe, Mn, Zn и Cr) у херби од њихове биорасположивости у земљишту. Поједини испитивани узорци хербе панонског тимијана могу се сматрати богатим гвожђем, док је садржај цинка низак у свим узорцима, и поред релативно високих концентрација у ризосфери, што указује на специфичну регулацију садржаја Zn код Th. pannonicus .

° Анализом корелација садржаја метала у листу и састава хедспејс фракција листа Th. pannonicus применом хемометријских метода, утврђена је корелација минерала, пре свих Zn, Mg и Mn, и испарљивих једињења. Ови резултати се могу довести у везу са биосинтезом испарљивих терпенских једињења: Zn са синтезом цитрала, Mg са синтезом сесквитерпена β-бурбонена, а Mn са синтезом неколико монотерпена.

° Садржај етарског уља у херби самониклих биљака износио је 0,03–1,43% (V/m), и разликовао се у зависности од локалитета и фенофазе у којој је херба сакупљена. Херба пореклом са Вршачких планина садржавала је веће количине етарског уља (0,49–1,43%, V/m) у поређењу са хербом са осталих локалитета сакупљеној у истим фенофазама (0,03–0,74%, V/m). Поред тога, садржај етарског уља био је већи пре и током цветања, него након цветања биљака.

° Етарска уља хербе самониклог панонског тимијана карактерисала су се високим садржајем кисеоничних монотерпена (11 узорака), кисеоничних сесквитерпена (5 узорака) или сесквитерпенских угљоводоника (2 узорка). На основу састава могу се поделити у пет група: (1) уља богата цитралом (Вршачке планине пре, током и након цветања), (2) уља са гермакреном D као најзаступљенијим једињењем (Девојачки бунар након цветања; планине Озрен и Ртањ током цветања), (3) етарска уља код којих су доминантне компоненте ( Е)-неролидол, спатуленол и кариофиленоксид (Девојачки бунар пре и током цветања; Гребенац пре и након цветања),

235

(4) етарско уље са линалолом као главном компонентом (планина Стол код Бора током цветања), и (5) етарско уље богато тимолом (Гребенац током цветања). Кисеонични сесквитерпени (Е)-неролидол и спатуленол нису до сада утврђени као главне компоненте раније испитиваних етарских уља Th. pannonicus , док етарска уља у којима преовлађује цитрал, линалол, гермакрен D или тимол, представљају уља већ познатих хемотипова панонског тимијана.

° Из метанолног екстракта хербе панонског тимијана изолована су и идентификована 4 једињења: апигенин 7-О-глукуронид, розмаринска киселина, 3-O-(2-кафенил)-розмаринска киселина и 3-O-(метил-2-кафенил)- розмаринска киселина, док је из воденог екстракта изолован и идентификован лутеолин 7-О-диглукуронид. 3-O-(Метил-2-кафенил)-розмаринска киселина и лутеолин 7-О-диглукуронид први пут су изоловани из биљака рода Thymus , док је присуство апигенин 7- О-глукуронида и 3-O-(2-кафенил)-розмаринске киселине први пут утврђено у Th. pannonicus у овом раду.

° Главна компонента поларних екстраката (водено-метанолних, инфуза и деодорисаног воденог екстракта) самониклог панонског тимијана била је розмаринска киселина. Поред фенолкарбоксилних киселина, розмаринске и њених деривата (3-O-(2-кафенил)-розмаринске киселине и 3-O-(метил-2- кафенил)-розмаринске киселине) у поларним екстрактима утврђено је и присуство флавоноидних хетерозида, међу којима су били најзаступљенији глукурониди апигенина и лутеолина. Садржај хетерозида лутеолина у екстрактима био је већи од садржаја хетерозида апигенина.

° Квантитативни састав поларних екстраката разликовао се у зависности од локалитета. Водено-метанолни екстракти хербе са Вршачких планина карактерисали су се присуством већих количина деривата розмаринске киселине (пре свега 3-O-(2-кафенил)-розмаринске киселине и 3-O-(метил-2- кафенил)-розмаринске киселине), док су водено-метанолни екстракти хербе

236

сакупљене на планинама у источној Србији (на Столу, Озрену и Ртњу) имали ниске концентрације ових киселина. У поређењу са осталим, ови екстракти су били најбогатији хетерозидима лутеолина и апигенина. Водено-метанолни екстракти хербе пореклом из Девојачког бунара и Гребенца, имали су најнижи садржај розмаринске киселине уз врло мале количине њених деривата. Садржај хетерозида апигенина био је приближан садржају ових једињења у одговарајућим екстрактима хербе са планина у источној Србији, а садржај хетерозида лутеолина између екстракта хербе са Вршачких планина и планина у источној Србији. Поред розмаринске киселине, главно једињење у испитиваним инфузима пореклом са Вршачких планина и у деодорисаном воденом екстракту био је лутеолин 7-О-диглукуронид, а у инфузима хербе са осталих локалитета лутеолин 7-О-глукуронид.

° У хедспејс фракцијама инфуза доминантну класу једињења представљали су кисеонични монотерпени. Поређењем састава хедспејс фракција инфуза у зависности од порекла хербе уочене су разлике у саставу. Најзаступљенија једињења била су гераниал и нерал у узорцима пореклом са Вршачких планина, 3-октанон и 1,8-цинеол у узорцима пореклом из Девојачког бунара, 1-октен-3-ол, 1,8-цинеол и тимол у узорку пореклом из Гребенца, 1-октен-3- ол и 1,8-цинеол у узорку са планине Озрен, линалол у узорку са планине Стол и 1,8-цинеол у хедспејс фракцији инфуза хербе са планине Ртањ.

° Испитивани поларни екстракти (водено-метанолни, инфузи и деодорисани водени екстракт) хербе самониклог панонског тимијана испољили су јаку редукциону и антирадикалску активност in vitro . Антиоксидантни ефекат водено-метанолних екстраката није се значајно разликовао у зависности од локалитета на коме је херба сакупљена, док су се међу инфузима према нешто јачој антиоксидантној активности издвајали инфузи хербе пореклом са Вршачких планина и из Гребенца. Утицај фенофазе на антиоксидантну активност водено-метанолних екстраката био је мање изражен. Антиоксидантна активност деодорисаног воденог екстракта није се значајно

237

разликовала од активности водено-метанолних екстракта хербе самониклог панонског тимијана. Испољена антиоксидантна активност екстраката не може се приписати дејству неком од појединачних састојака, већ је зависила од целокупног састава екстракта.

° Антимикробна активност инфуза хербе самониклог панонског тимијана испитивана је микродилуционом методом. Инфузи су инхибирали раст Грам(+) ( Staphylococcus aureus , Staphylococcus epidermidis , Bacillus subtilis и Enterococcus faecalis ) и Грам(–) бактерија (Escherichia coli , Klebsiella pneumoniae и Pseudomonas aeruginosa ). Сви инфузи су остварили најизраженији ефекат према соју гљивице Candida albicans . Најјачу антимикробну активност испољио је инфуз хербе пореклом из Гребенца, а потом инфузи хербе са планине Стол, са Вршачких планина, и из Девојачког бунара. Слабији ефекат остварио је инфуз хербе са планине Озрен, а најслабији инфуз хербе са планине Ртањ. Разлике у испољеној антимикробној активности завиле су од садржаја и структуре полифенолних једињења у инфузима, али и од састава хедспејс фракције инфуза.

° Испитивањем антиоксидантне активности in vivo , на моделу угљентетрахлоридом индукованог оксидативног стреса код пацова, деодорисани водени екстракт je испољио умерени антиоксидантни ефекат, али је у вишим испитиваним дозама (1,0–5,0 mL/kg TM) примена екстракта довела до значајног смањења интензитета липидне пероксидације и одржавања физиолошких концентрација глутатиона.

° Према ћелијама Ерлиховог асцитног тумора код миша деодорисани водени екстракт је деловао цитотоксично. На основу добијених резултата, механизам испољеног цитотоксичног дејства деодорисаног воденог екстракта in vivo може укључивати прооксидантни ефекат екстракта.

238

° Као оптималан период сакупљања хербе панонског тимијана може се сматрати период пре и током цветања, с обзиром на то да је садржај етарског уља у херби током ових периода већи него након цветања, као и да састав и антиоксидантна активност водено-метанолних екстраката не показују значајније разлике у односу на фенофазу.

° Јединке са Вршачких планина због већег садржаја етарског уља богатог цитралом, мање варијабилног састава и јаче активности инфуза одабране за плантажно гајење.

° У циљу утврђивање варијабилности хемијског састава и биолошке активности панонског тимијана гајеног у плантажним условима, испитиван је садржај и састав етарског уља, хемијски састав и антиоксидантна активност водено-метанолних екстраката 15 узорака хербе гајених у различитим условима.

° Садржај ЕУ у херби гајеног панонског тимијана износио је 0,32–1,20 ml/100 g, највиши садржај ЕУ од 1,20 ml/100 g одређен је у узорку гајеном у заштићеном простору без додатака ђубрива.

° У погледу састава и главних састојака испитивани узорци етарског уља хербе гајеног Th. pannonicus међусобно су слични. Као главне компоненете идентификовани су гераниал (39,24–46,24%) и нерал (29,92–35,62%), осим у уљу једног узорка где је геранилацетат (30,34%), представљао доминантно једињење.

° Главне компонентe водено-метанолних екстраката хербе гајених биљака биле су розмаринска киселина, хетерозиди апигенина (доминантан апигенин 7-О-глукуронид) и хетерозиди лутeолина (доминантан лутеолин 7- О-глукуронид), а утврђено је и присуство 3-O-(2-кафенил)-розмаринске киселине и 3-O-(метил-2-кафенил)-розмаринске киселине.

239

° Различитим режимом ђубрења јединки Th. pannonicus добијена је херба релативно уједначеног хемијског састава у погледу садржаја и састава етарског уља и састава водено-метанолних екстраката, што је резултовало и уједначеном антиоксидантном активношћу водено-метанолних екстраката.

° Ипак, на основу мањих разлика хемијског састава и in vitro антиоксидантне активности екстраката хербе гајеног панонског тимијана могу се разликовати групе узорака које се и макроскопски благо разликују: (1) херба 'глатког листа' која се одликује нижим садржајем етарског уља и вишим садржајем укупних полифенола и розмаринске киселине, и (2) херба 'длакавог листа' са вишим садржајм етарског уља и нижим садржајем укупних полифенола и розмаринске киселине. Етарска уља свих узорака одликовала су се високим садржајем гераниала и нерала (цитрала). Предност у одабиру форме панонског тимијана која би била погодна за плантажно гајење ради добијања етарског уља, имају биљке 'длакавог листа'.

° Хербе гајених биљака и самониклих биљака пореклом са Вршачких планина међусобно се не разликују значајно у погледу садржаја и састава етарског уља, док је садржај укупних полифенола био нешто нижи, а садржај розмаринске киселине виши у водено-метанолним екстрактима гајених биљака. Основна разлика у хемијском саставу је у садржају хетерозида апигенина, који је у водено-метанолним екстрактима хербе гајених биљака значајно већи него у екстрактима самониклих биљака. Са друге стране, антиоксидантна активност екстраката хербе гајеног панонског тимијана била је нешто нижа у поређењу са екстрактима хербе самониклог Th. pannonicus .

° На основу експериментално добијених резултата приређена је монографија потенцијалне биљне дроге, Thymi pannonici herba , у којој су дате дефиниција и особине дроге и захтеви за испитивање општег и специфичног квалитета. Као параметри специфичног квалитета предложени су садржај етарског уља (најмање 5,0 mL/кg) и садржај цитрала у етарском уљу (најмање 70%).

240

На основу резултата овог рада може се закључити да херба панонског тимијана, захваљујући високом садржају полифенолних једињења и етарског уља богатог цитралом, као и испољеној антиоксидантној и антимикробној активности, потенцијално представља нову биљну лековиту сировину, која би се у савременој фитотерапији могла примењивати слично дрогама Thymi herba и Serpylli herba. Поред тога, херба панонског тимијана се може користити као сировина за добијање етарског уља, цитрала и деодорисаног воденог екстракта, као потенцијалног састојка или адитива у козметичкој или прехрамбеној индустрији.

241

Литература

242

1. Adams R., Identification of essential oil component by gas chromatography/ quadrupole mass spectrometry, Allured Publishing Corporation, Carol Stream, 2001 . 2. Alonso W.R., Croteau R. ( 1991 ), Purification and characterization of the monoterpene cyclase γ-terpinene synthase from Thymus vulgaris , Archives of Biochemistry and Biophysics 286(2), 511–517. 3. Androutsopoulos V.P., Papakyriakou A., Vourloumis D., Tsatsakis A.M., Spandidos D.A. ( 2010 ), Dietary flavonoids in cancer therapy and prevention: Substrates and inhibitors of cytochrome P450 CYP1 enzymes, Pharmacology and Therapeutics 126(1), 9–20. 4. Argyropoulou C., Daferera D., Tarantilis P.A., Fasseas C., Polissiou M ( 2007 ), Chemical composition of the essential oil from leaves of Lippia citriodora H.B.K. (Verbenaceae) at two developmental stages, Biochemical Systematics and Ecology 35(12), 831–837. 5. Armatu A., Colceru-Mihul S., Bubueanu C., Draghici E., Pirvu L. ( 2010 ), Evaluation of antioxidant and free scavenging potential of some Lamiaceae species growing in Romania, Romanian Biotechnological Letters 15(3), 5274–5280. 6. Aziz E.E., Gad N. ( 2011 ), Physiological and chemical response of lemongrass ( Cymbopogon citratus L.) to cobalt nutrition, a herb yield, essential oil content and composition, Journal of Applied Sciences Research 7, 1732–1736. 7. Baranauskienè R., Venskutonis P.R., Viškelis P., Dambrauskienè E. ( 2003 ), Influence of nitrogen fertilizers on the yield and composition of thyme ( Thymus vulgaris ), Journal of Agricultural and Food Chemistry 51(26), 7751– 7758. 8. Barros L., Dueñas M., Dias M.I., Sousa M.J., Santos-Buelga C, Ferreira I.C.F.R. ( 2013 ), Phenolic profiles of cultivated, in vitro cultured and commercial samples of Melissa officinalis L. infusions, Food Chemistry 136(1), 1– 8. 9. Basile A., Giordano S., López-Sáez J.A., Cobianchi R.C. ( 1999 ), Antibacterial activity of pure flavonoids isolated from mosses, Phytochemistry 52(8), 1479–1482. 10. Baxter I., Hermans C., Lahner B., Yakubova E., Tikhonova M., Verbruggen, N., Chao D.-Y., Salt D.E. ( 2012 ), Biodiversity of mineral nutrient and trace element accumulation in Arabidopsis thaliana , PloS One 7(4), e35121. 11. Beers R.F.J., Sizer J.W. (1950 ) Spectrophotometric method for measuring of breakdown of hydrogen peroxide by catalase, Journal of Biological Chemistry 195, 133–140. 12. Begrow F., Engelbertz J., Feistel B., Lehnfeld R., Bauer K., Verspohl E.J. (2010 ), Impact of thymol in thyme extracts on their antispasmodic action and ciliary clearance, Planta Medica 76(4), 311–318. 13. Bentes J., Miguel M.G., Monteiro I., Costa M., Figueired A.C., Barroso J.G., Pedro L.G. ( 2009 ), Antioxidant activities of the essential oils and extracts of portuguese Thymbra capitata and Thymus mastichina , Italian Journal of Food Science 21(2), 183–196. 14. Berdowska I., Zieliński B., Fecka I., Kulbacka J., Saczko J., Gamian A. ( 2013 ), Cytotoxic impact of phenolics from Lamiaceae species on human breast cancer cells, Food Chemistry 141(2), 1313–1321. 15. Bergmayer U.H., Methoden der enzymatischen Analyse , Verlag Chemies, Weinheim, 1970 , pp. 483–484. 16. Bergonzelli G.E., Donnicola D., Porta N., Corthe I.E., Remy L.M. ( 2003 ), Essential oils as components of a diet- based approach to management of Helicobacter infection, Society 47(10), 3240–3246. 17. Beuthler E. (1984 ), Glutathione reductase, glutathione peroxidase, catalase, glutathione, у: Beutler E. (ур.), Red cell metabolism: a manual of biochemical methods, Grune and Stratton, New York. 18. Beuthler E., Duron O., Kelly B. ( 1983 ), Improved methods for the determination of blood glutathione, Journal of Laboratory and Clinical Medicine 61, 882–889. 19. Bianchini A., Santoni F., Paolini J., Bernardini A.-F., Mouillot D., Costa J. ( 2009 ), Partitioning the relative contributions of inorganic plant composition and soil characteristics to the quality of Helichrysum italicum subsp. italicum (Roth) G. Don fil. essential oil, Chemistry and Biodiversity 6(7), 1014–1033.

243

20. Bicchi C., Drigo S., Rubiolo P. ( 2000 ), Influence of fibre coating in headspace solid-phase microextraction-gas chromatographic analysis of aromatic and medicinal plants, Journal of Chromatography A 892(1–2), 469–485. 21. Bilia A.R., Giomi M., Innocenti M., Gallori S., Vincieri F.F. ( 2008 ), HPLC-DAD-ESI-MS analysis of the constituents of aqueous preparations of verbena and lemon verbena and evaluation of the antioxidant activity, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 46(3), 463–470. 22. Blásquez M.A., Manez S., Zafra-Polo M.C. ( 1994 ), Further flavonoids and other phenolics of Thymus webbianus Rouy, Zeitschrift fur Naturforschung C 49(9-10), 687–688. 23. Blumenthal M. , The Complete German Commission E Monographs, Therapeutic Guide to Herbal Medicines , 1st ed. American Botanical Council, Austin, Texas, 1998. 24. Boros B., Jakabová S., Dörnyei Á., Horváth G., Pluhár Z., Kilár F., Felinger A. ( 2010 ), Determination of polyphenolic compounds by liquid chromatography–mass spectrometry in Thymus species, Journal of Chromatography A 1217(51), 7972–7980. 25. Buege A.L., Aust D.S., Microsomal lipid peroxidation, у: Fleisher S., Parker L. (ур.), Methods in еnzymology, Academic Press, New York, 1978 . 26. Cabré M., Camps J., Paternáin Jl., Ferré N., Joven J. ( 2000 ), Time-course of changes in hepatic lipid peroxidation and glutathione metabolism in rats with carbon tetrachloride-induced cirrhosis, Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 27(9), 694–699. 27. Candan F, Unlu M, Tepe B, Daferera D, Polissou M, Sökmen A, Akpulat A. ( 2003 ), Antioxidant and antimicrobial activity of the essential oil and methanol extracts of Achillea millefolium subsp. millefolium Afan. (Asteraceae), Journal of Ethnopharmacology 87, 215–220. 28. Cantino P.D., Sanders R.W. ( 1986 ), Subfamilial classification of Labiatae, Systematic Botany 11(1), 163–185. 29. Carnat A., Carnat A.P., Fraisse D., Lamaison J.L. ( 1999 ), The aromatic and polyphenolic composition of lemon verbena tea, Fitoterapia 70(1), 44–49. 30. Carnat A., Carnat A.P., Fraisse D., Ricoux L., Lamaison J.L. ( 2004 ), The aromatic and polyphenolic composition of Roman camomile tea, Fitoterapia 75(1), 32–38. 31. Cazzola R., Camerotto C., Cestaro B. ( 2011 ), Anti-oxidant, anti-glycant, and inhibitory activity against α-amylase and α-glucosidase of selected spices and culinary herbs, International Journal of Food Sciences and Nutrition 62(2), 175–184. 32. Чајкановић В., Речник српских народних веровања о биљкама , САНУ, СКЗ, Београд, 1985 . 33. Ćavar S., Maksimović M., Šolić M.E., Jerković-Mujkić A., Bešta R. ( 2008 ), Chemical composition and antioxidant and antimicrobial activity of two Satureja essential oils, Food Chemistry 111(3), 648–653. 34. Ćavar S., Maksimović M., Vidic D. ( 2009 ), The essential oil of Thymus aureopunctatus (Beck) K. Malý, Natural Product Communications 4(3), 415–420. 35. Ćebović T. ( 2008 ), Uticaj ekstrakata imele ( Viscum album L.) sa različitih domaćina na stvaranje slobodnih radikala kiseonika i aktivnost antioksidantnih enzima , Doktorska disertacija, Univerzitet u Beogradu – Farmaceutski fakultet, Beograd. 36. Ćebović T., Spasić S., Popović M. (2008 ), Cytotoxic effects of the Viscum album L. extract on Ehrlich tumour cells in vivo , Phytotherapy Research 22, 1097–1103. 37. Ćebović T., Spasić S., Popović M., Borota J., Leposavić G. ( 2006 ), The European mistletoe ( Viscum album L.)

grown on plums extract inhibits CCl 4-induced liver damage in rats, Fresenius Environmental Bulletin 15(5), 393– 400. 38. Chatzopoulou P.S., Katsiotis S.T. ( 2006 ), Headspace analysis of the volatile constituents from Juniperus communis L. “berries” (cones) grown wild in Greece, Flavour and Fragrance Journal 21(3), 492–496.

