Contribuição À Citogenética De Testudines E Análise De Assimetria Flutuante Em Eretmochelys Imbricata, Cheloniidae

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA

Contribuição à citogenética de testudines e análise de assimetria flutuante em Eretmochelys imbricata, Cheloniidae.

Layse Aranha Marinho

NATAL-RN 2011

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA

Contribuição à citogenética de testudines e análise de assimetria flutuante em Eretmochelys imbricata, Cheloniidae.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ecologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ecologia.

Aluna: Layse Aranha Marinho Orientador: Dr. Wagner Franco Molina Co-orientador: Dr. Carlos Alfredo Galindo Blaha

NATAL-RN 2011

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências

Marinho, Layse Aranha. Contribuição à citogenética de testudines e análise de assimetria flutuante em Eretmochelys imbricata, Cheloniidae / Layse Aranha Marinho. – Natal, RN, 2011.

66 f. : Il.

Orientador: Prof. Dr. Wagner Franco Molina Coorientador: Prof. Dr. Carlos Alfredo Galindo Blaha.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Ecologia.

1. Citogenética – Dissertação. 2. Assimetria flutuante – Dissertação 3. Eretmochelys imbricata . – Dissertação. I. Molina, Wagner Franco II. Blaha, Carlos. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 575

Aos meus amigos...

AGRADECIMENTOS

Ao Programa de Pós Graduação em Ecologia pela oportunidade e grande contribuição no conhecimento da área.

A Deus e a toda a minha “grande família” por acreditar e apoiar as decisões tomadas nessa fase da minha vida.

Ao meu grande amigo Pablo Martinez pela orientação, paciência e grande incentivo de continuar no meio científico.

A Uedson Jacobina o cara que mora dentro do meu coração e sem ele eu não vivo...rsrsr.

Ao professor André Megali, pela ajuda imprescindível e toda paciência, sem ele...não ia dá pra terminar... heheh .

Ao professor Adrian Garda pelas tartarugas coletadas e cedidas para análises e por todo apoio... mesmo que por pouco tempo rsrs..

Ao professor Marcelo Vicari, sem ele, impossível a realização das últimas análises do meu trabalho.

Ao professor Carlos Blaha pela ajuda nesse último momento, com paciência e descrição.

Aos membros da banca pelas considerações a serem feitas

A galerinha do Tamar-Pipa, em especial Daniel, pelo apoio e as várias noites em claro para a realização das coletas.

Aos meus amigos de toda hora, que me incentivaram, acompanharam e ajudaram de todas as formas possíveis, sempre com uma cerveja para animar: Léo, Tanágara, Aline, Kelyane, Fran, Rutinha e Marília.

A todos os meus novos amigos do Projeto Pequenos Cetáceos em especial a Carol mocréia, Rosilda, Kelly Regina, Pedro minininha e Iraê.

Aos meus novos amigos argentinos: Mario Lendesma e Juampy pela ajuda e aquisição de material para o término do trabalho.

A Mariquinha por manter-me alimentada e com os níveis de cafeína suficientes.

Rapadura é doce, mas não é mole não... (Autor desconhecido)

SUMARIO

LISTA DE FIGURAS ix LISTA DE TABELAS xi LISTA DE ABREVIATURAS xii RESUMO xiii ABSTRACT xiv

1. INTRODUÇÃO 1 1.1 Origem e sistemática de Testudines 1 1.2.Estudos citogenéticos em Testudines 4 1.2.1 Família Chelidae 6 1.3 Estudos Morfológicos 7 1.3.1 Assimetria Flutuante 8 1.3.2 Eretmochelys imbricata 9 2. OBJETIVOS 11 3. MATERIAL E MÉTODOS 12 3.1. Material 12 3.1.1 Ponto de Coleta 12 3.1.2 Espécies estudadas 14 3.2. Métodos 15 3.2.1. Estudos citogenéticos 15 3.2.1.1 Cultivo de sangue periférico 15 3.2.1.2 Técnica de obtenção de cromossomos mitóticos 15 3.2.1.3 Detecção de regiões organizadoras de nucléolo 16 (RONs) 3.2.1.4 Detecção de Heterocromatina Constitutiva (Banda-C) 16 3.2.1.5 Banda - G 16 3.2.1.6 Coloração com fluorocromos base específica DAPI e 17 CMA3 3.2.1.7 Hibridação fluorescente in situ (FISH) 17 3.2.1.8 Análise cromossômica 18 3.2.2 Estudos morfológicos 19 3.2.2.1 Análise Estatística para cálculo de Assimetria 21 Flutuante 3.2.2.2 Programas utilizados 21

vii

4. CAPÍTULOS Capítulo I: Estudo Cariotípico em Mesoclemmys tuberculata 22 (Luederwaldt, 1926) (Testudines, Chelidae), Tartaruga da Caatinga Brasileira. Capítulo II: Assimetria Flutuante em tartaruga marinha 37 Eretmochelys imbricata: uso na aferição da seleção natural entre filhotes e adultos.

5. CONCLUSÕES 54

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 55

7 ANEXOS 62

viii

LISTAS DE FIGURAS

Figura 1. Hipóteses alternativas da relação filogenética das tartarugas 2 (Testudines). 1: Lee (1995, 1996,1997,2001;) 2:Laurin & Reisz, (1995); 3: Merck (1997); 4: Meyer, 1998. (Wyneken et al., 2008).

Figura 2. Pontos de coleta de dados no Estado do RN. Macaíba e 13 Caicó, coletas para o estudo citogenético. Tibau do Sul, coleta para estudos morfológicos. Em evidência a) Rio Barra Nova/Caicó; b) Praia do Chapadão/Pipa-Tibau do Sul.

Figura 3. Espécies estudadas - Estudos citogenéticos: a e b) 14 Mesoclemmys tuberculata; e Estudos morfológicos: c) Fêmea adulta de Eretmochelys imbricata; d) Filhote de Eretmochelys imbricata.

Figura 4. Caracteres contínuos, dados coletados dos indivíduos de 20 Eretmochelys imbricata: Comprimento e largura de nadadeiras.

Figura 5. Caracteres discretos, dados coletados em indivíduos de 20 Eretmochelys imbricata : Número de placas do casco e plastrão.

CAPÍTULO I

Figura 1 Cariótipo de Mesoclemmys tuberculata 2n=58 (NF=64). Barra 29 5µm.

Figura 2 Figura 2. Banda G. Barra 5µm. 29

Figura 3 a) Impregnação por nitrato de prata em destaque os 30 cromossomos portadores da região organizadora de nucléolo Barra 5µm. b) Localização da sonda 18S em um par de cromossomo pequeno. Barra 10 µm.

Figura 4. Banda C. O par nucleolar heterocromático (setas). Barra 5µm. 30

Figura 5. a) Imagem sobreposta da utilização de fluorocromos base 31 específico DAPI e CMA3. Barra 5 µm. b) Localização da sequência telomérica(TTAGGG)7 Barra 10µm.

Figura 6. Idiograma evidenciando o padrão de bandas claras e escuras 32 (banda-G), assim como os demais bandamentos utilizados no presente estudo.

CAPÍTULO II

Figura 1. Histogramas evidenciando a distribuição dos valores de AF em 45 Fêmeas (barra cheia em vermelho) e Filhotes (barra vazada em azul), para cada variável analisada: a) NPL (Número de placas do casco); b) CANT (Comprimento da nadadeira anterior); c) CPOS (comprimento da nadadeira posterior); d) LANT (Largura da nadadeira anterior); e) LPOS (Largura da nadadeira posterior) e análise de Box-plots entre os grupos Fêmeas e Filhotes, quanto as variáveis de NPL (f);CANT (g), CPOS (h),LANT (i) e LPOS (j).

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Espécies da família Chelidae com seus respectivos cariótipos 6 e números fundamentais (NF).

Tabela 2. Variáveis analisadas em fêmeas adultas e filhotes de 19 Eretmochelys imbricata.

CAPÍTULO II

Tabela1. Número de indivíduos assimétricos dentre os 136 analisados 42 quanto ao número de placas do casco e plastrão. NPL (Nº de Placas Laterais); NPCirc (Nº de Placas Circundantes); NPIM (Nº de Placas Inframarginais); NPP (Nº de Placas do Plastrão).

Tabela 2. Teste não paramétrico Mann-Whitneypara níveis de assimetria 43 flutuante utilizando as 5 variáveis analisadas entre os grupos: Filhotes vivos x mortos e Fêmeas x Filhotes.

Tabela 3. Herdabilidade no sentido estrito (h²) para as variáveis. 44

LISTA DE ABREVIATURAS

AF : Assimetria Flutuante

AT: Adenina-Timina.

CGH : Hibridação genômica comparativa

CMA3: Cromomicina A3.

DAPI: 4'6-diamidino-2-fenilindol.

DATP: desoxi Trisfosfato de Adenosina.

DNA: Ácido Desoxirribonucléico.

FISH: Hibridação fluorescente in situ.

FITC: Fluoresceína isotil cianato-avidina conjugada.

GC: Guanina-Citocina.

NF: Número fundamental.

NFDM: Leite em pó desnatado.

PBS: Buffer fosfato salino.

RDNA: Ácido Desoxirribonucléico ribossômico.

RNA: Ácido ribonucléico.

SSC: Solução salina concentrada

xii

RESUMO

O presente trabalho procurou contribuir ao conhecimento da ordem Testudines sob o ponto de vista citogenético e morfológico. No que diz respeito aos aspectos citogenéticos propôs a caracterização da espécie Mesoclemmys tuberculata (n=5), endêmica da caatinga, por meio de técnicas de citogenética convencional e molecular. Esta espécie apresentou 2n=58, NF=64, primeiro par submetacêntrico, o segundo metacêntrico e o terceiro subtelocêntrico, sendo os demais micromossomos telocêntricos. Esta espécie apresentou um par portador nucleolar, detectado pela impregnação do íon prata e utilização de sondas de DNAr 18S. que se mostrou heterocromático. Pequenos blocos heterocromáticos também foram encontrados em regiões centroméricas dos maiores cromossomos, assim como em regiões terminais na maioria dos outros cromossomos do complemento, que se mostraram GC+. Seqüências teloméricas mostraram padrões variáveis de intensidade de sinal, sendo que alguns repeats foram mais intensos nos micromossomos e de forma sutil nos maiores. Os padrões de bandamento G quando comparadas com outras espécies do gênero mostraram uma pronunciada similaridade entre ambas. A primeira descrição cariotípica na espécie auxiliará em futuros estudos e compreendimento dos aspectos evolutivos desta família. Sob o ponto de vista morfológico, realizou-se estudos de assimetria flutuante em Eretmochelys imbricata, tartaruga marinha, através de métodos de aferição comparativa entre filhotes e adultos e as suas implicações na seleção natural. Os dados foram coletados em dois momentos distintos: o primeiro no momento da desova da fêmea e o segundo na eclosão dos ninhos e nascimento dos filhotes. As características analisadas consistiram em medidas de comprimento e largura de nadadeiras anteriores e posteriores (CANT, LANT, CPOS e LPOS), também coletados dados de número de placas do casco; placas laterais (NPL), placas circundantes (NPCIRC) e plastrão; placas centrais (NPP), placas inframarginais (NPIM). Com os valores de assimetria foi calculado o valor de herdabilidade estricto para essas características, com o calculo baseado em apenas um parental. Foi realizado um teste não paramétrico de Mann-Whitneya partir das medidas repetidas comparando os grupos (fêmeas X filhotes; recém-nascidos X natimortos). As fêmeas adultas não apresentaram assimetria flutuante bilateral (AF=0) quanto ao número de placas do casco e plastrão, enquanto os filhotes, vivos e mortos, mostraram maior nível de variação quanto a estes parâmetros merísticos. Na análise entre fêmeas X filhotes encontrou-se diferença significativa entre os níveis de assimetria para as características de número de .placas do casco (p=0,006) e para a largura da nadadeira posterior (p=0,001) entre estes grupos. Os níveis de AF sugerem um indicador eficiente quanto à viabilidade ou manutenção do indivíduo até a fase reprodutiva. Ao analisarmos o coeficiente de herdabilidade em sentido estrito (h2) da AF a partir da análises de regressão observou-se que ambas apresentam valores baixos, e não significativo estatisticamente (p>0,1). Caso venha a ser excluído um papel mais efetivo dos efeitos genéticos na geração de AF, estratégias reprodutivas baseadas em elevado número de produtos filiais, como os observados em E. imbricata parecem implicar na produção de indivíduos com elevado nível de instabilidade do desenvolvimento.

