Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre sistema nervioso central en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth)
Laura Alejandra Mejía Agudelo
Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias, Departamento de Farmacia Bogotá, Colombia 2017
Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre sistema nervioso central en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth)
Laura Alejandra Mejia Agudelo
Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título de: Magister en Ciencias Farmacéuticas
Director (a): Ph.D Juan Camilo Marín Loaiza
Línea de Investigación: Fitoquímica y Farmacognosia Grupo de Investigación: Grupo de Investigación en Fitoquímica y Farmacognosia de la Universidad Nacional de Colombia (GIFFUN)
Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias, Departamento de Farmacia Bogotá, Colombia 2017
(Dedicatoria)
When you are smiling The whole world Que también vela por su amargura Smiles with you MB. “I begin with an idea and then it becomes something else” PP.
Agradecimientos
A todos los seres vivientes que hicieron parte de este trabajo. “The whole is greater than the sum of the parts” A.
A mis padres Luis Alfonso Mejia Muñoz y Gloria Inés Agudelo Roa, mi hermano Luis Alfonso Mejia Agudelo, quienes inundaron mi vida de ciencia desde pequeña, gracias por sus invaluables enseñanzas y motivación brindada en todo momento.
A los profesores Orlando Rivera Díaz y Jaime Uribe Meléndez quienes me introdujeron al maravilloso mundo de las plantas.
A mi profesor Juan Camilo Marín Loaiza por aceptarme con mis despistes siendo de otra disciplina, por sus enseñanzas en muchos momentos de mi vida, por su franqueza y su tranquilidad.
A mis profesores, Maritza Rojas, Mario Francisco Guerrero, Luis Fernando Ospina y Javier Rincón, quienes me enseñaron la paciencia, la disciplina, el orden y toma de desiciones. A Xavier Marquínez Casas quien me apasionó por la anatomía de las plantas y me enseñó a valorar las herramientas visuales.
A toda mi familia, mis amigos (Kelly Paez, Ricardo Perez), y compañeros de laboratorio que me dieron una palabra de aliento, apoyo, cariño en todos los momentos de este trabajo. Y a Aimer Gutierrez por su colaboración en el aspecto estadístico de este trabajo, mil gracias.
X Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Finalmente a la Universidad Nacional de Colombia, a la DIB sede Bogotá por el financiamiento parcial de este proyecto (código 34913); y a la Facultad de Ciencias por otorgarme la beca de exención de derechos académicos (2015-2017). Resumen y Abstract IX
Resumen
En Colombia, las enfermedades mentales afectan al 4.7% de la población. Una de las alternativas complementarias a la terapia alopática para tratar estas dolencias se basa en el uso de productos naturales. Dentro de las plantas usadas para tratar la depresión se encuentra la especie europea Hypericum perforatum. Los metabolitos a los que se les atribuye la actividad antidepresiva de esta especie son hipericina, hiperforina y ciertos flavonoides. En la búsqueda de una alternativa natural y accesible para el tratamiento de la depresión, se seleccionó como objeto de estudio la planta nativa Hypericum juniperinum (L.f.) Kunth. El objetivo del presente trabajo consistió en caracterizar morfo anatómica, fitoquímica y farmacológicamente la especie H. juniperinum. En el análisis morfo anatómico se encontró que H. juniperinum quien se encuentra dentro de la sección taxonómica Brathys, presenta glándulas translúcidas, y carece de glándulas negras típicas de la sección Hypericum donde está Hypericum perforatum. se encuentran compuestos de carácter fenólico a lo largo de la hoja, en el floema del tallo y en anteras; y lípidos en canales de hojas, parenquíma radial del tallo y en algunas estructuras florales. Por otra parte, en la evaluación fitoquímica preliminar se detectaron metabolitos de tipo flavonoide, terpenos/esteroides, taninos y saponinas; dentro de las moléculas aisladas se encuentra la quercetina y el metil ester del ácido 5O cafeoilquínico. Finalmente, en pruebas psicofarmacológicas en modelo murino evaluando el extracto metanólico (80%) obtenido de los órganos aéreos de Hypericum juniperinum en tres dosis de (150, 300 y 500 mg/kg,) y las fracciones de acetato de etilo y butanol dos en dosis de (150 y 300 mg/kg). se encuentra que el extracto metanólico de H. juniperinum en la dosis de 500 mg/Kg y la fracción de acetato de etilo en ambas dosis empleadas, disminuyen el tiempo de inmovilidad en la prueba de nado forzado y se observa una tendencia de disminución de tiempo de inmovilidad en la prueba de suspensión por la cola, asociada a un efecto de tipo antidepresivo del extracto metanólico de H. juniperinum. Palabras clave: Hypericum juniperinum, flavonoides, antidepresivo, Histoquímica, anatomía. X Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Abstract
In Colombia, mental illness affects 4.7% of the population. One of the complementary alternatives to allopathic therapy for the treatment of these ailments is based on the use of natural products. Among the plants used to treat depression is the European species Hypericum perforatum. The metabolites related to the antidepressant activity are hypericin, hyperforin and certain flavonoids. In the search for a natural and accessible alternative for the treatment of depression, the native plant Hypericum juniperinum was selected. The objective of the present work was to characterize the morphoanatomy, phytochemical and pharmacological activity of H. juniperinum. In the morphoanatomical analysis it was found that H. juniperinum which belongs to the taxonomical section Brathys, has translucent glands and it lacks of black glands typical of the Hypericum section where Hypericum perforatum is found. Phenolic compounds are found throughout the leaf and in the phloem of the stem, and anthers; lipids in leaf canals, stem radial parenchyma, and in some floral structures. On the other hand, in the preliminary phytochemical evaluation, metabolites of flavonoid type, terpenes / steroids, tannins, and saponins were detected, within the isolated molecules are the quercetin and the 5O cafeoyl quinic methyl ester. Finally, in the psychopharmacological tests in murine model evaluating the effect of the methanolic extract (80%) obtained from the aerial organs of Hypericum juniperinum in three doses of (150, 300 and 500 mg / kg,) and the fractions of ethyl acetate and butanol in two doses(150 and 300 mg / kg), it was obtained that the methanolic extract of H. juniperinum at 500 mg / kg and the fraction of ethyl acetate in both doses used, tend to decrease the immobility time in the forced swim test and a trend is observed in the tail suspension test, associated to an antidepressant effect of the methanolic extract of H. juniperinum.
Key words: Hypericum juniperinum, flavonoids, antidepressant, histochemistry, morphoanatomy. Contenido XI
Contenido
1. Marco teórico ...... 3 1.1 Depresión ...... 3 1.1.1 Medicamentos disponibles para el tratamiento de la depresión ...... 5 1.1.2 Productos naturales como alternativa terapéutica ...... 7 1.2 Generalidades del Género Hypericum ...... 9 1.2.1 Química y actividades biológicas reportadas para el género Hypericum ...... 10 1.2.2 Hypericum perforatum L...... 12 1.2.3 Género Hypericum en Colombia ...... 14 1.2.4 Hypericum juniperinum (L.f.)Kunth ...... 14
2. Justificación ...... 16
3. Objetivos ...... 17 3.1 Objetivo General ...... 17 3.2 Objetivos Específicos ...... 17
4. Materiales y Métodos ...... 18 4.1 Estudio Morfoanatómico ...... 18 4.1.1 Histología de los órganos aéreos de Hypericum juniperinum ...... 18 4.1.2 Histoquímica de los órganos aéreos de Hypericum juniperinum ...... 19 4.2 Estudio Fitoquímico ...... 20 4.2.1 Material vegetal ...... 20 4.2.2 Extracción y Fraccionamiento ...... 20 4.2.3 Pruebas fitoquímicas preliminares de Hypericum juniperinum ...... 21 4.2.4 Aislamiento y purificación de compuestos de H. juniperinum ...... 22 4.3 Estudio Farmacológico ...... 23 4.3.1 Animales ...... 23 4.3.2 Reactivos pruebas farmacológicas ...... 23 4.3.3 Preparación, dosis empleadas y administración de tratamientos ...... 23 4.3.4 Esquema de realización pruebas farmacológicas ...... 24 4.3.5 Tamizaje farmacológico en sistema nervioso central en modelo murino ...... 26 . Prueba farmacológica para determinar alteraciones de la actividad motora: prueba del alambre ...... 26 . Pruebas farmacológicas para evaluar la actividad exploratoria ...... 26 . Pruebas farmacológicas para evaluar la actividad ansiolítica ...... 27 . Pruebas farmacológicas para evaluar la actividad antidepresiva ...... 27 . Pruebas farmacológicas para evaluar la actividad sedante: Prueba de potenciación del sueño barbitúrico...... 28 XII Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
. Pruebas farmacológicas para evaluar la actividad anticonvulsivante: Prueba de convulsiones inducidas por electroshock máximo ...... 28 4.3.6 Consideraciones éticas ...... 28 4.3.7 Análisis de datos ...... 29
5. Resultados y discusión...... 31 5.1 Estudio Morfoanatómico de H. juniperinum (Kunth)...... 31 5.1.1 Tallo de Hypericum juniperinum (Kunth)...... 32 5.1.2 Hoja de Hypericum juniperinum (Kunth)...... 35 5.1.3 Flor de Hypericum juniperinum (Kunth)...... 38 5.2 Estudio Fitoquímico ...... 43 5.2.1 Pruebas fitoquímicas preliminares ...... 43 5.2.2 Aislamiento y purificación de metabolitos secundarios ...... 45 COMPUESTO P7: ...... 45 COMPUESTO AM2: ...... 47 5.3 Estudio Farmacológico...... 53 5.3.1 Tamizaje farmacológico en sistema nervioso central en modelo murino del extracto metanólico de H. juniperinum...... 53 . Prueba farmacológica para determinar alteraciones de actividad motora: Prueba del alambre ...... 53 . Pruebas farmacológicas de actividad exploratoria ...... 53 . Pruebas farmacológicas de actividad ansiolítica ...... 54 . Pruebas farmacológicas de actividad antidepresiva ...... 55 . Pruebas farmacológicas de actividad sedante: Prueba de potenciaciación del sueño barbitúrico ...... 59 . Pruebas farmacológicas de actividad anticonvulsivante: Prueba de convulsiones inducidas por electroshock máximo ...... 60 5.3.2 Tamizaje farmacológico en sistema nervioso central en modelo murino de las fracciones de acetato de etilo y butanol de H. juniperinum ...... 60 . Pruebas farmacológicas de actividad exploratoria ...... 61 . Pruebas farmacológicas de actividad anisolítica ...... 62 . Pruebas farmacológicas de actividad antidepresiva ...... 63 . Pruebas farmacológicas de actividad sedante: Prueba de potenciación del sueño barbitúrico...... 65
6. Conclusiones y recomendaciones ...... 69 6.1 Conclusiones ...... 69 6.2 Recomendaciones ...... 70
7. Bibliografía ...... 73
Anexo A ...... 82
Anexo B ...... 84 Contenido XIII Contenido XIV
Lista de figuras
Figura 1-1.Cifras mundiales referentes a la depresión, tomado y adaptado de (IHME, 2016; WHO, 2017; Ministerio de Salud, 2017)...... 5 Figura 1-2. Plantas empleadas para el tratamiento de la depresión, tomado y adaptado de (Sarris et al., 2011)...... 8 Figura 1-3.Distribución del género Hypericum en el mundo, tomado y adaptado de (Nürk, 2011)...... 9 Figura 1-4. Actividades reportadas en el Género Hypericum, tomado y adaptado de (Stojanovic et al., 2013; Russo et al., 2014)...... 11 Figura 1-5.Metabolitos encontrados en el género Hypericum...... 13 Figura 1-6. Distribución de Hypericum juniperinum (L.f.) Kunth en Colombia, tomada y modificada de (Bernal et al., 2015)...... 15 Figura 4-1. Esquema de fraccionamiento líquido-líquido por la metodología Kupchan modificada por (Otsuka, 2006)...... 21 Figura 4-2. Fase 1 del tamizaje farmacológico en sistema nervioso central (SNC) del extracto crudo, en 3 dosis empleadas (150, 300 y 500 mg/kg) de H. juniperinum, en el modelo murino.(Vectores ilustrativos tomados de freepik y Servier medical art)...... 25 Figura 4-3. Fase 2 del tamizaje farmacológico en sistema nervioso central (SNC) de las fracciones del extracto de H. juniperinum en 2 dosis empleadas (150 y 300 mg/kg), en el modelo murino.(Vectores ilustrativos tomados de freepik y servier medical art)...... 26 Figura 5-1. Morfología de Hypericum juniperinum. A. Hábito de la planta, tomado de (Flickr, 2007), B. Disposición de las hojas y flor, C. Distribución de las hojas, D. Longitud y forma de las hojas, glándulas redondeadas (Línea azul)...... 31 Figura 5-2. A. Corte transversal del tallo de Hypericum juniperinum. Disposición general de los diferentes tejidos...... 34 Figura 5-3. Corte transversal de hojas de Hypericum juniperinum. Disposición general de los diferentes tejidos...... 37 Figura 5-4.A. Flor de Hypericum juniperinum...... 40 Figura 5-5. Cromatografía en capa fina del extracto metanólico de Hypericum juniperinum,. Fase móvil: acetato de etilo: ácido fórmico: ácido acético: agua: diclorometano (100:10:10:11:26). Revelador NP-PEG (UV 365nm)...... 44 Figura 5-6.Esquema de purificación del compuesto P7 a partir de la fracción de acetato de etilo del extracto metanólico de H. juniperinum...... 46 Figura 5-7. Estructura de la quercetina...... 47 Figura 5-8.Esquema de purificación del compuesto AM2 a partir de la fracción de acetato de etilo del extracto metanólico de H. juniperinum...... 48 Contenido XV
Figura 5-9. Estructura del metil ester del ácido 3-O-cafeoilquínico (AM2),...... 51
Figura 5-10.Efecto del extracto metanólico de H. juniperinum evaluado a 3 dosis (150, 300 y 500 mg/kg) en la prueba de tablero agujereado...... 54 Figura 5-11.Efecto del extracto metanólico de H. juniperinum evaluado a 3 dosis (150,300 y 500 mg/kg) en la prueba de laberinto en cruz...... 55 Figura 5-12. Efecto del extracto metanólico de H. juniperinum evaluado a 3 dosis (150,300 y 500 mg/kg) en la prueba de nado forzado...... 57 Figura 5-13.Efecto del extracto metanólico de H. juniperinum evaluado a 3 dosis (150, 300 y 500 mg/kg) en la prueba de suspensión por la cola ...... 58 Figura 5-14.Efecto del extracto metanólico de H. juniperinum evaluado a 3 dosis (150,300 y 500 mg/kg) en la prueba de potenciación del sueño barbitúrico...... 60 Figura 5-15. Efecto de los extractos de acetato de etilo y butanol provenientes del fraccionamiento del extracto metanólico de H. juniperinum evaluados a 2 dosis (150, 300 mg/kg) en la prueba de campo abierto ...... 62 Figura 5-16. Efecto de los extractos de acetato de etilo y butanol provenientes del fraccionamiento del extracto metanólico de H. juniperinum evaluados a 2 dosis (150, 300 mg/kg) en la prueba de laberinto en cruz en ratones...... 63 Figura 5-17. Efecto de los extractos de acetato de etilo y butanol provenientes del fraccionamiento del extracto metanólico de H. juniperinum evaluados a 2 dosis (150, 300 mg/kg) en la prueba de nado forzado ...... 64 Figura 5-18. Efecto de los extractos de acetato de etilo y butanol provenientes del fraccionamiento del extracto metanólico de H. juniperinum evaluados a 2 dosis (150, 300 mg/kg) en la prueba de suspensión por la cola...... 65 Figura 5-19. Efecto de los extractos de acetato de etilo y butanol provenientes del fraccionamiento del extracto metanólico de H. juniperinum evaluados a 2 dosis (150, 300 mg/kg) en la prueba de potenciación del sueño barbitúrico...... 66 Contenido XVI
Lista de tablas
Pág.
