2003 Tese Ciafreitas.Pdf

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

TESE PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE DOUTOR EM FARMACOLOGIA

ESTUDO SOBRE A ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE SUBSTÂNCIAS EXTRAÍDAS E PURIFICADAS DE SECREÇÕES DA PELE DE ANFÍBIOS

CARLOS IBERÊ ALVES FREITAS

FORTALEZA - CE

- 2003 - UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

ESTUDO SOBRE A ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE SUBSTÂNCIAS EXTRAÍDAS E PURIFICADAS DE SECREÇÕES DA PELE DE ANFÍBIOS

CARLOS IBERÊ ALVES FREITAS

Tese submetida à Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Farmacologia como requisito parcial para obtenção do Título de Doutor em Farmacologia

Orientador:. Professor Dr. Krishnamurti de Moraes Carvalho

Fortaleza - CE

- 2003 - i

AGRADECIMENTOS

Ao Professor Krishnamurti de Moraes Carvalho por sua orientação e participação que ajudaram na elaboração, execução e revisão deste trabalho. Ao Professor José Luciano Moreira do departamento de Patologia e Medicina Legal desta Universidade, por sua amizade e dedicação inestimáveis, por sua participação no início deste trabalho. Aos colegas e amigos Professores da Universidade Federal Rural de Pernambuco, Dr. George Jimenez, por suas valiosas sugestões e auxílio na análise estatística, bem como Dr. Eduardo Coli que pelo apoio e amizade ao longo de nossa jornada. Ao Coordenador do Curso de Pós graduação em Farmacologia Dr. Ronaldo Albuquerque pela consideração e aos ensinamentos como professor. Aos demais que de alguma maneira contribuiram, sejam: colegas, bolsistas, funcionários e professores do Departamento de Departamento de Fisiologia e Farmacologia em especial a Dra. Helena Serra Azul, Dra Gisela Costa Camarão, Dr. Vietla S. Rao, Dr. Rui Capaz. Ao Departamento de Química Orgânica, onde foi realizado parte dos estudos de determinação das estruturas, sob a coordenação do Prof. Dr. Edilberto R. Silveira. Aos colegas de convivívio na Universidade Estadual do Ceará José Eduardo Honório Júnior, Patrícia Campêlo, Jackson Cortez, Cláudio Patrocínio, Valéria, Rosa Germana, Marcelo Monteiro, Juliana, Solane, Clemilson, AronaiAlexandre, Carla, Andrea, Janaína, Ana, Inez, Luciana que sempre me ofereceram sua amizade e contribuição, cada um a seu modo, para a realização deste trabalho. Ao colega e amigo Dr. Bruno Andrade Cardi pelos conselhos e ajuda. À bolsista e amiga Amanda Xavier pela e inestimável colaboração neste trabalho. Aos amigos Flávio Cyreneu, Ana Kelen, Karlliely, Rosemeire, Fernando Albuquerque e Marcelo Bezerra pelo apoio neste final de percurso. A Eduardo Ferreira Araújo por me possibilitar o bom funcionamento do computador e aos esclarecimentos técnicos e apoio recebido. Aos meus pais. E agradeço em especial à minha esposa Marinalva por seu companheirismo, carinho, dedicação, paciência, sugestões e incenivo na digitação deste trabalho, também aos meus filhos ii

Carlos Eduardo e Gabriel por terem sempre um sorriso dedicado a mim nas horas de dificuldade, mesmo com tantas ausências. Este trabalho foi realizado graças aos auxílios das seguintes instituições: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), através de convênios com a Universidade Esadual do Ceará. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), por meio de convênio com o Curso de Pós-Graduação em Farmacologia, Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Ceará e da concessão de Bolsa de Doutorado. Aos Laboratórios de Bioquímica Humana na pessoa da Dra. Lia Magalhães de Almeida e Neurofarmacologia, do Dr. Krishnamurti de Moraes Carvalho na Universidade Estadual do Ceará, onde foram desenvolvidos os experimentos necessários à realização deste trabalho.

E acima de tudo e de todos, a Deus, por me fazer aceitar com paciência tudo o que não podia iii

“Seríamos melhores se não tentássemos ser tão bons”

Sigmund Freud

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS i - ii

SUMÁRIO iv - vii

LISTA DE TABELAS ix

LISTA DE FIGURAS x - xiv

RESUMO xv - xvi

ABSTRACT xvii-xviii

JUSTIFICATIVA xvix-xxi

LISTA DE ABREVIATURAS xxii

1. INTRODUÇÃO 1 - 37 1.1. Um Breve Histórico das Drogas Antimicrobianas e a Resistência Bacteriana 1 - 3 1.2. Os Anfíbios 3 - 16 1.2.1. Considerações Gerais 3 - 4 1.2.2. Presença dos Anfíbios na Cultura do Homem 5 1.2.3. Distribuição 6 1.2.4. Características Pele dos Anfíbios 6 - 9 1.2.4.1. Glândulas Mucosas 9 1.2.4.2. Glândulas Granulosas 9 1.2.5. Componentes da Secreção de Anfíbios – Visão geral 10 - 14 1.2.6. Esteróides 15 1.2.6.1. Bufadienolídeos 15 Ocorrência na Natureza 16 1.3. Detecção de Atividade Antimicrobiana de Secreções Oriundas de Anfíbios – 16 - 17 Visão geral

1.3.1. Bufadienolídeos com Atividade Antimicrobiana 17 - 18

1.3.1.1. Bufadienolídeos Antineoplásicos 18 1.3.2. Diversas Substâncias Antimicrobianas Isoladas de Anfíbios Não Esteroidais - 18 - 19 Visão geral

1.3.3. Antimicrobianos Peptídicos Isolados de Anuras - Os mais estudados 19 1.3.3.1. Propriedades e Possíveis Mecanismos de Ação 19 - 21 v

1.3.3.2. Famílias Conhecidas de Peptídeos Antimicrobianos 21 a) Discoglossidae 21 - 23 Bombina variegata 21 Bombina orientalis 22 Bombina maxima 22 - 23 b) Pipidae 23 - 24 Xenopus laevis 23 Xenopus tropicalis 23 - 24 c) Hylidae 24 - 29 c.1. Phyllomedusinae 24 - 25 Phyllomedusa sauvagii 24 Phyllomedusa bicolor 24 - 25 Phyllomedusa distincta 25 Phyllomedusa hypochondrialis 25 Phyllomedusa tarsius 25 Phyllomedusa oreades 25 c2. Pelodryadinae 26 - 29 Litoria caerulea 26 Litoria chloris 26 Litoria citropa 26 - 27 Litoria dahlii 27 Litoria genimaculata 27 - 28 Litoria infrafrenata 28 Litoria aurea & L. raniformis 28 Litoria. splendida 28 - 29 Litoria xanthomera 29 d) Hyperoliidae 29 Kassina senegalensis 29 e) Pseudidae 30 Pseudis paradoxa 30 f) Ranidae 30 - 35 Rana brevipoda porsa 30 Rana rugosa 30 Rana catesbeiana 30 Rana sphenocephala 31 Rana clamitans 31 Rana esculenta 31 - 32 Rana ridibunda 32 Rana temporaria 32 Rana grylio 32 Rana palustris 32 - 33 Rana sylvatica 33 vi

Rana tigerina 33 Rana berladieri, Rana luteiventris, Rana pipiens 33 Rana aerolata 34 Rana japonica 34 Rana tarahumarae 35 Rana tagoi 35 g) Myobatrachidae 36 Uperoleia mjobergi 36 h) Bufonidae 36 Bufo boreas, B. bufo, B. viridis 36 Bufo bufo gargarizans 36

1.3.4. Peptídeos Antineoplásicos. 37 1.3.4.1. Magainina 2 e peptídeos análogos 37 1.3.4.2. Litoria. aurea & L. raniformis 37

2. OBJETIVOS 38

3. MATERIAL E MÉTODOS 39 - 48 3.1. Animais Utilizados na Obtenção das Amostras 39 3.1.1. Bufo schneideri Werner, 1894- Bufonidae 39 3.1.2. Leptodactylus pentadactylus Laurenti, 1768 Leptodactylidae : Leptodactylinae 39

3.2. Obtenção do Veneno de Bufo schneideri 40

3.3. Obtenção de Extratos de Pele de Bufo schneideri 40

3.4. Obtenção do Veneno de Leptodactylus pentadactylus 41

3.5. Purificação por Cromatografia em Colunas 41

3.6. Cromatografia em Placa Delgada de Sílicagel 42

3.7. Obtenção de Dados para Avaliação dos Índices de Rendimento de Extração do 42 Veneno Bruto de Bufo schneideri

3.8. Estudos quanto a Variabilidade do Veneno Bruto e seus Componentes em 42 Diversas Localidades de Coleta

3.9. Determinação de Proteínas 43

3.10. Eletroforese 43

3.11. Determinação da Estrutura das Substâncias Utilizadas 43

3.11.1. Determinação da sequência de aminoácidos dos peptídeos 43

3.11.2. Determinação da estrutura das novas substâncias biologicamente ativas 43 (não proteicas)

vii

3.12. Ensaio de Atividade Hemolítica 43 - 44

3.13. Ensaio de Atividade Antimicrobiana 44 - 47

3.13.1. Obtenção de Microorganismos 44

3.13.2. Preparação do Inóculo para Cultivo 45

3.13.3. Teste de Avaliação da Sensibilidade Antimicrobiana 45 - 47 a) Em Meio Sólido 45 - 46 Inoculação em Placa 45 Aplicação dos Discos e Amostra - Teste 45 - 46 Leitura de Resultados por Mensuração dos Halos 46 b) Em Meio Líquido 46 - 47

3.14. Avaliação dos Dados por Modelos Matemáticos e Estatísticos 47 - 48

3.14.1. Equação de Gompertz 47

3.14.2. Equação de Regressão Não Linear 48

3.14.3. Análise Estatística 48

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 49 – 119 4.1. Purificações Cromatográficas das Amostras de Bufo schneideri 49 - 50

4.1.1. Recromatografia do Pico1 parcialmente purificado de Bufo schneideri (F1) 50

4.2. Determinação da Estrutura das Novas Substâncias Biologicamente Ativas 51 - 55 (não proteicas) 4.2.1. Hellebrigenin 52

4.2.2. Telocinobufagin 53

4.2.3. Marinobufagin 53 - 54

4.2.4. Bufalin 54 - 55

4.3. Obtenção de Dados para Avaliação dos Índices de Rendimento Extração do 56 Veneno Bruto de Bufo schneideri

4.4. Cromatografia em Placa Delgada de Sílica 56 - 58

4.5. Estudos da Variabilidade do Veneno Bruto e seus Componentes em Diversas 59 - 60 Localidades de Coleta:

4.6. Purificações Cromatográficas das Amostras de Leptodactylus pentadactylus 61 - 64

4.6.1. Purificações Cromatográficas das Amostras de L. pentadactylus em Coluna 61 Filtrante Sephacryl S-400 4.6.1.1. Eletroforese do Pico 8 obtido pela Cromatografia em Coluna Filtrante Sephacryl 61 - 62 S-400

4.6.2. Purificações dos peptídeos de Leptodactylus pentadactylus 62 - 64

viii

4.7. Avaliação da Atividade Biológicas 65 - 119

4.7.1. Atividade hemolítica de amostras obtidas de Bufo schneideri 65 - 67

4.7.2. Atividade hemolítica de amostras obtidas de Leptodactylus pentadactylus 68 - 72 Amostras de natureza protéica 68 - 69 Amostras de natureza peptídica obtida em coluna hidrofóbica C18 com CLAE 70 - 72

4.7.3. Avaliação da Atividade Antimicrobiana 73- 107

4.7.3.1. Em Meio Sólido 73 - 78 a) Bufo schneider 73 - 77 b) Leptodactylus pentadactylus 78

4.7.3.2. Em Meio Líquido 78 - 119 a) Amostras de Bufo scneider 78 - 88 a.1. Extratos de Pele de B. schneideri 78 - 84 a.2 Amostras dos picos purificados obtidos de B. scneider 84 - 88 b) Amostras de Leptodactytlus pentadactylus 89- 111 b.1. Peptídeos 5, 6 e 7 de Leptodactytlus pentadactylus obtidos pela CLAE em C18 89 b.1.1. Avaliação da atividade tempo-dependente 89- 106 b.1.2. Avaliação da influência do pH na atividade antimicrobiana dos peptídeos de 106 L. pentadactylus b.2. Ensaio antimicrobiano com amostras do L. pentadactylus obtidas em coluna 106 filtrante Sephacryl S-400 em meio líquido b.2.1. Avaliação tempo/dependente da atividade antimicrobiana de substâncias 109- 118 extraídas de L. pentadactylus e influência da fervura. b.2.2. Determinação da concentração inibitória mínima antimicrobiana do pico 8 obtido 118 - 119 da cromatografia em coluna filtrante Sephacryl S 400 da secreção de Leptodactylus pentadactylus

5. CONCLUSÃO 120-122

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 123-156

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Farmacologia da bufotenina em humanos (OTT, 2001). 8

Tabela 2 - Classificação química dos produtos até então isolados da pele de anfíbios e 12 alguns exemplos

Tabela 3 - Principais classes de polipeptídeos da pele de anfíbios e algumas 14 características de ação biológica

Tabela 4 - Resultado da leitura em espectrofotômetro a 541 nm do sobrenadante dos 65 poços da placa de microtitulação da avaliação da atividade hemolítica dos das amostras obtidas da secreção da pele de Bufo schneideri

Tabela 5 - Resultado da leitura em espectrofotômetro a 541 nm do sobrenadante dos 68 poços da placa de microtitulação da avaliação da atividade hemolítica dos das amostras obtidas da cromatografia em Sephacryl S-400 da secreção da pele de Leptodactylus pentadactylus contra suspensão a 5% de sangue de ratos albinos Wistaro

Tabela 6 - Resultado da leitura em espectrofotômetro a 541 nm do sobrenadante dos 70 poços da placa de microtitulação da avaliação da atividade hemolítica dos das amostras peptídicas obtidas da cromatografia em coluna absorção hidrofóbica de fase reversa C18 de aminoetilagarose eluído em programa isocrático a 5 % com acetonitrila acrescida de ácido trifluoroacético da secreção da pele de Leptodactylus pentadactylus.

Tabela 7 - Tamanho dos halos de inibição de .amostras obtidas da secreção da pele de 73 Bufo schneideri frente aos microorganismos testados.

Tabela 8 - Ensaio antimicrobiano com amostras do Leptodactylus pentadactylus obtidas 107 em coluna filtrante Sephacryl S-400 em meio líquido

Tabela 9 - Tempo para inicio do crescimento bacteriano (lag) e taxa de crescimento 116 máximo (Tax), estimadas segundo as equações de Gompertz, para Salmonella choleraesus choleraesus var typhi, submetidas à várias condições de tratamento com amostras obtidas na coluna Sephacryl S 400 da secreção de Leptodactylus pentadactylus.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Esqueleto básico dos Bufadienolídeos 15

Figura 2 – Foto de um espécime Bufo schneideri W. 39

Figura 3 – Foto de um espécime Leptodactylus pentadactylus L. 39

Figura 4 – Representação esquemática da área de mensuração do halo de inibição na 47 placa de ensaio com meio sólido de Müeller – Hinton.

Figura 5 – Cromatograma do extrato bruto de Bufo schneideri em CLAE em coluna 49 adsorção hidrofóbica de fase reversa C18 de aminoetilagarose eluído em em gradiente de 0 (zero) a 40 % com acetonitrila acrescido de ácido trifluoroacético.

Figura 6 – Cromatograma obtido do pico 1 em coluna adsorção hidrofóbica de fase 50 reversa C18 de aminoetilagarose eluído em programa isocrático a 30 % com acetonitrila acrescida de ácido trifluoroacético

Figura 7 – Estrutura do Pico 1B: Hellebrigenin (3β, 5β, 14β - trihidroxi–19–oxo–20, 22 - 52 bufadienolídeo)

Figura 8 – Estrutura do Pico 2: Telocinobufagin (3β, 5β, 14β - trihidroxi – 20, 22 – 53 bufadienolídeo)

Figura 9 – Estrutura do Pico 3: Marinobufagin (14β, 15β - epóxi-3β, 5β -dihidroxi–20, 22 54 bufadienolídeo)

Figura 10 – Estrutura do Pico 4: Bufalin (3β, 14β - dihidroxi – 5β– bufa– 20, 22 -dienolídeo 55

Figura 11 – Esquema do resultado do extrato bruto de B. scneider aplicado na Lâmina de 57 Silicagel AL60 tendo como eluente o clorofórmio e sistema revelador a base de vanilina.

Figura 12 – Esquema do resultado do extrato bruto de B. scneider aplicado na Lâmina de 58 Silicagel AL60 tendo como eluente uma mistura de clorofórmio-metanol (9:1) e sistemarevelador o iodo.

Figura 13 - Cromatogramas de amostras de veneno de Bufo schneideri oriundas de 60 Areia (PB) e Fortaleza (CE).

Figura 14 - Cromatograma da purificação de proteínas em coluna preparativa filtrante 61 Sephacryl - S 400 (0,6 cm diãmetro por 46 cm comprimento) e eluída por tampão Tris– HCl 0,05 N

Figura 15 – Avaliação eletroforética para a análise de pureza da toxina (P8) em gel de 62 poliacrilamida 6% sob condições não desnaturantes e desnaturantes com SDS 1 % e β - mercaptoetanol.

Figura 16 – Cromatograma da obtenção dos peptídeos do exsudato liofilizado de 63 Leptodactylus pentadactylus fracionado por CLAE com coluna C18 eluído num gradiente de 5 a 80 % de acetonitrila durante 75 min., fluxo de 5 ml/min.

Figura 17 - Cromatograma de verificação da pureza cromatografia analítica em coluna 64 de adsorção hidrofóbica fase reversa C4 dos picos 5, 6 e 7 peptídicos de Leptodactylus pentadactylus respectivamente.

Figura 18 – Efeitos de variações parciais de da estrutura e grupos na atividade citotóxica 67 de bufodienolídeos, cardienolídeos de ocorrência natural e seus análogos relacionados.

Figura 19 - (A) Estrutura da squalamina, um aminosterol, 3β-N-1- [N(3-[4-aminobutil]) 75 1,3 diaminopropano] - 7α - hydroxi - 5α - colestan – 24 R - il sulfato e em (B) o sintético MSI- 1436 com R1 = espermina, R2 = R-OH e R3 = OH.

Figura 20 - Estrutura dos quatro bufadienolídeos isolados de B. schneideri. 77

Figura 21 - Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de 79 microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras de extratos de diferentes regiôes de pele de Bufo schneideri contra Enterobacter aerogenes em meio líquido

Figura 22 - Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de 80 microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras de extratos de diferentes regiôes de pele de Bufo schneideri contra Escherichia coli em meio líquido.

Figura 23 - Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de 81 microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras de extratos de diferentes regiôes de pele de Bufo schneideri contra Klebsiella pneumoniae em meio líquido.

Figura 24 - Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de 82 microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras de extratos de diferentes regiôes de pele de Bufo schneideri contra Salmonella choleraesuis choleraesuis var typhi em meio líquido.

Figura 25 - Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de 83 microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras de extratos de diferentes regiôes de pele de Bufo schneideri contra Bacillus subtilis em meio líquido.

Figura 26 - Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de 84 microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras de extratos de diferentes regiôes de pele de Bufo schneideri contra Staphylococus aureus em meio líquido.

xii

Figura 27 - Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de 85 microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras obtidas da secreção da pele de Bufo schneideri contra Enterobacter aerogenes em meio líquido.

Figura 28 - Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de 86 microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras obtidas da secreção da pele de Bufo schneideri contra Escherichia coli em meio líquido.

Figura 29 - Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de 87 microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras obtidas da secreção da pele de Bufo. schneideri contra Bacillus subtilis em meio líquido.

Figura 30 - Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de 88 microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras obtidas da secreção da pele de Bufo schneideri contra Staphylococcus aureus em meio líquido.

Figura 31 - Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de 90 microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras peptídicas 5, 6 e 7 obtidas de Leptodactylus pentadactylus contra Bacillus subtilis.

Figura 32 - Análise dos dados da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da 91 placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras peptídicas obtidas de Leptodactylus pentadactylus pelo modelo de Gompertz contra Bacillus subtilis.

Figura 33 - Análise dos dados da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da 92 placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras peptídicas obtidas de Leptodactylus pentadactylus pelo modelo de Equação de Regressão Não Linear contra Bacillus subtilis.

Figura 34 - Representação gráfica do resultado do Teste de Comparação Múltipla de 93 Tukey da influência das amostras peptídicas de Leptodactylus pentadactylus no início do crescimento (START) do Bacillus subtilis.

Figura 35 - Representação gráfica do resultado do Teste de Comparação Múltipla de 94 Tukey da influência das amostras peptídicas na inclinação (K) para análise da cinética de crescimento de Bacillus subtilis

Figura 36 - Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de 95 microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras peptídicas 5, 6 e 7 obtidas de Leptodactylus. pentadactylus contra Klebsiella pneumoniae.

Figura 37 - Análise dos dados da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da 96 placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras peptídicas obtidas de Leptodactylus pentadactylus pelo modelo de Gompertz contra Klebsiella pneumoniae. xiii

Figura 38 - Análise dos dados da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da 97 placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras peptídicas obtidas de Leptodactylus. pentadactylus pelo modelo de Equação de Regressão Não Linear contra Klebsiella pneumoniae.

Figura 39 - Representação gráfica do resultado do Teste de Comparação Múltipla de 98 Tukey da influência das amostras peptídicas de Leptodactylus pentadactylus no início do crescimento (START) de Klebsiella pneumoniae.

Figura 40 - Representação gráfica do resultado do Teste de Comparação Múltipla de 99 Tukey da influência das amostras peptídicas de Leptodactylus pentadactylus na inclinação (K) para análise da cinética de crescimento de Klebsiella pneumoniae.

Figura 41 - Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de 100 microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras peptídicas 5, 6 e 7 obtidas de Leptodactylus pentadactylus contra Staphyloccoccus aureus.

Figura 42 - Análise dos dados da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da 101 placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras peptídicas obtidas de Leptodactylus pentadactylus pelo modelo de Gompertz contra Staphylococcus aureus.

Figura 43 - Análise dos dados da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da 103 placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras peptídicas obtidas de Leptodactylus pentadactylus pelo modelo de Equação de Regressão Não Linear contra Staphylococcus aureus.

Figura 44 - Representação gráfica do resultado do Teste de Comparação Múltipla de 104 Tukey da influência das amostras peptídicas de Leptodactylus pentadactylus no início do crescimento (START) de Staphyloccoccus aureus.

Figura 45 - Representação gráfica do resultado do Teste de Comparação Múltipla de 105 Tukey da influência das amostras peptídicas na inclinação (K) para análise da cinética de crescimento de Staphyloccoccus aureus.

Figura 46 - Valores de absorbância a 492 nm com 6 horas de cultivo de Pseudomonas 109 aeruginosa obtidas com os picos 8, 10 e 11 da cromatografia em coluna de Sephacryl S-400 de Leptodactylus pentadactylus, com e sem desnaturação pelo calor

Figura 47 - Valores de absorbância a 492 nm com 12 horas de cultivo de Pseudomonas 110 aeruginosa obtidas com os picos 8, 10 e 11 da cromatografia em coluna de Sephacryl S-400 de Leptodactylus pentadactylus, com e sem desnaturação pelo calor.

Figura 48 - Valores de absorbância a 492 nm com 24 horas de cultivo de Pseudomonas aeruginosa obtidas com os picos 8, 10 e 11 da cromatografia em coluna de Sephacryl S-400 de Leptodactylus pentadactylus, com e sem desnaturação pelo calor.

xiv

Figura 49 - Curva de crescimento bacteriano estimada pela variação de densidade óptica 111 a 492 nm segundo as equações de Gompertz para Pseudomonas aeruginosa submetidas à várias condições de tratamento com amostras obtidas na coluna Sephacryl S 400 da secreção de Leptodactylus pentadactylus.

Figura 50 - Análise dos dados da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da 112 placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras peptídicas obtidas de L. pentadactylus pelo modelo de Equação de Regressão Não Linear contra Pseudomonas aeruginosa.

Figura 51 - Valores de absorbância a 492 nm com 6, 12 e 24 horas de cultivo de 114 Salmonella choleraesus choleraesus var typhi obtidas com os picos 8, 10 e 11 da cromatografia em coluna de Sephacryl S-400 de L. pentadactylus, com e sem desnaturação pelo calor.

Figura 52 - Curva de crescimento bacteriano estimada pela variação de densidade óptica 115 (492 nm) segundo as equações de Gompertz, para Salmonella choleraesus choleraesus var typhi, submetidas à várias condições de tratamento com, substratos extraídos de L. pentadactylus.

Figura 53 - Análise dos dados da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da 117 placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras peptídicas obtidas de L. pentadactylus pelo modelo de Equação de Regressão Não Linear contra Salmonella choleraesus choleraesus var typhi

RESUMO

ESTUDO SOBRE A ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE SUBSTÂNCIAS EXTRAÍDAS E PURIFICADAS DE SECREÇÕES DA PELE DE ANFÍBIOS. Carlos Iberê Alves Freitas. Tese de Doutoramento – Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, 2003. Orientador: Prof. Dr. Krishnamurti Morais Carvalho. Curso de Pós-graduação em Farmacologia, do Dept. de Fisiologia e Farmacologia.

A emergência de mocroorganismos resistente a multidrogas, tais como Staphylococcus aureus as resistentes a meticilina, Enterococcus resistente a vancomicina, e Mycobacterium tuberculosis resistente a drogas, tem incitado esforçospara desenvolver e pesquisar novas classes de antibióticos que possam ter utilidade clínica. Nos últimos anos, uma variedade de antibióticos de baixo peso molecular têm sido isolados de diversas espécies animais. Estes agentes incluem peptídeos, lipídios, e alcalóides, exibem atividade antibiótica contra micróbios do meio ambiente e considera-se que desempenhem um papel na imunidade inata. Compostos com largo espectro de atividade antimicrobiana que são sintetizados pelas glândulas granulares presentes na pele de anuras (rãs e sapos) têm recebido uma crescente atenção como agentes terapêuticos em potencial. Nós relatamos aqui a descoberta de um antibiótico esteroidal de atividade de largo espectro, bufadienolídeos, chamados hellebrigenin, telocinobufagin, marinobufagin e bufalin de Bufo schneideri, um sapo Brasileiro, com atividade inibitória diferenciada contra sete microorganismos e nenhuma atividade contra Pseudomonas aeruginosa. A secreção da pele do sapo foi obtida porcompressão manual das glândulas paracnemis e tibial. Tr~e peptídeos com estruta possivelmente relacionada com uma potente atividade inibitória para bactéria gram positiva, Staphylococcus aureus e uma potente proteína com forte atividade antimicrobiana contra Pseudomonas aeruginosa (MIC = 9,64 μg/ml) foi isolada com secreções da pele de Leptodactylus pentadactylus estimuladas por adrenalina obtidas por injeção subcutânea de 500 μl (100 μg/ml) e caracterizada. Os bufadienolídeos foram obtidos com separação em CLAE de fase reversa sendo executado utilizando-se uma coluna C-18 (15 μm, 100 Ao, Shim-pack PREP 250 mm x 25 mm) com um gradiente de 0-40 % de acetonitrila/água e 0,05 % de ácido trifluoroacético. Análise de NMR de alta resolução das amostras purificadas por aplicação de seqüência de pulsos modernos tais como 1H, 1H-COSY e NOESY, e determinação da correlação 1 13 heteronuclear dos carbono-hidrogênio ligados diretamente H, C-COSY (HETCOR) e via detecção do hidrogênio inversa (HMQC), bem como o seqüenciamento a longa distância, COLOC e HMBC, permitindo assim sua identificação como um esteróide do tipo bufodienolídeo. A proteína de L. pentadactylus foi purificada por cromatografia em Sephacryl S-400 (460 mm x 6 mm) eluída com um tampão (Tris – HCl 0,05 N) e sua pureza foi avaliada poreletroforese em condições desnayurantes e não desnaturantes.A proteína total foi determinada pelo método de Bradford usando albumina soro bovina como padrão. O isolamento dos peptídeos foi efetuado usando-se o exsudato liofilizado e redissolvendo em água bidestilada/TFA 0,05 % (20:1; P:V) e corrido numa coluna C18 de fase reversa em CLAE (15 μm, 100 Ao, Shim-pack PREP 250 mm x 25 mm) eluída com um gradiente linear de 5 - 80% em 103 min num fluxo de 5 ml/min com acetonitrila/água e ácido trifluoroacético 0.05 %. A atividade antimicrobiana de todas as amostras foi monitorada pelos métodos de Bauer – Kirby e placa de microdiluição padrãousando Escherichia coli ATCC 25922, Enterobacter aerogenes ATCC 1304, Klebsiella pneumoniae ATCC 10031, Salmonella choleraesus choleraesus var typhi ATCC 6534, Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 6538 P e Pseudomonas aeruginosa HUWC 1. No primeiro método, cada placa com agar Müeller –Hinton após promover incubação por 24 h a 35 °C. As zonas claras na superfície do agar foram tomadas como indicativoda xvi

atividade antibacteriana. O diâmetro destas foram mensuradas e a atividade foi expressa em área das zonas claras (mm2). As incubações com os microorganismos foram feitas em caldo de B.H.I. por diferentes tempos até 24 h a 35°C e estimada a influência da desnaturação na atividade das amostras protéicas. Após incubação, na absorbância de 492 nm cada poço foi determinado usando-se um Detector Shimadzu UV – VS modelo SPD - 10A VP. A mínima concentração inibitória (MICs) se possível foi determinada pelo método da microdiluição padrão. Todos os procedimentos foram executados de acordo com os manuais de instrução do Comitê National de Padronização para Laboratórios Clínicos (Wayne, PA, USA). A hemólise induzida por amostras foi determinada por incubação de uma suspensão 5% (v/v) de hemácias humanas dos tipos antigênicos A e O, rato e caprinos em tampão fosfato - salina com quantidades apropriadas das amostras a 37 ºC até 24 h. O sobrenadante foi mensurado em densidade optical a 541 nm. Esta foi comparada a uma suspensão tratada com detergente a 0,1 % com agitação enérgica e definido o % de hemólise. Todos os compostos manifestaram moderado ou nenhuma atividade hemolítica. A proteína de L. pentadactylus -4 -2 -1 -2 apresentou uma concentração hemolítica mínima de 2,09 x 10 , 1,34x10 , 1,07x10 e 1,34x10 μg para rato, caprino, tipos antigênicos humanos A e O humanos respectivamente. Sob refrigeração estes valores decrescem. Para analisar interrelação entre a assimetria e mecanismos, estimativa de parâmetros cinéticos foram obtidos pelos modelos matemáticos de equações de Gompertz e regressão não linear, ANOVA e teste de comparação múltipla de Tukey.

