Bakalářská Práce

Univerzita Palackého v Olomouci

Bakalářská práce

Olomouc 2014 Monika Grätzová Univerzita Palackého v Olomouci

Přírodovědecká fakulta

Katedra buněčné biologie a genetiky

Molekulární identifikace fytoplazem v alternativním hmyzím hostiteli: Javesella pellucida

Bakalářská práce

Monika Grätzová

Studijní program: Biologie Studijní obor: Molekulární a buněčná biologie Forma studia: Prezenční

Olomouc 2014 Vedoucí práce: Prof. RNDr. Milan Navrátil, CSc.

Prohlašuji, že jsem tuto bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením Prof. RNDr. Milana Navrátila, CSc. na Katedře buněčné biologie a genetiky PřF UP Olomouc a za použití literatury uvedené v závěru práce.

V Olomouci dne

Ráda bych poděkovala prof. RNDr. Milanu Navrátilovi, CSc. za jeho trpělivost, ochotu i čas, který mi při psaní mé bakalářské práce věnoval. Dále děkuji Mgr. Martinovi Starému a RNDr. Pavlu Lautererovi za sběr a identifikaci jedinců Javesella pellucida a Mgr. Daně Šafářové, Ph.D., RNDr. Pavle Válové a Janě Veselské za jejich pomoc, trpělivost a odborné rady při práci v laboratoři. Děkuji také Interní grantové agentuře Univerzity Palackého (IGA PrF_2013_002) za podporu. Souhrn

Fytoplazmy jsou bakteriální parazité rostlin. Osídlují rostlinný floém, kde narušují transport živin svého hostitele, což způsobuje celou řadu příznaků onemocnění, například chlorózu, proliferaci, virescenci, deformace a žloutnutí listů a barevné změny.

Jsou spojeny s mnoha onemocněními ekonomicky významných plodin, čímž výrazně snižují jejich výnosy. Rostliny jsou infikovány nejčastěji prostřednictvím hmyzích vektorů.

Cílem této práce bylo detekovat přítomnost fytoplazem v potenciálním hmyzím vektoru Javesella pellucida a tyto fytoplazmy následně identifikovat. Bylo analyzováno 163 vzorků ze třech lokalit, odchycených v průběhu tří let, metodami izolace DNA, PCR a RFLP.

Výsledky potvrdily přítomnost ´Candidatus Phytoplasma asteris´ (16SrI-C, 16SrI-F) a fytoplazmy stolburu.

Summary

Phytoplasmas are bacterial pathogens of plants. They colonize plant phloem where they disrupt the transport of nutrients, causing many symptoms of disease, like chlorosis, proliferation, virescence, leaf deformation and yellowing and color changes.

Phytoplasmas are associated with many diseases of economically important plants thus significantly reducing of yield. Plants are usually infected by insect vectors.

Objective of this thesis was to detect phytoplasmas in potential insect vector Javesella pellucida and identify them. 163 samples from three localities, cached during three years, were analyzed by methods of isolation of DNA, PCR and RFLP.

The results confirmed presence of ´Candidatus Phytoplasma asteris´ (16SrI-C, 16SrI-F) and stolbur phytoplasma.

Obsah

1. Úvod...... 8 2. Cíle práce...... 9 3. Literární přehled...... 10 3.1 Obecná charakteristika fytoplazem...... 10 3.2 Historie a objev ...... 10 3.3 Taxonomie a klasifikace...... 10 3.4 Genom a metabolismus ...... 11 3.5 Interakce s hostiteli...... 12 3.6 Javesella pellucida...... 14 3.7 Fytoplazma stolburu...... 16 3.8 Candidatus phytoplasma asteris...... 16 4. Materiál a metody...... 18 4.1 Meteriál...... 18 4.2 Metody...... 19 4.2.1 Izolace DNA...... 19 4.2.2 Nested PCR...... 19 4.2.2.1 Provedení nested PCR...... 20 4.2.3 Elektroforéza...... 21 4.2.4 RFLP...... 21 4.3 Vybavení laboratoře...... 22 4.3.1 Přístrojové vybavení a pomůcky...... 22

4.3.2 Použité chemikálie a roztoky...... 23

5. Výsledky ...... 24

6. Diskuze ...... 32 7. Závěr ...... 34 8. Seznam použitých zkratek...... 35 9. Seznam použité literatury...... 36 10. Přílohy...... 39

1. Úvod

Fytoplazmy jsou gram-pozitivní bakterie náležící do třídy Mollicutes. Jsou to kulovité, pleomorfní buňky bez buněčné stěny, obsahující ribozomy a DNA. Rozmnožují se pučením, přehrádečným dělením a fragmentací vláken, a to jak v rostlinách, tak ve hmyzích hostitelích. (Nečas et Krška, 2006). Jsou velmi významnými patogeny rostlin, včetně hospodářsky významných plodin, na nichž způsobují značné ekonomické ztráty. Jejich studium je ztíženo nemožností kultivace in vitro.

Parazitují intrabuněčně uvnitř floému, kde čerpají živiny a narušují tak přirozenou rovnováhu rostlinného hostitele, což způsobuje celou řadu příznaků, například chlorózu, proliferaci, virescenci, deformace a žloutnutí listů a barevné změny.

Jejich přenos je z velké části zprostředkováván hmyzími vektory, mezi něž patří především křísi, mery a ploštice. Jedním z potenciálních, avšak neprokázaných vektorů, vyskytujících se i na území České republiky, je ostruhovník průsvitný (Javesella pellucida). Jedinci tohoto druhu byli v průběhu třech let odchytáváni na třech lokalitách České republiky a byla v nich detekována přítomnost fytoplazem, které byly následně identifikovány. Použity byly metody izolace celkové DNA, polymerázové řetězové reakce (PCR) a délkového polymorfismu restrikčních fragmentů (RFLP).

2. Cíle práce

Cílem této bakalářské práce je:

1) Shromáždit literaturu a vypracovat literární rešerši týkající se charakteristiky rodu Phytoplasma a potenciálního hmyzího vektoru, Javesella pellucida.

2) Detekovat přítomnost fytoplazem v jedincích druhu Javesella pellucida a identifikovat je.

3) Zhodnotit význam potenciálního vektora pro šíření fytoplazem.

3. Literární přehled

3.1 Obecná charakteristika fytoplazem

Rod Phytoplasma, náležící do kmene Tenericutes, třídy Mollicutes, dříve nazýván také jako MLOs (z anglického mykoplasma-like organisms) (Doi et al., 1967). Je to ekonomicky významná skupina bakteriálních fytopatogenů přenášených hmyzem živícím se šťávami z floému (Seemüller et Schneider, 2004). Jde o prokaryotní, nehelikální gram-pozitivní bakterie s malým genomem, tvořeným 530 až 1350 kb (Marcone et al., 1999). Stejně jako ostatní Mollicutes nemají fytoplazmy pevnou buněčnou stěnu a jsou pleomorfní. Osídlují však endocelulárně pouze rostlinný floém (Oshima et al., 2004). Jsou pozorovatelné pod mikroskopem (Musetti et Favali, 2004) a detekovatelné pomocí imunochemických (Loi et al., 2002) a molekulárních metod. Způsobují onemocnění několika stovek druhů rostlin zahrnující ekonomicky významné plodiny (Marcone et al., 2004, McCoy et al., 1989).

3.2 Historie a objev

Poprvé byly pozorovány v 60. letech 20. století japonskými vědci (Doi et al., 1967) v lýku aster s příznaky žloutenky pomocí elektronového mikroskopu a popsány jako pleomorfní organismy bez buněčné stěny, morfologicky podobné mykoplazmám, známým patogenům živočichů včetně člověka. Díky této podobnosti byly nazvány MLOs, z anglického mycoplasma-like organisms, tedy organizmy mykoplazmám podobné, avšak nemožnost jejich kultivace způsobila obtíže v detailnější charakterizaci a dlouho bránila jejich definitivní klasifikaci. Nová éra výzkumu fytoplazem nastala se zavedením molekulárních metod založených na analýze DNA. DNA fytoplazem mohla být izolována, amplifikována za pomoci PCR metody a sekvenována. Fylogeneze a taxonomie fytoplazem byla přezkoumána pomocí RFLP analýzy ribozomální DNA, na jejímž základě byla postupně objasňována jejich genetická rozmanitost (Seemüller et al., 1998).

Mezinárodní komise systematické biologie (ICSB) v roce 1993 rozhodla, že označení „MLO“ bude nahrazeno synonymem „phytoplasma“. V roce 1994 Murray a Schleifer zavedli název „Candidatus Phytoplasma“ pro označení rodu rostlinných patogenů z řad fytoplazem (Seemüller et al., 1998).

3.3 Taxonomie a klasifikace

Ačkoli se zatím nepodařilo fytoplazmy kultivovat in vitro, fylogenetické rozbory založené na analýze konzervovaných genů ukázaly, že reprezentují samostatný monofyletický klád v rámci třídy Mollicutes (IRPCM, 2004).

