INSTITUTO AGRONÔMICO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA TROPICAL E SUBTROPICAL

CARACTERIZAÇÃO CITOMOLECULAR DA ESPÉCIE COFFEA ARABICA L., VARIEDADE TYPICA CRAMER E CULTIVAR MUNDO NOVO

ANGELA SANCHE ARTERO

Orientadora: Cecília Alzira Ferreira Pinto Maglio Co-orientadora: Miriam Perez Maluf

Dissertação submetida como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Agricultura Tropical e Subtropical Área de Concentração em Melhoramento Genético Vegetal

Campinas, SP Março 2006

Ficha elaborada pelo Núcleo de Informação e Documentação do Instituto Agronômico

A786 Artero, Angela Sanche Caracterização citomolecular da espécie Coffea arabica L., variedade typica cramer e cultivar Mundo Novo/ Angela Sanche Artero. Campinas, 2006 61 fls.; il.

Orientadora: Cecília Alzira Ferreira Pinto Maglio Co – orientadora: Miriam Perez Maluf Dissertação (Mestrado em Agricultura Tropical e Subtropical) – Instituto Agronômico

1. Coffea arabica L 2. Hibridação in situ 3. Caracterização Citomolecular 4 Marcadores cromossômicos 5. Região organizadora do nucléolo (NOR). I. Pinto-Maglio, Cecília Alzira Ferreira II. Maluf, Miriam Perez III. Instituto Agronômico. IV. Título

CDD 633.73

AGRADECIMENTOS

- Agradeço a minha orientadora, a pesquisadora Dra. Cecília A. F. Pinto Maglio pelo seu companheirismo, amizade, ensinamentos e o exemplo de perseverança para enfrentar todas as dificuldades ao longo deste projeto.

- A Profa. Dra. Miriam Maluf, minha co-orientadora, pela amizade, discussões e auxílio na execução deste e outros trabalhos.

- A pesquisadora Dra. Neiva Pierozzi pela confiança, amizade e auxílio em algumas etapas.

- A todos os colegas da Pós-Graduação em especial a Mary, Fernandinha, Paula e

Giovana; pelo convívio, amizade, apoio e paciência.

- Aos novos colegas de Laboratório em especial o Dr. Ricardo Lombello, Izabel

Moraes e Renata Baroni.

- A todos os colegas do Centro de Café pelo apoio e amizade.

- A pesquisadora Dra. Bernadete Silvarolla pela disposição e auxílio na coleta do material vegetal utilizado neste trabalho.

- A Dona Antônia pelo auxílio na execução deste trabalho.

- A todos os funcionários da Pós-Graduação.

- A minha família em especial ao meu irmãozinho tão querido.

- Ao Luciano pelo apoio e compreensão.

- A representante comercial da Olympus do Brasil, Sara Jane Arrozio, pela sobreposição das imagens da hibridação in situ fluorescente.

- A Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Ensino Superior (CAPES), pela concessão da bolsa de estudos. - Agradeço a todos que direta ou indiretamente colaboraram para a execução deste trabalho. SUMÁRIO

ÍNDICE DE FIGURAS...... vi LISTA DE ANEXOS...... vii RESUMO...... viii ABSTRACT...... ix 1 INTRODUÇÃO...... 01 2 REVISÃO DE LITERATURA...... 03 2.1 Café no Brasil...... 03 2.2 Taxonomia do Café...... 05 2.3 Origem de C. arabica L...... 06 2.4 Número e Morfologia de Cromossomos no Gênero Coffea L...... 09 2.5 Diferenciação dos Cromossomos no Gênero Coffea L. Através de Técnicas Citomoleculares...... 12 2.5.1 Hibridação in situ...... 12 2.5.2 Flurocromos...... 15 2.5.3 AgNOR...... 17 2.5.4 Bandas C...... 18 2.6 Regiões organizadoras do nucléolo em Coffea L...... 19 3. MATERIAL E MÉTODOS...... 21 3.1 Material...... 21 3.2 Métodos...... 21 3.2.1 Mitose...... 21 3.2.2 Meiose...... 22 3.2.3 Hibridação in situ...... 23 3.2.4 Sondas...... 24 3.2.5 Bandamento com CMA3/DA...... 24 3.2.6 Bandamento com CMA3 sem DA...... 25 3.2.7 Bandamento com DAPI/DA...... 25 3.2.8 Bandamento com nitrato de prata...... 25 3.2.9 Bandamento C...... 26 4 RESULTADOS...... 27 4.1 Coffea arabica, Variedade typica Cramer...... 27 4.1.1 Hibridação in situ fluorescente...... 27 4.1.2 Bandamento CMA3/DA...... 27 4.1.3 Bandamento CMA3...... 28 4.1.4 Bandamento DAPI/DA...... 29 4.1.5 Bandamento AgNOR...... 29 4.1.6 Bandamento C...... 30 4.2 Coffea arabica, Cultivar Mundo Novo...... 30 4.2.1 Hibridação in situ fluorescente...... 30 4.2.2 Bandamento CMA3/DA...... 31 4.2.3 Bandamento CMA3...... 31 4.2.4 Bandamento DAPI/DA...... 31 4.2.5 Bandamento AgNOR...... 32 4.2.6 Bandamento C...... 38 5. DISCUSSÃO...... 38 5.1 Sítios de DNA Ribossômico em Coffea arabica...... 38 5.2 Bandamento com Cromomicina...... 42 5.3 Bandamento com DAPI...... 44 5.4 Bandamento AgNOR...... 44 5.5 Bandamento C...... 46 5.6 Mecanismo de Dominância Nucleolar em C. arabica...... 46 6. CONCLUSÃO...... 48 7. REFERÊNCIAS...... 49 8 ANEXO...... 61 8.1 Anexo 1...... 61

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 – Células em metáfase mitótica do café (Coffea arabica L.) da variedade typica Cramer e da cultivar Mundo Novo. Setas indicam os sinais de hibridação in situ obtidos com as sondas: pTa71 que corresponde ao sítios de rDNA 45S (NORs); e pScT7 que evidencia sítios de rDNA 5S. Sondas marcadas com digoxigenina e contra-coloração dos cromossomos com DAPI. Variedade typica: (A) pTa71 e (B) pScT7. Cultivar Mundo Novo: (C) pTa71 e (D) pScT7...... 33 Figura 2 – Células mitóticas e meióticas do café (Coffea arabica L.) da variedade typica

Cramer com bandamento CMA3/DA e bandamento CMA3. Bandamento CMA3/DA: (A) Metáfase mitótica; (C, D, E) Células em meiose; setas indicam sinais positivos de bandas em regiões terminais (setas brancas) e bandas em regiões

intercalares (setas amarelas). Bandamento CMA3: (B) Metáfase mitótica com cromossomos sem sinais positivos de bandas...... 34 Figura 3 – Células mitóticas e meióticas do café (Coffea arabica L.) da cultivar Mundo Novo

com bandamento CMA3/DA e bandamento CMA3. Bandamento CMA3/DA: (A) cromossomos em metáfase mitótica; (C, D e E) Cromossomos meióticos; setas indicando os sinais positivos de bandas em regiões terminais (setas brancas) e

bandas em regiões intercalares (setas amarelas). Bandamento CMA3: (B) Cromossomos somáticos e (F) Cromossomos meióticos sem sinais positivos de bandas...... 35 Figura 4 – Bandamento com fluorocromo DAPI em cromossomos mitóticos e meióticos do café (Coffea arabica L.) da variedade typica Cramer e da cultivar Mundo Novo, sem sinais de bandas positivas. Variedade typica: (A) Metáfase mitótica e (C) Meiose - Metáfase I. Cultivar Mundo Novo: (B) Metáfase mitótica e (D) Prófase I - Diacinese...... 36 Figura 5 – Bandamento com nitrato de prata em cromossomos mitóticos e meióticos de C. arabica. (A e B) variedade typica Cramer; (C, D, E, F) cultivar Mundo Novo. (A, B, C, D, E) Cromossomos meióticos: bandas em cromossomos na fase de metáfase I e na fase de diacinese com setas indicando bandas em cromossomos associados ao nucléolo. (F) Cromossomos somáticos: bandas nos cromossomos associados ao nucléolo...... 37

ANEXO

Anexo 1 - Comparação de espécies, variedades e cultivares do gênero Coffea L., por meio de técnicas citomoleculares...... 61 ARTERO, Angela Sanche. Caracterização citomolecular da espécie Coffea arabica L., variedade typica Cramer e cultivar Mundo Novo. 2006. 61f. Dissertação (Mestrado em Melhoramento Genético Vegetal) – Pós-Graduação – IAC.

RESUMO

No gênero Coffea, a espécie C. arabica L. é comercialmente a mais importante representando 70% da produção mundial de café. É a única espécie tetraplóide (2n=4x=44) e autocompatível do gênero, as demais são diplóides (2n=2x=22) e autoincompatíveis. Diversas espécies de café, e gêneros próximos, tiveram seu complemento cromossômico caracterizado através de técnicas como a hibridação in situ fluorescente (FISH) de seqüências de DNA ribossômico (rDNA), correspondentes a regiões organizadoras do nucléolo (NORs); bandamento com os fluorocromos 4’, 6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e Cromomicina A3 (CMA3) que evidenciam regiões cromossômicas ricas em bases AT e em bases GC respectivamente; com prata (AgNOR) que revela NORs ativas no complemento e do bandamento C que evidencia regiões heterocromáticas. Este estudo propôs a caracterização do complemento cromossômico de C. arabica, variedade typica Cramer e cultivar Mundo Novo através de FISH, com duas sondas de rDNA, a seqüência 18S-5,8-26S (pTa71) e a seqüência 5S (pScT7); do bandamento com DAPI, CMA3, AgNOR e C. É investigada ainda a ocorrência de dominância nucleolar, anteriormente proposta para C. arabica. Obtiveram-se resultados iguais para a var. typica e a cv Mundo Novo. Em ambas, foram observados três pares de cromossomos com sinais referentes à seqüência 18S-5,8-26S (pTa71) e um par de cromossomos com sinais para a seqüência 5S (pScT7). Estudos anteriores com a cv Bourbon Vermelho de C. arabica, mostram resultado igual para pTa71, e diferente para pScT7. Desta sonda foram visualizados quatro sinais, dois a mais que os observados para typica e Mundo Novo, indicando que ambas podem ser distintas da cv Bourbon Vermelho pelo número de seqüências do rDNA 5S, sonda pScT7. A coloração com o DAPI não mostrou bandas positivas, no entanto, com a CMA3 foram visualizadas seis bandas na região terminal de três pares de cromossomos. A coincidência de número e posição, dos sinais do rDNA 18S-5,8S-26S, bandas CMA3 e AgNOR indicam que provavelmente as três técnicas detectaram a mesma região descrita como NOR e também que, em C. arabica não ocorre dominância nucleolar, sendo todos os sítios do rDNA 18S-5,8S-26S ativos.

Palavras-chave: Coffea arabica L., hibridação in situ, caracterização citomolecular, marcadores cromossômicos, região organizadora do núcleolo (NOR). ARTERO, Angela Sanche. Citomolecular characterization of species Coffea arabica L., typica Cramer variety and Mundo Novo cultivar. 2006. 61f. Dissertação (Mestrado em Melhoramento Genético Vegetal) – Pós-Graduação – IAC.

ABSTRACT

In the genus Coffea, the species C. arabica L. is commercially the most important representing 70% of the world production of coffee. It is the only tetraploid (2n=2x=44) and self-fertile species, the others are diploids (2n=2x=22) and self-sterile. Several coffee species and related genus, has been characterized through by techniques as fluorescence in situ hybridization (FISH) with DNA ribossomal sequence (rDNA), corresponding nucleolar organizing regions (NOR); banding with fluorochromes: 4’, 6’-diamidino-2- phenylindole (DAPI) for DNA AT-rich regions and Chromomycin A3 (CMA3) for GC-rich regions; silver staining (AgNOR) that reveals actives NOR in the chromosomal complement and C banding that evidenced heterochromatin regions. This study proposed the characterization of C. arabica, typica Cramer variety and Mundo Novo cultivar using the 18S-5,8-26S rDNA sequence (pTa71) and 5S rDNA sequence (pScT7), DAPI, CMA3, AgNOR e C banding. It was investigated the occurrence of nucleolar dominance, previously proposed to C. arabica. The two representatives of C. arabica presented the same results with the used techniques. Both revealed three pairs of chromosomes with 18S-5,8S-26S rDNA (pTa71) signals and one pair of 5S rDNA (pScT7) signals. In C. arabica Bourbon Vermelho cultivar were observed the same results with the use of the pTa71 probe; on the other hand the pScT7 evidenced two signals more, totalizing four signals. These results showed that typica Cramer and Mundo Novo may be distinguished by the Bourbon Vermelho for the number 5S sequences with use of pScT7 probe. The DAPI coloration has not resulted in positive bands, however, CMA3 showed more evident bands at terminal regions of three chromosomes pairs. The number and position of signals of 18S-5,8S-26S rDNA, bands of CMA3 and silver nitrate indicated that probably the three techniques detected the same region, described as associated NOR. These techniques also indicated that in C. arabica has not occurred nucleolar dominance.

Key-words: C. arabica L., in situ hybridization, citomolecular characterization, chromosome markers, nucleolar organizing region (NOR).

1 INTRODUÇÃO

O café (Coffea L.) foi introduzido no Brasil no século XVIII e se expandiu por todas as regiões do país (KRUG et al., 1938). A cafeicultura tem sido o alicerce da economia brasileira desde meados do século XIX. Hoje, com a diversificação na pauta de produtos que o país exporta, a participação do café foi reduzida, porém sua importância como expressivo gerador de divisas continua. O Brasil ainda permanece líder mundial na produção de café, com cerca de 300 mil produtores rurais, que ocupam uma área superior a 2,0 milhões de hectares (MORICOCHI, 2003). O café pertence à família Rubiaceae, gênero Coffea L., com cerca de 80 a 100 espécies (BRIDSON, 1994). Apesar do elevado número, apenas duas espécies são importantes comercialmente: Coffea arabica e C. canephora. A espécie C. arabica é a mais cultivada, sendo responsável por mais de 70% da produção mundial e também nacional de café (Pró-Café - Programa Integrado de Apoio à Cafeicultura). A espécie C. arabica é a única tetraplóide (2n=4x=44) e autocompatível descrita para o gênero, as demais são diplóides (2n=2x=22) e autoincompatíveis. (MENDES, 1949; MENDES1 1950; MENDES2 1950). C. arabica é considerado um alotetraplóide de segmento (PINTO-MAGLIO & CRUZ, 1998) provavelmente originado do cruzamento natural entre C. eugenioides e C. congensis ou C. canephora (RAINA et al., 1998; LASHERMES et al., 1999). Desde que foram iniciados os estudos citológicos de espécies do gênero Coffea dentro do programa de melhoramento do cafeeiro, no Instituto Agronômico (IAC), por volta de 1930, esforços vêm sendo feitos visando esclarecer a taxonomia, sistema de reprodução e, após isso, a caracterização e diferenciação do complemento cromossômico das espécies de café. No entanto, devido ao tamanho reduzido, cerca de 1 a 3 μm, e a cariomorfologia simétrica, o estabelecimento de cariótipos e diferenciação intra e interespecífica dos cromossomos de espécies de café têm sido uma tarefa relativamente difícil.

1Mendes, A.J.T. 2Mendes, C.H.T. Posteriormente, em estudos comparativos do comportamento meiótico de várias espécies, envolvendo a quantificação de pareamento cromossômico e número de quiasmas, foi constatado que também esses parâmetros eram insuficientes na distinção das espécies de café. Foram então iniciados estudos de caracterização das espécies do gênero Coffea, baseados no número de cromossomos associados à região organizadora do nucléolo (NOR) e na caracterização da morfologia de cromossomos na fase de paquíteno da meiose (PINTO-MAGLIO & CRUZ, 1998). Outras técnicas foram utilizadas como a coloração com orceína acética para estudar a morfologia dos cromossomos; o bandamento C para o estudo da constituição de regiões heterocromáticas e o bandamento por impregnação pela prata, que possibilita a determinação do número de cromossomos nucleolares ativos (PIEROZZI et al., 1999; PIEROZZI et al., 2003). Foram estabelecidos ainda, cariótipo e ideograma para cromossomos meióticos no paquíteno de C. arabica (PINTO-MAGLIO & CRUZ, 1998). O surgimento de novas técnicas citomoleculares abriu novas perspectivas, para os estudos de diferenciação e caracterização de cromossomos de Coffea, como o bandamento cromossômico com o fluorocromo 4’,-6’-diamidino-2-fenilindol (DAPI) que destaca regiões heterocromáticas ricas em bases AT, e o fluorocromo Cromomicina A3 (CMA3) que tem afinidade por regiões ricas em bases GC; e também a técnica de hidridação in situ fluorescente (FISH) que permite o mapeamento físico cromossômico de seqüências específicas de ácidos nucléicos como o DNA ribossômico (rDNA). Essas técnicas vêm sendo utilizadas em variedades e espécies de Coffea presentes no Banco de Germoplasma do IAC, permitindo assim a caracterização das espécies pela detecção de diferenças no número e localização dessas regiões/seqüências no complemento cromossômico (PINTO- MAGLIO et al., 2001; BARBOSA et al., 2001; LOMBELLO & PINTO-MAGLIO, 2004a; LOMBELLO & PINTO-MAGLIO, 2004b; LOMBELLO & PINTO-MAGLIO, 2004c; PINTO-MAGLIO et al., no prelo). A combinação de técnicas citomoleculares como bandamento C, bandamento com prata, bandamento com fluorocromos e FISH já possibilitaram em muitos gêneros a distinção de espécies, de grupos de populações dentro de espécies ou até mesmo a distinção de cromossomos individuais; sendo eficientes como marcadores cromossômicos. A técnica de FISH com sondas de rDNA, vem sendo utilizada ainda para esclarecer a origem de poliplóides e sua história evolutiva. Esses marcadores cromossômicos além de serem úteis para os estudos comparativos das espécies, baseados nas diferenças cariotípicas, podem ser utilizados em programas de cruzamentos, com vistas ao melhoramento genético, pois possibilitam a identificação e monitoramento, ao longo das gerações, da presença de cromossomos, segmentos cromossômicos ou seqüências de genes que eventualmente tenham sido introduzidos em espécies ou híbridos. Este trabalho teve como objetivo a ampliação do conhecimento das espécies e variedades do Banco de Germoplasma de café do IAC através da caracterização e diferenciação, por meio de técnicas citomoleculares, do complemento cromossômico da variedade typica Cramer e da cultivar Mundo Novo, ambas da espécie C. arabica L.