Tabla 1.Tinciones diferenciales realizadas en órganos aéreos de Hypericum juniperinum...... 19 Tabla 2. Resultados obtenidos pruebas fitoquímicas preliminares realizadas al extracto metanólico de H. juniperinum...... 44 Tabla 3. Desplazamiento químico en δ1H, δ APT 13C-RMN, COSY y HMBC del Metil ester del ácido 5O cafeoilquinico (AM2)...... 51 Contenido XVII
Lista de Símbolos y abreviaturas
Abreviaturas Abreviatura Término (5HT): Serotonina (À) : Antera (An): Androceo (APVP): Años potenciales de vida perdidos (ATCAs): Antidepresivos tricíclicos y policíclicos (CCD): Cromatografía en capa delgada (CC): Cromatografía en columna (Ca):Caliz (Cn): Canal (Co):Corola (COL): Herbario Nacional Colombiano (Cu):Cutícula (DA): Dopamina (DALYs): Disability adjusted life year- años de vida ajustados a la incapacidad AVAD (DMSO): Dimetilsulfóxido ems: error estándar de la media (Ep):Epidermis (Es): Estilos (Es):Estoma (Et) :Estigma EtOH: Etanol (FAA): Formol:ácido acético: EtOH (10:5:85, formol: ácido acético: EtOH 70%) FeCl3: Cloruro férrico (Fi): Filamento g: Gramos (Gi): Gineceo (HCa): Haz vascular del caliz (HCo): Haz vascular de la corola (Hv): Haz vascular (HvC): Haz vascular central Hz: Hertz (IMAOs):Inhibidores de la monoaminooxidasa (IRSN): Inhibidores de la recaptación de la serotonina/ noradrenalina (ISRSs): Inhibidores selectivos de la recaptación de la serotonina (IR):Infrarojo J: constante de acoplamiento KOH: Hidróxido de potasio KBr: Bromuro de potasio (Le): Lenticelas XVIII Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth). mA: miliamperios (MAO): Monoaminooxidasa (Me): Médula MHz: Mega Hertz mL: mililitro ms: microsegundos (NE): Norepinefrina NP-PEG: Natural products reagent, polyethylenglycol reagent (Pa): Parénquima (Pe): Parénquima empalizada (Po): Pólen ppm: partes por millón (Pra): Parénquima en radios (Pv): Parénquima vaina Rf: Factor de retención RMN: Resonancia Magnética Nuclear rpm: rotaciones por minuto (S): Surco medial (SARIS): Antagonistas e inhibidores de la recaptación de serotonina (Su): Suber (Te): Tecas (UV): Ultravioleta (Va): Vasos v.o: via oral (Xi): Xilema en radios de parénquima (YLD): Years lived with disability- Años de vida perdidos por la incapacidad AVD (δ): Desplazamiento químico (WHO): World Health Organization Introducción
El número de personas afectadas por desórdenes mentales va en aumento, particularmente en los paises de bajos ingresos e inmersos en conflictos armados como Colombia, esta problemática incrementa el riesgo de sufrir de ansiedad y depresión (Medicos sin fronteras, 2013). Ambas enfermedades son altamente prevalentes en la población. En el pais, la primera tiene una prevalencia del 5,3% y la segunda del 4,7% (WHO, 2017).
La depresión ha contribuido al incremento en las tasas de suicidio en el mundo con 800.000 casos por año (WHO, 2017). Los eventos depresivos están caracterizados por un periodo de al menos dos semanas en donde hay una pérdida de interés o placer, y al menos 4 de los siguientes síntomas se presentan: cambios en el sueño, alimentación, disminución de la energía, concentración o afección de imagen propia (National Institute of Mental Health , 2016).
Dentro de las terapias empleadas para el tratamiento de la depresión se encuentran los tratamientos psicológicos y el uso de medicamentos antidepresivos: Antidepresivos tricíclicos y policíclicos (ATCAs), inhibidores de la monoaminooxidasa (IMAOs), inhibidores selectivos de la recaptación de la serotonina (ISRS), antagonistas e inhibidores de la recaptación de serotonina (SARIS) y los inhibidores de la recaptación de serotonina y noradrenalina (IRSN) (WHO, 2017). Debido a los efectos secundarios tan marcados (mareo, nausea, efectos cardiacos, disfunción sexual, entre otros) y a los altos costos que presentan los fármacos antidepresivos convencionales, en estos momentos hay una tendencia mundial hacia el consumo de productos de origen herbal (Khawam et al., 2006). Esta postura se da porque los fitomedicamentos tienen menos efectos secundarios, no generan dependencia y tienen un menor costo, relacionado directamente con la adherencia al tratamiento farmacológico (Rodriguez-Landa, & Contreras, 2003; Müller , 2005). Algunas de las plantas empleadas popularmente para el tratamiento de la depresión son Croccus sativus (Azafrán), Lavandula spp., Rhodolia rosea, Hypericum 2 Introducción perforatum, entre otras, siendo esta última ampliamente comercializada en Europa y Estados Unidos generando ganancias que rondan los billones de dólares (Klemow et al., 2011).
Hypericum perforatum (Hypericaceae), también conocida como “Hierba de san Juan”, es una planta de origen europeo que ha sido empleada por siglos en preparaciones oleosas para tratar quemaduras, heridas, inflamación de la piel y dolor. Adicionalmente, cuando es administrada por vía oral se emplea para el tratamiento de la ansiedad y episodios depresivos moderados (Greeson et al., 2001).
H. perforatum contiene por lo menos diez clases de metabolitos secundarios que varían en concentración entre plantas individuales dependiendo de factores genéticos, condición de crecimiento, preparación y procesamiento del material (Greeson et al., 2001). La actividad antidepresiva de esta planta ha sido demostrada en modelos animales como el test de desesperanza aprendida y el modelo de déficit de escape crónico. Metabolitos como hiperforina y algunos flavonoides se consideran los constituyentes responsables de dicha actividad (Nathan, 2001).
Actualmente se tienen reportes de 54 especies del género Hypericum para el territorio colombiano, destacándose H. goyanesii y H. juniperinum como especies promisorias alto andinas y de páramo, priorizadas por el jardín botánico de Bogotá para procesos de conservación, reintroducción y restauración ecológica (Pérez- Martinez, 2015). Para nuestro trabajo decidimos seleccionar a la especie H. juniperinum; ya que al estar relacionada taxonómicamente con H. perforatum se esperaría que presentara una composición química similar y por ende una actividad biológica semejante a la de la especie oficinal. Al no contar H. juniperinum con estudios relacionados con su composición química, su morfo anatomía, ni la evaluación de su actividad biológica, esta especie puede ser una alternativa interesante en la búsqueda de plantas colombianas con actividad antidepresiva, por lo tanto dentro de los objetivos del proyecto se encuentra la caracterización tanto química como morfoanatómica; así como la evaluación sobre sistema nervioso central del extracto metanólico y de las fracciones obtenidas a partir de esta planta. 1. Marco teórico
1.1 Depresión
En el mundo hay alrededor de 350 millones de personas que sufren de depresión y de acuerdo a las proyecciones es un valor que va a aumentar en los próximos años. Esta enfermedad es la primera causa de discapacidad a nivel mundial ya que reduce la productividad en los trabajadores, sinomas como la pérdida de interés y falta de energía, producen efectos negativos en la vida cotidiana (Lüllmann et al., 2000).
En Colombia los desórdenes depresivos presentan una prevalencia de 4.7% y equivalen a 4.33% de los años de vida perdidos por la incapacidad YLD (Years lived with disability – Años de vida perdidos por la incapacidad AVD), dicha medida relaciona el número de casos presentes de una enfermedad junto con la duración y severidad de la misma (WHO, 2017). Adicionalmente, la depresión ocasiona el 1.88% de los DALYs (Disability adjusted life year- años de vida ajustados a la incapacidad AVAD) totales, una medida referente a la pérdida de años debidos a la incapacidad y mortalidad dados por una enfermedad en específico. Esto la ubica en el quinto lugar en el ranking de pérdida de años después de enfermedades no comunicables y enfermedades cardiacas (IHME, 2016) (Figura1-1).
Por otro lado, en la ultima encuesta Nacional de Salud Mental realizada en el 2015 se encontró que en adolecentes y adultos el transtorno con mayor prevalencia (12 meses), es el transtorno depresivo mayor y la fobia social; y en general se presentan en mayor proporción en mujeres que en hombres y en edades entre los 18 y 44 años (Ministerio de Salud, 2015). Para el año 2013 Médicos y fronteras dan un reporte de salud mental en zonas donde el conflicto armado estaba en auge (Caquetá, Putumayo, Nariño y Cauca). De 4455 pacientes atendidos encontraron que, como consecuencia de la violencia, el 67% de las personas presentan síntomas de ansiedad y depresión. Las personas que 4 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth). han vivido situaciones como desplazamiento, familiares asesinados o desaparecidos, tienden a desencadenar cuadros de tipo depresivo, adicionalmente tienen el doble de propensión a desarrollar ideas suicidas (Médicos sin fronteras, 2013). Más recientemente, el último boletín de salud mental colombiano, reporta que alrededor de 48.100 personas son tratadas por esta enfermedad, siendo interesante resaltar que la prevalencia es alta en adultos mayores de la zona urbana y en poblaciones universitarias (Ministerio de Salud , 2017).
La depresión es el resultado de interacciones entre los factores sociales, psicológicos y biológicos. Las personas que han sufrido de problemas en su vida como pérdida de empleo, luto y trauma psicológico tienen una mayor probabilidad de padecer esta enfermedad, adicionalmente dentro de los grupos en vulnerabilidad se encuentran niños expuestos al abandono, personas propensas al abuso de sustancias, y personas enfrentadas a conflictos y desastres naturales, entre otros (WHO, 2013).
Para diagnosticar un paciente con depresión, este debe presentar una sintomatología coherente con los criterios diagnosticos descritos en el manual de diagnóstico para desórdenes mentales, (DSM-IV) o en la clasificación internacional de enfermedades y desórdenes mentales (ICD-10) (Potokar & Thase, 2003). En la depresión el paciente experimenta síntomas de naturaleza afectiva, cognitiva o somática, como la miseria profunda, y culpa severa, también se evidencian efectos de naturaleza somática como el insomnio, pérdida de apetito, constipación, palpitaciones, pérdida de la líbido y en algunos casos pensamientos de carácter suicida (Lüllmann et al., 2000). Estos síntomas deben presentarse en la persona diariamente por lo menos durante dos semanas con una influencia negativa en las experiencias de trabajo, social u otros dominios importantes de la vida (Potokar & Thase, 2003). Dentro de las soluciones planteadas para reducir la depresión se encuentran los tratamientos psicológicos como la terapia cognitiva conductual, la psicoterapia interpersonal, la enseñanza de la relajación y los medicamentos antidepresivos (WHO, 2013). 5
Figura 1-1.Cifras mundiales referentes a la depresión, tomado y adaptado de (IHME, 2016; WHO, 2017; Ministerio de Salud, 2017).
1.1.1 Medicamentos disponibles para el tratamiento de la depresión
El tratamiento farmacológico de la depresión está relacionado con cambios en los niveles de los agentes que llevan a cabo el proceso de neurotransmisión, como lo son las monoaminas serotonina, noreprinefrina y dopamina. Actualmente el tratamiento de esta afección se realiza con inhibidores de la monoaminooxidasa (IMAOs), antidepresivos tricíclicos (TCAs), inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina (ISRSs), entre otros (Potokar & Thase, 2003). A continuación se da una breve descripción de estos fármacos. 6 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
- Antidepresivos tricíclicos y policíclicos (ATCAs): Estos agentes bloquean la recaptación de noradrenalina y serotonina en la neurona, incrementando de esta manera la concentración de las monoaminas en el espacio sináptico produciendo así el efecto antidepresivo asociado a que estos neurotransmisores regulan funciones cerebrales como el humor, atención, sueño, apetito y cognición (Hasler, 2010). Algunos ejemplos de fármacos pertenecientes a este grupo son la imipramina, amitriptilina, desipramina, nortriptilina, protriptilina y doxepina (Harvey, 2012).
- Inhibidores de la monoaminooxidasa (IMAOs): Los IMAOs aumentan los niveles de serotonina (5HT), norepinefrina (NE) y dopamina (DA) al bloquear la enzima monoaminooxidasa (MAO); responsable del metabolismo de estos neurotrasmisores. Estos fármacos presentan efectos irreversibles al unirse permanentemente a la enzima, inactivándola. Los fármacos de este grupo empleados son la fenelxina, isocarboxazida y selegilina, entre otros (Harvey, 2012). Estos medicamentos son efectivos en la reducción de los síntomas de la depresión. Sin embargo presentan restricciones dietarias (evitar el consumo de alimentos con tiramina) y efectos menos severos como sedación, boca seca y ganancia de peso (Harvey, 2012).
- Inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina (ISRSs): En 1980 se introducen los inhibidores selectivos de la recaptación de la serotonina (ISRSs), estos medicamentos aumentan los niveles de 5-HT específicamente, sin presentar efectos en los otros sistemas de neurotransmisión (Potokar & Thase, 2003). Los ISRSs inhiben específicamente la recaptación de la serotonina bloqueando selectivamente los transportadores de serotonina, de esta manera se garantiza una mayor concentración de la serotonina en el espacio sináptico, dando el efecto antidepresivo. Algunos fármacos pertenecientes a este grupo son fluoxetina, sertralina, paroxetina, fluvoxamina y citalopram (Harvey, 2012). Estos fármacos no presentan cardiotoxicidad como los grupos de medicamentos anteriormente mencionados, adicionalmente son relativamente seguros a altas dosis; a pesar de esto, los efectos secundarios incluyen agitación, ansiedad, ataques de pánico, insomnio, disfunción sexual entre otros, lo que es desagradable para los pacientes y hace que la adherencia al tratamiento farmacológico sea menor (Potokar & Thase, 2003). 7
Finalmente hacia 1990 aparece un grupo diferente de medicamentos antidepresivos que presentan una accion dual, los inhibidores de la recaptación de la serotonina/ noradrenalina (IRSN). Dentro de este grupo se destacan la desvenlafaxina, dutoxetina y venlafaxina (Potokar & Thase, 2003). Estos fármacos son efectivos en el tratamiento de los sintomas asociados con dolor crónico en pacientes depresivos (Harvey, 2012).
1.1.2 Productos naturales como alternativa terapéutica
Los extractos de plantas presentan un gran número de metabolitos. La actividad biológica del extracto se puede incrementar por efectos sinérgicos entre los metabolitos presentes. Estos metabolitos pueden actuar de diferentes maneras, al modificar la absorción, distribución, metabolismo y excreción de los contituyentes bioactivos, siendo una alternativa al empleo de una sola molécula purificada (Sarris et al., 2011).
La mayoría de las plantas empleadas para el tratamiento de la depresión, aunque presentan efectos secundarios, no son tan marcados en comparación con los antidepresivos convencionales descritos previamente (Sarris et al., 2011). Lo anterior genera una mayor percepción de seguridad por parte de los pacientes (Saki et al., 2014).
