La Vida En Río Tinto - Ángeles Aguilera / Virginia Souza-Egipsy / Elena González-Toril COLECCIÓN CIENCINTA

La vida en Río Tinto - Ángeles Aguilera / Virginia Souza-Egipsy / Elena González-Toril COLECCIÓN CIENCINTA

Nº1 -2020 Ángeles Aguilera / Virginia Souza-Egipsy / Elena González-Toril La vida enRí0 Tinto COLECCIÓN CIENCINTA Nº1-2020

Editorial La colección CIENCINTA pretende difundir y divul- gar los interesantes resultados de investigación del INTA, de la mano de prestigiosos investigadores, que han logrado ser referentes en sus respectivos campos de investigación. El carácter multidisciplinar del INTA ofrece la posibilidad de una colección divulgativa, rica, variada y atractiva, que hará las delicias de todo aquel lector que se acerque a esta apasionante aventura del saber: podrá viajar al espacio exterior, pasando por desiertos inhóspitos, descubriendo virus emergen- tes, y vida en condiciones extremas. ¡Bienvenido a Ciencinta!

Miguel Ángel Alonso Editor CAB La vida en Río Tinto Ángeles Aguilera1*, Virginia Souza-Egipsy2 y Elena González-Toril1

Centro de Astrobiología-CSIC-INTA, Carretera Ajalvir Km4, 28850 Torrejón de Ardoz, España.

1 Instituto Estructura de la Materia CSIC, Serrano 113 bis, 28006, Madrid. *Corresponding Author: A. Aguilera ([email protected]), Teléfono: +34 91 5206434. CATÁLOGO GENERAL DE PUBLICACIONES OFICIALES https://cpage.mpr.gob.es

Edita:

NIPO: 078-20-003-2 (edición en papel) NIPO: 078-20-004-8 (edición en línea) ISBN: 978-84-9091-517-2 (edición en papel) Depósito Legal: M-21173-2020

Fecha de edición: noviembre 2020

Maquetación e impresión: Vicente Aparisi - Din Impresores ©Portada: Luis Cuesta / Laguna Ácida de Peña del Hierro

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Los ecosistemas extremos y los microorganismos que los habitan, denominados extremófilos, han atraído desde siempre un interés científico considerable, no sólo porque demuestran que la vida es posible y adaptable a condiciones ambientales muy diversas y adversas sino también porque el estudio de este tipo de ambientes es imprescindible en el campo de la Astrobiología. Estos hábitats nos permiten entender mejor cuáles son los límites de la vida tal y como la conocemos, sirviendo como banco de pruebas a la hora de buscar vida en otras partes del universo. En este sentido, el estudio de los ambientes extremos ácidos (pH<3) es cada vez más importante ya que los ambientes ácidos son considerados como análogos terrestres de Marte, planeta al que se encaminan gran parte de las misiones espaciales actuales. Los extremófilos viven en hábitats que son muy hostiles o incluso letales para otras formas de vida y su estudio ha proporcionado descubrimientos innovadores que desafían algunos de los paradigmas de la biología moderna. De entre los ecosistemas extremos, los ambientes ácidos son relativamente escasos en todo el mundo y están generalmente asociados con la actividad volcánica y con depósitos minerales de gran interés económico. Además de la alta acidez, estos ambientes presentan condiciones químicas y físicas muy variables, dependiendo de su origen y de la naturaleza geoquímica del lugar. El pH ácido facilita la disolución de metales pesados en el agua, lo que provoca un impacto ambiental enorme. Río Tinto, situado en el suroeste de España, es uno de los ecosistemas ácidos extremos más inusuales descritos hasta el momento debido principalmente, además de a su acidez, a su extenso tamaño (92 Km), a sus altas concentraciones de metales pesados disueltos y, sobre todo, su alto nivel de diversidad microbiana, principalmente eucariótica. Numerosos estudios sobre Río Tinto han demostrado la importancia del ciclo del hierro, no sólo en la generación de las condiciones extremas del hábitat sino también en el mantenimiento de su diversidad microbiana. A lo largo del libro, revisaremos los trabajos realizados en cuanto a la geomicrobiología, biodiversidad y ecofisiología de los microorganismos que habitan en uno de los mayores y más importantes ambientes ácidos extremos descritos hasta ahora.

Ángeles Aguilera Elena González-Toril Virginia Souza-Egipsy Contenidos

1.- Introducción……………………………………………………………………………………………………… 7 1.1 Ambientes extremos y extremófilo ………………………………………………………………………………7 1.2 Microorganismos procariotas en ambientes extremos………………………………………………8 1.3 Microorganismos eucariotas en ambientes extremos… ………………………………………… 10 1.4 Mecanismos de resistencia en extremófilo …………………………………………………………… 13 1.5 Interés biotecnológico de los extremófilo … …………………………………………………………… 16

2. Naturaleza y origen de los ecosistemas ácidos extremos… ……………………19

3. Río Tinto y su entorno………………………………………………………………………………………27 3.1 Contexto geológico: Faja Pirítica Ibérica… ………………………………………………………………… 27 3.2 Cuenca hidrológica y clima… ……………………………………………………………………………………… 28 3.3 Comparación con otros ambientes ácidos extremos… …………………………………………… 32

4.- Biodiversidad microbiana de Río Tinto………………………………………………………35 4.1 Biodiversidad procariota……………………………………………………………………………………………… 36 4.2 Biodiversidad eucariota……………………………………………………………………………………………… 43 4.2.1 Microalgas acidófila … ………………………………………………………………………………………46 4.2.2 Euglenófitos y protozoos acidófil … ………………………………………………………………48 4.2.3 Hongos y levaduras acidófila ……………………………………………………………………………48 4.2.4 Plantas ………………………………………………………………………………………………………………49 4.3 Dinámica poblacional de las comunidades eucariotas …………………………………………… 51

5.- Modelo geomicrobiológico de Río Tinto… …………………………………………………53 5.1 Modelo geomicrobiológico del cauce principal ………………………………………………………… 53 5.2 Modelo geomicrobiológico de las salidas de mina … ……………………………………………… 56 5.3 Modelo geomicrobiológico de los lagos de cortas de mina …………………………………… 57 5.4 Papel de los eucariotas en el modelo geomicrobiológico de aguas ácidas…………… 61 Contenidos

6.- Formación y estructura de los biofilm …………………………………………………… 63

7.- Mecanismos de adaptación a ambientes ácidos extremos…………………… 71 7.1 Mecanismos de adaptación de procariotas acidófilo ……………………………………………… 71 7.2 Mecanismos de adaptación de eucariotas acidófilo … …………………………………………… 75 7.2.1 Adaptaciones a pH ácidos… ……………………………………………………………………………… 75 7.2.2 Adaptaciones a limitaciones nutricionales … ………………………………………………… 76 7.2.3 Adaptaciones fotosintéticas … ………………………………………………………………………… 77 7.2.4 Adaptaciones a metales pesados……………………………………………………………………… 81 7.3 La transferencia horizontal de genes como mecanismo de resistencia adaptativa ……………………………………………………………………………………………84

8.- Río Tinto y su importancia en Astrobiología… ……………………………………… 87 8.1 Interés astrobiológico de los extremófilos y los ambientes extremo ……………………89 8.2 Río Tinto como análogo terrestre de Marte………………………………………………………………90

9.- Bibliografía… ………………………………………………………………………………………………… 93

1. Introducción

1.1 Ambientes extremos consideramos normal y los organis- y extremófilos mos que viven en los límites de esta normalidad ambiental o más allá son La exploración del planeta nos ha lle- considerados extremófilos. Es intere- vado a continuos descubrimientos de sante señalar que los extremófilos no vida en ambientes que, inicialmente solo soportan tales condiciones ad- fueron considerados como inhabita- versas para llevar a cabo su actividad bles. De hecho, la vida puede surgir y metabólica, si no que necesitan de prosperar bajo condiciones ambienta- dichas condiciones extremas para de- 7 les muy duras. Esto ha dado lugar al sarrollarse. Los microorganismos capa- origen de una nueva disciplina dentro ces de tolerar estas condiciones, pero de la biología, la Extremofília, que es- que también pueden desarrollarse en tudia la diversidad, ecología y fisiol - hábitats moderados, no son verdade- gía de los ambientes extremos y los ros extremófilos, siendo considerados organismos que los habitan. Estos eco- extremo-tolerantes. sistemas se definen como lugares que El número de extremófilos iden- tienen uno o varios factores ambien- tificados ha crecido rápidamente en tales incompatibles con la mayoría de los últimos años (Tabla 1). Algunos las formas de vida, especialmente con ejemplos de esto los podemos encon- la vida humana, lo que la convierte trar en las comunidades microbianas en una defi ición absolutamente an- que viven a temperaturas elevadas, tropocéntrica. A pesar de la aparente como es el caso de las arqueas hiper- hostilidad de dichos hábitats, los eco- termófilas que pueden encontrarse a sistemas extremos pueden contener temperaturas superiores a los 100ºC un nivel de biodiversidad mayor de [1]. Otros organismos viven en zonas lo esperado. El medio ambiente que polares frías, como los psicrófilos de conocemos tiene oxígeno, nunca es la Antártida que son capaces de vivir demasiado frío ni demasiado caliente en aguas salobres con una salinidad (la mayoría de los organismos viven varias veces mayor que la del agua en un rango relativamente limitado de mar, a temperaturas inferiores a de temperaturas de 5°C a 40°C) una -10ºC y bajo una capa de hielo de 20 radiación moderada por la atmósfera. m de espesor [2]. De manera similar, Este mundo familiar define lo que hay organismos que viven en ambien- consisten en formas estructurales de TABLA 1. Algunos ejemplos de extremófilos resistencia, pero otras veces se trata y sus características ambientales. de mecanismos moleculares de adap- Factor Extremo Nombre Mínimo Óptimo Máximo tación metabólica que les permiten Temperatura Termófilos > 50 ºC > 60 ºC adecuarse a condiciones que para la Hipertermófilos > 60 ºC > 65 ºC > 70 ºC mayoría de organismos son adversas Psicrófilos 0 ºC < 25-30 ºC [3]. El interés por descubrir los entor- pH Alcalófilos < 8.5 > 10 nos extremos y los organismos que los Acidófilos > 0 < 3.0 habitan ha aumentado en los últimos años y tiene cobertura en distintas Salinidad Halófilos > 2 % 5- 20 % 30 % disciplinas de la ciencia; por un lado,

Presión Barófilos > 0.1 MPa 10 - 50 MPa < 100 MPa alguno de estos ambientes extremos, refleja las condiciones de la Tierra primitiva y nos ayudan a estudiar el tes muy alcalinos (hasta un pH de 12), origen de la vida, por otro lado, nos como la larva de la oruga de la rosa. En enseñan los límites de la vida y sus va- el otro extremo de la escala de pH se riables imprescindibles. Además, algu- encuentran los acidófilos, como la ar- nos de estos ambientes tienen un gran 8 quea Picrophilus oshimae que presenta interés en la exploración espacial por un pH óptimo de crecimiento de 0,7 o ser buenos análogos de planetas y am- Cyanidium caldarium, una microalga bientes extraterrestres a los que aún que habita en zonas de pH muy ácido, no podemos llegar. Por último, pero no entre 0 y 4. Algunas comunidades mi- por ello menos importante, destacar el crobianas han sido aisladas de zonas enorme potencial biotecnológico de hipersalinas, lagos o minas que con- estos microorganismos como fuente tienen soluciones salinas saturadas, de nuevas enzimas y otros productos como las presentes en el Mar Muerto. celulares y que se está empezando a Otras son capaces de crecer bajo po- conocer. tentes campos de radiación ionizante en reactores nucleares. También, po- 1.2 Microorganismos demos encontrar algunos microor- procariotas en ganismos que crecen en condiciones extremadamente secas, mientras que ambientes extremos otros crecen en las partes más profun- Cuando pensamos en los extremófi- das de los océanos sometidos a más los, los procariotas vienen a la mente de 1000 bares de presión hidrostática. primero. Los estudios pioneros de Para sobrevivir, estos organismos ad- Thomas Brock sobre los extremófilo quieren mecanismos que les permitan llevados a cabo en los ambientes hi- soportar la congelación, la deshidrata- drotermales de Yellowstone fijaron el ción completa, la falta de nutrientes, foco de la vida en ambientes extremos los altos niveles de exposición a la ra- en los procariotas y sus metabolismos. diación y otros desafíos físicos o quí- Por otro lado, su estructura básica les micos. A menudo estos mecanismos ha facilitado una mejor adaptación Introducción

a todo tipo de características físico- giones frías donde, debido a la mayor químicas ambientales, por ese motivo, salinidad marina, el agua aún no está son las bacterias y las arqueas las que completamente congelada por debajo ostentan todos los récords en extre- de los 0 ºC [1]. mofilia. Algunos de los ejemplos más En algunos casos, los organismos llamativos se recogen en la Tabla 2. son capaces de adaptarse a varios fac- Entre los hipertermófilos, la arquea tores ambientales extremos al mismo Geogemma barossi es el microorga- tiempo. La arquea termófila, Picro- nismo capaz de crecer a temperaturas philus oshimae, con una temperatura más altas identifi ado hasta el mo- óptima de crecimiento de 60 ºC, es el mento, con una temperatura óptima microorganismo descrito hasta el mode crecimiento de 121 ºC y otra máxima mento con un menor pH óptimo de de 130 ºC. También, entre los hiperter- crecimiento (0,7) pudiendo tener un mófilos, es interesante mencionar a metabolismo activo incluso a pH ne- Pyrolobus fumarii que, aunque tiene gativos. En relación con los alcalófilos una temperatura óptima de creci- tenemos el caso de la arquea Natrono- miento inferior, 105 ºC, es el hiper- bacterium gregoryi, que se desarrolla termófilo mejor caracterizado hasta en lagos y suelos carbonatados con el momento. Ambas arqueas se han un pH óptimo de 10. Estos ambientes detectado en chimeneas submarinas suelen ser, además, salinos, por lo que 9 donde estas temperaturas en el agua este microorganismo es también ha- son posibles debido a la mayor presión lófilo, pudiendo crecer con hasta un impuesta por la columna de agua. 20% de cloruro de sodio en el agua. Entre los psicrófilos destaca la bacte- Las arqueas del género Halobacterium ria Polaromonas vacuolata, con una que aparecen frecuentemente en las temperatura óptima de crecimiento salinas, presentan una concentración de 4 ºC pero que puede mantener su óptima de crecimiento de un 20% de actividad metabólica incluso a 0 ºC. cloruro de sodio, pero pueden incluso Se encuentra en el agua de mar en re- crecer en condiciones de saturación

TABLA 2. Ejemplos de extremófilos procariotas

Extremo Género/Especie Dominio Hábitat Mínimo Óptimo Máximo Fuentes hidrotermales Hipertermófilo Pyrolobus fumarii Archaea 90 ºC 106 ºC 113 ºC submarinas Fuentes hidrotermales Hipertermófilo Geogemma barossi Archaea 90 ºC 121ºC 130ºC submarinas Psicrófilo Polaromonas vacuolata Bacteria Hielo marino 0 ºC 4 ºC 12 ºC Fuentes hidrotermales Acidófilo Picrophilus oshimae Archaea -0.06 0.7 4 ácidas Alcalófilo Natronobacterium gregoryi Archaea Lagos carbonatados 8.5 10 12 32% Halófilo (NaCl) Halobacterium Archaea Salinas 15% 25% (Saturación) Barófilo Moritella yayanosii Bacteria Sedimentos oceánicos 500 atm 700 atm >1000 atm (más del 30%). Por último, la bacteria de los microorganismos extremófilo Moritella yayanosii es el microorga- sean multi-extremófilos o al menos, nismo identificado capaz de crecer a multi-resistentes [1]. mayor presión, soportando hasta más Aunque los extremófilos dependan de mil atmósferas aunque su presión de estas características extremas, no óptima de crecimiento es de 500 atm. dejan de ser situaciones que produ- Se encuentra en fondos abisales y se- cen estrés celular y es seguro que los dimentos, lugares que además de alta microorganismos aptos para desa- presión presentan muy bajas tempera- rrollarse en dichas condiciones deben turas, por lo que son también psicró- tener mecanismos que les permitan filos con una temperatura óptima de salvar dicho estrés. Deben existir tan- crecimiento de 4 ºC. Conviene señalar, tos mecanismos de adaptación como una vez más, que estas condiciones situaciones de estrés motivadas por extremas son absolutamente nece- factores físico-químicos extremos, en sarias para el crecimiento de los ex- realidad, más, si consideramos que al- tremófilos y la pérdida de las mismas gunas de estas situaciones se pueden suele conllevar su muerte. Por ejemplo, solventar por distintas estrategias. Geogemma barossi no puede crecer por debajo de 90 ºC, Picrophilus oshi- 1.3 Microorganismos 10 mae no puede desarrollarse con un pH eucariotas en superior a 4 y Halobacterium desapa- rece si la salinidad es inferior a 15%. Los ambientes extremos mecanismos de adaptación de estos Aunque los procariotas extremófilo microorganismos les han conducido son los más conocidos y mejor estu- evolutivamente hacia una especializa- diados, la vida microbiana eucariota ción que hace que condiciones extre- puede encontrarse creciendo activa- mas sean sus condiciones óptimas de mente en casi cualquier condición vida [1, 4, 5]. extrema en la que exista una fuente Como hemos visto en los ejemplos de energía para sostenerla, con la anteriores, no es extraño que los am- única excepción de la alta tempera- bientes extremos lo sean en más de tura (>70ºC) y la biosfera subterránea. una de sus variables físico-químicas El desarrollo de las tecnologías mole- ambientales, por ejemplo, las chi- culares y su aplicación a la ecología meneas hidrotermales submarinas microbiana ha aumentado nuestro co- presentan altas temperaturas y, a me- nocimiento de la diversidad eucariota nudo, son también ácidas, además, al en muchos entornos diferentes. Este estar muy profundas pueden también hecho resulta decisivo en los entornos presentar altas presiones. Los am- extremos ya que, por lo general, son bientes ácidos extremos suelen llevar más difíciles de reproducir en el labo- asociados altas concentraciones de ratorio [1, 4, 5]. Estudios de ecología metales pesados, como veremos en el molecular han demostrado que los or- caso de Río Tinto. Los ecosistemas con ganismos eucariotas son sumamente alta salinidad suelen ser fuertemente adaptables y no en menor medida que alcalinos, conllevando que la mayoría los procariotas revelando, además, una Introducción

novedosa diversidad genética en dife- res, probablemente los entornos más rentes entornos extremos. estudiados después de los hábitats La temperatura es uno de los prin- de hielo marino. La microalga verde cipales factores que determinan la Chlamydomonas nivalis se encuentran distribución y la abundancia de las con frecuencia en los campos de nieve especies debido a sus efectos en las perpetua de gran altitud donde son fo- actividades enzimáticas [1]. La mayo- tosintéticamente activas a pesar de las ría de los extremófilos que sobreviven bajas temperaturas y los altos niveles a altas temperaturas (95-115ºC) son de radiación ultravioleta [1]. Distintas microorganismos de los dominios Ar- comunidades microbianas compues- chaea o Bacteria. Por el contrario, para tas de bacterias psicrófilas, microalgas los microorganismos eucariotas, la y protozoos colonizan y crecen en lagu- temperatura más alta registrada es de nas de deshielo situadas en la superfi- 62ºC y la mayoría de los metazoos son cie del hielo o en canales de salmuera incapaces de crecer por encima de los en las zonas de sumergidas de hielo en 50ºC [8]. Sorprendentemente, los pro- el Ártico, incluso durante el invierno a cariotas fotosintéticos, como las ciano- temperaturas extremadamente bajas bacterias, nunca se han encontrado en hasta de -20ºC [2]. sistemas acuáticos ácidos y calientes. Los eucariotas también se en- En cambio, estos nichos ecológicos cuentran frecuentemente en hábi- 11 suelen ser profusamente colonizados tats anaerobios. Estos ambientes se por especies del orden Cianidiales, pueden encontrar en todo el planeta, compuesto por algas rojas unicelula- desde plantas de gestión de residuos res [1]. Se han aislado especies de los hasta profundas chimeneas hidro- géneros Galdieria y Cyanidium de termales en el fondo del océano. De fuentes hidrotermales que muestran hecho, muchos de los descubrimien- una temperatura de crecimiento óp- tos sobre el origen evolutivo de los tima de 45ºC y una temperatura de eucariotas han sido realizados gra- crecimiento máxima de 57ºC. Estas cias al estudio de estos protistas de fuentes termales extremas suelen ser ambientes anóxicos y extremos. De ácidas (pH 0,05-4) y se caracterizan particular interés son los sedimentos frecuentemente por altas concentra- anóxicos asociados a los ambientes ciones de metales como el cadmio, el hidrotermales y los entornos ricos en níquel, el hierro o el arsénico, que son hierro que podrían ser análogos para altamente tóxicos para casi todos los la vida temprana. Los ciliados son los organismos conocidos. eucariotas más comunes presentes en Los microorganismos eucariotas los hábitats anóxicos. Los ciliados de también han colonizado ambien- vida libre suelen ser aerobios y nece- tes caracterizados por temperaturas sitan la respiración mitocondrial para iguales o inferiores a 0ºC. Algunas es- la producción de energía. Sin embargo, pecies de algas abundan en la super- en los anaerobios, la mitocondria ha ficie de la nieve durante la primavera, sido reemplazada por los hidrogeno- y se han encontrado comunidades somas, orgánulo celular que actúa en microbianas complejas en los glacia- el metabolismo fermentativo para obtener energía en situaciones de anae- relación simbiótica entre microalgas robiosis. Esta función sería análoga a y los filamentos de hongos. Las espe- la respiración mitocondrial que llevan cies de líquenes más recurrentes que a cabo los microorganismos anaero- se encuentran en los desiertos son las bios. En el hidrogenosoma se oxida el grandes colonias de color verde lima ácido pirúvico, que es la molécula clave de Rhizocarpon geographicum, el gris de todo el metabolismo energético en cenizo Aspicilia cinerea y el naranja los seres vivos. El origen de este orgá- Caloplaca saxicola. Pueden tener miles nulo es un tanto ambiguo, aunque la de años de antigüedad, de hecho, el co- mayoría de los estudios lo consideran lorido liquen de roca Acarospora chlo- una mitocondria degenerada, que con rophana puede crecer sólo unos pocos el paso del tiempo ha perdido primero milímetros por siglo. parte o la totalidad de su ADN y des- Además de los desiertos, los Valles pués las propias enzimas encargados Secos de la Antártida son unos de los de llevar a cabo la respiración aeróbica ecosistemas más secos y extremos mitocondrial. Estos ciliados anaerobios de la Tierra. En estas regiones no hay no están filogenéticamente relaciona- hielo y muy poca agua líquida. Las dos entre sí, lo que nos indica que los temperaturas medias anuales rara vez procesos que permiten su adaptación superan los -30 ºC y las precipitaciones 12 se dieron varias veces de manera in- anuales inferiores a 10 mm hacen que dependiente a lo largo de su evolución estas condiciones polares se acerquen y tienen fuertes similitudes morfo- a la los procesos de desertificación. Sin lógicas con sus parientes aerobios, embargo, hay organismos uni- y mul- lo que implica que estos procesos de ticelulares que pueden sobrevivir en adaptación fueron bastante recientes. este ecosistema extremadamente frío Además de en los ciliados, los hidroge- y seco, encontrándose unos gusanos nosomas aparecen en un gran número nemátodos microscópicos en la cima de eucariotas anaerobios, algunos de de la cadena alimentaria. En invierno, ellos pertenecientes a los protistas y cuando el clima es demasiado frío y muchos de ellos a las levaduras. seco, estos nematodos entran en un Los ambientes terrestres extre- estado de letargo, llamado anhidrobio- mos donde la desecación es común y sis, en el que pierden hasta el 99 por el agua es un recurso escaso, también ciento del agua de sus cuerpos. son colonizados por los eucariotas. En De la misma manera, un número estos ecosistemas, el suelo suele estar considerable de eucariotas se puede cubierto por lo que se denominan “cos- encontrar en ambientes hipersalinos tras biológicas” que son comunidades como el Mar Muerto, uno de los lagos microbianas altamente especializadas más grandes y salados del mundo con formadas por asociaciones muy es- un contenido del 34% de sales disuel- trechas entre partículas de suelo, cia- tas [1]. El alga verde unicelular Dun- nobacterias, algas, musgos, hongos y aliella salina es capaz de crecer bajo líquenes. Sin duda, los recubrimientos estas altas concentraciones de sal más coloridos de las rocas son pro- expuesta, además de a una intensa ra- ducidos por los líquenes, una notable diación solar. D. salina también puede Introducción

encontrarse en una amplia gama de para su procesamiento han revolucio- hábitats marinos como océanos, lagos nado la forma en que estudiamos la de salmuera y lagunas que contienen biodiversidad y la biología de los orga- más de 2 Molar de sal y altos niveles nismos. La ecología molecular es una de magnesio. Dunaliella produce y acu- disciplina apasionante y en expansión, mula grandes cantidades de glicerol que permite abarcar una amplia gama intracelular como osmolito para evitar de cuestiones sobre la biodiversidad, la la alta presión osmótica producida por ecología, la fisiología, la evolución, o la las concentraciones iónicas del medio, conservación. Aunque estas técnicas así como una alta concentración de han revelado una diversidad filogen - b-caroteno para protegerse del efecto tica eucariota inesperadamente alta dañino de la radiación solar. en todo tipo de entornos, su impacto Las chimeneas hidrotermales de es aún más evidente en el campo de las profundidades marinas son tam- los entornos extremos, normalmente bién ambientes extremos en los que más difíciles de reproducir en el labo- los eucariotas están ampliamente ratorio. Los investigadores son ahora distribuidos. Estos hábitats son fuma- capaces de abordar cuestiones impor- rolas volcánicas submarinas calientes tantes sobre la diversidad microbiana que expulsan azufre y se encuentran, que no podían formularse de manera sobre todo, en las zonas de contacto realista hace unos años. 13 de las placas continentales. Estos ecosistemas sustentan extraordinarias 1.4 Mecanismos de comunidades en las profundidades resistencia en de los océanos, siendo las únicas comunidades de la Tierra cuya fuente de extremófilos energía inmediata no es la luz solar. Entre los numerosos mecanismos de Los gusanos tubulares, Alvinella pom- adaptación que presentan los diferen- pejana y las almejas son los habitantes tes tipos de extremófilos nos vamos más característicos de las chimeneas a detener en los relacionados con los abisales del Océano Pacífico, mientras hipertermófilos y con los halófilos que los camarones sin ojos sólo se en- que son, sin duda, los que mejor se cuentran en las zonas del Océano At- conocen. Todas las estructuras y acti- lántico. Estos organismos son capaces vidades celulares se ven afectadas por de sobrevivir a una exposición soste- el calor por lo que los termófilos e hi- nida y a largo plazo a temperaturas de pertermófilos, necesariamente, deben hasta 80 C° [1]. presentar múltiples adaptaciones a La mayoría de los eucariotas que las temperaturas en las que se desa- se encuentran en ambientes extre- rrollan su existencia. En algunos casos mos son unicelulares y el principal contienen altas cantidades de solutos obstáculo para su estudio es la falta que ayudan a estabilizar las proteínas de métodos de cultivo fiables. Los re- frente a la degradación térmica como cientes avances en la tecnología de sales, azúcares y otros compuestos pe- secuenciación masiva de ADN y las queños. Estos solutos tienen un efecto nuevas herramientas bioinformáticas protector sobre monómeros como el ATP y otras moléculas clave del me- de tipo C40 que están compuestos de tabolismo celular. Alternativamente, unidades isoprenoides repetitivas de algunos de estos monómeros pueden cinco átomos de carbono que se unen ser sustituidos por otras moléculas por enlace éter al glicerol fosfato. más termoestables. Además, las enzi- Además, la estructura global de estas mas y otras proteínas de los hiperter- membranas es de monocapa en vez mófi os son más estables frente a la de bicapa lipídica, lo que hace que las temperatura que las de los microorga- membranas sean mucho más estables nismos mesófilos y sus macromolécu- a altas temperaturas impidiendo su las tienen un funcionamiento óptimo degradación [1, 3, 4] a altas temperaturas. Los estudios de En cuanto a la protección de sus enzimas termoestables demuestran ácidos nucleicos, el aumento de solu- que sus secuencias de aminoácidos tos intracelulares como potasio y otros varían muy poco con respecto a las solutos orgánicos, proporciona mayor enzimas análogas mesófilas. Estas estabilidad al ADN. Además, produ- pequeñas variaciones parecen ser su- cen enzimas especiales como la girasa ficientes para conferir a las proteínas inversa, que tienen como función au- hipertermófilas una mayor estabilidad mentar la estabilidad del ADN al pro- frente a la temperatura. Esta estabi- ducir un superenrollamiento positivo 14 lidad también se incrementa como del mismo que lo estabiliza frente al consecuencia de la formación de en- calor. Las arqueas también sintetizan laces iónicos entre las cargas positivas proteínas semejantes a las histonas y negativas de las cadenas peptídicas eucarióticas implicadas en incremen- y a un empaquetamiento de las mis- tar el enrollamiento del ADN, por lo mas altamente hidrofóbico, lo que les tanto, su estabilidad, incluso llegan confiere una mayor resistencia frente a formar estructuras semejantes a a la desnaturalización en un ambiente los nucleosomas de eucariotas. Otras acuoso como es el del citoplasma. Ade- moléculas responsables de la estabi- más, se ha visto que las arqueas hi- lidad del ADN son las poliaminas que, pertermófilas presentan un complejo junto al magnesio, estabilizan el ADN proteico denominado termosoma que y el ARN en hipertermófi os. Sus ARN funciona como una chaperona ayu- ribosomales presentan hasta un 15% dando, por un lado, al correcto plega- más en su porcentaje de guaninas y miento de las proteínas de la célula y, citosinas, lo que hace que aumente el por otro, a mantener su estabilidad [1, número de puentes de hidrógeno en 3, 4] sus estructuras tridimensionales incre- Los termófilos presentan membra- mentando su estabilidad. Este mayor nas ricas en ácidos grasos saturados, al porcentaje, sin embargo, no se man- contrario de lo que ocurre en los psi- tiene en el genoma global, además, crófilos, permitiendo a la membrana la producción de poliaminas también ser estable a mayores temperaturas. está implicada en el aumento de esta- Los hipertermófilos, arqueas en su bilidad de los ribosomas [1]. mayoría, no presentan ácidos grasos Por otro lado, la mayoría de los ha- en sus membranas sino hidrocarburos lófilos utilizan iones inorgánicos para Introducción