Palavras-chaves : Citogenética, Mesoclemmys tuberculata, FISH, Assimetria Flutuante, Eretmochelys imbricata

xiii

ABSTRACT

This work has contributed to knowledge of the order Testudines from cytogenetic and morphological point of view. With regard to the aspects proposed cytogenetic characterization of the species Mesoclemmys tuberculata (n = 5), endemic to the Caatinga biomes, through conventional techniques of cytogenetics and molecular levels. This species presented 2n = 58, NF = 64, the first submetacentric pair, the second metacentric and third subtelocentric, and the other microchromosome telocentric. This species showed a nucleolar bearing pair, coincident with the 18S ribosomal rDNA and that proved to be heterochromatic. Small heterochromatic blocks were also found in the centromeres of the largest chromosomes, as well as terminal regions in most other chromosomes of the complement, that were GC +. Telomeric sequences showed variable patterns of signal intensity, with some repeats more intense in microchromosomes and subtly in the larger ones. When compared with other species of the genus, the G-banding patterns showed a marked similarity between them. The first karyotypic description of the species will aid in future studies and the understanding of evolutionary aspects of this family. From the morphological point of view, we carried out studies of fluctuating asymmetry in sea turtle Eretmochelys imbricata, using methods of benchmarking between hatchlings and adults and their implications for natural selection. Data were collected at two different times: first during the spawning female and the second during the outbreak and birth of the nest. The analyzed characteristics consisted of measurements of length and width of front and rear flippers (CANT, LANT, CPOS and LPOS) also collected data on the number of hull plates, side plates (NPL), the surrounding plates (NPCIRC), and plastron; plates power plants (NPP), inframarginais plates (NPIM). With the values of asymmetry we calculated the value of strict heritability for these traits, the calculation was based on only one parent. A nonparametric analysis Mann-Whitneywas performed to compare the groups (females X hatchlings, newborn hatchlings X dead hatchlings). Adult females showed no bilateral fluctuating asymmetry (FA = 0) on the number plates of the hull and plastron, while offspring, living and dead, showed a greater level of variation in these meristic parameters. In the analysis of females x hatchlings we found a significant difference between the levels of asymmetry in hoof plates (p=0.006) an the width of hindlimbs (p=0.001). Levels of FA suggest an accurate indicator as to the viability or maintenance of the individual to the reproductive phase. The coefficient of heritability (h2) of FA , obtained from the regression analysis, showed that both have low and not statistically significant values(p> 0.1). In the case of exclusion of the effective role of genetics in the generation of FA, reproductive strategies based on high number of subsidiaries products, such as those observed in E. imbricata seems to implicate the production of individuals with high level of developmental instability.

Keywords: Cytogenetic, Mesoclemmys tuberculata, FISH, Flutuacting asymmetry, Eretmochelys imbricata

xiv

1. INTRODUÇÃO

1.1 Origem e Sistemática de Testudines

A posição das tartarugas dentro da filogenia dos amniotas tem confundido os biólogos evolutivos por mais de um século. Esta controvérsia filogenética continua sem ser resolvida em parte porque as tartarugas tem uma morfologia única, na qual poucos caracteres podem ser utilizados para comparações diretas com qualquer outro grupo de amniotas. Entre as muitas hipóteses alternativas que foram postuladas para explicar a origem e as relações filogenéticas das tartarugas, os paleontólogos consideram colocá-las como os únicos sobreviventes dos répteis Anápsidos (ausência de fossas temporais no crânio) (Zordaya & Meyer, 2001). A classificação atual dos amniotas (répteis, aves e mamíferos) se baseia em um só caráter morfológico dominante, a presença e tipo de fossa temporal do crânio (Willinston 1917). Os amniotas viventes que possuem um crânio sem fossas são chamados Anápsidos (tartarugas), os que tem duas fossas na região temporal do crânio (tuatara, lagartos, serpentes, crocodilos e aves) são os Diápsidos e finalmente os que possuem uma única fossa temporal são os Sinápsidos (mamíferos). Entretanto, a posição filogenética tradicional das tartarugas como os únicos representantes anápsidos sobreviventes é muito controversa (Rieppel & deBraga 1996; deBraga & Rieppel,1997; Platz & Conlon,1997; Zardoya & Meyer,1998,2001; Hedges & Poling, 1999; Kumazawa & Nishida,1999; Mannen & Li,1999; Rieppel & Reisz, 1999; Cao et al.,2000). Hipóteses alternativas, baseadas em caracteres morfológicos e evidências de estudos moleculares tem colocado as tartarugas como grupo irmão de Arcosaurios (crocodilos e aves) (Hennig,1983; Platz & Conlon,1997; Zardoya & Meyer, 1998, 2001; Kumazawa & Nishida,1999), e como grupo irmão de Lepidosauria (tuatara, lagartos e serpentes) respectivamente (Rieppel deBraga,1996; deBraga & Rieppel, 1997).

Figura 1. Hipóteses alternativas da relação filogenética das tartarugas (Testudines). 1: Lee (1995, 1996,1997,2001;) 2:Laurin & Reisz, (1995); 3: Merck (1997); 4: Zardoya & Meyer (1998). (Fonte: Wyneken et al., 2008)

Segundo a hipótese clássica, as tartarugas divergiram dos Procolophonidos (Laurin & Reisz,1995) ou dos Pareisaurios (Gregory,1946; Lee,1995,1996,1997,2001), ou seja, a partir de pararépteis extintos. Entretanto, a evidência mitocondrial e nuclear favorece claramente uma relação das tartarugas com os Arcosaurios (Kumazawa & Nishida,1999; Zardoya & Meyer,1998,2001; Cao et al.,2000) e claramente rejeita a condição de tartarugas anapsidas (Cao et al.,2000), Por outra parte, nova evidência morfológica liga as tartarugas com os Lepidossauros (tuatara, lagartos e serpentes) (deBraga & Rieppel,1997). Uma posição filogenética dentro de Diápsidas implicaria que as tartarugas tinham fossas na região temporal do crânio, as quais se haviam fechado por uma extensão dorsal do osso quadrado em um suposto antepassado (deBraga & Rieppel, 1997). A verdadeira condição de anápsida sería restrita aos fósseis de Parareptilia e a condição de diápsido seria um caráter derivado compartilhado por todos os Saurópsidas, indicando sua origem monofilética (Zordoya & Meyer,2001). Testudines, que engloba todas as espécies de tartarugas, se caracteriza por possuir órgãos corporais internos dentro de uma carapaça; crânio sem fossas na região temporal; osso quadrado móvel; boca margeada por um bico

córneo; ausência de dentes e esterno e costelas não unidas em uma região ventral (Cabrera, 1998). Os Testudines atuais são classificados em 13 famílias com aproximadamente 300 espécies (Ayala-V, 2005). As duas linhagens de Testudines são Cryptodira (Grego, crypto = escondido, dire = pescoço), retraem a cabeça para dentro do casco curvando o pescoço na forma de S vertical, e os Pleurodyra (Grego, pleuro = lado) retraem a cabeça curvando o pescoço horizontalmente. Os Cryptodira são os únicos Testudines encontrados atualmente na maior parte do Hemisfério Norte, e existem formas aquáticas e terrestres na América do Sul, e terrestres, na África. Os Pleurodiras são encontrados atualmente apenas no Hemisfério Sul. A fauna de quelônios na América do Sul é muito rica e diversificada, contendo segundo Iverson, (1992b), cerca de 20% de todas as 300 espécies existentes de tartarugas, incluindo representantes de Chelydridae, Emydidae, Geoemydidae, Kinosternidae, Podocnemididae, Chelidae, Testudinidae, Cheloniidae e Dermochelyidae. Oito das treze famílias de quelônios existentes atualmente estão presentes no Brasil, mas, ao contrário do que acontece na maior parte do mundo, a fauna brasileira de quelônios é composta principalmente de Pleurodira. A taxonomia dos Testudines (sensu Pough, 2008), é a seguinte:

CLASSE REPTILIA

Subclasse ANAPSIDA

Ordem Testudines

Subordem Cryptodira

Família Testudinidae

Família Bataguridae

Família Emydidae

Família Trionychidae

Família Carretochelyidae

Família Dermatemydidae

Família Kinosternidae

Família Cheloniidae

Família Dermochelyidae

Família Chelydridae

Subordem Pleurodira

Família Chelidae

Família Pelomedusidae

Família Podocnemidae

1.2 Estudos Citogenéticos com Testudines

Jordan (1914) realizou o primeiro trabalho citogenético na ordem Testudines, com as espécies Crysemys picta, Terrapene carolina 2n=34 e 2n=32 cromossomos, respectivamente. Entretanto, estes números cromossômicos são inferiores aos descritos posteriormente por Bickham & Carr (1983) de 2n=50, devido provavelmente a metodologia empregada na época. Estudos citogenéticos em tartarugas são escassos. No início da década de 70, cerca de 15 espécies tiveram seus cariótipos descritos (Matthey, 1930, 1931; Nakamura, 1935, 1937; Wickbom, 1945; Susuki, 1950; Makino, 1952; Polli, 1952; Matthey & Van Brink 1957; Atkin, et al.,1965; Ohno, 1967; Sasaki & Itoh, 1967). Já a partir da segunda metade da década de 70 um grande número de espécies foi analisada nos trabalhos de Killebrew,(1975); Barros et al. (1976); Bickham & Baker (1976a); Bickham & Baker, (1976b); De Smet, (1978); Site et al.(1979); Bull & Legler,(1980); Bickham & Carr (1983); Bickham & Rogers (1985), entretanto, nesses estudos poucas espécies foram estudadas através de bandamentos diferenciais G e C, com exceção do trabalho de Bickham & Rogers(1985) que analisou várias espécies da sub-ordem Cryptodira mediante bandamento RONs e o trabalho de Martinez et al., (2009) que caracterizou as espécies Trachemys dorbigni e Chelonoidis (Geochelone) donosobarrosi através de bandamentos diferenciais C, RONs, Fluorocromos base-específicos e Hibridação in situ com sonda telomérica. Até o momento trabalhos com tartarugas, do ponto de vista citogenético, são escassos, provavelmente, porque se considera que as tartarugas representam um grupo muito conservado quanto a sua diversidade cariotípica.

Para organização dos cromossomos, Bickham (1975) propôs dividir em 3 grupos com base no tamanho e a posição do centrômero: Grupo A: Macrocromossomos metacêntricos e submetacêntricos; Grupo B: Macrocromossomos subtelocêntricos e telocêntricos; Grupo C: Microcromossomos. Para tartarugas Pleurodira, como na família Chelidae, são poucos os cromossomos bibraquiados, dessa forma, para tartarugas desta ordem é conveniente organizar os cromossomos de acordo com a nomenclatura de Levan et al. (1964) pela posição dos centrômeros: metacêntricos (m), submetacêntricos (sm), subtelocêntricos (st) e telocêntrico (t). Dentro da Sub-ordem Pleurodira, Bull & Legler (1980) dividem os cariótipos da Família Chelidae em dois grupos: a- Cariótipos com 2n=50-54 com poucos cromossomos telocêntricos, por exemplo, todos os gêneros da Austrália. b- Cariótipos com 2n=58-64 com muitos cromossomos telocêntricos, por exemplo, os gêneros da América do Sul, com exceção do gênero Chelus. A maioria das espécies da família Chelidae da América do Sul tiveram seus cariótipos estabelecidos (Barros et al.,1976; Bull & Legler, 1980; McBee et al., 1985; Reed et al., 1991), mas igual aos restantes dos táxons da família, poucas espécies foram analisadas mediante bandamentos C, e os bandamentos RONs, G e R são inexistentes, com exceção de Hidromedusa tectifera estudada por Noleto et al.,(2006). A família Pelomedusidae compreende os gêneros Pelusios e Pelomedusa, os quais apresentam 2n=34-36 respectivamente, ambos os gêneros haviam sido estudados mediante coloração convencional por Killebrew (1975) e De Smet (1978), e mediante bandamento C e G por Bull & Legler (1980). A família Podocnemidae apresenta 2n=26-28 cromossomos e em diversas espécies se tem descrito os bandamentos C e G (Bull & Legler,1980; Ortiz et al.,2005). A sub-ordem Pleurodira possui maior variação cariotípica do que Cryptodira, devido principalmente ao baixo número diplóide de Pelomedusidae e Podocnemidae, sendo estes cariótipos derivados dentro dos Testudines (Bull & Legler, 1980).

1.2.1 Família Chelidae

Entre os Pleurodira, a família Chelidae é considerada a mais rica, contendo 23 espécies das quais 19 ocorrem no Brasil (Souza, 2004). Sua distribuição se restringe à América do Sul, Austrália, Nova Guiné e à ilha Roti, na Indonésia. Provavelmente esta família sempre esteve restrita ao Hemisfério Sul e possui sua origem no antigo continente da Gondwana, pois nenhum fóssil foi encontrado em outras regiões (Ernst & Barbour, 1989). Entre as espécies da família Chelidae no Brasil, encontramos espécies que possuem distribuição restrita, como é o caso de Mesoclemmys tuberculata encontrada na região nordeste do Brasil (Ceará, Rio Grande do Norte, Paraíba, Alagoas, Sergipe, Bahia), habitando o Rio São Francisco e seus afluentes (Bour & Zaher, 2005). Dentre as 19 espécies da família que ocorrem no Brasil, 13 tem seus cariótipos descritos (Tabela 1), mas estudos com bandamentos diferenciais ainda são incipientes.