Las plantas Rhodiola rosea, Croccus sativus, Echium amoenum, Lavandula spp., Panax ginseng, Albizia jullbrissin e Hypericum perforatum han sido empleadas para el tratamiento de la depresión y cuentan con evidencia experimental que confirma su actividad (Dwyer et al., 2011) (Figura 1-2). Algunos de los mecanismos de acción reportados para estas especies son la inhibición de la recaptación de las monoaminas (serotonina, dopamina y noradrenalina), modulación de la unión de los ligandos a los receptores de la serotonina, inhibición de la monoaminooxidasa y modulación neuroendocrina (Sarris et al., 2011). De particular interés resulta Hypericum perforatum, especie medicinal europea que es indicada para el tratamiento de la depresión y que cuenta estudios clínicos que validan sus efectos (Maher et al., 2016). 8 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Figura 1-2. Plantas empleadas para el tratamiento de la depresión, tomado y adaptado de (Sarris et al., 2011). 9
1.2 Generalidades del Género Hypericum
La familia Hypericaceae esta conformada por tres tribus: Cratoxyleae que cuenta con 7 especies, Hypericeae con 494 especies y Vismieae con 102 especies (Nürk, 2011). Según estudios filogenéticos moleculares, esta familia comprende nueve géneros (Cratoxylum, Eliea, Harungana, Hypericum, Lianthus, Santomasia, Thornea, Triadenum, Visnia). Sin embargo, el 80% de la diversidad de este grupo se encuentra representada por el género Hypericum (Crockett, & Robson, 2011).
El género Hypericum cuenta con 469 especies, distribuidas por todo el hemisferio norte, en los Ándes, Sur de Africa, sureste de Asia y pocas especies se concentran en Australasia y Oceanía. El principal centro de diversidad de Hypericum se da en el área paleártica y en el neotrópico donde el 45% y el 30% de las especies descritas son nativas (Nürk, 2011) (Figura 1-3).
Figura 1-3.Distribución del género Hypericum en el mundo, tomado y adaptado de (Nürk, 2011).
Este género se encuentra agrupado en 36 secciones taxonómicas definidas por características morfológicas y rangos de distribución biogeográfica. Dentro de estas secciones destacan; la sección Hypericum con 42 especies distribuidas en Europa, África, Asia y América; la sección Brathys que cuenta con 87 especies distribuidas en Centroamérica, Sudamérica e islas del caribe; y la sección Trigynobrathys con 52 1 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en 0 modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth). especies encontradas en Sudamérica, sur de Canadá, este y sureste de Asia, Hawaii, Australia, Nueva Zelanda y Europa (Crockett, & Robson, 2011).
Las especies de este género se caracterizan por ser árboles, arbustos o hierbas, con hojas que pueden tener una disposición opuesta, composición simple, con margen entero sin estípulas con secreciones translúcidas a negras (Glandulas translúcidas y/o Glandulas negras), flores amarillas pentámeras con pétalos libres y varios estambres en 3 a 5 fascículos, estilos libres y el fruto capsular dehiscente con semillas cafés a negras (Ernst, 2003).
1.2.1 Química y actividades biológicas reportadas para el género Hypericum
El género Hypericum ha sido ampliamente estudiado desde el punto de vista químico en casi todas las secciones, aún así, se desconoce la composición química de aproximadamente el 60% de las especies (Crockett, & Robson, 2011). Algunos ejemplos relacionados con su composición química, de acuerdo a la sección de donde se agrupan, son: Para H. strictum, perteneciente a la sección Brathys (misma sección de H. juniperinum), se han reportado antraquinonas y flavonoides. Para H. laricifolium, de la misma sección, se han reportado xantonas, ácido caféico, triterpenos, derivados de ácido benzóico y cinámico. Por otro lado, para H. brasiliense, especie que se encuentra en la sección Trigynobrathys, se han reportado flavonoides, xantonas, derivados de fluoroglucinol y terpenos (Crockett et al., 2010). Finalmente para H. maculatum de la sección Hypericum se ha encontrado flavonoides, ácido clorogénico, hipericinas pseudohipericinas e hiperforinas, las ultimas en baja cantidad (Rusalepp et al., 2017). Lo anterior demuestra que, dependiendo de la sección en que se encuentre la especie son los tipos de metabolitos que esta produce.
Diversos artículos de revisión documentan numerosas actividades para especies del género Hypericum. Dentro de las principales actividades referenciadas se encuentra la evaluación de sus propiedades como antidepresivo, antiviral, antimicrobiano, antiinflamatorio y cicatrizante (Greeson et al., 2001; Ernst, 2003; Saddiqe et al., 2010; Stojanovic et al., 2013). Algunos de los metabolitos secundarios asociados a estas actividades son: hipericina y pseudohipericina (naftodiantronas) presentan actividad 11 antiretroviral, hiperforina y adhiperforina (derivados de fluoroglucinol) se relacionan con las propiedades antidepresivas; y los flavonoides se asocian con inhibición enzimática, antiinflamatorios, gastroprotectores y antidepresivos (Stojanovic et al., 2013) (Figura 1- 4). Hypericum perforatum es quizás la planta más destacada de este género, por lo que a continuación se da una breve descripción de la misma en el aspecto químico y su actividad de tipo antidepresivo.
Figura 1-4. Actividades reportadas en el Género Hypericum, tomado y adaptado de (Stojanovic et al., 2013; Russo et al., 2014). 1 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en 2 modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
1.2.2 Hypericum perforatum L.
La especie Hypericum perforatum (Hypericaceae), conocida popularmente como hierba de San Juan (en inglés St John´s wort), ha sido reconocida desde la antigüedad por sus propiedades medicinales. Destaca que Paracelso la empleaba para tratar heridas, parásitos y desórdenes psicóticos sin embargo, no lo describía como antidepresivo. Solo fue hasta el año 1630 que Angelo Sala reporta su uso para el tratamiento de la “melancolía” o la depresión. En el año 1900 se introdujo como antidepresivo y desde la publicación de la monografia Alemana en 1984 se inicia el proceso de validación de su actividad (Müller, 2005). Esta planta presenta una amplia distribución que va desde las islas Azores hasta China y desde la región mediterránea hasta los Himalayas. H. perforatum, se caracteriza por ser una hierba perteneciente a la sección Hypericum, que presenta glándulas negras en su tallo, hojas y flores. Las hojas son sésiles o con pecíolos cortos, glándulas translúcidas en la lámina foliar, inflorescencias con flores de tamaños entre 15 a 35mm de diámetro, pétalos amarillos, con ovario trilocular, tres estilos libres y estambres fasciculados (Ernst, 2003).
Los metabolitos característicos de esta especie son hipericina, pseudohipericina e hiperforina, además de las biflavonas ( I3, II8 biapigenina y amentoflavona), flavonoides (quercetina) y los glicósidos de flavonoides (rutina, hiperósido, isoquercitrina y quercitrina). Es importante resaltar que el flavonoide rutina se emplea como marcador para la autentificación química del extracto vegetal (Crockett, & Robson, 2011) (Figura 1- 5). Los anteriores metabolitos se encuentran principalmente en la sección Hypericum. Para el caso de las especies pertenecientes a las secciones Brathys y Trigynobrathys, se ha demostrado que ambas carecen de hipericina, pseudohipericina e hiperforina. Por otra parte si se ha demostrado la presencia de acilfluoroglucinoles diméricos, compuestos que los autores consideran unos posibles marcadores quimiotaxonómicos para estas dos secciones (Crockett, & Robson, 2011; Ccana-Ccapatinta et al., 2013).
La especie H. perforatum se encuentra incluida en la Farmacopea Europea y en la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) y en ambas es indicada para el tratamiento de la depresión, cura de heridas, eccema y tratamiento de quemaduras (Committee on herbal medicinal products , 2009). La actividad antidepresiva de extractos, moléculas aisladas y fracciones enriquecidas en flavonoides ha sido reportada en estudios in vivo 13
(Butterweck et al., 2000; Committee on herbal medicinal products, 2009; Russo et al., 2014; Ramalhete et al., 2016).
Figura 1-5.Metabolitos encontrados en el género Hypericum.
Clínicamente se ha demostrado que Hypericum perforatum controla la depresión leve y moderada (Maher et al., 2016). Adicionalmente, el extracto de H. perforatum es considerado seguro aunque presente efectos adversos e interacciones con 1 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en 4 modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth). medicamentos (Committee on herbal medicinal products, 2009). Algunos de los efectos adversos que se han descrito son: irritaciones gastrointestinales, reacciones alérgicas y fatiga con una incidencia de 2% a diferencia de los antidepresivos (ISRS) que presentan una incidencia entre el 20 y 50% con otros efectos secundarios más serios tales como efectos cardiacos, disfunción sexual, mareo, entre otros (Committee on herbal medicinal products, 2009). La hiperforina (0.5 a 6 %) es uno de los constituyentes del extracto a los que se le atribuye la actividad antidepresiva, con un mecanismo de acción mixto similar a los antidepresivos tricíclicos y a los inhibidores de retoma de la serotonina (IRSS) (Ramalhete et al., 2016). Sin embargo, extractos que no contienen hiperforina, pero si presentan flavonoides, mantienen la actividad antidepresiva en modelos farmacológicos murinos (Butterweck, 2003; Wang et al., 2010).
1.2.3 Género Hypericum en Colombia
En la cordillera de los Andes existe una mezcla compleja de hábitats que van desde praderas secas y húmedas hasta pantanos acídicos y turberas (Crockett et al., 2010). En los páramos colombianos se encuentran más de 4700 especies de plantas, que representan el 17% de la diversidad florística en Colombia. Dichas especies presentan una distribución limitada a pocas localidades o son endémicas. Según el catálogo de plantas y líquenes de Colombia reportado por (Bernal et al., 2015); hay 54 especies de Hypericum en el territorio colombiano. Por otra parte, de las 469 especies de Hypericum, solo 132 especies cuentan con algún estudio publicado, lo que implica que aún falta por conocer el potencial de este género (Stojanovic et al., 2013). Teniendo en cuenta que H. juniperinum no cuenta con investigaciones relacionadas con química, anatomía ni actividad sobre el sistema nervioso central, particularmente antidepresiva, consideramos interesante estudiar esta planta nativa desde estas perspectivas.
1.2.4 Hypericum juniperinum (L.f.)Kunth
La planta Hypericum juniperinum K. especie nativa de los páramos colombianos (Robson, 2015), se caracteriza por ser un arbusto de 0.2 a 2.5 metros de alto, con tallos de coloración café a naranja, las hojas son sésiles persistentes en el tallo, presenta flores de 4 a 12 mm con pétalos de color amarillo pálido, esta se encuentra en bosques abiertos y en áreas pantanosas del páramo y subpáramo entre los 2200 a 3800 m 15
(Pattinson, 2017). En Colombia, H. juniperinum presenta los siguientes nombres comunes: Chite (Antioquia, Boyacá, Cauca, Cundinamarca y norte de Santander), guardarocio (Cauca) y Escobo (diferentes regiones de Colombia), (Bernal et al., 2015).
H. juniperinum se encuentra distribuida en la región andina y en la sierra nevada de Santa Marta, además de los departamentos de Antioquia, Boyacá, Caldas, Cauca, Chocó, Cundinamarca, Huila, Meta, Magdalena, Norte de Santander, Santander, Putumayo y Tolima (Figura 1-6) (Bernal et al., 2015). Hypericum juniperinum, solo cuenta con artículos relacionados con su ecología (Crockett et al., 2010) y un artículo publicado recientemente que evalúa su actividad antimicrobiana (Plazas, 2017). En cuanto a sus usos tradicionales, las comunidades reportan el uso de las flores para tratar la tos, además de emplear las ramas como escobas, para hacer fuego y como protector de zonas húmedas (Duarte, & Parra, 2015).
Figura 1-6. Distribución de Hypericum juniperinum (L.f.) Kunth en Colombia, tomada y modificada de (Bernal et al., 2015). 1 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en 6 modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
2. Justificación
Las especies del género Hypericum son reconocidas por presentar propiedades antimicrobianas, antidepresivas y/o anti-inflamatorias. De todas ellas, únicamente Hypericum perforatum es empleada oficinalmente, aunque no sea la que presenta la mayor cantidad de constituyentes activos (Stojanovic et al., 2013). En consonancia con lo anterior, se postula que Hypericum juniperinum, una planta nativa de nuestros páramos colombianos, debido a su relación quimiotaxonómica es posible que presente efectos sobre el sistema nervioso central, probablemente asociados con una actividad antidepresiva. Por otro lado, H. juniperinum no cuenta con estudios que describan su composición química, ni su morfo anatomía, ni la evaluación de los efectos de ésta en el sistema nervioso central. Lo anteriormente expuesto representa una oportunidad para establecer el potencial terapéutico de H. juniperinum como una alternativa para el tratamiento de la depresión. 3. Objetivos
3.1 Objetivo General Caracterizar morfo-anatómicamente, químicamente y evaluar la actividad sobre sistema nervioso central en modelo murino del extracto metanólico de la planta Hypericum juniperinum
3.2 Objetivos Específicos
- Analizar histológicamente las estructuras presentes en los órganos aéreos de Hypericum juniperinum. - Determinar estructuralmente algunos de los constituyentes químicos del extracto metanólico de Hypericum juniperinum. - Evaluar la actividad sobre sistema nervioso central en modelo murino del extracto crudo y las fracciones de Hypericum juniperinum. 18 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
4. Materiales y Métodos
4.1 Estudio Morfoanatómico
4.1.1 Histología de los órganos aéreos de Hypericum juniperinum
Los órganos aéreos (tallos, hojas y flores) de Hypericum juniperinum fueron fijados en una solución de FAA (10:5:85, formol: ácido acético: EtOH 70%) por 48 h y posteriormente fueron tratados con los protocolos convencionales de Johansen, (1940), modificados de la siguiente manera: deshidratación en series de EtOH, 70% por 24 horas, 90%, 96%, 100% por 4 horas c/u; series de EtOH 100% etanol:histochoice® (agente aclarante) en serie Histoclear (90:10, 70:30, 50:50, 30:70, 100, 100); imbibición en parafina (paraplast plus, 60 ºC) tres veces por 24 horas c/u. Se realizaron secciones seriadas o individuales de 7 µm de grosor en un micrótomo de rotación (820 Spencer, American Optical Company, NY) y fijación en láminas con aplicación del reactivo de Haupt. Las láminas se colocaron en horno a 60ºC por 24 horas, luego se desparafinaron mediante dos pasos por xilol 100%, EtOH 50 : xilol 50 por 3 minutos (x2), seguido por hidratación en series de EtOH 100%, 95%, 70%, 50%, agua destilada por 2 minutos y tinción con astra-blue acidificado (1g/100 mL de 2% en ácido tartárico) para tinción azul de polisacáridos de pared celular primaria como celulosa y pectinas por 10 minutos, seguido por un lavado en agua destilada por 2 minutos y contratinción con fucsina básica etanólica (0,1 g/100mL en etanol al 50%) por 20 minutos para tinción roja de las paredes lignificadas y suberificadas, seguido de lavado en agua destilada por 15 segundos. Después de la tinción se realizó una deshidratación en series de EtOH (50%, 70%, 95%, 100%, 100%; 1 minuto c/u) y de etanol: xilol (70:30, 50:50; 2 minutos c/u), xilol 100% 2 veces por 3 minutos. Al final del proceso se adicionó citoresina sobre los portaobjetos, se 19 montó el cubreobjetos y se dejó secar al aire durante 2 semanas. Por último, se tomaron fotos de los cortes en un microscopio Olimpus BX50® con moticam pro 2828 en diferentes aumentos, indicados con barras de escala.
4.1.2 Histoquímica de los órganos aéreos de Hypericum juniperinum
A tallos, hojas y flores frescas de H. Juniperinum se les realizaron cortes a mano alzada y se llevaron a cabo tinciones diferenciales según lo descrito por (Ruzin, 1999) y (Johansen, 1940). Los cortes se observaron en un estereoscopio Leika M-205 en modo multifocus con una cámara MC 170 HD en diferentes aumentos y se tomaron fotos, donde mediante la coloración característica se detectan algunos de los metabolitos. En la Tabla 1 se presentan las tinciones realizadas.
Tabla 1.Tinciones diferenciales realizadas en órganos aéreos de Hypericum juniperinum.
