Universidade Federal Do Paraná Fernanda Colombi Cansian Abordagem Fitoquímica, Avaliação Farmacológica E Atividades Biológ
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ FERNANDA COLOMBI CANSIAN ABORDAGEM FITOQUÍMICA, AVALIAÇÃO FARMACOLÓGICA E ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE Tynanthus micranthus CORR. MELLO EX SCHUM. (BIGNONIACEAE) CURITIBA 2014 FERNANDA COLOMBI CANSIAN ABORDAGEM FITOQUÍMICA, AVALIAÇÃO FARMACOLÓGICA E ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE Tynanthus micranthus CORR. MELLO EX SCHUM. (BIGNONIACEAE) Tese apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas, Setor de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Paraná, como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor (a) em Ciências Farmacêuticas. Orientadora: Marilis Dallarmi Miguel Co-Orientador: Obdulio Gomes Miguel CURITIBA 2014 Cansian, Fernanda Colombi Abordagem fitoquímica, avaliação farmacológica e atividades biológicas de Tynanthus micranthus Corr. Mello ex Shum. (Bignoniaceae) Fernanda Colombi Cansian - Curitiba, 2014. 121 f. : il.(algumas color.) ; 30 cm Orientador: Professora Dra. Marilis Dallarmi Miguel Coorientador: Professor Dr. Obdulio Gomes Miguel Tese (doutorado) – Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Setor de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Paraná, Área de Concentração: Insumos, Medicamentos e Correlatos, 2014. Inclui bibliografia 1. Cipó cravo. 2. Atividade afrodisíaca. 3. Dotriacontane. 4.Atividade antioxidante. 5. Atividade imunológica. I. Miguel, Marilis Dallarmi. II. Miguel, Obdulio Gomes. III. Universidade Federal do Paraná. IV. Título. CDD 615.32 Dedico esse trabalho a meu Pai Jailson, a minha Mãe Sirlei, ao meu querido esposo Cássio, por estar sempre presente em todos os momentos importantes, e aos meus filhos Eduarda e Augusto que enchem minha vida de alegria. AGRADECIMENTOS Primeiramente à Deus pela minha existência e capacidade de realizar os meus objetivos. Ao meu esposo Cássio e meus filhos Eduarda e Augusto pelo apoio, incentivo, compreensão, amor e paciência nos momentos desafiantes. Aos meus pais Jailson e Sirlei que lapidaram minha personalidade e me oferecem todo seu amor incondicional, assim como meus irmãos Clarissa e Juliano. À Universidade Federal do Paraná e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas pela oportunidade. À minha orientadora Profª Drª Marilis Dallarmi Miguel e co-orientador Prof. Dr. Obdulio Gomes Miguel pelos ensinamentos, paciência, confiança e amizade. Ao Botânico Gert Hatschbach e Biólogo Osmar do S. Ribas pelas informações, identificação e depósito do exemplar da espécie em estudo. Ao Sr. Eugênio e Srª Sara da Fazenda Água Azul de Quinta do Sol/PR pela coleta e envio do material vegetal. Ao Departamento de Química e Bioquímica da Universidade Federal do Paraná pelos espectros de ressonância magnética nuclear. À Professora Vera Lucia Lângaro Amaral e seu aluno Rafael Alonso Salvador, da Universidade do Vale do Itajaí, pela ajuda na realização dos experimentos com os animais. À todos os colegas de mestrado, doutorado e iniciação científica dos laboratórios de farmacotécnica e fitoquímica, pela amizade, companheirismo e auxílio nos experimentos. À todos os professores do programa e aqueles que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho. “A menos que modifiquemos a nossa maneira de pensar, não seremos capazes de resolver os problemas causados pela forma como nos acostumamos a ver o mundo”. (Albert Einstein) RESUMO O presente trabalho teve como objetivo, ampliar os conhecimentos a respeito da constituição química e atividades biológicas da espécie Tynanthus micranthus Corr. Mello ex Schum. (Bignoniaceae), além de verificar através de ensaios farmacológicos, a atividade afrodisíaca desta planta, conforme sua utilização popular. Após o preparo dos extratos brutos e frações: isolou-se por cromatografia em coluna da fração hexânica das folhas o Dotriacontane e verificou-se sua atividade imunológica através do ensaio com nitroazul de tetrazólio; avaliou-se a atividade hemolítica dos extratos brutos e frações frente hemácias de carneiro; analisou-se a atividade antioxidante das frações hidroalcoólicas remanescentes através de ensaios enzimáticos; e avaliou-se a influência do extrato bruto do caule e folhas sobre o comportamento sexual de camundongos machos adultos. A substância dotriacontane, identificada por Ressonância Magnética Nuclear, demonstrou ativar neutrófilos em todas as concentrações testadas. A fração hexânica do caule apresentou atividade hemolítica sobre hemácias de carneiro, resultado estatisticamente igual ao controle positivo. A fração hidroalcoólica das folhas protegeu os eritrócitos contra o estresse oxidativo, mantendo o nível das enzimas oxidativas em condições normais na análise antioxidante. Na avaliação da atividade afrodisíaca, os animais tratados com os extratos