Espécies 2n NF Fonte Acantochelys macrocephala 48 60 McBee et al., 1985 Acantochelys radiolata 50 63 McBee et al., 1985 Acantochelys spixii 50 62 McBee et al., 1985 Chelus fimbriatus 50 66 Bull & Legler, 1980 Hidromedusa maximiliani - Hidromedusa tectifera 58 62 Bull & Legler, 1980 Mesoclemmys heliostemma - Mesoclemmys nasuta 58 64 Gormam, 1973 Mesoclemmys raniceps - Mesoclemmys tuberculata 58 64 Presente estudo Mesoclemmys vanderhaegei 58 66 Martinez 2007 Mesoclemmys gibba 58 66 McBee et al., 1985 Mesoclemmys hogei 58 64 Reed et al., 1991 Mesoclemmys perplexa - Phrynops williamsi - Phrynops tuberosus - Phrynops hilarii 58 64 Martinez, 2007 Phrynops geoffroanus 58 64 Bull & Legler, 1980 Platemmys platycephala 64 64 Barros et al., 1976 Rinemys rufipes 58 64 McBee et al., 1985

Tabela 1. Espécies da família Chelidae com seus respectivos cariótipos e números fundamentais (NF).

1.3 Estudos morfológicos

Do ponto de vista biológico, os estudos morfológicos são usados para a realização de análise quantitativa da variação morfológica dos organismos. Atualmente a morfometria costuma ser definida como o estudo estatístico das mudanças e variações na forma e no tamanho, ou a análise e mensuração de um componente complexo e multidimensional como a forma (Monteiro & Reis, 1999; Moraes, 2003). Diversas técnicas têm evoluído ao longo dos anos desde o estabelecimento de proporções entre as diversas partes do corpo, ainda hoje utilizadas nas descrições taxonômicas, até as sofisticadas técnicas estatísticas que utilizam modelos matemáticos complexos para explicar diferenças na forma ou tamanho. A morfometria é subdividida em morfometria tradicional e morfometria geométrica. A chamada morfometria tradicional, é o estudo da variação e covariação de medidas de distâncias entre pares de pontos, geralmente comprimentos e larguras de estruturas e, as vezes, proporções e ângulos também podem ser utilizados (Rohlf & Marcus, 1993; Moraes, 2003). A morfometria geométrica abrange uma série de técnicas que visam descrever e representar a geometria das formas estudadas. É capaz de descrever e localizar mais claramente as regiões de mudanças na forma, e de reconstruir e reconstituir graficamente estas mudanças. Esta descrição é feita através do estabelecimento de pontos anatômicos de referência em estruturas homólogas, os chamados marcos anatômicos (landmarks)(Zelditch, 2004). As coordenadas destes pontos, em duas ou três dimensões, são as variáveis que informarão sobre a geometria das estruturas estudadas. A vantagem do uso de coordenadas, é que estas incluem informações sobre suas posições relativas, e desta maneira permitem a reconstrução da forma após as diversas análises uni – e multivariadas. A morfometria geométrica tem maior robustez na análise integrada e exclui fatores de posição, orientação e tamanho na análise da forma (Monteiro & Reis, 1999; Moraes, 2003). Essa nova abordagem morfométrica começou a ser mais amplamente utilizada no início dos anos noventa, refletindo o resultado da busca dos pesquisadores em morfologia quantitativa por métodos que unissem o caráter geométrico das formas biológicas e a possibilidade de um tratamento

estatístico da variação. Ou seja, uma área de pesquisa entre a biologia, a estatística e a geometria (Monteiro & Reis, 1999). Além dos já citados, esta técnica é também utilizada em estudos ontogenéticos, caracterização de dimorfismo sexual e em filogenias de espécies aparentadas (Moraes, 2003). E detecção de índices de assimetria flutuante em estruturas bilaterais de diversos organismos. Claude & Rivera, (2008), utilizaram esta técnica para detecção de assimetria flutuante em dois clados de tartarugas terrestres e aquáticas Este estudo tem interessado diversas áreas do conhecimento por diferentes motivos. Os taxonomistas utilizam para mensurar diferenças entre espécies, criando referências para comparações. Os ecólogos discutem que a forma e o tamanho de um organismo devem caracterizar aspectos de sua evolução. Já os geneticistas se preocupam em estimar a herdabilidade de caracteres morfométricos, pois podem quantificar e separar as influências genotípicas das ambientais sob o fenótipo de uma população (Peres, et al., 1995).

1.3.1 Assimetria Flutuante

A estabilidade geométrica corporal conhecida como simetria é uma notável característica da morfogênese durante o desenvolvimento embrionário (Hofmann-Appollo,2009). Pode-se considerar como simétrico qualquer organismo que possa ser dividido, ao longo de pelo menos um plano, em duas metades perfeitamente iguais. Caso isso não possa ser feito, dizemos que o organismo é assimétrico. A maioria dos organismos apresenta características morfológicas bilaterais. Os desvios aleatórios da simetria bilateral perfeita são denominados de assimetrias flutuantes (AF), que é caracterizada por mudanças sutis, aleatórias e não direcionais entre os planos de simetria dos indivíduos durante o desenvolvimento ontogenético dos mesmos (Palmer & Strobeck 1986). A AF é empregada para medir a influência negativa de fatores externos sobre o desenvolvimento do fenótipo dos indivíduos. Sendo assim, altos índices de assimetria flutuante são indicativos de instabilidade no desenvolvimento e são utilizados para detectar o estresse em populações naturais (ex., Lens et al., 2001; Polak, 2003; Van Dongen, 2006), sendo usados

de forma crescente como uma ferramenta útil para inferir a saúde ou a qualidade de um organismo ou população, avaliando e dando indícios da interferência de fatores ambientais ou genéticos na estabilidade no desenvolvimento (Van Vallen, 1962; Thornhill 1991; Markow, 1995; Palmer, 1996; Gangestad & Thornhill 1999). Fatores genéticos e relacionados ao meio ambiente que aumentam essa instabilidade têm sido identificados durante longos anos de pesquisa. Dentre os fatores genéticos, encontram-se os altos níveis de endogamia, homozigose extrema, mutações e períodos de intensa seleção direcional que desequilibram o genoma e diminuem a capacidade do organismo de se proteger contra erros aleatórios. Dentre os inúmeros fatores ambientais estão as variações de temperatura, fontes deficientes de alimento e as poluições química e sonora. O coeficiente de variação é um indicador mais sensível dessa instabilidade podendo demonstrar variações de uma característica entre populações e dentro delas (Moller & Swaddle, 1997) Contudo, estudos sobre o papel das assimetrias na viabilidade e sobrevivência de qualquer espécie são inexistentes.

1.3.2 Eretmochelys imbricata (Linnaeus, 1766)

Eretmochelys imbricata é conhecida popularmente no Brasil como tartaruga-de-pente, tartaruga-verdadeira ou tartaruga-legítima e, assim como todas as espécies de tartarugas marinhas, apresenta um ciclo de vida complexo, utilizando diferentes ambientes ao longo de sua história de vida, implicando em mudança de hábitos. Embora seja uma espécie marinha, utiliza o ambiente terrestre (praia) para oviposição, garantindo o local adequado à incubação dos ovos e nascimento dos filhotes. Após o nascimento, passa por uma fase pelágica até cerca de 20 cm de comprimento de carapaça; a partir de então, migra para regiões costeiras ou insulares e estabelece uma residência, entrando na fase bentônica, onde se alimenta e se refugia até a maturidade sexual. Os animais adultos cruzam zonas oceânicas durante a migração entre áreas de alimentação e reprodução (Chacón, 2004). Semelhante às demais espécies de tartarugas marinhas, E. imbricata pode ser considerada uma espécie de crescimento lento, maturação tardia e vida longeva (Chacón, 2004). Apesar de não existir um método plenamente confiável para determinação da

idade a não ser por marcação e recaptura ou ainda esqueleto-cronologia (Bjorndal & Zug, 1995), provavelmente esta espécie requer mais de vinte anos para alcançar a fase adulta e continua a se reproduzir por pelo menos uma década (Chacón, 2004). Os estados brasileiros que detêm o maior número de registros reprodutivos de E.imbricata são, respectivamente, a Bahia (Lara-Ruiz et. al., 2006; Marcovaldi et. al., 2007), o Rio Grande do Norte (Marcovaldi et. al., 2007) e a Paraíba (Mascarenhas, et. al. 2004); ocorrências esparsas são registradas para Sergipe e Espírito Santo (Marcovaldi & Marcovaldi 1999). Dentre todas as tartarugas marinhas, a tartaruga-de-pente é uma das espécies que mais sofreu com a exploração, não só pela carne e ovos, mas principalmente por causa dos seus escudos de queratina (bekko) que recobrem a osteoderme, que sempre foram muito utilizados para artesanato, desde o Egito Antigo, até os modernos Europeus (Meylan, 1999). No século 20 o preço desta matéria prima era comparado ao do marfim e chifre de rinoceronte (Mack et al., 1979). Em muitas localidades o casco da tartaruga de pente foi ou é um item importante na economia, e, devido a essa demanda por carapaças, as populações enfrentaram drástico declínio (Limpus, 1997). A primeira vez que ela foi listada como uma das espécies em extinção pela IUCN (União Internacional para a Conservação da Natureza e dos Recursos Naturais) foi em 1968, sendo retida na lista em todas as subseqüentes publicações, até 1996, quando seu status foi mudado para Criticamente Ameaçada (Baillie & Groombridge, 1996). Foi incluída no Apêndice I pelo CITES (Convenção sobre o Comércio Internacional de Espécies Ameaçadas da Fauna e Flora Silvestres), e também listada nos Apêndices I e II da Convenção de Espécies Migratórias (CMS)(Meylan & Donnelly, 1999).

2- OBJETIVOS

2.1-Objetivo Geral

O presente trabalho se propôs, por meio de técnicas citogenéticas e morfométricas contribuir para o conhecimento em Testudines realizando a primeira descrição cariotípica da espécie Mesoclemmys tuberculata (Chelidae) e detectando o nível de assimetria flutuante em população natural de Eretmochelys imbricata.

2.2- Objetivos Específicos

1- Caracterizar cromossomicamente a espécie Mesoclemmys tuberculata da família Chelidae, a partir de coloração convencional, bandamentos C, G e

RONs, fluorocromos base-específicos DAPI/CMA3 . e hibridação in situ com sonda ribossomal 18S e sequencia telomérica.

2- Analisar a influência da seleção natural sobre características assimétricas bilaterais, através de comparações dos índices de assimetria flutuantes entre parental (fêmea) e indivíduos recém-eclodidos da espécie marinha Eretmochelys imbricata.

3- MATERIAL E MÉTODOS

3.1 MATERIAL

3.1.1 Pontos de coleta

Para realização dos estudos citogenéticos os indivíduos analisados foram coletados nos municípios de Caicó (-06° 27' 30'' / 37° 05' 52'„) e Macaíba (-05° 51' 30'' / 35° 21' 14'' ) (Fig. 5) Para estudos morfológicos a área de coleta de dados está situada a 6º 13' 40"s e 35º 03' 05"w, no vilarejo de Pipa, município de Tibau do Sul, (mapa/figura CC) estado do Rio Grande do Norte. O trecho monitorado para coleta de dados inclui três praias (Cancela, Minas e Sibaúma) e apresenta ao todo 4,2 km de extensão.

a) b)

Figura 2- Mapa do Brasil com destaque para o estado do Rio Grande do Norte. Pontos de coleta representados em: Macaíba e Caicó, coletas para o estudo citogenético. Tibau do Sul, coleta para estudos morfológicos. Em evidência a) Rio Barra Nova/Caicó; b) Praia do Chapadão/Pipa-Tibau do Sul

3.1.2 Espécies Estudadas

Na realização do estudo citogenético, foram analisados 5 exemplares (2 ♂ e 3 ♀) de Mesoclemmys tuberculata . Para as análises morfológicas todos os exemplares foram da espécie marinha, Eretmochelys imbricata, onde na utilização da técnica de morfometria tradicional, um total de 15 fêmeas adultas e 136 filhotes foram analisados.

a) b)

c) d)

Figura 3. Espécies estudadas - Estudos citogenéticos: a e b) Mesoclemmys tuberculata (Barra 5cm); c) Fêmea adulta de Eretmochelys imbricata; d) Filhote de Eretmochelys imbricata.