equilibrar la presión osmótica intrace- ATP dependiente de luz. Esto sucede lular, pudiendo llegar a ser varios ór- en ausencia de pigmentos clorofílicos denes de magnitud mayor fuera que por lo que no se considera fotosínte- dentro de las células. Halobacterium sis. No obstante, en este proceso de es el ejemplo más estudiado que sigue obtención y conservación de energía esta estrategia. Esta arquea bombea intervienen otros pigmentos sensibles grandes cantidades de potasio (K+) a la luz. En condiciones de baja airea- hacia el interior celular, de modo que ción, Halobacterium salinarum y algu- logra concentraciones incluso mayo- nos otros halófilos extremos sintetizan res a las del sodio exterior, con lo que una proteína denominada bacteriorro- mantiene el balance hídrico positivo dopsina que se inserta en la membrana característicos de la mayoría de las citoplasmática. La bacteriorrodopsina células. Por otro lado, la pared celular contiene retinol, una molécula de tipo de Halobacterium está formada por carotenoide que puede absorber ener- glicoproteínas y estabilizada por sodio gía luminosa y que le confiere un tono (Na+). Los iones de Na+ se unen a la púrpura. Cuando las células de Halo- pared y son fundamentales para su es- bacterium pasan de crecer en condicio- tabilidad, de tal manera que, cuando nes de alta aireación a condiciones en no hay suficiente sodio, la célula se las que el oxígeno es limitante, cambia rompe. Por este motivo, esta arquea su color de anaranjado a rojo púrpura 15 es una halófila obligada. Todo esto es a medida que la bacteriorrodopsina consecuencia de la alta cantidad de se incorpora a la membrana. Esto es aminoácidos cargados negativamente lo que hace que las salinas y algunos (glutámico y aspártico) que poseen lagos hipersalinos tengan colores roji- las glicoproteínas de la pared celular. zos. La producción de ATP mediada por De forma parecida, las proteínas del la luz y la bacteriorrodopsina también citoplasma de Halobacterium están sirve para bombear Na+ fuera de la cargadas negativamente pero en vez célula mediante un sistema antiporte de estabilizarse con Na+ lo hacen con Na+/H+, impulsando también la toma el K+ intracelular. Se trata de proteínas de nutrientes, incluyendo el K+ necesa- pobres en aminoácidos hidrofóbicos rios para alcanzar el equilibrio osmó- para mantener la disolución de las tico intracelular [6]. mismas en un citoplasma rico en K+. Además de las estrategias para De igual modo, los ribosomas de Halo- controlar la entrada y salida de ca- bacterium necesitan altas cantidades tiones, la mayoría de los halófilos se de K+ para mantener su estructura. De desarrollan en ambientes con con- esta manera, estos microorganismos centraciones muy altas de iones in- están adaptados a medios con altas orgánicos, lo que produce una gran concentraciones de iones, necesitando diferencia de presión osmótica entre el Na+ para su estabilidad exterior y K+ interior y el exterior de las células. Para para la interior [1, 6]. solucionar esto, los halófilos acumulan Otra estrategia frente a la alta sa- o sintetizan gran cantidad de com- linidad presente en algunas haloar- puestos orgánicos de bajo peso mo- queas está asociada a la síntesis de lecular denominados osmolitos. Estos compuestos contrarrestan la tenden- la búsqueda de nuevos compuestos cia de la célula a deshidratarse en bioactivos para usos industriales, condiciones de alta presión osmótica, agrícolas, ambientales y farmacéuti- permitiéndoles alcanzar un balance cos (Tabla 3). Este hecho es fácil de hídrico positivo respecto a su entorno. comprender si pensamos que, para Existen diferentes tipos de osmolitos ciertos procesos industriales, resulta que tienen en común su alta solubili- de alto interés disponer de biocatali- dad en agua. Los más frecuentes son zadores y otro tipo de moléculas que azúcares, alcoholes derivados de azú- trabajen a muy altas temperaturas cares y, aminoácidos y sus derivados. (procedentes de microorganismos La concentración intracelular de los os- termófilos), alta desecación (proce- molitos depende de los niveles de so- dentes de xerófilos), alta salinidad lutos externos, siendo la cantidad que (procedentes de halófilos), etc. No se puede sintetizar y acumular algo sólo en industria, sino también en característico de cada organismo y la ciencia básica, las biomoléculas que define su capacidad de resistir alta procedentes de extremófilos son salinidad. La glicina betaína es uno de de gran utilidad. El ejemplo más re- los osmolitos más comunes. Se trata presentativo es el de la enzima Taq de un derivado de la glicina en el que polimerasa, imprescindible en las re- 16 se han sustituido los átomos de hidró- acciones de polimerización del ADN geno del grupo amino por tres grupos (PCR) y que fue aislada en 1965 de un metilo. Esto deja una carga positiva hipertermófilo encontrado en el Par- permanente en el átomo de nitrógeno que Nacional de Yellowstone. Esta que aumenta la solubilidad de la sus- enzima es la base de la mayor parte tancia. Es un osmolito muy común es- de los estudios de bioquímica y biolo- pecialmente entre bacterias halófilas y gía molecular actuales. Las empresas cianobacterias. Algunas bacterias ha- siguen luchando por su patente con lófilas extremas producen otro tipo de unas ventas anuales de miles de mi- soluto compatible; la ectoína, que es llones de dólares [7]. un derivado cíclico del aspartato [1, 6]. La biotecnología desarrollada a partir de extremófilos ha alcanzado 1.5 Interés biotecnológico tal desarrollo comercial que ha im- de los extremófilos pulsado a lo largo del planeta numerosas iniciativas de investigación, Aunque en un principio, los extre- empresas biotecnológicas, búsqueda mófilos se consideraban como una continua de nuevos microorganis- «curiosidad científica», el potencial mos extremos y nuevos genes. Otros biotecnológico de estos microorga- ejemplos de extremófilos que se uti- nismos y sus productos celulares ha lizan actualmente en el ámbito co- supuesto un revulsivo que ha impul- mercial son las proteasas alcalinas sado su investigación en los últimos para detergentes. Este es un mercado años. Los campos de la biotecnología enorme que ocupa el 30% del total de que podrían beneficiarse de los ex- la producción mundial de enzimas. tremófilos son numerosos e incluyen También es interesante mencionar Introducción

TABLA 3. Ejemplos de extremófilos y su uso en biotecnología

Enzimas y biomoléculas Aplicaciones Termófilos e Alcohol deshidrogenasa Síntesis química Hipertermófilos DNA polimerasas Amplificación de DNA mediante PCR 50-110ºC Fosfatasa alcalina Diagnósticos Proteasas y lipasas Productos de uso diario Xilanasas Blanqueamiento de papel

Psicrófilos Celulasas y amilasas Detergentes 0-15ºC -galactosidasa Hidrólisis de lactosa en productos lácteos Proteínas nucleación de hielo Generación de nieve artificial, helados βÁc. grasos poli-insaturados Aditivos alimentarios, suplementos dieta

Halófilos Bacteriorodopsina Conmutador óptico en bioelectrónica 3-20% sal Ácido -linoleico, -caroteno Comida saludable, colorante alimenticio Membranas Surfactantes farmacéuticos Lípidosγ β Liposomas Polímeros reológicos Extracción de petróleo

Alcalófilos Celulasas, xilanasas, lipasas Detergentes pH>9 Proteasas Eliminación de gelatina en autorradiografías de rayos X Amilasas, lipasas Degradación de polímeros en detergentes

Acidófilos Oxidadores de Fe y/o S Biolixiviación de metales 17 pH 1-5 Microorganismos Ácidos orgánicos y solventes el -caroteno, un producto utilizado de reproducir en el laboratorio. Por en la industria alimentaria y que se otro lado, muchos de estos microor- β produce comercialmente a partir de ganismos mantienen relaciones un alga verde halófila, Dunaliella simbióticas o sintrópicas con otros bardawil. Aunque las aplicaciones organismos de su ambiente, por lo de las extremoenzimas o productos que el obtener cultivos puros es muy celulares de los extremófilos en la in- difícil. Para salvar esta limitación, se dustria aún resultan limitadas en la está abordando un enfoque distinto actualidad, sus aplicaciones poten- en la búsqueda de nuevos genes y ciales son enormes [5, 8]. moléculas de interés biotecnológico. En biotecnología, una de las prin- Se trata de la ecogenómica, basada cipales dificultades es el aislamiento en aplicar técnicas de secuenciación y cultivo masivo de los microorganis- masiva para aumentar nuestro cono- mos para su uso industrial, lo que es cimiento de la genómica estructural todavía más complicado en el caso de los microorganismos ambientales de muchos extremófilos. Se calcula sin necesidad de ser cultivados. Estas que se han aislado menos del 1% de técnicas permiten, además, conocer las especies terrestres. En el caso la biodiversidad y las características de los extremófilos, este hecho es ambientales, relacionar los genes im- especialmente patente, ya que las plicados a determinados estímulos condiciones extremas que necesi- del entorno y deducir los metaboli- tan para su desarrollo son difíciles tos producidos. Esta metodología ha ampliado considerablemente la po- proteínas en un futuro próximo. Por sibilidad de encontrar nuevos genes ejemplo, la identificación de propie- que den lugar a productos adecua- dades estructurales importantes para dos para la industria [1]. A pesar de la actividad y la estabilidad térmicas todo, los métodos convencionales permitirá la construcción de proteínas de detección para buscar nuevos con las propiedades catalíticas y tér- productos y aplicaciones de los ex- micas necesarias para ser utilizadas tremófilos, siguen siendo eficaces. con nuevos propósitos. También se Por ejemplo, la toma de muestras de producirán avances en la construc- las chimeneas hidrotermales de las ción de microorganismos recombi- profundidades marinas, utilizando nantes para fines específicos. Así, se sustratos selectivos para cultivos de ha diseñado una cepa recombinante enriquecimiento, ha permitido desde Deinococcus radiodurans para de- cubrir nuevas enzimas termoestables gradar compuestos orgánicos conta- (esterasas, lipasas, proteasas, xilana- minantes en ambientes radiactivos sas, etc.) [1, 5, 7, 8]. [9]. Teniendo en cuenta el elevado El potencial biotecnológico de los número de vertederos contaminados extremófilos aumenta exponencial- con orgánicos contaminantes, com- mente con el aislamiento y cultivo de puestos radiactivos y metales pesa- 18 nuevos organismos, la identificación dos en todo el mundo, los riesgos para de nuevos compuestos y rutas meta- la seguridad y el costo que entrañan bólica y mediante la caracterización las metodologías de limpieza físico- molecular y bioquímica de los com- química, la posible utilización de ponentes celulares. Esto provocará, microorganismos extremófilos mani- sin duda alguna, grandes avances pulados genéticamente es una pers- en el ámbito de la ingeniería de las pectiva importante y apasionante. 2. Naturaleza y origen de los ecosistemas ácidos extremos

Los ecosistemas extremos suelen propicios para la generación de bio- compartir varios factores ambienta- diversidad y de nuevos mecanismos les que normalmente se consideran de adaptación ambientales. Son incompatibles con la mayoría de las medios en los que las fuerzas evo- formas de vida, sin embargo, a pesar lutivas operan con especial inten- de esta aparente hostilidad, estos sidad. Estos ambientes extremos, ecosistemas suelen tener un nivel de sumamente selectivos y confinados biodiversidad mayor del esperado. espacialmente son, en definitiva, un Aunque en un principio los organis- medio favorable para la aparición 19 mos extremófilos sólo se considera- de una biodiversidad singular y de ban como curiosidades científicas, mecanismos adaptativos específi- su potencial en el campo de la bio- cos. Los ecosistemas extremos son tecnología es, hoy en día, una de las verdaderos generadores de singula- principales razones que motivan su ridad biológica, lo que los convierte estudio y cultivo. Los extremófilos en un medio de especial interés para han permitido realizar numerosos el estudio y para la preservación del avances en diferentes campos de patrimonio biológico. La singulari- la biotecnología, entre los que se dad y la especificidad hacen que es- encuentran la búsqueda de nuevos tos entornos sean también entornos compuestos bioactivos útiles en la especialmente frágiles. La quiebra industria, la agricultura, el medio de los equilibrios en un ecosistema ambiente y la farmacología [4, 7]. En ya al límite o el restablecimiento de los últimos años se han aislado un las condiciones “normales” o no ex- amplio rango de bacterias, arqueas, tremas marcan el final de una biodi- cianobacterias, protistas, algas y versidad específicamente ligada al hongos de estos ambientes debido a medio. su enorme potencial, no solo a nivel En este sentido, los ambientes biotecnológico, sino como posibles extremos ácidos y los microorganis- modelos para el estudio de la estamos que los habitan, los acidófilos, bilidad de biomoléculas y del origen son uno de los temas de estudio que de la vida. más importancia están adquirien- Por otro lado, los ambientes ex- do últimamente debido a las posi- tremos son extraordinariamente ble implicaciones biotecnológicas y A B

C D

Figura 1. Ecosistemas ácidos asociados con la actividad hidrotermal y volcánica. (a) Campo de sulfataras de Gunnuhver, situado en la Península de Reykjanes (NO, Islandia), (b) Precipitados amarillos de azufre elemental en los bordes de las chimeneas volcánicas, (c) Geiser situado en el valle Haukadalur (NO, Islandia), (d) Arroyos de agua naturales que se acidifican y calien an a temperaturas superiores a los 60ºC, producidos por la emanación de gases al atravesar zonas geotermales activas, (e) Lago ácido en el cráter de un volcán islandés. Naturaleza y origen de los ecosistemas ácidos extremos

medioambientales que se derivan pueden variar mucho en temperatu- de ellos. Los acidófilos son capaces ra (desde <0°C a >80°C) y contienen de vivir en condiciones de pH infe- concentraciones mucho mayores de riores a 2. En estas condiciones, las solutos y metales pesados disueltos proteínas se desnaturalizan perdien- que los ambientes de pH neutro. Por do cualquiera de sus propiedades lo tanto, los desafíos para la biota funcionales, por lo que estos orga- que crece en estos sitios son mayo- nismos han tenido que desarrollar res que sólo los de hacer frente a las sistemas que les permitan mantener concentraciones externas de iones + su citoplasma a un pH neutro sin ex- de hidronio (H3O ), que pueden lle- cluir el desarrollo de mecanismos de gar a ser entre cuatro y siete órdenes resistencia para sus proteínas extra- de magnitud mayor que las presen- celulares. tes en aguas neutras [10]. Muchos ecosistemas, incluyendo Los ambientes ácidos tienen dos suelos y aguas continentales, pue- orígenes principales que los diferen- den presentar valores de pH inferio- cian mucho en sus características fí- res a la neutralidad (pH 7). Se consi- sico-químicas y, como consecuencia, dera que los ambientes ácidos son en su ecología microbiana [13]. El pri- aquellos con valores de pH inferiores mer tipo de ecosistema ácido estaría a 5, dividiéndose en extremadamen- asociado con la actividad geotérmica 21 te ácidos (pH < 3) o moderadamen- y volcánica. La acidez de las aguas en te ácidos (pH 3-5). Muchas turberas, este caso se deriva de la generación suelos y aguas continentales son de ácido sulfúrico producida por la moderadamente ácidos pero los am- oxidación microbiana de formas re- bientes extremadamente ácidos son ducidas de azufre (Figura 1). Tanto el mucho menos comunes, pudiendo sulfuro de hidrógeno como el dióxido ser causados por fenómenos natu- de azufre son comunes en muchos rales (i.e. áreas geotérmicas y sulfu- gases volcánicos. La condensación ros metálicos expuestos) o de origen de estos dos gases produce azufre antropogénico, generalmente aso- elemental (2H2S + SO2 3S0 + 2H2O) ciados con la minería de metales y que, ocasionalmente, puede ser visto → carbón [10, 11]. Los ambientes ácidos como partículas prismáticas de azu- extremos son especialmente inte- fre que se forman alrededor de los resantes porque, en general, el bajo bordes de las chimeneas volcánicas pH del ecosistema es la consecuen- (Figura 1). La oxidación de sulfuro, cia del metabolismo microbiano y sulfito y otras formas de azufre por no de una condición impuesta por el arqueas y bacterias quimiolitoautó- ambiente como es el caso en muchos trofas, genera ácido sulfúrico. Estos otros entornos extremos (tempera- ambientes se conocen como campos tura, radiación, presión, etc.) [12]. En de sulfataras o fumarolas cuando se estas condiciones, las proteínas celu- desarrollan en la superficie terrestre, lares se desnaturalizan y pierden to- la extrema acidez que puede desa- das sus propiedades funcionales. Los rrollarse en esas aguas se produce ambientes ácidos extremos, además, por la destrucción de los minerales A

B C

D Naturaleza y origen de los ecosistemas ácidos extremos

silíceos, sobre todo en las zonas don- arqueas hipertermófilas oxidadoras Figura 2. Ambientes de las temperaturas son altas, dando de azufre que, además, son acidófi- ácidos extremos ge- lugar a pozas de barro ácido. Estos las, como es el caso de Sulfolobus o nerados por actividad ambientes se distribuyen en varias Acidianus. A medida que nos vamos geotérmica. (a) En lugares como Islandia, partes del mundo, incluyendo Nue- alejando de la zona caliente de emi- es fácil encontrar eco- va Zelanda (Rotorua), los EE.UU. (Ye- sión, la temperatura irá bajando pro- sistemas en los que se llowstone), Islandia (Krýsuvík), Rusia gresivamente, disminuyendo tam- dan gradientes de pH (Kamchatka), el Caribe (Santa Lucía bién la acidez de las aguas, lo que y temperatura debido y Montserrat), las Azores y Djibouti permite un aumento de la diversidad a la presencia de actividad geotermal. Las (noreste de África). y la sustitución progresiva de las ar- fumarolas se forman Un ejemplo de este tipo de eco- queas hipertermófilas por bacterias como consecuencia de sistemas se representa en la Figura 2, termófilas. Si la fumarola es ácida, grietas por las cuales donde se ejemplifica el gradiente de primero nos encontraremos bacte- emanan gases proce- pH que se da en una zona de fuma- rias oxidadoras de azufre, acidófilas dentes del subsuelo y son la fuente por rolas de una zona geotermal activa. y termófilas (p.e. Acidithiobacillus la que se produce el Las fumarolas se forman como con- caldus) las cuales serán sustituidas aporte de nuevos ele- secuencia de grietas por las cuales por otras no termófilas (p.e. Thioba- mentos y compuestos emanan gases procedentes del sub- cillus) según se enfríe la zona. A me- de azufre a las corrien- suelo. Estos gases se han producido dida que nos alejamos del “hot spot”, tes de agua, (b) Antes de entrar en la zona por calentamiento a consecuencia también desaparecerá el azufre, con 23 geotermal activa, los de una bolsa de magma cercana. A lo que la comunidad microbiana irá arroyos de deshie- menudo, estas grietas se pueden lle- cambiando por otra mesófila y neu- lo presentan baja nar de agua a alta presión y en ebu- trófila. También en estos lugares es temperatura, un pH llición, lo que da lugar a géiseres. En donde la temperatura no supera los neutro y son oligotró- otras ocasiones las fumarolas están 50ºC, siendo frecuente encontrar el ficos, (c) Al atravesar la zona geotermal, las por debajo de la superficie y pro- alga eucariota acidófila Cyanidium aguas se calientan, se ducen fuentes hidrotermales. En el caldarium. enriquecen en azufre. centro de la fumarola (“hot spot”) es Los ecosistemas ácidos geoter- Microorganismos qui- donde encontramos mayores tempe- males también aparecen en zonas miolitótrofos oxidan raturas (hasta 120ºC). En la mayoría hidrotermales abisales, como en la azufre produciendo la bajada de pH. El de los casos, los minerales son ricos elevación del Pacífico Oriental, la resultado son aguas en azufre, por lo que los microor- cordillera del Atlántico Medio y la muy calientes y ácidas ganismos que predominan en ellos cuenca de Guaymas donde descar- extremas, (d) Al salir suelen ser oxidadores de azufre. La gan grandes cantidades de azufre de la zona de fuma- oxidación del azufre va a promover reducido procedentes de fuentes rolas, la temperatura va disminuyendo, la bajada del pH, por lo que muchas magmáticas. En estas zonas, la aci- los compuestos de de estas fumarolas son también áci- dez generada por la oxidación de azufren van desapa- das o muy ácidas. azufre es neutralizada rápidamente reciendo y el pH se va Alrededor de la fumarola se suele por el agua de mar, restringiéndose neutralizando. establecer un gradiente de tempera- las zonas ácidas a los conductos de tura y de pH que será colonizado por ventilación que actúan como nichos distintos microorganismos según va- ecológicos para microorganismos ríen las condiciones ambientales (Fi- acidófilos [13]. Dadas las característi- gura 2). Generalmente encontramos cas de estos ambientes, las especies A B

C D

E F Naturaleza y origen de los ecosistemas ácidos extremos

que encontramos en ellos, además a la atmósfera por procesos de ero- Figura 3. Ecosistemas de acidófilos, son termófilos mode- sión, deshielo o movimientos geo- ácidos asociados rados o hipertermófilos. Esta mul- lógicos. Los depósitos naturales de con la presencia de tirresistencia les hace doblemente sulfuros pueden tener un origen hi- sulfuros metálicos. (a) Drenaje ácido de roca interesantes en los campos de la in- drotermal o ser de tipo volcánico. Si localizado en Parque vestigación básica, la astrobiología el origen es hidrotermal, el depósito Nacional de Pastoruri y la biotecnología. Entre estos mi- generalmente queda enterrado en el (Perú), (b) Corta microorganismos, destacan las arqueas subsuelo y la oxidación no siempre nera activa situada en del género Picrophilus, con un pH se produce. Como veremos, la Faja la Faja Pirítica Ibérica, (c) Drenaje ácido de óptimo de crecimiento de 0,7, siendo Pirítica Ibérica (FPI), eje central de mina localizado en el capaces de desarrollar su actividad este libro, es uno de los depósitos de entorno de Río Tinto, metabólica hasta un pH de -0,06. No sulfuros (mayoritariamente sulfuro (d) Escombreras cerca- sobreviven a pH superiores a 4 y son de hierro) y minerales polimetálicos nas a la corta minera las especies más acidófilas descritas más importantes del mundo. En este Cerro Colorado, activa en el actualidad en la hasta el momento. caso concreto, los sulfuros masivos cercanía de Nerva (e) El segundo origen de los ecosiste- tienen un origen complejo que no Una de las salidas de mas ácidos extremos está relaciona- ha sido completamente aclarado. El la corta abandonada do con la oxidación de los depósitos modelo más aceptado propone un de Peña de Hierro, de sulfuros metálicos presentes en la origen hidrotermal, semejante a las situada en las inme- diaciones del origen corteza terrestre (Figura 3). Cuando fumarolas hidrotermales actuales, 25 de Río Tinto, (e) Lago estos depósitos, formados mayori- lo que explicaría en gran medida la ácido generado en la tariamente por pirita (FeS2), se ex- formación del depósito. Sin embar- corta abandonada de ponen a la atmósfera y se combinan go, algunas características presentes Peña de Hierro. con agua, oxígeno y la presencia de en la FPI tendrían una mejor expli- bacterias quimiolitoautrótofas, se cación si fueran consideradas como libera hierro férrico y ácido sulfúrico cuencas sedimentarias asociadas a en el medio ambiente, reduciéndo- arcos volcánicos. Lo más probable es se drásticamente el pH de las aguas que en la formación de un depósito superficiales. Además de su extrema tan extenso hayan concurrido diver- acidez, estos ecosistemas también sos eventos minerales a lo largo del tienen una elevada concentración de tiempo. Cuando, por motivos geoló- metales pesados en el agua (como gicos, parte de la FPI quedó expuesta cadmio, cobalto, cobre, níquel y zinc) a la atmósfera, los microorganismos que, normalmente, están presentes empezaron a oxidar el sulfuro de en concentraciones milimolares, va- hierro, originándose un río de aguas rios órdenes de magnitud superiores ácidas y color rojo debido al hierro a la media de las aguas neutras [13, oxidado. En la mayoría de los casos, 14]. La oxidación de los depósitos de las aguas ácidas que tienen este ori- sulfuros metálicos puede ocurrir por gen no forman grandes cauces y se dos causas principales: denominan drenajes ácidos de roca Causas naturales: cuando el de- (Figura 3). pósito mineral se encuentra cerca Por causas antropogénicas: los sul- de la superficie terrestre y se expone furos metálicos (incluida la pirita) son de alto interés industrial por sí mismos la contaminación de acuíferos cerca- pero también por ir asociados a meta- nos (Figura 3) [13, 14]. les como oro, plata, cobre, etc. La activi- En este sentido, Río Tinto es uno dad de las explotaciones mineras desde los ecosistemas ácidos extremos plaza miles de toneladas de rocas para más inusuales descritos hasta el la extracción de dichos metales, expo- momento debido a su extensión en niendo dichos sulfuros a la atmósfera. tamaño, pH bajo bastante constan- Esta exposición provoca su oxidación te, altas concentraciones de metales y la consecuente aparición de lo que pesados y un alto nivel de diversidad se denominan drenajes ácidos de mi- microbiana, sobre todo eucariótica nas. Estos drenajes, extremadamente [15-19]. Debido a su extensión y fácil ácidos, se pueden presentar en forma acceso, Río Tinto es considerado un de ríos, lagos o canales de escorrentías excelente modelo para el estudio de asociados a los sedimentos y suponen la ecología microbiana de ambientes un grave problema ambiental debido ácidos extremos y en el campo de la a su acidez y a la alta concentración en Astrobiología, como veremos más metales pesados que pueden producir adelante.