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Café no Brasil O Brasil é o maior produtor e exportador de café no mundo, com 300 mil produtores rurais numa área de 2,4 milhões de hectares, e ainda o segundo maior consumidor, posicionando-se atrás apenas dos Estados Unidos. O café mais cultivado no Brasil e no mundo é o Arábica, cuja espécie é Coffea arabica (MORICOCHI, 2003). O café Arábica representa 74% da cafeicultura nacional, o restante é ocupado pelo cultivo do café Robusta que pertence à espécie C. canephora. Segundo o Pró-Café (Programa Integrado de Apoio à Cafeicultura), 25% da produção nacional de café é destinada ao mercado interno e os 75% restantes à exportação, os quais representaram, em média, 1,7 bilhões de dólares anuais em divisas nos últimos 10 anos. O Estado de São Paulo foi por muitos anos líder na produção de café no Brasil, porém atualmente, de acordo com a CONAB (Companhia Nacional de Abastecimento), ocupa a terceira posição no ranking nacional. O café foi introduzido no Brasil na região Norte em 1727 e a espécie introduzida foi a C. arabica variedade typica Cramer, mais conhecida como Café Nacional ou Crioulo, que foi cultivada no país por mais de um século. O Café Nacional chegou ao Estado de São Paulo, vindo do Rio de Janeiro, por volta de 1800 (KRUG et al., 1938; CARVALHO & FAZUOLI, 1993). Devido à decrescente produtividade do Café Nacional, outros cafeeiros tiveram que ser importados. Em 1859 foi introduzida a variedade bourbon de C. arabica, originária da Ilha da Reunião na África, que se apresentava mais produtivo que a variedade typica Cramer. Já em 1896 foi introduzida a variedade sumatra, que era uma linhagem mais produtiva da variedade typica Cramer, proveniente da Ilha de Sumatra. Os cafezais brasileiros desse período foram formados por sementes repassadas de um produtor para outro sem controle algum, e as variedades utilizadas eram: typica, bourbon e sumatra (KRUG et al., 1938). Por volta de 1930, com o início das pesquisas visando o melhoramento do café no Instituto Agronômico (IAC), as cultivares e variedades presentes nos cafezais do Estado de São Paulo e no Centro Experimental do IAC em Campinas passaram a ser caracterizadas por meio de estudos botânicos, morfológicos, citológicos e genéticos; visando esclarecer a taxonomia do gênero e a realização das primeiras hibridações e seleções. As variedades typica Cramer e bourbon originaram por mutação e hibridação natural ou artificial a maioria das variedades de C. arabica, sendo substituídas ao longo do tempo por novas variedades em geral mais produtivas. A variedade typica Cramer, caracteriza a espécie C. arabica, e tem sido utilizada como padrão em estudos comparativos (KRUG et al., 1938; CARVALHO & FAZUOLI, 1993). Em 1943, foram feitas as primeiras seleções de uma cultivar de C. arabica denominada Mundo Novo no município de Urupês-SP e que despertou grande interesse pela sua elevada produção, rusticidade e boa qualidade do produto (CARVALHO & FAZUOLI, 1993). A cultivar Mundo Novo que se originou do cruzamento natural entre a cultivar Bourbon Vermelho e a variedade sumatra (CARVALHO et al., 1952), é ainda hoje uma das cultivares de C. arabica mais utilizada pelos produtores no país com 35% da produção nacional, e utilizada ainda em hibridações intra ou interespecíficas. A cultivar Catuaí, é proveniente da hibridação artificial entre as cultivares Mundo Novo e Caturra e foi obtida com o objetivo de transferir o caráter CtCt da Caturra, que confere porte baixo, para a cultivar Mundo Novo que apresenta porte alto (CARVALHO & MÔNACO, 1972). Atualmente a cultivar Catuaí representa 60% da produção de café Arábica no Brasil (Pró- Café - Programa Integrado de Apoio à Cafeicultura) demonstrando que a redução no porte do cafeeiro foi um marco para a cafeicultura nacional devido à redução dos custos de produção (AGUIAR et al., 2004). O melhoramento genético do café Arábica tem sido dificultado pela baixa variabilidade genética observada em representantes da espécie C. arabica geralmente utilizadas em programas de melhoramento (ANTHONY et al., 2001; AGUIAR et al., 2004; MALUF et al., 2005). A baixa diversidade genética verificada nas cultivares de C. arabica é decorrente do seu processo de disseminação pelo mundo. Segundo ANTHONY et al. (2002) as representantes de C. arabica utilizadas nos programas de melhoramento são em geral provenientes das variedades botânicas: typica Cramer e bourbon. Na análise da diversidade genética de acessos silvestres e cultivares de C. arabica, incluindo as cultivares desenvolvidas no Brasil: Typica, Bourbon, Caturra e Catuaí, utilizando marcadores moleculares do tipo microssatélites e AFLP, ANTHONY et al. (2002) comprovaram a restrita base genética das cultivares quando comparadas a acessos silvestres da espécie e ainda uma estimativa da baixa distância genética entre as cultivares Typica e Bourbon, que foram desenvolvidas a partir das variedades botânicas: typica Cramer e bourbon. Apesar das dificuldades encontradas no melhoramento de espécies perenes e ainda com uma base genética restrita, como na espécie C. arabica, o IAC e outras instituições nacionais ao longo do tempo vêm desenvolvendo variedades de café com maior produtividade, precocidade, resistentes a pragas e doenças, e outras características importantes para a cultura, sendo que aos poucos as cultivares tradicionais como a Bourbon Vermelho, Bourbon Amarelo e Mundo Novo estão sendo substituídas por novas cultivares tais como Catuaí, Obatã, Tupi, entre outras. As cultivares desenvolvidas pelo IAC respondem por 90% da cafeicultura brasileira (THOMAZIELLO et al., 2000).

2.2 Taxonomia do Café O cafeeiro foi descrito pela primeira vez pelo botânico europeu Leonardo Rauwolf, seguido por Prospero Alpini que em sua viagem ao Egito publicou em 1591, referências ao café nomeado ‘Bon’. Quase um século depois Gaspar Commelin e em seguida Boerhave referem-se ao cafeeiro como uma espécie de jasmim. Em julho de 1714, Antoine de Jussieu descreve o café como o nome de Jasminum arabicum. Em 1735, Linneu propõe o gênero Coffea, que é utilizado até hoje, e descreve a primeira espécie de café denominada como Coffea arabica L. (CARVALHO, 1946; WRIGLEY, 1988). A segunda espécie do gênero Coffea L. foi descrita em 1783 por Lamarck como Coffea mauritana Lam., originária das ilhas Maurícia e Reunião. Outras duas espécies foram descritas em 1790 por João Loureiro oriundas de Zanzibar e Moçambique, sendo denominadas como Coffea zanguebarie Lour. e C. racemosa Lour. (CARVALHO, 1946). Com o passar do tempo, diversas espécies de café foram descritas e ainda hoje novas espécies são acrescentadas ao gênero como: C. heterocalyx, C. leonimontana, (STOFFELEN et al., 1996) C. vohemarensis, C. minutiflora, C. moratti, (DAVIS & RAKOTONASOLO, 2003) C. bridsoniae e C. kihansiensis (DAVIS & MVUNGI, 2004). Com a descoberta de novas espécies para o gênero Coffea L. principalmente a partir do século XIX, com a exploração de florestas tropicais na África, diversos botânicos tentaram descrever e dividir essas espécies dentro do gênero, gerando muitas sinonímias. Desses autores, um de maior destaque foi CHEVALIER (1947) que realizou uma vasta revisão para o gênero, coletando plantas no local de origem e analisando coleções de herbários (CLIFFORD & WILLSON, 1985). CHEVALIER (1947) dividiu o gênero Coffea L. em quatro seções: Paracoffea Mig., Argocoffea Pierre, Mascaracoffea Chev e Eucoffea K. Shum emend. A seção Eucoffea compreende as espécies de origem africana, incluindo C. arabica e C. canephora que são as espécies mais cultivadas no mundo, e foi dividida de acordo com características relacionadas a altura da planta, espessura das folhas, cor de fruto e distribuição geográfica em cinco subseções: Nanocoffea, Pachycoffea, Erythrocoffea, Melanocoffea, e Mozambicoffea. Num estudo posterior, LEROY (1980) demonstra a relação entre espécies do gênero Coffea e Psilanthus, ambos da família Rubiaceae. Este dividiu o gênero Coffea em quatro subgêneros: Coffea L., Psilanthopsis (Chev.) Leroy, Baracoffea (Leroy) Leroy e Paracoffea. A divisão em gênero e subgêneros foi feita com base em características como: tipo de inflorescência, habitat natural e formato da flor. Atualmente o café encontra-se classificado como pertencente à família Rubiaceae, tribo Coffeeae que é composta por dois gêneros: Coffea L. (subgêneros: Coffea e Baracoffea) e Psilanthus Hook f. (subgêneros: Psilanthus e Afrocoffea) que juntos abrangem mais de 100 espécies. O subgênero Coffea possui cerca de 80 espécies e tem como centro de origem regiões tropicais e subtropicais do Continente Africano, sendo a espécie C. arabica L., a primeira descrita para o gênero e até hoje a espécie mais importante comercialmente, nativa de regiões altas da Etiópia (BRIDSON, 1994; WRIGLEY, 1988).

2.3 Origem de C. arabica L. A espécie C. arabica, apesar de poliplóide, apresenta-se como um diplóide com herança dissômica. Este fato foi relatado por diversos autores, através de análises do comportamento meiótico (MEDINA, 1950), e estudos genéticos com haplóides (CARVALHO, 1952). Estudo realizado por MENDES & BACCHI (1940), revelou a ocorrência de pareamento entre cromossomos em uma variedade di-haplóide de C. arabica com 2n=2x=22 cromossomos, indicando pela primeira vez, a existência de similaridade entre os cromossomos do complemento desta espécie, isto é, os genomas que a constituíam aparentemente não eram tão distintos. Num estudo meiótico realizado por FORNI-MARTINS & CRUZ (1989) em uma planta de C. arabica, submetida à irradiação e contendo 2n=4x=44–1 cromossomos, foi constatada excepcionalmente a ocorrência de tri e tetravalentes. As autoras sugeriram que nesta planta de C. arabica as irregularidades meióticas provavelmente resultaram de alterações no sistema regulador do pareamento devido à radiação, ou que o cromossomo em falta poderia ser o portador de um ou vários genes que controlam o pareamento. O comportamento meiótico de C. arabica como um diplóide também foi observado por PINTO-MAGLIO & CRUZ (1998) e LASHERMES et al. (2000). A partir da análise do padrão de cromômeros na fase de paquíteno, PINTO- MAGLIO & CRUZ (1998) verificaram que os 22 bivalentes de C. arabica apresentam 54% de similaridade estrutural, o que foi confirmado pela presença de algumas associações secundárias, evidenciando citológicamente a condição de alotetraplóide de segmento desta espécie. Apesar dessa similaridade entre os cromossomos não homólogos de C. arabica, não foi observada a formação de multivalentes na meiose. Com base nestas observações PINTO-MAGLIO & CRUZ (1998) sugeriram a presença de um mecanismo de controle genético que impediria o pareamento entre cromossomos homeólogos em C. arabica. Este tipo de controle genético de pareamento foi relatado em outros híbridos interespecíficos poliplóides como o trigo (RILEY & CHAPMAN, 1958). A presença de um mecanismo que impede o pareamento de cromossomos homeólogos foi fundamental para a estabilidade reprodutiva do trigo e provavelmente dos poliplóides em geral (MOORE, 2000). Este mecanismo se encontra bem elucidado no hexaplóide Triticum aestivum, no qual sabe-se que o pareamento dos cromossomos é controlado pela atividade do gene Ph1, localizado no braço longo do cromossomo 5B (RILEY et al. 1960; RILEY, 1974), e que já foi mapeado até mesmo fisicamente (GILL et al., 1993). No tetraplóide Brassica napus também foi isolado um gene que impede o pareamento entre homeólogos, denominado PrBn (JENCZEWSKI & ALIX, 2003). Outras espécies, como Nicotiana tabacum (LAMMERTS, 1934), Gossypium hirsutum e G. barbadense (ENDRIZZI, 1962), Avena sativa (RAJHATHY & THOMAS, 1972), Festuca arundinaceae (EVANS & AUNG, 1986), espécies poliplóides de Aegilops sp. (CUÑADO & SANTOS, 1999), como o café, têm apresentado indícios da presença de tal mecanismo. Desde a década de 40, diversos estudos têm sido feitos visando estabelecer a origem auto ou alotetraplóide da espécie C. arabica. KRUG & MENDES (1940) relataram observações na microsporogênese de um híbrido triplóide, proveniente do cruzamento de C. arabica (2n=4x=44) e C. canephora (2n=2x=22), que apresentava características morfológicas intermediárias quando comparado a seus parentais. Como esperado, observaram irregularidades na distribuição dos cromossomos levando à formação de grãos de pólen estéreis. Visualizaram ainda a associação ocasional de três cromossomos na prófase e metáfase I, sugerindo a presença de regiões homeólogas nos cromossomos indicando assim um possível parentesco entre as espécies. O pareamento de cromossomos homeólogos entre C. arabica e C. canephora foi observado também por BOAVENTURA & CRUZ (1987) e LASHERMES et al. (2000) em híbridos tetraplóides destas espécies onde foi registrada a presença de tri e tetravalentes na meiose. Considerando a hipótese da alopoliploidia, CARVALHO & MÔNACO (1967) realizaram cruzamentos artificiais de C. arabica com formas tetraplóides das espécies diplóides: C. canephora, C. congensis e C. eugenioides, verificando que nessas o número de sementes produzidas era maior que em cruzamentos com outras espécies, indicando a possível participação delas no genoma de C. arabica. Com base no estudo comparativo da morfologia de cromossomos meióticos no paquíteno de 10 espécies de café, PINTO-MAGLIO & CRUZ (1987) sugeriram, que as espécies C. eugenioides, C. canephora, C. congensis ou C. liberica poderiam estar envolvidas na origem de C. arabica. BERTHOU et al. (1983) analisaram o padrão de restrição do DNA mitocondrial (mt DNA) e cloroplastidial (cp DNA) de nove espécies ou táxons de plantas de café, com o intuito de indicar as possíveis relações filogenéticas entre elas. Com relação ao DNA mitocondrial, as espécies C. arabica, C. eugenioides e C. congensis foram reunidas em um mesmo grupo, o que demonstra o mesmo padrão quanto ao mt DNA para as três espécies. Já com relação ao DNA cloroplastidial, as espécies C. arabica e C. eugenioides formaram um primeiro grupo, enquanto C. canephora e C. congensis formaram um segundo grupo. Segundo os autores, C. arabica seria um alotetraplóide oriundo da união de dois ramos evolutivos de Eucoffea que, com base nesses resultados, seriam formados por C. eugenioides de um lado e C. canephora e C. congensis do outro. CROS et al. (1998) estudando também o cp DNA de espécies de Coffea e Psilanthus, sugeriram com base na similaridade do espaço intergênico do cp DNA, que as espécies C. eugenioides e C. sp Moloundu podem ter sido a espécie maternal genitora de C. arabica. Analisando relações filogenéticas a partir de seqüências da região ITS 2 do DNA nucleolar ribossômico de vinte e três espécies de Coffea e três de Psilanthus, LASHERMES et al. (1997) descreveram que a espécie C. arabica apresentava somente um tipo de seqüência ITS 2 muito similar às seqüências encontradas nas espécies C. canephora, C. congensis e C. brevipes. Avaliando a diversidade genética em cultivares de C. arabica e nas espécies diplóides C. canephora e C. liberica por meio do uso de marcadores moleculares do tipo AFLP, STEIGER et al. (2002) constataram que C. canephora seria geneticamente mais próxima de C. arabica do que a espécie C. liberica. RAINA et al. (1998), visando comprovar a alopoliploidia e identificar as possíveis espécies diplóides que teriam dado origem a C. arabica, utilizaram a hibridação in situ genômica (GISH) para quatro combinações de espécies diplóides e a hibridação in situ fluorescente (FISH) com duas sondas de DNA ribossômico (rDNA), concluindo que C. arabica é um alotetraplóide oriundo possivelmente do cruzamento entre C. eugenioides e C. congensis. Já LASHERMES et al. (1999), investigando também a origem de C. arabica, utilizaram a técnica de GISH e sondas de RFLP testando quatro combinações de espécies diplóides, relatando que C. eugenioides e C. canephora seriam os possíveis parentais de C. arabica.

2.4 Número e Morfologia de Cromossomos no Gênero Coffea L. Inicialmente os estudos citológicos em espécies do gênero Coffea L. envolveram apenas a contagem do número de cromossomos. KRUG (1934) registrou 2n=44 cromossomos em metáfases mitóticas de C. arabica e 2n=22 cromossomos para as espécies C. canephora, C. excelsa (atualmente denominada C. dewevrei) e C. congensis. Este autor relatou num estudo posterior (KRUG, 1936) os mesmos números cromossômicos para diferentes variedades de C. arabica e outras quatro espécies do gênero, demonstrando ser 11 (x=11) o número básico de cromossomos para o gênero Coffea. MENDES (1938a) reunindo os resultados de número cromossômico de 165 plantas da família Rubiaceae, gênero Coffea, confirmou x=11 como o número básico para o gênero, e C. arabica como a única espécie tetraplóide (2n=4x=44), as demais seriam diplóides (2n=2x=22). A espécie C. racemosa teve o número cromossômico 2n=2x=22 cromossomos, determinado por SILVA (1956). Inicialmente o estabelecimento dos números cromossômicos não foi associado ao desenvolvimento de cariótipos para as espécies de café, devido ao tamanho reduzido dos cromossomos que apresentam cerca de 1 a 3 micrometros (μm) (KRUG, 1934). De acordo com MENDES (1956), os cromossomos do tetraplóide C. arabica são ainda ligeiramente menores que os cromossomos das espécies diplóides. MENDES (1938b) ao analisar a espécie C. excelsa, constatou que os cromossomos eram relativamente maiores que os das outras espécies analisadas por ele e ao construir o cariótipo desta espécie verificou a dificuldade de individualizar todos os cromossomos. Assim, os cromossomos do complemento desta espécie foram divididos em três classes de acordo como o tamanho. Na classe A foram agrupados três pares de cromossomos com 2 a 3 μm, a classe B foi formada por quatro pares com cerca de 2 μm e a classe C com quatro pares de cromossomos com 1 a 2 μm. Além do tamanho reduzido dos cromossomos, as pesquisas também evidenciaram que as espécies de café apresentam cariótipos bastante simétricos (BOUHARMOUNT, 1959; BOUHARMOUNT, 1963). Devido a alta similaridade dos cromossomos BOUHARMOUNT (1959; 1963) acabou desenvolvendo um cariótipo médio padrão para o gênero Coffea, onde destacavam-se apenas quatro dos onze cromossomos constituintes do complemento básico do gênero. Essas dificuldades, encontradas pelo pesquisador acima mencionado, podem ter sido decorrentes ainda do sistema de cortes histológicos usado na época, já que PIEROZZI et al. (1999) utilizando a técnica de esmagamento e coloração com orceína acética na análise das espécies C. canephora e C. dewevrei conseguiu detectar algumas diferenças entre os cariótipos dessas espécies e elaborar ideogramas para ambas. Como uma outra alternativa para superar o reduzido tamanho dos cromossomos somáticos de café, PINTO-MAGLIO & CRUZ (1987) analisaram os cromossomos meióticos no paquíteno de dez espécies do gênero Coffea, sendo nove diplóides e uma tetraplóide, C. arabica. Nesta fase da meiose os cromossomos homólogos apresentam-se totalmente pareados, portanto em número gamético n, e com comprimento médio de 30 μm, ou seja, dez vezes maiores que os cromossomos metafásicos mitóticos, e mostram ainda um padrão de cromômeros que facilita a sua identificação. Foram avaliados diversos parâmetros como: constituição e posição do centrômero, presença de regiões heterocromáticas, a constituição da região organizadora do nucléolo (NOR); os quais permitiram registrar o número de cromossomos associados ao nucléolo para cada uma das espécies, e através da comparação morfológica dos cromossomos, sugerir C. eugenioides, C. canephora, C. congensis ou C. liberica como possíveis espécies parentais para C. arabica. Dando seqüência à caracterização do complemento cromossômico de espécies de café, PINTO-MAGLIO & CRUZ (1998) elaboraram ainda um cariótipo e respectivo ideograma para a espécie C. arabica, a partir de cromossomos meióticos também na fase de paquíteno. Com relação ao padrão de cromômeros foi demonstrado que os 22 bivalentes de C. arabica apresentavam 54% de similaridade estrutural, o que foi comprovado pela presença de associações secundárias. Apesar disso não foram observadas anormalidades na meiose devido ao pareamento entre cromossomos homeólogos, fato que levou as autoras a levantarem a possibilidade da existência, em C. arabica, de um mecanismo de controle genético que impediria tal pareamento. Este trabalho, entre outros, mais uma vez evidenciou a similaridade dos cromossomos de café. Outras técnicas foram empregadas com o objetivo de diferenciar os cromossomos de café. PIEROZZI et al. (1999) avaliaram células somáticas das espécies C. canephora e C. dewevrei com a utilização de orceína acética que possibilita estudar a morfologia cromossômica, verificando que ambas as espécies apresentam uma constrição secundária nos cromossomos 1 e 3, e que os cromossomos 5, 10 e 11 são metacêntricos enquanto que os demais são submetacêntricos. PIEROZZI et al. (2003) estudaram seis espécies diplóides de café usando as técnicas de orceína acética, banda C e AgNOR. Com o uso da orceína acética, verificou-se nessas espécies uma predominância de cromossomos submetacêntricos e ao menos um metacêntrico. As bandas C foram encontradas preferencialmente em regiões centroméricas e pericentroméricas com certa similaridade entre as espécies observadas. No bandamento com a prata foi constatada a presença de um ou mais pares de cromossomos associado a NOR. Mais recentemente PINTO-MAGLIO et al. (2000; 2001) adaptaram técnicas citomoleculares, como por exemplo, o bandamento com fluorocromos e FISH, para serem aplicadas nas análises dos cromossomos de café. Os fluorocromos evidenciam regiões heterocromáticas ricas em bases AT ou GC enquanto que a hibridação in situ fluorescente (FISH) permite o mapeamento físico de seqüências de nucleotídeos específicas como o DNA ribossômico (rDNA). Inicialmente estas técnicas foram utilizadas na espécie tetraplóide C. arabica cv Bourbon Vermelho (PINTO-MAGLIO et al., 2000; 2001) e posteriormente em outras diplóides como: C. eugenioides, C. canephora Pierre ex Frohner (BARBOSA et al., 2001); C. brevipes, C. racemosa (LOMBELLO & PINTO-MAGLIO, 2004a); C. humilis, C. kapakata, C. sp. Moloundu, C. stenophylla (LOMBELLO & PINTO-MAGLIO, 2004b); C. canephora cv. Apoatã, C. salvatrix, C. sessiflora (LOMBELLO & PINTO-MAGLIO, 2004c); C. congensis e C. liberica (PINTO-MAGLIO et al., no prelo). Em comum estes autores observaram que dos fluorocromos utilizados apenas a Cromomicina A3 (CMA3) foi eficiente na distinção de bandas, possibilitando visualizar diferenças em número entre as espécies. Já a técnica de hibridação in situ permitiu a caracterização dos complementos das diferentes espécies baseada principalmente na quantificação dos sinais referentes às regiões organizadores do nucléolo, não sendo ainda possível associá-las aos diferentes cromossomos dos complementos. Na hibridação in situ, foram usadas duas sondas de rDNA, sendo que a sonda de rDNA pTa71 (região 18S- 5,8S-26S) apresentou maiores diferenças em número de sinais entre as espécies de café, quando comparada a sonda pScT7 (região 5S).