apresentaram uma diminuição sobre a latência de monta, aumento da frequência de monta e melhora na decisão de monta. Os resultados obtidos confirmam a importância em se aprofundar os estudos sobre esta espécie, pouco estudada, além de agregar indícios para a comprovação de sua utilização como planta afrodisíaca. Palavras chave: Cipó cravo, Atividade afrodisíaca, Dotriacontane, Atividade antioxidante, Atividade imunológica, Atividade hemolítica. ABSTRACT This work aimed to expand knowledge about the chemical constitution and biological activity of the species Tynanthus micranthus Corr. Mello ex Schum. (Bignoniaceae), and verify through pharmacological tests, the aphrodisiac activity of this plant, as its popular use. After preparation of the crude extracts and fractions: from the hexane extract of the leaves was isolated by column chromatography the dotriacontane, which was tested for its immune activity by testing with nitroblue tetrazolium; the hemolytic activity of extracts and fractions was evaluated against sheep erythrocytes; the antioxidant activity of the remaining hydroalcoholic fractions was analyzed by enzymatic assays; and it was evaluated the influence of the crude extract of the stem and leaves on the sexual behavior of adult male mice. The dotriacontane substance, identified by Nuclear Magnetic Resonance, demonstrated activate neutrophils at all concentrations tested. The hexane extract of the stem showed hemolytic activity on sheep erythrocytes statistically equal to the positive control. The hydroalcoholic fraction of leaves protected the erythrocytes against oxidative stress maintaining the level of oxidative enzymes normal in antioxidant analysis. In assessing the aphrodisiac activity, animals treated with the extracts showed a decrease on the latency of mounts, increased frequency of mounts and improvement at the decision of mount. The results confirm the importance of deepening the studies on this species, little studied, as well as adding evidence to corroborate its use as an aphrodisiac. Keywords: Clove vine, Aphrodisiac activity, Dotriacontane, Antioxidant activity, Immune activity, Hemolytic activity. LISTA DE ILUSTRAÇÕES FIGURA 1 - PERCENTAGENS DOS NÚMEROS DE OCORRÊNCIA DE METABÓLITOS ESPECIAIS ENCONTRADOS EM BIGNONIACEAE........................................................................ 22 FIGURA 2 - MAPA DA VEGETAÇÃO DO ESTADO DO PARANÁ............... 30 FIGURA 3 - VISTA DO LOCAL DA COLETA................................................ 31 FIGURA 4 - ASPECTO GERAL DAS FLORES DE ESPÉCIES DA FAMÍLIA BIGNONIACEAE........................................................ 32 FIGURA 5 - SISTEMA REPRODUTOR MASCULINO.................................. 33 FIGURA 6 - FISIOLOGIA NORMAL DA EREÇÃO........................................ 36 FIGURA 7 - BIOSSÍNTESE DA TESTOSTERONA....................................... 39 FIGURA 8 - ESTRUTURA QUÍMICA DO CITRATO DE SILDENAFIL (VIAGRA®)................................................................................. 42 FIGURA 9 - DEMONSTRAÇÃO ESQUEMÁTICA DO PLANEJAMENTO DO CITRATO DE SILDENAFIL................................................ 42 FIGURA 10 - RESULTADOS DA AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO SEXUAL MANTIDA POR HOMENS TRATADOS COM SILDENAFIL E PLACEBO.................................................................................. 43 FIGURA 11 - ESTRUTURAS QUÍMICAS DE CONHECIDAS SUBSTÂNCIAS COM EFEITO ADAPTÓGENO........................ 52 FIGURA 12 - FLUXOGRAMA DAS ETAPAS DO TRABALHO....................... 60 FIGURA 13 - IMAGEM DE SATÉLITE DO LOCAL DA COLETA.................... 61 FIGURA 14 - FOTOGRAFIA DA EXSICATA DE Tynanthus micranthus Corr. Mello ex Schum.......................................................................... 62 1 FIGURA 15 - ESPECTRO DE RMN H (CDCl3, 200 MHz) DO DOTRIACONTANE.................................................................... 76 FIGURA 16 - AMPLIAÇÃO DA REGIÃO ENTRE 0,85 – 2,2 ppm DO 1 ESPECTRO DE RMN H (CDCl3, 200 MHz) DO DOTRIACONTANE COM DETALHE DE CADA DESLOCAMENTO QUÍMICO.................................................... 76 FIGURA 17 - INTEGRAÇÕES DOS HIDROGÊNIOS DO ESPECTRO DE 1 RMN H (CDCl3, 200 MHz) DO DOTRIACONTANE, AMPLIADO NA REGIÃO ENTRE 0,85 – 2,2 ppm..................... 77 13 FIGURA 18 - ESPECTRO DE RMN C (CDCl3, 50 MHz) DO DOTRIACONTANE.................................................................... 78 FIGURA 19 - AMPLIAÇÃO DA REGIÃO ENTRE 12 - 34 ppm DO 13 ESPECTRO DE RMN C (CDCl3, 50 MHz) DO DOTRIACONTANE COM DETALHE DE CADA DESLOCAMENTO QUÍMICO.................................................... 78 FIGURA 20 - FÓRMULA ESTRUTURAL DE DOTRIACONTANE.................. 79 FIGURA 21 - FICHA DE ESPECIFICAÇÃO DO DOTRIACONTANE.............. 80 FIGURA 22 - IMAGENS DA ANÁLISE DE ATIVAÇÃO DE CÉLULAS DO SISTEMA IMUNOLÓGICO REALIZADO COM O DOTRIACONTANE ISOLADO DE Tynanthus micranthus........