26 3. Río Tinto y su entorno

3.1 Contexto geológico: de Riotinto, que constituye el mayor Faja Pirítica Ibérica depósito individual de sulfuros polime- tálicos descrito hasta el momento en el Río Tinto nace en la provincia de Huelva mundo. La mineralización está domi- (SE, España) y recorre más de 100 Km a nada por la pirita (FeS2) (más del 90% lo largo de la formación de pirita más en volumen), que es el principal mineral grande del mundo, la Faja Pirítica Ibé- de estos depósitos minerales, con can- rica (FPI), hasta desembocar en el At- tidades inferiores de esfalerita (ZnS), lántico (Figura 4). La FPI es uno de los galena (PbS), calcopirita (CuFeS2), ar- 27 depósitos de sulfuros polimetálicos senopirita (FeAsS) y otros sulfuros con más importantes del mundo. Sus di- cantidades todavía menores de cadmio, mensiones son de alrededor de 200 selenio, plata, oro, cobre, mercurio, etc. km de largo por 40 km de ancho. Per- La pirita se presenta en numerosas tex- tenece a la Zona Sur Portuguesa del turas diferentes, pudiéndose encontrar Macizo Hercínico Ibérico y se extiende desde en forma de cristales de grano desde el suroeste de España hasta la fino (coloquialmente denominados costa atlántica portuguesa. Está for- framboidales) hasta cristales de grano mado por tres grupos litológicos per- grueso [20, 21]. tenecientes al Paleozoico Superior: el Los depósitos de sulfuros metálicos Grupo Filita-Cuarcita, formado por una de la FPI han sido explotados indus- gruesa secuencia de lutitas y areniscas; trialmente desde el año 3000 a.C. para el Complejo Volcano-Sedimentario, que la extracción de oro, plata y cobre. En la incluye una secuencia volcánica má- época romana hubo un resurgimiento fico-félica interestratificada con lutitas; de la actividad minera, cuyas huellas y el Grupo Culm, en el que predominan permanecen en toda la FPI donde se las lutitas, areniscas y conglomerados han encontrado numerosos restos ar- [20, 21]. queológicos, como las norias hidráuli- Asociado con los materiales del cas que se pueden visitar en el British Complejo Volcano-Sedimentario, se Museum y en el Museo Arqueológico desarrollan muchos depósitos sub- de Huelva. Posteriormente, la actividad terráneos de sulfuros masivos, con minera disminuyó, aunque continuó reservas originales de 1700 Mt. Entre esporádicamente durante las domina- ellos se encuentra el distrito minero ciones visigoda y árabe y la Edad Media. A mediados del siglo XIX, coincidiendo una estación húmeda y templada en con la Revolución Industrial, la activi- invierno seguida de un verano seco y dad minera reapareció con mayor in- cálido. Esta estacionalidad afecta fuer- tensidad. Durante los siglos XIX y XX temente a las comunidades microbia- han estado activas casi cien minas con nas, sobre todo a las eucarióticas, al una producción total de 300 millones cambiar importantes características de toneladas de minerales polimetáli- hidroquímicas tales como el flujo de cos para la extracción de azufre, cobre, agua, la temperatura y la composición plomo y zinc principalmente [20, 21]. de los elementos químicos. A día de hoy, hay varias explotaciones Como consecuencia de su situación funcionando, las más importantes la en la FPI, las aguas de Río Tinto tienen mina Cobre Las Cruces en la provincia una concentración alta de sulfato y de Sevilla y el Proyecto Riotinto Atalaya de metales pesado, especialmente + Mining, ambas extrayendo cobre. de hierro férrico (Fe3 ) que va a ser el responsable del color rojo intenso del 3.2 Cuenca hidrológica agua. El contenido medio de sulfato y y clima de los principales metales pesados del río es de 15 mg L-1 de sulfato; 4 mg L-1 El Río Tinto nace en Peña del Hierro, de hierro; 90 mg L-1 de zinc; 88 mg L-1 28 en la Sierra de Padre Caro, al norte de de cobre; 5 mg L-1 de arsénico; y valores Huelva. Tras recorrer gran parte de la inferiores de cadmio, cobalto, níquel FPI, desemboca en el Atlántico junto y plomo (Tabla 4). Desde el punto de al río Odiel, formando un estuario co- vista físico-químico, las aguas del Río mún conocido como la Ría de Huelva. Tinto se parecen a aguas contamina- La superficie de su cuenca se calcula das procedentes de drenajes mineros, en unos 720 km2, con un caudal medio aunque la gran diferencia con estos anual de 100 hm3 al año. A lo largo del es que presentan mayor concentra- año se producen marcadas variaciones ción de metales que la mayoría de de esta media de caudal debido al cli- las aguas residuales mineras y que el ma mediterráneo, incluyendo largos bajo pH y el alto potencial redox se períodos de sequía y episodios de lluvia mantienen prácticamente constantes intensa. La precipitación media anual hasta su desembocadura en el Atlán- en la zona es de 812 mm, el 50% de la tico. Esta constancia en las caracte- cual se produce entre octubre y enero. rísticas físico-químicas se mantiene Sus aguas presentan un pH muy bajo a pesar de la entrada de afluentes de (1,2-3,0) y un potencial redox alto (583- pH neutro y baja carga de metales y 832 mV) a lo largo de todo su cauce. La de las lluvias, a menudo torrenciales, conductividad eléctrica, sin embrago es que recibe a lo largo de su recorrido. más variable (1,3-37 mS cm-1). La evapo- El aporte de esta agua externa puede transpiración es menor de 1mm día-1 en hacer subir el pH durante horas o invierno y hasta 10 mm día-1 en verano quizá días, pero pronto el agua del río [22, 23]. Bajo este régimen hidrológico, vuelve a sus características extremas. el río muestra una clara bimodalidad La causa de este equilibrio se explica en la disponibilidad anual de agua, con por la alta concentración de hierro, lo Río Tinto y su entorno

TABLA 4. Datos físico-químicos de diferentes ambientes neutros y ácidos. El Citarum River (Indonesia), está considerado como uno de los ríos más contaminados del mundo. Las unidades para los datos de los metales son mg L-1. DRAs- Drenajes Ácidos de Roca

 pH Fe Co Cu Zn Ni As Cd Media mundial (n=75) 7.1 0.07 0.0002 0.0015 0.0006 0.0008 0.0006 0.0001 Citarum River (Indonesia) 7.5 0.23 0.001 0.004 0.01 0.003 0.003 0.002 Río Tinto 3.1 7285.7 16.2 76.7 99.5 71.9 11.6 13.3 Río Odiel 4.7 130.7 0.7 12.2 12.7 0.21 0.13 0.3 Antártida DRAs 3.2 99.4 4.5 1.6 0.3 8.9 3.1 0.3 Glaciar Pastoruri DRAs (Perú) 3.5 44.6 22.7 10.4 15.7 22.7 0.1 0.4 Río Agrio (Argentina) 5.1 31.6 4.6 10.5 1.2 4.7 0.1 0.2

que convierte sus aguas en un medio las condiciones extremas del río. Su fuertemente tamponado. extrema acidez y las altas concentra- Estas características han hecho que, ciones de metales son el resultado de durante años, se haya considerado Río la oxidación de la pirita presente en las Tinto como un ambiente altamente rocas como consecuencia del metabo- contaminado. Sin embargo, hay auto- lismo de las bacterias quimiolitrótofas res que han datado las antiguas terra- que liberan ion férrico y ácido sulfú- 29 zas del río con más de un millón de años rico. A bajos pH, la oxidación química de antigüedad. La caracterización isotó- es lenta y la oxidación bacteriana es el pica y mineral de dichas terrazas mues- proceso dominante. tran que, ya entonces, el río tenía las La Cuenca hidrográfica de Río Tinto características extremas que presenta puede dividirse en tres zonas princi- en la actualidad (bajo pH, alta concen- pales en función de las características tración de hierro y alta concentración topográficas, geológicas y geoquími- de sulfato). En todo caso, no podemos cas: la zona septentrional, la zona de obviar la influencia que siglos de mine- transición y la zona del estuario, que ría han ejercido, y aún ejercen, sobre el se han diferenciado por una actividad río. Es probable que el río original, aun Pliocénica con dirección NE-SW [23]. La siendo extremo, fuese diferente al que zona norte comprende los municipios ahora conocemos. En realidad, la zona de Riotinto, Nerva, Berrocal, La Palma de la FPI por la que discurre Río Tinto del Condado y Niebla y sus alrededores es una mezcla de drenajes ácidos de (Figura 4). El área se caracteriza por ser roca naturales y de mina que confor- montañosa (100 a 660 m sobre el ni- man uno de los mejores lugares para vel del mar), estable en los parámetros el estudio de este tipo de ecosistemas hidroquímicos como el pH, que perma- extremos. nece entre 0,9 y 3 (valor medio de 2,3) Como en la mayoría de sistemas y una alta concentración de hierro en ácidos, el componente biológico juega solución (entre 1,5 y 20 g L-1). La zona un papel fundamental en la geoquí- de transición se encuentra entre las mica del sistema, siendo la comunidad poblaciones de Niebla y San Juan del bacteriana la principal responsable de Puerto, aunque su posición varía según A B Figura 4. Mapa de Río Tinto. (a) Cuenca hidrográfica dividida en cuatro zonas en función de las características topo- lógicas, geológicas y geoquímicas: la zona del origen, la zona del antiguo procesamiento minero, el área de transición y la C zona del estuario, La zona norte es estable en los parámetros hidroquímicos. La zona de transición se encuentra entre las poblaciones de Niebla y San Juan del Puerto, aunque su posición varía según el régi- 30 men de mareas y los cambios estacionales del caudal del río. El estuario, cerca de el régimen de mareas y los cambios es- hemos mencionado anteriormente, Palos de la Frontera, donde el agua de mar tacionales del caudal del río. En esta estas condiciones extremas son pro- provoca precipitacio- zona, los parámetros hidroquímicos ducto de la actividad metabólica de los nes de hierro férrico experimentan variaciones periódicas microorganismos, incluyendo las bac- en forma de sulfuros, debido a su neutralización por influe - terias oxidantes de hierro y azufre, que (b) Imagen de la zona cia del agua de mar, incluyendo un au- se encuentran en gran número en sus del origen del río, (c) Río Tinto a su paso mento del pH (superior a 3) y una dis- aguas. La mayoría de estos procariotas por Salinas, a unos 15 minución de la concentración de hierro son autotróficos. Por lo tanto, además Km del origen. férrico (inferior a 0,2 g L-1). La tercera de promover las condiciones extremas zona es el estuario cerca de Palos de la del hábitat también son productores Frontera, donde el agua de mar provo- primarios [12, 13]. ca precipitaciones de hierro férrico en A pesar de que las características forma de sulfuros y existe, además, actuales de Río Tinto son consecuencia una enorme influencia del Polo Indus- de la actividad oxidadora de hierro de trial de Huelva [24]. los microorganismos que lo habitan, no Dado que la pirita es el sulfuro do- podemos obviar el hecho de que el río minante en la Faja Pirítica Ibérica, el fluye a través de un importante entor- ion férrico es el oxidante dominante no minero que ha dejado numerosos en el río y el principal responsable del drenajes y salidas de mina que vierten pH constante debido a su capacidad sus aguas directamente al cauce del de tamponamiento químico [12]. Como río, siendo especialmente frecuentes Río Tinto y su entorno

en la parte alta de su cauce (Figura 3). con el exterior por las salidas de minas La minería, tanto a cielo abierto como y drenajes. Debido a la presencia de oxí- en galería, implica la profundización geno atmosférico, el hierro ferroso es rá- en el subsuelo buscando las vetas más pidamente oxidado por los oxidadores ricas en mineral, lo que suele suponer de hierro de modo que, en muy pocos alcanzar el agua de la capa freática que metros (en ocasiones centímetros), las ha de ser bombeada fuera para poder aguas pasan a tener un color rojo oscu- seguir con las labores de extracción. ro, muy semejantes a las del mismo cau- Esto suele realizarse a través de canales ce central del río. Además, serán aguas que constituyen las salidas de minas, con un mayor potencial redox y oxígeno las cuales pueden permanecen activas disuelto y una menor temperatura. Ge- muchos años después del cierre de la neralmente, el agua procedente de los mina, suponiendo un grave problema restos mineros que llega Río Tinto está ambiental en la FPI. ya oxidada y sus características son se- Por su parte, los drenajes ácidos de mejantes a las del propio río. mina son el resultado de la lixiviación Gran parte de la extracción del mi- que tiene lugar a través de viejas es- neral en la FPI se ha llevado a cabo me- combreras o pilas de mineral (Figura diante minería a cielo abierto, lo que 3). En ocasiones son también canaliza- genera enormes huecos en el terreno das para disminuir su impacto pero en denominados cortas mineras. Al final - 31 otras aparecen espontáneamente tras zar la actividad industrial, estas cortas un periodo de lluvias. Las característi- acaban por inundarse debido al agua cas geoquímicas de drenajes y salidas de lluvia y a la recuperación del nivel de minas, son muy similares ya que se freático natural de la zona, formando originan de forma parecida. Tanto en el lagos muy profundos de agua ácida interior de una mina como en el interior que, a menudo, contienen concentra- de una pila de mineral o escombreras, la ciones altas de otros metales de tran- concentración de oxígeno es muy baja o sición (Figura 3). En la actualidad, en los nula dando lugar a reacciones metabó- terrenos de la FPI (Huelva y Sevilla), hay licas anaerobias que implican la reduc- más de 25 cortas mineras inundadas, ción del hierro mayoritariamente. Por la mayoría en estado de abandono. El otro lado, en estas localizaciones tienen agua de estos lagos es generalmente lugar reacciones exotérmicas abióticas ácida (pH 3) y presenta concentracio- de síntesis de sulfuros, lo que hace que nes elevadas de sulfato y metales [25]. en el interior de las galerías estas aguas Por sus características, estos lagos se tengan temperaturas moderadamente pueden considerar también como fo- más altas, así como un potencial rédox, cos contaminantes del medio hídrico. una concentración de oxígeno y un pH En muchas ocasiones el agua acaba algo menor que en las aguas superfici - saliendo al exterior, por rebose (cortas les del río. La mayor concentración de de San Telmo o Nuestra Señora del hierro reducido confiere a estas aguas Carmen), filtraciones (Confesionarios, un color verdoso y transparente muy Angostura), o a través de galerías mine- característico. Estas condiciones se ras (Concepción, Peña del Hierro, Tinto mantienen hasta que el agua contacta Santa Rosa), incorporándose a la red fluvial, pudiendo causar graves proble- torno a 3 y se observan concentracio- mas medioambientales [25]. nes de metales pesados como hierro de hasta 99 mg L-1, zinc 2 mg L-1 o cobre 0, 3.3 Comparación con otros 6 mg L-1, lo que supone varios órdenes ambientes ácidos de magnitud menor que las descritas en Río Tinto (Tabla 4) [26]. En cuanto al extremos caso de Perú, el área de drenajes de roca Comparando Río Tinto con otros am- presenta un pH de 3 con concentracio- bientes ácidos extremos, nos damos nes de sulfato en torno a 184 mg L-1 y los cuenta de su singularidad. Si pensamos metales presentan una media de hierro en su origen natural, podemos com- de 44 mg L-1, o zinc 0,26 mg L-1 [27]. parar el río con los drenajes ácidos de También en los Andes, pero en la roca, aunque hasta el momento, no se parte argentina, existe un río que su- ha descrito ningún drenaje natural que pera al Tinto en lo que se refiere a caudal sea tan extenso ni con aguas tan carga- y extensión. Se trata del río Agrio, que das de metales pesados como las que nace en el volcán Copahue en la provin- se encuentran aquí. Dos ejemplos, muy cia de Neuquén, y recorre unos 400 km interesantes, por su extensión y por sus hasta desembocar en el río Neuquén condiciones multi-extremas, son los (Figura 5) [28]. Presenta un pH ácido ex- 32 drenajes ácidos naturales descritos en tremo entre 1 y 3 en su primer tramo du- la Antártida y en el entorno del glaciar rante unos 20 Km, para ir aumentando Pastoruri en los Andes peruanos donde, poco a poco hasta quedar neutralizado además de acidificación y alta concen- a los 40 Km de cauce. El agua tiene un tración de metales, tenemos bajas tem- color amarillo lechoso debido a la alta peraturas y alta radiación UV (Figura 5) concentración de azufre. Por ser de ori- [26, 27]. En ambos casos, la retirada ma- gen volcánico, su acidez es causada por siva de glaciares y zonas cubiertas por microorganismos quimiolitótrofos oxi- hielo como consecuencia del cambio dadores de azufre, siendo la concentra- climático global, está dejando al descu- ción de hierro insignifi ante. Debido a bierto superficies enormes de sulfuros la ausencia de hierro, no existe un tam- masivos de hierro que, hasta la fecha, ponamiento de las aguas y la acidez se estaban inalterados al no estar expues- va perdiendo cuando alcanza el lago tos a la atmósfera. Estas nuevas condi- Caviahue (pH 4) y con la entrada de nu- ciones ambientales están propiciando merosos afluentes que vierten al cauce la actividad de microorganismos oxida- principal. Además de su gran caudal, dores de hierro, lo que tiene como con- el interés añadido de este ambiente es secuencia la acidificación de las aguas que, al originarse desde un cráter volcá- de deshielo. Si comparamos la concen- nico, en sus primeros metros presenta tración de metales de dichas aguas con altas temperaturas, mientras que los las de Río Tinto, podemos ver que, aun- tramos posteriores están sometidos a que son mucho más bajas, sus implica- las bajas temperaturas y alta radiación ciones medioambientales y sanitarias UV características de un entorno de alta son muy importantes. En el caso de la montaña. De este modo, una vez más, Antártida, el pH de los drenajes está en confluyen varias condiciones ambien- Río Tinto y su entorno

A B

Figura 5. Imágenes de otros ambientes ácidos extremos. (a) Glaciar Pastoruri, el deshielo del glaciar en las últimas décadas está provocando una acidificación masiva de las aguas de escorrentía, modificando la flora y fauna del Parque Nacional de Hua - rán (Perú), (b) Río Agrio (Argentina) en su origen, atravesando la zona geotermal que le confiere sus características fisicoquí - cas, (c) Bahía Almirantazgo (Antártida), donde nuevamente, el deshielo está provocando la aparición de drenajes ácidos de roca en numerosos puntos, (d) Río Odiel a su paso por la zona de Beas, en esta zona se observa la influencia de las minas abandon - das que han ido vertiendo aguas ácidas a su cauce y modificando las condiciones físico-químicas del agua. tales extremas que las especies que lo el río antes de las minas es un río de habitan tienen que resistir [28]. aguas neutras que se va cargando de Por su parecido con aguas proce- metales pesados a lo largo del tramo dentes de la industria minera, podemos en el que atraviesa la cuenca minera. Al también comparar Río Tinto con otro de contrario de lo que ocurre en el Tinto, la los grandes ríos que atraviesan la Faja concentración de hierro no es suficie - Pirítica Ibérica, el río Odiel. Ambos ríos temente alta para mantener las aguas fluyen hacia un humedal costero cono- del Odiel tamponadas durante mucho cido como la Ría de Huelva que forma tiempo, por eso, cuando el río deja atrás parte de una importante Reserva Na- la cuenca minera, el pH se eleva nueva- tural (Marismas del Odiel), famosa mente, los metales van precipitando y por su alta diversidad ornitológica y las variables físico-químicas se van nor- por la presencia de vegetación halófil malizando [21]. (Figura 5). Esta zona recibe no sólo los En la cuenca del Odiel las concen- contaminantes transportados por la traciones medias de los principales los ríos Tinto y Odiel, sino también los metales son varios órdenes de magni- residuos de una gran zona industrial tud inferiores a las de Río Tinto (Tabla situada cerca de la ciudad de Huelva. A 4). Sin embargo, la longitud de los dre- diferencia de Río Tinto, el Odiel se ca- najes ácidos de mina a lo largo de su 34 racteriza por grandes variaciones de pH cuenca es mucho más grande y, debido (2,2 a 7,3) a lo largo de su recorrido, una a su mayor caudal, es el principal foco menor conductividad eléctrica (0,16-16 contaminante de metales de la Ría de mS cm-1) y un menor potencial redox Huelva y el Golfo de Cádiz. A lo largo (253-813 mV). Estas grandes variaciones de su cauce, el río Odiel recoge lixivia- son el resultado del diferente grado de dos de más de 30 minas antiguas que mezcla de las aguas neutras de su ca- van modificando las características becera con los drenajes naturales de físico-químicas y la biodiversidad de aguas ácidas con poca carga de metales sus aguas, convirtiéndolo en un ecosis- y con los drenajes ácidos de las minas tema de gran valor para comprender la que vierten sus aguas de manera esca- ecología microbiana de los ambientes lonada a lo largo de su cuenca. Es decir, ácidos [21]. 4. Biodiversidad microbiana de Río Tinto

La biodiversidad presente en las aguas to en las especies procariotas, mientras de Río Tinto es fundamentalmente que la mayor parte de los eucariotas microbiana e incluye especies tanto acidófilos son también capaces de vivir procariotas como eucariotas. Aunque a pH cercanos a la neutralidad. Los or- en algunas partes del río pueden ob- ganismos que toleran otros extremos servarse plantas, al igual que ocurre en físico-químicos (por ejemplo; tempe- otros ecosistemas ácidos extremos, sus raturas muy altas o hipersalinidad), raíces suelen crecer en sedimentos en además de la acidez extrema, tienden a los que el agua intersticial tiene un pH ser menos tolerantes al pH ácidos que 35 sensiblemente superior a 2. En general, aquellas especies que solo pueden to- la biodiversidad microbiana disminuye lerar la acidez extrema, lo que es parti- a pH más ácidos, aunque otros factores cularmente notable entre los acidófilos (por ejemplo; concentraciones de me- eucariotas [10, 13]. tales solubles y otros solutos) pueden Los microorganismos presentes en tener una influencia significativa. Los el río se van a clasificar también por el estudios realizados durante los últimos nicho ecológico en el que se desarro- 30 años sobre extremófilos acidófilos llen. Vamos a distinguir entre los que han demostrado la presencia de este forman parte de la columna de agua, tipo de microorganismos a lo largo de los que se encuentran en el lecho de los todo el “árbol de la vida”, encontrán- cauces, así como los que aparecen en dolos en los tres dominios; Bacteria, los lagos mineros. Además, según don- Archaea y Eukarya, lo que indica que la de se encuentren podremos distinguir acidofília es un rasgo que ha aparecido entre los que son planctónicos y los en muchas ocasiones durante la evolu- bentónicos. Los planctónicos se man- ción de la vida en el planeta, en vez de tienen suspendidos o flotando en la tratarse de un único evento evolutivo columna de agua y, aunque en algunos [10, 13, 29]. casos son capaces de moverse y nadar, Como en el caso de otros extremó- no pueden oponerse a las corrientes ni filos, los acidófilos son formas de vida a la turbulencia del agua. Los bentó- altamente especializadas y adaptadas nicos son los organismos que habitan a unas condiciones muy características, fijados a una superficie en los ecosis- siendo incapaces de crecer en ambien- temas acuáticos, pueden estar entre tes neutros. Esto es especialmente cier- los sedimentos o, más comúnmente, formando asociaciones complejas de- abundantes son tres: Acidithiobacillus, nominadas biopelículas o tapetes mi- Leptospirillum y Acidiphilium, todos crobianos que se distinguen bien en el ellos están implicados en el ciclo del fondo de los cauces fluviales. También hierro y/o del azufre (Figura 6) [12]. La se observan filamentos anclados al presencia constante y abundante de lecho del río o que flotan sobre las su- Acidithiobacillus y Leptospirillum nos perficies y en la columna de agua de los indica el papel protagonista que ocupa lagos estratificados [30-33]. el hierro en el ecosistema del río. Den- Un factor muy importante que contro del género Acidithiobacillus, encon- diciona la distribución de los organis- tramos representantes de las bacterias mos es la presencia de oxígeno y de luz. oxidadoras de hierro: At. ferrooxidans, En las aguas corrientes hay pocas zonas At. ferridurans y At. ferrivorans. De en- anaerobias ya que el flujo permite un tre ellas destaca At. ferrooxidans, ca- intercambio con el aire manteniéndose paz de oxidar el hierro ferroso aeróbi- oxigenadas sobre todo si la profundi- camente y reducir el hierro férrico en dad es baja. Sin embargo, en las zonas condiciones anaerobias (Tabla 5) [10, del cauce por debajo de las biopelícu- 13, 35]. También es especialmente inte- las fotosintéticas, se puede producir resante el papel de Acidithiobacillus fe- 36 una reducción drástica del oxígeno, al rrivorans, que tiene como peculiarida- igual que ocurre en los sedimentos por des su alta tasa de oxidación de hierro debajo de la superficie. En las aguas así como su capacidad de mantener embalsadas, estas zonas anaerobias un metabolismo activo a temperatu- aparecen cuando aumenta la profundi- ras muy bajas. Este microorganismo dad y a veces se ven afectadas por los puede mantenerse activo hasta los cambios de temperatura y la presencia 4ºC, siendo el responsable de procesos de filamentos fotosintéticos en deter- de oxidación de hierro en los momen- minadas épocas del año [30-33]. tos y lugares más fríos [36]. At. ferrivorans ha sido identificado incluso en 4.1 Biodiversidad drenajes ácidos de roca en la Antárti- procariótica da, siendo el principal responsable de la alteración de los sulfuros de hierro El uso combinado de metodologías que están quedando al descubierto de ecología microbiana convencional debido al aumento generalizado de (cultivo, aislamiento de especies y ca- las temperaturas y el consiguiente racterización fenotípica de los aisla- deshielo [26]. Por otro lado, esta espe- dos) y ecología molecular ha llevado a cie es muy eficiente como reductor de la identificación de las especies proca- hierro en condiciones anaerobias (es riotas más representativos de Río Tinto anaerobio facultativo al igual que At. [29, 30, 33 ,34]. En la columna de agua, ferrooxidans). Estas dos característi- más del 80% de las células pertenecen cas fisiológicas, hacen que, en el caso al dominio Bacteria, correspondiendo particular de Río Tinto, At. ferrivorans sólo una pequeña fracción al dominio tenga un papel relevante en las zonas Archaea. Los géneros bacterianos más más profundas, como son las balsas de Biodiversidad microbiana de Río Tinto

Figura 6. Modelo geomicrobiológico de Río Tinto. El elemento central que va a definir las características de Río Tinto es el hi - rro. (1) El hierro ferroso es oxidado por bacterias quimiolitótrofas, mayoritariamente por microorganismos autótrofos como At. ferrooxidans, At. ferrivorans y Leptospirillum y, en menor medida, por microorganismos heterótrofos. Como resultado de este metabolismo, se acidifica el medio y se oxida el hierro, dando lugar a las aguas rojas y ácidas que caracterizan el río, (2) La alta concentración de hierro férrico en disolución es responsable del tamponamiento del agua, (3) En las zonas anaerobias es donde se cerrará el ciclo del hierro, siendo reducido autótrofamente por bacterias del género Acidithiobacillus y, de forma heterótrofa, por otros microorganismos como Acidiphilium, Acidocella, Acidisphaera, etc. Además, Acidiphilium puede hacer esta función en microaerobiosis, con hasta un 60% de oxígeno disuelto. En la mayoría de los casos, esta reducción de hierro está acoplada a la oxidación de azufre, (4) El azufre también puede ser oxidado aeróbicamente por todas las especies del género Acidithiobacillus, (5) A pesar de las grandes cantidades de sulfato, la sulfatorreducción es minoritaria en estas aguas, quedando reducida a unos pocos microambientes, donde Desulfosporosinus, podría estar llevando a cabo esta reacción. TABLA 5. Biodiversidad procariota fina

Fuente Reductor Fuente de Temperatura Filogenia Microorganismo de facultativo Presencia en RT energía óptima carbono de hierro Acidithiobacillus AO Fe +, S, H Sí Mesófilo ferrooxidans 2 2 + At. ferridurans A. Fe2 , S, H2 Sí Mesófilo Muy abundante + Filo: Proteobacteria At. ferrivorans AO Fe2 , S Sí Psicrotolerante Clase: + At. ferriphilus AO Fe2 , S Sí Mesófilo Acidithiobacillia At. thiooxidans AO S No Mesófilo Esporádicamente Esporádicamente At. caldus AO S, H2 No Termotolerante en alguna salida de mina Acidiphilium spp. HO CO Sí Mesófilo Filo: Proteobacteria Clase: Acd. organivorans HO CO No Termotolerante Muy abundante Alphaproteobacteria Acidocella spp. HO CO Sí Mesófilo Filo: Proteobacteria Aparece + Clase: Ferrovum AO Fe2 No Psicrotolerante especialmente en Betaproteobacteria macrofilamentos Leptospirillum AO Fe + No Mesófilo 38 ferrooxidans 2 + Nitrospirae L. ferriphilum AO Fe2 No Termotolerante Muy abundante + L. rubarum AO Fe2 No Mesófilo + L. ferrodiazotrophum AO Fe2 No Mesófilo + Ferrimicrobium HO Fe2 Sí Mesófilo Aparece especialmente en Acidimicrobium AF Fe + Sí Termotolerante 2 macrofilamentos. + La presencia de un Actinobacteria Ferrithrix HO Fe2 No Termotolerante género u otro se + “Acidithiomicrobium” HO Fe2 No Termotolerante debe sobre todo, + a su temperatura “Acidithrix” HO Fe2 No Termotolerante óptima. + Sulfobcillus spp. FA CO, Fe2 , S, H2 Sí Termotolerante En sedimentos CO, algunas Algunas y a veces en Firmicutes Alyciclobacillus spp. HO o FA especies Termotolerante + especies macrofilamentos Fe2 ó S

Bacteria Desulfosporosinus spp. HO CO Sí Termotolerante + Ferroplasma spp. HO Fe2 Sí Termotolerante Esporádicamente No se ha Thermoplasmata Acidiplasma spp. HO Fe + Termotolerante en alguna salida 2 probado de mina

Archaea Thermoplasma spp. HO CO No Termófila AO = Autótrofo obligado; HO =Heterótrofo obligado; AF=Autótrofo facultativo; CO= Compuestos orgánicos

agua, donde la temperatura y la con- la temperatura del agua del río puede centración de oxígeno son menores. descender hasta los 6ºC. Además, también tiene un papel rele- En cuanto a las especies del género vante en las épocas invernales, donde Leptospirillum, como su nombre indica, Biodiversidad microbiana de Río Tinto

son bacterias con forma de coma o es- géneros asociados como son, entre pirilo. A menudo las células no se sepa- otros, Acidiphilium, Acidocella, Sulfoba- ran al dividirse con lo que se producen cillus, Acidiferrobacter y Ferrimicrobium, largas espirales de hasta 5 micras de dando lugar a comunidades complejas tamaño. Es la única bacteria detectada [30, 37]. en Río Tinto con morfología de espirilo, Otra peculiaridad del género Leptos- lo que permite una rápida identificació pirillum es que su pH óptimo es inferior de la misma al microscopio óptico (Figu- al de Acidithiobacillus, por lo que apare- ra 7). Todos los Leptospirillum aislados o ce en las zonas más ácidas del río. Ade- detectados en el río son oxidadores de más, tanto en el caso de Acidithiobacillus hierro y estrictamente aerobios, aun- como en el de Leptospirillum, el produc- que demuestran una alta capacidad de to principal de su metabolismo, el ion soportar concentraciones bajas de oxí- férrico, cuando se encuentra en altas geno, puediendo formar estructuras de concentraciones produce la inhibición resistencia en los momentos en los que de su crecimiento. En el río y otros dre- las condiciones ambientales son adver- najes ácidos, el ion férrico se acompleja sas. Estas peculiares formas de resisten- con sulfatos e hidróxidos formando pre- cia no son más que las células individua- cipitados como la jarosita, la schwert- les de Leptospirillum, que se recubren de mannita o la limonita. Estos precipita- exopolisacáridos hasta el punto de que, dos ocurren alrededor de las especies 39 al microscopio, pueden verse como pe- oxidadoras de hierro que se depositan queños cocos (Figura 7). Encontramos en los sedimentos. El género Leptospiri- representantes de todos los grupos del llum parece resistir mejor la inhibición género, L. ferrooxidans, L. ferriphilum, L. de crecimiento por férrico o por hidróxi- ferrodazotrophum y L. rubarum, aunque dos de hierro y sulfatos. El motivo puede predomina L. ferriphilum, que es la es- ser su gran capacidad de excretar EPSs pecie que soporta mayor temperatura para protegerse de un ambiente ad- pudiendo llegar a tener actividad meta- verso o el hecho de que, al tener un pH bólica hasta los 40ºC (Tabla 5). Como ya óptimo más bajo que Acidithiobacillus, se ha anticipado, los Leptospirillum son aparecen en lugares donde la formación productores eficientes de Sustancias Po- de precipitados en forma de hidróxidos liméricas Extracelulares (EPSs) lo que les es menor [30, 37]. permite mantenerse unidos formando Como hemos visto, At. ferrooxidans, filamentos. Estos filamentos suelen ser At. ferrivorans y las especies del género de pequeño tamaño (1-2 cm), tienen un Leptospirillum son oxidadores de hierro extremo adherido al sustrato del río y se y, por tanto, compiten por el mismo ni- mueven siguiendo la corriente, consti- cho ecológico, por lo que los vamos a tuyendo un nicho ecológico ideal donde encontrar en el río de forma alterna. La los microorganismos tienen oxigena- predominancia de un género respecto ción, sujección y fácil acceso a su fuente a otro va a depender de sus peculiari- de energía. Aunque en Río Tinto estas dades fisiológicas, como ya anticipá- estructuras filamentosas suelen estar bamos en los párrafos anteriores. En formadas por Leptospirillum como géne- general, las bacterias del género Lep- ro mayoritario, también aparecen otros tospirillum predominan en la zona alta A B