2.5 Diferenciação dos Cromossomos no Gênero Coffea L. Através de Técnicas Citomoleculares 2.5.1 Hibridação in situ A hibridação in situ é uma técnica que possibilita a localização de seqüências específicas de ácidos nucléicos (DNA ou RNA) in situ, seja no citoplasma, organelas ou cromossomos, bem como a detecção de introgressão de genomas em espécies híbridas. Esta técnica vem sendo utilizada na construção de mapas físicos de cromossomos, na análise e investigação da estrutura, função e evolução dos cromossomos, e na detecção de genomas (LEITCH et al., 1994). Dependendo do tamanho e natureza da sonda de DNA a ser empregada, a técnica de hibridação in situ é denominada FISH (Fluorescense in situ hybridization) quando as sondas são constituídas de seqüências únicas ou repetitivas e GISH (Genomic in situ hybridization) quando a sonda constitui-se do DNA genômico total de um organismo. Assim as metodologias empregadas nas técnicas de FISH e GISH são semelhantes, diferindo apenas no tamanho e origem das sondas a serem utilizadas (GILL, 1995; HESLOP-HARRISON & SCHWARZACHER, 1996). O primeiro estudo em espécies de Coffea com a hibridação in situ foi o de BARRE et al. (1998), que analisaram a contribuição cromossômica de parentais através de GISH, em híbridos diplóides provenientes do cruzamento interespecífico de C. liberica var. dewevrei (DEW) da África Central com C. pseudozanguebariae (PSE) do Kenya, e ainda um segunda geração desses híbridos (G2) obtidos do cruzamento com ambos os parentais. Utilizaram ainda a FISH com a sonda de rDNA pTa71 (região 18S-5,8S-26S), encontrando dois sinais localizados em regiões terminais de cromossomos de ambas as espécies parentais. Com a GISH observaram que os híbridos F1 apresentavam onze cromossomos provenientes de cada parental, sendo que um dos cromossomos originários de DEW apresentava um sinal referente a sonda de rDNA incluída no procedimento. Descrevem ainda que os híbridos G2 do retrocruzamento com PSE apresentaram treze cromossomos de PSE, enquanto que os híbridos do retrocruzamento com DEW apresentaram apenas nove de PSE. RAINA et al. (1998), com o intuito de identificar as espécies diplóides que deram origem ao alotetraplóide C. arabica, utilizaram a GISH com quatro combinações de espécies diplóides e FISH com duas sondas de rDNA: a pTa71 e a pTa794 (região 5S). Na GISH, observaram que o DNA dos 22 cromossomos de C. eugenioides se hibridava fortemente ao DNA de 22 cromossomos de C. arabica, enquanto o DNA dos 22 cromossomos restantes se ligaram ao DNA dos cromossomos de C. congensis. Com relação às sondas de rDNA, encontraram similaridades quanto a disposição dos sinais nas três espécies citadas acima, principalmente quanto aos quatro sinais de C. eugenioides obtidos com a pTa794 quando comparados a quatro dos seis sinais com essa mesma sonda em C. arabica. C. congensis apresentou dois sinais com ambas as sondas. C. eugenioides apresentou ainda dois sinais com a pTa71, enquanto C. arabica apresentou dois a mais, totalizando quatro sinais. LASHERMES et al. (1999) investigando também a origem de C. arabica, utilizaram a técnica de GISH testando quatro combinações de diplóides que seriam os possíveis parentais, relatando uma forte associação do DNA de 22 cromossomos de C. arabica com os cromossomos de C. eugenioides. O DNA dos demais cromossomos ligaram-se aos 22 cromossomos de C. canephora, discordando assim de RAINA et al. (1998), que colocaram C. eugenioides e C. congensis como possíveis espécies genitoras de C. arabica. Utilizando a técnica de FISH, foi feito o mapeamento no complemento cromossômico de seqüências de rDNA em outras espécies de café e em gêneros geneticamente próximos, presentes no Banco de Germoplasma do IAC. A hibridação in situ teve ainda a função de esclarecer o número de cromossomos que possuem o rDNA em C. arabica, já que PINTO-MAGLIO (1991) descreveu que apesar de apenas três cromossomos (14, 20 e 21) aparecerem ligados ao nucléolo, outros cromossomos possuem estrutura similar, com um cromômero na região terminal o que caracteriza um cromossomo nucleolar. PINTO-MAGLIO et al. (2000; 2001), analisando C. arabica cultivar Bourbon Vermelho, observaram seis bandas evidenciadas pela hibridação in situ com a sonda de rDNA pTa71 e quatro bandas com a seqüência 5S ou sonda pScT7. Utilizando a sonda pTa71 foi observado na hibridação, quatro sinais em cromossomos de C. eugenioides e dois sinais em C. canephora Pierre ex Frohner e C. liberica (BARBOSA et al., 2001); já com a sonda pScT7 foram observados dois sinais nas três espécies (PINTO-MAGLIO et al., no prelo). LOMBELLO & PINTO- MAGLIO (2003) estudando uma espécie selvagem diplóide de um gênero próximo ao café, Psilanthus ebractoteolatus, visualizaram dois sinais com ambas as sondas de rDNA: pTa71 e pScT7. LOMBELLO & PINTO-MAGLIO (2004a) analisando as espécies P. bengalensis, P. tranvancorensis, C. brevipes e C. racemosa, observaram dois sinais para todas as espécies estudadas com a utilização das sondas pTa71 e pScT7, exceto C. racemosa que apresentou quatro sinais com a pTa71. LOMBELLO & PINTO-MAGLIO (2004b), avaliando as espécies C. humilis, C. kapakata, C. sp. Moloundu e C. stenophylla, visualizaram na hibridação in situ com as sondas pTa71 e pScT7 dois sinais em todas as espécies, sendo que a única exceção foi C. sp. Moloundu, que apresentou quatro sinais com a sonda pTa71. LOMBELLO & PINTO-MAGLIO (2004c) visualizaram somente dois sinais nas espécies C. canephora cv. Apoatã, C. salvatrix, C. sessiflora utilizando as sondas de rDNA pTa71 e pScT7. As espécies C. congensis e C. liberica apresentaram dois sinais com as sondas pTa71 e pScT7 (PINTO-MAGLIO et al., no prelo). A hibridação in situ com seqüências de rDNA, vem sendo utilizada nas mais variadas espécies para diversos fins, como na análise filogenética, evolutiva e diferenciação das espécies como as constituintes dos gêneros Clivia (RAN et al., 1999; RAN et al., 2001), Hypochaeris (CERBAH et al., 1998; TREMETSBERGER et al., 2005), Hordeum (TAKETA et al., 1999; TAKETA et al., 2005) e Nicotiana (KITAMURA et al., 2001); ou até mesmo na diferenciação de cultivares como as das espécies Manihot esculenta (CARVALHO & GUERRA, 2002) e Phaseolus vulgaris L. (PEDROSA et al., 2003). O estudo do número e distribuição dos genes de rRNA, através da hibridação in situ, possibilita em algumas espécies como Citrus, Poncirus e híbridos entre eles (ROOSE et al., 1998), a identificação individual de cromossomos. Os sítios de rDNA podem ser úteis também como uma ferramenta auxiliar em programas de melhoramento. Em híbridos de trigo com Thinopyrum ponticum, que é uma espécie usada como fonte de genes de resistência a patógenos no processo de melhoramento do trigo, o número e a posição dos sítios de rDNA tem potencial como marcadores úteis para identificar a origem dos cromossomos nos híbridos (BRASILEIRO-VIDAL et al., 2003; BRASILEIRO-VIDAL et al., 2005). As seqüências de rDNA são utilizadas ainda para comprovar o estado híbrido de plantas após cruzamentos inter ou intraespecíficos, como já realizado em espécies de Lilium (MARASEK et al., 2004). O uso de sondas de rDNA como a pTa71 referente à seqüência 18S-5,8S-26S, pode ser útil ainda para determinar precocemente o nível de ploidia, e já foi utilizado para este fim em espécies e híbridos de Musa (OSUJI et al., 1998) e Hylocereus (TEL-ZUR et al., 2004), tendo coerência no número de sítios desta seqüência e nível de ploidia da planta. O número de sítios do rDNA 5S em espécies de Paspalum também coincide com o nível de ploidia (VAIO et al., 2005). O mapeamento dos sítios de rDNA fornece diversas informações sobre a organização dos genomas e já foi realizado em diferentes espécies como as dos gêneros Vigna e Phaseolus (GUERRA et al., 1996), Rhynchosposra (VANZELLA et al., 1998), Gossypium (JI et al., 1999), Lolium (THOMAS et al., 2001), Vicia (RAINA et al., 2001), Brassica (HASTEROK et al., 2001; KULAK et al., 2002; KOO et al., 2004), Lupinus (NAGANOWSKA & ZIELIŃSKA, 2002), Arrhenatherum (MITCHELL et al., 2003), Camellia (GU & XIAO, 2003), Hypochaeris (TREMETSBERGER et al., 2004), Haplopappus Cass. e Grindelia Willd. (BAEZA & SCHRADER, 2005).

2.5.2 Fluorocromos SCHWEIZER (1976) expõe a praticidade no bandamento cromossômico com fluorocromos específicos para regiões heterocromáticas ricas em bases GC ou AT, podendo selecionar os fluorocromos para uma coloração seqüencial de ambas as regiões. Este relata a afinidade de antibióticos como a Cromomicina A3 (CMA3) por regiões heterocromáticas ricas em bases GC, sendo que as bandas encontradas coincidem com outras discriminadas no bandamento C, porém nem todas as bandas C são discriminadas pelo fluorocromo. Descreve ainda que bandas da CMA3 puderam ser visualizadas em células metafásicas em regiões anteriormente descritas como nucleolares. Já o fluorocromo 4’,-6-diamidinino-2-phenylindole (DAPI) discrimina regiões heterocromáticas ricas em bases AT e é comumente utilizado associado com um contrastante negativo como a Actomicina D (AMD). Espécies de café e do gênero Psilanthus tiveram seu complemento cromossômico caracterizado pelo uso dos fluorocromos DAPI e CMA3. PINTO-MAGLIO et al. (2001) obtiveram para a cultivar Bourbon Vermelho de C. arabica, resultados negativos para o bandamento com DAPI e positivo para CMA3 tendo sido observadas seis bandas. BARBOSA et al. (2001) caracterizaram três espécies diplóides do gênero Coffea: C. eugenioides, C. canephora e C. dewevrei, com o uso desses fluorocromos. Em todas as espécies avaliadas não foram visualizadas bandas positivas nos cromossomos com a utilização do fluorocromo DAPI. No entanto, com a CMA3 foram observadas quatro bandas em C. eugenioides e seis nas espécies C. canephora e C. dewevrei. LOMBELLO & PINTO-MAGLIO (2003), estudando a espécie P. ebractoteolatus, não verificaram bandas com o uso do DAPI, porém visualizaram quatro bandas com a CMA3. LOMBELLO & PINTO-MAGLIO (2004a), avaliando as espécies do gênero Psilanthus: P. bengalensis e P. tranvancorensis e outras duas do gênero Coffea: C. brevipes e C. racemosa, não visualizaram bandas positivas com o uso do DAPI; já com a CMA3 foram verificadas quatro bandas em P. tranvancorensis e C. racemosa; e duas bandas em C. brevipes e P. bengalensis. LOMBELLO & PINTO- MAGLIO (2004b), avaliando as espécies C. humilis, C. kapakata, C. sp. Moloundu e C. stenophylla, observaram bandas com o DAPI apenas em C. stenophylla, porém estas não foram determinantes quanto a seu número. Já com a CMA3, C. kapakata, C. sp. Moloundu e C. stenophylla apresentaram quatro bandas, enquanto C. humilis apresentou cerca de oito bandas. LOMBELLO & PINTO-MAGLIO (2004c), com a aplicação da CMA3, verificaram nas espécies C. salvatrix e C. sessiflora quatro bandas e em C. canephora cultivar Apoatã, duas bandas. Nenhuma dessas espécies apresentou bandas positivas para o fluorocromo DAPI. As espécies C. congensis e C. liberica não tiveram resultados positivos com o uso do DAPI, porém com a CMA3 foram observadas seis bandas em ambas as espécies (PINTO-MAGLIO et al., no prelo). Diferenças no padrão de bandamento com fluorocromos possibilitam a diferenciação de gêneros, espécies, populações e até do complemento cromossômico; permitindo a identificação de cromossomos individuais. Espécies de gêneros como: Citrus, Poncirus (ROOSE et al., 1998), Clivia sp. (RAN et al., 1999), Nicotiana (NAKAMURA et al., 2001), Passiflora L. (MELO et al., 2001), Manihot (CARVALHO & GUERRA, 2002), Allium (KIM et al., 2002), Lupinus (HAJDERA et al., 2003), Citrus spp. (YAMAMOTO & TOMINAGA, 2003; YAMAMOTO & TOMINAGA, 2004), Selaginella (MARCON et al., 2005) e Paspalum (VAIO et al., 2005), por exemplo, já tiveram seu cariótipo caracterizado pelo uso da CMA3 e/ou DAPI.

2.5.3 AgNOR O nitrato de prata (AgNO3) tem afinidade por proteínas nucleoares presentes nos nucleólos e constrições secundárias de cromossomos que possuem genes de rDNA e, que podem estar envolvidos na formação da região organizadora do nucléolo (NOR). Com a utilização do nitrato de prata para o bandamento cromossômico, formam-se bandas em locais onde se encontram as proteínas nucleolares. As bandas podem ser vistas na prófase ou até em cromossomos metafásicos indicando a transcrição dessas proteínas no ultimo ciclo celular (GOODPASTURE & BLOOM, 1975). Algumas espécies diplóides de café já foram avaliadas quanto ao bandamento com a prata. PIEROZZI et al. (2003) avaliando sete espécies diplóides de Coffea verificaram a presença de um par de cromossomos com banda NOR em: C. canephora, C. congensis, C. dewevrei, C. eugenioides e C. liberica (hoje, C. dewevrei var. liberica); e dois pares para C. stenophylla e C. racemosa. Estes dados confirmam os resultados de PINTO-MAGLIO & CRUZ, (1987) para os números de cromossomos meióticos associados ao nucléolo observados nestas mesmas espécies. PINTO-MAGLIO et al. (no prelo), com o uso da prata, registraram também para as espécies C. canephora, C. congensis e C. dewevrei var. liberica a presença de apenas duas bandas, ou seja, apenas um par de cromossomos do complemento haplóide associado a NOR, porém contrastando com os resultados de PIEROZZI et al. (2003), destacaram a presença de quatro bandas NOR em dois pares de cromossomos em C. eugenioides. PINTO-MAGLIO et al. (no prelo) confirmaram a presença de quatro NORs para C. eugenioides através da hibridação in situ do rDNA 45S e pelo bandamento com CMA3. A coloração com o nitrato de prata vem sendo utilizada para identificar o número de nucléolos e possíveis sítios ativos da NOR em diferentes espécies vegetais, como as do gênero Lathyrus (MURRAY et al., 1992), Guizotia (DAGNE, 1995), Capsicum (MOSCONE et al., 1995), Clivia (RAN et al., 1999), Manihot (CARVALHO & GUERRA, 2002); e espécies como Secale cereale (MURRAY, 1994), o tetraplóide Medicago sativa e os diplóides M. coerulea e M. falcata (CALDERINI et al., 1996); Thinopyrum ponticum (BRASILEIRO-VIDAL et al., 2003), Brassica (HASTEROK et al., 2005), entre outras. As bandas evidenciadas pela impregnação pela a prata têm sido associadas a sítios de rDNA, principalmente ao sítio 18S-5,8S-26S. Alguns estudos envolvem o uso simultâneo da hibridação in situ com a seqüência 18S-5,8S-26S e a impregnação pela prata, como nas espécies: Allium commutatum Guss. (BESENDORFER et al., 2002), Lupinus angustifolius (HADJERA et al., 2003), outras dez espécies do gênero Hypochaeris (CERBAH et al., 1998), Picea omorika e P. abies (SILJAK-YAKOVLEV et al., 2002), espécies de Selaginella (MARCON et al., 2005), nas quais foi observada uma correspondência entre os sítios do rDNA 18S-5,8S-26S e o número máximo de bandas contrastadas pela prata, comprovando que todos os sítios deste rDNA estavam ativos. Nem sempre todos os sítios de rDNA estão ativos, ocorrendo uma variação no número de sítios ativos corados com a prata numa mesma espécie, porém, alguns sítios após o estudo de muitas células nunca são vistos em atividade. Isto já foi verificado nas em espécies como Hypochaeris chillensis (CERBAH et al., 1998) e Lupinus consentinii (HADJERA et al., 2003).