Podle kritérií ICSB by měly bakterie stejného druhu vykazovat alespoň 70% homologie celkové DNA. Homologie celkové DNA u fytoplazem je však obtížné určit, a proto jsou fytoplazmy klasifikovány na základě 16S rDNA. Bohužel však zatím nebyla nalezena jasná korelace mezi sekvenční homologií 16S rDNA a celého genomu a není známa žádná úroveň podobnosti 16S rDNA pro definování druhu. Většina druhů stejného rodu se však liší v sekvenci 16S rDNA o nejméně 1,5 % , obvykle více (Seemüller et al., 1998).

Ve fylogenezi, taxonomii a identifikaci druhů rodu Mycoplasma je velký význam kladen na 16S rDNA sekvence, což vedlo k jejich zahrnutí ve všech popisech nových druhů Mollicutes. V rámci rodu Candidatus phytoplasma může být popsán nový druh, pokud jeho 16S rDNA sekvence vykazuje méně než 97,5 % podobnost s jakýmkoli dříve popsaným druhem (Marcone et al., 2004). Existují však i případy, kdy je podobnost mezi druhy vyšší. Tehdy jde o odlišné druhy, pokud jsou přenášeny jinými vektory, mají jiné rostlinné hostitele (případně stejné, avšak jejich projevy jsou odlišné) nebo vykazují molekulární diverzitu prokázanou jinými způsoby, například hybridizací DNA sond (IRPCM, 2004). Jejich konečné rozčlenění však velmi komplikoval fakt, že fytoplazmy není možné kultivovat in vitro (Oshima et al., 2004).

V roce 1993 Lee et al. testovali 40 izolátů MLOs, pocházejících ze severní Ameriky, Asie a Evropy, RFLP analýzou 16S rDNA. Tyto vzorky následně klasifikovali do 9 skupin a 14 podskupin.

První rozsáhlejší schéma klasifikace fytoplazem bylo založeno na RFLP analýze 16S rDNA amplifikované pomocí PCR (Bertaccini et Duduk, 2009), kdy bylo 34 kmenů fytoplazem s použitím 17 restrikčních endonukleáz rozděleno do 14 hlavních skupin a 32 podskupin. Na základě dostupných dat o 16S rDNA sekvenci byl počet podskupin rozšířen na 41 a kombinací RFLP analýz 16S rRNA a sekvenování ribozomálního proteinů bylo nakonec rozpoznáno 46 podskupin (Lee et al. 1998).

V roce 2007 (Wei et al.) bylo za pomocí virtuální RFLP analýzy rozpoznáno celkem 28 skupin fytoplazem.

Přehled fylogenetických skupin fytoplazem podle IRPCM z roku 2004 je uveden v tabulce č. 9 v příloze.

3.4 Genom a metabolismus

První kompletně sekvenovaný genom bakteriálního patogenu rostlin osídlujícího floém, byl genom Candidatus Phytoplasma asteris, linie OY-M. Skládá se z jednoho chromozomu o 860 631 bp. Chromozom představuje kruhová molekula DNA s 28% obsahem G+C bazí. Obsahuje celkem 754 otevřených čtecích rámců, které zaujímají 73 % chromozomu (Oshima et al., 2004). Celkem bylo zatím sekvenováno 10 fytoplazem, a to Candidatus

Phytoplasma australiense, Aster yellows witches' -broom phytoplasma, Peanut witches'- broom phytoplasma, Onion yellows phytoplasma, Maize bushy stunt phytoplasma, Candidatus Phytoplasma mali, Beet leafhopper transmitted virescence phytoplasma, Candidatus Phytoplasma solani, Candidatus Phytoplasma asteris a Wheat blue dwarf phytoplasma (NCBI).

Rod Candidatus Phytoplasma také obsahuje jedinečnou sekvenci genu 16S rRNA - CAAGAYBATKATGTKTAGCYGGDCT a funkci stop kodonu má sekvence UGA. (Navrátil et al., 2008; IRPCM, 2004)

Stejně jako chromozom mykoplazem postrádá chromozom fytoplazem mnoho genů souvisejících s biosyntézou aminokyselin a mastných kyselin, cyklem trikarboxylových kyselin a s oxidativní fosforylací. Narozdíl od mykoplazem ale navíc postrádá i geny pro fosfotransferázový systém a metabolismus UDP-glukózy. Fytoplazmy mají tedy jedinečný metabolismus a systém přijmu cukrů. Nemají také většinu genů nezbytných pro syntézu nukleotidů.

Fytoplazmy osidlují cytoplazmu velmi bohatou na živiny, což nejspíš zpětně vedlo ke ztrátě mnoha genů a většinu metabolitů, které nedokáží syntetizovat, absorbují z hostitelské buňky. Genom fytoplazem ale kóduje geny pro syntézu kyseliny listové, která fytoplazmám pomáhá k adaptaci ve velmi odlišném prostředí rostlin a hmyzu, které osidlují.

Analýza genomu fytoplazem vedla k identifikaci glukanázy a proteinů podobných hemolysinu jako možných faktorů virulence. Ačkoli genom neobsahuje mnoho genů pro metabolismus, bylo nalezeno 27 genů kódujících transportní systémy, například pro malát, ionty kovů a aminokyseliny, což naznačuje schopnost čerpat metabolity z hostitelské buňky, čímž výrazně narušují metabolickou rovnováhu hostitelského organismu. To ve výsledku vede k příznakům onemocnění (Oshima et al., 2004).

3.5 Interakce s hostiteli

Šíření fytoplazem je nejčastěji uskutečňováno prostřednictvím hmyzích vektorů. Nejběžnějšími vektory jsou zástupci řádu Hemiptera (polokřídlí), rodů Cicadellidae (křísovití), Cixiidae (žilnatkovití), Psyllidae (merovití), Cercopidae (pěnodějkovití), Delphacidae (ostruhovníkovití), Derbidae, Menoplidae (měsíčníkovití) a Flatidae. Například z rodu Cicadellidae je 88 druhů schopno přenosu fytoplazem.

Jsou známy dva způsoby přenosu, trans-stage u většiny fytoplazem a transovarialní, známý pouze u několika z nich. Interakce mezi hmyzím vektorem a fytoplazmou bývá buď úzce specifická, nebo naopak jeden druh hmyzu může být přenašečem hned několika druhů fytoplazem a jeden druh fytoplazmy šířen více druhy hmyzu (Rojas-Martínez, 2009).

Fytoplazmy mohou přezimovat uvnitř hmyzích vektorů nebo ve vytrvalých rostlinách (Bertaccini et Duduk, 2009). Jsou známy případy snížení i zvýšení fitness infikovaného vektora (Christensen et al., 2005), fytoplazmy však na svého hmyzího hostitele žádný vliv mít nemusí. Mohou napadat různé orgány a tkáně v těle svého hostitele - slinné žlázy, střeva, hemolymfu, pohlavní orgány a další, v rostlinách však napadají pouze floém (Rojas-Martínez, 2009).

Do těla vektora se fytoplazma dostává jeho ústním ústrojím při nasátí šťáv z napadené rostliny a putují do jeho trávícího traktu, kde jsou vstřebávány do hemolymfy. Následně až několik týdnů kolonizují slinné žlázy hostitele. Období mezi vstupem do vektora a dosažením koncentrace schopné nakazit rostlinu, označujeme jako latentní období (Bertaccini et Duduk, 2009).

Ukázalo se, že většinu povrchových proteinů fytoplazem tvoří velký antigenní protein, který interaguje s mikrofilamenty střevních svalů hmyzu. Předpokládá se, že je tento protein pro přenos a infekci velmi důležitý (Suzuki et al., 2006)

K přenosu z vektoru do rostliny se musí fytoplazmy namnožit ve slinných žlázách hmyzu do dostatečně vysoké koncentrace. Poté mohou být vypuštěny spolu se slinami hmyzu do nové rostliny. Cyklus přenosu fytoplazem závisí na jejich životním cyklu a stravovacích návycích jejich hmyzích vektorů. Polyfágní vektoři mohou inokulovat velké množství druhů rostlin v závislosti na jejich rezistenci.

Mezi faktory ovlivňující přenos patří druh, pohlaví a věk hmyzího vektora, druh fytoplazmy a její schopnost interakce s vektorem a přizpůsobivost vůči prostředí (Rojas-Martínez, 2009).

Další možností přenosu fytoplazem je vegetativní rozmnožování, jako například roubování, řízkování a mikropropagace (Bertaccini et Duduk, 2009).

Symptomy napadení fytoplazmou jsou odrazem hormonální nerovnováhy a změn v translokaci uhlovodíků a aminokyselin v rostlině, infekce však nemusí vykazovat symptomy pouze v napadených tkáních. Některé studie dokázaly nerovnoměrnou distribuci fytoplazem v hostitelských rostlinách a sezónní výkyvy koncentrace patogenů u dřevin (Bertaccini et Duduk, 2009). Obecně bývá nejvyšší koncentrace ve zdrojových orgánech (listy), nižší ve stoncích a nízká v kořenech. U listnatých dřevin pravděpodobně přezimuje v kořenech a na jaře opět kolonizuje nadzemní části rostliny.