C D

E F G

H I

Figura 7. Microorganismos procariotas más característicos de Río Tinto. (a, b) Imágenes de microscopía de fluorescencia de una hibridación in situ (FISH) con una sonda específica de Acidithiobacillus. Las barras equivalen a 5 micras. (a) Células totales hibridadas con el fluorocromo de contraste (DAPI), (b) Células marcadas con la sonda, a simple vista, puede apreciarse que Aci- dithiobacillus era el microorganismo más abundante de la muestra. (c, d) Fotografías de un cultivo de Leptospirillum procedente de Río Tinto observado a microscopía óptica de contraste de fases. Se pueden observar células individuales en forma de vibrio, así como espirales de dos o más células. La barra equivale a 2 mm. (e, f, g) Micrografías TEM de células de Leptospirillum donde se puede observar la variabilidad de su morfología. Las barras equivalen a 0.2 micras. Las células individuales (e) generan gran cantidad de EPSs que llegan a encapsularlas por completo y le pueden dar apariencia de coco. Cuando las células no se separan al dividirse acaban formando filamentos en forma de espiral (f). Posee un único flagelo polar como se aprecia en la figura (g, Imagen de microscopía de fluorescencia de un cultivo de Acidiphilium aislado de Río Tinto y teñido con DAPI. La barra equivale a 5 micras. (i) Microscopía de fluorescencia de una hibridación in situ (FISH) donde se observa en rojo (fluorocromo Cy3) filame - tos de Ferrimicrobium y en verde células autofluorescentes de Chlorella. Los filamentos finos y a menudo de buen tamaño, so un buen soporte para la formación de biopelículas tanto procarióticas como eucarióticas. La barra equivale a 5 m. Biodiversidad microbiana de Río Tinto

del río (nacimiento y en las proximida- el microorganismo más abundante. des a la antigua mina de Peña de Hie- Esto se hace especialmente evidente rro). Este hecho, podría estar relaciona- en invierno cuando, en buena parte do con las condiciones más extremas del cauce del río, esta especie despla- de estas zonas. Se trata de los puntos za completamente a At. ferrooxidans. en los que el pH es siempre más bajo y Por el contrario, en las pilas de mineral, con mayor concentración de ion férrico, y debido a las reacciones exotérmi- condiciones a las que se adapta mejor cas abióticas y al menor contenido en Leptospirillum que otros quimiolitoau- agua, la temperatura en el centro de las tótrofos oxidadores de hierro y azufre. mismas suele ser alta, provocando la Además, en general, la temperatura del aparición de otras bacterias reductoras agua es siempre mayor en el curso alto de hierro como las actinobacterias Aci- del río ya que la columna de agua es, en dimicrobium, Ferrithrix y “Acidithiomi- general, más pequeña que en el resto crobium”, los clostridios Sulfobacillus y del cauce. Esto hace que esta zona sea Alicyclobacillus o algunas arqueas de la más adecuada para el crecimiento de clase Thermoplasmata. De este modo, Leptospirillum que para Acidithioba- debido a su alta versatilidad metabóli- cillus, apareciendo estos lugares fre- ca, At. ferrooxidans sería la especie pre- cuentemente tapizadas por filamentos sente en más lugares del río, ocupando ricos en Leptospirillum, lo que es aún los nichos ecológicos que no son ópti- 41 más evidente en verano cuando sube la mos para Leptospirillum u otros oxida- temperatura del agua [30, 37]. dores de hierro o azufre que crecen en En la región media del río, a la al- condiciones más extremas y restringi- tura de la localidad de Berrocal, pre- das de pH [30, 37]. domina At. ferrooxidans. En esta zona, En los lugares donde el agua es más el pH, el potencial rédox y las concen- fría por tener más profundidad parece traciones no excesivamente altas de haber un predominio de At. ferrivorans. hierro férrico se acercan a las condi- Esto se hace especialmente evidente ciones óptimas para el crecimiento de en invierno, cuando, en buena parte del esta bacteria (Tabla 5). Por otro lado, la cauce, desplaza completamente a At. concentración de zinc y cobre son ma- ferrooxidans. Donde no existe compe- yores, lo que favorece la presencia de tencia entre ambos géneros es en las At. ferrooxidans frente a otras bacterias zonas anaerobias del río como son el oxidadoras de hierro. Esta especie está fondo de las presas, sedimentos pro- presente en más lugares debido a su fundos, pozos mineros, pilas de mine- alta versatilidad metabólica, ocupando ral o fondos de cortas. En estos lugares, los nichos ecológicos que no son ópti- Acidithiobacillus, junto con otros reduc- mos para Leptospirillum u otros oxida- tores de hierro que veremos a conti- dores de hierro o azufre que crecen en nuación, cobran total protagonismo. condiciones más extremas y restringi- En el caso de las presas, las cortas, los das de pH. En el caso de las presas, las sedimentos o los pozos la temperatura cortas, los sedimentos o los pozos, la suele ser baja por la falta de radiación temperatura suele ser baja por falta de solar, siendo At. ferrivorans el protago- radiación solar, siendo At. ferrivorans nista de la biodiversidad procariota. El tercer género en abundancia en especialmente diversas. En ellas, apa- la columna de agua, Acidiphilium, es recen los tres géneros mayoritarios una especie acidófila heterótrofa con siendo, además, identificados otros un metabolismo diverso (Tabla 5). En acidófilos como la Betaproteobacteria aerobiosis obtiene su energía a partir “Ferrovum” y la Gammaproteobacte- de compuestos orgánicos mientras ria Acidiferrobacter, las Actinobacteria que, en condiciones anaerobias, es ca- Ferrimicrobium, Acidimicrobium, Fe- paz de oxidar azufre utilizando hierro rrithrix, Aciditerrimonas, “Acidithrix”, como aceptor de electrones y com- “Acidithiomonas”, los Clostridia Sulfo- puestos orgánicos como fuente de bacillus y Alicyclobacillus o las arqueas carbono. Este género es frecuente que Ferroplasma y Acidiplasma. Todos aparezca junto con Acidithiobacillus o estos acidófilos están relacionados Leptospirillum, ya que elimina los com- con el ciclo del hierro o del azufre y puestos orgánicos que son tóxicos para su presencia estará determinada por los oxidadores de hierro acidófilos. Esta detalles como las diferencias en su asociación entre especies resulta muy temperatura o pH óptimos de creci- efectiva permitiendo que Acidiphilium miento. Entre ellas, las actinobacte- aparezca distribuido a lo largo de todo rias son especialmente interesantes el cauce del río, tanto en la columna de porque debido a su morfología, largos 42 agua como en los sedimentos o en las filamentos muy finos que se entre cru- biopelículas. En la parte alta del río apa- zan, tienen la función de cohesionar recen diversas especies de Acidiphilium las células en las biopelículas proca- como son A. cryptum, A. organovorum y riotas, pudiéndose observar macrofi- A. multivorum mientras que en la par- lamentos de hasta varios metros de te baja, entre las localidades de Berro- longitud. Estos macrofilamentos sue- cal y Palma del Condado, Acidiphillium len aparecer en zonas de aguas tran- es menos abundante. Su presencia es quilas como las presas localizadas en sustituida por otras Alphaproteobacte- el cauce alto del río, siendo muy pro- ria filogenéticamente muy próximas a bable que procedan del fondo de las ella, como son Acidocella y Acidisphae- mismas, donde la concentración de ra. Este hecho podría estar relacionado oxígeno es muy baja. Por este motivo, con la relativa sensibilidad al cobre que los géneros que los conforman suelen muestran la mayoría de las especies de ser anaerobios facultativos reductores Acidiphilium [10, 30, 37]. de hierro como; At. ferrooxidans, At. Aunque estos tres géneros bacte- ferrivorans, Acidiphilium, Alicyclobaci- rianos son los más abundantes en la llus, Sulfobacillus o las mismas actin- columna de agua de Río Tinto, gracias obacterias; Acidisphaera, “Ferrovum” o a la aparición de técnicas de secuen- Acidiferrobacter [33]. ciación masiva se han identificado nu- Las arqueas de la clase Thermoplas- merosas especies procariotas que no mata como Acidiplasma y Ferroplasma habían sido detectadas anteriormente también aparecen en la zona más alta al ser muy minoritarias. Entre ellas, del río donde el pH es más bajo y la in- las biopelículas tanto fotosintéticas fluencia de la mina es mayor. Aunque como procariotas han resultado ser en principio la temperatura del agua Biodiversidad microbiana de Río Tinto

en estas zonas no es la más apropiada microorganismo esté fermentando o para encontrar este tipo de arqueas reduciendo hierro en los sedimentos termófilas moderadas, hay que tener del río, aunque no debemos obviar la en cuenta que durante el verano la posibilidad de que intervenga en el ci- temperatura puede ser mucho más ele- clo del azufre. De hecho, se ha descrito vada. Además, en las salidas las minas que esta bacteria en condiciones áci- y en las pilas de mineral, el agua que das es capaz de participar en un proce- fluye al río está más caliente debido a so de sulfurogénesis en colaboración la actividad litotrófica que tiene lugar con heterótrofas acidófilas (Acidocella, en su interior. Alicyclobacillus, Acidisphaera y Acidi- Las comunidades bacterianas aso- philum) [30]. ciadas a los sedimentos también han En resumen, la columna de agua resultado más diversas que la colum- es un reflejo de los géneros más abun- na de agua. Los oxidadores de hierro dantes presentes en las biopelículas y quimiolitoautótrofos siguen siendo sedimentos; Acidithiobacillus, Leptospi- los protagonistas, pero la menor ho- rillum y Acidiphilium, pero no hay que mogeneidad que caracteriza a los se- olvidar que la diversidad del sistema es dimentos hace que la posibilidad de mayor a la de estos tres géneros. encontrar microambientes sea mayor. En el lecho alto del río nos encontra- 4.2 Biodiversidad 43 mos precipitados de hidróxidos de hie- eucariótica rro y sulfatos que mantienen una estructura coloidal, siendo zonas en las Normalmente se asume que las altas que la diversidad no difiere mucho de concentraciones de metales presen- la columna de agua. En el caso del cur- tes en los hábitats ácidos extremos so medio aparecen sedimentos en los limitan el crecimiento y la diversidad que a menudo la concentración de oxí- de los eucariotas debido a su gran to- geno es muy baja. En estos lugares nos xicidad. También se ha propuesto que encontramos con las anaerobias facul- la deposición de hidróxidos metálicos tativas que ya conocemos: Acidithio- característica de estos ecosistemas bacillus, Acidiphilium, Acidisphaera, puede cambiar las condiciones físico- Sulfobacillus, Alicyclobacillus, Metalli- químicas de las superficies de rocas y bacterium, Ferrimicrobium, etc., pero, sedimentos, limitando drásticamente además, hay una nueva bacteria que el crecimiento de los microorganismos cobra protagonismo: Desulfosporosi- eucariotas. Sin embargo, la presencia nus. Estos organismos soportan pH de biopelículas densas de diferentes por debajo de 4 y puede formar endos- colores tapizando grandes superficies poras, lo que le hace muy persistente en el fondo del río así como la presen- aunque las condiciones ambientales cia de grandes masas de microalgas no sean siempre las adecuadas. Es una filamentosas flotando en la superficie bacteria fermentadora, reduce hierro del agua, son características comunes y puede hacer sulfatorreducción. La del cauce de Río Tinto (Figura 8). De he- alta acidez del río no favorece la sul- cho, las algas eucarióticas contribuyen, fatorreducción y, probablemente, este al menos, con el 60% de la biomasa del A B

C D

E F

Figura 8. Imágenes de biopelículas eucarióticas de Río Tinto. (a) Filamentos bacterianos cubiertos por Chlorella, (b) Filamentos de Zygnemopsis y Klebsormidium a su paso por la localidad de Berrocal. (c) Biopelículas compuestas por diatomeas del género Pinnularia y Chlorella, (d) Biopelículas de Cyanidium asociados a formaciones rocosas en la zona del origen del río, (e) Biopelícu- las de Chlamydomonas acidophila situados en fondo del cauce del río, muy frecuentes en el río a su paso por Nerva, (f) Extensas biopelículas formadas por Euglena mutabilis y Pinnularia cubiertas por filamentos del alga verde Zygnemopsis. Biodiversidad microbiana de Río Tinto

A B C

D E F

45 G

Figura 9. Micrografías e imágenes de algunos de las especies eucariotas más frecuentes de Río Tinto. (a) Micrografía de un helio- zoo del género Actinophrys, (b) Micrografía de microscopía óptica del protista fotosintético Euglena mutabilis, (c) Micrografía de un biofilm formado por especies de los géneros de diatomea Pinnularia y de la microalga roja Cyanidium, (d) Ameba del género Vahlkampfi aislada de las aguas del río, (e) Diatomeas del género Pinnularia, el más frecuente en Río Tinto, (f) Alga filament - sa Klebsormidium spp., (g) Extensos arbustos de la planta Erica andevalensis o brezo minero, distribuida a lo largo del borde del cauce del río, sobre todo en la parte del origen del mismo. río [34]. Esta inesperada abundancia y lamentos en la superficie del agua que biodiversidad eucariota convierte a Río pueden superar un metro de longitud. Tinto en uno de los ecosistemas ácidos Durante el invierno casi desaparecen extremos más únicos descritos hasta la debido, probablemente, al aumento en actualidad. la velocidad de la corriente de agua, lo que dificulta el mantenimiento de es- 4.2.1 Microalgas acidófilas tas estructuras. La biodiversidad eucariota de Río Tin- Las razones del predominio de es- to incluye especies pertenecientes a tas especies en concreto, no solo en Río muchos de los principales linajes euca- Tinto sino en otros ecosistemas ácidos riotas [15-19, 34]. La mayoría de las es- extremos, parecen encontrarse en su pecies eucariotas que habitan en el río gran capacidad de adaptación y su alta son especies de microalgas fotosintéti- especialización ecofisiológica. Esto les cas. Entre ellas, las clorófitas relaciona- ha permitido tener ventaja al colonizar das con los géneros Chlamydomonas, ambientes en los que la presión preda- Dunaliella y Chlorella, cianidiales, dia- toria por parte de otras especies es muy tomeas, crisófitas, así como el protista baja. En este sentido, una de las princi- fotosintético Euglena mutabilis, son los pales estrategias metabólicas para su- géneros eucariotas dominantes que perar la limitación en la concentración 46 aparecen formando grandes biopelí- de carbono necesario para la actividad culas verdes y marrones a lo largo del fotosintética, y que es muy característi- lecho del río (Figura 9). Los géneros de ca de los ambientes ácidos, es la mixo- diatomeas, Eunotia y Pinnularia, están trofía, es decir, poder alternar la auto- ampliamente distribuidas a lo largo trofía y la heterotrofía. La mixotrofia y del cauce del río [17, 18]. Estas especies la capacidad de migración en la colum- son conocidas por su alta tolerancia a na de agua para encontrar la luz y los los metales y al pH ácido, siendo fre- nutrientes óptimos son características cuentes también en otros ambientes de dos de los principales componentes ácidos. La baja diversidad de diatomeas de la comunidad eucariótica en aguas presentes en Río Tinto en comparación ácidas: Euglena mutabilis y Chamydo- con la diversidad que se encuentra en mona acidophila [38]. las aguas dulces vecinas apoya la idea Las zonas más ácidas y extremas de que existe un umbral entre pH 4,5 y del río están habitadas por dos es- 3,5 en el que desaparecen muchas especies relacionadas con los géneros pecies de diatomeas. La presencia de Dunaliella (Chlorophyta) y Cyanidium algas filamentosas de los géneros Zyg- (Rhodophyta). Dunaliella acidophila nemopsis y Klebsormidium es muy fre- es uno de los acidófilos más extremos cuente, sobre todo en los meses cálidos descritos, teniendo su pH óptimo de y secos de verano cuando la evapora- crecimiento entre 0 y 3. Por su parte, ción es mayor y las condiciones físico- Cyanidium es uno de los pocos euca- químicas del agua alcanzan valores to- riotas descritos hasta el momento, davía más extremos. Estas microalgas junto con algunos hongos, capaces filamentosas suelen adherirse a los se- de crecer a pH 1. El orden Cyanidiales dimentos del fondo y forman largos fi- está formado por un grupo de algas Biodiversidad microbiana de Río Tinto

rojas unicelulares con pH óptimos de La luz es otro factor limitante para crecimiento entre 0,5 y 3 y altas tem- la fotosíntesis en este tipo de ecosis- peraturas (50-55°C). Es muy frecuente temas ya que las grandes concentra- encontrarlos alrededor de las aguas ciones de metales disueltos, sobre termales y fumarolas de azufre ácido todo de hierro, hace que las aguas de así como en algunas zonas relaciona- estos ambientes sean de un color rojo das con drenajes ácidos entre las que intenso en muchas zonas, disminuyen- se encuentra Río Tinto [16, 18]. do drásticamente la cantidad de luz Las cianidiales tienen una mor- disponible para los microorganismos fología relativamente sencilla que fotosintéticos. Esto no supone un pro- consiste en una célula esférica con blema para las cianidiales que están una gruesa pared celular, un cloro- muy bien adaptadas a la falta de luz plasto alrededor del núcleo, hasta por crecer frecuentemente de manera tres mitocondrias y una gran vacuo- endolítica estando la disponibilidad de la. Representan uno de los grupos luz está severamente disminuida en el de algas más antiguos situados fi- interior de las rocas. A pesar de esto, logenéticamente en la base de las para este grupo se han descrito tasas algas rojas (Rhodophyta). Su aparato de actividad fotosintética que están en fotosintético parece representar un el mismo rango que el de otras algas estado de transición entre las ciano- verdes unicelulares, como Chlorella. 47 bacterias y los cloroplastos eucariotas Por otro lado, también se han obser- donde no existe estructuración de los vado fenómenos de fotoinhibición que tilacoides, tal y como ocurre en los indican una sensibilidad pronunciada cloroplastos de plantas superiores y a altos niveles de luz. El motivo de la algas verdes. Tanto las cianobacterias extraordinaria eficiencia fotosintética como las cianidiales presentan fico- que presentan estas microalgas parece bilisomas, que son complejos supra- encontrarse en el Fotosistema I (Pho- moleculares de pigmentos encontra- tosystem I-light harvesting complex I dos en la superficie de la membrana (PSI-LHCI)), que presenta importantes tilacoidal que sirven, principalmente, diferencias en cuanto a tamaño y for- como antenas recolectoras de luz en ma al compararlo con el de otras algas cianobacterias y algas rojas. Además, verdes. Estudios de análisis espectros- Cyanidium tiene una enorme versa- cópicos han demostrado que la unión tilidad metabólica, pudiendo crecer funcional de las proteínas del LHCI al como un heterótrofo en ausencia de Fotosistema I es mucho más compacta luz, al igual que ocurre en algunos que en el resto de organismos euca- protistas fotosintéticos como Eugle- riotas fotosintéticos descritos hasta el na, mostrando una gran tolerancia momento. Esta compactación permite a concentraciones elevadas de sa- a las cianidiales tener una mayor efi- les y metales pesados. Todo esto les ciencia fotosintética en condiciones de convierte en unos de los principales muy baja intensidad lumínica, lo que componentes de las comunidades eu- les facilita la colonización de nichos cariotas en casi todos los ambientes ecológicos inaccesibles para otro tipo ácidos extremos [39]. de organismos fotosintéticos [39]. 4.2.2 Euglenófitos y protozoos aparecen frecuentemente habitando acidófilos ambientes ácidos y que juegan un pa- Euglena mutabilis es uno de los protis- pel clave en la cadena alimentaria pelá- tas más extendidos en los ambientes gica de los lagos mineros ácidos. Entre ácidos de todo el planeta (Figura 9). Se ellos figuran varias especies de ciliados ha encontrado en comunidades micro- (i.e. especies pertenecientes a los géne- bianas de lagos volcánicos ácidos, zo- ros Urotricha, Oxytricha y Frontonia), nas geotérmicas ácidas y en drenajes flagelados (i.e. Ochromonas y Bodo), ácidos de minas, siendo considerado un amebas (i.e. Vahlkampfi y Naegleria) bioindicador de estos ecosistemas [40]. o heliozoos (i.e. Actinophyrs) (Figura 9) Debido a su metabolismo fotosintético [41, 42]. Muchas de estas especies no y a su abundancia, este protista des- son acidófilas sino que son ácido-tole- empeña un papel muy importante en rantes, pudiendo crecer en una amplia la producción primaria en esos entor- gama de pH. En las cortas ácidas mine- nos oligotróficos, pudiendo influir en ras, el fitoplancton suele estar domina- la diversidad y el metabolismo de toda do por el flagelado mixotrófico Ochro- la comunidad microbiana mediante la monas spp. [43]. Los ciliados parecen secreción de metabolitos. E. mutabilis tener una importancia menor en estos secreta metabolitos al medio externo, ambientes en relación con los lagos 48 incluyendo un gran número de ami- mesotróficos de pH neutro [44]. noácidos, compuestos de poliaminas, urea y algunos azúcares, pero no ácidos 4.2.3 Hongos y levaduras acidófilas grasos, lo que produce una contribu- Las microalgas y los protozoos acidó- ción selectiva de materia orgánica en filos han recibido más atención a la los ecosistemas ácidos [40]. Estos exu- hora de ser estudiados que los hongos dados pueden tener un impacto crucial y las levaduras a pesar de que se les en la comunidad bacteriana ya que los reconoce su activa participación en la procariotas transportan y reciclan la acidificación de entornos ricos en sul- mayoría de los metabolitos secretados furos [45]. Además, la mayoría de los por E. mutabilis. En consecuencia, este estudios relacionados con estos orga- protista puede desempeñar un papel nismos se han centrado en aspectos indirecto pero importante, no sólo en relacionados con la biodiversidad y se las zonas afectadas por drenajes ácidos sabe poco sobre su fisiología o sus in- de minas sino también en otros nichos teracciones con otras especies. Entre ecológicos que a menudo se conside- los hongos filamentosos se encuentran ran limitados por el nitrógeno. E. mu- algunos de los microorganismos más tabilis forma densas y extensas biope- acidófilos que se han descrito hasta la lículas a través de un comportamiento actualidad. Las especies Acontium cyla- fototáctico y aerotáctico, siendo capaz tium, Trichosporon cerebriae o Cepha- de moverse a través de los precipitados losporium sp. son capaces de crecer a que periódicamente cubren los tapetes un pH de aproximadamente 0 [45]. Sin microbianos en los ambientes ácidos. embargo, la mayoría de los hongos que Además de los euglenófitos existen viven en hábitats ácidos deben consi- otros grupos de protozoos que también derarse acido-tolerantes en lugar de Biodiversidad microbiana de Río Tinto

estrictamente acidófilos, ya que sue- En cuanto a las levaduras, los es- len poder crecer también a pH neutro tudios referentes a ellas en entornos o incluso alcalino. La mayoría de los ácidos son aún más escasos y suelen estudios de campo sobre hongos aci- referirse a estudios de biodiversidad dófilos se han llevado a cabo sólo con más que a los mecanismos de adapta- muestras de suelo, describiéndose más ción al estrés ácido. Se han identific - de 80 especies diferentes. do tres nuevas especies de levaduras Entre los hongos Ascomicetes se basidiomicetales asexuales en el en- han descrito especies pertenecientes torno de Río Tinto y de la Faja Pirítica a los Hemiascomicetos y Euascomice- Ibérica; Cryptococcus aciditolerans, tos en la Faja Pirítica Ibérica (FPI) (i.e. Cryptococcus ibericus y Cryptococcus géneros Glomerella y Lecytophora), así metallitolerans pertenecientes al or- como levaduras basidiomicetales per- den Filobasidiales y que forman un cla- tenecientes a las clases Himenomice- do bien separado [45]. Estas especies tos y Urediniomicetos [46]. Estas espe- de Cryptococcus son aparentemente cies también se han descrito en zonas especialistas en ambientes ácidos, ya geotermales ácidas [45]. Los hongos que requieren un pH bajo para su cre- parecen desempeñar un papel impor- cimiento, propiedad que no se había tante en los entornos ácidos al formar observado antes en las levaduras. Los biopelículas en las superficies de las ro- aislamientos fúngicos más comunes 49 cas junto con otras especies. Estas bio- son especies del género Rhodotoru- películas son el lugar de precipitación la, que se encuentran con frecuencia de metales y minerales y proporcionan en drenajes ácidos de minas así como un soporte físico a otras poblaciones y las Artroconidias, donde destaca el microbianas. Los hongos pueden mos- género Trichosporon sp., aunque tam- trar una gran resistencia a los metales bién se han encontrado otros géneros secuestrándolos, lo que permite que como Candida, Cryptococcus y Purpure- otras especies de microorganismos ocillium en entornos extremadamente menos tolerantes sean capaces de co- ácidos [47]. A pesar de que no se sabe lonizar su entorno [46]. En este sentido, prácticamente nada del papel que jue- la especie de hongo Purpureocillium li- gan las levaduras en la ecología de los lacinum aislada del Río Tinto precipita ambientes ácidos sí se han descrito específicamente la hidronio-jarosita. relaciones mutualistas entre E. mu- El mineral comienza a nuclearse en la tabilis y Cryptococcus. Cuando ambas pared fúngica de las células tanto vivas especies crecen juntas, la tolerancia de como muertas así como en las Sustan- las euglenas a un pH bajo así como a cias Poliméricas Extracelulares (EPSs) elevadas concentraciones de metales, secretadas por las células. El hongo es entre 10 y 100 veces mayor que en actúa como núcleo de cristalización ausencia de la levadura. para la precipitación pasiva de jarosita, favoreciendo una sobresaturación 4.2.4 Plantas iónica local y que ayuda a conformar y Otro aspecto importante a tener en controlar las propiedades geoquímicas cuenta es que la cuenca de Río Tinto del entorno [47]. no solo está habitada por organismos eucariotas unicelulares, si no que po- condiciones ácidas en los tejidos de I. demos encontrar diferentes plantas cylindrica, sugiere que el metabolismo creciendo en los suelos ácidos de las del hierro en las plantas es mucho más orillas del río. Las estrategias utiliza- complejo y versátil de lo que se pensa- das por estas plantas para superar los ba hasta ahora. Creemos que la acumu- problemas fisiológicos asociados a las lación de hierro, en forma de ferritina, a condiciones extremas del hábitat son nivel estructural y celular no sólo tiene diversas. Algunas son resistentes a los una función de almacenamiento de un metales pesados concentrados en los elemento crítico para el desarrollo de la suelos en los que crecen [48, 49]. Otras planta, sino que también desempeña concentran específicamente los meta- un papel fundamental en la preven- les en diferentes tejidos vegetales. ción el daño celular producido por el Imperata cylindrica es, probable- estrés oxidativo. La ferritina protege a mente, la planta más común relacio- las células del estrés oxidativo al mis- nada con los ambientes ácidos, al me- mo tiempo que almacenan hierro para nos en la Faja Pirítica Ibérica. Es una su uso en las funciones celulares que lo gramínea perenne con rizoma rastrero requieren [49, 50]. que crece en suelos ribereños forman- Además, también podemos encon- do comunidades de pastos altos en trar muy distribuido a lo largo de la Faja 50 manantiales y bancos de arena y se Pirítica Ibérica, el brezo endémico Erica encuentra frecuentemente creciendo andevalensis (Figura 9). Los suelos aso- en las orillas de Río Tinto. El estudio de ciados a las poblaciones de Erica son la distribución elemental de los meta- muy ácidos y bajos en disponibilidad les ha confirmado que es una planta de nutrientes, y estas plantas tienen hiperacumuladora de hierro, corres- que lidiar con un complejo entorno de pondiendo a este metal más del 1% raíces entre la escasez de nutrientes de su peso seco. El hierro se acumula y la toxicidad de los metales pesados. principalmente en forma de jarosita y Esta especie es capaz de tolerar las ferritina, siendo el contenido de metal duras condiciones ambientales de las mucho mayor en los rizomas que en las zonas mineras sin síntomas aparen- hojas [48, 49]. La jarosita se acumula tes de toxicidad, incluso en individuos principalmente en las raíces y los rizo- que crecen en las orillas del río con sus mas, mientras que la ferritina se en- raíces parcialmente sumergidas en el cuentra acumulada principalmente en agua ácida. La capacidad de sobrevivir los tejidos epidérmicos, parenquima- en esos suelos depende de diferentes tosos y vasculares de los brotes y hojas estrategias para hacer frente a las al- de I. cylindrica, encontrándose sobre tas concentraciones de metales como todo en las paredes celulares y en el ci- son la disminución de la absorción o el toplasma. Las acumulaciones de hierro transporte de elementos, la desintoxi- son claramente visibles en la superficie cación mediante la unión con ligandos del rizoma, formando extensos depó- orgánicos y la compartimentalización sitos en la epidermis abaxial y adaxial intracelular [51]. Las plantas de Erica no de las hojas. La presencia de la jarosita, hiperacumulan elementos como el co- un mineral que sólo puede formarse en bre y el plomo y la presencia del metal Biodiversidad microbiana de Río Tinto

de la raíz, junto con las tasas de creci- Esta bimodalidad estacional influye en miento lento, proporcionan protección gran medida en la biomasa de la comu- contra la toxicidad por la presencia ex- nidad fotosintética. En invierno el flujo cesiva de metales en el suelo. de agua puede ser muy rápido (ca. 0,25 Todos estos trabajos demuestran m sg-1) en algunos puntos, eliminando que los eucariotas son capaces de co- la mayoría de las biopelículas que han lonizar y dominar la biodiversidad mi- crecido durante el verano. En general, crobiana de los ambientes extremos las algas verdes son las responsables ácidos. Dado que algunos de estos eu- del aumento de biomasa eucariota du- cariotas acidófilos están estrechamen- rante el verano, lo que concuerda con te relacionados con especies homólo- otros estudios en ambientes ácidos. gas neutrófilas podemos concluir que Este hecho está estrechamente rela- los eucariotas deben tener la capacidad cionado con el importante aumento de adaptarse de los entornos neutros de los valores de temperatura y de la a los ácidos en escalas de tiempo geo- luz del día en verano, así como con la lógico relativamente cortas, que están disminución del flujo de agua, todo lo más ampliamente distribuidos y son cual facilita la deposición de las célu- más diversos filogenéticamente de lo las y la formación de biopelículas. El que podríamos pensar en un primer oxígeno disuelto aumenta en invierno momento. para disminuir drásticamente durante 51 los meses secos de verano y otoño. Sin 4.3 Dinámica poblacional embargo, la conductividad, el potencial de las comunidades Redox y el pH no muestran cambios estacionales significativos a lo largo del eucarióticas año. El análisis de la biomasa de microor- En general, aunque la biomasa va- ganismos eucariotas a lo largo del año ria estacionalmente, la diversidad de presenta una clara bimodalidad. En especies en las biopelículas fototrófi- invierno la biomasa eucariótica es sig- cas se mantiene bastante constante nificativamente menor que en verano, durante el año. Sólo las algas filame - lo que se correlaciona perfectamente tosas, como Zygnemopsis y Klebsor- con la bimodalidad que también existe midium tienen cambios estacionales en el flujo de agua de Río Tinto [16-18]. drásticos ya que, durante el verano, for- Los climogramas típicos de esta zona man grandes masas filamentosas que tienen una clara estacionalidad en la cubren la superficie del río en algunas pluviosidad y en el flujo de corriente de zonas para desaparecer casi totalmen- agua, presentando una estación húme- te durante el invierno, arrastradas por da y templada alternando con una esta- la mayor corriente de agua que se for- ción cálida y seca. La elevada capa freá- ma como consecuencia de las lluvias en tica de la región, mantiene el flujo del esta época. También hay variabilidad río durante el verano, aunque una alta en la presencia de flagelados heterótro- tasa de evaporación induce mayores fos los cuales, a diferencia de la mayo- concentraciones de metales pesados ría de eucariotas, aumentan su número debido a procesos de concentración. durante el invierno y la primavera para disminuir en el verano. Los ciliados, ro- crecer en las zonas más extremas del tíferos y heliozoos, de nuevo, son más río. La mayor biodiversidad eucarióti- comunes durante el verano y a finales ca se encuentra en las estaciones de del mismo. muestreo más alejadas del origen del Las diferencias en las caracterís- río que presentan valores físico-quí- ticas físico-químicas del agua de los micos del agua menos extremos en distintos tramos de Río Tinto, parecen términos de pH y presencia de metales ser las principales responsables de la disueltos. Estos resultados concuerdan heterogénea distribución de los mi- con un principio ecológico muy difun- crooganismos eucariotas a lo largo del dido que afirma que, el aumento de las cauce. Esta distribución parece estar condiciones ambientales extremas lle- más influenciada por la concentración va a una disminución de la biodiversi- de metales pesados que por el pH [16- dad dentro de ese ambiente. De acuer- 18]. Los sitios con condiciones más ex- do con este concepto, una reducción de tremas tienen mucha menos biomasa la diversidad y la abundancia dentro de y biodiversidad que los que presentan un medio ambiente dado debería ser características ambientales menos ex- evidente a lo largo de los gradientes en tremas. Sólo Dunaliella y Cyanidium, los que los parámetros ambientales se dos de los organismos eucariotas más vuelven extremos, lo que se observa a 52 acidófilos conocidos, son capaces de lo largo del río. 5. Modelo geomicrobiológico de Río Tinto

