Arsenijevic J.Pdf
Total Page:16
File Type:pdf, Size:1020Kb
УНИВЕРЗИТЕТ У БЕОГРАДУ ФАРМАЦЕУТСКИ ФАКУЛТЕТ Јелена С. Арсенијевић Хемијска и фармаколошка карактеризација хербе самониклог и плантажно гајеног панонског тимијана, Thymus pannonicus All. (Lamiaceae) Докторска дисертација Београд, 2014. UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF PHARMACY Jelena S. Arsenijević Chemical and pharmacological characterization of aerial parts of wild growing and cultivated Hungarian thyme, Thymus pannonicus All. (Lamiaceae) Doctoral dissertation Belgrade, 2014. Хемијска и фармаколошка карактеризација хербе самониклог и плантажно гајеног панонског тимијана, Thymus pannonicus All. (Lamiaceae) У овом раду испитан је хемијски састав и биолошка активност хербе самониклог и гајеног панонског тимијана, Thymus pannonicus All. (Lamiaceae), врсте која је до сада само делимично хемијски и фармаколошки испитана. Материјал је сакупљен на локалитетима на којима панонски тимијан самоникло расте у јужном Банату и на планинама у источној Србији. Варијације у саставу хербе самониклих биљака пореклом из јужног Баната испитане су у зависности од фенофазе у којој је извршено сакупљање. Уз примену различитих азотних и фосфорних ђубрива гајене су јединке пореклом са Вршачких планина. Садржај Cu, Fe, Mn, Zn и Cr одређен је применом атомске спектроскопије у ризосфери и херби самониклог панонског тимијана. Ради процене биорасположивости елемената у ризосфери, одређена је стварна и потенцијална киселост ризосфере. Садржај испитиваних елемената у херби зависио је од њихове биорасположивости у земљишту, а низак садржај Zn у херби и поред релативно високих концентрација у ризосфери указивао је на специфичну регулацију садржаја овог метала код Th. pannonicus . Методама атомске емисионе и апсорпционе спектроскопије одређен је садржај Cr, Co, Ni, Mo, Cu, Zn, Mn, Fe, Mg, Ca, K и Na у листу самониклог панонског тимијана. Kонцентрације испитиваних елемената биле су у физиолошким границама. Статичком хедспејс (ХС) екстракцијом издвојена је ХС фракција узорака листа самониклих биљака чији је састав анализиран GC и GC-MS методама. ХС фракције листа панонског тимијана богате монотерпенским угљоводоницима као главне компоненте садржавале су лимонен, мирцен, α- пинен и (E)-β-оцимен. У ХС фракцијама богатим кисеоничним монотерпенима најзаступљенији су били гераниал, нерал, 1,8-цинеол, као и 6-метил-5-хептен-2- он. Применом хемометријских метода, корелационом анализом и анализом главних компоненти, утврђена је корелација садржаја минерала, пре свих Zn, Mg и Mn, и испарљивих једињења листа, што се може довести у везу са биосинтезом испарљивих једињења. Садржај етарског уља (ЕУ) одређен је дестилацијом воденом паром у апаратури по Клевенџеру у херби самониклих и гајених биљака и износио је 0,03–1,43% ( V/m ). Састав ЕУ одређен је GC и GC-MS методама. Уља су била богата кисеоничним монотерпенима и кисеоничинм сесквитерпенима, а главне компоненте били су цитрал (гераниал и нерал), линалол, тимол, гермакрен D и (Е)-неролидол. Хроматографским техникама (хроматографијом на колони, хроматографијом на танком слоју, семипрепаративном HPLC ) из метанолног екстракта хербе самониклог панонског тимијана изоловано је четири једињења: апигенин 7-О-глукуронид ( 1), розмаринска киселина (РК) ( 2), 3-O-(2-кафенил)- розмаринска киселина ( 3) и 3-O-(метил-2-кафенил)-розмаринска киселина ( 4), док је из воденог екстракта изолован и идентификован лутеолин 7-О- диглукуронид ( 5). Структуре изолованих једињења утврђене су на основу анализе њихових UV , MS и/или 1H NMR спектара. Једињења 4 и 5 су по први пут изолована из биљака рода Thymus у овом раду. Поларни екстракти хербе израђени су екстракцијом 80%–ним метанолом, кључалом водом током 20 min и кључалом водом током 2 h. Добијени су суви водено-метанолни екстракти хербе самониклих и гајених биљака (ВМЕ), инфузи хербе самониклих биљака (5% m/V ) и суви деодорисани водени екстракт хербе самониклог панонског тимијана (ДВЕ), редом. Садржај укупних полифенола (СУП) у поларним екстрактима одређен је спектрофотометријски на бази Folin-Ciocalteu (FC ) реакције, а резултати су изражени у еквивалентима галне киселине (ГК). ВМЕ су садржавали 100,03– 215,37 mg ГК/g, инфузи 1122,25–1979,93 mg ГК/L, док је ДВЕ садржавао 205,00 mg ГК/g. HPLC анализом је у поларним екстрактима хербе утврђено присуство РК и њених деривата, као и флавоноида, пре свега глукуронида апигенина и лутеолина. HPLC методом у екстрактима је одређен садржај РК, хетерозида апигенина и хетерозида лутеолина. Главна компонента свих екстраката била је РК. Концентрацијe РК у ВМЕ износиле су 26,55–146,80 mg/g. Инфузи су садржавали 367,42–1199,47 mg/L РК, а ДВЕ 71,11 mg/g. Садржај хетерозида апигенина, изражен као апигенин, у ВМЕ хербе самониклих биљака, ВМЕ хербе гајених биљака, инфузима и ДВЕ био је: од количина у траговима