244

39. Chen F., Tholl D., D’Auria J.C., Farooq A., Pichersky E., Gershenzon J. ( 2003 ), Biosynthesis and emission of terpenoid volatiles from Arabidopsis flowers, Plant Cell 15(2), 481–494. 40. Chen J.H., Ho C.-T. (1997 ), Antioxidant аctivities of caffeic Acid and its related hydroxycinnamic acid compounds, Journal of Agricultural and Food Chemistry 45(7), 2374–2378. 41. Chizzola R., Michitsch H. ( 2003 ), Monitoring of metallic micronutrients and heavy metals in herbs, spices and medicinal plants from Austria, European Food Research And Technology 216(5), 407–411. 42. Chizzola R., Michitsch H., Franz C. ( 2008 ), Antioxidative properties of Thymus vulgaris leaves: comparison of different extracts and essential oil chemotypes, Journal of Agricultural and Food Chemistry 56(16), 6897–6904. 43. Christianson D.W. ( 2006 ), Structural biology and chemistry of the terpenoid cyclases, Chemical Reviews 106(8), 3412–3442. 44. Chun H., Shin D.H., Hong B.S., Cho H.Y., Yang H.C. ( 2001 ), Purification and biological activity of acidic polysaccharide from leaves of Thymus vulgaris L., Biological and Pharmaceutical Bulletin 24(8), 941–946. 45. Cowan M.M. ( 1999 ), Plant products as antimicrobial agents, Clinical Microbiology Reviews 12(4), 564–582. 46. Crocoll C. ( 2011 ), Biosynthesis of the phenolic monoterpenes, thymol and carvacrol, by terpene synthases and cytochrome P450s in oregano and thyme , Dissertation, Friedrich Schiller Universität – Biologisch- Pharmazeutische Fakultät, Jenа. 47. Croteau R., Alonso W.R., Koepp A.E., Johnson M.A. ( 1994 ), Biosynthesis of monoterpenes: Partial purification, characterization, and mechanism of action of 1,8-cineole synthase, Archives of Biochemistry and Biophysics 309(1), 184–192. 48. Cuendet M., Hostettmann K., Potterat O. ( 1997 ), Iridoid glucosides with free radical scavenging properties from Fragrea blumei , Helvetica Chimica Acta 80(4), 1144–1152. 49. Cushnie T.P.T., Lamb A.J. ( 2011 ), Recent advances in understanding the antibacterial properties of flavonoids, International Journal of Antimicrobial Agents 38, 99–107. 50. Dalton D., Foundations of organic chemistry: Unity and дiversity of structures, pathways, and reactions , John Wiley & Sons, Hoboken, 2011 . 51. Damašius J., Venskutonis P.R., Kaškoniene V., Maruška A. (2014 ), Fast screening of the main phenolic acids with antioxidant properties in common spices using on-line HPLC/UV/DPPH radical scavenging assay, Analytical Methods 6(8), 2774–2779. 52. Dandlen S.A., Lima A.S., Mendes M.D., Miguel M.G., Faleiro M.L., Sousa M.J., Pedro L.G., Barroso J.G., Figueiredo A.C. ( 2011 ), Antimicrobial activity, cytotoxicity and intracellular growth inhibition of Portuguese Thymus essential oils, Brazilian Journal of Pharmacognosy 21(6), 1012–1024. 53. Dapkevicius A., Van Beek T.A., Lelyveld G.P., Van Veldhuizen A., De Groot A., Linssen J.P.H., Venskutonis R. (2002 ), Isolation and structure elucidation of radical scavengers from Thymus vulgaris leaves, Journal of Natural Products 65 (6), 892–896. 54. De Coensel N., Desmet K., Górecki T., Sandra P. ( 2007 ), Determination of polydimethylsiloxane-air partition coefficients using headspace sorptive extraction, Journal of Chromatography A 1150(1–2), 183–189. 55. De Martino L., Bruno M., Formisano C., De Feo V., Napolitano F., Rosselli S., Senatore F. ( 2009 ), Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oils from two species of Thymus growing wild in southern Italy, Molecules 14(11), 4614–4624. 56. Delgado T., Marinero P., Asensio-S.-Manzanera M. C., Asensio C., Herrero B., Pereira J.A., Ramalhosa E. ( 2014 ), Antioxidant activity of twenty wild Spanish Thymus mastichina L. populations and its relation with their chemical composition, LWT - Food Science and Technology 57(1), 412–418. 57. Dembitskii A.D., Yurina R.A., Krotova G.I. ( 1985 ), The composition of the essential oils of Thymus marschallianus , Khimiya Prirodnykh Soedinenii 21(4), 477–480.

245

58. Demissie Z.A., Cella M.A., Sarker L.S., Thompson T.J., Rheault M.R., Mahmoud S.S. ( 2012 ), Cloning, functional characterization and genomic organization of 1,8-cineole synthases from Lavandula , Plant Molecular Biology 79(4-5), 393–411. 59. Диклић Н. (1974 ), Thymus L., у: Јосифовић M. (ур.), Флора Р. Србије, САНУ, Београд, pp . 475–509. 60. Domitrović R., Jakovac H., Grebić D., Milin C., Radosević-Stasić B. ( 2008 ), Dose- and time-dependent effects of luteolin on liver metallothioneins and metals in carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity in mice, Biological Trace Element Research 126(1–3), 176–185. 61. Dorman H.J., Deans S.G. ( 2000 ), Antimicrobial agents from plants: antibacterial activity of plant volatile oils, Journal of Applied Microbiology 88(2), 308–316. 62. Dorman H.J.D., Bachmayer O., Kosar M., Hiltunen R. ( 2004 ), Antioxidant properties of aqueous extracts from selected Lamiaceae species grown in Turkey, Journal of Agricultural and Food Chemistry 52(4), 762–770. 63. Dorman H.J.D., Peltoketo A., Hiltunen R., Tikkanen M.J. (2003 ), Characterisation of the antioxidant properties of de-odourised aqueous extracts from selected Lamiaceae herbs, Food Chemistry 83(2), 255–262. 64. Dranik L.I. ( 1966 ), A spectroscopic investigation of the phenolcarboxylic acids of Cynara scolymus , Khymia Prirodnykh Soedinenii 2(5), 303–306. 65. El Habazi K., Aboufatima R., Benharref A., Zyad A., Chait A., Dalal A. ( 2006 ), Study on the antinociceptive effects of Thymus broussonetii Boiss extracts in mice and rats, Journal of Ethnopharmacology 107(3), 406–411. 66. EMA/HMPC/130042/2010 Corr ., Community herbal monograph on Thymus vulgaris L. and Thymus zygis L., herba and Primula veris L. and Primula elatior (L.) Hill, radix, European Medicines Agency, Cometee on Herbal Medicinal Products, London, 2013. 67. EMA/HMPC/131901/2009 , Community herbal monograph on Thymus vulgaris L., Thymus zygis Loefl. ex L., aetheroleum, European Medicines Agency, Cometee on Herbal Medicinal Products, London, 2010. 68. EMA/HMPC/342332/2013 , Community herbal monograph on Thymus vulgaris L., Thymus zygis L., herba, European Medicines Agency, Cometee on Herbal Medicinal Products, London, 2014. 69. Engelbertz J., Lechtenberg M., Studt L., Hensel A., Verspohl E.J. ( 2012 ), Bioassay-guided fractionation of a thymol-deprived hydrophilic thyme extract and its antispasmodic effect, Journal of Ethnopharmacology 141(3), 848–853. 70. Fähnrich A., Brosemann A., Teske L., Neumann M., Piechulla B. ( 2012 ), Synthesis of ‘cineole cassette’ monoterpenes in Nicotiana section Alatae : gene isolation, expression, functional characterization and phylogenetic analysis, Plant Molecular Biology 79(6), 537–553. 71. Fähnrich A., Krause K., Piechulla B. ( 2011 ), Product variability of the “cineole cassette” monoterpene synthases of related Nicotiana species, Molecular Plant 4(6), 965–984. 72. Fähnrich A., Neumann M., Piechulla B. ( 2014 ), Characteristic alatoid ‘cineole cassette’ monoterpene synthase present in Nicotiana noctiflora , Plant Molecular Biology 85 (1-2), 135–145. 73. Falara V., Akhtar T.A., Nguyen T.T.H, Spyropoulou E.A., Bleeker P.M, Schauvinhold I., Matsuba Y., Bonini M.E., Schilmiller A.L., Last R.L., Schuurink R.C., Pichersky E. ( 2011 ), The tomato terpene synthase gene family, Plant Physiology 157(2), 770–789. 74. Fecka I., Turek S. ( 2008 ), Determination of polyphenolic compounds in commercial herbal drugs and spices from Lamiaceae: thyme, wild thyme and sweet marjoram by chromatographic techniques, Food Chemistry 108(3), 1039–1053. 75. Feng L.A., Jia X.B., Zhu M.M., Chen Y., Shi F. ( 2010 ), Antioxidant activities of total phenols of Prunella vulgaris L. in vitro and in tumor-bearing mice, Molecules 15, 9145–9156. 76. Fernández-Ginés J.M., Fernández-López J., Sayas-Barberá E., Pérez-Alvarez J.A. ( 2005 ), Meat products as functional foods: A review, Journal of Food Science , 70(2), 37–43.

246

77. Figueiredo A.C., Barroso J.G., Pedro L.G., Salgueiro L., Miguel M.G., Faleiro M.L. ( 2008 ), Portuguese Thymbra and Thymus species volatiles: chemical composition and biological activities, Current Pharmaceutical Design 14(29), 3120–3140. 78. Fujimoto A., Masuda T. ( 2012 ), Antioxidation mechanism of rosmarinic acid, identification of an unstable quinone derivative by the addition of odourless thiol, Food Chemistry 132(2), 901–906. 79. Garcia E., Cabrera C., Lorenzo M.L., López, M.C. ( 2000 ), Chromium levels in spices and aromatic herbs, The Science of the Total Environment 247(1), 51–56. 80. Generalić Mekinić I., Skroza D., Ljubenkov I., Šimat V., Smole Možina S., Katalinić V. ( 2014 ), In vitro antioxidant and antibacterial activity of Lamiaceae phenolic extracts: A correlation study, Food Technology and Biotechnology 52(1), 119–127. 81. Gião M.S., González-Sanjosé M.L., Rivero-Pérez M.D., Pereira C.I., Pintado M.E., Xavier M.F. ( 2007 ), Infusions of Portuguese medicinal plants: Dependence of final antioxidant capacity and phenol content on extraction features, Journal of the Science of Food and Agriculture 87, 2638–2647. 82. Goldberg D.M., Spooner R.J. ( 1983 ), Glutathione reductase, у: Bergmayer H.U. (ур.), Methods of enzymatic analysis, Vol. 3, Weinheim, Basel. 83. Gordo J., Máximo P., Cabrita E., Lourenço A., Oliva A., Almeida J., Filipe M., Cruz P., Barcia R., Santos M., Cruz H. (2012 ), Thymus mastichina : Chemical constituents and their anti-cancer activity, Natural Product Communications 7(11), 1491–1494. 84. Güleryüz G., Arslan H., Kirmizi S., Güçer S. ( 2002 ), Investigation of influence of tungsten mine wastes on the elemental composition of some alpine and subalpine plants on Mount Uludağ, Bursa, Turkey, Environmental Pollution 120(3), 707–716. 85. Hallachan T., Croteau R. ( 1988 ), Monoterpene biosynthesis: demonstration of a geranyl pyrophosphate: sabinene hydrate cyclase in soluble enzyme preparations from sweet marjoram ( Majorana hortensis ), Archives of Biochemistry and Biophysics 264(2), 618–631. 86. Hanahan D., Weinberg R.A. ( 2011 ), Hallmarks of cancer: The next generation, Cell 144(5), 646–674. 87. Handa S.S. ( 2008 ), An оverview of еxtraction techniques for medicinal and aromatic plants, у: Handa S.S., Khanuja S.P.S, Longo G., Rakesh D.D. (ур.), Extraction technologies for medicinal and aromatic plants, ICS- UNIDO, Trieste. 88. Hänsch R., Mendel R. (2009 ), Physiological functions of mineral micronutrients (Cu, Zn, Mn, Fe, Ni, Mo, B, Cl), Current Opinion in Plant Biology 12(3), 259–266. 89. Haraguchi H., Saito, T., Ishikawa, H., Date, H., Kataoka, S., Tamura, Y., Mizutani, K. ( 1996 ), Antiperoxidative components in Thymus vulgaris , Planta Medica 62 (3), 217–221. 90. Harley R.M., Atkins S., Budanstev A.L., Cantino .P.D., Conn B.J., Grayer R., Harley M.M., De Kok R., Krestovskaja T., Morales R., Paton A.J., Ryding O., Upson T. (2004 ), Labiatae, у: Kubitzki, K. (ур.), The families and genera of vascular plants, vol. VII, Springer, Berlin/Heidelberg, pp. 167–275. 91. Havsteen BH. ( 2002 ), The biochemistry and medical significance of the flavonoids, Pharmacology and Therapeutics 96, 67–202. 92. Hayes A.J., Markovic B. ( 2002 ), Toxicity of australian essential oil Backhousia citriodora (Lemon myrtle). Part 1. Antimicrobial activity and in vitro cytotoxicity, Food and Chemical Toxicology 40(4), 535–543. 93. He L.Z., Yang X.E., Stoffella P.J. (2005 ), Trace elements in agroecosystems and impacts on the environment, Journal of Trace Elements in Medicine and Biology 19(2–3), 125–140. 94. Hjortenkrans D.S.T., Bergbäck B.G., Häggerud A.V. ( 2007 ), Metal emissions from brake linings and tires: case studies of Stockholm, Sweden 1995/1998 and 2005, Environmental Science and Technology 41(15), 5224–5230.

247

95. Hoenig M. ( 2001 ), Preparation steps in environmental trace element analysis - facts and traps, Talanta 54(6), 1021–1038. 96. Horwath A., Grayer R., Keith-Lucas D., Simmonds M.S.J. ( 2008 ), Chemical characterisation of wild populations of Thymus from different climatic regions in southeast Spain, Biochemical Systematics and Ecology 36(2), 117–133. 97. Hossain M.B, Rai D.K., Brunton N.P., Martin-Diana A.B., Barry-Ryan C. ( 2010a ), Characterization of phenolic composition in Lamiaceae spices by LC-ESI-MS/MS, Journal of Agricultural and Food Chemistry 58, 10576– 10581. 98. Hossain M.B., Barry-Ryan C., Martin-Diana A.B, Brunton N.P. ( 2010б), Effect of drying method on the antioxidant capacity of six Lamiaceae herbs, Food Chemistry 123(1), 85–91. 99. Hudaib M., Speroni E., Di Pietra A.M., Cavrini V. ( 2002 ), GC/MS evaluation of thyme ( Thymus vulgaris L.) oil composition and variations during the vegetative cycle, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 29(4), 691–700. 100. Husain S.Z., Markham K.R. ( 1981 ), The glycoflavone vicenin-2 and its distribution in related genera within the Labiatae, Phytochemistry 20(5), 1171–1173. 101. Husted S., Persson D.P., Laursen K.H., Hansen T.H., Pedas P., Schiller M., Hegelund J.N., Schjoerring J.K. ( 2011 ), Review: The role of atomic spectrometry in plant science, Journal of Analytical Atomic Spectrometry 26(1), 52– 79. 102. Iijima Y., Gang D.R., Fridman E., Lewinsohn E., Pichersky E. ( 2004 ), Characterization of geraniol synthase from the peltate glands of sweet basil, Plant Physiology 134(1), 370–379. 103. Iijima Y., Wang G., Fridman E., Pichersky E. ( 2006 ), Analysis of the enzymatic formation of citral in the glands of sweet basil, Archives of Biochemistry and Biophysics 448(1–2), 141–149. 104. Illera V., Walter I., Cala V. ( 2001 ), Niveles de metales pesados en Thymus zygis desarrollado en suelos enmendados con residuos organicos urbanos, Revista Internacional de Contaminacion Ambiental 17(4), 179– 186. 105. Ismaili H., Milella L., Fkih-Tetouani S., Ilidrissi A., Camporese A., Sosa S., Altinier G., Della Loggia R., Aquino R. (2004 ), In vivo topical anti-inflammatory and in vitro antioxidant activities of two extracts of Thymus satureioides leaves, Journal of Ethnopharmacology 91(1), 31–36. 106. Ismaili H., Sosa S., Brkic D., Fkih-Tetouani S., Ilidrissi A., Touati D., Aquino R.P., Tubaro A. (2002 ), Topical anti- inflammatory activity of extracts and compounds from Thymus broussonettii , Journal of Pharmacy and Pharmacology 54 (8), 1137–1140. 107. Ismaili H., Tortora S., Sosa S., Fkih-Tetouani S., Ilidrissi A., Della Loggia R., Tubaro A., Aquino R. (2001 ), Topical anti-inflammatory activity of Thymus willdenowii , Journal of Pharmacy and Pharmacology 53(12), 1645–1652. 108. Jalas J. ( 1971 ), Notes on Thymus L. (Labiatae) in Europe. I. Supraspecific classification and nomenclature, Botanical Journal of the Linnean Society 64(2), 199–215. 109. Jalas J. ( 1972 ), Thymus L., у: Tutin T.G., Heywood V.H., Burges N.A., Moore D.M., Valentine D.H., Walters S.M., и сар. (ур.), Flora Europaea, Vol. 3. Cambridge University Press, Cambridge, pp. 172–182. 110. Jamali C.A., El Bouzidi L., Bekkouche K., Lahcen H., Markouk M., Wohlmuth H., Leach D., Abbad A. (2012 ), Chemical composition and antioxidant and anticandidal activities of essential oils from different wild moroccan Thymus species, Chemistry and Biodiversity 9(6), 1188–1197. 111. Janicsák G., Máthé I., Miklóssy-Vári V., Blunden G. ( 1999 ), Comparative studies of the rosmarinic and caffeic acid contents of Lamiaceae species, Biochemical Systematics and Ecology 27, 733–738. 112. Janicsák G., Veres K., Kakasy A.Z, Máthé I. ( 2006 ), Study of the oleanolic and ursolic acid contents of some species of the Lamiaceae, Biochemical Systematics and Ecology 34(5), 392–396.

248

113. Jarić S., Popović Z., Mačukanović-Jocić M., Djurdjević L., Mijatović M., Karadžić B., Mitrović M., Pavlović P. ( 2007 ), An ethnobotanical study on the usage of wild medicinal herbs from Kopaonik Mountain (Central Serbia), Journal of Ethnopharmacology 111(1), 160–175. 114. Jia H.L., Ji Q.L., Xing S.L., Zhang P.H., Zhu G.L., Wang X.H. ( 2010 ), Chemical composition and antioxidant, antimicrobial activities of the essential oils of Thymus marschallianus Will. and Thymus proximus Serg., Journal of Food Science 75(1), E59–65.

115. Jiménez J., Navarro M.C., Montilla M.P., Martin A., Martinez A. ( 1993 ), Thymus zygis oil: Its effects on CCl 4- induced hepatotoxicity and free radical scavenger activity, Journal of Essential Oil Research 5(2), 153–158. 116. Jordan M., Martinez R., Goodner K., Baldwin E., Sotomayor J. ( 2006 ), Seasonal variation of Thymus hyemalis Lange and spanish Thymus vulgaris L. essential oils composition, Industrial Crops and Products 24(3), 253–263. 117. Jurd L. ( 1957 ), The detection of aromatic acids in plant extracts by the ultraviolet absorption spectra of their ions, Archives of Biochemistry and Biophysics 66, 284–288. 118. Justesen U. ( 2000 ), Negative atmospheric pressure chemical ionisation low-energy collision activation mass spectrometry for the characterisation of flavonoids in extracts of fresh herbs, Journal of Chromatography A 902(2), 369–379. 119. Kabata-Pendias A., Pendias H., Trace Elements in Soils and Plants , 3rd Ed., CRC Press, Boca Ratón, FL, 2001 . 120. Kähkönen M.P., Hopia A.I., Vuorela H.J., Rauha J.-P., Pihlaja K., Kujala T.S., Heinonen M. ( 1999 ), Antioxidant activity of plant extracts containing phenolic compounds, Journal of Agricultural and Food Chemistry 47(10), 3954–3962. 121. Kalemba D., Kunicka A. ( 2003 ), Antibacterial and antifungal properties of essential oils, Current Medicinal Chemistry 10(10), 813–829. 122. Kampranis S.C., Ioannidis D., Purvis A., Mahrez W., Ninga E., Katerelos N.A., Anssour S., Dunwell J.M., Degenhardt J., Makris A.M., Goodenough P.W., Johnson C.B. ( 2007 ), Rational conversion of substrate and product specificity in a Salvia monoterpene synthase: Structural insights into the evolution of terpene synthase function, The Plant Cell 19(6), 1994-2005. 123. Kanias G.D., Souleles C., Loukis A., Philotheou-Panou E. ( 1998 ), Trace elements and essential oil composition in chemotypes of the aromatic plant Origanum vulgare , Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry 227(1–2), 23–29. 124. Kara D. (2009 ), Evaluation of trace metal concentrations in some herbs and herbal teas by principal component analysis, Food Chemistry 114(1), 347–354. 125. Karmokar A., Marczylo T.H., Cai H., Steward W.P., Gescher A.J., Brown K. ( 2012 ), Dietary intake of rosmarinic acid by Apc(Min) mice, a model of colorectal carcinogenesis: levels of parent agent in the target tissue and effect on adenoma development, Molecular Nutrition and Food Research 56(5), 775–783. 126. Karuza-Stojaković L., Pavlović S., Živanović P., Todorović B. ( 1989 ), Composition and yield of essential oils of various species of the genus Thymus L., Arhiv za Farmaciju 39, 105-111. 127. Katalinic V., Milos M., Kulisic T., Jukic M. ( 2006 ), Screening of 70 medicinal plant extracts for antioxidant capacity and total phenols, Food Chemistry 94(4), 550–557. 128. Keefover-Ring K., Thompson J.D., Linhart Y.B. ( 2009 ), Beyond six scents: defining a seventh Thymus vulgaris chemotype new to southern France by ethanol extraction, Flavour and Fragrance Journal 24(3), 117–122. 129. Keszei A., Webb H., Kulheim C., Foley W., Genetic Tools for Improving Tea Tree Oil , Rural Industries Research and Development Corporation, Canberra, Australia, 2010 . 130. Kitajima J., Ishikawa T., Urabe A. ( 2004 ), A new hydroxyjasmone glucoside and its related compounds from the leaf of thyme, Chemical and Pharmaceutical Bulletin 52(8), 1013–1014. 131. Кишгеци Ј., Адамовић Д., Гајење лековитог биља , Нолит, Београд, 1994 , стр. 173-179.