Onemocnění je charakteristické malformacemi a barevnými změnami květů, růstovými deformacemi, žloutnutím a sterilitou, obecně označované jako žloutenka (Seemüller et al., 1998). Mezi typické příznaky dále patří špatný vývoj, fylodie (přeměna květů na podobu listů), virescence (výskyt zeleného zbarvení u běžně nezelených částí květů), prodlužování stonků, červenání listů a stonků, žloutnutí, zakrnění rostlin a nekróza floému (Hogenhout et al., 2008). Projevy onemocnění závisejí na druhu fytoplazmy

13 a toleranci nebo naopak náchylnosti dané rostliny. U hmyzích vektorů se napadení zřídka projevuje smrtí jedince, protože fytoplazmy obvykle nesnižují fitness svého hlavního vektora.

Riziko snížených výnosů hospodářsky významných plodin je možné snížit vysazováním resistentních odrůd a aplikací postřiků proti hmyzím vektorům (Lee et al., 2002). Dále je možné využití tkáňových kultur k ozdravení rostlin s využitím křížové ochrany, tedy vysazování rostlin infikovaných nepatogenním kmenem fytoplazmy, který je chrání před infekcí vysoce patogenními kmeny.Tetracykliny a bakteriostatika inhibují růst fytoplazem (Davies et al., 1968).

3.7 Javesella pellucida

Javesella Pellucida, česky ostruhovník průsvitný, patří do řádu Hemiptera (polokřídlí) a čeledi Delphacidae (ostruhovníkovití) (NCBI). Tento druh byl zvláště v Evropě důkladně studován jako vektor mnoha rostlinných patogenů. V rámci rodu Javesella je v Evropě J. pellucida jeho nejrozšířenějším druhem (Brčák, 1979).

Vyskytuje se ve formě makropterní (viz obr. č. 1 a 2) a brachypterní (viz obr. 3 a 4). Dospělci jsou štíhlí, asi 4 mm dlouzí, charakterističtí průsvitnými předními křídly s černou žilnatinou, obvykle slabě nahnědlými nebo bělavými, samci bývají mnohem tmavší než samice. Na konci zadních holení mají ostruhovitý trn.

Obr. č. 1: Makropterní dospělá samice Obr. č. 2: Makropterní dospělý samec Javesella pellucida (převzato z www.britishbugs.org) Javesella pellucida (www.britishbugs.org)

Obr. č. 3: Brachypterní dospělá samice Obr. č. 4: Brachypterní dospělý samec Javesella pellucida (převzato z www.britishbugs.org) Javesella pellucida (www.britishbugs.org)

Jde o polyfágního živočicha vyskytujícího se na široké škále rostlin, například Elymus (pýrovník), Dactylis (srha), Poa (lipnice), Deschampsia (metlice), Agrostis (psineček), Lolium (jílek), Calamagrostis (třtina), Phleum (bojínek) a další, méně často na Carex (ostřice) a Equisetum (přeslička). Nejvhodnější jsou pro něj vlhké podmínky (Brčák, 1979).

Vyskytuje se od jara až do podzimu v travinách, na nichž se larvy i dospělci živí. Přezimuje ve stádiu nymfy, dospělci se objevují od začátku května. Za rok se vyvine jedna až dvě generace v závislosti na podmínkách, v teplejších oblastech, jako je Francie a Německo se vyvíjí obvykle dvě generace, v chladnějších, jako například Velká Británie, Česká republika nebo Skandinávie pouze jedna generace ročně. Maximální populace dosahuje první generace koncem května, druhá koncem července a začátkem srpna (Brčák, 1979).

Tento druh je běžně rozšířen v USA, Kanadě, severní Evropě a na Islandu, severní Africe, ve východním Mongolsku a Japonsku, byl nalezen i na Aljašce a na Kubě. Například v Polsku představuje J. pellucida 3 - 12 % celkové fauny křísů na obilninách a 1 - 18 % v travinách (Brčák, 1979).

Jsou známými vektory mnoha virových onemocnění rostlin včetně hospodářsky významných plodin, přenášejí například sterilní zakrslost ovsa (OSDV - oat sterile dwarf virus), drsnou zakrslost kukuřice (MRDV - maize rough dwarf virus) a evropskou proužkovitost pšenice (EWSV - european wheat strate mosaic virus). Byla u nich prokázána

15 přítomnost fytoplazem AY-C a AY-F (Orságová et al., 2011) a tudíž jsou i potenciálními vektory fytoplazem, jejich schopnost infikovat rostlinu však zatím nebyla dokázána.

3.9 Fytoplazma stolburu

Fytoplazma stolburu (16SrXII), nebo také Potato stolbur phytoplasma, Grapevine bois noir phytoplasma, VK grapevine yellows phytoplasma, Black wood of grapevine, Stolbur of tomato a Stolbur of tabaco, je významný rostlinný patogen rozšířený především v Evropě a v Asii (Růžička, 2008), kde napadá řadu zemědělských plodin.

Pravděpodobně nejvýznamněji ovlivňuje pěstování vinné révy (Vitis vinifera L.), na níž způsobuje závažné onemocnění zvané bois noir (BN), které významně snižuje výnosy především evropských vinic (Credi et al., 2006). Mezi další napadané rostliny patří Solanum tuberosum (brambor), Lycopersicon esculentum (rajče), Capsicum annuum (paprika) a Solanum melongena (lilek vejcoplodý). Dále například Trifolium spp. (jetel), Convolvulus arvensis (svlačec rolní), Urtica dioica (kopřiva dvoudomá) a mnoho dalších (Růžička, 2009; Credi et al., 2006).

Hlavním hmyzím vektorem je Hyalesthes obsoletus. Mezi další známé vektory patří Macrosteles laevis, Aphrodes bicinctus, Euscelis obsuletus, Macrosteles quadripunctulatus nebo například Anaceratagalia ribauti (Riedle-Bauer et al., 2006). U řady dalších zástupců hmyzu je schopnost přenosu předpokládaná, avšak nejsou potvrzenými vektory.

Mezi projevy tohoto onemocnění rostlin patří jejich zakrsnutí, chlorózy, malformace listů, zmenšení listů a jejich žloutnutí, červenání a nekróza (Credi et al., 2006). U vinné révy (Vitis vinifera L.) se mohou příznaky projevit na celém keři nebo pouze na některých výhonech či jejich částech. Mezi příznaky patří svinutí listů, chloróza, nekróza a změna zbarvení listů. Ta je odlišná na modrých odrůdách vína, kde jsou listy červené, a bílých odrůdách, kde se stolbur projevuje žlutozeleným zbarvením. Příznaky se liší v závislosti na fázi infekce a toleranci druhu rostliny (Lee et al., 2000), případně na teplotě, vlhkosti a dalších faktorech (Riedle-Bauer et al., 2006).

3.10 Candidatus Phytoplasma asteris

Fytoplazma žloutenky aster (AY z ang. aster yellows) je skupinou fytoplazem (16SrI) spojovanou s více než 100 ekonomicky významnými onemocněními rostlin po celém světě. Jde o nejrozšířenější skupinu fytoplazem vyznačující se vysokou diverzitou (Lee et Davis, 2000). Kmeny náležící do AY skupiny vytváří oddělenou podskupinu fytoplazem a podle analýz 16S rDNA jsou nejblíže příbuzné fytoplazmě stolburu (Lee et al., 1998). V rámci

16 skupiny AY bylo objeveno 6 fylogenetických linií, a to 16SrI-A, 16SrI-C, 16SrI-E, 16SrI-F, 16SrI- K a 16SrI-O a jedna linie zahrnující skupiny 16SrI-B, 16SrI-D, 16SrI-L, 16SrI-M a 16SrI-N (Lee et al., 2004).

Kmeny náležící do podskupin 16SrI-A, 16SrI-B a 16SrI-C jsou rozšířeny celosvětově, napadají více než 80 druhů rostlin a jsou přenášeny více než 30 druhy hmyzích vektorů (Brčák, 1979). Podskupiny 16SrI-L a 16SrI-M jsou rozšířeny v Evropě a 16SrI-D v Asii. Mezi hlavní vektory AY fytoplazem patří křískovití, Macrosteles spp., Euscelis spp., Scaphytopius spp. a Aphrodes spp. (Brčák, 1979). Další skupiny mají úzký rozsah rostlinných i hmyzích hostitelů a nacházejí se pouze na některých lokalitách. Mezi napadané rostliny patří například kukuřice, cibule, mečíky, oves, pšenice a trávy (Lee et al., 2004).