3.2.MÉTODOS

3.2.1 ESTUDOS CITOGENÉTICOS

3.2.1.1 Cultivo de sangue periférico

Para a obtenção de cromossomos mitóticos foi utilizada a técnica de Moorhead et al. (1960), com modificações. Após uma prévia desinfecção local, utilizou-se uma seringa estéril, heparinizada, e extraiu-se aproximadamente 0,5 a 2 ml de sangue. Como as tartarugas deste trabalho, encontram-se na subordem Pleurodira a extração foi feita da veia jugular e muitas vezes da veia e 15 gotas de sangue foram adicionadas em 5 ml de meio de cultivo RPMI 1640 e levados a estufa a 28º C durante 72 horas; Uma hora antes de retirar o cultivo da estufa, adicionou-se gotas de colchicina a 0,05%; O material foi transferido para um tubo de centrífuga e centrifugado a 800 rpm durante 10 minutos, desprezando-se o sobrenadante; Adicionou-se 10 ml de solução hipotônica de KCl 0,075 M e foi mantido na estufa a 28º C durante 30 minutos; Após isso centrifugado a 800 rpm durante 10 minutos e desprezado o sobrenadante; A fixação é feita com 3- 5 gotas de fixador Farmer 3:1 (metanol: ácido acético) Adicionou-se 10 ml de fixador Farmer 3:1 (metanol : ácido acético ) e o material foi ressuspendido; O último passo foi repetido pelo menos 3 vezes;

3.2.1.2 Técnicas de obtenção de cromossomos mitóticos

Após a preparação 3 a 4 gotas de suspensão celular, gotejadas sobre uma lâmina lavada e secas ao ar foram coradas com Giemsa, diluído a 5% em tampão fosfato, pH 6,8, por 10 min e analisadas em microscópio óptico. Para se obter o número cromossômico de cada espécie foram analisadas 30 metáfases por indivíduo.

3.2.1.3- Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs)

Para detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs), utilizou-se a técnica de impregnação pela prata idealizada por Howell & Black (1980), com algumas modificações: Sobre uma lâmina previamente preparada, colocou-se 2-3 gotas de solução aquosa de gelatina ( uma grama de gelatina incolor + 50 ml de água + 0,5ml de ácido fórmico), e 4-6 gotas de Ag-NO3 à 50%; em seguida coberta com uma lamínula e incubada em estufa à 60 C por 3-6 minutos.

3.2.1.4 Detecção de Heterocromatina Constitutiva (Banda-C)

Para detecção da heterocromatina constitutiva, foi utilizado o método de bandamento C (Summer, 1972), com algumas modificações estabelecidas no decorrer do trabalho. Esta técnica é descrita a seguir: Uma lâmina previamente preparada foi imersa em HCl 0,2N à temperatura ambiente, por 15 minutos, após este período lavagem em água destilada e secar ao ar; Em seguida a lâmina foi incubada, rapidamente, em uma solução de Ba o (OH)2.8H2O a 5% por um minuto a 42 C; rapidamente após esse tempo a lâmina foi mergulhada em HCl 0,2 (três vezes, aproximadamente 3 segundos), em seguida lavada com água destilada e incubada em solução 2xSSC à 60oC por 1 hora. Decorrido este tempo, lavada em água deionizada, seca ao ar e corada em Giemsa diluído a 6%, em tampão fosfato (pH 6,8), por 15 minutos.

3.2.1.5 Banda G

Para as análises de bandamento G foi utilizado o protocolo proposto por Seabright, (1971), com modificações. As lâminas com material a ser analisado foram envelhecidas previamente, ficando aproximadamente 6 a 8 dias em temperatura ambiente. Este material após envelhecimento foram submetidos a uma digestão com uma solução de tripsina a 0,1% em tampão fosfato 0,06M pH 6,8 a temperatura ambiente durante 15 a 20 segundos. A ação da tripsina foi parada mediante a lavagem com água destilada. Em seguida foi corado com Giemsa a 2% em tampão fosfato 0,06M pH 6,8 por 4-8 minutos, lavado em água corrente e secada ao ar livre. 16

3.2.1.6 Coloração com fluorocromos base específica DAPI e CMA3 (Barros-e-Silva & Guerra 2009)

A técnica de dupla coloração CMA3/DAPI foi usada para bandamento

CMA3, utilizando DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) como contracorante.

Lâminas envelhecidas por três dias, foram coradas com CMA3 (0.1 mg/ml) por 60 min e recoradas com DAPI (1 µg/ml) por 30 min. Em seguida, as lâminas foram montadas em glicerol:McIlvaine buffer pH 7.0 (1:1) e envelhecidas por três dias antes de analisadas em microscópio de epifluorescência sob filtros apropriados.

3.2.1.7 Hibridação fluorescente in situ (FISH) – FISH com sonda rDNA

18S e sonda telomérica (TTAGGG)7

Neste estudo, foram utilizadas sondas para o mapeamento físico destas sequências sobre cromossomos: uma sonda de rDNA 18S, obtida do DNA nuclear de Prochilodus argenteus (Hatanaka & Galetti, 2004), e uma sonda para sequencia telomérica dos vertebrados (Ijdo et al., 1991). As sondas foram marcadas pela técnica de PCR (Polimerase Chain Reaction), utilizando digoxigenina 11 dUTP (Roche). A reação de PCR de marcação a partir de primers para a região flanqueadora do plasmídeo PGemT foi realizada para clones de rDNA com (20ɳg DNA molde, tampão Taq polimerase 1X = 2mM

MgCl2, 40µM dATP, dGTP e dCTP, 28µM de dTTP, 12µM de dUTP 11- digoxigenina, 1µM primer M13 F, 1µM primer M13 R e 2 U de Taq polimerase), de acordo com as seguintes condições: 5 min a 94°; 35 ciclos: 1 min a 90°C, 1 min e 30s a 52°C e 1 mine 30s a 72°C. Para a marcação da sonda telomérica foi utilizada a seguinte reação (tampão Taq polimerase 1X= 2mM MgCl2 , 40µM dATP, dGTP e dCTP, 20µM de dTTP, 12 µM de dUTP 11-digoxigenina, 0,2µM primer (TTAGGG)6, 0,2µM primer (CCCTAA)6 e 2 U de Taq polimerase), de acordo com as seguintes especificações: duas condições de amplificação, a primeira amplificação é realizada com baixa estringência: 4min a 94°C; 12 ciclos de (1min a 94°C, 45s a 52°C e 1min e 30s a 72°C), seguidos por 35 ciclos de alta de (1min a 94°C, 1min e 30s a 60°C e 1min e 30s a 72°C). O

procedimento geral da FISH sob alta condição de estringência (2,5 ng/µL sonda, 50% formamida, 2X SSC, 10% sulfato dextrano) seguiu o procedimento geral descrito por Pinkel et al., (1986) com modificações. O processo foi iniciado com lavagens das lâminas com tampão PBS 1X por 5min à temperatura ambiente sob agitação e posteriormente desidratada em série alcoólica( 70%, 85% e 100%). Em seguida foram colocadas em RNAse (100µg/ml) por 1 hora e 30 minutos, em câmara úmida a 37°C. Após este período as lâminas foram lavadas em solução 2X SSC. O material é desidratado em uma série alcoólica , 5 minutos em cada banho e tratado com formamida 70%/2XSSC a 70°C, por 5 minutos para desnaturação dos cromossomos. Uma nova desidratação em série alcoólica foi realizada. Foram aplicados sobre as lâminas, 50µl de solução de hibridação contendo a sonda desnaturada, permanecendo overnight a 37°C em câmara úmida. Transcorrido esse tempo, as lâminas foram lavadas em solução de formamida 15%/0,2XSSC a 42°C por 10 minutos e logo em seguida lavadas em solução de Tween 20 (0,05%/4XSSC), sob agitação durante 5 minutos. Após, foi realizado um tratamento com 90µl de NFDM 5% (non fat dry milk – leite em pó desnatado) em 4XSSC, por 15 minutos à temperatura ambiente. A detecção do sinal foi realizada com o anticorpo anti digoxigenina rodamina (Roche). Os cromossomos foram contracorados com DAPI (0,2 µg/mL) em meio de montagem Vectashield (Vector), e analisados em microscópio de epifluorescência Olympus BX41 acoplado ao sistema de captura de imagens DP 71 (Olympus).

3.2.1.8 Análises cromossômicas

As preparações cromossômicas convencionais e preparações submetidas aos fluorocromos base específicos foram analisadas em fotomicroscópio de epifluorescência Olympus BX50, em um aumento de 1000X, equipado com sistema digital de captura de alta definição. As melhores metáfases foram fotografadas, e a partir destas foi estabelecido o padrão cariotípico, com a determinação da fórmula cromossômica e NF (Número Fundamental). A montagem dos cariótipos foi feita pela ordenação descrescente de tamanho dos cromossomos.

3.2.2 ESTUDOS MORFOLÓGICOS

Para o estudo com Assimetria Flutuante (AF), fêmeas adultas em processo de ovoposição e seus respectivos filhotes tiveram seus dados morfométricos mensurados. O procedimento de coleta de dados levou em consideração o mínimo distúrbio possível e o menor tempo de retenção do animal até à precisa coleta dos dados. Todos os procedimentos e manuseio dos animais tiveram o apoio do pessoal treinado do projeto TAMAR. Foram mensurados dados morfométricos da região dorsal, região ventral e apêndices, com auxílio de fita métrica de precisão de 0,1cm para as fêmeas adultas e um paquímetro digital (precisão de 0,001mm) para os filhotes, calculando-se os valores absolutos para cada indivíduo pela média de duas medidas repetidas. Todas as medidas foram realizadas pelo mesmo pesquisador, visando evitar distorções.

Os dados foram coletados em dois períodos:

1º período

No flagrante da fêmea adulta, os dados foram coletados após o término da desova e antes do retorno do animal ao mar. Um total de 15 fêmeas adultas tiveram seus dados morfométricos coletados (Tabela 2):

Tabela 2. Variáveis analisadas em fêmeas adultas e filhotes de Eretmochelys imbricata.

DADOS MORFOMÉTRICOS 1- Comprimento e largura das nadadeiras anteriores (CANT) (LANT) 2- Comprimento e largura das nadadeiras posteriores (CPOS) (LPOS) 3- Contagem do n° de placas laterais do casco (NPL) 4- Contagem do n° de placas circundantes do casco (NPCIRC) 5- Contagem do n° de placas centrais do plastrão (NPP) 6- Contagem do n° de placas inframarginais do plastrão (NPIM)

O comprimento da nadadeira por convenção foi obtido da curva da articulação até a extremidade da nadadeira e a largura da nadadeira, também por convenção, foi medida na região mais larga, correspondendo a região que antecede a unha.

Figura 4. Caracteres contínuos, dados coletados dos indivíduos de Eretmochelys imbricata: Comprimento e largura de nadadeiras (Fonte: Wyneken (2001) modificada).

Figura 5. Caracteres discretos, dados coletados em indivíduos de Eretmochelys imbricata : Número de placas do casco e plastrão (Fonte: Wyneken (2001) modificada).

2º período

Foram coletados os dados morfométricos dos filhotes, e este momento correspondeu a abertura do ninho (procedimento padrão do Projeto Tamar, para contagem do número total de ovos/filhotes), já que nenhum nascimento natural foi flagrado.

Neste momento para o estudo de AF por morfometria convencional, foram selecionados de forma aleatória 136 filhotes recém eclodidos, que tiveram seus dados morfométricos mensurados.

3.2.2.1 Análise Estatística para cálculo de Assimetria Flutuante

Assimetria flutuante (AF), proposta por Palmer & Strobeck (1986), foi o método utilizado no presente estudo. O referido processo consiste em eliminar a influência do tamanho individual do segmento, na qual é feita a análise usando a assimetria ponderada inversa por seu valor médio: Di - Ei AFi = (Di + Ei) / 2 Onde, Ei = média do segmento do lado esquerdo; Di = média do segmento do lado direito; A escolha deste método deu-se em função da possibilidade de correção das medidas de cada indivíduo, uma vez que a amostra é composta por elementos bem heterogêneos. Foram calculadas as médias das duas medidas (lado esquerdo e direito) para cada indivíduo amostrado, e em seguida, aplicado o teste não paramétrico Mann-Whitney comparando os grupos (fêmeas X filhotes; recém-nascidos X natimortos). É importante ressaltar que o teste é significativo se o nível descrito (p-valor) do mesmo for inferior ou igual a 0,05%.

3.2.2.2 Programas utilizados Para análises estatísticas foram utilizados os programas:  SISTAT Versão 12, 2007  R Versão 2.11.1, 2010  SPSS Versão 13.0, 2001

CAPITULO I

Estudo Cariotípico em Mesoclemmys tuberculata (Luederwaldt, 1926) (Testudines, Chelidae), Tartaruga da Caatinga Brasileira Marinho AL1, MR Vicari2 & PA, Martinez1. .

1Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Pós graduação em Ecologia, Natal,RN, Brasil.

2Universidade Estadual de Ponta Grossa, Campus de Uvaranas, Departamento de Biología Estrutural, Molecular e Genética, Ponta Grossa, PR, Brasil.