Los estudios geomicrobiológicos lle- 5.1 Modelo vados a cabo en Río Tinto y su entor- geomicrobiológico del no se han realizado en tres ambientes principales, cada uno de ellos cauce principal con características hidrogeoquími- El modelo que explica la ecología micas propias muy diferentes. Por un crobiana de Río Tinto se basa, funda- lado, tenemos el cauce central del mentalmente, en las propiedades físi- 53 río propiamente dicho donde se han co-químicas y geomicrobiológicas del realizado la mayor parte de los estu- hierro y azufre. Estos elementos pue- dios de biodiversidad. A este cauce den ser utilizados tanto como donador llegan numerosos drenajes ácidos y aceptor de electrones en el metabo- de minas así como arroyos prove- lismo de la mayoría de los procariotas nientes de escombreras y de salidas presentes en el agua del río. En su for- de las cortas mineras que, al no ser ma reducida, el hierro sería la principal drenadas, desbordan los túneles uti- fuente de energía de los procariotas lizados previamente. Estas salidas de cuantitativamente más representa- minas son muy interesantes ya que, tivos en el agua del río, como Leptos- en muy pocos metros, las aguas pa- pirillum spp., At. ferrooxidans y At. fe- san de ser completamente anóxicas rrivorans, así como de otras especies a oxigenarse, con lo que la sucesión menos abundantes como el caso de de microorganismos es muy rápida. Ferromicrobium, Acidimicrobium, “Fe- Por último, hablaremos de los lagos rrovun” o la arquea Ferroplasma acidi- de las cortas mineras. En cada uno philum. El hierro, en su forma oxidada, de estos ambientes se distinguen, puede ser utilizado como aceptor de además, zonas diferenciadas como electrones en condiciones anaerobias la columna de agua, los sedimentos por bacterias de las especies Ferromi- y las biopelículas flotantes o sésiles. crobium, Acidimicrobium, Acidithio- La presencia de zonas oxigénicas y bacillus, “Ferrovun” y Acidiferrobacter. zonas anaerobias también es un fac- Las bacterias del género Acidiphilium tor importante para describir la geo- pueden llevar a cabo la reducción del microbiología de cada ambiente. hierro en condiciones de anaerobiosis o de microaerobiosis (hasta un 60% de mediante técnicas moleculares, aunque oxígeno) (Figura 6) [52]. Estos procesos sí se han identificado usando técnicas de carácter anaerobio o microaero- convencionales de ecología microbiana bio quedarían restringidos a las zonas a partir de medios de enriquecimiento más profundas de aguas estancadas, [34]. La especie At. caldus podría estar sedimentos y biopelículas y supon- restringida a zonas de mayor tempera- drían la regeneración del ion ferroso tura como las zonas próximas a salidas para ser utilizado nuevamente como de minas o a escombreras abandona- fuente de energía. La regeneración del das, por lo que no sería fácil de encon- hierro mediante su reducción anaero- trar en la columna de agua. La presencia bia fue observada por primera vez en de microorganismos como At. thiooxi- especies del género Acidiphilium pero, dans y At. caldus dependería, además, posteriormente, se ha observado que de la existencia del ion férrico, que hace es común a muchos acidófilos incluido accesible el azufre presente en sulfuros Acidithiobacillus, especialmente abun- a los oxidadores estrictos de azufre [13, dante en las zonas anóxicas del río 52]. Como consecuencia de la oxidación (también; Ferromicrobium, Acidimicro- de hierro por bacterias quimiolitoautó- bium, “Ferrovun” o Acidiferrobacter, Ta- trofas a partir de sulfuros polimetálicos, bla 5). El hierro no solo tiene un papel tiene lugar la formación de numerosos 54 como metabolito en el desarrollo de compuestos intermedios de azufre que los procariotas sino que, además, es el pueden ser utilizados por los oxidadores responsable de que el pH se mantenga de azufre [13, 52]. De este modo, la ac- constante a lo largo del río por su efec- ción de los microorganismos oxidado- to tamponador. Por último, parece ser res de hierro, como Leptospirillum spp. que el ion férrico es un buen protector y At. ferrooxidans facultaría la acción contra radiación ultravioleta, lo que es de los oxidadores de azufre como At. una indudable ventaja ecológica para thiooxidans o At. caldus. Por otro lado, los microorganismos capaces de adap- tal y como hemos visto en el ciclo del tarse a estos ambientes [1]. hierro, en los lugares anóxicos la oxida- A pesar de que el hierro juega un ción de azufre acoplada a la reducción papel predominante en el Tinto, no de hierro se llevaría a cabo por bacterias podemos olvidar al azufre como otro como At. ferrooxidans o Acidiphilium. metabolito importante con concentra- En cuanto a la reducción de azufre, ciones muy elevadas en sus aguas. Es a pesar de que en los ambientes ácidos fuente de energía para bacterias qui- tanto de origen geotermal como de oxi- miolitoautótrofas pertenecientes al gé- dación de sulfuros tenemos grandes nero Acidithiobacillus que oxidan azufre cantidades de sulfato, no parece que en condiciones aerobias. Dentro de este predominen las bacterias sulfatorre- género tendrían un papel principal At. ductoras (SRB). El motivo más probable ferrooxidans y At. ferrivorans ya que han que explica este hecho es que, a pH áci- resultado ser las especie cuantitativa- do, los donadores de electrones clásicos mente más importantes dentro de este están en estado no asimilable por estas género. En cuanto a At. thiooxidans y At. bacterias. Tan solo hay algún indicio de Caldus, no han sido detectados en el río sulfatorreducción clásica relacionada Modelo geomicrobiológico de Río Tinto

con lugares ácidos anaerobios y que, po- recen en Río Tinto aunque todavía no se siblemente, se lleve a cabo en microni- sabe si se está dando sulfurogénesis, de chos que permitan la estabilidad de los ser así, podría tratarse de una forma de donadores de electrones. Sólo hay un generar sulfuro más acorde con un am- género bacteriano en ambientes ácidos biente ácido extremo que la sulfatorre- que puede ser sulfatorreductor. Se trata ducción clásica [13, 52, 53]. del género Desulfosporosinus, un firm - Los tres géneros cuantitativamente cute Gram-positivo, esporulante, mesó- más representativos en el río tendrían filo (25-40ºC, óptimo de 30ºC) y acidófi- especial relevancia dentro del modelo moderado (pH óptimo 5,2, y mínimo lo propuesto. Leptospirillum llevaría a 3,6). Es anaerobio obligado, capaz de cabo la oxidación del hierro, Acidithio- respirar heterotróficamente compues- bacillus se encargaría de la oxidación tos como H2, glucosa, piruvato, lactato, de hierro y azufre en condiciones aero- glicerol y fructosa utilizando sulfato bias así como de la oxidación de azu- como aceptor de electrones. Tiene una fre y regeneración del ion ferroso en enorme versatilidad metabólica, siendo condiciones anaerobias, y Acidiphilium capaz de llevar a cabo fermentaciones o junto con Acidithiobacillus realizarían de utilizar hierro férrico como aceptor la reducción de hierro acoplada a la de electrones. Los potenciales de reduc- oxidación de azufre en las zonas anae- ción en ambiente ácidos extremos nos robias. Con solo la acción de estos tres 55 indican que el férrico es mucho mejor géneros mayoritarios, se completa el aceptor de electrones que el sulfato, por ciclo del hierro, de modo que tenemos lo que una bacteria que es capaz de usar un ambiente que se desarrolla bajo el ambos receptores, posiblemente, esté control del hierro con una baja diversi- llevando a cabo la reducción de hierro en dad procariótica pero con microorga- vez de sulfatorreducción. Esto hace pen- nismos que presentan una alta versa- sar que la sulfatorreducción en aguas tilidad metabólica [12]. ácidas extremas es muy improbable a Aunque como ya hemos dicho, pesar de la presencia de Desulfosporosi- buena parte de las características del río nus. No obstante, la sulfatorreducción y son responsabilidad del metabolismo la sulfurogénesis en condiciones ácidas de las quimiolitoautótrofas oxidadoras ha sido un proceso muy estudiado por de hierro, no hay que obviar el papel de su potencial aplicación en biorremedia- las bacterias heterótrofas acidófilas. Las ción de aguas ácidas contaminadas con más numerosas son distintas especies metales pesados. Por el momento, no se del género Acidiphilium, pero también han obtenido buenos resultados pues aparecen de forma importante otras tí- el metabolismo de SRB elevaría el pH picas de drenajes ácidos de minas como del medio en un posible tratamiento de Acidocella, Acidimicrobium, Sulfobacillus biorremediación. En estudios llevados a o Alicyclobacillus (Tabla 5). Además de cabo en reactores de laboratorio se ha su acidofília, estos microorganismos tie- visto que, los co-cultivos de Desulfospo- nen en común que necesitan un escaso rosinus y Acidocella sí resultan efectivos requerimiento de materia orgánica para en la sulfurogénesis acoplada a la re- su desarrollo. En Río Tinto, dado el bajo ducción de hierro. Ambos géneros apa- pH, los compuestos orgánicos se hidro- lizan rápidamente y no están fácilmente 5.2 Modelo disponibles para los heterótrofos, aun- geomicrobiológico de que en ciertas zonas del río se forman nichos ricos en materia orgánica proce- las salidas de mina dente de las sustancias extracelulares poliméricas de las biopelículas. Como Las salidas de minas y drenajes proce- consecuencia de la acumulación y me- dentes de escombreras de mineral metabolismo de las especies que las inte- recen una especial mención ya que en gran, las biopelículas son, en sí mismas, ellas se puede observar el ciclo geomi- ricas en compuestos de carbono con crobiológico completo. En el río, el ciclo concentraciones suficientemente altas está representado en diferentes nichos como para que los heterótrofos acidófi- que, a menudo, no están en contacto o los puedan desarrollarse. Para la mayo- están alejados entre sí, no obstante, en ría de los oxidadores de hierro acidófilos los drenajes podemos observar todas las los compuestos orgánicos resultan tóxi- reacciones en unos pocos metros. En el cos, incluso aquellos que provienen de interior de las escombreras la concentra- su propio metabolismo (metabolitos se- ción de oxígeno y el pH son muy bajos cundarios). De este modo, la acción de mientras que la concentración de hierro los heterótrofos contribuye a un mejor y el potencial redox son altos, siendo la 56 crecimiento de las comunidades qui- temperatura moderadamente alta tam- miolitoautótrofas al utilizar la materia bién. Estas condiciones constituyen un orgánica presente. Por este motivo, es ambiente propicio para especies qui- difícil conseguir y mantener cultivos miolitótrofas, anaerobias facultativas, puros monoespecíficos de oxidadores acidófilas y reductoras de hierro. Como de hierro quimiolitoautótrofos, de igual ya veíamos en el modelo del río, un modo, es casi imposible encontrarlos ejemplo es el de Acidithiobacillus que, en solos en la naturaleza, desarrollándose estas condiciones, puede utilizar azufre siempre mejor junto a heterótrofos aci- como fuente de energía usando hierro dófilos. De este modo, tanto en el agua como aceptor de electrones, asimismo, del río como en los sedimentos y, sobre además de este microorganismo hay todo, en las biopelículas, los oxidadores otros capaces de desarrollarse en este desarrollan mejor su labor gracias a la ambiente utilizando el hierro como presencia de los microorganismos he- aceptor (At. ferrivorans, Acidiphilium, terótrofos que “limpian” el ambiente Acidocella, Ferrimicrobium, la arquea Fe- de compuestos orgánicos y metabolitos rroplasma, etc.) [54]. secundarios [12, 13, 30, 31, 52]. La mayoría Cabe resaltar que las salidas de minas de los heterótrofos acidófilos suelen ser son el lugar en el que se ha encontrado el anaerobios facultativos, pudiendo utili- mayor número de arqueas, Ferroplasma zar compuestos orgánicos como fuente fundamentalmente, ya que las condi- de energía y el férrico como aceptor, ciones de potencial redox permiten que siendo, en buena parte, responsables de aparezca este microorganismo que, aun- la regeneración del hierro ferroso en las que no es abundante en el río, sí aparece zonas anaerobias del río (sedimentos, en otras aguas ácidas extremas. Segu- fondo de presas o subsuelo) [13, 52]. ramente, Ferroplasma tiene una labor Modelo geomicrobiológico de Río Tinto

importante en la reducción de hierro en FPI. En ellos también tiene lugar el ci- el interior de minas, escombreras y pilas clo geomicrobiológico completo que de mineral. Como resultado de la acti- hemos descrito anteriormente, pero en vidad metabólica de Ferroplasma y de vez de darse horizontalmente se da en otros reductores de hierro, se producen vertical ya que la superficie del agua en unas aguas muy transparentes y de color estas zonas es aerobia y la concentra- verdoso debido a la alta concentración ción de oxígeno va disminuyendo con la de hierro reducido. Esta agua supone un profundidad. En general, la caracterís- aporte importante de sustrato para los tica clave de los lagos ácidos de cortas oxidadores de hierro tan abundantes en el mineras es que sus columnas de agua, cauce central de Río Tinto. Nada más sur- ricas en hierro y azufre, se estratifican gir, los cauces de estas pequeñas corrien- con frecuencia en términos de pH, con- tes de agua son tapizados por biopelículas centraciones de oxígeno y potenciales donde los eucariotas fotosintéticos tienen redox (Figura 11). Las zonas cercanas a la especial protagonismo. Pocos metros o superficie tienden a tener oxígeno, a ser incluso centímetros después de la sur- muy ácidas y con potenciales redox alta- gencia, el agua es oxidada rápidamente mente positivos mientras que las zonas debido a que la presencia de oxígeno y más profundas generalmente son anó- la alta concentración de hierro ferroso lo xicas, con un pH más alto y potenciales convierte en un ambiente ideal para la redox más bajos. Así, en la parte supe- 57 acción de los quimiolitoautótrofos oxi- rior de estos lagos ácidos tendrán lugar dadores de hierro como At. ferrooxidans, las reacciones de oxidación de hierro At. ferrivorans, Letospirillum spp., Acidimi- por microorganismos como Acidithioba- crobium o Ferrimicrobium. De este modo, cillus y Leptospirillum mientras que en la es muy frecuente que el agua procedente parte profunda se dará la reducción del de los restos mineros que llega a Río Tinto hierro acoplada a la oxidación de azufre está ya oxidada y sus características son por parte de géneros como Acidithioba- semejantes a las del propio cauce central cillus, Ferrimicrobium, Acidiphilium, Aci- del río. Un ejemplo del funcionamiento de docella, etc., completándose así el ciclo este tipo de drenajes se ilustra en la Figura del hierro [55]. 10, donde se describe el ciclo geomicrobio- Por otro lado, estos lagos pueden lógico de uno de los ejemplos más claros presentar una quimioclina estrecha de salida de mina en la FPI, el de La Zarza- como zona de transición entre estas dos Perrunal [54]. capas. La mayor parte de la producción primaria en los lagos o pozos ácidos 5.3 Modelo está mediada por microalgas acidófilas, geomicrobiológico de aunque las bacterias quimiolitotróficas también contribuyen a la fijación neta los lagos de cortas de de CO2. La disponibilidad de fosfato, mina que está estrechamente asociada con la reducción del óxido de hierro debido Algo parecido a las salidas de minas y a la insolubilidad del fosfato férrico, a drenajes ocurre en los lagos y presas menudo limita la producción primaria ácidas que se distribuyen por toda la en estos ambientes. Esto puede provo- 58

Figura 10. Modelo geomicrobiológico de un drenaje ácido de mina tipo. A menudo, las salidas y drenajes ácidos de mina, pueden ser explicados con modelos geomicrobiológicos semejantes al de Río Tinto. Lo interesante de estos lugares es que, en muy pocos metros, se observan todas las reacciones implicadas en dicho modelo. En el interior de la mina, la concentración de oxí- geno es baja y hay microorganismos que están reduciendo hierro, acoplado en muchos casos, a la oxidación de azufre. Por ello, el agua que sale a través de las bocas de mina está cargada de hierro ferroso, tiene un color verde y es muy transparente, lo que hace que sean lugares ideales para las eucariotas fotosintéticas acidófilas que suelen estar tapizados completamente de algas (LZ1). Por otro lado, el agua que sale cargada de hierro ferroso y en presencia del oxígeno atmosférico, es rápidamente oxidada por bacterias quimiolitótrofas oxidadoras de hierro. En pocos metros (LZ2 y LZ3) las aguas se teñirán de rojo. En las zonas más alejadas de la salida de la mina, tendrá lugar la oxidación de hierro por parte de bacterias quimiolitótrofas e irá aumentando el sulfato y los precipitados de hidróxidos de hierro y sulfatos y los fotoautótrofos están prácticamente desaparecidos.

car algunas anomalías aparentes. Por fundidad debido a su difusión desde las ejemplo, se ha visto que la presencia zonas profundas anóxicas y a su libera- de algas y la producción primaria neta ción por dentro de la zona de quimio- se concentraban justo por encima de clina. la quimioclina en el lago Cueva de la Los lagos ácidos que nos encon- Mora, a una profundidad de 7-8 m y tramos en la FPI no son tan homogé- donde la radiación solar era menor del neos como los drenajes o el propio 2% de la disponible en la superficie del río. Sus características físico-químicas lago [56]. Esto se atribuye a una mayor y geomicrobiológicas van a depen- biodisponibilidad de fosfato a esta pro- der del sustrato en el que se formen, Modelo geomicrobiológico de Río Tinto

Figura 11. Modelo geomicrobiológico de una corta tipo de la Faja Pirítica Ibérica. De entre las más de 20 cortas o lagos mineros que hay en la FPI, aquellas que presentan altas concentraciones de hierro férrico, tienen un modelo muy semejante al del Río Tinto. Lo más interesante de estos lugares es que, en un mismo ecosistema, se identifican todas las reacciones que se asocian al ciclo del hierro en aguas ácidas procedentes de la oxidación de sulfuros polimetálicos. En la parte superior del lago se da la oxidación del hierro por acción de microorganismos quimiolitótrofos oxidadores de hierro. Además, es la zona donde encontramos microorganismos fotosintéticos, fundamentalmente Chlamydomonas, que serán los productores primarios del sistema. Debido al color rojo oscuro de las aguas, no son muchos los metros en los que se produce fotosíntesis, ya que la luz casi es insignificante al cabo de 20 o 30 cm. En la zona anaerobia, se va a dar la reducción de hierro, regenerándose el hierro ferroso que quedará nuevamente a disposición de los oxidadores. Esta reducción, suele estar acoplada a la oxidación de azufre. La oxidación/reducción de hierro proporciona gradientes mayores hacia la superficie de potencial redox (ORP) y oxígeno disuelto (DO), y crecientes en profundidad de conductividad (EC), y de color. La superficie las aguas de estos lagos son rojos debido al hierro férrico, mientras que en profundidad son verdes, debido al hierro ferroso. A menudo, existe una estratificación marcada por una quimioclina que se suele encontrar a 1 o 1,5 metros de profundidad. lo que dará lugar a una mayor o me- también sulfato, en un ambiente como nor carga de metales pesados en sus este, estén solamente reduciendo hie- aguas. En concreto, la concentración rro. Por ello, la sulfatorreducción no es de hierro va a ser la que determine la muy aparente ni parece contribuir en geomicrobiología del lago. Hay cortas gran medida a la regeneración del sul- inundadas como San Telmo, con baja furo en estos ecosistemas [55]. concentración de hierro, que no permi- A pesar de que en los lagos con alta ten un tamponamiento de sus aguas y carga de hierro la sulfatorreducción donde no se está dando el mismo ciclo está muy disminuída es tanta la varie- geomicrobiológico que en Río Tinto. dad de lagos en la FPI que sí hay algún Otras cortas, como Nuestra Señora del caso donde se da claramente este fe- Carmen, Corta Atalaya o Peña de Hie- nómeno. Es el caso de la mina de cobre rro, así como las presas presentes en de Cantareras en la que es frecuente la parte alta del río, presentan una alta encontrar la zona superior del lago casi concentración de hierro y en sus aguas completamente llena de filamento se está oxidando hierro a alta veloci- hasta una profundidad de 15 cm [56]. dad en superficie, reduciéndose a me- Estos filamentos están formados por dida que descendemos (Figura 11) [55]. algas acidófilas creciendo sobre fil - La geomicrobiología de tipo de lagos mentos de bacterias de color marrón 60 se asemeja mucho a la de Río Tinto. En claro. Asociados a estos filamentos se la superficie de estos lagos a menudo puede observar una capa de color gris aparecen macrofilamentos de varios de sulfuro de cobre. La mayoría de las metros de longitud. El análisis mole- bacterias de los filamentos son hete- cular de estos filamentos indica que rotróficas y muchas de ellas se iden- están formados por microorganismos tificaron como reductoras de hierro. anaerobios facultativos (At. ferrivorans, La fijación fototrófica de CO2 en los At. ferrooxidans, Ferrimicrobium…), re- filamentos realizada por las algas productores de hierro y, a menudo, es fá- porciona el carbono orgánico utilizado cil encontrar algunos anaerobios obli- por los procariotas heterótrofos, ali- gados como Desulfosporosinus. Esto mentando la reducción disimiladora de hace pensar que dichos filamentos se hierro férrico y sulfato. Este ecosistema forman en lo más profundo del lago y microbiano es un buen ejemplo de ate- cuando alcanzan grandes dimensiones nuación natural de la contaminación se desprenden del fondo llegando a la del agua de la mina. El cobre liberado superficie. En cuanto al ciclo del azufre, de los minerales es inmovilizado por es probable que en algunos nichos de bacterias sulfatorreductoras presentes los sedimentos de los lagos pueda dar- en la capa inferior de los filamentos. La se la sulfatorreducción, pero no debe contribución de las arqueas acidófila ser muy abundante porque el alto pH al ciclo del carbono y el metal en am- inhibe ese metabolismo. Al igual que bientes anóxicos ha sido poco estudia- comentábamos en el modelo geomi- do, aunque la importancia potencial de crobiológico del río, lo más probable es estos procariotas en biopelículas anóxi- que microorganismos como Desulfos- cas ha sido destacada en estudios reali- porosinus, capaces de reducir hierro y zados en otras minas ácidas. Modelo geomicrobiológico de Río Tinto

5.4 Papel de los eucariotas no orgánico disuelto [62]. Nuevamente, en el modelo la presencia de Euglena y de Chlorella en estas aguas ácidas, incrementa signific - geomicrobiológico las tivamente la concentración de carbono aguas ácidas orgánico disuelto. Además, las bacterias acidófilas heterótrofas, como Acidiphi- Aunque los microorganismos eucariotas lium, usan los azúcares que secretan los no participan directamente en las trans- organismos fotosintéticos como son la formaciones geoquímicas del hierro y el fructosa, la glucosa y el manitol de origen azufre que dan lugar a la disolución de los eucariótico, lo que palia en gran medida minerales sulfurosos que provocan la for- la escasez de nutrientes de las aguas áci- mación de aguas ácidas, como es el caso das. Por otro lado, no todos los exudados de los quimiotróficos y los quimiotróficos producidos por los eucariotas promueven tienen, sin embargo, un impacto indirecto el crecimiento de bacterias acidófilas sino muy considerable dichos procesos geoquí- que pueden actuar inhibiéndolo o incluso micos [57]. En este sentido, se ha visto que impidiendo del todo su crecimiento. Un la presencia en grandes biopelículas de ejemplo claro de este comportamiento es E. mutabilis puede llevar a que las aguas el caso del glicolato, producido y excreta- ácidas estén sobresaturadas de oxígeno do al medio como parte del metabolismo disuelto, pudiendo llegar hasta un 200% de los microorganismos fotosintéticos 61 [58], mientras que, en ausencia de organis- presentes en las aguas ácidas. A pH áci- mos fotosintéticos, las aguas que drenan do, el glicolato está presente como ácido las minas subterráneas y los depósitos glicólico que, en común con el ácido acé- están frecuentemente desprovistas de oxí- tico y muchos otros ácidos alifáticos de geno disuelto y el hierro soluble tiende a pequeño peso molecular, es altamente estar presente predominantemente como tóxico para la mayoría de los acidófilos hierro ferroso reducido [59, 60]. La oxige- excepto para los Firmicutes como Sulfoba- nación de estas aguas por algas acidófila cillus [57]. Una de las características de las facilita la oxidación del hierro ferroso y de microalgas acidófilas es la capacidad de los compuestos de azufre reducidos pre- absorber, y presumiblemente de metabo- sentes por bacterias como Acidithiobaci- lizar nuevamente, el glicolato que habían lllus y Leptospirillum spp. en reacciones que excretado previamente. Esta capacidad son generadoras netas de protones y que de algunas microalgas para crecer como pueden dar lugar a una mayor acidific - heterótrofos ha sido ampliamente docu- ción del medio en las aguas posteriores al mentada en otras algas de otros ambien- punto de salida del drenaje de mina [61]. tes no extremos, por ejemplo, Chlorella Una segunda forma en que las algas pyrenoidosa excreta glicolato en condicio- pueden incidir en las transformaciones nes normales de luminosidad que es rápi- geoquímicas de las aguas ácidas es esti- damente absorbido de nuevo en ausencia mulando el crecimiento de los acidófilo de luz [63, 64]. heterótrofos reductores de hierro y azufre La importancia de las microalgas aci- a través de sus exudados y lisados orgá- dófilas en el mantenimiento de las po- nicos, ya que estas aguas suelen contener blaciones bacterianas heterótrofas de concentraciones muy pequeñas de carbo- ambientes ácidos ha quedado patente al comparar biopelículas que crecen en el ficativa en aquellas zonas en las que los interior de las minas con las que están en micelios de hongos se hayan establecido el exterior de los drenajes ácidos, recibien- previamente, mientras que las microal- do la luz solar [65, 66]. En los sitios subte- gas verdes flageladas como Dunaliella o rráneos, donde la producción primaria es Chlamydomonas, así como Euglenas, apa- mediada exclusivamente por las bacterias recen ya en las fases más tempranas de acidófilas quimiotróficas, las biopelículas la formación de las biopelículas, aunque están a menudo dominadas por la pre- en concentraciones muy bajas. Tras el es- sencia de procariotas autótrofos como tablecimiento de las especies flagelada «Ferrovum myxofaciens» mientras que, en se observa la aparición de las microalgas las biopelículas sitiadas en el exterior, son sésiles como Chlorella o Cyanidium, sien- las microalgas las que promueven el de- do generalmente las algas filamentosa sarrollo de las comunidades microbianas las últimas en aparecer. Una vez que se subyacentes. Estas últimas poblaciones forman las biopelículas, los microorganis- están generalmente dominadas por acidó- mos permanecen de forma más o menos filos heterótrofos, incluyendo muchos de constante a lo largo del año cubriendo las los que catalizan la reducción disimilatoria mismas zonas [17, 67]. del hierro férrico como son Acidiphilium, Al igual que ocurre con el resto de es- Acidocella y Acidobacterium spp. Además, pecies eucariotas, el papel ecológico que 62 también se ha visto que la sulfidogénesi juegan los hongos en los ambientes áci- es mucho más pronunciada en presencia dos tampoco ha sido estudiado adecua- de algas acidófilas que cuando las bac- damente hasta este momento. Se piensa terias sulfatorreductoras (SRB) aparecen que pueden una función preponderante solas. Esto corrobora la idea de que las mi- como degradadores primarios de mate- croalgas acidófilas estimulan el crecimien- ria orgánica compleja. Hay que tener en to de las bacterias heterótrofas al propor- cuenta que las aguas ácidas suelen ser cionarles sustratos orgánicos y sugiere que muy pobres en carbono orgánico fácil- tales interacciones pueden ser la base de mente degradable, como el procedente de las estrategias de colonización de nuevos la hojarasca por ejemplo, ya que en estos ambientes extremos por parte de los mi- ambientes no hay invertebrados que tri- croorganismos. turan activamente las hojas facilitando En este sentido, estudios realizados la degradación del carbono orgánico. En en Río Tinto sobre los procesos de colo- estas condiciones, los hongos pueden lle- nización de nuevos espacios por parte de gar a ser importantes como degradadores las especies indican que la secuencia de primarios de materia orgánica compleja. Al colonización se inicia con la acumulación mismo tiempo, los hongos contribuyen al de partículas amorfas compuestas princi- consumo de oxígeno en el agua, disminu- palmente por bacterias y granos inorgá- yendo de esta manera el estrés oxidativo nicos de minerales. Después de unas dos de las bacterias sulfatorreductoras y pue- semanas, la matriz orgánica también está den estar directamente involucrados en poblada por hongos y algunos eucariotas la reducción de hierro férrico o azufre, que heterótrofos como amebas y pequeños son importantes procesos de transporte de flagelados. Por su parte, las diatomeas electrones en aguas ácidas, contribuyendo sólo comenzarán una colonización signi- a la alcalinidad biológica [17]. 6. Formación y estructura de las biopelículas