Metabolitos Resultado Metodología Lípidos, cutina y Sudan IV: coloración roja Los cortes realizados se tiñen con suberina en zonas con presencia del sudan IV por 5 min, luego se lavan
metabolito con H2O destilada y se observan directamente Lípidos, cutina y Sudan III: coloración A los cortes realizados se les suberina naranja en zonas con adiciona una mezcla de Sudan III presencia del metabolito 0.5% en etanol al 70% Cutina y suberina, Sudan Black: coloración A los cortes realizados se les fosfolípidos, aceites negra en zonas con añade una solución de sudan Black esenciales presencia del metabolito ( 70% EtOH+ Sudan Black 0.007g)
Fenoles FeCl3: coloración café A los cortes realizados se les
oscuro- negro adiciona FeCl3 12% (0.12g en 10 mL de EtOH) Lignina (ácidos y Fluoroglucinol: coloración A los cortes realizados se les alcoholes rojiza en zona con la adiciona fluoroglucinol al 1% en fenilpropílicos) presencia del metabolito EtOH 96%, luego se les adiciona HCl al 25% Flavonoides, KOH: coloración roja en A los cortes realizados se les 20 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth). glicósidos zona con presencia del adiciona una solución de KOH al antracénicos metabolito 10% en etanol, luego se lava con agua destilada Alcaloides Dragendorff : coloración Se aplica el reactivo de dragendorff naranja-rojiza en presencia a los cortes y se evalúa la de alcaloides presencia de color Pectinas Rojo rutenio: coloración Se adiciona una solución de rojo de rojiza o rosada en zona con rutenio al 0.02% en agua destilada, presencia del metabolito luego se lava y se observa en el microscopio
4.2 Estudio Fitoquímico
4.2.1 Material vegetal
Las partes aéreas (tallo, hojas y flores) de Hypericum juniperinum fueron recolectadas en el periodo de época seca en la Vereda Arbolocos, del municipio Cuitiva, Boyacá. El material vegetal fue clasificado taxonómicamente por especialistas del Herbario Nacional Colombiano (COL) de la Universidad Nacional de Colombia y se depositó un ejemplar con el siguiente número de voucher (COL589611). El resto del material vegetal de Hypericum juniperinum, se secó en una estufa de aire recirculante a 40 ° C y se trituró con cuchillas en una licuadora (Hamilton Beach, Comercial) para su posterior procesamiento.
4.2.2 Extracción y Fraccionamiento
El material seco (1243 g) se humedeció con un volumen de 1.5 L de metanol al 80%. Se realizaron 3 procedimientos de extracción por percolación hasta agotamiento, evidenciado por CCD. A los extractos fluidos obtenidos se les redujo el volumen mediante presión reducida empleando un rotaevaporador a una temperatura de 40°C y 60 rpm, seguido a esto el extracto se llevó a un baño de María a 50°C hasta sequedad completa, obteniendose un total 395,58 g. 21
Finalmente se tomaron 100 g del extracto y se realizó un fraccionamiento líquido- líquido siguiendo la metodología descrita por Kupchan, adaptada de (Otsuka, 2006) (Figura 4-1), donde se obtuvo la fracción hexánica (1.019 g) 1.3%, fracción clorofórmica (6.774 g) 8.9%, la fracción de acetato de etilo (20.126 g) 26.3%, butanol (34 g) 45.6% y la fracción acuosa (13.721 g) 18%.
Figura 4-1. Esquema de fraccionamiento líquido-líquido por la metodología Kupchan modificada por (Otsuka, 2006).
4.2.3 Pruebas fitoquímicas preliminares de Hypericum juniperinum
Teniendo en cuenta la metodología reportada por (Salama, & Calle, 2005); se evaluaron los siguientes grupos de metabolitos: Alcaloides (Prueba de Mayer, Valser y Dragendorff), esteroides-glicósidos cardiotónicos (Lieberman-Burchard, Reacción de kedde, ensayo para digitoxosa, Keller-Kiliani. Vainillina/ácido sulfúrico en CCD), flavonoides (Shinoda, leucoantocianidinas y cloruro férrico. NP-PEG en CCD), saponinas
(espuma), taninos (gelatina sal, FeCl3), antraquinonas (Borntrager-Kraus y KOH en placa). 22 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
4.2.4 Aislamiento y purificación de compuestos de H. juniperinum
La purificación de los metabolitos se llevó a cabo mediante técnicas cromatográficas convencionales. Para la cromatografía en capa delgada (CCD) se utilizaron placas de silica gel F254 (0.2 mm) marca Merck®. Para la detección de los compuestos se empleó luz UV o los reactivos de aspersión vainillina al 1% en etanol y ácido sulfúrico 10% y NP-PEG (NP- 0.25g de Ácido difenilbórico aminoetilester en 25 mL metanol, PEG-1.25 g de Polietilenglicol 4000 en 25 mL de Etanol ). La cromatografía en columna (CC) se llevó a cabo empleando Sephadex LH-20 100 marca Sigma- Aldrich® y sílica gel 60 marca Merck® como fases estacionarias. Como fase móvil se emplearon mezclas de solventes de diferente polaridad (hexano, cloroformo, acetato de etilo y metanol, entre otros). Las fracciones fueron reunidas de acuerdo al seguimiento realizado por CCD.
Los compuestos purificados se analizaron por RMN (resonancia magnética nuclear). Estos espectros de 1H- y 13C-RMN fueron registrados en dimetilsulfóxido (DMSO-d6) Merck®, empleando un espectrómetro Bruker DRX® de 400MHz (1H a 400 MHz; 13C 100 MHz). Los desplazamientos químicos (δ) se reportan en ppm en relación con las señales del solvente (DMSO). Las constantes de acoplamiento (J) se reportan en Hz. Los espectros de 1D (1H, 13C, APT) y 2D (COSY, HMQC,HMBC) fueron llevados a cabo para la determinación de las estructuras. Los espectros fueron procesados en el programa Mes-RecNova. El espectro de Infrarojo (IR) fue realizado en pastillas de KBr empleando un espectrofotómetro (IR Affinity Shimatzu). El espectro de ultravioleta (UV) fue registrado por un lector UV/VIS Spectrophotometer Optizen pop. Las lecturas fueron realizadas en un rango de longitud de onda de 200 a 500 nm. Finalmente, los datos de espectrometria de masas fueron obtenidos en un equipo LCQ Fleet™ Ion Trap Mass
- + Spectrometer, equipado con ionización electrospray (ESI) en modo [M-H] [M-H] y MS/MS. 23
4.3 Estudio Farmacológico
4.3.1 Animales
Para el presente estudio se emplearon ratones albinos ICR machos de 7 a 9 semanas con pesos entre 25 a 40 g. Estos fueron suministrados por el Bioterio del Departamento de Farmacia de la Universidad Nacional de Colombia. Para la evaluación del extracto metanólico, así como de las fracciones obtenidas a partir de este; los ratones se distribuyeron en grupos de 6 por caja. Los animales permanecieron en un ciclo de 12 horas luz y 12 horas de oscuridad, con consumo de alimento y agua a voluntad. Posterior a un ayuno de 5 a 6 horas se inició la administración con los correspondientes tratamientos a evaluar. El protocolo empleado para las pruebas realizadas en el presente trabajo fue aprobado por el comité de ética de la Universidad Nacional de Colombia.
4.3.2 Reactivos pruebas farmacológicas
Para los diversos ensayos, se emplearon como controles positivos los siguientes fármacos: 1. Ansiolítico: Clonazepam (Coquan®) en solución oral, 2. Antidepresivo: Imipramina marca Sigma®, 3. Anticonvulsivante: Fenitoina sódica marca Sigma®, 4. Patrón de Hypericum: Extracto estandarizado de Hypericum perforatum (OKEY®) y finalmente para el ensayo potenciación del sueño barbitúrico se empleó el pentobarbital sódico (Penthal®).
4.3.3 Preparación, dosis empleadas y administración de tratamientos
Los tratamientos empleados se prepararon el día de la realización de las pruebas, adicionalmente fueron administrados en un volumen de 0.1mL/10g de peso del animal en todos los casos: Vehículo de administración, extracto metanólico de Hypericum juniperinum y extracto de Hypericum perforatum en 3 dosis (150, 300 y 500 mg/kg), fracción de acetato de etilo y butanol de Hypericum juniperinum en 2 dosis (150 y 300 mg/kg), clonazepam (dosis de 0.3mg/kg), imipramina (dosis de 35 mg/kg) y fenitoína sódica (20 mg/kg) por vía oral (v.o). Finalmente, pentobarbital sódico (45 mg/kg) por vía intraperitoneal (ip). 24 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Los extractos y fracciones de H. juniperinum junto con el extracto estandarizado de Hypericum perforatum (OKEY®), el patrón clonazepam, imipramina y fenitoína sódica, fueron solubilizados en un vehículo que estaba constituido por 10% de propilenglicol, 10% de glicerina, 2% de polisorbato 80 (Tween-80) y 78% agua destilada para completar el volumen. El pentobarbital sódico fue disuelto en solución salina al 0.9%.
4.3.4 Esquema de realización pruebas farmacológicas
La evaluación farmacológica se realizó en dos fases. En la primera fase se evaluaron 3 dosis del extracto metanólico de H. juniperinum (150, 300 y 500 mg/kg)(Figura 4-2.) y en la segunda fase se evaluaron las fracciones de acetato de etilo y butanol a dos dosis de 150 y 300 mg/kg (Figura 4-3). Previo al inicio de las pruebas, los animales permanecieron en un periodo de adaptación al experimentador de una semana, posteriormente fueron clasificados según la actividad exploratoria basal empleando los modelos de campo abierto y tablero agujereado en la fase 1 y 2 respectivamente, permitiendo distribuir los animales en seis grupos heterogéneos según actividad exploratoria basal (en todos los tratamientos quedaron animales muy exploradores como poco exploradores), con estas pruebas se balanceó la variable de actividad locomotora basal propia de cada animal.
Cada animal recibió una dosis diaria de su correspondiente tratamiento durante más de una semana; después de la segunda dosis administrada se inició el esquema de tratamiento de la siguiente manera, con la salvedad de una prueba por dia: Fase 1 (evaluación de extracto metanólico de H. juniperinum y H. perforatum a 3 dosis): suelo agujereado, nado forzado, suspensión por la cola, laberinto en cruz, potenciación del sueño barbitúrico y convulsión por electroshock. Fase 2 (evaluación de fracciones de acetato de etilo y butanol de H. juniperinum a 2 dosis): campo abierto, nado forzado, suspensión por la cola, laberinto en cruz, potenciación del sueño barbitúrico, convulsión por electroshock y el punto final del estudio. Para eliminar el efecto residual resultante de la administración de pentobarbital se dejó un intervalo de 7 días entre la prueba de potenciación del sueño y la de convulsión. Con esta batería de pruebas, se buscó determinar los efectos de los extractos sobre la actividad locomotora (suelo agujereado, campo abierto), los efectos de tipo antidepresivo (nado forzado, suspensión por la cola), de tipo ansiolítico (laberinto en cruz), sedante (potenciación del sueño barbitúrico) y anticonvulsivante (electroshock). Adicionalmente, para explorar posibles alteraciones 25 sobre la actividad motora, se aplicó la prueba del alambre, antes y después de la administración de los tratamientos.
Figura 4-2. Fase 1 del tamizaje farmacológico en sistema nervioso central (SNC) del extracto crudo, en 3 dosis empleadas (150, 300 y 500 mg/kg) de H. juniperinum, en el modelo murino.(Vectores ilustrativos tomados de freepik y Servier medical art). 26 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Figura 4-3. Fase 2 del tamizaje farmacológico en sistema nervioso central (SNC) de las fracciones del extracto de H. juniperinum en 2 dosis empleadas (150 y 300 mg/kg), en el modelo murino.(Vectores ilustrativos tomados de freepik y servier medical art).
4.3.5 Tamizaje farmacológico en sistema nervioso central en modelo murino
Teniendo en cuenta los reportes de actividad antidepresiva para plantas del género Hypericum (Committee on herbal medicinal products, 2009) se evalúo el extracto metanólico de H. juniperinum en 3 dosis y las fracciones de acetato de etilo y butanol en 2 dosis, ya que existen reportes de actividad en fracciones enriquecidas con flavonoides de H. perforatum (Butterweck et al., 2003; Bukhari, & Dar, 2013). A su vez estas fracciones se seleccionaron porque se obtuvieron en una considerable cantidad luego del fraccionamiento líquido-líquido. Siguiendo los protocolos reportados (Lapa et al., 2002), los extractos y las fracciones fueron evaluadas en los modelos que se describen a continuación:
. Prueba farmacológica para determinar alteraciones de la actividad motora: prueba del alambre
En este ensayo se posicionan los animales con las patas anteriores en un alambre que tiene 1 cm de diámetro y 15 cm de longitud a 20 cm de altura, se suelta el animal y se espera que logre con las patas posteriores agarrarse de este, se considera como ausencia de respuesta cuando los animales no logran agarrar el alambre 3 veces sucesivas, esta prueba se realiza antes y una hora después de la administración de los tratamientos.
. Pruebas farmacológicas para evaluar la actividad exploratoria
Prueba de campo abierto
Pasada una hora después de la administración por vía oral de cada tratamiento, los ratones se disponen en el centro de una caja de medidas (28 cm x 28 cm y de altura 28 cm) dividida en 16 cuadrantes, durante 5 minutos de observación se contabiliza el número de cruces en el centro y en la periferia. el cruce se define como el paso del ratón de un cuadrante a otro, al traspasar la línea blanca. El patrón utilizado fue clonazepam a 27 una dosis de 0.3 mg/Kg (v.o), del cual se espera un aumento en el número de cruces en el centro, debida a su actividad ansiolítica.
Prueba de tablero agujereado
Una hora después de la administración por vía oral de los tratamientos, los ratones se disponen en el centro de una caja que presenta 16 agujeros de 3.5 cm de diámetro, durante 5 minutos de observación se contabiliza el número de ingresos de la cabeza del animal al agujero (Head dippings). El patrón utilizado fue clonazepam a una dosis de 0.3 mg/Kg (v.o), se espera que el patrón tenga una reducción del número de head dippings.
. Pruebas farmacológicas para evaluar la actividad ansiolítica
Prueba de laberinto en cruz
Después de la administración por vía oral del tratamiento, cada ratón se dispone en el centro de un laberinto en cruz que presenta dos brazos abiertos y dos brazos cerrados, durante los 5 minutos de observación se registra la frecuencia de entrada en cada brazo y el tiempo de permanencia en cada uno de estos, junto con el tiempo de decisión. De esta manera se calcula el porcentaje de permanencia en cada zona. El patrón utilizado fue clonazepam en una dosis de 0.3 mg/Kg (v.o),de quien se espera un aumento en la permanencia en la zona abierta.
. Pruebas farmacológicas para evaluar la actividad antidepresiva
Prueba de nado forzado
Una hora después de la administración por vía oral del tratamiento, cada ratón es forzado a nadar individualmente durante 5 minutos dentro de un cilindro vertical de plástico (altura: 40 cm, diámetro: 18 cm) que contiene 15 cm de agua a 25°C. En este ensayo se registra el tiempo de inmovilidad, definido como el mínimo movimiento realizado por el animal para mantener la cabeza por fuera del agua y el tiempo de latencia que se define como el tiempo que tarda el animal en entrar en el primer estado de inmovilidad asociado con la desesperanza. El patrón empleado fue imipramina en una dosis de 35 mg/kg (v.o), el cual presentara una reducción del tiempo de inmovilidad, y un incremento del tiempo de latencia
Prueba de suspensión por la cola 28 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Una hora después de la administración del tratamiento, los animales fueron suspendidos en el borde de un estante (altura: 20 cm, ancho por cuadrante: 12,5 cm), con cinta adhesiva colocada en zona media de la cola (5 cm), la duración de la inmovilidad fue evaluada durante un periodo de 5 minutos. El patrón empleado fue imipramina en una dosis de 35 mg/kg (v.o), el cual presentara una reducción del tiempo de inmovilidad, y un incremento del tiempo de latencia.