Symptomy onemocnění se mohou lišit v závislosti na konkrétní podskupině. Typické symptomy AY náležících do podskupin 16SrI-A a 16SrI-B zahrnují virescenci a fylodii, barevné změny a deformace květů, žloutnutí a vzpřimování listů, prodlužování a etiolace internodií, nadměrné větvení axilárních výhonů, zakrslost a obecná deformace růstu rostlin. Infikované rostliny mohou vykazovat pouze některé z těchto příznaků. Symptomy související s podskupinou 16SrI-C jsou virecence a fylodie bez proliferace výhonů. Mezi projevy dalších AY patří deformace, zmenšování listů a květů, zkrácení internodií, deformace a kroucení listů, změny zbarvení květů a další příznaky typické pro infekci AY, u mírnějších druhů žloutenek nemusí infikované rostliny vykazovat žádné příznaky (Lee et al., 2004).

4. Materiál a metody

4.1 Materiál:

Experimenty byly prováděny na předem odchycených a identifikovaných jedincích druhu Javesella Pellucida uchovaných v 96% ethanolu při teplotě -80°C. Hmyz byl odchycen na různých lokalitách České republiky (Lednice, Perná a Březí) Mgr. Martinem Starým a identifikovány dr. Pavlem Lautererem. Odchyt probíhal v letech 2010, 2011 a 2012. Celkem bylo odchyceno 163 kusů hmyzu, 98 samců a 65 samic, u nichž byla provedena izolace DNA a následně experimenty pro detekci fytoplazem. Celkem 44 kusů bylo testováno mnou. Přehled testovaných jedinců v jednotlivých datech a lokalitách odchytu je zobrazen v tabulce č. 1.

Tabulka č. 1: Přehled odchycených a izolovaných jedinců Javesella pellucida Druh Datum sběru Izolováno Lokalita ♂ ♀ Javesella pellucida 8.7.2010 3 3 Březí Javesella pellucida 8.7.2010 2 0 Lednice, kravín Javesella pellucida 8.7.2010 10 6 Perná, Convolvulus Javesella pellucida 8.7.2010 1 3 Perná, Urtica Javesella pellucida 13.7.2010 3 0 Březí Javesella pellucida 13.7.2010 0 5 Lednice, kravín Javesella pellucida 13.7.2010 24 8 Perná Javesella pellucida 28.7.2010 1 1 Březí Javesella pellucida 28.7.2010 0 1 Lednice, kravín Javesella pellucida 28.7.2010 3 1 Perná, Urtica, Convolvulus Javesella pellucida 12.8.2010 4 1 Perná Javesella pellucida 29.6.2011 0 1 Lednice, kravín, smýkání Javesella pellucida 29.6.2011 0 2 Lednice, kravín, vysavač Javesella pellucida 29.6.2011 1 1 Lednice, příkopy u silnice Javesella pellucida 29.6.2011 0 1 Perná, podrost vinic, vysavač Javesella pellucida 8.7.2011 21 18 Lednice, kravín, vysavač Javesella pellucida 8.7.2011 13 0 Perná, kopřivy, smýkání Javesella pellucida 8.7.2011 10 9 Perná, vysavač Javesella pellucida 17.7.2011 1 1 Lednice, kravín Javesella pellucida 29.7.2011 0 1 Lednice, kravín Javesella pellucida 4.7.2012 0 2 Lednice, kravín Javesella pellucida 4.7.2012 0 0 Lednice-kravín, kopřiva Javesella pellucida 4.7.2012 1 0 Perná, Convolvulus, vysavač

4.2 Metody

4.2.1 Izolace DNA

K izolaci celkové DNA byla použita komerčně dostupná souprava Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega).

Každý kus hmyzu byl rozetřen pomocí plastového homogenizátoru v 1,5ml mikrozkumavce ve 200 µl lyzačního pufru Nuclei lysis solution. Získaný lyzát byl 15 minut inkubován při 65 °C a poté ponechán 5 minut při pokojové teplotě. K lyzátu byly přidány 3 µl RNase solution, mikrozkumavka byla obrácením promíchána, krátce centrifugována a ponechána 5 minut při pokojové teplotě. Následně byla směs 15 minut inkubována při 37 °C. Poté bylo přidáno 67 µl srážecího pufru Protein precipitation solution a směs byla 20 sekund vortexována při 1600 rpm. Mikrozkumavky byly 5 minut chlazeny na ledu a následně 4 minuty centrifugovány při 13 000 g. Vysrážené proteiny vytvořily bílý pelet na hladině.

Do stojanu na mikrozkumavky byly připraveny čisté 1,5ml mikrozkumavky s 200 µl isopropanolu. Do nich byl opatrně přenesen supernatant obsahující DNA tak, aby nedošlo k nasátí proteinového peletu. Obsah byl opatrně promíchán převrácením mikrozkumavek (5x) a umístěn na noc do -20°C.

Následující den byly mikrozkumavky centrifugovány 1 minutu při 13 000 g v pokojové teplotě. Vysrážená DNA vytvořila pelet na dně. Supernatant byl opatrně odstraněn vylitím. K DNA bylo přidáno 200 µl 70% ethanolu a převrácením mikrozkumavky byl pelet opláchnut. Obsah byl 1 minutu centrifugován při 13000 g v pokojové teplotě, ethanol byl vylit a mikrozkumavky s peletem DNA byly otřeny o filtrační papír a umístěny do vakuové odparky, kde došlo k jejich vysoušení při 45°C po dobu 30 minut. Po vysušení byl sediment rozpuštěn ve 30 µl pufru Rehydration solution 10 minut na třepačce při 65°C (speed 300). Takto upravené vzorky byly uchovávány při -20°C a následně použity pro další analýzy.

Na přístroji NanoDrop1000 byla spektrofotometricky změřena koncentrace a čistota vyizolované DNA.

4.2.2 Nested PCR

Přítomnost fytoplazem ve vzorcích byla detekována pomocí dvoufázové nested PCR amplifikace 16S rRNA genu. Tato metoda využívá dvou polymerázových řetězových reakcí, kdy je produkt první PCR použit jako templát v druhé PCR reakci. Při první PCR reakci s použitím prvního páru primerů dojde k namnožení delšího úseku DNA, následná PCR s použitím druhého páru primerů vede k namnožení vnitřního úseku DNA a tedy kratší sekvence.

Výhodou tohoto postupu je možnost amplifikovat DNA o velmi nízké koncentraci, vysoká výtěžnost a specifita, nevýhodou je vysoké riziko kontaminací častou manipulací.

4.2.2.1 Provedení Nested PCR

Podle rozpisu (tabulka č. 2) byla připravena reakční směs s prvním párem primerů P1/P7 pro odpovídající počet vzorků. Všechny kroky bylo nutné provádět ve sterilním laminárním boxu.

Tabulka č. 2: Složení reakční směsi pro nested PCR

Koncentrace Položka Konečná koncentrace Objem na 1 test pracovního roztoku Pufr 5x 1x 5,00 µl Voda 17,30 µl f primer 20 pmol/µl 0,2 µM 0,25 µl r primer 20 pmol/µl 0,2 µM 0,25 µl Taq polymeráza 5 U/ µl 1 U/reakce 0,20 µl

Do bloku chlazeného na ledu byl umístěn odpovídající počet mikrozkumavek pro PCR a jedna mikrozkumavka pro negativní kontrolu. Do všech bylo přeneseno 23 µl předem připravené reakční směsi a 2 µl vzorků (kromě negativní kontroly). Mikrozkumavky byly krátce zcentrifugovány, zvortexovány, opět zcentrifugovány a umístěny do termocycleru, kde byl nastaven program FLO pro primery P1/P7 (tabulka č. 3).

Tabulka č. 3: Podmínky nested PCR

Cyklus Teplota (°C) Čas (minuty) P1/P7 F2/R2 P1/P7 F2/R2 1 95 95 2 2 2 95 95 1 1 3 55 50 1 1 35 cyklů 4 72 72 3 1 5 72 72 10 10

Poté byly produkty PCR 40x naředěny a použity pro druhou PCR za použití primerů F2/R2 (tab. č. 3). Po dokončení druhé PCR reakce byly vzorky vyhodnoceny na horizontální elektroforéze v agarózovém gelu.

Použité primery pro 16S rDNA:

Sekvence primerů P1/P7 P1 (5´-AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT- 3´) (Deng et Hiruki, 1991) P7 (5´-CGTCCTTCATCGGCTCTT- 3´) (Schneider et al.,1995)

Sekvence primerů F2/R2 F2 (5´-GAAACGACTGCTAAGACTGG- 3´) (Gundersen et Lee, 1996) R2 (5´-TGACGGGCGGTGTGTGACAAACCCCG- 3´) (Lee et al., 1993)

4.2.3 Elektroforéza

Po dokončení PCR reakce byly vzorky vyhodnoceny pomocí horizontální elektroforézy na 1% agarózovém gelu, do něhož byly po rozvaření v TAE pufru (1x) a ochlazení na přibližně 65°C přidány 3 µl fluorescenčního barviva Good View (GVII) na 50 ml agarózy. Gel byl nalit do připravené horizontální elektroforetické vaničky s hřebínky, kde při pokojové teplotě ztuhnul. Po ztuhnutí byly hřebínky odstraněny a gel byl přelit TAE pufrem (1x) po vyznačenou rysku.