RESUMO No Brasil estudos citogenéticos na família Chelidae são incipientes, principalmente para as espécies que se distribuem na região Nordeste do Brasil. A espécie Mesoclemmys tuberculata (n=5), que está associada ao bioma Caatinga, não possui registros de estudos citogenéticos. Dessa forma, o presente trabalho caracterizou citogeneticamente através das técnicas de coloração convencional, impregnação com prata (Ag-Rons), bandamento C, bandamento G, fluorocromos-base especificos CMA3/DAPI e hibridação in situ com sonda telomérica (TTAGGG)n. A espécie apresentou número diplóide de 2n=58 e NF= 64, (2m+2sm+2st+52t). As RONs foram evidenciadas em um par telocêntrico de tamanho pequeno, que se mostrou positivo através da + cromomicina A3 (GC ), além disso as regiões teloméricas dos outros cromossomos do complemento e microcromossomos se mostraram GC+. Foi localizado conteúdo heterocromático nas regiões centroméricas da maioria dos cromossomos e nas regiões terminais. O par portador o sítio organizador nucleolar foi totalmente heterocromático. Quanto ao bandamento G, foi encontrado uma grande homologia entre os três primeiros pares quando comparados com outras espécies do gênero Phrynops e Mesoclemmys. Seqüências teloméricas mostraram padrões variáveis de intensidade de sinal, sendo que alguns sítios foram mais intensos nos microcromossomos e fracos nos cromossomos maiores. Não foi evidenciado sítios teloméricos intersticiais, situação já observada em algumas espécies da subordem Cryptodira. Estudos sob este aspecto ainda são escassos com outras espécies, sendo assim, estes dados poderão contribuir com o conhecimento citogenético e filogenético nos quelônios, pincipalmente para a familia Chelidae onde a sua filogenia ainda é alvo de controvérsias

Palavras chaves: Chelidae, Mesoclemmys tuberculata, citogenética, FISH.

ABSTRACT

Cytogenetic studies on the family Chelidae in Brazil are tentative, especially for species that are distributed in northeastern Brazil. The species Mesoclemmys tuberculata (n = 5), which is associated with the Caatinga biome, has no records of cytogenetic studies. Thus, the present study cytogenetically characterized by means of conventional staining, silver impregnation (Ag- NORs), C-banding, G-banding, base-specific fluorochromes CMA3/DAPI and in situ hybridization with telomeric probe (TTAGGG) 7. The species had a diploid number of 2n = 58 and NF = 64, (2m +2 sm +2 st +52 t). The NORs were found in a pair of telocentric small size, which proved positive by chromomycyn A3 (GC +), besides the telomeric regions of other chromosomes and microchromosomes of complement proved GC +. The C-banding showed that there was a low content of heterochromatin, restricted the centromeric regions of most chromosomes and also in some telomeres. Importantly, the nucleolar pair bearer introduced itself entirely heterochromatic. As for the G-banding, was found a high homology between three pairs when compared with other species of the genus and Phrynops Mesoclemmys. Telomeric sequences showed variable patterns of signal intensity, with some repeats more intense in the microchromosomes and subtly in the largest and no detectable interstitial markings, a situation already observed in some species of the suborder Cryptodira. Studies in this regard are still lacking with other species, so these data can contribute to knowledge on phylogeny and cytogenetic turtles, mostly of the family Chelidae where their phylogeny is still subject of controversy

Keywords: Chelidae, Mesoclemmys tuberculata, cytogenetic, FISH.

INTRODUÇÃO

As tartarugas da subordem Pleurodira são divididas em três famílias: Chelidae, Pelomedusidae e Podocnemidae (senso Pough,2008). Sendo Chelidae composta por 14 gêneros, dos quais sete são descritas para América do Sul, embora existam representantes de ocorrência no continente australiano e africano (Checklist 2006). No que diz respeito aos aspectos filogenéticos, analises baseadas em marcadores moleculares propõem uma monofilia baseada na teoria de tectônicas de placas entre os continentes australiano, africano e sulamericano, embora esta hipótese seja alvo de controvérsias (Seddon et al., 1997; Fujita et al., 2004). Nos testudines, estudos que abordam ecologia e taxonomia têm sido realizados, entretanto, analises que possam alicerçar os dados filogenéticos ainda são incipientes. No decorrer das ultimas décadas, a citogenética vem se destacando por uma abordagem eficiente na caracterização de grupos naturais, utilizando dados cariotípicos para identificação de espécies (citotaxonomia) e na elaboração de padrões de relacionamento e ou filogenias (citossistemática) (Dias, AL & Giuliano-Caetano, L. 2002). Essa ferramenta vem oferecendo o suporte para espécies taxonomicamente problemáticas ou em casos possíveis de espécies crípticas. Para a familia Chelidae, informações sobre cariótipos são fragmentadas e escassas, sendo baseadas apenas com coloração convencional (Ayres et al., 1969; Bickham 1975; Bickham & Baker, 1976; Bull & Legler, 1980; Bickham 1981; Bickham & Rogers, 1985). Recentemente o Noleto et al.,2006, caracterizaram a espécie Hydromedusa tectifera por meio de marcadores convencionais e hibridação in situ fluorescente (FISH). Neste sentido, a caracterização de um número maior de espécies com marcadores citomoleculares serão importantes no entendimento dos principais mecanismos evolutivos que envolvam representantes desta família. Os chélidos são os mais abundantes e amplamente distribuídos na América do Sul, onde apresentam padrões de endemismo em nível específico relacionados com as bacias hidrográficas (Souza, 2005). Entretanto, no que diz respeito aos aspectos citogenéticos, a maioria das espécies, ainda não se tem

o número diploide descrito, caso este da espécie Mesoclemmys tuberculata, endêmica do bioma caatinga, distribuída na região Nordeste do Brasil (Bour & Zaher, 2005). Neste sentido, o presente trabalho procurou caracterizar M. tuberculata através das técnicas de coloração convencional, impregnação com o íon prata (Ag-Rons), bandamento C, bandamento G, fluorocromos-base especificos CMA3/DAPI e hibridação in situ com sonda ribossomal 18S e telomérica, procurando establecer relações cromossômicas evolutivas na familia Chelidae.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram analisados cinco exemplares (2 ♂ e 3 ♀) de Mesoclemmys tuberculata, coletados no Município de Caicó-RN (-06° 27' 30'' / 37° 05' 52'„), Macaíba-RN (-05° 51' 30'' / 35° 21' 14''). Os cromossomos mitóticos foram obtidos a partir da cultura de linfócitos do sangue extraído da veia jugular dos animais, baseado na técnica de Moorhead et al.,1960, com modificações. As regiões heterocromáticas foram definidas segundo Summer (1972), enquanto a detecção das marcações Ag- Rons foi realizada conforme a técnica descrita por Howell & Black (1980). A análise de bandamento G foi realizada baseadao no protocolo de Seabright, (1971), e o idiograma foi organizado segundo o programa Easyidio (Versão

1.0). A coloração com os fluorocromos CMA3 e DAPI seguiu o protocolo de Barros-e-Silva & Guerra (2009). As análises de FISH foram utilizadas para a localização de genes rDNA

18s e sequência telomérica(TTAGGG)7. O rDNA 18S foi obtido da espécie de peixe Prochilodus argenteus Spix & Agassiz, seguindo o protocolo descrito por Hatanaka & Galetti (2004). A sonda 18s foi marcada com biotina 14-dATP através de Nick translation, seguindo as instruções do fabricante (Bionick Labeling System, Invitrogen;www.invitrogen.com). A detecção e amplificação dos sinais de hibridação foram realizados com avidina-fluorescente (FITC) conjugada e anticorpos anti-avidina biotinilados (Sigma-Aldrich; www.sigmaaldrich.com). A sonda telomérica (TTAGGG)7 foi marcada com digoxigenina 11-dUTP (Roche Applied Science; www.roche.com). O sinal de hibridação foi detectado usando anti-digoxigenina-rhodamine (Roche Applied

Science). Os cromossomos metafásicos foram tratados como descrito por Pinkel et al., (1986), contra-corados com 4‟,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) e analisados em fotomicroscópio óptico (Olympus, BX61; www.olympus.com). As imagens das metáfases foram capturadas usando software Image Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics; www.mediacy.com). Os cromossomos foram divididos em grupos quanto à posição do centrômero em metacêntricos, submetacêntricos, subtelocêntricos e telocêntricos, e dispostos em ordem decrescente de tamanho.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O número diplóide encontrado para Mesoclemmys tuberculata foi 2n=58, NF=64, apresentando o primeiro par submetacêntrico, o segundo par metacêntrico, o terceiro par subtelocêntrico e os demais cromossomos do complemento telocêntricos (Figura 1). Mesoclemmys tuberculata, antes conhecida como Phrynops tuberculatus é uma das espécies pouco estudada tanto em nível ecológico como genético, tendo em vista sua distribuição restrita. Análises comparativas dos dados citogenéticos de M. tuberculata com espécies do gênero Phrynops, como Phrynops geoffroanus (Bull & Legler, 1980), e outras espécies de Mesoclemmys demonstram um compartilhamento de uma mesma macroestrutura cariotípica com 2n=58 (NF=64) indicando a ausência de diversificação cariotípica entre os gêneros. De todas as espécies de tartarugas analisadas cariotípicamente somente seis tiveram descrito a presença de cromossomos sexuais. Na subordem Cryptodira os cromossomos sexuais identificados como XX/XY e ZZ/ZW, estão constituídos por macrocromossomos (Olmo & Signorino, 2005). Na subordem Pleurodira, Acanthochelys radiolata apresentou cromossomos sexuais heteromórficos XX/XY, mas só um macho foi examinado (McBee, et al., 1985) e Chelodina longicollis apresentou sistema cromossômico XX/XY, em um par de microcromossomos homomórficos (Ezaz et al., 2006). No presente estudo com Mesoclemmys tuberculata não apresentou cromossomos sexuais heteromórficos, esse resultado pode ser devido a técnicas empregadas no trabalho, por isso se faz necessário mais estudos implementando técnicas

moleculares como o CGH (Hibridação genômica comparativa) para detectar possíveis cromossomos sexuais crípticos. A análise do bandamento G (Figura 2), revelou grande homologia no padrão de bandas nos três primeiros pares quando comparados com outras espécies do gênero Mesoclemmys e Phrynops (Martinez, 2007) assim como dentro da ordem testudines, já que esse padrão também foi evidenciado em tartarugas da sub ordem Cryptodira (Moore et al.,1997). Sob o ponto de vista morfológico, este mesmo gênero vem sendo reavaliado diversas vezes. Na avaliação feita por McCord et al.,(2001) identificaram 14 espécies pertencentes ao um grande grupo, gênero Phrynops. Nesse mesmo estudo, este grande grupo foi dividido em seis gêneros, sendo Ranacephala, Rhinemys, Bufocephala e Mesoclemmys monotípicos. Quatro espécies permaneceram no gênero Phrynops e seis tornaram-se Batrachemys. Entretanto, Bour & Zaher (2005), ao descreverem uma nova espécie (Mesoclemys perplexa), discordaram da nova taxonomia, alegando que os gêneros Ranacephala, Mesoclemmys, Bufocephala e Batrachemys eram baseados em apenas dois caracteres relacionados. Neste aspecto, propuseram uma abordagem mais conservativa que incluía as espécies pertencentes a estes gêneros dentro do gênero Mesoclemmys. Nesta nova reclassificação M.hogei (Reed et al., 1991), M.nasatus (Kiester & Childress, 1973; Bull & Legler, 1980) e a espécie P. rufipes (gênero Rhinemys) (McBee et al., 1985), tiveram seus cariótipos descritos, consistindo todos de 2n=58 e NF=64. A evolução cromossômica em Testudines é um exemplo de extremo conservadorismo em altos níveis de categoria, sendo que cada familia parece seguir suas tendências cariotípicas de forma independente (Bickham & Carr, 1983). A família Chelidae apresenta 2n=50-64 cromossomos, a maioria microcromossomos. Por outro lado, as famílias Pelomedusidae (2n= 34-36) e Podocnemidae (2n=26-28), além de número diplóide menor, apresentam poucos microcromossomos. Esta enorme variação do número diplóide pode ser atribuída à rearranjos robertisonianos e inversões pericêntricas. (Bull & Legler,1980) descreveram que o números diplóides menores são derivados dentro do grupo. O sítios de RON evidenciados pela impregnação com o íon prata evidenciou um par cromossômico telocêntrico de tamanho pequeno (Figura

3a), que coincidiu com a hibridação in situ DNAr 18S (Figura 3b). Característica de RONs simples, em um par de microcromossomo é comum em ambas subordens de Testudines (Bickham & Baker,1976; Bickham et al., 1983; Bull & Legler, 1980; Sites et al., 1979b). No entanto, o gênero Mesoclemmys tem mostrado uma variação na posição destas RONs em algumas espécies, caso este verificado em Mesoclemmys vanderhagei com ocorrência no 4° par subtelocêntrico (Martinez, 2007), sugerindo uma possível inversão pericentromérica e uma translocação recíproca. Assim como, no oitavo par bibraquiado em Mesoclemmys dahli (Bull & Legler, 1980), o que também sugere que seja devido a uma inversão pericentromérica. O caráter da posição das RONs nestas espécies pode ser considerado como autopomorfias (Martinez, 2007) e parece se constituir em um caráter citotaxonômico na diferenciação destas espécies sob este ponto de vista. O bandamento C (Figura4) apresentou um reduzido conteúdo heterocromático, restrito as regiões centroméricas da maioria dos cromossomos e também em alguns telômeros. O par portador do sítio organizador nucleolar foi totalmente heterocromático. Entretanto, os fluorocromos base-específicos (Figura 5a) apresentaram regiões GC+ DAPI em posição terminal, condizente com a RON. Quanto a hibridação com a sonda telomérica (Figura 5b) não se evidenciou marcações intersticiais, situação já observada em algumas espécies da subordem Cryptodira como o trabalho de Martinez et al.,(2009) estes mesmos autores ao analisar as espécies Trachemys dorbigni e Chelonoidis donosobarrosi encontrou essa condição e sugeriram a possível perda de repetições teloméricas ou as mesmas se encontram em um número muito baixo para serem efetivamente detectadas. Na figura 6, fica evidenciado o padrão de bandas claras e escuras a partir do bandamento G assim como todos os bandamentos utilizados no trabalho.