. Pruebas farmacológicas para evaluar la actividad sedante: Prueba de potenciación del sueño barbitúrico.
Una hora después de la administración de cada tratamiento por vía oral, los ratones fueron inyectados con pentobarbital sódico en una dosis de 45 mg/kg (i.p), en este ensayo se evaluó el tiempo de latencia (tiempo donde hay pérdida de reflejo de enderezamiento) y el tiempo de duración de sueño (adquisición del reflejo de enderezamiento). El patrón utilizado en esta prueba fue clonazepam en una dosis de 0.3 mg/Kg (v.o), el cual presentara un incremento en la duración del sueño y una reducción en la latencia del mismo.
. Pruebas farmacológicas para evaluar la actividad anticonvulsivante: Prueba de convulsiones inducidas por electroshock máximo
Para esta prueba, y posterior a una hora de administración del tratamiento, a los animales se les adicionó solución salina al 0.9% en las córneas, luego se les aplicó una descarga eléctrica de 50 mA de corriente alterna de 60 Hz, durante 0.2 ms con un estimulador de marca Coulbourn instruments®. En este caso se asume como protección la ausencia de extensión tónica de las extremidades posteriores en un ángulo superior a 45°. El patrón empleado fue fenitoina sódica en una dosis de 20 mg/kg (v.o), de quien se espera una ausencia de la convulsión.
4.3.6 Consideraciones éticas
Los experimentos ejecutados en el presente trabajo se realizaron teniendo en cuenta la Ley N° 84 de 1989 “Por la cual se adopta el Estatuto Nacional de Protección de los Animales”, principalmente los artículos 23, 24, 25 y 26, y lo establecido por la resolución 008430 DE 1993 “por la cual se establecen las normas científicas, técnicas y administrativas para la investigación en salud”, en el título V, artículo 87 al 94. Teniendo 29 en cuenta que los resultados experimentales del presente proyecto no se pueden obtener por otro procedimiento, no pueden ser sustituidos por otros procedimientos análogos como cultivo de tejidos, modelos computarizados, etc.; y los presentes experimentos son necesarios para el control, prevención, diagnóstico o tratamiento de enfermedades que afectan al hombre.
Se tuvieron en cuenta los principios éticos internacionales para la investigación biomédica con animales- CIOM (Consejo Internacional de Organizaciones Médicas). Estos animales fueron tratados como seres sensibles, se cuidaron y se emplearon adecuadamente evitando o minimizando las molestias, la angustia y el dolor, dándoles las mejores condiciones de vida posible; en el punto final del estudio, se aplicó la eutanasia de los animales según las guias de AVMA. Al momento de concluir el presente trabajo los animales fueron dispuestos siguiendo los lineamientos del programa de gestión ambiental de la Universidad Nacional de Colombia en cuanto al manejo de residuos.
4.3.7 Análisis de datos
Los datos se expresan como el promedio (de una muestra de seis animales por grupo) +/- ems (error estándar del promedio). Previo examen de los criterios paramétricos de distribución normal (prueba de Shapiro Wilk) y homogeneidad de varianzas (prueba de Barlett), se procedió a un análisis de varianza de una vía, seguido de la prueba diferencias múltiples de Tukey. Cuando los supuestos paramétricos no se alcanzaron se aplicó la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de diferencias de Wilcoxon. Se asumió una p<0,05. Para el análisis de los datos se empleó el programa estadístico de R- Studio. De esta manera se determinaron las diferencias significativas entre tratamientos. 30 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth). 5. Resultados y discusión.
5.1 Estudio Morfoanatómico de H. juniperinum (Kunth).
Hypericum juniperinum es una planta con hábito arbustivo (Figura 5-1A), hojas sésiles, erectas, imbricadas (Figura 5-1 B y 5-1 C), la lámina foliar acicular, con un ápice agudo, las glándulas laminares se aprecian como redondeadas a simple vista (Figura 5-1D), presenta flores terminales solitarias, aisladas en pares (Figura 5-1 A); las flores presentan tamaños de 5 mm en adelante (Figura 5-1B, 5-4 A), con sépalos lanceolados (Figura 5-4 A), pétalos de color amarillo intenso, oblongos con apice apiculado (Figura 5- 4 A), los estambres son de color amarillo, alargados hasta 5 mm de largo, el ovario presenta una forma ovoide (Figura 5-4G), con 4 estilos.
Figura 5-1. Morfología de Hypericum juniperinum. A. Hábito de la planta, tomado de (Flickr, 2007), B. Disposición de las hojas y flor, C. Distribución de las hojas, D. Longitud y forma de las hojas, glándulas redondeadas (Línea azul). 32 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
5.1.1 Tallo de Hypericum juniperinum (Kunth).
El tallo de Hypericum juniperinum presenta una prominente capa de súber (Su), conformada de varias capas de células rectangulares, también se aprecian las lenticelas (Le) como una proliferación de células laxas; seguido de esto aparece la corteza parenquimática, luego el floema secundario (Fl) y luego el xilema (Xi), entre estas 2 capas se encuentra el cambium, lo que determina el crecimiento secundario de este tallo. Finalmente se puede apreciar la médula (Me) con células espaciadas entre si (Figura 5- 2A). El xilema está caracterizado por vasos de tipo reticulado (Vr) y perforados (Vp) (Figura 5-2B), adicionalmente se encuentra rodeado por filas de parénquima radial (Pra) que presentan sustancias de tipo oleoso (Figura 5-2C), en esta muestra no se observan anillos de crecimiento. En el análisis histoquímico se observó que los reactivos de sudan IV, sudan III y sudan black reaccionan con la suberina del tallo y ciertos aceites de la muestra dando una coloración roja para las dos primeras tinciones (Figura 5-2D y E) y negra para la última (Figura 5-2F). Los aceites se almacenan en parénquima radial a manera de tilides. En cuanto al reactivo de cloruro férrico se observó una coloración negra, a lo largo del floema, asociada a la presencia de sustancias de tipo fenólico (Figura 5-2G). En la tinción con fluoroglucinol se observa una coloración rosada-roja intensa en el xilema del tallo, siendo positiva para paredes lignificadas (Figura 5-2H). Para el caso de la tinción con KOH se observa una coloración roja a lo largo del tallo sin ubicación preferencial, esta coloración podría estar asociada a ciertos flavonoides y/o compuestos antraquinónicos (Figura 5-2I). No hubo presencia de alcaloides en los cortes realizados en el tallo con la tinión de dragendorff. Finalmente, la muestra de tallo de Hypericum juniperinum presenta pectina en los vasos del xilema del tallo, dando una coloración rosada con el reactivo de rojo de rutenio (Figura 5-2J), estos cortes se comparan frente al blanco (Figura 5-2K).
33 34 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Figura 5-2. A. Corte transversal del tallo de Hypericum juniperinum. Disposición general de los diferentes tejidos. Abreviaturas. Le: Lenticelas, Su: Súber, Me: Médula, Xi: Xilema, Fl: Floema. B. Disposición de los vasos y fibras en corte longitudinal Vr: Vasos reticulados, Vp: Vasos perforados, Pra: Parénquima radial. C. Almacenamiento de 35 sustancia oleosa Ac: Aceite en radios de parénquima. D. Tinción de sudan IV. E. Tinción de sudan III. F. Tinción de sudan Black. G. Tinción de cloruro férrico. H. Tinción con fluoroglucinol. I. Tinción con KOH. J. Tinción con rojo de rutenio. K. Tallo sin tinción (Blanco de tinción).
5.1.2 Hoja de Hypericum juniperinum (Kunth).
Las hojas de Hypericum juniperinum se encuentran dispuestas alternamente en forma arrosetada, carece de tricomas y presenta estomas de tipo anomocítico que se encuentran en la cara adaxial (epistomática) (Figura 5-3A y 5-3B), estas hojas están conformadas externamente por una cutícula gruesa (Cu) que recubre todas las células de la epidermis (Ep) en ambas caras de la hoja, dichas células son redondeadas. Seguida de esta se encuentra el parénquima en empalizada (Pe) que está presente a lo largo de toda la hoja (mesófilo homogéneo de tipo empalizada) con células de forma rectangular, el haz vascular (Hv) que presenta xilema (Xi) y floema (Fl), y está rodeado por parénquima a manera de una vaina (Pv), la hoja presenta canales tipo B (Cn) con células aplanadas (Figura 5-3C y 5-3D). En el análisis histoquímico se apreció que los reactivos de sudan IV, sudan III y sudan black reaccionan con la cutina presente en la epidermis (Ep) de la hoja y ciertos aceites presentes en la muestra dando una coloración roja para las dos primeras tinciones (Figura 5-3 E y 5-3F), y negra para la última prueba (Figura 5- 3G), adicionalmente esta dio positiva en los canales (Cn). En cuanto al reactivo de cloruro férrico se observó una coloración negra, a lo largo de todos los tejidos de la hoja mostrando presencia de sustancias de tipo fenólico sin ubicación específica (Figura 5- 3H). Por otra parte, en la tinción de fluoroglucinol se observa una coloración rosada-roja intensa en el haz vascular (Hv), siendo positiva para paredes lignificadas (Figura 5-3I). Para el caso de la tinción con KOH se observa una coloración roja en el parénquima empalizada de la hoja, esta coloración puede estar asociada a ciertos flavonoides y/o compuestos antraquinónicos (Figura 5-3J). No se encontraron alcaloides en los cortes realizados y teñidos mediante el reactivo de dragendorff. Finalmente la muestra de tallo de Hypericum juniperinum presenta pectina en el parénquima de vaina (Pv) que rodea el haz vascular (Hv) y en las células alrededor del canal(Figura 5-3K). Los anteriores cortes fueron comparados frente al blanco (Figura 5-3L). 36 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth). 37
Figura 5-3. Corte transversal de hojas de Hypericum juniperinum. Disposición general de los diferentes tejidos. Abreviaturas. A. Estomas de Hypericum juniperinum ubicados en la cara adaxial.B. Disposición general de las hojas. C. Corte transversal de hoja, con las siguientes estructuras: Cu: Cutícula, Ep: Epidermis, Pe: Parénquima empalizada, Hv: Haz vascular, Cn: Canal, Es: Estoma. D. Haz vascular central de Hypericum juniperinum, presenta, Pv: Parénquima vaina, Xi: Xilema, Fl: Floema. E. Tinción de sudan IV. F. Tinción de sudan III. G. Tinción de sudan Black. H. Tinción de cloruro férrico. I. Tinción con fluoroglucinol. J. Tinción con KOH. K. Tinción con rojo de rutenio. L. Hoja sin tinción (Blanco de tinción). 38 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
5.1.3 Flor de Hypericum juniperinum (Kunth).
La flor de Hypericum juniperinum presenta 4 verticilos florales: Cáliz, corola, androceo y gineceo; el cáliz y la corola conforman un perianto de tipo heteroclamídeo (Figura 5-4A y 5-4B). El cáliz presenta 5 sépalos amarillos, inervados cada uno por un haz vascular (HCa) (Figura 5-4C); la corola (Co) presenta 5 pétalos (Figura 5-4A y 5-4D). El androceo (An) está conformado por aproximadamente 21 estambres libres, con filamento alargado, con anteras bitecas y tetrasporangiadas, que rodean al gineceo (Gi). En el corte transversal del cáliz (Ca) y corola (Co) de H. juniperinum se observa externamente la epidermis (Ep), caracterizada por células redondeadas de tamaños similares, seguido a esto hay varias capas de células del parénquima (Pa) isodiamétricas, entre las cuales se observan los haces vasculares. El cáliz presenta un solo haz central (HCa) (Figura 5-4C), en tanto que en la corola (Figura 5-4 D) hay varios haces vasculares (HCo). En cáliz y corola se presentan canales (Cn) los cuales varian en el tamaño del lumen, pudiendo corresponder a canales tipo A. El androceo de H. juniperinum está conformado por un filamento alargado, con un haz vascular central que presenta las siguientes estructuras: el filamento (Fi), el surco medial (Sm) donde se inserta la antera (An), que presenta dos tecas (Te) donde se almacena el polen (Po) (Figura 5-4 E). El filamento presenta a nivel externo una epidermis (Ep) y un haz vascular central (HvC), con un parénquima con espacios esquizógenos similar a un aerénquima (Figura 5-4F). El ginecéo de H. juniperinum está conformado por 3 a 5 estilos (Et) con su correspondiente estigma (Es) con forma de cabezuela y un ovario (Ov) de tipo unicarpelar y trilocular (Figura 5-4G). En el corte transversal se observan canales de tipo A rodeando todo el ovario (Figura 5-4B). En el análisis histoquímico se detectó la presencia de aceites y compuestos de características lipídicas al hacer reaccionar la muestra con los reactivos de sudan III y sudan black dando una coloración roja para la primera tinción (Figura 5-4H) y negra para la siguiente, en los canales (Cn), en las anteras, estigma y finalmente con el polen (Figura 5-4I). Con el reactivo de cloruro férrico en las anteras, polen y tejidos de cáliz y corola se observó una coloración negra característica de compuestos de tipo fenólico (Figura 5-4J). En cuanto a la tinción de fluoroglucinol se observa una coloración rosada- roja intensa en los haces vasculares de cáliz y corola; para el caso de la tinción de KOH se observa una coloración roja dispuesta en las anteras y en el estigma de la flor (Figura 5-4K). No hubo presencia de alcaloides en los cortes realizados en la flor. Finalmente, la muestra de flor de Hypericum juniperinum presenta pectinas en la epidermis de cáliz, 39 corola, anteras y estigma de la flor (Figura 5-4L) estas tinciones están comparados frente al blanco (Figura 5-4A). 40 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Figura 5-4.A. Flor de Hypericum juniperinum. Disposición general. Abreviaturas. Gineceo (Gi), androceo (An), corola (Co), cáliz (Ca) estructura pentámera. B. Corte transversal de flor. C. Corte transversal del cáliz, con las siguientes estructuras: Epidermis (Ep), Parénquima (Pa), Haz vascular del Cáliz (HCa) y Canales (Cn), D. Corola (Co) junto con el Haz vascular de la Corola (HCo). E. Androceo (An) con el Fi: Filamento, A: Antera, Te: Tecas, Po: Polen, S: Surco medial, F. Estructura interna del filamento de la antera, Epidermis (Ep), Haz vascular central (HvC). G. Gineceo (Gi) con Es: Estilo, Et: estigma. H. Tinción de sudan III en cáliz, androceo y gineceo (de izquierda 41 a derecha). I. Tinción de sudan Black. J. Tinción de cloruro férrico. K. Tinción con KOH. L. Tinción con rojo de rutenio.
Los resultados obtenidos a partir de la caracterización morfoanatómica e histoquímica de Hypericum juniperinum no se encuentran reportados, por lo que el presente trabajo constituye un aporte al conocimiento de esta especie que se encuentra en áreas de páramo colombianas. Sin embargo, la descripción dada en el presente trabajo en cuanto a las características macroscópicas de la flor, tallo y hojas concuerda con el reporte de la especie (Robson, 1987); siendo los caracteres que la definen como H. juniperinum, los tallos erectos, hojas de 6 a 14 mm de largo, estilos de 3 a 5 mm de largo, más largos que el ovario.
Al estar H. juniperinum agrupada en el género Hypericum, los caracteres definidos que presenta son hojas simples, enteras con flores amarillas con pétalos libres y con estambres fasciculados, estilos libres y la presencia de glándulas (negras, rojas o translúcidas) (Nürk, 2011). La sección Brathys, donde pertenece Hypericum juniperinum, carece de glándulas negras; típicas de la sección Hypericum a donde pertenece Hypericum perforatum. Esta especie posee dichas glándulas distribuidas en tallos, hojas, sépalos y pétalos; y las emplea para el almacenamiento de metabolitos secundarios (Ciccarelli et al.,2013). pero si presenta glándulas translúcidas, que es un rasgo característico del género (Ernst, 2003).