Do první jamky byl nanesen marker molekulové hmotnosti Gene Ruler ™ 100bp Plus DNA Ladder, Fermentas, do dalších jamek 3 µl vzorku s 2 µl 0,1% bromfenolové modře rozpuštěné v 30% glycerinu.

Produkty byly separovány přibližně 45 minut pod napětím 80 V. Gel byl následně vyhodnocen pomocí UV transluminátoru (G:box, Syngene) napojeného na program GeneSnap v PC, v němž byl zdokumentován.

4.2.4 RFLP

Produkty PCR reakce s primery F2/R2 byly štípány pomocí restrikčních endonukleáz MseI a RsaI a analyzovány na 2,5% metagaróze v TBE pufru s přídavkem 3,5 µl barviva Gel red na 50 ml gelu. Do celkového objemu reakce 13 µl bylo přidáno 8 µl rekční směsi připravené podle tabulky č. 4 a 5 µl vzorku. Do první jamky byl nanesen marker molekulové hmotnosti Gene Ruler ™ 100bp DNA Ladder, ready-to use, Fermentas, do poslední vzorek obsahující DNA fytoplazmy stolburu, jejíž přítomnost byla předpokládána, pro přirovnání.

Vzorky byly do gelu pipetovány s přídavkem 2,5 µl bromfenolové modře, objem byl určen podle síly zóny z první elektroforézy. Vzorků se silnou zónou byly použity 3 µl, s méně silnými 4 µl, slabými 6 µl a velmi slabými 10 µl. Elektroforéza probíhala přibližně hodinu pod napětím 60 V.

Tabulka č. 4: Složení reakční směsi pro RFLP analýzu

Položka Objem na 1 test

Pufr (TBE) 1,3 µl Voda 5,2 µl BSA 1,3 µl RE 0,2 µl

4.3 Vybavení laboratoře

4.3.1 Přístrojové vybavení a pomůcky

 Elektroforetická komůrka (Fisherbrand)

 Kovový chladící blok (Corbett Research)

 Laminární box PV-100 (Telstar)

 Latexové rukavice

 Mikrovlnná trouba (OTF)

 Minicentrifuga E-Centrifuge (Wealtec)

 Minicentrifuga Spectrafuge™ 24D Digital Microcentrifuge (Labnet)

 Nanodrop 1000 (Thermo Scientific)

 Pipety

 Plastové homogenizátory

 Plastové mikrozkumavky 1,5 ml

 Skleněné kádinky

 Sterilní jednorázové plastové špičky

 Sušička Thermo Savant SpeedVac® (Thermo Scientific)

 Teplotní lázeň mixing block MB-102 (Bioer)

 Termoblok Dri-block® DB-20 (Techne)

 Termocyklér T-Personal (Biometra)

 UV transluminátor G: Box, dokumentační systém Syngene (Herolab)

 Váhy AND EK-200G, A&D Co. Ltd.

 Vortex MS1 Minishaker IKA (Profilab)

 Zdroj stejnosměrného proudu Power Pack P 25 (Biometra)

4.3.2 Použité chemikálie a roztoky

 0,1% bromfenolová modř v 30% glycerínu (Promega)

 70% etanol

 96% etanol

 Agarose for DNA electrophoresis (Serva)

 Gel RedTM Nucleic Acid Gel Stain (Biotium)

 Gene RulerTM 100 bp plus DNA Ladder (Fermentas)

 GoodView TM Nucleic Acid Stain (SBS Genetech)

 Isopropanol

 Methaphor® Agarose (Lonza)

 MyTaqTM DNA Polymerase (Bioline)

 Restrikční endonukleázy MseI a RsaI

 Sterilní voda

 TAE pufr 1x – pracovní roztok: 40 mmol/l Tris-acetát, 2 mmol/l EDTA

 TAE pufr 50x - zásobní roztok: 242 g Tris base, 57,1 ml ledová kyselina octová, 37,2 g

Na2EDTA . 2H2O (doplněno H2O na 1000 ml a pH upraveno na 8,5)

 TBE pufr 10x - zásobní roztok: 108 g Tris base, 55 g kyseliny borité, 40 ml 0,5 mol/l

EDTA (doplněno H2O na 1000 ml a pH upraveno na 8)

 TBE pufr 1x - pracovní roztok: 89 mmol/l Tris base, 89 mmol/l kyselina boritá,

2 mmol/l EDTA

 Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega)

5. Výsledky

Po provedení izolace celkové DNA byla na spektrofotometru NanoDrop1000 zjištěna koncentrace a čistota vyizolované DNA. Koncentrace mnou izolované DNA se pohybovala v rozmezí 8,7 až 248,3 ng/µl a její čistota vyjádřena A260/280 se pohybovala v rozmezí 1,45 až 2,10. Kompletní přehled hodnot jednotlivých měření je uveden v tab. č. 10 v příloze.

Po provedení nested PCR reakce, separaci produktů na gelu prostřednictvím horizontální elektroforézy a jejich vizualizaci pomocí transluminátoru (obr č. 5), byl u 41 jedinců z celkového počtu 163 kusů detekován PCR produkt o velikosti 1200 bp, a to u 17 samců a 24 samic (viz tab. č. 6). Pozitivní PCR tedy vyšla u 25,15 % jedinců, u samců 17,35 % a u samic 36,92 % (tabulky č. 5 a 6).

Obr. č. 5: Detekce fytoplazem pomocí nested PCR (primery F2/R2)

1000 bp

500 bp

M - Gene Ruler ™ 100bp Plus DNA Ladder, Fermentas 1-6 - vzorky (série 439/1-6) 2,6 - pozitivní jedinci N - negativní kontrola

U vzorků s viditelným PCR produktem byla dále provedena restrikční analýza pomocí restrikčních endonukleáz MseI a RsaI a vyhodnocena gelovou elektroforézou v UV transluminátoru (obr č. 6). Výsledné profily byly porovnány se známými profily specifických fytoplazem. Na základě tohoto porovnání byla u 6 kusů zjištěna AY-C, u 8 kusů AY-F, u 4 kusů STOL, u 1 kusu byla přítomnost fytoplazmy vyvrácena a u ostatních byly profily nespecifické a musely být dále analyzovány sekvencováním, což však není součástí této bakalářské práce.

Obr. č. 6: RFLP profily nested PCR produktů

MseI

RsaI

M - Gene Ruler ™ 100bp DNA Ladder, ready-to use, Fermentas 1-6 - vzorky (série 417/2,5,6,11, 12 a série 421/19), nespecifické profily STOL - fytoplazma stolburu

Tabulka č. 5: Výsledky detekce fytoplazem pomocí PCR v jednotlivých lokalitách

Datum Druh Lokalita Pozitivní Negativní sběru ♂ ♀ ♂ ♀ Javesella pellucida 8.7.2010 Březí 2 3 1 0 Javesella pellucida 8.7.2010 Lednice, kravín 0 0 2 0 Javesella pellucida 8.7.2010 Perná, Convolvulus 2 1 8 5 Javesella pellucida 8.7.2010 Perná, Urtica 0 1 0 3 Javesella pellucida 13.7.2010 Březí 0 0 3 0 Javesella pellucida 13.7.2010 Lednice, kravín 0 1 4 0 Javesella pellucida 13.7.2010 Perná 2 1 22 7 Javesella pellucida 28.7.2010 Březí 0 0 1 1 Javesella pellucida 28.7.2010 Lednice, kravín 0 1 0 0 Javesella pellucida 28.7.2010 Perná, Convolvulus,Urtica 0 0 3 1 Javesella pellucida 12.8.2010 Perná 0 0 4 1 Javesella pellucida 29.6.2011 Lednice, kravín, smýkání 0 1 0 0 Javesella pellucida 29.6.2011 Lednice, kravín, vysavač 0 1 0 1 Javesella pellucida 29.6.2011 Lednice, příkopy u silnice 1 1 0 0 Javesella pellucida 29.6.2011 Perná, podrost vinic, vysavač 0 0 0 1 Javesella pellucida 8.7.2011 Lednice, kravín, vysavač 1 12 20 6 Javesella pellucida 8.7.2011 Perná, kopřivy, smýkání 6 0 7 0 Javesella pellucida 8.7.2011 Perná, vysavač 3 0 7 9 Javesella pellucida 17.7.2011 Lednice, kravín 0 0 1 1 Javesella pellucida 29.7.2011 Lednice, kravín 0 0 0 1 Javesella pellucida 4.7.2012 Lednice, kravín 0 1 0 1 Javesella pellucida 4.7.2012 Lednice-kravín, kopřiva 0 0 0 0 Javesella pellucida 4.7.2012 Perná, Convolvulus, vysavač 0 0 0 1

Tabulka č. 6: Celkové výsledky detekce fytoplazem

Analyzováno Pozitivní PCR Prokázaná fytoplazma ♂ ♀ ♂ ♀ ♂ ♀ 98 65 17 24 10 8 Celkem: 163 kusů Celkem: 41 kusů Celkem: 18 kusů

V Březí bylo celkem odchyceno a analyzováno 11 jedinců, v Lednici 57 a v Perné 95. V grafu č. 1 je zobrazen celkový počet jedinců na všech těchto lokalitách rozdělen podle dekád ve všech letech, kdy k odchytu docházelo.