Palavras-chave: Antimicrobianos, anfíbios, purificação, metabolismo bacteriano. xvii

ABSTRACT

STUDIE OF ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF EXTRACTED SUBSTANCES OF AMPHIBIANS PURIFIED SKIN SECRETIONS. Carlos Iberê Alves Freitas. Tese de Doutoramento – Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, 2003. Orientador: Prof. Dr. Krishnamurti Morais Carvalho. Curso de Pós-graduação em Farmacologia, do Dept. de Fisiologia e Farmacologia.

The emergence of multidrug-resistant microorganisms, such as methicillin-resistant Staphylococcus aureus, vancomycin-resistant Enterococcus, and drug-resistant Mycobacterium tuberculosis, has prompted efforts to develop and search for new classes of antibiotics that may have clinical utility. In recent years, a variety of low molecular weight antibiotics have been isolated from diverse animal species. These agents include peptides, lipids, and alkaloids, exhibit antibiotic acivity against environmental microbes and are thought to play a role in innate immunity. Compounds with a broad spectrum of antimicrobial activity that are synthesized in granular glands present the skin of anurans (frogs and toads) have received increasing attention as potential therapeutic agents. We report a here the discovery of a broad – spectrum steroidal antibiotic activity, bufadienolides, called hellebrigenin, telocinobufagin, marinobufagin and bufalin of Bufo schneideri, a Brazilian toad, with differential growth-inhibitory activity against seven microorganisms and neither activity against Pseudomonas aeruginosa. Toad skin secretion was obtained by manual compression of the paracnemis and tibial glands. Three possible structurally related peptides with potent growth-inhibitory activity towards Gram-positive bacterium, Staphylococcus aureus and a potent novel antimicrobial protein with strong activity against Pseudomonas aeruginosa (MIC = 9,64 μg/ml) was isolated from the adrenaline stimulated Leptodactylus pentadactylus skin secretions obtained by a subcutaneous injection of 500μl (100μg/ml) and characterized. Bufadienolides was obtained with HPLC reversed-phase separation was achieved using a C-18 column (15 μm, 100 Ao, Shim-pack PREP 250 mm x 25 mm) with a gradient of 0 - 40 % acetonitrile/aqueous and 0.05 % trifluoroacetic acid. High resolution NMR 1 1 analysis of the purified samples by application of modern pulse sequencies such as H, H-COSY and 1 13 NOESY, H, C-COSY (HETCOR) and hydrogen-detected inverse (HMQC) heteronuclear correlation of directly attached carbon-hydrogen, as well as the long- range equivalent sequencies, COLOC and HMBC, allowed its identification as a steroid of the bufodienolide type. The protein of L. pentadactylus was purified by Sephacryl S-400 chromatography (460 mm x 6 mm) eluted with a buffer (0,05 N Tris – HCl) and its purity was evaluated by denaturing and non-denaturing gel eletrophoresis. Total protein was determined by the method of Bradford using bovine serum albumin as standard. Peptides isolation was perfomed using lyophilized exsudate and redissolved in bidestilled water/TFA 0,05 % (20:1; W:V) and run on a C18 reversed-phase HPLC column (15 μm, 100 Ao, Shim-pack PREP 250 mm x 25 mm) eluted with a linear gradient of 5-80% in 103 min at a flow rate of 5 ml/min with acetonitrile/aqueous and 0.05 % trifluoroacetic acid. Antimicrobial activity of the all samples was monitored by Bauer – Kirby and Standard microdilution plate methods using Escherichia coli ATCC 25922, Enterobacter aerogenes ATCC 1304, Klebsiella pneumoniae ATCC 10031, Salmonella choleraesus choleraesus var typhi ATCC 6534, Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 6538 P and Pseudomonas aeruginosa HUWC 1. In first method each plate with Müeller –Hinton agar before further incubation for 24 h at 35 °C. Clear zones in the agar underlays were taken as indicating antibacterial activity. The diameter of these were measured and activity was expressed as clear zone area (mm2). Incubations with microorganisms were carried out in B.H.I. broth for different time until 24 h at 35°C and was estimated the influence of desnaturation in activity for proteic samples. After incubation, the absorbance at 492 nm of each well was determined xviii

using a UV – VS Detector Shimadzu model SPD- 10A VP. Minimal inhibitory concentrations (MICs) if possible were determined by a standard microdilution method. All procedures were performed according to the guidelines of the National Committee for Clinical Laboratory Standards (Wayne, PA, USA). Hemolysis induced by samples was determined by incubating a 5% (v/v) suspension of human A and O antigenic type, rat and goat red blood cells (RBC) in phosphate- bufered saline with the appropriate amount of samples at 37 ºC until 24 h. The supernatant was measured in the optical density at 541 nm. The relative optical density compared to that of the suspension treated with 0.1% detergent with energetic agitation defined % hemolysis. All compound manifest moderate or no hemolytic activity. Protein of L. pentadactylus showed a minimal hemolytic -4 -2 -1 -2 concentration of the 2,09 x 10 , 1,34x10 , 1,07x10 and 1,34x10 μg for rat, goat, A and O human antigenic types respectivily. At refrigeration this values is decrease. To analyze the relationship between asymmetry and mechanisms, estimation of cinetic parameter was obtained from the Gompertz and non linear regression equation mathematical models, ANOVA and Tukey’s multiple comparison test.

Keywords: Antimicrobial, amphibians, purification, bacterial metabolism. xix

JUSTIFICATIVA

As doenças infecciosas estão entre as principais causas de morte da população humana. Esse fato é devido, em grande parte, ao surgimento de microorganismos multi-resistentes aos antibióticos, destacando-se as infecções estafilocóccicas e por gram negativos, sendo que os danos causados por microrganismos resistentes não atingem somente a saúde humana, causam queda de produção e morte de animais, assim como grande quebras de safra na agricultura. Portanto, apesar da disponibilidade de um grande número de antibióticos de última geração, torna-se ainda fundamental buscar compostos que possam atuar como novas drogas a serem utilizadas no combate as doenças infecciosas (POPKIROV & FITSCHEV, 1980; BOMAN, 1995; CUDIC et al., 2002). O surgimento do grande número atual de cepas bacterianas resistentes pode ter várias origens, sendo uma delas decorrente do próprio tipo de vida do ser humano. O principal fator é, sem dúvida, o consumo excessivo e inapropriado dos antibióticos por homens, outros animais e na agricultura. A prescrição do antibiótico é geralmente empírica e sem a identificação prévia do agente patogênico através de exames laboratoriais. Além disso, a sua venda sem exigência de uma prescrição médica em alguns países, associada ao suprimento irregular desse medicamento, à baixa qualidade da medicação e ao seu mau uso pelos pacientes que muitas vezes não completam o tratamento, contribuem para a seleção de novos microorganismos multi-resistentes. Associada a isso, uma grande quantidade de agentes antimicrobianos vem sendo usado na agropecuária para promover o crescimento de plantas e animais, o que ocasiona um aumento da resistência de microorganismos que são transmitidos para o homem. Ao mesmo tempo, o aumento da migração da população e o transporte de animais ou de produtos de origem animal trazem doenças para áreas onde nunca haviam se instalado, resultando no espalhamento de microorganismos resistentes aos antibióticos. Mudanças ambientais, tais como desmatamento e alterações climáticas também proporcionam contato mais íntimo dos homens com animais e insetos que transmitem doenças muitas vezes desconhecidas, além de ameaçarem plantas e animais que poderiam vir a ser novas fontes em potencial de antibióticos e outros fármacos (LOHNER & STAUDEGGER, 2001; BOYCE, 2001; FDA - CVM, 1999). Assim sendo, várias medidas sócio – político - econômicas deveriam ser tomadas para a contenção do desenvolvimento e de transmissão de resistência antimicrobiana. Redução do uso inapropriado e excessivo dos antibióticos no tratamento de doenças em geral, tanto humanas quanto de animais domésticos e da própria agricultura, poderia ser uma dessas medidas (CUNHA, 1998). Paralelamente, para que se consiga um efetivo controle das doenças infecciosas, tornou-se vital investir em pesquisa e em xx

pesquisadores que possam se dedicar à busca de substâncias naturais ou sintéticas que exibam atividades antimicrobianas específicas e, acima de tudo, que as exerçam através de mecanismos de ação alternativos daqueles dos antibióticos disponíveis (LEVY, 1998). Neste último aspecto temos que a conservação dos recursos genéticos do planeta, bem como sua exploração sustentável é tão importante que em vários países do mundo estão sendo criados programas de bioprospecção (SEIDL, 2002), integrando universidades, institutos de pesquisas, museus e a indústria farmacêutica, para descobrir e desenvolver novos fármacos, este trabalho desenvolvido assim como outros no Laboratório de Neurofarmacologia da UECE se integram a esta nova visão. Nesse contexto, a pesquisa, a purificação, e a caracterização química, biológica e estrutural de novas substâncias antimicrobianas provenientes da fauna e da flora brasileira são valiosas, uma vez que a própria evolução tratou de selecionar um vastíssimo espectro de substâncias eficientes que defendem contra infecções. A importância é tão grande que em termos de atividade biológica dos metabólitos pesquisados em universidades e centros de pesquisa os antibióticos representam 58%, antitumorais 10% e antifúngicos 5%. Os maiores conglomerados farmacêuticos, as multinacionais, parecem sofrer de uma "verdadeira febre de procura" por novos compostos moldados pela natureza durante milhões de anos de evolução, visto que este "laboratório" decididamente já testou bilhões de possibilidades para cada caso, e nos apresenta um verdadeiro tesouro pronto para ser explorado. A área de produção de moléculas bioativas com atividade farmacológica é uma das mais exploradas em Biotecnologia, envolvendo principalmente empresas de países industrializados, sendo que analisando diferentes metabólitos, quanto a sua atividade biológica, pesquisados nestas empresas, temos que os antibióticos constituem 26%, antitumorais 24% e antifúngicos 3%(FAT - Base de Dados Tropical, 1999), contudo isto deve ser feito de maneira coerente, pois muitos destes ecossistemas apresentam um equilíbrio frágil (TULP & BOHLIN, 2002). Os vertebrados, mais precisamente os anfíbios da ordem Anura, representam um verdadeiro laboratório de bioquímica, tendo em vista o arsenal de toxinas que fabricam. Atualmente, peptídeos antimicrobianos de origem animal estão sendo utilizados como modelos para o desenho de novas drogas com aplicação nas áreas agrícola e de saúde. Para tanto, seqüências anfifílicas de peptídeos vêm sendo desenhadas, sintetizadas e testadas in vitro, a fim de permitirem a obtenção de genes com potencial de resistência a fitopatógenos, bem como compostos ativos para a fabricação de drogas de xxi

amplo espectro e de múltipla aplicabilidade (BOMAN, 1995; BARRA et al., 1998, FLEURY et al., 1998; PRATES & BLOCH JÚNIOR, 2000). No Laboratório tem se procurado desenvolver trabalhos com a fauna encontrada na região Nordeste, além de contribuir para a valorização também de idéias conservacionistas, haja visto que existem várias espécies de anfíbios caminhando para a extinção quer por destruição de seus habitats, contaminação com poluentes ou mesmo por não ser um animal que na maioria das pessoas inspire simpatia. Mais de 210 peptídeos antimicrobianos de anfíbios já foram isolados, tendo como principal característica a natureza catiônica e a capacidade de permeabilizar membranas de microrganismos. Podem ser agrupados segundo sua estrutura primária e muitos são encontrados em indivíduos do mesmo gênero e até mesmo em indivíduos de gêneros distintos, pertencentes à mesma subfamília ou não. Mas não basta obter novos compostos com ação antimicrobiana e sim também buscar especificidade e novos mecanismos de ação. Atento a isto, nos trabalhos efetuados buscou-se substâncias que tivessem ação contra bactérias de importância em termos de resistência, sendo encontrado atividade intensa e de grande especificidade contra duas das espécies bactérias que foram, segundo Hooper (2001) foram as primeiras nas quais devenvolveram através de mutações simples alterações suficientes para causar causar níveis clínicos consideráveis de perigo, sendo elas a Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa, e em menor intensidade para Escherichia coli, um exemplo de uma bactéria que só com múltiplas mutações desenvolveram resistência. xxii

LISTA DE ABREVIATURAS

ATCC - American Type Cell Culture

B.H.I - Brain heart infusion (Infusão de cérebro e coração)

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

CHM Concentração hemolisante mínima COLOC Correlation Spectroscopy via Long-range Coupling (Correlação heteronuclear a longa distância de detecção normal)

1H, 1H-COSY Carbon Detected, Hydrogen– Hydrogen-1 Chemical Shift Correlated Spectroscopy

1H, 13C-COSY Carbon Detected, Hydrogen–Carbon-13 Chemical Shift Correlated Spectroscopy

HETCOR Heteronuclear Chemical Shift Correlation Spectroscopy (Correlação heteronuclear de detecção normal)

HMBC 1H- Detected Heteronuclear Multiple – Bond Correlated Spectroscopy

HMQC 1H- Detected Heteronuclear Multiple – Quantum Coherence

MIC Minimal Inhibition Concentration (Mínima concentração inibitória)

RMN Ressonância Magnética Nuclear

NO Óxido nítrico

NOESY Nuclear Overhauser Enhancement and Exchange Spectroscopy

SDS - Sulfato dodecil de sódio

TFA - Ácido trifluoroacético

1. INTRODUÇÃO

1.1. Um Breve Histórico das Drogas Antimicrobianas e a Resistência Bacteriana

As doenças infecciosas estão entre as principais causas de morte da população humana. Esse fato é devido, em grande parte, ao surgimento de microorganismos multi-resistentes aos antibióticos. Mesmo tendo a disponibilidade de um grande número de antibióticos de última geração, torna-se ainda fundamental buscar compostos que possam atuar como novas drogas a serem utilizadas no combate as doenças infecciosas (BOMAN, 1995; CUDIC et al., 2002) No começo da década de 40, antes do advento da penicilina como substância pura e produzida em larga escala, as doenças infecciosas de origem bacteriana se apresentavam com índices de mortalidade quase absolutos, tal como ocorria com a endocardite bacteriana, a febre tifóide e a própria pneumonia comunitária. Com os antibióticos, a evolução e o prognóstico dessas infecções reduziram-se a níveis dramáticos, suscitando a falsa impressão de que o universo bacteriano estaria fadado ao extermínio (COLLINS & LINE, 1976). Nestes anos que se seguiram, a cada passo temos sido testemunhas de uma batalha incessante, tendo de um lado o extraordinário desempenho biológico desses seres microscópicos, que com enorme plasticidade genética, vêm desenvolvendo mecanismos sofisticados de resistência que anulam os efeitos dos antibióticos e do outro, o empenho continuado dos pesquisadores e da indústria farmacêutica na busca de novas drogas que permitam-nos continuar à frente dos patógenos. Esta disputa praticamente se inicia na década de 60, quando começaram a ser relatados nos hospitais, graves surtos de infecções por estafilococos resistentes à penicilina, logo controlados com a descoberta da meticilina e oxacilina, beta - lactâmicos similares que resistiam à penicilinase elaborada pelo germe. Seguem-se como acontecimentos principais, as resistências do Haemophylus influenzae à ampicilina e dos bacilos gram-negativos às cefalosporinas de 1ª e 2ª gerações e aminoglicosídeos, principalmente gentamicina (HORODNICEANU et al., 1979, BANTAR et al., 1991). Para se contrapor a esta ameaça, surgem as cefalosporinas de 3ª geração, os carbapenemas e monobactâmicos, representados respectivamente pelo Imipenem, meropenem e aztreonam. A resposta defensiva das bactérias se faz logo em seguida, pela produção das chamadas beta- lactamases de espectro ampliado, elaboradas notadamente por Pseudomonas aeruginosa, Serratia, 2

Klebiella pneumoniae, Enterobacter, entre outros, e que passam a impedir a ação daqueles antibióticos (SANDERS et al., 1984,). A partir da década de 90 os gram positivos assumem o predomínio das infecções hospitalares, com o aumento da incidência dos Estafilococos resistentes a meticilina e oxocilina e o crescimento do Enterococo, um típico emergente resultante da pressão seletiva exercida principalmente pelas cefalosporinas de longa meia vida e excreção biliar, usadas de forma abusiva em nosso país. Essas resistências obrigam a uma maior utilização dos glicopeptídeos, notadamente a vancomicina, até então o último trunfo disponível. (AUSTIN et al., 1999). Um estudo realizado no Rio de Janeiro, entre 1997 e 1998, mostrou que nas amostras bacterianas de 206 crianças analisadas, 24% eram resistentes à penicilina e 52 %, à sulfa, um antibiótico usado com freqüência pelo Sistema Único de Saúde. Somando-se a esses acontecimentos, neste começo de novo século, estamos enfrentando problemas ainda mais graves, destacando-se a resistência do Streptococcus pneumoniae à penicilina e a outros beta-lactâmicos e macrolídeos, cepas de Mycobacterium tuberculosis resistentes às drogas disponíveis, Enterococos resistentes a vancomicina, estafilococos tolerantes à vancomicina e a emergência de agentes até então pouco considerados, como Acinetobacter baumanii e Stenotrophomanonas (Xanthomonas) maltophilia, multirresistentes. Ainda que se tenha reduzido a produção de novas drogas, cumpre destacar o lançamento das quinolonas de 3ª geração, levofloxacina, gatifloxacona e moxifloxacina, mais efetivas para gram-positivos, incluindo Streptococcus pneumoniae penicilino resistentes, Estafilococos meticilino sensíveis e igualmente para germes de infecções respiratórias como M. catarrhalis, H. influenzae, Chlamydia pneumoniae, Mycolasma e Legionella (ISENBERG et al., 1999, SCULLY, 1999, SAHM et al., 2000, McCAIG et al., 2003). É importante ressaltar que se deve aprender também como utilizar este arsenal de drogas antimicrobianas, pois segundo dados dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças, nos Estados Unidos, um país que tem controle sobre a venda de medicamentos, dos 150 milhões de receitas nos quais antimicrobianos são prescritos, pelo menos 50 milhões são desnecessários, sendo que na França temos 36 % dos antimicrobianos sendo indevidamente prescritos. Temos que o próprio homem um dos principais responsáveis pelo fenômeno da multi – resistência (TEMINE et al., 2003, GUILLEMOT et al., 1998). 3

Nesse contexto temos que a pesquisa, purificação, e a caracterizações química, biológica e estrutural de novas substâncias antimicrobianas provenientes da fauna e da flora brasileira são valiosas, pois a própria evolução tratou de selecionar um vasto espectro de substâncias eficientes que contra infecções.Nossa biodiversidade é tão grande que apesar de um desmatamento de 20.000 Km2 por ano na floresta Amazônica brasileira (INPE, 1998), foram encontradas 163 espécies diferentes de anfíbios em 28 inventários realizados no ano de 2002 (AZEVEDO – RAMOS & GALATTI, 2002)

1.2. Os Anfíbios

1.2.1. Considerações Gerais Os anfíbios têm um berço num cenário Devoniano, 300 a 250 milhões de anos, quando emergiram das águas vertebrados que tinham a capacidade devido a mudanças evolucionárias, de viver tanto na água como na terra e que dariam origem aos animais que encontramos hoje em dia, sendo que evidências fósseis sugerem uma múltipla origem para os anfíbios. Os anfíbios vivos ou Lissanfíbios podem ser definidos zoologicamente como animais que nas primeiras fases da vida respiram o ar dissolvido na água, mediante brânquias, e no estágio adulto o ar atmosférico. A classe Anfibia, quando definida de modo a incluir as linhagens recentes e os tetrapodes primitivos do paleozóico, representa um grupo parafilético correspondendo aos Tetrapoda exceto Aminiota. Entretanto, as linhagens modernas, classificados como pertencentes a uma destas três ordens descritas abaixo constituem um grupo monofilético fundamentado por várias características derivadas exclusivas (MICHL & KAISER, 1963, STORER et al., 1984, LAURENT, 1986; POUGH et. al. 2003). 1) Gymnophiona ou Apodos, anfíbios que são destituídos de membros, de aspecto vermiforme e podendo ou não apresentar escamas, a exemplo da cobra - cega ou cecílias. Dentre as 175 espécies conhecidas, sua maioria é de distribuição tropical (DUELLMAN & TRUEB, 1994); 2) Caudata ou Urodela, é distinguida dos outros anfíbios obviamente pela presença de uma cauda em todas as fases (larva, juvenil e adultos), e por ter um conjunto de membros em ângulos retos com o corpo e de tamanhos aproximadamente iguais (posteriores e anteriores), a exceção da família Sirenidae, a qual não apresentam membros posteriores. Salamandras são distinguidas das rãs e 4

cecílias também por numerosas características em seu esqueleto e musculatura (LARSON & DIMMICK, 1993). Estão divididos taxonomicamente em dez famílias baseadas na filogenia e características anatômicas, sendo que no Brasil só conhecida apenas uma espécie, Bolitoglossa altamazonica Cope 1874, uma salamandra, sendo que talvez um maior conhecimento da fauna amazônica venha a revelar a existência de mais salamandras, pois na vizinha Venezuela, na região limítrofe com o Brasil, se conhecem dois gêneros, Spelerpes e Bolitoglossa, com quatro espécies (LEITÃO, 1977).Isto nos abrem novas possibilidades e estimula-nos a pensar o quanto temos em nosso País por descobrir. 3) Anura ou Salientia, é constituída 28 famílias conhecidas e conta com mais de 4100 espécies conhecidas, apresentando corpo curto e troncudo, provido de quatro membros (mais longos os posteriores) adaptados à locomoção saltatória e reúnem: pererecas (tupi; originado de pere'reg, “ir aos saltos”) designação comum aos anfíbios anuros, arborícolas, de ventosas nos dedos, sobretudo os da família dos hilídeos; rãs e sapos (SOKOL, 1977, SEBBEN & SCHWARTZ, 1993). As inter-relações entre as três ordens de anfíbios vivos têm sido difícil de resolver, mesmo tendo sido efetuados além de estudos morfológicos, vários moleculares, tendo como a hipótese mais aceita, com uma segurança de 54 %, a da existência de uma inter-relação filogenética maior entre Caudata e Anura (hipótese batraquia) que a poucos anos tem sido alvo de contestação veemente (FELLER & HEDGES, 1998; ZARDOYA & MEYER, 2000). Com os estudos desenvolvidos nestas últimas décadas, é possível que em breve poderemos ter uma posição com relação a estes questionamentos de uma quimiotaxonomia. O Brasil é o país que apresenta o maior número de espécies de anfíbios, aproximadamente 517 espécies, das quais 61% são endêmicas (Núcleo de Informática Biomédica, 1997) o que pode ser ainda bem questionável. 5

1.2.2. Presença dos Anfíbios na Cultura do Homem Através da história, envenenamento por toxinas animais tem fascinado o homem, sendo que raramente é um fenômeno médico, muito mais por associação religiosa, simbolismo, trocadilhos e provocar divergências profissionais. As toxinas animais têm feito uma importante contribuição para o aumento do conhecimento na fisiologia humana e farmacologia, tanto pelo conhecimento dos mecanismos das mesmas ou pela sua utilização como ferramentas farmacológicas (KARALLIEDDE, 1995). Nem sempre ou em todos lugares sapos e rãs são sinais do mal. Para muitas culturas, são símbolos conectados a poderes divinos de fertilidade, regeneração, renovação e renascimento. No antigo Egito eles não eram conhecidos apenas como uma praga, mas como sinal de fertilidade e água, representada pela deusa Heket, sendo também representantes da esposa do deus Heqit, o qual regia a concepção e o nascimento. Na Mesoamérica pré -Colombiana, por muitas tribos era conhecido como Ceneotl, o patrono dos recém-nascidos e fertilidade. Também, rãs e sapos eram considerados espíritos da chuva e para os quais existiam vários rituais. Os primeiros Astecas chamavam o sapo de Tlaltecuhti, a deusa mãe terra, que governava o ciclo da vida, a morte e também o renascimento. Os antigos chineses que o sapo uma força predominantemente feminina - negativa, yin em oposição ao positivo - homem, yang. A lua, um símbolo yin, e para muitos contos chineses referem- se ao sapo cuja face é visível na lua cheia, ocasionalmente quando engole a esta causa eclipses. Rãs e sapos habitam o imaginário popular povoando fábulas, piadas e crendices. Em muitos contos e lendas chinesas, os sapos são ladinos e mágicos, um mestre em escapadas e encantamentos. Mas também é guardião também de segredos realmente poderosos do mundo, tais como o da imortalidade. Muitas lendas envolvem um sábio peregrino chamado Liu Hai e seus três lendários sapos de companhia Ch'an Chu que revelaram a este homem o segredo da vida eterna. Uma outra forma do poder dos sapos e rãs é o de que em muitas culturas e mitos participa química ou alquimicamente. Em muitos casos, estes mitos têm algum fundo de verdade, haja vista que algumas espécies contêm compostos tanto tóxicos como alucinógenos. Muitas tribos das Américas do Sul e Central usavam compostos de rãs e sapos como venenos e drogas alucinógenas para rituais de caça e religiosos (WADE & WEIL, 1994). 6

1.2.3. Distribuição Sua distribuição está atrelada à versatilidade destes animais devido a uma série de adaptações fisiológicas que permitem a sua sobrevivência em diferentes habitats, sob diversas condições. Os anfíbios são encontrados em todo mundo, exceto Groelândia e Antártida, apesar de existirem espécies a exemplo da Rana sylvatica que tem uma grande tolerância ao frio (MATUTTEb et al., 2000). Vivem principalmente na água ou em locais úmidos, nunca no mar, apesar de tolerarem ambientes de alta salinidade (J∅RGENSEN, 1997). Comuns em regiões temperadas úmidas e mais abundantes em florestas tropicais. Diversos anfíbios atingem o norte do círculo polar ártico, tolerando condições de congelamento. Um representante da família Bufonidae foi encontrado nos Andes a 4850 metros (COCHRAN, 1985). Os anfíbios vivem em áridos desertos, tais como o da Austrália e Sudoeste dos Estados Unidos, a exemplo de espécies como o B. alvarius que só é encontrado no deserto de Sonora (CLARKE, 1997; J∅RGENSEN, 1997). Características tais como aonde este animal vive influenciam na composição de substâncias secretadas pela pele quantitativamente e qualitativamente (CHRISTIAN & PARRY, 1997).

1.2.4. Características da Pele dos Anfíbios A pele dos vertebrados tem a mesma origem embrionária ectodermal que o cérebro, por isto, não é estranho encontrar substâncias na pele de anfíbios tais como peptídeos no trato gastrointestinal e cérebro de mamíferos ou mesmo destes (DEUCHAR, 1966, BARRA & SIMMACO, 1995), assim como encontramos semelhanças pelo menos em Xenopus laevis em células da mucosa gastroentérica com as granulosas da pele, morfológica e bioquimicamente, inclusive produzindo vários peptídeos em comum tais como as magaininas e a PGLa (peptídeo com amino-terminal glicina e carboxi- terminal leucinamida) (MOORE et al., 1992) Nos anfíbios, a pele tem para estes diversas funções vitais além de ser apenas uma estrutura de revestimento, desempenhando principalmente o transporte de água e solutos, fazendo a respiração, a regulação da temperatura corporal e defesa contra o ataque de microorganismos e 7

predadores. Em estudos anatômicos comparativos da pele de diversas espécies de anuras indicam que uma camada situada entre o stratum compactum e o stratum spongiosum o qual é acelular é composto de mucopolissacarídeos e cálcio, sendo ausente em espécies aquáticas, já nas terrestres é proeminente por desempenhar um importante papel no mecanismo de defesa contra a dessecação (ELKAN, 1968, DALY, 1995). Segundo Daly e colaboradores (1984) sugerem que o desenvolvimento evolucionário dos compostos de defesa de anfíbios deriva em duas categorias: (1) uma extensa variedade de compostos ativos que ocorrem naturalmente, tais como peptídeos ou aminas biogênicas que são elaborados em excessivas quantidades para uma função primariamente fisiológica e secundária de defesa e, (2) uma nova substância biologicamente ativa, freqüentemente com uma estrutura complexa e elaborada basicamente para uma função de defesa, a exemplo da batracotoxina, um alcalóide esteroidal extraordinariamente tóxico (TOKUYAMA & DALY, 1983, SULLIVAN et al., 2002). Na natureza certas cores da pele servem de alerta, a isto se dá o nome de aposematismo e ela ocorre quando a distinta aparência (coloração particular) funciona para advertir a inaproveitabilidade (não palatabilidade,toxicidade, ou habilidade em escapar a predação) a predadores. Isto é valido para vários anfíbios a exemplo da família Dendrobatidae, na qual Summers e Clough (2000) desenvolveram estudos tentando correlacionar a evolução da coloração e a toxicidade com análises das seqüências de DNA, estudos com programas de computador avaliando níveis de contraste de cada cor de vários espécimes em fotos com a vegetação, experimentos com camundongos e experimentos com predadores vertebrados e invertebrados. Curiosamente Lipps e Khan (2000) encontraram em estudos utilizando o método de ELISA que o veneno do sapo Bufo arenarum, uma espécie comum na região do Colorado, Estados Unidos, tem reatividade antigênica cruzada com veneno de Crotalus atrox, sendo que os autores não souberam explicar os resultados encontrados. A utilização de secreções de anfíbio como droga ilícita é ainda bem difundida. É descrito para o veneno de Bufo alvarius em humanos como classificação das dosagens de consumo o valor de 4 a 8 mg como o limiar inicial, leve (8 a 20 mg), comum (20 a 40 mg) e forte (40 a 80 mg). Sendo que podemos ver características da farmacologia da bufotenina e do 5-metoxi-N,N-dimetil triptamina (5-MeO-DMT) seus principais componentes psicoativos responsáveis pelos seus efeitos como droga (WADE & WEIL,1994, OTT, 2001). Podemos ver a seguir, na Tabela 1, alguns efeitos farmacológicos da bufotenina em humanos com as respectivas vias de aplicação. 8

Tabela 1 – Farmacologia da bufotenina em humanos (OTT, 2001).

VIA DOSAGEM (mg) EFEITOS Intravenoso 1 - 16 Alucinogênico1,4 Intravenoso 2,5 - 20 Não psicoativo1,4 Intravenoso 6,4 - 11,1 "Alucinações"2 Intravenoso 2 - 8 "Psicoticomimético"3 Intramuscular 10 - 12,5 "Alucinações"1 Intranasal <14,3 Não psicoativo5 Intranasal 6 - 10 Não psicoativo6 Intranasal 1 - 16 Não psicoativo3 Intranasal 40 - 100 Psicoativo1 Sublingual 50 Psicoativo1 Oral 100 Psicoativo1 Inalado (vapor) 2 - 8 Psicoativo1 Intraretal 50 Psicoativo7

1) Como sal de sulfato de creatinina (expresso como base). 2) Como 12-16 mg sal de oxalato (sal mono ou bi-oxalato, não especificado) 3) Como solução de oxalato de bufotenina (expresso como base; 2 e 4 mg, inativo i.v.). 4) Citando experimentos conduzidos por H.S. Isbell (pers. com. 4 Oct. 1956). 5) Como <40 mg de sal de sulfato de creatinina em solução em spray. 6) Base e sal de sulfato de creatinina (aparentemente expresso como base).