En cuanto a las estructuras características de Hypericum, Maggi et al. en el 2004 evidenciaron, mediante la reacción con sudan III, la presencia de aceite esencial en los canales secretorios y en las glándulas translúcidas de pétalos, sépalos y hojas de especies de Hypericum italianas; corroborando así lo encontrado por nosotros en H. juniperinum. Asimismo, la distribución de los canales es similar a la reportada por Ciccarelli et al. en el 2001, para H. perforatum. Dichos canales están ubicados en el parénquima de hoja, cáliz y corola. En H. juniperinum solo se observaron canales tipo B en el corte transversal de la hoja; glándulas translúcidas redondeadas a lo largo de la hoja y canales tipo A junto con glándulas translúcidas en cáliz, corola y ovario. Estos canales se comparten en todos los ejemplares del género Hypericum y cuando se encuentran asociados al mesófilo presentan metabolitos de carácter oleoso y terpénico (Perrone et al., 2013). La ubicación de las estructuras secretorias en la hoja por debajo de la epidermis y el hecho de que se presenten en la mayoría de los órganos de la planta, puede relacionarse que dichas estructuras producen metabolitos secundarios que 42 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth). pueden tener un rol defensivo frente a herbívoros y parásitos (Ciccarelli et al.,2001). Por último, teniendo en cuenta los resultados obtenidos en la prueba de sudan black donde en el xilema se encuentran zonas teñidas de color negro en forma de agregaciones de aceites, se hipotetiza que corresponden a tilides, los cuales se definen como células parenquimáticas que secretan sustancias a los vasos. Según lo reportado por Micco et al., (2016), son estructuras que se forman por la oclusión de los vasos, las cuales almacenan compuestos como gomas, resinas, almidón, cristales y compuestos fenólicos, estas presentan funciones defensivas a factores bióticos o abióticos. Los resultados de la parte histoquímica, donde se detectaron metabolitos como aceites, compuestos fenólicos, flavonoides, son consistentes con las pruebas fitoquímicas preliminares realizadas con el extracto crudo (ver sección 5.2.1) y estas a su vez con lo reportado en la literatura para esta especie (Plazas, 2017).
Por ultimo, teniendo en cuenta los resultados obtenidos en la prueba de sudan black, donde en el xilema se encuentran zonas teñidas de color negro en forma de agregaciones de aceites, se hipotetiza que corresponden a tilides, los cuales se definen como células parenquimáticas que secretan sustancias a los vasos. Según lo reportado por Micco et al., (2016), son estructuras que se forman por la oclusion de los vasos, las cuales almacenan compuestos como gomas, resinas, almidón, cristales y compuestos fenólicos, estas presentan funciones defensivas a factores bióticos o abióticos.
Los resultados de la parte histoquímica, donde se detectaron metabolitos como aceites, compuestos fenólicos, flavonoides, son consistentes con las pruebas fitoquímicas preliminares realizadas con el extracto crudo (ver sección 5.2.1), y estas a su vez con lo reportado en la literatura para esta especie (Plazas, 2017).
Teniendo en cuenta las condiciones de vida en el páramo, H. juniperinum tiene hojas de tipo cartaceas que presentan menor engrosamiento de paredes, característica reportada por (Mora-Osejo, 1995) para Hypericum goyanesii, H. mexicanum y H. strictum. Adicionalmente, presenta un parénquima en empalizada multiestratificado, y una cutícula gruesa, características de plantas de tipo xeromórfico (Mora-Osejo, 1995). Finalmente, la disposición de los estomas hacia la cara adaxial de la hoja correlacionada con la disposición de las hojas en modo arrosetado permite que la planta evite la pérdida de agua, rasgo esencial para encontrarse en este tipo de ambientes (Mora-Osejo, 1995). 43
5.2 Estudio Fitoquímico
5.2.1 Pruebas fitoquímicas preliminares
Los grupos de metabolitos encontrados en Hypericum juniperinum son: flavonoides/ ácidos fenólicos, esteroides/terpenos, taninos y saponinas (Tabla 2.). Estos resultados concuerdan con lo reportado para la sección Brathys, que presenta flavonoides como quercetina, rutina, hiperósido, quercitrina, isoquercitrina; y carece de los metabolitos biapigeninas, hipericina, pseudohipericina e hiperforina (Crockett, & Robson, 2011). En cuanto a los terpenos, para el género Hypericum se reportan monoterpenos, sesquiterpenos, y otros metabolitos como alcanos y aldehídos. En los aceites esenciales se encuentran sesquiterpenos en alta cantidad, siendo el E-cariofileno el compuesto más representativo (Guedes et al., 2012). Dentro del aceite fijo de H. perforatum se encuentran fitosteroles e hidrocarburos (Kokate et al., 2008).
Según lo reportado por (Plazas, 2017), los metabolitos encontrados en las hojas de H. juniperinum son terpenos, esteroides, fenoles, taninos, flavonoides, quinonas y cumarinas, y carece de glicósidos cardiotónicos y alcaloides, lo que está de acuerdo con los resultados presentados en el presente trabajo para el extracto metanólico de las estructuras aéreas de la planta. Sin embargo, contrario a Plazas (2017) la prueba de espuma fue positiva para el extracto metanólico de H. juniperinum, aunque se presume la presencia de saponinas, se requiere hacer la prueba de hemólisis para corroborar este resultado (Moses et al., 2014). Sin embargo, hay reportes de saponinas en H. perforatum (Bezáková et al ., 1999) y H. oblongifolium (Khan et al.,2010).
Al analizar la CCD del extracto crudo de Hypericum juniperinum revelada con NP-PEG y compararla con diversos patrones (rutina-isoquercetina, catequina, quercitrina, acido tánico, quercetina y extracto de Hypericum perforatum OKEY® ) (Figura 5-5), en el sistema de elución acetato de etilo: ácido fórmico: ácido acético: agua: diclorometano (100:10:10:11:26), es posible evidenciar la presencia abudante de ácidos fenólicos dada la coloración azul característica que presentan y la presencia de flavonoides con una coloración amarilla, específicamente se detecta quercetina (Rf: 0.85) y rutina (Rf: 0.28). Por otra parte, el extracto de H. juniperinum no presenta las dos manchas rojas distintivas de H. perforatum que corresponden a hipericina (Rf: 0.71) y pseudohipericina (Rf: 0.65) (Wagner, & Bladt, 2001). En conclusión, el extracto de H. juniperinum carece 44 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth). de las naftodiantronas hipericina y pseudohipercina, este resultado confirma el hecho de que la sección Brathys no biosintetiza estos metabolitos (Crockett, & Robson, 2011).
Figura 5-5. Cromatografía en capa fina del extracto metanólico de Hypericum juniperinum,. Fase móvil: acetato de etilo: ácido fórmico: ácido acético: agua: diclorometano (100:10:10:11:26). Revelador NP-PEG (UV 365nm).
Tabla 2. Resultados obtenidos pruebas fitoquímicas preliminares realizadas al extracto metanólico de H. juniperinum.
Tipo de metabolito Prueba Extracto Hypericum juniperinum Alcaloides Mayer - (+)-precipitado color crema Valser - (+)-precipitado color crema Dragendorff - (+)-precipitado color rojo- naranja
Flavonoides Cloruro férrico + (+)-color azul, morado Shinoda + (+)-coloración rojo- violeta Leucoantocianidinas - (+)-coloración roja 45
Terpenos Lieberman-Burchard + (+)-color rojo, azul a verde Glicósidos cardiotónicos Kedde - (+)-coloración roja Digitoxosa - (+)-coloración roja Keller- Kiliani - (+)-coloración roja a verdosa Saponinas Espuma +
Taninos Gelatina + (+)-precipitado que toma color azul cuando se añade cloruro férrico Antraquinonas Borntrager- Krauss - (+)-Coloración rosada a roja intensa
5.2.2 Aislamiento y purificación de metabolitos secundarios
COMPUESTO P7:
La fracción de acetato de etilo, se sometió a una columna cromatográfica empleando sílica gel 60 como fase estacionaria y eluida con solventes y mezclas de solventes de polaridad ascendente en diferentes proporciones (cloroformo, cloroformo:acetato de etilo, acetato de etilo, acetato de etilo:metanol y metanol). De este fraccionamiento se obtuvieron 18 fracciones. La fracción 6 se purificó nuevamente en una columna de sílica gel con una fase móvil de acetato de etilo a metanol en gradiente obteniendose 18 fracciones; para su posterior análisis se eligió la fracción 10 debido a la detección por cromatografía en capa fina (CCF) de un compuesto mayoritario. Ésta finalmente se sometió a una columna de Sephadex LH-20 empleando como sistema de elución diclorometano: metanol (9:1). Se obtuvieron 38 mg de un polvo de color amarillo que se denominó P7 (Figura 5-6). 46 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Figura 5-6.Esquema de purificación del compuesto P7 a partir de la fracción de acetato de etilo del extracto metanólico de H. juniperinum.
Para el compuesto P7; en el espectro UV (Anexo A-1) se observan dos bandas en 230 nm y 370 nm, siendo la primera correspondiente al sistema de los anillos A-C ysegunda la asociada al sistema B-C (sistema cinamoil) de un núcleo flavonoide. En el espectro infrarrojo (Anexo A-2) se observa una señal amplia en 3400 cm-1 correspondiente a estiramientos de O-H, seguido de sobretonos característicos de anillo
-1 aromático en 2000 cm-1, en 1610 cm se observa el estiramiento del carbonilo C=O, señales de un compuesto aromático con grupos hidroxilo y carbonilo. En el espectro de 1H-RMN (Ver anexo A-3) se observan 5 señales características de protones aromáticos con desplazamientos entre δ 6.00 y δ 8.00 ppm. Las señales en δ 6.87 (d, J=8.4), δ 7.52 (dd, J=6.4 y 2) y δ 7.67 (d, J=2) forman un típico sistema AMX que corresponde a los protones H5´, H6´ y H2´ del anillo B. Las señales presentes en δ 6.17 (d, J= 2) y δ 6.40 (d, J=2) presentan un acoplamiento meta y corresponden a las señales H6 y H8 del anillo A. Se destaca también una señal ancha a δ 9.59 correspondiente a grupos hidroxilo, y una señal de un singlete agudo en δ 12.49 que se atribuye al hidrógeno de un grupo hidroxilo (H5) que forma un puente de hidrógeno intramolecular con un carbonilo adyacente (C4). 13 En el espectro de carbono ( C-RMN) (Ver anexo A-4) se observan 15 átomos de carbono que corresponden a una estructura típica de un flavonoide (C6-C3-C6). En el espectro de 13C-RMN se observan las señales a δ 93.38 y δ 98.24 correspondientes a los carbonos C8 y C6 del anillo A. La señal a δ 135.74 corresponde al carbono que soporta 47 el grupo hidroxilo en C3, la señal a δ 175.83 corresponde a un grupo carbonilo. También se destacan las señales que se encuentran a campo bajo δ 160.72, δ 164.06, δ 147.73 y δ 146.77 que corresponden a carbonos aromáticos que soportan grupos hidroxilo en C5, C7, C3´y C4´, respectivamente. Comparando los datos encontrados con la literatura se encuentra que el compuesto P7 corresponde al flavonol quercetina (figura 5-7), (Kyriakou et al., 2012).
En los resultados de la técnica espectrometría de masas (EM-ESI) (Anexo A-12), se observa un ión pseudomolecular [M-H]- de 301.7 m/z. Con los datos obtenidos se corrobora que la molécula encontrada en Hypericum juniperinum es quercetina, moléculaampliamente distribuida en plantas. En el género Hypericum (Crockett, & Robson, 2011), se reporta en H. perforatum (Avato, 2005), H. scabrum (Jiang et al., 2015), entre otras.
Quercetina (P7): δ1H(400 MHz, DMSO-d6): 6.17(d, 1H, J=2, H6), 6.40 (d, 1H, J=2,H8), 6.87 (d, 1H, J=8.4, H5´), 7.52 (dd, 1H, J=6.4 y 2, H6´), 7.67(d, 1H, J=1.7, H2´), 9.59 (s,
1H, OH), 12.49 (s, 1H, 5-OH). δ13C(101 MHz, DMSO-d6): 93.38 (C8), 98.24 (C6), 102.97 (C10), 115.06 (C2´), 115.62 (C5´), 119.98 (C6´), 121.96 (C1´), 135.74 (C3), 145.08 (C2), 146.77 (C4´), 147.73 (C3´), 156.15 (C9), 160.72 (C5), 164.06 (C7), 175.83 (C4).
Figura 5-7. Estructura de la quercetina.
COMPUESTO AM2:
La fracción de acetato de etilo se sometió a una cromatografía en columna empleando como fase estacionaria sílica gel 60 marca Merck® empleando mezclas de solventes de 48 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth). diferente polaridad; comenzando con hexano, hexano:cloroformo, cloroformo, acetato de etilo y finalizando con la mezcla acetato de etilo:metanol en diferentes proporciones. De esta columna se obtuvieron 18 fracciones. Posteriormente, la fracción 9 se fraccionó, nuevamente, en una cromatografía de columna (sílicagel 60) empleando como sistema de elución solventes con polaridad ascendente en diferentes proporciones (cloroformo, acetato de etilo y metanol). De este fraccionamiento se obtuvieron 6 fracciones. Cuando se reveló la fracción 3 con NP-PEG se observó un compuesto mayoritario de color amarillo intenso; el cual se fraccionó en una columna de sílica gel con una mezcla de acetato de etilo:metanol en diferentes proporciones. De la fracción 4 de esta última columna se obtuvieron 52 mg del compuesto resinoso de color amarillo denominado AM2 (Figura 5-8).
Figura 5-8.Esquema de purificación del compuesto AM2 a partir de la fracción de acetato de etilo del extracto metanólico de H. juniperinum.
Para el compuesto AM2; en el espectro UV (Anexo A-5) se observan dos bandas en 215 nm y 330 nm. En el espectro infrarrojo (Anexo A-6) se observa una señal amplia en 3400 cm-1 correspondiente a estiramientos de O-H, seguido de sobretonos característicos de anillo aromático en 1750 cm-1; también se observa un estiramiento posiblemente debido a un doble enlace (C=C), en la señal 1250 cm-1 se observa una flexión de los grupos hidroxilos de la molécula. 49
En el espectro de 1H-RMN (ver anexo A-7) se observan tres señales características de protones aromáticos con desplazamientos entre δ 6.50 y δ 8.00 ppm. Las señales en δ 6.76 (d, J=8), δ 6.96 (dd, J= 8.4 y 1.6) y δ 7.02 (d, J=1.2 Hz) forman un típico sistema AMX que corresponde a los protones H5´, H6´ y H2´, respectivamente. Las señales presentes en δ 6.08 (d, J=16) y δ 7.36 (d, J=16) se encuentran acopladas y corresponden a señales de los protones olefínicos H8´ y H7´ que hacen parte de una insaturación con isomería trans. Se observa una señal desplazada a δ 5.00 (m, J=6.8, 6.8 y 4.5) correspondiente a un hidrógeno de un carbono metínico (H5) y una señal aguda a δ 3.58
(s) característica de los protones de un grupo metoxilo (O-CH3).