249

132. Kivilompolo M., Obůrka V., Hyötyläinen T. (2007 ), Comparison of GC-MS and LC-MS methods for the analysis of antioxidant phenolic acids in herbs, Analytical and Bioanalytical Chemistry 388(4), 881–887. 133. Klančnik A., Piskernik S., Jeršek B., Smole Možina S. ( 2010 ), Evaluation of diffusion and dilution methods to determine the antibacterial activity of plant extracts, Journal of Microbiological Methods 81(2), 121–126. 134. Kobayashi S., Watanabe J., Fukushi E., Kawabata J., Nakajima M., Watanabe M. ( 2003 ), Polyphenols from some foodstuffs as inhibitors of ovalbumin permeation through Caco-2 cell monolayers, Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 67(6), 1250–1257. 135. Koeduka T., Fridman E., Gang D.R., Vassão D.G., Jackson B.L., Kish C.M., Orlova I., Spassova S.M., Lewis N.G., Noel J.P., Baiga T.J., Dudareva N., Pichersky E. ( 2006 ), Eugenol and isoeugenol, characteristic aromatic constituents of spices, are biosynthesized via reduction of a coniferyl alcohol ester, Proceedings of the National Academy of Sciences 103, 10128–10133. 136. Komes D., Belščak-Cvitanović A., Horžić D., Rusak G., Likić S., Berendika M. ( 2011 ), Phenolic composition and antioxidant properties of some traditionally used medicinal plants affected by the extraction time and hydrolysis, Phytochemical Analysis 22(2), 172–180. 137. Koning S., Janssen H.-G., Brinkman U.A.T. ( 2009 ), Modern methods of sample preparation for GC analysis, Chromatographia 69(S1), 33–78. 138. Koşar M., Dorman H.J.D., Hiltunen R. ( 2005 ), Effect of an acid treatment on the phytochemical and antioxidant characteristics of extracts from selected Lamiaceae species, Food Chemistry 91(3), 525–533. 139. Kozics K., Klusová V., Srančíková A., Mučaji P., Slameňová D., Hunáková L., Kusznierewicz B., Horváthová E. (2013 ), Effects of Salvia officinalis and Thymus vulgaris on oxidant-induced DNA damage and antioxidant status in HepG2 cells, Food Chemistry 141(3), 2198–2206. 140. Kukić J., Petrović S., Niketić M. ( 2006 ), Antioxidant activity of four endemic Stachys taxa, Biological and Pharmaceutical Bulletin 29(4), 725–729. 141. Kukić J., Popović V., Petrović S., Mucaji P., Ćirić A., Stojković D., Soković M. ( 2008 ), Antioxidant and antimicrobial activity of Cynara cardunculus extracts, Food Chemistry 107, 861–868. 142. Kulevanova S., Stefova M., Kadifkova Panovska T., Tonic J., Stafilov T. ( 2001 ), Determination of flavones in species of Thymus L . (Lamiaceae) from Macedonian flora, Macedonian Pharmaceutical Bulletin 47(1-2), 9–14. 143. Кулеванова С. ( 1996 ), Проучавање на етеричното масло и флавоноидите во представници од родот Thymus L. во флората на Република Македонија, Докторска дисертација, Универзитет 'Св. Кирил и Методиј' – Фармацевтски гакултет, Скопје. 144. Kulišić T., Dragović-Uzelac V., Miloš M. ( 2006 ), Antioxidant аctivity of аqueous тea infusions prepared from oregano, thyme and wild thyme, Food Technolgy and Biotechnology 44(4), 485–492. 145. Lakušić B.S., Ristić M.S., Slavkovska V.N., Stojanović D.L., Lakušić D.V. ( 2013 ), Variations in essential oil yields and compositions of Salvia officinalis (Lamiaceae) at different developmental stages, Botanica Serbica 37(2), 127–139. 146. Lamaison J.L., Petitjean-Freytet C., Carnat A. (1991 ), Medicinal Lamiaceae with antioxidative activities, potential sources of rosmarinic acid, Pharmaceutica Acta Helvetiae 66(7), 185–188. 147. Landmann C., Fink B., Festner M., Dregus M., Engel K.-H., Schwab W. ( 2007), Cloning and functional characterization of three terpene synthases from lavender ( Lavandula angustifolia ), Archives of Biochemistry and Biophysics 465(2), 417–429. 148. Lawrence B.M., Tucker A.O. ( 2002 ), The genus Thymus as a source of commercial products, у: Stahl-Biskup E., Sáez F. (ур.), Thyme – The genus Thymus , Taylor and Francis, London and New York, pp. 252–262.

250

149. Lee I.-C., Bae J.-S., Kim T., Kwon O.J., Kim T.H. ( 2011 ), Polyphenolic constituents from the aerial parts of Thymus quinquecostatus var. japonica collected on Ulleung island, Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry 54 (5), 811–816. 150. Lima A.S., Schimmel J., Lukas B., Novak J., Barroso J.G., Figueiredo A.C., Pedro L.G., Degenhardt J., Trindade H. (2013 ), Genomic characterization, molecular cloning and expression analysis of two terpene synthases from Thymus caespititius (Lamiaceae), Planta 238(1), 191–204. 151. Link A., Balaguer F., Goel A. ( 2010 ), Cancer chemoprevention by dietary polyphenols: promising role for epigenetics, Biochemical Pharmacology 80(12), 1771–1792. 152. Lockwood G.B. ( 2001 ), Techniques for gas chromatography of volatile terpenoids from a range of matrices, Journal of Chromatography A 936(1-2), 23–31. 153. Ložiene K., Venskutonis P.R. ( 2005 ), Influence of environmental and genetic factors on the stability of essential oil composition of Thymus pulegioides , Biochemical Systematics and Ecology 33(5), 517–525. 154. Ložienè K., Venskutonis P.R., Šipailienė A., Labokas J. ( 2007 ), Radical scavenging and antibacterial properties of the extracts from different Thymus pulegioides L. chemotypes, Food Chemistry 103(2), 546–559. 155. Lu Y., Foo Y.L. ( 2001 ), Antioxidant activities of polyphenols from sage (Salvia officinalis ), Food Chemistry 75(2), 197–202. 156. Mabry T.J., Markham K.R., Thomas M.B., The Systematic Identification of Flavonoids , Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin, 1970 . 157. Maksimović Z., Milenković M., Vučićević D., Ristić M. ( 2008 ), Chemical composition and antimicrobial activity of Thymus pannonicus All. (Lamiaceae) essential oil, Central European Journal of Biology 3(2), 149–154. 158. Marczak Ł., Stobiecki M., Jasiński M., Oleszek W., Kachlicki P. (2010 ), Fragmentation pathways of acylated flavonoid diglucuronides from leaves of Medicago truncatula , Phytochemical Analysis 21, 224–233. 159. Marin P., Grayer R., Kite G., Matevski V. ( 2003 ), External leaf flavonoids of Thymus species from Macedonia, Biochemical Systematics and Ecology 31(11), 1291–1307. 160. Marin P., Grayer R., Kite G., Veljic M. ( 2005 ), External flavones from Thymus striatus Vahl (Lamiaceae), Biochemical Systematics and Ecology 33(11), 1179–1182. 161. Markham K.R., Ryan K.G., Bloor S.J., Mitchell K.A. (1998 ), An increase in the luteolin:apigenin ratio in Marchantia polymorpha on UV-B enhancement, Phytochemistry 48(5), 791–794. 162. Markham K.R., Techniques of Flavonoid Identification , Academic Press, London, 1982 . 163. Marković B., Obradinović Z., Veselinović M., Anđelković J., Stevanović P., Rakić M., Osnovna geološka karta SFRJ, 1:100 000, Geološki zavod SFRJ, Beograd, 1984 . 164. Mastelić J., Miloš M., Kuštrak D. ( 2000 ), Free and glycosidically bound volatiles of Mentha citrata Ehrh, Croatica Chemica Acta 73(3), 781–794. 165. Mata A.T., Proença C., Ferreira A.R., Serralheiro M.L.M., Nogueira J.M.F., Araújo M.E.M. ( 2007 ), Antioxidant and antiacetylcholinesterase activities of five plants used as Portuguese food spices, Food Chemistry 103(3), 778– 786. 166. Matés J.M. ( 2000 ), Effects of antioxidant enzymes in the molecular control of reactive oxygen species toxicology, Toxicology 153(1-3), 83–104. 167. Méndez J., Lojo M.I. ( 1969 ), Spectral characterization of coumarins and cinnamic acids, Microchemical Journal 14(4), 567–572. 168. Merghem R., Jay M., Viricel M.-R., Bayet C., Voirin B. ( 1995 ), Five 8-C-benzylated flavonoids from Thymus hirtus (Labiatae), Phytochemistry 38(3), 637–640. 169. Mężyk Z., Więckowski S.K. ( 1999 ). Studies of Trace Element Content in Selected Medical Herbs, Polish Journal of Environmental Studies 8(2), 129–130.

251

170. Miguel M.G. ( 2010 ), Antioxidant activity of medicinal and aromatic plants. A review, Flavour and Fragrance Journal 25, 291–312. 171. Miguel M.G., Costa L.A., Figueiredo A.C., Barroso J.G., Pedro L.G. ( 2007 ), Assessment of the antioxidant ability of Thymus albicans , Th. mastichina , Th. camphoratus and Th. carnosus essential oils by TBARS and micellar model systems, Natural Product Communications 2(Special Edition), 399–406. 172. Mihailović-Stanojević N., Belščak-Cvitanović A., Grujić-Milanović J., Ivanov M., Jovović D., Bugarski D., Miloradović Z. ( 2013 ), Antioxidant and antihypertensive activity of extract from Thymus serpyllum L. in experimental hypertension, Plant Foods for Human Nutrition 68(3), 235–240. 173. Miron T.L., Plaza M., Bahrim G., Ibáñez E., Herrero M. ( 2011 ), Chemical composition of bioactive pressurized extracts of Romanian aromatic plants, Journal of Chromatography A 1218(30), 4918–4927. 174. Mishra P.K., Singh P., Prakash B., Kedia A., Dubey N.K., Chanotiya C.S. ( 2013 ), Assessing essential oil components as plant-based preservatives against fungi that deteriorate herbal raw materials, International Biodeterioration and Biodegradation 80, 16–21. 175. Misra A., Srivastava N.K. ( 1991 ), Effect of the triacontanol formulation ‘Miraculan’ on photosynthesis, growth, nutrient uptake, and essential oil yield of lemongrass ( Cymbopogon flexuosus Steud. Watts.), Plant Growth Regulation 10, 57–63. 176. Miura K., Nakatani N. ( 1989 ), Antioxidative activity of flavonoids from thyme (Thymus vulgaris L .), Agicultural and Biological Chemistry 53(11), 3043–3045. 177. Monthel J., Vadala P., Leistel J.M., Cottard F., Ilic M., Strumberger A., Tosovic R., Stepanovic A., Mineral Deposits and Mining Districts of Serbia. Compilation Map and GIS Databases, Ministry of Mining and Energy Republic of Serbia, Geoinstitut, Belgrade & BRGM, France, 2002 , http://giseurope.brgm.fr/GIS_SERBIA/RC_51448_FR.pdf, http://giseurope.brgm.fr/GIS_SERBIA/SerbiaDistricts.pdf, http://giseurope.brgm.fr/GIS_SERBIA/SerbiaOreDeposits.pdf. 178. Morales R. ( 1996 ), Studies on the genus Thymus , Lamiales Newsletter 4, 6–8. 179. Morales R. ( 1997 ), Synopsis of the genus Thymus L. in the Mediterranean area, Lagascalia 19(1-2), 249–262. 180. Morales R. ( 2002 ), The history, botany and taxonomy of the genus Thymus , у: Stahl-Biskup E., Sáez F. (ур.), Thyme: The genus Thymus , Taylor and Francis, London and New York, pp. 1–43. 181. Moreno S., Scheyer T., Romano C.S., Vojnov A. ( 2006 ), Antioxidant and antimicrobial activities of rosemary extracts linked to their polyphenol composition, Free Radical Research 40(2), 223–231. 182. Muñoz-Muñoz J.L., Garcia-Molina F., Ros E., Tudela J., García-Canovas F., Rodriguez-Lopez, J.N. (2013), Prooxidant and antioxidant activities of rosmarinic acid, Journal of Food Biochemistry 37(4), 396–408. 183. Nagy T.O., Solar S., Sontag G., Koenig J. ( 2011 ), Identification of phenolic components in dried spices and influence of irradiation, Food Chemistry 128(2), 530–534. 184. Nakatani N., Miura K., Inagaki T. ( 1989 ), Structure of new deodorant and biphenyl compounds from thyme (Thymus vulgaris L.) and their activity against methyl mercaptan, Agricultural and Biological Chemistry 53, 1375–1381. 185. Németh É., Szabó K., Rajhárt P., Popp T. ( 2012 ), The effect of potassium supply on the production and drug quality of mint species [Die wirkung der kaliumversorgung auf die produktion und drogenqualität von minzen], Zeitschrift fur Arznei- und Gewurzpflanzen 17(4), 158–164. 186. Niki E. ( 2010 ), Assessment of аntioxidant цapacity in vitro and in vivo , Free Radical Biology and Medicine 49(4), 503–515. 187. Nikolić M., Glamočlija J., Ferreira I.C.F.R., Calhelha R.C., Fernandes T., Marković T., Marković D., Giweli A., Soković M. ( 2014 ), Chemical composition, antimicrobial, antioxidant and antitumor activity of Thymus serpyllum L.,

252

Thymus algeriensis Boiss. and Reut and Thymus vulgaris L. essential oils, Industrial Crops and Products 52, 183– 190. 188. Ocaña A., Reglero G. ( 2012 ), Effects of thyme extract oils (from Thymus vulgaris , Thymus zygis , and Thymus hyemalis ) on cytokine production and gene expression of oxLDL-stimulated THP-1-macrophages, Journal of Obesity , art. no. 104706. 189. Okazaki K., Kawazoe K., Takaishi Y. ( 2002 ), Human platelet aggregation inhibitors from thyme (Thymus vulgaris L.), Phytotheraphy Research 16, 398–399. 190. Omidbaigi R. Arjmandi A. ( 2002 ), Effects of NP supply on growth, development, yield and active substances of garden thyme ( Thymus vulgaris L.), Acta Horticulturae 576, 263–265. 191. Ormeño E., Goldstein A., Niinemets Ü. ( 2011 ), Extracting and trapping biogenic volatile organic compounds stored in plant species, TrAC Trends in Analytical Chemistry 30(7). 192. Osakabe N., Yasuda A., Natsume M., Sanbongi C., Kato Y., Osawa T., Yoshikawa Y. ( 2002 ), Rosmarinic acid, a major polyphenolic component of Perilla frutescens , reduces lipopolysaccharide (LPS)-induced liver injury in d- galactosamine (d-GalN)-sensitized mice, Free Radical Biology and Medicine 33(6), 798–806. 193. Osakabe N., Yasuda A., Natsume M., Yoshikawa T. ( 2004 ), Rosmarinic acid inhibits epidermal inflammatory responses: anticarcinogenic effect of Perilla frutescens extract in the murine two-stage skin model, Carcinogenesis 25(4), 549–557. 194. Ozaslan M., Karagoz I.D., Kilic I.H., Guldur M.E. ( 2011 ), Ehrlich ascites carcinoma, African Journal of Biotechnology 10(13), 2375–2378. 195. Özgen U., Mavi A., Terzi Z., Kazaz C., Asçi A., Kaya Y., Seçen H. ( 2011 ), Relationship between chemical structure and antioxidant activity of luteolin and its glycosides isolated from Тhymus sipyleus subsp. sipyleus var. sipyleus, Records of Natural Products 5(1), 12–21. 196. Paluszczak J., Krajka-Kuźniak V., Baer-Dubowska W. ( 2010 ), The effect of dietary polyphenols on the epigenetic regulation of gene expression in MCF7 breast cancer cells, Toxicology Letters 192, 119–125. 197. Panovska T.K., Stafilov T., Bauer S., Kulevanova S., Dorevski K. ( 1996 ), Determination of some trace elements in representatives of genus Thymus L. (Lamiaceae) by electrothermal atomic absorption spectrometry, Acta Pharmaceutica 46, 295–302. 198. Pavlović M. ( 2008 ), Proučavanje sastojaka Anthemis triumfettii (Asteraceae) i poređenje sa drugim vrstama podroda Cota, Doktorska disertacija, Univerzitet u Beogradu – Farmaceutski fakultet, Beograd. 199. Pereira O.R., Cardoso S.M. ( 2013 ), Overview on Mentha and Thymus polyphenols, Current Analytical Chemistry 9(3), 382–396. 200. Pereira O.R., Peres A.M., Silva A.M.S., Domingues M.R.M., Cardoso S.M. ( 2013 ), Simultaneous characterization and quantification of phenolic compounds in Thymus x citriodorus using a validated HPLC-UV and ESI-MS combined method, Food Research International 54(2), 1773–1780. 201. Pérez-Fons L., Aranda F.J., Guillén J., Villalaín J., Micol V. ( 2006 ), Rosemary (Rosmarinus officinalis ) diterpenes affect lipid polymorphism and fluidity in phospholipid membranes, Archives of Biochemistry and Biophysics 453(2), 224–236. 202. Petersen M. ( 2013 ), Rosmarinic acid: new aspects, Phytochemistry Reviews 12(1), 207–227. 203. Petrović S.S., Ristić M., Babović N., Lazić M., Francišković M., Petrović S.D. (2014 ), Chemical composition and antioxidative activity of essential oil of Thymus serpyllum L., Hemijska industrija , doi:10.2298/HEMIND130513051P. 204. Ph. Eur. 7.0, European Pharmacopoeia, 7th Edition, Cauncil of Europe, Strasbourg, 2011 . 205. Ph. Jug. V , Jugoslovenska farmakopeja 2000, Pharmacopoea Jugoslavica 2000, Еditio quinta, Savezini zavod za zaštitu i unapređenje zdrvlja: Savremena administracija, Beograd, 2001 .