Los estudios de ecología microbiana de microorganismos con diferentes en los ambientes de aguas ácidas se pigmentos fotosintéticos. Cuando los centran, sobre todo, en las comunida- microorganismos se agrupan gracias a des planctónicas de bacterias quimio- la presencia de una matriz que los une litotróficas porque son las que poseen y crecen sobre superficies reciben el la habilidad de catalizar reacciones de nombre de biopelículas [68]. óxido-reducción y disolver y precipitar La mayor parte de la biomasa eu- minerales. Junto a las bacterias, son cariótica en Río Tinto se encuentra también importantes los organismos formando estas biopelículas a lo largo 63 eucariotas capaces de resistir y desarro- de todo su cauce. Hay algunos eucario- llarse en ambientes ácidos y con gran tas que pueden ser planctónicos como cantidad de metales en solución. Así, Chlamydomonas, los ciliados o los he- el aspecto más característico de estos liozoos, pero los más abundantes son ambientes es el color rojo de las aguas los que están asociados entre sí. Esta y los sedimentos de color amarillo-ma- tendencia a mantenerse agrupados rrón debidos a la presencia de hidróxi- también les ayuda a no ser arrastrados dos de hierro y de sales de azufre pre- por el movimiento del agua y pueden cipitadas. Hay que destacar también llegar a crear largos filamentos que se la presencia de filamentos bentónicos mueven con la corriente. Existen varias o flotantes y biopelículas coloreadas razones por las que los organismos se sobre los sedimentos del cauce y en las unen formando biopelículas. De, esta orillas. En estas estructuras es donde manera, resisten las fuerzas físicas que se agrupan la mayor cantidad de los tienden a separar y arrastrar a los or- organismos bentónicos que necesitan ganismos en las aguas corrientes y les estar sujetos a una superficie para su permite mantenerse en el lugar donde desarrollo. En el caso de películas for- las condiciones son óptimas con res- madas principalmente por bacterias pecto a la intensidad de luz y las con- los colores son anaranjados, mientras diciones físico-químicas del agua. En el que en las zonas someras donde pue- caso de Río Tinto, las biopelículas han de llegar suficiente luz para realizar la sido extensamente estudiadas. Las fotosíntesis, estas películas y filame - más espectaculares son las fotosin- tos pueden aparecer como parches de téticas, que pueden alcanzar grandes diferentes colores debido a la presencia tamaños, sobre todo en verano (Figura 8) [17]. En los sedimentos asociados a por completo entre octubre y noviem- los cauces también se desarrollan bio- bre. Sobre la superficie de las zonas em- películas formadas mayoritariamente balsadas también aparecen filamentos por hongos y levaduras [32]. Asociados flotantes de composición mayoritaria- a estas biopelículas siempre aparecen mente bacteriana [33]. gran cantidad de bacterias que forman La capacidad que tienen los mi- estructuras flotantes o están asociadas croorganismos de adherirse sobre las a los sedimentos. superficies es debida a que producen Las biopelículas fotosintéticas de sustancias extracelulares poliméricas Río Tinto son estructuras tridimensio- (EPSs), sobre todo de carácter polisa- nales formadas mayoritariamente por cárido, que crean una matriz que los un único tipo de microorganismo pero envuelve [69]. En estas matrices se han que forman comunidades complejas detectado otros componentes como en las superficies que colonizan. Los proteínas, ácidos nucleicos, fosfolípi- primeros colonizadores son siempre dos y ácidos húmicos, constituyendo el bacterias y hongos que se depositan microhábitat en el que viven los orga- junto con una fina capa de minerales. nismos [70]. Crecer de esta manera les Los flagelados y ciliados heterotróficos confiere unas características diferentes aparecen desde el principio y a lo largo a cuando viven aislados y es una buena 64 del crecimiento de la biopelícula pero manera de resistir mejor las condicio- siempre en proporciones bajas. Eugle- nes ambientales adversas [71]. Aunque na es el único protista que consiguen el desarrollo de biopelículas en am- crear estructuras monoespecíficas y los bientes extremos acuáticos y terrestres más abundantes, después de los bacte- ha sido ampliamente documentado, rianos, son los formados por diatomeas los mecanismos de su desarrollo aún como Pinnularia. Generalmente, las no se comprenden bien. diferentes biopelículas no se mezclan No existen muchos trabajos que entre sí aunque suelen contactar late- estudien las características de las bio- ralmente o se superponerse unas sobre películas eucarióticas en ecosistemas otras. En las zonas más extremas en extremos como el de Río Tinto, pero un términos de pH ácido y con mayor can- aspecto importante es que las canti- tidad de metales en solución, las biope- dades de matriz extracelular extraídas lículas están principalmente formadas rondan los miligramos de peso seco por microalgas como Chlamydomonas, mientras que los estudios similares en Cyanidium y Dunaliella, con una impor- ambientes de pH neutro señalan can- tante presencia de bacterias y hongos. tidades de microgramos, es decir tres Mientras que en las zonas de cauces órdenes de magnitud menor en este más someros es donde se desarrollan último caso [72]. De igual manera, una biopelículas de Chlorella y Euglena. Los alta producción de matriz extracelular filamentos de algas verdes que flotan se ha descrito también en otros entor- como Zygnemopsis y Klebsormidium nos extremos, desde los hielos árticos tienen una presencia más estacional hasta las bacterias marinas de la Antár- y son especialmente abundantes en tida. Las cantidades totales de matriz junio, disminuyendo su presencia casi extracelular en las biopelículas de Río Formación y estructura de las biopelículas

Tinto mostraron una correlación posi- íntimamente ligadas a la pared celu- tiva con la concentración de metales lar; y la fracción coloidal, formada por pesados presentes en el agua, es decir, las sustancias orgánicas menos unidas al aumentar la concentración de meta- a las células. Ambas fracciones son les aumenta la cantidad de matriz ex- muy variables en los diferentes tipos tracelular producida. Estos resultados de biopelículas dependiendo de la es- son comparables a los encontrados en pecie mayoritaria que las componga. otros ambientes extremos ácidos en En general, las biopelículas tienen una particular y extremos en general. En mayor fracción coloidal que capsular y Río Tinto, la correlación entre el au- sólo en el caso de los que están forma- mento de la matriz extracelular y la dos por hongos la fracción capsular es disminución del pH también es signi- mayor que la coloidal. Estas diferencias ficativa, pues al bajar el pH aumenta deben estar relacionadas con la biolo- la cantidad de matriz extracelular. Por gía de cada tipo de organismo además otro lado, se ha visto que la producción de con las condiciones ambientales de sustancias extracelulares varia a lo que les rodean. largo del año. Así, durante el verano, las Al igual que en otros ambientes, en algas filamentosas como Zygnemopsis las biopelículas acidófilos de Río Tinto y Klebsormidium incrementan su bio- los polisacáridos son los principales masa más rápidamente, formando lar- componentes de la matriz extracelu- 65 gos filamentos flotantes, lo que se ha lar, llegando a representar hasta un relacionado con un incremento en la 85 % del peso seco total. En general, la productividad fotosintética. Estas algas fracción coloidal tiene un mayor por- filamentosas tienen mayor cantidad de centaje de polisacáridos que la capsu- matriz extracelular en las aguas ácidas lar en las biopelículas compuestas por de Río Tinto que las mismas especies microalgas. Los cationes metálicos son presentes en ambientes fríos o de zo- el segundo componente mayoritario, nas geotermales [73]. representando el 10% del peso seco to- En cuanto a la composición bioquí- tal y acumulándose mayoritariamente mica de la matriz extracelular en las en la fracción coloidal, la parte más ale- biopelículas eucarióticas de Río Tinto, jada de las células. Por el contrario, en los primeros estudios mostraron que las biopelículas de hongos los cationes estaban formadas mayoritariamente metálicos aparecían en mayor canti- por polisacáridos, metales pesados y dad en la fracción capsular. Ya hemos ácidos húmicos junto con pequeñas hablado anteriormente de la capacidad cantidades de proteínas y ADN [72,73]. de secuestrar y precipitar metales por En conjunto, la matriz extracelular re- parte de los hongos, lo que puede expli- presentaba hasta el 44 % del peso seco car la masiva presencia de metales en de las biopelículas analizadas, teniendo esta fracción. en cuenta que la fracción celular era la Los ácidos húmicos son el tercer mayoritaria. En la matriz extracelular componente principal, aunque sólo se pueden identificar dos fracciones representan el 4% del total, siendo en principales: las sustancias extracelula- la fracción coloidal de las microalgas res de la fracción capsular, que están donde aparecen en mayor cantidad. Mientras que en el caso de los hongos, culas bacterianas de los sedimentos en los ácidos húmicos estaban presentes cauces con agua y también podrían ser mayoritariamente en la fracción cap- abundantes en el río. sular. Estos ácidos húmicos resultan de Las pentosas como la xilosa, ribo- la degradación de la materia orgánica sa y arabidosa representan menos del y su presencia se ha relacionado con la 5% de la composición total de la matriz formación de complejos con metales. extracelular. También se encuentran En este caso, los hemos encontrado presentes en mucha menor cantidad en menor cantidad que en otros am- el ácido glucurónico y aminoazucares bientes previamente descritos, proba- como la glucosamina y la galactosami- blemente debido que el pH extrema- na, siempre en proporciones inferiores damente ácido impide la presencia de al 1%. Al comparar esta composición este tipo de compuestos. Otro de los con la de otros ambientes extremos, componentes importantes de la ma- vemos una correlación positiva entre triz extracelular son las proteínas, que el alto índice de toxicidad de las aguas alcanzan un 2% del total del peso, en- de Río Tinto y la presencia de azúcares contrándose la mayoría localizada en metilados como la 3-O-metilglucosa y la fracción capsular. El contenido en aminoazúcares como el inositol. La pre- proteínas no excede del 3% del total sencia de azucares metilados está rela- 66 del peso seco de forma similar a lo que cionado con un aumento de la solubili- ocurre en otros ambientes y al descrito dad de los polisacáridos. Además, estos en biopelículas bacterianas donde la monosacáridos pueden unirse para for- cantidad de proteínas extracelulares es mar alginatos que son un copolímero baja. Por último, hay que resaltar la pre- linear de manurosa y ácido gulurónico sencia de ADN en cantidades menores muy común entre las algas y algunas al 0,5% del peso seco, sin diferencias bacterias y que crea un gel muy hidro- entre las fracciones capsular o coloidal fílico de color amarillo-marrón como el y cuya función y procedencia aún no se que presentan las diatomeas en el río. ha determinado. En el caso de los protistas, como Eu- Un estudio pormenorizado de la glena, su pared celular no está basada composición de los monosacáridos en carbohidratos sino en una pelícu- presentes en estas biopelículas indica la proteica, aunque se han detectado que los azúcares más abundantes son glucosa, galactosa, manosa, xilosa y los neutros, siendo los mayoritarios la ramnosa en extractos de su superficie manosa y la glucosa y que representan celular [74]. En el caso de Río Tinto estas más del 50 % del total del peso seco. Le biopelículas presentan, además, una siguen las hexoaldosas con un 40 % de mayor proporción de fucosa. Este mo- abundancia, entre las que se han iden- nosacárido forma parte de la fucoidina tificado ramnosa, galactosa, fucosa y la presente en las paredes celulares de las gulosa. Este último es un monosacári- algas y sirve de punto de anclaje a otros do lineal en comparación con el resto azucares. que presentan formas cicladas. Los ga- La matriz extracelular podría ser lactoglucanos son mezclas de glucosa y en gran parte responsable de la mayor galactosa y son comunes en las biopelí- tolerancia de estas biopelículas a los Formación y estructura de las biopelículas

metales pesados. La capacidad de las la mayoría de los casos, los porcentajes sustancias poliméricas extracelulares de cationes metálicos se mantienen (EPSs) de adsorber cationes metálicos igual o ligeramente más bajos, siendo que pueden ser tóxicos les confiere una excepción el caso del plomo. Este un papel de protección celular por su metal aparece en las biopelículas de actividad quelante [75]. Esta capaci- Euglena y de Cyanidium en mayor con- dad está relacionada con la existencia centración que en el agua de la locali- de determinados grupos funcionales dad. En las biopelículas de Cyanidium, presentes en sus diferentes compo- además, se acumulaba también más nentes como proteínas, lípidos y car- arsénico. La diferencia entre las espe- bohidratos. A pH ácido, la mayoría de cies de microalgas en su capacidad de los metales están en forma catiónica unión de iones metálicos, está relacio- libre, mientras que a pH básico tienden nada con los grupos carboxílicos, hi- a precipitar como compuestos insolu- dróxilos, sulfatos y fosfatos presentes bles. En el mismo sentido, el pH ácido en los polisacáridos así como al tipo de modifica el estado iónico de los grupos proteínas que componen sus paredes funcionales de las EPSs cambiando sus celulares. En el caso de algas unicelu- propiedades electroquímicas. El grupo lares como Chlorella y Cyanidium se funcional más hidrofílico y con tenden- ha descrito un efecto muy marcado de cia a donar un electrón es el grupo car- este fenómeno frente a las algas mul- 67 boxílico y es el que da el carácter ácido ticelulares [76]. Las cianobacterias y las a las moléculas biológicas. A pH ácido algas unicelulares a pH 5 son capaces los grupos carboxilo tienden a estar de unir cationes de cobre en más pro- protonados mientras que los fosfatos y porción pero, al disminuir el pH a 2, esta sulfatos mantienen su carga negativa. capacidad disminuye drásticamente. La composición de los monosacáridos Como a pH más ácido los grupos car- de la fracción capsular, la que está más boxilo tienden a estar protonados y sin íntimamente unida a las membranas y carga, la capacidad de quelar metales paredes celulares, presenta pocos gru- disminuye. Dependiendo de las condi- pos funcionales capaces de quelar la ciones más o menos ácidas de las aguas gran cantidad de cationes metálicos en las que viven estas especies el efecto presentes en el ambiente. Este hecho quelante es más o menos marcado ya se corrobora experimentalmente ya que la unión de los diferentes cationes que la mayor cantidad de metales se ha también varía con el organismo y con la encontrado en la fracción coloidal. La cantidad de ligandos disponibles. fracción coloidal es la menos ligada a la En las aguas de Río Tinto existe una pared y membrana celular, permitien- gran variedad de metales disueltos en do que la presencia de metales quela- cantidades importantes. Hay que te- dos este alejado de la parte activa de la ner en cuenta que, en la contribución célula. iónica de los enlaces, las atracciones Al comparar las concentraciones de electrostáticas de corto alcance son metales presentes en el agua y la canti- esenciales y que se hacen más fuertes dad de ellos que se acumulan en las EPS a medida que aumenta la carga del ion de las biopelículas se puede ver que, en metálico y a medida que disminuyen sus radios. Así, la contribución iónica desde el punto de vista físico-químico, se incrementa drásticamente desde dejando de lado su microestructura y metales con dos cargas positivas a los como se disponen los microorganismos que tienen tres y hasta cuatro cargas dentro de estas biopelículas. Recogien- disponibles. Además, en estas aguas do las muestras en el campo y preser- ácidas se produce la precipitación de vándolas como si de tejidos se trataran, oxihidróxidos y hidroxisulfatos de hie- se han obtenido cortes transversales rro por procesos hidrogeoquímicos que que nos han permitido observar su pueden incrementar la precipitación espesor y relación con el sustrato, su de otros metales disueltos [77]. Un composición y la distribución de los mi- aspecto destacable de las localidades croorganismos dentro de la biopelícula con menor cantidad de hierro disuelto (Figura 12). Mediante microscopía elec- en el agua es que, la matriz extracelu- trónica de barrido hemos visualizado la lar mostraba más cantidad de hierro ultraestructura de diversas biopelículas y menos cantidad de cobre y zinc que fotosintéticas de Río Tinto, analizado las que había en el agua de la locali- cómo están organizados en su ambien- dad donde se encontraban. El cobre y te natural (Figura 13). Aun así, la mejor el zinc tiene radios similares mientras manera de conocer la microestructura que el ion férrico tiene un radio menor es visualizar a los microorganismos 68 que el ferroso. Estas variaciones en la junto a las sustancias extracelulares solubilidad de los cationes metálicos y los minerales que son tan abundan- tienen mucho que ver con los ciclos hi- tes en este ambiente y con el agua drogeoquímicos de las diferentes loca- que forma parte de las biopelículas. lidades y no tanto con la presencia de La técnica que mejor permite este tipo los microorganismos [54]. de observaciones es la microscopía de Figura 12. Imágenes de diferentes biopelícu- La mayoría de los estudios sobre barrido a bajas temperaturas, llamada las encontradas en Río biopelículas en ambientes extremos se en inglés LTSEM o CryoSEM (Figura 13). Tinto estudiados. Los han centrado en describir la diversidad Las imágenes de microscopía de barri- biofilms son fijados e y la relación entre estructura y función do de muestras congeladas permiten el campo y post-fij - dos en el laboratorio antes de incluirlos en una resina que se en- durece y permite cor- tar y pulir transversal- mente las muestras. Después se recubre con carbón evaporado para su observación por microscopia de barrido por electrones retrodispersados. Las flechas indican la p - sición de los biofilms en cada caso. Barra = 0,5 cm. Formación y estructura de las biopelículas

A B

C D

E F

Figura 13. Imágenes de diferentes técnicas de microscopía electrónica empleadas en el estudio de las biopelículas. (a) Por microscopia de barrido en muestras pulidas la resina se observa como el fondo negro. Los minerales presentan diferentes tonos de gris en función de su número atómico y la parte orgánica diferentes tonos de gris. Las biopelículas más gruesas son las de diatomeas y llegan a englobar capas de minerales. Barra 1µm. (b) Detalle de una biopelícula de diatomeas. Se distinguen brillantes los citoplasmas dentro de los frústulos de sílice y las bacterias aparecen en un tono gris claro (flecha). Barra 30 m. (c) Las biopelículas más finas y delicadas son las de Dunaliella. Apenas alcanzan unas decenas de micras y están asociadas con levaduras filamentosas y bacterias (flecha). Barra 30 m. (d) Las biopelículas están expuestas a la precipitación de minerales disueltos en las aguas y acaban siendo recubiertas paulatinamente. Nótese el incremento de brillo alrededor de las células desde la parte inferior a la superior de la imagen. Barra 100 µm. (e) Por LT-SEM se puede observar el aspecto de las biopelículas hidra- tadas y la distribución de las sustancias extracelulares poliméricas. Barra 20 µm. (f) La microscopia electrónica de transmisión es la que permite mayor resolución. Aquí podemos ver como la pared celular de un alga se recubre de minerales y el aspecto de las bacterias que rodean y forman parte de las biopelículas. Barra 0,5 µm. observar la distribución del agua y de parte de las biopelículas. Los cationes las fibras de sustancias extracelulares metálicos más abundantes asociados a embebidas en ella. Así, en el caso de las las capas más exteriores de las biopelí- biopelículas de Chlorella se ha podido culas son el hierro y el azufre, y también observar una red fibrosa entrelazada se han descrito la permineralización de muy marcada mientras que en las de las paredes celulares con sílice en algas Cyanidium y Pinnularia esta red presen- unicelulares atrapadas en los sedimen- ta un aspecto más laxo y menos marca- tos [79]. do. En las biopelículas de Euglena la re- En conclusión, la formación y es- lación entre las células es más laxa y no tructura de las biopelículas refleja la se observa una red de fibras entre ellas. adaptación sufrida por los microorga- En el caso de las bacterias, la unión en- nismos a las diferentes condiciones tre ellas es mucho más marcada, for- ambientales de Río Tinto. La asociación mado colonias y redes de sustancias de las diferentes especies en biopelícu- extracelulares mucho más compactas las les proporciona ventajas nutriciona- [78]. Mediante microscopía electrónica les y/o microambientales específicas de transmisión se puede obtener una que les protegen, en gran medida, de visión más detallada de la localización las extremas condiciones físico-quími- de los minerales a nivel ultraestructu- cas de las aguas que les rodean. Harán 70 ral sobre las paredes celulares de los falta más estudios in situ realizados microorganismos asociados a las EPSs. mediante técnicas de microsensores y En la observación con microscopía de mesocosmos controlados para poder barrido asociada a espectroscopía de comprender mejor los factores que rayos X se pueden realizar mapas de controlan la formación de estas biope- distribución de los diferentes elemen- lículas y la asociación entre diferentes tos alrededor de las células que forman especies. 7. Mecanismos de adaptación a ambientes ácidos extremos

A pesar de su simplicidad morfológica, los neutralidad para que las enzimas citoplas- microorganismos presentes en Río Tinto máticas puedan mantener su estructura son muy diversos, tanto genéticamente y realizar su función. En las especies que como en los mecanismos que utilizan para crecen a un pH óptimo entre 6 y 7, el pH adaptarse a las condiciones ambientales interno se mantiene próximo a la neutra- que los rodean. Los acidófilos tienen me- lidad mientras que en los acidófilos y alca- canismos de resistencia únicos que no es- lófilos el pH interno puede variar, estando tán presentes en organismos que habitan esta variación limitada por la sensibilidad otros ecosistemas no extremos. Por esta de las biomoléculas al pH. Así, Picrophilus 71 razón, los estudios relacionados con extre- oshimae, el más acidófilo de los microorga- mófilos en general y con acidófilos en par- nismos descritos hasta el momento, pre- ticular proporcionan información esencial senta un pH intracelular de 4,6 mientras sobre la adaptación a pH ácidos y sobre la que en alcalófilos se han llegado a medir resistencia a la toxicidad de los metales. En pH internos de 9,5. No se sabe con certeza este sentido, los recientes progresos en la si estos valores representan los dos límites investigación genómica de estas especies extremos de pH intracelular pero tales lí- han proporcionado nuevos conocimientos mites deben ser muy parecidos a éstos ya sobre el versátil metabolismo de estos ex- que el ADN se hidroliza a pH bajos y el ARN tremófilos. Además de ser un grupo muy a pH altos [1]. interesante para estudios evolutivos y eco- Aunque es difícil estudiar in vivo el pH lógicos, los acidófilos pueden ser fuentes intracelular, los estudios realizados hasta potenciales de nuevas enzimas que po- el momento confirman la existencia de drían ser útiles para aplicaciones biotecno- este gradiente de pH dentro y fuera de las lógicas y de biorremediación. células. Los mecanismos que les permiten a los microorganismos mantener su pH 7.1 Mecanismos de intracelular están relacionados con mo- adaptación en dificaciones en sus membranas celulares que las hacen más impermeables al tras- procariotas acidófilos paso de protones, así como al desarrollo Cuando hablamos del pH óptimo de cre- de bombas que ayudan a mantener este cimiento de un microorganismo siempre gradiente. Una prueba indirecta de que el hacemos referencia al pH extracelular ya pH intracelular de los acidófilos no es tan que el intracelular debe ser próximo a la ácido como el medio en el que viven es que, al provocar la lisis de un cultivo de un nio fuera de la célula, aunque en contraste microorganismo acidófilo, el pH del medio con sus parientes neutrófilos tienen que se incrementa. Además, la mayoría de las hacerlo contra un enorme gradiente de enzimas citoplasmáticas de las bacterias concentración de protones que puede su- y arqueas acidófilas que se han estudiado perar en hasta seis órdenes de magnitud tienen un pH óptimo de actividad cercano el de los ambientes neutros. Sin embargo, a 7. Sin embargo, en el caso de las enzimas al poseer membranas celulares que son involucradas en los procesos de oxidación notablemente impermeables a la entrada + del hierro que se encuentran en la región pasiva de iones H3O , los gradientes de pH periplásmica de los acidófilos Gram-nega- pueden mantenerse tanto en situación de tivos (p.e. la rusticianina), su pH de activi- reposo celular (sin energía) como por las dad óptimo es similar al del medio externo. células activas [13, 14]. (Mecanismo 1, Figu- Del mismo modo, las enzimas que son se- ra 14). cretadas activamente fuera de las células El segundo mecanismo, consiste en son, por necesidad, activas a un pH ácido tener una membrana celular cargada [10, 11]. positivamente, lo que disminuye drásti- La fuerza motriz de las bombas de pro- camente la entrada pasiva de protones al tones (FMP) es utilizada por los acidófilo citoplasma. Los microorganismos acidó- de igual manera a como lo hacen los proca- filos generan potenciales de membrana 72 riotas neutrófilos. La conversión de ADP en positivos a través de la entrada de catio- ATP por medio de las ATPasas de membra- nes como el potasio. En las células meta- na favorece el transporte sustratos a través bólicamente activas, el ATP se sintetiza a de ellas y sirve para estimular el movimien- través de la entrada controlada de iones to de rotación de los flagelos. Para generar de hidronio impulsado por la FPM. En las esta FMP, la mayoría de los procariotas ne- células inactivas, la FPM tiende a cero y, cesitan generar gradientes de protones, es para que se mantenga la misma diferen- decir, producir una diferencia de pH entre cia de pH entre el exterior y el citoplas- el citoplasma y el medio en el viven [1]. En ma, el potencial de membrana subirá un ambiente ácido, esta diferencia ya exis- para compensar la bajada de la FPM. De te de forma natural y los acidófilos podrían, este modo, en reposo celular, los poten- en teoría, generar ATP sin gasto de energía, ciales positivos de la membrana ofrecen aunque esto produciría rápidamente una protección contra la fuerza impulsora del fuerte acidificación del citoplasma. Para influjo de protones que, de otro modo, mantener este gradiente en los microor- llevaría a una rápida acidificación del ci- ganismos acidófilos se han propuesto dos toplasma y a la consiguiente muerte de mecanismos principales. las células [13, 14]. El primero, consiste en impedir la en- La entrada de protones tiene que pro- trada de protones al interior celular. Los ducirse de manera controlada para evitar acidófilos son capaces de distinguir la la acidificación del citoplasma. Sin embar- molécula de agua (H2O) de los iones hi- go, la oxidación del hierro ferroso tiene + dronio (H3O ). A esta última molécula se que tener lugar, necesariamente, fuera del le impide la entrada, así el pH intracelular citoplasma para evitar la precipitación del no se acidifica. Los acidófilos, como otros hierro férrico que es altamente insoluble procariotas, bombean los iones de hidro- por encima del pH 2,5. En los oxidadores de Mecanismos de adaptación a ambientes ácidos extremos

Figura 14. Representación esquemática de varios mecanismos de adaptación a ambientes ácidos. Las especies de microalgas eucariotas presentan transportadores de iónes metálicos (como NRAMP, CTR, ZIP y FTR) ya que muchos de ellos son esenciales para el metabolismo celular; producen fitoquelatinas (PCs), complejos entre PCs y metales (PC-MeC), enzimas involucradas en la síntesis de PCs (GCS-glutamil-cisteinil sintasa, GS-glutation sintasa, PCS-fitoquelatina sintasa), Complejos de bajo y alto eso molecular entre fitoquelatinas y metales dentro de las vacuolas citoplasmáticas (LMW PC-MeC y HMWPC-MeC); así como m - talotioneínas que se unen a los metales inactivándolos (MTP). Por su parte los procariotas acidófilos son capaces de distinguir + entre H2O y H3O , impidiendo la entrada de este último y reduciendo la acidez del citoplasma (Mecanismo 1). Presentan una membrana cargada positivamente lo que disminuye la entrada pasiva de cationes metálicos (Mecanismo 2), pero la hace más sensible a los aniones (Mecanismo 3). Los ácidos orgánicos como ácido láctico, no están disociados a pH ácidos, pudiendo entrar en la célula por difusión. En el citoplasma se disocia, puesto que el pH es mayor lo que lo hace perjudicial para la célula, la cual puede acabar lisándose (Mecanismo 4).