до 8,53 mg/g, 4,86–15,33 mg/g, 23,41–93,29 mg/L и 1,28 mg/g, редом. ВМЕ самониклих биљака садржавали су 3,12–17,25 mg/g, а гајених 3,70–10,51 mg/g хетерозида лутеолина, изражених као лутеолин. Концентрације хетерозида лутеолина у инфузима износиле су 109,62–259,61 mg/L, док је ДВЕ садржавао 4,09 mg/g. ХС екстракцијом и GC и GC -MS методом анализиране су испарљиве фракције инфуза у којима су се као главне компоненте, у зависности од узорка, налазили цитрал, линалол, 3-октанон и 1,8-цинеол. Антиоксидантна активност поларних екстраката испитана је in vitro применом два теста: укупна антиоксидантна активност (УАА) испитана је FRAP тестом, а антирадикалска активност DPPH тестом. ВМЕ и ДВЕ испољили су јаку УАА (FRAP 2,53–5,33 mmol Fe/g) и анти-DPPH активност (IC 50 12,71–24,62 μg/mL). Антиоксидантни ефекат ВМЕ гајених биљака био је нешто нижи од ефекта ВМЕ самониклих биљака. УАА инфуза износила је 68,09–124,58 mmol Fe/L, а неутрализација слободног DPPH радикала постигнута је са IC 50 1,32–2,96 μL/mL. Бујон микродилуционом методом испитана је антимикробна активност инфуза. Коришћени су стандардни сојеви четири Грам(+) и три Грам(–) бактерије и један сој гљивице Candida albicans . У испитиваном опсегу концентрација (31,25–500,00 μL/mL) сви инфузи су остварили антимикробни ефекат, а најбоља активност испољена је према гљивици C. albicans (МИК 31,25– 62,50 μL/mL). In vivo антиоксидантна активност ДВЕ испитана је на моделу оксидативног стреса код пацова индукованог угљентетрахлоридом. Примена ДВЕ у вишим испитиваним дозама (1,0–5,0 mL/kg TM) довела је до значајног смањења интензитета липидне пероксидације и одржавања физиолошких концентрација глутатиона. Могући механизам испољенe цитотоксичнe активности ДВЕ in vivo , испитане на моделу Ерлиховог асцитног тумора код миша, је прооксидантни ефекат екстракта у малигним ћелијама. Фенофаза у којој је извршено сакупљање хербе значајно је утицала на садржај и састав ЕУ. Садржај ЕУ био је већи пре и током, него након цветања биљака. Херба пореклом са Вршачких планина, чије је ЕУ садржавало цитрал као главни састојак, имала је већи садржај и мање варијабилан састав ЕУ од осталих узорака. Утицај фенофазе на састав и антиоксидантну активност ВМЕ био је мање изражен. Гајењем уз примену азотних и фосфорних ђубрива добијена је херба релативно уједначеног хемијског састава, а утицај различитог режима ђубрења није био изражен, што је резултовало и уједначеном антиоксидантном активношћу ВМЕ. Херба гајених биљака и херба самониклих биљака пореклом са Вршачких планина нису се значајније разликовале. Основна разлика је била у садржају хетерозида апигенина, који је у ВМЕ гајених биљака био значајно већи него у ВМЕ хербе самониклих биљака. Као основни параметар специфичног квалитета хербе панонског тимијана, Thymi pannonici herba , могу се поставити садржај ЕУ (најмање 5,0 mL/кg) и садржај цитрала у ЕУ (најмање 70%). Кључне речи : минерали, хедспејс, етарско уље, полифеноли, деодорисани водени екстракт, инфуз, сезонска варијабилност, антиоксидантна активност, антимикробна активност, цитотоксична активност Научна област : Фармација Ужа научна област : Фармакогнозија УДК број : Chemical and pharmacological characterization of aerial parts of wild growing and cultivated Hungarian thyme, Thymus pannonicus All. (Lamiaceae) The chemical composition and the biological activity of aerial parts of wild growing as well as cultivated plants of Hungarian thyme, Thymus pannonicus All. (Lamiaceae), were investigated in this study. The investigated material was collected on several localities in southern Banat and on the mountains in eastern Serbia, and furthermore, seasonal variations in the composition of the herb from southern Banat were studied. Cultivation of plants of Mt. Vršačke planine origin was performed by fertilization with different nitrogen and phosphorus fertilizers. The Cu, Fe, Mn, Zn and Cr content in the rhizosphere and aerial parts of Hungarian thyme was determined by atomic spectroscopy (AS). Additionally, real and potential acidity of rhizosphere was measured in order to assesse the bioavailability of elements. The obtained concentrations of investigated elements in herb samples were influenced by their availablity in rhizosphere. While relatively high content of Zn was found in rhizosphere samples, aerial parts of Hungarian thyme contained low levels of this element, indicating that specific regulation mechansims of zinc's content are present in Hungarian thyme. The Cr, Co, Ni, Mo, Cu, Zn, Mn, Fe, Mg, Ca, K and Na content in the leaves of wild growing plants was determined by suitable AS methods. Measured concentrations were found to be within physiological ranges for upper plant parts. Static headspace (HS) extraction followed by GC and GC-MS analysis was used for the characterization of the leaf volatile fraction. HS fractions