7) Com 10 mg sal dihidrato hidroclorídrico harmalina (30 mg não psicoativo). 9

Lacombe e colaboradores (2000) após estudos ultraestruturais e imunocitoquímicos descrevem três tipos de glândulas integumentares em representantes do gênero Phyllomedusa adultos responsáveis pelas secreções, lipídica, serosa e mucosa. As características glandulares bem como sua composição tem uma grande variação nas diferentes espécies de anfíbios, mas de uma maneira geral podemos descrever a participação principal de dois tipos de glândulas: a mucosa e a granulosa.

1.2.4.1. Glândulas Mucosas É a produção de exuberante secreção mucosa altamente hidrófila que garante a manutenção da umidade da superfície externa o que possibilita fundamentalmente a respiração cutânea que é uma característica dos anfíbios. Por ser viscosa, dificulta a preensão por predadores. Esta secreção facilita a muda de pele por estar entre as camadas córneas que se destacam e as camadas de epiderme subjacentes, possivelmente exercendo pressão sobre as mais externas.

1.2.4.2. Glândulas Granulosas É nos anfíbios uma derivação do epitélio que aparece primeiramente durante a metamorfose e que no Xenopus laevis foi encontrada uma participação em resposta aos hormônios da tireóide no desenvolvimento e expressão de componentes de sua secreção (REILLY et al., 1994). Embora a secreção mucosa colabore na defesa, a secreção das glândulas granulares é a principal responsável pela defesa passiva dos anfíbios. Esta freqüentemente é tóxica ou repelente e estão dispersas pelo corpo, sendo mais abundantes na cabeça, dorso e extremidades ou concentradas numa determinada região do animal a exemplo das glândulas parotóides encontradas em sapos do gênero Bufo e ainda, Litoria splendida e Salamandra salamandra (DUELMANN & TRUEB, 1986; WABNITZ et al., 1998). Apresenta aspecto viscoso, leitoso e ocorre através de secreção holócrina, normalmente após stress ou injúria. As glândulas granulosas são controladas por inervação simpática e seu conteúdo é secretado de 80 a 90% sob regulação neuronal, possivelmente neuropeptídeos liberados pela presença do predador (BEVINS & ZASLOFF, 1990; BARRA & SIMMACO, 1995, CASTILLO & ORCE, 1997). Após depleção, a glândula leva cerca de duas semanas em média para o conteúdo ser outra vez sintetizado. 10

1.2.5. Componentes da Secreção de Anfíbios – Visão geral A secreção produzida por anfíbios constitui num conjunto muito amplo e diversificada de substâncias, sendo que podem ser classificadas quanto a sua atividade em categorias de atividade biológicas diferentes a serem estudadas, pois ainda pouco se sabe a este respeito destas substâncias, bem como os mecanismos de ação das mesmas sobre outros sistemas biológicos vivos, haja vista que até o momento cerca de apenas 300 delas já foram isoladas e agrupadas, sendo que sua composição pode variar em na proporção de componentes em função da fase de vida do animal ou estímulos externos (BROWN et al., 1977, BEVINS & ZASLOFF, 1990, REILLY et al., 1994). O potencial destas substâncias bioativas pode ser ilustrado pela epibatidina, um alcalóide azabicicloheptano, que foi isolado de um veneno da pele de um sapo equatoriano chamado Epipedobates tricolor por Daly e colaboradores (1980) e teve sua estrutura elucidada 12 anos mais tarde (SPANDEa et al., 1992) e apresenta ação de analgesia 200 vezes mais potente que a morfina. Com o decorrer dos estudos determinou-se que a ação da epibatidina é via receptor neuronal nicotínico para acetilcolina, contudo, causava uma série de efeitos colaterais tais como paralisia, derrames e freqüentemente morte o que o teria descartado para o uso como um agente analgésico caso pesquisadores não a tivessem utilizado para molécula modelo para modificações por síntese e após testes com mais de 500 compostos achou-se um, o ABT 595, que tinha efeitos antinoceptivos iguais aos da morfina, entretanto sem causar dependência física, achando-se no momento ainda em testes na Europa para ser liberada para o uso em humanos (BADIO et al., 1997, BANNON et al., 1998, SHU, 1998, SPANG et al., 2000). O trabalho de Daly com a epibatidina também é de interesse por servir como um alerta, pois ao remover o espécime de estudo de seu habitat natural foi constatado que a substância alcalóide que Epipedobates tricolor produzia foi gradualmente diminuindo até não ser detectado mais na secreção deste anfíbio, o que sugere que a matéria-prima para esta substância era obtida da alimentação deste animal (DALY, 1998). Outra questão que deve ser mantida em foco é a variabilidade na composição da secreção da pele que pode ocorrer em função do sexo, idade ou outras diferenças fisiológicas que impõem muitas vezes flutuações sazonais. Como podemos observar no trabalho de Wabnitz e colaboradores (2000) com machos e fêmeas de um hilídeo australiano Litoria splendida no qual após três anos de estudos evidenciaram que no período reprodutivo no macho era encontrado um peptídeo que funcionava como feromônio, a splendiferina, em concentração dez vezes maior do que fora deste período; um segundo peptídeo antimicrobiano, a caerina 1.10, foi encontrada apenas no 11

macho e apresentou concentração constante durante o ano, sendo que existem outros peptídeos antimicrobianos que inclusive são mais potentes que este e estão presentes em ambos sexos. Ainda um terceiro encontrado nos dois sexos, a ceruleína que é um neuropetídeo, sofreu variação marcante durante o ano com o aparecimento de substâncias derivadas, uma cerulina dessulfatada e a Phe8 - ceruleína que aumentavam em quantidade diretamente em proporção ao decréscimo da cerulina por razões que os autores não souberam explicar, quanto a atividade destes compostos, haja vista que a cerulina é um vasodilatador potente, analgésico e hormônio, neste trabalho não foi avaliado. Outro trabalho com o mesmo animal procurou detectar a partir de quando era possível a detecção de peptídeos de defesa e observou que desde muito cedo com apenas dez dias da deposição dos ovos, ainda girinos, eram produzidos e continuavam ao longo da metamorfose, contudo não foram detectados nos ovos (WABNITZ et al., 1998). Existe uma seletividade quanto a resposta comportamental em função do predador em questão, o que foi objeto de estudo por Schmidt e colaboradores (2001) com girinos de Phyllomedusa tarsius, um anuro neotropical, i sto podendo possívelmente se refletir na composição de suas secreções. Muitos estudos têm sido direcionados as secreções da pele de anfibios da ordem anura (sapos, rãs e pererecas), com muitos poucos às salamandras e somente pouco mais de três estudos a investigação de bioatividade da cecílias. Dentre estes temos os trabalhos de Moodie (1978) que obeservou que as secreções da pele de uma cecília aquática, Typhlonectes compressicauda, era tóxica para um peixe Hoplias malabarius e o de Sawaya (1940) que demonstrou a cardiotoxicidade da secreção da peleda cecília Siphonops annulatus, mas não investigaram o seu mecanismo de ação. Um terceiro trabalho de Schwartz e colaboradores (1997).detectou atividade semelhante no coração, além de atividade hemolítica em Siphonops paulensis, gerando outro trabalho (SCHWARTZ et al., 1999) no qual o mesmo grupo encontrou indícios de que a atividade cardiotóxica era indireta e era atribuída ao fato de que a secreção da pele deste anfíbio ocasionava primeiramente uma atividade hemolítica que fazia com que aumentassem os níveis de potássio no meio. Farmacologicamente, os produtos bioativos atuam como irritantes locais, cardio, mio e neurotoxinas, agentes colinomiméticos, simpatomiméticos, alucinogênicos, anestésicos, hemolíticos, agentes citotóxicos e antimicrobianos (DALY & WITKOP, 1971; ROSEGHINI et al., 1988). 12

A classificação química dos produtos até então isolados da pele de anfíbios podem ser distribuída em 5 grupos: aminas biogênicas, peptídeos, proteínas proteolíticas, alcalóides e esteróides (HABERMEHL, 1969). Na tabela 2, podem ser observados estes grupos e alguns exemplos representantes dos mesmos.

Tabela 2 - Classificação química dos produtos até então isolados da pele de anfíbios e alguns exemplos.

CLASSE EXEMPLO

Alcalóides Como uma potente neurotoxina do Atelopus charquiensis, Chiriquitoxina (YANG & KAO, 1992, SEBBEN & SCHWARTZ, 1993). A pumiliotoxina-B, um alcalóide indolizinico da pele do Dendrobates pumilio, rã neotropical, afeta a anatomia e imunohistoquímica a reatividade e condutibilidade de fibras nervosas (TOKUYAMA et al., 1992, SPANDEa et

al., 1992, D’Este et al. 1999). Aminas biogênicas Destacam-se dos demais compostos encontrados na pele de anfíbios devido a sua ampla distribuição entre as diversas famílias de anuros. Ex: Leptodactilina - Leptodactylus ocellatus (CEI et al., 1967). Esteróides Substâncias de marcada atividade cardiotônica e cardiotóxica, Bufadienolídeos, isoladas de sapos do gênero Bufo (SHIMADA et al., 1985) Peptídeos Magaininas, possuindo 23 resíduos de aminoácidos, com poder antimicrobiano e cicatrizantedo Xenopus laevis (ZASLOFF, 1987). Proteínas Endopeptidase inativadora de hormônios peptídicos (CARVALHO et al., proteolíticas 1992, JORDIOU et al., 1993).

Eventualmente são relatados casos na literatura médica de pessoas que venham a ser intoxicadas por veneno de sapos no homem, sendo mais comum em cães. Devemos atentar para o fato de que estes anfíbioss não são capazes de inocular seu veneno voluntariamente, apesar de que a secreção pode ser lançada a uma certa distância quando as glândulas parotóideas são comprimidas ou como no caso de alguns hilídeos quando aprisionados, liberando secreção cutânea como uma forma de defesa contra predadores (POLUMBO et al., 1975, ROBERTS et al., 2000). Segundo Mignogna e colaboradores (1997), têm sido demonstrados há muito tempo já que a pele de anfíbios neotropicais e sul americano da subfamília Phyllomedusinae são uma das mais ricas fontes até então estudadas de peptídeos biologicamente ativos. Isto é confirmado facilmente, com mais de três dúzias de peptídeos isolados da pele destes animais e distribuindo-se por dez diferentes famílias: taquicininas, bradicininas, ceruleínas, bombesinas, sauvaginas, peptídeos opióides (dermorfinas e deltorfinas), peptídeos antimicrobianos (dermaseptinas e adenorregulinas), triptopfilinas, e um peptídeo NPY-like (MOR et al., 1994). Vários destes, tais como peptídeos opióides, sauvagina e as dermaseptinas, tem sido somente encontrados na pele destes hilídeos. Infelizmente, apesar de toda esta quantidade e variedade de substâncias, segundo Chen e colaboradores (2003), o estudo das secreções de anfíbios para a descoberta de novos peptídeos está com o tempo contado devido ao seu rápido declíneo global. Na tabela a seguir podemos ver para ilustrar a diversidade comentada mais acima, as principais classes de polipeptídeos da pele de anfíbios e algumas características de ação destas, bem como exemplos de onde podem ser encontradas. 14

Tabela 3 - Principais classes de polipeptídeos da pele de anfíbios e algumas características de ação biológica.

CLASSES CARACTERÍSTICAS Bombesinas Possuem um largo espectro de ações sobre a musculatura lisa vascular e extravascular. Inicialmente isolados da pele de anfíbios europeus do gênero Bombina, sendo que posteriormente foram isolados peptídeos análogos a partir de tecido cerebral e do trato gastrointestinal de mamíferos (NAGALLA et al., 1996). Bradicininas Além da bradicinina, reúne outros sete peptídeos, encontrados na sua maioria, em espécies da família Ranidae (ERSPAMER, 1984, ERSPAMER et al., 1986). Ceruleínas A ação destes ainda não está bem esclarecida, contudo sabe-se que reproduzem na musculatura lisa da bexiga urinária e do intestino e nas secreções exócrinas do pâncreas, estômago e fígado as ações do hormônio intestinal colecistocinina- pancreozimina, presente em mamíferos. Inicialmente isolada da pele de um hilídeo australiano, Litoria caerulea(BEVINS & ZASLOFF, 1990). Dermofinas Opióides que têm o mesmo espectro de ação das endorfinas (substâncias analgésicas endógenas) isolados da pele de algumas espécies de Phyllomedusa (NEGRI et al., 1992). Sauvaginas Possuem 40 resíduos de aminoácidos, tendo ação hipotensora moderada, agindo de forma complexa sobre a hipófise anterior, estimulando a liberação de hormônio adrenocorticotrópico (HACT) e de β-endorfinas. Primeiramente obtida da pele de Phyllomedusa sauvagei (DALY et al. 1992). Taquicininas Grupo composto por substâncias relacionadas com a substância P (polipeptídeo presente no trato gastrointestinal e no sistema nervoso de mamíferos). Estas substâncias agem intensamente sobre a musculatura lisa, vascular e extravascular, além do efeito estimulante sobre glândulas salivares e lacrimais. Como exemplo podendo-se destacar um dos mais potentes hipotensivos encontrados na natureza, o fisalemina, obtido da pele de várias espécies do gênero Physalaemus (SEVERINE et al., 2000). 15

1.2.6. Esteróides A presença de colesterol na secreção de glândulas granulosas na pele de anfíbios, segundo Croce e Bolognani (1975), tem sido descrita somente nos gêneros Bufo e Triturus. Estes autores atribuem como significado biológico e bioquímico do colesterol como estando relacionado com a biossíntese de glicosídeos cardíacos no veneno do gênero Bufo assim como esteróides não glicosídeos e ainda, componentes estruturais a exemplo dos fosfolipídios e sulfolipídios de membrana.

1.2.6.1. Bufadienolídeos Bufadienolídeos ou bufodienolídeos é definido como sendo esteróides cardiotóxicos C-24 juntamente com os cardienolídeos, ambos apresentando similaridade de ação biológica causando aumento da força contrátil do coração e um núcleo perhidrofenantreno na sua estrutura, diferindo por apresentarem no carbono C – 17 respectivamente um substituto pentadienolídeo e o outro um butenolídeo. A eficácia dessas substâncias já era conhecida pelos antigos egípcios que usavam “squill”, um bufodienolídeo contido em uma planta do gênero Scilla no tratamento de doenças do coração (KRENN & KOPP, 1988). Escilarena A, do grupo das escilareninas, um dos principais glicosídios dessa fonte, foi o primeiro bufodienolídeo que teve a sua estrutura elucidada em 1933 por Stoll e colaboradores. Nos anos seguintes, vários destes esteróides derivados de plantas ou de animais tiveram sua estrutura elucidada. Os bufadienolídeos de sapo ocorrem na forma conjugada e não conjugada, sendo os maiores bufadienolídeos de sapo são derivados de esteróides (STEYN & HEERDEN, 1998).

O 24 21 23 20 18 22 12 11 13 17 19 16 14 15 1 9 2 10 8 3 5 7 4 6 RO

Figura 1 - Esqueleto básico dos Bufadienolídeos 16

Ocorrência na Natureza Bufadienolídeos têm sido encontrados em plantas e em alguns animais, sendo neste último muito mais comum na família Bufonidae. Os venenos de sapos de diferentes espécies são usados para remédios na Ásia denominados Ch’an Su na China ou Senso no Japão que foram alvos de inúmeras investigações por pesquisadores, resultando no isolamento de vários bufadienolídeos e seus ésteres (KRENN & KOPP, 1988; KAMANO et al., 1998). Em 1922, Wieland e colaboradores separaram do veneno de um sapo japonês, Bufo vulgaris formosus Boulenger, a então chamada “bufotoxina” que posteriormente em 1949 teve sua estrutura designada bufotalina 14 – suberoil arginina éster (SHIMADAa et al., 1977). Nos besouros da família Lampyridae do gênero Photinus, sendo este o primeiro relato de isolamento de bufadienolídeos em artrópodes, investigações encontraram esteróides com o nome genérico de lucibufageninas que participam do mecanismo de defesa destes coleópteros conferindo- lhes gosto desagradável aos pássaros (EISNER et al. 1978; GOETZ et al., 1979). Do mesmo modo no gênero Bufo as bufotoxinas tornam os girinos pouco palatáveis e assim escapando de vários predadores aquáticos como, por exemplo, peixes (KIESECKER et al., 1996). Num representante da família Colubridae, Rhabdophis tigrinus, foram obtidas de material glandular material que resultou no isolamento e elucidação estrutural de várias geninas a exemplo da desacetilcinobufagina - 3 - O – hemissuccinato e bufotalina. Dimitrieva e colaboradores (2000) sugerem que um bufadienolídeo de mamífero endógeno pode estar envolvido na regulação da atividade Na+,K+- ATPase e a patogênese da hipertensão arterial sendo sintetizado do colesterol no córtex da adrenal por uma via metabólica que é independente da clivagem de cadeia lateral do colesterol.

1.3. Detecção de Atividade Antimicrobiana de Secreções Oriundas de Anfíbios – Visão geral

Uma pergunta que certamente se fizeram pesquisadores foi o por quê de anfíbios quando se feriam não apresentavam infecções em seus cortes. A despeito de habitar um ambiente aquático e terrestre potencialmente rico em patógenos tais como rios de fluxo lento, lagos, poças, água estagnada, oculto na copa das árvores e no solo de florestas, refugiado no subsolo embaixo de superfícies e em buracos de tocos de árvore rachados, locais particularmente convenientes a promoção do crescimento fúngico, anfíbios raramente sucumbiam a infecções fúngicas ou 17

bacterianas da pele, exceto nos casos de quebra da integridade das mesmas (DUELLMAN & TRUEB, 1994). Contrapondo em parte o que foi dito, Zasloff (1987) ao realizarem incisões na pele de Xenopus laevis, mantendo – os em água contaminada posteriormente, não observaram contaminação. A resposta a isto pode ser ilustrada com o trabalho de Bettin e Greven (1986) que mostraram que salamandras (Salamandra salamandra) quando privadas de suas secreções glandulares da pele morriam de variadas infecções a menos que mantida sob condições de esterilidade. Pavan em 1952 realizou testes com extratos brutos das glândulas granulares de Bufo viridis Laur., B. vulgaris Laur., Triton cristatus Laur. e Salamandra maculosa Laur., tendo detectado para os sapos uma fraca atividade apenas contra Proteus vulgaris e para a S. maculosa atividade para as 13 bactérias testadas. Já em Plethodon cinereus, um salamandra terrestre, foi encontrado em frações obtido em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) a partir de amostras de pele da cauda e glândula dermal atividade antibacteriana contra Staphylococcus aureus e atividade hemolítica em células de cobaio (FREDERICKS & DANKERT, 2000). Laib e colaboradores (2002) com secreções de Tylototriton verrucosus evidenciaram um largo espectro antimicrobiano, atividades proteolítica, inibidora de tripsina sendo que em contraste, nenhuma atividade hemolítica nem hemorrágica foi encontrada.

1.3.1. Bufadienolídeos com Atividade Antimicrobiana Kamano e colaboradores (1988) descreveram a inibição de uma série de Rhinovirus após testarem trinta e quatro bufadienolídeos e dois cardenolídeos relacionados isolados do Ch’an Su e da pele de Bufo formosus Boulenger, bem como por modificações químicas de compostos destes obtidos, sendo os 14 β - hidroxi bufadienolídeos em geral foram os que apresentaram uma mais forte atividade antiviral, contudo também eram os mais tóxicos do que os correspondentes 14 β, 15 β - epoxi bufadienolídeos. Squalamina, um antibiótico aminosterol isolado de um tubarão, Squalus acanthias, foi caracterizada sua potente atividade antimicrobiana contra fungos, bactérias e protozoários. Este esteróide catiônico solúvel em água é, portanto mais uma evidência do potencial destas substâncias (MOORE et al., 1993). 18

Outro trabalho que encontrou atividade antimicrobiana contra a bactéria Bacillus subtilis foi realizado com uma planta africana Bersama abyssinica por Taniguchi e Kubo (1993) e estes atribuem esta atividade possivelmente a bufadienolídeos.

1.3.1.1. Bufadienolídeos Antineoplásicos Kupchan e colaboradores (1969) isolaram e caracterizaram as Hellebrigenina 3 – acetato e 3,5 – diacetato da planta Bersama abysinica que inibiram significativamente in vitro uma cultura de células de carcinoma humano do nasofaríngeo e in vivo, apenas a primeira das duas contra carcinoma intramuscular de Walker 256 em ratos. Foi verificado que a bufalina, um bufadienolídeo que é um dos princípios ativos do Ch’an Su, induziu uma apoptose típica em células leucêmicas humanas U937 (WATABE et al., 1996). Nogawa e colaboradores (2001), obtiveram cinco novos bufadienolídeos, 3-beta-formil-oxi- resibufogenina, 19-oxobufalina, 19-oxodesacetilcinobufagina, 6-alfa-hidroxicinobufagina, e 1-beta- hidroxibufalina, juntamente com bufadienolídeos previamente conhecidos métodos espectroscópicos. Os bufadienolideos citados acima tiveram significante atividade inibitória contra as linhagens de células cancerosa KB e HL-60. Além disto, o primeiro bufadienolídeo citado apresentou-se ativo contra a linhagem MH-60.

1.3.1. Diversas Substâncias Antimicrobianas Isoladas de Anfíbios Não esteroidais A grande maioria dos antimicrobianos isolados até então são peptídeos, contudo existem outras substâncias que também possuem este efeito. A samandarona e a samandarina são alcalóides isolados de algumas espécies de anfíbios que inibem o crescimento de vários microorganismos. Já a espinacaemina, assim como a bufotenina, aminas biogênicas encontradas na pele de Leptodactylus pentadactylus e Bufo spp. respectivamente, atuam tanto sobre bactérias gram negativas como positivas e alguns fungos (HABERMEHL & PREUSSER, 1969, HABERMEHL & PREUSSER, 1970; PREUSSER et al., 1975). Os ácidos graxos miristoléico, linoléico e palmitoléico que são encontrados em secreções cutâneas do urodela Plethodon cinereus Green, teve efeitos sobre o Bacillus cereus (RICKRODE et al., 1986). Kamiya e colaboradores (1997) estudando o muco das salamandras gigante japonesa e chinesa, Megalobatrachus japonicus e Andrias davidanus respectivamente, caracterizou atividade de uma proteína do tipo lectínica inibida por N – acetil – D 19

– glicosamina, lactose, mucina tipo I, asialomucina tipo I que entre outras coisas apresentava ação antimicrobiana contra Bacillus subtilis.

1.3.3. Antimicrobianos Peptídicos Isolados de Anuras - Os mais estudados Desde de 1969, num dos trabalhos pioneiros de Csórdas & Michl para agora, foram isolados alguns grupos de peptídeos com propriedades anfifílicas que representam um grupo heterogêneo e em geral apresentam múltiplos modos de ação como: a) Antimicrobiano, hemolítico e citotóxico b) Liberador de histamina in vitro e atividade quimiotáxica, que facilita a atração de macrófagos (SALMON et al., 2001). c) Regulador de eventos fisiológicos in vivo ou modulador de um receptor específico (MOR et al., 1995, AMMAR et al., 1998).

Têm se isolado também de insetos, ou mesmo do veneno destes, peptídeos que apresentam seqüências com homologia ao de anfíbios e ação também antibiótica (FEHLBAUM et al., 1996). Os peptídeos antimicrobianos presentes nos vertebrados podem ser considerados como efetores ancestrais da imunidade e mais que meros remanescentes, conferem vantagens a estes animais e complementam os sistemas de defesa de seus organismos (NICOLAS & MOR, 1995).

1.3.3.1. Propriedades e Possíveis Mecanismos de Ação Estes peptídeos apresentam-se todos carregados positivamente e por isto chamados catiônicos, podendo formar hélices anfifílicas de comprimento variando de um peptídeo para outro, com a habilidade de se autopolimerizar formando longos filamentos com os grupamentos hidrofílicos para o interior e os hidrofóbicos em contato com as partes lipofílicas da membrana. Para formulação de um possível mecanismo de ação têm que se levar em conta uma série de trabalhos que apresentaram evidências para tal. Os estudos conformacionais revelaram que eram estruturas anfipáticas com potencial na forma de α-hélice. A confirmação da estrutura α-hélice veio posteriormente com o trabalho de Marion e colaboradores em 1988 com ressonância magnética nuclear. 20

As magaininas, peptídeos isolados de Xenopus laevis, foram usadas como modelos para a compreensão de como elas agiam por vários pesquisadores, sendo que Urrutia e colaboradores (1989) em estudos do comportamento da magainina 2 com abaixamento de pH em solução aquosa e aumento na concentração de íons, ocorria uma autopolimerização do peptídeo em longos filamentos, já a orientação em relação ao plano da bicamada lipídica depende da quantidade de peptídeo ligado a membrana (LUDTKE et al., 1996, BIGGIN & SANSOM, 1999). Utilizando também este mesmo peptídeo Duclohier e colaboradores (1989) demonstraram em membranas artificiais que ele forma um canal iônico composto de três a seis monômeros por canal e que transporta cloro meta – sulfato, reforçando estes dados temos que Cruciania e colaboradores (1992), ao incorporarem a membranas artificiais este peptídeo observavam um aumento de condutância na camada bilipídica. Trabalhos de espectroscopia - dicroismo circular revelaram a formação de α-hélice com vesículas de fosfatidilserina, mas não com vesículas de fosfatidilcolina atuam formando canais transmembrana helicoidais sugerindo que os constituintes de uma membrana poderiam influenciar a formação destes canais revelando uma especificidade (BECHINGER et al., 1998, SHAI, 1999). Fazendo-se a mensuração do potencial de membrana, estudos revelaram que a magainina 2 e a PGLA (Peptídeo que inicia em Glicina e termina em Leucina amida), sendo este segundo também um peptídeo isolado de Xenopus laevis, podem despolarizar rapidamente mitocôndrias e lipossomas por atuarem no seu citocromo oxidase decrescendo seu potencial, o que sugere que poderiam ser atacadas todas as membranas da célula (WESTERHOFFa et al., 1989, JURETIC et al., 1994), tendo sido confirmado em trabalhos com bactérias gram positivas e negativas posteriormente para as quais são necessários de 1 a 10 μg/ml , sendo que para uma célula de mamífero já é necessário 1 mg/ml (MATSUZAKI, 1997, MATSUZAKI, 1999). Em síntese temos que a porção amino-terminal do peptídeo positivamente carregado interage com os fragmentos lipídicos ácidos da membrana, induzindo a formação de α-hélice e polimerização. O complexo supramolecular em α-hélice liga-se superficialmente e paralelo a região hidrofóbica e começa a penetrar a membrana. a ligação deve ser transitória, e por fim a face não polar que tem afinidade com o solvente está numa posição energeticamente desfavorável a penetração da membrana continuará, causando simultânea dissipação do potencial de membrana desta e assimetria lipídica, a estrutura peptídica finalmente estará mantida firmemente no lugar pela porção folha beta a qual permanece na fase aquosa e o canal é formado. Permitindo entrada de cloro, efluxo de hidroxilas e potássio, desacoplamento respiratório da bactéria, despolarização da 21

membrana, resultando em morte desta a propriedade não-hemolítica pode estar ligada ao colesterol nas membranas das células nos zwitterions, haja vista que a fosfatidilcolina não induzem a formação de alfa hélices nestes peptídeos. Dos modelos sugeridos e mais aceitos para permeação de membrana temos primeiramente o modelo bastão cilíndrico no qual os peptídes primeiro acumulam na superfície da membrana, fazem a inserção no core lipídico da membrana, seguindo-se do recrutamento de monômeros adicionais para então formar um poro; já num segundo, denominado modelo carpete, os peptídeos estão ligados a superfície da membrana com suas superfícies hidrofóbicas voltadas para a membrana e suas hidrofílicas para o solvente, quando atinge uma concentração de monômeros peptídicos, a membrana é permeada e podem formar poros, sendo ainda que a carga tem influência sobre isto (SITARAM &, NAGARAJ, 1999, SHAI & OREN, 2001).

1.3.3.2. Famílias Conhecidas de Peptídeos Atualmente existem seis famílias de anuros nas quais já foram identificados peptídeos antimicrobianos. Os autores têm procurado agrupar os peptídeos antimicrobianos conforme sua homologia da seqüência de aminoácidos, similaridades das propriedades funcionais e conformacionais em 5 grupos, contudo existem muitas divergências e uma proposta satisfatória ainda não foi encontrada, sendo que a cada dia surgem propostas de novas famílias. Abaixo relacionamos os dados encontrados em extenso trabalho de revisão agrupando por famílias e gêneros. a) Discoglossidae Bombina variegata Foi designado como Bombinin – Peptides (BP), isolado de um sapo europeu (CSÓRDAS & MICHL, 1969), este peptídeo de 24 resíduos de aminoácido possuem atividade antibiótica e hemolítica, salientando uma ação bacteriostática contra Staphylococcus aureus. Em trabalhos de clonagem desta por Simmaco et al. (1991), obtiveram uma bombina de 27 resíduos e sem atividade hemolítica. 22

Bombina orientalis Os chamados Bombinins- Like Peptides, BLP 1 a 4, obtidos de um sapo asiático (GIBSON et al., 1991), com BLP1 e 2 apresentando 27 resíduos de aminoácido e BLP3 e 4 com 25 resíduos sendo que apesar da homologia com a bombina e ter atividade antibiótica também, não possuem uma apreciável atividade hemolítica. Outro grupo encontrado neste gênero foi encontrado por Mangoni e colaboradores (2000), as chamadas bombininas H (H de hidrofóbico e hemolítico), tendo ficado caracterizado que as bombininas são compostas de 25 a 27 resíduos de aminoácido e as bombininas H de 15 a 20, nos quais temos na posição dois da seqüência freqüentemente um D - aminoácido. Foi determinada por Miele e colaboradores (2000) a estrutura e a partir de uma seqüência gênica codificada um peptídeo denominado BLP-7.