253

206. Pieroni A., Giusti M.E., Quave C.L. ( 2011 ), Cross-cultural еthnobiology in the western Balkans: Medical ethnobotany and ethnozoology among Albanians and Serbs in the Pešter plateau, Sandžak, south-western Serbia, Human Ecology 39(3), 333–349. 207. Pina-Vaz C., Rodrigues P. E., Costa de Oliveira S., Tavares C., Salgueiro L., Cavaleiro C., Gonçalves М.Ј., Martinez de Oliveira, J. ( 2004 ), Antifungal activity of Thymus oils and their major compounds, Journal of European Academy of Dermatology and Dermatology 18, 73–78. 208. Pluhár Z. , Sárosi S., Pintér A., Simkó H. ( 2010 ), Essential oil polymorphism of wild growing Hungarian thyme (Thymus pannonicus ) populations in the Carpathian Basin, Natural Product Communications 5(10), 1681–1686. 209. Pluhár Z., Héthelyi É., Kutta G., Kamondy L. ( 2007 ), Evaluation of environmental factors influencing еssential oil quality of Thymus pannonicus All. and Thymus praecox Opiz., Journal of Herbs, Spices and Medicinal Plants 13(1), 23–43. 210. Pluhár Z., Kocsis M., Kuczmog A., Csete S., Simkó H., Sárosi S., Molnár P., Horváth G. ( 2012a ), Essential oil composition and preliminary molecular study of four Hungarian Thymus species, Acta Biologica Hungarica 63(1), 81–96. 211. Pluhár , Z., Sárosi, S., Simkó, H. ( 2012б), Environmental conditions and essential oil diversity of native Thymus pulegioides populations in highlands of Hungary and in the Carpathians, Acta Horticulturae 955, 65–71. 212. Qiusheng Z., Xiling S., Xubo, Gang L., Meng S., Changhai W. ( 2004 ), Protective effects of luteolin-7-glucoside against liver injury caused by carbon tetrachloride in rats, Pharmazie 59(4), 286–289. 213. Quideau S., Deffieux D., Douat-Casassus C., Pouységu L. ( 2011 ), Plant polyphenols: chemical properties, biological activities, and synthesis, Angewandte Chemie (International Ed. in English) 50(3), 586–621. 214. Raal A., Paaver U., Arak E., Orav A. ( 2004 ), Content and composition of the essential oil of Thymus serpyllum L. growing wild in Estonia, Medicina (Kaunas, Lithuania) 40(8), 795–800. 215. Rababah T.M., Banat F., Rababah A., Ereifej K., Yang W. ( 2010 ), Optimization of extraction conditions of total phenolics, antioxidant activities, and anthocyanin of oregano, thyme, terebinth, and pomegranate, Journal of Food Science 75(7), C626–C632. 216. Ražić S., Chemometrics in the аnalysis of real samples - From theory to application , University of Belgrade – Faculty of Pharmacy, 2011 . 217. Ražić S., Onjia A., Đogo S., Slavković L., Popović A. (2005 ), Determination of metal content in some herbal drugs – Empirical and chemometric approach, Talanta 67, 233–239. 218. Remon E., Bouchardon J.-L., Cornier B., Guy B., Leclerc J.-C., Faure O. ( 2005 ), Soil characteristics, heavy metal availability and vegetation recovery at a former metallurgical landfill: Implications in risk assessment and site restoration, Environmental Pollution 137(2), 316–323. 219. Richter J., Schellenberg I. ( 2007 ), Comparison of different extraction methods for the determination of essential oils and related compounds from aromatic plants and optimization of solid-phase microextraction/gas chromatography, Analytical and Bioanalytical Chemistry 387(6), 2207–2217. 220. Roby M.H.H., Sarhan M.A., Selim K.A.H., Khalel K.I. ( 2013 ), Evaluation of antioxidant activity, total phenols and phenolic compounds in thyme ( Thymus vulgaris L.), sage ( Salvia officinalis L.), and marjoram ( Origanum majorana L.) extracts. Industrial Crops and Products 43, 827–831. 221. Rodríguez Vaquero M.J., Tomassini Serravalle L.R., Manca de Nadra M.C., Strasser de Saad A.M. ( 2010 ), Antioxidant capacity and antibacterial activity of phenolic compounds from argentinean herbs infusions, Food Control 21(5), 779–785. 222. Roeder S., Hartmann A.-M., Effmert U., Piechulla B. ( 2007 ), Regulation of simultaneous synthesis of floral scent terpenoids by the 1,8-cineole synthase of Nicotiana suaveolens , Plant Molecular Biology 65(1-2), 107–124.

254

223. Ruberto G., Baratta M.T. (2000 ), Antioxidant activity of selected essential oil components in two lipid model systems, Food Chemistry 69(2), 167–174. 224. Ruiz-Navajas Y., Viuda-Martos M., Sendra E., Perez-Alvarez J.A., Fernández-López J. ( 2012 ), Chemical characterization and antibacterial activity of Thymus moroderi and Thymus piperella essential oils, two Thymus endemic species from southeast of Spain, Food Control 27(2), 294–299. 225. Sagdic O., Ozkan G., Aksoy A., Yetim H. ( 2009 ), Bioactivities of essential oil and extract of Thymus argaeus , Turkish endemic wild thyme, Journal of the Science of Food and Agriculture 89(5), 791–795. 226. Saito Y., Ito S., Koltunow A.M., Sakai H. ( 2011 ), Crystallization and preliminary X-ray analysis of geraniol dehydrogenase from Backhousia citriodora (lemon myrtle), Acta Crystallographia F 67, 665–667. 227. Sánchez-Vioque R., Polissiou M., De los Mozos-Pascual M., Tarantilis P., Herraiz-Peñalver D., Santana-Méridas O. (2013 ), Polyphenol composition and antioxidant and metal chelating activities of the solid residues from essential oil industry, Industrial Crops and Products 49, 150–159. 228. Sato Y., Suzaki S., Nishikawa T., Kihara M., Shibata H., Higuti T. ( 2000 ), Phytochemical flavones isolated from Scutellaria barbata and antibacterial activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus , Journal of Ethnopharmacology 72(3), 483–488. 229. Sayyari-Zahan H.M., Singh Sadana U., Steingrobe B., Claassen N. (2009 ), Manganese efficiency and maganese- uptake kinetics of raya ( Brassica juncea ), wheat ( Triticum aestivum ), and oat ( Avena sativa ) grown in nutrient solution and soil, Journal of Plant Nutrition and Soil Science 172(3), 425–434. 230. Schmidt A., Bischof-Deichnik C., Stahl-Biskup E. ( 2004 ), Essential oil polymorphism of Thymus praecox subsp. arcticus on the British Isles, Biochemical Systematics and Ecology 32(4), 409–421. 231. Schwab W., Davidovich-Rikanati R., Lewinsohn E. ( 2008 ), Biosynthesis of plant-derived flavor compounds, Plant Journal 54(4), 712–732. 232. SciFinder (2013a ), Citral regulatory information (CAS registry number 5392-40-5), Chemical Abstracts Service, Columbus, OH, https://scifinder.cas.org/ (приступљено: мај 2014.). 233. SciFinder (2013б), Geranial chemical properties (CAS registry number 141-27-5), Chemical Abstracts Service, Columbus, OH, https://scifinder.cas.org/ (приступљено: мај 2014.). 234. SciFinder (2013в), Neral chemical properties (CAS registry number 106-26-3), Chemical Abstracts Service, Columbus, OH, https://scifinder.cas.org/ (приступљено: мај 2014.). 235. SciFinder (2013г), α-Pinene chemical properties (CAS registry number 20283-92-5), Chemical Abstracts Service, Columbus, OH, https://scifinder.cas.org/ (приступљено: мај 2014.). 236. SciFinder (2013д), Camphene chemical properties (CAS registry number 79-92-5), Chemical Abstracts Service, Columbus, OH, https://scifinder.cas.org/ (приступљено: мај 2014.). 237. SciFinder (2013ђ), 6-Methyl-5-hepen-2-on chemical properties (CAS registry number 110-93-0), Chemical Abstracts Service, Columbus, OH, https://scifinder.cas.org/ (приступљено: мај 2014.). 238. SciFinder (2013е), 1,8-Cineole chemical properties (CAS registry number 470-82-6), Chemical Abstracts Service, Columbus, OH, https://scifinder.cas.org/ (приступљено: мај 2014.). 239. SciFinder (2013ж), α-Copaene chemical properties (CAS registry number 3856-25-5), Chemical Abstracts Service, Columbus, OH, https://scifinder.cas.org/ (приступљено: мај 2014.). 240. SciFinder (2013з), β-Bourbonene chemical properties (CAS registry number 5208-59-3), Chemical Abstracts Service, Columbus, OH, https://scifinder.cas.org/ (приступљено: мај 2014.). 241. SciFinder (2013и), 1-Octen-3-ol chemical properties (CAS registry number 3391-86-4), Chemical Abstracts Service, Columbus, OH, https://scifinder.cas.org/ (приступљено: мај 2014.). 242. SciFinder (2013ј), 3-Octanone chemical properties (CAS registry number 106-68-3), Chemical Abstracts Service, Columbus, OH, https://scifinder.cas.org/ (приступљено: мај 2014.).

255

243. SciFinder (2013к), 1-Octanol chemical properties (CAS registry number 111-87-5), Chemical Abstracts Service, Columbus, OH, https://scifinder.cas.org/ (приступљено: мај 2014.). 244. SciFinder (2013л ), Rosmarinic acid chemical properties (CAS registry number 20283-92-5), Chemical Abstracts Service, Columbus, OH, https://scifinder.cas.org/ (приступљено: мај 2014.). 245. Seelinger G., Merfort I., Wölfle U., Schempp C.M. ( 2008 ), Anti-carcinogenic effects of the flavonoid luteolin, Molecules 13(10), 2628–2651. 246. Shan B., Cai Y.Z., Sun M., Corke H. ( 2005 ), Antioxidant capacity of 26 spice extracts and characterization of their phenolic constituents, Journal of Agricultural and Food Chemistry 53(20), 7749–7759. 247. Shimada T., Endo T., Fujii H., Hara M., Omura M. ( 2005 ), Isolation and characterization of ( E)-β-ocimene and 1,8- cineole synthases in Citrus unshiu Marc, Plant Science 168(4), 987–995. 248. Simon L.M., Fatrai Z., Jonas D.J., Matkovics B. ( 1974 ), Study of metabolism enzymes during the development of Phaseolus vulgaris , Biochemie und Physiologie der Pflanzen 166, 389–393. 249. Симоновић Д., Ботанички речник. Имена биљака , САНУ, Београд, 1959 . 250. Sodré A.C.B., Luz J.M.Q., Haber L.L., Marques M.O.M., Rodrigues C.R., Blank A.F. ( 2012 ), Organic and mineral fertilization and chemical composition of lemon balm ( Melissa officinalis ) essential oil, Revista Brasileira de Farmacognosia 22(1), 40–44. 251. Spiridon I., Bodirlau R., Teaca, C. A. ( 2011 ), Total phenolic content and antioxidant activity of plants used in traditional Romanian herbal medicine, Central European Journal of Biology 6(3), 388–396. 252. Stagos D., Portesis N., Spanou C., Mossialos D., Aligiannis N., Chaita E., Panagoulis C., Reri E., Skaltsounis L., Tsatsakis A.M., Kouretas D. ( 2012 ), Correlation of total polyphenolic content with antioxidant and antibacterial activity of 24 extracts from Greek domestic Lamiaceae species, Food and Chemical Toxicology 50(11), 4115– 4124. 253. Stahl-Biskup E. (2002 ), Essential oil chemistry of the genus Thymus – a global view, у: Stahl-Biskup Е., Saez F. (ур.), Thyme: The genus Thymus , Taylor and Francis, London and New York, pp. 75–124. 254. Stanojković T., Kolundžija B., Ćirić A., Soković M., Nikolić D., Kundaković T. ( 2013 ), Cytotoxicity and antimicrobial activity of Satureja kitaibelii Wierzb. ex Heuff. (Lamiaceae), Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures 8(2), 845–854. 255. Stewart J., McKenna M. ( 2001 ), Thyme seedlings and thyme essential oil enhance nodulation and shoot weight of white clover, Ecological Society of America Annual Meeting Abstracts vol. 86, URL: http://abstracts.co.allenpress.com/pweb/esa2001/document/28260. 256. Sun Z., Zheng Q., Ma G., Zhang X., Yuan J., Wu H., Liu H., Yang J., Xu X. ( 2014 ), Four new phenolic acids from Clerodendranthus spicatus , Phytochemistry Letters 8(151), 16–21. 257. Sutherland G.K. ( 1958 ), Preliminary classification of some naturally occurring hydroxycinnamic acids through their ultraviolet spectra, Archives of Biochemistry and Biophysics 75, 412–417. 258. Szilvássy B., Rak G., Sárosi S., Novák I., Pluhár Z., Abrankó L. ( 2013 ), Polyphenols in the aqueous extracts of garden thyme ( Thymus vulgaris ) chemotypes cultivated in Hungary, Natural Product Communications 8(5), 605– 608. 259. Szőllősi R., Szőllősi Varga I. ( 2002 ), Total antioxidant power in some species of Labiatae (Adaptation of FRAP method), Acta Biologica Szegediensis 46(3-4), 125–127. 260. Šamec D., Gruz J., Strnad M., Kremer D., Kosalec I., Jurišić Grubešić R., Karlović K., Lucic A., Piljac-Žegarac J. (2010 ), Antioxidant and antimicrobial properties of Teucrium arduini L. (Lamiaceae) flower and leaf infusions (Teucrium arduini L. antioxidant capacity), Food and Chemical Toxicology 48, 113–119.

256

261. Šarić-Kundalić B., Dobeš C., Klatte-Asselmeyer V., Saukel J. ( 2010 ), Ethnobotanical study on medicinal use of wild and cultivated plants in middle, south and west Bosnia and Herzegovina, Journal of Ethnopharmacology 131(1), 33–55. 262. Šarić-Kundalić B., Dobeš C., Klatte-Asselmeyer V., Saukel J. ( 2011 ), Ethnobotanical survey of traditionally used plants in human therapy of east, north and north-east Bosnia and Herzegovina, Journal of Ethnopharmacology 133(3), 1051–1076. 263. Šoštarić I. ( 2012 ), Fitohemijska i genetička varijabilnost vrsta iz sekcije Serpyllum (Mill.) Benth. roda Thymus L. (Lamiaceae) u Srbiji , Doktorska disertacija, Univerzitet u Beogradu – Biološki fakultet, Beograd. 264. Sostaric I., Liber Z., Grdisa M., Marin P.D., Dajic Stevanovic Z., Satovic Z. ( 2012 ), Genetic diversity and relationships among species of the genus Thymus L. (section Serpyllum ), Flora 207(9), 654–661. 265. Takeuchi H., Lu Z.-G., Fujita T. ( 2004 ), New monoterpene glucoside from the aerial parts of thyme ( Thymus vulgaris L.), Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 68(5), 1131–1134. 266. Tan S., Lin Z. ( 2006 ), GenBank: Direct submission (Cloning and functional expression of cinenol synthase from Rosmarinus officinalis ), Accession number: DQ839411. 267. Tekoriene R., Ložiene K. (2012 ), Disinfecting capacity of essential oil of Thymus pulegioides L. (Lamiaceae) chemotypes against phytopathogenic Pseudomonas species, Acta Alimentaria 41(2), 257–264. 268. Teuscher Е., Medicinal spices, CRC Press, Boca Raton, 2008 . 269. Tholl D. ( 2006 ), Terpene synthases and the regulation, diversity and biological roles of terpene metabolism, Current Opinion in Plant Biology 9(3), 297–304. 270. Tomás F., Hernández L., Tomás-Barberan F. A., Ferreres F. ( 1985 ), Flavonoid glycosides from Thymus membranaceus , Zeitschrift Für Naturforschung C 40, 583–584. 271. Tomás-Barberán F., Grayer-Barkmeijer R.J., Gil M.I., Harborne J.B. ( 1988 ), Distribution of 6-hydroxy, 6-methoxy- and 8- hydroxyflavone glycosides in the Labiatae, the Scrophulariaceae and related families, Phytochemistry 27(8), 2631–2645. 272. Tounekti T., Munné-Bosch S., Vadel A.M., Chtara C., Khemira H. ( 2010 ), Influence of ionic interactions on essential oil and phenolic diterpene composition of Dalmatian sage ( Salvia officinalis L.), Plant Physiology and Biochemistry 48 (10-11), 813–821. 273. Trachoоtham D., Alexandre J., Huang P. ( 2009 ), Targeting cancer cells by ROS – mediated mechanisms: a radical therapeutic approach?, Nature Reviews: Drug Discovery 8(7), 579–594. 274. Triantaphyllou K., Blekas G., Boskou D. ( 2001 ), Antioxidative properties of water extracts obtained from herbs of the species Lamiaceae, International Journal of Food Sciences and Nutrition 52(4), 313–317. 275. Tschiggerl C., Bucar F. ( 2012 ), The volatile fraction of herbal teas, Phytochemistry Reviews , 11(2-3), 245–254. 276. Tschiggerl C., Bucar F. ( 2010 ), Investigation of the volatile fraction of rosemary infusion extracts, Scientia Pharmaceutica 78(3), 483–492. 277. Turumtay E.A., Islamo ǧlu F., Çavuş D., Şahin H., Turumtay H., Vanholme B. ( 2014 ), Correlation between phenolic compounds and antioxidant activity of Anzer tea ( Thymus praecox Opiz subsp. caucasicus var. caucasicus ), Industrial Crops and Products 52, 687–694. 278. Tzakou , O., Constantinidis , T. ( 2005 ), Chemotaxonomic significance of volatile compounds in Thymus samius and its related species Thymus atticus and Thymus parnassicus , Biochemical Systematics and Ecology 33(11), 1131– 1140. 279. Unal E.L., Mavi A., Kara A., Cakir A., Şengül M., Yildirim A. ( 2008 ), Antimicrobial and аntioxidant аctivities of some plants used as remedies in Turkish traditional medicine, Pharmaceutical Biology 46(3), 207–224. 280. Van den Broucke C.O., Lemli J.A. ( 1983 ), Spasmolytic activity of the flavonoids from Thymus vulgaris, Pharmaceutisch Weekblad Scientific Edition 5(1), 9–14.

257

281. Vardar-Unlü G., Candan F., Sökmen A., Daferera D., Polissiou M., Sökmen M., Dönmez E., Tepe, B. ( 2003 ), Antimicrobial and antioxidant activity of the essential oil and methanol extracts of Thymus pectinatus Fisch. et Mey. var. pectinatus (Lamiaceae), Journal of Agricultural and Food Chemistry 51(1), 63–67. 282. Velioglu Y.S., Mazza G., Gao L, Oomah B.D. ( 1998 ), Antioxidant activity and total phenolics in selected fruits, vegetables, and grain products, Journal of Agricultural and Food Chemistry 46, 4113–4117. 283. Vidic D., Ćavar S., Šolić M.E., Maksimović M. ( 2010 ), Volatile constituents of two rare subspecies of Thymus praecox , Natural Product Communications 5(7), 1123–1126. 284. Vigo E., Cepeda A., Gualillo O., Perez-Fernandez R. ( 2004 ), In vitro anti-inflammatory effect of Eucalyptus globulus and Thymus vulgaris : Nitric oxide inhibition in J77RA.1 murine macrophages, Journal of Pharmacy and Pharmacology 56 (2), 257–263. 285. Vila R. ( 1987 ), Contribción al estudio de polifenoles y aceites esenciales en el genero Thymus L. , Dissertatio doctoral, Universidad de Barcelona – Facultad de Farmacia, Barcelona. 286. Vila R. ( 2002 ), Flavonoids and further polyphenols in the genus Thymus , у: Stahl-Biskup E., Sáez F. (ур.), Thyme: The genus Thymus , Taylor and Francis, London and New York, pp. 144–176. 287. Vogel H., Silva M.L., Razmilic I. ( 1999 ), Seasonal fluctuation of essential oil content in lemon verbena (Aloysia triphylla ), Proceedings of the WOCMAP-2: Biological Resources, Sustainable Use, Conservation and Ethnobotany, Acta Horticulture 500, 75–80. 288. Vogel J.T., Tan B.-C., McCarty D.R., Klee H.J. ( 2008 ), The carotenoid cleavage dioxygenase 1 enzyme has broad substrate specificity, cleaving multiple carotenoids at two different bond positions, Journal of Biological Chemistry 283(17), 11364–11373. 289. Wang M., Kikuzaki H., Lin C.C., Kahyaoglu A., Huang M.T., Nakatani N., Ho C.-T. ( 1999 ), Acetophenone glycosides from thyme ( Thymus vulgaris L.), Journal of Agricultural and Food Chemistry 47(5), 1911–1914. 290. Wang M., Li J., Ho G., Peng X., Ho C.-T. ( 1998 ), Isolation and identification of antioxidative flavonoid glycosides from thyme ( Thymus vulgaris L.), Journal of Food Lipids 5, 313–321. 291. Weber L.W.D., Boll M., Stampfl A. ( 2003 ), Hepatotoxicity and mechanism of action of haloalkanes: Carbon tetrachloride as a toxicological model, Critical Reviews in Toxicology 33(2), 105–136. 292. Wichtl М., Teedrogen und Phytopharmaka: Ein Handbuch für die Praxis auf wissenschaftlicher Grundlage, 5. Auflage, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft, Stuttgart 2008 . 293. Wienkötter N., Begrow F., Kinzinger U., Schierstedt D., Verspohl E.J. ( 2007 ), The effect of thyme extract on β2- receptors and mucociliary clearance, Planta Medica 73(7), 629–635. 294. Wise M.L., Savage T.J, Katahira E., Croteau R. ( 1998 ), Monoterpene synthases from common sage ( Salvia officinalis ). cDNA isolation, characterization, and functional expression of (+)-sabinene synthase, 1,8-cineole synthase, and (+)-bornyl diphosphate synthase, The Journal of Biological Chemistry 273(24), 14891–14899. 295. Wojdyło A., Oszmiański J., Czemerys R. ( 2007 ), Antioxidant activity and phenolic compounds in 32 selected herbs, Food Chemistry 105(3), 940–949. 296. Wood E.J., Practical biochemistry for colleges, Pergamon Press, Oxford, 1989 . 297. Wu T., He M., Zang X., Zhou Y., Qiu T., Pan S., Xu X. ( 2013 ), A structure-activity relationship study of flavonoids as inhibitors of E. coli by membrane interaction effect, Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes , 1828 (11), 2751-2756. 298. Zarzuelo А., Crespo E. (2002), The medicinal and non-medicinal use of thyme, у: Stahl-Biskup E., Sáez F. (ур.), Thyme – The genus Thymus , Taylor and Francis, London and New York, pp. 263–292. 299. Zayed A.M., Terry N. ( 2003 ), Chromium in the environment: factors affecting biological remediation, Plant and Soil 249(1), 139–156.