2.5.4 Bandas C A heterocromatina constitutiva corresponde a uma região dos cromossomos permanentemente condensada, que pode conter genes, porém estes são inativos devido ao seu grau de condensação que impede a transcrição. O bandamento C é uma técnica que permite localizar a heterocromatina possibilitando a caracterização de cromossomos pela avaliação da quantidade e distribuição de bandas (MARKS & SCHWEIZER, 1974). O bandamento C envolve dois tratamentos, sendo inicialmente aplicado sobre os cromossomos uma solução básica de hidróxido de bário e em seguida uma solução salina em temperatura elevada, podendo ainda ser incluído um tratamento inicial com ácido acético ou ácido clorídrico. Esse procedimento leva a fragmentação do DNA que progressivamente é eliminado dos cromossomos. O DNA contido na região da heterocromatina é menos sensível a esse tratamento do que o DNA da eucromatina, possivelmente devido a uma associação mais forte entre DNA e proteínas na heterocromatina. Após a coloração com o Giemsa, são visualizadas regiões mais escuras que correspondem a heterocromatina e que são denominadas bandas C. PIEROZZI et al. (1999) avaliando células mitóticas das espécies C. canephora e C. dewevrei com o bandamento C, não encontraram diferenças significativas entre as espécies. Nessas espécies as bandas C foram encontradas predominantemente nas regiões centromérica e pericentromérica. Outras seis espécies diplóides de Coffea e uma de Psilanthus foram estudadas aplicando o bandamento C, sendo que nessas espécies as bandas também foram encontradas preferencialmente em regiões centroméricas e pericentroméricas, apresentando uma similaridade entre as espécies observadas (PIEROZZI et al., 2003). Diversas espécies vêm sendo avaliadas com o uso do bandamento C, como espécies do gênero Genipa que assim como o café, pertencem á família Rubiaceae. PIEROZZI et al. (1997), analisando o padrão de bandamento C nas espécies G. americana e G. infundibuliformes, relataram um alto número de bandas sendo essas encontradas em todos os cromossomos de ambas as espécies, porém nem sempre na mesma posição, permitindo a diferenciação das espécies por meio dessa técnica. O padrão das bandas C pode ser utilizado ainda em análises filogenéticas e estudo da evolução do cariótipo. O bandamento C associado à técnica de hibridação in situ fluorescente permitiu a separação de quatro espécies conhecidas e uma suposta espécie do gênero Clivia, família Amaryllidaceae, em três grupos. As bandas C coincidiram ainda com regiões do rDNA 18S-5,8S-26S (RAN et al., 2001). Em outras espécies, como Allium cepa L. (2n=2x=16), o bandamento C permitiu a distinção de todos os cromossomos do complemento (KIM et al., 2002). Já em plantas de Medicago sativa subesp. sativa, o bandamento C permitiu além da identificação de cromossomos, a análise de diversidade de um germoplasma e a identificação de aneuplóides (BAUCHAN et al., 2002). No gênero Alstroemeria, o bandamento C possibilitou a diferenciação de espécies e ainda a identificação de cromossomos dos parentais em híbridos interespecíficos (ISHIKAWA & ISHIZAKA, 2002). Assim como em Alstroemeria, o bandamento C vem sendo utilizado em várias espécies para determinar a variação cromossômica entre e dentro de espécies dos mais variados gêneros: Secale (MURRAY, 1994), Guizotia (DAGNE, 1995), Clivia e Narcissus (RAN et al., 1999; RAN et al., 2001; D’AMATO, 2004), Avena (JELLEN & LADIZINSKY, 2000), Bromus (TUNA et al., 2001; TUNA et al., 2004; TUNA et al., 2005), Arrhenatherum (MITCHELL et al., 2003), Allium (BESENDORFER et al., 2002), Manihot (CARVALHO & GUERRA, 2002), Triticum (DEDKOVA et al., 2004), Crepis japonica, Galinsoga parviflora e Chaptalia nutans (FREGONEZI et al., 2004).

2.6 Regiões organizadoras do nucléolo em Coffea L. PINTO-MAGLIO & CRUZ (1987) analisaram os cromossomos meióticos no paquíteno da tetraplóide C. arabica e de outras nove espécies diplóides de café. Foram avaliados, entre outros parâmetros, o número de cromossomos associados ao nucléolo e a constituição da região organizadora do nucléolo (NOR). Dentre as nove espécies diplóides analisadas C. racemosa e C. salvatrix apresentaram dois pares de cromossomos nucleolares, enquanto que outras seis exibiram somente um par de cromossomos nucleolares. Já C. stenophylla apresentou de um a três pares de cromossomos nucleolares. A espécie tetraplóide C. arabica apresentou de um a três pares de cromossomos associados ao nucléolo, sendo dois o número mais comum. PINTO-MAGLIO (1991); PINTO-MAGLIO & CRUZ (1998) constataram, estudando os cromossomos meióticos no estágio de paquíteno de C. arabica, variedade arabica L. (ou typica Cramer) e cultivar Bourbon Vermelho, que os cromossomos do complemento envolvidos na formação da NOR eram o 14, 20 e 21, sendo que os cromossomos 14 e 21 pareciam estar mais comumente associados à NOR. A observação de outros três pares de cromossomos que tinham em um de seus braços uma terminação típica de cromossomo nucleolar, ou seja, um cromômero satélite, porém nunca associados com o nucléolo, levou as autoras a sugerirem a existência de uma relação de dominância entre os cromossomos nucleolares na espécie C. arabica. A dominância nucleolar tem sido observada em diversas espécies, principalmente em híbridos interespecíficos, como é o caso de C. arabica. REEDER (1985) reuniu evidências sobre a dominância nucleolar em híbridos interespecíficos, incluindo muitos gêneros de plantas e animais como sapos e Drosophila, relatando a existência de dois mecanismos moleculares que poderiam atuar nesse processo. O primeiro mecanismo envolveria a competição entre genes ribossomais com número desigual de elementos “enhancer” (mecanismo desequilíbrio “enhancer”), e o segundo estaria relacionado a diferenças no sistema de transcrição dos genitores, no qual o fator de transcrição de uma espécie não reconheceria o promotor do gene ribossomal da outra (mecanismo fator espécie-específico). Já PONTES et al. (2003), estudando a dominância nucleolar no híbrido alotetraplóide Arabdopsis suecica, descrevem a atividade de NORs que são homólogas nas espécies parentais, no seu estágio ativo e inativo, sugerindo que a dominância nucleolar pode resultar de pequenas variações genéticas ou epigenéticas, não sendo um traço fundamental numa dada combinação de híbridos interespecíficos. PIEROZZI et al. (1999) avaliaram células somáticas das espécies C. canephora e C. dewevrei constatando que a NOR foi localizada no cromossomo 3 de ambas as espécies. Num estudo posterior, PIEROZZI et al. (2003) estudaram seis espécies diplóides de café usando AgNO3 e descreveram que nas análises iniciais foi observada a presença de um ou mais pares de cromossomos associado a NOR. A sonda de rDNA 18S-5,8S-26S está associada à formação da NOR e, portanto a presença de sítios desta sonda indica o número de cromossomos nucleolares mesmo quando estes não estão ativos. Na espécie tetraplóide C. arabica cultivar Bourbon Vermelho foram observadas com esta sonda três sítios do rDNA 18S-5,8S-26S (PINTO-MAGLIO et al., 2001), na mesma localização de três sítios evidenciados pela impregnação com a prata (PINTO-MAGLIO et al., no prelo). Em espécies diplóides do gênero Coffea, como descrito acima, também estão sendo feitas pesquisas referentes a NOR, com o uso da hibridação in situ e bandamento com prata, e ainda bandamento com a CMA3. Nas espécies diplóides a concordância nos resultados obtidos com tais técnicas também vem sendo observada.

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Material Foram utilizadas raízes e botões florais da variedade typica Cramer e da cultivar Mundo Novo de C. arabica L. (Tabela 1), cujas plantas estão disponíveis no Banco Ativo de Germoplasma do Centro de Análise e Pesquisa Tecnológica do Agronegócio do Café “Alcides Carvalho”, Fazenda Santa Elisa, no Instituto Agronômico (IAC) em Campinas/SP.

Tabela 1 - Plantas de C. arabica L. utilizadas neste estudo, com os respectivos números cromossômicos e registros no Banco de Germoplasma (BAG) e Herbário do IAC. Herbário C. arabica L. Número Origem BAG-IAC cromossômico IAC

typica Cramer 2n=4x=44 Variedade Coleção 2 IAC-25032

Mundo Novo 2n=4x=44 Cultivar 376-4 ----

3. 2 Métodos 3.2.1 Mitose Sementes de C. arabica da var. typica e da cv Mundo Novo, foram colocadas para germinar em placas de Petri com papel filtro, sendo umedecidas diariamente com água destilada e mantidas num fotoperíodo de 8 horas. Após 3 a 4 semanas, as raízes recém germinadas com cerca de 0,5 a 1,0 cm foram coletadas e tratadas com o agente anti- mitótico paradiclorobenzeno (PDB) por 4 horas. Essas raízes foram fixadas numa solução de álcool etílico e ácido acético (3:1) e armazenadas em freezer –20°C. Para as preparações citológicas, as raízes já fixadas, foram hidrolisadas numa mistura de enzimas (0,2% celulase, 0,2% citohelicase, 0,2% pectoliase; diluídas em solução 2 mM tampão Cítrico-Citrato pH 4,5) a 37°C por 20-30 minutos, para o amolecimento do meristema e em seguida esmagadas diretamente nas lâminas contendo ácido acético 45%. As lâminas com maior número de células, nas fases de pré-metáfase ou metáfase, foram selecionadas e mergulhadas no nitrogênio líquido para a retirada das lamínulas, em seguida foram secas à temperatura ambiente e imediatamente armazenadas na geladeira até serem utilizadas.

3.2.2 Meiose Para estudo dos cromossomos em meiose, foram coletados ramos com botões jovens da var typica e da cv Mundo Novo de C. arabica, os quais foram colocados em condições de laboratório apropriadas ao seu desenvolvimento, segundo o procedimento descrito por PINTO-MAGLIO (1983), até atingirem as fases da meiose de interesse, sendo essas paquíteno, diacinese e metáfase I. PINTO-MAGLIO (1983) descreveu que em C. arabica os botões florais ficam dormentes numa fase pré-meiótica até que ocorra a primeira chuva após o período de seca do inverno. Assim, foram coletados ramos com botões jovens que foram colocados numa câmara úmida para simular o que ocorre na natureza, realizando-se coletas periódicas de amostras para verificar a fase meiótica em que se encontravam os botões. Para as verificações periódicas, duas ou três anteras foram colocadas em lâminas e esmagadas em Carmim Acético 1,2% com auxilio de um bastão de vidro e após, a retirada do excesso de tecido das anteras, células mães de pólen foram cobertas com uma lamínula. Quando os botões encontravam-se nas fases de interesse, esses eram coletados, fixados em álcool etílico e ácido acético (3:1) e armazenadas em freezer –20°C. No preparo das lâminas para serem utilizadas nos experimentos descritos abaixo, as anteras foram esmagadas em ácido acético 45% e as lâminas com maior número de células em paquíteno, diacinese ou metáfase I foram selecionadas e a seguir mergulhadas no nitrogênio líquido para a retirada das lamínulas, secando em seguida à temperatura ambiente e sendo então armazenadas na geladeira até serem utilizadas.

3.2.3 Hibridação in situ Para a técnica de hibridação in situ fluorescente (FISH) foram utilizadas lâminas de metáfases mitóticas dos dois materiais: var typica e cv Mundo Novo. O protocolo utilizado para a hibridação foi o descrito por PENDAS et al. (1993), modificado por PINTO- MAGLIO et al. (2000) para ser utilizado em cromossomos de café. Este protocolo consta principalmente das seguintes etapas: a) Amplificação e marcação da sonda As sondas já inseridas em plasmídeos foram multiplicadas em bactérias e isoladas através de mini-preparação de plasmídeo bacteriano (miniprep). Uma porção dos plasmídeos foi submetida a digestão para certificar a presença do inserto ou sonda. Após isso, os plasmídeos foram marcados por nick translation com a digoxigenina associada ao nucleotídeo uracila (digoxigenina-11-dUTP Roche), através do sistema enzimático de marcação que envolve a DNase e a DNA polimerase, atuando na incorporação dos nucleotídeos marcados a uma das fitas de DNA da sonda. b) Pré-tratamento das preparações citológicas Antes de se proceder à hibridação, foi efetuado o pré-tratamento das preparações citológicas com RNAse e pepsina, que impedem a hibridação da sonda com ácidos nucléicos que não se constituem em alvo, e reduz as interações não específicas com proteínas ou outros componentes que poderiam se ligar à sonda. c) Desnaturação da sonda e cromossomos As sondas e as lâminas com as preparações cromossômicas foram desnaturadas para permanecerem com as respectivas cadeias de DNA em fita simples. A desnaturação das sondas e dos cromossomos foi feita separadamente. A sonda marcada foi diluída numa solução contendo sais, formamida, tampão fosfato e dextran sulfato; e submetida à desnaturação por 8 minutos à 99°C em banho-maria. Os cromossomos foram desnaturados pela adição nas lâminas da solução de desnaturação contendo sais, formamida e tampão fosfato na estufa à 80°C. d) Hibridação A sonda já desnaturada foi aplicada sobre os cromossomos também desnaturados. As lâminas com as preparações citológicas (DNA alvo e sonda), foram então incubadas, em câmara úmida e mantidas em estufa à 42°C por cerca de 16 horas (overnight). e) Lavagens após a hibridação Foram feitas lavagens das preparações citológicas após a hibridação com o objetivo de remover sondas não inteiramente associadas de modo que permanecessem somente as ligações perfeitas, ou quase perfeitas, dos nucleotídeos na fita dupla do DNA renaturado. f) Detecção dos sinais de hibridação Por meio de uma reação antígeno-anticorpo, a anti-digoxigenina conjugada ao fluorocromo fluoresceína se une a digoxigenina ligada aos nucleotídeos da sonda o que resulta na visualização de sinais fluorescentes observados no microscópio de fluorescência a partir do uso de filtros de luz específicos para o comprimento de onda da fluoresceína. As lâminas foram finalizadas com meio de montagem para fluorescência, com “anti-fading”, Vectashield (Vector Laboratories) contendo o contracorante 4’-6-diamidinino-2- phenylindole (DAPI). As imagens de células e sinais relativos aos pontos de hibridação foram observados através de um microscópio de epifluorescência Olympus BX50 equipado com filtro Olympus UMNB2 (excitação a 450 nm; emissão 570 nm) e uma câmera digital refrigerada Olympus Q-colors3 (3 megapixels), acoplados a um sistema de análise de imagens computadorizado contendo o programa Image-ProPlus versão 5.0.

3.2.4 Sondas Na hibridação in situ foram utilizadas duas sondas de rDNA: a pTa71 que abrange as regiões 18S– 5,8S–26S, com 9 kb isolada de Triticum aestivum (GERLACK & BEDBROOK, 1979) clonada no plasmídeo pUC19, e a pScT7 que corresponde a região 5S com 300-500 pb isolada de Secale cereale (LAWRENCE & APPELS, 1986), clonada no plasmídeo pUC8.

3.2.5 Bandamento com CMA3/DA

Na coloração com a Cromomicina A3 (CMA3) seguiu-se o procedimento descrito por SCHWEIZER (1976). Preparações citológicas de células meióticas e mitóticas feitas com 2 ou 3 dias de antecedência, foram incubadas com 50 μl da CMA3 0,025 g/ml por 1 hora no escuro a temperatura ambiente. Após o período de incubação, as lâminas foram lavadas com água deionizada e secas no escuro. Foi adicionado às lâminas, 100 μl da solução de distamicina-A (DA) 0,1 mg/ml e, essas foram incubadas por 20 minutos no escuro a temperatura ambiente. Em seguida, foram lavadas e secas no escuro. As lâminas foram montadas com uma solução contendo glicerina, MgCl2 e Tampão McIlvane, permanecendo incubadas durante 3 dias à 37°C antes de serem analisadas ao microcópio. As lâminas foram observadas através de um microscópio de epifluorescência Olympus BX50 equipado com filtro Olympus UMWBV (excitação a 400/440 nm; emissão 470 nm) e uma câmera digital Olympus Q-colors3 (3 megapixels), acoplados a um sistema de análise de imagens computadorizado.

3.2.6 Bandamento com CMA3 sem DA Foi utilizado o mesmo protocolo descrito acima (SCHWEIZER, 1976) sem a adição da Distamicina-A (DA). Lâminas de meiose e metáfase mitóticas com 2 ou 3 dias, foram incubadas com 50 μl da CMA3 0,025 g/ml por 1 hora no escuro a temperatura ambiente. As lâminas foram então lavadas com água deionizada e secas no escuro. Foi adicionada uma solução contendo: glicerina, MgCl2 e Tampão McIlvane, a seguir as lâminas foram mantidas no escuro à 37°C por 3 dias. As lâminas foram observadas através de um microscópio de epifluorescência Olympus BX50 equipado com filtro Olympus UMWBV (excitação a 400/440 nm; emissão 470 nm) e uma câmera digital refrigerada Olympus Q- colors3 (3 megapixels), acoplados a um sistema de análise de imagens computadorizado.

3.2.7 Bandamento com DAPI/DA O bandamento com o 4’, -6-diamidinino-2-phenylindole (DAPI) foi realizado de acordo com o protocolo de SCHWEIZER (1976). As lâminas de meiose e metáfases mitóticas foram incubadas no escuro por 20 minutos a temperatura ambiente com 100 μl da solução de DA 0,1 mg/ml, após isso foram lavadas com água deionizada e secas no escuro. Depois de secas, as lâminas foram coradas com 50 μl do DAPI 0,1 mg/ml por 30 minutos no escuro a temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas, secas no escuro e montadas em glicerina e água numa proporção de 1:4. Imagens das células foram observadas através de um microscópio de epifluorescência Olympus BX50 equipado com filtro Olympus UMWU (excitação a 330/385 nm; emissão 420 nm) e uma câmera digital refrigerada Olympus Q-colors3 (3 megapixels), acoplados a um sistema de análise de imagens computadorizado.

3.2.8 Bandamento com nitrato de prata Para o bandamento com nitrato de prata foi usado o protocolo de HOWELL & BLACK (1980) adaptado para a espécie em estudo. Inicialmente, foram preparadas duas soluções tendo a primeira 0,02 g/ml de gelatina e 1% de ácido fórmico diluídos em água. A segunda solução era composta de 0,5 g/ml do nitrato de prata diluído em água. Nas preparações citológicas de células meióticas e mitóticas, foi aplicada a proporção de 1:10 da primeira e segunda solução, respectivamente. As lâminas foram cobertas com uma lamínula e incubadas na estufa a 70°C por 1 minuto, sendo depois lavadas com água deionizada, secas ao ar e montadas com Permount. Fotomicrografias foram feitas das imagens das células usando-se filme para fotos em cor KODAK ULTRA 400 no fotomicroscópio Olympus VANOX.

3.2.9 Bandamento C Para o bandamento C foram testados vários protocolos. Inicialmente foi adotado um protocolo utilizado para espécies diplóides de café por PIEROZZI et al. (1999). Seguindo este protocolo foram utilizadas lâminas de metáfases mitóticas com cerca de 2 a 3 semanas, que foram incubadas numa solução saturada de hidróxido de bário a 55°C por 15 minutos, lavadas com água deionizada e secas ao ar. Após isso, foram incubadas no 2xSSC a 65°C por 2 horas, lavadas e secas ao ar e em seguida coradas com o corante Giemsa a 1% diluído no tampão Fosfato Sörensen por cerca de 15 minutos. As lâminas foram lavadas, secas ao ar e montadas com Permount. Como não foram observados resultados positivos com este procedimento na espécie tetraplóide de café utilizada neste estudo, foram testadas algumas modificações como um tempo maior no hidróxido de bário e no Giemsa 1%. Foi testado ainda o protocolo de SCHWAZACHER et al. (1980), que utiliza um tratamento inicial com ácido acético 45% a 60°C e o hidróxido de bário a temperatura ambiente. Com este protocolo também não foi possível observar bandas C, mesmo com a elevação da temperatura do hidróxido de bário para 55°C, sendo testado um terceiro protocolo de D’EMERICO et al. (2002), para o bandamento de cromossomos pequenos como os do café. O protocolo de D’EMERICO et al. (2002) envolve um tratamento inicial com ácido clorídrico à 0,2 N por 3 minutos à 60°C e tratamento com hidróxido de bário por 4 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, o tratamento com hidróxido de bário foi feito num período de tempo maior, cerca de 15 minutos, como os resultados ainda não estavam satisfatórios, este passou a ser usado inicialmente na temperatura de 55°C por cerca de 15 minutos. Com este protocolo foram obtidos os melhores resultados, sendo ainda necessário algumas adaptações para a espécie em estudo, com relação ao tempo de exposição ao ácido clorídrico e tratamento com hidróxido de bário a 55°C, contudo por um período menor.