Bombina maxima Foram isolados dois grupos de peptídeos antimicrobianos das secreções deste animal. O primeiro denominado maximinas 1, 2, 3, 4 e 5, estruturalmente relacionado aos bombinin-like peptides (BLPs), ocorrendo no entanto, varações na seqüência nas maximinas por toda a molécula. Foram detectadas além de uma potente atividade antimicrobiana, também citotóxica contra células tumorais e ação espermicida das maximinas, em destaque ainda temos que a maximina 3 possui uma significante atividade anti-HIV. Maximinas 1 e 3 foram tóxicas para camundongos com valores de DL50 de 8,2 e 4,3 mg/kg, respectivamente. Peptídeos de um segundo grupo, denominadas maximinas H1, H2, H3 e H4, tem homologia com peptídeos bombinina H. Estudos de seqüências de cDNA revelaram que um peptídeo maximina mais um maximina H derivaram de uma grande proteína comum (LAIc et al., 2002). Posteriomente, um novo clone de cDNA que codifica um precursor protéico de maximina 3 e um novo peptídeo foi isolado uma bibliotece de cDNA da pele de B. maxima, denominado maximina H5. Com Ile-Leu-Gly-Pro-Val-Leu-Gly-Leu-Val-Ser-Asp-Thr-Leu-Asp-Asp-Val-Leu-

Gly-Ile-Leu(NH2) como seqüência, chamando a atenção para três resíduos básicos de aspartato que lhe confere um caráter aniônico, diferentemente dos peptídeos maximina H catiônicos. Com relação a ação antimicrobiana esta só foi detectada somente para cepas da bactéria Gram-positiva

Staphylococcus aureus, apresentando-se ineficaz para outras bacérias e fungos testados. A presença de íons metálicos, tais como Zn+2 e Mg+2, não aumentaram a potência antimicrobiana. A maximina H5 representa o primeiro exemplo de peptídeo antimicrobiano aniônico de anfíbios, também 23

fornecendo a primeira evidência que estes aliados aos conhecidos peptídeos catiônicos juntos, possam tomar parte do sistema de defesa inatodestes animais (LAIa et al., 2002).

b) Pipidae Xenopus laevis Magaininas ou PGS 1 ou 2, Peptídeos que começam em Glicina e acabam em Serina, obtidas da pele de uma rã africana (ZASLOFF, 1987). PGLa, Peptídeo que começam em Glicina e acaba em Leucina amida (WILLIAMS et al., 1990). Moore e colaboradores (1991) encontraram em extratos de estômago desta espécie nove peptídeos antimicrobianos, sendo um inédito, de caráter básico denominado PGQ (Pro-Gly-Glu). Westerhoffb e colaboradores (1995), evidenciaram um sinergismo funcional das magaininas PGLa and magainina-2 na Escherichia coli, células tumorais e lipossomas. As magaininas atualmente podem ser encontradas comercialmente, sendo que a primeira tentativa de foi sob o nome de Cytolex®, um creme cicatrizante para úlceras diabéticas dos pés, bem como antibiótico oral, porém não foi aceito pelo FDA (Food and Drug Administration's - USA) nos seus protocolos finais. Já um novo derivado da magainina, o Locilex®, outro creme tópico com ação microbicida é, além da indicação da formulação anterior, também é empregada nas terapias contra o câncer, no tratamento de conjuntivites, acne, de doenças sexualmente transmissíveis, de micoses, além de serem drogas promissoras no tratamento da gripe (MAGAININ PHARMACEUTICALS INC., 2003).

Xenopus tropicalis Ali e colaboradores (2001) encontraram sete peptídeos (XT-1-XT-7) com atividade antimicrobiana da secreção da pele estimulando com a norepinefrina em X. tropicalis. Após caracterização estrutural destes peptídeos observou-se similaridade com a seqüência de aminoácidos de peptídeos antimicrobianos previamente isolados de Xenopus laevis foi baixa, sugerindo que estas espécies não têm uma grande relação de proximidade filogenética. Os peptídeos XT-5 e XT-3 são provavelmente ortólogos respectivamente do peptídeo glicina-leucina amida (PGL(a)) do X. laevis e da região N-terminal do espaçador da prolevitide. Os peptídeos XT-1, XT-6 e XT-7 mostram limitada similaridade estrutural à região do espaçador das proceruleínas de X. laevis e os parálogos 24

XT-2 e XT-4 são similares a regiões correspondentes da proxenopsina, já ortólogos das magaininas não foram identificados. A região C-terminal α-amidada do peptídeo XT-7 [Gly-Leu-Leu-Gly-Pro-

Leu-Leu-Lys-Ile-Ala-Ala-Lys-Val-Gly-Ser-Asn-Leu-Leu(NH2)] apresentou a mais baixa concentração mínima inibitória contra os microorganismos de referência (Staphylococcus aureus 5 μM, Escherichia coli 5 μM, e Candida albicans 40 μM), tendo se mostrado ativo contra isolados clínicos de S. aureus methicilina-resistante, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus grupo C, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa e Enterobacter cloacae. Este peptídeo foi contudo hemolítico contra eritrócitos humanos (50% de lise a 70 μM). Estudos de dicroísmo circular mostraram que XT-7 tem uma estrutura randõnica em pH 7,0 no meio aquoso, mas adota uma conformação de α hélice em presença de 50% de trifluoroetanol. Ao decrescer a cationicidade de XT-7 tanto por substituição do grupo C-terminal CONH2 por COOH ou por deleção do resíduo de Lisina(8) produz análogos com mais de 10 vezes em decréscimo da potência antimicrobiana.

c) Hylidae c.1. Phyllomedusinae Phyllomedusa sauvagii As Dermaseptinas (DS 1 -5), obtidas de uma perereca sul americana, constituindo uma família de peptídeos de 28 a 34 resíduos de aminoácido, ricos em Lisina. Tendo as DS1 e 5 sem apresentar atividade hemolítica, apenas antimicrobiana apesar de 40 % de similaridade entre as cinco, as atividades biológicas são distintas e agem em sinergismo, podendo potencializar 100 vezes a atividade antibiótica. Encurtando a DS3 para DS3- (1-16)-NH2 não afetaram a potência do peptídeo e reduções mais drásticos da DS3 para 10-12 resíduos curiosamente não afetaram a atividade para alguns microorganismos o que ocorreu para outros derivados das demais DS (MOR et al., 1994; FLEURY et al., 1998).

Phyllomedusa bicolor Um fato interessante é que Phylloxina (Pierre et al., 2000) não é estruturalmente homóloga a outras dermaseptinas ou as dermofinas/deltorfinas, mas dispõe de similaridades na seqüência com os fragmentos precursores de levitide e xenopsina, peptídeos antimicrobianos da pele de uma espécie evolucionariamente distante de anfíbio Xenopus laevis. 25

Amiche e colaboradores (2000), posteriormente isolaram um novo ativo contra molicutes (eubactéria sem parede), gram-positivo e pouco ativo contra gram-negativos.

Phyllomedusa distincta As Dermadistinctinas K, L, M, Q1 e Q2 apresentaram atividade antimicrobiana contra microorganismos gram positivos e negativos, destacando a atividade contra Pseudomonas aeruginosa resistente a meticilina (BATISTA et al., 1999). Do mesmo animal posteriormente foi isolado a Distinctina, um peptídeo antimicrobiano que diferia (Batista et al, 2001)

Phyllomedusa hypochondrialis

Obteve um peptídeo com seqüência obtida pelo N – terminal de NH2- Phe-Leu-Ser-Leu-Ile-

Pro-His-Ala-Ile-Asn-Al- Val-Ser-Ala-Ile-Ala-Lys His-Asn-COOH, denominado de JR2. Este apresentou baixa atividade hemolítica e ação antimicrobian contra as bactérias gram positivas Staphylococcus aureus ATCC 27853 e E. faecalis ATCC 25973 e ainda, contra as gram negativas Pseudomonas aeruginosa ATCC 25923 e Escherichia coli ATCC 25922 (LEITE et al., 2001).

Phyllomedusa tarsius Morales e colaboradores (2002) encontraram uma série de peptídeos variando de 23 a 32 resíduos de aminoácido com ação antimicrobiana contra Escherichia coli, Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25922, 27853 e 25923) que guardam uma homologia maior com as distinctinas isoladas de P. distincta.

Phyllomedusa oreades Em um recente trabalho realizado pela EMBRAPA-Recursos Genéticos e Biotecnologia tendo colaboração direta do Laboratório SABIN, Universidade de Brasília (UnB) e a Universidade de São Paulo (USP) foi isolada e caracterizada uma dermaseptina presente na secreção cutânea deste anfíbio recentemente descoberto no cerrado brasileiro (BRAND et al., 2002) 26

c2. Pelodryadinae Litoria caerulea Salmon e colaboradores (2000) fizeram um extenso trabalho visando o isolamento, caracterização estrutural e determinação da bioatividade da secreção defensiva da pele do hilídeo australiano Litoria caerulea. Este novo análogo da neuromedina U de mamíferos que apresenta grande homologia na sua seqüência de aminoácidos foi denominado de neuromedina U-23 (NmU- 23).

Litoria chloris Segundo Steinborner e colaboradores (1998), as glândulas da pele de Litoria chloris contem uma variedade de peptídeos incluindo quatro antibacterianos da família da caerina 1. Dois destes, cerinas 1.6 e 1.7, estão também presentes em Litoria xanthomera, confirmando que estas duas espécies pela composição de suas secreções são as mais próximas dentro do gênero Litoria. Os outros dois peptídeos, cerinas 1.8 e 1.9, são novos. Desta mesma espécie foram caracterizadas quanto a seqüência de aminoácidos, estrutura e atividade antimicrobiana de duas novas cerinas 1 das glândulas da pele denominadas cerina 1.8 Gly- Leu- Phe- Lys -Val-Leu-Gly-Ser-Val-Ala-Lys-His-Leu-Leu-Pro-His-Val-Val-Pro-Val-Ile-Ala-

Glu-Lys-Leu(NH2), e cerina 1.9, Gly-Leu-Phe-Gly-Val-Leu-Gly-Ser-Ile-Ala-Lys-His-Val-Leu-Pro- a His-Val-Val-Pro-Val-Ile-Ala-Glu-Lys-Leu(NH2) (WABNITZ et al., 1998).

Litoria citropa Dezesseis peptídeos tipo caeruleina foram isolados da secreção da pele de Litoria citropa. Existem quatro grupos destes peptídeos, sendo que o primeiro é baseado na estrutura do conhecido neuropeptídeo ceruleina [pGlu-Gln-Asp-Tyr (SO3)Thr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe(NH2)], renomeado recentemente de ceruleina 1.1. Exemplos de peptídeos pertencentes a outros grupos neste animal isolados são os seguintes: ceruleina 2.1 [pGlu-Gln-Asp-Tyr(SO3)Thr-Gly-Ala-His-Met-Asp-

Phe(NH2)], caeruleina 3.1 [pGlu-Gln-Asp-Tyr (SO3)Gly-Thr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe(NH2)] e ceruleina 4.1 [pGlu-Gln-Asp-Tyr (SO3)Thr-Gly-Ser-His-Met-Asp-Phe(NH2)]. Todos estes peptídeos são acompanhados por associações aonde a fenilalanina substitui metionina, e todos os oito peptídeos caeruleina são acompanhados pelos análogos dessulfatados (WABNITZa et al. 1999). 27

Através da combinação da espectrometria de massa de spray de elétrons, espectrometria de massa de condensação Lys-C e seqüenciador automático de Edman forneceram a possibilidade de conhecer seqüência de aminoácidos e isolar mais dezenove peptídeos citropina das glândulas granulosa dorsal e submental de Litoria citropa. A citropina 1.1 e citropina 1.2 são os dois maiores peptídeos da pele e ambos mostraram uma significante atividade antibacteriana com largo espectro (WABNITZb et al.,1999). Dando continuidade ao trabalho Wegener e colaboradores (1999), aprofundando os estudos antimicrobianos e procurando localizar a glândula de origem de tais peptídeos, verificou que dos dezenove peptídeos encontrados na secreção de glândulas granulares dorsais da pele deste animal, quinze destes também estão presentes na secreção da glândula submental, destacando entre eles a citropina 1.1 e 1.2 que são majoritários em ambas, tendo ainda a citropina 1.3, também com amplo espectro antimicrobiano.

Litoria dahlii Onze peptídeos foram isolados deste animal e denominados dahleinas, sendo que a exceção das dahleinas 1.1 e 1.2 que apresentaram alguma atividade antimicrobiana de largo espectro contra bactérias gram positivas para o restante esta não foi muito expressiva e ainda, as dahleinas 4 (4.1 a 4.3) e 5 (5.1 a 5.6) que correspondem a nove dos onze peptídeos encontrados são inativas contra microorganismos nas condições de teste. Ao serem testados num programa do National Cancer Institute (Washington) nenhum peptídeo mostrou atividade significativa anticâncer ao contrário da encontrada para a aureína, substãncia isolada da Litoria aurea. É importante salientar que os peptídeos dahleina 5 inibem fortemente a formação de óxido nítrico pela NO sintetase neuronal em concentrações μM (WEGENER et al., 2001).

Litoria genimaculata Os peptídeos obtidos das glândulas da pele desta espécie são denominados de maculatina. Seis peptídeos já foram isolados e caracterizados das glândulas dorsais nesta espécie, sendo que quatro mostraram atividade antibiótica, ressaltando a maculatina 1.1 que apresentou uma pronunciada atividade particularmente contra bactérias gram positivas. Esta substância é um peptídeo de 21 resíduos de aminoácido com uma prolina central o que confere mobilidade a esta molécula facilitando e incrementando sua atividade antimicrobiana. A maculatina 1.1 assemelha-se 28

com o conhecido peptídeo antibiótico caerina 1, exceto nos quatro resíduos de aminoácido centrais do sistema cerina 1 que estão ausentes na maculatina 1.1. (ROZEK et al., 1998, CHIA et al., 2000).

Litoria infrafrenata As glândulas granulosas dorsais desta espécie contêm cinco peptídeos incluindo a ceruleina, um conhecido neuropeptídeo, e quatro outros, denominados frenatinas 1, 2, 3 e 4, com pesos moleculares respectivamente de 1140, 1423, 2180 e 2493 Daltons (Da). A seqüência de aminoácidos das frenatinas e suas estruturas não correspondem aos peptídeos isolados de outros anfíbios ou animais. A frenatina 3, Gly-Leu-Met-Ser-Val-Leu-Gly-His-Ala-Val-Gly-Asn-Val-Leu-Gly-Gly- Leu-Phe-Lys-Ser(OH), que possue propriedades antimicrobiana (RAFTERY et al., 1996).

Litoria aurea & L. raniformis Dezessete peptídeos aureína da secreção das glândulas granulares dorsais de Litoria aurea, e 16 de L. raniformis. Dez destes, são comuns a ambas as espécies. Treze dos peptídeos aureína mostraram largo espectro antibiótico. Estes peptídeos foram chamados em 3 grupos (aureínas 1 - 3) de acordo com suas seqüências. A aureína-1, com somente 13 aminoácidos, é o menor peptídeo ativo antibiótico e anticâncer já relatado em anuras. A aureína 2.2 foi a de melhor atividade antibiótica. A aureína 1-3 peptides mostraram largo espectro antibiótico e atividade anticâncer, sendo a aureína-2.2, o maior componente da secreção da pele de L. aurea, a mais potente das aureína antibióticas, sendo, porém de espectro menor do que a caerina-1.1 e citropina-1.1. Outro peptídeo abundante de L. aurea e L. raniformis, aurein-3.1, apresentou atividade antibiótica moderada. As aureínas antibióticas mostraram uma maior ação contra bactérias gram-positivas do que negativas o que normalmente ocorre com peptídeos antibióticos de anfíbios (ROZEK et al., 2000).

Litoria. splendida A cerina 1.1 é um dos maiores constituintes peptídicos com ação antimicrobiana isolado,da peledeste anfíbio australiano 25 aminoácidos tendo em sua conformação duas bem definidas hélices de Leucina 2 a Lisina 11 e de Valina 17 a Histidina 24 separadas por uma região de menor definição da forma de hélice e grande flexibilidade. As características estruturais sugerem que este interaja com membranas semelhante ao modelo de carpete (WONG et al., 1997) 29

Girinos desta mesma espécie produzem peptídeos de defesa muito cedo no seu devenvolvimento, bem antes da metamorfose. Com o auxílio de CLAE espectroscopia de massa, peptídeos foram identificados e caracterizados, não sendo encontrado nenhum nos ovos após serem coolocados. O neuropeptídeo caeruleína foi detectado após 10 dias da deposição, e os peptídeos antibióticos caerina 1.1, cerina 1.6 e cerina 3.1 apareceram no 14° dia. A concentração de peptídeos aumenta com o princípio da metamorfose no 84° dia, quando a necessidade destes peptídeos é tão necessária quanto na fase adulta (WABNITZb et al., 1998). Nos peptídeos da pele do macho e da fêmea também da Litoria splendida foram encontradas diferenças com a descoberta do feromonio no macho esplendeiferina, juntamente com um novo antibiótico Phe8-caeruleína, que tem seus níveis variáveis em função da época que se encontra o animal (WABNITZ et al., 2000).

Litoria xanthomera A secreção das glândulas da pele L. xanthomera contêm sete peptídeos. Um deles é o conhecido peptídeo hipotensor ceruleína. Dois novos que apresentaram propriedades antibacterianas: cerina 1.6 [Gly-Leu-Phe-Ser-Val-Leu-Gly-Ala-Val-Ala-Lys-His-Val-Leu-Pro-His-

Val-Val-Pro-Val-Ile-Ala-Glu-Lys-Leu(NH2)], e cerina 1.7 [Gly-Leu-Phe-Lys-Val-Leu-Gly-Ser-Val-

Ala-Lys-His-Leu-Leu-Pro-His-Val-Ala-Pro-Val-Ile-Ala-Glu-Lys-Leu(NH2)] e ainda, outros dois sem propriedade antibacteriana semelhantes as cerinas 1.6 e 1.7, diferindo por não apresentar os primeiros dois resíduos de aminoácido. A identificação de peptídeos na L. xanthomera confirma que estas espécies é relacionada a L. caerula, L. gilleni e L. splendida mas não tanto como estas três entre si (STEINBORNERa et al.; 1997, STEINBORNERb et al., 1997).

d) Hyperoliidae Kassina senegalensis Isolada de extratos de pele oriunda de um anfíbio africano a kassinatuerina–1, um peptídeo linear antibiótico de largo espectro, tendo atividade contra Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Candida albicans nas respectivas concentrações inibitórias mínimas de 4, 8 e 70 μM (MATTUTEa et al., 2000). 30

e) Pseudidae Pseudis paradoxa Quatro peptídeos estruturalmente relacionados (pseudinas 1 – 4) com atividade antimicrobiana foram isolados de extratos da pele da rã paradoxal Pseudis paradoxa, sendo que a pseudina – 2, foi a que se mostrou mais potente, com baixa atividade hemolítica e mais abundante na pele deste anfíbio (OLSON III et al., 2001).

f) Ranidae Recentemente os peptídeos antimicrobianos do gênero Rana foram agrupados em oito famílias com base nas similaridades da seqüência de aminoácidos e compreendem as brevinina–1, brevinina–2, esculentina–1, esculentina–2, ranalexina, ranatuerina–2 e temporina (GORAYA et al., 2000), sendo que determinados peptídeos ocorrem em espécies diferentes.

Rana brevipoda porsa Brevininas (1 – 2). Estes peptídeos foram isolados de uma rã japonesa por Morikawa e colaboradores (1992) e o que chama a atenção é que não possuem qualquer homologia estrutura com magaininas e nem bombinas, segundo os autores, brev-1 apresenta um percentual de homologia com a pipinina, um peptídeo isolado da R. pipiens de atividade liberadora de histamina e, com um peptídeo de vespa com atividade nos aminoácidos hidrofóbicos da extremidade N-terminal, de quimiotaxia e atividade antimicrobiana também.

Rana rugosa As gaegurinas, um grupo de peptídeos de tamanho entre 24 e 37 resíduos de aminoácido isolada de uma rã coreana (PARK et al., 1994) de largo espectro antimicrobiano e nocividade pequena sobre hemácias humanas. Tendo já disponível comercialmente as gaegurinas 2 e 5.

Rana catesbeiana Ranalexina, um peptídeo antimicrobiano obtido de extratos de girinos da Rana catesbeiana, estruturalmente relacionado ao polimixina, um antimicrobiano (CLARK et al., 1994). De animais adultos foram isolados nove peptídeos, denominadas Ranatuerinas 1 - 9, de extratos da pele e exibindo atividade contra Staphylococcus aureus (GORAYA et al., 1998). 31

Rana sphenocephala Atravé da estimulação elétrica fotam obtidas secreções da pele desta rã e dela isolados três peptídeos com atividade inibitória do crescimento contra a bactéria gram negativa Eschericia coli. A caracterização estrutural demonstrou que os peptídeos brevinina-1Sa com concentração inibitória mínima (minimum inhibitory concentration - MIC) de 55 μM; brevinina-1Sb, MIC = 17 μM; brevinin-1Sc, MIC = 14 μM representam novos membros da família brevinina-1 de peptídeos antimicrobianos. Sua alta concentração na secreção da pele e extrema variabilidade na seqüência de aminoácidos sugere que a família brevinina de peptídeos pode ser um valoroso marcador molecular para a identificação e classificação taxonômica dos ranídeos (CONLON et al., 1999).

Rana clamitans Dez peptídeos apresentando atividade diferenciada inibitória do crescimento contra as bactérias Staphylococcus aureus (gram-positiva) e Escherichia coli (gram-negativa), e a levedura Candida albicans foram isolados de extratos de pele da rã Rana clamitans. Destes Ranatuerina-1C, ranalexina-1Ca, ranalexina-1Cb, ranatuerina-2Ca, e ranatuerina-2Cb, são membros de três famílias previamente caracterizadas que foram primeiramente identificadas na Rana catesbeiana. Outros cinco peptídeos estruturalmente relacionados (temporina-1Ca, -1Cb, -1Cc, -1Cd, e -1Ce), com 13 resíduos de aminoácido e contendo um C-terminal amidado, pertencentes a família das temporinas, primeiramente identificados na Rana temporaria. Estes dados reforçam a hipótese de que a distribuição e seqüências de aminoácidos de peptídeos antimicrobianos da pele podem ser uma ferramenta valiosa na identificação e classificação de ranídeos (HALVERSON et al., 2000).

Rana esculenta Foram isolados três peptídeos da secreção desta rã com atividade distinta contra gram positivos negativos, sendo o primeiro e segundo peptídeos apresentam homologia com as brevininas1 e 2 respectivamente, diferindo o terceiro, denominado esculentina que apresenta uma acentuada atividade contra Staphylococcus aureus e baixa atividade hemolítica (SIMMACO et al., 1993). Posteriormente foi isolado e caracterizado um peptídeo de grande potência tanto como antimicrobiano como hemolítico, a brevinina-1E, sendo que quando houve a deleção de três aminoácidos na porção N – terminal não afetou a atividade antimicrobiana muito, mas reduziu sensivelmente a atividade antimicrobiana (KWON et al., 1998). Já Wang2 e colaboradores (1998) 32

conseguiram isolar e caracterizar quatro potentes peptídeos inibidores do crescimento de Escherichia coli da família da brevinina-2, sendo que dois deles eram idênticos as brevininas 2Ec e 2Ef anteriormente isoladas na pele deste animal.

Rana ridibunda Ensaios realizados com a secreção da pele desta rã proveniente de Istambul, Turquia, evidenciaram uma forte ação antimicrobiana, sendo que não foi objetivo deste trabalho o isolamento da substância responsável pela atividade em questão, sendo que os autores suspeitam tratar de uma proteína (ÇEVIKBAS, 1978).

Rana temporaria A ranatuerina 1T foi isolada desta rã foram incluídas na família das ranatuerina 1, recebendo a letra T para caracterizar a espécie de onde foi isolada, possuindo atividade antimicrobiana contra a bacteria gram positiva Staphylococcus aureus (GORAYA et al., 1999). Wade e colaboradores (2000) relataram ter encontrado um pequeno peptídeo amida de caráter básico, altamente hidrofóbico co amplo espectro de atividade incluindo Staphylococcus aureus meticilino resistente e e Enterococcus faecium vancomicina resistente.

Rana grylio Foram isolados oito peptídeos com atividade diferenciada contra as bactérias gram positivo e negativo respectivamente, Staphylococcus aureus e Escherichia coli, também apresentando atividade inibitória contra a levedura Candida albicans, sendo seus peptídeos podendo ser agrupados pela similaridade da seqüência de aminoácidos nas famílias ranatuerina-1, ranatuerina-2 e ranalexina (KIM et al., 2000).

Rana palustris Suas secreções são tóxicas tanto para predadores como microorganismos. Foram isolados um total de 22 peptídeos com atividade inibitória do crescimento diferenciada sobre bactérias e leveduras de secreções da pele obtidas por eletro-estimulação e caracterizados estruturalmente. Destes 13, pertenciam as cinco famílias conhecidas de peptídeos antimicrobianos previamente identificado em outras espécies de ranídeos: brevinina-1 (3 peptídeos), esculentina-1 (2 peptídeos), 33

esculentina-2 (1 peptídeo), ranatuerina-2 (6 peptídeos), e temporina (1 peptídeo). Ainda, nove peptídeos mostraram pequena similaridade estrutural com outros peptídeos conhecidos e classificados em uma nova família: palustrina-1 (4 peptídeo s), com 27 a 28 resíduos de aminoácidos e uma ponte de cistina num anel heptapeptídico; palustrina-2 (3 peptídeos) com 31 resíduos de aminoácidos e uma região heptapeptídica cíclica e palustrina-3 (2 peptídeos) com 48 aminoácidos e região heptapeptídica cíclica. Os peptídeos pertencentes as famílias esculentina-1, esculentina-2 e palustrina-3 foram os mais potentes (BASIR, 2000).

Rana sylvatica Pela contração dos miócitos em volta das glândulas granulares nesta espécie temos a liberação de peptídeos antimicrobianos, sendo que após a obtenção de extratos de pele conseguiu-se isolar demonstrar a indução de um peptídeo da família da brevinina-1 ativo contra Staphylococcus aureus e Escherichia coli na pele da rã em resposta a uma mudança ambiental (MATTUTEb et al., 2000)

Rana tigerina Quatro novos peptídeos antimicrobianos de largo espectro com11 e 12 resíduos, chamados tigerininas, foram isolados de secreções da pele obtidas após estímulo com adrenalina. Tem como características uma ponte bissulfídica entre duas cisteínas formando um nonapeptídico. Análises conformacionais indicam que este peptídeo tende a formar estrutura beta exercendo permeabilização das membranas bacterianas. As tigerininas representam os menores peptídeos antimicrobianos catiônicos não helicoidais dos anfíbios (Sai et al. 2001).

Rana berladieri, Rana luteiventris, Rana pipiens Um total de 24 peptídeos com atividade antimicrobiana diferenciada sobre as duas bactérias Staphylococcus aureus e Escherichia coli e também a levedura Candida albicans. Dentre estes havia representantes das famílias de peptídeos brevinina–1, esculentina–2, ranatuerina–2 e temporina (Goraya et al., 2000). 34

Rana aerolata Na pele dorsal estão associadas, numerosas proeminentes glândulas granulosas. A análise da secreção da pele obtida por estimulação elétrica destas glândulas levaram a identificação e caracterização de oito peptídeos com atividades antimicrobiana e hemolítica pertencente a famílias previamente identificadas brevinina-1, temporina-1, palustrina-2, palustrina-3, esculentina-1 (dois peptídeos), e ranatuerina-2 (dois peptídeos). A estrutura primária dos peptídeos foi consistente com uma proximidade relação filogenética entre R. areolata e Rana palustris. Três peptídeos catiônicos contendo cisteína estruturalmente relacionados identificados mostraram similaridade de seqüência ao peptídeo Leucina–Arginina, um peptídeo com propriedades imunomodulatórias e liberadoras de histamina da pele de Rana pipiens. Dados sugerem que inibidores de protease nas secreções da pele podem desempenhar um papel complementara peptídeos α-hélice anfipáticos catiônicos na proteção de anuros a invasões por microorganismos (Ali et al., 2002).

Rana japonica A japonicina-1 (Phe-Phe-Pro-Ile-Gly-Val-Phe-Cys-Lys-Ile-Phe-Lys-Thr-Cys(OH) e japonicina-2 (Phe-Gly-Leu-Pro-Met-Leu-Ser-Ile-Leu-Pro-Lys-Ala-Leu-Cys-Ile-Leu-Leu-Lys-Arg- Ly-Cys(OH), dois peptídeos with differential growth-inhibitory activity against the Gram-negative bacterium, Escherichia coli e a bactéria gram-positiva Staphylococcus aureus, foram isolados de um extrato de pele da rã marrom japonesa R. japonica. Ambos apresentaram pequena similaridade de sua seqüência de aminoácidos com outros já isolados do mesmo gênero. Estudos revelaram que a japonicina-2 adota uma conformação helicoidal. Peptídeos semelhantes as famílias brevinina-1, brevinina-2, e tigerinina, previamente identificados na pele ranídeosasiáticos não foram detectados, tendo apenas um peptídeo temporina-relacionado (Ile-Leu-Pro-Leu-Val-Gly-Asn-Leu-Leu-Asn-

Asp-Leu-Leu(NH2) sido encontrado, a temporina-1Ja, que atipicamente não possui carga positiva. Os valores de concentração inibitória mínima (MIC) de peptídeos contra E. coli foram japonicina-1 (30 μM); japonicina-2 (12 μM); e temporina-1Ja (100 μM). Os valores de MIC contra S. aureus foram japonicina-1 (100 M); japonicina-2 (20 μM); e temporina-1 Ja (100 μM) (Isaacson et al., 2002) 35

Rana tarahumarae A população deste animal tem decrescido marcadamente nos últimos anos. A infecção pelo fungo Batrachochytrium dendrobatidis tem implicado no declínio não só deta espécie como de outras. Rollins-Smith e colaboradores (2002) procuraram avaliar in vitro se a peptídeos antimicrobianos da pele providenciam proteção contra este patógeno. Verificou-se que extratos da mistura de peptídeos de pele inibiam o crescimento de forma concentração-dependente, tendo sido isolados três peptídeos antimicrobianos com semelhanças com a família brevinina-1 e outros três com a ranatuerina-2. Os dois mais abundantes peptídeos, a ranatuerin-2TRa e brevinina-1Tra, respectivamente Gly-Ile-Met-Asp-Ser-Ile-Lys-Gly-Ala-Ala-Lys-Glu-Ile-Ala-Gly-His-Leu-Leu-Asp- Asn-Leu-Lys-Cys-Lys-Ile-Thr-Gly-Cys(OH) e (Phe-Leu-Pro-Val-Ile-Ala-Gly-Ile-Ala-Ala-Asn-Val- Leu-Pro-Lys-Leu-Phe-Cys-Lys-Leu-Thr-Lys-Arg-Cys(OH), foram ativos contra B. dendrobatidis (MIC de 50 μM para ranatuerina-2TRa e 12,5 μM para brevinina-1TRa contra zoosporos). Apesar destes dados de atividade contra B. dendrobatidis in vitro isto não ocorre na infecção natural possivelmente por fatores inerentes a mecanismos de imunidade inata.

Rana tagoi Dois peptídeos com propriedades antimicrobianas e citolítica foram purificados de um extrato da pele desta rã. A estrutura primária de um dos peptídeos [Phe-Leu-Pro-Ile-Leu-Gly-Lys-

Leu-Leu-Ser(10)Gly-Ile-Leu(NH2)] foi identificado como um membro da família das temporinas, já o segundo, [Ala-Ile-Gly-Ser-Ile-Leu-Gly-Ala-Leu-Ala(10)Lys-Gly-Leu-Pro-Thr-Leu-Ile-Ser-Trp-

Ile(20)Lys-Asn-Arg(NH2)] dispõe de 78% de identidade na seqüência com a melitina do veneno da abelha Apis florea. Comparado com a melitina, este peptídeo melitina relacionado (PRM) foi equipotente na inibição do crescimento da bactéria Gram-positiva Staphylococcus aureus, cinco vezes menos potente contra a Gram-negativa Escherichia coli e contra o fungo patogênico, Candida albicans. PMR foi 13 vezes menos hemolítico do que a melitina contra eritrócitos humanos e quatro e cinco vezes menos citolítico contra linfoma de camundongo derivado células T EL4 e fibroblastos L929, respectivamente. Contudo, nas concentrações não tóxicas, menor ou igual 8mg por mol, PRM não tem ação protetora em células HeLa da morte celular produzida por infecção por rhinovírus humano tipo 2 (Conlon et al., 2003). 36

g) Myobatrachidae g.1. Uperoleia mjobergi Da secreção das glândulas dorsais deste animal australiano foi isolado a uperina, um peptídeo antimicrobiano (Bradford et al., 1996) A comparação da sequência de aminoácidos revela similaridades da uperina-3, com as aureínas 1 - 3 e a citropina-1. As citropinas e aureínas são peptídeos de defesa relacionados do gênero Litoria, o que não é o caso das uperinas é um exemplo de convergência evolutionária, pois ambas famílias divergiram de um ramo comum a pelo menos 60 milhões de anos atrás mas conservaram características de suas secreções (Rozek et al., 2000).

h) Bufonidae Segundo alguns autores os peptídeos podem estar ausentes na secreção de sapos do gênero Bufo (Cei et al., 1968) ou presentes em pequenas quantidades (Daly & Witkop, 1971), contudo alguns autores questionam estas afirmações.