Figura 1. Cariótipo de Mesoclemmys tuberculata 2n=58 (NF=64) submetido a coloração convencional por guiemsa. Barra 5µm

Figura 2. Metáfase de M. tuberculata submetida ao bandamento G. Barra 5µm

Figura 3. Metáfases de M. tuberculata em a) Impregnação por nitrato de prata em destaque (setas) os cromossomos portadores da região organizadora de nucléolo Barra 5µm. b) FISH com sonda de DNAr 18 S (setas). Barra 10 µm

Figura 4. Metáfase de M. tuberculata submetida ao bandamento C. O par nucleolar heterocromático (setas). Barra 5µm.

Figura 5. Metáfase de M. tuberculata submetidos: a) Dupla coloração com fluorocromos DAPI e CMA3. Barra 5 µm. b) Localização da sequência (TTAGGG)n . de vertebrado por FISH, os sinais vermelhos correspondem as sequencias teloméricas. Barra 10µm.

Figura 6. Idiograma evidenciando o padrão de bandas claras e escuras (Banda-G) assim como os demais bandamentos utilizados no presente estudo.

A família Chelidae apresenta uma série de controvérsias a respeito de suas relações filogenéticas. Estudos citogenéticos com localização de DNAs repetitivos por FISH são escassos e restritos a poucas espécies (Noleto et al., (2006); Martinez et al.,2009). Neste trabalho é realizada a descrição do cariótipo e de marcadores cromossômicos para a espécie M. tuberculata. Os resultados indicam um grau acentuado de conservadorismo cromossômico para o grupo. Assim, a descrição cariotípica de M. tuberculata da caatinga do Brasil pode ser útil ao entendimento da evolução cariotípica e das relações filogenéticas da família.

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CAPÍTULO II

Assimetria Flutuante em tartaruga marinha Eretmochelys

imbricata: Uso na aferição da seleção natural entre filhotes e

adultos

Marinho, L.A 1 & Martinez, P.A1

1 Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Pós graduação em Ecologia. Natal- RN. Brasil

RESUMO

A simetria é uma notável característica da morfogênese durante o desenvolvimento embrionário. Os desvios aleatórios dessa simetria são denominados assimetria flutuante (AF). A assimetria Flutuante tem sido utilizada como uma ferramenta útil para indicar possíveis estresses genéticos ou ambientais durante o desenvolvimento dos indivíduos bem como a sua capacidade de estimar aptidão e seus efeitos na seleção sexual.,Com o objetivo de estimar os valores e analisar o papel da AF com um caráter de seleção natural na espécie marinha E. imbricata, analisamos fêmeas adultas e filhotes vivos e mortos comparando os valores encontrados nessas diferentes fases ontogenéticas através de análises morfométricas multivariadas. Os dados foram coletados em dois momentos distintos: o primeiro no momento da desova da fêmea e o segundo na eclosão dos ninhos e nascimento dos filhotes. As características analisadas consistiram em medidas de comprimento e largura de nadadeiras anteriores e posteriores (CANT, LANT, CPOS e LPOS), e também coletados dados de número de placas do casco; placas laterais (NPL), placas circundantes (NPCIRC) e plastrão; placas centrais (NPP), placas inframarginais (NPIM). Com os valores de assimetria foi calculado o valor de herdabilidade estricto para essas características. Foi calculado um valor de assimetria para cada variável correspondente a cada individuo analisado. Como os dados analisados não apresentaram distribuição normal nem homocedasticidade, foi então realizado um teste não-paramétrico de Kruskal-wallis, a partir das medidas repetidas comparando os grupos (fêmeas X filhotes; recém-nascidos X natimortos). As fêmeas adultas não apresentaram assimetria flutuante bilateral (AF=0) quanto ao número de placas do casco e plastrão, enquanto os filhotes, vivos e mortos, mostraram maior nível de variação quanto a estes parâmetros merísticos. Na análise entre fêmeas X filhotes encontrou-se diferença significativa entre os níveis de

assimetria para as características de número de .placas do casco (p=0,006) e para a largura da nadadeira posterior (p=0,001) entre estes grupos, indicando que aparentemente o nível de assimetria das estruturas seriais (placas) não está relacionada com a taxa de filhotes vivos de uma ninhada. Entretanto, os altos níveis de AF sugerem um indicador eficiente quanto à viabilidade ou manutenção do indivíduo até a fase reprodutiva. Ao analisarmos o coeficiente de herdabilidade em sentido estrito (h2) da AF a partir da análises de regressão para as variáveis observou-se que ambas apresentam valores baixos, e não significativo estatisticamente, sugerindo um pequeno papel do componente genético nos valores de AF. Caso venha a ser excluído um papel mais efetivo dos efeitos genéticos na geração de AF, estratégias reprodutivas baseadas em elevado número de produtos filiais, como os observados em E. imbricata parecem implicar na produção de indivíduos com elevado nível de instabilidade do desenvolvimento.

Palavras-chaves: Assimetria Flutuante, Eretmochelys imbricata, herdabilidade e seleção natural

ABSTRACT

Symmetry is a notable feature of morphogenesis during embryonic development. The random deviations of symmetry are termed fluctuating asymmetry (FA). FA has been used as a useful tool to indicate possible genetic or environmental stress during development of individuals and their ability to estimate their effects on fitness and sexual selection. The species Eretmochelys imbricata and the other species of sea turtles show a slow growth and their hatchlings go through a pelagic phase in which swimming performance is important for performing this function. With the purpose of estimating values and analyzing the role of FA with a character of natural selection, we analyzed live and dead adult females and hatchlings live comparing the values found in these different ontogenetic stages using multivariate morphometric analysis. Data were collected at two different periods: first during the spawning female and second during the outbreak and birth of the nest. The characters analyzed consisted of measurements of length and width of front and rear flippers (CANT, LANT, CPOS and LPOS), with the aid of tape measure to the adult females and digital caliper for hatchlings. We also collected data on number plates hull, side plates (NPL), the surrounding plates (NPCIRC), and plastron; plastron plates (NPP), inframarginais plates (NPIM). With the values of asymmetry we calculated the value of heritability for these traits narrowly defined, with the calculation based on only one parent. From these data, we calculated a value of asymmetry for each variable for each individual analyzed, the homoscedasticity was tested from the Box's test and multivariate normality of the data from the test of Mardia Skewness. Data did not show normal distribution or homogeneous variance and then a nonparametric test of Mann-Whitneywas performed, from repeated measures analysis comparing the groups (females X hatchlings, newborn hatchlings X dead hatchlings ), assuming a value of probability of p <0.05 as significant. Adult females showed no bilateral fluctuating asymmetry (FA = 0) on the number plates of the hull and plastron,

while offspring, living and dead, showed a greater level of variation in these meristic parameters. In the analysis of female X hatchlings, we found a significant difference between the levels of asymmetry to the number of features. Number of plates (p = 0.006) and the hindlimbs width (p = 0.001) between these groups, indicating that apparently the level of asymmetry of serial structures (plates) is not related to the rate of live hatchlings in a litter. However, since then, high levels of AF suggest an accurate indicator as to the viability or maintenance of the individual to the reproductive phase. Although there is evidence that the shape of the plastron of turtles is inheritable by analyzing the coefficient of heritability in the narrow sense (h2) of AF from the regression analysis for the variables of number plates and measurements of length and width of the flipperss that have both low and not statistically significant (p>0,1), suggesting a small role of genetics in the values of AF, especially as regards the features like the number of plaques analyzed where all females are symmetrical, unlike the young. Wether it should be excluded from a more effective role in the generation of the genetic effects of AF, reproductive strategies based on high number of products subsidiaries, such as those observed in E. imbricata seems to implicate the production of individuals with high level of developmental instability.

Keywords: Flutuacting asymmetry, Eretmochelys imbricata, heritability and natural selection.

INTRODUÇÃO

A maioria dos organismos apresenta características morfológicas bilaterais. Os desvios aleatórios da simetria bilateral perfeita são denominados de assimetrias flutuantes (AF). Estes desvios surgem devido à incapacidade dos organismos em desenvolver ambos os lados do seu corpo da mesma forma, e muitas vezes são indicativos de estresse ambiental ou fatores genéticos durante o desenvolvimento (Van Vallen, 1962; Thornhill 1991; Markov, 1995; Palmer, 1996; Gangestad & Thornhill 1999) A Assimetria Flutuante tem recebido bastante atenção por sua capacidade de estimar a aptidão (Palmer & Strobeck, 1986; Møller & Swaddle, 1997), e seus efeitos na seleção sexual (Möller, 1992, 1993; Swaddle & Cuthill, 1994a, b; Allen e Simmons, 1996; Swaddle, 1996). Assim como tem levantado várias questões acerca da herdabilidade desta AF e da extensão da genética aditiva envolvida no processo da mesma. A maioria dos estudos empíricos para estimar a herdabilidade da AF tem rendido valores muito baixos e não significantes (por exemplo, Leamy, 1999, Pelabon et al. 2004), mas ocasionalmente, herdabilidades significativas foram encontradas(Polak & Starmer 2001, Santos, 2002, Scheiner et al. 1991 Thornhill & Sauer 1992). Inúmeros estudos têm demonstrado uma correlação negativa entre seleção sexual e assimetria flutuante, indicando que os indivíduos mais simétricos obtêm um maior sucesso reprodutivo, o que ajuda a manter baixos níveis de assimetria dentro das populações (Möller, 1992, 1993; Swaddle, 1996). No entanto, normalmente tem sido observado que baixos níveis de assimetria podem ser mantidos por seleção natural, por razões funcionais, devido à redução do desempenho biomecânico (Balmford et al., 1993; Evans & Hatchwell, 1993; Thomas, 1993; Swaddle, 1997; Swaddle & Witter, 1998). Entretanto, estudos sobre estes aspectos em tartarugas marinhas ainda são inexistentes. A espécie Eretmochelys imbricata, assim como às demais espécies de tartarugas marinhas, tem um crescimento lento, maturação tardia e vida longa (Chacón, 2004). Após o nascimento, filhotes de tartarugas marinhas passam por uma fase pelágica até cerca de 20 cm de comprimento de carapaça, onde a capacidade natatória dos mesmos se faz importante para desempenhar tal função. Visando analisar o papel da AF como um caráter de

seleção natural nas tartarugas marinhas, no presente trabalho analisamos índices de assimetria flutuante em fêmeas adultas e filhotes, vivos e mortos, comparando os valores de assimetria nestas diferentes fases ontogenéticas da espécie a partir de análises morfométricas multivariadas.