hierro Gram-negativos, la oxidación del se transfieren por medio de citocromos hierro ferroso está mediada por proteínas solubles y/o ligados a la membrana y, en redox-activas (como la rusticianina en Aci- última instancia, por la citocromo oxidasa dithiobacillus ferrooxidans) retenidas en el donde se utilizan, junto con los protones, periplasma ácido [10, 13, 14]. Los electrones para reducir el oxígeno a agua. Las adaptaciones moleculares que Figura 14). Por otro lado, los acidófilos van a permiten mantener el fuerte gradiente ser sensibles a la mayoría de los aniones ya de pH tienen consecuencias derivadas que penetrarán en su interior fácilmente. que nos ayudan a entender algunas de De este modo, casi todos son sensibles a las características de los microorganis- iones cloruro (Cl-), nitrato (NO3) o meta- mos en ambientes ácidos extremos. Así, les aniónicos como el molibdato (MoO42-). aunque estas células pueden resistir la (Mecanismo 3, Figura 14) aunque no pare- acidificación directa de sus citoplasmas cen verse afectados por iones sulfato, muy por los iones de hidronio, son sensibles a comunes en su ambiente [10]. Este es el una acidificación indirecta mediada por principal motivo por el que, desde un pun- ácidos orgánicos débiles. Las pKa de mu- to de vistas industrial no se pueden llevar chos ácidos orgánicos tienen un pH supe- a cabo procesos de biolixiviación con agua rior a 3 (por ejemplo, el del ácido acético es de mar acidificada, necesitándose agua ~ 4,7) lo que significa que existen predo- dulce. minantemente en formas no disociadas Curiosamente, a pesar de estas en ambientes extremadamente ácidos. adaptaciones moleculares, las paredes Dado que muchos ácidos orgánicos son celulares de los procariotas acidófi- también lipofílicos pueden difundirse los no presentan grandes diferencias pasivamente a través de las membranas con las de los neutrófilos. Una excep- 74 celulares de los acidófilos. Una vez en ción a esto son las arqueas del orden el interior de la célula, los valores de pH Thermoplasmatales, donde el principal neutros hacen que los ácidos orgánicos mecanismo de adaptación a un medio se disocien. Este desequilibrio conduce a ácido extremo y termófilo se basa en la continua afluencia de los ácidos orgá- las adaptaciones de su cubierta celular. nicos, lo que produce una grave acidific - Estas arqueas no tienen pared celular ción y, frecuentemente, a la mortalidad y, sin embargo, viven en un ambiente de la célula. Por consiguiente, los acidó- en el que la concentración externa de filos son paradójicamente, mucho más protones es muy superior a la interna sensibles a los ácidos débiles que sus ho- y, además, en muchos casos son am- mólogos neutrófilos (Mecanismo 4, Figu- bientes termófilos e hipertermófilos. ra 14). Por otro lado, estos mismos ácidos De entre las Thermoplasmata, el género orgánicos no van a ser asimilables para Thermoplasma está muy estudiado y se las sulfatorreductoras clásicas puesto que sabe que posee una membrana de es- no están en formas asimilables para ellas. tructura única que le permite soportar La regeneración de los sulfuros quedará las condiciones ácidas y las altas tem- restringida a micronichos en los que el pH peraturas. Esta membrana está forma- sea algo superior, como puede ocurrir en da por un lipopolisacárido denominado sedimentos o en biopelículas de gran es- lipoglicano que forma una monocapa pesor [10, 13, 14]. tetraéter con glucosa y manosa, conte- Al presentar cargas positivas en su niendo también glicoproteínas pero no membrana, los acidófilos van a ser más re- esteroles. Picrophilus, al contrario que sistentes a altas concentraciones de catio- las otras Thermoplasmatales, sí posee nes metálicos, que son tóxicos para la ma- pared celular y un ADN con abundantes yor parte de los organismos (Mecanismo 2, pares de nucleótidos guanina-citosina Mecanismos de adaptación a ambientes ácidos extremos

que lo hace mucho más estable. Esta 7.2.1 Adaptaciones a pH ácidos composición y estructura especial de los Al igual que ocurre en los procariotas, el pH lípidos de su membrana le proporciona citoplasmático de los eucariotas acidófilo resistencia a pH bajos, perdiendo con- es casi neutro, por lo que tienen que enfren- sistencia a pH superiores a 4, por lo que tarse a gradientes de pH dentro y fuera de esta arquea solo sobrevive en ambien- las células extremadamente elevados. En tes extremadamente ácidos [1, 13, 14]. este sentido, Chlamydomonas acidophila mantiene un pH citosólico medio de 6,6 7.2 Mecanismos de tanto cuando el medio de cultivo está a pH adaptación en 2 como creciendo a pH 7. Por el contrario, su pariente neutrófila más cercana, Chla- eucariotas acidófilos mydomonas reinhardtii, mantiene un pH Es de esperar que los microorganismos citosólico de 7,1 en el medio de cultivo a pH eucariotas que crecen en ambientes ex- 7 [80]. Además, la diferencia de potencial tremadamente ácidos posean estructu- eléctrico transmembrana de C. acidophila, ras moleculares y controles fisiológico medida con electrodos intracelulares tanto muy diferentes en comparación con a pH 2 como a pH 7, es cercana a 0 mV, un las especies afines que viven en am- valor poco común para plantas, animales bientes de pH neutro. Hasta hace muy y protistas [80]. Mantener el pH neutro poco tiempo era imprescindible tener a en el citosol en un ambiente extracelular 75 las especies en cultivo para la secuen- a pH 2 indica la existencia de un gradiente ciación de su genoma. Sin embargo, y de protones transmembrana de 105 veces, hasta cierto punto, esta limitación se es decir, existen 105 veces más protones ha resuelto mediante el desarrollo del fuera que dentro de la célula. Además de campo de la metagenómica y la genó- en los acidófilos, en la naturaleza sólo hay mica de células únicas. La secuenciación descritos unos pocos ejemplos más de este del metagenoma, junto con otras técni- tipo de gradientes, como es en el estómago cas “ómicas” como la transcriptómica de los mamíferos (104 a 106 veces) y en la (análisis de los niveles de transcripción vacuola ácida de las células vegetales (105 de ARNm), la proteómica (estudio de veces). Mantener este tipo de gradientes la composición de proteínas) y la me- de protones a través de la membrana sería tabolómica (estudio de los metaboli- un esfuerzo energéticamente inalcan- tos celulares) han permitido un avance zable para las células si la membrana no extraordinario en el estudio de la bio- estuviera adaptada a la entrada pasiva de logía de sistemas, que facilitan enor- protones. De hecho, las Chlamydomonas memente el estudio combinado de las acidófilas son capaces de sobrevivir en una funciones de la comunidad microbiana amplia gama de pH extracelulares, man- en sí misma y sus interacciones con del teniendo un pH citosólico relativamente medio ambiente. En los últimos años, neutro, consumiendo ATP a un ritmo más el desarrollo de estas metodologías ha rápido cuando viven en condiciones áci- permitido profundizar en los mecanis- das que en condiciones neutras [80]. Se mos de adaptación de los extremófilos, piensa que la extrusión activa de protones tan difíciles siempre de ser cultivados en en una vacuola citosólica es el mecanismo el laboratorio y analizados in vitro. principal que usan estas microalgas para mantener el gradiente de protones. El pH acidófilos. La mayoría de las células vivas citosólico casi neutro puede mantenerse, tienen una carga superficial negativa a además, con la ayuda de las vacuolas con- pH neutro debido al exceso de aminoáci- tráctiles de estas microalgas, evitando así dos ácidos en las proteínas de membrana que los intercambiadores o transportado- y a la presencia de lípidos ácidos en la su- res de protones de la membrana celular perficie extracelular. Sin embargo, a pH 1, estén expuestos al bajo pH extracelular. la mayoría de los grupos aniónicos están Esto implicaría que la estructura primaria protonados, dejando una carga superficia de los transportadores de protones en este neta positiva. Este hecho también podría acidófilo puede no ser diferente de los que explicar su alta resistencia a los cationes se encuentran en los protistas neutrófilo polivalentes y a los metales pesados muy [80]. frecuentes en ambientes ácidos. Por el contrario, Dunaliella acidophila se ha adaptado a vivir en pH bajo (<5) de 7.2.2 Adaptaciones a limitaciones una manera muy diferente. Esta microalga nutricionales es uno de los acidófilos más extremos co- La mayoría de los entornos ácidos extre- nocidos, capaz de crecer de forma óptima mos tienen una baja productividad relacio- a valores de pH entre 0 y 3 y, manteniendo nada con concentraciones relativamente un pH intracelular de 7. Para conseguirlo bajas de amonio, fosfato o nitratos, siendo 76 utiliza una serie de mecanismos de adap- considerados ambientes oligotróficos [83, tación que contribuyen a reducir el flujo de 84]. Una ventaja metabólica para sobrevi- entrada de protones, expulsándolos acti- vir a pH bajos es, por tanto, la capacidad de vamente fuera de la célula. Estas adapta- algunas microalgas acidófilas de producir ciones incluyen la creación de un potencial fosfatasas. Chlamydomonas acidophila positivo en el interior de la célula, la exis- responde a la deficiencia de fosfato, no tencia de una carga superficial positiva y la sólo aumentando la actividad de la fosfa- presencia de uno de los transportadores de tasa total sino también produciendo otra protones de membrana, H+-ATPasa, más fosfatasa con un pH óptimo de actuación potentes descritos hasta el momento. A cercano a 2 [85]. Esta es una de las razones pH ácido, D. acidophila produce un exceso por las que C. acidophila es tan abundante de esta enzima H+-ATPasa que, aunque se en todos los ambientes ácidos extremos, parece a la encontrada en las plantas, es tanto en las zonas afectadas por la minería mucho más efectiva y difiere de ellas en va- como en los ambientes geotermales. rios aspectos cinéticos y estructurales. Las Además de esto, en Río Tinto las con- H+-ATPasas de la membrana celular de D. centraciones de ion bicarbonato son in- acidophila tienen un peso molecular mayor significantes, siendo el CO2 disuelto la y una actividad entre 2 y 3 veces superior a principal fuente de carbono inorgánico las de plantas, siendo 6,0 su pH óptimo, lo para las microalgas. La disponibilidad de que es ligeramente inferior al normal [81, CO2 para su fijación depende de la difusión 82]. hacia el interior de las células y/o de la ca- Otro factor que disminuye la permea- pacidad de las microalgas de acumularlo en bilidad a los protones de las células de D. su interior. La gran mayoría de los organis- acidophila es su carga superficial positiva, mos fotosintéticos acuáticos dependen de como ocurría en el caso de los procariotas los mecanismos de concentración de CO2 Mecanismos de adaptación a ambientes ácidos extremos

para elevar la concentración de CO2 cerca una absorción muy eficiente por parte de de la enzima Rubisco. Así, las algas verdes estos microorganismos de la luz roja, que y las cianobacterias poseen estos mecanis- es la longitud de onda dominante disponi- mos de concentración de CO2 para superar ble en estas aguas ácidas ricas en hierro y las barreras fotosintéticas causadas por la de un color rojo intenso [87]. baja concentración de CO2 disuelto que se Para estudiar cómo se han adaptado encuentra en la mayoría de los ambientes fotosintéticamente las microalgas y pro- acuáticos, y la lenta difusión de CO2 en el tistas autótrofos que habitan Río Tinto agua. Chlamydomonas acidophila presenta hemos utilizado dos enfoques metodo- un mecanismo de concentración de CO2 y lógicos principales la oximetría y la flu - muestra una alta afinidad en la utilización rimetría de pulso de amplitud modulada de CO2 a bajas concentraciones por eso (PAM). La oximetría facilita el cálculo de esta tan bien adaptada a las aguas ácidas curvas de fotosíntesis-irradiancia (curvas en lagos y en zonas con poca agitación [86]. P-I, en sus siglas en inglés) que nos permiten distinguir entre dos comportamientos 7.2.3 Adaptaciones fotosintéticas fotosintéticos diferentes, la fotoinhibición La actividad fotosintética es un proceso y la fotosaturación. Las curvas P-I refleja particularmente sensible a las condicio- los procesos biofísicos, bioquímicos y me- nes ambientales estresantes como la sa- tabólicos subyacentes que regulan la foto- linidad, el pH o la presencia de sustancias síntesis, permitiéndonos estimar los prin- 77 tóxicas. Hasta el momento, hay muy pocos cipales parámetros fotosintéticos como trabajos sobre la actividad fotosintética en son: la fotosíntesis máxima (Pmax); la irra- ambientes ácidos y la mayoría de estos es- diancia de compensación (Ic); la eficienci tudios se han centrado en el análisis de la fotosintética (a) o la tasa de fotoinhibición productividad primaria en lagos ácidos. Se (b). Por su parte, la fluorimetría PAM anali- ha visto que la baja productividad primaria za la cinética del transporte de electrones de estos entornos se debe principalmente en los pigmentos fotosintéticos midiendo a la presencia de metales pesados en el la emisión de fluorescencia. Esta medida agua o a la baja concentración de fosfato permite el estudio de parámetros como el reactivo soluble [83]. Curiosamente, el pH rendimiento cuántico efectivo del Fotosis- ácido no provoca por sí mismo reducciones tema II (Máximum Quantum Yield, Fv/Fm) significativas de la actividad fotosintética. y la Tasa de Transporte de Electrones (ETR), La luz es otro factor limitante de la pro- generalmente utilizados para caracterizar ductividad primaria en ambientes ácidos la eficiencia fotosintética de las comunida- debido a que la excesiva cantidad de hierro des biológicas. disuelto suele ser de color oscuro, lo que Todas las biopelículas fotosintéticas produce importantes cambios cuantita- analizadas en Río Tinto (Chlorella spp., tivos y cualitativos en la distribución de la Euglena mutabilis, Pinnularia spp. y Zyg- luz en la columna de agua [31]. A pesar de nemopsis spp.) mostraron un fuerte com- esto, se ha descrito una fuerte adaptación portamiento de fotoinhibición en sus cur- a bajas intensidades de luz en biopelículas vas P-I excepto en el caso de Zygnemopsis, bentónicas de diatomeas de lagos ácidos que mostró una curva P-I fotosaturada [31]. donde se ha medido actividad fotosintéti- Habitualmente, la fotoinhibición en las ca a pesar de la escasez de luz. Esto sugiere curvas P-I se observa en organismos adaptados a bajas intensidades lumínicas, que res de muestreo. Por ejemplo, las biopelí- no pueden disipar adecuadamente el ex- culas de Euglena que viven en diferentes cesivo flujo de fotones proporcionado por zonas de Río Tinto tienen valores fotosin- una alta irrandiancia. En nuestro caso, las téticos distintos. Hay que tener en cuenta biopelículas que presentan fotoinhibición que las características físico-químicas de suelen estar situadas en el fondo del lecho las aguas del río varían mucho a lo largo de del río, cubiertas por varios centímetros de su recorrido. Estos resultados podrían ex- agua roja muy coloreada. Además, estas plicarse por fenómenos de fotoadaptación especies presentan unos valores de Irra- en lugar de por procesos de fotoaclimata- diancia de Compensación (Ic, cantidad de ción. La fotoadaptación hace referencia a luz mínima necesaria para la fotosíntesis) los cambios en el genotipo que surgen, ya e Irradiancia de Saturación (Ik, cantidad sea de mutaciones o de cambios en la dis- de luz a la que se produce fotosaturación) tribución de los alelos dentro de un grupo muy bajos, lo que confirma su buena adap- de genes mientras que la fotoaclimatación tación a baja luminosidad. Incluso con irra- se refiere a los ajustes fenotípicos que sur- diaciones tan bajas como 5 mmol m-2 s-1, gen en respuesta a las variaciones de los en el caso de la diatomea Pinnularia sp., factores ambientales. se detectó actividad fotosintética. Por el Cuando comparamos los patrones de contrario, los filamentos de Zygnemopsis expresión global de las proteínas solubles 78 spp. que se sitúan flotando en la superfici celulares de Chlamydomonas acidophila del agua, donde la irradiación solar es ex- aisladas de Río Tinto y cultivadas tanto en tremadamente alta en verano, se compor- el agua natural del río como en medios ar- tan de manera muy diferente, exhibiendo tificiales a pH 2 pero en ausencia de meta- fenómenos de fotosaturación y actuando les, encontramos una clara sobreexpresión como una especie bien adaptada a con- de numerosas proteínas relacionadas con diciones de luz intensa. Esta diferencia en el estrés oxidativo junto con una compleja sus nichos ecológicos puede explicar el batería de proteínas involucradas en el me- diferente comportamiento fotosintético tabolismo primario y energético o la moti- entre las especies. lidad celular [88]. Sin embargo, los cambios Los valores máximos de fotosíntesis más dramáticos observados en el proteo- (Pmax) son bajos en comparación con ma de estas microalgas estaban relaciona- otros ambientes. En lagos ácidos de minas, dos con proteínas involucradas en el ciclo la productividad primaria del fitoplancto de Calvin y en el metabolismo fotosintéti- es baja probablemente debido a su escasa co. Curiosamente, una de las proteínas que biomasa. En nuestro caso, esta no puede más modificaba su expresión al compa- ser la razón ya que, en Río Tinto, los orga- rar cultivos control con los que crecían en nismos fotosintéticos representan más del agua natural de río era la ribulosa-1,5-bis- 65% de la biomasa total [34]. Otro motivo fosfato carboxilasa/oxigenasa (RuBisCo), para la baja productividad en estos am- una de las principales enzimas implicadas bientes extremos podría ser la falta de en la actividad fotosintética. Esta enzima, nutrientes como el amonio, el fosfato o el que cataliza el paso inicial y más signific - nitrato [83]. Todos los parámetros fotosin- tivo del ciclo de Calvin, la fijación del CO2 téticos analizados muestran diferencias a una forma orgánica, disminuye drásti- significativas entre las especies y los luga- camente su expresión en aguas naturales Mecanismos de adaptación a ambientes ácidos extremos

ricas en metales. Estos resultados están es- B en los periodos de mayor insolación del trechamente relacionados con la presencia año. Los organismos fotosintéticos tam- de altos niveles de metales pesados en las bién están expuestos a la radiación UV que aguas ácidas naturales ya que la inhibición puede repercutir muy negativamente en de la actividad fotosintética es una de las la síntesis de ADN, la actividad bioquímica, más importantes respuestas celulares a las la fotosíntesis, la absorción de nutrientes, condiciones de estrés por metales. Se han la biomasa y la biodiversidad en las comu- descrito resultados similares en la especie nidades de los ecosistemas acuáticos. La neutrófila Chlamydomonas reinhardtii en radiación UV perturba la cadena de trans- la presencia de cadmio y cobre, así como porte fotosintética por la fotodegradación en otros organismos fotosintéticos. de la proteína D1 en el Fotosistema II, lo que Por el contrario, una de las familias de está potenciado por la alta radiación PAR y proteínas más sobre-expresadas en este falta de nutrientes. Además, la radiación estudio fueron los fitocromos. El fitocrom UV está relacionada con la Respuesta Oxi- es una proteína con actividad quinasa pre- dativa (ROS) que causa daño oxidativo a la sente en organismos fotosintéticos cuya célula [89]. A pesar de los efectos adversos función es actuar como fotorreceptor fun- de la radiación solar y la radiación ultra- damentalmente de luz roja (600-700nm) violeta están muy bien documentados en y roja lejana (700-800nm). Por tanto, no es los entornos marino y de agua dulce, no de sorprender la inducción de este tipo de se sabe prácticamente nada sobre cómo 79 fotorreceptores en microalgas que viven afectan estos fenómenos a microorganis- en aguas en las que predomina el color mos fotosintéticos de ambientes ácidos, rojo, como es el caso de Río Tinto, en el que aunque es evidente su importancia ecoló- la elevada concentración de hierro férrico gica en esos entornos extremos. soluble en el bajo pH del río les confier En un intento de comprender mejor este color a sus aguas. Estudios en lagos cuáles son los cambios en la actividad me- ácidos mineros demuestran que sólo la tabólica de los eucariotas fotosintéticos luz roja es capaz de llegar a los sedimentos que viven en Río Tinto y que les ayudan del fondo [87]. Este color tiene un marcado a sobrevivir en este entorno, hemos es- efecto en la calidad e intensidad de la luz tudiado el rendimiento fotosintético de que llega a las células, con lo que el aumen- biopelículas naturales de E. mutabilis. Para to de los niveles de fitocromo podría ser un ello, analizamos la actividad de los fotosis- proceso de adaptación a estas condiciones temas y las variaciones transcripcionales a ambientales que ayudaría a los microor- lo largo del día [90]. Los análisis metatrans- ganismos fotosintéticos a sacar el mayor criptómicos proporcionan una vía muy partido posible del espectro de luz que les prometedora para explorar el metabolis- llega. mo de los organismos en sus condiciones Otro de los factores ambientales im- naturales, analizando su expresión genéti- portantes que pueden llegar a ser extraor- ca en relación con la variación de las con- dinariamente dañinos para los microor- diciones ambientales. Este análisis puso ganismos es la exposición a la radiación de manifiesto la enorme reprogramación ultravioleta (UV). Río Tinto, localizado al transcriptómica que Euglena sufre duran- sur de la Península Ibérica, puede llegar a te el mediodía, periodo de mayor intensi- recibir hasta 2 W m-2 de radiación UVA y dad lumínica y de radiación UV. Estos protistas muestran una fuerte fotoinhibición breexpresión de tránscritos relacionadas debido al estrés que les provoca el exceso con la proteína D1 y las proteasas Deg que de radiación solar. Hubo reducciones signi- indican que ambas fueron sintetizadas ficativas tanto en la Tasa de Transporte de continuamente durante todo el ciclo diario Electrones (ETR) como en el Rendimiento de las euglenas. Esto hace que exista una Cuántico Máximo del Fotosistema II (Fv/ fuente constante de proteína D1 recién Fm) en respuesta al aumento de la radia- sintetizada, aumentando su tasa de re- ción solar durante las horas centrales del emplazo, minimizando el daño de la luz al día. En este momento, las células paran Fotosistema II y reduciendo su tiempo de su actividad fotosintética para proteger al recuperación. Esta rápida respuesta podría aparato fotosintético del exceso de luz y de formar parte de una estrategia fotosintéti- radiación UV, siendo capaces de recuperar ca de protección fisiológica para entornos completamente su actividad fotosintética muy variables, como las aguas ácidas. hacia el final de la tarde, cuando estos pa- Para minimizar todavía más los efec- rámetros ambientales disminuyen signifi- tos negativos de la radiación solar, los cativamente. Este hecho indica que no se resultados del patrón de transcripción produce ningún daño persistente al apara- indican la presencia de un ritmo circa- to fotosintético, lo que apoya la presencia diano en estos euglenófitos que aumenta de la fotoinhibición dinámica en las biope- significativamente su capacidad de so- 80 lículas de Euglena. En este caso particular, brevivir en este entorno. Las biopelículas la fotoinhibición se debe a la radiación UV de euglenas analizadas tenían sus ciclos y no a la intensidad de la luz como revela de división sincronizados, realizando la el análisis de fluorimetría PAM. Cuando la mayor parte de su actividad fotosintética radiación UV es eliminada mediante un durante las primeras horas de la mañana filtro, no presentan fenómenos de fotoin- y la replicación de ADN a última hora de hibición en ningún momento del día. la tarde, cuándo la irradiación es mucho Nuestros análisis transcriptómicos menor, disminuyendo así la posibilidad también apoyan la existencia de una fo- de fenómenos de mutagénesis. La divi- toinhibición dinámica en la mayoría de las sión celular la realizan a lo largo de toda especies analizadas. La pérdida de activi- la noche. Durante el día, la mayor parte dad del Fotosistema II, por efecto de la fo- de los tránscritos que se están expre- toinhibición, inicia una serie de reacciones sando están relacionados con genes in- de reparación celular relacionadas princi- volucrados en la estabilidad y reparación palmente con la proteína D1 del centro de del Fotosistema II, la reparación del ADN reacción, que es el principal objetivo del dañado por los rayos UV, la disipación de daño oxidativo. La rápida degradación de la energía de los fotosistemas y el estrés la proteína D1 fotodañada por la acción de oxidativo, lo que confirma el fenómeno de las proteasas Deg y su sustitución por una fotoinhibición detectado por la fl orime- copia funcional sintetizada de nuevo es un tría PAM al mediodía. importante mecanismo de reparación del Nos gustaría destacar que, aunque E. Fotosistema II, crucial para la supervivencia mutabilis comparte muchas respuestas de de los organismos fotosintéticos en condi- estrés con otros organismos, a lo largo de ciones de estrés lumínico. Los resultados los análisis transcriptómicos hemos detec- transcriptómicos muestran una fuerte so- tado un gran porcentaje de genes desco- Mecanismos de adaptación a ambientes ácidos extremos

nocidos, muchos de los cuales no habían menor es la biodisponibilidad y, al mismo sido identificados previamente. Esto pone tiempo, menor es la toxicidad. De esta made relieve el hecho de que todavía no se nera, el estudio de extremófilos acidófilo han descrito muchos de los mecanismos puede proporcionar nuevos datos sobre los moleculares que subyacen a la adaptación mecanismos de resistencia a los metales al estrés ambiental en estos extremófilos pesados que no podríamos observar analizando solo los organismos neutrófilos 7.2.4 Adaptaciones a metales La capacidad de los eucariotas acidófi- pesados los para sobrevivir a las altas concentracio- Como hemos mencionado anteriormente, nes de metales se debe a una combinación un pH bajo facilita la solubilidad de los me- de sistemas extracelulares pasivos e intra- tales, en particular de los metales catióni- celulares activos. Dentro de los mecanis- cos (como el cadmio, el cromo o el cobre) mos de resistencia pasivos, los acidófilo y, por tanto, las aguas ácidas tienden a pre- eucariotas suelen encontrarse agrupados sentar altas concentraciones de metales formando biopelículas y producir sustan- pesados. Así pues, los acidófilos, además cias poliméricas extracelulares, las cuales de vivir en condiciones de pH extrema- pueden absorber metales, reduciendo en damente bajas, son capaces de soportar gran manera la cantidad de metal que concentraciones de metales pesados im- llega al interior celular. Por otro lado, el pensables en otros hábitats con un pH neu- mecanismo de defensa intracelular más 81 tro. La relación entre los metales pesados frecuentemente desencadenado por la y los microorganismos es paradójica, por entrada de metales es la producción de un lado, la mayoría de ellos son esenciales fitoquelatinas y metalotioneínas, peque- para la función celular y su falta causa im- ños péptidos capaces de unirse covalen- portantes disfunciones. Por otro lado, esos temente a los metales y conducirlos al mismos metales en altas concentraciones interior de vacuolas que posteriormente son extremadamente tóxicos. Por este serán exocitadas. De esta manera se neu- motivo, todos los organismos han desarro- traliza su efecto tóxico. llado numerosos sistemas y vías metabóli- Los conocimientos actuales sobre la cas reguladoras que están involucradas en variabilidad genética en la tolerancia a los su transporte e inmovilización para contro- metales, la adaptabilidad o los mecanis- lar sus concentraciones intracelulares. mos de desintoxicación se basan, principal- El nivel de ecotoxicidad de los metales mente, en la exposición de los organismos pesados es el resultado de la combinación a un único parámetro de estrés, aunque las de factores bióticos y abióticos. Los más poblaciones en el medio ambiente natural importantes son la biodisponibilidad de suelen estar expuestas a mezclas de varios los metales y la presencia de otros metales cationes a la vez. Las diferencias encontra- en el agua. El pH es uno de los parámetros das en el grado de expresión de las proteí- que más afecta a esta biodisponibilidad y, nas en respuesta a diferentes sustancias por consiguiente, a la toxicidad del metal. químicas indican que las interacciones Generalmente, a pH ácido, la mayoría de genotipo-ambiente desempeñan un papel los metales forman cationes libres solubles importante en la determinación de las res- que son más bio-accesibles para los mi- puestas de una población a las sustancias croorganismos. Cuanto más alto es el pH, tóxicas [91]. Por lo tanto, es esencial estudiar la respuesta a esa mezcla de condicio- tránscritos relacionados con el estrés celu- nes de estrés ambiental y la forma en que lar general y oxidativo. Cabe señalar que esa respuesta difiere de la causada por una estos altos niveles de tránscritos relaciona- sola sustancia química. das con el estrés general y oxidativo tam- Para abordar esta cuestión, hemos es- bién se observaron en la muestra control, lo tudiado la respuesta al estrés bajo concen- que sugiere una alta expresión constitutiva traciones ambientales de metales pesados de estos mecanismos de defensa en D. aci- en cultivos de Dunaliella acidophila que dophila, incluso después de años de creci- fueron aisladas en Río Tinto [92]. El género miento en ausencia de estrés por metales Dunaliella es particularmente atractivo pesados. Esto es particularmente relevante para los estudios sobre los mecanismos en el caso de dos enzimas; la fitoquelatin de adaptación a condiciones ambientales sintasa y la glutatión S-transferasa, así extremas ya que a él pertenecen dos de como para las metalotioneínas, ya que las especies eucarióticas más extremófila todas ellas están directamente relaciona- descritas hasta ahora, D. salina y D. acido- das con la respuesta a celular a metales phila. Además, las especies de Dunaliella pesados y a los procesos de detoxificació son bien conocidas por su extraordinaria [93]. Los tránscritos relacionados con estos tolerancia a la salinidad, la temperatura, la compuestos estaban expresados hasta 10 limitación de nutrientes y la irradiación. D. veces más que la media de las transcripcio- 82 acidophila se encuentra en múltiples hábi- nes, incluyendo los controles que no tenían tats ácidos en todo el mundo y su presencia el metal. en Río Tinto se ha correlacionado positiva- La presencia de una mezcla compleja mente con los valores más bajos de pH y de metales en el medio de crecimiento, las concentraciones más altas de metales como ocurre en el agua natural de Río pesados [16]. Estos hechos sugieren clara- Tinto, produce una respuesta transcriptó- mente que esta microalga ha adquirido mica diferente en D. acidophila, en compa- mecanismos de adaptación eficientes ración con la otra condición experimental, para hacer frente a las tensiones asociadas en la que las células crecían sólo en presen- a estos ecosistemas. cia de cadmio. Las principales diferencias Realizamos un análisis transcriptó- entre estas condiciones de cultivo están re- mico comparativo entre cultivos de D. lacionadas con la composición de metales acidophila crecidos en agua natural del río, y la presencia de quelantes naturales. Los en medio artificial sin metales a pH 2 y en análisis de las librerías transcriptómicas del medio artificial suplementado con un solo agua de Río Tinto sugerían una actividad metal, el cadmio. Al analizar y comparar basal, metabólica y energética, significat - los transcriptomas de las tres condiciones vamente mayor que cuándo las células cre- experimentales, se identificaron cambios cen en presencia de un solo metal o en el en respuesta a las altas concentraciones cultivo control. Es tentador pensar que esta de cadmio y al agua rica en metales natu- mayor actividad metabólica podría estar rales de Río Tinto [92]. Nuestros resultados relacionada con un incremento de la tasa sugieren que existe una respuesta consti- de renovación de las proteínas. El aumento tutiva en esta especie, es decir, incluso en del número de tránscritos relacionados con ausencia de metales pesados en el medio, procesos catabólicos proteómicos indica las células siguen produciendo numerosos una degradación de proteínas más activa Mecanismos de adaptación a ambientes ácidos extremos