Bufo boreas, B. bufo, B. viridis Em uma revisão de 1997, Clarke e colaboradores descrevem observações não publicadas de terem encontrado em cromatografia de camada delgada, revelado com azul de Coomassie 8 bandas e com prata que confere maior sensibilidade de coloração 21 foram detectadas. Posteriormente, estas bandas dissolvidas apresentaram atividade antibacteriana contra Staphylococcus aureus e Micrococcus luteus e efeito fungistático contra Neurospora crassa e Aspergyllus niger. Estes dados até agora após extensa revisão bibliográfica ainda não foram encontrados.

Bufo bufo gargarizans Deste sapo asiático que é empregado na medicina popular da Coréia dois peptídeos antimicrobianos: buforinas I e II foram isoladas do estômago deste anfíbio (Park et al., 1996), sendo que em termos de atividade antimicrobiana a buforina II é aproximadamente dez vezes mais potente contra um largo espectro de microorganismos do que a magainina-2, uma referência em peptídeos antimicrobianos de anfíbios (Park & Kim, 1998). 37

1.3.4. Peptídeos Antineoplásicos São relatados alguns peptídeos que além da ação antimicrobiana também possuem uma atividade antineoplásica, abaixo podemos ver alguns exemplos.

1.3.4.1. Magainina 2 e peptídeos análogos Este sem dúvida foram dos mais testados. Crucianib e colaboradores (1991), encontraram em seu estudo evidências que a atividade citotóxica rápida e irreversível contra tumores de células hematopoiéticas pela magainina 2 e seus análogos sintéticos por despolarização através da formação de canais iônicos, sendo que os análogos lisaram estas células com concentrações de 10 a 20 vezes menores que suas contrapartidas normais, parecendo ser que apesar de tanto as células de mamíferos malígnas quanto as normais serem suscetíveis a lise, as cancerosas o são mais. Estes análogos também inibiram o crescimento de pequenas células tumorais de pulmão (Ohsaki et al., 1992). Peptídeos estruturalmente similares as magaininas 2 e amida sintetizados testados. in vitro contra células leucêmicas P388 e in vivo para quatro tumores ascíticos murinos S180 e A549 demonstrando aumento de potência in vitro em relação a seus compostos originais. O peptídeo D- aminoácido MSI-238, provou ser tão efetivo quanto a doxorubicina nos estágios mais avançados de tumor ovariano e sua atividade pode ser atribuída a sua resistência a degradação proteolítica (Baker et al., 1993). Já Soballe e colaboradores (1995), utilizaram os peptídeos derivados de magaininas MSI-511, MSI- 130 e MSI – 98 para terapia experimental local de melanomas humanos e observaram atividade lítica tanto in vitro como em camundongos timectomizados

1.3.4.2. Litoria. aurea & L. raniformis As aureínas apresentaram uma atividade surpreendente, especialmente os peptídeos 1.2, 3.2 e 3.3 que mostraram atividade de mais de que 90% para todos os tipos de células cancerosas humanas testadas. O largo espectro da atividade anticâncer junto com a conhecida atividade na membrana bacteriana sugere que esta atividade é devido a penetração e ruptura da membrana de células cancerosas e infelizmente de células normais, mas não invalidade a sua potencialidade (Rozek et al., 2000). 38

2. OBJETIVOS

Isolar e purificar compostos bioativos obtidos da secreção mucosa de anfíbios.

Avaliar uma possível ação antimicrobiana de substâncias puras.

Conseguir identificar possíveis moléculas que venham a ser candidatas a ponto de partida para modificações visando aumentar a atividade antimicrobiana e reduzir a toxicidade 39

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Animais Utilizados na Obtenção das Amostras

3.1.1. Bufo schneideri Werner, 1894- Bufonidae

Popularmente conhecido como sapo ou cururú, provenientes de áreas circunvizinhas a região metropolitana de Fortaleza, Ceará e anteriormente denominado Bufo paracnemis Lutz 1925.

Figura 2 – Foto de um espécime Bufo schneideri W.

3.1.2. Leptodactylus pentadactylus Laurenti, 1768 Leptodactylidae : Leptodactylinae

Conhecidas como gia ou rã, são provenientes de áreas circunvizinhas a região metropolitana de Fortaleza, Ceará.

Figura 3 – Foto de um espécime Leptodactylus pentadactylus L. 40

3.2. Obtenção do Veneno de Bufo schneideri

Exsudatos foram obtidos destes anfíbios pela compressão das glândulas paratoideas e paracnêmicas para estimular a liberação da secreção destes e coletada em quadrados plásticos de 12,5 cm lateralmente, previamente pesados. Foram coletados material tanto de espécimes fêmeas como de machos e então homogeinizados. O material bruto coletado é separado em alíquotas e mantido sob refrigeração até a sua utilização. Para a elaboração do extrato bruto uma alíquota de 5 g é esmagada em gral de porcelana com o auxílio de um pistilo e acrescentados 25 ml de etanol absoluto, posteriormente sendo transferido para um béquer e sob refrigeração (4 oC) deixado em contato por 24 horas, posteriormente sendo centrifugada a 3600 xg por 15 minutos e coletado o sobrenadante para purificação (CARVALHO et al., 1992).

3.3. Obtenção de Extratos de Pele de Bufo schneideri

Estes extratos foram utilizados em testes de atividade antimicrobiana tentando avaliar se havia alguma variação da ação estudada com a localização no animal deste tecido e do solvente utilizado, no caso a água bidestilada e o etanol. Para obtermos este material, seis espécimes adultos de ambos os sexos de Bufo schneideri foram anestesiados com éter e sacrificados por ruptura de medula. Tiras de pele das regiões dorsal, ventral e glandular foram retiradas com o auxílio de lâminas de bisturi n° 23, o material foi pesado e submetido a extração com água bidestilada e o etanol PA para cada uma das três regiões de pele removida(aproximadamente 0,125 g/ml),durante 24 horas à temperatura de refrigeração sob agitação constante. Então realizaram-se filtrações em tecido de nylon e centrifugações a 15.000 x g por 20 minutos, a 4 oC. Os resíduos foram descartados e os sobrenadantes obtidos receberam a denominação de DA (extrato da região dorsal em água), DE (extrato da região dorsal em etanol), VA (extrato da região ventral em água), VE (extrato da região ventral em etanol). extrato da região em água), GA (extrato da região glandular em água), GE (extrato da região glandular em etanol), e GE. 41

3.4. Obtenção do Veneno de Leptodactylus pentadactylus

Os exsudatos destes anfíbios foram obtidos pela administração de uma injeção subcutânea de adrenalina 100 μg/ml na dose de 1mg/Kg de peso, sendo o exsudato coletado após 20 minutos em água bidestilada gelada (1:4; v:v), liofilizado (Liofilizador Edwards Modulyo-4K) e então estocado à – 25 °C.

3.5. Purificação por Cromatografia em Colunas

O material bruto coletado oriundo do veneno de Bufo schneideri foi submetido a fracionamento em Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) utilizando coluna de absorção hidrofóbica de fase reversa (Shim-pack PREP 2,5 cm de diâmetro por 25 cm de comprimento, sílica com granulação de 15 μm de φ, partícula de 100 Ao) (SHIMADZU LC-10ADVP) e eluída com gradiente de 0 a 40 % de acetonitrila com ácido trifluoroacético 0,05 % (TFA) por 60 min., com fluxo 5 ml/min, obtendo-se os picos 1, 2 3 e 4. Seguindo-se de uma recromatografia do pico 1 utilizando-se uma segunda coluna, analítica C-18 CLC (M) de 4,6 mm de diâmetro por 15 cm de comprimento com partículas de sílica de 5 μm de φ , partícula de 100 Ao) com um maior número de placas teóricas para a separação de dois picos que saiam muito próximos. Esta segunda coluna foi utilizada para checagem de pureza das amostras obtidas (CARVALHO et al., 1992; JOUDIOU et al., 1993). Para a obtenção dos peptídeos deste material, o pó liofilizado do exsudato de Leptodactylus pentadactylus foi diluído em TFA 0,05 % (20:1; P:V) e fracionado por CLAE usando coluna C18 (20 x 25 cm) eluído num gradiente de 5 a 80 % de acetonitrila durante 103 min., num fluxo de 5 ml/min. Na purificação de proteínas se utilizou-se uma coluna preparativa filtrante Sephacryl - S 400 (0,6 cm diãmetro por 46 cm comprimento) e eluída por tampão Tris – HCl 0,05 N, separando assim pelos diferentes pesos moleculares. 42

3.6. Cromatografia em Placa Delgada de Sílicagel

Desde muitas décadas atrás, ténicas de cromatografia em sílica ou papel tem sido utilizadas para evidenciar componentes do veneno de animais do gênero Bufo (SHIMADA et al., 1975, KAMANO et al., 1975). Foi realizada em cromatofolhas AL de sílicagel 60 F254 Merck® de 20x20 cm e de espessura de 0,2 mm do veneno bruto de Bufo schneideri. Numa primeira, teve como eluente o clorofórmio e sistema revelador a base de vanilina. A seguir, para outra amostra do veneno, foi utilizado como eluente uma mistura de clorofórmio-metanol (9:1), tendo o metanol a função de aumentar a polaridade e facilitar a separação, já como sistema revelador foi utilizado o iodo.

3.7. Obtenção de Dados para Avaliação dos Índices de Rendimento de Extração do Veneno Bruto de Bufo schneideri

Para fazer o extrato bruto de B. schneideri utilizou-se 5 g de veneno bruto em 25 mL de etanol absoluto, contudo para se te um valor de rendimento mais fiel após a purificação cromatográfica, avaliou-se o peso do resíduo Após a extração seguindo-se a purificação cromatográfica e coletados os picos, obteve-se os valores após liofilização por diferença de peso em frascos de eppendorff tarados previamente em balança analítica relacionando com o volume.

3.8. Estudos quanto a Variabilidade do Veneno Bruto e seus Componentes em Diversas Localidades de Coleta

Foi coletado veneno de Bufo schneideri em diferentes localidades em Estados do Nordeste para avaliar cromatograficamente a composição básica comparativa por cromatografia em coluna de CLAE C4 analítica. Os locais de coleta foram diferentes localidades nas cercanias de Fortaleza (CE); Mossoró (RN), Natal (RN); Areia (PB), Campina Grande (PB); Recife (PE). Sendo que para cada amostra seguiu-se os mesmos procedimentos de pesagem, extração e cromatografia, sendo esta última realizando-se inicialmente com a coluna equilibrada em 33% e após 30 minutos iniciando um gradiente para 40% de acetonitrila com 5% de ácido trifluoroacético. 43

3.9. Determinação de Proteínas

A concentração de proteína do pico 8 de Leptodactylus pentadactylus foi feita pelo método de Bradford (1976), usando albumina sérica bovina como padrão. A 100 μl de amostra foram adicionados 2,5 ml do reagente de Bradford e após 10 minutos de incubação, foramrealizadas leituras das absobâncias a 595 nm.

3.10 Eletroforese

A pureza das amostras foi avaliada por eletroforese em gel de poliacrilamida 6%, sob condições não desnaturantes e desnaturantes com SDS 1 % e β - mercaptoetanol, comparando-se ao lado com padrões de proteínas conhecidas para a determinação do peso molecular.

3.11. Determinação da Estrutura das Substâncias Utilizadas

3.11.1. Determinação da estrutura das novas substâncias biologicamente ativas (não protêicas) Essa etapa foi realizada no CENAUREN - Departamento de Química Orgânica da Universidade Federal do Ceará, por Daniel Esdras de Andrade Uchôa, sob a coordenação do Prof. Edilberto R. Silveira utilizando técnicas de Ressonância Magnética Nuclear de prótio e de carbono 13 num espectrômetro Bruker Avance DRX 500 e então comparando os dados espectrais encontrados com os documentados na literatura.

3.12. Ensaio de Atividade Hemolítica

Este ensaio tem sido empregado por quase que via de regra por diversos autores como triagem para amostras com a finalidade de avaliar-se tanto a atividade antimicrobiana, assim como também servir como uma indicação preliminar da citotoxicidade para uma possível futura utilização e foi realizado conforme as técnicas descritas por Mor e colaboradores (1994) e Tytler e colaboradores (1995) com modificações. Obteve-se uma amostra de sangue fresco heparinizado, lavando-o por três vezes com PBS

(50 mM Na3PO4, 150 mM NaCl, pH 7,3 ± 0,2) e centrifugando após cada lavagem a 900 x g/15 min. 44

Este ensaio foi feito em placa de microtitulação de poliestireno (8x12x1cm) consistindo de 96 poços de fundo cônico dispostos em 8 fileiras de 12 poços na qual uma alíquota de 100 μl foram incubados com igual volume de água destilada sob agitação para obtermos nosso controle 100 % de hemólise, já em PBS, apenas com uma leve homogeinização, como controle negativo 100 %, e ainda, em diluições seriadas em PBS, com o auxílio de uma micropipeta automática, das amostras- teste ao longo de cada fileira transferindo-se 100 μl para obter um volume final de 200 μl. Então, também com a micropipeta, foram adicionados 100μl de suspensão de hemácias a 10% em PBS em cada poço. A liberação de hemoglobina foi monitorada após centrifugação a 900 x g / 15 min em 100 μl de sobrenadante medida a uma absorbância de 541 nanômetros (nm) até 24 horas, sendo que os títulos foram determinados observando-se a maior diluição que ainda apresentou hemaglutinação total. Os bufadienolídeos foram ensaiados a partir da diluição seriada de 1 mg/ml de cada uma.

Ensaio de Atividade Antimicrobiana

Os procedimentos com a manipulação e realização dos ensaios de avaliação da atividade antimicrobiana seguiram as normas do Code of Federal Regulations (1977)

3.13.1. Obtenção de Microorganismos. As cepas microbianas, bactérias, utilizadas foram provenientes de coleções padronizadas American Type Cell Culture (ATCC) adquiridas da Universidade Federal de Pernambuco em estado de conservação por liofilização e do Hospital Universitário Walter Cantideo – UFC (HUWC), devidamente morfológica, fisiológica e bioquímicamente caracterizada. Bacillus subtilis ATCC 6633 Enterobacter aerogenes ATCC 1304 Escherichia coli ATCC 25922 Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 Pseudomonas aeruginosa HUWC 1 Salmonella choleraesuis choleraesuis var typhi ATCC 6534 Staphylococcus aureus ATCC 6538 P

3.13.2. Preparação do Inóculo para Cultivo As amostras de microorganismos foram obtidas por dissolução em caldo B.H.I. de uma alíquota deste material liofilizado, esta foi repicada para meio de Müeller – Hinton por 24 horas à temperatura de 35ºC e incubada a colônias isoladas de cultivos puros Após sua obtenção, cada microorganismos foi repicado em triplicata para tubos contendo meio de estocagem semi - sólido. Antes de serem utilizados nos experimentos , cada cepa microbiana foi repicada com o auxílio de uma alça de platina assepticamente para em diferentes tubos contendo caldo B.H.I. (Brain Heart Infusion, Merck®) e após pelo menos 5 horas de crescimento para em meios sólidos tais como MacConkey para verificar a pureza de tais amostras, só então, foram utilizadas nos experimentos. Cada uma destas cepas foram inoculadas em diferentes tubos contendo caldo B.H.I. Após incubação dos tubos por 5 horas visando se obter uma suspensão com turvação moderada, o inóculo foi devidamente padronizado, diluindo-se em salina (sol. NaCl 0,9%) e corrigindo a turbidez com auxílio de uma Escala de MacFarland (0,5 ml de BaCl2.H2O 0,048 M em 99,5 ml de H2SO4 0,36 N) para grau meio (108 unidades formadoras de colônia por mililitro). Este foi utilizado tanto para os enaios em meio sólido como em meio líquido.

3.13.3. Teste de Avaliação da Sensibilidade Antimicrobiana a) Em Meio Sólido

Inoculação em Placa Com um “swab” estéril para cada tubo com suspensão bacteriana se procedeu a semeadura em placas com ágar Müeller-Hinton e identificadas devidamente.

Aplicação dos Discos e Amostra - Teste Com pinça estéril foram adicionados discos de papel de filtro Whattmann n°5 estéreis de 6,25 mm de diâmetro às placas, sendo que cada um deles recebeu 10 μl da amostra teste para realizarem-se testes de avaliação de susceptibilidade microbiana (BAUER-KIRBY modificada, 1966). Após incubação pelo tempo de 18 horas à temperatura de 35ºC serão observadas as placas 46

testes. Paralelamente serão cultivados os mesmos microorganismos para comparações morfológicas das colônias para verificar a possibilidade de ocorrerem alterações culturais (COLLINS & LINE, 1976; CARDOSO et al., 1985).

Leitura de Resultados por Mensuração dos Halos Os halos de inibição são áreas circulares em que não se observam o crescimento de microorganismo que quando positivo se visualizam em torno dos discos de aplicação de amostras - teste, sendo estes halos mensurados com o auxílio de uma régua milimetrada, conforme a figura esquemática abaixo ilustra:

Figura 4 – Representação esquemática da área de mensuração do halo de inibição na placa de ensaio com meio sólido de Müeller – Hinton.

b) Em Meio Líquido

Esta técnica terá uma tripla finalidade: 1) Podemos ter um referencial comparativo com a maioria dos trabalhos realizadas por outros pesquisadores, 2) ter registros de pequenas variações pela sensibilidade da leitura pela espectrofotometria, 3)economizar reativos e amostras. Utilizou-se placas plásticas de microtitulação de 96 cavidades esterilizadas. Foi diluído 50 μl da amostra a ser testada no primeiro poço e proceda diluição seriada num volume fixo adicionado a partir segundo poço 50 μl de salina estéril ou PBS. Os ensaios devem ser desenvolvidos em duplicata. A este adicionou-se 50 μl de uma suspensão de bactérias a 108 unidades formadoras de 47

colônia/ml (segundo os autores 106 u.f.c./ml), esporos ou microconídios/ml em caldo de B.H.I. a cada poço. Diluindo-se 50 μl da suspensão de microorganismos em igual volume de formaldeído 0,4% fez-se o controle negativo e em meio de B.H.I, controle positivo. A inibição do crescimento foi determinada pela medida da densidade óptica em espectrofotômetro a 492 nm após uma incubação de até 24 h / 37°C.

3.14. Avaliação dos Dados por Modelos Matemáticos e Estatísticos

3.14.1. Equação de Gompertz

Utilizada para avaliar a cinética de crescimento bacteriano (LAKSHMINARAYANAN & PITCHAIMANI, 2003; MCCANN et al., 2003; VIALETTE et al., 2003). Onde podemos observar as fases de crescimento bacteriano denominadas de Lag e exponencial. Para compreender a relevância destas fases temos que a Lag, também conhecida como fase de adaptação ou latência, sendo o período em que a população bacteriana se adapta ao meio em que se encontra, iniciando a produção de metabólitos essenciais para o seu desenvolvimento como enzimas, por exemplo; já a fase exponencial (logarítmica ou log), é a fase na qual na qual a multiplicação ocorre com maior velocidade, aumentando exponencialmente a população a cada período de geração. A equação de Gompertz é definida pela expressão abaixo:

exp MUE Y = NO + C { - exp [( 2,718 ).( LAG – X ) + 1]} C

NO = log inicial do n° de células C = diferenças entre inicial/final do n° de células LAG = decaimento antes do crescimento (retardo ou antecipação antes da fase de crescimento exponencial) MUE = movimentação específica de crescimento X = tempo Y = log célula 48

3.14.2. Equação de Regressão Não Linear kt O coeficiente angular “K” é obtido a partir de regressão curvilínea (Y = a . e ) para curvas de crescimento (GIRALDO et al., 2002).

3.14.3. Análise Estatística Os dados ainda foram submetidos ao Teste de médias, Análise de variância, Teste Múltiplo de Comparação de Tukey, utilizando-se o programa Prisma v4. 49

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO:

4.1. Purificações Cromatográficas das Amostras de Bufo schneideri

O extrato bruto obtido de Bufo schneideri foi submetido a purificação em CLAE em coluna absorção hidrofóbica de fase reversa C18 de aminoetilagarose eluído em em gradiente de 0 (zero) a 40 % com acetonitrila acrescido de ácido trifluoroacético (Figura 5). O cromatograma obtido pode ser visto abaixo, sendo que os picos abaixo discriminados pelos números 0, 1, 2, 3, e 4 foram coletados. Esta operação foi realizada inúmeras vezes com a finalidade de acumular material em quantidade necessária para a realização dos testes de avaliação da atividade biológica e para a determinação das estruturas dos mesmos ou ainda, quando necessário recromatografia.

Figura 5 - Cromatograma do extrato bruto de Bufo schneideri em CLAE em coluna adsorção hidrofóbica de fase reversa C18 de aminoetilagarose eluído em em gradiente de 0 (zero) a 40 % com acetonitrila acrescido de ácido trifluoroacético.

Os picos 1, 2, 3 e 4 foram submetidos a cromatografia analítica em coluna de adsorção hidrofóbica fase reversa C4 para checar a pureza, sendo o material enviado para estudos em Ressonância Magnética Nuclear e assim, tivemos confirmadas as estruturas dos picos 2, 3 e 4. Já o pico 1 foi então recromatografado, conforme descrito e ilustrado (Figuras 9 e 10) mais adiante.

4.1.1. Recromatografia do Pico 1 parcialmente purificado de Bufo schneideri (F1) A seguir pode ser visto o cromatograma obtido do pico 1 em coluna adsorção hidrofóbica de fase reversa C18 de aminoetilagarose eluído em programa isocrático com acetonitrila acrescido de

ácido trifluoroacético (Figura 9). Os picos abaixo foram denominados como Z1, Z2, 1α, 1A, 1B e 1X e dentre estes 1A e 1B foram coletados. Desta cromatografia começou-se a coletar para uma mais efetiva purificação os picos denominados de 1A e 1B, resultando deste procedimento uma fração rica parcialmente purificada 1A e um 1B puro e com sua estrutura determinada, conforme pode ser observada na Figura 10.

Figura 9 - Cromatograma obtido do pico 1 em coluna adsorção hidrofóbica de fase reversa coluna, analítica C-18 CLC (M) de aminoetilagarose (4,6 mm x 15 cm) eluído em programa isocrático a 30 % com acetonitrila acrescida de ácido trifluoroacético

4.2. Determinação da Estrutura das Novas Substâncias Biologicamente Ativas (não proteicas)

Os estudos espectrométricos de Ressonância Magnéticos Nuclear (RMN) realizados por Uchôa (2001) das substâncias que foram isoladas do extrato etanólico da secreção das glândulas parotóideas de B. schneideri, possibilitaram identificar do material enviado pelo nosso grupo de pesquisa quatro compostos classificados como Bufadienolídeos, a saber: Pico 1B – Hellebrigenin (Figura 6), Pico 2 - Telocinobufagin (Figura 7), Pico 3 – Marinobufagin (Figura 8) e Bufalin – Bufalin (Figura 9), estando aqui ordenados em ordem crescente de hidrofobicidade. Algumas das substâncias isoladas neste trabalho são citadas em outros trabalhos com outras espécies do gênero Bufo, contudo são em muitas vezes produtos de síntese usados como referência para checar análogos e não propriamente isolados do material original do animal (KAMANO et al., 1968, SHIMADA et al., 1979). Já em 1965, Zelnick chamava a atenção para a necessidade de certos trabalhos serem revistos haja vista os avanços da ciência a purificação pondo em evidência a impureza de certos compostos cristalizados considerados anteriormente puros ou revelando novos bufadienolídeos. O levantamento bibliográfico dos dados de carbono 13 de bufadienolídeos encontrados na natureza mostrou que , apesar desses compostos terem sido relatados anteriormente, nesta mesma espécie no Rio Grande do Norte por Rossi e colaboradores (1997), havia equívocos nos assinalamento de seus dados de carbono 13, principalmente para o Telocinobufagin e o Marinobufagin, sendo que o material obtido no Laboratório de Neurofarmacologia da UECE possibilitou a confirmação do isolamento e correta caracterização de seus compostos, sendo que no marinobufagin divergia o ponto de fusão o que poderia sugerir a possibilidade de ser outro composto, sendo que em Reinynolds e colaboradores (1995) num trabalho anterior ao de Rossi em que a correlação dos dados de RMN para o Marinobufagin, isolado de Bufo marinus, é fornecida e está completamente de acordo com a proposição apresentada no trabalho de Uchôa. Wang1 e colaboradores (1998) procuraram estabelecer um método de CLAE para determinar o conteúdo dos constituintes ativos no veneno de bufonídeos utlizados na medicina tradicional chinesa, tendo conseguido isolar e quantificar o resibufogenin e cinobufagin, usando uma fase móvel com uma solução de acetonitrila-0.5% - KH2PO4 (50:50), com o pH ajustado com ácido 52

fosfórico para 3,25 + 0,02 e conseguindo para estes componentes uma boa separação. Neste trabalho não é descrito nenhum dos compostos isolados em nosso laboratório.

4.2.1. Hellebrigenin O pico 1B da recromatografia de F1 após estudos foi denominado de Hellebrigenin (3β, 5β, 14β - trihidroxi – 19 – oxo – 20, 22 – bufadienolídeo, sendo também realizados testes de avaliação da atividade biológica. Esta substância está presente em plantas do gênero Helleborus sp (Ranunculaceae), muito utilizada na antigüidade como contraceptiva e abortiva e citada por Riddle (1992) como um do três principais constituintes desta planta. A partir desta molécula tem sido sintetizado derivados acil cardiosteróides e estes são ativos por via oral, sendo um exemplo destes cardiotônicos a D 12316 (acrihellin), a hellebrigenin-3 β- dimetilacrilato, encontrando-se ainda em fase de avaliação clínica .

Figura 6 - Estrutura do Pico 1B: Hellebrigenin (3β, 5β, 14β - trihidroxi – 19 – oxo – 20, 22 – bufadienolídeo)

O 24 21 23 18 20 CH3 22 12 O 11 13 17 19 16 14 15 1 9 2 10 8 OH 3 5 7 4 6 HO OH

4.2.2. Telocinobufagin Estudos realizados no Laboratório de Neurofarmacologia da Universidade Estadual do Ceará, com o telocinobufagin (Figura 6) também evidenciaram que este bufadienolídeo induz uma forte atividade anestésica local mais forte e duradoura que as da lidocaína e bupivacaína, sugerindo que esta venha ser um protótipo para uma nova classe de anestésicos locais (PATROCÍNIO et al., 2002).

Figura 7 – Estrutura do Pico 2: Telocinobufagin (3β, 5β, 14β - trihidroxi –20, 22 – bufadienolídeo.

O 24 21 23 18 20 CH3 22 12 19 11 13 17 CH3 16 14 15 1 9 2 10 8 OH 3 5 7 4 6 HO OH

4.2.3. Marinobufagin Segundo estudos realizados por nosso grupo, o marinobufagin (Figura 7) induz atividade epileptiforme nos registros eletrográficos, sendo bloqueados os ataques por drogas tais como diazepan e fenitoína, podendo tendo em vista estas prerrogativas, ser utilizado para desenvolver um modelo de estudo para o status epilepticus para avaliação farmacologia de drogas anticonvulsivantes usadas no tratamento da epilepsia (NOGUEIRA et al., 2002). O marinobufagin foi o primeiro bufadienolídeo a ser obtido na forma cristalizada, não necessariamente puro, por Abel e Match em 1911, tendo só após dez anos mais tarde sido sugerido por Faust que os bufadienolídeos eram esteróides e esta filiação foi confirmada pelo diagrama dos 54

raios-x (CROWFOOT, 1935) e pela obtenção do metilciclo pentenofenantreno a partir do marino bufagin (JENSEN, 1937).

Figura 8 – Estrutura do Pico 3: Marinobufagin (14β, 15β - epóxi - 3β, 5β -dihidroxi–20, 22 – bufadienolídeo)

O 24 21 23 18 20 CH3 22 12 19 11 13 17 CH3 16 14 15 1 9 2 10 8 O 3 5 7 4 6 HO OH

4.2.4. Bufalin O bufalin (3β, 14β - dihidroxi – 5β – bufa – 20, 22 – dienolídeo) (Figura 8) é descrito como componente do veneno de outros animais do mesmo gênero que o estudado. Este foi descrito anteriormente em diversos experimentos de purificação de componentes do Ch’an Su ou Liu-Shen- Wan na China ou Senso no Japão como um dos três maiores constituintes juntamente com cinobufagin e resibufogenin, sendo nos dois primeiros preparados chineses elaborados principalmente a partir do Bufo bufo gargarizans e no terceiro, o B. japonicus (HONG et al., 1992). A bufalin é descrita como um inibidor de bomba de sódio - potássio-ATPase e tem apresentando efeitos analgésicos (WANG et al., 1994). 55

Figura 10 - Estrutura do Pico 4: Bufalin (3β, 14β - dihidroxi – 5β – bufa – 20, 22 – dienolídeo)

O 24 21 23 18 20 CH3 22 12 19 11 13 17 CH3 16 14 15 1 9 2 10 8 OH 3 5 7 4 6 HO

Algumas das substâncias evidenciada no Bufo schneideri foram encontradas em membros deste mesmo gênero conforme será discutido a seguir. Em Bufo crucifer, espécime existente no Brasil, foram encontrados em cromatografia com placa de sílicagel em um sistema de solventes bufadienolídeos dentre os quais foram encontrados a hellebrigenin e bufalin (ZELNICK, 1965). No Bufo vulgaris formosus, um sapo japonês, Shimada e colaboradores (1977) em estudos sobre seus esteróides cardiotóxicos encontraram o bufalin. Lin e colaboradores (1984) conseguiram isolar do Ch’an Su de Formosa, elaborado com uma mistura de Bufo bankorensis Boubour e Bufo bufo asiaticus Steindachner, identificaram dentre outros também telocinobufagin, marinobufagin e bufalin. Shimada e colaboradores (1987), encontraram trabalhando apenas com Bufo bankorensis Boubour dentre outros os mesmos três bufadienolídeos que Lin e colaboradores. Já no Bufo viridis, Shimada e colaboradores (1986) isolaram o telocinobufagin, marinobufagin e apó síntese do hellebrigenin, usando-o como referência isolou esta substância e análogos das secreções deste animal. Em Bufo bufo gargarizans Cantor obtido da Corea, Shimada e colaboradores (1985) isolaram e caracterizaram o marinobufagin e bufalin. Outros pesquisadores já haviam isolado as substâncias encontradas deste mesmo animal, porém nenhum utilizando CLAE e aplicando direto o extrato do veneno bruto e obtendo tantas substâncias puras em uma cromatografia com apenas uma passagem e nem apresentado uma atividade farmacológica para estas. 56

4.3. Obtenção de Dados para Avaliação dos Índices de Rendimento Extração do Veneno Bruto de Bufo schneideri

Para fazer o extrato bruto de B. schneideri utiliza-se 5 g de veneno bruto em 25 mL de etanol absoluto, contudo para se te um valor de rendimento mais fiel após a purificação cromatográfica. Este resíduo em média pesa 1,67 g o que representa aproximadamente 33,3 % do peso do veneno bruto, sendo assim, a parte que é solúvel representa 3,33 g (66,6 %) e foi usada para efeito de cálculo. Verificando o aspecto e a solubilidade do resíduo viu-se que este era de coloração esbranquiçada e de aspecto quebradiço, sendo que quando misturado a água bidestilada com tempo e agitação formava um gel, que com mais água e vigorosa agitação dissolvia-se, adquirindo a característica de um líquido viscoso. Este, com a adição de metanol precipitou prontamente. Os estudos além de caracterizar o veneno bruto, visaram possibilitar futuramente chegar a novos métodos de extração e assim, purificar novas substâncias. O rendimento médio estimado do pico 1 em relação ao bruto foi de 1,55 %. Para os picos 1A e Hellebrigenin em relação ao pico 1 foi de 49,17 % e 24,71 % respectivamente. Já estes dois em relação ao veneno bruto tiveram um rendimento médio estimado de 0,76 % para o pico 1A e 0,38 % para a Hellebrigenin.