258

300. Zgórka G., Głowniak K. ( 2001 ), Variation of free phenolic acids in medicinal plants belonging to the Lamiaceae family, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 26(1), 79–87. 301. Zhang H.-J., Li L.-N. ( 1994 ), Salvianolic acid I: A new depside from Salvia cavaleriei , Planta Medica 60(1), 70–72. 302. Zheng W., Wang S.Y. ( 2001 ), Antioxidant activity and phenolic compounds in selected herbs, Journal of Agricultural and Food Chemistry 49(11), 5165–5170. 303. Zhеng Q., Sun Z. Zhang X., Yuan J., Wu H., Yang J., Xu X. ( 2012 ), Clerodendranoic acid, a new phenolic acid from Clerodendranthus spicatus , Molecules 17(11), 13656–13661. 304. Zovko Коnčić M., Kremer D., Gruz J., Strnad M., Biševac G., Kosalec I., Šamec D., Piljac-Žegarac J., Karlović K. (2010 ), Antioxidant and antimicrobial properties of Moltkia petraea (Tratt.) Griesb. flower, leaf and stem infusions, Food and Chemical Toxicology 48, 1537–1542. 305. Živanović P. ( 1974 ), Uporedno proučavanje morfoloških i ekofizioloških osobina Thymus pannonicus All. subvar. griseus Ronn. i Thymus glabrescens Willd. subvar. firmus (Lyka) Diklić , Doktorska disertacija, Univerzitet u Beogradu – Farmaceutski fakultet, Beograd.

259

Прилози

260

Прилог 1. Резултати оптимизовања методе хедспејс екстракције

Оптимизовање методе хедспејс екстракције извршено је анализом резултата добијених екстракцијом испарљивих састојака 0,5 g узорка уситњене хербе панонског тимијана током 20, 30 и 60 min на температурама 60, 80, 90 и 100 °C. Поред тога, резултати су упоређени са саставом етарског уља добијеног из 30 g хербе ( Материјал и методе 3.3 ).

Abundance Signal: 05g_9030_1.D\FID1A.CH 50000 Signal: JAT71.D\FID1A.CH 48000 46000 44000 42000 40000 38000 36000 34000 32000 30000 28000 26000 24000 ЕУ 22000 20000 18000 16000 14000 12000 10000 8000 ХС 6000 4000 2000 0 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00 70.00 75.00 Time--> Слика 1. Хроматограм етарског уља хербе Th. pannonicus (ЕУ) и хроматограм хедспејс фракције хербе Th. pannonicus добијене екстракцијом током 30 min на температури од 90 °C (ХС)

261

Табела 1. Састав хедспејс фракција добијених под различитим условима и састав етарског уља хербе самониклог Th. pannonicus

Хедспејс фракције Етарско уље Температура (°C)/време инкубације узорка (min) 60/20 60/30 60/60 80/20 80/30 80/60 90/20 90/30 90/60 100/20 100/30 100/60 # Компоненте КИЛ КИЕ % % % % % % % % % % % % КИЕ % 1 α-Тујен 924 935.9 0.47 0.23 0.66 0.44 0.42 0.60 0.58 0.60 0.59 0.48 0.44 0.40 - - 2 α-Пинен 932 942.8 4.80 5.38 5.45 3.17 3.06 3.60 3.04 3.19 2.87 2.53 2.53 2.63 933.6 0.06 3 Камфен 946 957.7 6.41 6.69 7.10 4.40 3.95 4.89 4.08 4.01 3.44 3.26 3.35 3.43 948.7 0.07 4 1-Октен-3-ол 974 987.3 5.30 6.41 5.92 5.82 5.92 5.68 5.64 5.60 5.54 5.34 5.04 5.21 976.1 0.72 5 6-Метил-5-хептен-2-он 981 994.7 9.32 10.44 9.54 11.81 9.58 11.38 11.96 11.08 15.69 11.88 15.09 20.86 985.3 0.75 6 3-octanol 988 1006.0 2.89 2.13 1.84 1.22 2.20 1.14 0.99 0.83 - - - - 994.3 0.31 7 3-Октанол 1014 1024.1 - 0.19 0.41 0.10 0.18 0.36 0.51 0.62 0.52 0.45 0.41 0.76 - - 8 p-Цимен 1020 1032.5 т. т. т. т. т. т. т. т. т. т. т. т. 1024.7 0.28 9 Лимонен 1024 1033.0 т. т. т. т. т. т. т. т. т. т. т. т. 1028.8 0.40 10 1,8-Цинеол 1026 1037.4 18.51 22.13 21.64 16.97 16.51 18.23 15.12 16.72 15.72 15.06 13.67 14.84 1031.6 0.41 11 Бергамал 1051 1058.9 0.13 0.09 0.10 0.32 0.37 0.32 0.35 0.33 0.34 0.35 0.35 0.39 1052.6 0.09 12 γ-Терпинен 1054 1064.0 0.32 0.94 0.81 0.47 0.61 0.84 1.01 1.21 1.07 0.93 0.87 1.42 1058.5 т. 13 cis -Сабинен хидрат 1065 1073.5 1.86 2.53 2.10 1.75 3.31 1.82 3.59 3.14 2.26 2.15 1.55 1.08 1067.3 0.11 14 Терпинолен 1086 1094.8 - - 0.11 0.28 0.38 0.40 0.47 0.51 0.47 0.49 0.45 0.59 1089.0 0.20 15 Линалол 1095 1105.8 7.67 6.88 5.66 5.73 6.12 5.68 6.47 5.98 6.52 5.89 5.96 6.40 1100.2 0.89 16 Перилен 1102 1105.8 т. т. т. т. т. т. т. т. т. т. т. т. - - 17 n-Нонанал 1100 ------1104.4 0.10 18 Камфор 1140 1147.5 1.94 1.34 1.32 1.21 1.13 1.38 1.12 1.26 1.12 1.26 1.39 1.32 1144.7 0.45 19 trans -Хризантемал 1153 1154.4 2.44 1.99 1.84 2.86 2.31 2.28 2.36 2.38 2.37 2.45 2.57 2.62 1150.4 0.41 20 Цитронелал 1148 ------1154.6 0.09 21 Неролоксид 1154 ------1154.6 0.05 22 (Z)-Изоцитрал 1160 1168.9 - - - 0.80 0.88 0.76 1.01 0.97 0.88 1.02 0.99 0.71 1164.5 0.43 23 Борнеол 1165 ------1166.6 0.13 24 Роузфуран епоксид 1173 1179.4 0.79 0.74 0.87 1.35 1.45 1.38 1.63 1.63 1.58 1.67 1.68 1.37 1175.5 0.47 25 Терпинен-4-ол 1174 ------1178.5 0.30 26 (E)-Изоцитрал 1177 1186.8 0.43 0.61 0.65 1.46 1.48 1.32 1.62 1.62 1.42 1.74 1.65 1.15 1182.9 0.76 27 α-Терпинеол 1186 ------1191.8 0.43 28 Цитронелол 1223 ------1224.2 0.13 29 Нерол 1227 1233.2 - - - 1.11 1.14 1.20 1.17 1.40 1.51 1.75 1.99 2.09 1229.3 3.95 30 Нерал 1235 1245.6 12.83 12.70 11.86 12.81 13.07 11.40 12.88 11.72 10.25 11.78 10.44 7.16 1244.1 26.83 31 Гераниол 1249 1260.5 0.44 - - 0.37 0.54 0.44 - 0.54 0.55 0.82 0.91 0.84 1255.2 1.55

262

Хедспејс фракције Етарско уље Температура (°C)/време инкубације узорка (min) 60/20 60/30 60/60 80/20 80/30 80/60 90/20 90/30 90/60 100/20 100/30 100/60 # Компоненте КИЛ КИЕ % % % % % % % % % % % % КИЕ % 32 Гераниал 1264 1275.4 14.99 13.13 13.51 15.14 15.04 12.76 13.56 12.78 10.99 13.12 11.97 8.08 1274.5 36.35 33 Нерилформат 1280 ------1281.8 0.42 34 Геранилформат 1298 ------1302.7 0.10 35 Метилгеранат 1322 ------1324.3 0.34 36 Етилнеролат 1351 ------1360.3 1.58 37 Нерилацетат 1359 1367.9 1.48 0.79 0.93 1.77 1.71 1.71 1.49 1.70 1.83 2.29 2.33 2.46 1365.6 4.48 38 α-Копаен 1374 1380.0 - - - 0.34 0.31 0.35 0.32 0.33 0.40 0.46 0.48 0.49 1378.4 1.02 39 Геранилацетат 1379 ------1384.7 3.39 40 β-Бурбонен 1387 1389.3 2.55 2.24 2.59 2.90 2.58 3.00 2.76 2.93 4.17 4.81 5.15 4.88 1387.4 0.81 41 4а α,7 β,7а α-Непеталактон 1391 ------1407.1 0.12 42 (E)-Кариофилен 1417 1424.1 - 0.10 0.08 0.19 0.17 0.22 0.14 0.23 0.33 0.39 0.44 0.38 1421.9 0.23 43 β-Копаен 1430 1433.7 - - - - 0.05 0.04 0.05 0.07 0.11 0.10 0.16 0.08 1431.8 0.19 44 Гермакрен D 1484 1480.8 ------0.01 0.01 0.03 0.02 0.03 0.03 1479.1 0.12 45 β-Бисаболен 1505 1512.6 0.23 - 0.50 0.62 0.61 0.77 0.61 0.80 1.03 1.27 1.28 1.31 1510.5 2.31 46 Кариофилен оксид 1582 1588.5 ------0.02 0.04 0.06 0.08 0.06 1586.5 1.64 47 β-Атлантол 1608 ------1611.4 0.38 48 Гермакра-4(15),5,10(14)-триен-1-α-ол 1687 ------1689.9 0.54 Укупно идентификовано 95.80 97.69 95.48 95.40 95.06 93.96 94.54 94.23 93.66 93.84 93.26 93.05 94.36 Монотерпенски угљоводоници 11.99 13.42 14.54 8.86 8.60 10.69 9.68 10.16 8.96 8.14 8.04 9.24 1.01 Кисеонични монотерпени 63.50 62.93 60.48 63.65 65.05 60.69 62.38 62.16 57.36 61.37 57.46 50.51 84.29 Сесквитерпенски угљоводоници 2.79 2.34 3.16 4.04 3.71 4.38 3.90 4.38 6.07 7.05 7.54 7.17 4.67 Кисеонични сесквитерпени 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.06 2.56 Остала једињења 17.52 18.99 17.30 18.85 17.70 18.20 18.59 17.51 21.23 17.22 20.14 26.07 1.87 Садржај компоненти хедспејс фракција изражен је као средња вредност три одређивања под назначеним условима (температура и време). %, релативни удео компоненте у ХС фракцији; КИЛ, литературни Ковачев индекс; KИЕ, експериментално одређен Ковачев идекс (у случају анализираних хедспејс фракција израчунат као средња вредност индекса добијених за сваки узорак); т., трагови; -, компонента није детектована.

263

% neral % geranial

14.00 16.00

12.00 14.00

10.00 12.00 60 °C 10.00 60 °C 8.00 80 °C 80 °C 8.00 90 °C

%m/m 90 °C

6.00 %m/m 100 °C 6.00 100 °C 4.00 4.00 2.00 2.00

0.00 0.00 20 min 30 min 60 min 20 min 30 min 60 min Time Time

Слика 2 . Утицај температуре и трајања хедспејс екстракције на релативни садржај монотерпенских алдехида нерала и гераниала у ХС фракцијама хербе Th. pannonicus

% pinene %camphene

6.00 8.00 7.00 5.00 6.00 60 °C 4.00 60 °C 5.00 80 °C 80 °C 3.00 4.00 90 °C

%m/m 90 °C %m/m 3.00 2.00 100 °C 100 °C 2.00

1.00 1.00 0.00 0.00 20 min 30 min 60 min 20 min 30 min 60 min Time of equilibration Time

Слика 3. Утицај температуре и трајања хедспејс екстракције на релативни садржај монотерпенских угљоводоника пинена и камфена у ХС фракцијама хербе Th. pannonicus

% MHO % 1,8-cineole

25.00 25.00

20.00 20.00

60 °C 15.00 15.00 60 °C 80 °C 80 °C 90 °C 90 °C %m/m 10.00 %m/m 100 °C 10.00 100 °C

5.00 5.00

0.00 20 min 30 min 60 min 0.00 20 min 30 min 60 min Time Time

Слика 4 . Утицај температуре и трајања хедспејс екстракције на релативни садржај 6-метил-5-хептен-2-она ( МHO ) и монотерпенског етра 1,8-цинеола у ХС фракцијама хербе Th. pannonicus

264

% α-copaene % β-bourbonene

0.60 6.00

0.50 5.00

0.40 4.00 60 °C 60 °C 80 °C 80 °C 0.30 3.00 90 °C

%m/m 90 °C %m/m 100 °C 100 °C 0.20 2.00

0.10 1.00

0.00 0.00 20 min 30 min 60 min 20 min 30 min 60 min Time Time

Слика 5 . Утицај температуре и трајања хедспејс екстракције на релативни садржај сесквитерпенских угљоводоника α-копаена и β-бурбонена у ХС фракцијама хербе Th. pannonicus

265

Прилог 2. Резултати корелационе анализе садржаја метала и састава хедспејс фракција листа панонског тимијана

Анализа корелација је извршена израчунавањем Пирсоновог коефицијента коришћењем програма Minitab 13.12 . Узорци су чинили редове анализиране матрице, а колоне садржај компоненти хедспјес фракција и садржај метала у листу панонског тимијана сакупљеног на локалитетима 5 и 8–11 у јужном Банату

Скраћенице : tri Трициклен bor Борнеол thu α-Тујен roex Роузфуран епоксид pin α-Пинен teol Терпинен-4-oл cam Камфен icie (E)-Изоцитрал sab Сабинен ateol α-Терпинеол ool 1-Октен-3-ол sahac cis -Сабинен хидрат ацетат pib β-Пинен ciol Цитронелол oon 3-Октанон neol Нерол hon 6-Метил-5-хептен-2-он time Тимол метилетар myr Мирцен ner Нерал phe α-Феландрен care Карвакрол метилетар ate α-Терпинен ger Гераниал cym p-Цимен thuac 3-Tujanol acetat lim Лимонен verac neoiso -Вербанол ацетат cin 1,8-Цинеол nerac Нерилацетат ocz (Z)-β-Оцимен acop α-Копаен oce (E)-β- Оцимен gerac Геранилацетат ber Бергамал bour β-Бурбонен gte γ-Терпинен bcub β-Кубебен sah cis -Сабинен хидрат caryo (E)-Кариофилен clo cis -Линалол оксид byla β-Иланген tlo trans - Линалол оксид bcop β-Копаен ter Терпинолен ahum α-Хумулен rof Роузфуран far (E)-β-Фарнезен lin Линалол arom allo -Aromadendren octac 1-Октен-3-илацетат ecaryo 9-epi -(E)-Кариофилен per Перилен gmuur γ-Муролен rox cis -Роузоксид germ Гермакрен D menth 1,3,8-p-Ментатриен bgerm Бициклогермакрен saon Деххидро-сабина кетон bbis β-Бисаболен caal α-Камфоленал gcad γ-Кадинен meol cis -p-Мента-2,8-диен-1-ол calam trans -Каламенен caor Камфор dcad δ-Кадинен iciz (Z)-Изоцитрал caryoo Кариофилен оксид

266

Tабела 2. Корелациона анализа садржаја метала и састава хедспејс фракција листа Th. pannonicus tri thu pin cam sab ool pib oon thu -0.073 0.797 pin 0.247 0.195 0.375 0.487 cam 0.853 0.142 0.485 0.000 0.614 0.067 sab 0.469 0.610 0.196 0.590 0.078 0.016 0.483 0.021 ool -0.529 -0.299 -0.389 -0.504 -0.651 0.043 0.278 0.152 0.055 0.009 pib 0.767 0.381 0.431 0.791 0.682 -0.725 0.001 0.162 0.109 0.000 0.005 0.002 oon 0.098 0.423 0.414 -0.075 0.063 -0.296 0.298 0.729 0.116 0.125 0.792 0.825 0.284 0.281 hon -0.627 -0.524 -0.594 -0.594 -0.575 0.729 -0.828 -0.689 0.012 0.045 0.019 0.019 0.025 0.002 0.000 0.005 myr 0.659 0.515 0.479 0.701 0.613 -0.611 0.919 0.449 0.008 0.050 0.071 0.004 0.015 0.016 0.000 0.093 phe -0.142 0.196 -0.079 0.011 0.174 0.100 -0.210 -0.156 0.614 0.484 0.780 0.968 0.535 0.724 0.452 0.579 ate -0.217 0.176 -0.149 -0.060 0.147 0.159 -0.321 -0.238 0.438 0.529 0.596 0.832 0.601 0.570 0.243 0.393 cym -0.092 0.604 -0.083 -0.269 0.237 -0.216 0.088 0.732 0.744 0.017 0.770 0.333 0.394 0.440 0.756 0.002 lim 0.093 0.517 0.127 -0.111 0.204 -0.309 0.337 0.869 0.742 0.048 0.652 0.694 0.465 0.262 0.219 0.000 cin 0.188 -0.608 -0.187 0.135 -0.027 -0.038 -0.074 -0.604 0.502 0.016 0.505 0.630 0.923 0.894 0.794 0.017 ocz 0.283 0.451 0.558 0.504 0.382 -0.383 0.607 0.276 0.306 0.091 0.031 0.055 0.160 0.159 0.016 0.320 oce 0.896 -0.023 0.510 0.799 0.405 -0.572 0.719 0.312 0.000 0.935 0.052 0.000 0.134 0.026 0.003 0.257 ber -0.597 -0.586 -0.582 -0.624 -0.558 0.455 -0.721 -0.656 0.019 0.022 0.023 0.013 0.030 0.089 0.002 0.008 gte -0.270 0.250 -0.104 -0.072 0.174 0.144 -0.320 -0.213 0.330 0.368 0.712 0.800 0.536 0.608 0.245 0.446 sah -0.404 0.095 -0.379 -0.280 0.100 0.252 -0.571 -0.472 0.135 0.737 0.164 0.312 0.723 0.365 0.026 0.075 clo 0.291 0.214 0.016 -0.017 0.063 -0.186 0.306 0.690 0.293 0.445 0.954 0.951 0.823 0.506 0.267 0.004

267

tlo 0.168 0.266 0.110 -0.052 0.053 -0.154 0.286 0.687 0.550 0.338 0.696 0.853 0.851 0.584 0.301 0.005 ter -0.334 0.089 -0.310 -0.192 0.073 0.202 -0.427 -0.392 0.224 0.753 0.261 0.493 0.797 0.471 0.112 0.149 rof -0.581 -0.426 -0.553 -0.524 -0.539 0.770 -0.776 -0.638 0.023 0.113 0.033 0.045 0.038 0.001 0.001 0.011 lin 0.342 0.325 0.176 0.081 0.169 -0.302 0.442 0.780 0.213 0.237 0.531 0.774 0.548 0.274 0.099 0.001 octac -0.142 0.400 0.057 -0.213 0.108 -0.170 0.066 0.557 0.614 0.139 0.839 0.445 0.703 0.546 0.816 0.031 per -0.634 -0.455 -0.595 -0.575 -0.508 0.636 -0.831 -0.696 0.011 0.088 0.019 0.025 0.053 0.011 0.000 0.004 rox -0.402 -0.314 -0.395 -0.448 -0.259 0.132 -0.479 -0.441 0.138 0.254 0.145 0.094 0.351 0.640 0.071 0.100 menth 0.241 0.216 0.282 0.150 0.203 -0.343 0.280 0.514 0.388 0.440 0.308 0.592 0.468 0.211 0.311 0.050 saon -0.142 0.196 -0.079 0.011 0.174 0.100 -0.210 -0.156 0.614 0.484 0.780 0.968 0.535 0.724 0.452 0.579 caal 0.030 0.173 0.952 0.341 0.093 -0.264 0.291 0.275 0.915 0.537 0.000 0.213 0.742 0.342 0.293 0.321 meol 0.717 -0.309 0.665 0.726 0.171 -0.395 0.446 0.071 0.003 0.263 0.007 0.002 0.541 0.146 0.096 0.802 caor -0.053 0.065 0.611 0.369 -0.021 0.106 0.027 -0.182 0.851 0.818 0.015 0.176 0.941 0.706 0.924 0.517 iciz -0.606 -0.580 -0.595 -0.635 -0.602 0.596 -0.783 -0.666 0.017 0.023 0.019 0.011 0.017 0.019 0.001 0.007 bor -0.208 0.283 -0.140 -0.008 0.068 0.092 -0.308 -0.228 0.457 0.307 0.618 0.976 0.809 0.744 0.264 0.413 roex -0.572 -0.469 -0.552 -0.571 -0.461 0.657 -0.775 -0.629 0.026 0.078 0.033 0.026 0.084 0.008 0.001 0.012 teol -0.142 0.196 -0.079 0.011 0.174 0.100 -0.210 -0.156 0.614 0.484 0.780 0.968 0.535 0.724 0.452 0.579 icie -0.641 -0.463 -0.609 -0.608 -0.534 0.609 -0.848 -0.705 0.010 0.082 0.016 0.016 0.040 0.016 0.000 0.003 ateol -0.142 0.196 -0.079 0.011 0.174 0.100 -0.210 -0.156 0.614 0.484 0.780 0.968 0.535 0.724 0.452 0.579 sahac -0.556 -0.352 -0.521 -0.505 -0.486 0.802 -0.823 -0.611 0.031 0.198 0.047 0.055 0.066 0.000 0.000 0.016 ciol -0.578 -0.561 -0.556 -0.586 -0.536 0.444 -0.678 -0.635 0.024 0.030 0.031 0.022 0.039 0.097 0.005 0.011 neol -0.555 -0.433 -0.522 -0.539 -0.486 0.532 -0.737 -0.610 0.032 0.107 0.046 0.038 0.066 0.041 0.002 0.016 time 0.277 0.159 -0.051 0.181 0.097 -0.123 0.256 0.262