4 RESULTADOS

4.1 Coffea arabica, Variedade typica Cramer 4.1.1 Hibridação in situ fluorescente No complemento cromossômico de células somáticas da variedade typica Cramer foi possível visualizar seis sinais correspondentes à ocorrência de hibridação in situ fluorescente com o uso da sonda de rDNA pTa71, que corresponde à seqüência 18S–5,8S– 26S, responsável pela organização do nucléolo. Todos os sinais estão situados em regiões terminais dos cromossomos, e num dos pares os sinais são relativamente mais distendidos como pode ser observado na figura 1A. Nesta mesma figura 1A é possível observar ainda um núcleo interfásico no qual são claramente visíveis os seis sinais. Foi realizada também a hibridação in situ com a sonda pScT7, menor em pares de bases que a pTa71, que compreende somente a região de rDNA 5S. O uso da sonda de rDNA pScT7 resultou na visualização de dois sinais, sendo estes localizados na região terminal de um par de cromossomos (Figura 1B). O tamanho reduzido e a semelhança da morfologia entre os cromossomos metafásicos do complemento da var. typica, impossibilitaram a identificação dos cromossomos que estariam associados aos sinais obtidos com a hibridação de ambas as sondas de rDNA.

4.1.2 Bandamento CMA3/DA

O uso da Cromomicina A3 (CMA3) tem como finalidade diferenciar os cromossomos dentro do complemento cromossômico através do número e localização de bandas correspondentes a regiões ricas em bases GC. A Cromomicina pode ser aplicada associada ou não a Distamicina-A (DA) que é um contrastante negativo que favorece a distinção das bandas.

Foi aplicada a técnica de bandamento CMA3/DA em células mitóticas e meióticas da var. typica.

Nas metáfases mitóticas, foram visualizadas, com a aplicação de CMA3/DA, a presença de seis bandas em regiões terminais de três pares de cromossomos, tendo sido observadas outras bandas em regiões próximas ao centrômero (Figura 2A). Em um par de cromossomos observa-se, além de uma banda terminal, também a presença de uma banda pericentromérica, (Figura 2A - setas amarelas). Visualizam-se nesta mesma figura bandas pericentroméricas em outros cromossomos, não sendo possível determinar o número total de bandas presentes nas regiões pericentroméricas, devido à coloração menos intensa dessas bandas que em algumas células parecem estar presentes em quase todos os cromossomos do complemento.

Nas células em meiose o bandamento CMA3/DA foi realizado nas fases de metáfase I, paquíteno e diacinese. Na fase de metáfase I da meiose foram observadas também seis bandas em regiões terminais de três bivalentes (Figura 2B). Nesta fase da meiose não foram visualizadas bandas localizadas em regiões pericentroméricas. Nas células meióticas nas fases do paquíteno e diacinese, foram visualizados três bivalentes com bandas na região terminal, igualmente totalizando seis bandas (Figura 2C). Os bivalentes bandados apresentaram-se todos associados ao nucléolo (Figura 2C). Em algumas células foram observados apenas dois dos bivalentes bandados associados ao nucléolo estando o terceiro bivalente não associado (Figura 2D). Durante as análises, observaram-se células com mais de um nucléolo, que variavam em tamanho, isto é, em algumas células os vários nucléolos eram semelhantes em tamanho, em outras havia um maior com outro menor, ou ainda em tamanhos variados. A maioria das células apresentou-se com nucléolo único, tendo dois a três pares de cromossomos associados a ele. Na figura 2C é possível verificar, num dos pares de cromossomos associados ao nucléolo, além das bandas terminais da NOR, também a presença de outras bandas não terminais, (setas amarelas), podendo estas ser intercalares ou subterminais.

4.1.3 Bandamento CMA3

No material da var. typica foi aplicada também a técnica de bandamento CMA3 sem a adição da Distamicina-A (DA). A aplicação foi feita em células mitóticas na fase de metáfase e meióticas na fase de diacinese. Não foram observadas bandas positivas com o uso da CMA3 sem a adição da Distamicina-A (Figura 2E).

4.1.4 Bandamento DAPI/DA A técnica de bandamento com o 4’, -6-diamidinino-2-phenylindole (DAPI) tem como objetivo caracterizar os cromossomos dentro do complemento cromossômico através do número e localização de bandas correspondentes a regiões que sejam ricas em bases AT. Para esse procedimento foram utilizadas lâminas com células em metáfases mitóticas e lâminas com metáfases I da meiose de C. arabica var. typica. Não foram observadas bandas em qualquer um dos cromossomos do complemento deste material tanto nas células em mitose (Figura 4A) como nas células em meiose (Figura 4B).

4.1.5 Bandamento AgNOR O nitrato de prata tem afinidade por proteínas nucleolares, sendo utilizado para o bandamento de regiões organizadoras do nucléolo (NOR) ativas no último ciclo celular. Aplicando-se o bandamento com nitrato de prata em preparações citológicas na meiose e na mitose da var. typica, verificou-se que os resultados mais esclarecedores eram obtidos nas fases meióticas do paquíteno e da diacinese, pois possibilitavam não só a visualização simultânea do nucléolo e dos cromossomos a ele associados, como também das bandas situadas dentro do nucléolo, referentes às regiões satélite dos cromossomos nucleolares. Nos dois tipos de preparação, foi visualizado o número máximo de três pares de cromossomos bandados associados ao nucléolo. Em alguns casos, visualizou-se duas a três bandas no nucléolo, não sendo observadas, neste caso, bandas nos demais cromossomos do complemento (Figura 5A e 5B). Nestas células onde não foi possível visualizar exatamente a imagem de cromossomos inteiros e com bandas, associados ao nucléolo, pôde-se inferir o número das NORs ativas a partir das bandas formadas no nucléolo, com a concomitante ausência total de bandas nos demais cromossomos do complemento (Figura 5A e 5B). As lâminas de células mitóticas bandadas com nitrato de prata foram mais difíceis de serem analisadas quanto ao número de cromossomos com bandas, possivelmente devido a um maior acúmulo de grânulos da prata que dificultou a interpretação, no entanto, essas preparações permitiram a observação de ocorrência de variação no número de nucléolos presentes nas células, e também a ocorrência de variação no tamanho desses nucléolos dentro de uma mesma célula, e entre células. Foi registrado de um até seis nucléolos por célula.

4.1.6 Bandamento C O bandamento C discrimina regiões heterocromáticas, que aparentemente são menos sensíveis a tratamentos básicos, salinos e até ácidos, possivelmente devido a uma associação mais forte do DNA e proteínas na heterocromatina, ficando com uma coloração mais intensa após a aplicação de um corante, no final do processo. Para o bandamento C foi testado inicialmente o protocolo proposto por PIEROZZI et al. (1999) para espécies diplóides de café que não resultou na formação de bandas nos cromossomos do complemento da var. typica. Ao final do processo, todos os cromossomos apresentaram-se com a cromatina homogênea em toda sua extensão. Após isso, foi testado o protocolo de SCWARZACHER et al. (1980) para o bandamento de cromossomos pequenos, que difere do protocolo anterior pelo tratamento inicial dos cromossomos com ácido acético. Este segundo protocolo também teve resultado negativo, não sendo verificada a ocorrência de bandas. Testou-se um terceiro protocolo, proposto por D’EMERICO et al. (2002), que envolve um tratamento inicial com o ácido clorídrico. A utilização do ácido clorídrico também não foi suficiente para a ocorrência de bandas. Uma quarta modificação foi introduzida, utilizando o procedimento de SCWARZACHER et al. (1980) com alterações quanto à exposição ao ácido clorídrico e temperatura/tempo do hidróxido de bário. Com essas modificações foram visualizadas bandas em alguns cromossomos, mas as lâminas em geral, ficaram extremamente claras, mesmo aumentando-se a exposição ao corante Giemsa, indicando que o DNA dos cromossomos havia sido demasiadamente fragmentado não restando nem a heterocromatina.

4.2 Coffea arabica, Cultivar Mundo Novo 4.2.1 Hibridação in situ fluorescente Como resultado da hibridação in situ fluorescente, em células somáticas da cv Mundo Novo com a sonda pTa71, que abrange as regiões 18S–5,8S–26S, foram visualizados seis sinais todos localizados em regiões terminais de três pares de cromossomos (Figura 1C). As hibridações com a sonda pScT7 resultaram na visualização de dois sinais, correspondentes à região 5S, ambos localizados na região terminal de um par de cromossomos (Figura 1D).

4.2.2 Bandamento CMA3/DA

No bandamento CMA3/DA no material Mundo Novo, foram observadas em metáfases mitóticas a presença de seis bandas, situadas em regiões terminais de três pares de cromossomos (Figura 3A). Num destes pares de cromossomos, verifica-se a presença de bandas pericentroméricas, que estão destacadas na figura 3A com setas amarelas. Foram observadas ainda, pequenas bandas pericentroméricas, menos evidentes, em outros pares de cromossomos do complemento.

Com a aplicação do bandamento CMA3/DA em células meióticas os resultados foram os seguintes: a) nas células na fase de metáfase I foram visualizadas seis bandas, localizadas em regiões terminais de três bivalentes (Figura 3B); b) nas células em diacinese foram visualizados também três bivalentes, associados a NOR, com bandas em regiões terminais (Figura 3C). Eventualmente foram observados apenas dois bivalentes associados a NOR (Figura 3D).

4.2.3 Bandamento CMA3

Para o bandamento CMA3 sem DA foram analisadas também células em mitose e meiose. Em ambos os casos, foi observada uma coloração homogênea dos cromossomos, sem a distinção de bandas (Figura 3E; Figura 3F). Na fase de diacinese foram observados três bivalentes associados ao nucléolo, que ao contrário do resultado observado para o bandamento CMA3 com DA, apresentaram coloração homogênea sem a presença de bandas (Figura 3F). 4.2.4 Bandamento DAPI/DA O bandamento, com a utilização do fluorocromo DAPI com Distamicina-A, aplicado em células mitóticas na fase de metáfase da cv Mundo Novo, não resultou na visualização de bandas positivas, ou regiões ricas em bases AT, em qualquer um dos cromossomos do complemento (Figura 4C). O mesmo resultado foi obtido com a aplicação desta técnica em células na prófase I da meiose. Na figura 4D é possível visualizar uma célula meiótica, na fase de diacinese, com todos os cromossomos do complemento, incluindo os três bivalentes associados ao nucléolo, sem a presença de bandas positivas DAPI/DA.

4.2.5 Bandamento AgNOR Na cv Mundo Novo, como já descrito acima para a var. typica, os melhores resultados no bandamento com a prata foram visualizados na meiose. Observando-se células na prófase I na fase de diacinese (Figura 5C; Figura 5D), é possível constatar a presença de três bivalentes associados ao nucléolo e todos com bandas na região terminal onde há a inserção nucleolar ou NOR. Foram visualizadas também nesta fase da meiose, algumas poucas regiões relativamente escuras, semelhantes às bandas resultantes da impregnação pela prata em outros bivalentes do complemento da cv Mundo Novo, sendo que estas não eram tão evidentes como aquelas observadas nos cromossomos associados ao nucléolo. Em células meióticas na fase de metáfase I, visualizaram-se três bivalentes, com uma banda terminal em cada um deles. Em alguns cromossomos do complemento são visualizadas regiões com coloração relativamente mais intensa que o restante do braço cromossômico, mas não tão evidentes quanto as bandas observadas nos três bivalentes citados acima (Figura 5E). O resultado obtido para células em metáfase mitótica foi semelhante ao obtido para células em metáfase I da meiose, sendo observado no máximo três pares de cromossomos com bandas na região terminal, totalizando seis bandas. Em células mitóticas na fase de pré-metáfase, quando ainda é possível visualizar o nucléolo, constatou-se uma variação no número de cromossomos associados ao nucléolo, como na célula da figura 5F que apresentou somente três cromossomos associados ao nucléolo, sendo que a região terminal, ou região satélite destes apresentou uma coloração mais intensa, isto é, bandas AgNOR terminais. AA B B

A

D C D C

Figura 1 – Células em metáfase mitótica do café (Coffea arabica L.) da variedade typica Cramer e da cultivar Mundo Novo. Setas indicam os sinais de hibridação in situ obtidos com as sondas: pTa71 que corresponde ao sítios de rDNA 45S (NORs); e pScT7 que evidencia sítios de rDNA 5S. Sondas marcadas com digoxigenina e contra-coloração dos cromossomos com DAPI. Variedade typica: (A) pTa71 e (B) pScT7. Cultivar Mundo Novo: (C) pTa71 e (D) pScT7. Escala=5μm.

33 A B

C D

E

Figura 2 – Células mitóticas e meióticas do café (Coffea arabica L.) da variedade typica Cramer com bandamento CMA3/DA e bandamento CMA3. Bandamento CMA3/DA: (A) Metáfase mitótica; (B, C e D) Células em meiose; setas indicam sinais positivos de bandas em regiões terminais (setas brancas) e bandas em regiões intercalares (setas amarelas). Bandamento CMA3: (E) Metáfase mitótica com cromossomos sem sinais positivos de bandas. Escala=5μm.

34 A B

C D

E F

Figura 3 – Células mitóticas e meióticas do café (Coffea arabica L.) da cultivar Mundo Novo com bandamento CMA3/DA e bandamento CMA3. Bandamento CMA3/DA: (A) cromossomos em metáfase mitótica; (B, C e D) Cromossomos meióticos; setas indicando os sinais positivos de bandas em regiões terminais (setas brancas) e bandas em regiões intercalares (setas amarelas). Bandamento CMA3: (E) Cromossomos somáticos e (F) Cromossomos meióticos sem sinais positivos de bandas. Escala=5μm.

35 A B

C D

Figura 4 – Bandamento com fluorocromo DAPI em cromossomos mitóticos e meióticos do café (Coffea arabica L.) da variedade typica Cramer e da cultivar Mundo Novo, sem sinais de bandas positivas. Variedade typica: (A) Metáfase mitótica e (B) Meiose - Metáfase I. Cultivar Mundo Novo: (C) Metáfase mitótica e (D) Prófase I - Diacinese. Escala=5μm.

36 A B

C D

E F

Figura 5 – Bandamento com nitrato de prata em cromossomos mitóticos e meióticos C. arabica. (A e B) variedade typica Cramer; (C, D, E, F) cultivar Mundo Novo. (A, B, C, D, E) Cromossomos meióticos: bandas em cromossomos na fase de diacinese e na fase de metáfase I com setas indicando bandas em cromossomos associados ao nucléolo. (F) Cromossomos somáticos: bandas nos cromossomos associados ao nucléolo. Escala=5μm.

37 Avaliou-se ainda, a partir das preparações mitóticas, o número de nucléolos que eram formados no decorrer do ciclo celular. Em células na interfase e prófase foi observada uma variação no número e tamanho de nucléolos formados, tendo sido verificada a presença de um até seis nucléolos no máximo.

4.2.6 Bandamento C Para a cv Mundo Novo, o protocolo de PIEROZZI et al. (1999) não resultou na distinção das regiões heterocromáticas, sendo observada uma homogeneidade na coloração dos cromossomos no final do procedimento. Devido a isto foram testados os mesmos procedimentos alternativos usados para a var. typica que incluíam tratamentos iniciais com substâncias ácidas. Da mesma maneira foi testado o protocolo descrito por SCHWAZACHER et al. (1980) que inclui um tratamento inicial das células com ácido acético e que também teve um resultado negativo. Foi utilizado também o protocolo alternativo específico para o bandamento de cromossomos pequenos (D’EMERICO et al., 2002), como os cromossomos de C. arabica, no qual há um tratamento com ácido clorídrico aquecido que seria mais eficaz na fragmentação do DNA. Após algumas alterações no tempo de exposição ao ácido clorídrico e temperatura/tempo do hidróxido de bário, deste último protocolo, foram visualizadas bandas em alguns cromossomos, sendo necessário ainda novos testes para otimizar a temperatura e tempo de permanência das lâminas nos tratamentos.