4.4. Cromatografia em Placa Delgada de Sílica

Foram realizadas em cromatofolhas AL de sílicagel 60 F254 Merck® do veneno bruto de Bufo schneideri obtido por compressão dos agregados glandulares parotóideos e tibial. Nas Figuras 11 e 12 a seguir, conforme podem ser observados em esquemas ilustrativos que representam os resultados obtidos, haja vista que elas descolorem rapidamente. 57

Final da eluição

“Spots”

Início da eluição

Figura 11 - Esquema do resultado do extrato bruto de B. scneideri aplicado na Lâmina de Silicagel AL60 F254 Merck® tendo como eluente o clorofórmio e sistema revelador a base de vanilina.

Na Figura 11 podem se ver manchas que são denominadas no meio corrente de “spots” que apresentaram coloração azul variando do azul claro e pálido (pouco intenso), passando por um azul forte com lilás, até um azul escuro muito intenso. Tem-se que quanto mais intensa a cor, mais concentrado está o componente. Analisando esta placa, observa-se que ela apresenta características de triterpenos, no caso já se tem o conhecimento que a amostra é rica em esteroidais, sendo que desta foram evidenciados o Telocinobufagin (spot 2) e o Marinobufagin (spot 3), anteriormente já obtidos em cromatografia em CLAE. Isto foi realizado recortando os “spots” da lâmina de silicagel e submetendo-os a coluna analítica C18 CLC usando as amostras bem conhecidas obtidas em semipreparativa C18 como referência e então se viu coincidência de saída e condições. Posteriormente esta primeira placa foi repetida trocando-se o sistema revelador de vanilina para iodo, contudo só puderam ser vistos dois “spots”, outros puderam ser evidenciados passando esta mesma placa em vanilina. Fez-se então necessário ensaiar mais uma cromatografia nas condições descritas abaixo. 58

Final da eluição Apolares

Polares Início da eluição

Figura 12 - Esquema do resultado do extrato bruto de B. scneideri aplicado na Lâmina de Silicagel AL60 F254 Merck® tendo como eluente uma mistura de clorofórmio-metanol (9:1) e sistema revelador o iodo.

Nesta placa acima (Figura 12), foi utilizado como eluente uma mistura de clorofórmio e metanol, 90% e 10% respectivamente, tendo o metanol a função de aumentar a polaridade e facilitar a separação, já como sistema revelador foi utilizado o iodo. Pode se observar o ponto de aplicação se desdobrando em dois, tendo nesta região a concentração de compostos polares, já ao final temos um “spot” que denota a região de concentração de compostos apolares Os resultados são sugestivos que como um método de pré-purificação os ensaios em cromatofolhas de sílicagel constituem uma boa alternativa, pois além de serem um método mais barato, pode-se aplicar uma maior concentração de amostra bruta inicialmente e ao utilizar-se posteriormente às colunas de purificação cromatográficas em CLAE estas seriam menos sacrificadas e ganharia uma maior vida útil. Obviamente, isto não invalida a maior precisão de um perfil cromatográfico em CLAE e se torna válido quando já se conhece bem o material a ser utilizado e se quer acumular rapidamente material para ensaios biológicos. 59

4.5. Estudos da Variabilidade do Veneno Bruto e seus Componentes em Diversas Localidades de Coleta

Uma questão que se fez presente seria a da variabilidade destes picos principais na nossa espécie de objeto de estudo, o Bufo schneideri, era se haveria variabilidade muito grande da composição básica do veneno com amostras provenientes de diferentes lugares. Observou-se que há um grau de conservação dos picos primários que são os majoritários que foram detectados inicialmente, principalmente a Fração 1 e os picos correspondentes a Telocinobufagin, Marinobufagin e Bufalin, e vem sendo estudados no nosso Estado, contudo a concentração dos mesmos variou bastante. Em termos de atividade isto não ocorreu. Ilustrativamente abaixo (Figura 13), temos dois cromatogramas obtidos pelo sistema isocrático destes estudos, sendo que apesar de preparado o extrato na mesma concentração (5 g de veneno bruto para 25 mL de etanol absoluto), ser submetido as mesma condições de ensaio cromatográficas de concentração, conforme vemos nos cromatogramas em anexo, tendo como exemplo amostras oriundas de Areia (PB) e Fortaleza (CE), houve uma variação na concentração de Telocinobufagin e Marinobufagin de maneira evidente, pois nas amostras de Fortaleza o pico correspondente a Marinobufagin (3) é muito maior que a Telocinobufagin (2), o que ocorre ao contrário no obtido de Areia. As amostras coletadas em Mossoró (RN) e Recife (PE) são muito parecidas com as de Fortaleza, coincidindo as devidas proporções entre os picos principais e tempo de saída, chama a atenção uma maior quantidade da Fração 1 no material oriundo de Mossoró. Estas diferenças levam a questionar que fatores poderiam estar influenciando nesta variação. Um primeiro seria a possibilidade de termos os bufadienolídeos vindo da dieta, haja vista que eles já foram encontrados alguns em insetos, sendo que deve ser ressaltado que até então o Hellebrigenin, Telocinobufagin, Marinobufagin e Bufalin encontrados em nossas pesquisas ou similares, não foram descritos em insetos ou vice-versa. Um segundo fator poderia ser devido atribuído a diferentes características climáticas do local das coletas influenciando no metabolismo de síntese dos bufadienolídeos. Como terceiro, deve ser dito que não são conhecidas totalmente as funções dos bufadienolídeos nos anfíbios e portanto este poderia estar variando conforme necessidades fisiológicas ou mesmo patológicas nos animais coletados. Ainda, como quarto fator possível de ser cogitado, poderiam ser subespécies do mesmo animal. 60

Figura 13 - Cromatogramas de amostras de veneno de Bufo schneideri oriundas de Areia (PB) e Fortaleza (CE). 61

4.6. Purificações Cromatográficas das Amostras de Leptodactylus pentadactylus

4.6.1. Purificações Cromatográficas das Amostras de L. pentadactylus em Coluna Filtrante Sephacryl S-400

Na Figura 14 abaixo, pode ser visto o cromatograma desta purificação onde vemos evidenciado o Pico 8, que se destacou na avaliação da atividade biológica e foi alvo de estudo de várias frentes de investigação no Laboratório.

Figura 14 – Cromatograma da purificação de proteínas em coluna preparativa filtrante Sephacryl - S 400 (0,6 cm diâmetro por 46 cm comprimento) e eluída por tampão Tris– HCl 0,05 N

4.6.1. Eletroforese do pico 8 obtido na coluna Sephacryl S-400 de L. pentadactylus.

Conforme pode ser observado na Figura 10 abaixo, o pico 8 na eletroforese tanto em condições não desnaturantes (A) e desnaturantes com SDS 1 % e β - mercaptoetanol (B) apresentou uma única banda da proteína.

A = Em condições não desnaturantes B = Em condições desnaturantes com SDS 1 % e β - mercaptoetanol

Figura 15- Avaliação eletroforética para a análise de pureza da toxina (P8) em gel de poliacrilamida 6% sob condições não desnaturantes e desnaturantes com SDS 1 % e β - mercaptoetanol.

O pico 8 é uma proteína que apresentou um peso moleculaear aparente de 29 kDa e pode ser vista como uma única banda.

4.6.2. Purificação dos peptídeos de Leptodactylus. pentadactylus

Abaixo podemos observar o cromatograma de obtenção dos peptídeos deste anfíbio em coluna semipreparativa C18 em CLAE (Figura 14). Na Figura 15, logo após, temos o cromatigrama da checagem da pureza dos picos peptídicos em coluna analítica C4 de fase reversa.

Figura 16 - Cromatograma da obtenção dos peptídeos do exsudato liofilizado de Leptodactylus pentadactylus fracionado por CLAE com coluna C18 eluído num gradiente de 5 a 80 % de acetonitrila durante 75 min., fluxo de 5 ml/min.

Figura 17 – Cromatograma de verificação da pureza cromatografia analítica em coluna de adsorção hidrofóbica fase reversa C4 dos picos 5, 6 e 7 peptídicos de Leptodactylus pentadactylus respectivamente. 65

4.7. Avaliação de Atividades Biológicas

Os resultados experimentais de avaliação da atividade biológica das amostras obtidas podem ser subdivididos em duas partes: a) ação hemolítica das amostras e, b) antimicrobiana.

4.7.1. Atividade hemolítica de amostras obtidas de Bufo schneideri:

Os ensaios para a avaliação de uma possível atividade hemolítica por parte dos picos, assim como pelo extrato bruto, tem abaixo seus resultados expressos em tabelas comentadas.

Tabela 4 - Resultado da leitura em espectrofotômetro a 541 nm do sobrenadante dos poços da placa de microtitulação da avaliação da atividade hemolítica dos das amostras obtidas da secreção da pele de Bufo schneideri.

Amostra EB F1 Hb Tc Mb Bf Poço no 1 0 833 1010 1216 0 400 2 0 217 350 0 0 220 3 0 200 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0

______Quantidade da 62,5 125 250 125 amostra (μg)

Concentração ____ 0,125 0,25 0,5 ____ 0,25 (μL/mL)

Obs: 1. O valor de referência para servir como zero de calibragem do espectrofotômetro foi o sobrenadante de hemácia 5% de camundongo + salina (sol. NaCl 0,85%).

2. O poço 1 contém a amostra na concentração – mãe da cromatografia.

EB = Extrato bruto; F1 = Fração parcialmente purificada 1; Hb = Hellebrigenin; Tc = Telocinobufagin; Mb = Marinobufagin; Bf = Bufalin

Conforme pode-se observar na Tabela 4, quando comparado com o padrão utilizando a leitura da absorbância dos sobrenadantes dos poços das placas de microtitulação e realiza-se a leitura em 66

um espectrofotômetro a um comprimento de onda de 541 nm, sendo este calibrado quanto ao seu zero com o sobrenadante da incubação de uma suspensão de hemácias à 5% com igual volume de salina, pode-se verificar que apenas os picos 1 e 2 apresentaram leituras, o que evidencia que houve um aumento na concentração do sobrenadante detectável de hemoglobina, sendo muito mais preciso do que a observação à vista desarmada. A fração F 1, causou hemólise comprovadamente nos poço 1, 2 e 3, resultando numa concentração hemolisante mínima (CHM) para que se detecte a atividade nas condições experimentais de 0,125 μg/mL ou ainda, uma quantidade mínima de amostra no poço de 62,5 μg; na amostra do Hellebrigenin observou-se hemólise nos poços 1 e 2, o que significa uma CHM de 0, 25 μg/mL ou 125 μg; quanto ao Telocinobufagin detectamos uma intensa hemólise apenas no poço 1, com a concentração original (0,5 ug/mL, ou 250 μg), sendo esta mais intensa do que a obtida por incubação em condições idênticas de suspensão de hemácias à 5% e água (controle positivo) e posteriormente submetido a vigorosa agitação repetida deste controle. O Marinobufagin não apresentou atividade hemolítica nas condições experimentais, já o Bufalin apresentou hemólise nos poço 1 e 2, resultando numa CHM de 0, 25 μg/mL ou ainda, 125 μg. Importante ressaltar que o Hellebrigenin é uma amostra que foi obtida com alto grau de pureza da recromatografia com um sistema isocrático de concentração em CLAE, conforme pode ser observado em cromatograma da Figura 9. O resultado encontrado para o extrato bruto poderia talvez ser justificado por ser este em grande parte relativa constituído pelo Marinobufagin, amostra que não apresentou a atividade hemolítica. Outra ainda, seria pelo TFA estar como composto residual e ter atividade hemolítica nas demais amostras e não extrato bruto, contudo isto não procede, pois tivemos amostras obtidas da cromatografia que tanto apresentaram como não a atividade testada. Analisando os valores obtidos para a atividade hemolítica do Telocinobufagin pode se dizer que esta é mais significativa, considerando a intensidade, do que para a fração F1 e um pouco mais do que o Hellebrigenin baseado nos registros de absorbância do sobrenadante. Na literatura, para peptídeos vem sendo bem discutida cada vez mais a respeito de peculiaridades que poderiam ser possíveis causas da atividade hemolítica ser maior ou menor, contudo para bufodienolídeos não, o que abre uma série de possibilidades a serem exploradas. A atividade hemolítica em si pode ser referendada pelo trabalho de Das e colaboradores (1998) que encontraram uma série de alterações hematológicas e na bioquímica do sangue in vivo utilizando ratos destacando-se o decréscimo da hemoglobina, hematócrito, aumento de alguns 67

leucócitos e alterações enzimáticas e níveis de componente tais como glicose, uréia e creatinina como exemplo. Apesar de não ter utilizado hemácias conforme em nosso trabalho, mas células primárias de carcinoma de fígado (PRC/PRF/5), Kamano e colaboradores (1998) encontraram ao mensurar o -4 -1 índice de citotoxicidade (IC50) para o Telocinobufagin 3,5x10 μg /ml, Marinobufagin 5,2x10 μg /ml e Bufalin 2,8x10-4 μg /ml. Na Figura 18 abaixo, se observa a representação de uma Bufalin que no trabalho de Kamano e colaboradores (1998) apresentam o efeito de alterações nesta estrutura e sua influência na atividade citolítica.

Figura 18 – Efeitos de variações parciais de da estrutura e grupos na atividade citotóxica de bufodienolídeos, cardienolídeos de ocorrência natural e seus análogos relacionados.

4.7.2. Atividade hemolítica de amostras obtidas de Leptodactylus pentadactylus

Amostras de natureza protéica

Na Tabela 5, pode-se visualizar os valores obtidos em espectrofotômetro a 541 nm do sobrenadante das cavidades das placas de microtitulação (poços) utilizada nos ensaios de amostras obtidas da secreção de L. pentadactylus em cromatografia com coluna Sephacryl S-400® (P1 – P11). Visamos neste ensaio detectar a presença ou não da atividade hemolítica, sua intensidade, bem como estabelecer um título para estimativas quanto a relação concentração - atividade.

Tabela 5 - Resultado da leitura em espectrofotômetro a 541 nm do sobrenadante dos poços da placa de microtitulação da avaliação da atividade hemolítica dos das amostras obtidas da cromatografia em Sephacryl S-400 da secreção da pele de Leptodactylus pentadactylus contra suspensão a 5% de sangue de ratos albinos Wistar.

Amostra P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 Poço no 1 877 1088 864 988 845 987 1062 905 788 791 931 2 1223 1497 1158 1174 984 1179 1409 1064 885 999 940 3 1256 1403 1039 1062 968 849 1374 998 815 1148 675 4 829 823 713 849 1096 1046 1345 1006 864 1038 362 5 605 454 639 1000 1003 939 1210 946 686 652 204 6 257 138 290 718 835 914 962 913 754 497 146 7 92 170 166 407 329 350 1003 784 852 197 0 8 10 0 27 144 437 251 850 871 713 53 0 9 0 0 0 0 225 68 494 805 637 0 0 10 0 0 0 0 7 0 199 864 294 0 0 11 0 0 0 0 0 0 67 555 158 0 0 12 0 0 0 0 0 0 18 359 52 0 0 13 0 0 0 0 0 0 0 130 20 0 0 14 0 0 0 0 0 0 0 66 0 0 0 15 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 16 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 Título 27 26 27 27 28 27 211 215 212 27 25

Obs: 1. O valor de referência para servir como Zero de calibragem do espectrofotômetro foi o sobrenadante de hemácia 5% de camundongo + salina (sol. NaCl 0,85%).

2. O poço 1 contém a amostra na concentração – mãe da cromatografia. 69

Neste ensaio pode-se, não só detectar uma atividade hemolítica como também uma atividade aglutinante das hemácias (destacados com cor na Tabela 5), observa-se que no primeiro poço para todos os picos (P1 – P11).do ensaio das amostras obtidas da coluna Sephacryl S-400® (valores sombreados na tabela), um menor valor de leitura do sobrenadante que foi devido a uma outra atividade também observada que foi a de aglutinação das hemácias por parte da amostras testadas. Para os picos denominados de P8, P9 e P7 (em ordem decrescente de intensidade) apresentaram maior atividade hemolítica in vitro e mataram mais rapidamente nos ensaios in vivo realizados com ratos Wistar. O pico 8, o de maior intensidade hemolisante teve seu teor de proteína -4 determinado pelo método de Bradford e feito os devidos cálculos encontrou-se 2,09 x 10 μg, que corresponde a quantidade existente no poço que ainda causava hemólise, representando uma -6 concentração hemolisante mínima (CHM) para esta amostra de 2,09 x 10 μg/μl. Foram testadas in vitro com o pico 8 da cromatografia em Sephacryl S-400 hemácias de outras duas espécies, haja vista que foi o mais ativo contra a suspensão a 5% de hemácias de rato com um título de 215 como concentração hemolisante mínima. Para caprinos, encontrou-se um título de 28 -4 (CHM = 1,34x10 μg/μl), já em hemácias de humanos, também procurou-se avaliar uma possível variação quanto aos tipos sangüíneos O e A, tendo como resultado uma maior susceptibilidade à 8 -4 hemólise o tipo O comparando com o A, com títulos respectivamente de 2 (CHM= 1,34x10 μg/μl) 5 -3 e 2 (CHM = 1,07x10 μg/μl). Avaliou-se também a influência de temperatura mais baixa ( + 4 °C) nos eventos acima 8 6 -4 descritos, e foi encontrada uma redução dos títulos de 2 para 2 (CHM = 5,35x10 μg/μl) nos caprinos, também sendo observada esta variável nos ensaios com suspensão de sangue humano a 5% 8 4 -3 5 1 -2 que variou de 2 para 2 (CHM = 2,14x10 μg/μl) e de 2 para 2 (CHM = 17,12x10 μg/μl), respectivamente para os tipos O e A, podendo-se ver pelos resultados encontrados observou-se uma redução sensível da atividade hemolítica para todas as hemácias testadas, possivelmente pela menor velocidade de interação do sítio responsável pela atividade hemolítica com a superfície das diferentes hemácias. 70

Amostras de natureza peptídica obtida em coluna hidrofóbica C18 com CLAE

Foram avaliados os picos P1, P5, P6, P7 e P14, sendo que destes, continuaram os estudo dos P5, P6 e P7 devido a uma questão de viabilidade metodológica de separação e purificação com rendimento aceitável.

Tabela 6 - Resultado da leitura em espectrofotômetro a 541 nm do sobrenadante dos poços da placa de microtitulação da avaliação da atividade hemolítica dos das amostras peptídicas obtidas da cromatografia em coluna absorção hidrofóbica de fase reversa C18 de aminoetilagarose eluído em programa isocrático a 5 % com acetonitrila acrescida de ácido trifluoroacético da secreção da pele de L. pentadactylus.

Amostra Extrato Poço no Bruto P1 P5 P6 P7 P14 1 0 556 547 836 480 121 2 0 505 65 63 475 24 3 0 500 10 0 160 0 4 0 246 6 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 Títulos ___ 24 24 22 23 22

Obs: 1. O valor de referência para servir como zero de calibragem do espectrofotômetro foi o sobrenadante de hemácia 5% de camundongo + salina (sol. NaCl 0,85%).

2. O poço 1 contém a amostra a 50 % da concentração – mãe da cromatografia.

Os peptídeos 1 e 5 apresentaram o valor mais expressivo de CHM ( 24 ), contudo com intensidades diferentes. As amostras P6 e 7 também apresentaram títulos iguais ( 23 )e intensidades diferentes, sendo P6 o que apresenta os maiores valores de leitura de absorbância e de todos portanto o que causou uma hemólise mais intensa. A amostra P14 foi a que apresentou intensidade e título menos expressivo, sendo que o extrato do veneno bruto nas condições experimentais não apresentou atividade hemolítica em relação aos controles. Nascimento e colaboradores (2002) coletaram e recromatografaram duas frações hemolíticas de Leptodactylus ocellatus, um animal de espécie diferente do que foi utilizado nos experimentos aqui documentados, obtendo duas toxinas peptídicas com homologia que permite agrupá-los na família das brevininas. É vigente que a atividade hemolítica de eritrócitos humanos de um peptídeo antimicrobiano é freqüentemente usada para mensurar a citotoxicidade do mesmo e estimar seu índice terapêutico, pois se baseando na ausência ou presença de atividade hemolítica este peptídeo pode ser classificado 71

antibiótico ou venenoso, respectivamente. Contudo, este é um ponto que cada vez mais se torna discordante no meio científico. Helmerhorst e colaboradores (1999) afirmam enfaticamente que certos conceitos têm que ser revistos, pois em estudos mostraram que as propriedades hemolíticas de peptídeos catiônicos são fortemente dependentes de sob quais condições o ensaio de avaliação da atividade hemolítica é realizado, tal como a força iônica do tampão de incubação, o frescor da amostra de sangue e diferenças individuais dos diferentes antígenos dos grupos sangüíneos. Reforçando esta idéia mais nova temos vários trabalhos que podem ser citados, tendo a seguir apresentado alguns exemplos. Três peptídeos isolados por Simmaco e colaboradores (1993) da secreção da pele de uma rã européia, Rana esculenta, dois deles semelhantes a brevinina-1 e 2 isolados de uma rã japonesa, Rana brevipoda porsa, por Morikawa e colaboradores (1992), já o terceiro peptídeo, chamado esculentina, diferia muito dos outros dois, pois apesar dos três apresentarem atividade antimicrobiana mesmo que distinta contra bactérias gram negativas e positivas, sendo a esculentina que apresentou a maior atividade contra Staphylococcus aureus, tem uma mais baixa atividade hemolítica. Já Kwon e colaboradores (2000) em um estudo clonaram os genes de expressão e isolaram a gaegurina 4 de uma rã coreana chamada Rana rugosa, sendo que esta manifestou atividade antimicrobiana contra bactérias gram negativas e positivas, fungos e protozoários em detrimento de um muito discreto efeito hemolítico sobre hemácias humanas. Olson III e colaboradores (2000) observaram que o peptídeo pseudina-2, isolado do extrato da pele de Pseudis paradoxa é um dos peptídeos antimicrobianos mais potentes já encontrados, atuando contra Staphylococcus aureus e Candida albicans e com baixa atividade hemolítica. Os autores citam que este em contraste com estudos relatados anteriormente de avaliação da atividade hemolisante e expressos como valores de Concentração Hemolisante que lisa 50% das hemácias

(CH50) em μM que as temporinas da Rana grylio apresentavam 4 e 16 μM (KIM et al., 2000), kassinatuerina-1 da Kassina senegalensis 30 μM (MATTUTEa et al., 2000), ranatuerina-1 pela Rana catesbeiana 130 μM (GORAYA et al., 1998) foi encontrado para a pseudina-2 um valor de 300 μM que é considerável. Feder e colaboradores (2000) demonstraram que a interrelação entre estrutura-atividade da dermaseptina S4 mostrando as conseqüências oligomerização na citotoxicidade seletiva utilizando 72

várias bactérias gram negativas, protozoários e hemácias humanas.chegaram a conclusão que quando manipulavam os domínios hidrofóbicos para reduzir hidrofobicidade ou pelo aumento da rede de cargas positivas afetavam dramaticamente a atividade do peptídeo e resultava em vários análogos que dispunham de potente atividade antibacteriana mas reduzida atividade hemolítica, contudo, segundo Mangoni e colaboradores (2000) estudando as bombininas H (H de hidrofòbicas e hemolíticas) saumentar a hidrofobicidade e a cargas positivas não resulta em aumento da atividade pelo menos comprovadamente a antimicrobiana o que ésugestivo ue há um conjunto de fatores responsáveis tanto para a atividade antimicrobiana como para a hemolítica. 73

4.7.3. Avaliação da Atividade Antimicrobiana

4.7.3.1. Em Meio Sólido a) Bufo schneideri A Fração 1 e os picos 1B, 2 e 4 de Bufo schneideri apresentaram atividade antimicrobiana nos ensaios em meio sólido de Mueller – Hinton de amplo espectro para as bactérias testadas com disco de papel e também atividade hemolítica, a qual alguns autores associam esta atividade a antimicrobiana, já o Marinobufagin não apresentou nenhuma das duas atividades, conforme pode ser observado nos resultados abaixo apresentados na Tabela 7.

Tabela 7 -. Tamanho dos halos de inibição de .amostras obtidas da secreção da pele de Bufo schneideri frente aos microorganismos testados

Microorganismos

Amostras EBA EC KBP PA BCS STA Extrato Bruto ______8,0** Fração 1 14,5 12 ______15,0 13,0** Hellebrigenin 9,0 9,0 ______13,0 10,0 Telocinobufagin 15,0 9,0 9,0** ___ 15,0 13,5* Marinobufagin ______Bufalin ___ 8,0** ______8,0

* Tamanho do halo de inibição expresso em milímetros. ** Inibição parcial

EC = Escherichia coli ATCC 25922 STA = Staphylococcus aureus ATCC 6538P BCS = Bacillus subtilis ATCC 6631 EBA = Enterobacter aerogenes ATCC 13048 PA = Pseudomonas aeruginosa KBP = Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 ___ Resultado Negativo

A fração 1 (F1), já utilizada em ensaios anteriores com as outras amostras puras, serviu como referência para o Hellebrigenin puro, produto de sua recromatografia, encontrando-se também para este último atividade antimicrobiana, contudo não tão intensa quanto à fração F1. As alíquotas de F1 e do Telocinobufagin apresentaram atividade semelhante para os microorganismos testados, sendo que a maior atividade para Bacillus subtilis ATCC 6631, Staphylococcus aureus ATCC 6538P e Enterobacter aerogenes ATCC 13048, sendo que o 74

Hellebrigenin apesar de ter uma atividade menos intensa é efetivo para as mesmas bactérias que estes dois primeiros, ressaltando que os dois primeiros microorganismos são gram positivos. A alíquota testada do Marinobufagin, nas condições experimentais, não inibiu o crescimento de nenhuma das bactérias testadas, sendo que o Bufalin só demonstrou atividade inibitória do crescimento da bactéria Staphylococcus aureus ATCC 6538 e uma fraca atividade de inibição parcial para Escherichia coli ATCC. A bactéria gram negativa de metabolismo oxidativo Pseudomonas aeruginosa não foi inibida em seu crescimento por nenhuma das amostras utilizadas nas condições experimentais. As amostras 1B e 2, os de menor hidrofobicidade apresentaram as maiores atividades inibitórias contra os microorganismos testados. Uma possibilidade de não ter sido observada para o extrato bruto uma atividade antimicrobiana satisfatória e nenhuma hemolítica ou mais fraca, conforme foi observado para as outras amostras de B. schneideri que foram ensaiadas, pode ter uma possível explicação nos dados que estão no trabalho de Medina e Espinoza (1995) com Bufo marinus. Neste, ao realizar experimento com a secreção da pele contra diversas bactérias pelos métodos de macrodiluição com caldo nutritivo e em meio sólido com discos, só foi encontrada atividade antibacteriana contra Escherichia coli ATCC 25922 e Staphylococcus aureus ATCC 25923, sendo que apenas para a secreção obtida de fêmeas, tendo resultados negativos para a oriunda de machos desta espécie de sapo ao que usamos um homogenato de secreções de ambos os sexos como prática corrente em nosso laboratório. É importante ressaltar que a presença de atividade antimicrobiana no gênero Bufo, não havia sido descrita ainda para seus bufadienolídeos, mas apenas para peptídeos ou extratos da secreção da pele, como é mostrado no trabalho de Cunha-Filho e colaboradores (2002) com Bufo rubescens, onde se acharam atividade contra a bactéria Escherichia coli e uma fraca atividade hemolítica. A atividade antimicrobiana de algumas substâncias de origem lipídica foi descrita por Bibel e colaboradores (1993), contudo numa classe que não têm relação com os bufadienolídeos, as esfingosinas que acabam constituíndo barreiras da pele contra bactérias, produzidas no extrato córneo em humanos, destacando-se a esfinganina, ativa contra cepas resistentes de Staphylooccus aureus e fungos, tais como Candida albicans que se mostrou susceptível não só a esfinganina, mas também a esfingosina, dimetilesfingosina, e em menor grau a estearilamina. Em ensaios realizados 75

em meio líquido estes lipídios foram ativos contra Trichophyton mentagrophytes, T. tonsurans e Epidermatophyton floccosum (BIBEL et al., 1995). Kabara e colaboradores (1977) descrevem ensaios de triagem iniciais de atividade antimicrobiana com 40 ácidos graxos, dentre naturais e compostos sintéticos, encontrando atividade contra leveduras, bactérias gram positivas, contudo não para as negativas. Destacando-se os ácidos graxos epimino e selena, com cadeias lineares não substituídas. A presença e posição de uma dupla ou tripla ligação, normalmente um importante fator em cadeias longas de ácido graxo (maiores que 14 carbonos) teve pequeno ou nenhum efeito em ácidos graxos de 11 carbonos. A atividade antimicrobiana ótima foi encontrada para ácidos graxos e seus correspondentes monoglicerídeos quando o comprimento de cadeia era de 12 carbonos. A squalamina (Figura 18A), um novo aminosterol isolado dos tecidos de um tubarão Squalas acanthias e com estrutura química demonstrada como 3β-N-1- [N(3-[4-aminobutil])-1,3 diaminopropano]-7α-hydroxi- 5α-colestan-24R-il sulfato por espectroscopia de massa e NMR bidimensional, exibindo uma potente ação bactericida contra bactérias gram positivas e negativas (MOORE et al., 1993; RAO et al., 2000), diferenciando-se estruturalmente dos bufadienolídeos pela ausência de duplas, mas com o esqueleto carbônico semelhante é o mais. Dentre os análogos sintéticos deste, MSI- 1436, 3β-espermina-7α-hydroxi-5α-colestan-24R-il sulfato (Figura 18B).