268

0.317 0.572 0.858 0.518 0.732 0.663 0.357 0.346 ner -0.633 -0.516 -0.609 -0.629 -0.575 0.582 -0.822 -0.691 0.011 0.049 0.016 0.012 0.025 0.023 0.000 0.004 care -0.142 0.400 0.057 -0.213 0.108 -0.170 0.066 0.557 0.614 0.139 0.839 0.445 0.703 0.546 0.816 0.031 ger -0.634 -0.512 -0.609 -0.631 -0.568 0.565 -0.819 -0.687 0.011 0.051 0.016 0.012 0.027 0.028 0.000 0.005 thuac -0.359 -0.525 -0.356 -0.422 -0.363 0.166 -0.358 -0.394 0.189 0.044 0.192 0.118 0.184 0.555 0.190 0.146 verac -0.142 -0.356 -0.151 -0.202 -0.147 -0.211 0.005 -0.156 0.614 0.193 0.592 0.470 0.602 0.450 0.985 0.579 nerac -0.415 -0.438 -0.381 -0.387 -0.481 0.576 -0.571 -0.456 0.124 0.103 0.161 0.154 0.070 0.025 0.026 0.088 acop -0.350 -0.309 -0.299 -0.406 -0.414 0.331 -0.387 -0.120 0.201 0.263 0.279 0.133 0.125 0.227 0.155 0.670 gerac -0.187 0.041 -0.161 -0.189 0.360 0.107 -0.278 -0.206 0.504 0.884 0.565 0.500 0.188 0.704 0.316 0.462 bour -0.381 -0.251 -0.469 -0.557 -0.238 0.153 -0.327 -0.018 0.161 0.367 0.078 0.031 0.393 0.587 0.234 0.950 bcub 0.299 0.409 0.464 0.462 0.336 -0.347 0.562 0.295 0.279 0.130 0.082 0.083 0.221 0.205 0.029 0.286 caryo 0.288 0.605 0.226 0.316 0.552 -0.396 0.672 0.387 0.298 0.017 0.418 0.251 0.033 0.144 0.006 0.154 byla -0.151 -0.157 -0.181 -0.245 -0.147 -0.120 -0.063 0.084 0.590 0.576 0.518 0.378 0.600 0.670 0.825 0.766 bcop -0.046 0.240 -0.069 -0.154 0.223 -0.387 0.345 0.376 0.871 0.389 0.808 0.585 0.424 0.154 0.209 0.168 ahum 0.156 0.580 0.181 0.447 0.627 -0.359 0.629 -0.156 0.578 0.023 0.519 0.094 0.012 0.189 0.012 0.579 far 0.048 0.238 0.937 0.384 0.167 -0.298 0.358 0.245 0.864 0.392 0.000 0.158 0.552 0.280 0.190 0.379 arom 0.677 0.286 0.093 0.685 0.610 -0.439 0.723 0.030 0.006 0.301 0.740 0.005 0.016 0.101 0.002 0.916 ecaryo 0.488 0.176 0.785 0.654 0.334 -0.434 0.587 0.299 0.065 0.531 0.001 0.008 0.224 0.106 0.021 0.279 gmuur -0.128 -0.298 0.475 -0.032 -0.192 -0.270 0.063 0.091 0.648 0.281 0.074 0.909 0.492 0.331 0.824 0.747 germ 0.716 0.297 0.570 0.687 0.548 -0.677 0.816 0.507 0.003 0.283 0.026 0.005 0.034 0.006 0.000 0.054 bgerm 0.813 0.049 0.582 0.861 0.414 -0.524 0.743 0.176 0.000 0.862 0.023 0.000 0.125 0.045 0.002 0.531 bbis -0.425 -0.223 -0.399 -0.361 -0.499 0.443 -0.594 -0.467 0.114 0.424 0.141 0.186 0.058 0.098 0.019 0.079

269 gcad -0.021 -0.015 0.921 0.203 -0.114 -0.153 0.090 0.336 0.941 0.958 0.000 0.468 0.687 0.587 0.749 0.221 calam * * * * * * * * * * * * * * * * dcad -0.021 -0.015 0.921 0.203 -0.114 -0.153 0.090 0.336 0.941 0.958 0.000 0.468 0.687 0.587 0.749 0.221 caryoo 0.140 0.152 -0.040 -0.144 0.008 -0.098 0.169 0.560 0.618 0.587 0.888 0.609 0.977 0.727 0.546 0.030

Cr -0.205 0.240 0.008 -0.069 0.064 0.218 0.042 0.010 0.463 0.388 0.976 0.806 0.819 0.436 0.883 0.971

Ni -0.042 0.016 0.084 -0.018 0.283 -0.348 0.192 -0.031 0.881 0.954 0.767 0.949 0.307 0.204 0.493 0.912

Mo 0.090 -0.099 0.380 0.091 -0.382 0.238 0.174 0.355 0.749 0.727 0.163 0.748 0.160 0.393 0.535 0.194

Cu 0.430 -0.053 0.332 0.521 0.464 -0.456 0.616 -0.178 0.110 0.852 0.227 0.046 0.082 0.087 0.014 0.526

Zn -0.389 -0.442 -0.393 -0.283 -0.473 0.717 -0.634 -0.655 0.152 0.099 0.148 0.306 0.075 0.003 0.011 0.008

Mn -0.298 -0.048 -0.317 -0.256 0.147 0.099 -0.505 -0.387 0.281 0.865 0.250 0.358 0.602 0.725 0.055 0.154

Fe -0.015 0.213 -0.012 0.057 0.316 -0.017 0.014 -0.021 0.956 0.445 0.965 0.840 0.252 0.952 0.962 0.940

Mg -0.217 -0.448 -0.113 -0.410 -0.443 0.204 -0.366 -0.009 0.438 0.094 0.689 0.130 0.098 0.465 0.179 0.974

Ca 0.079 -0.190 0.099 -0.056 -0.073 0.054 0.129 0.176 0.780 0.497 0.726 0.843 0.796 0.847 0.647 0.531

K -0.324 -0.124 -0.244 -0.391 -0.002 0.211 -0.440 -0.110 0.238 0.659 0.381 0.150 0.995 0.451 0.101 0.697

Na -0.233 -0.069 -0.207 -0.313 0.173 -0.056 -0.285 -0.205 0.403 0.807 0.458 0.256 0.536 0.843 0.303 0.463

hon myr phe ate cym lim cin ocz myr -0.862 0.000 phe 0.059 -0.195 0.835 0.486 ate 0.163 -0.298 0.984 0.562 0.281 0.000 cym -0.446 0.137 0.130 0.102 0.096 0.626 0.645 0.718 lim -0.605 0.373 -0.155 -0.232 0.889 0.017 0.171 0.581 0.406 0.000 cin 0.280 -0.214 0.166 0.192 -0.597 -0.654 0.312 0.445 0.555 0.494 0.019 0.008

270 ocz -0.584 0.810 -0.132 -0.202 -0.138 0.035 -0.084 0.022 0.000 0.639 0.470 0.625 0.900 0.766 oce -0.733 0.614 -0.166 -0.254 0.064 0.266 0.068 0.297 0.002 0.015 0.555 0.362 0.821 0.338 0.811 0.282 ber 0.888 -0.821 -0.009 0.085 -0.429 -0.595 0.461 -0.557 0.000 0.000 0.974 0.763 0.111 0.019 0.084 0.031 gte 0.143 -0.271 0.971 0.990 0.121 -0.222 0.163 -0.119 0.612 0.328 0.000 0.000 0.668 0.426 0.562 0.672 sah 0.524 -0.501 0.280 0.435 -0.079 -0.436 0.073 -0.293 0.045 0.057 0.311 0.105 0.780 0.104 0.797 0.289 clo -0.492 0.456 -0.111 -0.170 0.448 0.566 -0.395 0.164 0.062 0.088 0.693 0.544 0.094 0.028 0.145 0.560 tlo -0.430 0.417 -0.143 -0.208 0.429 0.614 -0.558 0.133 0.110 0.122 0.610 0.457 0.111 0.015 0.031 0.636 ter 0.318 -0.421 0.846 0.900 0.006 -0.402 0.323 -0.241 0.247 0.118 0.000 0.000 0.982 0.137 0.240 0.388 rof 0.929 -0.798 0.021 0.122 -0.385 -0.579 0.143 -0.541 0.000 0.000 0.942 0.666 0.156 0.024 0.612 0.037 lin -0.638 0.571 -0.144 -0.221 0.513 0.673 -0.478 0.243 0.010 0.026 0.608 0.429 0.051 0.006 0.071 0.383 octac -0.316 0.021 -0.071 -0.109 0.786 0.773 -0.439 -0.132 0.252 0.940 0.800 0.698 0.001 0.001 0.102 0.639 per 0.974 -0.871 0.134 0.247 -0.398 -0.617 0.246 -0.590 0.000 0.000 0.633 0.374 0.142 0.014 0.378 0.021 rox 0.450 -0.552 0.176 0.268 -0.176 -0.437 0.520 -0.374 0.093 0.033 0.531 0.334 0.529 0.104 0.047 0.169 menth -0.491 0.158 -0.111 -0.170 0.615 0.678 -0.281 -0.100 0.063 0.574 0.694 0.545 0.015 0.005 0.311 0.724 saon 0.059 -0.195 1.000 0.984 0.130 -0.155 0.166 -0.132 0.835 0.486 * 0.000 0.645 0.581 0.555 0.639 caal -0.408 0.374 -0.092 -0.141 -0.233 -0.042 -0.157 0.584 0.131 0.170 0.743 0.616 0.403 0.883 0.576 0.022 meol -0.456 0.313 -0.103 -0.158 -0.279 -0.095 0.221 0.151 0.088 0.255 0.714 0.574 0.313 0.737 0.428 0.592 caor -0.003 0.117 0.131 0.124 -0.498 -0.479 -0.046 0.470 0.991 0.678 0.641 0.661 0.059 0.071 0.871 0.077 iciz 0.942 -0.833 -0.111 0.001 -0.448 -0.596 0.340 -0.565 0.000 0.000 0.694 0.997 0.094 0.019 0.216 0.028 bor 0.155 -0.286 0.712 0.770 0.120 -0.227 -0.019 -0.194 0.582 0.302 0.003 0.001 0.671 0.415 0.947 0.489 roex 0.934 -0.787 -0.135 -0.010 -0.404 -0.556 0.200 -0.533 0.000 0.001 0.633 0.971 0.136 0.031 0.474 0.041 teol 0.059 -0.195 1.000 0.984 0.130 -0.155 0.166 -0.132 0.835 0.486 * 0.000 0.645 0.581 0.555 0.639

271

icie 0.952 -0.882 0.125 0.250 -0.388 -0.636 0.308 -0.598 0.000 0.000 0.656 0.369 0.153 0.011 0.264 0.019 ateol 0.059 -0.195 1.000 0.984 0.130 -0.155 0.166 -0.132 0.835 0.486 * 0.000 0.645 0.581 0.555 0.639 sahac 0.875 -0.764 0.187 0.301 -0.338 -0.536 0.144 -0.518 0.000 0.001 0.505 0.275 0.218 0.039 0.607 0.048 ciol 0.833 -0.795 0.167 0.236 -0.401 -0.582 0.531 -0.539 0.000 0.000 0.551 0.397 0.138 0.023 0.042 0.038 neol 0.758 -0.763 0.467 0.538 -0.315 -0.554 0.478 -0.517 0.001 0.001 0.080 0.039 0.253 0.032 0.072 0.048 time -0.316 0.502 -0.071 -0.109 0.041 0.068 0.085 0.648 0.252 0.057 0.800 0.698 0.884 0.808 0.764 0.009 ner 0.944 -0.869 0.024 0.145 -0.410 -0.622 0.339 -0.590 0.000 0.000 0.933 0.606 0.129 0.013 0.216 0.021 care -0.316 0.021 -0.071 -0.109 0.786 0.773 -0.439 -0.132 0.252 0.940 0.800 0.698 0.001 0.001 0.102 0.639 ger 0.937 -0.868 0.030 0.150 -0.401 -0.617 0.337 -0.591 0.000 0.000 0.917 0.594 0.139 0.014 0.219 0.020 thuac 0.543 -0.493 -0.042 -0.016 -0.336 -0.343 0.491 -0.334 0.036 0.062 0.881 0.954 0.221 0.210 0.063 0.223 verac 0.183 -0.195 -0.071 -0.109 -0.179 -0.155 0.428 -0.132 0.514 0.486 0.800 0.698 0.523 0.581 0.111 0.639 nerac 0.735 -0.570 0.135 0.173 -0.382 -0.351 0.209 -0.387 0.002 0.026 0.633 0.537 0.159 0.200 0.454 0.155 acop 0.474 -0.534 0.053 0.055 0.029 0.084 0.039 -0.572 0.075 0.040 0.850 0.846 0.918 0.767 0.889 0.026 gerac 0.235 -0.258 0.131 0.233 0.020 -0.205 0.237 -0.175 0.399 0.354 0.641 0.403 0.943 0.464 0.395 0.534 bour 0.362 -0.479 0.213 0.197 0.215 0.141 0.233 -0.527 0.185 0.071 0.447 0.483 0.441 0.615 0.404 0.043 bcub -0.561 0.789 -0.127 -0.194 -0.107 0.045 -0.051 0.985 0.029 0.000 0.652 0.488 0.704 0.875 0.857 0.000 caryo -0.589 0.776 -0.151 -0.210 0.202 0.370 -0.372 0.570 0.021 0.001 0.592 0.452 0.469 0.174 0.172 0.026 byla 0.079 -0.299 0.034 -0.015 0.306 0.305 0.128 -0.393 0.779 0.279 0.903 0.959 0.267 0.270 0.650 0.147 bcop -0.274 0.180 -0.096 -0.179 0.465 0.568 -0.111 -0.046 0.324 0.521 0.732 0.524 0.081 0.027 0.694 0.870 ahum -0.316 0.578 -0.071 -0.109 -0.097 0.020 -0.144 0.503 0.252 0.024 0.800 0.698 0.732 0.943 0.608 0.056 far -0.432 0.431 -0.098 -0.149 -0.236 -0.037 -0.169 0.624 0.108 0.109 0.729 0.595 0.396 0.895 0.547 0.013 arom -0.534 0.794 -0.142 -0.193 -0.102 0.004 0.184 0.718

272

0.040 0.000 0.613 0.492 0.717 0.989 0.512 0.003 ecaryo -0.639 0.726 -0.159 -0.226 -0.235 -0.035 0.054 0.865 0.010 0.002 0.570 0.417 0.400 0.903 0.848 0.000 gmuur -0.056 -0.033 -0.104 -0.159 -0.280 -0.158 0.273 0.175 0.842 0.907 0.712 0.571 0.312 0.575 0.325 0.533 germ -0.860 0.702 -0.161 -0.272 0.338 0.548 -0.166 0.365 0.000 0.004 0.566 0.328 0.218 0.035 0.554 0.181 bgerm -0.685 0.776 -0.155 -0.237 -0.236 -0.027 0.183 0.714 0.005 0.001 0.582 0.395 0.396 0.924 0.514 0.003 bbis 0.541 -0.585 0.335 0.417 -0.196 -0.432 0.185 -0.396 0.037 0.022 0.223 0.122 0.484 0.108 0.510 0.143 gcad -0.316 0.193 -0.071 -0.109 -0.208 -0.050 -0.114 0.435 0.252 0.491 0.800 0.698 0.456 0.861 0.686 0.105 calam * * * * * * * * * * * * * * * * dcad -0.316 0.193 -0.071 -0.109 -0.208 -0.050 -0.114 0.435 0.252 0.491 0.800 0.698 0.456 0.861 0.686 0.105 caryoo -0.316 0.227 -0.071 -0.109 0.432 0.526 -0.439 -0.132 0.252 0.417 0.800 0.698 0.108 0.044 0.102 0.639

Cr 0.004 0.248 0.000 -0.025 -0.081 -0.005 0.022 0.523 0.987 0.373 0.999 0.929 0.773 0.987 0.939 0.045

Ni -0.121 0.183 -0.000 -0.022 -0.105 -0.077 0.544 0.368 0.667 0.514 1.000 0.937 0.709 0.786 0.036 0.177

Mo -0.236 0.338 -0.263 -0.350 -0.161 0.058 -0.097 0.491 0.397 0.217 0.344 0.201 0.567 0.838 0.731 0.063

Cu -0.318 0.498 -0.143 -0.200 -0.436 -0.272 0.468 0.466 0.249 0.059 0.612 0.474 0.105 0.326 0.078 0.080

Zn 0.793 -0.631 0.270 0.338 -0.508 -0.599 0.261 -0.409 0.000 0.012 0.331 0.218 0.053 0.018 0.347 0.130

Mn 0.417 -0.458 0.575 0.665 -0.053 -0.350 0.237 -0.311 0.122 0.086 0.025 0.007 0.850 0.201 0.396 0.259

Fe -0.108 0.042 0.678 0.638 0.173 0.052 0.293 0.080 0.701 0.882 0.005 0.011 0.538 0.855 0.289 0.776

Mg 0.217 -0.328 0.072 0.101 -0.123 -0.107 0.533 -0.209 0.437 0.233 0.800 0.721 0.663 0.704 0.041 0.455

Ca -0.124 0.233 -0.064 -0.130 -0.154 -0.032 0.235 0.304 0.659 0.403 0.821 0.644 0.583 0.910 0.400 0.271

K 0.408 -0.443 -0.108 -0.039 0.095 -0.038 -0.221 -0.405 0.131 0.098 0.702 0.891 0.737 0.892 0.428 0.134

Na 0.236 -0.248 -0.108 -0.011 -0.025 -0.185 0.150 -0.156 0.397 0.374 0.702 0.970 0.929 0.509 0.594 0.579

oce ber gte sah clo tlo ter rof ber -0.699

273

0.004 gte -0.276 0.067 0.320 0.812 sah -0.499 0.401 0.458 0.058 0.139 0.086 clo 0.163 -0.469 -0.217 -0.323 0.562 0.078 0.438 0.240 tlo 0.080 -0.473 -0.254 -0.330 0.922 0.776 0.075 0.361 0.230 0.000 ter -0.415 0.351 0.903 0.571 -0.261 -0.364 0.124 0.199 0.000 0.026 0.347 0.182 rof -0.679 0.802 0.112 0.515 -0.456 -0.455 0.326 0.005 0.000 0.690 0.049 0.088 0.089 0.236 lin 0.273 -0.608 -0.257 -0.422 0.975 0.932 -0.349 -0.591 0.324 0.016 0.356 0.117 0.000 0.000 0.202 0.020 octac 0.176 -0.301 -0.060 -0.235 -0.050 0.002 -0.203 -0.292 0.531 0.276 0.832 0.400 0.859 0.995 0.467 0.290 per -0.741 0.892 0.232 0.635 -0.498 -0.435 0.431 0.912 0.002 0.000 0.406 0.011 0.059 0.105 0.109 0.000 rox -0.470 0.710 0.259 0.383 -0.315 -0.406 0.578 0.376 0.077 0.003 0.351 0.159 0.252 0.133 0.024 0.167 menth 0.572 -0.468 -0.147 -0.370 -0.075 -0.052 -0.316 -0.455 0.026 0.079 0.601 0.175 0.790 0.855 0.251 0.089 saon -0.166 -0.009 0.971 0.280 -0.111 -0.143 0.846 0.021 0.555 0.974 0.000 0.311 0.693 0.610 0.000 0.942 caal 0.256 -0.389 -0.084 -0.275 -0.071 0.052 -0.241 -0.378 0.358 0.152 0.766 0.320 0.802 0.855 0.386 0.165 meol 0.851 -0.435 -0.191 -0.350 -0.064 -0.091 -0.294 -0.422 0.000 0.105 0.495 0.201 0.821 0.748 0.288 0.117 caor 0.039 -0.096 0.178 0.103 -0.327 -0.234 0.149 0.096 0.890 0.733 0.527 0.715 0.234 0.401 0.595 0.734 iciz -0.709 0.951 -0.015 0.464 -0.476 -0.463 0.243 0.885 0.003 0.000 0.958 0.081 0.073 0.083 0.384 0.000 bor -0.243 0.096 0.773 0.571 -0.163 -0.210 0.746 0.185 0.382 0.733 0.001 0.026 0.561 0.452 0.001 0.509 roex -0.669 0.812 -0.016 0.597 -0.449 -0.423 0.179 0.927 0.006 0.000 0.955 0.019 0.093 0.116 0.523 0.000 teol -0.166 -0.009 0.971 0.280 -0.111 -0.143 0.846 0.021 0.555 0.974 0.000 0.311 0.693 0.610 0.000 0.942 icie -0.750 0.922 0.236 0.634 -0.504 -0.499 0.461 0.906 0.001 0.000 0.397 0.011 0.056 0.058 0.084 0.000 ateol -0.166 -0.009 0.971 0.280 -0.111 -0.143 0.846 0.021 0.555 0.974 0.000 0.311 0.693 0.610 0.000 0.942