5 DISCUSSÃO

5.1. Sítios de DNA Ribossômico em C. arabica L. Nas duas representantes de C. arabica, var. typica Cramer e cv Mundo Novo, analisadas neste estudo foram verificados os mesmos resultados referentes à hibridação in situ com a sonda de rDNA pTa71, correspondente à região 18S-5,8S-26S , isto é, a presença de seis sinais, todos esses localizados em regiões terminais de três pares de cromossomos (Figuras 1A e 1C). Também PINTO-MAGLIO et al. (2000; 2001) obtiveram o mesmo número de sinais para a sonda pTa71 no estudo da cv Bourbon Vermelho de C. arabica. Apesar da coincidência quanto ao número desses sinais, pôde-se observar em muitas células, que a var. typica (Figura 1A) possui um dos pares mais distendidos, fato este não observado na cv Mundo Novo (Figura 1C) e nem relatado para a cv Bourbon Vermelho. Diferindo destes resultados, RAINA et al. (1998), descrevem para a região de rDNA 18S-5,8S-26S apenas quatro sinais localizados na região terminal de dois pares de cromossomos de uma forma cultivada de C. arabica. No presente estudo a hibridação com a sonda de rDNA pScT7 que corresponde à região 5S, isolada de Secale cereale com 300-500 pb, revelou a presença de apenas dois sinais localizados na região terminal de um par de cromossomos, tanto para o complemento da var. typica Cramer como da cv Mundo Novo (Figuras 1B e 1D). Na cv Bourbon Vermelho de C. arabica, PINTO-MAGLIO et al. (2001) relatam para os experimentos de hibridação in situ com esta mesma sonda pScT7 a presença de quatro sinais correspondentes a região 5S. RAINA et al. (1998) utilizando também uma sonda correspondente a região 5S, denominada pTa794, com 410 pb e isolada de trigo, registrou a presença de seis sinais para esta seqüência no complemento de C. arabica, sendo quatro encontrados na região terminal de ambos os braços de um par de cromossomos, e os outros dois na região terminal de um outro par. Ressaltando-se apenas que a seqüência 5S usada para a var. typica Cramer e para as cultivares Mundo Novo e Bourbon Vermelho diferem da sonda 5S usada no trabalho de RAINA et al. (1998), por terem sido isoladas de espécies diferentes, uma de trigo e a outra de Secale. Deve ser ressaltado ainda que estes últimos autores não descreveram ou informaram detalhes sobre a forma, se variedade ou cultivar, do material de C. arabica utilizado no estudo. Portanto verifica-se nos diferentes estudos para C. arabica que há maior variabilidade de resultados relativos à seqüência 5S do que para a seqüência 18S-5,8S-26S. Segundo MISHIMA et al. (2002) a seqüência 5S aparentemente corresponde a uma região menos conservada quando comparada à região 18S-5,8S-26S o que poderia explicar em parte esta variação. O número de sítios do rDNA 18S-5,8S-26S parece ser mais coerente com o nível de ploidia em algumas espécies de plantas (OSUJI et al., 1998; TEL-ZUR et al., 2004; VAIO et al., 2005) talvez pelo fato desta seqüência estar mais freqüentemente associada às regiões organizadoras do nucléolo (NOR) do que a seqüência 5S. No gênero Coffea L., trabalhos anteriores têm mostrado que aparentemente o número de seqüências de rDNA 18S-5,8S-26S presentes nos complementos também são coerentes com o nível de ploidia nas espécies diplóides (BARBOSA et al., 2001; LOMBELLO & PINTO-MAGLIO, 2003; LOMBELLO & PINTO-MAGLIO, 2004b; LOMBELLO & PINTO-MAGLIO, 2004c) e mesmo na tetraplóide C. arabica cv Bourbon Vermelho (PINTO-MAGLIO, 2000; 2001). Suposições envolvendo os ancestrais diplóides do alotetraplóide C. arabica, têm sido efetuadas devido à conservação de tal seqüência do rDNA. No entanto, no estudo evolutivo de gêneros como Hypochaeris (CERBAH et al., 1998), família Asteraceae, verificou-se que o número de locos do rDNA 18S-5,8S-28S reduziu-se ao longo do tempo devido a rearranjos cromossômicos. Baseado em estudos citomoleculares, envolvendo o DNA genômico total, a espécie C. arabica foi considerada um alotetraplóide, oriundo da hibridação natural entre as espécies: C. eugenioides e C. congensis ou C. eugenioides e C. canephora (RAINA et al., 1998; LASHERMES et al., 1999). Como já descrito neste estudo, tanto a var. typica como a cv Mundo Novo de C. arabica apresentaram seis sinais no seu complemento, resultantes da hibridação com a sonda da seqüência de rDNA 18S-5,8S-26S (Figuras 1A e 1C). Estes dados complementam os resultados obtidos por PINTO-MAGLIO et al. (2000; 2001), que também observaram seis sinais para esta seqüência na var. Bourbon Vermelho de C. arabica, e simultaneamente indicam que, ao menos uma das espécies diplóides, que deu origem a esta espécie, pode possuir quatro sinais para tal seqüência de rDNA. Estes dados reforçam os resultados obtidos para a espécie C. eugenioides, considerada como um dos parentais, e que apresenta quatro sinais de rDNA para a seqüência 18S-5,8S-26S, e os obtidos para C. congensis e C. canephora que apresentam apenas dois sinais para esta seqüência, e representam possivelmente o outro parental (BARBOSA et al., 2001; LOMBELLO & PINTO- MAGLIO, 2004c; PINTO-MAGLIO et al., no prelo). Todos os dados obtidos para os sítios de rDNA 18S-5,8S-28S, nos trabalhos acima referidos, diferem totalmente dos dados de RAINA et al. (1998) nos quais C. arabica apresentou somente quatro sinais referentes ao rDNA 18S-5,8S-28S ao invés dos seis sinais aqui encontrados e as espécies consideradas genitoras, C. eugenioides e C. congensis, apresentaram cada uma apenas um par de cromossomos ou dois sinais para esta mesma seqüência. Isto somente seria possível se for considerada a ocorrência de uma possível alteração no genoma das plantas analisadas por estes autores. Excetuando-se os resultados de RAINA et al. (1998), aparentemente no alotetraplóide C. arabica, o número de sítios do rDNA 18S-5,8S-26S foram conservados, já que a maioria dos trabalhos para esta espécie relata seis sinais, ou três sítios, para esta seqüência, localizados em três pares de cromossomos, sendo também coerentes com os resultados obtidos para seus possíveis parentais, ou seja, C. eugenioides com quatro sinais em dois pares e C. congensis ou C. canephora com dois sinais em um par de cromossomos. Esta regra, no entanto, parece não se aplicar às seqüências do rDNA 5S já que todas as espécies diplóides de café estudadas até o momento, mostraram apenas um sítio do rDNA 5S, incluindo as espécies consideradas parentais de C. arabica (PINTO-MAGLIO et al., artigo no prelo), e as formas de C. arabica, var. typica Cramer e cv Mundo Novo, que também apresentaram um único sítio do rDNA 5S. O esperado seria que estas duas formas do tetraplóide C. arabica apresentassem dois sítios do rDNA 5S, número este observado somente em C. arabica cv Bourbon Vermelho (PINTO-MAGLIO et al., 2000; 2001). Este resultado não se repetiu nas duas representantes tetraplóides analisadas neste estudo. Com relação à localização dos sítios 5S, a var. typica Cramer e a cv Mundo Novo apresentam os dois sinais do rDNA 5S situados em regiões terminais (Figuras 1B e 1D), enquanto que PINTO-MAGLIO et al. (2000; 2001) descrevem que a cv Bourbon Vermelho de C. arabica apresenta dois sinais 5S em regiões terminais e outros dois em regiões subterminais. Assim, os sítios do rDNA 5S registrados para todas as formas de C. arabica não correspondem em posição, com nenhuma das possíveis espécies diplóides parentais de C. arabica (BARBOSA et al., 2001; PINTO-MAGLIO et al, no prelo) que apresentam este rDNA na posição intercalar, o que indica a possível ocorrência de uma reorganização do genoma ou uma alteração estrutural no cromossomo portador desta seqüência em C. arabica, como uma inversão paracêntrica, por exemplo. Em outras espécies como as do gênero Nicotiana também foi observado o mesmo número de sítios do rDNA 5S para os diplóides e alotetraplóides, tendo ocorrido a eliminação de sítios 5S de um dos parentais no híbrido (CLARCKSON et al., 2005). Em algumas espécies da família Rosaceae já investigadas, parece que o sítio do rDNA 5S é menos conservado que o sítio 18S-5,8S-26S (MISHIMA et al., 2002). É possível que o mesmo fato observado por CLARCKSON et al. (2005) em Nicotiana e MISHIMA et al. (2002) em espécies da família Rosaceae tenha ocorrido em café na var. typica Cramer, isto é, a eliminação de um sítio do rDNA 5S, ao longo do tempo. A cv Mundo Novo é oriunda do cruzamento natural entre Bourbon e sumatra (CARVALHO et al., 1952), esta última uma linhagem mais produtiva da var. typica Cramer. Analisando-se os resultados aqui obtidos, em nível de cultivares e/ou variedades, tem-se que a cv Mundo Novo pode ter recebido de um de seus genitores um complemento cromossômico que possuía um único par de cromossomos com dois sinais correspondentes à seqüência de rDNA 18S-5,8S-26S, ambos situados na região terminal dos cromossomos, e do outro genitor um complemento com dois pares de cromossomos com quatro sinais correspondentes à essa seqüência, localizados também na região terminal. Embora estes dados sejam insuficientes para determinar qual dos genitores possa ter doado um ou os dois sítios do rDNA 18S-5,8S-26S pôde-se diferenciar a var. typica Cramer da cv Mundo Novo pelo fato de typica apresentar o par de sinais, correspondentes à seqüência de rDNA 18S- 5,8S-26S, de forma mais distendida do que a cv Mundo Novo (Figura 1A). Também o número de sítios 5S encontrados na cv Mundo Novo parece ser coerente com a sua origem varietal, já que os dois sinais observados num par de cromossomos podem ter sido herdados da cv Bourbon Vermelho, tendo a var. sumatra, que é uma linhagem da var. typica Cramer e portanto muito próxima geneticamente, ter contribuído com um dos genomas sem a presença de seqüências do tipo 5S ou possuí-las em tamanho muito reduzido o que impediria que fossem detectadas na hibridação in situ. A aplicação da técnica de hibridação in situ permitiu: a) através do uso da sonda de rDNA 18S-5,8S-26S diferenciar a var. typica Cramer da cv Mundo Novo pelo fato de typica apresentar o par de sinais, correspondentes à essa seqüência de rDNA 18S-5,8S-26S, de forma mais distendida do que a cv Mundo Novo; e b) através da sonda de rDNA 5S (pScT7) permitiu distinguir, com base no número de sítios do rDNA 5S presentes nos seus complementos, as duas representantes tetraplóides analisadas neste estudo, a var. typica Cramer e a cv Mundo Novo, da cv Bourbon Vermelho de C. arabica.

5.2 Bandamento com Cromomicina No bandamento com a CMA3/DA foram observadas na var. typica Cramer e na cv Mundo Novo a presença de seis bandas fortes em regiões terminais de três pares de cromossomos somáticos e na meiose em três pares de bivalentes associados ao nucléolo (Figuras 2A, 2C, 3A e 3C). A correspondência do número de bandas com a CMA3/DA, com a NOR ou sítios de seqüências rDNA 18S-5,8S-26S, não é ao acaso, e está relacionada à heterocromatina associada às constrições secundárias que apresentam riqueza relativa de pares de bases GC, fenômeno de ocorrência comum em animais e plantas. Segundo SCHWEIZER (1976, apud PINTO-MAGLIO et al. 2000) e SUMNER (1990, apud PINTO- MAGLIO et al. 2000) parece existir uma riqueza relativa de pares de bases GC nos cistrons ribossômicos, e por isto estas regiões se revelam habitualmente positivas com o fluorocromo CMA3. Em plantas tem sido observado a equivalência desses dois marcadores cromossômicos em espécies do gênero Manihot (CARVALHO & GUERRA, 2002), Selaginella (MARCON et al., 2005) Hypochaeris (RUAS et al., 2005) e ervas daninhas: Crepis japonica, Galinsoga parviflora e Chaptalia nutans, todas da família Asteraceae

(FREGONEZI et al., 2004). Também a associação de bandas da CMA3/DA com a formação da NOR foi observada em café na cv Bourbon Vermelho de C. arabica por PINTO-MAGLIO et al. (2000; 2001) que constataram uma correspondência no número de bandas CMA3/DA em cromossomos somáticos com o número de bivalentes bandados, com

CMA3/DA, em associação com o nucléolo na prófase meiótica.

A associação de bandas da CMA3/DA com a NOR foi comprovada mais uma vez em café, neste estudo, através da aplicação de CMA3/DA em células meióticas na prófase I quando as seis bandas observadas nos cromossomos somáticos apareceram na região terminal de três bivalentes associados ao nuclélo (Figuras 2C e 3C). Com a CMA3/DA foram evidenciadas ainda regiões com coloração menos intensa, localizadas próximas ao centrômero em C. arabica, var. typica Cramer e cv Mundo Novo (Figura 2A e 3A). Ambas as representantes de C. arabica apresentam a banda pericentromérica de maior intensidade em um par de cromossomos que possui também uma banda na região terminal. A cv

Bourbon Vermelho também apresentou bandas de menor intensidade com a CMA3/DA, localizadas em regiões pericentroméricas, porém assim como na var. typica Cramer e cv Mundo Novo apresentadas neste estudo, não foi possível determinar o número dessas (comunicação pessoal com a PqC. Dra. Cecília A. F. Pinto Maglio).

No bandamento da CMA3 não associado ao uso da Distamicina-A (DA), não foi possível visualizar bandas em typica e Mundo Novo, isso porque a contra-coloração com a

DA permite um maior contraste das regiões onde a CMA3 está ligada, evidenciando os locais ricos em bases GC. Porém, em algumas espécies do gênero Crotalaria L., o bandamento com a CMA3 sem a DA, permitiu a visualização de bandas com um padrão diferente do bandamento CMA3 com a adição da DA (MONDIN, 2003). A eficiência na diferenciação de espécies pelo padrão de bandamento com a

CMA3/DA já foi relatado em espécies do gênero Clivia, tendo auxiliado até na diferenciação intraespecífica, ou seja, na formação de grupos de populações constituintes de uma mesma espécie (RAN et al., 1999). Em dezessete acessos de Citrus spp., a CMA3 permitiu além da diferenciação dos acessos com base no padrão de bandamento, também a separação dos cromossomos em seis tipos, de acordo com o número e posição das bandas (YAMAMOTO & TOMINAGA, 2003).

Apesar do bandamento com a CMA3/DA não ter permitido este nível de distinção da var. typica Cramer e cv Mundo Novo, em algumas espécies como as do gênero

Psilanthus Hook f., que é geneticamente próximo ao café, o bandamento com a CMA3/DA atua como um marcador eficiente que permite a distinção das espécies (LOMBELLO & PINTO-MAGLIO, 2003; LOMBELLO & PINTO-MAGLIO, 2004a) Assim como nas espécies de café e na maioria das espécies vegetais, os sítios do rDNA 5S, não atuam na formação da NOR e parece não estar associados às regiões heterocromáticas evidenciadas pela CMA3. No entanto, há exceções quanto a relação do sítio 5S com a CMA3, como a espécie Lupinus consentinii, na qual um par de sinais observados com a sonda correspondente à região 5S do rDNA, corresponde a um par de bandas evidenciadas pela CMA3 (HADJERA et al., 2003).

O bandamento com a CMA3/DA apesar de não ter diferenciado a var. typica Cramer da cv Mundo Novo, analisadas neste estudo, parece ter sido um dos marcadores citogenéticos mais eficientes na distinção de espécies diplóides de café (Anexo 1). Nas espécies diplóides do gênero Coffea L. descritas na literatura, o número das bandas

CMA3/DA variou de duas a seis bandas, somente C. humilis apresentou um número de bandas CMA3/DA superior a seis (LOMBELLO & PINTO-MAGLIO, 2004b), como pode ser constatado no Anexo 1.

5.3 Bandamento com DAPI A utilização do fluorocromo DAPI associado a contra-coloração resultante do uso da DA não revelou bandas positivas na var. typica Cramer e cv Mundo Novo (Figuras 4A, 4B, 4C e 4D). O mesmo resultado negativo também foi obtido para a cv. Bourbon Vermelho de C. arabica (PINTO-MAGLIO et al., 2001). Com relação às espécies diplóides de café o resultado não foi diferente, sendo que a única exceção foi a espécie C. setenophylla. Mesmo assim as bandas eram pequenas impedindo os autores de discriminar o número de bandas visualizadas (LOMBELLO & PINTO-MAGLIO, 2004b). Outras espécies de plantas também apresentam o mesmo resultado DAPI negativo de C. arabica e demais espécies de café, como é o caso de espécies do gênero Passiflora L. (MELO et al., 2001) e da espécie Vernonia geminata (OLIVEIRA, 2005). Porém mais raramente, em algumas espécies como Nicotiana (NAKAMURA et al., 2001), Citrus (YAMAMOTO & TOMINAGA, 2004), entre outras o bandamento com o DAPI permite a visualização de regiões heterocromáticas.

5.4 Bandamento AgNOR Com relação ao bandamento com nitrato de prata, a var. typica Cramer e a cv Mundo Novo apresentaram o número máximo de seis bandas, localizadas em três pares de cromossomos (Figuras 5A, 5B, 5C, 5D e 5E). Em ambos representantes de C. arabica foi observado uma variação no número de cromossomos associados ao nucléolo, sendo de dois a três pares (Figuras 5B). Na cv Bourbon Vermelho foi observado o mesmo número de bandas AgNOR (PINTO-MAGLIO et al. 2001). A variação observada no número de cromossomos portadores da NOR (Figura 5A e 5B), evidenciados pela impregnação com o nitrato de prata, indica que nem sempre todos estão ativos, pois apesar da var. typica possuir três pares de cromossomos nucleolares, foi verificada em algumas células a presença de apenas dois pares de cromossomos bandados com a prata e ligados ao nucléolo (Figura 5B). Este fato não foi considerado como dominância nucleolar, já que neste estudo foi analisada apenas a dominância nucleolar total, isto é, cromossomos com sítios de rDNA que nunca se expressam. O número máximo de bandas observadas no bandamento com o nitrato de prata na var. typica Cramer e nas cvs Mundo Novo e Bourbon Vermelho (PINTO-MAGLIO et al. 2001) de C. arabica coincide com o número de sinais observados com a sonda de rDNA da seqüência 18S-5,8S-26S (pTa71), o que pode indicar tratar-se da mesma região. Em geral, o rDNA 18S-5,8S-26S parece estar mais comumente associado a NOR que o rDNA 5S, não somente nas espécies de café, mas em diferentes espécies como as do gênero Brassica (HASTEROK et al., 2005). O bandamento com o nitrato de prata possibilita também a visualização de nucléolos contendo bandas impregnadas. Neste trabalho verificou-se o número máximo de seis nucléolos por núcleo, em células na interfase mitótica de C. arabica var. typica Cramer e cv Mundo Novo. Os nucléolos apresentaram variações em tamanho dentro das células e entre células, como já observado em outras espécies como Picea, por SILJAK- YAKOVLEV et al. (2002). O número de nucléolos observado corresponde ao número de sinais com o rDNA 18S-5,8S-26S e número máximo de bandas observadas na coloração com o nitrato de prata para typica Cramer e Mundo Novo. A relação entre o número de sítios de rDNA com o número máximo de nucléolos por núcleo, foi observada também em Allium commutatum (BESENDORFER et al., 2002) e espécies do gênero Selaginella (MARCON et al., 2005). A correlação positiva verificada entre os dados obtidos, como o número e posição dos sinais e bandas, a partir das técnicas de hibridação in situ com a seqüência de rDNA

18S-5,8-26S, a coloração com a CMA3/DA e o bandamento de impregnação pela prata (Anexo 1) contribuíram para a caracterização tanto da var. typica Cramer como da cv Mundo Novo. A associação dos resultados dessas três técnicas também foi observada em Lupinus angustifolius (HADJERA et al., 2003) comprovando a relação dos resultados destas com a NOR.

5.5 Bandamento C Foram testados três protocolos de bandamento C neste estudo, tendo inicialmente sido utilizado o protocolo de PIEROZZI et al. (1999), que foi eficiente na distinção de regiões heterocromáticas nas espécies diplóides de café: C. canephora, C. congensis, C. dewevrei, C. eugenioides, C. kapakata, C. liberica e C. racemosa comprovando a possibilidade de sua utilização em espécies do gênero Coffea (PIEROZZI et al., 2003). Porém, excepcionalmente em typica e Mundo Novo esta técnica não demonstrou resultados positivos, tendo os cromossomos permanecidos relativamente íntegros no final do processo, ou seja, sem bandas. Apesar de terem sido testados vários protocolos que envolviam tratamentos iniciais mais drásticos os resultados foram considerados negativos. Apenas um destes protocolos resultou no inicio da formação de bandas nas duas representantes de C. arabica, indicando que a técnica de banda C pode ser eficaz no bandamento dos cromossomos da espécie tetraplóide, sendo necessário ainda algumas adaptações na técnica. O bandamento C na tetraplóide C. arabica será inédito, e esforços vêm sendo feitos continuamente para que sejam obtidos resultados positivos em breve.

5.6 Mecanismo de Dominância Nucleolar em C. arabica O fenômeno de dominância nucleolar já foi constatado em diversas espécies vegetais e animais (REEDER, 1985). A dominância nucleolar foi observada em espécies vegetais diplóides como Clivia caulescens e C. nobilis nas quais nem todos os sítios do rDNA 26S visualizados na hibridação in situ são ativos, comparativamente a outras duas espécies do gênero que possuem todos os sítios deste rDNA em atividade (RAN et al., 2001). A ocorrência de supressão da função nucleolar ou relação de dominância nucleolar é um fenômeno associado mais comumente com genomas híbridos, como é o caso da espécie alotetraplóide Arabdopsis suecica (PONTES et al., 2003). A dominância nucleolar ocorre devido à competição entre genes ribossomais com número desigual de elementos “enhancer” ou diferenças no sistema de transcrição dos genitores, no qual o fator de transcrição de uma espécie não reconheceria o promotor do gene ribossomal da outra (REEDER, 1985), ou ainda pode resultar de pequenas variações genéticas ou epigenéticas (PONTES et al., 2003). Em café, PINTO-MAGLIO & CRUZ (1991) levantaram a hipótese de ocorrência de relações de dominância nucleolar. As autoras descrevem que em C. arabica var. arabica L. (descrita também como typica Cramer) e cv Bourbon Vermelho, foram visualizados o número máximo de três bivalentes associados ao nucléolo, isto é, ativos e com seqüência de genes para o rRNA, porém, no complemento cromossômico da espécie havia outros três bivalentes, que embora nunca associados ao nucléolo, apresentavam estrutura de cromossomos nucleolares ou seja, com uma terminação abrupta em um de seus braços, sugerindo que nesta espécie poderia estar ocorrendo o mecanismo de supressão da função organizadora do nucléolo. Entretanto, foi verificado neste estudo através da hibridação in situ, que tanto na var. typica como na cv Mundo Novo da espécie C. arabica ocorre somente três pares de cromossomos com sítios do rDNA 18S-5,8-26S e a atividade destes, testada pela coloração com a prata, resultou positiva, ou seja, todos eles mostraram-se ativos. Sendo assim conclui-se que os outros três pares de cromossomos suspeitos de terem atividade NOR podem ter sofrido uma alteração estrutural, como a perda da região terminal, ficando apenas com a estrutura similar a de um cromossomo nucleolar, mas sem a função NOR. Resultados idênticos foram obtidos para a cv Bourbon Vermelho (PINTO- MAGLIO et al. no prelo). Apesar dos resultados deste estudo terem contribuído com novos dados para o estabelecimento de relações mais definidas entre as espécies do gênero Coffea L., o problema da identificação de individual de cromossomos permanece. Provavelmente a solução está na busca de marcadores cromossômicos ainda mais específicos, como sondas desenvolvidas especialmente para espécies de café.