A B

Figura 19 – (A) Estrutura da squalamina, um aminosterol, 3β-N-1- [N(3-[4-aminobutil])-1,3 diaminopropano]-7α-hydroxi- 5α-colestan-24R-il sulfato e em (B) o sintético MSI- 1436 com R1 = espermina, R2 = R-OH e R3 = OH.

Estes análogos, com estrutura idêntica a squalamina exceto por uma poliamina simétrica em C3 (espermidina), além de outras substituições em C7 e C24, aumentando em muito a sua eficácia antimicrobiana. Com a metodologia de síntese e ensaios de avaliação antimicrobianos de análogos MSI-1436 com Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans, pôde-se conhecer um pouco da inter-relação entre os grupos funcionais e a atividade, sendo descrito Alterações em C24 forneceram três variáveis: um sulfato que proporcionada carga negativa à molécula em pH neutro; um grupo amino, carga positiva; e um grupo hidroxi sem carga, apesar de alterar a estereoisomeria. Análogos com 7-hydroxyl. (α ou β) e sem este grupamento foram também testados influenciaram também na atividade , estas mudanças por si só refletiram em alterações não tão drásticas para alguns dos microorganismos testados como modificações em C3, contudo a somatória destas altera bastante a atividade antimicrobiana (JONES et al., 1996; SHU et al., 2002). 77

Podem ser visualizadas juntas na Figura 20 a seguir, as estruturas dos quatro bufadienolídeos isolados e utilizados nos experimentos de B. schneideri neste trabalho de doutoramento para que se possam tecer alguns comentários.

O O O O 24 24 21 21 23 23 18 20 18 20 CH3 22 CH3 22

12 19 12 17 O 11 13 17 CH 11 13 19 16 3 16 14 14 15 15 1 9 1 9 2 2 10 8 10 8 OH OH 3 5 7 3 5 7 4 6 4 6 HO HO OH OH

Helebrigenin Telocinobufagin O O O 24 O 24 21 23 21 23 18CH 20 18 20 3 22 CH3 22

19 12 17 12 11 13 19 13 17 CH3 16 CH 11 14 3 16 15 14 1 9 15 2 10 8 1 9 O 2 10 8 3 5 7 OH 4 6 3 5 7 HO 4 6 HO OH

Marinobufagin Bufalin

Figura 20 – Estrutura dos quatro bufadienolídeos isolados de B. schneideri.

Analisando-as, observa-se que todos os bufadienolídeos que apresentaram atividade, tanto hemolítica como antimicrobiana apresentavam no carbono14 um grupamento hidroxila, o que não acontece com o Marinobufagin que possui um grupamento epoxi e que nas condições experimentais não apresentou nenhuma das duas atividades testadas. A maior ou menor hidrofobicidade dos compostos pode ter um papel secundário, pois apesar dos dois mais ativos serem os menos hidrofóbicos, Hellebrigenin e Telocinobufagin, temos que o Marinobufagin que tem uma hidrofobicidade menor que o Bufalin, não apresenta nenhuma atividade dentre as testadas, ao contrário do Bufalin que apresentou fracas atividades antimicrobiana e hemolítica. 78

b) Leptodactylus pentadactylus

Os resultados com os picos oriundos da Sephacryl S-400® (P1 – P11) foram pouco expressivos, possivelmente devido a seu elevado peso molecular que prejudica a difusão radial do disco de ensaio para as extremidades, tendo então a necessidade de realizar ensaios em meio líquido, no qual não teremos influência do peso elevado. Já alguns peptídeos forneceram os resultados a seguir. Kennedy e Cooper (1998) observando fascinados a espuma que envolve os ovos de Leptodactylus pentadactylus em Trinidad especularam que devido as condições pouco higiênicas das águas esta espuma deve possuir substâncias antimicrobianas, porém estudos encontraram proteínas incomuns envolvidas na formação desta espuma, sendo que nenhuma substância antimicrobiana de largo espectro havia sido encontrada.

4.7.3.2. Em Meio Líquido

Os controles utilizados nos experimentos em meio líquido denominados de C1, composto de cultura de microorganismos utilizada como inóculo sem amostra e C2, 50 μl de cultura de microorganismos + 50 μl de meio de cultura BHI.

a) Amostras de Bufo scneider

a.1. Extratos de Pele de B. schneideri

Abaixo pode ser visto o resultado do diferentes extratos de pele denominados de DA (extrato da região dorsal em água), DE (extrato da região dorsal em etanol), VA (extrato da região ventral em água), VE (extrato da região ventral em etanol). GA (extrato da região glandular em água), GE (extrato da região glandular em etanol), e GE contra quatro microorganismos: Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella choleraesuis choleraesuis var typhi, Bacillus subtilis e Staphylococus aureus após 24 horas de incubação. Inicialmente se fez a pergunta de qual seria em termos de proteção contra microorganismo a área que necessitaria disto. Pelo maior contato com o solo e a forma de locomoção, a parte ventral seria bem sugestiva, contudo não se deve esquecer que quando se pensa em predadores, tanto pela exposição ou mesmo deglutição deste anfíbio, o dorso e a lateral são muito importantes também. 79

Figura 21 - Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras de extratos de diferentes regiões de pele de Bufo schneideri contra Enterobacter aerogenes em meio líquido.

2500

2000 GA GE 1500 VA

1000 VE DA Absorbância (492 nm) 500 DE C

0 1234567891011 Diluição

Como pode ser visto acima que para este microorganismo temos que as amostras do extrato feito com material oriundo da região dorsal do animal são menos eficientes, DA tem efeito apenas na concentração-mãe representando 6,25 mg do material e para DE com 3, 13 mg. Para as amostras da região ventral foram observados resultados melhores, contudo com uma redução menos intensa. As amostras DA e DE apresentaram uma concentração mínima para o efeito de inibição do crescimento desta bactéria de 0,78 e 0,2 mg respectivamente e uma redução mais intensa do crescimento conforme pode ser visto na Figura 19. A Enterobacter aerogenes é uma bactéria gram negativa que habita o trato digestório de animais e pode a ser importante como contaminante oportunista, encontrado em águas contaminadas ou que recebam dejetos de animais, podendo contaminar alimentos.

Figura 22 - Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras de extratos de diferentes regiões de pele de Bufo schneideri contra Escherichia coli em meio líquido.

2500

2000 GA GE 1500 VA VE 1000 DA DE

Absorbância (492 nm) 500 C

0 1234567891011 Diluição

É sugestivo que este microorganismo é sensível aos extratos, contudo de uma maneira geral, em concentrações altas é muito pouco responsíveis ao extrato VE nas condições experimentais. A concentração mínima para que se verifique inibição foi de 6,25 mg para GA, VA, DA, DE, sendo a exceção GE que teve seu efeito com 1,57 mg. A Escherichia coli é um importante indicador de contaminação por fezes, haja vista que faz parte da microbiota de inúmeros animais, podendo caracterizar quadros de diarréia em animais, podendo ser mortal em indivíduos jovens.

Figura 23 - Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras de extratos de diferentes regiões de pele de Bufo schneideri contra Klebsiella pneumoniae em meio líquido.

2500

2000 GA GE 1500 VA VE 1000 DA DE

Absorbância (492 nm) 500 C

0 1234567891011

Diluição

A exceção de VA que apresentou valores de absorbância semelhantes ao do controle mesmo na concentração mais alta e portanto, negativo, detectou-se para GA, DA e DE ação inibitória do crescimento de K. pneumoniae apenas na concentração mínima de 6,25 mg, sendo para VE 1,56 mg e GE de pelo menos 0,59 mg. Esta bactéria, gram negativa e uma Enterobacteriaceae, têm importância em casos de infecção hospitalar para humanos e animais, sendo pouco importante para anfíbios.

Figura 24 - Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras de extratos de diferentes regiões de pele de Bufo schneideri contra Salmonella choleraesuis choleraesuis var typhi em meio líquido.

2500

2000 GA GE 1500 VA VE 1000 DA DE 500

Absorbância (492 nm) C

0 1234567891011

Diluição

Semelhante ao observado e descrito para a bactéria anterior, ocorreu para VA com Salmonella choleraesuis choleraesuis var typhi, não sendo observado mais uma vez a sua ação inibitória nas condições experimentais. Já com VE, GA, DA e DE a ação inibitória do crescimento ocorreu apenas no valor de concentração maior (6,25 mg) e para GE verificou-se um valor de aproximadamente 0.39 mg. É de importância este indicativo de atividade, haja vista que as salmonelas, bactérias gram negativas da família das Enterobacteriaceae, são um caso de Saúde Pública podendo contaminar alimentos e afligirem a humanos e animais (SPIKA et al., 1987). Além disto, aliado a uma série de outras bactérias, a exemplo do Proteus sp., serem componentes da microbiota de répteis. 83

Figura 25 - Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras de extratos de diferentes regiões de pele de Bufo schneideri contra Bacillus subtilis em meio líquido.

2500

2000 GA

1500 GE VA 1000 VE DA Absorbância (492 nm) 500 DE C 0 1234567891011 Diluição

Esta bactéria, bem como a seguinte, Staphylococus aureus, são gram positivas e chamam a atenção pelo comportamento quando ensaiadas com o extrato VE que foi bem mais ativo contra elas do que para as quatro primeiras bactérias já apresentadas anteriormente que sãoclassificadas como sendo gram negativas. Pode-se observar uma maior resistência ao crescimento mesmo com a diluição seriada, sendo mais perceptível para GE mesmo apesar de apresentar um valor de concentração inibitória mínima de 0, 78 mg, para GA e VE 1,56 mg, VE 2,34 mg, DA 6,25 mg e DE considerado negativo.

Figura 26 - Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras de extratos de diferentes regiões de pele de Bufo schneideri contra Staphylococus aureus em meio líquido.

2500

2000 GA ) GE

1500 VA VE 1000 DA DE Absorbância (492 nm 500 C

0 1234567891011 Diluição

Neste se destaca a atividade antimicrobiana de GE que teve um valor de concentração inibitória menor do que 0,0061 mg ou ainda expressando em outra unidade 6,1 μg, podendo observar de uma maneira geral maior atividade para todas as amostras testadas com este microorganismo quando comparado com os valores de inibição e o comportamento encontrado para os outros testados. As concentrações inibitórias mínimas contra o S. aureus foram de GA 1,56 mg, VA 1,04 mg, VE 0,098 mg, DA e DE 0,78 mg. Nestes experimentos, pôde-se observar que GE se destaca das outras amostras em termos de atividade antimicrobiana com as bactérias testadas.

a.2 Amostras dos picos purificados obtidos de B. schneideri Os ensaios procederam utilizando os tempos de 12 e 24 horas como limites para uma avaliação extrema com Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Bacillus subtilis e .Staphylococcus aureus, as bactérias de maior expressividade nos testes em meio sólido. A seguir podem ser vistos os resultados de cada amostra com seus respectivos desvios-padrão com 12 e 24 horas entre parênteses para melhor entendimento dos gráficos de barra a exceção do extrato 85

bruto (EB) da secreção da pele de B. schneideri que apesar do ter sido testado com todas as bactérias e não terem sido observados nas condições experimentais atividade antmicrobiana, para melhor visualização do restante dos dados não aparecerá nas figuras abaixo.

Figura 27 - Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras obtidas da secreção da pele de Bufo schneideri contra Enterobacter aerogenes em meio líquido.

F1 = Fração parcialmente purificada 1; Hb = Hellebrigenin; Tc = Telocinobufagin; Mb = Marinobufagin; Bf = Bufalin; L1 (12) = Leitura 1 com 12 horas; L2 (24) = Leitura 2 com 24 horas

A amostra Telocinobufagin (657 ± 4,242641 e 938 ± 6,363961) foi a que inibiu mais intensamente este microorganismo, seguida pela Fração parcialmente purificada F1 (692 ± 4,949747 e 969 ± 4,949747)e a Hellebrigenin (838 ± 2,828427 e 1012 ± 4,242641), sendo mais intenso o efeito com 12 horas do que na leitura posterior decorrida mais 12 horas de crescimento, onde as diferenças foram menores. Em meio líquido as amostras do Marinobufagin (1035 ± 2,828427 e 1102 ± 2,828427) e o Bufalin (1019 ± 5,656854 e 1059 ± 3,535534) não apresentaram atividade antimicrobiana quando comparadas com os controles C1 (1050 ± 3,535534 e 1110 ± 2,828427) e C2 (1012 ± 1,414214 e 1046 ± 2,12132), sendo que notou-se uma maior dificuldade de solubilização conforme aumentava a hidrofobicidade, de Hellebrigenin para Bufalin. 86

Figura 28 - Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras obtidas da secreção da pele de Bufo schneideri contra Escherichia coli em meio líquido.

F1 = Fração parcialmente purificada 1; Hb = Hellebrigenin; Tc = Telocinobufagin; Mb = Marinobufagin; Bf = Bufalin; L1 (12) = Leitura 1 com 12 horas; L2 (24) = Leitura 2 com 24 horas

Observou-se uma maior atividade contra Escherichia coli para F1 (700 ± 5,656854 e 968 ± 3,535534), sendo que Hellebrigenin (838 ± 4,242641 e 1012 ± 4,242641), oriundo desta amostra anterior teve uma atividade um pouco menor que esta, mas maior que Telocinobufagin (859 ± 2,828427 e 1019 ± 2,828427). Uma discreta atividade foi encontrada para Bufalin (924 ± 4,242641 e 1026 ± 4,242641), mas nenhuma para Marinobufagin (1020 ± 5,656854 e 1054 ± 7,071068) comparativamente aos controles C1 (1022 ± 3,535534 e 1168 ± 5,656854) e C2 (968 ± 4,949747 e 1099 ± 4,949747). Com esta bactéria as diferenças entre 12 e 24 horas foram bem menores do que para outras ensaiadas. 87

Figura 29 - Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras obtidas da secreção da pele de Bufo schneideri contra Bacillus subtilis em meio líquido.

EB = Extrato bruto; F1 = Fração parcialmente purificada 1; Hb = Hellebrigenin; Tc = Telocinobufagin; Mb = Marinobufagin; Bf = Bufalin; L1 (12) = Leitura 1 com 12 horas; L2 (24) = Leitura 2 com 24 horas

Pode-se ver que as amostras F1 (662 ± 4,949747 e 965 ± 4,242641), Hellebrigenin (738 ± 6,363961 e 1004 ± 2,12132) e Telocinobufagin (657 ± 5,656854 e 944 ± 4,242641) apresentaram atividade antimicrobiana contra este microorganismo gram positivo, tanto com 12 como 24 horas, sendo que Marinobufagin (1075 ± 3,535534 e 1187 ± 2,828427) e Bufalin (1079 ± 2,828427 e 1189 ± 3,535534) não diferiram dos controles C1 (1175 ± 3,535534 e 1290 ± 3,535534) e C2 (1054 ± 4,242641 e 1182 ± 2,12132), podendo assim ser o Marinobufagin e Bufalin considerados sem atividade antimicrobiana nas condições experimentais contra Bacillus subtilis. Algumas cepas de B. subtilis e B. licheniformis foram isoladas de carneiro e frango incriminados em episódios de intoxicação alimentar, sendo a primeira mais conhecida por seus efeitos benéficos como produção de antibióticos e no controle biológico (FDA/CFSAN, 2003). 88

Figura 30 - Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana das amostras obtidas da secreção da pele de Bufo schneideri contra Staphylococcus aureus em meio líquido.

Pode-se ver que as amostras F1 (454 ± 3,535534 e 859 ± 6,363961), Hellebrigenin (461 ± 2,828427 e 896 ± 2,828427) e Telocinobufagin (354 ± 1,414214 e 726 ± 2,12132) apresentaram atividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus tanto com 12 como 24 horas, sendo que as duas primeiras amostras não se mostraram tão efetivas. O Marinobufagin (573 ± 4,242641 e 954 ± 2,12132) e Bufalin (502 ± 3,535534 e 910 ± 2,12132) tiveram um comportamento semelhante aos controles C1 (590 ± 4,242641 e 986 ± 4,949747) e C2 (559 ± 3,535534 e 943 ± 7,071068).

De uma maneira geral, tivemos atividade antimicrobiana de todas as amostras testadas contra os diferentes microorganismos, destacando-se Telocinobufagin, F1, Hellebrigenin, já a amostra Bufalin apresentou uma fraca atividade antimicrobiana contra algumas bactérias, sendo que contra nenhuma tivemos ação do Marinobufagin. Ao que parece em F1 temos um componente que tem atividade antimicrobiana ou ainda, o que é mais provável, age de maneira sinérgica com o Hellebrigenin. 89

b) Amostras de Leptodactytlus pentadactylus b.1. Peptídeos 5, 6 e 7 de Leptodactytlus pentadactylus obtidos pela CLAE em C18

b.1.1. Avaliação da atividade tempo-dependente

Iniciamente, foram realizados ensaios-piloto com um Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Salmonella choleraesuis choleraesuis var typhi, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus para efetuar uma triagem, resultando na repetição dos experimentos com alguma destas bactérias apenas. Realizaram-se ensaios com os picos peptídicos 5, 6 e 7 obtidos de Leptodactytlus pentadactylus contra três diferentes microorganismos em função da variável tempo com seis leituras (2, 4, 6, 8, 12 e 24 h) em triplicata para avaliar a influência do tempo nestes dados, sendo que se mostrou sem ação com 24 horas nas condições experimentais. Os resultados encontrados são descritos e ilustrados abaixo, tendo sido submetidos as análises pelo modelos de Gompertz e da Equação de regressão não linear, assim como testes estatísticos: 90

2000

1500 5 6 7 1000 C1 C2 Absorbância (492 nm) 500

0 L1(2h) L2(4h) L3(6h) L4(8h) L5(12h) L6(24h) Tempo (h)

Figura 31 - Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras peptídicas 5, 6 e 7 obtidas de Leptodactylus pentadactylus contra Bacillus subtilis.

Todos os picos testados inibem o crescimento do Bacillus subtilis até 6 horas, sendo que em 8 horas há uma aceleração do crescimento da bactéria quando incubada com a amostra 5, o que pode ser sugestivo do microorganismo estar utilizando-o como fonte de nutriente, sendo que os picos 6 e 7 ainda apresentam uma atividade inibitória do crescimento oque é sugestivo de uma maior atividade em relação as outras amostras testadas nestas condições. Com 12 horas apenas a amostra 6 apresenta alguma atividade antimicrobiana ainda. Na leitura 6, decorrido 24 horas, aparentemente as amostra deixaram de ser utilizadas como alimento e tem algum efeito deletério mais possivelmente devido a subprodutos metabólicos. 91

Bacillus subtillis

2000 Amostra 5 Amostra 6 Amostra 7 1500 C1 C2

1000 Abs (492 nm) Abs

500

0 0 5 10 15 20 25 30 Tempo (h)

Figura 32 - Análise dos dados da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras peptídicas obtidas de Leptodactylus pentadactylus pelo modelo de Gompertz contra Bacillus subtilis.

As amostras 6, 7 e o controle C1 desviam-se deste modelo, sendo apenas a amostra 5 e o controle C2 têm um desvio não significante, portanto não podendo-se fazer uma análise satisfatória por este modelo. O modelo teórico de Gompertz acima tem importância, pois através dele podemos analisar dois parâmetros importantes que são o tempo para início do crescimento bacteriano (lag) e taxa de crescimento máximo (Tax) que complementa as informações relacionadas com a cinética de crescimento. 92

Bacillus subtillis

2500 Amostra 5 Amostra 6 2000 Amostra 7 C1 1500 C2

1000 Abs (492Abs nm)

500

0 0 5 10 15 20 25 30 Tempo (h)

Figura 33 - Análise dos dados da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras peptídicas obtidas de Leptodactylus pentadactylus pelo modelo de Equação de Regressão Não Linear contra Bacillus subtilis.

Analisando os dados por este modelo teórico com um P<0,0001 de aceitabilidade deste procedimento. Nota-se que houve uma redução do valor inicial de crescimento deste microorganismo quando incubado com cada uma das três amostras peptídicas 5 (337,6 ± 10,89), 6 (161,1 ± 9,107) e 7 (275,2 ± 9,886) em relação aos controles C1 (518,8 ± 2,392) e C2 (482,8 ± 9,866), mostrando que seu efeito possivelmente foi só na fase inicial da bactéria, podendo ser uma ação direta sobre a cultura bacteriana reduzindo seu número ou na sua fase inicial de multiplicação. Porém temos uma cinética de crescimento diferente que pode ser visto acima, o que se traduz na inclinação, na qual 5, 6 e 7 foram maiores do que os controles C1 e C2 , podendo ser uma compensação metabólica, ou seja, acelerou a cinética para compensar o atraso inicial. 93

O início do crescimento (START) e a inclinação (K) que são parâmetros que permitem analisar a cinética mais detalhadamente e complementa as informações obtidas pelo modelo de Gompertz foram submetidos ao Teste de Comparação Múltipla de Tukey, resultando nas considerações a seguir:

Coeficiente linear - start Bacillus subtilis

600 A5 A6 500 A7 C1 400 C2

300 Abs (492nm) Abs 200 Coeficiente linear - linear Coeficiente start

100

0 A5 A6 A7 C1 C2 Amostras

Figura 34 - Representação gráfica do resultado do Teste de Comparação Múltipla de Tukey da influência das amostras peptídicas de Leptodactylus pentadactylus no início do crescimento (START) do Bacillus subtilis.

As amostras peptídicas se mostraram diferentes entre si com relação ao início do crescimento microbiano e destas para os controles C1 e C2, com um P<0,001 para a amostra 6 e de P<0,015 de significância para 5 e 7. Os controles se mostraram sem diferença significativa, com um P>0,05 quanto ao valor de START. 94

Coeficiente angular - K - Bacillus subtilis

0.125 A5 A6 A7 0.100 C1 C2

0.075

0.050 Coeficiente angular - K

0.025

0.000 A5 A6 A7 C1 C2 Amostras

Figura 35 - Representação gráfica do resultado do Teste de Comparação Múltipla de Tukey da influência das amostras peptídicas de Leptodactylus pentadactylus na inclinação (K) para análise da cinética de crescimento de Bacillus subtilis.

Quando se estuda a inclinação, temos que em termos cinéticos as amostras peptídicas 5 e 7 são sem diferença significativa (P>0,05) entre si, mas ambas diferentes de 6 (P<0,001) que apresentou uma possível compensação metabólica bem mais intensa por parte da bactéria para remediar a interferência inicial desta substância, sendo ainda importante salientar que as três amostras peptídicas diferem dos dois controles. Para os valores de K temos que C1 e C2 se mostraram diferentes com um P<0,05, o que já era esperado, pois são dois controles diferentes. 95

2500

2000 5

1500 6 7 C1 1000 C2

Absorbância (492 nm) 500

0 L1(2h) L2(4h) L3(6h) L4(8h) L5(12h) L6(24h) Tempo (h)

Figura - 36 Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras peptídicas 5, 6 e 7 obtidas de Leptodactylus pentadactylus contra Klebsiella pneumoniae.

Até as 8 horas, terceira leitura, as três amostras testadas inibem o crescimento da Klebsiella pneumoniae, sendo que com 12 horas a atividade antimicrobiana das amostras 5 (1326 ± 2,645751) e 6 (1371 ± 7) é muito pequena em relação ao controle C1 (1414 ± 3,605551), sendo 7 (1210 ± 6,244998) das três a que ainda apresenta uma atividade um pouco maior. Com 24 horas chama a atenção o aumento do crescimento da bactéria quando em presença da amostra 6 que possivelmente está sendo fonte de nutrientes.

Klebsiella pneumoniae

2500 Amostra 5 Amostra 6

2000 Amostra 7 C1 C2 1500

Abs (492 nm) Abs 1000

500

0 0 5 10 15 20 25 30 Tempo (h)

Figura - 37 Análise dos dados da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras peptídicas obtidas de Leptodactylus pentadactylus pelo modelo de Gompertz contra Klebsiella pneumoniae.

Todas as amostras e controles apresentaram um desvio do controle não significativo deste modelo teórico e portanto, podendo-se utilizar Gompertz para estudar os dados obtidos. Quando cultivado em presença das amostras 5 (3.468 ± 2,366), 6 (4.738 ± 0,3445) e 7 (5.174 ± 0,8143), pôde-se observar que tivemos um aumento da fase lag em relação aos dois controles, C1 (2.590 ± 3,460) e C2 (2.832 ± 2,913). Isto significa dizer que retardaram o início da fase de crescimento. Com relação a cinética da fase exponencial, nenhuma das três amostras teve efeito satisfatório de redução, sendo que a 7 ainda depois do tempo 12 h faz um incremento (135,2 ± 17,84) em relação aos controles C1 (113,0 ±35,22) e C2 124,6 ± 2,832). 97

Klebsiella pneumoniae

4000 Amostra 5 Amostra 6

3000 Amostra 7 C1 C2

2000 Abs (492 nm) Abs

1000

0 0 5 10 15 20 25 30 Tempo (h)

Figura 38 - Análise dos dados da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras peptídicas obtidas de Leptodactylus pentadactylus pelo modelo de Gompertz contra Klebsiella pneumoniae.

Este modelo teórico se aplica para todas as amostras e controles com um P<0,0001. Pôde se observar que os valores de início são menores para as amostras 5 (367,7 ± 11,37), 6 (310,2 ± 11,72) e 7 (313,1 ± 7,958) em relação aos controles C1 (498,2 ± 12,30) e C2 (419,9 ± 13,33). As amostras 6 (0,08969 ± 0,002508) e 7 (0,09574 ± 0,00174) apresentaram uma maior cinética que os dois controles C1 (0,06956 ± 0,001660) e C2 (0,07098 ± 0,001723), sendo observado para a amostra 6 aproximadamente 12 horas e com a 7, com 17 horas. Este retardo no crescimento inicial causado pelas amostras 6 e 7 parece ter sido remediada por uma compensação metabólica por parte da bactéria, ou seja, acelerou a cinética para compensar o atraso. Contudo, a amostra 5 (0,07887 ± 0,002065) manteve uma cinética de sua taxa metabólica com comportamento semelhante ao de C1 (0,06955 ± 0,001660) e C2 (0,07098 ± 0,001723), apesar de serem diferentes, houve interferência da amostra (retardo) no crescimento bacteriano e também impediu a compensação metabólica por parte 98

da bactéria. Isto é sugestivo que a amostra 6 teve um melhor desempenho para esta bactéria em relação as outras amostras.

Coeficiente linear - start Klebsiella pneumoniae

600 A5 A6 500 A7 C1 400 C2

300 Abs (492 nm) Abs 200 Coeficiente linear - linear Coeficiente start

100

0 A5 A6 A7 C1 C2 Amostras

Figura 39- Representação gráfica do resultado do Teste de Comparação Múltipla de Tukey da influência das amostras peptídicas de Leptodactylus pentadactylus no início do crescimento (START) de Klebsiella pneumoniae.

Após a análise por Tukey pode ser visto que o efeito inicial das amostras 6 e 7 sobre a Klebsiella pneumoniae é considerado sem diferença significativa, contudo ambos são diferentes dos dois controles. A amostra 5 tem um comportamento diferente das duas amostras peptídicas, P<0,05 para cada uma das duas, mas ainda assim tem efeito sobre este microorganismo, sendo também diferente dos controles C1 (P<0,001) e C2 (P<0,05). Os controles se mostraram diferentes entre si (P<0,001). 99

Coeficiente angular - K - Klebsiella pneumoniae

0.100 A5 A6 A7 C1 C2 0.075

0.050 Coeficiente angular - K 0.025

0.000 A5 A6 A7 C1 C2 Amostras

Figura 40 - Representação gráfica do resultado do Teste de Comparação Múltipla de Tukey da influência das amostras peptídicas de Leptodactylus pentadactylus na inclinação (K) para análise da cinética de crescimento de Klebsiella pneumoniae

O coeficiente angular das amostras 6 e 7 sobre a Klebsiella pneumoniae são considerados sem diferença significativa com um P<0,05 devido a sua proximidade de extremos considerando o desvio-padrão, contudo ambas amostras são diferentes dos dois controles C1 e C2 com um P<0,001. A amostra 5 é diferente de 6 e 7, P<0,05 e P<0,001 respectivamente. Os controles não apresentaram diferença significativa entre si (P>0,05). 100

2000

1500 5 6 7 1000 C1 C2

Absorbância (492 nm) 500

0 L1(2h) L2(4h) L3(6h) L4(8h) L5(12h) L6(24h) Tempo (h)

Figura 41- Resultado da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras peptídicas 5, 6 e 7 obtidas de Leptodactylus pentadactylus contra Staphyloccoccus aureus.

Os três peptídeos se mostraram ativos até 12 horas contra Staphyloccoccus aureus que é uma bactéria gram negativa, tendo apresentado os seguintes valores: 5 (1710,667 ± 1,527525), 6 (1554,667 ± 1,527525) e 7 (1688 ± 1,73205), C1 (1981,667± 1,527525) e C2 (2025,687 ± 0,5773). Pode-se observar que nas quatro primeiras horas o pico 7 se destaca dos outros dois pela sua atividade chegando a ter um crescimento menor que o controle de valor mais próximo em valor 2,16 vezes na leitura 1 (2 h) e 1,95 na leitura posterior (4 h).

101

Staphylococcus aureus

4000 Amostra 5 Amostra 6 Amostra 7 3000 C1 C2

2000 Abs (492 nm) Abs

1000

0 0 5 10 15 20 25 30 Tempo (h)

Figura 42- Análise dos dados da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras peptídicas obtidas de Leptodactylus pentadactylus pelo modelo de Gompertz contra Staphylococcus aureus.

Os dados apresentaram um desvio não significativo do modelo teórico de Gompertz. As amostras 5 e 7 influenciaram na fase lag aumentando sua duração, 4.012 ± 0,1090 e 4.079 ± 0,2694 respectivamente, frente aos controles C1 (2.979 ± 2,647) e C2 (3.316 ± 1,931), o que não ocorreu para a amostra 6 (2.972 ± 2,162) que apresentou um comportamento semelhante ao dos controles. Calculando uma razão (R) utilizando a fórmula: R = lagAx/lagC1 , onde Ax é o valor encontrado para a fase lag da amostra x e AC1 o da fase lag do controle C1, para uma melhor comparação dos dados do tempo para inicio do crescimento bacteriano (fase lag) podemos dizer que 102

as amostras 5 e 7 fazem com que o S. aureus aumente em 1,209 e 1,4753 vezes o tempo para o ínicio do crescimento desta bactéria. Com relação a e taxa de crescimento máximo (Tax), a amostra 5 (259,9 ± 12,19) e 7 (317,8±17,25) chegaram mais rápido o seu máximo que é um valor marcadamente inferior ao dos controles C1 (215,4±21,00) e C2 (124,6±13,89), o que não foi observado para a amostra 6 (167,1±19,47). Utilizando uma fórmula semelhante a empregada anteriormente e também estabelecendo referência com C1 que é a cultura sem qualquer substância incubada que possa alterar o crescimento normal da bactéria temos que a razão R = TaxaAx/TaxaC1; onde Ax é o valor da taxa de crescimento da amostra e TaxaC1 a do controle 1 (C1). Temos que amostras 5 e 7 chegam a este valor 1,2066 e 1,4753 vezes mais rápido. Apesar da aceleração de cinética parecer algo ruim ao ser percebido, temos um esgotamento deste microorganismo, o que poderia ser deletério para a sobrevivência deste. 103

Staphylococcus aureus

5000 Amostra 5 Amostra 6 4000 Amostra 7 C1 3000 C2

2000 Abs (492Abs nm)

1000

0 0 5 10 15 20 25 30 Tempo (h)

Figura 43 - Análise dos dados da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras peptídicas obtidas de Leptodactylus pentadactylus pelo modelo de Equação de Regressão Não Linear contra Staphylococcus aureus.