Graf č. 1: Celkový počet odchycených jedinců na všech lokalitách v jednotlivých obdobích

120

100

Počet jedinců 40

0 Jun III Jul I Jul II Jul III Aug I Aug II Období

V následujících grafech je uveden výskyt jedinců po dekádách v jednotlivých lokalitách a letech. Odchyt probíhal vždy na stejných místech po dobu jedné hodiny pomocí vysavače nebo smýkání. V obdobích s neuvedeným počtem odchyt proběhl, avšak nebyl nalezen žádný jedinec druhu J. Pellucida. Jedinci, u nichž byl detekován PCR produkt, jsou označeni jako pozitivní. Březí

Graf č. 2: Odchyt druhu J. Pellucida na lokalitě Březí, rok 2010

Březí 2010 8

6 4 2 Počet jedinců 0 Jun III Jul I Jul II Jul III Aug I Aug II Období

samci samice larvy

Graf č. 3: Zastoupení pozitivních jedinců J. pellucida na lokalitě Březí, rok 2010

Březí 2010 8

2 Počet Počet jedinců 0 Jun III Jul I Jul II Jul III Aug I Aug II Období

pozitivní negativní

V lokalitě Březí probíhal odchyt pouze v roce 2010. Nejvíce jich bylo odchyceno na počátku července. V dalších letech odchyt neprobíhal z důvodu likvidace porostů. Celkem bylo odchyceno 11 kusů, z toho 7 samců a 4 samice a přítomnost fytoplazmy byla prokázána u 5 kusů z nich, z nichž byli všichni samci. U všech těchto jedinců byla RFLP analýzou prokázána AY-C.

Lednice

Graf č. 4: Odchyt druhu J. Pellucida Graf č. 5: Zastoupení pozitivních jedinců na lokalitě Lednice, rok 2010 J. pellucida na lokalitě Lednice, rok 2010

Lednice 2010 Lednice 2010

6 6

4 4

2 2

Počet Počet jedinců Počet Počet jedinců 0 0 Jun III Jul I Jul II Jul III Aug I Aug II Jun III Jul I Jul II Jul III Aug I Aug II Období Období

samci samice larvy pozitivní negativní

Graf č. 6: Odchyt druhu J. Pellucida Graf č. 7: Zastoupení pozitivních jedinců na lokalitě Lednice, rok 2011 J. pellucida na lokalitě Lednice, rok 2011

Lednice 2011 Lednice 2011

50 50

40 40 30 30 20 20

10 10

Počet Počet jedinců Počet jedinců 0 0 Jun III Jul I Jul II Jul III Aug I Aug II Jun III Jul I Jul II Jul III Aug I Aug II Období Období

samci samice larvy pozitivní negativní

Graf č. 8: Odchyt druhu J. Pellucida Graf č. 9: Zastoupení pozitivních jedinců na lokalitě Lednice, rok 2012 J. pellucida na lokalitě Lednice, rok 2012

Lednice 2012 Lednice 2012

3 3

2 2

1 1

Počet Počet jedinců Počet jedinců 0 0 Jun III Jul I Jul II Jul III Aug I Aug II Jun III Jul I Jul II Jul III Aug I Aug II Období Období

samci samice larvy pozitivní negativní

V Lednici bylo odchyceno a izolováno 57 kusů hmyzu, z toho 25 samců a 32 samic. PCR produkt byl získán u 20 z nich, a to u 18 samic a 2 samců. U 3 byla RFLP analýzou zjištěna přítomnost fytoplazmy stolburu. U ostatních byly získány nespecifické profily.

Zvýšený výskyt druhu Javasella pellucida na počátku července roku 2011 mohl být způsoben příznivějšími podmínkami oproti ostatním letům, nízký počet v roce 2012 naopak nepříznivými podmínkami, změnami v prostředí nebo slabším rokem v periodickém kolísání počtu jedinců.

Perná

Graf č. 10: Odchyt druhu J. Pellucida Graf č. 11: Zastoupení pozitivních jedinců na lokalitě Perná, rok 2010 J. Pellucida na lokalitě Perná, rok 2010

Perná 2010 Perná 2010

40 40

30 30 20 20

10 10

Počet Počet jedinců Počet Počet jedinců 0 0 Jun III Jul I Jul II Jul III Aug I Aug II Jun III Jul I Jul II Jul III Aug I Aug II Období Období

samci samice larvy pozitivní negativní

Graf č. 12: Odchyt druhu J. pellucida Graf č. 13: Zastoupení pozitivních jedinců na lokalitě Perná, rok 2011 J. pellucida na lokalitě Perná, rok 2011

Perná 2011 Perná 2011

40 40

30 30 20 20

10 10

Počet Počet jedinců Počet jedinců 0 0 Jun III Jul I Jul II Jul III Aug I Aug II Jun III Jul I Jul II Jul III Aug I Aug II Období Období

samci samice larvy pozitivní negativní

Graf č. 14: Odchyt druhu J. pellucida Graf č. 15: Zastoupení pozitivních jedinců na lokalitě Perná, rok 2012 J. pellucida na lokalitě Perná, rok 2012

Perná 2012 Perná 2012

2 2

1 1

Počet jedinců Počet Počet Počet jedinců 0 0 Jun III Jul I Jul II Jul III Aug I Aug II Jun III Jul I Jul II Jul III Aug I Aug II Období Období

samci samice larvy pozitivní negativní

V lokalitě Perná bylo v letech 2010, 2011 a 2012 analyzováno celkem 95 jedinců, 66 samců a 29 samic, nejvíce v roce 2010 ve druhé dekádě července. Pozitivních bylo 13 samců a 3 samice, celkem tedy 16 pozitivních jedinců. U 8 z nich byla prokázána přítomnost AY-F, u jednoho AY-C, u 6 byly získány nespecifické profily a u jednoho jedince byla prokázána fytoplazma stolburu.

Tab. č. 7: Celkové procentuální zastoupení pozitivních jedinců

Rok Březí Lednice Perná 2010 45,5 % 25,0 % 9,8 % 2011 - 36,2 % 27,3 % 2012 - 50,0 % 0,0 %

Tab. č. 8: Zatoupení fytoplazem v jednotlivých lokalitách

Lokalita Stolbur AY-F AY-C Celkem Březí 0 0 5 5 Lednice 3 0 0 3 Perná 1 8 1 10 Celkem 4 8 6

6. Diskuze

Fytoplazmy způsobují v České republice významné ekonomické ztráty na hospodářsky významných plodinách, proto je jejich výskyt sledován a kontrolován. Jejich šíření je spojeno s hmyzími vektory. Tato práce se zabývá jedním z potenciálních vektorů fytoplazem, druhem Jevesella pellucida.

Javesella Pellucida, česky ostruhovník průsvitný, je významným zástupcem čeledi Delphacidae, běžně rozšířeným v mnoha zemích světa, včetně České republiky. Je známým vektorem virových onemocnění rostlin, avšak zatím není prokázaným vektorem fytoplazem, ačkoli jejich přítomnost v tělech hmyzích jedinců již byla dokázána Orságovou et al., (2011), kdy byla identifikována AY-F u 2 samců a 1 samice a AY-C u 1 samce. Mým úkolem bylo detekovat a identifikovat fytoplazmy z jedinců odchycených v letech 2010, 2011 a 2012 na třech lokalitách České republiky, a to v Březí, Lednici a Perné.

Ze 163 odchycených a testovaných jedinců bylo nejvíce kusů odchyceno v lokalitě Perná, a to 95, v Lednici 57 a v Březí pouze 11 z důvodu odchytu pouze v jednom roce. Největší výskyt byl zaznamenán v první dekádě července, v červnu a srpnu byl jejich počet naopak výrazně snížen (viz graf 1 ve výsledcích). V roce 2010 byl největší počet odchycen ve druhé dekádě července a v roce 2012 bylo v obou lokalitách odchytu nalezeno jen velmi málo jedinců. Z těchto výsledků je patrné střídání let s vysokým a nízkým výskytem druhu Javesella pellucida a odlišné teplotní podmínky v jednotlivých letech a tedy i kolísání období maximálního výskytu. Potvrdila se i přítomnost pouze jedné generace za rok. Výskyt mohl být také ovlivněn změnami ve složení porostů na lokalitách, případně zavedením postřiku.