274 sahac -0.650 0.643 0.284 0.601 -0.436 -0.396 0.361 0.839 0.009 0.010 0.304 0.018 0.104 0.144 0.186 0.000 ciol -0.677 0.967 0.213 0.307 -0.454 -0.480 0.470 0.744 0.006 0.000 0.445 0.266 0.089 0.070 0.077 0.001 neol -0.649 0.775 0.509 0.381 -0.436 -0.467 0.628 0.643 0.009 0.001 0.053 0.161 0.104 0.079 0.012 0.010 time 0.198 -0.301 -0.058 -0.119 0.342 0.139 -0.071 -0.292 0.479 0.276 0.837 0.673 0.213 0.622 0.801 0.290 ner -0.738 0.954 0.130 0.558 -0.497 -0.496 0.380 0.890 0.002 0.000 0.644 0.031 0.060 0.060 0.163 0.000 care 0.176 -0.301 -0.060 -0.235 -0.050 0.002 -0.203 -0.292 0.531 0.276 0.832 0.400 0.859 0.995 0.467 0.290 ger -0.737 0.955 0.136 0.559 -0.497 -0.500 0.386 0.886 0.002 0.000 0.629 0.030 0.060 0.058 0.155 0.000 thuac -0.420 0.729 -0.043 0.061 -0.282 -0.184 0.188 0.330 0.119 0.002 0.880 0.830 0.309 0.511 0.502 0.229 verac -0.166 0.516 -0.118 -0.232 -0.111 -0.143 0.102 0.123 0.555 0.049 0.676 0.406 0.693 0.610 0.716 0.662 nerac -0.485 0.525 0.137 0.219 -0.326 -0.137 0.062 0.488 0.067 0.044 0.627 0.433 0.236 0.627 0.825 0.065 acop -0.293 0.401 0.008 -0.045 -0.191 0.010 -0.049 0.263 0.289 0.138 0.976 0.873 0.494 0.973 0.864 0.343 gerac -0.219 0.177 0.255 0.655 -0.147 -0.190 0.370 0.239 0.432 0.529 0.358 0.008 0.601 0.498 0.175 0.391 bour -0.390 0.503 0.159 -0.059 0.017 0.060 0.267 0.210 0.151 0.056 0.571 0.836 0.953 0.831 0.336 0.452 bcub 0.296 -0.535 -0.113 -0.274 0.215 0.143 -0.219 -0.520 0.283 0.040 0.688 0.323 0.441 0.610 0.434 0.047 caryo 0.113 -0.569 -0.205 -0.266 0.634 0.670 -0.277 -0.542 0.687 0.027 0.463 0.338 0.011 0.006 0.317 0.037 byla 0.036 0.253 -0.017 -0.296 -0.268 -0.223 0.004 -0.008 0.898 0.363 0.952 0.284 0.334 0.425 0.988 0.977 bcop 0.002 -0.052 -0.179 -0.444 0.242 0.302 -0.171 -0.330 0.993 0.854 0.524 0.097 0.386 0.274 0.543 0.229 ahum 0.033 -0.301 -0.075 -0.136 -0.111 0.010 -0.137 -0.292 0.907 0.276 0.791 0.630 0.693 0.973 0.626 0.290 far 0.250 -0.411 -0.090 -0.282 -0.082 0.051 -0.249 -0.400 0.369 0.128 0.749 0.309 0.772 0.857 0.370 0.140 arom 0.525 -0.519 -0.161 -0.177 0.175 0.027 -0.193 -0.490 0.044 0.048 0.566 0.527 0.532 0.923 0.492 0.064 ecaryo 0.595 -0.615 -0.167 -0.321 0.115 0.063 -0.300 -0.589 0.019 0.015 0.552 0.243 0.684 0.824 0.277 0.021 gmuur 0.029 0.223 -0.135 -0.342 -0.113 -0.084 -0.049 -0.090 0.918 0.424 0.631 0.212 0.687 0.767 0.863 0.751

275

germ 0.895 -0.793 -0.263 -0.590 0.176 0.165 -0.451 -0.799 0.000 0.000 0.343 0.021 0.530 0.556 0.092 0.000 bgerm 0.833 -0.652 -0.219 -0.410 0.128 0.019 -0.334 -0.634 0.000 0.008 0.433 0.129 0.649 0.947 0.224 0.011 bbis -0.498 0.566 0.392 0.390 -0.334 -0.316 0.554 0.463 0.059 0.028 0.148 0.150 0.224 0.252 0.032 0.082 gcad 0.253 -0.301 -0.062 -0.239 -0.036 0.050 -0.203 -0.292 0.364 0.276 0.827 0.391 0.899 0.860 0.467 0.290 calam * * * * * * * * * * * * * * * * dcad 0.253 -0.301 -0.062 -0.239 -0.036 0.050 -0.203 -0.292 0.364 0.276 0.827 0.391 0.899 0.860 0.467 0.290 caryoo 0.004 -0.301 -0.183 -0.240 0.908 0.912 -0.203 -0.292 0.989 0.276 0.515 0.388 0.000 0.000 0.467 0.290

Cr -0.189 -0.111 0.047 -0.094 -0.149 -0.091 -0.052 -0.078 0.500 0.694 0.868 0.740 0.595 0.747 0.853 0.784

Ni -0.000 0.088 0.038 -0.131 -0.188 -0.305 0.029 -0.227 1.000 0.754 0.892 0.643 0.502 0.268 0.918 0.415

Mo 0.160 -0.234 -0.324 -0.632 0.272 0.166 -0.343 -0.081 0.568 0.401 0.239 0.011 0.326 0.555 0.211 0.774

Cu 0.309 -0.119 -0.197 -0.332 -0.007 -0.098 -0.126 -0.276 0.262 0.672 0.482 0.227 0.979 0.728 0.655 0.320

Zn -0.510 0.584 0.296 0.397 -0.430 -0.286 0.351 0.648 0.052 0.022 0.284 0.143 0.110 0.302 0.200 0.009

Mn -0.376 0.314 0.660 0.765 -0.241 -0.219 0.633 0.275 0.168 0.254 0.007 0.001 0.387 0.434 0.011 0.320

Fe 0.034 -0.185 0.657 0.000 -0.171 -0.245 0.420 -0.194 0.903 0.509 0.008 0.999 0.542 0.379 0.119 0.488

Mg -0.186 0.328 0.071 -0.093 0.010 -0.054 0.082 -0.018 0.507 0.233 0.801 0.741 0.973 0.847 0.771 0.950

Ca 0.011 -0.047 -0.128 -0.414 0.327 0.147 -0.116 -0.045 0.970 0.869 0.650 0.125 0.235 0.601 0.680 0.872

K -0.291 0.286 -0.029 0.492 -0.134 -0.065 0.056 0.477 0.292 0.302 0.918 0.062 0.633 0.819 0.842 0.072

Na -0.271 0.288 0.013 0.514 -0.148 -0.200 0.147 0.231 0.329 0.298 0.964 0.050 0.599 0.475 0.601 0.407

lin octac per rox menth saon caal meol octac 0.067 0.811 per -0.645 -0.319 0.009 0.246 rox -0.409 -0.202 0.515 0.130 0.470 0.049

276

menth 0.070 0.888 -0.496 -0.314 0.805 0.000 0.060 0.254 saon -0.144 -0.071 0.134 0.176 -0.111 0.608 0.800 0.633 0.531 0.694 caal 0.067 -0.092 -0.413 -0.261 0.050 -0.092 0.813 0.743 0.126 0.347 0.859 0.743 meol 0.029 -0.103 -0.461 -0.292 0.353 -0.103 0.492 0.918 0.714 0.084 0.291 0.197 0.714 0.062 caor -0.284 -0.375 0.055 -0.098 -0.263 0.131 0.709 0.332 0.306 0.168 0.847 0.729 0.344 0.641 0.003 0.227 iciz -0.617 -0.305 0.920 0.615 -0.474 -0.111 -0.395 -0.441 0.014 0.269 0.000 0.015 0.074 0.694 0.146 0.100 bor -0.212 -0.105 0.292 0.179 -0.163 0.712 -0.135 -0.151 0.449 0.710 0.290 0.523 0.562 0.003 0.630 0.590 roex -0.583 -0.288 0.901 0.374 -0.448 -0.135 -0.373 -0.416 0.023 0.298 0.000 0.169 0.094 0.633 0.171 0.123 teol -0.144 -0.071 0.134 0.176 -0.111 1.000 -0.092 -0.103 0.608 0.800 0.633 0.531 0.694 * 0.743 0.714 icie -0.653 -0.323 0.969 0.621 -0.502 0.125 -0.418 -0.467 0.008 0.240 0.000 0.013 0.056 0.656 0.121 0.079 ateol -0.144 -0.071 0.134 0.176 -0.111 1.000 -0.092 -0.103 0.608 0.800 0.633 0.531 0.694 * 0.743 0.714 sahac -0.566 -0.280 0.832 0.354 -0.435 0.187 -0.362 -0.404 0.028 0.312 0.000 0.195 0.105 0.505 0.185 0.135 ciol -0.589 -0.291 0.833 0.711 -0.453 0.167 -0.377 -0.421 0.021 0.292 0.000 0.003 0.090 0.551 0.166 0.118 neol -0.565 -0.280 0.742 0.679 -0.435 0.467 -0.362 -0.404 0.028 0.313 0.002 0.005 0.105 0.080 0.186 0.135 time 0.280 -0.071 -0.319 -0.202 -0.111 -0.071 -0.092 -0.103 0.312 0.800 0.246 0.470 0.694 0.800 0.743 0.714 ner -0.643 -0.312 0.949 0.652 -0.489 0.024 -0.412 -0.461 0.010 0.258 0.000 0.008 0.064 0.933 0.127 0.084 care 0.067 1.000 -0.319 -0.202 0.888 -0.071 -0.092 -0.103 0.811 * 0.246 0.470 0.000 0.800 0.743 0.714 ger -0.643 -0.305 0.946 0.656 -0.483 0.030 -0.413 -0.461 0.010 0.269 0.000 0.008 0.068 0.917 0.126 0.084 thuac -0.365 -0.181 0.556 0.647 -0.281 -0.042 -0.234 -0.261 0.180 0.519 0.031 0.009 0.310 0.881 0.402 0.347 verac -0.144 -0.071 0.213 0.376 -0.111 -0.071 -0.092 -0.103 0.608 0.800 0.447 0.168 0.694 0.800 0.743 0.714 nerac -0.423 -0.209 0.661 0.065 -0.325 0.135 -0.270 -0.302 0.117 0.455 0.007 0.817 0.237 0.633 0.330 0.274 acop -0.221 0.222 0.431 0.009 0.125 0.053 -0.299 -0.212

277

0.429 0.426 0.109 0.974 0.657 0.850 0.278 0.447 gerac -0.191 -0.094 0.265 0.324 -0.147 0.131 -0.122 -0.136 0.496 0.738 0.340 0.238 0.602 0.641 0.665 0.628 bour -0.050 0.213 0.362 0.355 0.032 0.213 -0.457 -0.411 0.860 0.447 0.185 0.194 0.910 0.447 0.087 0.128 bcub 0.268 -0.127 -0.567 -0.360 -0.107 -0.127 0.476 0.109 0.334 0.652 0.027 0.188 0.705 0.652 0.073 0.699 caryo 0.705 -0.151 -0.596 -0.364 -0.202 -0.151 0.241 -0.112 0.003 0.592 0.019 0.183 0.471 0.592 0.387 0.690 byla -0.232 0.611 0.087 0.124 0.563 0.034 -0.275 -0.064 0.405 0.016 0.758 0.659 0.029 0.903 0.321 0.820 bcop 0.312 0.468 -0.273 -0.075 0.342 -0.096 -0.125 -0.233 0.258 0.079 0.324 0.791 0.213 0.732 0.658 0.404 ahum 0.007 -0.071 -0.319 -0.202 -0.111 -0.071 0.254 -0.103 0.981 0.800 0.246 0.470 0.694 0.800 0.361 0.714 far 0.065 -0.098 -0.436 -0.276 0.035 -0.098 0.993 0.460 0.818 0.729 0.104 0.319 0.903 0.729 0.000 0.084 arom 0.200 -0.142 -0.540 -0.325 -0.010 -0.142 0.004 0.203 0.475 0.613 0.038 0.238 0.972 0.613 0.988 0.467 ecaryo 0.207 -0.159 -0.646 -0.397 0.067 -0.159 0.734 0.582 0.459 0.570 0.009 0.143 0.811 0.570 0.002 0.023 gmuur -0.074 -0.104 -0.034 0.173 -0.032 -0.104 0.538 0.267 0.794 0.712 0.903 0.537 0.909 0.712 0.038 0.335 germ 0.347 0.470 -0.863 -0.535 0.745 -0.161 0.329 0.654 0.204 0.077 0.000 0.040 0.001 0.566 0.231 0.008 bgerm 0.206 -0.155 -0.692 -0.439 0.179 -0.155 0.440 0.718 0.462 0.582 0.004 0.102 0.523 0.582 0.101 0.003 bbis -0.433 -0.214 0.605 0.706 -0.333 0.335 -0.277 -0.310 0.107 0.443 0.017 0.003 0.225 0.223 0.317 0.262 gcad 0.067 -0.071 -0.319 -0.202 0.089 -0.071 0.947 0.542 0.814 0.800 0.246 0.470 0.753 0.800 0.000 0.037 calam * * * * * * * * * * * * * * * * dcad 0.067 -0.071 -0.319 -0.202 0.089 -0.071 0.947 0.542 0.814 0.800 0.246 0.470 0.753 0.800 0.000 0.037 caryoo 0.892 -0.071 -0.319 -0.202 -0.111 -0.071 -0.092 -0.103 0.000 0.800 0.246 0.470 0.694 0.800 0.743 0.714

Cr -0.136 0.087 -0.082 -0.037 -0.095 0.000 0.106 -0.341 0.628 0.757 0.772 0.897 0.736 0.999 0.706 0.213

Ni -0.167 0.063 -0.183 0.124 0.010 -0.000 0.127 -0.079 0.552 0.824 0.514 0.659 0.973 1.000 0.652 0.780

Mo 0.287 -0.095 -0.353 -0.281 -0.063 -0.263 0.406 0.156 0.299 0.736 0.198 0.310 0.823 0.344 0.133 0.579

278

Cu 0.049 -0.404 -0.362 -0.038 -0.224 -0.143 0.364 0.345 0.863 0.135 0.185 0.893 0.422 0.612 0.182 0.208

Zn -0.545 -0.406 0.769 0.352 -0.478 0.270 -0.252 -0.240 0.036 0.134 0.001 0.198 0.072 0.331 0.365 0.390

Mn -0.333 -0.211 0.501 0.348 -0.293 0.575 -0.256 -0.233 0.225 0.450 0.057 0.204 0.289 0.025 0.356 0.402

Fe -0.151 0.201 -0.165 -0.079 0.166 0.678 -0.064 -0.064 0.592 0.472 0.558 0.779 0.554 0.005 0.821 0.820

Mg -0.058 -0.074 0.115 0.438 -0.110 0.072 -0.071 -0.065 0.838 0.794 0.682 0.102 0.696 0.800 0.802 0.817

Ca 0.296 -0.249 -0.251 -0.078 -0.253 -0.064 0.152 -0.001 0.284 0.371 0.367 0.782 0.362 0.821 0.588 0.996

K -0.177 0.084 0.449 0.091 -0.007 -0.108 -0.200 -0.193 0.529 0.766 0.093 0.746 0.982 0.702 0.475 0.490

Na -0.187 -0.087 0.257 0.424 -0.169 -0.108 -0.114 -0.195 0.505 0.757 0.354 0.115 0.547 0.702 0.686 0.486

caor iciz bor roex teol icie ateol sahac iciz -0.090 0.749 bor 0.224 0.012 0.422 0.967 roex -0.045 0.925 0.019 0.873 0.000 0.946 teol 0.131 -0.111 0.712 -0.135 0.641 0.694 0.003 0.633 icie -0.019 0.955 0.298 0.903 0.125 0.947 0.000 0.280 0.000 0.656 ateol 0.131 -0.111 0.712 -0.135 1.000 0.125 0.641 0.694 0.003 0.633 * 0.656 sahac -0.003 0.802 0.214 0.856 0.187 0.854 0.187 0.993 0.000 0.444 0.000 0.505 0.000 0.505 ciol -0.085 0.867 0.188 0.697 0.167 0.865 0.167 0.574 0.762 0.000 0.502 0.004 0.551 0.000 0.551 0.025 neol -0.122 0.759 0.314 0.607 0.467 0.822 0.467 0.767 0.664 0.001 0.254 0.016 0.080 0.000 0.080 0.001 time 0.021 -0.305 -0.105 -0.288 -0.071 -0.323 -0.071 -0.280 0.941 0.269 0.710 0.298 0.800 0.240 0.800 0.312 ner -0.061 0.982 0.196 0.903 0.024 0.991 0.024 0.817 0.829 0.000 0.484 0.000 0.933 0.000 0.933 0.000 care -0.375 -0.305 -0.105 -0.288 -0.071 -0.323 -0.071 -0.280 0.168 0.269 0.710 0.298 0.800 0.240 0.800 0.312 ger -0.067 0.980 0.200 0.899 0.030 0.990 0.030 0.810 0.814 0.000 0.474 0.000 0.917 0.000 0.917 0.000

279 thuac -0.071 0.589 -0.160 0.367 -0.042 0.497 -0.042 0.208 0.800 0.021 0.570 0.178 0.881 0.059 0.881 0.457 verac -0.070 0.265 -0.105 0.070 -0.071 0.184 -0.071 -0.280 0.804 0.340 0.710 0.803 0.800 0.510 0.800 0.312 nerac -0.075 0.572 0.053 0.560 0.135 0.575 0.135 0.666 0.790 0.026 0.852 0.030 0.633 0.025 0.633 0.007 acop -0.262 0.324 0.093 0.262 0.053 0.322 0.053 0.239 0.346 0.239 0.741 0.346 0.850 0.241 0.850 0.391 gerac -0.037 0.219 0.034 0.398 0.131 0.256 0.131 0.294 0.895 0.432 0.905 0.142 0.641 0.357 0.641 0.288 bour -0.427 0.311 0.040 0.176 0.213 0.294 0.213 0.036 0.112 0.259 0.887 0.530 0.447 0.288 0.447 0.898 bcub 0.404 -0.543 -0.186 -0.513 -0.127 -0.575 -0.127 -0.498 0.136 0.037 0.506 0.051 0.652 0.025 0.652 0.059 caryo -0.023 -0.570 -0.221 -0.507 -0.151 -0.606 -0.151 -0.516 0.935 0.027 0.429 0.054 0.592 0.017 0.592 0.049 byla -0.332 0.070 -0.008 -0.074 0.034 0.037 0.034 -0.227 0.227 0.804 0.978 0.793 0.903 0.896 0.903 0.415 bcop -0.410 -0.256 -0.191 -0.347 -0.096 -0.328 -0.096 -0.583 0.129 0.356 0.495 0.205 0.732 0.233 0.732 0.022 ahum 0.164 -0.305 -0.105 -0.288 -0.071 -0.323 -0.071 -0.280 0.560 0.269 0.710 0.298 0.800 0.240 0.800 0.312 far 0.701 -0.417 -0.143 -0.394 -0.098 -0.442 -0.098 -0.383 0.004 0.122 0.611 0.146 0.729 0.099 0.729 0.159 arom 0.055 -0.516 -0.209 -0.449 -0.142 -0.550 -0.142 -0.466 0.846 0.049 0.455 0.093 0.613 0.034 0.613 0.080 ecaryo 0.565 -0.617 -0.234 -0.557 -0.159 -0.656 -0.159 -0.561 0.028 0.014 0.402 0.031 0.570 0.008 0.570 0.030 gmuur 0.381 0.017 -0.153 -0.130 -0.104 -0.060 -0.104 -0.408 0.161 0.952 0.587 0.645 0.712 0.832 0.712 0.131 germ -0.023 -0.837 -0.270 -0.798 -0.161 -0.883 -0.161 -0.809 0.936 0.000 0.330 0.000 0.566 0.000 0.566 0.000 bgerm 0.348 -0.662 -0.227 -0.625 -0.155 -0.701 -0.155 -0.607 0.204 0.007 0.416 0.013 0.582 0.004 0.582 0.016 bbis 0.096 0.565 0.460 0.347 0.335 0.660 0.335 0.591 0.733 0.028 0.085 0.206 0.223 0.007 0.223 0.020 gcad 0.676 -0.305 -0.105 -0.288 -0.071 -0.323 -0.071 -0.280 0.006 0.269 0.710 0.298 0.800 0.240 0.800 0.312 calam * * * * * * * * * * * * * * * * dcad 0.676 -0.305 -0.105 -0.288 -0.071 -0.323 -0.071 -0.280 0.006 0.269 0.710 0.298 0.800 0.240 0.800 0.312 caryoo -0.375 -0.305 -0.105 -0.288 -0.071 -0.323 -0.071 -0.280 0.168 0.269 0.710 0.298 0.800 0.240 0.800 0.312