Este modelo teórico, com um P<0,0001, pode ser aplicado para todas as amostras e controles. Pôde se observar que os valores de início são menores para as amostras 5 (422,2 ± 15,78), 6 (470,2 ± 12,61) e 7 (310,7 ± 14,45) em relação aos controles C1 (696,8 ± 14,47) e C2 (618,5 ± 14,96) o que pode ser sugestivo de uma ação direta sobre os microorganismos quando da mistura suspensão de bactérias e amostras, reduzindo o número de bactérias. Em termos cinéticos traduzidos pela inclinação as amostras 5 (0,07486 ± 0,008425), 6 (0,08 ± 0,001778) e 7 (0,08974 ± 0,002960) não parecem ter diferenças pelos índices em termos de 104

comportamento do controle C2 (0,08249 ± 0,001614), sendo aparentemente até maiores que C1 (0,07469 ± 0,001393).

Coeficiente linear - start Staphylococcus aureus

800 A5 A6 700 A7 600 C1 C2 500

400

Abs (492 nm) 300

Coeficiente linear - start 200

100

0 A5 A6 A7 C1 C2 Amostras

Figura 44 - Representação gráfica do resultado do Teste de Comparação Múltipla de Tukey da influência das amostras peptídicas de Leptodactylus pentadactylus no início do crescimento (START) de Staphyloccoccus aureus.

As amostras 5 e 6 não tiveram diferença quanto ao seu comportamento sobre a bactéria com um P>0,05 com relação a redução da quantidade inicial de Staphyloccoccus aureus. A amostra 7, apesar de causar uma redução também tem um P diferencial significativo de 0,01 para a amostra 5 e de 0,001 quando comparada por Tukey com a amostra 6.

105

Coeficiente angular - K - Staphylococcus aureus

0.100 A5 A6 A7 C1 C2 0.075

0.050 Coeficiente angular -Coeficiente K 0.025

0.000 A5 A6 A7 C1 C2 Amostras

Figura 45 - Representação gráfica do resultado do Teste de Comparação Múltipla de Tukey da influência das amostras peptídicas de Leptodactylus pentadactylus na inclinação (K) para análise da cinética de crescimento de Staphyloccoccus aureus.

Pôde-se constatar que amostra 6 tem um comportamento semelhante aos dois controles na sua inclinação K com um P>0,05. As amostras 5 e 7 diferiram na sua inclinação (P<0,01), tendo esta última uma inclinação maior o que significa dizer que apresentou uma taxa metabólica maior do que a amostra 5. Não foi encontrada diferença do comportamento da inclinação quando comparados 5 com 6 ou então a amostra 6 com a 7 apresentando um P>0,05. Ao que parece temos para Staphyloccoccus aureus uma evidente alteração do crescimento desta bactéria pelas três amostras e analisando as informações encontradas pode ser sugestivo de um novo mecanismo pela forma de interferência.

Em Leptodactylus labyrinthicus, espécie coletada em Brasília, Zanotta e colaboradores (2002) purificaram e caracterizaram um novo peptídeo incluído numa nova família proposta, a Labyrinthin, devido a suas diferenciadas características com um número elevado de resíduos 106

hidrofóbico, ausência de cisteínas e região C – terminal amidada ainda não testado para verificar a sua atividade antimicrobiana, mas com grande semelhança a outros dois peptídeos isolados por este mesmo grupo, as labyrinthins 1 e 2 que apresentaram ação antimicrobiana e portanto sugestivo.

b.1.2. Avaliação da influência do pH na atividade antimicrobiana dos peptídeos de L. pentadactylus

Os ensaios com as frações de Leptodactylus pentadactylus peptídicas foram realizados com os picos 5, 6 e 7, variando-se desta vez o pH , que conforme alguns autores pode por vezes aumentar ou diminuir a atividade, sendo os peptídeos ensaiados em pH 6,0 e 7,4 . O valor de pH inferior ao neutro (6,0), foi escolhido conforme a literatura por em alguns casos facilitar a formação dos complexos citolíticos de membrana. Nas nossas condições experimentais não ocorreu qualquer diferença significativa.

b.2. Ensaio antimicrobiano com amostras do L. pentadactylus obtidas em coluna filtrante Sephacryl S-400 em meio líquido

Foi realizado como um piloto em condições extremas temporais para leitura, com 24 horas, utilizando todas as amostras obtidas nesta cromatografia (Tabela 7) e dela selecionado os resultados mais expressivos para testar com mais minúncias posteriormente, conforme são apresentados aqui os dados obtidos. Foi utilizada para as leituras no espectrofotômetro a mesma faixa de comprimento de onda (495 nm) e os mesmos controles (C1 e C2). 107

Tabela 8 – Ensaio antimicrobiano com amostras do Leptodactylus pentadactylus obtidas em coluna filtrante Sephacryl S-400 em meio líquido.

Microorganismo EBA SAC KBP STA BCS EC PA Amostra P1 1999 1674 1778 1723 1290 1574 222 P2 1742 1651 1546 1665 1420 1351 685 P3 1841 1767 1608 1539 1547 1615 433 P4 2000 2000 1214 1779 1849 1678 660 P5 1365 1217 1072 1179 1212 1198 465 P6 1123 1206 1128 1240 1370 1093 348 P7 1116 1116 1089 1217 1215 990 395 P8 1050 828 1083 1302 1270 1092 362 P9 895 870 1029 1003 877 1132 695 P10 1240 1042 1132 1035 711 1075 595 P11 1380 1114 1244 1362 1051 1080 671 C1 1397 1059 835 723 868 1224 1268 C2 1047 1003 825 513 729 1196 1247 Para a bactéria Enterobacter aerogenes (EBA) apenas P9 (895 ± 0,887017) foi menor que os dois controles C1 (1397± 1,38453) e C2 (1047 ± 7,07168), sendo que pelo teste de comparação múltipla de Tukey P9 difere dos controles C1 e C2 com um P < 0,001. Contra Salmonella choleraesus choleraesus var typhi (SAC) temos uma atividade antimicrobiana discreta para P8 (828 ± 2,828427) e P9 (870 ± 1,414214) em relação ao controle C2 (1003 ± 4,242641) e um pouco maior comparando com C1 (1059 ± 7,07106781). Nas condições experimentais, nenhuma amostra apresenta atividade contra Klebsiella pneumoniae (KBP) e Staphylococcus aureus (STA). Quando incubada com Bacillus subtilis (BCS) pôde-se detectar uma atividade fraca de P10 (711 ± 1,519231) para esta bactéria com 24 horas em relação aos controles C1 (868 ± 6,36396) e C2 (729 ± 1,557692), apesar de por Tukey este é diferente dos controles (P<0,001). Contra Escherichia coli (EC) com 24 horas, em relação aos controles C1 (1224 ± 1,169682) e C2 (1196 ± 1,0000) temos que apresentaram atividade antimicrobiana as amostras citadas em ordem decrescente de intensidade do seu efeito: P7 (990 ± 0,968215) > P10 (1075 ± 1,051345) > P8 (1092 ± 1,067971) e P6 (1093 ± 1,068949) > P11 (1080 ± 1,056235) > P9 (1132 ± 1,10709). Todas as amostras-teste apresentaram atividade antimicrobiana contra Pseudomonas aeruginosa, sendo as menos intensas P9 < P2 < P11 < P4 < P10. As mais expressivas P1 > P6 > P8 > P7 > P3 > P5. 108

Os primeiros quatro picos (P1, P2, P3, P4) não apresentaram atividade contra quaisquer microorganismo, a exceção do Pseudomonas aeruginosa, nas condições experimentais com 24 horas, possivelmente servindo apenas como fonte de nutrientes. Nas condições experimentais, nenhuma amostra apresenta atividade contra Klebsiella pneumoniae (KBP), Staphylococcus aureus (STA). Pelo nível de crescimento com algumas amostras - teste em relação aos controles o microorganismo com este tempo de ensaio utiliza-se destas como fonte de nutrientes. Todas as amostras-teste apresentaram atividade antimicrobiana contra Pseudomonas aeruginosa, sendo as menos intensas P9 < P2 < P11 < P4 < P10 e as mais expressivas P1 > P6 > P8 > P7 > P3 > P5, todos diferentes dos controles dos controles com P menores variando de 0,05 a 0,001. Por ter sido observado uma tendência para alguns picos ou uma fraca atividade com 24 horas em relação aos controles, procurou-se efetuar os experimentos seguintes com uma leitura em tempo menor, buscando se evidenciar alguma atividade satisfatória. Após traçarmos o perfil eletroforético, viu-se que alguns picos eram na verdade parte de outros, conforme podemos ver no agrupamento descritos a seguir: Pool 1 (P1 e P2), Pool 2 (P3), Pool 3 (P4, P5, P6, P7), Pool 4 (P8), Pool 5 (P9) e Pool 6 (P10 e P11). Procurando trabalhar com amostras realmente puras, conforme pode ser visto abaixo na cromatografia e eletroforese do P8, os ensaios se concentraram em alguns picos com atividades tóxicas mais expressivas, principalmente no P8, P10 e P11, estudando variáveis tais como tempo e temperatura, haja vista serem de natureza protéica.

Foi observado que pelo nível de crescimento com algumas amostras - teste em relação aos controles alguns microorganismos após algum tempo de ensaio utilizava-se destas como fonte de nutrientes. 109

b.2.1. Avaliação tempo/dependente da atividade antimicrobiana de substâncias extraídas de L. pentadactylus e influência da fervura. Em ensaios para determinação da DL50 com estudos toxicológicos foi observado que o pico 8, objeto de apuradas pesquisas no Laboratório de Neurofarmacologia da Universidade Estadual do Ceará (UECE), perdeu sua atividade quando aquecida a 90 ºC. Visando checar isto com a atividade antimicrobiana, resultaram os dados expostos a seguir.

20 16,5 18 P8 16 P8F 14 11,5 P10 12 P10F 10 7 4,5 P11 8 4,5 4 P11F 6

Absorbância (492 nm) C1 4 2

2 C2 0 0 Leitura 1 (6h)

Figura 46 - Valores de absorbância a 492 nm com 6 horas de cultivo de Pseudomonas aeruginosa obtidas com os picos 8, 10 e 11 da cromatografia em coluna de Sephacryl S-400 de Leptodactylus pentadactylus, com e sem desnaturação pelo calor

Para bactéria Pseudomonas aeruginosa, com 6 horas de decorrido o experimento (Figura 46), viu-se que P8 e P8F apresentaram atividade antimicrobiana, tendo valores de leitura de absorbância menores que os dois controles, indicando assim, menor densidade de crescimento. Para

P8 o crescimento foi de zero, já para a amostra P8F (7 ± 1,41421356) a redução é aproximadamente 66,7 % menor do que em P8. Estes dados são sugestivos de que mesmo com a desnaturação pelo calor, esta proteína conserva parcialmente sua atividade antimicrobiana, o que nos leva a supor que as estruturas quaternárias e terciárias contribuem para a atividade, mas não são totalmente essenciais. A amostra P10 tem atividade antimicrobiana, assim como P10F, sendo que a fervura reduziu a atividade aparentemente em 2,75 vezes a atividade dele natural. Observou-se que P11 tinha atividade antimicrobiana, assim como P11F e aparentemente é indiferente a fervura. 110

Com 12 horas (Figura 47), observou-se que a atividade antimicrobiana cai para todas as amostras, sendo ainda observada uma fraca tendência à atividade de P8F (51 ± 8,48528137) em relação aos controles C1 (103 ± 1,41421356) e C2 (63,5 ± 0,70710678). A amostra P11F aparentemente estimula o crescimento, possivelmente como apenas fonte de alimento.

200 160,5 180 P8

160 P8F

140 P10 103 120 P10F 100 61 70 62 68 P11 80 51 64 P11F 60 Absorbância (492 nm)

40 C1

20 C2

0 Leitura 2 (12 h)

Figura 47 - Valores de absorbância a 492 nm com 12 horas de cultivo de Pseudomonas aeruginosa obtidas com os picos 8, 10 e 11 da cromatografia em coluna de Sephacryl S-400 de Leptodactylus pentadactylus, com e sem desnaturação pelo calor.

Na leitura de 24 horas, vemos que a situação das amostras - teste muda pouco em relação às 12 horas entre si no perfil, contudo ainda tem alguma atividade em relação aos controles.

1200 1114 P8 1042 1003 P8-F 1000 900 825 P10 800 P10-F 558,5 587,5 577 P11 600 P11-F 400 C1

Absorbância (492 nm) C2 200

0 L3 (24 h)

Analisando o evento pela equação de Gompertz (Figura 49), tem-se um comportamento diferenciado para as amostras 8 e 8F dos controles C1 e C2. Nota-se que P8 não encurta ou diminui a fase lag consideravelmente, contudo altera a cinética de crescimento diminuindo-a (172,6 ± 1,48409) em relação aos controles C1 (184,8 ± 8,07808) e C2 (233,9 ± 6,75108). Já com P8F temos um encurtamento da fase lag, fazendo com que a bactéria entre mais cedo na fase de crescimento, contudo o máximo desta fase cinética é menor do que a dos controles, 23,5% e 51,35 % respectivamente para C1 e C2, significando uma redução pronunciada da taxa metabólica. Na Figura 49 podemos observar que quando utilizado este modelo podemos ver que as amostras 10, 10F, 11 e 11F têm um comportamento não condizente com existe modelo.

1500 PA.P8 PA.P8F PA.P10 1250 PA.P10F PA.P11 PA.P11F 1000 PA.C1 PA.C2

750 Abs (492 nm) Abs

500

250

0 0 5 10 15 20 25 30 Tempo (h)

Figura 49 - Curva de crescimento bacteriano estimada pela variação de densidade óptica a 492 nm segundo as equações de Gompertz para Pseudomonas aeruginosa submetidas à várias condições de tratamento com amostras obtidas na coluna Sephacryl S 400 da secreção de Leptodactylus pentadactylus Ainda resta salientar que as outras amostras não apresentam uma alta significância com o modelo teórico deste na o que é sugestivo possuir outro mecanismo de ação ou ainda, serem substâncias bem diferentes de P8 e P8F. 112

1500 PA.P8 PA.P8F PA.P10 1250 PA.P10F PA.P11

1000 PA.P11F PA.C1 PA.C2 750 Abs (492 nm)

500

250

0 0 5 10 15 20 25 30 Tempo (h)

Figura 50 - Análise dos dados da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras peptídicas obtidas de Leptodactylus pentadactylus pelo modelo de Equação de Regressão Não Linear contra Pseudomonas aeruginosa.

Neste modelo podemos ver, conforme considerações anteriores, que as amostras 10, 10F, 11 e 11F, fogem dos modelos utilizados sendo o desvio extremamente mais drástico para o modelo de Gompertz do que para este, ainda resta salientar que as outras amostras não apresentam uma alta significância com este modelo teórico. Os controles C1 e C2, assim como as amostras 8 e 8F atendem seu comportamento podendo inferir a estes algumas observações. O número inicial (START) é evidentemente reduzido para a amostra 8F (1,522 ± 1,761) em relação aos controles C1 (12,03 ± 0,3104) e C2 (3,759 ± 0,1737), gerando uma aceleração metabólica que pode ser compensatória por parte da bactéria. 113

Estes modelos teóricos servem para analisar os dados como um todo, o que nem sempre fornece informações precisas de determinadas situações de tempo, fato que em relação a antimicrobianos às vezes são dados de interesse. Conforme pôde ser visto representadas nas Figuras 49 e 50, as amostras P10, P10F, P11 e P11F têm um comportamento não condizente com as equações utilizadas como modelos, com um desvio extremamente significativo dos modelos, tanto para o de Gompertz como o da Equação de Regressão Não Linear, sendo o desvio extremamente mais drástico para o de Gompertz do que para este. 114

Abaixo podemos ver os dados obtidos para outro microorganismo, Salmonella choleraesus choleraesus var typhi, para os quais serão tecidos comentários

Figura 51 - Valores de absorbância a 492 nm com 6, 12 e 24 horas de cultivo de Salmonella choleraesus choleraesus var typhi obtidas com os picos 8, 10 e 11 da cromatografia em coluna de Sephacryl S-400 de Leptodactylus pentadactylus, com e sem desnaturação pelo calor.

Pode-se observar que de uma maneira 500 P8 geral que com 6 horas todas as amostras 450 400 P8-F têm atividade antimicrobiana em relação 350 P10 300 P10-F aos controles, tanto as nativas como as 250 P11 desnaturadas e que não aparecem 200 P11-F 150 C1 diferenças significativas de atividade 100 Absorbância (492 nm) Absorbância C2 50 entre as diferentes amostras, a exceção 0 L1 ( 6h) de P8 (307 ± 1,41421356) e P8F (266,5 ± 7,77817459).

600 P8 500 P8-F Na leitura 2 (12 h) a situação não tem P10 400 P10-F uma alteração muito significativa anão 300 P11 ser que já não há diferença entre as 200 P11-F C1 amostras nativas e desnaturadas 100 Absorbância (492 nm) C2 0 L2 (12 h)

1200 Com 24 horas temos que as amostras P8 nativas não tem mais atividade 1000 P8-F P10 800 antimicrobiana, a exceção de P8 (826 ± P10-F 1,41421356) em relação aos controles 600 P11 P11-F 400 C1 (900 ± 2,82842712)e C2 (1002,5± C1 Absorbância (492 nm) 200 C2 0,70710678). Todas as amostras

0 submetidas a tratamento térmico L3 (24 h) apresentaram atividade antimicrobiana.

115

1250 SA.P8 SA.P8F SA.P10 1000 SA.P10F SA.P11 SA.P11F SA.C1 750 SA.C2

Abs (492Abs nm) 500

250

0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 Tempo (h)

Figura 52 - Curva de crescimento bacteriano estimada pela variação de densidade óptica (492 nm) segundo as equações de Gompertz, para Salmonella choleraesus choleraesus var typhi, submetidas à várias condições de tratamento com, substratos extraídos de Leptodactylus pentadactylus.

Com relação a este modelo teórico a amostra P10 apresenta um desvio significativo de Gompertz quando este método é utilizado para lhe inferir considerações. O controle C2 teve um comportamento que o programa apenas conseguiu plotar seus pontos porém não efetuou sua curva. Pode ser observado que a fase lag das amostras P8 e P8F foram maiores do que o controle C1 e visualmente também maior que C2, sendo que as amostras restantes tiveram valores próximos aos controles. Utilizando a fórmula Razão: lagAx/lagC1, podemos ver as relações na Tabela 8. Detectou-se com algumas amostras um aumento da taxa metabólica de crescimento, sendo apresentadas a seguir em ordem decrescente P11 (163,7) > P8 (106,7) em relação ao controle C1 (94,56), tendo sido observado também que as amostras apresentadas a seguir reduziram a taxa 116

metabólica P8F (69,50), P11F (60,42) e P10F (53,70) em relação ao controle o que denota que de alguma maneira estas três amostras impedem uma compensação metabólica ou ainda, apenas atuam nesta fase de crescimento. As razões entre as amostras e os controles podem ser observados na

Tabela 8 abaixo, tendo sido utilizada a fórmula Razão: lagAx/lagC1 para se estimar estas relações.

Tabela 9 - Tempo para inicio do crescimento bacteriano (lag) e taxa de crescimento máximo (Tax), estimadas segundo as equações de Gompertz, para Salmonella choleraesus choleraesus var typhi, submetidas à várias condições de tratamento com amostras obtidas na coluna Se phacryl S 4 00 da secre ção de Leptodactylus pentadac tylus.

Amostras P8 P8F P10F P11 P11F PC1 PC2 lag 13,87 12,01 11,75 11,66 11,19 11,23 - Razão 1,227 1,069 0,563 1,038 0,996 1,000 - Taxa 106,7 69,50 53,70 163,7 60,42 94,56 - Razão 1,128 0,735 0,617 1,731 0,639 1,000 -

OBS: *Razão: lagAx/lagC1;; ** razão: TaxaAx/TaxaC1; onde Ax = amostras.

O aumento da fase lag de P8/ C1 (1,227) e muito mais discreto para P8F/ C1 (1,069) e P11/C1 (1,038) é sugestivo que atue no início do crescimento na adaptação da bactéria ao meio em que se encontra ou na produção de de metabólitos essenciais para o seu desenvolvimento. Uma redução para P10F/ C1 (0,563) pode ser indicativo de uma promoção da aceleração do processo de adaptação ou incremento de nutrientes, apesar de ter sido um valor acentuado que influenciou para ter sido esta segunda hipótese. Chamam a atenção os valores de incremento metabólico da taxa de P11 (1,731) e de redução da mesma de P10F/ C1 (0,617) e P11F/ C1 (0,639). Acelerar a fase lag ou a taxa metabólica pode não ter utilidade do ponto de vista de um antimicrobiano, contudo industrialmente haja visto que bactérias são utilizados em processos como facilitadores ou mesmo método de obtenção e beneficiamento de produtos estas substâncias tenham utilidade. 117

1250 SA.P8 SA.P8F SA.P10 1000 SA.P10F SA.P11 SA.P11F

750 SA.C1 SA.C2

Abs (492Abs nm) 500

250

0 0 5 10 15 20 25 30 Tempo (h)

Figura 53 - Análise dos dados da leitura em espectrofotômetro a 492 nm dos poços da placa de microtitulação da avaliação da atividade antimicrobiana com as amostras peptídicas obtidas de L. pentadactylus pelo modelo de Equação de Regressão Não Linear contra Salmonella choleraesus choleraesus var typhi.

Este modelo teórico com um P<0,0001pode ser aplicado para todas as amostras e controles. As amostras P8 (167,7 ± 35,54), P8F (182,8 ± 23,92), P10 (138,3 ± 38,28) e P11 (159,9 ± 16,28) reduziram o valor inicial de crescimento em relação aos controles C1 (328,5 ± 12,72) e C2 (287,9 ± 40,11), sendo sugestivo de possurem uma ação direta sobre esta bactéria. Analisando a inclinação K pôde-se observar que a amostra P10F (0,03645 ± 0,007032) reduziu o coeficiente angular em relação aos controles C1 (0,04125 ± 0,002451) e C2 (0,049329 ± 0,008895), já as amostras P10 (0,07927 ± 0,01772) e P11 (0,07897 ± 0,006484) aumentaram, possivelmente num efeito compensatório por parte da bactéria pelo atraso inicial que estas amostras causaram ou estas não tinham mais efeito inibitório sobre o crescimento da bactéria e serviram como incremento nutricional. As amostras P8 e P8F tiveram um valor de K igual aos controles, sendo 118

sugestivo que seu efeito sobre esta bactéria nas condições experimentais é mais direto sobre o microorganismo.

b.2.2. Determinação da concentração inibitória mínima antimicrobiana do pico 8 obtido da cromatografia em coluna filtrante Sephacryl S 400 da secreção de Leptodactylus pentadactylus Para complementar as informações obtidas nos experimentos que verificaram a atividade antimicrobiana do pico 8 (P8) contra Pseudomonas aeruginosa com os parâmetros tempo/dependência e desnaturação pelo calor, uma nova variável que é a de concentração. A amostra utilizada de P8 nativa utilizada foi de concentração menor do que a anteriormente -2 empregada nos ensaios. Foi encontrado um valor 3,21x10 μg de proteína ou ainda, 0,64 μg/mL como concentração mínima capaz de inibir esta bactéria com seis horas, já a desnaturada pelo calor foi de0,51μg ou 10,27 μg/mL. Proteínas com ação antimicrobiana têm sido isoladas com menos freqüência do que peptídeos. Como a exemplo, pode-se citar os obtidos de duas espécies de peixe, a Parasin, um peptídeo derivado da região N- terminal da histona H2A de peixe-gato, Parasilurus asotus (PARK et al., 1998) e uma proteína muito maiorrelacionada ou idêntica histona H2B, encontrada no muco da pele de outro peixe-gato, Ictalus punctatus (ROBINETTE et al., 1998). A atividade antimicrobiana na pele de carpa (Cyprinus carpio), e ensaios preliminares em truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss), e outras espécies foram sugestivos da possibilidadede outras grandes proteínas antimicrobianas (LEMAITRE et al., 1996; EBRAN et al., 2000). Em levantamentos bibliográficos têm sido encontrados de alguns anos para cá um considerável quantidade de trabalhos com peixes, sendo que Smith e colaboradores (2000) detectaram quatro proteínas da truta arco-íris, Oncorhynchus mykiss, com uma pronunciada atividade antimicrobiana contra bactérias gram positivas, posteriormente isoladas e caracterizadas a oncorhyncin II (FERNANDES et al., 2004) e oncorhyncin III (FERNANDES et al., 2003). Já Richards e colaboradores (2001) encontraram atividade antimicrobiana em material oriundo de salmão do Atlântico (Salmo salar), primeiramente em extratos ácidos, posteriormente isolando uma proteína antimicrobiana do fígado desta animal com um peso molecular de 20.734 Da e esta identificada como uma histona H1. A proteína apresentou uma concentração inibitória mínima de 31 μg/mL contra E. coli D31. 119

A atividade da proteína de Leptodactylus pentadactylus é extremante expressiva e específica, o que futuramente poderá constituir numa nova opção frente o crescente aparecimento de cepas multi-resistentes. 120

5. CONCLUSÕES

Com relação ao material obtido de Bufo schneideri, nas condições experimentais, temos que: Os picos 1B, 2, 3 e 4 são bufadienolídeos identificados respectivamente como Hellebrigenin, Telocinobufagin, Marinobufagin e Bufalin.

Telocinobufagin apresenta uma atividade hemolítica mais intensa na concentração original, contudo esta amostra tem um título de atividade menos expressivo que estes dois outros picos, sendo que Bufalin apresenta uma atividade hemolítica bem menos intensa do que a Hellebrigenin e Telocinobufagin.

Dentre os extratos de pele, o elaborado a partir da região glandular com etanol foi o mais ativo contra todas as bactérias testadas, tendo apresentado uma maior atividade contra Staphylococcus aureus.

Todos os picos testados, a exceção do Marinobufagin, foram ativos para a bactéria gram positiva o Staphylococcus aureus ATCC 6538P e a gram negativas Escherichia coli ATCC 25922.

Hellebrigenin apresenta também atividade antimicrobiana, contudo não tão intensa quanto F1.

A atividade antimicrobiana de F1 e do Telocinobufagin são semelhantes para os microorganismos testados, sendo que Hellebrigenin apesar de ter uma atividade menos intensa é efetivo para as mesmas bactérias que estes dois primeiros.

Telocinobufagin teve ação antimicrobiana em menor ou maior grau para todas as batérias testadas a exceção de Pseudomonas aeruginosa, a qual não foi inibida por nenhumas das amostras testadas

Marinobufagin aparentemente não apresenta atividade hemolítica, nem antimicrobiana nas condições experimentais utilizadas.

121

Em meio líquido a atividade antimicrobiana das amostras contra estes micoorganismos não diferiu significativamente dos resultados em meio sólido.

Com relação ao material obtido de Leptodactylus pentadactylus, nas condições experimentais, temos que: Os picos obtidos da cromatografia em Sephacryl S-400 apresentam atividade hemolítica, sendo que os picos 7, 8 e 9 os mais expressivos.

Todos eles (P1 –11) apresentam na concentração mais alta uma atividade aglutinante e em menores hemolítica

A atividade hemolítica do P8 é variável em termos de título conforme a espécie ou tipo sangüíneo, sofrendo influência da refrigeração.

O pico P8, extraído de L. pentadactylus apresenta uma intensa atividade antimicrobiana contra Pseudomonas aeruginosa e mais discreta para outras bactérias testadas (E. coli, S. aureus, K. pneumoniae, Enterobacter aerogenes, S. choleraesuis choleraesuis var typhi, B. subtilis)

A atividade antimicroniana contra Pseudomonas aeruginosa de P8 é reduzida, mas não abolida após tratamento térmico evidenciando a importância maior deuma estrutura primária, sendo que para S. choleraesuis choleraesuis var typhi o tratamento térmico possibilita uma maior durabilidade do efeito antimicrobiano.

De uma maneira geral que até 12 horas todas as amostras (P8, P8F, P10, P10F, P11 e P11F) têm atividade antimicrobiana contra S. choleraesuis choleraesuis var typhi em relação aos controles, tanto as nativas como as desnaturadas, sem diferenças significativas de atividade entre as diferentes amostras, a exceção de P8 e P8F com seis horas.

A ação antimicrobiana de P8 é principal parece ser por efeito direto sobre o microorganismo no início de seu crescimento.

122

As amostras P10, P11 e suas equivalentes desnaturadas pelo calor têm um comportamento não condizente com as outras amostras testadas, inclusive não se enquadrando nos modelos teóricos, sendo sugestivo possuir outro mecanismo de ação ou ainda, serem substâncias bem diferentes.

Os peptídeos 1 e 5 são os que apresentam o valor mais expressivo de CHM, contudo o que apresenta a maior intensidade é a amostra 6, sendo que não pareceu haver relação entre atividade antimicrobiana com hemolítica.

Os peptídeos 5, 6 e 7 de de L. pentadactylus apresentam atividade antimicrobiana para diferentes bactérias, tanto gram positivas como negativas, sendo que a forma que eles o fazem nem sempre é o mesmo.

Pelo modelo de Gompertz pôde ser visto que as amostras peptídicas 5 e 7 aumentam a fase lag das bactérias S. aureus e K. pneumoniae, sendo que sua influência sobre a fase de crescimento exponencial é bem variável.

Os peptídeos 5, 6 e 7 reduzem diretamente o numero inicial de bactérias quando incubado com estas assemelhando-se a um efeito bactericida..

As amostras apresentaram uma atividade antimicrobiana e mais influências metabólicas sobre Staphylococcus aureus com um mecanismo aparentemente desconhecido.

A influência do pH na atividade antimicrobiana dos peptídeos testados não foi significativa.

A ação antimicrobiana encontrada das amostras peptídicas não tem semelhanças com o material que na sua maioria apresenta características protéicas obtido da cromatogarfia em Sephacryl S-400.

As amostras testadas não só adquirem importância diretamente por seus resultados, mas também pela sua possível utilização como modelos e pontos de partida para novos compostos quer obtidos por síntese ou engenharia genética que venham nos fornecer novos e eficientes antimicrobianos. 123

6. BIBLIOGRAFIAS CONSTADAS

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