Na základě provedených experimentů jsem potvrdila přítomnost několika druhů fytoplazem v tělech odchycených jedinců, což však mohlo být způsobeno pouze tím, že tyto fytoplazmy napadají rostliny, na nichž se Javesella pellucida živí. U celkem 41 testovaných jedinců, což je 25,15 %, byl detekován PCR produkt o velikosti 1200 bp. Z nich byla u 18 (11 % celku) jedinců, 10 samců a 8 samic, prokázána přítomnost fytoplazmy. 14 jedinců, tedy 8,6 % z celku, bylo pozitivních na přítomnost fytoplazmy žloutenky aster, která už byla u tohoto druhu hmyzu dříve prokázána (Orságová et al., 2011). Nově byla zjištěna přítomnost fytoplazmy stolburu, a to u 4 (2,45 %) odchycených jedinců.

Dále jsem hodnotila přítomnost infikovaných jedinců v jednotlivých obdobích na třech lokalitách. Průměrně se na těchto územích nacházelo 27,53 % pozitivních jedinců.

Na lokalitě Březí se vyskytovala pouze AY-C, a to u 45,45 % odchycených jedinců. V Lednici byli nalezeni jedinci pozitivní pouze na fytoplazmu stolburu, a to 5,26 % jedinců. V Perné se vyskytovali všechny tři druhy fytoplazem, 1,05 % fytoplazmy stolburu, 8,42 AY-F a 1,05 % AY-C.

Pro důkaz, že je tento druh i hostitelem a vektorem těchto fytoplazem, by bylo třeba vykonat přenosové experimenty na živých jedincích, což však nebylo v rámci mé bakalářské práce možné.

7. Závěr

V rámci literárního přehledu své bakalářské práce jsem se věnovala charakterizaci, rodu Candidatus Phytoplasma, historii jeho objevu, taxonomii, strategii přenosu a jeho významu pro hospodářství, blíže pak charakterizaci mnou analyzovaného potenciálního vektoru Javesella pellucida a konkrétních druhů fytoplazem, fytoplazmy stolburu a žloutenky aster.

V experimentální části jsem analyzovala 163 jedinců Javesella pellucida s cílem prokázat přítomnost fytoplazem a jejich následné identifikace. U 41 jedinců byl detekován PCR produkt, 25,15 % všech analyzovaných jedinců tedy bylo pozitivních a byly dále testováni RFLP analýzou. Více byly pozitivní samice, a to 36,92 % testovaných, u samců pouze 17,35 %.

Restrikční analýza prokázala přítomnost fytoplazem u 18 jedinců, tedy 11% všech testovaných. Fytoplazmu stolburu jsem identifikovala u 4 jedinců (2,45 %), žloutenku aster AY-C u 6 jedinců (3,68 %) a AY-F u 8 jedinců (4,9 %). U 23 kusů byl detekován PCR produkt, avšak RFLP analýza prokázala nespecifické profily, jejichž identifikace nebyla součástí mé bakalářské práce. Potvrzení přítomnosti AY-C a AY-F v J. Pellucida je v souladu s dříve provedenými experimenty (Orságová et al., 2011).

Byla tedy potvrzena přítomnost fytoplazmy stolburu, AY-C a AY-F v alternativním hmyzím hostiteli Javesella pellucida, avšak dokázat, že je tento druh i vektorem, nebylo v podmínkách laboratoře možné.

8. Seznam použitých zkratek

1. 16S rDNA - ribozomální DNA se sedimentačním koeficientem 16S

2. 16S rRNA - ribozomální RNA se sedimentačním koeficientem 16S

3. AY - žloutenky aster (aster yellows)

4. bp pár bází (base pair)

5. BSA - hovězí sérový albumin (bovine serum albumine)

6. DNA - deoxyribonukleová kyselina (deoxyribonucleic acid)

7. EDTA - kyselina ethylendiamintetraoctová (ethylenediaminetetraacetic acid)

8. ICSB - International Conference on Systems Biology

9. IRPCM - International Research Programme on Comparative Mycopatholology

10. kb - kilobáze (1000 bází)

11. MLOs - organizmy podobné mykoplazmám (mykoplasma-like organisms)

12. NCBI - National Center for Biotechnology Information

13. PCR polamerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction)

14. RFLP délkový polymorfismus restrikčních fragmentů (restriction fragment lenght

polymorphism)

15. rpm - otáček za minutu (rotate per minute)

16. TAE- Tris-acetátový EDTA puf (Tris acetate EDTA buffer)

17. TBE - Tris-borátový EDTA pufr (Tris borate EDTA buffer)

18. UDP- uridindifosfát

9. Seznam použité literatury

Bertaccini A., Duduk B. (2009): Phytoplasma and phytoplasma diseases: a new review of recent research. Phytopathologia Mediterranea, 48: 355-378.

Brčák, J. (1979): Leafhopper and planthopper vectors of plant disease agents in central and southern Europe. In: Leafhopper Vectors and Plant Disease Agents, pp. 97–154. Edited by K. Maramorosch & K. F. Harris. New York: Academic Press.

Credi, R., Terlizzi, F., Milanesi, L., Bondavalli, R., Cavallini, G., Montermini, A., Dradi, D. (2006): Wild host plants of stolbur phytoplasma and its vector, Hyalesthes obsoletus, at sites of grapevine bois noir occurrence in Emilia-Romagna, Italy. 182-183. In: Ext. Abstracts 15th Meeting ICVG, Stellenbosch, South Africa

Davies, R. E., Whitcomb, R. F., Steere, R. L. (1968): Remission of aster yellows disease by antibiotics. Science 161, 793–794.

Doi, Y., Teranaka M., Yora K., Asuyama H. (1967): Mycoplasma-or PLT group-like microorganisms found in the phloem elements of plants infected with mulberry dwarf, potato witches’ broom, aster yellows, or paulownia witches’ broom. Annals of the Phytopathological Society of Japan 33, 259-266.

Hogenhout, S. A., Oshima, K., Ammar, el-D., Kakizawa, S., Kingdom, H. N. & Namba, S. (2008): Phytoplasmas: bacteria that manipulate plants and insects. Mol Plant Pathol 9, 403–423

IRPCM (2004): ‘Candidatus Phytoplasma’, a taxon for the wall-less, non-helical prokaryotes that colonize plant phloem and insects. IRPCM Phytoplasma/Spiroplasma Working Team– Phytoplasma taxonomy group. Int J Syst Evol Microbiol 54, 1243–1255.

Lee, I. M., Davis R.E. and Gundersen-Rindal DE (2000): Phytoplasma: Phytopathogenic Mollicutes. Annual Review of Microbiology (Annual Reviews) 54: 221–255.

Lee, I. M., Davis, R. E. (2000): Aster yellows. In Encyclopedia of Plant Pathology, pp. 60–63. Edited by O. C. Maloy & T. D. Murray. New York: Wiley.

Lee, I. M., Gundersen-Rindal, D. E., Davis, R. E., Bartoszyk, I. M. (1998): Revised classification scheme of phytoplasmas based on RFLP analyses of 16s rRNA and ribosomal protein gene sequences. lnternational Journal of Systematic Bacteriology 48: 1153-1169.

Lee, I. M., Gundersen-Rindal, D. E., Davis, R. E., Bottner, K. D., Marcone, C., Seemüller, E. (2004): ‘Candidatus Phytoplasma asteris', a novel phytoplasma taxon associated with aster yellows and related diseases. Int J Syst Evol Microbiol 54, 1037–1048.

Lee, I. M., Hammond, R.W., Davis, R. E., Gundersen, D. E. (1993): Universal amplification and analysis of pathogen 16S rDNA for classification and identification of mycoplasmalike organisms. Phytopathology 83: 834-842.

Loi, N., Ermacora, P., Carraro, L., Osler, R., Chen, T.A. (2002): Production of monoclonal antibodies against Apple proliferation phytoplasma and their use in serological detection. European Journal of Plant Pathology 108, 81-86.

Marcone, C., Gibb, K. S., Streten, C., Schneider, B. (2004): ‘Candidatus Phytoplasma spartii’, ‘Candidatus Phytoplasma rhamni’ and ‘Candidatus Phytoplasma allocasuarinae’, respectively associated with spartium witches'-broom, buckthorn witches'-broom and allocasuarina yellows diseases. Int J Syst Evol Microbiol 54, 1025–1029

Marcone, C., Neimark, H., Ragozzino, A., Lauer, U., Seemüller, E. (1999): Chromosome sizes of phytoplasmas composing major phylogenetic groups and subgroups. Phytopathology 89, 805–810.

McCoy, R. E., Caudwell, A., Chang, C. J., Chen, T. A., Chiykowski, L. N., Cousin, M. T., Dale, J. L., de Leeuw, G. T. N., Golino, D. A., Hackett, K. J., Kirkpatrick, B. C., Marwitz, R., Petzold, H., Sinha, R. C., Sugiura, M., Whitcomb, R. F., Yang, I.L., Zhu, B. M., Seemüller, E. (1989): Plant diseases associated with mycoplasma-like organisms. In: Whitcomb R. F., Tully J. G. (eds.). The Mycoplasmas, Vol. V., pp. 545-640. Academic Press, San Diego.