6 CONCLUSÕES

Com base nos resultados deste estudo concluiu-se que: a. C. arabica, var. typica Cramer e cv Mundo Novo apresentam em seu complemento cromossômico, três pares de cromossomos ou três bivalentes com seqüências de genes para o rRNA 18S-5,8S-26S, sendo todos estes sítios ativos, isto é, não foi detectada a ocorrência de relações de dominância nucleolar. b. O número e a localização dos sítios do rDNA 18S-5,8S-26S coincide com o número e localização das bandas mais intensas obtidas no bandamento com a CMA3 e na coloração com a prata, comprovando que em C. arabica, var. typica Cramer e cv Mundo

Novo há uma correlação entre sítios/seqüências do rDNA 18S-5,8S-26S, bandas CMA3 e prata com a NOR, demonstradas pelas três técnicas. c. Os sítios do rDNA 5S estão situados em posições diferentes nos cromossomos de C. arabica, quando comparados aos seus parentais diplóides, podendo essa seqüência ter sofrido uma alteração estrutural. Em relação ao número, os sítios de rDNA 5S na var. typica Cramer e na cv Mundo Novo parecem ter sido menos conservados do que os sítios de rDNA 18S-5,8S-26S, ao longo da evolução. d. Das técnicas utilizadas a que permitiu a distinção entre as representantes tetraplóides de C. arabica: var. typica Cramer, cv Mundo Novo e cv Bourbon Vermelho, foi a hibridação in situ com a seqüência 5S.

7 REFERÊNCIAS

AGUIAR, A.T.E.; GUERREIRO FILHO, O.; MALUF, M.P.; GALLO, P.B. & FAZUOLI, L.C. Caracterização de cultivares de Coffea arabica mediante utilização de descritores mínimos. Bragantia, v. 63, n. 2, p. 179-192, 2004.

ANTHONY, F.; BERTRAND, B.; QUIROS, O.; WILCHES, A.; LASHERMES, P.; BERTHAUD, J. & CHARRIER, A. Genetic diversity of wild coffee (Coffea arabica L.) using molecular markers. Euphytica, v. 118, p. 53-65, 2001.

ANTHONY, F.; COMBES, M.C.; ASTORGA, C.; BERTRAND, B.; GRAZIOSI, G. & LASHERMES, P. The origin of the cultivated Coffea arabica L. varities revealed by AFLP and SSR markers. Theoretical and Applied Genetics, v. 104, p. 894-900, 2002.

BAEZA, C. & SCHRADER, O. Comparative karyotype analysis in Haplopappus Cass. and Grindelia Willd. (Asteraceae) by double FISH with rRNA specific genes. Plant Systematics and Evolution, v. 251, p. 161- 172, 2005.

BARBOSA, R.L.; PIEROZZI, N.I.; LOMBELLO, R.A.; SILVAROLLA, M.B. & PINTO-MAGLIO, C.A.F. Caracterização citomolecular de três espécies de Coffea L.: C. eugenioides, C. canephora e C. dewevrei. In: II Simpósio de Pesquisa dos Cafés do Brasil, p. 293-298, 2001.

BARRE, P.; LAYSSAC, M.; D´HONT, A.; LOUARN, J.; CHARRIER, A.; HAMON, S. & NOIROT, J. Relationship between parental chromosomic contribution and nuclear DNA content in the coffee interspecific hybrid C. pseudozanguebarieae x C. liberica var. dewerei. Theoretical and Applied Genetics, v. 96, p. 301- 305, 1998.

BAUCHAN, G.R.; CAMPBELL, T.A. & HOSSAIN, M.A. Chromosomal polymorphism as detected by C- banding patterns in Chilean alfafa germplasm. Crop Science, v. 42, p. 1291-1297, 2002.

BERTHOU, F.; MATHIEU, C. & VEDEL, F. Chloroplast and mitochondrial DNA variation as indicator of phylogenetic relationships in the genus Coffea L. Theoretical and Applied Genetics, v. 65, p. 77-84, 1983.

BESENDORFER, V.; SAMARDŽIJA, M.; ZOLDOŠ, V.; ŠOLIĆ, M.E. & PAPEŠ, D. Chromosomal organization of ribosomal genes and NOR-associated heterochromatin, and NOR activity in some populations of Allium commutatum Guss. (Alliaceae). Botanical Journal of the Linnean Society, v. 139, p. 99-108, 2002.

BOAVENTURA, Y.M.S & CRUZ, N.D. Citogenética do híbrido interespecífico (Coffea arabica L. var. Bourbon x C. canephora Pierre ex Froehner var. Robusta (linden) Chev.) que originou o café ‘Icatu’. Turrialba, v. 37, n. 2, p.171-178, 1987.

BOUHARMONT, J. Recherches sur les affinités chromosomiques dans le genere Coffea. Institut Nationale pour letude agronomique du Congo Belge, Bruxelles, 94p, 1959. BOUHARMONT, J. Somatic chromosomes of some Coffea species. Euphytica, v. 12, p. 254-527, 1963.

BRASILEIRO-VIDAL, A.C.; CUADRADO, A.; BRAMMER, S.P.; ZANATTA, A.C.A.; PRESTES, A.M.; MORAES-FERNANDES, M.I.B. & GUERRA, M. Chromosome characterization in Thinopyrum ponticum (Triticeae-Poaceae) using in situ hybridization with different DNA sequences. Genetics and Molecular Biology, v. 26, n. 4, p. 505-510, 2003.

BRASILEIRO-VIDAL, A.C.; CUADRADO, A.; BRAMMER, S.P.; BENKO-ISEPPON, A.M. & GUERRA, M. Molecular cytogenetic charcterization of parental genomes in the partial amphidiploid Triticum aestivum x Thinopyrum ponticum. Genetics and Molecular Biology, v. 28, n. 2, p. 308-313, 2005.

BRIDSON, D.M. Additional notes on Coffea (Rubiaceae) from Tropical East Africa. Kew Bulletin, v. 49, p. 331-342, 1994.

CALDERINI, O.; PUPILLI, F.; CLUSTER, P.D.; MARIANI, A. & ARCIONI, S. Cytological studies of the nucleolus organizing regions in the Medicago complex: Sativa-coerulea-falcata. Genome, v. 39, n. 5, p. 914- 920, 1996.

CARVALHO, A. Distribuição geográfica e classificação botânica do gênero Coffea com referência especial a espécie arabica. Boletim da Superintendência dos Serviços de Café, Campinas, n. 226, 1946.

CARVALHO, A. Taxonomia de Coffea arabica L. VI – Caracteres morfológicos dos haplóides. Bragantia, v. 12, n. 4-6, p. 201-212, 1952.

CARVALHO, A. & FAZUOLI, L.C. Café. In: Furlani, A.M.C.; Viégas, G.P. (eds.). O melhoramento de plantas no Instituto Agronômico. Campinas, Instituto Agronômico, v.1, p. 29-76, 1993.

CARVALHO, A.; KRUG, C.A.; MENDES, J.E.T.; ANTUNES FILHO, H.; MORAIS, H.; ALOISI SOBRINHO, J.; MORAIS, M.V. & ROCHA, T.R. Melhoramento do cafeeiro IV – Café Mundo Novo. Bragantia, v. 12, n. 4-6, 1952.

CARVALHO, A. & MÔNACO, L.C. Genetic relationships of selected Coffea species. Ciência e Cultura, v. 19, n. 1, p. 151-165, 1967.

CARVALHO, A. & MÔNACO, L.C. Transferência do fator caturra para o cultivar Mundo Novo de Coffea arabica. Bragantia, v. 31, p. 279-399, 1972.

CARVALHO, R. & GUERRA, M. Cytogenetics of Manihot esculenta Crantz (cassava) and eight related species. Hereditas, v. 136, p. 159-168, 2002.

CERBAH, M.; COULAUD, J. & SILJAK-YAKOVLEV, S. rRNA organization and evolutionary relationships in the genus Hypochaeris (Asteraceae). The Journal of Heredity, v. 89, n. 4, p. 312-318, 1998.

CHEVALIER, A. Les caféires du globe. III. Systematique dês caféiers et faux caféiers, maladies et insects nuisibles. Encyclopedie. Biologique 28, Fascicule III. Paris, 1947.

CLARKSON, J.J.; LIM, K.Y.; KOVARIK, A.; CHASE M.W.; KNAPP, S. & LEITCH A.R. Long-term genome diploidization in allopolyploid Nicotiana section Repandae (Solanaceae). New Phytologist, v. 168, p. 241-252, 2005.

CLIFORD, M.N. & WILLSON, K.C. Coffee: botanic, biochemistry and Production of beans and beverage. The Avi Publishing Company, Inc. Connecticut, 19p., 1985.

CONAB – COMPANHIA NACIONAL DE ABASTECIMENTO, http://www.conab.gov.br/dowload/nupin/SAFRAS/3%20levantamento%20café.pdf, (20 outubro 2005).

CROS, J.; COMBES, M.C.; TROUSLOT, P.; ANTHONY, F.; HAMON, S; CHARRIER, A. & LASHERMES, P. Phylogenetic analysis of chloroplast DNA variation in Coffea L. Molecular Phylogenetics and Evolution, v. 9, n. 1, p. 109-117, 1998.

CUÑADO, N. & SANTOS, J.L. On the diploidization mechanism of the genus Aegilops: meiotic behavior of interspecif hybrids. Theoretical and Applied Genetics, v. 99, p. 1080-1086, 1999.

DAGNE, K. Karyotypes, C-banding and nucleolar numbers in Guizotia (Compositae). Plant Systematic and Evolution, v. 195, n. 1-2, p.121-135, 1995.

D’AMATO, G. Karyotype and heterochromatin characterization in some species of Narcissus (Amaryllidaceae). Caryologia, v. 57, p. 99-105, 2004.

DAVIS, A.P. & MVUNGI, E.F. Two new and endangered species of Coffea (Rubiaceae) from the Eastern Arc Mountains (Tanzania) and notes on associated conservation issues. Botanical Journal of the Linnean Society, v. 146, p. 237-245, 2004.

DAVIS, A.P. & RAKOTONASOLO, F. New species of Coffea L. (Rubiaceae) from Madagascar. Botanical Journal of the Linnean Society, v. 142, p. 111-118, 2003.

DEDKOVA, O.S.; BADAEVA, E.D.; MITROFANOVA, O.P.; ZELENIN, A.V. & PUKHALSKIY, V.A. Analyses of intraspecific divergence of hexaploid wheat Triticum spelta L. by C-banding of chromosomes. Russian Journal of Genetics, v. 40, n. 10, p.1111-1126, 2004.

D’EMERICO, S.D.; COZZOLINO, S.; PELLEGRINO, G.; PIGNONE, D. & SCRUGLI, A. Heterochromatin distribution in selected taxa of the 42-chromosomes of Orchis s. L. (Orchidaceae). Caryologia, v. 55, p. 55- 62, 2002.

ENDRIZZI, J.E. The diploid-like cytological behavior of tetraploid cotton. Evolution, v. 16, p. 325-329, 1962.

EVANS, G.M. & AUNG, T. The influence of the genotype of Lolium perenne on homoelogous chromosome association in hexaploid Festuca arundinacea. Heredity, v. 56, p. 97-103, 1986.

FORNI-MARTINS, E.R & CRUZ, N.D. Estudo da microsporogênese e formação de sementes de uma planta monossômica de café (Coffea arabica L.). Turrialba, v. 39, n.3, p. 323-327, 1989.

FREGONEZI, J.N.; TOREZAN, J.M.D. & VANZELA, A.L.L. A karyotypic study of three southern Brazilian Asteraceae species using fluorescence in situ hybridization a 45S rDNA probe and C-CMA3 banding. Genetics and Molecular Biology, v. 27, n. 2, p. 223-227, 2004.

GERLACH, W.L. & BEDBROOK, J.R. Cloning and characterization of ribossomal RNA genes from wheat and barley. Nucleic Acid Research, n.7, p. 1869-1885, 1979.

GILL, B.S. The molecular cytogenetic analysis of economically important traits in plant. In: Kew Chromosome Conference IV, p. 47-53, 1995.

GILL, K.S.; GILL, B.S.; ENDO, T.R. & MUKAI, Y. Fine physical mapping of Ph1, a chromosome pairing regulator gene in polyploid wheat. Genetics, v. 134, p. 1231-1236, 1993.

GOODPASTURE, C. & BLOOM, S.E. Visualization of nucleolar organizer regions in mammalian chromosomes using silver staining. Chromosoma, v. 53, p. 37-50, 1975.

GU, Z. & XIAO, H. Physical mapping of the 18S-26S rDNA by fluorescent in situ hybridization (FISH) in Camellia reticulata polyploid complex (Theaceae). Plant Science, v. 164, p. 279-285, 2003.

GUERRA, M.; KENTON, A. & BENNETT, M.D. rDNA sites in mitotic and polytene chromosomes of Vigna unguiculata (L.) Walp. and Phaseolus coccineus L. by in situ hybridization. Annals of Botany, v. 78, p. 157- 161, 1996.

HAJDERA, I.; SIWINSKA, D.; HASTEROK, R. & MALUSZYNSKA, J. Molecular cytogenetics analysis of genome structure in Lupinus angustifolius and Lupinus cosentinii. Theoretical and Applied Genetics, v. 107, p. 988-996, 2003.

HASTEROK, R.; JENKINS, J.; LANGDON, T.; JONES, R.N. & MALUSZYNSKA, J. Ribossomal DNA is an effective marker of Brassica chromosomes. Theoretical and Applied Genetics, v. 103, p. 486-490, 2001.

HASTEROK, R.; WOLNY, E.; KULAK, S.; ZDZIECHIEWICZ, A.; MALUSZYNSKA, J. & HENEEN, W.K. Molecular cytogenetic analysis of Brassica rapus-Brassica oleraceae var. alboglabra monosomic addition lines. Theoretical and Applied Genetics, v. 111, p. 196-205, 2005.

HESLOP-HARRISON, J.S. & SCHWARZACHER, T. Methods of genome analysis in plants. United States of America: CBR Press, p. 173-179, 1996.

HOWELL, W.M. & BLACK, D.A. Controlled silver-staining of the satellite regions with a protective colloidal developer: 1-step method. Experientia, v. 36, p. 1014-1015, 1980.

ISHIKAWA, T. & ISHIZAKA, H. Chromosome association and Giemsa C-banding of meiotic chromosomes in interespecific hybrid of Alstroemeria ligtu L. hybrid and A. pelegrina L. var. rosea, its amphidiploid, and sesquidiploid between the amphidiploids and parents. Breeding Science, v. 52, p. 27-33, 2002.

JELLEN, E.N. & LADIZINSKY, G. Giemsa C-banding in Avena insularis Ladizinsky. Genetic Resources and Crop Evolution, v. 47, p. 227-230, 2000.

JENCZEWSKI, E. & ALIX, K. From diploids to allopolyploids: The emergence of efficient pairing control genes in plants. Critical Reviews in Plant Sciences, v. 23, n.1, p. 21-45, 2003.

JI, Y.; DONATO, M.; CRANE, C.F.; RASKA, W.A.; ISLAM-FARIDI, M.N.; MCKNIGHT, T.D.; PRICE, H.J. & STELLY, D.M. New ribosomal RNA gene locations in Gossypium hirsutum mapped by meiotic FISH. Chromosoma, v.108. p. 200-207, 1999.

KIM, E.S.; PUNINA, E.O. & RODIONOV, A.V. Chromosome CPD(PI/DAPI) – and CMA/DAPI – banding patterns in Allium cepa L.. Russian Journal of Genetics, v 38, n. 4, p. 392-398, 2002.

KITAMURA, S.; INOUE, M.; SHIKAZONO, N. & TANAKA, A. Relationships among Nicotiana species revealed by the 5S rDNA spacer sequence and fluorescence in situ hybridization. Theoretical and Applied Genetics, v. 103, p. 678-686, 2001.

KOO, D-H.; PLAHA, P.; LIM, Y.P.; HUR, Y. & BANG, J-W. A high-resolution karyotype of Brassica napus spp. pekinensis revealed by pachytene analysis and multicolor fluorescence in situ hybridization. Theoretical and Applied Genetics, v.109, p. 1346-1352, 2004.

KRUG, C.A. Contribuição para o estudo da cytologia do genero Coffea. Boletim Técnico do Instituto Agronômico, n. 11, 1934.

KRUG, C.A. Estudos cytologicos em Coffea II. Boletim Técnico do Instituto Agronômico, n. 22, 1936.

KRUG, C.A. & MENDES, A.J.T. Cytological observations in Coffea IV. Journal of Genetics, v. 39, 189- 203, 1940.

KRUG, C.A.; MENDES, J.E.T. & CARVALHO, A. Taxonomia de Coffea arabica L. Descrição das variedades e formas encontradas no estados de São Paulo. Instituto Agronômico do Estado de São Paulo. Campinas, 1938. 1ª Reunião Sul-Americana de Botânica, Rio de Janeiro, outubro de 1938.

KULAK, S., HASTEROK, R. & MALUSZYNSKA, J. Karyotyping of Brassica amphidiploids using 5S and 25S rDNA as chromosome markers. Hereditas, v. 136, p.144-150, 2002.

LAMMERTS, W.E. On the nature of chromosome association in Nicotiana tabacum haploid. Cytologia, v.6, p. 38-50, 1934.

LASHERMES, P.; COMBES, M.C.; TROUSLOT, P. & CHARRIER, A. Phylogenetic relationships of coffee-tree species (Coffea L.) as inferred from ITS sequences of nuclear ribosomal DNA. Theoretical and Applied Genetics, v. 94, p. 947-955, 1997.

LASHERMES, P.; COMBES, M.C.; ROBERT, J.; TROUSLOT P.; D’HONT, A.; ANTHONY F. & CHARRIER, A. Molecular characterization and origin of the Coffea arabica L. genome. Molecular Genetics and Genomics, v. 261, p. 259-266, 1999.

LASHERMES, P.; PACZEK, V. TROUSLOT, P.; COMBES, M.C.; COUTURON, E. & CHARRIER, A. Single-Locus inheritance in the allotetraploid Coffea arabica L. and interespecif hybrid C. arabica x C. canephora. The Journal of Heredity, v. 91, n. 1, p.81-85, 2000.

LAWRENCE, G.J. & APPELS, R. Mapping the nucleolus organizer region, seed protein loci and isozyme loci on chromosome 1R in rye. Theoretical and Applied Genetics, v. 71, p. 742-749, 1986.

LEITCH, A.R.; SCHWARZACHER, T.; JACKSON, D. & LEITCH, I.J. In situ hybridization: a practical guide. Oxford: Bios Scientific Publishers Limited, 118 p, 1994.

LEROY, J.F. Evolution et taxogenese chez les caféiers: Hypothese sur leus origine. Comptes Rendus de l’Academic dês Sciences, Paris: p. 593-596, 1980.

LOMBELLO, R.A. & PINTO-MAGLIO, C.A.F. Cytogenetic Studies in Psilanthus ebracteolatus Hiern., a Wild Diploid Coffee Species. Cytologia, v.68, n. 4, p.425-429, 2003.

LOMBELLO, R.A. & PINTO-MAGLIO, C.A.F. Cytogenetic Studies in Coffea L. and Psilanthus Hook.f. Using CMA/DAPI and FISH. Cytologia, v. 69, n. 1, p. 85-91, 2004a.

LOMBELLO, R.A.& PINTO-MAGLIO, C.A.F. Heterocromatin and rDNA sites in Coffea L. chromosomes revealed by FISH and CMA/DAPI. I: C. humilis, C. kapakata, C. sp. Moloundu and C. stenophylla. Caryologia, v. 57, n. 1, p. 11-17, 2004b.