En el espectro de carbono APT 13C-RMN (Anexo A-8) se observan 17 átomos de carbono distribuidos así: seis carbonos cuaternarios (δ 73.06, δ 125.35, δ 145.37, δ 148.57, δ 165.38, δ 173.64); ocho carbonos metínicos (δ 69.34, δ 71.06, δ 66.86, δ 113.85, δ 114.61, δ 115.85, δ 121.36, δ 145.16); dos carbonos metilénicos (δ 34.90, δ 37.40) y un carbono metílico correspondiente al desplazamiento de δ 51.82. Con esta información postulamos la estructura de un derivado fenilpropanoide. En el espectro de APT 13C-RMN (Anexo A-8), se observan los siguientes carbonos: δ 173.64 y δ 165.38 ppm corresponden a carbonos conjugados de ester (C7 y C9), las señales en δ 148.57 y δ 145.37 ppm corresponden a carbonos aromáticos que soportan grupos hidroxilos (C4´ y C3´). Las señales en δ 145.16 y δ 114.61 corresponden a los carbonos conjugados olefinicos (C7´y C8´). Una señal en δ 51.82 ppm correspondiente a un carbono de un grupo metoxilo (-OCH3) y una señal en δ 73.06 correspondiente a un carbono cuaternario oxigenado (C1). Las señales con desplazamientos a δ 66.86, δ 69.34 y δ 71.06 corresponden a carbonos metínicos alifáticos oxigenados. Las señales a δ 37.40 y δ 34.90 son metilenos.
Del análisis del espectro 1H-1H COSY (Figura 5-9a, Anexo A-9) y (Tabla 3), se confirma que los protones olefínicos H8´(δ 6.08) y H7´(δ 7.36) están acoplados. Adicionalmente se aprecian acoplamientos entre los protones aromáticos H5´(δ 6.76) y H6´(δ 6.96). Por otro lado, el protón H5(δ 5.00) presenta acoplamientos con H6a y H6b, el protón alifático H4(δ 3.59) muestra acoplamientos con H3(δ 3.86), y este a su vez presenta acoplamientos con H2a (δ 2.08) y H2b (δ 1.75). Finalmente, el espectro COSY muestra acoplamientos entre los hidrógenos H2a y H2b; y entre H6a y H6b. 50 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Mediante el empleo de los espectros HMQC (Anexo A-10) y HMBC (Anexo A-11) (Tabla 3) se establece que hay conectividad a larga distancia entre H8´(6.08) y los carbonos C1´(125.35) y C9´(165.38) (Figura 5-9b, correlación destacada del protón olefínico con el carbonilo éster y el anillo aromático), además H7´(7.36) presenta conectividades con
C1´(125.35), C6´(121.36), C8´(114.61) y C9´(165.38). Estas interacciones permitieron ubicar la insaturación entre el carbonilo (C9´) y el anillo aromático disustituído, en la figura 5-9b se destacan sólo las correlaciones de H8´. Por otro lado, las siguientes interacciones confirman las posiciones de los hidrógenos en el anillo aromático; H5´(6.76) tiene conectividad con el C1´ (125.35), C3´(145.37), C4´(148.57) y C6´(121.36); H6´(6.96) muestra correlaciones con el C2´(113.85), C3´(145.37), C4´(148.57) y C7´(145.16); y por último el H2´(7.02) correlaciona con el C1´, C3´, C4´ y C6´, esta última correlación del anillo aromático se destaca en la (Figura 5-9b).
Adicionalmente, en el espectro de HMBC se aprecia que la señal con desplazamiento a δ 5.00 (H5) interacciona con los átomos de carbono C1 (δ 73.06), C3 (δ 66.86) C4 (δ 69.34), y C9´(δ 165.38), siendo esta una correlación importante porque establece la unión del grupo carbonilo éster con la porción alifática de la molécula (Figura 5-9b). Los protones alifáticos H6 (δ 2.12) están interaccionando con los carbonos C1 (δ 73.06), C2 (δ 37.40), C4(δ 69.34) y el carbonilo C7(δ 173.64) (Ver Figura 5-9b). De igual forma H2
(δ 2.08 y 1.75) correlaciona con C1, C3, C4, C6 y C7. Finalmente, la señal de hidrógeno a δ 3.58 (-OCH3) se encuentra a tres enlaces de distancia del carbono del carbonilo C7, correlación observada en la (Figura 5-9b). Lo anterior permite proponer que la porción del metil éster del ácido quínico se encuentra unida a la porción cafeoil por la posición C5. Las otras correlaciones presentes en la molécula se pueden apreciar en el (Anexo A-11).
Para el compuesto AM2 (Anexo A-13), se observa un ion pseudomolecular [M-H]- de
367.04 correspondiente a un metabolito con fórmula C17H20O9. Con los datos obtenidos se corrobora que la molécula encontrada en Hypericum juniperinum es el metil éster del ácido 5-O- cafeoilquínico.
Después de realizar el análisis espectroscópico y al comparar las señales de AM2 con las encontradas en la literatura (Pauli et al., 1999; Clifford, 2017), tenemos que el 51 compuesto AM2 corresponde a un metil éster del ácido clorogénico (metil éster del ácido 5-O-cafeoilquínico) (Figura 5-9). Este metabolito había sido identificado previamente en Hypericum sikokumontanum (Tanaka et al., 2009) e Hypericum japonicum (Wu et al.,1998). Este es el primer reporte de esta molécula en H. juniperinum.
a.
b.
Figura 5-9. Estructura del metil ester del ácido 5-O-cafeoilquínico (AM2), a. Flechas negras: acoplamientos observados en el espectro COSY. b. Flechas azules: correlaciones a 2 o 3 enlaces de distancia en el espectro HMBC (correlaciones destacadas de los hidrógenos OCH3,, H5, H6, H8´,y H2´. Para las otras correlaciones presentes ver el anexo A9.
Tabla 3. Desplazamiento químico en δ1H, δ APT 13C-RMN, COSY y HMBC del metil ester del ácido 5-O-cafeoilquínico (AM2).
1 13 H δ(J en Hz) APT 1 C-RMN δ COSY HMBC
1 - 73.06 52 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
2 2.08 (1H, m, H2a) 37.40 H2b, H3 C1,C3,C4,C6,C7 1.75 (1H, dd, J= 12 y 9.6Hz, H2b) H2a, H3
3 3.86 (1H,m) 66.86 H2a, H2b H4
4 3.59 (1H, m) 69.34 H3 C2, C3, C5, C6
5 5.00 71.06 H6a, H6b C1, C3, C4, C9´ (1H,m,J=6.8,6.8 y 4.5 Hz) H4
6 2.12(dd, 1H, J = 14.0, 3.0 Hz, 34.90 H6b, H5 C1, C2,C4, C7 H2a) 1.93 (2H,dd,J=14.2, y 3.6 Hz H2b) H6a, H5
7 - 173.64
8 3.58(3H,s,OCH3) 51.82 C7
1´ - 125.35
2´ 7.02(d, 1H, J=1.2Hz) 113.85 C1´,C3´, C4´, C6´
3´ - 145.37
4´ - 148.57
5´ 6.76 (d,1H,J=8Hz) 115.86 H6´ C1´, C3´, C4´,C6´
6´ 6.96 (dd,1H,J=8.4 y 1.6Hz) 121.36 H5´ C2´,C3´,C4´,C7´
7´ 7.36 (d,1H, J=16Hz) 145.16 H8´ C1´,C6´, C8´,C9´
8´ 6.08 (d,1H, J=16Hz) 114.61 H7´ C1´, C9´
9´ - 165.38
53
5.3 Estudio Farmacológico
5.3.1 Tamizaje farmacológico en sistema nervioso central en modelo murino del extracto metanólico de H. juniperinum.
. Prueba farmacológica para determinar alteraciones de actividad motora: Prueba del alambre
En todos los tratamientos (Extracto crudo en las 3 dosis empleadas y fracciones de acetato de etilo y butanol en ambas dosis), se encontró que los animales presentaban una actividad prensil normal, logrando tomar o agarrar con las patas posteriores el alambre, tanto antes de la administración de los extractos como a la hora después; mostrando de esta manera que posiblemente H. juniperinum carece de efectos que alteren la actividad motora que evidencien a nivel neuromuscular (Van Putten, 2011).
. Pruebas farmacológicas de actividad exploratoria
Prueba de tablero agujereado
En la prueba de tablero agujereado se encontró que no hay diferencias significativas en el número de entradas de la cabeza (head dippings) entre los tratamientos en comparación con el control (Clonazepam), estos valores oscilaron entre 40 y 80 entradas en los tratamientos, mostrando que no hay actividad exploratoria aumentada para el extracto crudo en las tres dosis evaluadas (150, 300 y 500 mg/kg) (Figura 5- 10). Esta prueba permite evaluar la actividad exploratoria del animal donde el comportamiento de introducir su cabeza en los agujeros relaciona la inspección del área de prueba con cierto grado de curiosidad (Vogel, 2008). Para esta prueba el control empleado, clonazepam, presentó una reducción en la actividad que fue estadísticamente significativa (p= 0,001) con respecto al vehículo.
54 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Figura 5-10.Efecto del extracto metanólico de H. juniperinum evaluado a 3 dosis (150, 300 y 500 mg/kg) en la prueba de tablero agujereado (Número de head dippings) en ratones machos ICR administrados por vía oral en dosis repetidas, n=6, ± E.M.S, p=‘***’0,001 , ANOVA.
. Pruebas farmacológicas de actividad ansiolítica
Prueba de laberinto en cruz
La prueba de laberinto en cruz evalúa el efecto ansiolítico de una sustancia, la cual genera un aumento en el número de entradas y tiempo de permanencia en la zona abierta del laberinto (Walf, & Frye, 2007). En el presente trabajo se encontró que no hay diferencias significativas de los tratamientos frente al vehículo para estos dos parámetros, p valor= 0.65 y p valor= 0.58 respectivamente (Figura 5-11 A y B). Estos resultados indican que a estas dosis el extracto de H. juniperinum no presenta actividad de tipo ansiolítico. El clonazepam, empleado como control mostró un aumento en el porcentaje de entradas en zona abierta.
55
A.
B.
Figura 5-11.Efecto del extracto metanólico de H. juniperinum evaluado a 3 dosis (150,300 y 500 mg/kg) en la prueba de laberinto en cruz en ratones machos ICR administrados por via oral en dosis repetidas, n= 6, ± E.M.S, ANOVA. A. Porcentaje de permanencia en zona abierta, B. Porcentaje de entradas en zona abierta.
. Pruebas farmacológicas de actividad antidepresiva
Los modelos de nado forzado y suspensión por la cola se basan en las acciones de los antidepresivos conocidos o en las respuestras de estres del animal, implicando que realmente no se puede definir cuando un ratón esta deprimido. Sin embargo, estos animales presentan anedonia que se considera el síntoma central de la depresión (equivalente a la desesperanza- inmovilidad del animal), por lo cual es un modelo adecuado para la investigación de esta enfermedad (Abelaira et al., 2013).
56 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Prueba de Nado Forzado
El test de nado forzado evalua efectos de sustancias antidepresivas en ratones. En esta prueba el animal se pone dentro un cilindro con agua de donde no puede salir. Al inicio de la prueba el animal intentará escapar, pero eventualmente se quedará inmóvil y el tiempo que permanezca en este estado es el parámetro indicativo del estado de desesperanza. Varias clases de antidepresivos reducen el tiempo de inmovilidad durante la prueba al incrementar el nado o el intento de escape (Abelaira et al., 2013). Con respecto a la prueba de nado forzado se encuentra que el extracto de H. perforatum presenta una reducción en el tiempo de inmovilidad en las dosis de 300 y 500 mg/kg. Este resultado concuerda con lo reportado por Bukhari & Dar (2013) y Ramalhete et al. (2016), para la actividad antidepresiva en prueba de nado forzado de esta especie. Por otra parte, el extracto metanólico de H. juniperinum presenta actividad a una dosis de 500 mg/kg, donde se observa una reducción en el tiempo de inmovilidad frente al vehículo y un aumento en el tiempo de latencia (Figura 5-12 A y B). Estos resultados se pueden relacionar con una posible actividad antidepresiva. El control imipramina muestra una reducción tanto del tiempo de inmovilidad como el de latencia. Adicionalmente, y a partir del ANOVA post hoc tukey, que permite establecer comparaciones multiples entre los tratamientos; otras diferencias significativas que se presentaron fueron las de las dos dosis del extracto de H. juniperinum (150 y 300 mg/kg) con el control imipramina, sugiriendo que estas dosis no presentan actividad antidepresiva p valor<0.01, similares resultados se obtienen en el tiempo de latencia, estas mismas dosis presentan diferencias significativas frente al control positivo imipramina, sugiriendo la carencia de efecto antidepresivo. 57
A.
B.
Figura 5-12. Efecto del extracto metanólico de H. juniperinum evaluado a 3 dosis (150,300 y 500 mg/kg) en la prueba de nado forzado en ratones machos ICR administrados por via oral en dosis repetidas, n=6, ± E.M.S, p= ‘***’ 0,001 ‘**’ 0,01 ‘*’ 0,05, ANOVA. A. Tiempo de inmovilidad (s), B. Tiempo de latencia.
Prueba de suspensión por la cola
El test se basa en el hecho de que los animales al ser suspendidos por la cola, se someten a un estres a corto plazo y sin posibilidad de escape, lo que conlleva a un estado de inmovilidad. En esta prueba se mide el tiempo de inmovilidad, siendo menor en antidepresivos en comparación con el vehículo (Cryan et al., 2005). En esta prueba no se observan diferencias significativas de los tratamientos frente al vehículo (Figura 5-13 A y B), sin embargo, hay una tendencia a la reducción del tiempo de inmovilidad en los extractos de ambos Hypericum frente al vehículo, en el caso del tiempo de latencia, también se observa un aumento de este tiempo frente al vehículo. Para este grupo experimental el control de variabilidad se realizó adecuadamente, sin embargo el peso de 58 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth). los animales pudo haber tenido un efecto sobre los resultados presentados, siendo descrito en Vogel, (2008), que los pesos adecuados para realizar esta prueba son entre 25 y 30 g, para el momento de la realización de esta prueba el peso de los animales estaba en un intervalo de 30 a 40 g, pudiendo influir en el tiempo de inmovilidad y el tiempo de latencia de esta prueba y el hecho de la carencia de diferencias significativas, sin embargo la tendencia de reducción de tiempo de inmovilidad es clara.
A.
B.
Figura 5-13.Efecto del extracto metanólico de H. juniperinum evaluado a 3 dosis (150, 300 y 500 mg/kg) en la prueba de suspensión por la cola en ratones machos ICR administrados por via oral en dosis repetidas, n=6, ± E.M.S, p=‘*’ 0,05, (A.) KRUSKALL WALLIS (B.) ANOVA, post Hoc: Tukey. A. Tiempo de inmovilidad (s), B. Tiempo de latencia(s).
59
. Pruebas farmacológicas de actividad sedante: Prueba de potenciaciación del sueño barbitúrico
En la prueba de potenciación del sueño barbitúrico se evalua el potencial hipnótico, sedativo o tranquilizante de una sustancia, lo que se evidencia por el aumento en el tiempo de duración del sueño al compararse con animales administrados con pentobarbital (Vogel, 2008). En el presente trabajo se observa que el parámetro de duración de sueño es prolongado en el control clonazepam habiendo diferencias significativas frente al vehículo (Figura 5-14B). Por otra parte, los tratamientos no presentan una prolongación del sueño en los ratones, demostrando que el extracto de H. juniperinum carece de actividad sedante. En el caso de la latencia del sueño se observa que el control clonazepam tarda menos tiempo en entrar en el estado de sueño en comparación con el vehículo (Figura 5-14A). En las diferentes dosis de ambos Hypericum hay un comportamiento similar al vehículo en cuanto al parámetro de latencia de sueño sin diferencias significativas entre los tratamientos. Estos resultados concuerdan con lo reportado en (Sanchez-Mateo et al., 2007) para H. reflexum, donde no hubo una prolongación del sueño inducido por pentobarbital.
A. 60 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
B.