en el agua natural en comparación con de tránscritos que no fueron caracteriza- las otras dos condiciones experimentales. dos, es decir, no se encontraron secuencias Además, también se observa una mayor semejantes en las bases de datos actuales actividad metabólica del nitrógeno, que in- que nos permitieran identificarlos. Esta cluye a los aminoácidos y el transporte de cifra estaba en torno al 20 % de las secuen- compuestos nitrogenados. Este aumento cias. Además, muchos de estos tránscritos, en la tasa de renovación proteica podría reconocidos como proteínas involucradas ayudar a los acidófilos a mantener la inte- en la respuesta celular antioxidante, eran gridad funcional de su proteoma en condi- muy parecidos a los encontrados en otras ciones ambientales tan adversas como las especies procariotas, lo que abre la puerta que viven ya que los metales pesados pro- a que los mecanismos de transferencia vocan una alteración de la funcionalidad de horizontal de genes sea una importante las proteínas [11]. fuente de nuevos genes en estas especies También hemos estudiado la res- extremófilas, permitiéndoles prosperar en puesta a metales pesados en cepas de condiciones ambientales adversas, como Chlamydomonas acidophila aisladas de veremos en la siguiente sección. Río Tinto. En este caso, trabajamos con Los organismos acidófilos también un metal esencial como es el cobre, que son capaces de transformar las especies puede llegar a alcanzar concentraciones metálicas en formas menos tóxicas o de hasta 6 mM en algunas zonas del río biodisponibles. En concreto, Cyanidium 83 [94]. El cobre es un metal traza que los or- caldarium es capaz de oxidar, reducir y ganismos aerobios necesitan en pequeñas metilar compuestos de arsénico, proceso cantidades debido a que juega un papel este último que conduce a la generación importante como cofactor en las enzimas de especies de arsénico volátil. Además, de las reacciones químicas que requie- se ha visto que Euglena mutabilis es par- ren oxígeno. Las altas concentraciones de ticularmente resistente al arsénico, lo cobre son, sin embargo, muy tóxicas para que podría depender de una nueva res- las células. Nuestros resultados sugieren puesta adaptativa a la presencia de este que un organismo hipertolerante, como C. metaloide tóxico. Los análisis transcriptó- acidophila, podría haber desarrollado me- micos realizados en E. mutabilis revelaron canismos de resistencia diferentes a los or- que esta especie evita la acumulación de ganismos no acidófilos. Por ejemplo, en las arsénico en la célula mediante la expre- librerías transcriptómicas analizadas no se sión de varios transportadores de mem- detectaron alteraciones en los tránscritos brana, induciendo también la expresión de proteínas que participan en los meca- de genes involucrados en mecanismos nismos de defensa antioxidante, a pesar activos de reparación del ADN y síntesis de los elevados niveles de cobre utilizados de proteínas que permiten a E. mutabilis experimentalmente. Sorprendentemente, mantener la integridad funcional de la tampoco se produjeron cambios en la ac- célula en condiciones difíciles. En con- tividad fotosintética de C. acidophila, aún a junto, todos estos resultados sugieren la concentraciones de cobre letales para mu- existencia de una respuesta al arsénico chas otras especies neutrófilas específica de E. mutabilis que puede des- Algo que llama la atención en estos es- empeñar un papel en su hipertolerancia tudios transcriptómicos es la gran cantidad a este metaloide tóxico [95]. Por otro lado, los análisis transcrip- tos genómicos, incluyendo la duplicación tómicos y metabolómicos llevados a de genes y la HGT, juegan papeles críticos cabo en Coccomyxa sp., una microalga estimulando la evolución adaptativa de aislada de un drenaje ácido de mina en los genomas microbianos en respuesta a Carnoulès (Francia) pusieron también de cambios ambientales [97]. Así pues, se ha manifiesto la inducción de un conjunto prestado gran atención a la duplicación de de transportadores de membrana que genes y/o genoma al ser estas las fuerzas podrían impedir la acumulación intrace- evolutivas dominantes para la innovación lular de arsénico [96]. Las observaciones funcional. Además, el proceso de HGT está realizadas con microscopía electrónica considerado como el mecanismo evolutivo de transmisión han mostrado la presen- predominante que contribuye a la diversi- cia de cuerpos densos en vacuolas intra- ficación del genoma [98] celulares en Chlamydomonas acidophila Por otro lado, el considerable aumento y Cyanidium caldarium, así como en de datos genómicos producido en los últi- otras especies de microalgas tratadas mos años, ha consolidado la teoría de que con metales pesados. Estos cuerpos los fenómenos de reducción del genoma densos contienen metales pesados, lo son una fuente generalizada de modifi- que confirma que la acumulación de caciones genéticas potencialmente res- metales en las vacuolas citoplasmáticas ponsables de la mayoría de la diversidad 84 es también un mecanismo que contri- fenotípica adaptativa de las especies [99]. buye a la tolerancia, manteniendo bajas Se ha observado pérdida de genes en una las concentraciones de metales en el ci- amplia gama de organismos, incluyendo toplasma. procariotas, protistas, hongos, plantas, e incluso animales, lo que nos da una eviden- 7.3 La transferencia cia sólida que apoya la omnipresencia de la horizontal de genes pérdida de genes en todos los reinos de la vida [99]. Sin embargo, todavía no está como mecanismo de clara cuál es la contribución de cada una de resistencia adaptativa las principales fuerzas evolutivas conocidas en la organización, estructura, y diversific - Como hemos mencionado anteriormente, ción de los genomas microbianos. los análisis filogenéticos de las librerías me- El enorme desarrollo de las técnicas tatrascriptómicas realizadas en microor- de secuenciación masiva y de la bioinfor- ganismos eucariotas de Río Tinto, indican mática está poniendo a disposición de los que muchos de los tránscritos encontrados investigadores un número creciente de son muy parecidos a los de otras especies genomas completos de microorganismos procariotas, lo que abre la puerta a que los acidófilos que están proporcionando los mecanismos de transferencia horizontal primeros resultados sobre las principa- de genes (HGT en sus siglas en inglés) sean les características genómicas en diversos una de las principales fuerzas adaptativas ambientes ácidos. Hasta la fecha, la ma- en estas especies, permitiéndoles coloni- yor parte de los genomas secuenciados zar nuevos ambientes, en principio, muy de especies acidófilas corresponden a adversos para su desarrollo. Desde hace procariotas de las especies Sulfobacillus décadas, se sabe que los reordenamien- acidophilus [100, 101], S. thermosulfidoox - Mecanismos de adaptación a ambientes ácidos extremos

dans [102, 103], S. benefaciens, y S. thermo- membrana bacterianos resistentes al sulfidooxidan , así como de diversas cepas arsénico que biotransforman este com- de “Ferrovum”, de Acidithiobacillus caldus puesto, así como ATPasas procedentes y At. ferrooxidans [104, 105]. Los estudios de arqueas que, probablemente, contri- de genómica comparada en distintas ce- buyen a la tolerancia para la temperatu- pas de “Ferrovum” han identificado genes ra que tienen estas microalgas [107]. De que proceden de otras especies en todas hecho, se estima que, al menos, el 5% las cepas analizadas. Los procesos de HGT de los genes de G. sulphuraria han sido estaban relacionados con genes asociados adquiridos por procesos relacionados a procesos de fagocitosis, transposasas, con el HGT [108]. Además, la reducción integrasas y genes que codifican proteínas en el número de genes que codifican los del sistema de secreción. Por otro lado, hay canales iónicos dependientes de voltaje, cepas que han perdido grupos de genes así como la adquisición de nuevas fami- relacionados con la movilidad, la quimiota- lias de genes relacionados con los trans- xis y la secreción de sustancias poliméricas portadores de cloruros han contribuido extracelulares importantes en la forma- significativamente a la resistencia a pH ción de biopelículas. Aunque la pérdida de ácido de estos microorganismos [107]. genes puede ser perjudicial durante las pri- También, se ha publicado el primer bo- meras etapas de la colonización de nuevos rrador de la secuencia del genoma del alga hábitats, una vez establecida en el nuevo verde acidófila Chlamydomonas eustigma 85 ecosistema, las poblaciones pueden verse [109]. Cuando se comparó este genoma beneficiadas por tener un tamaño de ge- con el de C. reinhardtii, su homónima neu- noma más pequeño [98]. trófila, se comprobó como cabía esperar, En el caso de los eucariotas acidófilos que los genes que codifican las proteínas se han secuenciado menos especies to- de choque térmico y los transportadores davía. Hasta ahora, existe información de membrana plasmática H+-ATPasa es- sobre los genomas de tres microalgas tán mucho más expresados en la especie termoacidófilas del orden Cianidiales acidófila. Además, C. eustigma también ha muy relacionadas entre sí; Cyanidios- perdido genes relacionados con las princi- chyzon merolae, Galdieria sulphuraria, pales rutas de fermentación que provoca- y Galdieria phlegrea [106-108]. Al igual ban una acidificación el citoplasma, adqui- que en el caso de los procariotas, estu- riendo genes que codifican para sistemas dios de genómica comparada han en- de tamponamiento de pH intracelular y contrado fenómenos de HGT aunque, genes de desintoxicación de arsénico me- en este caso, estos procesos se han dado diante. El hecho de que todas estas carac- entre organismos de diferentes Phylum terísticas también se hayan encontrado en ya que la HGT se producía entre proca- otras algas acidófilas verdes y rojas indica riotas ambientales y eucariotas. Estos la existencia de mecanismos comunes en procesos de HGT, con la adquisición de la adaptación a ambientes ácidos en euca- nuevas familias de genes y la pérdida de riotas. otros, han jugado un papel decisivo en Con respecto a Río Tinto, estudios me- la adaptación de estas algas rojas a los tatranscriptómicos en cultivos de Chla- ambientes ácidos [108]. Las algas Ciani- mydomonas acidophila y Dunaliella aci- diales han adquirido transportadores de dophila han demostrado la existencia de genes de la enzima fitoquelatina sintasa puesta a estrés oxidativo y desintoxicación de origen bacteriano que han jugado un de metales pesados que eran muy pareci- papel importante en su tolerancia a los dos a los de otros organismos procariotas metales [90, 110, 111]. Los metales pesados [94]. De hecho, encontramos dos fitoqu - suelen ser tóxicos porque desplazan de latina sintasa completamente diferentes a sus sitios de unión a los cofactores metáli- las descritas en otras algas verdes, hasta el cos de las enzimas endógenas y producen momento, a las que denominamos CaPCS1 reacciones anómalas con los grupos tiol y CaPCS2. Esto también ocurría en cultivos de las proteínas induciendo la formación de Dunaliella acidophila procedentes del de radicales libres que provocan daño ce- río cuando eran tratados con exceso de lular [112]. Como respuesta a los metales, metales, en este caso se denominó DaPCS las células suelen activar diversas vías de [110]. Con el fin de descubrir las relaciones desintoxicación entre las que se encuentra entre estos nuevos genes de fitoquelat - el aumento de la síntesis de compuestos na sintasa y los previamente descritos en de defensa que contienen azufre como la plantas, bacterias y algas verdes y poder así cisteína, el glutatión y las fitoquelatina interpretar su historia evolutiva, llevamos a (FQs). Este es un mecanismo de defensa de cabo un análisis filogenético. Las tres nue- primordial importancia para la tolerancia y vas fitoquelatina sintasa tuvieron los me- supervivencia de las plantas en presencia jores valores de semejanza con secuencias 86 de metales. Además de en una extensa procedentes de bacterias. Además, cuando variedad de plantas, la síntesis de estos estos genes se incorporaban en cultivos de compuestos también aumenta en las al- Escherichia coli se veía claramente que la gas y los hongos cuando se exponen a los expresión del gen CaPCS2 mejora su resis- metales. tencia al cadmio. La síntesis de las FQs en las plantas se De acuerdo con nuestros resultados, realiza vía enzimática a partir de la –glu- los genes de fitoquelatina sintasas en- tamilcisteina dipeptidil transpeptidasa, co- contrados en estas microalgas acidófilas γ múnmente denominada fitoquelatina sin- probablemente, tienen un origen bacte- tasa, la cual se expresa constitutivamente riano, siendo posteriormente adquiridos pero que también puede ser regulada a ni- por transferencia horizontal de genes en vel de transcripción y postranscripción. La algunos casos en múltiples ocasiones. La FQs tiene como sustrato el glutatión, cuya teoría del origen bacteriano de estos ge- síntesis puede ser afectada por el estrés nes también se apoya en que son más oxidativo. Se han encontrado genes que pequeños que los descritos en plantas, codifican la fitoquelatina sintasa en todas como ocurre en las bacterias. Se ha sugeri- las plantas vasculares, así como en algunas do también la existencia de transferencia algas, hongos e invertebrados. Además de horizontal de genes en las fitoquelatina en eucariotas, se han encontrado genes presentes en metazoos y hongos e incluso similares de esta enzima en procariotas, entre plantas vasculares. Nuestros resul- aunque de mucha menor longitud [113]. tados confirman que la historia evoluti- En cultivos de Chlamydomonas acido- va de estos genes es, en efecto, difícil de phila aislados de Río Tinto y tratados con dilucidar y demuestra que los genes pro- exceso de cobre hemos identificado nu- cariotas tienen que ser incluidos en estos meroso tránscritos relacionados con la res- análisis para resolver su filogenia 8. Río Tinto y su importancia en Astrobiología

Uno de los principales objetivos de la tres nos permite la interpretación de investigación astrobiológica es el estu- los datos obtenidos de forma remota, dio del origen de la vida y su búsqueda así como ensayar metodologías, proto- fuera de nuestro planeta. En la Tierra colos de muestreo y desarrollo de equi- la vida está ligada a la presencia de pamientos. En muchos casos lo que agua incluso en los ambientes donde buscamos es información sobre la po- escasea el agua líquida, ésta es el fac- sibilidad de formación y preservación tor imprescindible. Salvo en contadas de biomarcadores que identifiquen la excepciones, en todos los ambientes de presencia de vida presente o pasada. En 87 la Tierra encontramos seres vivos. Por nuestro planeta hay muchos entornos este motivo, entre las características con rangos extremos de temperatura, de habitabilidad, la presencia de agua salinidad, pH, presión y disponibili- líquida es lo primero en ser analizado dad de agua que pueden considerarse cuando se evalúa la posibilidad de en- análogos terrestres de estos ambien- contrar vida en otro planeta. tes planetarios y cuyo estudio se hace Existen diversos ambientes extra- prioritario a la hora de diseñar misiones terrestres que son de interés en Astro- espaciales. Estos entornos en la Tierra biología ya que sus condiciones am- tendrían características geológicas o bientales los hacen buenos candidatos ambientales que son similares a las para albergar o haber albergado seres que existen en un cuerpo planetario de vivos. Entre ellos destacan planetas interés astrobiológico y, aunque no re- como Marte y Venus, las lunas de Jú- plican todas las condiciones existentes piter (por ejemplo: Europa), o las lunas en el entorno extraterrestre, sí poseen de Saturno (Titán y Encelado), a donde factores específicos que pueden ayudar se encaminan las próximas misiones a comprender el funcionamiento de es- espaciales con objetivos claramente tos ambientes fuera de la Tierra. La in- astrobiológicos. Dado que estamos to- vestigación en los análogos terrestres davía muy lejos de poder llevar a cabo proporciona información fundamental misiones tripuladas que nos permitan sobre el comportamiento de la vida y su un estudio directo de estos lugares, capacidad para influir o cambiar su en- una estrategia muy utilizada es la bús- torno. Además del estudio de microor- queda de análogos de estos lugares en ganismos extremófilos vivos, el estudio la Tierra. El estudio en análogos terres- de los restos fósiles de la Tierra es necesario para poder identificar la presencia aportan datos sobre los límites de fac- de microorganismos ya desaparecidos tores ambientales para la existencia de en otros lugares. la misma, así como información valiosa En 1976, el programa Viking fue el para el estudio de su origen y evolución primero que envió una sonda a Marte en nuestro planeta. Se piensa que la vida con un objetivo claramente astrobio- microbiana comenzó hace unos 3.500 lógico, realizando una extensa serie de millones de años y los primeros pasos experimentos para buscar la presencia evolutivos se dieron en un mundo sin oxí- de vida y de compuestos orgánicos en geno, con una atmósfera incapaz de pro- su superficie. Los primeros datos me- porcionar protección contra la radiación didos acabaron con la esperanza de ultravioleta y con masas de agua calien- poder encontrar biomarcadores de la tes y probablemente ácidas. La enorme presencia de vida activa ya que las con- biodiversidad existente en la Tierra hoy diciones ambientales encontradas eran en día es el resultado de la interacción di- demasiado extremas para el desarrollo námica entre la oportunidad genética, la de microorganismos tal y como los co- capacidad metabólica y los desafíos am- nocíamos en aquellos momentos. Sin bientales. Durante la mayor parte de su embargo, en 1978 Thomas Brock pu- existencia nuestro entorno habitable ha blicó su libro Thermophilic microorga- estado dominado por microorganismos 88 nisms and life at high temperatures [1] siendo modificado por sus diferentes donde dejaba clara la presencia de vida metabolismos. Como consecuencia de por encima de 60ºC. Este hecho fue el esta actividad microbiana, las condicio- detonante para el enorme desarrollo nes físico-químicas del planeta han cam- que la ecología microbiana de ambien- biado constantemente. Así, por ejemplo, tes extremos experimentó durante las la liberación de oxígeno molecular por décadas de los 80 y 90, publicándose las cianobacterias como subproducto de numerosos trabajos describiendo los la fotosíntesis tuvo un doble efecto, por metabolismos de las especies en todo un lado, los organismos que no pudieron tipo de ecosistemas extremos, desde adaptarse a la presencia de oxígeno mi- salinas y salares, a desiertos, fuentes graron a microambientes anóxicos y, a hidrotermales, chimeneas submarinas, la vez, aparecieron otros nuevos capaces aguas ácidas extremas, ambientes po- de utilizar el oxígeno para sus reacciones lares, zonas volcánicas, etc. Esto obligó metabólicas. a redefinir y ampliar las condiciones de La vida ha desarrollado estrategias habitabilidad tanto en la Tierra como que le permiten sobrevivir incluso a los fuera de ella, surgiendo un nuevo con- más desalentadores límites físicos y quí- cepto del fenómeno de la vida mucho micos. A su vez, el constante cambio en más robusta y adaptable de lo que se las condiciones ambientales del planeta pensaba en un principio y abriendo la plantea nuevos desafíos evolutivos a los esperanza de poder encontrarla incluso organismos, favoreciendo el desarrollo en ambientes extraterrestres. de nuevos mecanismos de adaptación. Los ambientes extremos y los extre- Esta “coevolución” entre las especies y su mófilos han resultado cruciales para el entorno es una característica inherente desarrollo de la Astrobiología puesto que a los sistemas vivos. Las hipótesis sobre Río Tinto y su importancia en Astrobiología

el origen de la vida en la Tierra plantean La idea clave de esta hipótesis es que la aparición de las primeras células pri- la química primitiva de la vida apareció mitivas en zonas donde las condiciones asociada a la superficie de minerales de habitabilidad son similares a las de como la pirita en las fuentes hidroter- algunos ambientes extremos que exis- males submarinas. En este ambiente ten aún en día en la Tierra, por eso, des- anaeróbico, con altas presiones y tem- de el momento en que se empezaron a peraturas superiores 100 °C, la libera- describir los ambientes extremos, se ha ción de electrones durante la forma- intentado relacionar a LUCA (Last Uni- ción de la pirita serian el motor de las versal Common Ancestor) con un orga- primeras rutas metabólicas. nismo extremófilo. La principal pregunta a responder en la búsqueda de vida en 8.1 Interés astrobiológico otros planetas también es un problema de los ambientes antiguo en biología. En la Tierra, la vida ha sido capaz de colonizar todos los há- ácidos extremos bitats, hasta los más extremos, gracias a Los microorganismos acidófilos cobran la gran diversidad de metabolismos celu- un especial interés, ya que las condi- lares. De manera análoga, si existe vida ciones ambientales de los ecosistemas extraterrestre, su presencia y evolución que habitan son el producto de su me- estará determinada fundamentalmen- tabolismo quimiolitotrófico y no adap- 89 te por la presencia de agua y el entorno taciones a las limitaciones geofísicas geoquímico del planeta. del entorno, como ocurre con la mayo- La mayoría de las hipótesis sobre el ría de los otros extremófilos. Además, origen de la vida nos plantean una Tie- sus escasos requisitos energéticos los rra primitiva con una atmósfera fuer- sitúan entre los mejores candidatos temente reductora que contenía me- para el desarrollo de un sistema meta- tano, amoníaco, hidrógeno y vapor de bólico primitivo exitoso y los productos agua. Estas primeras moléculas serían inorgánicos de su metabolismo pue- las materias primas para la evolución den desempeñar un papel importante de la vida. En este entorno fue Oparin en la formación de minerales específi- en 1924 el que propuso la existencia cos que son, a su vez, biomarcadores de la “sopa primitiva” donde la vida extremadamente importantes que se desarrolló a través de la evolución muy bien pueden conducir a la detec- química gradual de estas moléculas ción de microorganismos similares en [114]. En 1988, Gunter Wächtershäuser otros planetas. y sus colaboradores consiguen generar Las especies presentes en Río Tinto péptidos a partir de aminoácidos en nos enseñan que es posible la vida a pH condiciones de laboratorio similares a bajos, incluso a pH negativos, que se pue- las de las fuentes hidrotermales sub- de vivir en presencia de altas concentra- marinas, pero utilizaron la superficie ciones de metales pesados y que el hierro, de sulfuros de hierro y níquel [115]. Este tan abundante en la superficie marciana, trabajo marca el comienzo de la teoría puede ser utilizado como fuente de ener- del “mundo de hierro-sulfuro”, donde gía, como aceptor de electrones siendo, la pirita tiene especial protagonismo. además, un elemento protector contra la radiación ultravioleta. Especies como ambientes extremos más estudiados At. ferrooxidans y At. ferrivorans presen- presentaban características físico-quí- tan características metabólicas que los micas muy semejantes a las encontra- hacen muy compatibles con ambientes das en Marte como baja temperatura, extraterrestres como el de Marte. Se tra- alta radiación UV y alta salinidad, lo ta de microorganismos quimiolitoautó- que hizo a los astrobiólogos recuperar trofos, fijadores de nitrógeno, anaerobio las esperanzas de poder encontrar se- facultativo, capaz de oxidar hierro en ñales de vida pasada o presente en este presencia de oxígeno y de reducirlo en planeta. De esta manera, las misiones su ausencia, por lo que sus exigencias posteriores a la Viking se han centra- elementales y moleculares son escasas, do en la comprensión de la evolución no necesitando compuestos de carbono climática y la historia hidrológica del complejos ya que les basta con el CO2 planeta lo que servirá para el cálculo de atmosférico. Además, el caso concreto de nuevos modelos de habitabilidad que At. ferrivorans es especialmente intere- puedan ser utilizados para que las fu- sante porque puede realizar su actividad turas misiones a Marte tengan mayor metabólica a bajas temperaturas (es ac- probabilidad de contener pruebas de la tivo a 4ºC), lo que le acerca aún más a las existencia de vida actual o fosilizada. condiciones ambientales marcianas. Por La geomorfología y mineralogía de 90 último, como consecuencia del metabo- la superficie de Marte ha sido amplia- lismo de estas especies, se producen pre- mente analizada mediante sondas en cipitados de hidróxido de hierro similares satélites que han orbitado alrededor del a los que abundan en Marte. En todo planeta (Mars Global Surveyor, MarsO- caso, no hay que obviar el hecho de que, dyssey, Mars Express, Mars Reconnais- en la Tierra, precipitados de hierro del sance Orbiter). Este amplio conocimien- tipo jarosita o schwertmannita aparecen to de la superficie marciana permitió la de forma biogénica en ambientes extre- selección de lugares de interés para las mos como los de Río Tinto, pero también misiones astrobiológicas con equipa- pueden aparecer de forma abiótica me- miento robótico directamente sobre su diante fenómenos de hidrotermalismo superficie (Mars Exploration Rovers-Op- y fotoreducción [116]. De igual forma, en portunity y Curiosity; Phoenix). En fun- Marte los hidróxidos de hierro podrían ción de estos datos se ha propuesto la tener también ambos orígenes o uno existencia de agua en las etapas primi- solo de ellos. tivas de la historia geológica del planeta [117]. Las características más distintivas 8.2 Río Tinto como del periodo Noachian en comparación análogo terrestre de con tiempos posteriores son las altas tasas de formación de cráteres, erosión y Marte formación de valles. Los análogos terrestres de Marte son Los depósitos de hematites y jarosi- los más estudiados porque es el lugar ta encontrados por el robot Opportuni- del que más información tenemos y al ty en el Meridiani Planum de Marte son que se encaminan la mayor parte de una mezcla de partes aproximadamen- las misiones espaciales. Algunos de los te iguales de sulfatos y basalto altera- Río Tinto y su importancia en Astrobiología

do que ha perdido el 50% del hierro, el Marte se produce por la pérdida de agua magnesio y calcio originales [118]. La [120]. La evaporación estacional del agua presencia de estos minerales implica cargada de hierro y azufre del río impulsa que la superficie de Marte tuvo que la precipitación de jarosita y schwert- sufrir procesos de hidrólisis de pirita mannita, mientras que la copiapita, la en condiciones ácidas ya que es única coquimbita, el yeso y otros minerales de explicación posible para la formación sulfato generan eflorescencias. Durante de estos depósitos minerales [119]. Es- la estación húmeda, aparecen los oxihi- tos minerales se encuentran en forma dróxidos de hierro amorfos que se depo- de arenas depositadas por el viento, sitan en forma de capas. En las terrazas formando dunas o sedimentos en ca- de los cauces del río, los sedimentos más pas. En otras zonas, como en el cráter antiguos muestran una creciente crista- Endurance, se ha sugerido la formación linidad de goetita que se reemplaza por de un lago efímero entre las dunas. Las hematita con el tiempo. Aunque la ma- aguas que dieron lugar a estos minera- teria orgánica no se conserva bien en los les debieron ser muy ácidas porque la sedimentos ácidos de Río Tinto, en ellos jarosita solo precipita a pH bajo. se han encontrado presencia de frag- Para comprender estos interesantes mentos de proteínas y otras moléculas entornos marcianos se han propuesto orgánicas [121]. En los sedimentos de los como análogos terrestres los sistemas cauces se han encontrado restos de las 91 hidrotermales ricos en hierro del océano comunidades microbianas que forman del periodo Precámbrico. Sin embargo, parte de las biopelículas que recubren los espectros disponibles hasta el mo- los cauces [79]. Al estudiar con detalle mento sólo muestran la hematita como los sedimentos precipitados se pueden la principal fase mineral de los depósitos encontrar los restos de las comunidades de hierro marcianos y no la sílice, muy microbianas que los colonizaban (Figura frecuente en los sistemas hidrotermales 15). Las bacterias dejan microporos en de la Tierra. Por otro lado, durante el Ar- los precipitados de hidróxidos de hierro caico superior y buena parte del Protero- y azufre, y los frústulos de sílice de las zoico se produjo la oxidación anaerobia y diatomeas también quedan englobados la precipitación de enormes masas hie- en los sedimentos y se pueden recono- rro en la corteza terrestre denominadas cer. En el caso de las algas filamentosas y formaciones de hierro bandeado (BIF en unicelulares, sus restos también quedan sus siglas en inglés). Existen diferentes preservados al recubrirse con los mine- mecanismos para la aparición de estas rales y sus formas se pueden identifi- formaciones que incluyen procesos abió- carse en los sedimentos. Con el tiempo ticos y biológicos. los huecos pueden llegar a rellenarse de La mineralogía descrita en la super- otros minerales y hacer desaparecer las ficie de Marte, ha hecho que Río Tinto estructuras formadas inicialmente. haya sido reconocido como uno de los Sólo existe una remota posibilidad de mejores y más extensos análogos terres- que los campos de hematites marcianos tres. En concreto, se trata de un análogo sean producto de un metabolismo qui- evaporítico en el que la formación de los miolitoautotrofico similar al encontrado minerales similares a los encontrados en en Río Tinto. Sin embargo, la mineralogía A B

C D

Figura 15. Estudio de los sedimentos de los cauces. (a) Imagen de la localidad de Origen, (b) Los sedimentos que se acumulan en el cauce del río presentan diferentes capas de minerales y texturas diferentes. Barra 0,5 cm, (c) En la microestructura de los sedimentos se distinguen microporos dejados por las bacterias (flechas negras) y las esferas de las algas unicelulares. Barra 50 µm, (d) Los frústu os de sílice de las diatomeas quedan englobados (flechas negras) al igual que las estructuras de algas filamentosas y unicelulares. Barra 30 m.

de Río Tinto y Meridiani Planum tienen origen hidrotermal. Aunque esto también claramente tanto similitudes como dife- se ha propuesto como la principal fuente rencias que deben ser cuidadosamente de fluidos ácidos en Marte, no es la única tenidas en cuenta a la hora de aplicar las fuente posible de acidez que interactuó lecciones aprendidas en Río Tinto a la ex- con las rocas basálticas en la región de ploración de Marte [122]. Las diferencias Meridiani [123]. No obstante, la gran simi- más obvias se refieren al entorno físico. litud que tienen el conjunto de minerales Mientras que los sedimentos de Meri- identificados en las rocas y sedimentos del diani Planum se acumularon por medio río y las observadas y/o deducidas para los de procesos eólicos y en un entorno árido afloramientos encontrados en Meridiani caracterizado por dunas y depresiones in- hace de Río Tinto uno de los mejores, más terdunares, los sedimentos de Río Tinto se completos y extensos ecosistemas análo- formaron en lechos de arroyos. Además, gos de Marte y cuyo estudio ayudará sin los precipitados del río deben su génesis duda al desarrollo de las misiones futuras a la oxidación de minerales de pirita de a este planeta. 8. Bibliografía

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Dra. Virginia Souza-Egipsy trabaja en el Instituto de Estructura de La Materia-CSIC en Madrid. Realizó su tesis doctoral en la Universidad Complutense de Madrid en colaboración con el Centro de Ciencias Medioambienta- les-CSIC. Estudió la estrategia adaptativa de los líquenes en zonas semiáridas con énfasis en la interacción de las costras biológicas y el sustrato mineral. En su etapa pos- todotal en Centre for Life Detection del JPL-NASA en Pasa- dena y en USC de Los Angeles (California) se especializó en los microorganismos en ambientes extremos y en la bús- queda de biomarcadores. Su acercamiento al estudio del ambiente extremo de Río Tinto ocurrió durante su etapa en el Centro de Astrobiología INTA-CSIC.

Elena González Toril es investigadora del Centro de Astrobiología (INTA-CSIC) en Madrid, España. Se licen- ció en Biología Molecular por la Universidad Autónoma de Madrid en 1996. Realizó su doctorado entre el Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CSIC-UAM) y en el Instituto Max Planck de Microbiología Marina en Bre- men, Alemania (2002). 2002-2003 fue postdoctoral en el Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CSIC-UAM). Desde 2003, es investigadora en el Centro de Astrobiolo- gía, Madrid (España). Tiene más de 20 años de experien- cia en estudios de biodiversidad y ecología microbiana de ecosistemas extremos, donde estudia la fisiología y los mecanismos de adaptación de los organismos que habitan en ellos. La vida en Río Tinto - Ángeles Aguilera / Virginia Souza-Egipsy / Elena González-Toril