LOMBELLO, R.A. & PINTO-MAGLIO, C.A.F. Heterocromatin and rDNA sites in Coffea L. chromosomes revealed by FISH and CMA/DAPI. I: C. canephora cv. Apoatã, C. salvatrix, C. sessiflora. Caryologia, v. 57, n. 2, p. 138-143, 2004c.

MALUF, M.P.; SILVESTRINI, M.; RUGGIERO, L.M.C.; GUERREIRO FILHO, O. & COLOMBO, C.A. Genetic diversity of cultivated Coffea arabica inbred lines assessed by RAPD, AFLP and SSR markers system. Scientia Agricola, v. 62, n. 4, p. 366-373, 2005.

MARASEK, A.; HASTEROK, R.; WIEJACHA, K. & ORLIKOWSKA, T. Determination by FISH and GISH of hybrid status in Lilium. Hereditas, v. 140, p. 1-7, 2004.

MARCON, A.B.; BARROS, I.C.L. & GUERRA, M. Variation in chromosome numbers, CMA bands and 45S rDNA sites in species of Selaginella (Pteridophyta). Annals of Botany, v. 95, p. 271-276, 2005.

MARKS, G.E. & SCHWEIZER, D. Giemsa banding karyotype differences in some species of Anemone and Hepatica nobilis. Chromosoma, v. 44, p. 405-421, 1974.

MEDINA, D.M. Observações citológicas em Coffea XV – Microsporôgenese em Coffea arabica L. var. rugosa K.M.S. Bragantia, v. 10, n. 3, p. 61-66, 1950.

MELO, N.F.; CERVI, A.C. & GUERRA, M. Karyology and cytotaxonomy of the genus Passiflora L. (Passifloraceae). Plant Systematics and Evolution, v. 226, p. 69-84, 2001.

MENDES, A.J.T. Observações citológicas em Coffea XV – Microsporôgenese em Coffea arabica L. Bragantia, v. 10, n. 3, p. 79-87, 1950.

MENDES, A.J.T. Os cromôsomios das rubiáceas. Boletim Técnico do Instituto Agronômico, n. 55, p. 1-11, 1938a.

MENDES, A.J.T. Morfologia dos cromossomos de Coffea excelsa. Boletim Técnico do Instituto Agronômico, n. 56, p. 1-10, 1938b.

MENDES, A.J.T. Citologia das espécies de Coffea. Sua importância para o melhoramento do cafeeiro. Boletim de Agricultura Ser., n. 55, p. 37-45, 1956.

MENDES, A.J.T. & BACCHI, O. Observações citológicas em Coffea V. Uma variedade haplóide (di- haploide) de C. arabica L. Jornal da Agronomia, v. 3, n. 3, p.183-207, 1940.

MENDES, C.H.T. Introdução ao estudo da auto-esterilidade no gênero Coffea. Bragantia, v. IX, p. 35-41, 1949.

MENDES, C.H.T. Observações citológicas em Coffea XVI – Microsporôgenese em Coffea canephora Pierre ex Froner. Bragantia, v. 10, n. 4, p. 97-104, 1950.

MISHIMA, M.; OHMIDI, N.; FUKUI, K. & YAHARA, T. Trends in site-number change of rDNA loci during polyploid evolution in Sanguisorba (Rosaceae). Chromosoma, v. 110, p. 550-558, 2002.

MITCHELL, C.C.; PARKINSON, S.E.; BAKER, T.J. & JELLEN, E.N. C-Banding and localization 18S- 5,8S-26S rDNA in tall oatgrass species. Crop Science, v. 43, p.32-36, 2003.

MONDIN, M. Estudo da evolução cariotípica do gênero Crotalaria L. (Leguminosae-Papilionoideae) com o emprego de técnicas de bandamento cromossômico e hibridação in situ fluorescente (FISH). 2003. Tese (Doutorado) – Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo, Piracicaba. 2003.

MOORE, G. Cereal chromosome structure, evolution, and pairing. Annual Review Plant Physiology Plant Molecular Biology, v. 51, p 195-222, 2000.

MORICOCHI, L.; NOGUEIRA JUNIOR, S.; MONTEIRO, J.L.M.; ALVES, H.S.; ÂNGELO, J. A. & PINO, F. A. Perfil tecnológico da indústria de café torrado e moído. Agricultura em São Paulo, v. 50, n. 1, p. 53- 72, 2003.

MOSCONE, E.A.; LOIDL, J.; EHRENDORFER, F. & HUNZIKER, A.T. Analysis of active nucleolus organizing regions in Capsicum (Solanaceae) by silver staining. American Journal of Botany, v. 82, n. 2, p. 276-287, 1995.

MURRAY, B.G. Heterochromatin and silver banding of rye (Secale cereale, Gramineae) chromosomes. Plant Systematic and Evolution, v. 193, n. 1-4, p. 243-248, 1994.

MURRAY, B.G.; BENNETT, M.D. & HAMMETT, K.R.W. Secondary constrictions and NORs of Lathyrus investigated by silver staining and in-situ hybridization. Heredity, v. 68, p. 473-478, 1992.

NAKAMURA, R.; KITAMURA, S.; INOUE, M.; OHMIDO, N. & FUKUI, K. Karyotype analysis of Nicotina kawakamii Y. Ohashi using DAPI banding and rDNA FISH. Theoretical and Applied Genetics, v. 102, p. 810-814, 2001.

NAGANOWSKA, B. & ZIELIŃSKA, A. Physical mapping of 18S-25S rDNA and 5S rDNA in Lupinus via fluorescence in situ hybridization. Cellular and Molecular Biology Letters, v. 7, n. 665-670, 2002.

OLIVEIRA, V.M. Estudos citotaxonômicos em espécies do gênero Vermonia Schreb. (Asteraceae: Vermoniae). 2005. Dissertação (Mestrado) - Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, Campinas. 2005.

OSUJI, J.O.; CROUCH, J.; HARRISON, G. & HESLOP-HARISSON, J.S. Molecular cytogenetics of Musa species, cultivars and hybrids: Location of 18S-5,8S-25S and 5s rDNA and telomere-like sequences. Annals of Botany, v. 82, p. 243-248, 1998.

PEDROSA, A.; VALLEJOS, C.E.; BACHMAIR, A. & SCHWEIZER, D. Integration of common bean (Phaseolos vulgaris L.) linkage and chromosomal maps. Theoretical and Applied Genetics, v. 106, p. 205-212, 2003.

PENDAS, A.M.; MORÁN, P. & GARCIA-VÁZQUEZ E. Ribosomal genes are interspersed throughout a heterochromatic arm in Atlantic salmon. Cytogenetics and Cell Genetics, v. 63, p.128-130, 1993.

PIEROZZI, N.I. & JUNG-MENDACOLLI, S.L. Karyotype and C-band analysis in two Genipa L. species (Rubiaceae, Gardenieae tribe). Cytologia, v. 62, p. 81-90, 1997.

PIEROZZI, N.I.; PINTO-MAGLIO, C.A.F. & CRUZ, N.D. Characterization of somatic chromosomes of two diploid species of Coffea L. with acetic orcein and C-band techniques. Caryologia, v. 52, n. 1-2, p. 1-8, 1999.

PIEROZZI, N.I.; PINTO-MAGLIO, C.A.F. & SILVAROLLA, B. Caracterização cariotípica de espécies diplóides de Coffea L. por técnicas de bandamento. In: 49º Congresso Brasileiro de Genética, Águas de Lindóia, p. 493, 2003.

PINTO-MAGLIO, C.A.F. Morfologia dos cromossomos nucleolares em fase de paquíteno no gênero Coffea. 1983. Tese Dissertação (de Mestrado) - Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, Campinas. 1983.

PINTO-MAGLIO, C.A.F. Identificação dos cromossomos paquitênicos de Coffea arabica L. 1991. Tese (Doutorado) - Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, Campinas. 1991.

PINTO-MAGLIO, C.A.F. & CRUZ, N.D. Pachytene chromosome morphology in Coffea L. I. nucleolar chromosomes. Caryologia, v. 40, n. 1-2, p. 7-23, 1987.

PINTO-MAGLIO, C.A.F. & CRUZ, N.D. Pachytene chromosome morphology in Coffea L. II. C. arabica L. complement. Caryologia, v. 51, n. 1, p. 19-35, 1998.

PINTO-MAGLIO, C.A.F.; CUÉLLAR, T.; BARBOSA, R.L. Aplicação de técnicas de citogenética molecular na caracterização dos cromossomos da espécie Coffea arabica L. I Simpósio de Pesquisa dos Cafés do Brasil, p. 444-446, 2000.

PINTO-MAGLIO, C.A.F.; BARBOSA, R.L.; CUÉLLAR, T.; MALUF, M.P.; PIEROZZI, N. I. & SILVAROLLA, B. Chromosome characterization in Coffea arabica L. using cytomolecular techniques. Chromosome Conference 14th, Würzburg, Alemanha, 9, p. 100, 2001.

PINTO-MAGLIO, C.A.F.; BARBOSA, R.L.; CUÉLLAR, T. & PIEROZZI, N. I. rDNA sites and heterochromatin in the alotetraploid Coffea arabica L. and its putative diploid ancestors revealed by FISH, silver stainig and CMA/DAPI, Caryologia, no prelo.

PONTES, O.; LAWRENCE, R.J.; NEVES, N.; SILVA, M.; LEE, J.H.; CHEN, Z.J.; VIEGAS, W. & PIKAARD, C.S. Natural variation in nucleolar dominance reveals the relationship between nucleolus organizer chromatin topogy and rRNA gene transcription in Arabdopisis. Cell Biology, v. 100, n. 20, p. 1418- 1423, 2003.

PRÓ CAFÉ – COORDENAÇÃO DO PROGRAMA INTEGRADO DE APOIO À CAFEICULTURA, http://www.agricultura.gov.br, (21 outubro 2005).

RAINA, S.N.; MUKAY, Y. & YAMAMOTO, M. In situ hybridization identifies the diploid progenitor species of Coffea arabica (Rubiaceae). Theoretical and Applied Genetics, v. 97, p. 1204-1209, 1998.

RAINA, S.N.; MUKAI, Y.; KAWAGUCHI, K.; GOEL, S. & JAIN, A. Physical mapping of 18S-5,8S-26S and 5S ribosomal RNA genes families in three important vetches (Vicia species) and their allied taxas constituting three species complexes. Theoretical and Applied Genetics, v. 103, p. 839-845, 2001.

RAJHATHY, T. & THOMAS, H. Genetic control chromosome pairing in hexaploid oats. Nature New Biology, v. 239, p. 217-219, 1972.

RAN, Y.; HAMMETT, K.R.W. & MURRAY, B.G. Phylogenetic analysis and karyotype evolution in the genus Clivia (Amaryllidaceae). Annals of Botany, v. 87, p. 823-830, 2001.

RAN, Y.; MURRAY, B.G. & HAMMETT, K.R.W. Karyotype analysis of the genus Clivia by Giemsa and fluorochrome banding and in situ hybridization. Euphytica, v.106, p. 139-147, 1999.

REEDER, R.H. Mechanisms of nucleolar dominance in animals and plants. The Journal of Cell Biology, v. 101, p. 2013-2016, 1985.

RILEY, R. Cytogenetics of chromosome pairing in wheat. Genetics, v. 78 p. 193-203, 1974.

RILEY, R. & CHAPMAN, V. Genetic control of the cytologically diploid behavior of hexaploid wheat. Nature, v. 182, p. 713-715, 1958.

RILEY, R.; CHAPMAN, V. & KIMBER, G. Position of the gene determining the diploid-like meiotic behavior of wheat. Nature, v. 186, p. 259-260, 1960.

ROOSE, M.L.; SCHWARZACHER, T. & HESLOP-HARRISON, J.S. The chromosomes of Citrus and Poncirus species and hybrids: Identification of characteristic chromosomes and physical mapping of rDNA loci using in situ hybridization and fluorochrome banding. The Journal of Heredity, v. 89, n.1, p. 83-86, 1998.

RUAS, C.F.; VANZELA, A.L.L; SANTOS, M.O.; FREGONEZI, J.N.; RUAS, P.M.; MATZENBACHER, N.I. & AGUIAR-PERECIN, M.L.R. Chromosomal organization and phylogenetic relationships in Hypochaeris species (Asteraceae) from Brasil. Genetics and Molecular Biology, v. 28, n. 1, p. 129-139, 2005.

SCHWAZACHER, T; AMBROS, P. & SCHWEIZER, D. Application of Giemsa banding to orchid karyotype analysis. Plant Systematic and Evolution, v. 134, p. 293-297, 1980.

SCHWEIZER, D. Reverse fluorescent chromosome banding with Cromomicin and DAPI. Chromosoma, v. 58, p. 307-354, 1976.

SILJAK-YAKOVLEV, S.; CERBAH, M.; COULAUD, J.; STOIAN, V.; BROWN, S.C.; ZOLDOS, V.; JELENIC, S. & PAPES, D. Nuclear DNA content, base composition, heterochromatin and rDNA in Picea omorika and P. abies. Theoretical and Applied Genetics, v. 104, p. 505-512, 2002.

SILVA, H.L. Número de cromossomos em Coffea racemosa Lour. Bragantia, v. 15, nota nº 5, p. XVII- XVIII, 1956.

SUMNER, A.T. A simple technique for demonstrating centromeric heterochromatin. Experiential Cellular Research, v. 75, p. 304-306, 1972.

STEIGER, D.L.; NAGAI, C.; MOORE, P.H.; MORDEN, C.W.; OSGOOD, R.V. & MING, R. AFLP analysis of genetic diversity within and among Coffea arabica cultivars. Theoretical and Applied Genetics, v. 105, p. 209-215, 2002.

STOFFELEN, P.; ROBBRECHT, E. & SMETS, E. Coffea (Rubiaceae) in Cameroon: A new species and a nomen recognized as species. Belgian Journal of Botany, v. 129, n. 1, p. 71-76, 1996.

TAKETA, S.; ANDO, H.; TAKEDA, K.; ICHII, M. & BOTHMER, R. Ancestry of American polyploid Hordeum species with the I genome inferred from 5S and 18S-25S. Annals of Botany, v. 96, p. 23-33, 2005.

TAKETA, S.; HARRISON, G.E. & HESLOP-HARRISON, J.S. Comparative physical mapping of the 5S and 18S-25S rDNA in nine wild Hordeum species and cytotypes. Theoretical and Applied Genetics, v. 98, p. 1- 9, 1999.

TEL-ZUR, N.; ABBO, S.; BAR-ZVI, D. & MIZRAHI, Y. Genetic relationships among Hylocereus and Selenicereus Vine Cacti (Cactaceae): Evidence from hybridization and cytological studies. Annals of Botany, v. 94, p. 527-534, 2004.

THOMAS, H.M.; HARPER, J.A. & MORGAN, W.G. Gross chromosome rearrangements are occurring in an accession of the grass Lolium rigidum. Chromosome Research, v. 9, p. 585-590, 2001.

THOMAZIELLO, R.A.; FAZUOLI, L.C.; PEZZOPANE, J.R. M.; FAHL, J.I. & CARELLI, M.L.C. Café Arábica: Cultura e Técnicas de Produção. Boletim Técnico do Instituto Agronômico, n. 187, 2000.

TREMETSBERGER, K.; TALAVERA, S.; STUESSY, T.F.; ORTIZ, M.A.; WEISS-SCHNEEWEISS, H. & KADLEC, G. Relationship of Hypochaeris zalsmanniana (Asteraceae, Lactuceae) an endangered species of the Iberian Peninsula, H. radicata and H. glabra and biogeographical implications. Botanical Journal of the Linnean Society, v. 146, p. 79-95, 2004.

TREMETSBERGER, K.; WEISS-SCHNEEWEISS, H.; STUESSY, T.; SAMUEL, R.; KADLEC, G.; ORTIZ, M.A. & TALAVERA, S. Nuclear ribosomal DNA and karyotypes indicate a NW African origin of South America Hypochaeris (Asteraceae, Cichorieae). Molecular Phylogenetics and Evolution, v. 35, p. 102-106, 2005.

TUNA, M.; GILL, K.S. & VOGEL, K.P. Karyotype and C-banding pattern of mitotic chromosomes in diploid bromegrass (B. riparius Rehm.). Crop Science, v. 41, p. 831-834, 2001.

TUNA, M.; VOGEL, K.P. & GILL, K.S.; ARUMUGANATHAN, K. C-Banding analyses of Bromus inermis genome. Crop Science, v. 44, p. 31-37, 2004.

TUNA, M.; VOGEL, K.P. & ARUMUGANATHAN, K. Genome size and Giemsa C-banded karyotype of tetraploid Bromus ciliatus L. Euphytica, v. 146, p. 177-182, 2005.

VAIO, M.; SPERANZA, P.; VALLS, J.F.; GUERRA, M. & MAZZELLA, C. Localization of the 5S and 45S rDNA and cpDNA sequence analysis in species of the Quadrifaria group of Paspalum (Poaceae, Paniceae). Annals of Botany, v. 96, p. 191-200, 2005.

VANZELA, A.L.L.; CUADRADO, A.; JOUVE, N.; LUCENO, M. & GUERRA, M. Multiple locations of the rDNA sites in holocentric chromosomes of Rhynchospora (Cyperaceae). Chromosome Research, v. 6, p. 345-349, 1998.

WRIGLEY, G. Coffee. Longman Scientific and Technical, London UK, 639 p, 1988.

YAMAMOTO, M. & TOMINAGA, S. High chromosomal variability of mandarins (Citrus spp.) revealed by CMA banding. Euphytica, v. 129, p. 267-274, 2003.

YAMAMOTO, M. & TOMINAGA, S. Chromosome identification in haploid clementine (Citrus clementina hort. ex Tanaka) by fluorescent staining. Scientia Horticulturae, v. 101, p. 201-206, 2004. ANEXO Anexo 1 – Comparação de espécies, variedades e cultivares do gênero Coffea L., por meio de técnicas citomoleculares.

Gênero Coffea L. Hibridação in situ Bandamento Referências rDNA CMA3/DA DAPI/DA AgNOR 18S-5,8S-26S 5S Tetraplóides C. arabica, cultivar Bourbon Vermelho 6t 2t/2subt 6t - 6t Pinto-Maglio et al. (2000; 2001) C. arabica, variedade typica Cramer 6t 2t 6t - 6t Presente estudo C. arabica, cultivar Mundo Novo 6t 2t 6t - 6t Presente estudo C. arabica 4t 4t/2i - Raina et al. (1998) Diplóides C. eugenioides 4t 2i* 4t - 4t* Barbosa et al. (2001) C. eugenioides 2t 4t - Raina et al. (1998) C. canephora Pierre ex Frohner 2t 2i* 4t/2i - 2t* Barbosa et al. (2001) C. liberica var. dewevrei 2t 2i* 4t/2i - 2t* Barbosa et al. (2001) C. brevipes 2t 2i 2t - Lombello e Pinto-Maglio (2004a) C. racemosa 4t 2i 4t - Lombello e Pinto-Maglio (2004a) C. humilis 2t 2i ~8t - Lombello e Pinto-Maglio (2004b) C. kapakata 2t 2i 2t/2i - Lombello e Pinto-Maglio (2004b) C. sp Moloundou 4t 2i 4t - Lombello e Pinto-Maglio (2004b) C. stenophylla 2t 2i 2t/2i + Lombello e Pinto-Maglio (2004b) C. canephora, cultivar Apoatã 2t 2i 2t - Lombello e Pinto-Maglio (2004c) C. salvatrix 2t 2i 4t - Lombello e Pinto-Maglio (2004c) C. sessiflora 2t 2i 4t - Lombello e Pinto-Maglio (2004c) C. congensis 2t* 2i* 4t/2i* - 2t* Pinto-Maglio et al. (no prelo) C. congensis 2t 2(?) - Raina et al. (1998) t – terminal; i – intercalar; (?) – localização não descrita • Publicação no prelo.