MATERIAL E MÉTODOS

Uma amostra de 151 indivíduos da espécie Eretmochelys imbricata, composta por 15 fêmeas em processo de ovoposição e seus respectivos filhotes (70 recém nascidos, 66 natimortos), coletados em três praias (Chapadão, Minas e Sibaúma), do Distrito de Pipa, Município de Tibau do Sul, Rio Grande do Norte (13' 40"s e 35º 03' 05"w), na temporada de desova 2009/2010. Para cada fêmea, 10 filhotes de seus ninhos tiveram seus dados morfométricos mensurados. Cada indivíduo, dentro do seu respectivo grupo, foi analisado quanto ao número de placas do casco (placas laterais e circundantes) e plastrão (placas centrais e inframarginais), bem como tiveram as medidas do comprimento e largura das nadadeiras anteriores e posteriores aferidas com auxilio de uma fita métrica flexível (precisão de 0,1cm), no caso de fêmeas adultas, ou paquímetro digital (precisão de 0,01mm), nos filhotes. Todas as medidas foram realizadas pelo mesmo pesquisador, visando evitar distorções. Nas fêmeas adultas os dados foram coletados logo após o término da desova, antes de retornarem ao mar, e nos filhotes no momento da saída do ninho, após o período de incubação. No total 8 variáveis foram analisadas sendo 4 elementos seriais do casco e plastrão: NPL (n° de placas laterais do casco); NPCirc (n° de placas circundadantes); NPIM (n° de placas inframarginais do plastrão); NPP (n° de placas centrais do plastrão) e 4 medidas morfométricas: CANT (comprimento da nadadeira anterior); CPOS ( comprimento da nadadeira posterior); LANT (largura da nadadeira anterior); LPOS ( largura da nadadeira posterior). O cálculo de Assimetria Flutuante (AF), foi obtido segundo o método proposto por Palmer & Strobeck (1986). Os valores encontrados de assimetria foram transformados em valores absolutos para realização dos testes. Testou- se a homocedasticidade a partir do Box‟s test e a normalidade multivariada a partir do teste de Mardia Skewness. Como os dados analisados não

apresentaram distribuição normal nem homocedasticidade, foi então realizado um teste não-paramétrico Mann-Whitney, a partir das medidas repetidas comparando os grupos (fêmeas X filhotes; recém-nascidos X natimortos), considerando-se um valor de probabilidade de p< 0,05, como significante. Para a realização da análise os valores de AF foram transformados a valores absolutos. A herdabilidade em “sentido estrito” (h²) da AF foi estimada para as diferentes variáveis de acordo com o proposto por Hartl & Clarck (2010), onde: b= (1/2) h², sendo b o coeficiente de regressão, e b= Cov (x,y) Var (x) Onde x é o valor de AF para as variáveis morfométricas de comprimento e largura das nadadeiras de uma determinada fêmea e y a média dos valores de AF dos seus filhotes. O fator ½ ocorre porque a regressão envolve somente um único parental (a fêmea), por tanto a h²=2b

RESULTADOS

As fêmeas adultas não apresentaram assimetria flutuante bilateral (AF=0) quanto ao número de placas do casco e plastrão, enquanto os filhotes, vivos e mortos, mostraram maior nível de variação quanto a estes parâmetros merísticos (AF=± 0,0714) (Tabela1).

Tabela1. Número de indivíduos assimétricos dentre os 136 analisados quanto ao número de placas do casco e plastrão. NPL (Nº de Placas Laterais); NPCirc (Nº de Placas Circundantes); NPIM (Nº de Placas Inframarginais); NPP (Nº de Placas do Plastrão). NPL NPCirc NPIM NPP Total de indivíduos assimétricos

Nº de Indiv. Fêmeas 0 0 0 0 0 Assimétricos

Filhotes 0 36 8 7 51

Percentagem de assimetria 0% 26,47% 5,88% 5,14% 37,5% em filhotes.

Aplicando o teste Mann-Whitney, observou-se que não existe diferença significativa nos níveis de AF para as variáveis de contagem de placas e variáveis contínuas de comprimento e largura de nadadeiras entre filhotes vivos e mortos (Tabela 2) Uma vez que não se detectou diferenças significativas entre filhotes vivos e mortos, estes foram tratados como uma categoria nas comparações com fêmeas adultas. Na análise entre fêmeas X filhotes (Tabela 2) foi estatisticamente significativa, indicando que existe diferença entre os níveis de assimetria para as características de número de placas do casco e para a largura da nadadeira posterior entre estes grupos (Tabela 2). A partir dos histogramas se evidencia a freqüência dos indivíduos quanto aos valores de assimetria encontrada entre fêmeas e filhotes para cada variável (Figuras 1 ).

Tabela 2. Teste não paramétrico Mann-Whitney para níveis de assimetria flutuante utilizando as 5 variáveis analisadas entre os grupos: Filhotes vivos x mortos e Fêmeas x Filhotes

Grupos/Variáveis NPL CANT LANT CPOS LPOS Chi-square 0,515 1,735 0,968 0,075 1,061 Vivos x Mortos df 1 1 1 1 1 p 0,473 0,188 0,325 0,784 0,303

Chi-square 7,581 0,156 0,154 0,019 11,453 Fêmeas x Filhotes df 1 1 1 1 1 p 0,006* 0,693 0,695 0,891 0,001*

*Valores significativos com p<0,05

Através da análise de regressão linear simples, com as variáveis contínuas, comprimento e largura, utilizando os valores de AF para tais variáveis, de fêmeas e filhotes, encontrou-se baixos valores de herdabilidade ( p > 0,05) obtidos a partir do valor de b, que corresponde ao coeficiente de regressão, que explica a variação de filhotes em relação a seu parental (Tabela 3).

Tabela 3. Herdabilidade no sentido estrito (h²) para as variáveis.

Variáveis b Std error F p h² NPC - - - - - CANT ‐0,401149 0,390826 1,0535 0,3249 ‐0,802298 CPOST 0,06821 0,049509 1,8985 0,1934 0,13642 LANT 0,02536 0,02536 0,0453 0,835 0,05072 LPOST 0,02536 0,02536 0,0453 0,835 0,05072

AnáliseBox de CPOS c) anterior); nadadeira da (Comprimento CANT b) casco); do placas (comprimento de danad (Número NPL a) analisada: variável cada para azul), Figura1

. Histogramas .

- plotsentre grupos os Fêmease Filhotes, quanto as variáveis NPLde (f);CANT (g), CPOS(h),LANT (i)e LPOS (j)

adeira posterior);d) LANT (Larguranadadeirada anterior); e) LPOS (Largura nadadeirada posterior)

evidenciando a distribuição dos valores de AF em Fêmeas (barra cheia em vermelho) e Filhotes (barra vazada em(barraFilhotesvazada e vermelho) em cheia(barra Fêmeas em AF de valoresevidenciando distribuiçãodos a

DISCUSSÃO

A assimetria flutuante foi registrada nesse estudo em caracteres contínuos das tartarugas, sendo que os valores de AF se mostraram mais evidentes quanto as características de n° de placas, ou seja caracteres discretos, onde somente os filhotes apresentaram variação quanto ao valor de assimetria, e as fêmeas para estas características se mostraram totalmente simétricas. O número de placas circundantes do casco representou a característica analisada em que ocorreu maior variação entre os filhotes, em relação ao número de placas centrais e inframarginais do plastrão, ambas com padrão de variação menor e similar entre si. Em todas essas características analisadas encontramos uma distribuição normal dos dados quanto aos valores originais de assimetria, critério importante, pois diferencia assimetria flutuante (expressão de ruídos no desenvolvimento) de antissimetria, onde os indivíduos assimétricos são esperados, e que geralmente um componente genético está envolvido (Van Valen, 1962; Palmer & Strobeck 1986,1992; Palmer et al., 1993; Palmer 1994; Rowe et al., 1997). Alguns estudos com variáveis ambientais como temperatura da areia (Yntema & Mrosovsky 1982), umidade (McGehee 1990) e a troca de gases entre o ninho e o ambiente (Ackerman 1980), tem comprovado uma relação direta com o desenvolvimento embrionário dos indivíduos. A partir do teste não paramétrico Mann-Whitney não se evidenciou diferença significativa dos níveis de AF entre os filhotes vivos e mortos, indicando que aparentemente o nível de assimetria das estruturas seriais (placas) não está relacionada com a taxa de filhotes vivos de uma ninhada. Entretanto, a partir de então, os altos níveis de AF sugerem um indicador eficiente quanto à viabilidade ou manutenção do indivíduo até a fase reprodutiva. Indivíduos com desvios dos fenótipos funcionais (viabilidade e fertilidade) para características quantitativas podem apresentar-se menos aptos e removidos sob ação da seleção estabilizadora (Zhang & Hill, 2005). Estima- se que 0,2% das tartarugas nascidas chegam à idade adulta (Revista Tamar 1999). Nossos resultados mostram que 37,49% dos filhotes quanto a

característica de número de placas mostraram-se assimétricos em relação às fêmeas adultas e 64,69% para medidas das suas estruturas de locomoção, o que parece indicar que uma grande parte desta mortalidade poderia estar influenciada pelos desvios de AF, apesar de apenas a característica de largura da nadadeira posterior ter apresentado valor significativo (Tabela 2) quando comparado com as fêmeas. Entretanto, devido à diferença no número amostral entre fêmeas e filhotes, essa discrepância pode conduzir a resultados não significativos, mesmo que diferenças práticas entre os grupos sejam consideráveis, uma vez que o grupo maior tem uma variância maior o teste tende a ser conservador, e quando o grupo menor tem uma variância maior este teste tende a ser liberal. Nesse caso, a variância de todas as variáveis das fêmeas adultas (grupo menor) apresentou uma menor variância que os filhotes (grupo maior), assim, o teste é considerado conservador (Maroco, 2010). Dessa forma, os resultados encontrados podem sim, representar informações importantes quanto aos níveis de assimetria de forma diferencial entre filhotes e fêmeas adultas. A análise de dois clados da superfamília Testudinoidea (Emydidae e Testuguria) indicaram menores níveis de assimetria bilateral em espécies aquáticas do que nas terrestres, defendendo que o ambiente pode influenciar na taxa de simetria dos organismos (Rivera & Claude, 2008). As características físicas do ambiente geram pressões seletivas nos indivíduos quanto a morfologia de estruturas relacionadas ao seu desempenho locomotor (Brinsmead & Fox, 2002; McGuigan et al., 2003). Os membros dos vertebrados podem desempenhar múltiplas tarefas, às vezes submetê-las a demandas conflitantes quanto a realização de movimentos dos músculos das nadadeiras anteriores e posteriores. Filhotes de tartarugas são capazes de locomoção proficiente logo após a eclosão (Cagle, 1950;. Miller et al, 1987; Zani & Claussen, 1994). Muitas espécies de tartarugas em sua fase juvenil apresentam comportamento alimentar generalista, tornando-se especialistas ao longo da fase adulta onde se tornam capazes de coordenar movimentos e direcionar suas preferências alimentares (Wyneken et al., 2008) Assim, as diferenças na locomoção entre os adultos que poderiam estar associados com os requisitos para a aquisição de diferentes tipos de alimentos, não pode ser esperada entre os jovens que enfrentam demandas locomotoras similares, já

que a falta de versatilidade na função motora poderia prejudicar o desempenho de alguns comportamentos (Biewener & Gillis, 1999). Os índices diferenciais de assimetria flutuante obtidos para medidas dos membros, principalmente nas nadadeiras posteriores e casco, em fases ontogenéticas distintas na espécie E. imbricata, sugerem um custo seletivo em relação a possíveis disfuncionalidades natatórias. Estes índices de AF revelam-se como aferidores efetivos de baixa qualidade genéticas ou de imperfeições no desenvolvimento ontogenético dos indivíduos. No Brasil, as cinco espécies de tartarugas marinhas encontradas estão ameaçadas de extinção, principalmente em função do aumento da pressão de captura incidental pela pesca, bem como em função de perturbações ambientais, decorrente da ocupação desordenada de vastas regiões litorâneas (Wetherall et al., 1993). Estudos genéticos em tartarugas marinhas no Brasil têm mostrado uma baixa variabilidade genética em populações das espécies; Caretta caretta (Soares, 2004), Lepidochelys olivacea e Dermochelys coriacea (Lara-Ruiz et al., 2006). O mesmo parece existir para Eretmochelys imbricata, onde diferentes estudos realizados com populações do México, Ilhas Virgens e Brasil têm revelado baixa diversidade haplotípica (Lara-Ruiz et al. 2006; Bass et al., 1996), além de uma alta taxa de hibridação (mais de 40%) (Lara-Ruiz et al. 2006). Estes fatores, combinados com declínios populacionais podem incrementar homozigosidade nas populações. Altos valores de assimetria flutuante são compatíveis com a noção de que a homozigosidade genética proporciona instabilidade do desenvolvimento (Phelan & Austad, 1994; Leamy & Klingenberg, 2005). Sendo assim, a redução da variabilidade genética, possivelmente devido à endocruzamentos ou a desorganização de blocos gênicos coadaptados induzidos por processos de introgressão pelos híbridos, podem resultar em um aumento da variância fenotípica. A herdabilidade de características relacionadas com o fitness continua sendo uma área bastante discutida na biologia evolutiva. Algumas evidências sugerem que a assimetria flutuante (AF) em caracteres sexuais secundários pode refletir a qualidade genética do portador dessa característica. Tem havido

um número significativo de relatos quanto a herdabilidade para AF no contexto de seleção sexual, como identificado para a asa do escorpião voador Panorpa japonica (Thornhill & Sauer, 1992); e na cauda da andorinha Hirundo rustica (Møller, 1994). Em contrapartida, um número crescente de trabalhos vem mostrando a não evidência de um componente herdável para assimetria. Como exemplo desta condição, verificou-se a ausência de variação genética aditiva em duas medidas de assimetria nas asas do inseto Gryllodes sigillatus (Eggert & Sakaluk, 1994; Tomkins & Simmons, 1999) Embora haja evidências de que a forma do plastrão das tartarugas seja herdável (Myers et al., 2006), ao analisarmos o coeficiente de herdabilidade em sentido estrito (h2) da AF a partir da análises de regressão para as variáveis de número de placas e medidas de comprimento e largura das nadadeiras (Tabela 3) observou-se que ambas apresentam valores baixos e não significativos estatisticamente (p>0,1), sugerindo um pequeno papel do componente genético nos valores de AF, principalmente no que diz respeito às características seriais do número de placas onde todas as fêmeas analisadas são simétricas, diferentemente dos filhotes. Caso venha a ser excluído um papel mais efetivo dos efeitos genéticos na geração de AF, estratégias reprodutivas baseadas em elevado número de produtos filiais, como os observados em E. imbricata, parecem implicar na produção de indivíduos com elevado nível de instabilidade do desenvolvimento. A validade desta hipótese para outras espécies de tartarugas marinhas permanece em aberto. Contudo, os resultados encontrados são instigantes e revelam uma relação aparentemente direta entre AF de estruturas corporais como preditor de processos seletivos para a espécie.