Figura 5-14.Efecto del extracto metanólico de H. juniperinum evaluado a 3 dosis (150,300 y 500 mg/kg) en la prueba de potenciación del sueño barbitúrico en ratones machos ICR administrados por via oral en dosis repetidas, n=6, ± E.M.S, p=‘*’ 0,05, ANOVA/ KRUSKALL WALLIS. A. Tiempo de latencia (s), B. Duracion del sueño(s).
. Pruebas farmacológicas de actividad anticonvulsivante: Prueba de convulsiones inducidas por electroshock máximo
El modelo de convusiones inducidas por electroshock máximo es empleado ampliamente para evaluar sustancias que puedan tener un potencial anticonvulsivante (Castel-Branco, et al., 2009), el criterio de protección (sustancia con potencial anticonvulsivante) es la ausencia de extensión de las patas posteriores en un ángulo mayor de 90º con respecto al ele corporal, para esta prueba todos los tratamientos a excepción del control empleado para convulsiones (fenitoina sódica), presentaron la extensión tónica/ clónica y no lograron recuperar el reflejo postural, sugiriendo la carencia de actividad de tipo anticonvulsivante.
5.3.2 Tamizaje farmacológico en sistema nervioso central en modelo murino de las fracciones de acetato de etilo y butanol de H. juniperinum
De acuerdo a lo descrito en la literatura para Hypericum perforatum, las fracciones con alto contenido de flavonoides también presentan actividad antidepresiva (Butterweck et al., 2003). Para esta fase del ensayo se seleccionaron las fracciones de acetato de etilo
61 y butanol de Hypericum juniperinum, ya que debido a sus características de polaridad se espera que presenten un alto contenido flavonoides.
. Pruebas farmacológicas de actividad exploratoria
Prueba de Campo abierto
Los ratones sometidos a las fracciones de acetato de etilo y butanol (150 y 300 mg/kg), en esta prueba no presentan un incremento en el número de cruces por el centro por lo que se descarta una actividad de tipo ansiolítico (Rejón-Orantes et al., 2011) (Figura 5-15 B). A su vez, no se presentó un aumento en el número de cruces totales por lo que las fracciones de H. juniperinum no afectan la actividad exploratoria (Figura 5-15A). Lo anterior indica que los efectos generados sobre el tiempo de inmovilidad en la prueba de nado forzado no son afectados por una actividad estimulante del extracto.
A. 62 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
B.
Figura 5-15. Efecto de los extractos de acetato de etilo y butanol provenientes del fraccionamiento del extracto metanólico de H. juniperinum evaluados a 2 dosis (150, 300 mg/kg) en la prueba de campo abierto en ratones machos ICR administrados por via oral en dosis repetidas, n=6, ± E.M.S,KRUSKALL-WALLIS/ ANOVA. A. Número de cruces centrales, B. Número de cruces totales.
. Pruebas farmacológicas de actividad anisolítica
Prueba de Laberinto en cruz
En esta prueba, las fracciones de acetato de etilo y butanol no presentaron diferencias significativas frente al vehículo, tanto para el porcentaje de entradas como para el tiempo en la zona abierta (Figura 5-16 A y B), lo que evidencia la ausencia de un efecto ansiolítico. En cuanto al control clonazepam, se tiene un aumento en el tiempo de permanencia en la zona abierta del 60% en comparación con el vehículo (30%), y también un aumento en el porcentaje de entradas de 50% frente a 30%. Cabe anotar, que en ambos tests no se presenta una diferencia significativa frente al vehículo.
63
A.
B.
Figura 5-16. Efecto de los extractos de acetato de etilo y butanol provenientes del fraccionamiento del extracto metanólico de H. juniperinum evaluados a 2 dosis (150, 300 mg/kg) en la prueba de laberinto en cruz en ratones machos ICR administrados por via oral en dosis repetidas, n=6, ± E.M.S, ANOVA. A. Porcentaje de permanencia en zona abierta, B. Porcentaje de entradas en zona abierta.
. Pruebas farmacológicas de actividad antidepresiva
Prueba de nado forzado
En la evaluación de las fracciones de acetato y butanol se encontró que la fracción de acetato de etilo en las dosis de 150 y 300 mg/kg muestra una reducción del tiempo de inmovilidad de los ratones con diferencias significativas frente al vehículo (Figura 5-17 A). Para el caso del tiempo de latencia, se encuentra que no hay diferencias significativas frente al vehículo, pero se observa una tendencia al aumento de este tiempo para la fracción de acetato de etilo en ambas dos dosis empleadas (Figura 5-17 B). 64 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
A.
B.
Figura 5-17. Efecto de los extractos de acetato de etilo y butanol provenientes del fraccionamiento del extracto metanólico de H. juniperinum evaluados a 2 dosis (150, 300 mg/kg) en la prueba de nado forzado en ratones machos ICR administrados por via oral en dosis repetidas, n=6, ± E.M.S, , p= ‘***’ 0,001 ‘**’ 0,01 ‘*’ 0,05, ANOVA/ KRUSKALL WALLIS. A. Tiempo de inmovilidad (s), B. Tiempo de latencia.
Prueba de suspensión por la cola
En el caso de las fracciones se encuentra que no hay diferencias significativas entre los tratamientos para el tiempo de inmovilidad y para el tiempo de latencia (Figura 5-18 A y B). Sin embargo se observa una tendencia en la disminución para el tiempo de inmovilidad y un aumento para el tiempo de latencia. Un comportamiento similar se observa con el control empleado (imipramina). 65
A.
B.
Figura 5-18. Efecto de los extractos de acetato de etilo y butanol provenientes del fraccionamiento del extracto metanólico de H. juniperinum evaluados a 2 dosis (150, 300 mg/kg) en la prueba de suspensión por la cola en ratones machos ICR administrados por via oral en dosis repetidas, n=6, ± E.M.S, ANOVA/KRUSKALL-WALLIS. A. Tiempo de inmovilidad (s), B. Tiempo de latencia(s).
. Pruebas farmacológicas de actividad sedante: Prueba de potenciación del sueño barbitúrico.
Se observa que para la prueba de potenciación del sueño barbitúrico las fracciones tanto de acetato como de butanol no presentan diferencias significativas frente al vehiculo, pero si frente al control clonazepam (Figura 5-19 A y B), lo que indica que ambos extractos no tienen efectos inductores o prolongadores de sueño. 66 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
A.
B.
Figura 5-19. Efecto de los extractos de acetato de etilo y butanol provenientes del fraccionamiento del extracto metanólico de H. juniperinum evaluados a 2 dosis (150, 300 mg/kg) en la prueba de potenciación del sueño barbitúrico en ratones machos ICR administrados por via oral en dosis repetidas, n=6, ± E.M.S, p= ‘***’ 0,001, ANOVA/KRUSKALL WALLIS. A. Tiempo de latencia (s), B. Duracion del sueño(s).
Cuando se comparan los tiempos de inmovilidad entre las dos pruebas (nado forzado vs suspensión por la cola) se encontró que en la prueba de suspensión por la cola hay un menor tiempo de inmovilidad entre los tratamientos en general en comparación con la prueba de nado forzado (150 s del vehículo en nado forzado vs 40 s en suspensión por la cola), estos resultados concuerdan con lo reportado por Cryan et al., (2005), quienes refieren que la inmovilidad basal varía en las dos pruebas, siendo más baja en la prueba de suspensión por la cola que en la de nado forzado, esto a su vez podría evidenciar la falta de diferencia significativa en la prueba de suspensión por la cola.
67
Los resultados obtenidos en la prueba de nado forzado para el extracto de Hypericum perforatum a una dosis de 300 y 500 mg/kg, concuerdan con los presentados por Paulke et al., (2007), donde reportan una reducción en el tiempo de inmovilidad en ratas administradas con extractos de esta especie (400 mg/kg). Al comparar los resultados obtenidos, H. juniperinum a una dosis de 500 mg/kg tiene un comportamiento similar a H. perforatum en dosis de 300 y 500 mg/kg, lo que podría sugerir una actividad de tipo antidepresivo para nuestro extracto. Por otra parte para las fracciones de acetato de etilo de H. juniperinum en ambas dosis (150 y 300 mg/kg), se apreció una reducción significativa frente al vehículo en relación con el tiempo de inmovilidad en la prueba de nado forzado y una tendencia en la reducción del tiempo de inmovilidad en la prueba de suspensión por la cola. Dicho resultado concuerda con lo reportado por (Butterweck et al., 2000), donde fracciones de H. perforatum enriquecidas en flavonoides, presentan una reducción del tiempo de inmovilidad en ratas administradas oralmente. Adicionalmente Guan & Liu, (2016) y Butterweck et al. (2003), reportan actividad antidepresiva para fracciones del extracto hidroalcoholico de Hypericum perforatum que carecían de hipericina e hiperforina, demostrando que los flavonoides, por sí solos, presentan actividad. Comparando los resultados de actividad obtenidos por las fracciones de acetato de etilo de Hypericum juniperinum, es posible que la actividad tipo antidepresiva de esta especie pueda atribuirse también a los flavonoides. Como ya se mencionó anteriormente, la especies de la sección Brathys, a la que pertenece H. juniperinum, son ricas en flavonoides pero no producen las naftodiantronas hipericina y pseudohipericina; ni el derivado de fluoroglucinol poliisoprenilado, hiperforina (Crockett & Robson, 2011). También es importante destacar que la fracción de acetato de etilo a dosis menores (150 y 300 mg/kg) que la del extracto crudo (500 mg/kg) tambien mantuvo la actividad antidepresiva. Lo anterior podría sugerir que quizas la fracción de acetato de etilo presenta algunos de los constituyentes activos del extracto metanólico de H. juniperinum.
Se ha reportado la actividad antidepresiva para numerosas especies que se encuentran en diferentes secciones del género Hypericum. Algunos ejemplos son: H. enshiense (sección Hypericum) (Wang et al., 2010), H. androsaemum y H. foliosum (sección Androsaemum) (Ramalhete et al., 2016), y H. reflexum, una especie endémica de las islas canarias, perteneciente a la sección Adenosepalum (Sanchez-Mateo et al., 2007). 68 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Tambien se ha reportado actividad antidepresiva en especies andinas de Hypericum provenientes de Brasil (Daudt et al., 2000) y Perú (Ccana-Ccapatinta et al., 2014) y pertenecientes a las secciones Brathys y Trigynobrathys. Los resultados obtenidos con H. juniperinum son similares a los encontrados en especies de la sección Brathys, que presentan actividad antidepresiva, aún en ausencia de los metabolitos a los que comunmente se les atribuye dicha actividad (hipericina, pseudohipericina e hiperforina) (Crockett & Robson, 2011). Por lo tanto la actividad antidepresiva mostrada por el extracto metanólico y la fracción de acetato de etilo de H. juniperinum podría atribuirse a los flavonoides presentes en esta.
El presente trabajo es la primera evidencia de la actividad antidepresiva de H. juniperinum. Nuestros resultados abren la puerta a la investigación con otras especies colombianas de Hypericum desde la perspectiva farmacológica y fitoquímica. Para pensar en H. juniperinum como una alternativa terapéutica se requieren estudios adicionales que establezcan la seguridad del extracto, que permitan profundizar en el mecanismo de acción y determinen los metabolitos responsables de la actividad.
6. Conclusiones y recomendaciones
6.1 Conclusiones
Microscópicamente, H. juniperinum carece de glándulas negras típicas de la sección Hypericum. Pero presenta glándulas translúcidas, adicionalmente presenta compuestos de carácter fenólico en el floema del tallo y a lo largo de la hoja; y lípidos en canales de hojas, y en la superficie de la antera y estilo. El estudio químico de la planta permitió establecer en el extracto metanólico de H. juniperinum la presencia de metabolitos tipo flavonoide, ácidos fenólicos, esteroides, taninos y posiblemente saponinas. No se detectaron alcaloides, ni las naftodiantronas hipericina y pseudohipericina que si están presentes en H. perforatum. Adicionalmente, de la fracción de acetato de etilo se purificaron y caracterizaron espectroscópicamente el flavonol quercetina y metil ester del ácido clorogénico (metil ester del ácido 5-O-cafeoilquínico) , siendo este el primer reporte de metabolitos aislados de H. juniperinum. El extracto de H. juniperinum (500 mg/Kg) y la fracción de acetato de etilo en ambas dosis empleadas (150 y 300 mg/Kg), disminuyen el tiempo de inmovilidad, en la prueba de nado forzado, y se observan tendencias de reducción del tiempo de inmovilidad en la prueba de suspensión por la cola con una posible actividad antidepresiva. Por otra parte, las dosis evaluadas del extracto crudo y de las fracciones, no generaron alteraciones en la actividad motora (prueba del alambre) y ni en la actividad exploratoria del animal (prueba de campo abierto y tablero agujereado). En las pruebas de inducción de sueño, convulsiones por electroshock y evaluación del efecto ansiolítico no se observó ningún efecto a ninguna de las dosis de extracto evaluadas.
70 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
6.2 Recomendaciones
Se recomienda continuar con el proceso de purificación de metabolitos secundarios de H. juniperinum con el fin de aumentar el conocimiento de la composición química de especies colombianas de Hypericum. Adicionalmente sería interesante comparar los perfiles cromatográficos por HPLC del extracto estandarizado de H. perforatum frente al extracto metanólico y de acetato de etilo de H. juniperinum, para poder establecer diferencias de metabolitos entre las plantas. En cuanto al estudio farmacológico, se recomienda implementar otros modelos que permitan profundizar en el mecanismo de acción del extracto. Teniendo en cuenta el efecto antidepresivo que presentó el extracto de H. juniperinum, se sugiere realizar pruebas de toxicidad al extracto bruto y las fracciones activas.
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-World Health Organization (WHO). (2017). Depression and other common mental disorders: Global health estimates . Geneva, Suiza: WHO. 82 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Anexo A
1. Espectro UV del compuesto Quercetina ( P7)
Anexo A 1. Espectro UV del compuesto quercetina (P7) Espectro UV del compuesto Quercetina ( P7)
Anexo A 2.Espectro IR del compuesto quercetina (P7) Bibliografía 83
2. Espectros obtenidos del compuesto Quercetina (P7)
Anexo A 3. Espectro de 1H RMN del compuesto Quercetina (P7)
Anexo A 4. Espectro de 13C RMN del compuesto Quercetina (P7) 84 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
3. Espectro UV del compuesto metil ester del 5-O- ácido cafeoil quínico (AM2)
Anexo A5. Espectro UV obtenido del compuesto metil ester del ácido 5-O- cafeoilquínico (AM2) 4. Espectro IR del compuesto metil ester del 5-O- ácido cafeoil quínico (AM2)
Anexo A6. Espectro UV obtenido del compuesto metil ester del ácido 5-O- cafeoilquínico (AM2) 5. Espectros RMN obtenidos del compuesto metil ester del 5-O-ácido cafeoil quínico (AM2) Bibliografía 85
Anexo A7. Espectro de 1H RMN obtenido del compuesto metil ester del ácido 5- O-cafeoilquínico (AM2) 86 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Anexo A8. Espectro de 13C RMN obtenido del compuesto metil ester del ácido 5- O-cafeoilquínico (AM2) Bibliografía 87
Anexo A9. Espectro de 1H-1H COSY obtenido del compuesto metil ester del ácido 5- O-cafeoilquínico (AM2)
Anexo A10. Espectro de 1H-13C HMQC obtenido del compuesto metil ester del ácido 5- O-cafeoilquínico (AM2) 88 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Anexo A11. Espectro de 1H-13C HMBC obtenido del compuesto metil ester del ácido 5- O-cafeoilquínico (AM2) Bibliografía 89
6. Espectrometria de masas de los compuestos P7 y AM2: Full MS (-) [M-H]-
Anexo A12: Espectro de masas del compuesto quercetina (P7) modo [M-H]- y MS/MS 90 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Anexo A13: Espectro de masas del compuesto metil ester del ácido 5-O- cafeoilquínico (AM2) modo [M-H]- y espectro de fragmentación MS/MS