Musetti, R., Favali, M. A. (2004): Microscopy techniques applied to the study of phytoplasma diseases: Traditional and inovative methods, In: Current issues of multidisciplinary microscopy research and education (Mendez-Vilas, A., Labajos-Broncano, L. Eds.) Formatex book series N°2, pp. 72-80

Navrátil, M., Válová, P., Starý, M. (2008): Fytoplazmy - obligátní intrabuněčné patogeny. In: Navrátil M., Fialová R. (eds.): Fytoplazmy - významné patogeny rostlin. Česká fytopatologická společnost, Univerzita Palackého v Olomouci, pp. 19.

Nečas, T., Krška, B. (2006): Candidatus phytoplasma prunorum (European stone fruit yellows phytoplasma (ESFY), Interaktivní databáze chorob a škůdců ovocných plodin

Orságová, H., Březíková, M., Gabriela Schlesingerová, G. (2011): Presence of phytoplasmas in hemipterans in Czech vineyards. In: Bulletin of Insectology 64, pp. 119-120

Oshima, K., Kakizawa, S., Nishigawa, H., Jung, H. Y., Wei, W., Suzuki, S., Arashida, R., Nakata, D., Miyata, S., Ugaki, M., Namba, S. (2004): Reductive evolution suggested from the complete genome sequence of a plant-pathogenic phytoplasma. Nat. Genet. 36:27-29.

Rojas-Martínez, R. I. (2009): Insect vectors of phytoplasmas. Encyclopedia of life support systems

Růžička, T. (2008): Fytoplazmy jako karanténní patogeny. In: Navrátil, M., Fialová, R. (eds.): Fytoplazmy – významné patogeny rostlin. Česká fytopatologická společnost, Univerzita Palackého v Olomouci, 2008, pp. 44-61.

Seemüller, E., Marcone, C., Lauer, U., Ragozzino, A., Göschl, M. (1998): Current status of molecular classification of the phytoplasmas. Journal of Plant Pathology 80, 3-26.

Seemüller, E., Schneider, B. (2004): ‘Candidatus Phytoplasma mali’, ‘Candidatus Phytoplasma pyri’ and ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’, the causal agents of apple proliferation, pear decline and European stone fruit yellows, respectively. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 54: 1217-1226.

Suzuki, S., Oshima, K., Kakizawa, S., Arashida, R, Jung, H. Y., Yamaji, Y., Nishigawa, H., Ugaki, M., Namba, S. (2006): Interaction between the membrane protein of a pathogen and insect microfilament complex determines insect-vector specificity. Proceedings of National Academy of Sciences USA 103, 4252–4257.

Wei, W., Davis, R. E., Lee, I. M., Zhao, Y. (2007): Computer-simulated RFLP analysis of 16S rRNA genes: identification of ten new phytoplasma groups. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 57: 1855-1867.

10. Přílohy

Tab. č. 9: Přehled fylogenetických skupin fytoplazem (IRPCM, 2004, upraveno)

Fylogenetická skupina Označení Druh ´Candidatus GenBank Ac. skupiny 16Sr Phytoplasma´ No. 'Ca. Phytoplasma asteris' M30790 Aster yellows group 16SrI 'Ca. Phytoplasma japonicum' AB010425 Peanut witches´- broom 16SrII 'Ca. Phytoplasma aurantifolia' U15442 group X-disease group 16SrIII 'Ca. Phytoplasma pruni' L04682 'Ca. Phytoplasma palmae' U18747 'Ca. Phytoplasma X80117 Coconut lethal yellowing cocostanzaniae' 16SrIV group 'Ca. Phytoplasma Y14175 cocosnigeriae' 'Ca. Phytoplasma castaneae' AB055986 'Ca. Phytoplasma ziziphi' AY072722 Elm yellows group 16SrV 'Ca. Phytoplasma vitis AF176319 'Ca. Phytoplasma ulmi' AF122910 Clover proliferation group 16SrVI 'Ca. Phytoplasma trifolii' AY390261 Ash yellows group 16SrVII 'Ca. Phytoplasma fraxini' AF092209 Loofah witches´- broom 16SrVIII 'Ca. Phytoplasma luffae' AF086621 group Pigeon pea witches´- 16SrIX 'Ca. Phytoplasma phoenicium' AF515636 broom group 'Ca. Phytoplasma mali' AJ542541 'Ca. Phytoplasma pyri' AJ542543 'Ca. Phytoplasma prunorum' AJ542544 Apple proliferation group 16SrX 'Ca. Phytoplasma spartii' X92869 'Ca. Phytoplasma rhamni' X76431 'Ca. Phytoplasma AY135523 allocasuarinae' Rice yellow dwarf group 16SrXI 'Ca. Phytoplasma oryzae' D12581 'Ca. Phytoplasma L76865 Stolbur group 16SrXII australiense' 'Ca. Phytoplasma solani' AF248959 BGWL group 16SrXIV 'Ca. Phytoplasma cynodontis' AJ550984 ´Ca. Phytoplasma 16SrXV 'Ca. Phytoplasma brasiliense' AF147708 brasiliense' group

Tab. č. 10: Seznam naměřených hodnot koncentrace a čistoty izolované DNA

Datum sběru Lokalita Pohlaví c DNA (ng/µl) A260/280 29.6.2011 Perná, svlačec, vysavač ♀ 47,3 1,62 29.6.2011 Lednice, příkop ♂ 86,1 2,10 29.6.2011 Lednice, příkop ♀ 14,1 1,92 17.7.2011 Lednice, kravín ♂ 42,8 1,94 17.7.2011 Lednice, kravín ♀ 63,5 1,82 29.7.2011 Lednice, kravín ♀ 248,3 2,05 8.7.2011 Perná, svlačec, vysavač ♂ 10,2 1,83 8.7.2011 Perná, svlačec, vysavač ♂ 15,4 1,75 8.7.2011 Perná, svlačec, vysavač ♂ 21,2 1,79 8.7.2011 Perná, svlačec, vysavač ♂ 8,8 1,62 8.7.2011 Perná, svlačec, vysavač ♂ 8,7 1,84 8.7.2011 Perná, svlačec, vysavač ♂ 17,8 1,67 8.7.2011 Perná, svlačec, vysavač ♂ 11,7 1,64 8.7.2011 Perná, svlačec, vysavač ♂ 21,7 1,82 8.7.2011 Perná, svlačec, vysavač ♂ 12,6 1,88 8.7.2011 Perná, svlačec, vysavač ♂ 10,5 1,98 8.7.2011 Lednice, kravín, vysavač ♀ 135,4 1,83 8.7.2011 Lednice, kravín, vysavač ♀ 47,0 1,63 8.7.2011 Lednice, kravín, vysavač ♀ 19,8 1,70 8.7.2011 Lednice, kravín, vysavač ♀ 72,0 1,50 8.7.2011 Lednice, kravín, vysavač ♀ 112,9 1,65 8.7.2011 Lednice, kravín, vysavač ♀ 25,3 1,83 8.7.2011 Lednice, kravín, vysavač ♀ 48,0 1,71 8.7.2011 Lednice, kravín, vysavač ♀ 51,9 1,45 8.7.2011 Lednice, kravín, vysavač ♀ 245,4 1,59 8.7.2011 Lednice, kravín, vysavač ♀ 49,5 1,87 8.7.2011 Lednice, kravín, vysavač ♀ 28,2 1,68 8.7.2011 Lednice, kravín, vysavač ♀ 61,0 1,83 8.7.2011 Lednice, kravín, vysavač ♀ 106,3 1,64 8.7.2011 Lednice, kravín, vysavač ♀ 22,1 1,68 8.7.2011 Lednice, kravín, vysavač ♀ 42,2 1,58 8.7.2011 Lednice, kravín, vysavač ♀ 30,7 1,66 8.7.2011 Lednice, kravín, vysavač ♀ 19,2 1,67 8.7.2011 Lednice, kravín, vysavač ♀ 54,0 1,33 4.7.2011 Lednice, kravín ♀ 23,3 1,62 4.7.2011 Lednice, kravín ♀ 175,0 1,65 8.7.2011 Lednice, kravín, vysavač ♂ 21,7 1,76 17.7.2011 Lednice, u silnice ♀ 63,5 1,79 4.7.2012 Perná, Urtica ♀ 118,5 1,76 8.7.2011 Perná, Urtica, smýkání ♂ 80,4 1,73 8.7.2011 Perná, Urtica, smýkání ♂ 22,2 1,92 8.7.2011 Perná, Urtica, smýkání ♂ 15,5 1,98 8.7.2011 Perná, Urtica, smýkání ♂ 29,1 1,86 8.7.2011 Perná, Urtica, smýkání ♂ 22,1 1,87