280

Cr 0.110 -0.018 -0.367 -0.014 0.000 -0.099 0.000 0.153 0.698 0.950 0.178 0.962 0.999 0.727 0.999 0.586

Ni -0.169 -0.041 -0.238 -0.079 -0.000 -0.114 -0.000 -0.253 0.547 0.883 0.393 0.779 1.000 0.685 1.000 0.364

Mo 0.316 -0.197 -0.390 -0.230 -0.263 -0.318 -0.263 -0.212 0.252 0.481 0.150 0.410 0.344 0.247 0.344 0.447

Cu 0.182 -0.229 -0.329 -0.244 -0.143 -0.325 -0.143 -0.454 0.516 0.411 0.231 0.381 0.612 0.237 0.612 0.089

Zn 0.193 0.659 0.197 0.614 0.270 0.704 0.270 0.811 0.491 0.008 0.481 0.015 0.331 0.003 0.331 0.000

Mn -0.065 0.338 0.436 0.409 0.575 0.494 0.575 0.540 0.818 0.218 0.104 0.130 0.025 0.061 0.025 0.038

Fe -0.195 -0.225 0.228 -0.184 0.678 -0.118 0.678 0.081 0.485 0.420 0.414 0.512 0.005 0.675 0.005 0.774

Mg -0.349 0.278 -0.123 0.105 0.072 0.218 0.072 0.225 0.203 0.315 0.663 0.709 0.800 0.436 0.800 0.421

Ca -0.101 -0.038 -0.481 -0.028 -0.064 -0.166 -0.064 -0.093 0.720 0.892 0.070 0.921 0.821 0.555 0.821 0.743

K -0.077 0.418 -0.164 0.601 -0.108 0.396 -0.108 0.425 0.785 0.121 0.558 0.018 0.702 0.144 0.702 0.114

Na -0.220 0.396 -0.224 0.467 -0.108 0.348 -0.108 0.360 0.431 0.144 0.423 0.079 0.702 0.203 0.702 0.188

ciol neol time ner care ger thuac verac neol 0.825 0.000 time -0.291 -0.280 0.292 0.313 ner 0.889 0.809 -0.319 0.000 0.000 0.247 care -0.291 -0.280 -0.071 -0.312 0.292 0.313 0.800 0.258 ger 0.890 0.810 -0.319 1.000 -0.305 0.000 0.000 0.246 0.000 0.269 thuac 0.733 0.474 -0.181 0.552 -0.181 0.546 0.002 0.074 0.519 0.033 0.519 0.035 verac 0.599 0.146 -0.071 0.249 -0.071 0.257 0.682 0.018 0.605 0.800 0.371 0.800 0.355 0.005 nerac 0.512 0.579 -0.209 0.561 -0.209 0.547 0.487 0.009 0.051 0.024 0.455 0.030 0.455 0.035 0.065 0.973 acop 0.443 0.290 -0.411 0.328 0.222 0.318 0.528 0.328 0.098 0.295 0.128 0.232 0.426 0.249 0.043 0.233 gerac 0.114 0.125 -0.094 0.219 -0.094 0.217 0.118 -0.094 0.687 0.657 0.738 0.434 0.738 0.438 0.676 0.738

281

bour 0.603 0.358 -0.210 0.315 0.213 0.315 0.706 0.699 0.017 0.191 0.453 0.252 0.447 0.253 0.003 0.004 bcub -0.518 -0.497 0.770 -0.567 -0.127 -0.568 -0.321 -0.127 0.048 0.059 0.001 0.028 0.652 0.027 0.243 0.652 caryo -0.563 -0.550 0.218 -0.601 -0.151 -0.602 -0.338 -0.151 0.029 0.034 0.436 0.018 0.592 0.018 0.217 0.592 byla 0.343 0.074 -0.213 0.074 0.611 0.080 0.453 0.631 0.211 0.792 0.447 0.792 0.016 0.777 0.090 0.012 bcop 0.042 -0.281 -0.096 -0.280 0.468 -0.274 0.284 0.644 0.882 0.310 0.732 0.313 0.079 0.323 0.305 0.010 ahum -0.291 -0.280 -0.071 -0.319 -0.071 -0.319 -0.181 -0.071 0.292 0.313 0.800 0.247 0.800 0.246 0.519 0.800 far -0.398 -0.382 -0.098 -0.436 -0.098 -0.436 -0.247 -0.098 0.141 0.160 0.729 0.104 0.729 0.104 0.375 0.729 arom -0.517 -0.508 0.731 -0.546 -0.142 -0.548 -0.307 -0.142 0.048 0.053 0.002 0.035 0.613 0.035 0.266 0.613 ecaryo -0.606 -0.590 0.510 -0.650 -0.159 -0.651 -0.367 -0.159 0.017 0.021 0.052 0.009 0.570 0.009 0.179 0.570 gmuur 0.296 -0.063 -0.104 -0.005 -0.104 0.001 0.435 0.763 0.284 0.823 0.712 0.986 0.712 0.996 0.105 0.001 germ -0.750 -0.762 0.107 -0.867 0.470 -0.862 -0.441 -0.092 0.001 0.001 0.705 0.000 0.077 0.000 0.100 0.744 bgerm -0.632 -0.606 0.530 -0.691 -0.155 -0.692 -0.392 -0.155 0.012 0.017 0.042 0.004 0.582 0.004 0.149 0.582 bbis 0.568 0.730 -0.214 0.643 -0.214 0.639 0.431 -0.037 0.027 0.002 0.443 0.010 0.443 0.010 0.109 0.895 gcad -0.291 -0.280 -0.071 -0.319 -0.071 -0.319 -0.181 -0.071 0.292 0.313 0.800 0.247 0.800 0.246 0.519 0.800 calam * * * * * * * * * * * * * * * * dcad -0.291 -0.280 -0.071 -0.319 -0.071 -0.319 -0.181 -0.071 0.292 0.313 0.800 0.247 0.800 0.246 0.519 0.800 caryoo -0.291 -0.280 -0.071 -0.319 -0.071 -0.319 -0.181 -0.071 0.292 0.313 0.800 0.247 0.800 0.246 0.519 0.800

Cr -0.120 0.084 0.458 -0.089 0.087 -0.097 0.080 -0.258 0.669 0.767 0.086 0.754 0.757 0.730 0.777 0.353

Ni 0.160 0.066 0.302 -0.069 0.063 -0.061 0.159 0.418 0.569 0.815 0.273 0.807 0.824 0.828 0.572 0.121

Mo -0.179 -0.216 0.408 -0.273 -0.095 -0.279 -0.225 0.011 0.523 0.439 0.132 0.325 0.736 0.314 0.421 0.970

Cu -0.055 -0.238 0.074 -0.281 -0.404 -0.278 0.007 0.396 0.846 0.394 0.794 0.311 0.135 0.317 0.979 0.144

Zn 0.564 0.697 -0.267 0.670 -0.406 0.654 0.511 -0.104

282

0.029 0.004 0.337 0.006 0.134 0.008 0.052 0.712

Mn 0.289 0.546 -0.118 0.416 -0.211 0.423 0.153 -0.195 0.296 0.035 0.675 0.123 0.450 0.116 0.587 0.486

Fe -0.029 0.315 0.113 -0.172 0.201 -0.167 -0.217 -0.172 0.917 0.253 0.690 0.540 0.472 0.552 0.438 0.540

Mg 0.381 0.513 -0.002 0.265 -0.074 0.256 0.402 0.121 0.161 0.050 0.995 0.341 0.794 0.356 0.137 0.669

Ca 0.017 0.055 0.318 -0.123 -0.249 -0.117 -0.132 0.144 0.951 0.845 0.248 0.663 0.371 0.677 0.639 0.609

K 0.139 0.105 -0.260 0.373 0.084 0.382 0.077 -0.098 0.620 0.710 0.349 0.171 0.766 0.161 0.786 0.727

Na 0.149 0.264 -0.108 0.359 -0.087 0.370 0.066 -0.149 0.595 0.342 0.701 0.189 0.757 0.174 0.815 0.596

nerac acop gerac bour bcub caryo byla bcop acop 0.734 0.002 gerac -0.044 -0.193 0.877 0.491 bour 0.369 0.716 0.083 0.175 0.003 0.769 bcub -0.372 -0.573 -0.168 -0.490 0.173 0.026 0.550 0.063 caryo -0.418 -0.409 -0.045 -0.259 0.522 0.121 0.130 0.875 0.352 0.046 byla 0.137 0.657 -0.229 0.741 -0.378 -0.448 0.628 0.008 0.412 0.002 0.165 0.094 bcop -0.158 0.397 -0.156 0.678 -0.064 0.290 0.700 0.574 0.143 0.579 0.005 0.819 0.294 0.004 ahum -0.209 -0.263 -0.094 -0.300 0.396 0.673 -0.213 0.221 0.455 0.343 0.738 0.277 0.144 0.006 0.447 0.428 far -0.286 -0.320 -0.129 -0.476 0.507 0.315 -0.291 -0.092 0.302 0.244 0.647 0.073 0.054 0.253 0.293 0.743 arom -0.388 -0.549 0.005 -0.424 0.762 0.476 -0.293 -0.036 0.152 0.034 0.985 0.115 0.001 0.073 0.289 0.900 ecaryo -0.447 -0.576 -0.077 -0.597 0.845 0.345 -0.377 -0.197 0.095 0.025 0.784 0.019 0.000 0.208 0.166 0.482 gmuur -0.128 0.122 -0.138 0.325 0.129 -0.106 0.373 0.391 0.650 0.664 0.625 0.236 0.646 0.706 0.171 0.150 germ -0.581 -0.225 -0.243 -0.262 0.330 0.287 0.213 0.324 0.023 0.419 0.382 0.345 0.229 0.299 0.445 0.239 bgerm -0.453 -0.528 -0.205 -0.576 0.721 0.279 -0.264 -0.178 0.090 0.043 0.464 0.025 0.002 0.315 0.342 0.526 bbis 0.379 0.208 -0.094 0.139 -0.381 -0.452 -0.000 -0.380

283

0.163 0.457 0.738 0.622 0.161 0.091 0.999 0.163 gcad -0.209 -0.221 -0.094 -0.371 0.359 0.024 -0.213 -0.202 0.455 0.429 0.738 0.174 0.189 0.933 0.447 0.470 calam * * * * * * * * * * * * * * * * dcad -0.209 -0.221 -0.094 -0.371 0.359 0.024 -0.213 -0.202 0.455 0.429 0.738 0.174 0.189 0.933 0.447 0.470 caryoo -0.209 -0.010 -0.094 0.139 -0.127 0.586 -0.213 0.292 0.455 0.972 0.738 0.622 0.652 0.022 0.447 0.292

Cr 0.211 -0.173 0.094 -0.143 0.540 0.180 -0.200 -0.130 0.450 0.537 0.740 0.611 0.038 0.521 0.474 0.645

Ni -0.075 -0.107 0.227 0.198 0.376 0.068 0.209 0.344 0.791 0.705 0.416 0.479 0.167 0.810 0.455 0.210

Mo -0.240 -0.293 -0.421 -0.248 0.508 0.169 -0.182 -0.075 0.388 0.289 0.118 0.373 0.053 0.546 0.516 0.790

Cu -0.376 -0.393 0.097 -0.126 0.405 0.442 -0.147 0.226 0.167 0.147 0.732 0.653 0.134 0.099 0.602 0.419

Zn 0.820 0.456 0.105 0.195 -0.404 -0.458 -0.089 -0.451 0.000 0.087 0.708 0.486 0.135 0.086 0.753 0.092

Mn 0.381 0.023 0.582 0.095 -0.288 -0.282 -0.206 -0.374 0.162 0.935 0.023 0.735 0.299 0.308 0.462 0.170

Fe 0.138 0.003 0.164 0.107 0.091 -0.069 0.094 0.026 0.624 0.991 0.560 0.706 0.746 0.807 0.739 0.927

Mg 0.399 0.321 0.053 0.347 -0.171 -0.283 0.126 -0.022 0.141 0.244 0.852 0.205 0.541 0.306 0.655 0.938

Ca -0.201 -0.408 0.046 -0.046 0.329 0.271 -0.264 0.024 0.472 0.131 0.871 0.871 0.232 0.329 0.342 0.931

K 0.084 -0.067 0.594 0.045 -0.397 -0.232 -0.099 -0.185 0.765 0.813 0.020 0.873 0.143 0.405 0.725 0.510

Na -0.089 -0.413 0.696 -0.154 -0.156 -0.046 -0.346 -0.295 0.752 0.126 0.004 0.583 0.579 0.871 0.206 0.285

ahum far arom ecaryo gmuur germ bgerm bbis far 0.368 0.177 arom 0.440 0.059 0.101 0.835 ecaryo 0.223 0.733 0.625 0.424 0.002 0.013 gmuur -0.104 0.504 -0.207 0.313 0.712 0.055 0.458 0.256 germ 0.258 0.349 0.464 0.537 0.090 0.353 0.203 0.082 0.039 0.751 bgerm 0.212 0.449 0.781 0.885 0.123 0.691

284

0.448 0.093 0.001 0.000 0.663 0.004 bbis -0.214 -0.293 -0.427 -0.478 -0.169 -0.615 -0.465 0.443 0.289 0.112 0.071 0.547 0.015 0.081 gcad -0.071 0.901 -0.142 0.682 0.590 0.254 0.383 -0.214 0.800 0.000 0.613 0.005 0.021 0.362 0.159 0.443 calam * * * * * * * * * * * * * * * * dcad -0.071 0.901 -0.142 0.682 0.590 0.254 0.383 -0.214 0.800 0.000 0.613 0.005 0.021 0.362 0.159 0.443 caryoo -0.071 -0.098 -0.142 -0.159 -0.104 0.055 -0.155 -0.214 0.800 0.729 0.613 0.570 0.712 0.846 0.582 0.443

Cr 0.317 0.141 0.377 0.275 -0.206 -0.093 0.124 0.014 0.249 0.615 0.166 0.321 0.461 0.742 0.660 0.961

Ni 0.189 0.145 0.330 0.293 0.382 0.104 0.195 -0.390 0.499 0.605 0.229 0.290 0.160 0.713 0.486 0.151

Mo -0.067 0.382 0.174 0.490 0.295 0.129 0.370 -0.222 0.811 0.160 0.535 0.064 0.286 0.647 0.175 0.425

Cu 0.513 0.414 0.486 0.498 0.453 0.311 0.506 -0.496 0.050 0.125 0.067 0.059 0.090 0.260 0.054 0.060

Zn -0.187 -0.265 -0.377 -0.432 -0.212 -0.688 -0.432 0.697 0.505 0.339 0.166 0.108 0.448 0.005 0.108 0.004

Mn -0.205 -0.272 -0.193 -0.294 -0.285 -0.478 -0.338 0.328 0.464 0.327 0.491 0.287 0.303 0.072 0.218 0.233

Fe 0.080 -0.051 0.140 0.029 -0.199 0.105 0.046 -0.109 0.776 0.856 0.620 0.919 0.476 0.709 0.871 0.698

Mg -0.406 -0.119 -0.269 -0.133 0.138 -0.287 -0.192 0.292 0.133 0.674 0.332 0.637 0.624 0.300 0.492 0.290

Ca -0.026 0.143 0.202 0.287 0.224 -0.026 0.196 -0.412 0.927 0.611 0.470 0.300 0.423 0.926 0.485 0.127

K -0.256 -0.224 -0.313 -0.326 -0.158 -0.296 -0.412 -0.079 0.358 0.423 0.257 0.236 0.574 0.284 0.127 0.778

Na -0.035 -0.114 -0.061 -0.135 -0.189 -0.306 -0.241 0.020 0.901 0.686 0.830 0.630 0.500 0.268 0.386 0.944

gcad calam dcad caryoo Cr Ni Mo Cu calam * * dcad 1.000 * * * caryoo -0.071 * -0.071 0.800 * 0.800

Cr 0.004 * 0.004 -0.342 0.989 * 0.989 0.213

Ni 0.068 * 0.068 -0.333 0.340

285

0.811 * 0.811 0.226 0.214

Mo 0.442 * 0.442 0.086 0.279 0.069 0.099 * 0.099 0.761 0.313 0.806

Cu 0.205 * 0.205 -0.047 0.013 0.582 0.242 0.465 * 0.465 0.867 0.963 0.023 0.384

Zn -0.197 * -0.197 -0.286 0.213 -0.343 -0.214 -0.381 0.481 * 0.481 0.302 0.446 0.211 0.444 0.162

Mn -0.196 * -0.196 -0.165 0.054 0.046 -0.678 -0.277 0.484 * 0.484 0.556 0.848 0.871 0.006 0.318

Fe -0.093 * -0.093 -0.235 0.356 0.518 -0.098 0.091 0.743 * 0.743 0.400 0.193 0.048 0.728 0.746

Mg 0.062 * 0.062 0.018 0.154 0.385 0.070 -0.057 0.826 * 0.826 0.949 0.584 0.156 0.803 0.839

Ca 0.166 * 0.166 0.212 0.271 0.490 0.638 0.534 0.555 * 0.555 0.449 0.329 0.064 0.010 0.040

K -0.121 * -0.121 -0.013 -0.041 -0.197 -0.350 -0.266 0.668 * 0.668 0.963 0.885 0.482 0.201 0.338

Na -0.106 * -0.106 -0.085 0.158 0.227 -0.362 0.052 0.707 * 0.707 0.764 0.573 0.416 0.185 0.854

Zn Mn Fe Mg Ca K

Mn 0.441 0.100

Fe -0.005 0.396 0.986 0.144

Mg 0.255 0.142 0.313 0.360 0.613 0.256

Ca -0.278 -0.178 0.284 0.253 0.316 0.526 0.305 0.364

K 0.158 0.486 -0.184 -0.314 -0.019 0.575 0.066 0.511 0.254 0.947

Na 0.015 0.577 0.044 0.081 0.211 0.703 0.957 0.024 0.876 0.774 0.450 0.003

Ћелија: Пирсонов коефицијент корелације израчуната p вредност Бројеви исписани масним словима означавају статистички значајне вредности Пирсоновог коефицијента за p=0,05. *, све вредности у колони/реду су једнаке.

286

Прилог 3. Резултати микроскопске анализе прашка хербе гајеног панонског тимијана

Слика 6. Нежлездане длаке (узорак Г11 )

Слика 7. Фрагмент епидермиса (узорак Г11 )

Слика 8. Пелтатне длаке (узорак Г11 )

287

Слика 9. Фрагмент папилозног епидермиса (узорак Г11 )

Слика 10. Нежлездане длаке на делу цвета (узорак Г04 )

Слика 11. Пелтатне длаке (узорак Г04 )

288

Слика 12. Стоме диацитног типа (узорак Г13 )

Слика 13. Пелтатне длаке (узорак Г13 )

Слика 14. Нежлездана длака са колабираном ћелијом и фрагмент епидермиса са стомама диацитног типа и пелтатном жлезданом длаком (узорак Г13 )

289

Прилог 4. Резултати ТLC анализе хербе гајеног панонског тимијана

Г01 Г02 Г03 Г04 Г05 Г06 Г07 Г08 Г09 Г10 Г11 Г12 Г13 Г14 Г15 S S

Слика 15. TLC хроматограм добијен анализом узорака хербе гајеног Th. pannonicus Узорак: Г01–Г06, херба 'глатког листа' сабрана у првој сезони вегетације; Г07–Г12, херба 'длакавог листа' сабрана у првој сезони вегетације; Г13, херба 'глатког листа' сабрана у трећој сезони вегетације; Г14, херба 'длакавог листа' сабрана у трећој сезони вегетације; Г15, херба биљке гајене у заштићеном простору сабрана у трећој сезони вегетације; S, стандард цитрала ( Citral ROTICHROM ® GC , Carl Roth , Немачка). Услови TLC анализе дати су у поглављу Резултати и дискусија Б.4 .

290