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5 CONCLUSÕES GERAIS

 Foi realizado a primeira descrição cariotípica da espécie Mesoclemmys tuberculata, através de coloração convencional e bandamentos diferenciais (C, G e RON), bem como a utilização da técnica de Hibridação fluorescente in situ com sonda de rDNA 18s e seqüência

telomérica (TTAGGG)7;

 A espécie Mesoclemmys tuberculata apresentou 2n=58 e NF=64, um par de cromossomo de tamanho pequeno portador da RON, pouca heterocromatina presente nos cromossomos, restrita a regiões centroméricas e o par organizador nucleolar heterocromático, coincidente com a marcação da sonda de rDNA 18S, além de marcações com a sonda telomérica. Não apresentou cromossomos sexuais possíveis de serem identificados com as técnicas utilizadas;

 Primeiro registro de detecção de assimetria flutuante em população natural de Eretmochelys imbricata em fases ontogenéticas diferentes;

 Os índices de assimetria flutuante encontrados podem ser indicativos de possíveis disfuncionalidades natatórias passíveis de seleção natural.

 Embora haja evidências de que a forma do plastrão das tartarugas seja herdável foi o coeficiente de herdabilidade em sentido estrito (h2) da AF número de placas e medidas de comprimento e largura das nadadeiras, observou-se que ambas apresentam valores baixos, e não significativo estatisticamente (p>0,1), sugerindo um pequeno papel do componente genético nos valores de AF.

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ANEXOS

ANEXO A. Valores de assimetria flutuante em fêmeas adultas de Eretmochlys imbricata, para as 8 variáveis analisadas: NPLAT (N° de placas laterais); NPCIRC (N° de placas circundantes); NPIM (N° de placas inframarginais); NPP(N° de placas do plastrão); CANT (Comprimento da nadadeira anterior); CPOS (Comprimento da nadadeira posterior); LANT(Largura da nadadeira anterior); LPOS(Largura da nadadeira posterior)

FÊMEAS NPLAT NPCIRC NPIM NPP AF CANT AF CPOS AF LANT AF LPOS 57942/57943 1 0 0 0 0 0,029018 -0,08556 -0,01361 0,009972 46023/44750 2 0 0 0 0 0,001726 -0,02849 -0,00549 -0,00784 45044/45045 3 0 0 0 0 0,009714 0,002703 0,015152 0 46011/46012 4 0 0 0 0 0,002571 0,009009 -0,01724 -0,00482 44721/44722 5 0 0 0 0 0,002762 0,016961 0,021236 -0,00462 43312/43313 6 0 0 0 0 0,010181 -0,00467 -0,00198 0,001558 46038/46039 7 0 0 0 0 0,006463 0,025874 -0,01648 0,00152 46002/44703 8 0 0 0 0 -0,01143 0 0 0,003401 44786/44787 9 0 0 0 0 -0,00228 0,002857 -0,0098 0,003165 57944/57945 10 0 0 0 0 0,00275 0,009881 -0,02685 0,003165 57940/57941 11 0 0 0 0 0,00275 0,009881 -0,02685 0,003165 43374/43375 12 0 0 0 0 0,008876 -0,00279 -0,00562 -0,00307 44721/44722 13 0 0 0 0 0 -0,00442 0,005747 -0,01389 57934/57935 14 0 0 0 0 0,012252 0,004178 -0,01504 0,00165 57929/57930 15 0 0 0 0 0,015658 -0,002 0,005263 -0,00888

ANEXO B. Valores de assimetria flutuante dos filhotes com suas respectivas fêmeas e ninhos nas diferentes variáveis. Filhotes vivos (valores em preto), filhotes natimortos (valores em vermelho).

Fêmea- N° Marcação Ninho NPL NPCIRC NPIM NPP AFCANT AFCPOS AFLANT AFLPOS do Tamar 57942/57943 7 0 0 0 0,045455 -0,00184 0,00249 0,005288 0,012299 57942/57943 7 0 0 0 0 -0,00347 -0,014 0,01264 0,001946 57942/57943 7 0 0,02 0 0 0,004362 0,004196 0,037246 0,002008 57942/57943 7 0 0 0 -0,03846 -0,00314 -0,01384 0,005432 0,015895 57942/57943 7 0 -0,02 0 0 0,007463 -0,00406 0,0016 -0,00501 57942/57943 7 0 0 0 0 -0,00445 -0,00956 0,004094 -0,01776 57942/57943 7 0 0 0 0 -0,00383 -0,02893 -0,00115 -0,00873 57942/57943 7 0 0 0 0,045455 0,002454 -0,0167 -0,01109 -0,01276 57942/57943 7 0 0 0 0 0,0135 0,016038 -0,00357 0,00364

46023/44750 6 0 0,021739 0 0 0,022449 -0,00065 -0,02636 -0,01821 46023/44750 6 0 0,02 0 0 -8,2E-05 0,000586 -0,00909 -0,01367 46023/44750 6 0 -0,02174 0 0 -0,00259 -0,0095 -0,02461 -0,0053 46023/44750 6 0 -0,02174 0 0 -0,00533 0,000109 -0,03714 -0,01724 46023/44750 6 0 0 0 0 -0,00262 -0,00291 -0,03956 -0,01882 46023/44750 6 0 0 0 0 0,000475 -0,01661 -0,00485 -0,01079 46023/44750 6 0 0 0 0 0,010755 0,012753 0,005982 0,007592 46023/44750 6 0 0,02 0 0 0,00165 0,000599 -0,00575 0,001048 46023/44750 6 0 0 0 0 -0,00962 -0,00614 0,001182 0,019742

45044/45045 26 0 0 0 0 0,007669 -0,02528 -0,05092 0,020033 45044/45045 26 0 0 0 0 -0,00061 -0,02459 0,022108 -0,04054 45044/45045 26 0 -0,02174 0 0 -0,01216 -0,00277 -0,00112 0,001817 45044/45045 26 0 0 0 0 0,026501 -0,02839 0,015991 -0,03063 45044/45045 26 0 0 0 0 -0,01437 -0,0197 0,00754 -0,0518 45044/45045 26 0 0 0 0 -0,00802 0,017818 0,015127 -0,02306 45044/45045 26 0 0 0 0 -0,00428 -0,00126 -0,0098 0,0162 45044/45045 26 0 0 0 0 -0,00735 0,000131 -0,01577 0,013619 45044/45045 26 0 0 0 0 0,000786 -0,0048 -0,01707 0,000233 45044/45045 26 0 0 0 0 0,001943 -0,0038 -0,00397 -0,01918

46011/46012 17 0 0 0 0 0,030062 -0,00961 0,001931 0,015224 46011/46012 17 0 0 0 0 0,008626 -0,00012 -0,00307 -0,00515 46011/46012 17 0 0 0 0 0,002883 -0,01185 -0,05451 0,013546 46011/46012 17 0 0 0 0 0,003591 -0,00553 -0,01 -0,02448 46011/46012 17 0 0 0 0 0,004159 0,000248 -0,00648 0,01078 46011/46012 17 0 0 0 0 0,000757 -0,00609 -0,00811 0,014905 46011/46012 17 0 0 0 0 0,001888 -0,019 0,012217 0,013952 46011/46012 17 0 0 0 0 0,005045 0,013639 0,0316 0,001411 46011/46012 17 0 0 0 0 0,073793 -0,02093 0,024846 -0,03081

44721/44722 24 0 0 0 0 -0,00017 0,004509 0,005796 0,030267 44721/44722 24 0 0 0 0 -0,00143 0,024453 -0,00076 0,008841 44721/44722 24 0 -0,02 0 0 -0,00265 -0,00048 0,008197 0,001491 44721/44722 24 0 -0,02 0 0 0,005908 0,01831 0,011327 0,018571 44721/44722 24 0 0 0 0 0,004913 -0,01418 -0,02122 -0,00563 44721/44722 24 0 0,021739 0 0 -0,00555 -0,00801 0,013998 -0,11162 44721/44722 24 0 0,021739 0 0 0,024838 -0,00373 0,009671 -0,01407 44721/44722 24 0 0 0 0 0,000301 -0,00373 0,009671 -0,01407 44721/44722 24 0 0 0 0 0,009066 0,026903 0,002955 -0,00136 44721/44722 24 0 0 0 0 0,001943 -0,0038 -0,00397 -0,01918

43312/43313 31 0 0 0 0 0,006746 0,009159 0,011019 0,005847 43312/43313 31 0 0 0 0 0,028409 0,016507 0,020728 -0,00483 43312/43313 31 0 0 0 0 0,006645 -0,00329 -0,00374 -0,00368 43312/43313 31 0 0 0 0 0,002146 -0,0056 0,002822 -0,04421 43312/43313 31 0 -0,02 0 0 -0,00409 -0,01731 0,015899 0,014107 43312/43313 31 0 0 0 0 0,008627 -0,01397 -0,00599 -0,028 43312/43313 31 0 0 0 0 0,007246 -0,00682 0,001 -0,00675 43312/43313 31 0 0 0 0 -0,00445 -0,00956 0,004094 -0,01776

46038/46039 13 0 0 0 0 -0,01063 0,01084 -0,00622 -0,01418 46038/46039 13 0 0 0 0 -0,00802 -0,02212 -0,01526 -0,00532 46038/46039 13 0 0,02 0 0 -0,00729 -0,0042 0,017139 -0,00805 46038/46039 13 0 0 0 0 -0,00883 -0,022 0,008829 -0,01943 46038/46039 13 0 0,021739 0 0 -0,00301 -0,01317 -0,04167 -0,01541 46038/46039 13 0 0 0 0 -0,00977 -0,01305 -0,00774 0,006335 46038/46039 13 0 0 0 0 0,000192 0,015754 -0,02618 0,002451 46038/46039 13 0 0 0 0 0,001943 -0,0038 -0,00397 -0,01918 46038/46039 13 0 0 0,071429 0 -0,01214 -0,0008 -0,01046 0,012209

46002/44703 34 0 0 0 0 -0,00912 0,003823 -0,00024 -0,02778 46002/44703 34 0 0 0 0 -0,01708 -0,00364 -0,00839 -0,02555 46002/44703 34 0 0 0 0 -0,00501 0,001627 -0,0007 -0,01673 46002/44703 34 0 0 0 0 -0,00496 -0,02781 -0,0029 -0,00597 46002/44703 34 0 0 0 0 0,000767 0,00104 0,018558 0,003061 46002/44703 34 0 0 0 0 -0,0081 0,0059 -0,01169 0,004562 46002/44703 34 0 0 0 0 0,023153 -0,01507 0,000727 -0,03907 46002/44703 34 0 0 0 0 -0,01027 0,005316 0,0067 0,008123 46002/44703 34 0 0 0 0 0 -0,00295 -0,02326 0,003858

44786/44787 43 0 -0,02174 0 -0,04545 0,002522 0,018019 0,009259 0,013478 44786/44787 43 0 0,02 0 0,038462 -0,0154 -0,00466 -0,0056 0,008341 44786/44787 43 0 0 0 0 -0,00704 0,011489 0,002317 0,025193 44786/44787 43 0 0,02 0 0 -0,01419 -0,00191 -0,01645 -0,00427 44786/44787 43 0 0 0 0 -0,02191 0,002023 0,011938 0,004496 44786/44787 43 0 0,02 0 0 -0,0038 0,013023 -0,01489 -0,00988

44786/44787 43 0 0 0 0 -0,0053 -0,0128 -0,01036 -0,0189 44786/44787 43 0 0 0 0 -0,01333 -0,00941 -0,01401 0,000232 44786/44787 43 0 -0,02 0 0 -0,00847 0,000794 -0,00406 0,000926 44786/44787 43 0 0 0 0 0,012211 0,002604 -0,00224 0

57944/57945 22 0 0 0 0 -0,03866 -0,00785 0,00366 -0,00128 57944/57945 22 0 0 0 0 -0,00648 -0,00192 -0,01183 -0,02085 57944/57945 22 0 0,02 0 0 -0,0246 0,00834 0,027174 0,002994 57944/57945 22 0 0 0,071429 0 0,000182 0,008988 0,00719 -0,00164 57944/57945 22 0 -0,04167 0 0 0,011736 -0,0067 -0,00836 -0,01011 57944/57945 22 0 0 0 0 -0,01517 -0,01419 -0,01525 0,028669 57944/57945 22 0 0,02 0 0 0,012171 -0,0042 -0,00616 -0,01536 57944/57945 22 0 0 0 0 -0,00912 -0,00893 -0,02251 -0,01086

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